CZ350595A3 - Mgdf polypeptide for stimulating growth and diferentiating megacaryocytes - Google Patents

Description

MGDF polypeptid pro stimulaci růstu a diferenciaci megakaryocytů

Oblast techniky i

, Vynález se týká nových proteinů, které jsou v tomto popisu označovány dvěma synonymními názvy, a to Mpl ligandy nebo MGDF. Tyto proteiny stimulují růst megakaryocytů a zvyšují diferenciaci nebo maturaci megakaryocytů, což se v konečném úhrnu projevuje zvýšením počtu krevních destiček. Vynález se také týká Způsobů získávání těchto proteinů v homogenní formě z různých zdrojů a způsobu jejich přípravy .rekombinantními technikami genového inženýrství.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je nová třída derivátů MGDF, v nichž je molekula MGDF připojena k vodorozpustnému polymeru, a způsobu výroby takových molekul. Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou deriváty MGDF, v nichž je molekula MGDF připojena k jedné nebo více polyethylenglykolových skupin (PEG) a způsobů jejich výroby.

Dosavadní stav techniky i Vynález zahrnuje přinejmenším dvě oblasti výzkumu.

' První z nich se týká vývoje megakaryocytů a následující

... ------- --produkce-krevních- dest-i-ček a- druhý se týká polypeptidového členu třídy receptorů růstového faktoru (zde označovaného názvem Mpl receptory) a jejich ligandů. Obě tyto oblasti výzkumu budou podrobněji charakterizovány v následujícím popisu.

A. Produkce krevních destiček z megakaryocytů

Krevní destičky jsou cirkulující buňky, které hrají rozhodující úlohu při prevenci krvácení a při koagulaci krve. Megakaryocyty jsou buněčným zdrojem krevních destiček a vznikají ze společných prekursorových buněk v kostní dřeni, z nichž vznikají všechny hematopoietické buňky. Tyto společné prekursorové buňky jsou známy jako pluripotentní kmenové buňky nebo PPCS.

Hierarchie megakaryocytových progenitorových buněk byla definována na základě doby vzniku a velikosti megakaryocytových (MK) kolonií objevujících se v systémech in vitro kultur v odpovědi na příslušné.růstové faktory.

Tzv. megakaryocyty burst-forming. unit megakaryocyte (BFU-MKj jsou. .nejprimitivnějšími, megakary.ocytovými progenitorovými buňkami. 0 BFU-MK se předpokládá, že nakonec vytvoří početné megakaryocytové jednotky vytvářející. kolonie (CFU-MK), které jsou diferencovanějšími progenitorovými ' buňkami, megakaryocytů?

Při následné diferenciaci megakaryocytových buněk ztrácejí tyto buňky schopnost mitozy, ale získávají schopnost endoreduplikace. Endoreduplikace (nebo endomitoza) je buněčný jev jaderného dělení za nepřítomnosti dělení buněk. Endoreduplikací vznikají nakonec polyploidní megakaryocyty. Další maturace megakaryocytů vede k získání cytoplasmatic,..kých organel a membránových složek, které jsou.charakteristické pro krevní destičky. . ..

Krevní destičky vznikají z maturovaných megakaryocytú špatně definovaným procesem, o němž se předpokládá, že je důsledkem fyzikální fragmentace megakaryocytů nebo jiného mechanismu. Pozorování rozsáhlých membránových struktur v megakaryocytech vedlo k vytvoření modelu tvorby krevních destiček, v němž demarkační membránový systém v hlavních rysech ohraničuje nascentní krevní destičky v těle buňky. Jiný model tvorby krevních destiček byl vyvinut na základě pozorování, že megakaryocyty tvoří dlouhé cytoplasmatické výčnělky omezené v intervalech odpovídajících velikosti krevních destiček, z nichž se krevní destičky pravděpodobně odtrhují díky tlakům vyvolaným krevním tokem v kostní dřeni a/nebo plicích. Tyto cytoplasmatické výčnělky byly nazvány Beckerem a DeBruynem (Becker a DeBruyn, Amer.

J. Anat. 145: 183 (1976)) přodestičkami, aby tak byl naznačen jejich předpokládaný prekursorový charakter při tvorbě destiček.

Přehled různých prekursorových buněk, které se podílejí na vývoji megakaryocytů a krevních destiček je uveden na obr. 1. Krajní buňka na levé straně obrázku . představuje pluripotentní kmenovou buňku (buňku PPSC) a od nich směrem vpravo jsou umístěny buňky BFU-MK a dále pak CFU-MK. Buňka podléhající endoreduplikaci, která je umístěna v obr. 1 bezprostředně napravo od PPSC, představuje maturovanou megakaryocytovou buňku. V důsledku endomitosy se tato buňka stala polyploidní. Další struktura, směrem vpravo, zahrnuje dlouhé cytoplasmatické výčnělky vycházející z polyploidního jádra maturované megakaryocytové buňky. Na pravém okraji obr. 1 je znázorněna řada krevních destiček, které vznikly fragmentací cytoplasmatických výčnělků.

* 4 . .

Dále je uveden přehled některých dosavadních — publikací-,-které se-vztahují k výše- uvedenému popisu - ----maturace megakaryocytů a produkce krevních destiček.

1. Williams, N. a Levine, R. F., British Journal of Haematology 52: 173-180 (1982);

2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes, vyd. Wiley-Liss, lne.: 1-10 (1990);

3. Gewirtz, A. M. , The Biology of. Hematopoiesis, vyd. WileyLiss, lne.: 123-132 (1990);

4. Han, Z. C., et al., Int. J. Hematol. 5: 3-14 (1991);

5. Hieuwenhuis, Η. K. a Sixma, J. New Eng. J. of Hed. 327: 1812-1813 (1992);

6. Long., M. , Stem Cells 11: 33-40 (1993).

Dále je uveden přehled některých, dosavadních, publikací,, které se vztahují k regulaci, produkce;. megakaryoc.ytú a krevních destiček::.

7. Hoffman, R. et al., Blood Cells 13: 75-86 (1987);

8. Hurphy, M. J., Hematology/Oncology Clinicsof North America. 3 (3): 465-478 (1988);

9. Hoffman, R. , Blood 74 (4): 1196-1212 (1989);

10. Mazur, E. M. a Cohen, J. L., Clin. Pharmacol. Ther., 46 (3): 250-256 (1989);

11...Gewirtz, A. M.. a. Calabretta., B., Int. J. Cell Cl.oning 8: 267-276 (1990);

12. Williams, N., Progress in Growth Factor Research 2: 81-95 (1990);

13. Gordon, M. S. a Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992);

14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993);

15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 1295-1304 (1993);

Také bylo oznámeno (viz Mazur E. M. et al., Blood 76: 290 až 297 (1990)), že humánní aplastické sérum obsahuje kolonii raegakaryocytů stimulující účinnost faktoru stimulujícího granulocytovou kolonii a faktorů přítomných v médiu kondicionovaném lymfocyty, odlišnou od IL-3. Molekula zodpovědná za tuto účinnost však za dosavadního stavu techniky nebyla izolována ani charakterizována.

C. Receptory Mpl

Virus myeloproliferativní leukémie (MPLV) je myší replikačné defektní retrovirus vyvolávající akutní leuke-.; mii u infikovaných savců. Zjistilo se, že gen exprimující MPLV se skládá z části genu kódujícího obal retroviru (nebo vnější proteinový plást) viru fúzovaného k sekvenci, která je příbuzná třídě receptorů cytokinu zahrnující receptory? GM-CSF, G-CSF a EPO.

Exprese genu MPLV popsaná výše má zajímavou biologickou vlastnost způsobující, že myší progenitorové buňky různých typů ihned nabývají závislost na růstovém faktoru při proliferaci a terminální maturaci. Kromě toho některé kultury buněk kostní dřeně akutně transformované MPLV obsahují megakaryocyty, což naznačuje, že existuje spojení mezi genem MPLV a růstem a diferenciací megakaryocytú.

V současné době je známo, že gen viru MPLV (označovaný zkratnou v-Mpl) má v savčích buňkách homolog označovaný názvem buněčný gen Mpl (c-Mpl). Za použití prób získaných z v-Mpl byla klonována cDNA odpovídající humánnímu genu c-Mpl (viz přihláška PCT s číslem WO 92/07074, publikovaná 30. dubna 1992, která je blíže charakterizována dále). Sekvenční analýza ukázala, že protein kódovaný produktem genu c-Mpl patří k vysoce konzervované supertřídě receptoru cytokinu podobně jako homologický produkt v genu v-Mpl.

r

O tomto buněčném genu, c-Mpl, se předpokládá, že má svou funkční úlohu při hematopoiesi. Tento předpoklad je založen na pozorování, že jeho exprese byla zjištěna pomocí ochrany RNAsovou próbou a experimenty RT-PCR v kostní dřeni, slezině a fetálních játrech normálních myší, ale nikoliv v jiných tkáních. c-Mpl je zejména-exprimován na megakaryocytech. Také bylo ukázáno, že humánní buněčný gen, humánní c-Mpl, je exprimován v CD34 pozitivních.buňkách obsahujících purifikovaňé megakaryocytya krevní destičky. CD34 je antigen, který je indikativní pro časné hematopoietické progenitorové buňky. Kromě toho expozice CD34 pozitivních buněk syntetickým oligodeoxynukleotidúm, které jsou pozitivní vzhledemk c-Mpl. mRNA'nebo. informaci, významně inhibují schopnost'vytvářet kolonie u megakaryocytových progenitorů ’ J·'

CFU-MK, ale nemají žádný účinek na erythroidhí nebo granulomakrofágové protenitory.

Výše uvedené údaje a pozorování naznačují, že c-Mpl kóduje molekulu povrchu buňky, která je zde označována názvem receptor Mpl. Tato molekula se váže k ligandu aktivujícímu receptor, přičemž možná dochází k produkci a/nebo vývoji megakaryocytů. - <

Patentová přihláška PCT s číslem WO 92/07074 je zaměřena na sekvenci proteinu produkovaného genem c-Mpl, a to jak z humánního, tak z myšího zdroje. Tento genový produkt, o němž se předpokládá, že je receptorem, jak to bylo vysvětleno výše, je sestaven z alespoň tří obecných oblastí nebo domén: extracelulární domény, transmembránové domény a intracelulární (nebo cytoplasmatické domény). Spolu spojeny vytvářejí tyto domény intaktní receptor Mpl.

Citovaná publikace PCT se také týká rozpustné formy tohoto receptorů, která v podstatě odpovídá extracelulární doméně maturovaného proteinu c-Mpl. Tato intracelulární doména obsahuje hydrofobní oblast, která, je-li připojena prostřednictvím transmembránové oblasti k extracelulární doméně

·.►·

I proteinu, dodává celému proteinu agregovatelnost a neroz* . pustnost. Když se na druhé straně extracelulární doména produktu genu c-Mpl oddělí od transmembránové domény a intracelulární domény, stane se rozpustnou. Proto je extracelulární forma proteinu označovaná názvem rozpustná forma tohoto receptorů.

. llď.l in* -«· ΑΛΊNásleduje přehled několika dosavadních publikací.,, _: vztahujících se k výše uvedenému popisu receptorů a genů v-Mpl a c-Mpl.

¹ ·. , , ,i :

17. Wendling, R. , et al., Leukemia 3 (7): 475-480 (1989);..

\ ’3Jt,

18. Wendling, R. , et al., Blood 73 (5): 1161-1167 (1989);·,-, ·_Λ ’ X

19. Souyri, Μ., et al., Cell 63: 1137-1147 (1990);

20. Vigon, I., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 56405644 (1992);

·«·

I

21. Skoda, R. C., et al., The EMBO Journal 12 (7): 26452653 (1993);

22. Ogawa, Μ., Blood 81 (11): 2844-2853 (1993);

23. Methia, N., et al., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993);

24. Wendling F., et al., Blood 80: 246A (1993).

D. Potřeba činidla schopného stimulovat produkci krevních destiček

Nedávno bylo oznámeno, že v lékařských centrech v Severní Americe, západní Evropě a Japonsku stále stoupá počet provedených transfusí krevních destiček (viz Gordon,

M. S.a Hoffman, R., Blood 80 (2): 302 až 307 (1992). Tento nárůst se zdá být do značné míry zapříčiněm pokrokem v lé- 1 kařské technice a větším přístupem k takovým technikám, jako * jsou srdeční chirurgie a'transplantace kostní dřeně, srdce a jater. K velké poptávce po zásobách krevních destiček přispěla také intenzifikace dávek .podávaných při léčbě . , pacientů postižených rakovinou a epidemie HIV-l.· -

Používání krevních .destiček nese. s sebou možnost..;, přenosu- různých: infekčních ichorob .přenosnýchckrví,. jakož i alloimunizace. Kromě toho, produkce krevních destiček je nákladná záležitost, a proto zvyšující še použití krevních destiček významně zvyšuje celkové náklady na léčení... V dů- . sledku toho existuje akutní potřeba vyvinout nové a zlepšené metody produkce- krevních: destiček, pro humánním aplikace.·:

ř

Jako příklady až dosud známých pokusů o zvýšení produkce krevních destiček je možno uvést následující prameny.

V US patentu č. 5 032 396 bylo oznámeno, že inter- j

l.eukin-7 (IL.-7). je schopen.stimulovat produkci krevních . . destiček. Interleukin-7 je také znám.pod označením lymfopoietin-1 a jedná se o lymfopoietický růstový faktor, který je schopný stimulovat růst B- a T-buněčných progenitorů v kostní dřeni. Publikovaná přihláška PCT s podacím číslem 88/03747, podaná 19.’ října ,1988 a Evropská patentová přihláška s číslem podání 88309977.2 podaná 24. října 1988 popisuje DNA, vektory a způsoby produkce savčích

IL-7 proteinů technikou rekombinace DNA. Data uvedená v tomto US patentu ukazují, že IL-7 může zvýšit množství cirkulujících krevních destiček v normálních a sublethálně ozářených myších.

V US patentu č. 5 087 448 se uvádí, že megakaryocytyty a krevní destičky je možno stimulovat k proliferaci v savcích tím, že se na ně působí interleukinem-6. Rekombinantní humánní interleukin-6 je glykoprotein o molekulové hmotnosti 26 000, který má několik biologických účinností. Data uvedená v tomto patentu ukazují, že IL-6 nemá žádný, účinek na zvětšování kolonií megakaryocytú in vitro.

Žádný z výše uvedených patentů neuvádí informace vztahující se k ligandům Mpl, které se podílejí na před- * loženém vynálezu.

Přes existenci výše uvedených publikací existuje nadále silná potřeba vyvinout nové stimulátory megakaryo-,·., cytů a/nebo krevních destiček v savcích.

E. Obor vztahující se k chemicky modifikovanému MGDF

Proteiny pro terapeutické použití jsou v současné době dostupné ve vhodných formách a množstvích, zejména v důsledku pokroku dosaženého v technologiích rekombinace DNA. Funkční skupiny chemických derivátů takových proteinů mohou účinné bránit proteolytickým enzymům ve fyzickém styku

I s hlavním řetězcem proteinu, a tak zabraňovat jejich --degradaci··, přídavnými’výhodamř jsou za určitých okolností’ · “ zvýšení stability a doby cirkulace terapeutického proteinu a snížení imunogenicity. Je však třeba zdůraznit, že účinek modifikace konkrétního proteinu nelze předvídat. Přehledný článek popisující modifikaci proteinu a fúzování proteinu je uveden v publikaci Francis, Focus on Growth Factors 3: 4 až (květen 1992); Vyd. Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lané, Londýn N20, OLD, Velká Británie).

Jednou takovou látkou, které se používá pro přípravu chemických skupin terapeutických proteinových výrobků je polyethylenglykol (PEG nebo peg). Tak například Adagen^^R\ což je pegylovaná adenosin deaminasa, je přípravek schválený pro léčení závažné kombinované imunodeficientní choroby; pegylovaná superoxid dismutasa byla klinicky zkoušena při léčení poškození hlavy; pegylovaný α-interferon byl zkoušen ve fázi I klinických .zkoušek léčby hepatitis; a bylo oznámeno předklinické zkoušení pegylované glukocerebrosidasy a pegylovaného hemoglobinu. Bylo ukázáno, že u některých proteinů: způsobuje připojení polyethylenglykolů ochranu přeď proteolýzou (Sada et al., J. Fermentation Bioingeneering .71: 137 až 139 (1991)) a jsou k dispozici metody umožňující připojení určitých polyethylenglykolových skupin (viz US patent č. 4 179 337, Dávíš et al.., Non-Immunogenic Polypeptides, patent vydán 18. prosince 1979; a US patent č. 4 002 531, Royer, Modif.ying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, patent vydán 11. ledna 1977). Přehled je uveden v publikaci Abuchowski et al., Enzymes as Drugs (J. S. Holcerberg a J. Roberts eds., str. 367 až 383 (1981)).

Pro modifikaci proteinů bylo použito jiných vodorozpustných polymerů, jako jsou kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxyme thylcelulosa-, dextran, polyviny 1alkohol-, polyvinylpyrrolidon, poly-l,3-dioxolan, póly-1,3,6trioxan, kopolymer ethylenu a maleinanhydridu a polyaminokyseliny (buď homopolymery nebo statistické kopolymery).

V případě polyethylenglykolů bylo použito řady různých prostředků pro připojení polyethylenglykolových molekul k proteinu. Obvykle se molekuly polyethylenglykolů připojují k proteinu prostřednictvím reaktivních skupin obsažených v proteinu. Pro takové připojení se hodí aminoskupiny, jako například aminoskupiny v lysinových zbytcích nebo u N-konce. Tak například Royer (US patent č. 4 002 531, viz výše) uvádí, že pro připojení polyethylglykolových molekul k enzymu bylo použito redukční alkylace. V EP íjj 0 539 167 (datum publikace: 28. dubna 1993; Wright, Peg ; Imidates and Protein Derivates Thereof) se uvádí, že peptidy a organické sloučeniny s volnou nebo volnými aminoskupinami se modifikují imidátovým derivátem PEG nebo příbuzného vodorozpustného organického polymeru. US patent č. 4 904 584 (Shaw, patent vydán 27. února 1990) se týká modifikace řady lysinových zbytků v proteinech za účelem připojení molekul polyethylenglykolu prostřednictvím re- .

. u/β aktivních aminoskupin. ,,

Jedním specifickým terapeutickým proteinem, který byl chemicky modifikován, je faktor stimulující kolonii granulocytů, G-CSF (viz Evropské patentové publikace č.,

I 5Í»·»

EP 0 401 384, EP 0 473 268 a EP 0 335 423)..

Jako další příklad je možno uvést pegylovaný interleukin-6 (IL-6) popsaný v EP 0 442 724 o názvu Modified hIL-6 (viz dosud nevyřízenou patentovou přihlášku USA s podacím číslem 07/632070). V těchto publikacích je popsáno připojení polyethylenglykolových molekul k IL-6. V EP 0 154 316 (datum publikace: 11. září 1985) je | popsána reakce lymfokinu s.aldehydem polyethylenglykolu.

..........'Schopnost' modifikace MGDF není v tomto oboru' známa, poněvadž susceptibilita každého jednotlivého proteinu k modifikaci je určena specifickými strukturními parametry takového proteinu. Kromě toho nelze na základě znalostí v tomto oboru předvídat účinek takové modifikace na biologické vlastnosti konkrétního proteinu. S ohledem na řadu klinic12 kých aplikací MGDF (viz výše) je žádoucí, aby byl k dispozici derivatizovaný MGDF s modifikovanými vlastnostmi. Takové molekuly by mohly vykazovat zvýšený poločas životnost a/nebo zvýšenou účinnost in vivo, jakož i jiné vlast* nosti.

Pegylace molekul proteinu má obvykle za následek % vznik směsi chemicky modifikovaných proteinových molekul. I

Jako ilustrativní příklad je možno uvést, že reakcí mole- 4 kuly proteinu s pěti lysinovými zbytky a volnou aminoskupinou u N-konce se za použití výše uvedených metod muže získat heterogenní směs látek, z nichž některé obsahují 6, jiné 5, další 4, další 3, 2, 1 nebo žádný polyethylenglykolový zbytek. Navíc ještě u molekul, s několika póly- . ethylenglykolovými.zbytky nemusí’ být'tyto zbytky 'připojeny, ve stejných místech. Často bude žádoucí získat homogenní ' produkt, který bude obsahovat v podstatě pouze jeden nebo malý počet (například 2 až 3) druhů modifikovaného proteinu, lišících se od sebe počtem a/nebo umístěním: chemických, skupin, jako. jsou. skupiny PEG... Při. určité, terapeutické indikaci mohou být nicméně směsi například mono-’, dia/nebo tripegylovaných látek někdy žádoucí nebo tolerovatelné.

Variabilita získaných směsí od várky k várce může být nevýhodná při vývoji terapeutického pegylovaného proteinového produktu. Při takovém vývoji je důležitou vlastností předvídatelnost biologické- účinnosti. Tak například L bylo ukázáno, že v případě neselektivní konjugace superoxid dismutasy s polyethylenglykolem bylo několik frakcí modifikovaného enzymu úplně inaktivních (P. McGoff et al. , Chem.

Pharm. Bull., 36: 3079 až 3091 (1988). Podobně se v publikaci Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2: 154 až 159 (1991) uvádí selektivní připojení linkerové skupiny karbohydrazidu k C-terminální karboxyskupině proteinového substrátu (inzulinu). Takové předvídatelnosti vlastností terapeutického proteinu nelze dosáhnout, když se jeho složení mění od várky k várce. Některé polyethylenglykolové skupiny nemusí být vázány tak pevně v některých místech jako jiné, a to muže mít za následek, že dojde k disociací takových skupin od proteinu. Je samozřejmé, že jsou-li skupiny připojeny nepravidelně, a jsou-li tedy i nepravidelně ) disociovány, farmakokinetiku terapeutického proteinu není / možno přesně předvídat.

Také by bylo vysoce žádoucí vyvinout derivatizovaný MGDF produkt, který by neobsahoval žádnou spojovací skupinu mezi polymerním zbytkem a zbytkem MGDF. Jedním problémem společným pro výše uvedené metody je, že tyto metody obvykle vyžadují přítomnosti spojovací skupiny mezi molekulou proteinu a molekulou polyethylenglykolu. Tyto spojovací skupiny mohou být antigenní, což jé také nevýhodou při vývoji terapeutického proteinu.

Způsob, na němž se nepodílí žádná spojovací skupina, je popsán v Francis et al., v Stability of protein pharniaceucals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern., T. and Manning, M. C.) Plenům, New York, 1991). Také metoda, kterou popsali Delgado et al. Coupling of PEG to Protein By Activation with Tresyl chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparátion” v Fisher et al., ed., Separaci, tions Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell

Biology and Biotechnology, Plenům Press, New York, NY, 1989 str. 211 áž 213, zahrnuje použití tresylchloridu, což má za následek, že mezi zbytkem polyethelynglykolu a zbytkem proteinu není přítomna žádná spojovací skupina. Tato metoda je obtížně použitelná pro výrobu terapeutických produktů, poněvadž použití tresylchloridu může vést ke vzniku toxických vedlejších produktů.

Chamov et al. (Bioconjugate Chem. 5: 133 až 140 (1994)) popisují modifikaci CD4 imunoadhesinu monomethoxypolyethylenglykol (MePEG glykol) aldehydem redukční alkylací. Autoři uvádějí, že 50 % CD4-Ig je MePEG-modi-' ' fikováno selektivní reakcí na α-aminoskupině u N-konce (tatáž publikace, str. 137). Autoři také uvádějí, že in vitro vazebná schopnost modifikovaného CD4-Ig (k proteinu gp 120) se snižuje v míře korelovatelné se stupněm MePEGylace j

(viz výše uvedená citace).

Existuje tedy potřeba vyvinout deriváty MGDF,

- zejména pegylovaný MGDF. Také existuje potřeba vyvinout metody nebo způsoby provádění takové derivatižace.

Podstata vynálezu

Jedním aspektem tohoto vynálezu jsou nové pólypeptidy, které jsou specifickými promotory růstů a/ňěbo vývoje megakaryocytů (Mpl¹ ligandy, nebo MGDF), kter.é v podstatě neobsahují.(tj. které¹jsou.izolovány) jiné proteiny (tj. savčí proteiny v případě Mpl ligandu¹získaného ze savčího zdroje). Takové proteiny je možno purifikovat z buněčných zdrojů produkujících tyto faktory přirozeně nebo po indukci jinými faktory. Také je možno je připravovat rekombinantními technikami genového inženýrství. Mpl ligandy je možno dále syntetizovat chemickými technologiemi nebo kombinací výše uvedených technologií.

Mpl ligandy podle vynálezu je možno získat v nativní formě ze savčích zdrojů. Dva příkladné Mpl lidandy izolované ze psí aplastické plasmy jsou popsány v příkladové části tohoto popisu. V jiných příkladech uvedených v tomto popisu je však ukázáno, že blízce příbuzné Mpl ligandy jsou přítomny v aplastické plasmě člověka a také vepře. Je pozoruhodné, že účinnost každého z Mpl ligandů (člověka, vepře i psa) je možno specificky inhibovat rozpustnou formou myšího Mpl receptoru, což ukazuje, že všechny tyto Mpl ligandy (jakož i ligandy z jiných savčích zdrojů, včetně z myši) jsou blízce příbuzné, jak pokud se týče,struktury, tak pokud se týče úrovně účinnosti.

Očekává se, že savčí Mpl ligandy z člověka, vepře j i jiných savců bude možno z přírodních zdrojů izolovat ς, postupy, které jsou podrobně popsány v příkladu 10. Předmětem vynálezu jsou tedy obecně savčí Mpl ligandy, jako jsou Mpl ligandy pocházející z psa, vepře, člověka, myši, koně, ovce a králíka. Obzvláštní přednost se dává Mpl ligandům, které pocházejí z psa, vepře a člověka.

Kromě toho byly geny kódující humánní Mpl ligandy klonovány z knihovny humánních fetálních ledvin a jater a. sekvenovány, jak je to popsáno v příkladové části uvedené dále. Byly nalezeny dvě humánní polypeptidové sekvence vykazující účinnost při buněčné zkoušce (viz příklad 4). Tyto «Ku sekvence se liší v délce, ale vykazují identitu ve velkém.,

Λ·'.

. úseku svých aminokyselinových sekvencí. Totožné části jsou homologické s erythropoietinem. Mpl ligandy jsou zde také označovány jako faktory růstu a vývoje megakaryocytů (MGDF). Hovoří-li se kdekoliv v tomto popisu o Mpl ligandech, je toto označení vždy zaměnitelné za označení MGDF a naopak.

Pod označením MGDF polypeptid se rozumí polypeptid vykazující účinnost spočívající ve specifické stimulaci nebo inhibici růstu a/nebo vývoje megakaryocytů. Příklady takových polypeptidu jsou uvedeny v tomto popisu.

Bylo zjištěno, že Mpl ligandy podle vynálezu jsou specificky účinné v třídě megakaryocytů, přičemž zvyšují maturaci a/nebo proliferaci megakaryocytů, jak to ukazují pokusy v příkladech 2 a 4 popsané dále. Pod označením specificky se rozumí, že tyto polypeptidy vykazují biologie16 kou účinnost relativně vyššího stupně vůči megakaryocytúm ve srovnání s mnoha jinými typy buněk. Od Mpl iigandu se stimulačním účinkem vůči megakaryocytúm očekává, že budou vykazovat in vivo účinnost stimulující produkci krevních' destiček prostřednictvím stimulace, maturace a diferenciace megakaryocytu.

Dva přednostní Mpl ligandy z psího zdroje vykazují zdánlivou molekulovou hmotnost přibližně 25 kDa a 31 kDa podle stanovení elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za použití natriumdodecylsulfátu (SDS-PAGE) za neredukčních podmínek. Oba tyto proteiny se purifikují v průběhu téhož purifikačního protokolu/ který je podrobně popsán v příkladové části uvedené dále..

Dva přednostní humánní, ligandy, .MGDF-l· a MGDF-2, mají délku 332 a 173 aminokyselin, nepočítaje v to 2T aminokyselin předpokládaného signálního peptidu. Tyto sekvence a sekvence třetí příbuzné..molekuly, MGDF-3 jsou znázorněny, na obr. 11 a 12.

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou způsoby izolace a purifikace Mpl ligandů podle vynálezu nebo jejich fragmentů ze savčích zdrojů, přednostně z úplné krve, séra nebo plasmy. Přednostním výchozím materiálem je zejména aplastická krev, sérum nebo plasma. Aplastickou krev, sérum nebo plasmu je možno získat způsobem, při němž se savec ozařuje radiačním zdrojem, jako je kobalt-60, při úrovni radiace přibližně 400 až 800 rad, aby se dosáhlo aplasticity. Takový postup je známý v tomto oboru, jak je to například zřejmé z publikací citovaných jako příklady v příkladu 1. V případě člověka je možno ozářenou krev, plasmu nebo sérum získat od pacientů po radiační terapii, například při léčení rakoviny.

Aplastická krev, sérum nebo plasma se potom podrobí purifikačnímu postupu, purifikační postup podle vynálezu zahrnuje následující klíčové stupně: lektinovou afinitní chromatografií a Mpl receptor-afinitní chromatografií. Každý z těchto stupňů má za následek přibližně 300 až 500-násobnou purifikaci 25 a 31kDa proteinu z psí aplastické plasmy. Výše uvedené purifikační stupně je možno kombinovat s jinými standardními postupy purifikace proteinů za účelem zvýšení čistoty Mpl ligandů podle vynálezu. Takové přídavné purifikační postupy jsou také podrobně popsány dále.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou polynukleotidy kódující expresi savčího proteinu Mpl ligandu. Takové sekvence DNA mohou zahrnovat izolovanou sekvenci DNA kódující expresi savčích proteinů Mpl ligandu, která je popsána dále. Sekvence DNA mohou také zahrnovat 5' a 3' savčí nekódující sekvence.lemující sekvenci kódující Mpl ligand. Sekvence,DNA mohou dále kódovat aminoterminální signální peptid. Takové sekvence je možno připravit jakýmikoliv známými metodami, včetně úplné nebo částečné chemické syntézy. Kodony je možno optimalizovat pro expresi v hostitelských buňkách, které byly zvoleny pro expresi (například E. coli nebo buňkách CHO).

Předmětem vynálezu jsou dále také molekuly rekombinantní DNA, z nichž každá obsahuje DNA vektoru a sekvenci DNA kódující savčí Mpl ligand. Molekula DNA obsahuje DNA Mpl ligandu v operativním spojení s regulační sekvencí schopnou řídit replikaci a expresi Mpl ligandu ve zvolené hoštitělške bunčěT 'Předmětem vynálezu jsou i’ hostitelské.....

buňky (například bakteriální, savčí, hmyzí, kvasinkové nebo rostlinné), které jsou transformovány takovými molekulami DNA pro použití při expresi proteinu Mpl ligandu.

Molekul DNA a transformovaných buněk podle vynálezu se používá při dalším aspektu tohoto vynálezu, tj. novém způsobu výroby rekombinantního savčího proteinu Mpl ligandu nebo jeho peptidových fragmentů. Při tomto způsobu se buněčná linie transformovaná sekvencí DNA kódující expresi proteinu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu (nebo rekombinantní molekula DNA popsaná výše) v operativním spojení s vhodnou regulační sekvencí nebo sekvencí kontrolující expresi tohoto proteinu kultivuje za vhodných podmínek umožňujících expresi rekombinantní DNA. Při tomto nárokovaném způsobu se může používat řady známých buněk jako hostitelských buněk pro expresi proteinu. V současné době jsou přednostními buněč nými liniemi pro produkci Mpl ligandu savčí buněčné linie {například buňky CHO) a bakteriální .buňky .(například, buňky.

E. coli).

t

V případě produkce Mpl. ligandu v E. coli se. přednostně používá u N-konce exprimovaného proteinu zbytků Met a ^J Lys, poněvadž-výtěžek- produktu’exprese:·.je;v tomtorpřípadě;- obvykle vyšší . Obzvláště přednostním, produktem,.exprese je Met-Lys-humánní. MGDF s celkem;165 aminokyselinami;(tj. Met~2-Lys-^-1[1-163]MGDF (číslování se provádí od první aminokyseliny maturovaného proteinu). Po purifikaci produktu exprimovaného v bakteriální buňce, jako je E. coli se mohou terminální zbytky Met-Lys odstranit enzymatickým zpracováním, jako například působením dipeptidasy (například kathepsinu C).

t

Exprimovaný protein Mpl ligandu „se potom izoluje z hostitelských buněk, buněčného lyzátu nebo kultivačního média vhodnými konvenčními metodami. Produkční médium je možno zpracovat stejnými purifikačními stupni nebo jejich modifikacemi, jakých se používá při izolaci Mpl ligandu z aplastické plasmy (viz příklad 7).

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou rekombinantní proteiny Mpl ligandu. Tyto proteiny v podstatě neobsahují žádné jiné savčí látky, zejména proteiny.

Proteiny Mpl ligandu podle tohoto vynálezu jsou také charakteristické tím, že vykazují jednu nebo více fyzikálních, biochemických, farmakologických nebo biologických.účinností _¥ charakterizovaných v tomto popisu.,

l.

Předmětem vynálezu jsou dále také chemicky modifikované MGDF obsahující zbytek MGDF proteinu připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru a způsoby výroby a použití takových látek. Vynález zejména zahrnuje chemicky modifikovaný MGDF, který je reakčním produktem MGDF s . reaktivními molekulami polyethylenglýkolu, v němž jsou skupiny PEG připojeny k MGDF. Takového připojení je možno dosáhnout pegylačními reakcemi uvedenými v tomto popisu, jako je acylace nebo alkylace. Acylace nebo alkylace pomocí. PEG. se může provádět za podmínek, při nichž je hlavní produkt monopegylován nebo polypegylován. Polypegylace / obvykle zahrnuje připojení PEG k epsílon-aminoskupinám lysinovýc zbytků a může přídavně zahrnovat pegylaci N-konce polypeptidu. Monopegylace přednostně zahrnuje připojení PEG k a-aminoskupině u N-konce proteinu. Výtěžek a homogenitu monopegylační reakce je možno zvýšit použitím takového typu redukční alkylace, který selektivně modifikuje α-aminoskupinu N-terminálního zbytku MGDF proteinu. Tím se zajistí selektivní připojení vodorozpustného polymerníhO zbytku k N-konci proteinu. Tak se získá v podstatě homogenní přípravek tvořený konjugátem molekul polymeru a MGDF .

........ pro'teíriiT,^-‘jakož i (v'případě že'še použije pólyetHýlěňglýkólu) přípravek zahrnující molekuly MGDF proteinu, v nichž je polyethylenglykolóvý zbytek přímo kopulován k proteinovému zbytku.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství izolovaného přírodního nebo rekombinantního Mpl ligandu, které jsou popřípadě derivatizovány vodorozpustným polymerem,ⁱjako je polyethylenglykol, v kombinaci s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem. Takových farmaceutických prostředků se může používat při léčení chorobných stavů nebo poruch, které jsou charakteristické nedostatkem megakaryocytů a/nebo krevních destiček, jakož i in vivo deficiencí Mpl ligandu. Také se jich může používat profylakticky pro zlepšení očekávané deficience megakaryocytů nebo krevních destiček (například v důsledku chirurgického zásahu).

Mpl ligandů podle vynálezu se může používat při $ léčení aplastických anemií, například pro zvýšení produkce krevních destiček u pacientů se .zhoršenou.produkci krevních destiček (jako jsou pacienti postiženi AIDS nebo pacienti, u kterých je aplikována chemoterapie rakoviny).

Mpl ligandu se může použít pro léčení krevních poruch, jako , je thrombocytopenie. Mpl ligandu se také může použít jako adjunktivní terapie, u pacientů, kterým byla transplantována kostní dřeň. Těmito pacienty mohou být lidé nebo jiní savci. Očekává se, že Mpl ligand z jednoho druhu bude užitečný i u jiného druhu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je tedy způsob léčení těchto a jiných patologických stavů, k nimž dochází v důsledku nedostatku krevních destiček, při němž se pacientům podává terapeuticky účinné množství farmaceutického prostředku popsaného výše. Takové terapeutické metody mohou zahrnovat podávání (simultánní nebo postupné) Mpl ligandu, účinného množství alespoň jednoho jiného faktoru stimulujícího megakaryocytovou kolonii, cytokinu (například EPO), rozpustného Mpl receptoru, hernatopoietinu, interleukinu, růstového faktoru nebo protilátky.

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou protilátky (například polyklonální, monoklonální, humanizované a rekombinantní) a fragmenty protilátek, které jsou zaměřeny proti savčímu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu, tj. které jsou vůči savčímu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu reaktivní. Součástí tohoto aspektu vynálezu jsou tedy buňky, které jsou schopny vylučovat takové protilátky (například hybridomy, v případě monoklonálních protilátek) a 2působy jejich produkce, jakož i jejich použití při diagnostických nebo léčebných postupech.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je zkoušení tělesných tekutin na přítomnosti Mpl ligandu. Při takovém zkoušení je možno používat protilátek, které specificky rozeznávají Mpl ligand. Při tom se muže použit přístupu s jedinou protilátkou nebo s.tzv. sandwichem. Takové zkoušky se může použít pro stanoveni, zda pacient potřebuje externí podávání Mpl ligandu a/nebo zda pacient nevykazuje deficienci krevních destiček nebo jejich poruchu. Stanovení je možno provádět definovaným způsobem za použití soupravy obsahujícívzorky pro pozitivní a negativní kontrolu, protilátku nebo protilátky a jiné standardní složky soupravy.

Jiné aspekty a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu přednostních provedení tohoto vynálezu.

Řada charakteristických znaků a výhod tohoto vynálezu je zřejmá z popisu, v němž se používá odkazů na připojené obrázky.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn přehled vývoje a maturace megakaryocytů a krevních destiček.

Obr. 2 ukazuje, že rozpustný myší Mpl receptor v podstatě úplně inhibuje schopnost plasmy ozářených psu (aplastické psí plasmy či APK9) indukovat vývoj megakaryocytů. Přitom je použito stanovení vývoje magakaryocytů popsané v příkladu 2.

Obr. 3 ukazuje, že aktivita získaná obohacováním z APK9 lektinovou afinitní chromatografií a Mpl receptorafinitní chromatografií (za použití Mpl Iigandu) stimuluje růst buněk buněk 1-A6.1 a že rozpustný myší Mpl receptor blokuje tento růst.

Na obr. 4 je uveden přehled purifikačních stupňů při purifikaci 25. a 31kDa formy psího .Mpl receptoru..z aplastické psí plasmy. ' .

Obr. 5 ukazuje purifikaci Mpl Iigandu pomocí HPLC š ^ů * J·' „ obrácenými fázemi (RP-HPLC). Frakce 21 obsahuje vysoce purifikovaný 31kDa Mpl íigand, frakce 22 obsahuje směs 31kDa a 25kDa Mpl Iigandu a frakce 23 obsahuje vysoce purif.ikovaný 25kDa Mpl Íigand.

Na obr. 6 je znázorněno porovnání aktivity Mpl Iigandu frakce obsahující 25kDa a/nebo 31kDa protein Mpl Iigandu při HPLC s obrácenými fázemi (sloupec C4).

Obr. 7 ukazuje počet megakaryocytů produkovaných v -kulturách CD34-selektovaných buněk periferní krve stimulovaných APK9, Mpl 'ligandem a různými -jinými faktory.

Obr. 8 ukazuje počet všech leukocytů produkovaných v kulturách CD34-selektovaných buněk periferní krve stimulovaných APK9, Mpl ligandem a různými jinými faktory.

Obr. 9 ukazuje procentický podíl megakaryocytů produkovaných v kulturách CD34-selektovaných buněk periferní krve stimulovaných APK9, Mpl ligandem a různými jinými faktory.

Obr. 10 ukazuje, že humánní IL-3 se nepodílí na vývoji megakaryocytů indukovaném Mpl ligandem.

Obr. 11 ukazuje cDNA a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci-humánního MGDF-1 a MGDF-2.

Obr. 12 ukazuje cDNA a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci humánního MGDF-3.

Obr. 13 ukazuje porovnání mezi MGDF-1 a dalšími MGDF (Mpl ligandy) z psího zdroje (A) a myšího zdroje (B).

Na obr. 14 je znázorněn příklad acylace MGDF za použití reaktivních N-hydroxysukcinimidyl (NHS) esterů monomethoxypolyethylenglykolu, která vede k polypegylovanému produktu.

Na obr. 15 je názorněn příklad nespecifické redukční alkylace MGDF za použití monomethoxypolyethylenglykolaldehydů, která vede k polypegylovanému produktu.

Na obr. 16 je znázorněn příklad místně specifické redukční alkylace MGDF na α-aminoskupině N-terminálního zbytku za použití monomethoxypolyethylenglykolaldehydů, při níž vzniká'^_v“podstatě“monopegylovaný-produkt.’ ’ ’

Na obr. 17 je znázorněna analýza HPLC, při níž dochází k vylučování molekul podle velikosti (SEC), konjugátů MePEG-MGDF připravených za použití aktivovaných derivátů MePEG o molekulové hmotnosti 20 kDa:

A) poly-MePEG-MGDF konjugát připravený acylací MGDF NHS-esterem MePEG (PEG 11),

B) poly-MePEG-MGDF konjugát připravený alkylací MGDF MePEG aldehydem (PEG 20),

C) poly-MePEG-MGDF konjugát připravený alkylací MGDF MePEG aldehydem (PEG 16).

Na obr. 18 jsou znázorněny počty krevních destiček u myší ošetřených rekombinantním humánním HGDF: kosočtverce = 22-353 MGDF pocházející z buněk CHO; otevřené kroužky = nepegylovaný 22-184 MGDF z E. coli (tj. 1-163íMGDF); a uzavřené kroužky = pegylovaný 22-184 MGDF z E. coli.

Na obr. 19 je znázoněno purifikační schéma r-HuMGDF.

Na obr. 20 je znázorněn účinek r-HuMGDF (E.coli 1-163 na počet destiček u myšího karboplatinového modelu. Myším Balb/c se intraperitoneálně injekčně podá jediná dávka karboplatinu (1,25 mg/myš) v den 0. Skupina, jíž se podává pouze excipient, neobdrží karboplatin. Po 24 hodinách se zvířatům ošetřeným karboplatinem subkutánně injekčně podává bud excipient nebo 100 μg/kg r-HuMGDF. denně až do konce studie (počet zvířat ve skupině (n) je 10, střídavě se odebírá krev vždy 5 zvířatům), . . Na obr. 21 je znázorněn účinek’rHuMGDF.(E. coli 1-163) na počet krevních destiček u myší ošetřených ozářením. Myši Balb/c se ozáří jednou dávkou gamma záření 500 rad z cesiového zdroje v den 0. Skupina, jíž se podává pouze excipient není ozařována. Po 24 hodinách se ozářeným zvířatům podává subkutánní injekcí bud excipient nebo 100 μg/kg rHuMGDF každý den, až do konce studie (počet zvířat ve skupině (η) = 8, střídavě se odebírá krev vždy čtyřem zvířatům).

Na obr. 22 je znázorněn účinek rHuMGDF (E. coli 1-163) na počet krevních destiček u myší ošetřených kombinací ozařování a karboplatinu. Myši Balb/c se ozáří jednou dávkou gamma záření 500 rad z cesiového zdroje a podá se jim karboplatin (1,25 mg/myš) v den 0. Po 24 hodinách se exponovaným zvířatům podává subkutánní injekcí bud excipient nebo 100 ug/kg rHuMGDF každý den, až do konce studie (počet zvířat ve skupině (n) = 8). Bez podpory r-HuMGDF většina zvířat studii nepřežije. V kontrolní skupině přežije 1 zvíře z 8, zatímco v ošetřené skupině přežije 8 zvířat z 8.

Na obr. 23 je znázorněn účinek r-HuMGDF (E. coli 1-163) na thrombocytopenii indukovanou ozářením u opic rhesus. Opice rhesus se ozáří 700 cGy ze zdroje Co-80. Počínaje 24 hodinami po ozáření, se opicím po dobu dalších 18 dnů subkutánně podává r-HuMGDF (n = 3) nebo humánní sérový albumin (n = 9) (vždy v dávce 25 ug/kg/den). Analýzy krevních buněk se provádějí pomocí elektronického analyzátoru, krevních buněk. Každý symbol představuje průměrnou hodnotu (± směrodatná odchylka).

Na obr. 24 je znázorněn účinek pegylovaného a glykosylovaného r-HuMGDF na počet krevních destiček u myší ošetřených karboplatinem a ozařováním. Myši se podrobí kombinovanému účinku karboplatinu a ozařování způsobem popsaným' ve studii znázorněné na obr. 22. Subkutánní injekce -uvedeného-přípravku r-HuMGDF- (-50 pg/kg/den) -se podávají- každý den po celou délku studie, počínaje 24 hodinami po inzultu. Počty krevních destiček se zjištují označený den za použití elektronického počítače buněk (Sysmex, Baxter).

Obr. 25 ukazuje syntetickou genovou sekvenci rekombinantního humánního MGDF, aminokyseliny l až 163, mající E. coli optimalizované kodony.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Nové faktory povzbuzující růst savčích megakaryocytů a/nebo produkující krevní destičky, kteréžto faktory jsou označovány názvem Mpl ligandy, které jsou předmětem í 1 .

tohoto vynálezu, jsou homogenní proteiny, které v podstatě nejsou spojeny s jinými proteinovými látkami. Přednostně jsou tyto proteiny z asi 90 %, výhodněji z asi 95 % a nejvýhodněji více než 98 % prosté jiných proteinů. Je možno je produkovat rekombinantními. technikami, .kterými., je. možno. zajistit produkci velkých množství, čistého aktivního: Mpl. ligandu užitečného pro terapeutické, aplikace... Alternativně, lze tyto proteiny získat v homogenní formě ze savčí aplastické krve, plasmy nebo séra, nebo ze savčí buněčné linie vylučující nebo. exprimující Mpl ligand.. Mpl. ligand nebo. jeho . účinné fragmenty je dále také možno syntetizovat chemicky.

Pod obecným označením Mpl ligandy, jak se ho používá v popisu tohoto vynálezu, se rozumějí Mpl ligandy popsané v tomto popisu, jakož i jejich účinné fragmenty a varianty, které jsou podrobněji popsány dále.

Přednostní Mpl ligandy z psího zdroje mají zdánA livou molekulovou hmotnost přibližně 25 a 31 kDa podle stanovení elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za použití dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) za neredukčních * * podmínek. Oba proteiny se purifikuji podle stejného purifikačního protokolu, který je podrobně popsán v příkladové části uvedené dále. Tak například oba tyto Mpl ligandy vážou lektin z pšeničných klíčků a imobilizovaný Mpl receptor. 25kDa forma zahrnuje následující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-LeuArg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-ProAsp-Ile-Tyr

31kDa forma zahrnuje následující aminokyslinovou sekvenci SEQ ID NO: 2:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-LeuArg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His

Aminokyseliny označené zkratkou Xaa v SEQ ID NO:

a 2 nejsou s určitostí známy, ale předpokládá se, že se jedná o cystein, serin, threonin nebo (méně pravděporobné) tryptofan.

Z. výše uvedených sekvencí je zřejmé, že 31kDa ligand obsahuje přinejmenším část 25kDa formy. Zejména prvních 21 aminokyselin 31kDa proteinu se přesně shoduje s aminokyser linami ve 25kDa proteinu. Tento důkaz, a zejména skutečnost, že oba tyto proteiny vykazují účinnost při stanovení aktivi. ty Mpl ligandů charakterizovaném v tomto popisu, vede k závěru, že oba tyto proteiny jsou velmi příbuzné, jak pokud se týče struktury, tak pokud se týče účinnosti. Je pravděpodobné, že 31kDa forma tohoto proteinu se od 25kDa formy liší v odlišné C-terminální sekvenci, odlišné glykosylaci a/nebo odlišném sestřihu genu kódujícího tyto proteiny.

Kromě informací, vztahujících se ke složení sekvence, uvedených výše, během sekvenování 25kDa pásu před závěrečným purifikačním stupněm (za použití HPLC s obrácenými fázemi) byla stanovena další sekvence. Tato sekvence je připojena k 25kDa pásu za neredukčních podmínek, ale nikoliv za redukčních podmínek, což ukazuje, že se jedná o výsledek štěpení 25kDa proteinu na dvě části (například proteasou), přičemž tyto části jsou spojeny disulfidovou vazbou. Tato sekvence (SEQ ID NO: 3) má následující složení:

Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gly-AlaVal-Ala-Leu

Přestože přesné umístění SEQ ID NO: 3 v sekvence 25kDa proteinu není jasné, soudí se na základě analogie s jinými cytokiny, jako jé erythropoietin, že by tato sekvence mohla být umístěna v 25kDa proteinu v blízkosti aminokyseliny s číslem 114.' Je pravděpodobné, ačkoliv to nebylo dosud prokázáno, že sekvence. SEQ ID NO: 3 se také vyskytuje v 31kD proteinu, pravděpodobně opět v blízkosti aminokyseliny s číslem 114. Výše uvedené informace.jsou podrobněji prodiskutovány v příkladu 7.

Po počátečních purifikačních experimentech! s psími ligandy, jejichž souhrn je uveden výše, byl nyní klonován gen kódující psí ligand. V důsledku toho byla . stanovena celá délka aminokyselinové sekvence psího ligandu (viz obr. 13A). Na základě výpočtů molekulové hmotnosti se předpokládá, že 25kDa a 31kDa psí ligandy jsou C-terminálními upravenými formami ligandu o úplné délce znázorněného na obr. 13A. Dále byl získán také myší Mpl ligand, jehož sekvence je uvedena na obr. 13B.

- Tyto purifikované ligandy je také možno charakterizovat specifickou aktivitou při zkoušce s humánními megakaryocyty (podle příkladu 2), která dosahuje hodnoty alespoň asi 5,7 x 10⁹ mekaryocytových (meg) jednotek/mg. Megakaryocytová jednotka je definována jako množství látky, které vede k produkci stejného množství megakaryocytů jako μΐ standardního kontrolního vzorku APK9 za použití zkoušky popsané v příkladu 2.

Takové purifikované ligandy jsou rovněž charakterizovány specifickou aktivitou při Mpl-dependentním růstu buněk, tj. zkoušce popsané v příkladu 4, kterážto aktivita dosahuje přinejmenším hodnoty asi 6,9 x 10⁹ jednotek buněčného růstu/mg. Jednotka buněčného růstu je definována jako množství ligandu, které vede k růstu 200 1A6.1 buněk při zkoušce podle příkladu 4.

Následující tabulka 1 ukazuje přídavné specifické výpočty aktivity pro skutečné purifikované psí Mpl ligandy vyrobené způsobem podle tohoto vynálezu.

T a b.u lkal

Mpl Ligand	1A6.1 zkouška (jednotky/mg)	Zkouška s humánními megakaryocyty (jednotky/mg)
31 kDa	6,52 x 109	5,7 x 109
25 kDa	10,5 x 109	14 x IQ9

Výše uvedené informace jsou sumarizovány v následujícím přehledu, v němž uvedeno několik příkladů Mpl ligandů podle vynálezu, které jsou charakterizovány jednou nebo více biochemickými a biologickými vlastnostmi:

(a) Mpl ligandy jsou izolovány z psí aplastické plasmy;

(b) Mpl ligandy mají zdánlivou molekulovou hmotnost přibližně 25 kDa nebo 31 kDa podle stanovení elektro30 forézou na polyakrylamidovém gelu za použití dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) 2a neredukčních podmínek;

(c) Mpl ligandy zahrnují následující aminokyselinové sekvence:

SEQ ID NO: 1, v případě.. 25kDa proteinu nebo SEQ ID NO: 2, v případě 31kDa proteinu;

(d) Mpl ligandy přídavně obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 (zvláště pak 25kDa protein);

(e) Mpl ligandy. se vážou k lektinu z pšeničných klíčku; , .

(f) Mpl lingady se vážou k imobilizovanému rozpustnému myšímu Mpl receptoru;

(g) aktivitu Mpl ligandu je možno inhibovat in. vitro rozpustným Mpl receptorem; a (h) Mpl ligandy se vážou k anexovému sloupci při pH od asi 8 do asi 9.

Biologické účinnosti přednostních Mpl ligandů podle vynálezu jsou demonstrovány jejich schopností specificky stimulovat růst a vývoj megakaryocytů při zkoušce povzbuzování růstu-megakaryocytů podle příkladu 2. Při této zkoušce Mpl ligand stimuluje diferenciaci humánních buněk CD34⁺ periferní krve (tj. buněk CD-34 získaných imunoadsorpční selekcí) v průběhu 8-denního období kultivace. Megakaryocyty se identifikují barvením za použití specifických protidestičkových antigenových protilátek a spočítají se pod mikroskopem. Mpl ligand také stimuluje růst faktordependentní buněčné linie 1A6.1. Za nepřítomnosti Mpl ligandu buňky hynou. Počet 1A6.1 buněk se stanoví po 2 dnech kultivace s Mpl ligandem.

Mpl ligandy popsané výše vykazují specifické aktivity popsané v tabulce 1.

Jako zdroje Mpl ligandů byly.zjištěny aplastická savčí krev, plasma nebo sérum. Neočekává se však, že by byly zdroje těchto ligandů omezeny na tyto známé látky. Zdroje tedy budou zahrnovat také jiné savčí tělesné tekutiny, buňky z nich získané atd.

Purifikace nativních Mpl ligandů ze savčích zdrojů je založena na dvou klíčových purifikačních stupních:

(a) lektinová afinitní chromátografie, přednostně za použití aglutininu z pšeničných klíčků a (b) afinitní chromatografie s imobilizovaným Mpl receptorem.

Mohou být též zařazeny přídavné stupně za účelem další purifikace proteinu. Takové stupně zahrnují například ionexovou chromatografií, gélovou filtrační chromatografií a chromatografií s obrácenými fázemi.

Purifikační techniky skutečně použité pro získání Mpl ligandu z psí aplastické plasmy zahrnují následující stupně (viz příklad 7):

(a) lektinovou afinitní chromatografií (obzvláštní přednost se dává chromatografií za použití aglutininu z pšeničních klíčků);

(b) afinitní chromátografii s rozpustným Mpl receptorem (Mpl-X) (přednostně za použiti imobilizovaného myšího Mpl-X);

(c) chromátografii s výměnou iontů (tj. aniontů nebo kationtů), přednostně za použití sloupce Mono Q?

(d) gelovou filtrační chromátografii za použití disociačních podmínek (přednostně za použití Superdex 200 plus SDS); a (e) chromátografii s obrácenými fázemi (přednostně za použití sloupce C-4).

Homogenní savčí Mpl ligand, včetně humánního ligandu, je možno získat aplikací výše uvedených purifikačních postupů na aplastickou krev, sérum nebo plasmu nebo na jiné zdroje savčího Mpl ligandu, například buněčné nebo tkáňové zdroje. Použité .purifikační stupně není nutno provádět v nějakém určitém pořadí, ale pořadí, které je uvedeno výše se dává přednost. Procedury, kterých je možno použít při kultivaci buněk (nebo tkání) za účelem produkce Mpl ligandu, jsou známé odborníkům v tomto oboru a může se jich například použít pro rozšíření nabídky výchozích látek.

Mpl ligand nebo jeden nebo více jeho peptidových fragmentů je také možno získat rekombinantními technikami. Pro získání sekvence DNA určitého Mpl ligandu se purifikovaný Mpl ligand redukuje a popřípadě štěpí proteasou, jako je trypsin. Enzymatické fragmenty se izolují a sekvenují konvenčními technikami. Alternativně, jak je to příkladně uvedeno v části popisu zabývající se příklady provedení, se intaktní purifikovaný protein může přímo sekvenovat v možném rozsahu, který je závislý na množství dostupného proteinu a potom se může sekvenované oblasti použít analogicky jako sekvenovaných, trypsinem vyštěpených, fragmentů při následujícím postupu. Oligonukleotidové próby se syntetizují za použití genetického kódu, aby byly předvídány všechny možné sekvence kódující aminokyselinové sekvence sekvenovaného fragmentu nebo fragmentů. Přednostně se jako próby vytvoří několik degenerovaných sekvencí. Gen Mpl ligandu se identifikuje za použití těchto prób při screeningu savčí genomové knihovny nebo jiného zdroje. Alternativně se může mRNA z buněčného zdroje Mpl ligandu použít pro vytvoření cDNA knihovny, již lze podrobit screeningu s próbami za účelem identifikace cDNA kódující Mpl ligandový polypeptid. Dále lze použít také PCR techniky pro prodloužení cDNA sekvence. Při tom se používá vhodných primerů.

Za použití těchto prób pro screening genomové knihovny se získá DNA klon. Pro získání klonu o plné délce se může prób založených na získané sekvenci DNA použít pro nový screening knihovny a hybridizači k úplné sekvenci DNA Mpl ligandu.

Humánní cDNA pro Mpl ligand je také možno získat subklonováním humánního genomového klonu o plné délce do expresního vektoru, jeho transfekcí do buněk COS, přípravou cDNA knihovny z takto transfekovaných buněk COS a hybridizačním screeningem na cDNA Mpl ligandu. Po identifikaci celé cDNA je možno celou cDNA nebo její část kódující aktivní fragment Mpl ligandu zavést do kteréhokoliv z různých expresních vektorů za účelem vytvoření expresního systému pro Mpl ligand nebo jeden nebo více jeho fragmentů.

Při takovém použití rekombinantních technik se získají přednostní sekvence DNA kódující Mpl ligandový polypeptid. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také tyto sekvence DNA, které nejsou asociovány se sekvencemi DNA kódujícími jiné proteiny (tj. jsou izolované). Takové sekvence kódují expresi Mpl ligandových polypeptidů s aktivitou Mpl ligandu (jako je například růst a/nebo vývoj megakaryocytů). Tyto sekvence DNA zahrnují sekvence kódující celý Mpl ligand nebo jeho fragment a sekvence, které hybridizují, přednostně za stringentních hybridizačních podmínek k sekvencím cDNA [viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manuál), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387 až 389].

Jako příklady stringentních hybridizačních podmínek je možno uvést hybridizaci v 4 X SSC při 62 až 67’C s následným promýváním 0,1 X SSC při 62 až 67’C po dobu asi 1 hodiny. Jako alternativní příklad stringentních hybridizačních podmínek je možno uvést hybridizaci...v 45 až 55% f.ormamidu, 4 X SSC při 40 až 45C.

Sekvence DNA hybridizující k sekvencím Mpl^ligandu za relaxovaných hybridizačních podmínek a kódující Mpl ligandové peptidy s biologickými vlastnostmi. Mpl ligandu také kódují nové Mpl ligandové polypeptidy podle tohoto vynálezu. Jako příklady takových hybridizačních podmínek s relaxovanou stringencí je možno uvést 4 X SSC při 45 až 55°C nebo hybridizaci s 30 až 40% formamidem při 40 až 45’C. Tak například sekvence DNA, která sdílí oblasti signifikantní homologie, například .místa glykosylace nebo místa disulfidových vazeb, se sekvencemi Mpl ligandu a která kóduje protein vykazující jednu nebo více biologických vlastností Mpl ligandu, jasněkóduje-Mpl ligandový polypeptid, i když se taková sekvence-DNA stringentně nehybridizuje k sekvenci nebo sekvencím Mpl ligandu.

Alelové variace (změny bází v populaci určitého druhu, k nimž dochází v přírodě a které mohou, nebo nemusí mít za následek změnu aminokyseliny) sekvencí DNA kódujících sekvence peptidů Mpl ligandu také spadají do rozsahu tohoto vynálezu, podobné jako příslušné analogy nebo deriváty, Do rozsahu tohoto vynálezu spadají podobně také sekvence DNA kódující polypeptidy Mpl ligandu, které se však odlišují využitím v kodonu v důsledku degenerací genetického kódu nebo variací sekvence DNA Mpl ligandu způsobených bodovými mutacemi nebo indukovaných modifikacemi za účelem zvýšení aktivity, poločasu rozpadu nebo produkce polypeptidů, které jsou jimi kódovány.

Za použití klonovacího postupu uvedeného v příkladu 11 (dále) byly získány aminokyselinové a cDNA sekvence humánních proteinů MGDF-1, MGDF-2 a MGDF-3, které jsou publikovány v tomto popisu. MGDF-1 Zahrnuje aminokyseliny 22 až 353. v obr. 11, tedy celkem 332 aminokyselin. MGDF-2 představuje omezenou část MGDG-1, tedy aminokyseliny 22 až 195 z obr. 11. MGDF-2 tedy obsahuje 174 aminokyselin. MGDF-3 zahrnuje aminokyseliny 22 až 289 z obr. 12, takže obsahuje 268 aminokyselin. V každém z publikovaných MGDF je součásti molekuly polypeptidů podle tohoto vynálezu také signální peptid (aminokyseliny 1 až 21 v obr. 11 a 12). Tento signální peptid se přednostně odstraňuje, aby došlo k růstu megakaryocytů a vývoji jejich aktivity. Přehledně lze MGDF 1 az' 3 definovat takto:

MGDF-1	aminokyseliny	22	až	353	obr. 11
MGDF-2	aminokyseliny	22	až	195	obr. 11
MGDF-3	aminokyseliny	22	až	289	obr. 12

Při zkouškách uvedených v tomto popisu jsou MGDF-1 -------------------a MGDF-2 účinné, zatímco MGDF-3 je-neúčinný.

Na základě dat vztahujících se k aktivitě, která jsou uvedena v tomto popisu, byla vytvořena hypotéza, že humánní MGDF je exprimován in vivo, jako v podstatě inaktivní nebo méně aktivní polypeptidový prekursor obsahující proměnlivé c-terminální aminokyseliny. Po odštěpení c-terminálních aminokyselin (jakož i signálního peptidu) si upravená forma molekuly zachovává aktivitu nebo se stává aktivnější. Na základě této hypotézy se předpokládá, že MGDF-1 může vyžadovat úpravu (například štěpení proteasou), aby vykazoval aktivitu. Tuto hypotézu potvrzuje skutečnost, že omezená forma MGDF-1 (tj. MGDF-2) je účinná.

Kondicionované médium z buněk 293 humánní ledviny (Invitrogen) transfekovaných MGDF-1 genem vykazuje aktivitu při zkoušce s buňkami podle přikladu 4. Na druhé straně, v jiných buněčných liniích, například buňkách 32-D, nebyla u této molekuly pozorována žádná aktivita. Předpokládá se, že to může znamenat, že buňky 293 jsou schopny zpracovat (upravit) molekulu MGDF-1, pravděpodobně jejím omezením, takže molekula, která je převážně zodpovědná za aktivitu má omezenou formu. Buňky 32-D nejsou schopny molekulu takto upravovat. .

S ohledem na tuto hypotézu se mohou různé aktivní molekuly získat omezením sekvence uvedené pro MGDF-1 (obr. 11). Strukturní znaky konzervované ve skupině cytokinů, jako je erythropoietin (EPO) zahrnují čtyři α-helikální svazky a čtyři cysteiny. Pokud se týče sekvence MGDF-1, je Cys 172 nejvíce C-terminálním prvkem z těchto evolučně konzervovaných funkčně esenciálních struktur. Přednostními omezenými variantami MGDF-1 jsou tedy kterékoliv z variant, které obsahují C-terminální omezení od aminokyseliny-173 do aminokyseliny 353 (současně s odštěpením signálního peptidu). Přednostně bude ze sekvence MGDF-1 odstraněno 50 až 185, zvláště pak 90 až 172, aminokyselin od C-konce. Jak je uvedeno v tomto popisu, za signální peptid je považován peptid o délce 21 aminokyselin. Signální peptid však může obsahovat 23 aminokyselin vztaženo na sekvenci MGDF-1. V důsledku toho spadají do rozsahu tohoto vynálezu také polypeptidy odpovídající zde popsaným polypeptidům, které však začínají v poloze 24'na obr. 11 nebo 12.

Dále jsou uvedeny některé specifické přednostní varianty MGDF-1, které by mohly vykazovat účinnost (tj. schopnost vyvolávat růst megakaryocytů a/nebo krevních destiček nebo vykazovat inhibiční/stimulační účinnost na přírodní receptor):

MGDF-4	aminokyseliny	22	až	172	obr.	11
MGDF-5	aminokyseliny	22	až	177	obr.	11
MGDF-6	aminokyseliny	22	až	191	obr.	11
MGDF-7	aminokyseliny	22	až	198	obr.	11
MGDF-8	aminokyseliny	22	až	265	obr.	11
MGDF-11	aminokyseliny	22	až	184	obr.	11

V některých klonech aminokyseliny 133 až 136 v sekvence MGDF-1 chybí, takže sekvence, které odpovídají výše uvedeným sekvencím, přičemž v nich však některé aminokyseliny chybí (a počet aminokyselin u C-konce je snížen o 4) mohou být také účinné.

V jednom klonu, který má terminační kodon v poloze 192, byl nalezen zbytek Ala místo zbytku Thr, jak je to znázorněno v poloze 191 na obr. 11. Do rozsahu vynálezu tedy spadají také varianty molekul MGDF, v nichž se v poloze 191 nachází Ala místo Thr.

MGDF-3 vzniká odstraněním sekvence, která je zde označována zkratkou I.VS-5 (intervenční sekvence-5), poněvadž tato sekvence je upravena sestřihem v pátém exonu této sekvence, poněvadž se 5' konec IVS-5 sekvence nalézá v kodonu, její odstranění má za následek rámcový posun ve zbývající sekvenci MGDF, který lze pozorovat od výchozí polohy 160 MGDF-3 do konce této molekuly.

U samotného MGDF-3 nebyla po transfekci do buněk fc

293 a zkoušení kondiciovaného média na aktivitu buněčnou zkouškou popsanou v příkladu 4 zjištěna až dosud žádná”

Z J.

aktivita. Zjevně jsou buňky 293 na rozdíl od MGDF-1 neschopné převést MGDF-3 na účinnou formu. Nicméně však vypuštěním c-terminálních aminokyselin z MGDF-3 by se snad také mohlo dospět k účinné formě (tento předpoklad se zakládá na výše * uvedené hypotéze o C-terminálním omezení. Tak například Cterminální omezení MGDF-3 od aminokyseliny 40 do aminokyseliny 102 muže mít za následek dosažení účinnosti.

Přednostně se odštěpují aminokyseliny 50 až 90. Jako dvě specifické varianty MGDF-2 je možno uvést

MGDF-9 aminokyseliny 22 až 179 obr. 12

MGDF-10 aminokyseliny 22 až 190 obr. 12

Ve všech Mpl ligandech uvedených v tomto popisu, včetně příkladných MGDF uvedených výše, může být u'^;N-konce přítomen methionylový zbytek, zejména když se tyto polypeptidy exprimují v bakteriálních hostitelských buňkách.

Polypeptidy Mpl ligandu je také možno získat známou •I · .

konvenční chemickou syntézou. Způsoby konstrukce polypeptidú podle vynálezu syntetickými postupy jsou známé odborníkům v tomto oboru. Synteticky zkonstruovaná sekvence polypeptidu Mpl ligandu může vykazovat biologické vlastnosti shodné s ‘ vlastnostmi Mpl ligandu díky tomu, že vykazuje stejné primární , sekundární nebo terciární strukturní a konformační ' charakteristiky. Takových polypeptidú je tedy možno použít jako biologicky aktivních nebo imunologických náhražek za ► přírodní purifikované polypeptidy Mpl ligandu při terapeutických a imunologických procesech.

Modifikace polypeptidú nebo sekvencí DNA kódujících Mpl ligand může odborník v tomto oboru provést zná39 mými technikami. Modifikace sekvencí Mpl Iigandu, které jsou předmětem zájmu, mohou zahrnovat náhradu, vsunutí nebo vypuštění zvoleného aminokyselinového zbytku z kódujících sekvencí. Techniky mutagenese, které jsou vhodné pro takové nahrazení, vsunutí nebo vypuštění aminokyselinového zbytku jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy [viz například US patent č. 4 518 584]. Přednost se dává konzervativním změnám v rozmezí od 1. do 20. aminokyseliny. Přednostní peptidy je možno vytvářet za použití proteolytických enzymů nebo přímou chemickou' syntézou. Takto získané varianty spadají do rozsahu významu polypeptidy Mpl Iigandu {či Mpl ligandové polypeptidy) a polynukleotidy Mpl Iigandu podle vynálezu.

Specifické mutace sekvencí Mpl ligandového polypeptidu mohou zahrnovat modifikace glykosylačního místa (například šeřinu, threoninu nebo asparaginu). K absenci glykosylace nebo jen k částečné glykosylaci dochází substitucí nebo delecí aminokyseliny v jakémkoliv glykosylačním rozpoznávacím místě připojeném k asparaginu nebo v jakémkoliv místě molekuly, které je modifikováno adicí O-připojeného sacharidu. Glykosylační rozpoznávací místo připojené k asparaginu zahrnuje tripeptidovou sekvenci, která je specificky rozpoznávána příslušnými buněčnými glykosylačními enzymy.

Tyto tripeptidové sekvence mají složení bud Asn-Xaa-Thr nebo Asn-Xaa-Ser, kde Xaa může být jakákoliv aminokyselina odlišná od Pro. Různé aminokyselinové substituce nebo delece v jedné nebo obou z poloh 1 a 3 glykosylačního rozpoznávacího místa (a/nebo delece aminokyseliny v poloze 2) má za následek absenci glykosylace v modifikované tripeptidové sekvenci. Exprese takto pozměněných nukleotidových- sekvencí má za následek vznik variant, které v tomto místě nejsou glykosylovány.

Přídavné analogy/deriváty MGDF

Jiné analogy a deriváty sekvencí MGDF (Mpl ligandů), které si mohou zachovat aktivitu MGDF.(Mpl ligandu) bud úplně nebo zčásti, je také možno připravit za použití technik uvedených v tomto popisu. Také tyto modifikace spadají do rozsahu vynálezu. »

Konkrétněji lze uvést, že do rozsahu vynálezu obecné spadají chemicky modifikované látky MGDF a způsoby jejich přípravy a použití. Jak je zřejmé z tohoto popisu, modifikace MGDF a zlepšení jejich vlastnosti jsou možné.

Jedním aspektem tohoto vynálezu je MGDF produkt obsahující MGDF protein připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému.polymernímu zbytku.

Jíním aspektem tohoto vynálezu je MGDF produkt, v němž je MGDF protein připojen k alespoň jedné polyethylenglykolové molekule.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou MGDF molekuly připojené k alespoň jedné molekule polyethylenglykolu proI střednictvím acylového nebo alkylového spojení.

Pegylace MGDF se může provádět za použití jakých- >· koliv pegylačních reakcí, které jsou známy v tomto oboru (viz například: Focus.on Growth Factors 3 (2): 4 až 10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384 a další publikace vztahující se k pegylaci uvedené v těchto citacích. Pegylace se přednostně provádí prostřednictvím acylační reakce nebo alkylační reakce za použití reaktivní polyethylenglykolové molekuly (nebo analogické molekuly reaktivního vodorozpustného polymeru). Tyto přednostní způsoby derivatizace polyethyleglykolu budou podrobněji popsány dále.

Acylace

Pegylace acylaci obecně zahrnuje reakci reaktivního esterového derivátu polyethylenglykolu (PEG) s MGDF proteinem. Pro pegylaci MGDF se může použit jakékoliv známé nebo i dodatečně objevené reaktivní PEG molekuly. Přednostním aktivovaným PEG esterem je PEG esterifikovaný N-hydroxysukcinimidem (NHS). Pod označením acylace, jak se ho používá v tomto popisu, se bez jakéhokoliv omezení rozumí vytvoření následujících typů vazeb mezi MGDF a vodorozpustným polymerem, jako je PEG: amidových, karbamátových, urethanových a podobných vazeb (viz Bioconjugate Chem. 5: 133 až 140 (1994)). Reakční podmínky je možno volit ze souboru podmínek, které jsou známé nebo které budou ještě vyvinuty v oboru pegylace, ale nemělo by se používat podmínek (teploty, rozpouštědel a pH), které by měly za následek inaktivaci MGDF, který má být modifikován. Reakční podmínky, které sé obecně hodí pro pegylaci MGDF jsou popsány dále. Příkladná reakce s NHS esterem monomethoxy-PEG je znázorněna na obr.

.

Pegylaci prostřednictvím acylace se obecně získá polypegylovaný produkt MGDF, v němž jsou epsílon-aminoskupiny lysinu pegylovány prostřednictvím acylové spojovací skupiny. Přednostní spojovací skupinou je amidová skupina. Také se dává přednost tomu, aby byl produkt v podstatě pouze (například více než z 95 %) mono-, di- nebo tripegylován.

Za normálních okolností však budou vznikat určité látky s vyšším stupněm pegylace (až do maximálního počtu lysi- - - — nových epsí-lon-aminokyselinov-ých. skupin. MGDF plus jedna _____ α-aminoskupina u aminového konce MGDF) v množství závislém na specificky použitých reakčních podmínkách. Je-li to žádoucí, mohou se z reakční směsi oddělovat pegylované látky s vyšší čistotou, zejména oddělením nezreagovaných látek, standardními purifikačními technikami, jako je mj. dialýza, vysolování, ultrafiltrace, ionexová chromatografie, gelová filtrační chromatografie a elektroforéza.

Alkylace

Pegylace prostřednictvím alkylace obecně zahrnuje reakci terminálního aldehydového derivátu PEG s proteinem, jako je MGDF, za přítomnosti redukčního činidla. Tak jako u acylace popsané výše jsou vhodné reakční podmínky popsány dále.

Při pegylaci alkylací může také vznikat polypegylovaný MGDF. Příklad redukční alkylační reakce za použití MGDF pro získání polypegylovaného produktu je znázorněn na obr. 15. Kromě toho je možno manipulovat reakční podmínky způsobem.uvedeným dále za účelem favorizace pegylace v podstatě pouze do polohy α-aminoskupiny u N-konce MGDF^ftj. pro získání monopegylované látky). Příklad redukční alkylační reakce: s MGDF pro získání monopegylovaného produktu je znázorněn na obr. 16. Jak v případě monopegylace, tak v případě polypegylace jsou PEG skupiny přednostně připojeny k proteinu prostřednictvím skupiny vzorce -CH₂“NH-. S ohledem na strukturu zbytku -CH₂- je tento typ spojení označován názvem alkylové spojení.

Při derivatizaci prostřednictvím redukční alkylace pro výrobu monopegylovaného produktu se využívá odlišné reaktivity, různých typů primárních aminoskupin (lysinu ve srovnání s N-koncem), které jsou k dispozici pro derivatizaci MGDF. Tato reakce se provádí při hodnotě pH (viz dále) umožňující využít rozdílů pK_a mezi epsílon-aminoskupinami lysinových zbytků a alfa-aminoskupinou N-terminálního zbytku proteinu. Při takové selektivní derivatizaci se reguluje připojení vodorozpustného polymeru obsahujícího reaktivní skupinu, jako je aldehydová skupina, k proteinu: ke konjugaci s polymerem dochází převážně u N-konce proteinu a . nedochází k významné modifikaci jiných reaktivních skupin, jako aminoskupin lysinového postranního řetězce. Jedním důležitým aspektem tohoto vynálezu je v podstatě homogenní příprava molekul konjugátu monopolymer/MGDF protein (tímto označením se rozumí MGDF protein, k němuž je polymerní i molekula připojena v podstatě pouze (tj. z 95 % nebo více) v jedné poloze). Konkrétněji je možno uvést, že za použití ,, polyethylenglykolu se podle vynálezu může získat pegylovan-ý MGDF protein, který, neobsahuje po-tenciálně-antigenní . spojovací skupiny a v němž je polyethylenglykolová molekula přímo kopulována s MGDF proteinem.

Přednostním aspektem tohoto vynálezu je tedy pegylovaný MGDF, v němž je skupina nebo v němž jsou skupiny PEG připojeny prostřednictvím acylových nebo alkylových '-.Jy skupin. Jak již bylo diskutováno výše, takové produkty mohou být monopegylovány nebo. polypegylovány (například mohou obsahovat 2 až 6, přednostně 2 až 5 PEG skupin). Skupiny PEG jsou obvykle připojeny k proteinu na alfa- nebo epsílonaminoskupinách aminokyselin, ale obecně mohou být skupiny^ PEG připojeny k jakékoliv aminoskupině připojené k proteinu, jež je dostatečně reaktivní, aby byla za vhodných reakčních podmínek připojena ke skupině PEG.

.> Polymerní molekuly použité jak při acylační, tak při alkylační reakci, je možno volit ze souboru vodoroza pustných polymerů nebo jejich směsí. Zvolený polymer by měl * být vodorozpustný, aby ve vodném prostředí, jako je fyziologické prostředí, nedošlo k výsrážení proteinu, k němuž má být tento polymer připojen. Zvolený polymer by měl být modifikován tak, aby obsahoval jedinou reaktivní skupinu, jako například jedinou reaktivní esterovou skupinu (v případě acylace) nebo aldehydovou skupinu (v případě alkylace), aby bylo možno stupen polymerace regulovat metodami uvede44 nými v tomto popisu. Přednostním reaktivním PEG aldehydem je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je stálý ve vodě, nebo jeho monoalkoxyderivát s 1 až 10 atomy uhlíku v alkoxylové části nebo aryloxyderivát (viz US patent č. 5 252 714).

Tento polymer může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Má-li se konečného produktu použít pro terapeutické účely, měl by být polymer farmaceuticky vhodný. Vodorozpustný polymer je možno volit ze souboru zahrnujícího například polyethylenglykol, monomethoxypolyethylenglykol, dextran, poly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykol, homopolymery propylenglykolu, kopolymery propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylované polyoly (například glycerol) a polyvinylalkohol. Pro acylační reakce by měl zvolený polymer obsahovat jedinou reaktivní esterovou skupinu a pro reduční alkylaci by měl zvolený polymer obsahovat jedinou reaktivní aldehydovou skupinu. Obvyklé se vodorozpustné. polymery nevolí ze souboru glykosylových zbytků, které se vyskytují v přírodě, poněvadž se obvykle účelněji připravují v savčích rekómbinantních expresních systémech. Polymer, může mít jakoukoliv molekulovou hmotnost' a může být rozvětvený nebo nerozvětvený.

vodorozpustných polymerů, které se hodí pro použití podle vynálezu, se obzvláštní přednost dává polyethylenglykolu (zkráceně PEG). Pod označením polyethylenglykol se zde rozumí jakákoliv forma PEG, které bylo použito pro derivatizaci jiných proteinů, jako je monoalkoxypolyethylenglykol s 1 až 10 atomy uhlíku-v alkoxylové části nebo aryloxypolyethylenglykol.

Pod označením MGDF se v tomto popisu rozumí kterákoliv z různých forem MGDF uvedených v tomto popisu. Do rozsahu tohoto pojmu tedy spadá například MGDF s plnou nebo omezenou délkou, a to jak glykosylované, tak neglykosylované formy. Přednostní molekuly MGDF pro derivatizaci jsou uvedeny dále.

MGDF-1	aminokyseliny	22	až	353	obr.	11
MGDF-2	aminokyseliny	22	až	195	obr.	11
MGDF-4	aminokyseliny	22	až	172	obr.	11
MGDF-11	aminokyseliny	22	až	184	obr.	11
MGDF-12	aminokyseliny	27	až	353	obr.	11
MGDF-13	aminokyseliny	27	až	195	obr.	11
MGDF-14	aminokyseliny	27	až	172	obr.	11
MGDF-15	aminokyseliny	27	až	184	obr.	11

číslování se ve všech případech vztahuje k číslováni aminokyselin podle obr. 11.

i'

Výše uvedené přednostní druhy MGDF mohou být glykosylovány, neglykosylovány nebo deglykosylovány a přednostně jsou neglykosylovány. Je možno je připravovat rekombínantními postupy jak v bakteriálních (například E. coli), tak savčích (například CHO) buňkách.

ť

Dále jsou uvedeny přednostní podskupiny chemicky derivatizovaných molekul podle vynálezu (vždy s jedná o mono- nebo polypegylovaný produkt, například o produkt obsahující 2 až 4 PEG zbytky připojené prostřednictvím acylových nebo alkylových skupin):

pegylovaný MGDF-11, pegylovaný MGDF-4 a

........ ........pegylovaný MGDF-2. .

Chemická derivatizace se obecně může provádět za jakýchkoliv vhodných podmínek pro reakce biologicky účinných látek s reaktivními polymery. Způsoby výroby pegylovaného MGDF budou obecně zahrnovat stupeň a) reakce polypeptidu

MGDF s polyethylenglykolem (jako například reaktivním esterovým nebo aldehydovým derivátem PEG) za podmínek, při nichž dochází k připojení MGDF k jedné nebo více skupin PEG a b) stupeň izolace reakčního produktu nebo produktů. Optimální reakční podmínky acylačních reakcí se budou obvykle určovat případ od případu, v závislosti na známých parametrech a požadovaném výsledku. Tak například, čím bude větší poměr PEG : protein, čím vyšší bude procentické zastoupení polypegylovaného produktu.

Redukční alkylace pro výrobu v podstatě homogenní populace molekul konjugátu monopolymer/MGDF protein budou v podstatě zahrnovat stupeň a) reakce MGDF proteinu s reaktivní molekulou PEG za redukčních alkylačních podmínek, při hodnotě pH vhodné pro selektivní modifikaci alfa-aminoskupiny u aminového konce MGDF proteinu a b) stupeň izolace reakčního produktu nebo produktů.

Pod označením podmínky redukční alkylace pro výrobu v podstatě homogenní populace molekul, konjugátu monopolymer/MGDF protein se rozumějí podmínky umožňující selektivní připojení vodorozpustné polymerní látky k Nkonci MGDF, Takové reakční podmínky obvykle využiji rozdíly v pK_a mezi aminoskupinami lysinu a alfa-aminoskupinou ú Nkonce (pK_a představuje hodnotu pH, při níž je 50 % aminoskupin protonováno a 50 % neprotonováno). Hodnota pH také ovlivňuje použitý poměr polymeru k proteinu. Obecně platí, že .při nižším pH je žádoucí vyšší nadbytek polymeru vzhledem k proteinu (tj. čím méně je reaktivní N-terminální alfa-aminoskupina, tím více polymeru je zapotřebí pro dosažení optimálních podmínek). Při vyšší hodnotě pH nemusí být poměr polymer : protein tak vysoký (jsou-li skupiny reaktivnější, je zapotřebí menšího počtu polymerních molekul). Pro účely tohoto vynálezu bude hodnota pH obvykle ležet v rozmezí do 3 do 9, přednostně od 3 do 6.

Dalším důležitým parametrem je molekulová hmotnost polymeru. Obecně platí, že čím je molekulová hmožnost polymeru vyšší, tím menší počet molekul polymeru se může k proteinu připojit. Při optimalizaci reakčních parametrů je podobně nutno vzít v úvahu také stupeň rozvětvení polymeru.

Obecně platí, že čím je molekulová hmotnost vyšší (nebo čím vyšší je stupeň rozvětvenítím vyšší je poměr polymer : protein. Při pegylačních reakcích podle vynálezu se obvykle dává přednost průměrné molekulové hmotnosti v rozmezí od asi 2 kDa do asi 100 kDa (pod pojmem asi se rozumí rozmezí ± 1 kDa·. Přednostní rozmezí molekulové hmotnosti je asi 5 až asi 50 kDa, s výhodou asi 12 až asi 25 kDa. Poměr vodorozpustného polymeru k MGDF proteinu bude obvykle v rozmezí . od 1 : 1 do 100 : 1, přednostně (v případě polypegylace) oď 1 : 1 do 20 :1a (v případě monopegylace) od 1 : 1 do 5 : 1.

·'·’ $

Za použití výše uvedených podmínek se při redukční alkylaci dosáhne: selektivního připojení polymeru k jakémukoliv MGDF proteinu obsahujícímu alfa-aminoskupinu u aminového konce a získá se v podstatě homogenní konjugát monoa. Λ polymer/MGDF protein. Pod označením konjugát monopolymer/ **?·' ' -JJ*

MGDF protein, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí

MGDF protein, k němuž je připojena jediná molekula polymeru.

Konjugát monopolymer/MGDF protein bude přednostně obsahovat molekulu polymeru v poloze N-konce a nikoliv na lysinových postranních aminoskupinách. Vyrobený produkt bude obsahovat přednostně více než 90 % a s výhodou více než 95 % konjugátu monopolymer/MGDF protein, přičemž zbytek bude tvořen nezreagovanými molekulami (tj. molekulami proteinu neobsahujícími zbytek’polymeru) ,^L V příkladech uvedených dále- jě ilustro— --- --·......

ván produkt, který sestává z alespoň asi 90 % konjugátu monopolymer/protein a asi 10 % nezreagovaného proteinu.

Biologickou aktivitu vykazuje konjugát monopolymer/protein.

Pro redukční alkylaci podle vynálezu by se mělo používat redukčního činidla stálého ve vodném roztoku, které je přednostně schopno redukovat pouze Schiffovu bázi vytvořenou při zahájení redukční alkylace. Přednostní redukční činidla se přitom volí ze souboru zahrnujícího tetrahydroboritan sodný, natriumkyanborhydrid a komplexy dimethylamin/boran, trimethylamin/boran a pyridin/boran. Zvláště vhodným redukčním činidlem je natriumkyanborhydrid.

Jiné reakční parametry, jako jsou rozpouštědla, reakční doby, teploty atd. a způsoby purifikace produktů, je možno určit případ od případu na základě publikovaných publikací· vztahujících se k derivatizaci proteinů vodorozpustnými polymery (viz publikace.citované v tomto popisu). Příklady podrobností jsou.uvedeny v příkladové části tohoto popisu;

Může být žádoucí připravit směs konjugátovýčh molekul, polymer/protein acylačními a/nebo alkylačními metodami. Přitom je výhodné, že je možno zvolit obsah konjugátu monopolymer/protein, který má být ve směsi přítomen. Je-li to žádoucí, může se tedy připravit směs různých proteinů s různým počtem připojených molekul polymeru (tj. 2, 3, 4 atd.) a tato směs se může smíchat s konjugátem monopolymer/ protein připraveným zde popsanými metodami. Tak se získá směs s předem určeným obsahem konjugátu monopolymer/protein.

Příklady provedení uvedené, dále ilustrují přípravu chemicky modifikovaného MGDF a přípravu pegylovaného MGDF acylaci a alkylaci. Jinými aspekty tohoto vynálezu jsou tedy tyto způsoby přípravy.

Jako chorobné stavy, u kterých lze dosáhnout úlevy, nebo které je možno modulovat podáváním produktů polymer/MGDF podle tohoto vynálezu, přicházejí v úvahu chorobné stavy popsané výše v souvislosti s obecnými aplikacemi molekul

MGDF. Ve srovnání s nederivatizovanými molekulami však mohou molekuly polymer/MGDF uvedené v tomto popisu vykazovat přídavné účinnosti nebo zvýšené nebo snížené účinnosti nebo též jiné charakteristiky.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou farmaceutické prostředky na bázi výše uvedených chemicky modifikovaných molekul MGDF. Tyto farmaceutické prostředky mohou obsahovat kteroukoliv z přísad, které zde byly uvedeny pro nederivatizované molekuly MGDF.

Jelikož řada studií v současné době probíhá, budou '7 se objevovat informace vztahující se k úrovní dávkování^při léčení různých podobných stavů u různých pacientů a na zákládě těchto informací, bude odborník v tomto oboru schopen určit vhodné:dávkování s ohledem na terapeutický kontext, věk a celkový zdravotní stav příjemce. Obvyklá dávka bude .ležet v rozmezí od 0,01 ug/kg tělesné hmotnosti (počítáno jako hmotnost samotného proteinu bez chemické modifikace) až .

300 ug/kg (vztaženo ke stejnému základu). Přednostní dávka bude obvykle ležet v rozmezí od 5 ug/kg tělesné hmotnosti do 100 ug/kg tělesné hmotnosti a zvláště vhodná dávka bude ležet.v rozmezí od 10 ug/kg tělesné hmotnosti do 70 tělesné hmotnosti. . *

Předmětem vynálezu je dále také způsob výroby polypeptidů MGDF (tj. Mpl ligandu) nebo jejich aktivních fragmentů. Jeden z těchto způsobů “podle vynálezu zahrnuje ------—.....

zavedení cDNA kódující polypeptid Mpl ligandu do expresního vektoru pro vytvoření expresního systému pro Mpl ligand. Tímto vektorem se transfekuje zvolená hostitelská buňka a transfekovaná buňka se kultivuje. Předmětem vynálezu je tedy také způsob kultivace vhodné buňky nebo buněčné linie transfekované sekvencí DNA kódující expresi polypeptidu Mpl ligandu pod kontrolou známých regulačních sekvencí. Regulační sekvence zahrnují fragmenty promotoru, fragmenty terminátoru a jiné vhodné sekvence, které řídí a kontrolují expresi proteinu ve vhodné hostitelské buňce. Exprimovaný faktor se potom izoluje a purifikuje z kultivačního média (nebo z buňky, je-li exprimován intracelulárně) vhodnými způsoby, které jsou známé odborníkům v tomto oboru. V souvislosti s polynukleotidy/polypeptidy podle tohoto vynálezu je také možno použít metod popsaných v US patentu číslo 5 272 071.

Jako vhodné buňky nebo buněčné linie přicházejí v úvahu savčí, buňky, jako jsou buňky ovárií čínského křečka (CHO) nebo.buňky 3T3. Selekce vhodných savčích hostitelských buněk a způsoby transformace, kultivace, amplifikacé, screeningu a přípravy produktu, včetně jeho purxf.ikace, jsou známé v tomto oboru, viz například publikace Géthing a Sambrook, Nátuře 293: 620 až 625.(1981); Kaufmán et al., Moll.. Cell. Biol.. 5 (7): 1750 až 1759 (1985) nebo Howley et' al., US 4 419 446. Jako jiné vhodné savčí buněčné linie je možno uvést opičí buněčné linie COS-1 a COS-7 a buněčnou linie CV-1. Jako další příklady savčích hostitelských buněk je možno uvést buněčné linie z primátů a buněčné linie z hlodavců, včetně transformovaných buněčných linií. Vhodné jsou také normální diploidní buňky, kmeny buněk získané z in vitro kultivace primárních tkání a také primární explantáty. Vhodné .buňky ..mohou .být genotypicky deficientní, pokud- se týče selekčního genu nebo mohou obsahovat dominantně působící selekční gen. Jako jiné vhodné savčí buněčné linie (na něž se však vynález neomezuje) je možno uvést buňky HeLa, myší buňky L929, linie 3T3 pocházející ze švýcarských myší Balb-c nebo NIH a buněčné linie BHK nebo HaK pocházející z křečka.

Podobně jsou jako hostitelské buňky užitečné pro provádění vynálezu také bakteriální buňky. Jako hostitelské buňky v oblasti biotechnologií jsou například dobře známy různé kmeny E. coli (například HB101, DH5a, DH10 a MC1061). Také se při tomto způsobu může použít různých kmenů Bacillus subtilis, Pseudomonas spp., jiných kmenů Bacillus, streptomyces spp. apod.

Jako hostitelské buňky pro expresi polypeptidů podle vynálezu přicházejí v úvahu také mnohé kmeny kvasinkových buněk, které jsou známy odborníkům v tomto oboru.

Pokud je to žádoucí, může se dále podle vynálezu použít jako hostitelských buněk také hmyzích buněk (viz například Miller et al., Genetic Engineering 8: 277 až 298 (1986) a citace líí uvedené v této publikaci).

Předmětem vynálezu jsou také rekombinantní molekuly nebe vektory, pro použití při způsobu exprese.nových polypeptidů Mpl ligandu. Tyto vektory obsahují sekvence DNA Mpl lingadu, které samotné nebo v kombinaci s jinými sekvencemi kódují polypeptidy Mpl ligandu podle vynálezu (se signálními peptidy, nebo bez nich) nebo jejich účinné fragmenty. Vektor použitý při této metodě obsahujetaké zvolené regulační sekvence v operativním spojení s kódujícími sekvencemi DNA podle vynálezu, které jsou schopny řídit jejich replikaci a expresi ve zvolených hostitelských buňkách.

Jedním vhodným vektorem je pXm, který je obzvláště žádoucí přo expresi v buňkách COS (Y. C. Yang et al., Cell^......47: 3 až 10 (1986)). Jiným vhodným vektorem, který je žádoucí pro expresi v savčích buňkách, například v buňkách CHO je pEMC2Bl. Expresní faktory v savčích buňkách, které jsou zde popsány, je možno syntetizovat technikami známými v tomto oboru. Složky těchto vektorů, například replikony, «

selekční geny, enhancery, promotory apod. je možno získat z přírodních zdrojů nebo syntetizovat známými postupy (viz Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159: 511 až 521 (1982); ’

Kaufman Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 689 až 693 (1985). Alternativně může DNA vektoru zahrnovat celý genom hovězího papillomaviru nebo jeho část (Lusky et al., Cell. 36: 391 až 401 (1984)) a je možno ho replikovat v buněčných liniích, jako jsou myší buňky C127 v podobě stabilního episomálního prvku. Trasfekce těchto vektorů do vhodných hostitelských buněk může mít za následek expresi polypeptidu Mpl ligandu.

K tomuto účelu je také možno použít jiných vhodných expresních vektorů, z nichž četné typy jsou známy v oboru savčí, hmyzí, kvasinkové, fungální a bakteriální exprese.

Z chorob nebo stavů, které lze léčit za použití látek a prostředků podle tohoto vynálezu, je možno uvést . choroby zahrnující již existující nebo očekávanou (například. v případě plánovaného chirurgického zásahu) deficienci megakaryocytů/krevních destiček. Takové stavy budou obvykle důsledkem'deficience (dočasné nebo stálé) aktivních Mpl ligandů in vivo. Generickým označením pro deficienci krevních destiček je thrombocytopenie, a proto způsoby a prostředky podle tohoto vynálezu jsou obecně vhodné pro léčení thrombocytopenie.

K thrombocytopenii (deficienci krevních destiček) může docházet z různých důvodů, například v-důsledku chemoterapie nebo jiných způsobů léčení-za použití různých léčiv, radiačního léčení nebo chirurgických zásahů, ztráty krve při nehodách. Thrombocytopenie může být také způsobena specifickými chorobnými stavy, jako je například aplastická anémie, idiopatická thrombocytopenie, metastáza nádorů, která vede k vývinu thrombocytopenie, systemický lupus erythematosus, splenomegalie, Fanconiho syndrom, deficience vitaminu B12, *

deficience kyseliny listové, May-Hegglinova anomálie, Wiskott-Aldrichův syndrom a paroxysmální nokturální hemoglobinurie. Ve všech těchto případech je možno použít sloučenin a prostředků podle vynálezu. Thrombocytopenie může být také důsledkem určitých způsobů léčení AIDS (například za použití AZT). Zvýšení počtu krevních destiček může být také důležité při určitých poruchách hojení ran.

S ohledem na předvídanou deficienci krevních destiček, například v důsledku plánovaného chirurgického zásahu, je možno Mpl Íigand podle vynálezu podávat několik dnů až několik hodin před tím, než je krevních destiček zapotřebí.

V akutních situacích, například v případě nehody nebo masivní ztráty krve, může být Mpl Íigand podáván spolu s krví nebo purifikovanými destičkami.

í

Mpl ligandy podle tohoto vynálezu mohou být také užitečné při stimulaci určitých typů buněk odlišných od megakaryocytů, pokud se zjistí, že tyto buňky exprimují Mpl receptor. Do rozsahu tohoto vynálezu spadá také určení podmínek, za nichž jsou tyto buňky, které exprimují Mpl receptor, responsivní vůči stimulaci Mpl ligandem.

Molekuly MGDF, které samy o sobě nejsou účinné při zkouškách aktivity uvedených v tomto popisu, mohou být užitečné jako modulátory (například inhibitory nebo stimulanty) Mpl receptoru in vitro nebo in vivo.

Při léčení výše uvedených chorob nebo stavů se polypeptidupodlé tohoto' vynálezů může používat samotných nebo v kombinaci s jinými cytokiny, rozpustnými Mpl receptory, hematopoietickými faktory, interleukiny, růstovými faktory nebo protilátkami.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou proto terapeutické prostředky pro léčení výše uvedených chorob nebo stavů. Tyto prostředky obsahují terapeuticky účinné množství polypeptidu Mpl ligandu nebo jeho terapeuticky účinného fragmentu ve směsi s farmaceuticky vhodným nosičem. Jako nosič přichází v úvahu voda (v 'případě injekčních prostředků), která je přednostně doplněna jinými látkami obvyklými ’ při výrobě roztoků určených pro podávání savcům. Obvykle se Mpl ligand k terapeutickým účelům podává ve formě prostředku ' obsahujícího purifikovaný protein ve spojení s jedním nebo více fyziologicky vhodných nosičů, excipientů nebo ředidel.

Jako příklady vhodných nosičů je možno uvést neutrální pufrovaný roztok chloridu sodného nebo roztok chloridu sodného smíchaný se,sérovým albuminem. Přednostně se produkt, zpracovává na prostředek ve formě lyofilizátu za spolupoužití vhodných excipientů (například sacharosy). Podle potřeby je možno přidávat i jiné standardní nosiče, ředidla^Ja excipienty. Jako příklady je možno uvést Tris pufr o pH'8,0 a acetátový pufr o pH 5,0, přičemž posledně uvedené pufry mohou dále obsahovat sorbitol. ' .

Prostředky podle vynálezu je možno systematicky podávat parenterální cestou. Alternativně je možno je podávat intravenosně nebo subkutánně. Pokud se používá systematického podávání, mohou být terapeutické prostředky podlé vynálezu ve formě apyrogenních parenterálně vhodných ř vodných roztoků. Příprava takových farmaceuticky vhodných proteinových roztoků s řízenou hodnotou pH^ isotonicitou, -^! stabilitou apod. jev rozsahu zkušeností běžného odborníka v tomto oboru.

r

Dávkovači režim při léčení výše uvedených chorob a stavů bude určovat ošetřující lékař, který bude brát v úvahu různé faktory modifikující působení léčiv podle vynálezu, jako je například věk, stav, tělesná hmotnost, pohlaví a strava pacienta, závažnost případné infekce, doba podávání a jiné klinické faktory. Obvyklý denní, režim by měl zahrnovat podávání 0,1 až 1000 μ5 proteinu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu, vztaženo na kg tělesné hmostnosti.

Terapeutických metod, prostředků a polypeptidů podle tohoto vynálezu se může používat samotných nebo v kombinaci s jinými cytokiny, rozpustnými Mpl receptory, hematopoietickými faktory,· interleukiny, růstovými faktory nebo protilátkami při léčení chorobných stavů, které jsou charakterizovány i jinými symptomy kromě deficience krevních destiček. Předpokládá se, že molekula Mpl ligandu bude užitečná při léčení určitých forem thrombocytopenie v kombinaci s obecnými stimulátory hernatopoiese, jako je IL-3 nebo GM-CSF. Spolu s Mpl ligandem se také může používat jiných megakaryocytických stimulačních faktorů, tj. meg-CSF, ‘u* faktorů kmenových buněk.(SCF), faktoru inhibutujícího leukémii (LIF), onkostatinu M (OSM) nebo jiných molekul se stimulační účinnosti na megakaryocyty. Jako přídavné cytokiny f,.' nebo hematopoietické faktory pro takové společné podávání je možno uvést IL-1 a, IL-1 β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,. IL-11, faktor stimulující kolonie-1 (CSF-1), GM-CSF, faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), EPO, interferon-a (IFN-a), IFN-β nebo IFN-gamma. dále může být užitečné podávat, bud současně .nebo postupně, účinné množství rozpustného savčího receptorů Mpl, který vykazuje pravědpodobný účinek na fragmentaci megakaryocytú na krevní destičky, když megakaryocyty dosáhly maturované formy. Podávání Mpl ligandu (za účelem zvýšení počtu maturovaných mégákárýÓcýtu)'“s'následným podáváním' rozpustného Mpl -recep- - toru (za účelem inaktivace ligandu a umožnění produkce krevních destiček z maturovaných megakaryocytú) se považuje za obzvláště účinný prostředek stimulace tvorby krevních destiček.. Výše uvedené dávkování je pak třeba přizpůsobit za účelem kompenzace výše uvedených přídavných složek terapeu56 tického prostředku. Pokrok dosažený u léčeného pacienta je možno monitorovat obvyklými metodami.

Jiná použití nových polypeptidú podle vynálezu^ zahrnují vývoj protilátek, které se vytvářejí standardními postupy. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají i protilátky reagující s Mpl ligandy podle tohoto vynálezu, jakož i reaktivní fragmenty takových protilátek. Tyto protilátky mohou být polyklonální, monoklonální, rekombinantní, chimérické, jednořetězcové a/nebo bispecifické atd. Jako fragmenty těchto protilátek přicházejí v úvahu jakékoliv protilátky, které jsou reaktivní vůči Mpl ligandu podle tohoto vynálezu, jako je F_ab, F._ab. atd. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také hybridomy vytvořené tak, že se Mpl ligand nebo jeho fragment podá jako antígen zvolenému.savci a potom se známým způsobem provede fúze buněk (například buněk sleziny) zvířete . s určitými rakovinnými buňkami za účelem vytvoření imortalizovaných buněčných linií. Do rozsahu tohoto vynálezu, spadají také způsoby používané pro vytvoření takových buněčných linií a’ protilátky zaměřené proti celému humánnímu polypeptidu Mpl ligandu. nebo jeho částem podle tohoto vynálezu.

Těchto protilátek se může používat k terapeutickým účelům, jako například pro inhibici vazby Mpl ligandu a jeho receptoru. Těchto protilátek se dále může používat pro in _c vivo a in vitro diagnostické účely, jako například (ve značené formě) pro detekci, přítomnosti Mpl. ligandu .v. těles- í né takutině.

Dále uvedené příklady slouží k dalšímu objasnění předloženého vynálezu. Tyto příklady mají výhrandě ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. V příkladech jsou zejména popsána přednostní provedení tohoto vynálezu. Standardní metody provádění mnoha postupů popsaných v těchto příkladech, jakož i vhodné alternativní postupy jsou uvedeny v uznávaných příručkách molekulární biologie, jako je například Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) a Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols In Molecular Biology, Greene associates/Wiley Interscience, New York (1990).

*1 ’$· <7

Příklady provedeni vynálezu t .

Příklad 1

Aplastické psí plasma

Heparinizovaná aplastická psí plasma (APK9) nebo normální psí plasma (NK9) byla připravena způsobem popsaným v následující publikacích, s tou výjimkou, že bylo š recipientům dodáno, vztaženo na jednotlivce, ozáření v dávce 450 rad:

1. Mazur, E. a South, K., Exp. Herna to 1·. 13: 1164-1172 (1985),

2. Arriaga, Μ. , South, K., Cohen, J. L., a Mazur, E. M.

Blood 69: 486-492 (1987) a

3. Mazur, E. , Basilico,. D. , Newton, J. L. , Cohen, J. L. ,

Charland., C., Sohl, P.A. , a Narendran, A., Blood 76: 17711782 (1990) .

Příklad 2

Zkouška s humánními megakaryocyty

APK9 a frakcionovaná APK9 byla zkoušena na schopnost stimulovat vývoj humá_nních megakaryocytů. z progenitorových i buněk CD34⁺. CD34-selektované buňky byly získány, z.buněk .periferní krve způsobem popsaným v Hokom Μ. H., Choi E.,

Nichol J. L., Hornkohl A., Arakawa T. a Hunt P., Molecular Biology of Haematopoiesis 3: 15 až 31, 1994 a byly inkubovány v Dulbeccově médiu modifikovaném podle Iscova (IMDM, GIBCO,

Grand Island, N.Y. USA) doplněném 1 % Glutaraine Pen-strep (Irwine, Sciencific, Santa Anna, Kalifornie, USA) a 10 % heparinizované, na destičky chudé, humánní AB plasmy. Toto médium obsahovalo také 2-merkaptoethanol (10^-4M), kyselinu pyrohroznovou (110 μ9/πι1), cholesterol (7,8 μ9/πι1), adenosin, guanin, cytidin, uridin, thymidin, 2-deoxycytosin, 2deoxyadenosin a 2-deoxyguanosin (vždy 10 μ9/π1, Sigma), humánní rekombinantní inzulín (10 μg/ml), humánní transfe» rin (300 μg/ml), sojové lipidy (1 %, Boehringer Mannheim),

Indianapolis, IN, USA), základní humánní rekombinantní růstový faktor fibroblastů (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA, USA), humánní rekombinantní epidermální růstový faktor (15 ng/ml), růstový faktor pocházející z krevních destiček (10 ng/ml, Amgen, lne., Thousand Oaks, Kalifornie, USA. CD34selektované buňky byly přeneseny do jamek mikrotitrové misky typu Terasaki (Vanguard, lne., Neptune, NJ, USA) v koncentraci 2 x 10⁵/ml kultivačního média (konečný objem 15 μΐ). Buňky byly inkubovány 8 dnů při 37’C komoře s řízenou vlhkostí a atmosférou obsahující 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu za přítomnosti 1 % glutaraldehydu s koktejlem monoklonálních protilátek (anti-GPIb, anti-GPIIb (Biodesigne) a anti-GP-Ib (Dako, Carpinteria, Kalifornie,. USA). Imunitní reakce byla vyvinuta za použití detekčního systému streptavidin-p-galaktosidasa (HistoMark, Kirkegaard a Perry). Megakaryocyty identifikované ná základě modrého zbarvení byly spočítány v mikroskopu s invertní fází při 100-násobném zvětšení. Výsledky jsou vyjádřeny jako prú< měrný počet megakaryocytů, vztažený na jamku, ± směrodatná odchylka (SEM) od střední hodnoty. V některých případech (když se stupeň, v jakém daný vzorek indukuje vývoj megakaryocytů normalizuje vzhledem k pozitivní kontrolní

APK9 pro tento pokus) se data uvádějí v jednotkách megakaryocytové (meg) jednotky/ml. Jedna taková jednotka je definována jako množství látky, které poskytne stejný počet megakaryocytů jako 1 μΐ APK9 standardu. Aktivita se považuje za aktivitu Mpl ligandu, pokud je možno ji blokovat MPL-X (rozpustný receptor Mpl) v koncentraci 5 až 10 pg/ml.

Ukazuje se, že APK9 obsahuje faktor nebo faktory, které v daném systému stimulují vývoj humánních megakaryocytů. CD34-selektované buňky inkubované s 10% NK9 po dobu 8 dnu vykazují zanedbatelný počet modře vybarvených megakaryocytú, zatímco v případě CD34-selektovaných buněk inkubovaných s 10% APK9 po dobu 8 dnů je počet modře vybarvených megakaryocytů velmi vysoký.

Obr. 2 ukazuje, že zvyšující se koncentrace Mpl-X přidané ke kultuře humánních megakaryocytů mají za následek zvyšující se inhibici vývoje megakaryocytů. Při koncentraci . Mpl-X vyšší než 5 ug/ml je inhibice úplná. Při tomto pokusu *

jsou CD34-selektované buňky stimulovány 5 % APK9. To ukazuje, že pro vývoj humánních megakaryocytů je zapotřebí aktivity, která interaguje s Mpl-X (předpokládaným Mpl ligandem. Dále z tohoto výsledku vyplývá, že v samotné APK9 je přítomen Mpl ligand.

Pokusy prováděné v souvislosti s vynálezem dále ukázaly, že aktivita Mpl ligandu,. která je potřebná pro, vývoj humánních megakaryocytů, je obsažena v APK9. APK9 (135 ml) byla zředěna šestinásobně Iscoveho médiem a nanesena na afinitní sloupec Mpl-X. Nenavázaná látka (látka proteklá sloupcem) byla shromážděna a před zkoušením zkoncentrována na původní objem. Navázaná látka byla eluována do 10 ml 1M roztoku chloridu sodného a 20 % shromážděného eluátu bylo podrobeno diafiltraci a před zkoušením čtyřnásobně zkoncentrováno. CD34^-selektované buňky inkubované v samotném ' médiu neposkytly megakaryocyty. Buňky inkubované v 5% APK9 (stejná várka, jaká byla nanesena na sloupec) vedly k vývinu megakaryocytů v počtu 48 + 8, vztaženo na jamku. Buňky inkubované v 10% nenavázané látce se nevyvinuly v megakaryocyty. Buňky inkubované v 10% eluátu poskytly megakaryocyty v počtu 120 + 44, vztaženo na jamku. Aktivita jak látky navázané na sloupci, tak eluátu, byla při zkoušení v podstatě úplně inhibována Mpl-X o koncentraci 5 μ9/»1.

Příklad 3

Transfekce myšího nebo humánního Mpl receptoru do myší buněčné linie

A. Myši Mpl receptor cDNA Myšího Mpl receptoru o úplné délce byla subklonována do expresního vektoru obsahujícího promotor transkripce pocházející z ltr viru myšího sarkomu Moloney Y. 5 tohoto konstruktu a 1 μ9 selektovatelného markerového plasmidu pWLNeo (Stratagene) bylo zavedeno současnou elektroporací do IL-3 dependentní myši buněčné linie (32D, klon 23; Greenberger et al., PNAS 80: 2931 až 2936 (1983)). Buňky byly 5 dnů kultivovány, potom byly izolovány a inkutovány v selekčním médiu s obsahem Geneticinu (800 ^g/ml, G418, Sigma) a myšího IL-3 (1 ng/ml). Přeživší buňky byly potom rozděleny na části s obsahem vždy 2 x 10⁵ buněk a kultivovány až do nárůstu populace, kterou bylo možno dále

A analyzovat. Šest populací bylo zkoušeno na povrchovou expresi Mpl receptoru pomocí analýzy FACS za použití polyklonálního králičího antipeptidového séra. Jedna populace byla vybrána pro třídění za použití stejného antipeptidového séra, jaké je zmíněno výše. Jednobuňkové klony rodičovské buněčné linie byly podrobeny selekci za použití růstu na 10% APK9 s Geneticinem. Po selekci v APK9 (35 dnů) byly buňky uchovávány v myším IL-3 o koncentraci 1 ng/ml. Pro tuto část práce byl zvolen jeden ze subklonů, 1A6.1.

B. Humánní Mpl receptor

Sekvence humánního Mpl receptorů o úplné délce' (Vigon I. et al., PNAS 89: 5640 až 5644 (1992)) byla subklonována do expresního vektoru obsahujícího promotor transkripce pocházející z viru myšího sarkomu Moloney ’ (stejný vektor, jakého bylo použito v případě myšího ’ receptorů). 6 μg tohoto konstruktu a 6 pg' amfotrofického retrovirového obalového konstruktu (Landau N. R., Littman D.

R. , J. Virology 66: 5110 až 5113 (1992)) bylo transfekováno do 3 x 10® buněk 293 za použití soupravy pro transfekcí CaPO₄ mammalian transfection kit (Stratagene). Stejné buňky byly podrobeny retransfekci po dvou a poté znovu po čtyřech dnech. Den následující po poslední transfekcí byly buňky 293 kultivovány společně s IL-3 dependentní myší buněčnou linií (32D, klon 23; Greenberger et al., PNAS 80:

2931 až 2936 (1983)). Po 24 hodinách byly buňky izolovány a umístěny na pás BSA gradientu (Path-o-cyte; Miles Iríc.).

Buňky byly expandovány v myším IL-3 (l ng/ml) a potom podrobeny selekci na růst ve 20% APK9. Potom byly buňky vytříděny na povrchovou expresi receptorů za pomocí FACS za použití polyklonálního králičího antipeptidového séra. Těchto buněk bylo posléze použito na zkoušení.

Příkl· ad 4 i»,

Stanovení Mpl ligandů v 1A6.1 _ ..... . --· · - ®

Buňky lA6.1byly promytím zbaveny kultury IL-3 a přeneseny (1000 buněk/celkový objem 15 μΐ, vztaženo na jamku) do mikrotitrových misek typu Terasaki s mediem alfa MEM (Gibco) doplněném 10 % fetálního telecího séra (FCS), Geneticinem (800 μg/ml) a směsí penicilinu a streptomycinu (pen/strep, 1 %, Gibco). Zkoušené vzorky byly přitom podrobeny sériovému ředění v poměru 1 : i. Po 48 hodinách byl pod mikroskopem stanoven počet životaschopných buněk v jamce. Jedna jednotka aktivity byla definována jako aktivita, jíž se dosáhne za přítomnosti 200 životaschopných buněk v jamce. Aktivita byla definována jako aktivita Mpl ligandu, pokud bylo možno ji úplně inhibovat přídavkem Mpl-X v koncentraci 5 až 10 mg/ml. Aktivita Mpl ligaridu v APK9 dosahovala v průměru hodnoty 4400 ± 539 jednotek/mililitr aplastické plasmy. Pokud není uvedeno jinak, jsou jednotky aktivity Mpl ligandu definovány ve stanovení 1A6.1.

Zkoušky s buňkami transfekovanými genem humánního Mpl receptorů (příklad 3B) byly prováděny v podstatě stejným způsobem, jako zkoušky s buňkami 1A6.1.

Příklad 5

Potvrzení přítomnosti. Mpl.ligandu v aplastické plasmě nebo séru z myšího, psího, vepřového a humánního zdroje

Mpl ligand je přítomen v aplastické plasmě, nebo séru z myšího, psího, vepřového a humánního zdroje (viz „ * <1 · tabulka 2). Myším BDF1 byla plasma odebrána před ozářením

a. 12 dnů po ozáření (500 rad). Plasma byla podrobena zkoušení za použití buněk 1A6.1, přičemž byla zjištěna aktivita 2000 jednotek/ml. Tuto aktivitu bylo možno v podstatě úplně inhibovat Mpl-X (10 μg/ml). Ozářená myší plasma byla také pozitivní při zkoušce s humánními megakaryocyty, kde vykázala aktivitu 1833 jednotek/mililitr. Psům byla plasma odebrána před ozářením„a 10 dnů po ozářeni (450 rad) . Plás'mabylá zkoušena jak za použití buněk 1A6.1-, tak za použití humánních megakaryocytů. Zjištěná aktivita byla při obou zkouškách úplně inhibovatelná Mpl-X (10 μg/ml). Vepřům byla plasma odebrána před ozářením a 10 dnů po ozáření (650 rad). Plasma byla zkoušena jak za použití buněk 1A6.1, tak za použití humánních megakaryocytů.

Zjištěná aktivita Mpl Iigandu byla při obou zkouškách úplně inhibovatelná Mpl-X (10 μg/ml), což je výsledek srovnatelný s výsledkem zjištěným u aplastické psí plasmy. Dále byla získána séra od aplastických humánních pacientů. Tato látka byla odebrána z kostní dřeně pacientů podrobených transplantaci. Séra od 6 pacientů byla zkoušena za použití buněk 1A6.1, kde byla zjištěna aktivita 903 jednotek/mililitr).

% této aktivity pocházelo z Mpl Iigandu (na základě inhibice Mpl-X o koncentraci 10 gg/ml). Séra od 14 aplastických pacientů byla také podrobena zkoušce s humánními megakaryocyty. Jako celá skupina vykazovala tato séra podstatnou aktivitu, 941 jednotek meg/ml. Tuto aktivitu bylo možno úplně inhibovat Mpl-X o koncentraci 10 μg/ml. Data za použití myšího IL-3 jsou zde zahrnuta pro potvrzení specifičnosti zkoušky 1A6.1, Přestože tento rekombinantní cytokin indukuje růst této buněčné linie, není inhibován Mpl-X o koncentraci 10 μg/ml.

Tabulka 2

Druh Zkouška s buňkami' Zkouška s humánními

1A6.1 (jednotky/ml) megakaryocyty (jednotky meg/ml) medium ' + Mpl-X médium + Mpl-X

Normální	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0
myš
Aplastická	2000	0	1833	nepro-
myš			... .	vedena	4
Normální	0 ± 0	0 + 0	0 + 0	0 ± 0
pes (
Aplastický	4400	0 + 0	792	0 + 0
pes	± 539		± 128

Tabulka 2- pokračování

Druh Zkouška s buňkami Zkouška s humánními

1A6.1 (jednotky/ml) megakaryocyty (jednotky meg/ml) medium + Mpl-X médium + Mpl-X

Normální vepř Aplastický vepř	0 + 0 3866 ± 1136	0 ± 0 0 ± 0	0 ± 0. 1284 + 182	0 + 1 10 ± 10
Normální	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0	0 + 0
člověk
Aplastický	903	114	941	0 + 0 <
člověk	+ 64	+ 33	+ 178
myší IL3	6000	6000	nepro-	nepro-
	+ 565	± 565	vedena	vedena

Příklade

Stimulace růstu buněk 1A6.1 Mpl ligandem a vývoj humánních megakaryocytů

Mpl ligand přinejmenším asi 100 000 x obohacený i lektinovou a afinitní chromatografií, viz příklad 7, stimuluje růst buněčné linie 1A6.1 a vývoj humánních megakaryocytů z CD34-selektovaných buněk periferní krve způsobem, který je závislý na dávce. Za tuto aktivitu je zodpovědný^- Mpl ligand,’ jak''to vyplývá z^_ obr. 2 a-3/- poněvadž aktivity při obou těchto zkouškách lze úplně inhibovat působením Mpl-X.

Původci tohoto vynálezu také ukázali, že buňky periferní krve CD34⁺ purifikované FACS se po inkubaci s Mpl

- 66 ligandem (v tomto případě 100 jednotek/ml po dobu 9 dnů) vyvinou v fenotypově normální maturované megakaryocyty. To potvrzuje, že purifikovaný Mpl ligand vykazuje stejný účinek na-megakaryocyty, jako surová APK9. Kromě toho bylo při tomto pokusu použito purifikovaných buněk CD34 ⁺ (100% CD34⁺) na rozdíl od CD34-selektovaných buněk, které představují pouze 30 až 50% CD34⁺.

Příklad 7 Purifikace psího Mpl ligandu

I. Shrnutí

- Proteiny (25 kDa 32 kDa) vykazující aktivity předvídané pro.ligand Mpl receptoru byly podrobeny purifikaci. Proteiny byly purifikovaný z plasmy ozářených psu postupem zahrnujícím afinitní chromatografii s aglutininem z pšeničných klíčků (WGA), afinitní chromatografii s Mpl? řéceptorem, anexovou chromatografii, gelovou filtrační chromatografii a HPLC s obrácenými.fázemi C44 (přehled tohoto purifikačního postupu je uveden na obr. 4). 25kDa a 31kDa Mpl ligandy byly vysoce purifikovaný, až do dosažení zřejmé homogenity a bylo zjištěno, že mají aminokyselinové sekvence uvedené v tomto popisu.

II. Metody

A. Vyčiření plasmy

......Zmrazená plasma (celkem 20 litrů) ozářených psů (viz příklad 1) byla ponechána roztát před noc při 4°Č.

Velké láhve se nechaly tát nejprve několik hodin při teplotě místnosti a teprve poté byly přemístěny do chladného prostoru. Nerozpustná látka byla odstraněna šestihodinovou centrifutací při 11 000 x g. Plasma byla zředěna fosfátem pufřovaným fyziologickým roztokem chloridu sodného o pH 7,3 s obsahem 0,01 % azidu sodného (PBS/azid) a přefiltrována přes filtr s póry o průměru 1,2 μπι. Po čeřicím postupu bylo obvykle dosaženo přibližně dvojnásobného zředění výchozí látky.

B. Afinitní chromatografie s aglutininem z pšeničných klíčků

I

Všechny operace byly prováděny při 4°C. Vyčiřená plasma. (2 várky) byla nanesena na sloupec s imobilizovaným aglutininem z pšeničních klíčků (1 litr, 10 x 12 cm, Ε Y Laboratories), který byl ekvilibrován v ΡΒΞ/azídu. Po nanesení vzorku byla nenavázaná látka ze sloupce vymyta PBS/azidem. Po promytí sloupce 0,5M roztokem chloridu sodného ve 20mM Tris-HCl o pH 8 byla aktivita Mpl ligandu navázaná na sloupec WGA eluována roztokem N-ačetylglukosaminu (0,35M/ (GlcNAc), chloridu sodného (0,5M), Tris-HCl (25mM) o pH 8. Aktivitu ^ligandu,.nebylo možno stanovit. ve přefiltrovaném výtoku ani .vé frakcích promývacího louhu.;

C. ’Afinitní chromatografie s receptorem Mpl-X

Použitý rozpustný myší receptor Mpl (Mpl-X) odpovídá celé extracelulární doméně Mpl receptorů bez Trp v poloze 483 (viz Vigon et al., 8: 2607 až 2615 (1993)). Pro optimalizaci vazby Mpl ligandu k afinitnímu sloupci s Mpl-X receptorem byl WGA eluát zkoncentrován membránovou ultrafiltrací (vylučovací mez molekulové hmotnosti 10 000, YM-10, Amicon) a následným zředěním byla koncentrace chloridu sodného nastavena na 0,2M. Zkoncentrovaný vzorek WGA byl nanesen na 20ml sloupec m-Mpl-X [myší rozpustný Mpl receptor/CNBr aktivovaná pryskyřice Sepharose (2,6 x 4,2 cm, 1,5 mg mMpl-X pryskyřice)] při průtokové rychlosti 0,9 ml/min. Sloupec byl promýván PBS/azidem (40 ml, 1,5 ml/min), promývací kapalinou s vysokým obsahem soli (405 ml; lOmM Tris-HCl, 1M chlorid sodný, IroM CHAPS, pH 8,0). Sloupec byl eluován 20mM CAPS, 1M

NaCl, 5mM CHAPS o pH 10,5. Vhodné frakce byly zachyceny a hodnota pH každé z nich byla upravena Tris pufrem.

Jak SDS-page, tak absorbance při 280 nm elučního profilu afinitního sloupce s Mpl-X receptorem vykazovala časný proteinový pík ve frakcích 1 až 4, zatímco hlavní podíl aktivity Mpl ligandu byl eluován po frakci 5.

D. Anexová chromatografie na sloupci Mono-Q

Frakce o nejvyšší čistotě z několika afinitních' sloupců z Mpl-X receptorem byly'spojeny, zkoncentrovány a diafiltrovány proti 20mM Tris-HCl, 5mM CHAPŠ o pH 8,7 do konečného objemu 58,5 ml. Koncentrace proteinu v produktu byla stanovena na základe absorbance při 280 nm (0,12 μg/lnl, což odpovídá celkem asi 7 mg proteinu). Produkt byl nanesen průtokovou rychlostí 0,5 ml/min na sloupec Mono Q HR 5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován ve 20mM Tris-HCl a 5mM CHABS o pH 8,7. Sloupec byl eluován lineárním gradientem až

A do 0,36M chloridu sodného ve stejném purfu v průběhu 27 minut. Potom byl sloupec promyt během 6.minut gradientem až. do 0,54M chloridu sodného a nakonec následovalo promytí 0,9M chloridem sodným. Byly zachycovány frakce o objemu 1 ml.

„ Eluční profil sloupce Mono-Q ukazuje, že žádný Mpl ligand nelze detegovat á jen nepatrné množství proteinu lze detegovat v proteklé kapalině a promývacích frakcích. Značná aktivita Mpl ligandu byla eluována ve frakcích 5 až. 7.......

v průběhu počátečních stádií gradientu chloridu sodného. Inflexe aktivity byla pozorována ve frakcích 8 až 10 a poté následoval druhý hlavní pík zahrnující frakce 11 až 15.

Za použití SDS-PAGE (neredukční podmínky) byl v aktivních frakcích pozorován výrazný 25kDa pás. Intenzita tohoto pásu je přímo úměrná aktivitě Mpl ligandu v těchto frakcích. Tento pás chyběl ve frakcích 3 a 4 (nulová aktivita), byl významný ve frakcích 5 a 6 (pík aktivity 1A6.1) a podobně intenzivně vybarvený pás byl také přítomen ve frakcích 11 až 14 (pík aktivity 1A6.1). Výše uvedený pás byl slabý ve spojených frakcích 15 a 16, což odpovídá významně nižší aktivitě ve frakci 16.

E. Experimenty za použití gelové eluce

Experimenty s gelovou elucí byly prováděny za použití alikvotů Mono Q frakcí 5 a 6 nebo Mono Q frakci 13 a

14. Při těchto experimentech byly frakce 5 a 6 (vždy 6 μΐ) spojeny, podobně jako frakce 13 a 14 (vždy 7,5 μΐ). Spojené frakce byly smíchány se vzorkem pufru SDS-PAGE (neredukčního) a naneseny na 12% SDS-gely. Po skončení elektroforézy byly vyříznuty dráhy, které jsou předmětem zájmu (1 mm) a vyříznuté proužky byly nařezány na malé kousky holicí čepelkou. Kousky byly přeneseny do l,5ml mikrocentrifugačních zkumavek obsahujících 0,5 ml PBS/5mM CHAPS, kde byly mírně promíchávány přes noc při teplotě 4’C. Následujícího dne byly zkumavky krátce odstředěny, byly odebrány alikvotní vzorky a ty byly diafiltrovány proti Iscoveho médiu doplněnému BSA, jako nosným proteinem. Diafiltrovaných vzorků bylo použito pro zkoušení.

Výsledky ukazují, že bylo možno pozorovat dva píky aktivty Mpl ligandu. Jeden pík odpovídal 25kDa oblasti gelu, zatímco druhý pík aktivity Mpl ligandu byl pozorován v 31kD oblasti.

F. Filtrace na gelu Superdex 200

Frakce 13 až 16 ze sloupce pro iontovou výměnu na anexu Mono Q, jakož i dvě ekvivalentní frakce z druhé frakcionace na sloupci Mono Q byly spojeny a zkoncentrovány v membránovém ultrafiltračním zařízení (Centricon-10, Amicon). Byl přidán SDS do konečné koncentrace 0,1% a vzorek byl nastříknut na sloupec Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia). Sloupec byl ekvilibrován v 50mM Tris-HCl, 0,1% SDS o pH 7,5 při průtokové rychlosti 0,3 ml/min, při teplotě místnosti. Byly zachycovány frakce vždy po 1 minutě. Zjistilo se, že většina proteinu ze vzorku se eluuje ve frakcích 32 až 40, zatímco aktivita Mpl ligandu byla detegována ve frakcích 42 až 46. Analýza frakcí pomocí SDS-PAGE ukázala, významný 25kDa pás v aktivních frakcích.

G. HPLC s obrácenými fázemi (C4)

Frakce 43 až 46 (spojené) a frakce 42 (samotná) z filtrace na Superdex 200 byly zkoncentrovány v membrámovém ultrafiltračním zařízení (Microcon-10, Amicon). Koncentrované vzorky byly odděleně naneseny na 1 x 100 mm sloupec s obrácenými fázemi (vrtaná mikrokolona s náplní SynChropak RP-4). Sloupec byl ekvilibrován v 0,04% kyselině trifluoroctové (TFA) vévodě (pufr A;). Jako pufru B bylo použito 0,035% TFA v 80% acetonitrilu. Po naštříknutí vzorku následoval lineární gradient až do 45% B během 4 minut a'poté lineární gradient až do 75% B během 40 minut. Průtoková rychlost byla 75 μΐ/min. Výsledky purifikace frakce 42 jsou uvedeny na obr. 5. Významné píky aktivity Mpl ligandu byly pozorovány ve frakcích 21 až 23. Tyto frakce byly analyzovány na 14% polyakrylamidovém gelu za neredukčních a redukčních podmínek. Frakce -21 se skládala z jediného 31kDa pásu, zatímco frakce 23 zahrnovala jediný široký 25kDa pás a frakce 22 obsahovala pásy jak v oblasti 25kDa, ták v oblasti 31kDa. Žádné jiné významné pásy nebyly pozorovány. Je třeba si povšimnout, že na základě dřívějších experimentů s gélovou elucí byla'aktivita Mpl ligandu připisována oběma těmto oblastem. Jeden menší pás o vysoké molekulové hmot71 nosti byl pozorován ve všech frakcích neredukujícího gelu. Tento pás však nebylo možno zjistit v redukujícím gelu.

H. Analýza N-terminální sekvence 25kDa a 31kDa Mpl ligandu

Analýza N-terminální sekvence byla prováděna na _v frakcích C4 RP-HPLC vykazujících aktivitu. Sekvence zjištěné u těchto proteinů jsou uvedeny výše. Kromě hlavní sekvence i, odpovídající 25kDa pásu (přinejmenším 90 % z celkem naneseného vzorku) byly při sekvenování zjištěny dvě menší sekvence (které jsou připisovány menšímu kontaminujícímu pásu popsaného v části G výše). Porovnání se známými sekvencemi ukázalo, že menší sekvence odpovídají těžkému řetězci a kappa řetězci psího Ig. Pokud by to bylo žádoucí, bylo by možno množství těchto menších nečistot dále snížit zařazením přídavného purifikačního stupně, přednostně dalšího stupně gelové filtrace.

I. Porovnání aktivit Mpl ligandu v C4 purifikovaných frakcích

Obr. 6 ukazuje data povržující, že aktivity přítomné ve frakcích 22 a 23 z C4 RP-HPLC chromatografického stupně jsou. v podstatě evivalentní. Frakce 22 obsahuje směs 25kDa a 31kDa pásu, zatímco frakce 23 obsahuje pouze 25kDa _v ' pás. Alikvoty každé frakce byly zředěny v poměru 1 : 45 000.

Zředěné frakce stimulovaly růst buněk 1A6.1 v podstatě fe stejně (frakce 22, 5 400 buněk na jamku; frakce 23, 6 000 buněk na jamku). Zředěné frakce byly inkubovány se vzrůstajícími koncentracemi Mpl-X. Tyto frakce byly stejně citlivék inhibici působením Mpl-X, tj. u obou došlo k úplné inhibici za použití koncentrace 7-1,4 μ9/η1. To ukazuje, že účinný protein nebo proteiny ve všech frakcích jsou představovány Mpl ligandy s ekvivalentní biologickou aktivitou.

Příklad 8

Porovnání Mpl ligandu s jinými faktory při vývoji megakaryocytů

Bylo oznámeno, že na růst megakaryocytů nebo jejich vývoj má vliv řada rekombinantních faktorů nebo organických ·» sloučenin, jako je forbolmyristoacetát (PMA). Z toho důvodu byly zkoumány účinky těchto faktorů na CD34-selektované buňky periferní krve. Ke kultuře byl, podle toho jak je to uvedeno, přidán humánní rekombinantní interleukin 3 (IL-3, až 2 ng/ml), faktor kmenových buněk (SCF, 50 ng/ml)/ interleukin 6 (IL-6, 25 ng/ml), erythropoietin (EPO, 1 jednotka/ml), faktor inhibující leukémii (LIF, 10 ng/ml) a faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF, 25 ng/ml, Amgen, lne.); interleukin 11 (IL-11, 25 ng/ml, R+D Systems, Minneapolis, MN, USA); nebo forbolmyristoacetát (PMA, 10^-10M, Sigma). Mpl ligandu bylo použito v koncentraci 275 jednotek/ml a APK9 v 5% koncentraci (což odpovídá 220 jednotkám/ml). Faktorů zkoušených v kombinaci · bylo použito ve stejné koncentraci jako při individuálním zkoušení. Po 8 dnech kultivace byly buňky fixovány v jamkách a bylo provedeno barvení megakaryocytů (n = 6 jamek pro každou podmínku) nebo byl stanoven celkový počet buněk (n = jamky pro každou podmínku). Data jsou uvedena jako střední hodnota ± směrodatná odchylka. >

Obr. 7 ukazuje,, že APK9 a Mpl ligand -vede-k nejvýš- - *

Šímu počtu megakaryocytů, vztaženo na jamku. Jaké IL-3 má za následek vývoj megakaryocytů, zejména v kombinaci s CSF.

IL-6, IL-11, ani EPO nemá velký vliv na počet megakaryocytů, a€ již se jich použije samotných nebo v kombinaci s IL-3.

Také PMA, ILF a GM-CSF vykazuje jen malý účinek. Na obr. 8 jsou uvedena data ze stejného experimentu, která ukazují celkový počet buněk zjištěných v jamce (celularita). APK9 a

Mpl ligand mají na celularitu malý vliv, zatímco IL-3 a SCF mají střední vliv. Nejvyšší účinek má kombinace SCF a IL-3. Dat uvedených na obr, 7 a 8 bylo použito pro výpočet procentických podílů megakaryocytů na jamku, což je uvedeno na obr. 9. Je jasné, že faktorem, který vyvolá nejvyšší procentický podíl megakaryocytů v jamce s kulturou, je Mpl ligand, účinná složka APK9. Tento výsledek ukazuje na specifičnost Mpl ligandu vzhledem k megakaryocytům.

Příklad 9

Aktivita Mpl ligandu spočívající v povzbuzení megakaryocytů není závislá na humánním IL-3

Mpl ligand stimuluje vývoj humánních megakaryocytů, když se ho použije jako přísady ke kultivačnímu médiu popsaného v příkladu 2. Přestože IL-3 se k tomuto médiu nepřidá, mohl by být přítomen v nedetegovatělně nízkých koncentracích v normální humánní plasmě, která je v toto médiu obsažena. I když by však byl IL-3 přítomen, nepodílí se na Mpl ligandem indukované megakaryopoiesi. To je zřejmé z obr. 10. IL-3 ,v koncentraci 2 ng/ml vykazuje při zkoušce s humánními megakaryocyty aktivitu 14 900 megakaryocytových jednotek/ml.

Tato aktivita je z 97 % inhibována pomocí anti-IL-3 (3,3 p.g/ml, Genzyme, Cambridge, MA, USA). Mpl ligand v koncentraci 8 203 meg jednotek/ml není inhibován anti-IL-3.

Příklad 10

- Analýza Mpl-ligandu z-vepře -·> -· -

i. Shrnutí

Proteiny z plasmy ozářeného vepře s aktivitou Mpl ligandu byly charakterizovány afinitní chromatografii WGA, afinitní chromátografii s Mpl receptorem, ionexovou chromatograf ií a HPLC s reversními fázemi C4. Tato aktivita byla také charakterizována elucí z proužků SDS-polyakrylamidových gelů.

Chromatografie Poznámka

WGA afinitní sloupec 4,4 x 10^.jednotek naneseno

3.4 x 10⁶ jednotek získáno sloupec s receptorem Mpl 2,7 x 10⁶ jednotek naneseno

2.4 x 10⁶ jednotek získáno iontová výměna, sloupec 2,4 x 10⁶ jednotek naneseno

Mono S, pH 6,0 4,4 x io⁶ jednotek získáno

HPLC s obrácenými fázemi C4 aktivita získána ve frakcích až 25 experimenty s gelovou elucí byly jasně rozlišeny dvě aktivity; jedna při asi 18 kDa a druhá při asi 28 kDa

Příklad 11 t

Klonování humánního Mpl Iigandu, humánního MGDF

Dále jsou popsány dva přístupy: ......

I. Přiklaď prvního přístupu ke klonování

A. Vytvoření humánní MGDF próby

Byla vytvořena řada degenerovaných PCR primerů založených na aminoterminální sekvenci psího proteinu. Pro amplifikaci MGDF genu z humánní genomové DNA bylo použito různých dvojic primerů. Po 40 cyklech amplifikace za použití negativního primeru 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO:4) kódujícího prvních 5 aminokyselin psího proteinu (SEQ ID NO:1) a pozitivního primeru 5' GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO:5) kódujícího aminokyseliny 16 až 21 sekvence SEQ ID NO: 1 se PCR produkt analyzuje na 2,0% agarosovém gelu v pufru TBE.

Z agarosového gelu byl vyříznut 63bp pas, který byl reamplifikován za použití stejné kombinace primerů. PCR produkt byl klonován do PCR li vektoru (firma Invitrogen, San Diego, Kalifornie, USA). Řada kolonií byla podroba screeningu sekvenováním DNA. Plasmidové DNA kódující peptid, který se podobá psímu MGDF proteinu, byl použit jako zdroj pro vytvoření radioaktivní próby určené pro screening cDNA knihoven. Genový fragment kóduje následující aminokyselinovou sekvenci.

Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-LeuLeu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO:6)

Agarosového pásu obsahujícího humánní HGDF bylo použito pro vytvoření próby horkou PCR. Při typické PCR reakci obsahuje celkový objem 100 μΐ vzorku následující přísady:

templátová DNA 5' primer (SEQ ID NO:4) 3' primer (SEQ ID NO: 5) 10 X pufr dATP (0,lmM) dTTP (lOmM) — -dGTP (lOmM)--dCTP (O.lmM) dCTP, P³² (10 μθϊ/μ1) dATP, P³² (10 μθΐ/μ1) Taq DNA polymerasa voda až 3 μΐ 1 μΐ, 20 pmol μΐ, 20 pmol 10 μΐ μΐ 2 μΐ μ-l·-----------------------------2 μΐ 5 μΐ 5 μΐ

0,5 μΐ, 2,5 jednotky 77 μΐ

Celkový objem

100 μΐ

Bylo použito následujících amplifikačních podmínek:

počáteční zahřívání	94°C,	2 minuty
teplotní hybridizace	53°C,	30 sekund
prodlužování	72°C,	30 sekund
denaturace	94°C,	30 sekund

Bylo provedeno 40 amplifikačních cyklů za použití zařízení Perkin Elmer GeneAmp System 9600.

Produkt byl purifikován průchodem přes sloupec push (Stratagene, San Diego, Kalifornie, USA). Ιμΐ próba byla-spočítána ve scintilačním počítači. K hybridizační směsi byly přidány próby obsahující l.a 3. miliony rozpadů/ml.

¹ *

B. Konstrukce knihovny z fetálních jater ·, *

Humánní polyA⁺ RNA z fetálních jater byla zakoupena od Clontech Laboratories. Pro syntézu*cDNA bylo použito asi 4 μg RNA, přičemž primování bylo provedeno za použití statistického hexameru, 5' GTA CGC GTT CTAGÁN.NNN NNT 3’ (SEQ ID NO:7), připojeného k oligomerů obsahujícímu místo Xbal. , .

Pro vytvoření dvouřetězcové cDNA bylo použito protokolu Gibco-BRL. Adaptor Eco R I-Bst X í (Invitrogen, i

San Diego, Kalifornie, USA)-byl ligován k dvouřetězcové cDNA, načež následovalo štěpení restrikčním enzymem Xbal. «

-Selekce cDNA podle velikosti byla provedena na sloupci S500 Sephacryl (Life Technologies, lne.). cDNA větší než 400 bp byly ligovány k savčímu expresnímu vektoru V19.8 (Martin F.,

Cell 63: 203 až 211 (1990)), který již byl rozštěpen EcoRI a Xbal. Kompetentní buňky E, coli DH10 byly transformovány a výsledná cDNA knihovna byla rozdělena na 7 částí, z nichž každá obsahovala 100 000 cDNA.

C. Screening lambda knihovny

Knihovna z humánních fetálních ledvin v lambda gtll byla zakoupena od firmy Clontech (titr 650 χ 10® pfu/ml).

Asi 2 miliony plaků bylo podrobeno screeningu pomocí próby vytvořené PCR (viz výše). Hybridizace byla prováděna v 6 X SSC, 5 X Denhardt, 0,1% SDS a jednořetězcové DNA. z lososího spermatu (100 ^g/ml) po dobu 15 hodin při 56’C.

Bylo provedeno několik cyklů screeningu. DNA byla amplifikována z jednotlivých plaků a hybridizována s vnitřním primerem, 5' AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3' (SEQ ID NO:

8) kódujícím aminokyseliny 7 až 13 ze SEQ ID NO: 6, za účelem identifikace pozitivních výsledků.

D. 3 Prime rychlá amplifikace konců cDNA (RACE) Λ i

I

Polyadenylovaná RNA z humánních fetálních ledvin a fetálních jater byla zakoupena od firmy Clontech. 1 μg.RNS' byl reversně transkribován za použití oligo 5' TTC GGC .

CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3' (SEQ ID NO: 9), jako ů primeru.

Pro vytvoření prvního řetězce cDNA bylo použito soupravy pro syntézu cDNA Gibco-BRL (Life Technologies lne., katalogové číslo 18267-013). Konečný objem byl 30 μΐ. Reakce byla zastavena přídavkem 500mM EDTA do konečné koncentrace i lOmM a reakční směs byla uchovávána při teplotě -20’C.

Při počáteční PCR bylo jako témpláťu pro reakci použito 0,5μ1 cDNA. Jako pozitivních primerů bylo použito primeru (SEQ ID NO: 9) a kompetitoru, oligo 5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TT-P 3' (SEQ ID NO: 10), zatímco oligonukleotidu 5' TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3' (SEQ ID NO: 11) kódujícího aminokyseliny 5 až 11 ze SEQ ID NO:6 bylo použito jako negativního primeru. Bylo provedeno 40 amplífikačních cyklu za použití následujícího protokolu: 94’C 30 sekund, 65’C - 30 sekund a 72’C - 30 sekund. Předtím byla provedena počáteční inkubace při 94’C po dobu 2 minut. Amplifikace byla prováděna v zařízení Perkin Elmer GeneAmp System 9600.

Nesting byl proveden za použití negativního primeru 5' GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3' (SEQ ID NO: 12) kódujícího aminokyseliny 8 až 14 ze SEQ ID NO: 6. Jako pozitivních primerů bylo použito primeru SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 10. Bylo provedeno 40 amplifikačních cyklů s teplotní hybridizací při 65’C. PCRprodukty byly analyzovány na 0,8% agaro^· sovém gelu a potom fotografovány pod UV světlem. Přitom byly viditelné pásy okolo. 0,8 až 1,2 kb.

Produkty PCR byly potom klonovány do vektoru PCR II (Invitrogen). Jednotlivé kolonie byly sesbírány a plasmidy byly izolovány za použití.souprav Qiagen (katalogová čísla 12143 a 12145)’. Za použití vektorových primerů bylo potom provedeno.dvouřetězcové, barvivém primované, sekvenování. Sekvence byly analyzovány za použití různých typů software GCG.

E. Prodloužení 5' a 3' primery

Pro izolaci sekvence MGDF genu s úplnou délkou bylo prováděno prodlužování 3’ a 5* primerem za‘použití.různých částí knihovny-z-fetálních jater, jako. templátu. Pro amplifikaci 5 primeru cDNA bylo použito asi 20 ng cDNA z každé části, jako templátu. Byl použit MGDF specifický pozitivní 'primer 5' GGA GTC ACG AAG CAG TTG AC 3' (SEQ ID NO: 13) kódující aminokyseliny 12 až 17 ze SEQ ID NO: 6 a 5' vektor vl9.8 negativní primer 5' CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3' (SEQ ID NO: 14. Amplifikace byla prováděna ve 30 cyklech s teplotní hybridizací při 53 “C. Nesting byl prováděn 30 cyklů s pozitivním primerem 5' GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3' (SEQ ID NO: 15) kódujícím aminokyseliny 1 až 6 ze SEQ ID NO: 6 a vektorovým primerem SEQ ID NO: 14.

Pro příměrovou extensi 3' konců MGDF cDNA bylo _v použito pozitivního vektorového primeru 5* GGC ATA GTC CGG

GAC GTC G 3' (SEQ ID NO: 16) a MGDF specifického primeru 5’

TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3' (SEQ. ID NO: 17) kódujícího aminokyseliny 1 až 6 SEQ ID NO: 6. Amplifikace byla prováděna ve 30 cyklech s teplotní hybridizací při 58^aC.

Nestingová amplifikace byla prováděna 30 cyklů za použití MGDF primeru SEQ ID NO:· 12 a vektorového primeru SEQ ID NO: 16. Specifické pásy byly patrné v částech 1, 7 a 8, <

které byly klonovány do PCR II vektoru. Purifikované plasmidové DNA z jednotlivých kolonií byly dále purifikovány a sekvenovány. ;

F. Izolace klonů humánního MGDF 0 plné délce ;

itMnoho počátečních klonů neobsahovalo část u aminokonce MGDF, poněvadž části MGDF sekvence bylo použito pro priming a nesting. Primeru 5' CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3' (SEQ ID NO: 18), jehož sekvence byla získána z pěti experimentů s příměrovou extenzí popsaných výše bylo použito jako negativního primeru. Jako pozitivní primer přitom posloužil

I * vektorový primer SEQ ID NO: 16. Bylo provedeno 35 cyklů amplifikace s teplotní hybridizací při 58’C. Pro nesting v

-------------------- -35-cyklech-bylo použitoMGDFsgečificKěhopříměru 5¹ CAÁ CAA

GTC GAC CTC-CAG CCA GAC ACC CCG 3' (SEQ ID NO: 19) s místem Sall a pro nesting v 35 cyklech bylo použito vektorového primeru SEQ ID NO: 15. PCR produkt byl klonován do PCR II vektoru a sekvenován.

II. Příklad druhého přístupu ke klonování

A. Klonování N-terminální cDNA psího MGDF

Degenerované oligonukleotidové primery byly zhotoveny na psí MGDF N-terminální aminokyselinové sekvenci popsané v předchozí části a bylo jich použito jako primeru při řetězových reakcích iniciovaných polymerasou (PCR pro amplifikaci MGDF-kódujících cDNA sekvencí). Úplná RNA byla připravena ze vzorku psích ledvin metodou s guanidiniumísokyanátem (Chomzynski a Sacchi, Biochem 162: 156 až 159 (1987)). První řetězec cDNA byl připraven se statistickým primerem - adapterem 5' GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNN NNT 3' (SEQ ID NO: 20) za použití reversní.transkriptasy MoMULV a bylo ho použito jako templátu při následujících reakcích PCR.

PCR byla prováděna za použití 0,5 μ,Ι (asi 50 ng) cDNA za použití primeru A .5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO: 4) a primeru s negativním řetězcem kódujícího aminokyseliny 1 až 6 ze SEQ ID NO: 1 a buď primeru B 5' GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 5) nebo primeru C 5’ GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3’ (SEQ ID NO: 21), což jsou primery pozitivního řetězce kódující aminokyseliny 16 až 21 ze SEQ ID NO: 1 se 3 nukleotidy navíc u 5' konce pro zvýšení stability při teplotní hybridizaci. PCR s Taq polymerasou byla prováděna 35 až 45 cyklů do té doby, dokud nebyly na agarosovém gelu pro elektroforetickou analýzu patrné pásy *, produktu. V prvních dvou cyklech PCR byl prováděn rehybridizační (teplotní hybridizace) stupeň (37’C, 2 minuty) a rehybridizace ve zbývajících cyklech byla prováděna l minutu při 50’C. V každém reakčním produktu bylo pozorováno více pásů produktů. Pomocí špičky Pasteurovy pipety byly odebrány části gelu obsahující pásy o přibližně očekávané velikosti (66 bp) a byla provedena jejich reamplifikace se stejnou dvojici primeru. DNA produkty byly klonovány do vektoru PCR II (Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Tři klony byly sekvenovány a bylo zjištěno, že kódují v jednom čtecím rámci očekávanou psí MGDF sekvenci, zbytky 1 až 21. Tímto způsobem byla získána jedinečná psí MGDF cDNA sekvence pokrývající oblast od třetího nukleotidu kodonu 6 do třetího nukleotidu ._w kodonu 15. Jednoho z těchto klonů bylo použito jako templátu pro přípravu značené psí MGDF cDNA próby.

*«

B. Konstrukce cDNA knihovny z humánních fetálních jater

RNA byla izolována z humánních fetálních jater (International Institute for the Advancement of Medicine,

Exton, PA, USA) lyží tkáně v 5,5M guanidiniumthiokyanátu a purifikací CsTFA (Pharmacia) centrifugací. Polyadenylovaná

RNA byla selektována za použití perlového produktu oligo (dT)₂₅ dynabeads (Dynal, podle instrukcí výrobce). Z této

RNA byla vyrobena dvouřetězcová cDNA za použití plasmidového systému Superscript pro syntézu cDNA (Life Technolo- * -«j gies lne.) s výjimkou použití odlišného linkerového , $ r

adaptéru: 5' TTG GTG TGC ACT TGT G 3' (SEQ ID NO: 22) a 5Λ s®

CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3' (SEQ ID NO: 23). Po selekci podle velikosti byla tato cDNA směrované vložena do míst

BstXI a Notl savčího expresního vektoru pBCB (pBCB byl získán z. plasmidu Rc/CMV, Invitrogen obsahujícího hlavní řetězec pucl9, CMV promotor a BGH polyadenylační místo).

Ligovaná DNA byla elektroporací zavedena do elektro-kom5 . petentního bakteriálního kmene 10 B (Life Technologies lne.).

C. Screening knihovny cDNA z humánních fetálních jater na MGDF

Filtrové repliky humánní fetální jaterní knihovny byly hybridizovány k radioaktivně značenému psímu MGDF

N-konec cDNA PCR produktu (5x SSPE, 2x Denhardt, 0,05% difosforečnan sodný, 0,5% SDS, kvasinkový tRNA lyzát (100 μΐ/litr) a denaturovaná lososí spermatová DNA (100 μςτ/ιηΐ)) hodin při 64’C. Filtry byly promyty při 64°C v 5x SSPE,

0,5% SDS a exponovány přes noc. Byly izolovány a analyzovány dva různé klony hybridizované k této próbě.

D. Exprese humánních MGDF cDNA klonů

Purifikovaná DNA z MGDF cDNA klonů byla transfekována do buněk 293 EBNA (Invitrogen). 1,5 μg DNA bylo smícháno se 7,5 μΐ Lipofectaminu (Life Technologies lne.) ve 100. μΐ séraprostého DMEM. Po 20minutové inkubaci při teplotě místnosti, byla směs DNA-Lipofectamine přidána, k 5 x 10⁵ buňkám/jamka (24=jamková čtvercová miska Greiner) .,v 400 μΐ DMEM s 1 % séra. (Fetal Cloně .II) a inkubována 6 hodin, při 37 °C. K buňkám bylo přidáno 500 μΐ DMEM s 20 % séra (Fetal Cloně II). Po 16 hodinách bylo médium odtaženo a bylo přidáno 500 μΐ DMEM.s .1 % séra (Fetal Cloně, II.). Po dalších 7 2’hodinách byla zpracované médium.shromážděno a odstředěno za použití rotačního- filtru s průměrem pórů 0,22 pm. Zpracované médium bylo podrobeno zkoušce na biologickou aktivitu MGDF...

III. Popis humánních MGDF klonů a jejich aktivita r

Za použití výše popsaných strategií klonování byly získány humánní cDNAklony znázorněné na obr.. 11 (MGDF-1 a . ⁴

MGDF-2; SEQ ID NO: 24, 25 a 26; 27) a obr. 12 (MGDFr3; SEQ ID NO: 28, 29). Každá z těchto sekvencí uvedených na obrázcích obsahuje předpokládanou signální sekvenci aminokyselin 1 až 21, takže maturovaný protein začíná vždy aminokyselinou 22.

Výsledky zkoušek aktivity za použití zkoušky s buňkami popsané v příkladu 4A (MGDF 1 až 3) jsou uvedeny v tabulkách 3 a 4. Podle tabulky 3 bylo médium zpracované buňkami 293 EBNA transfekovanými' jednotlivými konstrukty shromážděno po dvou dnech kultivace a potom zkoušeno na buňkách 1A6.1 (32D/mur-MPL+) ± 10 ng/ml mur-MPL-X. Podle tabulky 4 bylo médium zpracované buňkami 293 EBNA transfekovanými jednotlivými konstrukty shromážděno po čtyřechdnech kultivace a potom zkoušeno na buňkách 32D/mur-MPL+ (příklad 3A) a 32D-Hu~MPL+ (příklad 3B). Jak je zřejmé, humánní MGDF-1 a MGDF-2, ale nikoliv MGDF-3, je aktivní u-buněčných, linií. exprimují cích jak myší, tak humánní formu Mpl. Buněčná linie exprimující humánní Mpl receptor je responsivnější vzhledem k MGDF-1 a MGDF-2 než buněčná linie ₍ .

exprimující myší Mpl receptor. - , '-'S

Tabulka 3

Klon	- mur-MPL-X . (jednotky/ml)	+ mur-MPL-X (jednotky/ml) v
Medium	0	0
PBCO (kontrolní plasmid) 0	0
-MGDE-1._,._...........	12 800	800
MGDF-1./ opakování)	12 800	566
MGDF-2	4 525	....... 400
MGDF-2 (opakování)	12 800	1 131
MGDF-3	0	0
MGDF-3 (opakování)	0	0
APK9 kontrolní	4 400 + 400	0

Tabulka 4

Klon

32D/mur-MPL+ (jednotky/ml)

32D/hu-MPL+ (jednotky/ml)

MGDF-l	1	600	25	600
MGDF-2	6	400	50	000
MGDF-2 (opakování)	6	400	50	000 až

100 000

Následující tabulka 5 ukazuje, že aktivity humánního MGDF-l a MGDF-2 na buňky 32D/Hu-MPL+ (příklad 3B) jsou v podstatě úplné inhibovány rozpustným humánním Mpl receptorem (hu-MPL-X). hu-MPL-X byl obsažen ve zpracovaném médiu odděleném od buněk CHO produkujících tento protein. Médium zpracované buňkami CHO s hu-MPL-X bylo 120x žkoncentrováno a potom přidáno ke kulturám do obsahu 6,6 %. Zpracované médium z kontrolních CHO kultur nevykazovalo žádný účinek při této zkoušce. Zkouška byla prováděna způsobem popsaným v přikladu.4B, pouze s tím rozdílem, že životachopné buňky byly zjišťovány po 3 dnech.

I.

Tabulka 5

Klon _% -Hu-MPL-X + Hu-MPL-X (j ednotky/ml) (j ednotky/ml)

MGDF-l

MGDF-2

530

270

0__...

Zkouška s humánními megakaryocyty

MGDF-1 a MGDF-2, ale nikoliv MGDF-3, indukuje tvorbu megakaryocytú z CD34-selektovaných buněk z periferní krve. Experiment popsaný v tabulce 6 byl proveden v podstatě způsobem popsaným v příkladu 2, pouze s tím rozdílem, Že buňky periferní krve byly CD34-selektovány bez elutriace a kultura byla sklizena po 7 dnech. Zpracovaného média z 293 EBNA MGDF. konstruktu bylo použito při 20 % finálního objemu ±30 μg/ml mur-MPL-X. APK9 kontroly bylo použito při 6 % konečného objemu.

Tabulka 6

Klon	Megakaryocyty na jamku	Megakaryocyty na jamku
(-mur-I	4PL-X)	(+mur-MPL-	•X)
vektorová	0			0
kontrola
APK9 ,	100	±	3	0
kontrola
MGDF-1	142	+	48	17 +	2
MGDF-2	100	+	3	6 ±	2
MGDF-2.....	....
.(opakování)	86	+	10	0
MGDF-3	2	+	2	0

Příklad 12

Následující příklad popisuje syntézu 12 různě pegylovaných MGDF molekul, PEG 9 až PEG 12 a PEG 14 až PEG 21. V každém případě bylo jako molekuly MGDF pro pegylaci použito MGDF - 11 z E. coli (aminokyseliny 22 až 184 při číslování začínajícím od začátku signálního peptidu, nebo aminokyseliny 1 až 163 při číslování začínajícím od maturovaného proteinu). Podrobnosti vztahující se k těmto pegylovaným molekulám jsou shrnuty v tabulkách 7 až 10 (dále).

12.1 Příprava konjugátů poly-MePEG-MGDF acylací MGDF aktivovanými MePEG deriváty

Příprava konjugátů poly-MePEG{20 kDa)-MGDF (PEG 11)

Ochlazeny^-(Pcj roztok MGDF (2,5 mg/ml) v O,1M pufru Bicine o pH 8 byl přidán k desetinásobnému molárnímu nadbytku tuhého MePEG-sukcinimidylpropionátu o molekulové hmotnosti.20 kDa (Shearwater Polymers, lne.). Polymer byl rozpuštěn za mírného, míchání a další reakce byla provedena při. teplotě, místnosti.

Stupeň modifikace proteinu v průběhu reakce byl monitorován HPLC s vylučovací mezí.molekulové hmotnosti (SEC) ža použití sloupce Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech), který byl eluován O,1M fosfátovým pufrem ’(fosforečnan sodný) o pH 6,9 při rychlosti eluce 0,7 ml/min.

Analýza reakční- směsi pomocí SEC HPLC ukázala po 30 minutách redakční doby, že v reakční směsi není obsažen Žádný volný protein. V tomto okamžiku byla koncentrace proteinu v reakční směsi snížena na 1 mg/ml přídavkem sterilní vody a hodnota pH směsi byla upravena na 4 několika kapkami 0,5M kyseliny octové..

.............Ko.n j ugá t MePEG-MGDF - by-1 oddělen-od nadbytku^- MePEG ^_a~ jiných vedlejších produktů reakce ionexovou chromatografií za použití ionexové pryskyřice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Reakční směs byla nanesena (2,5 mg/ml pryskyřice) na sloupec a nezreagovaný MePEG byl eluován 3 objemy sloupce počátečního pufru A (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 15% glycerol). Potom byl konjugát MePEG-MGDF eluován za použití lineárního gradientu od 0 do 30 % v 10 objemech sloupce koncového pufru Β (ÍM chlorid sodný v pufru A). Eluát byl monitorován při 280 nm. Frakce obsahující konjugát poly-MePEG-MGDF byly spojeny, zkoncentrovány a sterilizovány filtrací.

a.

Purifikovaný konjugát poly-MePEG-MGDF byl analyzován SEC HPLC za použití filtračních sloupců TSK-GEL G4000SWXL a G2000SWXL zapojených do série. Proteiny byly detegovany na základě UV absorbance při 280 nm. Jako markérů molekulové hmotnosti globulárního proteinu bylo použito standardů pro gelovou filtraci BIO-RAD.

*

Jak je zřejmé z obr. 17A, podle SEC HPLC obsahoval produkt dvě hlavní složky (v přibližném poměru 2:1), jejichž eluční polohy odpovídají globurálním proteinům o , V;

molekulové hmotnosti 379,9 kDa a 150,0 kDa (viz také tabulka 8).

Konjugáty PEG 9, PEG 10 a PEG 12, vyrobené acylaci MGDF sukcinimidylestery, s MePEG o molekulové hmotnosti '6 až ;! 50 kDa byly připraveny podobným způsobem. Hlavní reakční parametry použité při těchto postupech jsou shrnuty v tabulce 7.

• - -...........- Výsledky 'analýzy SEC HPLC těchto konjugátu jsou........

uvedeny v tabulce 8.

12.2 Příprava konjugátů poly-MePEG-MGDF redukční alkylaci MGDF MePEGaldehydy

Příprava poly-MePEG(20 kDa)-MGDF konjugátu (PEG 20)

K ochlazenému (4’C) míchanému roztoku MGDF (2 ml,

2,5 mg/ml) ve lOOmM fosforečnanu sodném o pH 5 s obsahem natriurakyanborhydridu (20mM NaCNBH₃) byl přidán desetinásobný molární nadbytek monomethoxypolyethylenglykolaldehydu (MePEG) o průměrné molekulové hmotnosti 20 kDa a v míchání reakční směsi bylo pokračováno při stejné teplotě.

Stupeň modifikace proteinu v průběhu reakce byl monitorován HPLC s vylučovací mezí molekulové hmotnosti (SEC) za použití sloupce Superdex 200 HP 10/30 (Pharmacia Biotech), který byl eluován 0,lM fosfátovým pufrem (fosforečnan sodný) o pH 6,9. při. rychlosti .eluce: 0,7. ml/min.

Analýza reakční směsi pomocí. SEC. HPLC ukázala po 16 hodinách, že více než 90 % počátečního množství proteinu bylo modifikováno. V tomto okamžiku byla koncentrace proteinu v reakční směsi snížena na 1 mg/ml přídavkem sterilní vody a hodnota pH směsi byla upravena na 4 0,5M kyselinou octovou.

Konjugát MePEG-MGDF byl oddělen od nadbytku MePEG a jiných vedlejších produktů reakce ionexovou chromátografii za použití ionexové pryskyřice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Reakční směs byla nanesena (2,5 mg/ml pryskyřice) na sloupec a nezreagovaný MePEG byl eluován 3 objemy sloupce počátečního pufru A (20mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 15% glycerol). Potom byl konjugát MePEG-MGDF eluován za použití lineárního gradientu,od 0 do'30 % v 10 objemech sloupce koncového pufru Β (1M chlorid sodný v pufru A). Eluát byl monitorován při 280 nm. Frakce obsahující konjugát poly-Me89

PEG-MGDF byly spojeny, zkoncentrovány a sterilizovány filtrací.

Purifikovaný konjugát poly-MePEG-MGDF byl analyzován SEC HPLC za použití filtračních sloupců TSK-GEL G4000SWXL a G2000SWXL zapojených do série. Proteiny byly detegovány na základě UV absorbance při 280 nm. Jako markérů molekulové hmotnosti globulárního proteinu bylo použito standardů pro gelovou filtraci BIO-RAD.

Jak je zřejmé z obr. 17B, podle SEC HPLC obsahoval produkt dvě hlavní složky (52 a 47 % celkového množství), ’ jejichž eluční polohy odpovídají globulárním proteinům o molekulové hmotnosti 359,4 kDa a 159,3 kDa (viz také tabulka 8).

Konjugáty PEG 18, PEG 19 a PEG 21, vyrobené redukční alkylácí MGDF MePEGaldehydem o molekulové hmotnosti 6 až 25 kDa byly připraveny podobným způsobem. Hlavní reakční parametry použité při těchto postupech jsou shrnuty v tabulce 7.

/

Výsledky analýzy SEC HPLC těchto konjugátů jsou uvedeny v tabulce 8.

12.3'. Příprava konjugátů monomethoxypolyethylenglykol-MGDF s místem připojení v N-terminální a-aminoskupině

Příprava mono-MePEG(20 kDa)-MGDF konjugátu (PEG 16)

K ochlazenému (4°C) míchanému roztoku MGDF (2 ml,

2,5 mg/ml) ve lOOmM fosforečnanu sodném o pH 5 s obsahem natriumkyanborhydridu (20mM NaCNBH₃) byl přidán pětinásobný molární nadbytek methoxypolyethylenglykolaldehydu .

(MePEG) o průměrné molekulové hmotnosti,20 kDa a v míchání reakční směsi bylo pokračováno při stejné teplotě.

stupeň modifikace proteinu v průběhu reakce byl monitorován SEC HPLC za použití sloupce Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech), který byl eluován 0,lM fosfátovým pufrem (fosforečnan sodný) o pH 6,9 při rychlosti eluce 0,7 _n ml/min.

V

Analýza reakční směsi pomocí SEC HPLC ukázala po 16 hodinách, že bylo modifikováno přibližně 90 % počátečního množství proteinu. V tomto okamžiku byla koncentrace proteinu v reakční směsi snížena na 1 mg/ml přídavkem sterilní vody a hodnota pH směsi byla upravena na 4 0,5M kyselinou octovou.

Konjugát mono-MePEG(20 kDa)-MGDF byl oddělen od nadbytku MePEG a jiných vedlejších produktů reakce ionexovou chromatografií *ža použití, ionexové pryskyřice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

»

Reakční směs byla nanesena (2,5 mg/ml pryskyřice) na sloupec a nezreagovaný MePEG byl eluován 3 objemy sloupce počátečního pufru A (20mMfosforečnan sodný,* pH 7,2, 15% glýcerol). Potom byl konjugát MePEG-MGDF eluován za použití lineárního gradientu od 0 do 25 % ve 20 objemech sloupce i koncového pufru B (1M chlorid sodný v pufru A). Eluát byl monitorován .při 280 nm.. .Frakce obsahující konjugát mono-me- š?

PEG-.MGDF byly. spojeny, ..z.koncentrpvány a s.terilizpvány filtrací.

Homogenita konjugátů mono-MePEG-MGDF byla zkoušena elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodečylsulfátem sodným za použití 4 až 20% předem nalitých gradientových gelů (Novex). Byl pozorován jeden hlavní pás odpovídající poloze 46,9kDa proteinu.

Purifikovaný konjugát mono-MePEG-MGDF byl analyzován SEC HPLC za použití filtračních sloupců TSK-gel G4000SWXL a G2000SWXL zapojených do série. Proteiny byly detegovány na základě UV absorbance při 280 nm. Jako markérů molekulové hmotnosti globulárního proteinu bylo použito standardů pro gelovou filtraci Bio-Rad.

. _ v

Jak je zřejmé z obr. 17C, podle SEC HPLC obsahoval produkt jednu hlavní složku, jejíž eluční poloha odpovídá globulárnímu proteinu o molekulové hmotnosti 181,1 kDa (viz také tabulka 9).

Konjugáty mono-MePEG-MGDF s PEG 14,. PEG 15 a PEG 17, vyrobené redukční alkylací MGDF MePEGaldehydem o molekulové hmotnosti 6 až 25 kDa, byly připraveny podobným způsobem. Hlavní reakční parametry použité při těchto postupech jsou shrnuty v tabulce 7.

Výsledky analýzy SEC HPLCtěchto konjugátů jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 7

Shrnutí reakčních parametrů při modifikaci MGDF

Kód Reaktivní MePEG . Reakční podmínky

	Typ	m. h. <	konc. MGDF 'mg/ml)	pH	teplota (ec)	doba (h)	molární poměr MePEG/ MGDF
PEG	9	NHS	6 kDa	2,5	8	t .m.	0,5	15 ’
		ester
PEG	10	NHS ester	6 kDa	2,5	8	t .m.	0,5	10
PEG	11	NHS ester	20 kDa	2,5	8	t * 3Π»	0,5	10
PEG.	12	NHS ester	50 kDa	2,5	8	t.m.	0,5	5
PEG	14	alde-	6 kDa	2,5	5	4	16	5
PEG	15	hyd alde-	12 kDa	2,5	5	4	16	5
PEG	16	hyd alde-	20 kDa	2,5	5	4	16	- 5
PEG	17	hyd alde-	25 kDa	2,5	5	4	16	10
PEG	18	hyd alde-	6 kDa	5	5	4	16	10
PEG	19	hyd alde-	12 kDa	5	5	4	16	10
PEG	20	hyd alde-	20 kDa	5	5	4	16	10
PEG	21	hyd alde-	25 kDa	5	5	4	16	10
		hyd

m.h, = molekulová hmotnost t-.ra. - teplota místnosti

Tabulka 8

Shrnutí vlastností poly-MePEG-MGDF podle SEC HPLC

Kód Reaktivní MePEG Zjevná m.h. Obsah složky podle SEC (kDa) (%)

PEG	9	NHS ester	6	kDa	87,9 52,7	75 25 (inflexe)
PEG	10.	NHS	6	kDa	69,2	14
						(inflexe)
		ester			42,9	86
PEG	11	NHS	20	kDa	370,9	68
		ester			155,0	32
PEG	12	NHS	50	kDa	865,6	53
		ester			368,0	47
PEG	18	alde-	6	kDa	84,6	60
		hyd			41,5	40
PEG	19	alde'-	12	kDa	218,4	59
		hyd			106,7	41
PEG	20	alde-	20	kDa	359,4	52
		hyd			159,3	47
PEG	21	alde-	25	kDa	450,5	54
		hýd			218,4	46

Tabulka 9

Zjevná molekulová hmotnost konjugátů mono-MePEG-MGDF

Kód		Reaktivní	MePEG	Zjevná m.h.	Zjevná	m.h. podle
				podle SEC (kDa)	SDS	PAGE (kDa)
		Typ	m.h. (kDa)
PEG	14	aldehyd	6	44,5		27,7
PEG	15	aldehyd	12	104,7		38,3
PEG	16	aldehyd	20	181,1		46,9
PEG	17	aldehyd	25	226,4		55,5

12.4. Příprava konjugátů DiMePEG(12kDa)-MGDF redukční . · alkylací MGDF methoxypolyethylengiykolaldehydem^ (PEG 22)

Purifikovaná molekula označovaná názvem PEG 22. byla získána následujícím postupem:

Pětinásobný nadbytek methoxypolyethylenglykolaldehydu (MePEG, tj. látka vzorce OHC-(CH₂)₂O-(CH₂-CH₂O)_n-CH₃, kde n představuje index, jehož hodnota odpovídá molekulové hmotnosti produktu přibližně 12 kDa) (Shearwater Polymers) byl přidán k roztoku MGDF (2,5 mg/ml) (z E. coli, 1 až 163) v lOÓmM octanu sodném, pH 5,0, přičemž teplota byla udržována na 5’C. Po lOminutovém míchání bylo přidáno' dostatečné množství natriumkyanborhydridu (Aldrich), aby koncentrace této látky v reakční směsi byla 20mM.

Vzniklá směs byla 16 hodin míchána přibližně při 5’C. Na konci této doby byla přidána purifikovaná voda (podle US lékopisu) v dostatečném množství pro úpravu koncentrace MGDF na 1 mg/ml. Směs byla přefiltrována přes vakuový filtr s rozměry pórů 0,2 μιη. Tímto způsobem bylo z

získáno 90 mg reakčního produktu. K reakční směsi byla přidána malá množství i,0M primárního fosforečnanu a IN hydroxidu sodného pro dosažení koncentrace fosforečnanu lOmM * · a pH roztoku 6,8.

Konjugát byl purifikován na sloupci katexové pryskyřice. Byl připraven 40ml sloupec pro HPLC z SP-Sepharose s výškou lože 7,5 cm. Sloupec byl ekvilibrován s ekvilibračním pufrem (lOmM fosforečnan, pH 6,8, 15 % glycerolu). Potom byl na sloupec nanesen konjugát v množství 2,2 mg/ml pryskyřice rychlostí 0,15 objemu sloupce za minutu. Následovalo promývání ekvilibračním pufrem až do dosažení základní linie. Eluce sloupce byla provedena 10 objemy sloupce elučního činidla s lineárním gradientem od pufru A (25mM' fosforečnan, pH 7,2, 15 % glycerolu) do pufru B (pufr A + 0,3M chlorid sodný). Průtoková rychlost byla udržována na hodnota 0,15 objemu sloupce za minutu. Eluát byl monitorován při 280 nm.

Jednotlivé frakce byly analyzovány metodou SDS-PAGE a frakce obsahující DiPEG konjugát byly spojeny a přefiltrovány přes filtrační jednotku s průměrem pórů 0,2 μπι.

Příklad 13

Biologická účinnost pegylovaných molekul MGDF “A.“ PEG-9^_aŽ^_PEG-l2 a' PEG-1'4 až PEG-2r^_........................ ......

Byl zjištěn počet krevních destiček u myší léčených rekombinantním humánním MGDF a výsledky jsou uvedeny na obr.

18. Normálním myším Balb/c se jednou denně po dobu celkem 5 dnů subkutánní injekcí podává MGDF 22-353 z CHO (kosočtver96 ce), nepegylovaný MGDF22 až 184 z E. coli (otevřené kroužky) a pegylovaný MGDF 22 až 184 z E. coli (uzavřené kroužky) v koncentraci uvedené v popisu tohoto obrázku uvedeném výše.

hodin po poslední injekci byly zvířatům odebrány krevní vzorky z malého laterálního řezu v ocasní véné. Analýzy krevních buněk byla provedena pomocí elektronického analyf zátoru krevních buněk Sysmex (Baxter Diagnostics, lne., Irvine, Kalifornie, USA). Uvedená data představují střední hodnotu ze stanovení u čtyř zvířat + směrodatná odchylka od této střední hodnoty. Ostatní parametry krevních buněk, jako je celkový počet bílých krvinek nebo červených krvinek ’ nebyly touto léčbou ovlivněny.

Výše uvedeným způsobem byly zkoušeny i další formy rekombinantního humánního MGDF. .Počet krevních destiček.u myší léčených označenou formou rHuMGDF v dávce 50 nebo.,10 μg/kg/den, jsou uvedeny v následující tabulce 10. Tabelovaná data představují střední hodnotu vypočítanou z hodnot od čtyřech zvířat, přičemž, směrodatná odchylka, je uvedena.-, kurzívou.

Tabulka lo

	50 ug/kpZ-dep	10 ua/ka/dep
Forma	střední hodn.(n=4)	sem	střední hodn.(n=4)
CHO 22-353	4343	309	2571	80
E. coli 22-184	2021	29	1439	18
PEG 9	2728	56	2369 .	34
PEG 10	2431	291	1556	126
PEG 11	3778	59	1861	73
PEG 12	3885	156	1740	88
PEG 14 .	3567	80	2020	63
PEG 15	4402	57	2834	99
PEG 16	4511	239	3215	11
PEG 17	4140	188	3113	261
PEG 18	4586	59	2931	129
PEG 19	3980	330	4189	80
PEG 20	3942	285	3054	339
PEG 21	4195	145	4002	91

Sákl. linie

939

25

4

Klíč k tabulce 10

V každém případě bylo jako molekuly MGDF pro ----------pegylací-použi.to. MGDF-- li. z E,..coli.. (aminokyseliny.^., až

184 při číslování začínajícím od začátku signálního peptidu, nebo aminokyseliny l až 163, při číslování začínajícím od maturovaného proteinu). (Viz výše uvedený příklad 12.)

Název	Pegylace	Průměrná m.h. PEG	Reaktivní molekula PEG pro syntézu
PEG 9	polypegylovaný	6 kDa	NHS ester MePeg
PEG 10	polypegylovaný	6 kDa	NHS ester MePeg
PEG 11	polypegylovaný	20 kDa	NHS ester MePeg
PEG 12	polypegylovaný	50 kDa	-NHS ester MePeg
PEG 14	monopegylovaný	6 kDa	aldehyd MePeg
PEG 15	monopegylovaný	12 kDa	aldehyd MePeg
PEG 16	monopegylovaný .	2 0 kDa	aldehyd MePeg
PEG 17	monopegylovaný	2 5 kDa	aldehyd MePeg
PEG 18	polypegylovaný	6 kDa	aldehyd'MePeg '
PEG 19	polypegylovaný	12 kDa	aldehyd MePeg
PEG 20	polypegylovaný	20 kDa	aldehyd MePeg
PEG 21	polypegylovaný	25 kDa	aldehyd MePeg- „

Za počet krevních destiček odpovídající základní.' linii se považuje počet krevních destiček u normálních zvířat, kterým nebyly podány žádné látky.

Je zřejmé, že pegylace rekombinantního humánního MGDF neovlivňuje nepříznivě schopnost této molekuly zvyšovat počet krevních destiček u recipientních zvířat, a naopak může zvýšit aktivitu produktu 22-184 z E. coli na stejnou nebo vyšší úroveň, než je úroveň pozorovaná u molekuly 22-353 pocházející z CHO. ^ř

B. PEG-22 ·

Výsledky dosažené s PEG-22 jsou uvedeny na obr. 24. Pozoruhodné je, že k normalizaci počtu krevních destiček v případě použití PEG-22 došlo o několik dnů dříve než v případě použití MGDF o plné délce z CHO, PEG-16 nebo PEG-17.

*

Příkladl4

Exprese rekombinantního humánního MGDF (1 až. 163) v E. coli

Pro expresi r-HuMGDF v E. coli byla chemicky syntetizována sekvence kódující prvních 163 aminokyselin maturovaného proteinu za použití optimálních kodonů E. coli. K 5' konci genu byly přidány sekvence DMA kódující aminokyseliny methionin a lysin. Protein r-HuMGDF kódovaný touto sekvencí obsahuje proto 165 aminokyselin, počínaje s řetězcem Met-Lys. Sekvence tohoto genu je uvedena na obr.

25. j

Syntéza rHuMGDF (1-163) genu byla provedena v několika stupních. Nejprve byly za použití optimálních kodonů E. coli chemicky syntetizovány první komplementární oligonukleotidy (o délce 60 až 70 bp) představující sousední fragmenty genu. Během této syntézy byly k 5' konci maturovaného genu připojeny kodony pro aminokyselinu methionin a lysin a k 3' konci genu byl připojen stop kodon. Kromě toho byla na nejzazší konce 5' a 3' připojena štěpná místa pro restrikční enzymy Xbal (5' konec) a HindlII (3' konec) a ve vhodné vzdálenosti před počátečním methioninovým zbytkem bylo umístěno syntetické ribosomální vazebné místo. Potom byla provedena teplotní hybridizace komplementárních oligonukleotidů pro každý fragment genu. Ve třetím stupni byly ________jednotlivé .syntetické, fragmenty genu amplifikovány za......

použití PCR reakce. Ve čtvrtém stupni byly amplifikované fragmenty subklonovány do vhodného vektoru. V pátém stupni byla provedena verifikace sekvencí subklonovaných fragmentů. V šestém stupni byly jednotlivé fragmenty vzájemně ligovány a subklonovány do vhodného vektoru, přičemž byl rekonstruo100 ván r-HuMGDF (1-163) gen o plné délce. Nakonec byla provedena verifikace rekonstruovaného genu.

Syntetický r-HuMGDF genový fragment lemovaný restrikčními místy Xbal (u 5' konce) a HindlII (u 3' konce) obsahuje ribosomální vazebné místo, ATG start kodon, sekvenci kódující maturovaný Met-Lys r-HuMGDF protein a stop kodon.

’ *

Výše uvedený fragment byl klonován do míst Xbal a HindlII laktosou indukovatelného expresního vektoru pAMGll. Vektor pAMGll je plasmid s nízkým počtem kopií, jehož počátek replikace je odvozen z pRIOO. Expresní plasmid pAMGll může být získán z plasmidu pCFM1656 (přírůstkové číslo sbírky ATCC. 695.76'.,. datum uložení: 24. února 1994) sérií místně orientovaných změn bází PCR překrývající oligomutagenesí. Začne se místem BglII (plasmid bp # 180) bezprostředně ve směru 5' od promotoru replikace plasmidu P_COpg a pokračuje se směrem ke genům replikace plasmidu, přičemž .

•se provednou následující změny bázových párů:

101

dAMGII bo # bp v pCFM1656	změněný bp.v pAMGll
	204	T/A	C/G
	428	A/T	G/C
#	509	G/C	A/T
ϊΓ	617	- -	insert dvou G/C bp
#	679	G/C	T/A
	980	T/A	C/G
#	994	G/C	A/T
#	1004	A/T	C/G
#	1007	C/G	T/A
	1028	A/T	T/A
#	1047 .	C/G	T/A
#	1178	G/C	T/A
#	1466	G/C	T/A
#	2028	G/C	bp delece
#	2187	C/G	T/A
#	2480	A/T	T/A 6
#	2499-2502	AGTG	GTCA
		TCAC	CAGT
	2642	TCCGAGC	bp delece
		AGGCTCG
#	3435	G/C	A/T
#	3446	G/C	A/T
#	3643	A/T	T/A
#	4439-4512	_ _	insert bps

!> GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG

CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC (SEQ ID NOS: 30, 31) ~ ......''' a sekvence DNA mezi jedinečnými restrikčními místy Aatll a Clal se nahradí následujícím oligonukleotidem:

102

AatlI (#4358) * CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT3 ' TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3' -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5'

Clal (#4438) (SEQ ID NOS: 32, 33)

Exprese r-HuMGDF klonovaného do pAMGll je poháněna syntetickým promotorem, který je indukovatelný laktosou, jako je Ps4, jehož sekvence je:

5' GACGTCTCÁTAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-attcttgattaatattctcaattgtgagcgctcacaatttatcgat 3 ' .

(SEQ ID NO: 34)

Promotor Ps4 je potlačován represorem laktošy

I(Láci), což je produkt, genu láci z E. coli..

Plasmid. pAMGll-.rrHuMGDF .se..potom transformuje .do E. coli kmene K-12, který obsahuje allelu lacl^. Allela představuje mutaci v promotoru lad zvyšující expresi Láci, což má za následek přísnější kontrolu exprese proteinu poháněnou promotorem PS4. V tomto kmeni je tedy za nepřítomnosti laktosy exprese r-HuMGDF potlačena Láci. Po.přídavku laktosy se protein Láci, který se naváže na místo operátoru promotoru PS4, redukuje a začne trakripce r-HuMGDF prostřednictvím PS4. Hostitelská buňka E. coli použitá v tomto příkladu je uložena ve sbírce ATCC pod přírůstkovým číslem 69717 (datum uložení: 30. 11. 1994).

Hostitel, E. coli ATCC č. 69717, byl transformován plasmidem pAMGll-r-HuMGDF a buňky byly pěstovány podle následujícího fermentačního předpisu: Kmen E. coli se inoku103 luje.do půdy Luria a potom se smés asi 12 hodin inkubuje při 30’C. Buňky se za aseptických podmínek přenesou do fermentoru, který obsahuje vsázku média (kvasinkový extrakt

- 20 g/litr, kyselina citrónová - 3,4 g/litr, hydrogenfosforečnan draselný - 15 g/litr, Dow P2000 - 15 ml, glukosa

- 5 g/litr, heptahydrát síranu hořečnatého - 1 g/litr, stopové kovy - 5,5 ml/litr a vitaminy - 5,5 ml/litr). Ve vsázkové kultivaci se pokračuje tak dlouho, dokud jednorázová kultura nedosáhne optické density 5,0 ± 1,0 při 600 nm. Potom se zahájí fermentační fáze fed-batch, přičemž se nejprve přivádí první dodávané médium obsahující glukosu (70 g/litr) a heptahydrát síranu hořečnatého (6,75 g/litr). Rychlost dávkování se přizpůsobuje každé 2 hodiny podle předem stanoveného rozvrhu. Druhé dodávané médium obsahující tryptikasový pepton (129 g/litr) a kvasinkový extrakt (258 g/litr) se začne dávkovat, když kultura dosáhne optické density 20 až 25 při 600 nm. Průtoková rychlost druhého dodávaného -média se udržuje na konstantní hodnotě a pokračuje se v přizpůsobování prvního dodávaného média. Teplota během celé fermentace se udržuje přibližně na hodnotě 30°C a . jej i hodnota pH se udržuje na asi 7 přidáváním kyseliny nebo báze podle potřeby. Požadovaná hladina rozpuštěného kyslíku se udržuje úpravou rychlosti míchání, přívodu vzduchu a přívodu kyslíku do fermentoru. Když optická densita kultury dosáhne 57 až 63 při 600 nm, zahájí se přidávání třetího dodávaného média. Třetí dodávané médium (laktosa - 300 g/litr) se do fermentoru uvádí konstantní průtokovou rychlostí; uvádění prvního dodávaného média se přeruší a , rychlost přivádění druhého dodávaného média se upraví na ---------- novou -konstantní„hodnotu. Fermentace trvá přibližně .10. hodin od zahájení přívodu třetího dodávaného média. Na konci fermentace se kultura ochladí na 15 ± 5’C a buňky se sklidí centrifugací. Výsledná pasta se shromáždí a uloží při teplotě nižší než 6Ó°C.

104

Purifikace rekombinantního MGDF produkovaného v E. coli, popsaného výše, byla provedena takto: buněčná pasta (1800 g) byla suspendována přibližně v 18 litrech lOmM EDTA a suspenze byla zpracována ve vysokotlakém homogenizéru za tlaku 103 MPa. Suspenze rozbitých buněk byla odsředěna a peleta byla resuspendována v 10 litrech lOmM EDTA. Následovala nová centrifugace suspenze a získaná 200g peleta byla solubilízována ve 2 litrech lOmM Tris, 8M hydrochloridu guanidinu, lOmM DTT, 5mM EDTA o pH 8,7. Tento roztok byl pomalu zředěn převedením do 200 litrů lOmM CAPS, 3M močoviny, 30¾ glycerolu, 3mM cystaminu a lmM cysteinu o pH 10,5.

Zředěný roztok byl 16 hodin pomalu míchán při teplotě místosti a poté bylo pH upraveno na hodnotu 6,8. Roztok s upravenou hodnotou pH byl vyčiřen a nanesen na dvoulitrový sloupec CM Sepharose ekvilibrovaný s lOmM fosforečnanem sodným, 1,5M močovinou a 15% glycerolem o¹ pH 6,8. Po naneseni byl sloupec promyt lOmM fosforečnanem sodným a 15% glycerolem o pH 7,2. MGDF byl eluován gradientem chloridu sodného od 0 do 0,5M a lOmM fosforečnanem sodným o pH 7,2.

CM eluát byl zkoncentrován a pufr byl vyměněn za lOmM fosforečnan sodný o pH 6,5 za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000. Na koncentrovaný roztok (asi 2 mg/ml) bylo působeno cathepsinem C (500 až 1M) po dobu 90 minut při teplotě okolí.

Potom byl roztok nanesen na l,21itrový sloupec pro HPLC (SP High Performance Sepharose) ekvilibrovaný s lOmM fosforečnanem sodným, 15% glycerolem o pH 7,2. Po nanesení byl MGDF eluován za použití gradientu chloridu sodného (0,1 až 0,25M) a lOmM fosforečnanu sodného o pH 7,2.

105

K eluátu ze sloupce SP High Performance byl přidán síran amonný až do 0,6M koncentrace. Eluát byl nanesen na 1,6litrový sloupec Phenyl Toyopearl ekvilibrovaný s lOmM sodným, 0,6M síranem amonným, pH 7,2. Pík MGDF byl eluován síranem amonným (gradient od 0,6 do 0M), fosforečnanem sodným (lOmM), pH 7,2.

* Eluát ze sloupce Phenyl Toyopearl byl zkoncentrován a pufr byl vyměněn, za lOmM Tris, 5% sorbitol, pH 7,5 za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000.

Příklad 15 ¹ In vivo biologické vlastnosti r-HuMGDF (E. coli. 1-163) .

*· · ' .

Byla zjišťována biologická účinnost r-HuMGDF (E. coli 1-163) připraveného způsobem popsaným v příkladu 14 na hlodavce. Normálním samicím myši Balb/c se po dobu 5 po době jdoucích dnů subkutánně podávají injekce se zvyšující se dávkou r-HuMGDF. Rozmezí dávkování bylo od 15 do 1500 μg/kg/den. 24 hodin po poslední injekci byly zvířatům odebrány krevní vzorky. Analýza krevních buněk byla provedena pomocí elektronického počítače buněk Sysmex (Baxter). Při logaritmicky se zvyšující koncentraci cytokinu byl pozorován lineární nárůst počtu krevních destiček. Při dávkování 1 500 pg/kg/den se v tomto systému počet krevních destiček zvýšil na 300 % počáteční hodnoty (základní linie). Jiné parametry krevních buněk, jako je počet bílých nebo

.... ..........— červených buněk .nebo .hematokrit, nebyly, při, .tomto ošetření.

ovlivněny.

Krysám, kterým byla po dobu 6 dnů podávána dávka r-HuMGDF (E. coli 1-163) 300 μς^^/άβη byly odebrány krevní destičky a tyto krevní destičky byly podrobeny zkoušce na

106 schopnost agregace v odpovědi na ADP. Zjištěná data ukazují, že destičky od ošetřených zvířat v podstatě nelze odlišit od destiček kontrolních zvířat, poněvadž obě populace jsou stejně citlivé vůči agonistovi krevních destiček, ADP.

r-HuMGDF byl také hodnocen na schopnost odstranit thrombocytopenii spojenou s chemoterapií a/nebo ozařováním. Při této studii bylo použito carboplatinu, což je chemoterapeutikum vyvolávající hlubokou thrombocytopenii u člověka. Na počátku studie byla myším Balb/c subkutánní injekci podána dávka 1,25 mg carboplatinu. Po 24 hodinách začaly být myši léčeny r-HuMGDF (E. coli 1 - 16 3) nebo excipientem v denní dávce 100 μ9Α9/άβη, až do dokončení studie. Devátý den poklesl počet krevních destiček u myší léčených excipientem přibližné na 15 % normální hodnoty, zatímco u myší léčených r-HuMGDF zůstal počet krevních destiček na úrovni základní linie‘(viz obr. 20).

Při studiích s ozařováním byly myši podrobeny jedné dávce gamma záření (z cesiového zdroje, 500 rad). Jedná se o sublethální. dávku, která má za následek 90% snížení počtu krevních destiček do 11. dne. Počet krevních destiček se do 21. dne nevrátil na normální hodnotu. Když byl ozařovaným myším od prvního do 20. dne podáván r-HuMGDF (E. coli Γ-163) jednou denně v dávce 100 μg/kg/den, nebyl pokles počtu krevních destiček tak dramatický a návrat na hodnotu odpovídající základní linii byl rychlejší než u myší léčených excipientem (viz obr. 21).

Pro vyzkoušení aktivity r-HuMGDF za použití modelu extrémní a dlouhodobé thrombocytové cytopenie, bylo podání carboplatinu a ozařování aplikováno v kombinaci (obr. 22).

Za těchto okolností poklesl počet krevních destiček na extrémně nízkou hodnotu (3 až 5 % normální hodnoty) a většina zvířat (7 z 8) toto ošetření nepřežila. Když se

107 však byla těmto zvířatům každý den po celou dobu studie podávána subkutánní injekce r-HuMGDF v dávce 100 μ9Α9/άβη, thrombocytopenie byla významně potlačena, návrat na hodnotu odpovídající základní linii byl rychlejší a všechny zvířata léčená r-HuMGDF (8/8) přežila.

r-HuMGDF byl také zkoušen na opicích rhesus.

Normálním opicím rhesus byl subkutánní injekcí podáván r-HuMGDF v dávce 2,5 nebo 25 μ9Ας/άβη, celkem po dobu 10 dnů (den o až 9). U skupiny s nižší podávanou dávkou se * počet krevních destiček v den 12 zvýšil o 400 % a u skupiny s vyšší podávanou dávkou činilo toto zvýšení 700 %, také v den 12. Po ukončení injekčního podávání se počty krevních destiček vrátily na normální hodnotu do dne 25 až 30. Výše popsaným ošetřením nebyl ovlivněn počet bílých a červených krvinek.

r-HuMGDF (E. coli 1-163) byl také zkoušen na primátech s prudkou'thrombocytopenií (obr. 23). Modelová zvířata byla ozářena (dávkou 700 rad z kobaltového zdroje), což mělo za následek pokles počtu krevních destiček v den, 15 * na 1 až 2 % normální hodnoty. Do dne 35 až 40 se počet ' . krevních destiček vrátil na normální hodnotu. Naproti tomu počet krevních destiček u ozařovaných zvířat léčených každý den rHu-MGDF v dávce 25 μg/kg/.den klesl jen na 10 % normální hodnoty a v průměru nebyl nižší než 20 000/μ1, což je mezní ** hodnota, při níž se u humánních pacientů postižených ’ thrombocytopenií zahajuje transfuze krevních destiček.

U zvířat léčených r-HuMGDF byl také návrat na základní - —- - hodnotu-rychlejší; této-hodnoty bylo dosaženo v den-20— . .

Výše uvedená in vivo data ze studiín a hlodavcích a primátech plné podporují předpoklad, že rHuMGDF (E. coli 1-163) je účinným terapeutickým činidlem se schopností významně ovlivnit klinicky relevantní thrombocytopenie.

108

Příklad 16

Způsob produkce r-HuMGDF 1-332 v kultuře buněk chcP

Glykosylovaný r-HuMGDF 1-332 je produkován transfekovanými buňkami ovárií čínského křečka exprimujícími cDNA pro MGDF 1-332 pod kontrolou vhodného promotoru a s připojením ke genu kódujícímu amplifikovatelný selekční markér DHFR. Vhodným promotorem pro expresi MGDF.v buňkách CHO je

J

SRa (viz Mol. Cell. Biol. 8: 466 až 472 (1988) a WO 91/13160 (1991)). Vhodným vektorem pro expresi MGDF v buňkách CHO je pDSRa2 (viz WO 90/14363 (1990)). Příkladné .buněčné linie CHO jsou schopny produkovat sekretovaný MGDF ve standardním médiu pro buněčné kultury v množství v rozmezí) od 10 do 20 mg/litr. Toto množství je však možno zvýšit na 25 až 100 či více mg/litr. Pro produkci MGDF za použití typické buněčné linie je možno kulturu expandovat pasážováním v suspenzi nebo v nádobách pro tkáňové kultury·způsobem adherentního růstu za použití média, které zahrnuje stejná množství Dulbeccem modifikovaného'Eaglova média (DMEM) a Hamova média. F12 (DMEM/F12, Gibco). Použité médium může být doplněno 5 až 10 % fetálního hovězího séra (FBS) nebo dialyzovaného fetálního hovězího séra a methotrexatem (MTX) (pokud je ho zapotřebí, bývá typická koncentrace 'MTX 200 až 600nM) za účelem udržení selekčního tlaku. Toto médium by mělo být doplněno přídavnými neesenciálními aminokyselinami (NEAA) a glutaminem. Suspenzní kultury snadno propagují v rozmezí od inokulačních denzit 1 až 4 x ΙΟ^ buněk/ml. Při maximální densitě asi 1 x 10⁶ buněk/ml se . kultury expandují zředěním do většího objemu s počáteční hodnotou density krevních destiček při specifikované hodnotě inokulační density.

i

Má-li se MGDF produkovat v převalovaných láhvích, musí se vhodný objem suspenzní kultury o vhodné densitě

109 buněk vytvořit za použití buď magneticky míchaných rotačních nádob umístěných v prostředí s regulovanou teplotou (37 ± 1°C) nebo bioreaktoru typu míchané nádrže opatřené příslušnými měřicími a regulačními prvky. Převalované láhve (jako například láhve typu Falcon o objemu 850 cm³) je třeba zaočkovat na počáteční hustotu 1,5 až 3 χ 10⁷ buněk, počítáno na láhev a doplnit přídavným růstovým médiem (DMEM/F12 s 5 až 10 % FBS, IX NEAA a IX L-glutaminem) v množství vhodném pro vytvoření konfluentní monovrstvy během 3 až 4 dnů (150 až 300 ml/láhev). Růstové médium by mělo být zpočátku pufrováno hydrogenunličitanem sodným na pK 6,9 až 7,2 v rovnováze s oxidem uhličitým o parciálním tlaku 8 kPa až 12 kPa. Láhve by měly být zaplyněny směsí 10% oxidu uhličitého ve vzduchu a po upevnění v převalovacím zařízení 3 až 4 dny převalovány při teplotě 37 ± 1*C a frekvenci otáčení asi 1 min^-1. Po dosažení konfluence by mělo být v lahvích médium vyměněno za produkční médium neobsahující sérum. To lze provést vylitím nebo odsátím růstového média, promytím lahví isotonickým pufrem, jako je Dulbeccův fosfátem pufrovaný roztok chloridu sodného (D-PBS), v množství 50 až 100 ml/láhev a potom přidáním vhodného objemu hydrogenuhliČiη taném pufrovaného, séraprostého média DMEM/F12 (1 : 1) (200 až 300 ml/láhev) doplněného NEAA a L-glutaminem, jakož i síranem méďnatým, za účelem minimalizace kovalentní agregace (1 až 20μΜ). Láhve by měly být zaplyněna 10% oxidem uhličitým ve vzduchu a inkubovány při 37 + 1*C v převalovacím zařízení otáčejícím se s frekvencí 1 min¹ po dobu 6 + 1 dnů nebo tak dlouho, dokud metabolická aktivita nesníží koncentraci glukosy na hodnotu nižší než 0,5 mg/litr a/nebo hodnotu pH pod 6,6. Zpracované médium se může sklidit vylitím nebo aspirací z lahvi a nahradit čerstvým séraprostým produkčním médiem popsaným výše, za účelem dalších sklizní. Tento postup se může provádět tak dlouho, až již buňky nejsou schopny pokračovat v produkci v séruprostém prostředí a vytékají z převalovaných láhví.

110

Sklizené zpracované médium je možno purifikovat mikrofiltrací se slepým koncem za použití filtru o rozměru póru 0,45 μπι a/nebo 0,2 μπι (Sartorius Sartobran pH nebo Pall). Přefiltrované zpracované médium je třeba zchladit na 4°C a potom bud dočasně uložit při teplotě 4’C nebo ihned zkoncentrovat a dialyzovat na nízkou iontovou sílu za použití ultrafiltračního systému s příčným tokem (například Filtron YM-50). Ultrafiltrace a diafiltrace by se měla provádět při 4’C za účelem minimalizace rozkladu proteinu. Před stupni chromatografické purifikace by zpracované médium mělo být dialyzováno proti pufrovanému vodnému roztoku (například lOmM fosforečnanu draselnému o pH 6,8).

Kvalitu produktu ve zpracovaném médiu je možno nejlépe monitorovat za použití analýzy neredukující SDS-PAGE Western Blot. Touto analýzou se mohou zjistit relativní množství agregovaných, monomerních a proteolyticky degradovaných MGDF ve vzorcích.

Další způsob produkce MGDF z buněk CHO spočívá v adaptaci buněčné linie exprimující MGDF na séraprosté médium, jako je Gibco S-SFM II. Buňky je možno adaptovat sériovým pasážováním v médiu, které obsahuje malé přídavky séra nebo sérum vůbec neobsahuje. Když se zjistí, že buněčná linie dobře roste v takovém médiu a produkuje vhodná množství vyloučeného MGDF, může se v produkci pokračovat tak, že se sériovým pasážováním inokulační kultura převede do většího měřítka s větším objemem kultury a vznikou kulturou se zaočkuje vhodná produkční nádoba (například míchaný nádržový bioreaktor opatřený měřícími a regulačními prvky). Kultura se může nechat růst až do maximální density zajišťující životaschopnost za optimálních růstových podmínek (pH, živiny, teplota, kyslík, smykové míchání).

V optimální fázi produkce (kterou lze zjistit experimentálně na základě stanovení kvantity a kvality produktu) je možno ^a4·· -K

111 kulturu z bioreaktoru sklidit a buňky lze odstranit ze zpra covaného média hloubkovou filtrací (řádově mikronovou) nebo submikronovou mikrofiltrací s příčným tokem. Pokud se použije hloubkové filtrace, mělo by být médium dále vyčiřeno submikronovou filtrací se slepým koncem a teprve potom podrobeno koncentraci a dialýze, jak je to popsáno výše.

Vynález byl popsán jak obecně, tak na svých přednostních provedeních. Do rozsahu vynálezu však spadají i nejrůznější obměny a modifikace, které jsou odborníci v tomto oboru schopni provést na základě výše uvedeného popisu. Následující patentové nároky pokrývjí také všechny výše uvedené modifikace.

Všechny výše uvedené citace osvětlující oblast vynálezu a dosavadní stav techniky jsou zde citovány náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu jejich celého vynálezu.

- 112 SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Bartley, Tímothy D.

Bogenberger, Jakob M. Bosselman, Robert A. Hunt, Pamela Kinstler, Olaf, B.

Samal, Babru B.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Composition and Methods for

Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation (Látky a způsoby pro stimulaci růstu a diferenciace megakaryocytů) (iii) POČET SEKVENCÍ: 34 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Amgen lne.,
(B)	ULICE:	1840 Dehavilland Drive
(C)	MĚSTO:	Thousand Oaks
(D)	STÁT:	Kalifornie
(E)	ZEMĚ:	USA
(F)	PSČ:	91320-1789 (ZIP)

(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verze #1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:

(viil) INFORMACE O PATENTOVÉM ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Cook, Robert R.

(C) SPISOVÁ ZNAČKA: A-290-C

-Ί../·’ a ’φ; .>·&.. > S .1· i,.

_Tl x/

- . -r.*

113 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

Ala Pro Pro Ala Xaa	Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp
1	5	10	15
Ser His Val	Leu His	Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro	Asp Ile Tyr
	20	25	30

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec t

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg A3p 1.5 10 15

Ser His Val Leu His 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina .

(C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

114

Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 1 5 10 ⁵

Leu (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 bázových páru (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

GCNCCNCCNG CNTGYGA 17 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: T (A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ÍÍ) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein . **·

--- --/c-i- ί / .·τ --i

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Ala pro Pro Ala Cys Aap Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 1 5 ..10 ¹⁵

Ser His Val Leu His ' ”· ’’ · - - ' ' ^: (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

fr

AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21 í

- - * (2) INFORMACE O SEQ -I D NO: 9:--------------- . .. ...........

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina * (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární : Τ' I* V 'Aik' áí 1,4*···

116 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTT 29 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20 «

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů < .· (B) TYP: nukleová kyselina ¹ (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec

(D)	TOPOLOGIE: lineární		-
(ii) TYP	MOLEKULY: cDNA
			; ·,· '
			r-,ιΐ' . r* ·· Arr,
		: x7· '.*·: ’’ :ϊ’ -/:.-·«’*: ..v*···? • Λ.·'·.. . J.·Λ··>. +.<··*-' ;·;	'· ·· :* ť .
		* ‘.“‘Li • 3·· / '. · . -	ř Ji· ií ; ;

117 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina * (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární »· (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20.

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (íi) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

CCTTTACTTC TAGGCCTG 18 (2) INFORMACE 0 SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina * (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

GAGGTCACAA GCAGGAGGA

118 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

GGCATAGTCC .GGGACGTCG 19 .(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:,

TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) INFORMACE 0 SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D> TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:18:

CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19

119 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

Š (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

> CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina t

(C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA , (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:

GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

GCARTGYAAN ACRTGNGART C

120 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22: *

TTGGTGTGCA CTTGTG ’ 16 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA ·!?* y (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23: ζ

CACAAGTGCA CACCAACCCC 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1342 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec f (D) TOPOLOGIE: lineární

At (ii) TYP MOLEKULY: cDNA........ * (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 99..1094 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGAČTGAA TTGCTCCTCG 60

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC ČCG GČT CCT.'CCT-- j,;.; ·. 113

Secj-Pro Ala Pro Pro ...

' i...-· : ' 5 < ·

121

GCT Ala

TGT GAC CTC CGA GTC

CTC AGT AAA

CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC

161

Cys Asp Leu

Arg 10

Val

Leu

Ser

Ly3

Leu 15

Leu Arg Asp

Ser

His 20

Val

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

209

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

L V 4

25

' 30

35

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC .

257

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Ly3

Thr

40

45

50

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

305

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

55

60

65

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

.353

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

70

75

80

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

90

95

100

i»·

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

44 9

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

γ

105

110

115

1

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

497 .

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

120

125

130

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

545

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

135

140

145

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

593

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

150

155

160

165

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG -

641

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

170

175

180

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

. 689

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

185

190

195

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

AAC ..

737

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

200

205

210

. ; ::

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA .

785

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

215 220 225

122

CAC GAA CTC

TTG AAT GGA

ACT Thr

CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC

833

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Arg

Gly

Leu Phe Pro 240

Gly Pro

Ser Arg 245

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GKC

ATT

TCC

TCA GGA ACA

TCA GAC

ACA GGC

881

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser Gly Thr

Ser Asp

Thr Gly

250

255

260

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT TCT CCT

TCC CCA

ACC CAT

929

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr Ser Pro

Ser Pro

Thr His

265

270

275

CCT

cct

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT CTT CCA

CCC ACC

TTG CCC

977

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro Leu Pro

Pro Thr

Leu Pro

280

285

290

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT CCT GAC

CCT TCT

GCT CCA

1025

Thr

Pro

Val

val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu Pro Asp

Pro Ser

Ala Pro

295

300

305

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC ACA TCC

TAC ACC

CAC TCC

1073

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

A3n Thr Ser

Tyr Thr

His Ser

310

315

320

325

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA

1124

Gin

Asn

Leu

.Ser.

Gin..Glu.

Gly

330

TTGTCTCGTG	TACAGCTCCC	TTCCCTGCAG'	GGCGCCCCTG	GGAGACAACT	GGACAAGAT.T	1184
TCCTACTTTC	TCCTGAAACC	CAAAGCCCTG	GTAAAAGGGA	TACACAGGAC	TGAAAAGGGA e·	1244
ATCATTTTTC'	ACTGTACATT	ATAAACCTTC.	AGAAGCTKTT	TTTTTAAGCT	’ATCAGCAATA	1304
CTCATCAGAG	CAGCTAGCTC	TTTGGTCTAT	TTTCTGCA			1342

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 332 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(xi)	POPIS	SEKVENCE:-	SEQ ID	NO:25:
Ser 1	Pro Ala	Pro Pro 5	Ala Cys Asp	Leu Arg 10	Val Leu Ser Lys Leu' Leu 15
Arg	Asp Ser	His Val 20	Leu His Ser	Arg Leu 25	Ser Gin Cys Pro Glu Val 30
His	Pro Leu 35	Pro Thr	Pro Val Leu 40	Leu Pro	Ala Val Asp Phe Ser Leu 45

123

	Gly	Glu Trp Lys 50	Thr	Gin	Met 55	Glu	Glu
	Gly 65	Ala	Val	Thr	Leu	Leu 70	Leu	Glu	Gly
	Leu	Gly	Pro	Thr	Cys 85	Leu	Ser	Ser	Leu
	Val	Arg	Leu	Leu 100	Leu	Gly	Ala	Leu	Gin 10S
	Pro	Pro	Gin 115	Gly	Arg	Thr	Thr	Ala 120	His
	Leu	Ser 130	Phe	Gin	His	Leu	Leu 135	Arg	Gly
	Val 145	Gly	Gly	Ser	Thr	Leu 150	Cys	Val	Arg
	Val	Pro	Ser	Arg	Thr 165	Ser	Leu	Val	Leu
	Arg	Thr	Ser	Gly 180'	Leu	Leu	Glu	Thr	Asn 185
	Thr	Gly	Ser 195	Gly	Leu	Leu	Lys	Trp. 200	Gin t
	Pro	Gly 210	Leu	Leu	Asn	Gin	Thr 215	Ser	Arg
	Tyr 225	Leu	Asn	Arg	Ile	His 230	Glu	Leu	Leu
	Pro	Gly	Pro	Ser	Arg 245	Arg	Thr	Leu	Gly
	Thr	Ser	Asp	Thr 260	Gly	Ser	Leu	Pro	Pro 265
	Pro	Ser	Pro 275	Thř	His	Pro	Pro	Thr 280	Gly
	Pro	Pro 290	Thr	Leu	Pro	Thr	Pro 295	Val	Val
	Asp 305	Pro	Ser	Ala	PrO	Thr 310	Pro	Thr	Pro
	Ser	Tyr	Thr	His	Ser	Gin	Asn	Leu	Ser

325

Lys	Ala 60	Gin	Asp	Ile	Leu
Met 75	Ala	Ala	Arg	Gly	Gin 80
Gly	Gin	Leu	Ser	Gly 95	Gin
Leu	Leu	Gly	Thr 110	Gin	Leu
Asp	Pro	Asn 125	Ala	Ile	Phe.
Val	Arg 140	Phe	Leu	Met	Leu
Ala 155	Pro	Pro	Thr	Thr	Ala 160
Leu	Asn	Glu	Leu	Pro 175	Asn
Thr	Ala	Ser	Ala 190	Arg	Thr
Gly	Phe	Arg 205	Ala	Lys	Ile
Leu	Asp 220	Gin	Ile	Pro	Gly
Gly 235	Thr	Arg	Gly	Leu	Phe 240
Pro	Asp	Ile	Ser	Ser 255	Gly
Leu	Gin	Pro	Gly 270	Tyr	Ser
Tyr	Thr	Leu 285	Phe	Pro	Leu
Leu	His	Pro	Leu	Leu	Pro

300-.-..

Ser Pro	Leu Leu Asn Thr
315	320

Glu Gly * . _ »tr< a·

-í. Τ’·' ''.*· *+

124 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1342 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 99,.621 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGÓA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC ..AGC. CCG. GCT,, CCT. .CCT. . 113

Set Pro Ala Pro Pro

5

GCT Ala

TGT GAC

CTC CGA Leu Arg 10

GTC Val

CTC AGT AAA CTG CTT' CGT.GAC TCC CAT GTC

161

Cys

Asp

Leu

Ser

Lys

Leu Leu 15

Arg

Asp

Ser

His 20

Val · v**

ctt

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC.

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

cct;

TTG '

CCT/

ACA.-’:

209

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro.

Glu

Val

His

Pro.

Leu

Pro

Thr

25

30

35

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

257

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

40’

45

50

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

, 305

Gin

Met·

Glu

Glu

Thr

Lye

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr'

Leu

55

60

65

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

353

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

70

75

60

-

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg Leu

Leu

Leu

90

. 95

100

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

,AGG

449

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

105

110

115

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

497

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

120

125

130

/ .

125

TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545

Leu Leu 135

Arg

Gly Lys

Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly

Ser Thr

140

145

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

ccc

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

593

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

150

155

160

165

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

C CAAACAGGAC TTCTGGATTG

641

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

170

TTGGAGACAA	ACTTCACTGC	CTCAGCCAGA	ACTACTGGCT	CTGGGCTTCT	GAAGTGGCAG	701
CAGGGATTCA	GAGCCAAGAT	TCČTGGTCTG	CTGAACCAAA	CCTCCAGGTC	CCTGGACCAA	761
n	ACCTGAACAG	GATACACGAA	CTCTTGAATG	GAACTCGTGG	ACTCTTTCCT	321
GGACCCTCAC	GCAGGACCCT	AGGAGCCCCG	GACATTTCCT	CAGGAACATC	AGACACAGGC	8Θ1
TCCCTGCCAC	CCAACCTCCA	GCCTGGATAT	TCTCCTTCCC	CAACCCATCC	TCCTACTGGA	941
CAGTATACGC	TCTTCCCTCT	TCCACCCACC	TTGCCCACCC	CTGTGGTCCA'	GCTCCACCCC	1001
CTGCTTCCTG	ACCCTTCTGC	TCCAACGCCC	ACCCCTACCA	GCCCTCTTCT	AAACACATCC	1061
TACACCCACT	CCCAGAATCT	GTCTCAGGAA	GGGTAAGGTT	CTCAGACACT	GCCGACATCA	1121
GCATTGTCTC	GTGTACAGCT	CCCTTCCCTG	CAGGGCGCCC	CTGGGAGACA	ACTGGACAAG	1181
ATTTCCTACT	TTCTCCTGAA	ACCCAAAGCC	CTGGTAAAAG	GGATACACAG	GACTGAAAAG	1241
GGAATCATTT	TTCACTGTAC	ATTATAAACC	TTCAGAAGČT	ATTTTTTTAA	GCTATCAGCA	1301
ATACTCATCA	GAGCAGCTAG	CTCTTTGGTC	TATTTTCTGC	A		1342

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 174 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina £ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(Xi)	l POPIS	SEKVENCE':	SEQ	ID	NO:27:
Ser 1	Pro Ala	Pro Pro 5	Ala Cys Asp	Leu	Arg 10	Val Leu Ser Lys Leu Leu 15
Arg	Asp Ser	His Val 20	Leu His Ser	Arg 25	Leu	Ser Gin Cy3 Pro Glu Val 30
His	Pro Leu 35	Pro Thr	Pro Val Leu 40	Leu	Pro	Ala Val Asp Phe Ser Leu 45

126

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Zle

Leu

50

55

t

60

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Giy

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

75

a

80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Aan

Ala

Ile

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

130

135

140

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

145

150

155

160

Val

Pro

Ser

Arg

. Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

165

170

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: .

(A) DÉLKA: 1164 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 97..894 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28: ^r

AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG .60 . . $

GTCATGCTTC-TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT - - .... - 114Ser Pro Ala Pro Pro Ala.' ’ i 5

TGT

GAC

ctc

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT CGT

GAC

TCC CAT

GTC CTT - ; - ..

162

Cys

Asp

Leu

Arg

val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu Arg

Asp

Ser His

Val Leu

10

15

20

. _ · - ' *

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT CAC

CCT.

TTG -CCT

ACA CCT.. .

.210

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val His

Pro

Leu „Pro

Mhr .'Pro

25

Λ

30

35 '

127

GTC CTG CTG CCT

GCT GTG

1 GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA

ACC Thr

CAG Gin

258

Val Leu Leu 40

Pro

Ala

Val

Asp Phe 45

Ser

Leu

Gly

Glu Trp 50

Lys

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

CTG

.306 ^

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

55

60

65

70

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

CTC

354

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

75

-

60

85

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC.

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

402

Ser

Ser

Leu.

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

100

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

ACC

450

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Glv Arg

Thr

105

110

115

ACA

GCT

CAC

AAG

•GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

498

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

120

125

130

CTC

CGA

GGA

AAG

GAC

TTC

TGG

ATT

GTT

GGA

GAC

AAA

CTT

CAC

TGC

CTC

546

Leu

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

Ile

Val

Gly

ASp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

135

140

145

150

AGC

CAG

AAC

TAC

TGG

CTC

TGG

GCT

TCT

GAA

GTG

GCA

GCA

GGG

ATT

CAG

594

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Val

Ala

Ala

Gly

ile

Gin

155

160

165

i

AGC

CAA

GAT

TCC

TGG

TCT

GCT

GAA

CCA

AAC

CTC

ČAG

GTC

CCT

GGA

CCA

642

Ser

Gin

Asp

Ser

Trp

Ser

Ala

Glu

Přo

Asn

Leu

Gin

Val

Pro

Gly

Pro

170

175

180

AAT

ccc

CGG

ATA

CCT

GAA

CAG

GAT

ACA

CGA

ACT

CTT

GAA

TGG

AAC

TCG

690

Asn

Pro

Arg

Ile

Pro

Glu

Gin

Asp

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu

Trp

Asn

Ser

185

190

195

TGG

ACT

CTT

TCC

TGG

ACC

CTC

ACG

CAG

GAC

CCT

AGG

AGC

CCC

GGA

CAT

738

Trp

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

ASp

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

200

205

210

TTC

CTC

AGG

AAC

ATC

AGA

CAC

AGG

CTC

CCT

GCC

ACC

CAA

CCT

CCA

GCC

'786

„Phe

Leu

Arg

Asn

Ile

Arg

His

Arg

.Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala

215

220

22'5

230 '

TGG

ATA

TTC

TCC

TTC

CCC

AAC

CCA

TCC

TCC

TAC

TGG

ACA

GTA

TAC

GCT S

834

Trp

Ile

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

Tyr

Trp

Thr

Val

Tyr

Ala-

235

240

245

CTT

CCC

TCT

TCC

ACC

CAC

CTT

GCC

CAC

CCC

TGT

GGT

CCA

GCT

CCA

ccc

· -682

Leu

Pro

Ser

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

Cys

Gly

Pro

Ala

Pro

Pro/·

250

255

260

128

CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT 931

Pro Ala Ser

265

CTAAACACAT	CCTACACCCA	CTCCCAGAAT	CTGTCTCAGG	AAGGGTAAGG	TTCTCAGACA	991
CTGCCGACAT	CAGCATTGTC	TCGTGTACAG	CTCCCTTCCC	TGCAGGGCGC	CCCTGGGAGA	1051
CAACTGGACA	AGATTTCCTA	CTTTCTCCTG	AAACCCAAAG	CCCTGGTAAA	AGGGATACAC	1111
aggactgaaa	AGGGAATCAT	TTTTCACTGT	ACATTATAAA	CCTTCAGAAG	ČTA	1164

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 265 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY.: protein

(

xi)

POP

'IS

SEKVENC

E: SEQ

ID NO: 2

19:.

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

. 1

5

»

10

15

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val·

20

25

30

His.

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

50

55

60

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

*

75

-80 ·.

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin'

Leu

100

1-05

110

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Ásp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

Ile

Val

Gly

130

135

140

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

145

150

155

160

Val

Ala

Ala

Gly

Ile

Gin

Ser

Gin

Asp

Ser

Trp

Ser

LAla

Glu

Pro

Asn

165

170

175

129

Leu Gin

Val Pro 180

Gly

Pro Asn

Pro Arg Ile Pro Glu Gin Asp Thr Arg

185

190

Thr

Leu

Glu

Trp

Α3Π

Ser

Trp

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

Asp

1

195

200

205

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

Phe

Leu

Arg

Asn

ile

Arg

His

Arg

Leu

Pro

210

215

220

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala

Trp

Ile

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

225

230

235

240

Tyr

Trp

Thr

Val

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

245

250

255

4

CyS

Gly

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

Ser

260

265

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární $ (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:31:

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24

130 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 80 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:32:

CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT. TCTTGATTAA TATTCTCAAT TGTGAGCGCT CACAATTTAT (2) INFORMACE O SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 86 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:33:

CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA

TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT (2)’ INFORMACE O SEQ ID NO:34:

’ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: * (A) DÉLKA: 89 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina _f(C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

131 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:34:

GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC

TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT . ‘^; '

ZJC		O
r-'	Ol	Ξζ	c-
32	—4 - S		>
	Γί	c	σ
	—!	< JTH
	<
		C

	o
	</*
	r~
CD *	O
cr>

ic n<

QC

CT.

i cn

Claims (44)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. MGDF polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci látky zvolené ze souboru zahrnujícího MGDF-4, MGDF-5,

   MGDF-6, MGDF-7 a MGDF-8.
2. 2. Izolovaný polynukleotid kódující MGDF polypeptid podle nároku 1.
3. 3. Izolovaný polynukleotid podle nároku 2, kterým je sekvence DNA.

   Sekvence DNA podle nároku 3, kterou je sekvence

   CDNA.
4. 5. Sekvence cDNA podle nároku 4 vykazující odpovídající sekvenci, jak je znázorněna na obr. 11 nebo 12.
5. 6. ’ DNA vektor obsahuj ící DNA sekvenci podle: nároku 47. Vektor podle nároku 6, v němž je sekvence DNA operativně připojena k sekvenci DNA řídící expresi.
6. 8. Hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekovaná sekvencí DNA podle nároku 4.

   »
7. 9. Hostitelská buňka podle nároku 8 exprimující

   MGDF polypeptid kódovaný sekvencí DNA. '
8. 10. Způsob produkce MGDF polypeptidu, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka podle nároku 9 pěstuje ve vhodném živném médiu a z buněk nebo z živného média se izoluje MGDF polypeptid.

   133
9. 11. Způsob produkce MGDF polypeptidů podle nároku 10, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka E. coli.
10. 12. Způsob produkce MGDF polypeptidů podle nároku 10, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka CHO.
11. 13. Protilátka reaktivní vůči MGDF polypeptidů ** podle nároku 1.
12. 14. Monoklonální protilátka podle nároku 13.
13. 15. Rekombinantní protilátka podle nároku 13.
14. 16. MGDF derivát zahrnující MGDF polypeptid připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru.

    ’ ·
15. 17. MGDF. derivát podle nároku 16, kde MGDF polypeptid je zvolen ze souboru zahrnujícího MGDF-1, MGDF-2, MGDF-4, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 a MGDF-15.

    f
16. 18. MGDF derivát podle nároku 16, kde MGDF polypeptid je rekombinantně produkován v bakteriální buňce.
17. 19. MGDF derivát podle nároku 16, kde vodorozpustný polymer je farmaceuticky vhodný.

    f
18. 20. MGDF derivát podle nároku 16, kde vodorozpustný polymer je zvolen ze souboru zahrnujícího dextran, .poly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykoly, homopolymery propylenglykolu, kopolymery propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylované polyoly, polyvinylalkoholy a jejich směsi.

    134
19. 21. MGDF derivát podle nároku 16, kde vodorozpustným polymerem je polyethyle^jlykol. I
20. 22. MGDF derivát podle nároku 21, kde polyethylenglykolem je monomethoxypolyethylenglykol.
21. 23. MGDF derivát podle nároku 21, kde polyethylenglykol je připojen k MGDF polypeptidu acylovou nebo alkylovou vazbou.
22. 24. MGDF derivát podle nároku 23, kde polyethylenglykolová skupina je připojena k N-konci.
23. 25. MGDF derivát podle nároku 23, kde polyethylenglykolová skupina má průměrnou molekulovou hmotnost 10 až 50 kDa.
24. 26. MGDF derivát podle nároku 16, obsahující MGDF polypeptid kovalentně připojený ke dvěma molekulám vodorozpustného polymeru.
25. 27. MGDF derivát podle nároku 26, kde oběma molekulami vodorozpustného polymeru jsou polyethylenglykolové molekuly.
26. 28. Způsob spojování vodorozpustného polymeru s MGDF polypeptidem za vzniku MGDF derivátu podle nároku 16, přičemž vodorozpustný polymer obsahuje reaktivní aldehydovou skupinu, vyznačuj ící ’š e t í m , že se terminální aldehydový derivát polyethylenglykolu nechá reagovat s MGDF polypeptidem za přítomnosti redukčního činidla a izoluje se MGDF polypeptid připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru.

    135
27. 29. Způsob spojování vodorozpustného polymeru s MGDF polypeptidem za vzniku MGDF derivátů podle nároku 16, přičemž vodorozpustný polymer obsahuje jednu reaktivní aldehydovou skupinu, vyznačující se tím že se

    a) MGDF polypeptid uvede do styku s vodorozpustným . polymerem za podmínek redukční alkyláce při hodnotě pH, která je dostatečně kyselá, aby byla α-aminoskupina u amino í vého konce MGDF polypeptidů reaktivní a

    b) izoluje se MGDF polypeptid připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru.
28. 30. Způsob spojování vodorozpustného polymeru s MGDF polypeptidem za vzniku MGDF derivátu podle nároku 16, přičemž vodorozpustný polymer Obsahuje jednu reaktivní esterovou skupinu, vyznačující se tím, žé se

    a) MGDF polypeptid. uvede do styku s vodorozpustným polymerem za podmínek, při nichž dochází k připojení MGDF polypeptidů k vodorozpustnému polymeru acylovou vazbou a

    b) izoluje se MGDF polypeptid připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru.

    *

    Λ
29. 31. Způsob podle některého z nároků 28 až 30,

    V vyznačující s e t í m , že polymer je farmaceuticky vhodný.
30. 32. Způsob podle některého z nároků 28 až 30, vyznačující se tím, že vodorozpustný polymer je zvolen ze souboru zahrnujícího dextran, póly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykoly, homopolymery

    136 propylenglykolu, kopolymery propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylované:polyoly a polyvinylalkoholy.
31. 33. Způsob podle některého z nároků 28 až 30, vyznačující se tím, že vodorozpustným polymerem je polyethylenglykol.
32. 34. Monopegylovaný MGDF polypeptid.
33. 35. Monopegylovaný MGDF polypeptid podle nároku 34, kde MGDF polypeptid je zvolen ze souboru zahrnujícího MGDF-1, MGDF-2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7,

    MGDF-8, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 a MGDF-15.
34. 36. Způsob spojování molekuly polyethylenglykolu s MGDF polypeptidem za vzniku monopegylovaného MGDF polypeptidu podle nároku 34, přičemž molekula polyethylenglykolu obsahuje jednu reaktivní aldehydovou skupinu, vyznáču. t - . - i Sír' . .

    jicisetim,zese

    a) MGDF polypeptid uvede do styku s molekulou polyethylenglykolu za podmínek redukční alkylace při hodnotě pH, která je dostatečně kyselá, aby byla α-aminoskupina u aminového konce MGDF polypeptidu reaktivní a

    b) izoluje se pegylovaný MGDF polypeptid.

    Λ
35. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačující # se tím, že MGDF polypeptid je vyroben odštěpením Met²-Lys^_1 z polypeptidu získaného expresí DNA kódující polypeptid obsahující aminokyseliny 22 až 184 z obr. 11 a sekvenci Met-Lys u jeho N-konce v buňkách E. coli.

    *
36. 38. Způsob podle nároku 36, vyznačující se t í m , že MGDF polypeptid je vyroben

    137

    a. expresí DNA kódující polypeptid obsahující aminokyseliny 22 až 184 z obr. 11 a sekvenci Met-Lys u jeho N-konce v buňkách E. coli,

    b. izolací exprimovaného polypeptidu a , c. odštěpením Met“²-Lys^-1 z izolovaného polypeptidu.
37. 39. Způsob podle nároku 33 nebo 36, vyznačující se tím, že polyethylenglykolová molekula má molekulovou hmotnost 2 až 100 kDa.
38. 40. Monopegylovaný MGDF polypeptidový produkt připravitelný způsobem podle nároku 36.
39. 41. V podstatě homogenní přípravek MGDF polypeptidu podle nároku 34, monopegylovaného na α-aminoskupině u N-konce MGDF polypeptidu.
40. 42. Přípravek podle nároku 41, kde MGDF polypeptid je monopegylován polyethylenglykolem o průměrné molekulové hmotnosti 5 až 50 kDa.
41. 43. Monopegylovaný MGDF polypeptid podle nároku 34, v němž je polyethylenglykolová skupina připojena k N-konci polypeptidu.

    A.
42. 44. Monopegylovaný MGDF polypeptid podle nároku 34, jehož složka MGDF polypeptidu je vyrobena v E. coli.
43. 45. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje MGDF derivát podle nároku 16 a farmaceuticky vhodné ředidlo, adjuvans nebo nosič.
44. 46. Farmaceutický jící se tím, že polypeptid podle nároku 34 adjuvans nebo nósič.

    prostředek, vyznačuobsahuje monopegylovaný MGDF a farmaceuticky vhodné ředidlo,