WO2009057831A1 - 核初期化方法 - Google Patents

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Shinya Yamanaka
Kazutoshi Takahashi
Masato Nakagawa
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Kyoto University
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    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing induced pluripotent stem cells by reprogramming differentiated somatic cells.
  • Embryonic stem cells are stem cells established from early embryos of humans and mice, and can be cultured for a long period of time while maintaining the pluripotency capable of differentiating into all cells present in the living body. It has the characteristics. Using this property, human ES cells are expected as a resource for cell transplantation for many diseases such as Parkinson's disease, juvenile 'f' diabetes, and leukemia. However, there is a problem that transplantation of ES cells may cause rejection similar to organ transplantation. In addition, there are many opinions against the use of ES cells established by destroying human embryos from an ethical perspective.
  • a patient's own differentiated somatic cell is used to induce dedifferentiation, and the ES cell is a cell that has V, pluripotency or proliferative ability (this cell is referred to herein as V If you can establish "induced pluripotent stem cells”, “embryonic stem cell-like cells”, or "ES-like cells J"), It is expected that it can be used as an ideal pluripotent cell.Recently, it has been reported that this iPS cell can be produced in mouse and human somatic cells, and it has received a tremendous response. Les, Ru (International Publication WO2007 / 69666; Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007)
  • the above method uses multiple specific factors (Cell, 126, pp. 663-676, 2006 use four factors, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc) in somatic cells. It includes a step of introducing and initializing, and retroviral vectors are used for the introduction of factors.
  • c-Myc is a cancer-related transcription factor.
  • Patent Document 1 International Publication WO2007 / 69666
  • Patent Document 2 International Publication WO2008 / 118820
  • Non-Patent Document 1 Cell, 126, pp. 663-676, 2006
  • Non-Patent Document 2 Cell, 131, pp. 861-872, 2007
  • Non-Patent Document 3 Science, 318, pp.1917-1920, 2007
  • An object of the present invention is to provide a method for producing safe induced pluripotent stem cells. More specifically, it is an object of the present invention to provide safe induced pluripotent stem cells that are free from the risk of tumorigenesis in cells and tissues obtained by inducing induced pluripotent stem cells. Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing induced pluripotent stem cells.
  • a particularly preferable subject of the present invention is to provide a method for efficiently producing the above-mentioned safe induced pluripotent stem cells.
  • the present inventors are concerned about the risk of tumor disease in cells and tissues obtained by inducing differentiation by performing nuclear reprogramming using L-Myc, Salll, or Sall4 without using c-Myc.
  • the present inventors have found that safe artificial pluripotent stem cells can be provided, and that this method can produce safe artificial pluripotent stem cells very efficiently.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a method for producing a somatic cell induced pluripotent stem cell comprising the following three genes: an Oct family gene, a Klf amylie gene, and a Sox family gene.
  • a method is provided that includes the step of introducing.
  • the cells acquire pluripotency And culturing the cells for a time sufficient to proliferate.
  • a method comprising the step of introducing the following three genes: Oct3 / 4, Klf4, and Sox2 into somatic cells; and the following three genes: Oct3 / 4, After introducing Klf4, and Sox2 into a somatic cell, a method is provided comprising culturing the cell for a time sufficient for the cell to acquire pluripotency and proliferate.
  • a viral vector containing an Oct family gene, a viral vector containing a Kl amylie gene, and a viral vector containing a Sox family gene are respectively used as separate packaging cells.
  • a step of obtaining three types of culture supernatants by transfecting and culturing the cells, and a mixture of the three types of culture supernatants obtained by the above steps were prepared.
  • Initialize cells There is provided a method as described above comprising the steps.
  • Another preferred embodiment of this method provides the above method comprising the step of reprogramming somatic cells without performing drug selection.
  • the above-described gene introduction can be performed in the absence or presence of site force-in as necessary, and preferably in the absence of site force-in.
  • the above-described culture can be performed in the absence or presence of site force-in, if necessary, and preferably in the absence of site force-in.
  • the present invention further provides a method for producing an induced pluripotent stem cell in which the occurrence of tumor is substantially reduced or eliminated by the cells and tissues obtained after differentiation induction, and includes the following three types: A gene comprising: a family gene, a KK7 Amilly gene, and a Sox family gene, preferably an Oct 3/4 gene, a Klf4 gene, and a Sox2 gene, are introduced into a somatic cell.
  • the present invention provides a method for producing induced pluripotent stem cells from somatic cells according to the present invention, which comprises a combination of the following two genes: Oct family gene and Sox family gene, or A combination of Oct family gene and Klf ⁇ Amyly gene and at least one gene selected from the following three genes: L-Myc, Salll, and Sall4 Is provided.
  • a combination of the following two genes Oct3 / 4 and Sox2, or a combination of the following two genes: 0 3/4 and Klf4;
  • the above method comprising the step of introducing into a somatic cell at least one gene of choice of three genetic forces: L-Myc, Salll, and Sall4.
  • a method comprising the step of introducing the following genes: Lin28 and Z or Nanog into a somatic cell in addition to the above gene is also preferred.
  • V. A mode, and a method comprising a step of introducing Lin28 into a somatic cell is more preferred. It is.
  • c-Myc can be used in appropriate combination as desired.
  • a combination of the following three kinds of genes Oct family gene, Sox family gene, and Kl 7 amilly gene, preferably 0 3 / 4.
  • a method as described above comprising the step of introducing into a somatic cell a combination of Sox2 and Klf4 and at least one gene selected from the following three gene forces: L-Myc, Salll, and Sall4.
  • the above method comprising the step of introducing the following four genes: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and Salll into somatic cells; the following four genes: Oct3 / 4
  • the method comprising the steps of introducing Sox2, Klf4, and Sal 14 into somatic cells; the method comprising introducing the following four genes: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and L-Myc into somatic cells
  • the above-mentioned method comprising the step of introducing the following five genes: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Salll, and L-Myc into somatic cells; the following five genes: Oct3 / 4, Sox2,
  • the above method including the step of introducing Klf4, Sall4, and L-Myc into somatic cells; including the step of introducing the following five genes: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Salll, and Sall4 into somatic cells
  • the above method comprising the above-mentioned method; and a step of introducing the following six genes:
  • the somatic cell is preferably a human somatic cell.
  • a method further comprising the step of introducing Lin28 into somatic cells is also provided by the present invention, and preferred embodiments include Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L-Myc, and There is provided the above method comprising the step of introducing U n28 into a somatic cell.
  • the present invention further provides a method for producing an induced pluripotent stem cell that has been eliminated and eliminated in the cells and tissues obtained after differentiation induction, with substantially reduced tumor development.
  • Oct family gene and Sox family gene preferably Oct3 / 4 and Sox2, and at least one gene selected from the following three genes: L-Myc, Salll, and Sall4
  • a method comprising the step of introducing into In this method, a method further comprising a step of introducing a KK family gene such as K into a somatic cell is also a preferred embodiment, and Lin28 is introduced into the somatic cell together with or in place of the Klf amyly gene.
  • a method including a step is also preferred! /.
  • a method of producing induced pluripotent stem cells from somatic cells The following 6 genes: Oct family gene, Kl Amilly gene, Sox family gene, Myc family gene, Lin28 and Nanog, preferably the following 6 genes: Oct3 / 4, Klf4 A method comprising introducing Sox2, c-Myc, Lin28, and Nanog into a somatic cell.
  • at least one gene selected from the following three gene forces can be used instead of c-Myc: L-Myc, Salll, and Sall4, and this method is also a preferred embodiment.
  • the gene can be introduced into a somatic cell by a recombinant vector, and the combination force of the genes defined in each of the above methods is selected. It is preferable to introduce the gene into a somatic cell using a vector! /.
  • a viral vector or a non-viral vector may be used.
  • a nuclear reprogramming factor comprising a combination of genes defined in each of the above inventions is provided by the present invention. It is also preferable to further combine the TERT gene and the Z or SV40 Large T antigen gene with the above combination.
  • a nuclear reprogramming factor comprising a combination of gene products of the genes defined in each of the above inventions is also provided by the present invention, and a nucleus comprising a combination of gene products of the genes defined in each of the above inventions
  • a method comprising the step of contacting a reprogramming factor with a somatic cell.
  • the above method is also provided, comprising the step of adding the above nuclear reprogramming factor to a somatic cell culture.
  • the above method wherein the somatic cell is a mammal including a human, preferably a primate somatic cell, more preferably a human somatic cell; the somatic cell is a human fetal cell or adult human cell Provided is the above method, wherein the somatic cell is a somatic cell derived from a patient.
  • the present invention provides an induced pluripotent stem cell obtainable by the above method.
  • somatic cells induced by induced pluripotent stem cell force distribution obtained by the above method are also provided by the present invention.
  • Tissues, organs, body fluids, and individuals that are differentiated somatic cell populations are also provided by the present invention.
  • stem cell therapy is performed using somatic cells separated and collected from patient force.
  • a therapy including the step of inducing differentiation of the induced pluripotent stem cell obtained by the above method and transplanting the obtained somatic cell or a tissue, organ or body fluid as a population thereof to the patient.
  • the present invention provides a method for evaluating physiological effects and toxicity of compounds, drugs, toxicants and the like using various cells obtained by inducing differentiation of the induced pluripotent stem cells obtained by the above method.
  • FIG. 1 shows the results of alkaline phosphatase staining of human adult dermal fibroblast (adult HDF) force-induced iPS cells.
  • the gene shown in the left column was introduced into the adult HDF (HDFa-Slc7al) in which the mouse retrovirus receptor (Slc7al) was expressed by lentivirus infection using a retrovirus vector.
  • “I” shows the staining result in HDFa-Slc7al cells into which 4 genes of “Oct3 / 4, Sox2, K, C-Myc” were introduced.
  • the rightmost row and the second row from the right show the alkaline phosphatase staining results observed with a phase difference 10 days after gene transfer.
  • FIG. 2 shows the results of alkaline phosphatase staining of neonatal foreskin-derived fibroblast (BJ) force-induced iPS cells.
  • BJ neonatal foreskin-derived fibroblast
  • Slc7al mouse retrovirus receptor
  • Figure 3 shows ABCG-2 and SSE of adult HDF-derived iPS cells (clone iPS-HDFaSlc-87E6).
  • the photo shows a phase contrast image and a phase contrast image (10x each) through a rhodamine filter.
  • Figure 4 shows adult HDF-derived iPS cells (clone iPS-HDFaSlc-87E3, 4, and 12) and mouse HDG (HDFa) expressing the Slc7al gene ABCG-2, E-cadherin, SSEA -3
  • FIG. 5 shows the results of immunostaining for the expression of SSEA-4.
  • the photo shows a phase contrast image and a phase contrast image (each objective X10) through a Rhodamine 'filter.
  • FIG. 5 shows adult HDF-derived iPS cells (clone iPS-HDFaSlc-87El to 8, 11 and 12), NTERA2 clone Dl human embryonal cancer cells (NTERA2) and ad HD HD (HDF) power expressing mouse Slc7al gene
  • NTERA2 clone Dl human embryonal cancer cells
  • HDF ad HD power expressing mouse Slc7al gene
  • FIG. 4 is a diagram showing the PCR amplification results for each region of GDF3, DPPA4, DPPA2, ESG1, hTERT, and G3PDH.
  • FIG. 6 shows BJ-derived iPS cells (clone iPS-BJSlc-97G3, G5, H3, H5, El-10, Ell, and E12), NTERA2 clone Dl human embryonal cancer cells (NTERA2), and mouse Slc7al.
  • BJ BJ-Slc7al
  • FIG. 5 shows the results of PCR amplification of each region of G3 PDH.
  • FIG. 7 shows a mouse (5) after 5 weeks of subcutaneous injection of clone iPS-HDFaSlc-87E12 and the mouse excised tumor (A), and clone iPS-HDFaSlc-87E3 (B).
  • FIG. 6 shows the results of hematoxylin and eosin staining of teratoma-derived tissue from which mouse force was also injected subcutaneously with clone iPS-HDFaSlc-87E6 (C) and clone iPS_HDFaSlc-87E12 (D).
  • FIG. 8 is an immunostaining diagram showing in vitro differentiation of human HPS cells.
  • Human iPS-like cells were cultured on a HEMA-coated plate for 7 days and further cultured on a gelatin-coated dish for 7 days, and then the cells were collected and fixed with a fixative (PBS containing 10% formalin).
  • a fixative PBS containing 10% formalin.
  • Anti- ⁇ -smooth muscle actin antibody, anti- ⁇ III-tubulin antibody (bill-tubulin), and anti--fetoprotein antibody (a-fetoprotein) 1 Reaction was carried out as a secondary antibody, and further immunostaining was carried out using a secondary antibody.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of improving the efficiency of retrovirus gene transfer into human HDF.
  • An ecotropic (Eco) or amphotropic (Ampho) retrowinoles containing GFP cDNA was introduced into HDF (HDF-Slc7al) expressing HDF or mouse Slc7al gene.
  • the upper sound in the figure shows the results of fluorescence microscopy (the bar is 100 im), and the lower graph in the figure shows the flow cytometry results.
  • FIG. 10 shows the results of induction of iPS cells from adult HDF.
  • A shows a time chart of iPS cell establishment.
  • B is a cell morphology image of HDF
  • C is a typical image of a non-ES cell-like colony
  • D is a typical image of a human ES cell-like colony
  • E is a succession of established iPS cell lines g
  • H to N are SSEA-1 (H), SSEA-3 (1), SSEA-4 (J), TRA-1-60 (K), TRA-1-81 (L), TRA-
  • M 2-49 / 6E
  • N Nanog
  • Fig. 11 is a diagram showing the feeder-cell dependency of HI HPS cells.
  • A shows an image of iPS cells seeded on a gelatin-coated plate.
  • B shows an image of iPS cells cultured in a conditioned medium for MEF (MEF-CCM) on a matrigel-coated plate.
  • C shows an image of iPS cells cultured in a non-conditioned medium for human ES on a matrigenocoated plate.
  • FIG. 12 shows the results of RT-PCR analysis of ES cell marker genes for the expression of human ES cell marker genes in human HPS cells.
  • the cells from which RNA was isolated were iPS cell clone 201B, ES cell, NTERA2 clone D1 human embryonic cancer cell (NTERA2), and adult HDF (HDF) expressing the mouse Slc7al gene.
  • FIG. 13 shows Western plot analysis of ES cell marker genes (A) and quantitative PCR results of expression of retroviral transgenes (B) for the expression of human ES cell marker genes in human iPS cells. It is a figure. B represents the average of three tests, and bar represents the standard deviation.
  • FIG. 14 shows the results of bisulfite genomic sequencing of the promoter region of Oct3 / 4, REX1 and Nanog on the expression of human ES cell marker gene in human HPS cells.
  • A 3 ⁇ 4Pinole luciferase assay results ( It is the figure which showed B).
  • white circles and black circles indicate unmethylated and methylated CpGs.
  • B indicates the average of 4 tests, and bar indicates the standard deviation.
  • FIG. 15 shows high levels of telomerase activity and exponential proliferation of HI HPS cells.
  • A shows the detection result of telomerase activity by TRAP method using (+) sample inactivated by heat treatment as a negative control (IC is an internal control).
  • B shows the growth curve of iPS cells, showing the mean value and standard deviation of 4 tests.
  • FIG. 16 shows the results of genetic analysis of HI HPS cells. A has all four retroviruses integrated into the chromosomes of all clones! This is the result of genomic PCR showing the results.
  • B shows the result of Southern blot analysis using c-Myc cDNA probe. The asterisk in the figure indicates the endogenous c-Myc allele (2.7 kb), and the arrow indicates the mouse c-Myc allele (9.8 kb) derived from a single SNL feeder cell.
  • FIG. 17 is a view showing differentiation of HI HPS cells via embryoid bodies.
  • A shows a suspension culture image of iPS cells on the 8th day.
  • B to E show images of differentiated cells (B), neuron-like cells (C), epithelial cells (D), and paving stone-like cells (E) on day 16, respectively.
  • F to K are immunohistochemistry of ⁇ -fetoprotein (F), vimentin (G), ⁇ -smooth muscle actin (H), desmin (1), ⁇ III tubulin (J), and GFAP (K) The results of the analysis are shown. Par in the figure indicates 200 im (A, B) and 100 / x m (C to K). In FK, nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue).
  • L shows the results of RT-PCR analysis of various differentiation markers of the three germ layers.
  • FIG. 18 is a diagram showing the directed differentiation of human HPS cells.
  • A is a phase contrast image of differentiated iPS cells after 18 days of culture on PA6 cells.
  • B shows the results of immunohistochemical analysis of the cells shown in A with j3 III tuberin (red) and tyrosine hydroxylase (green) antibodies. Nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue).
  • C shows the results of RT-PCR analysis of dopaminergic neuron markers.
  • D is a phase contrast image of iPS cells differentiated into cardiomyocytes.
  • E shows the RT-PCR analysis result of the cardiomyocyte marker.
  • the bars in the A, B, and D images are 200 ⁇ m (A, D) and 100 ⁇ m ( ⁇ ).
  • FIG. 19 is a diagram showing teratomas in which the HPS cell force was also induced. Hematoxylin and eosin-stained images of teratoma-derived tissue induced with iPS cell force are shown (using clone 201B7).
  • FIG. 20 is a phase contrast image of human HPS cells established from adult fibroblast-like synoviocytes (HFLS, clone 243H1) and neonatal foreskin-derived fibroblasts (BJ, clone 246G1). In each image, par indicates 200 tm.
  • HFLS adult fibroblast-like synoviocytes
  • BJ neonatal foreskin-derived fibroblasts
  • FIG. 21 shows the expression of an ES cell marker gene in iPS cells derived from HFLS and BJ.
  • FIG. 22 is a diagram showing cells differentiated from iPS cells established from HFLS and BJ via embryoid bodies. Expression of ⁇ -smooth muscle actin, III tupurin and a-fetoprotein was confirmed by immunostaining.
  • FIG. 23 is a graph showing the effect of excluding a family single gene and c-Myc in induction of iPS cells from MEF derived from Nanog reporter mice.
  • A shows the result of iPS cell induction from MEF by Nanog selection using a family gene. The graph shows the number of GFP positive colonies. The results of three independent experiments are shown in different colors (white, gray, and black). “4 factors” indicates a combination of Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc.
  • B shows the influence of the timing of puromycin selection in iPS cell induction, and shows GFP positive colonies observed 28 days after introduction of 3 genes excluding 4 genes or c-My c.
  • C shows the effect of puromycin selection timing on the percentage of GFP positive colonies for all colonies.
  • FIG 4 is Myc, Klf, Fbxl5 with family proteins of Sox - illustrates the histology of teratoma derived from iPS cells derived from the reporter mice-derived MEF.
  • FIG 5 is a diagram showing the characteristics of the c- 3 one gene other than Myc (Oct3 / 4, Sox2, Klf4) and by retroviral introduced into Nanog- reporter mice MEF the established iPS cells.
  • the RT-PCR results showing the expression levels of the ES cell marker gene and 4 genes are shown.
  • endo the transcript from the endogenous gene
  • Tg the transcript from the retrovirus
  • Fig.26 shows the result of induction of established iPS cells by introducing three genes other than C-Myc (Oct3 / 4, Sox2, K4) into MEF derived from Fbxl5 reporter mice by retrovirus, and introduction It is a figure which shows the expression result of GFP.
  • A shows the morphology of iPS cells established by introduction of three genes other than C-Myc (Oct3 / 4, Sox2, Klf4). The bar below the photo shows 500 w in.
  • B shows the results of RT-PCR analysis of ES marker genes in iPS cells established by introduction of three genes (Oct3 / 4, Sox2, f4) other than ES, MEF, and c-Myc.
  • FIG. 27 shows chimeric mice derived from iPS cells (clone 142B-6 and 142B-12) established by introduction of three genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf4) other than c-Myc. is there.
  • FIG. 28 is a diagram showing the results of efficient isolation of iPS cells without drug selection.
  • A is a morphological image of i PS cells derived from TTF derived from an adult mouse having a Nanog-GFP-IRES-Puro porter. Either 4 genes or c-Myc was removed together with DsRed, and 3 genes were introduced into the cells and cultured for 30 days without drug selection.
  • Nanog reporter Nag-GFP
  • DsRed retrovirus Tg-DsRed
  • Bar indicates 500 / im.
  • B is a morphological image of iPS cells derived from an adult mouse-derived TTF lacking a force S, Nanog or Fbxl5 selection cassette containing a DsRed transgene regulated by an actually active promoter (ACTB, j3-actin gene). Show. Cells were transfected with either 4 genes or 3 genes excluding c-Myc together with GFP and cultured for 30 days without drug selection.
  • the expression of GFP retrovirus Tg-GFP was confirmed by fluorescence microscopy. Bar indicates 500 ⁇ .
  • C shows the results of RT-PCR analysis of the ES marker gene in iPS cells and ES cells derived from TTF without drug selection.
  • D is a chimeric mouse image derived from iPS cells derived from adult TTF without drug selection or c-Myc retrovirus.
  • FIG. 29 shows the results of induction of HIHPS cells by introduction of three genes other than c-Myc (Oct3 / 4, Sox2, Klf4).
  • A is an image showing that established human HPS cells (clones 253G and 246H) exhibit human ES cell-like morphology.
  • B is an iPS cell (253G) established by introduction of three genes other than c_Myc (Oct3 / 4, Sox2, Klf4), or four genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc) containing c-Myc.
  • 2 shows the expression results of the ES cell marker gene in HI HPS cells derived from HDF established using iPS cells (253F) established by.
  • FIG. 30 is established by introducing three genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf4) other than C-Myc into adult fibroblasts (HDL; 253G) and neonatal foreskin-derived fibroblasts (BJ; 246G). It is the figure which induced differentiation through the embryoid body from baboon HPS cells. Expression of human smooth muscle actin, III tubulin, and a-quote protein was confirmed by immunostaining.
  • FIG. 31 shows 293FT cells with 6 genes (Klf4, c-Myc, Oct3 / 4, Sox2, Nanog, and Lin2 8), or 2 different combinations of 4 genes (f4, c- Myc, Oct3 / 4, and Sox2; and Oct3 / 4, Sox2, Nanog, and Lin28) represented by T4F It is the figure which showed the number of colonies recognized. “ES-like” indicates the number of colonies that are morphologically similar to ES cell colonies, and “total” indicates the total number of ES-like and non-ES-like colonies. Exp # l, Exp # 2, Exp # 3, and ⁇ # 4 show the results of individual experiments. The vertical axis shows the number of colonies.
  • FIG. 32 shows the results of experiments conducted using mouse embryonic fibroblasts (MEF).
  • ⁇ shows the time chart of the experiment.
  • 1.0 1.0 5 M EF cells obtained from Nanog GFP ⁇ —FbxlS mice were plated on gelatin-coated 6-well plates.
  • 4 genes (Oct3 / 4, Klf4, Sox2, and Sall4; OSKA) or 3 genes (Oct3 / 4, Klf4, and Sox2; OSK) were introduced into the MEF using retrovirus.
  • 4 genes Oct3 / 4, Klf4, Sox2, and Sall4; OSKA
  • 3 genes OFct3 / 4, Klf4, and Sox2; OSK
  • GFP positive cells were counted, and the cells were stained with alkaline phosphatase (AP) and crystal violet (CV).
  • AP alkaline phosphatase
  • CV crystal violet
  • B shows the total number of GFP positive mouthpieces in three independent experiments (# 1, 2, and 3).
  • C shows the percentage of GFP positive colonies in three independent experiments (# 1, 2, and 3).
  • FIG. 33 shows the results of experiments conducted using human adult skin-derived fibroblasts (adult HDF).
  • adult HDF human adult skin-derived fibroblasts
  • 1.0 x 10 5 adult HDF cells expressing the murine retrovirus receptor slc7a were plated on 6 well plates.
  • the various gene combinations shown in the figure were introduced into the cells using a retroviral vector.
  • Six days after infection cells were adjusted to 5.0 ⁇ 10 5 cells and plated again on 100 mm plates coated with 1.5 10 6 mitomycin C-treated STO cells. Seven days later, the medium was replaced with primate ES cell medium supplemented with 4 ng / ml bFGF.
  • the figure shows the number of colonies 30 days after infection.
  • FIG. 34 shows human adult skin-derived fibroblasts (HDF) expressing mouse retrovirus receptor Sk7a (H4F: 4 genes derived from humans (Y4F: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc)) or 3 genes (Y3F: Oct3 / 4, Sox2, and Klf4) and mouse Sall4 (mSall4) or mouse Salll (mSalll) or both were introduced using retroviral vectors, and 32 days after infection (on the left side ) And the number of colonies confirmed on the 40th day (right bar).
  • HDF human adult skin-derived fibroblasts
  • Sk7a H4F: 4 genes derived from humans (Y4F: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc)
  • Y3F Oct3 / 4, Sox2, and Klf4
  • mouse Sall4 mSall4
  • mSalll mouse Salll
  • ⁇ + oc kj is a group infected with a retrovirus that is an empty vector instead of Y3F or Y4F
  • “+ mSall 4J is a group in which Sall4 is introduced simultaneously with Y3F or Y4F
  • “ + mSalll ” is simultaneously with Y3F or Y4F.
  • the vertical axis shows the number of colonies of human HPS cells confirmed on a 10 cm dish. The same experiment was repeated three times and the total number of colonies for each experiment is shown on the graph par.
  • FIG. 35 shows human adult skin-derived fibroblasts (HDF) expressing mouse retrovirus receptor Slc7a (4 T4F: Oct3 / 4, Sox2, Nanog, and Un28) or 3 genes.
  • Pups T3F: Oct3 / 4, Sox2, and Nanog
  • mouse Sall4 mSall4
  • mouse Salll mSal 11
  • “10 MockJ is a group infected with retroviruses that are empty vectors instead of T3F or T4F
  • “ + mSall4 ” is a group in which mSall4 is introduced simultaneously with T3F or T4F
  • “ + mSalll ” is a group in which mSal11 is simultaneously with T3F or T4F
  • “+ MSall4 + mSalll” indicates a group in which both mSall4 and mSalll are introduced simultaneously with T3F or T4F.
  • the vertical axis shows the number of colonies of human HPS cells confirmed on a 10 cm dish. The same experiment was repeated twice and the total number of colonies for each experiment was shown on the bar of the graph.
  • FIG. 36 shows that human adult skin-derived fibroblasts (HDF) expressing mouse retrovirus receptor Slc7a are divided into 4 genes (Y4F) or 3 genes (Y3F) and human Sall4 (hSall4). It is the figure which showed the number of the colonies introduce
  • the vertical axis shows the number of colonies of human HPS cells confirmed on a 10 cm dish. The same experiment was repeated 2 or 3 times and the total number of colonies for each experiment was shown on the bar of the graph.
  • FIG. 37 shows a mouse retrovirus using a lentiviral vector with a total of 4 genes, c3 Myc, L_Myc, or N-Myc gene added to 3 genes Oct3 / 4, Klf4, and Sox2.
  • 3 is a graph showing the results of counting the number of colonies of human iPS cells established by introducing into human adult skin-derived fibroblasts (HDFa-Slc7al) expressing the receptor Slc7a. The numbers on each graph indicate the ratio of the number of colonies of iPS cells to the total number of colonies.
  • FIG. 38 FIG.
  • FIG. 39 shows a teratoma obtained by injecting HI HPS cells (32R6) established by introducing 4 genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and L-Myc) into the testis of SCID mice.
  • This is a tissue staining image (hematoxylin 'eosin staining).
  • the top row shows tissue images of nerve tissue, gut-like tissue, and cartilage tissue from the left.
  • the lower row shows the tissue images of hair tissue, adipose tissue, and pigment tissue from the left.
  • FIG. 40 shows a GFP positive colony obtained by introducing 3 genes (Oct3 / 4, Klf4, and L-Myc) into MEF (MEF-Ng) derived from Nanog reporter mouse using a retroviral vector (FIG. 40). It is a photograph showing the form of iPS-MEF-Ng-443-3). The upper row is a GFP positive colony image, and the lower row is a phase contrast image.
  • FIG. 41 is a photograph showing the results of RT-PCR and genomic PCR performed on the clone derived from the GFP positive colony (iPS-MEF-Ng — 43-3) shown in FIG.
  • “Total” indicates endogenous and retrovirus-derived gene expression
  • “T g ” indicates retrovirus-derived gene expression
  • GenomeJ is a retrovirus-derived gene inserted into the genomic DNA. The result of having detected presence with the primer specific to each gene is shown. The numbers on the right side of the photo indicate the number of PCR cycles.
  • RF8 is a control ES cell
  • 20D17 is an iPS cell (Nanog) obtained by introducing 4 genes (Oct3 / 4, Klf4, L-Myc, and Sox2) into MEF-Ng. -iPS cells; Nature, 448, pp.313-317, 2007), “142E-9” was obtained by introducing 4 genes (Oct3 / 4, Klf4, L-Myc, and Sox2) into MEF-Fbx.
  • the obtained iPS cells (Fbx-iPS) are shown, and the results of performing similar experiments on these cells are shown.
  • “Pla S mid” is the result of using plasmids (pMXs-Sox2, pMXs-Oct3 / 4, pMXs-Klf4, pMXs-c-Myc, and pMXs-L-Myc) containing each gene. Indicates.
  • FIG. 42 shows mouse iPS cells (443-3-3, 443-3-6, 443-3-12) established by introducing 3 genes (Oct3 / 4, Klf4, and L-Myc). And 443-3-13) have the ability to differentiate into the three germ layers.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of confirmation by staining with anti-smooth muscle actin antibody, anti- ⁇ -fetoprotein antibody, and anti- ⁇ III-tubulin antibody antibody.
  • RF8 is a control mouse ES cell.
  • Fig.43 shows mouse iPS cells (443-3-3, 443-3-6, 443-3-12) established by introducing 3 genes (Oct3 / 4, Klf4, and L-Myc).
  • Fig.43-3-13 are histologically stained images of teratomas obtained by subcutaneous injection of nude mice (hematoxylin and eosin staining). From the top, tissue images of nerve tissue, intestinal tract-like tissue, muscle tissue, epidermal tissue, and cartilage tissue are shown.
  • FIG. 44 shows the expression of mouse retrowinores receptor Slc7a using lentiviral vector for c_Myc, L-Myc, and / or Lin2 8 gene in 3 genes of Oct3 / 4, Klf4, and Sox2.
  • 3 is a graph showing the results of counting the number of colonies of human iPS cells established by introduction into human adult skin-derived fibroblasts (HDFa-Slc7al). The black bar indicates the total number of colonies, and the white bar indicates the number of iPS cell colonies.
  • FIG. 45 is a diagram schematically showing the structure of various Myc chimeric genes and mutant genes.
  • the base sequence and amino acid sequence of Ms-c-Myc are shown in SEQ ID NO: 153 and 154 in the sequence listing, the base sequence and amino acid sequence of s-L-Myc are shown in SEQ ID NO: 155 and 156 in the sequence listing, Ms-cL-
  • the base sequence and amino acid sequence of Myc are shown in SEQ ID NO: 157 and 158 in the sequence listing, the base sequence and amino acid sequence of Ms-Lc-yc are shown in SEQ ID NO: 159 and 160 in the sequence listing, and the base of Ms-cLc-Myc
  • the sequence and amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 161 and 162 in the sequence listing, the base sequence and amino acid sequence of Ms-LcL-Myc are shown in SEQ ID NO: 163 and 164 in the sequence listing, and the base sequence of Ms-ccL-Myc
  • the base sequence lj and amino acid sequence of c-MycW135E are shown in SEQ ID NOs: 173 and 174, and the base sequence and amino acid sequence of c-MycV394D are shown in SEQ ID NO: 175 and The base sequence and amino acid sequence of c-MycL420P are shown in SEQ ID NOS: 177 and 178 in the sequence listing, the base sequence and amino acid sequence of L-MycW96E are shown in SEQ ID NOS: 179 and 180 in the sequence listing, L -MycV325D nucleotide sequence and amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 181 and 182 of the sequence listing, L-MvcL351P nucleotide sequence and amino acid sequence These are shown in SEQ ID NOS: 183 and 184 in the sequence listing.
  • FIG. 46 is a diagram of humans derived from human adult skin-derived fibroblasts (HDFa-S lc7al) expressing mouse retrovirus receptor Slc7a using lentiviral vectors with various Myc chimeric genes and mutant genes.
  • 3 is a graph showing the results of counting the number of coloae of HPS cells. From the top, the number of iPS cell colonies, the total number of colonies, and the ratio of the number of iPS cell colonies to the total number of colonies are shown.
  • the method of the present invention provided from the first aspect is a method for producing an induced pluripotent stem cell from a somatic cell, and comprises the following three genes: Oct family gene, Klf7 Amilly gene, And a step of introducing a Sox family gene into a somatic cell.
  • the following three genes: Oct family gene, KK7 family gene, and Sox family gene are introduced into the somatic cell.
  • the method includes culturing the cell for a time sufficient for the cell to acquire pluripotency and to proliferate.
  • Oct family gene the Klf Amilly gene, and the Sox family gene
  • Klf4 is preferred as the K1E7 family gene
  • Sox2 is preferred as the Sox family gene.
  • These genes include wild type genes, several (eg, 1-30, preferably;! -20, more preferably 1-10, and even more preferably 1-5). In particular, it is a chimeric gene obtained by appropriately combining 1 or 2 bases with substitution, insertion, and Z or deletion of a base, or an appropriate combination of family genes, which is the same as a wild-type gene. Genes having functions or improved functions can also be used.
  • the method of the present invention provided from the second aspect is a method for producing induced pluripotent stem cells from somatic cells, and comprises the following two genes: Oct family gene and Sox family communication. Child combination or the following two genes: Oct family gene and KK Amilly gene combination and at least one gene selected from the following three gene forces: L-Myc, Salll, and SaI14 It is characterized by including a step of introducing into cells. Not bound by any particular theory, but from the group of L-Myc, Salll, and SalM forces The selected gene is a nuclear reprogramming factor that has the effect of increasing the efficiency of nuclear reprogramming. The combination of the gene and the Klf7 Amilly gene) can be used to significantly improve the efficiency of nuclear reprogramming.
  • the above method comprises:
  • the method may further comprise a step of introducing a Klf7 amilly gene into somatic cells.
  • the above (a) nare, (0)! / Any of the embodiments, or any of the embodiments (a), (g), and the Klf7 amily gene added to the Lin family gene and Z or Nanog, preferably Lin28 and / or Alternatively, a step of introducing Nanog, more preferably Lin28 into somatic cells may be included. Furthermore, a step of introducing C-Myc into somatic cells may be included as desired.
  • Oct3 / 4 is preferred as the Oct family gene
  • Sox2 is preferred as the Sox family gene
  • Klf3 ⁇ 4 is preferred as the Kamimy gene.
  • Lin28 and Lin28b are known as the Lin family gene.
  • L-Myc is described in Table 1 of International Publication WO2007 / 69666
  • Sall4 is described in Table 4 and Table 5 of the International Publication.
  • Salll is an ES cell-specific expression gene and is known as one of zinc finger proteins and is thought to be involved in kidney development.
  • Salll's NCBI accession numbers are NM_021390 (mouse) and NM_002968 (human).
  • the NC28 accession numbers for lin28 are NM-145833 (mouse) and NM-024674 (human).
  • these genes include several (for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, particularly preferably) Is a mutant gene in which one or two bases are substituted, inserted and / or deleted, or a chimeric gene obtained by an appropriate combination of one gene in the family, and has the same function as the wild-type gene, Alternatively, a gene having an improved function can be used.
  • L-Myc or c-lvlyc there are several wild-type genes (for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1-5, especially preferred Is a mutant gene in which 1 or 2 bases are substituted, inserted, or deleted, or a chimeric Myc gene that has the same or improved function as the wild-type gene It is.
  • the methods for specifically analyzing the functions of various Myc chimeric genes and Myc point mutation genes and the results of Myc genes are specifically shown in the examples of the specification. Therefore, a mutant c-Myc gene, mutant L-Myc gene, or chimeric Myc gene having a desired improved function can be easily selected and used.
  • Preferred examples of the chimeric Myc gene include Ms-cL-Myc (SEQ ID NOs: 157 and 158) and Ms_cLc-Myc (SEQ ID NOs: 161 and 162), and more preferably Ms-cL-Myc. Is mentioned.
  • (h-2) a step of introducing Oct3 / 4, Klf4, L-Myc, and Lin28 into somatic cells;
  • Nanog is introduced into somatic cells together with or instead of Lin28.
  • a method comprising the step of:
  • an embodiment using Nanog together with Lin28 that is, a method including a step of introducing Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L_Myc, Lin28, and Nanog into a body cell is exemplified.
  • the method may include a step of introducing N-Myc into a body cell together with L-Myc or in place of L-Myc.
  • the step of introducing c-Myc into somatic cells as necessary may include a step of introducing tumors into cells or tissues obtained after induction of differentiation. In order to substantially reduce or eliminate this, it may be preferable not to include a step of introducing C-Myc into somatic cells.
  • somatic cells For the embodiment containing L-Myc, it is preferable to use human somatic cells as somatic cells to be reprogrammed.
  • Sox2, and K or a combination of Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and Shin-Myc (or c-Myc instead of L-Myc)
  • Shin-Myc or c-Myc instead of L-Myc
  • a combination of Oct3 / 4, Sox2, Nanog, and Lin28 it is preferable to further combine Salll or to further combine both Salll and Sall4. In these cases, it is preferable to use human somatic cells as somatic cells to be reprogrammed.
  • the method of the present invention provided from the third aspect is a method for producing induced pluripotent stem cells from somatic cells, comprising the following six genes: Oct family gene, Klf7 Amilly gene, It includes the step of introducing Sox family gene, Myc family gene, Lin28, and Nanog into somatic cells, and preferably the following 6 genes: Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 And introducing Nanog into the somatic cell.
  • the "artificial pluripotent stem cell” is a cell having properties close to those of an ES cell, and more specifically. In general, it includes undifferentiated cells that have pluripotency and proliferative potential, but this term should not be interpreted in a limited way in any way, and should be interpreted in the broadest sense. is there. Methods for preparing induced pluripotent stem cells using nuclear reprogramming factors are described in International Publications WO20 07/69666, Cell, 126, pp. 663-676, 2006 and Cell, 131, pp. 861-872, 2007 V, as a means for separating induced pluripotent stem cells, is specifically described in the above publication.
  • somatic cells to be initialized by the method of the present invention means all cells except totipotent cells such as ES cells, and the type thereof is not particularly limited. For example, you can use mature somatic cells in addition to fetal somatic cells.
  • somatic cells derived from mammals including humans are used, more preferably somatic cells derived from mice or primates.
  • human-derived somatic cells can be used.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells
  • tissue progenitor cells such as lymphocytes and epithelia.
  • somatic cells such as cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, liver cells, gastric mucosa cells.
  • somatic cells that have been separated by the patient themselves, or somatic cells that have been separated from other human forces with the same HLA antigen type.
  • somatic cells involved in disease or somatic cells involved in disease treatment can be used.
  • the method for introducing the gene into a somatic cell is not particularly limited.
  • a vector capable of expressing the gene is generally used.
  • Specific means of using a retroviral vector as a vector are disclosed in International Publications WO2007 / 69666, Cell, 126, pp. 663-676, 2006 and Cell, 131, pp. 861-872, 2007.
  • the case of using a lentiviral vector is disclosed in Science, 318, pp.1917-1920, 2007.
  • the case of using a plasmid that is a non-viral vector is described in Okita et al. (Science, Published online: October 9, 2008; 10.1126 / science.1164270). Appropriate means can be selected and employed from the force.
  • two or more genes selected from the above-mentioned gene strength may be incorporated into the vector, or several types of vectors incorporating one kind of gene may be used. If one or two of the above genes are already expressed in the somatic cell to be initialized, then one or two of the genes expressed from the combination of the above genes to be introduced It is needless to say that such a mode is included in the scope of the present invention.
  • a viral vector such as a retroviral vector is used as a means for introducing the gene into a somatic cell
  • a viral vector containing each gene to be introduced is prepared, and then each viral vector is separately prepared.
  • the culture supernatant containing each virus is prepared independently by transfecting the packaging cells and culturing the cells, and a mixture of these culture supernatants is prepared to infect the virus containing the gene. It is preferable to use for gene transfer by. By adopting this means, the gene transfer efficiency may be remarkably increased, and may be preferable particularly when nuclear reprogramming is performed without using c-Myc. However, it is also possible to transfect a plurality of viral vectors into a single packaging cell and prepare a culture supernatant containing a plurality of viral vectors for gene transfer.
  • an expression vector may be introduced into the somatic cell cultured on the feeder cell, but the somatic cell can be used without using the feeder cell.
  • the latter method may be suitable for increasing the efficiency of expression vector introduction.
  • the ability to appropriately use the feeder cells used for embryonic stem cell culture as feeder cells For example, STO cells that are fibroblast primary cultured cells of mouse 14-15 day embryos or fibroblast-derived cell lines Etc. can be used cells treated with a drug such as mitomycin C or radiation treated cells. Culture of somatic cells after gene introduction is preferably performed on a feeder cell. It is also possible to enter drug selection using puromycin or the like within a few days or 30 days after introduction of the gene.
  • a technique that can induce iPS cells without drug selection is also known (example 9 of International Publication WO2007 / 69666), and it is also preferable to induce iPS cells without drug selection.
  • nuclear reprogramming proceeds autonomously, and an induced pluripotent stem cell can be produced from the somatic cell.
  • an induced pluripotent stem cell can be produced from the somatic cell.
  • a medium suitable for animal species of somatic cells for example, a medium for embryonic stem cells (ES cells) (for example, primate ES cells, preferably human ES cells when introducing genes into human somatic cells)
  • ES cells embryonic stem cells
  • the cultured pluripotent stem cells can be obtained, for example, by culturing for 25 days or longer.
  • First viewpoint power The provided method is more efficient than a nuclear initialization using a combination of one or more of c_Myc, L-Myc, N-Myc, Salll, or Sall4. Initialization efficiency may be reduced, and in general, long-term culture is often required.
  • this method it is necessary to continue the culture preferably for 28 days or longer, more preferably 30 days or longer, even more preferably 33 days or longer, particularly preferably 350 or longer.
  • a culture period of 40 days or more, or even 45 days or more may be the optimum culture period.
  • a shorter culture period for example, 15 to 30 days.
  • a desired number of induced pluripotent stem cells may be obtained in a culture period of about 20 days.
  • pluripotency in the transfected cells means that various markers unique to undifferentiated cells such as alkaline phosphatase (ALP), SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2, and so on. It can be easily determined by detecting ⁇ -cadherin or the like.
  • markers and determination means are described in detail and in detail in the above publications (for example, Cell, 126, pp. 663-676, 2006, Cell, 131, pp. 861-872, 2007, etc.).
  • an induced pluripotent stem cell using the marker (GFP) positive as an index can be specified.
  • proliferation is generally a force colony that can be determined by colony formation (usually a cell population with about 500 to 1,000 induced pluripotent stem cell power) Since the shape of is known to have a characteristic appearance depending on the animal species, colonies formed by proliferation of induced pluripotent stem cells can be easily identified.
  • mouse induced pluripotent stem cells form swelled colonies
  • human induced pluripotent stem cells are known to form flat colonies. Since it is very similar to the colonies of mouse ES cells and human ES cells, those skilled in the art can confirm the degree of proliferation of the induced pluripotent stem cells by detecting the generated colonies of induced pluripotent stem cells.
  • Various media are known in the art that can maintain the undifferentiated and pluripotent properties of ES cells, or their properties, and by using a combination of appropriate media, Induced pluripotent stem cells can be efficiently separated. The separation ability and proliferation ability of the isolated artificial pluripotent stem cells can be easily confirmed by those skilled in the art by using a confirmation means that is widely used in ES cells.
  • gene introduction can be performed in the absence or presence of site force-in, if necessary, and preferably in the absence of site force-in. Further, in the above method, culture of somatic cells after gene introduction can be performed in the absence or presence of cytoforce-in as necessary.
  • Site power-in typically includes basic fibroblast growth factor (bFGF), Stem Cell Factor (SCF), Leukemia Inhibitory Factor (LIF), etc.
  • Gene transfer and Z or culture can be performed in the presence or absence of a physiologically active substance classified as force-in. Somatic cells after gene introduction can be cultured on a feeder cell modified to express cytoin.
  • nuclear reprogramming may be performed using a gene product encoded by the gene instead of the gene.
  • a nuclear reprogramming factor that is a gene product
  • means such as adding the above gene product to the medium can be employed.
  • One or two of the gene products of these genes are introduced into the nucleus by a fusion protein or microinstruction into the nucleus, and the remaining one or two genes are appropriately transferred.
  • Gene transfer method It can also be introduced by a method such as a method using a recombinant vector.
  • the gene product for example, in addition to the protein itself produced from the above gene, it may be in the form of a fusion gene product of the protein and other proteins or peptides.
  • a fusion protein with a green fluorescent protein (GFP) or a fusion gene product with a peptide such as histidine tag can be used.
  • GFP green fluorescent protein
  • a fusion gene product with a peptide such as histidine tag can be used.
  • introduction of one or more genes into a somatic cell may be replaced by contact of a low molecular weight compound with the somatic cell.
  • a low molecular weight compound include, for example, one or more genes selected from the group power consisting of Oct family gene, Klf Amilly gene, Sox family gene, Myc family gene, Lin family gene, Salll, Sall4, and Nanog gene.
  • a low molecular compound having an action of promoting expression can be used, and such a low molecular compound can be easily screened by those skilled in the art using the expression level of each gene as an index.
  • a gene encoding a factor that induces cell immortalization may be further combined.
  • the TERT gene and the following genes: SV40 Large Tantigen, HPV16 E6, HPV16 E7, and Bmil One or more genes selected They can be used alone or in appropriate combinations.
  • one or more genes selected from the group consisting of Fbxl5, ERas, ECAT15-2, Tell, and; 3-catenin may be combined and / or ECAT1, Esgl, Dnmt3L
  • One or more genes selected from the group consisting of ECAT8, Gd ⁇ , Soxl5, ECAT15-1, Fthll7, Rexl, UTF1, Stella, Stat3, and Grb2 can also be combined. These combinations are specifically described in International Publication WO2007 / 69666. However, the method of the present invention However, the genes that can be used are not limited to the genes specifically described above.
  • genes that encode factors related to differentiation, development, or proliferation, or other factors having physiological activity in addition to other genes that can function as nuclear reprogramming factors, genes that encode factors related to differentiation, development, or proliferation, or other factors having physiological activity. It is needless to say that one or more of these may be included, and such embodiments are also encompassed within the scope of the present invention.
  • methods for confirming nuclear reprogramming factors include screening methods for nuclear reprogramming factors described in International Publication WO 2005/80598 and identification of specific nuclear reprogramming factors described in International Publication WO2007 / 69666. The method can be used. The entire disclosures of International Publication WO 2005/80598 and International Publication WO2007 / 69666 are incorporated herein by reference.
  • nuclear reprogramming factor can be confirmed using a method in which appropriate modification or alteration is added to the above screening method.
  • a person skilled in the art can easily confirm that the combination of genes used in the above method acts as a nuclear reprogramming factor by the method described in the above publication.
  • HDAC histone deacetylase
  • Trichostatin A sodium butyrate
  • small molecule inhibitors such as MC 1293 and M344, siRNA and shRNA against HDAC (e.g., HDAC1 siRNA Smartpool (registered trademark, Millipore), HuSH 29mer shRNA Construct s against HDAC1 (OriGene))
  • Nucleic acid expression inhibitors such as G9a], G9a histone methyltransferase inhibitors [eg, BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2, pp.
  • siRNA for G9a and Forces such as shRNA (eg, nucleic acid expression inhibitors such as G9a siRNA (human) (Sant a Cruz Biotechnology)) are not limited to these.
  • shRNA eg, nucleic acid expression inhibitors such as G9a siRNA (human) (Sant a Cruz Biotechnology)
  • the nucleic acid expression inhibitor may be in the form of an expression vector containing DNA encoding siRNA or shRNA.
  • the use of the induced pluripotent stem cells produced by the method of the present invention is not particularly limited. It can be used for all kinds of tests, research, and treatment of diseases using ES cells.
  • the induced pluripotent stem cell obtained by the method of the present invention is treated with a growth factor such as retinoic acid, EGF, or darcocorticoid, and the like to obtain a desired differentiated cell (for example, nerve cell, cardiomyocyte, blood cell) Etc.) and an appropriate tissue can be formed.
  • a desired differentiated cell for example, nerve cell, cardiomyocyte, blood cell
  • Etc blood cell
  • the differentiation induction method is specifically described in International Publication WO200 7/69666 and the like.
  • V-induced induced pluripotent stem cells from the patient's own somatic cells, and cells obtained by separating the cells (for example, cardiomyocytes, insulin production) Cells or nerve cells) can be safely used in stem cell transplantation for various diseases such as heart failure, insulin-dependent diabetes, Parkinson's disease and spinal cord injury.
  • cells obtained by separating the cells for example, cardiomyocytes, insulin production
  • Cells or nerve cells can be safely used in stem cell transplantation for various diseases such as heart failure, insulin-dependent diabetes, Parkinson's disease and spinal cord injury.
  • the induced pluripotent stem cell is induced to prepare a somatic cell, tissue, or organ. It is also possible to evaluate the physiological action and toxicity of compounds, drugs, toxicants, etc. against this somatic cell, tissue or organ.
  • somatic cell power of a patient with a specific disease After preparing an induced pluripotent stem cell by the method of the present invention, the induced pluripotent stem cell is induced to differentiate to prepare a somatic cell, tissue, organ, or the like,
  • the drug candidate compound can also be screened by determining the therapeutic and / or prophylactic effect by acting the drug candidate compound on the somatic cell, tissue or organ.
  • the use of the induced pluripotent stem cell of the present invention is not limited to the above specific embodiment.
  • Example 1 Establishment of iPS cells from adult HDF in mouse ES cell medium
  • the Sk; 7al (mouse retrovirus receptor) gene was introduced into human adult skin-derived fibroblasts (adult HDF) or human neonatal foreskin-derived fibroblasts (BJ) using a lentivirus ( ⁇ HDFa- Slc7al '', ⁇ BJ-Slc7al "), HDFa-Slc7al or BJ-Slc7al After preparation, the cells were seeded on feeder cells (mitomycin-treated STO cells), and genes were introduced by retrovirus vectors in the following combinations.
  • Example 2 ECAT expression by iPS cells (1)
  • ECAT ES cell associated transcript
  • iPS cells derived from adult HDF (clone iPS-HDFaSlc-87E6) on feeder cells (mitomycin C-treated STO cells) previously cultured on 6-well plates, 5 x 10 4 per well And cultured for 4 days.
  • the cells were fixed with PBS containing 10% formalin, and after removing the fixative, the cells were washed with PBS, and further added with PBS containing 3% BSA for 45 minutes at room temperature.
  • Dilute primary antibodies (anti-human ABCG-2 antibody (mouse IgG), anti-SSEA-3 antibody (rat IgM), and anti-S SEA-4 antibody (mouse IgG)) 1: 100 with PBS containing 3% BSA, After incubation at 4 ° C, the cells were washed 3 times with PBS containing 1% BSA and diluted 1: 300 with PBS containing 1% BSA for 1 hour at room temperature. The reaction was carried out in the dark. Anti-mouse IgG antibodies labeled with Cy-3 (antibodies against ABCG-2 and SSEA-4; Chemicon) and anti-ra HgM antibodies (antibodies against SSEA-3; Jackson'Immuno Research) were used as secondary antibodies. The cells were washed with PBS and then observed and photographed under a microscope ( Figure 3). As a result, it was observed that iPS cell force SABCG-2, SSEA-3, and SSEA-4 derived from adult HDF were expressed.
  • Vioder cells previously seeded on 6-well plates with iPS cells derived from human adult skin-derived fibroblasts (adult HDF) (clone iPS-HDFaSlc-87E3, 87E4, and 87E12) Cells) were plated at a ratio of 5 ⁇ 10 4 per well and cultured for 5 days.
  • HDF which is a cell derived from the iPS cell
  • Cells were fixed with PBS containing 10% formalin. After the fixative was removed and the cells were washed with PBS, the cells were allowed to stand after adding blocking buffer (PBS containing 3% BSA) for 45 minutes at room temperature.
  • Secondary antibodies consist of Cy-3 labeled anti-mouse IgG antibody (antibodies against ABCG-2, E-cadherin, and SSEA-4) and anti-rat IgM antibody (anti-rats) diluted 1: 300 in Procking buffer. Antibody against SSEA-3). After the secondary antibody reaction, the antibody solution was removed and washed with PBS, and then the cells were observed with PBS containing 50% glycerol (FIG. 4).
  • iPS cells derived from human adult skin-derived fibroblasts expressed SSEA_3, SSEA-4, ABCG-2, and E-cadherin, which are the best surface cells of ES cells.
  • HDFa iPS cell-derived cells
  • SSEA-3 SSEA-4, ABCG-2, and E-cadherin! / A gap was also observed and did not appear.
  • Example 5 ECAT expression by iPS cells (4)
  • HIHPS cells derived from human neonatal foreskin fibroblasts (BJ fibroblasts) express ECAT.
  • RNA from HI HPS cells iPS—BJSlc-97E-1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, -97G-3, 5, -97H-3, and 5
  • NTERA2 Clone D1 human embryonic cancer cells passage number 35
  • BJ neonatal foreskin-derived fibroblasts
  • First strand cDNA was synthesized using oligo-dT20 primer and Rever Tra Ace-a-kit (Toyobo) according to the manufacturer's protocol. PCR was performed using primers as follows.
  • Example 6 Teratoma formation by human iPS cells
  • Example 6 Teratoma formation by human iPS cells
  • FIG. 7A shows mice and their teratomas injected subcutaneously with the iPS-HDFaSlc-87E12 clone.
  • FIG. 7 B shows clone iPS-HDFaSlc-87E3
  • C shows clone iPS-HDFaSlc-87E6
  • D shows teratoma-derived histology excised from mouse injected with clone iPS-HDFaSlc-87E12. Show.
  • Example 7 In vitro analysis of human iPS cells
  • Embryoid bodies were formed by suspension culture, and the differentiation ability of HI HPS cells in vitro was evaluated.
  • HI HPS cells iPS-HDFaSlc_127F2, E3
  • iPS-HDFaSlc_127F2, E3 were suspended in culture for 7 to 3 to form embryoid bodies. Thereafter, the embryoid body was transferred to a gelatin-coated plate and further cultured for 8 days, after which immunohistochemical analysis was performed.
  • the primary antibodies used are as follows.
  • Anti-smooth muscle actin antibody (Dako), anti- ⁇ III-Tuprin antibody (Chemicon), anti-ex-fetoprotein antibody (Dako), normal mouse IgG (2 mg / mU Chemicon), and normal Usagi IgG (2 mg / mU Chemicon) was diluted 1: 100 with PBS containing 3% BSA and used as the primary antibody. After reacting the primary antibody at room temperature for 1 hour, the cells were washed with PBS to react with the secondary antibody (3 ° / diluted 1: 300 with BSA-containing PBS). Nuclei were stained with DAPI.
  • ⁇ -smooth muscle actin (-SMA, mesoderm marker), III tubulin (ectodermal marker), and a-fetoprotein (endoderm marker) were positive. It was confirmed to differentiate in vitro via embryoid body formation (Fig. 8).
  • Example 8 Optimization of retroviral gene transfer for the production of chick HPS cells
  • Retro-Winores which has high gene transfer efficiency, is considered effective for induction of iPS cells from mouse fibroblasts (Takahashi et al, Cell, 126, ⁇ 663-676, 2006). Therefore, we optimized the gene transfer method in human adult skin-derived fibroblasts (adult HDF).
  • GFP green fluorescent protein
  • PLAT-E packaging cells As a control Using the ecotropic retrovirus produced by PLAT-E packaging cells (Morita et al, Gene Ther., 7, pp.1063-66, 2000) GFP was introduced into blast cells (MEF). In MEF, over 80% of cells expressed GFP (Figure 9).
  • adult HDF less than 20% clearly had lower GFP expression intensity than MEF, and GFP expression rate was less than 20%.
  • mice retroviral receptor Slc7al (Verrey et al., Pflugers Arch., 447, pp.532-542, 2004) (also known as mCATl) It was introduced into adult HDF using nchivirus.
  • GFP was introduced into HDFa-Slc7al using a homologous retrovirus. This method achieved a gene transfer efficiency of 60% ( Figure 9).
  • Example 9 Preparation of iPS cells from adult HDF using primate ES cell medium
  • FIG. 10A Human Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc were introduced into HDF-Slc7al using a retroviral vector (FIG. 10B, 8 10 5 cells / 100 mm dish).
  • FIG. 10E When HI HPS cells were grown on a SNL feeder cell using a primate ES cell-like medium containing bFGF, the cells formed a tightly packed flat colony (FIG. 10E). Each cell showed a cell morphology similar to that of human ES cells, characterized by large nucleolus and slight cytoplasm ( Figure 10F). As with human ES cells, spontaneous differentiation was sometimes observed at the center of the colony (FIG. 10G). These cells were also feeder-cell-dependent, similar to human ES cells, and did not adhere to gelatin-coated tissue culture plates. On the other hand, these cells are cultured on a Matrigenocoated plate for MEF-adjusted primate ES cells.
  • IC immunohistochemistry (imnmnocytochetnistry)
  • EB embryoid body
  • Example 10 Human ES cell marker expression by human iPS cells
  • HI HPS cells were able to detect a number of genetic markers of undifferentiated ES cells (eg, 03/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4, and (hTERT )) was expressed at a level equivalent to or higher than that of the human embryonic cancer cell line NTERA-2 (Fig. 12). From the results of the Western plot, protein levels of Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Sall4, E-CADHERIN, and hTERT were the same in HI HPS cells and human ES cells (FIG. 13A;). In HPS cells, transgene expression from retroviruses integrated into the chromosome was efficiently silenced, suggesting that it depends on the endogenous expression of these genes. ( Figure 13B).
  • Example 11 ES cell-specific gene promoter activity in human iPS cells
  • the luciferase reporter assay also showed that the human Oct3 / 4 and REX1 promoters were not present in force HDF, which had a high level of transcriptional activity in human HPS cells. Promoters of universally expressed genes such as human RNA polymerase ⁇ ( ⁇ ) showed one activity in both HPS cells and HDF (Fig. 14 ⁇ ).
  • Example 12 High telomerase activity and exponential growth of human iPS cells
  • HI HPS cells showed high telomerase activity (Fig. 15A).
  • Example 13 Evaluation of cross-contamination of HDF-derived HPS cells
  • Example 14 Differentiation of chick HPS cells via embryoid bodies
  • EBs embryoid bodies
  • iPS cells formed a ball-like structure (Fig. 17A).
  • Embryoid body-like structures were transferred to gelatin-coated plates and cultured for another 8 days.
  • the attached cells showed various cell morphology such as neuronal cells, paving stone cells, and epithelial cells (Fig. 17B-E).
  • ⁇ ⁇ II tupurin ectoderm marker
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • a-SMA spleen smooth actin
  • mesoderm mesoderm
  • desmin mesoderm
  • -Cells positive for fetoprotein endoderm
  • vimentin meoderm and body wall endoderm
  • RT-PCR results show that these differentiated cells have FOXA2 (endoderm marker), AFP (endoderm), cytokeratin 8 and 18 (endoderm), SOX17 (endoderm), BRACHYURY (mesoderm), It was confirmed that MSX1 (mesoderm), AP2 (ectoderm), and PAX6 (ectoderm) were expressed (FIG. 17L). On the other hand, the expression of Oct3 / 4, Sox2, and Nanog was clearly reduced. From these results, it was shown that iPS cell force can differentiate into S3 germ layer in vitro.
  • Example 15 Differentiation of human HPS cells into neurons
  • HI HPS cells were seeded on one cell layer of PA6 feeder and maintained for 2 weeks under differentiation conditions (Kawasaki et al., Neuron, 28, pp.31-40, 2000). The cells spread greatly, and a nervous structure was observed (Fig. 18A). Immunohistochemical analysis detected tyrosin hydroxylase and ⁇ -tubulin-positive cells in the culture (FIG. 18B). From the results of PCR analysis, donos such as AADC, ChAT, DAT, and LMX1B. The expression of MAP2, which is a minergic neuron, and other neuronal markers was confirmed (FIG. 18C). Also, Expression of Oct3 / 4, Sox2, and Nanog was reduced (Figure 18C). From these results, it was shown that iPS cells can be differentiated into neurons containing dopaminergic neurons by co-culture with PA6 cells.
  • Example 16 Directed differentiation of HI HPS cells into heart cells
  • Example 17 Teratoma formation from chick HPS cells
  • HI HPS cells (clone 201B7) were implanted subcutaneously into the dorsal flank of immunodeficient (SCID) mice. Tumor formation was observed after 9 weeks. By histological observation, various tissues including gastrointestinal tract-like epithelial tissue (ectoderm), striated muscle (mesoderm), cartilage (muscle), nerve tissue (endoderm), and keratin-containing flat tissue (endoderm) (Fig. 19) was included in the tumor.
  • ectoderm gastrointestinal tract-like epithelial tissue
  • meoderm striated muscle
  • cartilage muscle
  • nerve tissue endoderm
  • keratin-containing flat tissue endoderm
  • Example 18 Production of iPS cells from other human somatic cells
  • HFL S primary human-derived fibroblast-like synoviocytes
  • BJ cells neonatal foreskin
  • the skin skin strength of 36-year-old Caucasian female HDFs and HFLs obtained from the synovial tissue of a 69-year-old Caucasian male were purchased from Cell Applications.
  • BJ fibroblasts obtained from neonatal foreskin and NTERA-2 clone D1 human embryonic cancer cells were obtained from American Type Culture Collection.
  • Human fibroblasts NTERA-2, PLAT-E, and PLAT-A cells contain 10% sushi fetal serum (FBS), and 0.5% pecillin and streptomycin (Invitro Kojiman) Maintained in Danole Becko's modified Eagle medium (DMEM, Nakarai Tester).
  • 293FT cells 10% FBS, 2 mM L-glutamine (Invitrogen), 1 10- 4 M non mandatory amino acids (Invitrogen), and 1 mM sodium pyruvate (Sigma), and 0.5% Paix - DMEM containing cylinder and streptomycin Maintained at.
  • PA6 stromal cells (RIKEN BioResource Center) were maintained in ⁇ -MEM containing 10% FBS and 0.5% penicillin and streptomycin.
  • iPS cells were established and maintained in primate ES cell culture medium (Reprocell) supplemented with 4 ng / ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF, Wako Pure Chemical Industries).
  • iPS cells were prepared on a Matrigel-coated plate with MEF-prepared with 4 ng / ml bFGF.
  • Cells were seeded using primate ES cell culture medium (MEF-CM) or MEF-non-adjusted primate ES cell culture medium (reprocel). The medium was changed every day.
  • MEF-CM MEFs obtained by recovering embryos 13.5 days after fertilization of ICR mice were plated on 1 ⁇ 10 6 cells / 100 mm and cultured on a plate.
  • the cells were washed once with PBS and cultured in 10 ml primate ES cell culture medium. After culturing for 24 hours, the culture supernatant of MEF culture was collected, filtered through a 0.22 ⁇ m filter, and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • a 20-bp random sequence named “do” was introduced into the Notl / Sall site of the Oct3 / 4 expression vector. In order to prevent contamination between experiments, a unique percode was used in each experiment.
  • the open reading frames of human Sox2, Kl and c-Myc were also amplified by RT-PCR and subcloned into pENTR-D-TOPO (Invitrogen). All genes that were subcloned into pENTR-D-TOPO were introduced into the pMXs retroviral vector using the Gateway Cloning System (Invitrogen) according to the instructions.
  • the mouse Slc7al open reading frame was also amplified, subcloned into ENTR-D-TOPO, and introduced into pLenti6 / UbC / V5-DEST (Invitrogen) by the gateway system.
  • the regulatory regions of human Oct3 / 4 gene and REX1 gene were amplified by PCR and subcloned into pCRXL-T0P0 (Invitrogen).
  • PhOCT4_Luc and phREXl-Luc the fragment removed from the pCRXL vector by Kpnl / Bglll digestion was subcloned into the Kpnl / Bglll site of pGV-BM2.
  • hMYC-SlOll CAA CAA CCG AAA ATG CAC CAG CCC CAG c-Myo Tg PCR pMXs-AS3200 TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG Tg PCR pMXs- L3205 CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA Tg PCR hOct3 / 4-S1165 GAC AGG GGG AGG GGA.
  • hGDF3-S243 CTT ATG CTA CGT AAA GGA GCT GGG GDF3 RT-PCR hGDF3-AS850 GTG CCA ACC CAG GTC CCG GAA GTT
  • hREXI-RT-U CAG ATC CTA AAC AGC TCG CAG AAT REX1 RT-PCR hREXI-RT-L GCG TAC GCA AAT TAA AGT CCA GA
  • hFGF4-RT-U CTA CAA CGC CTA CGA GTC CTA CA FGF4 RT-PCR hFGF4-RT-L GTT GCA CCA GAA AAG TCA GAG TTG
  • hECAT15- 1-S532 GGA GCC GCC TGC CCT GGA AAA TTC DPPA4 RT-PCR hECAT15-l-AS916 TTT TTC CTG ATA TTC TAT TCC CAT
  • hF0XA2-S208 TGG GAG CGG TGA AGA TGG AAG GGC
  • F0XA2 RT-PCR hF0XA2-AS398 TCA TGC CAG CGC CCA CGT ACG ACG AC
  • hS0X17-S423 CGC TTT CAT GGT GTG GGC TAA GGA CG S0X17 RT-PCR hS0X17-AS583 TAG TTG GGG TGG TCC TGC ATG TGC TG
  • hAADC-S1378 CGC CAG GAT CCC CGC TTT GAA ATC TG AADC RT-PCR hAADC- AS1594 TCG GCC GCC AGC TCT TTG ATG TGT TC
  • hDAT-S 1935 ACA GAG GGG AGG TGC GCC AGT TCA CG
  • PLAT-E packaging cells were plated on 8 ⁇ 10 6 cells / 100 mm dish and cultured for a while. Next day, using Fugene6 transfection reagent (Roche) on PLAT-E cells The pMXs vector was transferred. After 24 hours of transfusion, the medium was replaced with a new medium, and after 24 hours, the culture supernatant was recovered as a virus-containing solution.
  • mouse fibroblasts (HDFa-Slc7al) expressing mouse Slc7al gene were adjusted to 8 10 5 cells / 100 mm dish and seeded.
  • Virus-containing solution is filtered through a pore size of 0.4 5 / zm off Iruta, supplemented with 4 beta g / ml Poripuren. Equal amounts of the supernatants containing each of the four retroviruses were mixed and transferred to HDFa-Slc7al dishes to be infected at a glance. After 24 hours, the supernatant containing the virus was removed and replaced with fresh medium. Six days later, HDF a-Slc7al cells were collected by trypsin treatment, adjusted to 5 ⁇ 10 4 cells / 100 mm dish on the SNL feeder cell layer, and seeded again.
  • PCR was performed with ExTaq (Takara). Quantitative PCR was performed using Platinum SYBR Darine qPCR Supermix UDG (Invitrogen) and analyzed by 7300 real-time PCR system (Applied system). Primer sequences are shown in Table 8.
  • Alkaline phosphatase staining was performed using a leukocyte alkaline phosphatase kit (Sigma).
  • a leukocyte alkaline phosphatase kit (Sigma).
  • cells were fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature. After washing with PBS, cells are treated with PBS containing 5% normal goat or donkey serum (Chemicon), 1% sushi serum albumin (BSA, Nacalai Tesque), and 0.1% Triton X-100 for 45 minutes at room temperature. did.
  • SSEA1 as primary antibody (1: 100 diluted) , Developmental Studies Hybridoma Punk), SSEA3 (diluted 1:10, donated by Dr, Peter W.
  • Nanog diluted 1:20, AF1997, R & D system
  • iS III Tupulin diluted 1: 100, CB412, Chemicon
  • glial fibrillary acidic protein (1:50 0) Diluted, Z0334, octopus
  • alpha smooth muscle actin diluted, ⁇ 1584, octopus
  • desmin 1: 100 diluted love vision
  • vimentin diluted 1: 100, SC-6260, Santa Cruz '
  • fetop Tin (1: 100 diluted, MAB1368, R & D system
  • Tyrosine hydroxylase (1: 100 diluted, ⁇ 152, Chemi Con) was used.
  • Secondary antibodies include cyanine3 (Cy3) -conjugated goat anti-Hg (1: 500 scale, Jackson'Immuno Research), Alexa546-conjugated goat anti-mouse IgM (1: 500 diluted, Invitrogen), Alexa 488-conjugated goat anti Usagi I g G (1: 500 dilution, Inbitoroji E down), Alexa 488 conjugated donkey anti-catcher formic IgG (1: 500 dilution, Invitrogen), Cy3 binding catcher formic anti-mouse IgG (1: 500 dilution, Chemicon) , And Alexa 488-conjugated goat anti-mouse IgG (diluted 1: 500, Invitrogen). Nuclei were stained with 1 ⁇ g / ml Hoechst 33342 (Invitrogen).
  • PA6 feeder cells were first seeded on gelatin-coated 6-well plates and incubated for 4 days until confluent.
  • the small chunks of iPS cells cultured via the EBs added on PA6 feeder single cell layer, 1 0% KSR (Invitrogen), 1 X 10-4 M non-essential amino acids, and 1 X 10- 4 M 2- Merukapute Tano -Glass containing 0.5% penicillin and streptomycin
  • iPS cells were maintained on Matrigue-coated plates in MEF-CM supplemented with 4 ng / ml bFGF for 6 days. Thereafter, the cells were cultured for 24 hours in a medium supplemented with RPMI1640 supplemented with B27 supplement (Invitrogen) (RPMI / B27) with 100 ng / ml human recombinant activin A (R & D system), followed by 10 Additional 40 ng / ml human recombinant bone morphogenetic factor 4 (BMP4, R & D system) was placed. After stimulation with site force in, cells were maintained in RPMI / B27 without site force in. The medium was changed every other day.
  • Genomic DNA (1 ig) was processed using the Cp genomic DNA modification kit (Chemicon) according to the method recommended by the manufacturer.
  • the treated DNA was purified using a QIA quick column (QIAGEN).
  • the promoter regions of human Oct3 / 4, Nanog, and Rexl genes were amplified by PCR.
  • the PCR product was subcloned into pCR2.1-TOPO.
  • the 10 clones of each Sampnore were sequenced using the M13 euversal primer. Table 8 shows the primer sequences used for PCR amplification.
  • Each reporter plus'mid (1 g) containing the firefly luciferase gene was introduced into HI HPS cells or HDF using 50 ng of pRL-TK (Promega). 48 hours after gene transfer, cells were lysed with 1 X Passive lysis buffer (Promega) and incubated at room temperature for 15 minutes. Luciferase activity was measured according to the manufacturer's protoconores using a Dual Luciferase Reporter Atsey System (Pug Mega) and Centra LB 960 Detection System (Versold).
  • the cells were collected by collagenase IV treatment, collected in a tube, centrifuged, and the pellet was suspended in DMEM / F12. A quarter of the confluent 100 mm dish force was injected subcutaneously into the dorsal flank of SCID mice (CLEA Japan). Nine weeks later, the tumor was excised, weighed, and fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde. Nophine embedded tissue was sliced and stained with hematoxylin and eosin. [0107] 11. Western plot
  • the membrane was blocked with TBST (20 mM Tris-HC1, ⁇ 7.6, 136 mM NaCl, and 0.1% Tween-20) containing 1% skim milk, and then reacted with the primary antibody at 4 ° C for 1 hour. . After washing with TBST, the membrane was reacted with a horseradish peroxidase (HRP) -conjugated secondary antibody for 1 hour at room temperature. The signal was detected by Immobilon Western chemiluminescence HRP substrate (Millipore) and LAS3000 imaging system (Fuji Film).
  • HRP horseradish peroxidase
  • Primary antibodies include anti-Oct3 / 4 (1: 600 diluted, SC-5279, Santa Cruz '), anti-Sox2 (1: 2000 diluted, AB5603, Chemicon), anti-Nanog (1: 200 diluted, R & D system), anti-Klf4 (1: 200 diluted, SC-20691, Santa Cruz), anti-c_Myc (1: 200 diluted, SC-764, Santa Cruz), anti-E-cadherin (l: diluted 1000, 610182) , BD Biosciences), anti-Dppa4 (1: 500 diluted, ab31648, Abcam), anti-FoxD3 (1: 200 diluted, AB5687, Chemicon), anti-telomerase (1: 1000 diluted, ab23699, Abcam), anti-Sall4 (Diluted 1: 400, ab29112, Abcam), anti-Lin28 (diluted 1: 500, AF3757, R & D system), anti- ⁇ -actin (diluted 1: 5000, ⁇ 5441, Sigma
  • Genomic DNA (5 ⁇ g) was digested with Bglll, EcoRI and Ncol. Digested DNA fragments were separated on a 0.8% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Amersham).
  • PCR was performed using the Powerplex 16 system (Promega) and analyzed using the ABI PRISM 3100 Genetic analyzer and Gene Mapper v3.5 (Applied Biosystem). Chromosome G panda analysis was performed at the Japan Genetic Research Institute (Japan).
  • telomerase activity was detected using the TRAPEZE telomerase detection kit (Chemicon) according to the instruction manual. Samples were separated by 10% acrylamide non-denaturing gel electrophoresis based on TBE. The gel was stained with SYBR Gold (1: 10000 diluted, Invitrogen).
  • RNA of HDF and hiPS cells was labeled with Cy3.
  • Samples were hybridized with whole human genome microarray 4 44K (G4112F, Agilent). Each sample was hybridized once with one color protocol. The array was scanned using a G2565BA microarray scanner system (Agilent) and the data analyzed using GeneSpringGX 7.3.1 software. Two kinds of standardization methods were applied. First, a signal intensity of less than 0.01 was set to 0.01. Each chip was then normalized to the 50th percentile of measurements taken from that chip.
  • IPS clones contain several retroviral integrations for each gene. Each clone has a total of more than 20 retroviral integration sites, which may increase the risk of tumor formation.
  • iPS cells could be established using family genes of four genes, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c_Myc.
  • mouse embryonic fibroblasts (MEF) containing the green fluorescent protein (GFP) -IRES-Pun transgene regulated by the Nanog gene regulatory element were used (Okita et al, Nature, 448, pp .313-317, 2007). Nanog is specifically expressed in mouse ES cells and preimplantation embryo cells (Chambers et al., Cell, 113, pp.643-655, 2003; Mitsui et al, Cell, 113, pp.63 to 642, 2003), is useful as a selection marker in iPS cell induction.
  • IPS cells selected with Nanog are indistinguishable from ES cells and have been shown to produce germline-competent chimeric mice (Wernig et al., Nature, 448, pp.318). -324, 2007; Okita et al., Nature, 448, pp.313-317, 2007; Maherali et al., Cell Stem Cell, 1, pp.55-70, 2007).
  • Oct3 / 4 belongs to the Oct family transcription factor containing the POU domain (Ryan et al, Genes Dev 11: 1207-25, 1997).
  • the homologues closest to Oct3 / 4 are Octl and Oct6. 0 3/4, Octl or Oct6 was introduced into the Nanog reporter MEF by retrovirus together with the remaining 3 genes.
  • Oct3 / 4 many GFP positive colonies were observed ( Figure 23).
  • Sox 2 belongs to a Sox (SRY-related HMG box) transcription factor characterized by the presence of a high-mobility group (HMG) domain (Sch. Ers et al., Dev. Cell, 3 , pp.167-170, 2002). Tested for Soxl, Sox3, Sox7, Soxl5, Soxl7, and Soxl8 When Soxl was used, GFP positive colonies were obtained. A small number of GFP positive colonies were also obtained when Sox3, Soxl5, and Soxl8 were used (FIG. 23a).
  • ⁇ 3 ⁇ 4 belongs to Kruppel-like factor (Klfs), a zinc finger protein containing a similar amino acid sequence (Dang et al., Int. J. Biochem) Cell Biol., 32, pp. 1103-1121, 2000). Tests were performed on Klfl, Klf2, and Klf 5, and GFP-expressing colonies were obtained when Klf2 was used (FIG. 23a :). IPS cells could also be induced when Klfl and Klf5 were used.
  • Klfs Kruppel-like factor
  • C-Myc has two related genes (N-Myc and L-Myc) (Adhikary et al.,
  • Ng Nanog-GFP-IRES- Puro r repo Ichita one
  • GFP CAG-EGFP
  • the expression level of the ES cell marker gene is lower in the iPS cells by Fbxl5 selection prepared using 4 genes than in ES cells (Takahashi et al., Cell, 126, pp.663-6 76, 2006). These iPS cells cannot produce adult chimeric mice when microinjected into blastocysts, but iPS cells produced without c-Myc are comparable to ES cells even when Fbxl5 selection is used.
  • the ES cell marker gene was expressed at the level of the level (Fig. 26B).
  • iPS cells prepared without using C-Myc adult chimeric mice were obtained with high iPS cell contribution ratio (Fig. 27, Table 9). Increased incidence of tumor formation was not observed in these chimeric mice.
  • chimera mice derived from iPS cells established by 4 genes were derived from iPS cells established by 3 genes without c-Myc, in which 6 out of 37 chimeric mice died due to tumor within 100 days after birth. Since all 26 chimeras survived within the observation period (less than 4 months), the risk of tumorigenicity may be reduced by using c-Myc. It became clear.
  • Adenoreto TTF with DsR ed recombinant gene (Vintersten et al., Genesis, 40, pp.241-246, 2004) that has a selectable marker but is regulated by a constitutively active promoter Therefore, iPS cells were prepared. Three genes excluding 4 genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc) or c-Myc were introduced into the cells. In addition, GFP retrovirus was introduced to monitor silencing. 4 gene introduced 0.5 X 10 5 cells forces the drug to about 1,000 colonies without selection after 30 days appeared. Most of these were GFP positive, indicating that no retroviral silencing occurred in these cells.
  • RT-PCR confirmed that Klf4 retrovirus silencing and the absence of the c-Myc transgene were confirmed in iPS cells prepared using 3 genes, and these iPS cells were transplanted into blastocysts. In this case, chimeric mice were obtained (FIG. 28D and Table 9). Based on the above results, iPS cells with excellent characteristics can be obtained without using C-Myc, and iPS cells can be efficiently produced from Adanoreto TTF without using drug selection. It has been shown.
  • Example 19 The experimental materials and methods in Example 19 are as follows.
  • the coding region of the family gene was amplified by RT-PCR using the primers listed in Table 11 (SEQ ID NOs: 127 to 152 in the Sequence Listing), subcloned into pDONR201 or pENTR-D-TOPO (invitrogen), and the LR reaction ( Invitrogen) was linked to pMXs-gw.
  • Retroviral vectors based on pMXs were transfected into PLAT-E cells (Morita et al., 7, pp.1063-1066, 2000) using Fugene 6 reagent (Roche) according to the manufacturer's instructions . After 24 hours, the medium was changed. After 24 hours, the virus-containing supernatant was collected, and gene transfer was performed by retrovirus infection. In the “mixing” protocol, a mixture of vectors each containing 4 genes is used to make a single dish of PLAT-E cells. The gene was introduced. In the “individual” method, each vector was transfected into a separate dish containing PLAT-E cells. Virus containing supernatant was mixed prior to gene transfer. Significantly higher gene transfer efficiency S was observed in the “individual” method.
  • TTF was also isolated from adult Nanog reporter mice or adult DsRed transgenic mice (Vintersten et al., Genesis, 40, pp. 24 246, 2004).
  • Retrovirus-containing supernatants were prepared by “individual” method. For introduction of the 4 genes, Klf4, c-Myc, Oct3 / 4, Sox2. And DsRed retrovirus-containing supernatants were mixed at a ratio of 1: 1: 1: 1: 4. When 3 genes were introduced, Klf4, Oct3 / 4, Sox2, Mock (empty vector), and DsRed retrovirus-containing supernatants were mixed at a ratio of 1: 1: 1: 1: 4.
  • Klf4, Oct3 / 4, Sox2, Mock empty vector
  • DsRed retrovirus-containing supernatants were mixed at a ratio of 1: 1: 1: 1: 4.
  • TTF was seeded at a rate of 8.0 x 10 5 cells per dish in a 100 mm dish without a feeder cell layer. Viral nopolyprene-containing supernatant was added to TTF and infected for 24 hours.
  • TTF into which 3 genes had been introduced was seeded again in a 100 mm dish having a single cell layer of SNL feeder at a rate of 3.5 ⁇ 10 5 cells per dish and cultured in a medium for ES cells.
  • TTF into which 4 genes had been introduced was reconstituted at a rate of 0.5 ⁇ 10 5 cells per dish in a 100 mm dish having a single cell layer of SNL feeder.
  • 30 to 40 days after gene transfer The number of colonies was measured after day. A portion of the colony was selected and passaged.
  • RT-PCR and teratoma formation were performed as previously reported.
  • 15-20 iPS cells were injected into a BDF1-derived blastocyst and transplanted into the uterus of a pseudopregnant mouse
  • Example 20 Establishment of human HPS cells from epithelial cells using 6 genes
  • PLAT-E cells were seeded and cultured in a 6 cm petri dish. The next day, the cells were treated with 9.0 g of a retroviral vector based on pMX containing Klf4, c-Myc, Oct3 / 4, Sox2, Nanog, and Lin28, using 27 ⁇ l of Fugene6 transfection reagent (Roche). I did a transfer exercise. After 24 hours, the medium was replaced with fresh medium. On the next day, the supernatant of PLAT-E cells was collected and filtered through a cellulose acetate 'filter (Whatman) having a pore size of 0.45-m. Seven days after the lentivirus infection, the epithelial cells were reseeded in a 3.0 ⁇ 10 6 cm dish, and the culture supernatant containing retrovirus and polyprene was added thereto.
  • Fugene6 transfection reagent Fugene6 transfection reagent
  • Table 12 shows the results of two experiments.
  • the first experimental result shows the number of colonies of cells induced by introducing the combination of each gene on the 23rd or 29th day after gene introduction
  • the second experimental result (Day23 in the right column) is "6F”
  • “-KM” and “-NL” indicate the number of colonies.
  • 'Do not introduce Lin-28 like Shiji! / Because the number of colonies of cells is smaller than the number of colonies when Lin-28 is introduced, Lin28 improves iPS cell establishment efficiency It was shown that they have an important role to play.
  • T4F 6 genes (Klf4, c-Myc, Oct3 / 4, Sox2, Nanog, and Lin28), and 2 different combinations of 4 genes (Kl, c-yc, Oct3 / 4, and IPS cells were induced using Sox2 and Oct3 / 4, Sox2, Nanog, and Lin28) shown as T4F in FIG. T4F is the same combination as disclosed in Yu et al., Science, 318, pp, 1917-1920, 2007.
  • “ES-like” indicates the number of colonies that are morphologically similar to the colonies of ES cells
  • total indicates the total number of ES-like colonies and non-ES-like colonies.
  • Exp # l, Exp # 2, Exp # 3, and Expft4 show the results of individual experiments.
  • iPS cell colonies having morphology similar to ES-like cell colonies were obtained by using a combination of 6 genes and 4 genes of Y4F.
  • T4F colonies having a morphology similar to that of ES-like cell colonies were not observed.
  • Example 21 Efficient generation of iPS cells using Sall4
  • Example 22 iPS cell induction promoting effect of mouse Sall4 and Z or mouse Salll
  • human skin-derived fibroblasts in which the mouse echotrophic receptor Slc7a gene was expressed using lentivirus were transferred to human-derived 4 Gene (Y4F: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc) or 3 genes (Y3F: Oct3 / 4, Sox2, and Klf4) and mouse Sall4 (mSall4) gene or mouse Salll (mSalll) gene It was introduced using retrovirus.
  • HDF was collected once, and then HDF adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells was seeded on STO cells treated with 1.5xl0 6 mitomycin C.
  • the cells were cultured in a primate ES cell culture medium (Reprocell) containing 4 ng / ml recombinant human bFGF (WAKO). The results of counting the number of ES cell-like colonies on days 32 and 40 after infection are shown in FIG.
  • Example 23 iPS cell induction promoting effect of mouse Sall4 and Z or mouse Salll (2)
  • HDFa-Slc7al Human adult skin-derived fibroblasts (HDFa-Slc7al) expressing the murine epithelial receptor Slc7a using lentivirus in accordance with the previously reported method (Cell, 131, pp.861-872, 2007)
  • HDFa-Slc7al was recovered once, and then adjusted to 5 10 5 HD Fa-Sic 7al was seeded on STO cells treated with 1.5 x 10 6 mitomycin C . After further culturing for 7 days, the cells were cultured in a primate ES cell culture medium (Reprocell) containing recombinant human 4 ng / ml bFGF (Wako Pure Chemical Industries). ES cell-like colonies 32 and 40 days after infection 0365
  • Figure 35 shows the result of counting the numbers.
  • the number of colonies when T3F + Mock and T4 F + Mock were introduced was 0, whereas when mSall4 was introduced at the same time as T3F or T4F, T3F + Two colonies were observed in the mSall4-introduced group.
  • T4F + mSall4-introduced group no human ES cell-like mouth was observed.
  • Example 24 Human Sall4 promotes iPS cell induction
  • HDFa-Slc7al human adult skin-derived fibroblasts expressing mouse echotropic receptor Slc7a using lentivirus
  • Four genes Y4F: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc
  • 3 genes Y3F: Oct3 / 4, Sox2, KM
  • human Sall4 hSall4
  • aHDF-Slc7al expressing the murine etropic virus receptor Slc7al gene were prepared according to a previously reported method (Cell, 131, pp.861-872, 2007). This aHDF- Slc7al was seeded at a rate of 3 x 10 5 pieces / 60 mm dish, and the next day, 4 human-derived genes (Oct3 / 4, Klf4, and Sox2 3 genes were prepared according to the method described in the above publication.
  • L-Mycl hereinafter simply referred to as “L-Myc”), c-Myc, or N-Myc gene) were introduced by retrovirus.
  • Cells were harvested 6 days after virus infection and plated on MSTO cells ( 5 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish). From the next day, the cells were cultured in a medium in which 4 ng / ml recombinant human bFGF (Wako Pure Chemical Industries) was added to a primate ES cell culture medium (Reprocell).
  • Reprocell a primate ES cell culture medium
  • FIG. 37 is a graph of Table 13, and the values on the graph indicate the ratio of the number of iPS cell colonies to the total number of colonies).
  • L-Myc iPS cell colony induction efficiency is 6 times higher than c-Myc.
  • the ratio of the number of iPS cell colonies to the total number of colonies was also about 2 times higher when L-Myc was used than when c-Myc was used.
  • An increase in the number of iPS cell colonies was also observed when N-Myc was used compared to c-Myc.
  • HI HPS cells 32R6 established by transfecting Oct3 / 4, Klf4, Sox2, and L-Myc 4 genes were transformed into recombinant human bFGF (4ng / mI) and Rho kinase inhibitor Y-27632 (10 ⁇ ) Including It was cultured in a primate ES cell culture medium (ReproCELL). One hour later, the cells were collected by treatment with collagen IV, centrifuged, and the cells were collected and suspended in DM EM / F12 containing Y-27632 (10 ⁇ ). One quarter of the cells (100 mm dish) that became confluent were injected into the testis of SCID mice.
  • the tumors were minced and fixed with PBS (-) containing 4% formaldehyde. Paraffin-embedded tissue was sliced and stained with hematoxylin. The results are shown in FIG. Histologically, the tumor is composed of multiple types of cells, and nerve tissue, intestinal tract-like tissue, cartilage tissue, hair tissue, adipocyte, and pigment tissue ”were observed. The ability was proved.
  • MEF was isolated (ME F_Ng) from a mouse (Nature, 448, pp.313-317, 2007) having a Nano g reporter prepared by incorporating EGFP and a puromycin-resistant I "raw gene into the Nanog locus.
  • MEFs were isolated (MEF-Fbx) from mice (Cell, 126, pp.663-676, 2006) having Fbxl5 reporters prepared by incorporating the ⁇ -geo gene into the Fbxl5 locus.
  • IPS cells were established by introducing genes (Oct3 / 4, Klf4, Sox2, and L-Myc) using retrovirus, selecting MEF-Ng with puromycin, and selecting MEF_Fbx with G418.
  • IPS cells reprogrammed with 4 genes of Oct3 / 4, Klf4, Sox2 and c-Myc were used.
  • 6 out of 37 chimeric mice died of the tumor within 100 days after birth (Nature Biotech., 26, pp.101-106, 2008), but instead of c-Myc, L-Myc It has been found that the use of sapphire significantly improves the number of living S and dramatically reduces tumorigenesis. '
  • the cells are cultured in an ES cell culture medium (DMEM (Nacalai Task)) with 15% fetal calf serum, 2 mM L-gnolectamine (Invitrogen), 100 M non-essential amino acid (Invitrogen), 100 M 2-mercapto
  • DMEM Non-fetal calf serum
  • Invitrogen 1 M non-essential amino acid
  • Invitrogen 100 M 2-mercapto
  • the cells were cultured using ethanol (invitrogen), 50 U / mL penicillin (Invitrogen) and 50 mg / mL streptomycin (Invitrogen).
  • the virus infectivity also picked up a GFP positive colony on day 46 (iPS_MEF-Ng-443-3 clone).
  • Figure 40 shows a photograph of the 16 cells that were picked up. All the cells were iPS cell colonies showing GFP positive.
  • RT-PCR and genomic-PCR were performed on clones derived from these GFP-positive colonies in order to examine gene expression. The results are shown in FIG. All clones expressed ESg marker genes, Nanog, Rexl, and ECAT1. In addition, three genes (Oct3 / 4, Klf4, and L-Myc) introduced in all iPS cell colonies were integrated into the genome. On the other hand, there were clones in which mRNA expression was not detected.
  • the four clones established in (1) (iPS-MEF-Ng-443-3-3, iPS-MEF-Ng-443-3-6, iPS-MEF-Ng-443-3-12, and iPS- MEF- Ng- 443- 3- 13) were seeded into low- binding dish (2 x 10 6 cells / 6 ⁇ El plates), embryoid bodies (embryoid body: EB) to form a.
  • ⁇ - fetoprotein R & D Systems
  • a marker for endoderm cell differentiation a marker for endoderm cell differentiation
  • ⁇ -smooth muscle induction a marker for mesoderm cell differentiation
  • ectoblast Staining was performed using each antibody of III-tupurin (Chemicon), a differentiation marker of the leaf system. The results are shown in FIG. The expression of these markers was confirmed by staining, and the obtained mouse iPS cells were confirmed to have the ability to differentiate into the three germ layer system.
  • the four clones established in (1) (iPS_MEF-Ng-443-3-3, iPS-MEF-Ng-443-3-6, iPS-MEF-Ng-443-3-12, and iPS-MEF- Ng-443-3-13) was injected under the skin of nude mice. After 4 weeks, teratoma formation was confirmed in all cases. Histologically, the tumor is composed of multiple types of cells, and nerve tissue, gut-like tissue, muscle tissue, epidermal tissue, and cartilage tissue were observed (Fig. 43). The ability was proved.
  • Example 26 Effects of L-Myc and Lin28 on induction of HPS cells
  • aHDF-Slc7al expressing the murine etropic virus receptor S1 c7a1 gene according to the method described previously (Cell, 131, pp.861-872, 2007) did.
  • the aHDF_Slc7al was sown at a rate of 3 ⁇ 10 5 pieces / 60 mm dish, and the following day, the following 3 genes, 4 genes, or 5 genes derived from human were introduced by retrovirus according to the method described in the above publication.
  • Lin28 markedly increased the number of iPS cell colonies.
  • the number of iPS cell colonies was significantly higher than when Lin28 was added to the four genes of Sox2, Oct3 / 4, Klf4, and c-Myc.
  • Lin28 also showed a synergistic effect on the action of L-Myc, which showed a synergistic effect on the action of c-Myc (Table 14).
  • the ratio of iPS cell colonies to the total number of mouths was also very high (84.7%) when using Sox2, 0 ct3 / 4, Klf4, L-Myc, and Lin28 5 genes. From the above results, it was revealed that the combination of 5 genes of Sox2, Oct3 / 4, Klf4, L-Myc, and Lin28 is extremely effective for improving the induction efficiency of human iPS cells.
  • Example 27 Effects of Myc chimeric gene and mutant gene on human iPS cell induction
  • Myc chimeric genes (Ms-cL-Myc, Ms-Lc-Myc, Ms-cLc-Myc, Ms-LcL-Myc, Ms-ccL-Myc, Ms-cLL-Myc, Ms-LLc- Myc, Ms-Lcc-Myc) and Myc point mutation genes (c-MycW135E, c-MycV394D, c-MycL420P, L-MycW96E, L-MycV325D, L-MycL351P) were constructed as follows.
  • mice c-Myc (Ms-c-Myc) and L-Myc ( ⁇ 3- and- ⁇ 0) are respectively incorporated into 5 ⁇ « ⁇ -0-lower 0? 0 (10 0 60) and ENTR-D -TOP 0 -Ms-c-Myc and pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc were prepared.
  • primers for introducing the point mutation shown in FIG. 45 based on the sequence information of mouse c-Myc (NCBI Acc.No.N_010849) and L-Myc (NCBI Acc.No. NM_008506).
  • PCR was carried out using pE NTR-D—TOPO-Ms-c-Myc and pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc as saddles.
  • the retroviral vector p Subcloned into MXs For the chimeric Myc shown in Fig. 45, each fragment was amplified with PCR, PCR was performed using the mixture of each fragment as a saddle, and subcloned into the pMXs of the retroviral vector as before. did.
  • Each retroviral vector obtained and the Sox2, Oct3 / 4, and Klf4 retroviral vectors used in Example 25 were prepared in adult skin-derived fibroblasts (aHDF-Slc7al) in the same manner as in Example 25. The number of total colonies and total HPS cell colonies (WPS colonies) that appeared on the 31st day after retrovirus infection was counted. The results are shown in FIG. 46 and Table 15 (FIG. 46 is a graph of Table 15).
  • 1 ⁇ ⁇ and Shin-1 ⁇ are nearly 100% identical in amino acid level in humans and mice. As shown in Figure 46 and Table 15. When mouse genes (Ms-c-Myc and Ms-L-Myc) were used, as in the case of human genes (c-Myc and L-Myc), c ⁇ Myc and L-Myc were confirmed to have substantially the same functions as human c-Myc and L-Myc.
  • the present invention provides a safe method for producing induced pluripotent stem cells and an efficient method for producing induced pluripotent stem cells.

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Abstract

　体細胞から安全な人工多能性幹細胞を効率的に製造する方法であって、下記の3種の遺伝子：Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子を体細胞に導入する工程を含む方法、又は下記の2種の遺伝子：Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ又は下記の2種の遺伝子：Octファミリー遺伝子及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせと、下記の3種の遺伝子から選ばれる少なくとも1種の遺伝子：L-Myc、Sall1、及びSall4とを体細胞に導入する工程を含む方法。

Description

明 細 書
核初期化方法
技術分野
[0001] 本発明は分化した体細胞を初期化して人工多能性幹細胞を製造する方法に関す るものである。
背景技術
[0002] 胚性幹細胞（ES細胞）はヒトゃマウスの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体に 存在する全ての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期にわたって培養する ことができるという特徴を有している。この性質を利用してヒト ES細胞はパーキンソン 病、若年' f生糖尿病、白血病など多くの疾患に対する細胞移植療法の資源として期待 されている。し力しながら、 ES細胞の移植は臓器移植と同様に拒絶反応を惹起してし まうという問題がある。また、ヒト胚を破壊して樹立される ES細胞の利用に対しては倫 理的見地から反対意見も多レ、。
[0003] 患者自身の分化体細胞を利用して脱分化を誘導し、 ES細胞に近 V、多能性や増殖 能を有する細胞（この細胞を本明細書にお V、て「人工多能性幹細胞」又は「iPS細胞」 と呼ぶが、この細胞は「誘導多能性幹細胞」、「胚性幹細胞様細胞」、又は「ES様細胞 Jと呼ばれる場合もある）を樹立することができれば、拒絶反応や倫理的問題のなレヽ 理想的な多能性細胞として利用できるものと期待される。最近、この iPS細胞をマウス 及びヒトの体細胞力 製造できることが報告され、極めて大きな反響を呼んでレ、る (国 際公開 WO2007/69666; Cell, 126， pp.663- 676, 2006; Cell, 131, pp.861- 872, 2007)
[0004] 上記の方法は複数の特定因子 (Cell, 126, pp. 663-676, 2006では Oct3/4、 Sox2、 K lf4、及び c-Mycの 4因子が用いられている)を体細胞に導入して初期化を行う工程を 含んでおり、因子の導入にはレトロウイルスベクターが用いられている。しかしながら、 c - Mycはがん関連転写因子であり、 c-Mycを含む上記の 4因子を体細胞に導入して 初期化を行った場合には、得られた人工多能性幹細胞から分化誘導した細胞や組 織が腫瘍ィ匕する可能性も否定できなレ、。レトロウイルスベクターを用レ、て ES細胞に遺 伝子を導入すると遺伝子がサイレンシングを受けることが知られており、レトロウイルス ベクターを用いて作製された上記の iPS細胞においても導入した遺伝子がサイレンシ ングを受けてレ、ることが確認されてレ、るが (国際公開 WO2007/69666の実施例 7)、導 入した外因性の c - Mycが子孫の個体にぉレ、ても発現しなレ、保障はなレ、。 C- Mycを用 いずに Oct3/4、 Sox2、 Lin28、及び Nanogの 4因子で核初期化を行う方法カ讣ムソンら により提案されている (Science, 318, pp.1917-1920, 2007;国際公開 WO2008/11882 0)。しかしながら iPS細胞の研究開発は、世界的に見ても、依然として Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び c - Mycの 4因子主体で進められてレ、るのが現状である。
[0005] なお、上記国際公開 WO2007/69666には Mycファミリー遺伝子を用いずにサイト力 インで置き換えることができることが教示されており、上記公報の実施例 5には、 C- My cに換えて塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)を用いることにより核初期化が可能に なることが具体的に示されている。また、上記の国際公開には初期化因子の候補とし て選択された 24種類の遺伝子のなかに Sall4が含まれることが示されているものの (表 4の No.13)、 Sall4が核初期化活性を有することは示されていない。また、 Mycファミリー 遺伝子の一つである L- Myc又は N- Mycを Oct3/4、 Sox2、及び Klf4と組合わせること により c - Mycと同程度の効率で iPS細胞を樹立できることが示されている (実施例の例 6 )。
特許文献 1：国際公開 WO2007/69666
特許文献 2：国際公開 WO2008/118820
非特許文献 1： Cell, 126, pp. 663-676, 2006
非特許文献 2: Cell, 131， pp. 861-872, 2007
非特許文献 3 : Science, 318， pp.1917-1920, 2007
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の課題は、安全な人工多能性幹細胞を製造する方法を提供することにある 。より具体的には、人工多能性幹細胞を分ィヒ誘導して得られる細胞や組織において 腫瘍化の懸念のない安全な人工多能性幹細胞を提供することが本発明の課題であ る。 また、本発明の別の課題は、人工多能性幹細胞を効率的に製造する方法を提供 することにある。
本発明の特に好ましい課題は、上記の安全な人工多能性幹細胞を効率的に製造 する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、 c - Mycを用レ、ること なく安全な人工多能性幹細胞を製造できることを見出した。
また、本発明者らは、 c- Mycを用いることなぐ L-Myc, Salll、又は Sall4を用いて核 初期化を行うことにより、分化誘導して得られる細胞や組織において腫瘍ィヒの懸念の なレ、安全な人工多能性幹細胞を提供できること、及びこの方法により極めて効率的 に安全な人工多能性幹細胞を製造できることを見出した。
本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
[0008] すなわち、本発明により、体細胞力 人工多能性幹細胞を製造する方法であって、 下記の 3種の遺伝子： Octファミリー遺伝子、 Klf アミリー遺伝子、及び Soxファミリー遺 伝子を体細胞に導入する工程を含む方法が提供される。
[0009] この方法の好まし 、態様によれば、下記の 3種の遺伝子： Octファミリー遺伝子、 Klf ファミリー遺伝子、及び Soxファミリー遺伝子を体細胞に導入した後、該細胞が多能性 ■ を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり該細胞を培養する工程を含む方法が 提供される。
この方法の別の好ましい態様によれば、下記の 3種の遺伝子： Oct3/4、 Klf4、及び S ox2を体細胞に導入する工程を含む方法;及び下記の 3種の遺伝子： Oct3/4、 Klf4、 及び Sox2を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な 時間にわたり該細胞を培養する工程を含む方法が提供される。
[0010] また、この方法のさらに別の好ましい態様によれば、 Octファミリー遺伝子を含むウイ ルスィベクター、 Kl アミリー遺伝子を含むウィルスベクター、及び Soxファミリー遺伝 子を含むウィルスベクターをそれぞれ別のパッケージング細胞にトランスフエタトして 該細胞を培養することにより 3種類の培養上清を得る工程、及び上記工程により得ら れた 3種類の培養上清の混合物を調製し、該混合物を用レ、て体細胞の初期化を行う 工程を含む上記の方法が提供される。
さらに、この方法の別の好ましい態様により、薬剤選キ尺を行わずに体細胞の初期化 を行う工程を含む上記の方法が提供される。 ·
[0011] 上記の方法において、上記の遺伝子導入を必要に応じてサイト力インの非存在下 又は存在下に行うことができ、好ましくはサイト力インの非存在下に行うことができる。 また、上記の培養を必要に応じてサイト力インの非存在下又は存在下に行うことがで き、好ましくはサイト力インの非存在下に行うことができる。
[0012] この発明により提供される人工多能性幹細胞は、分化誘導後に得られる細胞や組 織において腫瘍の発生が実質的に低減ないし排除されている。従って、さらに本発 明により、分化誘導後に得られる細胞や組織にぉレ、て腫瘍の発生が実質的に低減 ないし排除された人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の 3種の遺伝子 :〇 ファミリー遺伝子、 KK7アミリー遺伝子、及ぴ Soxファミリー遺伝子、好ましくは Oct 3/4遺伝子、 Klf4遺伝子おょぴ Sox2遺伝子を体細胞に導入する工程を含む方法が 提供される。
[0013] 別の観点からは、本発明により、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法で あって、下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及ぴ Soxファミリー遺伝子の組み合 わせ又は下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Klf^アミリー遺伝子の組み 合わせと、下記の 3種の遺伝子力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子： L-Myc、 Salll、 及び Sall4とを体細胞に導入する工程を含む方法が提供される。
[0014] 上記の発明の好ましい態様によれば、下記の 2種の遺伝子： Oct3/4及び Sox2の組 み合わせ又は下記の 2種の遺伝子： 0 3/4及ぴ Klf4の組み合わせと、下記の 3種の 遺伝子力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子： L - Myc、 Salll、及び Sall4とを体細胞に 導入する工程を含む上記の方法が提供される。上記の遺伝子に加えて下記の遺伝 子： Lin28及び Z又は Nanogを体細胞に導入する工程を含む方法も好まし V、態様で あり、 Lin28を体細胞に導入する工程を含む方法がより好ましい態様である。上記の 方法において、所望により c - Mycを適宜組合わせて用いることも可能である。
[0015] 上記の発明のさらに好ましい態様によれば、下記の 3種の遣伝子： Octファミリー遺 伝子、 Soxファミリー遺伝子、及ぴ Kl 7アミリー遺伝子の組み合わせ、好ましくは 0 3/ 4、 Sox2、及び Klf4の組み合わせと、下記の 3種の遺伝子力 選ばれる少なくとも 1種 の遺伝子： L- Myc、 Salll、及び Sall4とを体細胞に導入する工程を含む上記の方法が . 提供される。
[0016] より具体的には、下記の 4種の遺伝子： Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及ぴ Salllを体細胞に 導入する工程を含む上記の方法；下記の 4種の遺伝子： Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び Sal 14を体細胞に導入する工程を含む上記の方法；下記の 4種の遺伝子： Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び L-Mycを体細胞に導入する工程を含む上記の方法；下記の 5種の遺伝子： Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 Salll、及び L-Mycを体細胞に導入する工程を含む上記の方法 ；下記の 5種の遺伝子： Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 Sall4、及ぴ L-Mycを体細胞に導入する 工程を含む上記の方法；下記の 5種の遺伝子： Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 Salll,及び Sall4 を体細胞に導入する工程を含む上記の方法;及び下記の 6種の遺伝子: Oct3/4、 So x2、 Klf4、 Salll, Sall4、及ぴ L-Mycを体細胞に導入する工程を含む上記の方法が提 供される。
L - Mycを用レ、る場合には、体細胞がヒト体細胞であることが好ましい。
上記のレ、ずれかの方法にお 、て、さらに Lin28を体細胞に導入する工程を含む方 法も本発明により提供され、好ましい態様として Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 L-Myc,及ぴ U n28を体細胞に導入する工程を含む上記の方法が提供される。
[0017] この発明により提供される人工多能性幹細胞は、分化誘導後に得られる細胞や組 織において腫瘍の発生が実質的に低減ないし排除されている。従って、さらに本発 明により、分化誘導後に得られる細胞や組織にぉレ、て腫瘍の発生が実質的に低減 なレヽし排除された人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の 2種の遺伝子 ： Octファミリー遺伝子及ぴ Soxファミリー遺伝子、好ましくは Oct3/4及び Sox2と、下記 の 3種の遺伝子から選ばれる少なくとも 1種の遺伝子： L-Myc、 Salll,及び Sall4とを体 細胞に導入する工程を含む方法が提供される。この方法において、さらに KK ァミリ 一遺伝子、例えば K を体細胞に導入する工程を含む方法も好ましい態様であり、さ らに Klf アミリー遺伝子とともに又は Klf アミリー遺伝子に換えて Lin28を体細胞に導 入する工程を含む方法も好まし!/、態様である。
[0018] さらに別の観点からは、本発明により、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方 法であって、下記の 6種の遺伝子： Octファミリー遺伝子、 Kl アミリー遺伝子、 Soxファ ミリ一遺伝子、 Mycファミリー遺伝子、 Lin28、及び Nanog、好ましくは下記の 6種の遺伝 子： Oct3/4、 Klf4、 Sox2、 c-Myc, Lin28、及び Nanogを体細胞に導入する工程を含む 方法が提供される。この方法において、 c-Mycに換えて下記の 3種の遺伝子力 選ば れる少なくとも 1種の遺伝子: L - Myc、 Salll、及ぴ Sall4を用いることができ、この方法も 好ましい態様である。
[0019] 上記の各方法において、体細胞への上記遺伝子の導入を組換えベクターにより行 うことができ、上記の各方法において定義される遺伝子の組み合わせ力 選ばれる 少なくとも 1種以上を含む組換えベクターを用レ、て体細胞に該遺伝子を導入すること が好まし！/、。ベクターとしてはウィルスベクター又は非ウィルスベクターのレ、ずれを用 いてもよい。
[0020] さらに、上記の各発明において定義される遺伝子の組み合わせを含む核初期化因 子が本発明により提供される。上記の組み合わせにさらに TERT遺伝子及び Z又は S V40 Large T antigen遺伝子を組合わせることも好ましい。
[0021] また、上記の各発明において定義される遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含 む核初期化因子も本発明により提供され、上記の各発明において定義される遺伝子 の遺伝子産物の組み合わせを含む核初期化因子を体細胞に接触させる工程を含む 方法も本発明により提供される。好ましい態様として、体細胞の培養物中に上記の核 初期化因子を添加する工程を含む上記の方法も提供される。
[0022] 上記の各発明において、体細胞がヒトを含む哺乳類動物、好ましくは霊長類の体細 胞、より好ましくはヒトの体細胞である上記の方法；体細胞がヒト胎児細胞又は成人ヒ ト由来の体細胞である上記の方法;体細胞が患者から採取した体細胞である上記の 方法が提供される。
[0023] 別の観点からは、上記の方法により得ることができる人工多能性幹細胞が本発明に より提供される。また、上記の方法により得ることができる人工多能性幹細胞力 分ィ匕 誘導された体細胞も本発明により提供される。分化誘導された体細胞の集団である 組織、臓器、体液、及ぴ個体も本発明により提供される。
[0024] さらに本発明により、幹細胞療法であって、患者力 分離採取した体細胞を用いて 上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導し、得られた体細胞又はそ の集団である組織、臓器、若しくは体液を該患者に移植する工程を含む療法が提供 される。
さらに本発明により、上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導して 得られる各種細胞を用いて、化合物、薬剤、毒物などの生理作用や毒性を評価する 方法が提供される。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1はヒト成人皮膚線維芽細胞（adult HDF)力 誘導された iPS細胞のアルカリフ ォスファターゼ染色結果を示した図である。マウスレトロウイルス受容体（Slc7al)をレ ンチウィルス感染により発現させた adult HDF(HDFa- Slc7al)に、左段に示した遺伝 子をレトロウイレスベクターで導入した。「一」は、「Oct3/4、 Sox2、 K 、 C- Myc」の 4 遺伝子を導入した HDFa- Slc7al細胞での染色結果を示す。 写真の最右段及び右 から第二段目は、遺伝子導入から 10日後に位相差で観察されたアルカリフォスファタ ーゼ染色結果を示す。
[図 2]図 2は新生児包皮由来線維芽細胞 (BJ)力 誘導された iPS細胞のアルカリフォ スファターゼ染色結果を示した図である。マウスレトロウイルス受容体（Slc7al)をレン チウィルス感染により発現させた BJ (BJ-Slc7al)に対して左段に示した遺伝子をレトロ ウィルスベクターで導入した。写真の右から第二段目は、遺伝子導入から 10日後に 位相差で観察されたアルカリフォスファターゼ染色結果を示す。
[図 3]図 3は adult HDF由来の iPS細胞（クローン iPS- HDFaSlc- 87E6)の ABCG- 2、 SSE
A - 3、及び SSEA- 4の発現に関する免疫染色解析の結果、及び陰性対照としての 2次 抗体のみ（マウス IgG又はラッ HgM)の染色結果を示した図である。写真は位相差像 及びローダミン ·フィルターを介した位相差像 (それぞれ対物 X 10)を示す。
[図 4]図 4は adult HDF由来の iPS細胞（クローン iPS- HDFaSlc- 87E3、 4、及ぴ 12)及ぴ マウス Slc7al遺伝子を発現する adult HDF (HDFa)の ABCG- 2、 E-cadherin, SSEA- 3
、及び SSEA- 4の発現についての免疫染色の結果を示した図である。写真は位相差 像及びローダミン'フィルターを介した位相差像 (それぞれ対物 X 10)を示す。
[図 5]図 5は adult HDF由来の iPS細胞（クローン iPS- HDFaSlc-87El〜8、 11及ぴ 12)、 NTERA2クローン Dlヒト胚癌細胞（NTERA2)、及びマウス Slc7al遺伝子を発現する ad ult HDF(HDF)力 単離された RNAを基に得られた cDNAにおける、 OCT4、 Sox2、 N anog、 REX1、 FGF4、 GDF3、 DPPA4、 DPPA2、 ESG1、 hTERT、及ぴ G3PDHの各領域 の PCR増幅結果を示した図である。
[図 6]図 6は BJ由来の iPS細胞（クローン iPS- BJSlc- 97G3、 G5、 H3、 H5、 El〜10、 Ell、 及び E12)、 NTERA2クローン Dlヒト胚癌細胞（NTERA2)、及びマウス Slc7al遺伝子を 発現する BJ (BJ - Slc7al)力 単 ί隹された RNAを基に得られた cDNAにおける OCT4、 S ox2、 Nanogゝ REX1、 FGF4、 GDF3、 ECAT15— 1、 ECAT15-2、 ESG1、 hTERT、及び G3 PDHの各領域の PCR増幅結果を示した図である。
[図 7]図 7はクローン iPS-HDFaSlc- 87E12を皮下注射し、 5週間後のマウス及び該マウ ス力 摘出された腫瘍を示した図 (A)、並びにクローン iPS-HDFaSlc-87E3(B)、クロー ン iPS- HDFaSlc- 87E6(C)、及びクローン iPS_HDFaSlc- 87E12(D)のそれぞれを皮下注 射したマウス力も摘出された奇形腫由来組織のへマトキシリン'ェォジン染色結果を 示した図である。
[図 8]図 8はヒ HPS細胞の in vitroでの分化を示した免疫染色の図である。ヒト iPS様細 胞を HEMAコートプレート上で 7日間培養し、さらにゼラチンでコートしたディッシュ上 で 7日間培養した後に、細胞を集めて固定液（10%フオルマリン含 PBS)で固定した。細 胞に抗 - α-平滑筋ァクチン抗体（a- smooth muscle actin)、抗- β III-チューブリン抗 体 (bill- tubulin)、及ぴ抗- -フエトプロテイン抗体（a- fetoprotein)を 1次抗体として 反応させ、さらに 2次抗体を用いて免疫染色した。
[図 9]図 9はヒト HDFへのレトロウイルスの遺伝子導入効率の改善結果を示した図であ る。 HDF又はマウス Slc7al遺伝子を発現している HDF(HDF- Slc7al)に GFP cDNAを 含む ecotropic (Eco)又は amphotropic (Ampho)レトロウイノレスを導入した。図の上音 の写真は蛍光顕微鏡観察結果を示し (バーは 100 i mである）、図の下部のグラフは フローサイトメトリー結果を示す。
[図 10]図 10は adult HDFからの iPS細胞の誘導結果を示した図である。 Aは iPS細胞樹 立のタイムチャートを示す。 Bは HDFの細胞形態画像、 Cは非 ES細胞様コロニーの典 型的画像、 Dはヒト ES細胞様コロニーの典型的画像、 Eは樹立された iPS細胞株の継 g
代数 6(クローン 201B7)の細胞形態、 Fは高い拡大率での iPS細胞の画像、 Gはヒ HPS 細胞コロニーの中心部の自発的に分化した細胞画像をそれぞれ示す。 H〜Nは、そ れぞれ SSEA- 1 (H)、 SSEA-3 (1)、 SSEA-4 (J)、 TRA- 1-60 (K)、 TRA- 1-81 (L)、 TRA-2 -49/6E (M)、及ぴ Nanog (N)の免疫組織染色による分析結果を示す。核は Hoechst 33342 (青)により染色された。各画像におけるバーは、 200 μ m (B〜E、 G)、 20 /z m ( F)、及び 100 μ m (H~N)を示す。
[図 11]図 11はヒ HPS細胞のフィーダ一細胞依存性を示した図である。 Aはゼラチンコ ートされたプレート上に撒いた iPS細胞の画像を示す。 Bはマトリゲルコートされたプレ ート上の MEF用の調整培地 (MEF- CCM)中で培養した iPS細胞の画像を示す。 Cはマ トリゲノレコートされたプレート上のヒト ES用の非調整培地で培養した iPS細胞の画像を 示す。
[図 12]図 12はヒ HPS細胞におけるヒト ES細胞マーカー遺伝子の発現について、 ES細 胞マーカー遺伝子の RT-PCR解析結果を示した図である。 RNAを単離した細胞は、 i PS細胞クローン 201B、 ES細胞、 NTERA2クローン D1ヒト胚癌細胞（NTERA2)、及びマ ウス Slc7al遺伝子を発現する adult HDF(HDF)である。
[図 13]図 13はヒト iPS細胞におけるヒト ES細胞マーカー遺伝子の発現について、 ES細 胞マーカー遺伝子のウェスタンプロット分析 (A)及びレトロウイルス導入遺伝子の発 現の定量的 PCR結果 (B)を示した図である。 Bは 3回の試験の平均値を示し、バーは 標準偏差を示す。
[図 14]図 14はヒ HPS細胞におけるヒト ES細胞マーカー遺伝子の発現について、 Oct3 /4, REX1及び Nanogのプロモーター領域のバイサルファイトゲノミックシークェンスの 結果 (A) ¾ぴノレシフェラーゼアツセィの結果（B)を示した図である。 Aにおいて、白丸 及び黒丸は、非メチルイ匕及びメチル化 CpGsを示す。 Bは 4回の試験の平均値を示し 、バーは標準偏差を示す。
[図 15]図 15は高レベルのテロメラーゼ活性及ぴヒ HPS細胞の指数関数的増殖を示し た図である。 Aは熱処理により非活性ィ匕された (+)サンプルを陰性対照として使用した TRAP法によるテロメラーゼ活性の検出結果を示す (ICは内部対照)。 Bは iPS細胞の 増殖曲線を示し、 4回の試験の平均値及び標準偏差を示した。 [図 16]図 16はヒ HPS細胞の遺伝子分析結果を示した図である。 Aは全てのクローンの 染色体中に 4種全てのレトロウイルスが組み込まれて！/、る結果を示すゲノム PCRの結 果である。 Bは c- Myc cDNAプローブを用いたサザンブロット分析の結果を示す。図 中の星印は内因性 c-Myc対立遺伝子 (2.7 kb)を示し、矢印は SNLフィーダ一細胞に 由来するマウス c-Myc対立遺伝子 (9.8 kb)を示す。
[図 17]図 17はヒ HPS細胞の胚様体を介した分化を示した図である。 Aは 8日目におけ る iPS細胞の浮遊培養画像を示す。 B〜Eは 16日目の分化した細胞（B)、ニューロン様 細胞 (C)、上皮細胞 (D)、及び敷石様細胞 (E)の画像をそれぞれ示す。 F〜Kは、 α - フエトプロテイン (F)、ビメンチン (G)、 α-平滑筋ァクチン (H)、デスミン (1)、 β IIIチュー ブリン (J)、及び GFAP(K)の免疫組織化学分析の結果をそれぞれ示す。図中のパー は、 200 i m (A、 B)及び 100 /x m (C〜K)を示す。 F~Kにおいて、核は Hoechst 33342 (青)により染色した。 Lは、 3種の胚葉の様々な分化マーカーの RT-PCR分析結果を 示す。
[図 18]図 18はヒ HPS細胞の方向付けされた分化を示した図である。 Aは、 PA6細胞上 で 18日間培養した後の分化した iPS細胞の位相差画像である。 Bは、 j3 IIIチュープリ ン (赤)及びチロシンヒドロキシダーゼ (緑)抗体による Aに示した細胞の免疫組織化学 分析の結果を示す。核は Hoechst 33342(青)により染色した。 Cは、ドーパミン作用性 ニューロンマーカーの RT-PCR分析結果を示す。 Dは心筋細胞へ分化した iPS細胞の 位相差画像である。 Eは心筋細胞マーカーの RT- PCR分析結果を示す。 A、 B、及び Dの画像におけるバーは 200 β m (A、 D)及び 100 μ m (Β)である。
[図 19]図 19はヒ HPS細胞力も誘導された奇形腫を示した図である。 iPS細胞力 誘導 された奇形腫由来組織のへマトキシリン'ェォジン染色画像を示す (クローン 201B7を 使用)。
[図 20]図 20は成人線維芽細胞様滑膜細胞 (HFLS、クローン 243H1)及ぴ新生児包皮 由来線維芽細胞 (BJ、クローン 246G1)から樹立されたヒ HPS細胞の位相差画像である 。各画像において、パーは 200 t mを示す。
[図 21]図 21は HFLS及び BJに由来する iPS細胞中の ES細胞マーカー遺伝子の発現を 示した図である。 [図 22]図 22は HFLS及び BJから樹立された iPS細胞から胚様体を介して分化した細胞 を示す図である。 α -平滑筋ァクチン、 IIIチュープリン、 a -フエトプロテインの発現 を免疫染色により確認した。
[図 23]図 23は Nanogレポーターマウス由来 MEFからの iPS細胞の誘導におけるファミリ 一遺伝子及ぴ c-Mycを除外した場合の効果を示す図である。 Aは、ファミリー遺伝子 を用いた Nanog選択による MEFからの iPS細胞の誘導結果を示す。グラフは GFP陽性 コロニー数を示す。 3回の独立した実験結果を異なる色（白、灰、及び黒)で示した。「 4 factors」は、 Oct3/4、 Sox2、 Klf4,及び c- Mycの組み合わせを示す。 Bは iPS細胞誘 導におけるピューロマイシン選択のタイミングの影響を示しており、 4遺伝子又は c - My cを除いた 3遺伝子の導入の 28日後に観察された GFP陽性コロニーを示す。 Cは全コ ロニーに対する GFP陽性コロニーの百分率に対するピューロマイシン選択のタイミン グの影響を示す。
[図 24]図 24は Myc、 Klf、 Soxのファミリータンパク質を用いて Fbxl5 -レポーターマウス 由来 MEFから誘導された iPS細胞に由来する奇形腫の組織像を示す図である。
[図 25]図 25は c- Myc以外の 3つの遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4)をレトロウイルスにより Nanog-レポーターマウス由来 MEFに導入し樹立した iPS細胞の特徴を示す図である 。 ES細胞マーカー遺伝子及び 4遺伝子の発現レベルを示す RT-PCRの結果を示す。 特異的なプライマーセットを用いることにより、全転写産物、内在性遺伝子からの転 写産物（endo)、及びレトロウイルスからの転写産物（Tg)を 4遺伝子について区別した
[図 26]図 26は C- Myc以外の 3つの遺伝子（Oct3/4, Sox2, Kば 4)をレトロウイルスにより Fbxl5レポ一ターマウス由来 MEFに導入し樹立した iPS細胞を誘導した結果、並びに 導入した GFPの発現結果を示す図である。 Aは、 C- Myc以外の 3つの遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4)導入により樹立した iPS細胞の形態を示す。写真下のバーは 500 w inを示 す。 Bは ES、 MEF,及び c- Myc以外の 3つの遺伝子（Oct3/4, Sox2, f4)導入により 樹立した iPS細胞における ESマーカー遺伝子の RT- PCRによる分析結果を示す。
[図 27]図 27は c- Myc以外の 3つの遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4)導入により樹立した iP S細胞（クローン 142B - 6及び 142B - 12)に由来するキメラマウスを示す図である。 [図 28]図 28は薬剤選択なしで iPS細胞を効率的に単離した結果を示す図である。 Aは Nanog - GFP- IRES- Puro ポーターを有するアダルトマウス由来の TTFから誘導した i PS細胞の形態兩像である。細胞に DsRedとともに 4遺伝子又は c - Mycを除レ、た 3遺伝 子のいずれかを導入し、薬剤選択なしで 30日間培養した。 Nanogレポーター（Nanog - GFP)及ぴ DsRedレトロウイルス (Tg- DsRed)の発現は、蛍光顕微鏡によって確認し た。バーは 500 /i mを示す。 Bは実際に活性なプロモーター（ACTB、 j3 -ァクチン遺伝 子）により調節される DsRed導入遺伝子を含む力 S、 Nanog又は Fbxl5選択カセットを欠 いているアダルトマウス由来 TTFから誘導した iPS細胞の形態画像を示す。細胞は GF Pとともに 4遺伝子又は c-Mycを除いた 3遺伝子のいずれかを導入し、薬剤選択なしで 30日間培養した。 GFPレトロウイルス (Tg- GFP)の発現は、蛍光顕微鏡によって確認 した。バーは 500 μ πιを示す。 Cは薬剤選択なしで TTFから誘導した iPS細胞及び ES細 胞における ESマーカー遺伝子の RT-PCRによる分析結果を示す。 Dは薬剤選択又は c - Mycレトロウイルスを用いずにアダルトの TTFから誘導した iPS細胞に由来するキメ ラマウス画像である。
[図 29]図 29は c- Myc以外の 3つの遺伝子（Oct3/4， Sox2, Klf4)導入によりヒ HPS細胞 を誘導した結果を示す図である。 Aは樹立されたヒ HPS細胞（クローン 253G及び 246H )がヒト ES細胞様形態を呈することを示す画像である。 Bは c_Myc以外の 3つの遺伝子 (Oct3/4, Sox2, Klf4)導入により樹立した iPS細胞（253G)、又は c- Mycを含む 4つの 遺伝子（Oct3/4， Sox2, Klf4,c- Myc)導入により樹立した iPS細胞（253F)を用いて樹 立された HDFに由来するヒ HPS細胞における ES細胞マーカー遺伝子の発現結果を 示す。
[図 30]図 30は C- Myc以外の 3つの遺伝子（Oct3/4, Sox2,Klf4)を成人線維芽細胞（ HDL ; 253G)及び新生児包皮由来繊維芽細胞 (BJ;246G)導入により樹立されたヒ HPS 細胞から胚様体を介して分化を誘導させた図である。 ひ-平滑筋ァクチン、 IIIチュ 一ブリン、 a—クエトプロテインの発現を免疫染色により確認した。
[図 31]図 31は 293FT細胞に 6遺伝子（Klf4、 c- Myc、 Oct3/4、 Sox2、 Nanog,及び Lin2 8)、又は 4遺伝子の 2つの異なる組み合わせ（Y4Fで表される f4、 c-Myc、 Oct3/4、 及び Sox2 ;並びに T4Fで表される Oct3/4、 Sox2、 Nanog,及び Lin28)を導入した後確 認されるコロニーの数をグラフで示した図である。 "ES- like"は ES細胞のコロニーと形 態的に類似したコロニーの数を示し、 "total"は ES様コロニーと非 ES様コロニーの数 の総数を示す。 Exp#l、 Exp#2、 Exp#3,及ひ Έχρ#4は、それぞれ個別に実験を行った 結果を示す。縦軸はコロニー数を示す。
[図 32]図 32はマウス胚性線維芽細胞 (MEF)を用レ、て行った実験結果を示す。 Αは実 験のタイムチャートを示す。 Nanog GFP^—FbxlS マウスから得られた 1.0 1.05個の M EF細胞を、ゼラチンコートした 6ゥエルプレートに撒いた。翌日、 4遺伝子（〇ct3/4、 Klf 4、 Sox2、及び Sall4;OSKA)又は 3遺伝子（Oct3/4、 Klf4、及び Sox2; OSK)を MEFにレ トロウィルスを用いて導入した。感染から 4日後に細胞をマイトマイシン C処理 STO細 胞で被覆した 6ゥェルプレート上に 1： 2又は 1： 6の割合で再び撒レヽた。薬剤選択は 14 日目又は 21 0目に開始した。 28 S目に GFP陽性細胞をカウントし、細胞をアルカリフ 才スファターゼ (AP)及びクリスタルバイオレット（CV)で染色した。 Bは 3つの独立した 実験 (#1、 2、及び 3)における GFP陽性コ口-一数の総数を示す。 Cは 3つの独立した 実験 (#1、 2、及び 3)における GFP陽性コロニーの百分率を示す。
[図 33]図 33はヒト成人皮膚由来線維芽細胞（adult HDF)を用いて行った実験結果を 示す。マウスレトロウイルス受容体 slc7aを発現する 1.0 X 105個の adult HDF細胞を 6ゥ エルプレートに撒いた。翌 0、図に示す各種遺伝子の組み合わせをレトロウイルスべ クタ一により細胞に導入した。感染の 6日後に細胞を 5.0 X 105個に調整し、この細胞 を 1.5 106個のマイトマイシン C処理 STO細胞で被覆した 100 mmプレート上に再び 播いた。 7日後に培地を 4 ng/ml bFGFを補充した霊長類用 ES細胞培地に交換した。 図は感染から 30日後のコロニー数を示す。
[図 34]図 34はマウスレトロウイルス受容体 Sk7aを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細 胞（HDF)にヒト由来の 4遺伝子 (Y4F: Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び c- Myc)又は 3遺伝子 (Y3F: Oct3/4、 Sox2、及び Klf4)と、マウス Sall4 (mSall4)若しくはマウス Salll(mSalll)又 はその両方についてレトロウイルスベクターを用いて導入し、感染後 32日目 (左側の パー)及び 40日目（右側のバー)に確認されたコロニーの数を示した図である。 Γ+ oc kjは、 Y3F又は Y4Fに換えて空ベクターであるレトロウイルスを感染させた群、「+mSall 4Jは Y3F又は Y4Fと同時に Sall4を導入した群、「+mSalll」は Y3F又は Y4Fと同時に mS alllを導入した群、「+mSall4+mSalll」は Y3F又は Y4Fと同時に mSall4及び mSalllの両 方を同時に導入した群を示す。縦軸は 10cmシャーレ上に確認されたヒ HPS細胞のコ ロニー数を示す。同じ実験を 3回繰り返してグラフのパー上に各実験のコロニー数の 総数を示した。
[図 35]図 35はマウスレトロウイルス受容体 Slc7aを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細 胞（HDF)にヒト由来の 4遺伝子（T4F: Oct3/4、 Sox2、 Nanog,及び Un28)又は 3遺伝 子（T3F: Oct3/4、 Sox2、及ぴ Nanog)と、マウス Sall4(mSall4)若しくはマウス Salll(mSal 11)又はその両方をレトロウイルスベクターを用いて導入し、感染後 32日目 (左側のバ 一)及び 40日目 (右側のバー)に確認されたコロニーの数を示した図である。「十 MockJ は T3F又は T4Fに換えて空ベクターであるレトロウイルスを感染させた群、「+mSall4」 は T3F又は T4Fと同時に mSall4を導入した群、「+mSalll」は T3F又は T4Fと同時に mSal 11を導入した群、「+mSall4+mSalll」は T3F又は T4Fと同時に mSall4及び mSalllの両方 を同時に導入した群を示す。縦軸は 10cmシャーレ上に確認されたヒ HPS細胞のコロ ニー数を示す。同じ実験を 2回繰り返してグラフのバー上に各実験のコロニー数の総 数を示した。
[図 36]図 36はマウスレトロウイルス受容体 Slc7aを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細 胞（HDF)にヒト由来の 4遺伝子（Y4F)又は 3遺伝子 (Y3F)とヒト Sall4 (hSall4)とをレトロ ウィルスベクターを用いて導入し、感染性 32日目 (左側のバ一)及び 40日目（右側のバ 一)に確認されたコロニーの数を示した図である。「+Mock」は、 Y3F又は Y4Fに換えて 空ベクターであるレトロウイルスを感染させた群、「+hSall4」は Y3F又は Y4Fと同時に hS al を導入した群を示す。縦軸は 10cmシャーレ上に確認されたヒ HPS細胞のコロニー 数を示す。同じ実験を 2回又は 3回繰り返してグラフのバー上に各実験のコロニー数 の総数を示した。
[図 37]図 37は Oct3/4、 Klf4、及ぴ Sox2の 3遺伝子に、 c- Myc、 L_Myc、又は N- Myc遺 伝子を加えた計 4遺伝子をレンチウィルスベクターを用いてマウスレトロウイルス受容 体 Slc7aを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞（HDFa- Slc7al)に導入し、樹立した ヒト iPS細胞のコロニー数をカウントした結果を示したグラフである。各グラフ上の数値 はコロニーの総数に対する iPS細胞のコロニー数の割合を示す。 [図 38]図 38は 4遺伝子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4, L-Myc)をレンチウィルスベクターを用い てマウスレトロウイルス受容体 Slc7aを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞 (HDFa- S lc7al)に導入して樹立したヒ HPS細胞 (32R2, 32R6)が、三胚葉系への分化能を有する ことを α-平滑筋ァクチン、 αフエトプロテイン、及び3 III-チュープリン抗体を用いた 免疫染色により確認した結果を示す写真である。
[図 39]図 39は 4遺伝子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び L-Myc)を導入して樹立したヒ HPS 細胞 (32R6)を SCIDマウスの精巣内に注射して得られた奇形腫の組織染色像 (へマト キシリン 'ェォジン染色)である。上段は左から神経組織、腸管様組織、及び軟骨組 織の組織像を示す。下段は左から毛髪組織、脂肪組織、及び色素組織の組織像を 示す。
[図 40]図 40は 3遺伝子（Oct3/4、 Klf4、及ぴ L- Myc)をレトロウイルスベクターを用いて Nanogレポーターマウス由来 MEF(MEF-Ng)に導入して得られた GFP陽性コロニー（iP S - MEF- Ng- 443- 3)の形態を示す写真である。上段は GFP陽性コロニー像、下段は 位相差像である。
[図 41]図 41は図 40で示した GFP陽性コロニー（iPS- MEF- Ng_443- 3)由来のクローン について RT-PCR及ぴ Genomic PCRを行った結果を示した写真である。図中、「Total 」は内在性及びレトロウイルス由来の遺伝子発現を示し、「Tg」はレトロウイルス由来の 遺伝子発現を示し、 GenomeJはゲノム DNA中に挿入されたレトロウイルス由来の遣 伝子の存在を各遺伝子に特異的なプライマーで検出した結果を示す。写真右側の 数字は PCRのサイクル数を示す。図中、「RF8」はコントロールである ES細胞、「20D17 」は MEF- Ngに 4遺伝子（Oct3/4、 Klf4、 L-Myc,及ぴ Sox2)を導入して得られた iPS細 胞（Nanog-iPS細胞； Nature, 448, pp.313- 317， 2007)、「142E - 9」は MEF - Fbxに 4遺 伝子（Oct3/4、 Klf4、 L-Myc,及び Sox2)を導入して得られた iPS細胞（Fbx-iPS)を示 し、これらの細胞について同様の実験を行った結果を示す。図中、「PlaSmid」は各遣 伝子を含むプラスミド（pMXs- Sox2、 pMXs- Oct3/4、 pMXs- Klf4、 pMXs- c - Myc、及び pMXs-L-Myc)を用レ、た結果を示す。
[図 42]図 42は 3遺伝子（Oct3/4、 Klf4、及ぴ L- Myc)を導入して樹立したマウス iPS細 胞 (443- 3-3、 443-3-6、 443-3-12、及び 443- 3-13)が三胚葉系への分化能を有するこ とを抗 -平滑筋ァクチン抗体、抗 α -フエトプロテイン抗体、及び抗 β III -チューブリ ン抗体抗体を用レ、た染色により確認した結果を示した写真である。 RF8はコントロー ルのマウス ES細胞である。
[図 43]図 43は 3遺伝子（Oct3/4、 Klf4、及ぴ L- Myc)を導入して樹立したマウス iPS細 胞 (443- 3- 3、 443-3-6、 443- 3 - 12、及び 443- 3- 13)をヌードマウスの皮下に注射して 得られた奇形腫の組織染色像 (へマトキシリン 'ェォジン染色）である。上から神経組 織、腸管様組織、筋肉組織、表皮組織、及び軟骨組織の組織像を示す。
[図 44]図 44は Oct3/4、 Klf4,及び Sox2の 3遺伝子に c_Myc、 L- Myc、及び/又は Lin2 8遺伝子をレンチウィルスベクター一を用レ、てマウスレトロウイノレス受容体 Slc7aを発現 したヒト成人皮膚由来線維芽細胞 (HDFa - Slc7al)に導入して樹立したヒト iPS細胞のコ ロニー数をカウントした結果を示したグラフである。黒棒は全コロニー数を示し、白棒 は iPS細胞コロニー数を示す。
[図 45]図 45は各種 Mycキメラ遺伝子及び変異遺伝子の構造を模式的に示した図であ る。 Ms- c-Mycの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号 153及び 154に示し、 s - L - Mycの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号 155及び 156に示し、 Ms- cL - Mycの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号 157及び 158に示し、 Ms-Lc- y cの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号 159及ぴ 160に示し、 Ms- cLc - Mycの 塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号 161及ぴ 162に示し、 Ms - LcL - Mycの塩 基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号 163及び 164に示し、 Ms-ccL-Mycの塩基 配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号 165及び 166に示し、 Ms- cLL- Mycの塩基配 列とアミノ酸配列を配列表の配列番号 167及び 168に示し、 Ms- LLc - Mycの塩基配列 とアミノ酸配列を配列表の配列番号 169及ぴ 170に示し、 Ms- Lcc - Mycの塩基配列と アミノ酸配列を配列表の配列番号 171及び 172に示し、 c- MycW135Eの塩基配歹 ljとァ ミノ酸配列を配列表の配列番号 173及ぴ 174に示し、 c- MycV394Dの塩基配列とァミノ 酸配列を配列表の配列番号 175及ぴ 176に示し、 c - MycL420Pの塩基配列とアミノ酸 配列を配列表の配列番号 177及ぴ 178に示し、 L - MycW96Eの塩基配列とアミノ酸配 列を配列表の配列番号 179及ぴ 180に示し、 L-MycV325Dの塩基配列とアミノ酸配列 を配列表の配列番号 181及び 182に示し、 L - MvcL351Pの塩基配列とアミノ酸配列を 配列表の配列番号 183及ぴ 184に示す。
[図 46]図 46は各種 Mycキメラ遺伝子及び変異遺伝子をレンチウィルスベクターを用い てマウスレトロウイルス受容体 Slc7aを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞 (HDFa - S lc7al)に導入して樹立したヒ HPS細胞のコロエー数をカウントした結果を示したグラフ である。上から、 iPS細胞コ口-一数、全コロニー数、及び iPS細胞コロニー数の全コロ ニー数に対する割合 (％)をそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
[0026] 第一の観点から提供される本発明の方法は、体細胞から人工多能性幹細胞を製 造する方法であって、下記の 3種の遺伝子： Octファミリー遺伝子、 Klf7アミリー遺伝 子、及び Soxファミリー遺伝子を体細胞に導入する工程を含むことを特徵としており、 上記方法の好ましい態様では、下記の 3種の遺伝子： Octファミリー遺伝子、 KK7アミ リー遺伝子、及び Soxファミリー遺伝子を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲 得して増殖するのに十分な時間にわたり該細胞を培養する工程を含んでいる。
[0027] Octファミリー遺伝子、 Klf アミリー遺伝子、及び Soxファミリー遺伝子については国 際公開 WQ2007/69666にファミリー遺伝子の具体例が示されてレ、る。 Octファミリー遺 伝子としては Oct3/4が好ましぐ K1E7アミリー遺伝子としては Klf4が好ましぐ Soxフアミ リー遺伝子としては Sox2が好ましい。これらの遺伝子としては、野生型の遺伝子のほ 力、、数個（例えば 1〜30個、好ましくは;！〜 20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好まし • くは 1〜5個、特に好ましくは 1又は 2個）の塩基が置換、揷入、及び Z又は欠失した変 異遺伝子や、ファミリー遺伝子の適宜の組み合わせにより得られるキメラ遺伝子であ つて、野生型の遺伝子と同様の機能、又は改善された機能を有する遺伝子なども利 用可能である。
[0028] 第二の観点から提供される本発明の方法は、体細胞から人工多能性幹細胞を製 造する方法であって、下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及ぴ Soxファミリー遣 伝子の組み合わせ又は下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び KK アミリー 遺伝子の組み合わせと、下記の 3種の遺伝子力 選ばれる少なくとも 1種の遗伝子： L - Myc、 Salll、及び SaI14とを体細胞に導入する工程を含むことを特徴としている。いか なる特定の理論に拘泥するわけではなレ、が、 L-Myc、 Salll、及び SalM力 なる群から 選ばれる遺伝子は核初期化の効率を高める作用を有する核初期化因子であり、核 初期化のために不可欠な核初期化因子 (例えば Octファミリー遺伝子及び Soxファミリ 一遺伝子の組み合わせ、又は Octファミリ一遺伝子及び Klf7アミリー遺伝子の組み合 わせなど）と組合わせて用いることにより、核初期化の効率を顕著に改善することがで きる。
[0029] より具体的には、上記の方法は、
(a)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Soxファミリー遺伝子の組み合わせ 、並びに L- Mycを体細胞に導入する工程；
(b)下記の 2種の遺伝子： Octファミリ一遺伝子及び Soxファミリー遺伝子の組み合わせ 、並びに Salllを体細胞に導入する工程；
(c)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Soxファミリー遺伝子の組み合わせ 、並びに Sall4を体細胞に導入する工程；
(d)下記の 2種の遺伝子： Octファミリ一遺伝子及ぴ Soxファミリー遺伝子の組み合わせ 、並びに L- Myc及び Salllを体細胞に導入する工程；
(e)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Soxファミリー遺伝子の組み合わせ 、並びに L- Myc及び Sall4を体細胞に導入する工程；
(f)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Soxファミリー遺伝子の組み合わせ 、並びに Salll及ぴ Sall4を体細胞に導入する工程；
(g)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及ぴ Soxファミリー遺伝子の組み合わせ 、並びに L- Myc、 Salll、及ぴ Sal½を体細胞に導入する工程；
[0030] (h)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び KKアミリー遺伝子の組み合わせ、 並びに L - Mycを体細胞に導入する工程；
(i)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Klf7アミリー遺伝子の組み合わせ、 並びに Salllを体細胞に導入する工程；
(j)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Kl アミリー遺伝子の組み合わせ、 並びに Sall4を体細胞に導入する工程；
(k)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Klf7アミリー遺伝子の組み合わせ、 並びに L-Myc及ぴ Salllを体細胞に導入する工程； . (1)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Klf7アミリー遺伝子の組み合わせ、 並びに L- Myc及び Sall4を体細胞に導入する工程；
(m)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及び Kl アミリー遺伝子の組み合わせ 、並びに Salll及び Sall4を体細胞に導入する工程；又は
(0)下記の 2種の遺伝子： Octファミリー遺伝子及ぴ KK アミリー遺伝子の組み合わせ、 並びに L- Myc、 Salll、及び Sall4を体細胞に導入する工程；
を含んでいる。
[0031] また、上記の (a)ないし (g)のいずれかの態様において、さらに Klf7アミリー遺伝子を 体細胞に導入する工程を含んでレ、てもよレ、。さらに上記の (a)なレ、し (0)の！/、ずれかの 態様、または上記の (a)なレ、し (g)のいずれかの態様に Klf7アミリー遺伝子を加えた態 様において、 Linファミリー遺伝子及ぴ Z又は Nanog、好ましくは Lin28及び/又は Nan og、より好ましくは Lin28を体細胞に導入する工程を含んでいてもよい。さらに、所望 により C- Mycを体細胞に導入する工程を含んでいてもよい。
[0032] Octファミリー遺伝子としては Oct3/4が好ましぐ Soxファミリー遺伝子としては Sox2が 好ましぐ Klf アミリー遺伝子としては Klf¾が好ましレ、。また Linファミリー遺伝子として は Lin28および Lin28bが知られている力 Lin28が好ましレ、。 L - Mycについては国際公 開 WO2007/69666の表 1に記載されており、 Sall4については同国際公開の表 4及ぴ 表 5に記載されている。 Salllは ES細胞特異的発現遺伝子であり、かつ zincフィンガー 蛋白の一つとして知られており、腎臓の発生に関与していると考えられている。 Salll の NCBIァクセッション番号は NM_021390 (マウス）及ぴ NM_002968 (ヒト）である。また L in28の NCBIァクセッション番号は NM— 145833 (マウス)及び NM— 024674 (ヒト)である。
[0033] これらの遺伝子としては、野生型の遺伝子のほか、数個（例えば 1〜30個、好ましく は 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1又は 2 個）の塩基が置換、挿入、及び/又は欠失した変異遺伝子や、ファミリ一遺伝子の適 宜の組み合わせにより得られるキメラ遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機 能、又は改善された機能を有する遺伝子なども利用可能である。
[0034] 例えば、 L - Myc又は c-lvlycとしては野生型の遺伝子のほ力、、数個（例えば 1〜30個 、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個、特に好ましく は 1又は 2個）の塩基が置換、挿入、及ぴ 又は欠失した変異遺伝子、又はキメラ My c遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様か、又は改善された機能を有する遺伝子 も利用可能である。 Myc遺伝子にっレ、て各種の Mycキメラ遺伝子及び Myc点変異遺 伝子の機能を具体的に解析する手法及び結果が明細書の実施例に具体的に示さ れているので、この解析手法を用レ、ることにより、所望の改善された機能を有する変 異 c-Myc遺伝子、変異 L- Myc遺伝子、又はキメラ Myc遺伝子などを容易に選択して 使用することができる。当該キメラ Myc遺伝子の好ましい例としては、 Ms-cL - Myc (配 列番号： 157及び 158)及び Ms_cLc- Myc (配列番号： 161及び 162)が挙げられ、より好 ましくは Ms- cL - Mycが挙げられる。
[0035] この方法の好ましい態様としては、上記の方法において
(a-l)Oct3/4、 Sox2 及ぴ L- Mycを体細胞に導入する工程；
(a - 2)Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び L- Mycを体細胞に導入する工程；
(b-l)Oct3/4、 Sox2、及ぴ Salllを体細胞に導入する工程；
(b - 2)Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及ぴ Salllを体細胞に導入する工程；
(c-l)Oct3/4、 Sox2、及び Sall4を体細胞に導入する工程；
(c- 2)Oct3/4、 Sox2、 f4、及ぴ Sall4を体細胞に導入する工程；
(d - l)Oct3/4、 Sox2、 L-Myc,及ぴ Salllを体細胞に導入する工程；
(d - 2)Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 L- Myc、及ぴ Salllを体細胞に導入する工程；
(e - l)Oct3/4、 Sox2、 L- Myc、及び Sall4を体細胞に導入する工程； . (e- 2)〇ct3/4、 Sox2、 Klf4, L- Myc、及び SaMを体細胞に導入する工程；
(M)Oct3/4, Sox2、 Salll、及び Sall4を体細胞に導入する工程；
(f-2)Oct3/4、 Sox2、 K 、 Salll,及ぴ Sall4を体細胞に導入する工程；
(g - l)〇ct3/4、 Sox2、 L- Myc、 Salll,及び Sall4を体細胞に導入する工程； .
(g - 2)Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 L- Myc、 Salll、及ぴ Sall4を体細胞に導入する工程；
[0036] (h- l)Oct3/4、 Klf4、及び L- Mycを体細胞に導入する工程；
(i-l)Oct3/4, Klf4、及び Salllを体細胞に導入する工程；
(j- l)〇ct3/4、 Klf4、及ぴ Sall4を体細胞に導入する工程；
(k-l)Oct3/4、 Klf4、 L- Myc、及び Salllを体細胞に導入する工程； (卜 1)0は3/4、 Klf4、 L- yc,及び Sall4を体細胞に導入する工程；
(m- l)Oct3/4、 Klf4、 Salll、及び SaMを体細胞に導入する工程;又は
(o-l)Oct3/4、 Klf4、 L- Myc、 Salll、及び Sall4を体細胞に導入する工程
を含む方法を挙げることができる。
[0037] さらに、上記の方法において
(a- 3)Oct3/4、 Sox2、 L- Myc、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(a - 4)〇ct3/4、 Sox2、 Kl 、 L-Myc、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(b-3)Oct3/4、 Sox2、 Salll、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(b-4)Oct3/4, Sox2、 Klf4、 Salll、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(c - 3)Oct3/4、 Sox2、 Sall4、及ぴ Lin28を体細胞に導入する工程；
(c-4)Oct3/4、 Sox2、 KM、 Sall4、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(d- 3)Oct3/4、 Sox2、 L-Myc、 Salll、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(d - 4)Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 L-Myc、 Salll、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(e - 3)Oct3/4、 Sox2、 L- Myc、 Sall4、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(e-4)Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 L- Myc、 Sall4、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(f - 3)Oct3/4、 Sox2、 Salll, Sall4、及ぴ Lin28を体細胞に導入する工程；
(f-4)Oct3/4. Sox2、 Klf4、 Salll、 Sall4、及ぴ Lin28を体細胞に導入する工程；
(g - 3)Oct3/4、 Sox2、 L-Myc, Salll、 Sall4、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(g- 4)Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 L- Myc、 Salll、 Sall4、及ぴ Lin28を体細胞に導入する工程;
[0038] (h- 2)Oct3/4、 Klf4、 L- Myc、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(i-2)Oct3/4, Klf4, Salll、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
G-2)Oct3/4、 Klf4、 Sall4、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(k-2)Oct3/4、 Klf4、 L- yc, Salll、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
- 2)Oct3/4、 Klf4、 L - Myc、 Sall4、及び Lin28を体細胞に導入する工程；
(m - 2)Oct3/4、 KM、 Salll、 Sall4、及び Lin28を体細胞に導入する工程；又は
(o-2)Oct3/4, Klf4, L-Myc, Salll、 Sall4、及び Lin28を体細胞に導入する工程 を含む方法も好ましい。
[0039] 上記の各方法において、 Lin28とともに、又は Lin28に換えて Nanogを体細胞に導入 する工程を含む方法も好ましい。例えば、上記 (a- 4)の態様において、 Lin28とともに N anogを用いる態様、すなわち Oct3/4、 Sox2、 Klf4、 L_Myc、 Lin28、及び Nanogを体細 胞に導入する工程を含む方法などが例示される。
また、上記の各方法において、 L- Mycとともに、又は L- Mycに換えて N- Mycを体細 胞に導入する工程を含んでレ、てもよレ、。
さらに、上記の各方法において、必要に応じて c - Mycを体細胞に導入する工程を 含んでレ、てもよレ、が、分化誘導後に得られる細胞や組織にぉレ、て腫瘍の発生を実質 的に低減ないし排除するためには C- Mycを体細胞に導入する工程を含まないほうが 好ましい場合がある。
[0040] L - Mycを含む態様については、核初期化すべき体細胞としてヒト体細胞を用いるこ とが好ましい。また、 Oct3/4、 Sox2、及び K の組み合わせ、又は Oct3/4、 Sox2、 Klf4 、及びし- Myc (又は L- Mycに換えて c- Myc)の組み合わせを含む場合には、 Sall4をさ らに組合わせる場合、又は Salll及び Sall4の両方をさらに組合わせる場合が好ましレ、 。さらに、 Oct3/4、 Sox2、 Nanog,及び Lin28の組み合わせを含む場合には、 Salllをさ らに組合わせる場合、又は Salll及び Sall4の両方をさらに組合わせる場合が好ましい 。これらの場合についても核初期化すべき体細胞としてヒト体細胞を用レ、ることが好ま しい。
[0041] 第三の観点から提供される本発明の方法は、体細胞から人工多能性幹細胞を製 造する方法であって、下記の 6種の遺伝子： Octファミリー遺伝子、 Klf7アミリー遺伝 子、 Soxファミリー遺伝子、 Mycファミリー遺伝子、 Lin28、及ぴ Nanogを体細胞に導入 する工程を含むことを特徴としており、好ましくは下記の 6種の遺伝子： Oct3/4、 Klf4、 Sox2、 c- Myc、 Lin28、及び Nanogを体細胞に導入する工程を含んでいる。
[0042] 上記の第一なレ、し第三の観点力 提供される本発明の各方法において、「人工多 能性幹細胞」とは ES細胞に近い性質を有する細胞のことであり、より具体的には、未 分化細胞であって多能性及び増殖能を有する細胞を包含するが、この用語をいかな る意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。核 初期化因子を用いて人工多能性幹細胞を調製する方法については国際公開 WO20 07/69666、 Cell, 126, pp. 663-676, 2006及び Cell, 131, pp. 861-872， 2007に具体 的に説明されており、人工多能性幹細胞の分離手段につ V、ても上記公報に具体的 に説明されている。
[0043] 本発明の方法により初期化すべき「体細胞」とは、 ES細胞等の分化全能性細胞を 除く全ての細胞を意味し、その種類は特に限定されない。例えば、胎児期の体細胞 のほか、成熟した体細胞を用いてもよレ、。好ましくはヒトを含む哺乳類動物由来の体 細胞が用いられ、より好ましくはマウス由来の体細胞や霊長類由来の体細胞が用い られる。特に好ましくはヒト由来の体細胞を用いることができる。体細胞としては、具体 的には（1)神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（ 体性幹細胞）、（2)組織前駆細胞、又は（3)リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽 細胞 (皮膚細胞等）、毛細胞、肝臓細胞、胃粘膜細胞等の分化した細胞が挙げられ る。人工多能性幹細胞を疾病の治療に用いる場合には、患者自身力 分離した体細 胞ゃ、 HLA抗原の型が同一である他人力も分離した体細胞を用レ、ることが望ましぐ 例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞などを用いることがで きる。
[0044] 上記遺伝子を体細胞に導入する方法は特に限定されなレ、が、例えば、上記遺伝子 を発現可能なベクターを用いることが一般的である。ベクターとしてレトロウイルスべク ターを用いる具体的手段が国際公開 WO2007/69666、 Cell, 126, pp. 663-676, 2006 及び Cell, 131, pp. 861-872, 2007に開示されており、ベクターとしてレンチウィルス ベクターを用いる場合については Science, 318, pp.1917 - 1920, 2007に開示がある。 また、非ウィルスベクターであるプラスミドを用いる場合については沖田らの論文 (Scie nce, Published online: October 9, 2008; 10.1126/science.1164270)に記载されてレヽ るので、当業者はこれらのな力から適宜の手段を選択して採用することができる。べク ターを用レ、る場合には、ベクターに上記の遺伝子力 選ばれる 2種以上の遺伝子を 組み込んでもよレ、が、 1種類の遺伝子を組み込んだベクターを数種類用いてもよい。 初期化すべき体細胞において上記の遺伝子のうちの 1種又は 2種がすでに発現して レ、る場合には、導入すべき上記の遺伝子の組み合わせから発現している 1種又は 2 種の遣伝子を除くこともできる力 このような態様が本発明の範囲に包含されることは 言うまでもない。 [0045] 上記遺伝子を体細胞に導入する手段としてウィルスベクター、例えばレトロウイルス ベクターを用レ、る場合には、導入すべきそれぞれの遺伝子を含むウィルスベクターを 調製した後、各ウィルスベクターを別々のパッケージング細胞にトランスフエタトして該 細胞を培養することにより各ウィルスを含む培養上清をそれぞれ独立に調製し、それ らの培養上清の混合物を調製して遺伝子を含むウィルスを感染させることによる遺伝 子導入に用いることが好ましい。この手段を採用することにより、遺伝子導入効率を 顕著に高めることができる場合があり、特に c - Mycを用いずに核初期化を行う場合に 好ましい場合がある。もっとも、複数のウィルスベクターを単一のパッケージング細胞 にトランスフエクトし、複数のウィルスベクターを含む培養上清を調製して遺伝子導入 に用レ、ることも可能である。
[0046] 遺伝子を体細胞に導入する場合には、フィーダ一細胞上に培養された体細胞に対 して発現ベクターの導入を行ってもよいが、フィーダ一細胞を使用することなく体細胞 に発現ベクター導入を行ってもょレ、。発現ベクターの導入効率を高めるために後者 の方法が適してレ、る場合がある。フィーダ一細胞としては胚性幹細胞の培養に用い られるフィーダ一細胞を適宜使用することができる力 例えば、マウス 14〜15日胚の 線維芽細胞初代培養細胞や線維芽細胞由来細胞株である STO細胞等をマイトマイ シン Cなどの薬剤で処理した細胞や放射線処理した細胞などを用いることができる。 遺伝子導入後の体細胞の培養はフィーダ一細胞上で行うことが好ましい。また、遣伝 子導入後、数日なレ、し 30日程度の間にピューロマイシンなどを用レ、て薬剤選択を付 力 Dすることもできる。もっとも、薬剤選択を行わずに iPS細胞を誘導できる手法も知られ ており (国際公開 WO2007/69666の例 9など)、薬剤選択を行わずに iPS細胞を誘導す ることも好ましい。
[0047] 核初期化因子を導入した体細胞を適宜の条件下で培養することにより自律的に核 初期化が進行し、体細胞から人工多能性幹細胞を製造することができる。遺伝子を 体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり 細胞を培養することが好ましい。ヒト人工多能性幹細胞を製造する場合には、発現べ クタ一導入後の細胞の培養密度を通常の動物細胞培養の場合よりも低く設定するこ とが望ましい。例えば、細胞培養用ディッシュあたり:！〜 10万個、好ましくは 5万個程度 の細胞密度で培養を継続することが好ましレ、。
[0048] 通常は体細胞の動物種に適した培地、例えば胚性幹細胞 (ES細胞)用の培地 (例 えばヒト体細胞に遺伝子導入する場合には霊長類 ES細胞用、好ましくはヒト ES細胞 用の培地)を用いて、例えば 25日以上培養することにより人工多能性幹細胞を得るこ とができる。第一の観点力 提供される方法では、 c_Myc、 L-Myc、 N- Myc、 Salll、又 は Sall4の 1種又は 2種以上を含む組み合わせを用いて核初期化を行う場合に比べて 、核初期化の効率が低下する場合があり、一般的には長期間の培養が必要になるこ とが多い。例えば、この方法においては、好ましくは 28日以上、より好ましくは 30曰以 上、さらに好ましくは 33日以上、特に好ましくは 35 0以上培養を継続する必要がある 。特にヒト体細胞に遺伝子導入する場合には 40曰以上、さらには 45日以上の培養日 数が至適な培養日数になる場合もある。もっとも、第一の観点から提供される方法に よれば、バックグラウンドとなる夾雑細胞の混入を排除して、より純粋な細胞集団とし ての人工多能性幹細胞コロニーを取得することができ、遺伝子発現や分化能などの 点で極めて高品質な人工多能性幹細胞を得ることが可能になる。一方、第二の観点 及び第三の観点力 提供される本発明の方法では、一般的には人工多能性幹細胞 の生成効率が十分に高いことから、より短い培養日数、例えば 15日ないし 30日間、好 ましくは 20日程度の培養期間で所望の個数の人工多能性幹細胞を取得できる場合 がある。
[0049] 遺伝子導入した細胞が多能性を獲得したことは、例えば未分ィ匕細胞に特有の各種 マーカー、例えばアルカリフォスファターゼ (ALP)、 SSEA- 3、 SSEA- 4、 ABCG - 2、及 ひ Έ-cadherinなどを検出することにより容易に判定することができる。マーカーの種類 や判定手段については上記刊行物（例えば Cell, 126, pp. 663-676, 2006、 Cell, 13 1, pp. 861-872, 2007など）に具体的かつ詳細に説明されている。 ES細胞特異的発 現遺伝子のプロモーター下流に GFPなどのマーカー遺伝子を組み込んだ遺伝子を ' 有する体細胞を用いて核初期化を行った場合は、マーカー (GFP)陽性を指標として 人工多能性幹細胞を特定することが可能である。
また、増殖については一般的にはコロニー形成により判定することができる力 コロ ニー（通常は約 500個〜 1,000個程度の人工多能性幹細胞力もなる細胞集団である） の形状は動物種により特徴的な外観を呈することが知られてレ、るので、人工多能性 幹細胞が増殖して形成したコロニーを容易に特定することができる。
[0050] 例えば、マウス人工多能性幹細胞は盛り上がったコロニーを形成するのに対して、 ヒト人工多能性幹細胞は扁平なコロニーを形成することが知られており、これらのコロ ユー形状はそれぞれマウス ES細胞及ぴヒト ES細胞のコロニーと極めて類似している ので、当業者は生成した人工多能性幹細胞のコロニーを検出することにより人工多 能性幹細胞の増殖程度を確認することができる。 ES細胞の未分ィ匕性及び多能性を 維持可能な培地又はその性質を維持することができなレ、培地は当業界で種々知ら れており、適宜の培地を組み合わせて用いることにより、人工多能性幹細胞を効率よ く分離することができる。分離された人工多能性幹細胞の分ィヒ能及び増殖能は ES細 胞につレ、て汎用されてレ、る確認手段を利用することにより当業者が容易に確認可能 である。
[0051] 上記の方法において、必要に応じて遺伝子導入をサイト力インの非存在下又は存 在下に行うことができ、好ましくはサイト力インの非存在下に行うことができる。また、上 記の方法において、必要に応じて遺伝子導入後の体細胞の培養をサイト力インの非 存在下又は存在下に行うことができる。サイト力インとしては典型的には basic fibrobla st growth factor (bFGF)、 Stem Cell Factor (SCF)、 Leukemia Inhibitory Factor (LIF) などが挙げられるが、これらに限定されることはなく、当業界でサイト力インとして分類 されている生理活性物質の存在下又は非存在下で遺伝子導入及び Z又は培養を 行うことができる。サイト力インを発現するように改変したフィーダ一細胞上で遺伝子 導入後の体細胞を培養することもできる。
[0052] 上記の方法において、上記遺伝子に換えて上記遺伝子がコードする遺伝子産物を 用いて核初期化を行うこともできる。遺伝子産物である核初期化因子を用いて上記 の方法を行う場合には、体細胞及ぴ人工多能性幹細胞が増殖可能な環境にぉレ、て 核初期化因子と体細胞とを接触させればよい。より具体的には、例えば、上記の遺伝 子産物を培地中に添カ卩するなどの手段を採用することができる。これらの遺伝子の遺 伝子産物のうちの 1種又は 2種を融合タンパク質や核内へのマイクロインジヱクシヨン などの手法により核内に導入し、残りの 1種又は 2種の遺伝子を適宜の遺伝子導入方 法、例えば組換えベクターを用いる方法などによって導入することもできる。
[0053] 該遺伝子産物としては、例えば上記遺伝子から産生されるタンパク質自体のほか、 該タンパク質とその他のタンパク質又はペプチドなどとの融合遺伝子産物の形態で あってもよレ、。例えば、緑色蛍光タンパク質 (GFP)との融合タンパク質やヒスチジンタ グなどのペプチドとの融合遺伝子産物を用レ、ることもできる。また、 HIVウィルスに由 来する TATペプチドとの融合タンパク質を調製して用いることにより、細胞膜からの核 初期化因子の細胞内取り込みを促進させることができ、遺伝子導入などの煩雑な操 作を回避して、融合タンパク質を培地に添加するだけで初期化を誘導することが可 能になる。このような融合遺伝子産物の調製方法は当業者によく知られているので、 当業者は目的に応じて適宜の融合遺伝子産物を容易に設計して調製することが可 能である。
[0054] 上記の各方法において、 1種又は 2種以上の遺伝子の体細胞への導入を体細胞へ の低分子化合物の接触で置き換えることができる場合もある。このような低分子化合 物としては、例えば Octファミリー遺伝子、 Klf アミリー遺伝子、 Soxファミリー遺伝子、 Mycファミリー遺伝子、 Linファミリー遺伝子、 Salll、 Sall4、及び Nanog遺伝子からなる 群力 選ばれる 1種以上の遺伝子の発現を促進する作用を有する低分子化合物を 用いることができるが、このような低分子化合物は各遺伝子の発現量を指標として当 業者が容易にスクリーニングすることができる。
[0055] 上記の方法にお V、て、定義された各遺伝子に加えて、細胞の不死化を誘導する因 子をコードする遺伝子をさらに組み合わせてもよい。国際公開 WO2007/69666に開 示されているように、例えば、 TERT遺伝子、及び下記の遺伝子： SV40 Large T antig en、 HPV16 E6、 HPV16 E7、及び Bmilからなる群力 選ばれる 1種以上の遺伝子を単 独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。さらに、上記の遺伝子に加え て、 Fbxl5、 ERas、 ECAT15 - 2、 Tell,及び ;3 - cateninからなる群から選ばれる 1種以 上の遺伝子を組み合わせてもよぐ及び/又は ECAT1、 Esgl、 Dnmt3L、 ECAT8、 Gd Ω、 Soxl5、 ECAT15- 1、 Fthll7、 Rexl、 UTF1、 Stella, Stat3、及び Grb2からなる群から 選ばれる 1種以上の遺伝子を組み合わせることもできる。これらの組み合わせについ ては国際公開 WO2007/69666に具体的に説明されている。もっとも、本発明の方法 におレ、て使用可能な遺伝子は上記に具体的に説明した遺伝子に限定されることは ない。
[0056] 本発明の方法においては、核初期化因子として機能することができる他の遺伝子 のほか、分化、発生、又は増殖などに関係する因子あるいはその他の生理活性を有 する因子をコードする遺伝子の 1種又は 2種以上含むことができ、そのような態様も本 発明の範囲に包含されることは言うまでもない。例えば、核初期化因子を確認する手 段としては国際公開 WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方 法や国際公開 WO2007/69666に記載された具体的な核初期化因子の特定方法を利 用することができる。国際公開 WO 2005/80598及び国際公開 WO2007/69666の全て の開示を参照により本明細書の開示に含める。当業者はこれらの刊行物を参照する ことにより核初期化因子をスクリーニングし、本発明の方法のために利用することがで きる。また、上記のスクリーニング方法に適宜の修飾ないし改変を加えた方法を用い て核初期化因子を確認することもできる。上記の方法に用いられる遺伝子の組み合 わせが核初期化因子として作用することも上記の刊行物に記載された方法により当 業者が容易に確認することができる。
[0057] 本発明の方法において、人工多能性幹細胞の樹立効率を向上させるために、種々 の樹立効率改善剤の導入及び Z又は添加を行うこともできる。 iPS細胞の榭立効率 改善物質としては、例えば、ヒストンデァセチラーゼ (HDAC)阻害剤 [例えば、パルプ 口酸（VPAX Nat. Biotechnol., 26(7), pp. 795-797, 2008)、トリコスタチン A、酪酸ナトリ ゥム、 MC 1293や M344等の低分子阻害剤、 HDACに対する siRNA及び shRNA (例え ば、 HDAC1 siRNA Smartpool (登録商標、 Millipore)、 HuSH 29mer shRNA Construct s against HDAC1 (OriGene))などの核酸性発現阻害剤など]、 G9aヒストンメチルトラ ンスフェラーゼ阻害剤 [例えば、 BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2, pp.525-528, 2008)等 の低分子阻害剤、 G9aに対する siRNA及び shRNA (例えば、 G9a siRNA(human) (Sant a Cruz Biotechnology))などの核酸系発現阻害剤など]などが挙げられる力 これらに 限定されることはない。核酸系発現阻害剤は siRNA又は shRNAをコードする DNAを含 む発現ベクターの形態であってもよレ、。
[0058] 本発明の方法により製造される人工多能性幹細胞の用途は特に限定されず、 ES細 胞を利用して行われてレ、るあらゆる試験 ·研究や ES細胞を用いた疾病の治療などに 使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた人工多能性幹細胞をレ チノイン酸、 EGFなどの増殖因子、又はダルココルチコイドなどで処理することにより、 所望の分化細胞 (例えば神経細胞、心筋細胞、血球細胞など)を誘導することができ 、適宜の組織を形成させることができる。分化誘導方法については国際公開 WO200 7/69666などに具体的に説明されている。このようにして得られた分化細胞や組織を 患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。例え ば、患者自身の体細胞から安全性の高 V、人工多能性幹細胞を効率的に作製するこ とができ、この細胞を分ィ匕させることにより得られる細胞 (例えば心筋細胞、インスリン 産生細胞、又は神経細胞など)を心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病 や脊髄損傷など多様な疾患に対する幹細胞移植療法において安全に利用すること ができる。
[0059] また、例えば、ヒト体細胞から本発明の方法により人工多能†生幹細胞を調製した後 、この人工多能性幹細胞を分ィヒ誘導して体細胞、組織、又は臓器などを調製し、この 体細胞、組織、又は臓器などに対しての化合物、医薬、毒物などの生理作用や毒性 を評価することもできる。あるいは、特定の疾患の患者の体細胞力 本発明の方法に より人工多能性幹細胞を調製した後、この人工多能性幹細胞を分化誘導して体細胞 、組織、又は臓器などを調製し、この体細胞、組織、又は臓器などに対して医薬候補 化合物を作用させて治療及び/又は予防効果を判定することにより、医薬候補化合 物のスクリーニングを行うこともできる。もっとも、本発明の人工多能性幹細胞の用途 は上記の特定の態様に限定されることはない。
実施例
[0060] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明の範囲は下記の 実施例に限定されることはない。
例 1：マウス ES細胞培地における adult HDFからの iPS細胞の榭立
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞 (adult HDF)又はヒト新生児包皮由来線維芽細胞 (BJ )にレンチウィルスで Sk;7al (マウスレトロウイルス受容体)遺伝子を導入し (それぞれ、 「HDFa- Slc7al」、「BJ - Slc7al」とする）、 HDFa - Slc7al又は BJ - Slc7alは 800,000個に 調製した後、フィーダ一細胞（マイトマイシン処理 STO細胞)上にまき、以下の組み合 わせでレトロウイルスベクターにより遺伝子を導入した。
1. Oct3/4, Sox2, Klf4, c- yc, hTERT, Bmil
2. Oct3/4， Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E6, HPV16 E7
3. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E7
4. Oct3/4， Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, SV40 Large T antigen
5. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E6
6. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc
図中で示す「一」は、上記の組み合わせの「6. Oct3/4, Sox2, Klf4, c- Myc」を示す。 (Oct3/4, Sox2, KM, c- yc, TERTはヒト由来、 Bmilはマウス由来）
[0061] マウス ES細胞の培養条件下で薬剤選択無しで培養を続けたところ、 4の組み合わ せで遺伝子を導入したディッシュにおいて、ウィルス感染 8日後において iPS細胞と思 われるコロニーが出現した。他の組み合わせ（1力 3および 5)においても、 1の組み 合わせの場合ほどは明瞭ではないが、 iPS細胞様のコロニーが出現した。 4遺伝子（6 )のみを導入しても、全くコロニーは出現しなかったが、上記条件下で 4遺伝子のみ が導入された細胞はアルカリフォスファターゼ染色に対して明らかに陽性を呈してい た (図 1)。
[0062] 同様に、マウス Slc7al遺伝子を発現するヒト新生児包皮由来線維芽細胞 (BJ)を 80,0 00個に調製後、フィーダ一細胞（マイトマイシン処理 STO細胞）上にまき、以下の組み 合わせでレトロウイルスベクターにより遺伝子を導入した。
1. 4s(Oct3/4， Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, SV40 Large T antigen
2. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, Bmil
3. hTERT, SV40 Large T antigen
4. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4， c-Myc), hTERT, HPV16 E6
5. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, HPV16 E7
6. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, HPV16 E6.HPV16 E7
7. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT
8. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 9. DsRed
(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERTはヒト由来、 Bmilはマウス由来）
マウス ES細胞の培養条件下で 2週間培養を続けたところ、 4遺伝子 (8)のみが導入 された細胞はアルカリフォスファターゼ染色に対して陽性を呈した（図 2)。
[0063] 例 2 : iPS細胞による ECAT発現 (1)
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（adult HDF)力ら榭立されたヒ HPS細胞力 S、 ES細胞 で特異的に発現する遺伝子群である ECAT (ES cell associated transcript)を発現す るか否かを調べた。
adult HDFに由来する iPS細胞（クローン iPS- HDFaSlc- 87E6)を 6ゥエルプレートにあ らかじめ培養していたフィーダ一細胞（マイトマイシン C処理 STO細胞）上に、各ゥエル あたり 5 X 104個の割合で撒き、 4日間培養した。細胞を 10%ホルマリンを含 PBSで固定 し、固定液を除去後、 PBSで洗浄し、さらに室温で 45分間 3% BSA含 PBSを加え静置し た。一次抗体 (抗ヒト ABCG - 2抗体（マウス IgG)、抗 SSEA - 3抗体 (ラット IgM)、及び抗 S SEA- 4抗体（マウス IgG))を 3%BSA含 PBSで 1:100に希釈し、 4°Cでー晚反応させた後 、細胞を' 1% BSAを含む PBSで 3回洗浄し、 1% BSAを含む PBSで 1:300に希釈した二次 抗体を用いて室温で 1時間、遮光下で反応させた。二次抗体として Cy- 3で標識した 抗マウス IgG抗体 (ABCG-2及び SSEA- 4に対する抗体；ケミコン)及ぴ抗ラッ HgM抗 体 (SSEA - 3に対する抗体;ジャクソン'ィムノリサーチ）を使用した。細胞を PBSで洗浄 し、次いで顕微鏡下で観察及び撮影した（図 3)。この結果、 adult HDFに由来する iPS 細胞力 SABCG- 2、 SSEA - 3、及び SSEA - 4を発現していることが観察された。
[0064] 例 3： iPS細胞による ECAT発現 (2)
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞 (adult HDF)に由来する iPS細胞（クローン iPS- HDFaSl c - 87E3、 87E4、及び 87E12)をあらかじめ 6ゥエルプレートに播いておいたブイ一ダー 細胞（マイトマイシン C処理 STO細胞）上に各ゥエルあたり 5 X 104個の割合で撒き、 5日 間培養した。コントロ ルとして上記 iPS細胞の由来細胞である HDFを上記 6ゥヱルプ レート上に撒き、 2日間維持した。細胞を 10%ホルマリンを含む PBSで固定した。固定 液を除去し、細胞を PBSで洗浄した後、細胞を室温で 45分間ブロッキングバッファー（ 3% BSA含 PBS)を加え静置した。一次抗体 (抗 ABCG- 2抗体 (マウス IgG;プロッキング バッファーで 1:80に希釈）、抗 E-cadherin (マウス IgG; ;ブロッキングバッファーで 1:80 に希釈）、抗 SSEA- 3抗体（ラット IgM;ブロッキングバッファーで 1:250に希釈）、抗 SSE A - 4抗体（マウス IgG；ブロッキングバッファーで 1:250に希釈））と 4°Cでー晚反応させ た後、細胞をブロッキングバッファーで洗浄した。洗浄後、さらに細胞を二次抗体を用 いて室温で 1時間反応させた。二次抗体は、プロッキングバッファーで 1:300に希釈し た Cy- 3で標識した抗マウス IgG抗体 (ABCG- 2、 E-cadherin,及ぴ SSEA- 4に対する抗 体)及び抗ラット IgM抗体 (SSEA- 3に対する抗体)を用いた。 2次抗体反応後抗体溶 液を除去し、 PBSで洗浄した後、細胞に 50%グリセロールを含む PBSを加えて観察した (図 4)。
[0065] ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（adult HDF)に由来する iPS細胞は ES細胞の表面マ 一力一である SSEA_3、 SSEA - 4、 ABCG- 2、及び E- cadherinを発現していた。これに 対して、 iPS細胞の由来細胞である HDFaは SSEA- 3、 SSEA- 4、 ABCG- 2、及ぴ E- cadh erinの！/ヽずれも発現してレヽなかった。
[0066] 例 4： iPS細胞による ECAT発現 (3)
全 RNAを、ヒ HPS細胞クローン (iPS- HDFaSlc87E- 1〜8、 11及び 12)、 NTERA2クロ ーン D1ヒト胚癌細胞（継代数 35)、及びマウス Slc7al遺伝子を発現する adult HDF (継 代数 6)から単離した。第 1鎖 cDNAは oligo- dT20プライマー及び Rever Tra Ace- α - ki t (東洋紡)を製造業者のプロトコルに従って使用して合成した。 PCRはプライマーを 用レ、て以下の通りに行った。内在性 OCT3/4に対して hOct3/4- S1165及び hOct3/4 - AS1283;内在性 Sox2に対して hSox2-S1430及び hSox2-AS1555 ; Nanogに対して ECA T4_macaca- 968S及ぴ ECAT4 - macaca- 1334AS； REX1に対して hRex卜 RT- U及び hRe xl-RT-L； FGF4に対して hFGF4- RT- U及び hFGF4 - RT- L； GDF3に対して hGDF3- S 243及ぴ hGDF3-AS850： ECAT15- 1に対して hECAT15- S532及ぴ hECAT15 - AS916； ECAT15- 2に対して hECAT15- 2- S85及び hECAT15 - 2- AS667 ;ESG1に対して hpH34 - S40及ぴ hpH34- AS259 ;hTERTに対して hTERT_S3556及び hTERT- AS3713；並ぴ に G3PDHに対して G3PDH- F及び G3PDH- Rを使用した（表 1：配列表の配列番号 1か ら 22)。
この結果、多数のヒ HPS細胞クローン (iPS- HDFaSlc87E- 1〜8、 11及ぴ 12)が ECAT を発現しており、特に 87E6クローンは種々の ECATを発現してレ、た（図 5)。
[0067] [表 1]
Figure imgf000034_0001
[0068] 例 5： iPS細胞による ECAT発現 (4)
ヒト新生児包皮由来繊維芽細胞 (BJ線維芽細胞）に由来するヒ HPS細胞が ECATを 発現するか否かを確認した。
全 RNAをヒ HPS細胞（iPS— BJSlc - 97E - 1、 2、 4、 5、 6、 7、 8、 10、 11、 12、 -97G- 3、 5、 - 97H- 3、及び 5)、 NTERA2クローン D1ヒト胚性癌細胞 (継代数 35)、及びマウス Slc7al 遣伝子を発現する新生児包皮由来線維芽細胞 (BJ) (継代数 6)力 単離した。第 1鎖 cDNAは oligo - dT20プライマー及び Rever Tra Ace- a -kit (東洋紡）を用いて製造業 者のプロトコルに従って合成した。 PCRはプライマーを用いて以下の通りに行った。 内在性 OCT3/4に対して hOct3/4- S1165及ぴ hOct3/4- AS1283；内在性 Sox2に対し て hSox2- S1430及び hSox2- AS1555;Nanogに対して ECAT4- macaca- 968S及ぴ ECAT 4— macaca— 1334AS； REXlに対して hRexl-RT— U及び hRexl - RT— L； FGF4に対して hF GF4- RT- U及び hFGF4- RT - L； GDF3に対して hGDF3 - S243及び hGDF3 - AS850； EC AT15- 1に対して hECAT15- S532及ぴ hECAT15- AS916 ;ECAT15- 2に対して hECAT 15-2- S85及ぴ hECAT15- 2- AS667； ESGlに対して hpH34-S40及び hpH34-AS259； hT ERTに対して hTERT - S3556及ぴ hTERT - AS3713；並びに G3PDHに対して G3PDH - F 及び G3PDH-Rを使用した (表 2：配列表の配列番号 23から 44)。
[0069] この結果、多数のヒ HPS細胞クローン (iPS-BJSlc - 97E- 1、 2、 4、 5、 6、 7、 8、 10、 11、 12、 - 97G-3、 5、 - 97H- 3、及ぴ 5)力 ¾CATを発現していた（図 6)。
[0070] [表 2]
Figure imgf000035_0001
[0071] 例 6：ヒト iPS細胞による奇形腫形成 例6：ヒト iPS細胞による奇形腫形成
5.0 X 106個のヒト iPS細胞を、 SCIDマウス (雌、 5週齢）の背側面に皮下注射した。注 射の 5週間後に大きな腫瘍が観察された。腫瘍を切除して重量を計測し、外観を撮 影した。この腫瘍を 10%ホノレマリンを含む PBSで固定した。パラフィン包理した腫瘍を 4.5 m切片にスライスした薄切片をスライドガラス上に載せ風乾した後、へマトキシリ ン 'ェォジン染色を行った。図 7の Aは、 iPS-HDFaSlc-87E12クローンを皮下注射した マウス及ぴその奇形腫を示す。図 7の Bはクローン iPS - HDFaSlc- 87E3、同 Cはクロー ン iPS- HDFaSlc- 87E6、同 Dはクローン iPS- HDFaSlc - 87E12を皮下注射したマウスか ら切除された奇形腫由来の組織像をそれぞれ示す。
[0072] 例 7：ヒト iPS細胞の in vitro分ィ匕
• 浮遊培養を行うことにより胚様体 (Embryoid body： EBs)を形成させて、 in vitroでのヒ HPS細胞の分化能を評価した。ヒ HPS細胞 (iPS- HDFaSlc_127F2、 E3)を 7 3間浮遊 培養し、胚様体を形成させた。その後、胚様体をゼラチンコートしたプレートに移し、 さらに 8日間培養を継続し、その後免疫組織ィ匕学分析を行った。使用した一次抗体 は以下の通りである。抗 -平滑筋ァクチン抗体 (ダコ）、抗 β III -チュープリン抗体（ ケミコン）、抗- ex-フエトプロテイン抗体 (ダコ）、正常マウス IgG (2 mg/mUケミコン）、 及び正常ゥサギ IgG (2 mg/mUケミコン）は、それぞれ 3%BSA含 PBSで 1:100で希釈し、 一次抗体として使用した。一次抗体を室温で 1時間反応させた後に細胞を PBSで洗 浄し、二次抗体（3°/。BSA含 PBSで 1 : 300に希釈）を反応させた。なお、核は DAPIにより 染色した。その結果、 α -平滑筋ァクチン ( - SMA、中胚葉マーカー)、 IIIチューブ リン (外胚葉マーカー)、 a -フエトプロテイン (内胚葉マーカー)が陽性を示したことによ り、ヒ HPS細胞は胚様体形成を介して in vitroで分化することを確認した（図 8)。
[0073] 例 8 :ヒ HPS細胞の作製のためのレトロウイルスによる遺伝子導入の最適化
マウス線維芽細胞からの iPS細胞の誘導には高い遺伝子導入効率を有するレトロウイ ノレスが有効であると考えられている（Takahashi et al, Cell, 126, ρρ·663- 676， 2006)。 そこで、ヒト成人皮膚由来線維芽細胞 (adult HDF)における遺伝子導入方法を最適 化した。最初に PLAT- Aパッケージング細胞におレ、て作製した両種性（amphotropic) レトロウイルスを用いて adult HDFに緑色蛍光タンパク質（GFP)を導入した。対照とし て、 PLAT- Eパッケージング細胞 (Morita et al, Gene Ther., 7， pp.1063- 66， 2000)に ぉレ、て作製した同種指向性 (ecotropic)レトロウイルスを用レ、てマウス胎児線維芽細 胞 (MEF)に GFPを導入した。 MEFにおいては、 80%以上の細胞が GFPを発現した (図 9)。一方、 20%未満の adult HDFは MEFの場合より明らかに GFPの発現強度が低ぐ GFP発現率は 20%未満であった。
[0074] 遺伝子導入効率を改善するために、マウスレトロウイルスのレセプター Slc7al (Verr ey et al., Pflugers Arch., 447， pp.532- 542, 2004)(mCATlとしても知られている)をレ ンチウィルスを用いて adult HDFに導入した。次に同種指向性レトロウイルスを用いて HDFa - Slc7alに GFPを導入した。この方法により 60%の遺伝子導入効率が達成された (図 9)。
[0075] 例 9：霊長類 ES細胞培地を用レ、た adult HDFからの iPS細胞の作製
ヒ HPS細胞を誘導するためのプロトコルを図 10Aに概略を示した。ヒト Oct3/4、 Sox2 、 Klf4,及び c- Mycをレトロウイルスベクターにてを HDF- Slc7alに導入した（図 10B、 8 105細胞/ 100 mmディッシュ)。
遺伝子導入の 6日後、細胞をトリプシン処理により回収し、 5 X 104又は 5 X 105細胞/ 100 mmディッシュに調整した後、マイトマイシン C処理 SNLフィーダ一細胞 (McMahon et al., Cell, 62, pp.1073- 85, 1990)上に撒いた。翌日、培地（10% FBSを含む DMEM )を 4 ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF)を補充した霊長類 ES細胞用培地（ リプロセル）に交換した。約 2週間後、細胞形態がヒト ES細胞とは類似しない幾つかの 粒状コロニーが現れた (図 10C)。 25日目頃、平らでヒト ES細胞コロニーに類似した別 のタイプのコロニーが観察された (図 10D)。 5 X 104個の線維芽細胞から、約 10個のヒ ト ES細胞様コロニー及び約 100個の粒状コロニーが観察された (6回の独立した実験 において、 7/122、 8/84、 8/171、 5/73、 6/122、及ぴ 11/213個を観察した。結果を表 3 にまとめた)。
[0076] [表 3] ピックァ
it伝子導入 樹立され
ES様コロ 全コロニー ップされ
実験番号 親細胞 後 6日目に撒 たクロー ニー数 数 たコ口- いた細胞数 ン数 数
20 IB HDF 50000 7 129 7 5
500000 . 0 >1000
243H HFLS
50000 17 679 6 2
500000 0 420
246B HDF 500000 2 508
50000 8 92 6 6
50000 7 10 6 5
246G BJ 500000 86 98
500000 106 108
500000 0 320
249D HDF 500000 0 467
50000 8 179 6 4
50000 5 78 3 2
50000 6 128 3 3
253F HDF
500000 10 531
500000 3 738
282C HDF 50000 11 224 3 1
282H BJ 50000 13 15 3 2
282R HFLS 5000 31 98 6 2
[0077] 30日目に、ヒト ES細胞様コロニーを取り、酵素消化を行うことなく小さな塊に機械的 にばらばらにした。 5 X 105個の線維芽細胞力 始めた場合、ディッシュは 300個を超 える粒状コロニーによりほぼ覆われた。幾つかのヒト ES細胞様コロニーが粒状コロュ 一の間に観察される場合もあった力 粒状コ口-一が高密度であったため、ヒト ES細 胞様コロニーを単離することは困難であった。
[0078] ヒ HPS細胞を bFGFを含む霊長類 ES細胞様培地を用レ、て SNLフィーダ一細胞上で 増殖させたところ、細胞は固く密集した平らなコロニーを形成した (図 10E)。それぞれ の細胞は、大きな核小体とわずかな細胞質を特徴とするヒト ES細胞と同様の細胞形 態を示した (図 10F)。ヒト ES細胞の場合と同様に、コロニーの中心に自発性分化が観 察される場合があった (図 10G)。また、これらの細胞はヒト ES細胞と類似してフィーダ 一細胞依存性を示し、ゼラチンコートした組織培養プレートには接着しな力、つた。一 方、これらの細胞はマトリゲノレコートされたプレート上の MEF調整霊長類 ES細胞用培 地 (MEF- CM)中では未分ィ匕状態を維持したが、非調整霊長類 ES細胞用培地中では 未分化状態を維持しなかった（図 11)。樹立されたヒ HPS細胞のクローンを表 4にまと めた。
[表 4]
マーカ -の発現 多能性
クロ一ン 起源 RT-PCR IC EB PA6 心筋細 奇形腫 胞
201B1
201B2
201B3 HDF V
201B6
201B7 V
243H1
HFLS
243H7 V V
246B1 V
246B2
246B3
HDF
246B4
246B5
246B6
246G1 V· V
246G3 V
246G4 BJ
246G5
246G6
253F1
253F2
253F3 HDF
253F4 V
253F5
IC: 免疫組織化学（imnmnocytochetnistry) , EB : 胚 体（embryoid body)
[0080] 例 10：ヒト iPS細胞によるヒト ES細胞マーカーの発現
免疫染色解析により、ヒ HPS細胞は SSEA- 3、 SSEA- 4、 TRA-1-60, TRA- 1-81、及 び TRA- 2- 49/6E (アルカリフォスファターゼ)を含むヒト ES細胞特異的表面抗原 (Adew umi et al.， Nat. Biotechnol., 25, pp.803- 816， 2007)、並びに Nanog蛋白の発現を示 した (図 10の I〜N)。
[0081] RT - PCRにより、ヒ HPS細胞は、未分化 ES細胞の多数の遺伝子マーカー（例えば、 0 3/4、 Sox2、 Nanog, GDF3、 REX1、 FGF4、 ESG1、 DPPA2、 DPPA4、及ぴ（hTERT )など）をヒト胚性癌細胞株 NTERA- 2の場合と同等以上のレベルで発現してレ、ること が示された（図 12)。ウェスタンプロットの結果からは、 Oct3/4、 Sox2、 Nanog, Sall4、 E- CADHERIN,及び hTERTの蛋白質レべノレは、ヒ HPS細胞及びヒト ES細胞において同 等であった (図 13A；)。ヒ HPS細胞においては、染色体に組み込まれたレトロウイルスか らの導入遺伝子の発現は効率的にサイレンシングされていたことから、これらの遺伝 子の内因性発現に依存してレ、ることが示唆された (図 13B)。
[0082] 例 11：ヒト iPS細胞内における ES細胞特異的遺伝子プロモーターの活性
バイサルファイトゲノミックシークェンス法により、 Oct3/4、 REX1及び Nanogなどの多 能性に関連する遺伝子のプロモーター領域におけるシトシングァニンジヌクレオチド、（ CpG)のメチル化の状態を評価した結果、その領域の CpGジヌクレオチドは由来源の 親 HDF(HDF)におレ、ては高度にメチル化されて 、るのに対して、ヒ HPS細胞（201B2, 201B6, 201B7)では高度に脱メチル化されていることが判明した (図 14A)。これらの知 見から、これらのプロモーターがヒ HPS細胞において活性化されてレ、ることが示唆さ し。
[0083] ルシフェラーゼレポーターアツセィにおいても、ヒト Oct3/4及び REX1プロモーター は、ヒ HPS細胞においては高レベルの転写活性を有した力 HDFでは有さないことが 示された。ヒト RNAポリメラーゼ Π(ΡοΙΠ)などの普遍的に発現する遺伝子のプロモータ 一活性はヒ HPS細胞及び HDFの両方において同等の活性を示した (図 14Β)。
[0084] 例 12：ヒト iPS細胞の高テロメラーゼ活性及び指数関数的増殖
hTERTの高い発現レベル力 推測される通り、ヒ HPS細胞は高いテロメラーゼ活性 を示した (図 15A)。ヒ HPS細胞は、少なくとも 4ヶ月間は指数関数的に増殖した (図 15B) 。ヒ HPS細胞の計算上の倍増時間は、 46.9土 12.4 (クローン 201B2)、 47.8土 6.6 (20 1B6)、及び 43.2土 11.5 (201B7)時間であった（図 15B)。これらの時間は、既報のヒト ES細胞の倍増時間と同等であった (Cowan et al., N. Engl. J. Med., 350, pp.1353 - 56 ， 2004)。
[0085] 例 13： HDF由来ヒ HPS細胞の交差汚染（cross- contamination)評価
ヒ MPS細胞のゲノム DNAの PCRにより、全クローン力 種全てのレトロウイルスの組み 込みを有することが示された (図 16A)。 c-Myc cDNAプローブを用いたサザンプロット 分析により、それぞれのクローンがレトロウイルス組み込み部位の特有のパターンを 有することが判明した (図 16B)。また、 16のショートタンデムリピートのパターンは、ヒ H PSクローンと親の HDFとの間で完全に一致した。 HDF由来 iPS細胞の STR解析の結果 を表 5に示す。
[表 5]
Locus/
201B1 201B2 201B3 201B6 201B7 NTERA-2 HDF Clone
D3S1358
15 17 15 17 IS 17 15 17 15 17 15 15 17
TH01
5 S 5 5 5 9 5
D21S11
28 28 28 28 28 29 30 28
D18S51
14 14 14 14 14 13 14 ·
Penta_E
7 19 7 19 7 19 7 19 7 19 S 14 7 19
D5S818
11 11 11 11 11 8 11 11
D13S317 14
10 14 10 14 10 10 14 10 14 14 10 14
D7S820
9 10 9 10 9 10 9 10 9 10 12 9 10
D16S539
11 13 11 13 11 13 11 13 11 13 11 16 11 13
CSF1P0
10 10 10 10 10 9 11 10
Penta一 D
8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 11 12 8 10
AMEL
X X X X . X X Y X vWA
15 18 15 18 15 18 15 18 ' 15 18 19 15 18
D8S1179
8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 13 15 8 10
TPOX
■8 9 8 9 8 9 8 9 8 9 8 9 8 9
FGA
20 22 20 22 20 22 20 22 20 22 23 20 22 [0087] これらのパターンは、ナショナル ·インスティチュート'ォブ 'ヘルスのゥヱブサイト (htt p:// stemcells.nih.gov/research/nihresearch/ scunit/ genotyping.htm)で幸 ϋ告 れて レ、る榭立されたヒト ES細胞株の何れとも異なっていた。また、染色体の G横縞分析に より、ヒ HPS細胞が正常な 46ΧΧ核型を有することが示された。従って、ヒ HPSクローン は HDFに由来するものであり、 ES細胞のコンタミネーシヨンによるものではないと結論 された。
[0088] 例 14：ヒ HPS細胞の胚様体を介した分化
in vitroでのヒ HPS細胞の分化能を決定するために、浮遊培養を使用して胚様体 (E mbryoid body:EBs)を形成させた。浮遊培養の 8日目後、 iPS細胞はボール状の構造 を形成した (図 17A)。これらの Embryoid body様構造をゼラチンコートしたプレートに移 し、さらに 8日間培養を継続した。付着した細胞は、神経様細胞、敷石様細胞、及び 上皮細胞などの様々な細胞形態を示した（図 17B-E)。免疫組織化学分析により、 β ί IIチュープリン (外胚葉マーカー)、グリア原線維酸性蛋白 (GFAP、外胚葉)、ひ-平滑 筋ァクチン ( a - SMA、中胚葉)、デスミン (中胚菓)、 -フエトプロテイン (内胚葉)、及ぴ ビメンチン (中胚葉及び体壁の内胚葉)に対して陽性の細胞が検出された (図 17F - K) 。 RT - PCRの結果から、これらの分化した細胞において FOXA2 (内胚葉マーカー)、 A FP (内胚葉)、サイトケラチン 8及び 18(内胚葉)、 SOX17 (内胚葉)、 BRACHYURY (中胚 葉)、 MSX1 (中胚葉)、 AP2 (外胚葉)、及び PAX6 (外胚葉)が発現していることが確 認された（図 17L)。一方、 Oct3/4、 Sox2、及ぴ Nanogの発現は明らかに低減していた 。これらの結果より、 iPS細胞力 S3胚葉系にインビト口で分化できることが示された。
[0089] 例 15 :ヒ HPS細胞の神経細胞への分化
ヒ HPS細胞からの分化をヒト ES細胞についての既報の方法により誘導できるか否か を検討した。 PA6フィーダ一細胞層の上にヒ HPS細胞を撒き、分化条件下で 2週維持 '培養間した (Kawasaki et al., Neuron, 28， pp.31-40, 2000)。細胞は大きく広がり、レヽ くつ力 神経構造が観察された (図 18A)。免疫組織化学分析により、培養物中にチロ シンヒドロキシナ一ゼ及ぴ β ΠΙチューブリン陽性細胞が検出された (図 18B)。 PCR分 析の結果から、 AADC、 ChAT、、 DAT,及ぴ LMX1Bなどのドーノ、。ミン作用性神経マ 一力一、並びに他の神経マーカーである MAP2の発現が確認された (図 18C)。また、 Oct3/4、 Sox2、及ぴ Nanogの発現は低減した (図 18C)。これらの結果から、 iPS細胞が PA6細胞との共培養によりドーパミン作用性ニューロンを含む神経細胞に分化できる ことが示された。
[0090] 例 16：ヒ HPS細胞の心臓細胞への方向付けした分化
ァクチビン A及び骨形成因子 (BMP を利用した心臓細胞への分化に関する文献 (L aflamme et al., Nat. BiotechnoL, 25， pp.1015-24, 2007)を用いてヒ HPS細胞の心臓 への分化を検討した。分化誘導力 12日後、細胞塊は鼓動を始めた (図 18D)。 RT- P CRの結果から、これらの細胞が TnTc、 EF2C, ΝΚΧ2·5、 MYL2A,及び MYHCBなど の心筋細胞マーカーを発現していることが示された (図 18E)。一方、 Oct3/4、 Sox2、 及び Nanogの発現は著しく低減していた。これらの結果から、ヒ HPS細胞がインビトロ で心筋細胞八と分化できることが示された。
[0091] 例 17：ヒ HPS細胞からの奇形腫形成
インビボでの多能性を試験するため、ヒ HPS細胞 (クローン 201B7)を免疫不全 (SCID) マウスの背側の側腹部へ皮下移植した。 9週間後に腫瘍形成が観察された。組織学 的観察により、原腸管様上皮組織 (外胚葉)、横紋筋 (中胚葉)、軟骨 (筋肉)、神経組織 (内胚葉)、及びケラチン含有扁平組織 (内胚葉)を含む様々な組織 (図 19)が腫瘍に含 まれてレ、ることが示された。
[0092] 例 18：他のヒト体細胞からの iPS細胞の作製
HDFに加えて、成人男性の滑膜組織の初代ヒト由来線維芽細胞様滑膜細胞 (HFL S)及ぴ新生児の包皮由来の線維芽細胞から樹立された細胞株 (BJ細胞)新生児の 包皮由来の線維芽細胞力 樹立された細胞株を使用した (表 3)。 HFLS(5 X 104細胞/ 100 mmディッシュ)から iPS細胞の作成を試みた結果、 600個以上の粒状コロニー及び 17個のヒト ES細胞様コ口-一を得た。これらの 17個のコロニーのうち 6コロニーを試験 に供したところ、それらのうちの 2コロニーのみが増殖可能であった（図 20)。 5 X 105の HFし Sを撒!/、たディッシュは粒状コロニーで覆われており、ヒト ES細胞様コ口-一は確 認できなかった。一方、 BJ細胞力 iPS細胞の作成を試みた結果、 5 X loVlOO mmデ イツシュからの場合、僅かな粒状コ口-一も認められたものの 7〜13個のヒト ES細胞様 コロニー及び 5 X 105' 100 mmディッシュからの場合は 100個のヒト ES細胞様コ口-一を 得た (表 3)。そのうち 6個のヒト ES細胞様コロニーを取り、 5個のコロニーから iPS細胞を 確認した (図 20)。 HFLS及ぴ BJに由来するヒ HPS細胞は、ヒト ES細胞の場合と同等以 上のレべノレでヒト ES細胞マーカー遺伝子を発現してレ、た (図 21)。これらのヒ HPS細胞 は、 EBsを介して 3胚葉系に分ィ匕した (図 22)。 STR分析により、 iPS - HFLS細胞及び iPS - BJ細胞はそれぞれ HFLS及び BJ細胞に由来することが確認、された。表 6は HFLS由 来 iPS細胞の STR解析の結果を示し、表 7は BJ由来 iPS細胞の STR解析の結果を示す [表 6]
Figure imgf000045_0001
7] Locus/
246G1 246G3 246G4 246G5 246G6 BJ Clone
D3S1358
13 15 13 15 13 15 13 15 13 15 13 15
TH01
6 7 6 7 6 7 6 7 6 7 6 7
D21S11
28 28 28 28 28 28
D18S51
16 18 16 18 16 18 16 18 16 18 16 18
Penta_E
7 17 7 17 7 17 7 17 7 17 7 17
D5S818
11 11 11 11 11 11
D13S317
9 10 9 10 9 . 10 9 10 9 10 9 10
D7S820
11 12 11 12 11 12 11 12 11 12 11 12
D16S539
•9 13 9 13 9 13 9 13 9 13 9 13 .
CSF1P0
9 11 9 11 9 11 9 11 9 11 9 11
Penta_D
11 12 11 12 11 12 11 12 11 12 11 12 簾 L
X Y X Y X Y X Y X Y X Y
vWA
16 18 16 18 16 18 16 18 16 18 16 18
D8S1179
9 11 9 11 9 11 9 11 9 11 9 11
TPOX
10 11 10 11 10 11 10 11 10 11 10 11
FGA
22 23 22 23 22 23 22 23 22 23 22 23 以上の結果から、 4種の遺伝子： Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び c-Mycのレトロウイルスに よる遺伝子導入により、 adult HDF及び他の体細胞から iPS細胞を作製できることが示 された。樹立されたヒ HPS細胞は、細胞形態、増殖、フィーダ一細胞依存性、表面マ 一力一の発現パターン、遺伝子発現、プロモータ一活性、テロメラーゼ活性、インビト 口での分化能、及ぴ奇形腫形成能を含む多くの点でヒト ES細胞と類似していた。また 、 4種のレトロウイルスはヒ HPS細胞内でほぼ完全にサイレンシングされていた。このこ とから、これらの細胞は完全に初期化されており、自己再生については導入遺伝子 の継続的な発現に依存しなレ、こと力 S示された。
例 8〜18における実験材料及ぴ方法は以下の通りである。
1.細胞培養
36歳のカフカス人女性の顔の皮膚力 得た HDFs及び 69歳のカフカス人男性の滑 膜組織から得た HFLsはセルアプリケーション社力、ら購入した。新生児の包皮から得 た BJ線維芽細胞及び NTERA - 2クローン D1ヒト胚性癌細胞は、アメリカンタイプカルチ ヤーコレクション力 入手した。ヒト線維芽細胞 NTERA-2、 PLAT - E、及び PLAT - A細 胞は、 10%ゥシ胎児血清 (FBS)、並びに 0. 5%ぺェシリン及ぴストレプトマイシン (イン ビト口ジ工ン)を含有するダノレべッコ改変イーグル培地 (DMEM,ナカライテスタ)で維 持した。 293FT細胞は 10% FBS、 2 mM Lグルタミン (インビトロジェン)、 1 10— 4 M非必 須アミノ酸 (インビトロジェン)、及び 1 mMピルビン酸ナトリウム (シグマ)、並びに 0.5%ぺ -シリン及びストレプトマイシンを含有する DMEMで維持した。 PA6間質細胞 (理研バ ィォリソースセンター)は、 10% FBS及び 0.5%ペニシリン及びストレプトマイシンを含有 する α - MEMで維持した。 iPS細胞は 4 ng/ml組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ bFGF、和光純薬)を補充した霊長類 ES細胞用培地 (リプロセル)で樹立及び維持した 。継代においては、ヒト iPS細胞は、 PBSで一回洗浄し、その後 37°Cで 1 mg/mlコラゲ ナーゼ IV (インビトロジェン）を含む DMEM/F12でインキュベートした。ディッシュの縁 にあるコロニーが底面から分離し始めた時に、 DMEM/F12/コラゲナーゼを除去し、ヒ ト ES細胞培地で洗浄した。細胞を力きとり、 15 mlの円錐形チューブに回収した。適量 の培地を添加し、 SNLフィーダ一細胞上に新しいディッシュに移した。分割比は常に 1 :3とした。 iPS細胞をフィーダ一細胞を含まない状態で培養するためには、プレートは 4°Cで一晚 0.3 mg/mlマトリゲノレ ( BDバイオサイェンシス)でコートした。プレートは使 用前に室温に加温した。未結合のマトリゲルは吸引除去し、 DMEM/F12で洗浄した。 iPS細胞は、マトリゲルコートされたプレート上に、 4 ng/mlの bFGFを補充した MEF -調 整霊長類 ES細胞用培地 (MEF- CM)又は MEF-非調整霊長類 ES細胞用培地 (リプロセ ル)を用いて撒いた。培地は毎日交換した。 MEF- CMの調製のために、 ICRマウスの 受精後 13.5日目の胚を回収し得た MEFsを 1 X 106 cells/100 mmでプレートにまき一 晚培養した。翌日、細胞を PBSで一回洗浄し、 10 mlの霊長類 ES細胞用培地で培養し た。 24時間培養後、 MEF培養の培養上清液を回収し、孔径 0.22 μ mのフィルターで 濾過し、使用するまで- 20°Cで保存した。
[0097] 2.プラスミド構築
ヒト Oct3/4のオープンリーディングフレームを RT - PCRにより増幅し、 pCR2.1-TOPO にクロ一ニングした。 pCR2ュ- hOct3/4の EcoRIフラグメントを、 pMXsレトロウイルス ベクターの EcoRI部位に導入した。それぞれの実験を区別するために、 N バーコ一
20
ドと命名した 20_bpのランダム配列を Oct3/4発現ベクターの Notl/Sall部位へ導入し た。実験間でのコンタミネーシヨンを防ぐため、各実験において特有のパーコードを 使用した。ヒト Sox2, Kl 及び c-Mycのオープンリーディングフレームも RT- PCRにより 増幅し、 pENTR-D-TOPO (インビトロジェン)へサブクロ一ニングした。 pENTR- D-TO POへサプクローエングした全遺伝子を、ゲイトウエイクローニングシステム (インビトロ ジェン)を取扱説明書に従って用いて pMXsレトロウイルスベクターに導入した。マウス Slc7alオープンリーディングフレームも増幅し、 ENTR-D-TOPOにサプクローニン グし、ゲイトウエイシステムにより pLenti6/UbC/V5- DEST (インビトロジェン)に導入し た。ヒト Oct3/4遺伝子及ぴ REX1遺伝子の調節領域を、 PCRにより増幅し、 pCRXL- T 0P0 (インビトロジェン)にサブクロー-ングした。 PhOCT4_Luc及び phREXl- Lucのた めに、 pCRXLベクターから Kpnl/Bglll消化により除去したフラグメントを pGV - BM2の K pnl/Bglll部位にサプクローニングした。 ρΡοΙΠ- Lucのために、 pQBI-polIIの Aatll (平 滑末端)/ Nhelフラグメントを pGV- BM2の Kpnl (平滑末端)/ Nhel部位に挿入した。全 てのフラグメントをシークェンスにより確認した。プライマー配列を表 8 (配列表の配列 番号 45から 126)に示す。
[0098] [表 8] Primer Sequence (5， to 3，) Applications h0ct3/4-S944 CCC CAG GGC CCC ATT TTG GTA CC 0ct3/4 Tg PCR hSox2-S691 GGC ACC CCT GGC ATG GCT CTT GGC TC Sox2 Tg PCR hKlf4-S1128 ACG ATC GTG GCC CCG GAA AAG GAC C Klf4 endo and Tg
PCR
hMYC-SlOll CAA CAA CCG AAA ATG CAC CAG CCC CAG c-Myo Tg PCR pMXs - AS3200 TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG Tg PCR pMXs- L3205 CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA Tg PCR hOct3/4-S1165 GAC AGG GGG AGG GGA. GGA GCT AGG Endo 0ct3/4 h0ct3/4- AS1283 CTT CCC TCC AAC CAG TTG CCC CAA AC RT-PC hSox2-S1430 . GGG AAA TGG GAG GGG TGC AAA AGA GG Endo Sox2 hSox2-AS15S5 TTG CGT GAG TGT GGA TGG GAT TGG TG RT-PCR ·
ECAT4-macaca-968S CAG CCC CGA TTC TTC CAC CAG TCC C Nanog RT-PCR
ECAT4- macaca - 1334AS CGG AAG ATT CCC AGT CGG GTT CAC C
hGDF3-S243 CTT ATG CTA CGT AAA GGA GCT GGG GDF3 RT-PCR hGDF3-AS850 GTG CCA ACC CAG GTC CCG GAA GTT
hREXI-RT-U CAG ATC CTA AAC AGC TCG CAG AAT REX1 RT-PCR hREXI-RT-L GCG TAC GCA AAT TAA AGT CCA GA
hFGF4 - RT - U CTA CAA CGC CTA CGA GTC CTA CA FGF4 RT-PCR hFGF4-RT-L GTT GCA CCA GAA AAG TCA GAG TTG
hpH34-S40 ATA TCC CGC CGT GGG TGA AAG TTC ESG1 RT-PCR hpH34-AS259 ACT CAG CCA TGG ACT GGA GCA TCC
hECAT15- 1-S532 GGA GCC GCC TGC CCT GGA AAA TTC DPPA4 RT-PCR hECAT15-l-AS916 TTT TTC CTG ATA TTC TAT TCC CAT
hECAT15-2-S85 CCG TCC CCG CAA TCT CCT TCC ATC - DPPA2 RT-PCR hECAT15-2-AS667 ATG ATG CCA ACA TGG CTC CCG GTG
hTERT - S3234 CCT GCT CAA GCT GAC TCG ACA CCG TG hTERT RT-PCR hTERT- AS3713 GGA AAA GCT GGC CCT GGG GTG GAG C
hKlf4- AS1826 TGA TTG TAG TGC TTT CTG GCT GGG CTC C Endo Klf4
RT-PCR hMYC-S253 GCG TCC TGG GAA GGG AGA TCC GGA GC Endo c-Myc hJffC - AS555 TTG AGG GGC ATC GTC GCG GGA GGC TG RT-PCR hMSXl-S665 CGA GAG GAC CCC GTG GAT GCA GAG MSX1 RT-PCR h SXl-AS938 GGC GGC CAT CTT CAG CTT CTC CAG
hBRAC蘭 RY- S1292 GCC CTC TCC CTC CCC TCC ACG CAC AG BRACHYURY/T hBRACHYURY-AS1540 CGG CGC CGT TGC TCA CAG ACC. ACA GG RT-PCR hGFAP-S1040 GGC CCG CCA CTT GCA GGA GTA CCA GG GFAP RT-PCR hGFAP - AS1342 CTT CTG CTC GGG CCC CTC ATG AGA CG hPAX6 - S1206 ACC CAT TAT CCA GAT GTG TTT GCC CGA G PAX6 RT-PCR hPAX6-AS1497 ATG GTG AAG CTG GGC ATA GGC GGC AG
hF0XA2-S208 TGG GAG CGG TGA AGA TGG AAG GGC AC F0XA2 RT-PCR hF0XA2-AS398 TCA TGC CAG CGC CCA CGT ACG ACG AC
hS0X17-S423 CGC TTT CAT GGT GTG GGC TAA GGA CG S0X17 RT-PCR hS0X17-AS583 TAG TTG GGG TGG TCC TGC ATG TGC TG
hAADC-S1378 CGC CAG GAT CCC CGC TTT GAA ATC TG AADC RT-PCR hAADC- AS1594 TCG GCC GCC AGC TCT TTG ATG TGT TC
hChAT-S1360 GGA GGC GTG GAG CTC AGC GAC ACC ChAT RT-PCR hChAT - AS1592 CGG GGA GCT CGC TGA CGG AGT CTG
h AP2-S5401 CAG GTG GCG GAC GTG TGA AAA TTG AGA
GTG MAP2 RT-PCR hMAP2 - AS5587 CAC GCT GGA TCT GCC TGG GGA CTG TG
hDAT-S 1935 ACA GAG GGG AGG TGC GCC AGT TCA CG
hDAT-AS2207 ACG GGG TGG ACC TCG CTG CAC AGA TC SLC6A3/DAT
RT-PCR hLMXIB- S770 GGC ACC AGC AGC AGC AGG AGC AGC AG
hLMXIB- AS1020 CCA CGT CTG AGG AGC CGA GGA AGC AG LMX1B RT-PCR h YL2A-S258 GGG CCC CAT CAA CTT CAC CGT CTT CC
hMYL2A-AS468 . TGT AGT CGA TGT TCC CCG CCA GGT CC MYL2A RT-PCR hTnTo-S524 ATG AGC GGG AGA AGG AGC GGC AGA AC
hTnTc- AS730 TCA ATG GCC AGC ACC TTC CTC CTC TC TnTc RT-PCR hMEF2C-S1407 TTT AAC ACC GCC AGC GCT CTT CAC CTT G
h EF2C- AS1618 TCG TGG CGC GTG TGT TGT GGG TAT CTC G EF2C RT-PCR hMYHCB-S5582 CTG GAG GCC GAG CAG AAG CGC AAC G YHCB RT-PCR hMYHCB- AS5815 GTC CGC CCG CTC CTC TGC CTC ATC C
d 20 Reverse
TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT
transcription h YC-S857 GCC ACA GCA AAC CTC CTC ACA GCC CAC Southern blot h YC-AS1246 CTC GTC GTT TCC GCA ACA AGT CCT CTT C probe
hOct3/4-S CAC CAT GGC GGG ACA CCT GGC TTC AG 0ct3/4 cloning h0ct3/4-AS ACC TCA GTT TGA ATG CAT GGG AGA GC
hSox2-S CAC CAT GTA CAA CAT GAT GGA GAC GGA Sox2 cloning
GCT G
hSox2-AS TCA CAT GTG TGA GAG GGG CAG TGT GC
h lf4-S CAG CAT GGC TGT CAG TGA CGC GCT GCT Klf4 cloning
CCC
hKlf4-AS TTA AAA ATG TCT CTT CAT GTG TAA GGC
GAG hMYC-S CAC CAT GCC CCT CAA CGT TAG CTT CAC c-Myc cloning
CAA
hMYC-AS TCA CGC ACA AGA GTT CCG TAG CTG TTC
AAG
Slc7al-S CAC CAT GGG CTG CAA AAA CCT GCT CGG Mouse Slc7al
Slc7al-AS TCA TTT GCA CTG GTC CAA GTT GCT GTC cloning hREXl-pro5K-S ATT GTC GAC GGG GAT TTG GCA GGG TCA
CAG GAC
hREXxl-pro5K-AS CCC AGA TCT CCA ATG CCA CCT CCT CCC
AAA CG Promoter cloning h0ct3/4-pro5K-S CACTCG AGG TGG AGG AGC TGA GGG CAC
TGT GG
hOct3/4-pro5K-AS CAC AGA TCT GAA ATG AGG GCT TGC GAA
GGG AC mehREXl-Fl-S GGT TTA AAA GGG TAA ATG TGA TTA TAT Bisulfite
TTA sequencing mehREXl-Fl-AS CAA ACT ACA ACC ACC CAT CAA C
meh0ct3/4 F2-S GAG GTT GGA GTA GAA GGA TTG TTT TGG
TTT
mehOct3/4 F2 - AS CCC CCC TAA CCC ATC ACC TCC ACC ACC
TAA
mehNanog-FI-S TGG TTA GGT TGG TTT TAA ATT TTT G
mehNanog-FI-AS AAC CCA CCC TTA TAA ATT CTC AAT TA
[0099] 3.レンチウィルス作製及び感染
6 X 106細胞の 293FT細胞 (インビトロジェン)を 100 mmディッシュに播き、一晚培養し た。リポフエクトァミン 2000 (インビトロジェン)を取扱説明書に従って用いて 293FT細胞 に 9 /i gのビラパワーパッケージングミックス（Virapower packaging mix)と一緒に 3 μ gの pLenti6/UbC- Slc7aをトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨンの翌日培地交 換をおこなった。さらに 24時間後、上清を回収し、孔径 0.45 /1 mのセルロースァセテ ートフィルター (ワットマン)により濾過した。遺伝子導入の 1日前にヒト線維芽細胞を 8 X 105細胞/ 100 mmディッシュで撒いた。培地を 4 μ g/mlポリプレン (ナカライテスタ)を 補充したウィルス含有上清液を用いて置換して 24時間培養した。
[0100] 4.レトロウイルス感染及ぴ iPS細胞の作出
PLAT- Eパッケージング細胞を 8 X 106細胞/ 100 mmディッシュでプレートに撒き、一 晚培養した。翌曰、 PLAT - E細胞に Fugene6トランスフエクシヨン試薬（ロッシュ)を用い て pMXsベクターをトランスフエタトした。トランスフヱクシヨンの 24時間後、新しい培地と 交換し、、さらに 24時間後に培養上清をウィルス含有液として回収した。遺伝子導入 の一日前にマウス Slc7al遺伝子を発現してレ、るヒト線維芽細胞 (HDFa- Slc7al)を 8 1 05細胞/ 100 mmディッシュに調整し播いておいた。ウィルス含有液を孔径 0.45 /z mフ ィルターにより濾過し、 4 β g/mlポリプレンを補充した。 4種のレトロウイルスをそれぞ れ含有する等量の上清液を混合し、 HDFa- Slc7alのディッシュに移して、一晚感染さ せた。 24時間後、ウィルスを含む上清を除去し、新しい培地と交換した。 6日後、 HDF a- Slc7al細胞をトリプシン処理により採取し、 SNLフィーダ一細胞層の上に 5 x 104細 胞 /100 mmディッシュに調整し再度播いた。その翌日、培地を 4 ng/ml bFGFを補填 した霊長類 ES細胞用培地に交換した。培地は一日おきに交換した。遺伝子導入の 3 0日後、コロニーを採取し、 0.2 mlの霊長類 ES細胞培地に移した。コロニーを弱いピ ペッティングにより小さな塊に機械的に分離した。この細胞懸濁液を SNLフィーダ一 細胞をあら力^め播いておいた 24ゥエルプレート上に移した。この段階を継代数 1とし た。
[0101] 5.RNA単離及び逆転写
全 RNAをトライゾール試薬 (インビトロジェン)により抽出し、ゲノム DNAの混在を除去 するためにターボ DNAフリーキット（アンビオン)により処理した。 1 の全1¾^^を用ぃ て、 Rever Tra Ace - a (東洋紡)及び dT プライマ一を取扱説明書に従って用いて逆
20
転写反応を行った。 PCRは ExTaq (タカラ)で行った。定量的 PCRはプラチナ SYBRダリ ーン qPCRスーパーミックス UDG (インビトロジェン)を用いて行い、 7300リアルタイム P CRシステム（アプライドバイォシステム)により分析した。プライマー配列を表 8に示す
[0102] 6.アルカリフォスファタ一ゼ染色及び免疫組織化学分析
アルカリフォスファターゼ染色は、白血球アルカリフォスファタ一ゼキット (シグマ)を 用いて行った。免疫組織化学分析のために、細胞を室温で 10分間 4%のパラホルム アルデヒドを含有する PBSにより固定した。 PBSで洗浄後、細胞を室温で 45分間、 5% 正常ャギ又はロバ血清 (ケミコン)、 1%ゥシ血清アルブミン（BSA、ナカライテスク)、及 ぴ 0.1%トリトン X-100を含む PBSにより処理した。一次抗体として SSEA1 (1 : 100に希釈 、デベロップメンタルスタディーズハイブリドーマパンク)、 SSEA3 (1:10に希釈、 Dr, Pet er W. Andrewsから寄贈)、 SSEA4 (1:100に希釈、デベロップスタディーハイブリドーマ バンク)、 TRA-2-49/6E (1:20に希釈、デベロップメンタルスタディーズハイブリドーマ バンク)， TRA-1-60 (1:50に希釈、 Dr. Peter W. Andrewsから寄贈)、 TRA-1 - 81 (1:50 に希釈、 Dr. Peter W. Andrewsから寄贈)、 Nanog (1:20に希釈、 AF1997、 R&Dシステ ム)、 iS IIIチュープリン (1:100に希釈、 CB412、ケミコン)、グリア原繊維酸性蛋白（1:50 0に希釈、 Z0334、ダコ)、 α平滑筋ァクチン (希釈済み、 Ν1584、ダコ)、デスミン (1:100 に希釈ラブビジョン)、ビメンチン (1:100に希釈、 SC- 6260、サンタクルス')、 フエトプ 口ティン（1:100に希釈、 MAB1368、 R&Dシステム)、チロシンヒドロキシラーゼ (1:100に 希釈、 ΑΒ152、ケミコン）を使用した。二次抗体は、 cyanine3 (Cy3)結合ャギ抗ラッ Hg (1:500期尺、ジャクソン'ィムノリサーチ)、 Alexa546結合ャギ抗マウス IgM (1:500に 希釈、インビトロジェン)、 Alexa 488結合ャギ抗ゥサギ IgG (1:500に希釈、インビトロジ ェン)、 Alexa 488結合ロバ抗ャギ IgG (1:500に希釈、インビトロジェン)、 Cy3結合ャギ 抗マウス IgG (1:500に希釈、ケミコン)、及び Alexa 488結合ャギ抗マウス IgG (1:500に 希釈、インビトロジェン)を使用した。核は 1 ^ g/mlの Hoechst 33342 (インビトロジェン )により染色した。
7.インビトロでの分化
ヒ HPS細胞をコラゲナーゼ IVにより処理した後、 hydroxyrthyl methacrylateでコート したディッシュ上に移し 20%KSR (インビトロジェン)、 2 m L—グノレタミン、 1 x 10— 4 M非 必須アミノ酸、 1 X 10— 4 M 2-メルカプトエタノール (インビトロジェン)及び 0.5%のぺニシ リン及びストレプトマイシンを含む DMEM/F12培地を使用し、浮遊培養を行レ、胚様体 (EBs)を形成した。培地は一曰おきに交換した。浮遊培養の 8日後、 EBsをゼラチンコ ートしたプレートに移し、同じ培地中でさらに 8日間培養した。
ドーノ ミン作用性ニューロンへの分化のために、まず、 PA6フィーダ一細胞をゼラチ ンコートされた 6ゥエルプレート上に撒き、コンフルェントになるまで 4日間インキュベー トした。 EBsを介して培養した iPS細胞の小さな塊を PA6フィーダ一細胞層上に加え、 1 0% KSR (インビトロジェン)、 1 X 10—4 M非必須アミノ酸、及び 1 X 10— 4 M 2-メルカプトェ タノ—ル (インビトロジェン)、並びに 0.5%ペニシリン及びストレプトマイシンを含むグラス ゴー最小必須培地（インビトロジェン)を用いて培養した。
心筋細胞への分化のためには、 iPS細胞をマトリゲ コートされたプレート上で 4 ng/ ml bFGFを補充した MEF - CM中に 6日間維持した。その後、 RPMI1640に B27サプリメ ント（インビトロジェン)を補充した培地（RPMI/B27)に 100 ng/mlヒト組換えァクチビン A (R & Dシステム)を添加した培地を用いて 24時間培養し、続いて 10 ng/mlヒト組換 え骨形成因子 4 (BMP4, R & Dシステム)を補充してさらに 40間置いた。サイト力イン による刺激後、細胞はサイト力イン無しで RPMI/B27中に維持した。培地は一日おき に交換した。
[0104] 8ノくィサノレファイトシークェンス法
ゲノム DNA(1 i g)を、 Cpゲノム DNA修飾キット (ケミコン)を用いて製造業者が推奨す る方法に従って処理した。処理した DNAを QIAクイックカラム（QIAGEN)により精製し た。ヒト Oct3/4、 Nanog,及ぴ Rexl遺伝子のプロモーター領域を PCRによって増幅し た。 PCR産物を pCR2.1 - TOPOにサブクロ一ニングした。それぞれのサンプノレの 10ク ローンを M13ユエバーサルプライマーを用いてシークェンシングした。 PCR増幅に使 用したプライマー配列を表 8に示した。
[0105] 9.ルシフェラーゼアツセィ
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むそれぞれのレポータープラス 'ミド (1 g)を 50 ng の pRL - TK (プロメガ)を用いてヒ HPS細胞又は HDFに導入した。遺伝子導入の 48時 間後、細胞を 1 X Passive lysis buffer (プロメガ)により溶解し、室温で 15分間インキュ ペートした。ルシフェラーゼ活性を Dualルシフェラ一ゼレポーターアツセィシステム (プ 口メガ）及び Centra LB 960検出システム (バーソルド)を用いて製造業者のプロトコノレ に従って測定した。
[0106] 10.奇形腫形成
細胞をコラゲナ一ゼ IV処理により採取し、チューブに回収して遠心し、ペレットを D MEM/F12に懸濁した。コンフルェントな 100 mmディッシュ力も取った細胞の 4分の 1を SCIDマウス (日本クレア)の背側の側腹部へ皮下注入した。 9週間後に腫瘍を切除し て重量を測定し、 4%パラホルムアルデヒドを含有する PBSにより固定した。ノ フィン 包理した組織をスライスし、へマトキシリン'ェォジン染色を行った。 [0107] 11.ウェスタンプロット
セミコンフルェント状態にある細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテル (ロッシュ)を補充 した RIPA緩衝液 (50 m Tris— HC1、 ρΗ8·0、 150 mMNaCl, 1% Nonidet P-40 (NP—40) 、 1%デォキシコール酸ナトリウム及ぴ 0.1%SDS)により溶解した。 MEL - 1ヒト ES細胞株 の細胞溶解物をアブカム力 購入した。細胞溶解物 (20 μ g)を 8%又は 12% SDSポリア クリルアミドゲル電気泳動により分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜 (ミリポア)に移し た。膜は 1%スキムミルクを含む TBST (20 mM Tris - HC1、 ρΗ7·6、 136 mM NaCl、及び 0 .1% Tween- 20)でブロッキングし、その後、一晚 4°Cで一次抗体を反応させた。 TBST による洗浄後、膜を西洋ヮサビペルォキシダーゼ (HRP)結合二次抗体とともに室温で 一時間反応させた。シグナルをィモビロンウェスタン化学発光 HRP基質 (ミリポア)及 び LAS3000画像化システム（富士フィルム)により検出した。 1次抗体としては、抗 Oct3 /4 (1:600に希釈、 SC-5279、サンタクルス')、抗 Sox2 (1:2000に希釈、 AB5603、ケミコ ン)、抗 Nanog (1:200に希釈、 R&Dシステム)、抗 Klf4 (1:200に希釈、 SC- 20691、サンタ クルズ)、抗 c_Myc (1:200に希釈、 SC- 764、サンタクルズ)、抗 E- cadherin(l:1000に希 釈、 610182、 BDバイオサイエンス)、抗 Dppa4 (1:500に希釈、 ab31648、アブカム)、抗 FoxD3 (1:200に希釈、 AB5687、ケミコン)、抗テロメラーゼ (1:1000に希釈、 ab23699、 アブカム)、抗 Sall4 (1:400に希釈、 ab29112、アブカム)、抗 Lin28(l:500に希釈、 AF37 57、 R&Dシステム)、抗 βァクチン (1:5000に希釈、 Α5441、シグマ)、 2次抗体としては 抗マウス IgG- HRP (1:3000に希釈、 #7076、セルシグナリング)、抗ゥサギ IgG- HRP (1: 2000に希釈、 #7074、セルシグナリング)、及び抗ャギ IgG- HRP (1:3000に希釈、 SC - 2 056、サンタクルズ)を使用した。
[0108] 12.サザンプロット
ゲノム DNA(5 μ g)を、 Bglll, EcoRI、及び Ncolにより一晚消化した。消化した DNAフ ラグメントを 0.8%ァガロースゲルで分離し、ナイロン膜 (アマシャム)に移した。膜をジゴ
' キシゲニン (DIG)で標識した DNAプローブと共に DIG Easy Hyb緩衝液 (ロッシュ)中で —定の振盪下に 42°Cでー晚反応させた。洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合抗 D IG抗体 (1:10000に希釈、ロッシュ)を膜に添加した。シグナルは CDPスター（ロッシュ） により增強させ、 LAS3000画像化システムにより検出した。 [0109] 13.ショートタンデムリピート分析及び核型分析 (karyotyping)
ゲノム DNAを用いて、パワープレックス 16システム (プロメガ)により PCRを行レ、、 ABI PRISM 3100 Genetic analyzer及ぴ Gene Mapper v3.5 (アプライドバイオシステム)によ り分析した。染色体 Gパンド分析は日本遺伝子研究所（日本)で行った。
[0110] 14.テロメラーゼ活性の検出
テロメラーゼ活性は TRAPEZEテロメラーゼ検出キット (ケミコン)により取扱説明書に 従って検出した。サンプルは TBEをベースにした 10%アクリルアミド非変性ゲル電気 泳動により分離した。ゲルは SYBRゴールド (1:10000に希釈、インビトロジェン)により染 色した。
[0111] 15.クロマチン免疫沈降アツセィ
約 1 X 107個の細胞を室温下で 1%ホルムアルデヒドで 5分間架橋し、グリシン添加に より反応を停止した。細胞ライセートを超音波処理することにより、クロマチン - DNA複 合体を切断した。 Dynabeads Protein G (インビトロジェン)結合抗トリメチル Lys4ヒストン H3(07- 473， Upstate)、抗トリメチル Lys27ヒストン H3(07 - 449, Upstate),又は正常ゥサ ギ IgG抗体を用レ、て免疫沈降を行った。溶出液を定量的 PCRの铸型として用レ、た。
[0112] 16.DNAマイクロアレイ
HDF及ぴ hiPS細胞（クローン 201B)力 の全 RNAを Cy3により標識した。サンプルを 全ヒトゲノムマイクロアレイ 4 44K (G4112F、アジレント)とハイブリダィズさせた。各サ ンプノレは 1つのカラープロトコールと 1回ハイブリダィズさせた。アレイを G2565BAマイ クロアレイスキャナ一システム (アジレント)を用いてスキャンし、データを GeneSpringGX 7.3.1ソフトウェアを用いて分析した。 2種の標準化手法を適用した。先ず、 0.01未満の シグナル強度を 0.01と設定した。次いで、各チップを、そのチップから取得した測定 の 50番目の百分位数に標準化した。 hES H9細胞のマイクロアレイデータ（Tesar et al ., Nature, 448, pp.196-199, 2007)を GEO DataSets(GSM194390, http：〃 www.ncbi.n 1m. nih.gov/sites/entrez?db=gds&cmd=search&term=GSE7902)から回収した。 3つの 全てのサンプルにおいて" present"フラグ値を有する遺伝子を分析に用いた (32,266 遣伝子)。. HDF及び hiPS細胞のマイクロアレイデータを GEO DataSetsにァクセッション 番号 GSE9561として登録した。 [0113] 例 19： c - Mycを用レヽな MPS細胞の樹立
Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び c- Mycをマウス線維芽細胞にレトロウイルスを用いて導入 することにより得られるマウス iPS細胞 (Takahashi et al.， Cell, 126, pp.663- 76, 2006) の iPSクローンは各遺伝子について数個のレトロウイルスの組み込みを含んでレ、る。 各クローンは全部で 20を超えるレトロウイルスの組み込み部位を有しており、腫瘍形 成の危険を増大させる可能性がある。マウス iPS細胞の場合、 iPS細胞に由来するキメ ラマウス及びその子孫の〜 20%において腫瘍が発生することが分力 ており（Okita et al., Nature, 448, pp.313-17, 2007)、 c- Mycレトロウイルスの再活性化は、 iPS細胞を 用いて作製したキメラマウス及ぴその子孫マウスにおいて腫瘍形成発生率を増加さ せる可能性がある。そこで c - Mycを用レ、ずに iPS細胞を樹立する方法を検討した。
[0114] また、 Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び c_Mycの 4種の遺伝子のファミリー遺伝子を用いて i PS細胞を樹立できるか否かを検討した。この目的のために Nanog遺伝子調節エレメン トよって調節される緑色蛍光タンパク質 (GFP) -IRES - Pun導入遺伝子を含むマウス 胚性線維芽細胞（MEF)を使用した (Okita et al, Nature, 448, pp.313- 317, 2007)。 N anogはマウス ES細胞及び着床前胚細胞において特異的に発現してレ、るため (Chamb ers et al., Cell, 113, pp.643 - 655, 2003; Mitsui et al, Cell, 113, pp.63ト 642, 2003) 、 iPS細胞誘導における選択マーカーとして有用である。初期化誘導されれば GFPが 発現し、これが iPS細胞であるとの指標になる。 Nanogで選択した iPS細胞は ES細胞と 区別ができず、生殖系列に寄与する（germline-competent)キメラマウスを作製するこ とが示されている (Wernig et al., Nature, 448, pp.318 - 324， 2007; Okita et al.， Natur e, 448, pp.313-317, 2007; Maherali et al., Cell Stem Cell, 1, pp.55— 70， 2007)。
[0115] Oct3/4は POUドメインを含む Octファミリー転写因子に属する (Ryan et al, Genes D ev 11: 1207-25, 1997)。 Oct3/4に最も近いホモログは Octl及び Oct6である。 0 3/4 、 Octl又は Oct6を残りの 3遺伝子とともにレトロウイルスにより Nanogレポーター MEFに 導入した。 Oct3/4を用いた場合、多くの GFP陽性コロニーが観察された（図 23 。
[0116] Sox2は高移動度群 (high- mobility group； HMG)ドメインの存在によって特徴づけら れる Sox (SRY関連 HMGボックス）転写因子に属する (Sch印 ers et al., Dev. Cell, 3, pp .167-170, 2002)。 Soxl、 Sox3、 Sox7、 Soxl5、 Soxl7、及び Soxl8について試験を行い 、 Soxlを用いた場合に GFP陽性コロニーが得られた。また、 Sox3、 Soxl5、及び Soxl8 を用いた場合も少数の GFP陽性コロニーが得られた（図 23a)。
[0117] Κΰ¾はショウジヨウバエ胚パターンレギュ /一ター Kruppelのアミノ酸配歹 類似する アミノ酸配列を含む亜鉛フィンガータンパク質である Kruppel様因子（Klfs)に属する (D ang et al.， Int. J. Biochem. Cell Biol., 32, pp.1103-1121, 2000)。 Klfl、 Klf2、及び Klf 5について試験を行い、 Klf2を用いた場合に GFP発現コロニーが得られた（図 23a：)。 K lfl及び Klf5を用レ、た場合も iPS細胞を誘導することができた。
[0118] C- Mycには 2種の関連する遺伝子（N- Myc及ぴ L - Myc)が存在する (Adhikary et al.,
Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6， pp.635 - 645, 2005)。 N— Myc又は L—Mycを用いることに より GFP陽性コロニーが出現した（図 23a) D従って、 4遺伝子のファミリー遺伝子を用 いることによって iPS細胞を誘導することができることが示された。
[0119] ファミリー遺伝子について β geoが Fbxl5遺伝子座にノックインされた MEF(Tokuzaw a et al, Mol. Cell Biol., 23, pp.2699- 2708, 2003)から iPS細胞を誘導することができ る力、どうかを検討したところ、 Nanogに基づレ、た選択で得られた結果と類似した結果 が得られた。すなわち、 Sox2は Soxl又は Sox3で置き換えることができ、 Kl¾は K1Sで 置き換えることができ、また C- Mycは N- Myc又は L- Mycで置き換えることができた。フ アミリー遺伝子を用いて作製された細胞は増殖可能であり、 ES細胞と区別ができない 形態を呈し、かつヌードマウスにおいて奇形腫を形成した（図 24)。従って、これらの ファミリー遺伝子力 Wanogレポーター MEF及ぴ Fbxl5レポーター MEFの両方から iPS細 胞を誘導できることが示された。
[0120] Nanogレポーター MEFから数個の ES細胞様 GFP陽性コロユーが C- Mycを用いること なく得られた（図 23a)。先に沖田らは GFP陽性コロニーが C- Mycなしでは得られなレヽ ことを報告しているが (Okita et al., Nature, 448, pp.313-17, 2007)、この刊行物で報 告されている方法と上記の方法との相違点の一つは薬剤選択のタイミングにある。上 記刊行物に記載された方法ではピューロマイシン選択を遺伝子導入の 7日後に開始 しているが、今回の方法では薬剤選択を 14日目に開始した。 Nanogレポーター MEF に 4遺伝子 (Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及ぴ c- Myc)又は c- Mycを除いた 3遺伝子のいずれ かを導入し、遺伝子導入の 7日後、 14日後、又は 21日後にピューロマイシン選択を開 始した (図 23b)。 4遺伝子を用レ、た場合には GFP陽性コロニーがすべての条件にお いて観察され、ピューロマイシン選択を遅らせた場合にコロニー数は顕著に増加した 。 c- Mycを用いない場合は、選択を遺伝子導入の 7日後に開始した場合には GFP陽 性コ口-一は観察されな力 たが、選択を遺伝子導入の 14日後又は 21日後に開始し た場合に GFP陽性コロニーが出現した。コロニー数は各条件において 4遺伝子を用 レ、る場合よりも 3遺伝子を用いる場合の方が少なかった。 c- Mycレトロウイルス以外の 3遺伝子（Oct3/4、 Sox2、 klf4)を導入することで得られた Nanogで選択した iPS細胞は 、 ES細胞マーカー遺伝子を ES細胞の場合のレベルに匹敵するレベルで発現してお り（図 25)、胚盤胞に移植した場合にアダルトのキメラマウスを作出することができた（ 表 9)。
[表 9]
Figure imgf000059_0001
iPSクローンは全て、 MEF又は TTF力3ら MYCを除いた 3遺伝子で誘導した。
*FB： Fbxl5- /3 geoレポ一ター；
Ng： Nanog-GFP-IRES-Puror レポ一タ一；
GFP： CAG-EGFP
もう一つの相違点は、 C- Mycを除いた 3遺伝子を用いて iPS細胞を誘導した場合に は、 GFP陰性コロニー及びバックグラウンド細胞の数力 S4遺伝子を導入した場合よりも 少ないということである（図 23c)。従って、 C- Mycを用いずに iPS細胞を誘導する方法 は C- Mycを用いる iPS細胞誘導に比べて遅ぐかつ効率は低下するものの、 iPS細胞 誘導の特異性は向上するという利点がある。 [0123] β geoが Fbxl5遺伝子座にノックインされた MEF(Tokuzawa et al, Mol. Cell Biol., 2 3, pp.2699-2708, 2003)から c - Mycを用いずに数個の iPS細胞を生成することができた (図 26A)。先に高橋らは iPS細胞は c - Mycなしでは得られなかったことを報告している が (Takahashi et al, Cell, 126, pp.663- 676, 2006)、この刊行物で報告されている方 法と上記の方法において、 G418選択は同じタイミング、すなわち遺伝子導入の 3日後 に開始している。しかしながら、上記刊行物で報告されている方法ではコロニーを遺 伝子導入の 14〜21日後に選択しているのに対して、今回の実験では約 30日後にコロ ニー選択を行っている。また、今回の実験においては 4遺伝子（又は 3遺伝子）を含む レトロウイルスをそれぞれ独立した PLAT - E細胞 (Morita et al., Gene Ther., 7, pp.106 3-1066, 2000)を用いて別々に調製している。この操作によりレトロウイルスのトランス フエクシヨン効率が改善しており、 4遺伝子の全てを単一の Plat- E細胞で調製した既 報の方法に比べて iPS細胞コロニー数の顕著な増加が観察された。
[0124] 4遺伝子を用いて作製した Fbxl5選択による iPS細胞では ES細胞マーカー遺伝子の 発現レベルは ES細胞に比べて低レベルである (Takahashi et al., Cell, 126， pp.663-6 76, 2006)。この iPS細胞は胚盤胞へマイクロインジェクションした場合にアダルトのキメ ラマウスを作出することができないが、 c - Mycを用いずに作製した iPS細胞は、 Fbxl5 選択を用いた場合においても ES細胞に匹敵するレベルで ES細胞マーカー遺伝子を 発現していた（図 26B)。また、 C- Mycを用いずに作製した iPS細胞からはアダルトのキ メラマウスが高い iPS細胞寄与率で得られた（図 27、表 9)。腫瘍形成の発生率の増加 はこれらのキメラマウスにおいては観察されな力つた。すなわち、 4遺伝子により樹立 した iPS細胞由来のキメラマウスは、生後 100日以内に 37匹中 6匹のキメラマウスが腫 瘍が原因で死亡した力 c - Mycの無い 3遺伝子により樹立した iPS細胞由来のキメラマ ウスは、 26匹のキメラ全てが観察期間内（4か月弱）生存していたことから、 c - Mycを用 レ、なレ、ことにより、腫瘍形成性のリスクが減少することが明らかとなった。
[0125] c_Mycを用いずに、かつ薬剤選択なしで iPS細胞を効率的に単離できるか否かを調 ベた。 4遺伝子 (Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及ぴ c- Myc)又は c- Mycを除く 3遺伝子を Nanog レポーターを含むアダルトの尻尾線維芽細胞 (tail tip fibroblasts ;TTF)に導入し、ピ ユーロマイシン選択を適用せずに培養を継続した。遺伝子導入された細胞を視覚化 するために、 DsRedレトロウイルスを 4遺伝子又は 3遺伝子とともに導入した。。レトロゥ ィルス導入の 30日後には、 4遺伝子を用いて遺伝子導入したディッシュは多数の GFP 陰性コロニー及びバックグラウンド細胞で覆われた（図 28A、表 10 : Nanog - GFPレポ 一ター TTF+薬剤選択なし)。表中の括弧内の数値は、 GFP陽性コロニー又はクロー ンの数を示す。レトロウイルス（Oct3/4, Sox2, Klf4, (c- yc),及び DsRed)の割合は、 No.256において 1:1:1:(1):4、 No.272及び 309において 1:1:1:(1):1であった。 No.220に ぉレヽては DsRedを導入しなかった。
[0126] [表 10]
Figure imgf000061_0001
[0127] 蛍光顕微鏡下でこれらのコロニーのなかに GFP陽性コロニーが観察された（3回の 独立した実験において 4個、 132個、及び 424個のコロニー）。 GFP陽性コロニーは DsR ed陰性であり、この結果は Nanogで選択した iPS細胞において観察されたレトロウィル スのサイレンシングの結果と一致していた (Okita et al., Nature, 448, pp.313- 17， 200 7)。 c-Mycを除いた 3遺伝子を用いた場合には、コロニーのなかでバックグラウンド細 胞をほとんど持たないコロニーとして観察された（3回の独立した実験において 7個、 2 1個、及び 43個）。これらのコロニーの約半分はパッチ状態（patchy manner)で GFPを 発現していた。 DsRedは少数のコロニーにおいてのみ検出され、 DsRedは大部分が サイレンシングされていることが示された。 GFP及び DsRedの間でオーバーラップは観 察されな力、つた。これらのコロニーのほとんどは増殖可能であり、継代数 2においても GFP陽性であり、かつ DsRed陰性であった。従って、薬剤選択を行わない場合におい ても c - Mycを用レ、ることなく iPS細胞を作製でき、 iPS細胞作製の特異性が向上するこ とが示された。この iPS細胞においては Nanog- GFPは活性化され、力つレトロウイルス はサイレンシングされてレヽた。
[0128] 選択マーカーを有さなレ、が、構成的に活性なプロモーターによって調節される DsR ed組換え遺伝子 (Vintersten et al.， Genesis, 40, pp.241-246, 2004)を有するァダノレト TTFから、 iPS細胞の作製を試みた。 4遺伝子 (Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及ぴ c- Myc)又は c - Mycを除く 3遺伝子を細胞に導入した。さらに GFPレトロウイルスを導入してサイレン シングをモニターした。 4遺伝子を導入した 0.5 X 105個の細胞力 薬剤選択なしで 30 日後に約 1,000個のコロニーが出現した。これらの大部分は GFP陽性であり、これらの 細胞ではレトロウイルスのサイレンシングが生じていないことが示された。一方、 C- My cを除いた 3遺伝子を導入した 3.5 X 105個の細胞から 16個のコロニーが出現した（図 2 8B)。これらのコロニーの大部分は GFPを発現しておらず、残りのコロニーはわずかに GFPを発現していた。これらのコロニーは全て増殖可能であり、継代数 2においても iP S細胞の形態（ES細胞様形態）を示した。また、これらの細胞は全て GFP陰性であり、 レトロウイルスのサイレンシングが生じていることが示された。 RT-PCRにより、これらの 細胞では ES細胞に匹敵するレベルで ES細胞マーカー遺伝子が発現していることが 示された（図 28C)。さらに、 RT-PCRにより 3遺伝子を用いて作製された iPS細胞にお いて Klf4のレトロウイルスのサイレンシング及び c- Myc導入遺伝子の不存在が確認さ れ、これらの iPS細胞を胚盤胞に移植した場合にはキメラマウスが得られた（図 28D及 ぴ表 9)。以上の結果から、 C- Mycを用レ、ることなく優れた特性を有する iPS細胞を得る ことができ、薬剤選択を用レ、ることなくァダノレト TTFから iPS細胞を効率的に作製でき ることが示された。
[0129] 次に、 Oct3/4， Sox2及び Klf4に対するレトロウイルスをヒト新生児包皮由来線維芽 細胞 (BJ) (クローン 246H)又はヒト成人皮膚由来繊維芽細胞 HDF(253G)に導入した。 30日後、数個のヒ HPS細胞コロニーが出現した。これらの細胞はヒト ES細胞様のコロ ニー形態を示し、かつ増殖することができた（図 29A；)。 C- Myc以外の 3遺伝子を導入 した場合 (253G)、又は C- Mycに 3遺伝子を加えて同時に導入した場合 (253F)に、 H DFに由来するヒ HPS細胞が ES細胞マーカー遺伝子を発現することが確認された（図 29B)。また、 c- Mycレトロウイルスを用いずに誘導されたヒ HPS細胞の胚様体を介した 分化が確認された (図 30)。
[0130] 例 19における実験材料及ぴ方法は以下の通りである。
1.プラスミドの構築
ファミリー遺伝子のコード領域を表 11 (配列表の配列番号 127から 152)にリストした プライマーを用いた RT- PCRにより増幅し、 pDONR201又は pENTR- D- TOPO (インビ トロジェン）にサブクローニングし、 LR反応（インビトロジェン）により pMXs- gwに連結し た。
[0131] [表 11]
Genes Sequences
Soxl CAC CAT GTA CAG CAT GAT GAT GGA GAC CGA CCT
CTA GAT ATG CGT CAG GGG CAC CGT GC
Sox3 CAC CAT GTA CAG CCT GCT GGA GAC TGA ACT C G
TCA GAT GTG GGT CAG CGG CAC CGT TCC ATT
Sox7 CAC CTC GGC CAT GGC CTC GCT GCT GGG
CTC CAT TCC TCC AGC TCT ATG ACA CAC
CAC CAT GGC GCT GAC CAG CTC CTC ACA A
So 15
ΓΤΑ AAG GTG GGT TAG TGG CAT GGG
Soxl7 CAC CAG AGC CAT GAG CAG CCC GGA TG
CGT CAA ATG TCG GGG TAG TTG CAA TA
Soxl8 CAC CAT GCA GAG ATC GCC GCC CGG CTA CG
CTA GCC TGA GAT GCA AGC ACT GTA ATA GAC
Octl CAC CAT GAA TAA TCC ATC AGA AAC CAA T
GCT CTG CAC TCA GCT CAC TGT GCC
0ct6 CAC CAT GGC CAC CAC CGC GCA GTA TCT G
GGA ACC CAG TCC GCA GGG TCA CTG
Klfl CAC CAT GAG GCA GAA GAG AGA GAG GAG GC
TCA GAG GTG ACG CTT CAT GTG CAG AGC TAA
Klf2 CAC CAT GGC GCT CAG CGA GCC TAT CTT GCC
CTA CAT ATG TCG CTT CAT GTG CAA GGC CAG
Klf5 CAC CAT GCC CAC GCG GGT GCT GAC CAT G
rCG CTC AGT TCT GGT GGC GCT TCA '
L-MycffT ¾C CAT GGA CTT CGA CTC GTA TCA GCA CTA TTT C
ΓΤΑ GTA GCC ACT GAG GTA CGC GAT TCT CTT
N-MycWT AC CAT GCC CAG CTG CAC CGC GTC CAC CAT
ΓΤΑ GCA AGT CCG AGC GTG TTC GAT CT
2.レトロウイルスの形質導入
Fugene6試薬（ロッシュ）を製造業者の指示に従って用いて pMXsに基づいたレトロゥ ィルスベクターを PLAT - E細胞 (Morita et al.， Gene Ther., 7, pp.1063 - 1066， 2000)へ トランスフエクシヨンした。 24時間後に培地を交換し、さらに 24時間後にウィルス含有 上清を採取し、レトロウイルス感染による遺伝子導入を行った。「混合」プロトコルでは 4遺伝子をそれぞれ含むベクターの混合物を用レ、て PLAT- E細胞の単一ディッシュに 遺伝子導入した。「個別」方法では、各ベクターを PLAT- E細胞を含む個別のディッシ ュに遺伝子導入した。ウィルス含有上清は遺伝子導入の前に混合した。「個別」方法 において有意に高い遺伝子導入効率力 S観察された。
[0133] 3.薬剤選択を用いた iPS細胞の誘導
iPS細胞の誘導は既報の方法 (Takahashi et al.， Cell, 126, pp.663-676, 2006; Okit a et al, Nature, 448, pp.313- 17， 2007)を修正して行った。 Nanog- GFP-IRES- Puror レポーター又は Fbxl5- β geoレポーターのいずれか又は両方を含む MEFを SNLフィ ーダー細胞 (McMahon et al., Cell, 62, pp.1073-1085, 1990)をあらかじめ播いておい た 6ゥェルプレート及び 100 mmディッシュに 1.3 X 105細胞 Zゥエル (6ゥエルプレート） 及び 8.0 X 105細胞ノウエル（100 mmディッシュ）の割合で撒いた。遺伝子を導入した 細胞を LIF(Meiner et al" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, pp.14041- 14046, 1996) を含む ES細胞用培地で培養した。 ϋ418 (300 μ g/ml)又はピューロマイシン（1.5 g/ ml)による選択は既報の方法の通り開始した。遺伝子導入の 25曰から 30日後にコロニ 一数を測定した。コロニーの一部を選択して継代させた。
[0134] 4.薬剤選択を用いなレ PS細胞誘導
TTFをアダルト Nanogレポーターマウス又はアダルト DsRedトランスジェニックマウス 力も単離した (Vintersten et al., Genesis, 40, pp.24卜 246, 2004)。レトロウイルス含有 上清は「個別」方法で調製した。 4遺伝子の導入のために Klf4、 c-Myc, Oct3/4、 Sox2 .、及び DsRedのレトロウイルス含有上清を 1 : 1 : 1 : 1 :4の比率で混合した。 3遺伝子を導 入する場合は、 Klf4、 Oct3/4、 Sox2、 Mock (空ベクター）、及び DsRedのレトロウイルス 含有上清を、 1 : 1 : 1 : 1 : 4の比率で混合した。 DsRedトランスジエニックマウスにつ！/ヽて は、 GFPレトロウイルスを DsRedの代わりに使用した。トランスフエクシヨンのために TTF をフィーダ一細胞層を有しない 100 mmディッシュに 1ディッシュあたり 8.0 X 105細胞の 割合で撒いた。 TTFにウィルスノポリプレン含有上清を添加し、 24時間感染させた。 遺伝子導入の 4日後に 3遺伝子を導入した TTFを SNLフィーダ一細胞層を有する 100 mmディッシュに 1ディッシュあたり 3.5 X 105細胞の割合で再び撒き、 ES細胞用培地で 培養した。 4遺伝子を導入した TTFは SNLフィーダ一細胞層を有する 100 mmディッシ ュに 1ディッシュあたり 0.5 X 105細胞の割合で再度撒レ、た。遺伝子導入の 30日から 40 日後にコロニー数を測定した。コロニーの一部を選択して継代した。
5.iPS細胞の評価
RT-PCR及ぴ奇形腫形成を既報の方法の通り行った。キメラ実験にっレ、ては 15から 20個の iPS細胞を BDF1由来胚盤胞に注入し、これを偽妊娠マウスの子宮に移植した
[0135] 例 20 : 6遺伝子を用いた上皮細胞からのヒ HPS細胞の樹立
下記遺伝子： Klf4、 c- Myc、 Oct3/4、 Sox2、 Nanog,及び Lin28 (NCBI accession nu mber NM_145833 (マウス）又は NM_024674 (ヒト))の組み合わせ、又はその組み合わ せから 1又は 2以上の遺伝子を除いた組み合わせを用いて iPS細胞の誘導を行った。
[0136] 6 X 106個の 293FT細胞を 10cmシャーレに播いて一晩培養し、このシャーレに 3 μ g の pLenti6/UbC— Slc7alレンチウイノレスベクターを 9 μ gの Virapower packaging mixと 一緒にリポフエクトァミン 2000 (インビトロジェン)を用いてトランスフエクシヨンした。 24 時間後、培地を新しい培地に交換した。さらに 20時間後、培養上清を採取し、孔径 0. 45- /z mのセルロースアセテートフィルター（ワットマン）で濾過した。 5 105個の上皮 細胞を前日に用意した。培養上清を取り除いた上皮細胞のシャーレに上記の濾過し た培養上清に 4 g/mlのポリブレン (ナカライタスク）を添加したものをカ卩え、細胞を 24 時間培養した。
[0137] 6 cmのシャーレに 1.0 X 106個の PLAT- E細胞を播いて培養した。その翌日、細胞に Klf4、 c - Myc、 Oct3/4、 Sox2、 Nanog,及ぴ Lin28を含む pMXを基礎としたレトロウイノレ スベクター 9.0 gを 27 μ 1の Fugene6トランスフエクシヨン試薬（ロシュ）を用レ、てトラン スフエクシヨンした。 24時間後、培地を新しい培地に交換した。さらに次の日、 PLAT- E細胞の上清を回収し、孔径 0.45 - mのセルロースアセテート'フィルター（ワットマン )で濾過した。レンチウィルス感染の 7日後に、上皮細胞を 3.0 X 10 6 cmディッシュ に播き直し、レトロウイルスとポリプレンを含む上記の培養上清を添加した。
[0138] 結果を表 12に示す。表中の" 6F"は 6遺伝子（Klf4、 c- Myc、 Oct3/4、 Sox2、 Nanog、 及ぴ Lin28)を示し、 "L"は Lin28、 "N"は Nanog、 "M"は c- Myc、 "O"は Oct3/4、 "S"は Sox2、 "K"は Klf4をそれぞれ示す。文字の前の"-"は"-"に続く文字が示す遺伝子を 上記 6遺伝子力も除いた場合を意味しており、例えば"- L"は 6遺伝子から In- 28を除 いた残りの 5遺伝子を意味し、 "- KS"は 6遺伝子力 Klf4及び Sox2を除いた 4遺伝子を 意味する。表中の数値はコロニー数を示し、 "non-ES like"は非 ES様形態を有するコ ロニーを示し、 "ES like"は ES様細胞形態を有するコロニーを示す。
[表 12]
Figure imgf000067_0001
[0140] 表 12には 2回の実験結果を示した。 1回目の実験結果は、遺伝子導入後 23日又は 2 9曰目に各遺伝子の組み合わせを導入して誘導した細胞のコロニー数を示し、 2回目 の実験結果（右欄の Day23)は" 6F"、 "-KM",及び"- NL"の場合のコロニー数を示す 。 'しじのように Lin - 28を導入しな!/、細胞のコロニー数の方が Lin- 28を導入した場合の コロニー数よりも少なかったことから、 Lin28が iPS細胞の樹立効率を向上させるのに重 要な役割を担ってレ、ることが示された。
[0141] さらに、 6遺伝子（Klf4、 c-Myc、 Oct3/4、 Sox2、 Nanog,及び Lin28)、及び 4遺伝子 の 2つの異なる組み合わせ（図 31において Y4Fで示される Kl 、 c- yc, Oct3/4、及 ぴ Sox2、並びに図 31において T4Fで示される Oct3/4、 Sox2、 Nanog,及ぴ Lin28)を用 いて iPS細胞誘導を行った。 T4Fは Yu et al., Science, 318, pp, 1917-1920, 2007に開 示されているものと同じ組み合わせである。図 31において" ES - like"は ES細胞のコロ ニーと形態的に類似したコロニ一の数を示し、 "total"は ES様コロニーと非 ES様コロニ 一の数の総数を示す。 Exp#l、 Exp#2 Exp#3、及び Expft4はそれぞれ個別に実験を 行った結果を示す。これらの実験において、 6遺伝子及び Y4Fの 4遺伝子の組み合わ せを用いることによって ES様細胞コロニーと類似した形態を有する iPS細胞コロニーが 得られた。し力しながら、 T4Fの組み合わせでは、 ES様細胞コロニーと類似した形態 を有するコロニーの生成は認められなかった。
[0142] 例 21 : Sall4を用いた効率的な iPS細胞の生成
マウス胚性線維芽細胞 (MEF)及ぴヒト成人皮膚由来繊,維芽細胞 (adult HDF)を用レ、 て実験を行った結果、 3遺伝子（Klf4、 Oct3/4、及び Sox2)を用いた iPS細胞誘導は、 S all4をこの組み合わせに加えた場合、即ち KM, Oct3/4, Sox2,及び Sall4を用いた場 合に iPS細胞の作製効率を上昇させることが判明した（図 32及ぴ 33)。 S&114を 4遺伝子 (KM、 Oct3/4、 Sox2、及び c- Myc)にカ卩えた場合、より多数の iPS細胞コロニーが観察 された。これらの実験から、核初期化因子に Sall4を追加することによって iPS細胞の誘 導効率を改善できることが示された。
[0143] 例 22：マウス Sall4及び Z又はマウス Salllの iPS細胞誘導促進効果
既報の方法（Cell, 131, ρρ·861- 872, 2007)に従い、レンチウィルスを用いてマウス ェコトロピックレセプター Slc7a遺伝子を発現させた成人皮膚由来線維芽細胞 (adult HDF)に、ヒト由来の 4遺伝子 (Y4F: Oct3/4、 Sox2、 Klf4,及び c- Myc)又は 3遺伝子（ Y3F: Oct3/4、 Sox2、及ぴ Klf4)と、マウス Sall4(mSall4)遺伝子又はマウス Salll(mSalll )遺伝子とをレトロウイルスを用いて導入した。
[0144] 導入後 6日目に一且 HDFを回収し、その後 5 x 105個に調整した HDFを 1.5xl06個の マイトマイシン Cで処理した STO細胞上に播種した。翌日以降は、 4 ng/mlのリコンビ ナントヒト bFGF (WAKO)を含んだ霊長類 ES細胞培養用培地（リプロセル)で培養し た。感染後 32日目及び 40日目に ES細胞様コロニー数をカウントした結果を図 34に示 す。感染後 32日目においては、 Y3F+Mock (空ベクター）を導入した場合のコロニー 数は 1個、 Y4F+Mockを導入した場合のコロニー数は 37個であったのに対して、 Y3F 又は Y4Fと同時に Sall4を導入した場合には Y3F+mSall4導入群で 22個、 Y4F+mSall 4導入群で 73個のコロニーが認められた。 Y3F又は Y4Fに mSalllを導入した場合には 、 Y3F+mSalll導入群で 2個、 Y4F+mSalll導入群で 43個のコロニーが認められ、 Y3F 又は Y4Fのみを導入した場合と比べてコロニー数の差は大きくなかった。さらに Y3F 又は Y4Fに mSaMと mSalllとを同時に導入した場合のコロニー数は、 Y3F+mSall4+m Salll導入群で 34個、 Y4F+mSall4+mSalll導入群で 79個であった。
[0145] 感染後 40日目においては、 Y3F+Mockを導入した場合のコロニー数は 8個、 Y4F+ Mockを導入した場合のコロニー数は 57個であったのに対して、 Y3F又は Y4Fと同時 に mSall4を導入した場合には Y3F+mSall4導入群で 62個、 Y4F+mSall4導入群で 167 個のコロニーが認められた。 Y3F又は Y4Fに mSalllを導入した場合には、 Y3F+mSall 1導入群で 14個、 Y4F+mSalll導入群で 103個のコロニーが認められた。さらに Y3F又 は Y4Fに mSaMと mSalllとを同時に導入した場合のコロニー数は Y3F+mSall4+mSall 1導入群で 98個、 Y4F+mSall4+mSalll導入群で 193個であった。以上の結果から、 Y 3Fに mSall4を導入することにより、又は mSaMと mSalllとを同時に導入することによつ て 20ないし 100倍の効率でヒト iPS細胞を誘導できることが示された。また、 Y4Fに mSall 4を導入することにより、又は mSaMと mSalllとを同時に導入することによって 2ないし 4 倍の効率でヒ HPS細胞を誘導できることも示された。
[0146] 例 23：マウス Sall4及び Z又はマウス Salllの iPS細胞誘導促進効果 (2)
既報の方法 (Cell, 131， pp.861- 872， 2007)に従レ、、レンチウィルスを用いてマウスェ コトロピック受容体 Slc7aを発現させたヒト成人皮膚由来線維芽細胞 (HDFa-Slc7al) にヒト由来の 4遺伝子（T4F: Oct3/4、 Sox2、 Nanog、及ぴ Lin28)又は 3遺伝子（T3F: O ct3/4、 Sox2、及び Nanog)とともに、マウス Sall4(mSall4)又はマウス Salll(mSalll)あるい はその両方をレトロウイルスを用いて導入した。
[0147] 導入後 6日目に一且 HDFa- Slc7alを回収し、その後 5 105個に調整した HD Fa - Sic 7alを 1.5 X 106個のマイトマイシン Cで処理した STO細胞の上に播種した。さらに 7日 間培養した後、リコンビナントヒト 4 ng/ml bFGF (和光純薬)を含んだ霊長類 ES細胞培 養用培地 (リプロセル)で培養した。感染後 32日目及び 40日目に ES細胞様コロニー 0365
69 数をカウントした結果を図 35に示す。感染後 32日目においては、 T3F+Mock及ぴ T4 F+Mockを導入した場合のコロニー数は 0個であったのに対して、 T3F又は T4Fと同 時に mSall4を導入した場合には T3F+mSall4導入群で 2個のコロニーが認められた。 T4F+mSall4導入群ではヒト ES細胞様コ口-一は確認できなかった。
[0148] T3F又は T4Fと同時に mSalllを導入した場合には T3F+mSalll導入群で 3個、 T4F +mSalll導入群では 6個のコ口-一が認められた。さらに T3F又は T4Fとともに mSall4 と mSalllとを同時に導入した場合には、 T3F+mSall4 + mSalll導入群で 3個のコロニ 一が認められた。 T4F+mSall4+mSalll導入群ではヒト ES様コロニーは確認できなか つた。感染後 40日目においては、 T3F+Mock及び T4F+Mockを導入した場合のコロ ユー数は 0個であったのに対して、 T3F又は T4Fと同時に mSall4を導入した場合には T3F+mSall4導入群で 6個のコロニーが認められ、 T4F+mSall4導入群で 2個のコロニ 一が認められた。
[0149] T3F又は T4Fと同時に mSalllを導入した場合には T3F + mSalll導入群で 13個、 T4F +mSalll導入群で 22個のコロニーが認められた。さらに T3F又は T4Fに mSall4と mSall 1とを同時に導入した場合には、 T3F+mSall4+mSalll導入群で 17個のコロニーが認 められ、 T4F+mSall4+mSalll導入群では 11個のコロニーが認められた。 T3F及び T4 Fの導入による iPS細胞樹立においては、 mSall4を追加することで iPS細胞コロニー形 成における促進効果が認められ、 mSalllのほうがより効率的にヒ HPS細胞コロニーの 形成を誘導した。 さらに mSalllと mSall4の両方を T3F又は T4Fとともに導入することに よってヒト iPS細胞のコロユー形成をより促進できることが分かった。
[0150] 例 24:ヒト Sall4の iPS細胞誘導促進効果
Cell, 131, pp.861- 872， 2007に記載の方法に従い、レンチウィルスを用いてマウス ェコトロピック受容体 Slc7aを発現させたヒト成人皮膚由来線維芽細胞（HDFa- Slc7al )を用意し、翌日、ヒト由来の 4遺伝子 (Y4F: Oct3/4、 Sox2、 Klf4、及び c- Myc)又は 3 遺伝子（Y3F : Oct3/4、 Sox2、 KM)とヒト Sall4 (hSall4)とをレトロウイルスを用いて導入 した。導入後 6日目にー且 HDFを回収し、その後 5 X 105個に調整した HDFを 1.5 x 10 6個のマイトマイシン Cで処理した STO細胞の上に播種した。翌日以降は 4 ng/ralリコ ンビナントヒト bFGF (和光純薬)を含んだ霊長類 ES細胞培養用培地 (リブロセル)で培 養した。感染後 32日目及び 40日目に ES細胞様コロニー数をカウントした結果を図 36 に示す。
[0151] 感染後 32日目においては、 Y3F+ Mockを導入した場合のコロニー数は 1個、 Y4F+ Mockを導入した場合のコロニー数は 34個であったのに対して、 Y3F又は Y4Fと同時 に hSall4を導入した場合には Y3F+hSall4導入群で 8個、 Y4F+hSall4導入群で 52個 のコロニーが認められた。感染後 40日目においては、 Y3F + Mockを導入した場合の コロニー数は 5個、 Y4F+Mockを導入した場合のコロニー数は 52個であったのに対し て、 Y3F及ひ、Y4Fと同時に hSall4を導入した場合には Y3F+hSall4導入群で 32個、 Y4 F+hSall4導入群で 137個のコロニーが認められた。この結果、 Y3Fに hSall4を同時に 導入することにより 6ないし 8倍の効率でヒ HPS細胞コロニーを得ることができ、 Y4Fと 同時に hSaMを導入することによって 1.5ないし 2.5倍の効率でヒ HPS細胞コロニーを 得ることができることが示された。
[0152] 例 25:L- Mycの効果
(A) 4遺伝子（Oct3/4、 Klf4、 Sox2、及ぴ L- Myc)導入による核初期化の検討
(1)ヒ HPS細胞誘導に対する効果
マウスェコトロピックウィルスレセプター Slc7al遺伝子を発現させた成人皮膚由来線 維芽細胞（aHDF- Slc7al)を既報の方法（Cell, 131， pp.861-872, 2007) に従って作 製した。この aHDF- Slc7alを 3 x 105個 /60 mmディッシュの割合で蒔き、その翌日、上 記刊行物に記載された方法に従ってヒト由来の 4遺伝子（Oct3/4、 Klf4、及ぴ Sox2の 3遺伝子に L- Mycl (以下、単に「L- Myc」と称する)、 c- Myc、又は N- Myc遺伝子を加 えた合計 4遺伝子）をレトロウイルスで導入した。ウィルス感染から 6日後に細胞を回収 し、 MSTO細胞上への蒔き直しを行った (5 X 105個/ 100 mmディッシュ）。その翌日か ら霊長類 ES細胞培養用培地（リプロセル）に 4 ng/mlのリコンビナントヒト bFGF (和光 純薬)を加えた培地で培養を行った。
[0153] レトロウイルス感染後、 37日目に出現したヒ HPS細胞コロニー数をカウントした。 4回 の実験結果をまとめて表 13及び図 37に示す（図 37は表 13をグラフ化したものであり、 グラフ上の数値はトータルコロニー数に対する iPS細胞コロニー数の割合を示す)。 L - Mycを用いることにより、 iPS細胞コロニーの誘導効率が c- Mycに比べて6倍も高くなり 、トータルコロニー数に対する iPS細胞コロニー数の割合についても c- Mycの場合に 比べて L-Mycを用レ、た場合のほうが約 2倍増加してレ、た。 N - Mycを用レ、た場合にも c- Mycの場合に比べて iPS細胞コロニー数の増加が認められた。マウス線維芽細胞（ME F)由来の iPS細胞誘導においては、 C- Mycを用いた場合と L - Mycを用いた場合との 間に差が無いことが報告されてレ、るが (Nature Biotech., 26, pp.101 - 106, 2008)、ヒト 細胞を用いる場合には、 c- Mycよりも L- Mycを用いたほうが iPS細胞の誘導効率が顕 著に向上することが明らかとなった。
[表 13]
< Numb er of hi S colonies >
Figure imgf000072_0001
[0155] (2)in vitro分化誘導
Oct3/4、 Klf4、 Sox2、及び L- Mycの 4遺伝子導入により樹立されたヒト iPS細胞（32R2 , 32R6)を low- binding dishに播き、既報の方法 (Cell, 131, pp.861-872, 2007)に従つ て胚様体 (embryoid body :EB)を形成させた（100mmディッシュ）。 2週間培養後、内胚 葉系細胞の分化マーカーである α -フエトプロテイン（R&Dシステムズ)、中胚葉系細 胞の分化マーカーである 平滑筋ァクチン（和光純薬)、及び外胚葉系の分化マー カーである β III-チュープリン（ケミコン）の各抗体を用いた染色を行った。結果を図 3 8に示す。上記染色により各マーカーの発現が確認され、得られたヒ HPS細胞は三胚 葉系への分ィヒ能を有することが確認された。
[0156] (3)奇形腫形成能
Oct3/4、 Klf4、 Sox2、及び L- Mycの 4遺伝子導入により樹立されたヒ HPS細胞（32R6 )を、リコンビナントヒト bFGF(4ng/mI)及ぴ Rhoキナーゼ阻害剤 Y- 27632(10 μ Μ)を含 有する霊長類 ES細胞培養用培地（ReproCELL)中で培養した。 1時間後、 collagen IV で処理して細胞を採取後、遠心して細胞を回収し、 Y-27632 (10 μ Μ)を含有する DM EM/F12中に浮遊させた。コンブルエントになった細胞 (100 mmディッシュ)の 1/4量を SCIDマウスの精巣内に注射した。 2〜3ヶ月後、腫瘍を切り刻んで 4%ホルムアルデヒ ドを含有する PBS (-)で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、へマトキシリン 'ェ ォジンで染色した。この結果を図 39に示す。組織学的に腫瘍は複数の種類の細胞か ら構成されており、神経組織、腸管様組織、軟骨組織、毛髪組織、脂肪細胞、及ぴ 色素組織"が認められたことから、 iPS細胞の多能性が証明された。
[0157] (4)キメラマウスの腫瘍形成に対する影響
Nanog遺伝子座に EGFPとピューロマイシン耐 I"生遺伝子を組み込んで作製した Nano gレポーターを有するマウス（Nature, 448, pp.313-317, 2007)より MEFを単離した（ME F_Ng)。同様に Fbxl5遺伝子座に β - geo遺伝子を組み込んで作製した Fbxl5レポ一 ターを有するマウス（Cell, 126, pp.663- 676， 2006)より MEFを単離した（MEF- Fbx)。 これらの MEFに 4遺伝子（Oct3/4、 Klf4、 Sox2、及ぴ L - Myc)をレトロウイルスを用いて 導入し、 MEF-Ngについてはピューロマイシンで選択し、 MEF_Fbxについては G418 で選択することにより iPS細胞を樹立した (それぞれ Nanog - iPS及び Fbx-iPSと称する） 。これらの iPS細胞を C57BL/6マウスの胚盤胞に移植することによりキメラマウスを作 出した。キメラマウス及び F1マウスにおける腫瘍形成を検討した結果、現時点でそれ ぞれ以下の日数生存しており、また生存しているいずれのマウスにおいても腫瘍の 発生は認められな力 た。
[0158] キメラマウス Fbx- iPS : 19Zl9匹 349日生存中
キメラマウス Nanog - iPS： 15/16匹 363日生存中
Fl Nanog-iPS： lZl匹 255日生存中
Fl Nanog- iPS : 3Z3匹 181日生存中
Fl Nanog- iPS : 1/1匹 132日生存中
キメラマウス Nanog-iPS: 30Z30匹 63日生存中
キメラマウス Nanog-iPS： 12ノ14匹 62日生存中
Oct3/4、 Klf4、 Sox2 及び c- Mycの 4遺伝子により初期化を行った iPS細胞を用いた 場合には、生後 100日以内に 37匹中 6匹のキメラマウスが腫瘍が原因で死亡したが（ Nature Biotech., 26, pp.101- 106, 2008)、 c- Mycに代えて L-Mycを用いることにより生 存 S数に顕著な改善が認められ、かつ腫瘍発生が劇的に減少することが明らかとな つた。 '
[0159] (B) 3遺伝子（Oct3/4, Klf4, L-Myc)導入による核初期化の検討
(l)iPS細胞コロニー形成の有無
既報の方法 (Nature Biotech., 26, pp.101- 106, 2008)に従レ、 3遺伝子（Oct3/4、 Klf4 、及び L- Myc)導入による iPSの樹立を試みた。上記 (A)(1)ないし (4)に記載した MEF- Ngをゼラチンコートした 6ゥエル培養プレートに L3 X 105個/ゥエルの割合で蒔き、 24 時間後にマウス由来の 3遺伝子（Oct3/4、 Klf4、及び L- Myc)をレトロウイルスを用い て導入した。ウィルス感染から 4日後に細胞を回収し、 MSTO細胞上への蒔き直しを 行った（1.5 X 105個 /6ゥェルプレート)。翌日から細胞を LIFを加えた ES細胞培養用培 地（DMEM (ナカライタスク)に 15%牛胎仔血清、 2 mM L-グノレクミン (インビトロジェン)、 100 M非必須アミノ酸 (インビトロジェン)、 100 M 2—メルカプトエタノール (インビト ロジェン)、 50 U/mLペニシリン (インビトロジェン)と 50 mg/mLストレプトマイシン (イン ビトロジェン)をカ卩えたもの）を用いて培養した。ウィルス感染力も 46日目に GFP陽性コ ロニーをピックアップした（iPS_MEF - Ng-443- 3クローン)。ピックアップした 16個の細 胞の写真を図 40に示す。いずれの細胞も GFP陽性を示す iPS細胞コロニーであった。
[0160] これらの GFP陽性コロニー由来のクローンついて、遺伝子発現を検討するために R T-PCR及び Genomic- PCRを行った。結果を図 41に示す。いずれのクローンも ES細胞 のマーカ一遺伝子である Nanog、 Rexl、及び ECAT1を発現していた。また、全ての iP S細胞コロニーにおいて導入した 3種の遺伝子（Oct3/4、 Klf4、及び L- Myc)がゲノム 中に組み込まれていた。一方、 mRNAの発現が検出されないクローンもあった力 こ れはサイレンシングを受けているためと考えられる。
[0161] (2)in vitro分化誘導
前記 (1)で樹立した 4つのクローン (iPS- MEF - Ng-443 - 3-3、 iPS - MEF-Ng-443 - 3 - 6、 iPS- MEF- Ng- 443- 3- 12、及び iPS- MEF- Ng- 443- 3- 13)を low- binding dishに播き（2 x 106個 /6ゥエルプレート）、胚様体 (embryoid body :EB)を形成させた。 ES細胞培養用 培地で 2週間培養後、内胚葉系細胞の分ィヒマーカーである α -フエトプロテイン（R& Dシステムズ)，中胚葉系細胞の分ィ匕マーカーである α -平滑筋誘導に (ダコ)，外胚 葉系の分化マーカーである III-チュープリン（ケミコン）の各抗体を用いた染色を行 つた。結果を図 42に示す。染色によりこれらのマーカーの発現が確認され、得られた マウス iPS細胞は三胚葉系への分化能を有することが確認された。
[0162] (3)奇形腫形成能
前記 (1)で樹立した 4つのクローン（iPS_MEF- Ng- 443- 3- 3、 iPS-MEF-Ng- 443-3-6、 iPS-MEF- Ng- 443- 3- 12、及び iPS- MEF- Ng- 443- 3- 13)をそれぞれヌードマウスの皮 下に注射した。 4週間後に全例で奇形腫の形成が確認された。組織学的に腫瘍は複 数の種類の細胞から構成されており、神経組織、腸管様組織、筋肉組織、表皮組織 、及ぴ軟骨組織が認められたことから (図 43)、 iPS細胞の多能性が証明された。
[0163] 例 26：ヒ HPS細胞誘導における L - Myc及ぴ Lin28の効果
マウスェコトロピックウィルスレセプター Slc7al遺伝子を発現させた成人皮膚由来線 維芽細胞（aHDF- Slc7al)を既報の方法 (Cell, 131， pp.861- 872， 2007)に記載の方法 に従い作製した。この aHDF_Slc7alを 3 x 105個 /60 mmディッシュの割合で蒔き、その 翌日、上記刊行物に記載された方法に従ってヒト由来の以下の 3遺伝子、 4遺伝子、 又は 5遺伝子をレトロウイルスで導入した。
•Sox2、 Oct3/4、及ぴ Klf4
•Sox2、 Oct3/4、 Klf4、及び c- Myc
•Sox2、 Oct3/4、 Klf4,及び L- Myc
•Sox2、 Oct3/4、 Klf4、及ぴ Lin28
•Sox2、 Oct3/4、 Klf4、 c- Myc、及び Lin28
• Sox2、 Oct3/4、 Klf4、 L- Myc、及び Lin28
[0164] ウィルス感染から 6日後に細胞を回収し MSTO細胞上への蒔き直しを行った (5 x 105 個/ 100 mmディッシュ)。その翌日から霊長類 ES細胞培養用培地（リプロセル）に 4 ng /mlのリコンビナントヒト bFGF (和光純薬）を加えた培地で培養を行った。レトロウイノレ ス感染後、 37日目に出現した全コロニー（Total colonies)及ぴヒ HPS細胞コロニー数（ hiPS colonies)をカウントした。結果を表 14及び図 44に示す（図 44は表 14をグラフ化し たものである）。
[表 14]
Figure imgf000076_0001
[0166] Sox2、 Oct3/4、 Klf4、及び L- Mycの 4遺伝子に Lin28を加えることにより、 iPS細胞コロ ニー数が顕著に増加した。この iPS細胞コロニー数は、 Sox2、 Oct3/4、 Klf4、及び c- M ycの 4遺伝子に Lin28を加えた場合よりも顕著に多かった。また、 Lin28は c-Mycの作 用に対して相乗効果を示した力 L- Mycの作用に対してはさらに強い相乗効果を示 した（表 14)。トータルコ口-一数に対する iPS細胞コロニーの割合についても Sox2、 0 ct3/4、 Klf4、 L- Myc、及び Lin28の 5遺伝子を用いた場合は極めて高い割合（84.7%) を与えた。以上の結果から、ヒト iPS細胞の誘導効率を改善するためには、 Sox2、 Oct3 /4、 Klf4、 L - Myc、及び Lin28の 5遺伝子の組み合わせが極めて有効であることが明ら かとなつた。
[0167] 例 27：ヒト iPS細胞誘導における Mycキメラ遺伝子及び変異遺伝子の効果
図 45に示す各種 Mycキメラ遺伝子（Ms- cL- Myc、 Ms- Lc- Myc、 Ms- cLc- Myc、 Ms- L cL - Myc、 Ms-ccL- Myc、 Ms-cLL- Myc、 Ms- LLc-Myc、 Ms - Lcc - Myc)、及び Myc点変 異遺伝子（c- MycW135E、 c- MycV394D、 c- MycL420P、 L- MycW96E、 L- MycV325D 、 L - MycL351P)を以下のとおり構築した。まず、マウス c- Myc(Ms- c-Myc)及び L- Myc (^3-し-^ 0)をそれぞれ 5^«^-0-下0?0 (10 0 60)に組み込み、 ENTR-D-TOP 0 - Ms- c- Myc及び pENTR- D- TOPO- Ms- L- Mycを作製した。次に、マウス c- Myc (N CBI Acc.No· N _010849)及び L - Myc (NCBI Acc.No. NM_008506)の配列情報に基 づいて、図 45に示した点変異を導入するためのプライマーを作製し、これを用いて pE NTR - D— TOPO- Ms - c - Myc及ぴ pENTR- D-TOPO - Ms- L-Mycを鎢型として PCRを行 つた。各変異についてシークェンスで確認後、 LR反応にてレトロウイルスベクターの p MXsにサブクローニングした。図 45に示したキメラ Mycについては、各フラグメントを P CRにて増幅し、それぞれの組み合わせに じて混合したものを錄型として PCRを行 レ、、先と同様にレトロウイルスベクターの pMXsにサブクローニングした。
[0168] 得られた各レトロウイルスベクターと例 25で用いた Sox2、 Oct3/4、及び Klf4の各レト ロウィルスベクターとを例 25と同様にして成人皮膚由来線維芽細胞（aHDF- Slc7al) に導入し、レトロウイルス感染後、 31日目に出現した全コロニー (Total colonies)及び ヒ HPS細胞コロニー（WPS colonies)の数をカウントした。結果を図 46及ぴ表 15に示す (図 46は表 15をグラフ化したものである）。
[0169] [表 15]
Figure imgf000077_0001
[0170] 1^}^及びし-1^ (：は、いずれもヒトとマウスにおいてアミノ酸レべノレで 100%近い同 —性を有している。図 46及ぴ表 15に示されるように、マウス遺伝子（Ms- c - Myc及び M s - L- Myc)を用いた場合にもヒト遺伝子（c- Myc及び L- Myc)と同様にヒ HPS細胞コロ ニーが生じたことから、マウスの c~Myc及び L- Mycはヒトの c - Myc及び L- Mycと実質的 に同一の機能を持つことが確認された。
[0171] 各種の Mycキメラ遺伝子及び点変異遺伝子での結果を野生型と比較した結果、 Ms - cL- Myc及ぴ Ms- cLc- Mycを用いた場合に、野生型 L- Myc (L- Myc)と比べて iPS細 胞コロニー数が増加しており、特に Ms- cL- Mycを用レ、た場合に最も良好な結果が得 られた。また、点変異遺伝子での結果から、 C- Myc及び L- Myc共に C末端の 1つのァ ミノ酸（c- MycL420P及び L-MycL351P)が非常に重要なことも明ら力となった。以上の 結果から、ヒ HPS細胞樹立における Mycの重要な機能領域は、 c - Mycの N末端側 1/ 3の部分、 L-Mycの中央部分、及ぴ c/L-Mycの C末端部分であることが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明により安全な人工多能性幹細胞の製造方法及び効率的な人工多能性幹細 胞の製造方法が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 体細胞力 ^人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の 3種の遺伝子： Octフ アミリー遺伝子、 Klf^アミリー遺伝子、及び Soxファミリー遺伝子を体細胞に導入する 工程を含む方法。
[2] 下記の 3種の遺伝子： Octファミリー遺伝子、 Klf アミリー遺伝子、及び Soxファミリー遺 伝子を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間 にわたり該細胞を培養する工程を含む請求項 1に記載の方法。
[3] 下記の 3種の遺伝子： Oct3/4、 Klf4、及び Sox2を体細胞に導入する工程を含む請求 項 1に記載の方法。
[4] Octファミリー遺伝子を含むウィルスベクター、 KK7アミリー遺伝子を含むウィルスべク ター、及び Soxファミリー遺伝子を含むウィルスベクターをそれぞれ別のパッケージン グ細胞にトランスフエタトして該細胞を培養することにより 3種類の培養上清を得るェ 程、及ぴ上記工程により得られた 3種類の培養上清の混合物を調製し、該混合物を 用いて体細胞の初期化を行う工程を含む請求項 1ないし 3のいずれ力 ^項に記載の 方法。
[5] 薬剤選択を行わずに人工多能性幹細胞を製造する請求項 1な V、し 4の！/、ずれか 1項 に記載の方法。
[6] 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の 2種の遺伝子： Octフ アミリー遺伝子及び Soxファミリー遺伝子の組み合わせ又は下記の 2種の遺伝子： Oct ファミリー遺伝子及ぴ Klf アミリー遺伝子の組み合わせと、下記の 3種の遺伝子から 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子： L-Myc、 Salll、及び Sall4とを体細胞に導入するェ 程を含む方法。
[7] 下記の 2種の遺伝子： Oct3/4及び Sox2の組み合わせ又は下記の 2種の遺伝子： 0は3 /4及び Klf4の組み合わせと、下記の 3種の遺伝子力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝 子： L-Myc、 Salll、及び SaMとを体細胞に導入する工程を含む請求項 6に記載の方 法。
[8] 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の 3種の遺伝子： Octフ アミリー遺伝子、 Soxフアミ y—遺伝子、及び Ki アミ y—遺伝子の組み合わせと、下記 の 3種の遺伝子力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子: L-Myc、 Salll、及び Sall4とを体 細胞に導入する工程を含む方法。
下記の 3種の遺伝子： Oct3/4、 Sox2、及び Klf4の組み合わせと、下記の 3種の遺伝子 力も選ばれる少なくとも 1種の遺伝子： L - Myc、 Salll、及び Sall4とを体細胞に導入する 工程を含む請求項 8に記載の方法。 . 上記の遺伝子に加えて下記の遺伝子： Un28及び/又は Nanogを体細胞に導入する 工程を含む請求項 6ないし 9のいずれか 1項に記載の方法。
〇ct3/4、 Sox2、 Klf4, L- Myc、及び Lin28を体細胞に導入する工程を含む請求項 10 に記載の方法。
分化誘導後に得られる細胞や組織において腫瘍の発生が実質的に低減ないし排除 された人工多能性幹細胞を製造する方法であって、請求項 1ないし 11のいずれか 1 項に記載の工程を含む方法。
体細胞力 人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の 6種の遺伝子：Octフ アミリー遺伝子、 Klf^アミリー遺伝子、 Soxファミリー遺伝子、 Mycファミリー遺伝子、 Lin 28、及び Nanogを体細胞に導入する工程を含む方法。
下記の 6種の遺伝子： Oct3/4、 Klf4、 Sox2、 c- Myc、 Lin28、及び Nanogを体細胞に導 入する工程を含む請求項 13に記載の方法。
体細胞がヒト 含む哺乳類動物の体細胞である請求項 1ないし 14のいずれか 1項に 記載の方法。
体細胞力 Sヒトの体細胞である請求項 1ないし 14のいずれ力 1項に記載の方法。
請求項 1ないし 16のいずれ力 4項に記載の方法により得ることができる人工多能性幹 細胞。
請求項 17に記載の人工多能性幹細胞から分化誘導された体細胞。
請求項 18に記載の体細胞の集団である組織、臓器、体液、又は個体。
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