KR20140037036A - 생물제제의 맞춤형 제조 및 체세포의 재프로그래밍 방법 - Google Patents
생물제제의 맞춤형 제조 및 체세포의 재프로그래밍 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생물제제 생성물로 처리하는 동물에서 감소된 수준의 항원성을 갖는 핵산 생성물 및 폴리펩타이드 단백질 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 체세포는 다능성 줄기 세포로 형질전환되고, 원하는 핵산(들)으로 형질주입되며, 목적하는 핵산 생성물의 높은 수준의 제조자로 알려져 있는 체세포로 재-분화되는 동물로부터 분리된다. 본 발명은 집단을 치료하기 위한 일반적인 세포주, 인종 군을 치료하기 위한 인종 특이적 세포주 또는 개개를 치료하기 위한 환자 특이적 세포주를 얻기 위해서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 유도된 다능성 줄기 세포가 원래의 이들의 체세포로 재-분화되도록 하여 세포를 기형종을 형성하지 않고 동물을 치료적으로 치료하기 위해 사용할 수 있는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 관한 교차 참조
본 출원은 미국 특허 가출원 제61/429,409호(출원일: 2011년 1월 3일) 및 미국 특허 가출원 제61/431,376호(출원일: 2011년 1월 10일)의 우선권을 주장하며, 이 기초 출원들은 참고로서 이의 전문이 본 명세서에 포함된다.
현재 다수의 질병을 치료하기 위해 치료적으로 사용되는 많은 재조합 폴리펩타이드 및 단백질이 존재한다. 이러한 재조합 폴리펩타이드 및 단백질은 모두 일차 연속 비인간 또는 인간 2배체 세포계를 사용하여 상업적으로 제조된다. 예를 들면, 이들 중 일부는 대장균과 같은 세균을 사용하여 제조되는 반면에 나머지는 동물 유래의 여러 난소 세포주 또는 효모를 사용해서 제조된다. 세균은 특히 글라이코실화 패턴 및 기타 단백질 변형이 생물제제-수용체 결합 친화도, 생물제제 활성, 생물 분류, 또는 생체 또는 수용자 면역 인식을 위한 약물 동력학에 매우 중요한 경우 몇몇 폴리펩타이드 및 단백질의 제조에 사용될 수 없다. 글라이코실화가 결정적 변수인 경우 중국 햄스터 난소 세포가 현재 생체 제조에 있어서 가장 일반적으로 사용되는 세포주 중의 하나이다.
불행하게도, 장기간 또는 만성 치료에서의 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 사용 의무로 인해서 제품에 대한 환자 개발 중화 항체가 수득되어 환자가 약물에 덜 반응하거나 또는 반응하지 않게 된다. 몇몇 경우에 환자는 류머티스성 관절염, 소아류머티스관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 및 크론 병을 일상적으로 치료하기 위해 사용되는 것으로서, 동일한 부류, 예컨대 다양한 항-TNF 생물제제, 예컨대 에타너셉트(Etanercept)라고도 알려져 있는 엔브렐(Enbrel); 인플릭시맙(Infliximab)이라고도 알려져 있는 레미카이드(Remicaide); 세톨리주맙(Certolizumab) 및 D2E7라고도 알려져 있는 Humira 중 다른 약물로 교체할 수 있다. 그러나 하나의 특별한 항-TNF 생물제제에 대한 중화 항체의 생성으로 환자가 궁극적으로 또 다른 항-TNF 생물제제 제품에 대한 중화 항체를 생성하도록 한다. 몇몇 경우에, 환자에 대한 대안적인 치료법이 존재하지 않아서 이러한 중화 항체의 형성으로 환자에게 치료 선택권이 없어진다. 심지어 적당한 치료 선택권이 있다고 해도, 동일한 부류에서 다른 약물에 대한 중화 항체의 개발에 대한 소인은 결국 이러한 환자에게 치료 선택권이 없게 될 수 있다는 것을 의미한다.
인간 항체에 의해 중화될 수 있는 다른 생물제제 제품은 하기를 포함한다: HRT 및 호르몬 피임제에 의해 유발되는 유방암을 치료하기 위해 잠재적으로 사용할 수 있으며, 골다공증 및 화학요법 유래 골절 치료로 승인된 것으로서 다발성 경화증에 대한 혁신적 치료인 나탈리주맙(Natalizumab) 또는 티사브리(Tysabri) 및 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성제(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand: RANKL)에 대한 완전한 인간 단일클론 항체인 데노수맙(Denosumab). 아바테셉트(Abatecept)는 항-TNF 요법에 대해 치료효과가 없는 류머티스성 관절염 환자에서의 사용이 승인된 CTLA-4 융합 단백질이다. 이의 용도가 아바테셉트 유도 중화 항체에 대한 증거를 갖기에는 너무 새로운 것이지만, 이는 또한 인간 항체 중화 항체 반응을 유도할 수 있는 가능성을 갖는다.
항체 및 융합 단백질계 약물 이외의 다른 폴리펩타이드 및 단백질도 장기간 치료에 의한 면역 반응을 이끄는 것으로 나타났다. 예를 들면, 재조합 인간 에리트로포이에틴이 이의 효험을 감소시키는 중화 항체 형성을 이끌며, 희귀 무형성증 증상을 유발할 수 있다. 또한, 혈우병 환자의 응고 인자 요법에 대한 항체의 발생은 환자 중 25 내지 30%만큼 높다. 이는 응고 인자에 의한 일반적인 문제이다. 암 및 B형 간염에 대한 재조합 인터페론 알파 2a 요법도 또한 치료에 대한 중화 항체의 발생으로 방해를 받는다. 단신의 어린이에 대한 장기간의 성장 호르몬 요법에 대한 무반응도 또한 문제가 많다. 몇몇 인슐린 제품에 대한 중화 항체 형성에 대한 보고들도 있다.
중화 항체를 끌어내는 잠재력이 있는 다른 생물제제 약물에는 전혈, 혈청, 혈장 풀 또는 기타 생물제제 공급의 일차 공급원, 예를 들면, 인간 알부민, 인간 알파1-프로테아제 억제제, 인간 항 혈우병 인자/폰 빌레브란트 인자 복합체, 베이비빅 보툴리눔중독 면역 글로불린 정맥 주사, C1 에스터라제 억제제, 섬유소 밀봉제, 피브리노겐, 면역 글로불린 정맥 주사, 면역 글로불린 피하 주사, 단백질 C 농축물, Rho(D) 면역 글로불린 정맥 주사, 트롬빈, 폰 빌레브란트 인자/응고 인자 VIII 복합체를 포함한다.
재조합 폴리펩타이드 및 단백질은 하기를 포함하는 여러 특성들을 기본으로 하는 중화 항체 발생 및 면역 반응을 이끈다: 생물제제 치료기간, 반복 요법의 간격, 생물제제의 아미노산 조성, 및 생물제제의 변형, 예컨대 글라이코실화, 메틸화, 니트로실화, 시알릴화, 인산화, 황산화, 프레닐화, 셀렌환, 유비퀴틸화, 비타민-의존적 변형, 단백질 결합 관계, 아실화, 당화반응, 3차원 배열 및 다중코일화. 따라서, 생물제제로 치료하는 동물에서 감소된 항원성을 갖는 폴리펩타이드 단백질 제품을 생성하는 방법이 필요하다.
여기서 인용하는 모든 참고문헌에 대한 내용은 참고로서 이의 전문이 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포(synthetically produced pluripotent stem cell: spPSC) 또는 내생 다능성 줄기 세포(endogenous pluripotent stem cell: ePSC)를 형질주입(transfecting) 또는 형질전환(transforming)시킴으로써 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 생물제제, 핵산, 바이러스 및 백신을 제조하기 위한 방법을 제공함으로써 이러한 필요를 충족시킨다. 이러한 세포들은 처리되고 목적하는 생물제제를 발현시키고 형질주입 또는 형질전환된 spPSC 또는 ePSC에 의한 생물제제 제품의 발현을 유도하는 벡터로 형질전환되는 종으로부터 유래된다.
본 발명은 추가로 성인 세포로부터 spPSC를 생성하거나 또는 동물의 ePSC를 분리하는 단계 및 폴리펩타이드 또는 단백질이 줄기 세포에 의해 발현되는 조건 하에서 상기 폴리펩타이드 또는 단백질에 있어서 코팅하는 핵산으로 상기 spPSC 또는 ePSC를 형질주입 또는 형질전환시키는 단계를 포함하는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 대안적인 실시형태에서, 상기 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 투여하는 개체의 것으로서 동일한 인종 군의 세포로부터 상기 spPSC가 제조되거나 또는 ePSC가 분리된다. 다른 인종 군은 여러 가지 글라이코실화 패턴 및 하나의 군에서 다른 군으로의 뚜렷한 다형성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 재조합 폴리펩타이드 및 단백질은 spPSC 또는 ePSC로부터 제조되며, 상기 ePSC 또는 spPSC는 폴리펩타이드 또는 단백질이 투여된 개체와 동일한 인종 군으로부터 분리된 세포로부터 생성된다. 개체에는 spPSC 또는 ePSC로부터 제조된 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 투여할 것이며, 상기 spPSC는 제조되거나 또는 ePSC는 개체가 속하는 인종 군에 속하는 세포로부터 분리된다.
본 발명은 추가로 개체 동물에 폴리펩타이드 또는 단백질을 투여하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 spPSC, 예컨대 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 상기 동물의 세포로부터 제조하는 단계 또는 ePSC를 분리하는 단계, 및 상기 폴리펩타이드 또는 단백질이 상기 다능성 줄기 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기 폴리펩타이드 또는 단백질에 대해 코딩하는 핵산으로 상기 spPSC 또는 ePSC를 형질주입 또는 형질전환시키는 단계, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 상기 유도 다능성 줄기 세포로부터 분리하는 단계, 및 상기 분리된 폴리펩타이드 또는 단백질을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 폴리펩타이드 또는 단백질의 맞춤형 제조 방법을 제공하며, 이로 인해서 spPSC 또는 ePSC가 상업적으로 실행가능하고 유용하도록 한다. 본 발명은 장기간 또는 만성 용도에 있어서 폴리펩타이드 또는 단백질에 의해 통상적으로 발생하는 중화 항체 형성의 문제를 극복하기 위해서 환자에 특이적인 폴리펩타이드 또는 단백질을 제조하기 위한 환자 특이적 spPSC 또는 ePSC의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 환자는 임의의 동물일 수 있으며, 바람직하게는 포유류이고, 보다 바람직하게는 인간이다. 본 발명은 또한 핵산 또는 바이러스를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 목적하는 핵산 또는 바이러스를 제조하는 조건하에서 벡터로 spPSC 또는 ePSC를 형절주입 또는 형질전환시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 치료 용도의 밀접하게 매칭된 번역 이후 변형된 생물제제의 제조를 위한 환자-특이적 및 기간 또는 세포형 특이적 세포주를 얻기 위한 방법을 제공한다. 환자 특이적 줄기 세포는 SCNT, 유도 재프로그래밍, 단위생식 또는 ANT-OAR 재프로그래밍 방법을 사용하여 유도할 수 있거나, 표적 환자로부터 분리할 수 있다. 상기에 의해 유래되거나 분리된 다능성 줄기 세포는 예를 들면 삽입 또는 에피솜 발현 백터 또는 상동 재조합 방법을 사용하여 원하는 치료를 발현시키기 위한 표준 분자 생물공학 절차를 사용하여 유전적으로 변형시킬 수 있다. 유전적 변형 세포주는 배양으로 늘릴 수 있으며, 제조된 생물제제의 수명을 기본으로 예정될 수 있는 주기적 생물제제 생산 시행을 위해서 기탁될 수 있다(실시예 2). 대안적으로, 유래된 환자 특이적 줄기 세포주는 목적하는 치료 단백질을 가장 높은 수준으로 발현시키는 것이 일반적인 세포 형태로 배양으로 분화시킨 다음에 생물제제 제조에 사용될 수 있다. 분화는 각 생산 시행에 대해서 실행될 수 있거나, 제조된 치료요법의 수명을 기초로 이후 생산 시행을 위해 기탁된 분화된 환자 특이적 세포주 및 대규모로 시행될 수 있다(실시예 3).
또한, 글라이코실화 패턴 및 기타 번역 후 변형은 조직 및 세포 형태에 따라 다르다고 알려져 있으므로, 환자 특이적 줄기 세포주는 생물제제를 내생으로 발현시키는 세포 타입 중에서 또는 기관으로부터 분리된 성인 또는 체세포로부터 제조할 수 있다. 예로서, 다음에 SCNT, PGA, ANT-OAR 또는 재프로그래밍 기술을 적용시켜 생물제제 생산을 위한 다능성 세포주를 유도할 수 있다. 이렇게 해서 유래 또는 분리된 다능성 줄기 세포는 원하는 치료를 발현시키기 위한 표준 분자 생물공학 절차를 사용하여 유전적으로 변형시킬 수 있다. 유전적으로 변형된 세포주는 배양으로 늘릴 수 있으며, 생산된 생물제제의 수명을 기초로 지정될 수 있는 주기적 생물제제 생산 시행을 위해서 기탁될 수 있다(실시예 4 참조). 재프로그래밍된 세포(iPS 세포)의 "메모리" 특성의 추가의 이점을 취하면, 환자 및 조직 또는 세포-형태 특이적 iPS 세포는 내생적 번역 후 변형이 가능한 세포주를 보다 완전하게 생성하기 위해 원래의 이들 세포-형태로 다시 분화되도록 유도될 수 있다. 상기 iPS 세포는 원래의 세포 형태로 재-분화된 후에 또는 원래의 분리된 세포-형태로 재-분화되기 이전에 원하는 치료를 발현시키도록 유전적으로 변형될 수 있다(실시예 5 참조).
예를 들면, 성장 호르몬은 하수체 전엽에서 소마토트로프 셀에 의해 매우 높게 생성되는 것이 일반적이며, 또한 태반(영양 아층) 및 혀 및 음문 또는 항문의 피부 내의 세포에서 높게 발현된다. 인자 VIII 단백질 발현은 신장의 세관 세포에서 높으며, 인간 단백질 아틀라스에 따르면 다 조직 및 세포 형태에 의해 적당하게 발현된다. 항체는 일반적으로 비장 및 기타 림프계 기관의 배중심에서 성숙하는 B 세포에 의해서 생성된다. 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)이 높은 항체의 치료적 생성은 제조 세포주에 존재하는 IgG1 서브타입 항체의 2등분 위치에 N-아세틸글루코사민(GlcNac)을 둘 수 있는 GDP-D-만노스-4,6-데하이드라타제(GMD)의 수준에 의해서 결정된다(J Biol Chem., Vol. 273, pp. 14582-14587, 1998 및 BMC Biotechnol., 7:84-97 (2007). 높은 ADCC 활성을 갖는 항체의 생성은 CHO 제조 세포주를 사용하는 것이 항상 최적은 아니다(J Biol Chem. 278: 3466-3473, 2003). 본 발명은 제조된 항체, 융합 단백질 및 세포 세포독성 생물제제의 최적의 ADCC 활성을 위한 신규의 포유동물 세포주를 제공한다.
다량의 생물제제 생성과 관련이 있는 것으로 알려진 전사 인자는 환자 특이적 세포주로부터 발현 수준을 최적화하기 위해 원하는 유전자와 함께 형질주입시킬 수 있다. 예를 들면, 다량의 Pit-1 발현으로 성장 호르몬을 차단하거나 또는 방지하면서 세포 형태로 프로락틴 발현을 높일 수 있다(Genes Dev, 3: 946-958 1989).
단일클론 항체 생성은 Sino Biological Inc, Peoples Republic of China, morphogenics(Proc Natl Acad Sci, 103: 3557-3562, 2006)에 의해서 개발된 시스템 또는 기타 표준 생물공학 방법을 사용해서 유전자 코돈을 최적화함으로써 강화시킬 수 있다.
합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포의 생성
임의의 형태인 합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포를 본 발명의 맞춤형 생물제제를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 두 개의 주요한 카테고리는 유도되거나 재프로그래밍된 다기능 줄기 세포(iPSC) 및 핵이식(SCNT), ANT-OAR 및 단위생식에 의해 제조된 줄기 세포이다.
체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer: SCNT)은 적출된 난자에 성인 체세포의 핵을 주입하고, 준비된 수용기 자궁에 이식하여 정상 출산시켜 완전한 핵 유전적 클론을 수득하는 기술이다. 또한, 다능성 줄기 세포는 SCNT 방법을 사용해서 배양으로 유도하였다(Cell Reprogram. 12:105-113, 2010 및 Genome Res., 19: 2193-2201, 2009).
변형된 핵 이식-난모 세포 지원 재프로그래밍(altered nuclear transfer, oocyte assisted reprogramming: ANT-OAR)은 SCNT와 유사한 기술이지만 기부자 핵을 수용자 난자에 주입하기 이전에 유전적으로 변형시켜 ANT-난모 세포가 완전한 기관으로 분화 및 완전한 기관을 형성하는 것을 막는다(Genome Res. 19: 2193-2201, 2009).
단위 생식(parthenogenesis: PGA)은 또한 무투명대 핵 이식, 단위 생식의 활성화와 같은 기술; 및 SCNT와 같은 클로닝 기술을 사용해서 다능성 줄기 세포를 발생시키기 위해 사용되며, 단위 생식(PGA)은 또한 재프로그래밍된 줄기 세포를 발생시키기 위해서도 사용하였다(Cell Reprogram., 12: 105-113, 2010 및 Nature, 450:497-502 2007).
이러한 다능성 줄기 세포는 어느 정도 오랫동안의 장기간 배양으로 유지하여 재조합 단백질, DNA 및 바이러스용으로의 생물제제 제조에 있어서의 잠재적인 공급원으로 사용할 수 있다.
유도 또는 재프로그래밍된 spPSC
유도된 다능성 줄기 세포는 여러 측면, 예컨대 특정 줄기 세포 유전자 및 단백질의 발현, 크로마틴 메틸화 패턴, 배가 시간, 배양체 구성, 테라토마 형성, 가능성이 있는 키메라 형성, 및 효력 및 식별 가능성에서 배아 줄기(ES) 세포와 같은 천연 다능성 줄기 세포와 유사하다.
일반적으로 약어로서 iPS 세포 또는 iPSC라고 하는 유도된 다능성 줄기 세포는 특정 유전자의 "강제적" 발현을 유도함으로써 비-다능성 세포, 통상적으로는 성인 체세포로부터 인공적으로 유래된 다능성 줄기 세포의 형태이다(Nature Reports Stem Cells. 2007).
유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)는 비-다능성 세포로 특정 줄기-세포 관련 유전자를 형질주입하여 제조한다. 유도된 다능성 줄기 세포는 통상적으로 성인 섬유아세포와 같은 비-다능성 세포로 특정 줄기 세포-관련 유전자를 형질주입시켜 유도한다. 형질주입은 통상적으로 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포존을 통해서 획득된다. 형질주입된 유전자는 다른 유전자가 유도 효과를 강화시킨다고 제시되어 있지만 마스터 전사 조절자 Oct-3/4 (Pou5f1) 및 Sox2를 포함한다. 3 내지 4주 후에 소량의 형질주입 세포가 다능성 줄기 세포와 형태상으로 및 생화학적으로 유사해지기 시작하며, 형태학적 선별, 배가 시간 또는 리포터 유전자 및 항생제 선택을 통해서 분리되는 것이 일반적이다.
배아 줄기 세포 유래 섬유아세포 및 성인 섬유아세포 및 기타 세포는 배아 줄기 세포에 의한 융합(Cell. 126:652-655, 2006 및 Stem Cell Rev, 2: 331-340, 2006), 레트로바이러스 형질주입 기술을 사용하는 4개 유전자의 도입(Cell. 126:663-676, 2006), 단일 카세트 또는 비스스트로닉 렌티바이러스 형질 주입 방법(Stem Cells., 27:543-549, 2009, 및 Stem Cells., 27:1042-1049, 2009) 및 다능성 요구 전사 인자의 내생 자극(Stem Cells., 27:3053-3062, 2009)에 의한 다능성 상태를 만들기 위해서 재프로그래밍하였다. 다능성 유도는 또한 게놈의 메틸화 또는 폴리아데닐화 상태의 변형(PLoS One., 4:e8419, 2009), 마이크로RNAs(Dev Biol., 344:16-25, 2010), 요구되는 전사 인자의 작은 분자 활성화제, 외적 재프로그래밍(Regen Med., 2:795-816, 2007), 단백질계 재프로그래밍(Blood 116: 386-395, 2010), 배양으로 다능성 세포로부터의 배양 현탁액 또는 세포 추출물의 첨가, 다능성 유전자의 재할성화를 위한 유전자 돌연변이의 화학적 또는 방사선 또는 기타 수단, 및 내생 다능성 상태를 유도 또는 유지하는 성장 인자 또는 사이토카인 또는 세포 신호 부분의 첨가에 의해서 획득될 수도 있다.
다능성 상태로 세포를 재-프로그래밍하기 위한 레트로바이러스의 사용은 면역 결핍에 있어서의 유전자 치료 시도를 다시 부르는 위험이 존재한다. Cre-lox라고 하는 적출 기술은 성공적인 재프로그래밍 이후에 레트로바이러스를 제거하기 위해 사용하며, 피기백 트랜스포존 방법은 레트로바이러스의 필요성을 완전히 제거한다(Curr Opin Biotechnol., 20:516-521, 2009).
인간 iPSC는 4개의 피보탈 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)를 사용해서 레트로바이러스 시스템으로 다능성 줄기 세포로 인간 섬유아세포를 형질전환시켜 생성한다. 인간 iPSC는 또한 렌티바이러스 시스템을 사용하여 OCT4, SOX2, NANOG 및 다른 유전자 LIN28로 생성한다. 아데노바이러스는 또한 쥐의 피부 및 간 세포의 DNA로 필요한 4개의 유전자를 이동시켜 세포가 배아 줄기 세포와 동일해지도록 하기 위해 사용한다(Science 322(5903):945-949, 2008). 성인 세포의 iPSC로의 재프로그래밍은 또한 임의의 바이러스 형질주입 시스템이 전혀 필요하지 않은 플라스미드를 통해 획득될 수 있다(Science 322(5903):949-953, 2008). iPSC는 피기백 트랜스포존 시스템, 미니서클 기술, 단백질 자극 또는 상태 매질 자극 재프로그래밍을 사용해서 제조한다.
iPS 세포의 발생은 유도에 필요한 유전자에 따라 결정적으로 달라진다. Oct-3/4 및 Sox 유전자의 특정 구성원(Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15)은 부재가 유도를 불가능하게 하는 유도 공정과 관련된 결정적인 전사 조절자로서 규정한다. 그러나 Klf 패밀리(Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 패밀리(C-myc, L-myc 및 N-myc), Nanog 및 LIN28의 특정 구성원을 포함하는 부가적인 유전자는 유도 효과를 증가시키는 것으로 규정한다.
o Oct-3/4(Pou5f1)(캘리포니아주 샌 디에고 소재 바이오클론으로부터 얻을 수 있는 cDNA)(Nucleic Acids Res. 20 (17): 4613-20, 1992): Oct-3/4는 옥타머(octamer: "Oct") 전사 인자의 패밀리 중 하나이며, 다능성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 난할구 및 배아 줄기 세포와 같은 Oct-3/4+ 세포 중 Oct-3/4의 부재로 자발적인 영양 아층 분화가 나타나며, 이에 따라서 Oct-3/4의 존재로 배아 줄기 세포의 다능성 및 분화 잠재성이 나타난다. Oct-3/4와 가까운 유전자들, Oct1 및 Oct6을 포함하는 "Oct" 패밀리 중 다양한 다른 유전자들은 유도를 끌어내는 데 실패하여 유도 공정으로의 Oct-3/4의 독점성이 증명되었다.
o Sox 패밀리: 유전자의 Sox 패밀리는 다능성 줄기 세포에서 배타적으로 발현되는 Oct-3/4와 대조적으로 다분화능 및 단분화능 줄기 세포와 관련이 있는데도 불구하고 Oct-3/4와 유사한 다능성을 유지하는 것과 관련이 있다(Dev Biol. 227 (2): 239-55, 2000). Sox2(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA)는 유도에 사용되는 초기 유전자인 반면에(Mamm. Genome 5 (10): 640-642, 1995), Sox 패밀리 중 다른 유전자들은 유도 공정에서도 관여하는 것으로 확인되었다. Sox1(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA)은 Sox2와 유사한 효능을 갖는 iPS 세포를 생산하며, 유전자 Sox3(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 인간 cDNA), Sox15 및 Sox18도 또한 효능을 감소하지만 iPS 세포를 생성한다.
o Klf 패밀리: 유전자의 Klf 패밀리 중 Klf4는 마우스 iPS 세포의 발생을 위한 인자이다. Klf2(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA) 및 Klf4(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA)는 iPS 세포를 발생시킬 수 있는 인자이며, 관련 유전자 Klf1(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA) 및 Klf5(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA)도 역시 효능을 감소하지만 iPS 세포를 발생시킬 수 있다.
o Myc 패밀리: 유전자의 Myc 패밀리는 암에 연루되는 원종양 형성 유전자이다. C-myc(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA)는 마우스 iPC 세포의 발생과 연루되는 인자이다. 그러나, c-myc는 인간 iPS 세포의 발생을 위해 불필요할 수 있다. iPS 세포의 유도에 유전자의 "myc" 패밀리의 사용은 c-myc-유도 iPS 세포로 이식된 마우스 중 25%에서 치명적인 기형종이 발생한 것과 같이, 임상 치료로서 iPS 세포의 우발성에 문제가 발생한다. N-myc(캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA) 및 L-myc는 유사한 효능을 갖는 c-myc 대신에 유도하기 위한 것으로 인정된다.
o Nanog: (캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA) 배아 줄기 세포에서 Oct-3/4 및 Sox2와 함께 Nanog는 다능성을 촉진하는데 필수적이다(Cell 113 (5): 643-55, 2003).
o LIN28: (캘리포니아주 샌디에이고 소재 바이오클론에서 구입가능한 cDNA) LIN28은 분화 및 증식과 관련된 배아 줄기 세포 및 배아 암 세포에서 발현되는 mRNA 결합 단백질이다(Dev Biol 258 (2): 432-42, 2003).
합성 생성-다능성 줄기 세포의 동일성
발생된 spPSC는 하기의 관점에서 천연으로 분리된 다능성 줄기 세포(예컨대, 마우스 및 인간 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC)로 각각 mESC 및 hESC)와 현저하게 유사하여 천연으로 분리된 다능성 줄기 세포로의 spPSC의 동일성, 진정성 및 다능성을 확인한다.
세포 생물학적 특성:
o 형태론: iPSC는 ESC와 형태학적으로 유사하다. 각 세포는 원형이며, 큰 핵소체 및 부족한 세포질을 갖는다. iPSC의 콜로니는 또한 ESC의 것과 유사하다. 인간 iPSC는 hESC와 유사한 날카로운 모서리의 평평하고 빽빽하게 채워진 콜로니를 형성하고, 마우스 iPSC는 mESC와 유사한 콜로니를 형성하고, hESC보다는 덜 평평하고, 보다 더 응집된 콜로니를 형성한다.
o 성장 특성: 배가 시간 및 유사분열 활동은 ESC의 기초이며, 줄기 세포가 이들의 정의의 부분으로서 자기 재생을 해야하기 때문이다. iPSC는 ESC와 동일한 비율로 유사분열 활성이 있으며, 활발하게 자기 재생하고, 증식 및 분화한다.
o 줄기 세포 마커: iPSC는 ESC 상에서 발현되는 동일한 세포 표면 항원성 마커를 발현한다. 인간 iPSC는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E 및 Nanog를 포함하는 hESC에 특이적인 마커를 발현한다. 마우스 iPSC는 mESC와 유사하게 SSEA-1을 발현하지만, SSEA-3 및 SSEA-4는 발현하지 않는다.
o 줄기 세포 유전자: iPSC는 Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT를 포함하는 미분화 ESC에서 발현되는 유전자를 발현한다.
o 텔로머라제 활성: 텔로머라제는 ~50 세포 분열의 헤이플릭 한계에 의해 제한되지 않는 세포 분열을 유지하기 위해 필수적이다. hESC는 자기 재생 및 증식을 유지하기 위한 높은 텔로머라제 활성을 발현하며, iPSC는 또한 높은 텔로머라제 활성을 보여주며, 텔로머라제 단백질 복합체에 필수적인 성분인 hTERT(인간 텔로머라제 역전사 효소)를 발현한다.
다능성: iPSC는 완전하게 분화된 조직으로 ESC와 유사한 방식으로 분화할 수 있다:
o 신경 분화: iPSC는 신경, 발현 βIII-튜뷸린, 티로신 수산화효소, AADC, DAT, ChAT, LMX1B 및 MAP2로 분화할 수 있다. 카테콜아민-관련 효소의 존재는 hESC와 같은 iPSC가 도파민으로 활성화되는 신경 세포로 분화될 수 있음을 나타낼 수 있다. 줄기 세포-관련 유전자는 분화 이후에 하향 조정된다.
o 심장 분화: iPSC는 자발적으로 뛰기 시작하는 심장 근육 세포로 분화할 수 있다. 심장 근육 세포는 TnTc, MEF2C, MYL2A, MYHCβ 및 NKX2.5를 발현한다. 줄기 세포-관련 유전자는 분화 이후에 하향 조정된다.
o 기형종 형성: 면역결핍 마우스로 주입된 iPSC는 9주 후에 자발적으로 기형종을 형성한다. 기형종은 3개의 배엽, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로부터 유래된 조직을 함유하는 다중 계통의 암이며; 이는 다른 암과 다르게 통상적으로 단지 하나의 세포 형태를 갖는다. 기형종 형성은 다능성에 대한 랜드마크 테스트이다.
o 배양체: 배양물 중의 hESC는 "배양체"라고 하는 공-유사 배아-유사 조직을 형성하며, 유사분열성으로 활동적이고 분화된 hESC의 코어 및 세 개의 모든 배엽으로부터 완전하게 분화된 세포주변부로 이루어진다. iPSC는 또한 배양체를 형성하며, 주변 분화 세포를 갖는다.
o 4배성 보완성: 4배성의 낭포(그들 자체만이 배아외성 조직을 형성할 수 있음)로 주입된 마우스 태아 섬유아세포로부터의 iPS 세포는 낮은 성공률을 갖지만 전체 비-키메라 수정 마우스를 형성할 수 있다. 4배성 보완성 분석은 두 개의 포유동물 배아 세포가 결합하여 새로운 배아를 형성하는 생물학적 기술이다. 이는 다능성 줄기 세포의 연구 및 배아성 개발에 대한 특정 돌연변이의 결과를 연구하기 위해 유전적으로 변형 조직을 구성하기 위해 사용된다.
유도된 다능성 줄기 세포(iPS)는 소화관 장간막 세포(Cell Reprogram., 12:237-247, 2010), 망막 색소 상피 세포(Stem Cells., 28:1981-1991, 2010), 양막 세포(Differentiation., 80:123-129, 2010), 섬유아세포(J Vis Exp., 8:1553, 2009), 성인 신경 세포(Nature., Vol. 454, pp. 646-650, 2008), 치수(J Dent Res, Vol. 89, pp. 773-778,2010), 지방성 세포(Cell Transplant., 19:525-536, 2010), 난소(J Reprod Dev., 56:481-494, 2010) 및 배아, 태아 및 성인 공급원으로부터의 여러 다른 세포로부터 생성될 수 있다. iPS 세포는 몸체의 220개 세포 모든 타입이 아직 전신적으로는 조사되지 않았지만 이론적으로는 임의의 세포 타입으로부터 생성될 수 있다. 몇몇 최근 연구에서는 iPS 세포가 이들의 원래 세포 타입에 있어서의 '메모리'를 보유할 수 있다고 보고하였다. 이는 iPS 세포가 배양으로 때로는 자발적으로 대부분이 이들의 원래 세포 타입으로 재분화되는 것을 선호하는 것으로 번역된다.
내생 줄기 세포의 분리
내생 다능성 줄기 세포(ePSC)를 포함하는 줄기 세포는 이들의 표면 상에 발현되는 특이적 항원이 특징이며, 이에 의해 분리된다. 다능성 줄기 세포는 다른 방법 중에서 단계-특이적 태아 항원(stage-specific embryonic antigen: SSEA), 전사 인자 Oct4 및 Nanog 및 기타 마커의 발현에 의해 특징될 수 있다. 현재까지 분리된 내생 다능성 줄기 세포의 일차 타입은 매우 작은 태아-유사(very small embryonic-like: VSEL) 줄기 세포이다.
VSEL은 작으며(마우스에서는 3 내지 5 미크론 직경이며, 인간에서는 3-7 미크론 직경임), 세포질 비율에 대해 핵이 높다. VSEL는 SSEA1, Oct4, Nanog, Rex1 및 기타 다능성 줄기 세포 마커, 및 CD133, CD34, AP, cMet, LIF-R 및 CXCR4에 양성이다(J Am Coll Cardiol 53(1):10-20, 2009; Stem Cell Rev 4:89-99, 2008). 이들은 CD45에는 음성이다. VSEL는 HSC보다 작으며(3 내지 6 대 6 내지 8㎛), 높은 핵/세포질 비율을 갖는다. 상기 VSEL 핵은 크며, 개방형 크로마틴을 포함하고, 다수의 미토콘드리아가 있는 세포질의 좁은 가장자리로 둘러싸여 있다. 따라서, 이들의 형태는 초기 PSC와 일치한다.
PB 중의 순환 VSEL의 절대 수는 특별히 낮으므로(정상 상태 조건 하 혈액 1㎖ 중 1 내지 2 세포), 특별한 흐름 혈구 계산 프로토콜을 이들의 규명 및 분리를 위해 적용해야 한다. VSEL를 확인하기 위해 사용되는 표현형 마커는 CD45(마우스 및 인간)의 음성 발현, Sca-1(마우스)의 양성 발현, CXCR4, CD133 및 CD34(마우스 및 인간), 전구 줄기 세포 마커(즉, Oct-4, Nanog 및 SSEA)를 포함하며, 외피/생식 세포 줄기 세포의 몇몇 마커 특성을 발현한다.
단지 VSEL의 형광성 활성화 세포 선별 분리를 이용해서 UCB 100㎖에 존재하는 모든 VSEL의 선별을 작업 4일 내에 완료할 수 있다. 보다 효과적이고 경제적인 3-단계 분리 프로토콜로 Lin-/CD45-/CD133b UCB-VSEL의 초기 수 중 60%를 회수할 수 있다. 상기 프로토콜은 저장성 염화암모늄 용액 중의 적혈구의 용해, 면역 자기성 비드에 의해 CD 133b 세포 선별 및 크기-마커 비드 제어의 FACS에 의한 Lin-/CD45-/CD133b 세포의 선별을 포함한다. 분리된 세포는 작고 높은 원시성의 Lin-/CD45-/CD133b 세포의 SSEA-4b 및 Oct-4b군이 가장 풍부하다.
VSEL의 선별을 위한 또 다른 방법은 몇몇 표면 마커의 존재 및 세포의 직경을 기초로 한다. 요약하면, 초기 단계는 적혈구 세포의 용혈로 유핵 세포 분획을 수득하는 것이다. 적혈구 용혈 완충액을 피콜 원심분리 대신에 사용하며, 이는 후자의 접근법이 매우 작은 세포군을 크게 감소시킬 수 있기 때문이다. 이후에, 세포는 Sca-1(쥣과 VSEL) 또는 CD133(인간 VSEL), 판 조혈성 항원(panhematopoietic antigen, CD45), 조혈 계통 마커(lin) 및CXCR4에 대한 항체로 염색하며, 다중 파라미터, 살아있는 멸균 세포 선별 시스템(MoFlo, Beckman Coulter; FACSAria, Beckton Dickinson)dmmf 사용해서 선별한다. 이러한 방법은 대략 95%의 VSEL를 포함하는 직경이 2 내지 10㎛인 것들을 포함하도록 "연장된 림프구 게이트"를 사용한다.
내생 줄기 세포는 골수, 전혈, 제대혈, 지방 조직 또는 다른 공급원으로부터의 단핵 세포 분획 내에 포함될 수 있거나, CD34, CD133, CD105, CD117, SSEA1-4, 색소 배제 및 기타 특이적 줄기 세포 항원에 있어서의 선별로 정제할 수 있다. 줄기 세포는 전혈, 골수, 제대혈, 지방 조직, 비점막 및 탯줄 조직과 같은 단일 세포 현탁액으로 해리될 수 있는 기타 줄기 세포 공급원으로부터 피콜-하이팩을 이용한 밀도 구배 원심분리 또는 기타 시판되어 이용가능한 구배에 의해서 분리될 수 있다. 줄기 세포는 이러한 접근법으로부터 수득된 단핵 세포 분획물로부터 회수될 수 있다. 대안적으로 줄기 세포는 밀도 구배 원심분리 후 다른 분획물 내에서 확인할 수 있다(Stem Cells Dev. 2011 [Epub ahead of print].). 예를 들면, 제대혈은 PBS 중 1:1로 희석될 수 있으며, 히스토파크 1077(시그마) 상에 조심스럽게 오버레이해서, 상온에서 30 분 동안 1500 rpms로 원심분리한다. 상기와 같이 얻어진 층은 추가로 줄기 세포 분리를 위채 처리할 수 있다. 층(1)은 혈소판 층이고, 층(2)은 단핵 세포를 포함하는 연막이며, 층(3)은 피콜 층이고, 층(4)은 VSEL도 함유하는 적혈구 펠렛 층이다. 층(1, 2 및 3)은 수집할 수 있으며, FBS가 있거나 또는 없는 DMEM F12와 같은 적당한 배지로 희석하고, 다시 원심분리하여 세포 펠렛을 수득한다. 층(4)은 DMEM F12와 같은 적절한 배지로 희석될 수 있고, 표준 벤치탑 원심분리로 상온에서 15 분 동안 800 rpm에서 원심분리될 수 있다. 줄기 세포는 층(2)(연막) 및 층(4)(RBC 펠렛)으로부터 대부분 회수될 수 있다. 도 1은 전혈의 구배 원심분리로부터 얻어진 층의 전형적인 관을 보여준다. (1)은 혈소판을 나타내고; (2)는 줄기 세포 및 MNC의 연막이며; (3)은 피콜이고; 및 (4)는 RBC 펠렛 및 줄기 세포를 나타낸다.
또한, 글라이코실화 패턴 및 기타 번역 후 변형은 조직 및 세포 타입 중 상이하므로, 환자 특이적 줄기 세포주는 내생적으로 생물제제를 발현하는 세포-타입 중 또는 조직으로부터 분리된 성인 또는 체세포로부터 제조될 수 있다. 문헌[Rajpert-De Meyts E. et al. "Changes in the profile of simple mucin-type O-glycans and polypeptide GalNAc-transferases in human testis and testicular neoplasms are associated with germ cell maturation and tumour differentiation", Virchows Arch, Vol. 451:805-814 (2007) 참조. Pevalova M., et al. "post-translational modifications of tau protein". Bratisl Lek Listy,107:346-353(2006)] 참조.
불멸성 spPSC 및 ePSC의 제조
본 발명의 바람직한 실시형태에서, spPSC 및 ePSC는 폴리오마바이러스 시미안 바이러스 40(SV40)을 사용하여 통상적으로 큰 T-항원의 비-바이러스 유도를 통해 불멸화(immortalizing)되는 것이 바람직하다. 문헌[Rose, M.R. et al., (1983). "Expression of the Large T Protein of Polyoma Virus Promotes the Establishment in Culture of "Normal" Rodent Fibroblast Cell Lines". PNAS 80: 4354-4358 (1983); 및 Hofmann, M.C. et al. "immortalization of germ cells and somatic testicular cells using the SV40 large T antigen" Experimental Cell Research, 201:417-435 (1992)] 참조.
합성적으로 생산된, 바람직하게는 유도 다능성 줄기 세포 또는 보다 바람직하게는 분리된 내생 다능성 줄기 세포를 사용한 실시형태의 개요
바람직한 실시형태에서:
1. 내생 다능성 줄기 세포를 분리하고;
2. ePSC를 불멸화시키며;
3. 불멸화 ePSC는 비-바이러스성 기술을 사용해서 원하는 유전자, 바이러스 또는 핵산으로 형질주입시키고;
4. 다음에 형질주입된 불멸화 ePSC는 보다 효과적인 방식으로 핵산 생성물을 발현시킬 수 있도록 생식 세포주, 바람직하게는 난소 세포로 분화되도록 유도되며;
5. 분화된 세포는 현재 원하는 핵산을 함유하는 이전에 형질주입된 벡터로부터 원하는 핵산 생성물을 발현시키도록 유도될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서:
1. 체세포를 분리하며;
2. 상기 체세포를 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 세포)로 형질전환시키고;
3. iPS 세포를 불멸화시키며;
4. 불멸화된 iPS 세포는 원하는 유전자, 바이러스 또는 핵산을 함유하는 벡터로 형질주입되고;
5. 다음에 형질주입된 불멸화 iPS 세포는 보다 효과적인 방식으로 단백질을 발현시킬 수 있도록 체세포로 재-분화되도록 유도되며;
6. 재-분화된 세포는 현재 원하는 유전자를 함유하는 이전에 형질주입된 벡터로부터 원하는 단백질을 발현시키도록 유도될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서:
1. 내생 다능성 줄기 세포를 분리하고;
2. 불멸의 ePSC는 비-바이러스성 기술을 사용해서 원하는 유전자, 바이러스 또는 핵산으로 형질주입되며;
3. 다음에 형질주입된 불멸화 ePSC는 보다 효과적인 방식으로 핵산 생성물을 발현시킬 수 있도록 생식 세포주, 바람직하게는 난소 세포로 분화되도록 유도되고;
4. 분화된 세포는 현재 원하는 핵산을 함유하는 이전에 형질주입된 벡터로부터 원하는 핵산 생성물을 발현시키도록 유도될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태를 성취하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
대안적인 실시형태에서, ePSC 또는 spPSC는 불멸화되기 이전에 원하는 핵산을 함유하는 벡터로 형질주입될 수 있다. Du C. et al. "Generation of Variable and Fixed Length siRNA from a novel siRNA Expression Vector", Biomed. & Biophys. Res. Comm. 345:99-105 (2006); York Zhu, 미국 특허 제12/313,554호(2008년 11월 21일 출원) 참조. 또는, ePSC 또는 spPSC 세포는 재-분화하도록 유도될 수 있으며, 다음에 세포는 불멸화될 수 있고, 불멸화 및 재-분화된 세포는 원하는 핵산을 함유하는 벡터로 형질주입될 수 있다. 또 다른 가능성은 ePSC 또는 spPSC 세포는 재분화되도록 유도될 수 있고, 재-분화된 세포는 원하는 핵산으로 형질주입될 수 있으며, 재-분화 및 형질주입된 세포는 불멸화될 수 있다.
상기 ePSC 또는 spPSC 세포는 재-분화 이전에 배지, 바람직하게는 자가 조직 인간 혈청 및 줄기 세포 인자 또는 백혈병 억제 인자를 함유하는 세포 배양 배지 중에서 늘어나는 것이 바람직하다.
생성되는 폴리펩타이드 또는 단백질은 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 특히 원하는 것은 에리트로포이에틴, 인자 VIII, 인자 IX, 트롬빈, 항체 또는 항체 분획물, 알파 인터페론, 인터페론 알파 2A 및 2B(미국 특허 제4,810,645호 및 제4,874,702호 참조), 베타 인터페론(미국 특허 제4,738,931호 참조), 컨센서스 인터페론(미국 특허 제5,661,009호 참조), 성장 호르몬, 항혈우병 인자, G-CSF, GM-CSF, 가용성 수용체, 융합 단백질, 예컨대 면역글로불린(Ig)의 불변부에 대한 가용성 수용체의 융합(미국 특허 제5,155,027호 참조), TGF-β, 뼈 형태형성 단백질(bone morphogenic protein: BMP), TGFα, 인터류킨 2, β-글루코세레브로시다제 또는 이의 유사체, 알파1-프로테아제 억제제, 피브린, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자, 이미글루세라제(imiglucerase), 아갈시다제 베타(agalsidase beta), 라로니다제(laronidase), 알글루코시다제 알파(alglucosidase alpha), 알글루코시다제 알파(alglucosidase alpha), 티로트로핀 알파(thyrotropin alpha) 및 티모신 알파(thymosin alpha)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 또는 단백질이다.
임의의 항체 또는 항체 분획물은 본 발명의 공정으로 제조할 수 있다. 물론 원하는 것은 표적에 결합하는 항체 또는 항체 분획물이며, 상기 표적은 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 분자, 성장 인자 수용체, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 분자, 인터류킨 1, 인터류킨 4, 인터류킨 6, 인터류킨 11, 인터류킨 12, 감마 인터페론, 핵 인자 카파-B 리간드(RANKL)의 수용체 활성제 및 Blys로 이루어진 군으로부터 선택된다.
줄기 세포 분화 유도
원하는 단백질의 제조를 최적화하기 위해서 형질주입된 ePSC 또는 spPSC 세포는 체세포로 분화하도록 유도되어야 한다.
대안적인 실시형태에서, ePSC 또는 spPSC 세포군은 늘릴 수 있으며, 분화를 유도할 수 있고, 분화된 세포는 다음에 원하는 핵산으로 형질주입될 수 있다. 줄기 세포는 배양물로의 다양한 성장 인자 첨가(Blood., 85:2414-2421, 1995), 산소 분압과 같은 배양 조건의 조작에 의해 배양 배지 중의 영양분의 변경(BMC Cell Biol., 11:94, 2010), 또는 온도, 또는 세포 생물학 및 세포 분화 분야의 것으로 알려져 있는 기타 방법 중 다양한 세포외 매트릭스 상에서의 줄기 세포의 배양에 의해서 배양물 중 체세포 타입으로 분화하도록 유도될 수 있다. 예를 들면, 레티노산, TGF-β, 뼈 형태형성 단백질(BMP), 아스코르브산 및 베타-글리세로인산은 조골세포의 생성을 야기하며; 인도메타신, IBMX(3-아이소부틸-1-메틸잔틴), 인슐린 및 트라이요오드티로닌(T3)은 지방세포의 생성을 야기하고; αFGF, βFGF, 비타민 D3, TNF-β 및 레티노산은 미오사이트의 생성을 야기한다(CARDIAC-DERIVED STEM CELLS. (WO/1999/049015) March 1998). 생식 세포는 단층 배양, 배양체(EBs)의 형성, BMP4-생성 세포와의 공동응집 및 고환 또는 난소 세포-조정 배지의 사용 또는 재조합 인간 뼈 형태 형성 단백질(BMPs)로의 EB 형성을 이용해서 다능성 줄기 세포로부터 생성된다(PLoS One. 2009;4(4):e5338). 생식 세포 마커 유전자는 ZNF 도메인의 PR 도메인 함유 1(PR domain containing 14: PRDM 1, 또는 BLIMP1이라고도 알려져 있음), PR 도메인 함유 14(PRDM14), 단백질 알기닌 메틸트랜스퍼라제 5(protein arginine methyltransferase 5: PRMT5), DPPA3, IFITM3, GDF3, c-KIT, 케모카인(C-X-C 부분) 수용체 4(CXCR4), NANOS1-3, DAZL, VASA, PIWI 패밀리 유전자(PIWIL1 및 PIWIL2, 인간에서는 각각 HIWI 및 HILI로 알려져 있음), Mut-L 호모로그-1(Mut-L Homologue-1: MLH1), 합사기 복합체 단백질 1(synaptonemal complex protein 1: SCP1) 및 SCP3을 포함한다. 수득된 생식 세포주는 유전적으로 변형되어 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포 및 기타 현재 사용되는 제조 세포주의 사용과 유사하게 원하는 유전자 또는 단백질 생성물을 발현시킬 수 있다. 다양한 단계로 줄기 세포로부터 다양한 체세포주를 수득하기 위한 분화 전략은 줄기 세포 생물학 분야에 잘 알려져 있다.
고 수준의 생물제제 생성과 관련되는 것으로 알려져 있는 전사 인자는 환자 특이적 세포주로부터 발현 수준을 최적화하기 위해 원하는 유전자와 함께 형질주입될 수 있다. 예를 들면, 높은 수준의 Pit-1 발현으로 성장 호르몬 발현을 차단 또는 방지하면서 세포 타입에서 높은 프로락틴 발현을 유도할 수 있다(Genes Dev, 3:946-958, 1989).
단일클론 항체 생성은 Sino Biological Inc, morphogenics 또는 기타 표준 생물공학 방법으로 개발된 것과 같은 시스템을 사용해서 유전자 코돈을 최적화함으로써 강화시킬 수 있다.
본 발명에 따르면 재조합 폴리펩타이드 및 단백질은 ePSC 및 spPSC에서 생성하며, 상기 spPSC 및 ePSC는 특이적 번식 또는 인종 군에 의해 생성되는 폴리펩타이드 또는 단백질 중의 여러 글라이코실화 패턴을 동물의 특이적 종의 몇몇 번식 또는 인종 군이 가진다는 사실 때문에 특이적 번식 또는 인종 군의 세포로부터 생성 또는 분리된다. 본 발명에 따르면 인종 군은 흔히 공동의 혈통 또는 내혼(예를 들면 아슈케나지 유대인인 특이적 군 내의 결혼 실행)으로 이루어진 공동의 유산을 통해 서로 구성원 동일성을 갖는 사람의 군이다. 일반적으로, 높게 생물학적으로 저절로 지속되는 군이다. 폴리펩타이드 및 단백질의 상이한 글라이코실화 패턴을 가질 수 있는 인종 군의 예가 Levinson, David(1998), Ethnic Groups Worldwide: A Ready Reference Handbook, Greenwood Publishing Group에 예시되어 있다.
줄기 세포 요법의 방법 및 시스템
본 발명은 또한 기형종 형성 없이 줄기 세포 요법을 촉진시키기 위한 방법을 포함한다. 본 발명은 더 나은 치료적 이점에 있어서 상기에서 규정한 합성 생성 다능성 줄기 세포(spPSC)라고 하는 여기서의 재프로그래밍된 체세포의 관찰된 "메모리"를 유리하게 이용하는 방법을 나타낸다. 재프로그래밍 이전에 원래의 세포 타입으로 재분화되는 것이 바람직한 spPSC의 메모리는 대표적인 약물에 있어서의 spPSC의 안전성 및 치료적 유용성을 강화시키는 수단을 제공한다.
일반적인 단계
본 발명은 하기에 관한 것이다:
1. 재발생을 원하는 체세포 특히 원하는 체세포의 분리;
2. 체세포의 상기에서 기재한 것과 같은 합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포(spPSC), 특히 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로의 형질전환;
3. 체세포의 고유의 후생적 메모리를 유지하는 spPSC 군의 확대;
4. 배양으로 spPSC의 원래 체세포 타입을 갖는 재-분화된 체세포로의 재-분화;
5. 재-분화된 체세포의 목적하는 세포-타입의 몸체 영역으로의 투여 또는 운반.
최근 몇몇 연구에서는 spPSC 세포가 이들 원래의 세포 타입, 즉 (Stem Cells. 28: 1981-1991, 2010), (Nature, 467(7313):285-90, 2010), (Nat Biotechnol, 28,: 848-855, 2010) 및 (Mol Hum Reprod.,16:880-885, 2010)용 "메모리"를 보유하는 것으로 입증하였다. 상기는 spPSC가 이들 원래의 세포 타입으로 대부분 손쉽게 때때로 자발적으로 재-분화되는 것을 선호한다는 것으로 해석된다. 과학자 및 임상 과학자들은 임상 치료, 약물 발견, 질병 모형화 또는 독성 스크리닝(Curr Opin Biotechnol., 20: 516-521, 2009)에 유용할 수 있는 다능성 줄기 세포를 생성시키는 터널 결정에 초점을 맞추어, 다능성 줄기 세포의 메모리 측면이 안전한 인간 치료를 제공한다는 치료 이점을 놓치고 있다. 실제로, 재프로그래밍된 다능성 줄기 세포의 "메모리" 측면에 관한 결과를 공개한 과학자들은 spPSC 세포의 이러한 특성으로 치료가 가능하며, 이러한 세포의 치료 유용성을 제공하기 위한 이러한 특성의 현저함을 놓치고 있는 한계에 초점을 맞추었다.
spPSC의 메모리 측면은 다중 원점의 체세포로부터 관찰되었다. 예를 들면, 주요한 태아 레티날 상피세포는 OCT4, SOX2, LIN28 및 Nanog의 렌티바이러스 발현을 사용해서 iPSC로 재프로그래밍되며(Stem Cells. 28: 1981-1991, 2010), 다능성의 표준 테스트를 통과한다: 이들은 기형종을 형성하고, 다능성 줄기 세포 마커를 발현한다. 성장 배지로부터 기본 FGF를 제거한 후, 레티날 spPSC 세포주 중 몇몇은 레티날 상피 세포 계보로 다시 재-분화한다. 자발적으로 인간 태아 레티날 상피 spPSC 세포로부터 분화되는 세포 중 대략 60%가 레티날 상피 세포이며, spPSC, 인간 태아 레티날 상피 폐 섬유아 세포, 인간 포피 섬유아세포, 또는 인간 ESC 세포로부터의 5 내지 16% 레티날 상피 세포와 비교할 만하다. 그러나, 인간 태아 레티날 상피 세포로부터의 3개의 spPSC 세포 중 하나는 레티날 상피 세포로 전화 분화되지 않는다. 김 등(Nature, 467(7313):285-90, 2010)은 골수 전구 세포 및 피부 섬유아세포를 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc의 레트로바이러스 도입으로 늙은 쥐로부터 재프로그래핑하였다. 이들의 수득된 줄기 세포주 모두는 인간 샘플에 통상적으로 적용되는 기준을 사용해서 다능성을 입증했다. 이후의 이들 재프로그래밍된 다능성 줄기 세포의 분화로 섬유아세포 공급원보다 더 손쉽게 조혈 공급원이 조혈 계통으로 재-분화되며, 유사하게 섬유아세포 공급원은 조혈 공급원보다 더 손쉽게 간엽성 계통으로 재-분화된다는 것을 입증하였다. 상기 저자들은 또한 이러한 이들의 원래의 체세포 계통으로의 바람직한 재-분화 경향이 조혈 계통으로의 분화와 이후의 다능성 재프로그래밍 및 이후의 추가적인 분화의 또 다른 라운드에 의해 부분적으로 극복될 수 있다고 보여주었다. 예를 들면, 신경 전구 세포로부터 유래된 재프로그래밍된 세포는 조혈 계통으로 분화된 다음에 신경 세포로 분화되고, 재프로그래밍된 이후에 조혈 세포로 분화되는 신경 전구체보다 더 높은 조혈 군집 형성을 나타낸다.
원래의 세포 타입으로의 재-분화되는 재프로그래밍된 세포에 대한 선호의 유사한 관찰은 인간 태아 신경 전구 세포의 비-바이러스성 재프로그래밍을 사용해서 확인하였다(PLoS One., 4: e7076-e7088, 2009). 수득된 재프로그래밍된 세포는 몇몇 다능성 마커, 즉 세 개의 배엽 모두 용의 마커를 발현하며, 배양으로 배양체, 및 그러나 유전자 칩 분석(GeneChip analysis)을 이용하여 기형종을 형성할 수 있으며, 저자들은 재프로그래밍된 신경 전구 세포가 신경 줄기 세포 유전자의 몇몇 발현을 보유한다는 것을 입증했다. Polo 등(Nat Biotechnol, 28,: 848-855, 2010)은 마우스 꼬리 끝 유래 섬유아세포, 비장 B 세포, 골수 과립구 및 골격 근육 전구체에서 다능성 재프로그래밍 세포를 유도하였다. 자율적 분화 연구로 비장 B 세포 및 골수 과립구 재프로그래밍 spPSC 세포가 섬유아세포 또는 골격 근육 유래 spPSC 세포보다 더 효과적으로 조혈 전구체를 생기도록 한다. 흥미로운 것은 이러한 다양한 spPSC 세포주의 연속 계대는 16 계대까지 유전적 및 메틸화 차이의 폐기를 유도하며, 세포는 또한 계대 4에서의 초기 결과와 대조적으로 균등한 분화 효율을 입증한다. 흥미롭게도, 이러한 차등 분화 가능성 현상은 재프로그래밍된 체세포에 제한되지 않으며, 또한 특정 세포 계통으로 분화하기 위한 다른 유전적 서명 및 자발적 선호를 갖는 것으로 확인된 배아 줄기 세포주에서 관찰되었다(Nat Biotechnol., 26: 313-315, 2008)(Hum Reprod Update., 13: 103-120, 2007)(Dev Biol., 307:446-459, 2007)(BMC Cell Biol, 10:44, 2009).
줄기 세포는 이들의 표면 상에서 발현되는 특정 항원에 의해서 특성화 및 분리될 수 있다. 다능성 줄기 세포는 다른 방법 중에서도 단계-특이적 태아 항원(SSEA), 전사 인자 Oct4 및 Nanog 및 기타 마커의 발현으로 특성화될 수 있다. 태아 줄기 세포 유래 섬유아세포 및 성인 섬유아세포 및 기타 세포는 태아 줄기 세포와의 융합(Cell 126: 652-655, 2006 및 Stem Cell Rev, 2: 331-340, 2006), 레트로바이러스 형질주입 기술을 사용한 4개의 유전자의 첨가(Cell 126: 663-676, 2006), 단일 카세트 또는 비스스트로닉 렌티바이러스 형질주입 방법(Stem Cells 27: 543-549, 2009 및 Stem Cells 27: 1042-1049, 2009) 및 다능성 요구 전사 인자의 내생 자극(Stem Cells 27: 3053-3062, 2009)에 의해서 다능성 상태로 재프로그래밍된다. 다능성의 유도는 또한 게놈의 메틸화 또는 폴리아데닐화 상태의 변형(PLoS One 4: e8419, 2009), 마이크로RNAs(Dev Biol. 344: 16-25, 2010), 요구되는 전사 인자의 작은 분자 활성제, 후생적 재프로그래밍(Regen Med. 2: 795-816, 2007), 단백질계 재프로그래밍(Blood 116: 386-395, 2010), 배양으로 다능성 세포로부터의 배양 현탁액 또는 세포 추출물의 첨가, 다능성 유전자의 비활성화를 위한 유전자 돌연변이의 화학적 또는 방사선 또는 기타 수단, 또는 내생 다능성 상태를 유도 또는 유지하는 성장 인자 또는 사이토카인 또는 세포 시그널링 부분의 첨가에 의해서도 획득될 수 있다. 세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하기 위한 레트로바이러스의 사용은 면역 결핍에 있어서의 유전자 치료를 생각나게 하는 위험이 존재한다. 삭제 기술, 예컨대 Cre-lox 또는 피기백 트랜스포슨 방법을 사용해서 성공적인 재프로그래밍 후 레트로바이러스를 제거한다(Curr Opin Biotechnol. 20: 516-521, 2009). 클로닝 기술, 예컨대 SCNT 및 단위 생식(PGA)(Cell Reprogram. 12: 105-113, 2010)을 또한 사용해서 재프로그래밍된 다능성 줄기 세포를 발생시킨다(Nature 450:497-502, 2007).
현저한 양의 (경제적, 지적 및 노동적) 자원이 다능성 줄기 세포의 다양한 공급원을 발견하기 위해 투자되며, 특히 이러한 줄기 세포가 인간 재생 의약 치료에 적당할 것이라는 기대로 투자된다. 불행하게도, 성인 VSEL(Stem Cell Rev 4:89-99, 2008)를 제외하고, 현재까지 분리된 다능성 줄기 세포 모두가 좌절되었으며, 이는 기형종 형성, 종양 형성 및 심지어 신생물 특성의 문제 때문이다. 따라서, 이러한 다능성 줄기 세포에 있어서의 몇몇 유용성은 지난 15년 동안 이루어져 온 경제적, 지적 및 노동적 투자의 이점을 취하기 위해서 필요하다. 줄기 세포는 세포 생물학 또는 세포 분화 분야에서 잘 알려져 있는 기타 방법 중에서도 배양물로의 다양한 성장 인자의 첨가(Blood 85:2414-2421, 1995), 배양 배지 중의 영양소 변경, 산소 분압(BMC Cell Biol. 11:94, 2010) 또는 온도와 같은 배양 조건의 조작, 또는 다양한 세포외 매트릭스 상에서의 줄기 세포의 배양으로 체세포 타입으로 분화시키기 위해 유도할 수 있다. 예를 들면, 레티노산, FGF-β, 골형성 단백질(BMP), 아스코르브산 및 베타-글리세로포스페이트는 조골세포 생성을 유도하며; 인도메타신, IBMX(3-아이소부틸-1-메틸잔틴), 인슐린 및 트라이요오드사이로닌(T3)은 지방세포를 유도하고; aFGF, bFGF, 비타민 D3, TNF-β 및 레티노산은 근세포의 생성을 유도한다(WO/1999/049015) March 1998). 다양한 단계에서 줄기 세포로부터 다양한 체세포를 수득하기 위한 분화 전략은 줄기 세포 생물학 분야에서 잘 알려져 있다.
줄기 세포 치료는 조사 중에 있으며, 여러 인간 질환의 치료에 완전하다. NIH 웹사이트 www.clinicaltrials.gov에 포함되어 있는 임상 시험 정보는 3000개 이상의 줄기 세포 조사가 나열되어 있다. 평가 하의 질환으로는 하기를 포함한다: 혈액암, 백혈병, 림프종, 암, 골석화증, 무형성 빈혈 및 혈구감소증, 겸상 적혈구병 및 지중해 빈혈, 윤부 줄기 세포 결핍, 유방암, 급성 심근경색, 관질환, 말초동맥질환, 심부전, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 뇌졸증, 척수외상, 신경아 세포종, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 홍반성 낭창, 만성 상처 치유, 화상, 골절 치유, 연골 치료, CNS 종양, 골관절염, 신장부전증, 파킨슨씨 병, 골수종, 당뇨발궤양, 간 및 쓸개즙 간경변증, 확장성 심근병증, 빈혈증, 색소성 망막염, 크론병, 당뇨병성신경병증, 비만세포증, 난소암, 간질, 중증 근무력증, 자가면역 질환, 만성육아종증, 골괴사, 간부전, PMD 질환, 지질영양 이상증, 탈수질환, 연골 결손, 망막병, 홍반성 신장염, 알츠하이머 질환, 외상성 뇌 손상, 육종, 근염, 고혈당증, 황반변성, 궤양성 대장염, 근변성 및 기타.
줄기 세포는 당업계에서 실행되는 것으로 알려져 있는 다양한 마커를 사용해서 분리할 수 있다. 예를 들면, 통상의 줄기 세포 마커 목록은 http://stemcells.nih.gov/info/scireport/appendixe.asp#eii에서 확인할 수 있다. 신경 줄기 세포는 CD133를 사용해서 분리할 수 있으며; 간엽줄기세포 및 전구 세포는 골형성 단백질 수용체(BMPR)를 사용해서 분리할 수 있고; 조혈 줄기 세포는 CD34를 사용해서 분리할 수 있으며; 간엽줄기세포는 CD34+Sca1+Lin-마커의 조합으로 분리할 수 있고; 조혈 및 간엽줄기세포는 ckit, Stro1 또는 Thy1를 사용해서 분리할 수 있으며; 신경 및 췌장 전구체는 네스틴으로 분리할 수 있고; 외배엽, 신경 및 췌장 전구체는 비멘틴으로 분리할 수 있으며; 및 기타 마커에 의해 분리할 수 있다.
본 발명은 추가로 재생 의약용 체세포를 안전하게 재프로그래밍하고, 재-분화하는 방법을 제공한다. 유용한 체세포는 완전하게 분화된 체세포, 전구 세포 또는 보다 원시적 줄기 세포를 포함할 수 있다. 재생 요법을 요하는 기관에 따라서 보다 원시적인 줄기 세포는 장기 천자, 생체 검사, 찰과 또는 수술적 접근에 의해 보다 또는 덜 접근가능하게 될 수 있다. 보다 원시적인 줄기 세포를 사용하는 것이 이러한 줄기 세포로의 접근이 가능한 경우에 바람직하다. 완전하게 분화된 체세포보다 더 바람직하지만 전구 세포를 사용하는 것은 덜 바람직하다.
치료를 위해 표적화된 특수한 장기로부터의 체세포의 분리, 이러한 체세포의 재프로그래밍, spPSC의 내인성 "메모리"를 유지하도록 하는 배양에서의 짧은 기간의 팽창, 이후의 치료적 응용이 따르는 원래 세포 타입으로 재-분화시키는 것으로서 다능성 줄기 세포 방법을 사용할 수 있어 암 또는 기형종 형성의 위험을 줄여 환자를 치료할 수 있다.
재프로그래밍된 체세포는 1 내지 12 계대, 가장 바람직하게는 4 계대에서 사용할 수 있다. 재프로그래밍된 체세포는 표준 세포 생물학 및 분화 기술에 따라서 목적하는 재생성용 세포 타입으로 분화될 수 있다. 수득된 치료적 세포는 카테터, 예컨대 NOGAStar 또는 MyoStar 주입 카테터 또는 기타 승인된 카테터 주입 장치를 포함할 수 있는 표준 주입 기술을 사용해서 정맥 주사, 동맥 주사, 근육 주사 또는 기타 주입 방법으로 투여할 수 있다. 대안적으로, 치료적 세포는 최소 침습 또는 보다 침습적인 수술 방법에 의해서 표적 조직에 투여될 수 있다. 치료적 세포는 0 내지 15%, 보다 바람직하게는 5%의 자기유래의 인간 혈청 알부민을 함유하는 완충 조성물로 투여할 수 있다. 중추신경계 질환을 치료를 위해 치료적 세포는 자기 유래의 뇌척수액을 사용해서 완충되는 것이 바람직할 것이다. 치료적 세포는 또한 스캐폴드, 예컨대 콜라겐, 피브리노겐 또는 기타 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스들의 조합을 사용해서, 또는 스레드, 예컨대 알지네이트 또는 기타 표준 방법을 사용해서 만든 것을 사용해서 투여하여 제 위치에 세포를 유지하고, 재생 수선을 요구하는 장기와의 접촉을 유지할 수 있다.
바람직하게 최소 500개의 치료적 세포가 투여될 것이며, 통상적인 치료 요법에서는 15 밀리언 내지 500 밀리언 개의 세포를 이용할 것이다. 보다 바람직하게, 15 밀리언 내지 100 밀리언의 세포를 최적의 이점을 위해 투여할 것이다.
신경 질환, 예컨대 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 뇌졸증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 마비 및 기타 중추 신경계(CNS) 질환을 위한 세포 치료에 있어서의 예로서는 공개된 고정 내시경을 사용해서 비점막을 분리하는 것이 바람직할 것이다(J Spinal Cord Med. 29:191-203, 2006). 신경 줄기 및 전구 세포 또는 후각 초성 세포는 재생 의약 분야에서 실행하고 있는 것으로서 잘 알려져 있는 방법에 따라서 비점막으로부터 분리된다. 대안적으로, 신경능 줄기 세포는 인간 모낭으로부터 분리될 수 있다(Folia Biol . 56:149-157, 2010). 가장 바람직하게는, 신경 줄기 세포는 규정 인자의 첨가에 의해 재프로그래밍되며, 계대 4에 있어서 팽창 및 계대배양되고, 규정된 인자의 첨가에 의한 특수한 중추 신경계 세포로의 재-분화가 이루어지며, 이후에 재생 요법을 위해 환자로 투여된다.
본 발명은 재생 의학에 있어서의 체세포로 안전하게 재프로그래밍되고, 재-분화되는 방법을 제공한다. 유용한 체세포는 완전하게 분화된 체세포, 전구 세포 또는 보다 원시적인 줄기 세포를 포함할 수 있다. 재생 요법을 요하는 장기에 따라서, 보다 원시적인 줄기 세포가 장기 천자, 생체 검사, 찰과 또는 수술적 접근에 의해서 보다 또는 덜 접근가능할 수 있다. 보다 원시적인 줄기 세포의 사용은 이러한 줄기 세포로의 접근이 가능한 경우에 바람직하다. 완전하게 분화된 체세포보다는 더 바람직하지만 전구 세포를 사용하는 것은 덜 바람직하다.
척추 손상 치료에 있어서, 비점막은 견고한 내시경에 의해서 제거되며, 신경 줄기 세포는 Reynolds 및 Weiss(Science, 255:1707-1710, 1992)에 의해서 1992년에 최초로 기술된 신경구 분석(neurosphere assay)을 이용해 분리하며, 표피 성장 인자(EGF) 및 염기성 섬유모세포 생장 인자(bFGF)는 비점막 배양 수일 동안 생존하는 세포에 첨가해서 신경구 성장을 자극하고, 신경 줄기 세포는 배양 7 내지 10일 내에 회수할 수 있다. 수득된 신경 줄기 세포는 5 내지 7일 동안 히그로마이신 선별로 OCT4 및 NANOG의 운반을 위한 에피솜 벡터를 첨가해서 재프로그래밍한다. 세포는 4 계대까지 팽창 및 계대배양하여 집적화가 이루어지지 않는 콜로니를 수득한 다음에 자가 뇌척수액 또는 규정된 인자를 사용해서 비점막 및 줄기-유사 신경 전구 세포로 분화한다. 손상된 척수는 표준 정중선 절개 및 뒤쪽 정중선 척수절개술을 사용하는 수술 중에 노출되며, 반흔 조직은 허용가능한 만큼 제거되고, 치료적 세포는 자가 뇌척수액 중에서 완충되며, 생물작용 스캐폴드 상에 접종된 후에 손상된 척수로 직접 적용된다.
실시예
실시예 1
재조합 단백질 생성을 위해 환자 특이적으로 합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포의 유전적 변형
합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포(spPSC), 예컨대 SCNT 또는 PGA 또는 ANT-OAR 또는 iPSC는 유전적 변형을 위해 환자로부터 사용하여 생물제제 생성을 유도하였다. SCNT 유래 줄기 세포는 제조되는 제핵 난모세포로 환자의 세포의 핵을 이동시켜 제조한다. ANT-OAR 유래 줄기 세포는 제핵형 제조 난모세포로 변형된 핵을 이동시키기 전에 환자 핵 DNA를 유전적으로 변형시켜 제조한다. iPSC 유래 줄기 세포는 유전적 변형, 다능성 전사 인자의 활성제, 후생유전 변형 또는 상기에서 기재한 당업계에 알려져 있는 기타 방법을 사용하여 환자 세포를 재프로그래밍하여 제조한다. 수득된 환자 특이적 합성적으로 생산된 줄기 세포주는 생물제제 제조를 위한 이후의 유전자 변형을 위한 작업용 은행 및 마스터 세포 은행으로서 "기탁"하였다.
생식 세포는 단층 배양, 배양체(EBs)의 형성, BMP4-생성 세포와의 공동-응집, 고환 또는 난소 세포-조건 배지의 사용 또는 재조합 인간 골 형성 단백질(BMPs)에 의한 EB 형성을 이용해 다능성 줄기 세포로부터 생성된다. 생식 세포는 ZNF 도메인과 함께 PR 도메인 함유 1(PRDM 1, BLIMP1이라고도 함), PR 도메인 함유 14(PRDM14), 단백질 알기닌 메틸트랜스퍼라제 5(PRMT5), DPPA3, IFITM3, GDF3, c-KIT, 케모카인(C-X-C 부분) 수용체 4(CXCR4), NANOS1-3, DAZL, VASA, PIWI 패밀리 유전자(PIWIL1 및 PIWIL2, 인간에서는 각각 HIWI 및 HILI로 알려져 있음), Mut-L 동족체-1(MLH1), 합사기 복합체 단백질 1(SCP1) 및 SCP3을 포함할 수 있는 마커 유전자의 발현으로 확인된다. 수득된 생식 세포는 재조합 인자 VIII의 제조용으로 통상 사용되는 방법에 따라 원하는 유전자, 예컨대 인자 VIII로 형질주입된다.
실시예 2
재조합 인슐린 제조용의 환자 특이적인 합성적으로 생선된 다능성 줄기 세포의 유전적 변형
합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포(spPSC), 예컨대 SCNT 또는 PGA 또는 ANT-OAR 또는 iPSC 유래 줄기 세포는 유전적 변형을 위해 환자로부터 사용하여 생물제제 생성을 유도하였다. SCNT 유래 줄기 세포는 제조되는 제핵 난모세포로 환자의 세포의 핵을 이동시켜 제조한다. ANT-OAR 유래 줄기 세포는 제핵형 제조 난모세포로 변형된 핵을 이동시키기 전에 환자 핵 DNA를 유전적으로 변형시켜 제조한다. iPSC 유래 줄기 세포는 유전적 변형, 다능성 전사 인자의 활성제, 후생유전 변형 또는 상기에서 기재한 당업계에 알려져 있는 기타 방법을 사용하여 환자 세포를 재프로그래밍하여 제조한다. 수득된 환자 특이적인 합성적으로 생산된 줄기 세포주는 생물제제 제조를 위한 이후의 유전자 변형을 위한 작업용 은행 및 마스터 세포 은행으로서 "기탁"한다.
환자 특이적 줄기 세포 중의 인슐린 전구체의 발현은 사카로마이에스 세레비시애(S. cerevisiae)에서 인슐린 제조용으로 통상 사용되는 방법에 따라 실시하며[Kjeldsen T., et al., "Engineering-enhanced protein secretory expression in yeast with application to insulin", 21, May 2002, J Biol Chem., 277:18245-18248(May 2002); Zhang B., et al., "Intracellular retention of newly synthesized insulin in yeast is caused by endoproteolytic processing in the Golgi complex"., J Cell Biol., 153:1187-1198(June 2001); 및 Kristensen C. et al., "Alanine scanning mutagenesis of insulin"., J Biol Chem., 272:12978-12983(May 1997)] 또는 E. Coli [Son YJ., et al. "Effects of beta-mercaptoethanol and hydrogen peroxide on enzymatic conversion of human proinsulin to insulin.", J. Microbiol Biotechnol., 18:983-989 (May 2008)], 이어서 표준 방법에 따라 처리 및 정제한다. 환자 특이적 세포주를 발현시키는 인슐린 전구체는 이후의 인슐린 제조용으로 마스터 세포 은행 및 작업용 세포 은행으로서 "기탁"한다.
실시예 3
환자 특이적 합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포의 유전적 변형을 이용한 인슐린 제조용 베타-세포의 생성
인슐린 제조를 위해 체세포를 환자로부터 유전적 변형용으로 사용해서 spPSC를 제조하고, 이들을 사용해서 생물제제 제조를 유도하였다. spPSC 유래 줄기 세포는 유전적 변형, 다능성 전사 인자의 활성제, 후생유전 변형 또는 상기에서 기재한 당업계에 알려져 있는 기타 방법을 사용하여 환자 세포를 재프로그래밍하여 제조한다. 수득된 환자 특이적 합성적으로 생산된 줄기 세포주는 생물제제 제조를 위해 이후의 유전자 변형을 위한 작업용 은행 및 마스터 세포 은행으로서 "기탁"한다. 또는 내생 다능성 줄기 세포(ePSC)는 상기 기재된 수법에 따라 단리되어 기탁될 수 있다.
환자 특이적 줄기 세포 중의 인슐린 전구체의 발현은 상기에서 기재한 것과 같이 사카로마이에스 세레비시애(S. cerevisiae) 또는 이콜라이(E. Coli)에서의 인슐린 제조용으로 통상 사용되는 방법에 따라 실행한다. 적당한 인슐린 유전자 구조물로의 유전자 형질주입 이후에 세포는 베타 세포 생물학 컨소시엄, http://www.protocolonline.org/prot/Cell_Biology/Stem_Cells/Differentiation_of_Stem_Cell/index.html. Protocol Online.[Online][Cited: Dec 19, 2010.]의 [Shi, Y., et. Al. "Inducing embryonic stem cells to differentiate into pancreatic beta cells by a novel three-step approach with activin A and all-trans retinoic acid". Stem Cells., 23:656-662(2005); 또는 Tateishi, K., et. Al. "Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts", J Biol Chem., 283:31601-31607(2008)]에서 확인되는 표준 프로토콜에 따라 베타-세포 계통으로 분화된다.
수득된 발현 생물제제 생성물은 이후에 표준 방법에 따라 처리 및 정제된다. 수득된 환자 특이적 합성적으로 생산된 줄기 세포주는 생물제제 제조를 위해 이후의 유전자 변형을 위한 작업용 은행 및 마스터 세포 은행으로서 "기탁"한다.
대안적으로, 수득된 환자 특이적 줄기 세포는 위에 언급된 베타 세포 생물학 컨소시엄의 위에 언급된 Shi et. Al. 또는 위에 언급된 Tateishi et. Al.에서 확인되는 표준 프로토콜을 따라 베타-세포 계통으로 분화된다. 분화되면 환자 특이적 줄기 세포 중의 인슐린 전구체의 발현을 상기에서 기재한 것과 같이 사카로마이에스 세레비시애(S. cerevisiae) 또는 이콜라이(E. Coli) 중에서 인슐린 제조용으로 통상 사용되는 방법에 따라 실행한다. 수득된 생물제제 생성물은 다음에 표준 방법으로 처리 및 정제한다.
실시예 4
생물제제 항체 요법을 제조하기 위한 형질전환 및 재프로그래밍용 성인 (체세포) 항체 제조 세포의 분리
항체 제조 B 세포는 치료적 항체 생물제제를 제조하기 위해 환자 특이적 제조 세포주를 생성할 목적으로 말초혈, 골수 및 기타 손쉽게 접근가능한 조혈 세포 공급원으로부터 분리한다. B 세포는 CD19 발현을 기본으로 하는 이용가능한 키트를 사용해서 분리한다(StemCell Technologies). 희석 제한 또는 세포 선별 방법을 적용해서 가장 높은 수준의 면역글로불린(Ig)을 제조하는 세포를 선별할 수 있다. 짧은 팽창 후에 클론 고 Ig 제조 세포는 표준 재프로그래밍 기술을 사용해서 다능성 또는 전구체 상태로 재프로그래밍한다. 수득된 환자 특이적 줄기 세포는 표준 생물학적 기술 및 방법을 사용해서 목적하는 항체 유전자 구조물로 형질도입한다. 수득된 발현 항체 치료제제는 항체 치료제제용 물질 조성물의 소유자에 의해서 내밀히 유지되거나 또는 공개적으로 이용가능한 당업의 생물공학적 방법의 상태에 따라 처리 및 정제된다. 목적하는 정제 항체 생성물을 수득하기 위한 방법에는 이온 교환 크로마토그래피가 포함된다.
실시예 5
체세포 항체 제조 세포로의 재분화로 생물제제 항체 치료제제를 생성하기 위한 재프로그래밍 및 형질주입용 성인 (체세포) 항체 제조 세포의 분리
항체 제조 B 세포를 치료적 항체 생물제제를 제조하기 위해 환자 특이적 제조 세포주를 생성할 목적으로 말초혈, 골수 및 기타 손쉽게 접근가능한 조혈 세포 공급원으로부터 분리한다. 희석 제한 또는 세포 선별 방법을 적용해서 가장 높은 수준의 면역글로불린(Ig)을 제조하는 세포를 선별할 수 있다. 짧은 팽창 후에 클론 고 Ig 제조 세포는 표준 재프로그래밍 기술을 사용해서 다능성 또는 전구체 상태로 재프로그래밍한다. 수득된 환자 특이적 줄기 세포는 표준 생물학적 기술 및 방법을 사용해서 목적하는 항체 유전자 구조물로 형질도입한다. 유전자 변형 이후에 다능성 환자 특이적 세포주는 CD40L, BAFF, 톨-유사 수용체 활성화(toll-like receptor activation: TLR)[Hayashi E.A., et al. "TLR4 promotes B cell maturation: independence and cooperation with B lymphocyte-activating factor", J Immunol., 184:4662-4672 (2010)] 또는 B-세포 수용체(B-cell receptor: BCR) 활성화 및 노치-수용체 리간드 패밀리 활성화와 같은 당업계에 공지된 기타 B 세포 돌연변이 인자[Palanichamy A. et al. "Novel human transitional B cell populations revealed by B cell depletion therapy". 10, May 2009, J Immunol., Vol. 182, pp. 5982-5993 (2009); Thomas M.D. et al., "Regulation of peripheral B cell maturation", Cell Immunol., 239:92-102 (2006)]의 존재 하에 배양으로 성숙한 항체 제조 B 세포로 분화한다.
치료적 항체의 역가 및 친화도는 Li J., et al., "Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology", Proc Natl Acad Sci, 103:3557-3562(2006)에 기재된 형태학적 기술과 같은 방법을 사용해서 개선시킬 수 있다. 수득된 발현 항체 치료제제는 항체 치료제제용 물질 조성물의 소유자에 의해 내밀히 유지되거나 또는 공개적으로 이용가능한 당업계에 생물공학적 방법의 상태에 따라 처리 및 정제한다.
대안적으로, 다능성 환자 특이적 세포주는 CD40L, BAFF, 톨-유사 수용체 활성화(TLR)(Hayashi, et al. 상기 참조) 또는 B-세포 수용체(BCR) 활성화 및 노치-수용체 리간드 패밀리 활성화와 같이 당업계에 공지된 기타 B 세포 돌연변이 인자(Palanichamy A. et al. 상기 참조 및 Thomas, M.D. et al. 상기 참조)의 존재 하에 배양으로 성숙한 항체 제조 B 세포로 분화된다. 치료적 항체의 역가 및 친화도는 기재된 것과 같은(Li J., et al. 참조) 형태학적 기술과 같은 방법을 사용해서 개선시킬 수 있다.
수득된 환자 특이적 항체 제조 세포는 표준 기술 및 방법을 사용해서 목적하는 항체 유전자 구조물로 형질도입된다. 수득된 발현 항체 치료제제는 항체 치료제제용 물질 조성물의 소유자에 의해 내밀히 유지되거나 또는 공개적으로 이용가능한 당업계에 생물공학적 방법의 상태에 따라 처리 및 정제한다.
실시예 6
고 활성 ADCC 항체의 생성을 위한 환자 특이적 세포주의 생성
면역글로불린의 N-아세틸글루코사민(GlcNac) 번역 후 변형은 항체-의존적 세포-변형 독성(ADCC)에 중요하며, 비-퓨코실화 GlcNac 잔기는 Fc 감마 수용체에 있어서 매우 높은 친화도를 갖는다[Mori K., et al., "Non-fucosylated therapeutic antibodies: the next generation of therapeutic antibodies", Cytotechnology., 55:109-114(2007)].
따라서, 높은 수준의 ADCC를 갖는 항체 치료제제를 목적하는 경우에 적당한 수준에서 GlcNac를 이동시키고, 비-퓨코실화된 GlcNac를 남길 수 있는 환자 특이적 세포주가 바람직하다. 암종 세포는 GMD를 높은 수준으로 발현시키는 것으로 알려져 있으므로, 암 줄기 세포 및 다능성 세포는 유사한 유전자 표시를 가지므로, 다능성 세포는 또한 번역 후 GlcNac 부착에 원인이 될 수 있는 효소인 GMD를 높은 수준으로 발현시키는 것으로 기대할 수도 있다. 정상 조직 중 결장 및 췌장은 GMD를 가장 높은 수준으로 발현한다. 항체를 퓨코실화시키는 효소에 원인이 될 수 있는 FUT8의 부족은 리툭시맙(Rituximab) 또는 허셉틴(Herceptin)과 같은 효험에 있어서 ADCC 활성에 의존하는 치료적 항체 생성용의 환자 특이적 줄기 세포주로 바람직할 수 있다. 예를 들면, 쥐 하이브리도마 YB2/0 세포에서 생성되는 단클론 항체는 CHO 세포를 사용해서 생성되는 동일한 단클론 항체보다 50배 높은 ADCC 활성을 갖는다. B 세포 림프종뿐만 아니라 지방조직-유래 줄기 세포 및 생식 세포주는 FUT8의 평균 수준보다 더 높게 발현하며, 반면에 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell: HSC), 미성숙 B 세포, 정상 골격 근육은 평균 FUT8보다 낮게 발현한다.
조혈 줄기 세포는 줄기 세포 동원 작용제로의 전처리 또는 이러한 전처리 없이 골수 흡입 또는 전혈 성분 헌혈로부터의 표준 방법에 따라 분리한다. 분리된 HSC는 이후에 이전에 목적하는 바에 따라서 다능성으로 재프로그래밍된다. 수득된 환자 특이적 줄기 세포는 표준 기술 및 방법을 사용해서 목적하는 항체 유전자 구조물로 형질도입된다. 유전자 형질주입 후, 다능성 환자 특이적 세포주는 CD40L, BAFF, 톨-유사 수용체 활성화(TLR)(Hayashi E.A., et al., 상기 참조) 또는 B-세포 수용체(BCR) 활성화 및 노치-수용체 리간드 패밀리 활성화와 같은 당업계에 공지된 기타 B 세포 성숙 인자(Palanichamy A. et al. 상기 참조 및 Thomas, M.D. et al. 상기 참조)의 존재 하에 배양으로 성숙한 항체 제조 B 세포로 분화된다. 치료적 항체의 역가 및 친화도는 기재한 바와 같은 형태학적 기술과 같은 방법을 사용해서 개선시킬 수 있다(Li J., et al. 참조). 수득된 발현 항체 치료제제는 항체 치료제제용 물질 조성물의 소유자에 의해 내밀히 유지되거나 또는 공개적으로 이용가능한 당업계에 생물공학적 방법의 상태에 따라 처리 및 정제한다.
대안적으로 항체 제조 B 세포는 치료적 항체 생물제제를 제조하기 위해 환자 특이적 제조 세포주를 생성할 목적으로 말초혈, 골수 및 기타 손쉽게 접근가능한 조혈 세포 공급원으로부터 분리한다. 희석 제한 또는 세포 선별 방법을 적용해서 가장 높은 수준의 면역글로불린(Ig)을 제조하는 세포를 선별할 수 있다. 짧은 팽창 후에 클론 고 Ig 제조 세포는 표준 재프로그래밍 기술을 사용해서 다능성 또는 전구체 상태로 재프로그래밍한다. 수득된 환자 특이적 줄기 세포는 표준 생물학적 기술 및 방법을 사용해서 목적하는 항체 유전자 구조물로 형질도입한다. 유전자 변형 후에 다능성 환자 특이적 세포주는 푸코스가 적거나 또는 부족한 치료 항체의 제조용 HSC, 미성숙 B 세포 또는 골격 근육 세포로 분화한다.
본 발명의 바람직한 실시형태는 상기에서 기재한 것과 같이 기재하고 기술한 반면에, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는 바람직한 실시형태의 상기 개시에 의해 제한되지 않는다. 대신에, 본 발명은 하기의 청구의 범위를 참조해서 완전하게 결정해야 할 것이다.
[도면의 간단한 설명]
본 발명의 바람직하고 대안적인 실시예는 하기 도면을 참조하여 하기에 보다 상세하게 기재한다:
도 1은 전혈의 구배 원심분리로부터 얻어진 층을 나타낸 도면이다.
Claims (10)
- 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질이 줄기 세포에 의해 발현되는 조건 하에서 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산으로 합성적으로 생산된 다능성 줄기 세포(synthetically produced pluripotent stem cell: spPSC) 또는 내생 다능성 줄기 세포(endogenous pluripotent stem cell: ePSC)를 형질주입시키는(transfecting) 단계를 포함하되, 상기 spPSC 또는 ePSC는 동물의 세포로부터 생성 또는 분리되는 것인, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 에리트로포이에틴, 인자 VIII, 인자 IX, 트롬빈, 항체 또는 항체 분획물, 알파 인터페론, 인터페론 알파 2A 및 2B, 베타 인터페론, 성장 호르몬, 항혈우병 인자, G-CSF, GM-CSF, 가용성 수용체, TGF-β, 뼈 형태형성 단백질(bone morphogenic protein: BMP), TGFα, 인터류킨 2, β-글루코세레브로시다제 또는 이의 유사체, 알파1-프로테아제 억제제, 피브린, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자, 이미글루세라제(imiglucerase), 아갈시다제 베타(agalsidase beta), 라로니다제(laronidase), 글루코시다제 알파(glucosidase alpha), 티로트로핀 알파(thyrotropin alpha) 및 티모신 알파(thymosin alpha)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 분획물은 표적에 결합하며, 상기 표적은 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 분자, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 성장 인자 수용체, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 분자, 인터류킨 1, 인터류킨 4, 인터류킨 6, 인터류킨 11, 인터류킨 12, 감마 인터페론, 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성제(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand: RANKL) 및 Blys로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 수용체는 TNFα, TNFβ 및 Blys로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적에 결합하는 것인, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 형질주입된 spPSC를 불멸화시키는(immortalizing) 단계를 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
- (내용 없음)
- 제5항에 있어서, 상기 형질주입되고 불멸화된 spPSC의 분화를 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 형질주입된 spPSC 또는 ePSC의 분화를 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 형질주입되고 분화된 세포를 불멸화시키는 단계를 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 spPSC는 유도된 다능성 줄기 세포, 체세포 핵 이식에 의해 생성된 다능성 줄기 세포(SCNT 다능성 줄기 세포), 변형된 핵 이식, 난모 세포 지원 재프로그래밍(altered nuclear transfer, oocyte assisted reprogramming)에 의해 생성된 다능성 줄기 세포(ANT-OAR 다능성 줄기 세포) 및 단위 생식에 의해 생성된 다능성 줄기 세포(PGA 다능성)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
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Free format text: TRIAL NUMBER: 2017101005147; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20171023 Effective date: 20190930 |