PT764213E - Vectores que codificam genomas de aav recombinates - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "VECTORES QUE CODIFICAM GENOMAS DE AAV RECOMBINANTES"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente aos materiais e métodos do vírus adeno-associado (AAV) os quais são úteis para libertarem o ADN às células. Mais particularmente, a invenção refere-se a ! genomas de AAV recombinantes (rAAV), a métodos para acondicionamento de genomas de rAAV, a linhas de células estáveis que produzem os rAAV e a métodos para libertar os genes de i interesse às células utilizando os rAAV. i

ANTECEDENTES 0 vírus adeno-associado (AAV) é um parvovirus de replicação deficiente, cujo genoma de ADN de cordão singular é aproximadamente de 4,7 Kb em comprimento' incluindo as repetições de terminal invertido do nucleótido 145' (ITRs). Ver a Figura 1. A sequência de nucleótido do genoma AAV2 é apresentada em Srivastava et al., J. Virol.r 45: 555-564 (1983). As sequências de replicação cis direccionadas à replicação. do ADN virai (ori) , a encapsidação/acondicionamento (pkg) e a,integração do cromossoma da célula hospedeira (int) estão contidos dentro dos ITRs. Três promotores de AAV, p5, pl9, e p40 (denominados pelas suas posições relativas no mapa), dirigem a expressão das duas estruturas de leitura abertas internas de AAV de que codificam as proteínas rep e cap. Os dois promotores rep (p5 e pl9) , ligados com a união 2 diferencial do intrão de AAV singular (nos nucleótidos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52, e rep 40) do gene rep. As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas as quais são em última instância responsáveis pela replicação do genoma virai. 0 gene cap é expresso do promotor p40 e ele codifica as três proteínas cápside VP1, VP2, e VP3. Os locais de partida de translação alternativos e de não-consenso são responsáveis pela produção.das três proteínas cápside relacionadas. Um local de poliadenilação de consenso singular está localizado na posição 95 do mapa do genoma de AAV. O ciclo de vida e a genética dos AAV são revistos em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

Quando o AAV infecta uma célula humana, o genoma virai integra no cromossoma 19 resultando na infecção latente da célula. A produção do vírus contagioso não ocorre a menos que a célula seja infectada com um vírus auxiliar (por exemplo, um adenovirus ou um herpesvirus) . No caso do adenovirus, os genes EIA, E1B, E2A, E4 e VA fornecem funções auxiliares. Depois da infecção com um vírus auxiliar, o provírus AAV é resgatado e amplificado, e tanto o AAV como o adenovirus são produzidos. O AAV possui características únicas que o tornam atractivo como um vector para a libertação de ADN exterior às células. A infecção de AAV das células em cultura é não-citopática, e a infecção natural de seres humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, o AAV infecta a maior parte (se não todas) as células mamíferas permitindo a possibilidade de visar muitos tecidos diferentes in vivo. Kotin et al., EMBO J., 11(13): 5071-5078 (1992) relatam que o genoma de ADN do AAV sofre a integração visada no cromossoma 19 depois da infecção. A replicação do ADN virai não é 3 necessária para a integração, e assim o vírus auxiliar não é necessário para este processo. 0 genoma proviral AAV é contagioso como o ADN clonado em plasmídeos os quais fazem a construção de genomas recombinantes praticáveis. Além disso, devido aos sinais que dirigem a replicação do AAV, a encapsidação e a integração do genoma estão contidos dentro dos ITRs do genoma AAV, o interior aproximadamente de 4,3 Kbs do genoma (proteínas de cápside estruturais e de replicação de codificação, rep-cap) pode ser assim substituído com o ADN exterior tal como uma cassete de gene que contém um promotor, um ADN de interesse e um sinal de poliadenílação. Uma outra característica significativa do AAV é que ele é um vírus extremamente estável e forte. Ele resiste facilmente às condições usadas para inactivar o adenovirus (S6' a 65 °C durante várias horas), tornando a preservação a frio das vacinas baseadas em rAAV menos critica. Finalmente, as células infectadas por AAV não são resistentes à superinfecção. Vários grupos estudaram a utilização potencial do AAV no tratamento de estados de doença. 0 Tratado de Cooperação, do Pedido Internacional da Patente (PCT) No. WO 91/18088 publicado a 28 de Novembro de 1991 e o artigo de jornal correspondente por Chatterjee et al., Science, 258: 1485-1488 (1992) descrevem a transdução da resistência intracelular ao vírus-1 de imunodeficiência humano (.HIV-1) em linhas de células hematopoiéticas e não hematopoiéticas humanas utilizando um rAAV que codifica de um ARN de anti-sentido específico para a sequência TAR de VIH-1 e o sinal de poliadenílação. 0 artigo de revista de Yu etal., Gene Therapy, 1: 13-26 (1994) acerca da terapia genética para a infecção de HIV-1 enumera o AAV como um vector de terapia genético possível para as células estaminais hematopoiéticas. A utilização de vectores de rAAV como um sistema de libertação para a integração estável e a 4 expressão de genes (em particular o gene regulador transmembrânico da fibrose cística) em células epiteliais respiratórias culturadas é descrita no Pedido Internacional PCT No. WO 93/24641 publicado a 9 de Dezembro de 1993 e no artigo de jornal correspondente por Flotte et al., Am. J. Respír. Cell Mol. Biol., 7: 349-356 (1992). A terapia genética . que implica o rAAV no tratamento de hemoglobinopatias e outras doenças hematopoiéticas e em conferir resistência a multi-fármacos específicos para as células é proposta nò Pedido Internacional PCT No. WO 93/09239 publicado a 13 de Maio de 1993; Muro-Cacho et al., J. Immunol., 11: 231-237 (1992); LaFace et al., Virol., 162: 483-486 (1988); e Dixit et al., Gene, 104: 253-257 (1991). A libertação do gene terapêutico em células de glioma é proposta em Tenenbaum et al., Gene Therapy, 1 (Suplemento 1): Ξ80 (1994).

Um conceito relativamente novo no campo da transferência genética é o de que a imunização pode ser efectuada pelo produto de um gene transferido. Várias tentativas na "imunização genética" têm sido relatadas incluindo a injecção de ADN directa das sequências de nucleoproteína da influenza A [Ulmer et al., Science, 259: 1475-1749 (1993)], a imunização acelerada biolistica com sequências de hormonas de crescimento humanas [Tang et al., Nature, 356: 152-154 (1992) e a infecção com vectores retrovirais que contêm as sequências de proteína de envelope do HIV-1 gp 160 [Warner et al., AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, 7(8): 645-65.5 (1991)]. Enquanto estas abordagens parecem ser praticáveis, a inoculação de ADN directa pode não fornecer respostas imunes de longa duração e sérias questões de segurança rodeiam .a utilização de vectores retrovirais; A utilização de AAV para a imunização genética é uma abordagem nova que não está sujeita a esses problemas. 5

Um obstáculo à utilização de AAV para a libertação de ADN é a falta de esquemas altamente eficientes para a encapsidação de genomas recombinantes. Vários métodos têm sido descritos para a encapsidação de genomas de rAAV para gerar partículas virais recombinantes. Estes métodos necessitam todos de funções auxiliares de adenovirus e de- rep-cap in trans AAV. 0 mais simples envolve a transfecção do genoma de rAAV em células hospedeiras seguido pela co-infecção com o AAV de tipo selvagem e o adenovirus. Ver, por exemplo, a patente norte-americana No. 4,797,368 emitida a 10 de Janeiro de 1989 de Cárter and Tratschin, e o artigo de jornal correspondente por Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5 (11): 3251-3260 (1985) . Este método, no entanto, leva a níveis ínaceitavelmente altos de AAV de tipo selvagem. Uma outra estratégia geral implica o fornecimento' das funções de AAV em um segundo plasmídeo (separado do genoma de rAAV) que é co-transfectado com, o plasmídeo de rAAV. Ver, por exemplo, Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 81: 6466-6470 (1984) e Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 8 (10).: 3988-3996 (1988). Se nenhuma sobreposição de sequência existir entre os dois plasmídeos, então a produção de AAV de tipo selvagem é evitada como é descrito em Samulski et al., J. Virol., 63(9): 3822-3828 (1989). Esta estratégia é inerentemente ineficiente, no entanto, devido à exigência de três eventos de transferência de ADN separados (a co-transfecção de dois plasmídeos bem como a infecção com adenovirus) para gerar partículas de rAAV. A,grande produção em escala de rAAV por este método é cara e está sujeita a variações na eficiência da transfecção.

Vincent et al., Vaccines, 90: 353-359 (1990) relatam que uma linha de célula que exprime as funções de rep-cap pode ser usada para acondicionamento do rAAV. Tais métodos ainda necessitam da 6 transfecçao do genoma de rAAV na linha de célula e a titulação resultante de rAAV relatada foi muito baixa (só aproximadamente 103 unidades infecciosas/ml), Dutton, Genetic Engineering News, 14 (1): 1 e 14-15 (15 de Janeiro de 1994) relata que a Dra. Jane Lebkowski de Ciências Imunes Aplicadas fabrica rAAV utilizando plasmídeos de vírus AAV quimérico/Epstein-Barr que contêm um genoma de . AAV recombinante, o gene de resistência da higromicina e o fragmento EBV ori P e gene EBNA. Os plasmídeos são transfectados em células para gerarem linhas de células estáveis. As linhas de células estáveis são depois transfectadas com as funções rep-cap de AAV de tipo selvagem e infectadas com adenovirus para produzir o rAAV. Como o método de Vincent, o método de acondicionamento de lebkowski necessita tanto que a transfecção como eventos de infecção para gerar as partículas de rAAV.

Existe assim uma necessidade na, técnica para métodos eficientes de acondicionamento de genomas de rAAV e para rAAVs úteis específicos como vectores para a libertação de ADN às células.

Num primeiro aspecto da presente invenção é fornecido um vector de ADN como determinado na reivindicação' 4.

Num segundo aspecto da presente .invenção é fornecida uma célula hospedeira mamífera estavelmente transfectada com o vector de ADN da presente invenção. A presente invenção fornece vectores de ADN que compreendem genomas de AAV recombinantes (rAAV) úteis para a libertação de ADN de não-AAV de interesse a uma célula. Os genomas de rAAV para utilização com os vectores da invenção incluem os iTRs de AAV que flanqueiam as sequências de ADN de não-AAV de interesse e as' sequências a que 7 faltam rep-cap que codificam as proteínas, de rep-cap funcionais. Como é desejável exprimir o ADN de interesse como um polipéptido na célula, o genoma de rAAV também inclui um promotor (constitutivo ou regulável) e um sinal de poliadenilação operacionalmente ligado ao ADN de interesse para formar uma cassete de gene. A cassete genética também pode incluir sequências de intrão para facilitar o processamento do transcripto de ARN em células hospedeiras mamíferas. Uma cassete .genética presentementé preferida inclui os segmentos de ADN seguintes: (1) o primeiro ..promotor imediato cítomegalovírus· (CMV) , (2) o intrão de β-globina.do coelho, (3) os genes de rev e. envelope (gpl60) do vírus de imunodeficiência símio (SIV) ou de imunodeficiência humano (VIH) e (4) o sinal de poliadenilação de β-globina do coelho. Os genomas de rAAV da invenção são reunidos em vectores' úteis para- a transfecção de células a.s quais são pemissíveis para a ínfecção com um vírus auxiliar de AAV (por exemplo, o adenovirus, o adenovirus delectado El ou o herpesvírus). Um vector da invenção o qual contém um genoma de rAAV incluindo a cassete genética preferida precedente, um gene de resistência à neomicina, e sequências rep-cap de AAV de tipo selvagem foi depositado em células DH5 de E. coll com a American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mariland 20852,' em 1 de Junho de 1994 e foi determinado com o No. 69637 de Acesso .ATCC.

Os genomas. de rAAV preferidos incluem os genes de envelope e de SIV rev (gpl60) , ou os genes de envelope e de rev do VIH, como o(s) ADN(s) de não-AAV de interesse. Também preferidos são os genomas de rAAV os quais contêm sequências as quais codificam proteínas que pode melhorar perturbações neurológicas tais como: as sequências que codificam o factor de crescimento do nervo (NGF), o factor neurotrófico ciliar (CNTF), o factor neurotrófico ' derivado do 3 cérebro (BDNF) , as neurotrofinas 3 e 4/5 (NT-3 e 4/5) , o factor neurotrófico derivado da célula glial (G.DNF) , factores de crescimento de transformação (TGF) , e o factor de crescimento do fibroblasto básico' e acidico (a e bFGF) ; as sequências que codificam a hidroxila.se da tírosina (TH) e a decarboxilase de amino ácido aromático (AADC); as sequências que codificam a dismutase de superóxido (SOD 1 ou 2), a catalase e a peroxidase de glutatioha; as sequências que codificam os interferões, as linfocinas, as citoquinas e os seus antagonistas tal, como o factor de necrose de tumor (TNF), os anticorpos' específicos CD4, e os receptores de TNF ou de CD4; as sequências que codificam as isoformas do. receptor GABA, a decarboxilase do ácido glutâmico da enzima que sintetiza o GABA (GAD), os canais de potássio dependentes de cálcio ou os canais de potássio sensíveis a ATP; e as sequências que codificam a quinase da timidína. Também contemplados péla invenção são os genomas de rAAV incluindo as sequências de globina, oncogene, ras, e p53. Os genomas de AAV recombinantes incluindo os nucleótidos de anti-sentido que afectam a expressão de certos genes tais como os genes supressores da morte da célula (por exemplo, bcl-2) ou que afectam a expressão de receptores de amino ácidos excitativos (por exemplo, os receptores de glutamato e de NMDA) também são contemplados para modular as perturbações neurológicas.

Outras sequências de ADN de interesse contempladas pela invenção incluem sequências de agentes patogénicos incluindo: VIH-1 e VIH-2 (sequências diferentes das sequências de rev e gpl60); o vírus linfotrófico-T humano dos tipos I e II; o vírus sincicial respiratório; o vírus de parainfluenza dos tipos 1-4; o vírus do sarampo; o vírus da papeira; o vírus da rubéola; os vírus da poliomielite dos tipos 1-3; o vírus de influenza dos tipos A, B e C; o vírus de influenza não-humano (aviária, equina, suína); o 9 vírus da hepatite dos tipos A, B, C, D e E;. o rotavírus; o vírus de norwalk; o citomegalovíros; o vírus de Epstein-Barr; o vírus simples do herpes dos tipos 1 e 2; o vírus da varicela-zoster; o vírus do herpes humano do tipo 6; o hantavírus; o adenovírus; a pneumonia clamídia; a, clamídía tracomatosa; a pneumonia de micoplasma; a tuberculose de micobactéria; a micobactéria atípica; o vírus da leucemia felino; o vírus da imunodeficiência felino; o vírus de imunodeficiência bovino; o vírus da anemia contagioso equino; o vírus da encefa.lite da artrite dos caprinos; e o vírus de visna.

As linhas de células da invenção, são transfectadas de maneira estável tanto com os genomas de rAAV da invenção como com as cópias dos genes rep e cap de AAV.· As linhas de células preferidas são as linhas de células mamíferas, por exemplo, as linhas de células de HeLa. A infecção das linhas de células da invenção com o vírus auxiliar, de AAV resulta no acondicionamento . dos genomas de rAAV como partículas de rAAV contagiosas. Uma linha de célula estável presentemente preferida é a linha de célula Á64 HeLa a qual foi depositada com o ATCC em 1 de Junho de 1994 e designada com o No. de Acesso ATCC CRL 11639. A presente invenção também fornece linhas de células estáveis que contêm as sequências rep e cap de AAV mas nenhum genoma de rAAV.

Os AAV recombinantes gerados pelo processo de acondicionamento precedente são úteis para libertar o ADN de interesse às células. Os rAAV in vivo, podem ser usados como vectores de libertação de anti-sentido, vectores de terapia genéticos ou vectores de vacinas (isto é, imunização genética). 0 tratamento de condições de doença incluindo, por exemplo, a SIDA; perturbações neurológicas incluindo cancro, a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, a doença de 10

Huntington, e as doenças autoimunes tais como a esclerose múltipla, trauma, depressão, enxaqueca, dor ou perturbações de epilepsia; a leucemia da célula T. adulta; . paraparesia espasmódica . tropical; infecções do tracto respiratório superiores e inferiores; sarampo; parotidite; rubéola; poliomielite; influenza; hepatite; diarreia; infecções de citomegalovírus sistémicas; doença semelhante a uma mononucleose; infecções de virus Epstein-Barr sistémicas; mononucleose contagiosa clássica; infecções de herpes sistémico simples dos tipos 1 e 2; infecções. de herpes genital simples; varicela; roséola; a doença febril devido ao virus de herpes humano de tipo 6; pneumonia e síndroma, dé aflição respiratória no adulto; infecções; conjuntivite; infecções do tracto genital; tuberculose pulmonar e extrapulmonar; ' infecções sistémicas .devido a micobactérias atípicas; leucemia felina;. . VIH. felino; VIH bovino; anemia contagiosa, equina; artrite e encefalite nas cabras; e a pneumonia e a encefalite nas' ovelhas são contempladas pela invenção. Como um vector de vacina, o rAAV liberta um gene de interesse a uma célula e o gene é expresso na célula. Os vectores de vacina podem ser usados para gerar a imunidade intracelular se o produto genético for citoplásmico (por exemplo, se o produto genético prevenir a integração ou a replicação de um virus). Alternativamente, a imunidade extracelular/sistémica pode ser gerada se o produto genético for expresso na superfície da célula ou for segregado.

Um hospedeiro (especialmente um hospedeiro humano) pode ser imunizado contra um polipéptido. de um organismo que causa doença por se administrar ao hospedeiro uma quantidade que induz imunidade de um rAAV da invenção o qual codifica o polipéptido. A imunização de um hospedeiro humano com um rAAV da invenção implica a administração pela inoculação de uma dose que induz a imunidade do 11 vírus pela via parentérica(por exemplo, por injecção intravenosa, intramuscular ou subcutânea), por aplicação de ventosas na superfície, ou por inoculação em uma cavidade do corpo. Tipicamente, uma ou várias inoculações de entre aproximadamente 1000 e aproximadamente 10,000,000 de unidades infecciosas cada um, ..como medido em linhas de células de primatas humanos ou não humanos susceptíveis, são suficientes para efectuar a imunização de um hospedeiro humano. O vírus a ser usado ' como uma vacina pode ser utilizado na forma líquida ou congelada a vácuo (em combinação com um ou vários conservantes convenientes e/ou agentes protectores' para proteger o vírus durante o processo de congelação a vácuo). Para a terapia genética (por exemplo, de perturbações neurológicas as quais podem ser melhoradas por um produto genético específico) uma dose terapeuticamente eficaz de um rAAV da invenção o qual codifica o polipèptido é administrada a um hospedeiro em necessidade de tal tratamento. A utilização do rAAV da invenção na fabricação de um medicamento para aí induzir a imunidade, ou fornecer a terapia genética a um hospedeiro é contemplada.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

Outros aspectos numerosos e vantagens- da presente invenção serão evidentes depois da consideração da sua descrição detalhada seguinte, sendo feita referência ao desenho em que: A Figura 1 é uma representação esquemática do genoma de AAV; A Figura 2 é uma representação esquemática do plasmídeo psub201 que foi a fonte das sequências de AAV2 utilizadas nos exemplos; A Figura 3A até 3B é um diagrama de fluxo da construção de um genoma de rAAV da invenção no vector pAAV/DMV/SIVrev-gpl60; A Figura 4 é um diagrama de fluxo da construção do vector 12 pAAV/CMV/SIVrev-gpl60/neo/rep-cap útil para . gerar uma linha de célula estável que produz o rAAV da invenção;' e A Figura 5 é uma representação esquemática de' um método para' o acondicionamento de rAAV utilizando as linhas de células hospedeiras estáveis da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO DESENHO A presente invenção é ilustrada pelos exemplos seguintes que se relacionam com a produção e a utilização de rAAV da invenção. 0 exemplo 1 descreve a construção de um vector incluindo um genoma de rAAV que contém os genes SIV rev e envelope (gpl60) , enquanto, que o Exemplo 2 descreve a construção de um vector incluindo os genes de AAV rep-cap e um .gene de resistência à neòmicina. 0 exemplo 3 determina a construção de um vector á ser usado para gerar linhas de células estáveis que produzem o rAAV dos vectores descritos nos Exemplos 1 e 2. A geração de linhas de células estáveis que produzem o rAAV que codifica as proteínas de SIV rev e gpl6Õ é detalhada no Exemplo 4. O exemplo 5' determina um procedimento preferido para purificar o rAAV de linhas de células estáveis da invenção. O exemplo 6 descreve a geração de linhas de células estáveis que expressam os geries de AAV rèp-cap. 0 exemplo 7 apresenta resultados de da infecção de várias células e linhas de células mamíferas com o rAAV descrito no Exemplo 4 o qual mostra que a proteína gplõOé expressa nas células infectadas. 0 exemplo 8 descreve a geração de linhas de células estáveis que produzem um rAAV que inclui o gene de β-galactosidase como um ADN de interesse e é útil como um vírus de controlo positivo para a expressão de um ADN de interesse em células ou tecidos alvo. 0 exemplo 9 apresenta os resultados de experiências nas quais o rAAV da invenção foi usado para expressar um ADN de interesse ín vivo. 0 exemplo 10 13 descreve métodos contemplados pela invenção para aumentar a titulação de rAAV produzido por linhas de células estáveis.

Exemplo 1

Um vector incluindo· um genoma de rAAV que contém uma cassete genética SIV rev e envelope (gplSO) foi construído a partir de um plasmídeo existente designado psub201 [Samulski et al., supra].. A Figura 2 é um diagrama de- plasmídeo psub2 01 em que os locais de endonuclease de restrição são mostrados e abreviados como se segue: P, PvuII.; X, Xbal; B,'· BamHI; H, HindIII;· e N, Nael. 0 plasmídeo contém um genoma de AAV2 de tipo selvagem modificado clonado entre os locais de restrição PvuII. A sequência de ADN dô genoma de AAV2 da de tipo selvagem é estabelecida em· SEQ ID NO: 1. A sequência AAV2 foi modificada para incluir locais de restrição' convenientes. Especificamente, dois locais de restrição Xbal foram acrescentados através da adição de ligação nas. posições 190 e 4484 da sequência. Estes locais são internos às;repetições terminais invertidas 191 bp (ITRs) os quais incluem os ITRs 145 bp do genoma de AAV. A inserção destes locais permite a remoção completa do fragmento de 4,3 Kb interno que contém os genes de AAV rep-cap depois da digestão Xbal do plasmídeo. Na Figura 2, os ITRs 191 bp· são indicados por setas invertidas. O vector do genoma de rAAV. da invenção (pAAV/CMV/SIVrev-gpl60) foi gerado em vários passos.

Primeiro, o plasmídeo psub201 foi digerido com Xbal e o fragmento do vector 4 Kb aproximadamente incluindo os ITRs de AAV foi isolado. Uma cassete de expressão genética CMV foi depois inserida entre os ITRs de AAV por ligação de extremidade plana. A cassete de 14 expressão CMV foi derivada como um fragmento de ADN de Xbal-AfIlide 1,8 Kb do vector pCMV-NEO-BAM descrito em Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13-25 (1989).. Antes da' ligação,, as extremidades moleculares foram enchidas utilizando o fragmento Klenow do ADN da polimerase I. A cassete de expressão CMV conteve uma porção de. 750 bp do primeiro promotor imediato CMV, seguida por uma sequência de sinal de poliadenilação 360 bp\ e o, intrão 640 bp a qual. foi derivada do gene de β-globina do coelho. Entre as sequências de intrão e de poli A estavam dois locais declonagem: um único.local de BamHI e dois locais de restrição de EcoRI de fIanqueamento.. O vector resultante foi denominado pAAV'/CMV. Ver a Figura 3A. em que. os locais de -clivagem da endonuclea.se de restrição são mostrados e abreviados como se segue: B, BamHI; E, EcoRI; N, Nael; e P, PvuII.

Em segundo lugar, o vector de expressão pAAV/CMV foi linearizado no local de BamHI e as extremidades coesivas foram embotadas com Klenow. Um fragmento subgenómico 2,7 SIV Kb gerado por PÇR, que contém.as sequências rev e envelope (gpl60) [SEQ ID NO. 2, Hirsch et al.f Nature, 339: 389-392 (1989)] foi clonado no local de BamHI terminado embotado. 0 vector de genoma de AAV recombinante resultante, pAAV/CMV/SIVrev-gpl60, é de 8,53 Kb em comprimento. Ver a Figura 3B em que' os locais de clivagem da endonuclease de restrição são mostrados e abreviados como se segue: N, Nael e P, PvuII. 0 vector contém.os segmentos de ADN seguintes em sequência: (1) um.ITR de AAV, (2) o promotor de CMV, (3) o intrão de β-globina do coelho, (4). as sequências de SIV rev e envelope, (5) o sinal de poliadenilação da β-globina do coelho, e (6) um ITR de AAV. Em ensaios de transfecção transitórios das células 293 humanas, este vector resultou em elevados níveis de expressão da proteína SIV gpl6Q como determinado pox ensaios de radioimunoprecipitação utilizando soros policlonais de macacos infectados com SIV. 15 A invenção contempla especificamente a substituição por técnicas de ADN recombinante padrão das sequências seguintes para as sequências de SIV rev/envelope no vector precedente: As sequências de VIH-1 rev/envelope (a sequência de VIH-Imn rev/envelope é estabelecida em SEQ ID NO. 3); factor de crescimento de nervos. [Levi-Montalcini, Science, 237: 1154-1162 (1987)]; factor neurotrófico ciliar [Manthorpe et al., começando na página 135 em Nerve Growth Factors, Wiley and Sons (1989)]; factor. neurotrófico derivado da célula glial [Lin et al., Science, 260: 1130-1132 (1993) ]; factores de crescimento de transformação [Puolakkainen et al., começando na página 359 em Neurotrophic Factors, Academic Press (1993)]; factores de crescimento acídicos e de fibroblasto básico [Unsicker et al., começando na página 313 em Neurotrophic Factors, Academic Press (1993)]; neurotrofina 3 [Maisonpierre et al.., Genomics, 10: 558-568 (1991)]; factor neurotrófico derivado do cérebro [Maisonpierre, supra]; neurotrofina 4/5 [Berkemeier et al., Neuron, 7: 857-866 (1991) ]; hidroxilase de tirosina [Grima et al. , Nature, 326: 707-711 (1987)]; e decarboxilase de amino ácido, aromático [Sumi et al., J. Neurochemistry, 55: 1075-1078 (1990)].

Exemplo 2

Um designado plasmídeo' pSV40/neo/rep-cap o qual contém os genes de. AAV de rep-cap e um gene de resistência à neomicina foi construído para ser usado em conjunção com o vector do genoma de rAAV descrito no Exemplo 1 para gerar uma linha de célula estável que produz o rAAV.

Um designado plasmídeo pAAV/SVneo (Samulski et al., supra) foi digerido com EcoRI e BamHI para libertar uma inserção de 2,7 Kb incluindo uma porção 421 bp do primeiro promotor SV40, 1,4 Kb de um

I gene de resistência à neomicina, e um fragmento de ADN 852 bp que contém o local pequeno'de união t SV4 0 e o sinal de poliadenilação SV40. Esta inserção libertada foi 'clonada nos locais de BamHI e EcoRI de' pBLUESCRIPT KS+ (Stratagene, La Jolla, Califórnia) para gerar 5,66 Kb do plasmídeo pSY40/nèo. Depois, aproximadamente 4,3 Kb do fragmento de ADN que contém os genes de AAV rep-cap, derivados da'' digestão de psub201 com Xbal como descrito no Exemplo 1, foi ligado no local de restrição Xbal de pSV40/neo para criar o plasmídeo pSV40/neo/rèp-cap .(aproximadamente 10 Kb). A construção deste plasmídeo está detalhada na primeira metade da Figura 4 em que os locais de endonuclease de restrição são mostrados e abreviados como se segue: B, BamHI; E, EcoRI; HindIII; P, PvuI'1; N, Notl; RV, EcoRV; e X, Xbal. Este plasmídeo foi funcional em ensaios transitórios da actividade de rep e cap e foi ele próprio em última análise usado para derivar as linhas de células estáveis (ver o Exemplo 5 em baixo).

Exemplo 3

Um vector final a ser usado para gerar linhas de células estáveis que produzem o rAAV foi gerado a partir do vector pAAV/CMV/SIVrev-gpl6Q (Exemplo 1) e do plasmídeo pSV40/neo/rep-cap (Exemplo 2). A construção' implicou a remoção da cassete genética neo-rep-cap de pSV40/neo/rep-cap e a inserção dela em um único local de Nael em pAAV/CMV/S'IVrev-gpl60 (ver a Figura 3B) . Especificamente, o vector pAAV/CMV/SIVrev-gpl60/neo/rep-cap foi feito pela banda de gel de agarose que isola 7,0 Kb de um fragmento de ADN de EcoRV-Notl que contém os domínios de expressão SV/neo e rep-cap de pSV40/neo/rep-cap. As extremidades coesivas do fragmento foram embotadas com Klenow e o fragmento foi ligado no local de Nael terminado embotado 17 de pAAV/CMV/SIVrev-gplGO. Ver a Figura 4. 0 vector pAAV/CMV/SIVrev-gp!60/neo/rep-cap (ATCC 69637) contém os elementos seguintes: (1) o genoma de rAAV; (2): os genes de AAV rep-cap; e (3) o gene de resistência à neomicina.

Exemplo 4 0 vector pAAV/CMV/SIVrev-gpl60/neo/rep-cap foi usado para. gerar linhas de células estáveis que contêm tanto o genoma de rAAV da invenção' como os genes de AAV rep-cap.

As células de HeLa em 70 % de confluência foram transfectadas com 10 pg de ADN do plasmideo pAAV/CMV/SIVrev-gpl60/neo/rep-cap em pratos de 100 mm. As células· foram transfectadas durante. 6 horas depois da formação de complexos de DOTAP/ADN em meio pequeno de soro como prescrito pelo protocolo do fabricante (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, . Ind. ) . Depois da; remoção do meio de transfecção, o meio .de DMEM que contêm 10 % de- soro·fetal de bovino foram adicionados·.' às células. Três dias depois, o meio complementado com 700 ng/ml de Geneticina (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md.} foi usado para seleccionar as células que de maneira estável, expressaram o gene de resistência à neomicina. O meio de DMEM qge contém a Geneticina fresca foi adicionado a cada quatro dias. Os clones resistentes à Geneticina foram seleccionados 10-14 dias depois do meio selectivo ter .sido adicionado. Um. total de cinquenta e cinco colónias foram seleccionadas e transferidas para placas de 24 cavidades e expandidas para uma. análise adicional..

As cinquenta e cinco linhas de células HeLa resistentes à neomicina foram inicialmente filtradas para a actividade funcional do gene de rep; vinte e uma marcaram positivo.' A actividade'de gene .de rep foi 18 ensaiado através da infecção das linhas de. células com o adenovirus de tipo 5 (AdS). A infecção por adenovirus transactíva os genes de rep e cap. Isto resulta na replicação do genoma de rAAV e na encapsidação subsequente destas sequências em partículas de' rAAV infecciosas. Uma representação esquemática da produção de rAAV é mostrada na Figura 5. Depois do efeito citopático máximo induzido por Ad5 (CPE; arredondamento das células e 90 % de separação do frasco de cultura), os lisados de células foram preparados e o ADN Hirt, (ADN de, peso molecular baixo) foi isolado [Hirt, J, Mol. Bíol., 26: 365-369 (1967)]. A análise de- mancheamento de Southern foi usada para visualizar a síntese de formas.' replicativas de AAV recoiribinante (rAAV) (cordão' singular, formas monomé ricas, e diméricas). As', cavidades de controlo· que não receberam Ad5 foram sempre negativas. As linhas de. células com · elevados níveis relativos da actividáde do gene de rep foram seleccionadas para um estudo.adicional.

Para ensaiar a funcionalidade de gene de cap, as. linhas de células foram infectadas com Ad5 e lisados clarificados preparados depois do desenvolvimento de CPE máximo. Os lisados de células, Ad5, e o AAV de tipo selvagem foram usadas para infectarem as células HeLa. Depois do desenvolvimento do CPE induzido por Ad5 (72 hoías), o ADN de Hirt foi isolado e a análise de mancheamento de Southern executada. Os lisados das linhas de células gue deram origem às sequências replicativas de rAAV hibridizável gpl60 (SIV gpl60) foram marcados positivos para a produção de cápside.

Um titulado infeccioso de rAAV unidade/mL (IU/mL) produzido por cada linha de célula foi derivado por se co-infeccionarem as células C12 (que apresentam o gene de expressão rep e cap estável) com AdS e uma diluição de uma série- de dez vezes do lisado da linha 19 de célula clarificada a ser testado. Depois do CPE induzido por Ad5 máximo, o ADN de Hirt foi isolado e a análise de mancheamento de Southern executada para-detectar a presença de formas replicativas de rAAV. A diluição do ponto final que produziu intermediários de replicação monoméricos e diméricos visíveis foi tomada como o titulador. A estimativa de titulação foi baseada em duas a quatro experiências de replicação.

Os resultados da caracterização· de oito das cinquenta e cinco linhas de células são mostrados na Tabela 1 em baixo em que "ND" indica que' um valor não foi determinado. TABELA 1

Linha de célula Função'de rep Função de cap Titulação (IU/mL) A5 +- + io4 All +++ + + 105 A15 . 4-+++ + cn O j—1 A37 ++++ + ND A60 +++++ - · < IO1 ' A64 +++++ + 106 A69 ++ - ND A80 + + + + ' + 10s A linha de célula A64 (ATCC CRL 11639) produziu, uma .elevada titulação de rAAV (106 iu/ml) em lisados clarificados. Esta titulação é .aproximadamente 1000 vezes mais elevada do que a titulação de rAAV relatada por Vincent et al., supra. ' O rAAV produzido pelas várias linhas de células também foi testado para a sua capacidade de' expressar o SIV gpl60 em células HeLa infectadas com o vírus recombinante. As provisões concentradas de rAAV produzidas por oito linhas de células estáveis enumeradas na 20

Tabela 1 foram geradas. Os lisadòs de células que contêm as partículas de rAAV foram submetidos a purificação gradual de densidade de passo (CsCl). Depois de diálise de dessalinização e inactivação a calor de Ad5, as partículas de rAAV'foram usadas para infectar (transformar) as células HeLa em cultura. Duas linhas da investigação foram- perseguidas. Primeiro, as células transformadas foram testadas para a presença de ARNm específico de SIV gpl60 por se. ' executar PCR RT no ARN total reunido 72 horas depois da transdução. Os iniciadores específicos para SIV gpl60 amplificaram um fragmento predito de .300 bp só na presença de transcriptase reversa e de polimerase de Taq; as amostras que correram sem transcriptase reversa foram uniformemente negativas. Em segundo lugar, as células de HeLa. foram transformadas com várias diluições da mesma provisão de rAAV/SIV como descrito em cima e, 72 horas depois, da transdução, a imunofluorescêncía. índirecta foi executada nas células infectadas. Em todas as diluições testadas (fora de 1:200), as células positivas para' a proteína de SIV gp'160 foram detectadas; as diluições mais baixas tiveram claramente células mais positivas. · A linha de célula A64 foi testada para a produção de AAV de tipo selvagem por um método padrão. A linha de célula foi infectada com adenovirus para produzir o rAAV como um lisado. O lisado foi depois utilizado para infectar células HeLa normais quer: (i) sozinhas; (ii) com adenovirus; ou (iii). com adenovirus e AAV de tipo selvagem. Como um controlo, as células de HeLa foram infectadas com adenovirus e' AAV de tipo selvagem sem o rAAV. O . ADN de Hirt foi preparado e analisado pelo mancheamento de Southern (duas manchas diferentes) para replicar as formas quer de rAAV ou de AAV de tipo selvagem. Nenhum AAV de tipo selvagem foi detectado em células A64 não expostas ao AAV de tipo selvagem. 21

Como a presente invenção implica o estabelecimento de linhas de células estáveis que contêm não só as cópias dos genes de AAV rep e cap, mas também do genoma de rAAV (com os ITRs que flanqueiam o ADN de interesse), o rAAV é produzido simplesmente por se infectar a linha de célula com adenovirus. A transfecção do ADN exógeno não é necessária, aumentando por conseguinte a eficiência da produção de rAAV em comparação com os métodos anteriormente descritos. Outras caracteristicas significativas da invenção são as de que nenhum AAV de tipo selvagem é produzido e que a escala para' a produção.de rAAV é fácil e é limitada só por constrangimentos normais do crescimento de célula em cultura.

Exemplo 5

Um método para isolar e purificar o rAAV de linhas de . células estáveis (produtor) foi desenvolvido.

As células produtoras (por exemplo, as células A64 do Exemplo 4) foram disseminadas em uma densidade de célula de 3 x 106 células produtoras por 175 cm2 de área de. superfície em meio de crescimento. As células alcançaram uma densidade de aproximadamente 8 x 106 células- depois de 16-18 horas, e foram depois' infectadas com adenovirus (Ad5) em uma multiplicidade de infecção (moi) de 5 durante 1-2 horas em meio de crescimento. Um volume de infecção de 15 ml foi usado, e depois de 1-2 horas de infecção, 10 ml de meio de crescimento foram adicionados a cada frasco para se obter um volume final de 25 ml. [Alternativamente, o Ad5 pode ser adicionado directamente por: remoção de todos excepto 15 ml de meio de crescimento e adição de Ad5 em um volume de 10 ml (diluído em HBSS) para dar um volume final de 25 ml]. 22

As células foram colhidas aproximadamente 48-60 horas depois da infecção quando a maior parte das células foi libertada do frasco depois de uma agitação vigorosa. As células foram depois manchadas com tripano azul para determinar a percentagem de células viáveis. É desejável que seja maior do que 80 % para· ser viável. As células foram depois . transferidas para garrafas cónicas de 250 ml disponíveis (Corning) e peletizadas a 1000. x g durante 15 minutos a 4 °C. 0 sobrenadante resultante foi removido· salvando uma alíquota e as células foram suspensas em tampão TM (50 mM de Tris,, pH 8,0, e 1 mM de MgCl2) a uma densidade de' 5 x 106 células/ml.. As células foram submetidas a três ciclos de congelação/degelo em gelo seco com 2 minutos de vortização entre cada .degelo. As células lisadas foram depois aquecidas a 56 °C durante 30 minutos a 1 hora com vortização a cada 7,5 minutos durante o último degelo. Dez por cento de desoxicolato foram adicionados ao lisado a uma concentração final de 1 %, e a mistura foi incubada a 37, °C durante 30 minutos com vortização intermitente para se conseguir uma lise completa. Se necessário para alcançar uma lise completa, a mistura foi sonicada 3 vezes na colocação máxima durante 2 minutos de.cada vez. Um hemocitómetro foi usado para confirmar a lise de célula completa. Os restos da célula foram peletizados a 2000 x g durante 15 minutos a 4 °C. O rAAV que contém o sobrenadante foi salvo. O rAAV foi isolado usando 1,31 g/ml de almofada de CsCl. Vinte e um ml de sobrenadante lisado foi estendido em camadas em 14 ml de uma almofada de CsCl em um tubo SW-28, e girado a 16,000 r.p.m, 10 °C durante 16 horas. O sobrenadante resultante foi aspirado e a pílula de rAAV foi lavada com HBSS para remover o CsCl residual. A pílula de pAAV foi re-dissolvida em 20 mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2 (tampão de TMN) no volume mais pequeno manuseável (aproximadamente 500 μΐ/pilula) e deixada a hidratar durante a 23 noite. Foi depois aquecida a 56 “C durante 30 minutos com vortização a cada 5 minutos. Neste ponto final, o vírus foi dialÍ2ado contra o. tampão de TMN para remover todos os traços de césio se o vírus não ia ser adicionalmente purificado. 0 rAAV pode ser adicionalmente purificado pela junção isopícnica. Isto é apropriado em condições nas quais o vírus deve ser administrado . in vivo. 0 rAAV hidratado foi trazido até uma densidade de CsCl de 1,41 g/ml, e depois girado em um tubo SW-41 a 30 KB durante 4 8 horas a' 10 °C. A porção, superior do gradiente que contém o adenovirus (densidade de 1,34-1,36 g/ml) foi descartada e a porção remanescente do gradiente de CsCl foi diluída .com TMN para a uma densidade flutuante de menos de 1,1 g/ml. O rAAV foi depois peletizado por uma rotação durante a noite a > 60, 000 x g. O rAAV foi res suspenso em uma quantidade mínima do tampão de TMN complementado com 1 % de gelatina. Para a hidratação eficiente, a pílula foi deixada a assentar durante a noite a 4 O rAAV foi depois aliquotado e armazenado a -20 °C.

Exemplo 6

Em simultâneo com a geração das células estáveis descritas no Exemplo 4, as linhas de células HeLa estáveis foram estabelecidas por métodos semelhantes os quais contiveram os genes de rep-cap mas nenhum genoma de rAAV usando o plasmídeo pSV40/neo/rep-cap (Exemplo 2). Um total de cinquenta e duas linhas de células HeLa resistentes à neomicina foram isoladas e caracterizadas.

Para testar a função do gene de rep, cada linha de célula foi infectada com Ad5 e posteriormente transfectada com pAAV/CMV/SIVrev-gpl60. A seguir ao CPE- induzido por Ad5 (72 horas), 24 o ADN de Hirt foi isolado e a análise de mancheamento de Southern executada. A função de gene de rep foi marcada positiva para as linhas de células que produziram as sequências monoméricas e diméricas rAAV gpl60. A intensidade do sinal autoradiográfi.co foi usada como uma medida relativa da expressão do gene de rep (1-5+). As amostras de controlo com menos Ad5 nunca produziram fo.rmas replicativas de rAAV. A proficiência do gene de cap foi ensaiada de uma maneira semelhante (infecção de. Ad5 e transfecção· de pAAV/CMV/SIVrev-gpl60) , excepto que um lisado de célula clarificada' foi preparado depois do desenvolvimento de CPE máximo. ' As células de HeLa foram depois co-infectadas com uma porção do lisado da célula clarificada, Ad5, e AAV. de tipo selvagem. O ADN de Hirt foi isolado 72 horas depois, e a análise de hibridizaçâo foi usada para visualizar a existência dé formas, replicativas de rAAV/gpl60 (monoméricas e diméricas ).· No ensaio descrito, a linha de célula C12 produziu a proporção relativa mais elevada das sequências rAAV/gpl60/120.

Os resultados dos ensaios de caracterização são apresentados para oito linhas de células são apresentados na Tabela 2 em que a abreviatura "ND" indica que um valor não foi determinado.

Linha de célula C2 C12 C16 . cia C23 C25 C27 C4 4 TABELA 2

Função de rep +++++ +++ +++ +++ ++++

Função de cap + +++

ND

ND

ND ND + 25

Existem duas utilizações principais para as linhas de células estáveis que expressam as sequências de rep-cap: (1) a geração de partículas de rAAV se as linhas de células são transfectadas com um genoma de rAAV e. infectadas com o vírus auxiliar; e (2) determinação . das titulações infecciosas de rAAV. Para estimar as titulações infecciosas de rAAV, estas linhas de células são co-infectadas com adenovirus e as diluições em série da provisão do rAAV. Depois do: CEE máximo, o ADN de Hirt é isolado e as formas de rAAV replicativas são visualizadas pela análise de mancheamento de Southern. A titulação de ponto final (última diluição da provisão de rAAV para dar sinal de hibridização positivo) é depois usada· para determinar a titulação infecciosa.

Exemplo 7 A capacidade do rAAV produzido pela linha de célula Hela A64 para infectar (transformar) e produzir a proteína SIV gpl60 em vários tipos de células mamíferas em adição às células HeLa (ver o Exemplo 4) foi ensaiada. 0 rAAV (a uma multiplicidade da infecção de aproximadamente 1) foi usado para infectar, as células quer em uma monocamada ou em suspensão, dependendo do tipo de célula. Três dias depois da infecção·. do AAV, as células foram fixadas em acetona/metanol e avaliadas para a produção de· gpl60 por imunofluoréscência Indirecta utilizando antisoros policlonais de um macaco infectado com SIV. As células ou as linhas de células seguintes foram infectadas e mostraram produzir gpl60; . as células do cérebro de rato fetais. (neurónios e células gliais) , os fibroblastos do rato 3T3, vagina de rato, vagina humana, cólon humano, linfócitos do ser humano e do macaco e as células 293. Nenhum tipo de célula' não permissivo foi identificado. Estes resultados demonstram que o rAAV produzido pela linha de célula A64 26 infecta uma larga variedade de tipos de células mamíferas e leva à expressão de superfície de célula do' produto genético do envelope SIV, gpl6Q, nas células transformadas.

Exemplo 8

As linhas de células estáveis foram geradas que produziram o rAAV que transporta o gene da β-galactosidase como um gene de interesse.. Estes rAAV são úteis como controlo positivo para testar a expressão de um ADN de interesse em uma célula ou tecido alvo.

Um vector como o pAAV/CMV/SIVrev-gpl60/neo/rep-cap foi construído que incluiu a cassete de expressão genética da β-galactosidase (Clonte.ch, . Paio Alto, Califórnia.) que contém o- promotor. CMV humano, o gene E. coli da β-galactosidase, e a sequência de junçãó/poliadenilação SV-40 em . vez do intrão de β-globina ..do coelho, . o SIV . rev e as sequências de envelope, e o sinal de políadenilação da· β-globina do coelho entre os ITRs de AAV. Esta cassete de expressão genética da β-galactosidase foi . clonada no meio dos. ITRs de AAV por métodos recombinantes· padrão.

As linhas de células HeLa estáveis que produziram o gene da β-galactosidase que contém o rAAV (rAAV/^-gal)' foram geradas como descrito no Exemplo 4 utilizando o vector precedente.

Exemplo 9

Os rAAV^-gal do Exemplo 8 foram, usados para demonstrar a utilização de rAAV da invenção para a transferência genética nos cérebros de ratos vivos. 0 rAAV^-gal foi injectado directamente nos cérebros dé ratos e os cérebros foram depois examinados para a 27 evidência da actividade da β-galactosidase.

Os ratos Balb/c (n=3; macho; 9 meses) foram anestesiados e segurados'em uma plataforma estereotáctica de murino. Utilizando a' técnica estéril, o rAAV/.p-gal . (1 μΐ contém 3 x 106 unidades infecciosas) foi injectado no hipocampo direito. Os ratos adicionais (n-3) receberam uma injecçãode diluente como controlos. Uma semana depois da injecção, os ratos foram sacrificados por exsanguinação cardíaca seguida pela infusão sequencial de 50 ml de salina de tampão fosfato heparinizada, depois 50 ml de uma mistura de paraformaldeído (0,5 %) e glútaraldeído (2,5 %) em '0,1 M de tampão de fosfato (pH 7,3). Os cérebros inteiros foram retirados, pós-fixados na mesma mistura fixativa (2 horas) e congelados em O.C.T. As secções de criostato (10 pm) foram colocadas em lâminas microscópicas revestidas de poli-L-lisina e armazenadas a -20 °C. As lâminas foram descongeladas à temperatura ambiente, fixadas novamente (5 minutos a 4 °C) , lavadas duas vezes em PBS, e transferidas para a mancha de X-gal (um substracto para a actividade enzimática da β-galactosidase)Y DepoiS: da incubação durante a noite a 37 °, as lâminas foram lavadas duas vezes em PBS, contra-manchadas com . vermelho nuclear rápido, e examinadas microscopicamente para células manchadas de azul (células em que a β-galactosidase estava a ser expressa).

Nos cérebros dos ratos injectados com ΓΑΑν/β-gal, as células manchadas de azul no hipocampo foram facilmente detectadas depois do exame microscópico. Nos cérebros de ratos injectados com o diluente (controlos), nenhuma célula manchada de azul foi encontrada.

Exemplo 10 28 Vários métodos para aumentar a titulação de rAAV gerados de linhas de células estáveis os quais envolvem o fornecimento adicional dos genes de AAV rep . e cap às linhas de células são contemplados pela invenção.

Em um primeiro método o qual demonstra a utilidade de fornecer genes de rep e de cap adicionais> uma linha de célula produtora é transfectada com um plasmídeo que contém um plasmideo auxiliar que transporta, os genes de AAV rep e cap antes da infecção por adenovirus. Os resultados das experiências nas quais uma linha de célula produtora de ΓΑΑν/β-gal (H44) foi assim, transfectada são apresentados na Tabela .3 em baixo. TABELA 3

Tratamento Rendimento Virai IU/.célula Vezes de aumento Transfecção falsa 7 x IO7 7 0 50 pg de pBS/rép-cap 1 x 10! 100 14 100 pg de pBS/rep-cap 8 x 108 80 11 150 pg de pBS/rep-cap 1 x 109 110 16

Em um segundo método, os genes de AAV rep e cap são colocados em um plasmideo separado que contém uma origem EBV ou BPV da replicaçâo de ADN e um marcador de resistência ao fármaco (higromicina). 0 plasmideo será transfectado em uma linha de célula produtora e as novas linhas de células são depois seleccionadas na neomicina e na higromicina. Esta pressão de selecção resultará em linhas de células estáveis que contêm tanto os genomas de rAAV como múltiplas cópias dos genes de AAV rep e cap.

Em um terceiro método, os genes de AAV rep e cap são clonados no genoma do adenovirus na posição E3 sob o controlo do operador da 29 tetraciclina.

Enquanto a presente invenção tem sido descrita em termos de formas de realização preferidas, entendeu-se que as variações e os melhoramentos ocorrerão àqueles especialistas na técnica. , Por conseguinte, só tais limitações como aparecem nas reivindicações 'devem ser colocadas na invenção.

LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:. (i) REQUERENTE: Johnson, Philip.R. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: . Materiais . e Métodos de . Vírus Adenc-associados (iii) .. NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3 (iv) ENDEREÇO DE' CORRESPONDÊNCIA . (A) DESTINATÁRIO: Marshall, 0'Toole, Gerstein,. Murray & Borun . (B) RUA: 6300 Sears Tower, 233 s. Wacker Drive (C) CIDADE: Chicago (D) ESTADO: Ilínóis

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 60606 {v) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco flexível (B) . COMPUTADOR:' PC IBM Compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS 30 30 . 0, Versão (D) SUPORTE LÓGICO: Patentin, Emissão- NL N° 1.25 , (vi) DADOS DE APLICAÇÃO CORRENTES: '

(A) NÚMERO DE APLICAÇÃO: US (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE APLICAÇÃO ANTERIORES: (A) NÚMERO DE APLICAÇÃO: US 08/254,358 (B) DATA DE DEPÓSITO: 06 DE JUNHO DE 1994 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) ADVOGADO/AGENTE DE INFORMAÇÃO:· (A) NOME: Noland, Greta Ξ. (B) NÚMERO DE REGISTO: 35,302 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/RESUMO: 32634 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (312)474-6300 (B) TELEFAX: (312)474-0448 (C) TELEX: 25-3856 (2) INFORMAÇÃO. PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 31 (A) COMPRIMENTO: 4680 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) QUALIDADE DO CORDÃO: singular (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (x) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA:' SEQ ID NO. 1: TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC 6.0 CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG .120 GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCTGGAGG GGTGGAGTCG TGACGTGAAT TACGTCATAG 180 GGTTAGGGAG GTCCTGTATT AGAGGTCACG TGAGTGTTTT GCGACATTTT GCGACACCAT 240 GTGGTCACGC TGGGTATTTA AGCCCGAGTG AGCACGCAGG GTCTCCATTT TGAAGCGGGA 300 GGTTTGAACG CGCAGCCGCC ATGCCGGGGT TTTACGAGAT TGTGATTAAG GTCCCCAGCG 360 ACCTTGACGG GCATCTGCCC GGCATTTCTG ACAGCTTTGT GAACTGGGTG GCCGAGAAGG 420 AATGGGAGTT GCCGCCAGAT TCTGACATGG ATCTGAATCT GATTGAGCAG GCACCCCTGA 480 CCGTGGCCGA GAAGCTGCAG CGCGACTTTC TGACGGAATG GCGCCGTGTG AGTAAGGCCC 540 CGGAGGCCCT TTTCTTTGTG CAATTTGAGA AGGGAGAGAG CTACTTCCAC ATGCACGTGC 600 TCGTGGAAAC CACCGGGGTG AAATCCATGG TTTTGGGACG TTTCCTGAGT CAGATTCGCG 660 AAAAACTGAT TCAGAGAATT TACCGCGGGA TCGAGCCGAC TTTGCCAAAC TGGTTCGCGG 720 TCACAAAGAG CAGAAATGGC GCCGGAGGCG GGAAÇAAGGT GGTGGATGAG TGCTACATCC 780 CCAATTACTT GCTCCCCAAA ACCCAGCCTG AGCTCCAGTG GGCGTGGACT AATATGGAAC 840 AGTATTTAAG CGCCTGTTTG AATCTCACGG AGCGTAAACG GTTGGTGGCG CAGCATCTGA 900 CGCACGTGTC GCAGACGCAG GAGCAGAACA AAGAGAATCA GAATCCCAAT TCTGATGCGC 960 CGGTGATCAG ATCAAAAACT TCAGCCAGGT ACATGGAGCT GGTCGGGTGG CTCGTGGACA 1020 AGGGGATTAC CTCGGAGAAG CAGTGGATCC AGGAGGACCA GGCCTCATAC ATCTCCTTCA 1080 ATGCGGCCTC CAACTCGCGG TCCCAAATCA AGGCTGCCTT GGACAATGCG GGAAAGATTA 1140 TGAGCCTGAG TAAAACCGCC CCCGACTACC TGGTGGGCCA GCAGCCCGTG GAGGACATTT 1200 CCAGCAATCG GATTTATAAA ATTTTGGAAC TAAACGGGTA CGATCCCCAA TATGCGGCTT 1260 CCGTCTTTCT GGGATGGGCC ACGAAAAAGT TCGGCAAGAG GAACACCATC TGGCTGTTTG 1320 GGCCTGCAAC TACCGGGAAG ACCAACATCG CGGAGGCCAT AGCCCACACT GTGCCCTTCT 1380 ACGGGTGCGT AAACTGGACC AATGAGAACT TTCCCTTCAA CGACTGTGTC GACAAGATGG 1440 TGATCTGGTG GGAGGAGGGG AAGATGACCG CCAAGGTCGT GGAGTCGGCC AAAGCCATTC 1500 TCGGAGGAAG CAAGGTGCGC GTGGACCAGA AATGCAAGTC CTCGGCCCAG ATAGACOGGA 1560 CTCCCGTGAT CGTCACCTCC AACACCAACA TGTGCGCCGT GATTGACGGG AACTCAACGA 1620 32 CCTTCGAACA CCAGCAGCCG TTGCAAGACC GGATGTTCAA ATTTGAACTC ACCCGCCGTC 1680 TGGATCATGA CTTTGGGAAG GTCACCAAGC AGGAAGTCAA AGACTTTTTC CGGTGGGCAA 1740 AGGATCACGT GGTTGAGGT.G gagcatgaa!t TCTACGTCAA AAAGGGTGGA GCCAAGAAAA 1800 GACCCGCCCC CAGTGACGCA GATATAAGTG AGCCCAAACG GGTGCGCGAG TCAGTTGCGC 1860 AGCCATCGAC GTCAGACGCG GAAGCTTCGA TCAACTACGC AGACAGGTAC CAAAACAAAT 1920 GTTCTCGTCA CGTGGGCATG AATCTGATGC TGTTTCCCTG CAGACAATGC GAGAGAATGA 1980 ATCAGAATTC AAATATCTGG TTCACTCACG GACAGAAAGA CTGTTTAGAG TGCTTTCCCG 2040 TGTCAGAATC TCAACCCGTT TCTGTÇGTCA AAAAGGCGTA TCAGAAACTG TGCTACATTC 2100 ATCATATCAT GGGAAAGGTG CCAGACGCTT GCACTGCCTG CGATCTGGTC AATGTGGATT 2160 TGGATGACTG CATCTTTGAA CAATAAATGA TTTAAATCAG GTATGGCTGC CGATGGTTAT 2220 CTTCCAGATT ggctcgagga CACTCTCTCT GAAGGAATAA GACAGTGGTG GAAGCTCAAA 2280 CCTGGCCCAC CACCACCAAA GCCCGCAGAG CGGCATAAGG ACGACAGCAG GGGTCTTGTG 2340 CTTCCTGGGT ACAAGTACCX CGGACCCTTC AACGGACTCG ACAAGGGAGA GCCGGTCAAC 2400 GAGGCAGACG CCGCGGCCCT CGAGCACGAC AAAGCCTACG ACCGGCAGCT CGACAGCGGA 2460 GACAACCCGT ACCTCAAGTA CAACCACGCC GACGCGGAG.T TTCAGGAGCG CCTTAAAGAA 2520 GATACGTCTT TTGGGGGCAA CCTCGGACGA GCAGTCTTCC AGGCGAAAAA GAGGGTTCTT 2580 GAACCTCTGG GCCTGGTTGA GGAACCTGTT AAGACGGCTC CGGGAAAAAA GAGGCCGGTA 2640 GAGCACTCTC CTGTGGAGCC AGACTCCTCC TCGGGAACCG GAAAGGCGGG CCAGCAGCCT 2700 GCAAGAAAAA GATTGAATTT TGGTCAGAÇT GGAGACGCAG ACTCAGTACC TGACCCCCAG 2760 CCTCTCGGAC AGCCACCAGC AGCCCCCTCT GGTCTGGGAA CTAATACGAT GGCTACAGGC .2820 AGTGGCGCAC CAATGGCAGA CAATAACGAG GGCGCCGACG GAGTGGGTAA TTCCTCCGGA 2880 AATTGGCATT GCGATTCCAC ATGGATGGGC GACAGAGTCA TCACCACCAG CACCCGAACC 2940 TGGGCCCTGC CCACCTACAA CAACCACCTC TACAAACAAA TTTCCAGCCA ATCAGGAGCC 3000 TCGAACGACA ATCACTACTT TGGCTACAGC ACCCCTTGGG GGTATTTTGA CTTCAACAGA 3060 TTCCACTGCC ACTTTTCACC ACGTGACTGG CAAAGACTCA TCAACAACAA CTGGGGATTC 3120 CGACCCAAGA GACTCAACTT CAAGCTCTTT AACATTCAAG TCAAAGAGGT CACGCAGAAT 3180 GACGGTACGA CGACGATTGC CAATAACCTT ACCAGCACGG TTCAGGTGTT TACTGACTCG 3240 GAGTACCAGC TCCCGTACGT CCTCGGCTCG GCGCATCAAG GATGCCTCCC GCCGTTCCCA 3300 GCAGACGTCT TCATGGTGCC ACAGTATGGA TACCTCACCC TGAACAACGG GAGTCAGGCA 3360 GTAGGACGCT CTTCATTTTA CTGCCTGGAG TACTTTCCTT CTCAGATGCT GCGTACCGGA 3420 AACAACTTTA CCTTCAGCTA CACTTTTGAG GACGTTCCTT TCCACAGCAG CTACGCTCAC 3480 AGCCAGAGTC TGGACCGTCT CATGAATCCT CTCATCGACC AGTACCTGTA TTACTTGAGC 3540 AGMCAAACA CTCCAÃGTGG AACCACCACG CAGTCAAGGC TTCAGTTTTC TCAGGCCGGA 3600 GCGAGTGACA TTCGGGACCA GTCTAGGAAC TGGCTTCCTG GACCCTGTTA CCGCCAGCAG 3660 CGAGTATCAA AGACATCTGC GGATAACAAC AACAGTGAAT ACTCGTGGAC TGGAGCTACC 3720 AAGTACCACC TCAATGGCAG AGACTCTCTG GTGAATCCGG GGCCCGCCAT GGCAAGCCAC 3780 AAGGACGATG AAGAAAAGTT TTTTCCTCAG AGCGGGGTTC TCATCTTTGG GAAGCAAGGC 3840 33 TCAGAGAAAA CAAATGTGAA CATTGAAAAG GTCATGATTA CAGACGAAGA GGAAATCGGA 3900 ACAACCAATC CCGTGGCTAC GGAGCAGTAT GGTTCTGTAT CTACCAACCT· CCAGAGAGGC . 3960 AACAGACAAG CAGCTACCGC AGATGTCAAC ACACAAGGCG TTCTTCCAGG CATGGTCTGG 4020 CAGGACAGAG ATGTGTACCT TCAGGGGCCC ATCTGGGCAA AGATTCCACA CACGGACGGA 4080 CATTTTCACC CCTCTCCCCT CATGGGTGGA TTCGGACTTA 7VACACCCTCC TCCACAGATT 4140 CTCATCAAGA ACACCCCGGT ACCTGCGAAT CCTTCGACCA CCTTCAGTGC GGCAAAGTTT 4200 GCTTCCTTCA TCACACAGTA CTCCACGGGA CACGGTCAGC GTGGAGATCG AGTGGGAGCT 4260 GCAGAAGGAA AACAGCAAAC GCTGGAATCC CGAAATTCAG TACACTTCCA ACTACAACAA 4320 GTCTGTTAAT CGTGGACTTA CCGTGGATAC TAATGGCGTG TATTCAGAGC CTCGCCCCAT 4380 TGGCACCAGA TACCTGACTC GTAATCTGTA ATTGCTTGTT AATCAATAAA CCGTTTAATT ' ^ 4440 CGTTGCAGTT GAACTTTGGT CTCTGCGTAT. TTCTTTCTTA TCTAGTTTCC ATGGCTACGT 4500 AGATAATTAG CATGGCGGGT TAATCATTAA CTACAAGGAA CCCCTAGTGA TGGAGTTGGC 4560 CACTCCCTCT CTGCGCGCTC GCTCGCTCAÇ TGAGGCCGGG CGACCAAAGG TCGCCCGACG 4620 CCCGGGCTTT GCCCGGGCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG GAGTGGCCAA 4680 (2) INFORMAÇÃO. PARA A SEQ ID NO: 2: (!) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: ' (A) COMPRIMENTO: 2658 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

(C) QUALIDADE DO CORDÃO: SINGULAR (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: ATGGGATGTC TTGGGAATCA GCTGCTTATC GCGCTCTTGC TAGTAAGTGT TTTAGAGATT 60 TGTTGTGTTC AATATGTAAC AGTATTCTAT GGTGTACCAG CATGGAAGAA TGCGACAATT 120 CCCCTCTTCT GTGCAACCAA GAATAGGGAC ACTTGGGGAA CAACACAATG CTTGCCAGAT 180 AATGATGATT ACTCAGAATT GGCAATCAAT GTCACAGAGG CTTTTGATGC TTGGGATAAT 240 ACAGTCACAG AACAAGCAAT AGAGGATGTG TGGAACCTCT TTGAAACATC CATTAAGCCC 300 TGTGTAAAAC TCACCCCACT ATGTATAGCA ATGAGATGTA ATAAAACTGA GACAGATAGG 360 TGGGGTTTGA CAGGAAACGC AGGGACAACA ACAACAQCAA TAACAACAAC AGCAACACCA 420 AGTGTAGCAG AAAATGTTAT AAATGAAAGT AATCCGGGCA TAAAAAATAA TAGTTGTGCA 480 34 GGCTTGGAAC AGGAGCCCAT GATAGGTTGT AAATTTAACA TGACAGGGTT AAATAGGGAC 540 AAAAAGAAAG AATATAATGA AACATGGTAT TCAAGAGATT TAATCTGTGA GCAGTCAGCG 600 AATGAAAGTG AGAGTAAATG TTACATGCAT CATTGTAACAC CAGTGTTAT TCAAGAATCC 660 TGTGACAAGC ATTATTGGGA TGCTATTAGA TTTAGATACTG TGCACCGCC AGGTTATGCT . 720 TTGCTTAGGT GTAATGATTC AAATTATTTA GGCTTTGCTCC TAACTGTTC TAAGGTAGTG 780 GTTTCTTCAT GCACAAGAAT GATGGAGACG CAAACCTCTAC TTGGTTTGG CTTCAATGGT 840 ACTAGGGCAG AAAATAGAAC ATACATTTAT TGGCATGGCAA AAGTAATAG AACCATAATT 900 AGCTTGAATA AGTATTATAA TCTAACAATG AGATGTAGAAG ACCAGAAAA TAAGACAGTT 960 TTACCAGTCA CCATTATGTC AGGGTTGGTC TTCCATTCGCA GGCCATAAA TGAGAGACCA 1020 AAACAGGCCT GGTGCTGGTT TGAAGGAAGC TGGAAAAAGGC CATCCAGGA AGTGAAGGAA 1080 ACCTTGGTCA AACATCCCAG GTATACGGGA ACTAATGATAC TAGGAAAAT TAATCTAACA .1140 GCTCCAGCAG GAGGAGATCC AGAAGTCACT TTTATGTGGAC AAATTGTCG AGGAGAATTC 1200 TTATATTGCA AAATGAATTG GTTTCTTAAT TGGGTAGAGGÃ ÇAGAGACCA AAAGGGTGGC 1260 AGATGGAAAC AACAAAATAG GAAAGAGCAA CAGAAGAAAAA TTATGTGCC ATGTCATATT . 1320 AGACAAATAA TCAACACGTG GCACAAAGTA GGCAAAAATGT ATATTTGCC TCCTAGGGAA 1380 GGAGACCTGA CATGCAATTC CACTGTAACT AGTCTCATAGC AGAGATAGA TTGGATCAAT 1440' AGCAATGAGA CCAATATCAC CATGAGTGCA GAGGTGGCAGA ACTGTATCG ATTGGAGTTG '1500 GGAGATTACA AATTAATAGA GATTÂCTCCA ATTGGCTTGGC CCCCACAAG TGTAAGAAGG 1560' TACACCACAA CTGGTGCCTC AAGAAATAAG AGAGGGGTCTT TGTGCTAGG GTTCTTGGGT 1620 TTTCTCGCGA CAGCAGGTTC TGCAATGGGC GCGGCGTCCGT GACGCTGTC GGCTCAGTCC 1680 CGGACTTTGT TGGCTGGGAT AGTGCAGCAA CAGCAACAGCT GTTGGATGT GGTCAAGAGA 1740 CAACAAGAAT TGTTGCGACT GACCGTCTGG GGAACTAAGAA CCTCCAGAC TAGAGTCACT 1800 GCTATCGAGA AGTACCTGAA GGATCAGGCG CAGCTAAATTC ATGGGGATG '.TGCTTTTAGG 18 60 CAAGTCTGTC ACACTACTGT ACCATGGCCA AATGAAACATT GGTGCCTAA TTGGAACAAT 1920 ATGACTTGGC AAGAGTGGGA AAGACAGGTT GACTTCCTAGA GGCAAATAT AACTCAATTA 1980 TTAGAAGAAG CACAAATTCA GCAAGAAAAG AATATGTATGA ATTGCAAAA ATTAAATAGC 2040 TGGGATATCT TTGGCAATTG GTTTGACCTT ACTTCTTGGAT AAGATATAT ACAATATGGT 2100 GTACTTATAG TTCTAGGAGT AATAGGGTTA AGAATAGTAAT ATATGTAGT GCAAATGTTA 2160 GCTAGGTTAA GACAGGGTTA TAGGCCAGTG TTCTCTTCCCC TCCCGCTTA TGTTCAGCAG 2220 ATCCCTATCC ACAAGGGCCA GGAACCGCCA ACCAAAGAAGG AGAAGAAGG AGACGGTGGA 2280 GACAGAGGTG GCAGCAGATC TTGGCCTTGG CAGATAGAATA TATTCATTT CCTGATCCGC 2340 CAGTTGATAC GCCTCTTGAC TTGGCTATTC AGCAGCTGCAG GGATTGGCT ATTGAGGAGC 2400 TACCAGATCC TCCAACCAGT GCTCCAGAGC CTCTCAACGAC GTTGCAftAG AGTCCGTGAA 2460 GTCATCAGAA TTGAAATAGC CTACCTACAA TATGGGTGGCG CTATTTCCA AGAAGCAGTÀ 2520 CAAGCGTGGT GGAAACTTGC GCGAGAGACT CTTGCAAGCGC GTGGGGAGA CATATGGGAG 2580 ACTCTGGGAA GGGTTGGAAG AGGGATACTC GCAATCCCTAG GCGCATCAG GCAAGGGCTT 2640 GAGCTCACTC TCTTGTGA 2658 35 (2) INFORMAÇÃO de SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2571 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) QUALIDADE DO CORDÃO: singular (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: ATGAGAGTGA AGGGGATCAG GAGGAATTAT CAGCACTGGT GGGGATGGGG CACGATGCTC 60 CTTGGGTTAT TAATGATCTG TAGTGCTACA GAAAAATTGT GGGTCACAGT CTATTATGGG 120 GTACCTGTGT GGAAAGAAGC AACCACCACT CTATTTTGTG CATCAGATGC TAAAGCATAT 180 GATACAGAGG TACATAATGT TTGGGCCACA CAAGCCTGTG TACCCACAGA CCCCAACCCA 240 CAAGAAGTAG AATTGGTAAA TGTGACAGAA AATTTTAACA TGTGGAAAAA TAACATGGTA . 300 GAACAGATGC ATGAGGATAT AATCAGTTTA TGGGATCAAA GCCTAAAGCC ATGTGTAAAA 360 TTAACCCCAC TCTGTGTTAC TTTAAATTGC ACTGATTTGA GGAATACTAC TAATACCAAT 420 AATAGTACTG CTAATAACAA TAGTAATAGC GAGGGAACAA TAAAGGGAGG AGAAATGAAA ' 480 AACTGCTCTT TCAATATCAC CACAAGCATA AGAGATAAGA TGCAGAAAGA ATATGCACTT 540 CTTTATAAAC TTGATATAGT ATCAATAGAT AATGATAGTA CCAGCTATAG GTTGATAAGT 600 TGTAATACCT CAGTCATTAC ACAAGCTTGT CCAAAGATAT CCTTTGAGCC AATTCCCATA 660 CACTATTGTG CCGCGGCTGG TTTTGCGATT CTAAAATGTA ACGATAAAAA gttcagtgga' 720 AAAGGATCAT GTAAAAATGT CAGCACAGTA CAATGTACAC ATGGAATTAG GCCAGTAGTA 780 TCAACTCAAC TGCTGTTAAA TGGCAGTCTA GCAGAAGAAG AGGTAGTAAT TAGATCTGAG 840 AATTTCACTG ATAATGCTAA AACCATCATA GTACATCTGA ATGAATCTGT ACAAATTAAT 900 TGTACAAGAC CCAACTACAA TAAAAGAAAA AGGATACATA TAGGACCAGG GAGAGCATTT 960 TATACAACAA AAAATATAAT AGGAACTATA AGACAAGCAC ATTGTAACAT TAGTAGAGCA 1020 AAATGGAATG ACACTTTAAG ACAGATAGTT AGCAAATTAA AAGAACAATT TAAGAATAAA 108 0 ACAATAGTCT TTAATCAATC CTCAGGAGGG GACCCAGAAA TTGTAATGCA CAGTTTTAAT 1140 TGTGGAGGGG AATTTTTCTA CTGTAATACA TCACCACTGT TTAATAGTAC ttggaatGgt 1200 AATAATACTT GGAATAATAC TACAGGGTCA AATAACAATA TCACACTTCA ATGCAAAATA 1260 AAACAAATTA TAAACATGTG GCAGGAAGTA GGAAAAGCAA TGTATGCCCC' TCCCATTGAA ' 1320 GGACAAATTA GATGTTCATC AAATATIACA GGGCTACTAT TAACAAGAGA TGGTGGTAAG 1380 36 GACACGGACA CGAACGACAC CGAGATCTTC AGACCTGGAG GAGGAGATAT GAGGGACAAT 1440 TGGAGAAGTG AATTATATAA ATATAAAGTA GTAACAATTG AACCATTAGG AGTAGCACCC 1500 ACCAAGGCAA AGAGAAGAGT GGTGCAGAGA GAAAAAAGAG CAGCGATAGG AGCTCTGTTC 1560 CTTGGGTTCT TAGGAGCAGC AGGAAGCACT ATGGGCGCAG CGTCAGTGAC GCTGACGGTA 1620 CAGGCCAGAC TATTATTGTC TGGTATAGTG CAACAGCAGA ACAATTTGCT GAGGGCCATT 1680 GAGGCGCAAC AGCATATGTT GCAACTCACA GTCTGGGGCA TCAAGCAGCT CCAGGCAAGA 1740 GTCCTGGCTG TGGAAAGATA CCTAAAGGAT CAACAGCTCC TGGGGTTTTG GGGTTGCTCT 1800 GGAAAACTCA TTTGCACCAC TACTGTGCCT TGGAATGCTA GTTGGAGTAA TAAATCTCTG 1860 GATGATATTT GGAATAACAT GACCTGGATG CAGTGGGAAA GAGAAATTGA CAAT TACACA v 1920 AGCTTAATAT ACTCATTACT AGAAAAATCG CAAACCCAAC AAGAAAAGAA TGAACAAGAA 1980 TTATTGGAAT TGGATAAATG 'GGCAAGTTTG TGGAATTGGT TTGACATAAC AAATTGGCTG 2040 TGGTATATAA AAATATTCAT AATGATAGTA GGAGGCTTGG TAGGTTTAAG AATAGTTTTT . 2100 GCTGTACTTT CTATAGTGAA TAGAGTTAGG CAGGGATACT .CACCATTGTC GTTGCAGACC 2160 CGCCCCCCAG TTCCGAGGGG ACCCGACÃGG CCCGAAGGAA TCGAAGAAGA AGGTGGAGAG 2220 AGAGACAGAG ACACATCCGG .TCGATTAGTG CATGGATTCT TAGCAATTAT CTGGGTCGAC 2280 CTGCGGAGCC TGTTCCTCTT CAGCTACCAC CACAGAGACT TACTCTTGAT TGCAGCGAGG 2340 ATTGTGGAAC TTCTGGGACG CAGGGGGTGG GAAGTCCTCA AATATTGGTG GAATCTCCTA 2400 CAGTATTGGA GTCAGGAACT AAAGAGTAGT GCTGTTAGCT TGCTTAATGC CACAGCTATA 2460 GCAGTAGCTG AGGGGACAGA TAGGGTTATA GAAGTACTGC AAAGAGCTGG TAGAGCTATT 2520 CTCCACATAC CTACAAGAAT AAGACAGGGC TTGGAAAGGG CTTTGCTATA A 2571

Lisboa, 18-.de Junho de 2008

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Vector de ADN que compreende um genoma do vírus adeno-associado recombinante e as sequências de ADN que codificam as proteínas de rep/cap adeno-associadas, em que o referido- genoma do vírus adeno-associado recombinante compreende repetições terminais invertidas do vírus adeno-associado que flanqueiam as sequências de ADN do vírus não adeno-associado operacionalmente ligado ao promotor e as sequências de poliadenilaçâo e em que o referido genoma do vírus adeno-associado recombinante necessita de sequências de rep/cap que codificam as proteínas de rep/cap funcionais.

2. Vector de ADN de' acordo com a reivindicação 1 em que as referidas sequências de ÁDN do vírus não adeno-associado são as sequências de ADN que codificam uma proteína do vírus da imunodeficiência.

3. Vector de ADN de acordo com a reivindicação 2 o qual é' o vector pAAV/CMV/SIVrevgpl60/neo/rep-cap (ATCC 69637).

4. Célula hospedeira mamífera transfectada de maneira estável com o vector de ADN de acordo com a reivindicação 1.

5. Célula hospedeira mamífera de acordo com a reivindicação 4 em que as referidas sequências de ADN do vírus não adeno-associado são sequências de ADN que codificam uma proteína do vírus da imunodeficiência.

6. Célula hospedeira' mamífera de acordo com a reivindicação 5 a 2 qual é a linha de célula HeLa A64 (ATCC CRL 11639).

7. Método para produzir o virus adeno-associado recombinante infeccioso que compreende o passo de infectar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 4 com um virus auxiliar do virus adeno-associado.

8. Método de acordo com a reivindicação 7· em.que o referido virus auxiliar contém os genes de rep-cap do virus adeno-associado inseridos no sèu genoma.

9. Vector de ADN ' de acordo com a reivindicação 1 em que as referidas sequências de ADN do virus não adeno-associado são sequências de ADN que codificam um polipéptido seleccionado a partir do grupo que consiste de hidroxilase de tirosina, decarboxilase de amino ácido aromático, factor de crescimento do nervo, factor neurotrófico derivado do cérebro, NT-3, NT-4/5, factor neurotrófico derivado glial e factor de crescimento do fibroblasto. Lisboa, 18 de Junho de 2008