ES2302331T3 - Vectores que codifican genomas de aav recombinantes. - Google Patents

Vectores que codifican genomas de aav recombinantes. Download PDF

Info

Publication number
ES2302331T3
ES2302331T3 ES95927113T ES95927113T ES2302331T3 ES 2302331 T3 ES2302331 T3 ES 2302331T3 ES 95927113 T ES95927113 T ES 95927113T ES 95927113 T ES95927113 T ES 95927113T ES 2302331 T3 ES2302331 T3 ES 2302331T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
raav
virus
dna
rep
adeno
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES95927113T
Other languages
English (en)
Inventor
Philip R. Johnson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nationwide Childrens Hospital Inc
Original Assignee
Nationwide Childrens Hospital Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nationwide Childrens Hospital Inc filed Critical Nationwide Childrens Hospital Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2302331T3 publication Critical patent/ES2302331T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA MATERIALES DE VIRUS ADENOASOCIADOS (AAV) Y METODOS UTILES PARA SUMINISTRAR ADN A LAS CELULAS. ESPECIALMENTE, LA INVENCION PROPORCIONA GENOMAS RECOMBINANTES AAV (RAAV), QUE COMPRENDEN REPETICIONES TERMINALES INVERTIDAS, DE VIRUS ADENOASOCIADOS, LAS CUALES FLANQUEAN A SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN PARA UNA PROTEINA DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA, LIGADA OPERATIVAMENTE A SECUENCIAS PROMOTORAS Y DE POLIADENILACION. LA INVENCION PROPORCIONA TAMBIEN METODOS DE EMPAQUETAMIENTO DE LOS GENOMAS RAAV, LINEAS DE CELULAS HUESPED PRODUCTORAS DE RAAV Y METODOS PARA SUMINISTRAR LOS GENES DE INTERES A LAS CELULAS, UTILIZANDO EL RAAV. ESPECIALMENTE, SE DESCRIBEN RAAV UTILES PARA GENERAR INMUNIDAD FRENTE AL VIRUS-1 DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA Y PARA EL SUMINISTRO TERAPEUTICO DEL GEN DESTINADO AL TRATAMIENTO DE ALTERACIONES NEUROLOGICAS.

Description

Vectores que codifican genomas de AAV recombinantes.
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, a materiales de virus adenoasociados (AAV) y a métodos que son útiles para transportar ADN a células. Más en concreto, la invención se refiere genomas de AAV recombinantes (rAAV), a métodos para encapsular genomas de rAAV, a líneas celulares estables para producir rAAV, y a métodos para transportar genes de interés hasta células que utilizan los rAAV.
Antecedentes
Los virus adenoasociados (AAV) son parvovirus con replicación deficiente, cuyo genoma de ADN monocatenario tiene una longitud de aproximadamente 4,7 kb, incluyendo repeticiones terminales invertidas de 145 nucleótidos (ITR). Véase la Figura 1. La secuencia de nucleótidos del genoma de AAV2 se presenta en Srivastava et al., J. Virol., 45:555-564 (1983). Dentro de las ITR están contenidas secuencias de acción cis que dirigen la replicación del ADN vírico (ori), la encapsidación/encapsulación (pkg), y la integración en el cromosoma de la célula hospedante (int). Tres promotores de AAV, p5, p19 y p40 (nombrados según sus colocaciones relativas en el mapa), conducen la expresión de dos marcos de lectura abierta internos de AAV, que codifican las proteínas rep y cap. Los dos promotores rep (p5 y p19), acoplados con el corte y empalme diferencial del único intrón de AAV (en los nucleótidos 2107 y 2227), da como resultado la producción de cuatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40) a partir del gen rep. Las proteínas rep poseen múltiples propiedades enzimáticas que son responsables, en último término, de la replicación del genoma vírico. El gen cap se expresa a partir del promotor p40, y codifica las tres proteínas de la cápsida VP1, VP2 y VP3. Otros sitios de inicio de la traducción alternativos y no consenso son responsable de la producción de tres proteínas de la cápsida relacionadas. Un único sitio de poliadenilación consenso se encuentra en la posición del mapa 95 del genoma de AAV. El ciclo vital y la genética de AAV se indican en Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129 (1992).
Cuando AAV infecta a una célula humana, el genoma vírico se integra en el cromosoma 19, dando como resultado una infección latente de la célula. La producción de virus infecciosos no se produce a menos que la célula sea infectada con un virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus o herpesvirus). En el caso del adenovirus, los genes E1A, E1B, E2S, E4 y VA proporcionan funciones auxiliares. Tras la infección con el virus auxiliar, el provirus de AAV se rescata y amplifica, y se producen tanto AAV como adenovirus.
El AAV posee características exclusivas que le hacen atractivo como vector para transportar ADN extraño hacia células. La infección por AAV de células no es citopática, y la infección natural de seres humanos y otros animales es silenciosa y asintomática. Además, los AAV infectan a la mayoría de las células de mamífero (sino a todas), lo cual permite la posibilidad de un transporte dirigido hacia muchos tejidos diferentes in vivo. Kotin et al., EMBO J., 11(13):5071-5078 (1992) indican que el genoma de ADN de AAV experimenta una integración dirigida en el cromosoma 19 después de la infección. No es necesaria la replicación del ADN vírico para la integración y, por tanto, para este proceso no se requiere el virus auxiliar. El genoma provírico de AAV es infeccioso como ADN clonado en plásmidos que hacen factible la construcción de genomas recombinantes. Además, debido a que las señales que dirigen la replicación, la encapsidación del genoma y la integración de AAV están contenidas dentro de las ITR del genoma de AAV, aproximadamente 4,3 kb internos del genoma (que codifican la replicación y proteínas de la cápsida estructurales, rep-cap) pueden, por tanto, sustituirse por ADN extraño, tal como un módulo génico que contenga un promotor, un ADN de interés y una señal de poliadenilación. Otra características significativa de AAV es que es un virus extremadamente estable y resistente. Aguanta con facilidad las condiciones empleadas para inactivar los adenovirus (de 56ºC a 65ºC durante varias horas), haciendo que la conservación en frío de vacunas basadas en rAAV sea menos crítica. Por último, las células infectadas por AAV no son resistentes a la superinfección.
Diversos grupos han estudiado el uso potencial de AAV en el tratamiento de estados de enfermedad. La Publicación Internacional según el Tratado de Cooperación de Patentes (PCT) nº WO 91/18088, publicada el 28 de Noviembre de 1991, y el correspondiente artículo periodístico de Chatterjee et al., Science, 258:1485-1488 (1992), describen la transducción de resistencia intracelular al virus de la inmunodeficiencia humano-1 (VIH-1) en líneas celulares humanas hematopoyéticas y no hematopoyéticas utilizando un rAAV que codifica un ARN antisentido específico para la secuencia TAR y la señal de poliadenilación de VIH-1. El artículo periodístico de Yu et al., Gene Therapy, 1:13-26 (1994), que trata sobre la terapia génica para la infección por VIH-1, lista a los AAV como posibles vectores de terapia génica para células pluripotenciales hematopoyéticas. El uso de vectores de rAAV como sistemas de transporte para la integración y expresión estables de genes (en particular, el gen regulador transmembrana de la fibrosis quística) en células epiteliales de las vías respiratorias cultivadas se describe en la Publicación Internacional PCT nº WO 93/24641, publicada el 9 de Diciembre de 1993, y el correspondiente artículo periodístico de Flotte et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7:349-356 (1992). Una terapia génica que implica a rAAV en el tratamiento de hemoglobinopatías y otras enfermedades hematopoyéticas, y en conferir resistencia a múltiples fármacos específica de células, se propone en la Publicación Internacional PCT nº WO 93/09239, publicada el 13 de Mayo de 1993; Muro-Cacho et al., J. Immunol., 11:231-237 (1992); LaFace et al., Virol., 162:483-486 (1988); y Dixit et al., Gene, 104:253-257 (1991). El transporte de genes terapéuticos hacia células de glioma se propone en Tenenbaum et al., Gene Therapy, 1(suplemento 1):S80 (1994).
Un concepto relativamente nuevo en el campo de la transferencia de genes es que la inmunización puede conseguirse mediante el producto de un gen transferido. Se han indicado varios intentos de "inmunización genética", incluyendo la inyección directa de ADN de secuencias de nucleoproteína A de la gripe [Ulmer et al., Science, 259:1475-1749 (1993)], inmunización con pistola biolística con secuencias de la hormona del crecimiento humana [Tang et al., Nature, 356:152-154 (1992)], e infección con vectores retrovíricos que contienen secuencias de la proteína de la envuelta gp160 de VIH-1 [Warner et al., AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, 7(8):645-655 (1991)]. Aunque estos enfoques parecen factibles, la inoculación directa de ADN puede no proporcionar respuestas inmunológicas de acción a largo plazo, y el uso de vectores retrovíricos está rodeado de graves problemas de seguridad. El uso de AAV para la inmunización genética es un nuevo enfoque que no sufre estos problemas.
Un obstáculo para el uso de AAV para la administración de ADN es la falta de esquemas muy eficaces para la encapsidación de genomas recombinantes. Se han descrito varios métodos para encapsidar genomas de rAAV para generar partículas víricas recombinantes. Todos estos métodos requieren in trans rep-cap de AAV y funciones auxiliares de adenovirus. El método más sencillo implica transfectar el genoma de rAAV en células hospedantes, seguido de una coinfección con AAV de tipo salvaje y adenovirus. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.797.368, otorgada el 10 de enero, 1989, de Carter y Trastschin, y el correspondiente artículo periodístico de Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5(11):3251-3260 (1985). Sin embargo, este método produce unos niveles inaceptablemente elevados de AAV de tipo salvaje. Otra estrategia general implica suministrar las funciones de AAV sobre un segundo plásmido (diferente del genoma de rAAV) que se cotransfecta con el plásmido de rAAV. Véase, por ejemplo, Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470 (1984), y Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 8(10):3988-3996 (1988). Si no existe solapamiento de secuencias entre los dos plásmidos, entonces se evita la producción de AAV de tipo salvaje, como se describe en Samulski et al., J. Virol., 63(9):3822-3828 (1989). Sin embargo, esta estrategia es inherentemente ineficaz, debido al requerimiento de tres acontecimientos de transferencia de ADN diferentes (la cotransfección de dos plásmidos, así como la infección con adenovirus) para generar partículas de rAAV. La producción a gran escala de rAAV mediante este método es cara y está sometida a variaciones en la eficacia de la
transfección.
Vincent et al., Vaccines, 90:353-359 (1990) indican que puede utilizarse una línea celular que expresa funciones rep-cap para encapsular rAAV. Estos métodos aún requieren la transfección del genoma de rAAV en la línea celular, y la valoración resultante de rAAV indicada es muy baja (sólo aproximadamente 10^{3} de unidades infecciosas/ml). Dutton, Genetic Engineering News, 14(1):1 y 14-15 (15 de enero, 1994) indican que la doctora Jane Lebkowski de Applied Immune Sciences fabrica rAAV utilizando plásmidos quiméricos de AAV/virus de Epstein-Barr que contienen un genoma recombinante de AAV, el gen de resistencia a la higromicina y el fragmento ori P de EBV y el gen EBNA. Los plásmidos se transfectan en células para generar líneas celulares estables. Las líneas celulares estables entonces se transfectan con funciones rep-cap de AAV de tipo salvaje, y se infectan con adenovirus para producir rAAV. Como en el método de Vincent, el método de encapsulación de Lebkowski requiere acontecimientos de transfección e infección para generar partículas de rAAV.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos eficaces para encapsular genomas de rAAV, y de rAAV específicos útiles como vectores para el transporte de ADN a células.
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de ADN como se indica en la reivindicación 4.
En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedante de mamífero transfectada de forma estable con el vector de ADN de la presente invención.
La presente invención proporciona vectores de ADN que comprenden genomas de AAV recombinante (rAAV) útiles para transportar ADN de interés que no es de AAV a una célula. Los genomas de rAAV para su uso con los vectores de la invención incluyen ITR de AAV que flanquean secuencias de ADN de interés que no es de AAV, y carecen de secuencias rep-cap que codifican proteínas rep-cap funcionales. Puesto que resulta deseable expresar el ADN de interés como un polipéptido en la célula, el genoma de rAAV también incluye un promotor (constitutivo o regulable) y una señal de poliadenilación operablemente conectada al ADN de interés para formar un módulo génico. El módulo génico también puede incluir secuencias de intrones para facilitar el procesamiento del transcrito de ARN en las células hospedantes de mamífero. Un módulo génico preferido en la actualidad incluye los siguientes segmentos de ADN: (1) el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), (2) el intrón de \beta-globina de conejo, (3) los genes de la envuelta (gp160) y rev del virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV) o de la inmunodeficiencia humana (VIH), y (4) la señal de poliadenilación de \beta-globina de conejo. Los genomas de rAAV de la invención se ensamblan en vectores útiles para la transfección de células que son permisibles a la infección por un virus auxiliar de AAV (por ejemplo, adenovirus, adenovirus con E1 deleccionado o herpesvirus). Un vector de la invención que contiene un genoma de rAAV que incluye el anterior módulo génico preferido, un gen de resistencia a la neomicina, y secuencias rep-cap de AAV de tipo salvaje, se depositó en células DH5 de E. coli en American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, el 1 de junio, 1994, y se le asignó el nº de registro ATCC
69637.
Los genomas de rAAV preferidos en la actualidad para su uso con la invención incluyen los genes de la envuelta (gp160) y rev de SIV, o los genes de la envuelta y rev de VIH, como el(los) ADN de interés que no es(son) de AAV. También se prefieren genomas de rAAV que contengan secuencias que codifiquen proteínas que pueden mejorar trastornos neurológicos tales como: secuencias que codifican el factor del crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofinas 3 y 4/5 (NT-3 y 4/5), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), factores del crecimiento transformantes (TGF), y factor del crecimiento de fibroblastos ácido y básico (a- y bFGF); secuencias que codifican la tirosina hidroxilasa (TH) y aminoácido aromático descarboxilasa (AADC); secuencias que codifican la superóxido dismutasa (SOD 1 ó 2), catalasa y glutatión peroxidasa; secuencias que codifican interferones, linfoquinas, citoquinas y sus antagonistas, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF), anticuerpos específicos de CD4, y receptores de TNF o CD4; secuencias que codifican isoformas del receptor GABA, la enzima sintetizadora de GABA ácido glutámico descarboxilasa (GAD), canales de potasio dependientes de calcio o canales de potasio sensibles al ATP; y secuencias que codifican la timidina quinasa. La invención también contempla el uso de genomas de rAAV que incluyen secuencias de globina, oncogenes, ras y p53. Los genomas de AAV recombinantes que incluyen nucleótidos antisentido que afectan a la expresión de ciertos genes, tales como genes supresores de la muerte celular (por ejemplo, bcl-2) o que afectan a la expresión de receptores de aminoácidos excitatorios (por ejemplo, receptores de glutamato y NMDA) también se contemplan para modular trastornos neurológicos.
Otras secuencias de ADN de interés contempladas por la invención incluyen secuencias de patógenos que incluyen: VIH-1 y VIH-2 (secuencias diferentes de las secuencias rev y gp160); virus T-linfotróficos humanos de tipo I y II; virus sincitial respiratorio; virus de parainfluenza de tipos 1-4; virus del sarampión; virus de las paperas; virus de la rubéola; virus de la polio de tipos 1-3; virus de la gripe de tipo A, B y C; virus de la gripe no humanos (aviar, equina, porcina); virus de la hepatitis de tipo A, B, C, D y E; rotavirus; virus de Norwalk; citomegalovirus; virus de Epstein-Barr; virus del herpes simplex de tipo 1 y 2; virus de la varicela-zoster; virus del herpes humano de tipo 6; hantavirus; adenovirus; Chlamydia pneumoniae; Chlamydia trachomatis; Micoplasma pneumoniae; Mycobacterium tuberculosis; micobacterias atípicas; virus de la leucemia felina; virus de la inmunodeficiencia felina; virus de la inmunodeficiencia bovina; virus de la anemia infecciosa equino; virus de la artritis y encefalitis caprino; y visnavirus.
Las líneas celulares de la invención se transfectan de forma estable con genomas de rAAV de la invención y con copias de genes rep y cap de AAV. Las líneas celulares preferidas son líneas celulares de mamífero, por ejemplo, líneas celulares HeLa. La infección de las líneas celulares de la invención con un virus auxiliar de AAV produce la encapsulación de los genomas de rAAV como partículas infecciosas de rAAV. Una línea celular estable preferida en la actualidad es la línea celular HeLa A64, que se depositó en ATCC el 1 de Junio de 1994, y se le asignó el nº de registro ATCC CRL 11639. La presente invención también proporciona líneas celulares estables que contienen secuencias rep y cap de AAV pero no genoma de rAAV.
Los AAV recombinantes generados por los anteriores procesos de encapsulación son útiles para transportar el ADN de interés hasta células. In vivo, los rAAV pueden utilizarse como vectores de transporte antisentido, vectores de terapia génica o vectores de vacunas (es decir, inmunización genética). El tratamiento de trastornos de enfermedad que incluyen, por ejemplo, SIDA; trastornos neurológicos, incluyendo cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, y enfermedades autoinmunológicas, tales como esclerosis múltiple, traumatismos, depresión, migraña, dolor o trastornos de ataques; leucemia de células T en adultos; paraparesis espástica tropical; infecciones del tracto respiratorio superior e inferior; sarampión; paperas; rubéola; polio; gripe; hepatitis; diarrea; infecciones por citomegalovirus sistémicas; enfermedades de tipo mononucleosis; infecciones por el virus de Epstein-Barr sistémicas; mononucleosis infecciosa clásica; infecciones por herpes simplex de tipo 1 y 2 sistémicas; infecciones por herpes simplex genitales; varicela; roséola; enfermedad febril debida al virus del herpes de tipo 6 humano; neumonía y síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos; infecciones; conjuntivitis; infecciones del tracto genital; tuberculosis pulmonar y extrapulmonar; infecciones sistémicas debidas a micobacterias atípicas; leucemia felina; SIDA felino; SIDA bovino; anemia infecciosa equina; artritis y encefalitis en cabras; y neumonía y encefalitis en ovejas, se contempla por la invención. Como vector de vacunas, el rAAV transporta un gen de interés hasta una célula, y el gen se expresa en la célula. Los vectores de vacunas pueden utilizarse para generar inmunidad intracelular si el producto génico es citoplásmico (por ejemplo, si el producto génico evita la integración o replicación de un virus). Como alternativa, puede generarse inmunidad extracelular/sistémica si el producto génico se expresa sobre la superficie de la célula o se segrega.
Un hospedante (en especial un hospedante humano) puede inmunizarse contra un polipéptido de un organismo que provoca una enfermedad, administrando al hospedante una cantidad inductora de inmunidad de un rAAV de la invención que codifica el polipéptido. La inmunización de un hospedante humano con un rAAV de la invención implica la administración mediante inoculación de una dosis inductora de inmunidad del virus a través de la vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea), mediante escarificación superficial, o mediante inoculación hacia la interior de una cavidad corporal. De forma típica, una o varias inoculaciones de entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 10.00.000 unidades infecciosas, según se mide en líneas celulares susceptibles humanas o de primates no humanos, es suficiente para lograr la inmunización de un hospedante humano. El virus que se va a utilizar como vacuna puede emplearse en forma líquida o liofilizada (en combinación con uno o más conservantes adecuados y/o agentes protectores para proteger al virus durante el proceso de liofilización). Para la terapia génica (por ejemplo, de trastornos neurológicos que pueden mejorarse mediante un producto génico específico), se administra una dosis terapéuticamente eficaz de un rAAV de la invención que codifica el polipéptido, a un hospedante que necesite dicho tratamiento. Se contempla el uso de rAAV de la invención para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad, o para proporcionar una terapia génica, a un hospedante.
Breve descripción de los dibujos
Numerosos otros aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes tras considerar su siguiente descripción detallada, haciendo referencia a los dibujos, en los que:
la Figura 1 es una representación esquemática del genoma de AAV;
la Figura 2 es una representación esquemática del plásmido psub201, que es la fuente de las secuencias de AAV2 utilizadas en los ejemplos;
la Figura 3A a 3B es un diagrama de flujo de la construcción de un genoma de rAAV de la invención en el vector pAAV/CMV/SIVrev-gp160;
la Figura 4 es un diagrama de flujo de la construcción del vector pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap útil para generar una línea celular estable que produce rAAV de la invención; y
la Figura 5 es una representación esquemática de un método para encapsular rAAV utilizando líneas celulares estables de hospedantes de la invención.
Descripción detallada de los dibujos
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que tratan de la producción y uso de rAAV de la invención. El Ejemplo 1 describe la construcción de un vector que incluye un genoma de rAAV que contiene los genes de la envuelta (gp160) y rev de SIV, mientras que el Ejemplo 2 describe la construcción de un vector que incluye los genes rep-cap de AAV y un gen de resistencia a la miocina. El Ejemplo 3 expone la construcción de un vector que se utiliza para generar líneas celulares estables que producen rAAV a partir de los vectores descritos en los Ejemplos 1 y 2. La generación de líneas celulares estables que producen rAAV que codifican las proteínas gp160 y rev de SIV se detalla en el Ejemplo 4. El Ejemplo 5 expone un procedimiento preferido para purificar rAAV a partir de líneas celulares estables de la invención. El Ejemplo 6 describe la generación de líneas celulares estables que expresan los genes rep-cap de AAV. El Ejemplo 7 presenta los resultados de la infección de diversas líneas celulares y células de mamífero con los rAAV descritos en el Ejemplo 4, que demuestran que la proteína gp160 se expresa en las células infectadas. El Ejemplo 8 describe la generación de líneas celulares estables que producen un rAAV que incluye el gen de \beta-galactosidasa como ADN de interés y que es útil como virus de control positivo para la expresión de un ADN de interés en células o tejidos diana. El Ejemplo 9 presenta los resultados de experimentos en los que un rAAV de la invención se utilizó para expresar un ADN de interés in vivo. El Ejemplo 10 describe métodos contemplados por la invención para aumentar la valoración de rAAV producidos por líneas celulares estables.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Un vector que incluye un genoma de rAAV que contiene un módulo génico de envuelta (gp160) y rev de SIV se construyó a partir de un plásmido existente denominado psub201 [Samulski et al., supra]. La Figura 2 es un diagrama del plásmido psub201 en el que se muestran los sitios de endonucleasas de restricción y se abrevian como sigue: P, PvuII; X, XbaI; B, BamHI; H, HindIII; y N, NaeI. El plásmido contiene un genoma de AAV2 de tipo salvaje modificado clonado entre los sitios de restricción PvuII. La secuencia de ADN del genoma de AAV2 de tipo salvaje se presenta en SEQ ID NO: 1. La secuencia de AAV2 se modificó para que incluyera sitios de restricción convenientes. De forma específica, se añadieron dos sitios de restricción XbaI a través de la adición de conectores en las posiciones de la secuencia 190 y 4484. Estos sitios son internos a las repeticiones terminales invertidas (ITR) de 191 pb que incluyen las ITR de 145 pb del genoma de AAV. La inserción de estos sitios permite la eliminación completa del fragmento interno de 4,3 kb que contiene los genes rep-cap de AAV tras la digestión con XbaI del plásmido. En la Figura 2, las ITR de 191 pb se indican mediante flechas invertidas.
El vector del genoma de rAAV de la invención (pAAV/CMV/SIVrev-gp160) se generó en varias etapas.
En primer lugar, el plásmido psub201 se digirió con XbaI y se aisló el fragmento del vector de aproximadamente 4 kb que incluye las ITR de AAV. Entonces se insertó un módulo de expresión génico de CMV entre las ITR de AAV mediante acoplamiento de extremos romos. El módulo de expresión de CMV se derivó como un fragmento de ADN XbaI-AfilIII de 1,8 kb a partir del vector pCMV-NEO-BAM descrito en Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13-25 (1989). Antes del acoplamiento, los extremos moleculares se rellenaron utilizando un fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. El módulo de expresión de CMV contenía una porción de 750 pb del promotor inmediato temprano de CMV, seguido de un intrón de 640 pb y una secuencia de señal de poliadenilación de 360 pb que se derivaron del gen de \beta-globina de conejo. Entre el intrón y las secuencias de poliA se encontraban dos sitios de clonación: un sitio BamHI exclusivo y dos sitios de restricción EcoRI flanqueantes. El vector resultante se denominó pAAV/CMV. Véase la Figura 3A, en la que se muestran los sitios de ruptura por endonucleasas de restricción y se abrevian como sigue: B, BamHI; E, EcoRI; N, NaeI; y P, PvuII.
En segundo lugar, el vector de expresión pAAV/CMV se linealizó en el sitio BamHI y se crearon extremos romos en los extremos pegajosos con Klenow. Un fragmento subgenómico de 2,7 kb de SIV, generado mediante PCR, que contiene las secuencias de la envuelta (gp160) y rev [SEQ ID NO: 2, Hirsch et al., Nature, 339: 389-392 (1989)] se clonó en el sitio BamHI con extremos romos. El vector del genoma de AAV recombinante resultante, pAAV/CMV/SIVrev-gp160, tiene una longitud de 8,53 kb. Véase la Figura 3B, en la que se muestran los sitios de ruptura por endonucleasas de restricción y se abrevian como sigue: N, NaeI; y P, PvuII. El vector contiene los siguientes segmentos de ADN en secuencia: (1) una ITR de AAV, (2) el promotor de CMV, (3) el intrón de \beta-globina de conejo, (4) las secuencias de la envuelta y rev de SIV, (5) la señal de poliadenilación de \beta-globina de conejo, y (6) una ITR de AAV. En ensayos de transfección transitoria de células 293 humanas, este vector produce unos altos niveles de expresión de la proteína gp160 de SIV, según se determina mediante ensayos de radioinmunoprecipitación utilizando sueros policlonales de monos infectados con SIV.
La invención contempla específicamente la sustitución, mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, de las siguientes secuencias por las secuencias de envuelta/rev de SIV en el anterior vector: secuencias de envuelta/rev de VIH-1 (la secuencia de envuelta/rev de VIH-1_{MN} se indica en SEQ ID NO: 3); factor de crecimiento nervioso [Levi-Montalcini, Science, 237: 1154-1162 (1987)]; factor neurotrófico ciliar [Manthorpe et al., comienza en p. 135 en Nerve Growing Factors, Wiley and Sons (1989)]; factor neurotrófico derivado de células gliales [Lin et al., Science, 260: 1130-1132 (1993)]; factores del crecimiento transformantes [Puolakkainen et al., comienza en p. 359 en Neurotrophic Factors, Academic Press (1993)]; factores del crecimiento de fibroblastos ácidos y básicos [Unsicker et al., comienza en p. 313 en Neurotrophic Factors, Academic Press (1993)]; neurotrofina 3 [Maisonpierre et al., Genomics, 10: 558-568 (1991)]; factor neurotrófico derivado de cerebro [Maisonpierre, supra]; neurotrofina 4/5 [Berkemeier et al., Neuron, 7: 857-866 (1991)]; tirosina hidroxilasa [Grima et al., Nature, 326: 707-711 (1987)]; y aminoácido aromático descarboxilasa [Sumi et al., J. Neurochemistry, 55: 1075-1078 (1990)].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Un plásmido denominado pSV40/neo/rep-cap que contiene los genes rep-cap de AAV y un gen de resistencia a la neomicina se construyó para ser utilizado junto con el vector del genoma de AAV descrito en el Ejemplo 1 para generar una línea celular estable que produce rAAV.
Un plásmido denominado pAAV/SVneo (Samulski et al., supra) se digirió con EcoRI y BamHI para liberar un inserto de 2,7 kb que incluye una porción de 421 pb del promotor temprano de SV40, un gen de resistencia a la neomicina de 1,4 kb, y un fragmento de ADN de 852 pb que contiene el sitio de escisión t pequeño de SV40 y una señal de poliadenilación de SV40. Este inserto liberado se clonó en los sitios EcoRI y BamHI de pBLUESCRIPT KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) para generar el plásmido pSV40/neo de 5,66 kb. Después, el fragmento de ADN de aproximadamente 4,3 kb que contiene los genes rep-cap de AAV, derivado de la digestión de psub201 con XbaI como se describe en el Ejemplo 1, se acopló al sitio de restricción XbaI de pSV40/neo para crear el plásmido pSV40/neo/rep-cap (aproximadamente 10 kb). La construcción del plásmido se detalla en la primera mitad de la Figura 4, en la que se muestran los sitios de endonucleasas de restricción y se abrevian como sigue: B, BamHI; E, EcoRI; P, PvuII; N, NotI; RV, EcoRV; y X, XbaI. Este plásmido era funcional en ensayos transitorios de actividad rep y cap, y en último término se utilizó en sí mismo para derivar líneas celulares estables (véase el Ejemplo 5 a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Un vector final que se utiliza para generar líneas celulares estables que producen rAAV se generó a partir del vector pAAV/CMV/SIVrev-gp160 (Ejemplo 1) y el plásmido pSV40/neo/rep-cap (Ejemplo 2).
La construcción implica retirar el módulo génico neo-rep-cap de pSV40/neo/rep-cap e insertarlo en un sitio NaeI exclusivo en pAAV/CMV/SIVrev-gp160 (véase la Figura 3B). De forma específica, el vector pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap se produjo mediante el aislamiento de una banda en gel de agarosa de un fragmento de ADN EcoRV-NotI de 7,0 kb que contiene los dominios de expresión SV/neo y rep-cap a partir de pSV40/neo/rep-cap. Se crearon extremos romos en los extremos pegajosos con Klenow, y el fragmento se acopló en el sitio NaeI de extremos romos de pAAV/CMV/SIVrev-gp160. Véase la Figura 4. El vector pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap (ATCC 69637) contiene los siguientes elementos: (1) el genoma de rAAV; (2) los genes rep-cap de AAV; y (3) el gen de resistencia a la neomicina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
El vector pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap se utilizó para generar líneas celulares estables que contienen el genoma de rAAV de la invención y los genes rep-cap de AAV.
Células HeLa con una confluencia de 70% se transfectaron con 10 \mug de ADN del plásmido pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap en placas de 100 mm. Las células se transfectaron durante 6 horas después de la formación de complejos de DOTAP/ADN en medio sin suero como indica el protocolo del fabricante (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN). Después de la retirada del medio de transfección se añadió a las células medio DMEM que contiene suero bovino fetal al 10%. Tres días después, se utilizó medio suplementado con 700 \mug/ml de geneticina (Gibco-BRL, Gaithesburg, MD) para seleccionar células que expresasen de forma estable el gen de resistencia a la neomicina. Se añadió medio DMEM fresco que contiene geneticina cada cuatro días. Los clones resistentes a la geneticina se seleccionaron a los 10-14 días después de añadir el medio selectivo. Se seleccionó un total de 55 colonias y se trasladaron a placas de 24 pocillos y se expandieron para su posterior análisis.
Las 55 líneas celulares HeLa resistentes a la neomicina se seleccionaron, en primer lugar, para la actividad del gen rep funcional; 21 resultaron positivas. La actividad del gen rep se ensayó infectando las líneas celulares con adenovirus de tipo 5 (Ad5). La infección con el adenovirus transactiva los genes rep y cap. Esto da como resultado la replicación del genoma de rAAV y la posterior encapsidación de estas secuencias en partículas rAAV infecciosas. En la Figura 5 se muestra una representación esquemática de la producción de rAAV. Después del máximo efecto citopático inducido por Ad5 (CPE; las células se redondean y hay 90% de desprendimiento del matraz de cultivo), se prepararon lisados celulares y se aisló ADN de Hirt (ADN de bajo peso molecular) [Hirt, J. Mol. Biol., 26:365-369 (1967)]. Se utilizó un análisis de la transferencia Southern para visualizar la síntesis de formas replicativas de AAV recombinante (rAAV) (formas monocatenarias, monómeras y dímeras). Los pocillos control que no recibieron Ad5 siempre eran negativos. Las líneas celulares con altos niveles relativos de actividad del gen rep se seleccionaron para su posterior
estudio.
Para ensayar la funcionalidad del gen cap, se infectaron líneas celulares con Ad5 y se prepararon lisados aclarados después de desarrollarse el CPE máximo. Se utilizaron los lisados celulares, Ad5, y AAV de tipo salvaje para infectar células HeLa. Después del desarrollo de CPE inducido por Ad5 (72 horas), se aisló ADN de Hirt y se realizó un análisis de la transferencia Southen. Los lisados de las líneas celulares que produjeron secuencias replicativas de rAAV hibridables con gp160 (gp160 de SIV) puntuaron como positivas para la producción de cápsidas.
Se derivó una valoración infecciosa en unidades/ml (IU/ml) de rAAV producida por cada línea celular coinfectando células C12 (que muestran una expresión estable de los genes rep y cap) con Ad5 y diluciones en serie en diez veces de los lisados de líneas celulares aclarados que se van a ensayar. Después de un CPE máximo inducido por Ad5, se aisló ADN de Hirt y se realizó un análisis de la transferencia Southern para detectar la presencia de formas replicativas de rAAV. La dilución de punto final que produjo intermedios de replicación monómeros y dímeros visibles se tomó como la valoración. La estimación de la valoración se basó en dos a cuatro experimentos duplicados.
Los resultados de la caracterización de ocho de las 55 líneas celulares se muestran en la Tabla 1 a continuación, en la que "ND" indica un valor no determinado.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
1 
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular A64 (ATCC CRL 11639) produjo una alta valoración de rAAV (10^{6} IU/ml) en lisados aclarados. Esta valoración es aproximadamente 1000 veces mayor que la valoración de rAAV indicada por Vincent et al., supra.
Los rAAV producidos por las diversas líneas celulares también se ensayaron para su capacidad para expresar gp160 de SIV en células HeLa infectadas con el virus recombinante. Se generaron cepas concentradas de rAAV producidos por las ocho líneas celulares estables listadas en la Tabla 1. Los lisados celulares que contenían partículas de rAAV se sometieron a una purificación en gradiente de densidad en etapas (CsCl). Después de una diálisis de desalinización y de la inactivación por calor de Ad5, las partículas de rAAV se utilizaron para infectar (transducir) células HeLa en cultivo. Se siguieron dos líneas de investigación. En primer lugar, las células transducidas se ensayaron para la presencia de ARNm específico de gp160 de SIV llevando a cabo una RT-PCR sobre el ARN total recogido 72 horas después de la transducción. Los cebadores específicos de gp160 de SIV amplificaron un fragmento predicho de 300 pb sólo en presencia de transcriptasa inversa y Taq polimerasa; las muestras ensayadas sin transcriptasa inversa eran siempre negativas. En segundo lugar, se transdujeron células HeLa con diversas diluciones de la misma cepa rAAV/SIV que se describió anteriormente y, 72 horas después de la transducción, se realizó una inmunofluorescencia indirecta en las células infectadas. En todas las diluciones ensayadas (hasta 1:200) se detectaron células positivas para la proteína gp160 de SIV; las diluciones menores tenían, evidentemente, más células positivas.
La línea celular A64 se ensayó para la producción de AAV de tipo salvaje mediante un método convencional. La línea celular se infectó con adenovirus para producir rAAV como un lisado. El lisado entonces se utilizó para infectar células HeLa normales: (i) sólo; (ii) con adenovirus; o (iii) con adenovirus y AAV de tipo salvaje. Como control, células HeLa se infectaron con adenovirus y AAV de tipo salvaje sin rAAV. Se preparó ADN de Hirt y se analizó mediante transferencia Southern (dos transferencias diferentes) para formas replicantes de rAAV o de AAV de tipo salvaje. No se detectó AAV de tipo salvaje en células A64 que no fueron expuestas a AAV de tipo salvaje.
Debido a que la presente invención implica el establecimiento de líneas celulares estables que contengan no sólo copias de los genes rep y cap de AAV, sino también del genoma de rAAV (con ITR flanqueando el ADN de interés), se produce rAAV simplemente infectando la línea celular con adenovirus. No se requiere la transfección de ADN exógeno, aumentando, con ello, la eficacia de la producción de rAAV comparada con los métodos previamente descritos. Otras características significativas de la invención es que no se produce AAV de tipo salvaje y que la transformación de escala para la producción de rAAV es fácil y sólo está limitada por las restricciones normales del crecimiento celular en cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Se desarrolló un método para aislar y purificar rAAV a partir de líneas celulares estables (productoras).
Las células productoras (por ejemplo, las células A64 del Ejemplo 4) se sembraron con un densidad celular de 3 x 10^{6} células productoras por 175 cm^{2} de superficie específica en medio de crecimiento. Las células alcanzaron una densidad de aproximadamente 8 x 10^{6} células después de 16-18 horas, y entonces se infectaron con adenovirus (Ad5) a una multiplicidad de infección (moi) de 5 durante 1-2 horas en medio de crecimiento. Se utilizó un volumen de infección de 15 ml, y después de las 1-2 horas de infección, se añadieron 10 ml de medio de crecimiento a cada matraz para obtener un volumen final de 25 ml (como alternativa, Ad5 puede añadirse directamente: eliminando todo menos 15 ml del medio de crecimiento y añadiendo Ad5 en un volumen de 10 ml (diluido en HBSS) para producir un volumen final de 25 ml).
Las células se recogieron aproximadamente 48-60 horas después de la infección cuando la mayoría de las células se desprendieron del matraz después de una agitación vigorosa. Las células entonces se tiñeron con azul de tripano para determinar el porcentaje de células viables. Resulta deseable que más de 80% sean viables. Las células entonces se trasladaron a botellas cónicas desechables de 250 ml (Corning) y se sedimentaron a 1000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante resultante se retiró, guardando una parte alícuota, y las células se suspendieron en tampón TM (Tris 50 mM, pH 8,0, y MgCl_{2} 1 mM) a una densidad de 5 x 10^{6} células/ml. Las células se sometieron a tres ciclos de congelación/descongelación en hielo seco con agitación en vórtice durante 2 minutos entre cada descongelación. Las células lisadas entonces se calentaron hasta 56ºC durante 30 minutos a una hora, con agitación en vórtice cada 7,5 minutos durante la última descongelación. Se añadió desoxicolato al 10% al lisado hasta una concentración final de 1%, y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos con una agitación en vórtice intermitente para lograr una lisis completa. Si es necesario para lograr una lisis completa, la mezcla se sonica tres veces en el ajuste máximo durante 2 minutos cada vez. Se utilizó un hemocitómetro para confirmar la lisis celular completa. El residuo celular se sedimentó a 2000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Se guardó el sobrenadante que contiene
rAAV.
El rAAV se aisló utilizando un lecho de CsCl 1,31 g/ml. Se extendieron 21 ml del sobrenadante del lisado sobre un lecho de CsCl de 14 ml en un tubo SW-28, y se centrífugo a 16.000 rpm, 10ºC, durante 16 horas. El sobrenadante resultante se aspiró y el sedimento de rAAV se lavó con HBSS para eliminar el CsCl residual. El sedimento de rAAV se redisolvió en Tris 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM (tampón TMN) el volumen más pequeño manejable (aproximadamente 500 \mul/sedimento) y se dejó que se hidratase durante la noche. Después se calentó hasta 56ºC durante 30 minutos agitando en vórtice cada 5 minutos. En este punto final, el virus se dializó contra el tampón TMN para eliminar todas las trazas de cesio si el virus no se va purificar aún más.
El rAAV puede purificarse aún más mediante formación de bandas isopícnica. Esto resulta apropiado en condiciones en las que el virus se va a administrar in vivo. El rAAV hidratado se llevó hasta una densidad de CsCl de 1,41 g/ml, y después se agitó en un tubo SW-41 a 30K durante 48 horas a 10ºC. La porción superior del gradiente que contiene adenovirus (densidad de 1,34-1,36 g/ml) se rechazó y la porción restante del gradiente de CsCl se diluyó con TMN hasta una densidad hidrostática menor que 1,1 g/ml. Entonces el rAAV se sedimentó mediante una centrifugación durante la noche a >60.000 x g. El rAAV se resuspendió en una cantidad mínima de tampón TMN suplementado con gelatina al 1%. Para una hidratación eficaz, el sedimento se dejó en reposo durante la noche a 4ºC. Entones se formaron partes alícuotas de rAAV y se conservaron a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
Al mismo tiempo que la generación de las células estables descritas en el Ejemplo 4, se establecieron líneas celulares HeLa estables mediante métodos similares que contienen genes rep-cap pero no genoma de rAAV utilizando el plásmido pSV40/neo/rep-cap (Ejemplo 2). Se aisló y caracterizó un total de 52 líneas celulares HeLa resistentes a la neomicina.
Para ensayar la función del gen rep, cada línea celular se infectó con Ad5 y posteriormente se transfectó con pAAV/CMV/SIVrev-gp160. Después de CPE inducido por Ad5 (72 horas), se aisló ADN de Hirt y se realizó un análisis de la transferencia Southern. La función rep obtuvo una puntuación positiva en las líneas celulares que produjeron secuencias gp160 de rAAV monómeras y dímeras. La intensidad de la señal autorradiográfica se utilizó como una medida relativa de la expresión del gen rep (1-5+). Las muestras control sin Ad5 nunca produjeron formas replicativas de rAAV. La competencia del gen cap se ensayó de una manera similar (infección con Ad5 y transfección con pAAV/CMV/SIVrev-gp160), excepto que se preparó un lisado celular aclarado después del desarrollo del CPE máximo. Entonces se coinfectaron células HeLa con una porción del lisado celular aclarado, Ad5, y AAV de tipo salvaje. Se aisló ADN de Hirt 72 horas después, y se utilizó un análisis de hibridación para visualizar la existencia de formas replicativas de rAAV/gp160 (monómeras y dímeras). En el ensayo descrito, la línea celular C12 produjo la mayor proporción relativa de secuencias de rAAV/gp160/120.
Los resultados de los ensayos de caracterización de ocho líneas celulares se presentan en la Tabla 2, en la que la abreviatura "ND" indica que no se determinó un valor.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
2
Existen dos usos principales para las líneas celulares estables que expresan secuencias rep-cap: (1) la generación de partículas rAAV si las líneas celulares se transfectan con un genoma de rAAV y se infectan con un virus auxiliar; y (2) la determinación de valoraciones infecciosas de rAAV. Para la estimación de valoraciones infecciosas de rAAV, estas líneas celulares se coinfectan con adenovirus y diluciones en serie de la cepa de rAAV. Después del CPE máximo, se aisló ADN de Hirt y se visualizaron las formas replicativas de rAAV mediante análisis de la transferencia Southern. La valoración de punto final (última dilución de la cepa de rAAV que produce una señal de hibridación positiva) se utiliza entonces para determinar la valoración infecciosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7
Se ensayó la capacidad de rAAV producido por la línea celular HeLa A64 para infectar (transducir) y producir proteína gp160 de SIV en diversos tipos celulares de mamífero, además de células HeLa (véase el Ejemplo 4). El rAAV (a una multiplicidad de infección de aproximadamente 1) se utilizó para infectar células en una monocapa o en una suspensión, dependiendo del tipo celular. Tres días después de la infección con rAAV, las células se fijaron en acetona/metanol y se evaluaron para la producción de gp160 mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando antisuero policlonal a partir de un mono infectado con SIV. Las siguientes células o líneas celulares se infectaron y se demostró que producían gp160: células cerebrales de rata fetal (neuronas y células gliales), fibroblastos 3T3 de ratón, vagina de ragón, vagina humana, colon humano, linfocitos humanos y de mono, y células 293. No se identificó ningún tipo celular no permisivo. Estos resultados demuestran que el rAAV producido por la línea celular A64 infecta a una amplia gama de tipos celulares de mamífero y conduce a la expresión sobre la superficie celular del producto génico de la envuelta de SIV, gp160, en las células transducidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8
Se generaron líneas celulares estables que producían rAAV que porta el gen de \beta-galactosidasa como gen de interés. Estos rAAV son útiles como control positivo para ensayar la expresión de un ADN de interés en una célula o tejido diana.
Se construyó un vector como pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap que incluía un módulo de expresión génica de \beta-galactosidasa (Clontech, Palo Alto, CA) que contiene el promotor de CMV humano, el gen de \beta-galactosidasa de E. coli, y la secuencia de ruptura/poliadenilación de SV40 en lugar del intrón de \beta-globina de conejo, rev y secuencias de la envuelta de SIV, y una señal de poliadenilación de \beta-globina de conejo entre las ITR de AAV. Este módulo de expresión génica de \beta-galactosidasa se clonó entre las ITR de AAV mediante métodos recombinantes
convencionales.
Se generaron líneas celulares HeLa estables que producen rAAV que contiene el gen de \beta-galactosidasa (rAAV/\beta-gal) como se describe en el Ejemplo 4, utilizando el vector anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
El rAAV/\beta-gal del Ejemplo 8 se utilizó para demostrar el uso de rAAV de la invención para la transferencia de genes hacia los cerebros de ratones vivos. Se inyectó directamente rAAV/\beta-gal en los cerebros de ratones, y entonces los cerebros se examinaron para detectar evidencias de actividad \beta-galactosidasa.
Ratones Balb/c (n = 3; machos; 9 meses de edad) se anestesiaron y se aseguraron sobre una plataforma estereotáctica murina. Utilizando una técnica estéril, se inyectó rAAV/\beta-gal (1 \mul que contiene 3 x 10^{6} unidades infecciosas) en el hipocamplo derecho. Otros ratones (n = 3) recibieron una inyección de diluyente como control. Una semana después de la inyección, los ratones se sacrificaron mediante exanguinación cardíaca, seguido de una infusión secuencial de 50 ml de disolución salina tamponada con fosfato heparinizada, después 50 ml de una mezcla de paraformaldehído (al 0,5%) y glutaraldehído (al 2,5%) en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,3). Se retiraron los cerebros completos, se posfijaron en la misma mezcla de fijación (2 horas) y se congelaron en O.C.T. Secciones criostáticas (10 \mum) se colocaron sobre portaobjetos de microscopio revetidos con poli-L-lisina y se conservaron a -20ºC. Los portaobjetos se descongelaron a temperatura ambiente, se volvieron a fijar (5 minutos a 4ºC), se lavaron dos veces en PBS, y se trasladaron a un tinte X-gal (un sustrato para la actividad enzimática de \beta-galactosidasa). Después de una incubación durante la noche a 37ºC, los portaobjetos se lavaron dos veces en PBS, se contratiñeron con rojo rápido nuclear, y se estudiaron al microscopio para detectar células teñidas de azul (células en las que se está expresando la \beta-galactosidasa).
En los cerebros de los ratones inyectados con rAAV/\beta-gal, las células teñidas de azul en el hipocampo pudieron detectarse con facilidad tras el estudio microscópico. En los cerebros de ratones inyectados con diluyente (controles), no se encontraron células teñidas de azul.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
La invención contempla diversos métodos para aumentar la valoración de rAAV generados a partir de líneas celulares estables que implican proporcionar más genes rep y cap de AAV a las líneas celulares.
En un primer método que demuestra la utilidad de proporcionar más genes rep y cap, una línea celular productora se transfecta con un plásmido auxiliar que porta genes rep y cap de AAV antes de la infección con adenovirus. Los resultados de los experimentos en los que una línea celular productora de rAAV/\beta-gal (H44) transfectada de esta manera se muestran en la Tabla 3 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
3
En un segundo método, los genes rep y cap de AAV se colocan en otro plásmido que contiene un origen EBV o BPV de la replicación del ADN y un marcador de resistencia a un fármaco (higromicina). El plásmido se transfecta en una línea celular productora y entonces se seleccionan nuevas líneas celulares en neomicina e higromicina. Esta presión selectiva da como resultado líneas celulares estables que contienen los genomas de rAAV y múltiples copias de los genes rep y cap de AAV.
En un tercer método, los genes rep y cap de AAV se clonan en el genoma de adenovirus en la posición E3 bajo el control del operador de tetraciclina.
Aunque la presente invención se ha descrito en términos de las realizaciones preferidas, se entenderá que los expertos en la técnica realizarán variaciones y mejoras. Por tanto, sólo deben aplicarse a la invención las limitaciones que aparecen en las reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Johnson, Philip R.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Materiales y métodos de virus adenoasociados
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray y Borun
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6300 Sears Tower, 233 S. Wacker Drive
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Chicago
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 60606
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/254.358
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-JUN-1994
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Noland, Greta E.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 35.302
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 32634
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (312) 474-6300
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (312) 474-0448
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TÉLEX: 25-3856
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4680 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2658 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2571 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
9
10

Claims (9)

1. Un vector de ADN que comprende un genoma de virus adenoasociado recombinante y secuencias de ADN que codifican proteínas rep/cap adenoasociadas, en el que dicho genoma de virus adenoasociado recombinante comprende repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado que flanquean a secuencias de ADN que no son de virus adenoasociado unidas operablemente a un promotor y secuencias de poliadenilación, y en el que dicho genoma de virus adenoasociado recombinante carece de secuencias rep-cap que codifiquen proteínas rep-cap funcionales.
2. El vector de ADN de la reivindicación 1, en el que dichas secuencias de ADN que no son de virus adenoasociado son secuencias de ADN que codifican una proteína de un virus de la inmunodeficiencia.
3. El vector de ADN de la reivindicación 2, que es el vector pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap (ATCC 69637).
4. Una célula hospedante de mamífero transfectada de forma estable con el vector de ADN de la reivindicación 1.
5. La célula hospedante de mamífero de la reivindicación 4, en la que dichas secuencias de ADN que no son de virus adenoasociado son secuencias de ADN que codifican una proteína de un virus de la inmunodeficiencia.
6. La célula hospedante de mamífero de la reivindicación 5, que es la línea celular HeLa A64 (ATCC CRL 11639).
7. Un método para producir virus adenoasociados recombinantes infecciosos, que comprende la etapa de infectar una célula hospedante según la reivindicación 4, con un virus auxiliar de virus adenoasociado.
8. El método de la reivindicación 7, en el que dicho virus auxiliar contiene genes rep-cap de virus adenoasociado insertados en su genoma.
9. Un vector de ADN según la reivindicación 1, en el que dichas secuencias de ADN que no son de virus adenoasociado son secuencias de ADN que codifican un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en tirosina hidroxilasa, aminoácido aromático descarboxilasa, factor del crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, NT-3, NT-4/5, factor neurotrófico derivado de células gliales, y factor del crecimiento de fibroblastos.
ES95927113T 1994-06-06 1995-06-06 Vectores que codifican genomas de aav recombinantes. Expired - Lifetime ES2302331T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US254358 1988-10-06
US08/254,358 US5658785A (en) 1994-06-06 1994-06-06 Adeno-associated virus materials and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2302331T3 true ES2302331T3 (es) 2008-07-01

Family

ID=22963991

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES95927113T Expired - Lifetime ES2302331T3 (es) 1994-06-06 1995-06-06 Vectores que codifican genomas de aav recombinantes.

Country Status (11)

Country Link
US (3) US5658785A (es)
EP (2) EP0764213B1 (es)
JP (3) JP3720845B2 (es)
AT (1) ATE394498T1 (es)
AU (1) AU710804B2 (es)
CA (2) CA2576396A1 (es)
DE (1) DE69535749D1 (es)
DK (1) DK0764213T3 (es)
ES (1) ES2302331T3 (es)
PT (1) PT764213E (es)
WO (1) WO1995034670A2 (es)

Families Citing this family (346)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020159979A1 (en) * 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5658785A (en) * 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) * 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US6342390B1 (en) * 1994-11-23 2002-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Lipid vesicles containing adeno-associated virus rep protein for transgene integration and gene therapy
US6924128B2 (en) * 1994-12-06 2005-08-02 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors
US7745416B2 (en) * 1995-04-11 2010-06-29 The Regents Of The University Of California Method for in vivo regulation of cardiac muscle contractility
ES2337853T3 (es) * 1995-06-07 2010-04-29 University Of North Carolina At Chapel Hill Transduccion de mioblastos por vaa.
US6506379B1 (en) 1995-06-07 2003-01-14 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Intramuscular delivery of recombinant AAV
US20030206891A1 (en) * 1995-06-07 2003-11-06 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamycin-based biological regulation
US5846528A (en) 1996-01-18 1998-12-08 Avigen, Inc. Treating anemia using recombinant adeno-associated virus virions comprising an EPO DNA sequence
US5858351A (en) * 1996-01-18 1999-01-12 Avigen, Inc. Methods for delivering DNA to muscle cells using recombinant adeno-associated virus vectors
US5962313A (en) * 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US5837681A (en) * 1996-02-23 1998-11-17 Amgen Inc. Method for treating sensorineural hearing loss using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5929041A (en) * 1996-02-23 1999-07-27 Amgen Inc. Method for preventing and treating sensorineural hearing loss and vestibular disorders using glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF) protein product
US6455277B1 (en) 1996-04-22 2002-09-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides
US7138251B1 (en) 1996-04-22 2006-11-21 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a neurotrophic factor receptor
US6541012B2 (en) 1996-06-24 2003-04-01 Christoph Bogedain System for the production of AAV vectors
DE19625188A1 (de) * 1996-06-24 1998-01-08 Medigene Gmbh System zur Herstellung von AAV-Vektoren
US6294370B1 (en) 1997-06-24 2001-09-25 Medigene Ag System for the production of AAV vectors
US5866552A (en) * 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
ATE465267T1 (de) * 1996-09-06 2010-05-15 Univ Pennsylvania Rekombinante aav zur herstellung eines medikaments für die gentherapie von muskelzellen
EP0933997A4 (en) * 1996-09-06 2000-08-16 Chiron Corp METHODS AND COMPOSITIONS FOR LIVER-SPECIFIC ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC MOLECULES USING RECOMBINANT AAV VECTORS
US6924123B2 (en) 1996-10-29 2005-08-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Lentiviral LTR-deleted vector
GB9622500D0 (en) 1996-10-29 1997-01-08 Oxford Biomedica Ltd Therapeutic gene
GB2333527B (en) * 1996-10-29 2001-05-02 Oxford Biomedica Ltd Therapeutic gene
AU6975198A (en) * 1997-04-15 1998-11-11 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cdna for human gdnf and promoter therefor which allows regulated and constitutive expression
EP0969876A2 (en) * 1997-04-17 2000-01-12 Paola Leone Delivery system for gene therapy to the brain
US6242426B1 (en) * 1997-07-25 2001-06-05 Avigen, Inc. Induction of immune response to antigens expressed by recombinant adeno-associated virus
US6043221A (en) 1997-07-30 2000-03-28 Amgen Inc. Method for preventing and treating hearing loss using a neuturin protein product
WO1999006576A1 (en) 1997-08-04 1999-02-11 Calydon, Inc. A human glandular kallikrein enhancer, vectors comprising the enhancer and methods of use thereof
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6251677B1 (en) 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
CA2304168A1 (en) * 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
AU1269699A (en) * 1997-10-08 1999-04-27 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Chimeric parvovirus-based recombinant vector system that specifically targets the erythroid lineage
US6346415B1 (en) * 1997-10-21 2002-02-12 Targeted Genetics Corporation Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRS) for use with recombinant AAV vectors
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
ATE269412T1 (de) * 1998-04-24 2004-07-15 Univ Florida Rekombinanter adeno-assoziierter viraler vektor, der alpha-1 antitrypsin kodiert, zur gentherapie
CA2329259C (en) 1998-05-27 2003-08-05 Avigen, Inc. Convection-enhanced delivery of aav vectors
US6416992B1 (en) 1998-10-13 2002-07-09 Avigen, Inc. Compositions and methods for producing recombinant adeno-associated virus
US6200560B1 (en) * 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6759237B1 (en) * 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
ES2340230T3 (es) * 1998-11-10 2010-05-31 University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores viricos y sus procedimientos de preparacion y administracion.
US6790657B1 (en) * 1999-01-07 2004-09-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Lentivirus vector system
JP2002535289A (ja) * 1999-01-22 2002-10-22 ドウアリング，マシユー・ジヨン 神経疾患のワクチン媒介治療
US6387368B1 (en) 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US20040043488A1 (en) * 1999-02-17 2004-03-04 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Adeno-associated viral gene-transfer vector system
WO2000054595A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 John Guy Recombinant adeno-associated virus transfer of genes affecting demyelination
JP4693244B2 (ja) * 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
WO2000058479A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Amgen Inc. Beta secretase genes and polypeptides
US6893865B1 (en) 1999-04-28 2005-05-17 Targeted Genetics Corporation Methods, compositions, and cells for encapsidating recombinant vectors in AAV particles
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6793926B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
EP1939300A1 (en) 1999-05-28 2008-07-02 Targeted Genetics Corporation Methods and compositions for lowering the level of tumor necrosis factor (TNF) in TNF-associated disorders
JP2003501043A (ja) * 1999-05-28 2003-01-14 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 腫瘍壊死因子（ｔｎｆ）関連障害において、ｔｎｆのレベルを低下させるための方法および組成物
EP1204739B1 (en) * 1999-08-09 2008-08-06 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs
EP1916258B1 (en) 1999-08-09 2014-04-23 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs
CN1167662C (zh) * 1999-08-31 2004-09-22 旭硝子株式会社 邻二氯酰基氟的制备方法
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7115391B1 (en) 1999-10-01 2006-10-03 Genovo, Inc. Production of recombinant AAV using adenovirus comprising AAV rep/cap genes
WO2001025253A2 (en) 1999-10-01 2001-04-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Temperature-sensitive regulation of viral vector production
JP2003511082A (ja) * 1999-10-12 2003-03-25 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 第ｖｉｉｉ因子をコードするアデノ随伴ウィルスベクターとその使用法
FR2804028B1 (fr) * 2000-01-21 2004-06-04 Merial Sas Vaccins adn ameliores pour animaux de rente
EP1257656A2 (en) 2000-01-26 2002-11-20 Chiron Corporation Recombinant aav packaging systems
US6821775B1 (en) * 2000-02-11 2004-11-23 Genvec, Inc. Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
US8623379B2 (en) 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
EP2388015A1 (en) * 2000-03-02 2011-11-23 Emory University DNA expression vectors and methods of use
US7514239B2 (en) 2000-03-28 2009-04-07 Amgen Inc. Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof
ATE438414T1 (de) * 2000-06-01 2009-08-15 Univ North Carolina Verfahren und zusammensetzungen zur kontrollierter abgabe von rekombinant parvovirus vektoren
PT2077279E (pt) 2000-06-28 2012-09-14 Amgen Inc Moléculas do receptor de linfopoietina estromal tímica e suas utilizações
DK1372710T3 (da) * 2001-03-08 2010-01-18 Us Gov Health & Human Serv MVA der udtrykker modificeret HIV-kappe-, Gag- og Pol-gener
US7449562B2 (en) * 2001-06-29 2008-11-11 Novartis Ag PERV screening method and use thereof
EP1279740A1 (en) * 2001-07-26 2003-01-29 Vrije Universiteit Brussel Recombinant vector derived from adeno-associated virus for gene therapy
NZ532635A (en) 2001-11-13 2007-05-31 Univ Pennsylvania A method of identifying unknown adeno-associated virus (AAV) sequences and a kit for the method
WO2003047525A2 (en) * 2001-12-03 2003-06-12 The Regents Of The University Of California Expression of glial-derived neurotrophic factor for treatment of diseases of the eye
AU2002359284A1 (en) 2001-12-17 2003-06-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor
PT1453547T (pt) 2001-12-17 2016-12-28 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
AU2002359786A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-09 Hiroaki Mizukami Adeno-associated virus-mediated delivery of gdnf to skeletal muscles
US7662924B2 (en) 2002-02-22 2010-02-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Beta chain-associated regulator of apoptosis
EP2277522B1 (en) * 2002-03-01 2012-11-21 UCB Manufacturing, Inc. Methods for increasing or decreasing bone density and identifying molecules
CA2481813A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Children's Hospital, Inc. Antibody gene transfer and recombinant aav therefor
AU2003295502A1 (en) 2002-11-12 2004-06-03 Yucheng Chang Adenoviral vector vaccine
US20040248262A1 (en) 2003-01-22 2004-12-09 Koeberl Dwight D. Constructs for expressing lysomal polypeptides
WO2004075861A2 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus production
US20040248826A1 (en) * 2003-06-03 2004-12-09 Alberto Auricchio Treatment of cancer by in vivo gene-transfer induced TIMP-3 expression
US20050019927A1 (en) * 2003-07-13 2005-01-27 Markus Hildinger DECREASING GENE EXPRESSION IN A MAMMALIAN SUBJECT IN VIVO VIA AAV-MEDIATED RNAi EXPRESSION CASSETTE TRANSFER
DK2292780T3 (en) 2003-09-30 2017-12-04 Univ Pennsylvania Clades and sequences of adeno-associated virus (AAV), vectors containing them, and uses thereof
JP2007535304A (ja) 2003-11-24 2007-12-06 シドニー キンメル キャンサー センター ムチン抗原ワクチン
US8828957B2 (en) * 2003-12-11 2014-09-09 Microvax, Llc Methods for generating immunity to antigen
JP2007521835A (ja) 2004-02-10 2007-08-09 トラスティーズ・オブ・ダートマウス・カレッジ ニコチンアミドリボシドキナーゼ組成物およびそれらの使用方法
EP2298896A1 (en) 2004-06-22 2011-03-23 The Board of Trustees of the University of Illinois Methods of inhibiting tumor cell proliferation with FOXM1 siRNA
US7517870B2 (en) 2004-12-03 2009-04-14 Fondazione Telethon Use of compounds that interfere with the hedgehog signaling pathway for the manufacture of a medicament for preventing, inhibiting, and/or reversing ocular diseases related with ocular neovascularization
AU2005316476A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric vectors
US20070041943A1 (en) * 2004-12-29 2007-02-22 Children's Hospital Research Expression of virus entry inhibitors and recombinant AAV thereof
AU2006336468B2 (en) 2005-02-11 2012-04-12 University Of Southern California Method of expressing proteins with disulfide bridges
MX2007010306A (es) * 2005-02-23 2007-09-26 Uab Research Foundation Vacunacion mejorada con alquil-glicosido.
US7629315B2 (en) 2005-03-09 2009-12-08 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions for blocking the inhibitory effect of human CRP on human leptin
CN101218256B (zh) 2005-03-23 2017-04-19 根马布股份公司 用于治疗多发性骨髓瘤的cd38抗体
WO2006110689A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
WO2006130525A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Sidney Kimmel Cancer Center Methods for immunotherapy of cancer
BRPI0613025A2 (pt) 2005-07-11 2010-12-14 Globeimmune Inc composiÇço para reduzir a resistÊncia a um agente, mÉtodo para a preparaÇço de um veÍculo de levedura e uso da composiÇço
US7943374B2 (en) * 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
US9533036B2 (en) * 2005-11-07 2017-01-03 Microvax, Llc Methods for generating immune responses to influenza antigens with a secretable CD40L fusion protein
CN101528916B (zh) 2006-04-28 2013-09-04 宾夕法尼亚大学托管会 规模可调的aav生产方法
EP2029156A4 (en) * 2006-05-01 2010-07-21 Univ Southern California POLY THERAPY FOR TREATING CANCER
WO2007149115A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-27 Targeted Genetics Corporation Methods for treating target joints in inflammatory arthritis using aav vectors encoding a tnf antagonist
WO2008011344A2 (en) * 2006-07-17 2008-01-24 Nationwide Children's Hospital Inc. Disruption of programmed death-1 (pd-1) ligands to adjuvant adeno-associated virus vector vaccines
CA2658628A1 (en) * 2006-07-25 2008-01-31 Celladon Corporation Extended antegrade epicardial coronary infusion of adeno-associated viral vectors for gene therapy
EP2097095B1 (en) * 2006-11-29 2016-01-27 Nationwide Children's Hospital Myostatin inhibition for enhancing muscle and/or improving muscle function
US20080199837A1 (en) * 2007-02-17 2008-08-21 Kuester Deitra A Universal learning system
JP5579451B2 (ja) * 2007-03-19 2014-08-27 グローブイミューン，インコーポレイテッド ガンのための標的化治療の変異性回避の標的化アブレーションのための組成物
WO2009058564A2 (en) 2007-11-01 2009-05-07 Maxygen, Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
CA2715765A1 (en) * 2008-02-19 2009-08-27 Celladon Corporation Compositions for enhanced uptake of viral vectors in the myocardium
US7943379B2 (en) * 2008-04-30 2011-05-17 Nationwide Children's Hospital, Inc. Production of rAAV in vero cells using particular adenovirus helpers
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
PE20120021A1 (es) 2008-10-10 2012-02-10 Amgen Inc Mutantes fgf21
WO2010056901A2 (en) 2008-11-13 2010-05-20 University Of Southern California Method of expressing proteins with disulfide bridges with enhanced yields and activity
US9415121B2 (en) 2008-12-19 2016-08-16 Nationwide Children's Hospital Delivery of MECP2 polynucleotide using recombinant AAV9
US11219696B2 (en) 2008-12-19 2022-01-11 Nationwide Children's Hospital Delivery of polynucleotides using recombinant AAV9
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
WO2010109053A1 (es) 2009-03-27 2010-09-30 Proyeto De Biomedicina Cima, S.L. Métodos y composiciones para el tratamiento de cirrosis y fibrosis hepática
TR201906398T4 (tr) 2009-04-30 2019-05-21 Univ Pennsylvania Salgı bezleriyle ilişkili virüs yapılarını içeren iletken hava yolu hücrelerinin hedeflenmesine yönelik bileşimler.
SI2424991T1 (sl) 2009-05-02 2018-11-30 Genzyme Corporation Genska terapija za nevrodegenerativne motnje
CN107188950B (zh) 2009-05-05 2021-09-28 安姆根有限公司 Fgf21突变体及其用途
MX2011011815A (es) 2009-05-05 2012-01-27 Amgen Inc Mutantes fgf21 y usos de los mismos.
EP2491116A4 (en) 2009-10-22 2013-12-11 Univ Jefferson CELL-BASED ANTI-RISK COMPOSITIONS AND METHOD FOR THEIR PREPARATION AND USE
CA2780671A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Regulated expression system
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
CA2796055A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and .beta.-klotho binding proteins
EP2571987B1 (en) 2010-05-21 2017-03-01 Peptimed, Inc. Reagents for treating cancer
CA2816883A1 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Presage Biosciences, Inc. Therapeutic methods and compositions for solid delivery
JP6007463B2 (ja) * 2011-04-18 2016-10-12 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 薬剤送達粒子及びその製造方法
US20140155469A1 (en) 2011-04-19 2014-06-05 The Research Foundation Of State University Of New York Adeno-associated-virus rep sequences, vectors and viruses
US10196636B2 (en) 2011-04-21 2019-02-05 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of myotilin
WO2012145597A2 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of myotilin
US20130039888A1 (en) 2011-06-08 2013-02-14 Nationwide Children's Hospital Inc. Products and methods for delivery of polynucleotides by adeno-associated virus for lysosomal storage disorders
CA3106285A1 (en) 2011-07-25 2013-01-31 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4
CN110777124A (zh) 2011-10-27 2020-02-11 威尔斯达眼科制剂公司 编码视杆细胞来源的视锥细胞活力因子的载体
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
US9163259B2 (en) 2012-05-04 2015-10-20 Novartis Ag Viral vectors for the treatment of retinal dystrophy
BR112015002168A2 (pt) 2012-08-01 2017-11-07 Nationwide Childrens Hospital liberação intratecal de vírus 9 adeno-associado recombinante
CA2885216A1 (en) 2012-09-17 2014-03-20 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
AU2013323270B2 (en) 2012-09-28 2017-09-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill AAV vectors targeted to oligodendrocytes
EP2981612B1 (en) 2013-04-04 2019-07-03 Trustees of Dartmouth College Compositions and methods for in vivo excision of hiv-1 proviral dna
KR102413498B1 (ko) 2013-04-20 2022-06-24 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 엑손 2-표적 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물의 재조합형 아데노 부속 바이러스 전달
EP4219727A3 (en) 2013-08-27 2023-09-06 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Products and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP3065784A4 (en) 2013-11-05 2017-05-10 The Research Institute at Nationwide Children's Hospital COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING NF- kB AND SOD-1 TO TREAT AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
WO2015085147A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
AU2014368898B2 (en) 2013-12-20 2020-06-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy with neoantigen vaccine
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
WO2016025339A2 (en) 2014-08-09 2016-02-18 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene
US10842886B2 (en) 2014-10-10 2020-11-24 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Guided injections for AAV gene transfer to muscle
CN107106689A (zh) 2014-11-05 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
CA2966884A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Methods and materials for producing recombinant viruses in eukaryotic microalgae
MX2017006216A (es) 2014-11-14 2018-08-29 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y métodos para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ela).
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
CN114480440A (zh) 2014-11-21 2022-05-13 北卡罗来纳-查佩尔山大学 靶向中枢神经系统的aav载体
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
WO2016100977A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Methods for profiling the t-cel- receptor repertoire
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
MA41451A (fr) 2015-02-04 2017-12-12 Univ Washington Constructions anti-tau
WO2016127057A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill Optimized human clotting factor viii gene expression cassettes and their use
WO2016135558A2 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3268044A2 (en) 2015-03-11 2018-01-17 The Broad Institute Inc. Prmt5 inhibitors for the treatment of cancer with reduced mtap activty
ES2947311T3 (es) * 2015-05-07 2023-08-04 Univ South Florida Gen UBE3A modificado para un enfoque de terapia génica para el síndrome de Angelman
RU2733754C2 (ru) 2015-05-20 2020-10-06 Те Брод Инститьют Инк. Общие неоантигены
TWI750122B (zh) 2015-06-09 2021-12-21 美商博德研究所有限公司 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法
US10017832B2 (en) 2015-08-25 2018-07-10 Washington University Compositions and methods for site specific recombination at asymmetric sites
CN108136049A (zh) 2015-09-17 2018-06-08 全国儿童医院研究所 Galgt2基因治疗的方法和材料
US20190048340A1 (en) 2015-09-24 2019-02-14 Crispr Therapeutics Ag Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications
US11369692B2 (en) 2015-10-28 2022-06-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
EP3371305A1 (en) 2015-11-06 2018-09-12 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of glycogen storage disease type 1a
MX2018006116A (es) 2015-11-16 2019-04-04 Res Institute At Nationwide Children´S Hospital Materiales y metodos para el tratamiento de miopatias basadas en titina y otras titinopatias.
JP6932698B2 (ja) 2015-12-01 2021-09-08 クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフトＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ アルファ１アンチトリプシン欠乏症の治療のための材料および方法
EP3384035A4 (en) 2015-12-02 2019-08-07 Voyager Therapeutics, Inc. ASSAYS FOR DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES OF VAA
EP3387138B1 (en) 2015-12-11 2022-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav9
EP3387117B1 (en) 2015-12-11 2022-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav8
US11015173B2 (en) 2015-12-11 2021-05-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for AAV1
ES2918998T3 (es) 2015-12-11 2022-07-21 Univ Pennsylvania Método de purificación escalable para AAVrh10
KR20180118111A (ko) 2015-12-23 2018-10-30 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 근위축성 측색 경화증 및/또는 전두측두엽 퇴행의 치료 물질 및 방법
WO2017120589A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Washington University Compositions comprising chemerin and methods of use thereof
CA3011459A1 (en) 2016-01-13 2017-07-20 Merial, Inc. Recombinant aav vectors expressing osteoprotective genes, including has2 and lubricin, useful in the treatment of osteoarthritis and related joint conditions in mammals
US20190038771A1 (en) 2016-02-02 2019-02-07 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
US20190112353A1 (en) 2016-02-18 2019-04-18 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
US11066456B2 (en) 2016-02-25 2021-07-20 Washington University Compositions comprising TREM2 and methods of use thereof
JP6966463B2 (ja) 2016-02-26 2021-11-17 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 組換えウイルス産物及びｄｕｘ４エクソンスキッピングを誘導するための方法
WO2017158422A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis
PL3436593T3 (pl) 2016-03-28 2023-03-27 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Sposoby inaktywacji termicznej adenowirusów
IL262056B2 (en) 2016-04-02 2023-10-01 Res Inst Nationwide Childrens Hospital The U6 precursor system is optimized for tissue-specific expression
CN109121395B (zh) 2016-04-15 2022-08-09 全国儿童医院研究所 腺相关病毒载体递送β-肌聚糖和微RNA-29以及肌营养不良症的治疗
MA45477A (fr) 2016-04-15 2019-02-20 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration à vecteurs de virus adéno-associé de microarn-29 et micro-dystrophine pour traiter la dystrophie musculaire
US11401527B2 (en) 2016-04-17 2022-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for prophylaxis of organophosphates
SG11201809144XA (en) 2016-04-18 2018-11-29 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US20190346442A1 (en) 2016-04-18 2019-11-14 The Broad Institute, Inc. Improved hla epitope prediction
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017191503A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
KR102392236B1 (ko) 2016-05-18 2022-05-03 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
EP3478313B1 (en) 2016-06-29 2022-05-04 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) and other related disorders
US11427838B2 (en) 2016-06-29 2022-08-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (DM1) and other related disorders
EP3478828B1 (en) 2016-06-29 2024-09-04 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of friedreich ataxia and other related disorders
CA3029132A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of pain related disorders
JP7548696B2 (ja) 2016-07-06 2024-09-10 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 疼痛関連障害を処置するための物質及び方法
WO2018007871A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
WO2018020323A2 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of fatty acid disorders
EP3831281A1 (en) 2016-08-30 2021-06-09 The Regents of The University of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
WO2018071817A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Dimension Therapeutics Use of tonicifying agents to enhance recombinant adeno-associated virus yield
MA46863A (fr) 2016-11-17 2019-09-25 Kevin Foust Administration intrathécale de virus adéno-associé recombinant codant pour la protéine 2 de liaison méthyl-cpg
CN110191955B (zh) 2016-12-13 2024-05-31 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 在体外和体内对工程化的细胞中表达的化学物质诱导的信号传导复合物进行外源性药物激活的方法
US11549149B2 (en) 2017-01-24 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
KR102565256B1 (ko) 2017-02-12 2023-08-08 바이오엔테크 유에스 인크. Hla 기반 방법 및 조성물, 및 이들의 용도
WO2018154462A2 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 2 (sca2) and other spinocerebellar ataxia type 2 protein (atxn2) gene related conditions or disorders
US11407997B2 (en) 2017-02-22 2022-08-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (PH1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (AGXT) gene related conditions or disorders
JP2020508056A (ja) 2017-02-22 2020-03-19 クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフトＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ 遺伝子編集のための組成物および方法
EP3585898A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 1 (sca1) and other spinocerebellar ataxia type 1 protein (atxn1) gene related conditions or disorders
WO2018154418A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
HUE062476T2 (hu) 2017-03-17 2023-11-28 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Izomspecifikus mikrodisztrofin adenoasszociáltvírus-vektor által történõ bejuttatása izomdisztrófia kezelésére
JP7162021B2 (ja) 2017-03-17 2022-10-27 ニューカッスル ユニバーシティ 筋ジストロフィーを治療するためのマイクロジストロフィン断片のアデノ随伴ウイルスベクター送達
WO2018175775A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Dimension Therapeutics Cell culture methods involving hdac inhibitors or rep proteins
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
EP3619308A4 (en) 2017-05-05 2021-01-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT FOR HUNTINGTON'S MORBUS
IL270415B2 (en) 2017-05-12 2024-08-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for cell engineering and their uses in immuno-oncology
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CA3068906A1 (en) 2017-07-08 2019-01-17 Genethon Treatment of spinal muscular atrophy
JP7229989B2 (ja) 2017-07-17 2023-02-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 軌道アレイガイドシステム
KR20200044793A (ko) 2017-08-03 2020-04-29 보이저 테라퓨틱스, 인크. Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법
JP7502991B2 (ja) 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
SG11202003464VA (en) 2017-10-17 2020-05-28 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing for hemophilia a
EP3697915A4 (en) 2017-10-18 2021-12-08 Research Institute at Nationwide Children's Hospital ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR ADMINISTRATION OF MUSCLE SPECIFIC MICRODYSTROPHIN FOR THE TREATMENT OF MUSCLE DYSTROPHY
WO2019079755A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 Research Institute At Nationwide Children's Hospital METHODS AND MATERIALS FOR NT-3 GENE THERAPY
EP3701029A1 (en) 2017-10-26 2020-09-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
JP2021502123A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 アヴェクシス インコーポレーテッド ウイルスベクターの調製手段及び方法並びにその使用
US20210363521A1 (en) 2017-11-09 2021-11-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated CRISPR/CAS Systems For Treatment of DMD
WO2019102381A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Casebia Therapeutics Llp Materials and methods for treatment of autosomal dominant retinitis pigmentosa
US11578323B2 (en) 2017-12-14 2023-02-14 Bayer Healthcare Llc RNA-programmable endonuclease systems and their use in genome editing and other applications
US11793867B2 (en) 2017-12-18 2023-10-24 Biontech Us Inc. Neoantigens and uses thereof
WO2019123429A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Casebia Therapeutics Llp Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2a
WO2019123430A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Casebia Therapeutics Llp Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2a and/or non-syndromic autosomal recessive retinitis pigmentosa (arrp)
EP3737762A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 CRISPR Therapeutics AG Compositions and methods for gene editing by targeting transferrin
US11566236B2 (en) 2018-02-05 2023-01-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
MA51788A (fr) 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharma Substances et méthodes pour traiter des hémoglobinopathies
US20210130824A1 (en) 2018-02-16 2021-05-06 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing by targeting fibrinogen-alpha
JP7550648B2 (ja) 2018-03-19 2024-09-13 クリスパー セラピューティクス アーゲー 新規ｒｎａプログラム可能エンドヌクレアーゼ系およびその使用
WO2019204668A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for knockdown of apo(a) by gene editing for treatment of cardiovascular disease
WO2019210057A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Rapamycin resistant cells
CN112601557A (zh) 2018-06-08 2021-04-02 诺华股份有限公司 用于测量药物产品效力的基于细胞的测定
GB201809588D0 (en) 2018-06-12 2018-07-25 Univ Bristol Materials and methods for modulating intraocular and intracranial pressure
JP2021527657A (ja) 2018-06-18 2021-10-14 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 筋ジストロフィーを治療するための筋肉特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクターデリバリー
CA3104471A1 (en) 2018-06-18 2019-12-26 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating dystroglycanopathies and laminin-deficient muscular dystrophies
KR20210028162A (ko) 2018-06-29 2021-03-11 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 지대근 이영양증 2a형을 치료하기 위한 재조합 아데노 연관 바이러스 생성물 및 방법
AU2019328270A1 (en) 2018-08-29 2021-03-25 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for inhibition of expression of mutant GARS protein
US20210382068A1 (en) 2018-10-02 2021-12-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
JP2022514112A (ja) * 2018-10-15 2022-02-09 リジェネクスバイオ インコーポレイテッド 複製欠損型ウイルスベクター及びウイルスの感染性を測定するための方法
AU2019362000A1 (en) 2018-10-17 2021-05-20 Bayer Healthcare Llc Compositions and methods for delivering transgenes
MX2021006359A (es) 2018-11-30 2021-08-11 Novartis Ag Vectores virales de vaa y sus usos.
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
MX2021007556A (es) 2018-12-21 2021-09-10 Biontech Us Inc Método y sistemas de predicción de epítopos específicos de hla de clase ii y caracterización de células t cd4+.
US20220042045A1 (en) 2018-12-21 2022-02-10 Genethon Expression cassettes for gene therapy vectors
US20220106592A1 (en) 2018-12-31 2022-04-07 Research Institute At Nationwide Children's Hospital DUX4 RNA Silencing Using RNA Targeting CRISPR-CAS13b
KR20210124300A (ko) 2019-02-04 2021-10-14 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 Cln3 폴리뉴클레오티드의 아데노-관련 바이러스 전달
KR20210124299A (ko) 2019-02-04 2021-10-14 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 Cln6 폴리뉴클레오티드의 아데노-관련 바이러스 전달
US11529427B2 (en) 2019-02-15 2022-12-20 Crispr Therapeutics Ag Gene editing for hemophilia A with improved factor VIII expression
JP2022520875A (ja) 2019-02-25 2022-04-01 ノバルティス アーゲー Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症を治療するための組成物及び方法
CN113677801A (zh) 2019-02-25 2021-11-19 诺华股份有限公司 治疗bietti晶体营养不良的组合物和方法
MX2021010356A (es) 2019-02-26 2022-03-04 Res Inst Nationwide Childrens Hospital SUMINISTRO DE ß-SARCOGLICANO MEDIANTE VECTORES DE VIRUS ADENOASOCIADO Y EL TRATAMIENTO DE LA DISTROFIA MUSCULAR.
EP3937963A2 (en) 2019-03-12 2022-01-19 CRISPR Therapeutics AG Novel high fidelity rna-programmable endonuclease systems and uses thereof
EP3953458A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Engineered producer cell lines and methods of making and using the same
US20220193259A1 (en) 2019-04-15 2022-06-23 Sanford Research Gene therapy for treating or preventing visual effects in batten disease
EP3966327A1 (en) 2019-05-08 2022-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr/cas all-in-two vector systems for treatment of dmd
EP3969060A1 (en) 2019-05-17 2022-03-23 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Optimized gene therapy targeting retinal cells
MA56393A (fr) 2019-06-28 2022-05-04 Bayer Healthcare Llc Matériels et méthodes de régulation de l'édition de gènes
JP2022541070A (ja) 2019-07-25 2022-09-21 ノバルティス アーゲー 調節可能な発現系
ES2978666T3 (es) 2019-08-21 2024-09-17 Res Institute At Nationwidechildrens Hospital Suministro de alfa-sarcoglicano por vector de virus adenoasociado y tratamiento de la distrofia muscular
AU2020366531A1 (en) 2019-10-18 2022-05-26 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Gene therapy targeting cochlear cells
WO2021077101A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Materials and methods for the treatment of disorders associated mutations in the irf2bpl gene
US20230211018A1 (en) 2019-11-22 2023-07-06 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Materials and methods for treatment of disorders associated with the ighmbp2 gene
CA3165469A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Optimized gene therapy for targeting muscle in muscle diseases
CA3171959A1 (en) 2020-02-18 2021-08-26 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Aav-mediated targeting of mirna in the treatment of x-linked disorders
CA3174863A1 (en) 2020-04-14 2021-10-21 Ana BUJ BELLO Vectors for the treatment of acid ceramidase deficiency
CN115867650A (zh) 2020-04-20 2023-03-28 克里斯蒂安娜基因编辑研究公司 用于肺癌治疗的aav递送系统
WO2021257595A1 (en) 2020-06-15 2021-12-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery for muscular dystrophies
WO2022018638A1 (en) 2020-07-21 2022-01-27 Crispr Therapeutics Ag Genome-editing compositions and methods to modulate faah for treatment of neurological disorders
JP2023537070A (ja) 2020-08-07 2023-08-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド 小胞を標的とするタンパク質及びその使用
TW202227634A (zh) 2020-09-08 2022-07-16 美商薩羅塔治療公司 表現γ—肌聚醣之腺相關病毒載體之全身性遞送及肌肉失養症之治療
US20230357795A1 (en) 2020-09-15 2023-11-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Aav-mediated homology-independent targeted integration gene editing for correction of diverse dmd mutations in patients with muscular dystrophy
AU2021349277A1 (en) 2020-09-28 2023-05-11 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for treating muscular dystrophy
US20230392134A1 (en) 2020-09-30 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JP2023551279A (ja) 2020-11-30 2023-12-07 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ｆｓｈｄ）を治療するための組成物及び方法
WO2022132596A2 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Biontech Us Inc. Tissue-specific antigens for cancer immunotherapy
US20220228142A1 (en) 2020-12-17 2022-07-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for editing beta-globin for treatment of hemaglobinopathies
CA3209471A1 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Materials and methods for the treatment of lysosomal acid lipase deficiency (lal-d)
WO2022169922A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for treating disease associated with dux4 overexpression
WO2022170038A1 (en) 2021-02-05 2022-08-11 Amicus Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus delivery of cln3 polynucleotide
US20240254509A1 (en) 2021-03-04 2024-08-01 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for treatment of dystrophin-based myopathies using crispr-cas9 to correct dmd exon duplications
WO2022188797A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Engineered crispr/cas13 system and uses thereof
CA3216711A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus encoding methyl-cpg binding protein 2 for treating pitt hopkins syndrome via intrathecal delivery
JP2024515720A (ja) 2021-04-23 2024-04-10 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 筋ジストロフィーを治療するための製品及び方法
WO2022229702A2 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Takeda Pharmaceutical Company, Ltd. Aav8 capsid variants with enhanced liver targeting
WO2022229703A2 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Takeda Pharmaceutical Company, Ltd. New aav8 based immune escaping variants
WO2022234295A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Ucl Business Ltd Abca4 genome editing
MX2023013561A (es) 2021-05-17 2024-02-12 Sarepta Therapeutics Inc Produccion de vectores de aav recombinantes para tratamiento de distrofia muscular.
EP4108263A3 (en) 2021-06-02 2023-03-22 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a
EP4101928A1 (en) 2021-06-11 2022-12-14 Bayer AG Type v rna programmable endonuclease systems
BR112023023768A2 (pt) 2021-06-11 2024-02-27 Bayer Ag Sistemas de endonucleases programáveis por rna tipo v
WO2023283962A1 (en) 2021-07-16 2023-01-19 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Modified aav capsid for gene therapy and methods thereof
CN118159656A (zh) 2021-08-11 2024-06-07 坚固生物科技公司 肌营养不良的治疗
EP4144841A1 (en) 2021-09-07 2023-03-08 Bayer AG Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof
EP4402265A1 (en) 2021-09-16 2024-07-24 Novartis AG Novel transcription factors
WO2023060215A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for myelin protein zero silencing and treating cmt1b disease
EP4413376A1 (en) 2021-10-08 2024-08-14 Amicus Therapeutics, Inc. Biomarkers for lysosomal storage diseases
JP2023059858A (ja) 2021-10-15 2023-04-27 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 自己相補的アデノ随伴ウイルスベクター及び筋ジストロフィーの治療におけるその使用
JP2023081369A (ja) 2021-11-30 2023-06-09 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 自己相補的アデノ随伴ウイルスベクター及び筋ジストロフィーの治療におけるその使用
EP4198048A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Genethon Calpain-3 gene transfer increase using modified itr sequences
EP4198134A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Genethon Gamma-sarcoglycan gene transfer increase using modified itr sequences
EP4198046A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Genethon Alpha-sarcoglycan gene transfer increase using modified itr sequences
EP4198047A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Genethon Fukutin related protein gene transfer increase using modified itr sequences
WO2023122669A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Materials and methods for the treatment of limb girdle muscular dystrophy
WO2023118068A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Bayer Aktiengesellschaft Novel small type v rna programmable endonuclease systems
WO2023166425A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (angptl3) related conditions
WO2023168400A2 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Materials and methods for the treatment of eif2b5 mutations and diseases resulting therefrom
WO2023196818A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Genetic complementation compositions and methods
WO2023214346A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Novartis Ag Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides
WO2023240177A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Research Instiitute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for treating diseases or conditions associated with mutant or pathogenic kcnq3 expression
WO2023237587A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Bayer Aktiengesellschaft Novel small type v rna programmable endonuclease systems
WO2024011115A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus delivery of cln1 polynucleotide
WO2024015892A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 The Broad Institute, Inc. Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery
WO2024035782A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Aav Gene Therapeutics, Inc. Aav-mediated intramuscular delivery of insulin
WO2024064913A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Recombinant aav vectors for treating muscular dystrophy
WO2024081551A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 Passage Bio, Inc. Method of purifying full recombinant aav particles
WO2024081706A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus delivery to treat spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (smard1) and charcot-marie-tooth type 2s (cmt2s)
WO2024092126A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Cargo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for improved immunotherapies
WO2024129743A2 (en) 2022-12-13 2024-06-20 Bluerock Therapeutics Lp Engineered type v rna programmable endonucleases and their uses
WO2024151982A1 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Amicus Therapeutics, Inc. Gene therapy constructs for the treatment of pompe disease
WO2024163560A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Raav production methods
WO2024168276A2 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Cargo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunotherapies

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) * 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
AU7906691A (en) * 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5587308A (en) * 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
JP3952312B2 (ja) * 1993-11-09 2007-08-01 メディカル カレッジ オブ オハイオ アデノ関連ウイルス複製遺伝子を発現可能な安定な細胞株
PT733103E (pt) * 1993-11-09 2004-07-30 Targeted Genetics Corp Criacao de elevados titulos de vectores de aav recombinantes
FR2716682B1 (fr) * 1994-01-28 1996-04-26 Centre Nat Rech Scient Procédé de préparation de virus adéno-associés (AAV) recombinants et utilisations.
US5658785A (en) * 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods

Also Published As

Publication number Publication date
ATE394498T1 (de) 2008-05-15
US5858775A (en) 1999-01-12
EP1923466A2 (en) 2008-05-21
PT764213E (pt) 2008-06-27
WO1995034670A2 (en) 1995-12-21
EP0764213B1 (en) 2008-05-07
CA2576396A1 (en) 1995-12-21
AU710804B2 (en) 1999-09-30
JP3720845B2 (ja) 2005-11-30
EP0764213A1 (en) 1997-03-26
EP1923466A3 (en) 2008-08-20
CA2192215C (en) 2007-05-01
CA2192215A1 (en) 1995-12-21
US5786211A (en) 1998-07-28
US5658785A (en) 1997-08-19
AU3124395A (en) 1996-01-05
WO1995034670A3 (en) 1996-06-13
JP2007082565A (ja) 2007-04-05
DK0764213T3 (da) 2008-06-23
JPH10504185A (ja) 1998-04-28
JP2003024092A (ja) 2003-01-28
DE69535749D1 (de) 2008-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2302331T3 (es) Vectores que codifican genomas de aav recombinantes.
US7070998B2 (en) Adeno-associated virus materials and methods
US6962815B2 (en) AAV2 vectors and methods
US7186552B2 (en) Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6951758B2 (en) Helper virus-free AAV production
US7749492B2 (en) AAV vectors and methods
US20070065412A1 (en) Production of recombinant AAV using adenovirus comprising AAV rep/cap genes
JP2001512674A (ja) 組換えａａｖの生産効率を増強する方法
AU6098596A (en) Helper virus-free aav production
Zhao et al. Hot topics in adeno-associated virus as a gene transfer vector
US8529885B2 (en) AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
EP1664315B1 (en) Aav vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
Samulski Adeno-associated virus-based vectors for human gene therapy