PT2571503E - Composições e a sua utilização no tratamento de neoplasia, doença inflamatória e outros distúrbios - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES E A SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE NEOPLASIA, DOENÇA INFLAMATÓRIA E OUTROS DISTÚRBIOS

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As caudas N-terminais das histonas mantêm a estabilidade da cromatina e estão sujeitas a modificações associadas com a regulação transcricional. As melhores caracterizadas destas modificações são a acetilação, metilação e fosforilação para cada modificação, existem enzimas que tanto estabelecem a marca apropriada como a removem. Estas modificações devem então ser interpretadas pela maquinaria de transcrição. 0 reconhecimento de acetil-lisina é pricipalmente mediado por bromodominios, que são habitualmente componentes de complexos de fatores de transcrição. 0 bromodominio e família extra-terminal (BET) (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT) partilham uma arquitetura de domínio comum que compreende dois bromodominios N-terminais que exibem um alto nível de conservação de sequências, e um domínio C-terminal mais divergente que está implicado nas interações proteína-proteína. A regulação aberrante da modificação de histonas pode afetar a atividade genética e desempenha um papel na oncogénese. A acetilação da cadeia lateral de lisina é um evento regulador importante na função de proteínas não de histonas, incluindo, mas não limitadas a, Hsp90, p53, fatores de transcrição STAT, cortactina, beta-catenina e alfa-tubulina. Assim, seria de esperar que a modulação do reconhecimento da cadeia lateral de lisina exerça efeitos terapêuticos e fenotípicos importantes de forma ampla no desenvolvimento e doença. Apesar da importância do reconhecimento de acetil-lisina para a oncogénese, poucos moduladores do reconhecimento de acetil-lisina foram identificados.

Os documentos CA2710740, EP0989131, EP1297836 e US5712274 divulgam compostos de tienotriazolodiazepina para o tratamento de cancro, doenças inflamatórias e alérgicas. No entanto, nenhum destes documentos divulga os compostos presentemente divulgados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é definida nas reivindicações anexas. As matérias que não são abrangidas pelo âmbito das reivindicações, não fazem parte da presente invenção.

Conforme descrito abaixo, divulgam-se composições e a sua utilização no tratamento ou prevenção de uma neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para redução da fertilidade masculina. Em exemplos particulares, os compostos da invenção são utilizados para ultrapassar a resistência aos fármacos na neoplasia (por exemplo, cancro e doenças não malignas). Além disso, as composições divulgadas no presente documento são utilizadas no transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência. Mais especificamente, divulgam-se composições para interromper a interação de um polipéptido da família BET que compreende um bromodomínio com acetil-lisina e/ou cromatina (por exemplo, interromper uma interação de bromodomínio com uma modificação de acetil-lisina presente numa cauda N-terminal de uma histona) e inibir a oncogénese. Adicionalmente, os compostos da invenção podem ser utilizados para prevenir ou tratar uma doença inflamatória.

Divulga-se um composto de Fórmula I: em que

X é N ou CR5; R5 é H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído;

Rb é H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, ou -COO-R3, cada um dos quais é opcionalmente substituído; o anel A é arilo ou heteroarilo; cada Ra é independentemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um grupo heteroarilo ou arilo fusionado; R é alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo; cada um dos quais é opcionalmente substituído; Ri é — (CH2) n—L, no qual n é 0-3 e L é H, -COO-R3, -CO-R3, -CO-N (R3R4) , -S(0)2-R3, -S (O) 2-N (R3R4) , N (R3R4) , N(R4)C(0)R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; R2 é H, D, halogéneo, ou alquilo opcionalmente substituído; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) H, arilo arilo substituído, heteroarilo, ou heteroarilo substituído; (ii) heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; (iii) -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo ou -C2-C8 alquinilo, cada um contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N; -C3-Ci2 cicloalquilo, -C3-Ci2 cicloalquilo substituído, -C3-Ci2 cicloalquenilo, ou -C3-C22 cicloalquenilo substituído, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído; e (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 é independentemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R3 e R4 são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; R6 é alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R4 e R6 são tomados em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; m é 0, 1, 2, ou 3; desde que (a) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo ou fenilo substituído, R2 é H, Rb é metilo, e R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 1 e L é -CO-N (R3R4) , então R3 e R4 não são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de morfolino; (b) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo substituído, R2 é H, Rb é metilo, e R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 1 e L é -CO-N(R3R4) , e um de R3 e R4 é H, então o outro de R3 e R4 não é metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo substituído, piridilo ou piridilo substituído; e (c) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo substituído, R2 é H, Rb é metilo, e R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 1 e L é —COO—R3, então R3 não é metilo nem etilo; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, R é arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, L é H, -COO-R3, -CO-N (R3R4) , S(0)2-R3, -s (0) 2-N (R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3 ou arilo opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: H, -C4-C8 alquilo, contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de 0, S, ou N; ou NH2, N=CR4R6.

Em determinados exemplos, R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 1 e L é -CO-N (R3R4) , e um de R3 e R4 é H, e o outro de R3 e R4 é (CH2)p-Y, no qual p é 1-3 (por exemplo, p é 2) e Y é um anel que contém azoto (que pode ser aromático ou não aromático).

Em determinados exemplos, R2 é H, D, halogénio ou metilo.

Em determinados exemplos, RB é alquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, ou alcoxi; cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, RB é metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, ou C00CH20C(0)CH3.

Em determinados exemplos, o anel A é arilo ou heteroarilo de 5 ou 6 membros; Em determinados exemplos, o anel A é tiofuranilo, fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo, ou 5, 6, 7, 8-tetrahidroisoquinolinilo.

Em determinados exemplos, o anel A é fenilo ou tienilo;

Em determinados exemplos, m é 1 ou 2, e pelo menos uma ocorrência de RA é metilo.

Em determinados exemplos, cada RA é independentemente H, um alquilo opcionalmente substituído, ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um arilo.

Também se divulqa um composto de Fórmula II:

em que X é N ou CR5; R5 é H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído;

Rb é H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, ou -COO-R3, cada um dos quais é opcionalmente substituído; cada Ra é independentemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um grupo heteroarilo ou arilo fusionado; R é alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; R'1 é H, -COO-R3, -CO-R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) H, arilo arilo substituído, heteroarilo, heteroarilo substituído; (ii) heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; (iii) -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo ou -C2-C8 alquinilo, cada um contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N; -C3-Ci2 cicloalquilo, -C3-Ci2 cicloalquilo substituído; —C3-C12 cicloalquenilo, ou -C3-Ci2 cicloalquenilo substituído; cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído; m é 0, 1, 2, ou 3; desde que se R' i é -COO-R3, X é N, Ré fenilo substituído, e Rb é metilo, então R3 não é metilo nem etilo; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, R é arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, R é fenilo ou piridilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, R é p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl-fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo ou piridinilo.

Em determinados exemplos, R'i é -COO-R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; e R3 é -Ci-C8 alquilo, que contém 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N, e que pode ser opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, R'1 é -COO-R3, e R3 é metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo, ou t-butilo, ou R'1 é H ou fenilo opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, RB é metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, COOCH2OC(O)CH3.

Em determinados exemplos, RB é metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, ou COOCH2OC(O) CH3.

Em determinados exemplos, cada RA é independentemente um alquilo opcionalmente substituído, ou quaisquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um arilo fusionado.

Em determinados exemplos, cada RA é metilo.

Também se divulga um composto de fórmula III: em que

X é N ou CR5; R5 é H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído;

Rb é H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, ou -COO-R3, cada um dos quais é opcionalmente substituído; o anel A é arilo ou heteroarilo; cada RA é independentemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um grupo arilo ou heteroarilo fusionado; R é alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) H, arilo arilo substituído, heteroarilo, ou heteroarilo substituído; (ii) heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; (iii) -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo ou -C2-C8 alquinilo, cada um contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N; -C3-Ci2 cicloalquilo, -C3-Ci2 cicloalquilo substituído, -C3-Ci2 cicloalquenilo, ou -C3-C22 cicloalquenilo substituído, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído; e (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 é independentemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R3 e R4 são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; R6 é alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R4 e R6 são tomados em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; m é 0, 1, 2, ou 3; desde que: (a) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo ou fenilo substituído, Rb é metilo, então R3 e R4 não são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de morfolino; e (b) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo substituído, R2 é H, Rb é metilo, e um de R3 e R4 é H, então o outro de R3 e R4 não é metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo substituído, piridilo ou piridilo substituído; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, R é arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, R é fenilo ou piridilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, R é p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl-fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo ou piridinilo. Em determinados exemplos, R3 é H, NH2, ou N=CR4R6.

Em determinados exemplos, cada R4 é independentemente H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo opcionalmente substituído; cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, R6 é alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, um de R3 e R4 é H, e o outro de R3 e R4 é (CH2) p-Y, no qual p é 1-3 (por exemplo, p é 2) e Y é um anel que contém azoto (que pode ser aromático ou não aromático) .

Também se divulga um composto de fórmula IV: em que

X é N ou CR5; R5 é H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído;

Rb é H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, ou -COO-R3, cada um dos quais é opcionalmente substituído; o anel A é arilo ou heteroarilo; cada Ra é independentemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um grupo heteroarilo ou arilo fusionado;

Ri é — (CH2) n—L, no qual n é 0-3 e L é H, -COO-R3, -CO-R3, -CON(R3R4), -S(0)2-R3, -S (0)2-N(R3R4) , N(R3R4), N (R4) C (O) r3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; R2 é H, D, halogéneo, ou alquilo opcionalmente substituído; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) H, arilo arilo substituído, heteroarilo, ou heteroarilo substituído; (ii) heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; (iii) —C4—C3 alquilo, -C2-C8 alquenilo ou -C2-C8 alquinilo, cada um contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N; -C3-C42 cicloalquilo, -C3-C42 cicloalquilo substituído, -C3-C42 cicloalquenilo, ou -C3-C42 cicloalquenilo substituído, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído; e (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 é independentemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R3 e R4 são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de 4- 10 membros; R6 é alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R4 e R6 são tomados em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; m é 0, 1, 2, ou 3; desde que (a) se o anel A é tienilo, X é N, R2 é H, RB é metilo, e

Ri é - (CH2) n—L, no qual n é 0 e L é -CO-N (R3R4) , então R3 e R4 não são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de morfolino; (b) se o anel A é tienilo, X é N, R2 é H, RB é metilo, e Ri é — (CH2) n—L, no qual n é 0 e L é -CO-N (R3R4) , e um de R3 e R4 é H, então o outro de R3 e R4 não é metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo substituído, piridilo ou piridilo substituído; e (c) se o anel A é tienilo, X é N, R2 é H, RB é metilo, e Ri é -(CH2)n-L, no qual n é 0 e L é -COO-R3, então R3 não é metilo nem etilo; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 0-3 e L é —COO—R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; e R3 é -Ci-C8 alquilo, que contém 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N, e que pode ser opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, nélou2eLé alquilo ou -COO-R3, e R3 é metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo, ou t-butilo, ou nélou2eLéHou fenilo opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 0 e L é -CO-N (R3R4) , e um de R3 e R4 é H, e o outro de R3 e R4 é (CH2)p-Y, no qual p é 1-3 (por exemplo, p é 2) e Y é um anel que contém azoto (que pode ser aromático ou não aromático).

Em determinados exemplos, R2 é H ou metilo.

Em determinados exemplos, RB é metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, COOCH2OC(O)CH3.

Em determinados exemplos, o anel A é fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo, ou 5,6,7,8- tetrahidroisoquinolinilo.

Em determinados exemplos, cada RA é independentemente um alquilo opcionalmente substituído, ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um arilo.

Também se divulgam compostos de Fórmulas V-XXII no presente documento, e qualquer composto descrito no presente documento.

Ainda adicionalmente, divulga-se um método para tratamento ou prevenção de uma neoplasia num indivíduo, o método que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto de Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento.

Também é divulgado um composto de qualquer das Fórmulas I - IV. Também se divulga um método para a redução do crescimento, proliferação ou sobrevivência de uma célula neoplásica, o método que compreende contactar a célula com uma quantidade eficaz de um composto de qualquer das Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento, reduzindo assim o crescimento, proliferação ou sobrevivência de uma célula neoplásica.

Também se divulga um método para indução da diferenciação numa célula neoplásica, o método que compreende contactar a célula com um composto de qualquer das Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento, induzindo assim a diferenciação na célula neoplásica.

Também se divulga um método para indução da morte celular numa célula neoplásica, o método que compreende contactar a célula com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de qualquer das Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento, induzindo assim a morte celular na célula neoplásica.

Em determinados aspetos, os métodos compreendem adicionalmente selecionar o composto para ligação a um bromodomínio da família BET.

Em determinados aspetos, os métodos compreendem adicionalmente selecionar o composto para inibir a ligação do bromodomínio à cromatina num ambiente celular.

Em determinados aspetos, os métodos compreendem adicionalmente selecionar o composto para a especificidade de ligação utilizando fluorimetria de varrimento diferencial (DSF), Calorimetria de Titulação Isotérmica, e/ou um ensaio homogéneo de proximidade de luminescência (ALPHA-screen). Em determinados exemplos, o composto aumenta a estabilidade térmica do bromodominio no dito ensaio.

Em determinados aspetos dos métodos, o membro da família BET é BRD2, BRD3, BRD4 ou BRDT.

Em determinados aspetos dos métodos, a célula encontra-se num indivíduo.

Também se divulga um método para tratamento ou prevenção de uma neoplasia num indivíduo, o método que compreende administrar a um indivíduo, com necessidade da mesma, uma quantidade eficaz de um composto de Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento, prevenindo ou tratando assim uma neoplasia num indivíduo.

Em determinados aspetos, o indivíduo é um mamífero. Em determinados exemplos, o indivíduo é um paciente humano.

Em determinados aspetos, o método reduz o crescimento ou proliferação de uma neoplasia num indivíduo.

Em determinados aspetos, a neoplasia é acionada por um ativador transcricional. Em determinados exemplos, o ativador transcricional é myc.

Em determinados aspetos, o indivíduo tem uma neoplasia selecionada a partir do grupo que consiste em linfoma de Burkitt, cancro de pulmão de células pequenas, cancro da mama, cancro do cólon, neuroblastoma, blastoma glial multiforme, leucemia acionada por MLL, leucemia linfocítica crónica, carcinoma de linha média NUT, carcinoma de células escamosas e qualquer outro carcinoma associado com um rearranjo de NUT.

Noutro aspeto, a invenção proporciona uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Reivindicação 1 e um excipiente farmaceuticamente aceitável ou portador para o mesmo. Também se divulgam composições que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer outro composto descrito no presente documento e um excipiente farmaceuticamente aceitável ou portador para o mesmo.

Divulga-se um agente farmacêutico empacotado que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de qualquer das Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento, e instruções escritas para a administração do composto.

Divulga-se um método para tratamento ou prevenção de uma neoplasia num indivíduo, o método que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento, em que o composto interrompe a ligação de bromodomínio a acetil-lisina ou de outra forma desloca um membro da família BET da cromatina, prevenindo ou tratando assim a dita neoplasia.

Em determinados aspetos, o composto inibe a ligação do péptido Kac da histona H4 a um membro da família BET.

Em determinados aspetos, o membro da família BET é BRD2, BRD3, BRD4 ou BRDT.

Em determinados aspetos, o composto liga-se a um local de ligação de Kac de um bromodomínio de família BET.

Também se divulga um método para identificar um composto para o tratamento de uma neoplasia, o método que compreende contactar um composto de teste com um membro da família BET que compreende um bromodomínio; e detetar a ligação específica ao bromodomínio, identificando assim o composto de teste como útil para o tratamento de uma neoplasia.

Em determinados aspetos, a especificidade de ligação é testada utilizando fluorimetria de varrimento diferencial (DSF) .

Em determinados aspetos, a ligação aumenta a estabilidade térmica do dito bromodomínio.

Em determinados aspetos, a ligação é detetada utilizando Calorimetria de Titulação Isotérmica.

Em determinados aspetos, a ligação é detetada utilizando um ensaio homogéneo de proximidade de luminescência (ALPHA-screen).

Em determinados aspetos, o composto inibe a ligação do péptido Kac da histona H4 ao dito bromodominio.

Em determinados aspetos, o composto forma uma ligação de hidrogénio com uma asparagina evolucionariamente conservada no dito bromodominio.

Em determinados aspetos, o dito membro da família BET é BRD4 ou BRD2 e a asparagina é ASN140 em BRD4(1) e Asn429 em BRD2(2).

Em determinados aspetos, o composto liga-se de forma competitiva com a cromatina num ambiente celular.

Em determinados aspetos, a ligação competitiva com a cromatina é detetada utilizando recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP).

Em determinados aspetos, o método é levado a cabo numa célula neoplásica in vitro.

Em determinados aspetos, o método compreende adicionalmente detetar uma diminuição na proliferação celular, um aumento na morte celular, ou um aumento na diferenciação celular.

Em determinados aspetos, a morte celular é morte celular por apoptose.

Em determinados aspetos, a diferenciação celular é identificada através da deteção de um aumento da expressão de citoqueratina.

Em determinados aspetos, o método compreende adicionalmente detetar uma redução no alongamento transcricional.

Também se divulga um método para tratamento ou prevenção de neoplasia num indivíduo, o método que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de um composto de Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento, em que o dito composto é capaz de se ligar a um bromodomínio de família BET e interromper a dita interação do bromodomínio com a cromatina, prevenindo ou tratando assim o dito cancro.

Em determinados aspetos, o método induz morte celular ou diferenciação numa célula neoplásica do dito indivíduo.

Também se divulga uma composição para o tratamento ou prevenção de uma neoplasia, a composição que compreende uma quantidade eficaz de um composto selecionado a partir do grupo que consiste no composto de qualquer das Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que o dito composto inibe a ligação do péptido Kac da histona H4 a um bromodomínio da família BET.

Também se divulga um método para redução de inflamação num indivíduo, o método que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto de Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento.

Também se divulga um método para tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória num indivíduo, o método que compreende administrar a um indivíduo, com necessidade da mesma, uma quantidade eficaz de um composto de Fórmulas I-XXII, ou qualquer composto descrito no presente documento.

Em determinados aspetos, o indivíduo é um mamífero. Em determinados exemplos, o indivíduo é um paciente humano.

Em determinados aspetos, o método reduz o nível de citocinas, a libertação de histamina, ou a atividade biológica de uma célula imunoresponsiva.

Também se divulga um método para identificar um composto para o tratamento de inflamação, o método que compreende contactar um composto de teste com um membro da família BET que compreende um bromodomínio; e detetar a ligação específica ao bromodomínio, identificando assim o composto de teste como útil para o tratamento de inflamação.

Definições

Por "agente" entende-se qualquer composto químico de molécula pequena, anticorpo, molécula de ácido nucleico, ou polipéptido, ou fragmentos do mesmos.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "anel aromático" ou "arilo" significa um anel aromático monocíclico ou policíclico ou radical de anel que compreende átomos de carbono ou hidrogénio. Exemplos de grupos arilo adequados incluem, mas não estão limitados a, fenilo, tolilo, antacenilo, fluorenilo, indenilo, azulenilo, e naftilo, bem como frações carbocíclicas benzo-fundidas tal como 5,6,7,8-tetrahidronaftilo. Um grupo arilo pode ser não substituído ou opcionalmente é substituído com um ou mais substituintes, por exemplo, substituintes conforme descrito no presente documento para grupos alquilo (incluindo sem limitação alquilo (preferivelmente, alquilo inferior ou alquilo substituído com um ou mais halo), hidroxi, alcoxi (preferivelmente, alcoxi inferior), alquiltio, ciano, halo, amino, ácido borónico (-B(OH)2, e nitro). Em determinados exemplos, o grupo arilo é um anel monocíclico, em que o anel compreende 6 átomos de carbono.

Conforme utilizado no presente documento, 0 termo "alquilo" significa uma cadeia de hidrocarboneto não cíclico ramificado ou de cadeia linear saturado tendo desde 1 até 10 átomos de carbono. Alquilos de cadeia linear saturados representativos incluem metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo e n-decilo; enquanto alquilos ramificados saturados incluem isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 2-metilhexilo, 3-metilhexilo, 4-metilhexilo, 5-metilhexilo, 2.3- dimetilbutilo, 2,3-dimetilpentilo, 2,4-dimetilpentilo, 2.3- dimetilhexilo, 2,4-dimetilhexilo, 2,5-dimetilhexilo, 2,2- dimetilpentilo, 2,2-dimetilhexilo, 3,3-dimetilpentilo, 3,3-dimetilhexilo, 4,4-dimetilhexilo, 2-etilpentilo, 3- etilpentilo, 2-etilhexilo, 3-etilhexilo, 4-etilhexilo, 2-metil-2-etilpentilo, 2-metil-3-etilpentilo, 2-metil-4-etilpentilo, 2-metil-2-etilhexilo, 2-metil-3-etilhexilo, 2-metil-4-etilhexilo, 2,2-dietilpentilo, 3,3-dietilhexilo, 2,2-dietilhexilo, 3,3-dietilhexilo e semelhantes. Grupos alquilo incluídos nos compostos divulgados no presente documento podem ser não substituídos, ou opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes, tais como amino, alquilamino, arilamino, heteroarilamino, alcoxi, alquiltio, oxo, halo, acilo, nitro, hidroxilo, ciano, arilo heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, ariloxi, heteroariloxi, ariltio, heteroariltio, arilamino, heteroarilamino, carbociclilo, carbocicliloxi, carbocicliltio, carbociclilamino, heterociclilo, heterocicliloxi, heterociclilamino, heterocicliltio, e semelhantes. Alquilos inferiores são tipicamente preferidos para os compostos descritos no presente documento.

Por "bromodomínio" entende-se uma porção de um polipéptido que reconhece resíduos de lisina acetilados. Num exemplo, um bromodomínio de um polipéptido membro da família BET compreende aproximadamente 110 aminoácidos e partilha uma dobra conservada que compreende um grupo no sentido anti-horário de quatro hélices alfa ligado por diversas regiões de ansa que interagem com a cromatina.

Por "polipéptido da família BET" entende-se um polipéptido que compreende dois bromodomínios e um domínio extraterminal (ET) ou um fragmento do mesmo tendo atividade de regulação da transcrição ou atividade de ligação à lisina acetilada. Membro exemplares da família BET incluem BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT.

Por "polipéptido BRD2" quer-se dizer uma proteína ou fragmento do mesmo tendo pelo menos 85% de identidade com NP_005095 que é capaz de ligar a cromatina ou regular a transcrição.

Segue-se a sequência de um polipéptido BRD2 exemplar: MLQNVTPHNKLPGEGNAGLLGLGPEAAAPGKRIRKPSLLYEGFESPTMASVPALQLTPANPPPPEVSNP K

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Por "molécula de ácido nucleico BRD2" entende-se um polinucleótido que codifica um polipéptido BRD2 ou um fragmento do mesmo.

Por "polipéptido BRD3" quer-se dizer uma proteína ou fragmento do mesmo tendo pelo menos 85% de identidade com NP_031397.1 que é capaz de ligar a cromatina ou regular a transcrição.

Segue-se a sequência de um polipéptido BRD3 exemplar: 1 mstattvapa gipatpgpvn ppppevsnps kpgrktnqlq ymqnvvvktl wkhqfawpfy 61 qpvdaiklnl pdyhkiiknp mdmgtikkrl ennyywsase cmqdfntmft ncyiynkptd 121 divlmaqale kiflqkvaqm pqeevellpp apkgkgrkpa agaqsagtqq vaavssvspa 181 tpfqsvpptv sqtpviaatp vptitanvts vpvppaaapp ppafcpivpvv pptppvvkkk 241 gvkrkadttt pttsaitasr sesppplsdp kqakvvarre sggrpikppk kdledgevpq 301 hagkkgklse hlrycdsilr eralskkhaay awpfykpvda ealelhdyhd iikhpmdlst 361 vkrkmdgrey pdaqgfaadv rlmfsncyky nppdhevvam arklqdvfem rfakmpdepv 421 eapalpapaa pmvskgaess rsseesssds gssdseeera trlaelqeql kavheqlaal 481 sqapvnkpkk kkekkekekk kkdkekekek hkvkaeeekk akvappakqa qqkkapakka 541 nstttagrql kkggkqasas ydseeeeegl pmsydekrql sldinrlpge klgrvvhiiq 601 srepslrdsn pdeieidfet Ikpttlrele ryvksclqkk qrkpfsasgk kqaakskeel 661 aqekkkelek rlqdvsgqls sskkparkek pgsapsggps rlsssssses gsssssgsss 721 dssdse

Por "molécula de ácido nucleico Brd3" entende-se um polinucleótido que codifica um polipéptido BRD3.

Por "polipéptido BRD4" quer-se dizer uma proteína ou fragmento do mesmo tendo pelo menos 85% de identidade com NP_055114 que é capaz de ligar a cromatina ou regular a transcrição. 1 msaesgpgtr lrnlpvmgdg letsqmsttq aqaqpqpana astnppppet snpnkpkrqt 61 nqlqyllrw lktlwkhqfa wpfqqpvdav klnlpdyyki iktpmdmgti kkrlennyyw 121 naqeciqdfn tmftncyiyn kpgddivlma ealeklflqk inelpteete imivqakgrg 181 rgrketgtak pgvstvpntt qastppqtqt pqpnpppvqa tphpfpavtp dlivqtpvmt 241 vvppqplqtp ppvppqpqpp papapqpvqs hppiiaatpq pvktkkgvkr kadtttptti 301 dpiheppslp pepkttklgq rressrpvkp pkkdvpdsqq hpapeksskv seqlkccsgi 361 lkemfakkha ayawpfykpv dvealglhdy cdiikhpmdm stiksklear eyrdaqefga 421 dvrlmfsncy kynppdhavv amarklqdvf emrfakmpde peepvvavss pavppptkvv 481 appsssdsss dsssdsdsst ddseeeraqr laelqeqlka vheqlaalsq pqqnkpkkke 541 kdkkekkkek hkrkeeveen kkskakeppp kktkknnssn srivskkepap mkskppptye 601 seeedkckpra syeekrqlsl dinklpgekl grvvhiiqsr epslknsnpd eieidfetlk 661 pstlrelery vtsclrkkrk pqaekvdvia gsskmkgfss sesesssess ssdsedsetg 721 pa

Por "molécula de ácido nucleico Brd4" entende-se um polinucleótido que codifica um polipéptido BRD4.

Por "polipéptido BRDT" quer-se dizer uma proteína ou fragmento do mesmo tendo pelo menos 85% de identidade com NP_001717 que é capaz de ligar a cromatina ou regular a transcrição. 1 mslpsrqtai ivnppppeyi ntkkngrltn qlqylqkvvl kdlwkhsfsw pfqrpvdavk 61 lqlpdyytii knpmdlntik krlenkyyak aseciedfnt mfsncylynk pgddivlmaq 121 aleklfmqkl sqmpqeeqvv gvkerikkgt qqniavssak eksspsatek vfkqqeipsv 181 fpktsispln vvqgasvnss sqtaaqvtkg vkrkadtttp atsavkasse fsptfteksv 241 alppikenmp knvlpdsqqq ynvvktvkvt eqlrhcseil kemlakkhfs yawpfynpvd 301 vnalglhnyy dvvknpmdlg tikekmdnqe ykdaykfaad vrlmfmncyk ynppdhevvt 361 marmlqdvfe thfskipiep vesmplcyik tditettgre ntneassegn ssddsederv 421 krlaklqeql kavhqqlqvl sqvpfrklnk kkekskkekk kekvnnsnen prkmceqmrl 481 kekskrnqpk krkqqfiglk sedednakpm nydekrqlsl ninklpgdkl grwhiiqsr 541 epslsnsnpd eieidfetlk astlreleky vsaclrkrpl kppakkimms keelhsqkkq 601 elekrlldvn nqlnsrkrqt ksdktqpska venvsrlses sssssssses essssdlsss 661 dssdsesemf pkftevkpnd spskenvkkm knecilpegr tgvtqigycv qdttsanttl 721 vhqttpshvm ppnhhqlafn yqelehlqtv knisplqilp psgdseqlsn gitvmhpsgd 781 sdttmlesec qapvqkdiki knadswkslg kpvkpsgvmk ssdelfnqfr kaaiekevka 841 rtqelirkhl eqntkelkas qenqrdlgng ltvesfsnki qnkcsgeeqk ehqqsseaqd 901 ksklwllkdr dlarqkeqer rrreamvgti dmtlqsdimt mfennfd

Por "molécula de ácido nucleico BRDT" entende-se um polinucleótido que codifica um polipéptido BRDT.

Por "melhorar" entende-se diminuir, suprimir, atenuar, reduzir, travar, ou estabilizar o desenvolvimento ou progressão de uma doença.

Por "alteração" quer-se dizer uma mudança (aumento ou diminuição) nos níveis de expressão ou atividade de um gene ou polipéptido conforme detetado pelos métodos da técnica padrão tais como aqueles descritos no presente documento. Conforme utilizado no presente documento, uma alteração inclui uma mudança de 10% nos níveis de expressão, preferivelmente uma mudança de 25%, mais preferivelmente uma mudança de 40%, e ainda mais preferivelmente uma mudança de 50% ou mais nos níveis de expressão.

Por "análogo" entende-se uma molécula que não é idêntica, mas possui características funcionais ou estruturais análogas.

Por exemplo, um análogo de polipéptido retém pelo menos alguma da atividade biológica de um polipéptido de ocorrência natural correspondente, enquanto tem determinadas modificações bioquímicas que melhoram a função do análogo em relação ao polipéptido de ocorrência natural. Tais modificações bioquímicas poderiam aumentar a resistência do análogo às protéases, a permeabilidade de membrana, ou semi-vida, sem alterar, por exemplo, a ligação de ligandos. Um análogo pode incluir um aminoácido não natural.

Por "composto" entende-se qualquer composto químico de molécula pequena, anticorpo, molécula de ácido nucleico, ou polipéptido, ou fragmentos dos mesmos. 0 termo "diasterómeros" refere-se a estereoisómeros com dois ou mais centros de dissimetria e cujas moléculas não são imagens de espelho uma da outra. 0 termo "enantiómeros" refere-se a dois estereoisómeros de um composto que são imagens de espelho não sobreponiveis uma da outra. Uma mistura equimolar de dois enantiómeros designa-se uma "mistura racémica" ou um "racemato". 0 termo "halogéneo" designa -F, -Cl, -Br ou -I. 0 termo "haloalquilo" destina-se a incluir grupos alquilo conforme definido acima que são mono, di ou polisubstituídos por halogéneo, por exemplo, fluorometilo e trifluorometilo. 0 termo "hidroxil" significa -OH. 0 termo "heteroátomo" conforme utilizado no presente documento significa um átomo de qualquer elemento além de carbono ou hidrogénio. Heteroátomos preferidos são azoto, oxigénio, enxofre e fósforo. 0 termo "heteroarilo" refere-se a um sistema de anel monocíclico de 5-8 membros, bicíclico de 8-12 membros, ou triciclico de 11-14 membros tendo 1-4 heteroátomos no anel se monocíclico, 1-6 heteroátomos se bicíclico, ou 1-9 heteroátomos se triciclico, os ditos heteroátomos selecionados a partir de 0, N, ou S, e os restantes átomos do anel sendo carbono. Os grupos heteroarilo podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes como para os grupos arilo. Exemplos de grupos heteroarilo incluem, mas não estão limitadas a, piridilo, furanilo, benzodioxolilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, triazolilo, tiadiazolilo, isoquinolinilo, indazolilo, benzoxazolilo, benzofurilo, indolizinilo, imidazopiridilo, tetrazolilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzoxadiazolilo, e indolilo. 0 termo "heterocíclico" conforme utilizado no presente documento, refere-se a compostos orgânicos que contêm pelo menos um átomo além de carbono (por exemplo, S, 0, N) dentro de uma estrutura em anel. A estrutura em anel nestes compostos orgânicos pode ser aromática ou não aromática. Alguns exemplos de frações heterocíclicas incluem, mas não estão limitados a, piridina, pirimidina, pirrolidina, furano, tetrahidrofurano, tetrahidrotiopeno, e dioxano. 0 termo "isómeros" ou "estereoisómeros" refere-se a compostos que têm uma constituição química idêntica, mas diferem em relação à disposição dos átomos ou grupos no espaço. 0 termo "derivados isotópicos" inclui derivados de compostos nos quais um ou mais átomos nos compostos são substituídos com isótopos correspondentes dos átomos. Por exemplo, um derivado isotópico de um composto que contém um átomo de carbono (C12) seria um no qual o átomo de carbono do composto seria substituído com um isótopo C13. 0 termo "neoplásico" refere-se àquelas células que têm a capacidade para crescimento autónomo, isto é, um estado ou condição anormal caracterizada pelo crescimento celular de rápida proliferação. Um estado de doença neoplásica pode ser categorizado como patológico, isto é, que caracteriza ou constitui um estado de doença, ou pode ser categorizado como não patológico, isto é, um desvio do normal mas que não está associado com um estado de doença. 0 termo destina-se a incluir todos os tipos de crescimentos cancerígenos ou processos oncogénicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos, ou órgãos transformados malignamente, independentemente do tipo histopatológico ou estádio de invasão. As células "hiperproliferativas patológicas" ocorrem em estados de doença caracterizados por crescimento tumoral maligno. Exemplos de células hiperproliferativas não patológicas incluem proliferação de células associada com a reparação de feridas.

Neoplasmas ilustrativos passíveis de tratamento com um composto da invenção incluem leucemias (por exemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia de linhagem mista, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica), mieloma múltiplo, policitemia vera, linfoma cutâneo de células T (CTCL), linfoma (doença de Hodgkin, doença não Hodgkin), macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, e tumores sólidos tais como sarcomas e carcinomas (por exemplo, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, cancro coloretal, cancro pancreático, cancro da mama, cancro ovárico, cancro prostático, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcima papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais hepatoma, carcinoma dos duetos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, cancro do colo do útero, cancro uterino, cancro testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma de pulmão de células pequenas, carcinoma de pulmão de células não pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, tumor neuroendócrino, oligodendroglioma, schwanoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, e retinoblastoma).

Num aspeto, a neoplasia é acionada por um ativador transcricional dominante, tal como myc. Tais cancros incluem linfoma de Burkitt, cancro de pulmão de células pequenas, cancro da mama, cancro do cólon, neuroblastoma, blastoma glial multiforme, leucemias acionada por MLL, leucemias linfociticas crónicas, carcinoma de células escamosas envolvendo um rearranjo de NUT, bem como outros cancros envolvendo proteínas que contêm bromodomínios ou rearranjos de NUT. A linguagem "inibir o crescimento" do neoplasma inclui abrandar, interromper, deter ou parar o seu crescimento e metástases e não indica necessariamente uma eliminação total do crescimento neoplásico.

Por "modelagem computacional" quer-se dizer a aplicação de um programa computacional para determinar um ou mais dos seguintes: a localização e proximidade de ligação de um ligando a uma fração de ligação, o espaço ocupado de um ligando ligado, a quantidade de superfície de contacto complementar entre uma fração de ligação e um ligando, a energia de deformação de ligação de um determinado ligando com uma fração de ligação, e alguma estimativa da força de ligação do hidrogénio, interação de van der Waals, interação hidrofóbica, e/ou energias de interação eletroestática entre ligando e fração de ligação. A modelagem computacional também pode proporcionar comparações entre características de um sistema modelo e um composto candidato. Por exemplo, uma experiência de modelagem computacional pode comparar um modelo de farmacóforo com um composto candidato para avaliar a adequação do composto candidato com o modelo.

Por um "sistema computacional" quer-se dizer os meios de hardware, meios de software e meios de armazenamento de dados utilizados para analisar os dados coordenados atómicos. Os meios mínimos de hardware dos sistemas baseados em computadores divulgados no presente documento compreendem uma unidade central de processamento (CPU), meios de entrada, meios de saída e meios de armazenamento de dados. Desejavelmente um monitor é proporcionado para visualizar dados estruturais. Os meios de armazenamento de dados podem ser RAM ou meios para aceder a meios legíveis por computador descritos no presente documento. Exemplos de tais sistemas são estações de trabalho de microcomputadores disponíveis da Silicon Graphics Incorporated e Sun Microsystems funcionando baseados em Unix, sistemas operativos Windows NT ou IBM OS/2.

Por "suportes de dados legíveis por computador" entende-se qualquer tipo de suporte de dados que possa ser lido e acedido diretamente por um computador, por exemplo de modo que o suporte de dado é adequado para utilização no sistema de computacional acima mencionado. Os suportes de dados incluem, mas não estão limitados a: suportes de dados de armazenamento magnético tais como disquetes, suportes de dados de disco rígido e fita magnética; suportes de dados de armazenamento ótico tais como discos óticos ou CD-ROM; suportes de dados de armazenamento eletrónico como RAM e ROM; e híbridos destas categorias tais como suportes de dados magnéticos/óticos.

Nesta divulgação, "compreende", "compreendendo", "contendo" e "tendo" e semelhantes podem ter o significado a eles atribuído na lei de Patentes U.S. e podem significar "inclui", "incluindo" e semelhantes; "consistindo essencialmente em" ou "consiste essencialmente" da mesma fora têm o significado atribuído na lei de Patente U.S. e o termo é aberto, permitindo a presença de mais do que aquilo que é recitado até agora como características novas ou básicas daquilo que é recitado não é mudado pela presença de mais do que aquilo que é recitado, mas exclui formas de realização da técnica anterior. "Detetar" refere-se à identificação da presença, ausência ou quantidade do analito a ser detetado.

Por "etiqueta detetável" entende-se uma composição que quando ligada a uma molécula de interesse torna a última detetável, através de meios espectroscópicos, fotoquimicos, bioquímicos, imunoquímicos, ou químicos. Por exemplo, etiquetas úteis incluem isótopos radioativos, esferas magnéticas, esferas metálicas, partículas coloidais, corantes fluorescentes, reagentes densos aos eletrões, enzimas (por exemplo, conforme habitualmente utilizadas num ELISA), biotina, digoxigenina, ou haptenos.

Por "doença" entende-se qualquer condição ou distúrbio que danifica ou interfere com a função normal de uma célula, tecido, ou órgão. Exemplos de doenças suscetíveis de tratamento com os compostos delineados no presente documento incluem uma neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para redução da fertilidade masculina.

Utilizações adicionais das composições divulgadas no presente documento incluem, mas não estão limitadas a, utilização no transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência.

Por "quantidade eficaz" entende-se a quantidade de um agente necessário para melhorar os sintomas de uma doença em relação a um paciente não tratado. A quantidade eficaz de um ou mais compostos ativos utilizados para praticar a presente invenção para o tratamento terapêutico de uma doença varia dependendo da maneira de administração, a idade, peso corporal, e saúde geral do indivíduo. Em última análise, o médico assistente ou veterinário irá decidir a quantidade e regime de dosagem apropriados.

Tal quantidade é referida como uma "quantidade eficaz". 0 termo "enantiómeros" refere-se a dois estereoisómeros de um composto que são imagens de espelho não sobreponíveis uma da outra. Uma mistura equimolar de dois enantiómeros designa-se uma "mistura racémica" ou um "racemato". 0 termo "halogéneo" designa -F, Cl, Br ou I. 0 termo "haloalquilo" destina-se a incluir grupos alquilo conforme definido acima que são mono, di ou polisubstituidos por halogéneo, por exemplo, fluorometilo e trifluorometilo. 0 termo "hidroxil" significa -OH. 0 termo "heteroátomo" conforme utilizado no presente documento significa um átomo de qualquer elemento além de carbono ou hidrogénio. Heteroátomos preferidos são azoto, oxigénio, enxofre e fósforo. 0 termo "heteroarilo" refere-se a um sistema de anel monociclico de 5-8 membros, biciclico de 8-12 membros, ou triciclico de 11-14 membros tendo 1-4 heteroátomos no anel se monociclico, 1-6 heteroátomos se biciclico, ou 1-9 heteroátomos se triciclico, os ditos heteroátomos selecionados a partir de 0, N- ou S, e os restantes átomos do anel sendo carbono. Os grupos heteroarilo podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes, por exemplo, substituintes conforme descrito no presente documento para grupos arilo. Exemplos de grupos heteroarilo incluem, mas não estão limitadas a, piridilo, furanilo, benzodioxolilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, triazolilo, tiadiazolilo, isoquinolinilo, indazolilo, benzoxazolilo, benzofurilo, indolizinilo, imidazopiridilo, tetrazolilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzoxadiazolilo, e indolilo. 0 termo "heterocíclico" conforme utilizado no presente documento, refere-se a compostos orgânicos que contêm pelo menos um átomo além de carbono (por exemplo, S, 0, N) dentro de uma estrutura em anel. A estrutura em anel nestes compostos orgânicos pode ser aromática ou, em determinados exemplos, não aromática. Alguns exemplos de frações heterocíclicas incluem, mas não estão limitados a, piridina, pirimidina, pirrolidina, furano, tetrahidrofurano, tetrahidrotiopeno, e dioxano. 0 termo "isómeros" ou "estereoisómeros" refere-se a compostos que têm uma constituição química idêntica, mas diferem em relação à disposição dos átomos ou grupos no espaço. 0 termo "derivados isotópicos" inclui derivados de compostos nos quais um ou mais átomos nos compostos são substituídos com isótopos correspondentes dos átomos. Por exemplo, um derivado isotópico de um composto que contém um átomo de carbono (C12) seria um no qual o átomo de carbono do composto seria substituído com um isótopo C13.

Divulga-se uma série de alvos que são úteis para o desenvolvimento de fármacos altamente específicos para tratar um distúrbio caracterizados pelos métodos delineados no presente documento. Adicionalmente, divulgam-se meios fáceis para identificar terapêuticas que são seguras para utilização nos indivíduos. Adicionalmente, divulga-se uma via para analisar virtualmente qualquer número de compostos para os efeitos numa doença descrita no presente documento com rendimento de alto volume, alta sensibilidade, e complexidade baixa.

Por "adequação" entende-se a determinação por meios automáticos, ou semiautomáticos, das interações entre um ou mais átomos de uma molécula agente e um ou mais átomos ou locais de ligação de um membro da família BET (por exemplo, um bromodomínio de BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT), e a determinação da extensão até à qual tais interações são estáveis. Vários métodos baseados em computadores para adequação são adicionalmente descritos no presente documento.

Por "fragmento" entende-se uma porção de um polipéptido ou molécula de ácido nucleico. Esta porção contém, preferivelmente, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% do comprimento total da molécula de ácido nucleico ou polipéptido de referência. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 nucleótidos ou aminoácidos. "Hibridização" significa ligação de hidrogénio, que pode ser de ligação de hidrogénio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen invertido, entre bases nucleotidicas complementares. Por exemplo, adenina e timina são bases nucleotidicas complementares que se emparelham através da formação de ligações de hidrogénio.

Por "polinucleótido isolado" entende-se um ácido nucleico (por exemplo, um ADN) que é livre dos genes que, no genoma de ocorrência natural do organismo a partir do qual a molécula de ácido nucleico divulgada no presente documento é derivada, flanqueiam o gene. O termo incluir portanto, por exemplo, um ADN recombinante que é incorporado num vetor; num plasmideo ou vírus que se replica de forma autónoma; ou no AND genómico de um procariota ou eucariota; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um ADNc ou fragmento genómico ou de ADNc produzido por PCR ou digestão por endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Adicionalmente, o termo inclui uma molécula de ARN que é transcrita a partir de uma molécula de ADN, bem como um ADN recombinante que é parte de uma sequência de polipéptidos adicional que codifica um gene híbrido.

Por um "polipéptido isolado" entende-se um polipéptido conforme divulgado no presente documento que foi separado de componentes que o acompanham naturalmente. Tipicamente, o polipéptido é isolado quando ele é pelo menos 60%, em peso, livre de proteínas e moléculas orgânicas de ocorrência natural com as quais está naturalmente associado. Preferivelmente, a preparação é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99%, em peso, um polipéptido descrito no presente documento. Um polipéptido isolado pode ser obtido, por exemplo, através de extração a partir de uma fonte natural, através da expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica um tal polipéptido; ou através de síntese química da proteína. A pureza pode ser medida através de qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida, ou análise por HPLC.

Por "marcador" entende-se qualquer proteína ou polinucleótido tendo uma alteração no nível de expressão ou atividade que está associado com uma doença ou distúrbio.

Conforme utilizado no presente documento, "obter" tal como em "obter um agente" inclui sintetizar, comprar, ou de outra forma adquirir o agente. O termo "neoplásico" refere-se àquelas células que têm a capacidade para crescimento autónomo, isto é, um estado ou condição anormal caracterizada pelo crescimento celular de rápida proliferação. Um estado de doença neoplásica pode ser categorizado como patológico, isto é, que caracteriza ou constitui um estado de doença, ou pode ser categorizado como não patológico, isto é, um desvio do normal mas que não está associado com um estado de doença. O termo destina-se a incluir todos os tipos de crescimentos cancerígenos ou processos oncogénicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos, ou órgãos transformados malignamente, independentemente do tipo histopatológico ou estádio de invasão. As células "hiperproliferativas patológicas" ocorrem em estados de doença caracterizados por crescimento tumoral maligno. Exemplos de células hiperproliferativas não patológicas incluem proliferação de células associada com a reparação de feridas. A linguagem "inibir o crescimento" do neoplasma inclui abrandar, interromper, deter ou parar o seu crescimento e metástases e não indica necessariamente uma eliminação total do crescimento neoplásico. 0 significado médico comum do termo "neoplasia" refere-se ao "crescimento de novas células" que resulta como uma perda de capacidade de resposta aos controlos normais de crescimento, por exemplo para crescimento celular neoplásico. Uma hiperplasia "refere-se" a células que estão a passar por um ritmo de crescimento anormalmente elevado. No entanto, conforme utilizado no presente documento, o termo neoplasia geralmente refere-se a células que experimentam taxas de crescimento celular anormais. Neoplasias incluem "tumores", que podem ser benignos, pré-malignos ou malignos. 0 termo "obtenção" como em "composto de obtenção" é destinado a incluir comprar, sintetizar ou de outro modo adquirir o composto. 0 termo "isómeros ópticos" conforme é utilizado no presente documento inclui moléculas, também conhecidas como moléculas quirais, que são imagens não superponíveis umas das outras.

As frases "administração parentérica" e "administrado parentericamente" conforme são utilizadas no presente documento significam modos de administração diferente de administração entérica e tópica, normalmente por meio de injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e intraesternal.

Os termos "policíclico" ou "radical policíclico" refere-se ao radical de dois ou mais anéis cíclicos (por exemplo, cicloalquilos, cicloalquenilos, cilcloalquinilos, arilos e/ou heterocíclicos) nos quais dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis adjacentes, por exemplo, os anéis são "anéis fusionados". Os anéis que estão juntos através de átomos não adjacentes são designados anéis "com ponte". Cada um dos anéis do policiclo pode ser substituído com substituintes tais como descrito acima, como por exemplo, halogéneo, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfato, fosfinato, ciano, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino, e alquilarilamino), acilamino (incluindo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoil e ureido), amidino, imino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilo, alquilarilo, ou uma fração aromática ou heteroaromática. 0 termo "polimorfo" conforme utilizado no presente documento, refere-se a formas cristalinas sólidas de um composto da presente invenção ou complexo do mesmo. Polimorfos diferentes do mesmo composto podem exibir diferentes propriedades físicas, químicas e/ou espectroscópicas. Propriedades físicas diferentes incluem, mas não estão limitadas a estabilidade (por exemplo, ao calor ou à luz), compressibilidade e densidade (importante na formulação e fabrico do produto), e taxas de dissolução (que podem afetar a biodisponibilidade) . As diferenças na estabilidade podem resultar de alterações na reatividade química (por exemplo, oxidação diferencial, de tal forma que uma forma farmacêutica perde cor mais rapidamente quando compreendida por um polimorfo do que quando compreendida por outro polimorfo) ou características mecânicas (por exemplo, os comprimidos desfazem-se no armazenamento à medida que um polimorfo cineticamente favorável se converte num polimorfo mais estável termodinamicamente) ou ambos (por exemplo, comprimidos de um polimorfo são mais suscetíveis à degradação numa humidade elevada). Diferentes propriedades físicas dos polimorfos podem afetar o seu processamento. 0 termo pró-fármaco inclui compostos com frações que podem ser metabolizadas in vivo. Geralmente, os pró-fármacos são metabolizados in vivo por estearases ou por outros mecanismos em fármacos ativos. Exemplos de pró-fármacos e suas utilizações são bem conhecidos na técnica (Veja-se, por exemplo, Berge et ai. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 66:1-19) . Os pró-fármacos podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação final dos compostos, ou através da reação em separado do composto purificado na sua forma de ácido livre ou hidroxilo com um agente de esterificação adequado. Os grupos hidroxilo podem ser convertidos em ésteres através do tratamento com um ácido carboxílico. Exemplos de frações de pró-fármacos incluem frações de éster de alquilo inferior não ramificado ou ramificado, substituído ou não substituído, (por exemplo, ésteres de ácido propiónico), ésteres de alquenilo inferiores, ésteres de alquilo inferiores de aminoalquilo di-inferior (por exemplo, éster de dimetilaminoetilo), ésteres de alquilo inferiores de acilamino (por exemplo, éster de acetiloximetilo), ésteres de alquilo inferiores de aciloxi (por exemplo, éster de pivaloiloximetilo), ésteres de arilo (éster de fenilo), ésteres de alquilo inferiores de arilo éster de benzilo), ésteres de alquilo de arilo e arilo inferiores substituídos (por exemplo, com substituintes de metilo, halo, ou metoxi), amidas, amidas de alquilo inferiores, amidas de alquilo di-inferiores, e hidroxiamidas. Frações de pró-fármacos preferidos são ésteres de ácido propiónico e ésteres de acilo. Pró-fármacos que são convertidos em formas ativas através de outros mecanismos in vivo estão também incluídos.

Além disso, a indicação de estereoquímica através de uma ligação dupla carbono-carbono também é oposta do campo da química geral em que "Z" se refere ao que é muitas vezes referido como uma conformação "cis" (mesmo lado) ao passo que "E" se refere ao que é muitas vezes referido como uma conformação (lado oposto) "trans". Ambas as configurações, cis/trans e/ou Z/E são englobadas pelos compostos da presente invenção.

Com respeito à nomenclatura de um centro quiral, os termos configuração "d" e "1" são conforme definidos pelas Recomendações da IUPAC. No que diz respeito à utilização dos termos, diasterómero, racemato, epimero e enantiómero, estes serão utilizados no seu contexto normal para descrever a estereoquimica das preparações.

Por "reduz" entende-se uma alteração negativa de pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, ou 100%.

Por "referência" entende-se uma condição de controlo ou padrão.

Uma "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como uma base para a comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, um segmento de uma sequência de gene ou ADNc de comprimento completo, ou a sequência de gene ou ADNc completa. Para os polipéptidos, o comprimento da sequência polipeptidica de referência será de, geralmente, pelo menos cerca de 16 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 20 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 25 aminoácidos, e ainda mais preferivelmente cerca de 35 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos, ou cerca de 100 aminoácidos. Para os ácidos nucleicos, o comprimento da sequência de ácidos nucleicos de referência será de, geralmente, pelo menos cerca de 50 nucleótidos, preferivelmente pelo menos cerca de 60 nucleótidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75 nucleótidos, e ainda mais preferivelmente cerca de 100 nucleótidos ou cerca de 300 nucleótidos ou um número inteiro próximo ou entre os mesmo.

Por "liga-se especificamente" entende-se um composto ou anticorpo que reconhece e se liga a um polipéptido divulgado no presente documento, mas que não reconhece e se liga substancialmente a outras moléculas numa amostra, por exemplo, uma amostra biológica, que inclui naturalmente um polipéptido divulgado no presente documento.

As moléculas de ácidos nucleicos úteis nos métodos divulgados no presente documento incluem qualquer molécula de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido divulgado no presente documento ou um fragmento do mesmo. Tais moléculas de ácidos nucleicos não necessitam de ser 100% idênticas com uma sequência de ácidos nucleicos endógena, mas irão tipicamente exibir uma identidade substancial. Polinucleótidos que têm "identidade substancial" com uma sequência endógenas são tipicamente capazes de hibridizar com pelo menos uma cadeia de uma molécula de ácido nucleico de cadeia dupla. As moléculas de ácidos nucleicos úteis nos métodos divulgados no presente documento incluem qualquer molécula de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido divulgado no presente documento ou um fragmento do mesmo. Tais moléculas de ácidos nucleicos não necessitam de ser 100% idênticas com uma sequência de ácidos nucleicos endógena, mas irão tipicamente exibir uma identidade substancial. Polinucleótidos que têm "identidade substancial" com uma sequência endógenas são tipicamente capazes de hibridizar com pelo menos uma cadeia de uma molécula de ácido nucleico de cadeia dupla. Por "hibridizar" entende-se emparelhar para formar uma molécula de cadeia dupla entre sequências de polinucleótidos complementares (por exemplo, um gene descrito no presente documento), ou porções do mesmo, sob várias condições de restritividade. (Veja-se, por exemplo, Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507) .

Por exemplo, a concentração de sal restritiva será vulgarmente NaCl a menos do que cerca de 750 mM e citrato trissódico a 75 mM, preferivelmente NaCl a menos do que cerca de 500 mM e citrato trissódico a 50 mM, e mais preferivelmente NaCl a menos do que cerca de 250 mM e citrato trissódico a 25 mM. A hibridização de baixa restritividade pode ser obtida na ausência de solvente orgânico, por exemplo, formamida, enquanto a hibridização de alta restritividade pode ser obtida na presença de formamida a pelo menos 35%, e mais preferivelmente de formamida a pelo menos 50%. Condições de temperatura restritivas irão vulgarmente incluir temperaturas de pelo menos 30 °C, mais preferivelmente de pelo menos cerca de 37 °C, e ainda mais preferivelmente de pelo menos cerca de 42 °C. Parâmetros adicionais variantes, tais como o tempo de hibridização, a concentração de detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), e a inclusão ou exclusão de ADN portador, são bem conhecidos para os peritos na especialidade. Vários níveis de restringência são alcançados através da combinação destas várias condições, conforme necessário. Num exemplo preferido, a hibridização irá ocorrer a 30 °C em NaCl a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM, e SDS a 1%. Num exemplo mais preferido, a hibridização irá ocorrer a 37 °C em NaCl a 500 mM, citrato de sódio a 50 mM, SDS a 1%, formamida a 35%, e ADN de esperma de salmão desnaturado (ADNss) a 100 pg/ml. Num exemplo ainda mais preferido, a hibrizidação irá ocorrer a 42 °C em NaCl a 250 mM, citrato de sódio a 25 mM, SDS a 1%, formamida a 50%, e ADNss a 200 mg/ml. Variações úteis nestas condições serão prontamente aparentes para aqueles peritos na especialidade.

Para a maioria das aplicações, as etapas de lavagem que se seguem à hibridização irão também variar com a restringência. As condições de restringência de lavagem podem ser definidas pela concentração de sal e pela temperatura. Conforme acima, a restringência de lavagem pode ser aumentada através da diminuição da concentração de sal ou aumentando a temperatura. Por exemplo, a concentração de sal restringente para as etapas de lavagem será preferivelmente NaCl a menos do que cerca de 30 mM e citrato trissódico a 3 mM, e ainda mais preferivelmente NaCl a menos do que cerca de 15 mM e citrato trissódico a 1,5 mM. Condições de temperatura restringentes para as etapas de lavagem irão vulgarmente incluir uma temperatura de pelo menos 25 °C, mais preferivelmente de pelo menos cerca de 42 °C, e ainda mais preferivelmente de pelo menos cerca de 68 °C. Num exemplo preferido, as etapas de lavagem ocorrerão a 25 °C em NaCl a 30 mM, citrato de sódio a 3 mM, e SDS a 0,1%. Num exemplo mais preferido, as etapas de lavagem ocorrerão a 42 °C em NaCl a 15 mM, citrato de sódio a 1,5 mM, e SDS a 0,1 %. Num exemplo mais preferido, as etapas de lavagem ocorrerão a 68 °C em NaCl a 15 mM, citrato de sódio a 1,5 mM, e SDS a 0,1%. Variações adicionais nestas condições serão prontamente aparentes para aqueles peritos na especialidade. As técnicas de hibridização são bem conhecidas para aqueles peritos na especialidade e são descritas, por exemplo, em Benton e Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein e Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nova Iorque, 2001); Berger e Kimmel (Guide to

Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nova Iorque); e Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.

Por "substancialmente idêntica" entende-se uma molécula de ácido nucleico ou polipéptido que exibe pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência (por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas no presente documento) ou sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos descritas no presente documento). Preferivelmente, uma tal sequência é pelo menos 85%, 90%, 95%, 99% ou mesmo 100% idêntica ao nível dos aminoácidos ou ácidos nucleicos, com a sequência utilizada para comparação. A identidade de sequência é tipicamente medida utilizando software de análise de sequências (por exemplo, Pacote de

Software de Análise de Sequências do Genetics Computer Group,

University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP, ou PILEUP/PRETTYBOX). Tal software coincide sequências idênticas ou semelhantes atribuindo graus de homologia para várias substituições, deleções, e/ou outras modificações. Substituições conservativas tipicamente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Numa abordagem exemplar para a determinação do grau de identidade, um programa BLAST pode ser utilizado, com uma pontuação de probabilidade entre e.sup.-3 e e.sup.-100 indicando uma sequência estreitamente relacionada.

Por "reduz" ou "aumenta" entende-se uma alteração positiva ou negativa, respetivamente, de pelo menos cerca de 10%, 25%, 50%, 75%, ou 100% em relação a uma referência.

Por "desvio quadrático médio" entende-se a raiz quadrada da média aritmética dos quadrados dos desvios da média.

Por "redução da sobrevivência celular" entende-se inibir a viabilidade de uma célula ou induzir a morte celular relativamente a uma célula de referência.

Por "referência" entende-se uma condição de controlo ou padrão.

Uma "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como uma base para a comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, um segmento de uma sequência de gene ou ANDc de comprimento completo, ou a sequência de gene ou ADNc completa. Para os polipéptidos, o comprimento da sequência polipeptidica de referência será de, geralmente, pelo menos cerca de 16 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 20 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 25 aminoácidos, e ainda mais preferivelmente cerca de 35 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos, ou cerca de 100 aminoácidos. Para os ácidos nucleicos, o comprimento da sequência de ácidos nucleicos de referência será de, geralmente, pelo menos cerca de 50 nucleótidos, preferivelmente pelo menos cerca de 60 nucleótidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75 nucleótidos, e ainda mais preferivelmente cerca de 100 nucleótidos ou cerca de 300 nucleótidos ou um número inteiro próximo ou entre os mesmo.

Por "indivíduo" entende-se um mamífero, incluindo, mas não limitado a, um mamífero humano ou não humano, tal como um bovino, equino, canino, ovino, ou felino.

Por "liga-se especificamente" entende-se um composto ou anticorpo que reconhece e se liga a um polipéptido divulgado no presente documento, mas que não reconhece e se liga substancialmente a outras moléculas numa amostra, por exemplo, uma amostra biológica, que inclui naturalmente um polipéptido divulgado no presente documento. O termo "sulfidrilo" ou "tiol" significa -SH.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "tautómeros" refere-se a isómeros de moléculas orgânicas que prontamente se interconvertem através de tautometização, onde um átomo de hidrogénio ou protão migra na reação, acompanhado em algumas ocasiões por uma troca de uma ligação simples e uma ligação dupla adjacente.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "tratar", "tratando", "tratamento" e semelhantes, referem-se à redução ou melhoria de um distúrbio e/ou sintomas com ele associados. Por "melhorar" entende-se diminuir, suprimir, atenuar, reduzir, travar, ou estabilizar o desenvolvimento ou progressão de uma doença. Será apreciado que, embora não excluído, tratar um distúrbio ou condição não requer que o distúrbio, condição ou sintomas com eles associados sejam completamente eliminados.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "prevenir", "prevenindo", "prevenção", "tratamento profilático" e semelhantes, referem-se à redução da probabilidade de desenvolvimento de um distúrbio ou condição num indivíduo, que não tem, mas está em risco de, ou é suscetível de desenvolver um distúrbio ou condição. "Uma quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um composto, que confere um efeito terapêutico no indivíduo tratado. 0 efeito terapêutico pode ser objetivo (isto é, mensurável por alqum teste ou marcador) ou subjetivo (isto é, o indivíduo dá uma indicação de, ou sente um efeito) . Uma quantidade eficaz de um composto descrito no presente documento pode variar desde cerca de 1 mg/kg até cerca de 5000 mg/kg de peso corporal. Doses eficazes irão também variar dependendo da via de administração, bem como da possibilidade de co-utilização com outros agentes.

Os intervalos fornecidos no presente documento entendem-se como sendo resumidos para todos os valores dentro do intervalo. Por exemplo, um intervalo de 1 a 50 entende-se como incluindo qualquer número, combinação de números, ou subintervalo a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "tratar", "tratando", "tratamento" e semelhantes, referem-se à redução ou melhoria de um distúrbio e/ou sintomas com ele associados. Será apreciado que, embora não excluído, tratar um distúrbio ou condição não requer que o distúrbio, condição ou sintomas com eles associados sejam completamente eliminados. A não ser que especificamente mencionado ou seja óbvio a partir do contexto, conforme utilizado no presente documento, o termo "ou" entende-se como sendo inclusivo. A não ser que especificamente mencionado ou seja óbvio a partir do contexto, conforme utilizado no presente documento, os termos "um", "uma", e "o/a" entende-se como sendo singulares ou plurais. A não ser que especificamente mencionado ou seja óbvio a partir do contexto, conforme utilizado no presente documento, o termo "cerca" entende-se como dentro de um intervalo de tolerância normal na técnica, por exemplo dentro de 2 desvios padrão da média. Cerca pode ser entendido como dentro de 10% 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, ou 0,01% do valor indicado. A menos que seja claro a partir do contexto, todos os valores numéricos proporcionados no presente documento são modificados pelo termo cerca.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a estrutura dos dois estereoisómeros JQ1. O estereocentro em C6 está indicado por um asterisco (*). As Figuras 2A, 2B, e 2C são gráficos que mostram que o enantiómero (-)-JQ1 não se liga de forma competitiva com BRD4-NUT nas células. A Figura 2A mostra que a recuperação de fluorescência após o fotobranqueamento (FRAP) de GFP-BRD4 não é afetada pela presença de (-)-JQ1 (250 nM, 5 h) em comparação com o controlo de veiculo. Os dados representam a média ± d.p. (n = 5) . A Figura 2B mostra que GFP-BRD4 expresso demonstra uma recuperação melhorada na presença de (+)-JQ1 (250 nM, 5 horas), num estudo comparativo paralelo. Os dados representam a média ± d.p. (n = 5) . A Figura 2C proporciona uma comparação quantitativa da fração móvel de GFP-BRD4 observada nos estudos de FRAP (a,b). Os dados representam a média ± d.p. (n=5) e são anotados com valores de p conforme obtidos a partir de um teste t de duas caudas comparando amostras tratadas com ligando com controlos de veiculo. As Figuras 3A-3J mostram que JQ1 liga BRD4 competitivamente com cromatina e diferencia células de carcinoma da linha média NUT humano. A Figura 3A mostra a recuperação de fluorescência após o fotobranqueamento (FRAP) de GFP-BRD4 que demonstra uma recuperação melhorada na presença de JQ1. Os núcleos são falsamente corados em proporção à intensidade de fluorescência. Os círculos brancos indicam regiões de fotobranqueamento. As Figuras 3B-3D mostram que JQ1 acelera a recuperação de fluorescência em experiências de FRAP realizadas com GFP-BRD4 (Figura 3B) e GFP-BRD4-NUT (Figura 3C) transfetadas, mas não tem efeito na recuperação de GFP-NUT nuclear (Figura 3D) . A Figura 3E mostra uma comparação quantitativa de tempo com a recuperação de fluorescência máxima média para os estudos de FRAP (Figuras 3B-3D). Os dados representam a média ± d.p. (n = 5) , e são anotados com valores de p conforme obtido a partir de um teste t de duas caudas. 0 JQ1 (500 nM, 48 h) da Figura 3F prontifica uma perda de coloração nuclear focal para NUT (anti-NUT; 40x). A Figura 3G mostra que as células de NMC tratadas com JQ1 (500 nM, 48 h) demonstram sinais citológicos de diferenciação escamosa (H&E; 40x). A Figura 3H mostra que a diferenciação das células NMC por JQ1 (500 nM) é rápida, dependente do tempo e caracterizada por um aumento marcado na expressão de citoqueratina (AE1/AE3; 40x). As Figuras 3I-3J mostra que JQ1 atenua a rápida proliferação das linhas celulares 797 de NMC (Figura 31) e Per403 (Figura 3J) in vitro (Ki67; 4Ox) .

As Figuras 4A, 4B, e 4C são microfotografias que mostram que JQ1 induz seletivamente a diferenciação escamosa no carcinoma da linha média NUT. A Figura 4a mostra que as células 797 de NMC tratadas com JQ1 (500 nM) demonstram sinais citológicos de diferenciação escamosa dependentes do tempo (H&E; 40x e lOOx, conforme mostrado), exemplificado pelo alongamento e aplanamento celular e o desenvolvimento de cromatina aberta. A Figura 4B mostra que as células Per403 de NMC tratadas com JQ1 (500 nM, 48 h) exibem sinais comparáveis de diferenciação escamosa. O alongamento celular e queratinização do citosol são ilustrados por coloração de H&E e de queratina, respetivamente (40x) . A Figura 4C mostra que a linha celular TE10 de carcinoma escamoso não NMC falha na diferenciação em resposta a JQ1 (500 nM) , ilustrada por coloração de H&E e de queratina (AE1/AE3) (40x). A Figura 4D-a-4D-b mostra que JQ1 compromete a proliferação celular de NMC. A Figura 4D-a inclui duas microfotografias que mostram que JQ1 atenua a rápida proliferação de linhas celulares Per403 de NMC in vitro (Ki67; 40x) . As imagens são mostradas numa ampliação idêntica. A Figura 4D-b é um gráfico que mostra o efeito de JQ1 na proliferação celular (coloração com Ki67 e positividade; %) conforme medido por IHC, conforme levado a cabo em (4D-a) e Figura 3J. As células foram manualmente pontuadas como positivas (núcleos com coloração escura) ou negativas (núcleos com coloração azul clara) para Ki67 em cinco campos de alta potência. Os dados representam a média ± d.p. (n = 5) , e são anotados com valores de p conforme obtido a partir de um teste t de duas caudas. A Figura 4E-a, b, c, d mostra que a indução de diferenciação escamosa em células de carcinoma da linha média NUT por JQ1 é estereoespecí f ica e dependente do tempo. A Figura 4E-a inclui seis microfotografias, que mostram que células NMC 797 tratadas em lâminas de câmara com (-)-JQ1 (100 nM) exibiram fenótipos citosólicos comparáveis em comparação com os controlos tratados com veículo. (+)-JQl (100 nM, 48 h) prontificou a diferenciação escamosa exibida por alongamento, aplanamento celular e expressão aumentada de queratina. A Figura 4E-b mostra que células 797 de NMC tratadas com enantiómeros JQ1 ou veículo foram centrifugadas, fixadas, seccionadas e coradas para a expressão de queratina (esquerda; AE1/AE3, 20x). A análise baseada em imagem da expressão de queratina foi realizada em lâminas preparadas concorrentemente utilizando algoritmos imparciais de quantificação e mascaramento capazes de pontuar os núcleos para a intensidade de coloração (direita; 20x). A Figura 4E-c mostra que (+)-JQ1 (250 nM) induziu uma rápida expressão de queratina em células 797 de NMC tratadas em comparação com (-) -JQ1 (250 nM) e controlos de veiculo, conforme determinado por imunohistoquímica quantitativa. A percentagem de núcleos positivos por condição de tratamento é apresentada. Os dados representam a média ± d.p. (n = 3) e são anotados com valores de p conforme obtido a partir de um teste t de duas caudas. A Figura 4E-d, (+)-JQ1 (250 nM) desencadeia uma indução dependente do tempo de forte coloração de queratina (3+) das células 797 de NMC tratadas, em comparação com (-)-JQ1 (250 nM) . A percentagem de núcleos positivos por condição de tratamento é apresentada. Os dados representam a média ± d.p. (n = 3) e são anotados com valores de p conforme obtido a partir de um teste t de duas caudas. As imagens agrupadas são mostradas numa ampliação idêntica.

As Figuras 4Fa-c mostram que as linhas celulares de carcinoma escamoso que não possuem a translocação de BRD4-NUT são menos sensíveis ao tratamento com JQ1. As linhas celulares de carcinoma escamoso gastrointestinal (TT e TE10) foram cultivadas na presença de (+)-JQl (250 nM, círculos vermelhos) ou (-)-JQ1 (250 nM, círculos pretos) durante 72 horas. Os efeitos mínimos observados na proliferação celular com JQ1 são consistentes com um papel plausível na progressão do ciclo celular em células mitóticas7. Os dados representam a média ± d.p. (n = 3) . Os valores de CI50 foram calculados por regressão logística. As Figuras 5A-5K mostram que o tratamento com JQ1 inibe a proliferação, propiciando a diferenciação e morte celular in vitro e in vivo. A Figura 5a mostra os efeitos do crescimento da inibição de linhas celulares dependentes de BRD4-NUT. As células foram incubadas com (+)-JQl (círculos vermelhos) ou (-)-JQ1 (círculos pretos) e monitorizadas para a proliferação após 72 horas. (+)-JQ1 unicamente atenuou a proliferação por linhas celulares de NMC. Os dados são apresentados como média ± d.p. (n = 3) . Os valores de CI50 foram calculados por regressão logística. A Figura 5B mostra que os efeitos antiproliferativos progressivos de (+)-JQ1 em células 797 de NMC ao longo do tempo, foram demonstrados nos dias 1, 3, 7 e 10. Os pontos dos dados são média ± d.p. (n = 3). A Figura 5C mostra os resultados de citometria de fluxo para o conteúdo de ADN em células 797 de NMC. (+)-JQ1 (250 nM, 48 h) induziu uma paragem de G1 em comparação com (-) -JQ1 (250 nM) e um controlo de veículo. A Figura 5D mostra os resultados de uma análise de citometria de fluxo nas células de carcinoma escamoso NMC 797 tratadas com veículo, JQ1 e estaurosporina (STA), conforme indicado. PI, iodeto de propídio. AV, anexina-V. A Figura 5E mostra os resultados de obtenção de imagem por PET de xenoenxertos de 7 97 de NMC murinos. A absorção de FDG nos xenoenxertos dos membros posteriores é reduzida por tratamento com 50 mg kg-1 de JQ1 em comparação com o controlo de veículo. A Figura 5F mostra que o volume tumoral é reduzido em ratinhos com doença estabelecida (xenoenxertos de 797 de NMC) tratados com 50 mg kg-1 de JQ1 por dia em comparação com o controlo de veículo. Uma resposta significativa à terapêutica é observada por teste t de duas caudas aos 14 dias (p = 0,039) . Os dados representam a média ± d.p. (n = 7). A Figura 5G mostra que uma análise histopatológica de tumores de 797 de NMC excisados de animais tratados com JQ1 revela a indução da expressão de queratina (AE1/AE3, 40x) e proliferação comprometida (Ki67, 40x) , conforme comparado com animais tratados com veículo (a barra de escala é de 20 mm) . Os campos expandidos são proporcionados nas Figuras Suplementares 11, 12. A Figura 5H mostra que a viabilidade de xenoenxertos de 11060 de NMC derivados de pacientes foi confirmada por obtenção de imagem por PET. A Figura 51 mostra a resposta terapêutica de xenoenxertos de 11060 de NMC primários a (+)JQ1 (50 mg kg-1 por dia durante quatro dias), foi demonstrada por obtenção de imagem por PET. A Figura 5J mostra uma análise histopatológica de tumores de 11060 de NMC primários excisados de animais tratados com (+)-JQl, revela a indução da expressão de queratina (AE1/AE3, 20x; a barra de escala é de 20 mm), conforme comparado com os animais tratados com veiculo. A análise quantitativa da indução de queratina foi realizada usando mascaramento de imagem (Figura 5J, painel direito) e análise de positividade de pixel (Figura 5K) . Uma resposta significativa à terapêutica é observada por teste t de duas caudas (p = 0,0001). Os dados representam a média ± d.p. de três campos microscópicos amplos independentes. As imagens comparativas de tumores excisados corados e máscaras quantitativas são proporcionadas na Figura 9. A Figura 5L-a e 5L-b são gráficos que mostram que ratinhos que carregam xenoenxertos de 797 de NMC toleram a terapêutica de JQ1, que desencadeia um efeito antitumoral. A Figura 5L-a mostra que o tratamento de ratinhos que carregam xenoenxertos de 797 de NMC com JQ1 (50 mg kg-1 por dia) reduziu a carga tumoral ao longo de 14 dias de terapêutica. Os dados representam a média ± d.p. (n = 7) . A Figura 5L-b mostra que JQ1 não produziu sintomas adversos ou perda de peso. Os dados representam a média ± d.p. (n = 7) . A Figura 5M-a-d mostra que a indução de diferenciação escamosa em células de carcinoma da linha média NUT por JQ1 é estereoespecifica e dependente do tempo. A Figura 5M-a são microfotografias que mostram que células 797 de NMC tratadas em lâminas de câmara com (-)-JQ1 (100 nM) exibem fenótipos citosólicos comparáveis em comparação com os controlos tratados com veiculo. (+)-JQl (100 nM, 48 h) prontifica a diferenciação escamosa exibida por alongamento, aplanamento celular e expressão aumentada de queratina.

As Figuras 5M-b são microfotografias. Células 797 de NMC tratadas com enantiómeros JQ1 ou veiculo foram centrifugadas, fixadas, seccionadas e coradas para a expressão de queratina (esquerda; AE1/AE3, 20x) . A análise baseada em imagem da expressão de queratina foi realizada em lâminas preparadas concorrentemente utilizando algoritmos imparciais de quantificação e mascaramento capazes de pontuar os núcleos para a intensidade de coloração (direita; 20x) . A Figura 5M-c é um gráfico que mostra que ( + )-JQ1 (250 nM) induziu uma rápida expressão de queratina em células 797 de NMC tratadas em comparação com (-)-JQl (250 nM) e controlos de veiculo, conforme determinado por imunohistoquímica quantitativa. A percentagem de núcleos positivos por condição de tratamento é apresentada. Os dados representam a média ± d.p. (n = 3) e são anotados com valores de p conforme obtido a partir de um teste t de duas caudas. A Figura 5M-d é um gráfico que mostra que (+)-JQ1 (250 nM) desencadeia uma indução dependente do tempo de forte coloração de queratina (3+) das células 797 de NMC tratadas, em comparação com (-)-JQ1 (250 nM) . A percentagem de núcleos positivos por condição de tratamento é apresentada. Os dados representam a média ± d.p. (n = 3) e são anotados com valores de p conforme obtido a partir de um teste t de duas caudas. As imagens agrupadas são mostradas numa ampliação idêntica.

As Figuras 6A e 6B-a-6B-e proporcionam microfotografias que mostram que Jql propicia a diferenciação escamosa, paragem do crescimento e apoptose in vivo, conforme determinado por IHC. A análise histopatológica de tumores NMC excisados a partir de animais tratados com JQ1 (painel da direita) revela diferenciação escamosa (H&E, 40x) , apagamento de focos de NUT nucleares (NUT, lOOx), proliferação comprometida (Ki67, 40x), indução da expressão de queratina (AE1/AE3, 40x) e uma resposta apoptótica (TUNNEL, 40x), tudo conforme comparado com animais tratados com veiculo (painel esquerdo).

As Figuras 7A e 7B mostram que JQ1 seletivamente induz apoptose em NMC entre linhas celulares de carcinoma escamoso humano. A Figura 7A proporciona os resultados da análise por FACS. Células Per403 de NMC tratadas com JQ1 (500 nM, 24 ou 48 h) exibem indução de apoptose através de citometria de fluxo, em contraste com as linhas celulares TE10 e TT de carcinoma escamoso não NMC. PI, iodeto de propídio, AV, anexina V. A Figura 7B mostra uma quantificação e comparação de células positivas para anexina-V através de citometria de fluxo conforme realizada na Figura 5b e a. JQ1 (500 nM) exibiu uma indução rápida e dependente do tempo da apoptose em linhas celulares de NMC em comparação com linhas celulares de carcinoma escamoso não NMC. Os dados representam a média ± d.p. (n = 3) , e são anotados com valores de p conforme obtido a partir de um teste t de duas caudas.

As Figuras 8A-8C são gráficos que mostram que o tecido derivado de pacientes com NMC é sensível aos efeitos antiproliferativos de (+)-JQ1 in vitro. A Figura 8A mostra resultados a partir da análise de células 11060 de NMC derivadas de pacientes. As células foram isoladas de material clínico descartadas e cultivadas em culturas a curto prazo para os estudos in vitro. Os efeitos antiproliferativos da inibição de BRD4 nas células 11060 de NMC foram medidos após 72 horas de incubação com ( + ) -JQ1 (círculos vermelhos) ou (-)-JQl (círculos pretos). As células 11060 de NMC são unicamente sensíveis ao enantiómero (+)-JQl. Os dados são apresentados como média ± d.p. (n = 3) . Os valores de CI50 foram calculados por regressão logística. A Figura 8B mostra os efeitos antiproliferativos progressivos de (+)-JQ1 em células 11060 de NMC derivadas de pacientes ao longo do tempo conforme demonstrado nos dias 1, 3, 7 e 10. Os pontos dos dados são média ± d.p. (n = 3) . A Figura 8C mostra os resultados de citometria de fluxo para o conteúdo de ADN em células 11060 de NMC. (+)-JQ1 (250 nM, 48 h) induz uma paragem de G1 em comparação com (-) -JQ1 (250 nM) e um controlo de veiculo. As Figuras 9A e 9B proporcionam uma quantificação de expressão de queratina difusa e forte induzida por jql em tumores de xenoenxertos primários de 11060 de NMC derivadas de pacientes. A Figura 9a mostra uma imagem de baixa ampliação (0,8x) de um xenoenxerto primário de 11060 de NMC excisado derivado de um animal tratado com veiculo, seccionado e corado para a expressão de queratina (AE1/AE3; esquerda). A coloração total de queratina é baixa ao longo do tumor seccionado. A análise baseada em imagem da expressão de queratina foi realizada utilizando algoritmos imparciais de quantificação e mascaramento capazes de pontuar pixeis individuais para a intensidade de coloração (direita; A Figura 9B mostra uma imagem de baixa ampliação (0,8x) de um xenoenxerto primário de 11060 de NMC excisado derivado de um animal tratado com (+)-JQ1 (50 mg kg-1 diariamente durante quatro dias), seccionado e corado para a expressão de queratina (AE1/AE3; esquerda). Foi observada uma coloração difusa consistente com um efeito uniforme na indução de queratina em tumores tratados com JQ1. A análise baseada em imagem da expressão de queratina foi realizada utilizando algoritmos imparciais de quantificação e mascaramento capazes de pontuar pixeis individuais para a intensidade de coloração (direita; A positividade de pixeis é pontuada quantitativamente e relatada visualmente como azul (0), amarela (1+), laranja (2 + ) e vermelho (3 + ) . Todas as imagens emparelhadas são mostradas numa ampliação idêntica. A Figura 10 mostra que JQ1 exibe excelente biodisponibilidade oral e exposição farmacocinética adequada em roedores. Estudos farmacocinéticos de (+)-JQl foram realizados em ratinhos CD1 após administração intravenosa (Figura 10A, B) e oral (Figura 10B, C) . Os perfis de concentração plasmática média de (+)-JQ1 após administração de doses intravenosas (5 mg kg _1) . Os

dados representam a média ± d.p. (n = 3) . A Figura 10B mostra que os parâmetros farmacocinéticos calculados para (+)-JQ1 intravenoso demonstram uma excelente exposição ao fármaco [Área sob a curva (AUC) = 2090 h*ng/ml] e uma semi-vida de aproximadamente uma hora (Ti/2) . Os perfis de concentração plasmática média de (+)-JQ1 após administração de doses intravenosas (10 mg kg _1) . Os

dados representam a média ± d.p. (n = 3) . A Figura 10D mostra que os parâmetros farmacocinéticos calculados para (+)-JQ1 oral demonstra excelente biodisponibilidade oral (F = 49%), pico de concentração plasmática (Cmax = 1180 ng/ml) e exposição ao fármaco (AUC = 2090 h*ng/ml) . CL, eliminação; Vss, volume no estado estável; MRTINF, tempo de residência médio extrapolado para o infinito; Tmax, tempo para a concentração máxima. A Figura 11 é um gráfico que mostra dados de ligação de AlphaScreen para a ligação de enantiómeros JQ1 a BRD4.1. A Figura 11 é um gráfico que mostra dados de ligação de AlphaScreen para a ligação de enantiómeros JQ1 a BRD4.2. A Figura 13 é um gráfico que mostra perfis de JQ IS contra outros membros da família BET (ativo) e CBP (inactivo). A Figura 14 é um gráfico que mostra estudos de determinação de doses de uma biblioteca orientada de derivados de JQ1.

As Figuras 15A e 15B são gráficos. A Figura 15A mostra que JQ1 reduziu a carga tumoral num modelo de xenoenxerto murino de carcinoma da linha média Nut. A Figura 15B mostra o peso dos ratinhos tratados com JQ1.

As Figuras 16A-16D são gráficos que mostram a atividade de ligação de BRD4(1) e BRD4(2) de JQ1 e derivados do mesmo. As Figuras 17A-17D são gráficos que mostram o efeito de JQ1 e derivados do mesmo sobre a viabilidade celular de células de carcinoma da linha média NUT (NMC). As Figuras 18-55 mostram a viabilidade de dose-resposta para uma variedade de linhas celulares de cancro tratadas com JQ1 e derivados do mesmo.

As Figuras 56A-56D são gráficos que mostram os resultados de ensaios de ligação de compostos principais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção apresenta compostos e composições conforme definidos nas reivindicações anexas, que são úteis para o tratamento ou prevenção de uma neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para redução da fertilidade masculina. Os compostos e composições divulgados nas reivindicações anexas são utilizados no transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência. A invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de um inibidor de molécula pequena potente e permeável nas células (JQ1) com seletividade bioquímica para a família BET de bromodomínios, e de compostos relacionados capazes de regular a família de bromodomínios, que são uma família de polipéptidos que contêm um bromodomínio que reconhece resíduos de acetil-lisina na cromatina nuclear. A acetilação da lisina emergiu como uma modificação de sinalização de ampla relevância para a biologia celular e das doenças. 0 direcionamento a enzimas que fazem a mediação de forma reversível da acetilação da cadeia lateral foi uma área ativa de investigação na descoberta de fármacos durante muitos anos. Até à data esforços bem-sucedidos estiveram limitados aos "escritores" (acetiltransferases) e "eliminadores" (histona desacetilases) de modificações covalentes surgindo no contexto da cromatina nuclear. Inibidores potentes dos módulos de reconhecimento de acetil-lisina, ou bromodominios, ainda não foram descritos. A caracterização recente de estruturas co-cristalinas de alta resolução com BRD4 revelou excelente complementaridade de forma com a cavidade de ligação de acetil-lisina. A ligação de JQ1 aos bromodominios em tandem de BRD4 é competitiva com acetil-lisina e desloca BRD4 a partir da cromatina em células humanas. A translocação recorrente de BRD4 é observada num subtipo definido geneticamente de carcinoma escamoso humano incurável. A ligação competitiva de JQ1 à oncoproteina de fusão BRD4 resulta em diferenciação escamosa imediata e efeitos antiproliferativos específicos em linhas celulares derivadas de pacientes e num modelo murino de carcinoma dependente de BRD4. Estes dados estabelecem a exequibilidade de direcionar interações proteína-proteína de "leitores" epigenéticos e relata uma estrutura química versátil para o desenvolvimento de sondas químicas mais amplamente ao longo da família de bromodominios.

Proteínas que contêm bromodominios A regulação genética é fundamentalmente governada pela montagem de macromoléculas não covalente e reversível. A transdução de sinal para a ARN polimerase requer complexos proteicos de ordem mais elevada, regulados espacialmente por fatores de montagem, capazes de interpretar os estados de modificação pós-tradução da cromatina. Os leitores epigenéticos são proteínas estruturalmente diversas cada uma possuindo um ou mais módulos efetores evolutivamente conservados, que reconhecem modificações covalentes de proteínas de histonas ou ADN. A ε-Ν-acetilação de resíduos de lisina (Kac) nas caudas de histonas está associada com uma arquitetura de cromatina aberta e ativação transcricional3. 0 reconhecimento molecular específico de contexto de acetil-lisina é pricipalmente mediado por bromodominios.

As proteínas que contêm bromodomínios são de interesse biológico substancial, como componentes de complexos de fatores de transcrição (TAF1, PCAF, Gcn5 e CBP) e determinantes da memória epigenética4. Existem 41 proteínas humanas que contêm um total de 57 bromodomínios diversos. Apesar de grandes variações de sequências, todos os bromodomínios partilham uma dobra conservada que compreende um grupo no sentido anti-horário de quatro hélices alfa (az, aA, aB, ac) , ligadas por diversas regiões de ansa (ansas ZA e BC) que determinam a especificidade de substrato. As estruturas co-cristalinas com substratos peptídicos mostraram que a acetil-lisina é reconhecida por uma cavidade hidrofóbica central e é ancorada por uma ligação de hidrogénio com um resíduo de asparagina presente na maioria dos bromodomínios5. 0 bromodomínio e família (BET) extra-terminal (BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT) partilham uma arquitetura de domínio comum que compreende dois bromodomínios N-terminais que exibem um alto nível de conservação de sequências, e um domínio de recrutamento C-terminal mais divergente (Figure 1E)6. BRD4

Investigação recente estabeleceu uma lógica convincente para o direcionamento a BRD4, no cancro. BRD4 funciona para facilitar a progressão do ciclo celular e a redução de expressão em linhas celulares de cancro cultivadas propicia a paragem de G1. BRD4 é um importante mediador do alongamento transcricional, funcionando para recrutar o complexo de fatores de alongamento de transcrição positiva (P-TEFb)7,8. A cinase-9 dependente da ciclina, um componente essencial de P-TEFb, é um alvo validade na leucemia linfocítica crónica9, e foi recentemente ligado à transcrição dependente de c-Myc10. Os bromodomínios presentes em BRD4 recrutam P-TEFb para cromossomas mitóticos resultando na expressão aumentada de genes promotores do crescimento11. BRD4 permanece ligado a locais de iniciação transcricionais de genes expressos durante M/Gl mas não foi encontrado como estando presente em locais de iniciação que são expressos mais tarde no ciclo celular. A redução da expressão de BRD4 nas células em proliferação demonstrou levar à paragem de G1 e da apoptose12 através da diminuição dos níveis de expressão de genes importantes para a progressão mitótica13 e sobrevivência.

De forma mais importante, BRD4 foi recentemente identificado como um componente de uma translocação cromossómica t(15;19) recorrente numa forma agressiva de carcinoma escamoso humano15,16. Tais translocações expressam os bromodomínios N-terminais em tandem de BRD4 como uma quimera em estrutura com a proteína NUT (proteína nuclear nos testículos), definindo geneticamente o chamado carcinoma da linha média NUT (NMC). Estudos funcionais em linhas celulares derivadas de doentes com NMC validaram o papel essencial da oncoproteína BRD4-NUT na manutenção da vantagem de proliferação característica e bloqueio da diferenciação desta malignidade uniformemente fatal17. De forma notável, o silenciamento de ARN da expressão do gene BRD4-NUT para a proliferação e propicia diferenciação escamosa com um aumento acentuado na expressão de citoqueratina. Estas observações ressaltam a ampla utilidade e potencial terapêutico imediato de um inibidor de ação direta de proteínas de bromodomínios humanos. A invenção apresenta composições que são úteis para a inibição de proteínas de bromodomínios humanos.

Compostos da Invenção

A invenção proporciona compostos de acordo com a Reivindicação 1, que se ligam no bolso de ligação da estrutura cristalina apo do primeiro bromodomínio de um membro da família BET (por exemplo, BRD4). Estes compostos podem ser particularmente eficazes na inibição do crescimento, proliferação ou sobrevivência de células neoplásicas em proliferação ou da indução da diferenciação de tais células. Numa abordagem, os compostos úteis para o tratamento de uma neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para a redução da fertilidade masculina ou para utilização em transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e para facilitar a pluripotência são selecionados utilizando um programa de acoplamento molecular para identificar compostos que se espera que se liguem a um bolso de ligação estrutural de bromodomínio. Em determinadas formas de realização, um composto da invenção pode ligar-se a um membro da família BET e reduzir a atividade biológica do membro da família BET (por exemplo, reduzir o alongamento) e/ou interromper a localização subcelular do membro da família BET (por exemplo, reduzir a ligação à cromatina).

Em determinados exemplos, um composto da invenção pode prevenir, inibir, ou interromper, ou reduzir em pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, ou 100% a atividade biológica de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT) e/ou interromper a localização subcelular de tais proteínas, por exemplo, através da ligação a um local de ligação num bolso de ligação apo de um bromodomínio.

Em certas formas de realização, um composto da invenção é um composto de acordo com a Reivindicação 1 que é uma molécula pequena que tem uma massa molecular menor do que cerca de 1000 daltons, menos do que 800, menos do que 600, menos do que 500, menos do que 400, ou menos do que cerca de 300 daltons. JQ1 é uma nova tieno-triazolo-1,4-diazepina. A invenção proporciona adicionalmente sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da Reivindicação 1.

Divulga-se um composto de Fórmula I: em que

X é N ou CR5; R5 é H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído;

Rb é H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, ou -COO-R3, cada um dos quais é opcionalmente substituído; o anel A é arilo ou heteroarilo; cada Ra é independentemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um grupo heteroarilo ou arilo fusionado; R é alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo; cada um dos quais é opcionalmente substituído; Ri é — (CH2) n—L, no qual n é 0-3 e L é H, -COO-R3, -CO-R3, -CO-N (R3R4) , -S(0)2-R3, -S (O) 2-N (R3R4) , N (R3R4) , N(R4)C(0)R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; R2 é H, D (deutério), halogéneo, ou alquilo opcionalmente substituído; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) H, arilo arilo substituído, heteroarilo, ou heteroarilo substituído; (ii) heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; (iii) -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo ou -C2-C8 alquinilo, cada um contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N; -C3-Ci2 cicloalquilo, -C3-Ci2 cicloalquilo substituído, -C3-Ci2 cicloalquenilo, ou -C3-C42 cicloalquenilo substituído, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído; e (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 é independentemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R3 e R4 são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; R8 é alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R4 e R6 são tomados em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; m é 0, 1, 2, ou 3; desde que (a) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo ou fenilo substituído, R2 é H, Rb é metilo, e R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 1 e L é -CO-N (R3R4) , então R3 e R4 não são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de morfolino; (b) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo substituído, R2 é H, Rb é metilo, e R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 1 e L é -CO-N(R3R4) , e um de R3 e R4 é H, então o outro de R3 e R4 não é metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo substituído, piridilo ou piridilo substituído; e (c) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo substituído, R2 é H, Rb é metilo, e R4 é -(CH2)n-L, no qual n é 1 e L é —COO—R3, então R3 não é metilo nem etilo; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, R é arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, L é H, -COO-R3, -CO-N (R3R4) , S(0)2-R3, -s (0) 2-N (R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3 ou arilo opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: H, -Ci-C8 alquilo, que é opcionalmente substituído, contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de 0, S, ou N; ou NH2, N=CR4R6.

Em determinados exemplos, R2 é H, D, halogénio ou metilo.

Em determinados exemplos, RB é alquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, ou alcoxi; cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, RB é metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, ou C00CH20C(0)CH3 .

Em determinados exemplos, o anel A é arilo ou heteroarilo de 5 ou 6 membros; Em determinados exemplos, o anel A é tiofuranilo, fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo, ou 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolinilo.

Em determinados exemplos, o anel A é fenilo ou tienilo;

Em determinados exemplos, m é 1 ou 2, e pelo menos uma ocorrência de RA é metilo.

Em determinados exemplos, cada RA é independentemente H, um alquilo opcionalmente substituído, ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um arilo.

Também se divulga um composto de Fórmula II:

em que X é N ou CR5; R5 é H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído;

Rb é H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, ou -COO-R3, cada um dos quais é opcionalmente substituído; cada Ra é independentemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um grupo heteroarilo ou arilo fusionado; R é alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; R'1 é H, -COO-R3, -CO-R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) H, arilo arilo substituído, heteroarilo, heteroarilo substituído; (ii) heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; (iii) -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo ou -C2-C8 alquinilo, cada um contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N; -C3-Ci2 cicloalquilo, -C3-Ci2 cicloalquilo substituído; —C3-C12 cicloalquenilo, ou -C3-Ci2 cicloalquenilo substituído; cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído; m é 0, 1, 2, ou 3; desde que se R' i é -COO-R3, X é N, Ré fenilo substituído, e Rb é metilo, então R3 não é metilo nem etilo; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, R é arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, R é fenilo ou piridilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, R é p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl-fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo ou piridinilo.

Em determinados exemplos, R'i é -COO-R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; e R3 é -Ci-C8 alquilo, que contém 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N, e que pode ser opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, R'1 é -COO-R3, e R3 é metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo, ou t-butilo, ou R'1 é H ou fenilo opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, RB é metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, COOCH2OC(O)CH3.

Em determinados exemplos, RB é metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, ou COOCH2OC(O) CH3.

Em determinados exemplos, cada RA é independentemente um alquilo opcionalmente substituído, ou quaisquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um arilo fusionado.

Em determinados exemplos, cada RA é metilo.

Também se divulqa um composto de fórmula III:

em que X é N ou CR5; R5 é H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído;

Rb é H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, ou -COO-R3, cada um dos quais é opcionalmente substituído; o anel A é arilo ou heteroarilo; cada RA é independentemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um grupo arilo ou heteroarilo fusionado; R é alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) H, arilo arilo substituído, heteroarilo, ou heteroarilo substituído; (ii) heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; (iii) -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo ou -C2-C8 alquinilo, cada um contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N; -C3-Ci2 cicloalquilo, -C3-Ci2 cicloalquilo substituído, -C3-Ci2 cicloalquenilo, ou -C3-C22 cicloalquenilo substituído, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído; e (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 é independentemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R3 e R4 são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; R6 é alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R4 e R6 são tomados em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; m é 0, 1, 2, ou 3; desde que: (a) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo ou fenilo substituído, Rb é metilo, então R3 e R4 não são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de morfolino; e (b) se o anel A é tienilo, X é N, Ré fenilo substituído, R2 é H, Rb é metilo, e um de R3 e R4 é H, então o outro de R3 e R4 não é metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo substituído, piridilo ou piridilo substituído; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, R é arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, R é fenilo ou piridilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, R é p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl-fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo ou piridinilo. Em determinados exemplos, R3 é H, NH2, ou N=CR4R6.

Em determinados exemplos, cada R4 é independentemente H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo opcionalmente substituído; cada um dos quais é opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, R6 é alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído. Também se divulga um composto de fórmula IV:

em que X é N ou CR5; R5 é H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído;

Rb é H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, ou -COO-R3, cada um dos quais é opcionalmente substituído; o anel A é arilo ou heteroarilo; cada Ra é independentemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou qualquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um grupo heteroarilo ou arilo fusionado;

Ri é — (CH2) n—L, no qual n é 0-3 e L é H, -COO-R3, -CO-R3, - CO-N (R3R4) , -S(0)2-R3, -S (O) 2-N (R3R4) , N (R3R4) , N(R4)C(0)R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; R2 é H, D, halogéneo, ou alquilo opcionalmente substituído; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) H, arilo arilo substituído, heteroarilo, ou heteroarilo substituído; (ii) heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; (iii) -C4-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo ou -C2-C8 alquinilo, cada um contendo 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N; -C3-Ci2 cicloalquilo, -C3-Ci2 cicloalquilo substituído, -C3-Ci2 cicloalquenilo, ou -C3-C22 cicloalquenilo substituído, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído; e (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 é independentemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R3 e R4 são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de 4- 10 membros; R8 é alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo, cada um dos quais é opcionalmente substituído; ou R4 e R5 são tomados em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados para formar um anel de 4-10 membros; m é 0, 1, 2, ou 3; desde que (a) se o anel A é tienilo, X é N, R2 é H, RB é metilo, e Ri é - (CH2) n—L, no qual n é 0 e L é -CO-N (R3R4) , então R3 e R4 não são tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de morfolino; (b) se o anel A é tienilo, X é N, R2 é H, RB é metilo, e Ri é - (CH2) n—L, no qual n é 0 e L é -CO-N (R3R4) , e um de R3 e R4 é H, então o outro de R3 e R4 não é metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo substituído, piridilo ou piridilo substituído; e (c) se o anel A é tienilo, X é N, R2 é H, RB é metilo, e Ri é — (CH2) n—L, no qual n é 0 e L é -COO-R3, então R3 não é metilo nem etilo; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, R2 é -(CH2)n-L, no qual n é 0-3 e L é -COO-R3, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído; e R3 é -Ci-Cg alquilo, que contém 0, 1, 2, ou 3 heteroátomos selecionados a partir de O, S, ou N- e que pode ser opcionalmente substituído. Em determinados exemplos, nélou2eLé alquilo ou -COO-R3, e R3 é metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo, ou t-butilo, ou n é 1 ou 2 e L é H ou fenilo opcionalmente substituído.

Em determinados exemplos, R2 é H ou metilo.

Em determinados exemplos, RB é metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, COOCH2OC(O)CH3.

Em determinados exemplos, o anel A é fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo, ou 5,6,7,8- tetrahidroisoquinolinilo.

Em determinados exemplos, cada RA é independentemente um alquilo opcionalmente substituído, ou quaisquer dois RA em conjunto com os átomos aos quais cada está ligado, podem formar um arilo. A invenção refere-se aos compostos definidos na Reivindicação 1, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Também se divulgam compostos de Fórmulas V-XXII, e qualquer composto descrito no presente documento, tal como um composto representado pela fórmula:

um sal, solvato ou hidrato do mesmo,

Por exemplo, o composto pode ser (+)-JQl:

um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Divulga-se um composto representado pela fórmula:

ou

um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Divulga-se também um composto representado pela fórmula:

ou

um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Divulga-se também um composto representado por qualquer uma das fórmulas que se seguem:

ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Divulga-se também um composto representado por qualquer uma das fórmulas que se sequem:

um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Divulga-se também um composto representado por qualquer uma das estruturas que se seguem:

ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Divulgam-se as estruturas que se seguem:

ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Divulga-se também um composto representado pela estrutura:

ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Divulga-se também um composto representado pela estrutura:

ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Noutra forma de realização, o composto é representado pela estrutura:

ou um sal do mesmo.

Divulga-se também um composto que tem a quiralidade oposta de qualquer composto mostrado no presente documento.

Divulga-se um composto representado pela Fórmula (V) , (VI) , ou (VII):

em que R, Ri, e R2 e RB têm o mesmo significado que na Fórmula (I) ; Y é 0, N- S, ou CR5, em que R5 tem o mesmo significado que na Fórmula (I) ; n é 0 ou 1; e o círculo a tracejado na Fórmula (VII) indica um anel aromático ou não aromático; ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Em determinados aspetos de qualquer das Fórmulas I-IV e VI (ou qualquer fórmula no presente documento), R6 representa a porção não carbonilo de um aldeído mostrado no Quadro A, abaixo (isto é, para um aldeído de fórmula ReCHO, R6 é a porção não carbonilo do aldeído). Em determinados exemplos, R4 e R6 em conjunto representam a porção não carbonilo de uma cetona mostrada no Quadro A (isto é, para uma cetona de fórmula R6CHO, R4 e Rg são a porção não carbonilo da cetona) .

Quadro A:

Divulga-se um composto representado pela fórmula:

ou um sal, solvato, ou hidrato do mesmo.

Em determinados exemplos, o composto é JQ1 (racémico); em determinados exemplos, o composto é (+)-JQl. Em determinados exemplos, o composto é um composto selecionado a partir do grupo que consiste em:

ou um sal, solvato, ou hidrato do mesmo.

Exemplos adicionais de compostos incluem compostos de acordo com qualquer das seguintes fórmulas:

ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

Nas Fórmulas IX-XXII, R e R' podem ser, por exemplo, H, arilo arilo substituído, heteroarilo, heteroarilo, heterocicloalquilo, -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo, -C3-Ci2 cicloalquilo, -C3-Ci2 cicloalquilo substituído, -C3-Ci2 cicloalquenilo, ou -C3-Ci2 cicloalquenilo substituído, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído. Nas Fórmulas XIV, X pode ser qualquer substituinte para um grupo arilo conforme descrito no presente documento .

Os compostos da invenção podem ser preparados através de uma variedade de métodos. Por exemplo, os Exemplos químicos proporcionados no presente documento abaixo proporcionam esquemas sintéticos para a preparação do composto JQ1 (como o racemato) e os enantiómeros (+)-JQ1 e (-)-JQ1 (veja-se os Esquemas SI e S2). Uma variedade de compostos de Fórmulas (I)-(XXII) podem ser preparados por métodos análogos com substituição de materiais de iniciação apropriados.

Por exemplo, partindo de JQ1, a amina sintética pode ser preparada conforme mostrado no Esquema 1, abaixo.

Esquema 1

Conforme mostrado no Esquema 1, a hidrólise do éster de t-butilo de JQ1 produzir o ácido carboxílico, que é tratado com difenilfosforilazida (DPPA) e submetido a condições de rearranjo de Curtius para proporcionar a amina protegida com Cbz, que é depois desprotegida para produzir a amina. A elaboração subsequente do grupo amina, por exemplo, através de aminação redutiva produz aminas secundárias, que podem ser adicionalmente alquiladas para proporcionar aminas terciárias.

Esquema 2 0 Esquema 2 mostra a síntese de exemplos adicionais de compostos divulgados no presente documento, por exemplo, de Fórmula I, na qual o núcleo do anel fusionado é modificado (por exemplo, através de substituição de um anel aromático diferente como o Anel A na Fórmula I). A utilização de aminodiarilcetonas tendo funcionalidade apropriada (por exemplo, em lugar da aminodiarilcetona S2 no Esquema Sl, infra) proporciona novos compostos tendo uma variedade de núcleos de anéis fusionados e/ou apêndices de grupos arilo (correspondendo ao grupo R na Fórmula I) . Tais aminodiarilcetonas estão comercialmente disponíveis ou podem ser preparadas por uma variedade de métodos, alguns dos quais são conhecidos na técnica. 0 Esquema 3 proporciona esquemas sintéticos exemplares adicionais para a preparação de compostos adicionais.

Esquema 3

Conforme mostrado no Esquema 3, um precursor bicíclico fusionado (veja-se o Esquema Sl, infra, para a síntese deste composto) é funcionalizado com uma fração R (DAM = grupo protetor dimetilaminometileno) e depois elaborado através da reação com uma hidrazida para formar o núcleo fusionado tricíclico. 0 substituinte Rx pode ser variado através da seleção de uma hidrazida adequada.

Exemplos adicionais de compostos divulgados no presente documento (que podem ser preparados pelos métodos descritos no presente documento) incluem:

Amidas:

As amidas podem ser preparadas, por exemplo, através da preparação de um éster ou ácido carboxílico correspondente, seguido pela amidação com uma amina apropriada utilizando condições padrão. Em determinados exemplos, uma amida proporciona um "ligante" de dois carbonos com um anel que contém azoto terminal (por exemplo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, imidazolilo (incluindo N-metil-imidazolilo), morfolinilo, e semelhantes. Estruturas de amida exemplares incluem:

A utilização de um ligante de dois carbonos entre a fração de amida e o anel que contém azoto terminal é preferido. "Amidas inversas":

Aminas secundárias:

Ácidos borónicos:

Em determinados aspetos, um composto que tem pelo menos um centro quiral está presente na forma racémica. Em certos aspetos, um composto que tem pelo menos um centro quiral é enantiomericamente enriquecido, isto é, tem um excesso enant iomérico (e.e.) de pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 90%, 95%, 99%, 99% ou 100%. Em certos aspetos, um composto tem a mesma configuração absoluta que o composto ( + )-JQ1 ( (5)-terc-Butil-2-(4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][l,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetato) descrito no presente documento.

Em determinados aspetos de qualquer das Fórmulas divulgadas no presente documento, o composto não é representado pela seguinte estrutura: na qual:

R'i é C1-C4 alquilo; R'2 é hidrogénio, halogéneo, ou C1-C4 alquilo opcionalmente substituído com um átomo de halogéneo ou um grupo hidroxilo; R'3 é um átomo de halogéneo, fenilo opcionalmente substituído com um átomo de hidrogénio, C1-C4 alquilo, Ci-C4 alcoxi, ou ciano; —NR5— (CH2) m-R6 em que R5 é um átomo de hidrogénio ou C1-C4 alquilo, m é um número inteiro de 0-4, e R5 é fenilo ou piridilo opcionalmente substituído com um átomo de hidrogénio; ou -NR7-CO-- (CH2) n-Rs em que R7 é um átomo de hidrogénio ou C1-C4 alquilo, n é um número inteiro de 0-2, e Rs é fenilo ou piridilo opcionalmente substituído por um átomo de halogéneo; e R'4 é - (CH2) a-CO-NH-R9 em que a é um número inteiro de 1-4, e R9 é C1-C4 alquilo; C1-C4 hidroxialquilo; C1-C4 alcoxi; ou fenilo ou piridilo opcionalmente substituído por C1-C4 alquilo, C1-C4 alcoxi, amino ou um grupo hidroxilo ou -(CH2)b-COOR10 em que b é um número inteiro de 1-4, e Ri0 é C1-C4 alquilo. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal preparado a partir de um composto divulgado no presente documento (por exemplo, JQ1, um composto de Fórmula I-XXII) ou qualquer outro composto delineado no presente documento, tendo um grupo funcional ácido, tal como um grupo funcional ácido carboxilico, e uma base orgânica ou inorgânica farmaceuticamente aceitável. Bases adequadas incluem, hidróxidos de metais alcalinos, tais como, sódio, potássio, e lítio; hidróxidos de metais alcalino-terrosos, tais como, cálcio e magnésio; hidróxidos de outros metais, tais como, alumínio e zinco; amónia, e aminas orgânicas, tais como, mono, di, tri-alquilaminas substituídas por hidróxido; diciclohexilamina; tributil amina; piridina; N-metilo, N-etilamino; dietilamina; trietilamina; mono, bis, ou tris-(2-hidroxi-aminas de alquilo inferiores), tais como, mono, bis, ou tris-(2-hidroxietil)-amina, 2-hidroxi-terc-butilamina, ou tris-(hidroximetil)metilamina, N,N,-di-alquilo inferior-N-(hidroxi alquilo inferior)-aminas, tal como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)- amina, ou tri-(2-hidroxietil)amina; N-metil-D-glucamina; e aminoácidos, tais como, arginina e lisina. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" também se refere a um sal preparado a partir de um composto divulgado no presente documento, ou qualquer outro composto delineado no presente documento, que tem um grupo funcional básico, tal como um grupo funcional amino, e um ácido inorgânico ou orgânico farmaceuticamente aceitável. Ácidos adequados incluem sulfato de hidrogénio, ácido cítrico, ácido acético, ácido oxálico, ácido clorídrico, brometo de hidrogénio, iodeto de hidrogénio, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido isonicotínico, ácido lático, ácido salicilico, ácido tartárico, ácido ascórbico, ácido succínico, ácido maleico, ácido besílico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido glucarónico, ácido sacárico, ácido fórmico, ácido benzóico, ácido glutâmico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido benzenossulfónico, e ácido p-toluenossulfónico.

Sistemas e métodos de rastreio por computador

Divulga-se um meio de armazenamento legível por máquina que compreende as coordenadas estruturais de um local de ligação polipéptido de membro da família BET (por exemplo, domínio BRD4) identificado no presente documento. Este é o local de ligação proposto de JQ1. Um meio de armazenamento codificado com estes dados é capaz de mostrar uma representação gráfica tridimensional de uma molécula ou complexo molecular que compreende tais locais de ligação num ecrã de computador ou dispositivo de visualização semelhante.

Também são divulgados métodos para projetar, avaliar e identificar compostos que se ligam ao local de ligação mencionado anteriormente. Espera-se que tais compostos sejam para inibir a atividade biológica de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT) e/ou interromper a localização subcelular de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT). Também é divulgado um computador para produzir a) uma representação tridimensional de uma molécula ou complexo molecular, em que a dita molécula ou complexo molecular compreende um local de ligação; ou b) uma representação tridimensional de um homólogo da dita molécula ou complexo molecular, em que o dito homólogo compreende um local de ligação que tem um desvio quadrático médio dos átomos da estrutura principal dos ditos aminoácidos de não mais de cerca de 2,0 (mais preferentemente não mais de 1,5) angstroms, em que o dito computador compreende: (i) um meio de armazenamento legível por máquina que compreende um material de armazenamento de dados codificado com dados legíveis por máquina, em que os ditos dados compreendem as coordenadas de estrutura dos resíduos de aminoácidos no bolso de ligação estrutural de bromodomínio ou outro local de ligação de membro da família BET; (ii) uma memória de trabalho para armazenar instruções para o processamento de ditos dados legíveis por máquina; (iii) uma unidade de processamento central acoplada a dita memória de trabalho a dito meio de armazenamento de dados legíveis por máquina para o processar os ditos dados legíveis por máquina na dita representação tridimensional; e (iv) um visor acoplado à dita unidade de processamento central para visualizar dita representação tridimensional.

Assim, o computador produz uma estrutura gráfica tridimensional de uma molécula ou complexo molecular que compreende um local de ligação.

Também é divulgado um computador para produzir a) uma representação tridimensional de uma molécula ou complexo molecular definido por coordenadas de estrutura de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT) aminoácidos, ou uma representação tridimensional de um homólogo da dita molécula ou complexo molecular, em que o dito homólogo compreende um local de ligação que tem um desvio quadrático médio dos átomos da estrutura principal dos ditos aminoácidos de não mais de 2,0 (mais preferentemente não mais de 1,5) angstroms

Em aspetos particulares, o computador ou sistema de computadores pode incluir componentes que são convencionais na técnica, por exemplo, conforme descrito nos documentos de Patente U.S. N°s 5.978.740 e/ou 6.183.121. Por exemplo, um sistema de computadores pode incluir um computador que compreende uma unidade de processamento central ("CPU"), uma memória de trabalho (que pode ser, por exemplo, RAM (memória de acesso randómico) ou memória "núcleo", uma memória de armazenamento em massa (tal como uma ou mais unidades de disco ou unidades de CD-ROM), um ou mais terminais de visualização de tubo de raios catódicos (CRT) ou ecrã de cristal liquido (LCD) , um ou mais teclados, uma ou mais linhas de entrada, e uma ou mais linhas de saída, a totalidade dos quais está interligada por um barramento de sistema convencional.

Os dados legíveis por máquina conforme divulgados no presente documento podem ser inseridos no computador através da utilização de um modem ou modems ligados através de uma linha de dados. Alternativamente ou adicionalmente, o hardware de entrada pode incluir unidades de CD-ROM, unidades de disco ou memória flash. Juntamente com um terminal de visualização, um teclado pode também ser utilizado como um dispositivo de entrada. O hardware de saída acoplado ao computador através de linhas convencionais pode de forma similar ser implementado por dispositivos convencionais. Por meio de exemplo, o hardware de saída pode incluir um terminal de visualização CRT ou LCD para visualizar uma representação gráfica de um bolso de ligação conforme divulgado no presente documento utilizando um programa tal como QUANTA ou PYMOL. O hardware de saída poderia também incluir uma impressora, ou um unidade de disco para armazenar a saída do sistema para utilização posterior.

Em operação, a CPU coordena a utilização de vários dispositivos de entrada e de saída, coordena acessos de dados do armazenamento em massa e acessos a e desde a memória de trabalho, e determina a sequência de etapas de processamento de dados. Um número de programas pode ser utilizado para processar os dados legíveis por máquina do tipo divulgado no presente documento, incluindo software disponível comercialmente.

Um meio de armazenamento magnético para armazenar os dados legíveis por máquina divulgados no presente documento pode ser convencional. Um meio de armazenamento de dados magnético pode ser codificado com dados legíveis por máquina que podem ser levados a cabo por um sistema tal como o sistema de computadores descrito acima. 0 meio pode ser uma disquete ou disco rígido convencional, tendo um substrato adequado que pode ser convencional, e um revestimento adequado, que também pode ser convencional, em um ou em ambos os lados, contendo domínios magnéticos cuja polaridade ou orientação pode ser alterada magneticamente. 0 meio também pode ter uma abertura (não mostrada) para receber o veio de uma unidade de disco ou outro dispositivo de armazenamento de dados.

Os domínios magnético do meio são polarizados ou orientados de modo a codificar numa maneira que podem ser dados legíveis por máquina convencionais, tais como aqueles descritos no presente documento, para execução por um sistema como o sistema de computador descrito no presente documento.

Um meio de armazenamento de dados legíveis opticamente também pode ser codificado com dados legíveis por máquina, ou um conjunto de instruções, que podem ser levadas a cabo por um sistema de computadores. 0 meio pode ser um Disco Compacto -Memória Somente de Leitura (CD-ROM) ou um meio regravável tal como um disco magneto-óptico que pode ser legível opticamente e gravável magneto-opticamente.

No cado de CD-ROM, conforme é bem conhecido, um revestimento de disco é reflexivo e é impresso com uma pluralidade de reentrâncias para codificar os dados legíveis por máquina. A disposição das reentrâncias é lida refletindo luz de laser na superfície do revestimento. Um revestimento protetor, que preferentemente é substancialmente transparente, é fornecido na parte superior do revestimento reflexivo.

No caso de um disco magneto-óptico, conforme é bem conhecido, um revestimento de registo de dados não tem reentrâncias, mas tem uma pluralidade de domínios magnéticos cuja polaridade ou orientação pode ser mudada magneticamente quando aquecido acima de uma certa temperatura, como por um laser. A orientação dos domínios pode ser lida medindo a polarização da luz laser refletida do revestimento. A disposição dos domínios codifica os dados conforme descritos acima.

Os dados de estrutura, quando utilizados juntamente com um computador programado com software para traduzir aquelas coordenadas na estrutura tridimensional de uma molécula ou complexo molecular que compreende um bolso de ligação pode ser utilizado para uma variedade de propósitos, tal como descoberta de fármacos.

Por exemplo, a estrutura codificada pelos dados pode ser avaliado computacionalmente para esta habilidade para associar a entidades químicas. As entidades químicas que se associam ao local de ligação de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT) são esperados que inibam a proliferação ou induzam a diferenciação de uma célula neoplásica, inibiam a atividade biológica de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT), e/ou interrompam a localização subcelular. Tais compostos são candidatos a fármacos potenciais. Alternativamente, a estrutura codificada pelos dados podem ser mostradas numa representação tridimensional gráfica num ecrã de computador. Isto permite a inspeção visual da estrutura, bem como a inspeção visual ca associação da estrutura a entidades químicas.

Assim, também é divulgado um método para avaliar o potencial de uma entidade química se associar a) uma molécula ou complexo molecular que compreende um local de ligação definido pelas coordenadas de estrutura de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT), conforme descrito no presente documento, ou b) um homólogo da dita molécula ou complexo molecular, em que o dito homólogo compreende um bolso de ligação que tem um desvio quadrático médio dos átomos da estrutura principal dos ditos aminoácidos de não mais de 2,0 (mais preferentemente 1,5) angstroms.

Este método compreende as etapas de: i) utilizar meios computacionais para realizar uma operação de ajuste entre a entidade química e um local de ligação de um polipéptido de membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT) ou fragmento do mesmo ou complexo molecular; e ii) analisar os resultados da operação de ajuste para quantificar a associação entre a entidade química e o bolso de ligação. Este exemplo refere-se a avaliar o potencial de uma entidade química se associar a se ligar a um local de ligação de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT) ou fragmento do mesmo. O termo "entidade química", conforme é utilizado no presente documento, refere-se a compostos químicos, complexos de pelo menos dois compostos químicos, e fragmentos de tais compostos ou complexos.

Em certos aspetos, o método avalia o potencial de uma entidade química se associar a uma molécula ou complexo molecular definido pelas coordenadas de estrutura da totalidade de aminoácidos de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT), conforme descrito no presente documento, ou um homólogo da dita molécula ou complexo molecular tendo um desvio quadrático da média dos átomos da estrutura principal dos ditos aminoácidos de não mais de 2,0 (mais preferentemente não mais de 1,5) angstroms.

Num aspeto adicional, as coordenadas estruturais dos locais de ligação descritos no presente documento podem ser utilizadas num método para identificar um local de ligação de bromodomínio (por exemplo, um bolso de ligação estrutural de bromodomínio). Este método compreende as etapas de: a) utilizar as coordenadas atómicas de um membro da família BET; e b) utilizar a estrutura tridimensional para projetar ou selecionar o agonista ou antagonista potencial. É possível obter o composto por quaisquer meios disponíveis. Por "obtenção" se quer dizer por exemplo, sintetizar, comprar, ou de outro modo procurar o agonista ou antagonista. Se for desejado, o método envolve ainda colocar o agonista ou antagonista em contacto com um polipéptido de membro da família BET ou um fragmento do mesmo para determinar a habilidade do agonista ou antagonista potencial de interagir com a molécula. Se for desejado, o método envolve ainda a etapa de colocar uma célula neoplásica em contacto com um composto de ligação a bromodomínio e avaliar a citotoxicidade, avaliar a proliferação celular neoplásica, morte celular, atividade biológica de um membro da família BET, ou localização subcelular.

Num outro aspeto, é divulgado um método para identificar um antagonista potencial de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT), o método compreendendo as etapas de: a) utilizar as coordenadas atómicas de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT (por exemplo, bolso de ligação estrutural de bromodomínio); e b) utilizar a estrutura tridimensional para projetar ou selecionar o agonista ou antagonista potencial. A elucidação dos presentes inventores dos locais de ligação não identificados até agora de um bromodomínio fornece a informação necessária para projetar novas entidades químicas e compostos que podem interagir com bromodomínios, em todo ou em parte, e, portanto, podem modular (por exemplo, inibir) a atividade de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT). 0 projeto de compostos que se ligam a uma sequência de bolso de ligação estrutural de membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT) que reduzem a atividade biológica de um bromodomínio, ou que interrompem a localização subcelular de um membro da família BET conforme descrito no presente documento geralmente envolve a consideração de diversos fatores, Num exemplo, o composto fisicamente e/ou estruturalmente se associa a pelo menos um fragmento de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT), tal como um local de ligação dentro de uma sequência de bolso de ligação estrutural de bromodomínio. Interações moleculares não covalentes importantes nesta associação incluem ligação de hidrogénio, interações de van der Waals, interações hidrofóbicas e interações eletrostáticas. De forma desejável, o composto assume uma conformação que lhe permite associar aos locais de ligação de bromodomínio diretamente. Embora certas porções do composto não possa diretamente participar nestas associações, essas porções da entidade ainda podem influenciar a conformação global da molécula. Isto, por sua vez, pode ter um impacto significativo na potência do composto. Tais requisitos conformacionais incluem a estrutura tridimensional global e orientação do composto químico em relação à totalidade ou uma porção do local de ligação, ou o espaçamento entre grupos funcionais que compreendem diversos compostos químicos que interagem diretamente com o local de ligação ou homólogo do mesmo. 0 efeito de ligação ou inibidor potencial de um composto químico num local de ligação de bromodomínio pode ser analisado antes da sua síntese real e testes pela utilização das técnicas de modelação por computador. Se a estrutura teórica do dado composto sugere interação e associação insuficientes entre este e o local de ligação alvo, os testes do composto são evitados. No entanto, se a modelação por computador indica uma forte interação, a molécula é sintetizada e testada para sua habilidade de se ligar a uma sequência de bolso de ligação estrutural de membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT) ou para testar sua atividade biológica testando por exemplo, citotoxicidade numa célula neoplásica, testando uma redução da atividade biológica de um membro da família BET, ou testando a localização subcelular de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT) . Os compostos candidatos podem ser computacionalmente avaliados por meio de uma série de etapas em que as entidades químicas ou fragmentos são rastreados e selecionados para sua habilidade de associar ao bolso de ligação estrutural do bromodomínio.

Um perito na especialidade pode usar diversos métodos para rastrear compostos químicos, ou fragmentos para sua habilidade de se associar ao local de ligação de bromodomínio. Este processo pode começar pela inspeção visual de, por exemplo, um local de ligação no ecrã do computador com base nas coordenadas de estrutura de um membro da família BET descrito no presente documento, ou outras coordenadas que definem uma forma semelhante gerada a partir do meio de armazenamento legível por máquina. Os fragmentos ou compostos químicos selecionados são então posicionados numa variedade de orientações, ou ancorado, dentro desse local de ligação conforme definido supra. A ancoragem pode ser conseguida utilizando um software tal como Quanta e DOCK, seguido por minimização de energia e dinâmica molecular com campos de força de mecânica moleculares padrão, tais como CHARMM e AMBER,

Programas de computador especializados (por exemplo, conforme conhecidos na técnica e/ou comercialmente disponíveis e/ou conforme descrito no presente documento) podem também ajudar no processo de selecionar fragmentos ou entidades químicas.

Uma vez que entidades químicas ou fragmentos foram selecionados, podem ser montados num composto único ou complexo. A montagem pode ser precedida de inspeção visual da relação dos fragmentos entre si na imagem tridimensional mostrada na ecrã do computador em relação às coordenadas de estrutura do local de ligação alvo.

Em vez de proceder à construção de um inibidor de um bolso de ligação de uma maneira por etapas um fragmento ou entidade guímica conforme descrito acima, compostos inibidores ou outros compostos de ligação podem ser desenhados como um todo ou "de novo" utilizando ou um local de ligação vazio ou opcionalmente incluindo algumas porções de um inibidor conhecido. Existem vários métodos de projetar ligandos "de novo" conhecidos na técnica, alguns dos guais são comercialmente disponíveis (por exemplo, LeapFrog, disponível de Tripos Associates, St. Louis, Mo.).

Outras técnicas de modelação molecular também podem ser utilizadas (veja-se, por exemplo, N. C. Cohen et ai., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry, J. Med. Chem., 33, pp. 883-894 (1990); veja-se

também, M. A. Navia e M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210 (1992); L. M. Balbes et al., "A

Perspective of Modem Methods in Computer-Aided Drug Design", in Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5, K. B. Lipkowitz and D. B. Boyd, Eds., VCH, Nova Iorgue, pp. 337-380 (1994); veja-se também, W. C. Guida, "Software For Structure-Based Drug Design", Curr. Opin. Struct. Biology,, 4, pp. 777-781 (1994)) .

Uma vez gue um composto foi projetado ou selecionado, a eficiência com a qual a entidade pode se ligar a um local de ligação pode ser testada e otimizada por avaliação computacional.

Software especifico está disponível na técnica para avaliar a energia de deformação de composto e interações eletrostáticas. Exemplos de programas projetados para tais usos incluem: AMBER; QUANTA/CHARMM (Accelrys, Inc., Madison, WI) e semelhantes. Estes programas podem ser implementados, por exemplo, utilizando estações de trabalho gráfico disponíveis comercialmente. Outros sistemas de hardware e pacotes de software serão conhecidos pelos peritos na especialidade.

Outra técnica envolve o rastreio por computados de bibliotecas virtuais de compostos, por exemplo, conforme descrito no presente documento (veja-se, por exemplo,

Exemplos). Milhares de compostos podem ser rapidamente rastreados e os melhores compostos virtuais podem ser selecionados para rastreio adicional (por exemplo, por meio de síntese e testes in vitro ou in vivo ) . Bases de dados de moléculas pequenas podem ser rastreadas para entidades químicas que podem se ligar, em todo ou em parte, a um local de ligação de bromodomínio de um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT). Neste rastreio, a qualidade do ajuste de tais entidades ao local de ligação pode ser julgada pela complementaridade de forma ou por energia de interação estimada.

Um computador para produzir uma representação tridimensional de a) uma molécula ou complexo molecular, em que a dita molécula ou complexo molecular compreende um bolso de ligação estrutural de um membro da família BET definido pelas coordenadas de estrutura de resíduos de aminoácidos na sequência de bolso de ligação estrutural de um bromodomínio; ou b) uma representação tridimensional de um homólogo da dita molécula ou complexo molecular, em que o dito homólogo compreende um local de ligação que tem um desvio quadrático médio dos átomos da estrutura principal dos ditos aminoácidos de não mais de cerca de 2,0 (mais preferentemente não mais de 1,5) angstroms, em que o dito computador compreende: (i) um meio de armazenamento legível por máquina que compreende um material de armazenamento de dados codificado com dados legíveis por máquina, em que os ditos dados compreendem as coordenadas de estrutura dos resíduos de aminoácidos na sequência de bolso de ligação estrutural de um membro da família BET; (ii) uma memória de trabalho para armazenar instruções para o processamento de ditos dados legíveis por máquina; (iii) uma unidade de processamento central acoplada a dita memória de trabalho a dito meio de armazenamento de dados legíveis por máquina para o processar os ditos dados legíveis por máquina na dita representação tridimensional; e (iv) um visor acoplado à dita unidade de processamento central para visualizar dita representação tridimensional. Conforme descrito nos Exemplos, os compostos identificados utilizando métodos por computador podem opcionalmente ser testados in vitro ou in vivo, por exemplo, utilizando os "Métodos de rastreio adicionais" descritos a seguir, ou qualquer outro método conhecido na técnica, Métodos de rastreio adicionais

Conforme descrito anteriormente, a invenção fornece exemplos específicos de compostos químicos bem como outros compostos substituídos que se ligam a um bolso de ligação de bromodomínio e que induzem diferenciação celular ou reduzem a proliferação celular numa célula neoplásica. Também é divulgado um meio simples identificar agentes (incluindo ácidos nucleicos, péptidos, inibidores de moléculas pequenas, e miméticos) que são capazes de se ligar a um membro da família BET, que são citotóxicos para uma célula neoplásica, que reduzem a atividade biológica de um membro da família BET, ou que interrompem a localização subcelular de um membro da família BET. Espera-se que tais compostos também sejam úteis para o tratamento ou prevenção de uma neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para redução da fertilidade masculina. Além disso, as composições divulgadas no presente documento são utilizadas no transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência.

Em particular, certos aspetos da invenção são baseados pelo menos em parte na descoberta de que agentes que reduzem a atividade biológica de um polipéptido de membro da família BET são provavelmente úteis como agentes terapêuticos para o tratamento ou prevenção de uma neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para redução da fertilidade masculina. Além disso, as composições divulgadas no presente documento são utilizadas no transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência. Em aspetos particulares, o efeito de um composto da invenção ou outro agente é analisada testando a proliferação celular, sobrevivência celular ou morte celular. Em outra abordagem, os compostos da invenção e outros agentes são testados para seu efeito na regulação transcricional ou alongamento. Agentes e compostos da invenção que reduzem o crescimento, proliferação, ou invasividade de uma neoplasia são identificados para o tratamento ou prevenção de uma neoplasia. Os compostos da invenção também podem ser testados para seu efeito num célula imunorresponsiva, na libertação de citocina ou histamina, ou em qualquer outro marcador de doença inflamatória.

Virtualmente qualquer agente que especificamente se liga a um membro da família BET ou que reduz a atividade biológica de um membro da família BET pode ser utilizado nos métodos divulgados no presente documento. Os métodos divulgados no presente documento são úteis para o rastreio de baixo custo e alto rendimento de agentes candidatos que reduzem, diminuem a velocidade, ou estabilizam o crescimento ou proliferação de uma neoplasia ou para o tratamento ou prevenção de doença inflamatória. Um agente candidato que se liga especificamente a um bromodomínio de um membro da família BET é, em seguida, isolado e testado para atividade num ensaio in vitro ou ensaio in vivo para a sua capacidade para reduzir a proliferação de células neoplásicas, induzir a diferenciação e/ou aumentar a morte das células neoplásicas. Um perito na especialidade reconhece que os efeitos de um agente candidato sobre uma célula é tipicamente comparado a uma célula de controlo que não entrou em contacto com o agente candidato. Assim, os métodos de rastreio incluem a comparação da proliferação de uma célula neoplásica que entrou em contacto com um agente candidato com a proliferação de uma célula de controlo não tratada.

Em outros aspetos, a expressão ou a atividade de um membro da família BET numa célula tratada com um agente candidato é comparada com amostras de controlo não tratadas para identificar um composto candidato que diminui a atividade biológica de um membro da família BET na célula contactada. A expressão ou a atividade do polipéptido podem ser comparadas por meio de procedimentos bem conhecidos técnica, tais como transferência Western, citometria de fluxo, imunocitoquímica, ligação a contas revestidas com anticorpos específicos de bromodomínio e/ou magnéticas, hibridação in situ, hibridação in situ de fluorescência (FISH), ELISA, análise de microarranjo, RT-PCR, transferência Northern, ou ensaios colorimétricos, tais como o Ensaio de Bradford e Ensaio de Lowry.

Num exemplo de trabalho, um ou mais agentes candidatos são adicionados em várias concentrações ao meio de cultura contendo uma célula neoplásica. Um agente que reduz a expressão de um membro da família BET expresso na célula é considerado útil na presente invenção; um tal agente pode ser utilizado, por exemplo, como um agente terapêutico para prevenir, retardar, melhorar, estabilizar, ou tratar uma neoplasia ou doença inflamatória. Uma vez identificados, os agentes da invenção (por exemplo, os agentes que se ligam especificamente a e/ou antagonizaram um bromodomínio) podem ser utilizados para tratar uma neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para redução da fertilidade masculina. Além disso, as composições descritas no presente documento, são utilizadas no transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência. Um agente identificado de acordo com um método descrito no presente documento é entregue localmente ou sistemicamente no tratamento de neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para a redução da fertilidade masculina ou para utilização em transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), ou para facilitar a pluripotência in situ.

Num aspeto, o efeito de um agente candidato pode, em alternativa, ser medido ao nível da produção de um membro da família BET utilizando a mesma abordagem geral e técnicas imunológicas padrão, tais como transferência Western ou imunoprecipitação com um anticorpo específico para o membro da família BET. Por exemplo, os imunoensaios podem ser utilizados para detetar ou monitorizar a expressão de um membro da família de BET numa célula neoplásica. Num aspeto, um anticorpo policlonal ou monoclonal (produzido tal como descrito no presente documento) pode ser identificado que é capaz de se ligar e bloquear a atividade biológica ou interromper a localização subcelular de um membro da família de BET. Um composto que interrompe a localização subcelular, ou reduz a atividade biológica de um membro da família de BET é considerado particularmente útil. Mais uma vez, um tal agente pode ser utilizado, por exemplo, como uma agente terapêutico para prevenir ou tratar uma neoplasia ou doença inflamatória.

Alternativamente, ou adicionalmente, os compostos candidatos podem ser identificados em primeiro lugar testando aqueles que se ligam especificamente a e antagonizam um membro da família BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT) e subsequentemente testando o seu efeito sobre as células neoplásicas como descrito em Exemplos. Num aspeto, a eficácia de um agente candidato é dependente da sua capacidade para interagir com o membro da família de BET. Tal interação pode ser prontamente testada utilizando qualquer número de técnicas de ligação padrão e ensaios funcionais (por exemplo, aqueles descritos em Ausubel et al. , supra) . Por exemplo, um composto candidato pode ser testado in vitro para interação e ligação com um polipéptido divulgado no presente documento e a sua capacidade para modular a proliferação de células neoplásicas pode ser testada por quaisquer ensaios padrão (por exemplo, aqueles descritos no presente documento). Num aspeto, a divisão de células neoplásicas é determinada através do ensaio de incorporação de BrdU utilizando análise de citometria de fluxo. Num outro aspeto, a expressão de um membro da família de BET é monitorizada imunohistoquimicamente.

Os antagonistas de bromodominio potenciais incluem moléculas orgânicas péptidos, miméticos de péptido, polipéptidos, ligandos de ácidos nucleicos, aptâmeros, e anticorpos que se ligam a um bromodominio de membro da família BET e reduzem a sua atividade. Num aspeto particular, um composto candidato que se liga a um membro da família BET pode ser identificado utilizando uma técnica baseada em cromatografia. Por exemplo, um polipéptido recombinante membro da família BET tal como é divulgado no presente documento, pode ser purificado por técnicas padrão a partir de células modificadas para expressar o polipéptido, ou pode ser sintetizado quimicamente, uma vez que o péptido purificado é imobilizado numa coluna. Uma solução de agentes candidatos é então passada através da coluna, e um agente que se liga especificamente a um polipéptido de membro da família BET ou um fragmento do mesmo é identificado com base na sua capacidade para se ligar a um polipéptido de membro da família BET e ser imobilizado na coluna. Para isolar o agente, a coluna é lavada para remover as moléculas não ligadas especificamente, e o agente de interesse é, em seguida, libertado da coluna e recolhido. Agentes isolados por este método (ou qualquer outro método apropriado) podem, se for desejado, ser adicionalmente purificados (por exemplo, por meio de cromatografia líquida de alto desempenho). Adicionalmente, estes agentes candidatos podem ser testados quanto à sua capacidade para reduzir a proliferação de células neoplásicas ou viabilidade. Os agentes isolados por este método também podem ser usados, por exemplo, como agentes terapêuticos para tratar ou prevenir a neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para a redução da fertilidade masculina ou para utilização em transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência. Os compostos que são identificados como que se ligam a um membro da família de BET com uma constante de afinidade inferior ou igual a 1 nM, 5 nM, 10 nM, 100 nM, 1 mM ou 10 mM são considerados particularmente úteis na presente invenção. Compostos de teste e Extratos

Em certo aspeto, antagonistas de um membro da família BET (por exemplo, agentes que especificamente se ligam e reduzem a atividade de um bromodomínio) são identificados a partir de grandes bibliotecas de extratos de produtos naturais ou sintéticos (ou semissintéticos) ou bibliotecas químicas ou a partir de bibliotecas de polipéptidos ou ácidos nucleicos. de acordo com métodos conhecidos na técnica. Os peritos no campo de desenvolvimento e descoberta de fármacos entenderão que a fonte exata dos extratos de teste ou compostos não é crítica para o(s) procedimento (s) de rastreio divulgado (s) no presente documento. Os agentes utilizados em rastreios podem incluir aqueles conhecidos como agentes terapêuticos para o tratamento de uma neoplasia ou doença inflamatória. Alternativamente, praticamente qualquer número de extratos químicos desconhecidos ou compostos pode ser rastreada utilizando os métodos descritos no presente documento. Exemplos de tais extratos ou compostos incluem, mas não são limitadas a, extratos com base vegetal, fúngica, procariótica ou animal, caldos de fermentação, e compostos sintéticos, bem como a modificação dos polipéptidos existentes.

As bibliotecas de polipéptidos naturais na forma de extratos fúngicos, vegetais e animais são comercialmente disponíveis de várias fontes, incluindo Biotics (Sussex, RU) , Xenova (Slough, RU) , Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.), e PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, Mass.). Tais polipéptidos podem ser modificados para incluir um domínio de transdução de proteína utilizando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento. Adicionalmente, as bibliotecas naturais e produzidos sinteticamente são produzidas, se for desejado, de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por métodos de extração e fracionamento padrão. Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica, por exemplo em: DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994; Cho et al., Science 261:1303, 1993; Carrell et al.,

Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994; Carell et al. ,

Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994; e Gallop et al., J.

Med. Chem. 37:1233, 1994. Além disso, se for desejado, gualguer biblioteca ou composto é facilmente modificado utilizando métodos bioguímicos guímicos ou físicos padrão.

Numerosos métodos também estão disponíveis para a geração de síntese aleatória ou dirigida (por exemplo, semi-síntese ou síntese total) de gualguer número de polipéptidos, compostos químicos, incluindo, mas não limitado a, compostos com base em sacáridos, lípidos, péptidos e ácidos nucleicos. Bibliotecas de compostos sintéticos estão comercialmente disponíveis a partir de Brandon Associates (Merrimack, N.H.) e Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.). Alternativamente, os compostos químicos a serem utilizados como compostos candidatos podem ser sintetizados a partir de materiais de partida facilmente disponíveis utilizando técnicas e metodologias sintéticas padrão conhecidos para os vulgares peritos na especialidade. Transformações de química de síntese e as metodologias de grupo de proteção (proteção e desproteção) úteis na síntese dos compostos identificados pelos métodos descritos no presente documento são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles que, como descrito em R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic

Synthesis, 2a ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser e M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); e L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), e edições subsequentes dos mesmos.

As bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução (por exemplo, Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992), ou em esferas (Lam, Nature 354:82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364:555-556, 1993), bactérias (Ladner, documento de Patente U.S. N° 5.223.409), esporos (Ladner Patente U.S. N° 5.223.409), plasmideos (Cull et al. Proc Natl Acad Sei USA 89:1865-1869, 1992) ou em fagos (Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990; Devlin, Science 249:404-406, 1990; Cwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 87:6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991; Ladner supra.).

Adicionalmente, os peritos na especialidade da descoberta e desenvolvimento de fármacos prontamente entendem que os métodos de desreplicação (por exemplo, desreplicação taxonómica, desreplicação biológica, ou desreplicação química, ou qualquer combinação dos mesmos) ou a eliminação de replicatas ou repetições de materiais já conhecidos pela sua atividade devem ser utilizados sempre que possível.

Quando se encontra que um extrato bruto tem atividade de ligação de bromodomínio de membro da família BET, o fraccionamento adicional do extrato líder é necessário para isolar os constituintes moleculares responsáveis pelos efeitos observados. Assim, o objetivo do processo de extração, fracionamento e purificação é a caracterização cuidadosa de uma entidade química dentro do extrato bruto que reduz a proliferação de células neoplásicas ou viabilidade. Os métodos de fracionamento e purificação de tais extratos heterogéneos são conhecidos na técnica. Se for desejado, os compostos revelaram ser úteis como agentes terapêuticos são quimicamente modificados de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Descrevem-se métodos de tratamento de doenças e/ou distúrbios ou dos seus sintomas, que compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um composto das fórmulas no presente documento a um indivíduo (por exemplo, um mamífero tal como um ser humano) . Assim, um aspeto é um método de tratamento de um indivíduo que sofre de ou é suscetível a uma doença neoplásica ou distúrbio ou sintoma do mesmo. 0 método divulgado inclui a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade terapêutica de uma quantidade de um composto no presente documento suficiente para tratar a doença ou distúrbio ou sintoma do mesmo, sob condições tais que a doença ou distúrbio é tratado.

Os métodos aqui descritos incluem a administração a um indivíduo (incluindo um indivíduo identificado em necessidade de tal tratamento) uma quantidade eficaz de um composto descrito no presente documento, ou uma composição descrita no presente documento para produzir tal efeito. Identificar um indivíduo em necessidade de tal tratamento pode ser no julgamento de um indivíduo ou de um profissional de cuidado da saúde e pode ser subjectivo (por exemplo, opinião) ou objectivo (por exemplo, mensurável por um teste ou método de diagnóstico).

Também são divulgados os métodos terapêuticos que (que inclui o tratamento profilático) , em geral, compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos no presente documento, tal como um composto das fórmulas desta invenção a um indivíduo (por exemplo, animal, ser humano) em necessidade do mesmo, incluindo um mamífero, particularmente um ser humano. Tal tratamento será adequadamente administrado a indivíduos, particularmente seres humanos, que sofrem de, tendo, suscetíveis a, ou em risco de um doença, distúrbio, ou sintoma do mesmo. A determinação dos indivíduos "em risco" pode ser feita através de qualquer determinação objetiva ou subjetiva por meio de um teste diagnóstico ou a opinião de um indivíduo ou profissional de cuidado da saúde (por exemplo, teste genético, marcador de enzima ou proteína, Marcador (conforme definido no presente documento), histórico familiar, e semelhantes). Os compostos da reivindicação 1 podem também ser utilizados no tratamento de quaisquer outros distúrbios em que a neoplasia ou inflamação podem ser implicados.

Também se divulga um método para a monitorização do progresso do tratamento. 0 método inclui a etapa de determinação de um nível de marcador de diagnóstico (Marcador) (por exemplo, qualquer alvo delineado no presente documento modulado por um composto da invenção, uma proteína ou indicador do mesmo, etc.) ou medição diagnóstica (por exemplo, rastreio, ensaio) num indivíduo que sofre de ou é suscetível a um distúrbio ou sintomas do mesmo associado a neoplasia, em que ao indivíduo foi administrado uma quantidade terapêutica de um composto da invenção suficiente para tratar a doença ou sintomas da mesma. 0 nível de marcador determinado no método pode ser comparado com níveis conhecidos de marcador em controlos saudáveis normais ou em outros pacientes afligidos para estabelecer o estado patológico do indivíduo. Em exemplos preferidos, um segundo nível de marcador no indivíduo é determinada num ponto de tempo posterior à determinação do primeiro nível, e os dois níveis são comparadas para monitorizar o curso da doença ou a eficácia da terapêutica. Em certos exemplos preferidos, um nível de pré-tratamento de marcador no indivíduo é determinado antes do início do tratamento; este nível pré-tratamento de marcador pode então ser comparado com o nível de marcador no indivíduo após o início do tratamento, para determinar a eficácia do tratamento.

Terapêutica farmacêutica

Agentes descobertos que têm valor médico (por exemplo, JQ1 ou um composto de uma fórmula delineada no presente documento) utilizando os métodos descritos no presente documento são úteis como um fármaco ou como informação para a modificação estrutural de compostos existentes, por exemplo, por projeto de fármaco racional, Tais métodos são úteis para rastreio de agentes que têm um efeito sobre neoplasias, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para a redução da fertilidade masculina ou para utilização em transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência.

Para utilizações terapêuticas, as composições ou agentes identificados utilizando os métodos descritos no presente documento podem ser administrados sistemicamente, por exemplo, formuladas num tampão farmaceuticamente aceitável tal como solução salina fisiológica. As vias de administração preferíveis incluem, por exemplo, subcutânea, intravenosa, intraperitonealmente, intramuscular, ou injeções intradérmicas que fornecem níveis contínuos, sustentados do fármaco no paciente. 0 tratamento de pacientes humanos ou outros animais será levado a cabo utilizando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico identificado no presente documento num veículo fisiologicamente aceitável. Veículos adequados e sua formulação são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. A quantidade do agente terapêutico a ser administrada varia dependendo do modo de administração, a idade e o peso corporal do paciente, e com os sintomas clínicos da neoplasia, doença inflamatória, obesidade, fígado gordo (NASH ou outro), diabetes, aterosclerose, oclusão de stent arterial, insuficiência cardíaca, caquexia, doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças infeciosas associadas com bromodomínios, o tratamento de parasitas, malária, tripanossomas, e para a redução da fertilidade masculina ou para utilização em transplante de órgãos, modulação do estado celular para medicina regenerativa (isto é, através da promoção ou inibição da diferenciação celular), e facilitação da pluripotência. Geralmente, as quantidades estarão no intervalo dos que são utilizados para outros agentes utilizados no tratamento de outras doenças associadas com tais doenças ou estados, embora em certos casos, sejam necessárias quantidades inferiores devido ao aumento da especificidade do composto. Um composto é administrado a uma dosagem que é citotóxica para uma célula neoplásica, que reduz a atividade biológica de um membro da família BET, ou que reduz a proliferação, sobrevivência, ou invasividade de uma célula neoplásica, tal como determinado por um método conhecido para um perito na especialidade, ou utilizando qualquer ensaio que mede que a expressão ou a atividade biológica de um membro da família de BET. Em outro exemplo, o composto é administrado a uma dosagem que reduz a inflamação ou um sintoma de doença inflamatória.

Doença inflamatória,

As composições e os compostos de acordo com a reivindicação 1 são úteis para reduzir a inflamação e para o tratamento de doença inflamatória. A inflamação é o resultado de uma série complexa de sinais moleculares que envolvem o sistema imunitário, normalmente em resposta a infeções ou dano celular ou tecido. A inflamação normalmente constitui o início de cura do corpo; no entanto, quando não é adequadamente regulada a inflamação pode resultar em doenças crónicas, tal como artrite.

Por "resposta inflamatória" ou "resposta imunológica" entende-se a reação dos tecidos à lesão, infeção ou irritação caracterizada por vermelhidão, quentura, inchaço, dor, e perda de função produzida, como resultado do aumento do fluxo de sangue e um influxo de células do sistema imune e secreções. A inflamação é uma reação do corpo a microorganismos invasores infeciosos e resulta em um aumento do fluxo sanguíneo para a área afetada, a libertação de substâncias químicas que atraem as células brancas do sangue, um aumento do fluxo de plasma, e a chegada de monócitos para limpar os detritos. Tudo o que estimula a resposta inflamatória é dito ser inflamatório. A cascata inata, ou a resposta imune inata, é a resposta não específica montada pelo sistema imune e é caracterizada pela infiltração de células, tais como leucócitos, células natural killer mastócitos, eosinófilos e basófilos, bem como fagócitos, tais como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas em resposta à sinalização quimiotática no local da lesão ou infecção. As moléculas secretadas pelas células mencionadas anteriormente, tais como histamina e várias citocinas; e o sistema de complemento de proteínas circulantes contribuem para inflamação. Doenças caracterizadas pela inflamação são causas significativas de morbidade ou mortalidade em seres humanos.

Em determinados exemplos, o distúrbio inflamatório é distúrbio reumatoide. Distúrbios reumatoides, conforme é utilizado no presente documento, referem-se a qualquer de uma variedade de distúrbios inflamatórios caracterizados por inflamação, e às vezes degeneração e/ou desarranjo metabólico, das estruturas de tecido conjuntivo, especialmente as articulações, ligamentos, e tendões. Os distúrbios reumatoides tipicamente resultam em dor, rigidez e/ou limitação do movimento. 0 tecido particular ou tecidos afetados depende distúrbio reumatoide. Distúrbios reumatoides exemplares incluem mas não são limitados a, artrite reumatoide, artrite juvenil, bursite, espondilite, gota, escleroderma, doença de Still, e vasculite.

Em determinados exemplos, o distúrbio reumatoide é artrite reumatoide e "tratar" a artrite reumatoide inclui diminuir a gravidade frequência, e/ou ocorrência de um ou mais dos sintomas da artrite reumatoide. Em outros exemplos, o distúrbio reumatoide é artrite juvenil, bursite, espondilite, gota, escleroderma, doença de Still, ou vasculite, Os métodos divulgados no presente documento diminuem a gravidade, frequência, e/ou ocorrência de qualquer um ou mais dos sintomas destas condições patológicas.

Em vários exemplos, os sintomas de artrite ou outras doenças inflamatórias incluem vermelhidão, inchaço, inflamação, febre, amplitude de movimentos diminuída, e dor. Exemplos de reduzir a ocorrência ou gravidade de sintomas incluem, diminuir o número de articulações inchadas, diminuir o número de articulações dolorosas, diminuir a dependência de medicação da dor, diminuir a autoavaliação da frequência ou gravidade da dor, aumentar a liberdade de movimento, aumentar a mobilidade, diminuir a febre, e aumentar a capacidade de realizar atividades diárias. A neuroinflamação, caracterizada pela microglia ativada e astrócitos e a expressão local de uma ampla gama de mediadores inflamatórios, é uma reação fundamental à lesão cerebral, seja por trauma, acidente vascular cerebral, infeção, ou neurodegeneração. Acredita-se que esta resposta de tecido local seja parte de um processo de reparação e restauração. Como muitas condições inflamatórias em doenças periféricas, a neuroinflamação pode contribuir para a fisiopatologia de distúrbio do SNC.

Em determinados exemplos, o distúrbio inflamatório é distúrbio inflamatório da pele. Distúrbios inflamatórios da pele incluem rosácea, dermatite atópica, acne, dermatite seborreica, e celulite.

Em outros exemplos, a doença inflamatória é uma doença inflamatória cardiovascular ou isquémica. Uma doença ou distúrbio cardiovascular inflamatório pode ser uma doença ou distúrbio oclusivo, aterosclerose, uma doença valvular cardíaca, estenose, restenose, estenose em stent, enfarte do miocárdio, doença coronária arterial, síndromes coronarianas agudas, insuficiência cardíaca congestiva, angina pectoris, isquemia do miocárdio, ou trombose. Em outros exemplos, o local é um local secundário de lesão isquémica, tal como o SNC ou rim.

Em outros exemplos, a doença inflamatória é uma doença inflamatória intestinal ou isquémica. A doença inflamatória intestinal (IBD) refere-se a uma doença inflamatória crónica recorrente de etiologia incerta que afeta o intestino delgado e cólon que inclui tanto a doença de Crohn (DC) como colite ulcerativa (CU) . A doença de Crohn pode envolver qualquer parte do trato intestinal, mas envolve mais frequentemente o intestino delgado distai e/ou o cólon. A colite ulcerativa envolve apenas o cólon, em geral, limitada ao reto ou cólon distai. Estudos em modelos murinos de DC e CU sugerem fortemente que ambas as doenças são devido à desregulação da resposta imune da mucosa para antigénios da microflora da mucosa (Sartor, R. B. (1995) . Gastroenterol Clin North Am 24, 475-507) (Strober W, et al. (2002) Annu. Rev.

Immunol. 20:495-549). A colite ulcerativa ou a colite indeterminada refere-se a uma condição do cólon caracterizada por um estado de inflamação em que uma ou mais das seguintes caracteristicas histológicas são detetáveis: uma inflamação superficial caracterizada pela presença de perda de célula epitelial e ulceração irregular, pronunciada depleção de células caliciformes produtoras de mucina, e a redução da densidade das glândulas tubulares. Adicionalmente, na lâmina própria, um infiltrado celular inflamatório misto que consiste em linfócitos e granulócitos (o último consistindo principalmente em neutrófilos e, em menor grau, eosinófilos) associados a uma exsudação de células para o lúmen do intestino é observada. Também, o nível da submucosa pode apresentar edema acentuado com poucas células inflamatórias, enquanto na camada muscular externa, um perito na especialidade veria pouca ou nenhuma evidência de inflamação. Veja-se, por exemplo, Boirivant et al. Journal of Experimental Medicine 188: 1929-1939 (1998) . Os sintomas clínicos podem incluir, mas não são limitados a, diarreia, prolapso rectal, perda de peso, dor abdominal, e desidratação . A doença de Crohn refere-se à inflamação que afeta qualquer parte do trato alimentar, mas que afeta mais frequentemente a parte terminal do intestino delgado e/ou o cólon ascendente adjacente. Com frequência, a inflamação é caracterizada por "lesões descontinuas" que consiste em áreas de inflamação alternado com áreas de mucosa normal. A área afetada do intestino na doença de Crohn é marcada por eritema, edema e friabilidade aumentada; em momentos o intestino é constrito e unido a outros órgãos abdominais ou à parede do intestino. Fistulas entre o intestino afetado e outras estruturas incluindo a pele não são infrequentes. 0 exame microscópico do tecido na doença de Crohn revela erosões epiteliais, a perda de células caliciformes produtoras de mucina e uma extensa infiltração linfocitica envolvendo todas as camadas da mucosa; este infiltrado por vezes contém células gigantes indicativas de formação de granulomas. Quando a inflamação está presente durante um longo período (crónica), que por vezes pode causar cicatrizes (fibrose) . 0 tecido cicatricial não é normalmente tão flexível como o tecido saudável. Portanto, quando ocorre fibrose nos intestinos, a cicatriz pode estreitar a largura da passagem (lúmen) dos segmentos envolvidos do intestino. Essas áreas são chamadas constrições. As constrições podem ser ligeiras ou graves, dependendo de quanto eles bloqueiam o conteúdo do intestino de passar através da área estreitada. Os sinais clínicos/sintomas da doença de Crohn podem incluir, perda de peso, crescimento deficiente, dor abdominal, fístulas drenantes, prolapso retal e desidratação.

Em determinados exemplos, uma doença ou distúrbio inflamatório hepático. Por exemplo, doença ou distúrbio inflamatório hepático é selecionado a partir do grupo que consiste em hepatite autoimune, cirrose hepática, e cirrose biliar.

Formulação de Composições Farmacêuticas A administração de um composto para o tratamento de uma neoplasia ou doença inflamatória pode ser por qualquer meio adequado que resulta numa concentração do agente terapêutico que, combinado com outros componentes, é eficaz em melhorar, reduzir, ou estabilizar uma neoplasia ou doença inflamatória. 0 composto pode estar contido em qualquer quantidade apropriada em qualquer substância portadora adequada, e está geralmente presente numa quantidade de 1-95% em peso do peso total da composição. A composição pode ser proporcionada em uma forma de dosagem que é adequada para via de administração parentérica (por exemplo, subcutaneamente, intravenosamente, intramuscularmente, ou intraperitonealmente). As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (veja-se, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed.), ed. A. R.

Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Mareei Dekker, Nova Iorque).

As quantidades de dosagem humana podem inicialmente ser determinadas por extrapolação a partir da quantidade de composto utilizado em ratinhos, como um perito na especialidade reconhece que é de rotina na técnica para modificar a dosagem para os seres humanos em comparação com modelos animais. Em certas formas de realização prevê-se que a dosagem pode variar entre cerca de 1 mg de composto/kg de peso corporal e cerca de 5000 mg de composto/kg de peso corporal; ou desde cerca de 5 mg/kg de peso corporal até cerca de 4000 mg/kg de peso corporal ou desde cerca de 10 mg/kg de peso corporal até cerca de 3000 mg/kg de peso corporal; ou desde cerca de 50 mg/kg de peso corporal até cerca de 2000 mg/kg de peso corporal; ou desde cerca de 100 mg/kg de peso corporal até cerca de 1000 mg/kg de peso corporal; ou desde cerca de 150 mg/kg de peso corporal até cerca de 500 mg/kg de peso corporal; Em outras formas de realização, esta dose pode ser de cerca de 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, ou 5000 mg/kg de peso corporal. Em outras formas de realização, prevê-se que as doses podem estar no intervalo de cerca de 5 mg de composto/kg corporal de cerca de 20 mg composto/kg corporal. Em outras formas de realização as doses podem ser de cerca de 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 mg/kg de peso corporal. Naturalmente, esta quantidade de dosagem pode ser ajustada para cima ou para baixo, como é habitualmente feito nos protocolos de tratamento, dependendo dos resultados dos ensaios clínicos iniciais e as necessidades de um paciente particular.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para libertar o composto ativo substancialmente imediatamente após a administração ou em qualquer momento ou período de tempo predeterminado após a administração. Os últimos tipos de composições são geralmente conhecidas como formulações de libertação controlada, que incluem (i) formulações que criam uma concentração substancialmente constante do fármaco dentro do corpo durante um período prolongado de tempo; (ii) formulações que após um intervalo de tempo predeterminado criam uma concentração substancialmente constante do fármaco dentro do corpo durante um período prolongado de tempo; (iii) formulações que sustentam a ação durante um período de tempo predeterminado através da manutenção de um nível relativamente, constante, eficaz no corpo, com minimização concomitante de efeitos secundários indesejáveis associados a flutuações do nível no plasma da substância ativa (padrão cinético em dente de serra) ; (iv) formulações que localizam a ação por, por exemplo, colocação espacial de uma composição de libertação controlada adjacente a, ou em contacto com o timo; (V) formulações que permitem uma dosagem conveniente, de tal modo que as doses são administradas, por exemplo, uma vez a cada uma ou duas semanas; e (vi) formulações que têm como alvo uma neoplasia ou doença inflamatória utilizando veículos ou derivados químicos para entregar o agente terapêutico para um determinado tipo de célula (por exemplo, células neoplásicas). Para algumas aplicações, as formulações de libertação controlada obviam a necessidade de dosagem frequente durante o dia para sustentar o nível plasmático num nível terapêutico.

Qualquer uma de uma série de estratégias podem ser prosseguidas para obter a libertação controlada em que a taxa de libertação supera a taxa de metabolismo do composto em questão. Num exemplo, a libertação controlada é obtida através da seleção apropriada de vários parâmetros e ingredientes da formulação, incluindo, por exemplo, vários tipos de composições de libertação controlada e revestimentos. Assim, o agente terapêutico é formulado com excipientes apropriados numa composição farmacêutica que, após a administração, liberta o agente terapêutico de uma maneira controlada. Exemplos incluem ou composições de cápsulas ou comprimidos de unidade única ou múltipla, soluções oleosas, suspensões, emulsões, microcápsulas, microesferas, complexos moleculares, nanopartícuias, pensos, e lipossomas.

Composições parentéricas A composição farmacêutica pode ser administrada parentericamente por injeção, infusão ou implantação (por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou semelhantes) em formas farmacêuticas, formulações, ou por meio de dispositivos de distribuição adequados ou implantes contendo veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos convencionais. A formulação e preparação de tais composições são bem conhecidas dos peritos na especialidade da formulação farmacêutica. As formulações podem ser encontradas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, supra.

Composições para utilização parentérica podem ser fornecidas em formas farmacêuticas unitárias (por exemplo, em ampolas de dose única), ou em frascos contendo várias doses e em que um conservante adequado pode ser adicionado (veja-se abaixo) . A composição pode estar na forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um dispositivo de infusão, ou um dispositivo de entrega para implante, ou pode ser apresentada como um pó seco e reconstituído com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Além do agente ativo que reduz ou melhora uma neoplasia ou doença inflamatória, a composição pode incluir veículos e/ou excipientes parentericamente aceitáveis. Os agentes terapêuticos ativos podem ser incorporados em microesferas, microcápsulas, nanopartículas, lipossomas, ou semelhantes para libertação controlada. Além disso, a composição pode incluir agentes de suspensão, solubilização, estabilização ajuste do pH, agentes de ajuste da tonicidade, e/ou agentes dispersantes.

Conforme indicado acima, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem estar na forma adequada para injeção estéril. Para preparar tal composição, os agentes terapêuticos antineoplásicos ativos são dissolvidos ou suspensos num veiculo liquido parentericamente aceitável. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão água, água ajustada a um pH adequado pela adição de uma quantidade apropriada de ácido clorídrico. Hidróxido de sódio ou um tampão adequado, 1,3-butanodiol, solução de Ringer, solução de cloreto de sódio isotónica e solução de dextrose. A formulação aquosa também pode conter um ou mais conservantes (por exemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo ou n-propilo; Nos casos em que um dos compostos é apenas fracamente ou ligeiramente solúvel em água, um agente solubilizante ou de reforço da dissolução pode ser adicionado, ou o solvente pode incluir 10-60% p/p de propileno glicol ou semelhantes.

Composições parentéricas de libertação controlada

As composições parentéricas de libertação controlada podem estar na forma de suspensões aquosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluções oleosas, suspensões oleosas, ou emulsões. Alternativamente, o fármaco ativo pode ser incorporado em veículos biocompatíveis, lipossomas, nanopartícuias, implantes, ou dispositivos de infusão.

Os materiais para utilização na preparação de microesferas e/ou microcápsulas são, por exemplo, polímeros biodegradáveis/bioerodíveis tais como poligalactina, poli-(cianoacrilato de isobutilo), poli (2-hidroxietil-L-glutaminina) e, poli (ácido lático). Veículos biocompatíveis que podem ser utilizados aquando da formulação de uma formulação parentérica de libertação controlada são hidratos de carbono (por exemplo, dextranos), proteínas (por exemplo, albumina), lipoproteínas, ou anticorpos. Os materiais para utilização em implantes podem ser não biodegradáveis (por exemplo, polidimetilsiloxano) ou biodegradáveis (por exemplo, poli (caprolactona), poli (ácido lático), poli (ácido glicólico) ou poli (orto-ésteres) ou combinações dos mesmos). Formas Farmacêuticas sólidas para utilização oral

As formulações para utilização oral incluem comprimidos contendo os ingredientes ativo numa mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos. Tais formulações são conhecidas pelos peritos na especialidade. Os excipientes podem ser, por exemplo, diluentes ou cargas inertes (por exemplo, sacarose, sorbitol, açúcar, manitol, celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, lactose, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio, ou fosfato de sódio); agentes de granulação e de desintegração (por exemplo, derivados de celulose incluindo celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, croscarmelose sódica, alginatos, ou ácido algínico); agentes de ligação (por exemplo, sacarose, glucose, sorbitol, acácia, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pregelatinizado, celulose microcristalina, silicato de magnésio e alumínio, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, etilcelulose, polivinilpirrolidona, ou polietilenoglicol) ; e agentes lubrificantes, deslizantes, e antiadesivos (por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados, ou talco) . Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes de tamponamento,

Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas, opcionalmente para retardar a desintegração e a absorção no trato gastrointestinal e deste modo proporcionar uma ação sustentada durante um período mais longo. 0 revestimento pode ser adaptado para libertar o fármaco ativo num padrão predeterminado (por exemplo, com a finalidade de conseguir uma formulação de libertação controlada) ou pode ser adaptada para não libertar o fármaco ativo até depois da passagem do estômago (revestimento entérico). 0 revestimento pode ser um revestimento de açúcar, um revestimento de filme (por exemplo, baseado em hidroxipropil metilcelulose, metilcelulose, metil hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, copolímeros de acrilato, polietileno glicois e/ou polivinilpirrolidona), ou um revestimento entérico (por exemplo, com base em copolímero de ácido metacrílico, acetato ftalato de celulose, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, acetato sucinato de hidroxipropilmetilcelulose, acetato ftalato de polivinilo, goma-laca, e/ou etilcelulose) . Além disso, um material de retardamento no tempo, tal como, por exemplo, monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo pode ser utilizado.

As composições sólidas de comprimidos podem incluir um revestimento adaptado para proteger a composição de alterações químicas não desejadas, (por exemplo, degradação química antes da libertação da substância terapêutica ativa). 0 revestimento pode ser aplicado sobre a forma de dosagem sólida de uma maneira semelhante àquela descrita em Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, supra.

Pelo menos dois agentes terapêuticos podem ser misturados juntamente no comprimido, ou podem ser repartidos. Num exemplo, o primeiro agente terapêutico antineoplásico ativo está contido no interior do comprimido, e o agente terapêutico ativo está no exterior, de tal modo que uma porção substancial do segundo agente terapêutico é libertada antes da libertação do primeiro agente terapêutico.

As formulações para utilização oral podem também ser apresentadas na forma de comprimidos mastigáveis, ou como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente activo é misturado com um diluente sólido inerte (por exemplo, amido de batata, lactose, celulose microcristalina, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino), ou como cápsulas de gelatina moles em que o ingrediente ativo está misturado com água, ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina liquida, ou óleo de oliva, Pós e granulados podem ser preparados utilizando os ingredientes mencionados acima em comprimidos e cápsulas de uma maneira convencional utilizando, por exemplo, um misturador, um aparelho de leito fluidizado ou um equipamento de secagem por pulverização.

Formas farmacêuticas orais de libertação controlada

As composições para libertação controlada para utilização oral, podem, por exemplo, ser construídas para libertar o agente terapêutico ativo antineoplásico ou anti-inflamatório através do controlo da dissolução e/ou da difusão da substância ativa. A libertação controlada por dissolução ou difusão podem ser conseguidas pelo revestimento apropriado de um comprimido, cápsula, pélete, ou formulação granulada de compostos, ou incorporando o composto numa matriz apropriada. Um revestimento de libertação controlada pode incluir uma ou mais das substâncias de revestimento mencionadas acima e/ou, por exemplo, goma-laca, cera de abelha, glicocera, cera de rícino, cera de carnaúba, álcool estearílico, monostearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulose, resinas acrílicas, ácido dl-polilático acetato butirato de celulose, cloreto de polivinilo, acetato de polivinilo, vinil pirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metilmetacrilato, 2-hidroximetacrilato, hidrogéis de metacrilato, 1,3 butileno glicol, metacrilato de etileno glicol, e/ou polietilenoglicois; Numa formulação de matriz de libertação controlada, o material de matriz também pode incluir, por exemplo, metilcelulose hidratada, cera de carnaúba e álcool estearílico, carbopol 934, silicone, triestearato de glicerilo, acrilato de metilo-metacrilato de metilo, cloreto de polivinilo, polietileno, e/ou fluorocarboneto halogenado.

Uma composição de libertação controlada contendo um ou mais compostos terapêuticos podem também estar na forma de um comprimido ou cápsula flutuantes (isto é, um comprimido ou cápsula que, após administração oral, flutua no topo do conteúdo gástrico durante um certo período de tempo). Uma formulação de comprimido flutuante do(s) composto(s) pode ser preparada por granulação de uma mistura do(s) composto(s) com excipientes e 20-75% p/p de hidrocolóides, tais como hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, ou hidroxipropilmetilcelulose. Os grânulos obtidos podem depois ser prensados em comprimidos. Em contato com o suco gástrico, o comprimido forma uma barreira de gel substancialmente impermeável à água em torno da sua superfície. Esta barreira de gel toma parte na manutenção de uma densidade de menos do que um, permitindo desse modo que o comprimido permaneça flutuante no suco gástrico.

Terapêuticas de combinação

Opcionalmente, um agente terapêutico anti-neoplasia ou anti-inflamatório pode ser administrado em combinação com qualquer outra terapêutica de anti-neoplasia ou anti-inflamatória padrão conhecida na técnica. Tais métodos são conhecidos do perito na especialidade e descritos em

Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. Se for desejado, os agentes da invenção (ou outros compostos de formulas delineadas no presente documento, e derivados dos mesmos) são administrados em combinação com qualquer terapêutica antineoplásica convencional, cirurgia, terapêutica de radiação, ou quimioterapia, Em exemplos particulares, um composto da invenção é administrado em combinação com um modulador ou epigenético transcricional (por exemplo, inibidor de ADN metiltransferase, inibidores da histona deacetilase (inibidor de HDAC), inibidor da lisina metiltransferase), com fármacos anti-mitóticos (por exemplo, taxanos, alcaloides da vinca), moduladores de recetor de hormona (por exemplo, moduladores de recetor de estrógeno, moduladores de recetor de andrógeno), inibidores da via de sinalização celular (por exemplo, inibidores da tirosina quinase), moduladores da estabilidade da proteína (inibidores de proteassoma), inibidores de hsp90, agentes quimioterápicos convencionais, glicocorticoides, ácido retinoico todo trans ou outros agentes que promovem a diferenciação.

Kits ou sistemas farmacêuticos

As presentes composições podem ser montadas em kits ou sistemas farmacêuticos para utilização no melhoramento de uma neoplasia ou doença inflamatória. Os kits ou sistemas farmacêuticos de acordo com este aspeto compreendem um meio portador, tal como uma caixa, caixa de cartão, tubo, tendo em estreito confinamento aí um ou mais meios de recipiente, tais como frascos, tubos, ampolas, garrafas. Os kits ou sistemas farmacêuticos também podem compreender instruções associadas para a utilização dos agentes da invenção. A prática do presente invento utiliza, a menos que seja indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão bem dentro da competência de um perito na especialidade. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas técnicas são aplicáveis à produção de polipéptidos e os polinucleótidos descritos no presente documento, e, como tal, podem ser considerados em fazer e praticar a invenção. Técnicas particularmente úteis para formas de realização particulares serão discutidas nas seções que se seguem.

EXEMPLOS A prática do presente invento utiliza, a menos que seja indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão bem dentro da competência de um perito na especialidade. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas técnicas são aplicáveis à produção de polipéptidos e os polinucleótidos conforme descritos no presente documento, e, como tal, podem ser considerados em fazer e praticar a invenção. Técnicas particularmente úteis para formas de realização particulares serão discutidas nas seções que se seguem.

Os exemplos seguintes são apresentados de modo a proporcionar aos peritos na especialidade com uma divulgação e descrição completas de como preparar e utilizar o ensaio, rastreio, e métodos terapêuticos divulgados no presente documento, e não se destinam a limitar o âmbito de como os inventores consideram sua invenção.

I. EXEMPLOS QUÍMICOS - SÍNTESE E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO

Os compostos da invenção podem ser sintetizados por método descritos no presente documento, e/ou de acordo com métodos conhecidos por um perito na especialidade em vista da descrição no presente documento.

(2-amino-4,5-dimetiltiofen-3-il) (4-clorofenil)metanona (S2) 0 composto JQ1 foi preparado de acordo com o esquema mostrado acima.

Enxofre (220 mg, 6,9 mmol, 1,00 eq) foi adicionado como um sólido a uma solução de 4-clorobenzoílo acetonitrilo Si (1,24 g, 6,9 mmol, 1 equiv) , 2-butanona (0,62 ml, 6,9 mmol, 1,00 equiv), e morfolino (0,60 ml, 6,9 mmol, 1,00 equiv) em etanol (20 ml, 0,35 M) a 23 °C21. A mistura foi aquecida até 74 °C. Após 12 horas, A mistura de reação foi arrefecida até 23 °C e vertida em salmoura (100 ml). A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (3 X 50 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (50 ml) , foram secas sobre sulfato de sódio anidro, foram filtradas, e foram concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (Combiflash RF system, 40 grama de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar S2 (1,28 g, 70 %) como um sólido amarelo. (S)-terc-Butil-3-({[(9H-fluoren-9-il)metoxi]carbonil}amino)-4-{[3-(4-clorobenzoil)-4,5-dimetiltiofen-2-il]amino}-4-oxobutanoato (S3) (2 - ( 6-Cloro-lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio hexafluorofosfato (HCTU) (827 mg, 2,0 mmol, 2.00 equiv) , e N, ΛΤ-diisopropiletilamina (0,72 ml, 4,0 mmol, 4.00 equiv) foram adicionados sequencialmente a uma solução de éster β-tert-butílico do ácido 9-fluorenilmetoxicarbonil-aspártico [Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH] (864 mg, 2,1 mmol, 2,10 equiv) em N, iV-dimetilformamida (1,5 ml, 1,0 M) . A mistura depois foi agitada a 23 °C durante 5 min. S2 (266 mg, 1,0 mmol, 1 equiv) foi então adicionada como um sólido. A mistura da reação foi agitada a 23 °C. Após 16 horas, acetato de etilo (20 ml) e salmoura (20 ml) foram adicionados. As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 X 20 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (30 ml), foram secas sobre sulfato de sódio anidro, foram filtradas, e foram concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (Combiflash RF, 40 grama de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar S3 (625 mg, 90 %) como um óleo castanho. (S)-terc-butil 3-amino-4-((3-(4-clorobenzoil)-4,5- dimetiltiofen-2-il]amino}-4-oxobutanoato (S4) 0 composto S3 (560 mg, 0,85 mmol, 1 equiv) foi dissolvido em piperidina a 20% em solução de DMF (4,0 ml, 0,22 M) a 23 °C. Após 30 min, acetato de etilo (20 ml) e salmoura (20 ml) foram adicionados à mistura de reação. As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 X 20 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (3 x 25 ml) , foram secas sobre sulfato de sódio anidro, foram filtradas, e foram concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (sistema Combiflash RF, 24 gramas de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de et ilo-hexanos) para proporcionar a amina livre S4 (370 mg, 90 %) como um sólido amarelo. A pureza enantiomérica caiu para 75% (determinado com Cromatografia de Fluido Supercrítico (SFC) Berger utilizando uma coluna AS-H). (S)-terc-Butil 2- (5- (4-clorofenil)-6,7-dimetil-2-oxo-2,3- dihidro-lH-tieno[2,3-e][1,4]diazepin-3-il)acetato (S5) A amino cetona (S4) (280 mg, 0,63 mmol) foi dissolvido em solução em etanol de ácido acético a 10% (21 ml, 0,03 M) . A mistura foi aquecida até 85 °C. Após 30 minutos, todos os solventes foram removidos sob pressão reduzida, O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (sistema Combiflash RF, 12 gramas de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar o composto S5 (241 mg, 95 %) como um sólido branco. A pureza enant iomérica de S5 foi de 67 % (determinado com Cromatograf ia de Fluido

Supercrítico (SFC) Berger utilizando uma coluna AS-H). tert-Butil 2- (5- (4-clorofenil)-6,7-dimetil-2-tioxo-2,3- dihidro-lH-tieno[2,3-e] [1,4]diazepin-3-il)acetato (S 6)

Pentassulfureto de fósforo (222 mg, 1,0 mmol, 2,00 equiv), bicarbonato de sódio (168 mg, 2,0 mmol, 4,00 equiv) foram adicionados sequencialmente a uma solução de S5 (210 mg, 0,5 mmol, 1 equiv) em diglima (1,25 ml, 0,4 M). A mistura foi aquecida até 90 °C. Após 16 h, salmoura (20 ml) e acetato de etilo (35 ml) foram adicionados. As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (3 X 30 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (2 x 15 ml) , foram secas sobre sulfato de sódio anidro, foram filtradas, e foram concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (sistema Combiflash RF, 24 gramas de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de et ilo-hexanos) para proporcionar S6 (141 mg, como um sólido castanho com S5 recuperado (73 mg, 34%). terc-Butil 2-(4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2— f] [l,2,4]triazolo[4,3-a] [l,4]diazepin-6-il)acetato [ (±)JQ1]

Hidrazina (0,015 ml, 0,45 mmol, 1,25 equiv) foi adicionada a uma solução de S6 (158 mg, 0,36 mmol, 1 equiv) em THF (2,6 ml, 0,14 M) a 0 °C. A mistura de reação foi aquecida até 23 °C, e agitada a 23 °C durante 1 h. Todos os solventes foram removidos sob pressão reduzida. A hidrazina resultante foi utilizada diretamente sem purificação. A hidrazina foi em seguida dissolvida numa mistura 2:3 de ortoacetato de trimetilo e tolueno (6 ml, 0,06 M). A mistura foi aquecida até 120 °C. Após 2 h, todos os solventes foram removidos sob pressão reduzida, O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (sistema Combiflash, 4 g de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar JQ1 (140 mg, 85 % em 2 etapas) como um sólido branco. As condições de reação epimerizaram ainda mais o centro estereogénico, resultando no racemato, JQ1 (determinado com Cromatografia de Fluido Supercrítico (SFC) Berger utilizando uma coluna AS-H).

(S)-terc-Butil-3-({[(9H-fluoren-9-il)metoxi]carbonil}amino)-4-{ [ 3 - (4-clorobenzoil)-4,5-dimetiltiofen-2-il]amino}-4-oxobutanoato (S3) (benzotriazol-l-iloxi) tripirrolidinofosfónio (PyBOP) (494 mg, 0,95 mmol, 0,95 equiv), N,N-diisopropil-etilamina (0,50 ml, 2,8 mmol, 2,75 equiv) foram adicionados sequencialmente a uma solução de éster β-terc-butilico do ácido 9-fluorenilmetoxicarbonil-aspártico [Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH] (411 mg, 1,00 mmol, 1,0 equiv) em N,N-dimetilformamida (1,0 ml, 1,0 M) . A mistura depois foi agitada a 23 °C durante 5 min. S2 (266 mg, 1,0 mmol, 1 equiv) foi então adicionado como um sólido. A mistura da reação foi agitada a 23 °C. Após 4 h. acetato de etilo (20 ml) e salmoura (20 ml) foram adicionados. As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 X 20 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, foram secas sobre sulfato de sódio anidro, foram filtradas, e foram concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (sistema Combiflash RF, 40 gramas de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de et ilo-hexanos) para proporcionar S3 (452 mg, 72 %) como um óleo castanho. (S)-terc-butil 3-amino-4-((3-(4-clorobenzoil) -4,5- dimetiltiofen-2-il]amino}-4-oxobutanoato (S4) 0 composto S3 (310 mg, 0,47 mmol, 1 equiv) foi dissolvido em piperidina a 20% em solução de DMF (2,2 ml, 0,22 M) a 23 °C. Após 30 min, acetato de etilo (20 ml) e salmoura (20 ml) foram adicionados à mistura de reação. As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 X 20 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (3 x 25 ml) , foram secas sobre sulfato de sódio anidro, foram filtradas, e foram concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (sistema Combiflash RF, 24 gramas de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de etilo-hexano) para proporcionar a amina livre S4 (184 mg, 90 %) como um sólido amarelo. A pureza enantiomérica foi de 91 % (verificada com

Cromatografia Fluida Supercrítica Berger (SFC) e uma coluna AS-H). (S)-terc-Butil 2- (5- (4-clorofenil)-6,7-dimetil-2-oxo-2,3- dihidro-lH-tieno[2,3-e][1,4]diazepin-3-il)acetato (S5) A amino cetona (S4) (184 mg, 0,42 mmol) foi dissolvida tolueno (10 ml, 0,04 M). Sílica gel (300 mg) foi adicionada, e a mistura foi aquecida até 90 °C. Após 3 h, a mistura de reação foi arrefecida até 23 °C. A sílica gel foi filtrada, e lavada com acetato de etilo. Os filtrados combinados foram concentrados. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (sistema Combiflash RF, 12 gramas de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar o composto S5 (168 mg, 95 %) como um sólido branco. A pureza enantiomérica de S5 foi de 90 % (determinado com Cromatografia de Fluido Supercrítico (SFC) Berger utilizando uma coluna AS-H). {S)-terc--Butil 2-(4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H- tieno[3,2-f] [1,2,4]triazolo[4,3-a] [1,4]diazepin-6-il)acetato [ ( + )JQ1]

Terc-butóxido de potássio (1,0 M solução em THF, 0,3 ml, 0,30 mmol, 1,10 equiv) foi adicionado a uma solução de S5 (114

mg, 0,27 mmol, 1 equiv) em THF (1,8 ml, 0,15 M) a -78 °C. A mistura de reação foi aquecida até -10 °C, e agitada a 23 °C durante 30 min. A mistura de reação foi arrefecida até -78 °C, Clorofosfato de dietilo (0,047 ml, 0,32 mmol, 1,20 equiv) foi adicionado à mistura de reacção22. A mistura resultante foi aquecida até -10 0 C ao longo de 45 min. Hidrazida acética (30 mg 0,40 mmol, 1,50 equiv) foi adicionado à mistura de reacção. A mistura da reação foi agitada a 23 °C. Após 1 h. 1-butanol (2,25 ml) foi adicionado à mistura de reação, que foi aquecida a 90 °C. Após 1 hora, todos os solventes foram removidos sob pressão reduzida, O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna flash (sistema Combiflash, 4 g de sílica gel, gradiente 0 a 100% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar (+ )-JQ1 (114 mg, A92%) como um sólido branco com 90% de pureza enantiomérica (determinado com Cromatografia de Fluido Supercrítico (SFC) Berger utilizando uma coluna AS-H, 85 % de hexanos- metanol, 210 nm, tR (enantiómero R) = 1,59 min, tR (enantiómero S) = 3, 67 min, O produto foi ainda purificado por meio de HPLC quiral preparativa (Cromatografia Liquida de Alta Pressão Agilent utilizando uma coluna OD-H) para dar o enantiómero S em mais do que 99% de ee. 2H RMN (600 MHz, CDC13, 25 °C) δ 7,39 (d, J = 8,4 Hz, 2H) , 7,31 (d, J= 8,4 Hz, 2H) , 4,54 (t, J= 6,6 MHz, 1H) , 3,54-3,52 (m, 2H) , 2,66 (s, 3H) , 2,39 (s, 3H) , 1,67 (s, 3H) , 1,48 (s, 9H) . 13C RMN (150 MHz, CDC13, 25 °C) δ 171, 0, 163, 8, 155,7, 150,0, 136, 9, 131,1, 130, 9, 130, 6, 130,3, 128, 9, 81,2, 54,1, 38,1, 28,4, 14, 6, 13,5, 12,1. HRMS(ESI) calc. para C21H24CIN2O3S [M+H] + : 457,1460, encontrado 457,1451 m/z. TLC (EtOAc) , Rf: 0,32 (UV) [oc] 22D = + 75 (c 0,5, CHC13) (-)-JQl foi sintetizado de uma maneira semelhante, utilizando Fmoc-D-Asp (Ot-Bu) -OH como um material de partida, e foi ainda purificado por meio de HPLC quiral preparativa (Cromatografia Líquida de Alta Pressão Agilent utilizando uma coluna OD-H) para dar o enantiómero R em mais do que 99% de ee. [a]22D = - 72 (c 0,5, CHC13) Síntese de compostos adicionais

Os compostos adicionais foram preparados como ilustrado no Esquema S3.

Esquema S3 Síntese de derivados de hidrazina.

Conforme é mostrado no esquema S3, o éster t-butílico de (+)-JQ (1) foi clivado para render o ácido livre (2), que foi acoplado com hidrazina para render a hidrazida (3) . A reação com 4-hidroxibenzaldeído rendeu a hidrazona (4).

Tanto a hidrazida (3) como a hidrazona (4) apresentaram atividade em pelo menos um ensaio biológico.

Uma biblioteca de compostos foi preparada por reação da hidrazida (3) com uma variedade de compostos contendo carbonilo (veja-se o Quadro A, acima).

Os compostos adicionais foram preparados para serem utilizados, por exemplo, como sondas para o desenvolvimento do ensaio. Uma síntese exemplar é apresentada no Esquema S4, abaixo .

Os compostos adicionais foram preparados como mostrado no QuadroB, abaixo:

Os dados dos espectros para cada composto foram consistentes com a estrutura atribuída. II. ATIVIDADE BIOLÓGICA Exemplo de Referência 1: JQ1 A Figura 1 mostra enantiómeros JQ1.

Exemplo de Referência 2: JQ1 desloca BRD4 a partir da cromatina nuclear nas células.

Para estabelecer se JQ1 se liga aos bromodomínios competitivamente com a cromatina num ambiente celular, experiências de recuperação de fluorescência após o fotobranqueamento (FRAP) foram realizadas sob BRD4.

Investigação anterior demonstrou a utilidade de FRAP na avaliação do ritmo de redistribuição lateral de quimeras fluorescentes contendo bromodomínios, a seguir ao fotobranqueamento seletivo de regiões discretas de cromatina nuclear27. Células de osteossarcoma humano (U20S) transfetadas com um GFP-BRD4 exibem recuperação da intensidade de fluorescência dependente do tempo (Fig. 2A e 2B) . Na presença de ( + )-JQ1 (500 nM, a recuperação observada é consistente imediato com BRD4 nuclear deslocado (fig. 3A e 3B). Os estudos FRAP celulares confirmaram que os efeitos sobre a fração celular de BRD4 estão limitados ao estereoisómero (+)-JQ1 bioquimicamente ativo (Figura 2A-2C).

Tendo demonstrado uma ligação potente, seletiva para BRD4 em ensaios homogéneos e à base de células, o efeito de JQ 1 em fenótipos celulares dependentes de BRD4 relevantes em doença foram avaliados. A proteína de fusão BRD4-NUT patogénica que surge de translocação t(15;19) em NMC liga avidamente a loci diferenciados de cromatina acetilada. conferindo vantagem proliferativa e bloqueio de diferenciação. Utilizando FRAP, a capacidade de JQ1 para diretamente ter como alvo a oncoproteína BRD4-NUT foi avaliada. Em comparação com um controlo de veiculo, JQ1 (500 nM) marcadamente acelerou a recuperação por tempo de intensidade de fluorescência em regiões fotobranqueadas de células transfetadas com GFP-BRD4-NUT (Fig. 3C, 3E). De maneira importante, nenhum efeito foi observado na redistribuição de GFP-NUT (Fig. 3D, 3E) . Em suma, estes dados são consistentes com a ligação competitiva de JQ1 para BRD4 em células em cultura.

Exemplo de Referência 5: JQ1 induz a diferenciação escamosa e parada do crescimento no carcinoma dependente de BRD4. A inibição direta de produtos de genes expressos a partir das translocações oncogénicos recorrentes, é uma abordagem terapêutica validada em cancro28,29 . As consequências fenotipicas da inibição química da bromodomínios da família BET no carcinoma de linha média NUT dependente do BRD4 foram exploradas. A localização de cromatina BRD4-NUT é mecanicamente ligada aos bromodomínios em tandem preservados de BRD4 na proteína de fusão17. Uma caracteristica particular da NMC é o aparecimento de manchas nucleares discretas da oncoproteína BRD4-NUT por imunohistoquímica dirigida a NUT (IHC)30. 0 tratamento da linha celular 797 NMC derivada de paciente durante 48 horas com JQ1 (500 nM) apagou os focos nucleares, produzindo coloração difusa de NUT nuclear por IHC (Fig. 3f).

Um fenótipo diferenciação marcante é observado com knockdown de BRD4-NUT em linhas celulares NMC 17. JQ1 produziu um equivalente, fenótipo de diferenciação dependente do tempo e da dose, caracterizado por achatamento e o espalhamento das células, cromatina aberta e morfologia do fuso em células 797 NMC e Per403 (Fig. 3g e Fig. 4A, 4B, 4C) . A diferenciação foi rápida (<24 horas) e caracterizada pela expressão marcadamente aumentada de citoqueratina, uma caracteristica da diferenciação escamosa (Fig. 3 horas) . Depois de sete dias em cultura com exposições sub-micromolar a JQ1, a diferenciação terminal foi observada. De maneira importante, linhas celulares de carcinoma escamoso não BRD4-dependentes (TE10 e TT) não exibem efeitos de diferenciação de JQ1 (Fig. 4A, 4B, 4C). Em células NMC dependentes de BRD4, a diferenciação é acompanhada pela paragem do crescimento como era de se esperar, evidenciado pela coloração reduzida de Ki67 (Fig. 3i, j e 4L-a, 4L-b). Suportando adicionalmente um mecanismo de ação em alvo, os fenótipos de parada de crescimento e diferenciação são estimulados somente por (+)-JQl, enquanto (-)-JQ1 não mostra efeito observável (Figura 4E-a-4E-d).

De forma notável, o tratamento de JQ1 fenocopia as alterações morfológica e expressão aumentada de queratina observada com o silenciamento de BRD4-NUT por ARN de interferência (Figura 4F-a, b). Corroborando estes estudos morfológicos e IHC, a análise da expressão de três genes tecido escamosos canónicos por indução marcada identificada por RT-PCR (30 vezes) de queratina-14 por (+)-JQl em células NMC 797 (Fig 3i.) . A indução modesta da queratina-10 e efeito ausente na epiderme transglutaminase (TGM1) são consistentes com diferenciação progressiva para epitélio escamoso torácico, consistente com tumor primário do mediastino a partir do qual células NMC 797 derivam28. A indução de diferenciação com forte coloração (3+) de queratina por IHC é progressiva durante 72 h, conforme determinado por análise quantitativa de IHC (Figura 4M). Apoiando um mecanismo de ação em alvo, o fenótipo de diferenciação é estimulado apenas por (+)-JQl enquanto (-)-JQ1 não mostra efeito observável. De maneira importante, uma linha celular de carcinoma escamoso não BRD4-dependentes (TE10) não exibe efeitos de diferenciação a partir do tratamento de JQ1 (Fig. 4A, Em células NMC dependentes de BRD4, a diferenciação é acompanhada pela paragem do crescimento como era de se esperar, evidenciado pela coloração reduzida de Ki67 (Fig. 4A-4G). A atividade antiproliferativa dos enantiómeros JQ1 foi em seguida avaliado em linhas celulares de carcinoma escamoso humano independente de BRD4 (TE10 e TT)e dependentes de BRD4 (797 e Per403) . Conforme mostrado na Figura 5e e Figura 4F-a-c, (+) - JQ1 exibiu exclusivamente uma inibição dependente da dose do crescimento das células apenas em linhas celulares dependentes de Brd4 (797 IC50 = 140 nM; Per403 IC50 = 60 nM) . O efeito antiproliferativo potente e diferenciação irreversível observados por IHC sugeriu a indução de morte celular. Assim, a apoptose precoce e tardia foi avaliada com anexina V e coloração com iodeto de propídio por citometria de fluxo. Conforme esperado, a apoptose induzida por JQ1 imediata e progressiva em células de carcinoma humano-dependente Brd4 mas, na concentração utilizada níveis significativos de células apoptóticas em linhas de células que não portam a fusão BRD-NUT não foram detetados (Fig. 5b e Fig. 7)

Exemplo de Referência 6: Eficácia in vivo e efeito farmacodinâmico de JQ1 num modelo murino de NMC.

Para estabelecer se JQ1 pode atenuar o crescimento de carcinoma dependente de BRD4 como um agente único in vivo, um modelo de xenoenxerto de ratinho de NMC foi desenvolvido em ratinhos utilizando a linha celular 797 de NMC. Estudos de tratamento a curto prazo foram realizados com obtenção de imagem por PET como um ponto final primário para explorar se a atividade antitumoral de JQ1 poderia ser demonstrada e mais tarde seguida através de imagiologia não invasiva. Coortes correspondidos de ratinhos foram estabelecidos e cargas comparáveis de doença mensurável foram aleatoriamente submetidos a tratamento com JQ1 (50 mg kg-1) ou veículo, administrados diariamente através de injeção intraperitoneal. Antes da aleatorização e após quatro dias de terapêutica, os ratinhos foram avaliados através de obtenção de imagem por PET. Uma resposta marcada na absorção de FDG foi observada com tratamento com JQ1, enquanto os animais tratados com veículo demonstraram doença evidente e progressiva (Fig. 5e).

Em paralelo, coortes correspondidos de ratinhos que carregam tumores de 797 de NMC foram estudados para os efeitos de JQ1 no volume tumoral através de medição de calibre e efeito farmacodinâmico através de IHC quantitativa. O crescimento agressivo de xenoenxertos de 797 de NMC propiciou o término do estudo no dia catorze de tratamento, ponto no qual todos os animais tratados com veículo tinham atingido o limite de tamanho tumoral institucional. Os animais que recebiam JQ1 exibiram uma redução estatisticamente significativa no crescimento tumoral (Fig. 5c, p = 0,039; teste t de duas caudas). Para capturar dados farmacodinâmicos e mecanísticos comparativos, todos os animais foram sacrificados e os tumores foram explantados para análise histopatológica. De forma notável, JQ1 foi bem tolerado nesta dose e regime sem sinais adversos de toxicidade ou perda de peso evidente (Fig. 5d, 5L).

Para confirmar que o efeito antineoplásico observado com o tratamento com JQ1 estava associado com a integração do alvo, tecido tumoral seccionado foi examinado para a oncoproteina BRD4-NUT. Conforme apresentado na Figura 5e e Figura 6A, o tratamento com JQ1 resultou no apagamento de manchas nucleares, consistente com a ligação competitiva à cromatina nuclear. A dispersão das células e a expressão aumentada de queratina confirmaram a diferenciação escamosa farmacodinâmica. A coloração nuclear diminuída para Ki67 e coloração aumentada para TUNEL em animais tratados confirmou um efeito antiproliferativo e apoptótico em curso. Em conjunto, estes dados proporcionam uma ligação mecanística entre a inibição de BRD4 e uma resposta terapêutica a JQ1 in vi vo.

Numa tentativa de relatar o biomarcador farmacodinâmico (PD) da expressão de queratina tumoral de uma forma não tendenciosa, foram estabelecidos protocolos para a aquisição e análise de imagem por IHC. Amostras emparelhadas a partir de animais tratados e não tratados foram preparadas e analisadas utilizando protocolos padronizados e software comercialmente disponível (ImageScope; Aperio Technologies). JQ1 desencadeou uma expressão de queratina forte (3+) em xenoenxertos de 797 de NMC, uniformemente dentro de espécimes de tumores excisados (Figura 6Ba-e).

Em paralelo com estes estudos, um paciente com 29 anos de idade com NMC positivo para BRD4-NUT amplamente metastizado com origem no mediastino foi identificado. Com o objetivo de desenvolver um modelo de doença mais clinicamente relevante, culturas a curto prazo foram estabelecidas utilizando material clínico descartado obtido a partir de drenagem do fluido pleural de um tubo de tórax paliativo no paciente. Conforme mostrado na Figura 8, estudos in vitro confirmaram o efeito potente e estereosseletivo de (+)-JQl na viabilidade (CI50 = 4 nM) , e crescimento celular e progressão do ciclo celular. Quatro animais enxertados com material tumoral derivado de pacientes desenvolveram doença mensurável, que foi fortemente positiva por PET (Fig. 5h). Os animais foram divididos aleatoriamente em coortes de tratamento com veiculo ou (+)-JQ1. Antes da divisão para tratamento e após quatro horas de terapêutica, os ratinhos foram avaliados através de obtenção de imagem por PET. Uma resposta marcada na absorção de FDG foi observada com o tratamento com (+)-JQl, enquanto os animais tratados com veiculo demonstraram doença evidente e progressiva (Fig. 5i) . Mais uma vez, o material tumoral foi preparado para análise IHC quantitativa, que demonstrou a indução da expressão de queratina após o tratamento com (+)-JQ1 (Fig. 5j, k, Figura 9). Em conjunto, estes dados proporcionam uma ligação mecanistica entre a inibição de BRD4 e uma resposta terapêutica a JQ1 in vivo.

Através do panorama mutacional complexo e emergente do genoma do cancro, rearranjos cromossómicos recorrentes compreendem um subconjunto persuasivo de claros alvos genéticos no cancro. Conforme evidenciado pelo desenvolvimento bem-sucedido do direcionamento a inibidores da cinase BCR-ABL no CML, compostos sonda bem caracterizados 31'32r dados de cristalografia de alta resolução33, estudos de investigação translacional34, e modelos murinos informativos35, quando disponíveis, proporcionam uma plataforma ótima para a descoberta de ligandos e validação de alvos. Conforme relatado no presente documento, um novo inibidor de molécula pequena direcionado ao BRD4 é provavelmente útil para o tratamento de carcinoma escamoso humano definido geneticamente associado com a fusão de NUT-BRD4.

Além do carcinoma da linha média-NUT, os bromodomínios da família BET contribuem para numerosas outras doenças neoplásicas e não neoplásicas. BRD4 direciona o complexo P- TEFb para cromossomas mitóticos, resultando em expressão de genes promotores do crescimento, tais como c-Myc119 e o alvo cancerígeno bem estabelecido Aurora B13. Adicionalmente, BRD4 é amplificado no cancro da mama36 e é um marcador preditivo de sobrevivência entre os pacientes com cancro da mama37. Além destas funções na biologia do cancro, os membros da família BET foram reconhecidos como genes essenciais para a replicação de vírus38,39 e na mediação de respostas inflamatórias14. Assim, a disponibilidade de (+)-JQ1 e (-)-JQ1 como sondas químicas emparelhadas irá propiciar a investigação informativa amplamente na biologia transcricional, do desenvolvimento e das doenças. Também se descobriu que JQ1 exibe poucos efeitos desviados sobre os recetores celulares e excelentes propriedades farmacocinéticas das quais 49% de biodisponibilidade oral (Fig. 10), estabelecendo a plausibilidade do desenvolvimento de derivados semelhantes a fármacos, para aplicação terapêutica. A descoberta e otimização de inibidores de moléculas pequenas de alvos epigenéticos é um foco principal da investigação biomédica atual. Abordagens bem-sucedidas até o momento estão limitados à identificação de ligandos para enzimas modificadoras da cromatina40. Talvez o mais estudado são moduladores da desacetilação da cadeia lateral da lisina, para a qual numerosos inibidores farmacêuticos foram clinicamente desenvolvidos. Divulgam-se composições e métodos para desenvolver inibidores potentes e seletivos para leitores epigenéticos, incluindo o primeiro inibidor caracterizado pormenorizadamente da família BET de bromodominios. Em vista desta descoberta, a abordagem descrita no presente documento pode ser utilizada para a identificação de candidatos adicionais para a identificação de inibidores adicionais que possuem selectividade dentro da família BET.

Exemplo de Referência 7: Enantiómeros JQ1 ligam-se e inibem BRD4.1 e BRD4.2

As Figuras 11 e 12 mostram que enantiómeros JQ1 se ligam e inibem BRD4.1 e BRD4.2 A Figura 13 mostra uma comparação da ligação e inibição por JQls de membros da família BET (ativo) e CBP (inativo). A Figura 14 mostra os resultados de estudos de determinação de doses de uma biblioteca orientada de derivados de JQ1 (para as estruturas dos compostos, veja-se o Quadro B, acima).

Exemplo de Referência 8: JQ1 é eficaz para o tratamento de

cancro BRD3-NUT

Ratinhos foram implantados por via subcutânea com células BRD3-NUT. Os dados das medições dos tumores foram recolhidos semanalmente. Quando os tumores se tornaram palpáveis, os ratinhos foram divididos em 2 grupos de tratamento (n=10): JQ1 foi administrado a 50 mg/kg por via intraperitoneal (IP) 7 dias/semana e o veículos foi administrado IP 7 dias/semana. No dia 24 após a injeção, cinco ratinhos de cada grupo foram submetidos a eutanásia e amostras dos tumores foram recolhidas para serem enviadas para análise laboratorial. Ao longo do restante estudo, as amostras dos tumores foram recolhidas à medida que os ratinhos foram sacrificados. Para todas as amostras, uma metade do tumor foi fixada em formalina a 10% e a outra metade foi submetida a congelação rápida em gelo seco. O tratamento terminou no dia 32. Os volumes e pesos tumorais foram recolhidos semanalmente até que todos os ratinhos se tornaram moribundos ou os tumores atingiram 2 cm em qualquer dimensão. A Figura 15A é um gráfico que mostra que JQ1 mostrou eficácia in vivo contra BRD3-NUT num modelo de xenoenxerto murino. O tratamento com JQ1 resultou na regressão tumoral durante a terapêutica. Após cessação da terapêutica, o crescimento tumoral foi retomado. As diferenças de volume tumoral foram significativas em todos os pontos (p=7,65274E-09 no dia 24) JQ1 foi administrado a 50 mg/kg. A Figura 15B mostra que os ratinhos tratados com JQ1 mostraram uma perda de peso ligeira com rápida recuperação após a cessação da terapêutica.

Exemplo 9: JQ1 e análogos do mesmo são eficazes contra uma variedade de cancros

As Figuras 16A-16D mostram que JQ1 e derivados dos mesmos inibem a ligação de Brd4.1 e Brd4.2 com JQ1 a 5 μΜ (para as estruturas dos compostos, veja-se o Quadro A, acima). As Figuras 17A-17D mostram a viabilidade das células de carcinoma da linha média NUT (NMC) após tratamento com JQ1 e derivados do mesmo com composto a 2 μΜ (para as estruturas dos compostos, veja-se o Quadro A, acima). As Figuras 18-55 mostram a viabilidade de dose-resposta para uma variedade de linhas celulares de cancro. Estes dados indicam que JQ1 e derivados do mesmo mostram eficácia anti-cancro contra uma gama de cancros.

Os resultados relatados no presente documento foram obtidos utilizando os seguintes métodos e materiais.

Exemplo 10: Resultados do Ensaio de Ligação

Os resultados de um ensaio de ligação são mostrados no Quadro C.

A atividade de ligação dos compostos principais com o local 1 de BRD4 foi determinada através de um ensaio-Alfa com uma curva de dose-resposta de 12 pontos (Figura 56A). 0 composto (S)-JQ1 (JQS) foi utilizado como um controlo positivo. (R)-JQ1 (JQR) foi utilizado como um controlo negativo. Os compostos JQ6, JQ8, JQ13, JQ33 e JQ35 exibiram excelente atividade de ligação. Os resultados da atividade de ligação de todos os compostos principais com o local 2 de BRD4 foram também determinados através de um ensaio-Alfa com uma curva de dose-resposta de 12 pontos (Figura 56B). Os compostos JQ6, JQ8, JQ13, JQ33 e JQ35 exibiram excelente atividade de ligação. A atividade dos compostos principais foi examinada num ensaio-alfa com a linha celular 797 (derivada a partir de pacientes) para determinar os efeitos de crescimento da inibição de BRD4 nas linhas celulares dependentes de NUT-BRD4. As células foram incubadas com compostos e monitorizadas para a proliferação após 72 horas. 0 ajuste da curva foi calculado através de regressão logística (Figura 56C) . Todos os compostos principais foram examinados em ensaios celulares com a linha celular 10326 que derivou diretamente a partir de um paciente para determinar os efeitos de crescimento da inibição de BRD4 nas linhas celulares dependentes de NUT-BRD4 (Figura 56D) . As células foram incubadas com compostos e monitorizadas para a proliferação após 72 horas. O ajuste da curva foi calculado através de regressão logística.

Reagentes.

Linhas celulares de carcinoma da linha média que expressam BRD4-NUT endógeno, 7971 e PER-4032, foram descritas previamente. As linhas celulares TE10 e TT de carcinoma escamoso humano não NMC foram obtidas a partir dos Dr.es Anil Rustgi (University of Pennsylvania) e Adam Bass (Dana-Farber Cancer Institute). Células U20S foram obtidas a partir do ATCC. Construções de sobreexpressão de mamífero para GFP-BRD4, GFP-NUT e GFP-BRD4-NUT foram descritas anteriormente3. Os meios, tripsina, e antibióticos para cultura de tecidos foram comprados de Mediatech. Os anticorpos e corantes para imunohistoquímica e citometria de fluxo foram obtidos de Dako (Citoqueratina AE1/AE3 anticorpo Cat# N1590), Millipore (TUNEL Cat# S7100), Vector (Ki67 Cat# VP-RM04), Cell Signaling Technologies (NUT Cat# 3625), BD Pharmingen (Anexina V-FITC Cat# 556547) e Invitrogen (iodeto de propidio Cat# P3566) . Ensaio de Ligação de Acetil-Histona.

Foram realizados ensaios conforme descrito previamente8 com modificações mínimas a partir do protocolo do fabricante (PerkinElmer, EUA). Todos os reagentes foram diluídos em HEPES a 50 mM, NaCl a 100 mM, BSA a 0,1%, pH 7,4 suplementado com CHAPS a 0,05% e deixados a equilibrar até à temperatura ambiente antes da adição às placas. Uma diluição de 1:2 de 24 pontos dos ligandos foi preparada ao longo do intervalo de 150-0 μΜ e 4 μΐ transferidos para placas de 384 poços de baixo volume (ProxiPlateTM-384 Plus, PerkinElmer, EUA), seguidos por 4 μΐ de proteína marcada com HIS (BRD4/1, 250 nM, BRD4/2 e CREBBP, 2000 nM). As placas foram seladas e incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos, antes da adição de 4 μΐ de péptido biotinilado em concentração equimolar à proteína [péptido para BRD4(1) e BRD4(2): H4K5acK8acK12acKl6ac, H-

SGRGK(Ac)GGK(Ac)GLGK(Ac)GGAK(Ac)RHRK(Biotina)-OH; péptido para CREBBP: H3K36ac, Biotina-KSAPAT-GGVK(Ac)KPHRYRPGT-OH (Cambridge Research Biochemicals, Reino Unido)]. As placas foram seladas e incubadas durante 30 minutos adicionais, antes da adição de 4 μΐ de esferas dadoras revestidas com estreptavidina (25 pg/ml) e esferas recetoras queladas com níquel (25 pg/ml) sob condições baixa luminosidade. As placas foram seladas com papel metálico para proteger da luz, incubadas à temperatura ambiente ambiente durante 60 minutos e lidas num leitor de placas PHERAstar FS (BMG Labtech, Alemanha) utilizando um conjunto de filtros AlphaScreen de emissão 570/excitação 680. Os valores de CI50 foram calculados no Prism 5 (GraphPad Software, EUA) após normalização contra controlos de DMSO correspondentes e são dados como a concentração final de composto no volume de reação de 20 μΐ. Alinhamento de Sequências.

As sequências de aminoácidos para bromodomínios humanos de comprimento completo foram obtidas a partir de NCBI (BRD2 N.° de Acesso NP_005095, BRD3 N.° de Acesso NP_031397.1, BRD4 N.° de Acesso NP_055114.1, BRD-T N.° de Acesso NP_001717.2) . O alinhamento de sequências múltiplas de bromodomínios individuais foi realizado utilizando ClustalW19.

Recuperação de Fluorescência Após Fotobranqueamento (FRAP).

Os estudos de FRAP foram realizados em células U20S conforme descrito previamente3,20. Brevemente, células U20S foram transfetadas (lipofectamina; Invitrogen) com construções de sobreexpressão de mamífero que codificam quimera GFP com BRD4, NUT e BRD4-NUT. Uma região nuclear de 5 pm2 foi branqueada com intensidade de laser elevada numa célula dentro de cada campo, e medida para a recuperação com intensidade de laser baixa e um orifício de 150 pm. Imagens de campos idênticos foram adquiridas utilizando um microscópio confocal Nikon Cl Plus equipado com uma câmara aquecida a 37 °C e módulos de FRAP ao longo de 90 segundos. As intensidades médias da região branqueada foram medidas ao longo do tempo utilizando MetaMorph v7, e normalizadas para uma região independente de interesse antes do branqueamento. Os dados foram analisados para avaliar o tempo até à metade do valor máximo da recuperação de fluorescência em Microsoft Excel Mac 12.2.4.

Imunohistoquímica de Diferenciação e Proliferação.

Linhas celulares de cancro cultivadas (797, Per403, TT e TE10) foram cultivadas em lâminas de câmara a 1,0 x 104 células por câmara (lâminas de 4 câmaras) ou 5,0 x 103 células por câmara (lâminas de 8 câmaras). As células foram tratadas com JQ1 racémico, (+)-JQl, (-)-JQl, ou veículo (DMSO) e incubadas durante vários intervalos de tempo. Os meios foram então removidos e as câmaras foram lavadas com PBS frio. As células foram depois fixadas em formaldeido a 4% durante 20 minutos a 4 °C, lavadas com PBS e transferidas para o Dana-Farber/Harvard Cancer Center (DF/HCC) Specialized Histopathology Services Core em Brigham e Women's Hospital para coloração, conforme descrito abaixo. Os estudos imunohistoquímicos dos péletes celulares foram realizados primeiro crescendo linhas celulares de cancro (797 e Per403) em balões T-75, tratadas com JQ1 ou veiculo (DMSO) durante 48 horas. As células foram depois tripsinizadas e os péletes celulares foram formados através de centrifugação a 2.000 rpm durante 10 minutos, estabilizadas com 1/2 do volume de HistoGel (Richard-Alien Scientific) e albumina sérica bovina a 10%. Os péletes celulares foram lavados com PBS e fixadas em formaldeido a 4% durante 20 minutos a 4 °C. As células foram depois lavadas com PBS e transferidas para o DF/HCC Core Laboratory em Brigham and Women's Hospital para coloração, conforme descrito abaixo. A análise quantitativa da coloração de Ki67 (pontuação celular) foi realizada por microscopia óptica utilizando cinco campos de visão de alta potência (40x) por experiência. Todo o material fixado foi incorporado, seccionado e corado pelo DF/HCC Core Laboratory em Brigham and Women's Hospital, utilizando protocolos otimizados estabelecidos. As imagens foram obtidas utilizando um microscópio Olympus BX40 (Olympus Imaging America, Center Valley, PA) e uma câmara de cor Micropublisher 3.3 RTV (Qlmaging, Surrey, BC).

Ensaio de Proliferação Celular.

As células foram semeadas em placas de microtitulação brancas de 384 poços (Nunc) a 500 células por poço num volume total de 50 ml de meios. As células 797, TT e TE10 foram cultivadas em DMEM contendo penicilina/estreptomicina a 1% e FBS a 10%. As células Per403 foram cultivadas em DMEM contendo penicilina/estreptomicina a 1% e FBS a 20 %. Os compostos foram distribuídos em placas de ensaio de microtitulação por transferência de pino robótico (PerkinElmer JANUS equipado com uma ferramenta de pino de V&P Scientific 100 nl) . A seguir a uma incubação de 48 h a 37 °C, as células foram lisadas e os poços foram avaliados para o teor total em ATP utilizando um ensaio de proliferação comercial (Cell TiterGlo; Promega). As medições replicadas foram analisadas em relação à dose e estimativas de CI50 foram calculadas através de regressão logística (GraphPad Prism).

Citometria de Fluxo. Células de cancro humano cultivadas (797, Per403, TT e TE10) foram cultivadas em placas de cultura de tecidos de 6 poços (BD Falcon) a uma concentração inicial de 5,0 x 104 células por poço. As células foram tratadas com JQ1 (500 nM) , estaurosporina (50 nM) ou veiculo (DMSO a 0,05%) durante 24 ou 48 horas. Células tripsinizadas foram misturadas a 1:1 em gelo com tampão de Anexina-V/iodeto de propídio (HEPES a 10 mM pH 7,4, NaCl a 140 mM, CaCl2 a 2,5 mM) contendo Anexina V-FITC (BD Pharmigen, 1:500) e iodeto de propídio (Invitrogen, 1:1000).

As amostras foram imediatamente analisadas num BD FACS Canto II. As visualizações e análises de frações apoptóticas foram geradas utilizando software de análise de citometria de fluxo FlowJo (Tree Star, Inc.).

Estudos de Eficácia de Xenoenxerto.

Xenoenxertos de NMC foram estabelecidos através da injeção de células de NMC 797 (107) em Matrigel a 30% (BD

Biosciences) no dorso de ratinhos nus NCr fêmeas de 6 semanas de idade (Charles River Laboratories) . Doze dias após injeção, ratinhos com tumores mensuráveis foram divididos em coortes para serem tratados com JQ1 a 50 mg/kg IP ou veículo (DMSO a 5% em dextrose a 5%). O tamanho médios dos tumores no grupo de tratamento com JQ1 (n = 8) e grupo de veículo (n = 7) foram semelhantes (63,8 +/- 17,1 e 73,6 +/- 14,4 mm3 respetivamente) no início do tratamento. Os animais foram seguidos diariamente para os sintomas clínicos. As medições dos tumores foram avaliadas através de medições de calibre, e o volume calculado utilizando a fórmula Vol = 0,5xLxW2. Após 2 semanas de tratamento, todos os ratinhos foram humanamente submetidos a eutanásia, e os tumores foram fixados em formalina a 10% para exame histopatológico. A significância estatística dos volumes tumorais foi calculada por testes t de Student de duas caudas. Todos os estudos animais foram aprovados pelo IACUC do DFCI. Instrumentação.

Espectros de ressonância magnética nuclear de carbono-13 e protões (RMN 3H e RMN 13C) foram gravados com um espectrómetro INOVA com uma sonda Varian inversa 600 na Harvard Medical School East Quad NMR Facility. Os desvios guímicos são gravados em partes por milhão na escala δ e são referenciados a partir do prótio residual no solvente de RMN (CHC13: δ 7,24) para RMN 3H, as ressonâncias de carbono do solvente (CDCI3: δ 77,2) para RMN 13C NMR respetivamente. Os dados são relatados conforme se segue: desvio químico [multiplicidade (s = singleto, d = dupleto, t = tripleto, q = quarteto, m = multipleto, 1 = largo), constante(s) de acoplamento em hertz, integração]. Os espectros de massa de alta resolução (HRMS) foram registados num espectrómetro Bruker APEX 4,7 Tesler FTMS utilizando uma fonte de iões de eletropulverização (ESI) no Instrumentation Facility of the Department of Chemistry, Massachusetts Institute of

Technology. Os intermediários e produto final foram purificados com um sistema CombiFlash RF (Teledyne Isco). As soluções orgânicas foram concentradas em evaporadores rotativos Buchi R-205. As purezas enantioméricas foram verificadas com Cromatografia Fluida Supercrítica Berger (SFC) e uma coluna AS-H. A purificação preparativa enantiomérica foi realizada com Cromatografia Líquida de Alta Pressão Agilent e uma coluna OD-H (Broad Institute of Harvard e MIT).

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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC.

<120> COMPOSIÇÕES E A SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE NEOPLASIA, DOENÇA INFLAMATÓRIA E OUTROS DISTÚRBIOS <130> 86363WO(70157) <140> PCT/US2011/036701 <141> 16-05-2011 <150> 61/467.376 <151> 24-03-2011 <150> 61/375.863 <151> 22-08-2010 <150> 61/370.745 <151> 04-08-2010 <150> 61/334.991 <151> 14-05-2010 < 16 0 > 6 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1 <211> 801 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1

Met Leu Gin Asn Val Thr Pro His Asn Lys Leu Pro Gly Glu Gly Asn 15 10 15

Ala Gly Leu Leu Gly Leu Gly Pro Glu Ala Ala Ala Pro Gly Lys Arg 20 25 30 lie Arg Lys Pro Ser Leu Leu Tyr Glu Gly Phe Glu Ser Pro Thr Met 35 40 45

Ala Ser Val Pro Ala Leu Gin Leu Thr Pro Ala Asn Pro Pro Pro Pro 50 55 60

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Arg Leu Glu Asn Asn Tyr Tyr Trp Ala Ala Ser Glu Cys Met Gin Asp 130 135 140 phe Asn Thr Met Phe Thr Asn Cys Tyr lie Tyr Asn Lys Pro Thr Asp 145 150 155 160

Asp lie Val Leu Met Ala Gin Thr Leu Glu Lys lie Phe Leu Gin Lys 165 170 175 val Ala Ser Met Pro Gin Glu Glu Gin Glu Leu val Val Thr lie Pro ISO 185 190

Lys Asn Ser His Lys Lys Gly Ala Lys Leu Ala Ala Leu Gin Gly Ser 195 200 205

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Ala Leu Tyr Thr Pro Pro Pro Glu lie Pro Thr Thr Val Leu Asn lie 225 230 235 240 pro His Pro Ser Val lie Ser Ser Pro Leu Leu Lys Ser Leu His Ser 245 250 255

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Leu Ala Lys Lys Lys Gly val Lys Arg Lys Ala Asp Thr Thr Thr Pro 275 280 285

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Ser Leu Glu Pro Lys Ala Ala Arg Leu Pro Pro Met Arg Arg Glu Ser 305 310 315 320

Gly Arg Pro lie Lys Pro Pro Arg Lys Asp Leu Pro Asp Ser Gin Gin 325 330 335

Gin His Gin Ser Ser Lys Lys Gly Lys Leu Ser Glu Gin Leu Lys His 340 345 350

Cys Asn Gly lie Leu Lys Glu Leu Leu Ser Lys Lys His Ala Ala Tyr 355 360 365

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Asp Tyr His Asp lie lie Lys His Pro Met Asp Leu Ser Thr val Lys 385 390 395 400

Arg Lys Met Glu Asn Arg Asp Tyr Arg Asp Ala Gin Glu Phe Ala Ala 405 410 415

Asp Val Arg Leu Met Phe Ser Asn Cys Tyr Lys Tyr Asn Pro Pro Asp 420 425 430

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Arg Tyr Ala Lys Met Pro Asp Glu Pro Leu Glu Pro Gly Pro Leu Pro 450 455 460

Val Ser Thr Ala Met Pro Pro Gly Leu Ala Lys Ser ser ser Glu Ser 465 470 475 480

Ser ser Glu Glu Ser Ser Ser Glu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu 485 490 495

Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ser Glu Ser Ser Asp Ser 500 505 510

Glu Glu Glu Arg Ala His Arg Leu Ala Glu Leu Gin Glu Gin Leu Arg 515 S20 525

Ala Val His Glu Gin Leu Ala Ala Leu Ser Gin Gly Pro lie Ser Lys 530 535 540

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Arg Ala Pro Arg Pro Pro Gin Pro Lys Lys Ser Lys Lys Ala Ser Gly 580 585 590

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Gly Gly Ser Gly Thr Lys Leu Pro Lys Lys Ala Thr Lys Thr Ala Pro 610 615 620 pro Ala Leu Pro Thr Gly Tyr Asp ser Glu Glu Glu Glu Glu ser Arg 625 630 635 640

Pro Met Ser Tyr Asp Glu Lys Arg Gin Leu Ser Leu Asp lie Asn Lys 645 650 655

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Val Ala Val Ser Arg Leu Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser 770 775 780

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ser Asp Ser Asp Ser 785 790 795 800

Gly

<210> 2 <211> 726 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ser Thr Ala Thr Thr Val Ala Pro Ala Gly lie Pro Ala Thr Pro 15 10 15

Gly Pro Val Asn Pro Pro Pro Pro Glu Val Ser Asn Pro Ser Lys Pro 20 25 30

Gly Arg Lys Thr Asn Gin Leu Gin Tyr Met Gin Asn Val Val Val Lys 35 40 45

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Asp ser Ser Asp Ser Glu 725

<210> 3 <211> 722 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met Ser Ala Glu Ser Gly Pro Gly Thr Arg Leu Arg Asn Leu Pro Vai 1 5 10 15

Met Gly Asp Gly Leu Glu Thr Ser Gin Met Ser Thr Thr Gin Ala Gin 20 25 30

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Ser Ser Ser Glu Ser Ser Ser Ser Asp Ser Glu Asp Ser Glu Thr Gly 705 710 715 720

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<210> 4 <211> 947 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

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Gin Gly Ala Ser Val Asn Ser Ser Ser Gin Thr Ala Ala Gin val Thr 195 200 205

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Ala Leu Pro Pro lie Lys Glu Asn Met Pro Lys Asn Val Leu Pro Asp 245 250 255

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Gly Leu His Asn Tyr Tyr Asp Val Val Lys Asn Pro Met Asp Leu Gly 305 310 315 320

Thr lie Lys Glu Lys Met Asp Asn Gin Glu Tyr Lys Asp Ala Tyr Lys 325 330 335

Phe Ala Ala Asp val Arg Leu Met Phe Met Asn Cys Tyr Lys Tyr Asn 340 345 350

Pro Pro Asp His Glu val val Thr Met Ala Arg Met Leu Gin Asp Val 355 360 365

Phe Glu Thr His Phe Ser Lys lie Pro lie Glu Pro Val Glu Ser Met 370 375 380

Pro Leu Cys Tyr lie Lys Thr Asp lie Thr Glu Thr Thr Gly Arg Glu 385 390 395 400

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Val Asn Asn Gin Leu Asn Ser Arg Lys Arg Gin Thr Lys Ser Asp Lys 610 615 620

Thr Gin Pro Ser Lys Ala Val Glu Asn val Ser Arg Leu Ser Glu Ser 625 630 635 640

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Ser Glu Ser Ser Ser Ser Asp 645 650 655

Leu Ser Ser Ser Asp Ser ser Asp ser Glu Ser Glu Met Phe Pro Lys 660 665 670

Phe Thr Glu Val Lys Pro Asn Asp Ser Pro Ser Lys Glu Asn Val Lys 675 680 685

Lys Met Lys Asn Glu Cys lie Leu Pro Glu Gly Arg Thr Gly Val Thr 690 695 700

Gin lie Gly Tyr Cys Val Gin Asp Thr Thr Ser Ala Asn Thr Thr Leu 705 710 715 720

Val His Gin Thr Thr Pro Ser His Val Met Pro Pro Asn His His Gin 725 730 735

Leu Ala Phe Asn Tyr Gin Glu Leu Glu His Leu Gin Thr val Lys Asn 740 745 750 lie Ser Pro Leu Gin lie Leu Pro Pro Ser Gly Asp Ser Glu Gin Leu 755 760 765

Ser Asn Gly lie Thr val Met His Pro Ser Gly Asp Ser Asp Thr Thr 770 775 780

Met Leu Glu Ser Glu Cys Gin Ala Pro Val Gin Lys Asp lie Lys lie 785 790 795 800

Lys Asn Ala Asp ser Trp Lys ser Leu Gly Lys Pro val Lys Pro ser 805 810 815

Gly Val Met Lys Ser Ser Asp Glu Leu Phe Asn Gin Phe Arg Lys Ala 820 825 830

Ala lie Glu Lys Glu Val Lys Ala Arg Thr Gin Glu Leu lie Arg Lys 835 840 845

His Leu Glu Gin Asn Thr Lys Glu Leu Lys Ala Ser Gin Glu Asn Gin 850 855 860

Arg Asp Leu Gly Asn Gly Leu Thr val Glu Ser Phe Ser Asn Lys lie 865 870 875 880

Gin Asn Lys Cys Ser Gly Glu Glu Gin Lys Glu His Gin Gin Ser Ser 885 890 895

Glu Ala Gin Asp Lys Ser Lys Leu Trp Leu Leu Lys Asp Arg Asp Leu 900 905 910

Ala Arg Gin Lys Glu Gin Glu Arg Arg Arg Arg Glu Ala Met val Gly 915 920 925

Thr lie Asp Met Thr Leu Gin ser Asp lie Met Thr Met Phe Glu Asn 930 935 940

Asn Phe Asp 945

<210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <22 0> <221> M0D_RES <222> (5) . . (5) <223> Lys(Ac) <22 0>

<221> MOD_RES <222> (8) . . (8) <223> Lys(Ac) <22 0>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Lys(Ac) <22 0> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Lys(Ac) <22 0>

<221> MOD_RES <222> (20)..(20)

<223> Lys(Biotina)-OH <400> 5

Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 15 10 15

Arg His Arg Lys 20

<210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <22 0> <221> MOD_RES <222> (1) . . (1) <223> Biotina-Lys <22 0> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Lys(Ac) <22 0> <221> MOD_RES <222> (19)..(19)

<223> Thr-OH <400> 6

Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Vai Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg 1 5 10 15

Pro Gly Thr

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • CA 2710740 [0002] • EP 0989131 A [0002] • EP 1297836 A [0002] • US 5712274 A [0002] • US 5978740 A [0248] • US 6183121 A [0248] • US 5223409 A, Ladner [0288] • US 2011036701 W [0388] • US 61467376 B [0388] • US 61375863 B [0388] • US 61370745 B [0388] • US 61334991 B [0388]

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Lisboa, 7 de Abril de 2015

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto representado por uma fórmula estrutural selecionada a partir do grupo que consiste em: e

   ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos anteriores .
2. 2. Um composto da Reivindicação 1, representado pela fórmula estrutural

   ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. 3. Um composto da Reivindicação 1, representado pela fórmula estrutural

   ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
4. 4. Um composto da Reivindicação 2, representado pela fórmula estrutural

   ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. 5. Um composto da Reivindicação 3, representado pela fórmula estrutural

   ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
6. 6. Uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conforme definido em qualquer uma das Reivindicações 1-5 e um excipiente ou portador farmaceuticamente aceitável para o mesmo. Lisboa, 7 de Abril de 2015