MX2012013255A - Composiciones y metodos para tratar neoplasias, enfermedades inflamatorias y otros trastornos. - Google Patents

Abstract

La invención presenta composiciones y métodos para tratar o prevenir una neoplasia. Más concretamente, la invención proporciona composiciones y métodos para alterar la interacción de un polipéptido de la familia BET que comprende un bromodominio con la cromatina (p. ej., alterar la interacción de un bromodominio con una modificación de lisina acetilada presente en una cola N-terminal de la histona).

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA TRATAR NEOPLASIAS, ENFERMEDADES INFLAMATORIAS Y OTROS TRASTORNOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las colas N-terminales de las histonas mantienen la estabilidad de la cromatina y pueden sufrir modificaciones asociadas con la regulación de la transcripción. Las modificaciones de este tipo mejor caracterizadas son la acetilación, metilación y fosforilación. Para cada modificación, existen enzimas que o bien establecen la marca adecuada o bien la eliminan. A continuación, estas modificaciones deben ser interpretadas por el mecanismo de transcripción. El reconocimiento de la lisina acetilada está regulado principalmente por bromodominios , que son habitualmente componentes de los complejos de los factores de transcripción. La familia de bromodominios y dominio extraterminal (BET, por sus siglas en inglés) (p. ej . , BRD2 , BRD3, BRD4 y BRDT) comparte una estructura de dominios común que comprende dos bromodominios N-terminales que exhiben un alto grado de conservación secuencial y un dominio C-terminal más divergente que participa en interacciones proteína-proteína. La regulación anómala de la modificación de histonas puede afectar a la actividad génica y desempeñar un papel en la oncogénesis. La acetilación de la cadena lateral de la lisina es un evento regulador importante de la función Ref . : 237087 de proteínas que no sean histonas, que incluyen, sin carácter limitante, Hsp90, p53, factores de transcripción STAT, cortactina, beta-catenina y alfa-tubulina. De este modo, cabría esperar que la modulación del reconocimiento de la cadena lateral de la lisina ejerciera efectos fenotípicos y terapéuticos importantes en general respecto al desarrollo y a enfermedades . A pesar de la importancia del reconocimiento de la lisina acetilada para la oncogénesis, se han identificado pocos moduladores del reconocimiento de la lisina acetilada.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Según se describe a continuación, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para tratar o prevenir una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis , oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios , el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina. En modalidades particulares, los compuestos de la invención se emplean para superar la resistencia a fármacos en neoplasias (p. ej . , cáncer y enfermedades no malignas) . Otros usos de las composiciones de la invención incluyen, sin carácter limitante, el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia . Más concretamente, la invención proporciona composiciones y métodos para alterar la interacción de un polipéptido de la familia BET que comprende un bromodominio con lisina acetilada y/o cromatina (p. ej . , alterar la interacción de un bromodominio con una modificación de lisina acetilada presente en una cola N-terminal de la histona) e inhibir la oncogénesis. En otra modalidad, la invención previene o trata una enfermedad inflamatoria.

En un aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula I : (I) donde X es N o CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo , heterocicloalquilo , arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialguilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; Rx es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es H, -COO-R3, -CO-R3, -C0-N(R3R4), -S(0)2-R3, -S(0)2-N(R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R2 es H, D, halógeno o alquilo opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-CB) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; - (cicloalquilo C3-C12) , (cicloalquilo C3-Ci2) sustituido, - (cicloalquenilo C3-d2) o - (cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros ; R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R4 y R6 se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que (a) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo o fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y Rx es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -CO-N(R3R), entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino; (b) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -CO-N(R3R4), y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R4 no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; y (c) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -COO-R3, entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, L es H, -COO-R3, -CO-N(R3R4) , -S(0)2-R3f -S(0)2-N(R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3 O arilo opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: H, - (alquilo Ci-C8) , que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; o NH2, N=CR4R6.

En ciertas modalidades, Ri es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -CO-N(R3R4), uno de los grupos R3 y R4 es H, y el otro de los grupos R3 y R4 es (CH2)P-Y, donde p es 1-3 (p. ej . , p es 2) , e Y es un anillo que contiene nitrógeno (el cual puede ser aromático o no aromático) .

En ciertas modalidades, R2 es H, D, halógeno o metilo.

En ciertas modalidades, RB es alquilo, hidroxialquilo, haloalquilo o alcoxi, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt o COOCH2OC(0) CH3.

En ciertas modalidades, el anillo A es un arilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros. En ciertas modalidades, el anillo A es tiofuranilo, fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo o 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolinilo .

En ciertas modalidades, el anillo A es fenilo o tienilo.

En ciertas modalidades, m es 1 o 2 y al menos uno de los grupos RA es metilo.

En ciertas modalidades, cada RA es independientemente H, un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula II: (ID donde X es N o CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; R'i es H, -COO-R3, -CO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) - (alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) / conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; - (cicloalquilo C3-C12) , (cicloalquilo C3-Ci2) sustituido; - (cicloalquenilo C3-Ci2) o - (cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido; cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que si R'X es -COO-R3, X es N, R es fenilo sustituido y RB es metilo, entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R es fenilo o piridilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R es p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl-íenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo o piridinilo.

En ciertas modalidades, R'i es -COO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y R3 es -(alquilo Ci-C8) , que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N, y el cual puede estar opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R' X es -COO-R3, y R3 es metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo o t-butilo; o R'i es H o fenilo opcionalmente sustituido .

En ciertas modalidades, RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COO e, COOEt, COOCH2OC(0)CH3.

En ciertas modalidades, RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt O COOCH2OC(0)CH3.

En ciertas modalidades, cada RA es independientemente un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto. con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo fusionado.

En ciertas modalidades, cada RA es metilo. En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula III: (III) donde X es N o CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3/ cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido,- cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N; - (cicloalquilo C3-Ci2) , (cicloalquilo C3-Ci2) sustituido, - (cicloalquenilo C3-Ci2) o -(cicloalquenilo C3-C12) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R4 y R6 se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que: (a) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo o fenilo sustituido, RB es metilo, entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino; y (b) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R4 no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R es fenilo o piridilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, R es p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl-fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo o piridinilo. En ciertas modalidades, R3 es H, NH2 o N=CR4R6.

En ciertas modalidades, cada R4 es independientemente H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, Re es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, uno de los grupos R3 y R es H, y el otro de los grupos R3 y R4 es (CH2)P-Y, donde p es 1-3 (p. ej . , p es 2) , e Y es un anillo que contiene nitrógeno (el cual puede ser aromático o no aromático) .

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula IV: (IV) donde X es N O CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -C0O-R3, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es H, -COO-R3, -CO-R3, -C0-N(R3R4) , -S(0)2-R3, -S(0)2-N(R3R4) , N(R3R4) , N(R4)C(0)R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R2 es H, D, halógeno o alquilo opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; - (cicloalquilo C3-Ci2) , (cicloalquilo C3-Ci2) sustituido, - (cicloalquenilo C3-Ci2) o -(cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros ; R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R4 y R6 se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0, 1, 2 o 3 ; con la condición de que (a) si el anillo A es tienilo, X es N, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -C0-N(R3R ), entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino ; (b) si el anillo A es tienilo, X es N, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -CO-N(R3R4), y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; y (c) si el anillo A es tienilo, X es N, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -COO-R3, entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es -COO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y R3 es - (alquilo Ci - C8 ) , que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N, y el cual puede estar opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, n es 1 o 2 y L es alquilo o -COO-R3, y R3 es metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo o t-butilo; o n es l o 2 y L es H o fenilo opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -CO-N( R3R4 ) , uno de los grupos R3 y R4 es H, y el otro de los grupos R3 y R4 es (CH2)P-Y, donde p es 1-3 (p. ej . , p es 2) , e Y es un anillo que contiene nitrógeno (el cual puede ser aromático o no aromático) .

En ciertas modalidades, R2 es H o metilo.

En ciertas modalidades, RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, COOCH2OC (O) CH3.

En ciertas modalidades, el anillo A es fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo o 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolinilo .

En ciertas modalidades, cada RA es independientemente un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo.

La invención también proporciona compuestos de Fórmulas V-XXII en la presente y cualquier compuesto descrito en la presente .

En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una neoplasia en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII o cualquier compuesto descrito en la presente.

En ciertas modalidades, el compuesto es un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-IV.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de una célula neoplásica, comprendiendo el método poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, con lo que se reduce el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de la célula neoplásica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para inducir la diferenciación en una célula neoplásica, comprendiendo el método poner en contacto la célula con un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, con lo que se induce la diferenciación en la célula neoplásica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para inducir la muerte celular en una célula neoplásica, comprendiendo el método poner en contacto la célula con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, con lo que se induce la muerte celular en la célula neoplásica.

En ciertas modalidades, los métodos comprenden además seleccionar el compuesto para la unión al bromodominio de la familia BET.

En ciertas modalidades, los métodos comprenden además seleccionar el compuesto para inhibir la unión del bromodominio a la cromatina en un entorno celular.

En ciertas modalidades, los métodos comprenden además seleccionar el compuesto para la especificidad de unión empleando fluorxmetría diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés) , calorimetría isotérmica de titulación y/o un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente (ALPHA-screen) . En ciertas modalidades, el compuesto aumenta la estabilidad térmica del bromodominio en el ensayo.

En ciertas modalidades de los métodos, el miembro de la familia BET es BRD2, BRD3 , BRD4 o BRDT.

En ciertas modalidades de los métodos, la célula está en un sujeto.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar una neoplasia en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, con lo que se previene o trata la neoplasia en el suj eto .

En ciertas modalidades, el sujeto es un mamífero.

En ciertas modalidades, el sujeto es un paciente humano.

En ciertas modalidades, el método reduce el crecimiento o la proliferación de una neoplasia en un sujeto.

En ciertas modalidades, la neoplasia se desencadena por acción de un activador de la transcripción. En ciertas modalidades, el activador de la transcripción es myc.

En ciertas modalidades, el sujeto tiene una neoplasia seleccionada del grupo constituido por linfoma de Burkitt, cáncer pulmonar microcítico, cáncer de mama, cáncer de colon, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia desencadenada por MLL, leucemia linfocítica crónica, carcinoma de la línea media NUT, carcinoma de células escamosas o cualquier otro carcinoma asociado con una reorganización de NUT.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, y un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable para este.

En otro aspecto, la invención proporciona un agente farmacéutico envasado que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, e instrucciones por escrito para la administración del compuesto.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar una neoplasia en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, donde el compuesto altera la unión del bromodominio a la lisina acetilada o desplaza un miembro de la familia BET de la cromatina, con lo que se previene o trata la neoplasia.

En ciertas modalidades, el compuesto inhibe la unión del residuo peptídico Kac de la histona H4 a un miembro de la familia BET.

En ciertas modalidades, el miembro de la familia BET es BRD2, BRD3, BRD4 O BRDT.

En ciertas modalidades, el compuesto se une a un sitio de unión Kac de un bromodominio de la familia BET.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto para el tratamiento de una neoplasia, comprendiendo el método poner en contacto un compuesto de prueba con un miembro de la familia BET que comprende un bromodominio, y detectar la unión específica al bromodominio, con lo que se identifica si el compuesto de prueba es útil para el tratamiento de una neoplasia.

En ciertas modalidades, la especificidad de unión se evalúa empleando fluorimetría diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés) .

En ciertas modalidades, la unión aumenta la estabilidad térmica de el bromodominio.

En ciertas modalidades, la unión se detecta empleando calorimetría isotérmica de titulación.

En ciertas modalidades, la unión se detecta empleando un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente (ALPHA-screen) .

En ciertas modalidades, el compuesto inhibe la unión del residuo peptídico Kac de la histona H4 a el bromodominio .

En ciertas modalidades, el compuesto forma un puente de hidrógeno con una asparagina evolutivamente conservada en el bromodominio.

En ciertas modalidades, el miembro de la familia BET es BRD4 o BRD2 y la asparagina es Asnl40 en BRD4(1) y Asn429 en BRD2 (2) .

En ciertas modalidades, el compuesto se une competitivamente con la cromatina en un entorno celular.

En ciertas modalidades, la unión competitiva con la cromatina se detecta empleando recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP, por sus siglas en inglés) .

En ciertas modalidades, el método se lleva a cabo en una célula neoplásica in vitro.

En ciertas modalidades, el método comprende además detectar una reducción de la proliferación celular, un aumento de la muerte celular o un aumento de la diferenciación celular.

En ciertas modalidades, la muerte celular es una muerte celular por apoptosis.

En ciertas modalidades, la diferenciación celular se identifica detectando un aumento de la expresión de citoqueratina .

En ciertas modalidades, el método comprende además detectar una reducción en la elongación de la transcripción.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una neoplasia en un sujeto, comprendiendo el método administrar a el sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, donde el compuesto es capaz de unirse a un bromodominio de la familia BET y alterar la interacción de los bromodominios con la cromatina, con lo que se previene o trata el cáncer.

En ciertas modalidades, el método induce la diferenciación o muerte celular en una célula neoplásica de el sujeto.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición para el tratamiento o la prevención de una neoplasia, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado del grupo constituido por el compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII, o cualquier compuesto descrito en la presente, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde el compuesto inhibe la unión del residuo peptídico Kac de la histona H4 al bromodominio de la familia BET.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir la inflamación en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII o cualquier compuesto descrito en la presente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-XXII o cualquier compuesto descrito en la presente.

En ciertas modalidades, el sujeto es un mamífero. En ciertas modalidades, el sujeto es un paciente humano.

En ciertas modalidades, el método reduce el nivel de citocinas, la liberación de histaminas o la actividad biológica de una célula inmunosensible.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto para el tratamiento de la inflamación, comprendiendo el método poner en contacto un compuesto de prueba con un miembro de la familia BET que comprende un bromodominio, y detectar la unión específica al bromodominio, con lo que se identifica si el compuesto de prueba es útil para el tratamiento de la inflamación.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones.

Definiciones El término "agente" se refiere a cualquier compuesto químico de bajo peso molecular, anticuerpo, molécula de ácido nucleico o polipéptido, o fragmentos de estos.

La expresión "anillo aromático" o "arilo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un radical anular o a un anillo aromático monocíclico o policíclico que comprende átomos de carbono e hidrógeno. Los ejemplos de grupos arilo adecuados incluyen, sin carácter limitante, fenilo, tolilo, antracenilo, fluorenilo, indenilo, azulenilo y naftilo, así como también restos carbocíclicos benzofusionados tales como 5 , 6 , 7, 8-tetrahidronaftilo. Un grupo arilo puede no estar sustituido u opcionalmente está sustituido con uno o más sustituyentes , p. ej . , sustituyentes como los descritos en la presente para grupos alquilo (que incluyen, sin carácter limitante, alquilo (preferentemente alquilo inferior o alquilo sustituido con uno o más halo), hidroxi, alcoxi (preferentemente alcoxi inferior) , alquiltio, ciano, halo, amino, ácido borónico (-B(OH)2) y nitro). En ciertas modalidades, el grupo arilo es un anillo monocíclico, donde el anillo comprende 6 átomos de carbono.

El término "alquilo" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a un hidrocarburo no cíclico ramificado o de cadena lineal saturado que contiene habitualmente de 1 a 10 átomos de carbono. Los alquilos de cadena lineal saturados representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo y n-decilo; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, fce.rt-butilo, isopentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4 -metilpentilo, 2-metilhexilo, 3 -metilhexilo, 4 -metilhexilo, 5-metilhexilo, 2 , 3 -dimetilbutilo, 2,3-dimetilpentilo, 2, 4-dimetilpentilo, 2, 3-dimetilhexilo, 2,4-dimetilhexilo, 2 , 5-dimetilhexilo, 2 , 2 -dimetilpentilo, 2,2-dimetilhexilo, 3 , 3 -dimetilpentilo, 3 , 3-dimetilhexilo, 4,4- dimetilhexilo, 2-etilpentilo, 3-etilpentilo, 2-etilhexilo, 3-etilhexilo, 4-etilhexilo, 2-metil-2-etilpentilo, 2-metil-3-etilpentilo, 2-metil-4-etilpentilo, 2-metil-2-etilhexilo, 2-metil-3 -etilhexilo, 2-metil-4-etilhexilo, 2 , 2-dietilpentilo, 3, 3-dietilhexilo, 2 , 2-dietilhexilo, 3 , 3 -dietilhexilo y similares. Los grupos alquilo incluidos en los compuestos de esta invención pueden no estar sustituidos o pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes tales como amino, alquilamino, arilamino, heteroarilamino, alcoxi, alquiltio, oxo, halo, acilo, nitro, hidroxilo, ciano, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, ariloxi, heteroariloxi, ariltio, heteroariltio, arilamino, heteroarilamino, carbociclilo, carbocicliloxi, carbocicliltio, carbociclilamino, heterociclilo, heterocicliloxi, heterociclilamino, heterocicliltio y similares. Para los compuestos de esta invención se suelen preferir los alquilos inferiores.

El término "bromodominio" se refiere a una porción de un polipéptido que reconoce residuos de lisina acetilada. En una modalidad, un bromodominio de un polipéptido miembro de la familia BET comprende aproximadamente 110 aminoácidos y comparte un pliegue conservado que comprende un haz con giro a la izquierda de cuatro hélices alfa unidas mediante varias regiones bucle que interaccionan con la cromatina.

La expresión "polipéptido de la familia BET" se refiere a un polipéptido que comprende dos bromodominios y un dominio extraterminal (ET) o un fragmento de este que presenta actividad reguladora de la transcripción o actividad de unión a la lisina acetilada. Los ejemplos de miembros de la familia BET incluyen BRD2 , BRD3 , BRD4 y BRDT.

La expresión "polipéptido BRD2" se refiere a una proteína o fragmento de esta que presenta al menos un 85% de identidad respecto a NP_005095 y que es capaz de unirse a la cromatina o regular la transcripción.

A continuación se indica la secuencia de un polipéptido BRD2 a modo de ejemplo: MLQNVTPHNKLPGEGNAGLLGLGPEAAAPGKRIRKPSLLYEGFESPTMASVPALQL TPA PPPPEVSNPK KPGRVTNQLQYLHKWMKAL KHQFA PFRQPVDAVKLGLPDYHKIIKQPMDMGTI KRRLE NYY AASE CMQDFNTMFTNCYIYNKPTDDIVLMAQTLEKIFLQKVASMPQEEQELWTIPKNSH KGAKLAALQGSVT SAHQVPAVSSVSHTALYTPPPEIPTTVLNIPHPSVISSPLL SLHSAGPPLLAVTA APPAQPLAKKKGVK RKADTTTPTPTAILAPGSPASPPGSLEPKAARLPPMRRESGRPIKPPRKDLPDSQQ QHQSSKKGKLSEQL KHCNGILKELLSKKHAAYAWPFYKPVDASALGLHDYHDIIKHPMDLSTVKRKMENR DYRDAQEFAADVRL MFSNCYKY PPDHDWAMARKLQDVFEFRYAKMPDEPLEPGPLPVSTAMPPGLAKS SSESSSEESSSESS SEEEEEEDEEDEEEEESESSDSEEERAHRLAELQEQLRAVHEQLAALSQGPISKPK RKREKKEKKKKRKA EKHRGRAGADEDDKGPRAPRPPQPKKSKKASGSGGGSAALGPSGFGPSGGSGTKLP KATKTAPPALPTG YDSEEEEESRPMSYDEKRQLSLDINKLPGEKLGRWHIIQAREPSLRDSNPEEIEI DFETLKPSTLRELE RYVLSCLRKKPRKPYTIKKPVGKTKEELALEKKRELEKRLQDVSGQLNSTKKPPKK ANEKTESSSAQQVA VSRLSASSSSSDSSSSSSSSSSSDTSDSDSG La expresión "molécula de ácido nucleico BRD2" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido BRD2 o un fragmento de este .

La expresión "polipéptido BRD3" se refiere a una proteína o fragmento de esta que presenta al menos un 85% de identidad respecto a NP_031397.1 y que es capaz de unirse a la cromatina o regular la transcripción.

A continuación se indica la secuencia de un polipéptido BRD3 a modo de ejemplo: 1 mstattvapa gipatpgpvn ppppevsnps kpgrktnqlq ymqnvwktl wkhqfawpfy 61 qpvdaiklnl pdyhkiiknp mdmgtikkrl ennyywsase cmqdfntmft ncyiynkptd 121 divlmaqale kiflqkvaqm pqeevellpp apkgkgrkpa agaqsagtqq vaavssvspa 181 tpfqsvpptv sqtpviaatp vptitanvts vpvppaaapp ppatpivpw pptppwkkk 241 gvkrkadttt pttsaitasr sesppplsdp kqakwarre sggrpikppk kdledgevpq 301 hagkkgklse hlrycdsilr emlskkhaay awpfykpvda ealelhdyhd iikhpmdlst 361 vkrkmdgrey pdaqgfaadv rlmfsncyky nppdhevvam arklqdvfem rfakmpdepv 421 eapalpapaa pmvskgaess rsseesssds gssdseeera trlaelqeql kavheqlaal 481 sqapvnkpkk kkekkekekk kkdkekekek hkvkaeeekk akvappakqa qqkkapakka 541 nstttagrql kkggkqasas ydseeeeegl pmsydekrql sldinrlpge klgrwhiiq 601 srepslrdsn pdeieidfet lkpttlrele ryvksclqkk qrkpfsasgk kqaakskeel 661 aqekkkelek rlqdvsgqls sskkparkek pgsapsggps rlsssssses gsssssgsss 721 dssdse La expresión "molécula de ácido nucleico BRD3" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido BRD3.

La expresión "polipéptido BRD4" se refiere a una proteína o fragmento de esta que presenta al menos un 85% de identidad respecto a NP_055114 y que es capaz de unirse a la cromatina o regular la transcripción. 1 msaesgpgtr lrnlpvmgdg letsqmsttq aqaqpqpana astnppppet snpnkpkrqt 61 nqlqyllrw lktlwkhqfa wpfqqpvdav klnlpdyyki iktpmdmgti kkrlennyyw 121 naqeciqdfn tmftncyiyn kpgddivlma ealeklflqk inelpteete imivqakgrg 181 rgrketgtak pgvstvpntt qastppqtqt pqpnpppvqa tphpfpavtp dlivqtpvmt 241 vvppqplqtp ppvppqpqpp papapqpvqs hppiiaatpq pvktkkgvkr kadtttptti 301 dpiheppslp pepkttklgq rressrpvkp pkkdvpdsqq hpapeksskv seqlkccsgi 361 lkemfakkha ayawpfykpv dvealglhdy cdiikhpmdm stiksklear eyrdaqefga 421 dvrlmfsncy kynppdhew amarklqdvf emrfakmpde peepvvavss pavppptkvv 481 appsssdsss dsssdsdsst ddseeeraqr laelqeqlka vheqlaalsq pqqnkpkkke 541 kdkkekkkek hkrkeeveen kkskakeppp kktkknnssn snvskkepap mkskppptye 601 seeedkckpm syeekrqlsl dinklpgekl grvvhiiqsr epslknsnpd eieidfetlk 661 pstlrelery vtsclrkkrk pqaekvdvia gsskrakgfss sesesssess ssdsedsetg 721 pa La expresión "molécula de ácido nucleico BRD4" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido BRD .

La expresión "polipéptido BRDT" se refiere a una proteína o fragmento de esta que presenta al menos un 85% de identidad respecto a NP_001717 y que es capaz de unirse a la cromatina o regular la transcripción. 1 mslpsrqtai ivnppppeyi ntkkngrltn qlqylqkvvl kdlwkhsfsw pfqrpvdavk 61 lqlpdyytii knpmdlntik krlenkyyak aseciedfnt mfsncylynk pgddivlmaq 121 aleklfmqkl sqmpqeeqvv gvkerikkgt qqniavssak eksspsatek vfkqqeipsv 181 fpktsispln vvqgasvnss sqtaaqvtkg vkrkadtttp atsavkasse fsptfteksv 241 alppikenmp knvlpdsqqq ynvvktvkvt eqlrhcseil kemlakkhfs yawpfynpvd 301 vnalglhnyy dvvknpmdlg tikekmdnqe ykdaykfaad vrlmfmncyk ynppdhewt 361 marmlqdvfe thfskipiep vesmplcyik tditettgre ntneassegn ssddsederv 421 krlaklqeql kavhqqlqvl sqvpfrklnk kkekskkekk kekvnnsnen prkmceqmrl 481 kekskrnqpk krkqqfiglk sedednakpm nydekrqlsl ninklpgdkl grwhiiqsr 541 epslsnsnpd eieidfetlk astlreleky vsaclrkrpl kppakkimms keelhsqkkq 601 elekrlldvn nqlnsrkrqt ksdktqpska venvsrlses sssssssses essssdlsss 661 dssdsesemf pkftevkpnd spskenvkkm knecilpegr tgvtqigycv qdttsanttl 721 vhqttpshvm ppnhhqlafn yqelehlqtv knisplqilp psgdseqlsn gitvmhpsgd 781 sdttmlesec qapvqkdiki knadswkslg kpvkpsgvmk ssdelfnqfr kaaiekevka 841 rtqelirkhl eqntkelkas qenqrdlgng ltvesfsnki qnkcsgeeqk ehqqsseaqd 901 ksklwllkdr dlarqkeqer rrreamvgti dmtlqsdimt mfennfd La expresión "molécula de ácido nucleico BRDT" se refieré a un polinucleótido que codifica un polipéptido BRDT.

El término "mejorar" se refiere a reducir, suprimir, atenuar, disminuir, detener o estabilizar el desarrollo o avance de una enfermedad.

El término "alteración" se refiere a un cambio (aumento o reducción) de los niveles de expresión o la actividad de un gen o polipéptido que se detecta mediante métodos estándar conocidos en la técnica tales como los que se describen en la presente. Una alteración, tal como se describe en la presente, incluye un cambio de un 10% de los niveles de expresión, preferentemente un cambio de un 25%, más preferentemente un cambio de un 40% y, de la forma más preferida, un cambio de un 50% o superior de los niveles de expresión.

El término "análogo" se refiere a una molécula que no es idéntica, pero que tiene características estructurales o funcionales análogas. Por ejemplo, un análogo de un polipéptido conserva al menos parte de la actividad biológica de un polipéptido correspondiente de origen natural, a la vez que presenta ciertas modificaciones bioquímicas que potencian la función del análogo con relación al polipéptido de origen natural. Estas modificaciones bioquímicas podrían aumentar la resistencia a proteasas, la permeabilidad de membrana o la semivida del análogo, sin alterar, por ejemplo, la unión del ligando. Un análogo puede incluir un aminoácido no natural.

El término "compuesto" se refiere a cualquier compuesto químico de bajo peso molecular, anticuerpo, molécula de ácido nucleico o polipéptido, o fragmentos de estos.

El término "diastereómeros" se refiere a estereoisómeros con dos o más centros de asimetría y cuyas moléculas no son imágenes especulares una de otra.

El término "enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles una de otra. Una mezcla equimolar de dos enantiómeros se denomina "mezcla racémica" o "racemato" .

El término "halógeno" se refiere a -F, -Cl, -Br o -I.

El término "haloalquilo" pretende incluir grupos alquilo, según se han definido previamente, que están mono-, di- o polisustituidos con halógeno, p. ej . , fluorometilo y trifluorometilo .

El término "hidroxilo" se refiere a -OH.

El término "heteroátomo" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a un átomo de cualquier elemento que no sea carbono ni hidrógeno. Los heteroátomos preferidos son nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema anular aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros o tricíclico de 11-14 miembros que contiene 1-4 heteroátomos en el anillo si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico o 1-9 heteroátomos si es tricíclico, donde los heteroátomos se seleccionan entre O, N o S y el resto de átomos de los anillos son carbono. Los grupos heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes como para los grupos arilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin carácter limitante, piridilo, furanilo, benzodioxolilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, imidazolilo tiazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, triazolilo, tiadiazolilo, isoquinolinilo, indazolilo, benzoxazolilo, benzofurilo, indolizinilo, imidazopiridilo, tetrazolilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzoxadiazolilo e indolilo.

El término "heterocíclico" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos orgánicos que contienen al menos un átomo que no sea carbono (p. ej . , S, O, N) en una estructura anular. La estructura anular en estos compuestos orgánicos puede ser aromática o no aromática. Algunos ejemplos de restos heterocíclicos incluyen, sin carácter limitante, piridina, pirimidina, pirrolidina, furano, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno y dioxano.

El término "isómeros" o "estereoisómeros" se refiere a compuestos que presentan una constitución química idéntica, pero difieren con relación a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.

La expresión "derivados isotópicos" incluye derivados de compuestos en los que uno o más átomos de los compuestos se reemplazan por los isótopos correspondientes de los átomos. Por ejemplo, un derivado isotópico de un compuesto que contiene un átomo de carbono (C12) sería aquel en el que el átomo de carbono del compuesto se reemplazara por el isótopo de C13.

El término "neoplásico/a" se refiere a aquellas células que poseen la capacidad de crecimiento autónomo, es decir, una afección o estado anómalo que se caracteriza por un crecimiento celular que prolifera rápidamente. El estado de una enfermedad neoplásica se puede clasificar como patológico, es decir, que caracteriza o constituye un estado de enfermedad, o se puede clasificar como no patológico, es decir, una desviación de lo normal pero que no se asocia con un estado de enfermedad. Se pretende que el término incluya todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastáticos o células, tejidos u órganos transformados de forma maligna, independientemente del tipo histopatológico o el estado de invasión. Las células "hiperproliferativas patológicas" aparecen en estados de enfermedades caracterizados por el crecimiento de tumores malignos. Los ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen la proliferación de células asociada con la curación de heridas.

Los neoplasmas a modo ilustrativo aptos para el tratamiento con un compuesto de la invención incluyen, sin carácter limitante, 3 leucemias (p. ej . , leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia de linaje mixto, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica) , mieloma múltiple, policitemia vera, linfoma cutáneo de células T (LCCT) , linfoma (enfermedad de Hodgkin, enfermdedad no hodgkiniana) , macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas y tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (p. ej . , fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríporas, carcinoma de las glándulas cebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma pulmonar no microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, tumor neuroendocrino, oligodenroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma) .

En una modalidad, la neoplasia se desencadena por acción de un activador de la transcripción dominante tal como myc. Estos tipos de cáncer incluyen, sin carácter limitante, linfoma de Burkitt, cáncer pulmonar microcítico, cáncer de mama, cáncer de colon, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemias desencadenadas por MLL, leucemias linfocíticas crónicas, carcinoma de células escamosas que implica una reorganización de NUT, así como también otros tipos de cáncer que implican proteínas que contienen bromodominios o reorganizaciones de NUT.

La expresión "inhibición del crecimiento" del neoplasma incluye la lentificación, interrupción, detención o parada de su crecimiento y metástasis y no indica necesariamente una eliminación total del crecimiento neoplásico .

La expresión "modelización computacional" se refiere a la aplicación de un programa computacional para determinar uno o más de los siguientes parámetros: la ubicación y proximidad de la unión de un ligando a un resto de unión, el espacio ocupado de un ligando enlazado, la cantidad de superficie de contacto .complementaria entre un resto de unión y un ligando, la energía de deformación de la unión de un ligando dado a un resto de unión y cierta estimación de la fuerza de los puentes de hidrógeno y la energía de las interacciones de van der Waals, interacciones hidrófobas y/o interacciones electrostáticas entre el ligando y el resto de unión. La modelización computacional también puede proporcionar comparaciones entre las características de un sistema modelo y un compuesto candidato. Por ejemplo, un experimento de modelización computacional puede comparar un modelo farmacoforo de la invención con un compuesto candidato para evaluar el ajuste del compuesto candidato al modelo.

La expresión "sistema computacional" se refiere al medio de hardware, medio de software y medio de almacenamiento de datos empleados para analizar los datos de las coordinadas atómicas. El medio de hardware mínimo de los sistemas basados en computadoras de la presente invención comprende una unidad de procesamiento central (CPU) , un medio de entrada, un medio de salida y un medio de almacenamiento de datos . De forma deseable, se proporciona un monitor para visualizar los datos de las estructuras . El medio de almacenamiento de datos puede ser RAM o un medio para acceder al soporte informático de la invención. Los ejemplos de estos sistemas son las microcomputadoras comercializadas por Silicon Graphics Incorporated y Sun Microsystems que utilizan sistemas operativos basados en Unix, Windows NT o IBM OS/2.

La expresión "soporte informático" se refiere a cualquier soporte que se puede leer o al que se puede acceder directamente con una computadora, p. ej . , de manera tal que el soporte sea adecuado para emplear en el sistema computacional mencionado previamente. Los soportes incluyen, sin carácter limitante: soportes de almacenamiento magnético tales como disquetes, medios de almacenamiento de disco duro y cinta magnética; soportes de almacenamiento óptico tales como discos ópticos o CD-ROM; soportes de almacenamiento eléctrico tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como soportes de almacenamiento magnético/óptico .

En esta descripción, las expresiones "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que posee" y similares pueden tener el significado atribuido por la ley de patentes de EE. UU. y pueden referirse a "incluye", "que incluye" y similares; de modo similar, la expresión "que consiste esencialmente en" o "constituido esencialmente por" tiene el significado atribuido por la ley de patentes de EE. UU. y la expresión es abierta, con lo que permite la presencia de más de lo que ha sido citado, siempre que las características básicas y novedosas de lo que ha sido citado no se vean modificadas por la presencia de más de lo que ha sido citado, pero excluye modalidades de la técnica anterior.

El término "detectar" se refiere a identificar la presencia, ausencia o cantidad del analito que se ha de detectar.

La expresión "trazador detectable" se refiere a una composición que, cuando se une a una molécula de interés, hace que esta última sea detectable mediante métodos espectroscópicos , fotoquímicos , bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los trazadores útiles incluyen isótopos radioactivos, microesferas magnéticas, microesferas metálicas, partículas coloidales, tintes fluorescentes, reactivos de elevada densidad electrónica, enzimas (por ejemplo, como las utilizadas habitualmente en un ELISA) , biotina, digoxigenina o haptenos.

El término "enfermedad" se refiere a cualquier afección o trastorno que daña o interfiere con el funcionamiento normal de una célula, tejido u órgano. Los ejemplos de enfermedades que podrían tratarse con los compuestos enumerados en la presente incluyen una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis , oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios , el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina. Otros usos de las composiciones de la invención incluyen, sin carácter limitante, el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia .

La expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un agente necesaria para mejorar los síntomas de una enfermedad en comparación con un paciente no tratado. La cantidad eficaz del o los compuestos activos empleada para poner en práctica la presente invención para el tratamiento terapéutico de una enfermedad varía dependiendo del modo de administración, la edad, el peso corporal y el estado de salud general del sujeto. En última instancia, el médico o veterinario responsable determinará la cantidad adecuada y la pauta posológica. Esta cantidad se denomina cantidad "eficaz" .

El término "enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles una de otra. Una mezcla equimolar de dos enantiómeros se denomina "mezcla racémica" o "racemato".

El término "halógeno" se refiere a -F, -Cl, -Br o - I.

El término "haloalquilo" pretende incluir grupos alquilo, según se han definido previamente, que están mono-, di- o polisustituidos con halógeno, p. ej . , fluorometilo y trifluorometilo .

El término "hidroxilo" se refiere a -OH.

El término "heteroátomo" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a un átomo de cualquier elemento que no sea carbono ni hidrógeno. Los heteroátomos preferidos son nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema anular aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8- 12 miembros o tricíclico de 11-14 miembros que contiene 1-4 heteroátomos en el anillo si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico o 1-9 heteroátomos si es tricíclico, donde los heteroátomos se seleccionan entre 0, N o S y el resto de átomos de los anillos son carbono. Los grupos heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes , p. ej . , los sustituyentes que se han descrito en la presente para los grupos arilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin carácter limitante, piridilo, furanilo, benzodioxolilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, triazolilo, tiadiazolilo, isoquinolinilo, indazolilo, benzoxazolilo, benzofurilo, indolizinilo, imidazopiridilo, tetrazolilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzoxadiazolilo e indolilo.

El término "heterocíclico" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos orgánicos que contienen al menos un átomo que no sea carbono (p. ej . , S, O, N) en una estructura anular. La estructura anular en estos compuestos orgánicos puede ser aromática o, en algunas modalidades, no aromática. Algunos ejemplos de restos heterocíclicos incluyen, sin carácter limitante, piridina, pirimidina, pirrolidina, furano, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno y dioxano .

El término "isómeros" o "estereoisómeros" se refiere a compuestos que presentan una constitución química idéntica, pero difieren con relación a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.

La expresión "derivados isotópicos" incluye derivados de compuestos en los que uno o más átomos de los compuestos se reemplazan por los isótopos correspondientes de los átomos. Por ejemplo, un derivado isotópico de un compuesto que contiene un átomo de carbono (C12) sería aquel en el que el átomo de carbono del compuesto se reemplazara por el isótopo de C13.

La invención proporciona una serie de dianas que son útiles para el desarrollo de fármacos altamente específicos para tratar un trastorno, las cuales se caracterizan mediante los métodos definidos en la presente. Además, los métodos de la invención proporcionan un medio sencillo para identificar terapias que sean seguras para emplear en sujetos. Además, los métodos de la invención proporcionan una vía para analizar virtualmente los efectos de un número cualquiera de compuestos sobre una enfermedad descrita en la presente con una capacidad de procesamiento ' de gran volumen, elevada sensibilidad y baja complejidad.

El término "ajustar" se refiere a determinar por medios automáticos o semiautomáticos las interacciones entre uno o más átomos de una molécula agente y uno o más átomos o sitios de unión de un miembro de la familia BET (p. ej . , un bromodominio de BRD2, BRD3 , BRD4 y BRDT) , y determinar en qué medida las interacciones son estables . En la presente se describen con más detalle varios métodos basados en computadoras para realizar ajustes.

El término "fragmento" se refiere a una porción de un polipéptido o de una molécula de ácido nucleico. Esta porción contiene, preferentemente, al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la longitud total del polipéptido o la molécula de ácido nucleico de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos o aminoácidos .

El término "hibridación" se refiere a puentes de hidrógeno, los cuales pueden ser puentes de hidrógeno de tipo atson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido, entre nucleobases complementarias. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se aparen mediante la formación de puentes de hidrógeno.

La expresión "polinucleótido aislado" se refiere a un ácido nucleico (p. ej . , un ADN) que está exento de genes que, en el genoma de origen natural del organismo del cual procede la molécula de ácido nucleico de la invención, flanquean el gen. Por consiguiente, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un virus o plásmido que se replica de forma autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADNc o genómico producido por PCR o digestión con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias. Además, el término incluye una molécula de ARN que se transcribe a partir de una molécula de ADN, así como también un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional.

La expresión "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido de la invención que se ha separado de los componentes que lo acompañan de forma natural. Habitualmente, el polipéptido está aislado cuando está exento en al menos un 60%, en peso, de las proteínas y moléculas orgánicas de origen natural con las que está asociado de forma natural. Preferentemente, el preparado tiene al menos un 75%, más preferentemente al menos un 90% y, de la forma más preferida, al menos un 99% en peso de un polipéptido de la invención. Un polipéptido aislado de la invención se puede obtener, por ejemplo, por extracción a partir de una fuente natural, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifique el polipéptido, o sintetizando la proteína químicamente. La pureza se puede evaluar mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o mediante análisis de HPLC.

El término "marcador" se refiere a cualquier proteína o polinucleótido que presenta una alteración del nivel de expresión o la actividad que se asocia con una enfermedad o trastorno .

El término "obtener", tal como se utiliza en la presente, como en "obtener un agente", incluye sintetizar, comprar o adquirir el agente.

El término "neoplásico/a" se refiere a aquellas células que poseen la capacidad de crecimiento autónomo, es decir, una afección o estado anómalo que se caracteriza por un crecimiento celular que prolifera rápidamente. El estado de una enfermedad neoplásica se puede clasificar como patológico, es decir, que caracteriza o constituye un estado de enfermedad, o se puede clasificar como no patológico, es decir, una desviación de lo normal pero que no se asocia con un estado de enfermedad. Se pretende que el término incluya todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastáticos o células, tejidos u órganos transformados de forma maligna, independientemente del tipo histopatológico o el estado de invasión. Las células "hiperproliferativas patológicas" aparecen en estados de enfermedades caracterizados por el crecimiento de tumores malignos. Los ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen la proliferación de células asociada con la curación de heridas.

La expresión "inhibición del crecimiento" del neoplasma incluye la lentificación, interrupción, detención o parada de su crecimiento y metástasis y no indica necesariamente una eliminación total del crecimiento neopl sico .

El significado médico común del término "neoplasia" se refiere al "crecimiento de células nuevas" que da como resultado una pérdida de la capacidad de respuesta frente a controles normales del crecimiento, p. ej . , el crecimiento de células neoplásicas. Una "hiperplasia" se refiere a células que experimentan una tasa de crecimiento anormalmente elevada. Sin embargo, tal como se utiliza en la presente, el término neoplasia se refiere en general a células que experimentan tasas anormales de crecimiento celular. Las neoplasias incluyen "tumores", los cuales pueden ser benignos, premalignos o malignos.

El término "obtener", como en "obtener un compuesto", pretende incluir comprar, sintetizar o adquirir el compuesto.

La expresión "isómeros ópticos", tal como se utiliza en la presente, incluye moléculas, también denominadas moléculas quirales, que son imágenes especulares exactas no superponibles una de otra.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", tal como se utilizan en la presente, se refieren a modos de administración que no sean la administración enteral ni tópica, normalmente por inyección, e incluyen, sin carácter limitante, la infusión e inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardíaca, intradermal, intraperitoneal , transtraqueal, subcutánea, subcuticula , intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal .

Los términos "policiclilo" o "radical policíclico" se refieren al radical de dos o más anillos cíclicos (p. ej . , cicloalquilos , cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclilos) en el que dos o más carbonos son comunes en dos anillos adjuntos, p. ej . , los anillos son "anillos fusionados" . Los anillos que están unidos mediante átomos no adyacentes se denominan anillos "que actúan como puente". Cada uno de los anillos del policiclo puede estar sustituido con sustituyentes tales como los descritos previamente, como por ejemplo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi , ariloxicarboniloxi , carboxilato, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino) , acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo y ureído) , amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, sulfonato, sulfamollo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático .

El término "polimorfo" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a formas cristalinas sólidas de un compuesto de la presente invención o sus complejos. Los diferentes polimorfos del mismo compuesto pueden exhibir propiedades físicas, químicas y/o espectroscópicas diferentes. Las diferentes propiedades físicas incluyen, sin carácter limitante, estabilidad (p. ej . , frente al calentamiento o la luz) , compresibilidad y densidad (factores importantes para la formulación y la elaboración del producto) y tasas de disolución (las cuales pueden afectar a la biodisponibilidad) . Las diferencias de estabilidad pueden dar como resultado cambios en la reactividad química (p. ej . , una oxidación diferente, tal como que una forma farmacéutica se decolore más rápidamente cuando comprende un polimorfo que cuando comprende otro polimorfo) o unas características mecánicas diferentes (p. ej . , que los comprimidos se desmenucen durante el almacenamiento a medida que un polimorfo favorecido cinéticamente se convierte en el polimorfo más estable termodinámicamente) o ambas (p. ej . , que los comprimidos de un polimorfo sean más propensos a descomponerse cuando la humedad es elevada) . Las diferentes propiedades físicas de los polimorfos pueden afectar a su procesamiento .

El término "profármaco" incluye compuestos con restos que se pueden metabolizar in vivo. En general, los profármacos son metabolizados in vivo por esterasas o mediante otros mecanismos para obtener fármacos activos. Los ejemplos de profármacos y sus usos son bien conocidos en la técnica (remítase, p. ej . , a Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts" , J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los profármacos se pueden preparar in situ durante la purificación y aislamiento final de los compuestos, o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de ácido libre o hidroxilo con un agente esterificante adecuado. Los grupos hidroxilo se pueden convertir en ésteres mediante el tratamiento con un ácido carboxilico. Los ejemplos de restos de profármacos incluyen restos de tipo éster de alquilo inferior sustituido y no sustituido, ramificado o no ramificado (p. ej . , ésteres de ácido propiónico) , ésteres de alquenilo inferior, ésteres de di (alquilo inferior) aminoalquilo (p. ej . , éster de dimetilaminoetilo) , ésteres de acilamino (alquilo inferior) (p. ej . , éster de acetiloximetilo) , ésteres de aciloxi (alquilo inferior) (p. ej . , éster de pivaloiloximetilo) , ásteres de arilo (p. ej . , áster de fenilo) , ásteres de aril (alquilo inferior) (p. ej . , áster de bencilo) , ásteres de arilo y aril (alquilo inferior) sustituidos (p. ej . , con sustituyentes de tipo metilo, halo o metoxi) , amidas, amidas de alquilo inferior, amidas de di (alquilo inferior) e hidroxiamidas . Los restos de profármacos preferidos son los ásteres de ácido propiónico y los ásteres de acilo. También se incluyen los profármacos que se convierten en las formas activas mediante otros mecanismos in vivo.

Además, la indicación de la estereoquímica a través de un doble enlace carbono-carbono también es opuesta a la del campo químico general, en cuanto a que "Z" se refiere a lo que se suele denominar conformación "cis" (misma cara), mientras que "E" se refiere a lo que se suele denominar conformación " rans" (cara opuesta). Los compuestos de la presente invención engloban ambas configuraciones, cis/ trans y/o Z/E.

Con relación a la nomenclatura de un centro quiral, los términos de configuración "D" y "L" son como los definen las Recomendaciones de la IUPAC. En cuanto al uso de los términos diastereómero, racemato, epímero y enantiómero, estos se emplearán en su contexto normal para describir la estereoquímica de las preparaciones.

El término "reduce" se refiere a una alteración negativa de al menos un 10%, 25%, 50%, 75% o 100%.

El término "referencia" se refiere a una condición estándar o de control.

Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida empleada como base para la comparación de secuencias . Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia especificada o toda ella, por ejemplo, un segmento de la longitud completa de una secuencia génica o de ADNc, o la secuencia génica completa o ADNc completo. Para los polipéptidos , la longitud de la secuencia polipeptídica de referencia será generalmente de al menos aproximadamente 16 aminoácidos, preferentemente de al menos aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente de al menos aproximadamente 25 aminoácidos e incluso más preferentemente de aproximadamente 35 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia será generalmente de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, preferentemente de al menos aproximadamente 60 nucleótidos, más preferentemente de al menos aproximadamente 75 nucleótidos e incluso más preferentemente de aproximadamente 100 nucleótidos o aproximadamente 300 nucleótidos, o cualquier número entero similar a estos o comprendido entre estos .

La expresión "se une específicamente" se refiere a un compuesto o anticuerpo que reconoce y se une a un polipéptido de la invención, pero que no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, la cual incluye naturalmente un polipéptido de la invención.

Las moléculas de ácido nucleico útiles en los métodos de la invención incluyen cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de la invención o un fragmento de este. Estas moléculas de ácido nucleico no tienen que ser necesariamente 100% idénticas respecto a una secuencia endógena de ácido nucleico, pero habitualmente exhibirán una identidad sustancial. Los polinucleótidos que presentan una "identidad sustancial" respecto a una secuencia endógena suelen ser capaces de hibridarse con al menos una hebra de una molécula de ácido nucleico bicatenaria. Las moléculas de ácido nucleico útiles en los métodos de la invención incluyen cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de la invención o un fragmento de este. Estas moléculas de ácido nucleico no tienen que ser necesariamente 100% idénticas respecto a una secuencia endógena de ácido nucleico, pero habitualmente exhibirán una identidad sustancial. Los polinucleótidos que presentan una "identidad sustancial" respecto a una secuencia endógena suelen ser capaces de hibridarse con al menos una hebra de una molécula de ácido nucleico bicatenaria. El término "hibridar" se refiere al apareamiento para formar una molécula bicatenaria entre secuencias de polinucleótidos complementarias (p. ej . , un gen descrito en la presente) o porciones de estas, en varias condiciones de rigurosidad (remítase, p. ej . , a ahl, G. M. y S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R . (1987) Methods Enzymol. 152:507).

Por ejemplo, una concentración salina rigurosa será normalmente inferior a aproximadamente 750 mM para NaCl y 75 mM para citrato de trisodio, preferentemente inferior a aproximadamente 500 mM para NaCl y 50 mM para citrato de trisodio, y más preferentemente inferior a aproximadamente 250 mM para NaCl y 25 mM para citrato de trisodio. Se puede obtener una hibridación de baja rigurosidad en ausencia de disolvente orgánico, p. ej . , formamida, mientras que se puede obtener una hibridación de alta rigurosidad en presencia de al menos aproximadamente un 35% de formamida y, más preferentemente, de al menos aproximadamente un 50% de formamida. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas de al menos aproximadamente 30 °C, más preferentemente de al menos aproximadamente 37 °C y, de la forma más preferida, de al menos aproximadamente 42 °C. La variación de parámetros adicionales, tales' como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, p. ej . , dodecilsulfato de sodio (SDS) y la inclusión o exclusión de ADN portador, son muy conocidas por los expertos en la técnica. Se consiguen diferentes niveles de rigurosidad combinando estas condiciones diferentes según proceda. En una modalidad preferida, la hibridación tendrá lugar a 30 °C en NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM y un 1% de SDS. En una modalidad más preferida, la hibridación tendrá lugar a 37 °C en NaCl 500 mM, citrato de trisodio 50 mM, un 1% de SDS, un 35% de formamida y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (ADNes) . En una modalidad aún más preferida, la hibridación tendrá lugar a 42 °C en NaCl 250 mM, citrato de trisodio 25 mM, un 1% de SDS, un 50% de formamida y 200 g/ml de ADNes. Las variaciones útiles de estas condiciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

Para la mayoría de aplicaciones, los pasos de lavado tras la hibridación también variarán en cuanto a la rigurosidad. Las condiciones de la rigurosidad del lavado se pueden definir mediante la concentración salina y la temperatura. Del mismo modo que previamente, la rigurosidad del lavado se puede aumentar reduciendo la concentración salina o aumentando la temperatura. Por ejemplo, una concentración salina rigurosa para los pasos de lavado será preferentemente inferior a aproximadamente 30 mM para NaCl y 3 mM para citrato de trisodio, y más preferentemente inferior a aproximadamente 15 mM para NaCl y 1.5 mM para citrato de trisodio. Las condiciones rigurosas de temperatura para los pasos de lavado normalmente incluirán una temperatura de al menos aproximadamente 25 °C, más preferentemente de al menos aproximadamente 42 °C e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente 68 °C. En una modalidad preferida, los pasos de lavado tendrán lugar a 25 °C en NaCl 30 mM, citrato de trisodio 3 mM y un 0.1% de SDS . En una modalidad más preferida, los pasos de lavado tendrán lugar a 42 °C en NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1.5 mM y un 0.1% de SDS. En una modalidad más preferida, los pasos de lavado tendrán lugar a 68 °C en NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1.5 mM y un 0.1% de SDS. Las variaciones adicionales de estas condiciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Las técnicas de hibridación son muy conocidas por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Nati. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocole in Molecular Biology, Wiley Interscience , Nueva York, 2001) ; Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

La expresión "sustancialmente idéntico/a" se refiere a un polipéptido o una molécula de ácido nucleico que presenta al menos un 85% de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente) o una secuencia de ácido nucleico de referencia (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente) . Preferentemente, una secuencia de este tipo presenta al menos un 85%, 90%, 95%, 99% o incluso un 100% de identidad en el nivel de aminoácidos o ácido nucleico respecto a la secuencia empleada para la comparación.

La identidad secuencial se suele evaluar empleando un software de análisis secuencial (por ejemplo, el paquete de software de análisis secuencial del Grupo computacional de genética, Universidad de Wisconsin, Centro de biotecnología, 1710 University Avenue, Madison, Wis . 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP o PILEUP/PRETTYBOX) . Este software identifica secuencias idénticas o similares mediante la asignación de grados de homología a varias sustituciones, deleciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservativas suelen incluir sustituciones en los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En una estrategia a modo de ejemplo para determinar el grado de identidad, se puede emplear un programa BLAST, donde una puntuación de la probabilidad entre e.sup.-3 y e.sup.-100 indica una secuencia muy relacionada.

La expresión "reduce" o "aumenta" se refiere a una alteración negativa o positiva, respectivamente, de al menos aproximadamente un 10%, 25%, 50%, 75% o 100% con relación a una referencia.

La expresión "desviación cuadrática media" se refiere a la raíz cuadrada de la media aritmética de los cuadrados de las desviaciones respecto a la media.

La expresión "reducir la supervivencia celular" se refiere a inhibir la viabilidad de una célula o inducir la muerte celular con relación a una célula de referencia.

El término "referencia" se refiere a una condición estándar o de control.

Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida empleada como , base para la comparación de secuencias . Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia especificada o toda ella, por ejemplo, un segmento de la longitud completa de una secuencia génica o de ADNc, o la secuencia génica completa o ADNc completo. Para los polipéptidos , la longitud de la secuencia polipeptídica de referencia será generalmente de al menos aproximadamente 16 aminoácidos, preferentemente de al menos aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente de al menos aproximadamente 25 aminoácidos e incluso más preferentemente de aproximadamente 35 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia será generalmente de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, preferentemente de al menos aproximadamente 60 nucleótidos, más preferentemente de al menos aproximadamente 75 nucleótidos e incluso más preferentemente de aproximadamente 100 nucleótidos o aproximadamente 300 nucleótidos, o cualquier número entero similar a estos o comprendido entre estos.

El término "sujeto" se refiere a un mamífero, que incluye, sin carácter limitante, un mamífero humano o no humano, tal como un mamífero bovino, equino, canino, ovino o felino .

La expresión "se une específicamente" se refiere a un compuesto o anticuerpo que reconoce y se une a un polipéptido de la invención, pero que no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, la cual incluye naturalmente un polipéptido de la invención.

El término " sulfhidrilo" o "tiol" se refiere a -SH.

El término " tautómeros" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a isómeros de moléculas orgánicas que se interconvierten fácilmente por tautomerización, en la que un átomo de hidrógeno o protón migra en la reacción, en ocasiones acompañado por un intercambio de un enlace sencillo y un doble enlace adyacente .

Los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares, tal como se utilizan en la presente, se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o los síntomas asociados a este. El término "mejorar" se refiere a reducir, suprimir, atenuar, disminuir, detener o estabilizar el desarrollo o avance de una enfermedad. Cabe destacar que tratar un trastorno o afección no implica que el trastorno, la afección o los síntomas asociados a estos se eliminen completamente, aunque tampoco se excluye.

Los términos "prevenir", "que previene", "prevención", "tratamiento profiláctico" y similares, tal como se utilizan en la presente, se refieren a reducir la probabilidad de desarrollar un trastorno o afección en un sujeto, el cual no padece pero corre el riesgo o es propenso a desarrollar un trastorno o afección.

La expresión "una cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto que confiere un efecto terapéutico al sujeto tratado. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, se puede medir con alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de un efecto o siente un efecto) . Una cantidad eficaz de un compuesto que se describe en la presente puede estar comprendida entre aproximadamente 1 mg/Kg y aproximadamente 5000 mg/Kg de peso corporal . Las dosis eficaces también variarán dependiendo de la vía de administración, así como de la posibilidad de emplear conjuntamente otros agentes.

Se sobreentenderá que los intervalos que se proporcionan en la presente son abreviaturas para todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, se sobreentenderá que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo constituido por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50.

Los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares, tal como se utilizan en la presente, se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o los síntomas asociados a este. Cabe destacar que tratar un trastorno o afección no implica que el trastorno, la afección o los síntomas asociados a estos se eliminen completamente, aunque tampoco se excluye.

A menos que se indique específicamente lo contrario o que resulte obvio del contexto, se sobreentenderá que el término "o", tal como se utiliza en la presente, es inclusivo. A menos que se indique específicamente lo contrario o que resulte obvio del contexto, se sobreentenderá que los términos "un/a" y "el/la", tal como se utilizan en la presente, son singular o plural.

A menos que se indique específicamente lo contrario o que resulte obvio del contexto, el término "aproximadamente", tal como se utiliza en la presente, se interpreta como dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. "Aproximadamente" puede interpretarse como dentro de un 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% o 0.01% del valor mencionado. A menos que se indique claramente lo contrario en el contexto, todos los valores numéricos que se proporcionan en la presente están modificados con el término aproximadamente.

La mención de una lista de grupos químicos en cualquier definición de una variable en la presente incluye las definiciones de esa variable como cualquier grupo individual o combinación de grupos enumerados . La mención de una modalidad para una variable o aspecto en la presente incluye esa modalidad como una modalidad individual o combinada con cualesquiera otras modalidades o porciones de estas .

Cualesquiera composiciones o métodos que se proporcionan en la presente se pueden combinar con una o más de cualquiera de las demás composiciones y métodos que se proporcionan en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la estructura de dos estereoisómeros JQ1. El centro estereogénico en C6 se indica con un asterisco (*) .

Las Figuras 2A, 2B y 2C son gráficas que muestran que el enantiómero (-)-JQl no se une de forma competitiva a BRD4-NUT en células. La Figura 2A muestra que la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP) de GFP-BRD4 no se ve afectada por la presencia de (-)-JQl (250 nM, 5 h) en comparación con un control de vehículo. Los datos representan la media + s.d. (n = 5) . La Figura 2B muestra que el GFP-BRD4 expresado presenta una recuperación mejorada en presencia de (+) -JQ1 (250 nM, 5 h) en un estudio comparativo paralelo. Los datos representan la media ± s.d. (n = 5) . La Figura 2C proporciona una comparación cuantitativa de la fracción móvil de GFP-BRD4 observada en estudios de FRAP (Fig. 4A, fig. 2B) . Los datos representan la media + s.d. (n = 5) y se anotan con los valores p obtenidos de una prueba t de dos colas que compara las muestras tratadas con ligando y los controles de vehículo.

Las Figuras 3A-3J muestran que JQ1 se une a BRD4 de forma competitiva con cromatina y diferencia células humanas de carcinoma de la línea media NUT. La Figura 3A muestra la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP) de GFP-BRD4, que presenta una recuperación mejorada en presencia de JQ1. Los núcleos se han coloreado artificialmente de forma proporcional a la intensidad de la fluorescencia. Los círculos blancos indican las regiones de fotoblanqueo. Las Figuras 3B-3D muestran que JQ1 acelera la recuperación de fluorescencia en experimentos de FRAP realizados con GFP-BRD4 transfectado (Figura 3B) y GFP-BRD4-NUT (Figura 3C) , pero no ejerce ningún efecto sobre la recuperación de GFP-NUT nuclear (Figura 3D) . La Figura 3E muestra una comparación cuantitativa del tiempo necesario para obtener la mitad de la recuperación de fluorescencia máxima para estudios de FRAP (Figuras 3B-3D) . Los datos representan la media ± s.d. (n = 5) y se anotan con los valores p obtenidos de una prueba t de dos colas. En la Figura 3F, JQl (500 nM, 48 h) provoca una pérdida de tinción nuclear focal para NUT (anti-NUT; 40x) . La Figura 3G muestra que las células NMC tratadas con JQl (500 nM, 48 h) presentan signos citológicos de diferenciación escamosa (H-E; 40x) . La Figura 3H muestra que JQl (500 nM) produce la diferenciación de células NMC, la cual depende del tiempo y se caracteriza por un aumento destacado de la expresión de citoqueratina (AE1/AE3; 40x) . Las Figuras 3I-3J muestran que JQl atenúa la proliferación rápida de las líneas de células NMC 797 (Figura 31) y Per403 (Figura 3J) in vitro (KÍ67; 40x) .

Las Figuras 4A, 4B y 4C son micrográficas que muestran que JQl induce diferenciación escamosa de forma selectiva en el carcinoma de la línea media NUT. La Figura 4A muestra que las células NMC 797 tratadas con JQl (500 nM) presentan unos signos citológicos de diferenciación escamosa que dependen del tiempo (H-E; 40x y lOOx, según se indica) , que se ejemplifican mediante la aparición del huso celular, aplanamiento y la formación de cromatina abierta'. La Figura 4B muestra que las células NMC Per403 tratadas con JQl (500 nM, 48 h) presentan signos comparables de diferenciación escamosa. La formación del huso celular y la queratinización citosólica se ilustran mediante H-E y tinción de queratina, respectivamente (40x) . La Figura 4C muestra que la linea celular TE10 de carcinoma escamoso distinto de NMC no consigue la diferenciación como respuesta a JQl (500 nM) , lo cual se ilustra mediante H-E y tinción de queratina (AE1/AE3) (40x) .

Las Figuras 4Da-4Db muestran que JQl confiere proliferación celular NMC. La Figura 4Da incluye dos micrográficas que muestran que JQl atenúa la proliferación rápida de lineas celulares NMC Per403 in vitro (Ki67; 40x) . Las imágenes se muestran . exactamente con el mismo aumento. La Figura 4Db es una gráfica que muestra el efecto de JQl sobre la proliferación celular (tinción de Ki67 con resultado positivo; %), que se midió por IHC según se realizó en (4Da) y la Figura 3J. Las células se clasificaron manualmente con resultado positivo para Ki67 (núcleos con tinción oscura) o negativo (núcleos con tinción de color azúl pálido) en cinco campos de alta potencia. Los datos representan la media ± s.d. (n = 5) y se anotan con los valores p obtenidos de una prueba t de dos colas.

Las Figuras 4Ea, 4Eb, 4Ec, 4Ed muestran que la inducción de la diferenciación escamosa en células de carcinoma de la linea media NUT por acción de JQ1 es estereoespecifica y depende del tiempo. La Figura 4Ea incluye seis micrográficas, las cuales muestran que las células NMC 797 tratadas en pla- as Chamber Slide con (-)-JQl (100· nM) presentaron fenotipos citosólicos comparables respecto a los controles tratados con vehículo. (+)-JQl (100 nM, 48 h) provocó diferenciación escamosa, que se puso de manifiesto mediante la aparición del huso celular, aplanamiento y una mayor expresión de queratina. La Figura 4Eb muestra que las células NMC 797 tratadas con enantiómeros JQ1 o vehículo se centrifugaron, fijaron, seccionaron y tiñieron para determinar la expresión de queratina (izquierda; AE1/AE3, 20x) . Se realizó un análisis basado en imágenes de la expresión de la queratina en placas preparadas simultáneamente, empleando enmascaramiento no sesgado y algoritmos de cuantificación capaces de puntuar núcleos según la intensidad de la tinción (derecha; 20x) . La Figura 4Ec muestra que (+)-JQl (250 nM) indujo una expresión rápida de queratina en células NMC 797 tratadas en comparación con (-)-JQ1 (250 nM) y los controles de vehículo, según se determina por análisis inmunohistoquímico cuantitativo. Se presentan los porcentajes de núcleos con resultados positivos por condición de tratamiento. Los datos representan la media ± s.d. (n = 3) y se anotan con los valores p obtenidos de una prueba t de dos colas. En la Figura 4Ed, ( + )-JQl (250 nM) provoca una inducción dependiente del tiempo de tinción de queratina fuerte (3+) para las células NMC 797 tratadas, en comparación con (-)-JQl (250 nM) . Se presentan los porcentajes de núcleos con resultados positivos por condición de tratamiento. Los datos representan la media ± s.d. (n = 3) y se anotan con los valores p obtenidos de una prueba t de dos colas. Las imágenes agrupadas se muestran exactamente con el mismo aumento.

Las Figuras 4Fa-4Fc muestran que las lineas celulares de carcinoma escamoso que no poseen la traslocación BRD4-NUT son menos sensibles al tratamiento con JQ1. Se cultivaron lineas celulares de carcinoma escamoso gastrointestinal (TT y TE10) en presencia de (+)-JQl (250 nM, circuios rojos) o (-)-JQl (250 nM, circuios negros) durante 72 horas. Los efectos mínimos observados sobre la proliferación celular con JQ1 son coherentes con un papel razonable en la progresión del ciclo celular en células mitóticas.7 Los datos se presentan como la media ± s.d. (n = 3) . Los valores de CI5o se calcularon por regresión logística.

Las Figuras 5A-5K muestran que el tratamiento con JQ1 inhibe la proliferación y provoca la diferenciación y muerte celular in vitro e in vivo. La Figura 5A muestra los efectos sobre el crecimiento de la inhibición de BRD4 en líneas celulares dependientes de BRD4-NUT. Las células se incubaron con (+) -JQl (circuios rojos) o (-)-JQl (círculos negros) y se monitorizó la proliferación después de 72 horas. (+) -JQl atenuó únicamente la proliferación de las líneas celulares NMC. Los datos se presentan como la media ± s.d. (n = 3) . Los valores de CI50 se calcularon por regresión logística. La Figura 5B muestra los efectos antiproliferativos progresivos de (+) -JQl sobre las células NMC 797 en función del tiempo, que se presentaron en los días 1, 3, 7 y 10. Los puntos de evaluación son la media ± s.d. (n = 3) . La Figura 5C muestra los resultados de citometría de flujo para el contenido de ADN en células NMC 797. (+) -JQl (250 nM, 48 h) indujo una detención de Gl en comparación con (-)-JQl (250 nM) y el control de vehículo. La Figura 5D muestra los resultados de un análisis por citometría de flujo de células de carcinoma escamoso NMC 797 tratadas con vehículo, JQl o estaurosporina (STA) , según se indica. PI, yoduro de propidio. AV, anexina-V. La Figura 5E muestra los resultados de tomografía PET para xenoinjertos murinos NMC 797. La absorción de FDG en xenoinjertos de miembros traseros se redujo con el tratamiento de 50 mg kg -1 de JQl en comparación con el control de vehículo. La Figura 5F muestra que se reduce el volumen del tumor en ratones con una enfermedad estabilizada (xenoinjertos NMC 797) tratados con 50 mg kg -1 de JQl diariamente en comparación con el control de vehículo. Se observa una respuesta significativa a la terapia empleando una prueba t de dos colas a los 14 días (p = 0.039) . Los datos representan la media + s.d. (n = 7) . La Figura 5G muestra un análisis histopatológico de tumores NMC 797 extirpados de animales tratados con JQ1, el cual revela una inducción de la expresión de queratina (AE1/AE3, 4Qx) y una proliferación deteriorada (Ki67, 40x) , en comparación con los animales tratados con vehículo (la escala de la barra es de .20 µp?) . En las Figuras complementarias 11 y 12 se proporcionan campos ampliados. La Figura 5H muestra que la viabilidad de los xenoinjertos NMC 11060 derivados de pacientes se confirmó mediante tomografía PET. La Figura 51 muestra la respuesta terapéutica de los xenoinjertos NMC 11060 primarios frente a (+)-JQl (50 mg kg "1 diariamente durante cuatro días) , que se determinó mediante tomografía PET. La Figura 5J muestra un análisis histopatológico de tumores NMC 11060 primarios extirpados de animales tratados con (+) -JQ1, el cual revela una inducción de la expresión de queratina (AE1/AE3, 20x; la escala de la barra es de 20 µp?) , en comparación con los animales tratados con vehículo. El análisis cuantitativo de la inducción de queratina se realizó empleando enmascaramiento de imagen (Figura 5J, panel derecho) y análisis de pixeles con respuesta positiva (Figura 5K) . Se observa una respuesta significativa a la terapia empleando una prueba t de dos colas (p = 0.0001). Los datos representan la media ± s.d. de tres campos microscópicos amplios independientes. En las Figuras 9A-9B se proporcionan las imágenes comparativas de los tumores extirpados teñidos y los enmascaramientos cuantitativos.

Las Figuras 5La y 5Lb son gráficas que muestran que los ratones que contienen los xenoinjertos NMC 797 toleran la terapia con JQ1, la cual provoca un efecto antitumoral. La Figura 5La muestra que el tratamiento de ratones que contenían un xenoinjerto NMC 797 con JQ1 (50 mg kg _1 por día) redujo el tamaño del tumor en 14 días de terapia. Los datos representan la media ± s.d. (n = 7). La Figura 5Lb muestra que JQ1 no provocó síntomas adversos ni pérdida de peso. Los datos representan la media ± s.d. (n = 7) .

Las Figuras 5Ma-5Md muestran que la inducción de la diferenciación escamosa en células de carcinoma de la línea media NUT por acción de JQ1 es estereoespecífica y depende del tiempo. La Figura 5Ma son micrográficas que muestran que las células NMC 797 tratadas en placas Chamber Slide con (-)-JQ1 (100 nM) presentan fenotipos citosólicos comparables respecto a los controles tratados con vehículo. (+)-JQl (100 nM, 48 h) provoca diferenciación escamosa, que se pone de manifiesto mediante la aparición del huso celular, aplanamiento y una mayor expresión de queratina. La Figura 5Mb son micrográficas . Las células NMC 797 tratadas con enantiómeros JQ1 o vehículo se centrifugaron, fijaron, seccionaron y tiñieron para determinar la expresión de queratina (izquierda; AE1/AE3, 20x) . Se realizó un análisis basado en imágenes de la expresión de la queratina en placas preparadas simultáneamente, empleando enmascaramiento no sesgado y algoritmos de cuantificación capaces de puntuar núcleos según la intensidad de la tinción (derecha; 20x) . La Figura 5Mc es una gráfica que muestra que ( + )-JQl (250 nM) induce una expresión rápida de queratina en células NMC 797 tratadas en comparación con (-)-JQl (250 nM) y los controles de vehículo, según se determina por análisis inmunohistoquímico cuantitativo. Se presentan los porcentajes de núcleos con resultados positivos por condición de tratamiento. Los datos representan la media ± s.d. (n = 3) y se anotan con los valores p obtenidos de una prueba t de dos colas. La Figura 5Md es una gráfica que muestra que (+)-JQl (250 nM) provoca una inducción dependiente del tiempo- de tinción de queratina fuerte (3+) para las células NMC 797 tratadas, en comparación con (-)-JQ1 (250 nM) . Se presentan los porcentajes de núcleos con resultados positivos por condición de tratamiento. Los datos representan la media ± s.d. (n = 3) y se anotan con los valores p obtenidos de una prueba t de dos colas. Las imágenes agrupadas se muestran exactamente con el mismo aumento .

Las Figuras 6A y 6Ba-6Be proporcionan micrográficas que muestran que JQ1 provoca diferenciación escamosa, detención del crecimiento y apoptosis in vivo, según se determina por IHC. El análisis histopatológico de tumores MC extirpados de animales tratados con JQ1 (panel derecho) revela diferenciación escamosa (H-E, 40x) , debilitamiento de los focos de NUT nucleares (NUT, lOOx) , proliferación deteriorada (Ki67, 40x) , inducción de la expresión de queratina (AE1/AE3, 40x) y respuesta apoptótica (TUNEL, 40x) , todas ellas en comparación con los animales tratados con vehículo (panel izquierdo) .

Las Figuras 7A y 7B muestran que JQ1 induce apoptosis de forma selectiva en NMC entre líneas celulares de carcinoma escamoso humano. La Figura 7A proporciona los resultados del análisis FACS . Las células NMC Per403 tratadas con JQ1 (500 nM, 24 o 48 h) presentan inducción de apoptosis por citometría de flujo, a diferencia de las líneas celulares TE10 y TT de carcinoma escamoso distinto de NMC. PI, yoduro de propidio, AV, anexina V. La Figura 7B muestra la cuantificación y comparación de células con respuesta positiva a anexina V por citometría de flujo, según se llevó a cabo en la Figura 5A y 5B. JQ1 (500 nM) presentó una inducción rápida y dependiente del tiempo de la apoptosis en líneas celulares NMC en comparación con las líneas celulares de carcinoma escamoso distinto de NMC. Los datos representan la media + s.d. (n = 3) y se anotan con los valores p obtenidos de una prueba t de dos colas .

Las Figuras 8A-8C son gráficas que muestran que el tejido de NMC obtenido de pacientes es sensible a los efectos antiproliferativos de (+) -JQ1 in vitro. La Figura 8A muestra los resultados del análisis de células NMC 11060 obtenidas de pacientes. Las células se aislaron de material clínico desechado y se cultivaron en cultivos a corto plazo para estudios in vitro. Se evaluaron los efectos antiproliferativos de la inhibición de BRD4 en células NMC 11060 después de 72 horas de incubación con (+) -JQ1 (círculos rojos) o (-)-JQl (círculos negros). Las células NMC 11060 son sensibles únicamente al enantiómero (+)-JQl. Los datos se presentan como la media ± s.d. (n = 3) . Los valores de CI50 se calcularon por regresión logística. La Figura 8B muestra los efectos antiproliferativos progresivos de (+) -JQ1 sobre las células NMC 11060 obtenidas de pacientes en función del tiempo, que se presentaron en los días 1, 3, 7 y 10. Los puntos de evaluación son la media ± s.d. (n = 3). La Figura 8C muestra los resultados de citometría de flujo para el contenido de ADN en células NMC 11060. (+) -JQ1 (250 nM, 48 h) induce una detención de Gl en comparación con (-)-JQl (250 nM) y el control de vehículo.

Las Figuras 9A y 9B proporcionan la cuantificación de la expresión de queratina fuerte y difusa inducida por jql en tumores de xenoinjertos primarios NMC 11060 obtenidos de pacientes. La Figura 9A muestra una imagen de poco aumento (0.8x) de un xenoinjerto primario NMC 11060 extirpado obtenido de un animal tratado con vehículo, seccionado y teñido para determinar la expresión de queratina (AE1/AE3; izquierda) . La tinción global para la queratina es baja en todo el tumor seccionado. Se realizó un análisis basado en imágenes de la expresión de la queratina empleando enmascaramiento no sesgado y algoritmos de cuantificación capaces de puntuar píxeles individuales según la intensidad de la tinción (derecha) . La Figura 9B muestra una imagen de poco aumento (0.8x) de un xenoinjerto primario NMC 11060 extirpado obtenido de un animal tratado con (+) -JQ1 (50 mg kg "1 diariamente durante cuatro días) , seccionado y teñido para determinar la expresión de queratina (AE1/AE3; izquierda) . Se observa una tinción difusa coherente con un efecto uniforme de inducción de queratina en tumores tratados con JQ1. Se realizó un análisis basado en imágenes de la expresión de la queratina empleando enmascaramiento no sesgado y algoritmos de cuantificación capaces de puntuar píxeles individuales según la intensidad de la tinción (derecha) . La respuesta positiva del píxel se puntúa cuantitativamente y se registra visualmente como azul (0) , amarillo (1+) , naranja (2+) y rojo (3+) . Todas las imágenes agrupadas se muestran exactamente con el mismo aumento.

Las Figuras 10A-10D muestran que JQ1 presenta una biodisponibilidad oral excelente y una exposición farmacocinética adecuada en roedores. Se realizaron estudios farmacocinéticos de (+)-JQl en ratones CD1 tras administración intravenosa (Figura 10A, 10B) y oral (Figura 10B, C) . a, Perfiles de concentración media en plasma frente al tiempo de ( + ) -JQl tras la dosis intravenosa (5 mg kg . Los datos representan la media y s.d. (n = 3) . La Figura 10B muestra los parámetros farmacocinéticos calculados para ( +) -JQl intravenoso, que demuestran una exposición al fármaco excelente [Área bajo la curva (AUC) = 2090 h*ng/mL] y una semivida de aproximadamente una hora (??/2) . La Figura 10C muestra los perfiles de concentración media en plasma frente al tiempo de (+ ) -JQl tras la dosis oral (10 mg kg _1) . Los datos representan la media y s.d. (n = 3) . La Figura 10D muestra los parámetros farmacocinéticos calculados para (+)-JQl oral, que demuestran una biodisponibilidad oral (F = 49%) , concentración máxima en plasma (Cmáx = 1180 ng/mL) y exposición al fármaco (AUC = 2090 h*ng/mL) excelentes. CL, aclaramiento; Vss, volumen en estado estacionario; MRTINF, tiempo de residencia medio extrapolado al infinito; Tm¾x, tiempo necesario para obtener la concentración máxima.

La Figura 11 es una gráfica que muestra los datos de unión de AlphaScreen para los enantiomeros JQl que inhiben BRD4.1.

La Figura 12 es una gráfica que muestra los datos de unión de AlphaScreen para los enantiomeros JQl que inhiben BRD4.2.

La Figura 13 es una gráfica que muestra perfiles de JQl frente a otros miembros de la familia BET (activos) y CBP (inactivos) .

La Figura 14 es una gráfica que muestra estudios de posología para una colección central de derivados de JQl .

Las Figuras 15A y 15B son gráficas. La Figura 15A muestra que JQl redujo el tamaño del tumor en un modelo de xenoinjerto murino de carcinoma de la línea media NUT. La Figura 15B muestra el peso de los ratones tratados con JQl.

Las Figuras 16A-16D son gráficas que muestran la actividad de unión a BRD4(1) y BRD4(2) de JQl y sus derivados .

Las Figuras 17A-17D son gráficas que muestran el efecto de JQl y sus derivados sobre la viabilidad celular del carcinoma de la línea media NUT (NMC, por sus siglas en inglés) .

Las Figuras 18-55 muestran la viabilidad de la respuesta a la dosis para una serie de líneas de células cancerosas tratadas con JQl y sus derivados .

Las Figuras 56A-56D son gráficas que muestran los resultados de los ensayos de unión para los compuestos principales .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención presenta composiciones y métodos que son útiles para el tratamiento o la prevención de una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis, oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios , el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina. Otros usos de las composiciones de la invención incluyen, sin carácter limitante, el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia.

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de un inhibidor de bajo peso molecular potente y que penetra en las células (JQ1) con selectividad bioquímica por la familia BET de bromodominios, y compuestos relacionados capaces de regular la familia de bromodominios, que son una familia de polipéptidos que contienen un bromodominio que reconoce los residuos de lisina acetilada en la cromatina nuclear. La acetilación de la lisina se ha convertido en una modificación de la señalización de gran relevancia para la biología celular y de enfermedades. Durante muchos años, un área activa de la investigación para el descubrimiento de fármacos ha consistido en actuar sobre las enzimas que regulan de forma reversible la acetilación de cadenas laterales. Hasta ahora, los resultados con éxito se han limitado a los "escritores" (acetiltransferasas) y los "borradores" (histona-desacetilasas) de modificaciones covalentes que aparecen en el contexto de la cromatina nuclear. Todavía no se han descrito inhibidores potentes de los módulos de reconocimiento de la lisina acetilada o bromodominios . La caracterización reciente de una estructura cocristalina de alta resolución con BRD4 indicó una complementariedad conformacional excelente con la cavidad de unión de la lisina acetilada. La unión de JQ1 a los bromodominios tándem de BRD4 compite con la lisina acetilada y desplaza BRD4 de la cromatina en células humanas. Se observa una traslocación recurrente de BRD4 en un subtipo definido genéticamente e incurable de carcinoma escamoso humano. La unión competitiva de JQ1 a la oncoproteína de fusión BRD4 da como resultado una diferenciación escamosa inmediata y efectos antiproliferativos específicos en líneas celulares obtenidas de pacientes y en un modelo murino de carcinoma dependiente de BRD4. Estos datos establecen la posibilidad de actuar sobre las interacciones proteína-proteína de "lectores" epigenéticos y presentan un soporte químico versátil para el desarrollo de sondas químicas de forma más general en la familia de bromodominios.

Proteínas que contienen bromodominios La regulación génica está gobernada principalmente por el acoplamiento reversible y no covalente de macromoléculas. La transducción de señales a la ARN-polimerasa requiere complejos proteicos de orden superior, regulados espacialmente por factores de acoplamiento capaces de interpretar los estados de modificación de la cromatina tras la traducción. Los lectores epigenéticos son proteínas estructuralmente diversas, cada una de las cuales posee uno o más módulos efectores conservados evolutivamente, que reconocen modificaciones covalentes de ADN o proteínas de histonas. La e-?-acetilación de residuos de lisina (Kac) en colas de histonas se asocia con una estructura de cromatina abierta y la activación de la transcripción.3 El reconocimiento molecular con especificidad contextual de la lisina acetilada está regulado principalmente por los bromodominios .

Las proteínas que contienen bromodominios son de gran interés biológico, como componentes de complejos de factores de transcripción (TAFl, PCAF, Gcn5 y CBP) y determinantes de la memoria epigenética .4 Existen 41 proteínas humanas que contienen un total de 57 bromodominios diferentes. A pesar de presentar muchas variaciones secuenciales, todos los bromodominios comparten un pliegue conservado que comprende un haz con giro a la izquierda de cuatro hélices alfa (az, o¡A, cxB, °íC) unidas mediante diferentes regiones bucle (bucles ZA y BC) que determinan la especificidad del sustrato. Las estructuras cocristalinas con sustratos peptídicos indicaron que la lisina acetilada es reconocida por una cavidad hidrófoba central y está anclada mediante un puente de hidrógeno a un residuo de asparagina presente en la mayoría de bromodominios .5 La familia de bromodominios y dominio extraterminal (BET) (BRD2 , BRD3, BRD4 y BRDT) comparte una estructura de dominios común que comprende dos bromodominios N-terminales que exhiben un alto grado de conservación secuencial y un dominio de atracción C-terminal más divergente (Figura 1E de la referencia número 6) .

BRD4 Investigaciones recientes han establecido un fundamento contundente para emplear BRD4 como diana en el cáncer. BRD4 actúa propiciando la evolución del ciclo celular y su supresión en líneas de células cancerosas cultivadas provoca la detención de Gl . BRD4 es un regulador importante de la elongación de la transcripción, y actúa atrayendo el complejo del factor positivo de elongación de la transcripción (P-TEFb).7,8 La cinasa-9 dependiente de ciclina, un componente central de P-TEFb, es una diana validada para la leucemia linfocítica crónica,9 y se ha relacionado recientemente con la transcripción dependiente de c-Myc.10 Los bromodominios presentes en BRD4 atraen P-TEFb hacia los cromosomas mitóticos, lo cual da como resultado una mayor expresión de los genes que propician el crecimiento.11 BRD4 permanece unido a los sitios de inicio de la transcripción de los genes expresados durante M/Gl, pero no se ha encontrado presente en los sitios de inicio que se expresan posteriormente en el ciclo celular. Se ha demostrado que la supresión de BRD4 en células proliferantes conlleva la detención de Gl y la apoptosis12 mediante la reducción de los niveles de expresión de genes importantes para la evolución mitótica13 y la supervivencia14.

Lo más importante es que BRD4 ha sido identificado recientemente como un componente de una traslocación cromosómica t(15;19) recurrente en una forma agresiva de carcinoma escamoso humano.15'16 Estas traslocaciones expresan los bromodominios N-terminales tándem de BRD4 como una quimera en fase con la proteína NUT (proteína nuclear de los testículos) , que define genéticamente el denominado carcinoma de la línea media NUT (NMC, por sus siglas en inglés) . Estudios funcionales en líneas de células NMC obtenidas de pacientes han validado el papel esencial de la oncoproteína BRD4-NUT en el mantenimiento de la ventaja de proliferación característica y el bloqueo de la diferenciación de este tumor maligno indefectiblemente fatal17. Cabe destacar que el silenciamiento del ARN de la expresión del gen BRD4-NUT detiene la proliferación y provoca la diferenciación escamosa con un aumento destacado de la expresión de citoqueratina . Estas observaciones destacan la amplia utilidad y el inmediato potencial terapéutico de un inhibidor que actúe directamente sobre las proteínas de bromodominios humanos.

La invención presenta composiciones y métodos que son útiles para inhibir las proteínas de bromodominios humanos.

Compuestos de la invención La invención proporciona compuestos (p. ej . , JQ1 y compuestos de fórmulas que se enumeran en la presente) que se unen a la cavidad de unión de la estructura cristalina apo del primer bromodominio de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD4) . Sin pretender vincularse a ninguna teoría, estos compuestos pueden ser particularmente eficaces a la hora de inhibir el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de células neoplásicas proliferantes o de inducir la diferenciación de las células. En una estrategia, los compuestos útiles para el tratamiento de una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis , oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios, el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina o para emplear en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia se seleccionan empleando un programa de acoplamiento molecular para identificar los compuestos que se espera que se unan a una cavidad de unión estructural del bromodominio. En ciertas modalidades, un compuesto de la invención se puede unir a un miembro de la familia BET y reducir la actividad biológica del miembro de la familia BET (p. ej . , reducir la elongación) y/o alterar la ubicación subcelular del miembro de la familia BET (p. ej . , reducir la unión a la cromatina) .

En ciertas modalidades, un compuesto de la invención puede prevenir, inhibir, alterar o reducir al menos un 10%, 25%, 50%, 75% o 100% la actividad biológica de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3, BRD4 , BRDT) y/o alterar la ubicación subcelular de las proteínas, p. ej . , mediante la unión a un sitio de unión en una cavidad de unión apo del bromodominio.

En ciertas modalidades, un compuesto de la invención es una molécula de bajo peso molecular que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 1000 daltones, inferior a 800, inferior a 600, inferior a 500, inferior a 400 o inferior a aproximadamente 300 daltones. Los ejemplos de compuestos de la invención incluyen JQ1 y otros compuestos que se unen a la cavidad de unión de la estructura cristalina apo del primer bromodominio de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD4 (que se denomina en lo sucesivo en la presente BRD4(1); PDB ID 20SS) . JQ1 es una tienotriazolo-1 , 4 -diazepina novedosa. La invención proporciona además sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos.

En un aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula I : donde X es N o CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido,- RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es H, -COO-R3, -CO-R3, -C0-N(R3R4), -S(0)2-R3, -S(0)2-N(R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R2 es H, D (deuterio) , halógeno o alquilo opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Cx-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N; - (cicloalquilo C3-Ci2) , (cicloalquilo C3-Ci2) sustituido, - (cicloalquenilo C3-Ci2) o - (cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R y Rs se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que (a) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo o fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y Rx es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -CO-N(R3R4) , entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino; (b) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y x es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -CO-N(R3R4), y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R4 no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; y (c) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -COO-R3, entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, L es H, -COO-R3 , -CO-N(R3R4), - S(0)2-R3, -S(0)2-N(R3R4) , N(R3R4) , N(R4)C(0)R3 O arilo opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: H, - (alquilo Ci-C8) , que está opcionalmente sustituido y que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; O NH2, N=CR4R6.

En ciertas modalidades, R2 es H, D, halógeno o metilo. En ciertas modalidades, RB es alquilo, hidroxialquilo, haloalquilo o alcoxi, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt o COOCH2OC(0) CH3.

En ciertas modalidades, el anillo A es un arilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros. En ciertas modalidades, el anillo A es tiofuranilo, fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo o 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolinilo .

En ciertas modalidades, el anillo A es fenilo o tienilo. En ciertas modalidades, m es 1 o 2 y al menos uno de los grupos RA es metilo.

En ciertas modalidades, cada RA es independientemente H, un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula II: donde X es N o CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; R'i es H, -COO-R3, -CO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; - (cicloalquilo C3-C12) , (cicloalquilo C3-C12) sustituido; - (cicloalquenilo C3-C12) o - (cicloalquenilo C3-C12) sustituido; cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que si R'i es -COO-R3, X es N, R es fenilo sustituido y RB es metilo, entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R es fenilo o piridilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R es p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl-fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, 2Ti-F-fenilo o piridinilo.

En ciertas modalidades, R'i es -COO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y R3 es -(alquilo Ci-C8) , que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N, y el cual puede estar opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R' es -COO-R3, y R3 es metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo o t-butilo; o R'i es H o fenilo opcionalmente sustituido .

En ciertas modalidades, RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt, COOCH2OC(0)CH3.

En ciertas modalidades, RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt o COOCH2OC(0)CH3.

En ciertas modalidades, cada RA es independientemente un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo fusionado.

En ciertas modalidades, cada RA es metilo. En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula III: donde X es N o CR5; R5 ,es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo C!-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2_C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; -(cicloalquilo C3-C12) , (cicloalquilo C3-Ci2) sustituido, - (cicloalquenilo C3-Ci2) o - (cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2, N=CR4RS; cada R4 es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; RG es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R4 y R6 se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0 , 1 , 2 o 3 ; con la condición de que: (a) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo o fenilo sustituido, RB es metilo, entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino; y (b) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R4 no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R es fenilo o piridilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

En ciertas modalidades, R es p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, ?p-Cl-fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo o piridinilo. En ciertas modalidades, R3 es H, NH2 o N=CR4RS.

En ciertas modalidades, cada R4 es independientemente H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido .

En ciertas modalidades, Re es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido .

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula IV : Cl donde X es N o CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3 , cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es H, -COO-R3, -CO-R3, -CO-N(R3R4), -S(0)2-R3, -S(0)2-N(R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R2 es H, D, halógeno o alquilo opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; - (cicloalquilo C3-Ci2) , (cicloalquilo C3-C12) sustituido, - (cicloalquenilo C3-Ci2) o - (cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2, N=CR4R6; cada R4 es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros ; R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R y R6 se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que (a) si el anillo A es tienilo, X es N, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -CO-N(R3R4) , entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino; (b) si el anillo A es tienilo, X es N, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -CO-N(R3R4), y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R4 no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; y (c) si el anillo A es tienilo, X es N, R2 es H, RB es metilo y Rx es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -COO-R3, entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, Rx es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es -COO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y R3 es (alquilo Ci-C8) , que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N, y el cual puede estar opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, n es 1 o 2 y L es alquilo o -COO-R3, y R3 es metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo o t-butilo; o n es l o 2 y L es H o fenilo opcionalmente sustituido .

En ciertas modalidades, R2 es H o metilo.

En ciertas modalidades, RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COO e, COOEt, COOCH2OC(0)CH3.

En ciertas modalidades, el anillo A es fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo o 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolinilo .

En ciertas modalidades, cada RA es independientemente un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo.

La invención también proporciona compuestos de Fórmulas V-XXII y cualquier compuesto descrito en la presente.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto representado por la fórmula: una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, el compuesto es (+) -JQ1 una de sus sales, solvatos o hidratos.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto representado por la fórmula: una de sus sales, solvatos o hidratos.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto representado por la fórmula: una de sus sales, solvatos o hidratos.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: una de sus sales, solvatos o hidratos.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto representado por cualquiera de las siguientes estructuras : ?? 25 ?? 106 o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, un compuesto de la invención se puede representar mediante una de las siguientes estructuras: ?? ?? ?? ?? o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En una modalidad, el compuesto se representa mediante la estructura: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En otra modalidad, el compuesto se representa mediante la estructura: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En otra modalidad, el compuesto se representa mediante la estructura: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, un compuesto de la invención puede presentar la quiralidad opuesta respecto a cualquiera de los compuestos mostrados en la presente.

En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto representado por la Fórmula (V) , (VI) o (VII) : donde R, Ri, R2 y RB tienen el mismo significado que en la Fórmula (I) ; Y es O, N, S o CR5, donde R5 tiene el mismo significado que en la Fórmula (I) ; n es 0 o 1; y el círculo de puntos de la Fórmula (VII) indica un anillo aromático o no aromático; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades de cualquiera de las Fórmulas I-IV y VI (o cualquier fórmula de la presente) , R6 representa la porción no carbonílica de un aldehido que se muestra en la Tabla A más adelante (es decir, para un aldehido de fórmula R6CHO, Rg es la porción no carbonílica del aldehido) . En ciertas modalidades, R4 y R6 representan conjuntamente la porción no carbonílica de una cetona que se muestra en la Tabla A (es decir, para una cetona de fórmula R6C(0)R , R y R6 son la porción no carbonílica de la cetona) .

Tabla A: Placa 1 B jyty~ ú ? >M y>* k> ¾ -?" A. 'X - ? .

Placa 2 Placa 4 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A OJXrf^KA .O H En una modalidad, un compuesto se representa mediante la fórmula : (VIII) , o una de sus sales, solvatos o hidratos.

En ciertas modalidades, el compuesto es JQ1 (racémico) ; en ciertas modalidades, el compuesto es (+)-JQl. En ciertas modalidades, el compuesto es un compuesto seleccionado del grupo constituido por: (4) o una de sus sales, solvatos o hidratos.

Otros ejemplos de compuestos incluyen los compuestos de acuerdo con cualquiera de las siguientes fórmulas: hidratos.

En las Fórmulas IX-XXII, R y R' pueden ser, p. ej . , H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo, heterocicloalquilo, - (alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-C8) , (alquinilo C2-C8) , - (cicloalquilo C3-Ci2) , - (cicloalquilo C3-Ci2) sustituido, - (cicloalquenilo C3-Ci2) o - (cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido. En las Fórmulas XIV, X puede ser cualquier sustituyente para un grupo arilo según se ha descrito en la presente .

Los compuestos de la invención se pueden preparar mediante varios métodos, algunos de los cuales son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los Ejemplos químicos que se proporcionan a continuación en la presente proporcionan esquemas de reacción sintéticos para la preparación del compuesto JQl (como racemato) y los enantiómeros (+) -JQl y (-)-JQl (remítase a los Esquemas de reacción de reacción SI y S2) . Se pueden preparar varios compuestos de Fórmulas (I) - (XXII) mediante métodos análogos sustituyendo los materiales de partida adecuados.

Por ejemplo, partiendo de JQl, se puede preparar la amina análoga como se muestra en el Esquema 1 a continuación. squema de reacción 1 Según se muestra en el Esquema de reacción hidrólisis del éster t-butílico de JQ1 proporciona el ácido carboxílico, el cual se trata con difenilfosforilazida (DPPA) y se somete a condiciones de trasposición de Curtius para obtener la amina protegida con Cbz, la cual se desprotege a continuación para proporcionar la amina. La transformación posterior del grupo amino, p. ej . , mediante aminación reductiva proporciona aminas secundarias, las cuales se pueden alquilar adicionalmente para obtener aminas terciarias.

Esquema de reacción 2 El Esquema de reacción 2 muestra la síntesis de otros ejemplos de los compuestos de la invención, p. e . , de Fórmula I, en los que se modifica el núcleo de anillos fusionados (p. ej . , mediante la sustitución con un anillo aromático diferente como Anillo A en la Fórmula I) . El uso de cetonas aminodiarílicas con la funcionalidad adecuada ( . ej . , en lugar de la cetona aminodiarílica S2 en el Esquema de reacción SI, infra) proporciona compuestos nuevos que contienen varios núcleos de anillos fusionados y/o miembros de grupos arilo (correspondientes al grupo R en la Fórmula I) . Estas cetonas aminodiarílicas se pueden adquirir de proveedores comerciales o se pueden preparar mediante varios métodos, algunos de los cuales son conocidos en la técnica.

El Esquema de reacción 3 proporciona esquemas de reacción sintéticos adicionales a modo de ejemplo para preparar otros compuestos de la invención.

Esquema de reacción 3 Según se muestra en el Esquema de reacción 3, un precursor bicíclico fusionado (remítase al Esquema de reacción SI, infra, para la síntesis de este compuesto) se funcionaliza con un resto R (grupo protector DAM = dimetilaminometileno) y a continuación se transforma por reacción con una hidrazida para formar el núcleo fusionado tricíclico. Se puede variar el sustituyente Rx seleccionando la hidrazida adecuada.

Otros ejemplos de compuestos de la invención (que se pueden preparar mediante los métodos descritos en la presente) incluyen: Amidas : Las amidas se pueden preparar, p. ej . , preparando un ácido carboxílico o éster correspondiente y a continuación realizando una amidación con una amina adecuada en condiciones estándar. En ciertas modalidades, una amida proporciona un "conector" de dos carbonos con un anillo terminal que contiene nitrógeno (p. ej . , piridilo, piperidilo, piperazinilo, imidazolilo (incluido N-metilimidazolilo) , morfolinilo y similares) . Los ejemplos de estructuras de amidas incluyen: Se prefiere el uso de un conector de dos carbonos entre resto de amida y el anillo terminal que contiene nitrógeno.

"Amidas inversas" : Aminas sec ndarias : En ciertas modalidades, un compuesto con al menos un centro quiral está presente en forma racémica. En ciertas modalidades, un compuesto con al menos un centro quiral está enriquecido enantioméricamente, es decir, presenta un exceso enantiomérico (e.e.) de al menos aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 90%, 95%, 99%, 99% o 100%. En ciertas modalidades, un compuesto presenta la misma configuración absoluta que el compuesto (+) -JQ1 ( (S) -2- (4- (4-clorofenil) -2,3, 9-trimetil-6H-tieno [3,2-f] [1, 2 , 4] triazolo [4 , 3-a] [1 , 4] diazepin-6-il) acetato de tert-butilo) descrito en la presente.

En ciertas modalidades de cualesquiera Fórmulas descritas en la presente, el compuesto no se representa mediante la siguiente estructura: donde : R'i es alquilo Ci-C4; R'2 es hidrógeno, halógeno o alquilo Ci-C4 opcionalmente sustituido con un átomo halógeno o un grupo hidroxilo; R'3 es un átomo halógeno, fenilo opcionalmente sustituido con un átomo halógeno, alquilo Ci-C4, alcoxi Cx-C4 o ciano; -NR5- (CH2) m-R6, donde R5 es un átomo de hidrógeno o alquilo Ci-C4, m es un número entero de 0 a 4, y R6 es fenilo o piridilo opcionalmente sustituido con un átomo halógeno; o -NR7-CO-- (CH2)n-R8/ donde R7 es un átomo de hidrógeno o alquilo C1-C4, n es un número entero de 0 a 2, y R8 es fenilo o piridilo opcionalmente sustituido con un átomo halógeno; y R'4 es - (CH2) a-CO-NH-R9í donde a es un número entero de 1 a 4, y R9 es alquilo Ci-C4; hidroxialquilo C1-C4; alcoxi Ci-C4; o fenilo o- piridilo opcionalmente sustituido con alquilo Cx-C4, alcoxi C1-C4, amino o un grupo hidroxilo o - (CH2) b-COORi0, donde b es un número entero de 1 a , y Rio es alquilo Ci-C4.

La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal preparada a partir de un compuesto descrito en la presente (p. ej . , JQ1, un compuesto de Fórmulas I-XXII) o cualquier otro compuesto definido en la presente, que contiene un grupo funcional ácido, tal como un grupo funcional de tipo ácido carboxílico, y una base orgánica o inorgánica farmacéuticamente aceptable. Las bases adecuadas incluyen, sin carácter limitante, hidróxidos de metales alcalinos tales como sodio, potasio y litio; hidróxidos de metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio; hidróxidos de otros metales tales como aluminio y zinc; amoniaco y aminas orgánicas tales como mono-, di- o trialquilaminas sustituidas con hidroxi o no sustituidas; diciclohexilamina,- tributilamina; piridina,- N-metil-, N- etilamina dietilamina; trietilamina; mono-, bis- o tris [2-hidroxi (alquilo inferior) ] aminas tales como mono-, bis- o tris (2 -hidroxietil) mina, 2 -hidroxi- tert-butilamina o tris (hidroximetil) metilamina, N, N-di (alquilo inferior) -N- [hidroxi (alquilo inferior) ] aminas tales como N, N-dimetil-iV- (2-hidroxietil) amina o tri (2-hidroxietil) amina; N-metil-D-glucamina; y aminoácidos tales como arginina, lisina y similares. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" también se refiere a una sal preparada a partir de un compuesto descrito en la presente o cualquier otro compuesto definido en la presente, que contiene un grupo funcional básico, tal como un grupo funcional amino, y un ácido orgánico o inorgánico farmacéuticamente aceptable . Los ácidos adecuados incluyen, sin carácter limitante, hidrogenosulfato, ácido cítrico, ácido acético, ácido oxálico, ácido clorhídrico, bromuro de hidrógeno, yoduro de hidrógeno, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido isonicotínico, ácido láctico, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido ascórbico, ácido succínico, ácido maleico, ácido besílico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido glucarónico, ácido sacarínico, ácido fórmico, ácido benzoico, ácido glutámico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico y ácido p- toluenosulfónico .

Sistemas y métodos de análisis selectivo in Silico En otro aspecto, la invención proporciona un soporte de almacenamiento legible mecánicamente, el cual comprende las coordenadas estructurales del sitio de unión de un polipéptido miembro de la familia BET (p. ej . , un dominio BRD4 ) que se identifica en la presente. Este es el sitio de unión propuesto para JQ1. Un soporte de almacenamiento codificado con estos datos es capaz de mostrar una representación gráfica tridimensional de una molécula o un complejo molecular que comprenda los sitios de unión en la pantalla de una computadora o un dispositivo de visualización similar.

La invención también proporciona métodos para diseñar, evaluar e identificar compuestos que se unan al sitio de unión mencionado previamente. Cabe esperar que estos compuestos inhiban la actividad biológica de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3 , BRD , BRDT) y/o que alteren la ubicación subcelular de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3 , BRD4 , BRDT) . La invención proporciona una computadora para producir a) una representación tridimensional de una molécula o un complejo molecular, donde la molécula o complejo molecular comprende un sitio de unión; o b) una representación tridimensional de un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo comprende un sitio de unión que presenta una desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto de los aminoácidos que no sea superior a aproximadamente 2.0 (más preferentemente, no superior a 1.5) angstroms, donde la computadora comprende: (i) un soporte de almacenamiento de datos legible mecánicamente, que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde los datos comprenden las coordinadas estructurales de residuos aminoacídicos en la cavidad de unión estructural del bromodominio u otro sitio de unión del miembro de la familia BET; (ii) una memoria operativa para almacenar las instrucciones para procesar los datos legibles mecánicamente; (iii) una unidad de procesamiento central acoplada a la memoria operativa y a el soporte de almacenamiento de datos legible mecánicamente, para procesar los datos legibles mecánicamente y obtener la representación tridimensional; y (iv) una pantalla acoplada a la unidad de procesamiento central para mostrar la representación tridimensional.

De este modo, la computadora produce una estructura gráfica tridimensional de una molécula o un complejo molecular que comprende un sitio de unión.

En otra modalidad, la invención proporciona ' una computadora para producir una representación tridimensional de una molécula o un complejo molecular definida por las coordinadas estructurales de los aminoácidos de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3 , BRD4 , BRDT) , * o una representación tridimensional de un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo comprende un sitio de unión que presenta una desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto de los aminoácidos que no sea superior a 2.0 (más preferentemente, no superior a 1.5) angstroms.

En modalidades a modo de ejemplo, la computadora o sistema computacional puede incluir componentes que son convencionales en la técnica, p. ej . , según se describe en las Patentes de EE. UU. N.os 5,978,740 y/o 6,183,121 (incorporadas a la presente por referencia) . Por ejemplo, un sistema computacional puede incluir una computadora que comprenda una unidad de procesamiento central ("CPU"), una memoria operativa (que puede ser, p. ej . , RAM (memoria de acceso aleatorio) o memoria "central"), una memoria de almacenamiento masivo (tal como una o más unidades de disco o unidades de CD-ROM) , una o más terminales de visualización de tipo tubo de rayos catódicos (CRT, por sus siglas en inglés) o pantalla de cristal líquido (LCD, por sus siglas en inglés) , uno o más teclados, una o más líneas de entrada y una o más líneas de salida, todas las cuales están interconectadas mediante un bus de sistema convencional.

Los datos legibles mecánicamente de esta invención se pueden introducir en la computadora mediante el uso de un módem o módems conectados mediante una línea de datos. Como alternativa o de forma adicional, el hardware de entrada puede incluir unidades de CD-ROM, unidades de disco o memoria flash. Junto con una terminal de visualización, el teclado también se puede emplear como un dispositivo de entrada.

El hardware de salida acoplado a la computadora mediante líneas de salida se puede implementar de modo similar mediante dispositivos convencionales. A modo de ejemplo, el hardware de salida puede incluir una terminal de visualización CRT o LCD para mostrar una representación gráfica de una cavidad de unión de esta invención empleando un programa tal como QUA TA o PYMOL. El hardware de salida también puede incluir una impresora o una unidad de disco para almacenar la salida del sistema para un uso posterior.

Cuando está operativa, la CPU coordina el uso de los diferentes dispositivos de entrada y salida, coordina los accesos a los datos desde el almacenamiento masivo y los accesos a y desde la memoria operativa, y determina la secuencia de los pasos de procesamiento de datos . Se pueden emplear una serie de programas para procesar los datos legibles mecánicamente de esta invención, incluido software que se puede adquirir de proveedores comerciales.

El soporte de almacenamiento magnético para almacenar los datos legibles mecánicamente de acuerdo con la invención puede ser convencional. Un soporte de almacenamiento de datos magnético se puede codificar con datos legibles mecánicamente que pueden ser ejecutados por un sistema tal como el sistema computacional descrito previamente. El soporte puede ser un disquete o disco duro convencional, que contiene un sustrato adecuado que puede ser convencional, y un recubrimiento adecuado, que también puede ser convencional, en una o ambas caras, que contiene dominios magnéticos cuya polaridad u orientación se puede modificar magnéticamente. El soporte también puede tener una apertura (que no se muestra) para recibir el eje giratorio de una unidad de disco u otro dispositivo de almacenamiento de datos.

Los dominios magnéticos del soporte se polarizan u orientan para codificar, en un modo que puede ser convencional, los datos legibles mecánicamente tales como los descritos en la presente, para que sean ejecutados por un sistema tal como el sistema computacional descrito en la presente .

Un medio de almacenamiento de datos legible ópticamente también se puede codificar con datos legibles mecánicamente, o un conjunto de instrucciones, que pueden ser ejecutados por un sistema computacional. El soporte puede ser un disco compacto convencional con memoria solo de lectura (CD-ROM) o un soporte reescribible tal como un disco óptico-magnético que se puede leer por vía óptica y se puede escribir por vía óptico-magnética .

En el caso del CD-ROM, como es bien sabido, el recubrimiento del disco es brillante y está impreso con una pluralidad de fisuras para codificar los datos legibles mecánicamente. La distribución de fisuras es leída por una luz láser que se refleja en la superficie del recubrimiento. Se proporciona un recubrimiento protector, que preferentemente es sustancialmente transparente, encima del recubrimiento brillante.

En el caso de un disco óptico-magnético, como es bien sabido, el recubrimiento que graba los datos no tiene fisuras, sino que tiene una pluralidad de dominios magnéticos cuya polaridad u orientación se puede modificar magnéticamente cuando se calienta por encima de cierta temperatura, por ejemplo, con un láser. La orientación de los dominios se puede leer midiendo la polarización de la luz láser reflejada desde el recubrimiento. La disposición de los dominios codifica los datos según se ha descrito previamente.

Los datos estructurales, cuando se utilizan conjuntamente con una computadora programada con software para traducir esas coordenadas en la estructura tridimensional de una molécula o un complejo molecular que comprende una cavidad de unión, se pueden emplear con varios propósitos tales como el descubrimiento de f rmacos.

Por ejemplo, la estructura codificada por los datos se puede evaluar computacionalmente por su capacidad de asociarse con entidades químicas . Cabe esperar que las entidades químicas que se asocian a un sitio de unión de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3, BRD , BRDT) inhiban la proliferación o induzcan la diferenciación de una célula neoplásica, inhiban la actividad biológica de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3, BRD4, BRDT) y/o alteren la ubicación subcelular. Los compuestos de este tipo son candidatos de f rmacos potenciales . Como alternativa, la estructura codificada por los datos se puede mostrar en una representación gráfica tridimensional en la pantalla de una computadora. Esto permite la inspección visual de la estructura, así como también la inspección visual de la asociación de la estructura a entidades químicas .

De este modo, de acuerdo con otra modalidad, la invención se refiere a un método para evaluar el potencial de una entidad química para asociarse a a) una molécula o un complejo molecular que comprende un sitio de unión definido por coordinadas estructurales de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3, BRD4 , BRDT), según se describe en la presente, o b) un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo comprende una cavidad de unión que presenta una desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto de los aminoácidos que no sea superior a 2.0 (más preferentemente, 1.5) angstroms .

Este método comprende los pasos de: i) emplear medios computacionales para realizar una operación de ajuste entre la entidad química y un sitio de unión de un polipéptido o fragmento de este o un complejo molecular miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3, BRD4 , BRDT) ; y ii) analizar los resultados de la operación de ajuste para cuantificar la asociación entre la entidad química y la cavidad de unión. Esta modalidad se refiere a la evaluación del potencial de una entidad química para asociarse o unirse a un sitio de unión de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3, BRD4 , BRDT) o un fragmento de este.

La expresión "entidad química", tal como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos químicos, complejos de al menos dos compuestos químicos y fragmentos de los compuestos o complejos.

En ciertas modalidades, el método evalúa el potencial de una entidad química para asociarse a una molécula o un complejo molecular definido por coordinadas estructurales de todos los aminoácidos de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3, BRD4 , BRDT), según se describe en la presente, o un homólogo de la molécula o complejo molecular que presente una desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto de los aminoácidos que no sea superior a 2.0 (más preferentemente, no superior a 1.5) angstroms.

En una modalidad adicional, las coordinadas estructurales de uno de los sitios de unión que se describen en la presente se pueden emplear en un método para identificar un antagonista de una molécula que comprende un sitio de unión del bromodominio (p. ej . , una cavidad de unión estructural del bromodominio) . Este método comprende los pasos de: a) emplear las coordinadas atómicas de un miembro de la familia BET; y b) emplear la estructura tridimensional para diseñar o seleccionar el agonista o antagonista potencial. Se puede obtener el compuesto mediante cualquier medio disponible. El término "obtener" se refiere, por ejemplo, a sintetizar, comprar o adquirir el agonista o antagonista. Si se desea, el método implica además poner en contacto el agonista o antagonista con el polipéptido miembro de la familia BET o un fragmento de este para determinar la capacidad del agonista o antagonista potencial para interaccionar con la molécula. Si se desea, el método también implica además el paso de poner en contacto una célula neoplásica con un compuesto que se une al bromodominio y evaluar la citotoxicidad, evaluar la proliferación de la célula neoplásica, la muerte celular, la actividad biológica del miembro de la familia BET o la ubicación subcelular.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un antagonista potencial de un miembro, de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3, BRD4, BRDT) , comprendiendo el método los pasos de: a) emplear las coordenadas atómicas de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3 , BRD4 , BRDT) (p. ej . , una cavidad de unión estructural del bromodominio) ; y b) emplear la estructura tridimensional para diseñar o seleccionar el agonista o antagonista potencial.

La elucidación de los inventores de la presente de los sitios de unión hasta ahora no identificados de un bromodominio proporciona la información necesaria para diseñar nuevas entidades químicas y compuestos que podrían interaccionar con bromodominios , totalmente o en parte, y por consiguiente podrían modular (p. ej . , inhibir) la actividad de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3 , BRD4 , BRDT) .

El diseño de compuestos que se unen a una secuencia de una cavidad de unión estructural de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3 , BRD4 y BRDT) y que reducen la actividad biológica de un bromodominio o que alteran la ubicación subcelular de un miembro de la familia BET, de acuerdo con esta invención generalmente implica la consideración de varios factores. En una modalidad, el compuesto se asocia física y/o estructuralmente a al menos un fragmento de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) tal como un sitio de unión dentro de una secuencia de una cavidad de unión estructural del bromodominio. Las interacciones moleculares no covalentes que son importantes en esta asociación incluyen puentes de hidrógeno, interacciones de van der aals, interacciones hidrófobas e interacciones electrostáticas. De forma deseable, el compuesto adquiere una conformación que permite que se asocie al o a los sitios de unión del bromodominio directamente. Aunque ciertas porciones del compuesto quizás no participen directamente en estas asociaciones, esas porciones de la entidad pueden también influir sobre la conformación global de la molécula. Esto, a su vez, puede tener un impacto significativo en la potencia del compuesto. Tales requisitos conformacionales incluyen la estructura tridimensional global y la orientación del compuesto químico con relación a todo el sitio de unión o una porción de este, o el espacio entre los grupos funcionales comprendidos por varios compuestos químicos que interaccionan directamente con el sitio de unión o uno de sus homólogos.

El efecto de unión o inhibición potencial de un compuesto químico en un sitio de unión del bromodominio se puede analizar antes de su síntesis y evaluación real empleando técnicas de modelización computacional . Si la estructura teórica del compuesto dado sugiere una interacción y asociación insuficientes entre este y el sitio de unión diana, se obvia la evaluación del compuesto. En cambio, si la modelización computacional indica una interacción fuerte, la molécula se sintetiza y se evalúa para determinar su capacidad de unión a una secuencia de una cavidad de unión estructural de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) o para determinar su actividad biológica evaluando, por ejemplo, la citotoxicidad en una célula neoplásica, evaluando la reducción de la actividad biológica de un miembro de la familia BET o evaluando la ubicación subcelular de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3 , BRD4 y BRDT) . Los compuestos candidatos se pueden evaluar computacionalmente mediante una serie de pasos en los que se analizan selectivamente entidades químicas o fragmentos y se seleccionan según su capacidad para asociarse a la cavidad de unión estructural del bromodominio .

Un experto en la técnica puede emplear uno de los diferentes métodos para analizar selectivamente compuestos químicos o fragmentos según su capacidad para asociarse a un sitio de unión del bromodominio. Este proceso se puede iniciar mediante una inspección visual de, por ejemplo, un sitio de unión en la pantalla de la computadora basándose en las coordinadas estructurales de un miembro de la familia BET descritas en la presente u otras coordinadas que definan una forma similar generada a partir del soporte de almacenamiento legible mecánicamente. Los fragmentos o compuestos químicos seleccionados se colocan a continuación en varias orientaciones, o se acoplan, dentro de ese sitio de unión según se ha definido previamente. El acoplamiento molecular se puede realizar empleando un software tal como Quanta y DOCK, seguido de minimización de energía y dinámica molecular con campos de fuerzas de mecánica molecular estándares tales como CHARMM y AMBER.

Los programas informáticos especializados (p. ej . , conocidos en la técnica y/o que se pueden adquirir de proveedores comerciales y/o que se describen en la presente) también pueden facilitar el proceso de selección de los fragmentos o entidades químicas.

Una vez que se han seleccionado los fragmentos o entidades químicas adecuados, se pueden agrupar para formar un único compuesto o complejo. El agrupamiento puede ir precedido de una inspección visual de la relación de los fragmentos entre sí en la imagen tridimensional mostrada en la pantalla de la computadora con relación a las coordenadas estructurales del sitio de unión diana.

En lugar de proceder a construir un inhibidor de una cavidad de unión siguiendo un método por pasos de un fragmento o entidad química en cada paso según se ha descrito previamente, los compuestos inhibidores u otros compuestos de unión se pueden diseñar como un todo o "de novo" empleando un sitio de unión vacío u opcionalmente incluyendo alguna porción o porciones de uno o más inhibidores conocidos. Existen muchos métodos de diseño de ligandos de novo conocidos en la técnica, algunos de los cuales se pueden adquirir de proveedores comerciales (p. ej . , LeapFrog, comercializado por Tripos Associates, St. Louis, Mo.).

También se pueden emplear otras técnicas de modelización molecular de acuerdo con esta invención (remítase, p. ej . , a N. C. Cohén et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem. , 33, págs. 883-894 (1990) ; remítase también a M. A. Navia y M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design" , Current Opinions in Structural Biology, 2, págs. 202-210 (1992); L. M. Balbes et al., "A Perspective of Modern Methods in Computer-Aided Drug Design", en Reviews in Computational Chemistry, Vol . 5, K. B. Lipkowitz y D. B. Boyd, Eds . , VCH, Nueva York, págs. 337-380 (1994); remítase también a W. C. Guida, "Software For Structure-Based Drug Design", Curr. Opin. Struct. Biology, 4, págs. 777-781 (1994)).

Una vez que se ha diseñado o seleccionado un compuesto, la eficacia con la que esa entidad puede unirse a un sitio de unión se puede evaluar y optimizar mediante evaluación computacional .

Existe software computacional específico disponible en la técnica para evaluar la energía de deformación de compuestos y las interacciones electrostáticas. Los ejemplos de programas diseñados con estos fines incluyen: AMBER; QUANTA/CHARMM (Accelrys, Inc., Madison, WI) y similares. Estos programas se pueden implementar, por ejemplo, empleando tarjetas gráficas disponibles en el mercado. Los expertos en la técnica conocerán otros sistemas de hardware y paquetes de software .

Otra técnica implica el análisis selectivo in silico de colecciones virtuales de compuestos, p. ej . , según se describe en la presente (remítase, p. ej . , a los Ejemplos). Se pueden analizar rápidamente muchos miles de compuestos y se pueden seleccionar los mejores compuestos virtuales para análisis posteriores (p. ej . , mediante síntesis y evaluación in vitro o in vivo) . Se pueden analizar bases de datos de moléculas de bajo peso molecular para encontrar entidades químicas o compuestos que se puedan unir, en su totalidad o en parte, a un sitio de unión de un bromodominio de un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2, BRD3 , BRD4 y BRDT) . En este análisis selectivo, la calidad del ajuste de las entidades al sitio de unión se puede juzgar según la complementariedad de la forma o según la energía de interacción estimada.

Una computadora para producir una representación tridimensional de a) una molécula o un complejo molecular, donde la molécula o complejo molecular comprende una cavidad de unión estructural de un miembro de la familia BET definida por coordinadas estructurales de residuos aminoacídicos en la secuencia de la cavidad de unión estructural de un bromodominio; o b) una representación tridimensional de un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo comprende un sitio de unión que presenta una desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto de los aminoácidos que no sea superior a aproximadamente 2.0 (más preferentemente, no superior a 1.5) angstroms, donde la computadora comprende: (i) un soporte de almacenamiento de datos legible mecánicamente, que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde los datos comprenden las coordinadas estructurales de residuos aminoacídicos en la secuencia de la cavidad de unión estructural de un miembro de la familia BET; (ii) una memoria operativa para almacenar las instrucciones para procesar los datos legibles mecánicamente; (iii) una unidad de procesamiento central acoplada a la memoria operativa y a el soporte de almacenamiento de datos legible mecánicamente, para procesar los datos legibles mecánicamente y obtener la representación tridimensional; y (iv) una pantalla acoplada a la unidad de procesamiento central para mostrar la representación tridimensional. Según se describe en los Ejemplos, los compuestos identificados empleando métodos in silico se pueden evaluar opcionalmente in vitro o in vivo, por ejemplo, empleando "Otros Métodos de Análisis Selectivo" que se describen a continuación o cualquier otro método conocido en la técnica.

Otros métodos de análisis selectivo Según se ha descrito previamente, la invención proporciona ejemplos específicos de compuestos químicos, incluido JQ1, así como también otros compuestos sustituidos que se unen a una cavidad de unión de un bromodominio y que inducen la diferenciación celular o reducen la proliferación celular en una célula neoplásica. Sin embargo, la invención no está tan limitada. La invención proporciona además un medio sencillo para identificar agentes (incluidos ácidos nucleicos, péptidos, inhibidores de bajo peso molecular y miméticos) que son capaces de unirse a un miembro de la familia BET, que son citotóxicos para una célula neoplásica, que reducen la actividad biológica de un miembro de la familia BET o que alteran la ubicación celular de un miembro de la familia BET. Cabe esperar que estos compuestos también sean útiles para el tratamiento o la prevención de una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis , oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios, el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina. Otros usos de las composiciones de la invención incluyen, sin carácter limitante, el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia.

En particular, ciertos aspectos de la invención se basan al menos en parte en el descubrimiento de que los agentes que reducen la actividad biológica de un polipéptido miembro de la familia BET son probablemente útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento o la prevención de una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis, oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios, el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina. Otros usos de las composiciones de la invención incluyen, sin carácter limitante, el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia. En modalidades particulares, se analiza el efecto de un compuesto u otro agente de la invención evaluando la proliferación celular, supervivencia celular o muerte celular. En otra estrategia, se evalúan los agentes y compuestos de la invención para determinar su efecto sobre la elongación o regulación de la transcripción. Los agentes y compuestos de la invención que reducen el crecimiento, la proliferación o el estado de invasión de una neoplasia se identifican como útiles para el tratamiento o prevención de una neoplasia. En otra modalidad más, se evalúan los compuestos de la invención para determinar su efecto en una célula inmunosensible , en la liberación de histamina o citocina, o en cualquier otro marcador de enfermedades inflamatorias.

En los métodos de la invención se puede emplear prácticamente cualquier agente que se una específicamente a un miembro de la familia BET o que reduzca la actividad biológica de un miembro de la familia BET. Los métodos de la invención son útiles para la detección selectiva con gran capacidad de procesamiento y bajo costo de agentes candidatos que reduzcan, lentifiquen o estabilicen el crecimiento o la proliferación de una neoplasia o para el tratamiento o la prevención de enfermedades inflamatorias. A continuación, se aisla un agente candidato que se una específicamente a un bromodominio de un miembro de la familia BET y se evalúa para determinar su actividad en un ensayo in vi tro o un ensayo in vivo en cuanto a la capacidad para reducir la proliferación de células neoplásicas, inducir diferenciación y/o incrementar la muerte de células neoplásicas. Un experto en la materia se dará cuenta de que los efectos de un agente candidato en una célula se comparan normalmente con una célula de control correspondiente que no se pone en contacto con el agente candidato. De este modo, los métodos de análisis selectivo incluyen comparar la proliferación de una célula neoplásica puesta en contacto con un agente candidato con la proliferación de una célula de control no tratada.

En otras modalidades, la expresión o actividad de un miembro de la familia BET en una célula tratada con un agente candidato se compara con muestras de control no tratadas para identificar un compuesto candidato que reduzca la actividad biológica de un miembro de la familia BET en la célula puesta en contacto. La actividad o expresión polipeptídica se puede comparar mediante procedimientos muy conocidos en la técnica tales como la inmunostransferencia de Western, citometría de flujo, ensayo inmunocitoquímico, unión a microesferas magnéticas y/o recubiertas con un anticuerpo específico para un bromodominio , hibridación in situ, hibridación fluorescente in situ (FISH, por sus siglas en inglés) , ELISA, análisis de micromatriz, RT-PCR, inmunostransferencia de Northern o ensayos colorimétricos tales como el ensayo de Bradford y el ensayo de Lowry.

En un ejemplo experimental, se añaden diferentes concentraciones de uno o más agentes candidatos al medio de cultivo que contiene una célula neoplásica. Un agente que reduzca la expresión de un miembro de la familia BET expresado en la célula se considera útil en la invención; se puede emplear un agente de este tipo, por ejemplo, como agente terapéutico para prevenir, retrasar, mejorar, estabilizar o tratar una neoplasia o enfermedad inflamatoria. Una vez identificados, los agentes de la invención (p. ej . , agentes que se unen específicamente y/o que antagonizan un bromodominio) se pueden emplear para tratar una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis , oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios , el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina. Otros usos de las composiciones de la invención incluyen, sin carácter limitante, el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia. Un agente identificado de acuerdo con un método de la invención se suministra local o sistémicamente para tratar una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis, oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios, el tratamiento de parásitos, malaria. tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina o se emplea en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) o para favorecer la pluripotencia in si tu.

En una modalidad, el efecto de un agente candidato se puede medir, como alternativa, en cuanto al nivel de producción de un miembro de la familia BET empleando la misma estrategia general y técnicas inmunológicas estándar tales como inmunotransferencia de Western o inmunoprecipitación con un anticuerpo específico para el miembro de la familia BET. Por ejemplo, se pueden emplear inmunoensayos para detectar o monitorizar la expresión de un miembro de la familia BET en una célula neoplásica. En una modalidad, la invención identifica un anticuerpo monoclonal o policlonal (producido según se describe en la presente) capaz de unirse y bloquear la actividad biológica o alterar la ubicación subcelular de un miembro de la familia BET. Un compuesto que altera la ubicación subcelular o que reduce la actividad biológica de un miembro de la familia BET se considera particularmente útil. Nuevamente, un agente de este tipo se puede emplear, por ejemplo, como agente terapéutico para prevenir o tratar una neoplasia o enfermedad inflamatoria.

Como alternativa, o adicionalmente , los compuestos candidatos se pueden identificar evaluando en primer lugar aquellos que se unen específicamente y que antagonizan un miembro de la familia BET (p. ej . , BRD2 , BRD3 , BRD4 y BRDT) de la invención y posteriormente evaluando su efecto en células neoplásicas según se describe en los Ejemplos. En una modalidad, la eficacia de un agente candidato depende de su capacidad para interaccionar con el miembro de la familia BET. Tal interacción se puede evaluar fácilmente empleando cualquiera de las diferentes técnicas de unión y ensayos funcionales estándares (p. ej . , los que se describen en Ausubel et al., supra) . Por ejemplo, un compuesto candidato se puede evaluar in vitro para determinar la interacción y unión con un polipéptido de la invención y su capacidad para modular la proliferación de células neoplásicas se puede evaluar mediante cualquier ensayo estándar (p. ej . , los que se describen en la presente) . En una modalidad, la división de células neoplásicas se determina evaluando la incorporación de BrdU con análisis de citometría de flujo. En otra modalidad, la expresión de un miembro de la familia BET se monitoriza con ensayos inmunohistoquímicos .

Los antagonistas de bromodominios potenciales incluyen moléculas orgánicas, péptidos, miméticos de péptidos, polipéptidos , ligandos de ácidos nucleicos, aptámeros y anticuerpos que se unen a un bromodominio miembro de la familia BET y reducen su actividad. En un ejemplo particular, se puede identificar un compuesto candidato que se una a un miembro de la familia BET empleando una técnica basada en cromatografía. Por ejemplo, un polipéptido miembro de la familia BET recombinante de la invención se puede purificar mediante técnicas estándares a partir de células modificadas genéticamente para que expresen el polipéptido, o se puede sintetizar con métodos químicos; una vez purificado, el péptido se inmoviliza en una columna. A continuación, se hace pasar una solución de agentes candidatos a través de la columna y se identifica un agente que se una específicamente al polipéptido miembro de la familia BET o un fragmento de este basándose en su capacidad para unirse al polipéptido miembro de la familia BET y para quedar inmovilizado en la columna. Con el fin de aislar el agente, la columna se lava para eliminar las moléculas que no se unen específicamente y a continuación el agente de interés se libera de la columna y se recoge. Los agentes aislados mediante este método (o cualquier otro método adecuado) se pueden purificar adicionalmente, si se desea (p. ej . , mediante cromatografía líquida de alta resolución) . Además, estos agentes candidatos se pueden evaluar para determinar su capacidad para reducir la viabilidad o proliferación de células neoplásicas. Los agentes aislados mediante esta estrategia también se pueden emplear, por ejemplo, como agentes terapéuticos para tratar o prevenir una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis , oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios , el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina o para el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia. Los compuestos identificados que presentan una unión a un miembro de la familia BET con una constante de afinidad inferior o igual a 1 nM, 5 n , 10 nM, 100 nM, 1 µ? o 10 µ? se consideran particularmente útiles en la invención.

Extractos y compuestos de prueba En ciertas modalidades, los antagonistas de miembros de la familia BET (p. ej . , agentes que se unen específicamente y que reducen la actividad de un bromodominio) se identifican a partir de grandes colecciones de extractos sintéticos (o semisintéticos) o de productos naturales o colecciones de compuestos químicos o a partir de colecciones de polipéptidos o ácidos nucleicos, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Los expertos en el campo del desarrollo y descubrimiento de fármacos sobreentenderán que la fuente exacta de los compuestos o extractos de prueba no es crítica para el o los procedimientos de análisis selectivo de la invención. Los agentes empleados en los análisis selectivos pueden incluir los conocidos como agentes terapéuticos para el tratamiento de una neoplasia o enfermedad inflamatoria. Como alternativa, se puede analizar de forma selectiva prácticamente cualquier número de compuestos o extractos químicos desconocidos empleando los métodos descritos en la presente. Los ejemplos de estos extractos o compuestos incluyen, sin carácter limitante, extractos basados en plantas, hongos, procariotas o animales, caldos de fermentación y compuestos sintéticos, así como también la modificación de polipéptidos existentes.

Las colecciones de polipéptidos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales se pueden adquirir de varios proveedores comerciales, que incluyen Biotics (Sussex, Reino Unido) , Xenova (Slough, Reino Unido), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fia.) y PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, Mass.). Estos polipéptidos se pueden modificar para que incluyan un dominio de transducción de proteínas empleando métodos conocidos en la técnica y que se describen en la presente. Además, las colecciones producidas natural y sintéticamente se producen, si se desea, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, p. ej . , mediante métodos de fraccionamiento y extracción estándar. En la técnica se pueden encontrar ejemplos de métodos para la síntesis de colecciones moleculares, por ejemplo, en: De itt et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, 1993; Erb et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994; Zuckermann et al . , J. Med. Chem. 37:2678, 1994; Cho et al., Science 261:1303, 1993; Carrell efc al . , Angew. Chem. Int . Ed. Engl. 33:2059, 1994; Carell et al . , Angew. Chem. Int . Ed. Engl . 33:2061, 1994; y Gallop et al . , J. Med. Chem. 37:1233, 1994. Además, si se desea, se puede modificar cualquier colección o compuesto fácilmente empleando métodos químicos, físicos o bioquímicos estándar.

También existen numerosos métodos disponibles para generar síntesis aleatorias o dirigidas (p. ej . , semisíntesis o síntesis totales) de cualquier número de polipéptidos, compuestos químicos, incluidos, sin carácter limitante, los compuestos basados en sacáridos, lípidos, péptidos y ácidos nucleicos. Las colecciones de compuestos sintéticos se pueden adquirir de los proveedores comerciales Brandon Associates (Merrimack, N.H.) y Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.). Como alternativa, los compuestos químicos que se van a utilizar como compuestos candidatos se pueden sintetizar a partir de materiales de partida fáciles de obtener empleando técnicas sintéticas estándar y metodologías conocidas por los expertos en la técnica. Las transformaciones de química sintética y las metodologías de grupos protectores (protección y desprotección) útiles a la hora de sintetizar los compuestos identificados por los métodos descritos en la presente son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, las que se describen en R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989) ; T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2.a ed. , John Wiley and Sons (1991) ; L. Fieser y M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) y ediciones posteriores de estos.

Las colecciones de compuestos se pueden presentar en solución (p. ej . , Houghten, Biotecf-nigues 13:412-421, 1992) o sobre microesferas (Lam, Nature 354:82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364:555-556, 1993), bacterias (Ladner, Patente de EE. UU. N.° 5.223.409), esporas (Ladner, Patente de EE. UU. N.° 5.223.409), plásmidos (Culi et al., Proc Nati Acad Sci USA 89:1865-1869, 1992) o sobre fagos (Scott y Smith, Science 249:386-390, 1990; Devlin, Science 249:404-406, 1990; Cwirla et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 87:6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991; Ladner supra.) .

Además, los expertos en la técnica del desarrollo y descubrimiento de fármacos se darán cuenta rápidamente de que, siempre que sea posible, se deberán emplear métodos de desreplicación (p. ej . , desreplicación taxonómica, desreplicación biológica y desreplicación química o cualquier combinación de estas) o la eliminación de replicados o repeticiones de materiales ya conocidos por su actividad.

Cuando se determina que un extracto crudo presenta actividad de unión a un bromodominio miembro de la familia BET, es necesario un fraccionamiento adicional del extracto candidato positivo para aislar los constituyentes moleculares responsables del efecto observado. De este modo, el objetivo del proceso de extracción, fraccionamiento y purificación es la identificación y caracterización cuidadosa de una entidad química dentro del extracto crudo que reduzca la viabilidad o proliferación de las células neoplásicas. Los métodos de fraccionamiento y purificación de estos extractos heterogéneos son conocidos en la técnica. Si se desea, los compuestos que han demostrado ser útiles como agentes terapéuticos se pueden modificar químicamente de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

La presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades y/o trastornos o síntomas de estos, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprenda un compuesto de las fórmulas de la presente a un sujeto (p. ej . , un mamífero tal como un ser humano) . De este modo, una modalidad es un método para tratar un sujeto que padece o es propenso a padecer una enfermedad o trastorno neoplásico o síntomas de estos. El método incluye el paso de administrar al mamífero una cantidad terapéutica de una cantidad de un compuesto de la presente suficiente para tratar la enfermedad o trastorno o síntomas de estos, en condiciones tales que se trate la enfermedad o trastorno.

Los métodos de la presente incluyen administrar al sujeto (incluido un sujeto que se ha identificado que necesita el tratamiento) una cantidad eficaz de un compuesto descrito en la presente o una composición descrita en la presente para producir el efecto. La identificación de un sujeto que necesite el tratamiento puede ser a juicio de un sujeto o profesional de la sanidad y puede ser subjetiva (p. e . , una opinión) u objetiva (p. ej . , que se pueda medir con una prueba o método de diagnóstico) .

Los métodos terapéuticos de la invención (que incluyen tratamiento profiláctico) comprenden en general la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos de la presente, tales como un compuesto de las formulas de la presente, a un sujeto (p. ej . , animal, ser humano) que lo necesite, incluido un mamífero, particularmente un ser humano. El tratamiento se administrará de forma adecuada a sujetos, particularmente seres humanos, que padezcan, que presenten, que sean propensos a padecer o que corran el riesgo de padecer una enfermedad, trastorno o síntomas de estos. La determinación de los sujetos "que corren el riesgo de padecer" se puede realizar mediante cualquier determinación objetiva o subjetiva con una prueba de diagnóstico o una opinión de un sujeto o profesional sanitario (p. ej . , prueba genética, marcador proteico o enzimático, Marcador (según se define en la presente) , antecedentes familiares y similares) . Los compuestos de la presente también se pueden emplear en el tratamiento de cualquier otro trastorno en el que pueda haber una neoplasia o inflamación implicada.

En una modalidad, la invención proporciona un método para monitorizar la evolución del tratamiento. El método incluye el paso de determinar un nivel de marcador de diagnóstico (Marcador) (p. ej . , cualquier diana definida en la presente modulada por un compuesto de la presente, una proteína o indicador de esta, etc.) o medida de diagnóstico (p. ej . , pantalla, ensayo) en un sujeto que padece o es propenso a padecer un trastorno o síntomas de este asociados con neoplasias, donde se ha administrado al sujeto una cantidad terapéutica de un compuesto de la presente suficiente para tratar la enfermedad o los síntomas de esta. El nivel del Marcador determinado en el método se puede comparar con niveles conocidos del Marcador en controles normales sanos o en otros pacientes afligidos para establecer el estado de la enfermedad del sujeto. En modalidades preferidas, se determina un segundo nivel de Marcador en el sujeto en un punto de evaluación posterior a la determinación del primer nivel, y se comparan los dos niveles para monitorizar el curso de la enfermedad o la eficacia de la terapia. En ciertas modalidades preferidas, se determina un nivel de pretratamiento del Marcador en el sujeto antes de iniciar el tratamiento de acuerdo con esta invención; este nivel de pretratamiento del Marcador qe puede comparar posteriormente con el nivel de Marcador en el sujeto después de iniciar el tratamiento, para determinar la eficacia del tratamiento .

Agentes terapéuticos f rmacéuticos En otras modalidades, los agentes que se ha descubierto que presentan valor medicinal (p. ej . , JQ1 o un compuesto de una fórmula que se define en la presente) empleando los métodos descritos en la presente son útiles como fármacos o a modo informativo para realizar una modificación estructural de compuestos existentes, p. ej . , mediante diseño racional de fármacos. Estos métodos son útiles para el análisis selectivo de agentes que ejercen un efecto sobre una neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis , oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios , el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina o para el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia .

Para usos terapéuticos, las composiciones o los agentes identificados empleando los métodos que se describen en la presente se pueden administrar sistémicamente, por ejemplo, formulados en un amortiguador farmacéuticamente aceptable tal como suero fisiológico. Las vías preferidas de administración incluyen, por ejemplo, inyecciones subcutáneas, intravenosas, intraperitoneales, intramusculares o intradermales que proporcionan niveles sostenidos y continuos del fármaco en el paciente. El tratamiento de pacientes humanos u otros animales se llevará a cabo empleando una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico identificado en la presente en un portador fisiológicamente aceptable. Los portadores adecuados y su formulación se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. La cantidad del agente terapéutico que se ha de administrar varía dependiendo del modo de administración, la edad y el peso corporal del paciente y con los síntomas clínicos de la neoplasia, enfermedad inflamatoria, obesidad, esteatosis hepática (EHNA o de otro tipo) , diabetes, aterosclerosis , oclusión de stent arterial, paro cardíaco, caquexia, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas relacionadas con los bromodominios , el tratamiento de parásitos, malaria, tripanosomas y para reducir la fertilidad masculina o para el uso en trasplantes de órganos, en la modulación del estado celular para medicina regenerativa (es decir, propiciando o inhibiendo la diferenciación celular) y para favorecer la pluripotencia. En general, las cantidades estarán comprendidas en el intervalo de las empleadas para otros agentes que se utilizan en el tratamiento de otras enfermedades asociadas con las enfermedades o estados, aunque en ciertos casos se necesitarán cantidades inferiores debido a la mayor especificidad del compuesto. Se administra un compuesto con una dosis que sea citotóxica para una célula neoplásica, que reduzca la actividad biológica de un miembro de la familia BET o que reduzca la proliferación, supervivencia o estado de invasión de una célula neoplásica, según se determina con un método conocido por un experto en la técnica, o empleando cualquier ensayo que mida la expresión o la actividad biológica de un miembro de la familia BET. En otra modalidad, el compuesto se administra con una dosis que reduzca la inflamación o un síntoma de la enfermedad inflamatoria.

Enfermedad inflamatoria Las composiciones de la invención, incluidos los compuestos de las fórmulas que se definen en la presente, son útiles para reducir la inflamación y para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. La inflamación es el resultado de una serie compleja de señales moleculares que implican el sistema inmunitario, normalmente como respuesta a la infección o el daño celular o tisular. La inflamación constituye normalmente la iniciación de la curación por parte del cuerpo; sin embargo, cuando no está regulada debidamente, la inflamación puede dar como resultado enfermedades crónicas tales como la artritis .

La expresión "respuesta inflamatoria" o "respuesta inmunitaria" se refiere a la reacción de los tejidos vivos frente a una lesión, infección o irritación caracterizada por enrojecimiento, calentamiento, hinchazón, dolor y pérdida de la función que se producen como resultado del aumento del flujo sanguíneo y una afluencia de secreciones y células inmunitarias . La inflamación es la reacción del cuerpo f ente a microorganismos infecciosos invasores y da como resultado un aumento del flujo sanguíneo en el área afectada, la liberación de agentes químicos que atraen glóbulos blancos, un mayor flujo de plasma y la llegada de monocitos para limpiar los desechos . Se dice que cualquier factor que estimule la respuesta inflamatoria es inflamatorio.

La cascada innata, o la respuesta inmunitaria innata, es la respuesta no específica coordinada por el sistema inmunitario y se caracteriza por la infiltración de células, tales como leucocitos, linfocitos citolíticos naturales, mastocitos, eosinófilos y basófilos, así como también fagocitos, tales como los neutrófilos, macrófagos y células dendríticas como respuesta a la señalización quimiotáctica en el sitio de lesión o infección. Las moléculas segregadas por las células mencionadas previamente, tales como la histamina y varias citocinas, y el sistema del complemento de las proteínas circulantes contribuyen a la inflamación.

Las enfermedades caracterizadas por inflamación son causas destacadas de morbilidad y mortalidad en seres humanos .

En ciertas modalidades, el trastorno inflamatorio es un trastorno reumatoide. Los trastornos reumatoides, tal como se utilizan en la presente, se refieren a cualquiera de los diferentes trastornos inflamatorios caracterizados por inflamación y en ocasiones degeneración y/o desequilibrio metabólico de las estructuras del tejido conectivo, especialmente las articulaciones, ligamentos y tendones. Los trastornos reumatoides normalmente provocan dolor, rigidez y/o limitación del movimiento. El tejido o los tejidos particulares afectados dependen del trastorno reumatoide. Los ejemplos de trastornos reumatoides incluyen, sin carácter limitante, artritis reumatoide, artritis juvenil, bursitis, espondilitis, gota, escleroderma, enfermedad de Still y vasculitis .

En ciertas modalidades, el trastorno reumatoide es artritis reumatoide y "tratar" la artritis reumatoide incluye reducir la gravedad, frecuencia y/o incidencia de uno o más de los síntomas de la artritis reumatoide. En otras modalidades, el trastorno reumatoide es artritis juvenil, bursitis, espondilitis, gota, escleroderma, enfermedad de Still o vasculit s. Los métodos de la invención reducen la gravedad, frecuencia y/o incidencia de uno cualquiera o más de los síntomas de estas afecciones.

En varias modalidades, los síntomas de la artritis u otras enfermedades inflamatorias incluyen enrojecimiento, hinchazón, inflamación, fiebre, menor intervalo de movimiento y dolor. Los ejemplos de reducción de la incidencia o gravedad de los síntomas incluyen, sin carácter limitante, reducir el número de articulaciones inflamadas, reducir el número de articulaciones dolorosas, reducir la dependencia de la medicación para el dolor, reducir la autoevaluación del paciente de la frecuencia o gravedad de su dolor, aumentar la libertad de movimiento, aumentar la movilidad, reducir la fiebre y aumentar la capacidad para realizar tareas cotidianas .

La neuroinflamación, caracterizada por astrocitos y microglías activadas y la expresión local de una amplia gama de mediadores inflamatorios, es una reacción fundamental a la lesión cerebral, ya sea por trauma, accidente cerebrovascular, infección o neurodegeneración. Se cree que esta respuesta del tejido local es parte de un proceso de restauración y reparación. Del mismo modo que muchas afecciones inflamatorias en enfermedades periféricas, la neuroinflamacion puede contribuir a la patofisiología de los trastornos del SNC.

En ciertas modalidades, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio de la piel. Los trastornos inflamatorios de la piel incluyen, sin carácter limitante, rosácea, dermatitis atópica, acné, dermatitis seborreica y celulitis .

En otras modalidades, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad cardiovascular inflamatoria o isquémica. Una enfermedad o trastorno cardiovascular inflamatorio puede ser, sin carácter limitante, una enfermedad o trastorno oclusivo, aterosclerosis , una valvulopatía, estenosis, restenosis, estenosis intra-stent, infarto de miocardio, arteriopatia coronaria, síndromes coronarios agudos, fallo cardíaco congestivo, angina de pecho, isquemia miocárdica o trombosis. En otras modalidades, el sitio es un sitio secundario de lesión isquémica tal como el SNC o el riñon.

En otras mr lalidades, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad intestinal inflamatoria o isquémica.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se refiere a una enfermedad inflamatoria recurrente crónica de etiología indefinida que afecta al intestino delgado y el colon y que incluye la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) . La enfermedad de Crohn puede implicar cualquier porción del tubo digestivo pero más habitualmente implica el intestino delgado distal y/o el colon. La colitis ulcerosa implica solo el colon y generalmente se limita al recto o el colon distal. Los estudios con modelos murinos de EC y CU sugieren rotundamente que estas dos enfermedades son debidas a la mala regulación de la respuesta inmunitaria de la mucosa frente a antígenos en la microflora de la mucosa (Sartor, R. B. (1995) . Gastroenterol Clin North Am 24, 475-507) (Strober W, et al. (2002) Annu. Rev. Iwmunol . 20:495-549).

La colitis ulcerosa o colitis indeterminada se refiere a una afección del colon caracterizada por un estado de inflamación en el que se pueden detectar una o más de las siguientes características histológicas: una inflamación superficial caracterizada por la presencia de pérdida de células epiteliales y formación desigual de úlceras, reducción pronunciada de células calciformes que producen mucinas y reducción de la densidad de las glándulas tubulares. Además, en la lámina propia, se observa una infiltración de células inflamatorias mixtas constituida por linfocitos y granulocitos (constituidos los últimos principalmente por neutrófilos y, en menor grado, eosinófilos) asociados con una exudación de células en el lumen intestinal. Además, a nivel de la submocosa se puede observar un edema marcado con pocas células inflamatorias, mientras que, en la capa del músculo externo, un experto en la técnica detectaría poca o ninguna inflamación. Remítase, p. ej . , a Boirivant et al. Journal of Experimental Medicine 188: 1929-1939 (1998). Los síntomas clínicos pueden incluir, sin carácter limitante, diarrea, prolapso rectal, pérdida de peso, dolor abdominal y deshidratación.

La enfermedad de Crohn se refiere a una inflamación que afecta a cualquier parte del aparato digestivo, aunque en la mayoría de los casos afecta a la parte terminal del intestino delgado y/o el colon ascendente adyacente. Frecuentemente, la inflamación se caracteriza por "lesiones fragmentadas" constituidas por áreas de inflamación que se alternan con áreas de mucosa normal. El área afectada del intestino en la enfermedad de Crohn está marcada por eritema, edema y mayor friabilidad; en ocasiones el intestino presenta estenosis y está unido a otros órganos abdominales o a la pared intestinal. No es infrecuente encontrar fístulas entre el intestino afectado y otras estructuras, incluida la piel. El examen microscópico del tejido en la enfermedad de Crohn revela erosiones epiteliales, pérdida de células calciformes que producen mucinas y una gran infiltración linfocítica que implica todas las capas de la mucosa; esta infiltración contiene en ocasiones células gigantes que indican la formación de granulomas. Cuando la inflamación está presente durante un periodo largo de tiempo (crónica) , en ocasiones puede provocar cicatrices (fibrosis) . Normalmente el tejido cicatricial no es tan flexible como el tejido sano. Por consiguiente, cuando hay fibrosis en los intestinos, las cicatrices pueden estrechar la amplitud del pasaje (lumen) de los segmentos implicados del intestino. Estas áreas contraídas se denominan estenosis. Las estenosis pueden ser moderadas o severas, dependiendo de la medida en que bloqueen el contenido del intestino a la hora de pasar a través del área comprimida. Los síntomas/signos clínicos de la enfermedad de Crohn pueden incluir, sin carácter limitante: caquexia, pérdida de peso, poco crecimiento, dolor abdominal, fístulas con supuración, prolapso rectal y deshidratación.

En ciertas modalidades, una enfermedad o trastorno hepático inflamatorio. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno hepático inflamatorio seleccionado del grupo constituido por hepatitis autoinmunitaria, cirrosis hepática y cirrosis biliar.

Formulación de composiciones farmacéuticas La administración de un compuesto para el tratamiento de una neoplasia o enfermedad inflamatoria se puede realizar mediante cualquier método adecuado que dé como resultado una concentración del agente terapéutico que, combinada con otros componentes, sea eficaz para mejorar, reducir o estabilizar una neoplasia o enfermedad inflamatoria. El compuesto puede estar contenido en cualquier cantidad adecuada en cualquier sustancia portadora adecuada y está generalmente presente en una cantidad de un 1-95% en peso del peso total de la composición. La composición se puede proporcionar en una forma farmacéutica que sea adecuada para una vía de administración parenteral (p. ej . , subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal) . Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (remítase, p. ej . , a Remington : The Science and Practice of Pharmacy (20.a ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Phar aceutical Technology, eds . J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York) .

Las cantidades de las dosis humanas se pueden determinar inicialmente por extrapolación a partir de la cantidad de compuesto utilizada en ratones como un experto reconocerá es una práctica rutinaria en la técnica modificar la dosis para humanos en comparación con los modelos animales. En ciertas modalidades, se contempla que la dosis puede variar desde 1 pg de compuesto/kg de peso corporal hasta aproximadamente 5000 mg de compuesto/kg de peso corporal; o desde aproximadamente 5 mg/ g de peso corporal hasta aproximadamente 4000 mg/Kg de peso corporal o desde aproximadamente 10 mg/Kg de peso corporal hasta aproximadamente 3000 mg/Kg de peso corporal; o desde aproximadamente 50 mg/Kg de peso corporal hasta aproximadamente 2000 mg/Kg de peso corporal; o desde aproximadamente 100 mg/Kg de peso corporal hasta aproximadamente 1000 mg/Kg de peso corporal; o desde aproximadamente 150 mg/Kg de peso corporal hasta aproximadamente 500 mg/Kg de peso corporal. En otras modalidades, la dosis puede ser de aproximadamente 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 o 5000 mg/Kg de peso corporal. En otras modalidades, se contempla que las dosis pueden estar comprendidas en el intervalo desde aproximadamente 5 mg de compuesto/Kg de peso corporal hasta aproximadamente 20 mg de compuesto/Kg de peso corporal. En otras modalidades, las dosis pueden ser de aproximadamente 8, 10, 12, 14, 16 o 18 mg/Kg de peso corporal. Obviamente, esta cantidad de la dosis se puede ajustar aumentándola o reduciéndola, como se realiza rutinariamente en tales protocolos de tratamiento, dependiendo de los resultados de los ensayos clínicos iniciales y las necesidades de un paciente particular.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden formular para que liberen el compuesto activo de forma sustancial inmediatamente tras la administración o en cualquier momento predeterminado o periodo de tiempo después de la administración. Este último tipo de composiciones se conocen generalmente como formulaciones de liberación controlada, que incluyen (i) formulaciones que crean una concentración sustancialmente constante del fármaco en el cuerpo durante un periodo prolongado de tiempo; (ii) formulaciones que, tras un desfase temporal predeterminado, crean una concentración sustancialmente constante del fármaco en el cuerpo durante un periodo prolongado de tiempo; (iii) formulaciones que conservan la acción durante un periodo predeterminado de tiempo manteniendo un nivel relativamente constante y eficaz en el cuerpo, a la vez que minimizan los efectos secundarios indeseables asociados con las fluctuaciones en el nivel de la sustancia activa en plasma (patrón cinético de tipo onda de sierra) ; (iv) formulaciones que localizan la acción mediante, p. ej . , la ubicación espacial de una composición de liberación controlada adyacente o en contacto con el timo; (v) formulaciones que hacen posible una dosificación adecuada, de manera que las dosis se administran, por ejemplo, una vez por semana o cada dos semanas; y (vi) formulaciones que actúan sobre una neoplasia o enfermedad inflamatoria empleando portadores o derivados químicos para suministrar el agente terapéutico a un tipo de célula particular (p. ej . , una célula neoplásica) . Para algunas aplicaciones, las formulaciones de liberación controlada no necesitan dosificación frecuente durante el día para mantener el nivel en plasma en un nivel terapéutico.

Se puede seguir cualquiera de las diferentes estrategias existentes para obtener una liberación controlada en la que la tasa de liberación sea mayor que la tasa del metabolismo del compuesto en cuestión. En un ejemplo, la liberación controlada se obtiene mediante la selección adecuada de varios ingredientes y parámetros de formulación, que incluyen, p. ej . , varios tipos de recubrimientos y composiciones de liberación controlada. De este modo, el agente terapéutico se formula con excipientes adecuados en una composición farmacéutica que, al administrarla, libera el agente terapéutico de manera controlada. Los ejemplos incluyen composiciones de cápsulas o comprimidos de unidades únicas p múltiples, soluciones oleosas, suspensiones, emulsiones, microcápsulas , microesferas , complejos moleculares, nanopartículas , parches y liposomas .

Composiciones parenterales La composición farmacéutica se puede administrar por vía parenteral mediante inyección, infusión o implante (subcutáneo, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal o similares) en formas farmacéuticas, formulaciones o mediante implantes o dispositivos de suministro adecuados que contengan portadores y adyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales y atóxicos. La formulación y la preparación de las composiciones son bien conocidas por los expertos en el campo de la formulación farmacéutica. Las formulaciones se pueden encontrar en Remington: The Science and Practice of Phar acy, supra.

Las composiciones para uso parenteral se pueden proporcionar en formas farmacéuticas unitarias (p. ej . , en ampollas de dosis única) o en viales que contengan varias dosis y a los que se puede añadir un conservante adecuado (remítase más adelante) . La composición puede adoptar la forma de una solución, una suspensión, una emulsión, un dispositivo de infusión o un dispositivo de suministro para implante, o se puede presentar como un polvo seco que se ha de reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Además del agente activo que reduce o mejora una neoplasia o enfermedad inflamatoria, la composición puede incluir portadores y/o excipientes parenteralmente aceptables adecuados. El o los agentes terapéuticos activos se pueden incorporar a microesferas , microcápsulas , nanopartículas, liposomas o similares para la liberación controlada. Además, la composición puede incluir agentes de suspensión, solubilizantes , estabilizantes, agentes para ajustar el pH, para ajustar la tonicidad y/o agentes dispersantes.

Según se ha indicado previamente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden adoptar una forma adecuada para inyección estéril. Para preparar una composición de este tipo, el o los agentes terapéuticos antineoplásicos activos adecuados se disuelven o suspenden en un vehículo líquido parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear, se encuentran el agua, agua con un pH adecuado ajustado mediante la adición de una cantidad adecuada de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o un amortiguador adecuado, 1,3-butanodiol, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro sódico y solución de dextrosa. La formulación acuosa también puede contener uno o más conservantes (p. ej . , p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo) . En los casos en que uno de los compuestos sea solo poco o ligeramente soluble en agua, se podrá añadir una disolución que potencie o solubilice el agente, o el disolvente podrá incluir un 10-60% p/p de propilenglicol o similares.

Composiciones parenterales de liberación controlada Las composiciones parenterales de liberación controlada pueden adoptar la forma de suspensiones acuosas, microesferas , microcápsulas , microesferas magnéticas, soluciones oleosas, suspensiones oleosas o emulsiones. Como alternativa, el fármaco activo se puede incorporar a portadores biocompatibles, liposomas, nanopartículas, implantes o dispositivos de infusión.

Los materiales para emplear en la preparación de microesferas y/o microcápsulas son, p. ej . , polímeros biodegradables/bioerosionables tales como poligalactina, poli (cianoacrilato de isobutilo) , poli (2-hidroxietil-L- glutaminina) y poli (ácido láctico). Los portadores biocompatibles que se pueden emplear cuando se formula una formulación parenteral de liberación controlada son carbohidratos (p. ej . , dextranos) , proteínas (p. ej . , albúmina), lipoproteínas o anticuerpos. Los materiales para emplear en implantes pueden ser no biodegradables (p. ej . , polidimetilsiloxano) o biodegradables (p. ej . , poli (caprolactona) , poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) o poli (ortoesteres) o combinaciones de estos).

Formas sólidas de dosificación para uso oral Las formulaciones para uso oral incluyen comprimidos que contienen el o los principios activos en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables atóxicos. Estas formulaciones son conocidas por los expertos. Los excipientes pueden ser, por ejemplo, rellenadores o diluyentes inertes (p. ej . , sacarosa, sorbitol, azúcar, manitol, celulosa microcristalina, almidones que incluyen el almidón de la papa, carbonato de calcio, cloruro de sodio, lactosa, fosfato de calcio, sulfato de calcio o fosfato de sodio) ; agentes granulantes o desintegrantes (p. ej . , derivados de la celulosa que incluyen celulosa microcristalina, almidones que incluyen el almidón de la papa, croscarmelosa sódica, alginatos o ácido algínico) ; agentes aglutinantes (p. ej . , sacarosa, glucosa, sorbitol, acacia, ácido algínico, alginato de sodio, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, silicato de aluminio y magnesio, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona o polietilenglicol) y agentes lubricantes, deslizantes y antiadhesivos (p. ej . , estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados o talco) . Otros excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes saborizantes , plastificantes , humectantes, agentes amortiguadores y similares.

Los comprimidos pueden no estar recubiertos o pueden estar recubiertos empleando técnicas conocidas, opcionalmente para retrasar la desintegración y absorción en el tubo gastrointestinal y, por consiguiente, proporcionar una acción sostenida durante un mayor periodo de tiempo. Se puede adaptar el recubrimiento para que libere el fármaco activo siguiendo un patrón predeterminado (p. ej . , para conseguir una formulación de liberación controlada) o se puede adaptar para que no libere el fármaco activo hasta después de que pase por el estómago (recubrimiento entérico) . El recubrimiento puede ser un recubrimiento de azúcar, un recubrimiento pelicular (p. ej . , basado en hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolímeros de tipo acrilato, polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona) o un recubrimiento entérico (p. ej . , basado en un copolímero de ácido metacrílico, acetato- ftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato- ftalato de polivinilo, shellac y/o etilcelulosa) . Además, se puede emplear un material temporizador tal como, p. ej . , monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las composiciones de comprimidos sólidos pueden incluir un recubrimiento adaptado para proteger la composición de cambios químicos indeseados (p. ej . , degradación química antes de la liberación de la sustancia terapéutica activa) . El recubrimiento se puede aplicar sobre la forma farmacéutica sólida en un modo similar al que se describe en Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, supra.

En el comprimido se pueden mezclar conjuntamente al menos dos agentes terapéuticos, o se pueden repartir. En un ejemplo, el primer agente terapéutico activo contra neoplasias está contenido en el interior del comprimido y el segundo agente terapéutico activo está en el exterior, de manera que una porción sustancial del segundo agente terapéutico se libera antes de la liberación del primer agente terapéutico.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como comprimidos masticables o como cápsulas de gelatina dura, donde el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (p. ej . , almidón de la papa, lactosa, celulosa microcristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín) , o como cápsulas de gelatina blanda, donde el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva. Se pueden preparar polvos y granulados empleando los ingredientes mencionados previamente en comprimidos y cápsulas de modo convencional empleando, p. ej . , una mezcladora, un aparato de lecho fluido o un kit de secado por pulverización .

Formas farmacéuticas orales de liberación controlada Las composiciones de liberación controlada para uso oral se pueden construir, p. ej . , para que liberen el agente terapéutico activo antiinflamatorio o contra neoplasias controlando la disolución y/o la difusión de la sustancia activa. La liberación controlada por disolución o difusión se puede obtener con un recubrimiento adecuado de una formulación de compuestos de un comprimido, cápsula, pellet o granulado, o incorporando el compuesto a una matriz adecuada. El recubrimiento de liberación controlada puede incluir una o más de las sustancias de recubrimiento mencionadas previamente y/o, p. ej . , shellac, cera de abejas, glycowax, cera de ricino, cera de carnauba, alcohol estearílico, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulosa, resinas acrílicas, ácido dl-poliláctico, acetato-butirato de celulosa, cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo, vinilpirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metilmetacrilato, 2-hidroximetacrilato, hidrogeles de metacrilato, 1 , 3 -butilenglicol , metacrilato de etilenglicol y/o polietilenglicoles . En una formulación matricial de liberación controlada, el material de la matriz también puede incluir, p. ej . , metilcelulosa hidratada, cera de carnauba y alcohol estearílico, carbopol 934, silicona, triestearato de glicerilo, metilacrilato-metilmetacrilato, cloruro de polivinilo, polietileno y/o fluorocarburo halogenado.

Una composición de liberación controlada que contenga uno o más compuestos terapéuticos también puede adoptar la forma de un comprimido o cápsula flotante (es decir, un comprimido o cápsula que, tras la administración oral, flota en la superficie del contenido gástrico durante cierto periodo de tiempo) . Una formulación de comprimido flotante del o los compuestos se puede preparar granulando una mezcla del o los compuestos con excipientes y un 20-75% p/p de hidrocoloides tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa. A continuación, los gránulos obtenidos se pueden comprimir para formar comprimidos. Al entrar en contacto con el jugo gástrico, el comprimido forma una barrera de tipo gel sustancialmente impermeable en agua alrededor de su superficie. Esta barrera de tipo gel contribuye a mantener una densidad inferior a uno, con lo que permite que el comprimido permanezca flotante en el jugo gástrico.

Terapias combinadas Opcionalmente, un agente terapéutico antiinflamatorio o contra neoplasias se puede administrar combinado con cualquier terapia estándar antiinflamatoria o contra neoplasias conocida en la técnica; estos métodos son conocidos por los expertos y se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. Si se desea, los agentes de la invención (p. ej . , JQ1, compuestos de fórmulas definidas en la presente y derivados de estos) se administran combinados con cualquier terapia convencional contra neoplasias, incluida, sin carácter limitante, la cirugía, terapia radiológica o quimioterapia. En modalidades preferidas, un compuesto de la invención se administra combinado con un modulador epigenético o de la transcripción (p. ej . , inhibidor de la ADN-metiltransferasa, inhibidor de la histona-desacetilasa (inhibidor de HDAC) , inhibidor de la lisina-metiltransferasa) , con fármacos antimitóticos (p. ej . , taxanos, alcaloides de tipo vinca) , moduladores de receptores hormonales (p. ej . , moduladores de receptores de estrógenos, moduladores de receptores de andrógenos) , inhibidores de la cascada de señalización celular (p. ej . , inhibidores de tirosina-cinasa) , moduladores de la estabilidad proteica (inhibidores de proteasomas) , inhibidores de hsp90, agentes quimioterapéuticos convencionales, glucocorticoides, ácido retinoico todo-trans u otros agentes que fomentan la diferenciación.

Kits o sistemas farmacéuticos Las composiciones de la presente se pueden agrupar en kits o sistemas farmacéuticos para su uso en la mejora de una neoplasia o enfermedad inflamatoria. Los kits o composiciones farmacéuticas de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden un medio portador, tal como una caja, un envase de cartón, un tubo o similares, que contiene confinados en un espacio reducido uno o más medios contenedores tales como viales, tubos, ampollas, botellas y similares. Los kits o sistemas farmacéuticos de la invención también pueden comprender instrucciones asociadas para emplear los agentes de la invención.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están englobadas en el ámbito de los expertos. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía, por ejemplo, en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook, 1989) ; "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984) ; "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987) ; "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996) ; "Gene Transfer Vectors for ammalian Cells" (Miller y Calos, 1987) ; "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" , (Mullís, 1994) ; "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991) . Estas técnicas se pueden aplicar a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención y, en este sentido, pueden ser consideradas a la hora de realizar y llevar a la práctica la invención. Las técnicas particularmente útiles para modalidades particulares se discutirán en las secciones que siguen a continuación.

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa de cómo preparar y emplear el ensayo, análisis selectivo y los métodos terapéuticos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención .

EJEMPLOS La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están englobadas en el ámbito de los expertos . Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía, por ejemplo, en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook, 1989) ; "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996) ; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller y Calos, 1987) ; "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" , (Mullis, 1994) ; "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991) . Estas técnicas se pueden aplicar a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención y, en este sentido, pueden ser consideradas a la hora de realizar y llevar a la práctica la invención. Las técnicas particularmente útiles para modalidades particulares se discutirán en las secciones que siguen a continuación.

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo preparar y emplear el ensayo, análisis selectivo y los métodos terapéuticos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención.

I. EJEMPLOS QUÍMICOS - SINTESIS Y MÉTODOS DE PREPARACIÓN Los compuestos de la invención se pueden sintetizar mediante los métodos que se describen en la presente y/o de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica teniendo en cuenta la descripción de la presente.

Esquema de reacción SI. Síntesis del inhibidor bromodominios racémico (+) -JQ1 (2-Amino-4 , 5-dimetiltiofen- 3- il) (4-clorofenil) metanona (S2) El compuesto JQ1 se preparó de acuerdo con el esquema de reacción indicado previamente .

Se añadió azufre (220 mg, 6.9 mmol, 1.00 eq) como sólido a una solución de 4-clorobenzoilacetonitrilo SI (1.24 g, 6.9 mmol, 1 eq) , 2-butanona (0.62 mi, 6.9 mmol, 1.00 eq) y morfolina (0.60 mi, 6.9 mmol, 1.00 eq) en etanol (20 mi, 0.35 M) a 23 °C.21 A continuación, la mezcla se calentó hasta 70 °C. Después de 12 horas, la mezcla de reacción se enfrió hasta 23 °C y se vertió sobre salmuera (100 mi) . La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mi) . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 mi) , se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash RF, 40 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener S2 (1.28 g, 70%) como un sólido amarillo.

(S) -3- ( { [ ( 9H-Fluoren- 9 -il) metoxi] carbonil }amino) -4- { [3- (4-clorobenzoil) -4 , 5-dimetiltiofen-2-il] amino} -4-oxobutanoato de tert-butilo (S3) Se añadieron hexafluorofosfato de (2- (6-cloro-lH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3 , 3 -tetrametilaminio (HCTU) (827 mg, 2.0 mmol, 2.00 eq) y N, W-diisopropiletilamina (0.72 mi, 4.0 mmol, 4.00 eq) secuencialmente a una solución del éster ß-tert-butílico del ácido 9-fluorenilmetoxicarbonilaspártico [Fmoc-Asp (Ot-Bu) -OH] (864 mg, 2.1 mmol, 2.10 eq) en N,N-dimetilformamida (1.5 mi, 1.0 M) . A continuación, la mezcla se agitó a 23 °C durante 5 min. Después se añadió S2 (266 mg, 1.0 mmol, 1 eq) como sólido. La mezcla de reacción se agitó a 23 °C. Después de 16 horas, se añadieron acetato de etilo (20 mi) y salmuera (20 mi) . Las dos fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 mi) . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (30 mi) , se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (Combiflash RF, 40 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener S3 (625 mg, 90%) como un sólido de color café.

(S) -3-Amino-4- ( (3- (4-clorobenzoil) -4 , 5-dimetiltiofen-2-il) amino) -4-oxobutanoato de tert-butilo (S4) El compuesto S3 (560 mg, 0.85 mmol, 1 eq) se disolvió en una solución de piperidina al 20% en DMF (4.0 mi, 0.22 M) a 23 °C. Después de 30 min, se añadieron acetato de etilo (20 mi) y salmuera (20 mi) a la mezcla de reacción. Las dos fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 mi) . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (3 x 25 mi) , se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash RF, 24 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener la amina libre S4 (370 mg, 90%) como un sólido amarillo. La pureza enantiomérica se redujo hasta un 75% (determinada con cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) Berger empleando una columna AS-H) .

(S) -2- (5- (4-Clorofenil) -6, 7-dimetil-2-oxo-2 , 3-dihidro-lH-tieno [2, 3-e] [1, 4] diazepin-3-il) acetato de tert-butilo (S5) La aminocetona (S4) (280 mg, 0.63 mmol) se disolvió en una solución de ácido acético al 10% en etanol (21 mi, 0.03 ) . La mezcla de reacción se calentó hasta 85 °C. Después de 30 minutos, se eliminaron todos los disolventes a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash RF, 12 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener el compuesto S5 (241 mg, 95%) como un sólido blanco. La pureza enantiomérica de S5 fue de un 67% (determinada con cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) Berger empleando una columna AS-H) . 2- (5- (4-Clorofenil) -6, 7-dimetil-2-tioxo-2 , 3 -dihidro-lH-tieno[2,3-e] [1 , 4] diazepin-3 -il) acetato de tert-butilo (S6) Se añadieron pentasulfuro de fósforo (222 mg, 1.0 mmol, 2.00 eq) y bicarbonato de sodio (168 mg, 2.0 mmol, 4.00 eq) secuencialmente a una solución de S5 (210 mg, 0.5 mmol, 1 eq) en diglime (1.25 mi, 0.4 M) . La mezcla de reacción se calentó hasta 90 °C. Después de 16 h, se añadieron salmuera (20 mi) y acetato de etilo (35 mi) . Las dos fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 mi) . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 15 mi) , se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash RF, 24 gramos ¾e gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener S6 (141 mg, 65%) como un sólido de color café que contenía S5 recuperado (73 mg, 34%) . 2- (4- (4-Clorofenil) -2,3, 9-trimetil-6H-tieno [3,2-f] [1,2,4] triazolo [4 , 3 -a] [1, 4] diazepin-6-il) acetato de tert-butilo [(±)JQ1] Se añadió hidrazina (0.015 mi, 0.45 mmol, 1.25 eq) a una solución de S6 (158 mg, 0.36 mmol, 1 eq) en THF (2.6 mi, 0.14 M) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó hasta 23 °C y se agitó a 23 °C durante 1 h. Se eliminaron todos los disolventes a presión reducida. La hidrazina resultante se empleó directamente sin purificación. A continuación, la hidrazina se disolvió en una mezcla 2:3 de ortoacetato de trimetilo y tolueno (6 mi, 0.06 M) . La mezcla de reacción se calentó hasta 120 °C. Después de 2 h, se eliminaron todos los disolventes a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash, 4 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener JQ1 (140 mg, 85% en dos pasos) como un sólido blanco. Las condiciones de reacción epimerizaron adicionalmente el centro estereogénico, lo cual dio como resultado el racemato de JQ1 (que se determinó mediante cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) Berger con una columna AS-H) .

Esquema de reacción 32. Síntesis de (+)-JQl enriquecido enantioméricamente (5) -3- ({ [ (9H-Fluoren-9-il) metoxi] carbonil} amino) -4-{ [3-(4-clorobenzoil) -4 , 5-dimetiltiofen-2-il] amino} -4 -oxobutanoato de tert-butilo (S3) Se añadieron (benzotriazol-1-iloxil) tripirrolidinofosfonio (PyBOP) (494 mg, 0.95 mmol, 0.95 eq) y N, N-diisopropiletilamina (0.50 mi, 2.8 mmol, 2.75 eq) secuencialmente a una solución del éster ß - tert-butílico del ácido 9-fluorenilmetoxicarbonilaspártico [Fmoc-As (Ot-Bu) -OH] (411 mg, 1.00 mmol, 1.0 eq) en N, N-dimetilformamida (1.0 mi, 1.0 M) . A continuación, la mezcla se agitó a 23 °C durante 5 min. Después se añadió S2 (266 mg, 1.0 mmol, 1 eq) como sólido. La mezcla de reacción se agitó a 23 °C. Después de 4 h, se añadieron acetato de etilo (20 mi) y salmuera (20 mi) . Las dos fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 mi) . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash RF, 40 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener S3 (452 mg, 72%) como un sólido de color café .

(S) -3-Amino-4- ( (3- (4 -clorobenzoil) -4, 5-dimetiltiofen-2 -il) amino) -4-oxobutanoato de tert-butilo (S4) El compuesto S3 (310 mg, 0.47 mmol, 1 eq) se disolvió en una solución de piperidina al 20% en DMF (2.2 mi, 0.22 M) a 23 °C. Después de 30 min, se añadieron acetato de etilo (20 mi) y salmuera (20 mi) a la mezcla de reacción. Las dos fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 mi) . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (3 x 25 mi) , se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash RF, 24 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexano) para obtener la amina libre S4 (184 mg, 90%) como un sólido amarillo. La pureza enantiomérica fue de un 91% (evaluada con cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) Berger empleando una columna AS-H) .

(S) -2- (5- (4-Clorofenil) -6 , 7-dimetil-2-oxo-2 , 3-dihidro-lH-tieno [2, 3-e] [1, 4] diazepin-3-il) acetato de tert-butilo (S5) La aminocetona (S4) (184 mg, 0.42 mmol) se disolvió en tolueno (10 mi, 0.04 M) . Se añadió gel de sílice (300 mg) y la mezcla de reacción se calentó hasta 90 °C. Después de 3 h, la mezcla de reacción se enfrió hasta 23 °C. El gel de sílice se filtró y se lavó con acetato de etilo. Los filtrados combinados se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash RF, 12 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener el compuesto S5 (168 mg, 95%) como un sólido blanco. La pureza enantiomérica de S5 fue de un 90% (determinada con cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) Berger empleando una columna AS-H) .

{S) -2- (4- (4-Clorofenil) -2,3, 9-trimetil-6íí-tieno [3,2-f] [1 , 2 , 4] triazolo [4 , 3-a] [1 , 4] diazepin-6-il) acetato de tert-butilo [(±)JQ1] Se añadió tert-butóxido de potasio (solución 1.0 M en THF, 0.3 mi, 0.30 mmol, 1.10 eq) a una solución de S5 (114 mg, 0.27 mmol, 1 eq) en THF (1.8 mi, 0.15 M) a -78 °C. La mezcla de reacción se calentó hasta -10 °C y se agitó a 23 °C durante 30 min. La mezcla de reacción se enfrió hasta -78 °C. Se añadió clorofosfato de dietilo (0.047 mi, 0.32 mmol, 1.20 eq) a la mezcla de reacción.22 La mezcla resultante se calentó hasta -10 °C durante 45 min. Se añadió hidrazida acética (30 mg, 0.40 mmol, 1.50 eq) a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se agitó a 23 °C. Después de 1 h, se añadió 1-butanol (2.25 mi) a la mezcla de reacción, la cual se calentó hasta 90 °C. Después de 1 h, se eliminaron todos los disolventes a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (sistema Combiflash, 4 gramos de gel de sílice, gradiente de un 0 a un 100% de acetato de etilo-hexanos) para obtener (+)-JQl (114 mg, 92%) como un sólido blanco con un 90% de pureza enantiomérica (determinada con cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) Berger empleando una columna AS-H, 85% de hexanos-metanol, 210 nm, tR (enantiomero R) = 1.59 min, tR (enantiomero S) = 3.67 min) . El producto se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa quiral (cromatografía líquida de alta resolución Agilent empleando una columna OD-H) para obtener el enantiomero S con un ee superior al 99%.

XH RMN (600 MHz, CDCl3, 25 °C) d 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.31 (d, J = 8.4 Hz , 2H) , 4.54 (t, J" = 6.6 MHz, 1H) , 3.54-3.52 (m, 2H) , 2.66 (s, 3H) , 2.39 (s, 3H) , 1.67 (s, 3H) , 1.48 (s, 9H) . 13C RMN (150 MHz, CDC13, 25 °C) d 171.0, 163.8, 155.7, 150.0, 136.9, 131.1, 130.9, 130.6, 130.3, 128.9, 81.2, 54.1, 38.1, 28.4, 14.6, 13.5, 12.1.

HRMS(ESI) calculada para C21H24CI 2O3S [M+H]+: 457.1460, experimental 457.1451 m/z.

TLC (EtOAc) , Rf: 0.32 (UV) [a]22D = + 75 (C 0.5, CHC13) ( -) -JQ1 se sintetizó de modo similar, empleando Fmoc-D-Asp (Ot-Bu) -OH como material de partida, y se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa quiral (cromatografía líquida de alta resolución Agilent empleando una columna OD-H) para obtener el enantiómero R con un ee superior al 99%. [a]22D = - 72 (c 0.5, CHC13) Síntesis de otros compuestos Se prepararon otros compuestos de la invención según se ilustra en el Esquema de reacción S3.

Esquema de reacción S3. Síntesis de derivados de hidrazina (4) Según se muestra en el Esquema de reacción S3, se escindió el éster tert-butílico de (+)-JQl (1) para obtener el ácido libre (2) , que se acopló con hidrazina para obtener la hidrazida (3) . La reacción con 4-hidroxibenzaldehido proporcionó la hidrazona (4) .

Tanto la hidrazida (3) como la hidrazona (4) presentaron actividad en al menos un ensayo biológico.

Se preparó una colección de compuestos haciendo reaccionar la hidrazida (3) con una serie de compuestos que contenían carbonilo (remítase a la Tabla A anterior) .

Se prepararon otros compuestos para emplear, p. ej . , como sondas para el desarrollo de ensayos. En el Esquema de reacción S4 a continuación se muestra una síntesis a modo de ejemplo.

Esquema de reacción S4. Síntesis de derivados útiles como sondas Se prepararon otros compuestos según se muestra en la Tabla B a continuación: i97 Los datos de los espectros para cada compuesto fueron coherentes con la estructura asignada.

II. ACTIVIDAD BIOLÓGICA Ejemplo 1: JQl La Figura 1 muestra los enantiómeros de JQl .

Ejemplo 2: JQl desplaza BRD4 de la cromatina nuclear en células Para establecer si JQl se unía a bromodominios de forma competitiva con la cromatina en un entorno celular, se realizaron experimentos de recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP, por sus siglas en inglés) en BRD4. Estudios previos han demostrado la utilidad de FRAP a la hora de evaluar la velocidad de redistribución lateral de una quimera fluorescente que contiene un bromodominio tras el fotoblanqueo selectivo de regiones discretas de la cromatina nuclear.27 Las células de osteosarcoma humano (U20S) transíectadas con GFP-BRD4 exhiben una recuperación de la intensidad de fluorescencia que depende del tiempo (Fig. 2A y 2B) . En presencia de JQl (500 nM) , la recuperación observada es inmediata, lo cual es coherente con el BRD4 nuclear desplazado (Fig. 3A y 3B) . Los estudios celulares de FRAP confirmaron que los efectos de la fracción móvil de BRD4 se limitan al estereoisómero bioquímicamente activo (+) -JQl (Figura 2A-2C) .

Una vez demostrada la unión selectiva y potente a BRD4 en ensayos homogéneos y basados en células, se evaluó el efecto de JQ1 en fenotipos celulares dependientes de BRD4 y relevantes para enfermedades. La proteína de fusión BRD4-NUT patógena que surge de la traslocación t(15;19) en NMC se une firmemente a focos discretos de cromatina acetilada, con lo que confiere una ventaja proliferativa y un bloqueo de la diferenciación. Se evaluó la capacidad de JQ1 para actuar directamente sobre la oncoproteína BRD4-NUT empleando FRAP. En comparación con un control de vehículo, JQ1 (500 nM) aceleró de forma destacada el tiempo para la recuperación de la intensidad de fluorescencia en regiones fotoblanqueadas de células transfectadas con GFP-BRD4 -NUT (Fig. 3C, 3E) . Cabe destacar que no se observó ningún efecto sobre la redistribución de GFP-NUT (Fig. 3D, 3E) . En resumen, estos datos son coherentes con la unión competitiva de JQ1 a BRD4 en células cultivadas .

Ejemplo 5: JQ1 induce diferenciación escamosa y detención del crecimiento en carcinomas dependientes de BRD4 La inhibición directa de los productos génicos que se expresan a partir de traslocaciones oncogénicas recurrentes es una estrategia terapéutica validada para el cáncer.28,29 Se exploraron las consecuencias fenotípicas de la inhibición química de bromodominios de la familia BET en el carcinoma de la línea media NUT dependiente de BRD4. La ubicación de BRD4-NUT en la cromatina está relacionada mecanísticamente con los bromodominios t ndem conservados de BRD4 en la proteína de fusión.17 Un aspecto característico de NMC es la aparición de puntos nucleares discretos de la oncoproteína BRD4-NUT con un ensayo inmunohistoquímico dirigido a NUT (IHC)30. El tratamiento de la línea celular NMC 797 obtenida de pacientes durante 48 horas con JQ1 (500 nM) eliminó los focos nucleares y produjo una tinción de NUT nuclear difusa por IHC (Fig. 3F) .

Se observa un fenotipo de diferenciación sorprendente con la supresión de BRD4-NUT en líneas celulares de NMC.17 JQ1 presentó un fenotipo de diferenciación equivalente que dependía del tiempo y la dosis, caracterizado por dispersión y aplanamiento de las células, cromatina abierta y morfología de huso en células NMC 797 y Per403 (Fig. 3G y Fig. 4A, 4B, 4C) . La diferenciación fue rápida (< 24 horas) y caracterizada por una expresión significativamente mayor de citoqueratina, una característica de la diferenciación escamosa (Fig. 3H) . Después de siete días en cultivo con exposiciones submicromolares a JQ1, se observó diferenciación terminal. Cabe destacar que las líneas celulares de carcinoma escamoso no dependiente de BRD4 (TE10 y TT) no presentaron efectos de diferenciación para JQ1 (Fig. 4A, 4B, 4C) . En células NMC dependientes de BRD4 , cabe esperar que la diferenciación venga acompañada de detención del crecimiento, que se pone de manifiesto por una tinción de Ki67 reducida (Fig. 31, 3J y 4La, 4Lb) . Otro elemento a favor de un mecanismo de acción sobre la diana es que los fenotipos de diferenciación y detención del crecimiento solo son provocados por (+)-JQl, mientras que (-)-JQl no presenta ningún efecto observable (Figura 4Ea-4Ed) .

Cabe destacar que el tratamiento con JQ1 fenocopia los cambios morfológicos y aumenta la expresión de la queratina observada con silenciamiento de BRD4-NUT por interferencia de ARN (Figura 4Fa, 4Fb) . A favor de estos estudios morfológicos y de IHC, los análisis de expresión de tres genes de tejidos escamosos canónicos por RT-PCR identificaron una inducción pronunciada (30 veces mayor) de queratina-14 por parte de (+)-JQl en células NMC 797 (Fig. 3i) . La inducción modesta de queratina-10 y el efecto nulo en la transglutaminasa epidérmica (TGM1) son coherentes con una diferenciación progresiva hacia epitelio escamoso torácico, coherente con el tumor primario mediastinal del cual se obtuvieron las células NMC 797.28 La inducción de diferenciación con tinción de queratina fuerte (3+) por IHC es progresiva durante 72 h, según se determina por análisis de IHC cuantitativo (Figura 4M) . A favor de un mecanismo de acción sobre la diana, el fenotipo de diferenciación viene provocado solo por (+)-JQl, mientras que (-)-JQl no muestra ningún efecto observable. Cabe destacar que una linea celular de carcinoma escamoso no dependiente de BRD4 (TE10) no presentó efectos de diferenciación con el tratamiento de JQ1 (Figura 4Nc) . En células NMC dependientes de BRD4 , cabe esperar que la diferenciación venga acompañada de detención del crecimiento, que se pone de manifiesto por una tinción de Ki67 reducida (Fig. 4A-4G) .

A continuación se evaluó la actividad antiproliferativa de los enantiómeros de JQ1 en líneas celulares de carcinoma escamoso humano dependiente de BRD4 (797 y Per403) e independiente de BRD4 (TE10 y TT) . Según se muestra en la Figura 5a y la Figura 4Fa-4Fc, únicamente (+)-JQl presentó una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento celular solo en las líneas celulares dependientes de BRD4 (CI50 de 797 = 140 nM; CI50 de Per403 = 60 nM) . El potente efecto antiproliferativo y la diferenciación irreversible observada por IHC sugirieron la inducción de muerte celular. De este modo, se evaluó la apoptosis inicial y posterior empleando tinción con anexina-V y yoduro de propidio por citometría de flujo. Como era de esperar, JQ1 indujo una apoptosis inmediata y progresiva en células de carcinoma humano dependiente de BRD4, pero para la concentración empleada no se detectaron niveles significativos de células apoptóticas en líneas celulares que no contenían la fusión BRD-NUT (Fig. 5b y Fig. 7).

Ejemplo 6: Eficacia y efecto farmacodinámico de JQ1 en un modelo murino de NMC in vivo Para establecer si JQ1 podría atenuar el crecimiento de un carcinoma dependiente de BRD4 como agente único in vivo, se desarrolló un modelo de xenoinjerto en ratón para NMC empleando la línea celular NMC 797 en ratones. Se realizaron estudios de tratamiento a corto plazo con tomografla PET como punto de evaluación primario para explorar si la actividad antitumoral de JQ1 podría ser demostrada y posteriormente seguida por tomografía no invasiva. Los cohortes coincidentes de ratones con contribuciones establecidas comparables de enfermedades medibles se aleatorizaron para el tratamiento con JQ1 (50 mg kg"1) o vehículo, que se administraron por inyección intraperitoneal diaria. Antes de la aleatorización y después de cuatro días de terapia, los ratones se evaluaron mediante tomografía PET. Se observó una respuesta destacada en la absorción de FDG con el tratamiento de JQ1, mientras que los animales tratados con vehículo presentaron enfermedad evidente y progresiva (Fig. 5E) .

En paralelo, se estudiaron los cohortes coincidentes de ratones con tumores NMC 797 para determinar los efectos de JQ1 sobre el volumen del tumor mediante medición con calibre y los efectos farmacodinámicos mediante IHC cuantitativo. El crecimiento agresivo de los xenoinjertos de NMC 797 precipitó la terminación del estudio en el día catorce del tratamiento, momento en el que todos los animales tratados con vehículo estaban cerca de los límites institucionales de tamaño del tumor. Los animales que recibieron JQ1 presentaron una reducción estadísticamente significativa del crecimiento del tumor (Fig. 5c, p = 0.039; prueba t de dos colas). Para registrar datos farmacodinámicos y mecanísticos comparativos, se sacrificaron todos los animales y se extrajeron los tumores para realizar un análisis histopatológico . Cabe destacar que JQ1 fue bien tolerado en esta dosis y no se registraron signos adversos de toxicidad ni pérdida de peso evidente (Fig. 5D, 5L) .

Para confirmar que el efecto antineoplásico observado con el tratamiento de JQ1 estaba asociado con la unión a la diana, se examinó el tejido tumoral seccionado para evaluar la oncoproteína BRD4-NUT. Según se presenta en la Figura 5e y la Figura 6A, el tratamiento de JQ1 dio como resultado el debilitamiento de los puntos nucleares de NUT, lo cual es coherente con la unión competitiva a la cromatina nuclear. La dispersión celular y la mayor expresión de queratina confirmaron la diferenciación escamosa farmacodinámica. La menor tinción nuclear para Ki67 y la mayor tinción de tipo TUNEL en animales tratados confirmó un efecto apoptótico antiproliferativo continuado. De forma conjunta, estos datos proporcionan una correlación mecanística entre la inhibición de BRD4 y una respuesta terapéutica a JQ1 in vivo.

En un intento por definir el biomarcador farmacodinámico (FD) de la expresión de queratina en el tumor de forma no sesgada, se establecieron protocolos para el análisis y la adquisición de imágenes por IHC cuantitativo. Se prepararon muestras apareadas de animales tratados y no tratados y se analizaron empleando protocolos estandarizados y software disponible de proveedores comerciales (ImageScope; Aperio Technologies) . JQ1 provocó una expresión de la queratina fuerte (3+ ) en xenoinjertos de NMC 797 de forma uniforme en las muestras de los tumores extirpados (Figura 6Ba-6Be) .

De forma paralela a estos estudios, se identificó un paciente de 29 años con NMC metastático generalizado de respuesta positiva respecto a BRD4-NUT. Con el objetivo de desarrollar un modelo patológico más relevante desde el punto de vista clínico, se establecieron cultivos a corto plazo empleando material clínico desechado obtenido del fluido pleural drenado de una sonda paliativa en el pecho del paciente. Según se presenta en las Figuras 8A-8C, los estudios in vitro confirmaron el efecto potente y estereoselectivo de (+) -JQ1 sobre la viabilidad celular (CI50 = 4 nM) , el crecimiento y la evolución del, ciclo celular. Cuatro animales a los que se había injertado material tumoral obtenido de pacientes desarrollaron una enfermedad medible, que presentó una respuesta positiva fuerte en PET (Fig. 5H) . Se asignaron de forma aleatoria cohortes de tratamiento con (+) -JQ1 o vehículo a los animales. Antes de asignar el tratamiento y después de cuatro días de terapia, los ratones se evaluaron mediante tomografía PET. Se observó una respuesta destacada en la absorción de FDG con el tratamiento de (+) -JQ1, mientras que los animales tratados con vehículo presentaron enfermedad evidente y progresiva (Fig. 51) . Nuevamente, se preparó material tumoral para el análisis de IHC cuantitativo, que demostró la inducción de la expresión de queratina tras el tratamiento de (+) -JQ1 (Fig. 5J, 5K, Figura 9A-9B) . De forma conjunta, estos datos proporcionan una correlación mecanística entre la inhibición de BRD4 y una respuesta terapéutica a JQ1 in vivo.

En el emergente y complejo panorama mutacional del genoma del cáncer, las trasposiciones cromosómicas recurrentes comprenden un fascinante subgrupo de dianas genéticas claras para el cáncer. Según pone de manifiesto el desarrollo con éxito de inhibidores de cinasas que actúan sobre BCR-ABL en CML, los compuestos de sondas bien caracterizados, 31,32 los datos cristalográficos de alta resolución, 33 los estudios sobre investigación translacional34 y los modelos de murinos informativos, 35 cuando están disponibles, proporcionan una plataforma óptima para el descubrimiento de ligandos y la validación de dianas. Según se describe en la presente, es probable que un inhibidor de bajo peso molecular novedoso dirigido a BRD4 sea útil para el tratamiento del carcinoma escamoso humano definido genéticamente asociado con la fusión NUT-BRD4.

Además del carcinoma de la línea media NUT, los bromodominios de la familia BET participan en muchas otras enfermedades neoplásicas y no neoplásicas. BRD4 dirige el complejo P-TEFb hacia los cromosomas mitóticos, lo cual da como resultado la expresión de genes que propician el crecimiento tales como c-Myc11 9 y la diana para el cáncer bien establecida Aurora B.13 Además, BRD4 se amplifica en el cáncer de mama36 y es un marcador predictivo de la supervivencia entre los pacientes con cáncer de mama.37 Además de estas funciones en la biología del cáncer, los miembros de la familia BET han sido reconocidos como genes esenciales para la replicación de virus38,39 y en la mediación de respuestas inflamatorias.14 De este modo, la disponibilidad de (+)-JQl y (-)-JQl como sondas químicas apareadas proporcionará investigaciones informativas extensivamente en la biología de enfermedades, del desarrollo y de la transcripción. También se ha establecido que JQ1 presenta pocos efectos secundarios sobre receptores celulares y unas propiedades farmacocinéticas excelentes, que incluyen un 49% de biodisponibilidad oral (Fig. 10) , lo cual establece la viabilidad del desarrollo de derivados de tipo farmacológico para aplicación terapéutica.

El descubrimiento y la optimización de inhibidores de bajo peso molecular de dianas epigenéticas es un objetivo principal de la investigación biomédica actual. Las estrategias que han tenido éxito hasta ahora se limitan a la identificación de ligandos para enzimas que modifican la cromatina.40 Quizás los moduladores de la desacetilación de la cadena lateral de la lisina sean los más estudiados, para los cuales se han desarrollado clínicamente numerosos inhibidores farmacéuticos. La presente invención proporciona composiciones y métodos para desarrollar inhibidores potentes y selectivos de lectores epigenéticos , que incluyen el primer inhibidor completamente caracterizado de la familia BET de bromodominios . Teniendo en cuenta este descubrimiento, la estrategia expuesta en la presente se puede emplear para la identificación de candidatos adicionales para identificar inhibidores adicionales que tengan selectividad dentro de la familia BET.

Ejemplo 7: Los enantiomeros de JQl se unen e inhiben BRD4.1 y BRD4.2 Las Figuras 11 y 12 muestran que los enantiomeros de JQl se unen e inhiben BRD4.1 y BRD4.2. La Figura 13 muestra una comparación de la unión de JQ1S y la inhibición de miembros de la familia BET (activos) y CBP (inactivos) . La Figura 14 muestra los resultados de estudios de posología para una colección central de derivados de JQl (para consultar las estructuras de los compuestos, remítase a la Tabla B anterior) .

Ejemplo 8: JQ1 es eficaz para el tratamiento del cáncer BRD3-NU Se implantaron subcutáneamente células BRD3-NUT a ratones . Se registraron datos de medición de los tumores semanalmente . Cuando los tumores se volvieron palpables, los ratones se dividieron en dos grupos de tratamiento (n = 10) : se administraron 50 mg/kg de JQ1 por vía intraperitoneal (IP) 7 días/semana y se administró vehículo IP 7 días/semana. El día 24 después de la inyección, se sacrificaron cinco ratones de cada grupo y se tomaron muestras de los tumores para enviarlas al laboratorio de análisis. Durante el resto del estudio, se tomaron muestras de los tumores a medida que los ratones se sacrificaban. Para todas las muestras, se fijó la mitad del tumor en formalina al 10% y la otra mitad se congeló rápidamente en hielo seco. El tratamiento finalizó el día 32. Los pesos y los volúmenes de los tumores se registraron semanalmente hasta que todos los ratones se volvieron moribundos o los tumores alcanzaron 2 cm en cualquier dimensión. La Figura 15A es una gráfica que muestra que JQ1 presentó eficacia in vivo contra BRD3-NUT en un modelo de xenoinjerto en murinos . El tratamiento con JQ1 dio como resultado la regresión del tumor durante la terapia. Al cesar la terapia, se reanudó el crecimiento del tumor. Las diferencias en el volumen del tumor fueron significativas en todos los puntos (p = 7.65274E-09 el día 24). JQ1 se administró con una concentración de 50 mg/kg. La Figura 15B muestra que los ratones tratados con JQl presentaron una pérdida de peso moderada con una recuperación rápida después de cesar la terapia.

Ejemplo 9: JQl y sus análogos son eficaces contra varios tipos de cáncer Las Figuras 16A-16D muestran que JQl y sus derivados inhiben la unión de Brd .1 y Brd4.2 para una concentración 5 µ? de JQl (para consultar las estructuras de los compuestos, remítase a la Tabla A anterior) . Las Figuras 17A-17D muestran la viabilidad celular del carcinoma de la línea media NUT ( MC, por sus siglas en inglés) tras el tratamiento con JQl y sus derivados con una concentración 2 µ? (para consultar las estructuras de los compuestos, remítase a la Tabla A anterior) . Las Figuras 18-55 muestran la viabilidad de la respuesta a la dosis para una serie de líneas de células cancerosas . Estos datos indican que JQl y sus derivados presentan eficacia contra el cáncer para una amplia gama de tipos de cáncer.

Los resultados descritos en la presente se obtuvieron empleando los siguientes métodos y materiales.

Ejemplo 10: Resultados de los ensayos de unión En la Tabla C a continuación se muestran los resultados de un ensayo de unión.

Tabla C: CI50 del ensayo biológico y CI50 del ensayo celular La actividad de unión de los compuestos principales al sitio 1 de BRD4 se determinó mediante un ensayo Alpha con una curva de respuesta frente a la dosis de 12 puntos (Figura 56A) . Se empleó el compuesto (S) -JQ1 (JQS) como control de respuesta positiva. Se empleó ( R) -JQl (JQR) como control de respuesta negativa. Los compuestos JQ6, JQ8, JQ13, JQ33 y JQ35 presentaron una actividad de unión excelente. Los resultados de la actividad de unión para todos los compuestos principales al sitio 2 de BRD4 también se determinaron mediante un ensayo Alpha con una curva de respuesta frente a la dosis de 12 puntos (Figura 56B) . Los compuestos JQ6, JQ8, JQ13, JQ33 y JQ35 presentaron una actividad de unión excelente .

La actividad de los compuestos principales se examinó en un ensayo celular con la línea de células 797 (obtenida de un paciente) para determinar los efectos sobre el crecimiento de la inhibición de BRD4 en líneas celulares dependientes de BRD4-NUT. Las células se incubaron con los compuestos y se monitorizaron para determinar la proliferación después de 72 horas. El ajuste de la curva se calculó mediante regresión logística (Figura 56C) . Se examinaron todos los compuestos principales en ensayos celulares con la línea de células 10326, que se obtuvo directamente de un paciente, para determinar los efectos sobre el crecimiento de la inhibición de BRD4 en líneas celulares dependientes de BRD4-NUT (Figura 56D) . Las células se incubaron con los compuestos y se monitorizaron para determinar la proliferación después de 72 horas. El ajuste de la curva se calculó mediante regresión logística.

Reactivos Las líneas celulares de carcinoma de la línea media que expresan BRD4-NUT endógena, 7971 y PER-4032, se han descrito previamente. Las líneas celulares de carcinoma escamoso humano que no sea MC, TE10 y TT, se obtuvieron de los Drs . Añil Rustgi (Universidad de Pennsylvania) y Adam Bass (Instituto del Cáncer Dana-Farber) . Las células U20S se obtuvieron de ATCC. Los constructos de sobreexpresión para mamíferos GFP-BRD4, GFP-NUT y GFP-BRD4-NUT se han descrito previamente.3 Los medios, la tripsina y los antibióticos para el cultivo de tejidos se adquirieron de Mediatech. Los anticuerpos y tintes para los ensayos inmunohistoquímicos y la citometria de flujo se obtuvieron de Dako (Anticuerpo Citoqueratina AE1/AE3 Cat# N1590) , Millipore (TUNEL Cat# S7100) , Vector (Ki67 Cat# VP-RM04) , Cell Signaling Technologies (NUT Cat# 3625) , BD Pharmingen (Anexina V-FITC Cat# 556547) e Invitrogen (yoduro de propidio Cat# P3566) .

Ensayo de unión a histona acetilada Los ensayos se realizaron según se ha descrito previamente8 con pequeñas modificaciones respecto al protocolo del fabricante (PerkinElmer, EE. UU. ) . Todos los reactivos se diluyeron en HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, un 0.1% de BSA, pH de 7.4 complementado con un 0.05% de CHAPS y que se dejó equilibrar hasta temperatura ambiente antes de añadirlo a las placas. Se preparó una dilución en serie 1:2 de 24 puntos de los ligandos en el intervalo de 150 - 0 µ? y se transfirieron 4 µ? a placas de 384 pocilios de volumen pequeño (ProxiPlateTM-384 Plus, PerkinElmer, EE. UU.), seguidos de 4 µ? de proteína marcada con HIS (BRD4/1, 250 nM, BRD4/2 y CREBBP, 2000 nM) . Las placas se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, antes de añadir 4 µ? de péptido con biotina de concentración equimolar respecto a la proteína [péptido para BRD4 (1) y BRD4(2): H4K5acK8acK12acK16ac, H-SGRGK (Ac) GGK (Ac) GLGK (Ac) GGAK (Ac) RHRK (Biotina) -OH; péptido para CREBBP : H3K36ac, Biotin-KSAPATGGVK (Ac) KPHRYRPGT-OH (Cambridge Research Biochemicals, Reino Unido)] . Las placas se sellaron y se incubaron durante 30 minutos más, antes de añadir 4 µ? de microesferas dadoras recubiertas con estreptavidina (25 g/ml) y 4 µ? de microesferas aceptoras quelantes de níquel (25 g/ml) en condiciones de poca luz. Las placas se sellaron con papel de aluminio para protegerlas de la luz, se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos y se analizaron con un lector de placas PHERAstar FS (BMG Labtech, Alemania) empleando un set de filtros AlphaScreen 680 excitación/570 emisión. Los valores de CI50 se calcularon en Prism 5 (Software GraphPad, EE . UU. ) tras la normalización respecto a los controles de D SO correspondientes y se proporcionan como la concentración final del compuesto en el volumen de reacción de 20 µ?.

Alineación de secuencias Las secuencias de aminoácidos para los bromodominios humanos de longitud completa se obtuvieron de NCBI (BRD2 N.° de acceso NP_005095, BRD3 N.° de acceso NP_031397.1, BRD4 N.° de acceso NP_055114.1, BRD-T N.° de acceso NP_001717.2) . La alineación de múltiples secuencias de bromodominios individuales se realizó empleando ClustalW.19 Recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP, por sus siglas en inglés) Los estudios de FRAP se realizaron en células U20S según se ha descrito previamente.3,20 Brevemente, se transfectaron células U20S (lipofectamina; Invitrogen) con constructos de sobreexpresión para mamíferos que codifican la quimera GFP con BRD4, UT y BRD4-NUT. Se blanqueó una región nuclear de 5pm2 con alta intensidad láser en una célula de cada campo, y se evaluó la recuperación con baja intensidad láser y una apertura de 150 ym. Las imágenes de campos idénticos se adquirieron empleando un microscopio confocal Nikon Cl Plus equipado con una cámara calentada a 37 °C y módulos FRAP durante 90 segundos. Las intensidades medias de la región blanqueada se evaluaron en función del tiempo empleando MetaMorph v7, y se normalizaron respecto a una región independiente de interés antes del blanqueo. A continuación se analizaron los datos para determinar el tiempo necesario para obtener una recuperación de fluorescencia que fuera la mitad de la máxima en Microsoft Excel Mac 12.2.4.

Ensayo inmunohistoquim co - de diferenciación y proliferación Las líneas de células cancerosas cultivadas (797, Per403, TT y TE10) se desarrollaron en placas Chamber Slide con una concentración de 1.0 x 104 células por cámara (4 placas Chamber Slide) o 5.0 x 103 células por cámara (8 placas Chamber Slide) . Las células se trataron con JQ1 racémico, (+)-JQl, (-)-JQl o vehículo (DMSO) y se incubaron durante varios intervalos de tiempo. A continuación se retiró el medio y las cámaras se lavaron con PBS frío. A continuación las células se fijaron en un 4% de formaldehído durante 20 minutos a 4 °C, se lavaron con PBS y se transfirieron a los servicios especializados de histopatología del Centro contra el cáncer Dana-Farber/Harvard (DF/HCC) en Brigham and Women^s Hospital para la tinción, según se describe más adelante. Los estudios inmunohistoquímicos de los pellets celulares se realizaron en primer lugar cultivando las líneas de células cancerosas (797 y Per403) en recipientes T-75, que se trataron con JQ1 o vehículo (DMSO) durante 48 horas. A continuación las células se trataron con tripsina y los pellets celulares se formaron por centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos y se estabilizaron con ½ volumen de HistoGel (Richard-Alien Scientific) y un 10% de albúmina de suero bovino. Los pellets celulares se lavaron con PBS y se fijaron en un 4% de formaldehído durante 20 minutos a 4 °C. A continuación las células se lavaron con PBS y se transfirieron al laboratorio central de DF/HCC en Brigham and Women' s Hospital para la tinción, según se describe más adelante. El análisis cuantitativo de la tinción de Ki67 (puntuación celular) se realizó por microscopía óptica empleando cinco campos de visión de alta potencia (40x) por experimento. Todos los materiales fijados fueron embebidos, seccionados y teñidos por el laboratorio central de DF/HCC en Brigham and Women's Hospital, empleando protocolos optimizados establecidos. Las imágenes se obtuvieron empleando un microscopio Olympus BX40 (Olympus Imaging America, Center Valley, PA) y una cámara de color Micropublisher 3.3 RTV (Qlmaging, Surrey, BC) .

Ensayo de proliferación celular Las células se sembraron en placas de microvaloración blancas de 384 pocilios (Nunc) con una concentración de 500 células por pocilio en un volumen total de 50 pL de medio. Las células 797, TT y TE10 se cultivaron en DMEM que contenía un 1% de penicilina/estreptomicina y un 10% de FBS. Las células Per403 se cultivaron en DMEM que contenía un 1% de penicilina/estreptomicina y un 20% de FBS. Los compuestos se suministraron a las placas de ensayo de microvaloración mediante transferencia robótica de precisión (PerkinElmer JA US equipado con una herramienta de precisión de 100 nL V&P Scientific) . Después de 48 h de incubación a 37 °C, se realizó la lisis de las células y se evaluaron los pocilios para determinar el contenido total de ATP empleando un ensayo de proliferación comercial (Cell TiterGlo; Promega) . Las medidas reiteradas se analizaron con relación a la dosis y se calcularon las estimaciones de CI50 mediante regresión logística (GraphPad Prism) .

Citometría de flujo Las células de cáncer humano cultivadas (797, Per403, TT y TE10) se desarrollaron en placas de cultivo tisular de 6 pocilios (BD Falcon) con una concentración inicial de 5.0 x 104 células por pocilio. Las células se trataron con JQ1 (500 nM) , estaurosporina (50 n ) o vehículo (un 0.05% de DMSO ) durante 24 o 48 horas. Las células con tripsina se mezclaron en una proporción 1:1 sobre hielo con amortiguador de Anexina-V/yoduro de propidio (HEPES 10 mM, pH de 7.4, NaCl 140 mM, CaCl2 2.5 mM) que contenía Anexina V-FITC (BD Pharmingen, 1:500) y yoduro de propidio (Invitrogen, 1:1000). Las muestras se analizaron inmediatamente con un BD FACS Canto II. Las visualizaciones y los análisis de las fracciones apoptóticas se generaron empleando el software de análisis de citometría de flujo FlowJo (Tree Star, Inc.).

Estudios de eficacia de xenoinjertos Se establecieron xenoinjertos de NMC inyectando células NMC 797 (107) en un 30% de Matrigel (BD Biosciences) en el costado de ratones atímicos NCr hembra de 6 semanas (Charles River Laboratories) . Doce días después de la inyección, los ratones con tumores medibles se dividieron en cohortes para tratarlos con 50 mg/kg de JQ1 IP o vehículo (5% de DMSO en 5% de dextrosa) . El tamaño medio de los tumores en el grupo de tratamiento con JQ1 (n = 8) y el grupo de vehículo (n = 7) fue similar (63.8+/-17.1 y 73.6+/-14.4 mm3, respectivamente) al inicio del tratamiento. Los animales recibieron un seguimiento diario para determinar sus síntomas clínicos. Las medidas del tumor se evaluaron mediante mediciones con calibre, y el volumen se calculó empleando la fórmula Vol = 0.5xLxA2. Después de 2 semanas de tratamiento, se sacrificaron todos los ratones de modo humanitario, y los tumores se fijaron en un 10% de formalina para el examen histopatológico. La significación estadística de los volúmenes de los tumores se calculó mediante una prueba t de Student bilateral. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el IACUC del DFCI .

Instrumentación Los espectros de resonancia magnética nuclear de protón y de carbono- 13 RMN y 13C RMN) se registraron con un espectrómetro 600 INOVA de sonda inversa de Varían en las instalaciones de RMN East Quad de la Facultad de Medicina de Harvard. Los desplazamientos químicos se registraron en partes por millón en la escala d y se indican tomando como referencia el protio residual del disolvente de RMN (CHC13: d 7.24) para XH RMN y las resonancias de carbono del disolvente (CDC13: d 77.2) para 13C RMN, respectivamente. Los datos se presentan como se indica a continuación: desplazamiento químico [multiplicidad (s = singlete, d = doblete, t = triplete, c = cuadruplete, m = multiplete, a = ancho) , constante (s) de acoplamiento en Hertz, integración] . Los espectros de masas de alta resolución (HRMS) se registraron en un espectrómetro Bruker APEX 4.7 Tesler FTMS empleando una fuente iónica de electronebulización (ESI) en las instalaciones de instrumentos del Departamento de Química del Instituto de Tecnología de Massachusetts . Los intermedios y el producto final se purificaron con un sistema CombiFlash RF (Teledyne Isco) . Las soluciones orgánicas se concentraron en evaporadores rotatorios Büchi R-205. Las purezas enantioméricas se evaluaron con cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) Berger y una columna AS-H. La purificación preparativa de los enantiómeros se realizó con cromatografía líquida de alta resolución Agilent y una columna OD-H (Instituto Broad de Harvard y MIT) .

Referencias 1 Ptashne, M. Binding reactions: epigenetic switches, signal transduction and cáncer. Curr Biol 19, R234-241, (2009) . 2 Schreiber, S. L. y Bernstein, B. E. Signaling network model of chromatin. Cell 111, 771-778, (2002) . 3 Marushige, K. Activation of chromatin by acetylation of histone side chains . Proc Nati Acad Sci U S A 73, 3937-3941, (1976) . 4 Dey, A., Nishiyama, A., Karpova, T., McNally, J. y Ozato, K. Brd4 marks select genes on mitotic chromatin and directs postmitotic transcription. Mol Biol Cell 20, 4899-4909, (2009) . 5 Owen, D. J. et al. The structural basis for the recognition of acetylated histone H4 by the bromodomain of histone acetyltransferase gcn5p. Embo J 19, 6141-6149, (2000) . 6 Zeng, L. y Zhou, . M. Bromodomain: an acetyl-lysine binding domain. FEBS Lett 513, 124-128, (2002) . 7 Yang, X. J. Multisite protein modification and intramolecular signáling. Oncogene 24, 1653-1662, (2005) . 8 Yang, Z. et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell 19, 535-545, (2005) . 9 Phelps, M. A. et al. Clinical response and pharmacokinetics from a phase 1 study of an active dosing schedule of flavopiridol in relapsed chronic lymphocytic leukemia. Blood 113, 2637-2645, (2009). 10 Rahl, P. B. et al. c-Myc Regulates Transcriptional Pause Reléase. Cell 141, 4323-4445, (2010) . 11 Yang, Z., He, N. y Zhou, Q. Brd4 recruits P-TEFb to chromosomes at late mitosis to promote Gl gene expression and cell cycle progression. Mol Cell Biol 28, 967-976, (2008) . 12 Mochizuki, K. et al. The bromodomain protein Brd4 stimulates Gl gene transcription and promotes progression to S phase. J Biol Chem 283, 9040-9048, (2008). 13 You, J. et al. Regulation of aurora B expression by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell Biol 29, 5094-5103, (2009) . 14 Huang, B . , Yang, X. D . , Zhou, M. . , Ozato, K. y Chen, L. F. Brd4 coactivates transcriptional activation of NF-kappaB via specific binding to acetylated RelA. Mol Cell Biol 29, 1375-1387, (2009) . 15 French, C. A., Miyoshi, I., Aster, J. C. et al . BRD4 bromodomain gene rearrangement in aggressive carcinoma with translocation t (15;19). Am J Pathol 159(6), 1987-1992, (2001) . 16 French, C. A. et al . BRD4-NUT fusión oncogene: a novel mechanism in aggressive carcinoma. Cáncer Res 63, 304-307, (2003) . 17 French, C. A. et al. BRD-NUT oncoproteins: a family of closely related nuclear proteins that block epithelial differentiation and maintain the growth of carcinoma cells. Oncogene 27, 2237-2242, (2008) . 18 Miyoshi, S., Ooike, S., Iwata, K. , Hikawa, H. y Sugaraha, K. AN ITUMOR AGENT. (2009) . 19 Adachi, K. et al. (2006). 20 Sueoka, H.f Komatsu, H., Kobayashi, H. & Ehara, S. Thienotriazolodiazepine compounds and medicinal uses thereof. (1998) . 21 VonVoigtlander, P. F. y Straw, R. N. Alprazolam: Review of Pharmacological, Pharmacokinetic and Clinical Data. Drug Development Research 6, 1-12, (1985) . 22 Niesen, F. H., Berglund, H. y Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc 2, 2212-2221, (2007) . 23 Fedorov, O. et al. A systematic interaction map of validated kinase inhibitors with Ser/Thr kinases . Proc Nati Acad Sci U S A 104, 20523-20528, (2007) . 24 Bullock, A. N. et al. Structural basis of inhibitor specificity of the human protooncogene proviral insertion site in moloney murine leukemia virus (PIM-1) kinase. J Meó. Chem 48, 7604-7614, (2005). 25 Quinn, A. M. et al. A homogeneous method for investigation of methylation-dependent protein-protein interactions in epigenetics. Nucleic Acids Res 38, ell, (2010) . 26 Vollmuth, F. , Blankenfeldt , W. & Geyer, . Structures of the dual bromodomains of the P-TEFb-activating protein Brd4 at atomic resolution. J Biol Chem 284, 36547-36556, (2009) . 27 French, C. A. Molecular pathology of NUT midline carcinomas. J" Clin Pathol, (2008). 28 Huang, M. E. et al . Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia. Blood 72, 567-572, (1988). 29 Druker, B. J. et al . Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 344, 1031-1037, (2001). 30 Haack, H. et al. Diagnosis of NUT Midline Carcinoma Using a NUT-specific Monoclonal Antibody. A J Surg Pathol, (2009) . 31 Buchdunger, E. et al. Selective inhibition of the platelet-derived growth factor signal transduction pathway by a protein-tyrosine kinase inhibitor of the 2-phenylaminopyrimidine class. Proc Nati Acad Sci U S A 92, 2558-2562, (1995) . 32 Buchdunger, E. et al. Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2-phenylaminopyrimidine derivative. Cáncer Res 56, 100-104, (1996) . 33 Schindler, T. et al. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase. Science 289, 1938-1942, (2000) . 34 Druker, B. J. et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med 2, 561-566, (1996). 35 le Coutre, P. et al. In vivo eradication of human BCR/ABL-positive leukemia cells with an ABL kinase inhibitor. J Nati Cáncer Inst 91, 163-168, (1999). 36 Kadota, M. efc al . Identification of novel gene amplifications in breast cáncer and coexistence of gene amplification with an activating mutation of PIK3CA. Cáncer Res 69, 7357-7365, (2009). 37 Crawford, N. p. et al. Bromodomain 4 activation predicts breast cáncer survival . Proc Nati Acad Sci U S A 105, 6380-6385, (2008) . 38 You, J. et al. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen interacts with bromodomain protein Brd4 on host mitotic chromosomes. J Virol 80, 8909-8919, (2006) . 39 Abbate, E. A., Voitenleitner, C. & Botchan, M. R. Structure of the papillomavirus DNA-tethering complex E2:Brd4 and a peptide that ablates HPV chromosomal association. Mol Cell 24, 877-889, (2006) . 40 Colé, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat Chem Biol 4, 590-597, (2008).

Otras modalidades A partir de la descripción precedente, será evidente que se pueden realizar variaciones y modificaciones de la invención descrita en la presente para adaptarla a varios usos y condiciones. Tales modalidades también se engloban en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

La mención de una lista de elementos en cualquier definición de una variable en la presente incluye las definiciones de esa variable como cualquier elemento individual o combinación (o subcombinación) de elementos enumerados. La mención de una modalidad en la presente incluye esa modalidad como una modalidad individual o combinada con cualesquiera otras modalidades o porciones de estas .

Esta solicitud se relaciona con las Solicitudes Provisionales de Patente de los EE. UU. N.os 61/334,991, presentada el 14 de mayo de 2010; 61/370,745, presentada el 4 de agosto de 2010; y 61/375,863, presentada el 22 de agosto de 2010. El contenido de cada una de estas solicitudes se incorpora a la presente por referencia.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta descripción se incorporan a la presente por referencia del mismo modo que si se indicara específica e individualmente que cada patente y publicación independiente se incorpora por referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (94)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un compuesto de Fórmula I: (i) caracterizado porque X es N o CRS; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es H, -COO-R3, -CO-R3/ -CO-N(R3R4), -S(0)2-R3, -S (O) 2-N(R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3 arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sus ituido; R2 es H, D, halógeno o alquilo opcionalmente sustituido,- cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo C!-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N; - (cicloalquilo C3-C12) , (cicloalquilo C3-C12) sustituido, - (cicloalquenilo C3-C12) o -(cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2, N=CR4R6; cada R es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros ; R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R4 y R« se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que (a) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo o fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y Rx es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -CO-N(R3R4) , entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino; (b) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -CO- (R3R4) , y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R4 no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; y (c) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 1 y L es -COO-R3í entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

2. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

3. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque L es H, -COO-R3, -CO-N(R3R4), -S(0)2-R3, -S (0) 2-Ñ (R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3 o arilo opcionalmente sustituido .

El compuesto de conformidad la reivindicación 3, caracterizado porque cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: H, -(alquilo Ci-Ce) , que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N; o NH2, N=CR4R6.

5. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque R2 es H, D, halógeno o metilo.

6. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque RB es alquilo, hidroxialquilo, haloalquilo o alcoxi, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

7. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt o COOCH2OC(0)CH3.

8. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque el anillo A es un arilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros.

9. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque el anillo A es tiofuranilo, fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo o 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolinilo .

10. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque el anillo A es fenilo o tienilo.

11. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque m es 1 o 2 y al menos uno de los grupos RA es metilo.

12. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque cada RA es independientemente H, un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo.

13. Un compuesto de Fórmula II: caracterizado porque X es N o CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo arilo o heteroarilo, cada uno d opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; R'x es H, -COO-R3, -CO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Cx-Cs) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N; - (cicloalquilo C3-C12) , (cicloalquilo C3-C12) sustituido; - (cicloalquenilo C3-Ci2) o -(cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido; cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que si R'i es -COO-R3, X es N, R es fenilo sustituido y RB es metilo, entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

14. El contesto de conformidad la reivindicación 13, caracterizado porque R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

15. El compuesto de conformidad la reivindicación 14, caracterizado porque R es fenilo o piridilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

16. El compuesto de conformidad la reivindicación 15, caracterizado porque R es p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl-fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo o piridinilo.

17. El compuesto de conformidad la reivindicación 13, caracterizado porque R'i es -COO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y R3 es -(alquilo Ci-C8) , que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N, y el cual puede estar opcionalmente sustituido.

18. El compuesto de conformidad la reivindicación 17, caracterizado porque R'i es -COO-R3, y R3 es metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo o t-butilo; o R'i es H o fenilo opcionalmente sustituido.

19. El compuesto de conformidad la reivindicación 13, caracterizado porque RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt o COOCH2OC (0)CH3.

20. El compuesto de conformidad la reivindicación 13, caracterizado porque RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt o COOCH2OC(0)CH3.

El compuesto de conformidad la reivindicación 13, caracterizado porque cada RA es independientemente un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo fusionado.

22. El compuesto de conformidad la reivindicación 21, caracterizado porque cada RA es metilo.

23. Un compuesto de Fórmula III: (III) caracterizado porque X es N o CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3, cada uno de los cuales está opcxonalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; R es alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-C8) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N; - (cicloalquilo C3-Ci2) , (cicloalquilo C3-C12) sustituido, - (cicloalquenilo C3-C12) o -(cicloalquenilo C3-Ci2) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2/ N=CR4R6; cada R4 es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros ; R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R4 y R6 se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0, 1, 2 o 3; con la condición de que: (a) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo o fenilo sustituido, RB es metilo, entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino; y (b) si el anillo A es tienilo, X es N, R es fenilo sustituido, R2 es H, RB es metilo y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R4 no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

24. El compuesto de conformidad la reivindicación 23, caracterizado porque R es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

25. El compuesto de conformidad la reivindicación 24, caracterizado porque R es fenilo o piridilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

26. El compuesto de conformidad la reivindicación 24, caracterizado porque R es p-Cl-fenilo, o-Cl-fenilo, m-Cl- fenilo, p-F-fenilo, o-F-fenilo, m-F-fenilo o piridinilo.

27. El compuesto de conformidad la reivindicación 23, caracterizado porque R3 es H, NH2 o N=CRR6.

28. El compuesto de conformidad la reivindicación 23, caracterizado porque cada R4 es independientemente H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

29. El compuesto de conformidad la reivindicación 23, caracterizado porque R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

30. Un compuesto de Fórmula IV: (IV) caracterizado porque X es N O CR5; R5 es H, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; RB es H, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alcoxialquilo, haloalquilo, hidroxi, alcoxi o -COO-R3/ cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; el anillo A es arilo o heteroarilo; cada RA es independientemente alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un grupo arilo o heteroarilo fusionado; Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es H, -COO-R3, -CO-R3, -CO-N(R3R4), -S(0)2-R3, -S (O) 2-N (R3R4) , N(R3R4), N(R4)C(0)R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R2 es H, D, halógeno o alquilo opcionalmente sustituido; cada R3 se selecciona independientemente del grupo constituido por: (i) H, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido; (ii) heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; (iii) -(alquilo Ci-C8) , - (alquenilo C2-CB) o - (alquinilo C2-C8) , conteniendo cada uno de ellos 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre 0, S o N; - (cicloalquilo C3-C12) , (cicloalquilo C3-C12) sustituido, - (cicloalquenilo C3-C12) o - (cicloalquenilo C3-C12) sustituido, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; y (iv) NH2, N=CR4Re; cada R4 es independientemente H, alquilo, alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R3 y R4 se consideran conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros ; R6 es alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido; o R4 y R6 se consideran conjuntamente con el átomo de carbono al cual están unidos para formar un anillo de 4-10 miembros; m es 0, 1, 2 o 3 ; con la condición de que (d) si el anillo A es tienilo, X es N, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -CO-N(R3R4) , entonces R3 y R4 no se considerarán conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de morfolino; (e) si el anillo A es tienilo, x es N, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0 y L es -CO-N(R3R ), y uno de los grupos R3 y R4 es H, entonces el otro de los grupos R3 y R4 no será metilo, hidroxietilo, alcoxi, fenilo, fenilo sustituido, piridilo ni piridilo sustituido; y (f) si el anillo A es tienilo, X es N, R2 es H, RB es metilo y Ri es -(CH2)n-L/ donde n es 0 y L es -COO-R3, entonces R3 no será metilo ni etilo; o una de sus sales, solvatos o hidratos.

31. El compuesto de conformidad la reivindicación 30, caracterizado porque Ri es -(CH2)n-L, donde n es 0-3 y L es -COO-R3, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y R3 es - (alquilo Ci-C8) , que contiene 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados entre O, S o N, y el cual puede estar opcionalmente sustituido.

32. El compuesto de conformidad la reivindicación 31, caracterizado porque n es 1 o 2 y L es alquilo o -COO-R3, y R3 es metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, sec-butilo o t-butilo; o n es l o 2 y L es H o fenilo opcionalmente sustituido .

33. El compuesto de conformidad la reivindicación 30, caracterizado porque R2 es H o metilo.

34. El compuesto de conformidad la reivindicación 30, caracterizado porque RB es metilo, etilo, hidroximetilo, metoximetilo, trifluorometilo, COOH, COOMe, COOEt o COOCH2OC (O) CH3.

35. El compuesto de conformidad la reivindicación 30, caracterizado porque el anillo A es fenilo, naftilo, bifenilo, tetrahidronaftilo, indanilo, piridilo, furanilo, indolilo, pirimidinilo, piridizinilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo, triazolilo, isoxazolilo, quinolinilo, pirrolilo, pirazolilo o 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolinilo .

36. El compuesto de conformidad la reivindicación 30, caracterizado porque cada RA es independientemente un alquilo opcionalmente sustituido, o dos RA cualesquiera, junto con los átomos a los que cada uno de ellos está unido, pueden formar un arilo.

37. Un método para tratar o prevenir una neoplasia en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, o uno de sus derivados .

38. El método de conformidad la reivindicación 37, caracterizado porque el compuesto es un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-IV.

39. Un método para reducir el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de una célula neoplásica, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, con lo que se reduce el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de la célula neoplásica.

40. Un método para inducir la diferenciación en una célula neoplásica, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, con lo que se induce la diferenciación en la célula neoplásica.

41. Un método para inducir la muerte celular en una célula neoplásica, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, con lo que se induce la muerte celular en la célula neoplásica.

42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-41, caracterizado porque comprende además seleccionar el compuesto para la unión al bromodominio de la familia BET.

43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-41, caracterizado porque comprende además seleccionar el compuesto para inhibir la unión del bromodominio a la cromatina en un entorno celular.

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-41, caracterizado porque comprende además seleccionar el compuesto para la especificidad de unión empleando fluorimetría diferencial de barrido (DSF) , calorimetría isotérmica de titulación y/o un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente (ALPHA-screen) .

45. El método de conformidad la reivindicación 44, caracterizado porque el compuesto aumenta la estabilidad térmica del bromodominio en el ensayo.

46. El método de conformidad la reivindicación 42, caracterizado porque el miembro de la familia BET es BRD2, BRD3, BRD4 O BRDT .

47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, caracterizado porque la célula está en un sujeto.

48. Un método para prevenir o tratar una neoplasia en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, con lo que se previene o trata la neoplasia en el sujeto.

49. El método de conformidad la reivindicación 48, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.

50. El método de conformidad la reivindicación 48, caracterizado porque el sujeto es un paciente humano.

51. El método de conformidad la reivindicación 48, caracterizado porque reduce el crecimiento o la proliferación de una neoplasia en un sujeto.

52. El método de conformidad la reivindicación 48, caracterizado porque la neoplasia se desencadena por acción de un activador de la transcripción.

53. El método de conformidad la reivindicación 52, caracterizado porque el activador de la transcripción es myc.

54. El método de conformidad la reivindicación 48, caracterizado porque el sujeto tiene una neoplasia seleccionada del grupo constituido por linfoma de Burkitt, cáncer pulmonar microcítico, cáncer de mama, cáncer de colon, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia desencadenada por MLL, leucemia linfocítica crónica, carcinoma de la línea media NUT, carcinoma de células escamosas o cualquier otro carcinoma asociado con una reorganización de NUT.

55. Una composición caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, y un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable para este.

56. Un agente farmacéutico envasado caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, e instrucciones por escrito para la administración del compuesto.

57. Un método para prevenir o tratar una neoplasia en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizado porque el compuesto altera la unión del bromodominio a la lisina acetilada o desplaza un miembro de la familia BET de la cromatina, con lo que se previene o trata la neoplasia.

58. El método de conformidad la reivindicación 57, caracterizado porque el compuesto inhibe la unión del residuo peptídico Kac de la histona H4 a un miembro de la familia BET.

59. El método de conformidad la reivindicación 57, caracterizado porque el miembro de la familia BET es BRD2, BRD3, BRD4 o BRDT .

60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-39, caracterizado porque el compuesto se une al sitio de unión Kac de un bromodominio de la familia BET.

61. Un método para identificar un compuesto para el tratamiento de una neoplasia, caracterizado porque comprende poner en contacto un compuesto de prueba con un miembro de la familia BET que comprende un bromodominio, y detectar la unión específica al bromodominio, con lo que se identifica si el compuesto de prueba es útil para el tratamiento de una neoplasia.

62. El método de conformidad la reivindicación 61, caracterizado porque la especificidad de unión se evalúa empleando fluorimetría diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés) .

63. El método de conformidad la reivindicación 61, caracterizado porque la unión aumenta la estabilidad térmica del bromodominio .

64. El método de conformidad la reivindicación 61, caracterizado porque la unión se detecta empleando calorimetría isotérmica de titulación.

65. El método de conformidad la reivindicación 61, caracterizado porque la unión se detecta empleando un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente (ALPHA-screen) .

66. El método de conformidad la reivindicación 61, caracterizado porque el compuesto inhibe la unión del residuo peptídico Kac de la histona H4 a el bromodominio.

67. El método de conformidad la reivindicación 61, caracterizado porque el compuesto forma un puente de hidrógeno con una asparagina evolutivamente conservada en el bromodominio .

68. El método de conformidad la reivindicación 67, caracterizado porque el miembro de la familia BET es BRD4 o BRD2 y la asparagina es Asnl40 en BRD4(1) y Asn429 en BRD2 (2 ) .

69. El método de conformidad la reivindicación 61, caracterizado porque el compuesto se une competitivamente con la cromatina en un entorno celular.

70. El método de conformidad la reivindicación 69, caracterizado porque la unión competitiva con la cromatina se detecta empleando recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP, por sus siglas en inglés) .

71. El método de conformidad la reivindicación 69, caracterizado porque se lleva a cabo en una célula neoplásica in vitro.

72. El método de conformidad la reivindicación 71, caracterizado porque comprende además detectar una reducción de la proliferación celular, un aumento de la muerte celular o un aumento de la diferenciación celular.

73. El método de conformidad la reivindicación 72, caracterizado porque la muerte celular es una muerte celular por apoptosis.

74. El método de conformidad la reivindicación 71, caracterizado porque la diferenciación celular se identifica detectando un aumento de la expresión de citoqueratina .

75. El método de conformidad la reivindicación 71, caracterizado porque comprende además detectar una reducción en la elongación de la transcripción.

76. Un método para tratar o prevenir una neoplasia en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, en donde el compuesto es capaz de unirse a un bromodominio de la familia BET y alterar la interacción de los bromodominios con la cromatina, con lo que se previene o trata el cáncer.

77. El método de conformidad la reivindicación 76, caracterizado porque induce la diferenciación o muerte celular en una célula neoplásica del sujeto.

78. Una composición para el tratamiento o la prevención de una neoplasia, caracterizada porque comprende una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado del grupo constituido por los compuestos de conformidad con las reivindicaciones 1-36, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde el compuesto inhibe • la unión del residuo peptidico Kac de la histona H4 al bromodominio de la familia BET.

79. Un método para reducir la inflamación en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36.

80. Un método para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36.

81. El método de conformidad la reivindicación 80, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.

82. El método de conformidad la reivindicación 80, caracterizado porque el sujeto es un paciente humano.

83. El método de conformidad la reivindicación 80, caracterizado porque reduce el nivel de citocinas, la liberación de histaminas o la actividad biológica de una célula inmunosensible .

8 . Un método para identificar un compuesto para el tratamiento de la inflamación, caracterizado porque comprende poner en contacto un compuesto de prueba con un miembro de la familia BET que comprende un bromodominio, y detectar la unión específica al bromodominio, con lo que se identifica si el compuesto de prueba es útil para el tratamiento de la inflamación.

85. Un compuesto caracterizado porque es representado por la fórmula: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

86. El compuesto de conformidad la reivindicación 85, caracterizado porque es (+)-JQl: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

87. Un compuesto caracterizado porque es representado fórmula: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

88. Un compuesto caracterizado porque es representado a fórmula: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

89. Un compuesto caracterizado porque es representado ualquiera de las siguientes fórmulas : o una de sus sales, solvatos o hidratos.

90. Un compuesto caracterizado porque es representado cualquiera de las siguientes fórmulas: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

91. Un compuesto caracterizado porque es representado cualquiera de las siguientes estructuras: ?? ?? ?? ?64 o una de sus sales, solvatos o hidratos.

92. Un compuesto caracterizado porque es representado a estructura: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

93. Un compuesto caracterizado porque es representado a estructura: o una de sus sales, solvatos o hidratos.

94. Un compuesto caracterizado porque es representado a estructura: o una de sus sales, solvatos o hidratos.