KR102201902B1 - 암을 진단하기 위한 마커인 sox9 및 brd4, 및 이들을 이용한 암 예측 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암을 진단하기 위한 마커인 SOX9 및 BRD4를 이용한 암 예측 방법에 관한 것으로, 구체적으로 암 세포에서 BET 저해제인 JQ1이 BRD4에 의한 SOX9 전사를 억제하여 SOX9의 발현을 감소시키고, 아세틸화된 SOX9-BRD4 단백질-단백질 상호작용을 억제하며, SOX9 단백질 안정성을 감소시키는 것을 확인하였으므로, 상기 SOX9 및 BRD4를 암 진단 또는 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

암을 진단하기 위한 마커인 SOX9 및 BRD4, 및 이들을 이용한 암 예측 방법{SOX9 and BRD4, the markers for diagnosing cancer, and method for predicting cancer using the makers}
본 발명은 암을 진단하기 위한 마커인 SOX9 및 BRD4, 이들을 이용한 암 예측 방법, 및 항암제 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
성 결정 부위 Y-box9(SOX9)는 연골 형성 및 고환 발달에 중추적인 역할을 하고, 간, 외분비 췌장 및 장과 같은 다양한 성인 장기의 전구체 마커로 알려져 있다. SOX9 이형 접합 마우스는 출생시에 치사율을 나타내지만, SOX9 돌연변이 또는 발현 변형(Expression alteration)은 고환 및 골격 발달의 기능 장애를 유발한다. 발달 역할뿐만 아니라, 다양한 연구에서 SOX9은 암 발병, 진행, 전이, 암 줄기세포 유지 및 항암제에 대한 저항성 획득에 핵심적인 역할을 한다고 보고되었다. 암에서 SOX9의 상향 조절을 맡고 있는 일부 메커니즘이 밝혀졌다.
예를 들어, 식도암 줄기 세포군에서, 전사 보조활성인자인 YAP1은 SOX9 프로모터에 YAP1/TEAD 결합을 통해 SOX9 전사를 활성화시킨다. 전이성 종양 세포에서, SLUG는 SOX9의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 억제함으로써 SOX9 안정성을 높이는 것으로 알려져 있다. 그러나, SOX9 발현을 보다 효율적으로 조절하기위한 새로운 약제 및 전략을 개발하기 위해서는 추가연구가 필요하다.
아세틸화는 세포에서 주요한 전사 후 단백질 변형이고, 중심 세포 에너지-감지 분자 아세틸-CoA로부터 기능성 아세틸기가 제공되는 것으로서, 이 변형은 두 가지 타입, 즉 히스톤 아세틸화 및 비-히스톤 아세틸화로 나뉜다. DNA 조절부위의 히스톤 아세틸화는 '열린' 상태의 크로마틴의 전사 활성화와 관련되어 있다. 히스톤 아세틸화는 다른 공유결합의 후성 유전학적 적 변형과 마찬가지로 Writers(암호생산자), Erasers(암호제거자) 및 Readers(암호해독분자)에 의해 조절된다. Writers(암호생산자)로서, Gcn5/PCAF, CBP/p300, Rtt109 및 MYST 패밀리를 포함하는 히스톤 아세틸전달효소(HAT)는 염색질 형성(Chromation assembly)의 조절에 중요한 역할을 한다. 대조적으로, 히스톤 탈아세틸화효소(HDACs)는 Erasers(암호제거자) 역할을 한다. 이러한 HATs 및 HDACs는 전사 인자 및 에피제네틱 효소와 같은 비-히스톤 단백질을 표적으로 할 수도 있다. 최근 연구에서는 아세틸화가 전사 인자 및 효소의 안정성, 국소화 및 활성에 영향을 미친다고 알려졌다.
아세틸화된 라이신 잔기는 브로모도메인 및 Extra-terminal domain(BET) 패밀리 멤버와 같은 리더 단백질에 의해 인식된다. 최근, 여러 암과 BET의 연관성이 밝혀졌고, BET 저해제가 항암제로 개발되었다. BET 패밀리 멤버를 타겟으로하는 약물이 몇 가지 있지만, JQ1은 비교적 BRD4에 특이적이고 임상시험에서는 JQ1이 혈액암, 간암 및 유방암에 강력한 치료 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 광범위한 연구에도 불구하고, BET 저해제의 적용 가능성 및 근본적인 메커니즘을 연구하기 위한 추가적인 연구들이 필요하다.
이에 본 발명자들은 조기에 간암 및 식도암을 진단하기 위한 마커, 및 이를 이용하여 간암 및 식도암을 예측할 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 간암 및 식도암 세포에서 BET 저해제인 JQ1이 BRD4에 의한 SOX9 전사를 억제하여 SOX9의 발현을 감소시키고, 아세틸화된 SOX9-BRD4 단백질-단백질 상호작용을 억제하며, SOX9 단백질 안정성을 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 SOX9 및 BRD4를 간암 및 식도암 진단 또는 감암 및 식도암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있음을 밝혔으며, 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적음 암을 진단하기 위한 마커인 SOX9 및 BRD4를 이용한 암의 예측 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암을 진단하기 위한 마커인 SOX9 및 BRD4를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암을 진단하기 위한 마커인 SOX9 및 BRD4를 이용한 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피검체로부터 분리한 시료에서 SOX9 및 BRD4 단백질의 결합 수준 또는 단백질-단백질 상호작용을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 암의 진단 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 암 세포에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포 내 SOX9 및 BRD4 단백질의 결합 수준 또는 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 측정 결과, 단백질 결합 수준 또는 단백질-단백질 상호작용이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하는 경우 상기 피검물질을 암 치료용 조성물로 판별하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 BRD4 저해제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 암 세포에서 BET 저해제인 JQ1이 BRD4에 의한 SOX9 전사를 억제하여 SOX9의 발현을 감소시키고, 아세틸화된 SOX9-BRD4 단백질-단백질 상호작용을 억제하며, SOX9 단백질 안정성을 감소시키는 것을 확인하였으므로, 상기 SOX9, BRD4를 암 진단 또는 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 SK-Hep1 및 HCE7 세포에서 SOX9의 발현이 상실 후 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿에 의해 SOX9의 mRNA(상단) 및 SOX9, βactin, H3K27Ac 및 히스톤 H3의 단백질(하단)의 수준을 나타낸 도이다.
도 2는 SK-Hep1 및 HCE7 세포에서 SOX9의 발현이 상실 후 48 시간 동안 상처 치유 능력을 나타낸 도이다.
도 3은 SK-Hep1 및 HCE7 세포의 shCon 및 shSOX9에 대한 세포주기 분석을 나타낸 도이다.
도 4는 K-Hep1 및 HCE7 세포에서 후성 유전학적 약제를 24 시간 처리한 후 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 SOX9, YAP1, βactin, H3K27Ac 및 히스톤 H3의 SOX9의 mRNA(상단) 및 단백질(하단) 수준을 확인한 도이다(* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
도 5는 투여량에 따른 SOX9, βactin, H3K27Ac 및 히스톤 H3의 SOX9 mRNA(상단) 및 단백질(하단) 수준을 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 분석한 도이다.
도 6은 시간에 따른 SOX9, βactin, H3K27Ac 및 히스톤 H3의 SOX9 mRNA(상단) 및 단백질(하단) 수준을 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 근위 프로모터(Proximal promoter, PP) 및 원위 인핸서(Distal enhancer, DE)를 포함하는 SOX9의 개략도를 나타낸 도이다.
도 8은 SK-Hep1의 Con 및 JQ1의 SOX9 근위 프로모터 및 원위 인핸서에서 AcH4 및 BRD4의 결합을 나타내는 ChIP을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도이다(* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
도 9는 JQ1 처치 후, SK-Hep1 및 HCE7 세포의 Cytosolic(세포질) 및 Nuclear(핵) 추출물을 사용하여 SOX9, 튜블린 및 히스톤 H3를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 아세틸화 SOX9가 후성 유전학적 약제를 사용한 처치에서 SOX9 및 아세틸화 라이신의 항체로 면역 침전되고, 이를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 내인성 SOX9 및 BRD4가 JQ1의 유무에 따라 항-SOX9 및 BRD4 항체로 면역 침전되고, 이를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 SK-Hep1 세포를 JQ1(1mM, 24 시간) 및 프로테아좀 저해제 MG132(5 mM, 5 시간)로 처리하고, SOX9의 발현을 웨스턴 블럿팅으로 분석한 도이다.
도 13은 JQ1 및 MG132로 처리된 SK-Hep1 세포의 용해액을 콘트롤 IgG 또는 항-SOX9 항체를 사용하여 면역침전 시키고, 면역 복합체를 웨스턴 블롯으로 유비퀴틴화에 대해 분석하며, 튜블린을 IP 입력의 로딩 컨트롤로 사용한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 SK-Hep1 세포를 다양한 시점(0, 0.5, 1, 2, 3 및 6 시간)동안 CHX(25 ng/mL) 및 JQ1(1 μM)로 처리하고, 세포 용출액을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 Image J 프로그램을 이용하여 CHX 첨가 후 남은 SOX9의 상대적 비율을 나타내는 그래프를 나타낸 도이다.
도 16은 간암 및 식도암 세포에서 BET 저해제인 JQ1가 BRD4에 의한 SOX9 전사를 억제하여 SOX9의 발현을 감소시키는 기전을 도식화한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 피검체로부터 분리한 시료에서 SOX9 및 BRD4 단백질의 결합 수준 또는 단백질-단백질 상호작용을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 암의 진단 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
상기 시료는 조직, 세포, 혈장, 혈청, 혈액, 타액 및 소변일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 SOX9는 구체적으로 아세틸화된 SOX9인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 단백질의 결합 수준은 면역형광법, 면역침강법, 단백질 칩 분석, 웨스턴 블럿팅(Western blotting) 및 효소면역측정법(ELISA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하며, 구체적으로는 간암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 BET 저해제인 JQ1을 이용하여 암 세포에서 과발현된 SOX9 발현을 감소시키는 암 예방 및 치료 기전을 확인하였다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 암 세포에서 BET 저해제인 JQ1이 BRD4에 의한 SOX9 전사를 억제하여 SOX9의 발현을 감소시키고, 아세틸화된 SOX9-BRD4 단백질-단백질 상호작용을 억제하며, SOX9 단백질 안정성을 감소시키는 것을 확인하였으므로, 상기 SOX9 및 BRD4를 암 진단 마커로 이용할 수 있고, 암의 진단을 위한 정보를 제공하는데 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 암 세포에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포 내 SOX9 및 BRD4 단백질의 결합 수준 또는 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 측정 결과, 단백질 결합 수준 또는 단백질-단백질 상호작용이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하는 경우 상기 피검물질을 암 치료용 조성물로 판별하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하며, 구체적으로는 간암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 보다 바람직하다.
상기 단계 2)의 SOX9은 아세틸화된 SOX9인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 암 세포에서 BET 저해제인 JQ1이 BRD4에 의한 SOX9 전사를 억제하여 SOX9의 발현을 감소시키고, 아세틸화된 SOX9-BRD4 단백질-단백질 상호작용을 억제하며, SOX9 단백질 안정성을 감소시키는 것을 확인하였으므로, 상기 SOX9 및 BRD4 간 단백질 결합 및 단백질-단백질 상호작용을 측정하여 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 BRD4 저해제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 BRD4 저해제는 JQ1, MS417, CeMMEC2, I-BET 151(또는 GSK1210151A), I-BET 762(또는 GSK25762), PFI-1, Bromosporine, OTX-015, TEN-010, CPI-203, CPI-0610, RVX-208, BI2536, TG101348, LY294002, INCB054329, ABBV-075 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하고, 구체적으로는 JQ1인 것이 보다 바람직하다.
상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하며, 구체적으로는 간암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 발명자들은 암 세포에서 BRD4 저해제인 JQ1이 BRD4에 의한 SOX9 전사를 억제하여 SOX9의 발현을 감소시키고, 아세틸화된 SOX9-BRD4 단백질-단백질 상호작용을 억제하며, SOX9 단백질 안정성을 감소시키는 것을 확인하였으므로, 상기 SOX9, BRD4 및 JQ1을 이용하여 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포 배양
인간 간암 세포주 SK-Hep1 및 식도암 세포주 HCE7 각각은 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank; KCLB)에서 구입하였다. 각 세포주는 10% 소태아혈청(FBS; Welgene) 및 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen) 100 units/mL가 첨가된 DMEM(Welgene) 배지에서 배양하였다.
<실시예 2> shRNA 감염
shSOX9 컨스트럭트(construct)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 렌티바이러스(Lentivirus)를 제작하기 위하여, MISSION Lentiviral Packaging Mix를 사용했다. 안정적으로 shRNA를 발현하는 감염 변이세포는 1.25 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Puromycine) 존재 하에서 선택하였다.
<실시예 3> RNA 추출 및 RT-PCR
간암 및 식도암 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하고 DNase Ⅰ로 분해한 후, High Capacity cRNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용해 역전사하였다. cDNA의 증폭은 LightCycler® 480 SYBR Green Ⅰ Master(Roche)를 사용하여 제조사의 절차에 따라 LightCycler® 480 Ⅱ(Roche)에서 수행하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다 : GAPDH-F: 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'(서열번호 1), GAPDH-R: 5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'(서열번호 2), SOX9-F: 5'-GGCCTCTACTCCACCTTCACCT-3'(서열번호 3), SOX9-R: 5'-GACGGGTTGTTCCCAGTGCT-3'(서열번호 4).
<실시예 4> 핵-세포질 추출물(Nuclear-cytoplasmic extract)
세포질 추출 완충액(10 mM HEPES, pH 7.9, 50 mM NaCl, 0.5 M 수크로오스, 0.1 mM EDTA, 0.5 % TX100 및 1 mM DTT) 및 핵 단백질 추출용 RIPA 완충액(CellNest)를 사용하여 핵 및 세포질 분획물 각각을 제조하였다.
<실시예 5> 웨스턴 블럿팅(Western blotting)
간암 및 식도암 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 RIPA 완충액(CellNest)을 이용하여 용해하고, 초음파 처리하였다. 세포 용해물을 Laemmli 시료 완충액에서 가열하고, 30 ㎍의 단백질 양으로 SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동하였다. 단백질 농도는 브래드포드(Breadford) 단백질 분석을 통해 측정하였다. 항-SOX9 항체(Millipore #AB5535), 항-YAP1 항체(SANTA CRUZ #SC-15407), 항-βACTIN 항체(CST #4967 S), 항-Histone H3 항체(Abcam #ab1791), 항-H3K27Ac 항체(Abcam #ab4729) 및 항-alphatubulin 항체(SANTA CRUZ #SC-5549)를 이용하였다.
<실시예 6> 상처 치유 분석(Wound healing assay)
FBS가 포함되지 않은 배지에서 밤새 양분을 차단한 뒤, 세포 단층을 멸균된 마이크로 피펫 팁으로 긁어 내었다. 이후 24 시간 및 48 시간 후의 긁어 낸 부위의 초기 간격(0 시간) 및 이후 간격을 현미경 사진으로 확인하였다.
<실시예 7> 세포 주기 분석(Cell cycle analysis)
Cycle test Plus DNA Reagent Kit(BD Biosciences)를 사용하여 제조사의 절차에 따라 세포주기 검정을 수행하였다. FACS scan(BD Biosciences)을 사용하여 (세포 주기의) 세포 프로파일을 분석하였다.
<실시예 8> ChIP 분석(Chromatin immunoprecipitation assay)
ChIP 분석은 Upstate Biotechnology의 절차에 따라 수행하였다. ChIP 분석을 위해, 초음파 처리에 의해 깎인 DNA를 단백질 A 자성 비드(Merck)로 제거한 뒤, BRD4(Bethyl #301-985A100) 또는 AcH4(Millipore #06_866)로 침전하였다. 면역침전(IP) 후, 회수한 염색질 단편을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 모든 ChIP에 대해 IgG 대조군 실험을 수행하고 결과를 (IP-IgG) / (Input-IgG)로 나타냄으로써 IP/Input(1 %)에 통합시켰다. ChIP 프라이머는 다음과 같다 : SOX9_PP-F: 5'-CCAGTGCCACAATCCTCCTC-3'(서열번호 5), SOX9_PP-R: 5'-CAGTTTCGAGCTCCGCTTTC-3'(서열번호 6), SOX9_DE-F: 5'-TGGCAGTTTCAGTTGACCTTAG-3'(서열번호 7), SOX9_DE-R: 5'-GGCGTGTGCTTTGATTATAGG-3'(서열번호 8).
<실시예 9> 면역침강법(Immunoprecipitation)
간암 및 식도암 세포를 프로테아제 저해제(Millipore) 및 포스파타제 저해제(Roche)가 보충된 PRO-PREP(iNtRON)을 이용하여 용해하였다. 면역침강 분석을 수행하기 위해, 용해물(1 ㎎)을 항체와 함께 4℃에서 3 시간 동안 배양시켰고, 그 후 단백질-A 아가로스 비드(Roche)를 첨가하여 16 시간 동안 배양하였다. 상기 면역복합체(Immunocomplexes)를 PBS로 세척하고, <실시예 5>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
<실험예 1> 간암 및 식도암 세포에서 JQ1에 의한 SOX9의 발현 감소 확인
SOX9의 발현 수준을 몇몇 인간 암 세포 주에서 스크리닝하였고, SK-Hep1 및 HCE7 세포주가 가장 높은 SOX9 발현을 보여 추가 분석을 위해 선택되었다. SOX9이 이들 세포주에서 종양 형성을 일으키는지 확인하기 위해, Short hairpin RNA(shRNA)를 사용하여 안정한 SOX9 낙다운(knockdown) 세포를 생성하였다(도 1). SOX9의 손실은 상처 치유 능력을 감소시키고 두 세포주에서 세포주기의 정지를 개시했으며(도 2 및 3), 이 두 세포주가 SOX9을 표적으로 하는 약물 개발에 적합함을 암시하였다. SOX9가 아세틸화된 히스톤 H3 라이신 27(H3K27Ac)과 같은 활성 증강 인자 마커와 관련된 주요 인자로서의 역할을 할 수 있다는 점을 감안하여, SOX9 낙다운에 따라 H3K27Ac의 전체적인 수준을 확인했지만, 큰 차이는 발견되지 않았다. 자기 아세틸화 의존성(self-acetylation-dependent) 전사 활성의 변화 또는 HAT P300과의 직접적인 상호 작용과 같은 SOX9과 라이신 아세틸화 사이의 밀접한 연관성에 기초하여, 우리는 아세틸화 관련 후성 유전학적 약제인 JQ1(아세틸화 reader BRD4 저해제), 아피시딘(아세틸화 eraser HDAC 저해제) 및 C646(아세틸화 writer P300 저해제)에 초점을 맞추었다. JQ1은 두 세포주의 mRNA 및 단백질 수준에서 SOX9를 극적으로 낮추었다(도 4). C646은 SOX9 발현에 거의 영향을 주지 않은 반면에, 아피시딘은 SOX9 발현의 상향조절을 유도하였다. 전체적인 H3K27Ac 수준의 변화는 이러한 약물의 효과를 확인시켜 주었다(도 4). 동시에, 이러한 결과는 BRD4 저해제 JQ1이 SOX9 발현을 조절하는 후성 유전학적 약제로서 유용할 수 있음을 암시한다.
<실험예 2> SOX9 프로모터(Promoter) 및 인핸서(Enhancer)에서 JQ1에 의한 BRD4 결합의 직접 저해 및 SOX9 전사 억제 확인
SOX9의 발현이 JQ1에 의해 조절되는지 확인하기 위해, SK-Hep1 세포를 0.04, 0.2, 1 또는 5 mM의 JQ1에 24 시간 동안 노출시켰다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, SOX9의 mRNA 및 단백질 수준은 투여량 의존적으로 현저히 감소하였다. 우리는 JQ1 투여 후 SOX9의 발현을 측정했고, SOX9의 억제는 6 시간 후에 관찰되었으며, 주목할 만하게, 단백질 수준에서 SOX9 발현이 현저하게 감소하였다(도 6). SOX9의 하향조절이 BRD4의 SOX9 조절 영역으로의 직접 결합과 관련 있는지 확인하기 위해, SOX9의 전사 개시 부위(Transcription start site, TSS)의 258 kb 상류에 위치하는 원위 인핸서(Distal enhancer, DE)를 나타내는 SOX9의 DNA 조절 영역을 확인하기 위한 문헌 검색이 수행되었다(도 7). BRD4 및 아세틸화 히스톤 H4(AcH4)에 대한 항체를 사용하여 <실시예 8>의 ChIP 분석을 수행하고, SOX9의 원위 인핸서 및 근위 프로모터(proximal promoter, PP)의 qRT-PCR을 수행하였다. BRD4는 두 DNA 조절 영역에 매우 풍부하게 존재하였다. BRD4의 결합은 JQ1 처리시 6 시간 째에 현저하게 감소하였고(도 8), 이는 시간 의존적으로 SOX9의 전사와도 관련되어 있으며, 활성 히스톤 변형 마커인 AcH4의 발현을 감소시켰다(도 6 및 8). 종합해보면, 이 결과는 SOX9가 JQ1의 직접적 전사 표적임을 증명한다.
<실험예 3> JQ1에 의한 SOX9 및 BRD4 단백질 상호작용 간섭 확인
JQ1이 SOX9 세포내 위치(Subcellular localization)를 변화시킬 수 있는지를 분석하였다. 도 9에서 나타나듯이, SOX9는 주로 핵에 국한되어 있고, 핵 SOX9는 JQ1에 의해 현저히 감소되었다. 튜블린(Tubulin) 및 히스톤 H3는 핵 세포질 추출 조절에 사용되었다(도 9). SOX9는 세 개의 라이신 잔기(K61, K253 및 K398)에서 아세틸화되고, 아세틸화된 SOX9는 더 기능적인 것으로 보인다. 따라서, 우리는 다음으로 아세틸-라이신 항체로 <실시예 9>의 면역침강(IP) 분석법을 사용하여 후성 유전학적 약물을 투여했을 때 SOX9의 아세틸화 변화를 확인했고, JQ1이 이 변화에 영향을 받는 것을 발견했다. 우리는 SOX9의 아세틸화가 JQ1의 투여에 의해 감소됨을 관찰하였으며, 다른 약제(아피시딘 및 C646)에 의한 것은 아니었다(도 10). BRD4 결합 의존성 SOX9 아세틸화에 대한 변화가 있었는지 알아내기 위해, SOX9 및 BRD4에 대한 항체를 사용하여 <실시예 10>의 IP 분석을 수행했다. 도 9 내지 11은 JQ1이 SOX9 및 BRD4 간의 상호작용을 방해한다는 것을 보여준다. 종합적으로, 이 결과는 아마도 아세틸화된 SOX9가 BRD4에 의해 인식되고, 이 상호작용이 JQ1에 의해 저해된다는 것을 증명한다.
<실험예 4> JQ1에 의한 유비퀴틴화를 통해 SOX9 단백질 분해의 증가
SLUG는 상피간엽이행(Epithelial to mesenchymal transition, EMT)에 관여하는 단백질의 주요 전사인자이며, 유비퀴틴화의 조절을 통해 SOX9의 안정성을 증가시키고, 프로테아좀 분해가 SOX9의 중요한 턴오버 과정임을 나타낸다. JQ1이 이 단계를 표적으로 하는지 여부를 알아내기 위해, 세포를 JQ1 및 강력한 프로테아좀 저해제 MG132로 처리하였다. 결과는 SOX9 단백질 발현이 JQ1의 처리에 관계없이 MG132에 의해 증가되었음을 보여줬다(도 12). 다음으로, <실시예 10>의 IP 분석을 추가로 수행하여, SOX9 유비퀴틴화가 JQ1 처리에 의해 증가되었음을 보여주었다(도 13). 이 발견을 확인하기 위해, 사이클로헥시미드 체이스 분석(CHX chase assay)을 수행하여 단백질의 반감기를 추정했다. 도 1 및 15에서 나타나듯이, SOX9의 반감기는 JQ1의 존재 하에 단축되었다. 종합하면, 이 데이터는 JQ1이 유비퀴틴화에 의한 프로테아좀 관련 저하를 통해 SOX9의 안정성을 감소시킨다는 것을 암시하지만, 이전 연구에서 JQ1 처치에 따른 SLUG 수준의 변화가 없었으므로, JQ1에 의한 SOX9의 안정성 감소는 SLUG와는 무관한 것으로 보인다.
<110> YOU, JUENG SOO HONG, SEONG HWI <120> SOX9 and BRD4, the markers for diagnosing cancer, and method for predicting cancer using the makers <130> PB2019-031 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagtcaacgg atttggtcgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 tggaagatgg tgatgggatt 20 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggcctctact ccaccttcac ct 22 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 gacgggttgt tcccagtgct 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 ccagtgccac aatcctcctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 cagtttcgag ctccgctttc 20 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 tggcagtttc agttgacctt ag 22 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggcgtgtgct ttgattatag g 21

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  7. 1) 암 세포에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 암 세포 내 SOX9 및 BRD4 단백질의 결합 수준 또는 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 측정 결과, 단백질 결합 수준 또는 단백질-단백질 상호작용이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하는 경우 상기 피검물질을 암 치료용 조성물로 판별하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 암은 간암 또는 식도암인 것을 특징으로 하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 단계 2)의 SOX9은 아세틸화된 SOX9인 것을 특징으로 하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
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