TWI549955B - 治療腫瘤形成、發炎疾病及其他病症之組成物及方法 - Google Patents

Description

治療腫瘤形成、發炎疾病及其他病症之組成物及方法 [相關申請案]

本申請案請求下述美國臨時專利申請案之優先權：2010年8月4日提出申請之序號61/370,745、2010年8月22日提出申請之序號61/375,863及2011年3月24日提出申請之序號61/467,376。彼等申請案各者之全部內容均併入本文以資參考。

[美國聯邦資助研究之發明權利聲明]

本研究工作受美國國家衞生研究院獎助金資助，獎助金編號：K08CA128972；美國政府對本發明具有特定權利。

本發明有關於治療或預防腫瘤形成之組成物及方法。更具體而言，本發明提供破壞包括含溴區結構域之BET家族多肽與染色質間相互作用之組成物及方法。

組蛋白N端尾部維持染色質穩定性及進行與轉錄調控相關之修飾。彼等修飾之最佳特徵為乙醯化、甲基化及磷酸化。就每一種修飾而言，存在制定適當標記或將標記刪除之酵素；然後必須由轉錄機制解釋彼等修飾。乙醯基-離胺酸識別主要由轉錄因子複合物之一般成分的溴功能部位促成。該溴功能部位及附加末端(extra-terminal)(BET)-家族(例如，BRD2,BRD3,BRD4及BRDT)共有由展現高度序列保守性的兩個N端溴功能部位及與蛋白質-蛋白質相互作用有牽連之較分岐C端功能部位組成之一般功能部位架構。組蛋白修飾之異常調控會影響基因活性及於腫瘤形成中產生作用。於非組蛋白蛋白質[係包括，惟不限於Hsp90、p53、STAT轉錄因子、皮層蛋白(cortactin)、β-連環蛋白及α-微管蛋白]之作用中，離胺酸側鏈乙醯化為重要之調控項目。因此，離胺酸側鏈識別之調節被預期將於疾病形成中明顯地發揮重要表現型及治療效果。儘管乙醯基-離胺酸識別對腫瘤形成之重要性，惟幾乎無乙醯基-離胺酸識別之調節劑被鑑定出。

如下文所述，本發明之特徵為用於治療或預防腫瘤形成、發炎疾病、肥胖症、脂肪肝(NASH或其他)、糖尿病、動脈粥狀硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡病質、移植物對抗宿主疾病及含溴區結構域(bromodomain)相關之傳染疾病、治療寄生蟲、瘧疾、錐蟲、以及降低雄性生育力之組成物及方法。於特定具體實施例中，本發明之化合物係用於克服腫瘤形成(例如，癌症及非惡性疾病)之抗藥性。本發明之組成物的其他用途包括用於器官移植、再生醫學之細胞狀態調整(亦即，藉由促進或抑制細胞分化)以及促進多能性(pluripotency)，但不限於此。更具體而言，本發明提供用於擾亂包括含溴區結構域之BET家族多胜肽及乙醯基-離胺酸及/或染色質的交互作用(例如，擾亂含溴區結構域及存在於組蛋白N-端尾部之乙醯基-離胺酸修飾的交互作用)以及抑制癌生成之組成物及方法。於另一具體實施例中，本發明係預防或治療發炎疾病。

於一態樣中，本發明提供式I之化合物或其鹽、溶劑合物、或水合物： 其中，X為N或CR₅；R₅為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；R_B為H、烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷氧基烷基、鹵烷基、羥基、烷氧基、或-COO-R₃，其各者係視需要取代；環A為芳基或雜芳基；各R_A係獨立為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者任兩個R_A可與其所分別附接之原子一起形成稠合芳基或稠合雜芳基；R為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0至3，以及L為H、-COO-R₃、-CO-R₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R₄)、N(R₄)C(O)R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；R₂為H、D、鹵素、或視需要取代之烷基；各R₃係獨立選自下列所組成之群組： (i)H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、或經取代之雜芳基；

(ii)　雜環烷基或經取代之雜環烷基；

(iii) -C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，其分別含有0、1、2或3個選自O、S、或N之雜原子；-C₃-C₁₂環烷基、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基，其各者可視需要取代；以及

(iv) NH₂、N=CR₄R₆；

各R₄係獨立為H、烷基、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者R₃及R₄及其所附接之氮原子一起形成4至10員環；R₆為烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者R₄及R₆以及其所附接之碳原子一起形成4至10員環；

m為0、1、2、或3；

限制條件為

(a)　若環A為噻吩基，X為N，R為苯基或經取代之苯基，R₂為H，R_B為甲基，以及R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為1以及L為-CO-N(R₃R₄)，則R₃及R₄不與其所附接之氮原子一起形成N-嗎啉環；

(b)　若環A為噻吩基，X為N，R為經取代之苯基，R₂為H，R_B為甲基，以及R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為1以及L為-CO-N(R₃R₄)，且R₃及R₄中之一者為H，則R₃及R₄中之另一者不為甲基、羥基乙基、烷氧基、苯基、經取代之苯基、吡啶基或經取代之吡啶基；以及

(c)　若環A為噻吩基，X為N，R為經取代之苯基，R₂為H，R_B為甲基，以及R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為1以及L為-COO-R₃，則R₃不為甲基或乙基。

於某些具體實施例中，R為芳基或雜芳基，其各者係視需要取代。

於某些具體實施例中，L為H、-COO-R₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R₄)、N(R₄)C(O)R₃或視需要取代之芳基。於某些具體實例中，各R₃係獨立選自下列所組成之群組：H含有0、1、2或3個選自O、S、或N之雜原子的-C₁-C₈烷基；或NH₂、N=CR₄R₆。

於某些具體實施例中，R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為1以及L為-CO-N(R₃R₄)，且R₃及R₄中之一者為H，而R₃及R₄中之另一者為(CH₂)_p-Y，其中，p為1至3(例如，p為2)以及Y為含氮環(其可為芳香族或非芳香族)。

於某些具體實施例中，R₂為H、D、鹵素、或甲基。

於某些具體實施例中，R_B為烷基、羥基烷基、鹵烷基、或烷氧基；其各者係視需要取代。

於某些具體實施例中，R_B為甲基、乙基、羥基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、或COOCH₂OC(O)CH₃。

於某些具體實施例中，環A為5或6員芳基或雜芳基。於某些具體實施例中，環A為硫代呋喃基、苯基、萘基、聯苯基、四氫萘基、氫茚基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、嗒基、吡基、咪唑基、噁唑基、噻吩基、噻唑基、三唑基、異噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、或5,6,7,8-四氫異喹啉基。

於某些具體實施例中，環A為苯基或噻吩基。

於某些具體實施例中，m為1或2，且R_A於至少一次出現時為甲基。

於某些具體實施例中，各R_A係獨立為H、視需要取代之烷基，或者任兩個R_A可與其所分別附接之原子一起形成芳基。

於另一態樣中，本發明提供式II之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

其中，X為N或CR₅；R₅為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；R_B為H、烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷氧基烷基、鹵烷基、羥基、烷氧基、或-COO-R₃，其各者係視需要取代；各R_A係獨立為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者任兩個R_A可與其所分別附接之原子一起形成稠合芳基或稠合雜芳基；R為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；R’₁為H、-COO-R₃、-CO-R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；各R₃係獨立選自下列所組成之群組：(i)H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基；(ii)雜環烷基或經取代之雜環烷基；(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，其分別含有0、1、2或3個選自O、S、或N之雜原子；-C₃-C₁₂環烷基、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基；其各者可視需要取代；m為0、1、2、或3；限制條件為：若R’₁為-COO-R₃，X為N，R為經取代之苯基，以及R_B為甲基，則R₃不為甲基或乙基。

於某些具體實施例中，R為芳基或雜芳基，其各者係視需要取代。於某些具體實施例中，R為苯基或吡啶基，其各者係視需要取代。於某些具體實施例中，R為p-Cl-苯基、o-Cl-苯基、m-Cl-苯基、p-F-苯基、o-F-苯基、m-F-苯基、或吡啶基。

於某些具體實施例中，R’₁為-COO-R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基、以及R₃為-C₁-C₈烷基，其 含有0、1、2或3個選自O、S、或N之雜原子，且其可視需要取代。於某些具體實施例中，R’₁為-COO-R₃，且R₃為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、第二丁基、或第三丁基；或者R’₁為H或視需要取代之苯基。

於某些具體實施例中，R_B為甲基、乙基、羥基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、COOCH₂OC(O)CH₃。

於某些具體實施例中，R_B為甲基、乙基、羥基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、或COOCH₂OC(O)CH₃。

於某些具體實施例中，各R_A係獨立為視需要取代之烷基，或者任兩個R_A可與其所分別附接之原子一起形成稠合芳基。

於某些具體實施例中，各R_A為甲基。

於另一態樣中，本發明提供式III之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物： 其中，X為N或CR₅；R₅為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基， 其各者係視需要取代；R_B為H、烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷氧基烷基、鹵烷基、羥基、烷氧基、或-COO-R₃，其各者係視需要取代；環A為芳基或雜芳基；各R_A係獨立為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者任兩個R_A可與其所分別附接之原子一起形成稠合芳基或稠合雜芳基；R為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；各R₃係獨立選自下列所組成之群組：(i)H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、或經取代之雜芳基；(ii)雜環烷基或經取代之雜環烷基；(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，其分別含有0、1、2或3個選自O、S、或N之雜原子；-C₃-C₁₂環烷基、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基，其各者可視需要取代；以及(iv)NH₂、N=CR₄R₆；各R₄係獨立為H、烷基、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者R₃及R₄與其所附接之氮原子一起形成4至10員環；R₆為烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者R₄及R₆與其所附接之碳原子一起形成4至10員環；m為0、1、2、或3；限制條件為：

(a)若環A為噻吩基，X為N，R為苯基或經取代之苯基，R_B為甲基，則R₃及R₄不與其所附接之氮原子一起形成N-嗎啉環；以及

(b)若環A為噻吩基，X為N，R為經取代之苯基，R₂為H，R_B為甲基，以及R₃及R₄中之一者為H，則R₃及R₄中之另一者不為甲基、羥基乙基、烷氧基、苯基、經取代之苯基、吡啶基或經取代之吡啶基。

於某些具體實施例中，R為芳基或雜芳基，其各者係視需要取代。於某些具體實施例中，R為苯基或吡啶基，其各者係視需要取代。

於某些具體實施例中，R為p-Cl-苯基、o-Cl-苯基、m-Cl-苯基、p-F-苯基、o-F-苯基、m-F-苯基、或吡啶基。於某些具體實施例中，R₃為H、NH₂、或N=CR₄R₆。

於某些具體實施例中，各R₄係獨立為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基，其各者係視需要取代。

於某些具體實施例中，R₆為烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代。

於某些具體實施例中，R₃及R₄中之一者為H，而R₃及R₄中之另一者為(CH₂)_p-Y，其中，p為1至3(例如，p為2)以及Y為含氮環(其可為芳香族或非芳香族)。

於另一態樣中，本發明提供式IV之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物： 其中，X為N或CR₅；R₅為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；R_B為H、烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷氧基烷基、鹵烷基、羥基、烷氧基、或-COO-R₃，其各者係視需要取代；環A為芳基或雜芳基；各R_A係獨立為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者任兩個R_A可與其所分別附接之原子一起形成稠合芳基或稠合雜芳基；R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0至3，以及L為H、-COO-R₃、-CO-R₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R₄)、N(R₄)C(O)R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；R₂為H、D、鹵素、或視需要取代之烷基；各R₃係獨立選自下列所組成之群組：(i)H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、或經取代之雜芳基；(ii)　雜環烷基或經取代之雜環烷基；

(iii)　-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，其分別含有0、1、2或3個選自O、S、或N之雜原子；-C₃-C₁₂環烷基、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基，其各者可視需要取代；以及

(iv)　NH₂、N=CR₄R₆；

各R₄係獨立為H、烷基、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者R₃及R₄與其所附接之氮原子一起形成4至10員環；R₆為烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各者係視需要取代；或者R₄及R₆與其所附接之碳原子一起形成4至10員環；

m為0、1、2、或3；

限制條件為

(a)若環A為噻吩基，X為N，R₂為H，R_B為甲基，以及R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0以及L為-CO-N(R₃R₄)，則R₃及R₄不與其所附接之氮原子一起形成N-嗎啉環；

(b)若環A為噻吩基，X為N，R₂為H，R_B為甲基，以及R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0以及L為-CO-N(R₃R₄)，且R₃及R₄中之一者為H，則R₃及R₄中之另一者不為甲基、羥基乙基、烷氧基、苯基、經取代之苯基、吡啶基或經取代之吡啶基；以及

(c)若環A為噻吩基，X為N，R₂為H，R_B為甲基，以及R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0且L為-COO-R₃，則R₃不為甲基或乙基。

於某些具體實施例中，R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0至3，以及L為-COO-R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；以及R₃為-C₁-C₈烷基，其含有0、1、2、或3個選自O、S、或N之雜原子，且其可視需要取代。於某些具體實施例中，n為1或2，以及L為烷基或-COO-R₃，且R₃為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、第二丁基、或第三丁基；或者n為1或2，以及L為H或視需要取代之苯基。

於某些具體實施例中，R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0且L為-CO-N(R₃R₄)，而且R₃及R₄中之一者為H，而R₃及R₄中之另一者為(CH₂)_p-Y，其中，p為1至3(例如，p為2)以及Y為含氮環(其可為芳香族或非芳香族)。

於某些具體實施例中，R₂為H或甲基。

於某些具體實施例中，R_B為甲基、乙基、羥基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、COOCH₂OC(O)CH₃。

於某些具體實施例中，環A為苯基、萘基、聯苯基、四氫萘基、氫茚基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、嗒基、吡基、咪唑基、噁唑基、噻吩基、噻唑基、三唑基、異噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、或5,6,7,8-四氫異喹啉基。

於某些具體實施例中，各R_A係獨立為視需要取代之烷基，或者任兩個R_A可與其所分別附接之原子一起形成芳基。

本發明於本文中亦提供式V至XXII之化合物，以及本文中所述之任何化合物。

於另一態樣中，本發明提供用於治療或預防個體(subject)之腫瘤形成的方法，該方法包括將有效量之式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物投予至該個體。

於某些具體實施例中，該化合物為式I至IV之任何化合物。

於另一態樣中，本發明提供用於降低腫瘤細胞(neoplastic cell)之生長、增殖、或存活的方法，該方法包括使該細胞及有效量之式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物接觸，藉以降低腫瘤細胞之生長、增殖、或存活。

於另一態樣中，本發明提供誘導腫瘤細胞分化之方法，該方法包括使該細胞與式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物接觸，藉以誘導腫瘤細胞分化。

於另一態樣中，本發明提供誘導腫瘤細胞之細胞死亡的方法，該方法包括使該細胞與治療有效量之式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物接觸，藉以誘導腫瘤細胞之細胞死亡。

於某些具體實施例中，該等方法復包括選擇用於結合至BET家族之含溴區結構域的化合物。

於某些具體實施例中，該等方法復包括選擇用於在細胞環境中抑制含溴區結構域結合至染色質之化合物。

於某些具體實施例中，該等方法復包括使用示差掃描螢光測定法(differential scanning fluorimetry;DSF)、等溫滴定微量熱法(isothermal titration calorimetry)及/或螢光近距離勻相分析法(luminescence proximity homogeneous assay；ALPHA-screen)來選擇結合專一性之化合物。於某些具體實施例中，該化合物於所述之分析法中增加含溴區結構域之熱安定性。

於該等方法之某些具體實施例中，該BET家族成員為BRD2、BRD3、BRD4、或BRDT。

於該等方法之某些具體實施例中，該細胞係位於個體內。

於另一態樣中，本發明提供用於預防或治療個體之腫瘤形成的方法，該方法包括將有效量之式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物投予至有需要之個體，藉以預防或治療個體之腫瘤形成。

於某些具體實施例中，該個體為哺乳動物。於某些具體實施例中，該個體為人類患者。

於某些具體實施例中，該方法降低個體之腫瘤形成的生長或增殖。

於某些具體實施例中，該腫瘤形成係藉由轉錄活化子(transcriptional activator)驅動。於某些具體實施例中，該轉錄活化子為myc。

於某些具體實施例中，該個體具有選自下列所組成群組之腫瘤形成：伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、神經母細胞瘤、多型性神經膠母細胞瘤、MLL驅動之白血病、慢性淋巴性白血病、NUT中線癌、鱗狀細胞癌、或與NUT重排有關之任何其他癌症。

於另一態樣中，本發明提供包括治療有效量之式I至XXII之任何化合物、或本文中所述之任何化合物以及醫藥上可接受之賦形劑或載劑的組成物。

於另一態樣中，本發明提供包括治療有效量之式I至XXII之任何化合物、或本文中所述之任何化合物以及用於投予該化合物之書面指示的包裝藥物。

於另一態樣中，本發明提供用於預防或治療個體之腫瘤形成的方法，該方法包括將治療有效量之式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物投予至該個體，其中，該化合物擾亂含溴區結構域結合至乙醯基-離胺酸或者將BET家族成員自染色質移開，藉以預防或治療該腫瘤形成。

於某些具體實施例中，該化合物抑制組蛋白H4 Kac胜肽結合至BET家族成員。

於某些具體實施例中，該BET家族成員為BRD2、BRD3、BRD4、或BRDT。

於某些具體實施例中，該化合物結合至BET家族含溴區結構域之Kac結合位置。

於另一態樣中，本發明提供鑑別用於治療腫瘤形成之化合物的方法，該方法包括使試驗化合物與包括含溴區結構域之BET家族成員接觸；並偵測與含溴區結構域之專一性結合，藉以鑑別適用於治療腫瘤形成之試驗化合物。

於某些具體實施例中，結合專一性係使用示差掃描螢光測定法(DSF)分析。

於某些具體實施例中，結合係使該含溴區結構域之熱安定性增加。

於某些具體實施例中，結合係使用等溫滴定微量熱法偵測。

於某些具體實施例中，結合係使用螢光近距離勻相分析法(ALPHA-screen)偵測。

於某些具體實施例中，該化合物抑制組蛋白H4 Kac胜肽結合至該含溴區結構域。

於某些具體實施例中，該化合物與位於該含溴區結構域中之演化上保留的天冬醯胺酸形成氫鍵。

於某些具體實施例中，該BET家族成員為BRD4或BRD2，且該天冬醯胺酸為BRD4(1)中之Asn140以及BRD2(2)中之Asn429。

於某些具體實施例中，該化合物於細胞環境中與染色質競爭性地結合。

於某些具體實施例中，與染色質之競爭性結合係使用光漂白後螢光回復(fluorescence recovery after photobleaching；FRAP)偵測。

於某些具體實施例中，該方法係於活體外腫瘤細胞中進行。

於某些具體實施例中，該方法復包括偵測細胞增殖之降低、細胞死亡之增加、或細胞分化之增加。

於某些具體實施例中，細胞死亡為凋亡性細胞死亡(apoptotic cell death)。

於某些具體實施例中，細胞分化係藉由偵測細胞角質蛋白表現之增加而確認。

於某些具體實施例中，該方法復包括偵測轉錄延長作用之降低。

於另一態樣中，本發明提供用於治療或預防個體之腫瘤形成的方法，該方法包括將有效量之式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物投予至該個體，其中，該化合物可結合BET家族含溴區結構域並擾亂該含溴區結構域與染色質之交互作用，藉以預防或治療該癌症。

於某些具體實施例中，該方法誘導該個體之腫瘤細胞的細胞死亡或分化。

於另一態樣中，本發明提供用於治療或預防腫瘤形成之組成物，該組成物包括有效量之選自式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物所組成群組之化合物以及醫藥上可接受之賦形劑，其中，該化合物抑制組蛋白H4 Kac胜肽結合至BET家族含溴區結構域。

於另一態樣中，本發明提供用於降低個體發炎之方法，該方法包括將有效量之式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物投予至該個體。

於另一態樣中，本發明提供用於預防或治療個體之發炎疾病的方法，該方法包括將有效量之式I至XXII之任何化合物或本文中所述之任何化合物投予至有需要之個體。

於某些具體實施例中，該個體為哺乳動物。於某些具體實施例中，該個體為人類患者。

於某些具體實施例中，該方法降低細胞激素濃度、組織胺釋放、或免疫反應細胞之生物活性。

於另一態樣中，本發明提供鑑別用於治療發炎之化合物的方法，該方法包括使試驗化合物與包括含溴區結構域之BET家族成員接觸；並偵測與含溴區結構域之專一性結合，藉以鑑別適用於治療發炎之試驗化合物。

本發明之其他特徵與優點將由下列詳細說明以及申請專利範圍清楚了解。

定義

「藥劑」意指任何小分子化學化合物、抗體、核酸分子、或多胜肽、或其片段。

如本文所使用，術語「芳香環」或「芳基」意指包括碳原子及氫原子之單環或多環-芳香環或環基。適當之芳基實例包括，但不限於，苯基、甲苯基、蒽基、茀基、茚基、薁基、及萘基、以及苯并-稠合環部分如5,6,7,8-四氫萘基。芳基可未經取代或視需要經一個或多個取代基取代，該取代基如本文中所述烷基之取代基[係包括烷基(較佳為低碳數烷基或經一個或多個鹵基取代之烷基，但不限於此)、羥基、烷氧基(較佳為低碳數烷氧基)、烷基硫基、氰基、鹵基、胺基、硼酸(-B(OH)₂)、以及硝基]。於某些具體實施例中，該芳基為單環狀環，其中，該環包括6個碳原子。

如本文所使用，術語「烷基」意指典型具有1至10個碳原子之飽和直鏈或分支鏈非環狀烴。代表性之飽和直鏈烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基及正癸基；而飽和分支鏈烷基包括異丙基、第二丁基、異丁基、第三丁基、異戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基丁基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基戊基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2-甲基-4-乙基己基、2,2-二乙基戊基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基、3,3-二乙基己基等。內含於本發明之化合物中的烷基可未經取代或視需要經一個或多個取代基取代，該取代基如胺基、烷基胺基、芳基胺基、雜芳基胺基、烷氧基、烷基硫基、側氧基、鹵基、醯基、硝基、羥基、氰基、芳基、雜芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、芳基氧基、雜芳基氧基、芳基硫基、雜芳基硫基、芳基胺基、雜芳基胺基、碳環基、碳環基氧基、碳環基硫基、碳環基胺基、雜環基、雜環基氧基、雜環基胺基、雜環基硫基等。對本發明之化合物而言，典型較佳者為低碳數烷基。

「含溴區結構域」意指多胜肽的一部分，其可辨識乙醯化離胺酸殘基。於一具體實施例中，BET家族成員多胜肽之含溴區結構域包括大約110個胺基酸且共享一保留之摺疊，該保留之摺疊包括藉由與染色質進行交互作用之不同環區(loop region)所連結的四個α螺旋之左旋束(left-handed bundle)。

「BET家族成員多胜肽」意指包括兩個含溴區結構域以及具有轉錄調控活性或乙醯化離胺酸結合活性之額外末端結構域(extraterminal(ET) domain)或其片段的多胜肽。例示性之BET家族成員包括BRD2、BRD3、BRD4及BRDT。

「BRD2多胜肽」意指與可結合染色質或調控轉錄作用之NP_005095具有85%同一性(identity)的蛋白質或其片段。

例示性之BRD2多胜肽的序列如下：

「BRD2核酸分子」意指編碼BRD2多胜肽或其片段之多核苷酸。

「BRD3多胜肽」意指與可結合染色質或調控轉錄作用之NP_031397.1具有85%同一性的蛋白質或其片段。

例示性之BRD3多胜肽的序列如下：

「BRD3核酸分子」意指編碼BRD3多胜肽或其片段之多核苷酸。

「BRD4多胜肽」意指與可結合染色質或調控轉錄作用之NP_055114具有85%同一性的蛋白質或其片段。

「BRD4核酸分子」意指編碼BRD4多胜肽之多核苷酸。

「BRDT多胜肽」意指與可結合染色質或調控轉錄作用之NP_001717具有85%同一性的蛋白質或其片段。

「BRDT核酸分子」意指編碼BRDT多胜肽之多核苷酸。

「改善」意指減低、抑制、減弱、減小、阻止、或穩定疾病之發展或進程。

「改變」意指當藉由此技藝中已知之標準方法(如本文中所述之彼等方法)偵測時，基因或多胜肽於表現量或活性上之變化(增加或減低)。如本文所使用，改變係包括於表現量上有10%之變化，較佳25%之變化，更佳40%之變化，以及最佳於表現量上有50%或更高之變化。

「類似物」意指不完全相同但具有類似之功能或結構特徵的分子。舉例而言，多胜肽類似物保留了相對應之天然存在多胜肽的至少部分生物活性，同時具有某些生物化學修飾以使類似物之功能相較於天然存在之多胜肽更為提升。此等生物化學修飾可增加類似物之蛋白酶抗性、膜通透性、或半生期，但並不會改變如配位體結合。類似物可包括非天然胺基酸。

「化合物」意指任何小分子化學化合物、抗體、核酸分子、或多胜肽、或其片段。

術語「非鏡像異構物」意指具有兩個或更多個不對稱中心之立體異構物，且該等立體異構物之分子不互為鏡像。

術語「鏡像異構物」意指化合物之兩立體異構物，其互為不可重疊之鏡像。兩個鏡像異構物之等莫耳混合物稱為「消旋混合物」或「消旋物」。

術語「鹵素」係指-F、-Cl、-Br、或-I。

術語「鹵烷基」意欲包括經鹵素單-、二-或多取代之如前文所定義之烷基，例如，氟甲基及三氟甲基。

術語「羥基」意指-OH。

本文所使用之術語「雜原子」意指除了碳或氫以外之任何元素的原子。較佳之雜原子為氮、氧、硫及磷。

術語「雜芳基」意指芳香族5至8員單環、8至12員雙環、或11至14員三環環系，該環系若為單環則具有1至4個環雜原子，若為雙環則具有1至6個環雜原子，或者若為三環則具有1至9個環雜原子，該雜原子係選自O、N、或S，且剩餘之環原子為碳。雜芳基基團可視需要經一個或多個芳基之取代基取代。雜芳基基團之實例包括吡啶基、呋喃基、苯并二氧雜環戊烯基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基、噻唑基、異噁唑基、喹啉基、吡唑基、異噻唑基、嗒基、嘧啶基、吡基、三基、三唑基、噻二唑基、異喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、吲基、咪唑并吡啶基、四唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、及吲朵基，但不限於此。

本文所使用之術語「雜環」意指於環結構內含有至少一個不同於碳之原子(例如，S、O、N)的有機化合物。於此等有機化合物中之環結構可為芳香族或非芳香族。雜環部分之某些實例包括，但不限於，吡啶、嘧啶、吡咯啶、呋喃、四氫呋喃、四氫噻吩、及二烷。

術語「異構物」或「立體異構物」意指具有相同化學組成但原子或基團於空間中之排列不同的化合物。

術語「同位素衍生物」包括化合物之衍生物，於該衍生物中，化合物的一個或多個原子係以該原子的相對應同位素置換之。舉例而言，含有碳原子(C¹²)之化合物的同位素衍生物可為下述者：其中，該化合物的碳原子係以C¹³同位素置換之。

術語「腫瘤(neoplastic)」意指彼等具有自主生長能力之細胞，亦即，以快速增殖細胞生長為特徵之異常狀態或病症。腫瘤疾病狀態可分類為病理學的(亦即，以疾病狀態為特徵或構成疾病狀態)，或可分類為非病理學的(亦即，偏離正常但與疾病狀態無關)。該術語意欲包括所有類型之癌性生長(cancerous growth)或致癌過程(oncogenic process)、轉移性組織或惡性轉變之細胞、組織或器官，而不管組織病理學類型或侵襲之階段。「病理學上過度增殖」之細胞係出現於以惡性腫瘤生長為特徵之疾病狀態。非病理學上過度增殖之細胞的實例包括與傷口修復有關之細胞增殖。

可使用本發明之化合物治療的例示性腫瘤包括(但不限於此)白血病(例如，急性白血病、急性淋巴性白血病、急性骨髓細胞性白血病、急性前骨髓細胞性白血病、急性骨髓單核細胞性白血病、急性單核細胞性白血病、急性紅血球性白血病、多細胞系統白血病(mixed-lineage leukemia)、慢性白血病、慢性骨髓細胞性白血病、慢性淋巴性白血病)、多發性骨髓瘤、真性多血症(polycythemia vera)、皮膚T-細胞淋巴瘤(CTCL)、淋巴瘤(何杰金氏病(Hodgkin’s disease)、非何杰金氏病)、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重鏈病、以及固體腫瘤如肉瘤與惡性腫瘤(例如，纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑液膜瘤、間皮瘤、依紋氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、子宮肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、攝護腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳突狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、支氣管源癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm’s tumor)、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、多型性神經膠母細胞瘤、星狀細胞瘤、神經管母細胞瘤(medulloblastoma)、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、神經內分泌腫瘤、寡樹突膠質瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤)。

於一具體實施例中，腫瘤形成係藉由主要之轉錄活化子(例如，myc)驅動。此等癌症包括伯基特氏淋巴瘤、小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、神經母細胞瘤、多型性神經膠母細胞瘤、MLL驅動之白血病、慢性淋巴性白血病、與NUT重排有關之鱗狀細胞癌、以及與含有含溴區結構域之蛋白或NUT重排有關的其他癌症，但不限於此。

術語「抑制腫瘤之生長」包括減緩、中斷、阻止、或停止腫瘤之生長與轉移，但不必使腫瘤生長完全消除。

「電腦模擬」意指運用電腦程式來測定下列之一者或多者：配位體至結合部分之位置與結合接近性(binding proximity)、所結合之配位體的佔用空間、結合部分與配位體之間的互補接觸表面量、特定配位體結合至結合部分的變形能量、以及配位體與結合部分之間的氫鍵強度、凡得瓦爾交互作用(van der Waals interaction)、疏水性交互作用及/或靜電交互作用能量之若干評估。電腦模擬亦可提供模型系統與候選化合物之特徵間的比較。舉例而言，電腦模擬試驗可比較本發明之藥效基團模型(pharmacophore model)與候選化合物以評估候選化合物與模型之符合度(fit)。

「電腦系統」意指用於分析原子座標資料之硬體裝置、軟體裝置及資料儲存裝置。本發明之電腦類系統的最小硬體裝置包括中央處理器(CPU)、輸入裝置、輸出裝置及資料儲存裝置。希望提供顯示器以顯現結構資料。資料儲存裝置可為隨機存取記憶體(RAM)或用於存取本發明之電腦可讀取媒體的裝置。此等系統之實例為可購自Silicon Graphics Incorporated and Sun Microsystems running Unix based之微電腦工作站、Windows NT、或IBM OS/2操作系統。

「電腦可讀取媒體」意指可藉由電腦直接讀取並存取之任何媒體，舉例而言，藉此該媒體係適用於前述之電腦系統。媒體包括，但不限於：磁性儲存媒體如磁碟片、硬碟儲存媒體及磁帶；光學儲存媒體如光碟片或唯讀光碟(CD-ROM)；電氣儲存媒體如隨機存取記憶體及唯讀記憶體(ROM)；以及此等種類之混合體如磁性/光學儲存媒體。

於此揭示內容中，「包括」、「含有」及「具有」等可具有於美國專利法中對其等所認定之意義且可意指「包括」等，「實質上構成(consisting essentially of或consists essestially)」同樣具有於美國專利法中對其所認定之意義且該術語為開放式，允許存在所列述之外者，只要所列述之外者的存在不會改變所列述者之基本或新穎特徵，但需排除先前技術具體實施例。

「偵測」意指確認待偵測之分析物的存在、不存在或量。

「可偵測標記」意指一組成物，當該組成物連接至感興趣之分子時，可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、或化學方法使該感興趣之分子被偵測。舉例而言，適用之標記包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠體粒子、螢光染料、電子緻密試劑、酵素(例如，常用於ELISA者)、生物素、毛地黃素(digoxigenin)、或半抗原。

「疾病」意指會損害或妨礙細胞、組織或器官之正常功能的任何病症或疾患。可使用本文所述之化合物治療的疾病之實例包括腫瘤形成、發炎疾病、肥胖症、脂肪肝(NASH或其他)、糖尿病、動脈粥狀硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡病質、移植物對抗宿主疾病、與含溴區結構域相關之傳染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低雄性生育力。本發明之組成物的其他用途包括用於器官移植、再生醫學之細胞狀態調整(亦即，藉由促進或抑制細胞分化)以及促進多能性(pluripotency)，但不限於此。

「有效量」意指相較於未處理之患者，用以改善疾病之症狀所需的劑量。用以實施本發明而達到疾病之治療處理的活性化合物之有效量係隨著投藥之方式、個體之年齡、體重及一般健康狀況而變化。最後，將由主治醫師或獸醫師來決定適當之量及給藥方式。此量稱為「有效」量。

術語「鏡像異構物」意指化合物之兩立體異構物，其互為不可重疊之鏡像。兩個鏡像異構物之等莫耳混合物稱為「消旋混合物」或「消旋物」。

術語「鹵素」係指-F、-Cl、-Br或-I。

術語「鹵烷基」意欲包括經鹵素單-、二-或多取代之如前文所定義之烷基，例如，氟甲基及三氟甲基。

術語「羥基」意指-OH。

本文所使用之術語「雜原子」意指除了碳或氫以外之任何元素的原子。較佳之雜原子為氮、氧、硫及磷。

術語「雜芳基」意指芳香族5至8員單環、8至12員雙環、或11至14員三環環系，該環系若為單環則具有1至4個環雜原子，若為雙環則具有1至6個環雜原子，或者若為三環則具有1至9個環雜原子，該雜原子係選自O、N、或S，以及剩餘之環原子為碳。雜芳基基團可視需要經一個或多個取代基(例如，本文所述芳基之取代基)取代。雜芳基基團之實例包括吡啶基、呋喃基、苯并二氧雜環戊烯基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基、噻唑基、異噁唑基、喹啉基、吡唑基、異噻唑基、嗒基、嘧啶基、吡基、三基、三唑基、噻二唑基、異喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、吲基、咪唑并吡啶基、四唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、及吲哚基，但不限於此。

本文所使用之術語「雜環」意指於環結構內含有至少一個不同於碳之原子(例如，S、O、N)的有機化合物。於此等有機化合物中之環結構可為芳香族，或者於某些體實施例中為非芳香族。雜環部分之某些實例包括吡啶、嘧啶、吡咯啶、呋喃、四氫呋喃、四氫噻吩、及二噁烷，但不限於此。

術語「異構物」或「立體異構物」意指具有相同化學組成但原子或基團於空間中之排列不同的化合物。

術語「同位素衍生物」包括化合物之衍生物，於該衍生物中，化合物的一個或多個原子係以該原子的相對應同位素置換之。舉例而言，含有碳原子(C¹²)之化合物的同位素衍生物可為下述者：其中，該化合物的碳原子係以C¹³同位素置換之。

本發明提供一些適用於開發高專一性藥物之標靶以治療以本發明所述之方法為特徵的疾患。此外，本發明之方法提供簡易之方式來鑑別可安全使用於個體之療法。再者，本發明之方法提供具有高體積通量、高靈敏度及低複雜性之途徑，以用於實際上分析可作用於本文所述之疾病的任何數量之化合物。

「擬合」意指藉由自動或半自動方式測定藥劑分子之一個或多個原子與BET家族成員之一個或多個原子或結合位置(例如，BRD2、BRD3、BRD4及BRDT之含溴區結構域)之間的交互作用，並測定此等交互作用之穩定程度。用於進行擬合之各種電腦類方法係進一步描述於本文中。

「片段」意指多胜肽或核酸分子之一部分。此部分較佳係含有參照之核酸分子或多胜肽的全長之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000個核苷酸或胺基酸。

「雜合」意指互補核鹼基之間的氫鍵結，其可為華生-克立克(Watson-Crick)、虎克斯汀(Hoogsteen)或反虎克斯汀氫鍵結。舉例而言，腺嘌呤與胸腺嘧啶為藉由氫鍵之形成而配對的互補核鹼基。

「單離之多核苷酸」意指不含有基因之核酸(例如，DNA)，該基因係位於生物之天然存在基因體中，而本發明之核苷酸分子係衍生自該生物之天然存在基因體且位於該基因之側邊。因此，該術語包括如一重組DNA，該重組DNA係併入載體中；併入自主複製之質體或病毒中；或併入原核生物或真核生物之染色體DNA中；或者該重組DNA係不依賴其他序列而以單獨之分子存在(例如，藉由PCR或限制性核酸內切酶剪切所產生之cDNA或基因體或cDNA片段)。此外，該術語包括由DNA分子轉錄之RNA分子及重組DNA(其為編碼其他多胜肽序列之雜合基因的一部分)。

「單離之多胜肽」意指已自天然附有該多胜肽之成分中分離出的本發明之多胜肽。典型地，當該多胜肽不含有至少60重量%之與其天然結合的蛋白質或天然存在的有機分子時，則稱該多胜肽為單離的。製劑為較佳至少75重量%、更佳至少90重量%、最佳至少99重量%之本發明多胜肽。本發明之單離的多胜肽可例如，藉由下述方法獲得：自天然來源萃取；表現編碼此多胜肽之重組核酸；或化學合成該蛋白質。純度可藉由任何適當之方法測量，例如，管柱層析法、聚丙烯醯胺膠體電泳法、或HPLC分析法。

「標誌」意指於表現量或活性上具有與疾病或疾患相關之改變的任何蛋白質或多核苷酸。

如本文所使用，於「獲得藥劑」中之「獲得」係包括合成、購買或以其他方式取得該藥劑。

術語「腫瘤」意指彼等具有自主生長能力之細胞，亦即，以快速增殖細胞生長為特徵之異常狀態或病症。腫瘤疾病狀態可分類為病理學的(亦即，以疾病狀態為特徵或構成疾病狀態)，或可分類為非病理學的(亦即，偏離正常但與疾病狀態無關)。該術語意欲包括所有類型之癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉變之細胞、組織或器官，而不管組織病理學類型或侵襲之階段。「病理學上過度增殖之」細胞係存在於以惡性腫瘤生長為特徵之疾病狀態。非病理學上過度增殖之細胞的實例包括與傷口修復有關之細胞增殖。

術語「抑制腫瘤之生長」包括減緩、中斷、阻止或停止腫瘤之生長與轉移，但不必使腫瘤生長完全消除。

術語「腫瘤形成」之一般醫學意義係指因對正常生長控制喪失回應而導致的「新細胞生長」，舉例而言，係指腫瘤細胞生長。「過度增生」意指細胞經歷異常的高速生長。然而，如本文所使用，該術語腫瘤形成通常是指經歷異常細胞生長速率之細胞。腫瘤形成係包括「腫瘤」，其可為良性、癌前期、或惡性。

於「獲得化合物」中之術語「獲得」係意欲包括購買、合成或以其他方式取得該化合物。

本文所使用之術語「光學異構物」包括下述分子(亦稱為對掌性分子)：其彼此之間為確實不可重疊之鏡像。

本文所使用之用語「非經腸投藥」及「非經腸式投予」意指不同於腸內及局部投藥之投藥模式，通常是藉由注射投藥，且包括靜脈內、肌肉內、動脈內、脊椎腔內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹腔內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蜘蛛網膜下腔、脊椎內及胸骨內注射與灌注，但不限於此。

術語「多環基」或「多環狀基(polycyclic radical)」意指兩個或更多個環狀環之基團(例如，環烷基、環烯基、環炔基、芳基及/或雜環基)，其中，兩個鄰接之環係共用兩個或更多個碳原子，舉例而言，該等環為「稠合環」。藉由非鄰接之原子結合的環係稱為「橋」環。多環之各個環可經前文所述之取代基取代，該等取代基如鹵素、羥基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基羰基氧基、羧酸根(carboxylate)、烷基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸根(phosphate)、膦酸根基(phosphonato)、次膦酸根基(phosphinato)、氰基、胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基、及烷基芳基胺基)、醯基胺基(包括烷基羰基胺基、芳基羰基胺基、胺甲醯基及脲基)、甲脒基、亞胺基、氫硫基(sulfhydryl)、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸根(thiocarboxylate)、硫酸根(sulfate)、磺酸根基(sulfonato)、胺磺醯基、磺醯胺基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環基、烷基、烷基芳基、或芳香族或雜芳香族部分。

本文所使用之術語「多晶型」意指本發明之化合物的固體結晶型或其複合物。相同化合物之不同多晶型可顯現不同的物理、化學及/或光譜性質。不同的物理性質包括安定性(例如，熱或光)、可壓縮性及密度(於配方及產品製造中極為重要)及溶解速率(其可影響生體可用率(bioavailability))，但不限於此。安定性之差異可導因於化學反應性(例如，差別氧化(differential oxidation)致使由一種多晶型所組成之劑型比由另一種多晶型所組成之劑型更快變色)或機械特性(例如，錠劑於貯藏時破碎，因為動力學傾向之多晶型轉變為熱力學上更安定之多晶型)或兩者(例如，一種多晶型之錠劑於高溼度時更易於破裂)的改變。多晶型之不同物理性質可影響其製程。

術語「前藥」包括具有可於活體內代謝之部分的化合物。一般而言，前藥係於活體內藉由酯解酶或藉由其他機制代謝為活性藥物。前藥之實例及其用途為此技藝中所熟知(請參照，例如，Berge et al.(1977)"Pharmaceutical Salts",J. Pharm. Sci. 66:1-19)。前藥可於化合物之最終單離與純化過程中於原位製備，或藉由分別將所純化之化合物的游離酸形式或羥基與適當之酯化劑反應而製備。羥基可藉由使用羧酸處理而轉化為酯。前藥部分之實例包括經取代及未經取代、分支鏈或非分支鏈之低碳數烷基酯部分(例如，丙酸酯)、低碳數烯基酯、二-低碳數烷基-胺基低碳數-烷基酯(例如，二甲基胺基乙基酯)、醯基胺基低碳數烷基酯(例如，乙醯基氧基甲基酯)、醯基氧基低碳數烷基酯(例如，三甲基乙醯基氧基甲基酯)、芳基酯(苯基酯)、芳基-低碳數烷基酯(例如，苯甲基酯)、經取代(例如，具有甲基、鹵基、或甲氧基取代基)之芳基及芳基-低碳數烷基酯、醯胺、低碳數-烷基醯胺、二-低碳數烷基醯胺、以及羥基醯胺。較佳之前藥部分為丙酸酯及醯基酯。亦包括於活體內藉由之其他機制轉化為活性形式之前藥。

再者，源自一般化學領域之橫跨碳-碳雙鍵的立體化學表示法亦為相對的，其中，「Z」意指常被稱為「順式」(同側)構形者，而「E」則意指常被稱為「反式」(對側)構形者。本發明之化合物係同時涵蓋兩種構形：順式/反式及/或Z/E。

關於對掌性中心之命名法，術語「d」及「l」構形係如IUPAC建議(IUPAC Recommendation)所定義。至於術語非鏡像異構物、消旋物、差向異構物及鏡像異構物之使用，此等術語係以其正規內文使用以描述製劑之立體化學。

「降低」意指至少10%、25%、50%、75%或100%之負向改變。

「參照」意指標準或對照條件。

「參照序列」為使用作為序列比對之基礎的已定義序列。參照序列可為特定序列之子集或全部；例如，全長cDNA或基因序列之片段、或完整之cDNA或基因序列。就多胜肽而言，參照之多胜肽序列的長度通常為至少約16個胺基酸，較佳為至少約20個胺基酸，更佳為至少約25個胺基酸，甚至更佳為約35個胺基酸、約50個胺基酸、或約100個胺基酸。就核酸而言，參照之核酸序列的長度通常為至少約50個核苷酸，較佳為至少約60個核苷酸，更佳為至少約75個核苷酸，甚至更佳為約100個核苷酸、或約300個核苷酸、或與其相近或介於其間之任何整數。

「專一性結合」意指辨識並結合本發明之多胜肽的化合物或抗體，但該化合物或抗體實質上並不會辨識並結合樣品中之其他分子，例如，該樣品天然地包括本發明之多胜肽的生物樣品。

適用於本發明之方法的核酸分子包括編碼本發明之多胜肽或其片段的任何核酸分子。此等核酸分子不需與內生之核酸序列100%相同，但典型係顯現實質之同一性(substantial identity)。與內生序列具有「實質之同一性」的多核苷酸典型可與雙股核酸分子之至少一股雜合。適用於本發明之方法的核酸分子包括編碼本發明之多胜肽或其片段的任何核酸分子。此等核酸分子不需與內生之核酸序列100%相同，但典型係顯現實質之同一性。與內生序列具有「實質之同一性」的多核苷酸典型可與雙股核酸分子之至少一股雜合。「雜合」意指於各種嚴苛條件下使互補之多核苷酸序列(例如，本文所述之基因)或其部分之間進行配對以形成雙股分子。(請參照，例如，Wahl,G. M. and S. L. Berger(1987)Methods Enzymol. 152:399;Kimmel,A. R.(1987)Methods Enzymol. 153:507)。

舉例而言，嚴苛之鹽濃度通常為小於約750 mM NaCl與75 mM檸檬酸三鈉，較佳小於約500 mM NaCl與50 mM檸檬酸三鈉，以及更佳小於約250 mM NaCl與25 mM檸檬酸三鈉。低嚴苛雜交可於不存在有機溶劑(例如，甲醯胺)之情況下獲得，而高嚴苛雜交則可於存在至少約35%甲醯胺且更佳至少約50%甲醯胺之情況下獲得。嚴苛之溫度條件通常包括至少約30℃之溫度，更佳至少約37℃之溫度，最佳至少約42℃之溫度。變更額外之參數，例如，雜合時間、洗淨劑(諸如十二烷基硫酸鈉(SDS))之濃度、以及攜帶者DNA(carrier DNA)之內含或排除，為此技術領域中具有通常知識者所熟知。各種嚴苛之程度係藉由組合此等所需之各種條件而達成。於較佳具體實施例中，雜合係在30℃於750 mM NaCl、75 mM檸檬酸三鈉以及1% SDS中發生。於更佳具體實施例中，雜合係在37℃於500 mM NaCl、50 mM檸檬酸三鈉、1% SDS、35%甲醯胺以及100μg/ml變性之鮭魚精子DNA(ssDNA)中發生。於最佳具體實施例中，雜合係在42℃於250 mM NaCl、25 mM檸檬酸三鈉、1% SDS、50%甲醯胺以及200μg/ml ssDNA中發生。此等條件之適用變化為此技術領域中具有通常知識者所輕易了解。

就多數應用而言，雜合後之洗滌步驟於嚴苛度方面亦有所不同。洗滌嚴苛度條件可藉由鹽濃度以及藉由溫度界定。如上所述，洗滌嚴苛度可藉由降低鹽濃度或藉由提高溫度而增加。舉例而言，洗滌步驟之嚴苛鹽濃度較佳為小於約30 mM NaCl及3 mM檸檬酸三鈉，以及最佳為小於約15 mM NaCl及1.5 mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟之嚴苛溫度條件通常包括至少約25℃之溫度，更佳至少約42℃之溫度，甚至更佳至少約68℃之溫度。於較佳具體實施例中，洗滌步驟係在25℃於30 mM NaCl、3 mM檸檬酸三鈉以及1% SDS中發生。於更佳具體實施例中，洗滌步驟係在42℃於15 mM NaCl、1.5 mM檸檬酸三鈉以及1% SDS中發生。於更佳具體實施例中，洗滌步驟係在68℃於15 mM NaCl、1.5 mM檸檬酸三鈉以及1% SDS中發生。此等條件之額外變化為此技術領域中具有通常知識者所輕易了解。

雜合技術為此技術領域中具有通常知識者所熟知，且係敘述於如Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc. Natl. Acad. Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel et al.(Current Protocols inMolecular Biology,Wiley Interscience,NewYork,2001)；Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；以及Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中。

「實質上相同」意指相對於參照之胺基酸序列(例如，本文中所述之任一胺基酸序列)或核酸序列(例如，本文中所述之任一核酸序列)顯現出至少85%同一性的多胜肽或核酸分子。較佳地，於胺基酸或核酸層級上，此序列與用於比對之序列具有至少85%、90%、95%、99%、或甚至100%同一性。

序列同一性典型係使用序列分析軟體(例如，Sequence Analysis Software Package of Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis. 53705,BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程式)測量。此等軟體係藉由將同源性程度分配至各種取代、缺失、及/或其他修飾而比對出相同或相似之序列。保留性取代(conservative substitution)典型包括下列群組內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；以及苯丙胺酸、酪胺酸。於測定同一性程度之一例示性方法中，可使用BLAST軟體，當機率評分介於e. sup. -3至e.sup.-100之間時，顯示為接近之相關序列。

「降低」或「增加」分別指相對於參照者(reference)具有至少約10%、25%、50%、75%、或100%之負向或正向改變。

「均方根誤差」意指來自平均之誤差的平方之算數平均值的平方根。

「降低細胞存活」意指相對於參照之細胞，抑制細胞之生存能力或誘導細胞死亡。

「參照」意指標準或對照條件。

「參照序列」為使用作為序列比對之基礎的已定義序列。參照序列可為特定序列之子集或全部；例如，全長cDNA或基因序列之片段、或完整之cDNA或基因序列。就多胜肽而言，參照之多胜肽序列的長度通常為至少約16個胺基酸，較佳為至少約20個胺基酸，更佳為至少約25個胺基酸，甚至更佳為約35個胺基酸、約50個胺基酸、或約100個胺基酸。就核酸而言，參照之核酸序列的長度通常為至少約50個核苷酸，較佳為至少約60個核苷酸，更佳為至少約75個核苷酸，甚至更佳為約100個核苷酸、或約300個核苷酸、或與其相近或介於其間之任何整數。

「個體」意指哺乳動物，包括人類或非人類哺乳動物，例如，牛、馬、犬、羊、或貓，但不限於此。

「專一性結合」意指辨識並結合本發明之多胜肽的化合物或抗體，但該化合物或抗體實質上並不會辨識並結合樣品中之其他分子，例如，該樣品天然地包括本發明之多胜肽的生物樣品。

術語「氫硫基」或「硫醇基」意指-SH。

如本文所使用，術語「互變異構物」意指有機分子之異構物，該等異構物係藉由互變異構作用而輕易地互換，其中，氫原子及質子會於互變異構反應中遷移，且於某些時候會伴隨單鍵與鄰近雙鍵之轉換。

如本文所使用，術語「治療」等意指減輕或改善疾病及/或與該疾病有關之症狀。「改善」意指減低、抑制、減弱、減小、阻止、或穩定疾病之發展或進程。雖不欲設限，但應理解，治療疾病或病症並非要求完全消除疾病、病症、或與其相關之症狀。

如本文所使用，術語「預防」、「預防性治療」等意指降低個體罹患疾病或病症的可能性，其中，該個體並未罹患該疾病或病症，但具有罹患該疾病或病症之風險或可能性。

「有效量」意指對所治療之個體提供治療效果的化合物量。治療效果可為客觀的(亦即，可藉由某些試驗或標誌測量)或主觀的(亦即，由個體表明效果或由個體感覺出效果)。本文所述之化合物的有效量範圍可為約1 mg/Kg體重至約5000 mg/Kg體重。有效劑量亦隨著投藥途徑以及與其他藥劑共同使用的可能性而變化。

應理解本文所提供之範圍為該範圍中之所有數值的簡略表達方式。舉例而言，應理解1至50之範圍係包括來自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50所組成之群組的任何數字、數字之組合、或子範圍。

如本文所使用，術語「治療」等意指減輕或改善疾病及/或與該疾病有關之症狀。雖不欲設限，但應理解，治療疾病或病症並非要求完全消除疾病、病症、或與其相關之症狀。

除非具體敘明或由內文明顯可見，應理解本文所使用之術語「或」為包括的(inclusive)。除非具體敘明或由內文明顯可見，應理解本文所使用之術語「一(a；an)」及「該」為單數形或複數形。

除非具體敘明或由內文明顯可見，本文所使用之術語「約」應理解為於本技術領域之正常容許誤差範圍內，例如，於平均值之2標準偏差範圍內。「約」可理解為於所述數值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、或0.01%的範圍內。除非內文中另行指明，本文所提供之所有數值皆以術語「約」進行修飾。

於本文之變數(variable)的任何定義中，所列化學基團之敘述係包括該變數為任何單一基團或所列基團之組合的定義。本文之變數或態樣的具體實施例之敘述係包括作為任何單一具體實施例或與任何其他具體實施例或其部分組合之具體實施例。

本文所提供之任何組成物或方法可與本文所提供之其他組成物或方法的任何一者或多者組合。

本發明特徵組成物及方法係有用於治療或預防腫瘤形成、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病、及含溴區結構域(bromodomain)相關之感染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低男性生育力。本發明之組成物的進一步用途包括用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即藉由促進或抑制細的分化作用)、及促使分化多能性，但不限於此。

本發明係基於(至少部分地)發現具有對含溴區結構域之BET-家族以及能夠調節該含溴區結構域家族(其係含有識別核染色質之乙醯基-離胺酸殘基之含溴區結構域的多肽家族)之相關化合物為生物化學選擇性之細胞-可滲透的、有效的小分子抑制劑(JQ1)。與細胞及疾病生物學廣泛相關的訊號修飾係出現離胺酸乙醯化。許多年來對藥物活性區域的開發研究是標定可逆的調控側鏈乙醯化的酵素。迄今，已成功努力侷限於核染色質出現之共價修飾的"撰寫者(writer)"(乙醯基轉換酶)及"清除者(eraser)"(組蛋白去乙醯酶)。然而卻未有描述乙醯基-離胺酸識別組件或含溴區結構域的蛋白質抑制劑。含有BRD4之高解析共晶體結構的新近特徵顯露與乙醯基-離胺酸結合凹穴相配的優異外型。JQ1係與乙醯基-離胺酸競爭性地結合至BRD4之串列含溴區結構域並取代人類細胞中之染色質的BRD4。在無法治癒之人類鱗狀腫瘤之基因定義的亞型觀察到BRD4的週期性轉譯。JQ1競爭性地結合至BRD4融合致癌蛋白質導致於BRD4-依賴性腫瘤之源自人工細胞株及鼠科模型中立即鱗狀分化及專一性抗增生的影響。這些數據確認標定表觀遺傳的"讀取者"(epigenetic reader)之蛋白質-蛋白質相互作用的可行性並報導用於發展更廣泛於該含溴區結構域家族之化學探針的通用化學支架。

含溴區結構域之蛋白質

基因調控基本上是藉由可逆的、非共價裝配巨分子所決定。RNA聚合酶的訊號轉導需要較高排列的蛋白質複合物，藉由能夠詮釋染色質轉譯後之修飾狀態空間調控。表觀遺傳的讀取者是各自具有一種或多種演化上保守的效應組件之結構多樣化蛋白質，其係識別組蛋白蛋白質或DNA的共價修飾。組蛋白尾端的離胺酸殘基之ε-N-乙醯化(Kac)與開放染色質結構及轉錄活化有關。乙醯基-離胺酸的特定專一性分子調控主要藉由含溴區結構域來調控。

含有含溴區結構域之蛋白質實質為生物感興趣的，作為轉錄因子複合體(TAF1、PCAF、Gcn5及CBP)之組分並決定表觀遺傳的記憶。有41個人類蛋白質含有總共57個多變化的含溴區結構域。儘管有大序列變異，但所有含溴區結構域外型皆包括藉由多變化環狀區域(ZA及BC區域)鏈結4個左手方向的α-螺旋簇(α_Z、α_A、α_B、α_C)的保守摺疊，其決定受質專一性。含有胜肽受質的共-晶體結構顯示該乙醯基-離胺酸是藉由中央疏水凹穴來識別，且藉由與存在於大部分含溴區結構域中之天冬醯胺酸殘基的氫鍵結來錨栓⁵。含溴區結構域及占有共有域架構的含溴區結構域額外終端(BET)家族(BRD2、BRD3、BRD4及BRDT)呈現高程度的序列保存性，且更發散的C-端相關結構域(第1E圖)⁶。

BRD4

目前於癌症研究已建立強而有力的基本原理供標定BRD4。BRD4對促使進行細胞週期及於經剔除基因培養的癌症細胞中促使G1阻滯有功能。BRD4是轉錄延長作用的重要調控者，對補充正向轉錄因子複合物(P-TEFb)有功能^7,8。細胞週期素依賴性激酶-9(P-TEFb的中心組分)是慢性淋巴球性血友病中有效的標靶⁹，並觀測鏈結至c-Myc依賴性轉錄。存在於BRD4中的含溴區結構域補充P-TEFb到有絲分裂的染色體以使生長促進基因增加表現。BRD4於M/G1細胞週期期間仍保持鍵結至表現基因的轉錄起始處，且不會出現在細胞週期後的表現的起始處。已顯示於增生細胞中剔除BRD4會由於降低對有絲分裂進行¹³及生存¹⁴重要基因表現程度而導致G1阻滯及細胞凋亡¹²。

更重要地，近來BRD4已被鑑別為惡性人類鱗狀腫瘤中週期t(15；19)染色質片段易位的組分^15,16。該易位表示BRD4的串列N-終端含溴區結構域作為具有NUT(睪丸中的核蛋白質)蛋白質的框內嵌合體，基因上定義為NUT中線腫瘤(NMC)。於源自NMC人工細胞株中的功能性研究已確認，BRD4-NUT致癌蛋白於維持特徵性增生優勢及此均勻致命的惡性腫瘤之分化阻斷為十分重要角色¹⁷。尤其，BRD4-NUT基因表現的RNA沉默(RNA silencing)遏止增生及促進鱗狀分化與顯著增加細胞角蛋白表現。這些觀察強調人類含溴區結構域蛋白質之直接作用抑制劑的廣泛利用性及立即治療的潛力。

本發明特徵組成物及方法係有用於抑制人類含溴區結構域蛋白質。

本發明之化合物

本發明提供化合物(例如，JQ1及本文所述式之化合物)，其係結合於BET家族成員(例如，BRD4)之第一含溴區結構域之apo晶體結構的結合袋(binding pocket)。不欲受限於理論，這些化合物特別是有效於抑制增生性視網膜細胞的生長、增生或生存或誘發該增生性視網膜細胞的分化。於一方法中，該化合物有用於治療腫瘤形成、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病、及含溴區結構域相關之感染疾病、治療寄生蟲、瘧疾、錐蟲、以及用於降低男性生育力；或用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即，藉由促進或抑制細的分化作用)、以及選擇使用分子定位程式(molecular docking program)促使分化多能性，以鑑定該化合物預期結合至含溴區結構域結構的結合袋。於某些具體實施例中，本發明之化合物可結合至BET家族成員並降低該BET家族成員的生物活性(例如，降低延長作用)及/或中斷該BET家族成員次細胞定位(例如，減少染色質結合)。

於某些具體實施例中，本發明之化合物可預防、抑制、或中斷或降低至少10%、25%、50%、75%、或100%BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)的生物活性及/或中斷該蛋白質次細胞定位，例如，藉由結合至含溴區結構域之apo結合袋的結合位置。

於某些具體實施例中，本發明之化合物是具有分子量為少於約1000道耳吞(dalton)、少於800、少於600、少於500、少於400、及少於約300道耳吞的小分子。本發明之化合物的實例包括JQ1及結合於BET家族成員(例如，BRD4)之第一含溴區結構域之apo晶體結構的結合袋的其他化合物(後文中稱為BRD4(1)；PDB ID 2OSS)。JQ1是一種新穎噻吩并-三唑-1,4-二氮雜平。本發明進一步提供該化合物之醫藥上可接受的鹽。

於一態樣中，本發明提供式(I)之化合物或其鹽、溶劑合物、或水合物：

其中，X為N或CR₅；R₅為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；R_B為H、烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷氧基烷基、鹵烷基、羥基、烷氧基、或-COO-R₃，其各自係視需要取代；環A為芳基或雜芳基；各環A獨立為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者任兩個R_A連同其各自附接的原子可形成稠合芳基或稠合雜芳基；R為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0至3且L為H、-COO-R₃、-CO-R₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R₄)、N(R₄)C(O)R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；R₂為H、D(氘)、鹵素、或視需要取代之烷基；各R₃獨立為選自下列所組成群組者：(i)H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、或經取代之雜芳基；(ii)雜環烷基或經取代之雜環烷基；(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，各自含有0個、1個、2個或3個選自O、S、或N之雜原子、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基，其各自可視需要取代；以及(iv)NH₂、N=CR₄R₆；各R₄獨立為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者R₃及R₄一起與其附接的氮原子形成4至10員環；R₆為烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者R₄及R₆一起與其附接的碳原子形成4至10員環；m為0、1、2、或3；其限制條件為：

(a)若環A為噻吩基，X為N，R為苯基或經取代之苯基，R₂為H，R_B為甲基，及R₁為-(CH₂)_n-L，其中n為1且L為-CO-N(R₃R₄)，則R₃及R₄不會一起與其附接的氮原子形成嗎啉環；

(b)若環A為噻吩基，X為N，R為經取代之苯基，R₂為H，R_B為甲基，及R₁為-(CH₂)_n-L，其中n為1且L為-CO-N(R₃R₄)，且R₃及R₄之一者為H，則R₃及R₄之其餘者不為甲基、羥乙基、烷氧基、苯基、經取代之苯基、吡啶基或經取代之吡啶基；以及

(c)若環A為噻吩基，X為N，R為經取代之苯基，R₂為H，R_B為甲基，及R₁為-(CH₂)_n-L，其中n為1且L為-COO-R₃，則R₃不為甲基或乙基。

於某些具體實施例中，R為芳基或雜芳基，其各自係視需要取代。

於某些具體實施例中，L為H、-COOR₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R₄)、N(R₄)C(O)R₃或視需要取代之芳基。於某些具體實施例中，各R₃獨立為選自下列所組成群組者：H、視需要取代之-C₁-C₈烷基，其含有0個、1個、2個或3個選自O、S、或N之雜原子；或NH₂、N=CR₄R₆。

於某些具體實施例中，R₂為H、D、鹵素、或甲基。

於某些具體實施例中，R_B為烷基、羥基烷基、鹵烷基、或烷氧基，其各自係視需要取代。

於某些具體實施例中，R_B為甲基、乙基、羥基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、或COOCH₂OC(O)CH₃。

於某些具體實施例中，環A為5員或6員芳基或雜芳基。於某些具體實施例中，環A為硫代呋喃基、苯基、萘基、聯苯基、四氫萘基、二氫茚基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、嗒基、吡基、咪唑基、噁唑基、噻吩基、噻唑基、三唑基、異噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、或5,6,7,8-四氫異喹啉基。

於某些具體實施例中，環A為苯基或噻吩基。

於某些具體實施例中，m為1或2，且R_A在至少一次出現時為甲基。

於某些具體實施例中，各R_A獨立為H、視需要取代之芳基，或者任兩個R_A連同其各自附接的原子可形成芳基。

於另一態樣中，本發明提供式(II)之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物： 其中，X為N或CR₅；R₅為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；R_B為H、烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷氧基烷基、鹵烷基、羥基、烷氧基、或-COO-R₃，其各自係視需要取代；各環A獨立為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者任兩個R_A連同其各自附接的原子可形成稠合芳基或稠合雜芳基；R為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；R’₁為H、-COO-R₃、-CO-R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；各R₃獨立為選自下列所組成群組者：(i)H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基；(ii)雜環烷基或經取代之雜環烷基；(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，各自含有0個、1個、2個或3個選自O、S、或N之雜原子、-C₃-C₁₂環烷基、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基，其各自可視需要取代；m為0、1、2、或3；其限制條件為若R’₁為-COO-R₃，X為N，R為經取代之苯基，及R_B為甲基，則R₃不為甲基或乙基。

於某些具體實施例中，R為芳基或雜芳基，其各自係視需要取代。於某些具體實施例中，R為苯基或吡啶基，其各自係視需要取代。於某些具體實施例中，R為p-C1-苯基、或o-C1-苯基、m-C1-苯基、p-F-苯基、o-F-苯基、m-F-苯基或吡啶基。

於某些具體實施例中，R’₁為-COO-R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；以及R₃為-C₁-C₈烷基，其含有0個、1個、2個或3個選自O、S、或N之雜原子，且其可視需要取代。於某些具體實施例中，R’₁為-COO-R₃，以及R₃為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、第二丁基、或第三丁基；或者R’₁為H或視需要取代之苯基。

於某些具體實施例中，R_B為甲基、乙基、羥基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、COOCH₂OC(O)CH₃。

於某些具體實施例中，R_B為甲基、乙基、羥基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、或COOCH₂OC(O)CH₃。

於某些具體實施例中，各R_A獨立為視需要取代之烷基，或者任兩個R_A連同其各自附接的原子可形成稠合芳基。

於某些具體實施例中，各R_A為甲基。

於另一態樣中，本發明提供式(III)之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物： 其中，X為N或CR₅；R₅為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；R_B為H、烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷氧基烷基、鹵烷基、羥基、烷氧基、或-COO-R₃，其各自係視需要取代；環A為芳基或雜芳基；各環A獨立為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者任兩個R_A連同其各自附接的原子可形成稠合芳基或稠合雜芳基；R為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；各R₃獨立為選自下列所組成群組者：(i)H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、或經取代之雜芳基；

(ii)雜環烷基或經取代之雜環烷基；

(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，各自含有0個、1個、2個或3個選自O、S、或N之雜原子、-C₃-C₁₂環烷基、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基，其各自可視需要取代；以及

(iv)NH₂、N=CR₄R₆；

各R₄獨立為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者R₃及R₄一起與其附接的氮原子形成4至10員環；R₆為烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者R₄及R₆一起與其附接的碳原子形成4至10員環；m為0、1、2、或3；其限制條件為：

(a)若環A為噻吩基，X為N，R為苯基或經取代之苯基，R_B為甲基，則R₃及R₄不會一起與其附接的氮原子形成嗎啉環；以及

(b)若環A為噻吩基，X為N，R為經取代之苯基，R₂為H，R_B為甲基，及R₃及R₄之一者為H，則R₃及R₄之其餘者不為甲基、羥乙基、烷氧基、苯基、經取代之苯基、吡啶基或經取代之吡啶基。

於某些具體實施例中，R為芳基或雜芳基，其各自係視需要取代。於某些具體實施例中，R為苯基或吡啶基，其各自係視需要取代。

於某些具體實施例中，R為p-C1-苯基、o-C1-苯基、m-C1-苯基、p-F-苯基、o-F-苯基、m-F-苯基或吡啶基。於某些具體實施例中，R₃為H、NH₂、或N=CR₄R₆。

於某些具體實施例中，各R₄獨立為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基，其各自係視需要取代。

於某些具體實施例中，R₆為烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代。

於另一態樣中，本發明提供式(IV)之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

其中，X為N或CR₅；R₅為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；R_B為H、烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷氧基烷基、鹵烷基、羥基、烷氧基、或-COO-R₃，其各自係視需要取代；環A為芳基或雜芳基；各環A獨立為烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者任兩個R_A連同其各自附接的原子可形成稠合芳基或稠合雜芳基；R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0至3且L為H、-COO-R₃、-CO-R₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R₄)、N(R₄)C(O)R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；R₂為H、D、鹵素、或視需要取代之烷基；各R₃獨立為選自下列所組成群組者：(i)H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、或經取代之雜芳基；(ii)雜環烷基或經取代之雜環烷基；(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，各自含有0個、1個、2個或3個選自O、S、或N之雜原子、-C₃-C₁₂環烷基、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基，其各自可視需要取代；以及(iv)NH₂、N=CR₄R₆；各R₄獨立為H、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者R₃及R₄一起與其附接的氮原子形成4至10員環；R₆為烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、或雜芳基，其各自係視需要取代；或者R₄及R₆一起與其附接的碳原子形成4至10員環；m為0、1、2、或3；其限制條件為：

(a)若環A為噻吩基，X為N，R₂為H，R_B為甲基，及R₁為-(CH₂)_n-L，其中n為0且L為-CO-N(R₃R₄)，則R₃及R₄不會一起與其附接的氮原子形成嗎啉環；

(b)若環A為噻吩基，X為N，R₂為H，R_B為甲基，及R₁為-(CH₂)_n-L，其中n為O且L為-CO-N(R₃R₄)，且R₃及R₄之一者為H，則R₃及R₄之其餘者不為甲基、羥乙基、烷氧基、苯基、經取代之苯基、吡啶基或經取代之吡啶基；以及

(c)若環A為噻吩基，X為N，R₂為H，R_B為甲基，及R₁為-(CH₂)_n-L，其中n為O且L為-COO-R₃，則R₃不為甲基或乙基。

於某些具體實施例中，R₁為-(CH₂)_n-L，其中，n為0至3且L為-COO-R₃、視需要取代之芳基、或視需要取代之雜芳基；以及R₃為-C₁-C₈烷基，其含有0個、1個、2個或3個選自O、S、或N之雜原子，且其可視需要取代。於某些具體實施例中，n為1或2且L為烷基或-COOR₃，且R₃為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、第二丁基、或第三丁基；或者n為1或2且L為H或視需要取代之苯基。

於某些具體實施例中，R₂為H或甲基。

於某些具體實施例中，R_B為甲基、乙基、羥基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、COOCH₂OC(O)CH₃。

於某些具體實施例中，環A為苯基、萘基、聯苯基、四氫萘基、二氫茚基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、嗒基、吡基、咪唑基、噁唑基、噻吩基、噻唑基、三唑基、異噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、或5,6,7,8-四氫異喹啉基。

於某些具體實施例中，各環A獨立為視需要取代之烷基，或者任兩個R_A連同其各自附接的原子可形成芳基。

本發明亦提供式(V-XXII)之化合物及本文所述之化合物。

於另一態樣中，本發明提供下式表示之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於某些具體實施例中，該化合物為(+)-JQ1、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於另一態樣中，本發明提供下式表示之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於另一態樣中，本發明提供下式表示之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於另一態樣中，本發明提供下列式之任一者表示之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於另一態樣中，本發明提供下列式之任一者表示之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於另一態樣中，本發明提供下列式之任一者表示之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於某些具體實施例中，本發明之化合物可以下列結構之任一者表示之：

於一具體實施例中，該化合物為下結構表示者、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於另一具體實施例中，該化合物為下結構表示者、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於另一具體實施例中，該化合物為下結構表示者、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於某些具體實施例中，本發明之化合物可具有本文所示任一化合物之相對對掌性。

於某些具體實施例中，本發明提供式(V)、(VI)、或(VII)表示之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

其中，R、R₁、以及R₂及R₃如式(I)之相同意義；Y為O、N、S、或CR₅，其中，R₅如式(I)之相同意義；n為0或1；以及式(VII)中之虛線圓表示芳香環或非芳香環。

於任一式(I-IV)及(VI)(或本文任一式)之某些具體實施例中，R₆表示下表A中所示之醛的非-羰基部分(亦即，對於式R₆CHO之醛而言，R₆為該醛的非-羰基部分)。於某些具體實施例中，R₄及R₆一起表示下表A中所示之酮的非-羰基部分(亦即，對於式R₆C(O)R₄之酮而言，R₄及R₆為該酮的非-羰基部分)。

表A：

於一具體實施例中，該化合物為下式(III)表示者、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於某些具體實施例中，該化合物為(消旋的)JQ1；於某些具體實施例中，該化合物為(+)JQ1。於某些具體實施例中，該化合物為選自下列所組成群組之化合物、或其鹽、溶劑合物、或水合物：

該化合物之額外實施例包括如下列式之任一者之化合物、其鹽、溶劑合物、或水合物：

於式(IX-XXII)中，R及R’如可為H、芳基、經取代之芳基、雜芳基、雜環烷基、-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基、-C₂-C₈炔基、-C₃-C₁₂環烷基、經取代之-C₃-C₁₂環烷基、-C₃-C₁₂環烯基、或經取代之-C₃-C₁₂環烯基，其各自可視需要取代。於式(XIV)中，X可為本文所述芳基之任何取代基。

本發明之化合物可藉由各種方法(其中一些為本領域所習知方法)來製備。例如，下文提供之化學實例係提供化合物JQ1(作為消旋物)及立體異構物(+)-JQ1及(-)-JQ1之製備之合成方案(參照方案S1及S2)。式(I)至(XXII)之多種化合物可使用適當起始材料之取代的類似方法來製備。

例如，如下文方案1所示，從JQ1開始，可製備類似的胺。

如方案1所示，JQ1之第三丁基酯的水解供予羧酸，其係經二苯基磷疊氮化物(DDPA)處理並進行Curtius重排以提供經Cbz保護的胺，然後再去保護產生胺。該胺接著進行精緻化，例如，藉由還原性胺化反應產生二級胺，其可進一步烷化以提供三級胺。

方案2顯示本發明之化合物(例如，本發明之式I)之進一步實施例的合成，其中，該稠合環中心係經修飾(例如，藉由不同芳香環(如式I中之環A)之取代作用)。使用具有適當官能性之胺基二芳基酮(以下，例如，代替方案S1中之胺基二芳基酮S2)提供具有多種稠合環中心及/或芳基附加之新穎化合物(對應於式I之基團R)。該胺基二芳基酮係商業可購得或可藉由多種方法(其中一些為本領域中所習知者)製備。

方案3提供用於製備本發明之進一步的化合物之額外例示性合成方案。

如方案3所示，稠合雙環前驅物(請參照方案S1，以下，為此化合物之合成)係與部份R(DAM=二甲基胺基伸甲基)官能化，然後與醯肼反應合成為三環稠合環。取代基Rx可經選擇適當的醯肼而改變。

本發明之化合物(其可藉由本文所述方法來製備)之額外的實施例包括：醯胺：醯胺可藉由，例如，製備相應於羧酸或酯，接著使用標準條件及適當胺之醯胺化來製備。於某些具體實施例中，醯胺提供及末端含氮末端環(例如，吡啶基、哌啶基、哌基、咪唑基(包括N-甲基-咪唑基)、嗎啉基)等)之兩個碳"連結者"。例示性醯胺結構包括：

較佳者為使用該醯胺部分及該末端含氮環間的兩個碳連結者。

"反向醯胺"：

二級醯胺：

硼酸：

於某些具體實施例中，具有至少一個手性中心的化合物係以消旋形式存在。於某些具體實施例中，具有至少一個手性中心的化合物係富含鏡像立體異構物的，亦即具有至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、90%、95%、99%、99%或100%之鏡性異構物的過量值(enantiomeric excess,(e.e.))。於某些具體實施例中，具有相同絕對構形的化合物為本文所述之化合物(+)-JQ1((S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩基[3.2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮雜平-6-基)乙酸第三丁基酯)。

於本文所述任何式之某些具體實施例中，化合物不為下列結構表示者：

其中，R’₁為C₁-C₄烷基；R’₂為氫、鹵素、或視需要經鹵原子或羥基取代之C₁-C₄烷基；R’₃為鹵原子、視需要經鹵原子、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、或氰基取代之苯基；-NR₅-(CH₂)_m-R₆，其中，R₅為氫原子或C₁-C₄烷基，m為0至4的整數，及R₆為苯基或視需要經鹵原子取代之吡啶基；或-NR₇-CO--(CH₂)_n-R₈，其中，R₇為氫原子或C₁-C₄烷基，n為0至2的整數，及R₈為苯基或視需要經鹵原子取代之吡啶基；以及R’₄為-(CH₂)_a-CO-NH-R₉，其中，a為1至4的整數，及R₉為C₁-C₄烷基；C₁-C₄羥基甲基；C₁-C₄烷氧基；或苯基或視需要經C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、胺基或羥基取代之吡啶基或-(CH₂)_b-COOR₁₀，其中，b為1至4的整數，及R₁₀為C₁-C₄烷基。

於某些具體實施例中，該化合物不為JQ1、(+)-JQ1、或(-)-JQ1。於某些具體實施例中，該化合物不為JQ1抑制劑或JQ1-FITC共軛。

術語"醫藥上可接受之鹽"意指從本文所揭露化合物(例如，JQ1、式I-XXII之化合物)或本文所述任何其他化合物所製備之鹽，其具有酸性官能基(例如，羧酸官能基)以及醫藥上可接受之無機鹼或有機鹼。適當的鹼包括，但不限於：鹼金屬之氫氧化物如鈉、鉀、及鋰；鹼土金屬之氫氧化物如鈣及鎂；其他金屬之氫氧化物如鋁及鋅；氨水、及有機胺如經取代之-或經羥基取代之-單-、二-、或三烷基胺；二環己基胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基,N-乙基胺；二乙基胺；三乙基胺；單-，雙-，或參-(2-羥基-低級烷基胺)，例如單-、雙-、或參-(2-羥基-羥基乙基)-胺、2-羥基-第三丁基胺、或參-(羥基甲基)甲基胺；N,N,-二低級烷基-N-(羥基低級烷基)-胺，例如N,N,-二甲基-N-(2-羥基乙基)-胺、或三-(2-羥基乙基)胺；N-甲基-D-還原葡糖胺；以及胺基酸如精胺酸、離胺酸等。術語"醫藥上可接受之鹽"意指從本文所揭露化合物或本文所述任何其他化合物所製備之鹽，其具有鹼性官能基(例如，胺基官能基)以及醫藥上可接受之無機酸或有機酸。適當的酸包括，但不限於：硫酸、醋酸、草酸、鹽酸、溴化氫、碘化氫、硝酸、磷酸、異菸鹼酸、乳酸、水楊酸、酒石酸、抗壞血酸、琥珀酸、馬來酸、苯磺酸、富馬酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸、甲酸、苯酸、穀氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸及對甲苯磺酸。

虛擬篩選方法及系統

於另一態樣中，本發明提供可讀取儲存介質的機器，包括本文所鑑別之BET家族成員多肽(例如，BRD4域)結合位的結構座標。這是JQ1的結合位所提議。以這些數據編碼的儲存介質能夠於電腦螢幕或相似觀察裝置顯示一分子或包括該等結合位之分子複合物的三維圖形表示。

本發明亦提供用於設計、評估及確認結合至前述結合位之化合物的方法。該等化合物預期能抑制BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)的生物活性及/或中斷BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)次細胞定位。本發明提供電腦，以播放a)分子或分子複合物的三維圖形表示，其中，該分子或分子複合物包括結合位；或b)該分子或分子複合物之同源物(homologue)的三維圖形表示，其中，該同源物包括結合位，其具有來自該胺基酸之骨架原子為不多於約2.0(更佳不多於1.5)埃的均方根偏差，其中，該電腦包括：

(i)可讀取數據儲存介質的機器，包括以機器可讀取的數據編碼的數據儲存材料，其中，該數據包括該胺基酸殘基於含溴區結構域結構結合袋或其他BET家族成員結合位的結構座標；

(ii)工作記憶體，用於進行該機器可讀取的數據之儲存指令；

(iii)中央處理器，係與該工作記憶體及該可讀取數據儲存介質的機器耦合，用於將該機器可讀取數據處理為該三維圖形表示；以及

(iv)顯示器，係與該中央處理器耦合，用於顯示該三維圖形表示。

因此，該電腦顯示包括有結合位之分子或分子複合物的三維圖形結構。

於另一具體實施例中，本發明提供電腦，以顯示分子或分子複合物的三維圖形表示，係經BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)、胺基酸的結構座標定義；或顯示該分子或分子複合物之同源物的三維圖形表示，其中，該同源物包括結合位，其具有來自該胺基酸之骨架原子為不多於約2.0(更佳不多於1.5)埃的均方根偏差。

於例示性具體實施例中，該電腦或電腦系統可包括所屬領域中之傳統組件，例如，美國專利第5,978,740號及/或第6,183,121號所揭露者(全文併入本文作為參考)。例如，電腦系統可包括：包括中央處理器("CPU")之電腦、工作記憶體(其可如隨機存取記憶體或"核心"記憶體)、大量儲存記憶體(例如，一個或多個磁碟驅動器或唯讀光碟驅動器)一個或多個陰極射線管(CRT)或液晶顯示器(LCD)顯示終端機、一個或多個鍵盤、一個或多個輸入電路、以及一個或多個輸出電路，其全部皆與傳統系統匯流排互相連接。

本發明之機器可讀取的數據可藉由使用數據機或連接數據線的數據機輸入到電腦。或者或額外地，該輸入硬體可包括唯讀光碟驅動器、磁碟驅動器或快閃記憶體。於連接顯示器終端時，也可以使用鍵盤作為輸入裝置。

可以利用傳統裝置同樣執行藉由輸出電路及電腦耦合的輸出硬體。藉由實例，輸出硬體可包括陰極射線管或液晶顯示器終端，以用於顯示使用如QUANTA或PYMOL程式的本發明之結合袋的圖形表示。輸出硬體也可以包括印表機、或供後續使用儲存系統輸出的磁碟驅動器。

在操作方面，中央處理器協同各種輸入及輸出之裝置使用，取出大量儲存記憶體及存取及取出工作記憶體的途徑之協同數據途徑，以及決定數據處理步驟的序列。可以使用一些程式來處理本發明之機器可讀取的數據，包括商業上可購得的軟體。

用於儲存本發明之機器可讀取的數據之磁儲存介質可為習知的。可以藉由如上述電腦系統之系統來進行可以機器可讀取的數據來編碼的磁數據儲存介質。該介質可為傳統軟式磁片或硬碟，其在一側或雙側上具有適當基質(其可為習知)及適當塗層(其可為習知)，含有其極性或方向可經磁性改變的磁域。該介質也可含有用於接收硬碟或其他數據儲存裝置之主軸的開口(未圖示)。

該介質的磁域係經極化或定向，以便於以習知方法編碼如本文所述之機器可讀取的數據，達到藉由如本文所述之電腦系統之系統來執行。

光學可讀取的數據儲存介質也可以機器可讀取的數據或指令組來編碼，其可藉由電腦系統進行。該介質可為傳統密閉磁碟唯讀光碟或為光學可讀的且磁-光學可讀的可重寫介質如磁-光碟。

於唯讀光碟之例中，很清楚地，硬碟塗層是反射且印記複數個凹孔以編碼機器可讀取的數據。藉由離開該塗層表面之反射雷射光來讀取排列該凹孔。於該反射塗層的頂部較佳提供實質上透明的保護塗層。

於磁-光碟之例中，很清楚地，數據-紀錄塗層沒有凹孔，但藉由如雷射加熱高於某溫度時卻有其極性或方向可經磁性改變的磁域。藉由測量從該塗層反射雷射光的偏極化來讀取該域的方向。如上述，該域的排列編碼數據。

當用於連接電腦程序及軟體以轉譯那些協同成為包括結合袋之分子或分子複合物的三維結構時，可使用結構數據以達各種目的，例如，藥物研發。

例如，藉由數據編碼的結構可經計算評估其與化學個體相關的能力。與BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)之結合位相關的化學個體預期可抑制癌細胞的增生或誘發分化，以抑制BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)的生物活性及/或中斷次細胞定位。該化合物為有潛力的藥物候選。或者，可以圖形三維表示將藉由數據編碼的結構顯示於電腦螢幕。此得以目視檢查該結構，以及目視檢查與該結構相關的化學個體。

因此，根據另一具體實施例，本發明係關於用於評估與下列者相關之有潛力的化學個體之方法：a)包括結合位之分子或分子複合物，係如本文所述由BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)之結構座標所定義、或b)該分子或分子複合物的同源物，其中，該同源物包括結合袋，其具有來自該胺基酸之骨架原子為不多於約2.0(更佳不多於1.5)埃的均方根偏差。

此方法包括下列步驟：

i)利用方法來進行化學個體及BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)多肽或其片斷或分子複合體之結合位之間的合適操作；以及

ii)分析該合適操作之結果以定量該化學個體及結合袋之間的關聯。此具體實施例關於評估化學個體及BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)或其片斷之關聯或結合的潛力。

本文所用術語"化學個體"意指化學化合物、至少兩種化學化合物的錯合物、以及該化合物或錯合物之片段。

於某些具體實施例中，評估該化學個體與分子或分子複合物間的關聯之方法係由如本文所述BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)之所有胺基酸的結構座標、或該分子或分子複合物的同源物所定義，其中，該同源物具有來自該胺基酸之骨架原子為不多於約2.0(更佳不多於1.5)埃的均方根偏差。

於進一步的具體實施例中，本文所述一結合位之結構座標可使用鑑別包括含溴區結構域(例如，含溴區結構域結構結合袋)之分子之拮抗物用之方法。此方法包括下列步驟：

a)使用BET家族成員的分子座標；以及

b)利用三維結構來設計或選擇潛力促效物或拮抗物。可藉由任何可獲得的方法來得到該化合物。"獲得"意味如藉由合成、購買、或除此之外以取得該促效物或拮抗物。若有需要，該方法進一步涉及與含有BET家族成員多肽或其片斷之促效物或拮抗物接觸，以決定該潛力促效物或拮抗物與該分子相互作用的能力。若有需要，該方法亦進一步涉及與含有含溴區結構域結合化合物之癌細胞接觸、評估細胞毒性、評估癌細胞增生、細胞死亡、BET家族成員生物活性、或次細胞定位之步驟。

於另一具體實施例中，本發明提供鑑別BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)之潛力拮抗物的方法，該方法包括下列步驟：

a)使用BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)的分子座標(例如，含溴區結構域結構結合袋)；以及

b)利用三維結構來設計或選擇潛力促效物或拮抗物。

本案發明人至此未鑑別含溴區結構域之結合位的闡明提供設計新穎化學個體及可與該含溴區結構域(全部或部分)相互作用之化合物之必要資訊，且因而可調控(例如，抑制)BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)的活性。

根據本發明，關於設計結合至BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)結構結合袋序列之化合物(其降低含溴區結構域之生物活性或中斷該BET家族成員次細胞定位)一般涉及一些因素等考慮的問題。於一具體實施例中，該化合物及BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)之至少一片段實際及/或結構相聯，例如，結合位於含溴區結構域結合袋序列內。此相關重要非-共價分子相互作用包括氫鍵結、凡得瓦爾相互作用(van der Waals interactions)、疏水性相互作用及靜電力相互作用。所欲地，該化合物係假定為能夠使其與該含溴區結構域結合位直接相聯之構形。雖然該化合物的某些部份可能不直接參與這些相聯作用，但是該個體的那些部份仍然可能影響分子的整體構形。即，依序，對該化合物的效力有顯著的作用。該構形的要求包括該化學化合物與全部或部分結合位相關的整體三維結構及方向，或者包括與結合位或其同源物直接相互作用之一些化學化合物之官能基團之間的間距。

化學化合物對含溴區結構域結合位之有效抑制或抑制效果可藉由使用電腦建模技術於它實際合成及測試之前予以分析。若給定化合物的理論結構建議它與標靶結合位之間為不足以相互作用及相聯作用時，則排除測試該化合物。然而，若電腦建模指示為強相互作用時，則進行合成分子並測試其結合BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)結構結合袋序列的能力、或測試其生物活性，例如，藉由測定腫瘤細胞中的細胞毒性、藉由測定BET家族成員之生物活性的降低、或藉由測定BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)之次細胞位置。可藉由篩選化學個體片段及選擇他們與含溴區結構域結構結合袋相聯的能力之一系列步驟的方法來計算評估候選化合物。

所屬技術領域中之技藝者可使用一些方法之一種來篩選化學化合物，或與含溴區結構域結合位相聯的能力之片段。基於本文所述BET家族成員之結構座標或其定義與從機器可讀取的儲存介質所產生者為相似外型之其他座標，可藉由目視檢查如電腦螢幕上的結合位開始此方法。經選擇的片段或化學化合物然後於多個方向定位或停駐，在如前文所定義的結合位內。使用軟體如Quanta及DOCK，接著藉由使用標準分子力學的能量最小化及分子動力學如CHARMM及AMBER可完成停駐。

特殊化電腦程式(例如，本領域所習知者及/或商業上可購得者及/或本文所述者)亦可協助所選擇之片段或化學個體的過程。

一旦選定適合的化學個體或片段，他們可經彙編組合成單一化合物或複合物。可藉由在電腦螢幕上目視檢查該片段關聯於該標靶結合位的結構座標之彼此於三維影像顯示的關係之前進行彙編組合。

如本文所述每次以逐步方式代替進行結合抑制劑之結合袋與一片段或化學個體，使用未佔用結合位或視需要含有已知抑制劑某部份的整體或"重新"設計抑制或其他結合化合物。所屬技術領域中已知有許多重新配位體設計方法，且一些方法為商業上可購得(例如，LeapFrog，可購自Tripos Associates,St. Louis,Mo.)。

亦可根據本發明利用其他分子建模技術(例如，請參照N. C. Cohen et al.,"Molecular Modeling Software and 15 Methods for Medicinal Chemistry,J. Med. Chem.,33,pp. 883-894(1990)；或參照M. A. Navia and M. A. Murcko,"The Use of Structural Information in Drug Design",Current Opinions in Structural Biology,2,pp. 202-210(1992)；L. M. Balbes et al.,"A Perspective of Modern Methods in Computer-Aided Drug Design",in Reviews in Computational Chemistry,Vol.5,K. B. Lipkowitz and D. B. Boyd, Eds.,VCH,New 20 York,pp.337-380(1994)；或參照W. C. Guida,"Software For Structure-Based Drug Design",Curr. Opin. Struct.Biology,,4,pp.777-781(1994))。

一旦經設計或選定化合物，可藉由計算評估來測試並最佳化該個體能結合至結合位的效果。

專一性電腦軟體係本技術領域可購得，以評估化合物變形能及靜電相互作用。用於此用途所設計的程序之實例包括：AMBER；QUANTA/CHARMM(Accelrys,Inc.,Madison,WI)等。這些程序如可使用商業上可購得的圖形工作予以執行。對彼等技術領域之技藝者，已知其他硬碟系統及套裝軟體。

另外的技術涉及藉由電腦模擬篩選虛擬圖書館之化合物，例如，本文所述者(例如，請參照實施例)。數以千計的化合物可被快速地篩選且該虛擬化合物可再進一步篩選(例如，合成及體外或體內測試)予以選定。對於可全部或部分結合至BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)之化學個體或化合物，可篩選小分子資料庫。於此篩選中，可藉由互補形或相互作用能量來判斷或評估適合該個體之結合位的品質。

電腦係用於產生下列者之三維圖形表示者：

a)分子或分子複合物，其中，該分子或分子複合物包括BET家族成員之結構結合袋，其係由胺基酸殘基於含溴區結構域結構之結合袋續列的結構座標所定義；或

b)該分子或分子複合物之同源物的三維圖形表示，其中，該同源物包括結合位，其具有來自該胺基酸之骨架原子為不多於約2.0(更佳不多於1.5)埃的均方根偏差，其中，該電腦包括：

(i)機器可讀取的數據儲存介質，包括以機器可讀取的數據編碼的數據儲存材料，其中，該數據包括該胺基酸殘基於BET家族成員之結合袋序列的結構座標；

(ii)工作記憶體，用於進行該機器可讀取的數據之儲存指令；

(iii)中央處理器，係與該工作記憶體及該機器可讀取的數據儲存介質耦合，用於將該機器可讀取的數據處理為該三維圖形表示；以及

(iv)顯示器，係與該中央處理器耦合，用於顯示該三維圖形表示。如實施例所述，使用電腦模擬方法所鑑定的化合物可視需要地經體外或體內測試，例如，使用下文所述之"額外的篩選方法"、或本技術領域中習知的任何其他方法。

額外的篩選方法

如前文所述，本發明提供化學化合物之具體實例，包括JQ1、以及其他經取代之化合物，其係與含溴區結構域結合袋結合，以減少細胞分化或降低腫瘤細胞增生。然而，本發明並不受限於此。本發明復提供用於鑑定試劑(包括核酸、胜肽、小分子抑制劑、及模擬劑)之簡單方法，該試劑能夠結合至BET家族成員，且對腫瘤細胞具細胞毒性，該方法降低BET家族成員的生物活性、或中斷該BET家族成員次細胞位置。該化合物亦預期有用於治療或預防腫瘤、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病、與含溴區結構域相關之感染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低男性生育力。本發明之組成物的進一步用途包括用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即藉由促進或抑制細的分化作用)、及促使分化多能性，但不限於此。

尤其是本發明之某些態樣係基於至少部份發現降低BET家族成員多肽之生物活性的試劑，其係可能適用為治療劑，以用於治療或預防腫瘤、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病、及含溴區結構域相關之感染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低男性生育力。本發明之組成物的進一步用途包括用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即藉由促進或抑制細的分化作用)、及促使分化多能性，但不限於此。於特別具體實施例中，藉由檢驗細胞增生、細胞存活或細胞死亡來分析本發明之化合物或其他試劑的效果。於另一途徑中，本發明之試劑及化合物係檢驗它們對轉錄調節或延長之效果。鑑定降低腫瘤之生長、增生、或侵襲之本發明之試劑及化合物係有用於腫瘤之治療或預防。於另一具體實施例中，本發明之化合物係檢驗它們對免疫反應細胞、細胞激素或組織胺釋出、或發炎疾病的任一其他標誌之效果。

本發明之方法可利用專一性結合至BET家族成員或降低BET家族成員之生物活性的虛擬任何試劑。本發明之方法係有用於高通量低成本篩選候選試劑(其降低、減緩、或安定腫瘤之生長或增生)、或有用於治療或預防發炎疾病。專一性結合至BET家族成員之含溴區結構域的候選試劑再經單離及用於體外檢驗或體內檢驗對其降低腫瘤細胞增生、減少分化、及/或增加腫瘤細胞死亡之能力的活性進行測試。本技術領域中之技藝者應體會候選試劑對細胞的效果典型係不與該候選試劑接觸的相應控制細胞比較。因此，篩選方法包括比較經以候選試劑接觸的腫瘤細胞之增生與未經處理之控制細胞的增生。

於其他具體實施例中，與鑑定為候選化合物之未經處理的控制樣本比較，在經以候選試劑處理之細胞中之BET家族成員的表現或活性係降低經接觸的細胞中之BET家族成員的生物活性。可藉由本領域中之習知程序(例如，西方墨漬法(Western blotting)、流式細胞儀(flow cytometry)、免疫細胞化學法、結合至磁性及/或含溴區結構域-專一抗體-包覆的小珠、原位雜交、螢光原位雜交(FISH)、ELISA、微陣列分析、RT-PCR、北方墨漬法(Northern blotting)、或比色分析(colorimetric assays)如Bradford分析及Lowry分析)來比較多肽表現或活性。

於一操作實例中，以多種濃度添加一種或多種候選試劑至含有腫瘤細胞的培養皿。降低BET家族成員表現於細胞中之表現的試劑係適合本發明；該試劑可使用如治療劑，以預防、延緩、改善、安定、或治療腫瘤或發炎疾病。一旦業鑑定，本發明之試劑(例如，專一結合及/或對抗含溴區結構域之試劑)可用於治療腫瘤、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病、及含溴區結構域相關之感染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低男性生育力。本發明之組成物的進一步用途包括用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即藉由促進或抑制細的分化作用)、及促使分化多能性，但不限於此。局部地或全身性地投予根據本發明之方法鑑定之試劑，以治療腫瘤、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病、及含溴區結構域相關之感染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低男性生育力，或用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即藉由促進或抑制細的分化作用)、或促使原位分化多能性。

於一具體實施例中，候選試劑的效果可藉由使用相同一般方法及標準免疫技術(例如，含有對BET家族成員專一性抗體之西方墨漬法或免疫沉澱法)來測量在BET家族成員產生的濃度。例如，可使用免疫分析來偵測或監控BET家族成員於腫瘤細胞中的表現。於一具體實施例中，本發明鑑定能夠結合至BET家族成員及阻斷BET家族成員之生物活性或中斷BET家族成員次細胞位置的多株或單株抗體(如本文所述製造者)。中斷BET家族成員之次細胞位置、或降低BET家族成員之生物活性的化合物係認為尤其有用。又，該試劑可用作為如治療劑，以預防或治療腫瘤或發炎疾病。

或者，另外，候選化合物首先藉由分析專一結合至及對抗本發明之BET家族成員(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)之彼等，接著測試它們對腫瘤細胞的效果(如實施力所述)予以鑑定。於一具體實施例中，候選試劑的功效取決於其與BET家族成員相互作用的能力。該相互作用可使用任何標準結合技術及功能性分析(例如，前述Ausubel et al.所述彼等者)而易於檢驗。例如，候選化合物可於體外測試與本發明之多肽的相互作用及結合及藉由任何標準檢驗(例如，本文所述之彼等者)檢驗調控腫瘤細胞增生的能力。於一具體實施例中，使用流式細胞儀分析藉由檢驗BrdU併入來決定腫瘤細胞的分裂。於另一具體實施例中，免疫組織化學地監控BET家族成員的表現。

潛力含溴區結構域拮抗物包括有機分子、胜肽、胜肽模擬劑、多肽、核酸配位體、適體(aptamer)、及抗體，其係結合至BET家族成員含溴區結構域並降低其活性。於一特別實施例中，結合至BET家族成員之候選化合物可經使用以層析法為主的技術予以鑑定。例如，本發明之重組BET家族成員多肽可藉由標準技術從經設計的細胞純化出表現該多肽，或可藉由化學合成者，一旦經純化的多肽係於管柱中固定化。然後使候選試劑的溶液流過該管柱，且根據其能力所鑑定之專一性結合BET家族成員多肽或其片斷的試劑便結合至BET家族成員多肽並固定於該管柱。為了單離出該試劑，故清洗該管柱以移除掉非專一性結合分子，然後從該管柱釋出感興趣的試劑並收集。藉由此方法(或任何其他適當的方法)所單離的試劑，若有需要，可進一步進行純化(例如，藉由高效液相層析技術)。此外，可對這些候選試劑對於降低腫瘤細胞增生或存活力的能力進行測試。亦可使用經此方法所單離的試劑作為，例如，治療劑，以治療或預防腫瘤、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病、及含溴區結構域相關之感染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低男性生育力，或用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即藉由促進或抑制細的分化作用)、及促使分化多能性。考慮到特別有用於本發明，該經鑑定為結合至BET家族成員之化合物具有親和力係數少於或等於1 nM、5 nM、10 nM、100 nM、1μM或10μM。

測試化合物及萃取物

於某些具體實施例中，根據本領域中之習知方法，BET家族成員拮抗物(例如，專一性結合並降低含溴區結構域之活性的試劑)係從天然產物或合成的(或半合成的)萃取物之大資料庫或化學資料庫、或從多肽或核酸資料庫予以鑑定。藥物發現及發展領域中之彼等技藝者應能瞭解測試萃取物或化合物的確切來源對於本發明之篩選程序而言不是關鍵性的。用於篩選的試劑可包括已知作為用於治療腫瘤或發炎疾病之習知彼等者。或者，實際上任何許多未知化學萃取物或化合物可使用本文所述的方法來篩選。該萃取物或化合物的實例包括以植物、真菌、原核生物、或動物為主的萃取物、發酵液、及合成化合物、以及現存多肽的修飾物，但不限於此。

呈細菌、真菌、植物、及動物萃取物之型式之天然多肽的資料庫為商業上可自下列許多來源購得，包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft. Pierce,Fla.)、及PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,Mass.)。該些多肽可使用本領域及本文所述之習知方法進行修飾為包括有蛋白質域者。此外，若有需要，根據本領域習知方法(例如，藉由標準萃取及分餾方法)可製得天然及合成的自製資料庫。用於分子資料庫合成之方法的實例可於本領域中取得，例如：DeWitt et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909,1993；Erb et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422,1994；Zuckermann et al.,J. Med. Chem. 37:2678,1994；Cho et al.,Science 261:1303,1993；Carrell et al.,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059,1994；Carell et al.,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061,1994；以及Gallop et al.,J. Med. Chem. 37:1233,1994。再者，若有需要，使用標準化學、物理、或生物化學的方法係易於修改任何資料庫或化合物。

亦可使用眾多方法以用於任意諸多多肽、化學化合物(包括，但不限於：以醣、脂質、胜肽、及核酸為主的化合物)之隨機產生或直接合成(例如，半合成或全合成)。商業上可自Brandon Associates(Merrimack,N.H.)及Aldrich Chemical(Milwaukee,Wis.)購得合成化合物資料庫。或者，欲用作為候選化合物之化學化合物可使用本領域中具有通常知識者所周知之標準合成技術及方法易於取得的起始材料而合成者。藉由本文所述方法而鑑定有用於合成化合物之合成化學轉型及保護基團方法(保護作用及去保護作用)係本領域所周知，例如，包括下述之彼等者及其後撰版本：R. Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；T. W. Greene and P. G. M. Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.,John Wiley and Sons(1991)；L. Fieser and M. Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；以及L. Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)。

資料庫之化合物可存在於溶液(例如，Houghten,Biotechniques 13:412-421,1992)、或小株(Lam,Nature 354:82-84,1991)、晶片(Fodor,Nature 364:555-556,1993)、細菌(Ladner,U.S. Patent No. 5,223,409)、孢子(Ladner U.S. Patent No. 5,223,409)、質體(Cull et al.,Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869,1992)或噬菌體(Scott and Smith,Science 249:386-390,1990;Devlin,Science 249:404-406,1990;Cwirlaet al. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:63786382,1990;Felici,J. Mol. Biol. 222:301-310,1991;Ladner supra.)中。

此外，藥物發現及發展領域中之彼等技藝者應易於瞭解用於下列之方法:去複製(例如，分類的去複製、生物去複製、及化學去複製、或其任何組合)、消除複製或已知用於只要有可能利用於他們活性之重複材料。

當找到有BET家族成員含溴區結構域結合活性之粗萃取物時，需要進一步分餾該陽性引導萃取物以單離用於觀察效果之分子組成份。因此，萃取、分餾、及純化過程的目標是謹慎的特徵化及鑑定能降低腫瘤細胞增生或存活力之粗萃取物內的化學個體。該等異質萃取物之分餾及純化的方法於本領域中為已知。若有需要，根據本領域之已知方法，表示為適用於治療劑的化合物係經化學修飾。

本發明提供治療疾病及/或其病症或病徵之方法，該方法包括對個體(例如，哺乳動如人類)投予治療有效量之醫藥組成物，該醫藥組成物包括本文所述式之化合物。因此，一具體實施例為治療罹患或患有腫瘤疾病或其病症或病徵之個體的方法。該方法包括下列步驟:於經治療的疾病或病症之條件下，投予哺乳動物足以治療該疾病或其病症或病徵之本發明化合物之用量的治療量。

本發明方法包括投予個體(包括確認需要該治療之個體)有效量之本發明所述化合物、或本發明所述組成物，以產生上述的效果。確認需要該治療之個體可為個體之審判或醫療專業人員，且可為主觀的(例如，判斷)或客觀的(例如，藉由測試或診斷方法之可測量的)。

本發明之治療方法(其包括預防疾病的治療)一般包括投予有其需要個體(例如，動物、人類)，包括哺乳動物特別是人類治療有效量之本發明化合物，例如，本發明所述式之化合物。該治療將能適當地投藥到罹患、具有、患有或處於有風險於疾病或其病症或病徵之個體，特別是人類。彼等個體"處於風險"的確定可藉由診斷測試或個體的判斷或醫療專業提供者(例如，一般測試、酵素或蛋白質指標、標記(如本文所述)、家族病史等)之任何主觀或客觀決定予以獲得。本發明化合物亦可使用於治療可能涉及腫瘤或發炎的任何其他病症。

於一具體實施例中，本發明提供監控治療進展的方法。該方法包括在患有或染有與腫瘤相關之病症或其病徵之個體中，其中，該個體係已投予足以治療該疾病或其病徵之本文化合物之治療量，決定診斷標識物(指標)(例如，藉由本文化合物所修飾之任何標靶、蛋白質或其指示物)的濃度或診斷測量方法(例如，篩選、檢驗)之步驟。於該方法中決定的標記物之濃度可與健康正常組或其他患病的病患之標記物的已知濃度比較，以建立個體的疾病狀態。於較佳具體實施例中，個體中之標記物的第二濃度是在比決定第一濃度的時間點更晚點所決定的，並比較該兩個濃度對監控疾病的進展或該治療的效果。於某些較佳具體實施例中，於開始本發明之治療之前決定個體中之標記物的欲-治療濃度；此標記物的預-治療濃度然後可與在治療開始之後個體中之標記物的濃度比較，以決定該治療的效果。

醫藥上的治療學

於其他具體實施例中，使用本發明所述方法所發現有藥用價值的試劑(例如，JQ1或本文所述式之化合物)係適用為藥物或用為現存化合物之結構修飾之資訊，例如，合理化藥物設計。該方法係適用於篩選對下列者有效之試劑：腫瘤、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病及含溴區結構域相關之感染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低男性生育力，或用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即藉由促進或抑制細的分化作用)、及促使原位分化多能性。

對於治療用途，使用本發明所述方法鑑定的組成物或試劑可經全身性投藥，例如，調配為醫藥上可接受之緩衝液諸如生理食鹽水。投藥的較佳途徑包括如：皮下、靜脈內、腹膜腔內、肌肉內、或皮內注射，提供病患藥物連續、持續的濃度。可使用本文生物上可接受之載劑所鑑定之治療之治療有效量來進行人類病患或其他動物的治療。適合的載劑及其他的調配物如Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin所述者。治療劑的用量可依投藥方式、病患的年齡及體重、及具有下列疾病之臨床病徵而不同：腫瘤、發炎疾病、肥胖、脂肪肝(NASH或其他者)、糖尿病、動脈粥樣硬化、動脈支架阻塞、心臟衰竭、惡質病、移植物對抗宿主疾病及含溴區結構域相關之感染疾病、寄生蟲、瘧疾、錐蟲之治療、以及用於降低男性生育力，或用於器官移植、用於再生醫學的細胞狀態之調控(亦即藉由促進或抑制細的分化作用)、及促使原位分化多能性。一般而言，此用量可為彼等用於治療及上述疾病或狀態相關的其他疾病所用其他試劑的範圍，但於某些實例由於化合物增加的專一性而需要較低的用量。當以本領域技藝者所習知方法或使用任何檢驗測量為表現或有BET家族成員之生物活性，在對腫瘤細胞為細胞毒性的劑量下投予化合物，係降低BET家族成員的生物活性，或減少腫瘤細胞的增生、存活力或侵略。於另一具體實施例中，在降低發炎或發炎疾病的病徵之劑量下投予化合物。

發炎疾病

本發明之組成物(包括本文所述式之化合物)係有用於降低發炎作用及用於治療發炎疾病。發炎作用涉及免疫系統之分子訊號複雜連續的結果，通常對感染或細胞或組織之損傷反應。發炎作用通常是指身體治癒的開始；然而若發炎不恰當地調節時，則發炎作用會導致慢性疾病如關節炎。

藉由"發炎反應"或"免疫反應"表示活組織對以紅、熱、腫、痛為特徵的受傷、感染、或刺激，以及增加血流及免疫細胞匯集及分泌的結果所引起的功能損失之反應。發炎作用是對侵入感染性微生物體之身體的反應，因而導致對受侵襲區域之血流增加，吸引白血球釋出化學物，增加血漿流，以及使單核球清除細胞碎屑。發炎可以是刺激發炎反應的任何者。

免疫系統所承載的非專一性反應為先天性級聯(innate cascade)或先天性免疫反應，且其特徵是在受傷或感染處之細胞(例如，白血球、自然殺手細胞、肥大細胞、嗜酸性細胞及嗜鹼性細胞)的浸潤作用，以及吞噬細胞如嗜中性細胞、巨噬細胞及樹突細胞對化學趨向訊號之反應。藉由前述細胞所分泌的分子，例如，組織胺及多種細胞激素；以及循環蛋白之補體系統皆有助於發炎作用。以發炎作用為特徵的疾病是人類發病率及死亡率的重要原因。

於某些具體實施例中，該發炎病症為風濕性病症。本文所用之風濕性病症是指以發炎作用為特徵之任何多種的發炎病症，有時為結締組織結構特別是關節、韌帶及肌腱的退化及/或代謝性退化。風濕性病症典型導致痛、僵硬及/或運動受限。患病的特定組織或組織取決於風濕性病症。例示性風濕性病症包括，但不限於：風溼性關節炎、少年型關節炎(juvenile arthritis)、黏液囊炎、脊椎炎、痛風、硬皮病、史迪爾氏症(Still’s disease)及脈管炎(vasculitis)。

於某些具體實施例中，風濕性病症為風溼性關節炎，且"治療"風溼性關節炎包括減少該風溼性關節炎之一種或多種病徵的嚴重性、頻率及/或發生。於其他具體實施例中，風濕性病症為少年型關節炎、黏液囊炎、脊椎炎、痛風、硬皮病、史迪爾氏症或脈管炎。本發明之方法係減少這些病狀之任一種或多種病徵的嚴重性、頻率及/或發生。

於多種具體實施例中，關節炎或其他發炎疾病的病徵包括紅、腫、發炎作用、發燒、減少運動範圍及疼痛。減少該病徵的發生或嚴重性之實例包括，但不限於：減少關節腫大數量、減少關節疼痛數量、減少止痛藥劑的依賴、減少病患對其疼痛之自我評估的頻率或嚴重性、增加運動的自由度、增加活動性、減少發燒、以及增加進行每日工作的能力。

神經發炎作用(以活化的小神經膠質細胞及星狀細胞及廣幅發炎介質的局部表現為特徵)是對於腦部受傷(不管是創傷、中風、感染或神經退化)的基本反應。此局部組織反應被認為是部分的修復及恢復過程。如周圍疾病中許多發炎病狀一樣，神經發炎作用有助於CNS病症的病理生理學。

於某些具體實施例中，該發炎病症為發炎性皮膚病症。發炎性皮膚病症包括，但不限於：玫瑰斑(rosacea)、局部皮膚炎、痤瘡、脂溢性皮膚炎及蜂窩組織炎。

於另一具體實施例中，該發炎疾病為局部缺血性或發炎性心臟血管疾病。發炎性心臟血管疾病或病症可為，但不限於：堵塞性疾病或病症、動脈粥狀硬化、心瓣膜疾病、脈瓣狹窄(stenosis)、心瓣手術後的再狭窄(restenosis)、支架內再狹窄(in-stent-stenosis)、心肌梗塞、冠狀動脈疾病、急性冠狀動脈症候群、鬱血性心衰竭、心絞痛、心肌缺氧(myocardial ischemia)、或血栓形成(thrombosis)。於其他具體實施例中，該場所為缺血性傷害的次發性場所，例如，CNS或腎臟。

於其他具體實施例中，該發炎疾病為缺血性或發炎性腸道疾病。

發炎性腸道疾病(IBD)意指罹患小腸及結腸之不明病源學的慢性直腸發炎疾病，包括克隆氏症(Crohn’s disease,CD)及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)。克隆氏症可能涉及腸道任何部分，且一般涉及末端小腸及/或結腸。潰瘍性結腸炎僅涉及結腸，通常侷限於直腸或末端結腸。CD及UC的小鼠模型之研究強烈建議這些疾病之此兩個是由於在黏膜微生物群中對抗體之黏膜免疫反應的失調(Sartor,R. B.(1995). Gastroenterol Clin North Am 24,475-507)(Strober W,et al.(2002)Annu. Rev. Immunol. 20:495-549)。

潰瘍性結腸炎或未確定型結腸炎意指以發炎作用的狀態為特徵的結腸之病狀，其中具有可偵測的一種或多種下列組織學特徵：以出現上皮細胞脫失及斑點潰瘍、產生黏蛋白的杯狀細胞的大量耗損、以及管狀腺密度的減少為特徵的淺表性發炎作用。此外，於固有層(lamina propia)中，觀察到與細胞進入腸腔的滲出作用有關之淋巴細胞及顆粒細胞組成的(後文大多由嗜中性細胞，且更少程度上，嗜鹼性細胞組成)混合型發炎細胞浸潤。同樣，當本領域中之技藝者在外肌肉層看到極少甚至沒有跡象顯示為發炎作用，黏膜下層可顯示有少數發炎細胞的標示水腫。例如，請參照Boirivant et al. Journal of Experimental Medicine 188: 1929-1939(1998)。臨床病徵可包括，但不限於：腹瀉、脫肛、體重減輕、腹部疼痛及脫水。

克隆氏症涉及影響消化道的任何部位且通常影響小腸末端部位及/或鄰接降結腸的發炎作用。經常地，發炎作用係以由交替有正常黏膜區域及發炎區域組成的"跳耀式病變"為特徵。克隆氏症中之腸道的患病區域顯示有紅斑、水腫及增加脆性；經常使該腸道狹窄並連接到其他腹腔器官或腸壁。患病腸道及其他結構之間的瘺管包括經常發生的皮膚。克隆氏症中之組織的顯微鏡檢查顯示上皮膜糜爛、產生黏蛋白的杯狀細胞的耗損以及涉及黏膜所有層的大量淋巴細胞浸潤；此浸潤液有時含有象徵肉芽腫瘤形成的巨細胞。當發炎持續存在一段長時間(慢性的)時，有時就會產生瘢痕(纖維化)。瘢痕組織典型不如健康組織般可撓的。因此，當在腸出現纖維化時，瘢痕會使涉及該腸道片段的通道(內腔)之寬度狹窄。這些狹隘7的區域稱為狹窄部位(stricture)。該狹窄部位可能是輕微的或嚴重的，取決於有多少阻塞通過該狹窄區域的腸所容納量。克隆氏症的臨床症候/病徵可包括，但不限於：惡病體質(cachexia)、體重減輕、生長緩慢、腹部疼痛、引流瘺管(draining fistulae)、直腸脫肛及脫水。

於某些具體實施例中，發炎性肝病或病症。例如，發炎性肝病或病症係選自自體免疫肝炎、肝硬化及膽汁性肝硬化(biliary cirrhosis)所組成群組。

醫藥組成物的配製

可藉由任何適合的方式投予用於治療腫瘤形成或發炎疾病之化合物，其使組合其他成分的治療劑之濃度有效改善、減少、或穩定腫瘤形成或發炎疾病。該化合物可以任何適當的量包括於任何適合的载劑物質內，且一般以該組成物之總重量的1至95重量%存在。可以適合於經腸道外(例如，經皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、或腹腔注射)投藥路徑之劑量型式來給予該組成物。該醫藥組成物可根據傳統醫藥實踐(pharmaceutical practice)(例如，請參照Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.),ed. A. R. Gennaro,Lippincott Williams & Wilkins,2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)予以配製。

人類劑量用量最初可從用於小鼠之化合物的用量外推來決定，且熟悉此技藝者皆瞭解本領域中常規於將人類對照於動物模型以於修改劑量。於某些具體實施例中，設想該劑量可從約1微克(μg)化合物/公斤(kg)體重至約5000毫克(mg)化合物/kg體重；或從約5mg/kg體重至約4000mg/kg體重；或從約10mg/kg體重至約3000mg/kg體重；或從約50mg/kg體重至約2000mg/kg體重；或從約100 mg/kg體重至約1000 mg/kg體重；或從約150 mg/kg體重至約500 mg/kg體重之間變化。於其他具體實施例中，此劑量可為約1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500mg/kg體重。於其他具體實施例中，該劑量可為約8、10、12、14、16或18 mg/kg體重。當然，可向上或向下調整此劑量用量，如常規於治療方案所處理，取決於初始臨床試驗的結果及特定病患的需求。

可將本發明之醫藥組成物調製成依據投藥或於任何預定的時間或投藥後時間範圍以持續立即釋出活性化合物。該組成物的後期型式即一般習知的經控制之釋放調配物，其包括(i)於體內超過延長一段時間的範圍內，授予該藥物實質固定的濃度之調配物；(ii)於體內超過延長一段時間的範圍內，在預定遲延時間之後，授予該藥物實質固定的濃度之調配物；(iii)於預定時間範圍期間持續作用的調配物，係藉由以與活性物質之血漿濃度中變動相關附隨的不欲副作用最小化而於體內維持相對、固定、有效濃度(鋸齒動力學型)；(iv)局部作用之調配物，係藉由經控制之釋放組成物的空間配置來調整或與胸腺接觸；(v)能方便服藥的調配物，例如，一天一次或兩週一次投藥的劑量；以及(vi)標定腫瘤或發炎疾病的調配物，係藉由使用載劑或化學物衍生物以傳遞治療劑到特定細胞類型(例如，腫瘤細胞)，為達某些應用，經控制之釋放調配物排除每日慣常服藥期間的必要而是持續血漿濃度於治療濃度。

可進行任何許多策略以獲得其中釋放速率超過該化合物代謝難題之經控制釋放的。於一實例中，藉由適當選擇多種調配參數及組成份，包括如多種經控制釋放的組成物及包衣的類型，予以得到經控制釋放的。因此，該治療劑係與適當賦形劑調配成醫藥組成物，依據投藥以經控制的方式釋放出該治療劑。實例包括單一或複合之單位錠劑或膠囊組成物、油性溶液、懸浮劑、乳劑、微膠囊、分子複合物、奈米顆粒、貼布及脂質體。

經腸道外組成物

醫藥組成物可藉由注射、灌注或植入(經皮下、靜脈、肌肉、腹腔等)以調配物劑型、或藉由含有適當傳遞裝置或植入物之傳統、無毒性醫藥上可接受之載劑或佐劑經腸道外投予。該組成物的調配物或製劑係所屬領域中熟習此技藝者所周知的醫藥調配物。該調配物可於前文述及Remington：The Science and Practice of Pharmacy發現。

經腸道外使用的組成物可以單位劑型(例如，呈單一劑量安瓿)或以含有幾個劑量的小瓶給予，且其中可添加適合的保存劑(參考下文)。該組成物可為下列形式：溶液、懸浮劑、乳劑、灌注裝置、或用於植入的傳遞裝置，或呈乾燥粉末存在以於使用前與水或其他適合媒介物再組合。除了活性試劑降低或改善腫瘤形成或發炎疾病，組成物也可包括適合經腸道外可接受的載劑及/或賦形劑。活性治療劑可併入微球粒、微膠囊、奈米顆粒、脂質體等以於經控制釋放的。再者，該組成物可包括懸浮劑、溶解劑、安定劑、PH-調節劑、等張調節劑及/或分散劑。

如上文所述，本發明之醫藥上可接受的組成物可為適合於無菌注射之型式。為了製備該組成物，係使適合活性抗腫瘤治療劑溶解於或懸浮於經腸道外可接受的液體媒介物。該可接受的媒介物及溶劑中，可利用水、藉由添加適當用量的鹽酸、氫氧化鈉或適合的緩衝液調整成適合pH值的水、1,3-丁二醇、林格氏液(Ringer’s solution)、及等張氯化鈉溶液及葡萄糖溶液。水性調配物亦可包括一種或多種保存劑(例如，甲基-、乙基-、或正丙基-對羥基苯甲酸鹽)。當一化合物係僅少量或微溶解於水中時，可添加溶解增強劑或增溶劑，或該溶劑可包括10至60w/w%的丙二醇等。

經控制釋放的經腸道外組成物

經控制釋放的經腸道外組成物可為水性懸浮液、微球粒、微膠囊、磁性微球粒、油性溶液、油性懸浮液、或乳劑之型式。或者，可將活性藥物併入生物可相容的載劑、脂質體、奈米顆粒、植入物、或灌注裝置。

用於製備微球粒及/或微膠囊的材料如生物可降解的/生物可腐蝕的聚合物諸如聚激乳素(polygalactin)、聚-(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(2-羥基乙基-L-麩醯胺)、以及聚(乳酸)。當調配經控制釋放的經腸道外調配物為醣類(例如，右旋糖(dextrant))、蛋白質(例如，白蛋白)、脂蛋白、或抗體，可使用生物可相容的載劑。用於植入物的材料可為非-生物可降解的(例如，聚二甲基矽氧烷)或生物可降解的(例如，聚(己內酯)、聚(乳酸)、聚(羥乙酸)或聚(原酸酯)或其組合)。

口服使用之固體劑型

口服使用之固體劑型包括含有無毒性醫藥上可接受之賦形劑之混合物中的活性成分之錠劑。該調配物對所屬領域中熟習此技藝者為習知的。賦形劑可如：惰性稀釋劑或填料(例如，蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纖維素、澱粉包括馬鈴薯澱粉、碳酸鈣、氯化鈣、乳糖、磷酸鈣、硫酸鈣、或磷酸鈉)；製粒劑及崩散劑(例如，纖維素衍生物包括微晶纖維素、澱粉包括馬鈴薯澱粉、交聯羧甲基纖維素鈉、海藻酸鹽或海藻酸)；黏結劑(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯膠、海藻酸、海藻酸鈉、明膠、澱粉、預糊化澱粉、微晶纖維素、矽酸鋁鎂、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、或聚乙二醇)；及潤滑劑；助流劑；以及抗黏合劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、矽酸、氫化蔬菜油或滑石)。其它醫藥上可接受的賦形4劑可為著色劑、甜味劑、塑化劑、潤濕劑、緩衝劑等。

錠劑可為未經包衣或可經已知的技術加以包衣，視需要地延緩崩散並於胃腸道吸收，藉此提供持續作用超過更長時期。該包衣可為適應於預定模式中釋放活性藥物(例如，為達經控制釋放的調配物)或其可為適應不釋放活性藥物直到通過胃(腸溶衣)之後。該包衣可為糖衣、膜衣(例如，基於羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、甲基羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇及/或聚乙烯吡咯啶酮)、或腸溶衣(例如，甲基於甲基丙烯酸共聚物、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、醋酸羥丙基甲基琥珀酸酯、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、蟲膠及/或乙基纖維素)。再者，可利用時間遲緩材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

固體錠劑組成物可包括包衣適應於保護組成物以避免不需要的化學變化(例如，於活性治療劑物質釋放之前發生化學降解)。可以應用於固體劑型之相似方法進行包衣，如前述Encyclopedia of Pharmaceutical Technology。

可將至少兩種治療劑一起混合成錠劑，或可為經分配的。於一實例中，第一活性抗-腫瘤形成治療劑係包括於該錠劑的內部，以及第二活性治療劑係在外部，因此該第二治療劑的實質部份是於該第一治療劑釋出之前釋放。

口服使用的調配物亦可以下列方式呈現：可咀嚼的錠劑；或以硬明膠膠囊，其中該活性成分係與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯澱粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合；或以軟明膠膠囊，其中該活性成分係與水或油性介質如花生油、液體石蠟、或橄欖油)混合。可使用上述及成分在錠劑及膠囊下以傳統方法使用如混合機、流化床設備或噴霧乾燥裝備來製得粉劑及膠囊。

經 控制釋放的口服劑型

口服用途的經控制釋放的組成物可藉由控制活性物質的溶解及/或擴散而建構成釋放活性抗-腫瘤形成或抗-發炎治療劑。藉由適當包覆化合物之錠劑、膠囊、藥丸或顆粒調配物，或將化合物併入適當基質而可達到經控制釋放溶解或擴散。經控制釋放包覆可包括一種或多種包覆上述及物質及/或如下列者：蟲膠、蜂蠟、糖蠟、蓖麻蠟、卡瑙巴蠟(carnauba wax)、硬酯醇、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕櫚酸甘油酯、乙基纖維素、丙烯酸系樹脂、d1-聚乳糖、醋酸丁酸纖維素、聚氯乙烯、聚乙烯乙酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羥基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝膠、1,3丁二醇、甲基丙烯酸羥乙酯、及/或聚乙二醇。在經控制釋放的基質調配物中，該基質材料亦可包括如：水合甲基纖維素、卡瑙巴蠟及硬酯醇、carbopol 934、聚矽氧、三硬脂酸甘油酯、甲基丙烯酸酯-甲基甲基丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚乙烯及/或鹵化碳氟化合物。

含有一種或多種治療化合物之經控制釋放的組成物亦可為漂浮錠或膠囊(亦即錠劑或膠囊劑，於口服投藥時，於某期間範圍於胃容積之頂部漂浮)之型式。化合物之漂浮錠可藉由粒化含有賦形劑之化合物及20至75w/w%之水膠體(例如，羥乙基纖維素、羥丙基纖維素或羥丙基甲基纖維素)的混合物而製得。然後將所得顆粒壓縮模製成錠劑。當與胃液接觸時，錠劑於它的表面周圍形成實質上水無法滲透的凝膠屏蔽。此凝膠屏蔽參與維持使密度小於1，藉此使得該錠劑能於該胃液中漂浮。

組合治療

視需要地，抗-腫瘤形成或抗-發炎治療劑可與本領域中習知之任合其他標準抗-腫瘤形成或抗-發炎治療劑組合來投予；該方法係所屬領域中熟習此技藝者所周知的，且描述於Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin。若有需要，投予本發明之試劑(例如，JQ1、本文所述式之化合物、及其衍生物)可組合任合傳統抗-腫瘤治療，包括但不限於：手術、輻射治療、或化學治療。於較佳具體實施例中，本發明之化合物係與下列者組合投藥：表現遺傳調控劑或轉錄調控劑(例如，DNA甲基轉移酶抑制劑、組蛋白去乙醯酶抑制劑(HDAC抑制劑)、離胺酸甲基轉移酶抑制劑)、及抗有絲分裂藥物(例如，紫杉醇(taxanes)、長春鹼類(vinca alkaloids))、賀爾蒙受體調控劑(例如，雌激素受體調控劑、雄激素受體調控劑)、細胞訊號路徑抑制劑(例如，酪胺酸激酶抑制劑)、蛋白質穩定性之調控劑(蛋白酶體抑制劑)、hsp90抑制劑、傳統化學治療劑、醣類皮質激素、全反式視黃酸(all-trans retinoic acid)或促進分化之其他試劑。

套組或醫藥系統

本發明組成物可組裝成套組或醫藥系統，以用於改善腫瘤形成或發炎疾病。根據本發明之態樣，套組或醫藥系統包括載劑，即如盒、紙箱、管等，係具有密封侷限，其中一個或多個容器如小瓶、管、安瓿、瓶等。本發明之套組或醫藥系統亦可包括用於使用本發明之試劑的相關說明書。

除非另有指示，否則本發明之實行利用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之傳統技術，其係所屬領域中熟習此技藝者所習知之範圍。該技術係完全例示於下列文獻，例如：‘: A Laboratory Manual",second edition(Sambrook,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984)；"Animal Cell Culture"(Freshney,1987)；"Methods in Enzymology""Handbook of Experimental Immunology"(Weir,1996)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos,1987)："Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,1987)；"PCR：The Polymerase Chain Reaction",(Mullis,1994)；"Current Protocols in Immunology"(Coligan,1991)。這些技術可應用於製備本發明之多核苷酸及多肽，且因而可據以製備及實施本發明。用於特定具體實施例之特定有用技術將於下文部份中討論。

下文係提出實施例，以使本領域中具有通常知識者對應如何製備及使用本發明之檢驗、篩選及治療方法以及本發明之治療方法之完全揭露及描述，且此等實施例不欲意用於限制本案發明人僅代本發明之範疇。

實施例

除非另有指示，否則本發明之實行利用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之傳統技術，其係所屬領域中熟習此技藝者所習知之範圍。該技術係完全例示於下列文獻，例如：Molecular Cloning: A Laboratory Manual",second edition(Sambrook,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984)；"Animal Cell Culture"(Freshney,1987)；"Methods in Enzymology""Handbook of Experimental Immunology"(Weir,1996)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos,1987)："Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,l987)；"PCR：The Polymerase Chain Reaction",(Mullis,1994)；"Current Protocols in Immunology"(Coligan,1991)。這些技術可應用於製備本發明之多核苷酸及多肽，且因而可據以製備及實施本發明。用於特定具體實施例之特定有用技術將於下文部份中討論。

下文係提出實施例，以使本領域中具有通常知識者對應如何製備及使用本發明之檢驗、篩選及治療方法以及本發明之治療方法之完全揭露及描述，且此等實施例不欲意用於限制本案發明人僅代本發明之範疇。

I.　化學實施例-合成及製法

本發明化合物可利用本文敘述之方法，及/或慮及本文之說明，根據一般熟習此項技藝者已知之方法予以合成。

反應圖式S1.　消旋性溴功能部位抑制劑(±)-JQ1之合成

(2-胺基-4,5-二甲基噻吩-3-基)(4-氯苯基)甲酮(S2)根據上文所示反應圖式製備化合物JQ1。

於23℃下，添加呈固體之硫(220 mg，6.9 mmol，1.00 equiv)至4-氯苯甲醯乙腈S1(1.24 g，6.9 mmol，1 equiv)、2-丁酮(0.62 ml，6.9 mmol，1.00 equiv)及嗎啉(0.60 ml，6.9 mmol，1.00 equiv)之乙醇(20 ml，0.35 M)溶液中；接著加熱此混合物至70℃。12小時後，冷卻反應混合物至23℃²¹，將其傾入至鹽水(100 ml)中。以乙酸乙酯(3×50 ml)萃取水層。合併之有機層以鹽水(50 ml)洗滌，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。殘留物以急驟管柱層析法純化(CombiflashRF系統，40克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷類)，得到呈黃色固體之S2(1.28 g，70%)。

3-({[(9H-薄-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-4-{[3-(4-氯苯甲醯基)-4,5-二甲基噻吩-2-基]胺基}-4-酮基丁酸(S)-第三丁酯(S3)

相繼添加六氟磷酸(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲銨(HCTU)(827 mg，2.0 mmol，2.00 equiv)及N,N-二異丙基乙胺(0.72 ml，4.0 mmol，4.00 equiv)至9-薄基甲氧羰基-天冬胺酸β-第三丁酯[Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH](864 mg，2.1 mmol，2.10 equiv)之N,N-二甲基甲醯胺(1.5 ml，1.0 M)溶液中。然後於23℃攪拌此混合物5分鐘。接著添加呈固體之S2(266 mg，1.0 mmol，1 equiv)。於23℃攪拌此反應混合物；16小時後，添加乙酸乙酯(20 ml)及鹽水(20 ml)。分離兩層，水層以乙酸乙酯(2×20 ml)萃取。合併之有機層以鹽水(30 ml)洗滌，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash RF，40克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷類)，得到呈褐色油之S3(625 mg，90%)。

3-胺基-4-((3-(4-氯苯甲醯基)-4,5-二甲基噻吩-2-基)胺基)-4-酮基丁酸(S)-第三丁酯(S4)

於23℃下，使化合物S3(560 mg，0.85 mmol，1 equiv)溶於20%哌啶之DMF(4.0 ml，0.22 M)溶液中。30分鐘後，於反應混合物中添加乙酸乙酯(20 ml)及鹽水(20 ml)。分離兩層，水層以乙酸乙酯(2×20 ml)萃取。合併之有機層以鹽水(3×25 ml)洗滌，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash RF系統，24克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷類)，得到呈黃色固體之游離胺S4(370 mg，90%)。鏡像異構純度下落至75%(使用AS-H管柱，以Berger超臨界流體層析法(SFC)測定)。

2-(5-(4-氯苯基)-6,7-二甲基-2-酮基-2,3-二氫-1H-噻吩并[2,3-e][1,4]二氮呯-3-基)乙酸(S)-第三丁酯(S5)

使胺酮(S4)(280 mg，0.63 mmol)溶於10%乙酸之乙醇溶液(21 ml，0.03 M)中；加熱此反應混合物至85℃。30分鐘後，減壓去除所有溶劑。殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash RF系統，12克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷類)，得到呈白色固體之化合物S5(241 mg，95%)。S5之鏡像異構純度為67%(使用AS-H管柱，以Berger超臨界流體層析法(SFC)測定)。

2-(5-(4-氯苯基)-6,7-二甲基-2-硫酮基-2,3-二氫-1H-噻吩并[2,3-e][1,4]二氮呯-3-基)乙酸第三丁酯(S6)

相繼添加五硫化磷(222 mg，1.0 mmol，2.00 equiv)、碳酸氫鈉(168 mg，2.0 mmol，4.00 equiv)至S5(210 mg，0.5 mmol，1 equiv)之二乙二醇二甲醚(1.25 ml，0.4M)溶液中；加熱反應混合物至90℃。16小時後，添加鹽水(20 ml)及乙酸乙酯(35 ml)。分離兩層，水層以乙酸乙酯(3×30 ml)萃取。合併之有機層以鹽水(2×15 ml)洗滌，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash RF系統，24克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷類)，得到呈褐色固體之S6(141 mg，65%)以及回收之S5(73 mg，34%)。

2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮呯-6-基)乙酸第三丁酯[(±)JQ1]

於0℃下，添加肼(0.015 ml，0.45 mmol，1.25 equiv)至S6(158 mg，0.36 mmol，1 equiv)之THF(2.6 ml，0.14 M)溶液中。使反應混合物加溫至23℃，於23℃攪拌1小時。減壓去除所有溶劑。所得肼不需純化直接使用。接著使肼溶於原乙酸三甲酯及甲苯之2:3混合物(6 ml,0.06 M)中；加熱此反應混合物至120℃。2小時後，減壓去除所有溶劑。殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash系統，4克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯己烷類)，得到呈白色固體之JQ1(2個步驟140 mg，85%)。反應條件進一步使立體異構中心差向異構化，產生消旋物JQ1(使用AS-H管柱，以Berger超臨界流體層析法(SFC)測定)。

反應圖式S2.　鏡像異構性富集之(+)-JQ1之合成

3-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-4-{[3-(4-氯苯甲醯基)-4,5-二甲基噻吩-2-基]胺基}-4-酮基丁酸(S)-第三丁酯(S3)

相繼添加(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶鏻(PyBOP)(494 mg，0.95 mmol，0.95 equiv)、N,N-二異丙基乙胺(0.50 ml，2.8 mmol，2.75 equiv)至9-茀基甲氧羰基-天冬胺酸β-第三丁酯[Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH](411 mg，1.00mmol，1.0 equiv)之N,N-二甲基甲醯胺(1.0 ml，1.0 M)溶液中；接著於23℃攪拌此混合物5分鐘。然後添加呈固體之S2(266 mg，1.0 mmol，1 equiv)；於23℃攪拌此反應混合物。4小時後，添加乙酸乙酯(20 ml)及鹽水(20 ml)。分離兩層，水層以乙酸乙酯(2×20 ml)萃取。合併之有機層以鹽水洗滌，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash RF系統，40克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷類)，得到呈褐色油之S3(452 mg，72%)。

3-胺基-4-((3-(4-氯苯甲醯基)-4,5-二甲基噻吩-2-基)胺基)-4-酮基丁酸(S)-第三丁酯(S4)

於23℃下，使化合物S3(310 mg，0.47 mmol，1 equiv)溶於20%哌啶之DMF溶液(2.2 ml，0.22 M)中；30分鐘後，於反應混合物中添加乙酸乙酯(20 ml)及鹽水(20 ml)。分離兩層，水層以乙酸乙酯(2×20 ml)萃取。合併之有機層以鹽水(3×25 ml)洗滌，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash RF系統，24克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷)，得到呈黃色固體之游離胺S4(184 mg，90%)；鏡像異構純度91%(使用AS-H管柱，以Berger超臨界流體層析法(SFC)測定)。

2-(5-(4-氯苯基)-6,7-二甲基-2-酮基-2,3-二氫-1H-噻吩并[2,3-e][1,4]二氮呯-3-基)乙酸(S)-第三丁酯(S5)

使胺酮(S4)(184 mg，0.42 mmol)溶於甲苯(10 ml，0.04 M)中，添加矽膠(300 mg)，加熱此反應混合物至90℃。3小時後，冷卻反應混合物至23℃，濾出矽膠，以乙酸乙酯洗滌，濃縮合併之濾液。殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash RF系統，12克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷類)，得到呈白色固體之化合物S5(168 mg，95%)。S5之鏡像異構純度為90%(使用AS-H管柱，以Berger超臨界流體層析法(SFC)測定)。

2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮呯-6-5 yl)乙酸(S)-第三丁酯[(+)JQ1]

於-78℃下，添加第三丁醇鉀(於THF中之1.0 M溶液，0.3 ml，0.30 mmol，1.10 equil)至S5(114 mg，0.27 mmol，1 equiv)之THF(1.8 ml，0.15 M)溶液中。加溫此反應混合物至-10℃，於23℃攪拌30分鐘；冷卻反應混合物至-78℃。添加氯磷酸二乙酯(0.047 ml,0.32 mmol，1.20 equiv)至反應混合物²²中；所得混合物以45分鐘加溫至-10℃。添加乙醯肼(30 mg，0.40 mmol，1.50 equiv)至反應混合物中，於23℃攪拌此反應混合物。1小時後，添加1-丁醇(2.25 ml)於反應混合物，將其加熱至90℃。1小時後，減壓去除所有溶劑，殘留物以急驟管柱層析法純化(Combiflash系統，4克矽膠，梯度0至100%乙酸乙酯-己烷類)，得到呈白色固體之(+)-JQ1(114 mg，92%)，鏡像異構純度90%(使用AS-H管柱，以Berger超臨界流體層析法(SFC)測定，85%己烷類-甲醇，210 nm，t_R(R-鏡像異構物)=1.59 min，t_R(S-鏡像異構物)=3.67 min)。此產物以掌性製備性HPLC進一步純化(使用OD-H管柱，以Agilent高壓液相層析法(SFC)測定)，得到大於99%ee之S-鏡像異構物。

¹H NMR(600 MHz,CDCl₃,25℃)δ7.39(d,J=8.4 Hz,2H),7.31(d,J=8.4 Hz,2H),4.54(t,J=6.6 MHz,1H),3.54-3.52(m,2H),2.66(s,3H),2.39(s,3H),1.67(s,3H),1.48(s,9H)。

¹³C NMR(150 MHz,CDCl3,25℃)δ171.0,163.8,155.7,150.0,136.9,131.1,130.9,130.6,130.3,128.9,81.2,54.1,38.1,28.4,14.6,13.5,12.1。

HRMS(ESI)C₂₁H₂₄ClN₂O₃S之計算值[M+H]+：457.1460，實測值457.1451 m/z。

TLC(EtOAc)，Rf：0.32(UV)

[α]²² _D=+75(c 0.5，CHCl₃)

以類似方式合成(-)-JQ1，使用Fmoc-D-Asp(Ot-Bu)-OH作為起始物質，進一步以掌性製備性HPLC純化(使用OD-H管柱之Agilent高壓液相層析法)，得到大於99%ee之R-鏡像異構物。[α]²² _D=-72(c 0.5，CHCl₃)

其他化合物之合成

如反應圖式S3所闡明，製備本發明其他化合物。

反應圖式S3.　肼衍生物之合成

如反應圖式S3所示，(+)-JQ1(1)之第三丁酯裂解，得到游離酸(2)，其與肼耦合，得到醯肼(3)；再與4-羥苯甲醛反應得到腙(4)。

醯肼(3)以及腙(4)於至少一種生物分析中展現活性。

利用醯肼(3)及各種含羰基化合物之反應，製備化合物庫(見上文表A)。

製備其他化合物以供，例如，作為分析開發之探針用。一合成實例示於下文反應圖式S4。

反應圖式S4.　作為探針用之衍生物之合成

製備如下文表B所示之其他化合物：

各化合物之光譜數據與指定之結構式相符合。

II.　生物活性 實施例1：JQ1

第1圖係顯示JQ1鏡像異構物。

實施例2：JQ1置換得自細胞中核染色質之BRD4

欲確定於核環境中JQ1是否與染色質競爭結合溴功能部位，乃針對BRD4進行光漂白後之螢光回復(FRAP)實驗。先前之研究已證明於核染色質²⁷離散區域之選擇性光漂白後，FRAP於評估含溴功能部位螢光嵌合體橫向再分配進度之效用。以GFP-BRD4轉染之人類骨肉瘤細胞(U2OS)展現隨時間變化之螢光強度回復(第2A及2B圖)。於JQ1(50 0nM)存在下，觀察到之回復與經置換之核BRD4接近一致(第3A及3B圖)。細胞FRAP研究證實，BRD4移動區分之效應受限於具生物化學活性之(+)-JQ1立體異構物(第2A-2C圖)。

於同源及細胞系分析中證明具效力、選擇性結合於BRD4後，乃評估JQ1對與疾病相關、BRD4依賴性細胞表現型之影響。於NMC中，由t(15;19)易位產生之病原性BRD4-NUT融合蛋白渴望結合於乙醯基化染色質離散之集中點，賦予增殖優勢及分化區塊。使用FRAP，評估JQ1直接靶向BRD4-NUT癌蛋白之能力。相較於賦形劑對照組，JQ1(500 nM)明顯加速以GFP-BRD4-NUT轉染的細胞光漂白區域中之螢光強度回復時間(第3C、3E圖)。重要的是，未觀察到對GFP-NUT再分配之影響(第3D、3E圖)。總而言之，彼等數據與培養細胞中JQ1競爭結合於BRD4一致。

實施例5：JQ1誘導BRD4依賴性癌之鱗狀分化及生長停滯

直接抑制由復發、致癌基因易位表現之基因產物係經證實之癌症治療方法^28,29。針對化學抑制BRD4依賴性NUT中線癌上BET家族溴功能部位之表現型結果進行探討。BRD4-NUT染色質定位係機械性地連接於融合蛋白17中BRD4之保存串聯溴功能部位。NMC之典型特徵為利用NUT-導向免疫組織化學(IHC)³⁰時，BRD4-NUT癌蛋白之離散核斑點外觀。以JQ1(500 nM)處理得自病患之797 NMC細胞株48小時，核灶被抹去，產生擴散之被IHC染色之核NUT(第3f圖)。

於NMC細胞株¹⁷中，BRD4-NUT被擊倒時，觀察到顯著之分化表現型。JQ1產生對等、隨劑量及時間變化之分化表現型，於NMC 797及Per403細胞中，其特徵為細胞延伸且平坦，敞開之染色質及紡錘體形態(第3g圖及第4A、4B、4C圖)。分化迅速(<24小時)及特徵為細胞f5c顯著增強表現，係鱗狀分化之標誌(第3H圖)。以微莫耳濃度以下之低劑量暴露於JQ1培養7天後，觀察到終端分化。重要的是，非BRD4依賴性鱗狀癌細胞株(TE10及TT)未展現JQ1之分化效果(第4A、4B、4C圖)。於BRD4依賴性NMC細胞中，分化如預期地伴隨生長停滯，由Ki67染色減少得到證明(第3i、j及4L-a、4L-b圖)。準確作用機制之進一步支撐為，分化及生長停滯表現型僅由(+)-JQ1引起，而(-)-JQ1則未顯示可觀測之效應(第4E-a-4E-d圖)。

值得注意的是，JQ1治療表現型模擬形態變化及利用RNA干擾技術之BRD4-NUT靜默觀察到角蛋白表現增加(第4F-a、b圖)。為了確證彼等形態學及IHC研究，利用RT-PCR之三典型鱗狀組織基因之表現分析，鑑定出於NMC 797細胞中，角蛋白-14被(+)-JQ1顯著(30倍)誘導(第3i圖)。適度誘導角蛋白-10及對表皮轉穀胺醯胺酶(TGM1)缺乏影響與漸進分化為胸廓鱗狀上皮相符合，與NMC 797細胞得自縱隔膜原發性腫瘤²⁸相符合。如定量IHC分析所測定，利用IHC之以濃(3+)角蛋白染色之分化誘導係於72小時期間逐漸進行(第4M圖)。準確作用機制之支撐為，分化表現型僅由(+)-JQ1引起，而(-)-JQ1則未顯示可觀測之效應。重要的是，非BRD4依賴性鱗狀癌細胞株(TE10)未展現得自JQ1治療之分化效果(第4N-c圖)。於BRD4依賴性NMC細胞中，分化如預期地伴隨生長停滯，由Ki67染色減少得到證明(第4A-4G圖)。

接著評估JQ1鏡像異構物於BRD4依賴性(797及Per403)及BRD4無關(TE10及TT)人類鱗狀癌細胞株中之抗增殖活性。如第5a圖及第4F-a-c圖所示，(+)-JQ1只於BRD4依賴性細胞株中獨特地展現劑量依賴性之抑制細胞生長(797 IC50=140 nM；Per403 IC50=60 nM)。利用IHC所觀測之強力抗增殖效應及不可逆之分化暗示誘導細胞死亡。因此，利用流式細胞儀，以膜聯蛋白(annexin)-V及碘化丙錠染色評估早期及晚期細胞凋亡。如預期地，於BRD4依賴性人類癌細胞中，JQ1誘導立即及漸進之細胞凋亡，惟於未攜帶BRD-NUT融合之細胞株中，於所用濃度下，未檢測到顯著量之細胞凋亡細胞(第5b圖及第7圖)。

實施例6：JQ1於NMC鼠類模式中之活體內效力及藥力學效應

欲確定JQ1是否可於活體內呈單一製劑減弱BRD4依賴性癌症之生長，乃使用NMC 797細胞株於小鼠中形成NMC之異種移植模式。使用PET顯像作為主要終點進行短期治療研究，隨後進行非侵入性顯像，以探討是否可證明JQ1之抗腫瘤活性。使具有可預見疾病之已確立且可相較負擔之匹配小鼠群隨機化以使用JQ1(50 mg kg^-1)或賦形劑治療，每天經由腹膜內注射進行投與。隨機化之前及治療四天後，利用PET顯像評估小鼠。以JQ1治療觀察到明顯之FDG攝取反應，而以賦形劑治療之動物顯示明顯、漸進之疾病(第5e圖)。

同時，針對罹患NMC 797腫瘤之匹配小鼠群，利用卡鉗測量及利用定量IHC之藥力學效應，研究JQ1對腫瘤體積之影響。於治療第14天，NMC 797異種移植之侵略性生長促使研究終止，於此之前所有賦形劑處理動物已接近體制腫瘤大小極限。接受JQ1動物展現統計學上顯著之腫瘤生長減少(第5c圖，p=0.039；雙尾t-試驗)。欲獲得比較性機械學及藥力學數據，乃使所有動物犧牲，移出腫瘤供組織病理學分析。值得注意的是，於此劑量及療程下，JQ1耐受性良好，無毒性或明顯減重之不利徵兆(第5d、5L圖)。

為了證實以JQ1治療所觀測之抗腫瘤效應與標靶銜接(target engagement)相關，乃檢驗切片腫瘤組織之BRD4-NUT癌蛋白。如第5e圖及第6A圖所呈現，JQ1治療導使抹去NUT核斑點，與競爭結合於核染色質相符合。細胞延伸及角蛋白表現增加，證實藥力學之鱗狀分化。經治療之動物Ki67之核染色減少，TUNEL染色增加，證實抗增殖、細胞凋亡效正在進行。總之，彼等數據提供活體內BRD4抑制作用及JQ1治療反應之間於機械學上之關連。

為了致力於以不偏頗的方式記述腫瘤角蛋白表現之藥力學(PD)生物標記，乃建立定量IHC圖像獲取及分析之實驗流程。製備得自治療及未治療動物之成對試樣，使用標準化實驗流程及市售可得軟體進行分析(ImageScope；Aperio Technologies)。JQ1於NMC 797異種移植中，均勻地於切除之腫瘤樣本內，引起強大之(3+)角蛋白表現(第6Ba-e圖)。

與彼等研究並行地，查出一罹患從縱隔膜產生廣泛性轉移之BRD4-NUT陽性NMC之29年歲病患。於開發更臨床相關疾病模式之目標下，乃使用從病患緩和式胸管引流之胸膜積液得到之臨床廢料建立短期培養物。如第8圖所呈現，試管內研究證實(+)-JQ1對細胞活力(IC50=4 nM)、生長及細胞週期進展之立體選擇、強力影響。移植得自病患的腫瘤材料之四隻動物形成可預見之疾病，為強烈PET陽性(第5h圖)。隨機化分配動物成為賦形劑或(+)-JQ1治療群。治療分配之前及治療四天後，利用PET顯像評估小鼠。以(+)-JQ1治療觀察到明顯之FDG攝取反應，而以賦形劑治療之動物顯示明顯、漸進之疾病(第5i圖)。再次，製備腫瘤材料供定量IHC分析用，證明(+)-JQ1治療後誘導角蛋白表現(第5j、k圖、第9圖)。總之，彼等數據提供活體內BRD4抑制作用及JQ1治療反應之間於機械學上之關連。

於癌症基因體之新興、複雜變異之景觀下，一再發生之染色體重排構成癌症中清晰、基因標靶之引人注目之子集。由成功開發出CML中靶向BCR-ABL激酶抑制劑得證，可利用之充分特性化探針化合物^31,32、高解析度結晶學數據³³、轉譯研究調查³⁴、及提供資訊之鼠類模式³⁵將為配位體之發現及標靶確認提供最佳平台。如本文所記述，新穎之BRD4-導向小分子抑制劑很可能用於治療與NUT-BRD4融合相關之基因學上界定之人類鱗狀癌。

除了NUT中線癌外，BET家族溴功能部位亦促成許多其他腫瘤及非腫瘤疾病。BRD4引導P-TEFb複合物至有絲分裂染色體，造成生長促進基因如c-Myc¹¹⁹及已被確認之癌症標靶Aurora B¹³之表現。此外，BRD4於乳癌中被擴增³⁶，為乳癌病患存活之預測指標³⁷。除了於癌症生物學中之彼等功能外，BET家族成員已被確認係用於複製病毒^38,39及傳介炎性反應¹⁴之必要基因。因此，為成對化學探針之(+)-JQ1及(-)-JQ1之可利用性將於轉錄、發育及疾病生物學上寬廣地激起增進資訊之研究。亦發現JQ1對細胞受體展現一些偏離目標效應及極佳之藥物動力學性質(包括49%口服生物利用率)(第10圖)，建立開發治療應用之似藥物衍生物之可信性。

表觀遺傳標靶之小分子抑制劑之發現及最適化為當前生物醫學研究之主要焦點。迄今成功之方法僅限於鑑定出染色質修飾酵素之配位體⁴⁰。被研究最多者或許為離胺酸側鏈去乙醯作用之調節劑，為此臨床上已開發許多醫藥抑利劑。本發明提供用於形成表觀遺傳讀碼(readers)之強力、選擇性抑制劑之組成物及方法，包括第一個、徹底被表徵之BET家族溴功能部位之抑制劑。鑑於此項發現，本文概述之方法可鑑定用於識別BET家族內具有選擇性的其他抑制劑之其他候選物。

實施例7：JQ1鏡像異構物結合及抑制BRD4.1及BRD4.2

第11及12圖係顯示JQ1鏡像異構物結合及抑制BRD4.1及BRD4.2。第13圖係顯示JQ1S結合及抑制BET家族成員(活性)與CBP(非活性)之比較。第14圖顯示JQ1衍生物焦點庫(化合物結構式見上文表B)劑量範圍研究結果。

實施例8：JQ1治療BRD3-NUT癌症有效

小鼠皮下植入BRD3-NUT細胞。每週一次收集腫瘤測量數據。當腫瘤可觸知時，將小鼠分成兩個治療組別(n=10)：每週7天腹膜內(IP)投與50mg/kg JQ1及每週7天IP投與賦形劑。注射後第24天，使得自各組之五隻小鼠安樂死，收集腫瘤試樣供實驗室分析用。於研究之全部剩餘期間，小鼠犧牲時即收集腫瘤試樣。所有試樣中，一半腫瘤固定於10%福馬林中，另一半於乾冰上急速冷凍。於第32天治療終止。每週收集腫瘤體積及重量至所有小鼠垂死或者腫瘤任一尺寸達2cm為止。第15A圖顯示於鼠類異種移植模式中，JQ1展現對抗BRD3-NUT之活體內效力之圖形。以JQ1治療導使腫瘤於治療期間消退；治療中斷後，腫瘤恢復生長。於所有時間點，腫瘤體積差異均具顯著性(於第24天，p=7.65274E-09)；JQ1投與劑量為50 mg/kg。第15B圖顯示以JQ1治療小鼠展現溫和之重量減少，惟於治療中斷後則迅速回復。

實施例9：JQ1及其類似物對多種癌症具效力

第16A-16D圖顯示於5μM JQ1下，JQ1及其衍生物抑制Brd4.1及Brd4.2結合作用(化合物結構式見上文表A)。第17A-17D圖顯示於2μM化合物濃度下，以JQ1及其衍生物治療後之NUT中線癌(NMC)細胞活力(化合物結構式見上文表A)。第18-55圖顯示對各種癌症細胞株之劑量反應效力。彼等數據指示，JQ1及其衍生物對寬廣範圍之症狀具抗癌效力。

本文記述之結果係使用下述方法及材料獲得。

實施例10：結合分析結果

結合分析結果示於下文表C。

表C：生物分析IC ₅₀ 及細胞分析IC ₅₀

先導化合物及BRD4部位1之結合活性係利用具12個點劑量反應曲線之α-分析進行測定(第56A圖)。使用化合物(S)-JQ1(JQS)作為正對照組；使用(R)-JQ1(JQR)作為負對照組。化合物JQ6、JQ8、JQ13、JQ33及JQ35展現極佳之結合活性。所有先導化合物及BRD4部位2之結合活性結果亦係利用具12個點劑量反應曲線之α-分析進行測定(第56B圖)。化合物JQ6、JQ8、JQ13、JQ33及JQ35展現極佳之結合活性。

於細胞分析中，以797細胞株(衍生自病患)檢測先導化合物之活性，以測定BRD4抑制作用對BRD4-NUT依賴性細胞株之生長影響。使細胞及化合物一起培育，72小時後監測增殖。利用邏輯迴歸法計算曲線擬合(第56C圖)。所有先導化合物均於細胞-分析中以直接衍生自病患之10326細胞株進行檢測，以測定BRD4抑制作用對BRD4-NUT依賴性細胞株之生長影響(第56D圖)。使細胞及化合物一起培育，72小時後監測增殖。利用邏輯迴歸法計算曲線擬合。

試劑

內源BRD4-NUT表現中線癌細胞株，7971及PER-4032，先前已敘述。非NMC人類鱗狀癌細胞株TE10及TT得自Drs. Anil Rustgi(University of Pennsylvania)及Adam Bass(Dana-Farber Cancer Institute)。U20S細胞得自ATCC。用於GFP-BRD4、GFP-NUT及GFP-BRD4-NUT之哺乳類大量表現建構體先前已敘述³。組織培養用培養基、胰蛋白酶、及抗生素均購自Mediatech。用於免疫組織化學之抗體及染色劑及流式細胞儀得自Dako(細胞角蛋白AE1/AE3抗體Cat#N1590)、Millipore(TUNEL Cat# S7100)、Vector(Ki67 Cat# VP-RM04)、Cell Signaling Technologies(NUT Cat# 3625)、BD Pharmingen(膜聯蛋白V-FITC Cat# 556547)及Invitrogen(碘化丙錠Cat#P3566)。

乙醯基-組蛋白結合分析

如先前敘述進行分析⁸，惟將廠商(PerkinElmer，USA)實驗流程稍作修改。所有試劑均於補充0.05% CHAPS之50 mM HEPES、100 mM NaCl、0.1% BSA(pH 7.4)中稀釋，於添加至培養盤之前，令其平衡至室溫。製備濃度範圍為150-0μM之配位體之24個點1:2系列稀釋液，取4μl移入低容積384槽盤(ProxiPlateTM-384 Plus，PerkinElmer，USA)中，隨後添加4μl HIS-標記蛋白(BRD4/1，250 nM，BRD4/2及CREBBP，2000 nM)。密封槽盤，於室溫培育30分鐘，然後添加與該蛋白質等莫耳濃度之4μl生物素肽[BRD4(1)& BRD4(2)之胜肽：H4K5acK8acK12acK16ac，H-SGRGK(Ac)GGK(Ac)GLGK(Ac)GGAK(Ac)RHRK(生物素)-OH；CREBBP之胜肽：H3K36ac，生物素-KSAPATGGVK(Ac)KPHRYRPGT-OH(Cambridge Research Biochemicals,UK)]。密封槽盤，再培育30分鐘，然後於低光照條件下，添加4μl塗覆鏈黴抗生物素之供體珠粒(25μg/ml)及4μl鎳螫合物受體珠粒(25μg/ml)。以鋁箔密封槽盤防止光照，於室溫培育60分鐘，使用AlphaScreen 680激發/570發射濾光片組，於PHERAstar FS盤讀取器(BMG Labtech,Germany)上讀取數據。針對對應之DMSO對照組予以標準化後，於Prism 5(GraphPad Software，USA)中計算IC₅₀值，作為化合物於20μl反應容積中之最終濃度。

序列比對

全長人類溴功能部位之胺基酸序列得自NCBI(BRD2 Acession No. NP_005095、BRD3 Acession No. NP_031397.1、BRD4 Acession No. NP_055114.1、BRD-T Acession No.NP_001717.2)。使用ClustalW¹⁹進行個別溴功能部位之多序列比對。

光漂白後之螢光回復(FRAP)

如先前敘述^3,20，針對U20S細胞進行FRAP研究。簡言之，以編碼帶有BRD4、NUT及BRD4-NUT之GFP嵌合體之哺乳類大量表現建構體轉染U20S細胞(Lipofectamine；Invitrogen)。於一細胞之各視野內，以高強度雷射漂白5μm²核區域，並以低強度雷射及150μm針孔進行回復測量。使用配備37℃加熱腔及FRAP組件之Nikon C1 Plus共焦顯微鏡，以90秒獲取相同視野之影像。使用MetaMorph v7測量漂白區域之經時平均強度，並標準化為漂白前所關注之無關區域；然後於Microsoft Excel Mac 12.2.4中分析數據以評估回復一半最大螢光之時間。

分化及增殖免疫組織化學

以每腔室1.0×10⁴個細胞(4-腔室玻片)或每腔室5.0×10³個細胞(8-腔室玻片)之濃度，使培養之癌細胞株(797、Per403、TT及TE10)於腔室玻片上生長。以JQ1-消旋體、(+)-JQ1、(-)-JQ1、或賦形劑(DMSO)處理細胞，並培育不同時間。然後移出培養基，以冷PBS洗滌腔室。接著於4 ^o C下，使細胞固定於4%甲醛中20分鐘，以PBS洗滌，並轉移至Brigham and Women’s Hospital之Dana-Farber/Harvard Cancer Center(DF/HCC) Specialized Histopathology Services Core，以進行如下文敘述之染色。細胞沉澱物之進行免疫組織化學研究係先使癌細胞株(797及Per403)於T-75燒瓶中生長，以JQ1或賦形劑(DMSO)處理48小時；然後以胰蛋白酶分解細胞，於2,000 rpm離心10分鐘，形成細胞沉澱物，以容積HistoGel(Richard-Allen Scientific)及10%牛血清白蛋白使其穩定。細胞沉澱物以PBS洗滌，4℃下，於4%甲醛中固定20分鐘。接著以PBS洗滌細胞，並轉移至Brigham and Women’s Hospital之DF/HCC Core Laboratory，以進行如下文敘述之染色。Ki67染色之定量分析(細胞記分)係利用光學顯微鏡進行，每一實驗使用五個高倍率(40x)視野。由Brigham and Women’s Hospital之DF/HCC Core Laboratory使用已確立之最適化實驗流程，將所有經固定之材料包埋、切片及染色；使用Olympus BX40顯微鏡(Olympus Imaging America,Center Valley,PA)及Micropublisher 3.3 RTV彩色照相機(QImaging,Surrey,BC)獲取影像。

細胞增殖分析

以總容積50μL培養基中每槽500個細胞之量，將細胞接種於白色、384槽微量測試盤(Nunc)中。797、TT及TE10細胞生長於含1%青黴素/鏈黴素及10%FBS之DMEM中；Per403細胞生長於含1%青黴素/鏈黴素及20%FBS之DMEM中。利用自動針轉移法(PerkinElmer JANUS，配備V&P Scientific 100 nL針器械)，將化合物遞送至微量分析盤。於37℃培育48小時後，使細胞溶解，使用市售增殖分析法(CellTiterGlo；Promega)評估諸槽之總ATP含量。針對劑量重複測定進行分析，利用邏輯迴歸法(GraphPad Prism)計算IC₅₀估計值。

流 式細胞儀

以每槽5.0×10⁴個細胞之起始濃度，使培養之人類癌細胞(797、Per403、TT及TE10)於6槽組織培養盤(BD Falcon)中生長。以JQ1(500 nM)、星形孢菌素(50 nM)或賦形劑(DMSO 0.05%)處理細胞24或48小時。於冰上使經BD胰蛋白酶分解之細胞以1:1及含膜聯蛋白V-FITC(Pharmingen，1:500)及碘化丙錠(Invitrogen，1:1000)之膜聯蛋白-V/碘化丙錠緩衝液(10 mM HEPES pH 7.4、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl₂)混合；立即於BD FACS Canto II上分析試樣。使用FlowJo流式細胞儀分析軟體(Tree Star，Inc.)產生細胞凋亡區分之視覺化及分析。

異種移植效力研究

藉由注射於30% Matrigel(BD Biosciences)中之797 NMC細胞(10⁷)至6週齡雌性NCr裸鼠(Charles River Laboratories)脅腹內，建立NMC異種移植。注射12天後，將具有可測量腫瘤之小鼠分成以50 mg/kg JQ1 IP或賦形劑(5%DMSO之5%葡萄糖溶液)治療之群組。開始治療時，JQ1治療組(n=8)及賦形劑組(n=7)之腫瘤平均大小相似(分別為63.8+/-17.1及73.6+/-14.4 mm³)。每天密切注意動物臨床症狀。利用卡鉗測量法評估腫瘤大小，以公式Vol=0.5xLxW²計算體積。治療2週後，使所有小鼠人道安樂死，腫瘤固定於10%福馬林中供組織病理學檢測。利用雙側學生氏(Students)t-試驗計算腫瘤體積於統計學上之顯著性。所有動物研究均受DFCI之實驗動物管理及使用委員會(IACUC)認可。

儀器使用

以Harvard Medical School East Quad NMR Facility之Varian反向探針600 INOVA光譜儀記錄質子及碳-13核磁共振(¹H NMR及¹³C NMR)光譜。化學位移以有關δ級之百萬分之一記述，分別係，關於¹H NMR，涉及NMR溶劑中之殘留氕(CHCl₃：δ7.24)，關於¹³C NMR，涉及溶劑之碳共振(CDCl₃：δ77.2)。數據記述如下：化學位移[多峰性(s=單峰，d=雙峰，t=三重峰，q=四重峰，m=多重峰，br=寬峰)，單位為Hertz之偶合常數，整合]。高解析質譜(HRMS)使用Instrumentation Facility of the Department of Chemistry,Massachusetts Institute of Technology之電噴灑離子源(ESI)，於Bruker APEX 4.7 Tesler FTMS光譜儀上記錄。中間體及終產物以Combiflash RF系統(Teledyne Isco)純化。有機溶液於Bchi R-205旋轉蒸發器上濃縮。鏡像異構物純度使用Berger超臨界流體層析法(SFC)及AS-H管柱進行檢驗。鏡像異構物使用Agilent高壓液相層析法及OD-H管柱(Broad Institute of Harvard and MIT)進行。

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其他具體實例

從前述說明顯見，可對本文敘述之本發明進行變化及修飾使其順應各種用途及情況；此等具體實例亦隸屬下述專利申請之範圍內。

本文變數之任何界定中元件列表之詳述包括呈任何單一元件或所列舉元件之組合(或次組合)之該變數之界定。本文中具體實例之詳述包括呈任何單一具體實例或與任何其他具體實例或其部分組合之該具體實例。

本申請案與下述美國臨時專利申請案相關：2010年5月14日提出申請之序號61/334,991、2010年8月4日提出申請之序號61/370,745；及2010年8月22日提出申請之序號61/375,863。彼等申請案各者之全部內容均併入本文以資參考。

在此併入本說明書中所提及之所有專利及公開作為參照，猶如各個獨立的專利及公開被特定和個別地指示作為參照而併入。

<110> 達納-法柏癌症學院有限公司(DANA-PARBER CANCER INSTITUTE.INC.)

<120> 治療腫瘤形成、發炎疾病及其他病症之組成物及方法

<130> 86363WO(70157)

<140> PCT/US2011/036701

<141> 2011-05-16

<150> 61/467,376

<151> 2011-03-24

<150> 61/375,863

<151> 2010-08-22

<150> 61/370,745

<151> 2010-08-04

<150> 61/334,991

<151> 2010-05-14

<160> 6

<170> PatentIn vgrsion 3.5

<210> 1

<211> 801

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 726

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 722

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 947

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Lys(Ac)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Lys(Ac)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Lys(Ac)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> Lys(Ac)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> Lys(Biotin)-OH

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Biotin-Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Lys(AC)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Thr-OH

<400> 6

第1圖係顯示兩種JQ1立體異構物的結構。以星號(＊)標示的C6位置為立體中心。

第2A、2B及2C圖係顯示於細胞中(-)-JQ1對掌異構物沒有競爭結合至BRD4-NUT的圖示。第2A圖係顯示與載體控制組相比，GFP-BRD4之光褪色後的螢光回復(fluorescence recovery after photobleaching(FRAP))不受(-)-JQ1(250 nM，5小時(h))存在的影響。數據表示平均值±標準差(s.d.)(n=5)。第2B圖係顯示於平行比較性研究中，表現有GFP-BRD4組證實於(+)-JQ1(250 nM，5h)的存在中提高回復率。數據表示平均值±標準差(n=5)。第2C圖係提供在FRAP研究(a,b)中所觀察到GFP-BRD4之移動率的定量比較。數據表示平均值±標準差(n=5)，並註釋對照經配位子處理之樣品及載體控制組以雙尾t-檢定所獲得之p值。

第3A至3J圖係顯示JQ1及染色質及分化人類NUT中線腫瘤細胞競爭地結合至BRD4。第3A圖係顯示GFP-BRD4之光褪色後的螢光回復(FRAP)證實於JQ1的存在中提高回復率。細胞核按螢光強度比例顯示偽色。白色圈表示光褪色區域。第3B至3D圖係顯示於FRAP實驗中進行GFP-BRD4轉染(第3B圖)及GFP-BRD4-NUT轉染(第3C圖)，JQ1加速螢光回復，但對細胞核GFP-NUT(第3D圖)的螢光回復沒有效果。第3E圖顯示FRAP研究(第3B至3D)之時間對半-最大螢光回復的定量比較。數據表示平均值±標準差(n=5)，並註釋從雙尾t-檢定獲得之p值。第3F圖係JQ1(500 nM，48h)提示對於NUT(抗-NUT；40x)之焦點核染的損失。第3G圖係顯示經JQ1(500 nM，48h)處理之NMC細胞證實有鱗狀分化的細胞學症狀(H&E，40x)。第3H圖係顯示經JQ1(500 nM)處理之NMC細胞的分化提示於細胞角質蛋白表現中呈時間依賴性並有顯著增加的特徵(AE1/AE3；40x)。第3I至3J圖係顯示於體外JQ1減緩797 NMC細胞株(第3I圖)及Per NMC細胞株(第3J圖)的快速增生(Ki67；40x)。

第4A、4B及4C圖為顯微照片，係顯示JQ1選擇性地誘導NUT中線腫瘤細胞之鱗狀分化。第4A圖係顯示經JQ1(500 nM)處理之NMC797細胞證實呈時間依賴性有鱗狀分化的細胞學症狀(如H&E，40x及100x所示)，以染色質打開之細胞紡紗、平鋪及生長例示。第4B圖係顯示經JQ1(500 nM，48h)處理之NMC Per403細胞呈現可比較的鱗狀分化症狀。分別以H&E及角質蛋白染色(40x)圖解細胞紡紗及細胞性角質化。第4C圖係顯示藉由H&E及角質蛋白(AE1/AE3)染色(40x)圖解非-NMC鱗狀腫瘤細胞株TE10對JQ1(500 nM)的反應沒有區別。

第4D-a至4D-b圖係顯示JQ1減弱NMC細胞增生。第4D-a圖為兩張顯微照片，係顯示於體外JQ1減緩NMC Per430細胞株的快速增生(Ki67；40x)。圖像是於相同放大下顯示的。第4D-b圖係顯示JQ1對細胞增生的效果之圖表(Ki67染色及陽性；%)，係藉由如在(4D-a)及第3J圖實行之IHC所測量。細胞係以5倍高倍數視野人工評估為Ki67陽性(深色核染)或陰性(淡藍色核染)。數據表示平均值±標準差(n=5)，並註釋以雙尾t-檢定所獲得之p值。

第4E-a、b、c、d圖係顯示經JQ1處理之NUT中線腫瘤細胞之鱗狀分化的誘導是呈立體特異性及時間依賴性。第4E-a圖包括六張顯微照片，顯示與經載體處理的控制組相比，於腔室培養玻片上經(-)-JQ1(100 mM)處理之NMC797細胞呈現出可比較的細胞表現型。(+)-JQ1(100 mM，48h)促進鱗狀分化作用是以細胞紡紗、平鋪及角質蛋白的增強表現呈現。第4E-b圖係顯示經JQ1對掌性異構物或載體處理之NMC797細胞係經離心、固定、切片及染色以用於角質蛋白表現(左邊；AE1/AE3，20x)。同時於所製玻片之角質蛋白的圖像基礎分析是使用能夠用於染色強度之評估核的公正影像遮蓋及量化演算來完成。第4E-c圖係顯示與(-)-JQ1(250 nM)及載體控制組相比，(+)-JQ1(250 nM)在經處理之NMC797細胞誘導角質蛋白的快速表現，同樣是藉由定量免疫組織化學所決定。以每一處理條件之百分比陽性核表示。數據表示平均值±標準差(n=3)，並註釋以雙尾t-檢定所獲得之p值。第4E-d圖係顯示與(-)-JQ1(250 nM)相比，(+)-JQ1(250 nM)在經處理之NMC797細胞之角質蛋白染色(3+)引起強的時間依賴性誘導作用。以每一處理條件之百分比陽性核表示。數據表示平均值±標準差(n=3)，並註釋以雙尾t-檢定所獲得之p值。各組別的圖像皆呈相同放大顯示。

第4F-a至c圖係顯示沒有經BRD4-NUT轉位作用的鱗狀腫瘤細胞株對有經JQ1處理者更不敏感。胃腸的鱗狀腫瘤細胞株(TT及TE10)是在有(+)-JQ1(250 nM，紅色核)或(-)-JQ1(250 nM，黑色核)存在下培養72小時。於含有JQ1之細胞增生所觀察到的最小限度影響與在細胞週期進行有絲分裂細胞⁷之合理的角色一致。數據表示平均值±標準差(n=3)。IC₅₀值是藉由羅吉斯回歸(logistic regression)計算。

第5A至5K圖係顯示於體外及體內中JQ1處理抑制增生、迅速分化及細胞死亡。第5A圖係顯示對於BRD4-NUT依賴性細胞株之BRD4抑制作用的成長效果。細胞與(+)-JQ1(紅色核)或(-)-JQ1(黑色核)培養並於增生72小時後監控。數據表示平均值±標準差(n=3)。IC₅₀值是藉由羅吉斯回歸計算。第5B圖係顯示(+)-JQ1對於NMC797細胞之漸進式抗增生效果可由在第1、3、7及10天時延長一段時間得到證實。數據點為平均值±標準差(n=3)。第5C圖係顯示用於表示NMC797細胞中之DNA含量的流式細胞儀結果。與(-)-JQ1(250 nM)及載體控制組相比，(+)-JQ1(250 Nm，48h)誘導G1阻滯(G1 arrest)。第5D圖係顯示經載體、JQ1或星形孢菌素(Staurosporine，STA)處理之NMC797鱗狀腫瘤細胞之流式細胞分析結果，如碘化丙啶(propidium iodide，PI)及膜聯蛋白-V(annexin-V，AV)指示。第5E圖係顯示NMC797異種移植鼠之PET影像結果。相較於載體控制組，經50毫克(mg)/公斤(kg)JQ1處理之異種移植鼠後腿的FDG攝取係減少的。第5F圖係顯示經50mg/kg每日JQ1處理之患有建立疾病(NMC797異種移植)之小鼠相較於載體控制組者的腫瘤體積係減小的。在第14天藉由雙尾t-檢定(p=0.039)觀察到對治療有顯著反應。數據表示平均值±標準差(n=7)，第5G圖係顯示從經JQ1處理動物所切除之NMC797腫瘤之組織病理分析與經載體處理之動物者相比，顯現有誘導角質蛋白表現(AE1/AE)及減弱的增生(Ki67，40x)。擴大的視野提供於後附第11、12圖。第5H圖係顯示藉由PET影像確認源自人工NMC11060異種移植的生存力。第5I圖係顯示藉由PET影像證實初級11060NMC異種移植對於(+)-J01(每日50mg/kg，持續4天)之治療反應。第5J圖係顯示從經(+)-JQ1處理動物所切除之NMC11060腫瘤之組織病理分析與經載體處理之動物者相比，顯現有誘導角質蛋白表現(AE1/AE，20x；比例尺為20μm)及減弱的增生(Ki67，40x)。角質蛋白誘導的量化分析是使用影像遮蓋(第5J圖，右版面)及像素陽性分析(第5K圖)來完成。藉由雙尾t-檢定(p=0.0001)觀察到對治療有顯著反應。數據表示三個獨立廣角顯微鏡視野的平均值±標準差。第9圖係提供經染色切除之腫瘤及量化遮罩的比較圖像。

第5L-a及5L-b圖係為有NMC797異種移植小鼠忍受JQ1治療的圖示，其係引發抗腫瘤效果。第5L-a圖係顯示經JQ1(每日50mg/kg)處理之有NMC797異種移植小鼠在14天期間的治療減少負載的腫瘤。數據表示平均值±標準差(n=7)。第5L-b圖係顯示JQ1沒有產生不良症狀或體重減輕。數據表示平均值±標準差(n=7)。

第5M-a至d圖係顯示經JQ1處理之NUT中線腫瘤細胞之鱗狀分化的誘導是呈立體特異性及時間依賴性。第5M-a圖為顯微照片，顯示與經載體處理的控制組相比，於腔室培養玻片上經(-)-JQ1(100 mM)處理之NMC797細胞呈現出可比較的細胞表現型。(+)-JQ1(100 mM，48小時)促進鱗狀分化作用是以細胞紡紗、平鋪及角質蛋白的增強表現呈現。第4M-b圖為顯微照片。經JQ1對掌性異構物或載體處理之NMC797細胞係經離心、固定、切片及染色以用於角質蛋白表現(左邊；AE1/AE3，20x)。同時於所製玻片之角質蛋白的圖像基礎分析是使用能夠用於染色強度之評估核的公正影像遮蓋及量化演算來完成。第5M-c圖係顯示與(-)-JQ1(250 nM)及載體控制組相比，(+)-JQ1(250 nM)在經處理之NMC797細胞誘導角質蛋白的快速表現，其係藉由定量免疫組織化學所決定。以每一處理條件之百分比陽性核表示。數據表示平均值±標準差(n=3)，並註釋以雙尾t-檢定所獲得之p值。第5M-d圖係顯示與(-)-JQ1(250 nM)相比，(+)-JQ1(250 nM)在經處理之NMC797細胞之角質蛋白染色(3+)引起強的時間依賴性誘導作用。以每一處理條件之百分比陽性核表示。數據表示平均值±標準差(n=3)，並註釋以雙尾t-檢定所獲得之p值。各組的圖像皆呈相同放大顯示。

第6A及6B-a至6B-e圖係提供顯示體內JQ1引發麟狀分化、生長阻滯及細胞凋亡之顯微照片，其係藉由IHC測量。從經JQ1(右版面)處理動物所切除之NMC腫瘤之組織病理分析與經載體處理之動物者(左版面)相比，顯現有角質蛋白分化(H&E，40x)、細胞核NUT消失(NUT，100x)、減弱的增生(Ki67，40x)、誘導角質蛋白表現(AE1/AE3，40x)及細胞凋亡反應(TUNEL，40x)。

第7A及7B圖係顯示JQ1選擇性地誘導人類麟狀腫瘤細胞細胞株中之NMC的細胞凋亡。第7A圖係提供FACS分析結果。與非-NMC鱗狀腫瘤細胞細胞株TE10及TT相比，經JQ1(500 nM，24或48小時)處理之NMC Per403細胞藉由流式細胞分析呈現誘導細胞凋亡。PI為碘化丙啶，AV為膜聯蛋白-V。第7B圖係顯示藉由流式細胞分析之膜聯蛋白-V陽性細胞的量化及比較，其係如第5B及A圖所完成。相較於NMC細胞株與非-NMC鱗狀腫瘤細胞細胞株，JQ1(500 nM)呈現引發誘導細胞凋亡且呈時間依賴性。數據表示平均值±標準差(n=3)，並註釋以雙尾t-檢定所獲得之p值。

第8A至8C圖係顯示於體外源自NMC人工組織對JQ1之抗增生效果為敏感之圖示。第8A圖係顯示從源自人工NMC11060細胞之分析的結果。該細胞是從廢棄臨床材料單離出並於短時培養中生長以用於體外研究。對於NMC11060細胞之BRD4抑制作用的抗增生效果是在與(+)-JQ1(紅色核)或(-)-JQ1(黑色核)培養72小時後所測量的。NMC11060細胞對於(+)-JQ1對掌性異構物為獨特地敏感性。數據表示平均值±標準差(n=3)。IC₅₀值是藉由羅吉斯回歸計算。第8B圖係顯示(+)-JQ1對於源自人工NMC11060細胞之漸進式抗增生效果可由在第1、3、7及10天時延長一段時間得到證實。數據點為平均值±標準差(n=3)。第8C圖係顯示用於表示NMC11060細胞中之DNA含量的流式細胞儀結果。與(-)-JQ1(250nM)及載體控制組相比，(+)-JQ1(250Nm，48小時)誘導G1阻滯。

第9A及9B圖係於源自人工NMC11060初級異種移植腫瘤經JQ1所誘發的廣泛且強烈的角質蛋白表現的量化結果。第9A圖係顯示取自經載體處理動物所切除之NMC11060初級異種移植腫瘤、切片及染色於角質蛋白表現之低倍放大(0.8x)圖像(AE1/AE3；左)。角質蛋白的整體染色於所有切片的腫瘤中是淺色的。角質蛋白表現的圖像基礎分析是使用能夠用於染色強度之評估獨立像素的公正影像遮蓋及量化演算來完成(右)。第9B圖係顯示取自經(+)-JQ1處理動物(每日50mg/kg，持續4天)所切除之NMC11060初級異種移植腫瘤、經切片及染色用於角質蛋白表現之低倍放大(0.8x)圖像(AE1/AE3；左)。廣泛染色與觀察到以JQ1處理之腫瘤之角質蛋白誘發的均勻影響一致。角質蛋白表現的圖像基礎分析是使用能夠用於染色強度之評估獨立像素的公正影像遮蓋及量化演算來完成(右)。定量獲得像素陽性且視覺上記述為藍色(0)、黃色(1+)、橘色(2+)及紅色(3+)。所有成對圖像是於相同放大下顯示的

第10圖係顯示於齧齒動物中JQ1呈現優異口服生物可用率(bioavailability)及適當藥物動力的暴露。(+)-JQ1的藥物動力學研究是在CD1小鼠隨訪的靜脈內投藥(第10A、B圖)及口服投藥(第10B、C圖)完成。第10A圖為靜脈內投藥(5mg/kg)後之(+)-JQ1的平均血漿濃度-時間曲線圖。數據表示平均值±標準差(n=3)。第10B圖係顯示靜脈內(+)-JQ1證實優異的藥物暴露[曲線下的區域(AUC)=2090hr＊ng/mL]及近似一小時半衰期(T_1/2)之經計算的藥物動力學參數。第10C圖係顯示口服投藥(10mg/kg)後之(+)-JQ1的平均血漿濃度-時間曲線圖。數據表示平均值±標準差(n=3)。第10D圖係顯示口服(+)-JQ1證實優異的口服生物可用率(F=49%)、峰血漿濃度(C_max=1180ng/mL)及藥物暴露(AUC=2090hr＊ng/mL)之經計算的藥物動力學參數。CL為清除率；Vss為穩定狀態中之體積；MRT_INF為推至無窮大的平均停留時間；T_max為對最大濃度的時間。

第11圖係顯示JQ1對掌異構物抑制BRS4.1之AlphaScreen結合數據的曲線圖。

第12圖係顯示JQ1對掌異構物抑制BRS4.2之AlphaScreen結合數據的曲線圖。

第13圖係顯示JQ1對抗其他BET家族成員(亦即BET含溴區結構域)(活性)及CBP(非活性)之數據表示的曲線圖。

第14圖係顯示JQ1衍生物對於BRD4.1及BRD4.2抑制的集中庫之劑量-範圍研究的曲線圖。

第15A及15B圖係為曲線圖。第15A圖係顯示於Nut中線腫瘤之異種移植鼠模型中，JQ1降低腫瘤負載。第15B圖係顯示經JQ1處理小鼠之平均體重。

第16A至16D圖係顯示JQ1及其衍生物於5μM下之BRD4(1)及BRD4(2)結合活性之抑制的圖示。

第17A至17D圖係顯示JQ1及其衍生物在2μM下對Nut中線腫瘤細胞(NMC)細胞生存力%之效果的圖示。

第18至55圖係顯示經JQ1及其衍生物處理之多種癌症細胞株對生存力的劑量反應。

第56A至56D圖係顯示先導化合物結合試驗結果的圖示。第56A圖係顯示以BRD4.1進行先導化合物結合試驗之結果的圖示。第56B圖係顯示以BRD4.2進行先導化合物結合試驗之結果的圖示。第56C圖係顯示以797細胞株進行先導化合物結合試驗之結果的圖示。第56D圖係顯示以10326細胞株進行先導化合物結合試驗之結果的圖示。

由於本案的圖為結果數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (6)

1. 一種由選自下列者所組成群組之結構式表示之化合物、或其醫藥上可接受之鹽， 、以及
2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物、或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係由下列結構式表示：
3. 如申請專利範圍第1項所述之化合物、或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係由下列結構式表示：
4. 如申請專利範圍第2項所述之化合物、或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係由下列結構式表示：
5. 如申請專利範圍第3項所述之化合物、或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係由下列結構式表示：
6. 一種組成物，係包括治療有效量之如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之化合物、或其醫藥上可接受之鹽；及其醫藥上可接受之賦形劑或載劑。