KR20150132198A - 브로모도메인-함유 단백질 brd7 및 brd9의 억제에 의한 th2-매개 질환의 치료 - Google Patents

브로모도메인-함유 단백질 brd7 및 brd9의 억제에 의한 th2-매개 질환의 치료 Download PDF

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KR20150132198A
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알렉산더 코트
테리 크로포드
벤자민 파버
훈-런 황
조세 엠. 로라
스티븐 맥너슨
크리스토퍼 쥐. 나스베스척
안드레스 살머론
로버트 제이. 심즈 3세
알렉산더 엠. 테일러
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 브로모도메인 기능을 억제함으로써 Th2 사이토카인-매개 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

Description

브로모도메인-함유 단백질 BRD7 및 BRD9의 억제에 의한 TH2-매개 질환의 치료{TREATING TH2-MEDIATED DISEASES BY INHIBITION OF BROMODOMAIN-COMPRISING PROTEINS BRD7 AND BRD9}
관련 출원(들)의 상호 참조
본원은 본원에 참고로 인용된 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 출원 번호 제61/798,644호를 우선권으로 주장한다.
염색질(chromatin)은 염색체를 구성하는 DNA와 단백질의 복합체 조합이다. 이는 진핵 세포의 핵 안에서 발견되며, 이질염색질(응축된)과 진정염색질(확장된) 형태 사이에서 나누어진다. 염색질의 주요 성분은 DNA 및 단백질이다. 히스톤은, 그 주위로 DNA가 꼬이는 스풀(spool)로서 작용하는 염색질의 주요 단백질 성분이다. 염색질의 기능은 DNA를 세포에 맞춰 작은 부피로 패키징하여 DNA를 강화시킴으로써 유사 분열 및 감수 분열을 허용하고 DNA 발현과 복제를 제어하기 위한 메커니즘으로서 작용한다. 염색질 구조는 히스톤 단백질, 특히 히스톤 H3 및 H4, 가장 일반적으로 코어 뉴클레오좀 구조를 넘어 연장되는 "히스톤 꼬리(tail)" 내에서 일련의 번역-후 변형에 의해 제어된다. 히스톤 꼬리는 단백질-단백질 상호작용을 위해 유리되는 경향이 있으며 또한 히스톤 부분은 번역-후 변형되기 가장 쉽다. 이러한 변형은 아세틸화, 메틸화, 인산화, 유비퀴틴화, 수모화(SUMOylation)를 포함한다. 이러한 후생유전학적 마크는 특정 효소에 의해 작성 및 삭제되며, 이는 히스톤 꼬리 내의 특정 잔기 상의 태그(tag)를 대체함으로써 후생유전학적 코드를 형성하고, 이는 그 후 세포에 의해 해석되어 염색질 구조의 유전자 특이적 조절 및 이에 의한 전사를 허용한다.
모든 단백질 부류 중에, 히스톤이 번역-후 변형되기 가장 쉽다. 히스톤 변형은, 특정 자극에 대한 반응으로 추가되거나 제거될 수 있기 때문에 동적이며, 이러한 변형은 염색질 구조의 변화 및 유전자 전사의 변경 모두를 유도한다. 고유의 효소 부류, 즉 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 및 히스톤 아세틸라제(HDAC), 아세틸레이트 또는 탈-아세틸레이트 특이적 히스톤 라이신 잔기가 있다(문헌[Struhl K., Genes Dev., 1989, 12, 5, 599-606]).
약 110개의 아미노산 길이를 갖는 브로모도메인은 다수의 염색질-관련 단백질에서 발견되며 종종 다른 단백질 모티프에 인접해 있는 약 70개의 인간 단백질에서 식별되고 있다(문헌[JeanMougin F., et al., Trends Biochem. Sci., 1997, 22, 5, 151-153; and Tamkun J.W., et al., Cell, 1992, 7, 3, 561-572]). 브로모도메인과 변형된 히스톤 간의 상호작용은 염색질 구조 변화와 유전자 조절에 기초한 중요한 메커니즘일 수 있다. 브로모도메인-함유 단백질은 암, 염증 및 바이러스 복제를 포함한 질병 과정에 연루되어있다.
면역 관련 질환, 알레르기성 질환, 호흡기 질환 및 호산구 관련 질환 등의 TH2 사이토카인과 관련된 질환을 치료하기 위한 방법에 대한 필요성이 현재 존재한다.
요약
본원에 기재된 BRD7 및/또는 BRD9 브로모도메인은 Th2 사이토카인, 특히 IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현에 예기치 않게 중요한 역할을 하는 것이 입증되었다. 따라서, 본 발명은 포유동물에게 BRD7 및/또는 BRD9의 억제제의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서의 TH2 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 TH2 질환의 예방 또는 치료용 BRD7 및/또는 BRD9의 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 TH2 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 BRD7 및/또는 BRD9의 억제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 BRD7 및/또는 BRD9의 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 TH2 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다
또한, 본 발명은 화합물이 BRD7 및/또는 BRD9을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 TH2 질환 치료에 유용한 화합물을 식별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 BRD7 및/또는 BRD9의 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서의 IL4, IL5 또는 IL13의 생성을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13에 의해 매개된 TH2 질환(즉, IL-4 매개 질환, IL-5 매개 질환 또는 IL- 13 매개 질환)의 치료 방법을 제공한다.
도 1. 인간 T 아세포는 DMSO의 존재 하에서 또는 3가지 BRD7/9 억제제 화합물의 다양한 농도에서 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 48시간 동안 자극되었다. DMSO의 존재 하에 자극되지 않은 세포의 제어도 포함하였다. 세포 상등액은 자극의 말미에 수집하고, 사이토카인 수준은 루미넥스(Luminex) 플랫폼을 사용하여 측정하였다. 세포 생존율은 세포 역가-글로(Cell Titer-Glo) 키트(프로메가(Promega))를 사용하여 측정하였다. 도 1a는 IL-4에 세포 역가 글로(Glo) (CTG) 데이터 및 IL-5, TNF, IFN-γ 및 IL-17F 수준에 대한 데이터를 보여준다. 도 1b는 9개의 추가 사이토카인에 대한 데이터를 보여준다.
도 2. 건강한 자원자들의 말초 혈로부터 단리된 인간 비처리 T 세포(CD4+CD45RA+)를 시험관 내에서 Th2 세포 내로 분극하였다. 분화 6일 후, 세포를 세척하고, DMSO의 존재 하에 또는 화합물 BRD7/9(3) 및 BRD7/9(4)의 다양한 농도의 존재 하에서 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 40시간 동안 재-자극하였다. DMSO의 존재 하에 자극되지 않은 세포의 제어도 포함하였다. 세포 역가 글로 (CTG) 및 사이토카인 수준은 루미넥스 플랫폼을 사용하여 상등액에서 측정했다. 도 2a는 IL-5 및 TNF 데이터와 함께 CTG 데이터를 나타낸다. 도 2b는 9개 추가 사이토카인에 대한 데이터를 보여준다.
도 3. 건강한 자원자들의 말초 혈로부터 단리된 인간 비처리 T 세포(CD4+CD45RA+)를 시험관 내에서 Th2 세포 내로 분극하였다. 분화 6일 후, 세포를 세척하고, DMSO의 존재 하에 또는 화합물 BRD7/9(3) 및 BRD7/9(4)의 다양한 농도의 존재 하에서 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 40시간 동안 재-자극하였다. DMSO의 존재 하에 자극되지 않은 세포의 제어도 포함하였다. IL-5 수준을 루미넥스 플랫폼 및 알파리사(AlphaLISA) 검출 방법을 이용하여 상등액에서 측정하였다.
도 4. 건강한 자원자들의 말초 혈로부터 단리된 인간 비처리 T 세포(CD4+CD45RA+)를 시험관 내에서 Th2 세포 내로 분극하였다. 분화 6일 후, 세포를 세척하고, DMSO의 존재 하에 또는 화합물 BRD7/9(4), BRD7/9(5) 또는 BRD7/9(6)의 1 uM 농도에서 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 24시간 동안 재-자극하였다. DMSO의 존재 하에 자극되지 않은 세포의 제어도 포함하였다. IL-5 및 IL-13 mRNA 수준은 각 샘플에서의 GAPDH 수준으로 표준화된 RT-PCR을 사용하여 계산하였다. 배 유도(fold induction)는 자극되지 않은 대조군 세포(DMSO(-))에 대해 계산하였다.
도 5. 건강한 자원자들의 말초 혈로부터 단리된 인간 비처리 T 세포(CD4+CD45RA+)를 시험관 내에서 Th2 세포 내로 분극하였다. 분화 6일 후, 세포를 세척하고, DMSO의 존재 하에 또는 다양한 생화학적 효능을 가진 8개의 BRD7/9 화합물의 다양한 농도에서 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 40시간 동안 재-자극하였다. DMSO의 존재 하에 자극되지 않은 세포의 제어도 포함하였다. IL-5 및 IL-13 수준은 알파리사 검출 방법을 이용하여 상등액에서 측정하였다.
도 6. 건강한 자원자들의 말초 혈로부터 단리된 인간 비처리 T 세포(CD4+CD45RA+)를 시험관 내에서 Th1 및 Th17 세포로 분극하였다. 분화 6일 후, 세포를 세척하고, DMSO의 존재 하에 또는 화합물 BRD7/9(3) 및 BRD7/9(4)의 다양한 농도의 존재 하에서 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 40시간 동안 재-자극하였다. DMSO의 존재 하에 자극되지 않은 세포의 제어도 포함하였다. IFN-γ 및 IL-17A 수준은 루미넥스 플랫폼을 사용하여 상등액에서 측정하였다. CTG는 세포 생존률의 척도로서 결정하였다.
도 7. 건강한 자원자들의 말초 혈로부터 단리된 인간 비처리 T 세포(CD4+CD45RA+)를 DMSO의 존재 하에 또는 화합물 BRD7/9(3) 또는 BRD7/9(4)의 1 uM 농도에서 시험관 내에서 Th1, Th2, Th17 또는 Treg 세포로 분극하였다. 분화 7일 후, 세포를 세척하고, PMA/이오노마이신(Ionomycin) + 골지플러그(GolgiPlug)를 사용하여 6시간 동안 재-자극하였다. 특정 표지된 항체에 이어 FACS에 의한 세포 내 세포 염색을 수행하였다. 데이터를 검정하고 플로조(Flojo) 소프트웨어를 사용하여 도시하였다.
도 8. BalbC 마우스의 비장으로부터 단리된 마우스 비처리 T 세포(CD4+CD62L+)를 생체 외에서 Th2 세포 내로 분극하였다. 분화 4일 후, 세포를 세척하고, DMSO의 존재 하에 또는 화합물 BRD7/9(3), BRD7/9(4) BRD7/9(6) 및 BRD7/9(8)의 다양한 농도에서 항-CD3 및 항-CD28 항체 (다이나비즈(dynabeads))를 사용하여 40시간 동안 재-자극하였다. DMSO의 존재 하에 자극되지 않은 세포의 제어도 포함하였다. 세포 역가 글로(CTG) 및 사이토카인 수준을 루미넥스 플랫폼을 사용하여 상등액에서 측정하였다.
도 9. 이소형 1의 서열을 사용하여 BRD7 (서열 번호: 1) 및 BRD9 (서열 번호: 2) 모두에 대한 재조합 브로모도메인 단백질을 생성하였다. BRD7의 경우, DSF 검정에 사용된 단백질의 부분은 라인 3, 잔기 EEV에서 시작하고 라인 4, 잔기 QER에서 종료한다. BRD9의 경우, 사용된 단백질은 라인 3, 잔기 AEN에서 시작하고 라인 4, 잔기 MSK에서 종료한다.
도 10a-10c. 억제제 치료시 BRD9의 재편재화. 가시 영역은 180x 배율로 표시된 개별 핵이다. a. DMSO 대조군. b. 10 μΜ 화합물 "A"에 의한 치료. c. 10 μΜ 화합물 BRD7/9(1)에 의한 치료.
도 11. BRD7/9(8) 치료시 BRD9 재편재화에 대한 투여량-반응 곡선.
정의
본원에 사용된 "BRD7"은 적어도 BRD7의 이소형 1 및/또는 이의 임의의 이소형 또는 브로모도메인을 포함하는 천연 변이체를 포함한다. 브로모도메인은 아세틸 리신 잔기(들)에 결합된 단백질 도메인으로 알려져 있다. 인간 BRD7 이소형 1은 다음의 Q9NPI1-1의 아미노산 서열을 포함한다(UniprotKB/Swiss Protuniprot.org/uniprot/Q9NPI1).
본원에 사용된 "BRD9"는 적어도 BRD9의 이소형 1 및/또는 이의 임의의 이소형 또는 브로모도메인을 포함하는 천연 변이체를 포함한다. 전술한 바와 같이, 브로모도메인은 아세틸 리신 잔기(들)에 결합된 단백질 도메인으로 알려져 있다. 인간 BRD9 이소형 1은 다음의 Q9H8M2-5의 아미노산 서열을 포함한다(UniprotKB/Swiss Prot - uniprot.org/uniprot/Q9H8M2).
억제제의 바람직한 일 실시양태에서, 억제제는 BRD7 및/또는 BRD9의 이소형 1과 결합한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 억제제는 인간 BRD7 및/또는 9의 이소형 1과 결합한다.
본원에 사용된 "TH2 질환"은 체내에서 TH2 사이토카인의 국부 및/또는 전신성 수준 또는 활성으로 인해 비정형 증상이 나타날 수 있는 과잉의 TH2 사이토카인 및/또는 TH2 사이토카인 활성과 관련된 면역-관련 질환 또는 장애이다. 이러한 TH2 사이토카인은 TH2 세포 또는 선천성 림프구 세포와 같은 다른 세포 유형에 의해 발현된다. 본원에 사용된 TH2 사이토카인은 다음 중 어느 하나 또는 이들의 조합이다: IL-4, IL-5 및 IL-13. 특정 실시양태에서, TH2 질환은 호흡기 질환 또는 호산구성 장애이다. TH2 질환의 예로는 아토피성 피부염, 알레르기, 알레르기성 비염, 천식, 섬유증(특발성 폐 섬유증 포함), 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 과호산구성 증후군, 호산구성 식도염, 척-스트라우스 증후군 및 비강 용종을 포함한다.
"IL-4 매개 질환"은 체내에서 IL-4의 국부 및/또는 전신성 수준 또는 활성으로 인해 비정형 증상이 나타날 수 있는 과잉의 IL-4 수준 또는 활성과 관련된 질환을 의미한다. IL-4 매개 질환의 예는 암(예를 들어, 비-호지킨 림프종, 교모세포종), 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 섬유증, 폐 염증성 장애(예를 들어, 폐 섬유증, 예컨대 IPF), COPD 및 간 섬유증을 포함한다.
"IL-5 매개 질환"은 체내에서 IL-5의 국부 및/또는 전신성 수준 또는 활성으로 인해 비정형 증상이 나타날 수 있는 과잉의 IL-5 수준 또는 활성과 관련된 질환을 의미한다. IL-5 매개 질환의 예는 암(예를 들어, 비-호지킨 림프종, 교모세포종), 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 폐 염증성 장애(예를 들어, 폐 섬유증, 예컨대 IPF), COPD 및 간 섬유증을 포함한다.
"IL-13 매개 질환"은 체내에서 IL-13의 국부 및/또는 전신성 수준 또는 활성으로 인해 비정형 증상이 나타날 수 있는 과잉의 IL-13 수준 또는 활성과 관련된 질환을 의미한다. IL-13 매개 질환의 예는 암(예를 들어, 비-호지킨 림프종, 교모세포종), 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 섬유증, 폐 염증성 장애(예를 들어, 폐 섬유증, 예컨대 IPF), COPD 및 간 섬유증을 포함한다.
용어 "호흡기 장애"는 천식; 기관지염(예를 들어, 만성 기관지염); 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)(예를 들어, 기종(예를 들어, 담배-유발된 기종)); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생성을 수반하는 상태, 예를 들어 낭성 섬유증, 폐 섬유증(예를 들어, 특발성 폐 섬유증) 및 알레르기성 비염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 기도 염증, 과다 기도 분비 및 기도 폐쇄를 특징으로 할 수 있는 질환의 예는 천식, 만성 기관지염, 기관지확장증 및 낭성 섬유증을 포함한다.
용어 "호흡기성 장애"는 체내에서 호산구의 국부 또는 전신성 수준 또는 활성으로 인해 비정형 증상이 나타날 수 있는 과잉의 호산구 수와 관련된 장애를 의미한다. 과잉의 호산구 수 또는 활성과 관련된 장애는 천식(아스피린 민감성 천식 포함), 아토피성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염(계절성 알레르기성 비염 포함), 비-알레르기성 비염, 천식, 중증 천식, 만성 호산구성 천식 폐렴(아스피린 민감성 천식 포함), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 복강 질환, 척-스트라우스 증후군(결절성 동맥주위염 + 아토피), 호산구성 근육통 증후군, 과호산구성 증후군, 간헐성 혈관부종을 비롯한 부종성 반응, 연충 감염(여기서 호산구는 보호적 역할을 가질 수 있음), 온코세르카성 피부염 및 호산구-관련 위장 장애, 예컨대 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 장염 및 호산구성 결장염(이에 제한되지 않음), 비강 미세폴립증 및 폴립증, 아스피린 불내성 천식 및 폐쇄성 수면 무호흡을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 호산구-유도된 분비 생성물은 또한 만성 천식, 경피증 및 심내막심근 섬유증과 같은 상태에서 나타나는 종양 및 섬유화 반응에서의 혈관신생 및 결합 조직 형성의 촉진과 연관되어 왔다(문헌[Munitz A, Levi-Schaffer F. Allergy 2004; 59: 268-75, Adamko et al. Allergy 2005; 60: 13-22, Oldhoff, et al. Allergy 2005; 60: 693-6]). 다른 예는 암(예를 들어, 교모세포종(예컨대, 다형성 교모세포종), 비-호지킨 림프종(NHL)), 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 섬유증, 폐 섬유증(특발성 폐 섬유증(IPF) 및 경화증에 대해 속발성인 폐 섬유증 포함), COPD 및 간 섬유증을 포함한다.
본원에 사용된 "억제제"는, 유전자의 전자, RNA 성숙, RNA 번역, 단백질의 번역-후 변형, 단백질과 아세틸화된 리신 표적의 결합(예를 들어, 본원의 실시예 1에서 기재된 바와 같은 억제 검정에서) 등을 억제하는 임의의 화합물 또는 치료를 비롯해, 주어진 브로모도메인-함유 단백질(예를 들어, BRD7 또는 BRD9 함유 단백질)의 발현 및/또는 기능을 억제할 수 있는 임의의 화합물 또는 치료를 포함한다. 따라서, "브로모도메인-함유 단백질 BRD7을 억제하는 것"은 브로모도메인-함유 단백질 BRD7의 발현 및/또는 기능을 억제하는 것을 포함한다. 마찬가지로, "브로모도메인-함유 단백질 BRD9을 억제하는 것"은 브로모도메인-함유 단백질 BRD9의 발현 및/또는 기능을 억제하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시 양태에서, 본원에 기재된 검정을 이용하여 측정시, 억제제는 브로모도메인-함유 단백질의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 검출 가능하게 억제한다. 특정 실시양태에서, 억제제는 브로모도메인-함유 단백질의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 적어도 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 50% 이상, 75% 이상 또는 90% 이상 억제한다. 억제제는 주어진 브로모도메인-함유 단백질(예를 들어, BRD7 또는 BRD9 함유 단백질)의 발현 및/또는 기능을 억제함으로써 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13의 생성을 억제할 수 있다.
억제제는 천연 또는 합성 기원일 수 있다. 예를 들어, 이는 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 펩티드 또는 유기 화합물일 수 있다. 일 실시양태에서, 억제제는 siRNA, shRNA, 소분자 또는 거대고리이다.
BRD9 억제제는 일반적으로 BRD9 브로모도메인의 아세틸리신 결합 부위에 결합하고 단백질과 아세틸리신 또는 아세틸리신-변형 펩티드의 결합을 억제할 것이다. 아세틸리신과 접촉할 것으로 예상되는 BRD9 잔기는 (비-제한적으로) 스위스프로트(SwissProt) 항목 Q9H8M2에 따른 잔기 넘버링에 의해 Val165, Alal70, Tyrl73, Ala212, Asn216 및 Tyr222를 포함한다(도 9). 잔기 Asn216이 특히 중요하며, BRD9 억제제가 Asn216과 상호 작용할 것으로 예상된다. 마찬가지로, BRD7 억제제는 BRD7 브로모도메인의 아세틸리신 결합 부위와 상호 작용할 것이다. 아세틸리신과 접촉할 것으로 예상되는 BRD7으로부터의 잔기는 (비-제한적으로) 스위스프로트 항목 Q9NPI1에 따른 잔기 넘버링에 의해 Val160, Ala165, Tyr168, Ala207, Asn211 및 Tyr217을 포함한다(도 9). 잔기 Asn211이 특히 중요하며, BRD7 억제제가 Asn211과 상호작용할 것으로 예상된다.
일 실시양태에서, 억제제는 선택적으로 특정 브로모도메인-함유 단백질에 결합한다. 예를 들어, 억제제는 선택된 검정(예를 들어, 본원 실시예 3에 기재된 검정)에서 다른 브로모도메인-함유 단백질에 비해 주어진 브로모도메인-함유 단백질이 적어도 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상 또는 1,000배 이상 선택적일 수 있다. 일 실시양태에서, 억제제는 다른 브로모도메인-함유 단백질에 비해 브로모도메인-함유 단백질 BRD7이 적어도 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상 또는 1,000배 이상 선택적일 수 있다. 일 실시양태에서, 억제제는 다른 브로모도메인-함유 단백질에 비해 브로모도메인-함유 단백질 BRD9이 적어도 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상 또는 1,000배 이상 선택적일 수 있다. 일 실시양태에서, 억제제는 다른 브로모도메인-함유 단백질에 비해 브로모도메인-함유 단백질 BRD7 및 BRD9이 적어도 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상 또는 1,000배 이상 선택적일 수 있다. 다른 브로모도메인-함유 단백질의 비-제한적인 예는 ASH1L, ATAD2, ATAD2B, BAZ1A, BAZ1B, BAZ2A, BAZ2B, BPTF, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRD7, BRD8, BRD9, BRDT, BRPF1, BRPF3, BRWD1, BRWD3, CECR2, CREBBP(aka, CBP), EP300, GCN5L2, KIAA2026, MLL, MLL4, PBRM, PCAF, PHIP, SMARCA2, SMARCA4, SP100, SP110, SP140, SP140L, TAF1, TAF1L, TRIM24, TRIM28, TRIM33, TRIM66, ZMYND8 및 ZMYND11을 포함한다. 단백질이 하나 이상의 브로모도메인을 함유하는 경우, 선택도는 각각의 브로모도메인 대해 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 억제제는 10 μM 미만, 예를 들어 1 μM 미만, 예를 들어 100 nM 미만, 예를 들어 10 nM 미만, 예를 들어 1 nM 미만인 BRD7 및/또는 BRD9에 대한 IC50을 갖는다.
특정 실시양태에서, 억제제는 BRD7 및/또는 BRD9에 대한 결합 친화도 Kd가 1,000 nM 미만, 예를 들어 500 nM 미만, 예를 들어 100 nM 미만, 예를 들어 50 nM 미만이다. 특정 실시양태에서, 억제제는 BRD7 및/또는 BRD9에 대한 결합 친화도가 500 nM 내지 1 pM이다.
일 실시양태에서, 브로모도메인-함유 단백질 또는 메신저 억제제는 대응하는 메신저 RNA의 브로모도데민-함유 단백질 또는 번역의 전사를 억제할 수 있는 안티센스(antisense) 핵산이다. 안티센스 서열은 DNA, RNA(예를 들어, siRNA 또는 shRNA를), 리보솜 등일 수 있다. 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 또한 이는 안티센스 유전자에 의해 코딩되는 RNA일 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 당업자는 BRD7 또는 BRD9의 유전자 서열에 기초하여 siRNA 분자를 설계할 수 있다.
일 실시양태에서, 억제제는 폴리펩티드, 예를 들어, 브로모도메인-함유 단백질 영역을 함유하는 펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 또한 브로모도메인-함유 단백질, 또는 그의 단편 또는 그의 유도체에 대한 항체, 예를 들어, Fab 단편, CDR 영역 또는 단일 쇄 항체일 수 있다.
용어 "소분자"는 약 1000 amu 미만의 분자량을 갖는 유기 분자를 포함한다. 일 실시양태에서, 소분자는 약 800 amu 미만의 분자량을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 소분자는 약 500 amu 미만의 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서 사용될 수 있는 소분자는 하기 화합물을 포함한다:
Figure pct00001
이러한 소분자를 제조하는 데 사용될 수 있는 합성 중간체 및 공정은 국제 특허 출원 공보 번호 WO 2013/097601에 기재되어 있다.
용어 "거대고리(macrocycle)"는 9개 이상의 원자를 함유하는 고리를 갖는 유기 분자를 포함한다. 일 실시양태에서, 거대고리는 9 내지 약 24개 원자를 함유하는 고리를 갖는다. 다른 실시양태에서, 거대고리는 약 12 내지 약 16개의 원자를 함유하는 고리를 갖는다. 전형적으로 거대고리는 약 1,200 amu 미만의 분자량을 갖는다. 일 실시양태에서, 거대고리는 약 1,000 amu 미만의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 거대고리는 약 800 amu 미만의 분자량을 갖는다.
본원에 사용된 "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다.　바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 차도 또는 향상된 예후를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
억제제가 충분히 염기성 또는 산성인 경우, 억제제의 약제학적으로 허용가능한 염의 투여가 적절할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 토실레이트, 메탄설포네이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, α-케토글루타레이트 및 α-글리세로포스페이트를 형성하는 산으로 형성된 유기 산 부가염이다. 염산염, 황산염, 질산염, 중탄산염 및 탄산염을 비롯한 적합한 무기 염이 형성될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염은 당해 분야에 잘 알려져 있는 표준 순서를 이용하고, 예를 들면 아민 등의 충분히 염기성인 화합물과 생리적으로 허용가능한 음이온을 제공하는 적절한 산을 반응시킴으로써 얻어진다. 카르복실산의 알칼리 금속(예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 염 또는 알칼리토금속(예를 들어 칼슘) 염을 제조할 수 있다.
억제제는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있고, 선택된 투여 경로, 즉 경구 또는 비경구로, 정맥 내, 근육 내, 국소 또는 피하 경로에 적합한 다양한 형태로 포유동물 숙주 예를 들어 인간 환자에게 투여될 수 있다.
따라서, 억제제는 약학 적으로 허용 가능한 비히클 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 예를 들어 경구로 전신 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐로 둘러싸일 수 있고 정제로 압축될 수 있으며 환자의 식이 요법 음식에 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 억제제는 하나 이상의 부형제와 조합될 수 있고, 섭취 가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 0.1%의 억제제를 함유해야 한다. 조성물 및 제제의 백분율은 물론 다양할 수 있고 편리하게는 주어진 단위 투여 형태의 중량의 약 2% 내지 약 60%일 수 있다. 치료학적으로 유용한 조성물 중 활성 화합물의 양은 효과적인 투여 수준이 수득되도록 하는 양이다.
정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 또한 다음을 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 디칼슘 포스페이트; 붕해제 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제 예컨대 수크로스, 프룩토스, 락토스 또는 아스파탐 또는 향미제 예컨대 박하, 윈터그린의 오일 또는 체리 향료를 첨가할 수 있다. 단위 투여 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형에 더하여, 예컨대 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 존재할 수도 있고, 그렇지 않으면 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변형시킬 수도 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락 또는 설탕 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 상기 활성 화합물, 수크로스 또는 푸룩토스를 감미제로서, 메틸 및 프로파라벤을 방부제로서, 염료 및 향료 예컨대 체리 또는 오렌지 향을 함유할 수 있다. 물론, 모든 단위 투여 형태 제조에 사용된 재료가 약제학적으로 허용가능하고 실질적으로 사용되는 양에서 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제 및 장치에 혼입될 수 있다.
억제제는 또한 주입 또는 주사로 정맥 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 활성 화합물 또는 이의 염들의 용액은 임의로 무독성 계면활성제와 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 보통 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 막기 위해 방부제를 포함한다.
주사 또는 주입에 적합한 약학 투여 형태는 임의로 리포좀 내에 캡슐화된 멸균 주사 또는 주입가능한 용액 또는 분산액을 즉석 제조할 수 있는 활성 성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에서, 최종 투여 형태는 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 액체이고 안정해야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 비독성 글리세릴 에스테르, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 리포좀의 형성에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 또는 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등 다양한 항균 및 항진균제에 의해 초래될 수 있다. 많은 경우에서, 예컨대, 당, 완충제 또는 염화나트륨 등의 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴 등 흡수 지연제의 조성물에의 사용에 의해 야기될 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요한 경우 상기 열거 한 다른 다양한 성분과 함께 적절한 용매에 요구되는 양으로 억제제를 혼입하는 것에 이어서 여과 살균함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균 여과 용액에 존재하는 활성 성분 및 임의의 추가적인 바람직한 성분을 수득하는 진공 건조 및 분말 동결 건조 기술이다.
국소 투여를 위해, 억제제는 즉 이들이 액체인 경우에 순수한 형태로 적용될 수도 있다. 그러나, 일반적으로 고체 또는 액체일 수 있는 피부학적으로 허용가능한 담체와 조합된 조성물 또는 제형으로서 피부로 투여하는 것이 바람직할 것이다.
유용한 고체 담체는 활석, 클레이, 미세결정질 셀룰로오스, 실리카, 알루미나 등과 같은 미분된 고체를 포함한다. 유용한 액체 담체는 본 화합물이 선택적으로 비독성 계면 활성제의 도움으로 유효한 수준으로 용해되거나 분산될 수 있는 물, 알콜 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 블렌드를 포함한다. 예컨대 방향제 및 추가 항균제 등의 보조제가 주어진 용도 특성을 최적화하기 위해 첨가될 수 있다. 생성된 액체 조성물은 흡수성 패드로부터 적용되거나 도포 붕대 및 다른 드레싱을 함침하는 데 사용되거나 또는 펌프형 또는 에어로졸 분무기를 사용하여 유효 영역 상에 분무될 수 있다.
예컨대 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 개질된 셀룰로스 또는 개질된 미네랄 물질과 같은 증점제가 또한 사용자의 피부에 직접 도포하기 위한 확산성 페이스트, 겔, 연고, 비누 등을 형성하기 위해 액체 담체와 함께 사용될 수 있다.
피부에 억제제를 제공하는 데 사용될 수 유용한 피부과 조성물의 예는 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, 자케(Jacquet) 등(미국 특허 제4,608,392호), 게리아(Geria)(미국 특허 제4,992,478호), 스미스(Smith) 등(미국 특허 제4,559,157호) 및 워츠만(Wortzman)(미국 특허 제4,820,508호) 참조.
본 발명의 특정 실시양태는 RNAi 분자의 억제제 분자로서의 용도를 제공한다. RNAi 분자는 예를 들어 특정 mRNA 분자의 파괴를 초래함으로써 표적 유전자로부터 단백질 발현을 특별히 억제하는 siRNA, shRNA, 마이크로 RNA(miRNA) 및 다른 작은 RNA 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, RNAi 분자는 BRD7 및/또는 BRD9, 예컨대 BRD7 및/또는 BRD9의 이소형 1을 대상으로 한다. 특정 실시양태에서, RNAi 분자는 인간 BRD7 및/또는 BRD9을 표적으로 한다. 상업적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여, 당업자는 BRD7 또는 BRD9의 유전자 서열에 기초하여 RNAi 분자(예를 들어, siRNA 분자)를 디자인할 수 있다. RNAi 분자는 형질 감염, 전기 천공 또는 바이러스 전달과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 치료가 필요한 환자에게 전달(예를 들어, 투여)될 수 있다.
억제제의 유용한 투여량은 그들의 시험관내 활성 및 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 마우스 및 다른 동물의 효과적인 투여량으로부터 사람에 대해 추정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, 미국 특허 제4,938,949호 참조.
치료에 사용하기 위해 필요한 억제제의 양은 선택된 특정 염에 따라 다를 뿐만 아니라 투여 경로, 치료 증상의 특성 및 환자의 연령과 조건에 따라 다르며 궁극적으로는 의사 또는 임상의의 재량일 것이다.
억제제는 편리하게 단위 투여 형태로 제형화된다; 예를 들어, 단위 투여 형태 당 5 내지 1000 mg, 편리하게는 10 내지 750 mg, 가장 편리하게는 50 내지 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 이러한 단위 투여 형태로 제형화된 억제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
원하는 투여량은 편리하게 예를 들어 하루 2, 3, 4 또는 그 이상의 서브-투여량으로 단일 투여량으로 제공되거나 또는 적절한 간격으로 분할 투여될 수 있다. 서브-투여량 자체는 또한 취입기로부터의 다수 흡입제에 의하거나 여러 방울을 눈에 적용하는 것과 같이 다수의 불연속적으로 느슨하게 이격된 투여 간격으로 분할될 수 있다.
본 발명은 이제 하기 비-제한적인 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예 1: 억제 연구
물질 및 방법
T-아세포 제조 및 재-자극
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜(ficoll)(GE 바이오사이언스) 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 건강한 자원자들의 말초 혈로부터 분리하였다. 세포를 4일 동안 1E6 세포/ml에서 펜/스트렙(Pen/Strep) 및 10% FBS를 함유하는 RPMI(글루타맥스(Glutamax))(인비트로겐(Invitrogen))를 사용하고 PHA-P(시그마 L8754) lOug/ml를 첨가하여 배양하였다. 4일 후, 세포를 세척하여 모으고 RPMI 배지, PHA-P (10 ug/ml), rhIL-2(R & D 바이오시스템즈(202-IL)(4ng/ml)에서 1일 동안 1E6 세포/ml로 다시 시딩하였다. 세포를 세척하고 재-자극 동결하였다. 재-자극은 10% FBS 및 펜/스트렙을 함유하는 DMEM(글루타맥스)(인비트로겐)에서 1E6 세포/ml로 수행했다. 2E5 세포를 판정 포인트 당 사용하였다. 세포를 48시간 동안 DMSO(0.5%) 또는 화합물(0.5% DMSO 최종)의 존재 하에 5ug/ml의 항-CD3(BD 바이오사이언스 555336) 및 5ug/ml의 항-CD28(BD 바이오사이언스 555726)으로 자극했다. 사이토카인 수준을 제조사 사양에 따라 루미넥스 플랫폼(밀리포어(Millipore)) 또는 알파리사(AlphaLISA) 플랫폼(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정했다.
인간 비처리 T 세포( CD4 + CD45RA +) 및 분극 상태의 단리
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜(GE 바이오사이언스) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 건강한 자원자들의 말초 혈로부터 단리하였다. CD4+CD45RA+T 세포는 인간 비처리 CD4+ T 세포 격리 키트 II(130-094-131; 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotech)을 사용하여 비-T 헬퍼 세포 및 기억 CD4+ T 세포의 자기 고갈에 의해 PBMC로부터 단리하였다. TH17 분화 유도를 위해, 비처리 CD4 T 세포는 인간 T-활성화제 CD3/CD28 다이나비즈(Dynabeads®)(인비트로겐)을 사용하여 활성화하고, DMEM(인비트로겐)에서 다음 칵테일: TGF-베타 (10 ng/mL; R&D Biosystems), IL-6 (10 ng/mL; R&D Biosystems), IL-23 (10 ng/mL; R&D Biosystems), IL-l베타 (10 ng/mL; R&D Biosystems), 항-인간 IFN-감마 (lOug/mL; 클론 B140; eBioscience) 및 항-인간 IL-4 (lOug/mL; 클론 8D4-8; eBioscience)의 존재 하에서 6일 동안 배양하였다. TH1 조건에 대해 다음의 칵테일을 사용하였다: IL-12 (lOng/ml; R&D Biosystems), IL-2 (20ng/ml; R&D Biosystems), 항-인간 IL-4 (lOug/mL; 클론 8D4-8; eBioscience). TH2 조건은 IL- 4 (20ng/ml; R&D Biosystems), IL-2 (lOng/ml, R&D Biosystems), 항-인간 IFN-감마(lOug/mL; 클론 B140; eBioscience) 및 항-인간 p40( 5ug/ml; 클론 C8.4 eBiosciences)이다. iTreg의 경우, 다음을 사용하였다: TGF-베타(20 ng/mL; R&D Biosystems), IL-2 (lOng/ml; R&D Biosystems). 비처리 CD4 T 세포를 6 내지 8일 동안 각각의 조건으로 분극시켰다.
마우스 비처리 T 세포( CD4 + CD62L +) 및 분극 상태의 단리
CD4+CD62L+ 비처리 T 세포는 6 내지 8주된 암컷 BalbC 마우스의 비장에서 단리하였다. 비장 세포의 단일 세포 현탁액은 70-μm 나일론 세포 여과기(BD 바이오사이언스)를 사용하여 제조하였다. 적혈구 세포는 염화암모늄 용해 완충액(R7757; 시그마)를 이용하여 용해하고, cRPMI 10% FBS(61870-036; 인비트로겐)로 세척하였다. 비처리 CD4 T 세포는 자기-활성화 세포 분류 비드(130-093-227; 밀리테니 바이오텍)를 이용하여 정제하였다. 분류된 비처리 세포의 순도는 90% 이상이었다. 비처리 CD4 T 세포는 6-웰 플레이트(1 x 106 세포/ml)에서 배양하고, TH2, 분극 조건: IL-4 10ng/ml(214-14, Pepro), IL-2 10ng/ml(402-ML; R & D 바이오시스템즈), 10 μg/ml 항-IFN-γ 항체(554408; BD 파밍겐) 및 5 ug/ml의 항-IL-12 항체(554475; BD 파밍겐) 하에서 4일 동안 항-CD3/CD28 코팅 비드(다이나비즈 11452D; 인비트로겐)로 자극했다.
세포 생존율
세포 생존율은 ATP 존재 (G7572; 프로메가)의 정량 검정에 기초하여 생존 세포의 수를 결정하는 세포 역가 글로(Cell Titre Glo)®를 사용하여 검정했다.
인간 Th2 세포의 재-자극
6일 동안 분화된 Th2 세포를 세척하고, 10% FBS 및 펜/스트렙을 함유하는 정상 배지 DMEM(글루타맥스)(인비트로겐)와 함께 배양기를 켜짐(ON) 상태로 두었다. 다음 날, 2E5 세포를 판정 포인트 당 사용하였다. 5ug/ml의 항-CD3(BD 바이오사이언스 555336)과 5ug/ml의 항-CD28(BD 바이오사이언스 555726)로 24 또는 48시간 동안 DMSO(0.5%) 또는 화합물(0.5% DMSO 최종)의 존재 하에 세포를 자극했다. 사이토카인 수준은 제조자 사양을 사용하여 루미넥스 플랫폼(밀리포어) 또는 알파리사 플랫폼(퍼킨 엘머)을 사용하여 측정하였다.
마우스 Th2 세포의 재-자극
4일 동안 분화된 Th2 세포를 세척하고, 10% FBS 및 펜/스트렙을 함유하는 정상 배지 RPMI(글루타맥스)(인비트로겐)와 함께 배양기를 켜짐(ON) 상태로 두었다. 다음 날, 2E5 세포를 판정 포인트 당 사용하였다. 항-CD3/CD28 코팅 비드(다이나비즈 11452D; 인비트로겐)(1:1 비율)로 48시간 동안 DMSO(0.5%) 또는 화합물(0.5% DMSO 최종)의 존재 하에 세포를 자극했다. 사이토카인 수준은 루미넥스 플랫폼(밀리포어)을 사용하여 측정하였다.
실시간 RT - PCR
RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 알앤이지 미니 키트(RNeasy mini kit)(키아젠(Qiagen))를 사용하여 세포로부터 정제하였다. 첫 번째 가닥 cDNA를 수퍼스크립트(Superscript) III 역 전사효소를 이용하여 합성하였다. 정량적 실시간 PCR은 스트라타젠(Stratagene) MxPro3005p에서 정규화에 사용된, 단백질 IL-5, IL-13, 및 GAPDH를 인코딩하는 전사물에 대한 패스트스타트 유니버셜 프로브(FastStart Universal Probe) 마스터 믹스(로슈(Roche)) 및 택맨(TaqMan) 프로브를 사용하여 수행했다.
세포내 사이토카인 염색
세포내 염색을 위해, 세포를 골지플러그(Golgiplug)(BD 바이오사이언스)를 첨가하면서 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(시그마, 50ng/ml) 및 이오노마이신(시그마 500ng/ml)으로 5시간 동안 재-자극했다. 재-자극 후, 세포를 세척하고, 고정하고, 사이토픽스(Cytofix)/사이토펌(Cytoperm) 키트(554714; BD 바이오사이언스)를 사용하여 투과시키고, 사이토카인을 염색하여 인간 IL-17A(560487; eBioscience), IFNy(17-7319; eBioscience), IL-4(12-7049-42; eBioscience), Foxp3(12-4777-41; eBioscience)을 검출했다. Foxp3 세포내 염색을 위해, 세포를 고정하고, Foxp3/전사인자 염색 키트(00-5523-00, eBioscience)를 사용하여 투과시켰다. 세포를 팩스 칼리버(FACS Calibur)(BD 사이언스)에서 획득하고 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검정하였다.
DSF 검정
BRD7/9 DSF 프로토콜: 화합물(10 mM) 또는 DMSO를 DSF 검정 완충액(50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM 염화나트륨, 0.5 mM TCEP)에서 희석하여 0.5 mM의 화합물 용액 또는 5% DMSO를 생성하였다. DSF 검정 완충액에 단백질/염료 믹스(12.5 X SYPRO® 오렌지 및 브로모도메인 단백질, BRD7에 대해 6.25 mM 및 BRD9에 대해 7.5 mM)을 제조하였다. 384-웰 PCR 플레이트에 0.5 mM의 화합물 용액 또는 5% DMSO 3 ml를 이동시켰다. 화합물 플레이트에 12 ml의 단백질/염료 믹스를 가하고, 플레이트를 밀봉하고, 1분 동안 1,000 rpm에서 회전시켰다. 플레이트를 0.05℃/sec의 램프 속도로 25℃에서 85℃로 라이트사이클러(LightCycler) 480 II에서 실행하였다. 데이터를 라이트사이클러 480 SW 1.5.0의 Tm 호출 모듈로 검정하였다.
방법 및 결과
히스톤의 공유 결합의 변형은 유전자 발현 제어의 근본적인 메커니즘이고 진핵 세포의 재생에서 주요 후생 유전학적 메커니즘 중 하나이다(문헌[Kouzarides, Cell 128: 693-705 (2007)]). 고유의 전사 상태는 셀 유형 사양, 혈통 헌신, 세포 활성화 및 세포 사멸과 같은 기본적인 세포 프로세스를 정의하기 때문에, 이들의 비정상적 조절이 질병 범위의 핵심이다(문헌[Medzhitov et al., Nat. Rev. Immunol. 9: 692-703 (2009)]; [Portela et al., Nat. Biotech. 28: 1057-1068 (2010)]). 유전자 발현의 후생 유전학적 제어의 기본 구성 요소는 이러한 변형에 결합하는 특수 모티프를 수용하는 단백질에 의한 히스톤 변형의 해석이다. 그 중, 브로모도메인은 아세틸 히스톤에 결합하도록 진화하고 그렇게 함으로써 이들은 염색질 구조와 유전자 전사 사이의 근본적인 링크를 나타낸다(문헌[Fillipakoppoulos et al., Cell 149: 214-231 (2012)]). BRD7/9로 설명될 수 있는 2개의 단백질 BRD7 및 BRD9에 수용된 브로모도메인에 의해 약리학적으로 간섭을 받음으로써 면역-매개 질환의 치료 방법이 본원에 기재된다.
BRD7/9 브로모도메인이 면역-매개 질환의 치료 대상이 될 수 있는지 여부를 탐구하기 위해, BRD7/9 브로모도메인에 결합하도록 설계된 강력하고 선택적인 소분자 억제제 화합물을 사용함으로써 염색질의 아세틸화 히스톤과의 연결을 방지하는 기본적인 영향을 조사하였다. 이러한 실험에서, 인간 CD4+ T 세포가 자가면역 및 염증에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 이들 세포를 사용했다. 소분자 억제제가 오프-타겟 효과를 가질 수 있기 때문에, 생화학적 효능의 범위의 고유의 화학 시리즈로부터의 화합물의 패널을 시험하여(하기 표 1 참조) 상기 오프-타겟 효과를 배제하였다.
제 1 세트 실험에서, 인간 말초 혈 단핵 세포(PBMC)를 건강한 공여자로부터 정제하고, PHA-P 및 인간 재조합 인터루킨(IL)-2의 존재 하에서 배양하였다. 이 절차는 PBMC 제제 내에 존재하는 CD4+ T 세포의 활성화 및 팽창을 유도하고, 이는 원래 PBMC 제제(T 아세포)에 존재하는 모든 부분 집합을 대표하는 사전-활성화된 T 세포의 고농축 혼합물을 만든다. 항-CD3 및 항-CD28 항체의 조합을 이용한 T 세포 수용체(TCR)를 통한 이러한 세포의 활성화는 배양 배지에서 측정할 수 있는 사이토카인의 발현과 분비를 초래한다. 도 1a에 도시된 바와 같이, BRD7/9 억제제 BRD7/9(1), BRD7/9(2) 및 BRD7/9(3)은 루미넥스 플랫폼을 사용하여 측정시 IL-4 및 IL-5의 생성을, 투여량 의존적으로, 감소시키는 것으로 도시되었지만, 인터페론-감마(IFN-γ) 또는 IL-17F와 같은 다른 서브-세트를 나타내는 사이토카인은 아니다. 종양 괴사 인자(TNF)-알파, 일반적 전-염증성 사이토카인은 억제되지 않았다. 중요한 것은, (ATP 생성으로서 측정된) 세포 생존율은 어느 화합물에 의해서도 영향을 받지 않았다(도 1a). 또한, 9개의 추가적인 사이토킨의 넓은 패널에 대한 이들 억제제의 영향을 조사하였다. 이러한 임의의 사이토카인에 대한 유의적이고 일관된 효과는 화합물을 통해 찾을 수 없었다(도 1b).
IL-4 및 IL-5는 (IL-13과 함께) CD4+ T 세포의 T 헬퍼(Th) 유형 2 서브세트에 의해 선택적으로 생성된 사이토카인이고 천식과 알레르기성 비염 등의 알레르기 반응을 매개하는 것으로 알려져 있다(문헌[Fanta, Asthma. New Eng. J. Med. 360: 1002-1014 (2009)]). BRD7/9 억제제는 일관적으로 그리고 선택적으로 이들 Th2 사이토카인을 억제하므로, BRD7/9 억제는 Th2 세포에서 사이토카인 생성을 억제하는 효율적인 방법이 될 수 있다고 제안하였다. 이 가설을 시험하기 위하여, Th2 세포를 정제된 인간 비처리 CD4+ T 세포로부터 제조하였다. 이러한 비처리 T 세포는 마커 CD45RA의 표면 발현에 의해 식별하고, 이어서 방법 섹션에서 기재한 바와 같이 사이토카인의 표준 및 잘 확립된 믹스로 생체 외 분화시킬 수 있다. 도 2a에 도시된 바와 같이, BRD7/9 억제제 BRD7/9(3) 및 BRD7/9(4)는, 투여량 의존적으로, IL-5 생성을 감소시키는 것으로 나타났다. 도 1에 제시된 데이터와 일치되게, TNF-알파 또는 세포 생존율은 어느 화합물에 의해서도 영향을 받지 않았다. 9개의 추가 사이토카인 패널 상에서 그리고 도 1b에 기재된 데이터와 일관되게, IL-10, 다른 Th2-풍부 사이토카인을 제외하고는 임의의 시험 화합물의 영향은 발견되지 않았다(도 2b). 도 3에 도시된 바와 같이, BRD7/9 억제제 BRD7/9(3), BRD7/9(4)은 또한, 투여량 의존적으로, 루미넥스 및 알파리사 플랫폼을 사용하여 측정시 IL-5 생성을 감소시키는 것으로 나타났다.
본원에 제시된 데이터는 Th2 사이토카인 생성에서 BRD7/9 브로모도메인 대한 중요한 역할을 보여주며 브로모도메인이 염색질 결합을 매개하는 단백질 모티프이기 때문에, 이는 BRD7/9 브로모도메인 억제가 Th2 사이토카인을 암호화하는 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있음을 가정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, BRD7/9 억제제 BRD7/9(4), BRD7/9(5) 및 BRD7/9(6)는 IL-5 및 IL-13(정규의 Th2 사이토카인)의 유전자 전사 축적을 감소시키는 것으로 나타났다.
Th2 사이토카인 생성에 대한 영향이 BRD7/9 브로모도메인 억제에 의해 매개되는 것을 설명하기 위해, 실험의 추가 세트를 수행하였고, 여기서 다른 생화학적 효능 있는 억제제의 대형 패널 효과를 조사하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 모든 화합물은 IL-5 및 IL-13 생성에 선택적으로 영향을 미쳤다. 이 효과는 투여량-의존적이며 생화학적 효능에 비례하는 크기를 가졌다.
Th2 세포에서 BRD7/9 브로모도메인 억제의 관찰된 효과가 이 계통에 대해 선택적인지를 조사하였다. 비처리 CD4+ T 세포는 Th1 및 Th17 세포로 분화하고, 사이토카인 프로파일에 대한 억제제의 효과를 특히 정규 사이토카인 프로필: Th1 세포에서의 인터페론-감마(IFN-γ) 및 Th17 세포에서의 IL17A에 대해 조사하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, BRD7/9(3), BRD7/9(4) 억제제는 Th1 세포에서 IFN-γ에 영향을 미치지 않았다. 이와 유사하게, IL-17A에 대한 BRD7/9(4) 억제제의 효과는 Th17 세포에서 발견되지 않았고, 사이토카인에 대한 BRD7/9(3)의 매우 중간 정도의 효과만이 발견되었다.
종합적으로 보면, 지금까지 기재된 데이터는 BRD7/9 브로모도메인의 억제가 일어나고 투여량 의존적 Th2-특이적 사이토카인 IL-4, IL-5 및 IL-13의 선택적이고 투여량-의존적인 억제를 초래함을 입증한다.
BRD7/9 브로모도메인 억제가 주요 CD4+ T 세포의 서브세트, Th1, Th2, Th17 및 T 조절(TREG) 세포들 중 임의의 분화에 어떤 영향을 미쳤는지를 조사하였다. 이러한 목적으로, 인간 비처리 CD4+ T 세포를 방법 섹션에 기재된 사이토카인의 적절한 표준 및 잘-설정된 칵테일로 분화시키고 억제제 BRD7/9(3)과 BRD7/9(4)의 효과를 탐구하였다. IFN-γ 발현 세포(Th1), IL-4 발현 세포(Th2), IL-17A-발현 세포(Th17) 및 FoxP3-발현 세포(Tregs)를 정렬하기 위한 형광-활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 분화를 평가하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, Th1, Th2, Th17 또는 Tregs로의 비처리 T 세포의 분화 동안 BRD7/9 브로모도메인 억제는 기능적 영향이 없었다. 구체적으로, Th1 배양액에서 IFN-γ-발현 세포, 또는 Th2 배양액에서 IL-4-발현 세포, 또는 Th17 배양액에서 IL-17A-발현 세포, 또는 Treg 배양액에서 FoxP3-발현 세포의 수에 상당한 영향은 검출되지 않았다.
마지막으로, 본원에 보고된 연구에서 밝혀진 BRD7/9 브로모도메인의 중요한 역할이 마우스와 같은 다른 종에서 보존되는지 여부를 조사하였다. 마우스 비처리 T 세포를 4일 동안 Th2 세포로 분화한 후, 40시간 동안 항-CD3 및 항-CD28로 재-자극하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, BRD7/9 브로모도메인 억제는 정규 Th2 사이토카인 IL-4, IL-5 및 IL-13의 중요한 투여량-의존적 억제 결과를 낳았지만, 일반적 전-염증성 사이토카인 TNF-알파는 단지 중간 정도의 영향을 미쳤다. 화합물 어느 것도 세포 생존 능력에 상당한 효과를 나타내지 않았다(도 8).
요약하면, 본원에 기술된 바와 같이, BRD7/9 브로모도메인이 인간 및 마우스 Th2 사이토카인, 특히 IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현에 예기치 않게 그러나 중요한 역할을 하지만, 다른 사이토카인의 발현에서도 필수불가결하다는 것을 입증하였다. 또한, BRD7/9 브로모도메인 억제는 연구되는 임의의 T 세포 서브-세트의 분화에 어떠한 영향도 주지 않았다(Th1, Th2, Th17 및 Treg). Th2 사이토카인은 알레르기 질환을 매개하므로, 특히 비-제한적으로 천식, 호산구성 중증 천식, 호산구성 증후군, 알레르기성 비염 및 알레르기성 피부염 등의 질환을 치료하는 효과적인 방법을 발견하였다.
하기 표 1은 BRD7/9 화합물의 생화학적 데이터를 제공한다. 표 1의 IC50 값은 후술하는 알파리사 검정법을 사용하여 생성하였다.
IC50 값을 측정하기 위한 알파리사 검정:
Figure pct00002
하기 반응 완충액을 제조하였다:
1X 반응 완충액
Figure pct00003
3X 반응 완충액 용액 A - 6.3 uL
Figure pct00004
3X 결합제 용액 B - 6.3 uL
Figure pct00005
3X 비드 C - 6.3 uL
Figure pct00006
1X 반응 완충액
용액 A(웰 당 6.3 uL) 및 용액 B(웰 당 6.3 uL)를 합치고 실온에서 20분간 배양하였다. 어두운 곳에서, 비드 C 용액 6.3 uL를 첨가하였다. 생성된 용액을 마이크로플레이트 톱실(TopSeal)로 덮고 실온 어두운 곳에서 90분간 배양하였다. 플레이트를 인비젼(Envision)(프로토콜: 보정된 알파리사 프록시플레이트 플랫필드(AlphaLisa ProxiPlate Flatfield) 사용)으로 판독했다. 데이터를 수동 검정하거나 또는 활성 염기(Abase)를 사용하여 검정했다. 수동 처리된 데이터의 경우, IC50은 일반적으로 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 및 4 파라미터 투여량-반응 핏(fit)을 사용하여 유도하였다. 결과를 표 1에 제공한다.
표 1. 생화학적 시험관 효능을 포함한 본 실험에 사용된 BRD7/9 화합물 목록.
Figure pct00007
실시예 2: 억제제 치료시 BRD9 국부 시각화 검정
유도성 BRD9 형광 융합 단백질을 운반하는 안정한 세포주를 웰 당 20,000 세포로 시딩하였다. 상기 융합의 발현은 37℃에서 16시간 동안 2 μg/mL의 독시사이클린의 첨가에 의해 유도하였다. 이어서, 테스트 억제제를 실온에서 60분 동안 독시사이클린 결핍된 배지에 첨가하였다. 세포를 4% PFA로 고정시키고, 이어서 30 분 동안 훽스트(Hoechst) 염색하였다. 이미지는 녹색 및 청색 채널 모두에서 획득했다. 최소 선택된 크기의 녹색 BRD9 반점은 "피트(pit)"으로 확인하고 억제제에 대한 응답은 "세포 당 피트"으로 정량화하였다.
도 10a-10c는 BRD9 융합 단백질이 억제제의 부재 하에서 염색질로 주로 편재되고 화합물 첨가시 큰 반점으로 검색된 것을 보여준다. 도 11은 BRD9의 존재 하에 화합물 BRD7/9(8)을 사용하여 생성된 투여량-반응 곡선을 도시한다.
실시예 3: 다른 브로모도메인에 대한 BRD9 에 대한 선택도 결정
화합물 BRD7/9(8)은 BRD9(실시예 1)에 대해 상술한 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 알파리사에 의해 다양한 브로모도메인 결합을 시험하였다. 표 2에서 선택도 비는 기재된 브로모도메인에 대한 IC50을 BRD9 대한 IC50으로 나눈 것이다.
표 2. 결합 선택도
Figure pct00008
명확한 이해를 목적으로 본 발명을 예시 및 실시예에 의해 상세히 기재하였지만, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백히 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
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Phe Ser Phe Pro Val 145 150 155 160 Thr Asp Phe Ile Ala Pro Gly Tyr Ser Met Ile Ile Lys His Pro Met 165 170 175 Asp Phe Ser Thr Met Lys Glu Lys Ile Lys Asn Asn Asp Tyr Gln Ser 180 185 190 Ile Glu Glu Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Met Cys Thr Asn Ala Met 195 200 205 Ile Tyr Asn Lys Pro Glu Thr Ile Tyr Tyr Lys Ala Ala Lys Lys Leu 210 215 220 Leu His Ser Gly Met Lys Ile Leu Ser Gln Glu Arg Ile Gln Ser Leu 225 230 235 240 Lys Gln Ser Ile Asp Phe Met Ala Asp Leu Gln Lys Thr Arg Lys Gln 245 250 255 Lys Asp Gly Thr Asp Thr Ser Gln Ser Gly Glu Asp Gly Gly Cys Trp 260 265 270 Gln Arg Glu Arg Glu Asp Ser Gly Asp Ala Glu Ala His Ala Phe Lys 275 280 285 Ser Pro Ser Lys Glu Asn Lys Lys Lys Asp Lys Asp Met Leu Glu Asp 290 295 300 Lys Phe Lys Ser Asn Asn Leu Glu Arg Glu Gln Glu Gln Leu Asp Arg 305 310 315 320 Ile Val Lys Glu Ser Gly Gly Lys Leu Thr Arg Arg Leu Val Asn Ser 325 330 335 Gln Cys Glu Phe Glu Arg Arg Lys Pro Asp Gly Thr Thr Thr Leu Gly 340 345 350 Leu Leu His Pro Val Asp Pro Ile Val Gly Glu Pro Gly Tyr Cys Pro 355 360 365 Val Arg Leu Gly Met Thr Thr Gly Arg Leu Gln Ser Gly Val Asn Thr 370 375 380 Leu Gln Gly Phe Lys Glu Asp Lys Arg Asn Lys Val Thr Pro Val Leu 385 390 395 400 Tyr Leu Asn Tyr Gly Pro Tyr Ser Ser Tyr Ala Pro His Tyr Asp Ser 405 410 415 Thr Phe Ala Asn Ile Ser Lys Asp Asp Ser Asp Leu Ile Tyr Ser Thr 420 425 430 Tyr Gly Glu Asp Ser Asp Leu Pro Ser Asp Phe Ser Ile His Glu Phe 435 440 445 Leu Ala Thr Cys Gln Asp Tyr Pro Tyr Val Met Ala Asp Ser Leu Leu 450 455 460 Asp Val Leu Thr Lys Gly Gly His Ser Arg Thr Leu Gln Glu Met Glu 465 470 475 480 Met Ser Leu Pro Glu Asp Glu Gly His Thr Arg Thr Leu Asp Thr Ala 485 490 495 Lys Glu Met Glu Ile Thr Glu Val Glu Pro Pro Gly Arg Leu Asp Ser 500 505 510 Ser Thr Gln Asp Arg Leu Ile Ala Leu Lys Ala Val Thr Asn Phe Gly 515 520 525 Val Pro Val Glu Val Phe Asp Ser Glu Glu Ala Glu Ile Phe Gln Lys 530 535 540 Lys Leu Asp Glu Thr Thr Arg Leu Leu Arg Glu Leu Gln Glu Ala Gln 545 550 555 560 Asn Glu Arg Leu Ser Thr Arg Pro Pro Pro Asn Met Ile Cys Leu Leu 565 570 575 Gly Pro Ser Tyr Arg Glu Met His Leu Ala Glu Gln Val Thr Asn Asn 580 585 590 Leu Lys Glu Leu Ala Gln Gln Val Thr Pro Gly Asp Ile Val Ser Thr 595 600 605 Tyr Gly Val Arg Lys Ala Met Gly Ile Ser Ile Pro Ser Pro Val Met 610 615 620 Glu Asn Asn Phe Val Asp Leu Thr Glu Asp Thr Glu Glu Pro Lys Lys 625 630 635 640 Thr Asp Val Ala Glu Cys Gly Pro Gly Gly Ser 645 650 <210> 2 <211> 597 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Lys Lys His Lys Lys His Lys Ala Glu Trp Arg Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Glu Asp Tyr Ala Asp Lys Pro Leu Glu Lys Pro Leu Lys Leu Val Leu 20 25 30 Lys Val Gly Gly Ser Glu Val Thr Glu Leu Ser Gly Ser Gly His Asp 35 40 45 Ser Ser Tyr Tyr Asp Asp Arg Ser Asp His Glu Arg Glu Arg His Lys 50 55 60 Glu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Glu Lys Glu Lys His Leu 65 70 75 80 Asp Asp Glu Glu Arg Arg Lys Arg Lys Glu Glu Lys Lys Arg Lys Arg 85 90 95 Glu Arg Glu His Cys Asp Thr Glu Gly Glu Ala Asp Asp Phe Asp Pro 100 105 110 Gly Lys Lys Val Glu Val Glu Pro Pro Pro Asp Arg Pro Val Arg Ala 115 120 125 Cys Arg Thr Gln Pro Ala Glu Asn Glu Ser Thr Pro Ile Gln Gln Leu 130 135 140 Leu Glu His Phe Leu Arg Gln Leu Gln Arg Lys Asp Pro His Gly Phe 145 150 155 160 Phe Ala Phe Pro Val Thr Asp Ala Ile Ala Pro Gly Tyr Ser Met Ile 165 170 175 Ile Lys His Pro Met Asp Phe Gly Thr Met Lys Asp Lys Ile Val Ala 180 185 190 Asn Glu Tyr Lys Ser Val Thr Glu Phe Lys Ala Asp Phe Lys Leu Met 195 200 205 Cys Asp Asn Ala Met Thr Tyr Asn Arg Pro Asp Thr Val Tyr Tyr Lys 210 215 220 Leu Ala Lys Lys Ile Leu His Ala Gly Phe Lys Met Met Ser Lys Gln 225 230 235 240 Ala Ala Leu Leu Gly Asn Glu Asp Thr Ala Val Glu Glu Pro Val Pro 245 250 255 Glu Val Val Pro Val Gln Val Glu Thr Ala Lys Lys Ser Lys Lys Pro 260 265 270 Ser Arg Glu Val Ile Ser Cys Met Phe Glu Pro Glu Gly Asn Ala Cys 275 280 285 Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ala Glu Glu His Val Leu Ala Leu Val Glu 290 295 300 His Ala Ala Asp Glu Ala Arg Asp Arg Ile Asn Arg Phe Leu Pro Gly 305 310 315 320 Gly Lys Met Gly Tyr Leu Lys Arg Asn Gly Asp Gly Ser Leu Leu Tyr 325 330 335 Ser Val Val Asn Thr Ala Glu Pro Asp Ala Asp Glu Glu Glu Thr His 340 345 350 Pro Val Asp Leu Ser Ser Leu Ser Ser Lys Leu Leu Pro Gly Phe Thr 355 360 365 Thr Leu Gly Phe Lys Asp Glu Arg Arg Asn Lys Val Thr Phe Leu Ser 370 375 380 Ser Ala Thr Thr Ala Leu Ser Met Gln Asn Asn Ser Val Phe Gly Asp 385 390 395 400 Leu Lys Ser Asp Glu Met Glu Leu Leu Tyr Ser Ala Tyr Gly Asp Glu 405 410 415 Thr Gly Val Gln Cys Ala Leu Ser Leu Gln Glu Phe Val Lys Asp Ala 420 425 430 Gly Ser Tyr Ser Lys Lys Val Val Asp Asp Leu Leu Asp Gln Ile Thr 435 440 445 Gly Gly Asp His Ser Arg Thr Leu Phe Gln Leu Lys Gln Arg Arg Asn 450 455 460 Val Pro Met Lys Pro Pro Asp Glu Ala Lys Val Gly Asp Thr Leu Gly 465 470 475 480 Asp Ser Ser Ser Ser Val Leu Glu Phe Met Ser Met Lys Ser Tyr Pro 485 490 495 Asp Val Ser Val Asp Ile Ser Met Leu Ser Ser Leu Gly Lys Val Lys 500 505 510 Lys Glu Leu Asp Pro Asp Asp Ser His Leu Asn Leu Asp Glu Thr Thr 515 520 525 Lys Leu Leu Gln Asp Leu His Glu Ala Gln Ala Glu Arg Gly Gly Ser 530 535 540 Arg Pro Ser Ser Asn Leu Ser Ser Leu Ser Asn Ala Ser Glu Arg Asp 545 550 555 560 Gln His His Leu Gly Ser Pro Ser Arg Leu Ser Val Gly Glu Gln Pro 565 570 575 Asp Val Thr His Asp Pro Tyr Glu Phe Leu Gln Ser Pro Glu Pro Ala 580 585 590 Ala Ser Ala Lys Thr 595 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> LCBiot-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ac-Lys <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ac-Lys <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Ac-Lys <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Ac-Lys <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Lys-amide <400> 3 Ala Ala Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly 1 5 10 15 Ala Lys Arg His Arg Lys 20

Claims (73)

  1. 포유동물에서 TH2 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 포유동물에게 BRD7 또는 BRD9의 억제제의 치료학적 효과량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7을 억제하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD9을 억제하는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7 및 BRD9을 억제하는, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 브로모도메인(bromodomain)에 결합하는, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 BRD7 또는 BRD9의 이소형(isoform) 1에 결합하는, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 BRD7 및 BRD9의 이소형 1과 결합하는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 siRNA, shRNA, 소분자 또는 거대고리(macrocycle)인, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 과잉의 TH2 사이토카인과 연관된 면역-관련 질환 또는 장애인, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 아토피성 피부염, 알레르기, 알레르기성 비염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 과호산구성 증후군, 호산구성 식도염, 척(Churg)-스트라우스(Strauss) 증후군 및 비강 용종증으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 호흡기 장애인, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 천식; 기관지염; 만성 폐쇄성 폐 질환; 및 기도 염증과 관련된 병태로부터 선택되는, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 TH2 질환이 호산구성 장애인, 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 호산구성 장애가 천식, 아토피성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 비-알레르기성 비염, 만성 호산구성 폐렴, 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증, 복강 질환 (coeliac disease), 척-스트라우스 증후군, 호산구성 근육통 증후군, 과호산구성 증후군, 부종성 반응, 기생충 감염, 회선사상충증 피부염 및 호산구성-관련 위장 장애로부터 선택되는, 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 호산구성 장애가 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 장염 및 호산구성 대장염, 비강 미세용종증 및 용종증, 아스피린 불내성, 천식 및 폐쇄성 수면 무호흡증으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 다른 브로모도메인-함유 단백질에 비해 브로모도메인-함유 단백질 BRD7에 대해 적어도 5배 선택적인, 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 다른 브로모도메인-함유 단백질에 비해 브로모도메인-함유 단백질 BRD9에 대해 적어도 5배 선택적인, 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 다른 브로모도메인-함유 단백질에 비해 브로모도메인-함유 단백질 BRD7 및 BRD9에 대해 적어도 5배 선택적인, 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제 결합이 다른 브로모도메인 비해 BRD7에 대해 적어도 5배 선택적인, 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제 결합이 다른 브로모도메인 비해 BRD9에 대해 적어도 5배 선택적인, 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제 결합이 다른 브로모도메인에 비해 BRD7 및 BRD9에 대해 적어도 5배 선택적인, 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 IL-4, IL-5 또는 IL-13의 생성을 억제하는, 방법.
  23. TH2 질환의 예방적 또는 치료학적 치료를 위한 BRD7 또는 BRD9의 억제제.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7을 억제하는, 억제제.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD9을 억제하는, 억제제.
  26. 제 23 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7 및 BRD9을 억제하는, 억제제.
  27. 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 브로모도메인에 결합하는, 억제제.
  28. 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 BRD7 또는 BRD9의 이소형 1에 결합하는, 억제제.
  29. 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 BRD7 및 BRD9의 이소형 1과 결합하는, 억제제.
  30. 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 siRNA, shRNA, 소분자 또는 거대고리인, 억제제.
  31. 제 23 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 과잉의 TH2 사이토카인과 연관된 면역-관련 질환 또는 장애인, 억제제.
  32. 제 23 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 아토피성 피부염, 알레르기, 알레르기성 비염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 과호산구성 증후군, 호산구성 식도염, 척-스트라우스 증후군 및 비강 용종으로부터 선택되는, 억제제.
  33. 제 23 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 호흡기 장애인, 억제제.
  34. 제 23 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 천식; 기관지염; 만성 폐쇄성 폐 질환; 및 기도 염증과 관련된 병태로부터 선택되는, 억제제.
  35. TH2 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 BRD7 또는 BRD9의 억제제의 용도.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7을 억제하는, 용도.
  37. 제 35 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD9을 억제하는, 용도.
  38. 제 35 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7 및 BRD9을 억제하는, 용도.
  39. 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 브로모도메인에 결합하는, 용도.
  40. 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 BRD7 또는 BRD9의 이소형 1에 결합하는, 용도.
  41. 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 BRD7 및 BRD9의 이소형 1에 결합하는, 용도.
  42. 제 35 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 siRNA, shRNA, 소분자 또는 거대고리인, 용도.
  43. 제 35 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 과잉의 TH2 사이토카인과 연관된 면역-관련 질환 또는 장애인, 용도.
  44. 제 35 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 아토피성 피부염, 알레르기, 알레르기성 비염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 과호산구성 증후군, 호산구성 식도염, 척-스트라우스 증후군 및 비강 용종증으로부터 선택되는, 용도.
  45. 제 35 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 호흡기 장애인, 용도.
  46. 제 35 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH2 질환이 천식; 기관지염; 만성 폐쇄성 폐 질환; 및 기도 염증과 관련된 병태로부터 선택되는, 용도.
  47. BRD7 또는 BRD9의 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, TH2 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7을 억제하는, 약제학적 조성물.
  49. 제 47 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD9을 억제하는, 약제학적 조성물.
  50. 제 47 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7 및 BRD9을 억제하는, 약제학적 조성물.
  51. 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 브로모도메인에 결합하는, 약제학적 조성물.
  52. 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 BRD7 또는 BRD9의 이소형 1에 결합하는, 약제학적 조성물.
  53. 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 BRD7 및 BRD9의 이소형 1에 결합하는, 약제학적 조성물.
  54. 제 47 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 siRNA, shRNA, 소분자 또는 거대고리인, 약제학적 조성물.
  55. TH2 질환 치료에 유용한 화합물을 식별하기 위한 방법으로서, 상기 화합물이 BRD7 또는 BRD9를 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 화합물이 BRD7을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 제 55 항에 있어서, 상기 화합물이 BRD9을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 제 55 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정은 상기 화합물을 BRD7 또는 BRD9과 접촉시키고, 상기 BRD7 또는 BRD9의 활성이 감소하는지 여부를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 화합물이 BRD7과 접촉하는, 방법.
  60. 제 58 항에 있어서, 상기 화합물이 BRD9과 접촉하는, 방법.
  61. 제 58 항에 있어서, 상기 측정이 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되는, 방법.
  62. 포유동물에서 IL-4, IL-5 또는 IL-13의 생성을 억제하기 위한 방법으로서, 상기 포유동물에게 BRD7 또는 BRD9의 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7을 억제하는, 방법.
  64. 제 62 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD9을 억제하는, 방법.
  65. 제 62 항에 있어서, 상기 억제제가 BRD7 및 BRD9을 억제하는, 방법.
  66. 제 62 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 브로모도메에 결합하는, 방법.
  67. 제 62 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 적어도 BRD7 또는 BRD9의 이소형 1에 결합하는, 방법.
  68. 제 62 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 적어도 BRD7 및 BRD9의 이소형 1에 결합하는, 방법.
  69. 제 62 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 siRNA, shRNA, 소분자 또는 거대고리인, 방법.
  70. 제 1 항 내지 제 22 항 또는 제 62 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 상기 치료를 필요로 하는 포유동물인, 방법.
  71. 제 1 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 10 μM 미만, 예를 들어 1 μM 미만, 예를 들어 100 nM 미만, 예를 들어 10 nM 미만, 예를 들어 1 nM 미만의 BRD7 및/또는 BRD9에 대한 IC50을 갖는, 방법, 억제제, 용도 또는 조성물.
  72. 제 1 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 1000 nm 미만, 예를 들어 500 nM 미만, 예를 들어 100 nM 미만, 예를 들어 50 nM 미만의 BRD7 및/또는 BRD9에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법, 억제제, 용도 또는 조성물.
  73. 제 1 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 500 nM 내지 1 pM의 BRD7 및/또는 BRD9에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법, 억제제, 용도 또는 조성물.
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