JP2016519672A - ブロモドメイン含有タンパク質brd7およびbrd9の阻害によるth2媒介性疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
本発明はブロモドメイン機能を阻害することによってTh2サイトカイン媒介性疾患を治療する方法を提供する。本発明は治療に有効な量のBRD7及び/またはBRD9の阻害剤を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物のTH2疾患を治療する方法を提供する。本発明はこのほか、TH2疾患の予防的または治療的処置のためのBRD7及び/またはBRD9の阻害剤を提供する。本発明はこのほか、TH2疾患の治療のための薬剤を調製するためにBRD7及び/またはBRD9の阻害剤の使用を提供する。
Description
本特許出願は、2013年3月15日に出願した米国特許出願第61/798,644号の優先権の利益を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
クロマチンは、染色体を構成するDNA及びタンパク質の複雑な複合体である。クロマチンは真核細胞の核内にみられ、ヘテロクロマチン(凝縮した)及びユークロマチン(伸長した)形態に分けられる。クロマチンの主成分はDNA及びタンパク質である。ヒストンがクロマチンの主タンパク質成分であり、DNAが巻き付くスプールの役割を担う。クロマチンの機能は、DNAが細胞に収まるようにより小さな体積に包むこと、DNAを有糸分裂及び減数分裂が可能となるよう強化すること、ならびに発現及びDNA複製を制御する機序としての役割を担うことである。クロマチン構造はヒストンタンパク質に対する一連の翻訳後修飾によって制御される。ヒストンタンパク質としては、特にヒストンH3及びH4であり、最も一般にはコアヌクレオソーム構造を越えて伸長する「ヒストンテール」内のヒストンタンパク質である。ヒストンテールはタンパク質−タンパク質相互作用に空いている傾向があり、このほか翻訳後修飾を最も受けやすいヒストンの一部である。この修飾としてはアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化が挙げられる。このエピジェネティックマークは特異的な酵素によって書かれ及び消され、ヒストンテール内の特異的な残基上にタグを付け、これによりエピジェネティックコードを形成し、その後、それは細胞により解釈され、クロマチン構造の遺伝子特異的な調節及びこれによる転写が可能となる。
タンパク質の全クラスのうち、ヒストンが翻訳後修飾を最も受けやすい。ヒストン修飾が特定の刺激に反応して付加されるか、除去される可能性があり、この修飾によりクロマチンに対する構造的変化及び遺伝子転写の変化の双方を指示するため、ヒストン修飾は動的である。酵素の特異的なクラスは、すなわちヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)及びヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、アセチル化または脱アセチル化特異的ヒストンリジン残基(Struhl K.,Genes Dev.,1989,12,5,599〜606)である。
ブロモドメインはおよそ110アミノ酸長であり、多くのクロマチン関連タンパク質にみられ、およそ70ヒトタンパク質に確認されており、他のタンパク質モチーフに隣接していることが多い(Jeanmougin F.ら、Trends Biochem.Sci.,1997,22,5,151〜153;及びTamkunJ.W.ら,Cell,1992,7,3,561〜572)。ブロモドメイン及び修飾ヒストンの間の相互作用がクロマチン構造変化及び遺伝子調節を支える重要な機序となる可能性がある。ブロモドメイン含有タンパク質は癌、炎症及びウイルス複製を含む疾患プロセスに関わっている。
現在、TH2サイトカインに関連する疾患、例えば、免疫関連疾患、アレルギー性疾患、呼吸障害、及び好酸球関連疾患を治療する方法が必要である。
現在、TH2サイトカインに関連する疾患、例えば、免疫関連疾患、アレルギー性疾患、呼吸障害、及び好酸球関連疾患を治療する方法が必要である。
Struhl K.,Genes Dev.,1989,12,5,599〜606
Jeanmougin F.ら、Trends Biochem.Sci.,1997,22,5,151〜153
TamkunJ.W.ら,Cell,1992,7,3,561〜572
本明細書に記載したように、BRD7及び/またはBRD9ブロモドメインがTh2サイトカイン、特にIL−4、IL−5及びIL−13の発現に予期しない重要な役割を担うことが示されている。したがって、本発明は治療に有効な量のBRD7及び/またはBRD9の阻害剤を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物のTH2疾患を治療する方法を提供する。
本発明はこのほか、TH2疾患の予防的または治療的処置のためのBRD7及び/またはBRD9の阻害剤を提供する。
本発明はこのほか、TH2疾患の治療のための薬剤を調製するためにBRD7及び/またはBRD9の阻害剤の使用を提供する。
本発明はこのほか、BRD7及び/またはBRD9の阻害剤及び薬学的許容キャリアを含む、TH2疾患の治療に使用するための薬剤組成物を提供する。
本発明はこのほか、化合物がBRD7及び/またはBRD9を阻害するかどうかを決定することを含むTH2疾患を治療するのに有用な化合物を同定する方法を提供する。
本発明はこのほか、哺乳動物にBRD7及び/またはBRD9の阻害剤を投与することを含む、哺乳動物がIL4、IL5、またはIL13を産生することを阻害する方法を提供する。
本発明はこのほか、IL−4、IL−5、及び/またはIL−13によって媒介されたTH2疾患(すなわち、IL−4媒介性疾患、IL−5媒介性疾患、またはIL−13媒介性疾患)を治療する方法を提供する。
定義
本明細書に使用する場合、「BRD7」は少なくともBRD7のアイソフォーム1及び/またはそのアイソフォームまたはブロモドメインを含む自然に生じるバリアントのいずれかを含む。ブロモドメインはアセチル化リジン残基(単数または複数)を結合するタンパク質ドメインとして知られる。ヒトBRD7アイソフォーム1は以下のQ9NPI1−1(UniprotKB/Swiss Prot uniprot.org/uniprot/Q9NPI1)のアミノ酸配列を含む。
本明細書に使用する場合、「BRD7」は少なくともBRD7のアイソフォーム1及び/またはそのアイソフォームまたはブロモドメインを含む自然に生じるバリアントのいずれかを含む。ブロモドメインはアセチル化リジン残基(単数または複数)を結合するタンパク質ドメインとして知られる。ヒトBRD7アイソフォーム1は以下のQ9NPI1−1(UniprotKB/Swiss Prot uniprot.org/uniprot/Q9NPI1)のアミノ酸配列を含む。
本明細書に使用する場合、「BRD9」は少なくともBRD9のアイソフォーム1、及び/またはそのアイソフォームまたはブロモドメインを含む自然に生じるバリアントのいずれかを含む。上に記載したように、ブロモドメインはアセチル化リジン残基(単数または複数)を結合するタンパク質ドメインとして知られる。ヒトBRD9アイソフォーム1は以下のQ9H8M2−5(UniprotKB/Swiss Prot−uniprot.org/uniprot/Q9H8M2)のアミノ酸配列を含む。
阻害の1つの好ましい実施形態では、阻害剤はBRD7及び/またはBRD9のアイソフォーム1に結合する。さらにもう一つの好ましい実施形態では、阻害剤はヒトBRD7及び/または9のアイソフォーム1に結合する。
本明細書に使用する場合、「TH2疾患」は、非定型の症状がTH2サイトカインの体内の局所及び/または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰TH2サイトカイン及び/またはTH2サイトカイン活性に関連する免疫関連疾患または障害である。かかるTH2サイトカインがTH2細胞または他の細胞の型、例えば、生得的リンパ系細胞によって発現する可能性がある。本明細書に使用する場合、TH2サイトカインは以下のIL−4、IL−5及びIL−13のいずれか1つまたは組み合わせである。特定の実施形態では、TH2疾患は呼吸障害または好酸球障害である。TH2疾患の例としては、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症(特発性肺繊維症を含む)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−シュトラウス症候群、及び鼻ポリープが挙げられる。
「IL−4媒介性疾患」は、非定型の症状がIL−4の体内の局所及び/または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰IL−4濃度または活性に関連する疾患を意味する。IL−4媒介性疾患の例としては、癌(例えば、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫)、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症、肺炎症性障害(例えば、肺繊維症例えば、IPF)、COPD、及び肝繊維症が挙げられる。
「IL−5媒介性疾患」は、非定型の症状がIL−5の体内の局所及び/または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰IL−5濃度または活性に関連する疾患を意味する。IL−5媒介性疾患の例としては、癌(例えば、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫)、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症、肺炎症性障害(例えば、肺繊維症例えば、IPF)、COPD、及び肝繊維症が挙げられる。
「IL−13媒介性疾患」は、非定型の症状がIL−13の体内の局所及び/または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰IL−13濃度または活性に関連する疾患を意味する。IL−13媒介性疾患の例としては、癌(例えば、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫)、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症、肺炎症性障害(例えば、肺繊維症例えば、IPF)、COPD、及び肝繊維症が挙げられる。
用語「呼吸障害」には喘息、気管支炎(例えば、慢性気管支炎)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)(例えば、肺気腫(例えば、喫煙誘導肺気腫))、気道炎症を伴う病態、好酸球増多、繊維症及び過剰粘液産生、例えば、嚢胞性繊維症、肺繊維症(例えば、特発性肺繊維症)、及びアレルギー性鼻炎が含まれるが、これらに限定されない。気道炎症を特徴とすることができる疾患の例は、過剰気道分泌、及び喘息を含む気道閉塞、慢性気管支炎、気管支拡張症、及び嚢胞性繊維症である。
用語「好酸球障害」は、非定型の症状が好酸球の体内の局所または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰な好酸球数に関連する障害を意味する。過剰な好酸球の数または活性に関連する障害としては喘息(アスピリン過敏喘息を含む)、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎(季節性アレルギー性鼻炎を含む)、非アレルギー性鼻炎、喘息、重症喘息、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、小児脂肪便症、チャーグ−シュトラウス症候群(結節性動脈周囲炎の他にアトピー)、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球増多症候群、偶発性血管性浮腫を含む浮腫反応、蠕虫感染症、好酸球に保全的役割がある可能性がある場合、オンコセルカ皮膚炎及び好酸球関連消化管障害(好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎及び好酸球性結腸炎が挙げられるが、これらに限定されない)、鼻マイクロポリープ及びポリープ、アスピリン不耐症、喘息及び閉塞性睡眠時無呼吸が挙げられるが、これらに限定されない。このほか、好酸球由来分泌産物が、腫瘍の脈管形成及び結合組織形成の促進及び病状、例えば、慢性喘息、強皮症及び心内膜心筋繊維症にみられる線維性反応に関連している(Munitz A、Levi−Schaffer F.Allergy 2004;59:268〜75、Adamkoら、Allergy2005;60:13〜22、Oldhoffら、Allergy2005;60:693〜6)。他の例としては、癌(例えば、膠芽腫(例えば、多形成膠芽腫)、非ホジキンリンパ腫(NHL))、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症、肺繊維症(特発性肺繊維症(IPF)及び硬化症に続発する肺繊維症を含む)、COPD、肝繊維症が挙げられる。
本明細書に使用する場合、「阻害剤」は、所与のブロモドメイン含有タンパク質(例えばBRD7またはBRD9含有タンパク質)の発現及び/または機能を阻害することができる任意の化合物または治療を含み、遺伝子の転写、RNA成熟、RNA翻訳、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質をアセチル化リジン標的に結合すること(例えば、本明細書の実施例1に記載した阻害アッセイ)などを阻害する任意の化合物または治療を含む。したがって、「ブロモドメイン含有タンパク質BRD7を阻害すること」は、ブロモドメイン含有タンパク質BRD7の発現及び/または機能を阻害することを含む。同様に、「ブロモドメイン含有タンパク質BRD9を阻害すること」は、ブロモドメイン含有タンパク質BRD9の発現及び/または機能を阻害することを含む。例えば、特定の実施形態では、阻害剤は、例えば、本明細書に記載したアッセイを使用して測定できるほどブロモドメイン含有タンパク質の発現レベルまたは生物活性を阻害する。特定の実施形態では、阻害剤はブロモドメイン含有タンパク質の発現レベルまたは生物活性を少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも75%、または少なくとも90%阻害する。阻害剤は所与のブロモドメイン含有タンパク質(例えばBRD7またはBRD9含有タンパク質)の発現及び/または機能を阻害するによってIL−4、IL−5、及び/またはIL−13の産生を阻害する可能性がある。
阻害剤は天然または合成由来とすることができる。例えば、阻害剤は核酸、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、または有機化合物とすることができる。1つの実施形態では、阻害剤は、siRNA、shRNA、小分子、または大員環である。
BRD9阻害剤は、一般的にBRD9ブロモドメインのアセチルリジン結合部位に結合し、タンパク質がアセチルリジンまたはアセチルリジン修飾ペプチドに結合することを阻害する。アセチルリジンに接触すると予測されるBRD9の残基としては、SwissProtエントリQ9H8M2(図9)に従って残基に番号がつけられた(これらに限定されないが)Val165、Ala170、Tyr173、Ala212、Asn216、及びTyr222が挙げられる。残基Asn216が特に重要であり、BRD9阻害剤がAsn216と相互に作用しあうと予測される。さらに、BRD7阻害剤がBRD7ブロモドメインのアセチルリジン結合部位と相互に作用しあう。アセチルリジンに接触すると予測されるBRD7の残基としては、SwissProtエントリQ9NPI1(図9)に従って残基に番号がつけられた(これらに限定されないが)Val160、Ala165、Tyr168、Ala207、Asn211、及びTyr217が挙げられる。残基Asn211が特に重要であり、BRD7阻害剤がAsn211と相互に作用しあうと予測される。
1つの実施形態では、阻害剤は特異的なブロモドメイン含有タンパク質に選択的に結合する。例えば、阻害剤は、選択したアッセイ(例えば、本明細書の実施例3に記載したアッセイ)で他のブロモドメイン含有タンパク質より特定のブロモドメイン含有タンパク質に対して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、または少なくとも1,000倍選択的である。1つの実施形態では、阻害剤は、他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質BRD7に対して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、または少なくとも1,000倍選択的である。1つの実施形態では、阻害剤は、他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質BRD9に対して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、または少なくとも1,000倍選択的である。1つの実施形態では、阻害剤は、他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質BRD7及びBRD9に対して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、または少なくとも1,000倍選択的である。他のブロモドメイン含有タンパク質の非限定例としては、ASH1L、ATAD2、ATAD2B、BAZ1A、BAZ1B、BAZ2A、BAZ2B、BPTF、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD7、BRD8、BRD9、BRDT、BRPF1、BRPF3、BRWD1、BRWD3、CECR2、CREBBP(別名、CBP)、EP300、GCN5L2、KIAA2026、MLL、MLL4、PBRM、PCAF、PHIP、SMARCA2、SMARCA4、SP100、SP110、SP140、SP140L、TAF1、TAF1L、TRIM24、TRIM28、TRIM33、TRIM66、ZMYND8、及びZMYND11が挙げられる。タンパク質が1つ以上のブロモドメインを含有する場合、各ブロモドメインに対する選択性を測定することができる。
特定の実施形態では、阻害剤のBRD7及び/またはBRD9に対するIC50は、10μM未満、例えば、1μM未満、例えば、100nM未満、例えば、10nM未満、例えば、1nMである。
特定の実施形態では、阻害剤のBRD7及び/またはBRD9に対する結合親和性Kdは、1,000nm未満、例えば、500nM未満、例えば、100nM未満、例えば、50nM未満である。特定の実施形態では、阻害剤のBRD7及び/またはBRD9に対する結合親和性は500nM〜1pMである。
1つの実施形態では、阻害剤はブロモドメイン含有タンパク質の転写または対応メッセンジャーRNAの翻訳を阻害することができるアンチセンス核酸である。アンチセンス配列は、DNA RNA(例えば、siRNAまたはshRNA)、リボソームなどとすることができる。それは、一本鎖または二本鎖とすることができる。このほか、それはアンチセンス遺伝子によってコードされるRNAとすることができる。当業者が市販されているソフトウエアを使用して、BRD7またはBRD9の遺伝子配列に基づいてsiRNA分子を設計することができる。
1つの実施形態では、阻害剤はポリペプチド、例えば、ブロモドメイン含有タンパク質の領域を含有するペプチドとすることができる。ポリペプチドはこのほか、ブロモドメイン含有タンパク質に対する抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体、例えば、Fabフラグメント、CDR領域、または一本鎖抗体とすることができる。
用語「小分子」は、分子量が約1000amu未満である有機分子を含む。1つの実施形態では、小分子は分子量が約800amu未満とすることができる。もう1つの実施形態では、小分子は分子量が約500amu未満とすることができる。
本発明の特定の実施形態に使用することができる小分子としては、以下の化合物が挙げられる。
この小分子を調製するために使用することができる合成中間体及び方法が国際特許出願公開WO 2013/097601に記載されている。
用語「大員環」は、9または10個以上の原子を含有する環を有する有機分子を含む。1つの実施形態では、大員環は9〜約24個の原子を含有する環を有する。もう1つの実施形態では、大員環は約12〜約16個の原子を含有する環を有する。一般的に、小分子の分子量は約1200amu未満である。1つの実施形態では、大員環の分子量が約1000amu未満である。もう1つの実施形態では、大員環の分子量が約800amu未満である。
本明細書に使用する場合、「治療(treatment)」(及びその文法的変化、例えば、「治療する(treat)」または「治療すること(treating)」)は、治療される個人の自然経過を変えるための臨床的介入を意味し、予防のためまたは臨床病理学の経過の間に実施することができるものである。治療の望ましい効果としては、疾患の発症または再発を防ぐこと、症状の軽減、疾患の直接または間接的な病理的結果の減少、疾患進行率を低下させること、疾患病態の改善または好転、及び寛解または改善した予後が挙げられるが、これらに限定されない。
阻害剤が十分に塩基性または酸性である場合、阻害剤の薬剤学的に許容できる塩の投与が適切であるとすることができる。薬剤学的に許容できる塩の例は、生理学的に許容できるアニオンを形成する酸、例えば、トシラート、メタンスルホナート、アセタート、シトラート、マロナート、タルタラート、スクシナート、ベンゾアート、アスコルバート、α−ケトグルタラート、及びα−グリセロホスファートにより形成された有機酸添加塩である。このほか、好適な無機塩を形成することができ、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩が挙げられる。
薬剤学的に許容できる塩は、当技術分野でよく知られる標準的な方法を使用して、例えば、十分に塩基性の化合物、例えば、アミンと生理学的に許容できるアニオンをもたらす好適な酸を反応させることによって得ることができる。このほか、カルボン酸のアルカリ金属(例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム)またはアルカリ土類金属(例えばカルシウム)塩を生成することができる。
阻害剤は薬剤組成物として製剤化して、選択した投与の経路にふさわしいさまざまな形態、すなわち、経口または非経口、静脈内により、筋肉内、局所または皮下経路で哺乳動物宿主、例えば、ヒト患者に投与することができる。
したがって、阻害剤は、薬剤学的に許容できるビヒクル、例えば、不活性希釈剤または同化性食用キャリアと組み合わせて、例えば、経口で全身に投与することができる。阻害剤は、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができ、圧縮して錠剤にすることができ、または直接患者の食事の食品と混合することができる。経口治療的投与では、阻害剤は1つ以上の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラート剤などの形態で使用することができる。かかる組成物及び調剤は少なくとも0.1%の阻害剤を含有しなければならない。組成物及び調剤のパーセンテージは言うまでもなく、変えることができ、使いやすく所与の単位剤型の重量の約2〜約60%とすることができる。かかる治療に有用な組成物中の有効化合物の量は、効果的な投与濃度が得られるようにする。
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、このほか、結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン、賦形剤、例えば、リン酸ニカルシウム、崩壊剤、例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉、アルギン酸など、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムを含有することができ、甘味剤、例えば、蔗糖、果糖、乳糖もしくはアスパルテーム、または香味剤、例えば、ハッカ、冬緑油、またはチェリー香味剤を添加することができる。単位剤型がカプセルである場合、上記の型の物質に加えて、液体キャリア、例えば、植物油またはポリエチレングリコールを含有することができる。種々の他の物質が被覆剤として、またはその他の方法で固体単位剤型の物理的な形態を変更するように存在することができる。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルをゼラチン、ワックス、セラック、または糖などで被覆することができる。シロップまたはエリキシル剤が有効化合物、甘味剤として蔗糖または果糖、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、染料及び香味剤、例えば、チェリーまたはオレンジフレーバーを含有することができる。言うまでもなく、単位剤型を調製するのに使用される任意の物質は、薬剤学的に許容できるものにし、用いられる量で実質的に非毒性のものにしなければならない。また、持効性調剤及びデバイスに有効化合物を組み入れることができる。
阻害剤はこのほか、点滴または注射により静脈内にまたは胸腔内に投与することができる。水に、任意で非毒性界面活性剤と混合して有効化合物の溶液またはその塩を調製することができる。このほか、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン及びこれらの混合物、ならびに油に分散液を調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの調剤が微生物の成長を防止するために防腐剤を含有する。
注射または点滴に好適な薬剤剤型は、無菌の注射可能または点滴可能な溶液または分散液の即時調製に適合しており、任意でリポソームに封入した有効成分を含む無菌水性溶液もしくは分散液、または無菌粉末を含むことができる。いずれの場合でも、最終剤型は、製造及び貯蔵の条件下で、無菌、流動的であり及び安定していなければならない。液体キャリアまたはビヒクルは、溶媒または液体分散液媒質、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、非毒性グリセリルエステル、及び好適なこれらの混合物を含むことができる。例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合必要な粒子径の維持によって、または界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって微生物の作用を防止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝剤、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。組成物での吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンの使用により、注射可能組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
このほか、好適な溶媒中の必要な量の阻害剤を上に列挙した種々の他の成分に組み入れ、必要に応じて、濾過殺菌により無菌の注射可能溶液を調製する。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、あらかじめ無菌濾過した溶液に存在する任意の追加の所望の成分を加えて有効成分の粉末を生成する。
局所投与では、阻害剤は純粋形態で(すなわち、阻害剤が液体である場合)塗布することができる。しかし、一般的に皮膚病学的に許容できるキャリア(固体または液体とすることができる)と組み合わせて組成物または配合物として皮膚に阻害剤を投与することが好ましい。
有用な固体キャリアとしては、微粉固体、例えば、タルク、クレー、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどが挙げられる。有用な液体キャリアとしては、水、アルコールまたはグリコールまたは水−アルコール/グリコールブレンドが挙げられ、この中に本化合物を効果的な濃度で、任意で非毒性界面活性剤を使って溶解させる、または分散させることができる。補助剤、例えば、芳香剤及び追加の抗菌剤を添加して、所与の使用の特性を最適化することができる。包帯及び他の手当用品に含浸させるために使用される吸収パッドから、得られた液体組成物を塗布することができる、またはポンプ式またはエアゾールスプレーを使用して患部に吹き付けることができる。
このほか、増粘剤、例えば、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、改質セルロースまたは改質無機物質を液体キャリアとともに使用して、使用者の皮膚に直接塗布するために塗り広げられるペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することができる。
阻害剤を皮膚に塗布するために使用することができる有用な皮膚病学的組成物の例が、当技術分野で知られており、例えば、Jacquetら(米国特許第4,608,392号)、Geria(米国特許第4,992,478号)、Smithら(米国特許第4,559,157号)及びWortzman(米国特許第4,820,508号)を参照されたい。
本発明の特定の実施形態では阻害剤分子としてRNAi分子の使用が提供される。RNAi分子としては、siRNA、shRNA、マイクロRNA(miRNA)及び、例えば、特異的なmRNA分子を分解することによって、特に標的遺伝子からのタンパク質発現を阻害する他の小RNA分子が挙げられる。特定の実施形態では、RNAi分子は、BRD7及び/またはBRD9、例えば、BRD7及び/またはBRD9のアイソフォーム1を標的にする。特定の実施形態では、RNAi分子はヒトBRD7及び/またはBRD9を標的にする。当業者は市販されているソフトウエアを使用して、BRD7またはBRD9の遺伝子配列に基づいてRNAi分子(例えば、siRNA分子)を設計することができる。当技術分野で知られる方法を使用して、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはウイルストランスファーにより、RNAi分子を治療の必要な被験者に与える(例えば、投与する)ことができる。
動物モデルのin vitro活性、及びin vivo活性を比較することによって阻害剤の有用な用量を決定することができる。効果的な用量をマウス、及び他の動物、ヒトに外挿する方法が当技術分野で知られており、例えば、米国特許第4,938,949号を参照されたい。
治療に使用するために必要な阻害剤の量は、選択した特定の塩だけでなく、投与の経路、治療される病態の性質ならびに患者の年齢及び病態で変わり、最終的に担当医師または臨床医の裁量によるものとなる。
阻害剤は、使いやすく単位剤型に製剤化され、例えば、1単位剤型当たり5〜1000mg、使いやすく10〜750mg、最も使いやすく、50〜500mgの有効成分を含有する。1つの実施形態では、本発明は、かかる単位剤型に製剤化された阻害剤を含む組成物を提供する。
望ましい投与量は、使いやすく一回量または適切な間隔に投与される分割投与量、例えば、1日当たり2、3、4またはそれ以上の分割投与量(sub−dose)で示すことができる。分割投与量自体をさらに、例えば、いくつかのばらばらに厳密でなく間隔をあけた投与(例えば、吹入器による複数回の吸入または複数の小滴を眼球に差すことによる)に分割することができる。
これより以下の非限定例によって本発明を説明する。
(実施例1)
阻害試験
物質及び方法
T−Blasts調製及び再刺激
阻害試験
物質及び方法
T−Blasts調製及び再刺激
フィコール(GE Biosciences)密度勾配遠心分離法を使用して健常ボランティアの末梢血から末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。10ug/mlのPHA−P(Sigma L8754)を添加し、10%のFBS及びPen/Strepを含有するRPMI(Glutamax)(Invitrogen)を使用して1E6細胞/mlで4日間、細胞を培養した。4日後、細胞をプールし洗浄し、1E6細胞/mlで1日間、RPMI培地で、PHA−P(l0ug/ml)及びrhIL−2(R&D)Biosystems(202−IL)(4ng/ml)で、再植種した。再刺激のため細胞を洗浄し、凍結した。10%のFBS及びPen/Strepを含有するDMEM(Glutamax)(Invitrogen)で、1E6細胞/mlで再刺激した。決定点ごとに2E5細胞を使用した。DMSO(0.5%)または化合物(0.5%DMSO最終)の存在下で、5ug/mlの抗CD3(BD Bioscience 555336)及び5ug/mlの抗CD28(BD Bioscience 555726)とともに48時間、細胞を刺激した。Luminexプラットフォーム(Millipore)またはAlphaLISAプラットフォーム(Perkin Elmer)を使用して製造者の仕様書を使用して、サイトカイン濃度を測定した。
ヒトナイーブT細胞(CD4+CD45RA+)の分離及び分極条件
フィコール(GE Biosciences)密度勾配遠心分離法を使用して健常ボランティアの末梢血から末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。ヒトナイーブCD4+T細胞分離KitII(130−094−131、Miltenyi Biotech)を使用して、非Tヘルパー細胞及び記憶CD4+T細胞の磁気除去により、CD4+CD45RA+T細胞をPBMCから分離した。TH17分化の誘導のために、ヒトT−Activator CD3/CD28 Dynabeads(登録商標)(Invitrogen)を使用してナイーブCD4T細胞を活性化し、DMEM(Invitrogen)で、以下のカクテル:TGF−β(10ng/ml、R&D Biosystems)、IL−6(10ng/ml、R&D Biosystems)、IL−23(10ng/ml、R&D Biosystems)、IL−1β(10ng/ml、R&D Biosystems)、抗ヒトIFN−γ(10ug/ml、クローンB140、eBioscience)及び抗ヒトIL−4(10ug/ml、クローン8D4−8、eBioscience)の存在下で、6日間、培養した。TH1条件では、以下のカクテル:IL−12(10ng/ml、R&D Biosystems)、IL−2(20ng/ml、R&D Biosystems)、抗ヒトIL−4(l0ug/ml、クローン8D4−8、eBioscience)を使用した。TH2条件は、IL−4(20ng/ml、R&D Biosystems)、IL−2(10ng/ml、R&D Biosystems)、抗ヒトIFN−γ(10ug/ml、クローンB140、eBioscience)及び抗ヒトp40(5ug/ml、クローンC8.4eBiosciences)であった。iTregでは、以下、TGF−β(20ng/ml、R&D Biosystems)、IL−2(10ng/ml、R&D Biosystems)を使用した。それぞれの条件下で、6〜8日間、ナイーブCD4T細胞を分極した。
マウスナイーブT細胞(CD4+CD62L+)の分離及び分極条件
6〜8週齢の雌BalbCマウスの脾臓からCD4+CD62L+ナイーブT細胞を分離した。70μmナイロン細胞ストレーナ(BD Bioscience)を使用して、脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。塩化アンモニウム溶解緩衝液(R7757、Sigma)を使用して赤血球を溶解し、cRPMI10%FBS(61870−036、Invitrogen)で洗浄した。磁気活性化した細胞選別ビーズ(130−093−227、Miltenyi Biotec)を使用して、ナイーブCD4T細胞を精製した。選別したナイーブ細胞の純度は90%超であった。6ウェルプレートでナイーブCD4T細胞を培養し(1x106細胞/ml)、抗CD3/CD28被覆ビーズ(Dynabeads 11452D、Invitrogen)で、4日間、TH2分極条件:IL−4 10ng/ml(214−14、Pepro)、IL−2 10ng/ml(402−ML、R&D Biosystems)、10μg/ml抗IFN−γ抗体(554408、BD Pharmingen)及び5ug/ml抗IL−12抗体(554475、BD Pharmingen)下で、刺激した。
細胞生存性
存在するATP(G7572、Promega)の定量化に基づいて生細胞数を決定するCell Titre Glo(登録商標)を使用して、細胞生存性を評価した。
ヒトTh2細胞の再刺激
6日間分化したTh2細胞を洗浄し、10%FBS及びPen/Strepを含有する通常の培地DMEM(Glutamax)(Invitrogen)とインキュベータにONで放置した。次の日、決定点ごとに2E5細胞を使用した。DMSO(0.5%)または化合物(0.5%DMSO最終)の存在下で、5ug/mlの抗CD3(BD Bioscience 555336)及び5ug/mlの抗CD28(BD Bioscience 555726)とともに24または48時間、細胞を刺激した。Luminexプラットフォーム(Millipore)またはAlphaLISAプラットフォーム(Perkin Elmer)を使用して製造者の仕様書を使用して、サイトカイン濃度を測定した。
マウスTh2細胞の再刺激
4日間分化したTh2細胞を洗浄し、10%FBS及びPen/Strepを含有する通常の培地RPMI(Glutamax)(Invitrogen)とインキュベータにONで放置した。次の日、決定点ごとに2E5細胞を使用した。DMSO(0.5%)または化合物(0.5%DMSO最終)の存在下で、抗CD3/CD28被覆ビーズ(Dynabeads 11452D、Invitrogen)(1:1比)で、48時間、細胞を刺激した。Luminexプラットフォーム(Millipore)を使用して、サイトカイン濃度を測定した。
リアルタイムRT−PCR
製造者のプロトコルに従ってRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して、細胞からRNAを精製した。SuperScript III逆転写酵素を使用して、第一鎖cDNAを合成した。Stratagene MxPro3005pで、タンパク質IL−5、IL−13をコードする転写物のためのFastStart Universalマスターミックス(Roche)及びTaqmanプローブ、ならびに標準化のために使用したGAPDHを使用して、定量的リアルタイムPCRを実施した。
細胞内サイトカイン染色
細胞内染色のために、5時間、Golgiplug(BD Bioscience)を添加して、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)(Sigma、50ng/ml)及びイオノマイシン(Sigma、500ng/ml)で、細胞を再刺激した。再刺激後、細胞を洗浄し、続いてCytofix/Cytoperm Kit(554714、BD Bioscience)を使用して固定化、透過化し、ヒトIL−17A(560487、eBioscience)、IFNγ(17−7319、eBioscience)、IL−4(12−7049−42、eBioscience)、Foxp3(12−4777−41、eBioscience)を検出するため、細胞内サイトカインについて染色した。Foxp3細胞内染色のために、Foxp3/転写因子染色キット(00−5523−00、eBioscience)を使用して、細胞を固定化、透過化した。FACS Calibur(BD Bioscience)上に細胞を得て、FlowJoソフトウエアを使用してデータを分析した。
DSFアッセイ法
BRD7/9DSFプロトコル:化合物(10mM)またはDMSOをDSFアッセイ緩衝液(50mM HEPES、pH8.0、100mM NaCl、0.5mM TCEP)中で希釈し、0.5mM化合物溶液または5%DMSOを生成した。DSFアッセイ緩衝液中にタンパク質/色素ミックス(12.5X SYPRO(登録商標)Orange及びブロモドメインタンパク質、BRD7用6.25mM及びBRD9用7.5mM)を調製する。3mlの0.5mM化合物溶液または5%DMSOを384ウェルPCRプレートに移す。12mlのタンパク質/色素ミックスを化合物プレートに添加し、プレートを密封し、1000rpmで1分間、回転させた。プレートを、25℃〜85℃で、ランプ速度0.05℃/秒でLightCycler480IIにかけた。LightCycler480SW1.5.0.のTm Callingモジュ−ルで、データを分析した。
方法及び結果
ヒストンの共有結合修飾が、遺伝子発現の制御の基本的機序、及び真核細胞で行われる主要な後生機序の1つである(Kouzarides、Cell 128: 693〜705 (2007))。特異的な転写状態が基本的な細胞過程、例えば、細胞型の指定、分化系列決定、細胞活性化及び細胞死を定めるため、それらの異常調節が種々の疾患の中心にある(Medzhitovら、Nat.Rev.Immunol.9:692〜703(2009);Portelaら,Nat.Biotech.28:1057〜1068(2010))。遺伝子発現の後生制御の基本的な構成要素が、かかる修飾に結合する特殊モチーフを有するタンパク質によるヒストン修飾の解釈である。このうち、ブロモドメインが発生してアセチル化ヒストンに結合し、これによりクロマチン構造及び遺伝子転写の間で基本的な結合となる(Fillipakoppoulosら、Cell 149:214〜231(2012))。2つのタンパク質、BRD7及びBRD9(BRD7/9と記載することができる)にあるブロモドメインに薬理学的に干渉することによって、免疫媒介性疾患を治療する方法が、本明細書に記載されている。
BRD7/9ブロモドメインが免疫媒介性疾患の治療の標的となるかどうかを検討するため、BRD7/9ブロモドメインに結合するように設計した強力な及び選択的小分子阻害剤化合物を使用することの機能的影響、これによりクロマチン中のアセチル化ヒストンと結合することを妨げることを検討した。これらの実験では、ヒトCD4+T細胞を、この細胞が自己免疫及び炎症に重要な役割を担うことが知られているため、使用した。小分子阻害剤がオフターゲット効果を有することができるため、かかるオフターゲット効果を除外するように、さまざまな生化学的力価を有する異なる化学系列の化合物のパネル(以下の表1を参照)を試験した。
第1の実験セットでは、健常ドナーからヒト末梢血単核細胞(PBMC)を精製し、PHA−p及びヒト組み替えインターロイキン(IL)−2の存在下で培養した。この方法はPBMC調製物に存在する全CD4+T細胞の活性化及び膨張を誘導し、元のPBMC調製物(T blasts)に存在する全サブセットを示す事前に活性化したT細胞の高富化混合物を与える。抗CD3及び抗CD28抗体の組み合わせを使用したT細胞レセプター(TCR)を介したかかる細胞の活性化では、培地で容易に測定することができるサイトカインの発現及び分泌がもたらされる。図1aに示したように、BRD7/9阻害剤BRD7/9(1)、BRD7/9(2)及びBRD7/9(3)が、Luminexプラットフォームを使用して測定したとおり、用量依存的に、IL−4及びIL−5の産生を低下させるが、他のサブセットを示すサイトカイン、例えば、インターフェロン−γ(IFN−γ)またはIL−17Fの産生を低下させないことが示された。腫瘍壊死因子(TNF)−α、ジェネリック炎症促進性サイトカインは阻害されなかった。重要なことに、細胞生存性(ATP産生として測定した)が、いずれの化合物にも影響を受けなかった(図1a)。さらに、9つの追加のサイトカインの広いパネルへのこれらの阻害剤の影響を検討した。化合物全体に、これらのサイトカインのいずれに対する有意で安定した効果がみられなかった(図1b)。
IL−4及びIL−5(IL−13とともに)は、CD4+T細胞のTヘルパー(Th)型2サブセットによって選択的に生成されたサイトカインであり、アレルギー反応、例えば、喘息及びアレルギー性鼻炎を媒介することが知られている(Fanta、Asthma.New Eng.J.Med.360:1002〜1014(2009))。BRD7/9阻害剤が安定して及び選択的にこれらのTh2サイトカインを阻害したため、BRD7/9阻害がTh2細胞のサイトカイン産生を阻害する効率的な方法であるとすることができると提案された。この仮説を試験するため、精製したナイーブヒトCD4+T細胞からTh2細胞を調製した。これらのナイーブT細胞は、そのマーカーCD45RAの表面発現により同定し、及びその後、方法の節に記載したように、サイトカインの標準的及び確立した混合により、in vitroで分化させることができる。図2aに示したように、BRD7/9阻害剤BRD7/9(3)及びBRD7/9(4)が、用量依存的に、IL−5の産生を低下させることが示された。図1に示したデータのとおり、TNF−αまたは細胞生存性がいずれの化合物にも影響されなかった。9つの追加のサイトカインの広いパネルでは、図1bに記載したデータのとおり、IL−10、もう一つのTh2富化サイトカインを除いて、試験したいずれの化合物の影響もみられなかった(図2b)。図3に示したように、BRD7/9阻害剤BRD7/9(3)及びBRD7/9(4)が、Luminex及びAlphaLISA プラットフォームを使用して測定したとおり、用量依存的に、IL−5の産生を低下させることが示された。
本明細書に示したデータがTh2サイトカイン産生にBRD7/9ブロモドメインの重要な役割を示すため、及びブロモドメインがクロマチンへの結合を媒介するタンパク質モチーフであるため、BRD7/9ブロモドメイン阻害がTh2サイトカインをコードする遺伝子の転写に影響を与える可能性があるという仮説を立てた。図4に示したように、BRD7/9阻害剤BRD7/9(4)、BRD7/9(5)及びBRD7/9(6)がIL−5及びIL−13(標準的なTh2サイトカイン)の遺伝子転写物の蓄積量を低下させることが示された。
さらにTh2サイトカイン産生への影響がBRD7/9ブロモドメイン阻害によって媒介されたことを示すために、生化学的力価が異なる阻害剤の大きなパネルの影響を検討した追加の実験セットを実施した。図5に示したように、全化合物にIL−5及びIL−13の産生への選択的影響があった。この影響は用量依存的であり、生化学的力価に比例した大きさであった。
Th2細胞にみられたBRD7/9ブロモドメイン阻害の効果がこの系統に選択的であったかどうかを検討した。Th1及びTh17細胞にナイーブCD4+T細胞を分化した、及びそのサイトカイン特性、特に、標準的なサイトカインのその特性:Th1細胞中のインターフェロン−γ(IFN−γ)、及びTh17細胞中のIL17Aへの阻害剤の効果を検討した。図6に示したように、BRD7/9(3)及びBRD7/9(4)阻害剤がTh1細胞中のIFN−γに影響を与えなかった。同様に、BRD7/9(4)阻害剤のIL−17Aへの影響がTh17細胞にみられず、BRD7/9(3)のそのサイトカインへのきわめて少ない影響だけがみられた。
まとめると、ここまでに記載したデータがBRD7/9ブロモドメインの阻害が選択的及び用量依存的にTh2−特異的なサイトカインIL−4、IL−5及びIL−13の阻害をもたらすことを示す。
BRD7/9ブロモドメイン阻害が主要なCD4+T細胞サブセット、Th1、Th2、Th17及びT調節(Treg)細胞、のいずれかの分化に影響を与えたかどうかを検討した。その目的のため、方法の節に記載したサイトカインの好適な標準的及び確立したカクテルによりヒトナイーブCD4+T細胞を分化した、及び阻害剤BRD7/9(3)及びBRD7/9(4)の効果を検討した。IFN−γ発現細胞(Th1)、IL−4発現細胞(Th2)、IL−17A発現細胞(Th17)及びFoxP3発現細胞(Treg)を数え上げる蛍光活性化細胞分取法(FACS)を使用して分化を評価した。図7に示したように、ナイーブT細胞がTh1、Th2、Th17またはTregに分化する間にBRD7/9ブロモドメイン阻害の機能的影響がみられなかった。特に、Th1培養物中のIFN−γ発現細胞、またはTh2培養物中のIL−4発現細胞、またはTh17培養物中のIL−17A発現細胞、またはTreg培養物中のFoxP3発現細胞の数への有意な効果がみられなかった。
最後に、本明細書に報告した試験に含まれないBRD7/9ブロモドメインの重要な役割は他の種、例えば、マウスに保存されたかどうかを検討した。4日間、マウスナイーブT細胞をTh2細胞に分化し、その後、40時間、抗CD3及び抗CD28で再刺激した。図8に示したように、BRD7/9ブロモドメイン阻害が標準的なTh2サイトカインIL−4、IL−5及びIL−13の有意な及び用量依存的な阻害をもたらしたが、ジェネリック炎症促進性サイトカインTNF−αはわずかに影響を受けただけであった。細胞生存性への有意な効果を示した化合物はなかった(図8)。
要約すると、本明細書に記載したように、BRD7/9ブロモドメインがヒト及びマウスTh2サイトカイン、特にIL−4、IL−5及びIL−13の発現に予期しないが重要な役割を担うが、他のサイトカインの発現では不可欠ではないことを示した。さらに、BRD7/9ブロモドメイン阻害では、試験したいずれのT細胞サブセット(Th1、Th2、Th17及びTreg)の分化に効果がみられなかった。Th2サイトカインがアレルギー性疾患を媒介するため、かかる疾患(これらに限定されないが、喘息、好酸球重症喘息、好酸球性症候群、アレルギー性鼻炎及びアレルギー性皮膚炎などが挙げられる)を治療する効果的な方法が発見されている。
以下の表1が、BRD7/9化合物の生化学的データを提供する。以下に記載したAlphaLISAアッセイ法を使用して、表1のIC50値を生成した。
IC50値を測定するためのAlphaLISAアッセイ法
IC50値を測定するためのAlphaLISAアッセイ法
以下の反応緩衝液を調製した:
1X反応緩衝液
溶液A(1ウェル当たり6.3uL)及び溶液B(1ウェル当たり6.3uL)を混合し、20分間、室温でインキュベートした。うす暗い光で、6.3uLのビーズC溶液を添加した。マイクロプレートTopSealで得られた溶液に蓋をし、90分間、暗所で、室温でインキュベートした。Envisionでプレートを読んだ(プロトコル:修正されたAlphaLisa__ProxiPlate Flatfieldを使用して)。手作業で、またはActivity base(Abase)を使用して、または手作業でデータを分析した。手作業で処理したデータでは一般的に、GraphPad Prism5及び4つのパラメーターの用量−反応当てはめを使用してIC50データを生成した。結果を表1に提供する。
表1.生化学的なin vitroでの力価を含む本試験に使用されるBRD7/9化合物のリスト。
溶液A(1ウェル当たり6.3uL)及び溶液B(1ウェル当たり6.3uL)を混合し、20分間、室温でインキュベートした。うす暗い光で、6.3uLのビーズC溶液を添加した。マイクロプレートTopSealで得られた溶液に蓋をし、90分間、暗所で、室温でインキュベートした。Envisionでプレートを読んだ(プロトコル:修正されたAlphaLisa__ProxiPlate Flatfieldを使用して)。手作業で、またはActivity base(Abase)を使用して、または手作業でデータを分析した。手作業で処理したデータでは一般的に、GraphPad Prism5及び4つのパラメーターの用量−反応当てはめを使用してIC50データを生成した。結果を表1に提供する。
表1.生化学的なin vitroでの力価を含む本試験に使用されるBRD7/9化合物のリスト。
(実施例2)
阻害剤治療の際のBRD9局在化を視覚化するためのアッセイ
阻害剤治療の際のBRD9局在化を視覚化するためのアッセイ
1ウェル当たり20,000細胞で誘導性BRD9蛍光融合タンパク質を保持する安定した細胞系を植種した。16時間、37℃でドキシサイクリン2μg/mlの添加により融合の発現を誘導した。その後、60分間、室温でドキシサイクリンを含まない培地に試験阻害剤を添加した。4%PFAで細胞を固定化し、その後、30分間、ヘキスト染色した。緑及び青チャンネルの両者の画像を得た。選択した最小の大きさの緑BRD9点を「ピット」として同定し、阻害剤への反応を「1細胞当たりのピット」として示した。
図10A〜10Cは、BRD9融合タンパク質が主に阻害剤のないクロマチンに局在化されていること、及び化合物の添加の際に大きな点にみられることを示している。図11は、BRD9の存在下で、化合物BRD7/9(8)を使用して、生成した用量−反応曲線を示す。
(実施例3)
他のブロモドメインを上回るBRD9に対する選択性の決定
(実施例3)
他のブロモドメインを上回るBRD9に対する選択性の決定
BRD9に対して上にに記載したものとほぼ同じプロトコル(実施例1)を使用して、AlphaLisa_により化合物BRD7/9(8)が種々ブロモドメインへ結合することを試験した。表2の選択性比率は、示したブロモドメインのIC50をBRD9のIC50で割ったものである。
表2.結合選択性
表2.結合選択性
理解を明確にするため例証及び例示により本発明をある程度詳細に記載したが、説明及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。本明細書に引用した全特許及び科学文献の開示は、それらの全体が明確に参照として組み入れられる。
Claims (73)
- 治療に有効な量のBRD7またはBRD9の阻害剤を哺乳動物に投与することを含む前記哺乳動物のTH2疾患を治療する方法。
- 前記阻害剤がBRD7を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤がBRD9を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤がBRD7及びBRD9を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤がブロモドメインに結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤がBRD7またはBRD9のアイソフォーム1に結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤がBRD7及びBRD9のアイソフォーム1に結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記阻害剤がsiRNA、shRNA、小分子、または大員環である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TH2疾患が過剰TH2サイトカインに関連する免疫関連疾患または障害である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TH2疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−シュトラウス症候群、及び鼻ポリープから選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TH2疾患が呼吸障害である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TH2疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、及び気道炎症を伴う病態から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TH2疾患が好酸球障害である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記好酸球障害が喘息、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、小児脂肪便症、チャーグ−シュトラウス症候群、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球増多症候群、浮腫反応、蠕虫感染症、オンコセルカ皮膚炎及び好酸球関連消化管障害から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記好酸球障害が好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎及び好酸球性結腸炎、鼻マイクロポリープ及びポリープ、アスピリン不耐症、喘息及び閉塞性睡眠時無呼吸から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記阻害剤が他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質BRD7に対して少なくとも5倍選択的である、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤が他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質BRD9に対して少なくとも5倍選択的である、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤が他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質BRD7及びBRD9に対して少なくとも5倍選択的である、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤結合が他のブロモドメインよりBRD7に対して最少5倍選択的である、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤結合が他のブロモドメインよりBRD9に対して最少5倍選択的である、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤結合が他のブロモドメインよりBRD7及びBRD9に対して最少5倍選択的である、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤がIL−4、IL−5、またはIL−13の産生を阻害する、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- TH2疾患の予防的または治療的処置のためのBRD7またはBRD9の阻害剤。
- 前記阻害剤がBRD7を阻害する、請求項23に記載の阻害剤。
- 前記阻害剤がBRD9を阻害する、請求項23に記載の阻害剤。
- 前記阻害剤がBRD7及びBRD9を阻害する、請求項23に記載の阻害剤。
- 前記薬剤がブロモドメインに結合する、請求項23から26のいずれか一項に記載の阻害剤。
- 前記薬剤がBRD7またはBRD9のアイソフォーム1に結合する、請求項23から26のいずれか一項に記載の阻害剤。
- 前記薬剤がBRD7及びBRD9のアイソフォーム1に結合する、請求項23から26のいずれか一項に記載の阻害剤。
- 前記阻害剤がsiRNA、shRNA、小分子、または大員環である、請求項23から29のいずれか一項に記載の阻害剤。
- 前記TH2疾患が過剰TH2サイトカインに関連する免疫関連疾患または障害である、請求項23から30のいずれか一項に記載の阻害剤。
- 前記TH2疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−シュトラウス症候群、及び鼻ポリープから選択される、請求項23から30のいずれか一項に記載の阻害剤。
- 前記TH2疾患が呼吸障害である、請求項23から30のいずれか一項に記載の阻害剤。
- 前記TH2疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、及び気道炎症を伴う病態から選択される、請求項23から30のいずれか一項に記載の阻害剤。
- TH2疾患の治療のための薬剤を調製するためのBRD7またはBRD9の阻害剤の使用。
- 前記阻害剤がBRD7を阻害する、請求項35に記載の使用。
- 前記阻害剤がBRD9を阻害する、請求項35に記載の使用。
- 前記阻害剤がBRD7及びBRD9を阻害する、請求項35に記載の使用。
- 前記薬剤がブロモドメインに結合する、請求項35から38のいずれか一項に記載の使用。
- 前記薬剤がBRD7またはBRD9のアイソフォーム1に結合する、請求項35から38のいずれか一項に記載の使用。
- 前記薬剤がBRD7及びBRD9のアイソフォーム1に結合する、請求項35から38のいずれか一項に記載の使用。
- 前記阻害剤がsiRNA、shRNA、小分子、または大員環である、請求項35から41のいずれか一項に記載の使用。
- 前記TH2疾患が過剰TH2サイトカインに関連する免疫関連疾患または障害である、請求項35から42のいずれか一項に記載の使用。
- 前記TH2疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−シュトラウス症候群、及び鼻ポリープから選択される、請求項35から42のいずれか一項に記載の使用。
- 前記TH2疾患が呼吸障害である、請求項35から42のいずれか一項に記載の使用。
- 前記TH2疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、及び気道炎症を伴う病態から選択される、請求項35から42のいずれか一項に記載の使用。
- BRD7またはBRD9の阻害剤及び薬学的許容キャリアを含む、TH2疾患の治療に使用するための薬剤組成物。
- 前記阻害剤がBRD7を阻害する、請求項47に記載の薬剤組成物。
- 前記阻害剤がBRD9を阻害する、請求項47に記載の薬剤組成物。
- 前記阻害剤がBRD7及びBRD9を阻害する、請求項47に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤がブロモドメインに結合する、請求項47から50のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤がBRD7またはBRD9のアイソフォーム1に結合する、請求項47から50のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤がBRD7及びBRD9のアイソフォーム1に結合する、請求項47から50のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
- 前記阻害剤がsiRNA、shRNA、小分子、または大員環である、請求項47から53のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
- TH2疾患を治療するのに有用な化合物を同定する方法であって、前記化合物がBRD7またはBRD9を阻害するかどうかを決定することを含む、前記方法。
- 前記化合物がBRD7を阻害するかどうかを決定することを含む、請求項55に記載の方法。
- 前記化合物がBRD9を阻害するかどうかを決定することを含む、請求項55に記載の方法。
- 前記決定することが前記化合物をBRD7またはBRD9と接触させること、及び前記BRD7またはBRD9の活性が低下するかどうかを測定することを含む、請求項55から57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物をBRD7と接触させる、請求項58に記載の方法。
- 前記化合物をBRD9と接触させる、請求項58に記載の方法。
- 前記測定することが実施例1に記載したとおりに実施される、請求項58に記載の方法。
- 哺乳動物がIL−4、IL−5、またはIL−13を産生することを阻害する方法であって、前記哺乳動物にBRD7またはBRD9の阻害剤を投与することを含む、前記方法。
- 前記阻害剤がBRD7を阻害する、請求項62に記載の方法。
- 前記阻害剤がBRD9を阻害する、請求項62に記載の方法。
- 前記阻害剤がBRD7及びBRD9を阻害する、請求項62に記載の方法。
- 前記阻害剤がブロモドメインに結合する、請求項62から65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記阻害剤がBRD7またはBRD9の少なくともアイソフォーム1に結合する、請求項62から66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記阻害剤がBRD7及びBRD9の少なくともアイソフォーム1に結合する、請求項62から66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記阻害剤がsiRNA、shRNA、小分子、または大員環である、請求項62から68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物は、かかる治療の必要な哺乳動物である、請求項1から22または62から69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記阻害剤のBRD7及び/またはBRD9に対するIC50が、10μM未満、例えば、1μM未満、例えば、100nM未満、例えば、10nM未満、例えば、1nMである、請求項1から70のいずれか一項に記載の方法、阻害剤、使用または組成物。
- 前記阻害剤のBRD7及び/またはBRD9に対する結合親和性Kdが、1,000nm未満、例えば、500nM未満、例えば、100nM未満、例えば、50nM未満である、請求項1から71のいずれか一項に記載の方法、阻害剤、使用または組成物。
- 前記阻害剤のBRD7及び/またはBRD9に対する結合親和性が500nM〜1pMである、請求項1から71のいずれか一項に記載の方法、阻害剤、使用または組成物。
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