PL217872B1

PL217872B1 - Pochodna eteru alkilowego lub jej sól, stanowiąca 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynol lub jego sól

Info

Publication number: PL217872B1
Application number: PL402986A
Authority: PL
Inventors: Akihito Saitoh; Noboru Iwakami; Tamotsu Takamatsu
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2014-08-29
Also published as: IL161308A0; HU230407B1; PL369601A1; EP1437353A1; PL402986A1; CN101643470A; CA2464358C; HUP0500017A2; US20090111992A1; EP1437353B1; PL215264B1; ES2287324T3; WO2003035647A1; CN100500662C; US20050070521A1; BRPI0213393B8; AU2002344107B2; NZ532328A; JPWO2003035647A1; US20060194781A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna eteru alkilowego lub jej sól, stanowiąca 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynol lub jego sól.

Demencja dzieli się na demencję naczyniowo-mózgową i demencję neurodegeneratywną, a do leczenia tych chorób stosuje się różne środki takie jak leki poprawiające przepływ krwi mózgowej i leki poprawiające czynność umysłu.

Plamy starcze charakterystyczne dla choroby Alzheimer'a, która jest najbardziej typową demencją degeneratywną, składają się głównie z β proteiny amyloidowej (Αβ) wywodzącej się z β amyloidowego prekursora proteiny. Αβ uważana jest za substancję, która odkłada się na neuronach lub naczyniach mózgu co wywołuje chorobę taką jak demencja. Ponadto wiadomo, iż sama Αβ uszkadza neurony. Inhibitory neurotoksyczności wywołanej przez Αβ badane są jako środki lecznicze w przypadku choroby Alzheimer'a.

Jako związki, które mają aktywność inhibitującą neurotoksyczność wywołaną przez Αβ znane są, na przykład, pochodne 1,2-etanodiolu ujawnione w japońskich zgłoszeniach patentowych o nr nr JP-A-3-232830 i JP-A-4-95070, oraz pochodne N-alkoksyalkilo-N,N-dialkiloaminy ujawnione w międzynarodowej publikacji patentowej nr WO-00/76957.

Pochodne 1,2-etanodiolu ujawnione w japońskich zgłoszeniach patentowych nr JP-A-3-232830 i JP-A-4-95070, a w szczególności chlorowodorek (R)-1-(benzo[b]tiofen-5-ylo)-2-[2-(N,N-dietyloamino)etoksy]etanolu, wykazuje działanie ochronne przed neuronalną śmiercią spowodowaną przez Αβ (Society for Neuroscience, Abstracts, Vol. 24, Part 1, str. 228, 1998) i działanie zwiększające aktywność czynnika wzrostu nerwów (NGF) (WO 96/12717) i dlatego jest użytecznym środkiem leczniczym w chorobach nerwów ośrodkowych i obwodowych. Jednakże, pożądane są dalsze badania nad związkami o wyższej aktywności ochronnej neuronów i wyższej aktywności przyspieszającej regenerację nerwów, które to właściwości muszą mieć leki stosowane w leczeniu chorób nerwów ośrodkowych i obwodowych.

W wyniku prowadzonych badań mających na celu rozwiązanie powyższych problemów stwierdzono, że istnieją związki, które nie tylko mają aktywność antagonistyczną wobec wapnia, lecz także mają aktywność inhibitującą neurotoksyczność wywołaną przez Αβ, a do nich należą pochodne eteru alkilowego z aktywnością antagonistyczną wobec wapnia, opisane w publikacji nr WO 99/31056.

W wyniku dalszych badań obecni wynalazcy stwierdzili, że 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynol lub jego sól, ma działanie ochronne dla neuronów, ma działanie przyspieszające regenerację nerwu i działanie wzmagające wzrost aksonu, ma doskonałą oporność na zmiany metabolizmu i jest użytecznym środkiem leczniczym stosowanym w chorobach nerwów ośrodkowych i obwodowych, co spełnia warunki dla zgłoszenia obecnego wynalazku.

Wynalazek zostanie niżej wyjaśniony szczegółowo.

Sól 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-yIo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu obejmuje zwykle znane sole z grupami zasadowymi takie jak grupa aminowa i podobne oraz sole z grupami kwasowymi takie jak grupa hydroksylowa, grupa karboksylowa i podobne.

Sole z grupami zasadowymi obejmują, na przykład, sole z kwasami mineralnymi takimi jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas azotowy, kwas siarkowy i podobne, sole z organicznymi kwasami karboksylowymi takimi jak kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas szczawiowy, kwas fumarowy, kwas maleinowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas asparaginowy, kwas trichlorooctowy, kwas trifIuorooctowy i podobne, sole z kwasami sulfonowymi takimi jak kwas metanosulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas mezytylenosulfonowy, kwas naftalenosulfonowy i podobne.

Sole z grupami kwasowymi obejmują, na przykład, sole z metalami alkalicznymi takimi jak sód, potas i podobne, sole z metalami ziem alkalicznych takimi jak wapń, magnez i podobne, sole amoniowe i sole z zasadami organicznymi zawierającymi azot takimi jak trimetyloamina, trietyloamina, tributyloamina, pirydyna, N,N-dimetyloanilina, N-metylopiperydyna, N-metylomorfolina, dietyloamina, dicykloheksyloamina, prokaina, dibenzyloamina, N-benzylo-3-fenetyloamina, 1-efenamina, N,N'-dibenzyloetylenodiamina i podobne.

Z wyżej wymienionych soli, korzystne sole są solami dopuszczalnymi farmakologicznie.

Gdy 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynol lub jego sól ma izomery (na przykład, izomery optyczne, izomery geometryczne i tautomery), wynalazek obejmuje te wszystkie izomery, a pochodna lub jej sól może być w formie wodzianu lub solwatu albo w formie krystalicznej.

PL 217 872 B1

Związek według wynalazku można preparować w formę farmaceutycznych preparatów takich jak preparaty doustne (na przykład, tabletki, kapsułki, proszki, granulki, bardzo drobne granulki, pigułki, zawiesiny, emulsje, roztwory i syropy), zastrzyki, czopki, preparaty do stosowania zewnętrznego (na przykład, maści i przylepce), aerozole i tym podobne, stosując mieszanie tych związków z różnymi dodatkami farmaceutycznymi takimi jak zaróbki, lepiszcza, środki rozdrabniające, środki hamujące rozdrabnianie, inhibitory adhezji-zestalania, środki smarne, nośniki absorpcji-adsorpcji, rozpuszczalniki, wypełniacze, środki izotoniczne, rozcieńczalniki, środki emulgujące, środki zawiesinowe, środki zagęszczające, środki powlekające, środki przyspieszające absorpcję, przyspieszacze żelowania-koagulacji, stabilizatory światła, środki konserwujące, środki osuszające, stabilizatory emulsji-zawiesiny-dyspersji, ochraniacze barwy, inhibitory odtleniania-utleniania, środki słodzące-smakowe, środki barwiące, środki pieniące, środki zapobiegające pienieniu, środki uspokajające, środki antystatyczne, środki buforujące i utrzymujące pH, i tak dalej.

Powyższe różne środki farmaceutyczne otrzymuje się konwencjonalnymi sposobami.

Stałe doustne środki farmaceutyczne takie jak tabletki, proszki i granulki wytwarza się konwencjonalnymi sposobami, stosując farmaceutyczne dodatki do stałych preparatów, na przykład, zaróbki takie jak laktoza, sacharoza, chlorek sodu, glukoza, skrobia, węglan wapnia, kaolin, krystaliczna celuloza, bezwodny drugorzędowy fosforan wapnia, częściowo wstępnie żelowana skrobia, skrobia kukurydziana, kwas alginowy i tym podobne, lepiszcza takie jak zwykły syrop, roztwór glukozy, roztwór skrobiowy, roztwór żelatyny, alkohole poliwinylowe, etery poliwinylowe, poliwinylopirolidony, karboksymetyloceluloza, szelak, metyloceluloza, etyloceluloza, alginian sodowy, guma arabska, hydroksypropylometyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, woda, etanol i tym podobne, środki rozdrabniające takie jak wysuszona skrobia, kwas alginowy, proszek agarowy. Skrobia, poprzecznie usieciowane poliwinylopirolidony, sól sodowa poprzednie usieciowanej karboksymetylocelulozy, sól wapniowa karboksymetylocelulozy, skrobiowy glikolan sodowy i tym podobne, środki hamujące rozkruszanie takie jak alkohol stearylowy, kwas stearynowy, masło kakaowe, uwodorniony olej i tym podobne, inhibitory zespalania-adhezji takie jak krzemian glinu, wodorofosforan wapnia, tlenek magnezu, talk, bezwodnik kwasu krzemowego i tym podobne, środki smarne takie jak wosk karnauba, bezwodnik „lekkiego kwasu krzemowego, krzemian glinu, krzemian magnezu, uwodorniony olej, pochodne uwodornionego oleju roślinnego, olej sezamowy, biały wosk pszczeli, tlenek tytanu, suchy żel wodorotlenku glinu, kwas stearynowy, węglan wapnia, stearynian magnezu, talk, wodorofosforan wapnia, laurylosiarczan sodowy, glikole polietylenowe i tym podobne, przyspieszacze absorpcji takie jak czwartorzędowe sole amoniowe, laurylosiarczan sodowy, mocznik, enzymy i tym podobne i nośniki absorpcji-adsorpcji takie jak skrobia, laktoza, kaolin, benzotin, bezwodnik kwasu krzemowego, uwodniony ditlenek krzemu, metakrzemian magnezowoglinowy, koloidalna krzemionka i tym podobne.

Jeśli to konieczne, można wytwarzać tabletki pokryte konwencjonalną powłoką i otrzymać tabletki powleczone warstwą cukrową, tabletki powleczone żelatyną, tabletki powleczone warstwą zabezpieczającą przed działaniem soku żołądkowego, tabletki powleczone warstwą zabezpieczającą przed działaniem płynu w jelitach i tabletki powleczone filmem rozpuszczalnym w wodzie.

Kapsułki otrzymuje się w ten sposób, że związek według wynalazku miesza się różnymi dodatkami farmaceutycznymi podanymi wyżej i umieszcza otrzymaną mieszaninę w kapsułkach z twardej żelatyny, miękkich kapsułkach i tym podobnych.

Związek według wynalazku można preparować w formie wodnej lub oleistej zawiesiny, w formie syropu lub eliksiru w konwencjonalny sposób, stosując wyżej podane przykłady różnych dodatków do otrzymania ciekłego preparatu takie jak rozpuszczalniki, wypełniacze, środki izotoniczne, rozpuszczalniki, środki emulgujące, środki zawiesinowe, środki zagęszczające i tym podobne.

Czopki otrzymuje się przez dodanie odpowiedniego przyspieszacza absorpcji do, na przykład, glikolu polietylenowego, masła kakaowego, lanoliny, wyższego alkoholu, estru wyższego alkoholu, żelatyny, semi-syntetycznego glicerydu lub Witepsol'u.

Płyny do wstrzykiwania wytwarza się konwencjonalnym sposobem, stosując farmaceutyczne dodatki do ciekłego preparatu, na przykład, rozcieńczalniki takie jak woda, etanol, Macrogol, glikol propylenowy, kwas cytrynowy, kwas octowy, kwas fosforowy, kwas mlekowy, mleczan sodu, kwas siarkowy, wodorotlenek sodu i tym podobne, środki do ustalenia pH i bufory takie jak cytrynian sodu, octan sodu, fosforan sodu i tym podobne, środki stabilizujące takie jak pirosiarczyn sodu, kwas etylenodiaminoczterooctowy, kwas tioglikolowy, kwas tiomlekowy i tym podobne, środki izotoniczne takie jak chlorek sodu, glukoza, manitol, gliceryna i tym podobne, rozpuszczalniki takie jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, glikol propylenowy, benzoesan sodu, benzoesan benzylu, uretan, etanoloamina,

PL 217 872 B1 gliceryna i tym podobne, środki uspakajające takie jak glukonian wapnia, chlorobutanol, glukoza, alkohol benzylowy i tym podobne, oraz miejscowe środki znieczulające.

Maści w formie pasty, kremu lub żelu wytwarza się przez mieszanie i otrzymanie formy użytkowej konwencjonalnym sposobem, stosując farmaceutyczne dodatki, na przykład, bazowe składniki takie jak biała, miękka parafina, polietyleny, parafina, gliceryna, pochodne celulozy, glikole polietylenowe, silikon, bentonit i tym podobne, środki konserwujące takie jak p-oksybenzoesan metylu, p-oksybenzoesan etylu, p-oksybenzoesan propylu i tym podobne, środki stabilizujące i środki zwilżające.

Dla wytworzenia plastrów, wyżej wspomnianą maść, krem, żel lub pastę nakłada się na konwencjonalny podkład zwykłym sposobem. Jako podkład można stosować gładkie lub niegładkie tkaniny zrobione z bawełny, włókna ciętego lub włókna sztucznego, oraz filmy lub piankowe arkusze z miękkiego chlorku winylu, polietylenu, poliuretanu lub tym podobne.

Sposób podawania wyżej wspomnianych preparatów farmaceutycznych nie jest specjalnie ograniczony i jest dokładnie określony w zależności od formy farmaceutycznej, wieku, płci i innych warunków pacjenta oraz symptomów chorobowych pacjenta.

Dawka aktywnego składnika w preparacie farmaceutycznym jest dokładnie dobrana i zależy od drogi podawania, wieku, płci i odczucia pacjenta, oraz innych warunków. Zwykle, czynny składnik można podawać dorosłemu człowiekowi w dawce od 0,1 do 500 mg na dzień w jednej porcji lub kilku porcjach.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady, przykłady odniesienia i przykłady testowe.

W przykładach i przykładach odniesienia, stosunki mieszania eluentów są to stosunki objętościowe, a nazwy B.W.Silicażel, BW-127ZH lub FL-100DX (wytwarzane przez FUJI SILYSIA CHEMICAL LTD.) oznaczają nośnik stosowany w chromatografii.

Symbole stosowane w schemacie reakcji mają następujące Ac: acetyl, Boc: tert-butoksykarbonyl, Bz: benzoil, Piv: piwaloil, Bn: benzyl, Tr: trityl, MOM: metoksymetyl, BOM: benzyloksymetyl, TES: trietylosilil, THP: tetrahydropiranyl, MS: mezyl. Me: metyl. Et: etyl, Ph: fenyl, t-Bu: tert-butyl.

P r z y k ł a d 1 (powoływany w przykładzie 3)

Otrzymywanie chlorowodorku 1-(2-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]etyIo}-3-azetydynolu

W 4,2 ml octanu etylu rozpuszczono 1,03 g 1-{2-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]etylo}-3-azetydynolu i do roztworu dodano 0,86 ml 4,76 mol/l suchego roztworu chlorowodorek-octan etylu. Otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze przez 1 godzinę, a potem w temperaturze 5°C przez 1 godzinę. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, przemyto octanem etylu i wysuszono, otrzymując 0,98 g chlorowodorku 1-{2-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]etylo}-3-azetydynolu.

Temperatura topnienia: 101-102°C.

IR (KBr) cm^-1: 3132, 2952, 1423, 1340,1158, 814, 701

NMR (CDCI3) δ wartości: 2,97 (2H, t, J = 7 Hz), 3,2-3,3 (2H, m), 3,69 (2H, t, J = 7 Hz), 3,6-3,8 (2H, m), 3,9-4,1 (2H, m), 4,2-4,4 (2H, m), 4,6-4,8 (1H, m), 7,18 (1H, dd, J = 1,8 Hz), 7,29 (1H, d, J = 5 Hz), 7,41 (1H, d, J = 5 Hz), 7,65 (1H, d, J = 1 Hz), 7,78 (1H, d, J = 8 Hz).

P r z y k ł a d 2 (a) Otrzymywanie 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu 1

W 30 ml dimetylosulfotlenku rozpuszczono 6,50 g 5-[2-(3-chloropropoksy)etylo]-1-benzotiofenu i do roztworu dodano 5,60 g chlorowodorku 3-azetydynolu oraz 15,3 ml 5 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze 65°C przez 3,5 godziny. Po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej dodano wodę i octan etylu, pH ustalono na 1 dodając 6 M kwas chlorowodorowy i wodną warstwę oddzielono. Do warstwy wodnej dodano octan etylu, pH ustalono na 10 dodając 5 M wodny roztwór wodorotlenku sodu, po czym warstwę organiczną oddzielono. Organiczną * Ht/S-OH HCt

PL 217 872 B1 warstwę przemyto wodą, a potem nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu i rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej (eluent: chloroform:metanol = 30:1 do 10:1) i otrzymano 4,77 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu.

(b) Otrzymywanie 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu 2

(1) W 300 mL tetrahydrofuranu rozpuszczono 100 g kwasu 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propionowego, i po dodaniu 0,1 ml N,N-dimetyloformamidu dodawano 41,8 ml chlorku oksalilu przez okres 10 minut, po czym otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze przez 1,5 godziny. Otrzymany roztwór wkroplono do roztworu 65,7 g chlorowodorku 3-hydroksyazetydyny i 59,5 g wodorotlenku sodu w 600 ml wody w temperaturze 10°C, po czym mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Do roztworu reakcyjnego dodano 600 ml wody, 500 ml octanu etylu i chlorek sodu, i organiczną warstwę oddzielono. Do wodnej warstwy dodano 100 ml octanu etylu i organiczną warstwę oddzielono. W ten sposób otrzymane organiczne warstwy połączono, dodano 100 ml wody i pH ustalono na 3,5 dodając 6 M kwas chlorowodorowy, po czym organiczną warstwę oddzielono. Organiczną warstwę zatężono do objętości około 200 ml, przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, a następnie nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu, wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano 300 ml toluenu i otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 50°C aż do całkowitego rozpuszczenia produktu, po czym dodano kryształy zaszczepiające w temperaturze 40°C i otrzymaną mieszaninę powoli ochłodzono, a następnie mieszano, chłodząc lodem, przez 30 minut. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie i otrzymano 96,6 g 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]-1-(3-hydroksy-1-azetydynylo)-1-propanonu w postaci kryształów o jasno-brązowej barwie.

(2) W 60 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono 30,0 g 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]-1-{3-hydroksy-1-azetydynylo)-1-propanonu po czym wkroplono 275 ml 1 M roztworu kompleksu borowodoru z tetrahydrofuranem w tetrahydrofuranie i otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze przez 5 godzin. Do roztworu reakcyjnego dodano, wkraplając 81,9 ml 6 M kwasu chlorowodorowego i otrzymaną mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez 1,5 godziny. Po ochłodzeniu, rozpuszczalnik zatężono aby zmniejszyć objętość do 290 ml i nierozpuszczalny materiał odsączono. Do przesączu dodano 120 ml wody i 60 ml toluenu, wodną warstwę oddzielono, a następnie przemyto 60 ml toluenu. Do wodnej warstwy dodano 90 ml octanu etylu, pH ustalono na 9,5 dodając 5 M wodny roztwór wodorotlenku sodu i organiczną warstwę oddzielono. Organiczną warstwę przemyto nasyconym roztworem chlorku sodu i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem i do otrzymanej pozostałości dodano 5,35 g kwasu fumarowego oraz 54 ml etanolu. Otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 74°C aż do uzyskania całkowitego rozpuszczenia składników, po czym wkroplono do niej 161 ml octanu etylu. W ten sposób otrzymaną mieszaninę powoli ochłodzono, a następnie mieszano w temperaturze od 5 do 10°C przez 30 minut. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie roztworu i otrzymano 22,7 g 1/2 fumaranu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w postaci kryształów o jasno-brązowej barwie.

(3) W 45 ml wody zawieszono 22,7 g 1/2 fumaranu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo)-3-azetydynolu i dodano 68 ml octanu etylu, po czym pH ustalono na 9,5, dodając 1 M wodny roztwór wodorotlenku sodu i organiczną warstwę oddzielono. Następnie, organiczną warstwę przemyto nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu, wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i destylowano celem usunięcia rozpuszczalnika. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej (eluent: chloroform:metanol = 20:1 - 10:1) i krystalizowano z 40 ml eteru diizopropylowego, otrzymując 16,0 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w formie ciała stałego.

PL 217 872 B1

Temperatura topnienia: 60-62°C.

IR (KBr) cm^-1: 3095, 2944, 2769, 1361, 1191, 1098, 810, 709

NMR (CDCI3) δ wartości: 1,61 (2H, qn, J = 7Hz), 2,45 (2H, t, J = 7Hz), 2,7-2,9 (2H, m), 2,99 (2H, t, J = 7Hz), 3,45 (2H, t, J = 7Hz), 3,5-3,6 (2H, m), 3,66 (2H, t, J = 7Hz), 4,3-4,4 (1H, m), 7,22 (1H, dd, J = 1,8Hz), 7,28 (1H, d, J = 5Hz), 7,41 (1H, d, J = 5Hz), 7,67 (1H, d, J = 1Hz), 7,79 (1H, d, J = 8Hz).

P r z y k ł a d 3

Otrzymywanie chlorowodorku 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu

W taki sam sposób jak w Przykładzie 2, otrzymano chlorowodorek 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w formie bezbarwnych kryształów.

Temperatura topnienia: 71-73°C.

IR (KBr) cm^-1: 3301, 2937, 2809, 2631, 1125, 1099, 818, 765, 710

NMR (CDCI3) δ wartości: 1,8-1,9 (2H, m), 2,98 (2H, t, J = 7Hz), 2,9-3,1 (2H, m), 3,48 (2H, t, J = 6Hz), 3,69 (2H, t, J = 7Hz), 3,6-4,4 (4H, m), 4,5-4,7 (1H, m), 7,22 (1H, dd, J = 1,8Hz), 7,31 (1H, d, J = 5Hz, 7,44 (1H, d, J = 5Hz), 7,68 (1H, d, J = 1Hz, 7,81 (1H, d, J = 8Hz).

P r z y k ł a d 4

Otrzymywanie 1/2 fumaranu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu

W 10,0 ml etanolu rozpuszczono 5,00 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu, roztwór ogrzewano w temperaturze 70°C, dodano 0,99 g kwasu fumarowego i roztwór mieszano przez 30 minut. Do otrzymanego roztworu wkroplono 30 ml octanu etylu i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze 60°C przez 15 minut. Po 1 godzinnym okresie chłodzenia do temperatury 5°C mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez 1 godzinę. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, przemyto octanem etylu i po wysuszeniu otrzymano 5,83 g 1/2 fumaranu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w formie bezbarwnych kryształów.

IR (KBr) cm^-1: 3258, 2936, 2862, 1578, 1360, 1114, 1109, 707, 665

NMR (DMSO-d6) δ wartości: 1,5-1,6 (2H, m), 2,60 (2H, t, J = 7Hz), 2,91 (2H, t, J = 7Hz), 2,9-3,1 (2H, m), 3,39 (2H, t, J = 7Hz), 3,60 (2H, t, J = 7Hz), 3,6-3,8 (2H, m), 4,1-4,3 (1H, m), 6,50 (1H, s), 7,25 (1H, dd, J = 1,8Hz), 7,39 (1H, d, J = 5Hz), 7,72 (1H, d, J = 5Hz), 7,73 (1H, d, J = 1Hz) 7,89 (1H, d, J = 8Hz).

P r z y k ł a d 5

Otrzymywanie 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu

(1) W 12,5 ml toluenu zawieszono 5,00 g kwasu 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propionowego i 0,1 ml N,N-dimetyloformamidu dodano do tej zawiesiny. Następnie, 1,68 ml chlorku tionylu wkroplono w temperaturze 15°C i otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze przez 1 godzinę. Mieszaninę dodano, wkraplając do roztworu zawierającego 4,44 g 1/2 winianu 3-hydroksyazetydyny i 3,76 wodorotlenku sodu w 25 ml wody, w temperaturze 10°C, i mieszano w pokojowej temperaturze przez 1 godzinę. Do mieszaniny reakcyjnej dodano octan etylu, organiczną warstwę oddzielono, przemyto rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym a potem nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu, wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i destylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, celem usunięcia rozpuszczalnika. Pozostałość oczyszczono, stosując kolumnę chromatograficzną (eluent: chloroform : aceton = 3:1-1:1) i po krystalizacji z eteru diizopropylowego otrzymano 5,48 g

PL 217 872 B1

3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]-1-{3-hydroksy-1-azetydynylo)-1-propanonu w formie bezbarwnych kryształów.

IR (KBr) cm^-1: 3316, 2875, 1610, 1481, 1112, 992, 706

NMR (CDCI3) δ wartości: 2,2-2,4 (2H, m), 2,98 (2H, t, J = 7Hz), 3,6-3,8 (5H, m), 3,8-4,0 (1H, m), 4,1-4,3 (2H, m), 4,4-4,4 (1H, m), 7,20 (1H, dd, J = 1,8Hz), 7,28 (1H, dd, J = 1,5Hz), 7,41 (1H, d, J = 5Hz), 7,6-7,7 (1H, m), 7,79 (1H, d, J = 8Hz).

(2) W 20 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono 5,00 g 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]-1-{3-hydroksy-1-azetydynylo)-1-propanonu i dodano 1,09 g borowodorku sodu do otrzymanego roztworu. Następnie 4,25 ml kompleksu trifluorku boru z tetrahydrofuranem wkroplono w temperaturze 10°C i otrzymaną mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę, a potem w temperaturze 40°C przez 3 godziny. Następnie, mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 10°C, dodano do niej, wkraplając 30 ml 6 M kwasu chlorowodorowego i otrzymaną mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez 1 godzinę. Po ostudzeniu, rozpuszczalnik zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i dodano octan etylu. pH ustalono na 9,4 dodając 20% wodny roztwór wodorotlenku sodu i organiczną warstwę oddzielono. Tę organiczną warstwę przemyto wodą, następnie nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu, wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i destylowano pod zmniejszonym ciśnieniem celem usunięcia rozpuszczalnika. Otrzymaną pozostałość oczyszczono, stosując kolumnę chromatograficzną (eluent:chloroform:metanol = 20:1-10:1) i po krystalizacji z mieszaniny toluen:eter diizopropylowy (1:3, 14 ml) otrzymano 2,31 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo) 3-azetydynolu.

P r z y k ł a d 6

Otrzymywanie maleinianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu

W 56 ml acetonu rozpuszczono 8,00 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu, dodano 3,19 g kwasu maleinowego i otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 60°C aż do całkowitego rozpuszczenia składników. Następnie, mieszaninę reakcyjną powoli ostudzono i mieszano w temperaturze 5°C przez 30 minut. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, otrzymując 9,89 g maleinianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w formie bezbarwnych kryształów.

NMR (DMSO-d6) δ wartości: 1,6-1,8 (2H, m), 2,93 (2H, t, J = 7Hz), 3,13 (2H, t, J = 7Hz), 3,43 (2H, t, J = 6Hz), 3,63 (2H, t, J = 7Hz), 3,7-3,9 (2H, m), 4,1-4,3 (2H, m), 4,4-4,5 (1H, m), 6,04 (2H, s), 7,26 (1H, dd, J = 1,8Hz), 7,40 (1H, d, J = 5Hz), 7,7-7,8 (1H, m), 7,74 (1H, d, J = 5Hz), 7,92 (1H, d, J = 8Hz).

P r z y k ł a d 7

Otrzymywanie azotanu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo)-3-azetydynolu

W 20 ml octanu etylu rozpuszczono 10,0 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu i dodano 20 ml izopropanolu, a następnie dodano, wkraplając, 2,60 ml stężonego kwasu azotowego (61%) w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej wkroplono 60 ml octanu etylu i otrzymaną mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę, a potem w temperaturze 5°C przez 1 godzinę. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, otrzymując 11,3 g azotanu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w formie bezbarwnych kryształów.

IR (KBr) cm^-1: 3354, 2880, 1385, 1107, 712

NMR (DMSO-d6) δ wartości: 1,6-1,8 (2H, m), 2,93 (2H, t, J = 7Hz), 3,1-3,2 (2H, m), 3,44 (2H, t,

J = 6Hz), 3,64 (2H, t, J = 7Hz), 3,7-3,9 (2H, m), 4,0-4,4 (2H, m), 4,4-4,5 (1H, m), 7,27 (1H, d, J = 8Hz),

7,41 (1H, d, J = 5Hz), 7,74 (1H, d, J = 5Hz), 7,74 (1H, s), 7,92 (1H, d, J = 8Hz).

PL 217 872 B1

P r z y k ł a d 8

Otrzymywanie L-winianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu

W 40 ml octanu etylu rozpuszczono 10,0 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu i dodano 5,15 g kwasu L-winowego oraz 40 ml etanolu, po czym otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 65°C celem całkowitego rozpuszczenia składników. Następnie, otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 50°C przez 20 minut, wkroplono 40 ml octanu etylu w tej samej temperaturze i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze od 20 do 30°C przez 1 godzinę. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie i otrzymano 13,9 g L-winianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w formie bezbarwnych kryształów.

IR (KBr) cm^-1: 3318, 2807, 1305, 1126, 679, 483

NMR (DMSO-d6) δ wartości: 1,5-1,7 (2H, m), 2,82 (2H, t, J = 7Hz), 2,92 (2H, t, J = 7Hz), 3,2-3,4 (2H, m), 3,41 (2H, t, J = 6Hz), 3,61 (2H, t, J = 7Hz), 3,8-4,0 (2H, m), 4,02 (2H, s), 4,2-4,4 (1H, m), 7,26 (1H, dd, J = 2,8Hz), 7,40 (1H, d, J = 5Hz), 7,73 (1H, d, J = 5Hz), 7,7-7,8 (1H, m), 7,91 (1H, d, J = 8Hz).

P r z y k ł a d 9

Otrzymywanie 1/2 bursztynianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu

W 30 ml octanu etylu rozpuszczono 10,0 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu, dodano 2,03 g kwasu bursztynowego oraz 35 ml izopropanolu i otrzymaną mieszaninę ogrzewano do wrzenia aż do rozpuszczenia składników. Następnie, 40 ml octanu etylu wkroplono do mieszaniny reakcyjnej, mieszaninę reakcyjną powoli ostudzono i potem mieszano w temperaturze 50°C przez 30 minut. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, otrzymując 11,1 g 1/2 bursztynianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w formie bezbarwnych kryształów.

IR (KBr) cm^-1: 3250, 2936, 1576, 1361, 1109, 707, 652

NMR (DMSO-d6) δ wartości: 1,4-1,6 (2H, m), 2,35 (2H, s), 2,46 (2H, t, J = 7Hz), 2,7-2,9 (2H, m), 2,91 (2H, t, J = 7Hz), 3,38 (2H, t, J = 6Hz), 3,5-3,6 (2H, m), 3,59 (2H, t, J = 7Hz), 4,1-4,2 (1H, m), 7,25 (1H, dd, J = 2,8Hz), 7,39 (1H, d, J = 5Hz), 7,72 (1H, d, J = 5Hz), 7,7-7,8 (1H, m) 7,90 (1H, d, J = 8Hz).

P r z y k ł a d 10

Otrzymywanie cytrynianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu

W 14,1 ml etanolu rozpuszczono 10,0 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu, dodano 7,21 g kwasu cytrynowego (monowodzian) i otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 50°C w celu rozpuszczenia składników. Do otrzymanego roztworu dodano 35 ml octanu etylu i 5,6 ml etanolu w temperaturze 50°C, i mieszano w temperaturze 25°C. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 40°C, po czym dodano wkraplając 45 ml octanu etylu i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze 40°C w ciągu 10 minut, a następnie w temperaturze od 10 do 20°C przez 1 godzinę. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie i otrzymano 14,9 g cytrynianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu w formie bezbarwnych kryształów.

PL 217 872 B1

IR (KBr) cm^-1: 3374, 2943, 1720, 1224, 1104, 706

NMR (DMSO-d6) δ wartości: 1,6-1,7 (2H, m), 2,50 (2H, d, J = 15Hz), 2,58 (2H, d, J = 15Hz), 93 (2H, t, J = 7Hz), 2,99 (2H, t, J = 7Hz), 3,42 (2H, J = 6Hz), 3,5-3,6 (2H, m), 3,63 (2H, t, J = 7Hz), 4,0-4,1 (2H, m), 4,3-4,4 (1H, m), 7,26 (1H, d, J = 8Hz), 7,40 (1H, d, J = 5Hz), 7,73 (1H, d, J = 5Hz), 7,7-7,8 (1H, m), 7,91 (1H, d, J = 8Hz).

P r z y k ł a d 11

Otrzymywanie maleinianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu.

W 2,6 ml izopropanolu zawieszono 1,30 g związku piwalinianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynylu z kwasem maleinowym i po dodaniu 2,3 ml 5 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu w temperaturze 20°C otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze przez 6 godzin. Następnie, wodę i octan etylu dodano do mieszaniny reakcyjnej, organiczną warstwę oddzielono i przemyto kolejno wodą i nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu. Do otrzymanej w ten sposób warstwy organicznej dodano 0,29 g kwasu maleinowego i otrzymaną mieszaninę ogrzewano aż do całkowitego rozpuszczenia składników, po czym rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano 5,2 ml octanu etylu i 1,3 ml izopropanolu i otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze przez 30 minut, a potem oziębiano Iodem przez 1 godzinę. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie i otrzymano 0,76 g związku 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu z kwasem maleinowym w formie bezbarwnych kryształów.

P r z y k ł a d 12

W 10 ml izopropanolu zawieszono 2,00 g związku benzoesanu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-yIo)etoksy]propylo}-3-azetydynylu z kwasem maleinowym i do tego roztworu dodano 7,82 ml 2 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu. Otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze przez 1 godzinę. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano wodę i octan etylu i organiczną warstwę oddzielono, przemyto ją wodą a potem nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu, wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano 0,43 g kwasu maleinowego i krystalizowano z mieszaniny octanu etylu z izopropanolem (4:1, 10 ml) otrzymując związek 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynolu z kwasem maleinowym w formie bezbarwnych kryształów.

P r z y k ł a d 13

W 4 ml chloroformu rozpuszczono 0,83 g 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-(trityloksy)azetydyny i do roztworu dodano 1,66 ml 4,75 mol/l roztworu bezwodnego chlorowodoru w etanolu, po czym otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze przez 6 godzin. Następnie, wodę i chloroform dodano do mieszaniny reakcyjnej i wodną warstwę oddzielono. Do wodnej warstwy dodano octan etylu i pH ustalono na 10 dodając 5 M wodny roztwór wodorotlenku sodu. Organiczną warstwę oddzielono, przemyto ją wodą, a potem nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu, wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnie10

PL 217 872 B1 niem. Do pozostałości dodano 0,11 g kwasu maleinowego i krystalizowano z mieszaniny octanu etylu z izo-propanolem (4:1, 5 ml), otrzymując 0,33 g maleinianu 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo)-3-azetydynolu w formie bezbarwnych kryształów.

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a 1

Otrzymywanie kwasu 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propionowego

Do 4,60 g 2-(1-benzotiofen-5-ylo) 1-etanolu dodano 29 mg wodorotlenku potasu, 83 mg bromku tetra-n-butyloamoniowego i 5,67 ml akrylanu tert-butylu i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze od 45 do 50°C przez 2 godziny. Po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej dodano wodę i toluen, ustalono pH = 1 dodając 6 M kwas chlorowodorowy i organiczną warstwę oddzielono. Następnie, organiczną warstwę przemyto wodą, wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono, stosując kolumnę chromatograficzną (eluent: heksan:octan etylu = 5:1) i otrzymano 7,70 g 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propionianu tert-butylu w postaci bezbarwnego oleju.

IR (olej) cm^-1: 2978, 2867, 1729, 1368, 1159, 1112, 702

NMR (CDCI3) δ wartości: 1,43 (9H, s), 2,49 (2H, t, J = 6Hz), 2,99 (2H, t, J = 7Hz), 3,70 (2H, t, J = 6Hz), 3,70 (2H, t, J = 7Hz), 7,21 (1H, dd, J = 2,8Hz), 7,27 (1H, dd, J = 1,5Hz), 7,41 (1H, d, J = 5Hz), 7,6-7,7 (1H, m), 7,78 (1H, d, J = 8Hz).

(2) W 22,8 ml toluenu rozpuszczono 7,60 g 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propionianu tert-butylu i do roztworu dodano 94 mg monowodzianu kwasu p-toluenosulfonowego, po czym otrzymaną mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez 6 godzin.

Następnie, mieszaninę reakcyjną ochłodzono, wlano do niej wodę i octan etylu i organiczną warstwę oddzielono. Organiczną warstwę wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość krystalizowano z mieszaniny toluen-cykloheksan (1:4, 23 ml), otrzymując 5,30 g kwasu 3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propionowego w formie kryształów o jasno czerwonej barwie.

IR (KBr) cm^-1: 2860, 1719, 1273, 1128, 706

NMR (CDCI3) δ wartości: 2,63 (2H, t, J = 6Hz), 3,00 (2H, t, J = 7Hz), 3,73 (2H, t, J = 7Hz), 3,74 (2H, t, J = 6Hz), 7,20 (1H, dd, J = 18Hz), 7,28 (1H, dd, J = 15Hz), 7,41 (1H, d, J = 5Hz), 7,6-7,7 (1H, m), 7,79 (1H, d, J = 8Hz).

P r z y k ł a d t e s t o w y 1

[Działanie przyspieszające wzrost aksonu]

Komórki PC12 [adrenoszpikowy nowotwór z komórek chromochłonnych u szczura (reagują na czynnik wzrostu nerwu (NGF responders)] hodowano w inkubatorze (5% CO2, temperatura 37°C) stosując medium RPMI1640 (dostępne w firmie Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) zawierające 5% dezaktywowanej termicznie (56°C, 30 minut) końskiej surowicy krwi (dostępna w firmie Bio-Whittaker Inc.), 5% dezaktywowanej termicznie (56°C, 30 minut) płodowej surowicy cielęcej (dostępna w firmie Sigma Chemical Co.) i 25 μg/ml gentamycyny (dostępna w firmie GIBCO BRL).

Wyhodowane komórki PC12 umieszczono na okres 30 minut, w temperaturze 37°C, w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej zawierającym 1 mM EDTA, co umożliwiało wyjęcie tych komórek z kolby do hodowania. Stężenie wyhodowanych komórek PC12 ustalono na 5x10⁴ komórek/ml dodając medium RPMI1640 zawierające 1,5% dezaktywowanej termicznie końskiej surowicy, 1,5% dezaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej oraz 15 μg/ml gentamycyny i otrzymaną zawiesinę komórek umieszczono w 2 mililitrowych porcjach w płytkach do hodowli tkankowej (produkcji Falcon Inc.) powleczonych 0,01% poliornityny [rozpuszczonej w 150 mM buforu boranowego (pH = 8,4)]. Następnie, 2.5S-NGF [dostępny w firmie Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) (rozpuszczony w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej zawierającej 0,1% albuminy surowicy wołowej] i każdy z testowanych związków dodano do tego medium - w tym samym czasie i w takiej ilości, aby otrzymać końcowe stężenia które wynosiło do 40 ng/ml i 10 μΜ, odpowiednio, a następnie hodowano w atmosferze zawierającej 5% CO2 i w temperaturze 37°C. Po 48 godzinach hodowania, komórki umieszczono w 10% obojętnym roztworze formaliny na okres 30 minut, przemyto buforowanym fosforanem roztworem soli fizjologicznej i destylowaną wodą, a potem wysuszono. StoPL 217 872 B1 sując mikroskop fazowo-kontrastowy wybrano cztery pola widzenia i obserwowano 50 lub więcej komórek w każdym polu widzenia. Obliczono procentowy stosunek ilości komórek o zwiększonym neurycie, dłuższym niż średnica ciała komórkowego, do całkowitej liczby obserwowanych komórek, który zdefiniowano jako stopień wzrostu neurytu.

Aktywność przyspieszającą wzrost neurytu, obliczoną zgodnie z następującym wyrażeniem, określono jako stopień przyspieszenia wzrostu neurytu uzyskany przez dodanie każdego z testowanych związków, przyjmując, że szybkość wzrostu neurytu pod wpływem czynnika wzrostu nerwu (NGF) wynosi 100%:

(Stopień wzrostu neurytu uzyskany przez dodanie każdego z testowanych związków/stopień wzrostu neurytu pod wpływem czynnika wzrostu nerwu (NGF)) x 100 (%).

Uzyskano następujący stopień przyspieszenia wzrostu neurytu dla związku z Przykładu 81: 190%.

P r z y k ł a d t e s t o w y 2 (Aktywność przyspieszająca regenerację nerwu)

Test przeprowadzono według metody opisanej w J. Pharmaco. Exp. Ther., tom 290, str. 348 (1999) i Neuroscience, tom 88, str. 257 (1999).

Szczury rasy SD (samce, wiek od 6 do 7 tygodni, waga od 170 do 280 g) uśpiono przy pomocy pentobarbitalu i lewy nerw kulszowy każdego szczura odsłonięto w rejonie udowym, oddzielono go od otaczającej tkanki łącznej i odcięto przy obwodowej pozycji znajdującej się około 1 cm od mięśnia pośladkowego. Końce nerwu wprowadzono do sterylnej rurki silikonowej o długości 8 mm (średnica wewnętrzna 1,3 mm, średnica zewnętrzna 1,8 mm) na głębokość 3,5 mm w taki sposób, żeby można utworzyć przestrzeń 1 mm w środku rurki. Końce rurki przytwierdzono i nerw umieszczono z powrotem w tkance mięśniowej razem z rurką, po czym naciętą część zszyto. Siódmego dnia, testowany związek rozpuszczony w destylowanej wodzie podano oralnie w dawce 1 mg/kg wagi ciała i następnie testowany związek podawano raz dziennie przez 13 dni, w taki sam sposób jak podano wyżej.

Dwudziestego pierwszego dnia po nacięciu nerwu, nerw kulszowy znowu odsłonięto po uśpieniu zwierzęcia pentobarbitalem. Nerw w rejonie udowym i w rejonie goleniowym oddzielono od otaczających tkanek łącznych i silikonową rurkę w części naciętej usunięto. Elektrodę pobudzającą umieszczono na bliżej stronie w stosunku do miejsca nacięcia a elektrodę rejestrującą umieszczono w najdalszym miejscu w rejonie goleniowym. Włączono wzbudzanie elektryczne (napięcie: 2 Volt, opóźnienie: 1 msek i czas trwania: 100 gsek) i rejestrowano działanie potencjału indukowanego pod wpływem bodźca. Elektrodę rejestrującą stopniowo przesuwano bliżej środka i odległość pomiędzy miejscem nacięcia a najdalszą pozycją, przy której otrzymano działanie potencjału, zmierzono jako odległość regeneracyjną. Szybkość regeneracji nerwu kulszowego dla danego związku obliczono na podstawie następującego wzoru:

(odległość regeneracyjna dla grupy traktowanej danym związkiem) / (odległość regeneracyjna dla grupy kontrolnej) x 100 (%)

Otrzymano następujące wielkości szybkości regeneracji nerwu kulszowego dla testowanego, dla związku z Przykładu 10: 186%.

P r z y k ł a d t e s t o w y 3 (Aktywność inhibitująca śmierć neuronów wywołaną przez Αβ)

Efekt inhibitowania śmierci wyhodowanych neuronów wywołanej przez Αβ badano zmodyfikowaną metodą opisaną w Brain Res., tom 639, str. 240 (1994). Kawałki kory mózgowej wyodrębnione z mózgów embrionów (od 17 do 19 dni) szczurów gatunku Wistar pocięto na cienkie płatki, po czym neurony rozpuszczono działając trypsyną. Komórki rozdzielono w 48 zagłębieniach w płytce do ho₅ dowli tkankowej z gęstością 1 x 10⁵ komórek na wgłębienie i hodowano je w atmosferze 5% CO2 i w temperaturze 37°C w Dulbecco's modyfikowanym Eagle medium z dodanym suplementem B27 (produkcji GIBCO BRL) 13,6 mg/ml glukozy.

Między 12 a 13 dniem hodowli, do medium dodano roztwór chlorku potasu w takiej ilości, aby otrzymać stężenie chlorku potasu wynoszące 25 mmola/litr. Natychmiast potem, do medium dodano poszczególny testowany związek. Po 24 godzinach, Αβ (peptyd zawierający 25 do 35 pozostałości) rozpuszczony w destylowanej wodzie dodano do medium, aż uzyskano stężenie końcowe wynoszące 20 gmoli/litr. Po następnych 24 godzinach, medium zastąpiono Dulbecco modyfikowanym Eagle medium z dodanym suplementem 827 i 3,6 mg/ml glukozy oraz testowany związek.

Aktywność testowanego związku na inhibitowanie śmierci wyhodowanych neuronów określono inhibicją zmniejszenia zdolności redukcyjnej MMT. Próbę MMT [J. Immuno. Methods, tom 65, str. 55

PL 217 872 B1 (1983)] opracowaną przez Mosmann przeprowadzono 48 godzin po wymianie medium, i obliczono stopień inhibicji (%) testowanego związku na zmniejszenie wartości ocenianego MMT wywołanej przez dodanie Αβ.

Stopień inhibicji = [(wartość ocenionego MTT dla grupy traktowanej Αβ i lekiem) (wartość ocenionego MTT dla grupy nietraktowanej)] / [wartość ocenianego MTT dla grupy traktowanej Αβ] x 100 (%).

W ten sposób, oznaczony stopień inhibicji przy stężeniu 1 μΜ dla związku z Przykładu 10: 42%.

P r z y k ł a d t e s t o w y 4 (Metabolizm mikrosomów ludzkiej nerki)

W rurce do testowania umieszczono 50 μl buforowanego roztworu 100 mmoli/L fosforanu potasowego (pH 7,4) i 25 μl 3 mg proteiny/ml zebranych mikrosomów ludzkiej nerki (wytwórca Gentest Inc.), i dodano roztwór przygotowany przez zmieszanie 10 μL roztworu 66 mmol/L soli sodowej 6-fosforanu glukozy, 10 μΙ 10 jednostek/ml dehydrogenazy 6-fosforanu glukozy, 10 μL 26 mmol/L koenzymu fosforanu dinukleotydowego p-nikotynoamidu adeniny w formie utlenionej (nukleotyd trifosfopirydyny w formie utlenionej), 10 μL roztworu 66 mmola/L chlorku magnezu i 135 μL buforowanego roztworu 100 mmoli/L fosforanu potasowego (pH 7,4), i otrzymaną mieszaninę wstępnie inkubowano przez 5 minut. Następnie, do tej mieszaniny dodano 50 μL każdego z testowanych związków aż do uzyskania stężenia 6 μmoli/l aby zainicjować reakcję, i inkubację prowadzono w temperaturze 37°C przez 60 minut (końcowa objętość: 300 μL). Reakcję zakończono, dodając 600 μL acetonitrylu i mieszaninę wirowano z szybkością 12000 x g przez 15 minut, w temperaturze 4°C. Ciecz sklarowaną nad osadem oddzielono, zatężono przez wirowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, poddano wysokociśnieniowej ciekłej chromatografii i oznaczono pozostałą ilość testowanego związku po reakcji metabolicznej.

Pozostałą ilość (%) obliczono według następującego wzoru:

Pozostała ilość (%) = [(powierzchnia piku testowanego związku po 60 minutach reakcji)/(powierzchnia piku testowanego związku w przypadku zastopowania reakcji przez dodanie acetonitrylu jednocześnie z dodaniem testowanego związku po wstępnej inkubacji)] x 100.

Otrzymano następujące rezultaty dla pozostałej ilości (w procentach): dla związku z Przykładu 10: 70%.

Zastosowanie przemysłowe 1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynol lub jego sól, według wynalazku, wykazuje wspaniałe działanie wzmagające wzrost aksonu, działanie przyspieszające regenerację nerwu i działanie ochronne dla neuronów, jest także bardzo oporna na metabolizm i jest użytecznym środkiem leczniczym w chorobach nerwów centralnych i obwodowych.

Claims

1-{3-[2-(1-benzotiofen-5-ylo)etoksy]propylo}-3-azetydynol lub jego sól.