PL182136B1 - Genes for use in synthesising antipathogenic substances - Google Patents

Abstract

1. Czasteczka DNA kodujaca biosyntetyczny enzym uczestniczacy w szlaku biosyntezy pirolnitryny, zdefiniowana sekwencja nukleotydów okreslona jako SEK ID nr 1 albo sek- wencja nukleotydów, która z nia hybrydyzuje. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA kodująca biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny, cząsteczka DNA kodująca biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy sorafenu, biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny oraz gospodarz będący mikroorganizmem.

Zrekombinowane cząsteczki DNA, w szczególności kodujące biosyntetyczne enzymy uczestniczące w szlaku biosyntezy pirolnitryny, sorafenu i innych substancji antypatogenicznych, są wprowadzane do organizmów odpowiednich gospodarzy. Otrzymywane zrekombinowane organizmy oraz wytwarzane przez te organizmy substancje antypatogeniczne, są stosowane do ochrony roślin przed patogenami, zwłaszcza przed fitopatogenami.

Cząsteczki DNA kodujące substancje antypatogeniczne są wprowadzane do gospodarzy:

- heterologicznych, znanych z szybkiego wzrostu i namnażania, przy użyciu których uzyskuje się znacznie większe ilości substancji antypatogenicznych, niż by to było możliwe przy użyciu gospodarzy natywnych,

- heterologicznych dla zapewnienia samemu gospodarzowi zwiększonej oporności na atak patogenu,

- pierwotnych, pod kontrolą zmienionych, silnych elementów regulatorowych, umożliwiających wytwarzanie zwiększonych ilości substancji antypatogenicznej, oraz

- do zdolnych do kolonizowania roślin lub rizosfery gospodarzy heterologicznych, pod kontrolą zmienionych, silnych elementów regulatorowych, w celu zwalczania patogenów kontaktujących się z tymi zrekombinowanymi organizmami, wytwarzającymi zwiększone ilości substancji antypatogenicznej.

Rośliny z reguły podlegają zakażeniom przez grzyby i bakterie. Rozwinęło się wiele gatunków mikroorganizmów wykorzystujących różne zagłębienia w rosnącej roślinie. Rozwój niektórych fitopatogenów poszedł w kierunku zakażania powierzchni listowia. Rozprzestrzeniają się one z rośliny na roślinę drogą powietrzną lub z wykorzystaniem różnych innych nosicieli. Inne fitopatogeny rozwijają się w glebie i przede wszystkim zakażają korzenie i nowo kiełkujące siewki. Poza infekcjami wywoływanymi przez grzyby i bakterie, wiele chorób roślin powodują obleńce, które rozwijają się w glebie i zakażają korzenie, powodując zazwyczaj poważne zniszczenia jeśli przez kolejne lata na tej samej powierzchni gruntu uprawia się ten sam gatunek rośliny.

Z roku na rok, choroby roślin powodują znaczne straty w zbiorach, co powoduje zubożenie rolników i niedobory żywności dla lokalnych populacji w różnych częściach świata. Powszechne stosowanie fungicydów dało znaczne zabezpieczenie przed atakiem fitopatogenów, jednak pomimo wydatków na fungicydy szacowanych w skali światowej na miliard USD, światowe straty zbiorów oceniano w 1981 roku na około 10% wartości tych zbiorów (James, Seed Sci. & Technol. 9, 679-685 /1981/). Rozwój procesu destrukcyjnego choroby zależy od agresywności danego fitopatogenu i od odpowiedzi organizmu gospodarza, zatem jednym z celów większości programów hodowli roślin jest zwiększenie oporności gospodarzy roślinnych na chorobę. Nowe źródła genów i kombinacje opracowane w celu nadania oporności

182 136 na chorobę cieszyły się na ogół ograniczonym okresem skutecznego stosowania w wielu układach roślina uprawna/patogen z powodu szybkiej ewolucji fitopatogenów w kierunku pokonania genów oporności.

Istnieje ponadto wiele udokumentowanych przypadków ewolucji szczepów grzybiczych, które stały się oporne na konkretne fungicydy. Już w 1981 roku Fletcher i Wolfe (Proc. 1981 Brit. Crop Prot. Conf. /1981/ utrzymywał, że 24% populacji mączniaka na jęczmieniu jarym i 53% populacji mączniaka na jęczmieniu ozimym wykazywało znaczące różnice w odpowiedzi na środek grzybobójczy, triadimenol i że rozrzut tych populacji był różny dla różnych odmian jęczmienia, przy czym najbardziej wrażliwa odmiana wiązała się również z najwyższym występowaniem mniej wrażliwych typów grzybów. Podobne wahania we wrażliwości grzybów na fUngicydy udokumentowano dla mączniaka pszenicy (również na triadimenol), dla Botrytis (na benomyl), Pyrenophora (na organiczne związki rtęci), Pseudocercosporella (na fungicydy typu MBC) i Mycosphaerella fijiensis na triazole, wymieniając tylko niektóre z nich (patrz Jones i Clifford: Cereal Diseases, wyd.: John Wiley, /1983/). Choroby wywoływane przez obleńce zwalczano również skutecznie przez stosowanie pestycydów. Podczas gdy większość środków grzybobójczych jest stosunkowo nieszkodliwa dla ssaków, a problemy z ich stosowaniem polegają na rozwoju oporności grzybów, które są celem ich ataku, podstawowy problem w stosowaniu środków przeciw obleńcom leży w ich stosunkowo wysokiej toksyczności wobec ssaków. Większość środków obleńcobójczych stosowanych do zwalczania obleńców w glebie należy do grupy karbaminianów, organicznych związków chloru lub związków fosforoorganicznych. Związki te muszą być stosowane doglebowo ze szczególną ostrożnością.

Dla pewnych gatunków roślin uprawnych wyhodowano organizmy służące do biologicznego zwalczania patogenów jako dalszą alternatywę ochrony zbiorów. Organizmy służące do kontroli biologicznej posiadają zaletę zdolności kolonizacji i ochrony tych części rośliny, które są niedostępne dla konwencjonalnych fungicydów. Ta praktyka rozwinęła się w wyniku odkrycia, że rośliny uprawne rosnące na pewnych glebach są w sposób naturalny oporne na niektóre grzyby fitopatogenne i że ta supresyjna właściwość tych gleb zanika po autoklawowaniu. Okazało się ponadto, że gleby sprzyjające rozwojowi niektórych chorób roślin nabywały cechy hamowania rozwoju tych chorób w wyniku dodania niewielkich ilości gleby z pól tłumiących rozwój tych patogenów (Scher i wsp., Phytopathology 70, 412-417 /1980/). Następne badania wykazały, że za to zjawisko są odpowiedzialne bakterie tworzące kolonie w korzeniach. Zjawisko to jest obecnie określane biologicznym zwalczaniem choroby (Baker i wsp., Biological Control of Plant Pathogens, Freeman Press, San Francisco /1974/). W wielu przypadkach, najbardziej skutecznymi szczepami bakterii do biologicznego zwalczania choroby okazały się szczepy należące do gatunku Pseudomonas fluorescens (Weller i wsp., Phytopathology 73, 463-469 /1983/; Kloepper i wsp., Phytopathology 71, 1020-1024 /1981/). Do ważnych patogenów roślinnych, które są skutecznie zwalczane na drodze inokulacji nasion tymi bakteriami należy Gaemannomyces graminis, czynnik powodujący zgorzel podstawy źdźbła pszenicy (Cook i wsp., Soil Biol. Biochem. 8, 269-273 /1976/) oraz fitopatogeny Pythium i Rhizoctonia, powodujące gnicie bawełny (Howell i wsp., Phytopathology 69, 480-482 /1979/). Szereg zwalczających choroby roślin szczepów Pseudomonas wytwarza antybiotyki, które hamują wzrost grzybów fitopatogennych (Howell i wsp., Phytopathology 69, 480-482 (1979); Howell i wsp., Phytopathology 70, 712-715 /1980/), sugerowano więc ich stosowanie do zwalczania grzybów fitopatogennych w warstwie gleby otaczającej korzenie (w rizosferze). Jakkolwiek kontrola biologiczna wydawała się być obiecującą metodą zwalczania chorób roślin, nadającą się do szerokiego stosowania, znalazła ona zastosowanie głównie w środowisku roślin hodowanych w cieplarniach, gdzie istnieją najlepsze warunki do uzyskania sukcesu w zwalczaniu fitopatogenów rozwijających się w glebie. Zastosowanie mikroorganizmów naturalnych na wielką skalę do upraw polowych okazało się niemożliwe z powodu ograniczeń w produkcji tych mikroorganizmów (na ogół są to organizmy wolno rosnące), dystrybucji (mają krótki okres życia) i kosztów (wynikający z obydwu tych trudności). Ponadto, sukces

182 136 w kontroli biologicznej zależy w ogromnej mierze od identyfikacji występujących w stanie naturalnym szczepów, które mogą mieć ograniczone spektrum aktywności. Były również podejmowane wstępne próby zwalczania fitopatogennych obleńców z użyciem zwalczających je mikroorganizmów. Jakkolwiek podejście to jest ciągle przedmiotem badań, wiadomo już, że pewne rodzaje Streptomyces zwalczają obleńce węzłów korzeniowych (rodzaj Meliodogyne; publikacja zgłoszenia patentowego PCT, WO 93/18135; Research Corporation Technology), a toksyny z niektórych szczepów Bacillus thuringiensis (takich jak israeliensis) posiadają szerokie spektrum aktywności przeciw obleńcom, zatem preparaty zarodników albo żywych bakterii Bacillus mogą dawać możliwość dogodnej kontroli biologicznej (patrz: publikacja opisu patentowego europejskiego EP 0352052, Mycogen i publikacja opisu patentowego PCT, WO 93/19604, Research Corporation Technologies).

Do tradycyjnych metod ochrony roślin przed chorobami należy stosowanie antybiotyków, które znanymi sposobami, nanosi się na nasiona, części roślin lub wprowadza do gleby. Związki te są dotychczas wytwarzane metodami syntezy chemicznej lub biosyntezy przy udziale mikroorganizmów występujących w przyrodzie.

Znanych jest wiele organizmów, występujących w przyrodzie, które w swoim cyklu rozwojowym wytwarzają metabolity wtórne hamujące wzrost innych organizmów.

W szczególności, są znane mikroorganizmy wytwarzające metabolity aktywne jako antybiotyki. Od wykrycia penicyliny zidentyfikowano wiele takich związków, wykazujących aktywność antybiotyczną i ilość ta ciągle wzrasta.

Metabolity aktywne jako antybiotyki reprezentują szeroki zakres struktur. Do najważniejszych należą: aminoglikozydy (np. streptomycyna) i inne antybiotyki zawierające cukry, antybiotyki peptydowe (np. β-Laktamowe APS (substancje antypatogeniczne)), ryzoktycyna (patrz: Rapp C. i wsp. Liebigs Ann. Chem. 655-661 /1988/), pochodne nukleozydowe (np. blastycydyna S) i inne antybiotyki heterocykliczne zawierające azot (np. fenazyna i pirolnitryna) i/lub tlen, poliketydy (np. sorafen), laktony makrocykliczne (np. erytromycyna) i chinony (np. tetracyklina).

Aminoglikozydy i inne antybiotyki zawierające cukry

Aminoglikozydy są oligosacharydarni zawierającymi resztę aminocykloheksanolu połączoną wiązaniem glikozydowym z innymi aminocukrami. Streptomycyna, jeden z najlepiej poznanych związków z tej grupy, jest wytwarzana przez Streptomyces griseus. Biochemia i biosynteza tego związku jest złożona (przeglądu dokonał Mansouri i wsp. w publikacji: „Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms”, wyd.: Hershberger i wsp., American Society of Microbiology, Washington, D.C., str. 61-67 /1989/), zaangażowanych jest w nią 25 do 30 genów, z czego 19 dotychczas zanalizowano (Retzlaff i wsp.: Industrial Microorganisms: Bacie and Applied Molecular Genetics, wyd. Baltz i wsp., American Society of Microbiology, Washington, D.C., str. 183-194 /1993/). Streptomycyna i wiele innych aminoglikozydów hamuje syntezę białka w docelowych organizmach.

Antybiotyki peptydowe

Antybiotyki peptydowe klasyfikuje się na dwie grupy: (1) te, które są syntetyzowane przez układy enzymatyczne bez udziału aparatu rybosomalnego i (2) te, które do powstania prekursora tego antybiotyku wymagają translacji mRNA, w której pośredniczą rybosomy.

Nie-rybosomalne antybiotyki peptydowe powstają z udziałem wielkich, wielofunkcyjnych enzymów, które aktywują, modyfikują, polimeryzują a w niektórych przypadkach, cyklizują aminokwasy wchodzące w skład podjednostek, tworząc łańcuchy polipeptydowe. Wbudowywane są również inne kwasy, takie jak kwas aminoadypinowy, diaminomasłowy, diaminopropionowy, dihydroksy-aminokwas, izoseryna, kwas dihydroksybenzoesowy, kwas hydroksyizowalerianowy, (4R)-4-[(E)-2-butenylo]-4,N-dimetylo-L-treonina i omityna (K.atz i Demain, Bacteriological Review 41, 449-474 /1977/; Kleinkauf i von Dohren, Annual Review of Microbiology 41, 259-289 /1987/). Produkty te nie są kodowane przez żaden mRNA, w ich syntezie nie uczestniczą bezpośrednio rybosomy. Antybiotyki peptydowe syntetyzowane drogą nie-rybosomalną można z kolei pogrupować według ich ogólnej struktury

182 136 na kategorie związków o budowie liniowej, cyklicznej, laktonowej, cyklopeptydów rozgałęzionych i depsipeptydów (Kleinkauf i von Dohren, European Journal of Biochemistry, 192, 1-15 /1990/). Te różne grupy antybiotyków są wytwarzane w wyniku działania modyfikującego i cyklizującego enzymów. Podstawowy schemat polimeryzacji jest wspólny dla nich wszystkich. Peptydy syntetyzowane drogą nierybosomalną są wytwarzane zarówno przez bakterie jak i przez grzyby. Należą do nich edeina, liniowa gramicydyna, tyrocydyna i gramicydyna S z Bacillus brevis, mykobacylina z Bacillus subtilis, polimyksyna z Bacillus polymiyxa, etamycyna ze Streptomyces griseus, echinomycyna ze Streptomyces echinatus, aktynomycyna ze Streptomyces clavuligerus, enterochelina z Escherichia coli, gamma-(alfa-L-aminoadypilo)-L-cysteinylo-D-walina (ACV) z Aspergillus nidulans, alametycyna z Trichoderma viride, destrukcyna z Metarhizium anisolpliae, eniatyna z Fusarium okysporum i beauwerycyna z Beauveria bassiana. Istnieje rozległe podobieństwo funkcjonalne i strukturalne między układami prokariotycznymi i eukariotycznymi, co wskazuje na ich wspólne źródło. Aktywność antybiotyków peptydowych jest również rozległa, toksyczne działanie różnych antybiotyków peptydowych u zwierząt, roślin, bakterii i grzybów jest znane (Hansen, Annual Review of Microbiology 47, 535-564 /1993/; Katz i Demain, Bacteriological Reviews 41, 449-474 /1977/; Kleinkauf i von Dohren, Annual Review of Microbiology 41, 259-289 /1987/; Kleinkauf i Dohren, European Journal of Biochemistry, 192, 1-15 /1990/; Kolter i Moreno, Annual Review of Microbiology 46,141-163 /1992/).

Antybiotyki peptydowe syntetyzowane z udziałem rybosomów charakteryzują się obecnością genu strukturalnego dla samego antybiotyku. Gen ten koduje prekursor, który jest modyfikowany przez specyficzne enzymy z wytworzeniem dojrzałej cząsteczki. Użycie podstawowego aparatu syntetyzującego białka do syntezy antybiotyków peptydowych otwiera możliwości wytwarzania polimerów znacznie dłuższych, chociaż te antybiotyki peptydowe niekoniecznie muszą być bardzo duże. Poza genem strukturalnym potrzebne są dalsze geny do wydzielania poza komórką i nadania immunogenności. Przypuszcza się, że geny te są zlokalizowane w pobliżu genu strukturalnego, w większości przypadków prawdopodobnie na tym samym operonie. Istnieją dwie główne grupy antybiotyków peptydowych wytwarzanych z udziałem rybosomów: te, które zawierają niezwykły aminokwas, lantioninę i te, które lantioniny nie zawierają. Antybiotyki zawierające lantioninę (lantibiotyki) są wytwarzane przez bakterie gram-dodatnie, w tym przez rodzaje Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus i Streptomyces. Znane są antybiotyki liniowe (np. nizyna, subtylina, epidermina i gallidermina) i antybiotyki cykliczne (np. duramycyna i cynnamycyna) (Hansen, Annual Review of Microbiology 47, 535-564 /1993/; Kolter i Moreno, Annual Review of Microbiology 46, 141-163 /1992/). Lantibiotyki często zawierają inne charakterystyczne modyfikowane reszty, takie jak resztę dehydroalaniny (DHA) i dehydrobutyryny (DGB), pochodzące z dehydracji odpowiednio seryny i treoniny. Reakcja grupy tiolowej cysteiny z DHA daje lantioninę, a z DBH daje β-metylolantioninę. Antybiotyki peptydowe, które nie zawierają lantioniny mogą zawierać inne modyfikacje albo mogą się składać jedynie ze zwykłych aminokwasów używanych do syntezy białek. Antybiotyki peptydowe nie zawierające lantioniny są wytwarzane zarówno przez bakterie gram-dodatnie jak i gram-ujemne, w tym przez Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus i Escherichia. Do antybiotyków tej kategorii należą: laktacyny, laktocyny, sakacyna A, pediocyny, diplokokcyny i mikrocyny (Hansen, jak wyżej; Kolter i Moreno, jak wyżej).

Pochodne nukleozydowe i inne antybiotyki heterocykliczne, zawierające azot i/lub tlen

Wszystkie te związki zawierają pierścienie heterocykliczne, ale z drugiej strony bardzo różnią się strukturalnie, i jak podano w poniższych przykładach, wykazują bardzo różniące się od siebie aktywności biologiczne.

Polioksyny i nikkomycyny są pochodnymi nukleozydowymi i pod względem struktury przypominają UDP-N-acetyloglukozaminę, substrat dla syntazy chityny. Zidentyfikowano je jako kompetycyjne inhibitory syntazy chityny (Gooday, w książce: „Biochemistry of Celi

182 136

Walls and Membranes in Fungi” wyd.: Kuhn i wsp., Springer-Verlag, Berlin, str. 61 /1990/). Polioksyny są wytwarzane przez Streptomyces cacaoi, a nikkomycyny są wytwarzane przez S. tendae.

Fenazyny są zawierającymi azot związkami heterocyklicznymi o wspólnej, płaskiej aromatycznej strukturze trój cyklicznej. Zidentyfikowano ponad 50 występujących w stanie naturalnym fenazyn, różniących się podstawnikami przy podstawowej strukturze pierścieniowej. Okazało się, że tę grupę związków wytwarzają w stanie naturalnym wyłącznie bakterie, zwłaszcza Streptomyces, Sorangium i Pseudomonas (przeglądu dokonali Turner i Messenger w czasopiśmie Advances in Microbiol Physiology, 27, 211-275 /1986/). Ostatnio wyizolowano geny biosyntezy fenazyny ze szczepu P.aureofaciens (Pierson i Thomashow MPMI 5, 330-339 /1992/). Z powodu ich płaskiej struktury aromatycznej wysunięto przypuszczenie, że fenazyny mogą tworzyć interkalacyjne kompleksy z DNA (Hollstein i van Gemert, Biochemistry 10, 497 /1971/) i przez to zaburzają metabolizm DNA. Wykazano, że pochodna fenazynowa, myksyna, interkaluje z DNA (Hollstein i Butler, Biochemistry 11, 1345 /1972/), a lomofungina hamuje syntezę RNA w drożdżach (Cannon i Jiminez, Biochemical Journal 142, 457 /1974/; Ruet i wsp., Biochemistry 14, 4651 /1975/).

Pirolnitryna jest pochodną fenylopirolu o silnej aktywności antybiotycznej. Wykazano, że hamuje wzrost szerokiego zakresu grzybów (Homma i wsp., Soil Biol. Biochem. 21, 723-728 /1989/; Nishida i wsp., J. Antibiot., seria A, 18, 211-219 /1965/). Po raz pierwszy wyizolowano ją z Pseudomonas pyrrocinia (Arima i wsp., J. Antibiot., seria A, 18, 201-204 /1965/) i od tego czasu zidentyfikowano ją w szeregu innych gatunków Pseudomonas i Myxococcus (Gerth i wsp., J. Antibiot, 35, 1101-1103 /1982/). Ukazały się doniesienia, że związek ten hamuje transport elektronów w układzie oddechowym grzyba (Tripathi i Gottlieb, J. Bacteriol. 100, 310-318 /1969/) i rozłącza utleniającą fosforylację (Lambowitz i Slayman, J. Bacteriol. 112, 1020-1022 /1972/). Wysunięto również sugestię, że pirolnitryna powoduje uogólnione zniszczenie błony lipoproteinowej (Nose i Arima, J. Antibiot. Seria A, 22, 135-143 /1969/; Carlone i Scannerini, Mycopathologia et Mycologia Applicata 53,111-123 /1974/). Pirolnitryna jest biosyntetyzowana z tryptofanu (Chang i wsp., J. Antibiot. 34, 555-566).

Syntazy poliketydowe

Wiele antybiotyków, pomimo pozornej różnorodności strukturalnej posiada wspólne zasady biosyntezy. Ich cząsteczki są zbudowane z dwu węglowych bloków budulcowych, w których β-węgiel zawsze zawiera grupę ketonową stąd nazwa - poliketydy. Ogromna różnorodność strukturalna pochodzi z różnych długości łańcucha poliketydowego i różnych wprowadzanych łańcuchów bocznych, albo jako część tych dwóch bloków budulcowych albo po utworzeniu szkieletu poliketydowego. Grupy ketonowe mogą być również zredukowane do grup hydroksylowych albo usunięte. Każdy cykl dodawania dwu węgli przebiega z udziałem kompleksu enzymów zwanych syntazami poliketydowymi (PKS) w sposób podobny do biosyntezy kwasów tłuszczowych. Izoluje się i sekwencjonuje się geny biorące udział w biosyntezie ciągle wzrastającej ilości antybiotyków poliketydowych. Jest prawie oczywiste, że geny PKS są strukturalnie konserwatywne. Kodowane proteiny w zasadzie należą do dwu typów: białka typu I są polifunkcyjne, posiadają kilka domen katalitycznych zaangażowanych w różne etapy enzymatyczne, połączone ze sobą wiązaniami kowalencyjnymi (np. PKS dla erytromycyny, sorafenu i awermektyny (Joaua i wsp., Plasmid 28, 157-165 /1992/; MacNeil i wsp. w publikacji: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, wyd. Baltz i wsp., Americal Society for Microbiology, Washington D.C. str. 245-256 /1993/), podczas gdy białka typu II są monofunkcyjne (Hutchinson i wsp. w publikacji: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, wyd. Baltz i wsp., Americal Society for Microbiology, Washington D.C. str. 203-216 /1993/). Dla prostszych antybiotyków poliketydowych, takich jak aktinorodyna (wytwarzana przez Streptomyces coelicolor), kilka cykli addycji dwu węgli prowadzi się wielokrotnie na enzymach PKS kodowanych przez jeden zestaw genów PKS. Na odwrót, synteza bardziej skomplikowanych związków, takich jak erytromycyna i sorafen (patrz sekcja E w przykładach) wymaga zestawów genów PKS zorganizowanych w moduły,

182 136 przy czym każdy moduł prowadzi jeden cykl addycji dwu węgli (przegląd Hopwood'a i wsp. w publikacji: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, wyd. Baltz i wsp., Americal Society for Microbiology, Washington D.C. str. 267-275 /1993/).

Makrocykliczne laktony

Wspólną cechą tej grupy związków jest obecność dużego pierścienia laktonowego z różnymi podstawnikami przy tym pierścieniu. Związki te można dalej klasyfikować na podgrupy, w zależności od wielkości pierścienia i innych cech charakterystycznych. Te makrolidy posiadają 12-, 14-, 16- lub 17-członowe pierścienie laktonowe związane wiązaniami glikozydowymi z jednym lub z większą ilością aminocukrów i/lub dezoksycukrów. Są one inhibitorami syntezy białka i są szczególnie skuteczne wobec bakterii gram-dodatnich. Erytromycyna A, dobrze poznany makrolid wytwarzany przez Saccharopolyspora erythraea, składa się z 14-członowego pierścienia laktonowego połączonego z dwiema resztami dezoksycukrowymi. Sklonowane wiele genów do biosyntezy tego związku. Wszystkie one są zlokalizowane w segmencie o wielkości 60 kilozasad chromosomu S. erythraea. Zidentyfikowano co najmniej 22 ściśle powiązane otwarte ramki odczytu prawdopodobnie zaangażowane w biosyntezę erytromycyny (Donadio i wsp. w publikacji: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, wyd. Baltz i wsp., Americal Society for Microbiology, Washington D.C. str. 257-265 /1993/).

Chinony

Chinony są związkami aromatycznymi z dwiema grupami karbonylowymi na całkowicie nienasyconym pierścieniu. Związki te można z grubsza sklasyfikować na podgrupy według ilości występujących w nich pierścieni aromatycznych, np. na benzochinony, naftochinony i podobne. Dobrze znaną grupą są tetracykliny, które zawierają pierścień naftacenu z różnymi podstawnikami. Tetracykliny są inhibitorami syntezy białka i są skuteczne wobec zarówno gram-dodatnich jak i gram-ujemnych bakterii, takich jak riketsje, mikoplazmy i Spirochaeta. Pierścienie aromatyczne w tych tetracyklinach pochodzą z cząsteczek poliketydowych. Sklonowane geny biorące udział w biosyntezie oksytetracykliny (wytwarzanej przez Streptomyces rimosus) i dokonano ich ekspresji w Streptomyces lividans (Binnie i wsp., J. Bacteriol. 171, 887-895 /1989/). Geny PKS wykazują homologię z genami dla aktynorodyny, a zatem kodują proteiny PKS typu II czyli monofunkcyjne (Hopewood i Sherman, Ann. Rev. Genet. 24, 37-66/1990/).

Inne typy substancji antypatogenicznych

Zidentyfikowano kilka innych typów substancji antypatogenicznych. Jedną z nich jest antybiotyk 2-heksylo-5-propylo-rezorcynol wytwarzany przez pewne szczepy Pseudomonas. Po raz pierwszy wyizolowano go ze szczepu Pseudomonas B-9004 (Kanda i wsp., J. Antibiot. 28, 935-942 /1975/. Jest to dialkilo-podstawiona pochodna 1,3-dihydroksybenzenu. Wykazano, że posiada ona aktywność antypatogeniczną przeciw bakteriom gram-dodatnim (zwłaszcza przeciw rodzajowi Clavibacter), mikrobakteriom i grzybom.

Innym typem APS są metoksyakrylany, takie jak strobiluryna B. Strobiluryna B jest wytwarzana przez Basidiomycetes. Wykazuje ona szerokie spektrum aktywności przeciw-grzybiczej (Ankę T. i wsp., J. Antibiot. (Tokyo) 30, 806-810 /1977/). Konkretnie, strobilurynę B wytwarza grzyb Bolinia lutea. Aktywność przeciwgrzybicza tego antybiotyku jest wynikiem zdolności hamowania zależnego od cytochromu B transportu elektronów, a przez to, oddychania (Becker W. i wsp., FEBS Letters 132,329-333 /1981/).

Większość antybiotyków wyizolowano z bakterii, actinomycetes i grzybów. Ich rola w biologii organizmu gospodarza jest często nieznana, lecz wiele z nich stosuje się z ogromnym powodzeniem, zarówno w medycynie jak i w rolnictwie, do zwalczania mikroorganizmów chorobotwórczych. Do antybiotyków stosowanych w rolnictwie należą: blastycydyna S i kasugamycyna - do zwalczania czynnika warzenia ryżu (Pyricularia oryzae), walidamycyna - do zwalczania Rhizostonia solani, prumycyna - do zwalczania gatunków Botrytis i Sclerotinia oraz mildiomycyna - do niszczenia pleśni.

182 136

Wszystkie tradycyjne metody ochrony roślin przed chorobami, łącznie z hodowlą roślin opornych na chorobę, wprowadzaniem nowych fungicydów, i ostatnio, rozwojem metod identyfikacji organizmów do kontroli biologicznej, dają pomyślne rezultaty. Jest jednak oczywiste, że stale poszukuje się nowych metod ochrony roślin przed chorobami i właśnie niniejszy wynalazek, ujawniając budowę genów biorących udział w biosyntezie pirolnitryny i sorafenu oraz biosyntezie innych substancji antypatogenicznych, umożliwia stosowanie tych genów w nowych metodach ochrony roślin przed fitopatogenami.

Zgodnie z wynalazkiem cząsteczka DNA kodująca biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określoną jako SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z niąhybrydyzuje.

Korzystnie według wynalazku, cząsteczka DNA kodująca biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określoną jako sekwencja nukleotydów 396 do 2056 w SEK ID nr 1 albo sekwencjąnukleotydów, która z niąhybrydyzuje i cząsteczka ta koduje białko o sekwencji określonej jako SEK ID nr 2.

Korzystnie według wynalazku, cząsteczka DNA kodująca biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określoną jako sekwencja nukleotydów 2026 do 3166 w SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z niąhybrydyzuje.

Korzystnie według wynalazku, cząsteczka DNA kodująca biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolńitryny jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określoną jako sekwencja nukleotydów 3130 do 4904 w SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z nią hybrydyzuje i cząsteczka ta koduje białko o sekwencji określonej jako SEK ID nr 4.

Korzystnie według wynalazku, cząsteczka kodująca biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określoną jako sekwencja nukleotydów 4851 do 6122 w SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z niąhybrydyzuje i cząsteczka ta koduje białko o sekwencji określonej jako SEK ID nr 5.

Korzystnie, cząsteczki DNA kodujące biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny, według wynalazku, mają kodony genu zmienione zgodnie z preferencjami roślinnymi, przy zachowaniu niezmienionych, kodowanych aminokwasów.

Korzystnie, cząsteczki DNA kodujące biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny według wynalazku, są modyfikowane technikami inżynierii genetycznej tak, aby stanowiły część genomu roślinnego.

Zgodnie z wynalazkiem cząsteczka DNA kodująca enzym biosyntetyczny uczestniczący w szlaku biosyntezy sorafenu jest zdefiniowana sekwencją nukleotydową określoną jak SEK ID nr 6 albo sekwencją nukleotydową, która z nią hybrydyzuje i korzystnie ma kodony genu zmienione zgodnie z preferencjami roślinnymi, przy zachowaniu niezmienionych, kodowanych aminokwasów.

Korzystnie, cząsteczka DNA kodująca enzym biosyntetyczny uczestniczący w szlaku biosyntezy sorafenu według wynalazku jest modyfikowana technikami inżynierii genetycznej tak, aby stanowiła część genomu roślinnego.

Zgodnie z wynalazkiem biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny jest zdefiniowany przez sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEK ID nr 2, SEK ID nr 4 oraz SEK ID nr 5.

Zgodnie z wynalazkiem gospodarz będący mikroorganizmem jest transformowany wektorem ekspresyjnym zawierającym cząsteczkę DNA zdefiniowaną przez sekwencję nukleotydów SEK ID nr 1, nukleotydy 396 do 2056, albo nukleotydy 2026 do 3166, albo nukleotydy 3130 do 4904, albo nukleotydy 4851 do 6122 w SEK ID nr 1, przez sekwencję nukleotydów, która hybrydyzuje z wymienionymi sekwencjami, albo przez sekwencję nukleotydów kodującą białko o sekwencji określonej w SEK ID nr 2, SEK ID nr 4 albo SEK ID nr 5, przy czym gospodarz jest wybrany z grupy obejmującej bakterie, grzyby i drożdże.

182 136

Korzystnie, gospodarz według wynalazku jest czynnikiem kontroli biologicznej, zwłaszcza jest organizmem kolonizującym rośliny, albo korzystnie jest zdolny do wytwarzania dużych ilości substancji antypatogenicznej.

Cząsteczki DNA kodujące biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny, według wynalazku, zostały zidentyfikowane i wyizolowane z zespołu genów kodujących enzymy do biosyntezy pirolnitryny z Pseudomonas fluorescens (sekcja C przykładów). Cząsteczki te są stosowane do genetycznej rekombinacji organizmu gospodarza dla ekspresji pirolnitryny jako substancji antypatogenicznej.

Cząsteczki DNA kodujące biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy sorafenu, według wynalazku, zostały zidentyfikowane i wyizolowane z zespołu genów kodujących enzymy do biosyntezy sorafenu z Sorangium (sekcja E przykładów). Cząsteczki te są stosowane do genetycznej rekombinacji organizmu gospodarza, tak aby wytwarzał on sorafen, jako substancję anty patogeniczną.

Stwierdzono, że również inne substancje mogące mieć szkodliwy wpływ na namnażanie się lub wzrost patogenów roślinnych mogą być wytwarzane przez konkretne mikroorganizmy w szlakach biosyntezy kontrolowanych przez szereg genów, analogicznie jak pirolnitryna i sorafen. Do takich substancji należą antybiotyki cukrowe, takie jak aminoglikozydy, antybiotyki peptydowe, pochodne nukleozydowe i inne antybiotyki heterocykliczne zawierające azot i/lub tlen, poliketydy, laktony makrocykliczne i chinony.

Poznanie budowy genów dla pirolnitryny i sorafenu oraz dla innych substancji antypatogenicznych i mechanizmów ekspresji tych genów pozwala na wytwarzanie tych substancji w ilościach odpowiednich do stosowania w rolnictwie. Możliwość wprowadzania wytwarzanych cząsteczek do organizmów transgenicznych pozwala na wytwarzanie dużych ilości substancji antypatogenicznych, których cząsteczki są jednorodne chiralnie, w procesach tych bowiem nie powstają mieszaniny racemiczne, w których niektóre enancjomery mogą mieć mniejszą aktywność. Powstawanie racematów jest typowe w przypadku syntezy chemicznej tych związków.

Definicje stosowanych dalej w opisie określeń

Substancja antypatogeniczna: substancja wymagająca jednej lub większej ilości nieendogennych aktywności enzymatycznych obcych dla rośliny po to, aby mogła być wytwarzana w gospodarzu, gdzie nie występuje w stanie naturalnym, która to substancja wywiera szkodliwy wpływ na namnażanie lub wzrost patogenu. Pod pojęciem „nieendogennych aktywności enzymatycznych” rozumie się aktywności enzymatyczne, które nie występują w stanie naturalnym w gospodarzu, w którym ta substancja antypatogeniczna nie występuje w stanie naturalnym. Patogenem może być grzyb, bakteria, obleniec, wirus, wiroid, szkodnik owadzi lub ich kombinacje lub może to być bezpośredni, lub bezpośrednio czynnik wywołujący chorobę w organizmie gospodarza. Taka substancja antypatogeniczna może zapobiegać namnażaniu się lub wzrostowi fitopatogenu lub może zabijać ten fitopatogen. Substancja antypatogeniczna może być syntetyzowana z substratu występującego w stanie naturalnym w organizmie gospodarza. Alternatywnie, substancja antypatogeniczna może być syntetyzowana z substratu dostarczonego organizmowi gospodarza łącznie z potrzebnymi nieendogennymi aktywnościami enzymatycznymi. Substancją antypatogeniczną może być antybiotyk cukrowy, antybiotyk peptydowy, antybiotyk heterocykliczny zawierający azot, antybiotyk heterocykliczny zawierający tlen, antybiotyk heterocykliczny zawierający azot i tlen, poliketyd, lakton makrocykliczny i chinon. W tekście niniejszego opisu dla substancji antypatogenicznej przyjęto skrót: „APS”.

Substancja antyfitopatogemczna: substancja antypatogeniczna zdefiniowana powyżej, wywierająca niszczący wpływ na namnażanie i wzrost patogenu roślinnego (fitopatogenu).

182 136

Czynnik kontroli biologicznej: organizm wpływający na wzrost patogenu w taki sposób, że zmniejsza się zdolność tego patogenu do wywoływania choroby. Do czynników kontroli biologicznej dla roślin należą mikroorganizmy zdolne do kolonizacji roślin i rizosfery. Obejmują one mikroorganizmy gram-ujemne, takie jak Pseudomonas, Enterobacter i Serratia, mikroorganizmy gram-dodatnie należące do Bacillus i grzyby Trichoderma i Gliocladium. Organizmy te mogą działać jako czynniki kontroli biologicznej w swym stanie pierwotnym albo po ich modyfikacji technikami inżynierii genetycznej.

Patogen: Każdy organizm wywierający niszczący wpływ na wybranego gospodarza w odpowiednich warunkach. W zakresie niniejszego wynalazku termin „patogen” obejmuje grzyby, bakterie, obleńce, wirusy, wiroidy i szkodniki owadzie.

Promotor albo sekwencja regulacyjna DNA: Nie podlegająca translacji sekwencji DNA, która pomaga, wzmaga lub w inny sposób wpływa na transkrypcję, translację lub ekspresję związanej z nią strukturalnej sekwencji DNA, kodującej białko lub inny produkt DNA. Sekwencja promotora jest zwykle usytuowana na końcu 5' podlegającej translacji sekwencji DNA, na ogół w odległości 20 do 100 nukleotydów od końca 5' miejsca początku translacji.

Kodująca sekwencja DNA: sekwencja DNA podlegająca translacji w organizmie z wytworzeniem białka.

Operacyjnie związana z/stowarzyszona z: dwie sekwencje DNA „stowarzyszone” lub „operacyjnie związane” są od siebie zależne fizycznie lub funkcjonalnie. Przykładowo, promotor lub sekwencję regulacyjną DNA uważa się za „stowarzyszoną” z sekwencją DNA, która koduje RNA lub białko, jeśli te dwie sekwencje są związane operacyjnie albo usytuowane w taki sposób, że regulacyjna sekwencja DNA będzie wpływać na poziom ekspresji kodującej lub strukturalnej sekwencji DNA.

Konstrukcja chimerowa / fuzyjna sekwencja DNA: rekombinacyjna sekwencja DNA, w której promotor lub sekwencja regulacyjna DNA jest operacyjnie związana lub stowarzyszona z sekwencją DNA kodującą mRNA albo białko w taki sposób, że ta regulacyjna sekwencja DNA ma możliwość regulowania transkrypcji lub ekspresji stowarzyszonej z nią sekwencji DNA. Regulacyjna sekwencja DNA w konstrukcji chimerowej nie jest normalnie operacyjnie związana z towarzyszącą sekwencją DNA tak, jak w stanie naturalnym. Terminy „heterologiczny” i „nie-pokrewny” użyto do wskazania rekombinacyjnej sekwencji DNA, w której promotor lub regulacyjna sekwencja DNA i stowarzyszona sekwencja DNA są wyizolowane z organizmów należących do różnych gatunków lub rodzajów.

Krótki opis figur

Figura 1 przedstawia mapę restrykcyjną klonu kosmidowego pCIB169 z Pseudomonas fluorescens, zawierającego region genu biosyntezy pirolnitryny. Wskazane są miejsca dla enzymów restrykcyjnych EcoRI, Hindlll, KpnI, Notl, SphI i Xbal oraz pozycje nukleotydów w kiloparach zasad (kbp).

Figura 2 przedstawia mapę funkcyjną regionu genu pirolnitryny w MOCG134 wskazującą miejsca insercji 30 niezależnych insercji Tn5 wzdłuż długości kosmidu pCIB169 do identyfikacji genów biorących udział w biosyntezie pirolnitryny. Miejsca restrykcyjne dla EcoRI są oznaczone literą E, miejsca dla Notl, literą N. Wpływ insercji Tn5 na wytwarzanie pirolnitryny jest oznaczony znakiem „+” lub gdzie + oznacza sekwencję wytwarzającą pirolnitrynę, a - oznacza sekwencję nie wytwarzającą pirolnitryny.

Figura 3 przedstawia mapę restrykcyjną rejonu genu Pm MOCG134 o długości 9,7 kb z klonu pCIB169 zaangażowanego w biosyntezę pirolnitryny. Miejsca restrykcyjne dla EcoRI są oznaczone literą E, miejsca dla Notl, literą N, a miejsca dla Hindlll literą H. Pozycje nukleotydów są wskazane w kiloparach zasad.

Figura 4 przedstawia lokalizację różnych subklonów pochodzących z pCIB169, wyizolowanych do celów oznaczenia sekwencji.

182 136

Figura 5 przedstawia usytuowanie czterech otwartych ramek odczytu (ORF 1-4) odpowiedzialnych za biosyntezę pirolnitryny w szczepie MOCG134, zawartych we fragmencie Xbal/Notl o wielkości około 6 kb z pCIB 169 zawierającym region genu Pm.

Figura 6 przedstawia lokalizację fragmentów wyciętych w ORF 1-4 w zespole genów pirolnitryny w szczepie MOCG134. Wycięte fragmenty są przedstawione jako czarne prostokąty.

Figura 7 przedstawia mapę restrykcyjną klonu kosmidowego p98/l z Sorangium cellulosum zawierającego region genu biosyntezy sorafenu. Góma linia oznacza mapę restrykcyjną p98/l i pokazuje pozycje miejsc restrykcyjnych i ich odległość od lewego brzegu w kilozasadach. Wykazane miejsca restrykcyjne oznaczają: B - BamHI, Bg - Bglll, E - EcoRI, H - Hindlll, Pv - Pvul, Sm - Smal. Prostokąty poniżej mapy restrykcyjnej oznaczają lokalizację modułów biosyntezy. W każdym module domeny aktywności są oznaczone następująco: KS - β-ketoacylosyntaza, AT - acylotransferaza, KR - ketoreduktaza, ACP - białko przenoszące grupy acylowe, DH - dehydrataza, ER - enoilo-reduktaza, TE - tioesteraza.

Figura 8 przedstawia konstrukcję pCIB132 z pSUP2021.

Figura 9 przedstawia mapę restrykcyjną zespołu genów biosyntezy fenazyny, zawartego we fragmencie EcoRI-Hindlll o wielkości 5,7 kb. Orientacja i przybliżone pozycje sześciu otwartych ramek odczytu są podane poniżej mapy restrykcyjnej ORF1, która nie występuje w całości we fragmencie o wielkości 5,7 kb, koduje produkt o znaczącej homologii z syntazami roślinnymi DAHP. ORF2 (0,65 kb), ORF3 (0,75 kb) i ORF4 (l,15kb) posiadają domeny homologiczne odpowiednio do izochorizmatazy, dużej podjednostki syntazy antranilanowej i małej podjednostki syntazy antranilanowej. ORF5 (0,7 kb) nie wykazuje homologii z sekwencjami z baz danych. ORF6 (0,65 kb) posiada homologię koniec do końca z genem kodującym oksydazę 5'-fosforanu pirydoksyny z E.coli.

Krótki opis sekwencji w wykazie sekwencji

SEQIDNR 1	Sekwencja zespołu genów pirolnitryny
SEQ ID NR 2	Sekwencja białka dla zespołu genów pirolnitryny w ORF1
SEQ1DNR3	Sekwencja białka dla zespołu genów pirolnitryny w ORF2
SEQ ID NR 4	Sekwencja białka dla zespołu genów pirolnitryny w ORF3
SEQ ID NR 5	Sekwencja białka dla zespołu genów pirolnitryny w ORF4
SEQ ID NR 6	Sekwencja zespołu genów sorafenu
SEQ ID NR 7	Sekwencja roślinnego inicjatora translacji consensus (Clontech)
SEQ ID NR 8	Sekwencja roślinnego inicjatora translacji consensus (Joshi)
SEQ ID NR 9	Sekwencja oligonukleotydu do użycia w adaptorze molekularnym
SEQIDNR 10	Sekwencja oligonukleotydu do użycia w adaptorze molekularnym
SEQ ID NR 11	Sekwencja oligonukleotydu do użycia w adaptorze molekularnym
SEQ ID NR 12	Sekwencja oligonukleotydu do użycia w adaptorze molekularnym
SEQ ID NR 13	Sekwencja oligonukleotydu do użycia w adaptorze molekularnym
SEQ ID NR 14	Sekwencja oligonukleotydu do użycia w adaptorze molekularnym
SEQ ID NR 15	Oligonukleotyd użyty do zmiany miejsca restrykcyjnego

182 136

SEQ ID NR 16	Oligonukleotyd użyty do zmiany miejsca restrykcyjnego
SEQ ID NR 17	Sekwencja zespołu genów fenazyny
SEQ ID NR 18	Sekwencja białkowa dla phzl z zespołu genów fenazyny
SEQ ID NR 19	Sekwencja białkowa dla phz2 z zespołu genów fenazyny
SEQ ID NR 201	Sekwencja białkowa dla phz3 z zespołu genów fenazyny
SEQ ID NR 21	Sekwencja DNA dla phz4 z zespołu genów fenazyny
SEQ ID NR 22	Sekwencja białkowa dla phz4 z zespołu genów fenazyny

Depozyty

Klon	Numer akcesyjny	Data depozytu
pJL3	NRRL B-21254	20 maja 1994
p98/1	NRRL B-21255	20 maja 1994
pCIB169	NRRL B-21256	20 maja 1994
pCIB3350	NRRL B-21257	20 maja 1994
pCIB3351	NRRL B-21258	20 maja 1994

Poniżej przedstawione zostały sposoby identyfikacji i izolacji genów zaangażowanych w biosyntezę pirolnitryny i sorafenu oraz innych substancji antypatogenicznych i następnie zastosowanie zidentyfikowanych i wyizolowanych cząsteczek DNA do tworzenia transgenicznych roślin o zwiększonej oporności na choroby jak również do tworzenia ulepszonych szczepów do kontroli biologicznej, tzn. szczepów, które kolonizują gospodarzy roślinnych albo rizosferę i w których następuje ekspresja tych wyizolowanych genów. Ponadto, w oparciu o znajomość budowy i organizacji genów przedstawiono nowe możliwości wytwarzania APS, ich wyodrębniania i stosowania w użytkowych formach antypatogenicznych.

Sposoby klonowania genów dla substancji antypatogenicznych

W najprostszej procedurze klonowania genów dla APS klonuje się genomowy DNA z organizmu, o którym wiadomo, że wytwarza substancję antypatogeniczną i przenosi się sklonowany DNA w odpowiednim plazmidzie lub wektorze do organizmu gospodarza, który nie wytwarza APS, następnie identyfikuje się transformowane kolonie gospodarza, który nabył zdolność wytwarzania APS. Stosując technikę taką jak mutageneza transposomem γ::Τη5 (de Bruijn i Lupski, Gene 27, 131-149 /1984/) można dokładniej zdefiniować cały region transformującego DNA nadającego cechę antypatogeniczności. Alternatywnie lub dodatkowo, ten transformujący DNA, nadający cechę antypatogeniczności można rozszczepić na mniejsze fragmenty i dalej charakteryzować najmniejszy z nich, który jeszcze posiada cechę nadawania antypatogeniczności. Ponieważ organizm gospodarza nie mający zdolności wytwarzania APS, może należeć do innego gatunku niż organizm, z którego pochodzi APS, w wariancie tej techniki transformuje się DNA gospodarza do tego samego gospodarza, u którego została zniszczona zdolność wytwarzania APS w wyniku mutagenezy. W tym sposobie, mutuje się organizm wytwarzający APS i izoluje się mutanty nie wytwarzające APS i te uzupełnia się klonowanym genomowym DNA ze szczepu macierzystego wytwarzającego APS. Dalszym

182 136 przykładem standardowej techniki użytej do klonowania genów wymaganych do biosyntezy APS jest zastosowanie mutagenezy transposomem do generowania mutantów organizmu wytwarzającego APS, który to organizm po mutagenezie traci zdolność wytwarzania APS. Tak więc, region genomu gospodarza odpowiedzialny za wytwarzanie APS jest znaczony transposomem i może być łatwo odzyskany i użyty jako sonda do celów izolacji genów natywnych ze szczepu rodzicielskiego. Geny biosyntezy APS, wymagane do syntezy związków APS i podobne do genów dla znanych związków APS, mogą się nadawać do klonowania w oparciu o ich homologię sekwencji do genów biorących udział w biosyntezie znanych związków. Do technik odpowiednich do klonowania na podstawie homologii należy standardowy skrining bibliotek metodą hybrydyzacji DNA.

Ujawniona jest również nowa technika izolacji genów biosyntezy APS, które to geny mogąbyć użyte do klonowania genów dla dowolnego APS. Technika ta jest szczególnie przydatna do klonowania genów biosyntezy APS, które mogą być oporne na klonowanie wyżej wspomnianymi technikami. Jedną z przyczyn występowania takiej oporności na klonowanie jest to, że opisane powyżej techniki standardowe (za wyjątkiem klonowania z wykorzystaniem homologii) mogą preferencyjnie prowadzić do izolacji regulatorów biosyntezy APS. Jeśli jednak regulator zostanie zidentyfikowany, może on być użyty z zastosowaniem tego nowego sposobu do izolacji genów biosyntezy pod kontrolą sklonowanego regulatora. W sposobie tym, tworzy się bibliotekę mutantów z insercjątranspozonu w szczepie mikroorganizmu, który nie posiada tego regulatora lub, w którym ten gen regulacyjny został unieczynniony drogą konwencjonalnych technik rozerwania genu. Użyty transpozon insercyjny posiada nie zawierający promotora gen reporterowy (np. lacZ). Po przygotowaniu biblioteki insercyjnej przenosi się funkcjonalną kopię genu regulatorowego do biblioteki komórek (np. techniką koniugacji lub elektroporacji) i dokonuje się selekcji posianych na płytkach komórek pod kątem ekspresji genu reporterowego. Komórki analizuje się przed i po przeniesieniu genu regulacyjnego. Kolonie, w których zachodzi ekspresja genu reporterowego jedynie w obecności genu regulacyjnego posiadają insercje sąsiadujące z promotorami genów regulowanych przez ten regulator. Przyjmując, że regulator jest swoisty w odniesieniu do regulacji genów biosyntezy APS, geny znaczone w tej procedurze będą genami biosyntezy APS. Korzystnie, klonowanym genem regulacyjnym jest gen gafA opisany w publikacji patentowej PCT, WO 94/01561. Gen ten reguluje ekspresję genów biosyntezy pirolnitryny. Przedstawiony sposób jest korzystny dla klonowania genów biosyntezy pirolnitryny.

Alternatywny sposób identyfikacji i izolacji genu z mikroorganizmu wymaganego do biosyntezy substancji antypatogenicznej (APS), w którym to mikroorganizmie ekspresja tego genu przebiega pod kontrolą regulatora biosyntezy tego APS polega na tym, że:

(a) klonuje się bibliotekę fragmentów genomowych z tego mikroorganizmu do wektora w miejscu sąsiadującym z pozbawionym promotora genem reporterowym w wektorze, w taki sposób, że ekspresja tego genu reporterowego może przebiegać jedynie wówczas, gdy funkcja promotora jest dostarczona przez klonowany fragment, (b) transformuje się odpowiedniego gospodarza wektorami przygotowanymi w etapie (a), (c) identyfikuje się te transformanty z etapu (b), w których zachodzi ekspresja genu reporterowego jedynie w obecności tego regulatora, (d) identyfikuje się i izoluje fragment DNA związany operacyjnie z genetycznym fragmentem z tego mikroorganizmu, obecny w transformantach zidentyfikowanych w etapie (c), przy czym fragment DNA wyizolowany i zidentyfikowany w etapie (d) koduje jeden lub większą ilość polipeptydów potrzebnych do biosyntezy APS.

W celu użycia klonowanych genów APS do ekspresji transgenicznej, jest ważne, aby wszystkie geny potrzebne do syntezy z danego metabolitu były zidentyfikowane i sklonowane. Dzięki stosowaniu kombinacji lub wszystkich technik opisanych powyżej jest to możliwe dla każdego znanego APS. Ponieważ większość genów biosyntezy APS jest w mikroorganizmie zebrana w zespoły znajdujące się zwykle w jednym operonie, identyfikacja wszystkich tych genów będzie możliwa na podstawie identyfikacji pojedynczego locus w mikroorganizmie

182 136 produkującym APS. Poza tym, ponieważ zakłada się, że regulatory genów biosyntezy APS regulują cały szlak metaboliczny, klonowanie genów biosyntezy poprzez ich regulatory jest szczególnie atrakcyjnym sposobem klonowania tych genów. W wielu przypadkach regulator będzie kontrolował transkrypcję pojedynczego, całego operonu, co ułatwia klonowanie genów z użyciem tej strategii.

Stosując opisane sposoby, można klonować z mikroorganizmów geny potrzebne do biosyntezy każdego APS. Wektory ekspresyjne zawierające izolowane cząsteczki DNA, kodujące jeden lub większą ilość polipeptydów potrzebnych do biosyntezy substancji antypatogenicznej, takiej jak pirolnitryna lub sorafen można użyć do transformowania heterologicznego gospodarza. Odpowiednimi gospodarzami heterologicznymi, według wynalazku, są bakterie, grzyby i drożdże. W korzystnym wykonaniu transformowany gospodarz będzie zdolny do syntezy substancji antypatogenicznej nie występującej w stanie naturalnym w tym gospodarzu. Hodowlę tego gospodarza można prowadzić w warunkach pozwalających na produkcję tej antypatogenicznej substancji, którą następnie można odzyskać z organizmu gospodarza. Stosując, ujawnione w niniejszym opisie, metody manipulacji genowej i hodowlę transgenicznej rośliny można dokonać modyfikacji i ekspresji w transgenicznych roślinach klonowanych genów APS. Do odpowiednich genów służących do biosyntezy APS należą geny opisane na początku tej sekcji, a więc geny dla aminoglikozydów i innych antybiotyków zawierających cukry (np. streptomycyny), antybiotyków peptydowych (zarówno typów syntetyzowanych z udziałem rybosomów jak i drogą nierybosomalną), pochodnych nukleozydowych i innych antybiotyków heterocyklicznych zawierających azot i/lub tlen (np. dla polioksyn, nikkomycyn, fenazyn i pirolnitryny), poliketydów, laktonów makrocyklicznych i chinonów (np. sorafenu, erytromycyny i tetracykliny). Ekspresja w transgenicznych roślinach będzie przebiegać pod kontrolą odpowiedniego promotora. Będzie ona wymagała odpowiedniego kierowania komórkowego z uwzględnieniem prawdopodobnych prekursorów wymaganych dla danego APS. Jakkolwiek jest możliwa ekspresja w transgenicznych roślinach dowolnego genu APS dającego się izolować z użyciem procedur podanych w niniejszym opisie, szczególnie korzystna jest ekspresja w transgenicznych roślinach genów dla pirolnitryny, sorafenu, fenazyny i antybiotyków peptydowych, gramicydyny i epiderminy. Ekspresja tych klonowanych genów biosyntezy może również zachodzić w organizmach żyjących w glebie albo w organizmach kolonizujących rośliny, w celu nadania właściwości i zwiększenia w tych organizmach wydajności kontroli biologicznej.

Produkcja pirolnitryny, sorafenu i innych substancji antypatogenicznych w heterologicznych mikroorganizmach jako gospodarzach

Ekspresję klonowanych genów APS można prowadzić w heterologicznych gospodarzach bakteryjnych lub grzybiczych, co umożliwia produkcję APS z większą wydajnością od tej, jaka byłaby możliwa z użyciem gospodarzy natywnych. Techniki stosowane do takich manipulacji genetycznych są specyficzne dla różnych dostępnych gospodarzy i są one znane. Przykładowo, można użyć wektory ekspresyjne pKK223-3 i pKK223-2 do ekspresji heterologicznych genów w E.coli, w fuzji transkrypcyjnej albo translacyjnej, za promotorem tac albo trc. Dla uzyskania ekspresji operonów kodujących wielokrotne ORF, najprostszą procedurą jest insercja operonu do wektora takiego jak pKK223-3 w fuzji transkrypcyjnej i użycie pokrewnego miejsca wiązania rybosomu genów heterologicznych. Techniki nadekspresji w gatunkach gram-dodatnich, takich jak Bacillus są również znane i również mogąbyć stosowane (Quax i wsp. w publikacji: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, wyd. Baltz i wsp., American Society for Microbiology, Washington /1993/). Alternatywne układy do nadekspresji polegają na użyciu wektorów drożdżowych obejmujących Pichia, Saccharomyces i Kluyveromyces (Sreekrishna w publikacji: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, wyd.: Baltz, Hegeman i Skatrud, American Society for Microbiology, Washington /1993/; Dequin i Barre, Biotechnology 12, 173-177 /1994/; van den Berg i wsp., Biotechnology 8,135-139 /1990/).

182 136

Ekspresja klonowanych genów APS w heterologicznych gospodarzach bakteryjnych lub grzybiczych może zachodzić również w celach zwiększenia skuteczności szczepów biokontrolnych tych gospodarzy bakteryjnych i grzybiczych. Tak więc, sposobem ochrony roślin przed fitopatogenami jest traktowanie tych roślin czynnikiem kontroli biologicznej transformowanym jednym lub większą ilością wektorów razem zdolnych do ekspresji wszystkich polipeptydów niezbędnych do wytworzenia substancji antypatogenicznej w ilościach hamujących ten fitopatogen. Mikroorganizmami, które nadają się do heterologicznej nadekspresji genów APS są wszystkie mikroorganizmy zdolne do kolonizacji roślin albo rizosfery. Będą one kontaktowane jako takie z fitopatogenicznymi grzybami, bakteriami lub obleńcami, powodując hamowanie ich wzrostu. Do takich mikroorganizmów należą mikroorganizmy gram-ujemne, takie jak Pseudomonas, Enterobacter i Serratia, mikroorganizmy gram-dodatnie Bacillus i grzyby Trichoderma i Gliocladium. Szczególnie korzystnymi gospodarzami heterologicznymi są Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aurantiaca, Enterobacter cloacae, Serratia marcesens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum i Gliocladium virens, do których korzystnie przenosi się geny dla biosyntezy pirolnitryny, sorafenu, fenazyny i/lub antybiotyków peptydowych. Szczególnie korzystny dla biosyntezy pirolnitryny i/lub sorafenu jest szczep Pseudomonas fluorescens CGA267356 (opisany w publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0472494), który znajduje zastosowanie jako czynnik do kontroli biologicznej ze względu na własność produkcji pirolnitryny (ale nie fenazyny), w wyniku ekspresji genu pirolnitryny. W innym korzystnym wykonaniu, geny dla biosyntezy pirolnitryny i/lub sorafenu przenosi się do szczepu Pseudomonas aureofaciens 30-84, szczepu, posiadającego właściwość biokontroli ze względu na wytwarzanie fenazyny. Ekspresja w heterologicznych szczepach biokontrolnych wymaga selekcji wektorów odpowiednich do replikacji w wybranym gospodarzu i odpowiedniego doboru promotora. Znane techniki prowadzenia ekspresji w bakteriach gram-dodatnich i gram-ujemnych i w grzybach są dalej opisane w niniejszym opisie. .

Ekspresja genów dla pirolnitryny, sorafenu i innych substancji antypatogenicznych w roślinach

Sposobem ochrony roślin przed fitopatogenami jest transformowanie tych roślin jednym lub większą ilością wektorów łącznie zdolnych do ekspresji wszystkich polipeptydów niezbędnych do wytwarzania substancji antypatogenicznych w tych roślinach w ilościach hamujących ten fitopatogen. Geny do biosyntezy APS, w wyniku ekspresji w transgenicznych roślinach powodują biosyntezę wybranych APS w tych transgenicznych roślinach. W ten sposób generuje się transgeniczne rośliny o zwiększonej oporności na fitopatogeniczne grzyby, bakterie i obleńce. Aby ich ekspresja zachodziła w transgenicznych roślinach, same geny APS i sąsiadujące z nimi sekwencje mogą wymagać modyfikacji i optymizacji.

Jakkolwiek w wielu przypadkach ekspresja genów z mikroorganizmów może przebiegać w roślinach na wysokich poziomach bez modyfikacji, to jednak w transgenicznych roślinach może występować niski poziom ekspresji genów APS posiadających kodony, które nie są preferowane przez rośliny. Wiadomo, że wszystkie organizmy mają swoiste preferencje w odniesieniu do użycia kodonów, dlatego kodony genu APS można zmienić tak, aby były zgodne z preferencjami rośliny, a jednocześnie zachowały zdolność kodowania tych samych aminokwasów. Ponadto, najlepiej osiąga się wysoką ekspresję w roślinach stosując sekwencje kodujące, w których zawartość GC wynosi co najmniej 35%, a korzystnie powyżej 45%. Geny mikroorganizmów posiadające niską zawartość GC mogą dawać słabą ekspresję w roślinach w wyniku obecności motywów ATTTA, które mogą destabilizować informacje oraz motywy AATAAA, które mogą powodować nieprawidłową poliadenylację. W dodatku, potencjalne geny biosyntezy APS można selekcjonować na obecność miejsc nieuprawnionego cięcia i składania, co może powodować skracanie informacji. Wszystkie zmiany, których należy dokonać w obrębie sekwencji kodującej APS, takie jak opisane powyżej, można wykonać stosując znane techniki sterowanej miejscem mutagenezy, reakcji łańcuchowej polime

182 136 ryzacji (PCR), i konstruowania genu syntetycznego metodami opisanymi w publikacjach zgłoszeń patentowych europejskich, EP 0385962 (Monsanto), EP 0359472 (Lubrizol) i zgłoszenia światowego WO 93/07278 (Ciba-Geigy). Korzystnymi genami biosyntezy APS mogąbyć geny niemodyfikowane, ich ekspresja powinna przebiegać na wysokich poziomach w docelowych gatunkach roślin transgenicznych albo alternatywnie, mogą to być geny modyfikowane przez usunięcie motywów destabilizacji i nieprawidłowej poliadenylacji oraz miejsc nieuprawnionego cięcia i składania i modyfikowane dalej przez wprowadzenie kodonów preferowanych przez rośliny oraz z zawartością GC korzystną do ekspresji w roślinach. Jakkolwiek ekspresja preferowanych sekwencji genów może prawidłowo zachodzić zarówno w roślinach jednoliściennych jak i w dwuliściennych, można modyfikować sekwencje pod względem specyficznych preferencji kodonu i preferencji zawartości GC w roślinach jednoliściennych i dwuliściennych, wykazano bowiem, że preferencje te są różne (Murray i wsp., Nuci. Acids Res. 17, 477-498 /1989/).

W celu wydajnej inicjacji translacji, sekwencje sąsiadujące z inicjującą metioniną mogą wymagać modyfikacji. Sekwencje pokrewne z wybranymi genami APS mogą wydajnie inicjować translację w roślinach lub też mogą być mało wydajne. W przypadku, w którym są mało wydajne, można je modyfikować przez włączenie sekwencji, o których wiadomo, że są w roślinach wykazując dużą skuteczność. Odpowiednią sekwencję consensus dla roślin zaproponował Joshi (NAR 15, 6643-6653 /1987/; SEQ ID nr 8), a firma Clontech oferuje następny inicjator translacji consensus (katalog 1993/1994, str. 210; SEQ ID nr 7). Te sekwencje consensus są odpowiednie do modyfikacji genów biosyntezy APS. Sekwencje te wprowadza się do konstrukcji genu APS w górę od i obejmując ATG (pozostawiając kodon dla drugiego aminokwasu z genu APS niemodyfikowany) albo alternatywnie, w górę od i włączając kodon GTC następujący po ATG (z możliwością modyfikowania kodonu dla drugiego aminokwasu w tej konstrukcji transgenicznej).

Ekspresja genów APS w transgenicznych roślinach rozpoczyna się za promotorem funkcjonującym w roślinach. Wybór promotora będzie zależał od wymagań co do czasu i miejsca ekspresji, a także od docelowych gatunków. Dla ochrony roślin przed patogenami listowia korzystna jest ekspresja w liściach. Dla ochrony roślin przed patogenami pasożytującymi na kłosach, korzystna jest ekspresja w kwiatostanach (np. w kłosach, wiechach, kolbach i podobnych). Dla ochrony roślin przed patogenami korzeni, korzystna jest ekspresja w korzeniach. Do ochrony sadzonek przed patogenami żyjącymi w glebie, korzystna jest ekspresja w korzeniach i/lub w sadzonkach. W wielu przypadkach należy jednak rozważyć możliwość ekspresji przeciw więcej niż jednemu typowi fitopatogenu, a zatem korzystna będzie ekspresja w wielu tkankach. Jakkolwiek wykazano, że wiele promotorów z roślin dwuliściennych funkcjonuje w roślinach jednoliściennych i odwrotnie, idealnie, promotory z roślin dwuliściennych wybiera się do ekspresji w roślinach dwuliściennych, a promotory z roślin jednoliściennych stosuje się do ekspresji w roślinach jednoliściennych. Nie ma jednak ograniczeń co do pochodzenia tych wybranych promotorów. Wystarcza, że są one aktywne w pobudzaniu ekspresji genów biosyntezy APS. W niektórych przypadkach ekspresja APS w roślinach może dawać ochronę przed szkodnikami owadzimi. Transgeniczna ekspresja genów biosyntezy środka antypatogenicznego beuwerycyny (wyizolowanych z Beauveria bassiana) może przykładowo stanowić ochronę przed owadami niszczącymi rośliny uprawne.

Do korzystnych promotorów, które dają ekspresję konstytutywną należą promotory CaMV 35S i 19S i promotory z genów kodujących aktynę lub ubikwitynę. Jako dalsze korzystne promotory konstytutywne można wymienić geny 12(4-28), CP21, CP24, CP38 i CP29, których DNA są ujawnione w opisie.

Ekspresja genów APS może również przebiegać pod kontrolą promotorów regulowanych chemicznie. W takich przypadkach APS będzie syntetyzowany tylko wówczas, jeśli rośliny uprawne zostaną potraktowane indukującymi je związkami chemicznymi i następnie biosynteza APS zaniknie. Korzystna technologia chemicznego indukowania ekspresji genu jest szczegółowo opisana w publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0332104

182 136 (Ciba-Geigy), włączonego do niniejszego opisu jako odnośnik. Korzystnym promotorem do indukcji chemicznej jest promotor PR-la z tytoniu.

Korzystną kategorią promotorów są promotory indukowane uszkodzeniem. Opisano wiele promotorów, które pobudzają ekspresję w miejscach uszkodzenia jak również w miejscach zakażenia fitopatogenem. Są one odpowiednie do ekspresji genów APS ponieważ biosynteza APS jest uruchamiana przez zakażenie fitopatogenem, a zatem, APS gromadzi się jedynie wówczas, gdy pojawia się infekcja. Idealnie, taki promotor powinien być aktywny tylko lokalnie, w miejscach zakażenia i w ten sposób APS gromadziłby się tylko w komórkach, w których zachodzi potrzeba syntezy APS dla zabicia atakującego je fitopatogenu. Do korzystnych promotorów tego typu należą promotory opisane przez Stanforda i wsp., Mol. Gen. Genet. 215, 200-208 /1989/, Xu i wsp., Plant Molec. Biol. 22, 573-588 /1993/, Logemanna i wsp., Plant Celi 1, 151-158 /1989/, Rohrmeiefa i Lehle'go, Plant Molec. Biol. 22, 783-792 /1993/, Firek'a i wsp., Plant Molec. Biol. 22, 129-142 /1993/ i Wamefa i wsp., Plant J. 3, 191-201 /1993/).

Tkankowo swoiste schematy ekspresji obejmują schematy specyficzne dla tkanek zielonych, specyficzne dla korzeni, dla łodyg i dla kwiatów. Promotory odpowiednie do ekspresji w tkankach zielonych obejmują wiele promotorów, które regulują geny zaangażowane w fotosyntezie, a wiele z nich klonowano zarówno z roślin jednoliściennych jak i dwuliściennych. Korzystnym promotorem jest promotor z kukurydzy, PEPC z genu karboksylazy fosfoenolowej (Hudspeth i Grula, Plant Molec. Biol. 12, 579-589 /1989/). Promotorem korzystnym do ekspresji specyficznej dla korzeni jest promotor opisany przez Framonda (FEBS 290, 103-106 /1991/; publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0452268 (Ciba-Geigy), a także ujawniony w niniejszym wynalazku specyficzny dla korzeni promotor z genu T-l. Korzystnym promotorem specyficznym dla łodyg jest promotor opisany w publikacji zgłoszenia patentowego PCT, WO 93/07278 (Ciba-Geigy), pobudzający ekspresję genu trpA z kukurydzy.

Korzystne jest stosowanie transgenicznych roślin, w których zachodzi ekspresja genów biosyntezy APS w sposób specyficzny dla korzeni. W szczególnie korzystnym przypadku ekspresja genów biosyntezy pirolnitryny zaczyna się za promotorem swoistym dla korzeni, chroniąc transgeniczne rośliny przed fitopatogenem Rhizostonia. W innym przypadku, ekspresja genów biosyntezy fenazyny zaczyna się za promotorem swoistym dla korzeni, chroniąc transgeniczne rośliny przed fitopatogenem Gaeumannomyces graminis, a jeszcze w innym, ekspresję genów biosyntezy APS w transgenicznych roślinach prowadzi się w sposób indukowany uszkodzeniem albo w sposób indukowany infekcją patogenu. Przykładowo, w celu niszczenia patogenów na listowiu, prowadzi się ekspresję genów biosyntezy sorafenu zaczynając za promotorem indukowanym uszkodzeniem albo indukowanym patogenem.

Poza wyborem odpowiedniego promotora, konstrukcje do ekspresji APS w roślinach wymagają odpowiedniego terminatora transkrypcji, przyłączonego w dół od heterologicznego genu APS. Szereg takich terminatorów jest znanych i dostępnych (np. tml z CaMV, E9 z rbcS), przy czym do stosowania wynalazku może być użyty każdy dostępny terminator, o którym wiadomo, że funkcjonuje w roślinach.

Do kaset ekspresyjnych dla genów APS można wprowadzić wiele innych sekwencji. Należą do nich sekwencje wzmacniające ekspresję, takie jak sekwencje intronowe (np. z Adhl i bronze 1) oraz wirusowe sekwencje liderowe (np. z TMV, MCMV i AMV).

Warunkiem nadprodukcji APS w roślinach jest, aby gen biosyntezy APS kodujący pierwszy etap w szlaku metabolicznym miał dostęp do substratu metabolizowanego w tym szlaku. Dla każdego, indywidualnego APS i każdego szlaku substrat będzie prawdopodobnie rożny i różna może być jego lokalizacja w komórce. W wielu przypadkach substrat może się znajdować w cytosolu, podczas, gdy w innych przypadkach, może być zlokalizowany w niektórych organellach komórkowych. W przypadkach, w których aktywność biosyntezy występuje w chloroplastach, substrat często będzie się znajdował w chloroplaście i konsekwentnie, produkty genu biosyntezy APS w takim szlaku będą kierowane do odpowiednich organelli (np. do chloroplastu). Stosując znane techniki można ukierunkować lokalizację w komórce

182 136 enzymów kodowanych przez gen transgeniczny. W typowym sposobie, dokonuje się manipulacji DNA kodującego docelowy peptyd ze znanego, kierowanego do organelli produktu genu, po czym dokonuje się fuzji tego DNA w górę od żądanego genu APS (genów APS). Wiele takich sekwencji docelowych jest znanych dla chloroplastów, zbadano tez ich funkcje w konstrukcjach heterologicznych. Korzystnie, geny biorące udział w biosyntezie pirolnitryny kieruje się do chloroplastu ponieważ substrat dla tego szlaku, tryptofan, jest syntetyzowany w chloroplastach.

W pewnych sytuacjach nadekspresja genów APS może upośledzać komórkową dostępność substratu dla konkretnego szlaku, co może mieć szkodliwy wpływ na komórkę. W takich sytuacjach, pożądane jest zwiększenie ilości dostępnego substratu przez nadekspresję genów kodujących enzymy do biosyntezy tego substratu. W przypadku tryptofanu (substrat do biosyntezy pirolnitryny) można to osiągnąć przez nadekspresję genów trpA i trpB, a także genów dla podjednostek syntazy antranilanowej. Podobnie, nadekspresja enzymów do biosyntezy chorizmanianu, takich jak syntaza DAHP będzie wywierała skutek w produkcji prekursora do produkcji fenazyny. Następną drogą udostępnienia większej ilości substratu jest zamknięcie znanych szlaków wykorzystujących specyficzne substraty (pod warunkiem, że nie będzie to związane z niszczącymi działaniami ubocznymi). W ten sposób, syntetyzowany substrat jest kierowany do biosyntezy APS, a nie do biosyntezy innych związków.

Wektory odpowiednie do transformacji roślin zostały opisane wcześniej. Do transformacji, w której stosuje się Agrobacterium odpowiednie są wektory podwójne (binarne) albo wektory zawierające przynajmniej jedną brzeżną sekwencję T-DNA, natomiast do bezpośredniego przeniesienia genu odpowiedni jest każdy wektor i mogą być korzystne liniowe DNA zawierające jedynie żądaną konstrukcję. W przypadku bezpośredniego przeniesienia genu można zastosować transformację jednym rodzajem DNA albo ko-transformację (Schocher i wsp., Biotechnology 4, 1093-1096 /1986/). Zarówno przy bezpośrednim przeniesieniu genu jak i przy przeniesieniu za pośrednictwem Agrobacterium, transformację prowadzi się na ogół (ale niekoniecznie) z użyciem markera selekcyjnego, który może wprowadzać oporność na antybiotyk (kanamycynę, higromycynę lub metotreksat) albo na herbicyd (basta).

Synteza APS w transgenicznej roślinie będzie często wymagać jednoczesnej nadekspresji wielu genów kodujących enzymy do biosyntezy APS. Można tego dokonać przez transformację indywidualnych genów biosyntezy APS w różnych liniach roślinnych, pojedynczo, i następne skrzyżowanie uzyskanych linii. Selekcja i utrzymanie linii zawierających geny wielokrotne jest łatwiejsza jeśli do różnych konstrukcji stosowanych do transformacji dostosuje się różne markery selekcyjne. Linia, w której zostały zgromadzone wszystkie geny wymagane do biosyntezy APS będzie syntetyzować ten APS, podczas gdy inne linie nie będą. Takie podejście może być odpowiednie dla roślin hybrydowych, takich jak kukurydza, w których końcowa hybryda jest koniecznie krzyżówką między rodzicami. Utrzymanie różnych linii wsobnych z różnymi genami APS może być również korzystne w sytuacjach, w których konkretny szlak APS może prowadzić do wielu produktów APS, z których każdy ma zastosowanie. Przez zastosowanie różnych linii posiadających różne alternatywne geny do dalszych etapów w szlaku metabolicznym do otrzymania krzyżówki hybrydowej z liniami zawierającymi wszystkie pozostałe potrzebne geny, możliwe jest wytworzenie innych hybryd zawierających geny dla innych wybranych APS, które mogą mieć inne zastosowania.

Do alternatywnych sposobów produkcji linii roślinnych zawierających geny wielokrotne należy retransformacja istniejących linii uprzednio transformowanych genem lub genami APS (i ich selekcja innym markerem), a także użycie pojedynczych wektorów transformacji, zawierających wielokrotne geny APS, każdy pod odpowiednią kontrolą regulatora (np. promotora, terminatora lub podobnego czynnika). Biorąc pod uwagę łatwość konstruowania DNA, manipulowanie wektorami klonującymi do wprowadzenia wielokrotnych genów APS jest sposobem korzystnym.

182 136

Zanim materiał do rozmnażania (owoce, bulwy, ziarno, nasiona) będzie sprzedany jako produkt handlowy, zazwyczaj traktuje się go otoczką ochronną zawierającą herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki przeciwbakteryjne, środki przeciw obleńcom, przeciw mięczakom lub mieszaniny kilku tych związków. W miarę potrzeb, ze związków tych przygotowuje się formy użytkowe razem z nośnikami, środkami powierzchniowo czynnymi lub dodatkami ułatwiającymi stosowanie, zwyczajowo stosowanymi w takich formach, co chroni przed zniszczeniem spowodowanym bakteriami, grzybami lub szkodnikami zwierzęcymi.

W celu traktowania nasion, można na nasiona nanosić powłoczkę ochronną albo przez nasycenie bulw lub ziarna ciekłą formę użytkową albo przez ich powleczenie połączoną formą wilgotną lub suchą. W szczególnych przypadkach możliwe są inne sposoby traktowania roślin, takie jak traktowanie skierowane na pączki lub owoce.

Nasiona roślin, które zawierają sekwencję DNA kodującą wytwarzanie substancji antypatogenicznej, mogąbyć traktowane powłoką chroniącą nasiona, zawierającą związek stosowany do zaprawiania nasion, taki jak kaptan, karboksyna, tiram (TMTD®), metalaksyl (Apron®), pirimiphos-metyl (Actellic®) i inne związki, powszechnie stosowane do zaprawiania nasion. Tak przygotowane nasiona stanowią materiał do rozmnażania roślin.

Wytwarzanie pirolnitryny i sorafenu oraz innych substancji antypatogenicznych w gospodarzach heterologicznych

Substancje antypatogeniczne mogą skutecznie hamować wzrost mikroorganizmów, zwłaszcza mikroorganizmów fitopatogennych. Mogąbyć one wytwarzane w dużych ilościach w organizmach, w których zachodzi nadekspresja genów APS. Organizmami odpowiednimi do tego celu są bakterie gram-ujemne i gram-dodatnie, drożdże i rośliny. Do celów produkcji APS ważnym kryterium wyboru organizmu gospodarza jest łatwość manipulacji tym organizmem, szybkość wzrostu (np. fermentacja w przypadku mikroorganizmów) i niewrażliwość na wytwarzane w nadmiarze APS. W korzystnym rozwiązaniu, zwiększone ilości substancji antypatogenicznej syntetyzuje się w gospodarzu, w którym ta substancja antypatogeniczna występuje w stanie naturalnym i który to gospodarz jest transformowany jedną lub większą ilością cząsteczek DNA kodujących łącznie całkowity zestaw polipeptydów wymaganych do syntezy substancji antypatogenicznej. Takie sposoby wytwarzania APS, zwłaszcza antybiotyków, wykazują szereg zalet w stosunku do wytwarzania tych związków na drodze syntezy chemicznej, zwykle stosowanej do wytwarzania tych związków. Do tych zalet należą: niższe koszty produkcji i możliwość syntetyzowania związków w formie korzystnego biologicznego enancjomeru, a nie mieszanin racemicznych powstających nieuchronnie podczas syntezy organicznej. Możliwość wytwarzania związków o odpowiedniej strukturze stereochemicznej jest szczególnie ważna dla cząsteczek posiadających wiele aktywnych chiralnie atomów węgla. APS wytwarzane przez heterologicznych gospodarzy mogą być stosowane w medycynie (do zwalczania patogenów i chorób zakaźnych) oraz w rolnictwie.

Wytwarzanie kompozycji antypatogenicznych

Substancje antybiotyczne wytwarzane przez rekombinantowy czynnik kontroli biologicznej, albo zawiesina lub koncentrat mikroorganizmu stanowiącego ten czynnik są stosowane jako składnik aktywny w kompozycjach przeciwgrzybiczych. Kompozycje albo sam składnik aktywny nanosi się znanymi sposobami na rośliny chronione przed fitopatogenami, w ilościach hamujących ten fitopatogen.

Składniki aktywne same lub w postaci kompozycji można stosować wraz z innymi związkami nanosząc je na roślinę lub powierzchnię uprawy równocześnie lub kolejno. Tymi innymi związkami mogą być nawozy sztuczne albo pożywki mikroelementów lub inne preparaty wpływające na wzrost roślin. Mogą to być wybrane herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki przeciwbakteryjne, przeciw obleńcom, przeciw mięczakom lub mieszaniny kilku takich preparatów, jeśli to potrzebne, z dalszymi nośnikami, środkami powierzchniowo czynnymi lub dodatkami ułatwiającymi stosowanie, zwyczajowo stosowanymi w takich formach.

182 136

Odpowiednimi nośnikami i dodatkami mogą być ciała stałe lub ciecze odpowiadające substancjom zwykle stosowanym w technologii form użytkowych, np. substancje naturalne lub regenerowane substancje nieorganiczne, rozpuszczalniki, środki dyspergujące, zwilżające, lepiszcza, środki wiążące lub nawozy sztuczne.

Korzystnym sposobem stosowania składników aktywnych lub kompozycji agrochemicznej zawierającej co najmniej jeden z tych składników aktywnych jest podawanie na listowie. Ilość zabiegów i częstość ich stosowania zależy od intensywności zakażenia odpowiednim patogenem (typem grzyba). Składniki aktywne mogą również przenikać do rośliny od korzeni poprzez glebę (działanie systemowe) przez nasycenie miejsca wzrostu rośliny kompozycją ciekłą albo przez podanie tych związków w postaci stałej, np. w formie granulatu (stosowanie doglebowe). Składniki aktywne mogą być również stosowane do nanoszenia na nasiona (powlekanie), albo przez nasycenie nasion ciekłą formą użytkową zawierającą składniki aktywne, albo przez powleczenie ich formą stałą. W szczególnych przypadkach są również możliwe dalsze typy zastosowań, np. przez wybiórcze traktowanie łodyg lub pączków rośliny.

Składniki aktywne stosuje się w formie niemodyfikowanej, albo korzystnie, łącznie z dodatkami zwyczajowo stosowanymi w technologii form użytkowych. Wytwarza się w znany sposób koncentraty tworzące emulsje, pasty do powlekania, roztwory do bezpośredniego oprysku lub do rozcieńczania, rozcieńczone emulsje, proszki zwilżalne, proszki rozpuszczalne, proszki pyliste, granulaty, jak również preparaty kapsułkowane, np. w substancjach polimerowych. Uwzględniając właściwości danej kompozycji, wybiera się metody stosowania, takie jak oprysk, rozpylanie, opylanie, rozrzucanie lub zalewanie, zależnie od zamierzonego celu jak i występujących warunków. Stosowane ilości zawierają się w granicach od 50 g do 5 kg składnika aktywnego/hektar, korzystnie od 100 g do 2 kg składnika aktywnego/hektar, najkorzystniej od 200 g do 500 g składnika aktywnego/hektar.

Formy użytkowe, kompozycje lub preparaty zawierające składniki aktywne, i jeśli to potrzebne, stały lub ciekły środek pomocniczy, wytwarza się w znany sposób, np. przez dokładne, jednorodne zmieszanie i/lub wymieszanie tych składników aktywnych ze środkami wypełniającymi, np. rozpuszczalnikami, stałymi nośnikami i tam, gdzie to wskazane środkami powierzchniowo czynnymi.

Jako rozpuszczalniki stosuje się aromatyczne węglowodory, korzystnie frakcje od 2 do 12 atomów węgla, np. mieszaniny ksylenów lub podstawione naftaleny, ftalany, takie jak ftalan dibutylowy albo ftalan dioktylu, alifatyczne węglowodory, takie jak cykloheksan lub parafiny, alkohole i glikole i ich etery i estry, takie jak etanol, eter monometylowy lub monoetylowy glikolu etylenowego, ketony, takie jak cykloheksanon, rozpuszczalniki silnie polarne, takie jak N-metylo-2-pirolidon, dimetylosulfotlenek albo dimetyloformamid oraz epoksydowane oleje roślinne, takie jak epoksydowany olej kokosowy albo olej sojowy lub wodę.

Jako stałe nośniki, np. do proszków pylistych i proszków dyspergowalnych, stosuje się na ogół naturalne wypełniacze nieorganiczne, takie jak kalcyt, talk, kaolin, montmorylonitryl lub atapulgit. Dla poprawy własności fizycznych możliwe jest dodanie krzemionki o wysokim stopniu dyspersji lub absorbentów polimerowych o wysokim stopniu dyspersji. Odpowiednimi granulowanymi nośnikami adsorpcyjnymi są nośniki porowate, np. pumeks, tłuczona cegła, sepiolit lub bentonit. Odpowiednimi nośnikami nieadsorpcyjnymi są materiały, takie jak kalcyt lub piasek. Można ponadto stosować wiele wstępnie granulowanych materiałów pochodzenia organicznego lub nieorganicznego, zwłaszcza dolomit albo sproszkowane pozostałości roślinne.

Zależnie od własności składnika aktywnego użytego do formy użytkowej, stosuje się odpowiednie środki powierzchniowo czynne, niejonowe, kationowe i/lub anionowe, posiadające dobre własności emulgowania, dyspergowania i zwilżania. Termin „środek powierzchniowo czynny” (surfaktant) oznacza w niniejszym opisie również mieszaniny środków powierzchniowo czynnych.

Odpowiednimi anionowymi środkami powierzchniowo czynnymi są rozpuszczalne w wodzie mydła i rozpuszczalne w wodzie syntetyczne związki powierzchniowo czynne.

182 136

Spośród mydeł można stosować sole metali alkalicznych i sole metali ziem alkalicznych lub niepodstawione lub podstawione sole amoniowe wyższych kwasów tłuszczowych (o długości łańcuchów od 10 do 22 atomów węgla), przykładowo, sole sodowe lub potasowe kwasu oleinowego lub stearynowego albo mieszanin naturalnych kwasów tłuszczowych, które można uzyskać np. z oleju kokosowego lub z łoju. Można również użyć sól kwasu tłuszczowego z metylotauryną.

Częściej jednak stosuje się tak zwane surfaktanty syntetyczne, zwłaszcza sulfoniany i siarczany tłuszczowe, sulfonowane pochodne benzimidazolu lub alkiloarylosulfoniany.

Sulfoniany i siarczany tłuszczowe stosuje się zwykle w postaci soli z metalami alkalicznymi i metalami ziem alkalicznych lub w postaci niepodstawionych lub podstawionych soli amoniowych. Posiadają one rodniki alkilowe o długości od 8 do 22 atomów węgla, łącznie z resztą alkilową rodników alkilowych. Przykładami ich są: sól sodowa lub wapniowa kwasu lignosulfonowego, dodecylosiarczanu lub mieszaniny siarczanów alkoholi tłuszczowych uzyskanych z naturalnych kwasów tłuszczowych. Do tego rodzaju związków należą również sole estrów kwasu siarkowego i kwasów sulfonowych adduktów alkoholu tłuszczowego z tlenkiem etylenu. Sulfonowane pochodne benzimidazolowe zawierają korzystnie 2 grupy kwasu sulfonowego i jeden rodnik kwasu tłuszczowego złożonego z 8 do 22 atomów węgla. Przykładami alkiloarylosulfonianów są sole sodowe, wapniowe lub trójetanoloaminowe kwasu dodecylobenzenosulfonowego, dibutylonaftalenosulfonowego albo produktu kondensacji kwasu naftalenosulfonowego z formaldehydem. Można stosować również odpowiednie fosforany, to znaczy, sole estru kwasu fosforowego i adduktu p-nonylofenolu z 4 do 14 molami tlenku etylenu.

Spośród niejonowych środków powierzchniowo czynnych stosuje się korzystnie pochodne eteru poliglikolowego z alkoholami alifatycznymi lub cykloalifatycznymi lub nasyconymi lub nienasyconymi kwasami tłuszczowymi i alkilofenolami, które to pochodne zawierają 3-30 grup eteru glikolowego i 8 - 20 atomów węgla w (alifatycznej) reszcie węglowodorowej i 6 do 18 atomów węgla w reszcie alkilowej alkilofenolu.

Dalszymi odpowiednimi surfaktantami są rozpuszczalne w wodzie addukty tlenku polietylenu z glikolem polipropylenowym, z glikolem etylenodiamino-propylenowym i z glikolem alkilopolipropylenowym, zawierające 1-10 atomów węgla w łańcuchu alkilowym, które to addukty zawierają 20 - 250 grup eteru glikolu etylenowego i 10 do 100 grup eteru glikolu propylenowego. Te związki zwykle zawierają 1 do 5 jednostek glikolu etylenowego na jednostkę glikolu propylenowego.

Reprezentatywnymi przykładami niejonowych środków powierzchniowo czynnych są nonylofenolopolietoksyetanole, etery poliglikolu z olejem rącznikowym, addukty tlenku polipropyleno/polietylenowego, trójbutylofenoksypoli etoksyetanol, glikol polietylenowy i oktylofenoksyetoksyetanol. Odpowiednimi środkami powierzchniowo czynnymi są również estry kwasów tłuszczowych z polioksyetylenosorbitanem i trójoleinian polioksyetylenosorbitanu.

Jako kationowe środki powierzchniowo czynne stosuje się korzystnie czwartorzędowe sole amoniowe posiadające jako podstawnik przy azocie co najmniej 8 - 22 -węglowy rodnik alkilowy oraz jako dalsze podstawniki, niższe niepodstawione lub chlorowcowane rodniki alkilowe, benzylowe lub niższe rodniki hydroksyalkilowe. Sole te występują korzystnie w postaci halogenków, metylosiarczanów lub etylosiarczanów, np. chlorku stearylotrójmetyloamoniowego lub bromku benzylo-di(2-chloroetylo)etyloamoniowego.

Środki powierzchniowo czynne zwyczajowo stosowane w technologii form użytkowych są opisane w publikacjach: „McCutcheorfs Detergents and Emulsifiers Annual”, MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey /1979/ i Sisely and Wood: „ Encyclopedia of Surface Active Agents”, Chemical Publishing Co., Inc. New York /1980/.

Kompozycje agrochemiczne zazwyczaj zawierają od około 0,1 do około 99%, korzystnie od około 0,1 do około 95%, a najkorzystniej od około 3 do około 90% składnika aktywnego, od około 1 do około 99,9%, korzystnie od około 1 do około 99%, a najkorzystniej od około 5

182 136 do około 95% stałej lub ciekłej substancji pomocniczej oraz od około 0 do około 25%, korzystnie od około 0,1 do około 25%, a najkorzystniej od około 0,1 do około 20% środka powierzchniowo czynnego.

Produkty handlowe są na ogół przygotowane w postaci koncentratów, natomiast użytkownik będzie stosował preparaty rozcieńczone.

Przykłady

Następujące przykłady służą jako dalszy opis wynalazku i sposobów jego wykonania praktycznego. Nie mają one na celu ograniczania zakresu wynalazku lecz stanowią wskazówki, jak wynalazek może być wykorzystany w praktyce.

A. Identyfikowanie mikroorganizmów wytwarzających substancje antypatogeniczne

Mikroorganizmy można izolować z wielu źródeł i prowadzić skrining na ich zdolność hamowania wzrostu grzybów lub bakterii in vitro. Na ogół, mikroorganizmy rozcieńcza się i posiewa na pożywce, na którą lub do której wprowadza się zarodniki grzybów lub fragmenty grzybni bądź bakterie. Czyste strefy wokół nowo wyrosłych kolonii bakteryjnych wskazują na aktywność antypatogeniczną.

Przykład I. Izolowanie z gleby mikroorganizmów o właściwościach niszczenia Rhizoctonia

Próbkę 1 g gleby (zawierającą około 10⁶ - 10⁸ bakterii) zawieszono w 10 ml sterylnej wody. Po energicznym mieszaniu pozostawiono zawiesinę aby osiadły cząstki gleby. Sporządzono odpowiednie rozcieńczenia i określone ilości naniesiono na płytki agarowe z pożywką (lub na inną pożywkę wzrostową), tak, aby uzyskać 50-100 kolonii na płytce. Świeżo wyhodowaną grzybnię Rhizoctonia rozdrobniono przez zmieszanie i po okresie, kiedy kolonie bakterii wyrosły na tyle, że stały się już widoczne, na płytki agarowe natryskano zawiesiny fragmentów grzyba. Izolaty bakteryjne wykazujące aktywność przeciwgrzybiczą można zidentyfikować jako wolne od grzyba strefy otaczające kolonie po dalszej inkubacji płytek.

Wytwarzanie aktywnych biologicznie metabolitów przez te izolaty potwierdzono stosując na opisanych powyżej płytkach do oznaczeń przesącze z hodowli zamiast żywych kolonii. Te próby biologiczne można również użyć do monitorowania oczyszczania metabolitów. Oczyszczanie można zacząć od etapu ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym i zależnie od tego, czy składnik aktywny przechodzi do fazy organicznej czy pozostaje w fazie wodnej, stosuje się następne, różne etapy chromatograficzne. Takie etapy chromatograficzne są dobrze znane. W końcu oznacza się czystość i tożsamość chemiczną metodami spektroskopowymi.

B. Klonowanie pochodzących z mikroorganizmów genów zaangażowanych w biosyntezę substancji antypatogenicznych

Przykład II. Klonowanie genów zaangażowanych w biosyntezę substancji antypatogenicznych z ich naturalnego źródła techniką „ślepego strzału”

Pokrewne geny biosyntezy są w mikroorganizmach na ogół zlokalizowane w bliskim sąsiedztwie jeden obok drugiego i często w jednym operonie znajduje się więcej niż jedna otwarta ramka odczytu. Wynika stąd, że jedną z dróg klonowania genów kodujących enzymy biorące udział w jednym szlaku metabolicznym jest przeniesienie fragmentów genomowych z mikroorganizmu zawierającego ten szlak do takiego, w którym on nie występuje i następny skrining na obecność fenotypu, który nabył ten szlak.

W przypadku genów biosyntetazy kodujących enzymy prowadzące do wytwarzania substancji antypatogenicznej (APS), izoluje się genomowy DNA mikroorganizmu wytwarzającego substancję antypatogeniczną, trawi się ten genomowy DNA endonukleazą restrykcyjną takąjak Sau3A, frakcjonuje się pod względem wielkości w celu izolacji fragmentów o określonej wielkości (wybrana wielkość zależy od rodzaju wybranego wektora) i klonuje się fragmenty o wybranej wielkości do wektora (np. do miejsca BamHI w wektorze kosmidowym) i przenosi się do E.coli. Otrzymane klony E.coli przesiewa się na obecność tych, które wytwarzają substancję antypatogeniczną. Taki skrining może się opierać na bezpośredniej detekcji substancji antypatogenicznej, np. metodą próby biochemicznej.

182 136

Alternatywnie, skrining może być oparty na szkodliwym działaniu, związanym z obecnością substancji antypatogenicznej, na docelowy patogen. W takim skriningu selekcjonuje się klony wytwarzające substancję antypatogeniczną pod względem ich zdolności zabijania lub spowalniania wzrostu docelowego patogenu. Taka aktywność hamująca daje podstawę do znanych, standardowych prób skriningowych, takichjak przesiewanie na zdolność wytwarzania czystych stref na płytce bakteryjnej nasyconej docelowym patogenem (np. zarodnikami jeśli docelowym patogenem jest grzyb, komórkami jeśli docelowym patogenem jest bakteria). Klony wyselekcjonowane pod kątem aktywności antypatogenicznej można analizować dalej, dla potwierdzenia obecności substancji antypatogenicznej, stosując odpowiednie dla danej substancji standardowe techniki chemiczne lub biochemiczne.

Dalszą charakteryzację i identyfikację genów kodujących enzymy do biosyntetazy substancji antypatogenicznej prowadzi się następująco. Inserty DNA z klonów E.coli zidentyfikowanych jako dodatnie izoluje się i trawi na mniejsze fragmenty. Te mniejsze fragmenty reklonuje się do wektorów, wprowadza się do E.coli i następnie prowadzi się oznaczenia na obecność fenotypu antypatogenicznego. Alternatywnie, klony zidentyfikowane jako dodatnie poddaje się mutagenezie z użyciem transpozonu λ::Τη5 wykorzystując znane techniki (np. de Bruijn i Lupski, Gene 27, 131-149 /1984/). Stosując ten sposób, do DNA, o którym wiadomo, że nabył cechę wytwarzania APS, wprowadza się wiele rozrywających inwercji transpozonu, co umożliwia delineację określonego regionu (regionów) tego DNA odpowiedzialnych za wytwarzanie APS. Następnie, oznaczając sekwencję najmniejszego insertu wykazującego zdolność wytwarzania w E.coli substancji antypatogenicznej, wykrywa się otwarte ramki odczytu potrzebne do wytwarzania APS. Te otwarte ramki odczytu można w końcu rozerwać (patrz niżej) dla potwierdzenia ich roli w biosyntezie substancji antypatogenicznej.

W opisanych technikach, zamiast E.coli można użyć różne inne organizmy gospodarza, takie jak Bacillus i drożdże, stosując odpowiednie dla tego gospodarza wektory klonujące znane w technice. Przy wyborze organizmu gospodarza istnieje tylko jedno ograniczenie: nie powinien on być wrażliwy na substancję antypatogeniczną. dla biosyntezy której sklonowane geny.

Przykład III. Klonowanie genów zaangażowanych w biosyntezę substancji antypatogenicznej techniką mutagenezy transpozonem

Dla wielu mikroorganizmów wytwarzających substancje antypatogeniczne mutageneza transpozonem jest techniką rutynową, stosowaną do generowania mutantów insercyjnych. Technikę tę z powodzeniem użyto między innymi dla Pseudomonas (np. Lam i wsp., Plasmid, 13, 200-204 /1985/), Balillus (np. Youngman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2305-2309 /1983/), Staphylococcus (np. Pattee, J. Bacteriol. 145, 479-488 /1981/) i Streptomyces (np. Schauer i wsp., J. Bacteriol. 173, 5060-5067 /1991/). Głównym wymaganiem przy stosowaniu tej techniki jest możliwość wprowadzenia plazmidu zawierającego transpozon do mikroorganizmu zdolnego do insercji tego transpozonu w pozycji losowej w genomie. Wprowadzając plazmid zawierający transpozon do dużej liczby mikroorganizmów tworzy się ogromną bibliotekę mutantów insercyjnych. Plazmid można wprowadzać do mikroorganizmu każdą odpowiednią standardową techniką, np. metodą koniugacji lub technikami bezpośredniego przeniesienia genu, takimi jak elektroporacja.

Po sporządzeniu biblioteki transpozonów w sposób opisany powyżej, prowadzi się analizę tych transpozonowych mutantów insercyjnych na wytwarzanie APS. Można oczekiwać, że mutanty, które nie wytwarzają APS będą występować w większości, w wyniku insercji transpozonu do sekwencji genów biorących udział w biosyntezie APS. Mutanty te kieruje się zatem do dalszej analizy.

Następnie klonuje się DNA pochodzący z wyselekcjonowanych mutantów, sąsiadujący z insertem transpozonu, stosując znane techniki. Przykładowo, DNA gospodarza sąsiadujący z insertem transpozonu można klonować jako część biblioteki DNA przygotowanej z genomowego DNA wybranego mutantu. Ten sąsiadujący DNA gospodarza identyfikuje się z biblioteki stosując transpozon jako sondę DNA. Alternatywnie, jeśli użyty transpozon zawiera

182 136 odpowiedni gen oporności na antybiotyk, wówczas taki zmutowany insercyjny DNA można trawić endonukleazą restrykcyjną, która, co można przewidzieć, nie będzie cięła w obrębie tej sekwencji genowej ani pomiędzy jego sekwencją a punktem insercji w gospodarzu, po czym klonuje się powstałe fragmenty do mikroorganizmu takiego jak E.coli i poddaje selekcji stosując wybrany antybiotyk.

Sekwencjonowanie DNA poza wprowadzonym transpozonem ujawnia sąsiadujące sekwencje gospodarza. Te sąsiadujące sekwencje można z kolei użyć jako sondy hybrydyzacyjne do reklonowania nierozerwanego natywnego DNA gospodarza, stosując bibliotekę niezmutowanego gospodarza. Tak wyizolowany DNA z gospodarza niezmutowanego charakteryzuje się i stosuje do komplementacji nie zawierającego genów dla APS fenotypu mutantu. DNA stosowany do uzupełnienia może zawierać albo geny do biosyntetazy APS albo geny, które regulują cały lub część szlaku biosyntetazy APS. Dla upewnienia się, że wyizolowane sekwencje zawierają geny biosyntetazy APS, można je przenieść do gospodarza heterologicznego, który nie wytwarza APS i który nie jest wrażliwy na APS (takiego jak E.coli). Metodą przenoszenia coraz mniejszych cząstek wyizolowanego DNA i zsekwencjonowania najmniejszej efektywnej części, można zidentyfikować geny APS. Alternatywnie, wykorzystując znane techniki, można poddać klony zidentyfikowane jako dodatnie mutagenezie transpozonem λ::Τη5 (np. de Bruijn i Lupski, Gene 27, 131-149 /1984/). Stosując ten sposób, do DNA, który nabył zdolność wytwarzania APS wprowadza się wiele rozrywających insercji transpozonu, co umożliwia delineację konkretnego regionu (regionów) DNA odpowiedzialnego za produkcję APS. Te dalsze etapy prowadzi się w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie I. Dla uniknięcia możliwości, że sklonowane geny nie będą podlegać ekspresji w hetrologicznym gospodarzu z powodu nie funkcjonowania heterologicznego promotora, te klonowane geny przenosi się do wektora ekspresyjnego, gdzie zajdzie ich fuzja z promotorem, o którym wiadomo, że funkcjonuje w heterologicznym gospodarzu. Przykładem odpowiedniego wektora ekspresyjnego dla E.coli jest wektor pKK223, w którym wykorzystano promotor tac. Istnieją i są znane podobne, odpowiednie wektory ekspresyjne dla innych gospodarzy, takich jak drożdże. Na ogół, te fuzje są łatwe do przeprowadzenia dzięki organizacji typu operonu pokrewnych genów w mikroorganizmach i prawdopodobieństwa, że enzymy potrzebne do biosyntezy APS będą kodowane na jednym transkrypcie, co wymaga fuzji tylko jednego promotora.

Przykład IV. Klonowanie genów biorących udział w biosyntezie substancji antypatogenicznej techniką mutagenezy i komplementacji

W sposobie podobnym do opisanego powyżej stosuje się nieinsercyjne techniki mutagenezy (takie jak mutagenezę chemiczną i mutagenezę przez napromienianie) łącznie z komplementacją. Mikroorganizm wytwarzający APS poddaje się metagenezie nieinsercyjnej i mutanty, które utraciły zdolność wytwarzania APS selekcjonuje się do dalszej analizy. Z macierzystego szczepu wytwarzającego APS sporządza się bibliotekę genów. Dogodnym podejściem byłoby ligowanie fragmentów o wielkości 20-30 kilozasad w wektorze takim jak pVK100 (Knauf i wsp., Plasmid 8,45-54 /1982/) do E.coli zawierającej tra+ plazmid pRK2013, który umożliwiałby przeniesienie przez trójrodzicielską koniugację z powrotem do wyselekcjonowanego mutantu APS-minus (Ditta i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7247-7351 /1980/). Dalszym odpowiednim podejściem byłoby przeniesinie z powrotem do mutantu biblioteki genów drogą elektroporacji. W każdym przypadku prowadzi się następnie selekcję na wytwarzanie APS. Wyselekcjonowane kolonie charakteryzuje się dalej przez retransformację mutantu APS-minus mniejszymi fragmentami komplementującego DNA dla zidentyfikowania najmniejszego fragmentu komplementującego i następnie poddaje się go analizie sekwencji. Tak, jak w przykładzie II, geny wyizolowane w tej procedurze mogą być genami biosyntetycznymi albo genami regulującymi cały szlak biosyntetazy APS lub jego część. Dla upewnienia się, że wyizolowane sekwencje kodują geny biosyntezy, można je przenieść do gospodarza heterologicznego, który nie wytwarza APS i jest niewrażliwy na APS (takiego jak E.coli). Te ostatnie etapy prowadzi się w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie II.

182 136

Przykład V. Klonowanie genów biosyntezy substancji antypatogenicznej przez wykorzystanie regulatorów, które kontrolują ekspresję genów biorących udział w biosyntezie

Dalsze podejście do klonowania genów biorących udział w biosyntezie APS polega na użyciu regulatorów kontrolujących ekspresję tych genów. Bibliotekę mutantów z insercją transpozonu tworzy się w szczepie mikroorganizmu, który nie posiada regulatora albo w którym unieczynniono gen regulacyjny stosując konwencjonalne techniki rozerwania genu. Użyty transpozon insercyjny zawiera gen reporterowy bez promotora (np. lacZ). Po utworzeniu biblioteki insercyjnej do tej biblioteki komórek przenosi się funkcjonalną kopię genu regulacyjnego (np. przez koniugację lub elektroporację) i posiane na płytkach komórki selekcjonuje się na występowanie ekspresji genu reporterowego. Komórki analizuje się przed i po przeniesieniu genu regulacyjnego. Kolonie, w których zachodzi ekspresja genu reporterowego jedynie w obecności genu regulatorowego posiadają insercje sąsiadujące z promotorem genów regulowanych przez ten regulator. Przyjmując, że ten regulator jest specyficzny w zakresie czynności regulacyjnej dla genów biosyntezy APS, geny znaczone przez tę procedurę będą genami biosyntetazy APS. Geny te można następnie klonować i dalej charakteryzować stosując techniki opisane w przykładzie II.

Przykład VI. Klonowanie genów biosyntezy substancji antypatogenicznej przez wykorzystanie homologii

Do klonowania nowych genów biosyntezy substancji antypatogenicznej na podstawie ich homologii ze znanymi genami można stosować techniki standardowe. Przygotowuje się bibliotekę DNA żądanego mikroorganizmu i znakuje się ją znaczonym radioizotopem DNA pochodzącym z genu (genów) biosyntezy APS z innego organizmu. Nowo wyizolowane geny charakteryzuje się, sekwencjonuje i wprowadza do heterologicznego organizmu lub do zmutowanego szczepu APS-minus mikroorganizmu natywnego dla wykazania nabycia przez nie cechy wytwarzania APS.

C. Klonowanie genów biosyntezy pirolnitryny z Pseudomonas

Pirolnitiyna jest związkiem fenylopirolowym wytwarzanym przez wiele szczepów Pseudomonas fluorescens. Szczepy P fluorescens produkujące pirolnitrynę są szczepami skutecznie zwalczającymi grzybicze patogeny Rhizoctonia i Pythium (publikacja opisu patentowego światowego, WO 94/01561). Przypuszcza się, że biosynteza pirolnitryny zaczyna się od tryptofanu (Chang i wsp., J. Antibiotics. 34, 555-566 /1981/).

Przykład VII. Użycie genu regulacyjnego gafA do izolacji z Pseudomonas genów biosyntetazy pirolnitryny

Stosując podstawową zasadę opisaną w powyższym przykładzie 5, wyizolowano zespół genów kodujących enzymy do biosyntezy pirolnitryny. Genem regulacyjnym użytym w tej procedurze izolacji był gen gafA z Pseudomonas fluorescens. Wiadomo, że jest on częścią dwuskładnikowego układu regulacyjnego kontrolującego niektóre geny służące do biokontroli w Pseudomonas. Gen gafA jest opisany szczegółowo w publikacji opisu patentowego światowego, WO 94/01561 włączonej w całości do niniejszego opisu jako odnośnik. Gen gafA jest ponadto opisany w publikacji Gaffne/a i wsp. (Molecular Plant-Microbe Interactions 7, 455-463 /1994/), również w całości włączonej do niniejszego opisu jako odnośnik), gdzie jest opisany jako „ORF5”. Wykazano, że gen gafA reguluje biosyntezę pirolnitryny i wytwarzane chitynazy, żelatynazy i cyjanku. Do użycia w niniejszej technice izolacji nadają się szczepy, w których brakuje genu gafA lub w których ekspresja tego genu przebiega na niskich poziomach (i w konsekwencji ekspresja genów regulowanych przez gafA również na niskich poziomach).

Przykład VIII. Izolowanie genów biosyntezy pirolnitryny w Pseudomonas

Przeniesienie genu gafA z MOCG 134 do ściśle spokrewnionych, nie wytwarzających pirolnitryny dzikich szczepów Pseudomonas fluorescens powoduje, że szczepy te mogą wytwarzać pirolnitrynę (Gaffney i wsp., MPMI /1994/; patrz również Hill i wsp., Applied and Environmental Microbiology 60, 78-85 /1994/). Wskazuje to na fakt, że te ściśle spokrewnione szczepy posiadają geny strukturalne potrzebne do biosyntezy pirolnitryny lecz nie mogą

182 136 wytwarzać związku bez aktywacji pochodzącej z genu gafA. Jeden taki ściśle spokrewniony szczep, MOCG133, użyto do identyfikacji genów biosyntezy pirolnitryny. Do zmutowania MOCG133 użyto transpozon TnCIBlló (Lam, New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, str. 767-778, Alan R. Liss Inc. /1990/). Ten transpozon, pochodna Tn5, koduje cechę oporności na kanamycynę i zawiera blisko jednego końca gen reporterowy lacZ bez promotora. Ten transpozon wprowadzono do MOCG133 przez koniugację, stosując wektor plazmidowy pCIBlló (Lam, New Directions in Biological Control: Altematives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, str. 767-778, Alan R. Liss Inc. /1990/), który można uczynnić w MOCG133 lecz nie może się on replikować w tym organizmie. Tak więc większość, jeśli nie wszystkie, opome na kanamycynę transkoniugaty były wynikiem transpozycji TnCIBlló w różnych miejscach genomu MOCG133. Jeśli transpozon ulega integracji z chromosomem bakteryjnym za aktywnym promotorem, wówczas uaktywnia się reporterowy gen lacZ. Taką aktywację genu można śledzić wizualnie, stosując substrat, X-gal, który uwalnia nierozpuszczalny niebieski produkt po rozszczepieniu przez produkt genu lacZ. Transkoniugaty opome na kanamycynę zbiera się i nanosi na płytki podstawowe, z których następnie przenosi się je na płytki - repliki na warstwy szczepu S17-1 E.coli (Simon i wsp., Biotechnology 1, 784-791 /1983/) transformowanego plazmidem posiadającym źródło replikacji RK2 dla szerokiego zakresu gospodarzy, gen do selekcji na podstawie oporności na tetracyklinę i gen gafA. Szczep E.coli S17-1 zawiera zintegrowane z chromosomem geny tra do przeniesienia plazmidów przez koniugację. Tak więc, posiewanie na płytki - repliki mutantów insercyjnych z transpozonami na warstwę mutantów E.coli SI7-1 /gafA powoduje przeniesienie plazmidu zawierającego gafA do mutantów insercyjnych z transpozonami i umożliwia oznaczanie aktywności genu lacZ w obecności regulatora gafA (ekspresja gafA gospodarza jest niewystarczająca do wywoływania ekspresji genu lacZ a wprowadzenie gafA do plazmidu występującego w wielu kopiach jest bardziej skuteczne). Zidentyfikowano mutanty insercyjne, które wykazywały fenotyp „niebieski” (to znaczy z aktywnością lacZ) tylko w obecności gafA. W tych mutantach transpozon uległ integracji z genami, których ekspresja była regulowana przez gafA. Te mutanty (z wprowadzonym gafA) analizowano na zdolność wytwarzania cyjanku, chitynazy i pirolnitryny (sposobem opisanym przez Gaffhe/a i wsp., MPM1 /1994/, w druku), a więc, aktywności, które są regulowane przez gafA (Gaffney i wsp., MPMI /1994/, w druku). Jeden mutant nie wytwarzał pirolnitryny lecz wytwarzał cyjanek i chitynazę, co wskazuje na fakt, że insercja transpozonu nastąpiła w regionie genetycznym odpowiedzialnym jedynie za biosyntezę pirolnitryny. Sekwencje DNA flankujące jeden koniec tego transpozonu sklonowano przez trawienie enzymem Xhol chromosomalnego DNA wyizolowanego z wybranego mutantu insercyjnego, ligację fragmentów powstałych w wyniku trawienia do miejsca Xhol w pSP72 (Promega, numer katalogowy #P2191) i selekcję E.coli transformowanej produktami tej ligacji na pożywce z kanamycyną. Unikalne miejsce Xhol w tym transpozonie rozszczepia się za genem oporności na kanamycynę, co umożliwia jednoczesną izolację regionu flankującego pochodzącego z macierzystego szczepu MOCG133 na tym samym fragmencie Xhol. W rzeczywistości okazało się, że miejsce Xhol w sekwencji flankującej znajduje się w odległości około 1 kilozasady od końca transpozonu. Subfragment ze sklonowanego fragmentu Xhol pochodzący wyłącznie z tej znajdującej się w odległości 1 kilozasady sekwencji flankującej użyto następnie do wyizolowania natywnego (nierozerwanego) regionu genu z biblioteki kosmidowej szczepu MOCG134. Bibliotekę kosmidową przygotowano z częściowo trawionego Sau3A DNA MOCG134, selekcjonowanego pod względem wielkości fragmentów (30 do 40 kilozasad) i sklonowanego do miejsca BamHI w wektorze kosmidowym pCIB119, który jest pochodną c2XB (Bates i Swift, Gene 26, 137-146 /1983/ i pRK290 (Ditta i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7247-7351 /1980/). Wektor pCIB119 jest wektorem kosmidowym z podwójnym miejscem cos, posiadającym źródło replikacji RK2 o szerokim zakresie gospodarzy, a zatem, może się replikować zarówno w Pseudomonas jak i w E.coli. Stosując sekwencję flankującą około 1 kilozasady jako sondę hybrydyzacyjną wyizolowano szereg klonów z biblioteki klonu kosmidowego MOCG134.

182 136

Okazało się, że jeden spośród tych klonów przywrócił cechę produkcji pirolnitryny do insercyjnego mutantu z transpozonem, który utracił zdolność wytwarzania pirolnitryny. Ten klon zawierał insercję około 32 kilozasad. Oznaczono go symbolem pCIBl 69. Żywą hodowlę E.coli DH5a zawierającą kosmidowy klon pCIB169 zdeponowano w muzeum „Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 USA dnia 20 maja 1994 roku pod numerem akcesyjnym NRRL B-21256.

Przykład IX. Mapowanie i mutageneza Tn5 kosmidu pCIBl 69

Insert o wielkości 32 kilozasad w klonie pCIBl69 subklonowano do pCIBl89 w E.coli HB101, pochodnej plazmidu pBR322, który zawiera unikalne miejsce klonowania Notl. Wygodne miejsce Notl w insercie o wielkości 32 kilozasad oraz obecność miejsc Notl flankujących miejsce klonujące BamHI macierzystego wektora kosmidowego pCIBl 19 pozwoliło na subklonowanie fragmentów o wielkości 14 i 18 kilozasad do pCIBl89. Te klony mapowano przez trawienie enzymami restrykcyjnymi. Na fig. 1 przedstawione są wyniki tego mapowania. Na tych subklonach o wielkości 14 i 18 kilozasad przeprowadzono mutagenezę transpozonem λ Tn5, wykorzystując znane techniki (np. De Bruijn i Lupski, Gene 27, 131-149 /1984/). Do transfekcji opisanych powyżej subklonów o wielkości 14 i 18 kilozasad użyto faga λ Tn5 nadającego oporność na kanamycynę. Transfekcje fagiem λ Tn5 wykonywano uzyskując częstość infekcji równą 0,1 z następną selekcją na pożywce z kanamycyną. Po mutagenezie preparowano plazmidowy DNA i przenoszono go do E.coli HB101 z selekcją na kanamycynie dla umożliwienia izolacji plazmidowych klonów zawierających insercje Tn5. Ogółem zmapowano 30 niezależnych inserćji Tn5 w całej długości 32 kilozasad insertu (fig. 2). Każdą z tych inserćji krzyżowano z MOCG 134 przez podwójną rekombinację homologiczną i zweryfikowano metodą hybrydyzacji Southema stosując sekwencję Tn5 i wektor pCIBl89 jako sondy hybrydyzacyjne, w celu wykazania występowania podwójnej rekombinacji homologicznej, to znaczy, zamiany dzikiego typu genu MOCG 134 na gen z insercją Tn5. Dla każdej inserćji krzyżowej z MOCG 134 wykonywano próby na wytwarzanie pirolnitryny i zidentyfikowano region genetyczny o wielkości około 6 kilozasad jako biorący udział w produkcji pirolnitryny (patrz fig. 3 i fig. 5). Okazało się, że ten regon jest zlokalizowany centralnie w pCIBl69 i daje się łatwo subklonować w postaci fragmentu Xbal/Notl do plazmidu pBluescript II KS (Promega). Ten subklon Xbal/Notl oznaczono kodem pPRN5.9X/N (patrz fig. 4).

Przykład X. Identyfikacja otwartych ramek odczytu w klonowanych regionach genetycznych

Region genetyczny biorący udział w biosyntezie pirolnitryny subklonowano do sześciu fragmentów do celów sekwencj ono wania w wektorze pBluescript II KS (patrz fig. 4). Te fragmenty zajmują fragment Xbal/Notl o wielkości około 6 kilozasad opisany powyżej i rozciągają się od miejsca EcoRI od lewej strony na fig. 4 do wysuniętego najbardziej na prawo miejsca Hindlll (patrz fig. 4). Oznaczono sekwencje insertów w klonach pPRN1.77E, pPRNl.OlE, pPRN1.24E, pPRN2.18E, pPRN0.8H/N i pPRN2.7H stosując zestaw do sekwencj ono wania, Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Seąuencing Kit dostarczony przez firmę Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, postępując zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Reakcje sekwencjonowania prowadzono w aparaturze do sekwencjonowania „Applied Biosystems 373A Automated DNA Sequencer”. Surowe sekwencje DNA składano i edytowano stosując pakiet programów „INHERIT”, również dostarczony przez firmę Applied Biosystems, Inc. Otrzymano przylegającą sekwencję DNA o wielkości 9,7 kilozasad, korespondującą z fragmentem EcoRI/Hindlll z fig. 3 i wiązaną przez miejsca EcoRI#2 i HindIII#2 przedstawione na fig. 4.

Analizę sekwencji DNA tej przylegającej sekwencji o wielkości 9,7 kilozasad przeprowadzono wykorzystując pakiet programów GCG z Genetics Computer Group, Inc. Madison, Wl. We wszystkich sześciu ramkach translacyjnych tej sekwencji DNA poszukiwano otwartych ramek odczytu (ORF), stosując program rozpoznawania wzorów „FRAMES”. Stosując ten program zidentyfikowano cztery otwarte ramki odczytu i sporządzono tabelę częstości wystę

182 136 powania kodonów z ORF2 z regionu genu gafA, opublikowaną wcześniej (opis patentowy zgłoszenia światowego, WO 94/05793, fig. 5). Te ramki ORF leżą całkowicie we fragmencie Xbal/Notl o wielkości około 6 kilozasad opisanym w przykładzie IX (fig. 4) i są zawarte w sekwencji ujawnionej jako SEQ ID NR: 1. Analiza tabeli częstości użycia kodonów w sekwencji MOCG134 z regionu gafA w porównaniu z tymi czterema otwartymi ramkami odczytu wykazała, że było użytych bardzo niewiele rzadkich kodonów, co wskazuje, że użycie kodonów jest podobne w obydwu regionach. To wyraźnie wskazuje na rzeczywiste istnienie tych czterech otwartych ramek odczytu. W pozycji 3' do czwartej ramki znaleziono wiele p-niezależnych struktur pętlowych, co wskazuje na region, w którym powinna się zatrzymywać transkrypcja. Jest więc oczywiste, że translacja wszystkich czterech ORF biegnie z jednego transkryptu. Dane o sekwencjach otrzymane dla regionów z czterema zidentyfikowanymi ORF ujawniły piątą otwartą ramkę odczytu. Opierając się na badaniach ekspresji w E.coli wykazało, że nie jest ona zaangażowana w syntezę pirolnitryny.

Dla każdej otwartej ramki odczytu (ORF) w zespole genów pirolnitryny zidentyfikowano wiele przypuszczalnych miejsc początku translacji poprzez obecność kodonu startu (ATG lub GTG) w zgodnej fazie odczytu w górę od miejsca wiązania rybosomu. Do zidentyfikowania rzeczywistego miejsca początku translacji dla każdego genu zastosowano strategię komplementacji. Zsyntetyzowano primery do reakcji łańcuchowej polimeryzacji (PCR) w celu powielenia segmentów każdego genu pm, w górę od jednego z przypuszczalnych miejsc wiązania rybosomu do miejsca w dół od kodonu stopu (tabela 1). Jako matrycę do reakcji PCR użyto plazmid pPRN18Not (1506 CIP3, fig. 4). Produkty reakcji PCR klonowano w wektorze pRK(KK223-3MCS), który składa się z promotora Ptac i terminatora rrs z plazmidu pKK223-3 (Pharmacia) i ze szkieletu pRK290. Plazmidy zawierające każdą konstrukcję mobilizowano w odpowiednich mutantach z delecjąORF w MOCG134 w sposób opisany w przykładzie XII oraz przez kojarzenie trójrodzicielskie z użyciem pomocniczego plazmidu pRK.290 w E.coli HB101. Transkoniuganty selekcjonowano przez posiewanie na płytkach z pożywką minimalną dla Pseudomonas, z dodatkiem tetracykliny w stężeniu 30 mg/litr. Obecność plazmidów i prawidłowe orientacje wbudowanych produktów reakcji PCR sprawdzano przez wypreparowanie plazmidowego DNA, trawienie enzymem restrykcyjnym i elektroforezę w żelu agarozowym. Wytwarzanie pirolnitryny oznaczano metodą ekstrakcji i TLC, jak w przykładzie XI. Dla każdego genu pm badano, czy najkrótszy klon zachowujący zdolność wytwarzania pirolnitryny (komplementujący delecję ORF) zawiera rzeczywiste miejsce inicjacji translacji. Tak więc, kodony inicjacji zidentyfikowano następująco: ORF1 - ATG w pozycji nukleotydu 423, ORF2 - GTG przy pozycji nukleotydu 2026, ORF3 - ATG przy pozycji nukleotydu 3166 i ORF4 - ATG przy pozycji nukleotydu 4894. Program komputerowy „FRAMES” użyty do identyfikacji otwartych ramek odczytu rozpoznaje jedynie kodony startu ATG. Stosując opisaną tu metodę komplementacji wykazano, że ORF2 rzeczywiście zaczyna się kodonem GTG w pozycji nukleotydu 2039, a zatem jest dłuższa niż otwarta ramka odczytu zidentyfikowana przez program „FRAMES”.

182 136

Tabela 1

Konstrukcje DNA i gospodarze użyci do identyfikacji miejsc inicjacji translacji w zespole genów pirolnitryny⁸

Konstrukcja	Początek amplifikowanego fragmentu	Przypuszczalny kodon startub	Kodon stopuc	Koniec amplifikowanego segmentu	Szczep gospodarza0	Produkcja pirolnitryny
ORF1-1	294	357	2039	2056	ORF1D	4-
ORF 1-2	396	423	2039	2056	ORF1D	+
ORF 1-3	438	477	2039	2056	ORF1D	-
ORF2-1	2026	2039	3076	3166	ORF2D	+
ORF2-2	2145	2162	3076	3166	ORF2D	-
ORF2-3	2249	2215	3076	3166	ORF2D	-
ORF3-1	3130	3166	4869	4904	ORF3D	4-
ORF3-2	3207	3235	4869	4904	ORF3D	-
ORF3-3	3329	3355	4869	4904	ORF3D	-
ORF4-1	4851	4894	5985	6122	ORF4D	+
ORF4-2	4967	4990	5985	6122	ORF4D	-
ORF4-3	5014	5086	5985	6122	ORF4D	-

^a wszystkie numery pozycji nukleotydów odnoszą się do zespołu genów pirolnitryny przedstawionego w SEQ ID NR. 1 ^b pierwsza zasada z przypuszczalnego kodonu startu ^c ostatnia zasada z kodonu stopu ^d mutanty z delecjąORF opisane w przykładzie XII

Przykład XI. Ekspresja genów biosyntezy pirolnitryny w E.coli

Dla zbadania, czy tylko cztery geny są potrzebne do wytwarzania pirolnitryny, geny te przeniesiono do E.coli, którą analizowano pod kątem wytwarzania pirolnitryny. Do nadekspresji sklonowanego operonu w E.coli użyto wektor ekspresyjny pKK223-3 (Brosius i Holy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6929 /1984). Wektor pKK223-3 zawiera silny promotor tac, który w odpowiednim gospodarzu jest regulowany przez represor lac i indukowany przez dodanie do pożywki wzrostowej izopropylo-p-D-tiogalaktozydu (IPTG). Ten wektor modyfikuje się przez dodanie do istniejącego wielokrotnego miejsca klonowania następnych miejsc restrykcyjnych, co ułatwia klonowanie fragmentu Xbal/Notl o wielkości około 6 kilozasad (przykład VII i fig. 4) i fragmentu Xbal/Kpnl o wielkości 10 kilozasad (patrz fig. 4) do badań ekspresji.

W każdym przypadku klonowany fragment znajdował się pod kontrolą promotora tac z E.coli (z indukcją IPTG) ale był klonowany w fuzji transkrypcyjnej, a więc, użyte miejsce wiązania rybozomu mogło pochodzić z Pseudomonas. Każdy z tych klonów transformowano do komórek E.coli XLl-blue jako komórek gospodarza i indukowano 2,5 mM roztworem IPTG przed wykonaniem próby na obecność pirolnitryny metodą chromatografii cienkowarstwowej. Po indukcji IPTG, kultury hodowano w czasie 24 godzin w 10 ml pożywki L w temperaturze 37°C przy energicznym wstrząsaniu i następnie poddano ekstrakcji równą objętością octanu etylowego. Fazę organiczną odzyskano, odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w 20 μΐ metanolu. Na płytki chromatograficzne z żelem krzemionkowym (TLC) nanoszono po 10 μΐ ekstraktu i rozwijano toluenem jako fazą ruchomą. Płytki wysuszono i w celu wizualizacji opryskano odczynnikiem Urka. Odczynnik Urlća zawiera 1 g dimetyloaminobenzaldehydu w 50 ml 36% HC1 i 50 ml 95% etanolu. W tych warunkach

182 136 pirolnitrynę wykrywa się w postaci czerwonej plamy na płytce TLC. W tej próbie potwierdzono obecność pirolnitryny w obydwu konstrukcjach ekspresyjnych. Obecność pirolnitryny w obydwu tych ekstraktach potwierdzono ponadto metodami analizy HPLC i spektroskopii masowej. Analizę metodą HPLC można wykonać bezpośrednio po rozpuszczeniu odparowanej próbki w metanolu (w przypadku, gdy próbka jest rozpuszczona w 55% metanolu), stosując kolumnę Hewlett Packard Hypersil ODS (5 μΜ) o rozmiarach 100 mm x 2,1 mm. Pirolnitryna eluuje po około 14 minutach.

Przykład XIa. Konstruowanie szczepu MOCG134cPm zawierającego geny biosyntezy pirolnitryny pod kontrolą promotora konstytutywnego

Transkrypcję genów biosyntezy pirolnitryny reguluje gen gafA. Z tego względu, transkrypcja i wytwarzanie pirolnitryny nie osiągają wysokich poziomów aż do czasu wejścia gospodarza w późną, logarytmiczną i stacjonarną fazę wzrostu. W celu zwiększenia biosyntezy pirolnitryny we wcześniejszych fazach wzrostu zastąpiono promotor endogenny silnym konstytutywnym promotorem tac z E.coli. Geny Pm klonowano pomiędzy promotorem tac a silną sekwencją terminatora opisaną w powyższym przykładzie XI. Uzyskany syntetyczny operon wbudowano do klonu genomowego z delecją genów biosyntezy Pm ale wykazującego sekwencje homologiczne zarówno w górę jak i w dół od miejsca insercji. Ten klon uczynniano w szczepie MOCG134Pm, będącym mutantem z delecją genów Pm A-D. Geny Pm pod kontrolą konstytutywnego promotora tac wprowadzano do chromosomu bakteryjnego drogą podwójnej rekombinacji homologicznej. Otrzymany szczep MOCG134cPm wytwarzał pirolnitrynę we wcześniejszej fazie wzrostu niż szczep typu dzikiego.

Wytwarzanie pirolnitryny w szczepie typu dzikiego MOCG134, w szczepie MOCG134cPm i w szczepie zawierającym wprowadzone z plazmidem geny PRN pod kontrolą promotora tac (MOCG134pPm) analizowano w różnych punktach czasowych po 14, 17, 20, 23 i 26 godzinach wzrostu). Hodowle zaszczepiano rozcieńczeniem 1/10000 stacjonarnej fazy hodowli, pirolnitrynę ekstrahowano octanem etylowym i oznaczano ilość pirolnitryny przez całkowanie powierzchni piku pirolnitryny wykrywanego metodą HPLC przy długości fali 212 nm. Wyniki przedstawione w tabeli 2 wyraźnie dowodzą, że szczepy zawierające geny Pm pod kontrolą promotora tac wytwarzają pirolnitrynę znacznie wcześniej niż szczep typu dzikiego MOCG134. Nowe szczepy wytwarzają pirolnitrynę niezależnie od genu gafA i są użyteczne jako nowe szczepy biokontrolne.

Tabela 2

Wytwarzanie pirolnitryny przez różne szczepy w różnych punktach czasu

Czas wzrostu (godziny)	Ilość wytworzonej pirolnitryny (pole piku)
MOCG134	MOCG134cPm	MOCG134pPm
14	1250	7100	18300
17	3500	14600	26700
20	9600	16600	32100
23	17500	18900	31000
26	25000	22500	33500

Przykład XII. Konstruowanie mutantów z delecją genu pirolnitryny

W celu dalszego wykazania zaangażowania czterech ORF w biosyntezę pirolnitryny, w każdej ORF wytworzono niezależne dełecje i przeniesiono je na powrót do szczepu Pseudomonas fluorescens MOCG134 przez rekombinację homologiczną. Plazmidy użyte do generowania delecji są przedstawione na fig. 4 a pozycje tych delecji są przedstawione na fig. 6. Każda ORF jest zidentyfikowana w sekwencji ujawnionej jako SEQ ID NR.l.

182 136

0RF1 (SEQ ID NR.2)

Plazmid pPRN1.77E trawiono Mlul dla uwolnienia fragmentu o wielkości 78 par zasad, usytuowanego wewnętrznie w stosunku do ORF1. Odzyskano pozostały, zawierający wektor fragment o wielkości 4,66 kilozasady, poddano go ligacji T4 ligazą DNA i transformowano nim E. coli, szczep DH5a jako gospodarza. Ten nowy plazmid linearyzowano enzymem Mlul i za pomocą dużego fragmentu Klenowa polimerazy DNA I wytworzono tępe końce (Maniatis i wsp., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory /1982/). Do tego plazmidu dołączono kasetę genu fosfotransferazy neomycynowej II (NPTII) z plazmidu pUC4K (Pharmacia) metodą ligacji tępych końców i nową konstrukcją, oznaczoną kodem pBS(ORFlA) transformowano DH5a. Ta konstrukcja zawierała delecję 78 par zasad w ORF1. W tej pozycji dokonano insercji genu NPTII niosącego oporność na kanamycynę. Insert tego plazmidu (ORF1 z insercją NPTII) wycięto z wektora pBluescript KS II za pomocą EcoRI, poddano ligacji z miejscem EcoRI w wektorze pBR322 i transformowano nim E. coli, szczep HB101. Ten nowy plazmid analizowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym. Oznaczono go symbolem pBR322(ORFlA).

ORF2(SEQ ID NR.3)

Plazmidy pPRN1.24E i pPRNl.OlE zawierające przylegające do siebie fragmenty EcoRI obejmujące ORF2 trawiono podwójnie enzymami EcoRI i Xhol. Odzyskano fragment o wielkości 1,09 kilozasady z plazmidu pPRN1.24E i fragment o wielkości 0,69 kilozasady z plazmidu pPRNl.OlE i razem poddano je ligacji z miejscem EcoRI w pBR322. Otrzymanym plazmidem transformowano szczep gospodarza DH5a i budowę konstrukcji weryfikowano metodą trawienia enzymem restrykcyjnym i elektroforezy. Plazmid ten linearyzowano za pomocą Xhol i dokonano insercji kasety genu NPTII z plazmidu pUC4K. Nową konstrukcję oznaczonąjakopBR(ORF2A) transformowano HB101. Konstrukcję tę analizowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym i metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Zawiera ona gen NPTII w delecji 472 par zasad genu ORF2.

ORF3 (SEQ ID NR.4)

Plazmid pPRN2.56Sph trawiono enzymem Pstl dla uwolnienia fragmentu o wielkości 350 par zasad. Odzyskano pozostały, zawierający wektor, fragment o wielkości 2,22 kilozasady i do miejsca Pstl podłączono przez ligację kasetę genu NPTII z PUC4K. Tym pośrednim plazmidem, oznaczonym kodem pUC(ORF3A), transformowano DH5a i sprawdzano jego budowę przez trawienie enzymem restrykcyjnym i metodą elektroforezy w żelu agarozowym.

Konstrukcję z delecjągenu wycięto z pUC za pomocą SphI i poddano ligacji z miejscem SphI w pBR322. Nowy plazmid, oznaczony symbolem pBR(ORF5A) analizowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym i metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Zawiera on gen NPTII w delecji 350 par zasad genu ORF3.

ORF4 (SEQ ID NR.5)

Plazmid pPRN2.18E/N trawiono enzymem AatH dla uwolnienia fragmentu o wielkości 156 par zasad. Odzyskano pozostały, zawierający wektor fragment o wielkości 2,0 kilozasad, poddano go ligacji i transformacji do DH5a a następnie analizowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym i metodą elektroforezy. Nowy plazmid linearyzowano enzymem AatH i wytworzono tępe końce za pomocą T4 polimerazy DNA. Do tego plazmidu dołączono metodą ligacji tępych końców kasetę genu NPTII i tą nową konstrukcją oznaczoną jako pBS(ORF4A), transformowano DH5a. Insert wycięto z wektora pBluescript II KS za pomocą EcoRI, poddano go ligacji z miejscem EcoRI w wektorze pBR322 i przeniesiono do E. coli, szczepu HB101 jako gospodarza. Identyczność nowego plazmidu, oznaczonego kodem pBR(ORF4A), zweryfikowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym i metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Ten plazmid zawiera gen NPTII w delecji 264 par zasad genu ORF4.

182 136

Kontrola Km^R

W celu zbadania możliwych wpływów markera oporności na kanamycynę, kasetę genu NPTII z pUC4K wbudowano przez insercję w górę od regionu genu pirolnitryny. Plazmid pPRN2.5S (subklon pPRN7.2E) linearyzowano za pomocą Pstl i do miejsca Pstl ligowano kasetę NPTII. Ten pośredni plazmid transformowano do DH5a i weryfikowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym i metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Z plazmidu pUC wycinano za pomocą SphI konstrukcję z insercją genu i poddawano ją ligacji z miejscem SphI w pBR322. Ten nowy plazmid, oznaczony symbolem pBR(2.5SphlKm^R), zweryfikowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym i metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Zawiera on region NPTII wbudowany w górę od regionu genu pirolnitryny.

Każdą konstrukcję z delecją genu mobilizowano w MOCG134 metodą kojarzenia trójrodzicielskiego, stosując pomocniczy plazmid pRK2013 w E. coli HB101. Mutanty z przemieszczeniem genu selekcjonowano przez posiewanie na płytkach z pożywką minimalną Pseudomonas (PMM) wzbogaconą ilością 50 pg/ml kanamycyny i odwrotnie selekcjonowano na pożywce PMM wzbogaconej tetracykliną (30 pg/ml). Przypuszczalne mutanty z wymianą prawidłową weryfikowano metodą hybrydyzacji Southem'a, stosując jako sondę trawiony EcoRI DNA z pPRN18Not, pBR322 i kasetą NPTII, otrzymany z pUC4K (Pharmacia 1994, numer katalog. 27-4958-01). Prawidłowa hybrydyzacja charakteryzowała się brakiem hybrydyzacji z pBR322, hybrydyzacją pPRN18Not z odpowiednio przesuniętym fragmentem EcoRI (obrazującą delecję i insercję NPTII), hybrydyzacją sondy NPTII z przesuniętym pasmem i zanikiem pasma odpowiadającym wyciętemu fragmentowi. Po weryfikacji, badano mutanty delecyjne na zdolność wytwarzania pirolnitryny, 2-heksylo-5-propylo-rezorcynolu, cyjanku i chitynazy. Delecja w którejkolwiek ORF wstrzymywała wytwarzanie pirolnitryny ale nie wpływała na wytwarzanie innych substancji. Obecność kasety genu NPTII w kontrolnej konstrukcji Km^R nie miała wpływu na zdolność wytwarzania pirolnitryny, 2-heksylo-5-propylo-rezorcynolu, cyjanku ani chitynazy. Te doświadczenia wykazały, że do wytwarzania pirolnitryny potrzebna jest każda z czterech ORF.

Przykład XIIa. Klonowanie regionów kodujących do ekspresji w roślinach

Kodujące regiony otwartych ramek odczytu (ORF) 1,2,3 i 4 oznaczono odpowiednio symbolami pmA, pmB, pmC i pmD. Primery do amplifikacji w reakcji PCR zaprojektowano tak, aby zawierały regiony kodujące dla każdego genu pm od kodonu startu do. albo za kodon stopu, co przedstawia tabela 3. Dodatkowo, w primerach zaprojektowano dodatkowe miejsca restrykcyjne na końcach regionów kodujących a w przypadku pmB - zmianę kodonu inicjacji dla pmB z GTG na ATG. Jako matrycę do reakcji PCR użyto plazmid pPRN18Not (fig. 4). Produkty reakcji PCR klonowano do pPEH14 w celu badania ich funkcji. Plazmid pPEH14 jest modyfikacją plazmidu pRK(KK223-3) zawierającą syntetyczne miejsce wiązania z rybosomem w miejscu 11 do 14 zasad w górę od kodonów startu klonowanych produktów PCR. Wytworzone konstrukcje uczynniano w odpowiednich mutantach z delecją ORF opisaną powyżej metodą kojarzenia trójrodzicielskiego. Obecność każdego plazmidu i prawidłową orientację wbudowanego produktu PCR sprawdzano metodami ekstrakcji plazmidowego DNA, trawienia enzymem restrykcyjnym i elektroforezy w żelu agarozowym. Wytwarzanie pirolnitryny przez komplementowane mutanty badano w sposób opisany w przykładzie XI.

Po sprawdzeniu ekspresji funkcyjnego białka przez każdy region kodujący (np. wykazano możliwość przywrócenia zdolności wytwarzania pirolnitryny w mutancie z delecją ORF) przeprowadzono analizę sekwencji klonów i sekwencje te porównano z sekwencją zespołu genów dla pirolnitryny (1506 CIP3). Dla pmA, pmB i pmC sekwencje amplifikowanych regionów kodujących były identyczne z sekwencjami oryginalnego zespołu genów. W pmD nastąpiła zmiana jednej zasady w pozycji nukleotydu 5605 z G występującej w sekwencji oryginalnej na A w amplifikowanym regionie kodującym. Ta zmiana zasady powoduje zmianę z glicyny na serynę w wyprowadzonej sekwencji aminokwasowej ale nie wpływa na funkcję produktu tego genu, co wykazano w opisanych powyżej próbach komplementacji.

182 136

Tabela 3

Regiony kodujące genów pm'

Region kodujący	Początek amplifikowanego segmentu	Kodon startub	Kodon stopuc	Koniec ampl ifikowanego segmentu
pmA	423	423	2039	2055
pmB	2039	2039	3076	3081
pmC	3166	3166	4869	4075
pmD	4894	4894	5985	5985

numery wszystkich pozycji nukleotydów odnoszą się do sekwencji ID NR. 1 ^b Pierwsza zasada kodonu startu ^c Ostatnia zasada kodonu

Przykład XIIb. Ekspresja genów pm w roślinach

Regiony kodujące każdego genu pm opisanego w przykładzie XIIa subklonowano do roślinnej kasety ekspresyjnej składającej się z promotora CaMV 35S, sekwencji liderowej i terminatora CaMV 35S flankowanego przez miejsca restrykcyjne Xbal. Każdą konstrukcję zawierającą promotor, region kodujący i terminator uwalniano za pomocą enzymu Xbal, subklonowano do binamgo wektora transformacyjnego pCIB200 i prowadzono transformację do Agrobacterium tumifaciens, szczep Al36 jako gospodarza. Transformację tytoniu prowadzono w sposób podany przez Horsch'a i wsp. (Science, 227, 1229-1231 /1985/). Transformację Arabidopsis prowadzono w sposób opisany przez Lloyd'a i wsp. (Science, 234, 464-466 /1986/). Roślinki selekcjonowano i regenerowano na pożywce zawierającej 100 mg/litr kanamycyny i 500 mg/litr karbenicyliny.

Z poszczególnych roślinek tytoniu, co do których zachodziło przypuszczenie że zostały transformowane, zebrano tkankę liści. Tkankę listną Arabidopsis z około 10 niezależnych roślinek podejrzanych o transformację zebrano razem dla każdej konstrukcji genowej użytej do transformacji. RNA oczyszczono przez ekstrakcję fenolem i chloroformem, frakcjonowano metodą elektroforezy żelowej z formaldehydem i nanoszono metodą blottingu na membrany nylonowe. Sondy dla każdego regionu kodującego wykonano metodą losowego znakowania primera. Hybrydyzację prowadzono w 50% formamidzie w temperaturze 42°C w sposób opisany przez Sambrooka i wsp., Molecular Cloning, II wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory /1989/).

Dla każdego genu pm zidentyfikowano transgeniczne roślinki tytoniu, których pasma RNA silnie hybrydyzowały z sondą odpowiedniego genu pm, wykazując wielkość spodziewaną dla mRNA odczytanego z odpowiedniego genu pm. Podobne pasma były również widoczne w RNA ekstrahowanym z pulowanych próbek tkanki Arabidopsis. Te dane wskazują że mRNA kodujące enzymy biorące udział w szlaku biosyntezy pirolnitryny gromadzą się w transgenicznych roślinach.

D. Klonowanie genów biosyntezy rezorcynolu z Pseudomonas

2-Heksylo-5-propylo-rezorcynol jest następnym APS wytwarzanym przez niektóre szczepy Pseudomonas. Wykazano, że posiada on aktywność antypatogeniczną przeciw bakteriom gram-dodatnim (zwłaszcza przeciw rodzajowi Clavibacter), przeciw mikrobakteriom i grzybom.

Przykład XIII. Izolacja genów kodujących rezorcynol

Wyizolowano dwa mutanty z insercją transpozonu, nie posiadające zdolności wytwarzania 2-heksylo-5-propylo-rezorcynolu, następnej substancji, o której wiadomo, że jej biosynteza przebiega pod ogólną regulacją genu gafA w Pseudomonas fluorescens (publikacja zgłoszenia

182 136 patentowego PCT, WO 94/01561). Transpozon insercyjny TnCIB116 użyto do generowania bibliotek mutantów w MOCG134 i w pochodnej gafA' MOCG134 (BL1826). Pierwszy szczep przesiewano na występowanie zmian w hamowaniu grzybów in vitro, drugi - na obecność genów regulowanych promotorem gafA po wprowadzeniu tego promotora w plazmidzie (patrz sekcja C). Wyselekcjonowane mutanty charakteryzowano metodą HPLC, analizując w nich wytwarzanie znanych związków, takich jak pirolnitryna lub 2-heksylo-5-propylo-rezorcynol. Analiza metodą HPLC umożliwia porównanie nowych mutantów z macierzystym szczepem, dzikim. W żadnym przypadku nie wystąpił w mutancie pik HPLC odpowiadający 2-heksylo-5-propylo-rezorcynolowi. Mutant pochodzący z MOCG134 oznaczono symbolem BL 1846. Mutant pochodzący z BL1826 oznaczono symbolem BL1911. Rezorcynol oznacza się metodą HPLC w taki sam sposób jak pirolnitrynę (patrz przykład XI) z tym, że na kolumnę podaje się 100% metanol, a rezorcynol pojawia się w eluacie w 20 minucie.

Z wyżej zidentyfikowanych mutantów można klonować.geny biosyntezy rezorcynolu w następujący sposób. Z mutantów preparuje się genomowy DNA i klony zawierające insercję transpozonu i sąsiadującą sekwencję Pseudomonas otrzymuje się drogą selekcji na obecność klonów opornych na kanamycynę (oporność na kanamycynę jest kodowana przez transpozon). Sklonowaną sekwencję Pseudomonas stosuje się następnie jako sondę do identyfikacji sekwencji natywnych z banku genomowego P Fluorescens MOCG134. Sklonowane geny naty wne prawdopodobnie są genami biosyntetazy rezorcynolu.

E. Klonowanie genów biosyntezy sorafenu z Sorangium

Sorafen jest antybiotykiem poliketydowym wytwarzanym przez miksobakterię Sorangium cellulosum. Ten związek wykazuje szerokie spektrum aktywności przeciwgrzybiczej, dzięki czemu może być stosowany w rolnictwie. Sorafen jest zwłaszcza aktywny przeciw wielu patogenom listowia.

Przykład XIV. Izolowanie zespołu genów sorafenu.

Z Sorangium cellulosum izolowano genomowy DNA i trawiono go częściowo enzymem restrykcyjnym Sau3A. Selekcjonowano pod względem wielkości fragmenty od 30 do 40 kilozasad i sklonowane je do kosmidowego wektora pHC79 (Hohn i Collins, Gene, 11, 291-298 /1980/) uprzednio trawionego za pomocą BamHI i działano alkaliczną fosfatazą w celu zapobieżenia samoligacji. Tak przygotowaną bibliotekę kosmidową hybrydyzowano z sondą będącą fragmentem o wielkości 4,6 kilozasady, zawierającym region grał ze szczepu Streptomyces violaceoruber Tu22 kodujący ramki ORF 1-4 odpowiedzialne za biosyntezę granatycyny w S. violaceoruber. Identyfikowano klony kosmidowe, które hybrydyzowały z sondą grał i preparowano DNA do analizy metodą trawienia restrykcyjnego i dalszej hybrydyzacji. Zidentyfikowano kosmid p98/l, który zawierał fragment Sali o wielkości 1,8 kilozasady i silnie hybrydyzował z regionem grał. Ten fragment Sali znajdował się w większym fragmencie Pvul o wielkości 6,5 kilozasad w insercie p98/l o wielkości około 40 kilozasad. Oznaczenie sekwencji części insertu Sali o wielkości 1,8 kilozasady ujawniło homologię z genami dla białek acetylotransferazy potrzebnych do syntezy erytromycyny. Przeprowadzono mapowanie restrykcyjne kosmidu p98/l i sporządzono mapę przedstawioną na fig. 7. Żywą hodowlę E. coli HB101 zawierającą klon kosmidowy 98/1 zdeponowano 20 maja 1994 roku w Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604, Stany Zjednoczone, pod numerem akcesyjnym NRRL B-21255. Sekwencja DNA zespołu genów sorafenu jest ujawniona w SEQ ID NR. 6.

Przykład XV. Analiza funkcji zespołu genów sorafenu

Regiony w obrębie p98/l kodujące białka biorące udział w biosyntezie sorafenu identyfikowano w próbach rozrywania genu. W pierwszym etapie pozyskiwano fragmenty DNA z kosmidu p98/l przez trawienie Pvul i klonowano je do unikalnego miejsca klonowania Pvul (które to miejsce znajduje się w genie oporności na ampicylinę) w plazmidzie pSUP2021 charakteryzującym się szerokim zakresem gospodarzy (Simon i wsp. w publikacji:

182 136 „Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction”, wyd.: A Puhler, Springer Verlag, Berlin, str. 98-106 /1983/).Transformowane E. coli HB101 selekcjonowano na podstawie oporności na chloramfenicol i wrażliwości na ampicylinę. Wybrane kolonie zawierające odpowiednie inserty przeniesiono do Sorangium cellulosum SJ3 przez koniugację, wykorzystując sposób opisany w publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0501921 (Ciba-Geigy). Plazmidy przeniesiono do E. coli ED8767 zawierającej pomocniczy plazmid pUZ8 (Hedges i Mathew, Plazmid, 2, 269-278 /1979/) i komórki dawcy inkubowano z komórkami Sorangium cellulosum SJ3 w stacjonarnej fazie hodowli dla dokonania przeniesienia przez koniugację, postępując w zasadzie w sposób opisany w publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0501921 (przykład 5) i EP (późniejsze zgłoszenie, przykład 2). Do selekcji służyła kanamycyna, fleomycyna i streptomycyna. Stwierdzono, że żaden z dotychczas badanych plazmidów nie jest zdolny do autonomicznej replikacji w Sorangium cellulosum i że następuje integracja całego plazmidu z chromosomem na zasadzie homologicznej rekombinacji, w miejscu znajdującym się w sklonowanym fragmencie. Przebiega ona z niską częstotliwością. Zjawiska te można śledzić za pomocą znajdujących się na plazmidzie markerów oporności na antybiotyk. Integracja plazmidu w danym miejscu powoduje insercję tego plazmidu do chromosomu przy jednoczesnym rozerwaniu rego regionu w wyniku tego wydarzenia. Tak więc, można określić dany fenotyp, np. fenotyp wytwarzania sorafenu a zniszczenie tego fenotypu będzie wskazywać, że region DNA sklonowany do plazmidu musi odgrywać jakąś rolę charakteryzującą ten fenotyp.

Wyselekcjonowano rekombinacyjne klony pSUP2021 z insertami Pvul o wielkości około 6,5 kilozasady (pSN105/7), 10 kilozasad (pSN120/10), 3,8 kilozasady (pSN120/43-39) i 4,0 kilozasady (pSN 120/46). Lokalizacja na mapie restrykcyjnej (w kb) tych insertów Pvul, tak jak jest przedstawiona na fig. 7, jest następująca: pSN105/7 - 25,0 - 31,7, pSNl20/10 2,5-14,5, pSN120/43-39 - 16,1-20,0 i pSN120/46 - 20,0-24,0. Metodą trawienia za pomocą Pvul i Sali wykazano, że pSN105/7 zawiera fragment o wielkości 1,8 kilozasady opisany w przykładzie XI. Wszystkie rozerwania genu fragmentami Pvul o wielkości 3,8, 4,0, 6,5 i 10 kilozasad powodowały przerwanie wytwarzania sorafenu. Wyniki te wykazują że wszystkie te fragmenty zawierają geny lub fragmenty genów zaangażowanych w produkcję tego związku.

Następnie przeprowadzono próby rozrywania genu dwoma fragmentami Bglll pochodzącymi z kosmidu p98/l. Miały one wielkość 3,2 kilozasady (na mapie miejsce 32,4-35,6 na fig. 7) i 2,9 kilozasady (na mapie miejsce 35,6-38,5 na fig. 7). Te fragmenty klonowano do miejsca BamHI w plazmidzie pCIB132 pochodzącym z pSUP2021, zgodnie z fig. 8. Wycięto i odwrócono fragment Notl z pSUP2021 o wielkości około 5 kilozasad, następnie usunięto fragment BamHI o wielkości około 3 kilozasad. Żaden z tych fragmentów BgUI nie miał zdolności wstrzykiwania biosyntezy sorafenu po powtórnym wprowadzeniu do Sorangium opisanymi powyżej sposobami. Wskazuje to na fakt, że DNA z tych fragmentów nie bierze udziału w biosyntezie sorafenu. Badanie tej sekwencji wykazało obecność domeny tioesterazy w kierunku 5' ale blisko miejsca Bglll w lokalizacji 32,4. Ponadto, bezpośrednio za domeną tioesterazy znajdują się kodony końca transkrypcji, które prawdopodobnie rozgraniczają koniec regionu kodującego ORF1. Ponieważ fragmenty Bglll o wielkości 2,9 i 3,2 kilozasady znajdują się bezpośrednio po prawej stronie tych sekwencji, jest prawdopodobne, że w dół od ORF1 nie ma już innych genów biorących udział w biosyntezie sorafenu.

Delineacja lewego końca regionu biosyntezy wymagała izolacji dwu innych klonów kosmidowych, pJLl i pJL3, które częściowo nakładają się nap98/l na lewym końcu ale zawierają więcej DNA z lewej strony p98/l. Wyizolowano je przez hybrydyzację z fragmentem BamHI o wielkości 1.3 kilozasady ze skrajnego lewego odcinka p98/l (na mapie lokalizacja 0,0-1,3) z biblioteki genu z Sorangium Cellulosum. Należy zauważyć, że miejsce BamHI w miejscu 0,0 nie istnieje w chromosomie S. cellulosum lecz zostało utworzone jako wytwór sztuczny, przez ligację fragmentu restrykcyjnego Sau3A pochodzącego z genomu Sorangium cellulosum do miejsca klonowania BamHI w pHC79. Hybrydyzacja Southema z fragmentem BamHI o wielkości 1,3 kilozasady wykazałą że obydwa pJLl i pJL3 zawierają fragment BamHI o wielkości około 12,5 kilozasad, który to fragment zawiera sekwencje wspólne z fragmentem

182 136

1,3 kb, jako że ten fragment jest w rzeczywistości zdelinearyzowany przez miejsce BarnHI w pozycji 1,3. Żywą hodowlę E. coli HB101 zawierającą klon kosmidowy pJL3 zdeponowano 20 maja 1994 roku w Agricultural Research Culture CoUection (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604, Stany Zjednoczone, pod numerem akcesyjnym NRRL B-21254. Próby rozrywania genu z użyciem fragmentu BarnHI o wielkości 12,5 kilozasad wykazały, że ten fragment zawiera sekwencje zaangażowane w biosyntezę sorafenu. Rozrywanie genu z użyciem mniejszych fragmentów EcoRV pochodzących z tego regionu wykazało, że region ten jest potrzebny do biosyntezy sorafenu. Przykładowo, użyte do badań rozrywania genu dwa fragmenty EcoRV o wielkości 3,4 i 1,1 kilozasady sąsiadujące z dystalnym miejscem BarnHI w lewym końcu fragmentu o wielkości 12,5 kilozasady spowodowały zahamowanie biosyntezy sorafenu.

Przykład XVI. Analiza sekwencji zespołu genów sorafenu

Sekwencję DNA zespołu genów sorafenu oznaczono od miejsca Pvul w pozycji 2,5 do miejsca Bglll w pozycji 32,4 (patrz fig. 7) stosując zestaw do sekwencj ono wania „Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit” dostarczony przez Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, postępując według instrukcji producenta. Reakcje sekwencjonowania prowadzono w aparacie „Applied Biosystems 373A Automated DNA Seąuencer” i surową sekwencję DNA tłumaczono i edytowano przy użyciu pakietu programów „INHERIT”, również z Applied Biosystems, Inc. Do wyszukiwania otwartych ramek odczytu (ORF) we wszystkich sześciu ramkach translacji sekwencji DNA użyto program rozpoznawania wzorów „FRAMES”. Ogółem oznaczono około 30 kilozasad ciągłego DNA, korespondujących z regionem uznanym jako podstawowy dla biosyntezy sorafenu w próbach rozrywania genu opisanych w przykładzie XII. Ta sekwencja koduje dwie ORF o strukturze opisanej poniżej.

ORF1

ORF1 ma wielkość około 25,5 kb i koduje pięć modułów biosyntetycznych wykazujących homologię z modułami znalezionymi w genach biosyntezy erytromycyny z Saccharopolyspora erythraea (Donadio i wsp., Science 252, 675-679 /1991/). Każdy moduł zawiera domenę β-ketoacylosyntazy (KS), acylotransferazy (AT), ketoreduktazy (KR) i białka przenoszącego grupy acylowe (ACP) oraz domeny przetwarzania β-ketonu, mogące obejmować domenę dehydratazy (DH) i/lub enoiloreduktazy (ER). W biosyntezie struktury poliketydowej każdy moduł kieruje wbudowywaniem nowej dwuwęglowej jednostki wydłużającej i prawidłowym przetwarzaniem węgla β-ketonu.

ORF2

Poza ORF1, dane o sekwencji DNA z fragmentu p98/l rozciągającego się od miejsca Pvul w pozycji 2.5 kilozasad do miejsca Smal w pozycji 6,2 kilozasad wskazują na obecność następnej ORF (ORF2) bezpośrednio sąsiadującej z ORF1. Sekwencja DNA wykazuje obecność typowego modułu biosyntezy, który jest kodowany na ORF, której koniec 5' nie jest jeszcze zsekwencjonowany i znajduje się w pewnej odległości na lewo. Przez porównanie z innymi jednostkami genu biosyntezy poliketydu i ilością atomów węgla w strukturze pierścienia sorafenu, jest prawdopodobne, że ogółem powinno być osiem modułów aby kierować syntezą 17-węglowej cząsteczki sorafenu. Ponieważ w wyżej opisanej ORF1 znajduje się pięć modułów, można zakładać, że ORF2 zawiera dalsze trzy moduły i że rozciągają się one poza koniec kosmidu p98/l (pozycja 0 na fig. 7). Jest to całkowicie zgodne z opisem genu z przykładu XII. Klony kosmidowe pJLl i pJL3, rozciągające się za lewy koniec p98/l niosą prawdopodobnie sekwencję kodującą pozostałe moduły potrzebne do biosyntezy sorafenu.

Przykład XVII. Sorafen. Wymagania dla metylacji

Na ogół, synteza poliketydów przebiega w ten sposób, że w pierwszym etapie zachodzi kondensacja jednostki wyjściowej (zazwyczaj octanu) z jednostką wydłużającą (malonianem) ze stratą jednego atomu węgla w formie ĆO₂ i powstaniem łańcucha trój węglowego. We wszystkich następnych addycjach do pierścienia poliketydowego dołączone są dwie jednostki węgla (Donadio i wsp., Science, 252, 675-679 /1991/). Ponieważ sorafen posiada pierścień 17-węglowy, jest prawdopodobne, że istnieje 8 modułów biosyntezy wymaganych do syntezy tego

182 136 pierścienia. Pięć modułów jest kodowanych w ORF1 a szósty jest kodowany na końcu 3' ORF2. Jak wyjaśniono powyżej, jest możliwe, że pozostałe dwa moduły są również kodowane przez ORF2 w regionach, które się znajdują we fragmencie BamHI o wielkości 15 kilozasad z pJLl i pJL3, dla którego nie oznaczono jeszcze sekwencji.

Modułowy aparat biosyntezy poliketydu znajdujący się w Sorangium cellulosum jest potrzebny do wytwarzania sorafenu C, który nie wykazuje aktywności antypatogenicznej. Struktura tego związku jest taka sama jak obdarzonego aktywnością antypatogeniczną sorafenu A z tym wyjątkiem, że zamiast grup O-metylowych w pozycjach pierścienia 6, 7 i 14 sorafenu A znajdują się grupy hydroksylowe. Grupy te są metylowane przez specyficzne metylotransferazy z wytworzeniem aktywnego związku, sorafenu A. Podobna sytuacja zachodzi podczas biosyntezy erytromycyny w Saccharopolyspora erythraea. Końcowym etapem w biosyntezie tej cząsteczki jest metylacja trzech grup hydroksylowych przez metylotransferazę (Haydock i wsp., Mol. Gen. Genet. 230, 120-128 /1991/). Jest zatem wysoce prawdopodobne, iż podobna metylotransferaza (być może więcej niż jedna) bierze udział w biosyntezie sorafenu A (sorafen C jest niemetylowany a sorafen B częściowo metylowany). We wszystkich dotychczas zbadanych układach biosyntezy poliketydów, wszystkie geny biosyntezy i związane z nimi metylazy są zgrupowane w jeden zespół (Summers i wsp., J. Bacteriol. 174, 1810-1820 /1992/). Jest zatem prawdopodobne, że podobna sytuacja istnieje dla operonu sorafenu i że gen kodujący metylotransferazę (metylotransferazy) potrzebny do konwersji sorafenu B i C w sorafen A jest usytuowany w pobliżu ORF1 i ORF2, które kodują syntezę poliketydową. Opisane powyżej wyniki doświadczeń rozrywania genu wykazują że ten gen nie jest usytuowany bezpośrednio w dół od końca 3' ORF1 i że prawdopodobnie znajduje się w górę od ORF2 w DNA zawartym w pJLl i pJL3. Tak więc, stosując znane, standardowe techniki można sklonować gen metylotransferazy i oznaczyć jego sekwencję.

Oznaczanie sorafenu

Komórki Sorangium cellulosum hodowano w ciekłej pożywce wzrostowej zawierającej żywicę jono-wymienną XAD-5 wytwarzaną przez firmę Rohm and Hass w ilości 5% wagowo-objętościowych. Wytwarzany przez komórki sorafen A wiązał się z żywicą którą odfiltrowano przez filtr poliestrowy (Sartorius Β 420-47-N). Sorafen uwolniono z żywicy przez ekstrakcję izopropanolem (50 ml) w czasie godziny w temperaturze 30°C. Zebrano izopropanol zawierający sorafen A i zatężono go przez suszenie do objętości 1 ml. Oznaczone ilości tej próbki analizowano metodą HPLC przy długości fali 210 nm, wykrywając i analizując ilościowo sorafen A. Ta próba jest specyficzna dla sorafenu A (całkowicie metylowanego). Częściowo metylowane i niemetylowane formy sorafenu posiadają inne R_T i nie są oznaczane tą metodą. Procedurę tę zastosowano do oznaczania wytwarzania sorafenu A po rozerwaniu genu.

F. Klonowanie i charakteryzacja genów biosyntezy fenazyny z Pseudomonas aureofaciens

Antybiotyki fenazynowe są wytwarzane przez różne gatunki Pseudomonas i Streptomyces jako metabolity wtórne, w odgałęzieniu szlaku kwasu szikimowego. Postuluje się, że następuje kondensacja dwu cząsteczek kwasu chorizmowego łącznie z dwoma azotami pochodzącymi z glutaminy, tworząc trójpierścieniowy prekursor tego szlaku, fenazyno-l,6-dikarboksylan. Istnieje jednak dowód genetyczny, iż produktem pośrednim między chorizmanianem a fenazyno-l,6-dikarboksyłanem jest antranilan (Essar i wsp., J. Bacteriol. 172, 853-866 (1990). W Pseudomonas aureofaciens 30-84 wytwarzanie trzech antybiotyków fenazynowych: kwasu fenzyno-1-karboksylowego, kwasu 2-hydroksyfenazyno-l-karboksylowego i 2-hydroksy fenazyny jest głównym mechanizmem działania, dzięki któremu szczep ten chroni pszenicę przed fitopatogenem grzybiczym, Gaeumannomyces gramins, odmiana triticy (Pierson i Thomashow MPMI 5, 330-339 /1992/). Podobnie, fenazyna wytwarzana przez Pseudomonas fluorescens 2-79 jest głównym czynnikiem niszczącym G. Graminis, odmiana tritici (Thomashow i Weller. J. Bacteriol. 170, 3499-3508 /1988/).

182 136

Przykład XVIII. Izolowanie genów biosyntezy fenazyny

Pierson i Thomashow (jak wyżej) opisali klonowanie kosmidu, który niesie fenotyp biosyntezy fenazyny na mutantach z insercją transpozonu szczepu Pseudomonas aureofaciens 30-84, w których to mutantach tych zniszczono zdolność syntezy antybiotyków fenazynowych. Przygotowano bibliotekę mutantów szczepu 30-84 przez koniugację z E. coli S17-l(pSUP1021) i wyselekcjonowano mutanty niezdolne do wytwarzania antybiotyków fenazynowych. Wyselekcjonowane mutanty nie wytwarzały kwasu fenazynokarboksylowego, 2-hydroksyfenazyny ani kwasu 2-hydroksyfenazyno-l-karboksylowego. Mutanty te transformowano kosmidową genomową biblioteką szczepu 30-84, co doprowadziło do wyizolowania kosmidu pLSP259, który posiadał zdolność komplementacji mutantów fenazyny o zdolność syntezy kwasu fenazynokarboksylowgo, 2-hydroksyfenazyny i kwasu 2-hydroksyfenazyno-1-karboksylowego. pLSP259 charakteryzowano dalej drogą mutagenezy transpozonem, stosując faga λ ::Tn5 opisanego przez Bruijn'a i Lupski'ego (Gene 27, 131-149 /1984/). Zidentyfikowano segment DNA o wielkości 2,8 kilozasad jako odpowiedzialny za fenotyp komplementujący dla fenazyny. Ten segment o wielkości 2,8 kilozasad jest zawarty w większym fragmencie EcoRI o wielkości 9,2 kilozasad z pLSP259. W celu śledzenia wytwarzania fenazyny w E. coli, przeniesiono ten fragment EcoRI o wielkości 9,2 kilozasad i jego różne pochodne delecyjne do E. coli pod kontrolą promotora lacZ. Najkrótszą pochodną delecyjną która nadawała zdolność biosyntezy wszystkich trzech związków fenazyny tej E. coli zawierał insert o wielkości około 6 kilozasad. Insert ten oznaczono jako pLSP18-6H3del3. Ten plazmid zawierał segment o długości 2,8 kilozasad, który uprzednio uznano za krytyczny dla biosyntezy fenazyny w szczepie 30-84 jako gospodarzu. Otrzymano go od Dr LS Piersona (Department of Plant Pathology, U. Arizona, Tucson, AZ) do celów charakteryzacji sekwencji. Inne pochodne delecyjne nadawały zdolność wytwarzania kwasu fenazynokarboksylowego bakterii E. coli bez towarzyszącego wytwarzania 2-hydroksyfenazyny i kwasu 2-hydroksyfenazynokarboksylowego, co świadczy o tym, że w syntezę fenazyny i jej hydroksy-pochodnych mogąbyć zaangażowane co najmniej dwa geny.

Sekwencja DNA zawierająca geny biosyntezy fenazyny jest ujawniona na SEQ ID NR. 17. Plazmid pCIB3350 zawierający fragment Pstl-Hindlll z zespołu genów fenazyny zdeponowano 20 maja 1994 roku w Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604, Stany Zjednoczone, pod numerem akcesyjnym NRRL B-21257. Plazmid pCIB3351 zawierający fragment EcoRI-Pstl z zespołu genów fenazyny zdeponowano 20 maja 1994 roku w Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604, Stany Zjednoczone, pod numerem akcesyjnym NRRL B-21258. Plazmidy pCIB3350 i pCIB3351 zawierają cały gen fenazyny przedstawiony na sekwencji SEQ ID NR. 17. Oznaczenie sekwencji DNA insertu w pLSP18-6H3del3 ujawniło obecność czterech ramek ORF w krytycznym segmencie o wielkości 2,8 kilozasad i w sąsiedztwie tego segmentu. Ramce ORF1 (SEQ ID NR. 18) nadano nazwę phzl, ramkę ORF2 (SEQ ID NR. 19) oznaczono kodem phz2, ramkę ORF3 (SEQ ID NR. 20) nazwano phz3, ramce ORF4 (SEQ ID NR. 22) nadano nazwę phz4. Sekwencja DNA phz4 jest przedstawiona na SEQ ID NR. 21. Wielkość phzl wynosi około 1,35 kilozasad. Wykazuje ona homologię swego końca 5' z genem entB i E. coli kodującym izochorizmatazę. Ramka phz2 ma wielkość około 1,15 kilozasad. Wykazuje ona homologię swego końca 3' z genem trpG kodującym podjednostkę beta syntazy antranilanowej. Phz3 ma wielkość około 0,85 kilozasad. PHz4 ma wielkość 0,65 kilozasady i wykazuje homologię z genem pdxH z E coli kodującym oksydazę 5'-fosforanu pirydoksaminy.

Oznaczanie fenazyny

Thomashow i wsp. (Appl. Εηνΐτοη. Microbiol. 56, 908-912 /1990/) opisali sposób izolowania fenazyny. Polega on na zakwaszeniu hodowli do wartości pH 2.0 za pomocą HCI i ekstrakcji benzenem. Frakcje benzenowe odwadnia się siarczanem sodu i odparowuje do suchej pozostałości. Pozostałość tę rozpuszcza się w wodnym 5% roztworze kwaśnego węglanu sodu, poddaje ekstrakcji równą objętością benzenu, zakwasza się, przenosi do warstwy benzenu i suszy. Po frakcjonowaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami oznacza się stężenia fenazyny w sposób opisany przez Thomashow^ i wsp. (jak wyżej).

182 136

G. Klonowanie genów dla antypatogenicznych peptydów

Ta grupa substancji jest zróżnicowana. Klasyfikuje się ją na dwie grupy: (1) na związki, które są syntetyzowane przez układy enzymatyczne bez udziału aparatu rybosomalnego i (2) na te, które wymagają translacji mRNA z udziałem rybosomu do wytwarzania prekursora antybiotyku.

Antybiotyki peptydowe wytwarzane drogą nierybosomalną

Nierybozomalne antybiotyki peptydowe są składane przez duże enzymy wielofunkcyjne, które aktywują, modyfikują, polimeryzują a w niektórych przypadkach również cyklizują podjednostki aminokwasowe, tworząc łańcuchy polipeptydowe. Wbudowywują również inne kwasy, takie jak kwas aminoadypinowy, diaminomasłowy, diaminopropionowy, dihydroksyaminokwas, izoserynę, kwas dihydroksybenzoesowy hydroksyizowalerianowy, (4R)-4-[(E)-2-butenylo]-4,N-dimetylo-L-treoninę i omitynę (Katz i Demain, Bacteriological Review 41, 449-474 /1977/; Kleikauf i von Dohren, Annual Review of Microbiology 41, 259-289 /1987/). Te produkty nie są kodowane przez żaden mRNA a rybozomy nie uczestniczą bezpośrednio w ich syntezie. Antybiotyki peptydowe syntetyzowane nierybosomalnie można z kolei grupować według ich ogólnych struktur na kategorie związków o budowie liniowej, cyklicznej, laktonowej, rozgałęzionych cyklopeptydów i depsypeptydowej (Kleikauf i von Dohren, European Journal of Biochemistry 192, 1-15 /1990/). Te różne grupy antybiotyków są wytwarzane w wyniku działania modyfikującego i cyklizującego ezymów. Ogólny schemat polimeryzacji jest wspólny dla nich wszystkich. Antybiotyki peptydowe syntetyzowane nierybosomalnie są wytwarzane zarówno przez bakterie jak i przez grzyby. Zaliczają się do nich: edeina, liniowa gramicydyną tyrocydyna, i gramicydyna S z Bacillus brevis, mykobacylina z Bacillus subtilis, polimyksyna z Bacillus polymiyxa, etamycyna ze Streptomyces griseus, echinomycyna ze Streptomyces echinatus, aktynomycyna ze Streptomyces clavurigerus, enterochelina z Escherichia coli, gamma-(alfa-L-aminoadypilo)-L-cysteinylo-D-walina(ACV) z Aspergillus nidulans, alametycyna z Trichoderma viride, destruksyna z Metarhizium anisolpliae, eniatyna z Fusarium oxysporum i beuwerycyna z Beauveria bassiana. Istnieje bardzo duże podobieństwo funkcyjne i strukturalne między układami prokariotycznymi a eukariotycznymi, co sugeruje wspólne źródło dla obydwu tych układów. Aktywność antybiotyków peptydowych jest również bardzo rozległą działania toksyczne różnych antybiotyków peptydowych w stosunku do zwierząt, roślin, bakterii i grzybów są znane (Hansen, Annual Review of Microbiology' 47, 535-564 /1993/; Katz i Demain, Bacteriological Review 41, 449-474 /1977/; Kleinkauf i von Dohren, Annual Review of Microbiology 41, 259-289 /1987/; Kleinkauf i von Dohren, European Journal of Biochemistry 192, 1-15 /1990/; Kolter i Moreno, Annual Review of Microbiology 46, 141-163 /1992/).

Aminokwasy są aktywowane przez hydrolizę ATP z utworzeniem adenylowanego amino- lub hydroksykwasu, analogicznie do reakcji ładowania katalizowanych przez aminoacylo-tRNA-syntetazy, a następnie pomiędzy tymi aminokwasami a enzymem tworzą się półprodukty tioestrowe z wiązaniami kowalencyjnymi albo przy specyficznych resztach cysternowych albo z tiolem panteteiny. Ta zależna od aminokwasu hydroliza ATP jest często wykorzystywana w próbach oznaczania kompleksów: antybiotyk peptydowy - enzym (Ishihara i wsp., J. Bacteriol. 171, 1705-1711 /1989/). Po związaniu z enzymem, aktywowane aminokwasy mogą być modyfikowane zanim będą one wprowadzone do polipetydu. Do najpowszechniejszych modyfikacji należą epimeryzacja L-amino (hydroksy )-kwasów do form D, N-acylacje, cyklizacje i N-metylacje. Polimeryzacja przebiega przy udziale kofaktora panteteiny, dzięki któremu aktywowane podjednostki są kolejno dodawane do łańcucha polipeptydowego. Mechanizm, według którego peptyd jest uwalniany z kompleksu enzymu odgrywa ważną rolę w oznaczaniu klasy strukturalnej, do której należy produkt. Hydroliza lub aminoliza przez wolną aminę tioloestru będzie dawała peptyd liniowy (niemodyfikowany albo aminowany na końcu) taki jak edeina. Aminoliza tioloestru przez grupy aminowe samego peptydu będzie dawała albo peptyd cykliczny (atak przez terminalną grupę aminową) taki jak gramicydyna S albo peptyd rozgałęziony (atak przez aminę łańcucha bocznego), taki jak

182 136 bacytracyna. Laktonizacja grupą hydroksylową końcową lub przy łańcuchu bocznym będzie dawać lakton, taki jak destruksyna, lakton rozgałęziony albo cyklodepsipeptyd, taki jak beuwerycynę.

Enzymy prowadzące te reakcje są dużymi białkami wielofunkcyjnymi o masach cząsteczkowych dostosowanych do wielu różnych funkcji, które pełnią. Przykładowo, syntetazy gramicydyny 1 i 2 posiadają masy cząsteczkowe odpowiednio 120 i 280 kDa, syntetaza ACV posiada masę 230 kDa, syntetaza eniatyny jest cząsteczką o masie 250 kDa, syntetazy bacytracyny 1, 2 i 3 mają odpowiednio masy 335 kDa, 240 kDa i 380 kDa (Katz i Demain, Bacteriological Review 41, 449-474 /1977/; Kleinkauf i von Dohren, Annual Review of Microbiology 41, 259-289 /1987/; Kleinkauf i von Dohren, European Journal of Biochemistry 192, 1-15 /1990/). Rozmiary i złożoność tych białek oznaczają, że dla nadania zdolności całkowitej syntezy nierybosomalnej antybiotyków peptydowych trzeba dokonać przeniesienia i sklonowania stosunkowo niewielu genów. Poza tym, homologia funkcyjna i strukturalna istniejąca między bakteriami i eukariotycznymi układami syntetycznymi wskazuje, że można klonować odpowiednie geny z dowolnego źródła antybiotyku peptydowego wykorzystując dostępną informację o sekwencji, bieżącą informację o funkcjach i konwencjonalne techniki mikrobiologiczne. Przypuszcza się, że produkcja grzybobójczego, owadobójczego lub bakteriobójczego antybiotyku peptydowego w roślinach przyniesie korzyści w postaci zwiększenia odporności roślin na szkodniki.

Przykład XIX. Klonowanie genów biosyntezy gramicydyny S

Gramicydyna S jest cyklicznym antybiotykiem peptydowym hamującym kiełkowanie zarodników grzybów (Murray i wsp., Letters in Applied Microbiology 3, 5-7 /1986/), a zatem może być użyteczna do ochrony roślin przed chorobami grzybiczymi. Sklonowano i zsekwencjonowano operon biosyntezy gramicydyny S (grs) z Bacillus brevis ATCC 9999 obejmujący całkowite sekwencje kodujące dla syntetazy gramicydynowej 1 (GS1, grsA), inny gen w tym operonie o nieznanej funkcji (grsT) i GS2 (grsB) (Kratzschmar i wsp., J. Bacteriol. 171, 5422-5429 /1989/; Krause i wsp., J. Bacteriol. 162, 1120-1125 /1985/). Znanymi metodami zaprojektowano pary primerów do reakcji PCR, opierając się na opublikowanej sekwencji DNA, która nadawała się do amplifikacji segmentów o wielkości około 500 par zasad z operonu grs, stosując wyizolowany DNA z Bacillus brevis ATCC 9999 jako matrycę. Fragmantami przeznaczonymi do amplifikacji były:

(1) fragment końca 3' regionu kodującego grsB, obejmujący kodon terminacji, (2) fragment końca 5' sekwencji kodującej grsB obejmujący kodon inicjacji, (3) sekwencja końca 3' regionu kodującego grsA, obejmująca kodon terminacji, (4) fragment końca 5' sekwencji kodującej grsA obejmujący kodon inicjacji, (5) sekwencja końca 3' sekwencji kodującej grsT, z kodonem terminacji, (6) sekwencja z końca 5' sekwencji kodującej grsT, obejmująca kodon inicjacji.

Amplifikowane fragmenty znaczono radioaktywnie i nieradioaktywnie metodami znanymi w technice i stosowano je do skriningu bibliotek genomowego DNA w Bacillus brevis ATCC 9999 w wektorze takim jak XEMBL3. Sześć takich amplifikowanych fragmentów użyto parami do izolowania klonowanych fragmentów genomowego DNA, które to fragmenty zawierają nienaruszone sekwencje kodujące dla tych trzech genów biosyntezy. Klony hybrydyzujące z sondami 1 i 2 będą zawierały nienaruszoną sekwencję grsB, te, które hybrydyzują z sondami 3 i 4 będą zawierały nienaruszony gen grsA, te, które hybrydyzują z sondami 5 i 6 będą zawierały nienaruszony gen grsT. Sklonowany grsA wprowadzono do E. coli i ekstrakty przygotowane przez lizę transformowanych bakterii w znany sposób analizowano na aktywność metodą oznaczania fenyloalaninozależnej wymiany ATP-PPj (Krause i wsp., J. Bacteriol. 162, 1120-1125 /1985/) po usunięciu białek mniejszych od 120 kDa drogą chromatografii z filtracją żelową. GrsB badano podobnie, drogą oznaczania filtrowanych przez żel ekstraktów z transformowanych bakterii na obecność prolino-, walino-, omityno- i leucyno-zależnej wymiany ATP-PPj.

182 136

Przykład XX. Klonowanie genów biosyntezy penicyliny

Fragment o wielkości 38 kilozasad genomowego DNA z Penicillium chrysogenum przenosi zdolność syntetyzowania penicyliny do Aspergillus niger i Neurospora crassa, grzybów, które normalnie nie wytwarzają tego antybiotyku (Smith i wsp., Bio/Technology, 8, 39-41 /1990/). Geny odpowiedzialne za biosyntezę syntetazy delta-(L-alfa-aminoadypilo)-L-cysteinylo-D-waliny, syntetazy izopenicyliny N i acylotransferazy izopenicyliny N sklonowano z P. chrysogenum i Aspergillus nidulans i oznaczono ich sekwencje (Ramon i wsp., Gene 57, 171-181 /1987/; Smith i wsp., EMBO Journal 9, 2743-2750 /1990/; Tobin i wsp., J. Bacteriol., 172, 5908-5914/1990/). Klonowanie tych genów przeprowadzono opisaną powyżej metodą z wykorzystaniem reakcji PCR w celu uzyskania sond o wielkości około 500 par zasad z genomowego DNA albo z Penicillium chrysogenum (np. szczepu AS-P-78 dostarczonego przez Antibioticos S.A., Leon, Hiszpania) albo z Aspergillus nidulans, np. ze szczepu G69. Ich integrację i funkcję można sprawdzić transformując wymienione powyżej grzyby nie wytwarzające antybiotyku i śledząc wytwarzanie antybiotyku i aktywność poszczególnych enzymów w znany sposób (Smith i wsp., Bio/Technology, 8, 39-41 /1990/).

Przykład XXI. Klonowanie genów biosyntezy bacytracyny

Bacytracyna A jest rozgałęzionym antybiotykiem cyklopeptydowym posiadającym właściwości zwiększania odporności roślin na patogeny bakteryjne. Jest ona wytwarzana przez Bacillus licheniformis ATCC 10716 a do jej syntezy są potrzebne trzy wielofunkcyjne enzymy: syntetazy bacytracyny (BA) 1, 2 i 3. Masy cząsteczkowe BA1, BA2 i BA3 wynoszą odpowiednio 335 kDa, 240 kDa i 380 kDa. Badania fragmentu DNA Bacillus licheniformis o wielkości 32 kilozasad, kodującego białko BA2 i część białka BA3 wykazało, że co najmniej te dwa geny są połączone (Ishihara i wsp., J. Bacteriol. 171, 1705-1711 /1989/). Na podstawie obserwacji operonów biosyntezy gramicydyny S, penicyliny i surfaktyny można przypuszczać, że pierwsze białko w szlaku metabolicznym, BA1, jest kodowane przez gen znajdujący się stosunkowo blisko genów BA2 i BA3. BA3 oczyszczono sposobami opisanymi w literaturze i użyto do wytworzenia przeciwciał u królika (Ishihara i wsp., jak wyżej). Bibliotekę genomową DNA Bacillus licheniformis transformowano do E. coli i wykrywano klony, w których zachodzi ekspresja determinant antygenowych przeciw BA3, wykorzystując znane metody. Ponieważ BA1, BA2 i BA3 są spokrewnione antygenowe, użytą metodą detekcji wykryje się klony kodujące każdy z tych trzech enzymów. Identyczność każdego klonu potwierdzono, testując ekstrakty transformowanej E. coli na obecność wymiany ATP-PPj zależnej od konkretnego aminokwasu. Klony kodujące BA1 będą wykazywać wymianę leucyno-zależną zależną od kwasu glutaminowego, izoleucyno-zależną, klony kodujące BA2 będą wykazywać wymianę lizyno- i omityno-zależną a klony kodujące BA3 będą wykazywać wymianę izoleucyno-, fenyloalanino-, histydyno-zależną, zależną od kwasu asparaginowego i asparagino-zależną. Jeśli w ten sposób otrzyma się jeden lub dwa geny, wówczas inne można wyizolować technikami znanymi jako „chodzenie po chromosomach sondą molekularną” (Sambrook i wsp. w podręczniku: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press /1989/).

Przykład XXII. Klonowanie genów biosyntezy beuwerycyny i destruksyny

Beuwerycyna jest owadobójczym heksadepsipeptydem wytwarzanym przez grzyba Beauveria Bassiana (Kleinkauf i von Dohren, European Journal of Biochemistry, 192, 1-15 /1990/), chroniącym rośliny przed szkodnikami owadzimi. Beuwerycyna jest analogiem eniatyny, fitotoksycznego heksadepsipeptydu wytwarzanego przez niektóre fitopatogeniczne gatunki Fusarium (Burmeister i Platter, Phytopathology 77,1483-1487 /1987/). Destruksyna jest owadobójczym peptydem o budowie laktonowej, wytwarzanym przez grzyba, Metarhizium anisopliae (James i wsp., J. Insect Physiology, 39, 797-804 /1993/). Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw regionowi kompleksu syntetazy eniatyny odpowiedzialnemu za N-metylację aktywowanych aminokwasów reagują krzyżowo z syntetazami dla beuwerycyny i destruksyny, co dowodzi ich strukturalnego pokrewieństwa (Kleinkauf i von Dohren, European Journal of Biochemistry, 192, 1-15 /1990/). Gen dla syntetazy eniatyny (esynl) z Fusarium scirpi został już sklonowany i zsekwencjonowany (Haese i wsp., Molecular Microbiology 7,

182 136

905-914 /1993/) a informację o jego sekwencji wykorzystano do opracowania strategii klonowania genów dla syntetazy beuwerycyny i syntetazy destruksyny, jak opisano powyżej. Sondy dla genu syntetazy beuwerycyny (BE) i genu syntetazy destruksyny (DXS) otrzymano przez amplifikację specyficznych regionów genomowego DNA Beauveria bassiana albo genomowego DNA Metarhizium anisopliae, stosując jako primery do reakcji PCR oligomery, których sekwencje wzięto z sekwencji syntetazy eniatyny. Wybrano dwie pary primerów PCR: jedną parę umożliwiającą amplifikację segmentu genu BE obejmującego kodon inicjacji i drugą parę, umożliwiają amplifikację segmentu genu BE obejmującego kodon terminacji. Każda para będzie powodować syntezę fragmentu DNA o wielkości około 500 par zasad. Tymi znakowanymi fragmentami sondowano biblioteki genomowego DNA z Beauveria bassiana i Metarhizium anisopliase i wybrano klony, które hybrydyzowały z obydwiema. Całkowite sekwencje kodujące dla syntetazy beuwerycyny będą powodować pojawianie się zależnej od fenyloalaniny wymiany ATP-PPj w odpowiednim gospodarzu a sekwencje dla destruksyny będą powodować pojawianie się wymiany ATP-PPj walino-, izoleucyno- i alanino-zależnej. W ekstraktach z tych transforomowanych organizmów będzie również przebiegać bezkomórkowa biosynteza beuwerycyny i destruksyny.

Przykład XXIII. Klonowanie genów biosyntezy nieznanych antybiotyków peptydowych

Geny dla dowolnych antybiotyków peptydowych klonuje się wykorzystując regiony konserwatywne w sekwencji kodującej. Funkcje wspólne dla wszystkich syntetaz antybiotyków peptydowych, a więc, aktywację aminokwasu, wiązanie ATP i pantoteiny odzwierciedlają się w powtarzalnej strukturze domenowej, w której każda domena obejmuje około 600 aminokwasów. W obrębie domen znane są sekwencje konserwatywne i zakłada się, że pokrewne sekwencje będą występować w dowolnej syntetazie antybiotyku peptydowego, niezależnie od jej źródła. Porównano opublikowane sekwencje DNA genów dla syntetaz peptydowych, w tym syntetaz gramicydyny 1 i 2 (Hori i wsp., Journal of Biochemistry 106, 639-645 /1989/; Krause i wsp., J. Bacteriol. 162, 1120-1125 /1985/; Turgay i wsp., Molecular Microbiology 6, 529-546 /1992/), syntetaz tyrocydyny 1 i 2 (Weckermann i wsp., Nucleic Acids Research 16, 11841 /1988/), syntetazy ACV (MacCabe i wsp., J. Biological Chemistry 266, 12646-12654 /1991/), syntetazy eniatyny (Haese i wsp., Molecular Microbiology 7, 905-914 /1993/) i syntetazy surfaktyny (Fuma i wsp., Nucleic Acids Research 21, 93-97 /1993/; Grandi i wsp., Eleventh International Śpores Conference /1992/) i zidentyfikowano poszczególne powtarzające się domeny. Domeny z wszystkich tych syntetaz porównano jako grupę i zidentyfikowano sekwencje najbardziej konserwatywne. Na podstawie tych sekwencji konserwatywnych zaprojektowano oligomery DNA odpowiednie do hybrydyzacji ze wszystkimi badanymi wariantami tej sekwencji a inną sekwencję DNA, leżącą przykładowo w odległości od 0,1 do 2 kilozasad od pierwszej sekwencji DNA użyto do zaprojektowania drugiego oligomeru DNA. Takie pary oligomerów DNA użyto do amplifikacji w reakcji PCR leżącego między nimi segmentu nieznanego genu przez połączenie ich z genomowym DNA wypreparowanym z organizmu produkującego antybiotyk i prowadzono amplifikację w reakcji PCR. Wytworzony fragment DNA sekwencjonowano dla potwierdzenia jego identyczności i użyto jako sondę do identyfikacji klonów zawierających większe segmenty genu syntetazy peptydowej w bibliotece genomowej. Przez zastosowanie wariantu tego podejścia, w którym oligomery' zaprojektowane do hybrydyzacji z sekwencjami konserwatywnymi w ich genach użyto jako sondy hybrydyzacyjne a niejako primery w reakcjach PCR zidentyfikowano część genu syntetazy surfaktyny a Bacillus subtilis ATCC 21332 (Borchert i wsp., FEMS Microbiological Letters 92, 175-180 /1992/). Następnie zsekwencjonowano sklonowany genomowy DNA, który hybrydyzuje z sondą generowaną w reakcji PCR i całkowitą sekwencję kodującą otrzymano metodą „chodzenia po chromosomach”. Procedura „chodzenia po chromosomach” da również inne geny potrzebne do syntezy antybiotyku peptydowego, gdyż wiadomo, że są one zgrupowane w zespoły.

182 136

Innym sposobem pozyskiwania genów kodujących syntetazę (syntetazy) nowego antybiotyku peptydowego jest detekcja determinant antygenowych wytwarzanych w gospodarzu heterologicznym po transformacji odpowiednią biblioteką genomową przygotowaną z DNA pochodzącego z organizmu produkującego ten antybiotyk. Zakłada się, że wspólne cechy strukturalne syntetaz będą się odzwierciedlać w reakcjach krzyżowych z przeciwciałami wyhodowanymi przeciw innym białkom syntetaz. Takie przeciwciała przeciw syntetazom peptydowym oczyszczonym ze znanych organizmów wytwarzających antybiotyk wytwarza się znanymi sposobami (Ishihara i wsp., J. Bacteriol. 171, 1705-1711 /1989/). Transformowane organizmy zawierające fragmenty genomowego DNA pochodzące z organizmu wytwarzającego nieznany antybiotyk peptydowy testuje się na obecność determinant antygenowych, które rozpoznaj e się w anty surowicach przeciw syntetazie peptydowej w znany sposób. Sklonowany genomowy DNA zawarty w komórkach zidentyfikowanych za pomocą tych antysurowic rozpoznaje się i sekwencjonuje. W celu uzyskania całkowitej sekwencji kodującej i innych genów biosyntezy stosuje się wspomniane wcześniej techniki „chodzenia po chromosomach”.

Innym sposobem otrzymywania genów kodujących syntetazę nieznanego antybiotyku peptydowego jest oczyszczanie białka charakteryzującego się właściwościami odpowiedniej syntetazy peptydowej i oznaczenie jej całej lub częściowej sekwencji aminokwasowej. Aminokwasy występujące w antybiotyku oznacza się przez oczyszczanie tego antybiotyku z ekstraktu chloroformowego hodowli organizmu wytwarzającego ten antybiotyk, np. metodą chromatografii z odwróconymi fazami na kolumnie Cl8 w mieszaninie etanol/woda. Skład oczyszczonego związku oznacza się metodą spektrometrii masowej, NMR i analizy produktów kwaśnej hydrolizy. Aminokwasy lub hydroksykwasy występujące w tym antybiotyku peptydowym po ich dodaniu do zawierającego syntetazę peptydową ekstraktu z organizmu wytwarzającego ten antybiotyk będą powodować wymianę ATP-PPj. Reakcję tę stosuje się jako próbę do wykrywania obecności syntetazy peptydowej podczas procesu oczyszczania białka, co jest znane w technice. Zasadniczo czysty preparat syntetazy peptydowej stosuje się do oznaczenia jej sekwencji aminokwasowej, bądź przez bezpośrednie sekwencjonowanie nienaruszonego białka, uzyskując sekwencję aminokwasową N-terminalną, bądź przez wytworzenie, oczyszczenie i sekwencjonowanie peptydów pochodzących z tej nienaruszonej syhtetazy peptydowej w wyniku działania specyficznych enzymów proteolitycznych, co jest znane w technice. Sekwencję DNA wyprowadza się z sekwencji aminokwasowej syntetazy i projektuje się oligomery DNA zdolne do hybrydyzacji z taką sekwencją kodującą. Oligomery te stosuje się do sondowania biblioteki genomowej przygotowanej z DNA organizmu wytwarzającego dany antybiotyk. Wybrane klony sekwencjonuje się w celu ich identyfikacji i całkowite sekwencje kodujące i towarzyszące geny potrzebne do biosyntezy peptydu otrzymuje się technikami „chodzenia po chromosomach”. Ekstrakty z organizmów transformowanych komplementem genów biosyntezy peptydu, np. z bakterii lub grzybów, będą wytwarzać antybiotyk peptydowy po dostarczeniu żądanych aminokwasów, hydroksykwasów, ATP i panteteiny.

Dalsze metody klonowania genów wymaganych do syntezy nierybosomalnych antybiotyków peptydowych są opisane w sekcji B przykładów.

Antybiotyki peptydowe syntetyzowane z udziałem rybosomu

Antybiotyki peptydowe syntetyzowane z udziałem rybosomu charakteryzują się istnieniem genu strukturalnego dla samego antybiotyku, który to gen koduje prekursor podlegający następnej modyfikacji przez specyficzne enzymy wytwarzające dojrzałą cząsteczkę. Użycie ogólnego aparatu syntezy białek do syntezy antybiotyków peptydowych otwiera możliwości produkcji znacznie dłuższych polimerów, chociaż te antybiotyki peptydowe niekoniecznie są bardzo duże. Poza genem strukturalnym potrzebne są pozostałe geny do wydzielania poza komórkę i immunogenności. Uważa się, że te geny znajdują się blisko genu strukturalnego, w większości przypadków na tym samym operonie. Istnieją dwie główne grupy antybiotyków peptydowych wytwarzanych z udziałem rybosomu: te, które zawierają niezwykły aminokwas

182 136 lantioninę i te, które jej nie zawierają. Antybiotyki zawierające lantioninę (lantibiotyki) są wytwarzane przez bakterie gram-dodatnie, w tym, przez rodzaje Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus i Streptomyces. Znane są lantibiotyki liniowe (np. nizina, subtilina, epidermina i gallidermina) oraz lantibiotyki cykliczne (np. duramycyna i cynnamycyna) (Hansen, Annual Review of Microbiology 47, 535-564 /1993/; Kolter i Moreno, Annual Review of Microbiology 46, 141-163 /1992/). Lantibiotyki często zawierają inne charakterystyczne modyfikowane reszty, takie jak dehydroalaninę (DHA) i dehydrobutyrynę (DHB), pochodzące z odwodnienia odpowiednio seryny i treoniny. W reakcji grupy tiolowej cysteiny z DHA powstaje lantionina a w reakcji z DHB-p-metylolantionina. Antybiotyki peptydowe, które nie zawierają lantioniny mogą zawierać inne modyfikacje albo mogą się składać jedynie ze zwykłych aminokwasów stosowanych w syntezie białek. Antybiotyki peptydowe nie zawierające lantioniny są wytwarzane przez bakterie gram-dodatnie i gram-ujemne, w tym przez Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus i Escherichia. Do antybiotyków tej kategorii należą laktacyny, laktocyny, sakacyna A, pediocyny, diplokokkcyny, laktokokkcyny i mikrocyny (Hansen, jak wyżej; Kolter i Moreno, jak wyżej). W zasadzie, antybiotyki peptydowe, synteza których zaczyna się na rybosomach są przedmiotem kilku typów przetwarzania post-translacyjnego, w tym rozszczepienia proteolitycznego i modyfikacji aminokwasowych łańcuchów bocznych. Wymagają one specyficznego mechanizmu transportu i/lub immunogenności. Potrzeba ochrony przed działaniem tych antybiotyków silnie kontrastuje z brakiem takich układów dla antybiotyków peptydowych nierybosomalnych. Można to usprawnić, biorąc pod uwagę, że aktywność antybiotyczna wielu antybiotyków peptydowych syntetyzowanych z udziałem rybosomu jest ukierunkowana na wąski zakres bakterii, które są dość ściśle powiązane z organizmem go produkującym. W tej sytuacji potrzebny jest szczegółowy sposób rozróżniania producenta od konkurenta albo cała korzyść będzie stracona. Ta właściwość ogranicza użyteczność tej klasy cząsteczek jako antybiotyków. Są one mało użyteczne w przypadkach, gdy potrzebny jest szeroki zakres aktywności. W przypadkach, gdy korzystny jest bardzo wąski zakres aktywności, atrakcyjność tej klasy związków jest większa. W układach eukariotycznych, o których wiadomo, że nie są wrażliwe na jakikolwiek antybiotyk peptydowy tego typu, nie jest wyjaśnione, czy wytwarzanie antybiotyku peptydowego syntetyzowanego z udziałem rybosomu wymaga jednego z tych systemów transportu, czy transport poza komórkę jest jedynie sprawą umieszczenia antybiotyku w lokalizacji bardziej dogodnej do kontaktu z potencjalnymi patogenami. Ten problem może być zbadany eksperymentalnie, co jest opisane w poniższych przykładach.

Przykład XXIV. Geny klonujące do biosyntezy lantibiotyku

Badanie genów związanych z genami strukturalnymi dla lantibiotyków, nizyny, subtyliny i epiderminy, wykazało kilka otwartych ramek odczytu o wspólnej homologii sekwencji a ich wyprowadzone sekwencje aminokwasowe wskazują na funkcje związane z dojrzewaniem i transportem tego antybiotyku. Zsekwencjonowano geny spa z Bacillus subtilis ATCC 6633, łącznie z genem spaS, będącym genem strukturalnym kodującym prekursor subtyliny (Chung i Hansen, J. Bacteriol. 174, 6699-6702 /1992/; Chung i wsp., J. Bacteriol. 174, 1417-1422 /1992/; Klein i wsp., Applied and Environmental Microbiology, 58, 132-142 /1992/). Otwarte ramki odczytu znaleziono tylko w miejscu znajdującym się w górę od spaS, co najmniej w odległości 1 - 2 kilozasad. Kilka otwartych ramek odczytu, spaE, spaD, spaB i spaC okazało się częścią tej samej jednostki transkrypcyjnej, z przypuszczalnym promotorem w górę od spaE. Zarówno spaB, kodująca białko o długości 599 aminokwasów jak i spaD, kodująca białko o długości 177 aminokwasów wykazują homologię z genami zaangażowanymi w transport hemolizyny, kodując odpowiednio białka HylB i HlyD. SpaE, która koduje białko o długości 851 aminokwasów jest homologiczna z nisB, genem związanym z genem strukturalnym dla nizyny, o nieznanej funkcji. SpaC koduje białko o długości 442 aminokwasów o nieznanej funkcji ale rozerwanie tej ramki eliminuje produkcję subtyliny. Te geny są zawarte na segmencie genomowego DNA o wielkości około 7 kilozasad (Chung i Hansen, J. Bacteriol. 174, 6699-6702 /1992/; Chung i wsp., J. Bacteriol. 174, 1417-1422 /1992/; Klein

182 136 i wsp., Applied and Environmental Microbiology, 58, 132-142 /1992/). Nie wykazano z całkowitą pewnością, że te geny są całkowicie wystarczające do nadania zdolności wytwarzania subtyliny. Fragment o wielkości 13,5 kilozasad z plazmidu Tu32 ze Staphylococcus epidermis Tu3298 zawierający gen strukturalny dla epiderminy (epiA) również zawiera pięć otwartych ramek odczytu oznaczonych symbolami epiA, epiB, epiC, epiD, epiQ i epiP. Geny epiBC są homologiczne z genami spaBC, podczas gdy epiQ bierze udział w regulowaniu ekspresji operonu a epiP może kodować proteazę działającą podczas dojrzewania pre-epiderminy do epiderminy. EpiD koduje białko złożone ze 181 aminokwasów, wiążące koenzym, flawino-mononukleotyd i przypuszcza się, że prowadzi modyfikację post-translacyjną pre-epiderminy (Kupkę i wsp., J. Bacteriol. 174 /1992/; Peschel i wsp., Molecular Microbiology 9, 31-39 /1993/; Schnel i wsp., European Journal of Biochemistry 204, 57-68 /1992/). Zakłada się, że wiele, jeśli nie wszystkie geny potrzebne do biosyntezy lantibiotyku są zgrupowane, znajdują się blisko siebie fizycznie, razem albo na genomowym DNA albo na plazmidzie. Z tego powodu, postępowanie umożliwiające lokalizację jednego z potrzebnych genów będzie użyteczne przy poszukiwaniu i klonowaniu innych. Gen strukturalny dla lantibiotyku klonuje się przez zaprojektowanie sond oligonukleotydowych w oparciu o sekwencję aminokwasową oznaczoną z zasadniczo czystego preparatu samego lantibiotyku i podaną dla lantibiotyków: laktycyny 481 z podgatunku Lactococcus lactis CNRZ 481 (Piard i wsp., J. Biological Chemistry 268, 16361-16368 /1993/), streptokokcyny A-FF22 ze Streptococcus pyogenes FF22 (Hynes i wsp., Applied and Environmental Microbiology, 59, 1969-1971 /1993/) i saliwarycyny A ze Streptococcus salivarius 203P (Ross i wsp., Applied and Environmental Microbiology, 59, 2014-2021 /1993/). Fragmenty bakteryjnego DNA o wielkości około 10 -20 kilozasad, zawierające ten gen strukturalny klonowano i sekwencjonowano w celu oznaczenia regionów homologii z charakterystycznymi genami w operonach spa, epi i nis. Otwarte ramki odczytu wykazujące homologię z dowolnym z tych genów lub leżące w tej samej jednostce transkrypcyjnej co otwarte ramki odczytu posiadające homologię z jednym z tych genów klonowano indywidualnie w znany sposób. Fragment DNA zawierający wszystkie stowarzyszone ramki odczytu a nie zawierający innych, transformuje się do szczepu bakteryjnego nie wytwarzającego, takiego jak Escherichia coli i analizuje się produkcję lantibiotyku, wykazują obecność wszystkich genów potrzebnych do biosyntezy.

Przykład XXV. Klonowanie genów do biosyntezy nie-lantioninowych antybiotyków peptydowych syntetyzowanych z udziałem rybosomu

Przyjmuje się, że brak wyczerpujących modyfikacji podczas biosyntezy lantibiotyków powinien być związany z mniejszą ilością genów biorących udział w całkowitej syntezie antybiotyków peptydowych reprezentowanych przez laktacynę F, sakacynę A, laktokokcynę A i helwetycynę J. Wykryto zespoły genów zaangażowanych w biosyntezę antybiotyków w Lactobacillus johnsonii VPI11088 dla laktacyny F (Fremaux i wsp., Applied and Environmental Microbiology, 59, 3906-3915 /1993/). w Lactobacillus sake Lb706 dla sakacyny A (Axelsson i wsp., Applied and Environmental Microbiology, 59, 2868-2875 /1993/), w Lactococcus lactis dla laktokokcyny A (Stoddard i wsp., Applied and Environmental Microbiology, 58, 1952-1961 /1992/) i w Pediococcus acidilactici dla pediocyny PA-1 (Marugg i wsp., Applied and Environmental Microbiology, 58, 2360-2367 /1992/). Geny potrzebne do biosyntezy nowych nielantioninowych antybiotyków peptydowych klonowano wykonując początkowo oznaczenia sekwencji amiokwasowej zasadniczo oczyszczonego preparatu antybiotyku, następnie projektując oligomery DNA w oparciu o tę sekwencję aminokwasową i sondując bibliotekę DNA skonstruowaną albo z genomowego DNA albo z plazmidowego DNA z bakterii produkującej antybiotyk. Fragmenty DNA o wielkości około 5-10 kilozasad, zawierające gen strukturalny dla antybiotyku klonowano i sekwencjonowano. Otwarte ramki odczytu wykazujące homologię z genem sakB i Lactobacillus sake albo z lafX, ORFY albo ORFZ z Lactobacillus johnsonii albo takie, które są częścią tej samej jednostki transkrypcyjnej co gen lub geny strukturalne antybiotyku posiadające homologię z genami wspomnianymi powyżej klonowano indywidualnie w znany sposób. Fragment DNA zawierający wszystkie stowarzyszone

182 136 ramki odczytu a nie zawierający innych, transforomowano do szczepu bakteryjnego nie wytwarzającego, takiego jak Escherichia coli i analizowano produkcję antybiotyku, wykazując obecność wszystkich genów potrzebnych do biosyntezy.

H. Ekspresja genów biosyntezy antybiotyku w mikroorganizmie gospodarza

Przykład XXVI. Nadekspresja genów biosyntezy APS w celach nadprodukcji APS z zastosowaniem technologii typu fermentacji

Ekspresję genów biosyntezy APS można prowadzić w organizmach heterologicznych, do celów ich produkcji APS w większych ilościach, niż byłoby to możliwe przy użyciu gospodarzy natywnych. Gospodarzem odpowiednim do ekspresji heterologicznej jest E. coli. Techniki ekspresji genów w E. coli są znane. Przykładowo, można dokonać ekspresji klonowanych genów APS w E. coli stosując wektor ekspresyjny pKK223, co opisano w przykładzie XI. Klonowane geny można wprowadzać w fuzji transkrypcyjnej, tak, aby można było użyć dostępne miejsce wiązania rybosomu spokrewnione z genem heterologicznym. Takie podejście ułatwia ekspresję operonów, które kodują więcej niż jedną otwartą ramkę odczytu ponieważ translacja poszczególnych ORF będzie zależna od sygnałów na pokrewnym z nimi miejscu wiązania rybosomu. Alternatywnie, można dokonać fuzji genów APS z ATG wektora (np. jako fuzji Ncol), tak, aby użyć miejsce wiązania rybosomu z E. coli. Przy ekspresji wielu ORF w E. coli (występującej w przypadku operonów z wielokrotnymi ORF), ten typ konstrukcji może wymagać oddzielnego promotora przyłączonego przez fuzję do każdej ORF. Możliwa jest jednak fuzja pierwszego ATG operonu APS z miejscem wiązania rybosomu z E. coli z jednoczesnym wykorzystaniem przez inne ORF spokrewnionych miejsc wiązania rybosomu. Takie typy konstrukcji, przeznaczone do nadekspresji genów w E. coli są dobrze znane. Do odpowiednich promotorów bakteryjnych należą promotor lac, promotor tac (trp/lac) i promotor Ρλ z bakteriofaga λ. Do dostępnych w handlu, odpowiednich wektorów należą np. PKK223-3, pKK233-2, pDR540, pDR720, pYEJOOl i pPL-Lambda (z firmy Pharmacia, Piscataway, NJ).

Podobnie, do produkcji na skalę przemysłową białek heterologicznych stosuje się bakterie gram-dodatnie, szczególnie rodzaj Bacillus, a zwłaszcza Bacillus licheniformis. Można je przystosować do ekspresji genów biosyntezy APS (np. Quax i wsp. w publikacji: „Industrial Micoorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics”, wyd. Baltz i wsp., American Society for Microbiology, Washington /1993/). Do generowania fuzji transkrypcyjnych z genami biosyntezy APS stosuje się sygnały regulacyjne z genu Bacillus charakteryzującego się wysokim poziomem ekspresji (Quax i wsp., jak wyżej).

W niektórych przypadkach uzyskiwano wysoki poziom ekspresji genów bakteryjnych stosując układy drożdżowe, takie jak drożdże metylotroficzne, Pichia pastoris (Sreekrishna w publikacji: „Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics”, wyd..Baltz , Hegeman i Skatrud, American Society for Microbiology, Washington /1993/). Żądany gen APS umieszcza się za sekwencjami regulacyjnymi 5' genu oksydazy alkoholowej Pichia w wektorach takich jak pHIL-Dl i pHIL-D2 (Sreekrishna, jak wyżej). Takie wektory stosuje się do transformowania Pichia i wprowadzania heterologicznego DNA do genomu drożdży. Podobnie, do ekspresji heterologicznych genów bakteryjnych stosowano drożdże, Saccharomyces cerevisiae (np. Deąuin i Barre, Biotechnology 12, 173-177 /1994/). Drożdże Kluyveromyces lactis są również odpowiednim gospodarzem do heterologicznej ekspresji genu (np. Van den Berg i wsp., Biotechnology 8, 135-139 /1990/).

Nadekspresja genów APS w organizmach takich jak E. coli, Bacillus i drożdże, znanych z szybkiego wzrostu i namnażania, umożliwi produkcję metodą fermentacji większych ilości APS. Wybór organizmu może być ograniczony z powodu możliwej wrażliwości tego organizmu na wytwarzany przez niego APS. Taką prawdopodobną wrażliwość można jednak oznaczyć w procedurach opisanych w sekcji J. Z takich hodowli można izolować i oczyszczać APS (patrz sekcja G) przeznaczony do zwalczania mikroorganizmów takich jak grzyby i bakterie.

182 136

I. Ekspresja genów biosyntezy antybiotyków w mikroorganizmach gospodarza do ceOów kontroli biologicznej

Klonowane geny biosyntezy APS można użyć do zwiększenia skuteczności stosowanych do kontroli biologicznej szczepów różnych mikroorganizmów. Jedną z możliwości jest przeniesienie genów dla danego APS z powrotem do jego pierwotnego gospodarza pod silniejszą regulacją transkrypcji, wywołując produkcję większych ilości tego APS. Inną możliwością jest przeniesienie genów do gospodarza heterologicznego i wywołanie w tym gospodarzu heterologicznym produkcji APS, którego on normalnie nie wytwarza.

Mikroorganizmami odpowiednimi do heterologicznej nadekspresji genów APS są wszystkie mikroorganizmy zdolne do kolonizowania roślin lub rizosfeiy. Można je kontaktować z fitopatogennymi grzybami powodując hamowanie wzrostu tych grzybów. Należą do nich mikroorganizmy gram-ujemne, takie jak Pseudomonas, Enterobacter i Serratia, mikroorganizmy gram-dodatnie z rodzaju Bacillus i Streptomyces oraz grzyby Trichoderma i Gliocladium. Do szczególnie korzystnych gospodarzy heterologicznych należą Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aurantiaca, Enterobacter cloacae, Serratia marcesens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum i Gliocladium virens.

Przykład XXVII. Ekspresja genów biosyntezy APS w E. coli i w innych bakteriach gram-dodatnich

Dokonano już ekspresji wielu genów w bakteriach gram-ujemnych w sposób heterologiczny. W przykładzie XI opisana jest ekspresja genów biosyntezy pirolnitryny w E. coli przy użyciu wektora ekspresyjnego pKK223-3 (Pharmacia, numer katalogowy #27-4935-01). Ten wektor posiada silny promotor tac (Brosius J. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81) regulowany represorem lac i indukowany przez IPTG. Opracowano wiele innych układów ekspresyjnych do użycia w E. coli. Niektóre z nich są szczegółowo opisane w przykładach XIV-XVII. W indukowanym termicznie wektorze ekspresyjnym pPL (Pharmacia #27-4946-01) użyto ściśle regulowany promotor bakteriofaga λ, który pozwala na wysoki poziom ekspresji białek. Ten promotor lac daje dalsze możliwości ekspresji ale ekspresja z tego promotora nie przebiega na tak wysokich poziomach jak ekspresja z promotora tac. Jeśli do niektórych z tych wektorowych układów ekspresyjnych wprowadzi się replikony dla szerokiego zakresu gospodarzy, będzie możliwe wytwarzanie związków przeciwgrzybiczych w ściśle spokrewnionych bakteriach gram-ujemnych, takich jak Pseudomonas, Enterobacter, Serratia i Erwinia. Przykładowo, plazmid pLRKD211 (Kaiser i Kroos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5816-5820 /1984/) zawiera replikon dla szerokiego zakresu gospodarzy, ori T, umożliwiający replikację w wielu bakteriach gram-ujemnych.

W E. coli, do ekspresji promotora tac (np. Trp-lac) jest potrzebna indukcja przez IPTG. Jeśli ten sam promotor (np. w wektorze pLRKD211 o szerokim zakresie gospodarzy) wprowadzi się do Pseudomonas, staje się on aktywny konstytutywnie bez indukowania przez IPTG. Ten promotor trp-lac można umieścić przed każdym żądanym genem lub operonem do ekspresji w Pseudomonas lub w każdej innej bakterii ściśle spokrewnionej jeśli celem jest ekspresja konstytutywna genu. Jeśli operon zawiera informację dla biosyntezy APS, wówczas szczep bakterii gram-ujemnej nie mający właściwości biokontrolnych może stać się zdolny do ochrony roślin przed wieloma chorobami grzybiczymi. Tak więc, geny dla związków przeciwgrzybiczych można umieścić za silnym promotorem konstytutywnym, przenieść je do bakterii, która normalnie nie wytwarza produktów przeciwgrzybiczych i która posiada zdolność kolonizacji rośliny lub rizosfery i w ten sposób przekształcić te organizmy w efektywne szczepy biokontrolne. Do konstytutywnej ekspresji genów APS w bakteriach gram-ujemnych można również użyć inne możliwe promotory. Należy do nich przykładowo promotor z genów regulacyjnych gafA i lernA z Pseudomonas (publikacja opisu patentowego PCT, WO 94/01561) i promotor operonu z Pseudomonas savastanoi IAA (Gaffhey i wsp., J. Bacteriol. 172, 5593-5601 /1990/).

182 136

Syntetyczny operon Pm z promotorem tac opisanym w przykładzie XI wbudowano do dwu wektorów o szerokim zakresie gospodarzy, które replikują się w wielu bakteriach gram-ujemnych. Pierwszy wektor, pRK290 (Ditta i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (12), 7347-7351 /1980/) jest plazmidem replikującym się w małej ilości kopii a drugi wektor, pBBRIMCS (Kovach i wsp. Biotechniques 16 (5), 800-802 /1994/) replikuje się w średniej ilości kopii. Konstrukcje obydwu tych wektorów zawierające geny Pm wprowadzono do wielu szczepów bakterii gram-ujemnych i metodami chromatografii cienko-warstwowej i HPLC śledzono wytwarzanie pirolnitryny. Wykazano, że wiele szczepów wytwarzało heterologicznie pirolnitrynę. Należały do nich rodzaje E. coli, Pseudomonas (MOCG133, MOCG380, MOCG382, BL897, BL1889, BL2595) i Enterobacter taylorae (MOCG206).

Przykład XXVIII. Ekspresja genów biosyntezy APS w bakteriach gram-dodatnich

Heterologiczna ekspresja genów kodujących APS w bakteriach gram-dodatnich jest następnym sposobem pozyskiwania nowych szczepów biokontrolnych. Najlepiej są scharakteryzowane układy ekspresyjne dla Bacillus i Streptomyces. Promotor genu oporności na erytromycynę (ermR) ze Streptococcus pneumoniae okazał się aktywny w aerobach i anaerobach gram-dodatnich oraz w E. coli (Trieu-Cuot i wsp., Nuci. Acids Res. 18, 3660 /1990/). Następny promotor aktywności na antybiotyk z genu tiostreptonu użyto w wektorach klonujących Streptomyces (Bibb, Mol. Gen. Genet. 199, 26-36 /1985/). Wektor wahadłowy pHT3101 jest również odpowiedni do ekspresji w Bacillus (Lereclus, FEMS Microbiol. Letters 60, 211-218 /1989/). Przez ekspresję operonu (takiego jak operon pirolnitryny) albo poszczególnych genów kodujących APS pod kontrolą ermR lub innych promotorów możliwe jest przekształcenie drobnoustrojów glebowych w szczepy zdolne do ochrony roślin przed chorobami bakteryjnymi. Ważną zaletą tego sposobu jest to, że wiele bakterii gram-dodatnich wytwarza zarodniki, które można użyć w formach użytkowych, z których uwalniają się produkty biokontrolne o dłuższym okresie składowania. Rodzaje Bacillus i Streptomyces agresywnie kolonizują glebę. W rzeczywistości, obydwa te rodzaje wytwarzają metabolity wtórne, w tym antybiotyki aktywne przeciw szerokiemu zakresowi organizmów i dodanie do bakterii gram-dodatnich heterologicznych genów przeciwgrzybiczych (łącznie z tymi, które kodują pirolnitrynę, sorafen, fenazynę lub cykliczne peptydy) może podwyższyć własności biokontrolne tych szczepów.

Przykład XXIX. Ekspresja genów biosyntezy APS w grzybach

Wykazano, że Trichoderma harzianum i Gliocladium virens są czynnikami biokontrolnymi w uprawach polowych, w różnym stopniu skuteczności (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5.165,928 i UC 4.996.157 należące do Somell Research Foundation). Korzyści ze stosowania tych czynników biokontrolnych można znacznie zwiększyć drogą rozwoju ulepszonych szczepów przez wprowadzenie genów APS. Można tego dokonać wieloma sposobami znanymi w technice. Jednym ze sposobów jest transformacja grzyba za pośrednictwem protoplastu, z wykorzystaniem technik z poli-(glikolem etylenowym) lub elektroporacji. Alternatywnie, do transformacji protoplastów lub innych komórek grzyba posiadających zdolność regeneracji i rozwoju dojrzałych struktur, można zastosować technikę bombardowania cząstkami. Przekształcono wektor pAN7-l, po raz pierwszy użyty do transformacji Aspergillus a obecnie szeroko stosowany do transformacji grzybów. (Curragh i wsp., Mycol. Res. 97 (3), 313-317 /1992/; Tooley i wsp., Curr. Genet., 21, 55-60 /1992/; Punt i wsp., Gene 56, 117-124 /1987/) w taki sposób, aby zawierał operon pirolnitryny lub dowolne inne geny do biosyntezy APS. Ten plazmid zawiera gen oporności na higromycynę B z E. coli flankowany przez promotor gpd i terminator trpC z Aspergillus nidulans (Punt i wsp., Gene 56, 117-124/1987/).

182 136

J. Aktywność in vitro substancji antypatogenicznych przeciw patogenom roślinnym Przykład XXX. Procedury prowadzenia prób biologicznych dla wykrycia aktywności przeciwgrzybiczej

Hamowanie wzrostu grzyba przez potencjalny środek przeciwgrzybiczy można oznaczać wieloma technikami. Powszechnie stosowane metody makroskopowe są próbami dyfuzyjnymi na agarze (Dhingra i Sinclair w książce: Basic Plant Pathology Methods, wyd. CRC Press, Boca Raton, FLA /1985/ i próbami w pożywkach ciekłych (Broekaert i wsp., FEMS Microbiol. Lett. 69, 55-60 /1990/). W obydwu typach oznaczeń stosuje się do zaszczepiania zarodniki lub grzybnie. Podstawowe zapasy grzyba otrzymuje się postępując zgodnie ze standardowymi procedurami przyjętymi w mykologii. Zarodniki do prób biologicznych zbiera się z płytki z dojrzałym grzybem przez spłukanie powierzchni kolonii sterylną wodą lub buforem. Zawiesinę grzybni przygotowuje się przez umieszczenie grzyba z płytki w mieszalniku i zhomogenizowanie aż do zdyspergowania kolonii. Homogenat filtruje się przez kilka warstw gazy, zatrzymując większe cząstki. Zawiesinę, która przeszła przez gazę przemywa się przez wirowanie, zmieniając roztwór z nad osadu na świeży bufor. Taką zawiesinę grzybni zatęża się, dobierając stopień zatężenia empirycznie, testując zawiesinę przed użyciem w próbie biologicznej.

Próbę dyfuzji na agarze można prowadzić przez zawieszenie zarodników lub fragmentów grzybni w stałym podłożu wzrostowym i podanie środka przeciwgrzybiczego w punkcie, z którego będzie dyfundował. Można to wykonać przez dodanie zarodników lub grzybni do stopionej pożywki wzrostowej dla grzybów, wylanie tej mieszaniny do sterylnej płytki i odstawienie do żelowania. Na powierzchni płytki umieszcza się sterylne filtry i na te filtry nakrapla się roztwory środków przeciwgrzybiczych. Po zaabsorbowaniu cieczy na filtrze płytki inkubuje się w odpowiedniej temperaturze, zwykle przez 1-2 dni. Hamowanie wzrostu obrazuje się obecnością wokół filtrów stref, w których zarodniki nie kiełkuj bądź w których nie rośnie grzybnia. Siłę działania przeciwgrzybiczego, wyrażoną jako minimalna dawka efektywna badanego środka można oznaczyć ilościowo sporządzając rozcieńczenie seryjne tego środka na filtrach i oznaczając najniższą dawkę dającą widoczną strefę hamowania. Inną metodą wykonania próby dyfuzji na agarze jest wycięcie dołków w zestalonej pożywce wzrostowej dla grzybów i umieszczenie w tych dołkach roztworów środków przeciwgrzybiczych. Płytkę zaszczepia się w punkcie równoodległym od wszystkich dołków, zwykle w środku płytki, albo małą ilością zarodników albo zawiesiny grzybni albo wycina się cylinderek grzybni bezpośrednio z podstawowej hodowli tego grzyba na płytkach. Płytkę inkubuje się przez kilka dni, do czasu, aż rosnące grzybnie dotrą do dołków i obserwuje się oznaki hamowania wzrostu. Hamowanie rozpoznaje się po deformacji zwykle kolistej formy, jaką przyjmuje rosnąca kolonia grzyba. Hamowanie pojawia się zwłaszcza wówczas gdy front grzybni spłaszcza się a nawet wgłębia w stosunku do sekcji nie hamowanych na płytce. Minimalne stężenie hamujące można oznaczyć testując rozcieńczone roztwory badanego środka w celu znalezienia najniższego, którego działanie można jeszcze wykryć.

Próby biologiczne w pożywkach ciekłych prowadzi się stosując zawiesiny zarodników lub grzybnie, które inkubuje się w ciekłej pożywce wzrostowej dla grzybów, zamiast w podłożu stałym. Materiał grzyba, pożywkę i środek przeciwgrzybiczy miesza się we wgłębieniach w 96-dołkowej płytce do mikromianowania i śledzi się wzrost grzyba przez pomiar zmętnienia pożywki spektrofotometrycznie. Wzrosty zmętnienia korelują ze wzrostem biomasy i są miarą wzrostu grzyba. Hamowanie wzrostu oznacza się przez porównanie wzrostu grzyba w obecności środka przeciwgrzybiczego ze wzrostem bez tego środka. Przez testowanie rozcieńczonych roztworów inhibitora wzrostu grzybów można oznaczyć minimalne stężenie hamujące lub EC₅₀.

Przykład XXXI. Procedury prowadzenia prób biologicznych dla wykrycia aktywności przeciwbakteryjnej

Do oznaczenia aktywności przeciwbakteryjnej nieznanego związku można zastosować wiele prób biologicznych. Hamowanie wzrostu bakterii w podłożu stałym można oznaczyć przez zdyspergowanie inoculum hodowli bakteryjnej w stopionym podłożu i napryskanie

182 136 zawiesiny równomiernie na dnie sterylnej płytki petriego. Po zżelowaniu podłoża, na powierzchni umieszcza się sterylne krążki filtrów i na te krążki nanosi się badany materiał. Płytki inkubuje się przez dobę w odpowiedniej temperaturze i obserwuje się hamowanie wzrostu jako pole wokół filtra, w którym nie wyrosły bakterie albo, w których wzrost jest mniejszy w porównaniu z polami otaczającymi. Czyste związki można scharakteryzować przez oznaczenie minimalnej dawki efektywnej, najmniejszej ilości materiału, która daje strefę hamowania wzrostu. W pożywkach ciekłych można zastosować dwie inne metody. Wzrost hodowli można śledzić przez pomiar gęstości optycznej tej hodowli, w rzeczywistości stopnia rozproszenia światła. Jednakowe objętości hodowli zaszczepia się równymi ilościami inoculum, przy czym jedna hodowla zawiera znaną ilość potencjalnego środka przeciwbakteryjnego. Po inkubacji w odpowiedniej temperaturze i przy odpowiednim napowietrzaniu wymaganym przez testowaną bakterię, porównuje się gęstości optyczne hodowli. Dogodną długością fali dla porównań jest 600 nm. Środek przeciwbakteryjny można scharakteryzować przez oznaczenie minimalnej dawki efektywnej, najmniejszej ilości materiału powodującego zmniejszenie gęstości optycznej hodowli albo przez oznaczenie EC₅₀ czyli stężenia, przy którym wzrost badanej hodowli jest równy połowie wzrostu w hodowli kontrolnej. Opisane powyżej próby biologiczne nie różnicują działania bakteriostatycznego i bakteriobójczego. Można przeprowadzić inną próbę, w której można określić aktywność bakteriobójczą danego środka. Próbę tę prowadzi się przez inkubację bakterii i środka aktywnego łącznie z ciekłą pożywką przez czas i w warunkach potrzebnych do wywarcia działania przez ten środek. Po zakończeniu inkubacji bakterie można albo przemywać przez wirowanie i ponowne zawieszenie albo rozcieńczyć przez dodanie świeżej pożywki. W każdym przypadku stężenie środka przeciwbakteryjnego zmniejsza się do punktu, przy którym nie jest już spodziewana znacząca jego aktywność. Bakterie posiewa się na płytkach opryskując nimi stałe podłoże płytek i inkubuje się płytki przez dobę w odpowiedniej temperaturze. Zlicza się ilość kolonii wyrosłych na płytkach i porównuje się ilość, która wyrosła z mieszaniny ze środkiem przeciwbakteryjnym z tą która wyrosła na płytkach bez tego środka. Zmniejszenie ilości jednostek tworzących kolonie stanowi miarę aktywności bakteriobójczej danego środka. Aktywność bakteriobójczą można oznaczać ilościowo i wyrażać jako minimalną dawkę efektywną albo jako opisaną powyżej ED₅₀. Do oznaczeń takich jak te stosuje się bakterie z rodzajów Agrobacterium, Erwinia, Clavibacter, Xanthomonas i Pseudomonas.

Przykład XXXII. Oznaczanie aktywności antypatogenicznej związków APS

Związki APS testuje się stosując procedury opisane w przykładach XXX i XXXI w celu identyfikacji rodzajów grzybów i bakterii, przeciw którym są one aktywne. Testowany APS można wyizolować z komórek i z pożywki, w której prowadzono hodowlę gospodarza normalnie wytwarzającego ten związek lub alternatywnie można go izolować z organizmu gospodarza heterologicznego, przekształconego tak, aby produkował dany APS. Dalszą możliwością pozyskania APS jest synteza chemiczna związków o znanej strukturze chemicznej lub ich pochodnych.

Przykład XXXIII. Oznaczanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej pirolnitryny

a) Oznaczano aktywność anty-fitopatogeniczną fluorowanej 3-cyjano-pochodnej pirolnitryny (związek CGA 173506) przeciw fitopatogenom grzybowym kukurydzy, Diplodia maydis, Colletotrichum graminicola i Gibberella zeae-maydis. Hodowano zarodniki grzybów i zawieszano je w wodzie. Pożywkę ziemniaczano-glukozową zaszczepiano ilością około 1000 zarodników i dodawano albo związek CGA 173506 albo wodę w całkowitej objętości 100 μΐ do dołków w 96-dołkowej płytce do mikromianowania, po czym prowadzono odczyt w czytniku do płytek. Związek CGA 173506 otrzymano w postaci 50% proszku zwilżalnego i przygotowano zawiesinę podstawową o stężeniu 10 mg/ml w sterylnej wodzie. Tę zawiesinę podstawową rozcieńczano sterylną wodą w celu przygotowania próbek związku CGA 173506 do testów. Po zmieszaniu zarodników, pożywki i związku CGA 173506 wykonywano pomiary zmętnienia we wgłębieniach przez odczyt absorbancji w czytniku do płytek przy długości fali 600 nm. Ten odczyt przyjęto jako zmętnienie podstawowe, które odejmowano od odczytów

182 136 prowadzonych w następnych punktach czasowych. Oznaczono, że związek CGA 173506 w stężeniu 1 pg/ml hamował po 46 godzinach inkubacji wzrost Diplodia maydis o 64% a po 120 godzinach, w’tym samym stężeniu, hamował wzrost Colletotrichum graminicola o 50%. Po 40 godzinach inkubacji, zawartość 0,5 pg/ml związku CGA 173506 hamowała w 100% wzrost Gibberella zeae-maydis.

b) Badano wpływ pirolnitryny na wzrost grzybowych patogenów kukurydzy. Pirolnitryna hamowała wzrost Bipolaris maydis, Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae i Rhizoctonia solani. W celu oznaczenia hamowania wzrostu, autoklawowane krążki filtrów ( o średnicy 0,25 cala, dostarczone przez firmę Schleicher i Schuell) umieszczano w pobliżu obwodu płytek PDA (DIFCO). Na te krążki nanoszono pipeta roztwory, w ilości 2,5 pg pirolnitryny (25 μΐ) na jeden krążek a na drugi krążek nanoszono 25 μΐ 63% etanolu. Z płytek podstawowych hodowli grzyba wycinano cylinderki grzybów i umieszczano w środku płytek PDA. Każdym rodzajem grzyba zaszczepiano jedną płytkę. Grzybom pozwalano rosnąć, po czym, w odpowiednim czasie oznaczano hamowanie wzrostu. Hamowanie wzrostu grzyba oceniano wizualnie.

K. Ekspresja genów biosyntezy antybiotyku w transgenicznych roślinach Przykład XXXIV. Modyfikacja sekwencji kodujących i sekwencji sąsiadujących Opisane w niniejszym zgłoszeniu klonowane geny APS można modyfikować do celów ekspresji w transgenicznych gospodarzach roślinnych. Prowadzi się to w celu otrzymania dających się wyekstrahować z transgeniczych roślin ilości APS (to znaczy, w podobnych celach do opisanych w powyższej sekcji E) albo alternatywnie, celem takiej ekspresji może być zgromadzenie APS w tkance rośliny dla zapewnienia ochrony roślin gospodarza przed patogenem. Rośliny gospodarza, w których przebiega ekspresja genów biosyntezy APS, i które produkują APS w swych komórkach będą miały zwiększoną odporność na atak fitopatogenu i będą się lepiej bronić przed stratami plonów związanych z tym atakiem.

Transgeniczna ekspresja w roślinach genów pochodzących od mikroorganizmów może wymagać modyfikacji tych genów dla uzyskania optymalnej ich ekspresji w roślinach. Zwłaszcza bakteryjne otwarte ramki odczytu (ORF), które kodują oddzielne enzymy, ale które są kodowane przez ten sam transkrypt w oryginalnym mikroorganizmie, dają najlepszą ekspresję w roślinach na oddzielnych transkryptach. Dla uzyskania tego, każdą ORF z mikroorganizmu izoluje się indywidualnie i klonuje w kasecie, która dostarcza sekwencję roślinnego promotora na końcu 5' tej ORF i roślinny terminator transkrypcji na końcu 3' danej ORF. Wyizolowana sekwencja ORF korzystnie zawiera kodon inicjacji ATG i kodon zakańczania STOP ale może zawierać dodatkową sekwencję za kodonem inicjacji ATG i za kodonem STOP. Ponadto ORF może być skrócona o ile ciągle zachowuje żądaną aktywność. W przypadkach szczególnie długich ORF wersje skrócone, zachowujące aktywność mogą być korzystne do ekspresji w transgenicznych organizmach. Pod określeniami „promotor roślinny” i „roślinny terminator transkrypcji” rozumie się promotory i terminatory transkrypcji, które działają w komórkach roślinnych. Obejmuje ono promotory i terminatory transkrypcji, które mogą pochodzić ze źródeł nieroślinnych, takich jak wirusy (przykładem jest wirus mozaiki kalafiorowej).

W niektórych przypadkach może nie być potrzebna modyfikacja sekwencji kodujących ORF i sekwencji sąsiadujących. Wystarczy wyizolować fragment zawierający żądaną ORF i wbudować ją w dół od promotora roślinnego. Przykładowo, Gaffiiey i wsp. (Science, 261, 754-756 /1993/) dokonał z powodzeniem ekspresji genu nahG z Pseudomonas w roślinach transgenicznych pod kontrolą promotora CaMV 35S i terminatora CaMV tml bez modyfikacji sekwencji kodującej, z przyłączonym w dalszym ciągu genem z Pseudomonas o długości 56 par zasad w górę od ATG i z sekwencją o długości 165 par zasad w dół od kodonu STOP, ciągle przyłączonymi do ORF nahG. Korzystnie, powinno się pozostawiać jak najmniejszą sąsiadującą sekwencję z mikroorganizmu w górę od ATG i w dół od kodonu STOP. W praktyce, taka konstrukcja będzie zależała od dostępności miejsc restrykcyjnych.

182 136

W innych przypadkach, ekspresja genów pochodzących z mikroorganizmów może stwarzać trudności. Trudności te są dokładnie poznane w technice a zwłaszcza są one wspólne dla genów pochodzących z niektórych źródeł, takich jak Bacillus. Trudności te mogą występować również w przypadku genów biosyntezy APS, dlatego można dokonać modyfikacji tych genów technikami znanymi w tej dziedzinie. Mogą wystąpić następujące trudności:

(1) Preferencje użycia kodonów. Preferencje użycia kodonów w roślinach różnią się od preferencji użycia kodonów w niektórych mikroorganizmach. Porównanie użycia kodonów w klonowanej ORF pochodzącej z mikroorganizmu z użyciem kodonów w genach roślinnych (a szczególnie w genach z rośliny docelowej) umożliwi identyfikację w obrębie ORF kodonów, które korzystnie powinny być zmienione. Typowo, ewolucja roślin poszła w kierunku silnej preferencji nukleotydów C i G w trzeciej pozycji zasad w roślinach jednoliściennych podczas gdy rośliny dwuliścienne często stosują w tej pozycji nukleotydy A lub T. Przez modyfikację genu przez wprowadzenie korzystnego użycia kodonów dla konkretnych, docelowych gatunków transgenicznych można będzie pokonać wiele kłopotów opisanych poniżej dla zawartości GC/AT i nieuprawnionego cięcia i składania.

(2) Zawartość GC/AT. W genach roślinnych zawartość GC wynosi na ogół ponad 35%. Sekwencje ORF, które są bogate w nukleotydy A i T mogą powodować szereg problemów w roślinach. Po pierwsze, sądzi się, że motywy ATTTA powodują destabilizację sygnałów a znajdują się na końcu 3' wielu krótko żyjących mRNA. Po drugie, przypuszcza się, że występowanie sygnałów poliadenylacji takich jak AATAAA w nieodpowiednich pozycjach w tym sygnale powoduje przedwczesne skrócenie transkrypcji. Ponadto, rośliny jednoliścienne mogą rozpoznawać sekwencje bogate w AT jako miejsca cięcia i składania (patrz niżej).

(3) Sekwencje sąsiadujące z kodonem inicjującym metioniny. Rośliny różnią się od mikroorganizmów tym, że ich sygnały nie posiadają zdefiniowanego miejsca wiązania z rybosomem. Przyjmuje się raczej, że rybosomy przyłączają się do końca 5' sygnału i poszukują pierwszego dostępnego ATG, od którego zaczyna się translacja. Niezależnie od tego, przyjmuje się, że istnieje preferencja dla niektórych nukleotydów sąsiadujących z ATG i że można zwiększyć ekspresję genów pochodzących z mikroorganizmów przez włączenie przy ATG inicjatora translacji eukariotycznej sekwencji consensus. Firma Clontech w katalogu z 1993/1994 roku (str. 210) zaleca sekwencję GTCGACCATGGTC (SEQ ID NR 7) jako inicjatora translacji sekwencji consensus do ekspresji genu uidA E. coli w roślinach. Ponadto, Joshi (NAR 15, 6643-6653 /1987/) porównał wiele sekwencji roślinnych sąsiadujących z ATG i zaleca consensus TAAACAATGGCT (SEQ ID NR8.). W przypadkach, kiedy występują trudności w ekspresji ORF pochodzących z mikroorganizmów w roślinach, włączenie jednej z tych sekwencji do inicjującego ATG może poprawić translację. W takich przypadkach ostatnie trzy nukleotydy z sekwencji consensus mogą być nieodpowiednie do włączenia do modyfikowanej sekwencji z powodu modyfikacji drugiej reszty AA. Korzystne sekwencje sąsiadujące z kodonem inicjującym metioniny mogą być różne w różnych gatunkach roślin. Przegląd 14 genów z kukurydzy w bazie danych GenBank dało następujące wyniki:

Pozycja przed kodonem inicjacji ATG w 14 genach kukurydzy

	-10	-9	-8	-7	-6	-5	-4	-3	-2	-1
c	' 3	8	4	6	2	.5	6	0	10	7
T	3	0	3	4	3	2	1	1	1	0
A	2	3	1	4	3	2	3	7	2	3
G	6	3	6	0	6	5	4	6	1	5

Taką analizę można przeprowadzić dla żądanego gatunku rośliny, do którego mają być wprowadzone geny APS i modyfikować sekwencję sąsiadującą z ATG wprowadzając korzystne nukleotydy.

182 136 (4) Usuwanie miejsc nieuprawnionego cięcia i składania

Geny klonowane ze źródeł nieroślinnych i nie dostosowywane do ekspresji w roślinach mogą również zawierać motywy, które mogą być rozpoznawane w roślinach jako miejsca 5' lub 3' cięcia i składania i mogąbyć rozszczepiane, generując sygnały skrócone lub z delecjami.

Techniki mody fikaj i sekwencji kodujących i sekwencji sąsiadujących są dobrze znane. W przypadkach, kiedy początkowa ekspresja bakteryjnego ORF jest niska i opisane powyżej zmiany w sekwencji wydają się celowe, można skonstruować geny syntetyczne, postępując w znany sposób. Są one przykładowo opisane w publikacjach patentów europejskich EP 0 385.962 (Monsanto), EP 0359.472 (Lubrizol) i w publikacji zgłoszeniowej PCT, WO 93/07278 (Ciba-Geigy). W większości przypadków korzystne jest śledzenie ekspresji konstrukcji genowych stosując protokoły badań pośrednich (które są powszechnie znane) przed ich przeniesieniem do transgenicznych roślin.

Przykład XXXV. Konstruowanie wektorów do transformacji roślin Dostępnych jest wiele wektorów do transformacji roślin i geny według wynalazku mogąbyć użyte razem z każdym z takich wektorów. Wybór wektora będzie zależał od preferowanej techniki transformacji i docelowego gatunku, który się zmierza transformować. Dla niektórych docelowych gatunków mogąbyć korzystne różne antybiotyczne lub herbicydowe markery selekcyjne. Do markerów selekcyjnych rutynowo stosowanych w transformacji należą gen nptll, który nadaj e oporność na kanamycynę i pokrewne antybiotyki (Messing i Vierra, Gene 19, 259-268 /1992/; Bevan i wsp., Naturę 304, 184-187 /1983/), gen bar, nadający oporność na herbicyd, fosfinotrycynę (White i wsp., Nuci. Acids Res. 18, 1062 /1990/, Spencer i wsp., Theor. Appl. Genet. 79, 625-631 /1990/), gen hph, nadający oporność na antybiotyk, higromycynę (Blochinger i Diggelmann, Mol. Celi Biol. 4, 2929-2931) oraz gen dhfr, nadający oporność na metotreksat (Bourouis i wsp., EMBO J. 2(7), 1099-1104 /1983/).

(1) Konstruowanie wektorów odpowiednich do transformowania z użyciem Agrobacterium.

Dostępnych jest wiele wektorów do transformowania z użyciem A-grobacterium tumefaciens. Na ogół zawierają one co najmniej jedną brzeżną sekwencję T-DNA oraz wektory takie jak pBIN19 (Bevan, Nuci. Acidss Res./1984/). Poniżej jest opisane konstruowanie dwu typowych wektorów.

Konstruowanie pCIB200 i pCIB2001

Podwójne (binarne) wektory pCIB200 i pCIB2001 stosowano do konstruowania rekombinantowych wektorów do użycia z Agobacterium skonstruowano w poniższy sposób. Plazmid pTJS75kan przygotowano przez trawienie Narl plazmidu pTJS75 (Schmidhauser i Helinski, J. Bacteriol. 164, 446-455 /1985/), pozwalając na wycięcie genu oporności na tetracyklinę, następnie dokonano insercji fragmentu Accl pUC4K niosącego NPTII (Messing i Vierra, Gene, 18, 259-268 /1982/; Bevan i wsp. Naturę 304, 184-187 /1983/; McBride i wsp., Plant Molecular Biology 14, 266-276 /1990/). Łączniki Xhol ligowano do fragmentu EcoRV z pCIB7, który zawiera ramiona prawe i lewe T-DNA, podlegający selekcji w roślinach chimerowy gen nos/nptll i poliłącznik pUC (Rothstein i wsp., Gene 53, 153-161 /1987/) po czym trawiony przez Xhol fragment klonowano do trawionego Sali pTJS75kan otrzymując pCIB200 (patrz również publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego EP 0 332.104, przykład 19). Plazmid pCIB200 zawiera następujące unikalne poliłącznikowe miejsca restrykcyjne: EcoRI, Sstl, KpnI, Bglll, Xbal i Sali. PCI2001 jest pochodną pCIB200, który otrzymano przez insercję do poliłącznika dodatkowych miejsc restrykcyjnych. Unikalnymi miejscami restrykcyjnymi w poliłączniku pCIB2001 były EcoRI, Sstl, KpnI, Bglll, Xbal, Sali, Mlul, Bell, AvrII, Apal, Hpal i Stul. Poza tymi unikalnymi miejscami restrykcyjnymi pCIB2001 ma również roślinny i bakteryjny gen oporności na kanamycynę, ramiona lewe i prawe T-DNA do transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, pochodzącą z RK2 funkcję trfA do mobilizacji między E. Coli i innych gospodarzy oraz funkcje OriT i OriV, również z RK2. Poliłącznik pCIB2001 jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swe własne sygnały regulacyjne.

182 136

Konstruowanie pCIBlO i jego pochodnych selekcjonowanych na higromycynie

Podwójny wektor pCIBlO zawiera gen kodujący oporność na kanamycynę do selekcji w roślinach, sekwencje lewego i prawego ramienia T-DNA oraz sekwencje z plazmidu o szerokim zakresie gospodarzy pRK252, co pozwala na jego replikację zarówno w E. coli jak i w Agrobacterium. Jego konstrukcja jest opisana przez Rothstein'a i wsp. (Gene 53, 153-161 /1987/). Skonstruowano wiele pochodnych pCIBlO, które zawierają gen dla fosfotransferazy higromycynowej B opisany przez Gritz'a i wsp. (Gene, 25, 179-188 /1983/). Te pochodne umożliwiają selekcję transgenicznych komórek tylko na higromycynie (pCIB743) albo higromycynie i kanamycynie (pCIB715 i pCIB717).

(2) Konstruowanie wektorów odpowiednich do transformacji bez użycia Agrobacterium

Transformowanie bez użycia Agrobacterium tumefaciens omija wymaganie obecności sekwencji T-DNA w wybranym wektorze transformacyjnym, a zatem, wektory nie posiadające tej sekwencji mogą być stosowane poza wektorami opisanymi powyżej, zawierającymi sekwencje T-DNA. Do technik transformacji nie polegających na Agrobacterium należą transformowanie przez bombardowanie cząstkami, pobór protoplastu (np. za pomocą PEG i elektroporacji) i mikrowstrzykiwanie. Wybór wektora zależy głównie od preferowanego sposobu selekcji dla gatunków transformowanych. Poniżej jest opisane konstruowanie niektórych typowych wektorów.

Konstruowanie pCIB3064

PCIB3064 jest pochodzącym od pUC wektorem nadającym się do stosowania w technikach bezpośredniego przeniesienia genu w kombinacji z selekcją za pomocą herbicydu basta (albo fosfinotrycyny). Plazmid pCIB246 zawiera promotor CaMV 35S w fuzji operacyjnej z genem GUS z E. coli i terminator transkrypcji CaMV 35S. Jest on opisany w publikacji zgłoszenia patentowego PCT, WO 93/07278. Promotor 35S tego wektora zawiera dwie sekwencje 5' ATG miejsca startu. Te miejsca mutowano stosując standardowe techniki reakcji PCR w taki sposób, że usuwano ATG i generowano miejsca restrykcyjne Sspl i PvuII. Nowe miejsca restrykcyjne znajdowały się w odległości 96 i 37 par zasad od unikalnego miejsca Sali i 101 i 42 par zasad od rzeczywistego miejsca startu. Otrzymaną pochodną oznaczono kodem pCIB3025. Z tego plazmidu pCIB3025 wycięto gen GUS przez trawienie Sali i SacI, dodano w tępe końce i poddano powtórnej ligacji, uzyskując plazmid pCIB3060. Z uzyskanego z John Innes Centre, Norwich, plazmidu pJIT82 wycięto fragment Smal o długości 400 par zasad zawierający gen bar ze Streptomyces viridochromogenes i dokonano jego insercji do miejsca Hpal w pCIB3060 (Thompson i wsp. EMBO J, 6, 2519-2523 /1987/). Powstał plazmid pCIB3064, w którym gen bar znajdował się pod kontrolą promotora i terminatora CaMV 35S do selekcji z użyciem herbicydu, gen oporności na ampicylinę (do selekcji w E. coli) i poliłącznik z unikalnymi miejscami SphI, Pstl, Hindlll i BamHI. Ten wektor nadaje się do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swe własne sygnały regulacji.

Konstruowanie pSOG19 i pSOG35 pSOG35 jest wektorem transformacyjnym, w którym wykorzystuje się gen reduktazy dehydrofolianowej w E. coli (DHFR) jako marker selekcyjny nadający oporność na metotreksat. W reakcji PCR dokonano amplifikacji promotora 35S (około 800 par zasad), intronu 6 z genu Adh 1 z kukurydzy (około 550 par zasad) i niepodlegającej translacji sekwencji liderowej GUS (18 par zasad) z pSOGlO. Fragment o długości 250 par zasad, obejmujący gen reduktazy dehydrofolianowej typu II z E. coli również amplifikowano w reakcji PCR i te dwa fragmenty PCR zespolono z fragmentem Sacl-Pstl z pBI221 (Clontech), który zawiera szkielet wektora pUC19 i terminator syntazy nopalinowej. Po zmontowaniu tych fragmentów powstał pSOG19, zawierający promotor 35S w fuzji z sekwencją intronu 6, sekwencją liderową GUS, genem DHFR i terminatorem syntazy nopalinowej. Po zastąpieniu sekwencji liderowej GUS w SOG19 sekwencją liderową z wirusa mozaiki niedobarwliwej kukurydzy (MCMVj powstał wektor pSOG35. Wektory SOG19 i pSOG35 niosą gen pUC oporności na ampicylinę i zawierają miejsca Hindlll, SphI, Pstl i EcoRI dostępne dla klonowania obcych sekwencji.

182 136

Przykład XXXVI. Wymagania dla konstrukcji roślinnych kaset ekspresyjnych

Sekwencje genów przeznaczone do ekspresji w transgenicznych roślinach montuje się przed tym w kasetach ekspresyjnych za odpowiednim promotorem i w górę od odpowiedniego terminatora transkrypcji. Takie kasety ekspresyjne można łatwo przenosić do roślinnych wektorów transformacyjnych, opisanych w przykładach II-VI.

Wybór promotora

Na wybór promotora stosowanego w kasetach ekspresyjnych będą wpływać przestrzenne i czasowe prawa ekspresji genu transgenicznego (transgenu) w transgenicznej roślinie. Wybrane promotory będą wzbudzały ekspresję transgenów w określonych typach komórek (takich jak komórki tkanki okrywającej liści, komórek mezofilowych, komórek kory korzeni) albo w określonych tkankach lub narządach (korzeniach, liściach lub kwiatach). Wybór ten będzie również zdeterminowany planowanym miejscem biosyntezy APS. Alternatywnie, wybrany promotor może wzbudzać ekspresję genu po indukcji światłem lub ekspresja ta może być wynikiem czasowej regulacji pochodzącej z promotora innego typu. W następnym rozwiązaniu alternatywnym, wybrany promotor może być regulowany chemicznie. Stwarza to możliwość indukowania pobudzenia promotora do syntezy APS tylko na żądanie i wywoływanego przez traktowanie induktorem chemicznym.

Terminatory transkrypcji

Wiele terminantorów transkrypcji jest dostępnych do stosowania w kasetach ekspresyjnych. Sąone odpowiedzialne za zakańczanie transkrypcji za genem transgenicznym i za jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednimi terminatorami transkrypcji są te, które funkcjonują w roślinach i zawierają terminator CaMV 35S, terminator tml, terminator syntazy nopalinowej i terminator rbcS E9 z grochu. Można je stosować do roślin jednoliściennych jak i dwuliściennych.

Sekwencje wzmacniające lub regulujące ekspresję.

Wiadomo, że wiele sekwencji wzmacnia ekspresję genu znajdującego się w tej samej jednostce transkrypcyjnej i te sekwencje mogąbyć użyte w połączeniu z genami według wynalazku w celu zwiększenia ich ekspresji w transgenicznych roślinach.

Wiele sekwencji intronowych wzmacnia ekspresję, zwłaszcza w roślinach jednoliściennych. Przykładowo, okazało się, że gen Adhl z kukurydzy znacznie zwiększa ekspresję genu typu dzikiego pod jego rodzimym promotorem po wprowadzeniu do komórek kukurydzy. Szczególnie skuteczny okazał się intron 1. Wzmacniał on ekspresję w konstrukcjach ftizyjnych z genem acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis i wsp., Genes Develop. 1, 1183-1200 /1987/). W niektórych układach eksprerymentalnych intron z genu bronze 1 z kukurydzy wywiera podobne działanie wzmacniające ekspresję (Callis i wsp., jak wyżej). Sekwencje intronowe rutynowo wprowadza się do transformacyjnych wektorów roślinnych, na ogół w obrębie lidera nie podlegającego translacji.

Okazało się również, że wiele liderowych sekwencji nie podlegających translacji pochodzących z wirusów wzmacnia ekspresję i są one szczególnie skuteczne w komórkach roślin dwuliściennych. Szczególnie skuteczne we wzmacnianiu ekspresji okazały się sekwencje liderowe z wirusa mozaiki tytoniowej (TMV, „sekwencja Ω „), z wirusa mozaiki niedobarwliwej kukurydzy (MCMV) i z wirusa mozaiki lucerny (AMV) (Gallie i wsp., Nuci. Acids Res. 15, 8693-8711 /1987/; Skuzeski i wsp., Plant Molec. Biol. 15, 65-79 /1990/).

Kierowanie produktu genowego do celu w komórce

W roślinach istnieją różne mechanizmy kierowania do celu produktów genowych. Sekwencje kontrolujące funkcjonowanie tych mechanizmów zostały dokładnie scharakteryzowane. Przykładowo, kierowanie produktów genowych do chloroplastu jest kontrolowane przez sekwencję sygnałową znajdującą się na końcu aminowych różnych białek. Sekwencja ta jest rozszczepiana podczas importu chloroplastu prowadzącego do dojrzałego białka (np. Comai i wsp., J. Biol. Chem. 263, 15104-15109 /1988/). Takie sekwencje sygnałowe można poddawać fuzji z heterologicznymi produktami genowymi w celu wpływu na import produktów heterologicznych dla chloroplastu (van den Broeck i wsp., Naturę 313, 358-363 /1985/). DNA

182 136 kodujące odpowiednie sekwencje sygnałowe można izolować z końca 5' cDNA kodujących białko RUBISCO, białko CAB, enzym syntazy EPSP, białko GS2 i wiele innych białek zlokalizowanych w chloroplaście. .

Inne produkty genowe są kierowane do innych organelli, takich jak mitochondrion i peroksyzom (np. Unger i wsp., Plant Molec. Biol. 13, 411-418 /1989/). Można również dokonać manipulacji cDNA kodujących te produkty, co prowadzi do kierowania heterologicznych produktów genowych do tych organelli. Przykładami takich sekwencji są kodowane w jądrze ATP-azy i specyficzne izoformy aminotransferaz asparaginowych dla mitochondrii. Kierowanie do komórkowych ciał białkowych opisał Rogers i wsp. ((Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 82, 6512-6516/1985/).

Scharakteryzowano ponadto sekwencje kierujące produkty genowe do innych przedziałów komórki. Sekwencje końców aminowych są odpowiedzialne za kierowanie do ER, apoplastu i za wydzielanie poza komórkę z komórek aleuronowych (Koehler i Ho, Plant Celi 2, 769-783 /1990/). Poza tym, sekwencje aminoterminalne w połączeniu z sekwencjami końca karboksylowego są odpowiedzialne za kierowanie produktów genowych do wakuoli (Shinshi i wsp., Plant Molec. Biol. 14, 357-368 /1990).

Przez fuzję odpowiednich sekwencji kierujących opisanych powyżej z żądanymi sekwencjami transgenu, możliwe jest skierowanie tego produktu transgenu do każdej organelli lub przedziału komórkowego. W celu skierowania do chloroplastu dokonuje się fuzji sekwencji sygnałowej chloroplastu z genu RUBISCO, z genu CAB, z genu syntazy EPSP albo z genu GS2 w zgodnej fazie z aminoterminalnym ATG tego transgenu. Wybrana sekwencja sygnałowa powinna obejmować znane miejsce rozszczepienia a przy konstruowaniu produktu fuzyjnego należy mieć na uwadze wszystkie aminokwasy pozostające po rozszczepieniu, które są potrzebne do tego rozszczepienia. W niektórych przypadkach wymaganie to może być spełnione przez dodanie niewielkiej liczby aminokwasów pomiędzy miejscem rozszczepienia a ATG transgenu albo alternatywnie, przez zamianę niektórych aminokwasów w obrębie sekwencji transgenu. Fuzje skonstruowane do importu do chloroplastu można badać na wydajność wejścia do chloroplastu metodą translacji in vitro konstrukcji transkrybowanych in vitro i następnego umieszczania w chloroplaście in vitro stosując techniki opisane przez Bartletfa i wsp. w książce pod red. Edelman'a i wsp. „Methods in Chloroplast Molecular Biology”, Elsevier, str. 1081-1091 /1982/; Wasmann'a i wsp. (Mol. Gen. Genet. 205, 446-453 /1986/). Te techniki konstruowania są dobrze znane i nadają się do zastosowania zarówno w mitochondriach jak i w peroksyzomach. Wybór celu, który może być wymagany dla genów biosyntezy APS będzie zależał od lokalizacji w komórce prekursora potrzebnego jako punkt startu dla danego szlaku metabolicznego. Będzie to na ogół lokalizacja w cytosolu lub w chloroplastach, chociaż w niektórych przypadkach może to być lokalizacja w mitochondriach lub w peroksyzomach. Produkty genów biosyntezy APS nie będą na ogół wymagały kierowania do ER, apoplastu lub do wakuoli.

Opisane powyżej mechanizmy kierowania komórkowego można zastosować nie tylko w powiązaniu z ich rodzimymi promotorami lecz również w powiązaniu z promotorami heterologicznymi, tak, aby osiągnąć cel kierowania do określonego miejsca w komórce w warunkach regulacji transkrypcji promotora, który ma inny wzór w ekspresji niż promotor, z którego pochodzi sygnał kierowania na określony cel.

Przykład XXXVII. Przykłady konstruowania kasety ekspresyjnej

Ekspresja genów kodujących APS może być regulowana przez dowolny promotor, którego ekspresja jest możliwa w roślinach, niezależnie od pochodzenia tego promotora.

Taki dowolny promotor, podlegający ekspresji w roślinach występuje w połączeniu z dalszymi sekwencjami wymaganymi lub wybranymi do ekspresji genu APS. Do takich sekwencji należą (lecz nie ograniczają się do nich) terminatory transkrypcji, sekwencje obce zwiększające ekspresję (takie jak introny (np. intron 1 Adh), sekwencje wirusowe (np. ΤΜΥ-Ω) i sekwencje kierujące produkt genu do określonych organelli i przedziałów komórkowych.

182 136

Ekspresja konstytutywana: promotor CaMV 35S

Konstruowanie plazmidu pCGN1761 jest opisane w publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego EP 0 392.225 (przykład 23). Plazmid pCGN1761 w szkielecie typu pUC zawiera „podwójny” promotor 35S i terminator transkrypcji tml z unikalnym miejscem EcoRI między tym promotorem a terminatorem. Skonstruowano pochodną pCGN 1761, która posiada modyfikowany poliłącznik obejmujący miejsca Notl i Xhol oprócz istniejącego miejsca EcoRI. Pochodną tę oznaczono kodem pCGN1761ENX. PCGN 1761ΕΝΧ jest użyteczny do klonowania sekwencji cDNA lub sekwencji genów (łącznie z sekwencjami ORF pochodzącymi z mikroorganizmów) w obrębie poliłącznika, do celów ich ekspresji pod kontrolą promotora 35S w transgenicznych roślinach. Całą kasetę: promotor 35S - sekwencja genu - terminator tml w tej konstrukcji można wyciąć w miejscach 5' dla Hindlll, SphI, Sali i Xbal w stosunku do promotora i w miejscach 3' dla Xbal, BamHI i Bgll w stosunku do terminatora i przenieść do wektorów transformacyjnych takich jak opisanych w przykładzie XXXV. Ponadto, fragment podwójnego promotora 35S można usunąć przez wycięcie 5' enzymami Hindlll, SphI, Sali, Xbal lub Pstl i 3' w dowolnych miejscach restrykcyjnych poliłącznika (EcoRI, Notl lub Xhol) w celach wymiany na inny promotor.

Modyfikacja pCGN1761ENX przez optymizację miejsca inicjacji translacji

W każdej konstnikcji opisanej w tej sekcji można wprowadzać modyfikacje wokół miejsc klonowania przez wprowadzenie sekwencji, które mogą wzmagać translację. Jest to szczególnie użyteczne jeśli do roślinnych kaset ekspresyjnych wprowadza się geny pochodzące z mikroorganizmów, ponieważ te geny mogą nie zawierać sekwencji sąsiadujących z ich inicjującą metioniną co może być pomocne do inicjowania translacji w roślinach. W przypadkach, kiedy geny pochodzące z mikroorganizmów mają być klonowane w roślinnych kasetach ekspresyjnych w ich ATG, to dla optymizacji ekspresji może być przydatna modyfikacja miejsca ich insercji. Przykładowo jest opisana modyfikacja pCGN1761ENX polegająca na wprowadzeniu jednej z kilku optymizowanych sekwencji do ekspresji w roślinach (np. Joshi, NAR 15, 6643-6653 /1987/).

PCGN1761ENX rozszczepia się SphI, traktuje polimeraząT4 DNA i poddaje powtórnej ligacji, niszcząc miejsce SphI mieszczące się w kierunku 5' od podwójnego promotora 35S. Powstaje wektor pCGN1761ENX/Sph-. PCGN1761ENX/Sph- rozcina się EcoRJ i poddaje ligacji z traktowanym podwyższoną temperaturą adaptorem molekularnym o sekwencji:

5'-ATTTCTAAAGCATGCCGATCGG-3' (SEQ ID NR 9) /5'-AATTCCGATCGGCATGCTTTA-3' (SEQ ID NR 10). Powstaje wektor pCGNSENX, który zawiera kwasi-optymizowaną roślinną sekwencję inicjacji translacji TAAA-C sąsiadującą z ATG, która sama jest częścią miejsca SphI dogodnego do klonowania heterologicznych genów w ich inicjującej metioninie. W dół od miejsca SphI zachowane pozostająmiejsca EcoRI, Notl i Xhol.

Skonstruowano alternatywny wektor, w którym wykorzystano miejsce Ncol i inicjującym kodonie ATG. Ten wektor, oznaczony kodem pCGN1761NENX otrzymano przez inercję traktowanego podwyższoną temperaturą adaptora molekularnego sekwencji

5'-AATTCTAAACCATGGCGATCGG-3' (SEQ ID NR 11) /5'-AATTCCGATCGCCATGCTTTA-3' (SEQ ID NR 12) w miejscu EcoRI plazmidu pCGN1761ENX (SEQ. ID. NR 14 i 15). Tak więc, ten wektor zawiera kwasi-optymizowaną sekwencję TAAACC, sąsiadującą z inicjującym ATG w obrębie miejsca Ncol. Poniżej znajdują się miejsca EcoRI, Notl i Xhol. Przed tą manipulacją niszczy się jednak dwa miejsca Ncol w wektorze pCGN1761ENX (w pozycjach w górę od jednostki 5' promotora 35S) stosując techniki podobne do opisanych powyżej dla SphI albo alternatywnie, stosując reakcje PCR „do wnętrza na zewnątrz” (Innes i wsp., PCR Protocols: A guide to methods and appłications. Academic Press, Nowy Jork /1990/; patrz przykład 41). Tę manipulację śledzi się obserwując jakikolwiek możliwy niekorzystny wpływ na ekspresję, dokonując insercji dowolnego roślinnego cDNA albo sekwencji genu reporterowego do miejsca klonowania i następnie wykonując rutynową analizę ekspresji w roślinach.

182 136

Ekspresja pod promotorem regulowanym chemicznie

W tej sekcji jest opisana wymiana podwójnego promotora 35S w pCGN1761ENX na dowolny promotor z wyboru. Jako przykład opisano regulowany chemicznie promotor PR-la. Ten promotor z wyboru wycina się korzystnie z jego źródła enzymami restrykcyjnymi ale może on być amplifikowany w reakcji PCR z użyciem primerów niosących odpowiednie terminalne miejsca restrykcyjne. Jeśli konieczna jest reakcja łańcuchowa polimeryzacji PCR, wówczas promotor należy resekwencjonować dla wykrycia błędów w amplifikacji po skolonowaniu amplifikowanego promotora w docelowym wektorze. Regulowany chemicznie promotor PR-la z tytoniu wycina się z plazmidu pCIB1004 (patrz opis patentowy europejski 0 332.104, przykład 21 do konstruowania) i przenosi się do plazmidu pCGN1761ENX. Plazmid pCIB1004 przecina się Ncol i do powstałego nawisu 3' linearyzowanego fragmentu wprowadza się tępe końce przez traktowanie polimerazą T4 DNA. Ten fragment przecina się enzymem Hindlll i uzyskany fragmenty zawierający promotor PR-la oczyszcza się w żelu i klonuje do pCGN1761ENX, z którego uprzednio usunięto podwójny promotor 35S. Dokonuje się tego przez cięcie Xhol, wprowadzenie tępych końców polimerazą T4 DNA, cięcie Hindlll i wyizolowanie większego fragmentu zawierającego wektor-terminator, do którego klonuje się fragment promotora pCIB1004. Otrzymuje się pochodną pCGN 1761ΕΝΧ z promotorem PR-la i z terminatorem tml oraz z wbudowanym między nimi poliłącznikiem z unikalnymi miejscami EcoRI i Notl. Do tego wektora można wprowadzić wybrane geny APS i produkty fuzji (np. promotor - gen - terminator) można następnie przenieść do dowolnego, wybranego wektora transformacyjnego, łącznie z tymi, które są opisane w niniejszym zgłoszeniu.

Ekspresja konstytutywna: promotor aktyny

Wiadomo, że szereg izoform aktyny jest wytwarzanych w większości typów komórek, a więc, promotor aktyny stanowi dobry wybór dla promotora konstytutywnego. Konkretnie, sklonowano i scharakteryzowano promotor z genu Actl z ryżu (McEIroy i wsp., Plant Celi 2, 163-171 /1990/). Fragment 1.3 kb tego promotora zawiera wszystkie elementy regulacyjne potrzebne do ekspresji w protoplastach ryżu. Ponadto, wiele wektorów ekspresyjnych opartych na promotorze Actl skonstruowano specjalnie do użycia w roślinach jednoliściennych (McEIroy i wsp., Mol. Gen. Genet. 231, 150-160 /1991/). Wbudowane są w nie Actl-intron 1, Adhl 5' sekwencja flankująca i Adhl-intron 1 (z genu dehydrogenazy alkoholowej kukurydzy) oraz sekwencja z promotora CaMV 35S. Wektory wykazujące najwyższy poziom ekspresji okazały się fuzjami 35S i intronu Actl albo Actl 5'-sekwencji flankującej i intronu Actl. Optymizacja sekwencji wokół inicjującego kodonu ATG (w genie reporterowym GUS) również wzmaga ekspresję. Promotorowe kasety ekspresyjne opisane przez McEIro/a i wsp. Mol. Gen. Genet. 231, 150-160 /1991) można łatwo modyfikować do celów ekspresji genów biosyntezy APS i są one szczególnie użyteczne do użycia w roślinach jednoliściennych. Przykładowo, z konstrukcji McEIro/a można usunąć fragmenty zawierające promotor i użyć je do wymiany podwójnego promotora 35S w pCGN1761ENX, który staje się wówczas dostępny do insercji sekwencji określonych genów. Tak skonstruowane geny fuzyjne można następnie przenieść do odpowiednich wektorów transformacyjnych. W innej publikacji doniesiono, że promotor Actl z ryżu z jego pierwszym intronem daje wysoki poziom ekspresji w hodowlach komórek jęczmienia (Chibbar i wsp., Plant Celi Rep. 12, 506-509 /1993).

Ekspresja konstytutywna: promotor ubikwityny

Ubikwityna jest kolejnym produktem genowym, o którym wiadomo, że gromadzi się w wielu typach komórek a jej promotor był klonowany z wielu gatunków w celu użycia w roślinach transgenicznych, np. w słoneczniku (Binet i wsp. Plant Science 79, 87-94 /1991/, kukurydzy (Christensen i wsp., Plant Molec. Biol. 12, 619-632 /1989/). Prowadzono badania rozwojowe z promotorem ubikwityny kukurydzy w układach transgenicznych jednoliściennych. Jego sekwencja i wektory skonstruowane od transformacji roślin jednoliściennych są ujawnione w publikacji patentu europejskiego EP 0341.926 (Lubrizol). Ponadto, Taylor i wsp. (Plant Celi Rep. 12, 491-495 /1993/ opisał wektor (pAHC25), który zawiera promotor ubikwityny kukurydzy i pierwszy intron i jest wysoce aktywny w zawiesinach komórek wielu

182 136 roślin jednoliściennych po jego wprowadzeniu technika bombardowania mikrowstrzyknięciami. Promotor ubikwityny jest wyraźnie użyteczny do ekspresji genów biosyntezy APS w transgenicznych roślinach, zwłaszcza w jednoliściennych. Dogodnymi wektorami są pochodne pAHC25 lub dowolne wektory transformacyjne opisane w tym zgłoszeniu, modyfikowane przez wprowadzenie odpowiedniego promotora ubikwityny i/lub sekwencji intronowych.

Ekspresja specyficzna dla korzeni

Korzystnym wzorem ekspresji dla genów APS jest ich ekspresja w korzeniach. Ekspresja w korzeniach jest szczególnie potrzebna do zwalczania żyjących w glebie fitopatogenów takich jak Rhizoctonia i Pythium. Ekspresja APS tylko w tkance korzeni mogłaby mięć zaletę niszczenia fitopatogenów atakujących korzenie bez towarzyszącego gromadzenia się APS w tkance liści, kwiatów i w nasionach. Dogodnym promotorem jest promotor opisany przez Framonda (FEBS 290, 103-106 /1991/) oraz w publikacji patentu europejskiego EP 0 452.269 (Ciba-Geigy). Ten promotor przenosi się do odpowiedniego wektora, takiego jak pCGN1761ENX do insercji odpowiedniego genu APS i następnego przeniesienia całej kasety: promotor-gen-terminator do żądanego wektora transformacyjnego.

Promotory indukowane uszkodzeniem

Promotory indukowane uszkodzeniem są szczególnie przydatne do ekspresji genów biosyntezy APS ponieważ są one aktywne nie tylko w miejscu uszkodzenia lecz również w miejscach infekcji fitopatogenem. Opisano wiele takich promotorów (np. Xu i wsp. Plant Molec. Biol. 22, 573-588 /1993/; Logemann i wsp., Plant Celi 1, 151-158 /1989/; Rohrmeier i Lehle, Plant Molec. Biol. 22, 783-792 /1993/, Firek i wsp., Plant Molec. Biol. 22, 129-142 /1993/, Warner i wsp., Plant J. 3, 191-201 /1993/). Wszystkie te promotory nadają się do ekspresji genów biosentezy pirolnitryny, sorafenu oraz innych APS.

Logemann i wsp. (jak wyżej) opisali sekwencje 5' w górę od genu wun 1 dwuliściennej rośliny, ziemniaka. Xu i wsp. (jak wyżej) wykazali, że indukowany uszkodzeniem promotor pin2 z dwuliściennego ziemniaka jest aktywny w jednoliściennym ryżu. Ponadto, Rohrmeier i Lehle (jak wyżej) opisali klonowanie cDNA Wipl kukurydzy, który jest indukowany z uszkodzeniem i może być użyty do izolacji rodzimego promotora z wykorzystaniem standardowych technik. Podobnie, Firek i wsp. (jak wyżej) i Warner i wsp. (jak wyżej) opisali indukowany uszkodzeniem gen z jednoliściennej rośliny Aspargus officinalis, którego ekspresja zachodzi w miejscach uszkodzenia i inwazji patogenu. Stosując znane techniki klonowania, te promotory można przenosić do odpowiednich wektorów, dokonać fuzji z genami biosyntezy APS i zastosować do ekspresji tych genów w miejscach infekcji fitopatogenu.

Ekspresja z preferencją wiązki rdzeniowej

W publikacji zgłoszenia patentowego PCT, WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisana jest izolacja genu trpA kukurydzy, którego ekspresja przebiega preferencyjnie w komórkach wiązki rdzeniowej. Przedstawiona jest tam sekwencja genu i promotor, rozciągające się w górę do nukleotydu -1726 od początku transkrypcji. Wykorzystując standardowe techniki biologii molekularnej ten promotor lub jego część można przenieść do wektora takiego jak pCGN1761, gdzie może on zastąpić promotor 35S i być użyty do pobudzenia ekspresji obcego genu w sposób preferowany w rdzeniu. W rzeczywistości, fragmenty zawierające promotor z preferencją wiązki rdzeniowej lub cześć tego promotora można przenieść do dowolnego wektora i modyfikować do celów stosowania w transgenicznych roślinach.

Ekspresja swoista dla pyłków kwiatowych

W publikacji zgłoszenia patentowego PCT, WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisana jest również izolacja genu zależnej od wapnia proteinokinazy (CDPK) kukurydzy, którego ekspresja zachodzi w komórkach pyłku. Sekwencja genu i promotor, rozciągają się w górę do 1400 par zasad od początku transkrypcji. Wykorzystując standardowe techniki biologii molekularnej ten promotor lub jego część można przenieść do wektora takiego jak pCGN 1761, gdzie może on zastąpić promotor 35S i być użyty do pobudzenia ekspresji obcego genu w sposób preferowany w pyłku. W rzeczywistości, fragmenty zawierające promotor z preferencją pyłku lub

182 136 część tego promotora można przenieść do dowolnego wektora i modyfikować do celów stosowania w transgenicznych roślinach.

Ekspresja swoista dla liści

Gen kukurydzy kodujący karboksylazę fosfoenolową (PEPC) jest opisany przez Hudspeth'a i Grula'ę (Plant Molec Biol. 12, 579-589 /1989/). Wykorzystując standardowe techniki biologii molekularnej, promotor dla tego genu można użyć do pobudzenia ekspresji każdego genu w sposób swoisty dla liści w roślinach transgenicznych.

Ekspresja z kierowaniem do chloroplastu

Chen i Jagendorf (J. Biol. Chem. 268, 2363-2367 /1993/) opisali użycie z powodzeniem przejściowego peptydu chloroplastu do importu heterologicznego transgenu. Użyty peptyd jest peptydem przejściowym z genu rbcS z Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen i wsp. Mol. Gen. Genet. 205, 193-200 /1986/). Stosując enzymy restrykcyjne Dral i SphI albo Tsp5091 i SphI, można wyciąć sekwencję DNA kodującą ten przejściowy peptyd z plazmidu prbcS-8B (Poulsen i wsp, jak wyżej) i przekształcać do użycia z dowolną konstrukcję opisaną powyżej. Fragment Dral-SphI rozciąga się od miejsca -58 względem inicjującego rbcS ATG do pierwszego aminokwasu dojrzałego peptydu włącznie (również metioniny), bezpośrednio za importowanym miejscem cięcia, podczas gdy fragment Tsp55091-SphI rozciąga się od miejsca -8 względem inicjującego rbcS ATG do pierwszego aminokwasu dojrzałego peptydu włącznie. Tak więc, fragment ten może być odpowiednio wbudowany do poliłącznika dowolnej, wybranej kasety ekspresyjnej dając fuzję transkrypcyjną z nie podlegającym translacji liderem wybranego promotora (np. 35S, PR-la, aktyny, ubikwiny, i podobnych), umożliwiając w ten sposób insercję żądanego genu APS w prawidłowej fuzji w dół od peptydu przejściowego. Konstrukcje tego typu są konstrukcjami rutynowymi. Przykładowo, tam, gdzie koniec Dral jest już uzupełniony tępymi końcami, miejsce 5' Tsp5091 można modyfikować polimerazą T4 DNA doprowadzając do tępych końców lub alternatywnie można poddawać ligacji z sekwencją łącznika lub adaptora, ułatwiając jego fuzję z wybranym promotorem. Miejsce 3' SphI można utrzymać jako takie albo alternatywnie można poddać ligacji z sekwencjami adaptora albo łącznika dla ułatwienia jego insercji do wybranego wektora w taki sposób aby udostępnić odpowiednie miejsca restrykcyjne do następnej insercji wybranego genu APS. W idealnym rozwiązaniu utrzymuje się ATG miejsca SphI, które zawiera pierwszy ATG wybranego genu ATG. Chen i Jagendorf (jak wyżej) opisali sekwencje consensus do idealnego rozszczepienia do importu do chloroplastu; w każdym przypadku w pierwszej pozycji dojrzałego białka korzystna była metionina. W następnych pozycjach istnieje więcej odchyleń i rodzaj aminokwasu nie jest już tak ważny. W każdym przypadku konstrukcje fuzyjne można badać na wydajność importu in vitro metodami opisanymi przez Bartletta i wsp. (w książce pod red. Edelmanna i wsp., „Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, str. 1081-1091 /1982/ i Wasmanna i wsp. (Mol. Gen. Genet. 205, 446-453 /1986/). W zasadzie, najlepszym podejściem może być generowanie fuzji, stosując wybrany gen APS bez modyfikacji na końcu aminowym, wprowadzając modyfikacje tylko wówczas, gdy jest oczywiste, że te fuzje nie są ze znaczącą wydajnością importowane do chloroplastu, a w tym przypadku można dokonywać modyfikacji zgodnie z ustalonym piśmiennictwem (Chen i Jagendorf, jak wyżej, Wasman i wsp., jak wyżej, Ko i Ko, J. Biol. Chem. 267,13910-13916 /1992/).

Korzystny wektor konstruuje się przez przeniesienie fragmentu Dral-SphI kodującego peptyd przejściowy z prbcS-8B do wektora klonującego pCGN1761ENX/Sph-. Ten plazmid rozszczepia się EcoRI i preparuje się tępe końce przez działanie polimerazą T4 DNA. Plazmid prb-cS-8B rozszczepia się SphI i poddaje ligacji z traktowanym podwyższoną temperaturą adaptorem molekularnym o sekwencji

5' -CCAGCTGGAATTCCG-3' (SEQ. ID NR. 13) /5' -CGGAATTCCAGCTGGCATG-3' (SEQ ID NR. 14).

Otrzymany produkt fosfory luje się na końcu 5' przez działanie kinazą T4. Następne rozszczepienie enzymem Dral uwalnia fragment kodujący peptyd przejściowy, który to fragment poddaje się ligacji z miejscami ex-EcoRI z tępymi końcami w modyfikowanym wektorze

182 136 opisanym powyżej. Klony zorientowane wobec końca'5' insertu sąsiadującego z końceńi 3' promotora 35S identyfikuje się przez sekwencjonowanie. Te klony zawierają fuzję DNA sekwencji liderowej 35S z sekwencją: promotor - peptyd przejściowy w prbcS-8A, rozciągającą się od miejsca -58 względem ATG rbcS do ATG dojrzałego białka i obejmując przy tej pozycji unikalne miejsce SphI i nowo powstałe miejsce EcoRI oraz istniejące miejsca Notl i Xhol z pCGN176ENX. Ten nowy wektor oznaczono kodem pCGN1761/CT. Sekwencje DNA przeniesiono do pCGN1761/CT w zgodnej fazie przez amplifikację techniką reakcji PCR i wprowadzenie miejsc SphI, NsphI albo Nlalll przy amplifikowanych ATG, które po cięciu odpowiednim enzymem restrykcyjnym poddano ligacji z przeciętym SphI pCGN1761/CT. Dla ułatwienia konstruowania, może być potrzebna wymiana kodonu dla drugiego aminokwasu w klonowanym genie, jednak w prawie wszystkich przypadkach zastosowanie reakcji PCR łącznie ze standardową sterowaną miejscem mutagenezą umożliwi konstruowanie dowolnej żądanej sekwencji wokół miejsca rozszczepienia i pierwszej metioniny dojrzałego białka.

Następny korzystny wektor skonstruowano przez wymianę podwójnego promotora 35S pCGN1761ENX na fragment BamHI-SphI z prbcS-8A, który zawiera regulowany światłem promotor rbcS-8A o pełnej długości, rozciągający się od nukleotydu -1038 (względem miejsca startu transkrypcji) do kodonu pierwszej metioniny dojrzałego białka. Modyfikowany pCGN1761 ze zniszczonym miejscem SphI rozszczepia się enzymami Pstl i EcoRI i traktuje polimerazą T4 DNA w celu wprowadzenia tępych końców. PrbcS-8A rozszczepia się za pomocą SphI i poddaje ligacji z traktowanym podwyższoną temperaturą adaptorem molekularnym o sekwencji opisanej powyżej. Uzyskany produkt fosforyluje się na końcu 5' przez traktowanie kinazą T4. Po następnym rozszczepieniu przez BamHI uwalnia się fragment zawierający promotor-peptyd przejściowy, który to fragment traktuje się polimerazą T4 DNA wprowadzając tępe końce w miejscu BamHI. Powstały fragment: promotor-peptyd przejściowy klonuje się do przygotowanego wektora pCGN1761ENX, otrzymując konstrukcję zawierającą promotor rbsS-8A i peptyd przejściowy z miejscem SphI zlokalizowanym w miejscu rozszczepienia do insercji heterologicznych genów. Poza tym, w dół od miejsca SphI znajdują się miejsca klonowania EcoRI (odtworzone), Notl i Xhol. Tę konstrukcje oznaczono kodem pCGN1761rbcS/CT.

W celu użycia innych sekwencji kodujących peptyd przejściowy z chloroplastu GS2 z innych źródeł (roślin jednoliściennych i dwuliściennych) i z innych genów, można przeprowadzić podobne manipulacje. Ponadto, można prowadzić podobne procedury w celu uzyskania kierowania do innych przedziałów wewnątrzkomórkowych takich jak mitochondria.

Przykład XXXVIII. Techniki izolowania nowych promotorów odpowiednich do ekspresji genów APS

Nowe promotory izoluje się stosując standardowe techniki biologii molekularnej, łącznie z technikami opisanymi poniżej. Po izolacji, dokonuje się ich fuzji z genami reporterowymi, takimi jak GUS albo LUC i analizuje się ich wzory ekspresji w roślinach transgenicznych (Jefferson i wsp., EMBO J. 6, 3901-3907 /1987/; Ow i wsp. Science 234, 856-859 /1986/). Promotory, które wykazują żądane wzory ekspresji poddaje się fuzji z genami APS do ekspresji w roślinach.

Subtraktywne klonowanie cDNA

Techniki subtraktywnego klonowania cDNA są użyteczne do generowania bibliotek cDNA wzbogaconych w konkretną populację mRNA (np. Hara i wsp., Nuci. Acids Res. 19, 1097-7104 /1991/)· Ostatnio opisano techniki pozwalające na konstruowanie bibliotek subtraktywnych z małej ilości tkanki (Sharma i wsp., Biotechniques 15, 610-612 /1993/). Te techniki są przydatne do wzbogacania sygnałów specyficznych dla tkanek, które mogą być dostępne jedynie w małych ilościach, takich jak tkanka bezpośrednio przylegająca do uszkodzenia albo miejsca zakażonego patogenem.

182 136

Różnicowy skrining standardowymi technikami plus/minus cDNA niosące faga λ pochodzące z różnych populacji RNA (to znaczy z korzeni względem całej rośliny, swoistych dla łodyg względem całej rośliny, punktów miejscowego zakażenia patogenem względem całej rośliny i podobnych) posiewano z niską gęstością i przenoszono do dwu zestawów filtrów hybrydyzacyjnych (przegląd różnych technik skriningu, patrz Calvet, Pediatr. Nephrol. 5, 751-757 /1991/). cDNA pochodzące z „wybranej” populacji RNA hybrydyzowano z pierwszym zestawem a cDNA pochodzące z RNA całych roślin hybrydyzowano z drugim zestawem filtrów. Łysinki, które hybrydyzowały z pierwszą sondą ale nie z drugą wybrano do dalszej oceny. Zebrano je i ich cDNA użyto do skriningu plam w blottingu typu Northern „wybranego” RNA względem RNA pochodzącego z różnych innych tkanek i źródeł. Klony wykazujące żądane wzory ekspresji użyto do klonowania sekwencji genów z biblioteki genomowej dla umożliwienia izolacji rodzimego promotora. Klonowane promotory o długości od 50Ó do 5000 par zasad poddano fuzji z genem reporterowym (np. GUS albo LUC) i z powrotem wprowadzono do transgenicznych roślin do celów analizy ekspresji.

Różnicowy skrining przez obrazowanie różnicowe

RNA izoluje się z różnych źródeł, to znaczy, z”wybranego” źródła i z całych roślin traktowanych jako kontrola i poddaje się analizie techniką obrazowania różnicowego opisanego przez Liang i Pardee (Science 257, 967-971 /1992/). Amplifikowane fragmenty, które pojawiają się w RNA „wybranym” ale nie w RNA kontrolnym oczyszcza się w żelu i stosuje jako sondy w blottingu typu Northern dla próbek innego RNA niż opisany powyżej. Fragmenty, które hybrydyzują selektywnie z żądanym RNA klonuje się i stosuje jako sondy do izolacji cDNA a także fragmentu genomowego DNA, z którego może być wyizolowany promotor. Wyizolowany promotor poddaje się fuzji z genem reporterowym GUS albo LUC, jak opisano powyżej, dla oznaczenia wzorów jego ekspresji w transgenicznych roślinach.

Izolacja promotora z użyciem technologii „pułapki promotora”

W celu identyfikacji w roślinie-gospodarzu sekwencji wzbudzających ekspresję w żądanych typach komórek albo z żądaną siłą można zastosować insercję genów reporterowych bez promotora do transgenicznych roślin. Warianty tej techniki są opisane przez Otta i Chua'ę (Mol. Gen. Genet. 223, 169-179 /1990/ i Kertbundita i wsp. (proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5212-5216 /1991/). W standardowych doświadczeniach transgenicznych tę samą zasadę można zastosować do identyfikacji elementów wzmacniacza w genomie gospodarza, gdzie ma się odbywać ekspresja konkretnego transgenu na szczególnie wysokich poziomach.

Przykład XXXIX. Transformacja roślin dwuliściennych

Techniki transformacji roślin dwuliściennych są dobrze znane i obejmują techniki oparte na Agrobacterium i techniki, w których nie stosuje się Agrobacterium.

Techniki bez udziału Agrobacterium oparte są na pobraniu egzogennego materiału genetycznego bezpośrednio przez protoplasty lub komórki. Można to przeprowadzić metodami z użyciem glikolu polietylenowego (PEG) albo elektroporacji, bombardowania cząstkami albo przez mikrowstrzyknięcie. Przykłady tych technik są opisane przez Paszkowskiego i wsp. (EMBO J. 3, 2717-2722 /1984/; Potrykus^ i wsp. (Mol. Gen. Genet. 199, 169-177 /1985/; Reich'a i wsp., (Biotechnology 4, 1001-1004 /1986/ i Klenia i wsp. (Naturę 327, 70-73 /1987/). W każdym przypadku z transformowanych komórek regenerowano całe rośliny, stosując znane, standardowe techniki.

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium jest korzystną techniką transformacji roślin dwuliściennych z powodu wysokiej wydajności i szerokiego zastosowania do wielu różnych gatunków. Do ważnych gatunków roślin uprawnych, które rutynowo transformuje się Agrobacterium należą: tytoń, pomidory, słonecznik, bawełna, rzepak oleisty, ziemniaki, soja, lucerna i topola [patrz publikacje opisów patentowych europejski EP 0 317.511 (bawełna), EP 0 249.432 (pomidory; Colegene), publikacja opisu patentowego światowego PCT, WO 87/07299 (kapusta; Colegene), publikacja opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki 4.795.855 (topola)]. Transformacja z udziałem Agrobacterium na ogół wymaga

182 136 przeniesienia wektora binarnego niosącego obcy, żądany DNA (np. CIB200 albo pCIB2001) do odpowiedniego szczepu Agrobacterium, co może zależeć od komplementu genów vir zawartych w szczepie gospodarza Agrobacterium, albo na współrezydującym plazmidzie Ti albo chromosomalnie [stosuje się np. szczep CIB542 dla pCIB2001 (Ukens i wsp. Plant Celi 5, 159-169 /1993/)]. Przeniesienia rekombinantowego wektora binarnego do Agrobacterium dokonuje się drogą kojarzenia trójrodzicielskiego, stosując E. coli zawierającą ten rekombinantowy wektor binarny, pomocniczy szczep E. coli, niosący plazmid taki jak pRK2013 i zdolny do kierowania tego rekombinantowego wektora binarnego do docelowego szczepu Agrobacterium. Alternatywnie, taki rekombinantowy wektor binarny można przenosić do Agrobacterium przez transformację DNA (Hófgen i Willmitzer, Nuci. Acids Res. 16, 9877 /1988/).

Transformacja docelowych gatunków roślin rekombinantowym Agrobacterium zazwyczaj wymaga wspólnej hodowli tego Agrobacterium z przeszczepami tych roślin, według procedury znanej w stanie techniki. Transformowaną tkankę regeneruje się na pożywce umożliwiającej selekcję roślin posiadających marker oporności na antybiotyk łub herbicyd obecny pomiędzy ramionami binarnego plazmidu T-DNA.

Przykład XL. Transformowanie roślin jednoliściennych

Transformacja większości gatunków roślin jednoliściennych stała się obecnie procedurą rutynową. Do korzystnych technik należą: bezpośrednie przeniesienie genu do protoplastu z użyciem PEG albo elektroporacji i bombardowanie tkanki kallusa cząsteczkami. Można prowadzić transformacje jednym rodzajem DNA lub wieloma rodzajami DNA (kotransformację). Ko-transformacja może mieć tę zaletę, że unika się konstruowania złożonego wektora i generuje się transgeniczne rośliny z niewiązanym loci dla żądanego genu i markera selekcyjnego, co umożliwia usunięcie markera selekcyjnego w następnych pokoleniach, co należy uznać za korzystne. Niedogodnością ko-transformacji jest poniżej 100% częstość integracji oddzielnych rodzajów DNA do genomu (Schocher i wsp., Biotechnology, 4, 1093-1096 /1986/).

W publikacjach opisów patentowych EP 0292.435 (Ciba-Geigy), EP 0 392.225 (CibaGeigy) i WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisane są techniki przygotowania kallusa i protoplastów z całkowicie wsobnej linii kukurydzy, transformacja protoplastów z użyciem PEG albo elektroporacja i regenerowanie roślinek kukurydzy z transformowanych protoplastów. Gordon-Kamm i wsp. (Plant Celi 2, 603-618 /1990/) i Fromm i wsp. (Biotechnology 8, 833-839 /1990/) opublikowali techniki transformowania linii A188-pochodnej kukurydzy przez bombardowanie cząstkami. Ponadto, w publikacji zgłoszeniowej WO 93/07278 (CibaGeigy) i w pracy Koziefa i wsp. ((Biotechnology 11, 194-200 /1993/) opisane są techniki transformacji całkowicie wsobnych linii kukurydzy przez bombardowanie cząstkami. W tej technice wykorzystuje się niedojrzałe zarodki kukurydzy o długości 1,5-2,5 mm, wycinane z kolby kukurydzy po 14-15 dniach od zapylenia i aparaturę PDS-lOOOHe Biolistics do bombardowania.

Transformacje ryżu można również prowadzić technikami bezpośredniego przeniesienia genu, z użyciem protoplastów albo bombardowania cząstkami. Transformacje za pośrednictwem protoplastu opisano dla odmian Japonica i Indica (Zhang i wsp. Plant Celi Rep.7, 379-384 /1988/; Shimamoto i wsp., Naturę 338, 274-277 /1989/; Datta i wsp., Biotechnology 8, 736-740 /1990/). Obydwie odmiany są również rutynowo transformowane z użyciem bombardowania cząstkami (Christou i wsp. Biotechnology 9, 967-962 /1991/).

W publikacji opisu patentowego EP 0332.581 (Ciba-Geigy) opisane są techniki generowania, transformowania i regemerowania protoplastów Pooideae. Pozwalają one na transformowanie Dactylis i pszenicy. Transformację pszenicy opisał ponadto Vasil i wsp. (Biotechnology 10, 667-674 /1992/) stosują bombardowanie cząstkami komórek typu C długotrwałego, zdolnego do regeneracji kallusa oraz Vasil i wsp. (Biotechnology 11, 1553-1558 /1993/ i Weeks i wsp. (Plant Physiol. 102, 1077-1084 /1993/) przez bombardowanie niedojrzałych zarodków i niedojrzałego kallusa pochodzącego z niedojrzałych zarodków. Korzystną techniką transformacji pszenicy pozostaje jednak transformacja przez bombardowanie niedojrzałych zarodków z hodowlą na pożywce o wysokiej zawartości sacharozy albo

182 136 wysokiej zawartości maltozy przed etapem dostarczania genu. Przed bombardowaniem, dowolną ilość zarodków (0,75 - 1 mm długości) umieszczono na płytkach na podłożu MS z dodatkiem 3% sacharozy (Murashiga i Skoog, Physiologia Plantarum 15, 473-497 /1962/) i 3 mg/litr 2,4-D do indukowania zarodków somatycznych i utrzymywano je w ciemności. W dniu bombardowania zarodki wyjmowano z pożywki indukcyjnej i umieszczano w płynie osmotycznym (np. w pożywce indukcyjnej z sacharozą lub maltozą dodaną w żądanym stężeniu, na ogół 15%). Zarodki pozostawiono do plazmolizy na 2-3 godziny i następnie bombardowano. Na ogół stosowano 20 zarodków na płytkę, ale nie jest to wartość krytyczna. Plazmid zawierający odpowiedni gen (taki jak pCIB3064 albo pSG35) strącano na cząstkach złota o wymiarach mikrometrycznych, stosując znane procedury. Każdą płytkę z zarodkami ostrzeliwano w urządzeniu DuPont Biolistics® z helem, stosując ciśnienie rażenia około 1000 funtów/cal² i ekran 80 mesh. Po bombardowaniu, zarodki umieszczano w ciemności na około 24 godziny, ciągle w płynie osmotycznym. Po 24 godzinach zarodki wyjmowano z płynu osmotycznego i powtórnie umieszczano w płynie indukującym, gdzie je przechowywano przez okres około miesiąca przed ich regeneracją. Po upływie około miesiąca, przeszczepy zarodków z rozwijającym się kallusem zarodkowym przenoszono do płynu regenerującego (MS + 1 mg/litr NAA, 5 mg/litr GA) z dodatkiem odpowiedniego środka selekcyjnego (10 mg/litr basta w przypadku pCIB3064 i 2 mg/litr metotreksatu w przypadku pSOG35). Po upływie około miesiąca, rozwinięte pędy przenoszono do większych sterylnych pojemników znanych pod nazwą „GA7”, które zawierały połowę stężenia MS, 2% sacharozy i to samo stężenie środka selekcyjnego.

W publikacji opisu patentowego WO 94/13822, włączonego jako odnośnik do niniejszego opisu, podane są sposoby transformacji pszenicy.

Przykład XLI. Ekspresja pirolnitryny w roślinach transgenicznych.

Zawartość nukleotydów GC we wszystkich czterech ORF dla pirolnitryny wynosi od 62 do 68%, a zatem, nie występują trudności w ich ekspresji w roślinach związane z zawartością AT. Może być jednak korzystna modyfikacja tych genów w taki sposób, aby zawierały kodony preferowane w odpowiednim, docelowym gatunku rośliny. Można dokonywać opisanych poniżej funkcji dla każdego żądanego promotora z jednoczesną modyfikacją lub bez niej (np. w celu optymalizacji inicjacji translacji w roślinach albo dla zwiększenia ekspresji).

Ekspresja za promotorem 35S

Każdą z czterech ORF dla pirolnitryny przenoszono do plazmidu pBluescript KS II w celu dalszych manipulacji. Wykonano to prowadząc reakcje łańcuchowej polimeryzacji PCR z użyciem primerów homologicznych do każdego końca każdego genu i dodatkowo zawierających miejsce restrykcyjne ułatwiające przeniesienie zamplifikowanych fragmentów do wektora pBluescript. Dla ramki ORF1, primer aminoterminalny zawiera miejsce Sali a primer końca karboksylowego zawiera miejsce Notl. Podobnie, dla ramki ORF2, primer aminoterminalny zawiera miejsce Sali a primer końca karboksylowego zawiera miejsce Notl. Dla ramki ORF3, pirmer aminoterminalny zawiera miejsce Notl a primer końca karboksylowego zawiera miejsce Xhol. Podobnie, dla ramki ORF4, primer aminoterminalny zawiera miejsce Notl a primer końca karboksylowego zawiera miejsce Xhol. Następnie, amplifikowane fragmenty rozszczepiano odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (dobranymi tak, aby nie powodowały cięć wewnątrz ORF) i poddawano ligacji z plazmidem pBluescript, również uprzednio odpowiednio ciętym. Klonowanie poszczególnych ORF w pBluescript ułatwia późniejsze manipulacje. Destrukcję wewnętrznych miejsc restrykcyjnych, co jest potrzebne do dalszych konstrukcji, prowadzono metodą PCR „do wewnątrz - na zewnątrz” (Innes i wsp. PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press, New York /1990/). Poszukano unikalnych miejsc restrykcyjnych po każdej stronie miejsca przeznaczonego do destrukcji (idealnie w odległości od 100 do 500 par zasad od miejsca, które ma być zniszczone) i ustawiono dwie oddzielne reakcje amplifikacji. Jedną zaczynano od unikalnego miejsca po lewej stronie od miejsca przeznaczonego do zniszczenia i amplifikowano DNA w górę do tego miejsca, stosując oligonukleotyd obejmujący to miejsce i zawierający odpowiednią zmianę zasad. Druga

182 136 amplifikacja rozciągała się od miejsca przeznaczonego do destrukcji, w górę od miejsca unikalnego, na prawo od miejsca przeznaczonego do destrukcji. Oligonukleotyd obejmujący miejsce przeznaczone do destrukcji w tej drugiej reakcji ma wbudowaną tę samą zmianę zasad jak ten, który stosowano w pierwszej amplifikacji a w idealnym przypadku, ma wspólną zakładkę o długości od 10 do 25 nukleotydów z oligonukleotydem z pierwszej reakcji. Tak więc, produkty z obydwu reakcji mają wspólną zakładkę, która zawiera taką samą zmianę zasad w miejscu restrykcyjnym, odpowiadającą tej, jaką wytworzono w każdej amplifikacji. Po tych dwu amplifikacjach, amplifikowane produkty oczyszczano w żelu dla usunięcia czterech użytych primerów oligonukleotydowych, mieszano razem i reamplifikowano w reakcji PCR stosując te dwa primery zawierające unikalne miejsca restrykcyjne. W tej końcowej reakcji PCR, zakładka między tymi dwoma amplifikowanymi fragmentami daje sekwencję primera potrzebną do pierwszej rundy syntezy. Produkt tej reakcji rozciąga się od lewej strony unikalnego miejsca restrykcyjnego do prawej strony tego unikalnego miejsca restrykcyjnego i obejmuje modyfikowane miejsce restrykcyjne usytuowane wewnętrznie. Ten produkt można rozszczepić w miejscach unikalnych i wbudować do niemodyfikowanego genu w odpowiedniej lokalizacji, zastępując fragment typu dzikiego.

W celu uwolnienia ORF1 od pierwszego z jej dwóch wewnętrznych miejsc SphI, zaprojektowano oligonukleotydy obejmujące i homologiczne do miejsc Xmal i Espl. Oligonukleotyd Xmal użyto w reakcji PCR razem z oligonukleotydem obejmującym pierwsze z miejsc SphI i zawierającym sekwencję ...CCCCCICATGC... (niższa nić, SEQ ID NR. 15), a więc, wprowadzając zmianę zasad w miejscu SphI. W drugiej reakcji CPR wykorzystano oligonukleotyd obejmujący miejsce SphI (nić górna) i zawierający sekwencję ...GCATGAGGGGG... (SEQ ID NR. 16) i użyto go w kombinacji z oligonukleotydem obejmującym miejsce Espl. Te dwa produkty oczyszczano w żelu i amplifikowano przy użyciu oligonukleotydów obejmujących Xmal i Espl i otrzymany fragment rozszczepiano za pomocą Xmal 1 Espl i stosowano do wymiany natywnego fragmentu w klonie ORF1. Zgodnie z powyższym opisem, modyfikowanym miejscem SphI jest GCATGA i nie powoduje ono zmiany kodonu. Możliwe są inne zmiany w tym miejscu (np. wymiana drugiego nukleotydu na G, T albo A) bez wpływu na integralność aminokwasu.

Podobną strategię przyjęto dla zniszczenia drugiego miejsca SphI w ORFI. W tym przypadku, odpowiednim miejscem restrykcyjnym umiejscowionym po lewej stronie jest Espl a miejscem restrykcyjnym po prawej stronie jest miejsce Pstl, zlokalizowane blisko końca 3' genu albo alternatywnie, miejsce Sstl, które nie występuje w sekwencji ORF lecz w bezpośrednim sąsiedztwie, w poliłączniku pBluescript. W tym przypadku, odpowiedni jest taki nukleotyd, który obejmuje to miejsce albo alternatywnie, jeden z dostępnych pirmerów pBluescript do sekwencjonowania. To miejsce SphI modyfikuje się tak, aby zawierało sekwencję GAATGC albo GCATGT albo GAATGT. Każda z tych zmian niszczy to miejsce nie powodując wymiany kodonu.

Dla uwolnienia ORF2 od jej pojedynczego miejsca SphI stosowano podobną procedurę. Po lewej stronie wprowadzono miejsca restrykcyjne Pstl albo Mlul a miejsca restrykcyjne po prawej stronie, Sstl, wprowadzano wraz z poliłącznikiem pBluescript. W tym przypadku miejsce to zmieniano na GCTTGC, GCATGC albo GCTTGT. Pomimo tych zmian zachowana jest integralność aminokwasów.

ORF3 nie ma wewnętrznych miejsc SphI

W przypadku ORF4, odpowiednim miejscem restrykcyjnym po prawej stronie jest Pstl ale ramka ta nie zawiera odpowiedniego miejsca usytuowanego po lewej stronie od pojedyńczego miejsca SphI przeznaczonego do wymiany. Można zatem użyć miejsce restrykcyjne w poliłączniku pBluescript z takim samym skutkiem jak opisano powyżej. Miejsce SphI modyfikowano wymieniając je na GGATGC, GTATGC, GAATGC albo GCATGT i podobnie.

Usunięcie miejsc SphI z genów biosyntezy pirolnitryny w sposób opisany powyżej ułatwia ich przeniesienie do wektora pCGN1761SENX przez amplifikację z użyciem oligonukleotydowego primera aminoterminalnego, który wprowadza miejsce SphI przy ATG i primera

182 136 karboksyterminalnego, który wbudowuje miejsce restrykcyjne nie występujące w genie przeznaczonym do amplifikacji. Uzyskany amplifikowany fragment rozszczepia się za pomocą SphI i enzymu restrykcyjnego przecinającego sekwencję końca karboksylowego i klonuje się go do pCGN1761SENX. Odpowiednimi miejscami dla enzymów restrykcyjnych wprowadzanych do primera karboksyterminalnego są: Notl (dla wszystkich czterech ORF), Xhol (dla ORF3 i ORF4) oraz EcoRI (dla ORF4).

Biorąc pod uwagę wymaganie, że w pozycji 6 miejsca rozpoznawanego przez SphI musi się znajdować nukleotyd C, w niektórych przypadkach drugi kodon w ORF może wymagać wymiany tak, aby zaczynał się od nukleotydu C. Taka konstrukcja wiąże każdą ORF w jej kodonie ATG z miejscami SphI zoptymalizowanego translacyjnego wektora pCGN1761SENX wiązaniem operacyjnym z podwójnym promotorem 35S. Po zakończeniu tworzenia tej konstrukcji końcowe sekwencje genu i miejsca fuzji poddaje się sekwencjonowaniu dla upewnienia się, że nie wystąpiły niepożądane wymiany zasad.

Przez użycie aminoterminalnego primera oligonukleotydowego, który wprowadza miejsce Ncol zamiast miejsca SphI w kodonie ATG, można łatwo klonować ramki ORF 1-4 do zoptymalizowanego translacyjnego wektora pCGN1761NENX. Żadna z czterech ORF genu biosyntezy pirolnitryny nie zawiera miejsca Ncol, a więc, w tym przypadku nie jest potrzebna destrukcja wewnętrznych miejsc restrykcyjnych. Primery do końca karboksylowego tego genu projektuje się w sposób opisany powyżej a klonowanie prowadzi się w podobny sposób. Biorąc pod uwagę wymaganie, że w pozycji 6 miejsca rozpoznawanego przez Ncol musi się znajdować nukleotyd G, w niektórych przypadkach drugi kodon w ORF może wymagać wymiany tak, aby zaczynał się od nukleotydu G. Taka konstrukcja wiąże każdą ORF w jej kodonie ATG z miejscem Ncol wektora pCGN1761SENX wiązaniem operacyjnym z podwójnym promotorem 35S.

Kasety ekspresyjne odpowiednich wektorów, pochodnych pCGN1761, przenosi się do wektorów transformacyjnych. Tam, gdzie to możliwe, kasety ekspresyjne wielokrotne przenosi się do pojedyńczego wektora transformacyjnego aby zmniejszyć ilość transformacji w roślinie i krzyżówek między transformatorami, co może być potrzebne do otrzymania roślin, w których zachodzi ekspresja wszystkich czterech ORF i wytwarzanie pirolnitryny.

Ekspresja za promotorem 35S z kierowaniem do chloroplastu

ORF 1-4 pirolnitryny amplifikowane z użyciem oligonukleotydów niosących miejsce SphI w końcu aminowym klonowano do kierowanego do 35S-chloroplastu wektora pCGN1761/CT. Fuzji dokonywano do miejsca SphI zlokalizowanego w miejscu rozszczepienia peptydu przejściowego rbcS. Powstałe kasety ekspresyjne przenoszono do odpowiednich wektorów transformacyjnych (patrz wyżej) i używano do generowania roślin transgenicznych. Ponieważ prekursorem dla biosyntezy pirolinitryny jest tryptofan syntetyzowany w chloroplastach, może być korzystna ekspresja genów biosyntezy pirolnitryny w chloroplastach, co zapewnia bezpośrednie dostawy substratu. Rośliny transgeniczne, w których zachodzi ekspresja wszystkich tych czterech ORF będą kierować produkty wszystkich czterech genów do chloroplastów i syntetyzować pirolnitrynę w chloroplastach.

Ekspresja za rbcS z kierowaniem do chloroplastu

ORF 1-4 pirolnitryny amplifikowane z użyciem oligonukleotydów niosących miejsce SphI w końcu aminowym klonowano do kierowanego do rbcS-chloroplastu wektora pCGN1761rbcS/CT. Fuzji dokonywano do miejsca SphI zlokalizowanego w miejscu rozszczepienia peptydu przejściowego rbcS. Powstałe kasety ekspresyjne przenoszono do odpowiednich wektorów transformacyjnych (patrz wyżej) i używano do generowania roślin transgenicznych. Ponieważ prekursorem dla biosyntezy pirolnitryny jest tryptofan synteyzowany w chloroplastach, może być korzystna ekspresja genów biosyntezy pirolnitryny w chloroplastach, co zapewnia bezpośrednie dostawy substratu. Rośliny tmasgeniczne, w których zachodzi ekspresja wszystkich czterech ORF będą kierować produkty wszystkich czterech genów do chloroplastów i syntetyzować pirolnitrynę w chloroplastach. Ekspresja tych czterech ORF będzie jednak indukowana światłem.

182 136

Przykład XLII. Ekspresja sorafenu w roślinach transgenicznych

Klon p98/l zawiera całkowity gen ORF1 biosyntezy sorafenu, kodujący pięć biosyntetyczny ch modułów dla biosyntezy sorafenu. Częściowo zsekwencjonowana ORF2 zawiera trzy pozostałe moduły a ponadto, potrzebna do dalszej biosyntezy sorafenu metylaza sorafenowa jest zlokalizowana na tym samym operonie.

Ramkę ORF1 sorafenu przekształcano do celów ekspresji w transgenicznych roślinach w następujący sposób. Amplifikowano fragment DNA końca aminowego ORF1 w reakcji PCR, stosując p98/l jako matrycę. Primer 5' oligonukleotydowy obejmuje albo miejsce SphI albo miejsce Ncol przy ATG do klonowania w wektorach odpowiednio pCGN 1761 SENX i pCGNNENX. Ponadto, 5'-oligonukleotyd zawiera albo zasadę C (do klonowania przez SphI) albo zasadę G (do klonowania za pomocą Ncol) bezpośrednio za ATG, tak więc, wymienia się drugi aminokwas białka albo na histydynę albo na asparagin (można projektować inne aminokwasy w pozycji 2 zmieniając dodatkowo inne zasady w drugim kodonie). 3'-Oligonukleotyd do amplifikacji jest usytuowany przy pierwszym miejscu Bglll w ORF. Wprowadza on dystalne miejsce EcoRI umożliwiające cięcie amplifikowanego fragmentu enzymami SphI (albo Ncol) i EcoRI i następne klonowanie do pCGN1761SENX (lub pCGN1761NENX). Dla ułatwienia rozszczepienia amplifikowanych fragmentów, każdy oligonukleotyd zawiera kilka dodatkowych zasad na końcu 5'. Korzystnie, oligonukleotydy te, poza żądanymi miejscami restrykcyjnymi i dodatkowymi sekwencjami, wykazują homologię 12-30 par zasad z matrycą ORF1. W tej manipulacji następuje fuzja około 112 aminokwasów aminoterminalnych ORF1 przy jej ATG z miejscami SphI lub Ncol optymalizowanych wektorów translacyjnych pCGN1761SENX albo pCGN1761NENX w powiązaniu z promotorem 35S. Pozostała część ORF1 jest zawarta na trzech fragmentach Bglll, które można kolejno klonować do unikalnego miejsca Bglll w powyższych konstrukcjach. Wprowadzenie pierwszego z tych fragmentów nie sprawia trudności i wymaga jedynie rozszczepienia konstrukcji aminoterminalnej przez Bglll i następnego wprowadzenia pierwszego z tych fragmentów. W celu wprowadzenia dwu pozostałych fragmentów, potrzebne jest częściowe trawienie konstrukcji aminoterminalnej (ponieważ konstrukcja ta ma obecnie dodatkowe miejsce Bglll) i wprowadzenie następnego fragmentu Bglll. Tak więc, jest możliwe skonstruowanie wektora zawierającego całkowita ORF1 sorafenu, o wielkości około 25 kb w fuzji operacyjnej z promotorem 35S.

Alternatywnym podejściem do konstruowania ORF1 sorafenu przez fuzje kolejnych fragmentów restrykcyjnych jest amplifikacja całkowitej ORF w reakcji PCR. Bames i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216-2220 /1994/) opisali ostatnio techniki bardzo wiernej amplifikacji w reakcji PCR fragmentów dochodzących do 35 kb. Techniki te można zastosować do ORF1. Oligonukleotydy specyficzne dla każdego końca ORF1, z odpowiednimi dodanymi miejscami restrykcyjnymi użyto do amplifikacji całego regionu kodującego i następnie klonowano go do odpowiednich miejsce w odpowiednim wektorze, takim jak pCGN1761 albo jego pochodne. W zasadzie, po amplifikacji w reakcji PCR zaleca się sekwencjonowanie dla upewnienia się, że w amplifikowanej sekwencji nie zaszła żadna wymiana zasad. Alternatywnie, można przeprowadzić próby funkcyjne bezpośrednio w transgenicznych roślinach.

Jeszcze innym podejściem do ekspresji genów biosyntezy poliketydów (takich jak sorafen) w roślinach transgenicznych jest przygotowanie konstrukcji do ekspresji w roślinach, złożonej z jednostek transkrypcyjnych, zawierających mniej niż zwykle zestawów modułów i dostarczenie pozostałych modułów na innych jednostkach transkrypcyjnych. Przyjmuje się, że biosynteza antybiotyków poliketydowych, takich jak sorafen, jest procesem wymagającym kolejnej aktywności specyficznych modułów i że do syntezy specyficznej cząsteczki aktywności te powinny być dostarczone w określonej kolejności, a więc, jest prawdopodobne, że ekspresja rożnych transgenów w roślinie zawierającej różne moduły może prowadzić do biosyntezy nowych cząsteczek poliketydowych ponieważ sekwencyjna natura enzymatyczna genów typu dzikiego jest zdeterminowana ich konfiguracją na jednej cząsteczce. Zakłada się, że lokalizacja pięciu specyficznych modułów dla biosyntezy sorafenu na ORF1 jest cechą decydującą w biosyntezie sorafenu że ekspresja powiedzmy trzech modułów na jednym transgenie

182 136 i innych dwu modułów na drugim, razem z ORF2 może doprowadzić do biosyntezy poliketydu o innej strukturze cząsteczki i prawdopodobnie i innej aktywności antypatogenicznej. Wszystkie takie odchylenia w ekspresji modułów mogą prowadzić do syntezy nowych poliketydów w organizmach transgenicznych.

Jakkolwiek szczegóły konstrukcji są podane tylko dla ORF1, podobne techniki stosuje się do wywołania ekspresji ORF2 i genu metylazy sorafenu w transgenicznych roślinach. Zakłada się, że do wytworzenia aktywnego sorafenu w roślinach jest potrzebna ekspresja wszystkich trzech genów, co jest szczegółowo opisane w niniejszym opisie.

Fuzji opisanego powyżej typu można dokonywać do każdego żądanego promotora, po przeprowadzeniu modyfikacji lub bez nich (np. w celu optymalnej inicjacji translacji w roślinach albo dla wzmocnienia ekspresji). ORF zidentyfikowane jako uczestniczące w biosyntezie sorafenu zawierają około 70% nukleotydów GC, a więc, nie przypuszcza się, że sekwencje kodujące będą wymagać modyfikacji dla zwiększenia zawartości GC dla optymalnej ekspresji w roślinach. Może być jednak korzystne modyfikowanie genów tak, aby zawierały kodony preferowane w danym docelowym gatunku rośliny.

Przykład XLIII. Ekspresja fenazyny w transgenicznych roślinach

Zawartość nukleotydów GC we wszystkich klonowanych genach kodujących enzymy uczestniczące w biosyntezie fenazyny wynosi od 58 do 65%, w więc, nie sądzi się, aby podczas ich ekspresji w roślinach mogły wystąpić jakiekolwiek trudności związane z zawartością nukleotydów AT (chociaż może być korzystne modyfikowanie genów tak, aby zawierały kodony preferowane w danym docelowym gatunku rośliny). Fuzji opisanego poniżej typu można dokonywać do każdego żądanego promotora, po przeprowadzeniu modyfikacji lub bez nich (np. w celu optymalnej inicjacji translacji w roślinach albo dla wzmocnienia ekspresji).

Ekspresja za promotorem 35S

Każda z trzech ORF dla fenazyny przenoszono do plazmidu pBluescript SK II do dalszych przekształceń. Ramkę phzB ORF przenoszono w postaci fragmentu EcoRI-Bglll sklonowanego z plazmidu pLSP18-6H3del3 zawierającego całkowity operon fenazyny. Ten fragment przenoszono do miejsc EcoRI-BamHI w plazmidzie pBluescript SK II. Ramkę pHzC ORF przenoszono z pLSP18-6H3de!3 w postaci fragmentu Xhol-Scal klonowanego do miejsc Xhol-Smal w pBluescript SK II. Ramkę pHzD ORF przenoszono z pLSP18-6H3de!3 w postaci fragmentu Bglll-Hindlll do miejsc BamHI-Hindlll w pBluescript SK II.

Destrukcje wewnętrznych miejsc restrykcyjnych, co jest potrzebne do dalszych etapów konstrukcji prowadzono stosując opisane powyżej reakcje PCR metodą „do wewnątrz-na zewnątrz” (Innes i wsp. PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press, New York /1990/). W przypadku phzB ORF, usunięto dwa miejsca SphI (jedno z nich zlokalizowane w górę od ORF pozostawiono nienaruszone). Pierwsze z nich zniszczono stosując technikę unikalnych miejsc restrykcyjnych EcoRI (na lewo od miejsca SphI przeznaczonego do usunięcia) i Bell (na prawo od miejsca SphI). Aby ta manipulacja dała pomyślny wynik, DNA, który ma być cięty enzymem Bell do celów końcowego składania produktu reakcji PCR metodą „do wewnątrz-na zewnątrz” musi być wytworzony w gospodarzu E. coli dam-minus, takim jak SCSI 10 (Stratagene). Dla drugich miejsc SphI w phzB, wybranymi miejscami restrykcyjnymi były Pstl i Spel, przy czym ten drugi był poza phzB ORF w poliłączniku pBluescript. Ramka phzC ORF nie zawiera wewnętrznych miejsc SphI, a więc procedura ta nie jest dla niej potrzebna. Ramka phzD ORF posiada jednak pojedyncze miejsce SphI, które można usunąć stosując unikalne miejsca restrykcyjne Xmal i Hindlll (miejsce Xmal/Smal w poliłączniku pBluescript już nie występuje z powodu insercji ORF pomiędzy miejscami BamHI a Hindlll).

Usunięcie miejsc SphI z genów biosyntezy fenazyny w sposób opisany powyżej ułatwia ich przeniesienie do wektora pCGN1761SENX przez amplifikację z użyciem oligonukleotydowego primera aminoterminalnego, który wprowadza miejsce SphI w ATG i primera karboksyterminalnego, który wbudowuje miejsce restrykcyjne nie występuje w genie przeznaczonym do amplifikacji. Uzyskany amplifikowany fragment rozszczepia się za pomocą

182 136

SphI, enzymu restrykcyjnego przecinającego sekwencję końca karboksylowego i klonuje się go do pCGN1761SENX. Odpowiednimi miejscami dla enzymów restrykcyjnych do wprowadzenia do pirmera karboksyterminalnego są: EcoRI i Notl (dla wszystkich trzech ORF; Notl będzie wymagała sekwencjonowania dla sprawdzenia poprawności złożonej, końcowej konstrukcji) i Xhol (dla phzB i phzD). Biorąc pod uwagę wymaganie, że w pozycji 6 miejsca rozpoznawanego przez SphI musi się znajdować nukleotyd C, w niektórych przypadkach drugi kodon w ORF może wymagać wymiany tak, aby zaczynał się od nukleotydu C. Taka konstrukcja wiąże każdą ORF w jej kodonie ATG z miejscami SphI zoptymalizowanego translacyjnego wektora pCGN1761SENX wiązaniem operacyjnym z podwójnym promotorem 35S. Po zakończeniu tworzenia tej konstrukcji ostateczne insercje genu i miejsca fuzji poddaje się sekwencj onowaniu dla upewnienia się, że nie zaszły niepożądane wymiany zasad.

Przez użycie oligonukleotydowego primera aminoterminalnego, który wprowadza miejsce Ncol zamiast miejsca SphI w kodonie ATG, można łatwo sklonować trzy ramki phz ORF do zoptymalizowanego translacyjnego wektora pCGN1761NENX. Żadna z trzech ORF genu biosyntezy fenazyny nie zawiera miejsca Ncol, a więc, w tym przypadku nie jest potrzebna destrukcja wewnętrznych miejsc restrykcyjnych. Primery do końca karboksylowego tego genu projektuje się w sposób opisany powyżej a klonowanie prowadzi się w podobny sposób. Biorąc pod uwagę wymaganie, że w pozycji 6 miejsca rozpoznawanego przez Ncol musi się znajdować nukleotyd G, w niektórych przypadkach drugi kodon w ORF może wymagać wymiany tak, aby zaczynał się od nukleotydu G. Taka konstrukcja wiąże każdą ORF w jej kodonie ATG z miejscem Ncol wektora pCGN1761NENX wiązaniem operacyjnym z podwójnym promotorem 35S.

Kasety ekspresyjne odpowiednich wektorów, pochodnych pCGN1761, przenosi się do wektorów transformacyjnych. Tam, gdzie to możliwe, kasety ekspresyjne wielokrotne przenosi się do pojedyńczego wektora transformacyjnego aby zmniejszyć ilość transformacji w roślinie i krzyżówek między transformatorami, co może być potrzebne do otrzymania roślin, w których zachodzi ekspresja wszystkich czterech ORF i wytwarzanie fenazyny.

Ekspresja za promotorem 35S z kierowaniem do chloroplastu

Trzy ramki ORF fenazyny amplifikowane z użyciem oligonukleotydów niosących miejsce SphI w końcu aminowym klonowano do kierowanego do 35S-chloroplastu wektora pCGN1761/CT. Fuzji dokonywano do miejsca SphI zlokalizowanego w miejscu rozszczepienia peptydu przejściowego rbcS. Powstałe kasety ekspresyjne przenoszono do odpowiednich wektorów transformacyjnych (patrz wyżej) i używano do generowania roślin transgenicznych. Ponieważ prawdopodobnym prekursorem w biosyntezie pirolnitryny jest choryzmanian syntetyzowany w chloroplastach, może być korzystna ekspresja genów biosyntezy fenazyny w chloroplastach, co zapewnia bezpośrednie dostawy substratu. Rośliny transgeniczne, w których będzie przebiegała ekspresja wszystkich trzech ORF będą kierować produkty wszystkich trzech genów do chloroplastów i syntetyzować fenazynę w chloroplastach.

Ekspresja za rbcS z kierowaniem do chloroplastu

Trzy ramki ORF fenazyny amplifikowane z użyciem oligonukleotydów niosących miejsce SphI w końcu aminowym klonowano do kierowanego do rbcS-chloroplastu wektora pCGN1761rbcS/CT. Fuzji dokonywano do miejsca SphI zlokalizowanego w punkcie rozszczepienia peptydu przejściowego rbcS. Powstałe kasety ekspresyjne przenoszono do odpowiednich wektorów transformacyjnych (patrz wyżej) i używano do generowania roślin transgenicznych. Ponieważ prawdopodobnym prekursorem dla biosyntezy fenazyny jest choryzmanian syntetyzowany w chloroplastach, może być korzystna ekspresja genów biosyntezy fenazyny w chloroplastach, co zapewnia bezpośrednie dostawy substratu. Rośliny transgeniczne, w których zachodzi ekspresja wszystkich trzech ORF będą kierować produkty wszystkich czterech genów do chloroplastów i syntetyzować fenazynę w chloroplastach. Ekspresja tych trzech ORF będzie jednak indukowana światłem.

182 136

Przykład XLIV. Ekspresja syntetyzowanego bez udziału rybosomu antybiotyku peptydowego gramicydyny w transgenicznych roślinach.

Uprzednio sklonowane i zsekwencjonowano trzy geny biosyntezy gramicydyny z Bacillus brevis·. grsA, grsB i grsT (Turgay i wsp., Mol. Microbiol. 6, 529-546 /1992/; Kraetzschmar i wsp., J. Bacteriol. 171, 5422-5429 /1989/). Mają one długość odpowiednio 3296, 13358 i 770 par zasad. Te sekwencje są również opublikowane w banku GeneBank pod numerami akcesyjnymi Χ61658 i M29703. Opisane manipulacje można prowadzić z użyciem ogólnie dostępnych klonów opublikowanych przez Turga/a (jak wyżej) i Kraetzschmafa (jak wyżej) albo alternatywnie, stosując nowo wyizolowane klony z Bacillus brevis wyizolowane w sposób podany w niniejszym opisie.

Każdy z trzech genów ORF: grsA, grsB i grsT amplifikowano z użyciem oligonukleotydów obejmujących całą sekwencję kodującą. Po lewej stronie (w górę) oligonukleotyd zawiera miejsce Sstl a na prawo (w dół) - miejsce Xhol. Te miejsca restrykcyjne nie występują w żadnej z trzech sekwencji kodujących i umożliwiają cięcie produktów amplifikacji enzymami Sstl i Xhol do celów insercji do odpowiednich miejsc w pBluescript USk. W ten sposób generowano klony pBL-GRSa, pBL-GRSb i pBLGRSt. Zawartość CG w tych genach wynosi od 35 do 38%. Idealnie, sekwencje kodujące te trzy geny można modyfikować technikami opisanymi w sekcji K, jest jednak możliwe, że te niemodyfikowane geny mogą podlegać ekspresji na wysokich poziomach w roślinach transgenicznych bez napotykania na trudności związane z zawartością AT. W każdym przypadku może być korzystna modyfikacja genów, tak aby zawierały kodony preferowane w odpowiednich docelowych gatunkach roślin.

Ramka ORF grsA nie zawiera ani miejsca SphI ani Ncol. Ten gen można zatem amplifikować z pBLGSRa stosując aminoterminalny oligonukleotyd, który wprowadza albo miejsce SphI albo miejsce Ncol przy ATG i drugi karboksy- terminalny oligonukleotyd, który wprowadza miejsce Xhol, co umożliwia amplifikację produktu, który ma być klonowany bezpośrednio do pCGN1761SENX albo pCGN1761NENX za podwójnym promotorem 35S.

Ramka ORF grsB nie zawiera miejsca Ncol, a zatem, gen ten można amplifikować stosując aminoterminalny oligonukleotyd zawierający miejsce Ncol w ten sam sposób jak to opisano powyżej dla ORF grsA. Amplifikowany fragment rozcina się za pomocą Ncol i Xhol i poddaje ligacji z pCGN 1761ΝΕΝΧ. Ramka ORF grsA zawiera jednak trzy miejsca SphI, które usuwa się w celu ułatwienia następnych etapów klonowania. Miejsca te usuwa się stosując opisaną powyżej technikę reakcji PCR „do wewnątrz-na zewnątrz”. Unikalnymi miejscami klonowania znajdującymi się w genie grsB a nie występującymi w pBluescript IISK sąEcoN I, PUM 1 i Rsrll. Ani EcoN 1 ani pfIM 1 nie mogą by ć użyte razem z Rsrll do usunięcia pierwszych miej sc a Rsrll może być użyta łącznie z miejscem Apal z poliłącznika pBluescript do usunięcia trzeciego miejsca. Po zniszczeniu tych miejsc (bez powodowania zmiany aminokwasów), całą grsB ORF można amplifikować stosując oligonukleotyd aminoterminalny zawierający miejsce SphI przy ATG i oligonukleotyd karboksyterminalny wprowadzający miejsce Xhol. Otrzymany fragment klonuje się do pCGN1761SENX. W celu korzystnej amplifikacji w reakcji PCR fragmentów o takiej wielkości, zmodyfikowano procedury amplifikacji według Bames'a (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2216-2220 /1994/), który opisał amplifikację z dużą wiernością dużych fragmentów DNA. Alternatywne podejście do przeniesienia ORF grsB do pCGN 1761SENX bez potrzeby destrukcji tych trzech miejsc restrykcyjnych SphI polega na przeniesieniu do miejsc klonujących SphI i Xhol w pCGN 1761SENX fragmentu aminoterminalnego grsB przez amplifikację od miejsca ATG tego genu, stosując oligonukleotyd aminoterminalny, który wprowadza miejsce SphI przy ATG i drugi oligonukleotyd, który sąsiaduje i znajduje się wpołożeniu 3' do miejsca PfIMl w ORF i który zawiera miejsce Xhol. Tak więc, aminoterminalny amplifikowany fragment przecina się za pomocą SphI i Xhol i klonuje się do pCGN1761SENX. Następnie, pozostałą część genu grsB wycina się pBLGRSb stosując PfIMl i Xhol (które przecinająpoliłącznik pBluescript) i klonuje się do aminoterminalnej konstrukcji przenoszącej uprzednio ciętej enzymami PfIMl i Xhol w celu rekonstrukcji genu.

182 136

Ramka ORF grsT nie zawiera ani miejsca SphI ani Ncol. Ten gen można zatem amplifikować z pBLGSRt stosując aminoterminalny oligonukleotyd, który wprowadza albo miejsce SphI albo miejsce Ncol przy kodonie inicjacji, zmienionym na ATG (z GTG) w celu ekspresji w roślinach i drugi karboksy-terminalny oligonukleotyd, który wprowadza miejsce Xhol, co umożliwia, amplifikacje produktu, który ma być klonowany bezpośrednio do pCGN1761SENX albo pCGN1761NENX za podwójnym promotorem 35S.

Biorąc pod uwagę wymaganie, że w pozycji 6 miejsca rozpoznawanego przez SphI musi się znajdować nukleotyd C, a w pozycji 6 miejsca rozpoznawanego przez Ncol musi się znajdować nukleotyd G, w niektórych przypadkach drugi kodon w ORF może wymagać wymiany tak, aby zaczynał się od odpowiedniego nukleotydu.

W sposób opisany w innej części opisu uzyskano rośliny transgeniczne, w których przebiega ekspresja wszystkich trzech genów biosyntezy gramicydyny. Rośliny transgeniczne, w których zachodzi ekspresja wszystkich trzech genów syntetyzują gramicydynę.

Przykład XLV. Ekspresja syntetyzowanego rybosomalnie lantibiotyku peptydowego, epiderminy, w roślinach transgenicznych

Ramka epiA ORF koduje jednostkę struktury dla biosyntezy epiderminy i ma długość około 420 par zasad (GenBank, numer akcesyjny Χ07840; Schnell i wsp., Naturę 333, 276-278 /1988/)· Ten gen można subklonować, stosując techniki reakcji PCR, z plazmidu pTu32 do pBluescript SK II z użyciem oligonukleotydów zawierających terminalne miejsca restrykcyjne BamHI (5') i Pstl (39- Zawartość GC w sekwencji genu epiA wynosi 27%. Można ją zwiększyć stosując techniki syntezy genu opisane w innej części opisu. Jednak taka modyfikacja sekwencji nie musi być zasadnicza dla celów uzyskania wysokiego poziomu ekspresji w roślinach. Następnie ORF epiA przenosi się do wektora klonującego pCGN1761SENX albo pCGN1761NENX przez amplifikację tego genu w reakcji PCR, stosując oligonukleotyd aminoterminalny obejmujący początkową metioninę i niosący miejsce SphI (do klonowania do pCGN1761SENX) albo miejsce Ncol (do klonowania do pCGN1761NENX) razem z oligonukleotydem karboksyterminalnym zawierającym miejsce EcoRI, Notl albo Xhol do klonowania albo do pCGN1761SENX albo do pCGN1761NENX. Biorąc pod uwagę wymaganie, że w pozycji 6 miejsca rozpoznawanego przez SphI musi się znajdować nukleotyd C a w pozycji 6 miejsca rozpoznawanego przez Ncol musi się znajdować nukleotyd G, w niektórych przypadkach drugi kodon w ORF może wymagać wymiany tak, aby zaczynał się od odpowiedniego nukleotydu.

Stosując techniki klonowania opisane w niniejszym opisie albo znane w stanie techniki, subklonowano z plazmidu Tu32 do pBluescript SK II pozostałe geny operonu epi (to znaczy epiB, epiC, epiD, epiQ i epiP). Te geny są odpowiedzialne za modyfikację i polimeryzację kodowanej przez epiA jednostki struktury. Są one opisane przez Kupke'go i wsp. (J. Bactweriol. 174, 5354-5361 /1992/) i SchnelFa i wsp. (Eur. J. Biochem. 204, 57-68 /1992/). Subklonowane ORF przekształca się w celu przeniesienia do wektorów - pochodnych pCGN1761 w sposób opisany powyżej. Kasety ekspresyjne odpowiednich wektorów - pochodnych pCGN1761 przenosi się do wektorów transformacyjnych. Tam gdzie to możliwe, wielokrotne kasety ekspresyjne przenosi się do pojedynczego wektora transformacyjnego aby zmniejszyć ilość transformacji roślinnych i krzyżówek pomiędzy transformantami, co może być potrzebne do uzyskania roślin, w których zachodzi ekspresja wszystkich żądanych ORF i które wytwarzają epidemię.

L. Analiza transgenicznych roślin na kumulacje APS

Przykład XLVI. Analiza ekspresji genu APS.

Ekspresje genów APS w transgenicznych roślinach można analizować stosując standardowe techniki blottingu typu Northern, do oceny ilości mRNA dla danego APS, gromadzącego się w tkankach. Alternatywnie, ilość produktu genu APS można oznaczyć metodą analizy Westema, stosując antysurowice przeciw produktom genu biosyntezy APS. Antysurowice hoduje się stosując ogólnie znane techniki, białka natomiast pochodzą z ekspresji genów APS w gospodarzu takim jak E. coli. Dla uniknięcia powstawania antysurowic przeciw wielu

182 136 produktom genów APS, ekspresja których przebiega w E. coli z wielu operonów ORF, geny biosyntezy APS można pobudzać do ekspresji w E. coli indywidualnie. Alternatywnie, można hodować antysurowice przeciw peptydom syntetycznym tak zaprojektowanym, aby były homologiczne albo identyczne ze znaną, wyprowadzoną sekwencją aminokwasową biosyntetycznego APS. Techniki te są powszechnie znane.

Przykład XLVII. Analiza wytwarzania APS w transgenicznych roślinach

Dla każdego APS użyto znane metody wykrywania produkcji APS w tkankach transgenicznych roślin. Metody te są opisane w odpowiednim piśmiennictwie na temat APS. Dla pirolnitryny zastosowano procedurę opisana w przykładzie XI a dla sorafenu - procedurę podaną w przykładzie XVII. Fenazynę oznaczano metodą opisaną w przykładzie XVIII. Dla wytwarzanych bez udziału rybosomów antybiotyków peptydowych, takich jak gramicydyna S, odpowiednią ogólną techniką jest analiza wymiany ATP-PPj. W przypadku gramicydyny, ekspresje genu grsA można śledzić przez pomiar fenyloalanino-zależnej wymiany ATP-PPj a gen grsB można oznaczać na podstawie prolino-, walino-, omityno- albo luceyno-zależnej wymiany ATP-PPj. Alternatywne techniki są opisane przez Gause'go i Brazhnikovą (Lancet 247, 715 /1944/). Antybiotyki peptydowe syntetyzowane z udziałem rybosomów izoluje się ekstrakcję butanolem, rozpuszczenie w metanolu i w eterze dietylowym i następną chromatografię, co zostało opisane przez Allgaiefa i wsp., dla epiderminy (Eur. J. Biochem. 160, 9-22 /1986/). Dla wielu APS (pirolnitryny, gramicydyny, fenazyny) odpowiednie techniki oznaczania są podane w wydawnictwie Merck Index (Merck & Co., Rahway, NJ /1989/).

M. Oznaczanie odporności na chorobę w roślinach transgenicznych

W transgenicznych roślinach, w których zachodzi ekspresja genów biosyntezy APS oznaczano odporność na fitopatogeny, stosując techniki znane w fitopatologii. Przy stosowaniu patogenów listowia, rośliny hoduje się w cieplarni i w odpowiednim stadium rozwoju wprowadza się inoculum badanego fitopatogenu w odpowiedni sposób. Dla fitopatogenów żyjących w glebie, patogen wprowadza się do gleby przed albo w czasie wysiewu nasion. Przy wyborze odmiany rośliny uprawnej do wprowadzenia genów bierze się pod uwagę względna wrażliwość fitopatogenu. Tak więc, jest korzystne aby wybrana odmiana była wrażliwa na większość badanych fitopatogenów, co pozwoli na oznaczenie zwiększonej odporności.

Próba na odporność na fitopatogeny listowia

Przykład XLVIII. Odporność na chorobę oznaczana na fitopatogenach liści tytoniu Transgeniczne rośliny tytoniu, w których zachodzi ekspresja genów APS i które wytwarzają związek APS poddano następującym testom na chorobę.

Phytophthora parasitica / zaraza gnilna tytoniu. Próby na odporność na Phytophthora parasitica, organizm wywołujący zarazę gnilną prowadzono w 6-tygodniowych roślinkach hodowanych w sposób opisany przez Alexandera'a i wsp., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7327-7331). Roślinki nawadniano, pozwalano na odpłynięcie wody i zaszczepiano przez wprowadzenie do gleby 10 ml zawiesiny zarodni (sporangium) (300 sporangiów/ml). Zakażone roślinki utrzymywano w cieplarni w temperaturze 23-25°C w ciągu dnia i 20-22°C w ciągu nocy. W próbach stosowano następujący wskaźnik więdnięcia: 0 = brak objawów: 1 = pewne objawy więdnięcia ze zmniejszonym napęcznieniem: 2 = wyraźne objawy więdnięcia ale brak gnicia lub zatrzymania rozwoju 3 = wyraźne objawy więdnięcia z zatrzymaniem w rozwoju ale brak wyraźnego gnicia łodyg; 4 = poważne więdnięcie z widzialnym gniciem łodyg i częściowym zniszczeniem układu korzeniowego; 5 = tak jak w punkcie 4 ale rośliny bliskie śmierci lub padłe i z poważnym zmniejszeniem układu korzeniowego. Wszystkie próby prowadzono ze ślepą próbą, na roślinach rozmieszczonych losowo.

Pseudomonas syringae. Pseudomonas syringae, odmiana tabaci (szczep #551) wstrzykiwano do dwóch niższych liści na kilku 6-7 tygodniowych roślinkach w stężeniu 10⁶ albo 3 χ 10⁶ na ml w wodzie. Sześć pojedyńczych roślinek oceniano w każdym punkcie czasowym. Rośliny zarażone przez Pseudomonas tabaci oceniano w pięcio-punktowej skali ciężkości choroby: 5 = 100% obumarłej tkanki, 0 = brak objawów choroby. Wyniki ocen dla każdego dnia

182 136 analizowano testem T (LSD) i wykazywano grupy po uśrednieniu wyników, czyli oznaczeniu Średniej Wartości Stopnia Choroby. Wartości, po których występują te same litery w dniu oceny nie różnią się statystycznie.

Cercospora nicotianae. Zawiesinę zarodników Cercospora nicotianae, ATCC # 18366 (100.000 - 150.000 zarodników/ml) opryskano aż do spływania powierzchnię liści. Roślinki utrzymywano w 100% wilgotności przez 5 dni, następnie spryskiwano wodą 5-10 razy dziennie. W każdym punkcie czasowym oceniano sześć poszczególnych roślinek. Cercospora nicotianae oceniano na podstawie procentu powierzchni liści wykazującego objawy choroby. Wyniki ocen dla każdego dnia analizowano w teście T (LSD) i wykazywano grupy po uśrednieniu wyników, czyli oznaczeniu Średniej Wartości Stopnia Choroby. Wartości, po których występują te same litery w dniu oceny nie różnią się statystycznie.

Analizy statystyczne. Wszystkie testy obejmowały rośliny nietransgeniczne (sześć roślin na oznaczenie albo ta sama odmiana jako linia transgeniczna; Alexander i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7327-7331). Przeprowadzono parowane testy T dla porównania różnego genotypu i traktowanych grup dla każdej oceny.

Oznaczanie odporności na fitopatogeny żyjące w glebie

Przykład XLIX. Odporność na Rhizoctonia solani

Próby na roślinach dla oceny odporności na Rhizoctonia solani prowadzono przez sadzenie lub flancowanie nasion lub sadzonek do naturalnie lub sztucznie zakażonej gleby. W celu przygotowania gleby zakażonej sztucznie, moczono w wodzie nasiona prosa, ryżu, owsa lub podobne, następnie autoklawowano je i zaszczepiano bryłkami fitopatogenu grzybowego pobranego z płytki agarowej. Kiedy nasiona całkowicie porosły fitopatogenami, suszono je na powietrzu i mielono na proszek. Proszek ten wmieszano do gleby w stężeniu wywołującym chorobę w oznaczeniach eksperymentalnych. Postęp choroby oceniano przez porównanie ilości zaatakowanych stanowisk, ocen uszkodzeń korzeni i wagi łodyg i korzeni roślin transgenicznych i nietrasgenicznych rosnących w zakażonej glebie. Oceny choroby można również porównać z ocenami dla roślin rosnących w tych samych warunkach ale bez fitopatogenów dodanych do gleby.

Przykład L. Odporność na Pseudomonas solanacearum

Próby na roślinach dla oceny odporności na Pseudomonas solanacearum prowadzono przez sadzenie lub flancowanie nasion lub sadzonek do naturalnie lub sztucznie zakażonej gleby. W celu przygotowania sztucznie zakażonej gleby, prowadzono hodowlę bakterii we wtrząsanych hodowlach w kolbach, następnie mieszano z glebą w stężeniu doświadczalnie oznaczonym jako wywołującym chorobę. Korzenie roślin mogą wymagać lekkiego okaleczenia aby zapoczątkować rozwój choroby. Zaawansowanie choroby można oceniać przez porównanie ilości zaatakowanych stanowisk, stopnia zwiędnięcia i wagi łodyg i korzeni u roślin transgenicznych i nietransgenicznych rosnących w zakażonej glebie. Oceny choroby można również porównać z ocenami dla roślin rosnących w tych samych warunkach ale bez fitopatogenów dodanych do gleby.

Przykład LI. Odporność na żyjące w glebie grzyby będące wektorami przenoszącymi wirusy

Wiele żyjących w glebie gatunków polymyxa, Olpidium i Spongospora jest wektorami dla przenoszących się wirusów. Należą do nich: (1) Polymyxa betae, który przenosi wirusa nekrotycznej żółtaczki buraka (czynnik wywołujący chorobę rhizomania) na buraka cukrowego, (2) Polymyxa graminis, który przenosi żyjącego w glebie wirusa mozaiki pszenicy na pszenicę oraz wirusa żółtej mozaiki jęczmienia i wirusa zwykłej mozaiki na jęczmień, (3) Olpidium brasicae, przenoszący wirusa martwicy tytoniu na tytoń oraz (4) Spongospora subterranea przenoszący wirusa „Mop Top” na ziemniaki. Nasiona lub sadzonki roślin, w których zachodzi ekspresja APS w korzeniach (konstytutywnie lub w sposób specyficzny dla korzeni) wysiewano lub flancowano w sterylnej glebie i do gleby wprowadzano inoculum grzyba zawierającego badanego wirusa. Po upływie określonego czasu oznaczano w transgenicznych roślinach objawy zakażenia i kumulacji wirusa techniką ELISA i blottingu typu Northern.

182 136

W próbach kontrolnych roślin nie zaszczepiano lub zaszczepiano grzybem nie zawierającym badanego wirusa. Analizowane linie roślin transgenicznych najlepiej powinny być wrażliwe na wirusa aby można było oznaczyć skuteczność ochrony opartej na APS. W przypadkach wirusów takich jak wirus zwykłej mozaiki jęczmienia, które są przenoszone przez Polymyxia i jednocześnie drogą mechaniczną zapewnia się dalszą kontrolę przez mechaniczne wprowadzenie wirusa do roślin, które są chronione przed infekcja z gleby poprzez ekspresję APS w korzeniach.

Odporność na grzyby przenoszące wirusy nabywana drogą ekspresji APS zapobieganie infekcjom wirusowym docelowych roślin uprawnych, polepszając zdrowie roślin i wydajność zbiorów.

Przykład LII. Odporność na obleńce

Transgeniczne rośliny, w których zachodzi ekspresja APS analizowano pod względem odporności na obleńce. Nasiona lub sadzonki wytwarzające APS w korzeniach (np. konstytutywnie lub w wyniku ekspresji specyficznej dla korzeni) wysiewano lub flancowano w sterylenej glebie i do gleby wprowadzano inoculum obleńca. Niszczenie obleńców oznaczano w odpowiednim punkcie czasu. Obleńce atakujące korzenie, takie jak Meloidogyne spp. wprowadzano do transgenicznych roślin tytoniu lub pomidorów, w których zachodzi ekspresja APS. Mątwiki, takie jak Heterodera spp. wprowadzano do transgenicznych zbóż, ziemniaka i buraka cukrowego. Nicienie, takie jak Pratylenchus spp. wprowadzano do treansgenicznej soji, lucerny lub kukurydzy. Nicienie nerkowate, takie jak Rotylenchulus spp. wprowadzano do transegicznej soji, bawełny lub pomidorów. Niszczyka zjadliwego (Ditylenchus spp.) wprowadzano do transgenicznej lucerny. Szczegółowy opis technik skriningu na odporność na obleńce znajduje się w wydawnictwie „Methods for Evaluating Plant Species for Resistance to Plant Parasitic Nematodes” pod redakcją Staffa, wyd.: Society of Nematologists, Hyattsville, Maryland /1990/).

Przykłady ważnych fitopatogenów pasożytujących na gatunkach roślin uprawnych.

Przykład LIII. Odporność na chorobę kukurydzy

Transgeniczne rośliny kukurydzy, w których zachodzi ekspresja genów APS i które wytwarzają związek APS poddano następującym testom na zakażenie. Testy dla każdego fitopatogenu prowadzono stosując standardowe procedury fitopatologiczne.

Choroby listowia i zgnilizna łodyg (1) Helmintosporioza liści kukurydzy (Helminthosporium turcicum t syn. Exserohilum turcicum).

(2) Antraknoza trwa (Colletotrichum graminicola t - ten sam patogen jak dla zgnilizny łodyg).

(3) Południowa Helmintosporioza liści kukurydzy (Helminthosporium maydis t, syn.: Bipolaris maydis).

(4) Łamliwość źdźbła zbóż (Kabatiella zeae) (5) Rdza pospolita (Puccinia sorghi) (6) Rdza południowa (Puccinia polysora) (7) Szara łamliwość źdźbła (Cercospora zeae madydis t i C. sorghi) (8) Zgnilizna łodyg (kompleks dwu lub większej ilości patogenów: Ptyhium aphanidermatum t - wczesny, Erwinia chrysanthemi-zaea wczesny, Colletotrichum graminicola t, Diplodia maydis t, D. Macrospora,Gibberella zeae t, Fusarium moniliforme t, Macrophomina phaseolina, Cephalosporium acremonium) (9) Choroba Goss'a (Clavibacter nebraskanense)

Ważne pleśnie kłosów (1) Zgnilizna kukurydzy (Gibberella zeae t, ta sama jak przy zgniliźnie łodyg, Aspergillus flavus, A. parasiticus, Aflatoksyna') (2) Diplodioza (Diplodia maydis i D. Macrospora, ten sam organizm jak przy zgniliźnie łodyg) (3) Głownia pyłkowa (Sphacelotheca reiliana, syn, Ustilago reliana)

182 136

Przykład LIV. Odporność pszenicy na chorobę

Transgeniczne rośliny pszenicy, w których zachodzi ekspresja genów APS i które wytwarzają związek APS poddano następującym testom na zakażenie. Testy dla każdego fitopatogenu prowadzono stosując standardowe procedury fitopatologiczne.

(1) Septorioza (Septoria tritici, S. Nodorum) (2) Mączniak prawdziwy (Erysiphe graminis) (3) Rdza żółta zbóż (Puccinia striiformis) (4) Rdza brunatna pszenicy (Pucinia recondita, P. hordei) (5) Inne: Fuzarioza brunatna i fuzarioza sadzonek (Fusarium culmorum i Fusarium roseum), łamliwość źdźbła (Pseudocercosporella herpotrichoides), zgorzel podstawy źdźbła (Gaeumannomyces graminis) (6) wirusy (wirus żółtej mozaiki jęczmienia, wirus żółtej karłowatości jęczmienia, wirus żółtej mozaiki pszenicy)

N. Próba na skuteczność biokontroli w szczepach mikroorganizmów, w których zachodzi ekspresja genów APS

Przykład LV. Ochrona bawełny przed Rhizoctonia solani

Próby oznaczania ochrony bawełny przed infekcją wywołaną Rhizoctonia solani prowadzono w ten sposób, że wysiewano nasiona traktowane szczepem biokontrolnym w glebie zakażonej naturalnie i sztucznie. W celu przygotowania gleby zakażonej sztucznie, moczono w wodzie nasiona prosa, ryżu, owsa lub innych, podobnych nasion, autoklawowano je i zakażano wycinkami patogenów grzybiczych pobranych z płytki agarowej. Kiedy nasiona całkowicie porosły patogenem, suszono je na powietrzu i mielono na proszek. Proszek ten mieszano z glebą w proporcji ustalonej doświadczalnie, w takiej ilości, która wywołuje chorobę. Tę zakażoną glebę umieszczano w naczyniach i wysiewano nasiona w rzędach o głębokości 1,5 cm. Szczepy biokontrolne hodowano w wytrząsanych kolbach w laboratorium. Komórki zbierano przez wirowanie, zawieszano w wodzie i podlewano nimi nasiona. Nasiona kontrolne podlewano jedynie wodą. Postęp choroby oceniano po 14 dniach przez porównanie liczby plam i. stopnia uszkodzenia korzeni sadzonek traktowanych i nietraktowanych. Ocenę stopnia zaawansowania choroby można porównać ź oceną dla sadzonek rosnących w tych samych warunkach ale bez dodawania patogenu do gleby.

Przykład LVI. Ochrona ziemniaków przez Claviceps michiganese, podgatunek speedonicum

Claviceps michiganese, podgatunek speedonicum jest przyczyną bakteriozy pierścieniowej ziemniaków i w zasadzie roznosi się przed wysadzaniem kiedy „sadzeniaki” bulw ziemniaka są krojone nożem w celu zwiększenia ilości materiału do sadzenia. Przenoszenie patogenu na powierzchni noża powoduje zakażenie całej partii sadzeniaków. Próby na oznaczenie ochrony ziemniaków przed czynnikiem wywołującym bakteriozę pierścieniową prowadzono przez inokulację kawałków bulw ziemniaczanych zarówno patogenem jak i szczepem biokontrolnym. Patogen wprowadzano przez przecięcie bulwy zakażonej w sposób naturalny i następnie użycie tego noża do cięcia innych bulw na kawałki. Kawałki te traktowano zawiesiną bakterii biokontrolnej albo wodą w próbach kontrolnych. Postęp choroby oceniano pod koniec sezonu wzrostu, oceniając żywotność roślin wydajność i ilość bulw zakażonych przez Clavibacter.

O. Izolowanie związków APS z organizmów, w których zachodzi ekspresja klonowanych genów

Przykład LVII. Procedury ekstrakcji w celu APS

Aktywne związki APS można wyizolować z komórek lub pożywki wzrostowej szczepów typu dzikiego lub transformowanych, wytwarzających APS. Można to przeprowadzić stosując znane procedury izolowania cząsteczek o znanych własnościach.

Przykładowo, w celu wyodrębnienia APS zawierających wiele pierścieni benzenowych (pironitryna i sorafen) hoduje się kultury przez 24 godziny w 10 ml pożywki L w odpowiedniej temperaturze i poddaje się ekstrakcji równą objętością octanu etylowego. Warstwę

182 136 organiczną odzyskuje się, odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszcza się w 20 μί metanolu.

W przypadku pirolnitryny, w celu wyodrębnienia związku: antypatogenicznego z pożywki wzrostowej transformowanego szczepu produkującego antybiotyk, prowadzi się dalszą procedurę. Prowadzi się ekstrakcję pożywki 80% acetonem a następnie usuwa się aceton przez odparowanie i prowadzi drugą ekstrakcję eterem dietylowym. Usuwa się eter dietylowy przez odparowanie i suchy ekstrakt zawiesza się w małej objętości wody. Małe ilości ekstraktu antybiotyku naniesione na małe, sterylne krążki bibuły filtracyjnej na płytce agarowej będą hamowały wzrost Rhizoctonia solani, co wskazuje na obecność aktywnego związku antybiotycznego.

Korzystny sposób wyodrębniania fenazyny opisał Thomashow i wsp. (Appl. Environ. Microbiol. 56, 908-912 /1990/). Hodowle zakwasza się do pH 2.0 kwasem solnym i poddaje ekstrakcji benzenem. Frakcje benzenowe suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje do suchej pozostałości. Pozostałość rozpuszcza się w wodnym, 5% roztworze NaHCO₃, poddaje ekstrakcji równą objętością benzenu, zakwasza, wprowadzając substancję do warstwy benzenu i suszy się ją.

Dla antybiotyków peptydowych (które są na ogół hydrofobowe), odpowiednie są techniki ekstrakcji z użyciem butanolu, metanolu, chloroformu albo heksanu. W przypadku gramicydyny izolację prowadzi się metodą opisaną przez Gause;go i Brazhnikowa (Lancet 247, 715 /1944/9- Epidemię izoluje się korzystnie w sposób opisany przez Allgaie/a i wsp. (Eur. J. Biochem. 160, 9-22 /1986/). Polega ona na ekstrakcji butanolem i rozpuszczeniu w metanolu i eterze dietylowym. Techniki izolowania wielu APS (np. pirolnitryny, gramicydyny, fenazyny) są podane w encyklopedii „Merck Index” (Merck & Co., Rahway, NJ /1989/).

P. Wytwarzanie form użytkowych i zastosowanie izolowanych antybiotyków

Przeciwgrzybicze formy użytkowe można sporządzać stosując składniki aktywne zawierające albo wyizolowane APS albo alternatywnie, zawiesiny albo koncentraty komórek je wytwarzających. Formy te można sporządzać w postaci ciekłej lub stałej.

Przykład LVIII. Ciekłe postaci kompozycji przeciwgrzy bieży ch

W poniższych przykładach, zawartość składników kompozycji podana jest w procen-

tach wagowych. 1. Koncentraty tworzące emulsje: a b Składnik aktywny 20% 40% Dodecylobenzenosulfonian wapniowy 5% 8% Eter oleju rącznikowego z glikolem polietylenowym (36 moli tlenku etylenu) 5% - Eter trój buty lofenolu z glikolem polietylenowym (36 moli tlenku etylenu) - 12% Cykloheksanon - 15% Mieszanina ksylenów 70% 25%

c 50% 6% 4% 20% 20%

Przez rozcieńczenie wodą tych koncentratów można sporządzać emulsje o dowolnym żądanym stężeniu.

2. Roztwory	a	b	c	d
Składnik aktywny	80%	10%'	5%	95%
Eter monometylowy glikolu etylenowego	20%	-	-	-
Glikol polietylenowy 400	-	70%	-	-
N-metylo-2-pirolidon	-	20%	-	-
Epoksydowany olej arachidowy	-	-	1%	5%
Destylat ropy naftowej (zakres temp, wrzenia: 160-190°C)	-	-	94%	-
Roztwory te można stosować w formie mikrokropelek.

182 136

3. Granulaty Składnik aktywny Kaolin Krzemionka o wysokim stopniu dyspersji Atapulgit

a b 5% 10% 94% - 1% - - 90%

Składnik aktywny rozpuszcza się w chlorku metylenowym, roztwór natryskuje się na nośnik i odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem.

4. Proszki pyliste	a	b
Składnik aktywny	2%	5%
Krzemionka o wysokim stopniu dyspersji	1%	5%
Talk	97%	-
Kaolin	-	90%

Proszki gotowe do użycia otrzymano przez dokładne zmieszanie nośników ze składnikiem aktywnym.

Przykład LIX. Stałe formy użytkowe kompozycji przeciwgrzybiczych

W poniższych przykładach zawartość składników kompozycji wyrażono w procentach wagowych

1. Proszki zwilżalne:	a	b	c
Składnik aktywny	20%	60%	75%
Lignosulfonian sodowy	5%	5%	-
Laurylosiarczan sodowy	3%	5%
Diizobutylonaftalenosulfonian sodowy	-	6%	10%
Eter oktylofenolu z glikolem polietylenowym
(7-8 moli tlenku etylenu)	-	2%	-
Krzemionka o wysokim stopniu dyspersji	5%	27%	10%
Kaolin	67%	-	-
Składnik aktywny dokładnie miesza się ze środkami pomocniczymi i mieszaninę drobno

miele się w odpowiednim młynku, uzyskując proszki zwilżalne, które można rozcieńczać wodą, sporządzając zawiesiny o żądanych stężeniach

2. Koncentrat tworzący emulsje:
Składnik aktywny Eter oktylofenolu z glikolem polietylenowym	10%
(4-5 moli tlenku etylenu)	3%
Dodecylobenzenosulfonian wapniowy Eter oleju rącznikowego z glikolem polietylenowym	3%
(36 moli tlenku etylenu)	4%
Cykloheksanon	30%
Mieszanina ksylenów	50%
Z tego koncentratu można otrzymać emulsje o dowolnym żądanym stężeniu przez rozcieńczenie wodą.
3. Proszki pyliste	a	b
Składnik aktywny	5%	8%
Talk	95%	-
Kaolin	-	92%
Proszki gotowe do użycia otrzymuje się przez zmieszanie składnika aktywnego z nośnikami i zmielenie mieszanki w odpowiednim młyn ku. 4. Granulat wytłaczany
Składnik aktywny	10%
Lignosulfonian sodowy	2%
Karboksymetyloceluloza	1%
Kaolin	87%

182 136

Składnik aktywny miesza się i miele z substancjami pomocniczymi i następnie mieszankę zwilża wodą. Wytłacza się ja i suszy w strumieniu powietrza.

5. Granulat powlekany:

Składnik aktywny Glikol polietylenowy 200 Kaolin

3% 3% 94%

Drobno zmielony składnik aktywny dodaje się równomiernie, w mieszalniku, do zwilżonego glikolem polietylenowym kaolinu. W ten sposób otrzymuje się niepylący granulat powlekany.

6. Koncentrat zawiesiny:

Składnik aktywny Glikol etylenowy Nonylofenolo-glikol polietylenowy (15 moli tlenku etylenowego) Lignosulfonian sodowy Karboksymetyloceluloza 37% wodny roztwór formaldehydu Olej silikonowy w 75% emulsji wodnej Woda

40% 10% 6% 10% 1% 0,2% 0,8% 32%

Drobno zmielony składnik aktywny dokładnie miesza się z substancjami pomocniczymi uzyskując koncentrat zawiesiny, z którego można sporządzać zawiesiny o żądanym stężeniu przez rozcieńczenie wodą.

182 136

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: CIBA-GEIGY AG (B) ULICA: Klybeckstr. 141 (C) MIASTO: Bazyleja (E) PAŃSTWO: Szwajcaria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 4002 (G) TELEFON: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX; +41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 (ii) TUTUŁ WYNALAZKU: Geny do syntezy substancji antypatogennych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 22 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY; PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ; 7000 par zasad (B) TYP; kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA; Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(B) SZCZEP: pojedynczy (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA; 357... 2039 (D) INNE INFORMACJE: /znakowanie = ORF1 (ix) CECHY;

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 2249... 3076 (D) INNE INFORMACJE: /znakowanie = ORF2

182 136 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 3166...4869 (D) INNE INFORMACJE: /znakowanie = ORF3 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 4894... 5985 (D) INNE INFORMACJE: /znakowanie = ORF4 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 1:

GAATTCCGAC AACGCCGAAG AAGCGCGGAA CCGCTGAAAG AGGAGCAGGA ACTGGAGCAA

ACGCTGTCCC AGGTGATCGA CAGCCTGCCA CTGCGCATCG AGGGCCGATG AACAGCATTG

GCAAAAGCTG GCGGTGCGCA GTGCGCGAGT GATCCGATCA TTTTTGATCG GCTCGCCTCT

TCAAAATCGG CGGTGGATGA AGTCGACGGC GGACTGATCA GGCGCAAAAG AACATGCGCC

AAAACCTTCT TTTATAGCGA ATACCTTTGC ACTTCAGAAT GTTAATTCGG AAACGGAATT

TGCATCGCTT TTCCGGCAGT CTAGAGTCTC TAACAGCACA TTGATGTGCC TCTTGC

ATG GAT GCA CGA AGA CTG GCG GCC TCC CCT CGT CAC AGG CGG CCCGCC

Met Asp Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ser Pro Arg His Arg Arg ProAla

1015

TTT GAC ACA AGG AGT GTT ATG AAC AAG CCG ATC AAG AAT ATC GTCATC

Phe Asp Thr Arg Ser Val Met Asn Lys Pro Ile Lys Asn Ile ValIle

2530

GTG GGC GGC GGT ACT GCG GGC TGG ATG GCC GCC TCG TAC CTC GTCCGG

Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Trp Met Ala Ala Ser Tyr Leu ValArg

4045

GCC CTC CAA CAG CAG GCG AAC ATT ACG CTC ATC GAA TCT GCG GCGATC

Ala Leu Gin Gin Gin Ala Asn Ile Thr Leu Ile Glu Ser Ala AlaIle

5560

CCT CGG ATC GGC GTG GGC GAA GCG ACC ATC CCA AGT TTG CAG AAGGTG

Pro Arg Ile Gly Val Gly Glu Ala Thr Ile Pro Ser Leu Gin LysVal

70 7580

TTC TTC GAT TTC CTC GGG ATA CCG GAG CGG GAA TGG ATG CCC CAAGTG

Phe Phe Asp Phe Leu Gly Ile Pro Glu Arg Glu Trp Met Pro GinVal

9095

AAC GGC GCG TTC AAG GCC GCG ATC AAG TTC GTG AAT TGG AGA AAGTCT

Asn Gly Ala Phe Lys Ala Ala Ile Lys Phe Val Asn Trp Arg LysSer

100 105110

CCC GAC CCC TCG CGC GAC GAT CAC TTC TAC CAT TTG TTC GGC AACGTG

Pro Asp Pro Ser Arg Asp Asp His Phe Tyr His Leu Phe Gly AsnVal

120

180

240

300

356

404

452

500

548

596

644

692

740

182 136

115 120 125

CCG AAC TGC GAC GGC GTG CCG CTT ACC CAC TAC TGG-CTG CGC AAG CGC788

Pro Asn Cys Asp Gly Val Pro Leu Thr His Tyr Trp Leu Arg Lys Arg

130 135140

GAA CAG GGC TTC CAG CAG CCG ATG GAG TAC GCG TGC TAC CCG CAG CCC836

Glu Gin Gly Phe Gin Gin Pro Met Glu Tyr Ala Cys Tyr Pro Gin Pro

145 150 155160

GGG GCA CTC GAC GGC AAG CTG GCA CCG TGC CTG TCC GAC GGC ACC CGC884

Gly Ala Leu Asp Gly Lys Leu Ala Pro Cys Leu Ser Asp Gly ThrArg

165 170175

CAG ATG TCC CAC GCG TGG CAC TTC GAC GCG CAC CTG GTG GCC GAC TTC932

Gin Met Ser His Ala Trp His Phe Asp Ala His Leu Val Ala AspPhe

180 185190

TTG AAG CGC TGG GCC GTC GAG CGC GGG GTG AAC CGC GTG GTC GAT GAG980

Leu Lys Arg Trp Ala Val Glu Arg Gly Val Asn Arg Val Val AspGlu

195 200205

GTG GTG GAC GTT CGC CTG AAC AAC CGC GGC TAC ATC TCC AAC CTG CTC1028

Val Val Asp Val Arg Leu Asn Asn Arg Gly Tyr Ile Ser Asn LeuLeu

210 215220

ACC AAG GAG GGG CGG ACG CTG GAG GCG GAC CTG TTC ATC GAC TGC TCC1076

Thr Lys Glu Gly Arg Thr Leu Glu Ala Asp Leu Phe Ile Asp CysSer

225 230 235240

GGC ATG CGG GGG CTC CTG ATC AAT CAG GCG CTG AAG GAA CCC TTC ATC1124

Gly Met Arg Gly Leu Leu Ile Asn Gin Ala Leu Lys Glu Pro PheIle

245 250255

GAC ATG TCC GAC TAC CTG CTG TGC GAC AGC GCG GTC GCC AGC GCC GTG1172

Asp Met Ser Asp Tyr Leu Leu Cys Asp Ser Ala Val Ala Ser AlaVal

260 265270

CCC AAC GAC GAC GCG CGC GAT GGG GTC GAG CCG TAC ACC TCC TCG ATC1220

Pro Asn Asp Asp Ala Arg Asp Gly Val Glu Pro Tyr Thr Ser SerIle

275 280285

GCC ATG AAC TCG GGA TGG ACC TGG AAG ATT CCG ATG CTG GGC CGG TTC1268

Ala Met Asn Ser Gly Trp Thr Trp Lys Ile Pro Met Leu Gly ArgPhe

290 295300

GGC AGC GGC TAC GTC TTC TCG AGC CAT TTC ACC TCG CGC GAC CAG GCC1316

Gly Ser Gly Tyr Val Phe Ser Ser His Phe Thr Ser Arg Asp GinAla

305 310 315320

ACC GCC GAC TTC CTC AAA CTC TGG GGC CTC TCG GAC AAT CAG CCG CTC1364

Thr Ala Asp Phe Leu Lys Leu Trp Gly Leu Ser Asp Asn Gin ProLeu

325 330335

AAC CAG ATC AAG TTC CGG GTC GGG CGC AAC AAG CGG GCG TGG GTC AAC 1412

182 136

Asn

Gin

Ile

Lys

Phe

Arg

Val

Gly Arg

Asn

Lys

Arg

Ala

Trp

Val

Asn

340

345

350

AAC

TGC

GTC

TCG

ATC

GGG

CTG

TCG

TCG

TGC

TTT

CTG

GAG

CCC

CTG

GAA

1460

Asn

Cys

Val

Ser

Ile

Gly

Leu

Ser

Ser

Cys

Phe

Leu

Glu

Pro

Leu

Glu

355

360

365

TCG

ACG

GGG

ATC

TAC

TTC

ATC

TAC

GCG

GCG

CTT

TAC

CAG

CTC

GTG

AAG

1508

Ser

Thr

Gly

Ile

Tyr

Phe

Ile

Tyr

Ala

Ala

Leu

Tyr

Gin

Leu

Val

Lys

370

375

380

CAC

TTC

CCC

GAC

ACC

TCG

TTC

GAC

CCG

CGG

CTG

AGC

GAC

GCT

TTC

AAC

1556

His

Phe

Pro

Asp

Thr

Ser

Phe

Asp

Pro

Arg

Leu

Ser

Asp

Ala

Phe

Asn

385

390

395

400

GCC

GAG

ATC

GTC

CAC

ATG

TTC

GAC

GAC

TGC

CGG

GAT

TTC

GTC

CAA GCG

1604

Ala

Glu

Ile

Val

His

Met

Phe

Asp

Asp

Cys

Arg Asp

Phe

Val

Gin

Ala

405

410

415

CAC

TAT

TTC

ACC

ACG

TCG

CGC

GAT

GAC

ACG

CCG

TTC

TGG

CTC

GCG

AAC

1652

His

Tyr

Phe

Thr

Thr

Ser

Arg Asp Asp

Thr

Pro

Phe

Trp

Leu

Ala

Asn

420

425

430

CGG

CAC

GAC

CTG

CGG

CTC

TCG

GAC

GCC

ATC

AAA

GAG

AAG

GTT

CAG

CGC

1700

Arg

His

Asp

Leu

Arg

Leu

Ser

Asp

Ala

Ile

Lys

Glu

Lys

Val

Gin

Arg

435

440

445

TAC

AAG

GCG

GGG

CTG

CCG

CTG

ACC

ACC

ACG

TCG

TTC

GAC

GAT

TCC

ACG

1748

Tyr

Lys

Ala

Gly

Leu

Pro

Leu

Thr

Thr

Thr

Ser

Phe

Asp Asp

Ser

Thr

450

455

460

TAC

TAC

GAG

ACC

TTC

GAC

TAC

GAA

TTC

AAG

AAT

TTC

TGG

TTG

AAC

GGC

1796

Tyr

Tyr

Glu

Thr

Phe

Asp

Tyr

Glu

Phe

Lys

Asn

Phe

Trp

Leu

Asn

Gly

465

470

475

480

AAC

TAC

TAC

TGC

ATC

TTT

GCC

GGC

TTG

GGC

ATG

CTG

CCC

GAC

CGG

TCG

1844

Asn

Tyr Tyr

Cys

Ile

Phe

Ala

Gly

Leu

Gly

Met

Leu

Pro

Asp Arg

Ser

485

490

495

CTG

CCG

CTG

TTG

CAG

CAC

CGA

CCG

GAG

TCG

ATC

GAG

AAA

GCC

GAG

GCG

1892

Leu

Pro

Leu

Leu

Gin

His

Arg

Pro

Glu

Ser

Ile

Glu

Lys

Ala

Glu

Ala

500

505

510

ATG

TTC

GCC

AGC

ATC

CGG

CGC

GAG

GCC

GAG

CGT

CTG

CGC

ACC

AGC

CTG

1940

Met

Phe

Ala

Ser

Ile

Arg Arg

Glu

Ala

Glu

Arg

Leu

Arg

Thr

Ser

Leu

515

520

525

CCG

ACA

AAC

TAC

GAC

TAC

CTG

CGG

TCG

CTG

CGT

GAC

GGC

GAC

GCG

GGG

1988

Pro

Thr

Asn

Tyr Asp

Tyr

Leu

Arg

Ser

Leu

Arg Asp

Gly Asp

Ala

Gly

530

535

540

CTG

TCG

CGC

GGC

CAG

CGT

GGG

CCG

AAG

CTC

GCA

GCG

CAG GAA

AGC

CTG

2036

Leu

Ser

Arg Gly Gin Arg

Gly

Pro

Lys

Leu

Ala

Ala

Gin

Glu

Ser

Leu

545

550

555

560

182 136

TAGTGGAACG CACCTTGGAC CGGGTAGGCG TATTCGCGGC CACCCACGCT GCCGTGGCGG2096

CCTGCGATCC GCTGCAGGCG CGCGCGCTCG TTCTGCAACT GCCGGGCCTG AACCGTAACA2156

AGGAOGTGCC CGGTATCGTC GGCCTGCTGC GCGAGTTCCT TCCGGTGCGC GGCCTGCCCT2216

GCGGCTGGGG TTTCGTCGAA GCCGCCGCCG CG ATG CGG GAC ATC GGG TTC TTC2269

Met Arg Asp Ile Gly Phe Phe

CTG GGG TCG CTC AAG CGC CAC GGA CAT GAG CCC GCG GAG GIG GTG CCC 2317

Leu Gly Ser Leu Lys Arg His Gly His Glu Pro Ala Glu Val Val Pro 10 1520

GGG ΟΓΤ GAG CCG GTG CTG CTC GAC CTG GCA CGC GCG ACC AAC CTG CCG2365

Gly Leu Glu Pro Val Leu Leu Asp Leu Ala Arg Ala Thr Asn Leu Pro

3035

CCG CGC GAG ACG CTC CTG CAT GTG ACG GTC TGG AAC CCC ACG GCG GCC2413

Pro Arg Glu Thr Leu Leu His Val Thr Val Trp Asn Pro Thr Ala Ala

45 5055

GAC GCG CAG CGC AGC TAC ACC GGG CTG CCC GAC GAA GCG CAC CTG CTC2461

Asp Ala Gin Arg Ser Tyr Thr Gly Leu Pro Asp Glu Ala His LeiiLeu

6570

GAG AGC GTG CGC ATC TCG ATG GCG GCC CTC GAG GCG GCC ATC GCG TTG2509

Glu Ser Val Arg Ile Ser Met Ala Ala Leu Glu Ala Ala Ile AlaLeu

8085

ACC GTC GAG CTG TTC GAT GTG TCC CTG CGG TCG CCC GAG TTC GCG CAA2557

Thr Val Glu Leu Phe Asp Val Ser Leu Arg Ser Pro Glu Phe AlaGin

95100

AGG TGC GAC GAG CTG GAA GCC TAT CTG CAG AAA ATG GTC GAA TCG ATC2605

Arg Cys Asp Glu Leu Glu Ala Tyr Leu Gin Lys Met Val Glu SerIle

105 110115

GTC TAC GCG TAC CGC TTC ATC TCG CCG CAG GTC TTC TAC GAT GAG CTG2653

Val Tyr Ala Tyr Arg Phe Ile Ser Pro Gin Val Phe Tyr Asp GluLeu

120 125 130135

CGC CCC TTC TAC GAA CCG ATT CGA GTC GGG GGC CAG AGC TAC CTC GGC2701

Arg Pro Phe Tyr Glu Pro Ile Arg Val Gly Gly Gin Ser Tyr LeuGly

140 145150

CCC GGT GCC GTA GAG ATG CCC CTC TTC GTG CTG GAG CAC GTC CTC TGG2749

Pro Gly Ala Val Glu Met Pro Leu Phe Val Leu Glu His Val LeuTrp

155 160165

GGC TCG CAA TCG GAC GAC CAA ACT TAT CGA GAA TTC AAA GAG ACG TAC2797

Gly Ser Gin Ser Asp Asp Gin Thr Tyr Arg Glu Phe Lys Glu ThrTyr

170 175180

CTG CCC TAT GTG CTT CCC GCG TAC AGG GCG GTC TAC GCT CGG TTC TCC 2845

182 136

Leu

Pro 185

Tyr Val

Leu

Pro

Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Arg Phe Ser

190

195

GGG

GAG

CCG

GCG

CTC

ATC

GAC

CGC

GCG

CTC

GAC

GAG

GCG

CGA

GCG

GTC

2893

Gly

Glu

Pro

Ala

Leu

Ile

Asp Arg

Ala

Leu

Asp

Glu

Ala

Arg

Ala

Val

200

205

210

215

GGT

ACG

CGG

GAC

GAG

CAC

GTC

CGG

GCT

GGG

CTG

ACA

GCC

CTC

GAG

CGG

2941

Gly

Thr

Arg Asp

Glu

His

Val

Arg

Ala

Gly

Leu

Thr

Ala

Leu

Glu

Arg

220

225

230

GTC

TTC

AAG

GTC

CTG

CTG

CGC

TTC

CGG

GCG

CCT

CAC

CTC

AAA

TTG

GCG

2989

Val

Phe

Lys

Val

Leu

Leu

Arg

Phe

Arg

Ala

Pro

His

Leu

Lys

Leu

Ala

235

240

245

GAG

CGG

GCG

TAC

GAA

GTC

GGG

CAA

AGC

GGC

CCG

AAA

TCG

GCA

GCG

GGG

3037

Glu

Arg

Ala

Tyr

Glu

Val

Gly

Gin

Ser

Gly

Pro

Lys

Ser

Ala

Ala

Gly

250

255

260

GGT

ACG

CGC

CCA

GCA

TGC

TCG

GTG AGC

TGC

TCA

CGC

TGACGTATGC

3083

Gly

Thr

Arg

Pro

Ala

Cys

Ser Val Ser Cys

Ser Arg

265

270

275

CGCGCGGTCC CGCGTCCGCG CCGCGCTCGA CGAATOCTGA TGCGCGCGAC (

3CAGTGTTAT

3143

CTCACAAGGA GAGTTTGCCC CC ATG ACT CAG AAG AGC CO

: GCG AAC GAA CAC

3195

Met

l Tłu

r Gin Lys Ser Pro Ala Asn Glu His

1

5

10

GAT

AGC

AAT

CAC

TTC

GAC

GTA ATC

ATC

CTC

GGC

TCG

GGC ATG

TCC

GGC

3243

Asp

Ser

Asn

His

Phe

Asp

Val

Ile

Ile

Leu

Gly

Ser

Gly Met

Ser

Gly

15

20

25

ACC

CAG

ATG

GGG

GCC

ATC

TTG

GCC

AAA

CAA

CAG

TTT

CGC

GTG

CTG

ATC

3291

Thr

Gin

Met

Gly Ala

Ile

Leu

Ala

Lys

Gin

Gin

Phe

Arg

Val

Leu

Ile

30

35

40

ATC

GAG

GAG

TCG

TCG

CAC

CCG

CGG

TTC

ACG

ATC

GGC

GAA

TCG

TCG

ATC

3339

Ile

Glu

Glu

Ser

Ser

His

Pro

Arg

Phe

Thr

Ile

Gly

Glu

Ser

Ser

Ile

45

50

55

CCC

GAG

ACG

TCT

CTT

ATG

AAC

CGC

ATC

ATC

GCT

GAT

CGC

TAC

GGC

ATT

3387

Pro

Glu

Thr

Ser

Leu

Met

Asn

Arg

Ile

Ile

Ala

Asp Arg Tyr

Gly

Ile

60

65

70

CCG

GAG

CTC

GAC

CAC

ATC

ACG

TCG

TTT

TAT

TCG

ACG

CAA

CGT

TAC

GTC

3435

Pro

Glu

Leu

Asp

His

Ile

Thr

Ser

Phe

Tyr

Ser

Thr

Gin

Arg Tyr

Val

75

80

85

90

GCG

TCG

AGC

ACG

GGC

ATT

AAG

CGC

AAC

TTC

GGC

TTC

GTG

TTC

CAC

AAG

3483

Ala

Ser

Ser

Thr

Gly

Ile

Lys

Arg

Asn

Phe

Gly

Phe

Val

Phe

His

Lys

95

100

105

CCC

GGC

CAG

GAG

CAC

GAC

CCG

AAG

GAG

TTC

ACC

CAG

TGC

GTC

ATT

CCC

3531

Pro

Gly

Gin

Glu

His

Asp

Pro

Lys

Glu

Phe

Thr

Gin

Cys

Val

Ile

Pro

182 136

110115

GAG CTG CCG TGG GGG CCG GAG AGC CAT

Glu Leu Pro Trp Gly Pro Glu Ser His 125130

GCC TAC TTG TTG CAA GCC GCC ATT AAA

Ala Tyr Leu Leu Gin Ala Ala Ile Lys 140145

AAA ACT ACC GTG ACC GAA TAC CAC GCC Lys Thr Thr Val Thr Glu Tyr His Ala 155160

ACC ACC GCC CAG GGC GAA CGG TTC ACC

Thr Thr Ala Gin Gly Glu Arg Phe Thr 175

GGA GGA CCT CGC GCG CCG CTC GCG ACC

Gly Gly Pro Arg Ala Pro Leu Ala Thr 190195

CCG TGT CGC TTC AAG ACG CAC TCG CGC Pro Cys Arg Phe Lys Thr His Ser Arg 205210

GGG GTC AAG CCG TTC GAC GAC ATC TTC

Gly Val Lys Pro Phe Asp Asp Ile Phe 220225

CGC TGG CAC GAG GGG ACC TTG CAC CAC Arg Trp His Glu Gly Thr Leu His His 235240

TGG GTG ATT CCG TTC AAC AAC CAC CCG

Trp Val Ile Pro Phe Asn Asn His Pro 255

AGC GTC GGC CTG CAG CTC GAC CCG CGT Ser Val Gly Leu Gin Leu Asp Pro Arg 270275

TCC GCA CAG CAG GAA TTC GAT GAG TTC

Ser Ala Gin Gin Glu Phe Asp Glu Phe 285290

GGG GCT CAG TTC CGG GAC GCC GTG CCG

Gly Ala Gin Phe Arg Asp Ala Val Pro 300305

GAC CGC CTG CAA TTC TCG TCG AAC GCC Asp Arg Leu Gin Phe Ser Ser Asn Ala 315320

CTG ATG CTG CAC GCG AAC GGC TTC ATC

120

TAT TAC CGG CAA GAC GTC GAC 3579

Tyr Tyr Arg Gin Asp Val Asp

135

TAC GGC TGC AAG GTC CAC CAG 3627

Tyr Gly Cys Lys Val His Gin

150

GAT AAA GAC GGC GTC GCG GTG 3675

Asp Lys Asp Gly Val Ala Val 165 170

GGC CGG TAC ATG ATC GAC TGC 3723

Gly Arg Tyr Met He Asp Cys

180 185

AAG TTC AAG CTC CGC GAA GAA 3771

Lys Phe Lys Leu Arg Glu Glu 200

AGC CTC TAC ACG CAC ATG CTC 3819

Ser Leu Tyr Thr His Met Leu 215

AAG GTC AAG GGG CAG CGC TGG 3867

Lys Val Lys Gly Gin Arg Trp

230

ATG TTC GAG GGC GGC TGG CTC 3915

Met Phe Glu Gly Gly Trp Leu 245 250

CGG TCG ACC AAC AAC CTG GTG 3963

Arg Ser Thr Asn Asn Leu Val

260 265

GTC TAC CCG AAA ACC GAC ATC 4011

Val Tyr Pro Lys Thr Asp Ile 280

CTC GCG CGG TTC CCG AGC ATC 4059

Leu Ala Arg Phe Pro Ser Ile 295

GTG CGC GAC TGG GTC AAG ACC 4107

Val Arg Asp Trp Val Lys Thr

310

TGC GTC GGC GAC CGC TAC TGC 4155

Cys Val Gly Asp Arg Tyr Cys

325 330

GAC CCG CTC TTC TCC CGG GGG 4203

182 136

Leu	Met	Leu His Ala Asn	Gly Phe Ile Asp Pro Leu Phe Ser Arg Gly
335	340	345
CTG	GAA	AAC ACC GCG GTG	ACC ATC CAC GCG	CTC GCG GCG CGC CTC ATC 4251
Leu	Glu	Asn Thr Ala Val 350	Thr Ile His Ala 355	Leu Ala Ala Arg Leu Ile 360
AAG	GCG	CTG CGC GAC GAC	GAC TTC TCC CCC	GAG CGC TTC GAG TAC ATC 4299
Lys	Ala	Leu Arg Asp Asp 365	Asp Phe Ser Pro 370	Glu Arg Phe Glu Tyr Ile 375
GAG	CGC	CTG CAG CAA AAG	CTT TTG GAC CAC	AAC GAC GAC TTC GTC AGC 4347
Glu	Arg 380	Leu Gin Gin Lys	Leu Leu Asp His 385	Asn Asp Asp Phe Val Ser 390
TGC	TGC	TAC ACG GCG TTC	TOG GAC TTC CGC	CTA TGG GAC GCG TTC CAC 4395
Cys 395	cys	Tyr Thr Ala Phe 400	Ser Asp Phe Arg	Leu Trp Asp Ala Phe His 405 410
AGG	CTG	TGG GCG GTC GGC	ACC ATC CTC GGG	CAG TTC CGG CTC GTG CAG 4443
Arg	Leu	Trp Ala Val Gly 415	Thr Ile Leu Gly 420	Gin Phe Arg Leu Val Gin 425
GCC	CAC	GCG AGG TTC CGC	GCG TCG CGC AAC	GAG GGC GAC CTC GAT CAC 4491
Ala	His	Ala Arg Phe Arg 430	Ala Ser Arg Asn 435	Glu Gly Asp Leu Asp His 440
CTC	GAC	AAC GAC CCT CCG	TAT CTC GGA TAC	CTG TGC GCG GAC ATG GAG 4539
Leu	Asp	Asn Asp Pro Pro 445	Tyr Leu Gly Tyr 450	Leu Cys Ala Asp Met Glu 455
GAG	TAC	TAC CAG TTG TTC	AAC GAC GCC AAA	GCC GAG GTC GAG GCC GTG 4587
Glu	Tyr 460	Tyr Gin Leu Phe	Asn Asp Ala Lys 465	Ala Glu Val Glu Ala Val 470
AGT	GCC	GGG CGC AAG CCG	GCC GAT GAG GCC	GCG GCG CGG ATT CAC GCC 4635
Ser 475	Ala	Gly Arg Lys Pro 480	Ala Asp Glu Ala	Ala Ala Arg Ile His Ala 485 490
CTC	ATT	GAC GAA CGA GAC	TTC GCC AAG CCG	ATG TTC GGC TTC GGG TAC 4683
Leu	Ile	Asp Glu Arg Asp 495	Phe Ala Lys Pro 500	Met Phe Gly Phe Gly Tyr 505
TGC	ATC	ACC GGG GAC AAG	CCG CAG CTC AAC	AAC TCG AAG TAC AGC CTG 4731
Cys	Ile	Thr Gly Asp Lys 510	Pro Gin Leu Asn 515	Asn Ser Lys Tyr Ser Leu 520
CTG	CCG	GCG ATG CGG CTG	ATG TAC TGG ACG	CAA ACC CGC GCG CCG GCA 4779
Leu	Pro	Ala Met Arg Leu 525	Met Tyr Trp Thr 530	Gin Thr Arg Ala Pro Ala 535
GAG	GTG	AAA AAG TAC TTC	GAC TAC AAC CCG	ATG TTC GCG CTG CTC AAG 4827
Glu	Val 540	Lys Lys Tyr Phe	Asp Tyr Asn Pro 545	Met Phe Ala Leu Leu Lys 550

182 136

GCG TAC ATC ACG ACC CGC ATC GGC CTG GCG CTG AAG AAG TAGCCGCTCG4876

Ala Tyr Ile Thr Thr Arg Ile Gly Leu Ala Leu Lys Lys

555 560565

ACGACGACAT AAAAACG ATG AAC GAC ATT CAA TTG GAT CAA GCG AGC GTC4926

Met Asn Asp Ile Gin Leu Asp Gin Ala SerVal

1510

AAG AAG CGT CCC TCG GGC GCG TAC GAC GCA ACC ACG CGC CTG GCC GCG4974

Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ala Tyr Asp Ala Thr Thr Arg Leu AlaAla

2025

AGC TGG TAC GTC GCG ATG CGC TCC AAC GAG CTC AAG GAC AAG CCG ACC5022

Ser Trp Tyr Val Ala Met Arg Ser Asn Glu Leu Lys Asp Lys ProThr

3540

GAG TTG ACG CTC TTC GGC CGT CCG TGC GTG GCG TGG CGC GGA GCC ACG5070

Glu Leu Thr Leu Phe Gly Arg Pro Cys Val Ala Trp Arg Gly AlaThr

50 55'

GGG CGG GCC GTG GTG ATG GAC CGC CAC TGC TCG CAC CTG GGC GCG AAC5118

Gly Arg Ala Val Val Met Asp Arg His Cys Ser His Leu Gly AlaAsn

65 7075

CTG GCT GAC GGG CGG ATC AAG GAC GGG TGC ATC CAG TGC CCG TTT CAC5166

Leu Ala Asp Gly Arg Ile Lys Asp Gly Cys Ile Gin Cys Pro PheHis

8590

CAC TGG CGG TAC GAC GAA CAG GGC CAG TGC GTT CAC ATC CCC GGC CAT5214

His Trp Arg Tyr Asp Glu Gin Gly Gin Cys Val His Ile Pro GlyHis

100105

AAC CAG GCG GTG CGC CAG CTG GAG CCG GTG CCG CGC GGG GCG CGT CAG5262

Asn Gin Ala Val Arg Gin Leu Glu Pro Val Pro Arg Gly Ala ArgGin

110 115120

CCG ACG TTG GTC ACC GCC GAG CGA TAC GGC TAC GTG TGG GTC TGG TAC5310

Pro Thr Leu Val Thr Ala Glu Arg Tyr Gly Tyr Val Trp Val TrpTyr

125 130135

GGC TCC CCG CTG CCG CTG CAC CCG CTG CCC GAA ATC TCC GCG GCC GAT5358

Gly Ser Pro Leu Pro Leu His Pro Leu Pro Glu Ile Ser Ala AlaAsp

140 145 150155

GTC GAC AAC GGC GAC TTT ATG CAC CTG CAC TTC GCG TTC GAG ACG ACC5406

Val Asp Asn Gly Asp Phe Met His Leu His Phe Ala Phe Glu ThrThr

160 165170

ACG GCG GTC TTG CGG ATC GTC GAG AAC TTC TAC GAC GCG CAG CAC GCA5454

Thr Ala Val Leu Arg Ile Val Glu Asn Phe Tyr Asp Ala Gin HisAla

175 180185

ACC CCG GTG CAC GCA CTC CCG ATC TCG GCC TTC GAA CTC AAG CTC TTC5502

Thr Pro Val His Ala Leu Pro Ile Ser Ala Phe Glu Leu Lys LeuPhe

190 195200

182 136

GAC GAT TGG CGC CAG TGG CCG GAG GTT GAG TCG CTG GCC CTG GCG GGC 5550

Asp Asp Trp Arg Gin Trp Pro Glu Val Glu Ser Leu Ala Leu Ala Gly 205 210215

GCG TGG TTC GGT GCC GGG ATC GAC TTC ACC GTG GAC CGG TAC TTC GGC5598

Ala Trp Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Thr Val Asp Arg Tyr PheGly

220 225 230235

CCC CTC GGC ATG CTG TCA CGC GCG CTC GGC CTG AAC ATG TCG CAG ATG5646

Pro Leu Gly Met Leu Ser Arg Ala Leu Gly Leu Asn Met Ser GinMet

240 245250

AAC CTG CAC TTC GAT GGC TAC COC GGC GGG TGC GTC ATG ACC GTC GCC5694

Asn Leu His Phe Asp Gly Tyr Pro Gly Gly Cys Val Met Thr ValAla

255 260265

CTG GAC GGA GAC GTC AAA TAC AAG CTG CTC CAG TGT GTG ACG CCG GTG5742

Leu Asp Gly Asp Val Lys Tyr Lys Leu Leu Gin Cys Val Thr ProVal

270 275280

AGC GAA GGC AAG AAC GTC ATG CAC ATG CTC ATC TCG ATC AAG AAG GTG5790

Ser Glu Gly Lys Asn Val Met His Met Leu Ile Ser Ile Lys LysVal

285 290295

GGC GGC ATC CTG CTC CGC GCG ACC GAC TTC GTG CTG TTC GGG CTG CAG5838

Gly Gly Ile Leu Leu Arg Ala Thr Asp Phe Val Leu Phe Gly LeuGin

300 305 310315

ACC AGG CAG GCC GCG GGG TAC GAC GTC AAA ATC TGG AAC GGA ATG AAG5886

Thr Arg Gin Ala Ala Gly Tyr Asp Val Lys Ile Trp Asn Gly MetLys

320 325330

CCG GAC GGC GGC GGC GCG TAC AGC AAG TAC GAC’ AAG CTC GTG CTC AAG5934

Pro Asp Gly Gly Gly Ala Tyr Ser Lys Tyr Asp Lys Leu Val LeuLys

335 340345

TAC CGG GCG TTC TAT CGA GGC TGG GTC GAC CGC GTC GCA AGT GAG CGG5982

Tyr Arg Ala Phe Tyr Arg Gly Trp Val Asp Arg Val Ala Ser GluArg

350 355360

TGATGCGTGA AGCCGAGCOG CTCTCGACCG CGTCGCTGCG CCAGGCGCTC GCGAACCTGG6042

CGAGCGGCGT GACGATCACG GCCTACGGCG CGCCGGGCCC GCTTGGGCTC GCGGCCACCA6102

GCTTCGTGTC GGAGTCGCTC TTTGCGAGGT ATTCATGACT ATCTGGCTGT TGCAACTCGT6162

GCTGGTGATC GCGCTCTGCA ACGTCTGCGG CCGCATTGCC GAACGGCTCG GCCAGTGCGC6222

GGTCATCGGC GAGATCGCGG CCGGTTTGCT GTTGGGGCCG TCGCTGTTCG GCGTGATCGC6282

ACCGAGTTTC TACGACCTGT TGTTCGGCCC CCAGGTGCTG TCAGCGATGG CGCAAGTCAG6342

CGAAGTCGGC CTGGTACTGC TGATGTTCCA GGTCGGCCTG CATATGGAGT TGGGCGAGAC6402

182 136

GCTGCGCGAC AAGCGCTGGC GCATGCCCGT

GGCCGCGATC GGCATGATCG TCGCCATCGT

GGCGCTGCCC TATGTGCTCT TCTGCGGTGT

GGCGCGCATC ATCGACGACC TGGAGCTCAG

TGCCGCGATG CTGACGGATG CGCTCGGATG

GAGCGGGCCC GGCTGGGCAT TTGCGCGCAT

GTGCGCGCTG CTGGTGCGCT TOGTGGTTCG

GCA'PGCGACG CGCGACCGCT TGGCCGTGTT

GACGTCGCTG ATCGGATTCC ATAGCGCTTT

CCGGGTGCCC GGCGTCGCGA AGGAGTGGCG

CGCGATCGCA GCGGGCGGGC TCGTCGCACC

TTCGAAAGGC ACGCTCGCCA GCGACGCGCC

CGCACTTGCG GTATCGGCGG TGCCGGTGAT

CGCCATGGTG GGCGCGCGGC ACGCAATGTC

GATGCTGCTT GCAACGATTG CCTCGCTATC

GCTCGTCAGC CTGCTCGCGT ATCTGGTGCT

ACCGACCCTT GCGCGGCTCG CGTCGACCGC

GTTCTGCTTC GTAATGTTGT CGGCACTCGC

TGGCGCACTT GCCGCGGCGC TGTTCGTGCG

CGACAACGTC GAAGGTTTCG TCAAGCTT

6462

6522

6582

6642

6702

6762

6822

6882

6942

7000 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 560 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 2

Met 1

Asp Ala Arg Arg 5

Leu

Ala Ala

Ser

Pro 10

Arg

His

Arg Arg

Pro 15

Ala

Phe

Asp Thr Arg 20

Ser

Val

Met

Asn

Lys 25

Pro

Ile

Lys

Asn

Ile 30

Val

Ile

Val

Gly

Gly 35

Gly

Thr

Ala

Gly

Trp 40

Met

Ala

Ala

Ser

Tyr 45

Leu

Val

Arg

Ala

Leu 50

Gin

Gin

Gin

Ala

Asn 55

Ile

Thr

Leu

Ile

Glu 60

Ser

Ala

Ala

Ile

Pro 65

Arg

Ile

Gly Val Gly Glu 70

Ala

Thr

Ile

Pro 75

Ser

Leu

Gin

Lys

Val 80

Phe

Phe

Asp

Phe

Leu 85

Gly Ile

Pro

Glu

Arg 90

Glu

Trp

Met

Pro

Gin 95

Val

Asn

Gly

Ala

Phe 100

Lys

Ala Ala

Ile

Lys 105

Phe

Val

Asn

Trp

Arg 110

Lys

Ser

Pro

Asp

Pro 115

Ser

Arg Asp

Asp

His 120

Phe

Tyr

His

Leu

Phe Gly 125

Asn

Val

182 136

Pro

Asn 130

Cys

Asp Gly Val

Pro 135

Leu

Thr

His

Tyr

Trp 140

Leu Arg Lys

Arg

Glu 145

Gin

Gly

Phe

Gin

Gin 150

Pro

Met

Glu

Tyr

Ala 155

cys

Tyr Pro

Gin

Pro 160

Gly

Ala

Leu

Asp

Gly 165

Lys

Leu

Ala

Pro

cys 170

Leu

Ser

Asp Gly

Thr 175

Arg

Gin

Met

Ser

His 180

Ala

Trp

His

Phe

Asp 185

Ala

His

Leu

Val

Ala 190

Asp

Phe

Leu

Lys

Arg 195

Trp

Ala

Val

Glu

Arg Gly 200

Val

Asn

Arg

Val 205

Val

Asp

Glu

Val

Val 210

Asp Wal Arg

Leu

Asn 215

Asn

Arg Gly Tyr

Ile 220

Ser

Asn

Leu

Leu

Thr 225

Lys

Glu Gly Arg

Thr 230

Leu

Glu

Ala

Asp

Leu 235

Phe

Ile

Asp

cys

Ser 240

Gly

Met

Arg Gly Leu 245

Leu

Ile

Asn

Gin

Ala 250

Leu

Lys

Glu

Pro

Phe 255

Ile

Asp

Met

Ser

Asp 260

Tyr

Leu

Leu

cys

Asp 265

Ser

Ala

Val

Ala

Ser 270

Ala

Val

Pro

Asn

Asp Asp 275

Ala

Arg Asp Gly 280

Val

Glu

Pro

Tyr

Thr 285

Ser

Ser

Ile

Ala

Met 290

Asn

Ser

Gly Trp

Thr 295

Trp

Lys

Ile

Pro

Met 300

Leu

Gly Arg

Phe

Gly 305

Ser

Gly Tyr

Val

Phe 310

Ser

Ser

His

Phe

Thr 315

Ser

Arg Asp

Gin

Ala 320

Thr

Ala

Asp

Phe

Leu 325

Lys

Leu

Trp Gly

Leu 330

Ser

Asp

Asn

Gin

Pro 335

Leu

Asn

Gin

Ile

Lys 340

Phe

Arg

Val

Gly

Arg 345

Asn

Lys Arg

Ala

Trp 350

Val

Asn

Asn

Cys

Val 355

Ser

Ile

Gly

Leu

Ser 360

Ser

Cys

Phe

Leu

Glu 365

Pro

Leu

Glu

Ser

Thr 370

Gly

Ile

Tyr

Phe

Ile 375

Tyr

Ala

Ala

Leu

Tyr 380

Gin

Leu

Val

Lys

His 385

Phe

Pro

Asp

Thr

Ser 390

Phe

Asp

Pro

Arg

Leu 395

Ser

Asp

Ala

Phe

Asn 400

Ala

Glu

Ile

Val

His

Met

Phe

Asp Asp Cys Arg Asp

Phe

Val

Gin

Ala

405 410 415

182 136

His Tyr Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asp Thr Pro Phe Trp Leu Ala Asn

420 425 430

Arg His Asp Leu Arg Leu Ser Asp Ala Ile Lys Glu Lys Val Gin Arg 435 440445

Tyr Lys Ala Gly Leu Pro Leu Thr Thr Thr Ser Phe Asp Asp Ser Thr 450 455460

Tyr Tyr Glu Thr Phe Asp Tyr Glu Phe Lys Asn Phe Trp Leu AsnGly

465 470 475480

Asn Tyr Tyr Cys Ile Phe Ala Gly Leu Gly Met Leu Pro Asp ArgSer

485 490495

Leu Pro Leu Leu Gin His Arg Pro Glu Ser Ile Glu Lys Ala Glu Ala 500 505510

Met Phe Ala Ser Ile Arg Arg Glu Ala Glu Arg Leu Arg Thr Ser Leu 515 520525

Pro Thr Asn Tyr Asp Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Asp Gly Asp Ala Gly 530 535540

Leu Ser Arg Gly Gin Arg Gly Pro Lys Leu Ala Ala Gin Glu Ser Leu 545 550 555560 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 275 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 3

Glu Pro Ala Glu Val Val Pro Gly Leu Glu Pro Val Leu Leu Asp Leu 20 2530

Ala Arg Ala Thr Asn Leu Pro Pro Arg Glu Thr Leu Leu His Val Thr 35 4045

Val Trp Asn Pro Thr Ala Ala Asp Ala Gin Arg Ser Tyr Thr Gly Leu 50 5560

Pro Asp Glu Ala His Leu Leu Glu Ser Val Arg Ile Ser Met Ala Ala 65 70 7580

Leu Glu Ala Ala Ile Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Asp Val Ser Leu

182 136

9095

Arg Ser Pro Glu Phe Ala Gin Arg Cys Asp Glu Leu Glu Ala Tyr Leu 100 105110

Gin Lys Met Val Glu Ser Ile Val Tyr Ala Tyr Arg Phe Ile Ser Pro 115 120125

Gin Val Phe Tyr Asp Glu Leu Arg Pro Phe Tyr Glu Pro Ile Arg Val 130 135140

Gly Gly Gin Ser Tyr Leu Gly Pro Gly Ala Val Glu Met Pro LeuPhe

145 150 155160

Val Leu Glu His Val Leu Trp Gly Ser Gin Ser Asp Asp Gin ThrTyr

165 170175

Arg Glu Phe Lys Glu Thr Tyr Leu Pro Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Arg 180 185190

Ala Val Tyr Ala Arg Phe Ser Gly Glu Pro Ala Leu Ile Asp Arg Ala 195 200205

Leu Asp Glu Ala Arg Ala Val Gly Thr Arg Asp Glu His Val Arg Ala 210 215220

Gly Leu Thr Ala Leu Glu Arg Val Phe Lys Val Leu Leu Arg PheArg

225 230 235240

Ala Pro His Leu Lys Leu Ala Glu Arg Ala Tyr Glu Val Gly GinSer

245 250255

Gly Pro Lys Ser Ala Ala Gly Gly Thr Arg Pro Ala Cys Ser Val Ser 260 265270

Cys Ser Arg

275 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 567 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 4

Met Thr Gin Lys Ser Pro Ala Asn Glu His Asp Ser Asn His Phe Asp 15 10 15

Val Ile Ile Leu Gly Ser Gly Met Ser Gly Thr Gin Met Gly Ala Ile 20 25 30

182 136

Leu

Ala

Lys 35

Gin

Gin

Phe Arg

Val 40

Leu

Ile

Ile

Glu

Glu 45

Ser

Ser

His

Pro

Arg 50

Phe

Thr

Ile

Gly Glu 55

Ser

Ser

Ile

Pro

Glu 60

Thr

Ser

Leu

Met

Asn 65

Arg

Ile

Ile

Ala

Asp Arg Tyr Gly 70

Ile

Pro 75

Glu

Leu

Asp

His

Ile 80

Thr

Ser

Phe

Tyr

Ser 85

Thr Gin

Arg Tyr

Val 90

Ala

Ser

Ser

Thr

Gly 95

Ile

Lys

Arg

Asn

Phe 100.

Gly

Phe Val

Phe

His 105

Lys

Pro

Gly

Gin

Glu 110

His

Asp

Pro

Lys

Glu 115

Phe

Thr

Gin Cys

Val 120

Ile

Pro

Glu

Leu

Pro 125

Trp Gly

Pro

Glu

Ser 130

His

Tyr Tyr Arg Gin 135

Asp

Val

Asp

Ala

Tyr 140

Leu

Leu

Gin

Ala

Ala 145

Ile

Lys

Tyr Gly Cys Lys 150

Val

His

Gin

Lys 155

Thr

Thr

Val

Thr

Glu 160

Tyr

His

Ala

Asp

Lys 165

Asp Gly

Val

Ala

Val 170

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly Glu 175

Arg

Phe

Thr

Gly Arg Tyr Met 180

Ile

Asp cys 185

Gly Gly

Pro

Arg 190

Ala

Pro

Leu

Ala

Thr 195

Lys

Phe

Lys Leu

Arg 200

Glu Glu

Pro Cys Arg 205

Phe

Lys

Thr

His

Ser 210

Arg

Ser

Leu

Tyr Thr His 215

Met

Leu

Gly

Val 220

Lys

Pro

Phe

Asp

Asp 225

Ile

Phe

Lys

Val

Lys Gly Gin Arg Trp Arg Trp 230 235

His

Glu

Gly

Thr 240

Leu

His

His

Met

Phe 245

Glu Gly Gly Trp

Leu 250

Trp

Val

Ile

Pro

Phe 255

Asn

Asn

His

Pro

Arg 260

Ser

Thr Asn

Asn

Leu 265

Val

Ser

Val

Gly

Leu 270

Gin

Leu

Asp

Pro

Arg 275

Val

Tyr

Pro Lys

Thr 280

Asp

Ile

Ser

Ala

Gin 285

Gin

Glu

Phe

Asp

Glu 290

Phe

Leu

Ala

Arg Phe 295

Pro

Ser

Ile

Gly

Ala 300

Gin

Phe

Arg Asp

Ala 305

Val

Pro

Val

Arg

Asp Trp 310

Val

Lys

Thr

Asp Arg 315

Leu

Gin

Phe

Ser 320

182 136

Ser Asn Ala Cys Val Gly Asp Arg Tyr Cys Leu Met Leu His Ala Asn 325 330335

Gly Phe Ile Asp Pro Leu Phe Ser Arg Gly Leu Glu Asn Thr Ala Val 340 345350

Thr Ile His Ala Leu Ala Ala Arg Leu Ile Lys Ala Leu Arg Asp Asp 355 360365

Asp Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Tyr Ile Glu Arg Leu Gin Gin Lys 370 375380

Leu Leu Asp His Asn Asp Asp Phe Val Ser Cys Cys Tyr Thr Ala Phe

385 390 395400

Ser Asp Phe Arg Leu Trp Asp Ala Phe His Arg Leu Trp Ala Val Gly

405 410415

Thr Ile Leu Gly Gin Phe Arg Leu Val Gin Ala His Ala Arg Phe Arg 420 425430

Ala Ser Arg Asn Glu Gly Asp Leu Asp His Leu Asp Asn Asp Pro Pro 435 440445

Tyr Leu Gly Tyr Leu Cys Ala Asp Met Glu Glu Tyr Tyr Gin Leu Phe 450 455460

Asn Asp Ala Lys Ala Glu Val Glu Ala Val Ser Ala Gly Arg Lys Pro

465 470 475480

Ala Asp Glu Ala Ala Ala Arg Ile His Ala Leu Ile Asp Glu Arg Asp

485 490495

Phe Ala Lys Pro Met Phe Gly Phe Gly Tyr Cys Ile Thr Gly Asp Lys 500 505510

Pro Gin Leu Asn Asn Ser Lys Tyr Ser Leu Leu Pro Ala Met Arg Leu 515 520525

Met Tyr Trp Thr Gin Thr Arg Ala Pro Ala Glu Val Lys Lys Tyr Phe 530 535540

Asp Tyr Asn Pro Met Phe Ala Leu Leu Lys Ala Tyr Ile Thr Thr Arg 545 550 555560

Ile Gly Leu Ala Leu Lys Lys

565 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 363 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

182 136 (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID

Met Asn Asp Ile Gin Leu Asp Gin Ala 15

Gly Ala Tyr Asp Ala Thr Thr Arg Leu 2025

Met Arg Ser Asn Glu Leu Lys Asp Lys 3540

Gly Arg Pro Cys Val Ala Trp Arg Gly 5055

Met Asp Arg His Cys Ser His Leu Gly 6570

Ile Lys Asp Gly Cys Ile Gin Cys Pro 85

Glu Gin Gly Gin Cys Val His Ile Pro 100105

Gin Leu Glu Pro Val Pro Arg Gly Ala 115120

Ala Glu Arg Tyr Gly Tyr Val Trp Val 130135

Leu His Pro Leu Pro Glu Ile Ser Ala 145150

Phe Met His Leu His Phe Ala Phe Glu 165

Ile Val Glu Asn Phe Tyr Asp Ala Gin 180185

Leu Pro Ile Ser Ala Phe Glu Leu Lys 195200

Trp Pro Glu Val Glu Ser Leu Ala Leu 210215

Gly Ile Asp Phe Thr Val Asp Arg Tyr 225230

Ser Arg Ala Leu Gly Leu Asn Met Ser 245

Gly Tyr Pro Gly Gly Cys Val Met Thr

260265

Val Lys Lys Arg Pro Ser 15

Ala Ser Trp Tyr Val Ala 30

Thr Glu Leu Thr Leu Phe 45

Thr Gly Arg Ala Val Val 60

Asn Leu Ala Asp Gly Arg 75 80

His His Trp Arg Tyr Asp 95

His Asn Gin Ala Val Arg 110

Gin Pro Thr Leu Val Thr 125

Tyr Gly Ser Pro Leu Pro 140

Asp Val Asp Asn Gly Asp 155 160

Thr Thr Ala Val Leu Arg 175

Ala Thr Pro Val His Ala 190

Phe Asp Asp Trp Arg Gin 205

Gly Ala Trp Phe Gly Ala 220

Gly Pro Leu Gly Met Leu 235 240

Met Asn Leu His Phe Asp 255

Ala Leu Asp Gly Asp Val 270

182 136

Lys Tyr Lys Leu Leu Gin Cys Val 275280

Val Met His Met Leu Ile Ser Ile 290295

Arg Ala Thr Asp Phe Val Leu Phe 305310

Gly Tyr Asp Val Lys Ile Trp Asn 325

Ala Tyr Ser Lys Tyr Asp Lys Leu 340

Thr Pro Val Ser Glu Gly Lys Asn 285

Lys Lys Val Gly Gly Ile Leu Leu 300

Gly Leu Gin Thr Arg Gin Ala Ala 315320

Gly Met Lys Pro Asp Gly Gly Gly 330335

Val Leu Lys Tyr Arg Ala Phe Tyr 345350

Arg Gly Trp Val Asp Arg Val Ala Ser Glu Arg

355 360 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28958 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 6

CGATCGCGTC GGCCTCGACA CCGTCGAAGA GGTCACGCTC GAAGCTCCCC TCGCTCTCCC60

CTCTCAAGGC ACCATTCTCA TCCAGATCTC CGTCGGACCC ATGGACGAGG CGGGACGAAG120

GTCGCTCTCC CTCCATGGCC GGACCGAGGA CGCTCCTCAG GACGCCCCTT GGACGCGCCA180

CGCGAGCGGG TCGCTCGCTA AAGCTGCCCC OKXCTCTCC TTCGATCTTC ACGAATGGGC240

TCCTCCGGGG GGCACGCCGG TGGACACCCA AGGCTCTTAC GCAGGCX7TCG AAAGCGGGGG300

GCTCGCCTAT GGGCCTCAGT TCCAGGGACT TCGCTCCGTC TGGAAGCGCG GCGACGAGCT360

CTTCGCCGAG GCCAAGCTCC CGGACGCAGG CGCCAAGGAT GCCGCTCGGT TCGCCCTCCA420

CCCCGCCCTG TTCGACAGCG CCCTGCACGC GCTTGTCCTT GAAGACGAGC GGACGCCGGG480

CGTCGCTCTG CCCTTCTCGT GGAGAGGAGT CTCGCTGCGC TCCGTCGGCG CCACCACCCT540

GCGCGTGCGC TTCCATCGTC CGAATGGCAA GTCCTCCGTG TCGCTCCTCC TCGGCGACGC600

182 136

ΠΙΙίΠΗΗϋΗΗΠΗΗΗ

CCCCTCGCCT CGGTCCAAGC GCTCGCCACG CGCATCACGT CCCAGGAGCA 660 CAGGGAGCTT CCCTCCACGA TGCTCTCTTC CGGCTTGTCT GGAGAGATCT 720 ACGTCGCTCT CTGAGGCCCC GAAGGGTGTC CTCCTAGAGA CAGGGGGTCT 780 CTGCAGGCGT CTCTCGCCCG CTACGAOGGT CTCGCTGCCC TCCGGAGCGC 840 GGOGCTTCGC CTCCGGGCCT CGTCGTCGTC CCCTTCATCG ATTCGCCCTC 900 ATAGAGAGCG CTCACAACTC CACCGCGCGC GCCCTCGCCT TGCTGCAAGC 960 GACGAACGCC TCG2CTCCTC GCGCCTCGTC CTGCTCACCC GACAGGCCAT 1020 CCCGACGAGG ACGTCCTCGA CCTCCCTCAC GCTCCTCTCT GGGGCCTTGT 1080 CAAAGOGAAC ACCCGGAGCT- CCCTCTCTTC CTCGTCGACC TGGACCTCGG 1140 GAGCGOGCCC TGCTCGGCGC GCTCGACACA GGAGAGCGTC AGCTCGCTCT 1200 AAATGCCTCG TCCCGAGGTT GGTGAATGCA CGCTCGACAG AGGCGCTCAT 1260 GTATCCAOGT GGAGCCTTCA TATCCCGACC AAAGGCACCT TCGACTCGCT 1320 GACGCTCCTC TAGCCCGTGC GCCCCTCGCA. CAAGGCCAAG TCCGCGTCGC 1380 GCAGGTCTCA ACTTCCGCGA TGTOCTCAAC ACCCTTGGCA TGCTTCCGGA 1440 CCGCTCGGCG GCGAAGGCGC GGGCATTGTC ACCGAAGTCG GCCCAGGTGT 1500 ACTGTAGGCG ACCGGGTGAT GGGCATCTTC CGCGGAGGCT TTGGCCCCAC 1560 GACGCCCGCA TGATCTGCCC CATCCCCGAT GCCTGGTCCT TCGTCCAAGC 1620 CCCGTCGTCT TTCTCACCGC CTACTATGGA CTCGTCGATG TCGGGCftTCT 1680 CAACGTGTCC TCATCCATGC GGCCGCAGGC GGCGTCGGTA CTGCCGCCGT 1740 O3CCACCTCG GCGCCGAAGT CTTCGCCACC GCCAGTCCAG GGAAGTGGGA 1800 GCGCTCGGCT TCGACGATGC GO^CTCGCG TCCTCACGTG ACCTGGAATT 1860 TTCCTGCGCT CCACACGAGG GCGCGGCATG GATGTCGTCC TCAACGCCTT 1920 TTCGTCGACO CTTCGCTGCG TCTCCTGCCG AGCGGTGGAA GCTTTGTCGA 1980 ACGGATATCC GCGAGCCCGA CGCCGTAGGC CTCGCCTACC CCGGCGTCGT 2040 TTCGATCTCT TGGAGGCTGG ACCGGATCGA ATTCAAGAGA TGCTCGCAGA 2100

GCTGCTCGAC CTGTTCGAGC GCGGCGTGCT TCGTCCGCCG CCCATCACGT CCTGGGACAT 2160 CCGGCATGCC CCCCAGGCGT TCCGCGCGCT CGCTCAGGCG CGGCATATTG GAAAGTTCGT 2220

182 136

CCTCACCGTT CCCGTCCCAT CGATCCCCGA AGGCACCATC CTCGTCACGG GAGGCACCGG 2280

GCGCTCATCG CGOGCCACCT CGTCGCCAAT CGCGGCGACA AGCACCTGCT 2340

CGAAAGGGTG CGAGCGCTCC GGGGGCCGAG GCATTGCGGA GCGAGCTOGA 2400

GCTGCGGTCA OGCTCGCXCG GTGCGACGCG GCCGATCCAC GCGCGCTCCA 2460

GACAGCATCC CGAGCGCTCA CCCGCTCACG GCCGTCGTGC ACGCCGCCGG 2520

GATGGGCTGA TCAGCGACAT GAGCCCCGAG CGCATCGACC GCGTCTTTGC 2580

GAOGCCGCTT GGCACTTGCA TCAGCTCACC CAGGACAAGG COGCTCGGGG 2640

TTCTCGTCCG CCTCCGGCGT CCTCGGCGGT ATGGGTCAAT CCAACTACGC 2700

GCGTTCCTTG ACGCGCTCGC GCATCACCGA CGCGTCCATG GGCTCCCftGG 2760

GCATGGGGCC ATTGGGCOGA GCGCAGCGGA ATGACCCGAC AACCTCAGCG 2820

CGCTCGCATG AGGCGCGCGG TCTCCGATCC ATCGCCTCGG ACGAGGGTCT 2880

GATATGGCGC TCGGGCGCCC GGAGCCCGCG CTGGTCCCCG CCCGCTTCGA 2940

CTCGGCGCGA AGGCCGACGG GCTACCCTCG ATGTTCCAGG GTCTCGTCCG -3000

GCGCGCAAGG TCGCCAGCAA TAATGCCCTG GCCGCGTCGC TCACCCAGCG 3060

CTCCCGCCCA CCGACCGCGA GCGCATGCTG CTCGATCTCG TCCGCGCCGA 3120

GTCCTCGGCC TCGCCTCGTT CGAATCGCTC GATCCCCGTC GCCCTCTTCA 3180

CTCGATTCCC TCATGGCCAT CGAGCTCCGA AATCGACTCG CCGCCGCCAC 3240

CTCCAAGCCA (WTCCTCTT CGACCACCCG ACGCCCGCCG CGCTCGCGAC 3300

GGGAAGCTCC TCCAGCATGA AGCTG(XGAT CCTCGCCCCT TGGCCGCAGA 3360

CTAGAGGOCA CTCTCrCCGC GATAGCCGTG GACGCTCAAG CACGCCCGAA 3420

CGCCTGCAAT CCTGGTTGTC GAAGTGGAGC GACGCTCAGG CTGCCGACGC 3480

CTCGGCAAGG ATTTCAAGTC TGCTACGAAG GAAGAGCTCT TCGCTGCTTG 3540

TTCGGAGGCC TGGGTAAATG AATAACGACG AGAAGCTTGT CTCCTACCTA 3600

TGAATGAGCT TCAGCGTGCT CATCAGCCCC TCCGCGCGGT CGAAGAGAAG 3660

GAGCACGAGC CCATCGCCAT CGTGGCGATG AGCTGCCGCT TCCCGGGCGA CGTGCGCACG3720

CCCGAGGATC TCTGGAAGCT CTTGCTCGAT GGGAAAGATG CTATCTCCGA CCTTCCCCCA3780

AACCGTGGTT GGAAGCTCGA CGCGCTCGAC GTCCACGGTC GCTCCCCAGT CCGAGAGGGA3840

GGCTTCTTCT ACGACGCAGA CGCCTTCGAT CCGGCCTTCT TCGGGATCAG CCCACGCGAG3900

100

182 136

ΙΙΗΗΗΙΗΗ ΠΠΠΗΗΗ

TCGATCCCCA GCAGCGGCTC CTCCTCGAGA TCTCATGGGA AGCCTTCGAG 3960

TCGACCCTGC CTCGCTCCAA GGGAGCCAAA GCGGCGTCTT CGTCGGCGTG 4020

ACTACGACGC ATTGCTGGAG AACGCAGCTG GCGAACACAA AGGATTCGTT 4080 GCACAGCGAG CGTCGCCTCC GGCCGGATCG CGTATACATT CGGCTTTCAA 4140 TCAGCGTGGA CACGGCGTGC AGCTCCTCGC TCGTCGCGGT TCACCTCGCC 4200 TGCGCCGTGG CGAATGCTCC CTGGOGCTCG CCGGCGGCGT GACOGTCATG 4260 CAGTCTTCGT CGCGTTCGAT TCCGAGAGCG CGGGCGCCCC CGATGGTCGC 4320 TCTCGGTGGA GGCCAACGGT TCGGGCTGGG CCGAGGGCGC CGGGATGCTC 4380 GCCTCTCCGA TGCCGTCCAA AACGGTCATC CCGTCCTOGC CGTCCTTCGA 4440 TCAACCAGGA CGGCCGGAGC CAAGGCCTCA CCGCGCCCAA TGGCCCTGCC 4500 TCATCCGGCA AGCGCTCGAC AGOGOGCGGC TCACTCCAAA GGACGTCGAC 4560 CTCACGGCAC GGGAACCACC CTCGGAGACC CCATCGAGGC ACAGGCCATT 4620 ATGGCGAGGC CCATTCCCAA GACAGACCCC TCTGGCTTGG AAGTCTCAAG 4680 GACATGCTCA GGCCGCGGCC GGCGTGGGAA GCGTCATCAA GATGGTGCTC 4740 AAGGCCTCTT GCCCAAGACC CTCCATGCCC AGAATCCCTC CCCCCACATC 4800 CGGGCACGGT AAAGCTCCTG AACGAGCCCG TCGTCTGGAC GACCAACGGG 4860 ACGCCGGCGT CTCCGCCTTC GGCATCTCCG GCACCAACGC CCACGTCATC 4920 CCCCCGCCAT CGCCCGGGTC GAGCOCGCAG OSKACAGCC CGCGTCCGAG 4980 CAGCGTGGCC CGTGCTCCTG TCGGCCAAGA GCGAGGCGGC CGTGCGCGCC 5040 GGCTCCGCGA CCACCTCCTC GCCAAAAGCG AGCTCGCCCT CGCCGATGTG 5100 lOSCGACCAC GCGCGCCCAC TTCGAGCAGC GCGCCGCTCT CCTCGTCAAA 5160 AGCTCCTCTC CGCCCTCGAT GCGCTGGCCC AAGGACATTC CGCCGCCGTG 5220 GCGGGGCCCC AGGAAAGCTC GCCGTCCTCT TCACGGGGCA AGGAAGCCAG 5280 TGGGCCGCGG aTTCTACGAC GTTTTCCCCG TCTTCCGGGA CGCCCTCGAC 5340 CCCACCTCGA CCGCGAGCTC GACCGCCCCC TGCGCX3ACGT CCTCTTCGCT 5400

CCCGACGGCT CCGAGCAGGC CGCGCGCCTC GAGCAAACCG (TTTCACCCA GCCGGCCCTG 5460

TTTGCCCTCG AAGTCGCCCT CTTTCAGCTT CTACAATCCT TCGGTCTGAA GCCCGCTCTC 5520

182 136

101

CTCCTCGGAC ACTCCATTGG CGAGCTCGTC GCCGCCCACG TCGCCGGCGT CCTTTCTCTC5580

CAGGACGGCT GCACCCTCGT CGCCGCCCGC GCAAAGCTCA TGCAAGCGCT CCCACAAGGC5640

GGCGCCATGG TCACCCTCCG AGCCTCCGAG GAGGAAGTCC GCGACCTTCT CCAGCOCTAC5700

GAAGGCCGAG CTAGCCTCGC CGCCCTCAAT GGGOCTCTCT CCACCGTCGT CGCTGGCGAT5760

GAAGACGCGG TGGTGGAGAT CGCCCGCCAG GCCGAAGCCC TCGGACGAAA GACCACACGC5820

CTGCGCGTCA GCCACGCCTT CCATTCCCCG CACATGGACG GAATGCTCGA CGACTTCCGC5880

CGCGTCGCCC AGAGCCTCAC C1ACCATCCC GCACGCATCC CCATCATCTC CAACGTCACC5940

GGCGCGCGCG CCACGGACCA CGAGCTCGCC TCGCCCGACT ACTGGGTCCG CCACGTTCGC6000

CACACCGTCC GCTTCCTCGA CGGOGTACGT GCCCTTCACG CCGAAGGGGC ACGTGTCTTT6060

CTCGAGCTCG GGCOTCACGC TGTCCTCTCC GCCCTTGCGC AAGACGCCCT CGGACAGGAC6120

GAAGGCACGT CGCCATGCGC CTTCCTTCCC ACCCTCCGCA AGGGACGCGA CGACGCCGAG6180

GCGTTCACCG COGOGCTCGG OGCTCTCCAC TCCGCAGGCA TCACACCCGA CTGGAGCGCT6240

TTCTTCGCCC CCTTCGCTCC ACGCAAGGTC TCXDCTCCCCA CCTATGCCTT CCAGCGCGAG6300

CGCTTCTGGC CCGACGCCTC CAAGGCACCC GGCGCCGACG TCAGCCACCT TGCTCCGCTC6360

GAGGGGGGGC TCTGGCAAGC CATCGAGCGC GGGGACCTCG ATGCGCTCAG CGGTCAGCTC6420

CACGTGGACG GCGACGAGCG GCGCGCCGCG CTCSCCCTGC TCCTTCCCAC CCTCTCGAGC6480

TTTCGCCACG AGCGGCAAGA GCAGAGCACG GTCGACGCCT GGCGCTACCG TATCACCTGG6540

AAGCCTCTGA CCACCGCCGA AACACCCGCC GACCTCGCCG GCACCTGGCT CGTCGTCCTG6600

CCGGCCGCTC TGGACGACGA CGCGCTCCCC TCCGCGCTCA CCGAGGCGCT CACCCGGCGC6660

GGCGCGCGCG TCCTCGCCTT GCGCCTGAGC CAGGCCCACC TGGACCGCGA GGCTCTCGCC6720

GAGCATCTGC GCCAGGCTTG CGCCGAGACC GCCCCGATTC GCGGCGTGCT CTCGCTCCTC6780

GCCCTCGACG AGCGCCCCCT CGCAGACCGT CCTGCCCTGC CCGCCGGACT CGCCCTCICG6840

CTTTCTCTCG CTCAAGCCCT CGGCGACCTC GACCTCGAGG CGCCCTTGTG GTTCTTCACG6900

CGCGGCGCCG TCTCCATTGG ACACTCTGAC CCCCTCGCCC ATCCCGCCCA GGCCATGACC6960

TGGGGCTTGG GCCGCGTCAT CGGCCTCGAG CACCCCGACC GGTGGGGAGG TCTCGTCGAC7020

GTCTGCGCTG GGGTCGACGA GAGCGCCGTG GGCCGCTTGC TGCCGGCCCT CGCCGAGCGC7080

CACGACGAAG ACCAGCTCGC TCTCCGCCCG GCCGGACTCT ACGCTCGCCG CATCGTCCGC7140

GCCCCGCTCG GCGATGCGCC TCCCGCGCGC GACTTCACGC CCGGAGGCAC CATTCTCATC7200

102

182 136

ΗΗΗΗΗΠΠΗΙΗΠΗΠίΙ

CCGGCGCCAT TGGCGCTCAC GTCGCCCGAT TCCTCATCAG CCGCCGAGGC GCCGAGGCCC CGGCCCTCGG CGCGCGCACC ACCCTCGCCG CCACGCTTCT TGAGCAGCTC GACGCOGAAG GCGGCATCGA ACACCACGCT CCGCTCGACG TCTCCGGCAA GGTCGAAGGT GCAAAGCACC ACGCCTTTGT TCTCTTTTCG TCCGGCGCGG ACGCGGCCGC AAACGCCTTC CTCGACGCCC CAGCGACGTC GGTGGCCTGG GGCGCGTGGG CAGCCCACCT CCAACAGCGC GGTCTGTCGC TCGCGCTGGC TCTGGAGCAC GACGAGACCA GCTTTGCGCC TTCGTTCAGC GCCGCTCGCC CGCAGCGCGC TCTCGAGACC AGCGAAGGCG TCCTCGACAA GCTCCGGAGC CGCTCGGAGA TGCGCCACGA GACGGCCCTC GTCCTCGGCC AGGGCTTCCT CGATCTCGGT CTCGATTCGC AACAGGCCAC CGGCATCAAG CTCCCGGCCA GAGTCGCGCT CTTCTTGCGC GACTCGCTCG AGCCCGACGC CGCCGCGCTC CCGGCGCTTC TCGGCATGGC CCTCCGCCTG CCGGGCGGCG TGGCCCAGGG ACGCGACGGC GTCGAGCCCA TCTACGACCC CGACCCCGAC GCCAAGACCA ACCAGGTCGA CCTCTTCGAC CCTCCCTTCT TCGACCCCCA GCACCGCCTG CTCCTCGAAT TCGTCCCCCC CACCCTCAAG GATTCCCCCA AATACGCATT GCGAGAGGCG AGCACCGAAG

CAAGGCACCG CCGGGTCCTT TGCCGCGGGG (33CTTGGCCT

GGCTCGCTCG AAGAGGCGCT 7260

CTGGCGCCTC GGAGCTCCAC7320

CGTGCGATGT CGCCGACCGG7380

GGTCGCAGGT CCGCGCCGTG7440

CCACCTCTTT CAGGGATCTC7500

TCCACGACCT GCTCGGCTCT7560

CCGTCTGGGG CGGCGGACAG7620

TTGCCGAGCA TCGGCGCAGC7680

GCGGCGGCGG CATGGCCACC7740

GGATGGC5CCC CTCGCTTGCC7800

CCGTCACCGT CGCCGACATC7860

CCCGCCCGCT CCTGCGCGAT7920

CGTCCTCCGA GCATGGCCCG7980

GCGAGCAGCT TCGTCTGCTC8040

ACGAAGGCGC CTCCCATGTC8100

TCATGGCCGT CGAGCTTCGC8160

CCCTCGCCTT CGACCATCCC8220

CCCACGCCCT CGGCACGAGG8280

GCGCCGCGAG CGACGAGCCC8340

TCGGCGATGT OSACGCTCTT8400

TTCCAAAGGC CCGATGGGAT8460

AGAGCTACGT CCGGCATGCC8520

TTGGCATCAG CCCCCGGGAG8580

CTGCCTGGCA GGCCCTCGAA8640

COGGCGTCTT CGTCGGCATC8700

ATTCCGACGC TTATGCCCTC8760

ACACGCTCGG CCTGCAAGGG8820

182 136

103

CCCGCGCTCT CGGTCGACAC CGCCTGCTCC TCCTCGCTCG TCGCCCTCCA CCTCGCCTGC8880

CAAGCCCTCC GACAGGGCGA GTGCAACCTC GCCCTCGCCG CGGGCGTCTC CGTCATGGCC8940

TCCCCCGAGG GCTTCGTCCT CCTTTCCCGC CTGCGCGCCT TGGCGCCCGA CGGCCGCTCC9000

AAGACCTTCT CGGCCAACGC CGACGGCTAC GGACGCGGAG AAGGCGTCAT O3TCCTTGCC9060

CTCGAGCGGC TCGGTGACGC CCTCGCCCGA GGACACCGCG TCCTCGCCCT CCTCCGCGGC9120

ACCGCCATCA ACCACGACGG CGCGTCGAGC GGTATCACCG CCCCCAACGG CACCTCCCAG9180

CAGAAGGTCC TCCGCGCCGC GCTCCACGAC GCCCGCATCA CCCCCGCCGA CGTCGACGTC9240

GTCGAGTGCC ATGGCACCGG CACCTCCTTG GGAGACCCCA TCGAGGTGCA AGCCCTGGCC9300

GCCGTCTACG CCGACGGCAG ACCCGCTGAA AAGCCTCTCC TTCTCGGCGC GCTCAAGACC9360

AACATCGGCC ATCTCGAGGC CGCCTCCGGC CTCGCGGGCG TCGCCAAGAT CGTCGCCTCC9420

CTCCGCCATG ACGCCCTGCC CCCCACCCTC CACACGGGCC CGCGCAATCC CTTGATTGAT9480

TGGGATACAC TCGCCATCGA CGTCGTTGAT ACCCCGAGGT CTTGGGCCCG CCACGAAGAT9540

AGCAGTCCCC GCCX3CGCCGG CGTCTCCGCC TTCGGACTCT CCGGCACCAA CGCCCACGTC9600

ATCCTCGAGG AGGCTCCCGC CGCCCTGTCG GGCGAGCCCG CCACCTCACA GACGGCGTCG9660

CGACCGCTCC CCGCGGCGTG TG2CGTGCTC CTGTCGGCCA GGAGCGAGGC CGCCGTCCGC9720

GCCCAGGCGA AGCGGCTCOG CGACCACCTC CTCGCCCACG ACGACCTCGC CCTTATCGAT9780

GTGGCCTATT CGCAGGCCAC CACCCGCGCC CACTTCGAGC ACCGCGCCGC TCTCCTGGCC9840

CGCGACCGCG ACGAGCTCCT CTCCGCGCTC GACTCGCTCG CCCAGGACAA GCCCGCCCCG9900

AGCACCGTTC TCGGCCGGAG CGGAAGCCAC GGCAAGGTCG TCTTCGTCTT TCCTGGGCAA9960

GGCTCGCAGT GGGAAGGGAT GGCCCTCTCC CTGCTCGACT OCTCGCCGGT CTTCCGCGCT10020

CAGCTCGAAG CATGCGAGCG CGCGCTCGCr CCTCACGTCG AGTGGAGCCT GCTCGCCGTC10080

CTGCGCCGCG ACGAGGGCGC CCCCTCCCTC GACCGCGTCG ACGTCGTACA GCCCGCCCTC10140

TTTGCCGTCA TGGTCTCCCT GGCCGCCCTC TGGCGCTCGC TCGGCGTCGA GCCCGCCGCC10200

GTCGTCGGCC ACAGCCAGGG CGAGATCGCC GCCGCCTTCG TCGCAGGCGC. TCTCTCCCTC10260

GAGGACGCGG CWGCATCGC CGCCCTGCGC AGGAAAGCGC TCACCACCGT CGGCGGCAAC10320

GGCGGCATGG CCGCCGTCGA GCTCGGCGCC TCCGACCTCC AGACCTACCT CGCTCCCTGG10380

GGCGACAGGC TCTCCACCGC CGCCGTCAAC AGCCCCAGGG CTACCCTCGT ATCCGGCGAG10440

CCCGCCGCCG TCGACGCGCT GCTCGACGTC CTCACCGCCA CCAAGGTGTT CGCCCGCAAG 10500

104

182 136

ATCCGCGTCG ACTACGCCTC CCACTCCGCC CAGATGGACG CCGTCCAAGA OGAGCTCGCC	10560
GCAGGTCTAG CCAACATCGC TCCTCGGACG TGCGAGCTCC CTCTTTATTC GAOCGTCACC	10620
GGCACCAGGC TCGACGGCTC CGAGCTCGAC GGCGCGTACT GGTATCGAAA CCTCCGGCAA	10680
ACCGTCCTGT TCTCGAGCGC GACCGAGCGG CTCCTCGACG ATGGGCATCG CTTCTCCGTC	10740
GAGGTCAGCC CCCATCCCGT GCTCACGCTC GCCCTCCGCG AGACCTGCGA GCGCTCACCG	10800
CTCGATCCCG TCGTCGTCGG CTCCATTCGA CGAGAAGAAG GCCACCTCGC CCGCCTGCTC	10860
CTCTCCTGGG CGGAGCTCTC TACCCGAGGC CTCGCGCTCG ACTGGAAGGA CTTCTTCGCG	10920
CCCTACGCTC CCCGCAAGGT CTCCCTCCCC ACCTACCCCT TCCAGCGAGA GCGGTTCTGG	10980
CTCGACGTCT CCACGGACGA ACGCTTCCGA CGTCGCCTCC GCAGGCCTGA CCTCGGCCGA	11040
CCAATCCCGC TGCTCGGCGC CGCCGTCGCC TTCGCCGACC GCGGTGGCTT TCTCTTTACA	11100
GGGCGGCTCT CCCTCGCAGA GCACCCGTGG CTCGAAGGCC ATGCCGTCTT CGGCACACCC	11160
ATCCTACCGG GCACCGGCTT TCTCGAGCTC GCCCTGCACG TCGCCCACCG CGTCGGCCTC	11220
GACACCGTCG AAGAGCTCAC GCTCGAGGCC CCTCTCGCTC TCCCATCGCA GGACACCGTC	11280
C1OCTCCAGA TCTCCGTCGG GCCCGTGGAC GACGCAGGAC GAAGGGCGCT CTCTTTCCAT	11340
AGCCGACAAG AGGACGCGCT TCAGGATGGC CCCTGGACTC GCCACGCCAG CGGCTCTCTC	11400
TCGCCGGCGA CCCCATCCCT CTCCGCCGAT CTCCACGAGT GGCCTCCCTC GAGTGCCATC	11460
CCGGTGGACC TCGAAGGCCT CTACGCAACC CTCGCCAACC TCGGGCTTGC CTACGGCCCC	11520
GAGTTCCAGG GCCTCCGCTC CGTCTACAAG CGCGGCGACG AGCTCTTTGC CGAAGCCAAG	11580
CTCCCGGAAG CGGCCGAAAA GGATGCCGCC CGGTTTGCCC TCCACCCTGC GCTGCTCGAC	11640
AGCGCCCTGC ATGCACTGGC CTTTGAGGAC GAGCAGAGAG GGACGGTCGC TCTGCCCTTC	11700
TCGTGGAGCG GAGTCTCGCT GCGCTCCGTC GGTGCCACCA CCTTGCGCGT GCGCTTCCAC	11760
CGTCCCAAGG GTGAATCCTC CGTCTCGATC GTCCTGGCCG ACGCCGCAGG TGACCCTCTT	11820
GCCTCGGTGC AAGCGCTCGC CATGCGGACG ACGTCCGCCG CGCAGCTCCG CACCCCGGCA	11880
GCTTCCCACC ATGATGCGCT CITCCGCGTC GACTGGAGCG AGCTCCAAAG CCCCACTTCA	11940
ĆCGCCTGCCG CCCCGAGCGG CGTCCTTCTC GGCACAGGCG GCCACGATCT CGCGCTCGAC	12000
GCCCCGCTCG CCCGCTACGC CGACCTCGCT GCCCTCCGAA GCGCCCTCGA CCAGGGCGCT	12060

TCGCCTCCCG GCCTCGTCGT CGCCCCCTTC ATCGATCGAC CGGCAGGCGA CCTCGTCCCG 12120

182 136

105

AGCGCCCACG	AGGCCACCGC GCTCGCACTC GCCCTCTTGC AAGCCTGGCT CGCCGACGAA	12180
CGCCTCGCCT	CGTCGCGCCT CGTCCTCGTC ACCCGACGCG CCGTCGCCAC CCACACCGAA	12240
GACGACGTCA	AGGACCTCGC TCACGCGCCG CTCTGGGGGC TCGCGCGCTC CGCGCAAAGT	12300
GAGCACCCAG	ACCTCCCGCT CTTCCTCGTC GACATCGACC TCAGCGAGGC CTCCCAGCAG	12360
GCCCTGCTAG	GCGCGCTCGA CACAGGAGAA CGCCAGCTCG CCCTCCGCAA CGGGAAACCC	12420
CTCATCCCGA	GGTTGGCGCA ACCACGCTCG ACGGACGCGC TCATCCCGCC GCAAGCACOC	12480
ACGTGGCGCC	TOCATATTCC GAOCAAAGGC ACCTTCGACG CGCTCGCCCT CGTCGACGCC	12540
CCCGAGGCCC	AGGCGCCCCT CGCACACGGC CAAGTCCGCA TCGCCGTGCA OGCGGCAGGG	12600
CTCAACTTCC	GCGATGTCGT CGACACCCTT GGCATGTATC CGGGCGACGC GCCGCCGCTC	12660
GGAGGCGAAG	GCGCGGGCAT CGTTACTGAA GTCGGTCCAG GTGTCTCCCG ATACACCGTA	12720
GGCGACCGGG	TGATGGGGGT CTTCGGCGCA GCCTTTGGTC CCACGGCCAT CGCCGACGCC	12780
CGCATGATCT	GCCCXZATCCC CCACGCCTGG TCCTTCGCCC AAGCCGCCAG CGTCCCCATC	12840
ATCTATCTCA	CCGCCTACTA TGGACTCGTC GATCTCGGGC ATCTGAAACC CAATCAACGT	12900
GTCCTCATCC	ATGOGGCCGC CGGCGGCGTC GGGACGGCCG CCGTTCAGCT CGCACGCCAC	12960
CTCGGCGCCG	AGGTCTTTGC CACCGCCAGT CCAGGGAAGT GGAGCGCTCT OOGCGCGCTC	13020
GGCTTCGACG	ATGCGCACCT CGCGTCCTCA CGTGACCTGG GCTTCGAGCA GCACTTCCTG	13080
CGCTCCACGC	ATGGGCGOGG CATGGATGTC GTCCTCGACT GTCTGGCACG O3AGTTCGTC	13140
GACGCCTCGC	TGCGCCTCAT GCCGAGCGGT GGACGCTTCA TCGAGATGGG AAAGACGGAC	13200
ATCCGTGAGC	CCGACGCGAT CGGCCTCGCC TACCCTGGCG TCGTTTACCG CGCCTTCGAC	13260
GTCACAGAGG	CCGGACCGGA TCGAATTGGG CAGATGCTCG CAGAGCTGCT CAGO2TCTTC	13320
GAGCGCGGTG	TGCTTCGTCT GCCACCCATC ACATCCTGGG ACATCCGTCA TGCCCCCCAG	13380
GCCTTCCGCG	CGCTCGCCCA GGCGCGGCAT GTTGGGAAGT TCGTCCTCAC CATTCCCCGT	13440
CCGATCGATC	CCGAGGGGAC CGTCX7rCATC ACGGGAGGCA CCGGGACGCT AGGAGTCCTG	13500
GTCGCACGCC	ACCTCGTCGC GAAACACAGC GCCAAACACC TGCTCCTCAC CTCGAGGAAG	13560
GGCGCGCGTG	CTCCGGGCGC GGAGGCTCTG CGAAGCGAGC TCGAAGCGCT GGGGGCCTCG	13620
GTCACCCTCG	TCGCGTGCGA CGTGGCCGAC CCACGCGCCC TCCGGACCCT CCTGGACAGC	13680
ATCCCGAGGG	ATCATCCGAT CACGGCCGTC GTGCACGCCG CCGGCGCCCT CGACGACGGG	13740

CCGCTCGGTA GCATGAGCGC CGAGCGCATC GCTCGCCTCT TTGACCCCAA GCTCGATGCC 13800

106

182 136

GCTTGGTACT TGCATGAGCT CACCCAGGAC GAGCCGGTCG CGGCCTTCGT CCTCTTCTCG	13860
GCCGCCTCCG GCGTCCTTGG TGGTCCAGGT CAGTCGAACT ACGCCGCTGC CAATGCCTTC	13920
CTCGATGCGC TCGCACATCA CCGGCGCGCC CAAGGACTCC CAGCCGCTTC GCTCGCCTGG	13980
GGCTACTGGG CCGAGCGCAG TGGGATGACC CGGCACCTCA GCGCCGCCGA CGCCGCTCGC	14040
ATGAGGCGCG CCGGCGTCCG GCCCCTCGAC ACTGACGAGG CGCTCTCCCT CTTCGATGTG	14100
GCTCTCTTGC GACCCGAGCC CGCTCTGGTC CCTGCCCCCT TCGACTACAA CGTGCTCAGC	14160
ACGAGTGCCG ACGGCGTGCC CCCGCTGTTC CAGCGTCTCG TCCGCGCTCG CATCGCGCGC	14220
AAGGCCGCCA GCAATACTGC aTTCGCCTCG TCGCTTGCAG AGCACCTCTC CTOCCTOCCG	14280
CCCGCCGAAC GCGAGCGCGT CCTCCTCGAT CTCGTCCGCA CCGAAGCCGC CTCCGTCCTC	14340
GGCCTCGCCT CGTTCGAATC GCTCGATCCC CATCGCCCTC TACAAGAGCT CGGCCTCGAT	14400
TCCCTCATGG CCCTCGAGCT CCGAAATCGA CTCGCCGCCG CCGCCGGGCT GCGGCTCCAG	14460
GCTACTCTCC TCTTCGACTA TCCAACCCCG ACTGCGCTCT CACGCTmT CACGACGCAT	14520
CTCTTCGGGG GAACCACCCA CCGCCCCGGC GTACCGCTCA CCCCGGGGGG GAGCGAAGAC	14580
CCTATCGCCA TCGTGGCGAT GAGCTGCCGC TTCCCGGGCG ACGTGCGCAC GCCCGAGGAT	14640
CTCTGGAAGC TCTTGCTCGA CGGACAAGAT GCCATCTCCG GCTTTCCCCA AAATCGCGGC	14700
TGGAGTCTOG ATGCGCTCGA CGCCCCCGGT CGCTTCCCAG TCCGGGAGGG GGGCTTCGTC	14760
TACGACGCAG ACGCCTTCGA TCCGGCCTTC TTCGGGATCA GTCCACGTGA AGCGCTCGCC	14820
GTTGATCCCC AACAGCGCAT TTTGCTCGAS ATCACATGGG AAGCCTTCGA GCGTGCAGGC	14880
ATCGACCCGG CCTCCCTCCA AGGAAGCCAA AGCGGGGTCT TCGTTGGCGT ATGGCAGAGC	14940
GACTACCAAT GCATCGCTGG TGAACGCGAC TGGCGAATAC AAGGACTCGT TGCCACCGGT	15000
AGCGCAGCGC GTCCGTCCGG CCGAATCGCA TACACGTTCG GACTTCAAGG GCCCGCCATC	15060
AGCGTGGAGA CGGCGTGCAG C1TCCTCGTC GCGGTTCACC TCGCCTGCCA GGCCCCCCCC	15120
CACGGCGAAT ACTCCCTGGC GCTCGCTGGC GGCGTGACCA TCATGGCCAC GCCAGCCATA	15180
TTCATCGCGT TCGACTCCGA GAGCGCGGGT GCCCCCGACG GTCGCTGCAA GGCCTTCTCG	15240
CCGGAAGCCG ACGGTTCGGG CTGGGCCGAA GGCGCCGGGA TGCTCCTGCT CGAGCGCCTC	15300
TCCGATGCCG TCCAAAACGG TCATCCCGTC CTCGCCGTCC TTCGAGGCTC CGCCGTCAAC	15360

CAGGACGGCC GGAGCCAAGG CCTCACCGCG CCCAATGGCC CTGCCCAGGA GCGCGTCATC 15420

182 136

107

CGGCAAGCGC	TCGACAGCGC GCGGCTCACT CCAAAGGACG TCGACGTCGT CGAGGCTCAC	15480
GGCACGGGAA	CCACCCTCGG	AGACCCCATC	GAGGCACAGG	CCGTriTTGC	CACCTATGGC	15540
GAGGCCCATT	CCCAAGACAG	ACCCCTCTGG	CTTGGAAGCC	TCAAGTCCAA	CCTGGGACAT	15600
ACTCAGGCCG	CGGCCGGCGT	CGGCGGCATC	ATCAAGATGG	TGCTCGCGTT	GCAGCACGGT	15660
CTCTTGOrA	AGACCCTCCA	TGCCCAGAAT	CCCTCCCCCC	ACATCGACTG	GTCTCCAGGC	15720
ATCGTAAAGC	TCCTGAACGA	GGCCGTCGCC	TGGACGACCA	GCGGACATCC	TCGCCGCGCC	15780
GGTGTTTCCT	CGTTCGGCGT	CTCCGGCACC	AACGCCCATG	TCATCCTCGA	AGAGGCTCCC	15840
GCCGCCACGC	GGGCCGAGTC	AGGCGCTTCA	CAGCCTGCAT	CGCAGCXX3CT	CCCCGCGGCG	15900
TGGCCCGTCG	TCCTGTCGGC	CAGGAGCGAG	GCCGCCGTCC	GCGCCCAGGC	TCAAAGGCTC	15960
CGCGAGCACC	TGCTCGCCCA	AGGCGACCTC	ACCCTCGCCG	ATGTGGCCTA	TTCGCTGGCO	16020
ACCACCCGCG	CCCACTTCGA	GCACCGCGCC	GCTCTCGTAG	CCCACGACCG	CGACGAGCTC	16080
CTCTCCGCGC	TCGACTCGCT	CGCCCAGGAC	AAGCCCGCAC	CGAGCACCGT	CCTCGGACGG	16140
AGCGGAAGCC	ACGGCAAGGT	CGTCTTCGTC	TTTCCTGGGC	AAGGCTCGCA	GTGGGAAGGG	16200
ATGGCCCTCT	CCCTGCTCGA	CTCCTCGCCC	GTCTTCCGCA	CACAGCTCGA	AGCATGCGAG	16260
CGCGCGCTCC	GTCCTCACGT	CGAGTGGAGC	CTGCTCGCCG	TCCTCCGCCG	CGACGAGGGC	16320
GCCCCCTCCC	TCGACCGCGT	CGACGTCGTG	CAGCCCGCCC	TCTTTGCCGT	CATGGTCTCC	16380
CTGGCCGCCC	TCTGGCGCTC	GCTCGGCGTC	GAGCCCGCCG	CCGTCGTCGG	CCACAGCCAG	16440
GGCGAGATAG	CCGCCGCCTT	CGTCGCAGGC	GCTCTCTCCC	TCGAGGACGC	GGCCCGCATC	16500
GCCGCCCTGC	GCAGCAAAGC	GTCACCACCG	TCGCCGGCAA CGGGCATGGC	CGCCGTCGAG	16560
CTCGGCGCCT	CCGACCTCCA	GACCTACCTC	GCTCCCTGGG	GCGACAGGCT	CTCCATCGCC	16620
GCCGTCAACA	GCCCCAGGGC	CACGCTCGTA	TCCGGCGAGC	CCGCCGCCGT	CGACGCGCTG	16680
ATCGACTCGC	TCACCGCAGC	GCAGGTCTTC	GCCCGAAGAG	TCCGCGTCGA	CTACGCCTCC	16740
CACTCAGCCC	AGATGGACGC	CGTCCAAGAC	GAGCTCGCCG	CAGGTCTAGC	CAACATCGCT	16800
CCTCGGACGT	GCGAGCTCCC	TCTTTATTCG	ACCGTCACCG	GCACCAGGCT	CGACGGCTCC	16860
GAGCTCGACG	GCGCGTACTG	GTATCGAAAC	CTCCGGCAAA	CCGTCCTGTT	CTCGAGCGCG	16920
ACCGAGCGGC	TCCTCGACGA	TGGGCATCGC	TTCTTCGTCG	AGGTCAGCCC	TCATCCCGTG	16980
CTCACGCTCG	CCCTCCGCGA	GACCTGCGAG	CGCTCACCGC	TCGATCCCGT	CGTCGTCGGC	17040

TCCATTCGAC GCGACGAAGG CCACCTCCCC CGTCTCCTTG CTCTCTTGGG CCGAGCTCTA 17100

108

182 136

TGGCCGGGCC TCACGCCCGA GTGGAAGGCC TTCTTCGCGC CCTTCGCTCC CCGCAAGGTC	17160
TCACTCCCCA CCTACGCCTT CCAGCGCGAG CGTTTCTGGC TCGACGCCCC CAACGCACAC	17220
CCCGAAGGCG TCGCTCCCGC TGCGCCGATC GATGGGCGGT TTTGGCAAGC CATCGAACGC	17280
GGGGACCTCG ACGCGCTCAG CGGCCAGCTC CACGCGGACG GCGACGAGCA GCGCGCCGCC	17340
CTCGCCCTGC TCCTTCCCAC CCTCTCGAGC TTTCACCACC AGCGCCAAGA GCAGAGCACG	17400
GTCGACACCT GGCGCTACCG CATCACGTGG AGGOCTCTGA CCACCGCCGC CACGCOCGCC	17460
GACCTCGCCG GCACCTGGCT OCTCGTCGTG CCGTCCGCGC TCGGCGACGA CGCGCTCCCT	17520
GCCACGCTCA CCGATGCGCT TACCCGGCGC GGCGCGCGTG TCCTCGCGCT GCGCCTGAGC	17580
CAGGTTCACA TAGGCCGCGC GGCTCTCACC GAGCACCTGC GCGAGGCTGT TGCCGAGACT	17640
GCCCCGATTC GCGGCGTGCT CTCCCTCCTC GCCCTCGACG AGCGCCCCCT CGCGGACCAT	17700
GCCGCCCTGC CCGCGGGCCT TGCCCTCTCG CTCGCCCTCG TCCAAGCCCT CGGCGACCTC	17760
GCCCTCGAGG CTCCCTTGTG GCTCTTCACG CGCGGCGCCG TCTCGATTGG ACACTCCGAC	17820
CCACTCGCCC ATCCCACCCA GGCCATGATC TGGGGCTTGG GCCGCGTCGT CGGCCTCGAG	17880
CACCCCGAGC GGTGGGGCGG GCTOGTCGAC CTCGGCGCAG CGCTCGACGC GAGCGCCGCA	17940
GGCCGCTTGC TCCCGGCCCT CGCCCAGCGC CACGACGAAG ACCAGCTCGC GCTGCGCCCG	18000
GCCGGCCTCT ACGCACGCCG CTTCGTCCGC GCCCCGCTCG GCGATGCGCC TGCCGCTCGC	18060
GGCTTCATGC CCCGAGGCAC (^TCCTCATC ACCGGTGGTA CCGGCGCCAT TGGCGCTCAC	18120
GTCGCCCGAT GGCTCGCTCG AAAAGGCGCT GAGCACCTCG TCCTCATCAG CCGACGAGGG	18180
GCCCAGGCCG AAGGCGCCGT GGAGCTCCAC GCCGAGCTCA CCGCCCTCGG CGCGCGCGTC	18240
ACCTTCGCCG CGTGCGATGT CGCCGACAGG AGCGCTGTCG CCACGCTTCT CGAGCAGCTC	18300
GACGCCGGAG GGCCACAGGT GAGCGCCGTG TTCCACGCGG GCGGCATCGA GCXXCACGCT	18360
CCGCTCGCCG CCACCTCCAT GGAGGATCTC GCCGAGGTTG TCTCCGGCAA GGTACAAGGT	18420
GCAAGACACC TCCACGACCT GCTCGGCTCT CGACCCCTCG ACGCCTTTGT TCTCTTCTCG	18480
TCCGGCGCGG TCGTCTGGGG CGGCGGACAA CAAGGCGGCT ATGCCGCTGC GAACGCCTTC	18540
CTCGATGCCC TGGCCGAGCA GCGGCGCAGC CTTGGGCTGA CGGCGACATC GGTGGCCTGG	18600
GGCGTGTGGG GCGGCGGCGG CATGGCTACC GGGCTCCTGG CAGCCCAGCT AGAGCAACGC	18660

GGTCTGTCGC CGATGGCCCC CTCGCTGGCC GTGGCGACGC TCGCGCTGGC GCTGGAGCAC 18720

182 136

109

GACGAGACCA CCCTCACCGT	CGCCGACATC GACTGGGCGC GCTTTGCGCC TTCGTTCAGC	18780
GCCGCTCGCT CCCGCCCGCP	CCTGCGCGAT TTGCCCGAGG CGCAGCGCGC TCTCGAAGCC	18840
AGCGCCGATG CGTCCTCCGA	GCAAGACGGG GCCACAGGCC TCCTCGACAA GCTCCGAAAC	18900
CGCTCGGAGA GCGAGCAGAT	CCACCTGCTC TCCTCGCTGG TGCGCCACGA AGCGGCCCTC	18960
GTCCTGGGCC ATACCGACGC	CTCCCAGGTC GACCCCCACA AGGGCTTCAT GGACCTCGGC	19020
CTCGATTCGC TCATGACCGT	CGAGCTTCGT CGGCGCTTGC AGCAGGCCAC CGGCATCAAG	19080
CTCCCGGCCA CCCTCGCCTT	CGACCATCCC TCTCCTCATC GCGTCGCGCT CTTCTTGCGC	19140
GACTCGCTCG CCCACGCCCT	CGGCGCGAGG CTCTCCGTCG AGCGCGAOGC CGCCGCGCTC	19200
CCGGCGCTTC GCTCGGCGAG	CGACGAGCCC ATCGCCATCG TCGGCATGGC CCTCCGCTTG	19260
CCGGGCGGCA TCGGCGATGT	CGACGCTCTT TGGGAGTTCC TCGCCCAAGG ACGCGACGCC	19320
GTCGAGCCCA TTCCCCATGC	CCGATGGGAT GCCGGTGCCC TCTACGACCC CGACCCCGAC	19380
GCCAAGGCCA AGAGCTACGT	CCGGCATGCC GCCATGCTCG ACCAGGTCGA CCTCTTCGAT	19440
CCTGCCTTCT TTGGCATCAG	CCCTCGCXSAG GCCAAATACC TCGACCCCCA GCACCGCCTG	19500
CTCCTCGAAT CTGCCTGGCT	GGCCCTCGAG GACGCCGGCA TCGTCCCCTC CACCCTCAAG	19560
GATTCTCCCA CCGGCGTCTT	CGTCGGCATC GGCGCCAGCG AATACGCACT GCGAAACACG	19620
AGCTCCGAAG AGGTCGAAGC	GTATGCCCTC CAAGGCACCG CCGGGTCCTT TGCCGCGGGG	19680
CGCTTGGCCT ACACGCTCGG	CCTGCAAGGG CCCGCGCTCT CGGTCGACAC CGCCTGCTCC	19740
TCCTCGCTCG TCGCCCTCCA	CCTCGCCTGC CAAGCCCTCC GACAGGGCGA GTGCAACCTC	19800
GCCCTCGCCG CGGGCGTCTC	CGTCATGGCC TCCCCCGGGC TCTTCGTCGT CCTTTCCCGC	19860
ATGCGTGCTT TGGCGCCCGA	TGGCCGCTCC AAGACCTTCT CGACCAACGC CGACGGCTAC	19920
GGACGCGGAG AGGGCGTCGT	CGTCCTTGCC CTCGAGCGGC TCGGCGACGC CCTCGCCCGA	19980
GGACACCGCG TCCTCGCCCT	CGTCCGCGGC ACCGCCATGA ACCATGACGG CGCGTCGAGC	20040
GGCATCACCG CCCCCAATGG	CACCTCCCAC CAGAAGGTCC TCCGCGCCGC GCTCCACGAC	20100
GCCCATATCG GCCCTGCCGA	CGTCGACGTC GTCGAATGCC ATGGCACCGG CACCTCCTTG	20160
GGAGACCCCA TCGAGGTGCA	AGCCCTGGCC GCCGTCTACG CCGATGGCAG ACCCGCTGAA	20220
AAGCCTCTCC TTCTCGGCGC	ACTCAAGACC AACATTGGCC ATCTCGAGGC CGCCTCCGGC	20280
CTCGCGGGCG TCGCCAAGAT	CGTCGCCTCC CTCCGCCATG ACGCCCTGCC CCCCACCCTC	20340

CACACGACCC CGCGCAATCC CCTGATCGAG TGGGATGCGC TCGCCATCGA CGTCGTCGAT 20400

110

182 136

GCCACGAGGG CGTGGGCCCG CCACGAAGAT GGCAGTCCCC GCCGCGCCGG CGTCTCCGCC	20460
TTCGGACTCT CCGGCACCAA CGCCCACGTT ATCCTCGAAG AGGCTCCCGC GATCCCGCAG	20520
GCGGAGCCCA CCGCGGCACA GCTCGCGTCG CAGCCGCTTC CCGCAGCCTG GCCCGTGCTC	20580
CTGTCGGCCA GGAGCGAGCC GGCCGTGCGC GCCCAGGCCC AGAGGCTCCG CGACCACCTC	20640
CTCGCCCACG ACGACCTCGC CCTGGCCGAT GTAGCCTACT CGCTCGCCAC CAOCOGGGCT	20700
ACCTTCGAGC ACCGTGCCGC TCTCGTGGTC CACGACCGCG AAGAGCTOCT CTCCGCGCTC	20760
GATTCGCTCG CCCAGGGAAG GCCCGCCCCG AGCACCGTCG TCGAACGAAG CGGAAGCCAC	20820
GGCAAGGTCG TCTTCGTCTT TCCTGGGCAA GGCTCGCAGT GGGAAGGGAT GGCCCTCTCC	20880
CTGCTCGATA CCTCGCCGGT CTTCCGGGCA CAGCTCGAAG CGTGCGAGCG CGCCCTCGCG	20940
CCCCACGTGG ACTGGTCGCT GCTCGCGGTG CTCCGCGGCG AGGAGGGOGC GCCCCCGCTC	21000
GACCGGGTCG ACGTGGTCCA GCCCGCGCTG TTCTCGATGA TGGTCTCGCT GGCCGCCCTG	21060
TGGCGCTCCA TGGGCGTCGA GCCCGACGCG GTGGTCGGCC ATAGCCAGGG CGAGATCGCC	21120
GCGGCCTGTG TGGCGGGCGC GCTGTCGCTC GAGGACGCTG CCAAGCTGGT GGCGCTGCGC	21180
AGCCGTGCGC TCGTGGAGCT CGCCGGCCAG GGGGCCATGG CCGCGGTGGA GCTGCCGGAG	21240
GCCGAGGTCG CACGGCGCCT CCAGCGCTAT GGCGATCGGC TCTCCATCGG GGCGATCAAC	21300
AGCCCTCGTT TCACGACGAT CTCCGGCGAG CCCCCTGCCG TCGCCGCCCT GCTCCGCGAT	21360
CTGGAGTCCG AGGGCGTCTT OSCCCTCAAG CTGAGTTACG ACTTCGCCTC CCACTCCGCG	21420
CAGGTCGAGT CGATTCGCGA CGAGCTCCTC GATCTCCTGT CGTGGCTCGA GCCGCGCTCG	21480
ACGGCGGTCC O3TTCTACTC CACGGTGAGC GGCGCCGCGA TCGACGGGAG CGAGCTCGAC	21540
GCCGCCTACT GGTACCGGAA CCTCCGGCAG CCGGTCCGCT TCGCAGACGC TGTGCAAGGC	21600
CTCCTTGCCG GAGAACATCG CTTCTTCGTG GAGGTGAGCC (XAGTCCTGT GCTGACCTTG	21660
GCCTTGCACG AGCTCCTCGA AGCGTCGGAG O3CTCGGCGG CGGTGGTCGG CTCTCTGTGG	21720
AGCGACGAAG GGGATCTACG GCGCTTCCTC GTCTCGCTCT CCGAGCTCTA CGTCAACGGC	21780
TTCGCCCTGG ATTGGACGAC GATCCTGCCC CCCGGGAAGC GGGTGCCGCT GCCCACCTAC	21840
CCCTTCCAGC GCGAGCGCTT CTGGCTCGAC GCCTCCACGG CACCCGCCGC CGGCGTCAAC	21900
CACCTTGCTC CGCTCGAGGG GCGGTTCTGG CAGGCCATCG AGAGCGGGAA TATCGACGCG	21960

CTCAGCGGCC AGCTCCACGT GGACGGCGAC GAGCAGCGCG CCGCCCTTGC CCTGCTCCTT 22020

182 136

111

CCCACCCTCG	CGAGCTTTCG CCACGAGCGG CAAGAGCAGG GCACGGTCGA CGCCiGGCGC	22080
TACCGCATCA	CGTGGAAGCC TCTGACCACC GCCACCACGC CCGCCGACCT GGCCGGCACC	22140
TGGCTCCTCG	TCGTGCCGGC CGCTCTGGAC GACGACGCGC TCCCCTCCGC GCTCACCGAG	22200
GCGCTCGCCC	GGCGCGGCGC GCGCGTCCTC GCCGTGCGCC TGAGCCAGGC CCACCTGGAC	22260
CGCGAGGCTC	TCGCCGAGCA CCTGCGCCAG GCTTGCGCCG AGACCGCGCC GCCTCGCGGC	22320
GTGCTCTCGC	TCCTCGCCCT CGACGAAAGT CCCCTCGCCG ACCATGCCGC CGTGCCCGCG	22380
GGACTCGCCT	TCTCGCTCAC CCTCGTCCAA GCCCTCGGCG ACATCGCCCT CGACGCGCCC	22440
TTGTGGCTCT	TCACCCGCGG CGCCGTCTCC GTCGGACACT CXKACCCCAT CGCCCATCCG	22500
ACGCAGGCGA	TGACCTGGGG CCTGGGCCGC GTCGTCGGCC TCGAGCACCC CGAGCGCTGG	22560
GGAGGGCTCG	TCGACGTCGG CGCAGCGATC GACGCGAGCG CCGTGGGCCG CTTGCTCCCG	22620
GTCCTCGCCC	TGCGCAACGA TGAGGACCAG CTCGCTCTCC GCCCGGCCGG GTTCTACGCT	22680
CGCCGCCTCG	TO2GCGCTCC GCTCGGCGftC GCGCCGCCCG CACGTACCTT CAAGCCCOGA	22740
GGCACCCTCC	TCATCACCGG AGGCACCGGC GCS2GCTGGCG CTCACGTCGC CCGATGGCTC	22800
GCTCGAGAAG	GCGCAGAGCA CXTCGTCCTC ATCAGCCGCC GAGGGGCCCA GGCCGAGGGC	22860
GCCTCGGAGC	TCCACGCCGA GCTCACGGCC CTGGGCGCGC GCGTCACCTT CGCCGCGTGT	22920
GATGTCGCCG	ACAGGAGCGC TGTCGCCACG CTTCTCGAGC AGCTCGACGC CGftAGGGTCG	22980
CAGGTCCGCG	CCGTGTTCCA CGCGGGCGGC ATCGGGCGCC ACGCTCCGCT CGCCGCCACC	23040
TCTCTCATGG	AGCTCGCCGA CGTTGTCTCT GCCAAGGTCC TAGGCGCAGG GAACCTCCAC	23100
GACCTGCTCG	GTCCTCGACC CCTCGACGCC ITCTTCCTTT TCTCGTCCAT CGCAGGCGTC	23160
TGGGGCGGCG	GACAACAAGC CGGATACGCC GCCGGAAACG CCTTCCTCGA O3CCCTGGCC	23220
GACCAGCGGC	GCAGTCTTGG ACAGCCGGAC ACGTCCGTGG TGTGGGGCGC GTGGGGCGGC	23280
GGCGGTGGTA	TATTCACGGG GCCCCTGGCA GCCCAGCTGG AGCAACGTOG TCTGTCGCCG	23340
ATGGCCCCTT	CGCTGGCCGT GGCGGCGCTC GCGCAAGCCC TGGAGCACGA CGAGACCACC	23400
GTCACCGTCG	CCGACATCGA CTGGGCGCGC TTTGCGCCTT CGATCAGCGT CGCTCGCTCC	23460
CGCCGCTCCT	GCGCGACTTG CCCGAGCAGC GCGCCCTCGA AGACAGAGAA GGCGCGTCCT	23520
CCTCCGAGCA	CGGCCCGGCC CCCCGACCTC CTCGACAAGC TCCGGAGCCG CTCGGAGAGC	23580
GAGCAGCTCC	GTCTGCTCGC CGCGCTGGTG TGCGACGAGA CGGCCCTCGT CCTCGGCCAC	23640

GAAGGCCGCT TCCCAGCTCG ACCCCGACAA GGCTTCTTCG ACCTCGGTCT CGATTCGATC 23700

112

182 136

ATGACCGTCG AGCTTCGTCG GCECTTGCAA CAGGCCACCG GCATCAAGCT CCCGGCCACC	23760
CTCGCCTTCG ACEATCCCTC TCCTCATCGC GTCGCGCTCT TCATGCGCGA CTCGCTCGCC	23820
CACGCCCTCG GCACGAGGCT CTCCGCCGAG GCGACGCCGC CGCGCTCCGG CCGCGCCTCG	23880
AGCGACGAGC CCATCGCCAT CGTCGGCATG GCCCTGCGCC TGCCGGGCGG CGTCGGCGAT	23940
GTCGACGCTC TTTGGGAGTT CCTCCACCAA GGGCGCGACG CGGTCGAGCC CATTCCACAG	24000
AGCCGCTGGG ACGCCGGTGC CCTCTACGAC CCCGACCCCG ACGCCGACGC CAAGAGCTAC	24060
GTCCGGCATG OCGCGATGCT CGACCAGATC GACCTCTTCG ACCCTGCCTT CTTCGGCATC	24120
AGCCCCCGGG AGGCCAARCA CCTCGACCCC CAGCACCGCC TGCTCCTCGA ATCTGCCTGG	24180
CTGGCCCTCG AGGACGCCGG CATCGTCCCC ACCTCCCTCA AGGACTOCCT CACOGGCGTC	24240
TTCGTCGGCA TCTGCGCCGG CGAATACGOG ATGCAAGAGG CGAGCTCGGA AGGTTCCGAG	24300
GTTTACTTCA TCCAAGGCAC TTCCGCGTCC TTTGGCGOGG GGGGCTTGGC CTATACGCTC	24360
GGGCTCCAGG GGCCGCGATC TTCGGTCGAC ACCGCCTGCT CCTCCTCGCT CGTCTCCCTC	24420
CACCTCGCCT GCCAAGCCCT CCGACAGGGC GAGTGCAACC TCGCCCTCGC CGCGGGCGTG	24480
TCGCTCATGG TCTCTCCCCA GACCTTCGTC ATCCTTTCCC GTCTGCGCGC CTTGGCGCCC	24540
GACGGCCGCT CCAAGACCTT CTCGGACAAC GCCGACGGCT ACGGACGCGG AGAAGGCGTC	24600
GTCGTCCTTG CCCTCGAGCG GATCGGCGAC GCWTCGCCC GGAGACACCG ajTCCTCGTC	24660
CTCGTCCGCG GCACCGCCAT CAACCACGAC GGCGCGTCGA GCGGTATCAC CGCCCCCAAC	24720
GGCACCTCCC AGCAGAAGGT CCTCCGGGCC GCGCTCCACG AO3CCCGCAT CACCCCCGCC	24780
GACGTCGACG TCGTCGAGTG CCATGGCACC GGCACCTCGC TGGGAGACCC CATCGAGGTG	24840
CAAGCCCTGG CCGCCGTCTA CGCCGACGGC AGACCCGCTG AAAAGCCTCT CCTTCTCGGC	24900
GCGCTCAAGA CCAACATCGG CCATCTCGAG GCCGCCTCCG GCCTCGCGGG CGTCGCCAAG	24960
ATGGTCGCCT CGCTCCGCCA CGACGCCCTG CCCCCCACCC TCCACGCGAC CCCACGCAAT	25020
CCCCTCATCG AGTGGGAGGC GCTCGCCATC GACGTCGTCG ATACCCCGAG GCCTTGGCCC	25080
CGCCACGAAG ATGGCAGTCC CCGCCGCGCC GGCATCTCCG CCTTCGGATT CTCGGGCACC	25140
AACGCCCACG TCATCCTCGA AGAGGCTCCC GCCGCCCTGC CGGCCGAGCC CGCCACCTCA	25200
CAGCCGGCGT CGCAAGCCGC TCCCGCGGCG TGGCCCGTGC TCCTGTCGGC CAGGAGCGAG	25260

GCCGCCGTCC GCGCCCAGGC GAAGCGGCTC CGCGACCACC TCGTCGCCCA CGACGACCTC 25320

182 136

113

ACCCTCGCGG ATGTGGCCTA TTCGCTGGCC ACCACCCGCG CCCACTTCGA GCACCGCGCC	25380
GCTCTCGTAG CCCACAACCG CGACGAGCTC CTCTCCGCGC TCGACTCGCT CGCCCAGGAC	25440
AAGCCCGCCC CGAGCACCGT CCTCGGACGG AGCGGAAGCC ACGGCAAGCT CGTCTTCGTC	25500
TTTCCTGGGC AAGGCTCGCA GTGGGAAGGG ATGGCCCTCT CGCTGCTCGA CTCCTCGCCC	25560
GTCTTCCGCG CTCAGCTCGA AGCATGCGAG OGCGCGCTCG CTCCTCACGT CGAGTGGAGC	25620
CTGCTCGCCG TCCTGCGCCG CGACGAGGGC GCCCCCTCCC TCGACOGOGT CGACGTCGTA	25680
CAGCCCGCCC TCTTTGCCGT CATGGTCTCC CTGGCGGCCC TCTGGCGCTC GCTCGGCGTA	25740
GAGCCCGCCG CCGTCGTCGG CCACAGTCAG GGCGAGATCG CCGCCGCCTT CGTO3CAGGC	25800
GCTCTCTCCC TCGAGGAOGC GGCCCGCATC GCCGCCCTGC GCAGCAAAGC GCTCACCACC	25860
GTCGCCGGCA ACGGGGCCAT GGCCGCCGTC GAGCTCGGCG OTCCGACCT CCAGACCTAC	25920
CTCGCTCCCT GGGGCGACAG GCTCTCCATC GOCGCCGTCA ACAGCCCCAG GGCCACGCTC	25980
GTGTCCGGCG AGCCCGCCGC CATCGACGCG CTGATCGACT CGCTCACCGC AGCGCAGGTC	26040
TTCGCCCGAA AAGTCCGCGT CGACTACGCC TCCCACTCOG CCCAGATGGA CGCCGTCCAA	26100
GACGAGCTCG CCGCAGGTCT AGCCAACATC GCTCCTCGGA CGTGOGAGCT CCCTCTTTAT	26160
TCGACCGTCA CCGGCACCAG GCTCGACGGC TCCGAGCTCG ACGGCGCGTA CTGGTATCGA	26220
AACCTCCGGC AAACCGTCCT GTTCTCGAGC GOGACCGAGC GGCTCCTCGA CGATGGGCAT	26280
CWTTCTTCG TCGAGGTCAG OXCCATCCC GTGCTCACGC TOGCCCTCCG CGAGACCTGC	26340
GAGCGCTCAC CGCTCGATCC CGrTCGTCGTC GGCTCCATTC GACGCGACGA AGGCCACCTC	26400
GCCCGCCTGC TCCTCTCCTG GGCGGAGCTC TCTACCCGAG GCCTCGCGCT CGACTGGAAC	26460
GCCTTCTTCG CGCCCTTCGC TCCCCGCAAG GTCTCCCTCC CCACCTACCC CTTCCAACGC	26520
GAGCGCTTCT GGCTCGACGC CTCCACGGCG CACGCTGCCG ACGTCGCCTC CGCAGGCCTG	26580
ACCTCGGCCG ACCACCCGCT GCTCGGCGCC GCCGTCGCCC TCGCCGACCG CGATGGCTTT	26640
GTCTTCACAG GACGGCTCTC CCTCGCAGAG CACCCGTGGC TCGAAGACCA CGTCGTCTTC	26700
GGCATACCCT GTCCTGCCAG GCGCCGCCTC CTCGAGCTCG CCCTGCATGT CGCCCATCTC	26760
GTCGGCCTCG ACACCGTCGA AGACGTCACG CTCGACCCCC CCOTCGCTCT CCCATCGCAG	26820
GGCGCCGTCC TCCTCCAGAT CTCCGTCGGG CCCGCGGACG GTGCTGGACG AAGGGCGCTC	26880
TCCGTTCATA GCCGGCGCCA CGACGCGCTT CAGGATGGCC CCTGGACTCG CCACGCCAGC	26940
GGCTCTCTCG CGCAAGCTAG CCCGTCCCAT TGCCTTCGAT GCTCCGCGAA TGGCCCCCCC	27000

114

182 136

TCGGGCGCCA CCCAGGTGGA CACCCAAGGT TTCTACGCAG CCCTCGAGAG CGCTGGGCTT	27060
GCTTATGGCC CCGAGTTCCA GGGCCTCCGC CGCCGTCTAC AAGCGCGGCG ACGAGCTCTT	27120
CGCCGAAGCC AAGCTCCCGG ACGCCGCCGA AGAGGACGCC GCTCGTTTTG CCCTCCACCC	27180
CGCCCTGCTC GACAGCGCCT TGCAGGCGCT CGCCTTTGTA GACGACCAGG CAAAGGCCTT	27240
CAGGATGCCC TTCTCGTGGA GCGGAGTATC GCTGCGCTCC GGTCGGAGCC ACCACCCTGC	27300
GCGTGCGTTT CCACCGTCCT GAGGGCGAAT CCTCGCGCTC GCTCCTCCTC GCCGACGCCA	27360
GAGGCGAACC CATCGCCTCG GTGCAAGCGC TCGCCATGCG CGCCGCGTCC GCCGAGCAGC	27420
TCCGCAGACC CGGGAGCGTC CCACCTCGAT GCCCTCTTCC GCATCGACTG GAGCGAGCTG	27480
CAAAGCCCCA CCTCACCGOC CATCGCCCCG AGCGGTGCCC TCCTCGGCAC AGAAGGTCTC	27540
GACCTCGGGA CCAGGGTGCC TCTCGACCGC TATACCGACC TTGCTGCTCT ACGCAGCGCC	27600
CTCGACCAGG GCGCTTCGCC TCCAAGCCTC GTCATCGCCC CCTTCATCGC TCTGCCCGAA	27660
GGCGACCTCA TCGCGAGCGC CCGCGAGACC ACCGCGCACG CGCTCGCCCT CTTGCAAGCC	27720
TGGCTCGCCG ACGAGCGCCT O3CCTCCTCG CGCCTCGCCC TCGTCACCCG ACGCGCCGTC	27780
GCCACCCACG CTGAAGAAGA CGTCAAGGGC CTCGCTCACG CGCCTCTCTG GGGTCTCGCT	27840
CGCTCCGCGC AGAGCGAGCA CCCAGAGCGC CCTCTCGTCC TCGTCGACCT CGACGACAGC	27900
GAGGCCTCCC AGCACGCCCT GCTCGGCGCG CTCGACGCAA GAGAGCCAGA GATCGCCCTC	27960
CGCAACGGCA AACCCCTOGT TCCAAGGCTC TCAO3CCTGC CCCAGGCGCC CACGGACACA	28020
GCGTCCCCCG CAGGCCTOGG AGGCACCGTC CTCATCACGG GAGGCACCGG CACGCTCGGC	28080
GCCCTGGTCG CGCGCCGCCT CGTCGTAAAC CACGACGCCA AGCACCTGCT CCTCACCTCG	28140
CGCCAGGGCG CGAGCGCTCC GGGTGCTGAT GTCTTGOGAA GCGAGCTCGA AGCTCTGGGG	28200
GCTTCGGTCA CCCTCGCCGC GTGCGACGTG GCCGATCCAC GCGCTCTAAA GGACCTTCTG	28260
GATAACATTC CGAGCGCTCA. CCCGGTCGCC GCOGTCGTGC ATGCCGCCAG CGTCCTCGAC	28320
GGCGATCTGC TCGGCGCCAT GAGCCTCGAG CGGATCGACC GCGTCTTCGC CCCCAAGATC	28380
GATGCCGCCT GGCACTTGCA TCAGCTCACC CAAGATAAGC CCCTTGCCGC CTTCATCCTC	28440
TTCTCGTCCG TCGCCGGCGT CCTCGGCAGC TCAGGTCACT CCAACTACGC CGCTGCGAGC	28500
GCCTTCCTCG ATGCGCTTGC GCACCACCGG CGCGCGCAAG GGCTCCCTGC CTCATCGCTC	28560

GCGTGGAGCC ACTGGGCCGA GCGCAGCGCA ATGACAGAGC ACGTCAGCGC CGCCGGCGCC 28620

182 136

115

CCTCGCATGG AGCGCGCCGG CCTTCCCTCG ACCTCTGAGG AGAGGCTCGC CCTCTTCGAT 28680

GCGGCGCTCT TCCGAACCGA GACCGCCCTG GTCCCCGCGC GCTTCGACTT GAGCGCGCTC 28740

AGGGCGAACG CCGGCAGCGT CCCCCCGTTG TTCCAACGTC TCGTCCGCGC TCGCACCGTA 28800

CGCAAGGCCG CCAGCAACAC CGCCCAGGCC TCGTCGCTTA CftGAGOGCCT CTCAGCCCTC 28860

CCGCCCGCCG AACGCGAGCG TGCCCTGCTC GATCTCATCC GCACCGAAGC CGCCGCCGTC 28920

CTCGGCCTCG CCTCCTTCGA ATCGCTCGAT CCCGATCG 28958 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 13 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy .

(C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniową (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1... 13 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja z roślinnego inicjatora translacji consensus (Clontech)” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 7

GTCGACCATG GTC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane

116

182 136 (B) POZYCJA: 1... 12 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja z roślinnego inicjatora translacji consensus (Joshi)” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 8

TAAACAATGG CT 12 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja oligonukleotydowa do użycia jako adaptor molekularny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 9

AATTCTAAAG CATGCCGATC GG 22 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1...21 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja oligonukleotydowa do użycia jako adaptor molekularny”

182 136

117 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 10

AATTCCGATC GGCATGCTTT A 21 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja oligonukleotydowa do użycia jako adaptor molekularny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 11

AATTCTAAAC CATGGCGATC GG 22 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1...21 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja oligonukleotydowa do użycia jako adaptor molekularny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 12

118

182 136

AATTCCGATC GCCATGGTTT A 21 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1... 15 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja oligonukleotydowa do użycia jako adaptor molekularny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 13

CCAGCTGGAA TTCCG 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1... 19 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja oligonukleotydowa do użycia jako adaptor molekularny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 14

CGGAATTCCA GCTGGCATG

182 136

119 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1... 11 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „oligonukleotyd użyty do wprawa dzania wymiany zasad do miejsca SphI w ramce ORF1 z zespołu genów pirolnitryny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 15

CCCCCTCATG C (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 1... 11 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „oligonukleotyd użyty do wprawa dzania wymiany zasad do miejsca SphI w ramce ORF1 z zespołu genów pirolnitryny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 16

GCATGAGGGG G

120

182 136 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4603 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 230... 1597 (D) INNE INFORMACJE: /gen= „phz1” /znakowanie= ORF1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1597...2761 (D) INNE INFORMACJE: /gen= „phz2” /znakowanie= ORF2 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 2764... 3600 (D) INNE INFORMACJE: /gen= ,,phz3 /znakowanie= ORF3 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: cechy mieszane (B) POZYCJA: 3597... 4265 (D) INNE INFORMACJE: /znakowanie= ORF4 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 17

GCATGCCGTG ACCTCCGCCG GTGGCGTGGC CGCCGGCCTG CACCTGGAAA CCACCCCTGA

CGACGTCAGC GAGTGCGCTT CCGATGCCGC CGGCCTGCAT CAGGTCGCCA GCCGCTACAA

AAGCCTGTGC GACCCGCGCC TGAACCCCTG GCAAGCCATT ACTGCGGTGA TGGCCTGGAA

AAACCAGCCC TCTTCAACCC TTGCCTCCTT TTGACTGGAG TTTGTCGTC ATG ACC Met Thr

120

180

235

283

GGC

ATT CCA TCG ATC GTC CCT

TAC GCC TTG CCT ACC AAC CGC GAC CTG

Gly

Ile

Pro 5

Ser

Ile

Val

Pro

Tyr 10

Ala

Leu

Pro

Thr

Asn 15

Arg Asp

Leu

CCC GTC AAC CTC GCG CAA TGG AGC ATC GAC CCC GAG CGT GCC GTG CTG

331

182 136

121

Pro Val 20	Asn Leu Ala Gin	Trp Ser Ile Asp Pro Glu Arg Ala Val Leu
25	30
CTG GTG	CAT GAC ATG CAG	CGC TAC TTC CTG	CGG CCC TTG CCC GAC GCC 379
Leu Val 35	His Asp Met Gin 40	Arg Tyr Phe Leu	Arg Pro Leu Pro Asp Ala 45 50
CTG CGT	GAC GAA GTC GTG	AGC AAT GCC GCG	CGC ATT CGC CAG TGG GCT 427
Leu Arg	Asp Glu Val Val 55	Ser Asn Ala Ala 60	Arg Ile Arg Gin Trp Ala 65
GCC GAC	AAC GGC GTT CCG	GTG GCC TAC ACC	GCC CAG CCC GGC AGC ATG 475
Ala Asp	Asn Gly Val Pro 70	Val Ala Tyr Thr 75	Ala Gin Pro Gly Ser Met 80
AGC GAG	GAG CAA CGC GGG	CTG CTC AAG GAC	TTC TGG GGC CCG GGC ATG 523
Ser Glu	Glu Gin Arg Gly 85	Leu Leu Lys Asp 90	Phe Trp Gly Pro Gly Met 95
AAG GCC	AGC CCC GCC GAC	CGC GAG GTG GTC	GGC GCC CTG ACG CCC AAG 571
Lys Ala 100	Ser Pro Ala Asp	Arg Glu Val Val 105	Gly Ala Leu Thr Pro Lys 110
CCC GGC	GAC TGG CTG CTG	ACC AAG TGG CGC	TAC AGC GCG TTC TTC AAC 619
Pro Gly 115	Asp Trp Leu Leu 120	Thr Lys Trp Arg	Tyr Ser Ala Phe Phe Asn 125 130
TCC GAC	CTG CTG GAA CGC	ATG CGC GCC AAC	GGG CGC GAT CAG TTG ATC 667
Ser Asp	Leu Leu Glu Arg 135	Met Arg Ala Asn 140	Gly Arg Asp Gin Leu Ile 145
CTG TGC	GGG GTG TAC GCC	CAT GTC GGG GTA	CTG ATT TCC ACC GTG GAT 715
Leu Cys	Gly Val Tyr Ala 150	His Val Gly Val 155	Leu Ile Ser Thr Val Asp 160
GCC TAC	TCC AAC GAT ATC	CAG CCG TTC CTC	GTT GCC GAC GCG ATC GCC 763
Ala Tyr	Ser Asn Asp Ile 165	Gin Pro Phe Leu 170	Val Ala Asp Ala Ile Ala 175
GAC TTC	AGC AAA GAG CAC	CAC TGG ATG CCA	TCG AAT ACG CCG CCA GCC 811
Asp Phe 180	Ser Lys Glu His	His Trp Met Pro 185	Ser Asn Thr Pro Pro Ala 190
GTT GCG	CCA TGT CAT CAC	CAC CGA CGA GGT	GGT GCT ATG AGC CAG ACC 859
Val Ala 195	Pro Cys His His 200	His Arg Arg Gly	Gly Ala Met Ser Gin Thr 205 210
GCA GCC	CAC CTC ATG GAA	CGC ATC CTG CAA	CCG GCT CCC GAG CCG TTT 907
Ala Ala	His Leu Met Glu 215	Arg Ile Leu Gin 220	Pro Ala Pro Glu Pro Phe 225
GCC CTG	TTG TAC CGC CCG	GAA TCC AGT GGC	CCC GGC CTG CTG GAC GTG 955
Ala Leu	Leu Tyr Arg Pro 230	Glu Ser Ser Gly 235	Pro Gly Leu Leu Asp Val 240

122

182 136

CTG ATC GGC GAA ATG TCG GAA CCG CAG GTC CTG GCC GAT ATC GAC TTG	1003
Leu	Ile	Gly 245	Glu Met Ser Glu Pro Gin Val	Leu	Ala	Asp 255	Ile Asp Leu
250
CCT	GCC	ACC	TCG ATC GGC GCG CCT CGC CTG	GAT	GTA	CTG	GCG CTG ATC	1051
Pro	Ala 260	Thr	Ser Ile Gly Ala Pro Arg Leu 265	Asp	Val 270	Leu	Ala Leu Ile
CCC	TAC	CGC	CAG ATC GCC GAA CGC GGT TTC	GAG	GCG	GTG	GAC GAT GAG	1099
Pro 275	Tyr Arg	Gin Ile Ala Glu Arg Gly Phe 280	Glu 285	Ala	Val	Asp Asp Glu 290
TCG	CCG	CTG	CTG GCG ATG AAC ATC ACC GAG	CAG	CAA	TCC	ATC AGC ATC	1147
Ser	Pro	Leu	Leu Ala Met Asn Ile Thr Glu 295 300	Gin	Gin	Ser	Ile Ser Ile 305
GAG	CGC	TTG	CTG GGA ATG CTG COC AAC GTG	CCG	ATC	CAG	TTG AAC AGC	1195
Glu	Arg	Leu	Leu Gly Met Leu Pro Asn Val 310 315	Pro	Ile	Gin	Leu Asn Ser 320
GAA	CGC	TTC	GAC CTC AGC GAC GCG AGC. TAC	GCC	GAG	ATC	GTC AGC CAG	1243
Glu	Arg	Phe 325	Asp Leu Ser Asp Ala Ser Tyr 330	Ala	Glu	Ile 335	Val Ser Gin
GTG	ATC	GCC	AAT GAA ATC GGC TCC GGG GAA	GGC	GCC	AAC	TTC GTC ATC	1291
Val	Ile 340	Ala	Asn Glu Ile Gly Ser Gly Glu 345	Gly	Ala 350	Asn	Phe Val Ile
AAA	CGC	ACC	TTC CTG GCC GAG ATC AGC GAA	TAC	GGC	CCG	GCC AGT GCG	1339
Lys Arg 355	Thr	Phe Leu Ala Glu Ile Ser Glu 360	Tyr Gly 365	Pro	Ala Ser Ala 370
CTG	TCG	TTC	TTT CGC CAT CTG CTG GAA CGG	GAG	AAA	GGC	GOC TAC TGG	1387
Leu	Ser	Phe	Phe Arg His Leu Leu Glu Arg 375 380	Glu	Lys	Gly	Ala Tyr Trp 385
ACG	TTC	ATC	ATC CAC ACC GGC AGC CGT ACC	TTC	GTG	GGT	GCG TCC CCC	1435
Thr	Phe	Ile	Ile His Thr Gly Ser Arg Thr 390 395	Phe	Val	Gly	Ala Ser Pro 400
GAG	CGC	CAC	ATC AGC ATC AAG GAT GGG CTC	TCG	GTG	ATG	AAC CCC ATC	1483
Glu	Arg	His 405	Ile Ser Ile Lys Asp Gly Leu 410	Ser	Val	Met 415	Asn Pro Ile
AGC	GGC	ACT	TAC CGC TAT CCG CCC GCC GGC	CCC	AAC	CTG	TCG GAA GTC	1531
Ser	Gly 420	Thr	Tyr Arg Tyr Pro Pro Ala Gly 425	Pro	Asn 430	Leu	Ser Glu Val
ATG	GAC	TTC	CTG GCG GAT CGC AAG GAA GCC	GAC	GAG	CTC	TAC ATG GTG	1579
Met 435	Asp	Phe	Leu Ala Asp Arg Lys Glu Ala 440	Asp 445	Glu	Leu	Tyr Met Val 450
GTG	GAT	GAA	GAG CTG TAA ATG ATG GCG CGC	ATT	TGT	GAG	GAC GGC GGC	1627
Val	Asp	Glu	Glu Leu * Met Met Ala Arg 455 1	Ile 5	Cys	Glu	Asp Gly Gly 10

182 136

123

CAC GTC His Val	CTC GGC Leu Gly	CCT TAC CTC AAG GAA ATG GCG CAC CTG GCC CAC ACC	1675
Pro Tyr 15	Leu Lys Glu	Met 20	Ala	His Leu	Ala His Thr 25
GAG TAC	TTC ATC	GAA GGC	AAG ACC CAT	CGC	GAT	GTA CGG	GAA ATC CTG	1723
Glu Tyr	Phe Ile 30	Glu Gly	Lys Thr His 35	Arg Asp	Val Arg	Glu Ile Leu 40
CGC GAA	ACC CTG	TTT GCG	CCC ACC GTC	ACC	GGC	AGC CCA	CTG GAA AGC	1771
Arg Glu	Thr Leu 45	Phe Ala	Pro Thr Val 50	Thr	Gly	Ser Pro 55	Leu Glu Ser
GCC TGC	CGG GTC	ATC CAG	CGC TAT GAN	CCG	CAA	GGC CGC	GCG TAC TAC	1819
Ala Cys 60	Arg Val	Ile Gin	Arg Tyr Xaa 65	Pro	Gin	Gly Arg 70	Ala Tyr Tyr
AGC GGC	ATG GCT	GCG CTG	ATC GGC AGC	GAT	GGC	AAG GGC	GGG CGT TCC	1867
Ser Gly 75	Met Ala	Ala Leu 80	Ile Gly Ser	Asp	Gly 85	Lys Gly	Gly Arg Ser 90
CTG GAC	TCC GCG	ATC CTG	ATT CGT ACC	GCC	GAC	ATC GAT	AAC AGC GGC	1915
Leu Asp	Ser Ala	Ile Leu 95	Ile Arg Thr	Ala 100	Asp	Ile Asp	Asn Ser Gly 105
GAG GTG	CGG ATC	AGC GTG	GGC TCG ACC	ATC	GTG	CGC CAT	TCC GAC CCG	1963
Glu Val	Arg Ile 110	Ser Val	Gly Ser Thr 115	Ile	Val	Arg His	Ser Asp Pro 120
ATG ACC	GAG GCT	GCC GAA	AGC CGG GCC	AAG	GCC	ACT GGC	CTG ATC AGC	2011
Met Thr	Glu Ala 125	Ala Glu	Ser Arg Ala 130	Lys	Ala	Thr Gly 135	Leu Ile Ser
GCA CTG	AAA AAC	CAG.GCG	CCC TCG CGC	TTC	GGC	AAT CAC	CTG CAA GTG	2059
Ala Leu 140	Lys Asn	Gin Ala	Pro Ser Arg Phe 145	Gly	Asn His 150	Leu Gin Val
CGC GCC	GCA TTG	GCC AGC	CGC AAT GCC	TAC	GTC	TCG GAC	TTC TGG CTG	2107
Arg Ala 155	Ala Leu	Ala Ser 160	Arg Asn Ala	Tyr	Val 165	Ser Asp	Phe Trp Leu 170
ATG GAC	AGC CAG	CAG CGG	GAG CAG ATC	CAG	GCC	GAC TTC	AGT GGG CGC	2155
Met Asp	Ser Gin	Gin Arg 175	Glu Gin Ile	Gin 180	Ala	Asp Phe	Ser Gly Arg 185
CAG GTG	CTG ATC	GTC GAC	GCC GAA GAC	ACC	TTC	ACC TCG	ATG ATC GCC	2203
Gin Val	Leu Ile 190	Val Asp	Ala Glu Asp 195	Thr	Phe	Thr Ser	Met Ile Ala 200
AAG CAA	CTG CGG	GCC CTG	GGC CTG GTA	GTG	ACG	GTG TGC	AGC TTC AGC	2251
Lys Gin	Leu Arg 205	Ala Leu	Gly Leu Val 210	Val	Thr	Val Cys 215	Ser Phe Ser
GAC GAA	TAC AGC	TTT GAA	GGC TAC GAC	CTG	GTC	ATC ATG	GGC CCC GGC	2299
Asp Glu	Tyr Ser	Phe Glu	Gly Tyr Asp	Leu	Val	Ile Met	Gly Pro Gly

124

182 136

220 225 230

CCC Pro 235

GGC AAC CCG AGC GAA

GTC CAA CAG CCG AAA ATC AAC CAC CTG CAC

2347

Gly Asn

Pro Ser Glu 240

Val

Gin Gin

Pro

Lys 245

Ile Asn

His

Leu His 250

GTG

GCC

ATC

CGC

TCC

TTG

CTC

AGC

CAG

CAG

CGG

CCA

TTC

CTC

GCG

GTG

2395

Val

Ala

Ile

Arg

Ser 255

Leu

Leu

Ser

Gin

Gin 260

Arg

Pro

Phe

Leu

Ala 265

Val

TGC

CTG

AGC

CAT

CAG

GTG

CTG AGC

CTG

TGC

CTG

GGC

CTG

GAA

CTG

CAG

2443

Cys

Leu

Ser

His 270

Gin

Val

Leu

Ser

Leu 275

Cys

Leu

Gly

Leu

Glu 280

Leu

Gin

CGC

AAA

GCC

ATT

CCC

AAC

CAG

GGC

GTG

CAA AAA

CAG

ATC

GAC

CTG

TTT

2491

Arg Lys

Ala

Ile

Pro

Asn

Gin

Gly Val

Gin

Lys

Gin

Ile

Asp

Leu

Phe

285 290 295

GGC AAT GTC GAA CGG GTG GGT TTC TAC AAC ACC TTC GCC GCC CAG AGC 2539

Gly Asn Val Glu Arg Val Gly Phe Tyr Asn Thr Phe Ala Ala Gin Ser 300 305310

TCG AGT GAC CGC CTG GAC ATC GAC GGC ATC GGC ACC GTC GAA ATC AGC2587

Ser Ser Asp Arg Leu Asp Ile Asp Gly Ile Gly Thr Val Glu Ile Ser

315 320 325330

CGC GAC AGC GAG ACC GGC GAG GTG CAT GCC CTG CGT GGC CCC TCG TTC2635

Arg Asp Ser Glu Thr Gly Glu Val His Ala Leu Arg Gly Pro Ser Phe

335 340345

GCC TCC ATG CAG TTT CAT GCC GAG TCG CTG CTG ACC CAG GAA GGT CCG2683

Ala Ser Met Gin Phe His Ala Glu Ser Leu Leu Thr Gin Glu GlyPro

350 355360

CGC ATC ATC GCC GAC CTG CTG CGG CAC GCC CTG ATC CAC ACA CCT GTC2731

Arg Ile Ile Ala Asp Leu Leu Arg His Ala Leu Ile His Thr ProVal

365 370375

GAG AAC AAC GCT TCG GCC GCC GGG AGA TAA CC ATG CAC CAT TAC GTC2778

Glu Asn Asn Ala Ser Ala Ala Gly Arg * Met His His Tyr Val

380 385 15

ATC ATC GAC GCC TTT GCC AGC GTC CCG CTG GAA GGC AAT CCG GTC GCG2826

Ile Ile Asp Ala Phe Ala Ser Val Pro Leu Glu Gly Asn Pro Val Ala

1520

GTG TTC TTT GAC GCC GAT GAC TTG TCG GCC GAG CAA ATG CAA CGC ATT2874

Val Phe Phe Asp Ala Asp Asp Leu Ser Ala Glu Gin Met Gin ArgIle

3035

GCC CGG GAG ATG AAC CTG TCG GAA ACC ACT TTC GTG CTC AAG CCA CGT2922

Ala Arg Glu Met Asn Leu Ser Glu Thr Thr Phe Val Leu Lys ProArg

4550

AAC TGC GGC GAT GCG CTG ATC CGG ATC TTC ACC CCG GTC AAC GAA CTG 2970

182 136

125

Asn Cys 55

Gly Asp Ala Leu

Ile Arg Ile Phe Thr Pro Val Asn Glu Leu

60

65

ccc

TTC

GCC

GGG

CAC

CCG

TTG

CTG

GGC

ACG

GAC

ATT

GCC

CTG

GGT

GCG

3018

Pro

Phe

Ala

Gly

His

Pro

Leu

Leu

Gly

Thr

Asp

Ile

Ala

Leu

Gly

Ala

70

75

80

85

CGC

ACC

GAC

AAT

CAC

CGG

CTG

TTC

CTG

GAA ACC

CAG

ATG

GGC

ACC

ATC

3066

Arg

Thr

Asp

Asn

His

Arg

Leu

Phe

Leu

Glu

Thr

Gin

Met

Gly

Thr

Ile

90

95

100

GCC

TTT

GAG

CTG

GAG

CGC

CAG

AAC

GGC

AGC

GTC

ATC

GCC

GCC

AGC

ATG

3114

Ala

Phe

Glu

Leu

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Ile

Ala Ala

Ser

Met

105

110

115

GAC

CAG

CCG

ATA

CCG

ACC

TGG ACG

GCC

CTG

GGG

CGC

GAC GCC

GAG

TTG

3162

Asp

Gin

Pro

Ile

Pro

Thr

Trp

Thr Ala

Leu

Gly Arg Asp Ala

Glu

Leu

120

125

130

CTC

AAG

GCC

CTG

GGC

ATC

AGC

GAC

TCG

ACC

TTT

CCC

ATC

GAG

ATC

TAT

3210

Leu

Lys

Ala

Leu

Gly

Ile

Ser

Asp

Ser

Thr

Phe

Pro

Ile

Glu

Ile

Tyr

135

140

145

CAC

AAC

GGC

CCG

CGT

CAT

GTG

TTT

GTC

GGC

CTG

CCA

AGC

ATC

GCC

GCG

3258

His

Asn

Gly

Pro

Arg

His

Val

Phe

Val

Gly

Leu

Pro

Ser

Ile

Ala

Ala

150

155

160

165

CTG

TCG

GCC

CTG

CAC

CCC

GAC

CAC

CGT

GCC

CTG

TAC

AGC

TTC

CAC

GAC

3306

Leu

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Asp

His

Arg

Ala

Leu

Tyr

Ser

Phe

His

Asp

170

175

180

ATG

GCC

ATC

AAC

TGT

TTT

GCC

GGT

GCG

GGA

CGG

CGC

TGG

CGC

AGC

CGG

3354

Met

Ala

Ile

Asn

Cys

Phe

Ala

Gly Ala Gly Arg Arg. Trp Arg

Ser

Arg

185

190

195

ATG

TTC

TCG

CCG

GCC

TAT

GGG

GTG

GTC GAG GAT

GCG

NCC

ACG

GGC

TCC

3402

Met

Phe

Ser

Pro

Ala

Tyr Gly Val

Val Glu Asp

Ala

Xaa

Thr

Gly

Ser

200

205

210

GCT

GCC

GGG

CCC

TTG

GCG

ATC

CAT

CTG GCG

CGG

CAT

GGC

CAG

ATC

GAG

3450

Ala

Ala

Gly

Pro

Leu

Ala

Ile

His

Leu

Ala

Arg

His

Gly

Gin

Ile

Glu

215

220

225

TTC

GGC

CAG

CAG

ATC

GAA

ATT

CTT

CAG

GGC

GTG

GAA

ATC

GGC

CGC

CCC

3498

Phe

Gly

Gin

Gin

Ile

Glu

Ile

Leu

Gin

Gly Val

Glu

Ile

Gly Arg

Pro

230

235

240

245

TCA

CTC

ATG

TTC

GCC

CGG

GCC

GAG

GGC

CGC

GCC

GAT

CAA

CTG

ACG

CGG

3546

Ser

Leu

Met

Phe

Ala

Arg

Ala

Glu

Gly Arg

Ala

Asp

Gin

Leu

Thr

Arg

250

255

260

GTC

GAA

GTA

TCA

GGC

AAT

GGC

ATC

ACC

TTC

GGA

CGG

GGG

ACC

ATC

GTT

3594

Val

Glu

Val

Ser

Gly

Asn

Gly

Ile

Thr

Phe

Gly Arg Gly

Thr

Ile

Val

265

270

275

126

182 136

CTA TGA ACAGTTCAGT ACTAGGCAAG CCGCTGTTGG GTAAAGGCAT GTCGGAATCG 3650

Leu *

CTGACCGGCA CACTGGATGC GCOGTTCCCC GAGTACCAGA AGCCGCCTGC CGATCCCATG	3710
AGCGTGCTGC ACAACTGGCT CGAACGCGCA CGCCGCGTGG GCATCCGCGA ACCCCGTGCG	3770
CTGGCGCTGG CCACGGCTGA CAGCCAGGGC OGGCCTTCGA CACGCATCGT GGTGATCAGT	3830
GAGATCAGTG ACACOGGGGT GCTGTTCAGC ACCCATGCCG GAAGCCAGAA AGGCOGOGAA	3890
CTGACAGAGA ACCCCTGGGC CTCGGGGACG CTGTATTGGC GCGAAACCAG CCAGCAGATC	3950
ATCCTCAATG GCCAGGCCGT GCGCATGCCG GATGCCAAGG CTGACGAGGC CTGGTTGAAG	4010
CGCCCTTATG CCACGCATCC GATGTCATCG GTGTCTCGCC AGAGTGAAGA ACTCAAGGAT	4070
GTTCAAGCCA TGCGCAACGC CGCCAGGGAA CTGGCCGAGG TTCAAGGTCC GCTGCCGCGT	4130
CCCGAGGGTT ATTGCGTGTT TGAGTTACGG CTTGAATCGC TGGAGTTCTG GGGTAACGGC	4190
GAGGAGCGCC TGCATGAACG CTTGCGCTAT GACCGCAGCG CTGAAGGCTG GAAACATCGC	4250
CGGTTACAGC CATAGGGTCC CGCGATAAAC ATGCTTTGAA GTGCCTGGCT GCTCCAGCTT	4310
CGAACTCATT GCGCAAACTT CAACACTTAT GACACCCGGT CAACATGAGA AAAGTCCAGA	4370
TGCGAAAGAA CGCGTATTCG AAATACCAAA CAGAGAGTCC GGATCACCAA AGTGTGTAAC	4430
GACATTAACT CCTATCTGAA TTTTATAGTT GCTCTAGAAC GTTGTCCTTG ACCCAGCGAT	4490
AGACATCGGG CCAGAACCTA CATAAACAAA GTCAGACATT ACTGAGGCTG CTACCATGCT	4550
AGATTTTCAA AACAAGCGTA AATATCTGAA AAGTGCAGAA TCCTTCAAAG CTT	4603

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 456 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 18

Met Thr Gly Ile Pro Ser Ile Val Pro Tyr Ala Leu Pro Thr Asn Arg 15 10 15

Asp Leu Pro Val Asn Leu Ala Gin Trp Ser Ile Asp Pro Glu Arg Ala 20 25 30

Val Leu Leu Val His Asp Met Gin Arg Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Pro

182 136

127

40

Asp Ala Leu Arg Asp Glu Val Val Ser Asn 5055

Trp Ala Ala Asp Asn Gly Val Pro Val Ala 6570

Ser Met Ser Glu Glu Gin Arg Gly Leu Leu 8590

Gly Met Lys Ala Ser Pro Ala Asp Arg Glu 100105

Pro Lys Pro Gly Asp Trp Leu Leu Thr Lys 115120

Phe Asn Ser Asp Leu Leu Glu Arg Met Arg 130135

Leu Ile Leu Cys Gly Val Tyr Ala His Val 145150

Val Asp Ala Tyr Ser Asn Asp Ile Gin Pro 165170

Ile Ala Asp Phe Ser Lys Glu His His Trp 180185

Pro Ala Val Ala Pro Cys His His His Arg 195200

Gin Thr Ala Ala His Leu Met Glu Arg Ile 210215

Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Arg Pro Glu Ser 225230

Asp Val Leu Ile Gly Glu Met Ser Glu Pro 245250

Asp Leu Pro Ala Thr Ser Ile Gly Ala Pro 260265

Leu Ile Pro Tyr Arg Gin Ile Ala Glu Arg 275280

Asp Glu Ser Pro Leu Leu Ala Met Asn Ile 290295

Ser Ile Glu Arg Leu Leu Gly Met Leu Pro 305310

Asn Ser Glu Arg Phe Asp Leu Ser Asp Ala

325330

Ala Arg Ile Arg Gin 60

Thr Ala Gin Pro Gly 80

Asp Phe Trp Gly Pro 95

Val Gly Ala Leu Thr 110

Arg Tyr Ser Ala Phe 125

Asn Gly Arg Asp Gin 140

Val Leu Ile Ser Thr

160

Leu Val Ala Asp Ala 175

Pro Ser Asn Thr Pro 190

Gly Gly Ala Met Ser 205

Gin Pro Ala Pro Glu 220

Gly Pro Gly Leu Leu 240

Val Leu Ala Asp Ile 255

Leu Asp Val Leu Ala 270

Phe Glu Ala Val Asp 285

Glu Gin Gin Ser Ile 300

Val Pro Ile Gin Leu

320

Tyr Ala Glu Ile Val 335

128

182 136

Ser Gin Val Ile Ala Asn Glu Ile Gly Ser Gly Glu Gly Ala Asn Phe

340 345 350

Val Ile Lys Arg Thr Phe Leu Ala Glu Ile Ser Glu Tyr Gly Pro Ala 355 360365

Ser Ala Leu Ser Phe Phe Arg His Leu Leu Glu Arg Glu Lys Gly Ala 370 375380

Tyr Trp Thr Phe Ile Ile His Thr Gly Ser Arg Thr Phe Val Gly Ala

385 390 395400

Ser Pro Glu Arg His Ile Ser Ile Lys Asp Gly Leu Ser Val Met Asn

405 410415

Pro Ile Ser Gly Thr Tyr Arg Tyr Pro Pro Ala Gly Pro Asn Leu Ser 420 425430

Glu Val Met Asp Phe Leu Ala Asp Arg Lys Glu Ala Asp Glu Leu Tyr 435 440445

Met Val Val Asp Glu Glu Leu *

450455 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 388 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 19

Met 1

Met

Ala

Arg

Ile 5

Cys

Glu

Asp Gly Gly 10

His Val Leu

Gly

Pro 15

Tyr

Leu

Lys

Glu

Met 20

Ala

His

Leu

Ala

His 25

Thr

Glu Tyr Phe

Ile 30

Glu

Gly

Lys

Thr

His 35

Arg Asp

Val

Arg

Glu 40

Ile

Leu

Arg Glu Thr 45

Leu

Phe

Ala

Pro

Thr 50

Val

Thr

Gly

Ser

Pro 55

Leu

Glu

Ser

Ala Cys Arg 60

Val

Ile

Gin

Arg 65

Tyr

Xaa

Pro

Gin

Gly Arg 70

Ala

Tyr Tyr

Ser Gly Met 75

Ala

Ala

Leu 80

Ile Gly

Ser

Asp

Gly Lys Gly Gly Arg Ser 85 90

Leu Asp Ser

Ala

Ile 95

Leu

182 136

129

Ile Arg Thr Ala Asp Ile Asp Asn Ser Gly Glu Val Arg Ile Ser Val 100 105110

Gly Ser Thr Ile Val Arg His Ser Asp Pro Met Thr Glu Ala Ala Glu 115 120125

Ser Arg Ala Lys Ala Thr Gly Leu Ile Ser Ala Leu Lys Asn Gin Ala 130 135140

Pro Ser Arg Phe Gly Asn His Leu Gin Val Arg Ala Ala Leu Ala Ser

145 150 155160

Arg Asn Ala Tyr Val Ser Asp Phe Trp Leu Met Asp Ser Gin Gin Arg

165 170175

Glu Gin Ile Gin 180	Ala Asp	Phe Ser Gly Arg Gin Val Leu Ile Val Asp
185	190
Ala Glu Asp Thr	Phe Thr	Ser Met Ile Ala	Lys Gin Leu Arg Ala Leu
195		200	205
Gly Leu Val Val	Thr Val	Cys Ser Phe Ser	Asp Glu Tyr Ser Phe Glu

210 215 220

Gly Tyr Asp Leu Val Ile Met Gly Pro Gly Pro Gly Asn Pro SerGlu

225 230 235240

Val Gin Gin Pro Lys Ile Asn His Leu His Val Ala Ile Arg SerLeu

245 250255

Leu Ser Gin Gin Arg Pro Phe Leu Ala Val Cys Leu Ser His Gin Val 260 265270

Leu Ser Leu Cys Leu Gly Leu Glu Leu Gin Arg Lys Ala Ile Pro Asn 275 280285

Gin Gly Val Gin Lys Gin Ile Asp Leu Phe Gly Asn Val Glu Arg Val 290 295300

Gly Phe Tyr Asn Thr Phe Ala Ala Gin Ser Ser Ser Asp Arg LeuAsp

305 310 315320

Ile Asp Gly Ile Gly Thr Val Glu Ile Ser Arg Asp Ser Glu ThrGly

325 330335

Glu Val His Ala Leu Arg Gly Pro Ser Phe Ala Ser Met Gin Phe His 340 345350

Ala Glu Ser Leu Leu Thr Gin Glu Gly Pro Arg Ile Ile Ala Asp Leu 355 360365

Leu Arg His Ala Leu Ile His Thr Pro Val Glu Asn Asn Ala Ser Ala 370 375380

Ala Gly Arg *

130

182 136

385 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 279 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 20

Met His His Tyr Val Ile Ile Asp Ala Phe	Ala Ser Val Pro Leu Glu
1	5	10	15
Gly Asn	Pro Val Ala Val Phe 20	Phe Asp Ala 25	Asp Asp Leu Ser Ala Glu 30
Gin Met	Gin Arg Ile Ala Arg 35	Glu Met Asn 40	Leu Ser Glu Thr Thr Phe 45
Val Leu 50	Lys Pro Arg Asn Cys 55	Gly Asp Ala	Leu Ile Arg Ile Phe Thr 60
Pro Val 65	Asn Glu Leu Pro Phe 70	Ala Gly His	Pro Leu Leu Gly Thr Asp 75 80
Ile Ala	Leu Gly Ala Arg Thr 85	Asp Asn His 90	Arg Leu Phe Leu Glu Thr 95
Gin Met	Gly Thr Ile Ala Phe 100	Glu Leu Glu 105	Arg Gin Asn Gly Ser Val 110
Ile Ala	Ala Ser Met Asp Gin 115	Pro Ile Pro 120	Thr Trp Thr Ala Leu Gly 125
Arg Asp 130	Ala Glu Leu Leu Lys 135	Ala Leu Gly	Ile Ser Asp Ser Thr Phe 140
Pro Ile 145	Glu Ile Tyr His Asn 150	Gly Pro Arg	His Val Phe Val Gly Leu 155 160
Pro Ser	Ile Ala Ala Leu Ser 165	Ala Leu His 170	Pro Asp His Arg Ala Leu 175
Tyr Ser	Phe His Asp Met Ala 180	Ile Asn Cys 185	Phe Ala Gly Ala Gly Arg 190
Arg Trp	Arg Ser Arg Met Phe 195	Ser Pro Ala 200	Tyr Gly Val Val Glu Asp 205
Ala Xaa 210	Thr Gly Ser Ala Ala 215	Gly Pro Leu	Ala Ile His Leu Ala Arg 220

182 136

131

His Gly Gin Ile Glu Phe Gly Gin Gin Ile Glu Ile Leu Gin Gly Val

225 230 235240

Glu Ile Gly Arg Pro Ser Leu Met Phe Ala Arg Ala Glu Gly Arg Ala

245 250255

Asp Gin Leu Thr Arg Val Glu Val Ser Gly Asn Gly Ile Thr Phe Gly 260 265270

Arg Gly Thr Ile Val Leu * 275 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1007 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1...669 (D) INNE INFORMACJE: /gen= „phz4” /znakowanie^ ORF4 /uwaga= „Ta sekwencja DNA powtarza się z SEK ID NR 17 w wyniku czego nakładająca się na nią ORF4 może podlegać translacji oddzielnie” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 21

ATG AAC AGT TCA GTA CTA GGC AAG CCG CTG TTG GGT AAA GGC ATG TCG

Met Asn Ser Ser Val Leu Gly Lys Pro Leu Leu Gly Lys Gly Met Ser

1015

GAA TCG CTG ACC GGC ACA CTG GAT GCG CCG TTC CCC GAG TAC CAGAAG

Glu Ser Leu Thr Gly Thr Leu Asp Ala Pro Phe Pro Glu Tyr GinLys

2530

CCG CCT GCC GAT CCC ATG AGC GTG CTG CAC AAC TGG CTC GAA CGCGCA

Pro Pro Ala Asp Pro Met Ser Val Leu His Asn Trp Leu Glu ArgAla

4045

CGC CGC GTG GGC ATC CGC GAA CCC CGT GCG CTG GCG CTG GCC ACG GCT

Arg Arg Val Gly Ile Arg Glu Pro Arg Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ala

144

192

132

182 136

55 60

GAC AGC CAG GGC CGG CCT TCG ACA CGC ATC GTG GTG ATC AGT GAG ATC240

Asp Ser Gin Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Val Val Ile Ser GluIle

70 7580

AGT GAC ACC GGG GTG CTG TTC AGC ACC CAT GCC GGA AGC CAG AAA GGC288

Ser Asp Thr Gly Val Leu Phe Ser Thr His Ala Gly Ser Gin LysGly

9095

CGC GAA CTG ACA GAG AAC CCC TGG GCC TCG GGG ACG CTG TAT TGG CGC336

Arg Glu Leu Thr Glu Asn Pro Trp Ala Ser Gly Thr Leu Tyr Trp Arg

100 105110

GAA ACC AGC CAG CAG ATC ATC CTC AAT GGC CAG GCC GTG CGC ATG CCG384

Glu Thr Ser Gin Gin Ile Ile Leu Asn Gly Gin Ala Val Arg Met Pro

115 120125

GAT GCC AAG GCT GAC GAG GCC TGG TTG AAG CGC CCT TAT GCC ACG CAT432

Asp Ala Lys Ala Asp Glu Ala Trp Leu Lys Arg Pro Tyr Ala Thr His

130 135140

CCG ATG TCA TCG GTG TCT CGC CAG AGT GAA GAA CTC AAG GAT GTT CAA480

Pro Met Ser Ser Val Ser Arg Gin Ser Glu Glu Leu Lys Asp Val Gin

145 150 155160

GCC ATG CGC AAC GCC GCC AGG GAA CTG GCC GAG GTT CAA GGT CCG CTG528

Ala Met Arg Asn Ala Ala Arg Glu Leu Ala Glu Val Gin Gly Pro Leu

165 170175

CCG CGT CCC GAG GGT TAT TGC GTG TTT GAG TTA CGG CTT GAA TCG CTG576

Pro Arg Pro Glu Gly Tyr Cys Val Phe Glu Leu Arg Leu Glu Ser Leu

180 185190

GAG TTC TGG GGT AAC GGC GAG GAG CGC CTG CAT GAA CGC TTG CGC TAT624

Glu Phe Trp Gly Asn Gly Glu Glu Arg Leu His Glu Arg Leu Arg Tyr

195 200205

GAC CGC AGC GCT GAA GGC TGG AAA CAT CGC CGG TTA CAG CCA TAGGGTCCCG 676

Asp Arg Ser Ala Glu Gly Trp Lys His Arg Arg Leu Gin Pro 210 215220

CGATAAACAT GCTTTGAAGT GCCTGGCTGC TCCAGCTTCG AACTCATTGC GCAAACTTCA736

ACACTTATGA CACCCGGTCA ACATGAGAAA AGTCCAGATG CGAAAGAACG CGTATTCGAA796

ATACCAAACA GAGAGTCCGG ATCACCAAAG TGTGTAACGA CATTAACTCC TATCTGAATT856

TTATAGTTGC TCTAGAACGT TGTCCTTGAC CCAGCGATAG ACATCGGGCC AGAACCTACA916

TAAACAAAGT CAGACATTAC TGAGGCTGCT ACCATGCTAG ATTTTCAAAA CAAGCGTAAA976

TATCTGAAAA GTGCAGAATC CTTCAAAGCT T

1007

182 136

133 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 222 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 22

Met 1

Asn

Ser

Ser

Val 5

Leu

Gly Lys

Pro

Leu 10

Leu

Gly Lys

Gly

Met 15

Ser

Glu

Ser

Leu

Thr 20

Gly

Thr

Leu Asp

Ala 25

Pro

Phe

Pro

Glu

Tyr 30

Gin

Lys

Pro

Pro

Ala 35

Asp

Pro

Met

Ser

Val 40

Leu

His

Asn

Trp

Leu 45

Glu

Arg

Ala

Arg

Arg 50

Val

Gly

Ile

Arg

Glu’ Pro 55

Arg

Ala

Leu

Ala 60

Leu

Ala

Thr

Ala

Asp 65

Ser

Gin

Gly Arg

Pro 70

Ser

Thr

Arg

Ile

Val 75

Val

Ile

Ser

Glu

Ile 80

Ser

Asp

Thr

Gly

Val 85

Leu

Phe

Ser

Thr

His 90

Ala

Gly

Ser

Gin

Lys 95

Gly

Arg

Glu

Leu

Thr 100

Glu

Asn

Pro

Trp

Ala 105

Ser

Gly

Thr

Leu

Tyr Trp Arg 110

Glu

Thr

Ser 115

Gin

Gin

Ile

Ile

Leu 120

Asn

Gly Gin

Ala

Val 125

Arg

Met

Pro

Asp

Ala 130

Lys

Ala

Asp

Glu

Ala 135

Trp

Leu

Lys Arg

Pro 140

Tyr

Ala

Thr

His

Pro 145

Met

Ser

Ser Val

Ser 150

Arg

Gin

Ser

Glu

Glu 155

Leu

Lys Asp

Val

Gin 160

Ala

Met

Arg

Asn

Ala Ala Arg 165

Glu

Leu

Ala 170

Glu Val

Gin

Gly

Pro 175

Leu

Pro

Arg

Pro

Glu 180

Gly Tyr Cys

Val

Phe 185

Glu

Leu

Arg

Leu

Glu 190

Ser

Leu

Glu

Phe

Trp Gly 195

Asn

Gly Glu

Glu 200

Arg

Leu

His

Glu

Arg 205

Leu

Arg Tyr

Asp Arg Ser Ala Glu Gly Trp Lys His Arg Arg Leu Gin Pro

210 215 220

182 136

182 136

Mapa funkcyjna regionu genu pirolnitryny w MOCG134

(+)(+)(+)(+)

Ε EE kb

Wpływ insercji Tn5 na wytwarzanie pirolnitryny

S = Gospodarz

I wytwarzający pirolnitrynę

Gospodarz nie wytwarzający pirolnitryny

E = Eco RI miejsce; N = Not I miejsce

Fig. 2

182 136

182 136

Kb

182 136

Region genu Prn w MOCG134

E 1 _	1,77	B , B 1 ^01 1	1,24	1 2,18
1 Xba -----i-----------------------------------------------------------------------------------------------------
	ORF1	ORF2		- ORF3 ORF4
Okb	1,0	2,0	3,0	4,0 5.0 6,0

I___________i___________I___________i-----------1-----------1___________i___________i__________1___________i___________1___________i___________L

Fig. 5

182 136

Delecje w regionie genu Prn w MOCG134

E E EE । 1,77 । 1,01 । 1,24।2,18

I ' Ή.................¹ .........

ORF1 ORF2 ORF3ORF4 kb 1,0 2.0 3,0 4,0 5,06,0

I । I________i________1________i_______L______i_______L______i________I________iL

Fig. 6

182 136

182 136

182 136

1 2 3 4 56

-» I-----------------------1-----------------------1-----------------------I-----------------------1-----------------------11

E C Sm C S P Sm SmH

I__LJ________________L_J_l I ll — >

LI I LEETIII

--->-----—> ORF5

----E---> ORF3	ORF4	---> ES&Sl ORF6
___________\///// Λ
ORF1	ORF2
E=EcoRI	C=Clal	Sm=Smal
S=Sall	P=Pstl	H=Hindlll

Fig. 9

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Cząsteczka DNA kodująca biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny, zdefiniowana sekwencją nukleotydów określoną jako SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z niąhybrydyzuje.
2. 2. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określonąjako sekwencja nukleotydów 396 do 2056 w SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z niąhybrydyzuje.
3. 3. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określonąjako sekwencja nukleotydów 2026 do 3166 w SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z niąhybrydyzuje.
4. 4. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określonąjako sekwencja nukleotydów 3130 do 4904 w SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z niąhybrydyzuje.
5. 5. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że jest zdefiniowana sekwencją nukleotydów określonąjako sekwencja nukleotydów 4851 do 6122 w SEK ID nr 1 albo sekwencją nukleotydów, która z niąhybrydyzuje.
6. 6. Cząsteczka DNA według zastrz. 2, znamienna tym, że koduje białko o sekwencji określonej jako SEK ID nr 2.
7. 7. Cząsteczka DNA według zastrz. 4, znamienna tym, że koduje białko o sekwencji określonej jako SEK ID nr 4.
8. 8. Cząsteczka DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że koduje białko o sekwencji określonej jako SEK ID nr 5.
9. 9. Cząsteczka DNA według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że kodony genu są w niej zmienione zgodnie z preferencjami roślinnymi, przy zachowaniu niezmienionych, kodowanych aminokwasów.
10. 10. Cząsteczka DNA według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że jest modyfikowana technikami inżynierii genetycznej tak, aby stanowiła część genomu roślinnego.
11. 11. Cząsteczka DNA kodująca enzym biosyntetyczny uczestniczący w szlaku biosyntezy sorafenu, zdefiniowana sekwencją nukleotydową określonąjako SEK ID nr 6 albo sekwencją nukleotydową, która z niąhybrydyzuje.
12. 12. Cząsteczka DNA według zastrz. 11, znamienna tym, że kodony genu są w niej zmienione zgodnie z preferencjami roślinnymi, przy zachowaniu niezmienionych, kodowanych aminokwasów.
13. 13. Cząsteczka DNA według zastrz. 11 albo 12, znamienna tym, że jest modyfikowana technikami inżynierii genetycznej tak, aby stanowiła część genomu roślinnego.
14. 14. Biosyntetyczny enzym uczestniczący w szlaku biosyntezy pirolnitryny, zdefiniowany przez sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEK ID nr 2, SEK ID nr 4 oraz SEK ID nr 5.
15. 15. Gospodarz będący mikroorganizmem transformowany wektorem ekspresyjnym zawierającym cząsteczkę DNA zdefiniowaną przez sekwencję nukleotydów SEK ID nr 1, nukleotydy 396 do 2056, albo nukleotydy 2026 do 3166, albo nukleotydy 3130 do 4904, albo

    182 136 nukleotydy 4851 do 6122 w SEK ID nr 1, przez sekwencję nukleotydów, która z nimi hybrydyzuje, albo przez sekwencję nukleotydów kodującą białko o sekwencji określonej w SEK ID nr 2, SEK ID nr 4 albo SEK ID nr 5, przy czym gospodarz jest wybrany z grupy obejmującej bakterie, grzyby i drożdże.
16. 16. Gospodarz według zastrz. 15, znamBeniKiy tym, że jest czynnikiem kontroli biologicznej.
17. 17. Gospodarz według zastrz. 16, znamienny tym, że jest organizmem kolonizującym rośliny.
18. 18. Gospodarz według zastrz. 15, znamienny tym, że jest zdolny do wytwarzania dużych ilości substancji antypatogenicznej.

    * * *