KR100371904B1 - 항병원성물질을합성하기위한유전자 - Google Patents

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필립 유진 해머
스코트 조셉 유크네스
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Abstract

본 발명은 APS를 생물학적으로 합성하는데 필요한 폴리펩티드의 재조합체 발현을 통하여 숙주에서 항병원성 물질(APS)을 생산하는 것에 관한 것이다. 특정 항병원성 물질을 생산하는데 필요한 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제공되며, 아울러 소망하는 임의의 APS를 재조합적으로 생합성하는데 필요한 유전자를 동정하고 단리하는 방법도 제공한다. 클로닝된 유전자는 소망하는 숙주 생물에서 형질전환되고 발현되어 숙주를 병원체로 부터 보호하고, 숙주를 생물방제제로서 개발되며 또 다량의 APS를 균일하게 생산하는 것을 비롯한 다양한 목적을 위하여 본 발명에 따라 APS를 생산한다.

Description

항병원성 물질을 합성하기 위한 유전자
본 발명은 병원체로 부터 숙주 생물을 보호하기 위한 방법, 보다 특히 식물 병원체로 부터 식물을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 식물병원체에 대해 향상된 내성을 갖는 트랜스제닉(transgenic) 식물 및 향상된 생물방제 특성을 갖는 생물방제 생물을 제공한다. 본 발명은 또한 식물병원체로 부터 식물을 보호하기 위한 방법 및 항병원성 물질을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
식물은 흔히 진균이나 세균에 의해 감염되고, 많은 미생물종이 생장 식물에 의해 제공되는 상이한 활동범위를 이용하는 것으로 밝혀졌다. 일부 식물병원체들은 잎 표면을 감염시키는데 관여되며 공기를 통하여 식물 대 식물 접촉으로 퍼지거나 또는 다양한 벡터를 통하여 퍼지는 반면에, 다른 식물병원체는 토양에서 생겨나서 바람직하게는 뿌리 및 새로이 발아된 묘목 등을 감염시킨다. 진균 및 세균에 의한 감염 이외에, 많은 식물 질병은 토양에서 생겨 뿌리를 감염시키며, 전형적으로는 동일 작물종이 동일 경지에서 수년간 계속 재배되는 경우에 심각한 손상을 초래하는 선충에 의해 유발된다.
식물 질병은 매년 상당한 양의 곡물 손실을 유발하고 있어 전세계의 많은 지역에서 농부에게 경제적 곤란과 지역민에게 영양 결핍을 초래하고 있다. 살진균제 사용 확대로 식물병원체의 공격으로 부터 상당히 안정해졌지만 살진균제에 대한 10억 달러의 지출에도 불구하고 1981년 전세계의 곡물 손실은 곡물의 약 10%에 달하였다(제임스, Seed Sci. & Technol. 9: 679-685(1981)). 질병의 파괴 과정의 심각성은 식물병원체의 공격성 및 숙주의 반응에 따라 다르므로 식물 개량 프로그램의 한가지 목적은 질병에 대한 숙주 식물의 내성을 향상시키기 위한 것이다. 질병에 대한 내성을 제공하기 위해 개발된 신규 유전자 공급원 및 이들의 조합물은 내성 유전자를 견디는 식물병원체가 급격히 발생되기 때문에 많은 작물 병원체계에서 성공적인 사용될 수 없어 그 사용이 제한되어 왔다. 또한, 특정 살진균제에 대해 내성인 진균 균주의 발생이 여러 문헌에서 보고되어 있다. 1981년 초, 플레쳐 및 울프는 Proc.1981 Brit.Crop Prot. Conf. (1981)에서 봄 보리에서 생긴 가루로 되는 노즐 병균 집단의 24% 및 겨울 보리에서 생긴 노균 병균 53%가 살진균제인 트리아디메놀에 대하여 상당한 변형을 나타내고 또 이들 집단의 분포는 보리 품종간에 상이하며 가장 감염되기 쉬운 종도 감염성이 덜한 진균 유형의 최고 발생율을 나타낸다고 주장하였다. 살진균제에 대한 진균의 감수성에서 유사한 변형은 몇 개 예로서 밀노균병균(트리아디메놀에 대하여), 보트리티스(베노밀에 대하여), 피레노포라(유기수은에 대하여), 슈도세르코스포렐라(MBC-유형의 살진균제에 대하여) 및 미코스파에렐라 피지엔시스(Mycosphaerella fijiensis)(트리아졸에 대하여)를 들 수 있다(존스 및 클리포드; Cereal Diseases, 존 윌리 출판, 1983). 선충에 의해 유발된 질병들은 살충제를 도포함으로써 성공적으로 제어되어 왔다. 대부분의 살진균제는 포유류에 대하여 비교적 무해하고 또 이들의 사용과 관련한 문제가 표적 진균의 내성 발생과 관련된 것임에 반하여, 살선충제의 사용과 관련한 주요 문제는 포유류에 대한 독성이 비교적 높다는 것이다. 토양 선충을 방제하기 위해 사용된 대부분의 살선충제는 카르바메이트, 유기염소 또는 유기인 그룹이고, 특별히 주의하여 토양에 도포하여야 한다.
일부 작물종에서는 작물을 보호하기 위한 다른 수단으로서 생물방제 생물이 이용되고 있다. 생물방제 생물은 통상의 살진균제로는 접근할 수 없는 식물 위치에 살면서 식물을 보호할 수 있는 이점이 있다. 이러한 방법은 일부 토양에서 자란 작물이 특정 진균 식물병원체에 대하여 천연적으로 내성이고 또 이들 토양의 억제 특성이 오토클레이빙에 의해 제거된다는 사실을 인지함으로써 개발되었다. 또한 특정 질병의 발병에 관여하는 토양이 억제성 들에서 취한 소량의 토양을 부가함으로써 또한 억제성으로 될 수 있다는 것도 확인되었다(Scher 일행, Phytopathology 70: 412-417 (1980)). 뒤이은 연구는 뿌리에 서식하는 세균이 상기 현상에 관련되는 것을 밝혔으며, 지금은 생물적 질병방제로서 공지되어 있다(베이커 일행, Biological Control of Plant Pathogens, 프리맨 출판사, 샌 프란시스코, 1974). 많은 경우에, 생물적 질병방제 세균의 가장 효과적인 균주는 슈도모나스 플루오레센스 종이다(웰러 일행, Phytopathoiogy73: 463-469(1983); 클로에퍼 일행, Phytopathology71: 1020-1024 (1981)). 이들 세균으로 종자 접종함으로써 효과적으로 방제되는 중요한 식물병원체는 밀의 입고병의 병원균(Cook 일행, Soil Biol.Biochem 8: 269-273(1976)인 가에마노마 이세서 그라미니스 (Gaemannomyces graminis) 및 목화가 습기에 의해 썩는데 관여되는 피튬(Pythium) 및 리족토니아(Rhizoctonia) 식물병원체이다. 몇 개의 생물학적 질병을 방제하는 슈도모나스 균주는 진균 식물병원체의 생장을 억제하는 항생물질(Howell 일행, Phytopathology69: 480-482(1979);Howell 일행, Phytopathology70: 712-715(1980))을 생산하며 이들은 근권에서 진균 식물병원체의 방제에도 연관된다. 생물방제는 처음에는 질병 방제를 위한 널리 이용될 방법으로서 기대되었으나, 토양기원 식물병원체 방제에 가장 성공적으로 사용되는 온실 작물의 환경에 주로 이용된다는 것이 밝혀졌다. 천연적으로 생기는 미생물을 다량으로 투여하는 것은 이들 미생물의 생산(서서히 자란다), 분포(생존이 짧다) 및 비용(이들 문제의 결과로서) 문제 때문에 가능하지 않은 것으로 밝혀져있다. 또한 생물방제 법은 제한되는 효율 스펙트럼을 가질 수 있는 천연에서 생기는 균주의 동정으로 그 성공이 크게 제한된다. 초기의 방법은 생물방제 생물을 이용하여 선충 식물병원체를 방제하는데 편중되었다. 이들 방법은 여전히 탐구중이지만, 일부 스트렙토마이세스(Streptomyces)종은 뿌리 결절 선충 (멜리오도기네(Meliodogyne)종)(WO 93/18135호, Research Corporation Technology)을 방제하는 것으로 보고되어 있고 또 일부 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주(이스라엘리엔시스(israeliensis)와 같은)로 부터 얻은 독소가 광범위한 항선충 활성을 가지는 것으로 밝혀졌고 또 포자 또는 바실루스 제제는 적합한 생물방제 특성(미코겐에 의한 EP 0 352 052호, 리서치 코포레이숀 테크놀로지에 의한 WO 93/19604호)을 제공할 수 있다고 알려져있다.
질병 내성을 갖도록 식물을 개량하는 것을 비롯한 질병으로 부터 작물을 보호하기 위한 전통적인 방법, 지속적인 살진균제의 개발 및 보다 최근의 생물방제 생물의 동정은 성공적으로 실행되어 왔다. 그러나 과학자들은 질병으로 부터 작물을 보호하는 새로운 방법을 계속 연구해야 할 것이다. 본 발명은 식물병원체로 부터 식물을 보호하기 위한 신규 방법을 제공한다.
본 발명은 식물병원체의 중식 또는 성장에 유해한 효과를 갖는 다수 유전자 생합성 경로를 통하여 특정 미생물에 의해 제조된 물질에 대한 유전학적 기초를 제시한다. 이들 물질은 아미노글리코시드와 같은 탄수화물함유 항생물질, 펩티드 항생물질, 뉴클레오시드 유도체 및 질소 및/또는 산소를 함유하는 기타 헤테로시클릭 항생물질, 폴리켑티드, 대환식 락톤 및 퀴논을 포함한다.
본 발명은 숙주 생물에서 특정의 항병원성 물질을 재조합적으로 생산하는데 필요한 전체 유전자 세트를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 유전자가 트랜스제닉 식물에서 발현되도록 APS 유전자 서열을 조작하는 방법을 제공한다. 이렇게하여 변형된 트랜스제닉 식물은 식물병원체 공격에 대하여 향상된 내성을 갖는다. 본 발명은 또한 유전자 산물이 필요로 하는 물질의 유용성에 맞게 적합한 지역에 있도록 APS 유전자 산물을 세포로 보내는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 물질 전구체를 코딩하는 유전자의 과잉발현 및 과잉생산에 의하여 APS 대사경로를 통한 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 숙주 생물에서 특정 APS의 생합성에 관련된 유전자를 동정하고 단리하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이질성 APS를 생산하고 또 통상의 숙주범위 밖의 토양기원 식물병원체 및 묘목 식물병원체의 방제에 효과적인 생물방제 균주의 개량을 기술한다.
따라서 본 발명은 질병 방제 방법도 제공한다. 이들 방법은 APS 생합성 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 사용 및 APS 유전자를 발현하는 생물방제제의 사용도 포함한다.
본 발명은 또한 단리가능하고 또 농업용 제제로 사용하기에 충분한 다량의 APS를 생산하는 방법도 제공한다. 이들 제조 방법의 특정 이점은 제조된 분자의 균일한 키럴성; 트랜스제닉 생물에서 생산이 라세미 혼합물을 생성하지 않고 일부 에난티오머의 활성은 감소되는 점이다.
정의
본 발명에서 사용된 바와 같이, 이하의 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다.
항병원성 물질: 생산될 식물에 대해 외인성이고 숙주에서 천연적으로 생기지 않는 하나 이상의 비내인성 효소 활성을 필요로하는 물질로서 병원체의 증식 또는 성장에 유해한 악영향을 갖는 물질. "비내인성 효소 활성"이라는 용어는 숙주에 천연적으로 생기는 것이 아닌 효소 활성이라는 의미로서 항병원성 물질은 천연적으로 생기지 않는다. 병원체는 진균, 세균, 선충, 바이러스, 비로이드, 곤충 또는 이들의 조합물일 수 있고 또 숙주 생물에서 질병의 직접적 또는 간접적인 원인 물질일 수 있다. 항병원성 물질은 식물병원체의 증식 또는 성장을 억제할 수 있거나 또는 식물병원체를 치사시킬 수 있다. 항병원성 물질은 숙주에서 천연적으로 생기는 물질로 부터 합성될 수 있다. 이와다르게는, 항병원성 물질은 필수적인 비내인성 효소 활성과 합께 숙주에 제공된 물질로 부터 합성될 수 있다. 항병원성 물질은 탄수화물 함유 항생물질, 펩티드 항생물질, 질소를 함유하는 헤테로시클릭 항생물질, 산소를 함유하는 헤테로시클릭 항생물질, 질소 및 산소를 함유하는 헤테로시클릭 항생물질, 폴리켑티드, 대환식 락톤 및 퀴논일 수 있다. 항병원성 물질은 본 명세서를 통하여 이후 "APS"로 약칭한다.
항식물병원성 물질: 식물의 병원균(식물병원체)의 증식과 성장에 유해한 영향을 갖는 항병원성 물질.
생물방제제: 병원체의 성장에 영향을 주어 질병을 일어키는 병원체의 능력을 감소시키는 생물. 식물에 대한 생물방제제는 식물 또는 근권에 서식할 수 있는 미생물을 포함한다. 이러한 생물방제제는 슈도모나스, 엔테로박터 및 세라티아와 같은 그램 양성 미생물, 바실루스와 같은 그램 양성 미생물 및 트리코데르마 및 글리오클라디움과 같은 진균을 포함한다. 생물은 원래 상태로 생물방제제로서 작용할 수 있거나 또는 이들은 본 발명에 따라 유전공학적으로 처리될 수 있다.
병원체: 적합한 조건하에서 선정 숙주상에 유해한 영향을 유발하는 생물. 본 발명의 범위내에서 용어 병원체는 진균, 세균, 선충, 바이러스, 비로이드 및 곤충을 포함하여 의미한다.
프로모터 또는 조절 DNA 서열: 단백질 또는 기타 DNA 산물을 코드화하는 관련 구조 DNA서열의 전사, 번역 또는 발현을 보조하거나 향상시키거나 또는 악영향을 주는 전사되지 않는 DNA서열. 프로모터 DNA 서열은 번역된 DNA 서열의 5'말단, 번역 개시 위치의 5' 말단으로 부터 20 내지 100 뉴클레오티드 사이에 위치한다.
코딩 DNA 서열: 생물에서 번역되어 단백질을 생성하는 DNA 서열.
기능적으로 연결된/관련된: "관련된" 또는 기능적으로 연결된" 2개의 DNA 서열은 물리적으로 또는 기능적으로 관련된다. 예컨대 프로모터 또는 조절 DNA 서열은 이들 2개 서열이 기능적으로 연결되거나 또는 조절 DNA 서열이 코딩 또는 구조DNA 서열의 발현 정도에 영향을 주도록 위치하면 RNA 또는 단백질을 코드화하는 DNA 서열과 결합되어 있다고 볼 수 있다.
키메라 구조/융합 DNA서열: 프로모터 또는 조절 DNA 서열이, 조절 DNA 서열이 관련된 DNA 서열의 전사 또는 발현을 조절할 수 있도록 mRNA를 코드화하거나 또는 단백질로 발현되는 DNA서열과 기능적으로 연결되거나 결합된 재조합 DNA 서열. 키메라 구조의 조절 DNA 서열은 천연적으로 산출되는 바와 같이 DNA 서열과 기능적으로 연결되지 않는다. "이질성" 또는 "비동족"이라는 용어는 프로모터 또는 조절 DNA 서열 및 관련 DNA 서열이 상이한 종 또는 속의 생물로부터 단리된 재조합 DNA 서열을 의미한다.
도 1 : 피롤니트린 생합성 유전자 영역을 갖는 수슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fuorescens)로 부터 얻은 코스미드 클론 pCIB169의 제한지도. 효소 EcoRI, HindIII, KpnI, NotI, SphI 및 XbaI 제한위치 뿐만 아니라 kbp중의 뉴클레오티드 위치도 표시되어 있다.
도 2 : 피롤니트린을 생합성하기 위한 유전자의 동정에 필요한 pCIB169 길이를 따라 30개의 독립 Tn5 삽입물의 삽입점을 지시하는 MOCG134의 피롤니트린 유전자 영역의 기능 지도. EcoRI 제한위치는 E로 표시하고, NotI 위치는 N으로 표시한다. prn 생산시에 Tn5 삽입물의 효과는 + 또는 -로 나타내며, +는 prn 생산자이고 -는 prn 비생산자이다.
도 3 : 피롤니트린 생합성에 관여된 클론 pCIB169의 9.7 kb MOCG134 Prn 유전자 영역의 제한지도. EcoRI 제한위치는 E로 나타내고, NotI 위치는 N으로 표시하며, 또 HindIII 위치는 H로 나타낸다. 뉴클레오티드 위치는 kbp로 표시한다.
도 4 : 서열을 결정하기 위해 단리된 pCIB169로 부터 유도된 다양한 서브클론의 위치.
도 5 : MOCG134 균주에서 피롤니트린 생합성에 관련되는 4개의 오픈 리딩프레임(ORFs 1-4)의 Prn 유전자 영역을 포함하는 pCIB169의 ~6kb XbaI/NotI 단편 상에서의 위치.
도 6 : MOCG134의 피롤니트린 유전자군에서 ORFs 1-4가 결실된 단편의 위치.
도 7 : 소라펜 생합성 유전자 영역을 갖는 소란지움 셀룰로숨(Sorangium cellulosum)으로 부터 얻은 코스미드 클론 p98/1의 제한 지도. 맨 위의 선은 p98/1의 제한 지도를 도시하고 또 제한위치의 장소와 좌측 엣지로 부터 이들의 거리를 kb로 나타낸 것이다. 제한위치는 다음을 포함한다: B, Bam HI; Bg BgI II; E, Eco RI; H, Hind III; Pv, Pvu I; Sm, Sma I. 제한지도 아래의 박스는 생합성 모듈의 위치를 도시한다. 각 모듈내에서 활성 도메인은 다음과 같이 나타낸다: β-케토아실합성효소(KS), 아실트랜스퍼라제(AT), 케토환원효소(KR), 아실 캐리어 단백질(ACP), 탈수효소(DH), 에노일 환원효소(ER) 및 티오에스테레라제(TE).
도 8 : pSUP2021로 부터 작성한 pCIB132의 구성.
도 9 : 5.7 kb EcoRI-HindIII 단편상에 함유된 페나진 생합성 유전자군의 제한 엔도뉴클레아제 지도. 6개의 오픈 리딩 프레임의 방향 및 인접 위치는 제한 지도 아래에 나타낸다. 5.7 kb 단편내에 전체적으로 존재하지 않는 ORF1은 식물 DAHP합성효소와 상당한 상동성을 갖는 산물을 코드화한다. ORF2 (0.65 kb), ORF3 (0.75 kb) 및 ORF4 (1.15 kb)는 이소코리스마타제, 안트라닐레이트 합성효소 대형 서브유닛, 및 안트라닐레이트 합성효소 소형 서브유닛과 상동인 도메인을 갖는다. ORF5 (0.7 kb)는 데이터 베이스 서열과 아무런 상동성을 나타내지 않는다. ORF6 (0.65 kb) 산물은 대장균에서 피리독신 5'-포스페이트 옥시다제를 코딩하는 유전자와 말단 대 말단 상동성을 갖는다.
서열목록에서 서열의 간단한 설명
서열확인번호 1: 피롤니트린 유전자군의 서열
서열확인번호 2: 피롤니트린 유전자군의 ORF 1의 단백질 서열
서열확인번호 3: 피롤니트린 유전자군의 ORF 2의 단백질 서열
서열확인번호 4: 피롤니트린 유전자군의 ORF 3의 단백질 서열
서열확인번호 5: 피롤니트린 유전자군의 ORF 4의 단백질 서열
서열확인번호 6: 소라펜 유전자군의 서열
서열확인번호 7: 식물 콘센서스 번역 개시제(클론테크)의 서열
서열확인번호 8: 식물 콘센서스 번역 개시제(죠시)의 서열
서열확인번호 9: 어뎁터 분자에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 서열
서열확인번호 10: 어뎁터 분자에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 서열
서열확인번호 11: 어뎁터 분자에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 서열
서열확인번호 12: 어뎁터 분자에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 서열
서열확인번호 13: 어뎁터 분자에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 서열
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기탁
미생물에 의한 항병원성 물질의 생산
많은 생물은 이차 대사산물을 생성하고 또 이들의 일부는 다른 생물의 생장을 억제시킨다. 페니실린이 발견된 이래, 항생물질 활성을 갖는 많은 화합물이 확인되어 왔고 또 계속적인 연구의 결과로 그 수가 늘어나고 있다. 항생물질 활성 대사산물은 광범위한 화학 구조를 갖는다. 가장 중요한 것은 아미노글리코시드 (예컨대, 스트렙토마이신) 및 탄수화물 함유 기타 항생물질, 펩티드 항생물질 (예컨대 β-lactAPS, 리족티신(Rapp, C. 일행, Liebigs Ann. Chem.: 655-661(1988)), 뉴클레오시드 유도체 (예컨대, 블라스티시딘 S) 및 질소를 함유하는 기타 헤테로사이클 항생물질 (예컨대, 페나진 및 피롤니트린) 및/또는 산소, 폴리켑티드 (예컨대, 소라펜), 마크로시클릭 락톤 (예컨대, 에리트로마이신) 및 퀴논 (예컨대, 테트라사이클린)이다.
아미노글리코시드 및 기타 탄수화물 함유 항생물질
아미노글리코시드는 아미노 당에 글리코시드로 연결된 아미노시클로헥산을 잔기로 구성된 올리고당류이다. 가장 많이 연구된 그룹중의 하나인 스트렙토마이신은 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로 부터 생산된다. 이 화합물의 생화학 및 생합성은 복잡(Mansouri 일행에 의한 Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms (편집: 허쉬베르거 일행), 아메리칸 소사이어티 포 마이크로바이올로지, 워싱톤, 디.씨. 61-67 페이지(1989))하고 또 25 내지 30개의 유전자를 포함하며, 그중 19개가 지금까지 분석되었다(Retzlaff 일행: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics (편집: 발츠 일행), 어메리칸 소사이어티 포 마이크로바이올로지, 워싱톤 디.씨. 183-194 페이지(1993)). 스트렙토마이신 및 기타 많은 아미노글리코시드는 목적하는 생물에서단백질 합성을 억제한다.
펩티드 항생물질
펩티드 항생물질은 2종류로 대별된다: (1) 리보솜 기구의 참여없이 효소제에 의해 합성되는 펩티드 항생물질, 및 (2) 항생물질의 전구체를 제공하기 위하여 리보솜이 매개된 mRNA의 번역을 필요로하는 펩티드 항생물질.
비-리보솜 펩티드 항생물질은 서브유닛 아미노산을 활성화시키고, 변형시키며, 중합하고 또 경우에 따라서는 고리화함으로써 폴리펩티드 사슬을 형성하는 대형의 다능성 효소에 의해 형성된다. 아미노아디프산, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 디히드록시아미노산, 이소세린, 디히드록시벤조산, 히드록시이소발레르산, (4R)-4-[(E)-2-부테닐]-4,N-디메틸-L-트레오닌 및 오르니틴과 같은 기타 산도 포함될 수 있다(Katz & Demain, Bacteriological Review 41: 449-474 (1977); Kleinkauf & von Dohren, Annual Review of Microbiology 41: 259-289 (1987)). 생성물은 mRNA에 의해 코드화되지 않고 또 리보솜은 이들의 합성에 직접적으로 관여하지 않는다. 비-리보솜적으로 합성된 펩티드 항생물질은 이들의 일반적 구조에 따라 선형, 고리형, 락톤, 측쇄 시클로펩티드 및 뎁시펩티드류로 구분될 수 있다 (Kleinkauf & von Dohren, European Journal of Biochemistry192: 1-15 (1990)). 이들 상이한 군의 항생물질은 효소를 변형시키고 고리화하는 작용에 의해 생산된다; 중합 반응의 기본적 구도는 모두에서 공통된다. 비-리보솜적으로 합성된 펩티드 항생물질은 세균 및 진균에 의해 제조되며 바실루스 브레비스(Bacillus brevis)로 부터 얻은 에데인, 선형 그마미시딘, 티로시린 및 그라미시딘 S, 바실루스 서브티리스로 부터 얻은 미코바실린, 바실루스 폴리믹사로 부터 얻은 폴리믹신, 스트렙토마이세스 그리세우스로 부터 얻은 에타마이신, 스트렙토마이세스 에키나투스로 부터 얻은 에키노마이신, 스트렙토마이세스 클라블리게루스로 부터 얻은 액티노마이신, 에세리키아 콜리로 부터 얻은 엔테로첼린, 아스페르길루스 니둘란스로 부터 얻은 감마-(알파-L-아미노아디필)-L-시스테닐-D-발린 (ACV), 트리코데르마 비리데로 부터 얻은 알라메티신, 메타리지움 아니솔플리아애로 부터 얻은 데스트럭신, 후사륨 옥시스포룸으로 부터 얻은 에니아틴 및 베아우베리아 바시아나로 부터 얻은 베아우베리신을 포함한다. 원핵과 진핵 계 사이에는 광범위한 기능적 및 구조적 유사성이 존재하며 이는 양쪽이 동일 기원임을 제시한다. 펩티드 항생물질의 활성은 동물, 식물, 세균 및 진균에서 상이한 펩티드 항생물질의 유사하게 넓은 독성 효과를 나타낸다고 알려져있다(Hansen, Annual Review of Microbiology47: 535-564 (1993); Katz & Demain, Bacteriological Reviews41: 449-474 (1977); Kleinkauf & von Dohren, Annual Review of Microbiology41: 259-289 (1987); Kleinkauf & von Dohren, European Journal of Biochemistry192: 1- 15 (1990); Kolter & Moreno, Annual Review of Microbiology46: 141-163 (1992)).
리보솜-합성된 펩티드 항생물질은 항생물질 그자체에 대한 구조 유전자가 존재하는 것을 특징으로 하며, 특정 효소에 의해 변형되어 성숙 분자를 생성하는 전구체를 코드화한다. 펩티드 항생물질을 합성하기 위해 일반적인 단백질 합성 장치를 이용하면 보다 긴 중합체를 제조할 수 있지만, 이들 펩티드 항생물질은 반드시 클 필요는 없다. 구조 유전자 이외에, 세포외 분비 및 면역을 위하여 다른 유전자가 필요할 수 있으며 또 이들 유전자는 구조 유전자 근처에 위치하는 것으로 알려져있고, 대부분의 경우 동일 오페론상에 존재한다. 리보솜상에는 2가지 유형의 펩티드 항생물질이 존재한다: 즉 특이한 아미노산 란티오닌을 함유하는 항생물질과 그렇지 아니한 항생물질로 대별된다. 란티오닌-함유 항생물질(란티바이오틱스)을 락토코커스(Lactococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 바실루스(Bacillus) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 비롯한 그람-양성 세균에 의해 생산된다. 선형 란티바이오틱스 (예컨대, 니신, 서브틸린, 에피데르민 및 갈리데르민) 및 환형 란티바이오틱스(예컨대, 두라마이신 및 신나마이신)은 공지되어 있다(한센, Annual Review of Microbiology 47: 535-564 (1993); 콜터와 모레노에 의한 Annual Review of Microbiology 46: 141-163 (1992)). 란티바이오틱스은 세린 및 트레오닌의 탈수반응으로 부터 유도된 데히드로알라닌(DHA) 및 데히드로부티린(DHB)과 같은 기타 특징 변형된 잔기를 함유한다. 시스테인으로 부터 얻은 티올을 DHA와 반응시키면 라티오닌을 형성하며 또 DHB와 반응시키면 β-메틸안티오닌을 수득한다. 란티오닌을 함유하지 않는 펩티드 항생물질은 기타의 변형물을 함유할 수 있거나, 또는 이들은 단백질 합성에 사용되는 통상의 아미노산으로 구성될 수 있다. 비-란티오닌 함유 펩티드 항생물질은 락토바실루스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 엔테로코커스(Enterococcus) 및 에세리키아(Escherichia)를 비롯한 그람 양성 및 그람 음성 세균에 의해 생산된다. 상기 유형의 항생물질은 락타신, 락토신, 사카신 A, 페디오신, 디플로코신, 락토코신 및 마이크로신 (한센, 상기 동일; 콜터 및 모레노, 상기 동일)을 포함한다.
질소 및/또는 산소를 함유하는 뉴클레오시드 유도체 및 기타 헤테로시클릭 항생물질
이들 화합물은 모두 헤테로시클릭 고리를 함유하지만, 구조적으로 다르면 이하의 실시예에서 설명한 바와 같이 아주 상이한 생물학적 활성을 갖는다.
폴리옥신 및 니코마이신은 뉴클레오시드 유도체로서 키틴 합성효소의 기질인 UD-N-아세틸글루코사민과 구조적으로 유사하다. 이들은 키틴 합성효소의 경쟁적 억제물질로서 알려져 있다 (굳데이에 의해 Biochemistry of Cell Walls and Membranes in Fungi(쿤 일행 편저), Springer-Verlag, Berlin 페이지 61 (1990)). 폴리옥신은 스트렙토마이세스 카카오이 (Streptomyces cacaoi)에 의해 생산되며 또 니코마이신은 에스. 텐다에(S. tendae)에 의해 생산된다.
페나진은 통상의 평면상 방향족 트리시클릭 구조를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 화합물이다. 50개 이상의 천연적으로 산출되는 페나진이 확인되어 있으며, 각기 기본 고리 구조상에서 치환기가 상이한 구조이다. 이 유형의 화합물은 세균에 의해서만, 특히 스트렙토마이세스, 소란지움(Sorangium) 및 슈도모나스(Pseudomonas)(Tumor & Messenger, Advances in Microbiol Physiology 27: 211-275 (1986) 참조)에 의해서 천연적으로 생산된다. 최근, 피. 아우레오파시엔스(P.aureofaciens)균주의 페나진 생합성 유전자가 단리되었다 (피어슨 및 토마쇼 MPMI 5 330-339 (1992)). 이들은 평면상 방향족 구조를 갖기 때문에, 페나진은 DNA와 내위첨가 착물을 형성할 수 있으므로 DNA 대사를 방해할 수 있을 것이라고제안되어왔다. 페나진 믹신은 DNA를 내위첨가는 것으로 알려졌고(홀슈타인 및 버틀러, Biochemistry11: 1345 (1972)) 또 페나진 로모푼진은 효모에서 RNA 합성을 억제하는 것으로 알려졌다(캐논 및 지미네즈, Biochemical Journal142: 457(1974): 루에 일행, Biochemistry14: 4651 (1975)).
피롤니트린(Pyrrolnitrin)은 강한 항생물질 활성을 갖는 페닐피롤 유도체로서 다양한 범위의 진균을 억제하는 것으로 알려져있다(호마 일행, Soil Biol. Biochem.21: 723-728 (1989); 니시다 일행, J. Antibiot., ser A,18: 211-219 (1965)). 이것은 원래 슈도모나스 피로시니아(Pseudomonas pyrrocinia)로 부터 단리(아리마 일행, J. Antibiot., ser. A,18: 201-204 (1965))된 것으로서 그 이후로 몇개의 다른 슈도모나스종 및 믹소코커스 종으로 부터 단리되었다(게르트 일행, J. Antibiot.35: 1101-1103 (1982)). 이 화합물은 진균의 호흡 전자 수송(트리타티 및 고트리에, J. Bacteriol.100: 310-318 (1969)) 및 분리된 산화적 부인산반응(람보위츠 및 슬레이만, J. Bacteriol.112: 1020-1022 (1972))를 억제하는 것으로 보고되어 있다. 피롤니트린은 또한 일반적인 지단백질 막 손상을 유발 (노즈 및 아리마, J. Antibiot., ser A,22: 135-143 (1969); 카를론 및 스캐너리니, Mycopathologia et Mycologia Applicata53: 111-123 (1974))하는 것으로 알려져있다. 피롤니트린은 트립토판으로 부터 생합성(창 일행, J. Antibiot.34: 555-566)되며 피.플루오레센스(P.fuorescens)로 부터 생합성 유전자가 클로닝되었다(실시예의 C 부분 참조). 따라서, 본 발명의 한가지 예는 이질성 숙주에서 피롤니트린을 생합성하기 위한 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 DNA 분자에관한 것으로, 이 분자는 숙주 생물을 유전 공학적으로 변형시켜 상술한 항변원성 물질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예는 피롤니트린을 생합성하는데 필요한 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.
폴리켑티드 합성효소
분명한 구조적 다양성에도 불구하고 많은 항생물질은 공통된 생합성 패턴을 공유하고 있다. 이 분자들은 2개의 탄소-형성 블록, 즉 언제나 케토기를 갖는 β-탄소로 부터 구성되므로 폴리켑티드라 칭한다. 많은 구조적 다양성은 폴리켑티드 사슬의 상이한 길이 및 2개 탄소 형성 블록의 일부로 도입되거나 또는 폴리켑티드 주쇄가 형성된 후 도입된 상이한 측쇄로 부터 유도된다. 케토기는 가수분해 환원되거나 또는 제거될 수 있다. 2개 탄소 부가는 지방산 생합성과 유사한 방식으로 폴리켑티드 합성효소(PKS)로 불리는 효소 복합체에 의해 실시된다. 폴리켑티드 항생 물질의 수를 증가시키기 위한 생합성 유전자는 단리되어 서열결정되어 있다. PKS 유전자는 구조적으로 보존되는 것이 알려져있다. 암호화된 단백질은 2개 유형으로 대별된다: 유형 I 단백질은 공유결합으로 서로 결합된 상이한 효소 단계를 실시하는 몇개의 촉매 도메인을 갖는 다능성 단백질(예컨대 에리트로마이신, 소라펜 및 아베르멕틴에 대한 PKS(요아우아 일행, Plasmid 28: 157-165(1992): 맥네일 일행, Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (발츠 일행 편저), 어메리칸 소사이어티 포 마이크로바이올로지, 워싱톤 디.씨. 245-256 페이지(1993))인 반면에, 유형 II 단백질은 단일기능 단백질이다(허친슨 일행: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (발츠 일행,편저), 어메리칸 소사이어티 포 마이크로바이올로지, 워싱톤 디.씨. 203-216 페이지 (1993)). 액티노로딘(스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)에 의해 생산됨)과 같은 단순한 폴리켑티드 항생물질의 경우, 하나의 PKS 유전자 세트에 의해 코드화되는 PKS 효소상에서 2개 탄소 부가가 수회 실시될 수 있다. 이와 대조적으로, 에리쓰로마이신 및 소라펜과 같은 보다 복잡한 화합물의 합성(실시예의 E 부분 참조)은 모듈로 조직화된 PKS 유전자 세트를 포함하며, 각 모듈은 2개 탄소 첨가를 1회 실시한다(홉우드 일행: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (발츠 일행 편저), 어메리칸 소사이어티 포 마이크로바이올로지, 워싱톤 디.씨. 267-275 페이지 (1993)). 따라서, 본 발명은 소란지움으로 부터 수득한 소라 펜의 생합성 유전자를 제공한다(실시예의 E부분 참조). 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예는 이질성 숙주중에서 소라펜을 생합성하기 위한 1 또는 그 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA 분자에 관한 것으로, 이 분자는 상술한 항병원성 물질을 발현하도록 숙주 생물을 유전적으로 조작하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예는 소라펜의 생합성에 필요한 단리된 폴리펩티드에도 관한 것이다.
마크로시클릭 락톤
이 화합물류는 다양한 고리 치환기를 갖는 다수의 락톤 고리를 갖는다. 이들은 고리 크기 및 기타 특징에 따라서 세분될 수 있다. 예컨대 마크로리드는 하나 이상의 아미노당 및/또는 데옥시당에 글루코시드 결합된 12-, 14-, 16- 또는 17-원 락톤 고리를 함유한다. 이들은 단백질 합성의 억제제로서 특히 그람 양성 세균에대하여 효과적이다. 사카로폴리스포라 에리쓰라에아(Saccharopolyspora erythraea)에 의해 생성되는 것으로 많이 연구되어진 마크로리드인 에리쓰로마이신 A는 2개의 데옥시 당에 결합된 14-원 락톤 고리로 구성된다. 생합성 유전자의 대부분이 클로닝 되어 있다; 이들은 모두 에스. 에리쓰라에아 염색체의 60 kb 절편내에 위치하였다. 적어도 22개의 밀접하게 연관된 오픈 리딩 프레임이 에리쓰로마이신 생합성에 관련될 것으로 확인되었다 (도나디오 일행, Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (편집: 발츠 일행), 어메리칸 소사이어티 포 마이크로바이올로지, 워싱톤 디.씨.. 페이지 257-265 (1993)).
퀴논
퀴논은 불포화된 고리상에 존재하는 2개의 카르보닐 기를 갖는 방향족 화합물이다. 이 화합물은 존재하는 방향족 고리의 수에 따라서 예컨대 벤조퀴논, 나프토퀴논 등으로 세별될 수 있다. 많이 연구된 종류는 테트라사이클린으로 상이한 치환기를 갖는 나프타센 고리를 함유하고 있다. 테트라사이클린은 단백질 합성 억제제로서 그람 양성 및 그람 음성 세균 모두 뿐만 아니라 리켓차, 미코플라즈마 및 스피로체트에 대하여 효과적이다. 테트라사이클린에 존재하는 방향족 고리는 폴리켑티드 분자로 부터 유도된 것이다. 옥시테트라사이클린 (스트렙토마이세스 리모수스(Streptomyces rimosus)에 의해 생산됨)의 생합성에 관련된 유전자는 클로닝되어 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)에서 발현되었다 (비니 일행, J. Bacteriol.171: 887-895 (1989)). PKS 유전자는 액티노로딘에 대한 유전자와 상동이므로 유형 II(단일기능성) PKS 단백질을 암호화한다 (호프우드 및 세르만,Ann. Rev. Genet.24: 37-66 (1990)).
기타 유형의 APS
기타 몇개의 다른 APS가 동정되어 있다. 이들중의 하나는 슈도모나스의 특정 균주로 부터 생산되는 항생물질인 2-헥실-5-프로필-레조르시놀이다. 이것은 슈도모나스 균주 B-9004로 부터 맨처음 단리 (간다 일행, J. Antibiot.28: 935-942(1975))된 것으로 1,3-디히드록시벤젠의 디알킬-치환된 유도체이다. 이것은 그람 양성 세균 (예컨대, 클라비박터 종), 미코세균 및 진균에 대하여 항병원성 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다른 APS 유형은 스트로빌루린(Strobilurin) B와 같은 메톡시아 크릴레이트이다. 스트로빌루린 B는 담자균류로 부터 생산되는 것으로 광범위한 살진균 활성 스펙트럼을 갖는다 (앙케, 티. 일행. Journal of Antibiotics(도쿄) 30: 806-810 (1977)). 특히, 스트로빌루린 B는 보리니아 루테아 (Bolinia lutea) 진균으로 부터 생산된다. 스트로빌루린 B는 항진균 활성을 갖는 것으로 보이며 이러한 활성으로 말미암아 시토크롬 b 의존형 전자 수송을 억제함으로써 호흡을 방해한다 (벡커, 더블유. 일행, FEBS Letters 132: 329-333 (1981)).
대부분의 항생물질은 세균, 방선균류 및 진균으로 부터 단리되었다. 숙주 생물의 생물 기능에서 이들의 역할은 아직 알려져있지 않지만, 이들의 대부분은 의약 및 농업 분야에서 미생물 병원체를 방제하기 위해 성공적으로 사용되고 있다. 농업 분야에 사용되어온 항생물질로서 벼 마름증 (피리쿨라리아 오리자애(Pyricularia oryzae))을 방제하기 위한 블라스티시딘 S 및 카수가마아신, 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)를 방제하기 위한 발리다마이신, 보트리티스(Botrytis) 및 스클레로티니아(Sclerotinia)종을 방제하기 위한 프루마이신, 및 노균을 방제하기 위한 밀 디오마이신을 들 수 있다.
지금까지, 식물 보호에서 항생물질의 사용은 화학 합성 또는 발효를 통한 화합물의 생산과 종자, 식물 위치 또는 토양에 도포하는 것에 관련되어 있다. 본 발명은 다수의 항-식물병원성 물질의 생합성 유전자를 동정하여 단리하는 것과, 이들 유전자를 사용하여 향상된 내질병 특성을 갖는 트랜스제닉 식물을 창제하는 것과, 단리된 유전자를 숙주 식물 또는 근권에 서식하는 생물에서 발현시키는 것에 의해 생물방제 균주를 창제하는 것에 관한 것이다. 또한 이러한 유전자는 APS를 제조하고 단리하기 방법과 항병원성 배합물에서 용도를 제공한다.
합병원성 물질에 대한 유전자를 클로닝하는 방법
항생물질 생합성 유전자를 코딩하는 유전자는 본 발명에 따른 다수의 수법을 이용하여 클로닝될 수 있다. APS 유전자를 클로닝하는 가장 간단한 방법은 APS를 생산하는 것으로 확인된 생물로 부터 게놈 DNA를 클로닝하고, 적합한 플라스미드나 벡터상에 클로닝된 DNA를 APS를 생산하지 않는 숙주 생물로 전달한 다음 APS 생산능을 갖는 형질전환된 숙주 콜로니를 확인하는 것으로 구성된다. λ::Tn5 트랜스포손 돌연변이와 같은 수법(드 브루이진 및 럽스키, Gene27: 131-149 (1984))을 이용하여, APS-공여 DNA를 형질전환하는 정확한 영역이 정확하게 규정될 수 있다. 이와 다르게, APS-공여 DNA를 형질전환하는 것은 보다 작은 단편으로 절단될 수 있고 APS-공여 능력을 유지하는 가장 작은 단편이 확인될 수 있다. APS를 생산하는 능력을 결여하고 있는 숙주 생물은 APS가 유도하는 생물에 대하여 상이한 종일 수 있지만, 이 수법의 변형은 숙주 DNA를 돌연변이에 의해 방해된 APS 생산능을 갖는 동일 숙주로 형질전환시키는 것을 포함한다. 이 방법에서, APS 생산 생물은 돌연변이되고 APS를 생산하지 않는 돌연변이체를 분리하며, 또 이들은 APS 생산 친주로 부터 얻은 클로닝된 게놈 DNA에 의해 보충될 수 있다. APS 생합성에 필요한 유전자를 클로닝하기 위해 사용된 표준 수법의 다른 예는 돌연변이후에는 APS를 생산하지 않는 APS 생산 생물의 돌연변이체를 생성하기 위한 트랜스포손 돌연변이법을 이용하는 것이다. 따라서 APS 생산에 관련된 숙주 게놈의 영역은 트랜스포손으로 표시되고 또 용이하게 회수되며 친주로 부터 천연 유전자를 단리하기 위한 탐침으로 사용된다. APS의 합성에 필요하고 또 공지된 APS 화합물과 유사한 APS 생합성 유전자는 공지 화합물의 생합성 유전자와 서열 상동성으로 인하여 클로닝될 수 있다. 상동에 의한 클로닝에 적합한 수법은 DNA 혼성수법에 의해 표준 라이브러리 스크리닝하는 방법을 포함한다.
본 발명은 APS 유전자를 클로닝하기 위해 사용될 수 있고 또 상술한 수법들을 이용한 클로닝에 대하여 불용성일 수 있는 APS 생합성 유전자를 단리하기 위한 신규 수법을 기술한다. 클로닝에 대하여 불용성인 한가지 이유는 상술한 표준 수법(상동법에 의한 클로닝 제외)이 APS 생합성의 조절인자의 단리를 초래할 수 있기 때문이다. 그러나 이러한 조절인자가 확인되면, 클론된 조절유전자의 제어하에 생합성 유전자를 단리하는 방법을 이용하여 사용될 수 있다. 이 방법에서, 트랜스포손 삽입 돌연변이의 라이브러리는 조절유전자를 갖지 않는 미생물 균주에서 생성되거나 또는 통상적인 유전자 분해 수법에 의해 무능하게된 조절유전자를 가지고있다. 사용된 삽입 트랜스포손은 프로모터를 갖지 않는 리포터 운전자(예컨대, lacZ)를 갖는다. 삽입 라이브러리가 작성되면, 다수의 조절유전자의 복제물이 세포의 라이브러리로 전달되며(예컨대, 접합 또는 엘렉트로포레이숀에 의해) 또 리포터 유전자의 발현을 위해 플레이팅된 판을 선택한다. 조절 유전자를 전달하기 전후에 세포를 분석한다. 조절 유전자 존재하에서만 리포터 유전자를 발현하는 콜로니를, 조절 유전자에 의해 조절되는 유전자의 프로모터 근처에 삽입한다. 이 조절 유전자가 APS-생합성 유전자 조절에 특이적이라고 가정하면, 이러한 과정에 의해 표시된 유전자는 APS를 생합성할 수 있는 유전자일 것이다. 바람직한 구체예에서, 클론된 조절 유전자는 PCT 출원 WO 94/1561호에 기재된 gafA 유전자로서 피롤니트린의 생합성 유전자의 발현을 조절한다. 따라서, 본 발명의 방법은 피롤니트린의 생합성 유전자를 클로닝하는 바람직한 방법이다.
유전자의 발현이 APS 생합성 조절유전자 제어하에 있는 항병원성 물질(APS)의 생합성에 필요한 미생물로 부터 유전자를 동정하고 단리하는 다른 방법은, (a) 상기 미생물로 부터 얻은 유전자 단편의 라이브러리를, 프로모터 작용이 클론된 단편에 의해서 제공될 때에만 상기 리포터 유전자의 발현이 일어나도록 벡터내의 프로모터 없는 리포터 유전자 옆의 벡터에 클로닝하고;
(b) 단계 (a)로 부터 생성한 벡터를 적합한 숙주로 형질전환시키며;
(c) 상기 조절 유전자 존재하에서만 리포터 유전자를 발현하는 형질전환체를 단계(b)로 부터 동정하고, 또
(d) 단계 (c)에서 동정된 형질전환체중에 존재하는 상기 미생물로 부터 얻은유전자 단편에 기능적으로 연결된 DNA 단편을 동정하고 단리하는 것을 포함하며, 단계 (d)에서 단리되고 동정된 DNA 단편은 상기 APS의 생합성에 필요한 하나 이상의 폴리 펩티드를 코딩한다.
트랜스제닉 발현에 사용하기 위한 클론된 APS 유전자를 위하여, 특정 대사 산물로 부터 생합성하는데 필요한 유전자를 동정하여 클로닝하는 것이 중요하다. 상술한 수법 모두를 사용하거나 조합하면, 공지 APS에도 가능하다. 대부분의 APS 생합성 유전자는 통상 미생물내에 무리져 있고, 단일 오페론에 의해 코딩되기 때문에, 모든 유전자의 동정은 APS 생산 미생물에서 단일 위치를 동정함으로써 가능하다. 또한, APS 생합성 유전자의 조절인자는 전체 경로를 조절하는 것으로 밝혀져 있기 때문에, 이들의 조절유전자를 통한 생합성 유전자의 클로닝은 이들 유전자를 클로닝하는 특히 유리한 방법이다. 많은 경우, 조절유전자는 단일 전체 오페론의 전사를 제어할 것이므로 이러한 전력을 이용하면 유전자의 클로닝을 용이하게 할 수 있다.
상기 출원에 기재된 방법을 이용하며, APS에 대한 생합성 유전자를 미생물에 클로닝할 수 있다. 피롤니트린 및 소라펜과 같은 항병원성 물질을 생합성하기 위한 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터는 이질 숙주를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 이질 숙주는 세균, 진균, 효모 및 식물이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 형질전환된 숙주는 상기 숙주에서 천연적으로 생기지 않는 항병원성 물질을 합성할 수 있을 것이다. 이 숙주는 상기 항병원성 서열 형성을 허용하는 조건하에서 성장할 수 있으므로 숙주로부터 수집될 수 있다. 명세서에 기재된 유전자 조작 및 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법을 이용하여 클론된 APS 생합성 유전자는 트랜스제닉 식물에서 발현될 수 있다. 적합한 APS 생합성 유전자는 이 부분의 앞부분에서 기재한 바와 같은 유전자, 즉 아미노글리코시드 및 기타 탄수화물 함유 항생물질(예컨대, 스트렙토마이신), 펩티드 항생물질(비 리보솜적으로 또 리보솜적으로 합성된 유형), 질소 및/또는 산소를 함유하는 뉴클레오시드 유도체 및 기타 헤테로사이클 항생물질(예컨대, 폴리옥신, 니코마이신, 페나진 및 피롤니트린), 폴리켑티드, 마크로시클릭 락톤 및 퀴논(예컨대, 소라펜, 에리트로마이신 및 테트라사이클린)을 포함한다. 트랜스제닉 식물에서 발현은 적합한 프로모터 제어하에서 실시되며 또 특정 APS에 필요한 전구체를 고려하여 적합한 목적 세포를 정한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 과정에 의해 단리된 APS 유전자를 트랜스제닉 식물에서 발현시키는 것을 포함하지만, 특히 바람직한 것은 피롤니트린, 소라펜, 페나진 및 펩티드 항생물질 그라미니시딘 및 에피데르민을 포함한다. 클로닝된 생합성 유전자는 이들 생물에서 생합성 능력을 부여하고 향상시키기 위하여 토양 또는 식물에 서식하는 생물에서 발현될 수 있다. 특히 바람직한 APS 유전자는 피롤니트린, 소라펜, 페나진 및 펩티드 항생물질을 코드화하는 유전자이다.
이질 미생물 숙주에서 항병원성 물질의 생산
클로닝된 APS 유전자는 이질 세균 또는 진균 숙주에서 발현되어 천연 숙주로 부터 얻을 수 있는 효율 보다 훨씬 효과적으로 APS를 생산할 수 있다. 이들 유전자 조작에 필요한 수법은 상이한 숙주에 대해 특이적이고 종래 기술에 공지되어 있다.예컨대, 발현 벡터 pKK223-3 및 pKK223-2는 대장균에서 tac 또는 trc 프로모터 뒤에 전사 또는 번역 융합물로 이질 유전자를 발현하기위해 사용될 수 있다. 다수와 ORF를 코딩하는 오페론을 발현시키기 위하여, 가장 간단한 방법은 이 오페론을 pKK223-3과 같은 벡터에 전사 융합되게 삽입함으로써 이질 유전자의 동종 리보솜 결합 위치를 사용할 수 있다. 바실루스(Bacillus)와 같은 그람 양성 종에서 과잉발현시키기 위한 수법은 이 기술분야에서 공지되어 있고 또 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다 (콱스 일행; Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, 발츠 일행 편저, 어메리칸 소사이어티 포 마이크로바이올로지, 워싱톤 (1993)). 과잉 발현을 위한 다른 계는 피시아 (Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루베로마이세스 (Kluyveromyces) (스리크리스나, Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, 발츠, 헤게만 및 스카트루드 편저; 어메리칸 소사이어티 포 마이크로바이올로지, 워싱톤(1993); 데퀸 및 바레, 바이오테크놀로지 12: 173-177(1994); 반 덴 베르그 일행, 바이오테크놀로지 8: 135-139 (1990)).
클로닝된 APS 유전자는 이러한 세균 및 진균 숙주의 생물방제 균주의 효율을 증가시키기 위하여 이질 세균 및 진균 숙주에서 발현될 수 있다. 따라서, 식물 병원체로 부터 식물을 보호하기 위한 방법은 식물을 식물병원체를 억제하는 양의 항병원성 물질을 생산하는데 필요한 모든 폴리펩티드를 발현할 수 있는 하나 이상의 벡터로 형질전환된 생물방제제로 처리하는 것이다. APS 유전자를 이질적으로 과잉발현하기에 적합한 미생물은 식물 또는 근권에 서식할 수 있는 모든 미생물이다.이렇게 됨으로써 이들은 이들의 성장을 억제하는 식물병원성 진균, 세균 및 선충과 접촉하게 될 것이다. 이들은 슈도모나스, 엔테로박터 및 세라티아와 같은 그람 음성 미생물, 바실루스와 같은 그람 양성 미생물 및 트리코데르마 및 글리오클라 등과 같은 진균을 포함한다. 특히 바람직한 이질 숙주는 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomons fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia), 슈도모나스 아우레오파시엔스(Pseudomonas aureofaciens), 슈도모나스 아우란티아카 (Pseudomonas aurantica), 엔테로박터 클로아카애 (Enterrobacter cloacae), 세라티아 마르세센스(Serratia marscesens), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 트리코데르마 하르지아눔(trichoderma harzianum) 및 글리오클라듐 비렌스(Gliocladium virens)이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 피롤니트린, 소라펜, 페나진 및/또는 펩티드 항생물질을 생합성하기 위한 유전자는 상술한 특히 바람직한 이질 숙주로 전달될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 페나진 및/또는 소라펜을 생합성하기 위한 유전자는 슈도모나스 플루오레센스 균주 CGA267356(유럽 공개특허 공보 0 472 494호에 기재됨)에 전달되어 그곳에서 발현될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 피롤니트린 및/또는 소라펜을 생합성하기 위한 유전자는 페나진 생산으로 인한 생물방제 특성을 갖는 슈도모나스 아우레오파시엔스 균주(30-84)로 전달된다. 이질 생물방제 균주에서의 발현은 선정된 숙주에서 복제하기에 적합한 벡터의 선정 및 적합한 프로모터의 선정을 필요로한다. 이 수법은 그람 음성 및 그람 양성 세균 및 진균에서 발현하기 위해공지된 수법으로 본 명세서의 여러곳에 기재되어 있다.
식물에서 항식물병원성 물질에 대한 유전자의 발현
식물병원체로 부터 식물을 보호하는 방법은 식물에서 식물병원체를 억제하는 양의 항식물병원성 물질을 생산하는데 필요한 폴리펩티드를 발현할 수 있는 하나 이상의 벡터로 식물을 형질전환시키는 것이다. 본 발명의 APS 생합성 유전자는 트랜스제닉 식물에서 발현되면 트랜스제닉 식물에서 선정된 APS의 생합성을 유발한다. 이렇게하여 식물병원성 진균, 세균 및 선충에 대하여 향상된 내성을 갖는 트랜스제닉 식물이 생성된다. 트랜스제닉 식물에서 발현시키기 위하여, APS 유전자 및 인접 서열은 변형과 최적화를 필요로할 수 있다.
많은 경우 미생물로 부터 얻은 유전자는 변형없이 식물에서 고도로 발현될 수 있지만, 식물에서 바람직하지 않은 코돈을 갖는 APS 유전자로 부터는 트랜스제닉 식물에서 발현은 낮을 수 있다. 이 기술분야에서는 모든 생물은 특정 코돈 서호성을 가지고 있고 또 APS 유전자 코돈은 코딩하는 아미노산을 유지하면서 식물 선호성에 부응하도록 변형될 수 있다. 또한 식물에서 고도의 발현은 35% GC함량 이상, 바람직하게는 45% 이상을 갖는 코딩 서열로 부터 수득할 수 있다. GC 함량이 낮은 미생물 유전자는 메세지를 불안정화시킬 수 있는 ATTTA 모티프 및 부적절한 폴리아데닐화를 유발할 수 있는 AATAAA의 존재로 인하여 식물에서 발현이 불량하다. 또한 가능한 APS 생합성 유전자는 메세지 단절을 유발할 수 있는 부절적할 스플라이스 위치의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 상술한 바와 같은 APS 코딩 서열내에서 가능한 모든 변화는 공지된 위치 특이적 변이 수법, PCR 및 합성 유전자구조을 이용하여 유럽 공개 특허 EP 0 385 962호 (몬산토), EP 0 359 472호(루브리졸) 및 WO 93/07278호 (시바 가이기)에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 바람직한 APS 생합성 유전자는 비변형 유전자일 수 있고, 목적하는 트랜스제닉 식물종에서 고도로 발현될 수 있어야하거나, 또는 부적절한 폴리아데닐화 모티프 및 부적절한 스플라이스 위치를 제거함으로써 변형될 수 있고 또 식물에 바람직한 코돈을 혼입하는 것에 의해 변형될 수 있으며 또 식물에서 발현하는데 바람직한 GC 함량을 갖는다. 바람직한 유전자 서열은 단자엽 및 쌍자엽 식물종 모두에서 적절하게 발현될 수 있지만, 서열들은 단자엽 또는 쌍자엽의 특정 코돈 선호성 및 GC 함량 선호성을 설명하기 위해 변형될 수 있으며, 이들 선호성은 서로 상이한 것으로 알려져있다(무레이 일행, Nucl. Acids Res.17: 477-498 (1989)).
번역을 효과적으로 개시하기 위해, 개시 메티오닌 근처에 있는 서열들은 변형될 필요가 있다. 선정된 APS 유전자와 동종인 서열들은 식물에서 효과적으로 번역을 개시할 수 있지만, 동종이 아니면 효과적이 아닐 수 있다. 번역이 효과적으로 개시되지 않는 경우, 이들은 식물에서 효과적인 것으로 알려진 서열을 혼입하는 것에 의해 변형될 수 있다. 조시는 식물에 대한 적절한 콘센서스(consensus)를 제시하였고 (NAR 15: 6643-6653 (1987); 서열확인 번호: 8) 또 클론테크는 추가의 콘센서스 번역 개시제를 제시하였다 (1993/1994 카탈로그, 210 페이지: 서열확인 번호: 7). 이들 콘센서스는 본 발명의 APS 생합성 유전자와 함께 사용하기에 적합하다. 이 서열들은 ATG를 포함하는 APS 유전자 구조(비변형된 APS 유전자의 제 2 아미노산을 가지면서)로 혼입되거나, 또는 이와 다르게는 ATG에 대한 GTC를 포함하도록혼입될 수 있다 (전달 유전자의 제 2 아미노산을 변형시키는 것에 의해).
트랜스제닉 식물에서 APS 유전자의 발현은 식물에서 기능적인 것으로 밝혀진 프로모터 뒤에 존재한다. 프로모터의 선택은 발현에 필요한 온도 및 공간 요건에 따라 그리고 목적하는 종에 따라서 다양할 것이다. 식물을 엽상 병원체로 부터 보호하기 위해서는 잎에서 발현되는 것이 바람직하다; 이삭 병원체로 부터 식물을 보호하기 위해서는 꽃(예컨대, 수상 화서, 원추 화서, 옥수수 속 등) 에서 발현되는 것이 바람직하다; 뿌리 병원체로 부터 식물을 보호하기 위해서는 뿌리 및/또는 묘목에서 발현되는 것이 바람직하다. 그러나, 많은 경우, 하나 이상의 유형의 식물병원체로 부터 보호하려고하므로 다수 조직에서 발현되는 것이 바람직할 것이다. 쌍자엽식물로 부터 많은 프로모터는 단자엽 식물에서도 이용가능한 것으로 밝혀져있지만, 그와 반대로 이상적으로는 쌍자엽 식물의 프로모터는 쌍자엽식물에서 발현되고 또 단자엽 식물에서는 단자엽용 프로모터를 사용하는 것이다. 그러나, 선택된 프로모터의 출처에는 아무런 제한이 없다; APS 생합성 유전자의 발현을 추진하는데 이용되기만 하면 충분하다. 어떤 경우에는 식물에서 APS의 발현은 곤충 해충으로 부터 보호할 할 수 있다. APS 베아우베리신(베아우베리아 바시아나(Beauveria bassiana)로 부터 단리됨)에 대한 생합성 유전자를 트랜스제닉 발현하는 것은 작물 식물의 곤충 해충에 대하여 보호작용을 제공할 수 있다.
구성적으로 발현되는 바람직한 프로모터는 CaMV 35S 및 19S 프로모터, 및 액틴 또는 유비퀴틴을 코딩하는 유전자로 부터 얻은 프로모터를 포함한다. 또한 바람직한 구성적 프로모터는 12(4-28), CP21, CP24, CP38 및 CP29 유전자로 부터 얻은프로모터로서 그의 cDNA는 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명의 APS 유전자는 화학적으로 조절되는 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있다. 이로써 작물이 유발 화학물질로 처리될 때 APS가 합성될 수 있으며 또 APS 생합성은 줄어든다. 유전자 발현을 화학적으로 유발하는 바람직한 수법은 본 명세서에 참고로 포함된 유럽 공개특허 EP 0 332 104호(시바-가이기)에 자세하게 기재되어 있다. 화학적 유도에 바람직한 프로모터는 담배 PR-1a 프로모터이다.
바람직한 프로모터 유형은 상처 유발성이다. 상처난 위치 및 식물병원체 감염 위치에서 발현되는 다수의 프로모터가 기재되어 있다. 이들은 APS 생합성이 식물병원체 감염에 의해 개시되기 때문에 APS 유전자의 발현에 적합하므로 APS는 감염이 생길 때에만 축적된다. 이상적으로는, 이러한 프로모터는 감염 위치에서 국부적으로 활성이어야 하고 또 이렇게하여 APS는 침입하는 식물병원체를 치사시키기 위해 APS를 합성할 필요가 있는 세포에서 축적된다. 이러한 유형의 바람직한 프로모터는 스탠포드 일행에 의해 Mol.Gen, Genet.215: 200-208 (1989), 후 일행에 의해 Plant Molec. Biol.22: 573-588 (1993), 롱맨 일행에 의해 Plant Cell1: 151-158(1989), 로르마이에르와 렐르에 의해 Plant Molec. Biol.22: 783-792 (1993), 피렉 일행에 의해 Plant Molec. Biol.22: 129-142 (1993), 및 와너 일행에 의한 Plant J. 3: 191-201 (1993)에 의해 기재된 프로모터를 포함한다.
바람직한 조직 특이적 발현 패턴은 녹색 조직 특이적, 뿌리 특이적, 줄기 특이적 및 꽃 특이적 일 수 있다. 녹색 조직에서 발현하기에 적합한 프로모터는 광합성에 관련된 조절 유전자를 포함하며 이들의 많은 것이 단자엽식물 및 쌍자엽 식물로 부터 클론되었다. 바람직한 프로모터는 포스페놀 카르복시라제 유전자로 부터 얻은 옥수수 PEPC 프로모터(후드스페트 및 그룰라에 의해 Plant Molec. Biol.12: 579-589 (1989)) 이다. 뿌리 특이적 발현을 위해 바람직한 프로모터는 드 프라몬드에 의해 기재된 프로모터(FEBS 290: 103-106 (1991); 시바-가이기에게 허여된 유럽 특허 0 452 269호)이고 또 다른 바람직한 뿌리 특이의 프로모터는 본 발명에 의해 제공되는 T-1 유전자이다. 바람직한 줄기 특이적 프로모터는 WO 93/07278호(시바-가이기에게 허여)에 기재된 것으로 옥수수 trpA 유전자의 발현을 촉진하는 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 뿌리 특이적으로 APS 생합성하는 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 피롤니트린에 대한 생합성 유전자는 식물병원성인 리족토니아로 부터 트랜스제닉 식물을 보호하기 위해 뿌리 특이적 프로모터 뒤에서 발현된다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 구체예로서, 페나진에 대한 생합성 유전자는 식물병원체인 가애우마노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)에 대하여 트랜스제닉 식물을 보호하기 위해 뿌리 특이적 프로모터 뒤에서 발현된다. 더욱 바람직한 구체예는 상처 유도성 또는 병원체 감염 유도 방식으로 APS 생합성 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이다. 예컨대 더욱 바람직한 구체예는 엽상 병원체를 방제하기 위한 상처 유도성 또는 병원체 유도성 프로모터 뒤에 있는 소라펜에 대한 생합성 유전자의 발현을 포함한다.
적합한 프로모터를 선정하는 이외에, 식물에서 APS를 발현하기 위한 구조는 이질성 APS 유전자의 하류에 부착된 적합한 전사 터미네이터를 필요로한다. 몇개의터미네이터가 유용하며 또 종래 기술에 공지되어 있다(예컨대, CaMV로 부터 얻은 tm1, rbcS로 부터 얻은 E9). 식물에서 작용하는 것으로 공지된 터미네이터는 본 발명에서도 사용될 수 있다.
다수의 기타 서열이 APS 유전자에 대한 발현 카세트에 혼입될 수 있다. 이들은 인트론 서열(예컨대, Adh1 및 bronze1로 부터) 및 바이러스성 리더 서열(예컨대 TMV, MCMV 및 AMV로 부터) 처럼 발현을 향상시키는 것으로 밝혀진 서열을 포함한다.
식물에서 APS의 과잉생산은 경로의 제 1 단계를 암호화하는 APS 생합성 유전자가 경로의 기질에 접근할 수 있는 것을 필요로한다. 개별 APS 및 경로가 관련되는 한, 이 기질은 상이할 것이므로, 식물에서 세포 위치도 다를 것이다. 많은 경우 기질은 세포질에 위치하지만, 다른 경우에는 다른 세포 기관에 위치할 수 있다. 식물에서 생합성 활성이 엽록체에서 생기므로, 이들 기질은 엽록체에 위치할 수 있으며 따라서 이러한 경로를 위한 APS 생합성 유전자는 적합한 기관(예컨대, 엽록체)을 향할 것이다. 효소에 의해 코딩되는 전달유전자의 하부세포 위치는 이 기술에서 공지된 수법을 이용하여 실시될 수 있다. 전형적으로, 공지된 기관을 향하는 유전자 산물로 부터 목적하는 펩티드를 코딩하는 DNA는 조작되고 필요로하는 APS 유전자의 상류에 융합된다. 많은 이러한 목적 서열은 엽록체로 공지되어 있고 또 이질 구조에서 이들의 작용은 알려져있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 피롤니트린 생합성을 위한 유전자는 경로 기질인 트립토판이 엽록체에서 합성되기 때문에 엽록체로 향한다.
몇몇 상황에서, APS 유전자의 과잉발현은 특정 경로에 대한 기질의 세포 유용성을 감소시킬 수 있어 세포에 유해할 수 있다. 상기와 같은 상황에서는 기질의 생합성을 위한 효소를 코딩하는 유전자의 과잉발현에 의해 유용한 기질의 양을 증가시키는 것이 바람직하다. 트립토판 (피롤니트린 생합성에 대한 기질)의 경우, trpA 및 trpB 유전자 및 안트라닐레이트 합성효소 서브유닛을 과잉발현하는 것에 의해 달성될 수 있다. 유사하게, DAHP 합성효소와 같은 코리스메이트 생합성에 필요한 효소의 과잉발현은 페나진 생산에 필요한 전구체의 생산에 효과적이다. 보다 유용한 기질을 제조하기 위한 다른 방법은 특정 기질을 사용하는 공지 경로를 종지시키는 것에 의한다 (이것은 아무런 부작용없이 실시될 수 있다). 이와같이하여, 합성된 기질은 APS의 생합성을 향하여 매개되고 기타 화합물에 향하지 않는다.
식물 형질전환에 적합한 벡터는 본 명세서 전반에 걸쳐 기재되어 있다. 아그로박테륨 매개된 형질전환을 위하여, 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 갖는 바이너리 벡터 또는 벡터들이 적합한 반면, 직접적인 유전자 전달을 위해서는 임의의 벡터가 적합하며 또 관심을 두고 있는 구조를 갖는 선형 DNA가 바람직할 수 있다. 직접적인 유전자 전달의 경우, 단일 DNA종을 사용한 형질전환 또는 공동형질전환이 이용될 수 있다(스콜처 일행, Biotechnology4: 1093-1096 (1986)). 직접적인 유전자 전달 및 아그로박테륨 매개된 전달의 경우 모두, 적합한 항생물질 (카나마이신, 히그로마이신 또는 메타트렉세이트) 또는 제초제(베스타)에 대한 내성을 제공할 수 있는 선택 마커를 이용하여 형질전환을 실시할 수 있다. 그러나 선택 마커의 선택은 본 발명에 중요하지 않다.
트랜스제닉 식물에서 APS의 합성은 APS 생합성 효소를 코딩하는 다수의 유전자를 동시에 과잉생산하는 것을 필요로한다. 이것은 개별 APS 생합성 유전자를 직접적인 식물주로 형질시키는 것에 의해 생성한 주를 교배시키는 것에 의해 달성된다. 다수의 유전자를 갖고 있는 주의 선택과 유지는 다양한 형질전환 작성물이 상이한 선택 마커를 사용하면 실시될 수 있다. 모든 필요한 APS 생합성 유전자가 피라미드식으로 된 주는 APS를 합성하는 반면에 다른 주는 생산하지 않을 것이다. 이러한 방법은 최종 잡종이 2개 양친 사이의 교배인 옥수수와 같은 잡종 작물에 적합하다. 상이한 APS 유전자를 갖는 상이한 교배주의 선택은 특정 APS 경로가 다수의 APS 산물로 유발될 수 있는 상황에서 유리할 수 있고, 이들 각각은 유용성을 갖는다. 나머지 필요한 모든 유전자를 갖는 주를 잡종 교배시키기 위한 경로에서 나중 단계를 위한 다른 상이한 유전자를 갖는 상이한 주를 이용함으로써 상이한 이용성을 갖는 상이한 선별 APS를 갖는 상이한 잡종을 형성할 수 있다.
다수의 유전자를 갖는 식물주를 생산하기 위한 다른 방법은 APS 유전자 또는 APS 유전자들(상이한 마커로써 선택)을 사용하여 이미 형질전환된 기존의 식물주를 재형질전환시키는 것을 포함하고 또 다수의 유전자를 갖는 단일 형질전환 벡터의 사용을 필요로하며, 이들은 모두 각기 적합한 조절 유전자 제어(예컨대, 프로모터, 터미네이터 등)하에 있다. DNA 작성을 용이성을 고려할 때, 다수의 APS 유전자를 갖는 클로닝 벡터의 작성이 바람직한 방법이다.
식물 증식물질(과일, 괴경, 알곡, 종자), 특히 종자가 제품으로 시판되기 전에, 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들 화합물의 수개의 혼합물을 포함하는 보호성 코팅으로 처리하는 것이 통상적이다. 필요에 따라, 이들 화합물은 세균, 진균 또는 동물 해충에 의해 유발되는 손상으로 부터 보호하기 위해 배합기술에서 흔히 통상적으로 사용되는 기타 담체, 계면활성제 또는 투여 증진 보조제와 함께 배합될 수 있다. 종자를 처리하기 위하여, 괴경 또는 알곡을 액체 배합물로 함침시키거나 또는 이들을 습윤 또는 건조 배합물의 조합물로써 코팅하는 것에 의해 종자에 보호성 코팅을 도포할 수 있다. 특별한 경우 싹 또는 과일을 처리하는 것과 같은 식물에 도포하는 방법도 가능하다. 본 발명에 따른 식물 종자는 항병원성 물질의 생산을 코딩하는 DNA 서열을 포함하며 캅탄, 카르복신, 티람(TMTD?), 메타락실(Apron?), 피리미포스-메틸(Actellic?) 및 종자 처리에 통상적으로 사용되는 물질과 같은 종자 처리 화합물을 포함하는 종자 보호성 코팅으로 처리될 수 있다. 따라서 본 발명의 한가지 목적은 종자 처리에 통상적으로 사용되는 종자 보호 코팅으로 처리된 식물 증식 물질, 및 특히 항병원성 물질 생산을 코딩하는 종자를 제공하는 것에 관한 것이다.
이질 숙주에서 항병원성 물질의 생산
본 발명은 APS를 수득하기 위한 방법도 제공한다. 이들 APS는 미생물, 특히 식물병원성 미생물의 성장을 억제시키는데 효과적일 수 있다. APS는 APS 유전자가 과잉발현된 생물로 부터 다량 생산될 수 있고 또 이를 위해 적합한 생물은 그람 음성 및 그람 양성 세균과 효모 그리고 식물이다. APS 생산을 위하여, 숙주 생물의 선택에서 중요한 범위는 조작의 용이성, 성장의 신속도(즉, 미생물의 경우에서 발효) 및 APS가 과잉생산되지 않은 점이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 크게 향상된 양의 항병원성 물질이 숙주에서 합성되고, 이 항병원성 물질은 천연적으로 생기며, 상기 숙주는 상기 항병원성 물질을 합성하는데 필요한 완전한 폴리펩티드 세트를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자로 형질전환된 것이다. 이들 APS 생산방법은 항생물질과 같은 APS의 제조에 흔히 사용된 화학적 합성 수법에 비하여 현저한 이점을 갖는다. 이들 이점은 제조 원가가 절감된다는 것과, 유기 합성법에 의해 불가피하게 생기는 라세미체 혼합물과는 반대로 바람직한 생물학적 에난티오머 화합물을 합성할 수 있는 점에 있다. 입체화학적으로 적합한 화합물을 생산할 수 있는 점은 많은 키럴 활성 탄소원자를 갖는 분자에 특히 중요하다. 이질 숙주에 의해 생산되는 APS는 의료 분야(즉, 병원체 및/또는 전염병 방제) 및 농업 분야에서 사용될 수 있다.
항병원성 조성물의 배합
본 발명은 또한 활성성분이 본 발명의 재조합성 생물방제제에 의해 생산된 항생물질 또는 미생물의 현탁액 또는 농축액인 항진균 조성물의 제조도 포함한다. 상기 활성성분은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 화합물 또는 화합물군과 함께 균일하게 혼합된다. 본 발명은 또한 활성성분 또는 활성성분을 포함하는 항진균 조성물을 식물병원체를 억제할 수 있는 양으로 식물에 도포하는 것을 포함하는 식물병원체로 부터 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 활성성분은 조성물 형태로 흔히 도포되며 또 작물 재배지 또는 처리될 식물에 기타 화합물과 동시에 또는 연속해서 도포될 수 있다. 이들 화합물은 비료 또는 미량영양 공여제 또는 식물 성장에 영향을 주는 기타 제제일 수 있다.이들은 선택적 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들 제제의 몇개의 혼합물일 수 있고, 필요에 따라 배합 기술에서 흔히 사용되는 기타 담체, 계면활성제 또는 투여증진 보조제를 함께 사용될 수 있다. 적합한 담체 및 보조제는 고체 또는 액체일 수 있고 배합물 수법에서 흔히 사용되는 물질, 예컨대 천연 또는 재생 무기 물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착제, 결합제 또는 비료에 해당된다.
본 발명의 활성성분 또는 하나 이상의 활성성분을 함유하는 농약 조성물을 도포하는 바람직한 방법은 엽면 투여이다. 투여 횟수 및 투여 비율은 상응하는 식물병원체(진균 유형)에 의해 감염된 정도에 따라 다르다. 그러나, 활성성분은 식물의 재배지를 액체 조성물로 함침시키는 것에 의해 토양을 통하여 전체 식물로 침투(전신 작용)되거나, 또는 고체형태, 예컨대 과립 형태의 화합물을 토양으로 투여(토양 투여)하는 것에 의해 침투될 수 있다. 활성성분은 종자를 활성성분을 함유하는 액체 배합물로 함침시키거나 또는 활성성분을 고체 배합물로 코팅하는 것에 의해 종자에 도포(코팅)될 수 있다. 특별한 경우, 기타 유형의 투여, 예컨대 식물 줄기나 싹을 선택적으로 처리하는 것도 가능하다.
활성성분은 원형 그대로의 형태 또는 배합 기술에서 흔히 사용되는 보조제와 함께 사용되고 또 공지 방법에 의해 유화농축액, 피복성 페이스트, 직접 분무가능한 또는 희석가능한 용액, 희석 유제, 수화제, 가용성 산제, 살포제, 과립제 및 중합 물질중의 캡슐화제로 배합될 수 있다. 조성물의 성질과 마찬가지로 분무, 원자화, 살포, 뿌리기 또는 붓기와 같은 투여방법은 의도하는 목적 및 주위 환경에 따라 선정한다. 유리한 투여비율은 헥타아르당 50 g 내지 5 kg의 활성성분, 바람직하게는 100 g 내지 2 kg/ha, 가장 바람직하게는 200 g 내지 500 g 활성성분/ha이다.
활성성분 및 경우에 따라 고체 또는 액체 보조제를 함유하는 배합물, 조성물 또는 제제는 공지 방식, 예컨대 활성성분을 증량제, 예컨대 용매, 고체 담체 및 경우에 따라 계면활성 화합물(계면활성제)과 함께 균일하게 혼합 및/또는 분쇄하는 것에 의해 제조된다.
적합한 용매는 방향족 탄화수소, 바람직하게는 8 내지 12개의 탄소원자를 갖는 분획물, 예컨대 크실렌 혼합물 또는 치환된 나프탈렌; 디부틸 프탈레이트 또는 디옥틸 프탈레이트와 같은 프탈레이트; 시클로헥산 또는 파라핀과 같은 지방족 탄화수소; 에탄올, 에틸렌글리콜, 모노메틸 또는 모노에틸 에테르와 같은 알코올 및 글리콜과 이들의 에테르와 에스테르: 시클로헥산온과 같은 케톤; N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸술폭시드 또는 N,N-디메틸포름아미드와 같은 강한 극성 용매, 뿐만 아니라 에폭시화된 코코넛 오일 또는 콩기름과 같은 에폭시화된 식물오일; 또는 물이다.
예컨대 살포제 및 분산성 분말제용으로 사용되는 고체 담체는 대개 칼 사이트, 탈크, 카올린, 몬모릴로나이트 또는 애터펄자이트와 같은 천연 광물성 충전제이다. 또한 물리적 성질을 개선시키기 위하여 고분산 실리카 또는 고분산 흡수성 중합체를 첨가할 수도 있다. 적합한 흡수성 과립 담체는 다공성 타입, 예컨대 경석, 파쇄 벽돌, 세피올라이트 또는 벤토나이트이며, 적합한 비흡수성 담체 재료는 칼사이트 또는 모래이다. 더나아가, 특히 돌로마이트나 분쇄된 식물 잔사와 같은무기 또는 유기성의 많은 과립화 재료를 사용할 수 있다.
적합한 계면활성 화합물은, 배합시킬 활성성분의 성질에 따라, 우수한 유화성, 분산성 및 습윤성을 갖는 비이온, 양이온 및/또는 음이온 계면활성제이다.
용어 "계면활성제"는 계면활성제의 혼합물을 포함하는 것으로 이해된다.
적합한 비누는 고급 지방산(10 내지 22개 탄소원자 사슬)의 알카리 금속 염, 알칼리 토금속염 또는 비치환되거나 또는 치환된 암모늄 염, 예컨대 올레산 또는 스테아르산, 또는 코코넛 오일 또는 탤로우 오일로 부터 수록할 수 있는 천연 지방산 혼합물의 나트륨 또는 칼륨염이다. 지방산 메틸 타우린 염도 사용될 수 있다.
그러나, 보다 흔히 소위 합성 계면활성제, 특히 지방산 술포네이트, 지방 술페이트, 술폰화된 벤즈이미다졸 유도체 또는 알킬아릴술포네이트이다.
지방 술포네이트 또는 술페이트는 대개 알칼리 금속염,알 칼리 토금속염 또는 치환 혹은 비치환 암모늄염의 형태이고, 대개 아실 라디칼의 알킬 부분도 포함하는 탄소수 8 내지 22의 알킬 라디칼을 함유하며, 그 예로는 리그노술폰산, 도데실술페이트 또는 천연 지방산으로부터 제조된 지방 알코올 술페이트 혼합물의 나트륨 또는 칼슘염이다. 이들 화합물은 또한 술페이트화 및 술폰화 지방 알코올/에틸렌옥사이드 부가물의 염도 포함한다. 술폰화 벤즈이미다졸 유도체는, 바람직하게는 2개의 술폰산기와 탄소수 약 8 내지 22의 지방산 라디칼 한개를 함유한다. 알킬아릴술포네이트는 예컨대 도데실벤젠술폰산, 디부틸나프탈렌술폰산 또는 나프탈렌술폰산과 포름알데히드 축합 생성물의 Na, Ca 또는 트리에탄올아민 염이다. 또한 이에 상응되는 포스페이트, 예컨대 p-노닐페놀과 에틸렌옥사이드 4 내지 14몰과의 부가물의 인산 에스테르의 염 또는 인지질도 적합하다.
적합한 비이온 계면활성제는 바람직하게는 3 내지 30개의 글리콜에테르기를 함유하며 (지방족)탄화수소 라디칼내의 탄소수가 8 내지 20이고 알킬페놀의 알킬 라디칼내 탄소수가 6 내지 18인 지방족 또는 지환족 알코올, 혹은 포화 또는 불포화 지방산 및 알킬페놀의 폴리글리콜에테르 유도체이다.
그외의 적합한 비이온 계면활성제는 폴리에틸렌옥사이드와 프로필렌 글리콜, 에틸렌디아미노폴리프로필렌글리콜 및 알킬사슬내 탄소수가 1 내지 10인 알킬폴리프로필렌글리콜과의 수용성 부가물이며, 이 부가물은 20 내지 250개의 에틸렌글리콜에테르기와 10 내지 100개의 프로필렌글리콜에테르기를 함유한다. 이들 화합물은 보통 프로필렌글리콜 단위 하나당 1 내지 5단위의 에틸렌글리콜을 함유한다.
비이온 계면활성제의 예로는 노닐페놀 폴리에톡시에탄올, 피마자유 폴리글리콜 에테르, 폴리프로필렌/폴리에틸렌 옥사이드 부가물, 트리부틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 및 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 들 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레에이트와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산 에스테르이다.
양이온 계면활성제는 바람직하게는 탄소수 8 내지 22인 하나이상의 알킬 라디칼을 N-치환기로서 함유하고 저급 할로겐화 혹은 비치환 알킬, 벤질 또는 저급 히드록시알킬 라디칼을 기타 치환기로서 함유하는 4차 암모늄 염이다. 이러한 염은 할라이드, 메틸술페이트 또는 에틸술페이트의 형태인 것이 바람직하다. 그예로서는 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드 또는 벤질디(2-클로로에틸)에틸암모늄 브로마이드를 들 수 있다.
배합분야에서 흔히 사용되는 계면활성제는 "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 1979, and Sisely and Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chemical Publishing Co., Inc. New York, 1980에 기재되어 있다.
농화학 조성물은 통상 약 0.1 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 95%, 가장 바람직하게는 약 3 내지 약 90%의 활성 성분, 약 1 내지 약 99.9%, 바람직하게는 약 1 내지 약 99%, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 95%의 고체 또는 액체 보조제, 및 약 0 내지 약 25%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 25%, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20%의 계면활성제를 함유한다.
시판 제품은 농축물로 제형화되는 것이 바람직하지만, 최종 소비자는 대개 희석 배합물을 사용할 것이다.
이하의 실시예는 본 발명을 보다 자세하게 설명하기 위한 것이고 본 발명의 실시방법을 제시한다. 이들은 어떠한 제한을 의미하지 않으며, 오히려 본 발명을 실시하는 방법 지침을 제시할 따름이다.
A. 항병원성 물질을 생산하는 미생물의 동정
많은 공급원으로 부터 미생물을 단리하고 또 시험관내에서 진균 또는 세균 성장을 억제하는 능력에 대하여 스크리닝하였다. 전형적으로, 미생물을 희석시키고 진균 포자 또는 균사체 단편, 또는 세균이 도입되었거나 또는 도입될 배지상에 플레이팅하였다. 따라서, 새로이 단리된 세균 클로니 근처의 맑은 영역은 항병원성 활성의 표시이다.
실시예 1: 토양으로 부터 항-리족토니아 특성을 갖는 미생물의 단리
1 g의 토양(약 106-108세균 함유)을 10 ml의 멸균수에 현탁시켰다. 급격하게 혼합한 후, 토양 입자를 침전시켰다. 적합하게 희석시키고 적정량으로 나누어 영양 한천 플레이트(또는 기타 적합한 성장 배지)에 플레이팅하여 플레이트당 50 내지 100개의 콜로니를 얻었다. 혼합시키는 것에 의해 새로 배양된 리족토니아 균사를 단편화시키고 또 세균 콜로니의 성장이 확인된 후 진균 단편의 현탁액을 한천 플레이트상에 분무하였다. 항진균 활성을 갖는 세균 단리물은 플레이트를 배양하면 이들 주위에 진균이 없는 영역의 존재에 의해 확인될 수 있다.
이러한 단리물에 의한 생활성 대사산물의 생산은 상술한 바와 같이 플레이트 분석법에서 살아있는 콜로니 대신 배양 여액을 사용함으로써 확인되었다. 이러한 생물검정은 대사산물의 정제를 제어하기 위해 이용될 수 있다. 정제는 유기 용매 추출 단계로써 개시될 수 있고 또 활성물질이 추출되어 유기상으로 들어가는지 또는 수성 상에 잔존하는지 여부, 상이한 크로마토그래피 단계에 따라 다르다.
이들 크로마토그래피 단계는 이 기술분야에서 공지되어 있다. 궁극적으로, 순도와 화학적 주체는 분광학적 방법을 이용하여 결정된다.
B. 미생물로 부터 항병원성 생합성 유전자의 클로닝
실시예 2: 천연 공급원으로 부터 항병원성 생합성 유전자의 숏건 클로닝
관련 생합성 유전자는 미생물에서 서로 인접하게 위치하고 또 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 한개의 오페론에 의해 코딩된다. 따라서, 단일 생합성 경로에서 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 한가지 방법은 상기 경로를 함유하는 미생물로 부터 게놈 단편을 상기 경로를 함유하지 않는 미생물로 전달하여 이 경로에 의해 전달된 표현형을 스크리닝하는 것이다.
항병원성 물질(APS)을 생산하도록하는 효소를 코딩하는 생합성 유전자의 경우, 항병원성 물질을 생산하는 미생물의 게놈 DNA를 단리하고, Sau3A와 같은 제한 효소로 분해시킨 다음 선택된 크기(선택된 크기는 사용된 벡터에 따라서 다르다)의 단편을 단리하기 위해 크기를 분별하며 또 선택된 크기의 단편을 대장균(E.coli)으로 전달하기 위해 벡터에 클로닝(예컨대 코스미드 벡터의 BamHI 위치)하였다. 생성한 대장균 클론을 항병원성 물질을 생산하는지에 대해 스크리닝하였다. 이러한 스크리닝은 생화학적 분석과 같은 항병원성 물질의 직접적인 검출을 기본으로 한다.
이와다르게는, 상기와 같은 스크리닝은 표적 병원체에 대한 항병원성 물질과 관련된 악영향을 기본으로 할 수 있다. 이들 스크린에서, 항병원성 물질을 생산하는 클론은 표적 병원체를 치사시키거나 그 성장을 억제시키는 역할을 하는 것으로 선택되었다. 이러한 억제 활성은 표적 병원체(예컨대 표적 병원체가 진균인 경우 포자, 표적 병원체가 세균인 경우 세포)로 함침된 세균 플레이트상에서 투명한 영역이 생성되는지에 대해 스크리닝하는 것과 같이, 이 기술분야에서 공지된 표준 스크리닝 분석법에 대한 기초를 형성한다. 이들의 항병원성 활성을 기준하여 선택된 클론은 특정 항병원성 물질에 대한 표준 화학적 및 생화학적 수법을 이용하여 항병원성 물질의 존재를 확인하는 것에 의해 분석될 수 있다.
항병원성 물질에 대한 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 특징화하고 동정하는 것은 다음과 같이 실시한다. 대장균 클론 양성인 것으로 확인된 DNA 삽입물을 단리하고 더 작은 단편으로 분해시켰다. 더 작은 단편을 벡터에 다시 클로닝하여 대장균에 다시 삽입한 다음 항병원성 표현형에 대해 다시 분석하였다. 이와다르게는, 양성으로 확인된 클론을 이 기술분야에서 공지된 수법을 이용하여 λ::Tn5 트랜스포손 돌연변이처리시킬 수 있다(예컨대, 드 브루이진과 럽스키에 의한 Gene27: 131-149 (1984)). 상기한 방법을 이용하여 다수의 분열된 트랜스포손 삽입물을, APS 생산을 가능하게하는 DNA로 도입함으로써 APS 생산 책임이 있는 DNA의 정확한 영역을 기술할 수 있다. 따라서, 대장균상에서 항병원성 물질 생산을 부여하는 것으로 밝혀진 최소 삽입물의 길이의 결정은 APS 생산에 필요한 오픈 리딩 프레임을 알려줄 것이다. 이들 오픈 리딩 프레임은 흔히 나누어질 수 있는데(이하 참조) 이는 항병원성 물질의 생합성에서 이들의 역할을 확인시켜준다.
이 기술분야에서 공지된 숙주에 적합한 클로닝 벡터를 사용하여 기술된 수법에서 대장균 대신 바실루스 및 효모와 같은 다양한 숙주 생물을 사용할 수 있다. 숙주 생물은 생합성 유전자가 클로닝되기 때문에 그 선택시 항병원성 물질에 대하여 감수성이 아니어야하는 오직 하나의 제한이 있다.
실시예 3: 트랜스포손 돌연변이를 이용한 항병원성 물질에 대한 생합성 유전자의 클로닝
항병원성 물질을 생산하는 것으로 알려진 많은 미생물중에서, 트랜스포손 돌연변이는 삽입 돌연변이체를 생성하기 위한 통상적인 수법이다. 이 수법은 슈도모나스(예컨대 램 일행에 의해 Plasmid 13: 200-204 (1985)), 바실루스(예컨대 영맨 일행에 의해, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2305-2309 (1983)), 스타필로코커스 (예컨대 파테에 의해 J. Bacteriol. 145: 479-488 (1981)), 및 스트렙토마이세스 (예컨대 쇼에르 일행에 의해 J. Bacteriol. 173: 5060-5067 (1991)) 와 기타 종에서 성공적으로 채용되어 왔다. 이 수법에 대한 주요 요건은 플라스미드를 함유하는 트랜스포손을 게놈내의 임의 위치에 트랜스포손을 삽입할 수 있는 미생물로 도입하는 능력이다. 플라스미드를 다수의 미생물로 도입하는 것에 의해 삽입 돌연변이체의 대형 라이브러리를 제조하였다. 플라스미드를 미생물로 도입하는 것은 접합, 직접적 유전자 전달수법, 예컨대 엘렉트로포레이숀과 같은 적합한 표준 수법에 의해 실시할 수 있다.
상술한 방식으로 트랜스포손 라이브러리를 생성하면, 트랜스포손 삽입 돌연변이체는 APS의 생산을 위해 분석될 수 있다. APS를 생산하지 않는 돌연변이체는 APS 생합성에 필요한 유전자 서열로 트랜스포손 삽입의 결과로서 주로 생길 수 있다. 따라서 이들 돌연변이체는 더 분석하기 위해 선택될 수 있다.
트랜스포손 삽입물과 인접하는 선택된 돌연변이체로 부터 얻은 DNA는 표준 수법에 의해 클로닝될 수 있다. 예컨대, 프랜스포손 삽입물 근처의 숙주 DNA는 선택된 돌연변이체의 게놈 DNA로 제조된 DNA의 라이브러리의 일부로서 클로닝될 수 있다. 인접하는 숙주 DNA는 트랜스포손을 DNA 탐침으로서 사용하여 라이브러리로 부터 동정된다. 이와다르게는, 사용된 트랜스포손이 항생물질 내성에 적합한 유전자를 함유하면, 이 삽입 돌연변이체 DNA는 상기 유전자 서열 사이 또는 그의 서열과 숙주 삽입점 사이를 절단하지 않을 것으로 기대되는 적합한 제한효소로써 분해된 다음 그로써 생성된 단편을 선택된 항생물질을 사용하여 선택될 수 있는 대장균과 같은 미생물로 클로닝될 수 있다.
삽입된 트랜스포손을 초과한 DNA를 서열결정화시키면 인접 숙주 서열을 알수 있다. 인접하는 서열은 비돌연변이성 숙주 라이브러리를 이용하여 분열되지 않은 천연 숙주 DNA를 재클로닝하기 위한 혼성화 탐침으로서 사용될 수 있다. 상보적인 DNA는 APS 생합성 유전자 또는 APS 생합성 경로의 전부 또는 일부를 조절하는 유전자를 함유할 수 있다. 단리된 유전자가 생합성 유전자를 코딩하도록 이들은 APS를 생산하지 않고 또 APS에 대해 감수성이 아닌 이질 숙주(예컨대, 대장균)로 전달될 수 있다. 단리된 DNA의 소형 조각을 전달하고 가장 작은 효과적인 조각을 서열화함으로써, APS 유전자를 동정할 수 있다. 이와다르게는, 양성으로 확인된 클론을 이 기술분야에서 공지된 수법을 이용하여 λ::Tn5 트랜스포손 돌연변이처리시킬 수 있다(예컨대 드 브루이진 및 럽스키에 의해 Gene27: 131-149 (1984)). 이 방법을 이용하여, 다수의 트랜스포손 삽입물이 APS 생산을 가능하게하는 DNA 로 도입되어 APS 생산에 책임이 있는 DNA의 정확한 영역을 기술할 수 있다. 이러한 단계는 실시예 1에 기술된 방식과 유사하게 실시할 수 있다. 이질 프로모터의 비 작용성으로 인하여 클론된 유전자가 이질 숙주에서 발현될 가능성을 피하기 위하여, 클론된 유전자는 발현 벡터로 전달될 수 있으며 벡터에서 이들은 이질 숙주에서 작용하는 것으로 공지된 프로모터에 융합될 수 있다. 대장균의 경우, 적합한 박현 벡터의 예는tac 프로모터를 이용하는 pKK223이다. 유사한 적합한 발현 벡터는 효모와 같은 기타 숙주에 대하여 존재할 수 있고 이는 이 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 융합은 미생물중의 관련 유전자의 오페론 유형 조직으로 인하여 용이하게 실시될 수 있기 때문에 APS 생합성에 필요한 생합성 효소는 오직 하나의 프로모터 융합을 필요로하는 단일 전사체상에서 코딩될 것이다.
실시예 4: 돌연변이 및 상보성검정을 이용한 항병원성 생합성 유전자의 클로닝
상술한 방법과 유사한 방법은 상보성검정과 함께 비삽입성 돌연변이 수법(화학적 돌연변이 및 방사선 돌연변이)을 이용하는 것을 포함한다. APS 생산 미생물을 비삽입성 돌연변이처리시키고 또 APS 생산능을 상실한 돌연변이체를 이후의 분석을 위해 선택하였다. 양친 APS 생산 균주로 부터 유전자 라이브러리를 제조하였다. 하나의 적합한 방법은 삼양친 접합법에 의해 선택된 APS 음성 돌연변이체(디타 일행에 의한 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7247-7351(1980))로 전달될 수 있는 tra+ 플라스미드 pRK2013을 갖고 있는 대장균으로 들어갈 pVK100(크나우프 일행에 의한 Plasmid 8: 45-54 (1982))과 같은 벡터로 20 내지 30 kb의 단편을 결찰시키는 방법이다. 또 다른 적합한 방법은 엘렉트로포레이션법을 통하여 유전자 라이브러리의 돌연변이체로 전달하는 방법이다. APS 음성 돌연변이체를 상보성검정하는 DNA의 더 작은 단편으로 재형질감염시킴으로써 선택된 콜로니를 특징화시켜 성공적으로 상보성검정하는 단편을 확인하고 이를 서열결정 분석하였다. 실시예 2의 경우, 상기 방법으로 단리된 유전자는 APS 생합성 경로 전체 또는 일부를 조절하는 생합성 유전자(들)일 수 있다. 단리된 서열들이 생합성 유전자들을 코딩한다는 것을 확인하기 위해, 이들은 APS를 생산하지 않고 APS에 대하여 감수성이 아닌 이질 숙주(예컨대, 대장균)에 도입될 수 있다. 상기 후술한 단계는 실시예 2에 기재된 방법과 유사한 방식으로 실시된다.
실시예 5: 생합성 운전자의 발현을 제어하는 조절유전자를 이용하는 것에 의한 합병원성 생합성 유전자의 클로닝
APS 생합성 유전자를 클로닝하는 방법은 이들 생합성 유전자의 발현을 제어하는 조절 유전자의 이용에 따라 다르다. 트랜스포손 삽입 돌연변이체의 라이브러리는 조절유전자를 갖지 않거나 또는 통상의 유전자 분해 수법에 의해 못쓰게된 조절 유전자를 갖는 미생물 균주에서 만들어질 수 있다. 사용된 삽입 트랜스포손은 프로모터를 갖지 않는 리포터 운전자(예컨대, lacZ)를 포함한다. 이 삽입 라이브러리가 작성되면, 조절 유전자의 기능적 복제물은 세포의 라이브러리로 전달되며(접합 또는 엘렉트로포레이션법에 의해) 또 플레이팅된 세포는 리포터 유전자의 발현을 위해 선택된다. 조절 유전자를 전달하기 전후에 세포를 측정하였다. 조절 유전자 존재하에서만 리포터 유전자를 발현하는 콜로니를 조절 유전자에 의해 조절되는 유전자의 프로모터 근처에 삽입하였다. 조절 유전자가 APS 생합성 유전자에 대한 조절에 특징적이라고 가정할 때, 이러한 방법으로 표시된 유전자는 APS 생합성 유전자일 것이다. 이들 유전자는 클로닝될 수 있고 또 실시예 2에 기재된 수법을 이용하여 더 특징화될 수 있다.
실시예 6: 상동성에 의한 항병원성 생합성 유전자의 클로닝
신규 항병원성 생합성 유전자의 클로닝을 실행하기 위해서는 공지 유전자에 대한 이들의 상동성을 이용한 표준 DNA 수법을 이용할 수 있다. 관심을 두고 있는 미생물의 DNA 라이브러리를 작성한 다음 상이한 생물의 APS 생합성 유전자로부터 유도된 방사성원소 표지된 DNA를 이용하여 탐침처리하였다. 새로이 단리된 유전자를 특성화하고 서열결정하며 이질 미생물 또는 천연 미생물의 돌연변이 APS 음성 균주로 도입함으로써 APS 생산능의 전달을 확인하였다.
C. 슈도모나스로 부터 피롤니트린 생합성 유전자의 클로닝
피롤니트린은 다양한 슈도모나스 플루오레센스 균주로 부터 생산된 페닐피롤화합물이다. 피롤니트린을 생산하는 피.플루오레센스 균주는 리족토니아 및 피튬 진균 병원체 (WO94/01561호)에 대하여 효과적인 생물방제 균주이다. 피롤니트린의 생합성은 트립토판에서 개시되는 것으로 추정된다 (창 일행, J. Antibiotics 34: 55-566 (1981)).
실시예 7: 슈도모나스로 부터 피롤니트린 생합성 유전자를 단리하기 위해 gafA 조절 유전자의 사용
피롤니트린 생합성 효소를 코딩하는 유전자군을 상기 실시예 5에 기술한 기본적 원리를 이용하여 단리하였다. 이 단리 방법에 사용된 조절 유전자는 슈도모나스 플루오레센스로 부터 얻은 gafA 유전자였고 이것은 슈도모나스에서 특정 생물방제 유전자를 제어하는 2성분 조절계의 일부인 것으로 알려져있다. gafA 유전자는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 WO 94/01561호에 기재되어 있다. gafA는 또한 가프네이 일행(Molecular Plant-Microbe Interactions 7: 455-463, 1994, 역시 본 명에서에 참고문헌으로 포함되어 있다)에 의해서도 기재되어 있고 "ORF5"로 약칭되어 있다. gafA유전자는 피롤니트린 생합성, 키티나제, 젤라티나제 및 시아나이드 생산을 조절하는 것으로 알려져있다. gafA 유전자를 결여하고 있거나 또는 그 유전자의 발현이 미미한(따라서 gafA-관련 유전자의 발현도 적다) 균주가 이 단리 수법에 적합하게 사용될 수 있다.
실시예 8: 슈도모나스에서 피롤니트린 생합성 유전자의 단리
MOCG 134로 부터 gafA 유전자를 슈도모나스 플루오레센스의 밀접하게 관련된 피롤니트린을 생산하지 않는 야생형 균주로 전달하면 이들 균주는 피롤니트린을 생산하는 능력을 갖게된다. (가프네이 일행, MPMI (1994)); 힐 일행, Applied And Environmental Microbiology 60 78-85 (1994) 참조). 이는 이들 밀접하게 관련된 균주가 피롤니트린 생합성에 필요한 구조 유전자는 갖고 있지만 gafA 유전자에 의해 활성화되지 않으면 피롤니트린을 생산할 수 없다는 것을 지시한다. 이러한 밀접하게 관련된 균주, MOCG133는 피롤니트린 생합성 유전자를 동정하는데 사용되었다. 트랜스포손 TnCIB116(램, New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, pp 767-778, 알란 알. 리스, 인코포레이티드 (1990))은 MOCG133을 돌연변이처리하기 위해 사용되었다. 이 트랜스포손 Tn5 유도체는 카나마이신 내성을 코딩하고 한쪽 단부에 프로모터없는 lacZ 리포터 유전자를 함유한다. 이 트랜스포손은 MOCG133으로 이동할 수 있지만 그속에서는 복제할 수 없는 플라스미드 벡터 pCIB116 (램, New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, pp767-778, 알란 알. 리스, 인코포레이티드 (1990))을 이용한 접합에 의해 MOCG 133으로 도입하였다. 따라서, 대부분의 카나마이신 내성인 접합완료체는 TnCIB116가 MOCG133 게놈내의 다른 위치로 전위한 결과이다. 트랜스포손이 활성 프로모터 뒤의 세균 염색체로 삽입되면, lacZ 리포터 유전자는 활성화된다. 이러한 유전자 활성화는 기질 X-gal을 이용하여 목측 제어될 수 있으며 lacZ 유전자 산물에 의해 분해되면 불용성 청색 생성물을 방출한다. 카나마이신 내성인 접합완료체를 수집하여 마스터 플레이트에 배열시킨 다음 광숙주 범위를 갖는 RK2 복제기점, 테트라사이클린 선택 유전자 및 gafA 유전자를 갖는 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주 S7-1(시몬 일행, Bio/technology 1: 784-791 (1983))의 잔디에 레플리카 플레이팅하였다. 대장균 S17-1 균주는 플라스미드의 접합 전달에 필요한 염색체 삽입된 tra 유전자를 함유한다. 따라서, 삽입 트랜스포손 돌연변이체를 S17-1/gafA 대장균 잔디로 레플리카 플레이팅하면 gafA를 갖는 플라스미드의 삽입 트랜스포손 돌연변이체로 전달되어 gafA 조절유전자의 존재하에서 분석될 lacZ 유전자를 활성화시킨다(숙주 gafA의 발현은 lacZ 발현을 유발하기에 불충분하고 다복제 플라스미드상의 gafA의 도입이 더 효과적이다). 청색 표현형 (lacZ 활성)을 갖는 삽입 돌연변이체는 gafA 존재하에서만 동정되었다. 이들 돌연변이체에서, 트랜스포손은 그의 발현이 gafA에 의해 조절되는 유전자 사이에 삽입되었다. 이들 돌연변이체 (도입된 gafA를 가짐)는 시아나이드, 키티나제 및 피롤니트린을 생산하는 능력으로 측정 (가프네이 일행, 1994 MPMI, 출판중)될 수 있으며 그 활성은 gafA에 의해 조절되는 것으로 공지되어 있다 (가프네이 일행, 1994 MPMI, 출판중). 한개의 돌연변이체는 피롤니트린을 생산하지 않았지만 시아나이드와 키티나제는 생산하였는데 이는 트랜스포손이 피롤니트린 생합성에만 관여하는 유전자 영역에 삽입되었음을 나타낸다. 트랜스포손의 한개 말단에 존재하는 DNA 서열을 XhoI를 사용하여 선택된 삽입 돌연변이체로 부터 단리된 염색체 DNA를 XhoI로써 분해시키는 것에 의해 클로닝한 다음 이 분해물로 부터 유도된 단편을 pSP72 (프로메가, cat. #P2191)의 XhoI 위치로 결찰시키고 이 결찰 생산물로 형질전환된 대장균을 카나마이신상에서 선택하였다. 트랜스포손내에 있는 독특한 XhoI 위치는 카나마이신 내성에 필요한 유전자를 초과하여 절단하여 동일한 XhoI 단편상에서 단리된 양친 MOCG 133 균주로 부터 유도된 인접 영역을 활성화시켰다. 사실 인접 영역의 XhoI 위치는 트랜스포손의 말단으로 부터 약 1 kb 떨어져 위치하는 것으로 밝혀졌다. ~1 kb 인접 서열로 부터 유도된 클론된 XhoI 단편의 서브단편을 사용하여 MOCG134 균주의 코스미드 라이브러리로 부터 천연 (즉, 파괴되지 않은) 유전자 영역을 단리하였다. 코스미드 라이브러리는 부분적으로 Sau3A 분해된 MOCG 134 DNA로 부터 작성하였고, 그 크기는 30 내지 40 kb 사이의 단편이며 c2XB(베이트 및 스위프트에 의한 Gene26: 137-146(1983)) 및 pRK290 (디타 일행에 의한 Proc. Natl. Acad. Sci. USA77: 7247-7351(1980))의 유도체인 코스미드 벡터 pCIB199의 독특한 BamHI 위치로 클로닝되었다. pCIB119는 넓은 숙주범위의 복제 기점 RK2를 갖는 이중-cos 위치 코스미드 벡터이므로 슈도모나스 뿐만 아니라 대장균에서 복제될 수 있다. ~1 kb 인접 서열을 혼성화 탐침으로 사용하여 MOCG 134 코스미드 클론 라이브러리로 부터 수개의 클론을 단리하였다. 이들중 한개의 클론은 피롤니트린 생산능을 상실한 트랜스포손 삽입 돌연변이체에피롤니트린 생산능을 회복시키는 것으로 밝혀졌다. 이 클론은 ~32kb의 삽입물을 갖고 있고 또 pCIB169로 표시되었다. 코스미드 클론 pCIB169를 포함하는 대장균 DH5α의 생육 배양물은 미합중국 61604 일리노이 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 Agricultural Research Culture Collection (NRRL)에 1994년 5월 20일 수탁번호 NRRL B-21256으로 수탁되어 있다.
실시예 9: pCIB169의 맵핑 및 Tn5 돌연변이처리
클론 pCIB169의 32 kb 삽입물을 독특한 NotI 클로닝 위치를 함유하는 pBR322의 유도체인 대장균 HB101내의 pCIB189에 서브클로닝하였다. 양친 코스미드 벡터 pCIB119의 NotI 위치 인접 BamHI 클로닝 위치 뿐만 아니라 32 kb 삽입물 내의 유리한 NotI 위치는 14 내지 18 kb의 단편을 pCIB189로 서브클로닝되게한다. 이들 클론을 제한효소에 의해 맵핑하고 도 1은 그 결과를 도시한다. λTn5 트랜스포손 돌연변이는 이 기술분야에서 공지된 수법을 이용하여 14 및 18 kb 서브클론상에서 실시하였다(예컨대 드 브루이진 및 럽스키에 의한 Gene27: 131-149 (1984)). 카나마이신 내성을 제공하는 λTn5 파아지를 사용하여 상술한 14 및 18 kb 서브클론을 감염시켰다. λTn5 감염은 카나마이신을 기본으로한 선택과 함께 0.1 감염 중복도로 실시하였다. 돌연변이용 플라스미드 DNA를 작성한 다음 카나마이신 선택성을 갖는 대장균 HB101을 다시 형질전환시켜 Tn5 삽입물을 갖는 플라스미드 클론을 단리하였다. 총 30개의 독립적인 Tn5 삽입물을 32 kb 삽입물의 길이를 따라 지도화하였다(도 2). 이들 삽입물 각각은 이중 상동 재조합법을 이용하여 MOCG 134로 삽입되므로 Tn5 서열 및 pCIB189 벡터를 혼성화 탐침으로 사용하는 서던 혼성법에 의해 확인되며 야생형 MOCG 134 유전자가 Tn5 삽입 유전자로 대체된 이중 상동 재조합의 발생을 나타내었다. 피롤니트린 분석법은 MOCG 134로 교배된 삽입물의 각각에 대하여 실시되었고 약 6 kb의 유전자 영역이 피롤니트린 생산에 관여하는 것으로 밝혀졌다(도 3 및 5 참조). 이 영역은 pCIB169에 집중적으로 위치하는 것으로 알려져있고 또 XbaI/NotI 단편으로서 pBluescript II KS(프로메가 제조)에 용이하게 서브클로닝될 수 있다. XbaI/NotI 서브클론은 pPRN5.9X/N으로 표시하였다(도 4 참조).
실시예 10: 클론된 유전자 영역에서 오픈 리딩 프레임의 동정
피롤니트린 생산에 관여된 유전자 영역을 6개 단편에 서브클로닝하여 벡터 pBluescript II KS에서 서열결정하였다(도 4 참조). 이들 단편은 상술한 ~6 kb XbaI/NotI 단편에 걸쳐 존재하며 도 4의 좌측상의 EcoRI 위치에서 부터 최우측인 HindIII 위치에 걸쳐있다(도 4 참조). 클론 pPRN1.77E, pPRN1.01E, pPRN1.24E, pPRN2.18E, pPRN0.8H/N 및 pPRN2.7H의 삽입물의 서열은 캐나다 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드가 공급하는 Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit를 사용하여 제조자가 제시한 실험순서에 따라 결정하였다. 서열결정 반응은 어플라이드 바이오시스템스 373A 오토메이티드 DNA 서열분석기상에서 실시하였고 또 원료 DNA 서열을 모아서 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드가 공급하는 "INHERIT" 소프트웨어 팩케이지를 이용하여 편집하였다. 도 3의 EcoR/HindIII 단편에 상응하고 도 4에 도시한 EcoRI 위치 #2 및 HindIII 위치 #2로 둘러싸인 9.7 kb의 연속적인 DNA 서열을 수득하였다.
DNA 서열분석은 위스콘신 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹이 시판하는 GCG 소프트웨어 팩케이지를 이용하여 연속적인 9.7 kb 서열상에서 실시하였다. 패턴 인식 프로그램 "FRAMES"을 사용하여 DNA 서열의 6개 번역 프레임중에 있는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 조사하였다. 상기 프로그램과 이미 공고된(WO 94/05793호; 도 5) gafA유전자 영역의 ORF2로 부터 수득한 코돈 빈도 테이블을 이용하여 4개의 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 이들 ORF는 모두 실시예 9에서 ~6 kb XbaI/NotI 단편내에 위치하고 있으며(도 4) 또 서열확인번호: 1에 기재된 서열내에 존재하였다. 이들 4개의 오픈 리딩 프레임을 gafA 영역의 MOCG134 DNA 서열로 부터 얻은 코돈 빈도 사용 테이블을 비교함으로써 극소수의 코돈이 사용됨을 알수 있는데 이는 코돈 사용이 이들 양쪽 유전자 영역에서 유사하다는 것을 나타낸다. 이는 4개의 오픈 리딩 프레임이 실재하는 것임을 강력히 시사한다. 4번째의 리딩 프레임의 3' 영역에서 다수의 ρ 독립적 스템 루프 구조가 발견되었는데 이는 전사가 종지될 수 있는 영역을 제시한다. 따라서 모든 4개의 ORF는 단일 전사물로 부터 번역됨이 분명하였다. 4개의 확인된 ORF를 초과하는 영역에 대해 수득한 서열 데이타는 대장균 발현 연구를 기초로 하여 피롤니트린 합성에 관여되지 않는 것으로 확인된 5번째 오픈 리딩 프레임을 나타내었다.
피롤니트린 유전자군내의 각각의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 경우, 프레임내의 개시 코돈(ATG 또는 GTG) 및 상류 리보솜 결합 위치의 존재에 의해 다수의 가상적인 번역 개시 위치가 확인되었다. 각 유전자에 대한 실제 번역 개시 위치를 확인하기 위해 상보성검정법도 실시하였다. 가상적인 리보솜 결합 위치의 상류로 부터 종지 코돈의 하류에 이르는 각 prn 유전자의 절편을 증폭시키기 위하여 PCR 프라이머를 합성하였다(표 1). 플라스미드 pPRN18Not (1506 CIP3, 도 4)는 PCR 반응에 대한 주형으로 사용되었다. 이 PCR 생성물을 pKK223-3 (파마시아 제품) 및 pRK290 주쇄로 부터 얻은 Ptac 프로모터 및 rrs 터미네이터로 구성된 벡터 pRK(KK223-3MCS)에 클로닝하였다. 각 작성물을 함유하는 플라스미드는 대장균 HB101내의 헬퍼 플라스미드 pRK290을 사용한 삼친 메이팅에 의해 실시예 12에 기재된 바와 같이 MOCG134의 각 ORF-결실 돌연변이체로 이동하였다. 30 mg/l 테트라사이클린이 보충된 슈도모나스 최소 배지상에서 플레이팅하는 것에 의해 접합 완료체를 선택하였다. 삽입된 PCR 생성물의 플라스미드 및 정확한 방향성의 존재는 플라스미드 DNA 제조, 제한효소 분해 및 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 확인하였다. 피롤니트린 생산은 실시예 11에 기재한 바와 같은 추출 및 TLC 분석법으로 측정하였다. 각 prn 유전자의 경우, 피롤니트린 생산을 회복한 가장 짧은 클론(즉, ORF 결실체를 상보성검정)은 실제의 번역 개시 위치를 함유하는 것으로 확인되었다. 따라서 개시 코돈은 다음과 같이 확인되었다: 뉴클레오티드 위치 423에서 ORF1-ATG, 뉴클레오티드 위치 2026에서 ORF2-GTG, 뉴클레오티드 위치 3166에서 ORF3-ATG 및 뉴클레오티드 위치 4894에서 ORF4-ATG. 오픈 리딩 프레임을 확인하기 위해 사용된 패턴 "FRAMES" 컴퓨터 프로그램은 오직 ATG 개시 코돈만을 인식한다. 여기서 기술한 상보성검정법을 이용하면, 뉴클레오티드 위치 2039에 있는 GTG 코돈을 사용하여 ORF2가 실제로 개시되므로 "FRAMES" 프로그램에 의해 확인된 오픈 리딩 프레임 보다 더 길다.
[표 1]
피롤니트린 유전자군a에서 번역 개시 위치를 확인하기 위해 사용된 DNA 구조 및 숙주
실시예 11: 대장균내에서 피롤니트린 생합성 유전자의 발현
피롤니트린을 생산하는데 오직 4개의 유전자가 필요한지를 확인하기 위해,이들 유전자를 대장균으로 전달한 다음 피롤니트린을 생산하는지 평가하였다. 클론된 오페론을 대장균에서 과잉발현시키기 위하여 발현벡터 pKK223-3을 사용하였다. (브로시우스 및 홀리, Proc. Natl. Acad. Sci. USA81: 6929 (1984)). pKK223-3은 강한 tac 프로모터를 함유하며, 적합한 숙주에서 lac 억제 유전자에 의해 조절되며 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 세균 성장 배지에 부가함으로써 유도되었다. 발현 연구를 위하여 ∼6 kb XbaI/NotI 단편 (실시예 7 및 도 4 참조) 및 10 kb XbaI/KpnI 단편 (도 4 참조)을 클로닝하기 위해 기존의 다수의 클로닝 위치에 추가의 유용한 제한위치를 부가함으로써 상기 벡터를 변형시켰다. 각 경우에서 클로닝된 단편은 대장균 tac 프로모터 (IPTG 유도) 제어하에 있지만, 전사 융합물로 클로닝되므로 사용된 리보솜 결합 위치는 슈도모나스로 부터 유도될 수 있을 것이다. 이들 클론의 각각은 대장균 XL1-블루 숙주 세포로 형질전환되었고 또 박층 크로마토그래피에 의해 피롤니트린에 대해 측정하기 전에 2.5 mM IPTG로 유도되었다. 37℃의 10 ml L 육즙내에서 급격하게 교반하면서 IPTG 도입한 후 24시간 동안 배양하였다. 유기상을 회수하고 진공하에서 증발시키며 잔류물을 20 μℓ의 메탄올에 용해시켰다. 실리카겔 박막 크로마토그래피(TLC) 판에 10 μℓ의 추출액을 스포팅하고 이동상으로서 톨루엔을 사용하여 크로마토그래피시켰다. 이 플레이트를 건조시키고 밴 우르크(van Urk's) 시약을 사용하여 분무하여 가시화하였다. 우르크 시약은 50 ml 36% HCl 및 50 ml 95% 에탄올중의 p-디메틸아미노벤즈알데히드 1g을 포함한다. 이들 조건하에서 피롤니트린은 TLC 플레이트상에서 자주색점으로 나타난다. 이 분석결과는 양쪽 발현 구조에 피롤니트린이 존재함을 확인해준다. HPLC 및질량 분광분석법은 양쪽 추출물에서 피롤니트린이 존재함을 확인해주었다. HPLC 분석은 메탄올에 용해시킨 후 (샘플이 55% 메탄올에 용해된 경우) 100 x 2.1 mm 크기의 휴렛 팩커드 하이퍼실(Hypersil) ODS 칼럼(5 μM)을 이용하여 직접적으로 실시하였다.
실시예 11a: 구성적 프로모터하의 피롤니트린 생합성 유전자를 갖는 MOCG134cPrn 균주의 작성
피롤니트린 생합성 유전자의 전사는 gafA에 의해 조절된다. 따라서, 전사 및 피롤니트린 생산은 후-로그상 및 정지 성장상으로 되어야 최고에 도달한다. 초기 성장상에서 피롤니트린 합성을 증가시키기 위하여, 내인성 프로모터를 강한 구성적 대장균 tac 프로모터로 대체하였다. 상기 실시예 11에 기재한 tac 프로모터와 강한 터미네이터 서열 사이에 Prn 유전자를 클로닝하였다. 생성한 합성 오페론을 결실된 Prn 생합성 유전자는 갖지만 삽입 위치의 상류 및 하류 모두의 상동 서열은 갖지 않도록 게놈 클론에 삽입하였다. 이 클론을 유전자 Prn A-D의 결실 돌연변이체인 MOCG134-Prn 균주로 이동시켰다. 구성적 tac 프로모터 제어하의 Prn 유전자를 이중 상동 재조합을 통하여 세균의 염색체에 삽입하였다. 생성한 균주 MOCG134cPrn은 야생형 균주 보다 빨리 피롤니트린을 생산하는 것으로 밝혀졌다.
야생형 균주 MOCC134, MOCG134cPrn, 및 플라스미드에 기인한 PRN 유전자를 함유하는 균주의 피롤니트린 생산은 tac 프로모터 (MOCG134pPrn) 제어하에서 여러 시간 간격 (14, 17, 20, 23 및 26 시간 동안 성장) 동안 측정하였다. 1/10,000 희석율의 정지상 배양물을 사용하여 배양물을 접종시키고, 피롤니트린을 아세트산 에틸로 추출하며, 또 HPLC에 의해 212 nm에서 검출된 피롤니트린의 피크 영역을 합치는 것에 의해 피로니트린의 양을 측정하였다. 표 3에 도시된 결과는 tac 프로모터 제어하의 Prn 유전자를 함유하는 균주는 야생형 MOCG134 균주 보다 훨씬 빨리 피롤니트린을 생산함을 분명히 나타낸다. 이 새로운 균주는 gafA와 무관하게 피롤니트린을 생산하므로 새로운 생물방제 균주로서 유용하다.
[표 3]
상이한 시간에서 상이한 균주의 피롤니트린의 생산
실시예 12: 피롤니트린 유전자 결실 돌연변이체의 작성
피롤니트린 생합성에서 4개의 ORF이 관여한다는 것을 증명하기 위해, 각 ORF에서 독립적인 결실변이처리시키고 상동 재조합에 의해 슈도모나스 플루오레센스 균주 MOCG134로 전달하였다. 결실변이체를 생성하기 위해 사용된 플라스미드를 도 4에 도시하며 또 결실의 위치는 도 6에 도시한다. 각 ORF는 서열확인번호: 1에 기재된 바와 같은 서열내에 있는 것으로 확인되었다.
ORF1 (서열확인번호: 2):
플라스미드 pPRN1.77E를 Mlu1으로 분해시켜 ORF1로 부터 내부적으로 78bp 단편을 분리해내었다. 잔류하는 4.66 kb 벡터-함유 단편을 회수하고 T4 DNA 리가제를 사용하여 재결찰시키며 또 대장균 숙주 균주 DH5α로 형질전환시켰다. 이 새로운 플라스미드를 Mlu1으로 고리화시키고 또 DNA 중합효소 I의 클레노 대형 단편을 사용하여 무딘 말단을 생성하였다(마니아티스 일행, Molecular Cloning, 콜드 스프링 하버 라보라토리 (1982)). pUC4K(파마시아 제품)로 부터 얻은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NPTII) 유전자를 무딘 말단 결찰에 의해 플라스미드에 결찰시키고 새로이 작성된 pBS(ORF1△)를 DH5α로 형질전환시켰다. 이 작제물은 카나마이신 내성을 제공하는 NPTII 유전자가 삽입된 위치에서 ORF1의 78 bp 결실을 포함하고 있었다. 이 플라스미드 (예컨대, NPTII 삽입물을 갖는 ORF1)의 삽입물을 EcoRI을 사용하여 pBluescript II KS 벡터로 부터 잘라내고, 벡터 pBR322의 EcoRI 위치에 결찰시킨 다음 대장균 숙주 균주 HB101을 형질전환시켰다. 새로운 플라스미드는 제한효소 분해에 의해 확인하였고 pBR322(ORF1△)로 나타내었다.
ORF2 (서열확인번호: 3):
ORF2 근처에 EcoRI 단편을 함유하는 플라스미드 pPRN1.24E 및 pPRN1.0E를 EcoRI 및 XhoI을 사용하여 이중으로 분해시켰다. pPRN1.24로 부터는 1.09 kb 단편 그리고 pPRN1.01E로 부터는 0.69 kb 단편을 회수하고 pBR322의 EcoRI 위치에 결찰시켰다. 생성한 플라스미드를 숙주 균주 DH5α로 형질전환시켰고 그 작제물을 제한효소 분해 및 전기영동법에 의해 확인하였다. 이 플라스미드를 XhoI으로 선형화시키고, pUC4K로 부터 얻은 NPTII 유전자 카세트를 삽입한 다음 새로운 작제물(pBR(ORF2△)로 표시됨)을 HB101로 형질전환시켰다. 이 작제물은 제한분해 및 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 확인하였으며 ORF2 유전자의 472 bp 결실체 내에 NPTII를 함유하고 있었다.
ORF3 (서열확인번호: 4):
플라스미드 pPRN2.56Sph를 PstI으로 분해시켜 350 bp의 단편을 수득하였다. 잔류하는 2.2 kb의 벡터 함유 단편을 회수하고 pUC4K로 부터 수득한 NPTII 유전자 카세트를 PstI 위치로 결찰시켰다. pUC(ORF3△)으로 표시되는 중간체 플라스미드를 DH5α로 형질전환시킨 다음 제한분해 및 아가로오스 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 유전자 결실 작제물을 SphI을 사용하여 pUC로 부터 절단해내고 pBR322의 SphI 위치로 결찰시켰다. pBR(ORF5△)로 표시되는 새로운 플라스미드를 제한효소 분해 및 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 확인하였다. 이 플라스미드는 ORF3 유전자의 350 bp 결실체내에 NPTII 유전자를 함유하였다.
ORF4(서열확인번호: 5):
플라스미드 pPRN2.18E/N을 AatII를 사용하여 분해시켜 156 bp의 단편을 수득하였다. 나머지 2.0 kb의 벡터 함유 단편을 회수하고, 재결찰시킨 다음 DH5α로 형질전환시키고 또 제한효소 분해 및 전기영동에 의해 확인하였다. 새로운 플라스미드를 AatII를 사용하여 선형화시킨 다음 T4 DNA 중합효소를 사용하여 무딘 말단을 생성하였다. NPTII 유전자 카세트를 무딘 말단 결찰법에 의해 상기 플라스미드에 결찰시켜 pBS(ORF4△)로 표시되는 새로운 작제물을 DH5α로 형질전환시켰다. 삽입물을 EcoRI을 사용하여 pBluescript II KS 벡터로 부터 절단해내고, 벡터 pBR322의 EcoRI 위치로 결찰시키며 또 대장균 숙주 균주 HB101로 형질전환시켰다. pBR(ORF4△)로 표시되는 새로운 플라스미드는 제한효소 분해 및 아가로오스 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 이 플라미드는 ORF4 유전자의 264 bp 결실체내에 NPT II 유전자를 함유한다.
Km R 제어:
카나마이신 내성 마커의 영향을 제어하기 위해, pUC4K로 부터 얻은 NPTII 유전자 카세트를 피롤니트린 유전자 영역의 상류에 삽입하였다. 이 플라스미드 pPRN2.5S(pPRN7.2E의 서브클론)를 PstI으로 선형화시키고 또 NPTII 카세트를 PstI위치에 결찰시켰다. 이 중간체 플라스미드를 DH5α로 형질전환시키고 또 제한분해 및 아가로오스 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 이 유전자 삽입 작제물을 SphI을 사용하여 pUC로 부터 절단해내고 pBR322의 SphI 위치에 결찰시켰다. pBR(2.5SphIKmR)로 표시된 새로운 플라스미드는 제한효소 분해 및 아가로오스 겔 전기 영동에 의하여 확인하였다. 이것은 피롤니트린 유전자 영역의 상류에 삽입된 NPTII를 함유한다.
유전자 결실 작제물 각각을 헬퍼 플라스미드 pRK2013을 사용하여 대장균 HB101에서 삼친 교배에 의해 MOCG134로 이동시켰다. 유전자 치환 돌연변이체는 50 μg/ml의 카나마이신이 보충된 슈도모나스 최소 배지(PMM)상에 플레이팅함으로써 선택하였고 또 30 μg/ml의 테트라사이클린이 보충된 PMM상에 플레이팅함으로써 반대로 선택하였다. 가상의 완전 치환 돌연변이체는 pPRN18Not, pBR322 및 pUC4K로 부터 수득한 NPTII 카세트 (파마시아 1994 카탈로그 번호 27-4958-01)를 사용하여 EcoRI 분해된 DNA를 찾아내는 것에 의한 서던 혼성법으로 확인하였다. 완전한 혼성은 pBR322에 대하여 혼성되지 않고, 적당하게 크기 이동된 EcoRI 단편(NPTII의 결실 및 삽입을 반영)에 대한 pPRN18Not의 혼성, 이동된 밴드에 대한 NPTII 탐침의 혼성화 및 상응하는 결실된 단편의 소실에 의해 분명히 알 수 있다.
확인한 후, 결실 돌연변이체를 피롤니트린, 2-헥실-5-프로필-레조르시놀, 시아나이드 및 키티나제 생산에 대해 시험하였다. 어느 하나의 ORF가 결실되면 피롤니트린 생산을 제거하지만, 다른 물질의 생산에는 영향을 주지 않는다. KMR제어 하의 NPTII 유전자 카세트의 존재는 피롤니트린, 2-헥실-5-프로필-레조르시놀, 시아나이드 또는 키티나제의 생산에 아무런 영향을 주지 않았다. 이들 실험으로 부터 피롤니트린을 생산하기 위해서는 4개의 ORF 각각을 필요로함을 알 수 있다.
실시예 12a: 식물에서 발현하기 위한 코딩 영역의 클로닝
ORF 1, 2, 3 및 4의 코딩 영역을 prnA, prnB, prnC 및 prnD로 각각 표시하였다. 표 2에 도시한 개시 코돈으로 부터 종지 코돈 까지 각 prn 유전자에 대한 코딩 영역을 PCR 증폭시키기 위하여 프라이머를 고안하였다. 부가적으로, 코딩 영역의 말단에 제한위치를 부가하고 또 prnB의 경우 prnB에 대한 개시 코돈을 GTG에서 ATG로 변경하기위해 프라이머를 고안하였다. 플라스미드 pPRN18Not (도 4)는 PCR 반응의 주형으로 사용되었다. 플라스미드 pPEH14는 클론된 PCR 산물의 개시 코돈의 상류의 합성 리보솜 결합 위치 11 내지 14 염기를 함유하는 pRK(KK223-3)의 변형물이다. 이 작제물은 상술한 바와 같이 삼친 교배에 의해 각 ORF 결실 돌연변이체로 이동하였다. 각 플라스미드 및 삽입된 PCR 산물의 정확한 방향성의 존재는 플라스미드 DNA 추출, 제한분해 및 아가로오스 겔 전기영동에 의해 확인되었다. 상보성검정된 돌연변이체의 피롤니트린 생산은 실시예 11에 기재된 방식으로 확인하였다
각 코딩 영역에 의한 기능적 단백질 발현이 확인된 후(즉, ORF결실 돌연변이체에 대하여 피롤니트린 생산능을 회복된 것이 증명된 후) 클론을 서열결정하고 피롤니트린 유전자군(1506 CIP3)의 서열과 비교하였다. prn.A, prnB 및 prnC의 경우, 증폭된 코딩 영역의 서열은 원래의 유전자 군 서열과 일치하였다. prnD의 경우 뉴클레오티드 위치 5605에서 원래 서열중의 G가 증폭된 코딩 영역에서 A로 일염기 변형이 존재하였다. 이 염기 변화로 유추된 아미노산 서열에서 글리신이 세린으로 변하게되지만 상술한 상보성검정 시험에 따른 유전자 산물의 기능에는 영향을 주지 않는다.
[표 2]
prn 유전자a의 코딩 영역
상기 실시예 12a에 기재된 각 prn 유전자의 코딩 영역을 CaMV 35S 프로모터 및 Xba I 제한위치 근처의 리더와 CaMV 35S 터미네이터로 구성된 식물 발현 카세트에 서브클로닝하였다. 프로모터, 코딩 영역 및 터미네이터로 구성된 각 작성물을 Xba I으로 분리시키고, 이원 형질전환 벡터 pCIB200으로 서브클로닝한 다음 아그로박테륨 투미파시엔스(Agrobacterium tumifaciens) 숙주 균주 A136로 형질전환시켰다. 담배 형질전환은 호슈 일행에 의해 Science 227: 1229-1231, 1985에 기재된 바와 같이 실행하였다. 아라비도프시스(Arabidopsis) 형질전환은 리오이드 일행에 의해 Science 234: 464-466, 1986에 기재된 바와 같이 실행하였다. 어린 식물을 선택하고 100 mg/L 카나마이신 및 500 mg/L 카르베네실린을 함유하는 배지상에서 재생시켰다.
형질전환될 것으로 예상되는 개별 식물로 부터 담배 잎 조직을 수집하였다. 형질전환에 사용된 각 유전자 구조에 대하여 형질전환될 약 10개의 독립적인 식물로 부터 아라비도프시스 잎 조직을 수집하였다. 페놀:클로로포름 추출에 의해 RNA를 정제하고 나일론 막상에 블로팅하기 전에 포름알데히드 겔 전기영동에 의해 분획처리하였다. 샘브룩 일행에 의한 몰리큘라 클로닝(Molecular Cloning: 제 2판, 콜드 스프링 하버 라보라토리, 1989)에 기재된 바와 같이 42℃에서 50% 포름아미드중에서 혼성화를 실시하였다.
각 prn 유전자에 대하여, 적합한 prn 유전자 탐침에 대하여 강하게 혼성되고 개별 prn 유전자로 부터 전사된 mRNA에 대해 예상되는 크기를 나타내는 RNA 밴드를 생산하는 트랜스제닉 담배 식물을 확인하였다. 아라비도프시스 조직의 모아진 샘플로 부터 추출된 RNA에서 유사한 밴드가 나타났다. 이 데이타는 피롤니트린 생합성 경로의 효소를 코딩하는 mRNA가 트랜스제닉 식물에 축적됨을 나타낸다.
D. 슈도모나스로 부터 레조르시놀 생합성 유전자의 클로닝
2-헥실-5-프로필-5-레조르시놀은 슈도모나스의 특정 균주에 의해 생산되는 다른 APS이다. 이것은 그람 양성 세균(특히, 클라비박터 종), 미코세균 및 진균에 대하여 항병원성 활성을 갖는 것으로 알려져있다.
실시예 13: 레조르시놀을 코딩하는 유전자의 단리
슈도모나스 플루오레센스에서 gafA 유전자의 전면적인 조절하에 있는 것으로 알려진 다른 물질인 항병원성 물질 2-헥실-5-프로필-레조르시놀 생산능이 없는 2개의 트랜스포손-삽입 돌연변이체가 단리되었다(WO 94/01561호). 삽입 트랜스포손 TnCIB116을 사용하여 MOCG134의 돌연변이체 및 MOCG134(BL1826)의 gafA-유도체의 라이브러리를 작성하였다. 전자는 시험관내에서 진균 억제에서 변화가 있는지 조사하였고, 나중 것은 플라스미드상에 gafA를 도입한 후 gafA에 의해 조절되는 유전자에 대해 스크리닝하였다(C참조). 선택된 돌연변이체를 HPLC에 의해 피롤니트린 및 2-헥실-5-프로필-레조르시놀과 같은 공지 화합물의 생산능에 대해 분석하였다. HPLC 분석으로 야생형 양친 균주의 신규 돌연변이체를 비교할 수 있었다. 각 경우, 2-헥실-5-프로필-레조르시놀에 상응하는 HPLC 피이크는 돌연변이체에서 찾아볼 수 없었다. MOCG134로 부터 유도된 돌연변이체를 BL1846으로 표시하였다. BL1826으로 부터 유도된 돌연변이체를 BL1911로 나타내었다. 레조르시놀에 대한 HPLC는 레조르시놀을 용출시키기 위하여 100% 메탄올을 20분 동안 칼럼에 가한 이외에는 피롤니트린에서와 동일한 과정(실시예 11 참조)으로 실시하였다.
레조르시놀 생합성 유전자는 이하의 방식으로 상술한 돌연변이체로 부터 클로닝될 수 있다. 상기 돌연변이체로 부터 게놈 DNA를 얻고, 카나마이신 내성 클론(카나마이신 내성은 트랜스포손에 의해 코딩됨)을 선택함으로써 트랜스포손 삽입 및 인접 슈도모나스 서열을 함유하는 클론을 수득하였다. 이 클로닝된 슈도모나스 서열을 탐침으로 사용하여 피. 플루오레센스 MOCG134의 게놈 라이브러리로 부터 천연 서열을 확인하였다. 클로닝된 천연 유전자는 레조르시놀 생합성 유전자를 나타낸다.
E. 소란지움(Sorangium)으로 부터 소라펜 생합성 유전자의 클로닝
소라펜은 믹소세균인 소란지움 셀룰로숨에 의해 생산되는 폴리켑티드 항생물질이다. 이 화합물은 농업 용도에 유용한 넓은 항진균 활성을 갖고 있다. 특히, 소라펜은 광범위한 엽면 병원체에 대하여 활성을 갖는다.
실시예 14: 소라펜 유전자군의 단리
게놈 DNA를 소란지움 셀룰로숨으로 부터 단리하고 Sau3A로 부분적으로 분해시켰다. 30 내지 40 kb 범위의 단편을 선택하고, 미리 BamHI으로 분해되고 또 자가결찰을 방지하기 위하여 알칼리성 포스파타제 처리된 코스미드 벡터 pHC79 (혼 및 콜린스, Gene11: 291-298 (1980))에 클로닝시켰다. 이렇게 제조된 코스미드 라이브러리는 에스. 스트렙토아이세스 비올라세오루버(Streptomyces violaceoruber)에서 그라나티신의 생합성에 관련되는 ORF 1-4를 코딩하는 스트렙토마이세스 비올라 세오루버 균주 Tu22의 graI 영역을 함유하는 4.6 kb 단편으로 찾았다. graI 탐침과 혼성되는 코스미드 클론을 확인하고 제한 분해 및 추가의 혼성화에 의해 분석하기 위한 DNA를 제조하였다. 코스미드 p98/1은 graI 영역과 강하게 혼성되는 1.8 kb SaII 단편을 함유하는 것으로 확인되었다. 이 SaII 단편은 p98/1의 ~40 kb 삽입물 내의 대형의 6.5 kb PvuI 단편내에 위치하였다. 1.8 kb SaII 삽입물의 일부의 서열을 결정하면 에리쓰로마이신의 합성에 필요한 아세틸트랜스퍼라제 단백질과 상동성을 나타내었다. 코스미드 p98/1의 제한 지도화를 실시하여 도 7에 도시된 지도를 완성하였다. 코스미드 클론 98/1을 포함하는 대장균 HB101의 생육 배양물은 미합중국 61604 일리노이 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 Agricultural Research Culture Collection (NRRL)에 1994년 5월 20일 수탁 번호NRRL B-21255로 수탁되어 있다. 소라펜 유전자군의 DNA 서열은 서열확인번호: 6에 기재되어 있다.
실시예 15: 소라펜 유전자군의 기능적 분석
소라펜의 생합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 p98/1내의 영역을 유전자 분해 실험을 통하여 확인하였다. 먼저, 코스미드 p98/1을 PvuI으로 제한분해함으로써 DNA 단편을 유도하고 이것을 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드 pSUP2021 (시몬 일행에 의해 Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction (에이. 풀러 편저), 스프링거 베르라그, 베를린 98-106 페이지(1983))의 독특한 PvuI 클로닝 위치(암피실린 내성 유전자내에 존재)에 클로닝시켰다. 형질전환된 대장균 HB101은 클로람페니콜 내성이지만 암피실린에는 감수성을 나타내는 것을 기초해서 선택하였다. 적합한 삽입물을 갖는 선택된 콜로니를 유럽공개특허 0 501 921호(시바-가이기)에 기재된 방법을 이용한 접합법에 의해 소란지움 셀룰로숨 SJ3으로 전달하였다. 플라스미드를 헬퍼 플라스미드 pUZ8(헤드게스 및 매튜, 플라스미드 2: 269-278 (1979))을 갖는 대장균 ED8767로 전달하고 또 공여 세포를 EP 0 501 921호(실시예 5) 및 (실시예 2)에 기재된 바와 같이 접합 전달을 위해 정지상의 배양물로 부터 소란지움 셀룰로숨 SJ3 세포와 함께 배양하였다. 카나마이신, 플레오마이신 및 스트렙토마이신을 기초로해서 선택하였다. 지금까지 시험된 어떤 플라스미드도 소란지움 셀룰로숨에서 자동적으로 복제를 할 수 없었고, 오히려 전체 플라스미드가 클로닝된 단편 내의 위치에서 상동 재조합에 의해 낮은 빈도로 염색체에 통합되는 경우가 있었다. 이들 현상은 플라스미드상에 항생물질 내성 마커가 존재하는 것으로선택될 수 있다. 특정 위치에서 플라스미드가 통합되면 플라스미드가 염색체로 삽입되게되고 그로 인하여 그 영역의 부수적인 파괴를 초래한다. 따라서, 관심을 두고 있는 표현형, 즉 소라펜 생산이 측정될 수 있고 또 표현형의 파괴는 플라스미드로 클로닝된 DNA 영역이 표현형의 결정에 관여한다는 것을 제시한다.
약 6.5 kb (pSN105/7), 10 kb (pSN120/10), 3.8 kb (pSN120/43-39) 및 4.0 kb(pSN120/46) 크기의 PvuI 삽입물을 갖는 재조합 pSUP2021 클론을 선택하였다. 도 7에 도시한 바와 같은 상기 PvuI 삽입물의 지도 위치(kb)는 다음과 같다: pSN105/7-25.0-31.7, pSN120/10-2.5-14.5, pSN120/43-39 - 16.1-20.0 및 pSN120/46 - 20.0-24.0. pSN105/7은 PvuI 및 SalI으로 분해시키는 것에 의해 실시예 11에 나타낸 1.8 kb의 단편을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 3.8, 4.0, 6.5 및 10 kb PvuI 단편을 사용한 유전자 파괴는 소라펜 생산능의 상실을 초래한다. 이들 결과는 모든 단편이 상기 화합물의 생산에 관계되는 유전자 또는 유전자 단편을 함유한다는 것을 제시한다.
따라서 유전자 파괴 실험은 코스미드 p98/1로 부터 유도된 2개의 BglII 단편을 사용하여 실시하였다. 이들은 3.2 kb (도 7상의 지도 위치 32.4-35.6) 및 2.9 kb(도 7상의 지도 위치 35.6-38.5) 크기이었다. 이들 단편을 도 8에 따라 pSUP2021로 부터 유도된 플라스미드 pCIB132의 BamHI 위치로 클로닝하였다. pSUP2021의 ~5 kb NotI 단편을 잘라낸 다음 ~3 kb BamHI 단편을 제거함으로써 반전시켰다. 이들 BgIII 단편은 상술한 방법을 이용하여 소란지움에 재도입될 때 소라펜 생합성을 파괴할 수 없다. 이것은 이들 단편의 DNA가 소라펜 생합성에는 아무런 관련이 없음을제시한다. 이들 단편의 DNA 서열을 조사하면 티오에스테라제 도메인 5'의 존재를 나타내지만 위치 32.4의 BgIII 위치 근처에는 존재하지 않았다. 또한, 티오에스테라제 도메인 바로 뒤에는 전사 종지 코돈이 있었는데 이것은 ORFI 코딩 영역의 말단을 구별짓는 것으로 보인다. 2.9 및 3.2 kb BgIII 단편은 이들 서열의 바로 우측에 있기 때문에 ORF1로 부터 하류에는 소라펜 생합성에 관여하는 기타 유전자가 존재하지 않는것으로 보인다.
2개의 기타 코스미드 클론, pJL1 및 pJL3을 단리하는데 필요한 생합성 영역의 좌측 단부의 윤곽은 좌측 단부의 p98/1과 중복되지만 더 많은 p98/1 좌측 DNA를 포함한다. 이들은 소란지움 셀룰로숨 유전자 라이브러리에 대하여 P98/1 (지도 위치 0.0-1.3)의 좌측 맨끝에 있는 1.3 kb BamHI 단편과 혼성화시키는 것에 의해 단리된다. 0.0에 있는 BamHI 위치는 에스. 셀룰로숨 염색체에 존재하지 않지만 소란지움 셀룰로숨 게놈으로 부터 유도된 Sau3A 제한 단편을 pHC79의 BamHI 클로닝 위치에 결찰시키는 것에 의해 인위적으로 형성된 것임을 알아야한다. 13. kb BamHI 단편파 서던 혼성화시키면 pJL1 및 pJL3은 각기 1.3 kb 단편에 대하여 공통적인 서열을 함유하는 약 12.5 kb BamHI 단편을 함유하는데 이 단편은 1.3 위치에 있는 BamHI 위치에 의해 구별된다. 코스미드 클론 pJL3을 포함하는 대장균 HB101의 생육 배양물은 미합중국 61604 일리노이 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 Agricultural Research Culture Collection (NRRL)에 1994년 5월 20일 수탁번호 NRRL B-21254로 수탁되어 있다. 12.5 kb BamHI 단편을 사용한 유전자 파괴 실험은 이 단편이 소라펜 합성에 관여하는 서열을 함유한다는 것을 나타내었다. 상기영역으로 부터 유도된 보다 작은 EcoRV 단편을 사용한 유전자 파괴는 소라펜 생합성에 대한 상기 영역의 요건을 지시한다. 예컨대, 12.5 kb 단편의 좌측 단부에 있는 BamHI 위치와 인접하게 위치한 3.4 및 1.1 kb의 2개 EcoRV 단편은 유전자 파괴 실험에 사용될 때 소라펜 생합성에서의 환원을 초래하였다.
실시예 16: 소라펜 유전자군의 서열분석
소라펜 유전자군의 DNA 서열은 캐나다 포스터시에 소재하는 어플라이드 바이오시스템스가 공급하는 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit를 사용하여 제조자가 지시하는 수순을 따라서 2.5 위치에 있는 PvuI 부위에서 부터 32.4 위치에 있는 BgIII 부위까지 측정하였다. 서열결정 반응은 어플라이드 바이오시스템스 373A 자동화 DNA 서열분석기에서 실시하였고 그 원료 DNA 서열을 모아서 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드로 부터 구입한 "INHERIT" 소프트웨어 팩케이지를 이용하여 편집하였다. DNA 서열의 6개의 번역 프레임에서 오픈 리딩 프레임(ORF)에 대하여 패턴 인식 프로그램 "RFAMES"을 사용하였다. 인접하는 DNA의 약 30 kb를 모으며 이것은 상기 실시예 12에 기재된 파괴실험에서 소라펜 생합성에 결정적인 것으로 결정된 영역에 상당하였다. 이 서열은 이하에 기술한 구조를 갖는 2개의 ORF를 코딩한다.
ORF1:
ORF1은 약 22.5 kb 크기로서 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea)의 에리쓰로마이신 생합성 유전자에서 발견된 모듈과 상동성을 갖는 5개의 생합성 모듈을 코딩한다(도날디오 일행,Science252: 675-679 (1991)). 각 모듈은 β-케토아실합성효소 (KS), 아실트랜스퍼라제(AT), 케토리덕타제 (KR) 및 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인 뿐만 아니라 탈수효소(DH) 및/또는 에노일 환원효소(ER) 도메인을 포함할 수 있는 β-케톤 가공 도메인을 함유한다. 폴리켑티드 구조의 생합성에서, 각 모듈은 새로운 2개의 탄소 증량기 단위의 혼입과 β-케톤 탄소의 정확한 가공을 지시한다.
ORF2:
ORF1 이외에, 2.5 kb에 있는 PvuI 위치 및 6.2 kb에 있는 SmaI 위치에 인접하는 p98/1 단편으로 부터 얻은 DNA 서열 데이타는 ORF1 바로 근처에 다른 ORF(ORF2)가 존재할 것이라는 것을 제시한다. 이 DNA 서열은 5' 말단이 서열결정화 되지 않은 것으로 좌측에서 떨어져 있는 ORF를 코딩할 것으로 보이는 전형적인 생합성 모듈이 존재함을 나타낸다. 기타 폴리켑티드 생합성 유전자 단위를 소라펜 고리 구조내의 탄소원자의 수와 비교할때, 17개의 탄소 분자 소라펜을 직접적으로 합성하기 위해 총 8개의 모듈이 존재해야 할 것으로 보인다. 상술한 ORF1에는 5개의 모듈이 존재하기 때문에, ORF2는 다른 세개의 모듈을 함유할 것으로 보여지며 또 이들은 코스미드 p98/1의 좌측 단부 (도 7의 위치 0) 넘어 까지 연장될 것으로 보인다. 이는 실시예 12의 유전자 기술과 전체적으로 일치한다. p98/1의 좌측 단부 넘어서 까지 연장되는 코스미드 클론 pJL1 및 pJL3은 소라펜 생합성에 필요한 나머지를 코딩하는 서열을 갖는 것으로 추정된다.
실시예 17:소라펜: 메틸화의 요건
폴리켑티드의 합성은 전형적으로 첫단계로서 스타터 유닛(통상적으로 아세테이트)와 익스텐터 유닛(말로네이트)의 축합을 필요로 하며 그로써 한개의 탄소원자는 CO2형태로 제거되어 3개의 탄소 사슬을 수득한다. 추가의 부가로 폴리켑티드 고리에 2개의 탄소 유닛의 부가를 초래하게된다(도날디오 일행, Science252: 675-679 (1991)). 소라펜은 17개의 탄소 고리를 갖기 때문에, 이것을 합성하기 위해서는 8개의 생합성 모듈이 필요할 것이다. 5개의 모듈은 ORF1에서 코딩되고 여섯번째는 ORF2의 3' 말단에 존재한다. 상술한 바와 같이, 나머지 2개의 모듈은 서열이 결정되지 않은 pJL1 및 pJL3으로 부터 얻은 15 kb BamHI 단편에 있는 영역중의 ORF2에 의해 코딩될 것이다.
소란지움 셀룰로숨에 존재하는 폴리켑티드 모듈 생합성 장치는 항병원성 활성을 갖지 않는 화합물, 소라펜 C의 생산에 필요하다. 이 화합물의 구조는 고리의 6, 7 및 14 위치에 있는 소라펜 A의 O-메틸기가 히드록시기인 이외에는 항병원성 소라펜 A의 구조와 동일하다. 이들은 특정 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화되어 활성 화합물 소라펜 A를 형성한다. 사카로폴리스포라 에리쓰라에아에서 에리쓰로마이신을 생합성할 때에도 유사한 상황이 존재한다. 분자의 생합성에서 마지막 단계는 메틸트랜스퍼라제에 의해 3개의 히드록시기가 메틸화되는 것이다(헤이덕 일행, Mol. Gen. Genet. 230: 120-128 (1991)). 따라서, 유사한 메틸트랜스퍼라제(또는 그 이상)는 소라펜 A의 생합성(소라펜 C는 메틸화되지 않은 것이고 또 소라펜 B는 부분적으로 메틸화된 것이다)에서도 작용할 것이다. 지금까지 조사된 모든 폴리켑티드 생합성 시스템에서, 모든 생합성 유전자 및 관련 메틸화제는 함께 군을 이루고 있다(서머스 일행, J. Bacteriol174: 1810-1820 (1992)). 따라서, 소라펜 오페론에도 유사한 상황이 존재하고 또 소라펜 B 및 C를 소라펜 A로 전환시키는데 필요한 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 폴리켑티드 합성효소를 코딩하는 ORF1 및 ORF2 근처에 존재할 것이다. 상술한 유전자 파괴 실험의 결과로 부터 상기 유전자는 ORF1의 3'말단으로 부터 바로 하류에 존재하지 않고 pJL1 및 pJL3에 함유된 DNA중의 ORF2의 상류에 존재할 것이다. 따라서 이 기술분야의 표준 수법을 이용하여 메틸트랜스퍼라제 유전자는 클로닝될 수 있고 서열결정될 수 있다.
소라펜 확인
소란지움 셀룰로숨 세포를 교환 수지, XAD-5(롬 앤드 하스 제품)(5% w/v)를 함유하는 액체 생장 배지에서 배양하였다. 수지에 결합된 세포에 의해 상산된 소라펜 A를 폴리에스테르 필터(Sartorius B 420-47-N)를 통하여 여과함으로써 수집하고 그 소라펜을 50 ml 이소프로판올을 사용하여 30℃에서 1시간 동안 추출하는 것에 의해 방출시켰다. 소라펜 A를 함유하는 이소프로판올을 수집하고 건조시키는 것에 의해 약 1 ml 부피로 건조시켰다. 동량으로 나눈 샘플을 210 nm에서 HPLC에 의해 분석하여 소라펜 A를 검출하고 정량하였다. 이 분석 과정은 소라펜 A(완전히 메틸화된 것임)에만 특이한 것이고; 부분적으로 메틸화되거나 전혀 메틸화되지 않은 소라펜은 상이한 RT를 가지며 상술한 방법으로 측정될 수 없다. 이 방법은 유전자를 파괴한 후에 소라펜 A 생산을 측정하기 위해 이용되었다.
F. 슈도모나스 아우레오파시엔스로 부터 페나진 생합성 유전자의 클로닝및 특징화
페나진 항생물질은 시키미산 경로를 분기시키는 2차 대사산물로서 다양한 종류의 슈도모나스 및 스트렙토마이세스종에 의해 생산된다. 2개의 코리스미산 분자가 글루타민으로 부터 유도된 2개의 질소와 함께 축합되어 3개 고리를 갖는 페나진 경로 전구체 페나진 1,6-디카르복시레이트를 형성하는 것으로 추정된다. 그러나 안트라닐레이트가 또한 코리스메이트와 페나진-1,6-디카르복시레이트 사이의 중간체라는 유전학적 증거가 있다(에사르 일행, J. Bacteriol. 172: 853-866 (1990)). 슈도모나스 아우레오파시엔스 30-84에서, 3개의 페나진 항생물질, 페나진-1-카르복시산, 2-히드록시페나진-1-카르복시산 및 2-히드록시페나진의 생산은 진균 식물병원체인 가에우마노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis) 변종 트리티시 (피어슨 및 토마쇼, MPMI 5: 330-339 (1992))로 부터 밀을 보호하는 균주에 의한 주요 작용 형태이다. 이와 마찬가지로, 슈도모나스 플루오레센스 2-79에서, 페나진 생산은 지. 그라니스 변종. 트리티시의 제어에 중요한 인자이다(토마쇼 및 웰러, J. Bacteriol. 170: 3499-3508 (1988)).
실시예 18: 페나진 생합성 유전자의 단리
피어슨 및 토마토(상술한 바와 같음)는 페나진 항생물질 합성능이 파괴된 슈도모나스 아우레오파시엔스균주 30-84의 트랜스포손 삽입 돌연변이체에 대한 페나진 생합성 표현형을 제공하는 코스미드의 클로닝을 기술하였다. 균주 30-84의 돌연변이체 라이브러리는 대장균 S17-1 (pSUP1021) 및 페나진 항생물질을 합성할 수 없는 돌연변이체를 접합시키는 것에 의해 작성하였다. 선택된 돌연변이체는 페나진카르복시산, 2-히드록시페낙신 또는 2-히드록시-페나진 카르복시산을 생산할 수 없었다. 이들 돌연변이체를 균주 30-84의 코스미드 게놈 라이브러리에 의해 형질전환시켜 페나진 카르복시산, 2-히드록시페나진 및 2-히드록시페나진카르복시산을 합성 함으로써 페나진 돌연변이체를 상보성검정할 수 있는 능력을 갖는 코스미드 pLSP259를 단리하기에 이르렀다. 이 pLSP259는 브루이진 및 럽스키에 의해 기술된 λ::Tn5 파아지를 사용한 트랜스포손 돌연변이법에 의해 특징화되었다(Gene27: 131-149 (1984)). 따라서 약 2.8 kb의 DNA 절편이 페나진 상보성검정 표현형에 관련있는 것으로 확인되었고; 이 2.8 kb 절편은 pLSP259의 대형 9.2 kb EcoRI 단편내에 위치한다. lacZ 프로모터 제어하에서 대장균에 대한 9.2 kb EcoRI 단편의 전달 및 결실 유도체를 대장균에서 페나진의 생산에 대해 평가하였다. 모든 세개의 페나진 화합물의 생합성능을 대장균에 제공하는 것으로 공지된 가장 짧은 결실 유도체는 약 6 kb의 삽입물을 함유하고 있고 또 pLSP18-6H3del3으로 표시하였다. 이 플라스미드는 숙주 30-84 균주에서 페나진을 생합성하는데 결정적인 것으로 확인된 2.8 kb 절편을 함유하며 이것은 서열 특징화하기 위해 닥터 엘에스 피어슨로 부터 얻을 수 있다(아리조나 투슨에 소재하는 유니버시티 어브 아리조나의 식물 병리학부 소속). 기타 결실 유도체는 2-히드록시페나진 및 2-히드록시페나진카르복시산의 생산을 수반하지 않으면서 대장균에서 페나진카르복시산의 생산을 제공할 수 있고, 이는 2개 이상의 유전자가 페나진 및 그의 히드록시 유도체의 합성에 관여할 수 있다는 것을 제시한다.
페나진 생합성 유전자를 포함하는 DNA 서열은 서열확인번호: 17에 기재되어있다. 플라스미드 pCIB3350은 페나진 유전자군의 PstI-HindIII 단편을 함유하고 또 미합중국 61604 일리노이 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 Agricultural Research Culture Collection (NRRL)에 1994년 5월 20일 수탁번호 NRRL B-21257로 수탁되어 있다. 플라스미드 pCIB3351은 페나진 유전자군의 EcoRI-PstI 단편을 함유하고 또 미합중국 61604 일리노이 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 Agricultural Research Culture Collection (NRRL)에 1994년 5월 20일 수탁번호 NRRL B-21258로 수탁되어 있다. pLSP18-6H3del3의 삽입물의 DNA 서열의 결정은 결정적인 2.8kb 절편내 및 근처에 4개의 ORF가 존재함을 나타낸다. ORF1 (서열확인번호: 18)는 phz1로 표시하고, ORF2(서열확인번호: 19)는 phz2로 나타내며 또 ORF3(서열확인번호: 20)은 phz3으로 표시하고 또 ORF4(서열확인번호: 22)는 phz4로 표시한다. phz4의 DNA서열은 서열확인번호: 21에 도시한다. phz1은 약 1.35 kb 크기이고 또 이소코리스메이트를 코딩하는 대장균의 entB 유전자의 5' 말단과 상동성을 갖는다. phz2는 약 1.15 kb 크기이고 또 안트라닐레이트 합성효소의 베타 서브유닛을 코딩하는 trpG 유전자의 3' 말단에서 일부 상동성을 갖는다. phz3은 약 0.85 kb 크기이다. phz4는 약 0.65 kb 크기이고 또 피리독사민 5'-포스페이트 옥시다제를 코딩하는 대장균의 pdxH 유전자에 대하여 상동이다.
페나진 측정
토마쇼 일행(Appl Environ Microbiol56: 908-912 (1990)은 페나진의 단리방법을 기술하고 있다. 이 방법은 배양물을 HCl을 사용하여 pH 2.0으로 산성화시킨다음 벤젠으로 추출하는 것을 포함한다. 벤젠 분획을 Na2SO4로 탈수시키며 또 증발건조시켰다. 잔류물을 수성 5% NaHCO3에 재용해시키고 동량의 벤젠을 사용하여 재추출하며 산성화시킨 다음 벤젠으로 분배시키고 다시 건조시켰다. 페나진 농도는 토마쇼 일행(상동)에 의해 기술된 바와 같이 역상 HPLC에 의해 정제한후 결정하였다.
G. 펩티드 항병원성 유전자의 클로닝
이 물질군은 크게 2개 군으로 대별된다: (1) 리보솜 기구의 참여없이 효소계에 의해 합성된 펩티드, 및 (2) mRNA를 리보솜 매개로 번역하여 항생물질의 전구체를 제공하는 것을 필요로하는 펩티드.
비-리보솜 펩티드 항생물질
비리보솜 펩티드 항생물질은 서브유닛 아미노산을 활성화시키고, 변형시키며 중합시키고 또 경우에 따라 고리화시키는 대형의 다능성 효소에 의해 조립되어 폴리펩티드 사슬을 형성한다. 아미노아디프산, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 디히드록시아미노산, 이소세린, 디히드록시벤조산, 히드록시이소발레르산, (4R)-4-[(E)-2-부테닐]-4,N-디메틸-L-트레오닌과 같은 기타 산 및 오르니틴도 포함된다(카츠 및 데메인에 의한, Bacteriological Review 41: 449-474 (1977); 클라인카우프 및 봉 도렌에 의한 Annual Review of Microbiology 41: 259-289 (1987)). 생산물은 mRNA에 의한 코딩된 것이 아니고 또 리보솜은 이들의 합성에 직접적으로 관여하지 않는다. 비 리보솜적으로 합성된 펩티드 항생물질은 그의 일반적 구조에 따라서 선형, 고리형, 락톤, 측쇄 시클로펩티드 및 뎁시펩티드 (클라인 및 봉 도렌에 의한 European Journal of Biochemistry 192: 1-15 (1990))로 세별된다. 이들 상이한 군의 항생물질은 효소를 변형시키거나 고리화하는 작용에 의해 생산된다; 중합 반응의 기본적 방법은 모두에게 공지되어 있다. 비 리보솜적으로 합성된 펩티드 항생물질은 세균 및 진균에 의해 합성되며 또 바실루스 브레비스 (Bacillus brevis)로부터 얻은 에데인, 선형 그라미시딘, 티로시딘 및 그라미시딘 S, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)로 부터 얻은 미코바실린, 바실루스 폴리믹사 (Bacillus polymiyxa)로 부터 얻은 폴리믹신, 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus)로 부터 얻은 에타마이신, 스트렙토마이세스 에키나투스 (Streptomyces echonatus)로 부터 얻은 에키노마이신, 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuloigerus)로 부터 얻은 액티노마이신, 대장균으로 부터 얻은 엔테로켈린, 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans)로 부터 얻은 감마-(알파-L-아미노아디필)-L-시스테이닐-D-발린(ACV), 트리코데르마 비리데 (Trichoderma viride)로 부터 얻은 알라메티신, 메타르히지움 아니솔플리아애 (Metarhizium anisolpliae)로 부터 얻은 데스턱신, 후사륨 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)으로 부터 에니아틴, 및 베아우베리아 바시아나 (Beauveria bassiana)로 부터 얻은 베아우베리신을 포함한다. 진핵계와 원핵계 사이에는 광범위한 기능적 및 구조적 유사성이 존재하는데 이는 양쪽 모두가 동일한 기원을 갖는다는 것을 암시한다. 펩티드 항생물질의 활성 또한 동물, 식물, 세균 및 진균 모두에서 상이한 펩티드 항생물질의 광범위한 독성 효과와 유사하다고 알려져있다 (한센에 의한 Annual Review of Microbiology47: 535-564 (1993); 카츠 및 데마인,Bacteriological Reviews41: 449-474 (1977); 클라인카우프 및 봉 도렌에 의한 Annual Review of Microbiology41: 259-289 (1987); 클라인카우프 및 봉 도렌에 의한 European Journal of Biochemistry 192: 1-15(1990); 콜터 및 모레노, Annual Review of Microbiology 46: 141-163 (1992).
아미노산은 ATP를 가수분해하는 것에 의해 활성화되어 아데닐화된 아미노산 또는 히드록시산을 형성하며, 이는 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 실행된 반응과 유사하며 또 이어 이들 아미노산과 효소 사이에 판테테인에 의해 제공된 티올 또는 특정 시스테인 잔기에서 공유 티오에스테르 중간체가 형성된다. ATP의 아미노산 의존성 가수분해 방법이 펩티드 항생물질 효소 착물 분석에 흔히 사용된다(이시하라 일행, Journal of Bacteriology171: 1705-1711 (1989)). 일단 효소에 결합되면, 활성화된 아미노산은 폴리펩티드에 혼입되기 전에 변형될 수 있다. 가장 일반적인 변형은 L-아미노(히드록시)산을 D-형으로 에피머화, N-아실화, 고리화 및 N-메틸화하는 것이다. 판테테인 보조인자의 작용을 통하여 중합화가 일어나며, 이로써 활성화된 서브유닛은 순차적으로 폴리펩티드 사슬에 부가된다. 효소 착물로 부터 펩티드가 방출되는 메카니즘은 생성물이 속하는 구조 유형의 결정에 중요하다. 가수분해 또는 티오에스테르의 유리 아민에 의한 아미노분해반응은 에데인과 같은 선형 (비변형 또는 말단에 아미노화된) 펩티드를 생성하고, 펩티드 자체상에 아민기에 의해 티올에스테르를 아미노 분해시키면 그라미시딘 S와 같은 고리(말단 아민에 의한 공격)를 생성하거나, 또는 박시트라신, 펩티드와 같은 측쇄(측쇄 아민으로 부터 공격)를 형성할 것이고; 말단 또는 측쇄 히드록시를 사용한 락톤화 반응은 데스트럭신, 측쇄 락톤과 같은 락톤, 또는 베아우베리신과 같은 시클로뎁시펩티드를 생성할 것이다.
상기 반응을 실시하는 효소는 대형의 다능성 단백질로서 이들이 실행하는 다양한 종류의 작용에 따라서 분자량을 갖는다. 예컨대, 그라미시딘 합성효소 1 및 2는 각기 120 내지 280 kDa이고; ACV 합성효소는 230 kDa이며; 에니아틴 합성효소는 250 kDa이고; 박시트라신 합성효소 1, 2, 3은 각각 335, 240 및 380 kDa이다. (카츠 및 데마인, Bacteriological Reviews41: 449-474 (1977); 클라인 및 봉도렌에 의한 Annual Review of Microbiology41: 259-289 (1987); 클라인카우프 및 봉 도렌에 의한 European Journal of Biochemistry 192: 1-15 (1990). 이들 단백질의 크기와 복잡성은 완전한 펩티드 항생물질의 비-리보솜 합성 능력을 전달하기 위해서 몇개의 유전자가 반드시 클로닝되어야함을 의미한다. 또한, 세균 및 진핵 합성계 사이의 기능적 및 구조적 상동성은 펩티드 항생물질의 임의의 기원으로 부터 얻은 유전자가 다양한 서열정보, 현재의 기능적 정보 및 통상의 미생물 수법을 이용하여 클로닝 될 수 있음을 의미한다. 해충에 대한 내성으로 인하여 농업에서 유리한 식물에서 살진균, 살충 또는 살균성 펩티드 항생물질의 생산이 기대되고 있다.
실시예 19: 그라미시딘 S 생합성 유전자의 클로닝
그라미시딘 S는 고리상 항생물질 펩티드로서 진균 포자의 발아를 억제하는 것으로 알려져있고 (무레이 일행, Letters in Applied Microbiology3: 5-7 (1986)), 따라서 진균 질병으로 부터 식물을 보호하는데 유용하다. 바실루스 브레비스(Bacillus brevis) ATCC 9999로 부터 얻은 그라미시딘 S 생합성 오페론(grs)을클로닝 및 서열결정하였고, 예컨대 그라미시딘 합성효소 1에 대한 전체 코딩 서열(GS1, grsA), 알려지지 않은 기능을 갖는 오페론중의 다른 유전자(grsT) 및 GS2 (grsB)(클라츠슈마르 일행, Jouranl of Bacteriology171: 5422-5429 (1989); 크라우세 일행, Jouranl of Bacteriology162: 1120-1125 (1985))를 포함한다. 이 기술분야에서 공지된 수법에 의하여, PCR 프라이머 쌍들은 단리된 바실루스 브레비스 ATCC 9999 DNA를 주형으로 사용하여 grs 오페론으로 부터 약 500 염기쌍의 절편을 증폭시키기에 적합한 공고된 DNA로 부터 고안된다. 증폭될 단편은 (1) 종지 코돈 근처의 grsB의 코딩 영역의 3' 말단, (2) 개시 코돈을 포함하는 grsB 코딩 영역의 5' 말단, (3) 종지 코돈을 포함하는 grsA의 코딩 영역의 3' 말단, (4) 개시 코돈을 포함하는 grsA의 코딩 서열의 5' 말단, (5) 종지 코돈을 포함하는 grsT의 코딩 서열의 3' 말단 및 (6) 개시 코돈을 포함하는 grsT의 코딩 서열의 5' 말단이다. 증폭된 단편은 이 기술분야에서 공지된 수법에 의해 방사성 표지되거나 비방사성 표지되어 λ EMBL3과 같은 벡터에 작성된 바실루스 브레비스 ATCC 9999 DNA의 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용된다. 3개의 생합성 유전자의 완전한 코딩 서열을 함유하는 게놈 DNA의 클로닝된 단편을 단리하기 위해 6개의 증폭된 단편을 쌍으로 사용하였다. 탐침 1 및 2와 혼성화되는 클론은 완전한 grsB 서열을 함유할 것이고, 탐침 3 및 4와 혼성화되는 클론은 완전한 grsA 유전자를 함유할 것이며, 탐친 5 및 6과 혼성화되는 클론은 완전한 grsT 유전자를 함유할 것이다. 클론된 grsA를 대장균에 도입한 다음 이 기술에서 공지된 방법을 통하여 형질전환된 세균을 용균시키는 것에 의해 제조한 추출물을, 겔 여과 크로마토그래피에 의해 120 kDa 보다 작은 단백질을 제거한 후 페닐알라닌-의존 ATP-PPi 교환반응을 측정함으로써 활성을 시험하였다. grsB도 형질전환된 세균으로 부터 얻은 겔 여과된 추출물을 프롤린, 발린, 오르니틴 및 로이신 의존성 ATP-PPi 교환반응에 대해 측정함으로써 유사하게 시험하였다.
실시예 20: 페니실린 생합성 유전자의 클로닝
페니실리이움 크리소게눔 (Penicilium chrysogenum)으로 부터 얻은 게놈 DNA의 38 kb 단편은 정상적으로는 페니실린을 생산하지 않는 진균, 아스페르길루스 니거 (Aspergillus niger) 및 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)에게 페니실린 합성능을 전달한다 (스미쓰 일행, Bio/Technology 8: 39-41 (1990)). 델타-(L-알파-아미노아디필)-L-시스테이닐-D-발린 합성효소, 이소페니실린 N 합성효소 및 이소페니실린 N 아실트랜스퍼라제의 생합성에 관여되는 유전자를 개별적으로 피. 크리소게눔 및 아스페르길루스 니둘란스에 클로닝한 다음 이들의 서열을 결정하였다(라몬 일행, Gene 57: 171-181 (1987); 스미스 일행, EMBO Journal9: 2743-2750(1990); 토빈 일행, Journal of Bacteriology172: 5908-5914 (1990). 상술한 PCR을 기본한 방법에 따라서 상기 유전자의 클로닝을 실시하여 페니실리움 크리소게눔(예컨대 스페인 레온에 소재하는 Antibioticos, S.A로 부터 얻은 AS-P-78 균주) 또는 아스페르길루스 니둘란스, 예컨대 G69 균주로 부터 얻은 게놈 DNA로 부터 약 500 염기쌍의 탐침을 수득하였다. 이들의 통합 및 작용은 상술한 항생물질 비-생산성 진균을 형질전환시킨 다음 항생물질 생산능과 개별적인 효소 활성을 평가함으로써 확인할 수 있다 (스미쓰 일행, Bio/Technology8: 39-41 (1990)).
실시예 21: 바시트라신 A 생합성 유전자의 클로닝
바시트라신 A는 세균성 식물병원체에 대한 질병 내성을 향상시키는 역할을 하는 측쇄 시클로펩티드 항생물질이다. 이것은 바실루스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) ATCC 10716에 의해 생산되며 그의 합성에는 3개의 기능적 효소, 바시트라신 합성효소(BA) 1, 2 및 3이 필요하다. BA1, BA2 및 BA3의 분자량은 각각 335 kDa, 240 kDa 및 380 kDa이다. BA2 단백질 및 BA3 단백질의 일부를 코딩하는 바실루스 리케니포르미스 DNA의 32 kb 단편은 적어도 2개의 유전자가 연결되어 있음을 나타낸다(이시하라 일행, Journal of Bacteriology171: 1705-1711 (1989)). 그라미시딘 S, 페니실린 및 서팍틴 생합성 오페론으로 부터 증거는 상기 경로의 제 1 단백질인 BA1이 BA2 및 BA3과 비교적 밀접하게 관련된 유전자에 의해 코딩될 것이라는 것을 제시한다. BA3은 공개된 방법에 의해 정제되었고 또 토끼에서 항체를 만들기 위해 사용된다(이시하라 일행, 상동). 바실루스 리케니포르미스 DNA의 게놈 라이브러리를 사용하여 대장균을 형질전환시키고 또 BA3과 관련된 항원 결정기를 발현하는 클론을 이 기술에서 공지된 방법에 따라서 검출하였다. BA1, BA2 및 BA3은 항원적으로 관련되어 있기 때문에, 이 검출방법은 3개의 효소 각각을 코딩하는 클론을 제공할 것이다. 각 클론은 형질전환된 대장균으로 부터 얻은 추출물을 사용하여 적합한 아미노산 의존성 ATP-PPi 교환반응이 있는지에 대해 실험함으로써 확인되었다. BA1을 코딩하는 클론은 로이신-, 글루타민산- 및 오르니틴-의존성 교환반응을 나타낼 것이고 또 BA2를 코딩하는 클론은 리신- 및 오르리틴-의존성 ATP-PPi 교환반응을 나타낼 것이며 또 BA3을 코딩하는 클론은 이소로이신, 페닐알라닌-, 히스티딘-, 아스파탐산- 및 아스파라긴산-의존성 교환반응을 나타낼 것이다. 상기 방법에 의해 한개 또는 2개의 유전자를 얻는다면, 다른 것들은 "워킹(walking)" 또는 "염색체 워킹(chromosome walking)" 수법 (샘브룩 일행, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 라보라토리 출판사, 1989)과 같은 이 기술에서 공지된 수법에 의해 단리될 수 있다.
실시예 22: 베아우베리신 및 데스트럭신 생합성 유전자의 클로닝
베아우베리신은 베아우베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 진균에 의해 생산된 살충성 헥사뎁시펩티드 (클라인카우프 및 봉 도렌 저술, European Journal of Biochemistry192: 1-15 (1990))로서 곤충 해충으로 부터 식물을 보호한다. 에니아틴 유사체는 후사륨의 식물병원성 종에 의해 생산된 식물독성 헥사뎁시펩티드이다(버마이스터 및 플래트너 저술, Phytopathology77: 1483-1487 (1987)). 데스트럭신은 메타르히지움 아니소플리아애 (Metarhizium anisopliae) 진균에 의해 생산되는 살충성 락톤 펩티드 (제임스 일행 저술, Journal of Insect Physiology39: 797-804(1983))이다. 활성화된 아미노산의 N-메틸화에 관여하는 에니아틴 합성효소 착물의 영역에 관련된 모노클로날 항체는 베아우베리신 및 데스트럭신의 합성효소와 교차 반응하므로 이들은 구조적으로 관련지워져있음을 알 수 있다 (클라인카우프 및 봉도렌 저술, European Journal of Biochemistry192: 1-15 (1990)). 후사륨 스커피(Fusarium scirpi)로 부터 얻은 에니아틴 합성효소 유전자(esyn1)를 클론닝한 다음 서열결정 (하에세 일행 저술, Molecular Microbiology7:· 905-914 (1993))하고, 또 서열정보를 이용하여 상술한 베아우베리신 합성효소 및 데스트럭신 합성효소 유전자에 대한 클로닝 전략을 실시하였다. 베아우베리아 바시아나 게놈 DNA 또는 메타르히지움 아니소플리아애 게놈 DNA의 특정 영역을, 에니아틴 합성효소 서열로 부터 얻은 올리고머를 PCR 프라이머로 사용하여 증폭시킴으로써 베아우베리신 합성 효소 (BE) 유전자 및 데스트럭신 합성효소(DXS) 유전자에 대한 탐침을 제조하였다. 2쌍의 PCR 프라이머를 선택하였는데, 하나는 개시 코돈 근처의 BE 유전자 절편을 증폭시킬 수 있고 또 나머지 하나는 종지 코돈 옆에 있는 BE 유전자의 절편을 증폭시킬 수 있다. 각 쌍은 약 500 염기쌍 크기의 DNA 단편의 생산을 유발한다. 베아우베리아 바시아나 및 메타르히지움 아니소플리아애로 부터 얻은 게놈 DNA 라이브러리를 표지된 단편으로 탐침처리시키고 이들과 혼성화되는 클론을 선택하였다. 베아우베리신 합성효소의 완전한 코딩 서열은 적합한 숙주에서 페닐알라닌-의존성 ATP-PPi 교환반응의 출현을 유발할 것이고, 또 데스트럭신의 완전한 코딩 서열은 발린-, 이소로이신- 및 알라닌-의존성 ATP-PPi 교환반응의 출현을 초래할 것이다. 이들 형질전환된 생물로 부터 얻은 추출물은 각 베아우베리신 및 데스트럭신의 무세포 생합성을 실시할 것이다.
실시예 23: 공지되지 않은 펩티드 항생물질을 생합성하기 위한 클로닝 유전자
임의의 펩티드 항생물질 유전자를 코딩 서열내의 보존되는 영역을 이용하여 클로닝시켰다. 펩티드 항생물질 합성효소에 일반적인 기능, 즉 아미노산 활성화, ATP- 및 판토테인 결합능은 각 도메인이 약 600 아미노산 근처인 반복되는 도메인 구조에 반영되어 있다. 도메인내에서, 고도로 보존되는 서열은 공지되어 있고, 또관련된 서열은 기원에 관계없이 임의의 펩티드 항생물질 합성효소로 존재할 것이라고 보여진다. 그라미시딘 합성효소 1 및 2 (호리 일행 저술, Journal of Bioshemistry106: 639-645 (1989); 크라우세 일행 저술, Journal of Bacteriology162: 1120-1125(1985); 투르게이 일행, Molecular Microbiology6: 529-546 (1992)), 트리코시딘 합성 효소 1 및 2 (웨커만 일행 저술, Nucleic Acids Rsearch16: 11841 (1988)), ACV 합성효소 (맥카베 일행 저술, Journal of Biological Chemistry 266: 12646-12654(1991)), 에니아틴 합성효소 (하에세 일행 저술, Molecular Microbiology7: 905-914(1993)), 및 서팍틴 합성효소 (푸마 일행 저술, Nucleic Acids Research21: 93-97(1993); 그란디 일행, 제 11차 국제 포자 회의(1992))를 비롯한 펩티드 합성효소 유전자의 공개된 DNA 서열을 비교하고 개별적 반복되는 도메인을 확인하였다. 모든 합성효소로 부터 도메인을 그룹으로 비교하고, 가장 고도로 보존되는 서열을 확인하였다. 이들 보존된 서열로 부터, 서열의 관측된 변이체에 대하여 혼성화시키기에 적합한 DNA 올리고머를 디자인하고 제 1 DNA 서열로 부터 0.1 내지 2 kb 떨어져 있는 다른 DNA 서열을 사용하여 다른 DNA 올리고머도 고안하였다. 이러한 DNA 올리고머 쌍을 사용하여 공지된 유전자의 개재 절편을 PCR에 의해 증폭시키고, 이들을 항생 물질을 생산하는 생물로 부터 제조된 게놈 DNA와 조합한 다음 PCR 증폭처리시켰다. 생산된 DNA 단편을 서열결정하여 그 정체를 확인하고 게놈 라이브러리에서 펩티드 합성효소 유전자의 대형 절편을 함유하는 클론을 확인하기 위한 탐침으로 사용하였다. 유전자내의 보존되는 서열과 혼성화되도록 고안된 올리고머를 PCR 반응의 프라이머로서 보다는 혼성화 탐침으로사용한 상기 방법의 변형으로 바실루스 서브틸리스 ATCC 21232 (보르체르트 일행 저술, FEMS Microbiological Letters92: 175-180 (1992)로 부터 얻은 서팍틴 합성효소 유전자의 일부를 확인할 수 있다. PCR 생성된 탐침에 혼성화되는 클로닝된 게놈 DNA를 서열결정화시킨 다음 "워킹" 과정에 의해 완전한 코딩 서열을 수득하였다. 이러한 "워킹" 과정은 군을 이루는 것으로 알려져 있기 때문에 펩티드 항생물질 합성에 필요한 다른 유전자도 수득할 것이다.
신규 펩티드 항생물질의 합성효소를 코딩하는 유전자를 수득하기 위한 다른 방법은 항생물질 생산 생물로 부터 얻은 DNA로 부터 제조한 적합한 게놈 라이브러리를 이용하여 형질전환시킨 후 이질 숙주에서 발현된 항원 결정기를 선택하는 것이다. 합성효소의 공통적인 구조 특징은 상이한 합성효소 단백질에 대하여 생긴 항체와의 교차반응에 의해 확인될 것이다. 이러한 항체는 공지 방법에 의해 항생물질을 생산하는 공지 생물로 부터 정제된 펩티드 합성효소에 대하여 유도한 것이다.(이시하라 일행 저술, Journal of Bacteriology171: 1705-1711 (1989)). 공지되지 않은 펩티드 항생물질의 생산자로 부터 얻은 게놈 DNA의 단편을 갖는 형질전환된 생물을, 이 기술분야에서 공지된 방법에 의해 안티-펩티드 합성효소 항혈청에 의해 인식되는 항원 결정기의 존재에 대해 시험하였다. 항혈청에 의해 확인된 세포에 의해 실행된 클로닝된 게놈 DNA를 회수하고 서열결정하였다. 전체 코딩 서열 및 기타 생합성 유전자를 수득하기 위해 상술한 바와 같은 워킹 수법을 사용한다.
공지되지 않은 펩티드 항생물질의 합성효소를 코딩하는 유전자를 수득하기 위한 다른 방법은 적합한 펩티드 합성효소의 특징을 갖는 단백질을 정제한 다음 그의 아미노산 서열을 결정하는 것에 의해서이다. 항생물질에 존재하는 아미노산은 먼저 항생물질 생산 생물의 배양액의 클로로포름 추출액으로 부터 C18칼럼상에서 에탄올-물 혼합물로 역상 크로마토그래피시키는 것에 의해 정제된다. 정제된 화합물의 조성을 질량 분광기, NMR 및 산 가수분해 생성물의 분석을 통하여 결정한다. 펩티드 항생물질에 존재하는 아미노산 -또는 히드록시 산은 항생물질 생산 생물로부터 얻은 펩티드 합성효소 함유 추출물에 부가될 때 ATP-PPi 교환반응을 유발할 것이다. 이 반응은 이 기술분야에서 공지된 것과 같은 단백질 정제방법중에 펩티드 합성효소의 존재를 검출하기 위한 분석으로 이용된다. 이 기술분야에서 공지된 바와 같이, 완전한 단백질을 직접적으로 서열결정하여 N-아미노산 서열을 수득하거나, 또는 완전한 펩티드 합성효소로 부터 유도된 펩티드의 생산, 정제 및 특정의 단백질 분해 효소의 작용으로 서열결정하는 것에 의해 아미노산 서열을 결정하기 위해 실질적으로 순수한 펩티드 합성효소 제제를 사용한다. 상기 합성효소의 아미노산 서열로 부터 DNA 서열을 얻고 이러한 코딩 서열에 혼성화될 수 있는 DNA 올리고머를 고안하였다. 이 올리고머를 항생물질 생산 미생물의 DNA로 부터 제조된 게놈 라이브러리 탐침으로 사용하였다. 선택된 클론을 서열결정화함으로써 이들의 정체를 확인하고, 펩티드 생합성에 필요한 완전한 코딩 서열 및 관련 유전자를 워킹 수법을 이용하여 수득하였다. 펩티드 생합성 유전자 전체로 형질전환된 생물, 예컨대 세균 또는 진균으로 부터 얻은 추출물은 필요한 아미노산 또는 히드록시산, ATP및 판테테인이 제공되면, 펩티드 항생물질을 생산할 것이다.
비-리보솜 펩티드 항생물질을 합성하는데 필요한 유전자를 클로닝하는 다른 방법은 실시예의 섹션 B에 기재되어 있다.
리보솜-합성된 펩티드 항생물질
리보솜-합성된 펩티드 항생물질은 특정 효소에 의해 변형되어 성숙 분자를 형성하는 전구체를 코딩하는 항생물질 그자체의 구조 유전자가 존재하는 것을 특징으로한다. 펩티드 항생물질을 합성하기 위해 일반적인 단백질 합성 기구를 이용함으로써 훨씬 긴 중합체를 제조할 길을 열었지만 이들 펩티드 항생물질은 반드시 길 필요는 없다. 구조 유전자 이외에, 세포의 분비 및 면역을 위해 기타 유전자가 필요하며, 또 이들 유전자는 구조 유전자 바로 옆에 위치할 것으로 생각되며, 대부분의 경우 동일 오페론에 존재할 것이다. 리보솜상에서 제조된 펩티드 항생물질에는 2개 부류가 있다: 독특한 아미노산 란티오닌을 함유하는 군과 그렇지 않은 군. 란티오닌-함유 항생물질(란티바이오틱스)은 락토코커스(Lactococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 바실루스(Bacillus) 및 스트렙토마이세스종을 비롯한 그람 양성 세균에 의해 생산된다. 선형 란티바이오틱스(예컨대, 니신, 서브틸린, 에피데르민 및 갈리데르민) 및 환형 란티바이오틱스(예컨대, 두라마이신 및 신나마이신)는 공지되어 있다 (한센 저술, Annual Review of Microbiology47: 535-564 (1993); 콜터 및 모레노 저술, Annual Review of Microbiology46: 141-163 (1992)). 란티바이오틱스는 세린 및 트레오닌의 탈수에 의해 유도된 데히드로아닐린(DHA) 및 데히드로부티린(DHB)과 같은 특성 변화된 잔기를 흔히 함유한다. 시스테인으로 부터의 티올을 DHA와 반응시키면 란티오닌을 수득하며, DHB와 반응시키면 β-메틸란티오닌을 수득한다. 란티오닌을 함유하지 않는 펩티드 항생물질은 기타 변형을 함유할 수 있거나, 또는 이들은 단백질 합성에 사용된 통상의 아미노산만으로 구성될 수 있다. 비-란티오닌 함유 펩티드 항생물질은 락토바실루스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 엔테로코커스(Enterococcus) 및 에세리키아를 비롯한 그람 양성 및 그람 음성 세균에 의해 생산된다. 이 종류의 항생물질은 락타신, 락토신, 사카신 A, 페디오신, 디플로코신, 락토코신 및 미크로신을 포함한다 (한센 저술, 상동; 콜터 및 모레노 저술, 상동). 일반적으로, 합성이 리보솜에서 시작되는 펩티드 항생물질은 단백질 분해 및 아미노산 사슬의 변형을 비롯한 몇가지 유형의 번역후 가공을 받기 쉬워 특정의 수송 및/또는 면역 메카니즘을 필요로한다. 이들 항생물질의 효과로 부터 보호할 필요는 비-리보솜 펩티드 항생물질에 대한 이러한 시스템을 갖지 않을 때 강하게 나타난다. 이것은 리보솜에 의해 합성된 많은 펩티드 항생물질의 항생물질 활성이 항생물질 생성 생물과 밀접하게 관련된 좁은 범위의 세균에 향한다는 것을 고려하면 이해될 것이다. 이러한 상황하에서, 경쟁자로 부터 생산자를 구별하기 위한 특정 방법이 필요하며, 그렇지 않으면 그 이점을 상실할 것이다. 항생물질로서, 상기 특성은 매우 제한된 범위의 활성이 유리한 경우, 광범위한 활성이 그 효과를 향상시킬 때 상기 분자의 유용성을 제한한다. 펩티드 항생물질 종류에 감수성이 아닌 것으로 알려진 진핵생물계에서, 리보솜에 의해 합성된 펩티드 항생물질이 이들 수송계중의 어느 하나를 필요로하는지 또는 세포의 수송이 항생물질을 잠재적인 병원체와 마주칠 보다 좋은 위치에 두기 위한 것인지는 분명하지 않다. 이 문제는 이후 제시한 실시예에 나타낸 바와 같은 실험으로 설명될 것이다.
실시예 24: 란티바이오틱의 생합성 유전자의 클로닝
란티바이오틱스인 니신, 서브틸린 및 에피데르민의 구조 유전자와 연결된 유전자를 조사하면 서열 상동성을 갖는 몇개의 오픈 리딩 프레임이 존재하는데, 그의 예상된 아미노산 서열은 항생물질의 성숙과 수송에 필요한 기능을 제시한다. spaS를 비롯한 바실루스 서브틸리스 ATCC 6633의 spa 유전자, 서브틸린에 대한 전구체를 코딩하는 구조 유전자는 서열결정되어 있다 (청 및 한센 저술, Journal of Bacteriology174: 6699-6702 (1992); 청 일행 저술, Journal of Bacteriology174: 1417-1422 (1992); 클라인 일행 저술, Applied and Environmental Microbiology58: 132-142 (1992)). 오픈 리딩 프레임은 spaS의 상류에서만, 적어도 1 내지 2 kb 거리내에서 발견되었다. 오픈 리딩 프레임들의 몇개는 동일한 전사 유닛의 일부, spaE, spaD, spaB 및 spaC와 함께 spaE의 추정 프로모터 상류의 일부인 것으로 보인다. 599 아미노산의 단백질을 코딩하는 spaB 및 177 아미노산의 단백질을 코딩하는 spaD는 HyIB 및 HIyD 단백질을 코딩하는 헤모리신의 수송에 필요한 유전자와 상동성을 갖는다. 851 아미노산의 단백질을 코딩하는 SpaE는 니신의 구조 유전자에 연결되고 기능은 알려지지 않은 유전자인 nisB와 상동이다. SpaC는 기능이 알려지지 않은 442개 아미노산의 단백질을 코딩하지만, 그것을 파괴하면 서브틸린 생산능이 제거된다. 이들 유전자는 약 7 kb 크기의 게놈 DNA의 절편에 함유된다(청 및 한센 저술, Journal of Bacteriology174: 6699-6702 (1992); 청 일행저술, Journal of Bacteriology174: 1417-1422 (1992): 클라인 일행, Applied and Environmental Microbiology58: 132-142 (1992)). 이들 유전자가 서브틸린 생산능을 제공하기에 완전히 충분한지는 아직 분명치 않다. 에피데르민의 구조 유전자(epiA)를 함유하는 스타필로코커스 에피데르미스 Tu3298의 플라스미드 Tu32로 부터 얻은 13.5 kb 단편은 또한 epiA, epiB, epiC, epiD, epiQ 및 epiP로 표시된 5개의 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 유전자 epiBC는 유전자 spaBC와 상동이지만, epiQ는 오페론의 발현을 조절하는데 관여하는 것으로 보이며, 또 epiP는 에피데르민에 대하여 전-에피데르민이 성숙되는 동안 작용하는 프로테아제를 코딩할 수 있다. EpiD는 보조효소 플라빈 모노뉴클레오티드에 결합되는 181개의 아미노산 단백질을 코딩하며 전-에피데르민의 번역후 가공 수식을 실행하는 것으로 보인다(쿠프케 일행 저술, Journal of Bacteriology174: (1992); 페쉘 일행 저술, Molecular Microbiology9: 31-39 (1993); 슈넬 일행 저술, European Journal of Biochemistry204: 57-68(1992). 란티오바이오틱의 생합성에 필요한 유전자의 대부분이 군을 이루고 또 물리적으로 게놈 DNA 또는 플라스미드상에 가깝게 존재하여 필요한 유전자중의 어느 하나의 위치를 찾는다면 다른 유전자를 찾고 클로닝하는 것도 유용할 것이라고 기대되어 왔다. 란티오바이오틱의 구조 유전자는 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 아종 락티스 (lactis) CNRZ 481로 부터의 란티바이오틱스 락티신 481 (피아드 일행 저술, Journal of Biological Chemistry268: 16361-16368 (1993)), 스트렙토코커스 피로게네스 (Streptococcus pyrogenes) FF22로 부터의 스트렙토코신 A-FF22 (하이네스 일행, Applied and EnvironmentalMicrobiology59: 1969-1971(1993)), 및 스트렙토코커스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius) 203으로 부터의 살리바리신 A (로스 일행, Applied and Environmental Microbiology59: 2014-2021(1993))에 대하여 실시된 바와 마찬가지로 란티바이오틱 그자체의 실질적으로 정제된 제제로 부터 결정된 아미노산 서열을 기준으로 한 올리고뉴클레오티드 탐침을 디자인하는 것에 의해 클로닝될 수 있다. 구조 유전자를 함유하는 약 10 내지 20 kb 크기의 세균 DNA의 단편을 클로닝하고 서열결정화하여 spa, epi 및 nis 오페론에서 특징화된 유전자의 상동성의 영역을 결정하였다. 이들 유전자와 상동성을 갖거나 또는 동일 전사 단위내에 존재하는 오픈 리딩 프레임은 이들 유전자의 어느 하나와 상동성을 갖는 오픈 리딩 프레임을 이 기술분야에서 공지된 수법을 이용하여 개별적으로 클로닝될 수 있다. 모든 관련된 리딩 프레임을 함유하는 DNA의 단편 및 기타 리딩 프레임을 사용하여 대장균과 같은 세균의 비-생산성 균주로 형질 전환시키고 란티바이오틱의 생산을 조사하여 필요한 유전자 모두가 존재하는지를 확인하였다.
실시예 25: 비-란티오닌 함유, 리보솜으로 합성된 펩티드 항생물질의 생합성에 대한 클로닝 유전자
란티바이오틱스에 존재하는 광범위한 변형이 없으면 락타신 F, 사카신 A, 락토코신 A 및 헬베티신 J에 의해 예시된 펩티드 항생물질의 완전한 합성을 설명하는데 필요한 유전자의 수를 감소시킬 것이라고 본다. 항생물질의 생합성에 관여하는 군을 이룬 유전자는 락타신 F의 경우 락토바실루스 존소니 VPl11088, (프레마우스 일행, Applied and Environmental Microbiology59: 3906-3915 (1993)), 사카신 A의 경우 락토바실루스 케이크 Lb706 (아셀슨 일행 저술, Applied and Environmental Microbiology59: 2868-2875 (1993)), 락토코신 A의 경우 락토코쿠스 락티스 (스토다드 일행 저술, Applied and Environmental Microbiology59: 1952-1961 (1992)), 및 페디오신 PA-1의 경우 페디오코커스 아시딜라크티시 (마루그 일행 저술, Applied and Environmental Microbiology58: 2360-2367 (1992))에서 찾아볼 수 있다. 신규한 비-란티오닌-함유 펩티드 항생물질의 생합성에 필요한 유전자는 실질적으로 정제된 항생물질 제제의 아미노산 서열을 결정화하고, 이 아미노산 서열을 기본으로하여 DNA 올리고머를 디자인하며 또 생산성 세균으로 부터 얻은 게놈 또는 플라스미드 DNA로 부터 작성된 DNA 라이브러리를 사용하여 탐침하는 것에 의해 클로닝되었다. 항생물질에 대한 구조 유전자를 함유하는 5 내지 10 kb의 단편을 클로닝하고 서열결정하였다. 락토바실루스 세이크 (Lactobacillus sake)로부터 얻은 sakB 또는 락토바실루스 존소니로 부터의 lafX, ORFY 또는 ORFZ와 상동성을 갖거나 또는 상술한 운전자와 항생물질 구조 유전자들과 동일한 전사 단위의 일부인 오픈 리딩 프레임을 개별적으로 공지 방법으로 클로닝하였다. 관련된 모든 리딩 프레임을 함유하고 그외의 것은 함유하지 않는 DNA 단편을 대장균과 같은 세균의 비-생산성 균주로 형질전환시키고 또 항생물질 생산에 대해 조사하여 필요한 유전자가 존재하는지를 확인하였다.
H. 미생물 숙주에서 항생물질 생합성 유전자의 발현
실시예 26: 발효형 기술을 이용하여 APS를 과잉생산하기 위해 APS 생합성 유전자의 발현
본 발명의 APS 생합성 유전자는 이들의 천연 숙주로 부터 얻을 수 있는 양 보다 다량으로 이들을 생산하기 위해 이질 숙주에서 발현될 수 있다. 이질 발현용으로 적합한 숙주는 대장균이고 또 대장균에서 유전자 발현 수법은 잘 공지되어 있다. 예컨대 클론된 APS 유전자는 실시예 11에 기재된 바와 같이 발현 벡터 pKK223을 사용하여 대장균에서 발현될 수 있다. 클로닝된 유전자는 전사 융합물로 융합되어 이질 유전자와 상동인 유용한 리보솜 결합위치를 사용할 수 있다. 이러한 방법은 하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 오페론의 발현을 촉진시키므로 개별 ORF의 번역은 상동 리보솜 결합 위치 신호에 의존성일 것이다. 이와 다르게는 APS 유전자는 벡터의 ATG에 융합(NcoI 융합으로)되어 대장균 리보솜 결합위치를 이용하게된다. 대장균에서 다수의 ORF 발현을 위하여(다수의 ORF를 갖는 오페론의 경우), 이러한 유형의 작제물은 각 ORF로 융합될 별도의 프로모터를 필요로 할 것이다. 그러나 이들의 천연 리보솜 결합 위치를 이용하기 위해서는 다른 ORF를 필요로하면서 APS 오페론의 첫 ATG를 대장균 리보솜 결합 위치로 융합시킬 수 있다. 대장균에서 유전자를 과잉발현시키기 위한 작제물의 유형은 이 기술분야에서 잘 공지되어 있다. 적합한 세균 프로모터는 박테리오파아지 λ로 부터의 lac 프로모터, tac (trp/lac) 프로모터, 및 Pλ 프로모터를 포함한다. 적합한 시판중인 벡터는 예컨대 pKK223-3, pKK233-2, pDR540, pDR720, pYEJ001 및 pPL람다 (미국 뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 제품)를 포함한다.
유사하게, 그람 양성 세균, 흔히 바실루스 종 및 특히 바실루스 리케니포르미스는 이질 단백질의 상업적 규모의 생산에 이용되며 APS 생합성 유전자의 발현을위해 개질될 수 있다(예컨대 Quax 일행; Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds: 발츠 일행, 미국 미생물학회, 워싱톤(1993)). 고도로 발현된 바실루스 유전자로 부터 얻은 조절 시그널(예컨대 아밀라제 프로모터, Quzx 일행, 상동)은 APS 생합성 유전자와 함께 전사 융합물을 생성하기 위해 사용된다.
어떤 경우에는 세균 유전자의 고도의 발현은 메틸로트로픽 효모 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)와 같은 효모계 (스리크리스나 저술: Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, 발츠, 헤게만, 및 스카트루드 편저, 미국 미생물학회, 워싱톤 (1993))를 이용하여 달성할 수 있다. 관심을 두고 있는 APS 유전자는 pHIL-D1 및 pHIL-D2 (스리크리스나, 상동)와 같은 벡터내의 피치아 알코올 옥시다제 유전자의 5' 조절 유전자 서열 뒤에 위치할 수 있다. 이러한 벡터는 피치아 (Pichia)를 형질전환하기 위해 사용되며 이질 DNA를 효모 게놈으로 도입한다. 마찬가지로, 효모 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae)도 이질 세균 유전자를 발현하기 위해 사용되었다 (예컨대, 데퀸 및 바레, Biotechnology12: 173-177 (1994)). 효모 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)는 이질 유전자 발현을 위해 적합한 숙주이다 (예컨대, 반 덴베르그 일행, Biotechnology 8: 135-139 (1990)).
신속한 성장과 증폭으로 잘 알려진 대장균, 바실루스 및 효모와 같은 생물에서 APS 유전자의 발현은 APS의 발효에 의한 대량 생산을 가능하게 할 것이다. 생물의 선택은 과잉생산될 APS에 대한 생물의 감수성에 의해 제한될 수 있다: 그러나감수성은 J부분에서 기재된 방법에 의해 결정된다. APS는 진균 및 세균과 같은 미생물의 제어하에 사용하기 위해 이러한 배양물로 부터 단리 및 정제될 수 있다.("G"참조).
I. 생물방제를 위하여 미생물 숙주에서 항생물질 생합성 유전자의 발현
본 발명의 클로닝된 APS 생합성 유전자는 다양한 미생물의 생물방제 균주의 효능을 증가시키기 위하여 이용될 수 있다. 한가지 방법은 특정 APS에 대한 유전자를 강한 전사 조절하에서 원래의 숙주로 전달함으로써 APS의 다량 생산을 유발하는 방법이다. 다른 방법은 유전자를 이질 숙주로 보내고 원래 숙주에서는 생산할 수 없는 APS를 이질 숙주에서 생산하도록 하는 방법이다.
APS 유전자의 이질 과잉생산에 적합한 미생물은 식물 또는 근권에 서식할 수 있는 모든 미생물이다. 이들은 이들의 성장 억제를 유발하는 식물병원성 진균과 접촉될 것이다. 이는 슈도모나스, 엔테로박터 및 세라티아와 같은 그람 음성 미생물, 그람 양성 미생물 바실루스 및 스트렙토마이세스 종 및 진균 트리코데르마 및 글리오클라디움을 포함한다. 특히 바람직한 이질 숙주는 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 세파시아, 슈도모나스 아우레오파시엔스, 슈도모나스아우란티아카, 엔테로박터 클로아카에, 세라티아 마르세센스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 세레우스, 트리코데르마 비리데, 트리코데르마 하르지아눔 및 글리오클라디움 비렌스이다.
실시예 27: 대장균 및 기타 그람 음성 세균에서 APS 생합성 유전자의 발현
많은 유전자들이 이질 방식으로 그람 음성 세균에서 발현되어 왔다. 실시예11은 발현벡터 pKK223-3 (파마시아 카탈로그 #27-4935-01)을 사용하여 대장균에서 피롤니트린을 생합성하기 위한 유전자의 발현을 기술하고 있다. 이 벡터는 lac 리프레서에 의해 조절되고 또 IPTG에 의해 유도되는 강한 tac 프로모터 (브로시우스, 제이. 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81)를 갖는다. 대장균에서 사용하기 위한 다수의 기타 발현계가 개발되었고 그 자세한 내용은 상기 실시예 14 내지 17에 기재되어 있다. 열유도성 발현 벡터 pPL (파마시아 #27-4946-01)는 강하게 조절되는 박테리오파아지 λ프로모터를 이용하는데 이로써 고도의 단백질 발현이 가능하다. lac 프로모터는 다른 발현 수단을 제공하지만 이 프로모터는 tac 프로모터와 같이 고도로 발현되지 않는다. 광 숙주 범위 레플리콘을 이들 발현계 벡터에 부가함으로써 슈도모나스, 엔테로박터, 세라티아 및 에르위니아와 같은 그람 음성 세균과 밀접하게 관련된 항진균 화합물의 생산이 가능하다. 예컨대 pLRKD211 (카이저 및 크로스, Proc. Natl. Acd. Sci. USA81: 5816-5820 (1984))는 많은 그람 음성 세균에서 복제를 가능하게하는 광숙주 범위의 레플리콘 ori T를 함유한다.
대장균에서, tac (즉, trp-lac) 프로모터를 발현시키기 위해서는 IPTG에 의한 유도가 필요하다. 이와 동일한 프로모터 (예컨대, 광숙주 범위 플라스미드 pLRKD211)가 슈도모나스에 도입되면, 이 프로모터는 IPTG에 의해 유도되지 않더라도 구성적으로 활성이다. 이 trp-lac 프로모터는 슈도모나스중에서 발현을 위해 필요한 유전자 또는 오페론의 전면에 위치할 수 있거나 또는 이러한 유전자를 구성적으로 발현시키기 위하여 밀접하게 관련된 세균에 존재할 수 있다. 관심을 갖고 있는 오페론이 APS의 생합성에 필요한 정보를 함유하면, 그람 음성 세균의 생물방제음성 균주는 다양한 진균 질병으로 부터 식물을 보호할 수 있을 것이다. 따라서, 항진균성 화합물에 대한 유전자는 강한 구성적 프로모터 뒤에 위치할 수 있고 정상적으로는 항진균 생성물을 생산하지 않고 식물 또는 근권에 서식할 수 있는 특성을 갖는 세균으로 형질전환시켜 이들 생물을 효과적인 생물방제 균주로 전환시킨다. 다른 가능한 프로모터는 그람 음성 세균에서 APS 유전자의 구성적 발현을 위해 사용될 수 있다. 이들은 슈도모나스 조절 유전자 gafA 및 lemA (WO 94/01561호)로 부터 얻은 프로모터 및 슈도모나스 사바스타노이 (Pseudomonas savastanoi) IAA 오페론 프로모터 (가프네이 일행, J. Bacteriol. 172: 5593-5601 (1990))를 포함한다.
상기 실시예 11a에서 기술한 tac 프로모터를 갖는 합성 Prn 오페론을 광범위한 그람 음성 세균에서 복제되는 2개의 광숙주 범위 벡터로 삽입하였다. 제 1 벡터, pRK290 (디타 일행, 1980, PNAS 77(12) pp. 7347-7351)은 낮은 복제수의 플라스미드이고 제 2 벡터, pBBR1MCS (코바하 일행, 1994, Biotechniques 16(5): 800-802)는 중간 정도의 복제수 플라스미드이다. Prn 유전자를 함유하는 양 벡터 작제물을 다수의 그람 음성 세균 균주에 도입하고 TLC 및 HPLC에 의해 피롤니트린을 생산하는지에 대해 조사하였다. 다수의 균주가 이질적으로 피롤니트린을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 대장균, 슈도모나스종(MOCG133, MOCG380, MOCG382, BL897, BL1889, BL2595) 및 엔테로박터 타일로라애(MOCG206)를 포함한다.
실시예 28: 그람 양성 세균에서 APS 생합성 유전자의 발현
그람 양성 세균에서 APS 유전자를 코딩하는 유전자의 이질 발현은 신규 생물방제 균주를 제조하는 다른 방법이다. 바실루스 및 스트렙토마이세스에 대한 발현계가 가장 잘 특징화되어 있다. 스트렙토코커스 프네우모니아애 (Streptomyces pneumoniae)로 부터 얻은 에리쓰로마이신 내성 유전자에 대한 프로모터 (ermR)는 그람 양성 호기성 생물 및 대장균 (트리에우-쿠오트 일행, Nucl. Acids Res18: 3660 (1990))에서 활성인 것으로 밝혀졌다. 티오스트렙톤 유전자로 부터 다른 항생 물질 내성 프로모터가 스트렙토마이세스 클로닝 벡터에 사용되었다(비브, Mol Gen Genet199: 26-36 (1985)). 셔틀 벡터 pHT3101 또한 바실루스에서 발현하기에 적합하다 (레레클루스, FEMS Microbiol Lett60: 211-218 (1989)). ermR 또는 기타 프로모터 제어하에서 오페론(피롤니트린 오페론과 같은) 또는 개별 APS 코딩 유전자를 발현시킴으로써 토양 바실리 (bacilli)를 미생물 질병으로 부터 식물을 보호할 수 있는 균주로 전환할 수 있다. 이 방법의 중요한 이점은 많은 그람 양성 세균이 보다 긴 저장 수명을 갖는 생물방제 식물을 생산하는 배합물로 사용될 수 있는 포자를 생산하는 점이다. 바실루스 및 스트렙토마이세스종은 토양의 공격성 서식자이다. 사실상 양쪽은 다양한 범위의 미생물에 대하여 항생물질 활성을 포함하는 제 2 대사물질을 생산하며 피롤니트린, 소라펜, 페나진 또는 고리형 펩티드를 비롯한 이질성 항진균 유전자를 그람 양성 세균에 부가함으로써 이들 생물들을 보다 우수한 생물방제 균주로 만들 수 있다.
실시예 29: 진균에서 APS 생합성 유전자의 발현
트리코데르마 하르지아눔 및 글리오클라디움 비렌스는 이 분야에서 다양한 수준의 생물방제 특성을 제공하는 것으로 알려져있다 (미국 특허 5,165,928호 및 미국 특허 4,996,157호, 모두 코넬 리서치 파운데이션에게 허여된 것임). 이들 생물방제를 성공적으로 사용하면 APS 유전자를 도입함으로써 향상된 균주의 개발을 도모할 수 있다. 이는 이 기술분야에서 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 한가지 방법은 PEG 또는 엘렉트로포레이숀-매개 수법에 의한 원형질 매개된 진균의 형질전환법이다. 이와다르게는, 원형질 또는 기타 진균 세포를 형질전환시키는 것과 함께 재생된 성숙 구조로 발달하는 능력을 갖도록 입자 폭파법을 이용할 수 있다. 아스페르길루스 형질전환을 위해 원래 개발된 것으로 지금은 진균 형질전환을 위해 널리 이용되는 벡터 pAN7-1 (쿠라그 일행, Mycol. Res. 97(3): 313-317 (1992); Toley 일행, Curr. Genet. 21: 55-60 (1992); Punt 일행, Gene 56: 117-124 (1987))를 유전공학 처리시켜 피롤니트린 오페론을 함유하도록 하거나, 또는 APS 생합성을 위한 기타 유전자를 함유시킨다. 이 플라스미드는 아스페르길루스 니둘란스 gpd 프로모터 및 trpC 터미네이터(펀트 일행, Gene56: 117-124 (1987)) 옆에 대장균 히그로마이신 B 내성 유전자를 함유한다.
J. 식물 병원체에 대한 항식물병원성 물질의 시험관내 활성
실시예 30: 항진균 활성을 측정하기 위한 생물검정법
가능한 항진균제에 의해 진균 성장을 억제시키는 것은 다수의 분석 형태로 측정될 수 있다. 일반적으로 이용되는 거시적인 방법은 한천 확산분석법 (딩그라 및 신클레어, Basic Plant Pathology Methods, CRC 출판사, 보카 랜톤, FLA (1985)) 및 액체 매질에서 분석법 (부로에케르트 일행, FEMS Microbiol. Lett.69: 55-60 (1990))을 포함한다. 양쪽 분석법 모두 진균 포자 또는 균사체를 접종원으로 사용하여 실시한다. 진균 저장액의 유지는 표준 균학적 과정에 따라서 하였다. 배양액의 표면을 멸균수 또는 완충액으로 씻어내는 것에 의해 진균의 성숙 플레이트로 부터 생물분석용 포자를 수집하였다. 혼합기중 플레이트로 부터 진균을 위치시키고 콜로니가 분산될 때 까지 균질화시키는 것에 의해 균사체의 현탁액을 제조하였다. 균질물을 몇개층의 투박한 무명을 통하여 여과하여 대형 입자를 배제시켰다. 투박한 무명을 통과하는 현탁액을 원심분리에 의해 세척하고 상층액을 신선한 완충액으로 교체하였다. 균사체 현탁액의 농도는 이용될 생물검정법으로 현탁액을 시험하는 것과 같이 실험에 의해 조정하였다.
한천 확산분석법은 포자 또는 균사체 단편을 고형의 시험 배지에 현탁시키고 또 항진균제를 확산되는 공급점에서 인가함으로써 실시하였다. 이는 포자 또는 균사체를 용융된 진균 성장 배지에 부가한 다음 그 혼합물을 멸균 접시에 붓고 겔화 시키는 것에 의해 실시할 수 있다. 멸균 필터를 배지의 표면상에 놓고 항진균제 용액을 필터에 점점으로 도포하였다. 액체가 필터에 의해 흡수된 후, 플레이트를 적합한 온도에서 약 1 내지 2일간 배양하였다. 성장 억제는 포자가 발아되지 않거나 또는 균사체가 성장하지 않은 필터 주변 영역의 존재로써 확인하였다. 최소 유효량으로 표시된 항진균제의 능력은 필터상으로 항진균제를 일련으로 희석되게 점부가 하는 것에 의해 정량될 수 있고 관측가능한 억제 영역을 나타내는 최저 투여량을 측정하였다. 다른 한천 확산 분석법은 웰을 고화된 진균 성장 배지로 전달하고 또 항진균제 용액을 이들에 제공하는 것을 포함한다. 모든 웰로부터 동일한 거리에 있는 지점, 흔히 플레이트의 중심에서 소량의 포자 또는 균사체 현탁액 또는 진균의 저장 배양 플레이트로 부터 직접적으로 절단한 균사체 플러그로 플레이트를 접종한다. 이 플레이트를 균사체가 웰에 도달할 때 까지 수일간 배양한 다음 성장 억제 사인이 있는지 관찰하였다. 억제는 진균 콜로니가 보통 성장하고 있는 것으로 보는 약간 원형 형태의 변형이 있는 것으로 확인된다. 특히, 전면에 생긴 균사체가 평탄하거나 또는 플레이트의 억제되지 않은 영역에 대하여 오목한 경우, 성장 억제가 생긴 것이다. 최소 유효 농도는 효과가 검출될 수 있는 희석액을 시험함으로써 결정될 수 있다.
액체 매질에서 생물검정법은 고체 배지 대신 액체 진균 성장 배지에서 배양되는 포자 또는 균사체의 현탁액을 사용하여 실시하였다. 진균 접종원, 배지 및 항진균제를 96 웰 마이크로티터 플레이트의 웰에서 혼합하고 배양물의 탁도를 분광광도계로써 측정함으로써 진균 성장을 측정하였다. 탁도가 증가하면 생물질량의 증가와 관련되므로 진균 성장 정도를 나타낸다. 성장 억제는 항진균제의 존재하에서 진균의 성장을 항진균제 부재하에서의 진균의 성장과 비교함으로써 측정하였다. 항진균 억제제의 희석 용액을 시험함으로써, 최소 억제 농도 또는 EC50를 측정할 수 있다.
실시예 31: 항균 활성을 검출하기 위한 생물검정수법
알려지지 않은 화합물의 항균 활성을 측정하기 위해 다수의 생물검정법을 이용할 수 있다. 고체 배지중의 세균 성장의 억제율은 세균 배양물의 접종원을 용융 배지에 분산시키고 또 그 현탁액을 멸균 페트리 접시의 바닥에 균일하게 분포시키는 것에 의해 측정할 수 있다. 배지을 겔화시킨 후, 멸균 필터 디스크를 그 표면에놓고 시험 물질을 동량으로 나누어 점점으로 도포하였다. 이 플레이트를 적합한 온도에서 철야로 배양하고 세균이 성장한 필터 주변의 영역에서 성장 억제를 관찰하였다. 주위 영역에 비하여 성장이 감소되었다. 순수한 화합물은 최소 유효량을 측정함으로써 특징화될 수 있고, 최소량의 물질은 성장억제 영역을 나타낸다. 액체 배지에서, 2개의 다른 방법이 이용될 수 있다. 배양물의 성장은 배양물의 광학 밀도, 실질적으로 입사광의 산란을 측정함으로써 제어될 수 있다. 동량의 접종원을 동량의 배양물 부피에 접종하면 한개의 배양물이 공지된 양의 항균제를 함유하는 것으로 확인되었다. 적합한 온도에서 배양한 후, 세균에 필요한 적합한 통기를 시험한 후, 배양물의 광학밀도를 비교하였다. 대조에 적합한 파장은 600 nm 이다. 항균제는 최소 유효량, 배양물의 밀도 감소를 초래하는 최소량의 물질을 측정하거나, 또는 시험 배양물의 성장이 대조용의 1/2인 농도를 지칭하는 EC50을 평가하는 것에 의해 특징화될 수 있다. 상술한 생물검정법은 세균 발육 저지 효과 및 살균 효과 사이에 아무런 차이가 없다. 항균제의 살균 활성을 측정하는 다른 검정법을 실시할 수도 있다. 이 분석법은 세균 및 활성 성분을 액체 배지와 함께 활성성분이 그의 표과를 충분히 발휘할 수 있는 시간 및 조건하에서 액체 배지를 배양하는 것에 의해 실시할 수 있다. 상기한 바와 같은 배양이 완료되면, 세균은 원심분리 또는 재현탁에 의해 세척되거나, 또는 새로운 배지를 부가하는 것에 의해 희석될 수 있다. 어떤 경우든, 현저한 활성을 더 이상 나타내지 않는 지점 까지 항균제의 농도를 감소시킨다. 세균을 플레이팅하고 고체 배지에 분포시키며 그 판을 적합한 온도에서성장이 나타날 때 까지 철야로 배양하였다. 플레이트에 생기는 콜로니의 갯수를 세고, 항균제를 함유한 혼합물로 부터 생긴 갯수를 항균제를 함유하지 않는 혼합물로 부터 생긴 갯수와 비교하였다. 콜로니 형성 유닛에서의 감소는 항균제의 살균 활성의 측도이다. 살균 활성은 최소 유효량으로 정량될 수 있거나, 또는 상술한 바와 같이 EC50으로 정량될 수 있다. 이들 검정법에 사용된 세균은 아그로박테륨, 에르위니아, 클라비박터, 크산토모나스 및 슈도모나스 종을 포함한다.
실시예 32: APS의 항병원성 활성 측정
실시예 30 및 31의 과정을 이용하여 APS를 분석하여 활성인 진균 및 세균의 범위를 확인하였다. APS를 세포로 부터 단리하고 숙주 생물의 배지는 정상적으로 APS를 생산하거나, 또는 APS를 생산하도록 유전공학처리된 이질 숙주로 부터 단리될 수 있다. 다른 가능성은 공지 화학 구조의 APS 화합물 또는 이들의 유도체를 화학적으로 합성하는 것이다.
실시예 33: 피롤니트린의 항균 활성 측정
a) 피롤니트린(CGA173506으로 표시)의 플루오르화된 3-시아노-유도체의 항 병원성 활성은 옥수수 진균 식물병원체인 디플로디아 메이디스, 콜레토트리쿰 그라미니콜라 및 지베렐라 제아애-메이디스로 부터 관찰되었다. 진균의 포자를 수집하고 물에 현탁시켰다. 약 1000개의 포자를 플레이트 판독기에 적합한 96개 웰 마이크로티터의 웰에서 100 마이크로리터 부피의 감자 덱스트로오스 육즙 및 CGA173506 또는 물에 접종하였다. 이 화합물 CGA173506은 50% 수화제로서 수득하였고, 그 저장 현탁액은 멸균수중의 10 mg/ml 농도로 제조하였다. 저장 현탁액을 멸균수로 희석하여 시험에 사용할 173506을 제조하였다. 포자, 배지 및 173506을 혼합한 후, 플레이트 판독기중의 600 nm에서 흡수도를 판독함으로써 웰중의 탁도를 측정하였다. 이 판독을 배경 탁도로서 취하고, 나중에 취한 판독치로부터 감하였다. 배양한지 46시간 후, 1 mg/ml의 173506의 존재는 디플로디아 메이디스의 성장을 64%로 감소시키는 것으로 확인되었고 또 120시간 후에는 동일한 농도의 173506은 콜레토트리쿰 그라미니콜라의 성장을 50% 정도 억제시켰다. 배양한 지 40시간 후, 173506의 0.5 mg/ml의 존재는 지베렐라 제아애-메이디스를 100% 억제하였다.
b) 피롤니트린이 다양한 옥수수 진균 병원체의 성장에 대하여 갖는 영향을 시험하였고 비폴라리스 메이디스 (Bipolaris maydis), 콜레토트리쿰 그라미니콜라(Colletotrichum graminicola), 디플로디아 메이디스 (Diplodia maydis), 후사륨 모닐리포르메 (Fusarium moniliforme), 지베렐라 제아애(Gibberella zeae) 및 리족토니아 술라니 (Rhizoctonia solani)의 성장을 억제시켰다. 성장억제를 측정하기 위하여 오토클레이브 처리된 필터 디스크 (슐레이크너 및 슈엘로 부터 0.25 인치 직경)를 PDA(DIFCO) 플레이트 근처에 위치시켰다. 용액을 피펫으로 이들 필터상에 가하였다. 2.5 mg의 피롤니트린 (25 마이크로리터)을 한개의 필터 디스크에 놓고 25 마이크로리터의 63% 에탄올을 다른 디스크상에 놓았다. 진균 플러그를 저장 플레이트로 부터 취하고 PDA 플레이트의 중심에 위치시켰다. 각 진균을 한개의 플레이트 상에 접종하였다. 진균을 성장시키고 적합한 시간에서 억제를 평가하였다. 상술한 진균의 억제는 목측 관찰되었다.
K. 트랜스제닉 식물에서 항생물질 생합성 유전자의 발현
실시예 34: 코딩 서열 및 인접 서열의 수식
출원에 기재된 클로닝된 APS 생합성 유전자는 트랜스제닉 식물 숙주에서 발현되도록 수식될 수 있다. 이것은 트랜스제닉 식물로 부터 APS의 추출가능한 양을 생산하기 위해(즉, 상기 E 부분에서 기재된 유사한 이유 때문에) 실시될 수 있거나, 또는 다르게는 이러한 발현 목적은 숙주 식물상에서 병원체 보호를 제공하기 위하여 식물 조직에서 APS가 축적되는 것일 수 있다. APS 생합성 유전자를 발현하고 또 세포에서 APS를 생산하는 숙주 식물은 향상된 식물병원체 공격에 대한 내성을 가지므로 이러한 공격과 관련된 작물 손실을 보다 더 잘 견디게된다.
미생물 공급원으로 부터 유도된 유전자의 식물에서 트랜스제닉 발현은 식물에서 이들의 발현을 최적화하기 위해 이들 유전자의 변형을 필요로한다. 이를 위하여 특히, 별도의 효소를 코딩하지만 천연 미생물에서 동일 전사물에 의해 코딩되는 세균 ORF는 식물에서 별도의 전사물로서 가장 잘 발현된다. 단리된 ORF 서열은 바람직하게는 개시 ATG 코돈 및 종결 STOP 코돈을 포함하지만 개시 ATG 및 STOP 코돈 이외에 추가의 서열을 포함할 수 있다. 또한, ORF는 잘려진 형태이지만, 여전히 필요한 활성은 갖는다. 특히, 활성을 그대로 갖게 잘려진 형태의 긴 ORF가 트랜스제닉 생물에서의 발현에 바람직할 수 있다. "식물 프로모터" 및 "식물 전사 터미네이터"라는 것은 식물 세포내에서 작용하는 프로모터 및 전사 터미네이터를 의미한다. 이는 바이러스 (예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스)와 같은 비-식물성 공급원으로 부터 유도될 수 있는 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함한다.
특정 경우, ORF 코딩 서열과 인접 서열의 수식은 필요치 않다. 관심을 갖고 있는 ORF를 함유하는 단편을 단리하고 이것을 식물 프로모터의 하류에 삽입하는 것이 충분하다. 예컨대 가프네이 일행 (Science261: 754-756 (1993))은 코딩 서열을 수식하지 않고 또 여전히 부착된 슈도모나스 유전자 ATG 상류의 56 bp 및 nahG ORF에 부착된 STOP 코돈 하류의 165 bp를 갖는 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV tml 터미네이터 존재하의 트랜스제닉 식물에서 슈도모나스 nahG 유전자를 성공적으로 발현시켰다. 미생물 서열 인접 위치에는 ATG 상류 및 STOP 코돈의 하류가 부착되어야한다.
다른 경우에는, 미생물 공급원으로 부터 유도된 유전자의 발현은 발현시에 문제를 유발할 수 있다. 이들 문제는 이 기술분야에서 잘 특징화되어 있고 또 바실루스와 같은 특정 공급원으로 부터 유도된 유전자와 공통점을 갖는다. 이들 문제는 본 발명의 APS 생합성 유전자에도 적용될 수 있고 또 이들 유전자의 수식은 이 기술분야에서 공지된 수법을 사용하여 실시될 수 있다. 이하의 문제가 생길 수 있다. (1)코돈 사용: 식물에서 바람직한 코돈 사용은 특정 미생물에서의 바람직한 코돈과 상이하다. 클론된 미생물 ORF내에의 코돈 사용을 식물에서의 사용 (표적 식물로 부터 얻은 유전자)과 비교하면 바람직하게는 변경되어야하는 ORF내의 코돈을 확인할 수 있다. 전형적으로 식물 발달은 단자엽식물의 제 3 기저 위치의 뉴클레오티드 C 및 G를 선호하는 반면에 쌍자엽식물은 흔히 상기 위치의 뉴클레오티드 A 또는 T를 사용한다. 어떤 유전자를 특정 표적 트랜스제닉 종에 대한 바람직한 코돈 용도에 맞게 수정하면, 이하의 GC/AT 함량 및 부정 스플라이싱에 나타낸 많은 문제가극복될 수 있다.
(2)GC/AT 함량: 식물 유전자는 전형적으로 35% 이상의 GC 함량을 갖는다. A 및 T가 풍부한 뉴클레오티드인 ORF 서열은 식물에서 몇가지 문제를 유발할 수 있다. 첫째, ATTTA 모티프는 메세지의 불안정화를 초래할 수 있고 많은 단명하는 mRNA의 3' 말단에서 찾을 수 있다. 둘째, 메세지내의 부적합한 위치에서 AATAAA와 같은 폴리아데닐화 신호의 발생은 전사의 조기 절단을 유발하는 것으로 보인다. 또한 단자엽식물은 AT가 풍부한 서열을 스플라이싱 위치로 인식한다(이하 참조).
(3)개시 메티오닌에 인접하는 서열: 식물은 그의 메세지가 정의된 리보솜 결합 위치를 갖지 않는 점에서 미생물과 상이하다. 오히려, 리보솜은 메세지의 5' 말단에 부착되어 번역을 개시하는 제 1 유용 ATG에 대해 스캐닝한다. 그럼에도 불구하고, ATG 옆에는 특정 뉴클레오티드가 선호되며 미생물 유전자의 발현은 ATG에서 진핵동물의 콘센서스 번역 개시제가 혼입되는 것에 의해 향상된다. 클론테크(1993/1994 카탈로그, 210 페이지)는 서열 GTCCACCATGGTC (서열확인번호: 7)를 식물에서 대장균 uidA 유전자를 발현시키기 위한 콘센서스 번역 개시제로서 제안하였다. 또한, 죠시(NAR15: 6643-6653 (1987))는 ATG옆에 있는 많은 식물 서열을 비교하고 콘센서스 TAAACAATGGCT (서열확인번호: 8)를 제안하였다. 식물에서 미생물 ORF의 발현이 문제가 있는 상황에서, 이들 서열을 개시 ATG에 부가하는 것은 번역을 향상시킬 수 있다. 이러한 경우, 콘센서스의 마지막 세개 뉴클레오티드는 두번째 AA 잔기의 수식 때문에 수식된 서열에 혼입되기에 적합하지 않을 수 있다. 개시 메티오닌 옆에 바람직한 서열은 식물 종 마다 상이하다. GenBank 데이타베이스에 존재하는 14개 옥수수 유전자의 조사는 이하의 결과를 제공한다:
상기 분석은 APS 유전자가 삽입될 소망하는 식물 종에 대하여 실시될 수 있고, 수식된 ATG 옆의 서열은 바람직한 뉴클레오티드를 혼입하도록 수식된다.
(4)부적합한 스플라이스 위치의 제거: 비-식물 공급원으로 부터 클로닝되고 식물에서 발현을 위해 최적화되지 않은 유전자는 식물에서 5' 또는 3' 스플라이스 위치로서 인식될 수 있는 모티프를 함유할 수 있다.
코딩 서열과 인접 서열의 수식 방법은 이 기술분야에서 공지되어 있다. 미생물 ORF의 초기 발현이 낮고 상술한 바와 같은 서열 변화가 적합하다고 생각되는 경우, 합성 유전자의 작성은 이 기술분에서 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 예컨대 유럽 공개특허 EP 0 385 962호(몬산토), EP 0 359 472호(루브리졸) 및 WO 93/07278호(시바-가이기)에 기재되어 있다. 대부분의 경우, 트랜스제닉 식물로 전달하기 전에 일시적인 분석 방법을 이용하여 유전자 작제물의 발현을 분석하는 것이 바람직하다.
실시예 35:식물 형질전환 벡터의 작성
식물의 형질전환에 적합한 다수의 형질전환용 벡터가 있고, 본 발명의 유전자는 이러한 벡터와 조합되어 사용될 수 있다. 사용할 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 수법 및 형질전환하려는 목적 종에 따라서 다를 것이다. 특정 표적 종의 경우, 상이한 항생물질 또는 제초제 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에 보통 사용되는 선택 마커는 카나마이신 및 관련 항생물질에 대하여 내성을 제공하는 nptII 유전자 (메싱 및 비에라, Gene19: 259-268 (1982); 베반 일행, Nature304: 184-187 (1983)), 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 bar 유전자 (화이트 일행, Nucl Acids Res18: 1062 (1990), 스펜서 일행, Theor Appl Gent79: 625-631 (1990)), 항생물질 히그로마이신에 대한 내성을 제공하는 hph 유전자 (블로칭거 및 디겔만, Mol Cell Biol4: 2929-2931), 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 제공하는 dhfr 유전자 (보우로우이스 일행, EMBO J.2(7): 1099-1104 (1983))를 포함한다.
(1) 아그로박테륨 형질전환에 적합한 벡터의 작성
아그로박테륨 튜메파시엔스를 사용한 형질전환에 유용한 많은 벡터가 있다. 이들은 전형적으로 적어도 하나의 T-DNA 경계 서열을 갖고 있으며 또 pBIN19 (베만, Nucl. Acids Res. (1984))와 같은 벡터를 포함한다. 2개의 전형적인 벡터의 작성법을 이하에 나타낸다.
pCIB200 및 pCIB2001의 작성
바이너리 벡터 pCIB200 및 pCIB2001은 아그로박테륨과 함께 사용하기 위한 재조합 벡터를 작성하기 위해 사용되며 이하의 방식으로 작성되었다. pTJS75 (슈미트호이저 및 헬린스키, J. Bacteriol.164: 446-455 (1985))를 NarI로 분해하는 것에 의해 테트라사이클린 내성 유전자를 절단한 다음 NPTII (메싱 및 비에라, Gene 19: 259-268 (1982); 베반 일행, Nature304: 184-187 (1983); 맥브라이드 일행, Plant Molecular Biology14: 266-276 (1990))를 갖는 pUC4K로 부터 AccI 단편을 삽입하는 것에 의해 pTJS75kan을 생성하였다. 좌우측 T-DNA 경계, 식물 선택성 nos/nptII 키메라 유전자 및 pUC 폴리링커(로쓰슈타인 일행, Gene53: 153-161(1987))을 함유하는 pCIB7의 EcoRV 단편에 XhoI 링커를 결찰시키고, XhoI-분해된 단편을 SalI-분해된 pTJS75kan에 클로닝시켜 pCIB200을 생성하였다 (EP 0 332 104호, 실시예 19 참조). pCIB200은 이하의 독특한 폴리링커 제한위치를 함유한다: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI 및 SalI. pCIB2001은 폴리링커에 추가의 제한위치를 삽입함으로써 작성한 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커에 있는 독특한 제한위치는 EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MIuI, BcII, AvrII, ApaI, HpaI 및 StuI이다. 이들 독특한 제한위치를 함유하는 이외에 pCIB2001은 식물 및 세균 카나마이신 선택, 아그로박테륨-매개된 형질전환에 필요한 좌우측 T-DNA 경계, 대장균과 기타 숙주 사이에서 이동에 필요한 RK2-유도된 trfA 기능 및 RK2로 부터의 OriT 및 OriV 기능을 갖는다. pCIB2001 폴리링커는 자신의 조절 서열을 함유하는 식물 발현 카세트를 클로닝하는데 적합하다.
pCIB10 및 히그로마이신 선택 유도체의 작성
바이너리 벡터 pCIB10은 식물에서 선택에 필요한 카나마이신 내성을 코딩하는 유전자, T-DNA 좌우측 경계 서열을 함유하며 대장균 및 아그로박테륨에서 복제할 수 있도록 광숙주 범위의 플라스미드 pRK252로 부터 서열을 포함한다. 이들의구조는 로쓰슈타인 일행 (Gene 53: 153-161 (1987))에 의해 기재되어 있다. 이들 유도체는 히그로마이신 (pCIB743), 또는 히그로마이신 및 카나마이신 (pCIB715, pCIB717)을 기초로하여 트랜스제닉 식물 세포를 선택할 수 있다.
(2) 비-아그로박테륨 형질전환에 적합한 벡터의 작성
아그로박테륨 튜메파시엔스를 사용하지 않은 형질전환은 선택된 형질전환 벡터에서 T-DNA 서열에 필요한 요건을 필요로하지 않고 따라서 T-DNA 서열을 함유하는 상술한 바와 같은 벡터 이외에, 이들 서열을 갖지 않는 벡터가 사용될 수 있다. 아그로박테륨에 의존하지 않는 형질전환 수법은 입자 폭파법, 원형질 흡수(예컨대 PEG 및 엘렉트로포레이션) 및 미량주입법과 같은 형질전환법을 포함한다. 벡터의 선택은 형질전환될 종의 선택에 따라서 다르다. 이하, 일부 전형적인 벡터의 작성예를 설명한다.
pCIB3064의 작성
pCIB3064는 제초제 바스타(또는 포스피노트리신)에 의해 선정되는 것과 함께 직접적인 유전자 전달 수법에 적합한 pUC-유도된 벡터이다. 플라스미드 pCIB246은 대장균 GUS 유전자에 융합된 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 전사 터미네이터를 포함하고 또 PCT 공개 출원 WO 93/07278호에 기재되어 있다. 이 벡터의 35S 프로모터는 개시 위치의 2개 ATG 서열 5'를 함유한다. 이들 위치는 ATG를 이동시키는 방식과 같이 표준 PCR 수법을 이용하여 돌연변이처리되어 제한위치 SspI 및 PvuII를 생성한다. 이들 새로운 제한위치는 독특한 SaII위치로 부터 96 내지 37 bp 떨어져 있고 또 실제의 개시 위치로 부터 101 내지 42 bp 떨어져 있다. 생성한 pCIB246의 유도체를 pCIB3025로 표시한다.
GUS 유전자는 pCIB3025를 SalI 및 SacI으로 분해시켜 절단시킨 것이고, 말단은 무딘 말단이며 또 재결찰되어 플라스미드 pCIB3060을 생성한다. 플라스미드 pJIT82는 노르위치에 있는 존 인네스 센터로 부터 구입한 것으로 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스로 부터의 bar 유전자를 함유하는 400 bp SmaI 단편을 절단해내어 pCIB3060의 HpaI 위치(톰슨 일행, EMBO J6: 2519-2513 (1987))에 삽입하였다. CaMV 35S 프로모터 및 제초제 선택용 터미네이터 제어하의 bar 유전자, 암피실린 내성 유전자(대장균 선택) 및 독특한 위치 SphI, PstI, HindIII 및 BamHI를 갖는 폴리링커를 포함하는 pCIB3064를 생성한다.
pSOG19 및 pSOG35의 작성
pSOG35는 대장균 유전자 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)를 메토트렉세이트에 대한 내성을 제공하는 선택 마커로서 사용하는 형질전환 벡터이다. PCR을 사용하여 35S 프로모터(~800 bp), 옥수수 Adh1 유전자로 부터 인트론 6(~550 bp) 및 pSOG10으로 부터 GUS 비번역 리더 서열의 18 bp를 증폭시켰다. 대장균 디히드로폴레이트 환원효소 타입 II 유전자를 코딩하는 250 bp 단편을 PCR에 의해 증폭시키고 이들 2개의 PCR 단편은 pUC19 벡터 구조 및 노팔린 합성효소 터미네이터를 포함하는 pBI221(클론테크)로 부터 얻은 SacI-PstI 단편을 사용하여 조립하였다. 이들 단편을 조립하면 인트론 6 서열, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 합성효소 터미네이터와 융합된 35S 프로모터를 함유하는 pSOG19를 생성하였다. pSOG19내에 있는 GUS 리더를 옥수수 클로로틱 모톨 바이러스 (MCMV)로 부터의 리더 서열로 대체하면벡터 pSOC35가 생성된다. pSOG19 및 pSOG35는 암피실린 내성에 대한 pUC 유전자를 가지며 또 외래 서열의 클로닝에 유용한 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 위치를 갖는다.
실시예 36: 식물 발현 카세트의 작성에 필요한 요건
트랜스제닉 식물에서 발현시키기 위한 유전자 서열을 적합한 프로모터 뒤 및 적합한 전사 터미네이터의 상류에서 발현 카세트로 조립하였다. 이들 발현 카세트는 상술한 실시예 2 내지 6에 기재된 식물 형질전환 벡터로 용이하게 전달될 수 있다.
프로모터 선택
발현 카세트에 사용된 프로모터의 선택은 트랜스제닉 식물에서 전달유전자의 공간적 및 일시적 발현 패턴을 결정할 것이다. 선택된 프로모터는 특정 세포 유형(잎 표피 세포, 메오스필 세포, 뿌리 코르텍스 세포) 또는 특정 조직 또는 기관(뿌리, 잎 또는 꽃)에서 전달유전자을 발현할 것이고 또 이 선택은 APS의 생합성에 필요한 위치를 반영할 것이다. 이와 다르게는, 선택된 프로모터는 약하게 유도되거나 또는 기타 일시적으로 조절되는 프로모터하에서 유전자를 발현할 수 있다. 다른 구체예는 선택된 프로모터는 화학적으로 조절될 수 있다. 이는 필요할 때에만 화학적 유도제 처리에 의해 APS를 유발할 수 있다.
전사 터미네이터
발현 카세트에는 다양한 전사 터미네이터가 존재한다. 이들은 전달 유전자의 전사 종결 및 이들의 정확한 폴리아데닐화에 관여한다. 식물에서 작용하는 것으로알려진 적합한 전사 터미네이터는 CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 합성효소 터미네이터, 강남콩 rbcS E9 터미네이터를 포함한다. 이들은 단자엽 식물 및 쌍자엽식물 모두에게 사용될 수 있다.
발현의 증가 및 조절을 위한 서열
전사 단위내에서 유전자 발현을 향상시키는 것으로 알려진 많은 서열이 있고 이들 서열은 본 발명의 유전자와 조합되어 트랜스제닉 식물에서의 발현을 증가시킨다.
다양한 인트론 서열은 발현, 특히 단자엽 식물 세포에서 발현을 증가시키는 것으로 알려져있다. 예컨대 옥수수 Adh1 유전자의 인트론은 옥수수 세포로 도입되면 천연의 프로모터 제어하에서 야생형 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 인트론 1은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자(콜리스 일행, Genes Develep1: 1183-1200 (1987))과 함께 조합된 융합 구조물에서 발현을 향상시키는 것으로 알려져있다. 동일한 실험계에서, 옥수수 bronze1 유전자로 부터의 인트론은 발현 향상에 있어서 유사한 효과를 갖는다(콜리스 일행, 상동). 인트론 서열은 식물 형질전환 벡터, 전형적으로 비-번역 리더내로 혼입된다.
바이러스로 부터 유도된 다수의 비-번역 리더 서열은 발현을 향상시키는 것으로 알려져있고, 또 이들은 쌍자엽식물 세포에서 특히 효과적이다. 특히, 담배 모자이크 바이러스(TMV, "Ω-서열"), 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스 (MCMV) 및 알팔파 모자이크 바이러스(AMV)로 부터의 리더 서열은 발현을 향상시키는 것으로 알려져있다(예컨대 갈리에 일행, Nucl. Acids Res.15: 8693-8711 (1987): 스쿠제스키일행, Plant Molec. Biol.15: 65-79 (1990)).
세포내에서 유전자 산물의 타겟팅
유전자 산물을 얻기 위한 다양한 메카니즘이 식물에 존재하는 것으로 알려져 있고 이들 메카니즘의 기능을 제어하는 서열은 자세하게 특징화되어 있다. 예컨대 엽록체에 대한 유전자 산물을 얻는 것은 다양한 단백질의 아미노 말단에서 발견되는 시그널 서열에 의해 제어되며 성숙 단백질을 수득하기 위해 엽록체에서 절단된다 (예컨대, 코마이 일행, J. Biol. Chem.263: 15104-15109 (1988)). 이들 시그널 신호는 이질 생성물을 엽록체로 보내는데 효과적인 이질 유전자 산물에 융합될 수 있다 (반 덴 브로엑 일행, Nature313: 358-363 (1985)). 적합한 시그널 서열을 코딩하는 DNA는 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 합성효소, GS2 단백질 및 기타 엽록체에 위치하는 것으로 공지된 많은 단백질을 코딩하는 cDNA의 5' 말단으로 부터 단리될 수 있다.
다른 유전자 산물은 미토콘드리온 및 퍼옥시좀(예컨대 웅거 일행, Plant Molec. Biol.13: 411-418 (1989))과 같은 기타 기관에 위치할 수 있다. 이들 산물을 코딩하는 cDNA는 유전자조작처리되어 이들 기관에 이질 유전자 산물을 보낼 수 있다. 이러한 서열의 예는 핵 코팅된 ATPase 및 미토콘드리아로 부터의 특정 아스파테이트 아미노 트랜스퍼라제 이소폼이다. 단백질체를 세포로 보내는 것은 로저 일행 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA82: 6512-6516 (1985))에 의해 기재되어 있다.
그 밖에, 서열들이 유전자 산물을 기타 세포 구획으로 보내는 것으로 특징지워져 있다. 아미노 말단 서열은 ER, 아포플라스트 및 호분립 세포로 부터 세포외분비에 관여한다. 부가적으로, 카르복시말단 서열과 조합된 아미노 말단 서열은 유전자 산물을 액포로 보내는 것에 관여된다.
상술한 바와 같은 적합한 표적 서열을 관심을 두고 있는 전달유전자에 융합 시킴으로써, 전달유전자 산물을 기관 또는 세포 구획으로 직접적으로 보낼 수 있다. 엽록체를 목표로하는 경우, 예컨대 RUBISCO 유전자, CAB 유전자, EPSP 합성효소 유전자 또는 GS2 유전자로 부터 얻은 엽록체 시그널 서열을 전달 유전자의 아미노 말단 ATG에 융합시켰다. 선택된 시그널 서열은 공지된 절단 위치를 가져야하고 또 작성된 융합물은 절단에 필요한 절단 위치 뒤의 아미노산을 고려해야한다. 특정 경우, 이 요건은 소량의 아미노산을 절단 위치와 전달유전자 ATG 사이에 부가하거나 또는 전달유전자 내부의 일부 아미노산을 대체하는 것에 의해 충족될 수 있다. 엽록체 수송에 대하여 작성된 융합물은 시험관내에서 전사된 작성물의 시험관내에서의 번역에 의한 엽록체 흡수 효능에 의해, 바레트 일행에 의해 기재된 수법을 이용한 시험관내 엽록체 흡수에 의해 시험될 수 있다 (데엘만 일행(편저), Methods in Chloroplast Molecular Biology, 엘스비에르, pp 1081-1091 (1982)): 와스만 일행, Mol. Gen. Genet.205: 446-453 (1986)). 이들 작성 수법은 이 기술분야에서 잘 공지되어 있고 또 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에 대하여 동일하게 적용될 수 있다. APS 생합성 유전자에 필요할 수 있는 타겟팅의 선택은 주어진 경로에서 출발지점에 필요한 전구체를 세포에 위치시키는 것에 따라 다르다. 이는 세포질 또는 엽록체일 수 있지만, 특정 경우에는 미토콘드리아 또는 퍼옥시소말일 수 있다. APS 생합성 유전자의 유전자 산물은 ER, 아포플라스트 또는 액포로 타겟팅하는 것을 필요로하지 않는다.
세포 타겟팅에 필요한 상술한 메카니즘은 동종 프로모터와 조합되어 사용될 수 있을 뿐만 아니라 이질 프로모터와 조합되어 사용될 수 있어 시그널 유도체를 목적으로 하는 프로모터의 발현 패턴과 상이한 패턴을 갖는 프로모터의 전사 조절 하에서 특수 세포 타겟팅 목표를 달성할 수 있다.
실시예 37: 발현 카세트 작성물의 예
본 발명은 프로모터의 기원에 상관없이, 식물에서 발현할 수 있는 임의의 프로모터 조절하에 APS를 코딩하는 유전자의 발현을 포함한다.
본 발명은 또한 APS 유전자의 발현에 필요하거나 발현을 위하여 선택된 다른 서열과 조합된 식물 발현성 프로모터의 사용을 포함한다. 이러한 서열은 이들에 제한되는 것은 아니라 전사 터미네이터, 발현을 향상시키기 위한 외인성 서열(인트른(예컨대 Adh 인트론 1)), 바이러스성 서열(예컨대 TMV-Ω) 및 유전자 산물을 특정 기관 및 세포 구획으로 보내기 위한 서열을 포함한다.
구성적 발현: CaMV 35S 프로모터
플라스미드 pCGN1761의 작성은 공개된 유럽 특허 0 392 225호(실시예 23)에 기재되어 있다. pCGN1761은 "이중" 35S 프로모터 및 tml 전사 터미네이터와 함께 프로모터와 터미네이터 사이에 독특한 EcoRI 위치를 함유하고 또 pUC-유형의 구조를 갖는다. 존재하는 EcoRI 위치 이외에 NotI 및 XhoI 위치를 포함하는 변형된 폴리링커를 갖는 pCGN1761의 유도체를 작성하였다. 이 유도체를 pCGN1761ENX로 칭하였다. 이 pCCN1761ENX는 트랜스제닉 식물에서 35S 프로모터 제어하에 발현이 일어나도록 cDNA 서열 또는 유전자 서열(미생물 ORF 서열 포함)을 그의 폴리링커 사이에 클로닝하는데 유용하다. 이러한 작성물의 전체 35S 프로모터-유전자 서열-tml 터미네이터 카세트는 프로모터에 대하여 5'에 HindIII, SphI, SalI 및 XbaI 위치 및 터미네이터에 대해 3'에 XbaI, BamHI 및 BglI 위치에 의해 절단되어 실시예 35에서 기재한 바와 같은 형질전환 벡터로 전달하는데 유용하다. 또한 이중 35S 프로모터 단편을 다른 프로모터로 대체하기 위해서는 5'에서 HindIII, SphI, SalI, XbaI 또는 PstI 그리고 폴리링커 제한위치 (EcoRI, NotI 또는 XhoI)중의 어느 하나로 3' 절단하는 것에 의해 제거될 수 있다.
번역 개시 위치의 최적화에 의한 pCGN1761ENX의 변형
상기 부분에서 기술한 임의의 구성중에서, 클로닝 위치에서 변형은 번역을 향상시킬 수 있는 서열을 도입하는 것에 의해 실시할 수 있다. 이는 특히 미생물로 부터 유도된 유전자가 식물 발현 카세트로 도입될 때, 이들 유전자들은 식물에서 번역 개시에 적합할 수 있는 개시 메티오닌 근처에 서열을 함유할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 미생물로 부터 유도된 유전자가 ATG 위치에서 식물 발현 카세트로 클로닝되면, 이것은 이들의 발현을 최적하기 위한 삽입 위치를 변형시키는데 유용하다. pCGN1761ENX의 변형은 식물 발현에 적합한 수개의 최적화 서열중의 어느 하나를 혼입하는 예에 기술되어 있다 (예컨대, 죠시, NAR15: 6643-6653 (1987)).
pCGN1761ENX를 SphI으로 절단하고, T4 DNA 중합효소로 처리하며 재결찰시킴으로써 이중 35S 프로모터에 대하여 5'에 위치한 SphI 위치를 파괴하였다. 이로써 벡터 pCGN1761ENX/Sph-가 생성되었다. pCGN1761ENX/Sph-를 EcoRI으로 절단하고 서열 5'-AATTCTAAAGCATGCCGATCGG-3'(서열확인번호: 9)/5'-AATTCCGATCGGCATGCTTTA-3'(서열확인번호: 10)의 어닐링된 분자 어댑터로 결찰시켰다. 이로써 벡터 pCGNSENX가 생성되며, 이것은 이들의 개시 메티오닌에서 이질 유전자를 클로닝하기에 적합한 SphI 위치의 일부인 ATG 근처의 쿼시(quasi) 최적화된 식물 번역 개시 서열 TAAA-C 를 포함한다. SphI 위치, EcoRI, NotI 및 XhoI 위치의 하류는 그대로 유지된다.
개시 ATG에서 NcoI 위치를 이용하는 다른 벡터도 작성하였다. pCGN1761NENX로 표시된 이 벡터는 서열 5'-AATTCTAAACCATGGCGATCGG-3'(서열확인번호: 11)/5'-AATTCCGATCGCCATGGTTTA-3' (서열확인번호: 12)의 어닐링된 분자 어댑터를 pCGN1761ENX EcoRI 위치 (서열확인번호 14 및 15)에 삽입하는 것에 의해 제조하였다. 따라서, 이 벡터는 NcoI 위치내에 존재하는 개시 ATG 근처에 쿼시-최적화된 서열 TAAACC을 포함한다. 하류 위치는 EcoRI, NotI 및 XhoI 이다. 그러나, 조작하기 전에 pCGN1761ENX 벡터내의 2개의 NcoI 위치 (5', 35S 프로모터 유닛의 상류 위치)를 상기 SphI에서와 유사한 방식으로 파괴시키거나 또는 다르게는 "내부-외부" PCR (인네스 일행, PCR 순서: A guide to methods and applications. 아카데미 출판사, 뉴욕 (1990); 실시예 41 참조)을 이용하여 파괴시킬 수 있다. 이 조작은 식물 cDNA 또는 리포터 유전자 서열을 클로닝 위치로 삽입한 다음 식물내에서 일반적으로 발현 분석하는 것에 의해 발현에 대한 악영향을 분석할 수 있다.
화학적으로 조절가능항 프로모터하의 발현
여기서는 pCGN1761ENX내의 이중 35S 프로모터를 다른 프로모터로 대체하는 것을 기술하고 있다; 그 예로서 화학적으로 조절된 PR-1a 프로모터가 기재되어 있다. 프로모터의 선택은 제한효소에 의해 공급원을 절단함으로써 수득하지만, 다르게는 적합한 말단 제한위치를 갖고 있는 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시킬 수도 있다. PCR 증폭을 실시해야하다면, 프로모터는 표적 벡터에서 증폭된 프로모터를 클로닝한 후 증폭 에러를 확인하기 위해 재서열결정해야한다. 화학적으로 조절 가능한 담배 PR-1a 프로모터를 플라스미드 pCIB1004 (EP 0 332 104호, 실시예 21 참조)로 부터 절단해내고 플라스미드 pCGN1761ENX로 전달하였다. pCIB1004를 NcoI으로 절단하고 생성된 선형화된 단편의 3' 오버행을 T4 DNA 중합효소 처리로써 무디게 만들었다. 단편을 HindIII로 절단하고 그 단편을 함유하는 생성한 PR-1a 프로모터를 겔 정제하며 또 이중 35S 프로모터가 제거된 pCGN1761ENX로 클로닝하였다. XhoI으로 절단하고 T4 중합효소로 무디게 만든 다음 대형의 벡터 터미네이터 함유 단편을 단리하여 pCIB1004 프로모터 단편을 클로닝시켰다. 이로써 PR-1a 프로모터 및 tml 터미네이터와 함께 독특한 EcoRI과 NotI 위치 사이에 폴리링커를 갖는 pCGN1761ENX 유도체를 생성하였다. 선택된 APS 유전자를 벡터에 삽입하고 융합 생성물(즉, 프로모터-유전자-터미네이터)을 선택된 형질전환 벡터로 형절전환시켰다.
구성적 발현: 액틴 프로모터
액틴의 몇개 이소폼이 대부분의 세포 유형에서 발현되는 것으로 알려져있고 따라서 액틴 프로모터는 구성적 프로모터로 적합하다. 특히 벼 Act1 유전자로 부터 프로모터는 클로닝되어 특징화되어 있다 (McElroy 일행, Plant Cell2: 163-171 (1990)). 프로모터의 1.3 kb 단편은 벼 원형질에서 발현하기에 필요한 모든 조절 원소를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 또한 Act1 프로모터를 기본한 다수의 발현 벡터가 단자엽식물에 사용하기 위해 특이적으로 작성되었다 (McElroy 일행, Mol. Gen. Genet.231: 150-160 (1991)). 이들은 Actl-인트론 1, Adh 1 5' 인접 서열 및 Adh1-인트론 1 (옥수수 알코올 데히드로게나제 유전자) 및 CaMV 35S 프로모터로 부터 수득한 서열에 혼입된다. 최고의 발현을 나타내는 벡터는 35S 융합물이고 또 Act1 인트론 또는 Act1 5'-인접 서열 및 Act1 인트론의 융합물이다. 개시 ATG(GUS 리포터 유전자의) 근처의 서열을 최적화하면 발현이 향상된다. 맥엘로이 일행(Mol. Gen. Genet,231: 150-160 (1991))에 의해 기재된 프로모터 발현 카세트는 APS 생합성 유전자의 발현을 위해 쉽게 변형될 수 있고 또 단자엽식물 숙주에서 사용하기에 특히 적합하다. 예컨대 단편을 함유하는 프로모터는 맥엘로이 구조로부터 제거될 수 있고 pCGN1761ENX에서 이중 35S 프로모터를 대체할 수 있고, 특정 유전자 서열의 삽입에 유용하다. 이렇게하여 작성된 융합 유전자를 적합한 형질전환 벡터에 전달하였다. 다른 보고에서는 제 1 인트론을 갖는 Act1 프로모터는 배양된 보리 세포에서 높은 직접적 발현율을 나타내었다(치바르 일행, Plant Cell Rep.12: 506-509 (1993)).
구성적 발현: 유비퀴틴 프로모터
유비퀴틴은 많은 세포 유형에서 축적되는 것으로 알려진 유전자 산물로서 그의 프로모터는 트랜스제닉 식물에 사용하기 위해 몇개의 종으로 부터 클로닝되었다(예컨대, 해바라기-비네트 일행, Plant Science79: 87-94 (1991)), 옥수수-크리스텐센 일행, Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)). 옥수수 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 단자엽계에서 개발되었고, 단자엽 형질전환에 대하여 작성된 그의 서열 및 벡터는 특허 공개 유럽특허 0 342 926호(루브리졸)에 기재되어 있다. 또한 테일러 일행(Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993))은 옥수수 유비퀴틴 프로모터 및 제 1 인트론을 포함하는 벡터(pAHC25)를 기술하고 있으며 또 미량주입 폭파법을 통하여 도입될 때 다수의 단자엽 식물의 세포 현탁액에서 높은 활성을 나타낸다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물, 특히 단자엽식물에서 APS 생합성 유전자를 발현하는데 특히 적합하다. 적합한 벡터는 pAIIC25의 유도체이거나 또는 본 출원에 기재된 형질전환 벡터중의 어느 하나일 수 있으며, 적합한 유비퀴틴 프로모터 및/또는 인트론 서열을 도입하는 것에 의해 변형될 수 있다.
뿌리 특이적 발현
본 발명의 APS에 대한 바람직한 발현 패턴은 뿌리 발현이다. 뿌리 발현은 리족토니아 및 피튬과 같은 토양 생성 식물병원체의 제어에 특히 유용하다. 잎 및 꽃 조직 및 종자에서 APS가 동시에 축적됨없이 뿌리 조직에서만 APS를 발현시키는 것은 뿌리 침입 식물병원체를 제어하는데 유리할 것이다. 적합한 뿌리 프로모터는 데 프라몬드(FEBS290: 103-106 (1991))에 의해 기재된 것으로 유럽 공개 특허 공보 0 452 269호(시바-가이기)에 기재되어 있다. 이 프로모터는 관심을 두고 있는 APS를 삽입하기 위해 pCGN1761ENX와 같은 적합한 벡터로 전달된 다음 전체 프로모터-유전자-터미네이터 카세트를 관심을 두고 있는 형질전환 벡터로 전달한다.
상처 유도성 프로모터
상처 유도성 프로모터는 상처 유도될 때 뿐만 아니라 식물병원체 감염 위치에서 전형적으로 활성이기 때문에 APS 생합성 유전자의 발현에 특히 적합하다. 이러한 수많은 프로모터가 기재되어 있고(예컨대 Xu 일행, Plant Molec. Biol.22: 573-588 (1993), 로게만 일행, Plant Cell 1: 151-153 (1989), 로마이어 및 레흘러, Plant Molec. Biol.22: 783-792 (1993)), 피렉 일행, Plant Molec. Biol.22: 129-142(1993), 와너 일행, Plant J.3, 191-201 (1993))) 또 이들은 모두 본 발명에 바람직하게 사용될 수 있다. 로게만 일행(상동)은 쌍자엽식물인 감자 wun1 유전자의 5' 상류 서열을 기술하고 있다. Xu 일행(상동)은 쌍자엽 식물인 감자로 부터 얻은 상처 유도성 프로모터(pin2)가 단자엽식물인 벼에서 활성이라고 기재하고 있다. 또한 로르마이어 및 레레 (상동)는 상처로 유발된 것으로 표준 수법을 이용하여 천연 프로모터를 단리하기 위해 사용될 수 있다고 기재된 옥수수 Wip1 cDNA의 클로닝을 기재하고 있다. 유사하게, 프렉 일행(상동) 및 와너 일행(상동)은 국부적인 상처 위치 및 병원체 침입 위치에서 발현된 단자엽 식물 아스파라구스 오피시날리스로 부터의 상처 유발된 유전자를 기술하였다. 이 기술분에서 공지된 클로닝 수법을 이용하여, 이들 프로모터는 적합한 벡터로 전달될 수 있고, 본 발명의 APS 생합성 유전자에 융합되어 식물병원성 감염 위치에서 이들 유전자의 발현을 위해 사용되었다.
피트 특이적 발현
특허출원 WO93/07278호(시바-가이기)에는 피트(심) 세포에서 특이하게 발현되는 옥수수 trpA 유전자의 단리가 기재되어 있다. 전사 개시 위치로 부터 -1726 뉴클레오티드 까지 연장된 유전자 서열 및 프로모터가 제시되어 있다. 표준 분자 생물학적 수법을 이용하여, 이 프로모터 또는 그의 일부를 pCGN1761과 같은 벡터로전달하고 그곳에서 35S 프로모터를 대체하여 피트 특이적 방식으로 외래 유전자의 발현을 유발한다. 사실상 피트 특이적 프로모터 또는 그의 일부를 함유하는 단편은 벡터로 전달되어 트랜스제닉 식물에서 변형될 수 있다.
화분 특이적 발현
특허출원 WO 93/07278호(시바-가이기)애는 화분 세포에서 발현된 옥수수 칼슘 의존적 단백질 키나제(CDPK)의 단리가 기재되어 있다. 유전자 서열 및 프로모터는 전사개시 위치로 부터 1400 bp까지 걸쳐 존재한다. 표준 분자 생물학적 수법을 이용하여, 상기 프로모터 또는 그의 일부를 pCGN1761과 같은 벡터로 전달하고 그곳에서 35S 프로모터를 대체하며 화분 특이적 방식으로 외래 유전자의 발현을 실시하였다.
잎 특이적 발현
포스페놀 카르복시라제(PEPC)를 코딩하는 옥수수 유전자는 허드 스페트 및 그룰라 (Plant Molec Biol 12: 579-589 (1989)에 의해 기재되어 있다. 표준 분자 생물학적 수법을 이용하여 상기 유전자에 대한 프로모터를 사용하여 트랜스제닉 식물에서 잎 특이적 방식으로 유전자 발현을 유발하였다.
엽록체를 향한 발현
첸 및 자겐도르프 (J. Biol. Chem.268: 2363-2367(1993))는 이질 전달 유전자의 수송에 대한 엽록체 전달 펩티드의 성공적인 사용을 기술하고 있다. 사용된 펩티드는 니코티아나 플럼바기니폴리아(폴슨 일행, Mol. Gen. Genet.205: 193-200(1986))의 rbcS 유전자로 부터의 전달 펩티드이다. 제한효소 DraI 및 SphI을 사용하거나, 또는 Tsp5091 및 Sph1을 사용하여, 전달 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 코스미드 prbcS-BB(폴슨 일행, 상동)으로 부터 절단해낼 수 있고 또 상술한 작제물 중의 어느 하나와 함께 조작될 수 있다. DraI-SphI 단편은 개시 rbcS ATG에 대하여 -58로 부터 절단 위치를 수송한 직후 성숙 펩티드의 제 1 아미노산(메티오닌) 까지 연결되며, Tsp5091-SphI 단편은 개시 rbcS ATG에 대하여 -8로 부터 성숙 펩티드의 제 1 아미노산 까지 연결되어 있다. 따라서 이들 단편은 선정된 프로모터의 비-번역 리더에 대하여 전사 융합물을 생성하는 발현 카세트의 폴리링커로 적합하게 삽입되는 반면에, 전달 펩티드의 하류에서 필요한 APS 유전자가 정확한 융합물로 삽입되게 한다. 이러한 종류의 작성은 이 기술분야에서 통상적인 것이다. 예컨대, DraI 말단은 이미 무딘 말단인 반면에, 5' Tsp5091 위치는 T4 중합효소 처리에 의해 무딘 말단으로 되거나, 또는 링커 또는 어댑터 서열에 결찰되어 선택된 프로모터에 대한 융합을 용이하게한다. 3' SphI 위치는 그대로 유지되거나, 또는 어댑터 또는 링커 서열에 결찰되어 선택된 APS 유전자의 삽입에 필요한 유용한 제한위치를 만들도록 선택된 벡터로의 삽입을 용이하게한다. 이상적으로는, SphI 위치의 ATG는 유지되고 또 선택된 APS 유전자의 제 1 ATG를 포함한다. 첸 및 자겐도르프(상동)는 엽록체 이동을 위하여 이상적인 절단에 필요한 콘센서스 서열을 제공하고, 또 그러한 경우 메티오닌은 성숙 단백질의 제 1 위치애 존재하는 것이 바람직하다. 그다음 위치에서는 변형이 있을 수 있고 그 아미노산은 그리 중요하지 않다. 어떤 경우든, 융합 구조는 바트레트 일행(Edelmann 일행(편저), Methods in Chloroplast Molecular Biolgy, 엘스비어, 1081-1091 페이지 (1982)) 및 와스 만 일행(Mol.Gen. Genet.250: 446-453 (1986))에 기재된 방법을 이용하여 시험관내 이동 효율성에 대해 평가할 수 있다. 전형적으로, 가장 좋은 방법은 아미노 말단에서 아무런 변형없이 선택된 APS 유전자를 사용하여 융합물을 생성하고 이러한 융합물이 고효율로 엽록체로 수송되지 않으면 변형물을 혼입하는 것이 바람직하고, 이러한 변형은 문헌에 따라서 실시할 수 있다(첸 및 자겐도르프, 상동; 와스만 일행, 상동: Ko & Ko, J. Biol. Chem.267: 13910-13916 (1992)).
바람직한 벡터는 prbcS-8B로 부터의 단편을 코딩하는 DraI-SphI 전사물 펩티드를 클로닝 벡터 pCGN1761ENX/Sph-에 전달하는 것에 의해 작성한다. 이 플라스미드를 EcoRI으로 절단하고 말단을 T4 DNA 중합효소로 처리함으로써 무딘 말단으로 만들었다. 플라스미드 prbcS-8B를 SphI으로 절단하고 또 서열 5'-CCAGCTGGAATTCCG-3'(서열확인번호: 13)/5'-CGGAATTCCAGCTGGCATG-3'(서열확인번호: 14)의 어닐링된 분자 어댑터에 결찰시켰다. 그 생성물을 T4 키나제로 처리함으로써 5'말단 포스포릴화시켰다. 이어 DraI으로 절단하여 상술한 변형된 벡터의 무딘 말단 ex-EcoRI 위치로 결찰된 단편을 코딩하는 전달 펩티드를 생성하였다. 35S 프로모터의 3' 말단에 인접한 삽입물의 5' 말단으로 향하는 클론을 서열결정법에 의해 확인하였다. 이들 클론은 rbcS ATG에 대하여 -58에서 부터 성숙 단백질의 ATG에 이르는 rbcS-8A 프로모터-전달 펩티드 서열로 35S 리더 서열이 융합된 DNA 융합물 및 독특한 SphI 위치, 새로이 작성된 EcoRI 위치 뿐만 아니라 기존의 pCGN1761ENX의 NotI 및 XhoI 위치를 포함한다. 이 새로운 벡터를 pCGN1761/CT로 명명한다. PCR 수법을 이용하고 SphI, NsphI 또는 NIaIII 위치를 증폭된 ATG에 삽입하는 것에 의해 DNA 서열을pCGN1761/CT로 전달한 다음 적합한 효소로 제한 효소를 분해하여 SphI-분해된 pCGN1761/CT에 결찰시켰다. 작성을 용이하게 하기 위해, 클로닝된 유전자의 제 2 아미노산을 변화시킬 수도 있지만, 대부분의 경우 표준 위치특이적 돌연변이법과 함께 PCR법을 이용하면 절단 위치 근처에 소망하는 서열 및 성숙 단백질의 제 1 메티오닌을 구조를 만들 수 있다.
pCGN1761ENX의 이중 35S 프로모터를, 뉴클레오티드 -1038 (전사 개시 위치에 대하여) 부터 성숙 단백질의 제 1 메티오닌 까지의 전체 길이 조절되는 prbcS-8A 프로모터를 함유하는 prbcS-8A의 BamHI-SphI 단편으로 대체하는 것에 의해 바람직한 벡터를 작성하였다. 파괴된 SphI 위치를 갖는 변형된 pCGN1761을 PstI 및 EcoRI으로 절단시키고 또 T4 DNA 중합효소로 처리하여 무딘 말단을 만들었다. prbcS-8A를 SphI으로 절단하고 상술한 서열의 어닐링된 분자 어댑터로 결찰시켰다. 생성한 생성물은 T4 키나제로 처리함으로써 제조한 5' 말단 포스포릴화된 것이다. 이어 BamHI으로 절단하여 T4 DNA 중합효소로 처리된 단편을 함유하는 프로모터-전달 펩티드를 방출하여 BamIII 무딘 말단을 생성한다. 이렇게 하여 생성한 프로모터 전달 펩티드 단편을 pCGN1761ENX 벡터로 클로닝하고, rbcS-8A 프로모터 및 전달 펩티드와 함께 이질 유전자를 삽입하기 위한 절단 위치에 위치하는 SphI 위치를 갖는 구조물을 생성하였다. 이이 SphI 위치의 하류에는 EcoRI(재생 됨), NotI 및 XhoI 클로닝 위치를 생성하였다. 이 작재물을 pCGN1761rbcS/CT로 명명한다.
기타 공급원(단자엽식물 및 쌍자엽식물) 및 기타 유전자로 부터 서열을 코딩하는 기타 GS2 엽록체 전달 펩티드를 이용하여 유사한 조작을 실시할 수 있다. 또한 미토콘드리아와 같은 아세포 구획으로 보내기 위해 유사한 과정을 실시할 수 도있다.
실시예 38: APS 유전자를 발현하기에 적합한 새로운 프로모터의 단리수법
상술한 수법중의 어느 하나를 이용하고 표준분자생물학적 수법을 이용하여 새로운 프로모터를 단리하였다. 일단 단리하면, 이들을 GUS 또는 LUC와 같은 리포터 유전자애 융합시키고 이들의 트랜스제닉 식물에서의 발현 패턴을 분석하였다(제퍼슨 일행, EMBO J.6: 3901-3907 (1987): 오우 일행, Science234: 856-859(1986)). 소망하는 발현 패턴을 나타내는 프로모터를 식물에서 발현시키기 위해 APS 유전자애 융합시켰다.
마이너스 cDNA 클로닝
마이너스 cDNA 클로닝 수법은 mRNA의 특정 집단에 풍부한 cDNA 라이브러리의 생성에 유리하다(예컨대, Hara 일행, Nucl, Acids Res.19: 1097-7104(1991)). 최근, 소량 조직으로 부터 마이너스 라이브러리를 작성하는 수법이 제안되어 왔다 (샤프마 일행, Biotechniques15: 610-612(1993)). 이들 수법은 상처입거나 병원체 감염된 부위 바로 근처의 조직과 같은 소량으로 이용될 수 있는 조직특이적 메세지 증대에 적합하다.
표준 플러스/마이너스 수법에 의한 분별 스크리닝
상이한 RNA 집단(즉, 뿌리 대 전체 식물, 줄기 특이적 대 전체 식물, 국부적인 병원체 감염 부위 대 전체 식물 등)으로 부터 유도된 cDNA를 갖는 λ 파아지를 저 밀도로 플레이팅하고 2개 세트의 혼성화 필터로 전달하였다(분별 스크리닝 수법을 위하여, Calvet, Pediatr. Nephrol.5: 751-757 (1991) 참조). "선택" RNA 집단으로 부터 유도된 cDNA를 제 1 세트에 혼성시키고 또 전체 식물 RNA로 부터 유도된 cDNA를 제 2 필터 세트에 혼성시켰다. 제 1 프로브에 혼성되지만 제 2 프로브에는 혼성되지 않는 플라크를 다음 평가를 위해 선택하였다. 이들을 선택하여 이들의 cDNA를 "선택" RNA 대 다양한 조직 및 공급원으로 부터 얻은 RNA를 노던 블럿 스크리닝하기 위해 사용하였다. 동종 프로모터를 단리할 수 있는 게놈 라이브러리로 부터 유전자 서열을 클로닝하기 위해 필요한 발현 패턴을 갖는 클론을 사용하였다. 클로닝된 프로모터의 500 내지 5000 bp 사이에 리포터 유전자(예컨대, GUS, LUC)를 융합시키고 또 발현 분석을 위해 트랜스제닉 식물로 재도입하였다.
분별 디스플레이를 위한 분별 스크리닝
상이한 공급원, 즉 선택 공급원 및 대조용인 전체 식물로 부터 RNA를 단리하고, 리앙 및 파르디 (Science257: 967-971 (1992))의 분별 디스플레이 수법에 처리시켰다. 선택 RNA에서는 나타나지만 대조용에서는 나타나지 않는 증폭된 단편을 겔 정제시키고 상술한 바와 같이 상이한 RNA 샘플을 갖는 노던 블럿상에서 프로브로서 이용하였다. 필요한 RNA에 대해 선택적으로 혼성화되는 단편을 클로닝하고 프로모터가 단리될 수 있는 cDNA 및 게놈 DNA 단편을 단리하기 위한 프로브로서 사용한다. 단리된 프로모터를 상술한 바와 같이 GUS 또는 LUC 리포터 유전자에 융합시켜 트랜스제닉 식물에서 발현 패턴을 평가하였다.
"프로모터 트랩"수법을 이용한 프로모터 단리
프로모터없는 리포터 유전자를 트랜스제닉 식물에 삽입하는 것은 소망하는세포 유형에서 발현을 구동하거나 또는 소망하는 강도를 갖는 숙주 식물에서 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 수법의 변형은 오트 및 추아(Mol. Gen. Genet.223: 169-179 (1990)) 및 케르분디트 일행(Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 5212-5216 (1991))에 의해 기재되어 있다. 표준 트랜스제닉 실험에서, 숙주 게놈에서 엔헨서 원소를 확인하기 위해 동일한 원리가 적용될 수 있으며, 특정 전달 유전자는 특히 고수준으로 발현될 수 있다.
실시예 39: 쌍자엽식물의 형질전환
쌍자엽식물에 대한 형질전환 수법은 이 기술분야에서 공지된 것이고 아그로박테륨을 기본한 수법 및 아그로박테륨을 필요로하지 않는 수법을 포함한다. 비-아그로박테륨 수법은 원형질 또는 세포에 의해 직접적으로 외인성 유전자 물질을 혼입하는 것을 포함한다. 이것은 PEG 또는 엘렉트로포레이션 매개 혼입, 입자 폭파 매개 전달 또는 미량주입에 의해 달성될 수 있다. 이들 수법의 예는 파스코우스키 일행, EMBO J.3: 2717-2722 (1984), 포트리쿠스 일행, Mol. Gen. Genet.199: 169-177 (1985), 라이히 일행, Biotechnology 4: 1001-1004(1986) 및 클라인 일행, Nature327: 70-73 (1987)에 의해 기재되어 있다. 각 경우, 형질전환된 세포는 이 기술분야의 표준 수법을 이용하여 전체 식물로 재생될 수 있다.
아그로박테륨 매개 형질전환은 많은 상이한 종에 대하여 넓은 유용성과 고효율의 형질전환율을 갖기 때문에 쌍자엽식물의 형질전환에 특히 바람직한 수법이다. 아그로박테륨에 의해 통상적으로 형질전환가능한 많은 작물종은 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 평지, 감자, 대두, 알팔파 및 포플라(EP 0 317 511호(목화), EP 0249 432호 (감자, 칼겐), WO 87/07299호 (브라시카, 칼겐), US 4,795,855호(포플라)를 포함한다. 아그로박테륨 형질전환법은 전형적으로 외래 DNA를 갖는 바이너리 벡터를 적합한 아그로박테륨 균주로 전달하는 것을 포함하며 이것은 동시에 존재하는 Ti 플라스미드 또는 염색체중 어느 하나에 숙주 아그로박테륨 균주에 의해 실시된 vir 유전자의 상보성검정에 따라 다르다 (예컨대, pCIB200 및 pCIB2001에 대한 CIB542 균주 (유크네스 일행, Plant Cell5: 159-169 (1993)). 재조합 바이너리 벡터를 아그로박테륨으로 전달하는 것은 재조합 바이너리 벡터를 갖는 대장균, pRK2013과 같은 플라스미드를 갖고 또 목적하는 아그로박테륨 균주에 대하여 재조합 바이너리 벡터를 이동시키는 헬퍼 대장균 균주를 사용하여 삼친 교배수법으로 실시한다. 이와다르게는, 재조합 바이너리 벡터는 DNA 형질전환수법에 의해 아그로박테륨으로 전달될 수 있다(회프겐 및 빌미처, Nucl. Acids Res.16: 9877 (1988)).
재조합 아그로박테륨에 의한 표적 식물종의 형질전환은 아그로박테륨을 식물의 이식물과 함께 공동배양하는 것 포함하며 그 수법은 이 기술분야에서 공지되어있다. 형질전환된 조직은 바이너리 플라스미드 T-DNA 경계 사이에 존재하는 항생물질 또는 제초제 내성 마커를 갖는 선택성 배지에서 재생된다.
실시예 40: 단자엽식물의 형질전환
단자엽 식물종의 형질전환은 통상적인 수법이 되고 있다. 바람직한 수법은 PEG 또는 엘렉트로포레이숀 수법을 이용하여 유전자를 직접적으로 원형질에 도입하는 방법 및 캘러스 조직으로 입자 폭파하는 방법을 포함한다. 형질전환은 단일 DNA종 또는 다수 DNA종(즉, 공동형질전환)을 사용하여 실시할 수 있고 이들 수법들은 본 발명에 모두 적합하다. 공동형질전환은 복잡한 벡터 구성을 피할 수 있고, 관심을 두고 있는 유전자의 결합되지 않은 로치(loci) 및 선택 마커를 갖는 트랜스제닉 식물을 생성하며, 뒤이은 세대에서 선택 마커를 제거할 수 있는 바람직한 이점을 갖는다. 그러나 공동형질전환법의 단점은 개별의 DNA종이 게놈으로 통합된 100% 미만이라는 것이다 (쇼커 일행 Biotechnology4: 1093-1096 (1986)).
특허출원 EP 0 292 435호(시바 가이기), EP 0 392 225호(시바 가이기) 및 WO 93/07278호(시바 가이기)에는 엘리트 근교계의 옥수수로 부터 캘러스 및 원형질을 제조하는 수법, PEG 또는 엘렉트로포레이션을 이용한 원형질의 형질전환법 및 형질전환된 원형질로 부터 옥수수 식물을 재생하는 방법이 기재되어 있다. 고돈-캄 일행(Plant Cell2: 603-618 (1990)) 및 프롬 일행(Biotechnology8: 833-839 (1990))은 입자 폭파법을 이용하여 A188-유도된 옥수수계를 형질전환시키는 방법을 제안하였다. 또한 WO 93/07278호(시바-가이기) 및 코지엘 일행(Biotechnology11: 194-200 (1993))은 입자 폭파법에 의해 엘리트 근교계 옥수수를 형질전환시키는 방법을 기재하였다. 이 수법은 수정된지 14 내지 15일 후의 옥수수 이삭으로 부터 절단된 1.5 내지 2.5 mm 길이의 미성숙 옥수수 배 및 폭파를 위한 PDS-1000He 바이 올리스틱스 장치를 이용한다.
벼의 형질전환은 원형질 또는 입자 폭파법을 이용하여 직접적인 유전자 전달 수법에 의해 실시할 수 있다. 원형질 매개된 형질전환법은 자포니카-유형 및 인디카-유형(Zhang 일행, Plant Cell Rep7: 379-384 (1988); 시마모토 일행, Nature338: 274-277 (1989); 다타 일행, Biotechnology8: 736-740 (1990))에 대하여 기재되어 있다. 양쪽 유형은 입자 폭파법을 이용하여 통상적으로 형질전환가능하다(크리스토우 일행, Biotechnology9: 957-962(1991)).
특허출원 EP 0 332 581호(시바 가이기)애는 푸이데아애 (Pooideae) 원형질의 생성, 형질전환 및 재생수법이 기재되어 있다. 이들 수법은 닥틸리스 및 밀의 형질전환을 가능하게 한다. 또한 밀 형질전환법은 입자 폭파법을 이용하여 타입 C 장기간 재생가능한 캘러스 세포로 형질전환하는 방법이 바실 일행(Biotechnology10: 667-674 (1992))에 의해 기재되어 있고 또 미성숙 배 및 미성숙 배 유도된 캘러스를 입자 폭파법을 이용하여 형질전환시키는 방법이 바실 일행(Biotechnology11: 1553-1558 (1993)) 및 위크스 일행 (Plant Physiol.102: 1077-1084 (1993))에 의해 기재되어 있다. 밀 형질전환에 바람직한 형질전환법은 미성숙 배의 입자 폭파법에 의한 밀의 형질전환을 포함하고 또 유전자 전달하기 전에 높은 수크로오스 또는 높은 말토오스 단계를 포함한다. 폭파하기 전에, 다수의 배(0.75-1 mm 길이)를 3% 수크로오스(무라시가 및 스쿠그, Physiologia Plantarum15: 473-497 (1962)) 및 3 mg/l 2,4-D를 갖는 MS 배지로 플레이팅하여 체세포 배를 유도하여 암소에서 두었다. 폭파 선택일에, 배를 유도 배지로 부터 제거하고 또 오스모티쿰(즉, 소망하는 농도, 전형적으로 15%로 부가된 수크로오스 또는 말토오스를 갖는 유도 배지)에 방치하였다. 배를 2 내지 3 시간 동안 원형질 용해처리시킨 다음 폭파시켰다. 목적 플레이트당 20개의 배가 전형적이지만 중요하지는 않다. 적합한 유전자를 갖는 플라스미드(pCB3064 또는 pSG35)를 표준 수법을 이용하여 마이크로미터 크기의 금 입자상으로 석출시켰다. 각 플레이트의 배를 표준 80 메쉬 스크린을 이용하여 ~1000 psi의 파열 압력을 이용하여 듀풍 Biolistics?헬륨 장치로써 쏘았다. 폭파후, 배를 암소로 보내 약 24 시간 동안 방치하였다(여전히 오스모티쿰상에서). 24시간 후, 배를 오스모티쿰으로 부터 제거해서 유도배지로 다시 보내어 그곳에서 재생하기 전에 약 한달간 유지시켰다. 약 한달 후, 발생중인 배 캘러스를 갖는 배 이식물을 추가로 적합한 선택제(pCIB3064의 경우 10 m/l 바스타 그리고 pSOG35의 경우 2 mg/l의 메토트렉세이트)를 함유하는 재생 배지(MS + 1mg/리터 NAA, 5 mg/리터 GA)로 전달하였다. 약 한달 후, 발생된 순을 반강도 MS, 2% 수크로오스 및 동일 농도의 선택제를 함유하는 GA7s로 공지된 대형 멸균 용기로 전달하였다. 특허 출원 WO 94/13822호는 밀 형질전환방법을 기재하고 있으며 이것은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.
실시예 41: 트렌스제닉 식물에서 피롤니트린의 발현
모든 4개 피롤니트린 ORF의 GC 함량은 62 내지 68%이므로 식물에서 발현될 때 AT-함량 관련된 문제가 예상될 수 있다. 그러나 적합한 표적 식물종에서 바람직한 코돈을 포함하는 유전자를 변형시키는 것이 유리하다. 하기한 종류의 융합은 변형을 가하거나 가하지 않고 실시될 수 있다(예컨대, 식물에서 번역 개시를 위해 또는 발현 향상을 위해).
35S 프로모터 뒤의 발현
4개의 피롤니트린 ORF 각각을 유전자조작하기 위해 pBluescript KS II로 전달하였다. 이것은 각 유전자의 말단과 상동인 프라이머를 사용하여 PCR 증폭법에 의해 실시되며 또 증폭된 단편을 pBluescript 벡터로 전달하기 위한 제한위치를 포함한다. ORF1의 경우, 아미노 말단 프라이머는 SalI 위치를 포함하고 또 카르복시 말단 프라이머는 NotI 위치를 포함한다. 이와 유사하게 ORF2의 경우, 아미노말단 프라이머는 SalI 위치를 포함하고 또 카르복시말단 프라이머는 NotI 위치를 포함한다. 이와 유사하게 ORF3의 경우, 아미노말단 프라이머는 NotI 위치를 포함하고 또 카르복시말단 프라이머는 XhoI 위치를 포함한다. 이와 유사하게, ORF4의 경우, 아미노말단 프라이머는 NotI 위치를 포함하고 또 카르복시말단 프라이머는 XhoI 위치를 포함한다. 따라서, 증폭된 단편을 적합한 제한 효소(이들이 ORF내에서 절단하지 않기 때문에 선택)로 절단한 다음 pBluescript로 결찰시켜 상응하게 절단시켰다. pBluescript 내의 개별 ORF의 클로닝은 다음 유전자조작을 가능하게한다.
다음 구조에 필요한 내부 제한위치를 분해시키는 것은 내부-외부 PCR법을 이용하여 실시한다(이네스 일행, PCR Protocols: A guide to methods and applications, 아카데미 출판사, 뉴욕 (1990)). 분해될 위치 옆(이상적으로는 분해될 위치로 부터 100 내지 500 bp) 및 2개의 개별 증폭 위치에서 독특한 제한위치를 설계한다. 하나는 분해될 위치의 좌측의 독특한 위치로 부터 연장되고 파괴될 위치까지의 DNA를 증폭시키며 상기 위치로 부터 올리고뉴클레오티드를 증폭시키고 적합한 염기 변화를 혼입함으로써 분해하였다. 제 2 증폭은 파괴될 위치에서 부터 분해될 위치의 우측의 독특한 위치로 까지 걸쳐 있다. 제 2 반응에서 파괴될 위치에 있는 올리고뉴클레오티드는 제 1 증폭에서와 같이 동일한 염기 변화를 혼입하므로 이상적으로 제 1 반응으로 부터 얻은 올리고뉴클레오티드와 10 내지 25개 뉴클레오티드가 중복된다. 따라서, 양 반응의 생성물은 각 증폭에서 실시된 제한위치에서 동일한 염기 변화를 갖는 점에서 중복된다. 2회 증폭후, 증폭된 생성물을 겔 정제(사용된 4개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제거하기 위해)하고, 함께 혼합한 다음 독특한 제한위치에 걸친 2개의 프라이머를 사용한 PCR 반응에서 재증폭시켜 혼합하였다. 최종 PCR반응에서, 2개의 증폭된 단편 사이를 중첩하는 것은 합성의 제 1 기에 필요한 프라이밍을 제공한다. 이 반응의 생성물은 독특한 제한위치의 좌측에서 부터 독특한 제한위치 우측까지 걸쳐 있으며 또 내부에 위치하는 변형된 제한 위치를 포함한다. 이 생성물은 독특한 위치를 갖도록 절단되며 또 야생형 단편을 치환함으로써 적합한 위치에서 변형되지 않은 유전자로 삽입된다.
ORF1가 첫 내부 SphI 위치 2개를 갖지 않도록 하기 위해, 독특한 XmaI 및 EspI에 상동인 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 제 1 SphI 위치 근처에 있고 또 서열 ....CCCCCTCATGC.... (하부 가닥, 서열확인번호: 15)을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 함께 XmaI 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응에 이용하여 SphI 위치에 염기 변화를 도입하였다. 제 2 PCR 반응은 서열 .....GCATGAGGGGG.....(서열확인번호: 16)을 포함하는 SphI 위치(상부 가닥)와 인접하는 올리고뉴클레오티드를 이용하며, EspI 위치 근처의 올리고뉴클레오티드와 조합되어 사용한다. 2개의 생성물을 겔 정제하고 XmaI 및 EspI 근처의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시키고 생성한 단편을 XmaI 및 EspI으로 절단하며 ORF1 클론에서 천연 단편을 치환하기 위해 사용하였다. 상술한 내용에 따르면, 변형된 SphI 위치는 GCATGA이고 코돈 변화를초래하지 않는다. 상기 위치에서 아미노산 통합성에 영향을 주지 않고 다른 변화도 가능하다(즉, 제 2 뉴클레오티드를 G, T 또는 A로 변경). ORF1중의 제 2 SphI 위치를 파괴하기 위해서도 상기와 유사한 방법을 이용한다. 이 경우, EspI은 적합한 좌측 제한위치이고 또 우측 제한위치는 ORF 서열에서 발견되지 않는 유전자 또는 SstI의 3' 말단 근처에 위치하지만 pBluescript 폴리링커 바로 근처에 존재하는 PstI이다. 상기 경우, 적합한 올리고뉴클레오티드는 상기 위치 근처의 올리고뉴클레오티드이거나, 또는 pBluescript 서열 결정 프라이머중의 하나일 수 있다. 이 SphI 위치는 CAATGC 또는 GCATGT 또는 GAATGT로 변형된다. 각 변화는 코돈 변화를 유발하지 않은 채 위치를 변경시킨다.
ORF2가 단일 SphI 위치를 갖지 않도록 하기 위해, 상기와 유사한 방법을 이용한다. 좌측 제한위치는 PstI 또는 MluI에 의해 제공되며 또 적합한 우측 제한위치는 pBluescript 폴리링커내의 SstI에 의해 제공된다. 상기 경우에서 위치는 GCTTGC, GCATGC 또는 GCTTGT로 변경된다. 이들 변화는 아미노산 통합성을 유지한다.
ORF3은 내부 SphI 위치를 갖지 않는다.
ORF4의 경우, PstI은 적합한 우측에 독특한 위치를 제공하지만, 단일 SphI 위치에 있는 적합한 위치는 변경되지 않았다. 상기 경우 pBluescript 폴리링커에서 제한위치는 상술한 동일 효과를 위해 사용될 수 있다. SphI 위치는 CGATGC, GTATGC, GAATGC 또는 GCATGT 등으로 변형된다.
상술한 바와 같이 피롤니트린 생합성 유전자로 부터 SphI 위치를 제거하는것은 ATG에서 SphI 위치를 포함하는 아미노말단 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 증폭되는 유전자중에서 발견되지 않는 제한위치를 포함하는 카르복시말단 프라이머를 사용하여 증폭하는 것에 의해 pCGN1761SENX 벡터로 전달하는 것을 용이하게 한다. 생성한 증폭된 단편은 SphI 및 카르복시말단 서열을 절단하는 제한 효소로 절단되며 pCGN1761SENX에 클로닝된다. 카르복시말단 프라이머로 삽입되기에 적합한 제한효소 위치는 NotI (4개의 ORF 모두에 대하여), XhoI (ORF3 및 ORF4에 대하여) 및 EcoRI (ORF4에 대하여) 이다. SphI 인식 부위내의 위치 6에 있는 뉴클레오티드 C에 대한 요건을 고려할 때, 일부 경우에서 ORF의 제 2 코돈은 뉴클레오티드 C로 출발하기 위해 변경될 필요가 있을 수 있다. 이 구조는 이중 35S 프로모터에 작용가능하게 연결된 번역 최적화 벡터 pCGN1761SENX SphI 위치가 ATG에 연결된 ORF로 융합된다. 구조가 완성된 후 최종 유전자 삽입 및 융합지점은 소망하지 않는 염기 변화가 생기지 않은 것을 확인하기 위해 재서열결정시킨다.
ATG에서 SphI 위치 대신 NcoI 위치가 삽입된 아미노말단 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써, ORF 1-4는 번역 최적화 벡터 pCGN1761NENX로 용이하게 클로닝될 수 있다. 피롤니트린 생합성 유전자 ORF 4개중 어느 것도 NcoI 위치를 갖지 않으므로 내부 제한위치를 파괴할 필요가 없다. 유전자의 카르복시 말단에 대한 프라이머는 상술한 바와 같이 디자인되며 클로닝은 유사한 방식으로 실시된다. NcoI 인식 부위내의 위치 6에 있는 뉴클레오티드 G에 대한 요건을 고려할 때, 일부 경우 ORF에 대한 제 2 코돈은 뉴클레오티드 G에 의해 개시되도록 변경될 필요가 있다. 이 구조는 이중 35S 프로모터에 작용가능하게 연결된 pCGN1761SENX의 NcoI 위치가 ATG에 연결된 ORF로 융합된다.
적합한 pCGN1761-유도체 벡터의 발현 카세트는 형질전환 벡터로 전달될 수 있다. 가능한 다수의 발현 카세트가 단일 형질전환 벡터로 전달되면 식물 형질전환 횟수 및 모든 4개의 ORF를 발현하는 식물을 생산할 필요가 있는 형질전환체 사이의 교배를 감소시켜 피롤니트린을 생성한다.
엽록체를 표적으로 하는 35S 뒤의 발현
아미노말단에 SphI 위치를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭된 피롤니트린 ORF 1-4를 35S-엽록체를 표적으로하는 벡터 pCGN1761/CT로 클로닝하였다. 융합물은 rbcS 전달 펩티드의 절단 위치에서 위치하는 SphI 위치로 만들었다. 이렇게 하여 제조된 발현 카세트를 적합한 형질전환 벡터(상술함)로 전달하여 트랜스제닉 식물을 생성하였다. 피롤니트린 생합성에 대한 전구체인 트립토판이 엽록체에서 합성되므로, 기질의 즉각적인 공급을 확실히 하기 위해 엽록체에서 피롤니트린에 대한 생합성 유전자를 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 모든 4개의 ORF를 발현하는 트랜스제닉 식물은 모든 4개의 유전자 생성물을 엽록체로 향하게할 것이므로 엽록체에서 피롤니트린을 합성할 것이다.
엽록체를 표적으로하는 rbcS 뒤의 발현
아미노말단에 SphI 위치를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭된 피롤니트린 ORF 1-4를 rbcS-엽록체를 표적으로하는 벡터 pCGN1761rbcS/CT로 클로닝 하였다. 융합물은 rbcS 전달 펩티드의 절단 위치에 위치하는 SphI 위치로 만들었다. 이렇게 하여 제조된 발현 카세트를 적합한 형질전환 벡터(상술함)로 전달하여 트랜스제닉 식물을 생성하였다. 피롤니트린 생합성에 대한 전구체인 트립토판이 엽록체에서 합성되므로, 기질의 즉각적인 공급을 확실히 하기 위해 엽록체에서 피롤니트린에 대한 생합성 유전자를 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 모든 4개의 ORF를 발현하는 트랜스제닉 식물은 모든 4개의 유전자 생성물을 엽록체로 향하게할 것이므로 엽록체에서 피롤니트린을 합성할 것이다. 그러나 4개의 ORF의 발현은 약하게 유도될 것이다.
실시예 42: 트랜스제닉 식물에서 소라펜의 발현
클론 p98/1은 소라펜 생합성에 대한 5개의 생합성 모듈을 코딩하는 소라펜 생합성 유전자 ORF1를 함유한다. 부분적으로 서열결정된 ORF2는 나머지 3개 모듈을 함유하고 또 소라펜 생합성에 필요한 다른 것은 동일 오페론상에 위치하는 소라펜 메틸라제이다.
소라펜 ORF1은 이하의 방식으로 트랜스제닉 식물에서 발현되도록 조작된다. 먼저 DNA 단편을 PCR 및 주형으로서 p98/1을 사용하여 OrF1의 아미노말단으로 부터 증폭시켰다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 벡터 pCGN176SENX 또는 pCGNNENX 각각에 클로닝하기 위해 ATG에서 SphI 위치 또는 NcoI 위치를 포함한다. 또한 5' 올리고뉴클레오티드는 ATG 바로 뒤에 염기 C (SphI 클로닝의 경우) 또는 염기 G (NcoI 클로닝의 경우)를 포함할 수 있으므로 단백질의 제 2 아미노산은 히스티딘 또는 아스파탐산(기타 아미노산은 위치 2에서 제 2 코돈의 다른 염기를 추가로 변경하는 것에 의해 선택될 수 있다)으로 변경될 수 있다. 증식에 필요한 3' 올리고뉴클레오티드는 ORF의 BglII 위치에 위치하며 또 증폭된 단편을 SphI (또는 NcoI)및 EcoRI으로 절단되게하는 EcoRI 위치로 혼입시킨 다음 pCGN1761SENX (또는 pCGN1761NENX)로 클로닝하였다. 증폭된 단편을 절단하기 위해, 각 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에서 몇개의 추가의 염기를 포함하다. 올리고뉴클레오티드는 필요한 제한위치 및 추가의 서열 이외에 ORF1 주형과 12 내지 30 bp의 상동성을 갖는다. 이 조작은 ORF1의 아미노말단 ∼112 아미노산을 그의 ATG에서 번역 최적화된 벡터 pCGN1761SENX 또는 pCGN1761NENX의 SphI 또는 NcoI 부위로 이중 35S 프로모터에 연결되도록 융합시킨다. ORF1의 나머지는 상술한 구조의 독특한 BglII 위치로 축차로 클로닝될 수 있는 세개의 BglII 단편상에서 실시된다. 이들 제 1 단편의 도입은 아무런 문제가 없고 제 1 단편을 도입한 후에 BglII을 사용하여 아미노말단 구조를 절단하는 것을 필요로한다. 2개의 나머지 단편을 도입하기 위하여, 아미노말단 구조의 부분적인 분해(이 구조는 추가의 BglII 위치를 갖지 않기 때문에), 이어 BglII 단편의 도입을 필요로한다. 따라서 35S 프로모터에 작용가능하게 융합된 소라펜 ORF1의 전체 ∼25 kb를 함유하는 벡터를 작성할 수 있다.
순차적인 제한 단편의 융합에 의해 소라펜 ORF1을 작성하기 위한 다른 방법은 PCR을 이용하여 전체 ORF를 증폭시키는 것이다. 바네스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA91: 2216-2220 (1994))는 PCR에 의해 35 kb의 단편을 고충실도 증폭하기 위한 방법을 기재하고 있으며, 이들 수법은 ORF1에 적용될 수 있다. 적합한 제한위치가 부가된 각 ORF1에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 전체 코딩 영역을 증폭시키기 위해 이용될 수 있고 pCGN1761 또는 그의 유도체와 같은 적합한 벡터에 적절한 위치로 클로닝될 수 있다. 전형적으로 PCR 증폭후, 증폭된 서열에서 염기 변화가 없었음을 확증하기 위해 재서열결정하는 것이 바람직하다. 이와다르게는, 트랜스제닉 식물에서 직접적으로 작용을 측정할 수 있다.
트랜스제닉 식물에서 폴리켑티드 생합성에 필요한 유전자(소라펜)를 발현시키기 위한 방법은 식물에서 통상의 모듈 보충 이외에 전사 단위를 포함하는 구조를 작성하고 기타 전사 단위상에 나머지 모듈을 제공하는 것이다. 소라펜과 같은 폴리켑티드 항생물질의 생합성은 특정 분자를 합성하기 위한 특정 모듈의 순차적인 활성을 필요로하는 방법으로 이들 활성들은 특정 순서로 제공되어야하며, 상이한 모듈을 갖는 식물에서 상이한 전달 유전자의 발현은 신규한 폴리켑티드 분자의 생합성으로 유발될 수 있는데 이는 야생형 유전자의 순차적인 효소 성질이 단일 분자상에서 이들의 구조에 의해 규정되기 때문이다. ORF1상의 소라펜 생합성에 필요한 5개의 특이적인 모듈의 위치는 소라펜의 생합성에서 결정적이고 또 하나의 전달 유전자상에 3개의 모듈 및 다른 전달 유전자상에 나머지 2개 모듈이 ORF2와 함께 발현하면 상이한 분자 구조 및 상이한 항병원성 활성을 갖는 폴리켑티드를 생합성할 수 있을 것이다. 본 발명은 트랜스제닉 생물에서 신규한 폴리켑티드의 생합성을 초래하는 모듈 발현의 모든 변형을 포함한다.
특정 작성 구체예는 상기 ORF1만에 대해 제공하지만, 트랜스제닉 식물에서 ORF2 및 소라펜 메틸라제를 발현하기 위해 유사한 수법이 사용될 수 있다. 식물에서 기능적인 소라펜을 발현시키기 위하여, 모든 세개의 유전자가 발현되어야하고 또 이는 상기 명세서에서 자세하게 설명된 바와 같다.
상술한 종류의 융합물은 변형을 가하거나 또는 가하지 않은 채 임의의 소망하는 프로모터로 제조될 수 있다 (식물에서 최적화된 번역 개시를 위해 또는 발현 향상을 위하여). 소라펜 생합성용으로 확인된 ORF는 약 70% GC 함량을 갖기 때문에, 코딩 서열들은 식물에서 최적 발현에 필요한 GC 함량을 증가시키기 위하여 변형되어야한다. 그러나 적합한 표적 식물종에서 바람직한 코돈을 포함하도록 유전자를 변형시키는 것이 유리할 수 있다.
실시예 43: 트랜스제닉 식물에서 패나진의 발현
패나진을 합성하기 위한 생합성효소를 코딩하는 모든 클로닝된 유전자의 GC 함량은 58 내지 65% 이므로 식물에서 이들의 발현시 AT-함량 관련된 문제(적절한 표적 식물종에서 바람직한 코돈을 포함하는 유전자를 변형시키는 것이 유리할 수 있지만)가 예상될 수 있다. 하기 나타낸 종류의 융합물은 변형되거나 또는 변형되지 않고 소망하는 프로모터로 제조될 수 있다(예컨대 식물에서 최적화된 번역 개시를 위하여 또는 발현 향상을 위하여).
35S 프로모터 뒤의 발현
3개의 페나진 ORF 각각을 유전자조작하기 위해 pBluescript KS II로 전달하였다. phzB ORF는 전체 페나진 오페론을 함유하는 플라스미드 pLSP18-6H3del3으로 부터 클로닝된 EcoRI-BglII 단편으로서 전달되었다. 이 단편을 pBluescript SKII의 EcoRI-BamHI 위치로 전달하였다. phzC ORF는 클로닝된 XhoI-ScaI 단편인 pLSP18-6H3del3으로 부터 pBluescript II SK의 XhoI-SmaI 위치로 전달되었다. phzD ORF는 BglII-HIndIII 단편인 pLSP18-H3del3으로 부터 pBluescript II SK의 BamHI-HindIII 위치로 전달되었다. 다음 구조에 필요한 내부 제한위치를 파괴시키는 것은 상술한내부-외부 PCR법을 이용하여 실시하였다(이네스 일행, PCR Protocols: A guide to methods and applications, 아카데미 출판사, 뉴욕 (1990)). phzB ORF의 경우, 2개의 SphI 위치가 파괴되었다(ORF의 상류에 위치하는 한개 위치는 변형되지 않은 것이다). 이들 부위의 첫번째는 독특한 제한위치 EcoRI (파괴될 SphI 위치의 좌측) 및 BclI(SphI 위치의 우측)를 사용하여 파괴시켰다. 성공적으로 조작하기 위해, 내부-외부 PCR 생성물의 최종 조립물에 대한 BclI 절단될 DNA는 SCS110 (스트라타진)과 같은 댐-마이너스 대장균 숙주에서 생산되어야한다. 제 2 phzB SphI 위치의 경우, 선택된 독특한 제한위치는 pstI 및 SpeI이고, 후자는 pBluescript 폴리링커에서 phzB ORF를 초과한다. phzC ORF는 내부 SphI 위치를 갖지 않으며, 따라서 상기 과정은 phzC에는 필요치않다. 그러나 phZD ORF는 독특한 제한 효소 위치 XmaI 및 HindlII (pBluescript 폴리링커의 XmaI/SmaI 위치는 BamHI 및 HindIII 위치 사이에 ORF의 삽입으로 인하여 더 길게 존재한다)를 사용하여 제거될 수 있는 단일 SphI 위치를 갖는다.
상술한 바와 같이 페나진 생합성 유전자로 부터 SphI 위치를 제거하는 것은 ATG에서 SphI 위치를 포함하는 아미노말단 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 증폭되는 유전자중에서 발견되지 않는 제한위치를 포함하는 카르복시말단 프라이머를 사용하여 증폭하는 것에 의해 pCGN1761SENX 벡터로 전달하는 것을 용이하게한다. 생성한 증폭된 단편은 SphI 및 카르복시말단 서열을 절단하는 제한 효소로써 분해시키고 pCGN1761SENX에 클로닝하였다. 카르복시말단 프라이머로 삽입되기에 적합한 제한 효소 위치는 EcoRI 및 NotI (3개의 ORF 모두에 대하여; NotI은 서열이 완전할때 체킹될 필요가 있다) 및 XhoI (phzB 및 phzD에 대하여)이다. SphI 인식 위치내의 위치 6에 있는 뉴클레오티드 C에 대한 요건을 고려할 때, 일부 경우에서 ORF의 제 2 코돈은 뉴클레오티드 C로 출발하도록 변경될 필요가 있을 수 있다. 이 구조는 이중 35S 프로모터에 작용가능하게 연결된 번역 최적화 벡터 pCGN1761SENX의 SphI 위치에 ORF를 그의 ATG에서 융합시킨다. 구조가 완성된 후 최종 유전자 삽입 및 융합지점은 소망하지 않는 염기 변화가 생기지 않은 것을 확인하기 위해 재서열결정시킨다.
ATG에서 SphI 위치 대신 NcoI 위치가 삽입된 아미노말단 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써, 세개의 phz ORF는 번역 최적화 벡터 pCGN1761NENX로 용이하게 클로닝될 수 있다. 페나진 생합성 유전자 ORF 3개중 어느 것도 NcoI 위치를 갖지 않으므로 내부 제한위치를 파괴할 필요가 없다. 유전자의 카르복시 말단에 대한 프라이머는 상술한 바와 같이 디자인되며 클로닝은 유사한 방식으로 실시하였다. NcoI 인식 위치내의 위치 6에 있는 뉴클레오티드 G에 대한 요건을 고려할 때, 일부 경우 ORF에 대한 제 2 코돈은 뉴클레오티드 G에 의해 개시되도록 변경될 필요가 있다. 이 구조는 각 ORF를 그의 ATG에서 이중 35S 프로모터에 작용가능하게 연결된 pCGN1761SENX의 위치에 융합시킨다.
적합한 pCGN1761-유도체 벡터의 발현 카세트는 형질전환 벡터로 전달될 수 있다. 가능한 다수의 발현 카세트가 단일 형질전환 벡터로 전달되면 식물 형질전환 횟수 및 모든 4개의 ORF를 발현하는 식물을 생산할 필요가 있는 형질전환체 사이의 교배를 감소시켜 페나진을 생성한다.
엽록체를 표적으로 하는 35S 뒤의 발현
아미노말단에 SphI 위치를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭된 세개의 페나진 ORF를 352-엽록체를 표적으로하는 벡터 pCGN1761/CT로 클로닝하였다. 융합물은 rbcS 전달 펩티드의 분해 위치에 위치하는 SphI 위치로 만들었다. 이렇게 하여 제조된 발현 카세트를 적합한 형질전환 벡터(상술함)로 전달하여 트랜스제닉 식물을 생성하였다. 페나진 생합성에 대한 전구체인 코리스메이트가 엽록체에서 합성되므로, 기질을 즉각적인 공급을 확실히 하기 위해 엽록체에서 페나진에 대한 생합성 유전자를 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 모든 3개의 ORF를 발현하는 트랜스제닉 식물은 모든 3개의 유전자 생성물을 엽록체로 향하게할 것이므로 엽록체에서 페나진을 합성할 것이다.
엽록체를 표적으로하는 rbcS 뒤의 발현
아미노말단에 SphI 위치를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭된 3개의 페나진 ORF를 rbcS-엽록체를 표적으로하는 벡터 pCGN1761rbcS/CT로 클로닝하였다. 융합물은 rbcS 전사물 펩티드의 절단 위치에 위치하는 SphI 위치로 만들었다. 이렇게 하여 제조된 발현 카세트를 적합한 형질전환 벡터(상술함)로 전달하여 트랜스제닉 식물을 생성하였다. 페나진 생합성에 대한 전구체인 코리스메이트가 엽록체에서 합성되므로, 기질의 즉각적인 공급을 확실히 하기 위해 엽록체에서 페나진에 대한 생합성 유전자를 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 모든 3개의 ORF를 발현하는 트랜스제닉 식물은 모든 4개의 유전자 생성물을 엽록체로 향하게할 것이므로 엽록체에서 페나진을 합성할 것이다. 그러나 3개의 ORF의 발현은 약하게 유도될 것이다.
실시예 44: 트랜스제닉 식물에서 비-리보솜적으로 합성된 펩티드 항생물질 그라미시딘의 발현
세개의 바실루스 브레비스 그라미디신 생합성 유전자 grsA, grsB 및 grsT는 이미 클로닝되고 서열결정되어 있다(투르게이 일행, Mol. Microbiol.6: 529-546(1992); 크라애츠튜마르 일행, J. Bacterial.171: 5422-5429 (1989)). 이들은 3296, 13358 및 770 bp 길이이다. 이들 서열은 GenBank 수탁 번호 X61658 및 M29703으로 공개되어 있다. 여기서 기재된 조작법은 투르게이 일행(상동) 및 크라에츠슈마르 일행(상동)에 의해 기재된 공중이 이용할 수 있는 클론을 사용하거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 단리된 바실루스 브레비스로 부터 새로이 단리된 클론을 사용하여 실시할 수 있다.
세개의 ORF grsA, gRSb 및 grsT 각각은 전체 코딩 서열에 걸쳐 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭되었다. 좌측(상류) 올리고뉴클레오티드는 SstI위치를 포함하고 우측(하류) 올리고뉴클레오티드는 XhoI 위치를 포함한다. 이들 제한위치는 세개의 코딩 서열중 어느 하나에서 발견되지 않으며 또 증폭될 생성물을 pBluescript II SK의 상응하는 위치로 삽입하기 위해 SstI 및 XhoI으로 절단할 수 있다. 이들 유전자의 CG 함량은 35 내지 38% 범위이다. 이상적으로는, 세개의 유전자를 코딩하는 코딩 서열은 K 부분에서 언급한 수법을 이용하여 다시 제조될 수 있지만, 비변형 유전자는 이들의 AT 함량에 기인한 아무런 문제 없이 트랜스제닉 식물에서 고도로 발현될 수 있다. 어떤 경우든, 적합한 목적하는 식물종에서 바람직한 코돈을 포함하도록 운전자를 변형시키는 것이 유리하다.
ORF grsA는 SphI 위치 및 NcoI 위치를 함유하지 않는다. 이 유전자는 ATG에서 SphI 위치 또는 NcoI위치를 삽입하는 아미노 말단 올리고뉴클레오티드 및 Xho 위치를 삽입하는 제 2 카르복시말단 올리고뉴클레오티드를 사용하여 pBLGSRa로 부터 증폭될 수 있으므로 증폭 생성물은 직접적으로 이중 35S 프로모터 뒤의 pCGN1761SENX 또는 pCGN1761ENX로 클로닝될 수 있다.
ORF grsB는 NcoI 위치를 함유하지 않으므로 상기 유전자는 grsA ORF에서 상술한 바와 같은 방식으로 NcoI위치를 함유하는 아미노 말단 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭될 수 있다. 증폭된 단편은 NcoI 및 XhoI으로 절단한 다음 pCGN1761NENX로 결찰시켰다. 그러나 grsB ORF는 세개의 SphI 위치를 함유하고 또 이들은 뒤이은 클로닝 단계를 위하여 분해될 수 있다. 이 위치는 상술한 바와 같은 "내부-외부" PCR 수법을 이용하여 분해될 수 있다. grsB 유전자내에 찾을 수 있고 pBluescript II SK내 한정되지 않는 독특한 클로닝 위치는 EcoN1, PflM1 및 RsrII이다. EcoN1 또는 PflM1은 처음의 2개 위치를 제거하기 위해 RsrII와 함께 사용될 수 있고 또 RsrII는 세번째 위치를 제거하기 위해 pBluescipt 폴리링커의 ApaI 위치와 함께 사용될 수 있다. 이들 위치가 일단 분해되면(아미노산에서 변화를 유발하지 않으면서), grsB ORF의 전체가 ATG에서 SphI 위치 및 Xho 위치를 혼입하는 카르복시말단 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭될 수 있다. 생성한 단편을 pCGN1761SENX에 클로닝하였다. 이러한 크기의 단편을 PCR 증폭시키기 위하여, 대형 DNA 단편을 고충실도로 증폭시키는 것을 기술한 바네스 (1994, Proc. Natl. Acad.Sci. USA91: 2216-2220 (1994))가 제시한 증폭 방법을 변형시켰다. grsB ORF를 세개의 SPhI 위치의 분해를 필요치 않으면서 pCGN1761SENX로 전달하기 위한 다른 방법은 ATC에서 SphI 위치를 혼입하는 아미노말단 올리고뉴클레오티드 및 XhoI 위치를 포함하는 ORF내의 PflMI 위치의 3'에 인접하는 제 2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자의 ATG로 부터 증폭시키는 것에 의해 grsB의 아미노말단 단편의 pCGN1761SENX의 SphI 및 XhoI 클로닝 위치로 전달하는 것을 포함한다. 따라서 아미노말단 증폭된 단편을 SphI 및 XhoI으로 절단하고 또 pCGN1761SENX로 클로닝하였다. 이어 grsB 유전자의 나머지 부분을 PflMI 및 XhoI (pBluescript 폴리링커에서 절단)를 사용하여 pBLGRSb로 부터 절단시키고 또 PflMI 및 XhoI으로 절단된 구조를 갖는 아미노말단으로 클로닝하여 유전자를 재구성하였다.
ORF grsT는 SphI 위치 및 NcoI 위치를 함유하지 않는다. 이 유전자는 식물에서 발현되기 위해 ATG로 변경된(GTG로 부터) 개시 코돈에서 SphI 위치 또는 NcoI 위치를 삽입하는 아미노말단 올리고뉴클레오티드 및 XhoI 위치를 삽입하는 제 2 카르복시말단 올리고뉴클레오티드를 사용하여 pBLGSRt로 부터 증폭되어 증폭 생성물을 이중 35S 프로모터 뒤의 pCGN1761SENX 또는 pCGN1761NENX로 직접적으로 클로닝시킬 수 있다. SphI 인식 위치내의 위치 6에 있는 뉴클레오티드 C에 대한 요건 및 NcoI 인식 위치내의 위치 6에 있는 뉴클레오티드 C에 대한 요건을 고려할 때, 일부 경우에서 ORF의 제 2 코돈은 적합한 뉴클레오티드로 개시되도록 변경될 필요가 있다.
본 명세서에 기술한 바와 같이 모든 세개의 그라미시딘 생합성유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물을 생성할 수 있다. 모든 세개의 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물은 그라미시딘을 합성한다.
실시예 45: 트렌스제닉 식물에서 리보솜적으로 합성된 펩티드 란티바이오틱 에피데르민의 발현
epiA ORF는 에피데르민 생합성에 대한 구조 유닛을 코딩하고 약 420 bp 길이를 갖는다(Genebank 수탁번호 X07840; 슈넬 일행 Nature333: 276-278 (1988)). 이 유전자를 말단 제한위치 BamHI(5') 및 PstI(3')를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 수법에 의해 플라스미드 pTu32로 부터 pBluescript SK II로 서브클로닝하였다. epiA 유전자 서열은 27%의 GC 함량을 갖고 또 상기 명세서에서 언급된 유전자 합성 수법을 이용하여 증폭될 수 있다; 이 서열 변형은 필수적이지 않지만 식물에서 고도의 발현을 가능하게한다. 이어 개시 메티오닌 및 SphI 위치(pCGN1761SENX로 클로닝하는 경우) 또는 NcoI 위치(pCGN1761NENX로 클로닝하는 경우)를 갖는 아미노말단 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 pCGN1761SENX 또는 pCGN1761NENX로 클로닝하기 위한 EcoRI, NotI 또는 XhoI 위치를 갖는 카르복시 말단 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자를 PCR 증폭시키는 것에 의해 epiA ORF를 클로닝 벡터 pCGN1761SENX 또는 pCGN1761NENX로 전달할 수 있다. SphI 인식 위치내의 위치 6에 있는 뉴클레오티드 C에 대한 요건 및 NcoI 인식 위치 내의 위치 6에 있는 뉴클레오티드 G에 대한 요건을 고려할 때, 일부 경우에서 ORF의 제 2 코돈은 적합한 뉴클레오티드로 개시되도록 변경될 필요가 있다.
본 명세서에 기술한 바와 같은 클로닝 수법을 이용하여, epi 오페론의 나머지 유전자(즉, epiB, epiC, epiD, epiQ 및 epiP)를 플라스미드 pTu32로 부터 pBluescript SK II로 서브클로닝하였다. 이들 유전자는 epiA-코딩된 구조 유닛의 변형과 중합에 관여하고 또 쿠프케 일행(J. Bacterial.174: 5354-5361 (1992)) 및 슈넬 일행(Eur. J. Biochem.204: 57-68 (1992))에 기재되어 있다. 서브클로닝된 ORF는 상술한 바와 같이 유전자 조작되어 pCGN1761-유도체 벡터로 전달되었다. 적합한 pCGN1761-유도체 벡터의 발현 카세트를 형질전환 벡터로 전달하였다. 식물 형질전환의 횟수 및 모든 필요한 ORF를 발현하는 식물을 생성할 필요가 있는 형질전환체 사이의 교배를 감소시키기 위하여 가능한 다수의 발현 카세트를 단일 형질전환 벡터에 전달하면, 에피데르민을 생성한다.
L. APS 축적하기 위한 트랜스제닉 식물의 분석
실시예 46: APS 유전자 발현의 분석
트랜스제닉 식물에서 APS 유전자의 발현은 조직에 축적되는 APS mRNA의 양을 평가하는 표준 노던 블러팅 수법을 이용하여 분석할 수 있다. 이와 다르게는, APS 유전자 산물의 양은 APS 생합성 유전자 생성물에 대하여 유발된 항혈청을 사용한 웨스턴 분석법에 의해서 평가될 수 있다. 항혈청은 통상의 수법을 이용하여 제조하며 대장균과 같은 숙주에서 APS 유전자의 발현으로 부터 유도된 단백질이다. 복수개의 ORF 오페론으로 부터 복수개의 APS 유전자를 발현하는 대장균으로 부터 복수개의 유전자 산물에 대한 항혈청을 생성하는 것을 피하기 위해, APS 생합성 유전자는 대장균에서 개별적으로 발현될 수 있다. 이와 다르게는, 항혈청은 공지된 APS 생합성 예상된 아미노산 서열과 상동이거나 또는 동일하게 디자인된 합성 펩티드에대하여 유발될 수 있다. 이들 수법은 이 기술분야에 공지되어 있다.
실시예 47: 트랜스제닉 식물에서 APS 생산의 분석
각 APS에 대하여, 트랜스제닉 식물 조직에서 APS 생산을 검출하기 위해 공지된 방법을 사용한다. 이들 방법은 적합한 APS 문헌에서 찾아 볼 수 있다. 피롤니트린의 경우, 실시예 11에 기재된 방법이 이용될 수 있고, 또 소라펜의 경우 실시예 17에 기재된 방법이 이용될 수 있다. 페나진 측정의 경우, 실시예 18에 기재된 방법이 이용될 수 있다. 그라미시딘 S와 같은 비-리보솜적 펩티드 항생물질의 경우, 적합한 일반적 수법은 ATP-PPi 교환반응을 분석하는 것이다. 그라미시딘의 경우, grsA 유전자는 페닐알라닌-의존형 ATP-PPi 교환반응에 의해 평가될 수 있고 또 grsB 유전자는 프롤린, 발린, 오르니틴, 또는 로이신 의존형 ATP-PPi 교환반응에 의해 평가될 수 있다. 다른 수법은 가우스 및 브라즈니코바(Lancet247: 715 (1944))에 의해 기재되어 있다. 리보솜적으로 합성된 펩티드 항생물질의 경우, 알가이에르 일행이 에피데르민에 대하여 기재한 바와 같이(Eur, Ju. Biochem.160: 9-22(1986)), 부탄을 추출하고, 메탄올 및 디에틸 에테르에 용해시킨 후 크로마토그래피시키는 것에 의해 단리시킬 수 있다. 많은 APS(애컨대 피롤니트린, 그라미시딘, 페나진)의 경우, 적합한 수법은 머크 인덱스에 제시되어 있다(머크 앤드 컴패니, 뉴저지 라웨이 소재(1989)).
M. 트랜스제닉 식물에서 질병 내성의 분석
APS 생합성 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물을 식물병리학에서 공지된 수법을 이용하여 식물병원체에 대한 내성을 평가하였다. 엽상 병원체의 경우, 식물을온실에서 키우고 또 적합한 성장 단계에서 관심을 두고 있는 식물병원체의 접종을 적합한 방식으로 실시한다. 토양기원의 식물병원체의 경우, 병원체는 종자가 파종되기 전에 또는 파종됨과 동시에 토양에 도입된다. 유전자를 도입하기 위해 선택한 식물 품종은 식물병원체에 대한 감도를 고려하여 선택한다. 따라서, 선정된 품종은 관심을 두고 있는 대부분의 식물병원체에 처리되면 향상된 내성을 나타내는 것이 바람직하다.
엽상 식물병원체에 대한 내성 분석
실시예 48: 담배 엽상 식물벙원체에 대한 질병 내성
APS 유전자를 발현하고 또 APS 화합물을 생산하는 것으로 밝혀진 트랜스제닉 담배 식물을 이하의 질병 시험처리하였다.
피토프토라 파라지티카 (Phytophthora parasitica)/흑색 엽병 흑색 엽병의 병원체인 피토프토라 파라지티카에 대한 내성 분석은 알렉산더 일행에 의해 Pro. Natl. Acad. Sci, USA90: 7327-7331호에 기재된 바와 같이 6주령 식물상에서 실시하였다. 식물에 물을 주고, 침지시킨 다음 10 mL의 포자낭 현탁액 (300 포자낭/mL)을 토양에 도포하는 것에 의해 접종하였다. 접종된 식물을 낮에는 23 내지 25℃로 유지되고 또 밤에는 20 내지 22℃로 유지되는 온실에 방치하였다. 이 평가에 이용된 시들어죽는 지수는 다음과 같다: 0 = 아무런 증상없슴; 1 = 약간의 시든 징후가 있슴; 2 = 뚜렷한 시듬 현상이 있지만 썩거나 발육 저해는 나타내지 않음; 4 = 심각한 시듬현상을 나타내고 줄기가 썩고 또 뿌리계에도 일부 손상 있슴; 5 = 4와 거의 유사하지만 거의 치사한 식물에 가깝고 뿌리계 감소도 심각하다. 모든 분석은임의로 배열된 식물에 대해 실시하였다.
슈도모나스 시린가애(Pseudomonas syringae)슈도모나스 시린가애 타바치 품종(#551 균주)을 몇개의 6 내지 7 주령 식물의 잎 2개에 H2O중의 106또는 3 x 106/ml 농도로 주입하였다. 6개의 식물을 각 시점마다 평가하였다. 슈도모나스 타바치로 감염된 식물을 질병 정도를 5점 기준으로 심각도로 평가하였다. 5 = 100%치사 조직, 0 = 아무 증상없슴. 매일 T-시험(LSD)를 실시하여 평가하고 또 평균 질병 평가한 후 그룹으로 나타내었다. 동일 평가일에 동일 글자로 나타낸 것은 통계학적으로 현저히 상이하지않다.
세르코스포라 니코티아나애(Cercospora nicotianae)세르코스포라 니코티아나애 (ATCC #18366)의 포자 현탁액(100,000 내지 150,000 포자/ml)를 잎의 표면에 분무하였다. 식물을 100% 습도에서 5일간 유지하였다. 식물을 H2O로 하루에 5 내지 10회 습윤시켰다. 6개의 식물을 각 시점마다 평가하였다. 세르코스포라 니코티아나애는 질병 중상을 나타내는 % 잎 면적으로 평가하였다. T-시험(LSD)은 매일 평가하였고 또 평균 질병 평가치를 구한 후 그룹으로 나타내었다. 동일 평가일에 동일 글자로 나타낸 것은 통계학적으로 현저히 상이하지 않다.
통계학적 분석모든 시험은 비-트랜스제닉 식물을 포함한다 (분석당 6개 식물 또는 트랜스제닉 주로서 동일 품종을 이용)(알렉산더 일행, Pro. Natl. Acad. Sci. USA90: 7327-7331). T-시험을 쌍으로 실시하여 각 평가일에 상이한 유전자형 및 처리 그룹을 비교하였다.
토양기원의 식물병원체에 대한 내성의 분석
실시예 49: 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 내성
리족토니아 솔라니에 대한 내성을 평가하기 위한 식물 평가는 종자 또는 묘목을 천연 또는 인위적으로 감염된 토양에 심거나 이식하는 것에 의해 실시하였다. 인위적으로 감염된 토양을 만들기 위하여, 기장, 벼, 귀리 또는 기타 유사한 종자를 물로 습윤시킨 다음 고압솥에 처리시키고 또 한천 플레이트로 부터 취한 진급 식물병원체 플러그를 접종하였다. 종자가 식물병원체와 함께 충분히 성장하면, 이들을 공기 건조시키고 또 분말로 분쇄하였다. 분말을, 질병을 유발하는 것으로 실험적으로 결정된 비율로 토양에 혼합하였다. 스탠드 카운트, 뿌리 병해 비율 및 감염된 토양에서 성장한 트랜스제닉 식물 및 비-트랜스제닉 식물순 및 뿌리 중량을 비교함으로써 질병을 평가하였다. 질병 평가는 토양에 식물병원체가 부가되지 않은 이외에는 동일 조건하에서 성장한 식물의 비율과 비교함으로써 실시할 수 있다.
실시예 50: 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대한 내성
슈도모나스 솔라나세아룸에 대한 내성을 평가하기 위한 식물 평가는 종자 또는 묘목을 천연 또는 인위적으로 감염된 토양에 심거나 이식하는 것에 의해 실시하였다. 인위적으로 감염된 토양을 만들기 위하여, 세균을 진탕 플라스크 배양물에서 성장시킨 다음 질병을 유발하는 것으로 실험적으로 결정된 비율로 토양과 혼합하였다. 식물의 뿌리는 질병을 유발하기 위하여 약간 상처를 입는 것이 좋다. 스탠드 카운트, 뿌리 병해 비율 및 감염된 토양에서 성장한 트랜스제닉 식물 및 비-트랜스제닉 식물 순 및 뿌리 중량을 비교함으로써 질병을 평가하였다. 질병 평가는 토양에 식물병원체가 부가되지 않은 이외에는 동일 조건하에서 성장한 식물의 비율과 비교함으로써 실시할 수 있다.
실시예 51: 바이러스 전달을 위한 벡터인 토양기원의 진균에 대한 내성
많은 토양기원의 폴리믹사, 올피듐 (Olpidium) 및 스폰고스포라(Spongospora) 종은 바이러스 전달을 위한 벡터이다. 이들은 (1) 비트의 괴저병 황색 엽맥 바이러스(땅속줄기 질병의 병인제)를 사탕무우로 전달하는 폴리믹사 베타애 (Polymyxa betae), (2) 토양기원의 밀 모자이크 바이러스를 밀로 전달하고 또 황색 보리 모자이크 바이러스 및 보리 마일드 모자이크 바이러스를 보리로 전달하는 폴리믹사 그라미니스 (Polymyxa graminis) (3) 담배 괴저병 바이러스를 담배로 전달하는 올피듐 브라시카애 (Olpidium brassicae), 및 (4) 감자 몹 탑(Mop top) 바이러스를 감자로 전달하는 스폰고스포라 서브테라네아 (Spongospora subterranea)를 포함한다. 뿌리에서 ApS를 발현하는 종자 또는 식물(예컨대 구성적으로 또는 뿌리 특이적 발현하에 있는)을 멸균 토양에 파종하거나 이식하고 또 소정의 바이러스를 갖는 진균 접종물을 토양에 도입하였다. 적절한 시간 후에 트랜스제닉 식물을 바이러스 증세에 대하여 평가하고 또 ELISA 및 노던 블럿에 의해 바이러스의 축적을 평가하였다. 대조 실험은 접종을 하지 않은 것과 조사중인 바이러스를 갖지 않는 진급으로 감염시키는 것을 포함한다. 분석중인 트랜스제닉 식물계는 이상적으로는 APS를 기본한 보호 효율을 시험하기 위해 바이러스에 대해 감수성이어야한다. 폴리믹사에 의해 전달되고 또 기계적으로 전달가능한 보리의 마일드 모자이크 바이러스와 같은 바이러스의 경우, 뿌리에서 APS 발현에 의해 토양 감염으로 부터 보호된 식물에 바이러스를 도입하는 것에 의해 대조 실험을 실시하였다.
APS의 발현에 의해 제공되는 바이러스 전달성 진균에 대한 내성은 표적 작물의 바이러스 감염을 방지함으로써 식물 건강과 수율을 향상시킨다.
실시예 52: 선충에 대한 내성
APS를 발현하는 트랜스제닉 식물을 선충에 대한 내성에 대해 분석하였다. 뿌리에서 APS를 발현(예컨대 구성적으로 또는 뿌리 특이적 발현)하는 종자 또는 식물을 멸균 토양에 파종하거나 이식하고 선충 접종물을 토양에 도입하였다. 선충 손상을 적합한 시점에서 평가하였다. 멜로이도자인 (Meloidogyne) 종과 같은 뿌리 결절 선충을 APS를 발현하는 트랜스제닉 담배 또는 감자에 도입하였다. 헤테로데라(Heterodera) 종과 같은 시스트 선충을 트랜스제닉 곡류, 감자 및 사탕 무우에 도입하였다. 프라티렌쿠스 (Pralylenchus) 종과 같은 병해 선충을 트랜스제닉 콩, 알팔파 또는 옥수수에 도입하였다. 로틸렌쿨루스 (Rotylenchulus) 종과 같은 레니폼 선충을 트랜스제닉 콩, 목화 또는 토마토에 도입하였다. 디틸렌쿠스 (Ditylenchus)종을 트랜스제닉 알팔파에 도입하였다. 선충에 대한 내성을 스크리닝하기 위한 상세한 수법은 Starr(편집: Methods for Evaluating Plant Species for resistance to Plant Parasitic Nematodes, Society of Nematologists, Hyattsville, Maryland (1990))에 기재되어 있다.
농업작물종에서 중요한 식물병원체의 예
실시예 53: 옥수수에서 질병 내성
APS 유전자를 발현하여 APS 화합물을 생성하는 것으로 알려진 트랜스제닉 옥수수 식물을 이하의 질병 시험에 처리하였다. 각 식물병원체에 대한 시험은 표준 식물병원성 시험과정에 따라 실시하였다.
잎 질병 및 줄기 썩음병
(1) 노던 옥수수 잎 고조병 (헬민토스포륨 투르시쿰+Syn. 엑세로힐룸 투르시쿰)
(2) 안트라스크노스 (콜렉토트리쿰 그라미니콜라+-줄기 썩음병과 동일)
(3) 서던 옥수수 잎 고조병 (헬민토스포륨 메이디스+syn. 비폴라리스 메이디스)
(4) 아이 스포트 (카바티엘라 제아애)
(5) 일반적 녹병 (푸시니아 소르히)
(6) 서던 녹병 (푸시니아 폴리소라)
(7) 회색 잎 점병 (세르코스포라 제아애-메이디스+ 및 씨. 소르히)
(8) 줄기 썩음병 (이하에 나타낸 병원체 2개 이상의 복합병-피튬 아파니데르마툼+-초기, 에르위니아 크리산테미-제아애-초기, 콜렉토트리쿰 그라미니콜라+, 디플로디아메이디스스+, 디. 마크로스포라, 지배렐라 제아애+, 후사륨 모닐리포르메+, 마크로포미나 파세올리나, 세팔로스포륨 아크레늄)
(9) 고스'병 (클라비박터 네브라스카넨세)
중요한 이삭 곰팡이
(1) 지베렐라 이삭 썩음병(지베렐라 제아애+-줄기 썩음병과 동일)
아스페르길루스 플라부스, 에이. 파라지티쿠스, 아플라톡신
(2) 디플로디아 이삭 썩음병 (디플로디아 메이디스+ 및 디.마크로스포라-줄기 썩음병과 동일 생물)
(3) 헤드 혹수병 (스파셀로테카 레이리아나-syn. 우스틸라고 레이릴아나)
실시예 54: 밀에서 질병 내성
APS 유전자를 발현하고 APS 화합물을 생성하는 것으로 나타낸 트랜스제닉 밀 식물을 이하의 질병 시험에 처리하였다. 각 병원체에 대한 시험은 표준 식물병원성 시험과정에 따라 실시하였다.
(1) 셉토리아 질병 (셉토리아 트리티시, 셉토리아 노도룸)
(2) 가루로되는 노균병균 (에리시페 그라미니스)
(3) 황색 녹병 (푸시니아 스트리이포르미스)
(4) 갈색 녹병 (푸시니아 레콘디타, 푸시니아 호르데이)
(5) 기타 갈색 기부 썩음병/묘목 고조병 (후사륨 쿨모룸 및 후사륨 로제움), 아이스포트 (슈도세르코스포렐라 헤르포트리코이데스), 테이크-올 (가애우마노마이세스 그라미니스)
(6) 바이러스 (보리 황색 모자이크 바이러스, 보리 황색 난장이 바이러스, 밀 황색 모자이크 바이러스)
N. APS 유전자를 발현하는 미생물 균주에서 생물방제 효율의 분석
실시예 55: 리족토니아 솔라니로부터 목화의 보호
리족토니아 솔라니에 의해 유발된 감염으로 부터 목화의 보호 정도를 결정하기 위한 분석시험은 천연적으로 또는 인위적으로 감염된 토양에서 생물방제 균주로 처리된 종자를 심는 것에 의해 실시하였다. 인위적으로 감염된 토양을 만들기 위하여, 기장, 벼, 귀리 또는 기타 유사한 종자를 먼저 물로 습윤시킨 다음 고압솥에 처리하고 한천 플레이트로 부터 취한 진균 병원체 플러그를 접종하였다. 종자가 병원체와 함께 충분히 성장하면, 이들을 공기 건조시키고 또 분말로 분쇄시켰다. 분말을 질병을 일어키는 것으로 실험적으로 결정된 비율로 토양에 혼합하였다. 감염된 토양을 포트에 넣고 종자를 1.5 cm 깊이의 이랑에 파종하였다. 생물방제 균주는 실험실에서 진탕 플라스크에서 성장하였다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고 물에 재현탁시키며 또 종자위로 흠뻑 적셨다. 대조용 식물은 물만으로 적셨다. 14일 후, 처리된 묘목 및 미처리 묘목의 스탠드 카운드 및 뿌리 병해정도를 비교함으로써 질병을 평가하였다. 질병 정도는 병원체를 토양에 부가하지 않은 이외에는 동일한 조건하에서 성장한 묘목을 비교함으로써 평가하였다.
실시예 56: 클라비셉스 미시카니스 (Claviceps michiganese) 아종 스피도니쿰(speedonicum)으로부터 감자의 보호
클라비셉스 미시카니스 아종 스피도니쿰은 감자의 원형 뿌리 질병의 병인제로서 전형적으로 많은 중식 물질을 생성하기 위해 감자의 종자 괴경을 나이프로 절단하여 심기 전에 만연된다. 나이프의 표면상으로 병원체를 전달하면 전체 종자 뱃치의 접종을 초래한다. 환형 뿌리 질병의 병인제로 부터 감자를 보호하는 것을 측정하는 분석법은 병원체 및 생물방제 균주로 감자 종자를 접종함으로써 실시하였다. 천연적으로 감염된 괴경을 절단한 다음 그 나이프를 사용하여 다른 괴경을 절단하는 것에 의해 병원체를 도입하였다. 이어, 종자편을 생물방제 세균 현탁액으로 처리하고 대조용은 물로 처리하였다. 성장 말기에 식물의 활기, 수율 및 클라비박터로 감염된 괴경의 수를 평가함으로써 질병을 평가하였다.
O. 클로닝된 유전자의 생물 발현으로 부터 APS의 단리
실시예 57: APS 단리를 위한 추출 방법
활성 APS는 APS를 생산하는 형질전환된 균주의 야생형의 세포 또는 성장 배지로 부터 단리될 수 있다. 이것은 공지 특징의 분자를 단리하기 위한 공지 수법을 이용하여 실시할 수 있다.
예컨대, 다수의 벤젠 고리(피롤니트린 및 소라펜)를 함유하는 APS의 경우, 배양물을 10 ml L 육즙중, 적합한 온도에서 24시간 동안 성장시킨 다음 동일 부피의 아세트산 에틸을 사용하여 추출하였다. 유기상을 회수하고 진공하에서 증발시켜 잔류물을 20 μℓ의 메탄올중에 용해시켰다.
피롤니트린의 경우, 상기 항생물질을 생산하는 형질전환된 균주의 성장 배지로 부터 활성인 항병원성 화합물을 추출하기 위한 추가의 과정을 더 실시할 수 있다. 이는 배지를 80% 아세톤으로 추출한 다음 아세톤을 증발에 의해 제거하고 다시 디에틸 에테르로 추출하는 것에 의해 실시할 수 있다. 디에틸 에테르는 증발에 의해 제거될 수 있고 건조된 추출물은 소량의 물에 재현탁시킨다. 소량의 항생물질 추출물을 한천 플레이트상에 위치된 소형 멸균 필터페이퍼 디스크상에 놓으면 리족토니아 솔라니의 성장을 억제하므로 이는 활성 항생물질 화합물의 존재를 나타낸다.
페나진을 단리하기 위한 바람직한 방법은 토마쇼 일행(Appl. Environ Microbiol.56: 908-912 (1990))에 의해 기재되어 있다. 이 방법은 배양액을 HCl을 사용하여 pH2.0으로 산성화시킨 다음 벤젠으로 하는 것을 포함한다. 벤젠 추출물을 Na2SO4로써 탈수시킨 다음 증발건조시켰다. 잔류물을 수성 5% NaHCO3에 용해시키고 동부피의 벤젠을 사용하여 재추출하며 산성화시키고 또 벤젠에 분배시키고 재건조시켰다.
펩티드 항생물질(전형적으로 소수성임)의 경우, 부탄올, 메탄올, 클로로포름 또는 헥산을 사용한 추출수법이 적합하다. 그라미니시딘의 경우, 단리는 가우세 및 브라즈니코바 (Lancet247: 715 (1944))에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 에피데르민의 경우, 알가이에르 일행이 에피데르민에 대해 기술한 방법(Eur. Ju. Biochem.160: 9-22 (1986))이 적합하며, 부탄을 추출 및 메탄올 및 디에틸 에테르에 용해시키는 것을 포함한다. 많은 APS의 경우(예컨대 피롤니트린, 그라미시딘, 페나진), 적합한 수법은 머크 인덱스(머크 앤드 컴패니, 라웨이, 뉴저지 (1989))에 제시되어 있다.
P. 단리된 항생물질의 배합물 및 용도
단리된 APS 또는 APS를 생산하는 세포의 현탁액 또는 농축액을 포함하는 활성성분을 사용하여 항진균 배합물을 제조할 수 있다. 배합물은 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다.
실시예 58: 항진균 조성물의 액체 배합물
이하의 실시예에서, 조성의 %는 중량기준이다:
소망하는 농도의 유제는 농축물을 물로 희석시키는 것에 의해 제조할 수 있다.
상기 용액은 미적 형태로 투여되기에 적합하다.
활성성분을 염화 메틸렌에 용해시키고, 이 용액을 담체에 분무하며 그 용매를 진공에서 증발시킨다.
활성성분을 담체와 긴밀하게 혼합함으로써 즉시 사용가능한 살포제를 수득한다.
실시예 59: 항진균 조성물의 고체 배합물
이하의 실시예에서 조성의 %는 중량기준이다.
활성성분을 보조제와 완전하게 혼합하고 그 혼합물을 적합한 분쇄기에서 분쇄시켜, 물로 희석되면 소망하는 농도의 현탁액을 생성할 수 있는 수화제를 생성한다.
소망하는 농도의 유제는 상기 농축액을 물로 희석시키는 것에 의해 제조할 수 있다.
활성성분을 담체와 혼합하고 그 혼합물을 적합한 분쇄기에서 분쇄시키는 것에 의해 즉시 사용할 수 있는 살포제를 수득한다.
활성성분을 혼합하고 보조제와 분쇄하며 그 혼합물을 물로 습윤시킨다. 이혼합물을 압출시키고 공기 기류중에서 건조시킨다.
미세하게 분쇄된 활성성분을 혼합기에서 폴리에틸렌 글리콜로 습윤된 카올린에 균일하게 도포한다. 상기와 같이 하여 비분진 피복된 과립을 수득한다.
미세하게 분쇄된 활성성분을 보조제와 긴밀하게 혼합하여 물로 희석함으로써 소망하는 농도의 현탁액을 생성할 수 있는 현탁 농축액을 수득한다.
본 발명은 특수한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 수많은 변형, 수식 및구체예도 가능하므로 따라서 이러한 모든 변형, 수식 및 구체예는 본 발명의 정신과 범위에 속하는 것으로 본다.

Claims (30)

  1. 서로 잡종화될 수 있고 또 피롤니트린의 생합성 경로에 필요한 하나 이상의 생합성효소를 코딩하는 모든 DNA 분자를 포함하는 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는, 피롤니트린 생합성 경로에 필요한 하나 이상의 생합성효소를 코딩하는 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피롤니트린을 생성하는 생물이 슈도모나스(Pseudomonas) 균주인 DNA 분자
  3. 제2항에 있어서, 상기 DNA 분자가 수탁번호 NRRL B-21256으로 기탁된 플라스미드 pClB169에 포함된 DNA분자.
  4. 제1항에 있어서, 서열 2에 기술된 단백질 서열을 코딩하는 DNA 분자.
  5. 제1항에 있어서, 서열 4개 기술된 단백질 서열을 코딩하는 DNA 분자.
  6. 제1항에 있어서, 서열 5에 기술된 단백질 서열을 코딩하는 DNA 분자.
  7. 제1항에 있어서, 유전자 코돈이 코딩된 아미노산을 유지하면서 식물 선호 코돈과 일치하도록 변형된 DNA 분자.
  8. 제1항에 있어서, 식물 게놈의 일부를 형성하도록 유전자조작된 DNA 분자.
  9. 제1항의 DNA분자에 의해 코딩된 피롤니트린의 생합성 경로에 필요한 생합성 효소.
  10. 제9항에 있어서, 상기 효소가 수탁번호 NRRL B-21256으로 기탁된 플라스미드 pCIB169에 포함된 DNA 분자에 의해 코딩되는 생합성 효소.
  11. 제10항에 있어서, 서열 2에 기술된 단백질 서열을 포함하는 생합성 효소.
  12. 제10항에 있어서, 서열 3에 기술된 단백질 서열을 포함하는 생합성 효소.
  13. 제10항에 있어서, 서열 4에 기술된 단백질 서열을 포함하는 생합성 효소.
  14. 제10항에 있어서, 서열 5에 의해 기술된 단백질 서열을 포함하는 생합성 효소.
  15. 숙주 세포에 벡터를 넣어 형질전환시킬 때 DNA 분자에 의해 코딩된 하나 이상의 효소를 발현할 수 있는 제1항 내지 제8항 중 어느 하나에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 숙주 세포가 세균, 진균, 효모 및 식물 세포로 구성된 군으로부터 선택된 발현 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 숙주 세포가 식물 세포인 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, DNA 분자가 식물에서 작동하는 프로모터 및 전사 터미네이터의 제어하에 있는 발현 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 프로모터가 구성적 프로모터, 화학적으로 조절된 프로모터, 상처 또는 병원체 유도성 프로모터 및 조직 특이적 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 발현 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 조직 특이적 프로모터가 뿌리 특이적 프로모터인 발현 벡터.
  21. 제15항에 있어서, 관련된 구조 유전자의 발현을 강화시키는 것으로 알려진 추가의 서열을 포함하는 발현 벡터.
  22. 제17항에 있어서, 관련된 구조 유전자가 식물 엽록체 표적으로 하는 것으로 알려진 추가의 서열을 포함하는 발현 벡터.
  23. 세균, 진균, 효모, 옥수수, 밀 및 보리식물로 이루어진 군으로부터 선택되며, 숙주가 제 15항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주.
  24. 피롤니트린 합성에 필요한 완전한 효소세트를 집합적으로 코딩하는 DNA 분자 세트를 포함하는 트랜스제닉 식물의 생성 방법에 있어서, 상기 식물이 식물병원체에 의해 유발된 유해 효과로부터 보호되고, 제1항에 따른 각각의 피롤니트린 생합성 유전자를 우선 다른 식물로 형질전환시키고, 그 결과 형성된 식물을 교배하여 상기 식물병원체를 억제하는 양의 피롤니트린을 생성하도록 하는 방식으로 상기 개별 피롤니트린 생합성 유전자를 포함하거나 발현하는 식물을 생성하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물의 생성 방법.
  25. 피롤니트린 합성에 필요한 완전한 효소 세트를 집단적으로 코딩하는 DNA 분자 세트를 포함하는 트랜스제닉 식물의 생성 방법에 있어서,
    상기 식물은 식물병원체에 의해 유발된 유해 효과로부터 보호되고,
    (a) 제1항에 따른 하나 이상의 피롤니트린 생합성 유전자를 이미 함유하는 트랜스제닉 식물을 하나 이상의 추가의 피롤니트린 유전자로 재형질전환시키거나;또는
    (b) 상기 식물병원체를 억제하는 양의 피롤니트린을 생성하도록 식물에서 작용하는 식물 발현 시그널의 조절 제어하에 제 1항에 따른 복수의 피롤니트린 유전자를 갖는 단일 형질전환 벡터를 이용하여 식물을 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물의 생성 방법.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 형질전환체에 도입된 외인성 DNA의 하나 이상의 복제물을 수득한 후대 식물의 게놈속에 안정적으로 혼입시킴으로써 일차 형질전환체를 유성적으로 또는 영양생식적으로 재생하는 단계를 더 포함하는 방법.
  27. (a) 식물 중에서 식물병원체를 억제하는 양으로 항식물병원성 물질을 생성하는데 필요한 모든 생합성 효소를 집단적으로 발현할 수 있는 제15항에 따른 하나 이상의 벡터로 트랜스제닉 식물을 형질전환시키는 단계;
    (b) 상기 벡터 DNA가 수득될 후대 식물의 게놈으로 안정하게 혼입되도록 단계 (a)로부터 얻어진 트랜스제닉 식물의 후대를 생성하는 단계; 및
    (c) 상기 후대 식물의 세포에서 항병원적 유효량의 항식물병원성 물질을 생성하는 단계를 포함하는, 식물병원체로부터 트랜스제닉 식물의 후대를 보호하는 방법.
  28. 식물병원체를 억제하는 양으로 항식물병원성 물질을 생성하는데 필요한 모든생합성 효소를 집단적으로 발현할 수 있는 제15항에 따른 하나 이상의 벡터로 형질전환된 생물방제제로 식물을 처리하는 것을 포함하는, 식물병원체로부터 식물을 보호하는 방법.
  29. (a) 숙주에서 피롤니트린을 생성하는데 필요한 모든 생합성 효소를 집단적으로 발현할 수 있는 제15항에 따른 하나 이상의 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계 ;
    (b) 피롤니트린을 생성할 수 있는 조건하에서 상기 숙주를 성장시키는 단계; 및
    (c) 상기 숙주로부터 피롤니트린을 수집하는 단계를 포함하는, 균일한 키랄성을 갖는 다량의 피롤니트린을 생산하는 방법.
  30. 제23항에 따른 숙주 또는 이 숙주의 현탁액 또는 농축물에 의해 생성된 식물병원체 억제량의 항병원성 물질을 활성 성분으로서 포함하는 조성물을 식물에 적용하는 단계를 포함하는, 식물병원체로부터 식물을 보호하는 방법.
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