KR20170020490A

KR20170020490A - Pd-1 및 lag-3와의 면역반응성을 가진 공유 결합된 디아바디, 및 그것의 사용 방법

Info

Publication number: KR20170020490A
Application number: KR1020177001638A
Authority: KR
Inventors: 에지오 본비니; 레슬리 에스. 존슨; 칼파나 샤; 모테-모스 로스 라; 폴 에이. 무어; 스코트 코에니그
Original assignee: 마크로제닉스, 인크.
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2017-02-22
Also published as: TWI693232B; MY177324A; GEP20197034B; CN106715470A; JP2017526632A; US20220041714A1; EA036737B1; SI3161004T1; EA201790087A1; IL249764A0; WO2015200119A1; NZ727772A; EP3161004A1; WO2015200119A8; ECSP16096342A; KR102514330B1; US11098119B2; CA2953818A1; SA516380600B1; PH12016502590B1

Abstract

본 발명은 두 개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고 PD-1의 에피토프에 면역특이적인 적어도 하나의 에피토프-결합 부위 및 LAG-3의 에피토프에 면역특이적인 적어도 하나의 에피토프-결합 부위를 가지고 있는 이중-특이적 디아바디 (즉, "PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디")에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 본 발명은 네 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고 PD-1의 하나의 (또는 두 개의) 에피토프(들)에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위 및 LAG-3의 하나의 (또는 두 개의) 에피토프(들)에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있는 이중-특이적 디아바디 (즉, "PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명은 또한 추가적으로 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 이러한 디아바디 ("이중-특이적 Fc 디아바디 및 이중-특이적, 4가 Fc 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명의 디아바디는, 특히 이러한 분자가 인간 세포의 표면 상에 배열되기 때문에, PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명은 이러한 디아바디를 함유하는 약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에 있어서 이러한 디아바디의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.

Description

PD-1 및 LAG-3와의 면역반응성을 가진 공유 결합된 디아바디, 및 그것의 사용 방법{COVALENTLY BONDED DIABODIES HAVING IMMUNOREACTIVITY WITH PD-1 AND LAG-3, AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원에 대한 교차 참조 :

본 출원은 미국 특허 출원 번호 62/017,467 (2014년 6월 26일 출원됨; 특허 출원 중)에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록에 대한 참조 :

본 출원은 37 C.F.R. 1.821 et seq.에 의해 컴퓨터로 판독 가능한 매체에 개시된 하나 이상의 서열 목록 (파일명: 1301_0115PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, 2015년 6월 2일에 생성되었고, 50,015 바이트의 크기를 가짐)을 포함하며, 이 파일은 전부 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 분야:

본 발명은 두 개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고 PD-1의 에피토프에 면역특이적인 적어도 하나의 에피토프-결합 부위 및 LAG-3의 에피토프에 면역특이적인 적어도 하나의 에피토프-결합 부위를 가지고 있는 이중-특이적 디아바디 (즉, "PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디")에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 본 발명은 네 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고 PD-1의 하나의 (또는 두 개의) 에피토프(들)에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위 및 LAG-3의 하나의 (또는 두 개의) 에피토프(들)에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있는 이중-특이적 디아바디 (즉, "PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역글로불린 Fc 도메인 ("이중-특이적 Fc 디아바디" 및 "이중-특이적, 4가 Fc 디아바디")을 추가적으로 포함하는 이러한 디아바디에 관한 것이다. 본 발명의 디아바디는, 특히 이러한 분자들이 인간 세포의 표면 상에 배열되기 때문에, PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명은 이러한 디아바디를 함유하는 약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료시 이러한 디아바디의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.

I. 세포-매개 면역 반응

인간 및 다른 포유동물의 면역 시스템은 감염 및 질환으로부터의 보호를 제공할 책임이 있다. 이러한 보호는 체액 면역 반응 및 세포-매개 면역 반응 둘 다에 의해 제공된다. 체액 반응은 외래 표적 (항원)을 인식하고 중화시킬 수 있는 항체 및 다른 생체 분자의 생산을 초래한다. 그에 반해서, 세포-매개 면역 반응은 항원의 인식에 반응하여 T-세포에 의한 매크로파지, 자연 살해 세포 (NK), 및 항원-특이적 세포독성 T-림프구의 활성화, 및 다양한 사이토카인의 방출을 수반한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48).

항원에 대한 면역 반응을 선택적으로 매개하는 T-세포의 능력은 두 개의 별개의 신호 전달 상호작용을 필요로 한다 (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation," Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339). 첫 번째로, 항원-제공 세포 (APC)의 표면 상에 배열된 항원은 항원-특이적 나이브(naive) CD4⁺ T-세포에 제공되어야 한다. 이러한 제공은 T-세포가 제공된 항원에 특이적일 면역 반응을 시작하도록 지시하는 T-세포 수용체 (TCR)를 통해 신호를 전달한다. 두 번째로, APC 및 별개의 T-세포 표면 분자 간의 상호작용을 통해 매개된 일련의 동시-자극 및 억제 신호는 먼저 T-세포의 활성화 및 증식을 촉발하고 궁극적으로는 그것들의 억제를 촉발한다. 따라서, 제1 신호는 면역 반응에 대한 특이성을 부여하는 반면에 제2 신호는 반응의 성질, 규모 및 기간을 결정하는 역할을 한다.

면역 시스템은 동시자극 및 동시-억제 리간드 및 수용체에 의해 엄격하게 제어된다. 이 분자들은 T-세포 활성화를 위한 제2 신호를 제공하며 감염에 대한 면역 반응을 최대화하는 한편 자신에 대한 면역력을 제한하기 위해서 양성 및 음성 신호의 균형잡힌 네트워크를 제공한다 (Wang, L. et al. (March 7, 2011) "VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses," J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, B. et al. (2008) "The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections," Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). 특히 중요한 것은 항원-제공 세포의 B7.1 (CD80) 및 B7.2 (CD86) 리간드와 CD4⁺ T-림프구의 CD28 및 CTLA-4 수용체 간의 결합이다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321). CD28에 B7.1 또는 B7.2의 결합은 T-세포 활성화를 자극하고; CTLA-4에 B7.1 또는 B7.2의 결합은 이러한 활성화를 억제한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28은 T-세포의 표면 상에서 구성적으로 발현되는 반면에 (Gross, J., et al. (1992) "Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse," J. Immunol. 149:380-388), CTLA4 발현은 T 세포 활성화 후 신속하게 상향 조절된다 (Linsley, P. et al. (1996) "Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement," Immunity 4:535-543). CTLA4가 더 높은 친화도의 수용체이기 때문에 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126), 결합은 먼저 T-세포 증식을 시작한 다음 (CD28을 통해) 그것을 억제하며 (CTLA4의 초기 발현을 통해), 이로 인해 증식이 더 이상 필요하지 않을 때 효과를 약화시킨다.

CD28 수용체의 리간드의 추가 조사는 관련된 B7 분자 세트 ("B7 슈퍼패밀리")의 확인 및 특성화로 이어졌다 (Coyle, A.J. et al. (2001) "The Expanding B7 Superfamily : Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T-Cell Function," Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells." Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance," Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) "CD28/B7 System of T-Cell Costimulation," Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) "Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses," Microbes Infect. 6:759-766). 현재는 패밀리의 여러 구성원들이 공지되어 있다: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), 유도성 동시-자극자 리간드 (ICOS-L), 예정된 사멸-1 리간드 (PD-L1; B7-H1), 예정된 사멸-2 리간드 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 및 B7-H6 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2).

II. PD-1

예정된 사멸-1 ("PD-1")은 면역 반응을 광범위하게 부정적으로 조절하는 T-세포 조절자의 확대된 CD28/CTLA4 패밀리의 대략 31 kD I형 막단백질 구성원이다 (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily , Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; 미국 특허 번호 6,808,710; 7,101,550; 7,488,802; 7,635,757; 7,722,868; PCT 공개 번호 WO 01/14557). CTLA4와 비교하여, PD-1이 더 많다.

PD-1은 활성화된 T-세포, B 세포, 및 단핵구 상에서 발현되고 (Agata, Y. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. et al. (2002) "Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC," J. Immunol. 169:5538-5545) 자연 살해 (NK) T-세포에서는 낮은 수준으로 발현된다 (Nishimura, H. et al. (2000) "Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice," J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).

PD-1의 세포 외 영역은 CTLA4의 동등한 도메인에 대하여 23% 동일성을 가진 단일 면역글로불린 (Ig)V 도메인으로 구성된다 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). 세포 외 IgV 도메인에 막관통 영역 및 세포 내 꼬리가 뒤따른다. 세포 내 꼬리는 면역 수용체 티로신-기반 억제 모티프 및 면역 수용체 티로신-기반 스위치 모티프 내에 위치한 두 개의 인산화 부위를 함유하며, 이것은 PD-1이 TCR 신호를 부정적으로 조절한다고 제안한다 (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; Blank, C. et al. (Epub 2006 Dec 29) "Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer," Immunol. Immunother. 56(5):739-745).

PD-1은 B7-H1 및 B7-DC에 결합하여 그것의 면역 시스템 억제를 매개한다 (Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s : Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260; 미국 특허 번호 6,803,192; 7,794,710; 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT 공개 번호 WO 01/39722; WO 02/086083).

B7-H1 및 B7-DC는 인간 및 쥐 조직, 예를 들어, 심장, 태반, 근육, 태아 간, 비장, 림프절, 및 흉선, 뿐만 아니라 쥐 간, 폐, 신장, 췌장 및 소장의 섬세포의 표면 상에서 광범위하게 발현되는 결합 리간드이다 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). 인간에서, B7-H1 단백질 발현은 인간 내피 세포 (Chen, Y. et al. (2005) "Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells," Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al. (2005) "Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1" Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al. (2002) "B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis," J. Immunol. 169:3581-3588), 심근 (Brown, J.A. et al. (2003) "Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production," J. Immunol. 170:1257-1266), 합포체영양아세포 (Petroff, M.G. et al. (2002) "B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface," Placenta 23:S95-S101)에서 발견되었다. 분자들은 또한 일부 조직의 체류 매크로파지에 의해, 인터페론 (IFN)-γ 또는 종양 괴사 인자 (TNF)-α로 활성화된 매크로파지에 의해 (Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation," Nat. Immunol 2:261-268), 및 종양에서 (Dong, H. (2003) "B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity," J. Mol. Med. 81:281-287) 발현된다.

B7-H1과 PD-1 간의 상호작용은 T 세포 및 B 세포에 결정적인 음성 동시-자극 신호를 제공하는 것으로 발견되었고 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298) 세포사 유도물질로서 기능한다 (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition," J. Molec. Med. 83:193-202). 더 구체적으로는, 저농도의 PD-1 수용체와 B7-H1 리간드 간의 상호작용이 항원-특이적 CD8⁺ T-세포의 증식을 강력하게 억제하는 억제 신호의 전송을 초래하는 것으로 발견되었고; 더 높은 농도에서는 PD-1과의 상호작용이 T 세포 증식을 억제하지 않지만 다수의 사이토카인의 생산을 현저히 감소시킨다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). 제대혈의 휴지기 및 이전에 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포, 및 심지어는 나이브 T-세포에 의한 T 세포 증식 및 사이토카인 생산은 가용성 B7-H1-Fc 융합 단백질에 의해 억제되는 것으로 발견되었다 (Freeman, G.J. et al. (2000) "Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation," J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation," Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) "PD-1:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T-cells and is overcome by IL-2," Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126).

T-세포 활성화 및 증식을 억제하는데 있어서 B7-H1 및 PD-1의 역할은 이 생체 분자들이 염증 및 암의 치료를 위한 치료적 표적으로서 역할을 할 수도 있다는 것을 제안하였다. 따라서, 감염 및 종양을 치료하고 후천적 면역 반응을 상향 조절하기 위한 항-PD-1 항체의 사용이 제안되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401; 미국 특허 번호 7,521,051; 7,563,869; 7,595,048; PCT 공개 번호 WO 2004/056875; WO 2008/083174 참조). PD-1에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체가 Agata, T. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772 및 Berger, R. et al. (2008) "Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies," Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051에 의해 보고되었다 (또한, 미국 특허 번호 8,008,449 및 8,552,154; 미국 특허 공개 번호 2007/0166281; 2012/0114648; 2012/0114649; 2013/0017199; 2013/0230514 및 2014/0044738; 및 PCT 특허 공보 WO 2003/099196; WO 2004/004771; WO 2004/056875; WO 2004/072286; WO 2006/121168; WO 2007/005874; WO 2008/083174; WO 2009/014708; WO 2009/073533; WO 2012/135408, WO 2012/145549 및 WO 2013/014668 참조).

III. LAG-3

림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3, CD223)은 활성화된 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 및 NK 세포에 의해 발현되고, 구성적으로 형질 세포양 수지상세포에 의해 발현되는 세포-표면 수용체 단백질이고; LAG-3은 B 세포, 단핵구 또는 테스트된 어느 다른 세포 유형에 의해서는 발현되지 않는다 (Workman, C.J. et al. (2009) "LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis," J. Immunol. 182(4):1885-1891).

LAG-3은 T-세포 동시-수용체 CD4에 밀접하게 관련되어 있는 것으로 발견되었다 (Grosso, J.F. et al. (2009) "Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells," J. Immunol. 182(11):6659-6669; Huang, C.T. et al. (2004) "Role Of LAG-3 In Regulatory T-Cells," Immunity 21:503-513; Workman, C.J. et al. (2009) "LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis," J. Immunol. 182(4):1885-1891). CD4와 유사하게, LAG-3은 또한 MHC 등급 II 분자에 결합하지만 훨씬 더 높은 친화도로 결합한다 (Workman, C.J. et al. (2002) "Phenotypic Analysis Of The Murine CD4-Related Glycoprotein, CD223 (LAG-3)," Eur. J. Immunol. 32:2255-2263; Huard, B. et al. (1995) "CD4/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Analyzed With CD4- And Lymphocyte Activation Gene-3 (LAG-3)-Ig Fusion Proteins," Eur. J. Immunol. 25:2718-2721; Huard, B. et al. (1994) "Cellular Expression And Tissue Distribution Of The Human LAG-3- Encoded Protein, An MHC Class II Ligand," Immunogenetics 39:213-217).

연구는 LAG-3이 T-세포 증식, 기능 및 항상성을 부정적으로 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다 (Workman, C.J. et al. (2009) "LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis," J. Immunol. 182(4):1885-1891; Workman, C.J. et al. (2002) "Cutting Edge: Molecular Analysis Of The Negative Regulatory Function Of Lymphocyte Activation Gene-3," J. Immunol. 169:5392-5395; Workman, C.J. et al. (2003) "The CD4-Related Molecule, LAG-3 (CD223), Regulates The Expansion Of Activated T-Cells," Eur. J. Immunol. 33:970-979; Workman, C.J. (2005) "Negative Regulation Of T-Cell Homeostasis By Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223)," J. Immunol. 174:688-695; Hannier, S. et al. (1998) "CD3/TCR Complex-Associated Lymphocyte Activation Gene-3 Molecules Inhibit CD3/TCR Signaling," J. Immunol. 161:4058-4065; Huard, B. et al. (1994) "Lymphocyte-Activation Gene 3/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Modulates The Antigenic Response Of CD4 ⁺ T Lymphocytes," Eur. J. Immunol. 24:3216-3221).

연구는 항체 차단을 통한 LAG-3 기능의 억제가 LAG-3-매개 면역 시스템 억제를 반전시키고 효과기 기능을 부분적으로 회복시킬 수 있다고 제안하였다 (Grosso, J.F. et al. (2009) "Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells," J. Immunol. 182(11):6659-6669; Grosso, J.F. et al. (2007) "LAG-3 Regulates CD8 ⁺ T-Cell Accumulation And Effector Function During Self And Tumor Tolerance," J. Clin. Invest. 117:3383-3392). LAG-3는 T 세포 수용체 (TCR)-유도성 칼슘 유동의 억제를 통해 T 세포 확장을 부정적으로 조절하는 것으로 발견되었으며, 기억 T 세포 풀(pool)의 크기를 제어한다 (Matsuzaki, J. et al. (2010) "Tumor-Infiltrating NY- ESO -1-Specific CD8+ T-Cells Are Negatively Regulated By LAG-3 And PD-1 In Human Ovarian Cancer," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 107(17):7875-7880; Workman C.J., et al. (2004) "Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223) Regulates The Size Of The Expanding T-Cell Population Following Antigen Activation in vivo," J. Immunol. 172:5450-5455).

사전 개발에도 불구하고, 신체 면역 시스템이, 특히 더 낮은 치료 농도에서, 암 세포 또는 병원체-감염된 세포를 공격하도록 더 활발하게 지시할 수 있는 개선된 조성물에 대한 필요성이 남아있다. 후천적 면역 시스템이 암 및 질환에 대한 강력한 방어 메커니즘일 수는 있지만, 그것은 종종 종양 미세 환경에서 면역 억제 메커니즘, 예를 들어, PD-1 및 LAG-3의 발현에 의해 방해된다. 종양 환경에서 종양 세포, 면역 세포, 및 간질 세포에 의해 발현된 동시 억제 분자는 암 세포에 대한 T-세포 반응을 대부분 감쇠시킬 수 있다.

하기 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명은 PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 디아바디를 제공함으로써 이 필요성을 해결한다. 이러한 디아바디는 소진된 및 내성 종양-침윤성 림프구의 표면 상에 존재하는 PD-1 및 LAG-3 세포-표면 분자에 결합하고, 이로 인해 수용체 리간드에 결합하는 이러한 세포-표면 분자의 능력을 손상시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 PD-1 및 LAG-3-매개 면역 시스템 억제를 차단하고, 이로 인해 면역 시스템의 지속적인 활성화를 촉진하는 작용을 한다. 이 속성은 이러한 이중-특이적 디아바디가 암 및 병원체-관련 질환 및 상태의 치료에 유용성을 갖도록 허용한다. 본 발명은 이러한 디아바디 및 그것들의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명의 요약:

본 발명은 두 개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고 PD-1의 에피토프에 면역특이적인 적어도 하나의 에피토프-결합 부위 및 LAG-3의 에피토프에 면역특이적인 적어도 하나의 에피토프-결합 부위를 가지고 있는 이중-특이적 디아바디 (즉, "PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디")에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 본 발명은 네 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고 PD-1의 하나의 (또는 두 개의) 에피토프(들)에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위 및 LAG-3의 하나의 (또는 두 개의) 에피토프(들)에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있는 이중-특이적 디아바디 (즉, "PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명은 또한 추가적으로 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 이러한 디아바디 ("이중-특이적 Fc 디아바디" 및 "이중-특이적, 4가 Fc 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명의 디아바디는, 특히 이러한 분자가 인간 세포의 표면 상에 배열되기 때문에, PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명은 이러한 디아바디를 함유하는 약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료시 이러한 디아바디의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.

상세하게는, 본 발명은 PD-1의 에피토프 및 LAG-3의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 이중-특이적 Fc 디아바디를 제공하는데, 디아바디는 네 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하며, 각각은 아미노 말단 및 카르복시 말단을 가지며;

(A) 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되고, 제2 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되고, 및 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되고;

(B) 디아바디의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 각각, N-말단에서 C-말단 방향으로, PD-1 또는 LAG-3에 면역특이적인 항체의 경쇄 가변 도메인, LAG-3 또는 PD-1에 면역특이적인 항체의 중쇄 가변 도메인, 헤테로다이머-촉진 도메인 및 CH2-CH3 도메인을 포함하며, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 PD-1의 에피토프 또는 LAG-3의 에피토프를 결합시킬 수 있는 에피토프-결합 부위를 형성하도록 회합할 수 없고;

(C) 디아바디의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 각각, N-말단에서 C-말단 방향으로, PD-1 또는 LAG-3에 면역특이적인 항체의 경쇄 가변 도메인, LAG-3 또는 PD-1에 면역특이적인 항체의 중쇄 가변 도메인, 및 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하며, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 PD-1의 에피토프 또는 LAG-3의 에피토프를 결합시킬 수 있는 에피토프-결합 부위를 형성하도록 회합할 수 없고;

(I) (1) 제1 폴리펩타이드 사슬의 경쇄 가변 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 가변 도메인은 회합하여 에피토프-결합 부위를 형성하고 제1 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 가변 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 경쇄 가변 도메인은 회합하여 제2 에피토프-결합 부위를 형성하고;

(2) 제3 폴리펩타이드 사슬의 경쇄 가변 도메인 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 가변 도메인은 회합하여 제3 에피토프-결합 부위를 형성하고 제3 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 가변 도메인 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 경쇄 가변 도메인은 회합하여 제4 에피토프-결합 부위를 형성하며;

형성된 에피토프-결합 부위 중 두 개는 PD-1의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있고 형성된 에피토프-결합 부위 중 두 개는 LAG-3의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있고;

II. 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 상이하며 서열 번호:16 및 서열 번호:17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고:

III. 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 회합하여 Fc 도메인을 형성한다.

본 발명은 또한 이러한 이중-특이적 Fc 디아바디의 구체예에 관한 것이며 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 각각 서열 번호:24의 아미노산을 가진다.

본 발명은 또한 이러한 이중-특이적 Fc 디아바디의 구체예에 관한 것이며 LAG-3에 면역특이적인 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 번호:11의 아미노산 서열을 가지고, LAG-3에 면역특이적인 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 가진다.

본 발명은 또한 이러한 이중-특이적 Fc 디아바디의 구체예에 관한 것이며 PD-1에 면역 특이적인 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 번호:2의 아미노산 서열을 가지고, PD-1에 면역 특이적인 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 가진다.

본 발명은 또한 상기 지시된 Fc 디아바디, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 중 어느 것의 유효량을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이러한 약학적 조성물의 구체예에 관한 것이며 이중-특이적 Fc 디아바디의 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 수령체 개체에서 암을 치료하는데 효과적인 양이다.

본 발명은 또한 이러한 약학적 조성물의 구체예에 관한 것이며 암은 부신암, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양(Ewing's tumor), 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 골 섬유 이형성증, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 섬세포 종양, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비성 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두상 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아 암, 말초 신경초 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀성 혈액 장애, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암, 또는 자궁암이다.

본 발명은 또한 이러한 약학적 조성물의 구체예에 관한 것이며 이중-특이적 Fc 디아바디의 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 수령체 개체에서 병원체의 존재와 관련된 질환을 치료하는데 효과적인 양이다.

본 발명은 또한 이러한 약학적 조성물의 구체예에 관한 것이며 병원체는 박테리아, 균류 또는 바이러스이다.

본 발명은 또한 암 치료를 필요로 하는 개체에게 이러한 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 병원체의 존재와 관련된 질환의 치료가 필요한 개체에게 제8 항 또는 제9 항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 병원체의 존재와 관련된 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

도 1은 염기성 DART®의 도메인의 다이어그램을 나타낸다.
도 2는 Fc-함유 DART®의 도메인의 다이어그램을 나타낸다.
도 3은 Fc-DART®의 도메인의 다이어그램을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 디아바디의 도메인의 다이어그램을 나타낸다. 네 개의 폴리펩타이드 사슬은 함께 복합체를 형성하여 디아바디를 형성하며, 이것들 중 두 개는 폴리펩타이드 사슬 1 및 3의 도메인을 가지고, 이것들 중 두 개는 폴리펩타이드 사슬 2 및 4의 도메인을 가진다. 이황화 결합 (세로줄로 도시됨)은 폴리펩타이드 사슬 1과 2, 폴리펩타이드 사슬 1과 3 및 폴리펩타이드 사슬 3과 4를 공유 결합으로 연결한다. 같은 폴리펩타이드 사슬의 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인은 결과로 생긴 디아바디가 PD-1에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 도메인 및 LAG-3에 면역 특이적인 두 개의 에피토프-결합 도메인을 갖도록 상이한 에피토프 (PD-1 또는 LAG-3)로 향한다.
도 5는 T-세포의 증진시키는 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체의 능력을 평가하기 위한 프로토콜의 다이어그램을 나타낸다.
도 6은 allo-MLR 검정의 시작시 PD-1 mAb 1 (5C4; BMS-936558), PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, 람브롤리주맙) 및 PD-1 mAb 3 (EH12.2H7; Dana Farber)의 추가가 IgG1 아이소타입 대조군 항체와 비교하여 강력한 T-세포 증식 반응을 유도했다는 것을 나타낸다. 또한 PD -1 mAb 4 (CT-011; CureTech, BAT-1), 항-CTLA mAb 및 LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS)으로 얻어진 증식 반응이 나타난다. 응답자 (R) 세포는 판(pan) T 세포이고; 자극자 (S)세포는 성숙한 수지상세포 (mDC)이다.
도 7은, T-세포 증식 가능성에 대하여, 단독으로 또는 PD-1 mAb 1 (5C4; BMS-936558), PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, 람브롤리주맙)와 조합으로, LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS)의 평가 결과를 나타낸다. 응답자 (R) 세포는 판 T 세포이고; 자극자 (S)세포는 성숙한 수지상세포 (mDC)이다.
도 8은 APC 및 CD4 T-세포 둘 다에서 발현된 인간 HLA-등급 II 분자에 결합하는 가용성 인간 LAG-3 (shLAG-3)가 IgG 아이소타입 또는 응답자 (R) (판 T 세포) 플러스 자극자 (S) (성숙한 수지상세포 (mDC)) 대조군 웰과 비교하여 강력한 증식 반응을 유도했다는 것을 나타낸다.
도 9A-9B는 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디가 항-PD-1 mAb (5C4) 또는 항-LAG-3 mAb (25F7)와 비교하여 강력한 T-세포 증식 반응을 유도했다는 것을 나타낸다. 도 9A는 본 발명의 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 디아바디 (PD-1 x LAG- Fc -DART®-1 및 PD-1 x LAG- Fc -DART®-2), PD-1 mAb 1 (5C4; BMS-936558)), LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS), 가용성 인간 LAG-3 (ShLAG-3), 대조군 IgG, 응답자+자극자 세포 (판 T 세포 및 성숙한 수지상세포; R+S) 및 자극자 세포 (성숙한 수지상세포; S)를 사용하여 얻어진 T-세포 증식 반응을 나타낸다. 도 9B는 다른 y-축 스케일을 사용하여, PD-1 x LAG- Fc -DART®-1 및 PD-1 x LAG- Fc -DART®-2, PD-1 mAb 1 (5C4; BMS-936558)), LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS), 및 PD-1 mAb 1 (5C4; BMS-936558)) + LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS)에 대하여 같은 데이터를 나타낸다.

본 발명은 두 개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고 PD-1의 에피토프에 면역특이적인 적어도 하나의 에피토프-결합 부위 및 LAG-3의 에피토프에 면역특이적인 적어도 하나의 에피토프-결합 부위를 가지고 있는 이중-특이적 디아바디 (즉, "PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디")에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 본 발명은 네 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고 PD-1의 하나의 (또는 두 개의) 에피토프(들)에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위 및 LAG-3의 하나의 (또는 두 개의) 에피토프(들)에 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있는 이중-특이적 디아바디 (즉, "PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명은 또한 추가적으로 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 이러한 디아바디 ("이중-특이적 Fc 디아바디" 및 "이중-특이적, 4가 Fc 디아바디")에 관한 것이다. 본 발명의 디아바디는, 특히 이러한 분자가 인간 세포의 표면 상에 배열되기 때문에, PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명은 이러한 디아바디를 함유하는 약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 장애에서 이러한 디아바디의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 이중-특이적 디아바디는, 특히 이러한 분자가 인간 세포의 표면 상에 배열되기 때문에, PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명은 이러한 디아바디를 함유하는 약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 장애의 치료에서 이러한 디아바디의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 함께 공유 결합으로 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 사슬을 포함한다.

상기 논의된 바와 같이, T-세포 활성화는 두 개의 별개의 신호를 필요로 한다. 제1 신호는 항원-제공 세포 (APC) 상에서 발현된 인간 백혈구 항원 (HLA)의 맥락에서 펩타이드 항원을 인식한 T-세포의 표면 상에서 발현된 T-세포 수용체 (TCR)에 의해 제공된다. 제2 신호는 APC 상에서 발현된 동시-자극 리간드, B7-1 및 B7-2의 동족 쌍 및 T-세포 상에서 발현된 그것들의 해당 수용체, CD28 및 CTLA-4의 상호작용에 의해 제공된다.

이 수용체-리간드 축 내에서, B7-동시-자극자 분자와 CD28 수용체의 결합은 T-세포 활성화 및 증식 반응을 "서서히 줄이기 위해서(wind down)" T-세포 증식을 자극하고 그 이후 B7-1 및 B7-2 리간드와 강력하게 경쟁하는 CTLA-4, 부정적 조절자 및 CD28에 대한 반수용체의 발현을 유도할 수 있다. CD28를 결합시키는 아고니스트(agonist) 항체는 T-세포 효과기 기능을 유도하고 종양 근절 면역력의 발생을 증진시키는 것으로 나타났으며 사실상 동시-자극성이다. 반대로, CTLA-4 결합을 차단하는 안타고니스트(antagonist)는 자가면역으로 이어질 수 있는 지속적인 증식을 유지하면서 T-세포가 그것들의 효과기 기능을 해제하는 것을 방지할 수 있다.

정상적인 항상성 중에 및 항원에 대한 면역 반응의 프라이밍 단계(priming phase)에서 면역 시스템을 활성화시키는 기능을 하는 CTLA-4:B7-1/B7-2 축과 평행하게, 제2 수용체-리간드 축은 면역 시스템을 억제하는 기능을 하고, 이로 인해 면역 반응의 효과기 단계 중에 CTLA-4에 대한 대칭점(counter-point)의 역할을 한다. 이 제2 축은 T-세포의 표면 상에서 발현된 예정된 세포사-1 단백질 (PD-1) 수용체의, 각각 항원-제공 세포 (APC) 및 상피 세포에서 발현된 그것의 해당 리간드, PD-L1 및 PD-L2로의 결합을 수반한다 (Chen L. et al. (2013) "Molecular Mechanisms Of T-Cell Co-Stimulation And Co-Inhibition," Nature Reviews Immunology 13(4):227-242). CD28에 결합하여 T-세포 반응을 자극하는 아고니스트 항체와 대조적으로, PD-1 또는 PD-L1에 결합하는 항체는 PD-1/PD-L1 결합을 상쇄 또는 차단하고 T-세포로의 암성 신호의 전달을 방지함으로써 T-세포 반응을 유지할 수 있다. 이것은 T-세포 증식, 세포독성, 및 사이토카인 분비를 증가시키거나 유지한다. 종합해 보면 아고니스트 항체, 예를 들어, 항-CD28은 양성 신호 경로를 표적화하며 그러므로 동시-자극자인 한편, 안타고니스트 항체, 예를 들어, 항-PD-1은 음의 신호 경로를 표적화하며 체크포인트 억제자로 불린다.

CTLA-4 및 PD-1이 표준 체크포인트 억제자를 대표하지만, 면역 조절 수용체-리간드 쌍의 성장하는 패밀리가 존재한다. 상기 논의된 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3)은 APC 상에서 발현된 HLA-등급 II 분자에 결합하는 T-세포 상에서 발현된 추가적인 체크포인트 억제자 표적이다. LAG-3는 소진된 및 내성 종양-침윤성 림프구 ("TIL") 상에서 PD-1과 함께 동시-발현되고 (Matsuzaki, J. et al. (2010) "Tumor-Infiltrating NY- ESO -1-Specific CD8+ T-Cells Are Negatively Regulated by LAG-3 and PD-1 in Human Ovarian Cancer," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 107(17):7875-7880; Okazaki, T. et al. (2011) "PD-1 and LAG-3 inhibitor Coreceptors Act Synergistically To Prevent Autoimmunity In Mice," J. Exp. Med. 208(2):395-407), LAG-3 발현은 종양 면역학 및 자가면역 둘 다에서의 역할을 내포하는 T-조절 세포에 대하여 보고되었다. 동물 모델은 항-LAG-3가 종양 성장을 둔화시키기에 충분한 강력한 종양 근절 면역력을 유도하고, 항-PD-1 mAb와 조합으로 제공될 때는 완벽한 종양 퇴화를 촉발할 수 있다는 것을 입증하였다 (Woo, S.R. et al. (2012) "Immune Inhibitory Molecules LAG-3 And PD-1 Synergistically Regulate T-Cell Function To Promote Tumoral Immune Escape," Cancer Res. 72(4):917-927). 항-LAG-3 mAb BMS-986016을 수반하는 조합 요법은 현재 단독으로 또는 항-PD-1 mAb (니볼루맙 / BMS-936558)와 조합으로 초기 단계 임상 조사 중에 있다 (Creelan, B.C. (2014) "Update on Immune Checkpoint Inhibitors in Lung Cancer," Cancer Control 21(1):80-89 참조).

본 발명의 이중-특이적 디아바디는 소진된 및 내성 종양-침윤성 림프구의 표면 상에 존재하는 PD-1 및 LAG-3 세포-표면 분자에 결합하고, 이로 인해 수용체 리간드에 결합하는 이러한 세포-표면 분자의 능력을 손상시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 PD-1 및 LAG-3-매개 면역 시스템 억제를 감쇠시키고, 지속적인 면역 시스템 활성화를 촉진할 수 있다.

I. 일반적인 기술 및 일반적인 정의

본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않으면, 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이것들은 당업계의 기술범위 내에 있다. 이러한 기술은 문헌, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; Oligonucleotide Synthesis (Gait, M.J., Ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ; Cell Biology: A Laboratory Notebook (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; Animal Cell Culture (Freshney, R.I., Ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (Mather, J.P. and Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (Doyle, A. et al., Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) New York, NY; Weir's Handbook of Experimental Immunology (Herzenberg, L.A. et al. Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, K. et al., Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; Current Protocols in Immunology (Coligan, J.E. et al., eds., 1991)Z John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; Immunobiology 7 (Janeway, C.A. et al. 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Shepherd, P. et al. Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; Using Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow, E. et al. Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; The Antibodies (Zanetti, M. et al. Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); 및 DeVita, Hellman, and Rosenberg's Cancer: Principles & Practice of Oncology, Eighth Edition, DeVita, V. et al. Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA에서 충분히 설명된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항체"는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 표적, 예를 들어, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드, 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것들의 돌연변이, 자연 발생 변종, 필수의 특이성의 항원 인식 부위를 가지고 있는 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 및 키메라 항체, 및 필수의 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 변형된 배치를 포함한다. 자연 발생 항체는 전형적으로 폴리펩타이드 "중쇄" ("H") 두 카피 및 폴리펩타이드 "경쇄" ("L") 두 카피를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 ("VL") 및 경쇄 불변 영역 ("CL")으로 구성되고, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 ("VH") 및 보통 세 개의 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 폴리펩타이드의 CH2 및 CH3 도메인은 서로 상호작용하여 면역 시스템 세포의 표면 상에 존재하는 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 영역을 형성한다.

항원의 에피토프를 결합시키는 온전한, 변형되지 않은 항체 (예를 들어, IgG)의 능력은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 상의 가변 도메인 (즉, 각각 VL 및 VH 도메인)의 존재에 의존한다. 항체 경쇄 및 항체 중쇄의 상호작용 및, 특히, 그것의 VL 및 VH 도메인의 상호작용은 항체의 에피토프-결합 부위 중 하나를 형성한다. 그에 반해서, 항체의 "scFv" 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬에 함유된 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하며 도메인들은 기능적 에피토프-결합 부위로의 두 개의 도메인의 자가-조립을 허용하기에 충분한 길이의 플렉시블(flexible) 링커로 분리된다.

VL 및 VH 도메인의 자가-조립은 불충분한 길이 (약 12개 미만의 아미노산 잔기)의 링커 때문에 불가능하게 되고, scFv 구조 중 둘은 서로 상호작용하여 하나의 사슬의 VL이 다른 사슬의 VH와 회합하는 2가 분자인 "디아바디"를 형성한다 (Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG -Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658에서 재검토됨).

진단법에서 그것들의 공지된 사용 외에, 항체는 치료제로서 유용한 것으로 나타났다. 지난 수십 년간 항체의 치료적 가능성에 대한 관심이 되살아났으며, 항체는 생명공학-유래 약물의 주요 클래스 중 하나가 되었다 (Chan, C.E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-666). 거의 200개의 항체-기반 약물이 사용 승인되었거나 개발 중에 있다.

용어 "단클론성 항체"는 동질의 항체 집단을 말하며 단클론성 항체는 항원의 선택적 결합에 수반되는 아미노산 (자연 발생 및 비-자연 발생)으로 구성된다. 단클론성 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위로 향한다. 용어 단클론성 항체는 온전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것들의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂ Fv), 단일-사슬 (scFv), 이것들의 돌연변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 요구되는 특이성 및 항원에 결합하는 능력의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배치도 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 제조되는 방식 (예를 들어, 하이브리도마(hybridoma), 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물, 등에 의해)에 관하여 제한되는 것은 아니다. 용어는 전체 면역글로불린, 뿐만 아니라 상기 "항체"의 정의에서 기술된 단편 등을 포함한다. 단클론성 항체의 제조 방법은 업계에 공지되어 있다. Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497의 방법 또는 이것의 변형이 이용될 수 있는 방법 중 하나이다.

전형적으로, 단클론성 항체는 마우스, 래트 또는 토끼에서 개발된다. 항체는 세포, 세포 추출물, 또는 원하는 에피토프를 함유한 단백질 조제물의 면역원성 양으로 동물을 면역화함으로써 생산된다. 면역원은 1차 세포, 배양된 세포주, 암성 세포, 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 조직일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 면역화에 사용된 세포는 면역원으로서 사용 전에 일정 기간 (예를 들어, 적어도 24시간) 동안 배양될 수도 있다. 세포는 그 자체로서 또는 Ribi와 같은 비-변성 보조제와 조합하여 면역원으로 사용될 수도 있다. 일반적으로, 세포는 면역원으로서 사용될 때 온전하고 바람직하게는 생존 가능한 상태를 유지해야 한다. 온전한 세포는 파열된 세포보다 면역화된 동물에 의해 항원이 더 잘 검출되게 할 수도 있다. 변성 또는 거친 보조제, 예를 들어, 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)의 사용은 세포를 파열시킬 수도 있고 그러므로 단념된다. 면역원은 주기적인 간격으로, 예를 들어, 격주, 또는 매주 여러 번 투여될 수도 있거나, 또는 동물에서 (예를 들어, 조직 재조합체에서) 생존력을 유지하는 방식으로 투여될 수도 있다. 대안으로, 원하는 병원성 에피토프에 면역특이적인 기존의 단클론성 항체 및 임의의 다른 동등한 항체는 시퀀싱되어 업계에 공지된 어떤 수단으로도 재조합에 의해 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 항체가 시퀀싱되고 이어서 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 또는 증식을 위한 벡터로 클로닝된다. 원하는 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내 벡터에서 유지될 수도 있으며 그 후 숙주 세포는 확장되고 미래의 사용을 위해 냉동될 수 있다. 이러한 항체의 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체의 친화도, 또는 다른 특성을 개선하기 위해 본 발명의 이중-특이적 분자, 뿐만 아니라 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 개화된(caninized) 항체를 생성하기 위한 유전자 조작에 사용될 수도 있다. 항체의 인간화에서 일반적인 원칙은 항체의 에피토프-결합 부분의 염기성 서열을 보유하는 한편, 항체의 비-인간 나머지를 인간 항체 서열로 바꾸는 것을 수반한다. 단클론성 항체를 인간화하기 위해서는 네 개의 일반적인 단계가 있다. 상기 단계들은 다음과 같다: (1) 시작 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 예측된 아미노산 서열을 결정하는 단계 (2) 인간화된 항체 또는 개화된 항체를 설계하는 단계, 즉, 인간화 또는 개화 공정 중에 어떤 항체 프레임워크 영역을 사용할지를 결정하는 단계 (3) 실제의 인간화 또는 개화 방법론/기술 단계 및 (4) 인간화된 항체의 트랜스펙션 및 발현 단계. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 및 6,331,415 참조.

천연 항체는 단 하나의 에피토프 종에 결합할 수 있지만 (즉, 그것들은 단일-특이적임), 그것들은 상기 종의 다수의 카피를 결합시킬 수 있다 (즉, 2가 또는 다원자가를 나타냄). 다양한 재조합 이중-특이적 항체 포맷이 개발되었는데 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968 참조), 이것들 대부분은 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 추가의 결합 단백질 (예를 들어, scFv)에 융합하거나 또는 예를 들어, 두 개의 Fab 단편 또는 scFv를 융합하기 위해 링커 펩타이드를 사용한다. 전형적으로, 이러한 접근법은 타협과 절충을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2013/174873, WO 2011/133886 및 WO 2010/136172는 링커의 사용이 치료적 설정에서 문제를 유발할 수도 있으며, 삼중-특이적 항체들이 하나 이상의 항원에 결합하게 하도록 CL 및 CH1 도메인이 각각의 천연 위치에서 전환되고 VL 및 VH 도메인이 다양화되는 삼중-특이적 항체 (WO 2008/027236; WO 2010/108127)를 교시한다는 것을 개시한다. 따라서, 이 문서들에서 개시된 분자는 결합 특이성을 추가적인 항원 종을 결합시키는 능력으로 교환한다. PCT 공개 번호 WO 2013/163427 및 WO 2013/119903은 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 부가물을 함유하기 위한 CH2 도메인의 변형을 개시한다. 문서는 CH2 도메인이 효과기 기능을 매개하는데 있어서 최소한의 역할만을 수행할 가능성이 크다는 것을 나타낸다. PCT 공개 번호 WO 2010/028797, WO2010028796 및 WO 2010/028795는 3가 결합 분자를 형성하기 위해서 Fc 영역이 추가적인 VL 및 VH 도메인으로 대체된 재조합 항체를 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2003/025018 및 WO2003012069는 개개의 사슬이 scFv 도메인을 함유하는 재조합 디아바디를 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2013/006544는 헤테로다이머 구조를 수득하기 위해 단일 폴리펩타이드 사슬로서 합성된 다음 단백질 가수분해되는 다원자가 Fab 분자를 개시한다. 따라서, 이 문서들에서 개시된 분자는 효과기 기능을 매개하는 능력 모두 또는 그 일부를 추가적인 항원 종을 결합시키는 능력으로 교환한다. PCT 공개 번호 WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 및 WO 1991/003493은 항체 또는 항체 일부에 추가적인 결합 도메인 또는 작용기의 추가 (예를 들어, 항체의 경쇄에 디아바디의 추가, 또는 항체의 경쇄 및 중쇄에 추가적인 VL 및 VH 도메인의 추가, 또는 이종 기원 융합 단백질 또는 연쇄 다중 Fab 도메인을 서로에게 추가)를 개시한다. 따라서, 이 문서들에서 개시된 분자는 네이티브(native) 항체 구조를 추가적인 항원 종을 결합시키는 능력으로 교환한다.

업계는 추가적으로 두 개 이상의 다른 에피토프 종을 결합시킬 수 있다는 점 (즉, 2가 또는 다원자가 이외에 이중-특이성 또는 다중 특이성을 나타냄)에서 천연 항체와는 다른 디아바디를 생산하는 능력에 주목하였다 (예를 들어, Holliger et al. (1993) "'Diabodies ': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv - Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).

디아바디의 디자인은 단일-사슬 가변 영역 단편 (scFv)을 기반으로 한다. 이러한 분자는 짧은 연결 펩타이드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결함으로써 제조된다. Bird et al. (1988) ("Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426)는 한 가변 영역의 카르복시 말단 및 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 대략 3.5 nm를 연결하는 연결 펩타이드의 예를 기술한다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되었다 (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 링커는 추가적인 기능, 예를 들어, 약물의 부착 또는 고체 지지물에 부착을 위해 차례로 변형될 수 있다. 단일-사슬 변종은 재조합으로 또는 합성으로 생산될 수 있다. scFv의 합성 생산을 위해서, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산을 위해서, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드는 적합한 숙주 세포, 진핵세포, 예를 들어, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포, 또는 원핵세포, 예를 들어, 대장균(E. coli)으로 도입될 수 있다. 원하는 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 일상적인 조작, 예를 들어, 결찰에 의해 제조될 수 있다. 결과의 scFv는 업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.

미국 특허 번호 7,585,952 및 미국 특허 공개 번호 2010-0173978은 ErbB2에 면역특이적인 scFv 분자에 관한 것이다. scFv 분자의 한 유형인 이중-특이적 T-세포 인게이저(engager) ("BiTE")가 기술되었다 (WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) "BiTE: A New Class Of Antibodies That Recruit T-Cells," Drugs of the Future 33: 137-147; Bargou, et al. 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T-Cell-Engaging Antibody," Science 321: 974-977). 이러한 분자는 두 개의 항원-결합 도메인을 가지는 단일 폴리펩타이드 사슬 분자로 구성되며, 두 개의 항원-결합 도메인 중 하나는 CD3 에피토프에 면역특이적으로 결합하고 그 중 두 번째는 표적 세포의 표면 상에 존재하는 항원에 면역특이적으로 결합한다.

비-단일-특이적 디아바디의 제공은 상당한 이점을 제공한다: 상이한 에피토프를 동시-결찰 및 동시-국소화하는 능력. 따라서 2가 디아바디는 치료 및 면역진단을 포함하는 광범위한 용처를 갖는다. 2가는 다양한 용처에서 디아바디의 설계 및 엔지니어링에 큰 유연성을 허용하며, 멀티머 항원에 대한 향상된 결합력, 상이한 항원의 교차-결합, 및 두 표적 항원의 존재에 의존하는 특이적 세포 유형에 대하여 지시된 표적화를 제공한다. 그것들의 증가된 원자가, 낮은 해리율 및 순환으로부터의 신속한 클리어런스로 인해 (~50 kDa 이하의 작은 크기의 디아바디에 대하여), 업계에 공지된 디아바디 분자는 또한 종양 이미지화 분야에서의 특별한 사용을 나타냈다 (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris ," Protein Eng. 10:1221).

디아바디의 2가는 상이한 세포의 동시-결찰, 예를 들어, 종양 세포에 세포독성 T-세포의 가교에 대한 사용으로 이어졌다 (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T-Cells," Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305). 따라서, 예를 들어, 디아바디 에피토프-결합 도메인은 CD3, CD16, CD32, 또는 CD64와 같은 임의의 면역 효과기 세포의 표면 결정요인에 관한 것일 수도 있으며, 이것들은 T 림프구, 자연 살해 (NK) 세포 또는 다른 단핵 세포 상에서 발현된다. 많은 연구에서, 효과기 세포 결정요인, 예를 들어, Fcγ 수용체 (FcγR)에 결합하는 디아바디는 또한 효과기 세포를 활성화시키는 것으로 발견되었다 (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen ( CEA )-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti- CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). 보통, 효과기 세포 활성화는 Fc-FcγR 상호작용을 통해 효과기 세포에 항원 결합된 항체의 결합에 의해 촉발되고; 따라서, 이 점에 있어서, 디아바디 분자는 그것들이 Fc 도메인을 포함하는지에 관계없이 Ig-유사 기능성을 나타낼 수도 있다 (예를 들어, 업계에 공지되거나 본원에서 예시된 임의의 효과기 기능 검정 (예를 들어, ADCC 검정)에서 분석된 바와 같음). 종양 및 효가기 세포를 교차-결합함으로써, 디아바디는 효과기 세포를 종양 세포의 근처로 가져올 뿐만 아니라 효과적인 종양 살해로 이어진다 (예를 들어, Cao et al. (2003) " Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197 참조).

하지만, 상기 이점들은 현저한 비용이 발생한다. 이러한 비-단일-특이적 디아바디의 형성은 두 개 이상의 별개의 그리고 상이한 폴리펩타이드의 성공적인 조립을 필요로 한다 (즉, 이러한 형성은 디아바디가 상이한 폴리펩타이드 사슬 종의 헤테로다이머화를 통해 형성되는 것을 필요로 한다). 이 사실은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 호모다이머화를 통해 형성되는 단일-특이적 디아바디와는 대조적이다. 비-단일-특이적 디아바디를 형성하기 위해서 적어도 두 개의 다른 폴리펩타이드 (즉, 두 개의 폴리펩타이드 종)가 제공되어야 하기 때문에, 및 이러한 폴리펩타이드의 호모다이머화가 비활성 분자로 이어지기 때문에 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), 이러한 폴리펩타이드의 생산은 같은 종의 폴리펩타이드 사이에서 공유 결합을 방지하기 위한 방식으로 달성되어야 한다 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588).

그러므로 업계는 이러한 폴리펩타이드의 비-공유 결합에 의한 회합을 교시하였다 (예를 들어, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조). 하지만, 업계는 비-공유 결합으로 회합된 폴리펩타이드로 구성된 이중-특이적 디아바디가 불안정하며 비-기능적 모노머로 쉽게 해리된다는 것을 인식하였다 (예를 들어, Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).

이러한 시도에 직면하여, 업계는 DART®로 불리는 안정하고, 공유 결합된 헤테로다이머 비-단일-특이적 디아바디를 개발하는데 성공하였다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; 및 Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449 참조). 이러한 디아바디는 두 개 이상의 공유 결합에 의해 복합체를 형성한 폴리펩타이드를 포함하고 이용된 폴리펩타이드 종 각각으로 하나 이상의 시스테인 잔기를 조작하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이러한 구조의 c-말단에 시스테인 잔기의 추가는 폴리펩타이드 사슬 사이의 이황화 결합을 허용하며, 2가 분자의 결합 특성에 개입하지 않으면서 결과의 헤테로다이머를 안정화하는 것으로 나타났다.

가장 단순한 DART®의 두 개의 폴리펩타이드 각각은 세 개의 도메인을 포함한다 (도 1). 제1 폴리펩타이드는 다음을 포함한다: (i) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 도메인, (ii) 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인, 및 (iii) 제2 폴리펩타이드로 헤테로다이머화를 촉진하고 디아바디의 제1 폴리펩타이드를 제2 폴리펩타이드를 공유 결합시키는 역할을 하는 제3 도메인. 제2 폴리펩타이드는 상보성 제1 도메인 (VL2 도메인), 상보성 제2 도메인 (VH1 도메인) 및 헤테로다이머화 및 제1 폴리펩타이드 사슬과의 공유 결합을 촉진하기 위해 제1 폴리펩타이드 사슬의 제3 도메인과 복합체를 형성하는 제3 도메인을 함유한다. 이러한 분자는 안정하고, 강력하며 두 개 이상의 항원을 동시에 결합시키는 능력을 가진다.

한 구체예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드의 제3 도메인은 각각 이황화 결합을 통해 폴리펩타이드를 함께 결합시키는 역할을 하는 시스테인 잔기를 함유한다. 폴리펩타이드 하나 또는 둘 다의 제3 도메인은, 디아바디 폴리펩타이드의 복합체 형성이 세포 (예를 들어, B 림프구, 수지상세포, 자연 살해 세포, 매크로파지, 호중구, 호산구, 호염기구 및 비만 세포)의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 형성하도록, 추가적으로 CH2-CH3 도메인의 서열을 가지고 있을 수도 있다 (도 2). 이러한 분자의 많은 변이가 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 이 Fc-함유 DART®는 세 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수도 있다. 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드는 세 개의 도메인을 함유한다: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인. 이러한 DART®의 제2 폴리펩타이드는 다음을 함유한다: (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 헤테로다이머화 및 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬과의 공유 결합을 촉진하는 도메인. 이러한 DART®의 제3 폴리펩타이드는 CH2-CH3 서열을 포함한다. 따라서, 이러한 DART®의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 함께 복합체를 형성하여 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위, 뿐만 아니라 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위를 형성한다. 제1 및 제2 폴리펩타이드는 그것들의 각각의 제3 도메인에 시스테인 잔기를 수반하여 이황화 결합을 통해 서로 결합된다. 특히, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 서로 복합체를 형성하여 이황화 결합을 통해 안정화되는 Fc 도메인을 형성한다. 이러한 디아바디는 향상된 효능을 가진다. 이러한 Fc-함유 DART®는 두 방향 중 하나를 가질 수도 있다 (표 1):

표 1
제1 방향	3^rd 사슬	NH₂-CH2-CH3-COOH
	1^st 사슬	NH₂-VL1-VH2-헤테로다이머-촉진 도메인-CH2-CH3-COOH
	2^nd 사슬	NH₂-VL2-VH1-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH
제2 방향	3^rd 사슬	NH₂-CH2-CH3-COOH
	1^st 사슬	NH₂-CH2-CH3-VL1-VH2-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH
	2^nd 사슬	NH₂-VL2-VH1-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH

Fc -DART®라고 불리는 더 복잡한 DART® (도 3)가 또한 기술되어 있다 (WO 2012/018687). Fc -DART®는 네 개의 폴리펩타이드 사슬을 가진다. 이러한 디아바디의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 세 개의 도메인을 함유한다: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인. Fc-DART®의 제2 및 제4 폴리펩타이드는 다음을 함유한다: (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 헤테로다이머화 및 Fc-DART™의 제1 폴리펩타이드 사슬과의 공유 결합을 촉진하는 도메인. 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인, 및 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인은 단일-특이적, 이중-특이적 또는 사중-특이적인 4가 결합을 허용하기 위해서 같거나 다를 수도 있다 (표 2).

표 2
이중-특이적	2^nd 사슬	NH₂-VL2-VH1-COOH
	1^st 사슬	NH₂-VL1-VH2-[CH2-CH3]-COOH
	3^rd 사슬	NH₂-VL1-VH2-[CH2-CH3]-COOH
	4^th 사슬	NH₂-VL2-VH1-COOH
사중-특이적	2^nd 사슬	NH₂-VL2-VH1-COOH
	1^st 사슬	NH₂-VL1-VH2-[CH2-CH3]-COOH
	3^rd 사슬	NH₂-VL3-VH4-[CH2-CH3]-COOH
	4^th 사슬	NH₂-VL4-VH3-COOH

본 출원의 전반에 걸쳐, 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242에서와 같이 EU 인덱스(index)를 따른다.

용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 임의의 길이, 특히 3, 5, 10, 15, 20 또는 25개 초과의 아미노산 잔기의 길이의 아미노산의 폴리머를 나타내기 위해서 본원에서 교체 가능하게 사용된다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수도 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수도 있으며, 비-아미노산에 의해 방해될 수도 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 어떤 다른 조작 또는 변형, 예를 들어, 라벨링 구성요소와의 컨쥬게이션(conjugation)에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산 (예를 들어, 비천연 아미노산, 등 포함)의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 업계에 공지된 다른 변형이 정의 내에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 단일 사슬 또는 복합 사슬로서 발생할 수 있다.

용어 "디아바디" 및 "DART™"는 상기 논의되었다. DART®은 적어도 두 개의 에피토프-결합 부위를 형성하도록 공유 결합에 의한 상호작용을 통해 바람직하게는 서로 복합체를 형성하는 적어도 두 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 디아바디의 유형이며, 이것은 같거나 다른 에피토프를 인식할 수도 있다. 디아바디 또는 DART™의 폴리펩타이드 사슬 중 둘은 각각 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하지만, 이 영역들은 에피토프-결합 부위를 형성하도록 상호작용하지 않는다 (즉, 그것들은 상호 간에 "상보성"이 아님). 오히려, 디아바디 또는 DART™ 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 (예를 들어, 제1) 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상이한 (예를 들어, 제2) 디아바디 또는 DART^™ 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 상호작용하여 에피토프-결합 부위를 형성한다. 유사하게, 디아바디 또는 DART™ 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 (예를 들어, 제1) 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 상이한 (예를 들어, 제2) 디아바디 또는 DART™ 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 상호작용하여 에피토프-결합 부위를 형성한다. DART™ 분자는 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665, WO 2008/157379 및 Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb ( CD32B ) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; 및 Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449에서 개시된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드에 관하여 용어 "회합" 또는 "회합하는" (예를 들어, 한 디아바디 폴리펩타이드가 또 다른 것으로, 면역글로불린 경쇄가 면역글로불린 중쇄로, 한 CH2-CH3 도메인이 또 다른 CH2-CH3 도메인으로, 등)은 폴리펩타이드의 비-공유 결합을 나타내도록 의도된다. 용어 "복합체" 또는 "복합체 형성"은 폴리펩타이드의 공유 결합을 나타내도록 의도된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 디아바디는 그것들의 에피토프-결합 도메인이 그것들의 각각의 인식된 에피토프에 동시에 결합될 수 있는 경우 "배위 결합"을 매개한다고 한다. 이러한 결합은 동시에 일어날 수도 있다.

본 발명의 디아바디의 에피토프-결합 도메인은 그것들의 인식된 에피토프에 "면역특이적인" 방식으로 결합한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체, 디아바디 또는 다른 에피토프-결합 분자는 대안의 에피토프에 비해 더 빈번하고, 더 신속하고, 더 긴 기간 동안 및/또는 더 높은 친화도로 상기 에피토프와 반응하거나 회합하는 경우 또 다른 분자 (즉, 에피토프)의 영역에 "면역특이적으로" 결합한다고 한다. 예를 들어, 바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체는 다른 바이러스 에피토프 또는 비-바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것보다 더 높은 친화도, 결합력으로, 더 쉽게, 및/또는 더 긴 기간 동안 상기 바이러스 에피토프를 결합시키는 항체이다. 또한 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 면역특이적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)가 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있거나 결합하지 않을 수도 있는 것으로 이해된다. 이와 같이, "특이적으로 결합하는"은 반드시 독점적 결합을 필요로 하는 것은 아니다 (하지만 포함할 수 있음). 반드시 그러한 것은 아니지만, 일반적으로는, 결합에 대한 언급은 "특이적" 결합을 의미한다.

이러한 분자의 다양한 면역글로불린 도메인은 제한되는 것은 아니지만, IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을 포함하는 임의의 아이소타입 또는 알로타입의 면역글로불린으로부터 유래될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 하기 논의된 바와 같이 이러한 면역글로불린은 IgG 면역글로불린으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 사용된 IgG 아이소타입은 IgG1이지만, 다른 아이소타입 (예를 들어, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이것들의 알로타입)의 IgG가 이용될 수도 있다.

II. 본 발명의 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디

본 발명은 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 이러한 분자의 억제 활성을 감쇠시키기 위해 두 개의 다른 에피토프, PD-1의 에피토프 및 LAG-3의 에피토프에 배위 결합할 수 있게 하는 항체의 에피토프-결합 단편을 가지고 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이러한 감쇠는 검출 가능한 PD-1 및 또는 LAG-3 억제 활성의 적어도 20%의 감소, 적어도 50%의 감소, 적어도 80%의 감소, 또는 적어도 90%의 감소, 또는 검출 가능한 PD-1 및 또는 LAG-3 억제 활성의 완전한 제거를 말한다.

A. 항-PD-1 결합 능력

PD-1에 면역특이적인 항체가 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,008,449; 8,552,154; PCT 특허 공보 WO 2012/135408; WO 2012/145549; 및 WO 2013/014668 참조). 추가적인 원하는 항체는 PD-1 또는 이것의 펩타이드 단편을 사용하여 유도된 항체-분비 하이브리도마를 단리시킴으로써 제조될 수도 있다. 인간 PD-1 (20개의 아미노산 잔기 신호 서열 (밑줄로 도시됨) 및 268개의 아미노산 잔기 성숙 단백질을 포함함)은 다음 아미노산 서열 (서열 번호:1)을 가진다:

MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA

TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL

PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE

VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI

GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT

IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL

바람직한 항-PD-1 항체는 PD-1 mAb 1 (5C4; BMS-936558), PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, 람브롤리주맙), PD-1 mAb 3 (EH12.2H7; Dana Farber) 및 PD-1 mAb 4 (CT-011; CureTech, BAT-1)를 포함한다.

PD-1 mAb 1의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:2) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKAS GITFS NSGMH WVRQA PGKGLEWVA V

IWYDGSKRYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCAT ND

DY WGQGTLVT VSS

PD-1 mAb 1의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:3) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D

ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ SSNWPRT FGQ

GTKVEIK

PD-1 mAb 2의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:4) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT NYYMY WVRQA PGQGLEWMG G

INPSNGGTNF NEKFKN RVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCAR RD

YRFDMGFDY W GQGTTVTVSS

PD-1 mAb 2의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:5) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASKGVS TSGYSYLH WY QQKPGQAPRL

LIY LASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YC QHSRDLPL

T FGGGTKVEIK

PD-1 mAb 3의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:6) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKAS GYSFT SSWIH WVKQR PGQGLEWIG Y

IYPSTGFTEY NQKFKD KATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCA RWR

DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS

PD-1 mAb 3의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:7) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISC RASQSVS TSGYSYMH WY QQKPGQPPKL

LIK FGSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YC QHSWEIPY

T FGGGTKLEI K

PD-1 mAb 4의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:8) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKAS GYTFT NYGMN WVRQA PGQGLQWMG W

INTDSGESTY AEEFKG RFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVR VG

YDALDY WGQG TLVTVSS

PD-1 mAb 4의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:9) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITC SARSSVS YMH WFQQKPG KAPKLWIY RT

SNLAS GVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYC QQR SSFPLT FGGG

TKLEIK

B. 항-LAG-3 결합 능력

LAG-3에 면역 특이적인 항체가 또한 공지되어 있다 (예를 들어, WO 2014/008218 참조). 추가적인 원하는 항체는 LAG-3 또는 이것의 펩타이드 단편을 사용하여 유도된 항체-분비 하이브리도마를 단리시킴으로써 제조될 수도 있다. 인간 LAG-3 (28개의 아미노산 잔기 신호 서열 (밑줄로 도시됨) 및 497개의 아미노산 잔기 성숙 단백질을 포함함)은 다음 아미노산 서열 (서열 번호:10)을 가진다:

MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAE VP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL

QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT

VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA

VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV

HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN

VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP

PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI

ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA

QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL

LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE

ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL

바람직한 항-LAG-3 항체는 LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS)이다. LAG-3 mAb 1의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:11) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVY GGSFS DYYWN WIRQP PGKGLEWIG E

INHNGNTNSN PSLKS RVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAF GYS

DYEYNWFDP W GQGTLVTVSS

LAG-3 mAb 1의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (서열 번호:12) (CDR은 밑줄로 도시됨)을 가진다:

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSIS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D

ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ RSNWPLT FGQ

GTNLEIK

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체의 에피토프-결합 단편"은 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 단편을 의미한다. 에피토프-결합 단편은 이러한 항체의 CDR 도메인 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 모두 6개를 함유할 수도 있으며, 이러한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있지만, 이러한 항체의 것과는 다른, 상기 에피토프에 대한 면역특이성, 친화도 또는 선택성을 나타낼 수도 있다. 하지만, 바람직하게는, 에피토프-결합 단편은 이러한 항체의 6개의 CDR 도메인 모두를 함유할 것이다. 항체의 에피토프-결합 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬 (예를 들어, scFv)일 수도 있거나, 또는 두 개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수도 있으며, 각각은 아미노 말단 및 카르복시 말단 (예를 들어, 디아바디, Fab 단편, Fab₂ 단편, 등)을 가진다.

C. 본 발명의 바람직한 DART® 디아바디

1. 일반적인 고려사항

본 발명의 바람직한 디아바디는 총 네 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 이중-특이적, 4가 Fc-DART® 디아바디이다 (도 3). 네 개의 폴리펩타이드 사슬은 Fc 도메인을 형성하기 위해 함께 복합체를 형성하는 두 개의 CH2-CH3-함유 폴리펩타이드 (즉, 디아바디의 "제1" 및 "제3" 폴리펩타이드 사슬) 및 두 개의 동일한 비-CH3-함유 폴리펩타이드 (즉, 디아바디의 "제2" 및 "제4" 폴리펩타이드 사슬)를 포함하며, 이것들 각각은 디아바디의 CH2-CH3-함유 폴리펩타이드와 복합체를 형성하여 PD-1 또는 LAG-3에 면역 특이적인 에피토프-결합 도메인을 형성한다. 따라서, 예를 들어, 제1 폴리펩타이드 사슬은 항-PD-1 (또는 항-LAG-3) 가변 경쇄 (VL) 도메인 및 항-LAG-3 (또는 항-PD-1) 가변 중쇄 (VH) 도메인을 함유할 것이며, PD-1 및 LAG-3 에피토프-결합 도메인의 제1 쌍을 형성하기 위해, 상보성 항-PD-1 (또는 항-LAG-3) VH 도메인 및 상보성 항-LAG-3 (또는 항-PD-1) VL 도메인을 가지고 있는 제2 폴리펩타이드 사슬과 복합체를 형성할 것이다. 유사하게, 제3 폴리펩타이드 사슬은 항-PD-1 (또는 항-LAG-3) 가변 경쇄 (VL) 도메인 및 항-LAG-3 (또는 항-PD-1) 가변 중쇄 (VH) 도메인을 함유할 것이며, PD-1 및 LAG-3 에피토프-결합:도메인의 제2 쌍을 형성하기 위해, 상보성 항-PD-1 (또는 항-LAG-3) VH 도메인 및 상보성 항-LAG-3 (또는 항-PD-1) VL 도메인을 가지고 있는 제4 폴리펩타이드 사슬과 복합체를 형성할 것이다.

같은 폴리펩타이드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인이 상이한 에피토프에 관한 것이기 때문에, 그것들은 PD-1 또는 LAG-3을 결합시킬 수 있는 에피토프-결합 도메인을 형성하기 위해 함께 복합체를 형성할 수 없다. 제1 폴리펩타이드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인은 바람직하게는 이 도메인들의 복합체 형성을 실질적으로 방지하기 위해서 충분히 짧은 개재 링커 펩타이드 만큼 서로 떨어져 있다. 예시의 링커는 서열 (서열 번호:13: GGGSGGGG)을 가진다. 유사한 길이의 다른 링커 (같은 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인이 서로 상호작용하는 것을 방지하기 위해서)가 대안으로 이용될 수도 있다.

도 4에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 가장 바람직한 이중-특이적, 4가 Fc-DART® 디아바디는 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하도록 변형된 Fc-DART® 디아바디이다. 이러한 도메인의 포함은 디아바디의 폴리펩타이드 사슬 사이에서 헤테로다이머 형성을 조장한다. 이러한 도메인의 포함이 필수적인 것은 아니며, 본 발명은 이러한 도메인을 가지고 있지 않은 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디를 포함한다. 바람직한 헤테로다이머-촉진 도메인은 "E-코일" 도메인 (서열 번호:14): E VAAL E K E VAAL E K E VAAL E K E VAAL E K, 및 "K-코일" 도메인 (서열 번호:15): K VAAL K E K VAAL K E K VAAL K E K VAAL K E를 포함한다. 더 구체적으로, 함께 복합체를 형성하도록 요구되는 폴리펩타이드 사슬의 쌍은 각각 하나의 (또는 그 이상의) 이러한 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하도록 조작되며, 하나의 폴리펩타이드 사슬의 이용된 도메인(들)은 다른 폴리펩타이드 사슬의 이용된 도메인(들)에 대하여 상보적이다 (예를 들어, 하나의 폴리펩타이드 사슬은 E-코일 도메인을 함유할 것이고 다른 하나는 K-코일 도메인을 함유할 것이다). 두 개의 폴리펩타이드 사슬이 하나 이상의 이러한 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하도록 조작되는 경우, 그것들은 같은 전하이거나 또는 더 바람직하게는 반대 전하일 수 있다.

하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하기 위해서 상기 기술된 E-코일 및 K-코일 서열의 변형을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인이 특히 바람직하다. 이러한 시스테인 잔기의 존재는 하나의 폴리펩타이드 사슬 상에 존재하는 코일이 또 다른 폴리펩타이드 사슬 상에 존재하는 상보성 코일에 공유 결합되고, 이로 인해 폴리펩타이드 사슬을 서로에게 공유 결합시키고 디아바디의 안정성을 증가시키도록 허용한다. 이러한 특히 바람직한 것의 예는 서열 번호:14의 류신 잔기가 시스테인 잔기로 대체된 (밑줄로 도시됨) 아미노산 서열 (서열 번호:16): EVAA C EKEVAALEKEVAALEKEVAALEK를 가지는 변형된 E-코일, 및 서열 번호:15의 류신 잔기가 시스테인 잔기로 대체된 (밑줄로 도시됨) 아미노산 서열 (서열 번호:17): KVAA C KEKVAALKEKVAALKEKVAALKE를 가지는 변형된 K-코일을 포함한다는 것이다.

제1 폴리펩타이드의 가변 중쇄 도메인 및 상기 폴리펩타이드의 헤테로다이머-촉진 도메인은 바람직하게는 1, 2, 3개 또는 그 이상의 시스테인을 함유하는 개재 링커 펩타이드 만큼 서로 떨어져 있다. 바람직한 시스테인-함유 스페이서 펩타이드는 서열 번호:18: GGCGGG인 서열을 가진다. 유사한 길이의 다른 링커 (또 다른 폴리펩타이드 사슬의 시스테인 잔기와 공유 결합할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하기 위해서)가 이용될 수도 있다.

바람직하게는, 제1 폴리펩타이드 사슬의 이용된 헤테로다이머-촉진 도메인 및 CH2-CH3 도메인은 헤테로다이머-촉진 도메인에게 개선된 안정화를 제공하는 개재 시스테인-함유 링커 펩타이드 만큼 서로 떨어져 있다. 적합한 시스테인-함유 링커 펩타이드는 아미노산 서열 (서열 번호:19): DKTHTCPPCP를 갖지만, 더 바람직한 링커는 아미노산 서열 (서열 번호:20): LEPKSADKTHTCPPC를 가진다. 유사한 길이의 다른 링커 (또 다른 폴리펩타이드 사슬의 시스테인 잔기와 공유 결합할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하기 위해서)가 대안으로 이용될 수도 있다.

야생형 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다 (위치 결정은 Kabat et al. (1992) Sequences Of Proteins Of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242의 EU 인덱스와 같다) (서열 번호:21):

삼중-특이적 또는 사중-특이적 디아바디에 대하여 (즉, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬이 동일하지 않은 디아바디에 대하여, 호모다이머화가 두 개의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인 사이에서 또는 두 개의 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인 사이에서 발생하는 것을 감소시키거나 방지하는 것이 바람직하다. 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬 사이에서 헤테로다이머화를 촉진하기 위해서, 이 사슬들의 CH2-CH3 도메인은 바람직하게는 이러한 헤테로다이머화를 촉진하기 위해 변형된다. 예를 들어, 아미노산 치환 (바람직하게는 '놉(knob)'을 형성하는 부피가 큰 측기를 포함하는 아미노산, 예를 들어, 트립토판으로 치환)은 입체적 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지하고 상보성, 또는 협조적 돌연변이가 조작된 도메인, 즉, '홀(hole)'과 쌍을 이루기 위해 돌연변이된 도메인을 의무화하도록 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2 또는 CH3 도메인으로 도입될 수 있다 (예를 들어, 글리신으로 치환). 이러한 돌연변이 세트는 디아바디 분자를 포함하는 포함하는 폴리펩타이드의 임의의 쌍으로 조작될 수 있고, 또한, 상기 쌍의 폴리펩타이드 사슬의 임의의 일부로 조작될 수 있다. 호모다이머화보다 헤테로다이머화를 선호하는 단백질 조작 방법은, 특히 면역글로불린-유사 분자의 조작에 관하여, 업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,695,936 및 특허 공보 2007/0196363, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, 및 Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis ," J. Immunol. Methods 296:95-101 참조; 이것들 각각은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 바람직한 놉은 네이티브 IgG Fc 도메인을 변형 T366W를 함유하도록 변형시킴으로써 생성된다. 바람직한 홀은 네이티브 IgG Fc 도메인을 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 변형시킴으로써 생성된다. 본 발명의 디아바디의 정제를 돕기 위해서, 홀 돌연변이를 함유하는 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A 결합 부위를 제거하기 위해 위치 435 (H435R)에서의 치환을 추가적으로 포함한다. 따라서, 홀 돌연변이를 함유하는 폴리펩타이드의 호모다이머는 단백질 A에 결합하지 않는 반면에, 높 및 홀 함유 헤테로다이머의 결과로서 형성된 디아바디는 놉 돌연변이를 함유하는 폴리펩타이드 사슬 상의 단백질 A 결합 부위를 통해 단백질 A를 결합시키는 능력을 보유할 것이다.

본 발명은 또한 비슷한 야생형 Fc 도메인에 관하여 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하는 변종 Fc 도메인을 포함하는 분자를 포함한다. 변종 Fc 도메인을 포함하는 분자는 보통 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자에 관하여 표현형을 변화시켰다. 변종 표현형은 NK 의존적 또는 매크로파지 의존적 검정으로 분석된 바와 같이 변화된 혈청 반감기, 변화된 안정성, 세포 효소에 대한 변화된 민감성 또는 변화된 효과기 기능으로서 표현될 수도 있다. 변화된 효과기 기능으로서 확인된 Fc 도메인 변형은 업계에 공지되어 있으며, 활성화 수용체로의 결합을 증가시키고 (예를 들어, FcγRIIA (CD16A) 억제 수용체로의 결합을 감소시키는 (예를 들어, FcγRIIB (CD32B) 변형을 포함한다 (예를 들어, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890 참조). CD32B로의 결합이 감소되고 및/또는 CD16A로의 결합이 증가된 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시의 변종은 F243L, R929P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 함유한다. 이 아미노산 치환들은 임의의 조합으로 인간 IgG1 Fc 도메인에 존재할 수도 있다. 한 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변종은 F243L, R929P 및 Y300L 치환을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변종은 F243L, R929P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변종은 N297Q 치환, L234A 및 L235A 치환 또는 D265A 치환을 함유하는데, 이 돌연변이들이 FcR 결합을 폐지하기 때문이다. 이러한 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 "놉-함유" 서열 (서열 번호:22):

PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV

DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV

EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

EALHN H YTQK SLSLSPGK

또는 단백질 A 결합을 폐지하기 위해 H435R 치환을 가진 "홀-함유" 서열 (서열 번호:23)을 가질 것이다:

PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV

DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSL S C A V KGFYPSDIAV

EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFL V SK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

EALHN R YTQK SLSLSPGK

인식된 바와 같이, "홀-함유" CH2-CH3 도메인 (예를 들어, 서열 번호:22)은 제1 폴리펩타이드 사슬에서 이용될 수 있으며, 이 경우에, "놉-함유" CH2-CH3 도메인 (예를 들어, 서열 번호:22)은 제3 폴리펩타이드 사슬에서 이용될 것이다.

제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬이 상이하지 않은 본 발명의 For 이중-특이적, 4가 디아바디에 대하여, 바람직한 CH2-CH3 도메인은 아미노산 서열 (서열 번 호:24)을 가지는 변형된 CH2-CH3 도메인이다:

PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV

DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

EALHNHYTQK SLSLSPG

따라서, 요약하면, 본 발명의 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 디아바디 Fc-DART® 디아바디의 바람직한 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 동일한 서열을 가지고, 이러한 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 Fc-DART® 디아바디의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 동일한 서열을 가지며, 표 3에서 나타난 바와 같다:

표 3
변이	제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 도메인	제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 도메인
I	(항-PD-1 에피토프-결합 도메인의 VL) - (링커) - (항-LAG-3 에피토프-결합 도메인의 VH) - (링커) - (변형된 E-코일 헤테로다이머-촉진 도메인) - (링커) - (변형된 CH2-CH3 도메인)	(항-LAG-3 에피토프 결합 도메인의 VL) - (링커) - (항-PD-1 에피토프 결합 도메인의 VH) - (링커) - (변형된 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인)
II	(항-PD-1 에피토프 결합 도메인의 VL) - (링커) - (항-LAG-3 에피토프 결합 도메인의 VH) - (링커) - (변형된 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인) - (링커) - (변형된 CH2-CH3 도메인)	(항-LAG-3 에피토프 결합 도메인의 VL) - (링커) - (항-PD-1 에피토프 결합 도메인의 VH) - (링커) - (변형된 E-코일 헤테로다이머-촉진 도메인)
III	(항-LAG-3 에피토프 결합 도메인의 VL) - (링커) - (항-PD-1 에피토프 결합 도메인의 VH) - (링커) - (변형된 E-코일 헤테로다이머-촉진 도메인) - (링커) - (변형된 CH2-CH3 도메인)	(항-PD-1 에피토프 결합 도메인의 VL) - (링커) - (항-LAG-3 에피토프 결합 도메인의 VH) - (링커) - (변형된 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인)
IV	(항-LAG-3 에피토프 결합 도메인의 VL) - (링커) - (항-PD-1 에피토프 결합 도메인의 VH) - (링커) - (변형된 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인) - (링커) - (변형된 CH2-CH3 도메인)	(항-PD-1 에피토프 결합 도메인의 VL) - (링커) - (항-LAG-3 에피토프 결합 도메인의 VH) - (링커) - (변형된 E-코일 헤테로다이머-촉진 도메인)

2. 제1 예시적 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 Fc -DART® 디아바디 (PD-1 x LAG-3 Fc -DART®-1)

본 발명의 제1 특히 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 Fc-DART® 디아바디 ("PD-1 x LAG-3 Fc -DART®-1")는 동일한 서열의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 가진다. 이러한 제1/제3 폴리펩타이드 사슬은 아미노산 서열 (서열 번 호:25)을 가진다:

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ

GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH

WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS

LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAACE KEVAALEKEV

AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLY

ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV

VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP

PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG

SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPG

여기서, 아미노산 잔기 1-107은 LAG-3 mAb 1 (서열 번호:12)의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 108-115는 링커 GGGSGGGG (서열 번 호:13)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 116-228은 PD-1 mAb 1 (서열 번호:2)의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 229-234는 시스테인-함유 스페이서 펩타이드 GGCGGG (서열 번호:18)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 235-262는 변형된 E-코일 (서열 번호:16)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 263-277은 시스테인-함유 링커 펩타이드 LEPKSADKTHTCPPC (서열 번호:20)의 아미노산 잔기이고 아미노산 잔기 278-494는 변형된 CH2-CH3 도메인 (서열 번호:24)의 아미노산 잔기이다.

이러한 제1/제3 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 분자는 (서열 번호:26)이다:

gaaattgtcc tgacacagtc tcccgcaacc ctgagtttga gtcctgggga

gcgagcaact ctctcctgcc gagcctccca gagtatctcc tcctacctcg

cctggtacca acagaagcca gggcaggctc caaggctgct tatctatgac

gcctctaacc gcgcaactgg gattcccgca cgcttctccg gctctggttc

cggcacagac tttacactta ctatctctag cctggagcca gaagactttg

ccgtgtacta ttgtcagcaa cgttccaatt ggccccttac ctttgggcag

ggcactaact tggaaatcaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt

tcagctggtc gagagtggtg gcggcgttgt gcaacctggg cgttccctcc

gattggactg taaagcttcc ggcattactt tctcaaattc cggcatgcat

tgggtgaggc aagcccctgg aaaagggctc gaatgggtgg ctgtgatttg

gtacgatggc agcaaacggt actacgccga ttctgttaag ggccgcttta

ccatctcccg cgataactca aagaacacac tgtttctgca aatgaatagt

cttagagccg aggacaccgc cgtgtactac tgtgccacaa atgacgatta

ttgggggcag ggcacattgg tcacagtgtc ttccggagga tgtggcggtg

gagaagtggc cgcatgtgag aaagaggttg ctgctttgga gaaggaggtc

gctgcacttg aaaaggaggt cgcagccctg gagaaactgg agcccaaatc

tgctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagccgcgg

ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctctat

atcacccggg agcctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata

atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta

caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca

tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc

ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc

agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc

tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca

ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact

acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gt

이러한 PD-1 x LAG-3 Fc -DART®-1의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 동일한 서열을 가진다. 이러한 제2/제4 폴리펩타이드 사슬은 아미노산 서열 (서열 번 호:27)을 가진다:

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ

GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN

WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV

TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAACKEKV

AALKEKVAAL KEKVAALKE

여기서, 아미노산 잔기 1-107은 PD-1 mAb 1 (서열 번호:3)의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 108-115는 링커 GGGSGGGG (서열 번 호:13)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 116-235는 LAG-3 mAb 1 (서열 번 호:11)의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 236-241은 시스테인-함유 스페이서 펩타이드 GGCGGG (서열 번호:18)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 242-269는 변형된 K-코일 (서열 번호:17)의 아미노산 잔기이다.

이러한 제2/제4 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 분자는 (서열 번호:28)이다:

gagatcgtac ttacccagtc tcccgccacc ctttccctga gtcctggtga

gcgggccact ctttcctgtc gcgcaagcca atcagtttct agctacctcg

catggtatca gcagaagcca gggcaggcac ccaggcttct catctatgac

gccagtaacc gcgcaaccgg gatacctgct agattttccg gcagtggatc

tgggaccgat ttcacactga caatttcatc cttggaacca gaagatttcg

cagtctacta ctgccagcaa tcttccaact ggccaagaac tttcggacag

gggaccaaag tggaaattaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt

ccagctccag caatggggag ccgggctgct gaaaccctct gaaacactga

gtctcacatg tgccgtttat ggaggttcct tctccgatta ttactggaac

tggattcgtc agcctcccgg caagggcctg gagtggatcg gtgagattaa

ccacaatggc aataccaata gcaatcctag tttgaaatct cgcgtcactc

tttccctcga tacaagcaaa aaccagtttt ctttgaaatt gcgatctgta

actgctgctg atactgccgt gtattactgc gcattcggct actccgacta

tgaatataat tggttcgatc cttggggaca gggaacattg gtaaccgtgt

catccggagg atgtggcggt ggaaaagtgg ccgcatgtaa ggagaaagtt

gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt aaggaaaagg tcgcagccct

gaaagag

3. 제2 예시적 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 Fc -DART® 디아바디 (PD-1 x LAG-3 Fc -DART®-2)

본 발명의 제2 특히 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 Fc-DART® 디아바디 (PD-1 x LAG-3 Fc -DART®- 2)는 동일한 서열의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬이다. 이러한 제1/제3 폴리펩타이드 사슬은 아미노산 서열 (서열 번호:29)이다:

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ

GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN

WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV

TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAACEKEV

AALEKEVAAL EKEVAALEKL EPKSADKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP

KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE

PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP

G

여기서, 아미노산 잔기 1-107은 PD-1 mAb 1 (서열 번호:3)의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 108-115는 링커 GGGSGGGG (서열 번 호:13)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 116-235는 LAG-3 mAb 1 (서열 번 호:11)의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 236-241은 시스테인-함유 스페이서 펩타이드 GGCGGG (서열 번호:18)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 242-269는 변형된 E-코일 (서열 번호:16)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 270-284는 시스테인-함유 링커 펩타이드 LEPKSADKTHTCPPC (서열 번호:20)의 아미노산 잔기이고 아미노산 잔기 285-501은 변형된 CH2-CH3 도메인 (서열 번호:24)의 아미노산 잔기이다.

이러한 제1/제3 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 분자는 (서열 번호:30)이다:

gagatcgtac ttacccagtc tcccgccacc ctttccctga gtcctggtga

gcgggccact ctttcctgtc gcgcaagcca atcagtttct agctacctcg

catggtatca gcagaagcca gggcaggcac ccaggcttct catctatgac

gccagtaacc gcgcaaccgg gatacctgct agattttccg gcagtggatc

tgggaccgat ttcacactga caatttcatc cttggaacca gaagatttcg

cagtctacta ctgccagcaa tcttccaact ggccaagaac tttcggacag

gggaccaaag tggaaattaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt

ccagctccag caatggggag ccgggctgct gaaaccctct gaaacactga

gtctcacatg tgccgtttat ggaggttcct tctccgatta ttactggaac

tggattcgtc agcctcccgg caagggcctg gagtggatcg gtgagattaa

ccacaatggc aataccaata gcaatcctag tttgaaatct cgcgtcactc

tttccctcga tacaagcaaa aaccagtttt ctttgaaatt gcgatctgta

actgctgctg atactgccgt gtattactgc gcattcggct actccgacta

tgaatataat tggttcgatc cttggggaca gggaacattg gtaaccgtgt

catccggagg atgtggcggt ggagaagtgg ccgcatgtga gaaagaggtt

gctgctttgg agaaggaggt cgctgcactt gaaaaggagg tcgcagccct

ggagaaactg gagcccaaat ctgctgacaa aactcacaca tgcccaccgt

gcccagcacc tgaagccgcg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca

aaacccaagg acaccctcta tatcacccgg gagcctgagg tcacatgcgt

ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg

tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga

ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc

cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca

ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg

tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt

ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc

atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg

ggt

PD-1 x LAG-3 Fc -DART®-2의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 동일한 서열을 가진다. 이러한 제2/제4 폴리펩타이드 사슬은 아미노산 서열 (서열 번호:31)을 가진다:

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ

GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH

WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS

LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAACK EKVAALKEKV

AALKEKVAAL KE

여기서, 아미노산 잔기 1-107은 LAG-1 mAb 1 (서열 번호:12)의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 108-115는 링커 GGGSGGGG (서열 번 호:13)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 116-228은 PD-1 mAb 1 (서열 번호:2)의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 229-234는 시스테인-함유 스페이서 펩타이드 GGCGGG (서열 번호:18)의 아미노산 잔기이고, 아미노산 잔기 235-262는 변형된 K-코일 (서열 번호:17)의 아미노산 잔기이다.

이러한 제2/제4 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 분자는 (서열 번 호:32)이다:

gaaattgtcc tgacacagtc tcccgcaacc ctgagtttga gtcctgggga

gcgagcaact ctctcctgcc gagcctccca gagtatctcc tcctacctcg

cctggtacca acagaagcca gggcaggctc caaggctgct tatctatgac

gcctctaacc gcgcaactgg gattcccgca cgcttctccg gctctggttc

cggcacagac tttacactta ctatctctag cctggagcca gaagactttg

ccgtgtacta ttgtcagcaa cgttccaatt ggccccttac ctttgggcag

ggcactaact tggaaatcaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt

tcagctggtc gagagtggtg gcggcgttgt gcaacctggg cgttccctcc

gattggactg taaagcttcc ggcattactt tctcaaattc cggcatgcat

tgggtgaggc aagcccctgg aaaagggctc gaatgggtgg ctgtgatttg

gtacgatggc agcaaacggt actacgccga ttctgttaag ggccgcttta

ccatctcccg cgataactca aagaacacac tgtttctgca aatgaatagt

cttagagccg aggacaccgc cgtgtactac tgtgccacaa atgacgatta

ttgggggcag ggcacattgg tcacagtgtc ttccggagga tgtggcggtg

gaaaagtggc cgcatgtaag gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc

gccgcactta aggaaaaggt cgcagccctg aaagag

III. 약학적 조성물

본 발명은 암 또는 병원체의 존재와 관련된 질환의 치료를 위한 약학적 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 약학적 조성물 (예를 들어, 불순한 또는 비-멸균 조성물)의 제조에 유용한 대량의 약물 조성물 및 단위 투약 형태의 조제물로 사용될 수 있는 약학적 조성물 (즉, 대상체 또는 환자에게 투여에 적합한 조성물)을 포함한다. 이러한 조성물은 본 발명의 변형된 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 예방적 또는 치료적 유효량, (및 특히 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적, 4가 Fc-DART® 디아바디) 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 분자의 예방적 또는 치료적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 디아바디 및 특정 병원체-관련 항원에 특이적인 제2 치료적 항체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 악성 종양의 존재를 특징으로 하는 질환을 말한다. 이러한 암은 부신암, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성불완전섬유원증, 골 섬유 이형성증, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비성 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두상 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아 암, 말초 신경초 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀성 혈액 장애, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암, 또는 자궁암을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "병원체의 존재와 관련된 질환"은 박테리아 (예를 들어, 대장균, 클로스트리듐 디피실레(C. difficile), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella thyphimurium), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 콜레래(Vibrio cholerae), 네이세리아 고노뢰애(Neisseria gonorrhoeae), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헤모필루스 인플루엔재, 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 등), 균류 (예를 들어, 칸디다(Candida), 아스페르질루스(Aspergillus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 코키디오이데스(Coccidioides), 히스토플라스마(Histoplasma), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 스타치보트리스(Stachybotrys), 등), 원생동물 (아메보조아(Amoebozoa), 엑스카바타(Excavata), 크로말베올라타(Chromalveolata), 엔타모에바(Entamoeba), 플라스모듐(Plasmodium), 지아르디아(Giardia), 트리파노소마(Trypanosoma), 콕시디아(Coccidia), 베스노이티아(Besnoitia), 디크로코엘륨(Dicrocoelium), 리슈마니아(Leishmania), 등) 또는 바이러스 (및 특히 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-관련 바이러스, B 바이러스 (마카신 헤르페스바이러스 I(macacine herpesvirus I)), BK 바이러스, 분야바이러스(bunyavirus), 치쿤군야 바이러스(chikungunya virus), 콕사키 바이러스(cocksackie virus), 코로나바이러스(coronavirus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 동부 말 뇌염 바이러스(eastern equine encephalitis virus), 에볼라 바이러스(ebola virus), 엔테로바이러스(enterovirus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 한타바이러스(hantavirus), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus), B형 간염 바이러스(hepatitis B 바이러스), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), D형 간염 바이러스(hepatitis D virus), E형 간염 바이러스(hepatitis E virus), 단순 헤르페스 바이러스 1(herpes simplex virus 1), 단순 헤르페스 바이러스 2(herpes simplex virus 2), 인간 포말 바이러스(human foamy virus), 인간 헤르페스 바이러스 3(human herpes virus 3), 인간 헤르페스 바이러스 5(human herpes virus 5), 인간 헤르페스 바이러스 6(human herpes virus 6), 인간 헤르페스 바이러스 7(human herpes virus 7), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 인간 유두종바이러스(human papillomavirus), 인간 β-림프친화 바이러스(human β-lymphotropic virus), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 I(human T-cell leukemia virus I), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 II(human T-cell leukemia virus II), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), JC 바이러스, JEV, 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스, 라싸 바이러스(Lassa virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(choriomeningitis), 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 홍역 바이러스(measles virus), 볼거리 바이러스(mumps virus), 니파 바이러스(Nipah virus), 노로바이러스(norovirus), 노르워크 바이러스(Norwalk virus), 오르토레오바이러스(orthoreovirus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 파르보바이러스(parvovirus), 폴리오바이러스(poliovirus), 광견병 바이러스(rabies virus), 레오바이러스(reovirus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 리노바이러스(rhinovirus), 리프트 밸리 열 바이러스(Rift Valley fever virus), 로타바이러스(rotavirus), 풍진 바이러스(rubella virus), 두창 바이러스(smallpox virus), 세인트루이스 뇌염 바이러스(St Louis encephalitis virus), 대두창 바이러스(variola major virus), 소두창 바이러스(variola minor virus), 수두-대상포진 바이러스(vericella-zoster virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 서부 말 뇌염 바이러스(western equine encephalitis virus), 또는 황열병 바이러스(yellow fever virus))에 의한 감염과 관련된 질환을 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 유익한 또는 원하는 임상 결과를 포함하는 유익한 또는 원하는 결과 및 바람직하게는 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법을 나타낸다. 이러한 유익한 또는 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 감염된 세포 또는 다른 병에 걸린 세포의 증식 감소 (또는 파괴), 질환으로부터 발생한 증상의 감소, 질환으로 고통받는 것의 생활의 질의 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약물처리 용량의 감소, 질환 진행의 지연, 및/또는 반려동물 수령체의 생존 연장.

특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열되는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제 (예를 들어, 프로인트 보조제 (완전 및 불완전)), 부형제, 또는 비히클을 말한다. 이러한 약학적 담체는 물 및 석유, 동물성 오일, 식물성 오일 또는 합성 기원 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥 내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한, 특히, 주사액에 대하여, 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 또한, 필요한 경우에, 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이 조성물들은 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 분말, 지효성 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 조성물의 성분은 별도로 공급되거나 단위 투약 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사세(sachette)와 같이 밀봉된 용기 내에서 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서, 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플은 성분이 혼합될 수 있도록 투여 전에 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 음이온으로 형성된 것들, 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2 철 수산화물, 아이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디를, 단독으로 또는 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 함유하는 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩(pack) 또는 키트를 제공한다. 추가적으로, 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제가 또한 약학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 이러한 용기(들)와 관련된 것은 약학적 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 안내문일 수 있으며, 이 안내문은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.

본 발명은 상기 방법에서 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 본 발명의 하나 이상의 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기에서 암 또는 병원체-관련 항원의 존재를 특징으로 하는 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 하나 이상의 병원체-관련 항원을 결합시키는 하나 이상의 항체 또는 디아바디를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 다른 예방제 또는 치료제는 화학치료제이다. 다른 구체예에서, 예방제 또는 치료제는 생물학적 또는 호르몬 치료제이다.

IV. 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 생산 방법

본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 가장 바람직하게는 업계에 널리 공지되어 있는 바와 같이 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 재조합 발현을 통해 생산된다.

본 발명의 폴리펩타이드는 편의상 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 제조될 수도 있다 (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

대안으로, 항체는 재조합에 의해 제조되고 업계에 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 발현될 수도 있다. 항체는 먼저 숙주 동물에서 만들어진 항체를 단리시키고, 유전자 서열을 얻고, 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 재조합에 의해 항체를 발현시키기 위한 유전자 서열을 사용하여 재조합에 의해 제조될 수도 있다.

이용될 수도 있는 또 다른 방법은 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 우유에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 우유에서 재조합에 의해 항체를 발현시키는데 적합한 방법이 개시되어 있다 (예를 들어, Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et al.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157 참조). 항체의 유도체, 예를 들어, 키메라, 인간화된, 단일-사슬, 등을 제조하는데 적합한 방법은 업계에 공지되어 있다. 또 다른 대안으로는, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합으로 제조될 수도 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; 및 Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455 참조).

원하는 항체 또는 단백질은 에드만 분해(Edman degradation)에 의해 시퀀싱될 수도 있으며, 이것은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 질량 분석법 또는 에드만 분해로부터 생성된 펩타이드 정보는 원하는 단백질을 클로닝하는데 사용되는 프로브 또는 프라이머를 설계하는데 사용될 수 있다.

원하는 단백질의 대안의 클로닝 방법은 원하는 항체 또는 단백질을 발현하는 세포에 대하여 정제된 단백질 또는 이것의 일부를 사용하는 "패닝"에 의한 것이다. "패닝" 과정은 제2 세포 유형에서 원하는 cDNA를 발현하거나 과발현하는 조직 또는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 얻고, 원하는 단백질로의 특이적 결합에 대하여 제2 세포 유형의 트랜스펙션된 세포를 스크리닝하여 실시될 수도 있다.

"패닝"에 의해 세포-표면 단백질을 암호화하는 포유류 유전자를 클로닝하는데 사용된 방법의 상세한 설명은 업계에서 발견될 수 있다 (예를 들어, Aruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 and Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation," Endocrinol. 140:5841-5854 참조).

항체, 및 다른 펩타이드 아고니스트, 안타고니스트 및 조절자를 암호화하는 cDNA는 업계의 표준 방법에 따라 특정 세포 유형으로부터 mRNA를 역전사하여 얻을 수 있다. 구체적으로, mRNA는 Sambrook et al. Supra에서 제시된 과정에 따라 다양한 용해 효소 또는 화학 용액을 사용하여 단리되거나 제조사 (예를 들어, Qiagen, Invitrogen, Promega)에 의해 제공된 동봉된 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 핵산-결합 레진으로 추출될 수 있다. 이어서 합성된 cDNA는 제2 유형의 세포에서 원하는 항체 또는 단백질을 생산하기 위해 발현 벡터로 도입된다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 숙주 세포에서 복제 가능해야한다. 적합한 발현 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스(retrovirus), 및 코스미드(cosmid)를 포함하는, 플라스미드, 바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

원하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터는 전기천공법, 칼슘 클로라이드, 루비듐 클로라이드, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 이용한 트랜스펙션; 미세투사물 충격법; 리포펙션; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 감염원, 예를 들어, 천연두 바이러스(vaccinia virus)인 경우)을 포함하는 많은 적절한 수단 중 임의의 것에 의해서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 의존할 것이다.

이종 기원 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포는 원하는 항체, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 단리시킬 목적을 위해 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 비-제한 예는 COS, HeLa, 및 CHO 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 숙주 세포는, 숙주 세포에, 존재하는 경우, 원하는 해당 내인성 항체 또는 단백질보다 약 5배 초과, 더 바람직하게는 10배 초과, 더 바람직하게는 20배 초과, 더 바람직하게는 50배 초과, 더 바람직하게는 100배 초과의 수준으로 cDNA를 발현한다. 원하는 단백질로의 특이적 결합에 대한 숙주 세포의 스크리닝은 바람직하게는 면역검정 또는 FACS에 의해 영향을 받는다. 원하는 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포는 이 방법으로 확인될 수 있다.

모체 펩타이드 아고니스트, 안타고니스트 또는 조절자 분자에 관하여 결과로 생긴 단백질의 아미노산 서열의 추가, 결실, 또는 변화를 암호화하는 돌연변이 펩타이드 아고니스트, 안타고니스트, 및 조절자를 생산하는데 현재 이용될 수도 있는 다양한 기술이 또한 이용 가능하다.

본 발명은 성질에 크게 영향을 미치지 않는 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디에 대한 변형 및 향상된 또는 감소된 활성을 가지는 변종을 포함한다. 폴리펩타이드의 변형은 업계에서 일상적인 관례이다. 변형된 폴리펩타이드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 크게 해롭게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 추가, 또는 화학적 유사체의 사용을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 서로 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 글리신/알라닌; 발린/아이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신. 이 폴리펩타이드는 또한 글리코실화된 및 비-글리코실화된 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 다른 번역 후 변형, 예를 들어, 다른 당, 아세틸화, 및 인산화로의 글리코실화을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 보존적일 것이다, 즉, 치환된 아미노산은 원래의 아미노산과 유사한 화학적 성질을 가지고 있을 것이다. 이러한 보존적 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예는 상기 제공되어 있다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 변형에서 가변 영역과 같은 영역의 완전한 재설계의 범위 내에 있을 수 있다. 가변 영역의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변화시킬 수 있다. 다른 변형 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하는, 업계에 공지되어 있는 커플링 기술의 사용을 포함한다. 변형은, 예를 들어, 면역검정용 라벨의 부착, 예를 들어, 방사선면역검정용 방사성 모이어티의 부착에 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는 업계에서 확립된 과정을 사용하여 제조되고 업계에 공지된 표준 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 10개의 인접한 아미노산 및 가변 중쇄 영역의 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 이종 기원 면역글로불린 불변 영역을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 공개적으로 기탁된 하이브리도마로부터 생산된 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해서, 항체 융합 단백질은 면역 효과기 세포의 원하는 바이러스 에피토프 또는 원하는 활성화 수용체 또는 이러한 활성화 수용체 및 네이티브 분자에서 그것이 부착되는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어, 또 다른 영역의 이종 기원 서열 또는 상동성 서열을 발현하는 면역 효과기 세포의 표면 상에 존재하는 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인을 함유한다.

본 발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 업계에 공지되어 있는 과정들로 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 항체의 단백질 가수분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 기술된 재조합 방법 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩타이드)에 의해 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩타이드, 최대 약 50개 아미노산의 특히 더 짧은 폴리펩타이드는 편의상 화학적 합성으로 제조된다. 화학적 합성 방법은 업계에 공지되어 있으며 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 이러한 폴리펩타이드는 고체상 방법을 이용하는 자동화된 폴리페타이드 합성기로 생산될 수 있다.

V. 본 발명의 조성물의 사용

본 발명은 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디, 이러한 분자로부터 유래된 폴리펩타이드, 이러한 분자 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 본원에서 기술된 다른 약제를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디가 PD-1 및 LAG-3에 의해 매개된 면역 시스템의 억제를 감쇠시키는 능력을 가진다는 점에서, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 암 및 병원체의 존재 (예를 들어, 박테리아, 균류, 바이러스 또는 원생동물 감염)와 관련된 질환을 포함하는, 원치 않게 억제된 면역 시스템과 관련된 임의의 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수도 있다.

VI. 투여 방법

본 발명의 조성물은 본 발명의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방, 및 개선을 위해 제공될 수도 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 조성물은 실질적으로 정제된다 (즉, 그것의 효과를 제한하거나 원치 않는 부작용을 생산하는 물질들이 실질적으로 없음). 특정 구체예에서, 대상체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 비-영장류 (예를 들어, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 등) 또는 영장류 (예를 들어, 게먹이 원숭이(cynomolgus monkey)와 같은 원숭이, 인간, 등)이다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 인간이다.

다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜 내 캡슐화, 극미립자, 마이크로캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포 내 섭취(endocytosis) (예를 들어, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스의 일부로서 핵산의 구조 또는 다른 벡터 등이 공지되어 있으며 본 발명의 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 투여 방법은 비경구 투여 (예를 들어, 피부 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하), 경막 외, 및 점막 (예를 들어, 비강 내 및 구강 경로)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 본 발명의 분자는 근육 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사(bolus injection)에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장내 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수도 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수도 있다. 투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 폐 투여는 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제가 들어있는 제형의 사용에 의해 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; 및 4,880,078; 및 PCT 공개 번호 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903 참조, 이것들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 또한 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디가 이러한 분자의 양을 나타내는 앰플 또는 사세와 같이 밀봉된 용기 내에 포장될 수도 있다는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 밀봉된 용기 내에서 건조 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되며, 예를 들어, 물 또는 식염수를 이용하여 대상체에게 투여에 적절한 농도로 복원될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 밀봉된 용기 내에서 건조 멸균된 동결건조 분말로서 적어도 5 μg, 더 바람직하게는 적어도 10 μg, 적어도 15 μg, 적어도 25 μg, 적어도 50 μg, 적어도 100 μg, 또는 적어도 200 μg의 단위 투약량으로 공급된다

본 발명의 동결건조된 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 그것들의 원래의 용기 내에서 2 내지 8℃에서 저장되어야 하고 분자는 복원된 후 12시간 내에, 바람직하게는 6시간 내에, 5시간 내에, 3시간 내에, 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 대안의 구체예에서, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 분자, 융합 단백질, 또는 컨쥬게이션된 분자의 양 및 농도를 나타내는 밀봉된 용기 내에서 액체 형태로 공급된다. 바람직하게는, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 액체 형태는 분자가 적어도 1 μg/ml, 더 바람직하게는 적어도 2.5 μg/ml, 적어도 5 μg/ml, 적어도 10 μg/ml, 적어도 50 μg/ml, 또는 적어도 100 μg/ml의 농도로 존재하는 밀봉된 용기에서 공급된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 한 구체예에서, 약학적 조성물의 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 얻기에 충분한 양이며, 제한 없이, 질환으로부터 기인한 증상의 감소, 감염의 증상 (예를 들어, 바이러스량, 열병, 통증, 패혈증, 등) 또는 암의 증상 (예를 들어, 암 세포의 증식, 종양 존재, 종양 전이, 등)의 감쇠, 이로 인한 질환으로 고통받고 있는 것들의 생활의 질 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약물 처리 용량의 감소, 예를 들어, 표적화 및/또는 내재화를 통해 또 다른 약물 처리 효과 증진, 질환의 진행 지연, 및/또는 개체의 생존 연장과 같은 임상 결과를 포함한다.

유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 약물, 화합물, 또는 약학적 조성물의 유효량은, 직접적으로 또는 간접적으로, 바이러스 존재의 (또는 이것의 효과의) 증식을 감소시키고 바이러스성 질환을 감소시키고 및/또는 바이러스성 질환의 발달을 지연시키기에 충분한 양이다 . 일부 구체예에서, 약물, 화합물, 또는 약학적 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물, 또는 약학적 조성물과 함께 달성될 수도 있거나 달성되지 않을 수도 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 화학치료제의 투여의 맥락에서 고려될 수도 있고, 단일 약제는, 하나 이상의 다른 약제와 함께, 바람직한 결과가 달성될 수도 있거나 달성된 경우, 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수도 있다. 개체의 요구는 다양하지만, 각 구성요소의 유효량의 최적의 범위의 결정은 업계의 기술 범위 내에 있다. 항체 투여에 전형적인 투약량은 0.1 내지 100 mg/kg/체중의 하나 이상의 단위 용량을 포함한다.

장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 또는 개선에 효과적인 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 제형에서 이용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상태의 심각성에 의존적일 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선에서 추정될 수도 있다. 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디에 대하여, 환자에게 투여된 투약량은 전형적으로 대상체의 체중의 적어도 약 0.01 μg/kg, 적어도 약 0.05 μg/kg, 적어도 약 0.1 μg/kg, 적어도 약 0.2 μg/kg, 적어도 약 0.5 μg/kg, 적어도 약 1 μg/kg, 적어도 약 2 μg/kg, 적어도 약 5 μg/kg, 적어도 약 10 μg/kg, 적어도 약 20 μg/kg, 적어도 약 50 μg/kg, 적어도 약 0.1 mg/kg, 적어도 약 1 mg/kg, 적어도 약 5 mg/kg, 적어도 약 10 mg/kg, 적어도 약 30 mg/kg, 적어도 약 50 mg/kg, 적어도 약 75 mg/kg, 적어도 약 100 mg/kg, 적어도 약 125 mg/kg, 적어도 약 150 mg/kg 또는 그 이상이다.

또 다른 구체예에서, 환자는 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 이러한 예방적 또는 치료적 유효량의 1회 이상의 용량을 포함하는 치료 요법이 투여되는데, 치료 요법은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일에 걸쳐 투여된다. 특정 구체예에서, 치료 요법은 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 간헐적으로 투여하는 것 (예를 들어, 제공된 주의 제1 일, 제2 일, 제3 일 및 제4 일에 용량을 투여하고 같은 주의 제5 일, 제6 일 및 제7 일에 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 투여하지 않는 것)을 포함한다. 전형적으로는, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 치료 경로가 있다. 각 경로는 같은 요법 또는 상이한 요법일 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 투여된 용량은 본 발명에 포함된 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 일일 예방적 또는 치료적 유효량이 달성될 때까지 요법(들)의 처음 4분의 1, 처음 절반 또는 처음 3분의 2 또는 4분의 3에 걸쳐 (4 경로 치료 중 제1, 제2, 또는 제3 요법에 걸쳐) 증가된다.

한 구체예에서, 환자에게 투여된 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 투약량은 단일 약제 치료법으로서의 사용에 대하여 계산될 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디는 다른 치료적 조성물과 조합으로 사용되고 환자에게 투여된 투약량은 이러한 디아바디가 단일 약제 치료법으로서 사용될 때보다 더 적다.

특정 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 치료가 필요한 지역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있고; 이것은, 제한적인 것이 아니라, 예를 들어, 국소적 주입에 의해, 주사에 의해, 또는 이식물의 수단에 의해 달성될 수도 있으며, 상기 이식물은 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴 재료이고, 막, 예를 들어, 실라스틱 막, 또는 섬유를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 분자를 투여할 때, 분자가 흡수하지 않는 재료를 사용하기 위해서는 주의를 기울여야 한다.

또 다른 구체예에서, 조성물은 소포, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다 (Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327 참조; 일반적으로 본원 참조).

또 다른 구체예에서, 조성물은 제어된 방출 또는 지효성 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 임의의 기술이 본 발명의 하나 이상의 분자를 포함하는 지효성 방출 제형을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,526,938; PCT 공보 WO 91/05548; PCT 공보 WO 96/20698; Ning et al. (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al. (1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조, 이것들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 한 구체예에서는, 제어된 방출 시스템에서 펌프가 사용될 수도 있다 (Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; 및 Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579 참조). 또 다른 구체예에서, 폴리머 재료는 항체의 제어된 방출을 달성하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate ," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112); 미국 특허 번호 5,679,377; 미국 특허 번호 5,916,597; 미국 특허 번호 5,912,015; 미국 특허 번호 5,989,463; 미국 특허 번호 5,128,326; PCT 공개 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개 번호 WO 99/20253 참조). 지효성 방출 제형에 사용된 폴리머의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-co-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리코시드 (PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드 (PLA), 폴리(락티드-co-글리콜리드) (PLGA), 및 폴리오르토에스터를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 치료 표적 (예를 들어, 폐)의 부근에 배치될 수 있고, 따라서 전신 용량의 단지 일부만을 필요로 한다 (예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 이식물로서 유용한 폴리머 조성물은 Dunn et al.에 따라 사용된다 (U.S. 5,945,155 참조). 이 특정 방법은 폴리머 시스템으로부터 생체 활성 재료의 제자리(in situ) 제어된 방출의 치료적 효과를 기반으로 한다. 이식은 일반적으로 치료적 처치를 필요로 하는 환자의 신체 내 어느 곳에서도 일어날 수 있다. 또 다른 구체예에서, 비-폴리머 지효성 전달 시스템이 사용되고, 이에 의해 비-폴리머 이식물은 대상체의 신체에서 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 신체에 이식되면, 이식물의 유기 용매는 소산되거나, 분산되거나, 또는 조성물에서 주위 조직액으로 침출될 것이며, 비-폴리머 재료는 점점 응고되거나 침전되어 고체, 미소다공성 매트릭스를 형성할 것이다 (U.S. 5,888,533 참조).

제어된 방출 시스템은 Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533)에 의한 리뷰에서 논의된다. 당업자에게 공지되어 있는 임의의 기술들이 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지효성 방출 제형을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,526,938; 국제 공개 번호 WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조, 이것들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

특정 구체예에서 본 발명의 조성물이 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 폴리펩타이드 사슬 중 하나 이상을 암호화하는 핵산인 경우, 핵산은 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 그것을 구성하고 핵산이 세포 내로 들어가도록, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해 (미국 특허 번호 4,980,286 참조), 또는 직접적인 주사에 의해, 또는 극미립자 충격법 (예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont)의 사용에 의해, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션제로의 코팅에 의해 핵산을 투여함으로써, 또는 핵산을 핵으로 들어가는 것으로 알려져 있는 호메오박스-유사 펩타이드로 연결하여 투여함으로써 (예를 들어, Joliot et al. (1991) " Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868 참조), 등에 의해, 생체 내로 투여되어 핵산의 암호화된 디아바디의 발현을 촉진할 수 있다. 대안으로, 핵산은 상동 재조합에 의한 발현을 위해 세포 내로 도입되고 숙주 세포 DNA 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 치료적 또는 예방적 유효량으로 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는, 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상체는 약 1 내지 10주 동안, 바람직하게는 2 내지 8주 내지, 더 바람직하게는 약 3 내지 7주, 및 더 바람직하게는 약 4, 5, 또는 6주 동안 본 발명의 분자로 주 당 1회 치료된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하루에 1회, 하루에 2회, 또는 하루에 3회 투여된다. 다른 구체예에서, 약학적 조성물은 주 1회, 주 2회, 2주마다 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 연 2회 또는 연 1회 투여된다. 또한 치료에 사용된 분자의 유효한 투약량은 특정 치료의 과정에 걸쳐 증가하거나 감소할 수도 있다.

지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 그것은 하기 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해될 것이다. 이러한 실시예들은 예시의 방법으로 제공되며 명시되지 않는 한 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

PD-1 x LAG-3 이중-특이적 디아바디의 생산 및 성질

allo-MLR 검정의 맥락 내에서, T-세포를 HLA-미스매칭 (Latchman, Y.E. et al. (2004) "PD-L1-Deficient Mice Show That PD-L1 On T-Cells, Antigen-Presenting Cells, And Host Tissues Negatively Regulates T-Cells." Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(29):10691-10696; Wang, W. et al. (2008) "PD-L1/PD-1 Signal Deficiency Promotes Allogeneic Immune Responses And Accelerates Heart Allograft Rejection," Transplantation 86(6):836-44) 또는 미토겐/약학적 자극에 반응하여 증식하도록 유도한다. 동시자극 분자를 표적으로 하는 아고니스트 항체는 T-세포 신호 전달을 재시행하고 T-세포 효과기 기능을 촉진하거나 구동하는 전사 인자를 안정화시킴으로써 증식 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Melero, I. et al. (2013) "Agonist Antibodies to TNFR Molecules That Costimulate T and NK Cells," Clin. Cancer Res. 19(5):1044-1053). 유사하게, T-세포 반응을 부정적으로 조절하는 핵심 체크포인트 분자를 표적으로 하는 안타고니스트 항체는 T-세포 신호 전달 및 효과기 기능을 유지하고 이로 인해 항종양 면역력을 개선함으로써 증식 반응을 유도할 수 있다 (Capece, D. et al. (2012) "Targeting Costimulatory Molecules to Improve Antitumor Immunity," J. Biomed. Biotech. 2012:926321). 동종 항원에 반응하는 증식에 대하여 동시-자극 또는 체크포인트 표적에 대한 단클론성 항체의 효과는 ³H-티미딘의 혼입에 따라 단기간 혼합된 림프구 (allo-MLR) 반응에서 쉽게 측정될 수 있다. 증식을 향상시키는 체크포인트 억제자에 대한 항체의 능력을 해결하기 위해, 벤치마크 항-PD-1 또는 항-LAG-3 mA를 생성하였고, 정제하였고, allo-MLR 검정의 시작시 20, 10, 5, 2.5, 및 1.25 μg/ml로 외인성으로 추가하였다 (도 5). 5-6일의 끝에서, ³H-티미딘으로의 펄스를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였고 80시간 동안 배양하여 증식을 측정하였다. 인간 PD-1, LAG-3, 및 CTLA-4에 대한 여러 벤치마크 항체를 동종 항원 자극에 반응하여 T-세포 증식을 향상시키는 능력으로 평가하였다. 도 6에서 나타난 바와 같이, allo-MLR 검정의 시작시 PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558), PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, 람브롤리주맙), 또는 PD-1 mAb 3 (EH12.2H7; Dana Farber)의 추가는 IgG1 아이소타입 대조군 항체 또는 응답자 및 자극자를 함유하는 대조군 웰과 비교하여 강력한 T-세포 증식을 유도하였다. 방사선 조사된 자극자 세포를 단독으로 함유하는 웰은 증식하지 않음을 입증하였다. 용량 의존적 증식 반응이 관찰되었지만, PD-1 mAb 4 (CT-011; CureTech, BAT-1)는 PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558), PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, 람브롤리주맙), 또는 PD-1 mAb 3 (EH12.2H7; Dana Farber)과 비교하여 최소한의 증식을 나타냈다. 약간의 용량 의존성 증식 반응을 또한 LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS)로 관찰하였으며, 이것을 유사하게 Yervoy® 이필리무맙, 항-CTLA-4 mAb (Bristol Myers-Squib)와 비교하였다.

동물 모델에서 강력한 항-종양 면역력을 유도하는데 있어서 단독으로 제공된 항체와 비교하여 LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS)과 함께 제공된 PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558)의 놀라운 효과 (Woo, S.R. et al. (2012) "Immune Inhibitory Molecules LAG-3 And PD-1 Synergistically Regulate T-Cell Function To Promote Tumoral Immune Escape," Cancer Res. 72(4):917-927)는 조합으로 제공된 벤치마크 mAb가 항체 단독보다 allo-유도성 T-세포 증식을 더 강화시킬 수도 있다고 제안하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 항-LAG-3 mAb (25F7)를 단독으로 또는 항-PD-1 mAb (PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558) 또는 PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, 람브롤리주맙))와 조합으로 그것의 증식 가능성에 대하여 평가하였다. 이전에 관찰된 바와 같이, 항-PD-1 mAb는 둘 다 용량 의존적 방식으로 강력한 증식을 유도하였다. 그에 반해서, 항-PD-1 mAb와 함께 항-LAG-3 mAb의 제공은 항-PD-1 mAb 단독으로 관찰된 것보다 향상된 증식을 유도하지 않았다. 항-LAG-3 mAb는 단독으로 아이소타입 IgG1 대조군 또는 응답자 플러스 자극자 대조군 웰과 비교하여 단지 약간의 T-세포 증식만을 나타냈다.

항-PD-1 mAb로 관찰된 것보다 단독으로 또는 조합으로 증식을 유도할 수 없는 항-LAG-3 mAb의 능력은 allo-MLR 검정 중에 T-세포 상에서 LAG-3 발현이 없거나 또는 항-LAG-3 mAb가 음성 신호 캐스케이드를 차단하기 위해 LAG-3에 결합하지 않는다고 제안하였다. LAG-3 신호 변환을 유도할 가능성을 분석하기 위해서, 가용성 인간 LAG-3 단백질 ("shLAG-3")을 allo-MLR에 첨가하여 항-LAG-3 mAb 및/또는 항-PD-1 mAb와 비교하였다. 도 8에서 나타난 바와 같이, APC 및 CD4 T-세포 둘 다에서 발현된 인간 HLA-등급 II 분자에 결합하는 가용성 인간 LAG-3는 IgG 아이소타입 또는 응답자 플러스 자극자 대조군 웰과 비교하여 강력한 증식 반응을 유도하였다. LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS)의 첨가는 가용성 인간 LAG-3 단백질의 증식 효과를 차단하지 않는 것으로 보였고, 약간의 용량 의존적 증식 반응이 관찰되었기 때문에, 약간 향상된 T-세포 증식을 가질 수도 있다. 이전 관찰과 일치하게, 항-PD-1 mAb는 강력한 T-세포 증식을 유도하였으며 이것은 가용성 인간 LAG-3 단백질 및/또는 LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS) 둘 다의 첨가에 의해 더 향상되었다. 항-PD-1 항체에 아이소타입 IgG1 대조군의 첨가는 PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558) 단독으로 관찰된 것보다 T-세포 증식을 향상시키지 않았다. 항-LAG-3 mAb의 존재 하에서도 강력한 T-세포 증식을 유도하는 가용성 LAG-3의 능력은 불분명하다. 하나의 가능성은 항-LAG-3 mAb가 단순하게 가용성 LAG-3 mAb에 의해 유도된 강력한 증식 신호를 차단할 수 없다는 것이다. 대안 -- 반드시 상호 배타적인 가능성은 아니지만 -- 가용성 인간 LAG-3 단백질이 항-LAG-3과 함께 증식 반응을 더 강화시킬 수 있는 면역 교차-결합 복합체를 형성한다는 것이다.

T-세포 증식을 강화시키는 가용성 LAG-3의 능력은 아주 근접한 항-PD-1 및 항-LAG-3 mAb 둘 다의 도입이 allo-MLR 검정 내에서 T-세포 증식 반응을 향상시킬 수도 있다고 제안하였다. 이 가능성을 해결하기 위해서, 벤치마크 항-PD-1 및 항-LAG-3를 이중 친화도 재표적화 (DART®)-이중-특이적 포맷 내에서 두 방향으로 구성하였다: LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS) - PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558) 이중-특이적, 4가 Fc-DART® 디아바디 (PD-1 x LAG-3 Fc -DART®-1) 및 PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558) - LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS) 이중-특이적, 4가 Fc-DART® 디아바디 (PD-1 x LAG-3 Fc -DART®-1). 두 가지 Fc-DART® 포맷을 allo-MLR의 시작시 외인성으로 추가하였고 (상기 기술된 용량-의존적 방식으로) 그것들의 T-세포 증식 가능성에 대하여 평가하였다.

도 9A-9B에서 나타난 바와 같이, 두 개의 -DART® 디아바디는 놀랍게도 PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558) 및/또는 LAG-3 mAb 1 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS)으로 얻어진 것들보다 더 강력한 T-세포 증식 반응을 유도하였다. 가용성 인간 LAG-3 ("shLAG-3")는 다시 allo-MLR 검정 내에서 강력한 T-세포 증식을 입증하였다. DART® 및 가용성 인간 LAG-3 단백질 둘 다에 의해 유도된 강력한 증식 신호는 항-PD-1 mAb 또는 항-LAG-3 mAb 단독의 기여를 최소화하였다. 항-PD-1 및 LAG-3 mAb 둘 다가 IgG1 아이소타입 대조군 또는 응답자 플러스 자극자 웰 단독으로 관찰된 것보다 용량 의존적 방식으로 T-세포 증식을 유도하는 한편, 항-PD-1과 항-LAG-3의 조합은 항체 단독보다 향상된 증식을 입증하였으며, 문헌에서의 이전 보고와 같이 기능적 시너지 효과를 입증하였다 (Wang, W. et al. (2008) "PD-L1/PD-1 Signal Deficiency Promotes Allogeneic Immune Responses And Accelerates Heart Allograft Rejection," Transplantation 86(6):836-44; Melero, I. et al. (2013) "Agonist Antibodies to TNFR Molecules That Costimulate T and NK Cells," Clin. Cancer Res. 19(5):1044-1053; Capece, D. et al. (2012) "Targeting Costimulatory Molecules to Improve Antitumor Immunity," J. Biomed. Biotech. 2012:926321).

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 개개의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 그 전문이 참조로 포함되는 바와 같은 정도로 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 그것의 특정 구체예와 관련되어 기술된 한편, 추가의 변형이 가능한 것으로 이해될 것이며 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원칙에 따르고 본 발명이 속하고 적용될 수도 있는 업계 내에서 공지된 또는 통상적인 실행의 범위 내에 있고 상기 제시된 근본적인 특징에 적용될 수도 있는 본 개시물로부터의 이탈을 포함하는 본 발명의 임의의 변화, 사용, 또는 개조를 커버하도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics, Inc. Bonvini, Ezio Johnson, Leslie S Moore, Paul A Shah, Kalpana La Motte-Mohs, Ross <120> Covalently Bonded Diabodies Having Immunoreactivity with PD-1 and LAG-3 and Methods of Use Thereof <130> 1301.0115PCT <150> 62/017,467 <151> 2014-06-26 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc <222> (1)..(288) <223> human PD-1 including signal sequence <400> 1 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 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cagtcttcct cttcccccca 900 aaacccaagg acaccctcta tatcacccgg gagcctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 960 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1020 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1080 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1140 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1200 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1260 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1320 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1380 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1440 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1500 ggt 1503 <210> 31 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second and Fourth Polypeptide Chains of the Exemplary PD-1 x LAG-3 Fc-DART-2 diabody <400> 31 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 115 120 125 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe 130 135 140 Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala 165 170 175 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 180 185 190 Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 210 215 220 Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys 225 230 235 240 Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys 245 250 255 Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 <210> 32 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding the Second and Fourth Polypeptide Chains of the Exemplary PD-1 x LAG-3 Fc-DART-2 diabody <400> 32 gaaattgtcc tgacacagtc tcccgcaacc ctgagtttga gtcctgggga gcgagcaact 60 ctctcctgcc gagcctccca gagtatctcc tcctacctcg cctggtacca acagaagcca 120 gggcaggctc caaggctgct tatctatgac gcctctaacc gcgcaactgg gattcccgca 180 cgcttctccg gctctggttc cggcacagac tttacactta ctatctctag cctggagcca 240 gaagactttg ccgtgtacta ttgtcagcaa cgttccaatt ggccccttac ctttgggcag 300 ggcactaact tggaaatcaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtc 360 gagagtggtg gcggcgttgt gcaacctggg cgttccctcc gattggactg taaagcttcc 420 ggcattactt tctcaaattc cggcatgcat tgggtgaggc aagcccctgg aaaagggctc 480 gaatgggtgg ctgtgatttg gtacgatggc agcaaacggt actacgccga ttctgttaag 540 ggccgcttta ccatctcccg cgataactca aagaacacac tgtttctgca aatgaatagt 600 cttagagccg aggacaccgc cgtgtactac tgtgccacaa atgacgatta ttgggggcag 660 ggcacattgg tcacagtgtc ttccggagga tgtggcggtg gaaaagtggc cgcatgtaag 720 gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc gccgcactta aggaaaaggt cgcagccctg 780 aaagag 786

Claims

PD-1의 에피토프 및 LAG-3의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 이중-특이적 Fc 디아바디로서, 상기 디아바디는 각각 아미노 말단 및 카르복시 말단을 가진 네 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하며,
(A) 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되고, 상기 제2 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되고, 상기 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되고;
(B) 상기 디아바디의 상기 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 각각, N-말단에서 C-말단 방향으로, PD-1 또는 LAG-3에 면역 특이적인 항체의 경쇄 가변 도메인, LAG-3 또는 PD-1에 면역특이적인 항체의 중쇄 가변 도메인, 헤테로다이머-촉진 도메인 및 CH2-CH3 도메인을 포함하며, 상기 경쇄 가변 도메인 및 상기 중쇄 가변 도메인은 PD-1의 에피토프 또는 LAG-3의 에피토프에 결합할 수 있는 에피토프-결합 부위를 형성하도록 회합할 수 없고;
(C) 상기 디아바디의 상기 제2 및 상기 제4 폴리펩타이드 사슬은 각각, N-말단에서 C-말단 방향으로, PD-1 또는 LAG-3에 면역 특이적인 항체의 경쇄 가변 도메인, LAG-3 또는 PD-1에 면역특이적인 항체의 중쇄 가변 도메인, 및 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하며, 상기 경쇄 가변 도메인 및 상기 중쇄 가변 도메인은 PD-1의 에피토프 또는 LAG-3의 에피토프에 결합할 수 있는 에피토프-결합 부위를 형성하도록 회합할 수 없고;
(I) (1) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬의 상기 경쇄 가변 도메인 및 상기 제2 폴리펩타이드 사슬의 상기 중쇄 가변 도메인은 회합하여 제1 에피토프-결합 부위를 형성하고 상기 제1 폴리펩타이드 사슬의 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 폴리펩타이드 사슬의 상기 경쇄 가변 도메인은 회합하여 제2 에피토프-결합 부위를 형성하고;
(2) 상기 제3 폴리펩타이드 사슬의 상기 경쇄 가변 도메인 및 상기 제4 폴리펩타이드 사슬의 상기 중쇄 가변 도메인은 회합하여 제3 에피토프-결합 부위를 형성하고 상기 제3 폴리펩타이드 사슬의 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 제4 폴리펩타이드 사슬의 상기 경쇄 가변 도메인은 회합하여 제4 에피토프-결합 부위를 형성하며;
상기 형성된 에피토프-결합 부위 중 두 개는 PD-1의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있고 상기 형성된 에피토프-결합 부위 중 두 개는 LAG-3의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있고;
II. 상기 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 상이하고 서열 번호:16 및 서열 번호:17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며;
III. 상기 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인은 회합하여 Fc 도메인을 형성하는, 이중-특이적 Fc 디아바디.
제1 항에 있어서, 상기 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인은 각각 서열 번호:24의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중-특이적 Fc 디아바디.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, LAG-3에 면역특이적인 항체의 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호:11의 아미노산 서열을 가지고, LAG-3에 면역특이적인 항체의 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중-특이적 Fc 디아바디.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1에 면역 특이적인 항체의 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호:2의 아미노산 서열을 가지고, PD-1에 면역 특이적인 항체의 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중-특이적 Fc 디아바디.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항의 이중-특이적 Fc 디아바디의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제5 항에 있어서, 상기 이중-특이적 Fc 디아바디의 상기 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 수령체 개체에서 암을 치료하는데 효과적인 양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5 항에 있어서, 상기 암은 부신암, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성불완전섬유원증, 골 섬유 이형성증, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비성 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두상 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아 암, 말초 신경초 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀성 혈액 장애, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암, 또는 자궁암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5 항에 있어서, 상기 이중-특이적 Fc 디아바디의 상기 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 수령체 개체에서 병원체의 존재와 관련된 질환을 치료하는데 효과적인 양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제8 항에 있어서, 상기 병원체는 박테리아, 균류 또는 바이러스인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
암 치료를 필요로 하는 개체에게 제6 항 또는 제7 항의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
병원체의 존재와 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 제8 항 또는 제9 항의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 병원체의 존재와 관련된 질환의 치료 방법.