KR20140071350A

KR20140071350A - 신경퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20140071350A
Application number: KR1020147005574A
Authority: KR
Inventors: 지빌레 헤쓰; 크리스티안 횔셔; 안드레에스 뵈메; 아녜스 므뉘트; 로랑 프라디에; 베로니크 토펭
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하; 유니버시티 오브 얼스터
Priority date: 2011-09-01
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2014-06-11
Also published as: AU2012300796A1; RU2618412C2; US20130116179A1; US20160354445A1; HK1196282A1; JP6185914B2; CA2842133A1; TW201322993A; HUE029294T2; CN103813801A; MX349224B; US9987332B2; TWI559929B; PL2750698T3; JP2014525430A; RS55115B1; CY1120094T1; BR112014005025A2; MX2014002155A; WO2013030409A1

Abstract

본 발명은 신경퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신경퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR USE IN THE TREATMENT OF A NEURODEGENERATIVE DISEASE}

본 발명의 대상은, desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트(adjuvant), 및/또는 보조 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물이다.

알츠하이머 질환

알츠하이머 질환(AD)은, 피질 뉴런의 상실, 특히, 연합성 신피질 및 해마를 초래하고, 결국 인지 기능의 서행형 또는 진행형 상실로 이어지고, 궁극적으로는 치매 및 사망에 이르는, 신경퇴행성 장애이다. 이 질환의 주요 특징은 미스폴딩된(misfolded) 단백질의 응집 및 침착이다(Bertram et al 2010; Mancuso et al 2010): (1) 세포외 노인성 또는 신경성 '플라크'로서의 응집된 베타-아밀로이드(Aβ) 펩타이드, 및 (2) 세포내 신경섬유 '매듭'(NFT: neurofibrillary tangle)으로서의 과인산화된 타우(tau) 단백질.

유전학적으로, AD는 2개의 형태로 나뉜다: (1) 조기-발병 가족성 AD(60세 미만), 및 (2) 후기-발병 산발성 AD(60세 이상). 드물게, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 프레세닐린 1(PSEN 1) 및 프레세닐린 2(PSEN2) 유전자에 돌연변이를 일으키는 질환은 조기-발병 가족성 AD를 초래하는 것으로 알려져 있고, 한편, APOE(대립유전자 4)는 후기-발병 AD에 대한 가장 중요한 유일한 위험 인자이다(Bertram et al 2010).

단백질 산화 및 지질 과산화에 의해 입증되는, 미토콘드리아 기능이상 및 산화 스트레스는 AD 뇌의 특성이다. 반응성 산소 종(ROS)의 생성과 화학적 반응성 종의 파괴(breakdown) 사이의 항산화제에 의한 불균형은 산화 스트레스로 이어진다. Aβ는 직접적인 산화 효과를 갖지만, 이는 미토콘드리아 환원 활성을 방해하여 유리 라디칼의 증가를 초래할 수도 있다. 뉴런은, 이들이 기타 포유동물 세포 유형에 비하여 낮은 수준의 항산화제를 가지므로 ROS의 증가에 대해 덜 방어할 수 있고, 따라서, 산화 스트레스에 고도로 민감한 것으로 생각된다. 최초의 뉴런 배양물에의 Aβ의 첨가는 ATPase의 억제, 세포 전위의 변화, 및 Ca² ⁺ 유입을 초래한다(Varadarajan et al 2000; Higginsa et al 2010).

이러한 파괴성 질환에 대한 치유법은 현재 존재하지 않고, 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 승인된 몇몇의 치료법은 AD의 진행을 멈추기보다는 단지 증상을 개선하는데 부분적으로 효과적이다(Wollen 2010, Aderinwale et al 2010). 현재, 허가된 AD에 대한 약제 치료요법은 아세틸콜린에스테라제 억제제, 예를 들면, 타크린(Tacrine), 도네피질(Donepizil), 리바스티그민(Rivastigmine), 갈란타민(Galantamine) 및 NMDA 수용체 길항제 메만틴(memantine)이다. 이들 약물의 효과는 매우 한정되어 있고, 주요 작용은 이 또한 질환의 발달을 예방하기보다는 증상을 감소시키는 것이다. 다른 약물은 '오프 라벨(off label)'로, 예를 들면, 스타틴(Statin)(콜레스테롤 수준 환원제), 항고혈압 약물, 또는 항-염증 약물 등으로 제공될 수 있다. 이들 약물 중 AD의 진행을 감소시키는 것으로 증명된 약물은 없었다(Kaduszkiewicz et al 2005; Holscher, 2005). AD를 치료하기 위한 다른 전략들이 조사 중이다. 뉴런 성장 인자 α(NGF)가 노인성 플라크를 감소시키고 인지 기능을 개선할 수 있음이 발견되었다(De Rosa et al 2005). 현재 인슐린 내성은 AD에서의 주요 문제점 중 하나로서 공지되어 있으므로(Hoscher and Li, 2010), 인슐린 자체 대신에 다른 성장 인자, 예를 들면, 인크레틴(incretin) 호르몬 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1)이 전-임상 연구에서 우수한 효과를 나타내고 있다. GLP-1 인크레틴 유사체 리라글루타이드(liraglutide)는 아밀로이드 플라크의 수를 감소시켰고, 베타-아밀로이드 수준을 감소시켰으며, 인지 손상 및 시냅스 기능이상을 예방하였고, 염증 반응을 감소시켰고, AD의 유전자전이 마우스 모델의 뇌에서 시냅스 성장 및 뉴런 생성을 향상시켰다(McClean et al 2011). 뇌에서의 아밀로이드 플라크 및 관련된 염증 반응은 AD의 주요 특징이다. 유사한 보호 효과는 AD의 유전자전이 마우스 모델에서 다른 GLP-1 유사체 수용체 작용제를 이용하여 발견되었다(Li et al 2010).

파킨슨 질환

파킨슨 질환(PD)은, 도파민 합성 능력을 크게 감소시키고, 그 결과로 선조(striatal) 도파민 수용체에의 연결에 실패하는, 일반적으로 흑질 선상체(nigrostriatal) 뉴런의 선택적 퇴행을 특징으로 하는, 근육 운동의 만성 신경퇴행성 장애이다(Gandhi et al 2005). 임상학적으로 질환이 나타나기 전에, 흑질 치밀부(SNc: substantia nigra pars compacta)에서 흑질 선상체 뉴런의 사멸이 침묵적으로 발생하고, 이는 아마도 동시적 아폽토시스성, 흥분독성, 유리-라디칼 매개된 신경 염증 사건의 발생의 결과일 것이다. PD의 병리에 대한 치유, 또는 PD의 병리를 제동하는 수단을 제공하는 치료학적 전략은 찾기 어려운 상태이다. 확립된 약물 치료요법은 근본적으로 일시적인 처방이고, 모든 환자에 대해 효과적인 것은 아니다. 아폽토시스성 세포 사멸은 선택적 흑질 선상체 뉴런 사멸에서 중심 구성요소들 중 하나이므로(Schapira 2001), 향후 치료 전략은 항-아폽토시스성 특성을 지닌 바이오-분자의 표적화된 사용을 포함할 수 있다. 대안으로, 신경 영양 특성을 또는 도파민작용성 표현형을 갖는 세포의 신경생성을 자극하는 능력을 지닌 분자에 의해 긍정적인 치료 효과가 생성될 수 있다. 최근, 흥분독성 스트레스를 받은 PC12 세포의 배양액에서, 글루카곤-유사 펩타이드-1 수용체(GLP-1) 작용제 엑센딘-4가 신경 영양(Perry et al 2002) 및 신경 보호(Perry et al 2002) 특성을 나타냄이 관찰되었다. 최근, 엑센딘-4가 흑질 병변의 진행을 제동하거나 심지어 역전시킴이 밝혀졌고, 2마리의 PD 마우스 모델에서 1회 확인되었다(Harkavyi et al 2008). 또한, 엑센딘-4 치료가, PD의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 마우스 모델에서, 퇴행에 대한 도파민작용성 뉴런을 보호하였고, 도파민 수준을 보존하였으며, 운동 기능을 개선시켰음이 밝혀졌다(Li et al 2009).

헌팅턴 질환

헌팅턴 질환(HD)은, 불수의 신체 운동뿐만 아니라, 정신 및 인지 이상으로 전형화되는, 유전적 신경퇴행성 장애이다. HD에 근거한 유전적 결함은 HD 유전자의 엑손 1에서의 CAG 트리뉴클레오타이드 반복의 확장을 포함하고, 이는 헌팅틴(htt) 단백질에서의 폴리글루타민 확장을 초래한다. 이것은 이상 프로세싱 및 유해한 세포내 응집으로 이어진다. 최근, 엑센딘-4 치료가, 췌장 및 뇌에의 돌연변이체 htt 포접(inclusion)의 발달을 억제하고, 대사 효과 및 운동 기능이상을 개선하고, HD 마우스의 생존을 연장시킴이 밝혀졌다(Martin et al 2009).

뇌졸중

뇌졸중의 병태생리학은 아폽토시스를 통한 피질 및 선조 뉴런의 사멸을 포함한다(Mattson, 2007).

최근, 엑센딘-4의 투여는, 일시적 중뇌 동맥 폐색 뇌졸중 마우스 모델에서 뇌 손상을 감소시켰고, 기능적 결과를 향상시켰음이 밝혀졌다(Li et al 2009). 게르빌루스쥐 중 뇌 허혈 모델에서, 엑센딘-4를 이용한 GLP-1 수용체 자극은, 일시적 뇌 허열 손상에 대해 미세교세포 활성화를 방해함으로써 허혈-관련된 뉴런 사멸을 약화시켰음이 추가로 밝혀졌다. (Lee et al 2011). 테라모토(Teramoto) 등(2011)은, 엑센딘-4가 뇌 허혈-관류 손상 마우스 모델에서 효과적임을 밝혔다. 엑센딘-4 치료는, 경색부 체적을 유의하게 감소시켰고, 기능적 결손을 개선하였다.

말초 감각 신경병증

당뇨병을 앓고 있는 개체 중 약 60 내지 70%는 소정 정도의 신경 손상, 구체적으로는 손 및/또는 발의 손상된 감각, 느려진 위 운동성 또는 수근관 증후군을 야기하는 신경병증을 갖는다. 현재, 장기 고혈당증 및 관련된 대사 장해에 의해 야기된 신경 손상을 역전시키는 치료요법은 존재하지 않는다. GLP-1 발현은 결절성 신경절의 뉴런에서 확인되었고, 이는 말초 신경 전달에서의 GLP-1의 역할을 시사한다(Nakagawa 2004). 비-당뇨병성 설치류의 피리독신-유도된 말초 신경병증의 설치류 모델에서, GLP-1 및 s.c. 엑센딘-4는 몇몇의 피리독신-유도된 기능적 및 형태학적 결함에 대해 부분적으로 보호하고 축삭돌기 크기의 표준화를 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다(Perry et al 2007).

인지 기능, 기분 및 기억:

GLP-1 수용체 작용제는, 모리스 수중 미로(Morris water maze)에서 측정된 바와 같이, 설치류에서 인지 기능을 향상시킬 수 있고; GLP-1 수용체 녹-아웃 마우스는, 해마 GLP-1 수용체 유전자 전이 후에 저장되는 학습 결핍증을 특징으로 하는 표현형을 갖는다(During et al 2003). 최근, 이삭슨(Isacson) 등(2010)은, 성체 설치류에서 해마-관련 인지 및 기분-관련 행동에 대한 만성 엑센딘-4 치료의 효과를 밝혔다. 다른 연구에서, 당뇨병의 마우스 모델의 배근 신경절에서 발견되는 다발성 신경병증은 엑센딘-4에 의해 역전되었다(Himeno et al 2011). 다른 GLP-1 유사체, 리라글루타이드가, 고지방 식이-유도된 비만 및 인슐린 내성을 앓고 있는 마우스에서 인지 기능 및 해마 시냅스 가소성에 대해 이로운 효과를 발휘하는 것이 밝혀졌다(Porter et al 2010).

글루카곤-유사 펩타이드 1

글루카곤-유사 펩타이드 1, GLP-1 또는 GLP-1(7-36)은, 프로글루카곤 유전자에서 인코딩되는, 30-아미노산 펩타이드 호르몬이다. 이것은 소화관의 내분비 L 세포에서 주로 생성되고, 지방, 단백질 가수분해물, 및/또는 글루코스를 함유하는 음식물이 십이지장으로 들어갈 때 혈류로 분비된다. 가장 광범위하게 연구되는 GLP-1에 의해 활성화되는 세포는 췌장의 인슐린-분비 베타 세포이고, 여기서 이의 정의된 작용은 글루코스-유도된 인슐린 분비의 증강이다. 베타 세포에서의 GLP-1 수용체(GLP-1R) 활성화시, 아데닐릴 사이클라제(AC)가 활성화되고, cAMP가 생성되며, 결국 2차 메신저 경로, 예를 들면, 단백질 키나제 A(PKA) 및 Epac 경로의 cAMP-의존성 활성화로 이어진다. 글루코스-유도된 인슐린 분비를 향상시키는 단기 효과뿐만 아니라, 연속적 GLP-1R 활성화도 인슐린 합성, 베타 세포 증식, 및 신경생성을 증가시킨다(Doyle et al 2007). 또한, GLP-1은 일반적으로 글루카곤의 농도를 조절하고, 위 배출을 늦추고, (프로-)인슐린의 생합성을 자극하고, 인슐린에 대한 민감성을 증가시키고, 글리코겐의 인슐린-비의존성 생합성을 자극한다(Holst (1999); Curr. Med. Chem 6: 1005; Nauck et al (1997) Exp Clin Endocrinol Diabetes 105:187; Lopez-Delgado et al (1998) Endocrinology 139:2811).

인슐린 및 글루카곤 분비에 대한 GLP-1의 특정 효과는, 지난 20년에 걸친 연구 활동을 발생시켰고, 현재 2형 진성 당뇨병(T2DM)을 치료하는데 사용되고 있는, 천연 발생 GLP-1 수용체(GLP-1R) 작용제, 엑센딘 4를 얻었다(Doyle et al 2007).

췌장 이외의 조직(뇌, 신장, 폐, 심장, 및 주요 혈관)에서, GLP-1은 특정 구아닌 뉴클레오타이드-결합 단백질(G-단백질) 커플링된 수용체를 활성화시킬 수 있다.

GLP-1은 성장 인자-유사뿐만 아니라 신경보호 특성도 나타냈다(McClean et al 2010). 또한, GLP-1은 해마 뉴런의 아폽토시스의 유도를 감소시키고, 공간 및 연상 학습을 향상시킨다(During et al 2003). 페리(Perry) 등(2002)은, 글루타메이트-유도된 아폽토시스에 대해, 배양된 래트 해마 뉴런을 GLP-1이 완전히 보호할 수 있음을 보고하였다. GLP-1 유사체 (Val8) GLP-1 및 N-아세틸-GLP-1은 해마에서 시냅스 전달의 장기 강화(LTP)에 대한 중요한 효과를 나타냈다(McClean et al 2010). GLP-1 유사체 리라글루타이드는, 유전자전이 AD 마우스 모델에서, 아밀로이드 플라크의 수를 감소시켰고, 베타-아밀로이드 수준을 감소시켰으며, 인지 손상 및 LTP 억압을 예방하였고, 염증 반응을 감소시켰으며, 시냅스 성장 및 신경생성을 향상시켰다(McClean et al 2011).

GLP-1, 리라글루타이드 및 엑센딘-4는 혈뇌 장벽(BBB: blood brain barrier)을 통과하는 것으로 밝혀졌다(Kastin et al 2001; McClean et al 2011). 페리 등(2003)은, GLP-1 및 엑센딘-4가 뇌에서의 베타 아밀로이드의 수준 및 뉴런에서의 아밀로이드 전구체 단백질의 수준을 감소시켰음을 발견하였다. 엑센딘-4 또는 리라글루타이드를 이용한 만성 치료는 성체 마우스 해마 치아 이랑에서 세포 증식 및 신경아세포 분화에 영향을 미친다(Li et al 2010; Hamilton et al 2011).

리라글루타이드는, 화학식 Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε(γ-글루타밀(N^α-헥사데카노일)))GLP-1(7-37)을 갖는 GLP-1 유사체이다. 리라글루타이드는 일반적으로 비경구 투여된다.

화합물 desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ (AVE0010, 릭시세나타이드)는 엑센딘-4의 유사체이다. 릭시세나타이드는 제WO 01/04156호에 서열번호 93으로서 개시되어 있다:

서열번호 1: 릭시세나타이드 (44 AS)

서열번호 2: 엑센딘-4 (39 AS)

서열번호 3: GLP-1(7-36) (30 AS)

엑센딘은, 혈당 농도를 저하시킬 수 있는 펩타이드의 그룹이다. 엑센딘은 GLP-1 (7-36)과 단지 약 50%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 따라서, 엑센딘은 일반적으로 GLP-1 유사체로서 간주되지 않는다.

릭시세나타이드는, 원래의(native) 엑센딘-4 서열의 C-말단 절단을 특징으로 한다. 릭시세나타이드는, 엑센딘-4에 존재하지 않는 6개의 C-말단 리신 잔기를 포함한다. 현재까지는, 릭시세나타이드는, 상기 C-말단 리신 잔기는 약물이 혈-뇌-장벽을 통과하는 것을 방해할 수 있어서, CNS 장애, 특히, 신경퇴행성 질환의 치료에 적합한 약물로서 고려되지 않았었다. 현재, 릭시세나타이드가 특정 메커니즘 및/또는 조절되는 메커니즘에 의해 혈-뇌-장벽을 통과하여 수송될 수 있다는 지적이 존재하지 않는다.

본 발명의 실시예 1에서, 릭시세나타이드는, 둘 모두 현재 2형 당뇨병을 위한 치료제로서 사용되고 있는 GLP-1 유사체 리라글루타이드 및 엑센딘-4에 비해 우수한 특성을 가짐이 입증되었다:

(a) 놀랍게도, 릭시세나타이드는 혈뇌 장벽을 통과할 수 있다. 본 발명의 데이터는, 고농도의 수송률이 최대 수준까지로 한정되므로, 수송이 조절됨을 나타낸다. 또한, 릭시세나타이드는 리라글루타이드와 비교하여 보다 낮은 비경구 용량에서 뇌에 흡수된다.

(b) 릭시세나타이드는 뇌에서 GLP-1 수용체를 활성화시키고, cAMP 생성을 유도한다. 놀랍게도, 릭시세나타이드는, 리라글루타이드가 생성시키는 것보다 cAMP를 더 높은 수준으로 생성시키고, 이는 동일한 용량에서 GLP-1 수용체의 활성화에 있어서의 유효성이 보다 높음을 입증한다.

(c) 릭시세나타이드는 치아 이랑에서 선조 세포의 증식을 유도할 수 있다. 동일한 용량으로 투여될 때, 릭시세나타이드는, 엑센딘-4와 또는 리라글루타이드와 비교하여, 개선된 효과를 제공한다. 신경퇴행성 질환에서, 이들 효과는 질환-변경 효과를 구성할 수 있다.

(d) 릭시세나타이드는, 리라글루타이드와 비교하는 경우, 치아 이랑에서 (세포 스트레스에 대해) 우수한 신경보호 효과를 나타냈다.

(e) 놀랍게도, 릭시세나타이드의 10nM 용량을 이용한 사전-치료가 SH-SY5Y 신경아세포종 세포를 1200μM의 메틸 글리옥살 스트레스로부터 보호하는데 충분하였다. 세포를 1200μM의 메틸 글리옥살 스트레스로부터 보호하는데 리라글루타이드는 200nM 용량이 필요하였고, 이것은, 릭시세나타이드의 보다 낮은 용량이 보호를 유도하는데 충분함을 나타내는 것이다(또한, GLP-1 작용제를 이용한 사전-치료에 의해 얻어진 실시예 2의 데이터도 참조).

실시예 2는, 릭시세나타이드를 이용한 후-치료가 SH-SY5Y 신경아세포종 세포를 2mM 메틸 글리옥살 스트레스 또는 1mM H₂O₂ 스트레스로부터 보호하는데 충분하였음을 입증한다. 대조적으로, 리라글루타이드는 세포를 MG 또는 H₂O₂에 의한 스트레스로부터 보호하지 않았다.

실시예 3에서, 릭시세나타이드는, 신경퇴행에 대해, 로테논 치료된 LUHMES 세포에서 유의한 신경보호 효과를 나타냈다. 릭시세나타이드는 다른 GLP-1 수용체(GLP-1R) 작용제와 비교하여 이점을 제공한다. 로테논 치료된 LUHMES 세포에서, 릭시세나타이드는 리라글루타이드보다 3배 더 낮은 농도에서 유의하게 활성이고, 이 결과는 실시예 1의 메틸 글리옥살 모델에서 보여진 예상하지 못한 우수한 활성 효과에 조력한다. 엑세나타이드는 0.3 및 1μM의 농도에서 유의한 효과를 유발하지 않았다. 대조적으로, 릭시세나타이드는 이들 농도에서의 생존률의 용량-의존적 향상을 제공한다.

실시예 4에서, 생체내 릭시세나타이드 치료가 알츠하이머 질환의 유전자전이 마우스 모델에서 아밀로이드 플라크 부하의 감소로 이어짐이 입증된다. 따라서, 릭시세나타이드의 신경보호 특성에 추가하여, 릭시세나타이드는, 뇌 병리학적 병변, 예를 들면, 아밀로이드 플라크를 감소시킬 수 있고, 따라서, 알츠하이머 질환에 대한 매력적인 예방 및/또는 치료를 나타낸다. 리라글루타이드에 대해 이전에 맥린(McLean) 등(2011)에 의해 기술된 용량(25nmolm/kg)보다 더 낮은 용량(10nmol/kg)에서 활성이 관찰된다.

따라서, 릭시세나타이드는 신경퇴행성 질환, 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및/또는 뇌졸중의 치료 및/또는 예방에 적합하다.

본 발명의 제1 양상은, desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트(adjuvant), 및/또는 보조 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물이다.

본 발명의 다른 양상은, desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 및/또는 보조 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물이다.

신경퇴행성 질환은, 임의의 신경퇴행성 질환, 특히, 산화 스트레스, 신경돌기 무결성의 상실, 아폽토시스, 뉴런 상실 및/또는 염증 반응과 관련된 신경퇴행성 질환이다.

본 발명에서, 신경돌기 무결성의 상실은 수지상 돌기(dendritic spine) 상실, 시냅스 가소성의 상실 및/또는 새로운 상보성 신경돌기 발아의 상실을 포함한다.

신경퇴행성 질환은 인지 손상과 관련될 수 있다.

특히, 신경퇴행성 질환은, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 진행성 핵상 마비(PSP: progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(MSA: multiple system atrophy), 루이체 치매(Lewy body dementia), 파킨슨 질환 치매, 뇌전증, 뇌졸중, 헌팅턴 무도병, 뇌 저산소증, 다발성 경화증, 및 말초 신경병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 말초 신경병증은 진성 당뇨병과 관련될 수 있다.

신경 퇴행성 질환은, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 및 뇌졸중으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 신경 퇴행성 질환은, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 루이체 치매, 파킨슨 질환, 및 파킨슨 질환 치매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것도 바람직하다. 이들 질환 중 어느 하나는 파킨슨 증상(Parkinsonism)과 관련될 수 있다.

진행성 핵상 마비 및 다계통 위축증은 파킨슨-플러스 증후군(Parkinson-plus syndrome)으로서 총괄적으로 알려져 있다.

본 발명에서, 파킨슨증상은, 특정 증상, 예를 들면, 진전(tremor), 운동저하증(hypokinesia), 경직 및/또는 자세 불안정의 조합을 특징으로 하는 신경학적 증후군이다.

한 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환이다. 알츠하이머 질환은 산화 스트레스 및 뉴런 상실과 관련될 수 있다.

다른 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 파킨슨 질환이다. 파킨슨 질환은 산화 스트레스, 염증 반응, 아폽토시스, 뉴런 상실, 특히, 도파민작용성 뉴런의 상실, 예를 들면, 도파민 부족을 초래하는, 흑질의 상실과 관련될 수 있다.

뉴런 상실은 아폽토시스에 의해 야기될 수 있다.

다른 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 진행성 핵상 마비이다. 진행성 핵상 마비는 뉴런 상실, 특히, 도파민작용성 뉴런의 상실과 관련될 수 있다.

다른 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 다계통 위축증이다. 다계통 위축증은 뉴런 상실, 특히 도파민작용성 뉴런의 상실과 관련될 수 있다.

다른 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 루이체 치매이다. 루이체 치매는 뉴런 상실, 특히 도파민작용성 뉴런의 상실과 관련될 수 있다. 루이체 치매는 파킨슨 질환과 관련될 수 있다.

다른 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 파킨슨 질환 치매이다. 파킨슨 질환 치매는 뉴런 상실, 특히, 도파민작용성 뉴런의 상실과 관련될 수 있다. 특히, 파킨슨 질환 치매는 파킨슨 질환과 관련된다.

또 다른 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 뇌졸중이다. 뇌졸중은 허혈에 의해 야기된 뉴런 상실과 관련될 수 있고, 여기서, 허혈은 폐쇄(blockage)(예를 들면, 혈전증 또는 동맥 색전증) 또는 출혈에 의해 야기될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 다발성 경화증이고, 이는 CNS에서의 염증성 프로세스와 관련될 수 있다.

본 발명의 데이터는, (a) 릭시세나타이드가 신경보호 및/또는 신경생성 효과를 제공한다는 것, 그리고 (b) 릭시세나타이드가 다른 GLP-1 작용제, 예를 들면, 엑센딘-4 또는 리라글루타이드와 비교하여 우수하다는 것을 입증한다. 따라서, 릭시세나타이드는 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 및 뇌졸중에서 질환-변경 효과를 제공할 수 있다. 특히, 릭시세나타이드의 투여는, 신경보호 및 신경생성이 질환의 진행을 늦추어 삶의 질을 향상시킬 수 있으므로, 신경퇴행성 질환의 초기 단계에서의 치료에 적합하다.

따라서, 본 발명의 한 양상에서, 신경퇴행성 질환은 초기 단계에 있다. 예를 들면, 알츠하이머 질환은 초기-단계 알츠하이머 질환일 수 있다. 또한, 초기-단계 알츠하이머 질환(AD)은 전구 알츠하이머 질환 또는 치매전 알츠하이머 질환이라고 한다. (Dubois et al. 2010). 초기 단계 알츠하이머 질환은 지지적인 바이오마커 데이터 또는 알츠하이머 질환 병리와 관련된 객관적인 기억 불평을 나타내는, 뇌척수액(CSF)에서 저수준의 타우 단백질에 대한 β-아밀로이드 42(Ab42) 펩타이드 비가 발견되거나, 또는 뇌에서 아밀로이드 PET(psitron emission tomography: 양전자 방출 단층촬영술) 제제, 예를 들면, E. Lilly(Avid)로부터의 AmyVid^TM에 의해 아밀로이드 플라크가 검출되는, 환자로서 정의될 수 있다.

다른 실시형태에서, 파킨슨 질환은 초기-단계 파킨슨 질환일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 진행성 핵상 마비는 초기-단계 진행성 핵상 마비일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 다계통 위축증은 초기-단계 다계통 위축증일 수 있다. 다른 실시형태에서, 루이체 치매는 초기-단계 루이체 치매일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 파킨슨 질환 치매는 초기-단계 파킨슨 질환 치매일 수 있다.

또한, 릭시세나타이드는, 특히, 명확한 진단을 받지 않은 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 것으로 의심되는 환자들에서의 신경퇴행성 질환의 예방에 적합하다. 본 발명의 다른 양상에서, 본원에 기술되는 약제학적 조성물은 신경퇴행성 질환의 예방에 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 상황에서, desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ (릭시세나타이드)는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 당해 분야 숙련가는 릭시세나타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 알고 있다. 본 발명에서 사용되는 릭시세나타이드의 바람직한 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트이다.

본 발명에서, desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 이를 필요로 하는 환자에게 치료학적 효과를 유도하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다.

본 발명에서, desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 적합한 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 및/또는 보조 물질과 제형화될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 본원에 기술된 바와 같은 신경퇴행성 질환에서, 본원에 기재된 바와 같은 신경보호 및 신경재생 효과에 의한 질환-변경 효과를 제공한다. 특히, 질환-변경 반응은, 본원에 기술된 바와 같은, 신경퇴행성 질환의 치료, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 루이체 치매, 파킨슨 질환 치매, 뇌졸중, 뇌전증, 뇌졸중, 헌팅턴 무도병, 뇌 저산소증, 다발성 경화증, 및 말초 신경병증의 치료에서 얻어질 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 예를 들면, 주사에 의해(예를 들면, 근육내 주사에 의해 또는 피하 주사에 의해) 비경구 투여될 수 있다. 적합한 주사 장치, 예를 들면, 활성 성분을 포함하는 카트리지, 및 주사 바늘을 포함하는, 소위 "펜"이 공지되어 있다. 화합물 desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 적합한 양으로, 예를 들면, 1 내지 50㎍/용량, 5 내지 40㎍/용량, 10 내지 30㎍/용량, 10 내지 15㎍/용량 또는 15 내지 20㎍/용량 범위 내의 양으로 투여될 수 있다.

본 발명에서, 화합물 desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 1 내지 50㎍의 범위, 5 내지 40㎍의 범위, 10 내지 30㎍의 범위, 10 내지 20㎍의 범위, 10 내지 15㎍의 범위, 또는 15 내지 20㎍의 범위 내의 1일 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 1일 1회 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 조성물은 액체 조성물로서 제공될 수 있다. 당해 분야 숙련가는 비경구 투여에 적합한 릭시세나타이드의 액체 조성물을 알고 있다. 본 발명의 액체 조성물은 산성 pH 또는 생리학적 pH를 가질 수 있다. 산성 pH는 바람직하게 pH 1 내지 6.8, pH 3.5 내지 6.8, 또는 pH 3.5 내지 5의 범위 내이다. 생리학적 pH는 바람직하게 pH 2.5 내지 8.5, pH 4.0 내지 8.5, 또는 pH 6.0 내지 8.5의 범위 내이다. pH는 약제학적으로 허용되는 희석된 산(전형적으로 HCl) 또는 약제학적으로 허용되는 희석된 염기(전형적으로 NaOH)에 의해 조정될 수 있다.

본 발명의 액체 조성물은 적합한 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는, 페놀, m-크레졸, 벤질 알콜 및 p-하이드록시벤조산 에스테르로부터 선택될 수 있다. 바람직한 보존제는 m-크레졸이다.

본 발명의 액체 조성물은 등장성 제제를 포함할 수 있다. 적합한 등장성 제제는 글리세롤, 락토스, 소르비톨, 만니톨, 글루코스, NaCl, 칼슘 또는 마그네슘 함유 화합물, 예를 들면, CaCl₂로부터 선택될 수 있다. 글리세롤, 락토스, 소르비톨, 만니톨 및 글루코스의 농도는 100 내지 250mM의 범위 내일 수 있다. NaCl의 농도는 150mM 이하일 수 있다. 바람직한 등장성 제제는 글리세롤이다.

본 발명의 액체 조성물은 0.5㎍/mL 내지 20㎍/mL, 바람직하게는 1㎍/ml 내지 5㎍/ml의 메티오닌을 포함할 수 있다. 바람직하게, 액체 조성물은 L-메티오닌을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상은, 본원에 기술된 바와 같은 의학적 징후의 예방 및/또는 치료 방법을 나타낸다. 예를 들면, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료 방법일 수 있다.

특히, 상기 방법은, 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들면, 신경보호 및/또는 신경생성에 의한 질환-변경 반응을 유발한다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 방법의 신경보호 및 신경재생 효과에 의한 질환-변경 치료요법은 본원에 기술된 바와 같은 신경퇴행성 질환에서 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 투여에 의해 제공된다. 특히, 질환-변경 반응은, 본원에 기술된 바와 같은 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 루이체 치매, 파킨슨 질환 치매, 뇌전증, 뇌졸중, 헌팅턴 무도병, 뇌 저산소증, 다발성 경화증, 및 말초 신경병증의 치료에서 얻어질 수 있다.

본 발명의 방법에서, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 치료학적 유효량이 투여된다.

본 발명의 또 다른 양상은, 본원에 기술된 바와 같은 의학적 징후의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 조성물의 용도를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은, 본원에 기술된 바와 같은, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명된다.

도 1. (도 1a) i.p. 염수 비히클(0.9% w,v NaCl) 또는 i.p. 릭시세나타이드(2.5, 25 또는 250nmol/kg 체중) 주사 30분 후의 야생형 암컷 마우스(n=5, 평균 연령 24주)의 뇌에서 측정된 총 릭시세나타이드 농도(pmol/L). 값은 평균±S.E.M이다. ^*p<0.05, ^**p<0.01. (도 1b) i.p. 염수 비히클(0.9% w,v NaCl) 또는 i.p. 릭시세나타이드(2.5, 25 또는 250nmol/kg 체중) 주사 3시간 후의 야생형 암컷 마우스(n=5, 평균 연령 24주)의 뇌에서 측정된 총 릭시세나타이드 농도(pmol/L). 값은 평균±S.E.M이다. ^*p<0.05.
도 2. (도 2a) i.p. 염수 비히클(0.9% w,v NaCl) 또는 i.p. 리라글루타이드(2.5, 25 또는 250nmol/kg 체중) 주사 30분 후의 야생형 암컷 마우스(n=5)의 뇌에서 측정된 총 리라글루타이드 농도(pmol/L). 값은 평균±S.E.M이다. ^*p<0.05, ^**p<0.01. (도 2b) i.p. 염수 비히클(0.9% w,v NaCl) 또는 i.p. 리라글루타이드(2.5, 25 또는 250nmol/kg 체중) 주사 3시간 후의 야생형 암컷 마우스의 뇌에서 측정된 총 리라글루타이드 농도(pmol/L). 값은 평균±S.E.M이다. ^*p<0.05.
도 3. (도 3a) 분석 30분 전의 25nmol/kg bw 리라글루타이드의 ip. 주사는 대조군에 비하여 뇌에서의 cAMP의 유의한 증가를 나타냈다(p<0.05; t-검정). (도 3b) 분석 30분 전의 25nmol/kg bw 릭시세나타이드의 ip. 주사는 대조군에 비하여 뇌에서의 cAMP의 유의한 증가를 나타냈다(p<0.01; t-검정). (도 3c) 리라글루타이드의 효과를 릭시세나타이드와 직접 비교하는 경우, 약물들 사이의 유의한 차이가 발견된다(p<0.05; t-검정).
도 4. 치아 이랑에서의 세포 증식에 대한, 3주 동안의 엑센딘-4, 리라글루타이드 또는 릭시세나타이드 25nmol/kg bw. 1일 1회 주사의 효과(BrdU 염색). 값은 평균±S.E.M이다. ^*p<0.05, ^**p<0.01. 릭시세나타이드는 엑센딘-4 및 리라글루타이드(p<0.05) 및 대조군(p<0.01)에 비하여 증가된 세포 증식 활성을 나타낸다.
도 5. 3주 동안의 릭시세나타이드 ip. 1일-1회(25nmol/kg bw ip.) 만성 주사의 조직학적 분석. BrdU 면역-조직학적 분석에서, 치아 이랑 뇌 부분에서 보다 많은 세포가 발견되었다. 또한, 보다 어린 뉴런이 발견되었다(더블 코르틴 염색). 값은 평균±S.E.M이다. ^*=p<0.05, ^**=p<0.01.
도 6. (도 6a) LDH 분석. 릭시세나타이드를 이용한 SH-SY5Y 세포의 사전-치료에 이은 메틸 글리옥살 스트레스. (^***<0.0001). 10nM 용량의 릭시세나타이드는, 1200μM의 메틸 글리옥살 스트레스로부터 세포를 보호하는데 충분하였다. (도 6b) LDH 분석. 리라글루타이드를 이용한 SH-SY5Y 세포의 사전-치료에 이은 메틸 글리옥살 스트레스. ^*p<0.05, ^**p<0.001, ^***<0.0001. 200nM 용량의 리라글루타이드는, 1200μM의 메틸 글리옥살 스트레스로부터 세포를 보호하는데 충분하였다. 보다 낮은 용량의 10nM 또는 100nM은 효과를 나타내지 않았다.
도 7. 메틸 글리옥살(MG) 및 과산화수소(H₂O₂) 처리 후 릭시세나타이드 또는 리라글루타이드를 이용한 스트레스-후 치료. X-축은 각종 검정 조건을 나타내고, Y-축은 흡광도를 나타낸다. ^*=p<0.05, ^**=p<0.01. (도 7a) 릭시세나타이드 후-치료, (도 7b) 리라글루타이드 후-치료.
도 8. 릭시세나타이드 또는 리라글루타이드를 이용한 사전-치료에 이은 메틸 글리옥살(MG) 스트레스. X-축은 각종 검정 조건을 나타내고, Y-축은 흡광도를 나타낸다. ^*=p<0.05, ^***=p<0.001. (도 8a) 릭시세나타이드, (도 8b) 리라글루타이드, 및 (도 8c) 엑센딘-4의 사전-치료 효과.
도 9. 다양한 농도의 릭시세나타이드의 존재 하에 (로테논 노출에 의해 유도된 표준화된 세포 생존률 감소의 역전 백분율로서 나타내어지는) LUHMES 세포의 신경보호. 로트 = 로테논. NS = 유의하지 않음; ^* = p < 0.05; ^*** = p < 0.001.
도 10. 다양한 농도의 엑센딘-4/엑세나타이드의 존재 하에 (로테논 노출에 의해 유도된 표준화된 세포 생존률 감소의 역전 백분율로서 나타내어지는) LUHMES 세포의 신경보호. 로트 = 로테논. NS = 유의하지 않음; ^* = p < 0.05.
도 11. 다양한 농도의 리라글루타이드의 존재 하에 (로테논 노출에 의해 유도된 표준화된 세포 생존률 감소의 역전 백분율로서 나타내어지는) LUHMES 세포의 신경보호. 로트 = 로테논. NS = 유의하지 않음; ^*** = p < 0.001.
도 12. 릭시세나타이드 치료는 알츠하이머 질환 유전자전이 마우스의 뇌에서의 아밀로이드 플라크 부하를 감소시킨다. 7개월령 APP/PS1 유전자전이 마우스에서의 70일 동안의 릭시세나타이드 치료(10nmol/kg, i.p. 매일)는, 베타 아밀로이드 면역조직화학 및 뇌 피질의 단면에서 β 아밀로이드에 대해 양성인 면적 %의 측정에 의해 정량된 바와 같이 베타 아밀로이드 플라크 부하를 감소시킨다. 값은 평균 +/- S.E.M(^**p<0.01)이다.
도 13. 릭시세나타이드 치료는 알츠하이머 질환 유전자전이 마우스의 뇌에서의 아밀로이드 플라크 부하를 감소시킨다. 7개월령 APP/PS1 유전자전이 마우스(알츠하이머 질환 모델)에서의 70일 동안의 릭시세나타이드 치료(10nmol/kg, i.p. 매일)는, 콩고 레드를 이용한 조직학적 염색 및 뇌 피질의 단면에서 콩고 레드에 대해 양성인 면적 %의 측정에 의해 정량된 바와 같이 성숙 아밀로이드 플라크 부하를 감소시킨다. 값은 평균 +/- S.E.M(^*p<0.05)이다.

실시예 1

릭시세나타이드는, 전형적으로 비경구 투여되는, 펩타이드 약물이다. 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 루이체 치매, 파킨슨 질환 치매 또는 뇌졸중에 대한 활성을 유발하기 위해서, 릭시세나타이드는 혈-뇌-장벽을 통과해야만 한다. 릭시세나타이드는, 특히, 비경구 투여되는 경우에, 릭시세나타이드가 하기 특성들 중 하나 이상을 제공하는 경우, 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방에 적합하다:

(a) 릭시세나타이드는 혈뇌 장벽을 통과할 수 있고,

(b) 릭시세나타이드는 뇌에서 GLP-1 수용체를 활성화시키고, 수용체 활성화에 의해 생리학적 효과를 유도하고,

(c) 릭시세나타이드는 적합한 모델에서 질환-변경 효과를 제공하고,

(d) 릭시세나타이드는 적합한 모델에서 신경보호성이고,

(e) 릭시세나타이드는 다른 GLP-1 수용체 작용제, 예를 들면, 리라글루타이드 또는 엑세나타이드보다 더 이점을 제공한다.

뇌에 의한 릭시세나타이드 흡수

본 발명의 실시예에서, GLP-1 수용체 작용제인 릭시세나타이드가 혈-뇌-장벽(BBB)을 통과하였는지가 기술된다. 3개의 용량(2.5nmol/kg bw, 25nmol/kg bw 및 250nmol/kg bw, ip.)이 시험되었고, 주사 30분 후 및 3시간 후의 마우스 뇌 조직에서 발견되는 수준을 실험하였다. 릭시세나타이드 수준은 모든 용량으로의 전달 30분 후에 향상되었고, 또한 낮은 수준(2.5nmol/kg bw) 및 중간 수준(25nmol/kg bw) 둘 다로 검출되었지만, 250nmol/kg bw의 고용량의 릭시세나타이드는 검출되지 않았다. 이러한 차이는, 여기서 시험된 고농도의 릭시세나타이드의 유입을 제한하여, 뇌로의 릭시세나타이드의 수송이 조절됨을 시사한다(도 1).

뇌에서의 리라글루타이드 흡수와 릭시세나타이드 흡수의 비교

릭시세나타이드에 대한 상기 결과를 GLP-1 작용제, 리라글루타이드(Novo Nordisk에 의한 Victoza)에 대한 결과와 비교하였다. 상기에 논의되고 도 1 및 도2에 나타낸 바와 같이, 릭시세나타이드 수준은 2.5nmol/kg bw ip.의 최저 용량으로의 뇌에서 유의한 증가를 나타냈고, 반면에 리라글루타이드는 이 용량에서 증가를 나타내지 않았고(도 2), 이는, 릭시세나타이드가 리라글루타이드보다 낮은 농도에서 뇌에 흡수됨을 시사한다.

이러한 발견으로부터, 릭시세나타이드는, 릭시세나타이드가 리라글루타이드에 비하여 더 낮은 용량으로, 본원에 기술된 바와 같은 신경퇴행성 질환에 대한 치료학적 효과를 발휘할 수 있도록, 리라글루타이드에 비하여 더 낮은 용량의 릭시세나타이드가 혈-뇌-장벽을 통과할 것을 요구한다고 결론지어진다.

뇌에서의 GLP -1 수용체 활성화/ cAMP 의 생성

예비 연구는, 릭시세나타이드가, cAMP 수준의 향상과 연관되어 있는, 췌장 GLP-1 수용체를 활성화시킴을 밝혔다(검토를 위해, 예를 들면, Doyle et al., 2007 참조한다).

본 발명의 실시예에서, 릭시세나타이드 i.p. 주사가 뇌에서의 cAMP의 양을 증가시켰음이 처음으로 밝혀졌고, 이것은, 릭시세나타이드가 뇌에서 GLP-1 수용체를 활성화시킴을 나타낸다(도 3b). GLP-1 수용체에 대한 릭시세나타이드(25nmol/kg bw i.p.) 및 리라글루타이드(25nmol/kg bw i.p., 결과에 대해서는 도 3a를 참조한다)의 효과의 직접적인 비교는 도 3c에 나타낸다. 릭시세나타이드는 동일한 용량에서 리라글루타이드(^*=p<0.05)보다 유의하게 높은 수준의 cAMP를 생산하고, 이것은 릭시세나타이드의 보다 높은 유효성을 입증한다.

뇌에서의 릭시세나타이드의 신경생성 효과/질환-변경 효과

뉴런 선조 줄기 세포 증식에 대한, 릭시세나타이드 i.p., 엑센딘-4 i.p. 및 리라글루타이드 i.p.의 3주 동안의 만성 주사의 효과를 조사하였다. 치아 이랑에서 향상된 줄기 세포 증식이 발견되었다(BrdU 염색, 도 4 및 도 5). 놀랍게도, 릭시세나타이드는 엑센딘-4 또는 리라글루타이드와 비교하는 경우에 유의하게 향상된 세포 증식을 가졌고(^*=p<0.05), 이것은, 동일한 용량으로 주사되는 경우 엑센딘-4 및 리라글루타이드보다 릭시세나타이드가 뇌에서 더 유효함을 나타낸다.

또한, 치아 이랑에서의 어린 뉴런의 수는, 리라글루타이드와 비교하는 경우에 릭시세나타이드 주사 후에 증가하였고(더블 코르틴 염색, 데이터 나타내지 않음), 이것은, 선조 세포가 뉴런으로 분화함을 나타낸다. 이는, 릭시세나타이드가 지속적인 향상을 유도함을 입증한다.

줄기 세포에 대한 릭시세나타이드의 이러한 효과(증식 및 분화)는 뇌 회복(repair)을 위한 중요한 양상이어서, 이들 효과는 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 및 뇌졸중에서 질환-변경 효과를 제공할 수 있다.

뇌에서의 릭시세나타이드의 신경보호 효과

뉴런 세포 배양 연구에서, 릭시세나타이드는, 릭시세나타이드가 세포 스트레스 상태에서 신경보호 효과를 갖는지를 조사하기 위해서 시험되었다. 독성 약물 메틸 글리옥살을 사용하여 세포 생존률을 감소시켰다. 릭시세나타이드의 첨가는, 최저 농도의 메틸 글리옥살을 이용하여 모든 용량에서 100% 보호를 제공하고, 시험된 최고 농도의 메틸 글리옥살로도 보호를 유지하여, 용량-의존적 방식으로 신경보호 효과를 나타냈다(도 6a). 10nM 용량의 릭시세나타이드는, 1200μM의 메틸 글리옥살 스트레스로부터 세포를 보호하는데 충분하였다.

또한, 릭시세나타이드는 리타글루타이드와 비교하여 우수한 보호를 나타냈다. 도 6b에서, 리라글루타이드는 10nM의 용량으로 세포를 보호할 수 없었음이 밝혀진다. 1200μM의 메틸 글리옥살 스트레스로부터 세포를 보호하기 위해서, 200nM 용량의 리라글루타이드가 요구되었고, 10 또는 100nM의 보다 낮은 용량은 효과를 나타내지 않았다.

재료 및 방법

뇌에서의 cAMP 의 측정

동물

그룹당 5마리의 암컷 야생형(C57BL/6 백그라운드) 마우스를 사용하였다. cAMP 측정을 위해, 2회의 별개의 실험으로, 마우스에 25nmol/kg 체중(bw)의 리라글루타이드, 릭시세나타이드, 또는 대조군으로서의 염수(0.9% w.v.)를 i.p. 주사하였다. 주사 30분 후, 마우스 뇌를 즉시 제거하였고, 즉각 동결시켰다.

cAMP 의 조직 추출

0.1M HCl을 이용하여 각각의 뇌를 추출하였다. 조직 g당 10ml의 0.1M HCl을 첨가하였다. 샘플을 초음파처리하였고, 이어서, 4℃에서 15분 동안 10,000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 따라 내어 직접 cAMP ELISA 키트(Enzo Life Sciences)에 의한 측정에 직접 사용하였다. 키트에 제공된 0.1M HCl을 이용하여 희석을 수행하였다.

면역조직화학

펜토바르비톤(0.3ML; Euthanal, Bayer AG, Leverkusen, Germany)을 이용하여 마취하기 18시간 전에 동물에게 BrdU(180mg/kg bw; i.p.)를 투여하였고, PBS에 이어서 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 경심 관류(perfused transcardially)하였다. 뇌를 제거하여 PBS 중의 30% 슈크로스에 밤새 넣어 두었다. BrdU 또는 더블 코르틴(DCX)에 대한 면역조직화학은 45㎛의 자유 부유 절편(free floating section)에 대해 수행되었다. 내생적 퍼옥시다제 활성은, 3%의 과산화수소에서의 절편의 항온처리에 의해 켄칭되었다. DNA의 변성은 2N HCl에 이어서 0.1M의 붕사에서의 10분 동안의 항온처리와 관련되었다. 절편을, BrdU(1:200, 마우스 모노클로날 항-BrdU, Sigma)에 대한, 또는 DCX 염소 폴리클로날 항-더블 코르틴(1:200, Santa Cruz, USA, sc-710)에 대한 1차 항체 중에서 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어서, 2차 항체(1:200, 말 항-마우스, Vector elite ABC 키트, 마우스, Vector laboratories)를 가하였다. 절편을 아비딘 비오틴 효소 시약에서 항온처리하였고, Vector SG 기질 크로모겐에서 항온처리하였다(상세 설명을 위해서는 Gengler et al. 2010을 참조한다).

현미경

Olympus CX 40 현미경을 이용하여, 입체학적 기술을 이용하여, 절편을 분석하였다. 이것은, 치아 이랑(DG)의 과립 세포층(GCL)에 걸쳐 무작위 절편화를 시작하는 것과 5번째 절편마다 수집하는 것에 관여한다. 40배 대물렌즈를 이용하여 분석을 수행하였고, 대표 화상은 5.1MPix 디지털 카메라를 이용하여 촬영하였다. 각각의 약물 그룹에 대해, 4 내지 6마리의 마우스 뇌를 분석하였다. 각각의 뇌로부터 8 내지 12개의 절편을 취하였다. 분석된 뇌 영역은 -1.3 내지 -2.5mm 브레그마(bregma) 범위였다. DG에서의 모든 양성 세포를 ImageJ 소프트웨어(NIH의 프리웨어, http://rsbweb.nih.govl/ij/)를 이용하여 계수하였다. GCL에서, BrdU 또는 DCX에 대해 양성인 세포를 계수하였다.

SH - SY5Y 세포주

SH-SY5Y는, 4년령 암컷에서 전이성 신경아세포종 부위의 골수 생검으로부터 1970년에 확립되었던 3회-클로닝된 사람 신경아세포종 세포주이다. 이들 세포는, 도파민 베타 가수분해효소 활성, 아세틸콜린 작용성, 글루타메이트 작용성 및 아데노신 작용성이다. SH-SY5Y 세포는, 부유 세포 및 부착 세포의 혼합물뿐만 아니라, 다중의 단기의 미세 세포 프로세스를 갖는 신경아세포의 클러스터 형태로서 성장한다. 레티노산 및 콜레스테롤 처리는 세포가 수지상으로 성장하고 분화되도록 할 수 있다.

릭시세나타이드 또는 리라글루타이드를 이용한 SH-SY5Y 세포의 사전-치료에 이은 메틸 글리옥살 스트레스

SH-SY5Y 세포는, 10% 가열 불활성화된(56℃에서 20분 동안 가열됨) 소 태아 혈청 및 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된, F12(1:1) 및 Glutamax를 갖는 둘베코 최소 필수 배지에서 배양되었고, 습윤 5% CO₂, 37℃ 항온처리기에서 항온처리되었다. 세포를 80% 컨플루언시(confluency)로 트립신처리하였고, 트리판 블루 배제 방법(Countess, Invitrogen)에 의해 세포를 계수한 후, 2 x 10⁴ 세포를 라미닌(Laminin) 코팅된 96-웰 플레이트(Nunc, Inc)에 95% 세포 생존률로 플레이팅하였다. 세포 부착 12시간 후, 세포를 10nM, 100nM 및 200nM와 같이 다양한 용량에서 릭시세나타이드 또는 리라글루타이드로 사전-치료하였고, 이어서, 300μM, 600μM 및 1200μM의 농도에서 혈청 불포함 배지 중의 메틸 글리옥살 스트레스원을 첨가하였다(도 6a 및 도 6b). 데이터는 PRISM 5.0C(GraphPad Software, Inc.)에 의해 분석되었고, 유의성은 0,05 이항의 p 값으로서 정의되었다.

과산화수소 스트레스를 받은 SH-SY5Y 세포에 대한 릭시세나타이드 또는 리라글루타이드 사전-치료의 효과

세포를 10nM 및 100nM 리라글루타이드 또는 릭시세나타이드로 사전-치료하였고, 이어서, 200μM, 400μM 및 800μM의 농도로 혈정 불포함 배지 중의 과산화수소 스트레스원을 첨가하였다.

LDH 검정

세포 배양 배지는 민감성 락테이트-데하이드로게나제(LDH) 검정(Sigma에 의함)을 이용하여 분석했다. LDH 검정은 총 세포질 LDH를 통해 또는 배지에 방출된 세포질 LDH의 양의 기능으로서의 막 무결성(membrane integrity)에 의해 사멸 세포수의 측정값을 제공한다. 방출된 LDH의 측정은 LDH의 작용에 의한 NAD의 감소에 근거한다. 얻어진 감소된 NAD(NADH)는 테트라졸륨 염료의 화학량론적 전환에 사용된다. 최종 착색된 화합물은 비색법에 의해 측정된다.

요약

본 실시예의 데이터는, 릭시세나타이드가 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 진행성 해상 마비, 다계통 위축증, 루이체 치매, 파킨슨 질환 치매, 또는 뇌졸중의 치료 및/또는 예방에 적합함을 입증한다. 또한, 릭시세나타이드는, 둘 모두 현재 2형 당뇨병을 위한 치료제로서 사용되고 있는 GLP-1 유사체 리라글루타이드 및 엑센딘-4에 비해 우수한 특성을 갖는다.

특히, 본 실시예의 데이터는 하기를 입증한다:

(e) 놀랍게도, 릭시세나타이드의 10nM 용량을 이용한 사전-치료가 SH-SY5Y 신경아세포종 세포를 1200μM의 메틸 글리옥살 스트레스로부터 보호하는데 충분하였다. 세포를 1200μM의 메틸 글리옥살 스트레스로부터 보호하는데 리라글루타이드는 200nM 용량이 필요하였고, 이것은, 릭시세나타이드의 보다 낮은 용량이 보호를 유도하는데 충분함을 나타내는 것이다.

실시예 2

메틸 글리옥살(MG) 및 과산화수소(H ₂ O ₂ ) 처리 후 릭시세나타이드 또는 리라글루타이드를 이용한 스트레스-후 치료

SHSY-5Y 세포를 96웰 플레이트에 식종하였고, 12시간의 혈청 절식(serum starvation) 후에 600mM 및 1mM의 H₂O₂, 그리고 1mM 및 2mM의 MG를 이용하여 3시간 동안 스트레스를 주었다. 이 세포를 0, 1, 10, 50 및 100nM의 릭시세나타이드, 그리고 0, 10, 50, 100 및 200nM의 리라글루타이드를 이용하여 치료하였다. 24시간 후, 50μL의 XTT 시약을 첨가하였고, 8시간 동안 항온처리하였다. 검정 체적은 100μL였다.

도 7은, 릭시세나타이드를 이용한 후-치료가 MG 또는 H₂O₂를 이용한 스트레스 후의 생존 세포의 수를 용량-의존적 방식으로 유의하게 증가시켰음을 입증한다(특히, 도 7a에서 600μM의 H₂O₂ 및 2mM의 MG를 이용하여 얻어진 데이터들을 참조한다). 리라글루타이드는 세포를 MG 또는 H₂O₂에 의한 스트레스로부터 보호하지 않았다(도 7b).

릭시세나타이드 또는 리라글루타이드를 이용한 사전-치료에 이은 메틸 글리옥살(MG) 스트레스

SHSY-5Y 세포를 96웰 플레이트에 식종하였고, 12시간의 혈청 절식(serum starvation) 후에, 0, 1, 10, 50 및 100nM의 릭시세나타이드, 그리고 0, 10, 50, 100 및 200nM의 리라글루타이드 및 엑센딘-4를 이용하여 4시간 동안 치료하였고, 그 후에, 400μM 및 600μM의 MG를 이용하여 14시간 동안 스트레스를 주었다. 50μL의 XTT 시약을 첨가하였고, 8시간 동안 항온처리하였다.

도 8은, MG 또는 H₂O₂를 이용한 스트레스 전의 릭시세나타이드를 이용한 사전-치료가 생존 세포의 수를, 1nM의 최저 용량으로 시작하여 50nM에서 최상의 결과를 갖는 용량-의존적 방식으로 유의하게 증가시켰음을 입증한다(도 8a). 또한, 리라글루타이드도 세포를 보호하였지만, 100nM의 보다 높은 용량에서만 보호하였다(도 8b). 엑센딘-4는 MG 또는 H₂O₂에 의한 스트레스로부터 세포를 보호하지 않았다(도 8c).

재료 및 방법

스트레스원으로서 메틸 글리옥살을 이용한 SHSY-5Y 세포로의 사전-치료 검정

1. SHSY-5Y 세포는, 10% FBS(Cat No. 10437, Invitrogen Inc.) 및 1% Penn Strep(Cat No. 15070063, Invitrogen Inc.)을 갖는 DMEM+F12 Glutamax 배지(Cat No. 313310, Invitrogen Inc.)에 유지되었다.

2. 80 내지 90% 컨플루언트 배양액을 0.25x 트립신 EDTA 용액을 이용하여 트립신 처리하였고, 사전에 CO₂ 항온처리기 내의 37℃에서 2시간 동안 1㎍/㎠의 농도로 라미닌(L2020, Sigma)으로 코팅하고 멸균 재증류수로 2회 세척한, 96웰 플레이트(Cat No. 55301, Orange Scientific)에 식종하였다.

3. 12 내지 15시간 후, 다음 12시간 동안, 10% FBS 함유 배지로부터 혈정 불포함 배지(SFM)로 배지를 교환하였다.

4. 세포를 인크레틴(incretin)으로 4시간 동안 사전-치료하였고, 검정은 다양한 농도의 150ml 체적 포맷에서 수행하였고, 신선한 SFM을 대조군에 각각 4시간 동안 첨가하였다.

5. 웰을 1x HBSS 및 150μl의 600μM 메틸 글리옥살(Cat No. M0252, Sigma)로 세척하였고, SFM을 시험 웰 및 대조군에 각각 12시간 동안 첨가하였다.

6. 상청액을 수집하여 LDH 검정을 수행하였고, -20℃에 저장하였다.

7. 75μl의 XTT 용액(Cat No. 11465015001, Roche Inc.)(커플링 시약 함유)을 나머지 세포에 첨가하였고, 37℃에서 4시간 동안 항온처리하였다. 검정은, 흡광도 측정에 의해 결정될 수 있는, 착색된 화합물에 대한 테트라졸륨염 XTT를 감소시키는 대사 활성 세포의 능력에 근거한다. 증가된 흡광도는 대사 활성 세포의 증가된 수를 나타낸다.

8. 흡광도는, 각각의 웰에 대해 492nm 및 690nm에서 측정하고 A₄₉₂에서 A₆₉₀을 뺄셈함으로써 얻어졌다.

9. LDH(Cat No. G1780, Promega) 검정을 위해, 50μl의 상청액을 50μl의 기질과 함께 96웰 플레이트에 첨가하였고, 실온에서 60분 동안 암실에서 항온처리하였다.

10. 50μl의 정지 용액을 첨가하였고, 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

11. XTT 및 LDH 검정에 대한 데이터는 Prism V를 이용하여 분석하였다.

요약

실시예 2의 데이터는, 릭시세나타이드가 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 진행성 해상 마비, 다계통 위축증, 루이체 치매, 파킨슨 질환 치매, 또는 뇌졸중의 치료 및/또는 예방에 적합함을 입증한다. 또한, 릭시세나타이드는 GLP-1 유사체 리라글루타이드 및 엑세나타이드에 비하여 우수한 특성을 갖는다.

10nM 용량의 릭시세나타이드를 이용한 사전-치료는 SH-SY5Y 신경아세포종 세포를 600μM 메틸 글리옥살 스트레스로부터 보호하는데 충분하였다. 100nM 내지 200nM 용량의 리라글루타이드는 세포를 600μM 메틸 글리옥살 스트레스로부터 보호하는데 충분하였고, 이는 보다 낮은 용량의 릭시세나타이드가 보호를 유도하는데 충분함을 나타낸다. 따라서, 릭시세나타이드는 상기 나타낸 바와 같은 질환의 예방에 적합하다. 이들 데이터는 실시예 1에서 얻어진 데이터와 일치하고(도 6a 및 도 6b), 이는, 릭시세나타이드가 리라글루타이드와 비교하여 SH-SY5Y 신경아세포종 세포에서 (세포 스트레스에 대해) 우수한 신경보호 효과를 나타냈음을 입증한다.

또한, 릭시세나타이드를 이용한 후-치료는 SH-SY5Y 신경아세포종 세포를 2mM 메틸 글리옥살 스트레스 또는 1mM H₂O₂ 스트레스로부터 보호하는데 충분하였다. 대조적으로, 리라글루타이드는 세포를 MG 또는 H₂O₂에 의한 스트레스로부터 보호하지 않았다.

실시예 3

글루카곤-유사 펩타이드-1 수용체(GLP-1R) 작용제 릭시세나타이드를 이용한 치료는 로테논 독성에 대해 사람 뉴런 세포를 보호한다.

본 실시예에서, 세포 모델에서의 신경보호 실험이 기술되고, 이는 파킨슨 질환, 파킨슨 질환 치매, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 및 루이체 치매의 치료에서의 릭시세나타이드의 사용을 지지한다. 본 실시예는, 릭시세나타이드가 파킨슨 질환, 파킨슨 질환 치매, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 및 루이체 치매에서 취약한 뉴런을 보호함으로써, 이러한 질환의 진행을 서행시키거나, 제동하거나, 또는 역전시킬 수 있음을 입증한다. 이들 질환은, 신경 전달 물질로서 도파민을 이용하는 뉴런의 상실과 관련된다.

본 실시예는, 룬드 사람 중뇌 뉴런(Lund Human Mesencephalic neuron)(LUHMES 세포)이라고 칭하는, 자연에서 도파민 작용성으로 존재하는 사람 세포주를 이용한 시험관내 배양 검정을 나타낸다. 이들 세포는 문헌[Lotharius et al. (2002)]에 기술된다. 이들 세포로부터의 배양액은, 도파민작용성 세포를 사멸시키고 사람에게의 우연한 노출 또는 환경적 노출시 파킨슨 질환과 관련되는 것으로 알려져 있는 로테논에 시험관내 노출되었다. 로테논의 파킨슨 질환과의 연합은 문헌[Sherer et al., 2003 및 Tanner et al., 2011]에 기술되어 있다. 로테논은, 도파민-생성 뉴런을 사멸시켜 사람 파킨슨 질환의 주요 특성을 실험적으로 재생성시킴으로써 파킨슨 증상을 야기할 수 있다.

본 실시예에서, 글루카곤-유사 펩타이드-1 수용체(GLP-1R) 작용제 릭시세나타이드는, 로테논에 의해 유도된 신경퇴행에 대해 LUHMES 세포에서 유의한 신경보호 효과를 나타낸다(도 9). 릭시세나타이드는 다른 GLP-1 수용체(GLP-1R) 작용제와 비교하여 이점을 제공한다. LUHMES 세포에서 로테논에 대한 릭시세타나이드의 신경보호 효과는, 리라글루타이드보다 3배 더 낮은 농도에서 유의하게 활성이고(도 9 및 도 11), 이 결과는 실시예 1의 메틸 글리옥살 모델에서 이전에 보여진 릭시세나타이드의 예상하지 못한 우수한 활성 효과에 조력한다.

엑세나타이드는 0.3μM 및 1μM의 농도에서 향상된 생존률을 유도하지 않는다. 대조적으로, 릭시세나타이드는 이들 농도에서의 생존률의 유의한 향상을 제공한다(도 9 및 도 10).

재료 및 방법

로테논에 대한 신경보호를 평가하기 위해, 표준 세포-배양 배지에서 95% 습윤 공기, 5% CO₂ 대기의 37℃에서 LUHMES 세포를 성장시켰다. 플라스틱 플라스크에서의 배양 2일 후, 성장 인자를 함유하는 분화 배지를 첨가하였고, 세포를 추가의 2일 동안 항온처리하였다. 세포는 해리되었고, 세포를 코팅된 다중-웰 플레이트에 식종하였고, 신선한 분화 배지를 추가의 4일 동안 첨가하였다. 분화 6일째, 로테논(0.75μM)으로의 치료 전에, 세포를 각종 농도의 릭시세나타이드, 엑세나타이드(엑센딘-4) 또는 리라글루타이드로 1시간 동안 치료하였다. 72시간 후에 레자주린-기반 검정, 세포 산화-환원을 통해 형광 생성물을 생성하는 대사적으로 활성인 세포의 지표를 이용하여 신경보호를 측정하였다. 생성되는 형광물질은 배양액 중의 생세포의 수에 비례하고, 따라서, 치료에 의해 제공되는 뉴런 LUHMES 세포의 보호 정도를 측정한다. n=12 측정으로부터의 데이터를 로테논 부재의 대조군에 관한 세포 생존률 판독의 정규화에 따라 비교하였다. 실험 그룹 사이의 통계학적 비교를 위해 일원 변량 분석(one-way analysis of variance)에 이은 던네트(Dunnett) 시험을 사용하였다. 0.05 미만의 p 값은 유의한 것으로 여겨졌고, 그래프에 하기와 같이 별표로 나타냈다: ^*=p<0.05; ^**=p<0.01; ^***=p<0.001; NS=유의하지 않음. 신경보호는 로테논에 의해 유도된 생존률 감소의 역전 백분율로서 나타냈다.

요약

실시예 3의 데이터는, 릭시세나타이드가 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 파킨슨 질환, 진행성 핵상 마비(PSP), 다계통 위축증(MSA), 루이체 치매, 파킨슨 질환 치매 또는 뇌졸중의 치료 및/또는 예방에 적합함을 입증한다. 또한, 릭시세나타이드는 GLP-1 유사체 리라글루타이드에 그리고 엑센딘-4에 비하여 우수한 특성을 갖는다.

본 실시예에서, 릭시세나타이드는, 로테논에 의해 유도된 신경퇴행에 대해 LUHMES 세포에서 유의한 신경보호 효과를 나타낸다(도 9). 릭시세나타이드는 다른 GLP-1 수용체(GLP-1R) 작용제와 비교하여 이점을 제공한다. 로테논 처리된 LUHMES 세포에서, 릭시세나타이드는 리라글루타이드보다 3배 더 낮은 농도에서 유의하게 활성이다. 엑세나타이드는 0.3μM 및 1μM의 농도에서, 유의한 효과는 관찰되지 않을 수 있다. 대조적으로, 릭시세나타이드는 이들 농도에서의 생존률의 용량-의존적 향상을 제공한다.

실시예 4: APP _swe /PS1 _ΔE9 유전자전이 마우스에서의 릭시세나타이드의 효과

신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환의 치료에 대한 릭시세나타이드의 이익을 추가로 입증하기 위해서, 본 실시예에서, 뇌에 아밀로이드 플라크를 가지고 있는 유전자전이 마우스에서의 릭시세나타이드 치료의 효과를 기술한다. APPswe/PS1_Δ _E9 유전자전이 마우스는 아밀로이드 뇌 병리를 나타내는 알츠하이머 질환의 잘 특성확인된 모델이다. 릭시세나타이드 치료(10nmol/kg, i.p., 매일)는 7개월령 APP/PS1 유전자전이 마우스에서 아밀로이드 플라크가 뇌에서 이미 발병되었을 때의 연령에 개시하여 70일 동안 지속하였다.

유전자전이 동물

C57BI/6 백그라운드를 갖는 APP_swe/PS1_ΔE9 마우스를 Jackson lab(http://research.jax.org/repository/alzheimers.html)으로부터 입수하였다. 이형접합 수컷을 근처(Harlan, UK)에서 구입한 야생형 C57/BI6 암컷과 함께 사육하였다. 새끼를 귀새김(ear punch)하였고, APP-서열(전방: "GAATTCCGACATGACTCAGG, 서열번호 4", 후방: "GTTCTGCTGCATCTTGGACA, 서열번호 5")에 특이적인 프라이머로의 PCR을 이용하여 유전자형화(genotyped)하였다. 전이유전자를 발현하지 않는 마우스를 야생형 대조군으로서 사용하였다. 모든 연구에서 수컷 동물을 사용하였다. 동물을 개별적으로 가두었고, 온도-제어실(T:21.5℃±1)에서 12/12 명-암 사이클(빛을 08h00에 켜고 20h00에 끔)을 유지하였다. 음식 및 물은 임의로 이용가능하였다. 동물은 연구의 시작 2주 전에 매일 취급하였다.

릭시세나타이드를 이용한 치료

치료가 시작되었을 때 마우스는 7개월령이었다. 이 때, 마우스는 이미 아밀로이드 뇌 병리를 나타냈다. 마우스에게 릭시세나타이드(10nmol/kg 체중) 또는 염수(0.9% w/v)를 70일 동안 1일 1회 복강내(i.p.) 주사하였다. 실험은 1986년의 동물법(과학적 절차)에 따라 UK 내무부에 의해 허가되었다.

릭시세나타이드는 사노피(Sanofi)에 의해 공급되었다. 동결건조된 펩타이드를 Milli-Q 물에서 1mg/ml의 농도로 재구성하였다. 분취량을 동결기에 저장하였고, 주사를 위해 0.9% 염수에서 재구성하였다.

조직학적 제제

동물은, PBS 완충액에 이어서 매우 차가운 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 경심 관류하였다. 뇌를 제거하였고, 30% 슈크로스 용액에 밤새 이동시키기 적어도 24시간 전에 4% 파라포름알데하이드에 고정시켰다. 이어서, Envirofreeze^TM을 이용하여 뇌를 즉각 동결시켰고, Leica 크라이오스탯(cryostat)을 이용하여 -2 내지 -3 Bregma의 깊이로 40-미크론 두께의 관상 절편을 잘라냈다. 무작위로 처음 절편을 취하고 그 후로 6번째 절편마다 취하는 입체학적 규칙에 따라 절편을 선택하였다.

표준 방법(상세 설명을 위해 McClean et al. 2011 참조)을 이용하여, 토끼 폴리클로날 항 아밀로이드 베타 펩타이드(1:200, Invitrogen, UK, 71-5800)를 이용하여 베타 아밀로이드를 염색시켰고, 콩고 레드를 이용하여 중핵 플라크를 염색시켰다. 절편당 2매의 피질 화상을 촬영(10배 대물렌즈 이용)함으로써 베타 아밀로이드 및 콩고 레드를 분석하였다(뇌당 7 내지 10 절편을 가짐; 릭시세나타이드 10nmol/kg bw에 대해 n=6, 염수에 대해 n=12). 모든 염색은 Axio Scope 1(Zeiss, Germany)에 의해 가시화되었고, Image J(NIH, USA)로의 다중 스레시홀드 플러그-인(multi threshold plug-in)을 이용하여 분석하였다.

결과

치료 개시시에 이미 아밀로이드 뇌 병리를 가지고 있는 APP_swe/PS1_ΔE9 유전자전이 마우스에서, 70일 동안의 릭시세나타이드 치료는, 염수-치료된 마우스와 비교하여, 베타 아밀로이드 면역반응성 62%(p<0.0039, 반복 측정 t-시험)로 측정된 바와 같이, 베타 아밀로이드 플라크 부하의 감소로 이어진다(도 12).

유사하게, 릭시세나타이드 치료는, 각각의 염수-치료된 APP/PS1 마우스에 비교하여, 콩고 레드 조직학적 염색에 의해 52%로 정량된 바와 같이, 중핵 아밀로이드 플라크 부하를 감소시켰다(도 13).

리라글루타이드에 대해 이전에 기술된 용량보다 저용량(10nmol/kg)에서 활성을 관찰하였다(25nmol/kg, McClean et al 2011).

요약

2개의 독립적 기술을 이용한 이들 데이터는, 릭시세나타이드가 알츠하이머 질환의 동물 모델에서 뇌 아밀로이드 병리를 감소시킬 수 있음을 입증한다. 데이터는, 릭시세나타이드가 뇌아밀로이드 플라크 병리를 감소시킴으로써 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환의 치료 및/또는 예방에 적합함을 입증한다. 따라서, 릭시세나타이드의 신경보호 특성 이외에도, 릭시세나타이드는 병리학적 병변, 예를 들면, 아밀로이드 플라크를 감소시킬 수 있고, 따라서, 알츠하이머 질환에 대한 매력적인 치료 및/또는 예방을 나타낸다. 또한, 실시예 1의 데이터로부터 예측되는 바와 같이, GLP-1 유사체 리라글루타이드에 대해 이전에 기술된 용량보다 낮은 용량에서 활성이 달성된다.

참조문헌

SEQUENCE LISTING <110> SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH UNIVERSITY OF ULSTER <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR USE IN THE TREATMENT OF A NEURODEGENERATIVE DISEASE <130> 51246PWO <150> EP 11179784.1 <151> 2011-09-01 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> desPro36-Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2 <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GLP-1(7-36) <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> forward primer <400> 4 gaattccgac atgactcagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> reverse primer <400> 5 gttctgctgc atcttggaca 20

Claims

desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트(adjuvant), 및/또는 보조 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 비경구 투여용으로 제조되는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이, 산화 스트레스, 신경돌기 무결성의 상실, 아폽토시스, 뉴런 상실 및/또는 염증 반응을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 인지 손상과 관련되는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 진행성 핵상 마비(PSP: progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(MSA: multiple system atrophy), 루이체 치매(Lewy body dementia), 파킨슨 질환 치매 뇌전증, 뇌졸중, 헌팅턴 무도병, 뇌 저산소증, 다발성 경화증, 및 말초 신경병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 말초 신경병증이 진성 당뇨병과 관련되는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이, 알츠하이머 질한, 파킨슨 질환, 및 뇌졸중으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 알츠하이머 질환이 초기-단계 알츠하이머 질환인, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 파킨슨 질환이 초기-단계 파킨슨 질환인, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 desPro³⁶엑센딘-4(1-39)-Lys₆-NH₂ 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이, 10㎍ 내지 20㎍의 범위로부터 선택되는 1일 용량으로 투여하기 위해 제조되는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료 방법.
제11항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 및 뇌졸중으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 조성물이 질환-변경(disease-modifying) 반응을 유발하는, 방법.