KR101309770B1 - 인슐린―올리고머 접합체，제형 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 양이온 및 인슐린 화합물 접합체를 포함하는 착물을 제공한다. 상기 인슐린 화합물 접합체는, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티와 같은 변형 모이어티에 접합되는, 인간 인슐린 또는 이것의 유사체와 같은 인슐린 화합물을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 착물을 포함하는 고체 및 약학 조성물, 상기 착물을 제조하는 방법, 및 인슐린 화합물 결핍 및 다른 질병의 치료에서 상기 착물을 이용하는 방법을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 신규한 인슐린 화합물 접합체 및 신규한 인슐린 화합물 접합체를 이용하기 위한 변형 모이어티를 포함한다. 본 발명은 또한 신규한 인슐린 화합물 접합체와 같은 약학제의 투여를 위한 지방산 조성물, 및/또는 본 발명의 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물을 제공한다.
인슐린, 올리고머, 접합체

Description

인슐린―올리고머 접합체，제형 및 이들의 용도{Insulin-Oligomer Conjugates, Formulations and Uses Thereof}
1. 관련출원
본 출원은 2004년 7월 19일자로 출원된 미국특허출원 제60/589,058호, 2004년 10월 15일자로 출원된 미국특허출원 제60/619,153호, 2004년 12월 2일자로 출원된 미국특허출원 제60/632,578호, 및 2005년 2월 24일자로 출원된 미국특허출원 제60/655,838호, 및 2005년 2월 24일자로 출원된 미국특허출원 제60/655,803호의 전문을 우선권 주장하고, 참조로서 포함한다. 이와 함께, Radhakrishnan 등에 의해 2005년 7월 19일자로 출원된 아래의 출원들을 참조로서 포함한다: 미국특허출원 제11/184,668호, "Cation complexes of insulin compound conjugates, formulations and uses thereof"; 미국특허출원 제11/184,594호, "Insulin-oligomer compound conjugates, formulations and uses thereof"; 미국특허출원 제11/184,528호, "Fatty acid formulations for oral delivery of proteins and peptides, and uses thereof".
2. 분야
본 발명은 인슐린 또는 인슐린 유사체가 변형 모이어티와 결합하는 신규한 인슐린 화합물 접합체에 관한 것이다. 상기 발명은 또한 상기 인슐린 화합물 접합체의 양이온 착물 및 상기 인슐린 화합물 접합체 및/또는 변형 모이어티를 포함하는 약학 제형에 관한 것이다.
3. 배경
아연(zinc) 착물화 인슐린 화합물은, 예를 들어, 상표명 HUMULIN® 및 HUMALOG® 으로 상업적으로 이용할 수 있다. 아연 착물화 인슐린은 통상적으로 육각형태 (hexameric form)로 존재한다.
아실화 인슐린의 결정화에서 아연의 용도에 대해 다양한 방법이 기술하여 왔다. 예를 들어, 2001년 11월 15일자로 공개된, Mark L. Brader et al .의 미국 특허공개 20010041786, "Stabilized acylated insulin formulations"는 pH 7.1 내지 7.6에서 지방산-아실화 인슐린 또는 지방산-아실화 인슐린 유사체를 함유하고 아연 및 바람직하게는 페놀 화합물(phenolic compound)을 이용하여 안정화된, 비경구 전달용 수성 용액에 대한 제형, 특히 주사용 제형을 기술하고 있다. Schaffer et al .로부터 Novo Nordisk A/S로 양도된, 2002년 12월 17일자로 공고된 미국특허 6,451,970, "Peptide derivatives"는 인슐린 화합물 및 인슐린 유사체의 유도체(derivatives)를 설명하며, 여기서 B-사슬의 N-말단 아미노기 및/또는 B28, B29 또는 B30 위치에서 Lys의 이-아미노기(e-amino group)는 12~22 탄소원자를 가지는 긴사슬 탄화수소(hydrocarbon) 그룹 및 이것의 아연착물을 이용하여 아실화된다.
프로타민(protamines) 및 페놀 화합물(phenolic compounds)은 아실화 인슐린의 결정화에서의 사용에 대하여 설명되어왔다. 발명의 명칭이 모두 "Insoluble insulin compositions"인, Brader의 미국특허 6,268,335(2001년 7월 31일) 및 6,465,426(2002년 10월 10일)은 아실화 인슐린, 프로타민 착물화 화합물(protamine complexing compound), 헥사머-안정화 페놀 화합물(hexamer-stabilizing phenolic compound), 및 2가의 금속 양이온(divalent metal cation)으로 구성되는 불용성 조성물을 설명한다.
현재의 접근법은 특히 천연 인슐린 화합물 또는 인슐린 화합물 유사체의 결정화 또는, 비-아실화 인슐린 화합물에 비하여 증가된 지질 친화도를 가지는 아실화 인슐린 화합물에 맞추어져 있다. 당해 기술분야에서, 아실화 인슐린 화합물 이외에 친수성 및/또는 양친매성 인슐린 화합물 유도체와 같은 유도 인슐린 화합물을 포함하는 약학적으로 허용가능한 착물, 및 비-아실화 친유성 인슐린 화합물 유사체의 안정화에 대한 요구가 있다. 또한 당해 기술분야에서, 현존하는 접합체에 비하여 증가된 생체이용률 또는 다른 개선된 약학적 속성을 가지는 새로운 단백질 접합체에 대한 요구가 있다. 당해 기술분야에서, 단백질 및 단백질 접합체의 경구 전달을 용이하게 하는 새로 제형에 대한 요구가 있다. 마지막으로, 인슐린 화합물과 같은 단백질의 경구 생체 이용률을 개선하는 복합적인 접근에 대한 요구가 있으며, 이 요구는 단백질의 경구 전달(delivery)에 대한 편의를 최대화하기 위해 개선된 제형에서 고체로서 제공되는 개선된 경구 단백질 접합체를 포함한다.
4. 발명의 요약
일반적으로, 본 발명은 변형 모이어티에 접합하는 인슐린 화합물을 가지는 인슈린 화합물 접합체, 및 양이온을 포함하는 착물을 제공하고 이때, 상기 인슐린 화합물 접합체는 상기 양이온으로 착화된다. 예를 들어, 상기 인슐린 화합물은 천연 인슐린 또는 인슐린 유사체일 수도 있다. 인슐린 화합물의 예는 인간 인슐린, 라이스프로 인슐린(lyspro insulin), 데스30(des30) 인슐린, 천연 프로인슐린(native proinsulin), 인공 프로인슐린(artificial proinsulins) 등을 포함한다. 예를 들어, 상기 양이온 성분은 Zn++, Mn++, Ca++, Fe++, Ni++, Cu++, Co++ 및 Mg++으로 구성된 군에서 선택되는 2가의 금속 양이온일 수도 있다.
상기 변형 모이어티는 인슐린 화합물 접합체가 상응하는 비접합 인슐린 화합물과 비교하여 보다 많게(more), 보다 적게(less) 또는 동일하게(equally) 용해성이 되도록 선택될 수도 있다. 상기 변형 모이어티는 바람직하게는 상기 인슐린 화합물 접합체가 pH 약 7.4의 수용액 내에서 상응하는 비접합 인슐린 화합물 보다 적어도 1.05, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 또는 15배 보다 더 용해성이 되도록 선택된다. 바람직하게는 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 접합체가 pH 약 7.4에서 약 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L, 125 g/L, 또는 150 g/L를 초과하는 수용해도를 가지도록 선택된다. 또한, 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 접합체가 상응하는 비접합 인슐린 화합물과 동일하거나 또는 보다 더 용해성이 되도록 선택되고, 상기 인슐린 화합물 접합체의 수용해도는 아연의 첨가에 의해 감소한다. 다른 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 접합체가 상응하는 비접합 인슐린 화합물과 동일하거나 또는 보다 더 용해성이 되도록 선택되고; 및 상기 착물의 수용해도는 인슐린 화합물의 수용해도 보다 크다. 또 다른 구현예에서, 상응하는 모 인슐린 화합물(parent insulin compound)과 비교하여 상기 인슐린 화합물 접합체의 상대적인 지질 친화도(krel)는 1이거나 또는 1미만이다.
본 발명은 또한 변형 모이어티와 접합하는 인슐린 화합물을 가지는 신규한 인슐린 화합물 접합체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 다음의 일반식을 가지는 변형 모이어티와 결합하는 인슐린 화합물을 제공한다:
Figure 112007014591843-pct00001
(일반식 VI)
여기서, X, Y 및 Z는 독립적으로 선택되는 결합기(linking group)이고, 각각은 선택적으로 존재하며, X는, 존재한다면, 공유결합으로 인슐린 화합물과 결합하고,
R1 또는 R2 중 적어도 하나는 존재하며, 저급 알킬(lower alkyl)이고, 카르보닐기(carbonyl group)를 임의로 포함할 수도 있으며,
R2는 -CH3, -H, 토실레이트(tosylate), 또는 활성화기(activating group)와 같은 캡핑기(capping group)이고, 그리고
PAG는 하나 이상의 알칼렌 글리콜 모이어티(alkalene glycol moiety)(즉, 옥시알칼렌 모이어티(oxyacalene moieties))를 통합한 선형 또는 분지형 탄소사슬이며, 및 -S-, -O-, -N-, 및 -C(O)-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 모이어티를 선택적으로 통합한다,
여기서, 상기 변형 모이어티는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 중원자(heavy atoms) 중 최대수를 가진다 가진다.
본 발명의 구현예에서, 어떠한 하나 이상의 X, Y 및 Z는 존재하지 않을 수도 있다. 또한, 존재한다면, X, Y 및/또는 Z는 -C(O)-, -O-, -S-, -C- 및 -N- 에서 독립적으로 선택될 수도 있다. 일 구현예에서, Z는 -C(O)-이다. 다른 구현예에서, Z는 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, R1은 저급 알킬이고, R2는 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, R2는 저급 알킬이고, R1은 존재하지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 선형 또는 분지형인, -C, -C-, -O-, =O, -S-, -N-, -Si-으로 구성된 군에서 선택되는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 원자의 백본(backbone)를 가지는 치환된 탄소 사슬 모이어티를 포함할 수도 있다. 상기 중원자는 통상적으로 하나 이상의 탄소원자 및 -O-, -S-, -N-, 및 =O로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비탄소 중원자를 포함할 것이다. 상기 탄소원자 및 비탄소 중원자는 통상적으로 모든 비탄소 중원자에 대하여 적어도 1 탄소원자, 바람직하게는 모든 비탄소 중원자에 대하여 적어도 2 탄소원자, 보다 바람직하게는 모든 비탄소 중원자에 대하여 적어도 3 탄소원자의 비율로 존재한다. 상기 탄소원자 및 산소원자는 통상적으로 모든 산소원자에 대하여 적어도 1 탄소원자, 바람직하게는 모든 산소원자에 대하여 적어도 2 탄소원자, 보다 바람직하게는 모든 산소원자에 대하여 적어도 3 탄소원자의 비율로 존재한다. 상기 변형 모이어티는 분지형 또는 선형 C1 -6, 분지형 또는 선형, 또는 카르보닐과 같은, 하나 이상의 캡핑기를 포함할 수도 있다. 상기 변형 모이어티는 통상적으로 수소를 포함할 것이고, 상기 수소의 하나 이상은 불소로 치환될 수도 있다(중원자이지만, 전술한 일반식의 중원자로서 포함시키지 않아야 한다). 상기 변형 모이어티는 몇몇 경우에는 특별히 비치환 알킬 모이어티는 배제할 수도 있다. 상기 변형 모이어티는 예를 들어, 카르바메이트(carbamate), 카르보네이트(carbonate), 에테르(ether), 에스테르(ester), 아미드(amide), 또는 2차 아민기 같은 결합기에 의하여, 또는 이황화결합(disulfide bond)에 의하여, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드의 아미노기(amino group), 히드록시기(hydroxyl group) 또는 자유 카르복시산기(free carboxyllic acid group)와 같은 아미노산 상의 가용기(available group)와, 결합할 수도 있다. 상기 결합기에서 분자는 상기 변형 모이어티의 일부분으로 간주된다. 바람직한 구현예에서, 상기 변형 모이어티의 분자량은 HIM2 변형 모이어티의 분자량보다 적다.
본 발명은 다음 일반식의 변형 모이어티를 가지는 인슐린 화합물 접합체를 포함하며:
Figure 112007014591843-pct00002
(일반식 VII)
여기서, n은 1,2,3 또는 4이고, m은 1,2,3,4 또는 5이고; 및/또는
Figure 112007014591843-pct00003
(일반식 VIII)
여기서, n은 1,2,3,4 또는 5이고, m은 1,2,3 또는 4이다.
인슐린 및 다른 폴리펩타이드를 변형시키기 위한 상기 모이어티의 용도 뿐만 아니라, 상기 신규한 변형 모이어티가 그 자체로 본 발명의 측면이라는 것은 자명할 것이다.
본 발명은 또한 상기 인슐린 화합물 접합체 및/또는 본 발명의 양이온-인슐린 화합물 접합체를 포함하는 신규한 제형을 제공한다. 본 발명자들은 뜻밖에도 특정 지방산 조성물이 특별히 경구 전달에 유용하며, 구체적으로는 인슐린 및 인슐린 화합물 접합체와 같은, 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 접합체의 경구 전달 및/또는 본 발명의 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물의 경구 전달에 유용하다는 것을 발견하였다. 일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 포화 또는 불포화 C4, C5, C6, C7, C8, C9 또는 C10 지방산 및/또는 상기 지방산의 염을 가지는 지방산 조성물을 제공한다. 바람직한 지방산은 카프릴산(caprylic), 카프르산(capric), 미리스틴산(myristic) 및 라우린산(lauric)이다. 바람직한 지방산염은 카프릴산(caprylic), 카프르산(capric), 미리스틴산(myristic) 및 라우린산(lauric)의 나트륨염(sodium salts)이다. 상기 조성물의 지방산 함유량은 통상적으로 하한(lower limit)으로서 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0 % w/w을 가지고, 상한(upper limit)으로서 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 또는 12.0 % w/w을 가지는 범위내이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물의 지방산 함유량은 하한(lower limit)으로서 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0 % w/w을 가지고, 상한(upper limit)으로서 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 또는 12.0 % w/w을 가지는 범위내이며, 상기 조성물의 지방산 함유량은 통상적으로 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 또는 99.9% w/w 단일 지방산, 바람직하게는 카프릴산(caprylic), 카프르산(capric), 미리스틴산(myristic) 또는 라우린산(lauric), 또는 이들의 염보다 더 크다.
본 발명은 또한 인슐린 결핍증을 치료하는 방법 또는 그렇지 않다면 본 발명의 인슐린 화합물 접합체, 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물, 및/또는 제형을 이용하여 환자에게 인슐린을 보충하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 필요로 하는 환자에게 본 발명의 인슐린 화합물 접합체, 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물, 및/또는 제형 중 하나 이상의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다.
6. 정의
다음은 본 명세서 및 청구범위에 걸쳐 사용되는 용어의 정의이다. 상기 제공되는 정의는 다른 표시가 없다면 본 명세서에 걸쳐 적용한다. 여기에 정의되지 않은 용어는 그 용어가 속하는 기술분야에서 통상적으로 이해되는 의미를 가진다.
아미노산 서열에 관하여 사용될 때, " 부가( Addition ) "는 상기 서열 내에 삽입 뿐만 아니라 상기 서열의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에서 하나 이상의 아미노산의 연장을 포함한다.
" 착물 ( Complex ) "이란 하나 이상의 인슐린 화합물 또는 인슐린 화합물 접합체가 하나 이상의 금속 원자 또는 이온과 배위결합을 형성하는 분자결합(molecular association)을 가리킨다. 착물은 용액내에 존재할 수도 있고 또는 결정, 미세결정, 또는 무정형 고체와 같은 고체로서 존재할 수도 있다. " 착물 혼합물( Complex mixture)" 은 용액 형태 또는 고체형태로, 둘 이상의 다른 착물을 가지는 혼합물을 의미한다. 착물 혼합물은 예를 들어, 다른 인슐린 화합물, 다른 인슐린 화합물 접합체, 다른 혼성 착물, 다른 양이온, 상기 전술한 것의 조합 등을 포함할 수도 있다. "혼성 착물( Hybrid complex )" 은 둘 이상의 다른 인슐린 화합물 및/또는 인슐린 화합물 접합체를 가지는 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물을 의미한다.
" 착물화제 ( Complexing agent )" 는 전하의 다양성(multiplicity of charges)를 가지고, 인슐린 화합물 접합체와 결합 또는 착물화하는 분자를 의미한다. 본 발명의 용도에 적합한 착물화제의 예는 프로타민(protamines), 설펜(surfen), 글로빈 단백질(globin proteins), 스페르민(spermine), 스페르미딘 알부민(spermidine albumin), 아미노산(amino acids), 카르복시산(carboxylic acids), 다중 양이온성 폴리머 화합물(polycationic polymer compounds), 양이온성 폴리펩티드(cationic polypeptides), 음이온성 폴리펩티드(anionic polypeptides), 뉴클레오티드(nucleotides), 및 안티센스(antisense)를 포함한다. 전문이 참조로서 여기에 포함되는, Brange, J., Galenics of Insulin compound, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1987)을 보시오.
아미노산의 부가, 삭제 또는 치환에 관하여 사용되는 "보존( Conservative )" 은 상기 인슐린 화합물의 치료학적 효능을 완전히 감소시키지는 않는 아미노산 사슬의 부가, 삭제 또는는 치환을 의미하는 것으로, 다시 말해, 즉, 상기 효능은, 상응하는 천연 인슐린 화합물과 같이 과학적으로 허용가능한 제어의 치료학적 효능에 비하여, 감소될 수도 있고, 동일하거나, 또는 향상될 수도 있다.
"친수성( Hydrophilic )" 은 수용해성 특성을 나타내는 것을 의미하고, " 친수성 모이어티( hydrophilic moiety ) " 용어는 친수성이고 및/또는, 다른 화학물질(chemical entity)이 부착될 때, 상기 화학물질의 친수성도(hydrophilicity)가 증가하는 모이어티를 가리킨다. 실시예들은 당 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리알킬렌 모이어티(polyalkylene moieties)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "친유성( Lipophilic )" 은 지방 및 지방 조직에의 축적, 지질내에서의 용해능(ability to dissolve) 및/또는 생물학적 멤브레인을 투과(penetrate), 상호작용(interact) 및/또는 횡단(traverse)하는 능력과 같은 지방 용해성 특성을 나타내는 것을 의미하고, " 친유성 모이어티 ( lipophilic moiety )" 는 친유성이고 및/또는 다른 화학물질이 부착될 때, 상기 화학물질의 지질 친화도(lipophilicity)가 증가하는 모이어티를 의미한다. " 양친매성 ( Amphiphilic )" 은 친수성 및 지질 친화성의 특성을 나타내는 것을 의미하고 " 양친매성 모이어티 ( amphiphilic moiety )" 용어는 양친매성이고 및/또는 폴리펩타이드 또는 비-폴리펩타이드 약물에 부착될 때, 생성되는 접합체, 예를 들어, 특정 PEG-지방산 변형 모이어티(PEG-fatty acid modifying moieties), 및 당-지방산 변형 모이어티(sugar-fatty acid modifying moieties)의 양친매성이 증가하는 모이어티를 의미한다.
"저급 알킬 ( Lower alkyl )" 은 1~6 탄소원자, 즉, C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6를 가지는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 알킬 모이어티를 의미한다. "고급 알 킬( Higher alkyl )" 은 6 이상의 탄소원자, 예를 들어, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20 등을 가지는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 알킬 모이어티를 의미한다.
" 단분산 ( Monodispersed )" 은 혼합물 내의 화합물의 약 100%가 동일한 분자량을 가지는 화합물의 혼합물을 칭한다. "실질적 단분산( Substantially monodispersed)" 은 상기 혼합물 내의 화합물 중 적어도 95%가 동일한 분자량을 가지는 화합물의 혼합물을 칭한다. "완전 단분산 ( Purely monodispersed )" 은 상기 혼합물 내의 화합물의 약 100%가 동일한 분자량 및 동일한 분자구조를 가지는 화합물의 혼합물을 칭한다. 따라서, 완전 단분산 혼합물은 단분산 혼합물이지만, 단분산 혼합물이 반드시 완전 단분산 혼합물인 것은 아니다. ' 실질적 단분산( Substantially monodispersed )" 은 상기 혼합물의 화합물 중 적어도 95%가 동일한 분자량 및 동일한 분자구조를 가질 때의 화합물의 혼합물을 칭한다. 따라서, 실질적 완전 단분산 혼합물은 실질적 단분산 혼합물이지만, 실질적 단분산 혼합물이 반드시 실질적 완전 단분산 혼합물인 것은 아니다. 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물의 인슐린 화합물 접합체 성분은 바람직하게는 단분산, 실질적 단분산, 완전 단분산 또는 실질적 완전 단분산이지만, 또한 다중분산(polydispersed)일 수도 있다. "다중분산( Polydispersed )" 은 단분산, 실질적 단분산, 완전 단분산 또는 실질적 완전 단분산이 아닌 분산도(dispersity)를 가지는 것을 의미한다.
여기에서 구체적으로 사용되는 "천연 인슐린 화합물( Native insulin compound)" 은 천연, 합성 또는 유전학적으로 가공된 소스에 의해 제공되는 포유류의 인슐린 화합물(예를 들어, 인간 인슐린, 소(bovine) 인슐린 화합물, 돼지(porcine) 인슐린 화합물 또는 고래(whale) 인슐린 화합물)을 의미한다. 인간 인슐린은 이황화 결합에 의해 가교-결합되는(cross-linked) 21-아미노산 A-사슬 및 30-아미노산 B-사슬로 구성된다. 적합한 교차-결합되는 인간 인슐린은 다음의 세 개의 이황화 가교(bridge)를 포함한다: A7과 B7 사이의 첫번째, A20과 B19 사이의 두번째, 및 A6과 A11 사이의 세 번째. 인간 인슐린은 다음의 세 개의 자유 아미노기를 보유한다: B1-페닐알라닌(Phenylalanine), A1-글리신(Glycine), 및 B29-리신(Lysine). A1 및 B1 위치에 자유 아미노기는 α-아미노기이다. B29 위치에 자유 아미노기는 이-아미노기(e-amino group)이다. "인슐린 유사체( Insulin analog )" 는 상응하는 천연 인슐린에 비하여 일부, 전체 또는 향상된 활성을 나타내거나 또는 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro into)에서 전부(ome), 전체 또는 향상된 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 예를 들어, 하나 이상의 보존성 아미노산 부가, 삭제 및/또는 치환된 인간 인슐린의 구조를 가지는 폴리펩타이드로 전환되는 폴리펩타이드를 의미한다. 인슐린 유사체는 Dahiyat et al . 의 이름으로 2002년 3월 18일에 출원된, 미국특허공개 20030049654, "Protein design automation for protein libraries"에 설명된 바와 같이, 공지기술(known techniques)을 이용하여 규명될 수 있다. 프로인슐린(proinsulins), 프리-프로인슐린(pre-proinsulins), 인슐린 전구체(insulin precursors), 인간 및 인간이 아닌 동물의 단일 사슬 인슐린 전구체 및 전술한 것의 임의 유사체는 또한, 비-포유류(non-mammalian) 인슐린처럼, 인슐린 유사체로서 여기에서 언급된다. 많은 인슐린 유사체가 기술분야에서 알려져있다 (하기의 논의를 참조). 만약 문맥이 구체적으로 다른 것을 지칭하지 않는다면(예를 들어, "인간 인슐린" 또는 그런 종류의 다른 것과 같은 특정 인슐린이 언급됨), 상기 용어 "인슐린 화합물( insulin compound )" 은 천연 인슐린 및 인슐린 유사체를 포함하도록 광범위하게 사용된다.
" 폴리알킬렌 글리콜( polyalkylene glycol )" 또는 PAG는 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(PPG: polypropylene glycol), 및 폴리부틸렌 글리콜(PBG: polybutylene glycol) 및 이들의 조합(예를 들어, PEG, PPG, PPG, 및 PBG 서브유닛에서 선택되는 둘 이상의 다른 PAG 유닛과 같은 둘 이상의 다른 PAG 서브유닛의 조합을 포함하는 선형 또는 분지형 폴리머)과 같은 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 폴리알킬렌 글리콜 폴리머를 가리키고 상기 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol)의 모노알킬에테르(monoalkylether)를 포함한다. 상기 용어 PAG 서브유닛은 단일 PAG 유닛을 의미하며, 예를 들어, " PEG 서브유닛( PEG subunit )" 은 단일 폴리에틸렌 글리콜 유닛, 예를 들어, -(CH2CH2O)-를 가리키고, " PPG 서브유닛( PPG subunit )" 은 단일 폴리프로필렌 글리콜 유닛, 예를 들어, -(CH2CH2CH2O)-을 가리키며, " PBG 서브유닛( PBG subunit )" 은 단일 폴리프로필렌 글리콜 유닛, 예를 들어, -(CH2CH2CH2CH2O)-를 가리킨다. PAGs 및/또는 PAG 서브유닛은 또한 치환된 PAGs 또는 PAG 서브유닛, 예를 들어, iso-PPG 또는 iso-PBG와 같은 하나 이상의 분지형 PAG 서브유닛을 포함하는 PAGs 뿐만 아니라, 메틸, 에틸 또는 프로필 측쇄 또는 카르보닐 측쇄와 같은 알킬 측쇄를 포함하는 PAGs를 포함한다.
"프로인슐린 화합물( Proinsulin compound )" 은 B-사슬의 C-말단이 5 이상의 아미노산을 가지는 천연 또는 인공 C-펩타이드를 통해 상기 A-사슬의 N-말단과 결합하는, 인슐린 화합물을 의미한다. "프로인슐린 화합물( Proinsulin compound )" 은 가용성 단백질으로서 분비(excretion)를 촉진하도록 선택되는 서열, 또는 N-말단의 접합을 방지하도록 선택되는 서열, 또는 정제를 향상시키도록 선택되는 서열(예를 들어, 정제 컬럼에 대해 결합 친화도를 가지는 서열)과 같은, B-사슬의 N-말단과 결합하는 선도 서열을 추가로 포함하는 프로인슐린을 의미한다. "단일 사슬 인슐린 화합물 전구체( Single chain insulin compound precursor )" 또는 "미니프로인슐린 화합물( miniproinsulin compound )" 은 B-사슬의 C-말단이(또는 상기 C-말단에서 제거된 1,2,3 또는 4 아미노산을 가지는 절단된 B-사슬) 개재(intervening) C-펩타이드 없이, 또는 1,2,3 또는 4 아미노산을 가지는 단축 C-펩타이드를 통해서, 1,2,3 또는 4 아미노산에 의해, N-말단에서 짧아진 절단된 A-사슬 또는 A-사슬의 N-말단과 결합되어 있는 인슐린 화합물을 의미한다.
" 프로타민 ( Protamine )" 은 천연(예를 들어, 어류의 정자(fish sperm)) 또는 재조합 소스로부터 수득되는 강한 염기성 단백질(basic protein) 혼합물을 가리킨다. Hoffmann, J. A., et al ., Protein Expression and Purification, 1:127-133 (1990) 참조. 상기 프로타민 조성물은, 종종 "프로타민 염기(protamine base)"라고 불리우는, 비교적 무염(salt-free)인 단백질의 제조방법 또는 상기 단백질의 염을 포함하는 제조방법으로 제공될 수 있다.
"단백질( protein )" " 펩타이드 ( peptide )" 및 " 폴리펩타이드 ( polypeptide )" 는 적어도 2 및 어떠한 길이까지의 아미노산 서열을 가지는 화합물을 가리키도록 여기에서 상호교환적으로 사용된다.
"R-형(R- type )" 은 인슐린 화합물 접합체, 양이온 및 페놀과 같은 안정화 화합물의 존재하에 형성되는 착물 배열(conformation)를 의미한다. "T-형(T- type )" 은 페놀과 같은 안정화 화합물 없이 인슐린 화합물 접합체 및 양이온의 존재하에 형성되는 착물 배열를 의미한다. T-형 또는 R-형 착물은 프로타민을 포함 또는 배제할 수도 있다.
"과학적으로 허용가능한 제어( scientifically acceptable control )" 는 실험의 주제에 대해 기술분야에서 통상의 기술을 가진자에게 수용가능한 실험적 제어를 의미한다.
"고체( solid )" 는 구조의 3차원 규칙성(regularity)이 있는 물질의 상태를 의미하며; 상기 용어는 결정형 고체, 무정형 고체 모두, 및 결정형 고체 및 무정형 고체의 조합을 가리키면서 여기에서 광범위하게 사용된다. "양이온-인슐린 화합물 접합체 고체( cation - insulin compound conjugate solid )" 는 양이온-인슐린 화합물 접합체를 포함하는 고체, 바람직하게는 1가 또는 다가 양이온과 배위결합하는 고체를 가리킨다. "결정( crystal )" 은 규칙적인 다면체 모양(regular polyhedral shape)의 고체를 의미한다. "결정형( crystalline )" 은 결정의 특성을 가지는 고체를 가리킨다. "미세결정( microcrystal )" 은 주로 미시적 크기, 일반적으로 가장 긴 치수가 1 micron ~ 100 microns 범위 내에 있는 물질로 구성된 고체를 의미한다. 일부 경우에, 미세결정형 조성물의 개개의 결정은 주로 단일 결정학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결정은 미세결정이 아니다. 용어 "미세결정형( microcrystalline )" 는 미세결정이 되는 상태를 가리킨다. "무정형( amorphous )" 은 형태가 결정형이 아닌 고체 물질을 가리킨다. 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 표준 기법, 예를 들어, x-레이(ray) 결정학적 기법, 주사 전자현미경(scanning electron microscopy) 또는 광학현미경(optical microscopy)을 이용하여 무정형 물질과 결정을 구별할 수 있다. "고체 혼합물( solid mixture )" 은 두 개의 다른 고체의 혼합물을 의미한다. "결정 혼합물( crystal mixture )" 은 두 개의 다른 결정의 혼합물을 의미한다. "공-결정( co - crystal )" 은 두 개 이상의 다른 인슐린 화합물 및/또는 인슐린 화합물 접합체를 가지는 결정을 의미한다. 본 발명의 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물은 전술한 형태 중 어느 것으로 또는 상기 형태 중 둘 이상의 혼합물로 제공될 수도 있다.
"치환( substitution )" 은 상기 인슐린 화합물 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 일부 경우에, 상기 치환된 아미노산은 침묵 변경(silent alteration)을 생성하면서, 기능적 등가물(functional equivalent)로서 기능한다. 치환은 보존적일 수 있으며; 예를 들어, 보존 치환은 상기 치환된 아미노산이 속하는 분류의 다른 구성원에서 선택될 수도 있다. 비극성(소수성) 아미노산의 예는 알라닌(alanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 발린(valine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine)을 포함한다. 극성 중성(비전하성)(polar nuetral) 아미노산의 예는 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 티로신(tyrosine), 아스파라긴(asparagine), 및 글루타민(glutamine)을 포함한다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산의 예는 아르기닌(arginine), 리신(lysine) 및 히스티딘(histidine)을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산의 예는 아스파르트산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid)을 포함한다.
다른 취지의 기재가 없다면 "수용해도( water solubility )" 또는 "수성 용해도( aqueous solubility )" 는 pH 7.4인 수성 완충용액(aqueous buffer solution)에서 결정된다.
7. 발명의 상세한 설명
본 발명은 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물 및 상기 착물을 포함하는 다양한 조성물 뿐만 아니라 상기 착물 및 조성물을 제조 그리고 이용하는 방법을 제공한다. 상기 착물은 인슐린 화합물 결핍을 특징으로 하는 질환과 같은 다양한 의학적 질환의 치료를 위하여 인슐린 화합물을 투여하기에 유용하다. 상기 착물은 일반적으로 양이온 성분 및 인슐린 화합물 접합체 성분을 포함한다. 상기 인슐린 화합물 접합체 성분은 일반적으로 변형 모이어티와 결합한 인슐린 화합물을 포함한다. 상기 착물 및/또는 조성물의 다른 적합한 성분의 예는 안정화제(stabilizing agents), 착물화제(complexing agents), 및 양이온-단백질 착물을 제조하는데 사용하기 위하여 기술분야에서 공지된 다른 성분을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 인슐린 화합물 접합체 및/또는 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물을 포함하는 신규한 인슐린 접합체 및 지방산 제형을 제공한다.
7.1 인슐린 화합물
상기 양이온-인슐린 화합물 접합체는 인슐린 화합물 성분을 포함한다. 상기 인슐린 화합물은, 예를 들어 인간 인슐린과 같은 포유류 인슐린 화합물 또는 인슐린 화합물 유사체일 수도 있다.
인슐린 화합물 유사체의 광범위한 다양성은 기술분야에서 공지되었다. 바람직한 인슐린 화합물 유사체는 리신(lysine), 바람직하게는 B 사슬의 C-말단의 5 아미노산 내의, 예를 들어 B26, B27, B28, B29 및/또는 B30 위치에서 리신을 포함한다. 적합한 유사체의 일 세트(set)는 EP-A 1227000107(참조로서 여기에 포함되는 전문)에 설명되어 있고, B28 위치에서 상기 아미노산 잔기는 Asp, Lys, Leu, Val, 또는 Ala이고; B29 위치에서 상기 아미노산 잔기는 Lys 또는 Pro이며; B1O 위치에서 상기 아미노산 잔기는 His 또는 Asp이고; B1 위치에서 상기 아미노산 잔기는 Phe, Asp이거나, 또는 단독으로 삭제되거나 또는 B2 위치에서 상기 잔기의 삭제와 함께 삭제되며; B30 위치에서 상기 아미노산 잔기는 Thr, Ala, 또는 삭제되고; 및 B9 위치에서 상기 아미노산 잔기는 Ser 또는 Asp이며; B28 또는 B29 위치 중 하나는 Lys인 것으로 제공되는 경우를 제외한, 상기 인슐린 화합물의 서열을 가진다.
적합한 인슐린 화합물 유사체의 다른 예는 AspB28 인간 인슐린, LysB28 인간 인슐린, LeuB28 인간 인슐린, ValB28 인간 인슐린, AlaB28 인간 인슐린, AspB28ProB29 인간 인슐린, LysB28ProB29인간 인슐린, LeuB28ProB29 인간 인슐린, ValB28ProB29 인간 인슐린, AlaB28ProB29 인간 인슐린 뿐만 아니라 상기에 설명된 치환 지침들을 사용하여 제공되는 유사체를 포함한다. 인슐린 화합물 단편은 B22-B30 인간 인슐린, B23-B30 인간 인슐린, B25-B30 인간 인슐린, B26-B30 인간 인슐린, B27-B30 인간 인슐린, B29-B30 인간 인슐린, B1-B2 인간 인슐린, B1-B3 인간 인슐린, B1-B4 인간 인슐린, B1-B5 인간 인슐린, 인간 인슐린의 A 사슬 및 인간 인슐린의 B 사슬을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
적합한 인슐린 화합물 유사체의 또 다른 예들은 2003년 7월 31일에 출원된 미국 특허공개 20030144181A1, "Insoluble compositions for controlling blood glucose"; 2003년 6월 5일에 출원된 미국 특허공개 20030104983A1, "Stable insulin formulations"; 2003년 2월 27일에 출원된 미국 특허공개 20030040601A1, "Method for making insulin precursors and insulin analog precursors"; 2003년 1월 2일에 출원된 미국 특허공개 20030004096A1, "Zinc-free and low-zinc insulin preparations having improved stability"; 2003년 8월 22일에 출원된 미국 특허 6,551,992Bl, "Stable insulin formulations"; 2003년 3월 18일에 출원된 미국 특허 6,534,288B1, "C peptide for improved preparation of insulin and insulin analogs"; 2003년 3월 11일에 출원된 미국 특허 6,531,448B1, "Insoluble compositions for controlling blood glucose"; 2003년 1월 28일에 출원된 미국 특허 RE37,971E, "Selective acylation of epsilon-amino groups"; 2002년 12월 26일에 출원된 미국 특허공개 20020198140A1, "Pulmonary insulin crystals"; 2002년 10월 15일에 출원된 미국 특허 6,465,426B2, "Insoluble insulin compositions"; 2002년 9월 3일에 출원된 미국 특허 6,444,641B1, "Fatty acid-acylated insulin analogs"; 2003년 9월 26일에 출원된 미국 특허공개 20020137144A1, "Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast"; 2002년 9월 19일에 출원된 미국 특허공개 20020132760A1, "Stabilized insulin formulations"; 2002년 7월 27일에 출원된 미국 특허공개 20020082199A1, "Insoluble insulin compositions"; 2002년 1월 1일에 출원된 미국 특허 6,335,316B1, "Method for administering acylated insulin"; 2001년 7월 31일에 출원된 미국 특허 6,268,335B1, "Insoluble insulin compositions"; 2001년 11월 15일에 출원된 미국 특허공개 20010041787A1, "Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast"; 2001년 11월 15일에 출원된 미국 특허공개 20010041786A1, "Stabilized acylated insulin formulations"; 2001년 11월 8일에 출원된 미국 특허공개 20010039260A1, "Pulmonary insulin crystals"; 2001년 11월 1일에 출원된 미국 특허공개 20010036916A1, "Insoluble insulin compositions"; 2001년 7월 12일에 출원된 미국 특허공개 20010007853A1, "Method for administering monomelic insulin analogs"; 2000년 4월 18일에 출원된 미국 특허 6,051,551A, "Method for administering acylated insulin"; 2000년 3월 7일에 출원된 미국 특허 6,034,054A, "Stable insulin formulations"; 1999년 10월 26일에 출원된 미국 특허 5,970,973A, "Method of delivering insulin lispro"; 1999년 9월 14일에 출원된 미국 특허 5,952,297A, "Monomelic insulin analog formulations"; 1999년 7월 13일에 출원된 미국 특허 5,922,675A, "Acylated Insulin Analogs"; 1999년 3월 30일에 출원된 미국 특허 5,888,477A, "Use of monomelic insulin as a means for improving the bioavailability of inhaled insulin"; 1999년 2월 23일에 출원된 미국 특허 5,873,358A, "Method of maintaining a diabetic patient's blood glucose level in a desired range"; 1998년 5월 5일에 출원된 미국 특허 5,747,642A, "Monomelic insulin analog formulations"; 1997년 12월 2일에 출원된 미국 특허 5,693,609A, "Acylated insulin compound analogs"; 1997년 7월 22일에 출원된 미국 특허 5,650,486A, "Monomeric insulin analog formulations"; 1997년 7월 8일에 출원된 미국 특허 5,646,242A, "Selective acylation of epsilon-amino groups"; 1997년 1월 28일에 출원된 미국 특허 5,597, 893A, "Preparation of stable insulin analog crystals"; 1996년 8월 20일에 출원된 미국 특허 5,547,929A, "Insulin analog formulations"; 1996년 8월 2일에 출원된 미국 특허 5,504,188A, "Preparation of stable zinc insulin compound analog crystals"; 1995년 12월 12일에 출원된 미국 특허 5,474,978A, "Insulin analog formulations"; 1995년 10월 24일에 출원된 미국 특허 5,461,031A, "Monomeric insulin analog formulations"; 1983년 12월 20일에 출원된 미국 특허 4,421,685A, "Process for producing an insulin"; 2001년 4월 24일에 출원된 미국 특허 6,221,837, "Insulin derivatives with increased zinc binding"; 1993년 1월 5일에 출원된 미국 특허 5,177,058, "Pharmaceutical formulation for the treatment of diabetes mellitus"(인슐린 화합물-B31-Arg-OH 및 인간 인슐린-B31-Arg-B32-Arg-OH를 포함하며, B31의 염기로 변형된 인슐린 화합물 유도체를 포함하고, 5.8과 8.5 사이의 등전점(isoelectric point) 및/또는 약학적으로 허용가능한 부형제의 적어도 하나의 생리학적으로 항독성인(tolerated) 염, 약 1㎍ ~ 약 200㎍(zinc/IU) 범위의 비교적 높인 아연 이온 함량을 가지는 약학 제형을 설명한다)에서 볼 수 있다. 전술한 특허문서 각각의 전체 명세서는 참조로서 여기에 포함되며, 구체적으로는 다양한 인슐린 화합물 접합체의 제조방법, 용도, 조성물에 대해 개시하고 있다.
양이온-인슐린 화합물 접합체를 제조하는데 사용되는 인슐린 화합물은 다양한 공지의 펩타이드 합성 기법, 예를 들어 전통적인 (용액)방법(classical (solution) methods), 고체상 방법(solid phase methods), 반-합성 방법(semi-synthetic methods), 및 재조합 DNA 방법(recombinant DNA methods) 중 어느 것에 의해서도 제조될 수 있다. 예를 들어, Chance et al .의 미국 특허출원 07/388,201, EPO383472, Brange et al .의 EPO214826, 및 Belagaje et al .의 미국 특허 5,304,473 은 다양한 프로인슐린 화합물 및 인슐린 화합물 유사체를 개시하고 있고 참조로서 여기에 포함된다. 상기 인슐린 화합물 유사체의 A 및 B 사슬은 또한 전구체 분자 또는 재조합 DNA 기법을 이용하는 단일사슬 인슐린 화합물 전구체 분자와 같은 프로인슐린 화합물을 통하여 준비될 수도 있다. Frank at al ., "Peptides: Synthesis-Structure-Function," Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds. D. Rich and E. Gross (1981); Bernd Gutte, Peptides : Synthesis, Structures, and Applications, Academic Press (October 19, 1995); Chan, Weng 및 White, Peter (Eds.), Finoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press (March 2000); 펩타이드 합성, 재조합 생성물 및 방법에 관한 설명을 위하여 참조로서 여기에 포함된 전문을 참조하시오.
7.2 변형 모이어티
상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물은 인슐린 화합물 접합체를 제공하도록 인슐린 화합물과 결합하는(예를 들어, 공유결합으로 또는 이온결합으로) 변형 모이어티를 포함한다. 변형 모이어티는 여기에서 설명되는 바람직한 특성을 가지는 인슐린 화합물을 제공하는 인슐린 화합물과 결합하는 모이어티이다. 예를 들어, 상기 변형 모이어티는 다양한 환경(GI 관, 및/또는 혈류와 같은)에서 인슐린 화합물의 분해(degradation) 속도를 감소시킬 수 있고, 따라서, 상기 환경에서 변형 모이어티의 부재시에 분해되는 것보다 상기 변형된 형태에서 분해되는 인슐린 화합물이 더 적다. 바람직한 변형 모이어티는 모 인슐린 화합물의 치료학적으로 상당한 백분율의 생물학적 활성을 보유하는 인슐린 화합물 접합체를 허용하는 모이어티이다. 또한, 바람직한 변형 모이어티는 양친매성(amphiphilic) 또는 친수성(hydrophilic)인 모이어티이고, 및/또는 상응하는 인슐린 화합물 또는 상응하는 비접합 인슐린 화합물과 같이, 상기 인슐린 화합물 접합체가 양친매성 또는 친수성 또는 과학적으로 허용가능한 제어보다 덜 친유성이 되게하는 모이어티이다.
상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물에 유용한 적합한 변형 모이어티 및 인슐린 화합물 접합체의 예는 전문이 참조로서 여기에 포함되는 다음 특허에서 찾을 수 있다: 2001년 10월 16일에 출원된 미국 특허 6,303,569, "Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents"; 2001년 4월 10일에 출원된 미국 특허 6,214,330, "Coumarin and related aromatic-based polymeric prodrugs"; 2000년 9월 5일에 출원된 미국 특허 6,113,906, "Water-soluble non-antigenic polymer linkable to biologically active material"; 1999년 11월 16일에 출원된 미국 특허 5,985,263, "Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates"; 1999년 5월 4일에 출원된 미국 특허 5,900,402, "Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins"; 1997년 10월 28일에 출원된 미국 특허 5,681,811, "Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same"; 1997년 6월 10일에 출원된 미국 특허 5,637,749, "Aryl imidate activated polyalkylene oxides"; 1997년 3월 18일에 출원된 미국 특허 5,612,460, "Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides"; 1996년 10월 22일에 출원된 미국 특허 5,567,422, "Azlactone activated polyalkylene oxides conjugated to biologically active nucleophiles"; 1995년 4월 11일에 출원된 미국 특허 5,405,877, "Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides"; 및 1994년 10월 25일에 출원된 미국 특허 5,359,030, "Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same". 본 발명의 제형에 유용한 접합 폴리펩타이드의 추가적인 예는 전체 명세서가 참조로서 여기에 포함되는 아래의 미국 특허출원에서 찾을 수 있다: 1998년 8월 14일에 출원된 미국특허출원 09/134,803; 2001년 12월 19일에 출원된, 10/018,879; 2002년 9월 5일에 출원된 10/235,381 및 2001년 6월 4일에 출원된 09/873,797. 상기 전술한 각 특허 및 특허출원의 전문은 폴리펩타이드를 변형하는데 사용되는 모이어티에 관한 그들의 설명에 대하여 참조로서 여기에 포함된다.
상기 변형 모이어티는 이들의 백본에 약한 또는 분해가능한 결합(linkages)을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 PAGs는 가수분해하기 쉬운 락티드(lactide), 글리코리드(glycolide), 카르보네이트(carbonate), 에스테르(ester), 카르바메이트(carbamate) 등과 같은 가수분해에 불안정한 결합을 포함할 수 있다. 상기 접근법들은 상기 폴리머를 저(lower) 분자량 단편으로 절단되게 허용한다. 상기 폴리머의 예는, 예를 들어, 전문이 참조로서 여기에 포함되는 Hubbell et al .의 미국 특허 6,153,211에 설명되어 있다. 또한 전문이 참조로서 여기에 포함되는 Ekwuribe et al .의 미국 특허 6,309,633를 참조하시오.
상기 변형 모이어티는 어느 친수성 모이어티, 친유성 모이어티, 양친매성 모이어티, 염-형성(salt-forming) 모이어티, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 대표적인 친수성, 양친매성, 및 친유성 폴리머 및 변형 모이어티는 아래에 보다 자세히 설명된다.
7.2.1 친수성 모이어티
적합한 친수성 모이어티의 예는 PAG 모이어티, 다른 친수성 폴리머, 당 모이어티, 폴리소르베이트(polysorbate) 모이어티, 및 이들의 조합이다.
7.2.2 폴리알킬렌 글리콜 모이어티( Polyalkylene Glycol Moieties )
PAGs는 반복되는 알킬렌 글리콜 유닛(alkylene glycol units)을 가지는 화합물이다. 일부 구현예에서, 상기 유닛은 모두 동일하다(예를 들어, PEG 또는 PPG). 다른 구현예에서, 상기 알킬렌 유닛은 다르다(예를 들어, 폴리에틸렌-혼성-프로필렌 글리콜(polyethylene-co-propylene glycol), 또는 PLURONICS®). 상기 폴리머는 임의의 혼성폴리머(copolymers)(예를 들어, 에틸렌 옥사이드 및 산화 프로필렌 옥사이드는 혼성 중합화된다) 또는 분지형 또는 그래프트(graft) 혼성폴리머일 수 있다.
PEG는 바람직하게 PAG이고, 이것을 매우 바람직한 특성을 가지고 있고 미국 식약청(Food and Drug Administration)으로부터 일반적으로 안전하다고 승인(GRAS: generally regarded as safe)되었으므로 생물학적 적용에 유용하다. PEG는 통상적으로 일반식 H-(CH2CH2O)n-H을 가지고 있으며, 이때, 비록 상기 캡핑 모이어티는, 예를 들어, 모노-메톡시(mono-methoxy) 또는 디-히드록시(di-hydroxy)로 변화할 수도 있더라도, n은 약 2 ~ 약 4000 또는 그 이상의 범위일 수 있다. PEG는 통상적으로, 무색, 무취, 수-용해성 또는 수-혼화성(분자량에 따라 좌우됨), 열안정성, 화학적으로 불활성, 가수분해 안정성, 및 일반적으로 무독성이다. PEG는 또한 생체적합성이며, 통상적으로 신체내에서 면역반응을 나타내지 않는다. 바람직한 PEG 모이어티는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 또는 이 이상의 PEG 서브유닛을 포함한다.
상기 PEG는 단분산, 실질적 단분산, 완전 단분산 또는 실질적 완전 단분산(예를 들어, 전문이 참조로서 여기에 포함되며, 모두 2001년 6월 4일에 출원된 미국 특허 09/873,731 및 미국 특허 09/873,797의 출원인에 의해 이미 설명된) 또는 다중분산될 수도 있다. 비교적 저 분자량의 단분산 폴리머를 이용하는 것에 대한 하나의 장점은 그들이 용이하게 규정된 접합 분자를 형성하며, 재생가능한 합성 및 FDA 승인 모두를 용이하게 할 수 있다는 것이다.
상기 PEG는 각 말단에서 히드록시기(hydroxyl group)를 가지는 선형일 수있다(상기 인슐린 화합물의 잔여물에 접합되기 전에). 상기 PEG는 또한 메톡시-PEG(methoxy-PEG)(또는 mPEG)와 같은 알콕시 PEG(alkoxy PEG)일 수 있으며, 여기서 일 말단은 비교적 불활성의 알콕시 기(예를 들어, 선형 또는 분지형 OC1 -6)인 반면, 다른 말단은 히드록시기이다(상기 인슐린 화합물과 결합된).
상기 PEG는 또한, 일 구현예에서 R(-PEG-nOH)m으로 표현될 수 있는 분지형일 수 있으며, 여기서 R은 펜타에리트리톨(pentaerythritol), 당(sugar), 리신(lysine) 또는 글리세롤(glycerol)과 같은 중심(통상적으로 다가(polyhydric)인) 코어 제제(core agent)를 나타내고, n은 PEG 서브유닛의 개수를 나타내며, 각 가지(arm)에서 변화할 수 있고, 통상적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50이며, m은 가지(arms)의 개수를 나타내고, 2 내지 상기 코어 제제상의 부착 지점의 최대 개수의 범위이다. 각 분지는 동일하거나 다를 수 있으며, 예를 들어, 에테르 및/또는 에스테르로 종결(terminated)될 수 있다. 가지 m의 개수는 3 내지 100 또는 그 이상의 범위일 수 있고, 하나 이상의 말단 히드록시기는 상기 인슐린 화합물의 잔여물과 결합할 수 있으며, 그렇지 않으면 화학적인 변형이 될 수 있다.
다른 분지형 PEGs는 일반식 (CH3O-PEG-)PR-Z으로 표현되는 PEGs를 나타내며, 여기서, p는 2 또는 3이고, R은 리신 또는 글리세롤과 같은 중심 코어를 나타내고, Z는 화학적 활성이 되기 쉬운 카르복시기와 같은 기(group)을 나타낸다. 또 다른 분지형 형태인, 펜던트(pendant) PEG는 상기 PEG 사슬의 말단이라기 보다는 상기 PEG 백본을 따라서, 또는 상기 PEG 사슬의 말단 뿐만아니라 상기 PEG 백본을 따라서, 카르복시기와 같은 반응기를 가진다. 분지한 PEG는 일반식 PEG(-LCHX2)n으로 표현되고, 여기서 L은 결합기이고 X는 활성화된 말단기이다.
7.2.3 당 모이어티( Sugar Moieties )
여기에 설명되는 변형 모이어티는 당 모이어티를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 당 모이어티는 적어도 하나의 사카로스기(saccharose group)의 탄수화물 생성물이다. 대표적인 당 모이어티는 글리세롤 모이어티, 모노-, 디-, 트리- 및 올리고사카라이드(oligosaccharides), 및 녹말, 글리코겐, 셀루로스 및 폴리사카라이드 검(gum)과 같은 폴리사카라이드(polysaccharides)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 모노사카라이드는 C6 및, 포도당(glucose), 프럭토스(fructose), 만노스(mannose), 갈락토스(galactose), 리보스(ribose), 및 세도헵튤로스(sedoheptulose)와 같은 상기의(바람직하게는 C6 내지 C8) 당을 포함하고; 디-(di-) 및 트리사카라이드(trisaccharides)는 수크로스(sucrose), 셀로바이오스(cellobiose), 말토스(maltose), 락토스(lactose), 및 라피노스(raffinose)와 같이, 두 개 또는 세 개의 모노사카라이드 유닛(바람직하게는 C5 to C8)을 가지는 모이어티를 포함한다. 당 모이어티를 사용하는 접합은, 전문이 참조로서 여기에 포함되는 미국 특허 5,681,811, 5,438,040, 및 5,359,030에 설명되어 있다.
7.2.4 폴리소르베이트 모이어티( Polysorbate Moieties )
상기 변형 모이어티는 하나 이상의 폴리소르베이트 모이어티를 포함할 수도 있다. 예는 소르비탄 에스테르(sorbitan esters) 및 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene)으로 유도된 폴리소르베이트를 포함한다. 폴리소르베이트 모이어티를 이용하는 접합은 전문이 참조로서 여기에 포함되는 미국 특허 5,681,811, 5,438,040, 및 5,359,030에 설명되어 있다.
7.2.5 생체적합성 수-용해성 다중양이온 모이어티( Biocompatible Water - soluble Polycationic Moieties )
일부 구현예에서는, 생체적합성 수-용해성 다중양이온 폴리머가 사용될 수 있다. 생체적합성 수-용해성 다중양이온 폴리머는 예를 들어, 펜던트기(pendant groups)로서 부착된 양자화된 헤테로사이클(protonated heterocycles)을 가지는 임의의 변형 모이어티를 포함한다. 본 문맥에서, "수 용해성(Water soluble)"이란 변형 모이어티 전체가 완충액(buffered saline) 또는 20 내지 37℃ 사이의 온도에서, 공용매로서 첨가된 소량의 유기용매를 가지는 완충액과 같은 수용액에서 용해성이라는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티 자체는 원래 수용액에 충분히 용해성이지 않으나, 그렇지만 PEG 사슬과 같은 수-용해성 폴리머와 함께 접목함으로써(grafting) 용액 속으로 함유된다. 예는, 폴리-L-Lys(poly-L-Lys) 및, 천연 또는 합성 아미노산 또는 아미노산 혼합물이 양으로 하전된 다른 폴리아미노산, 예를 들어 폴리(D-Lys)[poly(D-Lys)], 폴리(오르니신)[poly(ornithine)], 폴리(Arg)[poly(Arg)], 및 폴리(히스티딘)[poly(histidine)]을 포함하는 폴리아미노산처럼, 상기 변형 모이어티 백본 또는 상기 변형 모이어티 측쇄(side chains)상에 아민기(amine groups)를 가지는 폴리아민(polyamines); 그리고 폴리(아미노스티렌)[poly(aminostyrene)], 폴리(아미노아크릴레이트)[poly(aminoacrylate)], 폴리(N-메틸 아미노아크릴레이트 [poly(N-methyl aminoacrylate)], 폴리(N-에틸아미노아크릴레이트)(poly(N-ethylaminoacrylate)], 폴리(N,N-디메틸 아미노아크릴레이트)[poly(N,N-dimethyl aminoacrylate)], 폴리(N,N-디에틸아미노아크릴레이트)[poly(N,N-diethylaminoacrylate)], 폴리(아미노메타크릴레이트)[poly(aminomethacrylate)], 폴리(N-메틸 아미노-메타크릴레이트)[poly(N-methyl amino-methacrylate)], 폴리(N-에틸 아미노메타크릴레이트)[poly(N-ethyl aminomethacrylate)], 폴리(N,N-디메틸 아미노메타크릴레이트)[poly(N,N-dimethyl aminomethacrylate)], 폴리(N,N-디에틸 아미노메타크릴레이트)[poly(N,N-diethyl aminomethacrylate)], 폴리(에틸렌이민)[poly(ethyleneimine)], 폴리(N,N,N-트리메틸아미노아크릴레이트 클로라이드)[poly(N,N,N-trimethylaminoacrylate chloride)], 폴리(메티아크릴아미도프로필트리메틸 암모늄 클로라이드)[poly(methyacrylamidopropyltrimethyl ammonium chloride)] 같은 4차 아민의 폴리머[polymers of quaternary amines], 및 키토산(chitosan) 같은 천연 또는 합성 폴리사카라이드와 같은 비펩타이드 폴리아민(nonpeptide polyamines)을 포함한다.
7.2.6 다른 친수성 모이어티( Other Hydrophilic Moieties )
상기 변형 모이어티는 또한 다른 친수성 폴리머를 포함할 수도 있다. 예는 폴리(옥시에틸화 글리세롤)[poly(oxyethylated glycerol)], 폴리(옥시에틸화 소르비톨)[poly(oxyethylated sorbitol)], 및 폴리(옥시에틸화 포도당)[poly(oxyethylated glucose)] 같은 폴리(옥시에틸화 폴리올)[poly(oxyethylated polyols)]; 폴리(비닐 알코올)[poly(vinyl alcohol)]("PVA"); 덱스트란(dextran); 탄수화물계 폴리머 등을 포함한다. 상기 폴리머는 호모폴리머(homopolymers) 또는 임의의 또는 블록(block) 혼성폴리머(copolymers) 및 상기 폴리머의 모노머(monomers), 선형 사슬 또는 분지형을 기초로 하는 3원폴리머(terpolymers)일 수 있다.
적합한 부가적 폴리머의 구체적인 예는 폴리(옥사졸린)[poly(oxazoline)], 2기능성 폴리(아크릴로일모르포린)[difunctional poly(acryloylmorpholine)]("PAcM"), 및 폴리(비닐피롤리돈)("PVP")를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. PVP 및 폴리(옥사졸린)는 본 기술분야에서 널리 알려져 있으며, 이들의 제조방법은 당업자에게 이미 명백할 것이다. PAcM 및 이것의 합성법 및 용도는 전문이 참조로서 여기에 포함된 명세서인, 미국특허 5,629,384 및 미국특허 5,631,322에 설명되어 있다.
7.2.7 생체점착성 다중음이온 모이어티( Bioadhesive Polyanionic Moieties )
특정 친수성 폴리머는 잠재적으로 유용한 생체점착성 성질을 가지는 것처럼 보인다. 상기 폴리머의 예는 예를 들어, Mathiowitz, et al .의 미국특허 6,197,346에서 찾을 수 있다. 카르복시기(carboxylic groups)를 포함하는 상기 폴리머는(예를들어, 폴리(아크릴산)[poly(acrylic acid)])은 생체점착성 특성을 나타내고, 또한 여기에 설명되는 상기 인슐린 화합물과 용이하게 접합된다. 폴리(락티드-혼성-글리코리드)[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 및 폴리오르소에스테르(polyorthoesters) 처럼 분해시에 카르복시산기(carboxylic acid groups)를 노출하는 급성 생체분해성(rapidly bioerodible) 폴리머는, 또한 생체점착성 폴리머이다. 상기 폴리머가 분해하면서, 이들은 상기 폴리머가 위장관(gastrointestinal tract)에 강력하게 점착할 수 있도록 카르복시산기를 노출할 수 있으며, 상기 인슐린 화합물 접합체의 전달을 보조할 수 있다.
7.2.8 친유성 모이어티( Lipophilic Moieties )
일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다. 상기 친유성 모이어티는 친유성 폴리머 및/또는 올리고머 뿐만 아니라, 알킬 모이어티(alkyl moieties), 알케닐 모이어티(alkenyl moieties), 알키닐 모이어티(alkynyl moieties), 아릴 모이어티(aryl moieties), 아릴알킬 모이어티(arylalkyl moieties), 알킬아릴 모이어티(alkylaryl moieties), 지방산 모이어티(fatty acid moieties), 아다만탄틸(adamantantyl), 콜레스테릴(cholesteryl)을 포함하는, 기술분야의 당업자에 의해 이해되는 다양한 친유성 모이어티일 수도 있다.
상기 알킬 모이어티는 포화 또는 불포화, 선형, 분지형 또는 사이클릭 탄화수소 사슬일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 알킬 모이어티는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 이 이상의 탄소원자를 가진다. 예는 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 프로필(propyl), 부틸(butyl), 펜틸(pentyl), 헥실(hexyl), 헵틸(heptyl), 옥틸(octyl), 노닐(nonyl), 데실(decyl), 언데실(undecyl), 도데실(dodecyl), 트리데실(tridecyl), 테트라데실(tetradecyl), 펜타데실(pentadecyl), 헥사데실(hexadecyl), 옥타데실(octadecyl), 노나데실(nonadecyl) 및 에이코실(eicosyl) 같은 포화, 선형 알킬 모이어티; 이소프로필(isopropyl), 2차-부틸(sec-butyl), 4차-부틸(tert-butyl), 2-메틸부틸(2-methylbutyl), 4차-펜틸(tert-pentyl), 2-메틸-펜틸(2-methyl-pentyl), 3-메틸펜틸(3-methylpentyl), 2-에틸헥실(2-ethylhexyl), 2-프로필펜틸(2-propylpentyl) 같은 포화, 분지형 알킬 모이어티; 및 비제한적으로 비닐(vinyl), 알릴(allyl), 1-부테닐(1-butenyl), 2-부테닐(2-butenyl), 에티닐(ethynyl), 1-프로피닐(1-propynyl), 및 2-프로피닐(2-propynyl)을 포함하는, 상기의 포화 알킬 모이어티로부터 유도된 불포화 알킬 모이어티를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 알킬 모이어티는 저급 알킬 모이어티이다. 또 다른 구현예에서, 상기 알킬 모이어티는 C1 내지 C3 저급 알킬 모이어티이다. 일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 구체적으로 알킬 모이어티(alkyl moiety)를 구성하지 않고, 또는 구체적으로 저급 알킬 모이어티를 구성하지 않으며, 또는 구체적으로 알칸 모이어티(alkane moiety)를 구성하지 않고, 또는 구체적으로 저급 알칸 모이어티를 구성하지 않는다
상기 알킬기(alkyl groups)는 치환되지 않거나 또는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있으며, 상기 치환기는 바람직하게는 상기 접합체의 합성 방법을 간섭하지 않거나 또는 상기 접합체의 생물학적 활성을 제거하지 않는다. 잠재적인 간섭 기능(potentially interfering functionality)은 상기 기능이 비간섭(non-interfering)이 되도록 보호기(protecting group)로 적절하게 차단될 수 있다. 각 치환기는 부가적인 비간섭 치환기로 선택적으로 치환될 수도 있다. 용어 "비간섭(non-interfering)"은 상기 치환기를 본 발명의 방법에 따라 수행되는 어떠한 반응의 실행 가능성도 제거하지 않는 것으로 특징짓는다.
상기 친유성 모이어티는 천연 또는 합성, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 지방산 모이어티 같은 지방산 모이어티이다. 일부 구현예에서, 상기 지방산 모이어티는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 이 이상의 탄소원자를 가진다. 일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 구체적으로 지방산 모이어티를 구성하지 않으며; 또는 구체적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 이 이상의 탄소원자를 가지는 지방산 모이어티를 구성하지 않는다.
상기 모이어티가 아릴 고리(aryl ring)를 포함할 때, 상기 고리는 상기 모이어티가 분자내 방식(intramolecular fashion)에서 카르바메이트 모이어티(carbamate moiety)와 반응할 수 있고 스스로의 가수분해를 보조할 수 있도록 배치되는 친핵성 관능기(OH, 또는 SH 같은)로 기능화될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 친핵성기는, 가수분해되거나 그렇지 않으면 생체내에서(in vivo) 분해 가능한 보호기(protecting group)로 보호되고, 상기 보호기가 보호해제(deprotect)될 때, 상기 접합체의 가수분해 및 상기 모 인슐린 화합물의 결과로서 생긴 방출이 용이하게 되는 결과로 보호된다.
적합한 변형 모이어티의 다른 예는-C(CH2OH)3; -CH(CH2OH)2; -C(CH3)3; -CH(CH3)2를 포함한다.
7.2.9 양친매성 모이어티( Amphiphilic Moieties )
일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 양친매성 모이어티를 포함한다. 많은 폴리머 및 올리고머는 양친매성이다. 이들은 종종, 친수성 및 친유성 모이어티를 포함하는 블록 혼성-폴리머(block co-polymers), 분지형 혼성폴리머(branched copolymers) 또는 그래프트 혼성-폴리머(graft co-polymers)이며, 이들은 선형 사슬, 분지형, 또는 그래프트 폴리머 또는 혼성-폴리머와 같은 올리고머 및/또는 폴리머 형태일 수 있다.
상기 양친매성 변형 모이어티는 여기에 설명되는 어떤 친유성 및 친수성 모이어티의 조합도 포함할 수도 있다. 상기 변형 모이어티는 통상적으로 적어도 하나의 관능기, 예를 들어, 종종 상기 변형 모이어티의 말단에 있는, 할로(halo), 히드록실(hydroxyl), 아민(amine), 티올(thiol), 설폰산(sulfonic acid), 카르복시산(carboxylic acid), 이소시아네이트(isocyanate), 에포폭시(epoxy), 에스테르(ester) 등을 포함한다. 상기 반응성 관능기는 친유성 선형 또는 분지형 사슬 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴알킬, 또는 알킬아릴기, 또는 친유성 폴리머 또는 올리고머를 부착하는데 사용될 수 있고, 그에 따라 상기 변형 모이어티의 지질 친화도를 증가시킬 수 있다(따라서 일반적으로 양친매성이 되게 한다).
상기 친유기는, 예를 들어, 모노- 또는 디- 카르복시산으로부터, 또는 안하이드라이드(anhydrides) 또는 산염화물(acid chlorides)와 같은 카르복시산의 적합한 반응성 등가물(reactive equivalents)에서 유도될 수 있다. 친유기에 적합한 전구체의 예는 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid), 부티르산(butyric acid), 발레르산(valeric acid), 이소부티르산(isobutyric acid), 트리메틸아세트산(trimethylacetic acid), 카프론산(caproic acid), 카프릴산(caprylic acid), 헵탄산(heptanoic acid), 카프르산(capric acid), 펠라르곤산(pelargonic acid), 라우린산(lauric acid), 미리스틴산(myristic acid), 팔미틴산(palmitic acid), 스테린산(stearic acid), 베헤닌산(behenic acid), 리그노세린산(lignoceric acid), 세라틴산(ceratic acid), 몬타논산(montanoic acid), 이소스테아린산(isostearic acid), 이소노나논(isononanoic acid), 2-에틸헥사논산(2-ethylhexanoic acid), 올레산(oleic acid), 리시노렌산(ricinoleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 에루신산(erucic acid), 대두 지방산(soybean fatty acid), 아마인 지방산(linseed fatty acid), 탈수 비버 지방산(dehydrated castor fatty acid), 톨유 지방산(tall oil fatty acid), 오동유 지방산(tung oil fatty acid), 해바라기 지방산(sunflower fatty acid), 잇꽃 지방산(safflower fatty acid), 아크릴산(acrylic acid), 메타아크릴산(methacrylic acid), 무수 말레인산(maleic anhydride), 무수 오르토프탈린산(orthophthalic anhydride), 테레프탈린산(terephthalic acid), 이소프탈린산(isophthalic acid), 아디프산(adipic acid), 아젤란산(azelaic acid), 세바신산(sebacic acid), 무수 테트라하이드로프탈린산(tetrahydrophthalic anhydride), 무수 헥사하드로프탈린산(hexahydrophthalic anhydride), 숙신산(succinic acid) 및 폴리올레핀 카르복실산(polyolefin carboxylic acids)이다.
상기 말단의 친유기는 등가일필요는 없으며, 즉, 상기 생성되는 혼성폴리머는 동일하거나 또는 다른 말단의 친유기를 포함할 수 있다. 상기 친유기는 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 모노(mono) 또는 디(di)-기능성 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 사이클로알킬(cycloalkyl), 아릴알킬(arylalkyl) 또는 알킬아릴(alkylaryl)기이다.
7.2.10 PAG - 알킬 변형 모이어티( PAG - alkyl Modifying Moieties )
상기 변형 모이어티는 하나 이상의 선형 또는 분지형 PAG 모이어티 및/또는 하나 이상의 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환 알킬 모이어티를 가지는 선형 또는 분지형 폴리머형 모이어티일 수도 있다. 특정한 경우에, 상기 모이어티는 양친매성으로 간주되며; 그런, 상기 PAG 및 알킬 모이어티는 상기 모이어티가 더욱 친유성 또는 더욱 친수성이 되도록 변화될 수도 있다. 특정 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 구체적으로 알킬 모이어티를 구성하지 않고, 다른 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 구체적으로 알칸 모이어티를 구성하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 PAG 모이어티는 선형 또는 분지형 형태로 배열된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 PAG 서브유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 PAG 모이어티는 PEG, PPG 및/또는 PBG 서브유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 알킬 모이어티는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 탄소원자를 가진다. 상기 알킬 모이어티는 바람직하게는 알칸 모이어티이다. 상기 변형 모이어티는 -OCH3 같은 캡핑 모이어티를 포함할 수도 있다. 더욱이, 상기 변형 모이어티는 피발로일기(pivaloyl group) 같은 소수성기(hydrophobic group)를 포함할 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 다음의 일반식을 가지며,:
Figure 112007014591843-pct00004
(일반식 I)
여기서, o, p 및 q는 독립적으로 O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50이고, o, p 및 q 중 적어도 하나는 2 이상이다. X, Y 및 Z는 -C-, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NH-, -NHC(O)-, 및 -C(O)NH-으로부터 독립적으로 선택되고, R은 H 또는 알킬, 바람직하게는 저급 알킬, 보다 바람직하게는 메틸이다. 상기 변수 o, p 및 q는 바람직하게는 친수성 또는 양친매성 변형 모이어티를 수득하도록 선택되고, 바람직하게는 친수성 또는 양친매성 인슐린 화합물 접합체, 바람직하게는 단일접합체(monoconjugate), 이접합체(diconjugate) 또는 삼접합체(triconjugate)를 수득하도록 인슐린 화합물과 관련하여 선택된다. 염기성 인슐린 화합물 유지에 사용되는 인슐린 화합물 접합체에 대한 바람직한 일 구현예에서, o, p 및 q는 상기 인슐린 화합물과 인접하는(proximal) PAG 및 상기 인슐린 화합물 말단의(distal) 알킬 모이어티를 수득하도록 선택된다. 택일적으로 O, P 및 Q는 상기 인슐린 화합물과 인접하는(proximal) 알킬 모이어티 및 상기 인슐린 화합물 말단의(distal) PAG를 수득하도록 선택된다. 택일적인 구현예에서, R은 피발로일기 또는 알킬-피발로일기이다.
관련 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 다음의 일반식을 가지며:
Figure 112007014591843-pct00005
(일반식 II),
여기서, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이고, n은 2 ~ 100, 바람직하게는 2 ~ 50, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이며, X는 -C-, -O-, -C(O)-, -NH-, -NHC(O)-, 또는 -C(O)NH-이고, Y는 저급 알킬 또는 -H이다. X는 바람직하게는 0이고, Y는 바람직하게는 -CH3이다. 일부 경우에, 상기 카르보닐기(carbonyl group)(-C(O)-)는 부재(absent)일 수도 있고, 상기 -(CH2)-모이어티는 하이드록시기(hydroxyl group) 또는 자유 카르복시산기(free carboxyllic acid group)와 같은 아미노산 상의 가용기(available group)와 결합할 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 아래에서 선택되는 구조를 가진다:
Figure 112007014591843-pct00006
, 및
(상기 바로 앞선(immediately preceding) 변형 모이어티가 B29에서 인간 인슐린과 결합할 때, 상기 생성되는 단일접합체는 IN105로 언급된다)
Figure 112007014591843-pct00007
,
(상기 바로 앞선(immediately preceding) 변형 모이어티가 B29에서 인간 인슐린과 결합할 때, 상기 생성되는 단일접합체는 HIM2로 언급된다). 전술한 모이어티의 어떤 것은, 예를 들어, 친핵성 잔기, 예를 들어, A1, B1 또는 B29에서 인간 인슐린과 결합할 수도 있다. 일부 경우에, 상기 카르보닐기(carbonyl group)(-C(O)-)는 부재(absent)이거나 또는 알킬 모이어티, 바람직하게는 저급 알킬 모이어티로 치환될 수도 있으며, 상기 -(CH2)-모이어티는 하이드록시기(hydroxyl group) 또는 자유 카르복시산기(free carboxyllic acid group)와 같은 아미노산 상의 가용기(available group)와 결합할 수도 있다.
다른 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 다음의 일반식을 가지며:
Figure 112007014591843-pct00008
(일반식 III),
여기서, 각각의 C는 독립적으로 선택되고, m 탄소를 가지는 알킬 모이어티이며, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이고; 각각의 PAG는 독립적으로 선택되며, n 서브유닛을 가지는 PAG 모이어티이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이며; 각각의 X는 독립적으로 선택되고 PAG와 C를 결합하는 결합 모이어티(linking moiety)이며, 바람직하게는 -C-, -O-, -C(O)-, -NH-, -NHC(O)-, 또는 -C(O)NH-이다. 일부 구현예에서, 상기 Cm-X 모이어티는 부재(absent)이고, 상기 PAGn 모이어티는 -OH 모이어티 또는 -OCH3 모이어티로 말단화된다. 예를 들어, 상기 PAG는 PEG, PPG, 및/또는 PBG를 포함하는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 PAG 서브유닛을 가지는, 메톡시-말단(methoxy-terminated) 또는 하이드록시-말단(hydroxy-terminated) PAG일 수도 있다. 일부 경우에, 상기 카르보닐기(carbonyl group)(-C(O)-)는, 하이드록시기(hydroxyl group) 또는 자유 카르복시산기(free carboxyllic acid group)와 같은 아미노산 상의 가용기(available group)와 결합할 수도 있는 알킬 모이어티, 바람직하게는 저급 알킬 모이어티로 대체될 수도 있다.
상기 변형 모이어티는, 예를 들어, 다음의 일반식을 가지며:
Figure 112007014591843-pct00009
(일반식 IV),
여기서, 각각의 C는 독립적으로 선택되고, m 탄소를 가지는 알킬 모이어티이며, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이고; 각각의 PAG는 독립적으로 선택되며, n 서브유닛을 가지는 PAG 모이어티이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이며; X는 -O-, 또는 -NH-이고; 각각의 o는 독립적으로 선택되며 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 예를 들어, 상기 PAG는, PEG, PPG,및/또는 PBG 서브유닛을 포함하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 PAG 서브유닛을 가질 수도 있다. 일부 경우에, 부착점에 근접한(proximal) 상기 카르보닐기(carbonyl group)(-C(O)-)는 부재(absent)이거나, 또는 알킬 모이어티, 바람직하게는 저급 알킬 모이어티로 대체될 수도 있고, 상기 -(CH2)-모이어티는 하이드록시기(hydroxyl group) 또는 자유 카르복시산기(free carboxyllic acid group)와 같은 아미노산 상의 가용기(available group)와 결합할 수도 있다.
상기 변형 모이어티는, 예를 들어, 다음의 일반식을 가질 수도 있으며:
Figure 112007014591843-pct00010
(일반식 V),
여기서, 각각의 C는 독립적으로 선택되고, m 탄소를 가지는 알킬 모이어티이며, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이고; 각각의 PAG는 독립적으로 선택되며, n 서브유닛을 가지는 PAG 모이어티이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이며; 각각의 X는 독립적으로 선택되고 PAG와 C를 결합하는 결합 모이어티(linking moiety)이며, 바람직하게는 -C-, -O-, -C(O)-, -NH-, -NHC(O)-, 또는 -C(O)NH-이고; 각각의 o는 독립적으로 선택되며 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 일부 구현예에서, 상기 Cm-X 모이어티는 부재(absent)이고, 상기 PAGn 모이어티는 -OH 모이어티 또는 -OCH3 모이어티로 말단화된다. 예를 들어, 상기 PAG는 PEG, PPG, 및/또는 PBG를 포함하는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 PAG 서브유닛을 가지는, 메톡시-말단(methoxy-terminated) 또는 하이드록시-말단(hydroxy-terminated) PAG일 수도 있다. 일부 경우에, 부착점에 근접한(proximal) 상기 카르보닐기(carbonyl group)(-C(O)-)는 부재(absent)일 수도 있고, 상기 -(CH2)-모이어티는 하이드록시기(hydroxyl group) 또는 자유 카르복시산기(free carboxyllic acid group)와 같은 아미노산 상의 가용기(available group)와 결합할 수도 있다.
다른 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 다음의 일반식을 가지며:
Figure 112007014591843-pct00011
(일반식 VI)
여기서, X, Y 및 Z는 독립적으로 선택되는 결합기(linking group)이고, 각각은 선택적으로 존재하며, X는, 존재한다면, 공유결합으로 인슐린 화합물과 결합하고,
R1 및 R2 중 적어도 하나는 존재하고, 저급 알킬(lower alkyl)이며, 카르보닐기(carbonyl group)을 선택적으로 포함할 수도 있고,
R2는 -CH3, -H, 토실레이트(tosylate), 또는 활성화기(activating group)와 같은 캡핑기이며, 및
PAG는 하나 이상의 알칼렌 글리콜 모이어티(alkalene glycol moiety)(즉, 옥시알칼렌 모이어티(oxyalkalene moieties))를 통합하고, 선택적으로 -S-, -O-, -N-, 및 -C(O)-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 모이어티를 통합하는 선형 또는 분지형 탄소사슬이며,
여기서, 상기 변형 모이어티는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 중 최대수의 중원자(heavy ayoms)를 가진다.
본 발명의 구현예에서, X, Y 및 Z 중 하나 이상은 부재(absent)이다. 또한, 존재할 때, X, Y 및/또는 Z는 -C(O)-, -O-, -S-, -C- 및 -N-에서 독립적으로 선택될 수도 있다. 일 구현예에서, Z는 -C(O)-이다. 다른 구현예에서, Z는 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, R1은 저급 알킬이고, R2는 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, R2는 저급 알킬이고, R1은 존재하지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 -C, -C-, -O-, =O, -S-, -N-, -Si-로 구성된 군에서 선택되는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 원자의 백본을 가지는 선형 또는 분지형, 치환 탄소 사슬 모이어티를 포함할 수도 있다. 상기 중원자는 통상적으로 하나 이상의 탄소원자 및 -O-, -S-, -N-, 및 =O로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비탄소 중원자를 포함할 것이다. 상기 탄소원자 및 비탄소 중원자는 통상적으로 모든 비탄소 중원자에 대하여 적어도 1 탄소원자, 바람직하게는 모든 비탄소 중원자에 대하여 적어도 2 탄소원자, 보다 바람직하게는 모든 비탄소 중원자에 대하여 적어도 3 탄소원자의 비율로 존재한다. 상기 탄소원자 및 산소원자는 통상적으로 모든 산소원자에 대하여 적어도 1 탄소원자, 바람직하게는 모든 산소원자에 대하여 적어도 2 탄소원자, 보다 바람직하게는 모든 산소원자에 대하여 적어도 3 탄소원자의 비율로 존재한다. 상기 변형 모이어티는 분지형 또는 선형 C1 -6 같은 캡핑기, 분지형 또는 선형, 또는 카르보닐같은 하나 이상의 캡핑기를 포함할 수도 있다. 상기 변형 모이어티는 통상적으로 수소를 포함할 것이고, 수소의 하나 이상은 불소(중원자이지만 전술한 일반식에서 중원자로서 포함시키지 않는다)로 치환될 수도 있다. 상기 변형 모이어티는 일부 경우에 구체적으로는 비치환 알킬 모이어티를 배제한다. 상기 변형 모이어티는, 예를 들어, 카르바메이트(carbamate), 카르보네이트(carbonate), 에테르(ether), 에스테르(ester), 아미드(amide) 또는 2차 아민기에 의해, 또는 이황화 결합에 의해, 폴리펩티드의 아미노산기, 하이드록시기 또는 자유 카르복시산과 같은 아미노산 상의 가용기와 결합할 수도 있다. 상기 결합기의 분자는 상기 변형 모이어티의 부분으로서 간주된다.바람직한 구현예에서, 상기 변형 모이어티의 분자량은 상기 HIM2 변형 모이어티의 분자량보다 적다.
본 발명은 다음의 일반식을 가지는 변형 모이어티를 포함하며:
Figure 112007014591843-pct00012
(일반식 VII),
여기서, n은 1, 2, 3 또는 4이고, m은 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
본 발명은 다음의 일반식을 가지는 변형 모이어티를 포함하며:
Figure 112007014591843-pct00013
(일반식 VIII),
여기서, n은 1, 2, 3,4 또는 5이고, m은 1, 2, 3 또는 4이다.
본 발명은 다음의 일반식을 가지는 변형 모이어티를 포함하며:
Figure 112007014591843-pct00014
(일반식 IX)
여기서, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12,13,14, 15,16, 17,18, 19 또는 20이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12,13,14, 15,16, 17,18, 19 또는 20이다.
본 발명은 또한 다음의 일반식을 가지는 변형 모이어티를 포함하며:
Figure 112007014591843-pct00015
(일반식 X)
여기서, PAG는 PAG m 서브유닛을 가지는 PAG이고, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이며, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
다른 바람직한 변형 모이어티는 다음을 포함한다:
Figure 112007014591843-pct00016
Figure 112007014591843-pct00017
Figure 112007014591843-pct00018
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Figure 112007014591843-pct00021
Figure 112007014591843-pct00022
및
Figure 112007014591843-pct00023
아래의 변형 모이어티는 염기성 인슐린 화합물 대체요법(replacement regimen)에서 사용하기에 특히 바람직할 수 있다.
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Figure 112007014591843-pct00026
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Figure 112007014591843-pct00031
및
Figure 112007014591843-pct00032
또 다른 변형 모이어티는 다음을 포함하며:
Figure 112007014591843-pct00033
Figure 112007014591843-pct00034
Figure 112007014591843-pct00035
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여기서, R은, -H, -OH, -CH2OH, -CH(OH)2, -C(O)OH, -CH2C(O)OH, 또는 카르보디이미드(carbodiimide), 혼합 무수물(mixed anhydride), 또는 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide) 또는 캡핑기 같은, 활성 모이어티이다. 본 발명은 또한 단백질 또는 펩타이드, 바람직하게는 인슐린 화합물에 부착된 상기 모이어티를 포함한다. 구체적인 접합 방법은 하기에 보다 자세히 논의된다. 상기 변형 모이어티 중에서, 바람직한 모이어티는 상기 인슐린 화합물이 상응하는 비접합 인슐린 화합물보다 약한 친유성 및/또는 보다 강한 친수성이 되게하는 모이어티이다. 본 발명은 하나 이상의 카르보닐기, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 또는 5 카르보닐기를 추가로 포함하는 상기 변형 모이어티를 포함하며, 상기 카르보닐기는 상기 변형 모이어티에 삽입 될 수도 있고, 또는 -O- 또는 -CH2-는 카르보닐로 대체될 수도 있다. 더욱이, 임의의 -CH2- or -CH3- 모이어티는, 예를 들어 저급 알킬 또는 -OH 또는 동일하거나 또는 다를 수도 있는, 1, 2, 3, 4, 또는 5 PAG 서브유닛을 가지는 PAG 사슬로 치환될 수도 있다. 바람직하게는 R은 각각의 -O-가 적어도 2탄소에 의해 가장 가까운 -O-로부터 분리되도록 선택된다. 본 발명은 또한 상기 모이어티의 둘 이상이 리신 같은 분지형 모이어티에 부착되는 분지형 변형 모이어티를 포함한다.
본 발명의 구체예에 따른 접합체의 친수성/지질 친화성과 같은, 약학적 특성은 예를 들어, 상기 변형 모이어티의 친유성 및 친수성 부분을 조정함으로써, 예를 들어, PAG 모노머의 개수의 증가 또는 감소 알킬 사슬의 유형 및 길이, 상기 PAG-펩타이드 결합의 성질, 및 접합지점의 개수를 조정함으로써, 변화할 수 있다. 상기 변형 모이어티-펩타이드의 정확한 성질은, 생리학적 pH에서 또는 플라즈마에서 가수분해에 대해 안정하고(stable) 및/또는 민감(sensitive)하도록, 변화될 수 있다. 본 발명은 또한 폴리펩타이드, 바람직하게는 인슐린 화합물과 결합하는 전술한 어떠한 변형 모이어티도 포함한다. 바람직하게는, 상기 변형 모이어티는 바람직하게는, 상기 변형 모이어티는, 예를 들어 적어도 1.05, 1.25. 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 또는 15의 승수(multiplier)로, 상기 폴리펩타이드가 상응하는 비접합 폴리펩타이드보다 더 용해성이 되도록 한다. 본 발명의 변형 모이어티는, 예를 들어, 임의의 유용한 부착점에서, 인간 인슐린과 같은 인슐린 화합물과 결합할 수도 있다. 바람직한 부착점은 친핵성 잔기, 예를 들어, A1, B1 및/또는 B29이다.
더욱이, 본 발명의 일 측면이 카르복시산 형태의 일반식 VII 및 VIII의 상기 모이어티에 제한되지 않는, 신규한 변형 모이어티를 포함한다는 것은 자명할 것이다. 또한, 상기 변형 모이어티가 카르복시기일 때, 혼합 무수물(mixed anhydrides)로 변환될 수 있고 아미드 결합을 포함하는 접합체를 생성하는 펩타이드의 아미노기와 반응할 수 있다. 다른 절차에서, 상기 카르복시기는 수-용해성 카르보디이미드로 처리될 수 있고, 아미드 결합을 포함하는 접합체를 생성하는 펩타이드와 반응할 수 있다. 결국, 본 발명은 일반식 VII 및 VIII의 변형 모이어티의 활성형태 같이, 여기에 존재하는 신규한 모이어티의 활성형태 및 카르보디이미드, 혼합 무수물, 또는 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimides) 같은, 본 발명의 다른 신규한 올리고머를 포함한다.
일부 경우에, 상기 변형 모이어티는 일 아미노산 또는 C-말단과 결합하는 둘 이상의 연속(series of) 아미노산을 통하여 폴리펩타이드와 결합할 수도 있고, 또는 폴리펩타이드의 측쇄와 결합할 수도 이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 Thr의 -OH 또는 -C(O)OH에서 결합하고, 상기 mm-변경(mm-modified) Thr은 카르복시 말단에서 폴리펩타이드어와 결합한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 Thr의 -OH 또는 -C(O)OH에서 결합하고, 상기 변형된 Thr은 데스(des)-Thr 인슐린 화합물의 B29 아미노산(예를 들어, 인간 인슐린에서 B29 Lys)과 결합한다. 다른 예에서, 상기 mm은 인슐린 화합물 B-사슬로부터 말단 옥타펩타이드(octapeptide)의 Thr의 -OH 또는 -C(O)OH에서 결합하고, 상기 mm-변경 옥타펩타이드는 데스-옥타(des-octa) 인슐린 화합물의 B22 아미노산과 결합한다. 다른 변형들은 본 명세서의 관점에서 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다.
7.2.11 염-형성 모이어티( Salt - forming Moieties )
일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 염-형성 모이어티를 포함한다. 상기 염-형성 모이어티는 카르복실레이트(carboxylate) 및 암모늄(ammonium)을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 당업자에 의해 이해되는 다양하고 적합한 염-형성 모이어티일 수도 있다. 일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티가 염 형성 모이어티를 포함할 때, 상기 인슐린 화합물 접합체는 n 염 폼(form)으로 제공된다. 상기 구현예에서, 상기 인슐린 화합물 접합체는 클로로(chloro), 브롬(bromo), 요오드(iodo), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 카르보네이트(carbonate), 설페이트(sulfate), 토실레이트(tosylate), 및 메실레이트(mesylate)와 같은 음이온(negative ions), 또는 나트륨(sodium), 칼륨(potassium), 칼슘(calcium), 리튬(lithium), 및 암모늄(ammonium)과 같은 양이온(positive ions)을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 당업자에 의해 이해되는, 적합하고 약학적으로 허용가능한 반대이온(counterion)과 관련있다.
변형 모이어티의 전술한 예시는 구체화하려는 의도이며, 어떤 방식으로든 한정하려 하는 것으로 받아들여서는 안된다. 당기술분야의 당업자는 특정 기능을 수득하기 위한 접합에 적합한 모이어티가 여기에 설명되고 청구된 화학적 접합 메카니즘(mechanisms) 기반 내에서 가능할 것이라는 것을 인지할 것이다. 따라서, 부가적인 모이어티는 여기에 설명된 바와 같이 원리에 따라 선택되고 사용될 수 있다.
7.3 접합 방법( Conjugation Strategies )
변형 모이어티와의 접합정도, 분자상에 접합자리의 선택, 및 변형 모이어티의 선택과 같은 인자(factor)는, 예를 들어, 생체내(in vivo) 분해에 보다 적게 영향받고, 따라서, 플라즈마 반감기가 증가된 접합체를 생성하도록 변경될 수도 있다. 예를 들어, 상기 인슐린 화합물은 변형 모이어티의 결합을 용이하게 하기 위하여 적절한 부착(attachment)(즉, 변형 모이어티 접합)자리에서 상기 인슐린 화합물 구조상에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 자리에 변형 모이어티를 포함하도록 변형될 수도 있다. 예로서, 상기 적합한 접합자리는 리신(lysine) 아미노산 잔기와 같은, 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.
일부 예에서, 상기 인슐린 화합물 접합체는 단일접합체(mono-conjugates)이다. 다른 구현예에서, 상기 인슐린 화합물 접합체는 이접합체(di-conjugates), 삼접합체(tri-conjugates), 사접합체(tetra-conjugates), 오접합체(penta-conjugates) 등과 같은 다중접합체이다. 상기 인슐린 화합물 상의 변형 모이어티의 개수는 상기 인슐린 화합물 상의 접합자리의 개수에 의해서만 제한된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 인슐린 화합물 접합체는 일접합체, 이접합체, 삼접합체, 사접합체, 및/또는 오접합체의 혼합물이다.
바람직한 접합방법은 상기 모 인슐린 화합물의 일부 또는 전체 생체활성(bioactivity)과 관련있는 접합체를 수득하는 방법이다.
바람직한 접합 자리는 A1 N-말단, B1 N-말단, 및 B29 리신 측쇄를 포함한다. 상기 B29 단일접합체 및 B1, B29 이접합체는 매우 바람직하다. 다른 바람직한 부착점은 상기 인슐린 화합물의 C-펩타이드 성분 또는 리더 펩타이드 성분 상의 아미노기이다.
하나 이상의 변형 모이어티(즉, 단일 또는 다수의 변형 모이어티 구조)는 상기 인슐린 화합물과 결합할 수도 있다. 다수 개의 상기 변형 모이어티는 바람직하게는 동일하다. 그러나, 상기 다수 개의 변형 모이어티는 서로 다를 수도 있고, 또는 택일적으로, 다수 개의 변형 모이어티 중 일부는 동일 할 수도 있으며, 일부는 다를 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 다수 개의 변형 모이어티가 상기 인슐린 화합물과 결합할 때, 하나 이상의 변형 모이어티와 상기 인슐린 화합물을 가수분해성 결합으로 결합 및 하나 이상의 변형 모이어티와 상기 인슐린 화합물을 비가수분해성 결합으로 결합하는 것이 보다 바람직할 수도 있다. 택일적으로, 다수 개의 변형 모이어티와 상기 인슐린 화합물을 결합시키는 결합 모두는 가수분해성일 수도 있지만, 변화하는 가수분해도(degrees of hydrolability)를 가지는데, 예를 들어, 하나 이상의 변형 모이어티가 바디(body)에서 가수분해에 의해 상기 인슐린 화합물로부터 신속히(rapidly) 제거될 수도 있고, 하나 이상의 변형 모이어티가 바디(body)에서 가수분해에 의해 상기 인슐린 화합물로부터 천천히(slowly) 제거될 수도 있도록한다.
7.3.1 변형 모이어티와 인슐린 화합물의 결합( Coupling of Modifying Moiety to Insulin Compound )
상기 변형 모이어티는 바람직하게는 상기 인슐린 화합물과 공유결합으로 결합한다. 상기 변형 모이어티 상에 하나 이상의 모이어티는 상기 인슐린 화합물과 공유결합으로 결합할 수도 있다. 결합은 가수분해성 또는 비가수분해성 결합 또는 이 둘의 혼합물을 이용할 수도 있다(즉, 다른 접합자리에서 다른 결합).
일부 구현예에서, 상기 인슐린 화합물은 가수분해성 결합을 이용하여 상기 변형 모이어티와 결합한다(예를들어, 에스테르(ester), 카르보네이트(carbonate) 또는 가수분해성 카바메이트(carbamate) 결합). 가수분해성 결합의 사용은 전구약물로서 작용하는 인슐린 화합물 접합체를 제공할 것이다. 전구약물 접근법은 상기 인슐린 화합물-변형 모이어티 접합체가, 상기 변형 모이어티 접합자리가 인슐린 화합물의 결합영역에 있을 때처럼, 비활성(즉, 상기 접합체는 상기 인슐린 화합물의 첫번째 작용 메카니즘을 통해서 바디(body)에 영향을 주는 성능이 부족하다)일 경우에 바람직하다. 가수분해성 결합의 사용은 또한, 활성 약물을 제공하도록 하나 이상의 변형 모이어티가 각각의 인슐린 화합물-변형 모이어티 접합체로부터 절단되기 때문에 규정된 시간에 걸쳐 상기 인슐린 화합물을 투여하면서, 지속방출성(time-release) 또는 서방성(controlled-release) 효과를 제공할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 인슐린 화합물은 비가수분해성 결합(예를 들어, 비가수분해성 카바마이트(carbamate), 아미드(amide), 또는 에테르(ether) 결합)을 이용하여 상기 변형 모이어티와 결합한다. 상기 인슐린 화합물-변형 모이어티 접합체가 연장된 기간 동안, 예를 들어, 투약 후 2시간 동안, 혈류에서 순환하도록 상기 인슐린 화합물 접합체의 치료학적으로 중요한 양을 허용하는 것이 바람직할 경우, 비가수분해성 결합의 사용이 바람직할 수도 있다. 비가수분해성 방식(fashion)에서 상기 인슐린 화합물과 상기 변형 모이어티를 공유결합하는데 사용되는 결합은 통상적으로 공유결합, 에스테르 모이어티, 카르보네이트 모이어티, 카바메이트 모이어티, 아미드 모이어티 및 이차 아민 모이어티로 구성된 군에서 선택된다.
친핵성 하이드록시 관능기(nucleophilic hydroxyl functions) 및/또는 아미노 관능기(amino functions)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 친핵성 잔기에서 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물과 결합할 수도 있다. 친핵성 하이드록시 관능기는 예를 들어, 세린(serine) 및/또는 티로신(tyrosine) 잔기에서 발견될 수도 있고, 친핵성 아미노 관능기는 예를 들어, 히스티딘(histidine) 및/또는 Lys 잔기에서, 및/또는 상기 인슐린 화합물의 A 또는 B 사슬의 하나 이상의 N-말단에서 발견될 수도 있다. 변형 모이어티가 상기 나트리우레틱 펩타이드의 N-말단과 결합할 때, 결합은 바람직하게는 이차 아민(secondary amine)을 형성한다.
상기 변형 모이어티는, 예를 들어, 티오에스테르(thioester), 티오에테르(thioether) 또는 설포네이트 결합(sulfonate bond)을 형성함으로써, 자유 -SH기에서 상기 인슐린 화합물과 결합할 수도 있다.
상기 변형 모이어티는 하나 이상의 아미노기를 통해서 상기 인슐린 화합물과 결합할 수도 있다. 인간 인슐린의 예는 A1, B1, 및 B29에서 아미노기를 포함한다. 일 구현예에서, 단일 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 상의 단일 아미노기와 결합한다. 다른 구현예에서, 두 개의 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 상의 다른 아미노기와 각각 연결된다. 두 개의 아미노기와 결합하는 두 개의 변형 모이어티가 있을 때, 바람직한 배열은 B1 및 B29의 결합이다. 다중 폴리머가 있을 때, 상기 폴리머는 모두 동일할 수도 있고, 또는 하나 이상의 상기 폴리머는 서로 다를 수도 있다. 폴리머와 상기 인슐린 화합물 결합의 다양한 방법 및 유형은, 전문이 참조로서 여기에 포함되며, 2001년 6월 4일에 출원된 미국 특허출원 09/873,899, "Mixtures of insulin compound conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same"에 설명되어 있다. 또 다른 구현예에서, 일부 전구약물 접근법이 사용될 수도 있으며, 상기 변형 모이어티의 일부분은 가수분해된다. 예를 들어, 친유성 성분이 생체내(in vivo)에서 가수분해하여 마이크로peg화 접합체(micropegylated conjugate)를 수득하도록 하는 친수성 및 친유성 성분을 가지는 변형 모이어티를 설명하는, Ekwuribe et al .의 미국특허 제6,309,633호(전문이 참조로서 여기에 포함됨)를 참조하시오.
7.3.2 변형 모이어티의 선택 및 인슐린-화합물 접합체 및 이들의 착물의 특성( Selection of Modifying Moiety and Properties of the Insulin - Compound Conjugate and Complexes Thereof )
상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 접합체 및 이들의 착물에 바람직한 특성을 제공하도록 선택될 수도 있다. 바람직한 변형 모이어티는, 수성 용액(aqueous solution)에서 상기 인슐린 화합물이 상기 변형 모이어티의 부재시 상기 인슐린 화합물의 수용해도보다 더 용해성이 되도록, 바람직하게는 수성 용액에서 상기 모 인슐린 화합물(즉, 상응하는 비접합 인슐린 화합물)보다 적어도 1.05, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 또는 15배 용해성이 되도록 선택된다. 예를 들어, 착물화 되지 않은(uncomplexed) 천연 인간 인슐린은 pH 약 7.4에서 ~18mg/ml의 용해도를 가진다. 본 발명자들은 적어도 1.05, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 또는 15 승수(multiplier)로 인간 인슐린보다 더 용해성인 인간 인슐린 접합체를 착물화하는 방법을 발견하였다.
특정 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 인슐린 화합물 접합체가, 약 4 ~ 약 8의 범위인 pH에서, 바람직하게는 약 5 ~ 약 7.5의 범위인 pH에서, 이상적으로는 약 7.4의 pH에서 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 20 g/L, 50 g/L, 100 g/L, 또는 심지어 150 g/L 까지도 초과하는 수성 용해도(aqueous solubility)를 가지도록 선택된다.
상기 인슐린 화합물 접합체는 상응하는 비접합 인슐린 화합물처럼, 과학적으로 허용가능한 제어보다 많이 포유류에서 구강으로 생체에 이용가능할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 인슐린 화합물 접합체는 상응하는 비접합 인슐린 화합물처럼, 과학적으로 허용가능한 제어보다 많이 인간에서 구강으로 생체에 이용가능할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 인슐린 화합물의 흡수는 예를 들어 상기 접합체의 플라즈마 수준(plasma levels)에 의해 측정되는 것처럼, 비접합 인슐린 화합물 제어의 흡수보다 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 또는 4배 더 크다.
본 발명의 일부 측면에서 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 접합체가 상응하는 비접합 인슐린 화합물보다 더욱 용해성이 되도록 선택되는 반면, 다른 측면에서, 상기 변형 모이어티는 역시 또는 택일적으로, 상기 인슐린 화합물 접합체가 상응하는 비접합 인슐린 화합물과 동일하게 또는 더욱 친수성이 되도록 선택될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 또한, 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 접합체가 상응하는 비접합 인슐린 화합물보다 더욱 양친매성으로 되도록 선택될 수도 있다.
일부 구현예에서, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체는 수용해성(water soluble)과 동일하거나 또는 (a) 상응하는 비착물화 인슐린 화합물 접합체, (b) 상응하는 비착물화 및 비접합 인슐린 화합물, 및/또는 (c) 상응하는 착물이지만 비접합체인 인슐린 화합물 보다 더욱 수용해성이다.
바람직한 구현예에서, 상기 인슐린 화합물 접합체의 수용해도는 Zn++의 첨가에 의해 감소된다. 일부 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 접합체가 상응하는 비접합 인슐린 화합물과 동일하게 용해성이 되도록 또는 더욱 용해성이 되도록 선택되고, 상기 인슐린 화합물 접합체의 수용해도는 아연의 첨가에 의해 감소된다. 다른 구현예에서, 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 화합물 접합체가 상응하는 비접합 인슐린 화합물과 동일하게 용해성이 되도록 또는 더욱 용해성이 되도록 선택되고, 상기 인슐린 화합물 접합체의 수용해도는 아연의 첨가에 의해 감소되며, 상기 양이온 착물의 수용해도는 인슐린 화합물의 수용해도보다 크다. 다른 측면에서, 상기 인슐린 화합물 접합체는 지방산 아실화 인슐린 화합물(fatty acid acylated insulin compound)이고, 상기 양이온은 아연이며, 상기 인슐린 화합물 접합체의 수용해도는 아연의 첨가에 의해 감소된다. 또 다른 예에서, 상기 인슐린 화합물 접합체는, 상응하는 비접합 인슐린 화합물과 동일하거나 또는 더욱 용해성인 지방산 아실화 인슐린 화합물(fatty acid acylated insulin compound)이고, 상기 양이온은 아연이며, 상기 인슐린 화합물 접합체의 수용해도는 아연의 첨가에 의해 감소된다.
특정한 바람직한 구현예에서, 상응하는 모 인슐린 화합물에 비하여 상기 인슐린 화합물 접합체의 지질 친화도는 1 또는 1 미만이다. 상응하는 모 인슐린 화합물과 비교하여 상기 인슐린 화합물 접합체의 상대적인 지질 친화도(krel)는, 예를 들어 다음과 같이 결정될 수 있으며: krel = (t접합체 - to)/(t인간 - t0), 여기서, 상대적인 지질 친화도는 40℃에서 등용매 용리(isocratic elution)에 의하여 LiChroSorb RP18 (5㎛, 250 X 4 mm) 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼에서 측정된다. 아래의 혼합물은 용리액(eluents)로서 사용될 수 있다: 10% 아세토니트릴(acetonitrile)을 함유하는, pH 7.3에서 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer) 및 수중 50% 아세토니트릴(50% acetonitrile in water). 보이드 타임(void time)(t0)은 질산나트륨(sodium nitrate) 0.1 mM을 주입함으로써 규정(정의)된다. 인간 인슐린에 대한 체류시간(retention time)은, (c)(i) 및 (c)(ii)의 혼합물 사이에서 비율(ration)을 변화시킴으로써 적어도 2t0으로 조정된다. 바람직하게는, 상기 실시예에서, 상기 상대적인 지질 친화도는 약 1과 동일하거나 또는 1 미만이거나 또는 1보다 상당히 적다. 바람직한 구현예에서, 상기 인슐린 화합물은 인간 인슐린이고, 상기 상대적인 지질 친화도는 1 미만이다. 바람직하게는 상기 상대적인 지질 친화도는 약 0.99, 0.98, 0.97, 0.96, 0.95, 0.94, 0.93, 0.92, 0.91, 또는 0.90 미만이다. 인슐린 및 인슐린 접합체의 용해도 및/또는 지질 친화도를 결정하는 기법에 대한 논의는, 전문이 참조로서 여기에 포함되는, 1998년 5월 12일에 출원된 Harelund et al .의 공고된 미국 특허 5,750,499, "Acylated insulin"에 설명되어 있다.
일 구현예에서, 상기 상대적인 지질 친화도는 상기에 설명된 바와 같고, 상기 변형 모이어티는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 탄소를 가지는 탄소사슬이며, 이때 상기 탄소사슬은 내부에 삽입되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 옥시기(oxy groups)를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 상대적인 지질 친화도는 상기에 설명된 바와 같고, 상기 변형 모이어티는 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 탄소를 가지는 탄소사슬이며, 이때 상기 탄소사슬은 내부에 삽입되는 2, 3 또는 4 옥시기(oxy groups)를 포함한다. 관련 구현예에서, 상기 상대적인 지질 친화도는 상기에 설명된 바와 같고, 상기 변형 모이어티는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 폴리알칼렌 글리콜 유닛(polyalkalene glycol units)을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 상기 상대적인 지질 친화도는 상기에 설명된 바와 같고, 상기 변형 모이어티는 2, 3 또는 4 폴리에틸렌 글리콜 유닛(polyethylene glycol units) 및 1, 2 또는 3 폴리프로필렌 글리콜 유닛(polypropylene glycol units)을 포함한다.
7.4 금속 양이온 성분 및 착물의 특성( Metal Cation Component and Characteristics of Complexes )
상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물은 금속 양이온을 포함한다. 상기 양이온 성분으로서 사용하기에 적합한 금속 양이온은 상기 인슐린 화합물 접합체와 착물화(complexing), 집합화(aggregating), 또는 결정화(crystallizing)할 수 있는 임의의 금속 양이온을 포함한다. 상기 금속 양이온은 상기 인슐린 화합물 접합체로 착물화되는 것이 바람직하다. 단일 또는 다중 양이온이 사용된다. 상기 양이온은 바람직하게는 상기 인슐린 화합물 접합체로 현저히 산화하지 않고, 즉, 상기 착물은 이들의 의도하고자 하는 목적에 쓸모없게 되는 정도까지 산화하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 금속 양이온은 생체적합성이다. 금속 양이온은 주입자리(injection site)에서의 상당한 면역학적인 반응과 같이, 수용자의 체네에서 과도하게 크지 않은 유해한 효과를 나타낸다. 그러나, 일부 환경에서, 상기 독성의 위험 및 다른 유해효과는 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물의 장점에 의해 결함을 능가하고(outweighed), 따라서 상기 환경에서 허용가능할 수도 있다.
생물학적 활성제를 안정화하기 위한 금속 양이온의 적합성 및 필요한 생물학적 활성제에 대한 금속 양이온의 비율은, 입자크기 감소 및/또는 캡슐화 이전에(prior to) 및 다음에(following) 금속 양이온-안정화된 생물학적 활성제의 입자상에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis), 등전압 포커싱(isoelectric focusing), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 및 HPLC 분석법과 같은 안정도에 대한 다양한 테스트를 수행함으로써 기술분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.
상기 금속 양이온 성분은 하나 이상의 1가(monovalent), 2가(divalent), 또는 3가(trivalent) 금속 양이온, 또는 이들의 조합을 적절하게 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 금속 양이온은 II족(Group II) 또는 전이금속 양이온이다. 적절한 2가 양이온의 예는 Zn++, Mn++, Ca++, Fe++, Ni++, Cu++, Co++ 및/또는 Mg++를 포함한다. 1가 양이온이 포함될 때, 이것은 바람직하게는 Na+, Li+, 또는 K+이다. 상기 양이온은 바람직하게는 염화염 또는 아세테이트염, 가장 바람직하게는 ZnCl2 및 ZnAc과 같은 염으로서 첨가된다.
인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 일반적으로 약 1:1과 약 1:100 사이, 바람직하게는 약 1:2와 약 1:12 사이이며, 가장 바람직하게는 약 1:2와 약 1:7 사이 또는 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 1:7이다. 구체적인 구현예에서, Zn++은 양이온 성분으로서 사용되며, 이것은 약 1:1 및 약 1:100, 바람직하게는 약 1:2와 약 1:12 사이, 보다 바람직학는 약 1:2와 약 1:7 사이 또는 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 1:7의 아연 양이온 성분 대 인슐린 화합물 접합체 몰비에서 제공된다.
상기 양이온 성분은 바람직하게는 Zn++ 같은 약 90% 단일 양이온보다 많다. 바람직하게는, 상기 양이온은 약 95%, 99%, 또는 99.9% Zn++ 보다 많다.
바람직하게는 키모트립신 분해에 대한 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체의 내성은 상응하는 비착물화 인슐린 화합물 접합체의 키모트립신 분해의 내성보다 크다. 바람직하게는 키모트립신 분해에 대한 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체의 내성은 상응하는 착물화된 비접합(complexed but unconjugated) 인슐린 화합물의 키모트립신 분해의 내성보다 크다.
상기 착물화 인슐린 화합물 접합체는 상응하는 비착물 인슐린 화합물 접합체처럼, 포유류에서 과학적으로 허용가능한 제어보다 경구적으로 보다 많이 생체에 이용가능할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체는 상응하는 비착물화 인슐린 화합물 접합체처럼, 인간에서 과학적으로 허용가능한 제어보다 경구적으로 보다 많이 생체에 이용가능할 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어 상기 접합체의 플라즈마 수준(plasma levels)에 의해 측정되는 상기 착물화 인슐린 화합물의 흡수는 비착물화 인슐린 화합물 접합체의 흡수보다 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 또는 4배 크다.
상기 착물화 인슐린 화합물 접합체는 상응하는 착물화 비접합 인슐린 화합물처럼, 포유류에서 과학적으로 허용가능한 제어보다 경구적으로 보다 많이 생체에 이용가능할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체는 상응하는 착물화 비접합 인슐린 화합물처럼, 인간에서 과학적으로 허용가능한 제어보다 경구적으로 보다 많이 생체에 이용가능할 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어 상기 접합체의 플라즈마 수준(plasma levels)에 의해 측정되는 상기 착물화 인슐린 화합물의 흡수는 착물화 비접합 인슐린 화합물 접합체의 흡수보다 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 또는 4배 크다.
7.5 착물화제 ( Complexing agents )
일부 구현예에서, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물은 하나 이상의 착물화제를 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 착물화제의 예는 프로타민(protamines), 설펜(surfen), 글로빈 단백질(globin proteins), 스페르민(spermine), 스페르미딘 알부민(spermidine albumin), 아미노산(amino acids), 카르복시산(carboxylic acids), 다중양이온성 폴리머 화합물(polycationic polymer compounds), 양이온성 폴리펩티드(cationic polypeptides), 음이온성 폴리펩티드(anionic polypeptides), 뉴클레오티드(nucleotides), 및 안티센스(antisense)를 포함한다. 전문이 참조로서 여기에 포함되는, Brange, J., Galenics of Insulin compound, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1987)을 참조하시오. 상기 조성물을 안정화하기 위한 착물화제의 적합성은 본 명세서의 관점에서 기술분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물은 구체적으로 착물화제를 배제하거나 또는 상당히 회피한다.
바람직한 착물화제는 프로타민(protamine)이다. 고체형태에서, 상기 프로타민은 인슐린 화합물 대 프로타민에 대하여 바람직하게는 약 3:1 내지 약 1:3의 몰비, 보다 바람직하게는 약 2:1 내지 약 1:2의 몰비, 이상적으로는 약 1:1의 몰비로 존재할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물은 구체적으로 착물화제를 배제하거나 또는 상당히 회피한다.
아미노산은 또한 착물화제로서 예를 들어, 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 세린 트레오닌(serine threonine), 페닐 알라닌(phenyl alanine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid), 및 히스티딘(histidine), 및 디글리신(diglycine)과 같은 올리고펩타이드(oligopeptides)로서 사용된다.
카르복시산(carboxylic acids) 또한 착물화제로서 사용하기에 적합하며; 예는, 아세트산(acetic acid) 및, 시트르산(citric acid), 3-하이드록시부티르산(3-hydroxybutyric acid) 및 락트산(lactic acid) 같은 하이드록시카르복시산(hydroxycarboxylic acids)을 포함한다.
7.6 안정화제( Stabilizing agents )
일부 구현예에서, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물은 하나 이상의 안정화제를 포함한다. 바람직한 안정화제는 페놀 화합물(phenolic compounds) 및 방향족 화합물(aromatic compounds)을 포함한다. 바람직한 페놀 화합물은 페놀(phenol), m-크레졸(m-cresol) 및 m-파라벤(m-paraben) 또는 이들의 혼합물이다. 상기 안정화제는 상기 안정화제의 부재시의 상응하는 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물 처럼, 과학적으로 허용가능한 제어와 관련하여 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물의 안정성을 향상시키는 임의의 양으로 제공될 수도 있다.
7.7 착물의 제공( Presentation of Complexes )
상기 착물은 양이온-인슐린 화합물 접합체의 실질적인 순수 파우더(subbstantially pure powder), 또는 약학적으로 허용가능한 다른 성분과 함께 양이온-인슐린 화합물 접합체 고체를 포함하는 파우더와 같은, 건조 고체(dry solid)로서 제공될 수도 있다. 상기 착물을 또한, 수성 또한 유기성 매질에서 용해된 상태 및/또는 상기 매질에서 용해되지 않은 고체로 제공될 수도 있다.
7.7.1 고체 조성물( Solid Compositions )
상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물은 고체로서 제공될 수도 있다. 상기 고체는 예를 들어, 건조된 상태로 또는 수성 용액(aqueous solution), 유기성 용매(organic solvent), 유탁액(emulsion), 미세유탁액(microemulsion), 또는 건조되지 않은 다른 형태의 용해되지 않은 상태일 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물은 순수 가공 고체 조성물(pure processed solid composition)로서 제공된다. 순수 가공 고체 조성물(pure processed solid compostion)에서, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 일반적으로 약 3:4 내지 약 3:0.5(인슐린 화합물 접합체:양이온), 약 3:3.5 내지 약 3:1, 또는 이상적으로(ideally) 약 3:1이다.
가공된 순수 고체 T-형 조성물(processed pure solid T-type compostion)(양이온, 인슐린 화합물 접합체는 함께, 그러나 프로타민은 없음)에서, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 일반적으로 약 3:4 내지 약 3:0.5(인슐린 화합물 접합체 : 양이온), 약 3:3.5 내지 약 3:1, 또는 이상적으로 약 3:1이다. 가공된 순수 고체 T형 프로타민 조성물(양이온, 인슐린 화합물 접합체는 함께, 그러나 프로타민은 없음)에서, 인슐린 화합물 대 양이온의 몰비는 일반적으로 약 3:6 내지 약 3:0.5(인슐린 화합물 접합체 : 양이온), 약 3:5 내지 약 3:1, 또는 이상적으로 약 3:2이다.
가공된 순수 고체 R-형(렌테(lente)) 조성물(양이온, 인슐린 화합물 및 안정화 화합물(예를 들어, 페놀 용액)은 함께,그러나 프로타민은 없음)에서, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 일반적으로 약 3:4.5 내지 약 3:0.9, 바람직하게는 약 3:3.9 내지 약 3:2.4의 범위일 수 있다.가공된 순수 고체 R-형(울트라렌테(ultralente)) 조성물(양이온, 인슐린 화합물 및 안정화 화합물(예를 들어, 페놀 용액)은 함께,그러나 프로타민은 없음)에서, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 일반적으로 약 3:12에서 약 3:4.5 이상, 바람직하게는 약 3:9 내지 약 3:4.8, 보다 바람직하게는 약 3:6 내지 약 3:5.4의 범위일 수 있다. 가공된 순수 고체 R-형 프로타민 조성물(양이온, 인슐린 화합물 및 안정화제(예를 들어, 페놀 용액), 및 프로타민과 함께)에서, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 일반적으로 약 3:12 내지 약 3:3, 바람직하게는 약 3:9 내지 약 3:4.5, 보다 바람직하게는 약 3:6.9 내지 약 3:5.4의 범위일 수 있다.
Na+와 같은 1가 양이온에서, 상기 고체는 약 3:6 내지 약 3:3의 인슐린 화합물 접합체 대 양이온 비를 가진다고 예상된다.
본 발명의 고체 조성물은, 예를 들어, 본 발명의 인슐린 화합물 접합체 및/또는 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물을 포함하는 파우더 같은 조성물을 포함한다. 바람직하게는 상기 고체 조성물은 약학적으로 허용가능한 순도 수준(level of purity), 즉, 인간에게 사용하기 위한 조성물의 적합성을, 허용할 수 없을 정도로 감소시키는 오염물질이 없는 순도 수준에서 제공된다.
일부 구현예에서, 조성물은 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 성분이 약 90% 이상의 결정형, 바람직하게는 약 95% 이상의 결정형, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 결정형인 것으로 제공된다. 다른 구현예에서, 조성물은 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 성분이 약 90% 이상의 무정형 고체, 바람직하게는 약 95% 이상의 무정형 고체, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 무정형 고체인 것으로 제공된다.
또 다른 예에서, 조성물은 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 성분은 무정형 고체 및 결정형 고체의 혼합물로 존재하는 것으로 제공된다. 예를 들어, 무정형 고체 대 결정형 고체의 비는 약 1:10 내지 약 10:1, 또는 약 1:9 내지 약 9:1, 또는 약 1:8 내지 약 8:1, 또는 약 1:7 또는 약 7:1, 또는 약 1:6 내지 약 6:1, 또는 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:4 내지 약 4:1, 또는 약 1:3 내지 약 3:1, 또는 약1:2 내지 약 2:1 , 또는 약 1:1일 수도 있다.
더욱이, 조성물은, 인슐린 화합물 접합체를 가지는 고체와 함께 천연 인슐린 화합물을 포함하는 고체, 또는 다른 인슐린 화합물 접합체를 포함하는 고체와 함께 하나의 인슐린 화합물 접합체를 포함하는 고체와 같이, 다른 인슐린 화합물을 가지는 양이온-인슐린 화합물 고체의 혼합물을 이용하여 제공될 수 있다.
그리고, 상기 고체 유형 및 인슐린 화합물/인슐린 화합물 접합체 성분은 모두 변할 수도 있다. 예를 들어, 조성물은 천연 인슐린 화합물 및 무정형 인슐린 화합물 접합체를 이용하여 Zn-인슐린 화합물 결정을 포함하여 제공될 수 있고, 또는 조성물은 천연 인슐린 화합물 및 결정형 Zn-인슐린 화합물 접합체를 이용하여 무정형 Zn-인슐린 화합물 고체을 포함하여 제공될 수 있다. 상기 혼합물은 용해 프로파일(dissolution profile) 및/또는 약물동태학 프로파일(pharmacokinetic profile)에서의 변화와 같은, 물리적 특성에서의 변화를 수득하는데 사용될 수도 있다.
상기 고체의 평균 입자크기는 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100 microns이고, 보다 바람직하게는 1-50 microns이며, 가장 바람직하게는 1-25 microns이고, 이상적으로 1-15 microns이다. 작은 입자크기는 미세결정화 상태(microcrystallization conditions), 분무 건조(spray drying), 제분(milling), 진공건조(milling), 냉동건조(freeze drying) 등에 의해 수득될 수도 있다.
일 구현예에서, 건조시에 상기 조성물은 약 96% w/w 이상의 인슐린 화합물 접합체 및 약 0.05, 0.1, 0.15, 또는 0.2 내지 약 4% w/w 아연을 함유한다. 다른 구현예에서, 건조시에 상기 조성물은 약 91% w/w 이상의 인슐린 화합물 접합체, 약 0.05, 0.1, 0.15, 또는 0.2 내지 약 4% w/w 아연 및 약 0.2 내지 약 5% w/w 페놀을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 건조시에 상기 조성물은 약 82% w/w 이상의 인슐린 화합물 접합체, 약 0.05, 0.1, 0.15, 또는 0.2 내지 약 4% w/w 아연 및 약 0.2 내지 약 14% w/w 프로타민을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 건조시에 상기 조성물은 약 71% w/w 이상의 인슐린 화합물 접합체, 약 0.05, 0.1, 0.15, 또는 0.2 내지 약 4% w/w 아연, 약 0.2 내지 약 14% w/w 프로타민, 및 약 0.2 내지 약 15% w/w 페놀을 함유한다.
다른 구현예에서, 건조시에 상기 조성물은 약 0.1 내지 약 2% w/w Zn++, 및 약 0.08 내지 약 1% w/w 페놀, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1.3% w/w Zn++, 및 약 0.1 내지 약 0.7% w/w 페놀, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 3.5% w/w Zn++이상으로 또는 동일하게, 그리고 약 0.1 내지 약 3% w/w 페놀, 가장 바람직하게는 약 1.3 내지 약 2.2% w/w Zn++이상으로 또는 동일하게, 그리고 약 0.4 내지 약 2% w/w 페놀을 포함한다.
상기 착물은 렌테-형(lente-type) 제조방법으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 건조 렌테-형 제조방법에서, Zn은 약 0.1 내지 약 2% w/w 범위의 양으로 제공되고, 페놀은 약 0.08 내지 약 1% w/w 범위의 양으로 존재하며, 잔여 % w/w의 인슐린 화합물 접합체가 존재한다. 이상적으로, 건조 렌테-형(dried lente-type) 제조방법에서, Zn은 약 0.5 내지 약 1.3% w/w 범위의 양으로 제공되고, 페놀은 약 0.1 내지 약 0.7% w/w 범위의 양으로 존재하며, 잔여 % w/w의 인슐린 화합물 접합체가 존재한다.
상기 착물은 울트라렌테-형(ultralente-type) 제조방법으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 건조 울트라렌테-형 제조방법에서, Zn은 약 1 내지 약 3.5% w/w 이상의 또는 동일한 범위의 양으로 제공되고, 페놀은 약 0.1 내지 약 3% w/w 범위의 양으로 존재하며, 잔여 % w/w의 인슐린 화합물 접합체가 존재한다. 이상적으로, 건조 울트라렌테-형(dried ultralente-type) 제조방법에서, Zn은 약 1.3 내지 약 2.2% w/w 이상의 또는 동일한 범위의 양으로 제공되고, 페놀은 약 0.4 내지 약 2% w/w 범위의 양으로 존재하며, 잔여 % w/w의 인슐린 화합물 접합체가 존재한다.
7.7.2 액체 조성물( Liquid Compositions )
상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물은 액체의 용해되지 않은 성분으로서 제공될 수도 있다. 예를 들어, 상기 액체는 침전물로서 양이온-인슐린 화합물 접합체를 포함하는 수성 용액일 수도 있고, 또는 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체는 현탁액, 유탁액 또는 미세유탁액의 성분으로서 제공될 수도 있다. 상기 액체는 또한 용해되지 않는 성분과 함께, 용해되는 성분 또는 착물을 포함할 수도 있다.
7.7.3 혼합물 및 공-결정( Mixtures and Co - crystals )
본 발명의 조성물은 예를 들어, 착물 혼합물(complex mixtures), 고체 혼합물(solid mixtures), 혼성 착물(hybrid complexes), 및 공-결정(co-crystals)을 포함할 수도 있다.
따라서, 예를 들어, 본 발명은 두 개 이상의 인슐린 화합물 접합체 및/또는 비접합 인슐린 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 상기 조성물이 고체일 때, 상기 고체는 다른 형태를 가질 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 고체는 결정화될 수도 있고 다른 고체는 무정형 고체가 될 수도 있다. 이 밖에 알려진 바와 같이, 상기 고체는 건조 형태로 제공될 수도 있고, 또는 액체 혼합물의 고체성분으로 제공될 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 혼합물은 두 개 이상의 인슐린 화합물 접합체를 포함하고, 상기 다른 인슐린 화합물 접합체는 다른 용해도를 가지고 있다.
일 구현예에서, 상기 착물 중 하나는 친유성 인슐린 화합물 접합체를 포함하고, 다른 하나는 친수성 인슐린 화합물 접합체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 착물들은 다른 인슐린 화합물 접합체를 포함할 수도 있으며, 여기서, 하나 이상의 상기 착물은 약 1 내지 약 4시간의 순환 반감기를 가지고, 하나 이상의 상기 착물은 상기 첫번째 착물의 순환 반감기보다 현저하게 큰 순환 반감기를 가진다. 관련 구현예에서, 상기 착물 중 하나는 속효성 프로파일(rapid-acting profile)을 가지고, 상기 착물 중 다른 것은 중간-지속성 프로파일(medium-to-long acting profile)을 가진다. 또한, 상기 착물 중 하나는 염기성 인슐린 화합물 제어에 적합한 프로파일을 가질수도 있고 반면에 다른 것은 식후 포도당 조절에 적합한 프로파일을 가진다. 바람직한 혼합물은 HIM2 및 인슐린의 혼합물, HIM2 및 IN105의 혼합물, IN105 및 인슐린 화합물의 혼합물, IN105 및 지방산 아실화 인슐린(fatty acid acylated insulin)의 혼합물, HIM2 및 지방산 아실화 인슐린(fatty acid acylated insulin)의 혼합물이다. 적합한 지방산 아실화 인슐린(fatty acid acylated insulins)은 전문이 참조로서 여기에 포함되는 아래의 미국특허에서 설명된다: 2003년 3월 11일자로 공고된, 미국특허 6,531,448, "Insoluble compositions for controlling blood glucose"; 2003년 1월 28일자로 공고된, 미국특허 RE37,971, "Selective acylation of epsilon-amino groups"; 2002년 10월 15일자로 공고된, 미국특허 6,465,426, "Insoluble insulin compositions"; 2002년 12월 3일자로 공고된, 미국특허 6,444,641, "Fatty acid-acylated insulin analogs"; 2002년 1월 1일자로 공고된, 미국특허 6,335,316, "Method for administering acylated insulin"; 2001년 7월 31일자로 공고된, 미국특허 6,268,335, "Insoluble insulin compositions"; 2000년 4월 18일자로 공고된, 미국특허 6,051,551, "Method for administering acylated insulin"; 1999년 7월 13일자로 공고된, 미국특허 5,922,675, "Acylated Insulin Analogs"; 1997년 12월 23일자로 공고된, 미국특허 5,700,904, "Preparation of an acylated protein powder"; 1997년 12월 2일자로 공고된, 미국특허 5,693,609, "Acylated insulin analogs Granted"; 1997년 7월 8일자로 공고된, 미국특허 5,646,242, "Selective acylation of epsilon-amino groups"; 1997년 5월 20일자로 공고된, 미국특허 5,631,347, "Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein"; 2002년 12월 17일자로 공고된, 미국특허, "Method of acylating peptides and novel acylating agents"; 2000년 1월 4일자로 공고된, 미국특허 6,011,007, "Acylated insulin"; 1998년 5월 12일자로 공고된, 미국특허 5,750,497, "Acylated insulin Granted"; 1999년 5월 18일자로 공고된, 미국특허 5,905,140, "Selective acylation method"; 2003년 9월 16일자로 공고된, 미국특허 6,620,780, "Insulin derivatives"; 2001년 1월 26일자로 공고된, 미국특허 6,251,856, "Insulin derivatives"; 2001년 4월 3일자로 공고된, 미국특허 6,211,144, "Stable concentrated insulin preparations for pulmonary delivery"; 2001년 10월 30일자로 공고된, 미국특허 6,310,038, "Pulmonary insulin crystals"; 및 2001년 1월 16일자로 공고된, 미국특허 6,174,856, "Stabilized insulin compositions". 특히 바람직한, 12, 13, 14, 15, 또는 16-탄소 지방산을 가지는 단일-지방산 아실화 인슐린은 인간 인슐린의 Lys(B29)와 공유결합한다.
일 구현예에서, 상기 발명은 두 개의 다른 인슐린 화합물 및/또는 인슐린 화합물 접합체를 가지는 공-결정을 제공한다. 바람직하게는 공-결정은 아래의 특성 중 하나 이상을 가진다: 실질적으로 균질한 용해(substantially homogenous dissolution), 생체내(in vivo) 단일 분해 곡선, 및/또는 단일 피크 약물동태학 프로파일(single peak pharmacodynamic profile). 바람직한 공-결정은 HIM2 및 인슐린의 공-결정, HIM2 및 IN105의 공결정 및 IN105 및 인슐린 화합물의 공-결정이다.
일 구현예에서, 상기 공-결정은 인간 인슐린을 포함하고, 인간 인슐린을 가지는 공-결정화는 상응하는 상기 인슐린 화합물 접합체의 결정의 용해도에 비하여 상기 결정의 용해도를 감소시킨다. 다른 구현예에서, 상기 공-결정은 인간 인슐린을 포함하고, 인간 인슐린을 가지는 공-결정화는 상응하는 상기 인슐린 화합물 접합체의 결정의 용해도에 비하여 상기 결정의 용해도를 줄인다.
다른 구현예에서, 상기 공-결정은 속효성(rapid acting), 빠른 제거(rapid clearing), 및/또는 높은 잠재성의(highly potent) 인슐린 화합물 접합체, 및 지속성(long-acting), 느린 제거(slow clearing), 및/또는 잠재성이 거의 없는(poorly potent) 인슐린 화합물 접합체를 포함한다. 바람직하게는 상기 공-결정은 식후 포도당 조절 또는 밤새 염기성 인슐린 화합물 제어에 적합한 PK/PD 프로파일을 가진다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인슐린 화합물 접합체가 인간 인슐린 또는 라이스프로 인슐린(lyspro insulin)과 함께 포함되는 혼합물 또는 공-결정을 제공한다. 본 발명의 혼합물은 두 개의 다른 인슐린 화합물 접합체를 포함할 수도 있다. 상기 혼합물은 인슐린 화합물 접합체 및 비접합 인슐린 화합물을 포함할 수도 있다. 상기 혼합물은 다른 인슐린 화합물을 가지는 다른 인슐린 화합물 접합체를 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 두 개의 다른 인슐린 화합물 접합체 및/또는 인슐린 화합물 접합체 및 비접합 인슐린 화합물을 가지는 착물을 제공한다. 본 발명은 둘, 셋 또는 이 이상의 다른 인슐린 화합물 접합체의 혼성 공-결정(hybrid co-crystal)을 제공한다. 본 발명은 비접합 인슐린 화합물을 가지는 인슐린 화합물 접합체를 가지는 착물을 제공한다. 본 발명은 두 개 이상의 다른 친수성 인슐린 화합물 접합체; 두 개 이상의 다른 소수성 인슐린 화합물 접합체; 두 개 이상의 다른 양친매성 인슐린 화합물 접합체; 친수성 인슐린 화합물 접합체 및 친유성 인슐린 화합물 접합체; 친수성 인슐린 화합물 접합체 및 비접합 인슐린 화합물; 비접합 인슐린 화합물과 함께 HIM2; 비접합 인슐린 화합물과 함께 IN105; IN105와 함께 HIM2; 인슐린 화합물 및 IN105과 함께 HIM2; 및 전술한 요소들의 다른 조합을 가지는 공-결정을 제공한다. 이 밖에 언급한 바와 같이, 상기 착물들은 건조 고체로서, 용액에 용해되는 착물로서 및/또는 용액에 용해되지 않는 착물로서 제공될 수도 있다. 다양한 조합들은, 예를 들어, 착물 또는 확장 프로파일(extended profile)을 가지는 공-결정을 제공하도록 이용될 수도 있다.
7.8 본 발명의 착물의 용해도( Solubility of Complexes of the Invention )
바람직하게는 pH 약 7.4에서 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물의 수성 용해도는 상기 비착물 인슐린 화합물 접합체의 수성 용해도의 약 1/15, 1/14, 1/13, 1/12, 1/11, 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5 내지 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 <10배까지이다. 전술한 상한 및 하한의 임의의 조합은 본 발명의 범위 이내이다. 그러나, 바람직한 범위는 약 1/15 내지 <5이고, 보다 바람직하게는 약 1/10 내지 약 2이며, 이상적으로는 약 1/10 내지 <0 이다. 본 발명의 특별히 놀라운 측면에서, pH 약 7.4에서 용액의 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체의 수성 용해도는 종종 pH 약 7.4에서 용액의 상기 인슐린 화합물 접합체의 수성 용해도보다 현저히 적다. 그러나, 특정 구현예에서, pH 약 7.4에서 용액의 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체의 수성 용해도는 pH 약 7.4에서 용액의 상기 인슐린 화합물 접합체의 수성 용해도와 같거나, 크고, 또는 현저하게 클 수도 있다는 것은 자명할 것이다.
하나의 의외의 구현예에서, pH 약 7.4에서 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물의 수성 용해도는 pH 약 7.4에서 용액내의 상응하는 비접합 인슐린 화합물 접합체의 용해도보다 현저하게 적고, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물은약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.1, 또는 6.9 내지 약 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 또는 8.9 범위의 pH에 걸쳐 수성 용액 내에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 또는 130 g/L 보다 많이 녹아 있을 수도 있다. 더욱 다른 구현예에서, pH 약 7.4에서 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물의 수성 용해도는 pH 약 7.4에서 용액 내의 상기 상응하는 인슐린 화합물 접합체의 용해도보다 현저하게 적고, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물은 약 5.8 내지 약 8.5의 pH 범위에 걸쳐, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 8의 pH 범위에 걸쳐, 가장 바람직하게는 약 6.9 내지 약 7.8의 pH 범위에 걸쳐 수성 용액 내에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 또는 130 g/L 보다 많이 녹아 있다.
바람직하게는 본 발명의 인슐린 화합물 접합체는 pI±약 2.5와 같은 pH의 수성 용액에서 결정을 생성하도록 선택되며, 여기서, 인슐린 화합물 접합체의 농도는 약 0.5 mg/ml ~ 약 50 mg/ml, 바람직하게는 약 5 mg/ml ~ 약 30 mg/ml, 보다 바람직하게는 약 15 mg/ml ~ 약 30 mg/ml이고, 상기 결정 형성은 약 3, 4 또는 5% w/w/ 양이온 대 인슐린 화합물 접합체에서 발생하기 시작하며, 이때 상기 양이온은 바람직하게는 Z++이다. 바람직하게는 결정은 약 4, 4.1, 4.2, 4.3 또는 4.4 ~ 약 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7 또는 5.8 범위의 pH에서, 바람직하게는 4 ~ <6.4 범위의 pH, 바람직하게는 4 ~ <5.8, 바람직하게는 약 4.2 ~ 약 5.5, 보다 바람직하게는 약 4.4 ~ 약 5.2 범위의 pH에서 수성 용액에서 프로타민 없이 단일접합체를 위해 존재한다. 바람직하게는 결정은 약 3.5 내지 <5.8, 바람직하게는 약 3.8 내지 약 5.5, 보다 바람직하게는 약 4.0 내지 약 5.2의 pH에서 프로타민 없이 이접합체를 위하여 존재한다. 바람직하게는 결정은 약 3 내지 <5.5, 바람직하게는 약 3.3 내지 약 5, 보다 바람직하게는 약 3.8 내지 약 4.8의 pH에서 프로타민 없이 삼접합체를 위하여 존재한다.
7.8.1 R-형 착물 (R- type Complexes )
바람직하게는 pH 약 7.4에서 상기 인슐린 화합물 접합체의 R형 Zn 착물의 수성 용해도는 약 10 내지 약 150 g/L, 보다 바람직하게는 약 20 내지 약 130 g/L, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 110 g/L, 보다 바람직하게는 약 35 내지 약 60 g/L의 범위를 가진다.
바람직하게는 pH 약 7.4에서 프로타민을 가지는 상기 인슐린 화합물 접합체의 R형 Zn 착물의 수성 용해도는 약 10 내지 약 110 g/L, 보다 바람직하게는 약 20 내지 약 85 g/L, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 70 g/L의 범위를 가진다.
7.8.2 T-형 착물(T- type Complexes )
바람직하게는 pH 약 7.4에서 상기 인슐린 화합물 접합체의 T형 Zn 착물의 수성 용해도는 약 30 내지 약 175 g/L, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 160 g/L, 보다 바람직하게는 약 70 내지 약 150 g/L의 범위를 가진다.
바람직하게는 pH 약 7.4에서 프로타민을 가지는 상기 인슐린 화합물 접합체의 R형 Zn 착물의 수성 용해도는 약 10 내지 약 150 g/L, 보다 바람직하게는 약 20 내지 약 130 g/L, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 110 g/L, 보다 바람직하게는 약 35 내지 약 60 g/L의 범위를 가진다.
7.8.3 NPH -형 착물( NPH - Type Complexes )
바람직하게는 pH 약 7.4에서 상기 인슐린 화합물 접합체의 NPH-형 착물의 수성 용해도는 약 1 내지 약 150 g/L, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 120 g/L, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 90 g/L의 범위를 가진다.
7.9 약학적 특성( Pharmaceutical Properties )
상기 인슐린 화합물 접합체와 양이온의 착물화는 일반적으로, 상응하는 비착물 인슐린 화합물 접합체와 같이 과학적으로 허용가능한 제어와 관련하여 상기 인슐린 화합물 접합체의 개선된 약학적 특성을 생성한다.
일부 경우에, 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체는 상응하는 비착물 인슐린 화합물 접합체처럼 과학적으로 허용가능한 제어와 관련하여 확장된(extended) 또는 변경된(altered) pK 프로파일을 나타낼 것이다. 특정한 경우에, 상기 pK 프로파일은 리스프로-유사 프로파일(lispro-like profile)을 나타낼 것이다. pK 프로파일은 표준 생체내(in vivo) 실험, 예를 들어, 생쥐(mice), 쥐(rats), 개, 또는 인간 실험을 이용하여 평가될 수 있다. 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물의 속성을 평가하기 위하여 여기에 설명되는 분석시험은 본 발명의 일 측면이다.
상기 착물은 개선된 화학적 안정성을 나타낼 수도 있다. 안정성에 대한 다양한 평가는 플라즈마의 존재, 프로테아제의 존재, 간 균질화액(liver homogenate)의 존재, 산성조건(acidic conditions)의 존재, 및 염기성 조건(basic conditions)의 존재와 같은 다양한 분석조건에 상기 착물을 노출함으로써 평가될 수 있다. 안정성은, 하나 이상의 상기 분석조건에서 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체의 안정성이 동일한 조건에서 상기 비접합 인슐린 화합물 접합체의 안정성보다 클 때, 비착물화 인슐린 화합물 접합체에 비하여 개선된다. 산성환경에서 안정성을 결정하기 위한 바람직한 분석시험은 적어도 2시간동안 pH 2를 가지는 용액에 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체를 노출시키는 단계를 수반하며, 여기서, 상응하는 비착물화 인슐린 화합물 접합체와 같이, 과학적으로 허용가능한 제어에 비하여 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체의 감소된 분해는 개선된 안정성을 나타내는 것이다. 생체내(in vivo) 분석시험은 또한 안정성을 테스트하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 착물화 인슐린 화합물 접합체의 안정성은 대상의 위장관에 노출 및 적절한 제어로 비교함으로써 테스트될 수 있다.
7.10 제조방법( Method of Making )
본 발명은 또한 여기에 설명되는 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 하나 이상의 인슐린 화합물 접합체를, 여기에 설명된 것처럼 하나 이상의 양이온과 함께, 여기에 설명된 것처럼 고체를 형성하도록 접촉시키는 단계를 수반한다.
Zn++과 같은 2가 양이온에서, 약 2 mg/ml ~ 약 50 mg/ml 범위의 인슐린 화합물 농도를 가지는 수성 용액 내의 조성물을 제조하는데 사용되는 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 일반적으로 약 1:15(인슐린 화합물 접합체:양이온) ~ 약 1:0.4, 바람직하게는 약 1:9 ~ 약 1:2의 범위일 수 있다.
상기에 설명된 수성 용액 조건에서 T-형 고체(양이온 및 인슐린 화합물 접합체와 함께 그러나 프로타민은 없음)를 제조하기 위하여, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 바람직하게는 1:1.5 ~ 1:3이고, 이상적으로는 약 1:2이다. 상기에 설명된 수성 용액 조건에서 R-형 고체(양이온, 인슐린 화합물 및 안정화 화합물(예를 들어, 페놀 화합물)과 함께 그러나 프로타민은 없음)를 제조하기 위하여, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 바람직하게는 약 1:4 ~ 약 1:9이고, 바람직하게는 약 1:7 ~ 약 1:9이며, 이상적으로는 약 1:8이다.
상기에 설명된 수성 용액 조건에서 T-형 프로타민 고체(양이온 및 인슐린 화합물 접합체와 함께 그러나 프로타민은 없음)를 제조하기 위하여, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 바람직하게는 1:1.5 ~ 1:9이고, 이상적으로는 약 1:2이다. 상기에 설명된 수성 용액 조건에서 R-형 프로타민 고체(양이온, 인슐린 화합물 및 안정화 화합물(예를 들어, 페놀 화합물)과 함께 그러나 프로타민은 없음)를 제조하기 위하여, 인슐린 화합물 접합체 대 양이온의 몰비는 바람직하게는 약 1:2 ~ 약 1:15이고, 바람직하게는 약 1:7 ~ 약 1:9이며, 이상적으로는 약 1:8이다.
상기 인슐린 화합물 접합체는 바람직하게는 2 이상 ~ 약 100 g/L, 바람직하게는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ~ 약 40 g/L, 보다 바람직하게는 약 10 ~ 약 30 g/L의 범위에서 농도를 수득하도록 계산되는 양이 버퍼에 첨가된다.
상기 양이온이 2가(예를 들어, Zn++, Ca++)일때, 약 0.04 ~ 약 10 g/L, 바람직하게는 약 0.1 ~ 약 5 g/L, 보다 바람직하게는 약 0.2 ~ 약 4 g/L 범위의 농도를 수득하도록 계산되는 양이 첨가되는 것이 바람직하다. T-형 결정 또는 T-형 프로타민 결정에서, 상기 양이온 농도는 약 0.04 ~ 약 1 g/L, 보다 바람직하게는 약 0.1 ~ 약 0.3 g/L 범위가 바람직하다. R-형 결정 또는 R-형 프로타민 결정에서, 상기 양이온 농도는 바람직하게는 약 1 ~ 약 5 g/L, 보다 바람직하게는 약 1.5 ~ 약 4 g/L이다.
상기 양이온이 1가일 때, 약 0.08 ~ 약 40 g/L, 바람직하게는 약 0.4 ~ 약 20 g/L, 보다 바람직하게는 약 0.8 ~ 약 16 g/L 범위의 농도를 수득하도록 계산되는 양이 첨가되는 것이 바람직하다.
상기 방법은 안정화제를 상기 양이온 및 인슐린 화합물 접합체와 결합하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 안정화제는 상기에 기술된 바와 같다. 사용할 때, 상기 안정화제는 안정화제의 부재시에 동일한 시약 및 반응조건을 이용하여 수득되는 것보다 더 큰 정도의 고체형성(a greater degree of solid formation)을 제공하기에 충분한 양으로 첨가된다. 상기 안정화제가 페놀 화합물(예를 들어, 페놀, m-크레졸, m-파라벤)일 때, 약 10 ~ 약 50 % w/w, 보다 바람직하게는 약 20 내지 약 40% w/w, 가장 바람직하게는 약 25 ~ 약 35% w/w의 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 안정화제는 페놀 화합물(예를 들어, 페놀, m-크레졸, m-파라벤)이며, 약 0.01 ~ 약 10 % w/w, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 약 5% w/w, 보다 바람직하게는 약 0.01 ~ 약 1% w/w의 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 방법은 양이온-인슐린 화합물 접합체를 수득하도록 수성 용액에서 인슐린 접합체, 양이온 및 안정화제를 결합하는 단계를 수반하며, 여기서, 상기 조합은 용해된 착물(solublized complexes) 및/또는 결정화(crystalline) 또는 비-결정화(non-crystalline) 고체를 수득할 수도 있다.
상기 방법은, 프로타민과 같은 착물화제의 사용을 추가로 포함하고, 상기 양이온 및 인슐린 화합물 접합체와 결합하며, 그리고 또한 안정화제를 선택적으로 포함할 수 있다.
약 5 ~ 약 8 범위의 pH를 가지는 수성 용액에서 고체를 제조하기 위하여, 프로타민은 바람직하게는 인슐린 화합물 접합체에 비하여 약 4 ~ 약 45% w/w(프로타민/인슐린 화합물), 바람직하게는 약 8 ~약 25% w/w, 바람직하게는 약 9 ~약 20% w/w, 이상적으로는 약 10 ~ 약 12% w/w 의 양으로 제공된다. T-형 고체에서, 바람직한 pH 범위는 약 5 ~ 약 6, 보다 바람직하게는 약 5 ~ 약 5.5, 가장 바람직하게는 약 5.1 ~ 약 5.3, 이상적으로는 약 5.2이다. R-형 고체에서, 바람직한 pH 범위는 약 6 ~ 약 7, 보다 바람직하게는 약 6.2 ~ 약 6.8, 가장 바람직하게는 약 6.4 ~ 약 6.6, 이상적으로는 약 6.5이다.
본 발명자들을 페놀과 같은 안정화제의 부재시에 T-형 착물이 프로타민 T-형 착물로 변환된다는 의외의 발견을 하였다. 상기 T-형 착물은 페놀의 부재시에 수성 용액에서 상기 Zn을 인슐린 화합물 분자와 함께 착물화함으로써 제조된다. 프로타민은 그 후 T-형 착물을 프로타민 T-형 착물로 전환시키도록 첨가된다. 양 및 pH의 범위는 아래와 같다.
따라서, 일 구현예에서, 상기 방법은 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물을 수득하기 위하여 수성 용액에서 인슐린 화합물 접합체, 양이온 및 착물화제를 결합하는 단계를 수반하며, 이때 상기 결합은 용해되는 착물 및/또는 결정형 또는 무정형 고체를 수득할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물을 수득하기 위하여 수성 용액에서 인슐린 화합물 접합체, 양이온, 착물화제 및 안정화제를 결합하는 단계를 수반하며, 이때 상기 결합은 용해되는 착물 및/또는 결정형 또는 무정형 고체를 수득할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 방부제(preservatives)를 포함할 수 있다. 적합한 방부제의 예는 벤질 알코올, p-하이드록시벤조산 에스테르(p-hydroxybenzoic acid esters), 글리세롤(glycerol)을 포함한다. 페놀, m-크레졸, 및 m-파라벤 같은 안정화제 역시 방부제로서 사용될 수 있다. 글리세롤 및 페놀은 멸균 효과를 강화하도록 적절하게 함께 첨가된다.
상기 고체를 제조하는데 유용한 다른 성분은 NaCl, 글리세롤, 모노사카라이드와 같은 등장제(isotonic agents)를 포함한다.
상기 양이온 인슐린 화합물 접합체 고체는 통상적으로 비교적 빨리 형성될 수 있다. 예를 들어, 고체 형성은 통상적으로 3일 이내에, 종종 24시간 이내에 완성된다. 일부 경우에 결정형성을 개선하기 위하여 반응을 느리게 하는 것이 바람직할 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 고체는, 고체의 침전을 유도하기 위하여 온도 저하의 요구없이, 실온(25℃)에서 형성된다. 예를 들어, 실온은 R-형 및 T-형 결정에 효과적이다. 고체형성을 위한 온도는 바람직하게는 약 0 ~ 약 40 ℃, 바람직하게는 약 17 ~ 약 30 ℃, 및 보다 바람직하게는 약 22 ~ 약 27 ℃, 이상적으로는 약 25℃이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 결정형 또는 무정형 고체를 제공하도록 인슐린 화합물 접합체 및 금속 양이온을 수성 용액에서 결합하는 단계를 포함한다. 상기 양이온이 첨가될 상기 인슐린 화합물 접합체를 함유하는 수성 용액은, 바람직하게는 상기 인슐린 화합물 접합체의 pI +/- 약 1.5, 바람직하게는 pI +/- 약 1, 보다 바람직하게는 pI +/- 약 0.75 범위의 pH를 가지는 완충용액이다. 상기 범위는 또한 T-형, R-형 및 프로타민 착물에 적용한다. 그러나, 중성 프로타민 착물(NPH-형)에서, 바람직한 pH는 약 7 ~ 약 8.5이고, 보다 바람직하게는 약 7.5 ~ 약 8이다. 일단 금속 양이온이 첨가되면, pH는 조금씩 변화할 수도 있고, pH는 상기에 설명된 pH범위를 표적으로 하여 조정될 수도 있다. 페놀 화합물과 함께, 미세한 pH 변화가 있을 수도 있고, 산 또는 염기는 바람직한 범위로 조정하는데 사용될 수 있다.
인슐린 화합물 접합체에서 pI 값은 통상적으로 약 7 미만, 바람직하게는 약 6 미만, 보다 바람직하게는 약 5.5 미만의 pH를 필요로 한다. 중성 변형 모이어티는 통상적으로 약 4.75 +/-.25 범위의 pI를 가진다. 인간 인슐린 이접합체에서, 상기 pI 범위는 통상적으로 4.25 +/-.25이다. 인간 인슐린 삼접합체에서, 상기 pI 범위는 통상적으로 3.5 +/-.25이다.
적합한 버퍼 시스템의 예는 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer), 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer), 트리스 버퍼(tris buffer), 소듐 포스페이트 및 암모늄 아세테이트의 혼합물(mixture of sodium phosphate and ammonium acetate), 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer), 소듐 아세테이트 및 암모늄 아세테이트의 혼합물(mixture of sodium acetate and ammonium acetate), 및 시트르산 버퍼(citric acid buffer), 및 에탄올 및/또는 아세토니트릴[B]도 포함하는 상기 전술한 임의의 버퍼 시스템[A](예를 들어, 약 1:1 ~ 약 10:1의 A:B 백분율비)을 포함한다. 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 고체가, 에탄올 또는 아세토니트릴과 같은 유기성 용매를 함유하는 수성 혼합물에서 형성될 수 있다는 것은 본 발명의 놀라운 측면이다.
본 발명의 하나의 특이한 특성은 유용한 양이온-인슐린 화합물 접합체 착물을 제공할 뿐만 아니라, 본 발명은 또한 제조공정에서 비접합 인슐린 화합물로부터 양이온-인슐린 화합물 접합체를 분리하는 방법도 제공한다는 것이다. 상기 공정에서, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체는 용액으로부터 침전될 수 있고, 상기 용해되는 비접합 인슐린 화합물은, 예를 들어, 여과에 의해 제거될 수 있다. 상기 특성은 인슐린 화합물 접합체의 제조방법에서 2 단계를 제거한다: 농축 단계(concentration step) 및 냉동건조 단계(lyophilization step).
가공된 순수 고체 조성물은 원심분리 및/또는 여과, 이어서 세척(예를 들어, 에탄올/물을 이용하여), 및 냉동건조(lyophilization) 및 진공건조(vacuum drying)와 같은, 표준 기법을 이용하여 형성될 수도 있다. 여러 번의 세척은 페놀 및/또는 양이온 함량을 조정하는데 이용될 수도 있다.
7.11 제형( Formulation )
상기 착물은 공지기술에 따라 약학적 담체내에 투여를 위하여 제형화될 수도 있다. 예를 들어 전문이 약학적 복용형태의 선택, 제조 및 사용에 관한여 그들의 설명에 대한여 참조로서 여기에 통합되는, Alfonso R. Gennaro, Remington: Tlie Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (June 2003), 및 Howard C. Ansel, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed(October 1999) 참조하시오.
통상적으로 무정형 또는 결정형 고체 형태인, 상기 착물은 약학적으로 허용가능한 담체와 결합할 수 있다. 상기 담체는 약학 조성물의 어떤 다른 성분과도 융화할 수 있다는 견지에서 허용되어야만 하고, 상기 활성 성분에 의해 제공되는 장점에 비하여, 대상에게 과도하게 유해하지 않아야한다. 상기 담체는 고체 또는 액체일 수도 있고, 또는 둘 다 일수도 있다. 그것은 바람직하게는 1회-복용(unit-dose) 제형, 예를 들어, 타블렛으로 제형화된다. 상기 1회-복용 형태는, 예를 들어, 상기 양이온-인슐린 화합물 착물의 약 0.01 또는 0.5 중량& 내지 95 중량% 또는 99 중량%를 포함한다. 상기 약학 조성물은 어떤 공지의 약학적 기법에 의해 제조되지만, 비제한적으로 상기 성분을 혼합하는 단계, 선택적으로 하나 이상의 보조 성분(accessory ingredient)을 포함하는 단계에 의해 제조될 수도 있다. 적합한 약학 조성물의 예는 경구(oral), 직장(rectal), 흡입(inhalation)(예를 들어, 에어로졸(aerosol)을 통하여) 구강(buccal)(예를 들어, 설하(sub-lingual)), 질(vaginal), 비경구(parenteral)(예를 들어, 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 피부내(intradermal), 관절내(intraarticular), 늑막내(intrapleural), 복막내(intraperitoneal), 대뇌내(intracerebral), 동맥내(intraarterial), 또는 정맥내(intravenous)), 국부(topical)(즉, 기도표면(airway surfaces)를 포함하는, 점막표면(mucosal surfaces)), 경비(nasal) 표면 및 경피(transdermal) 투여(administration)용으로 제조되는 조성물을 포함한다. 어느 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 처리되는 조건의 성질 및 심각함에 따라 및 사용되는 구체적인 양이온-인슐린 화합물 착물의 성질에 따라 결정될 것이다. 바람직한 경구 조성물은 환자에 섭취용으로 제조되는 조성물이다. 이상적으로, 상기 경구 조성물은 위를 통과하면서 살아남도록 또는 실질적으로 살아남도록 제조되고, 상기 활성성분의 전달을 위하여 장(intestine)에서 완전히 또는 실질적으로 완전히 용해하도록 제조된다. 적합한 경피투여 시스템의 예는 초음파(ultrasonic), 이온토포레시스(iontophoresis) 및 패치(patch) 전달 시스템을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 포화 또는 불포화 C4, C5, C6, C7, C8, C9 또는 C10 및 상기 지방산의 염을 제공한다. 바람직하게는 지방산은 카프린산, 카프르산, 미리스틴산 라우린산이다. 바람직한 지방산 염은 타프린산의 나트륨염, 카프르산, 미리스틴산 및 라우린 산이다.
바람직한 지방산 조성물은 단일 지방산 또는 단일 지방산염을 포함하지만, 다른 지방산 또는 지방산염의 현저한 양을 포함하지는 않다. 본 발명의 일 측면에서, 상기 조성물의 지방산 함량은 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, [0327] 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 또는 99.9% w/w 보다 크다. 다른 구현예에서, 상기 조성물의 지방산 함량은 하한(lower limit)으로서 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0 % w/w을 가지고, 상한(upper limit)으로서 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 또는 12.0 % w/w 를 가지는 범위 내이다. 더욱 다른 예에서, 상기 조성물의 지방산 함량은 하한으로서 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0 % w/w를 가지고, 상한으로서 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 또는 12.0 % w/w를 가지는 범위 내이며, 상기 조성물의 지방산 함량은 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 또는 99.9% w/w 이상의 단일 지방산이다.
상기 제형의 활성성분은 접합 또는 비접합, 착물화 또는 비착물화 단백질 및/또는 펩타이드를 포함할 수도 있다. 바람직한 단백질 및/또는 펩타이드는 여기에 설명되어 있는 것이다. 바람직한 접합체는 여기에 설명되어 있는 것이다. 바람직한 착물은 여기에 설명되어 있는 것이다. 바람직한 경구 조성물은 환자에 의한 섭취용으로 제조되는 조성물이다. 이상적으로, 상기 경구 조성물은 위를 통과하면서 살아남도록 또는 실질적으로 살아남도록 제조되고, 상기 활성성분의 전달을 위하여 장(intestine)에서 완전히 또는 실질적으로 완전히 용해하도록 제조된다. 상기 제형은 일부경우에 장코팅(enteric coating)을 포함할 수도 있고, 일부 경우에는, 상기 제형은 구체적으로 장코팅을 배제할 것이다. 여기에 설명되는 다른 형태들도 물론 적합하지만, 상기 조성물은 바람직하게는 타블렛, 파우더, 경질 젤라틴 캡슐(hard gelatin capsule), 또는 연질 젤라틴 캡슐(soft gelatin capsule)로서 제공된다.
본 발명의 지방산은 지방산 아실화 인슐린(fatty acid acylated insulins)을 포함할 수도 있다. 적합한 지방산 아실화 인슐린의 예는 전문이 참조로서 여기에 포함되는 아래의 미국 특허에서 설명된다:2003년 3월 11일자로 공고된, 미국특허 6,531,448, "Insoluble compositions for controlling blood glucose"; 2003년 1월 28일자로 공고된, 미국특허 RE37,971, "Selective acylation of epsilon-amino groups"; 2002년 10월 15일자로 공고된, 미국특허 6,465,426, "Insoluble insulin compositions"; 2002년 12월 3일자로 공고된, 미국특허 6,444,641, "Fatty acid-acylated insulin analogs"; 2002년 1월 1일자로 공고된, 미국특허 6,335,316, "Method for administering acylated insulin"; 2001년 7월 31일자로 공고된, 미국특허 6,268,335, "Insoluble insulin compositions"; 2000년 4월 18일자로 공고된, 미국특허 6,051,551, "Method for administering acylated insulin"; 1999년 7월 13일자로 공고된, 미국특허 5,922,675, "Acylated Insulin Analogs"; 1997년 12월 23일자로 공고된, 미국특허 5,700,904, "Preparation of an acylated protein powder"; 1997년 12월 2일자로 공고된, 미국특허 5,693,609, "Acylated insulin analogs Granted"; 1997년 7월 8일자로 공고된, 미국특허 5,646,242, "Selective acylation of epsilon-amino groups"; 1997년 5월 20일자로 공고된, 미국특허 5,631,347, "Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein"; 2002년 12월 17일자로 공고된, 미국특허, "Method of acylating peptides and novel acylating agents"; 2000년 1월 4일자로 공고된, 미국특허 6,011,007, "Acylated insulin"; 1998년 5월 12일자로 공고된, 미국특허 5,750,497, "Acylated insulin Granted"; 1999년 5월 18일자로 공고된, 미국특허 5,905,140, "Selective acylation method"; 2003년 9월 16일자로 공고된, 미국특허 6,620,780, "Insulin derivatives"; 2001년 1월 26일자로 공고된, 미국특허 6,251,856, "Insulin derivatives"; 2001년 4월 3일자로 공고된, 미국특허 6,211,144, "Stable concentrated insulin preparations for pulmonary delivery"; 2001년 10월 30일자로 공고된, 미국특허 6,310,038, "Pulmonary insulin crystals"; 및 2001년 1월 16일자로 공고된, 미국특허 6,174,856, "Stabilized insulin compositions". 특히 바람직한, 12, 13, 14, 15, 또는 16-탄소 지방산을 가지는 단일-지방산 아실화 인슐린은 인간 인슐린의 Lys(B29)와 공유결합한다.
경구 투여에 적합한 약학 조성물은, 각각이 규정된 양의 인슐린 화합물 접합체 혼합물을 함유하는 캡슐(capsules), 카세제(cachets), 로젠(lozenges), 또는 타블렛(tablets); 파우더(powder) 또는 과립(granules); 수성(aqueous) 또는 비수성액(non-aqueous liquid)의 용액 또는 현탁액; 또는 수중유(oil-in-water) 또는 유중수(water-in-oil) 에멀전(emulsion)과 같은 별개의 단위체(discrete units)로 제공될 수도 있다. 상기 제형은 상기 인슐린 화합물 접합체 혼합물과 적합한 담체(상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 보조 성분을 함유할 수도 있는)를 결합하는 단계를 포함하는 적합한 조제방법에 의해 제조될 수도 있다. 제형은 고체의 현탁액, 착물화 양이온-인슐린 화합물 접합체, 비착물화 활성성분(예를 들어, 천연 인슐린 화합물, 인슐린 화합물 접합체), 및 전술한 것들의 혼합물을 포함할 수도 있다.
일반적으로, 본 발명의 약학조성물은 상기 착물을 액체 또는 고체상 담체와, 또는 둘 다와 균일 및 밀접하게 혼합하고, 필요하다면 그 후에, 생성된 혼합물을 형상화(shaping)함으로써 제조된다. 예를 들어, 타블렛은 인슐린 화합물 접합체 혼합물을 함유하는, 선택적으로 하나 이상의 보조 성분을 함유하는 파우더 또는 과립을 압착(compressing) 또는 몰딩(molding)함으로써 제조될 수도 있다. 압착된 타블렛은 접합제(binder), 윤활유(lubricant), 불활성 희석제(inert diluent), 및/또는 표면 활성/분산 제제(surface active/dispersing agent)와 선택적으로 혼합된 파우더 또는 과립과 같은, 자유-유동(free-flowing) 형태의 혼합물을, 적합한 장비로 압착함으로써 제조될 수도 있다. 몰딩된 타블렛은 불활성 액상 접합체로 적신 파우더형 화합물을, 적합한 장비로 몰딩함으로써 제조될 수도 있다.
구강(설하(sub-lingual)) 투여용으로 적합한 약학조성물은 풍미(flavored) 베이스(base), 보통 수크로오스(sucrose), 아카시아(acacia) 또는 트래거캔스(tragacanth)의 인슐린 화합물 접합체 혼합물을 포함하는 로젠; 그리고 젤라틴(gelatin) 및 글리세린(glycerin) 또는 수크로오스(sucrose) 및 아카시아(acacia)와 같은 불활성 베이스의 인슐린 화합물 접합체 혼합물을 포함하는 정제(pastilles)를 포함한다. 적합한 제형의 예는 미국특허공개 20030229022 ("Pharmaceutical formulation"); 20030236192 ("Method of modifying the release profile of sustained release compositions"); 20030096011 ("Method of producing submicron particles of a labile agent and use thereof); 20020037309 ("Process for the preparation of polymer-based sustained release compositions"); 20030118660 ("Residual solvent extraction method and microparticles produced thereby"); 뿐만 아니라 미국특허 6,180,141 ("Composite gel microparticles as active principle carriers"); 6,737,045 ("Methods and compositions for the pulmonary delivery insulin compound"); 6,730,334 ("Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles"); 6,685,967 ("Methods and compositions for pulmonary delivery of insulin compound"); 6,630,169 ("Particulate delivery systems and methods of use"); 6,589,560 ("Stable glassy state powder formulations; 6,592,904 ("Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use"); 6,582,728 ("Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders"); 6,565,885 ("Methods of spray drying pharmaceutical compositions"); 6,546,929 ("Dry powder dispersing apparatus and methods for their use"); 6,543,448 ("Apparatus and methods for dispersing dry powder medicaments"); 6,518,239 ("Dry powder compositions having improved dispersivity"); 6,514,496 ("Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use"); 6,509,006 ("Devices compositions and methods for the pulmonary delivery of aerosolized medicaments"); 6,433,040 ("Stabilized bioactive preparations and methods of use"); 6,423,344 ("Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use"); 6,372,258 ("Methods of spray-drying a drug and a hydrophobic amino acid"); 6,309,671 ("Stable glassy state powder formulations"); 6,309,623 ("Stabilized preparations for use in metered dose inhalers"); 6,294,204 ("Method of producing morphologically uniform microcapsules and microcapsules produced by this method"); 6,267,155 ("Powder filling systems, apparatus and methods"); 6,258,341 ("Stable glassy state powder formulations"); 6,182,712 ("Power filling apparatus and methods for their use"); 6,165,463 ("Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use"); 6,138,668 ("Method and device for delivering aerosolized medicaments"); 6,103,270 ("Methods and system for processing dispersible fine powders"); 6,089,228 ("Apparatus and methods for dispersing dry powder medicaments"); 6,080,721 ("Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone"); 6,051,256 ("Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use"); 6,019,968 ("Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use"); 5,997,848 ("Methods and compositions for pulmonary delivery of insulin compound"); 5,993,783 ("Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder. alpha.1 -antitrypsin"); 5,922,354 ("Methods and system for processing dispersible fine powders"); 5,826,633 ("Powder filling systems, apparatus and methods"); 5,814,607 ("Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone"); 5,785,049 ("Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments"); 5,780,014 ("Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1 -antitrypsin"); 5,775,320 ("Method and device for delivering aerosolized medicaments"); 5,740,794 ("Apparatus and methods for dispersing dry powder medicaments"); 5,654,007 ("Methods and system for processing dispersible fine powders"); 5,607,915 ("Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone"); 5,458,135 ("Method and device for delivering aerosolized medicaments"); 6,602,952 ("Hydrogels derived from chitosan and poly(ethylene glycol) or related polymers"); 및 5,932,462 ("Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces")에서 찾을 수 있다. 더욱이, 적합한 지속적인 방출 제형은 전문이 참조로서 여기에 포함되며, 1999년 10월 19일자로 공고된, Cardinal Health의 미국특허 5,968,554, "A sustained release pharmaceutical preparation"에 설명되어 있다. 적합한 미세입자 제형은 2003년 10월 30일자로 공개된, Spherics, Inc.의 국제특허공개 WO/2003-049,701, "Methods and products useful in the formation and isolation of microparticles"에 설명되어 있다. 적합한 생물학적 점착성 제형은 2004년 5월 6일자로 공개된, Spherics, Inc.의 국제특허공개 WO/2003-051,304, "Bioadhesive drug delivery system with enhanced gastric retention"에 공개되어 있다.
비경구 투여용으로 적합한 본 발명의 구현예에 따른 약학조성물은, 그 제조방법이 바람직하게는 대상 수용체의 혈액과 등장성(isotonic)인, 상기 착물의 멸균 수성 및 비수성 주입용액을 포함한다. 상기 제조방법은 항산화제(anti-oxidants), 버퍼제(buffers), 세균발육 억제제(bacteriostats) 및 대상 수용체의 혈액과 등장성인 조성물이 되게 하는 용질(solutes)를 포함할 수도 있다. 수성 및 비수성 멸균 현탁액은 현탁제제 및 강화(thickening)제제를 포함할 수도 있다. 상기 조성물은, 예를 들어 밀봉된 앰플(ampoules) 및 바이알(vials)과 같은 1회 복용(unit＼dose) 또는 다회 복용(multi-dose) 용기(container)로 존재할 수도 있고, 예를 들어, 사용하기 바로 전에 멸균 액체 담체, 식염수(saline) 또는 주사용수(water-for-injection)의 첨가만을 요구하는 동결건조(freeze-dried)(냉동건조(lyophilized)) 상태에서 저장될 수도 있다. 즉석(extemporaneous)주사용액 및 현탁액은 앞서 기술된 종류의 멸균 파우더, 과립 및 타블렛으로부터 제조될 수도 있다. 예를 들어, 밀봉한 용기로 1회 복용 형태의 착물 혼합물을 가지는 주사가능하며 안정된 멸균성 조성물이 제공될 수도 있다. 상기 착물의 혼합물은 대상(subject)에 주입하기에 적합한 액상 조성물을 형성하도록, 적합하고 약학적으로 허용가능한 담체로 재구성될 수 있는 동결건조 형태로 제공된다. 비경구 1회 복용 형태는 통상적으로 착물의 혼합물 약 1 microgram 내지 약 10 mg 을 포함한다. 상기 착물이 현저하게 수불용성(water-insoluble)일 때, 생리학적으로 허용가능한 충분한 양의 에멀전화 제제(emulsifying agent)는 수성 담체(aqueous carrier)에서 상기 전구약물을 에멀전화하도록 충분한 양으로 사용될 수도 있다. 하나의 상기 유용한 에멀전화 제제는 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline)이다.
경구 투여용의 고체 투약량은 통상적으로 약 2 mg ~ 약 500 mg, 바람직하게는 약 10 mg ~ 약 250 mg, 이상적으로는 상기 착물의 약 20 mg ~ 약 110 mg이다.
직장(rectal) 투여용으로 적합한 약학 조성물은 바람직하게는 1회 투약 좌약으로서 제공된다. 이것은 상기 착물과 하나 이상의 통상적인 고체형 담체, 예를 들어, 코코아 버터(cocoa butter)를 혼합하고, 그후 상기 생성되는 혼합물을 형상화함으로써 제조될 수도 있다.
스킨에 국부적으로 적용하기에 적합한 약학조성물은 바람직하게는 연고(ointment), 크림(cream), 로션(lotion), 페이스트(paste), 겔(gel), 스프레이(spray), 에어로졸(aerosol), 또는 오일(oil) 형태를 취한다. 사용될 수도 있는 담체는 페트롤레움 젤리(petroleum jelly), 라놀린(lanolin), 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 경피 강화제(transdermal enhancers), 및 이들 둘 이상의 조합을 포함한다.
경피 투여용으로 적합한 약학조성물은 지연시간 동안 수용체의 표피와 직접 접촉하면서 잔여하도록 개작된 별개의 패치(patches)로서 제공될 수도 있다. 경피 투여용으로 적합한 조성물은 또한, 이온토포레시스(예를 들어, Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986) 참조)에 의하여 운반될 수도 있고, 통상적으로 인슐린 화합물 접합체의 혼합물의 임의의 버퍼 수성 용액 형태를 취할 수도 있다. 적합한 제형은 시트레이트(citrate) 또는 비스/트리스(bis/tris) 버퍼(pH 6) 또는 에탄올/물(ethanol/water)을 포함하고, 0.1 내지 0.2M의 활성 성분을 함유한다.
바람직한 구현예에서, 상기 착물은, 전문이 참조로서 여기에 포함되며, Opawale et al .에 의해 2003년 8월 13일에 출원된 미국 특허출원 60/494,821에 설명된, 고체 지방산 제형의 성분으로서 투여된다.
특정 구현예에서, 상기 인슐린 화합물 접합체는 상기 양이온 및/또는 상기 고체를 형성하는데 필요한 다른 성분으로부터 분리되어 제공될 수도 있다. 예를 들어, 상기 인슐린 화합물 접합체는 건조 고체로서 제공될 수도 있고, 양이온, 안정화제, 방부제 및/또는 다른 성분을 함유하는 완충용액은 분리되어 제공될 수도 있으며, 따라서 사용자는 상기 양이온-인슐린 화합물 전구체 착물을 생성하도록 분리 성분을 결합할 수도 있다.
7.12 치료방법( Methods of treatment )
상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물 및 이들의 제형은, 순환하는 인슐린 화합물의 양의 증가시키는 질환의 치료에 유용하고(외부 소스(source)로부터 인슐린 화합물 투여의 부재시에 대상에 의해 제공되는 양에 비하여) 바람직한 치료 또는 생리학적 효과를 나타낸다. 예를 들어, 치료되는 상기 질환은 유형 I 또는 유형 II 당뇨병(diabetes), 전당뇨병(prediabetes) 및/또는 대사증후군(metabolic syndrome)일 수도 있다. 일 구현예에서 상기 조성물은 당뇨병의 증상을 경감하도록 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 당뇨병의 발병을 방지 또는 지연하기 위하여 전당뇨병 환자에게 투여된다.
본 발명의 방법에 따라 투여하기 위한 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물의 유효량은 혼합물, 및 환자에 따라 다소 변화할 것이고, 환자의 연령및 질환, 이동경로 및 치료되는 질환과 같은 인자에 따라 변할 것이다. 상기 복용량은 당업자에게 공지된 일정한 약물학적 절차에 따라 결정될 수 있다.
일반적인 제안에 따라, 약 0.025 ~ 약 10 mg/kg의 활성성분(즉, 접합체)의 경구 복용량은, 인슐린 화합물 접합체 혼합물의 중량을 기초로 계산되는 모든 중량으로 치료학적 효능을 가질 것이다. 보다 바람직한 범위는 약 0.06 ~ 약 1 mg/kg이고, 가장 바람직한 범위는 약 0.125 ~ 약 0.5 mg/kg 이다.
비경구 복용량은 통상적으로, 인슐린 화합물 접합체 혼합물의 무게에 따라 계산되는 전체 무게를 가지는, 약 0.5㎍/kg ~ 약 0.5 mg/kg의 범위이다. 보다 바람직한 범위는 약 1 ㎍/kg ~ 약 100 ㎍/kg 범위이다.
투여 빈도는 보통 하루에 한 번, 두 번, 또는 세 번씩, 또는 질환을 제어하는데 필요한 만큼이다. 택일적으로, 상기 양이온-인슐린 화합물 접합체 조성물은 지속적인 주입에 의해 투여될 수도 있다. 치료의 지속은 치료되는 인슐린 화합물 결핍의 유형에 따라 좌우되고, 환자의 살아 있는 동안일 수도 있다. 예를 들어, 상기 착물은 식전 0 ~ 30분 이내에 투여될 수도 있다. 예를 들어, 상기 착물은 취침전 0 ~ 2시간 이내에 투여될 수도 있다.
5. 도면의 간단한 설명
도 1-15B는 본 발명의 다양한 결정형 고체의 현미경사진(photomicrographs)을 나타낸 것이다. 도 1 및 2는 24시간 동안 성장한 결정인, 농도30g/L HIM2의 T-형(T-type) Zn 착물을 나타내는 Zeiss Axiovert 현미경을 사용하여 촬영한 현미경사진이다. 도 3은 5일 동안 성장한 결정인, 농도 30g/L HIM2의 T-형(T-type) Zn 착물을 나타내는 Zeiss Axiovert 현미경을 사용하여 촬영한 현미경사진이다. 도 4는 4일 동안 성장한 30g/L의 결정에서 HIM2의 R-형(R-type) Zn 착물을 나타내는 Zeiss Axiovert 현미경을 사용하여 촬영한 현미경사진이다. 도 5는 30% 유기물을 함유하는 IN105의 R-형 결정형 Zn 착물의 현미경사진을 나타낸 것이다. 도 6A-10B는 유기용매를 사용하여 제조된 HIM2의 다양한 R-형 Zn 착물의 현미경사진을 나타낸 것이다. 도 11A-14B는 HIM2 및 IN 105의 다양한 R-형 공-결정화(co-crystallized) Zn 착물을 나타낸 것이다. 도 15A-15B는 HIM2 및 인간 인슐린의 다양한 R-형 공-결정화 Zn 착물 결정의 현미경사진을 나타낸 것이다. 본 발명은 도 1-15B의 모두 나타나는 형상을 가지는 결정을 포함한다.
도 16-20는 HIM2 및 다양한 Zn-HIM2 착물에서의 쥐혈액 포도당 분석시험(MBGA: Mouse Blood Glucose Assay)을 나타내는 것이다. 도 16은 HIM2에서 MBGA 잠재적 생체효능(biopotency) 프로파일을 나타낸 것이다. 도 17은 Zn HIM2 인슐린 화합물 R 형에서 MBGA 생체효능 프로파일을 나타낸 것이다. 도 18은 Zn HIM2 인슐린 화합물 제조 T-형에서 MBGA 생체효능 프로파일을 나타낸 것이다. 도 19는 프로타민을 가지는 Zn HIM2 인슐린 화합물 제조에서 MBGA 생체효능 프로파일을 나타낸 것이다. 도 20은 복용 후 30 및 90분에서 R형 프로타민 착물의 포도당 저하 효과(lowering effect)를 나타낸 것이다.
도 21-24는 IN-186, IN- 192, IN-190, IN-191, IN-189, IN- 178, IN-193, IN-194, IN-185, IN-196 및 IN-197에서 MBGA 생체효능 프로파일을 나타낸 것이다.
도 25 및 26은 본 발명의 Zn-HIM2 착물에서 개 클램프 연구(dog clamp study) 결과를 나타낸 것이다. 도 27 및 28은 본 발명의 Zn-IN105 착물에서 개 클램프 연구(dog clamp study) 결과를 나타낸 것이다.
도 29 및 30은 추가적인 부형제(excipient) 없이 인산버퍼에서 3% w/v 카프르산 나트륨염(capric acid sodium salt)의 IN105으로 투약된 개에 대한 개 클램 프 연구(dog clamp study) 결과를 나타낸 것이다.
도 31-33은 143mg 라우레이트(laurate)과 함께 또는 143 mg 라우레이트(laurate) 없이 143mg 카파르테(Caparte)와 함께 30mg 엑스로탭(Exlotab)을, IN105 6mg 및 150mg 마니톨(Mannitol)을 함유하는 타블렛으로 투약된 개에 대한 개 클램프 연구(dog clamp study) 결과를 나타낸 것이다.
도 34-37은 원형 타블렛 150mg 및 280mg 카프레이트(caprate) 타블렛 및 140mg/140mg 카프레이트/라우레이트 타블렛으로 투약된 개에 대한 개 클램프 연구(dog clamp study) 결과를 나타낸 것이다.
8 합성 실시예( Synthesis Examples )
본 발명을 구체화 및 설명하기 위해 하기의 실시예를 제공한다.
8.1 보호 MPEG 6 C 3 올리고머 (3-{2-[2-(2-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }-에톡시)- 에톡시 ]- 에톡시 }-프로피온산 4차-부틸 에스테르)[(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-Methoxy- ethoxy )- ethoxy ]- ethoxy }- ethoxy )- ethoxy ]- ethoxy }- propionic acid tert -butyl ester )]의 합성
Figure 112007014591843-pct00040
메틸 헥사에틸렌 글리콜(methyl hexaethylene glycol)(1.0g, 3.37mmol) 및 4차-부틸 아크릴레이트(tert-butyl acrylate)(0.216g, 1.69mmol)를 건조 THF(10 mL)에 용해시켰다. 금속 나트륨(0.4mg, 0.016mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 4h 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물에 1M HCl(15mL)을 첨가하여 켄칭하였다(quench). 상기 켄칭된 반응 혼합물을 그후 CH2Cl2(1 x 50 mL, 1 x 25 mL)로 추출 하였다. 상기 유기층을 건조(MgSO4) 및 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(silica gel chromatography)(용리액로서 에틸 아세테이트)로 정제한 후에 상기 생성물을 오일(0.832g, 58%)로 수득하였다.
8.2 MPEG 6 C 3 올리고머산 (3-{2-[2-(2-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }- 에 톡시)- 에톡시 ]- 에톡시 }-프로피온산)[(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2- Methoxy - ethoxy )-ethoxy]-ethoxy}-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propionic acid )]의 합성
Figure 112007014591843-pct00041
상기 4차-부틸 에스테르(0.165g, 0.0389mmol)를 트리플루오로아세트산(2.0mL)에서 실온하에 교반함으로써 탈보호화시켰다(deprotected). 상기 함량은 이후 일정 중량(0.125g, 87%)으로 농축되었다.
8.3 활성 MPEG 6 C 3 올리고머 (3-{2-[2-(2-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }-에톡시)- 에톡시 ]- 에톡시 }-프로피온산 2,5- 디옥소 - 피롤리딘 -1-일 에스테르)[(3-{2- [2-(2-{2-[2-(2-Methoxy- ethoxy )- ethoxy ]- ethoxy }- ethoxy )- ethoxy ]- ethoxy }-propionic acid 2,5- dioxo - pyrrolidin -1- yl ester )]의 합성
Figure 112007014591843-pct00042
상기 산(0.660g, 1.79mmol) 및 N-하이드록시숙신이미드(0.2278g, 1.97mmol)를 건조 CH2Cl2(15mL)에 용해시켰다. 에틸 디메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로 클로라이드(ethyl dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride)(EDC, 0.343g, 1.79mmol)를 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후에, 상기 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고, 물(2 x 45 mL)로 세척하였다. 상기 유기층을 건조(MgSO4)시키고 일정 중량으로 농축하였다. 상기 생성물은 오일(0.441g, 53%)이었다.
8.4 보호 MPEG 4 C 3 올리고머 (3-(2-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }- 에톡 시)-프로피온산 4차-부틸 에스테르)[(3-(2-{2-[2-(2- Methoxy - ethoxy )- ethoxy ]-ethoxy}-ethoxy)-propionic acid tert - butyl ester )]의 합성
Figure 112007014591843-pct00043
메틸 테트라에틸렌 글리콜(methyl tetraethylene glycol)(1.0g, 4.80mmol) 및 4차-부틸 아크릴레이트(tert-butyl acrylate)(0.308g, 2.40mmol)를 건조 THF(10 mL)에 용해시켰다. 금속 나트륨(0.6mg, 0.024mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 4h 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물에 1M HCl(15mL)을 첨가하여 켄칭시켰다(quench). 상기 켄칭된 반응 혼합물을 그후 CH2Cl2(1 x 50 mL, 1 x 25 mL)으로 추출하였다. 상기 유기층을 건조(MgSO4) 및 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(silica gel chromatography)(용리액로서 에틸 아세테이트)에 의해 정제한 후에, 상기 생성물을 오일(1.28g, 79%)로 수득하였다.
8.5 MPEG 6 C 3 올리고머산의 합성(3-(2-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }- 에 톡시)-프로피온산)[(3-(2-{2-[2-(2- Methoxy - ethoxy )- ethoxy ]- ethoxy }- ethoxy )-propionic acid )]
Figure 112007014591843-pct00044
상기 4차-부틸 에스테르(1g, 3.42mmol)를 트리플루오로아세트산(6.0mL)에서 실온하에 교반하여 탈보호화시켰다(deprotected). 상기 함량을 이후 일정 중량(0.87g, 91%)으로 농축시켰다.
8.6 활성 MPEG 4 C 3 올리고머 (3-(2-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }- 에톡시 )-프로피온산 2,5- 디옥소 - 피롤리딘 -1-일 에스테르)[(3-(2-{2-[2-(2- Methoxy - ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethoxy)-propionic acid 2,5- dioxo - pyrrolidin -1- yl ester)]의 합성
Figure 112007014591843-pct00045
상기 산(0.6g, 2.14mmol) 및 N-하이드록시숙신이미드(0.271g, 2.35mmol)를 건조 CH2Cl2(20mL)에 용해시켰다. 에틸 디메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로 클로라이드(ethyl dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride)(EDC, 0.409g, 2.14mmol)를 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후에, 상기 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고, 물(2 x 45 mL)로 세척하였다. 상기 유기층을 건조(MgSO4)시키고, 일정 중량으로 농축하였다. 상기 생성물은 오일(0.563g, 69%)이었다.
8.7 보호 MPEG 4 C 3 올리고머 (3-(2- 메톡시 - 에톡시 )-프로피온산 4차-부틸 에스테르)[(3-(2- Methoxy - ethoxy )- propionic acid tert - butyl ester )]의 합성(3-(2- 메톡 시- 에톡시 )-프로피온산 4차-부틸 에스테르)
Figure 112007014591843-pct00046
메틸 테트라에틸렌 글리콜(methyl tetraethylene glycol)(5.0g, 41.6mmol) 및 4차-부틸 아크릴레이트(tert-butyl acrylate)(2.66g, 20.8mmol)를 건조 THF(20 mL)에 용해시켰다. 금속 나트륨(0.47mg, 20.8mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 4h 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물에 1M HCl(30mL)를 첨가하여 켄칭시켰다(quench). 상기 켄칭된 반응 혼합물을 그후 CH2Cl2(1 x 100 mL, 1 x 50 mL)으로 추출하였다. 상기 유기층을 건조(MgSO4) 및 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(silica gel chromatography)(용리액로서 에틸 아세테이트)로 정제한 후에, 상기 생성물을 오일(7.5g, 89%)로 수득하였다.
8.8 MPEG 6 C 3 올리고머산 (3-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]-프로피온산)[(3-[2-(2-Methoxy-ethoxy)-ethoxy]-propionic acid )]의 합성
Figure 112007014591843-pct00047
상기 4차-부틸 에스테르(1g, 4.90mmol)를 트리플루오로아세트산(6.0mL)에서 실온하에 교반함으로써 탈보호화하였다(deprotected). 상기 함량을 이후 일정 중량(0.652g, 89%)으로 농축되었다.
8.9 2-[2-(2- 프로폭시 - 에톡시 )- 에톡시 ]-에탄올(1)의 합성
Figure 112007014591843-pct00048
트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol)(19.5 g, 0.13 mol)을 테트라안하이드로퓨란(tetrahydrofuran)(150mL)에 용해시키고, 수소화 나트륨(sodium hydride)(2.60g, 0.065mol)을 0.5h 이상 조금씩 나누어서(portion wise)으로 첨가하였으며, 상기 반응물을 1h 동안 더 교반하였다. 그후 테트라하이드로퓨란(30 mL)에 용해된 1-브로모프로판올(bromopropanol)(8.0g, 0.065mol)은 추가 깔대 기(funnel)을 통하여(via addition funnel) 적가로(dropwise) 첨가하였으며, 상기 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 조 반응 혼합물(crude reaction mixture)은 셀라이트(Celite)를 통하여 여과시키고, CH2Cl2로 세척하였으며, 증발시켜 건조하였다. 상기 생성오일을 CH2Cl2 (250 mL)에 용해시키고, 포화 NaCl(250 mL), H2O(250 mL)로 세척하였으며, MgSO4으로 건조하고, 증발시켜 건조하였다. 컬럼 크로마토그래피(실리카, 에틸 아세테이트)는 노르스름한 오일(2.24g, 수율 18%) 1을 수득하였다 (2.24 g, 수율 18%).
8.10 탄산 4-니트로- 페닐 에스테르 2-[2-(2- 프로폭시 - 에톡시 )- 에톡시 ]-에틸 에스테르[ carbonic acid 4- nitro - phenyl ester 2-[2-(2- propoxy - ethoxy )- ethoxy ]- ethyl ester]의 합성
Figure 112007014591843-pct00049
4-니트로클로로포르메이트(4-nitrochloroformate)(3.45g, 17.1mmol) 및 1(2.2g, 11.4mmol)을 CH2Cl2(20mL)에 용해시켰다. 10분 동안 교반한 후, TEA(2.1mL, 15mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 조 반응물을 CH2Cl2(50mL)로 희석하고, 1M HCl(50mL), H2O(50mL)로 세척하였으며, MgSO4로 건조하고, 증발시켜 건조하였다. 컬럼크로마토그래피(실리카, 에틸 아세테이트/헥산, 3:2)는 노르스름한 오일 2를 수득하였다.(2.57 g, 수율 63%).
8.11 탄산 2,5- 디옥소 - 피롤리딘 -1-일 에스테르 2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]-에틸 에스테르[ carbonic acid 2,5- dioxo - pyrrolidin -l- yl ester 2-[2-(2- methoxy - ethoxy)-ethoxy]-ethyl ester ]의 합성
Figure 112007014591843-pct00050
트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(triethylene glycol monomethyl ether)(1.0g, 6.1mmol) 및 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트(N,N'-disuccinimidyl carbonate)(1.87g, 7.3mmol)을 아세토니트릴(10 mL)에 용해시켰다. 그후 트리에틸아민(1.3mL, 9.15mmol)을 첨가하고, 상기 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 조 반응물을 증발시켜 건조하였고, 포화 NaHCO3(50 mL)에 용해시켰으며, 에틸 아세테이트(2x50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하여, 증발시켜 건조하였다. 컬럼 크로마토그래피(실리카, 에틸 아세테이트)는 맑은 오일(0.367 g, 수율 20%) 1을 수득하였다.
8.12 탄산 2,5- 디옥소 - 피롤리딘 -1-일 에스테르 2-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡 시]- 에톡시 }-에틸 에스테르[ carbonic acid 2,5- dioxo - pyrrolidin -l- yl ester 2-{2-[2-(2-methoxy- ethoxy )- ethoxy ]- ethoxy }- ethyl ester ](1)의 합성
Figure 112007014591843-pct00051
테트라에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(tetraethylene glycol monomethyl ether)(1.0g, 4.8mmol) 및 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트(disuccinimidyl carbonate)(1.48g, 5.8mmol)를 아세토니트릴(10 mL)에 용해시켰다. 그후 트리에틸아민(1.0mL, 7.2mmol)을 첨가하고, 상기 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 조 반응물을 증발시켜 건조하고, 포화 NaHCO3(30 mL)에 용해시켰으며, 에틸 아세테이트(2x30 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하였으며, 증발시켜 건조하였다. 컬럼 크로마토그래피(실리카, 에틸 아세테이트/MeOH, 20:1)는 맑은 오일 1을 수득하였다(0.462g, 수율 28%)
8.13 부트 -3- 에노익 산 에틸 에스테르( but -3- enoic acid ethyl ester )의 합성
Figure 112007014591843-pct00052
비닐아세트산(vinylacetic acid)(10.0g, 0.12mol)을 에탄올(200 mL)에 용해시키고, 진한 황산(cone. sulfuric acid)(0.75mL, 0.014mol)에 첨가하였다. 상기 반응물을 4h 동안 가열하여 환류시켰다. 조 반응물을 에틸 아세테이트(200mL)로 희석하고, H2O(20OmL), 포화 NaHCO3(200 mL)로 세척하였으며, MgSO4로 건조하고, 증발시켜 건조하여, 맑은 오일 1을 수득하였다(3.17 g, 23%).
8.14 4-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }-부티르산 에틸 에스테르(4-{2-[2-(2-Methoxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-butyric acid ethyl ester )의 합성
Figure 112007014591843-pct00053
트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(4.27g, 0.026mol) 및 부트-3-에노익 산 에틸 에스테르(But-3-enoic acid ethyl ester)(1.5 g, 0.013 mol)를 테트라하이드로퓨란(10mL)에 용해시켰다. 럼프(lump) Na0(0.030g, 0.013mol)를 첨가하고, 상기 반응물을 4h 동안 교반하였다. 조 반응물을 1M HCl (20mL)로 켄칭하고, 에틸 아세 테이트(3 x 20mL)로 세척하였다. 유기층을 결합시키고, H2O(2 x 10 mL)로 세척하였으며, MgSO4로 건조하고, 증발시켜 건조하여, 노르스름한 오일 2를 수득하였다(1.07g, 수율 30%).
8.15 4-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }-부티르산(4-{2-[2-(2- Methoxy -ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-butyric acid )의 합성
Figure 112007014591843-pct00054
4-{2-[2-(2-메톡시-에톡시)-에톡시]-에톡시}-부티르산 에틸 에테르(1.07g, 4.0mmol)을 1M NaOH (10mL)에 용해시키고, 상기 반응물을 2h 동안 교반하였다. 조 반응물을 포화 NaCl(40mL)로 희석하고, 진한 HCl로 pH 약 2로 산화시키며, CH2Cl2(2 x 50mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하며, 증발시켜 건조하여 맑은 오일 3을 수득하였다(0.945 g, 수율 94%).
8.16 4-{2-[2-(2- 메톡시 - 에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }-부티르산 2,5- 디옥소 - 피롤리딘 -1-일 에스테르[4-{2-[2-(2- Methoxy - ethoxy )- ethoxy ]- ethoxy }- butyric acid 2,5- dioxo-pyrrolidin-1-yl ester ]의 합성
Figure 112007014591843-pct00055
N-하이드록시숙신이미드(0.55g, 4.8mmol) 및 EDCI(1.15g, 6.0mmol)을 CH2Cl2 (7 mL)에 용해시켰다. 그후 CH2Cl2 (2 mL)에 용해된, 4-{2-[2-(2-메톡시-에톡시)-에톡시]-에톡시}-부티르산(0.940g, 3.8mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 조 반응물을 CH2Cl2(21 mL)로 희석하고, 1M HCl(30mL), H2O(30mL)로 세척하였으며, MgSO4로 건조하고, 증발시켜 건조하였다. 컬럼 크로마토그래피(실리카, 에틸 아세테이트)는 맑은 오일 4를 수득하였다(0.556g, 수율 43%).
9 착물의 제조
인슐린 화합물 접합체의 아연 착물을 제조하기 위한 방법들이 연구되었다. 인슐린 화합물 및 인슐린 화합물 유사체의 착물화/결정화에 사용되는 공개된 방법을 제외한 새로운 방법들이 HIM2의 아연 착물을 제조하기 위하여 개발되었다. HIM2는 B29에 결합된 변형 모이어티를 가지는 인간 인슐린 단일접합체이며, 여기서, 상기 변형 모이어티는 다음 구조를 가진다:
Figure 112007014591843-pct00056
.
추가로 착물(complexes)은, B29에 결합된 변형 모이어티를 가지는 인간 인슐린 단일접합체인, IN105를 이용하여 제조하였고, 여기서 상기 변형 모이어티는 아래의 구조를 가진다:
Figure 112007014591843-pct00057
.
상기 방법은 세 가지 주요 유형인, 인슐린 화합물 접합체 고체의 "T-형" 및 "R-형" 및 "프로타민" 양이온 착물을 제공한다.
9.1 T-형 고체의 제조 및 분석
9.1.1 HIM2 (2 g/L)의 T-형 Zn 착물의 사전 제조( attempted preparation )
약 2g/L의 HIM2 용액을 10% HCl로 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 빙초산(glacial acetic acid)을 상기 용액의 1OmL 분액(aliquot)(20mg 단백질)에 첨가하여, 최종농도 0.25M가 되도록 하였다. 2% w/w ZnCl2 용액 20(또는 40)μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축된 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 5.1(또는 5.5)로 조정하였다. 상기 용액을 실온(또는 +5℃)에서 15분 동안 교반하고, 그후 실온(또는 +5℃에서) 하루동안 놔두어, 고체가 형성되도록 하였다. 상기 반응물을 실온에서 하루동안 놔둔 후에 결정 또는 침전물이 형성되지 않았다. 미국 특허 5,504,188, "Preparation of stable zinc insulin compound analog crystals."의 실시예 2 참조하시오.
9.1.2 HIM2 (10 g/L 농도)의 T-형 Zn 착물
약 10 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl로 최종 pH 약3을 가지도록 제조하였다. 빙초산을 상기 용액의 1OmL 분액(aliquot)(100mg 단백질)에 첨가하여, 최종농도 0.25M로 되게 하였다. 10% w/w ZnCl2 용액 40μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH는 농축된 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 5.20까지 조정하였다. 상기 용액을 +5℃에서 15분 동안 교반하고, 그후 +5℃ 5일동안 놔두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응혼합물을 원심분리관로 이동하여, 10분동안 2000 RPM으로 원심분리하였다. 상기 용액은 따라내고, 상기 고체는 차가운 DI수(cold DI water) 5 mL로 세척하였다. 상기 용액을 10분 동안 2000 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내고, 상기 고체는 다른 차가운 DI 수 5mL로 세척하였다. 또 다시, 상기 샘플을 10분 동안 약 2000 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 상기 샘플을 표준강도(proof) 200인 차가운 EtOH로 세척하고, 10분 동안 2000 RPM으로 원심분리한 다 음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플을 냉동건조기에서 건조시켜, 백색 고체를 제조하였다.
9.1.3 HIM2 (20 g/L 농도)의 T-형 Zn 착물
약 20 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl로 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 빙초산을 상기 용액의 1OmL 분액(aliquot)(200mg 단백질)에 첨가하여, 최종농도가 0.25M로 되도록 하였다. 10% w/w ZnCl2 용액 80μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축된 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 5.37까지 조정하였다. 상기 용액을 +5℃에서 15분 동안 교반하고, 그후 +5℃에서 4일동안 놔두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응혼합물을 원심분리관로 옮겨, 20분동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 상기 용액을 따라내고, 상기 고체는 차가운 DI수(cold DI water) 5 mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내고, 상기 고체는 다른 차가운 DI 수 5mL로 세척하였다. 또 다시, 상기 샘플을 2분 동안 약 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 상기 샘플을 표준강도 200인 차가운 EtOH로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플은 냉동건조기에서 건조시켜, 백색 고체를 제조하였다.
9.1.4 HIM2 (30 g/L 농도)의 T-형 Zn 착물
약 30 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl로 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 빙초산을 상기 용액의 5OmL 분액(aliquot)(1.5g 단백질)에 첨가하여, 최종농도가 0.25M로 되게 하였다. 10% w/w ZnCl2 용액 600μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축된 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 5.34까지 조정하였다. 상기 용액을 +5℃에서 5일동안 놔두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응혼합물을 원심분리관로 옮겨, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하였다. 상기 용액을 따라내고, 상기 고체는, 각각의 세척시에 H2O를 원심분리 및 따라내면서, 차가운 DI수(cold DI water) 10 mL로 3번 세척하였다. 상기 샘플을 이후 표준강도 200인 EtOH 10mL로 3번 세척하였다. 이를 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하였고, 각각의 세척 후에 따라내었다. 상기 샘플을 냉동건조기에서 건조시켜, 백색 고체를 제조하였다.
도 1 및 2 는 24시간 동안 성장한 결정을 나타내는, Zeiss Axiovert 현미경을 이용하여 찍은 현미경사진이다. 도 1 에서, 결정크기는 길이 약 11.3μM 및 직경 약 5.3 μM이다. 도 2 에서, 왼편의 결정의 크기는 길이 약 15.1μM 및 직경 약 5.9μM이며, 오른편의 결정의 크기는 길이 약 9.1μM 및 직경 약 5.3μM이다. 도 3 은 5일 동안 성장한 결정을 나타내는, Zeiss Axiovert 현미경을 이용하여 찍은 현미경 사진이다. 일 측면에서, 본 발명은 도 1, 2 또는 3 에서 나타난 바와 같은 형상을 가지는 결정을 포함한다.
9.1.5 HIM2 (50 g/L 농도)의 T-형 Zn 착물
약 50 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl로 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 빙초산을 상기 용액의 1OmL 분액(aliquot)에 첨가하여, 최종농도가 0.25M로 되게 하였다. 10% w/w ZnCl2 용액 200μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축된 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 5.23까지 조정하였다. 상기 용액을 +5℃에서 15분 동안 교반하였고, 그후 +5℃에서 4일동안 놔두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응혼합물을 원심분리관로 옮겨, 20분동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 상기 용액을 따라내고, 상기 고체를 차가운 DI H2O(cold DI H2O) 5 mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내고, 상기 고체는 다른 5mL의 차가운 DI H2O로 세척하였다. 또 다시, 상기 샘플을 2분 동안 약 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 상기 샘플을 표준강도 200인 차가운 EtOH로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플을 냉동건조기에서 건조시켜, 백색 고체를 제조하였다.
9.1.6 HIM2 의 T-형 Zn 착물 (1 g 스케일)
약 10 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl로 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 빙초산을 상기 용액의 5OmL 분액(aliquot)(500mg 단백질)에 첨가하여, 최종농도가 0.25M로 되게 하였다. 10% w/w ZnCl2 용액 200μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축된 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 5.49까지 조정하였다. 상기 용액을 +5℃에서 15분 동안 교반하고, 그후 +5℃에서 7일 동안 놔두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 상기 용액을 따라내고, 상기 고체는 차가운 DI H2O(cold DI H2O) 10 mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 상기 물 세척을 두 번 더 반복하였다. 상기 샘플을 표준강도 200인 차가운 EtOH 10mL로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, EtOH를 따라내었다. 두 번 이상의 EtOH 세척을 동일한 방식으로 수행한 다음, 상기 샘플을 4일 동안 냉동건조기에서 건조시켰다.
9.1.7 중성 pH 에서 HIM2 의 T-형 Zn 착물 (5 g 스케일)
약 10 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl로 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 10% ZnCl2 용액 2 mL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축된 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 7.05까지 조정하였다. 상기 용액을 실온에서 밤새 교반하여, 고체가 형성되도록 하였다.
유백색의 Zn-HIM2 반응 혼합물(50OmL)을, 부분적으로, 350 mL 미세-프리트(fine-fritted)(4.5-5um) 디스크 깔대기(disc funnel)(ChemGlass CG1402-28, 직 경 90mm)에 첨가하였다. 상기 여과액을 약 4-6시간 동안 진공에 적용하면서 가지 달린 플라스크(side-arm flask)에 수집하였다. 일 선택사항으로, 상기 케이크(cake)를 차가운 1% ZnCl2 100 mL로 세척하고, 상기 여과액은 분리하여 수집하였다. 상기 케이크는 차가운 얼음 물(ice-cold water) 100 mL로 세척하였고, 상기 여과액은 다시 수집하였다. 상기 케이크는 또한 냉각된 10% 에탄올 100 mL로 세척하고, 상기 여과액은 다시 한번 수집하였다. 상기 케이크의 최종 세척액은 새로운 냉각수 10OmL였고, 상기 최종 여과액을 수집하였다. 상기 케이크는 진공하에서 건조 및/또는 12-18 시간 이상 대기-건조(air-dried)하였다. 건조 후에, 상기 케이크를 깔대기에서 벗겨내어 중량를 측정하였으며, 수분/단백질 함량을 HPLC로 측정하였다. 상기 공정 중에 유실된 Zn-HIM2의 농도를 측정하기 위하여, 상기 다양한 세척 단계로부터 수집한 여과액을 또한 HPLC를 이용하여 분석하였다. 상기 여과로 98%의 전체수율과 함께 2.5% w/w Zn 함량을 수득하였다.
9.1.8 중성 pH 에서 HIM2 의 T-형 Zn 착물(500 mg 스케일)
약 10 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl로 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 10% ZnCl2 용액 200μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축된 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 7.06까지 조정하였다. 상기 용액을 +5℃에서 15분 동안 교반하고, 이후에, +5℃에서 2일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분동안 2800 RPM으로 원심분리하 였다. 상기 용액은 따라내고, 상기 고체는 차가운 DI H2O(cold DI H2O) 10 mL로 세척하였다. 상기 용액은 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 후, H2O를 따라내었다. 상기 물 세척을 두 번 더 반복하였다. 상기 샘플은 표준강도 200인 차가운 EtOH 10mL로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 후에, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행하였고, 상기 샘플을 냉동건조기에서 2일 동안 두어, 건조시켰다.
9.1.9 T-형 고체 조성물에 대한 결과
반응 관찰(observation) 용해도(mg/gL) % w/w Zn
9.1.1 고체형성 없음 N/A N/A
9.1.2 백색 고체 NEM NEM
9.1.3 백색 고체 NEM NEM
9.1.4 백색 고체 NEM 0.53
9.1.5 백색 고체 146 0.66
9.1.6 백색 고체 109 0.55
9.1.7 백색 고체 ND 2.50
9.1.8 백색 고체 ND 1.63
NEM(Not enough material) = 물질이 충분하지 않음
ND(no data) = 수치없음
9.2 R-형 고체의 제조 및 분석
9.2.1 2g/L의 HIM2 과 페놀의 R-형 Zn 착물
약 2g/L의 HIM2 용액을 빙초산을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀 33μL를 상기 용액의 분액(aliquot) 10mL에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 5.89로 조정하였다. 10% w/w ZnCl2 용액 160μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 실온에서 3일 동안 두어, 더 많은 침전물이 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분 동안 3400 RPM으로 원심분리하였다. 상청액(supernatant)은 따라내고, 고체는 차가운 DI 수(DI water) 5 mL로 세척하였다. 상기 용액을 15분 동안 3200 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 이후, 상기 샘플은 표준강도 200의 차가운 EtOH 5mL로 세척하고, 15분 동안 3200 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플은 차가운 EtOH 5mL로 다시 세척하였으나, 원심분리하지 않았다. 상기 고체를 상기 관의 하부에 가라앉게 한 후에, 고속 진공(speed vacuum)에 두어, 건조시켰다.
9.2.2 20g/L HIM2 의 R-형 Zn 착물 제조
약 20 g/L의 HIM2 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀 66μL를 상기 용액의 분액(aliquot) 10mL에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 6.43으로 조정하였다. 10% ZnCl2 용액 320μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 실온에서 4일 동안 두어, 더 많은 침전물이 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5 mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내고, 상기 고체는 다른 차가운 DI H2O 5mL로 세척하였다. 상기 샘플을 다시 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 상기 샘플을 표준강도 200의 차가운 EtOH 5mL로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플은 3일 동안 냉동건조하였다.
9.2.3 30g/L의 HIM2 의 R-형 Zn 착물 제조
약 30 g/L의 HIM2 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀 99μL를 상기 용액의 분액(aliquot) 10mL에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 6.47로 조정하였다. 이후, 10% ZnCl2 용액 480μL는 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 실온에서 4일 동안 두어, 더 많은 침전물이 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5 mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내고, 상기 고체는 다른 차가운 DI H2O 5mL로 세척하였다. 상기 샘플을 다시 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 상기 샘플은 표준강도 200의 차가운 EtOH 5mL로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플은 3 일 동안 냉동건조하였다.
도 4 는 4일 동안 성장한 고체를 나타낸다. 상기 사진은 Zeiss Axiovert 현미경을 이용하여 촬영하였다. 결정의 평균길이는 약 9.7μL이다.
9.2.4 50g/L의 HIM2 의 R-형 Zn 착물 제조
약 50 g/L의 HIM2 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀 165μL를 상기 용액의 분액(aliquot) 10mL에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 6.82로 조정하였다. 10% ZnCl2 용액 800μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 실온에서 4일 동안 두어, 더 많은 침전물이 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5 mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내고, 상기 고체는 다른 차가운 DI H2O 5mL로 세척하였다. 상기 샘플을 다시 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 상기 샘플을 표준강도 200의 차가운 EtOH 5mL로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플은 3일 동안 냉동건조하였다.
9.2.5 1g 스케일의 HIM2 의 R-형 Zn 착물 제조
약 10 g/L의 HIM2 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀 165μL를 상기 용액의 분액(aliquot) 50mL에 첨가하였다. 상기 pH는 농축 수산화 암모늄을 이용하여 6.42로 조정하였다. 10% ZnCl2 용액 800μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 실온에서 4일 동안 두어, 더 많은 침전물이 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 10mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 물 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행하였다. 상기 샘플을 이후, 표준강도 200의 차가운 EtOH 10mL로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행한 다음, 상기 샘플을 4일 동안 냉동건조기에 두었다.
9.2.6 5g 스케일의 HIM2 의 R-형 Zn 착물 제조
약 10 g/L의 HIM2 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀 1500μL를 상기 용액의 분액(aliquot) 450mL에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 7.1로 조정하였다. 10% ZnCl2 용액 1800μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 실온에서 밤 새 두어, 더 많은 침전물이 형성되도록 하였다.
상기에 수행한 반응을 세 개의 여과실험으로 분리하였다. 실험 1에서, 상기 반응 혼합물은 미세 thruf 퍼널(fine fritted funnel)을 통하여 여과시켰고, 이후 1% ZnCl2 용액으로 세척하였다. 상기 물질은 진공여과를 이용하여 밤새 건조하였다. 상기 두 번째 실험은, 여과지(filter paper)도 함유하는 미디움 소결 여과기(medium fritted filter) 위로 여과하였다. 상기 물질은 이후, 에탄올 및 물로 세척하였고 진공여과를 이용하여 밤새 건조하였다. 마지막으로, 세 번째 실험은 미세 프리트 퍼널을 통하여 여과하고, 1% ZnCl2 용액으로 세척하며, 또한 에탄올 및 물로 세척하였다. 상기 물질은 또한 진공여과로 밤새 건조하였다.
실험 1
(미세-프리트, ZnCl2 세척, H2O/EtOH 세척없음)		 실험 2
(여과지, 매체 프리트, EtOH/H2O 세척)		 실험 3
(미세-프리트, EtOH/H2O 세척)
수율 74% 93% 58%
w/w % Zn 1.99 2.83 2.06
w/w % 페놀 0.033 0.45 1.28
9.2.7 중성 pH 에서 HIM2 의 R-형 Zn 착물
약 10 g/L의 HIM2 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀 165μL를 상기 용액의 분액(aliquot) 50mL에 첨가하였다. 그후, 10% ZnCl2 용액 200μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 7.18로 조정하였다. 상기 용액은 실온에서 2일 동안 두어, 더 많은 침전물이 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분 동안 2800 RPM으로 원심분리하였다. 그러나, 상기 물질이 처음에는 상기 관의 하부에 모이지 않았고, 따라서 약 2시간 동안 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5mL로 세척하였다. 상기 용액을 60분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 물 세척을 두 번 더 반복하였다. 상기 샘플은 이후, 표준강도 200의 차가운 EtOH 5mL로 세척하고, 60분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행하였다. 물질은 상기 세번째 EtOH 세척 후에 탁해졌고(cloudy), 상기 반응물을 밤새 냉장고에 두어, 더 많이 침전하도록 하였다. 상기 용매는 2일 동안 냉동건조기에 두었다.
9.2.8 R-형 고체 조성물에 대한 결과
반응 관찰 용해도(mg/mL) % w/w Zn 페놀
9.1.2 백색 고체 NEM NEM NEM
9.1.3 백색 고체 44.75 1.21 0.097
9.1.4 백색 고체 50.49 1.74 0.41
9.1.5 백색 고체 36.24 2.32 0.52
9.1.6 백색 고체 47.7 1.06 0.16
9.1.7 백색 고체 ND See above See above
9.1.8 백색 고체 ND 1.74 1.62
NEM = 물질 충분하지 않음
ND = 수치없음
9.3 프로타민 고체의 제조 및 분석
9.3.1 산성 pH 에서 HIM2 와 프로타민의 T-형 Zn 착물의 제조
프로타민을, 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 된, 10g/L HIM2의 저장용액에 첨가하였다. 빙초산을 상기 용액의 분액(100mg 단백질) 10 mL에 첨가하였다. 10% ZnCl2 용액 200μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 pH 약 5로 조정하였다. 상기 용액을 5℃에서 15분 동안 교반한 후, 5℃에서 2일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 10mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 물 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행하였다. 상기 샘플을 이후, 표준강도 200의 차가운 EtOH 10mL로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행한 다음, 상기 샘플을 2일 동안 냉동건조기에 두었다.
9.3.2 중성 pH 에서 HIM2 와 프로타민의 T-형 Zn 착물의 제조
약 30 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 빙초산 100mL을 상기 용액의 분액(1.5g 단백질) 50 mL에 첨가하였다. 10% ZnCl2 용액 600μL을 상기 반응물에 첨가하고 이어서 프로타민 225mg을 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 6.95로 조정하고, 상기 반응물을 5℃에서 15분 동안 교반한 후, 5℃에서 2일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 10mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 물 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행하였다. 상기 샘플을 이후, 표준강도 200인 차가운 EtOH 10mL로 세척하였고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행한 다음, 상기 샘플을 3일 동안 냉동건조기에 두었다.
9.3.3 산성 pH 에서 HIM2 와 프로타민의 R-형 Zn 착물의 제조
약 10 g/L의 HIM2 용액을 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀(2.48mL)을 상기 용액의 분액(1.5g 단백질) 150 mL에 첨가하였다. 상기 반응물의 pH는 농축 수산화 암모늄을 이용하여 pH 약 6.57로 조정하였다. 10% ZnCl2 용액 12μL를 상기 반응물에 첨가하고 이어서 프로타민 225mg을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 다음, 실온에서 2일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 50mL로 세척하였다. 상기 용액을 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 물 세척을 동일한 방 식으로 두 번 더 수행하였다. 상기 샘플은 이후, 표준강도 200인 차가운 EtOH 10mL로 세척하고, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행한 다음, 상기 샘플은 2일 동안 냉동건조기에 두었다.
9.3.4 중성 pH 에서 HIM2 와 프로타민의 R-형 Zn 착물의 제조
약 10 g/L의 HIM2 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀(495mL)을 상기 반응물 150 mL에 첨가하였다. 10% ZnCl2 용액 600 mL를 상기 반응물에 첨가하고 이어서 프로타민 75mg을 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 pH 7.01로 조정하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 50mL로 세척하였다. 상기 용액을 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 H2O는 따라내었다. 물 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행하였다. 상기 샘플을 이후, 표준강도 200인 차가운 EtOH 50mL로 세척하고, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행한 다음, 상기 샘플을 2일 동안 냉동건조기에 두었다.
9.3.5 프로타민 고체 조성물에 대한 결과
반응 관찰 용해도(mg/mL) % w/w Zn 페놀
9.3.1 백색 고체 ND 0.66 N/A
9.3.2 백색 고체 ND 2.47 N/A
9.3.3 백색 고체 36.78 1.22 9.87
9.3.4 백색 고체 NEM NEM NEM
NEM = 물질 충분하지 않음
ND = 수치없음
9.4 인슐린 화합물 이접합체 착물의 제조 및 분석
9.4.1 A1 및 B29 인슐린 화합물 이접합체에서의 T-형 Zn 착물
인간인슐린의 B29 및 A1에 결합된 변형 모이어티 -C(O)(CH2)5(OCH2CH2)7OCH3를 가지는 인슐린 화합물 이접합체(DICON-1)를 약 10g/L 용액에 첨가하고, 10% HCl을 이용하여 최종 pH 3.15가 되도록 제조하였다. 최종 농도 0.25M로 될 때까지 빙초산을 상기 용액의 분액 3.75mL에 첨가하였다. 이후 10% ZnCl2 용액 15 μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 4.90으로 조정하였다. 상기 용액을 5℃에서 15분 동안 교반한 후, 5℃에서 6일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다(백색 고체를 수득하였다).
9.4.2 A1 및 B29 인슐린 화합물 이접합체의 R-형 Zn 착물
DICON-1를 약 10 g/L의 용액에 첨가하고, 10% HCl을 이용하여 최종 pH 3.15가 되도록 제조하였다. 액화 페놀 약 12μL를 상기 용액의 분액(aliquot) 3.75mL에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 5.75로 조정하였다. 10% ZnCl2 용액 60μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 실온에서 4일 동안 두어, 더 많은 침전물이 형성되게 하였다(백색 고체를 수득하였다).
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5 mL로 세척하였다. 상기 용액을 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내고, 상기 용액은 다른 차가운 DI H2O 5mL로 세척하였다. 상기 샘플을 다시 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 상기 샘플을 표준강도 200의 차가운 EtOH 5mL로 세척하고, 20분 동안 2600 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플을 3일 동안 냉동건조하였다.
9.4.3 이접합체 B1, B29 ( lOmg / mL )
DICON-1을 약 10 g/L의 용액에 첨가하였고, 액화 페놀 33μL를 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 5.34로 조정하였다. 이후, 10% ZnCl2 용액 160μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 2주(two weeks) 동안 교반하여, 고체가 형성되도록 하였다(백색 고체를 수득하였다).
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리 하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5 mL로 3번 세척하였다. 상기 용액을 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하고, 각 세척 단계 후에 따라내었다. 상기 샘플을 다시 표준강도 200의 차가운 EtOH 5mL로 3번 세척하였고, 각 세척 단계 후에 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플을 다시 15분 2600 RPM으로 원심분리하고, 각 세척단계 후에 따라내었다. 동안 상기 샘플은 2일 동안 냉동건조하였다.
9.4.4 이접합체 B1, B29 (2 Omg / mL )
DICON-1을 약 20 g/L의 용액에 첨가하고, 액화 페놀 66μL를 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 7.65로 조정하였다. 10% ZnCl2 용액 320μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 용액은 실온에서 2주(two weeks) 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다(백색 고체를 수득하였다).
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5 mL로 3번 세척하였다. 상기 용액을 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하고, 각 세척 단계 후에 따라내었다. 상기 샘플은 다시 표준강도 200의 차가운 EtOH 5mL로 3번 세척하였다. 다시 상기 샘플을 15분 동안 2600 RPM으로 원심분리하고, 각 세척 단계 후에 따라내었다. 상기 샘플은 2일 동안 냉동건조하였다.
9.5 T-형 IN105 고체의 제조 및 분석
9.5.1 IN105 단일접합체의 T-형 Zn 착물 (10 g/L 농도)
약 10 g/L의 IN105 용액(100mg)은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 10% w/w ZnCl2 용액 50μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 7.52로 조정하였다. 상기 탁한 용액을 교반한 후, 실온에서 5일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분 동안 2900 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 3x10 mL로 세척하였다. 상기 용액을 10분 동안 2900 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내고, 상기 용액을 또다른 DI H2O로 세척하였다. 이후 상기 샘플을 표준강도 200인 차가운 EtOH 3x10mL로 세척하고, 10분 동안 2900 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플은 진공건조하여, 백색고체(90mg)를 수득하였다.
9.5.2 IN105 단일접합체의 T-형 Zn 착물(1g 스케일)
약 10 g/L의 IN105 용액(1g)은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 10% ZnCl2 용액 500μL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 약 7.4로 조정하였다. 상기 탁한 용액을 15분 동안 교반한 후, 실온에서 약 2일 동안 둔 다음 여과하였다.
상기 반응 혼합물을 청소용 진공배관하에서(under house vacuum) 소결된 유 리 깔대기(미세한)을 통하여 여과하였다. 여과 물질과 함께 상기 소결된 유리깔대기 함께 밤새 유리 건조기(glass dessicator)에 진공상태로 두어, 백색의 미세 파우더(900mg)을 생성하였다.
9.5.3 중성 pH 에서 IN105 단일접합체의 T-형 Zn 착물(5g 스케일)
약 10g/L의 IN105 용액(5g, lot#Nobex040706L)은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 10% ZnCl2 용액 2 mL를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 약 7.4로 조정하였다. 상기 탁한 용액을 실온에서 밤새 두어, 고체를 형성하도록 한 다음, 여과하였다.
상기에 수행한 반응은 4x50 mL 원심분리관으로 분리하고, 초기의 총 2시간 동안 3200 RPM으로 원심분리하였다. 상기 물질을 이후 20분 동안 9000 RPM으로 원심분리하고, 5℃에서 밤새 보관하였다. 상청액은 따라내고, 고체는 각각의 관의 차가운 DI H2O 10 mL로 세척하였다. 상기 관들을 거꾸로 뒤집고, 약 1시간 동안 3200 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 H2O는 따라내고, 상기 고체는 다른 차가운 DI H2O 10 mL로 세척하였다. 다시, 상기 샘플을 약 1시간 동안 3200 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 H2O는 따라내었다. 상기 샘플을 표준강도 200인 차가운 EtOH 2x10mL로 세척하고, 1시간 동안 3200 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플은 2일 동안 진공건조하여, 백색고체 1.64g(lot#Nobex040730L-A)를 수득하였다.
9.5.4 T-형 IN105 고체 조성물에 대한 결과
반응 관찰 용해도(mg/mL)
pH 약 7.4,
0.1M 인산 버퍼		 % w/w Zn
9.5.1 백색 고체 80-85 0.0
9.5.2 백색 고체 10-20 1.67
9.5.3 백색 고체 ND 1.88
9.6 R-형 IN105 고체의 제조 및 분석
9.6.1 중성 pH 에서 IN105 와 페놀의 R-형 Zn 착물
약 10 g/L의 IN105 용액(500mg)은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3을 가지도록 제조하였다. 10% ZnCl2 용액 200μL 및 액화 페놀 165μL을 상기 용액에 첨가하였다. 상기 pH는 농축 수산화 암모늄을 이용하여 7.37로 조정하였다. 상기 탁한 용액을 실온에서 2일 동안 교반하여, 고체가 형성되도록 한 다음, 여과하였다.
상기 반응 혼합물을 청소용 진공배관하에서(under house vacuum) 소결된 유리 깔대기(미세한)을 통하여 여과하였다. 여과 물질과 함께 상기 소결된 유리깔대기 함께 밤새 유리 건조기(glass dessicator)에 진공상태로 두어, 백색의 미세 파우더(400mg)을 생성하였다.
9.6.2 5g 스케일의 IN105 접합체의 R-형 Zn 착물
약 10 g/L의 IN105 용액(4.2g, lot#Nobex040706L)은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀 1.5mL 및 10% ZnCl2 용액 1.8mL를 상기 용액에 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 약 7.4로 조정하였다. 상기 매우 탁한 용액을 실온에서 밤새 두어, 더 많은 침전물을 형성하도록 하였다.
상기에 수행한 반응물을 4x50 mL 원심분리관으로 분리하고, 초기의 총 2시간 동안 3200 RPM으로 원심분리하였다. 상기 물질을 이후 20분 동안 9000 RPM으로 원심분리하고, 5℃에서 밤새 보관하였다. 상청액은 따라내고, 고체는 각각의 관의 차가운 DI H2O 10 mL로 세척하였다. 상기 관들을 거꾸로 뒤집고, 약 1시간 동안 3200 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 H2O는 따라내고, 상기 고체는 다른 차가운 DI H2O 10 mL로 세척하였다. 다시, 상기 샘플을 약 1시간 동안 3200 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 H2O는 따라내었다. 상기 샘플을 표준강도 200의 차가운 EtOH 2x10mL로 세척하였고, 1시간 동안 3200 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. 상기 샘플은 2일 동안 진공건조하여, 백색고체 2.34g(lot#Nobex040730L-A)를 수득하였다.
9.6.3 R-형 IN105 고체 조성물에 대한 결과
반응 관찰 용해도
(mg/mL)* 		% w/w Zn % w/w 페놀
9.6.1 백색 고체 ND 1.85 2.37
9.6.2 백색 고체 10-25 1.71 2.66
ND = 자료없음 (No data)
* pH 약 7.4의 인산 버퍼내에서 용해도
9.7 프로타민 IN105 고체의 제조 및 분석
9.7.1 산성 pH 에서 IN105 단일접합체와 프로타민의 R-형 Zn 착물의 제조
약 10 g/L의 INI05 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀(248μL)을 상기 용액의 분액(aliquot)(150mg 단백질) 15mL에 첨가하였다. 상기 pH를, 농축 수산화 암모늄을 이용하여 pH 약 6.50으로 조정하였다. 10% ZnCl2 용액 1μL를 상기 반응물에 첨가한 다음, 프로타민 22.5mg을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 실온에서 2일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5mL로 세척하였다. 상기 용액을 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 물 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행하였다. 상기 샘플은 이후, 표준강도 200의 차가운 EtOH 10mL로 세척하고, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행한 다음, 상기 샘플을 2일 동안 진공건조하였다.
9.7.2 중성 pH 에서 IN105 접합체와 프로타민의 R-형 Zn 착물의 제조
약 10 g/L의 INI05 용액은 10% HCl을 이용하여 최종 pH 약 3이 되도록 제조하였다. 액화 페놀(49.5μL)를 반응물 15mL에 첨가하였다. 10% ZnCl2 용액 60μL를 상기 반응물에 첨가한 다음, 프로타민 7.5mg을 첨가하였다. 상기 pH를 농축 수산화 암모늄을 이용하여 pH 7.00으로 조정하였다. 상기 반응물을 실온에서 3일 동안 두어, 고체가 형성되도록 하였다.
상기 반응 혼합물을 원심분리관으로 옮겨, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리하였다. 용액은 따라내고, 고체는 차가운 DI H2O 5mL로 세척하였다. 상기 용액을 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, H2O를 따라내었다. 물 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행하였다. 상기 샘플을 이후, 표준강도 200의 차가운 EtOH 50mL로 세척하고, 15분 동안 2800 RPM으로 원심분리한 다음, 상기 EtOH를 따라내었다. EtOH 세척을 동일한 방식으로 두 번 더 수행한 다음, 상기 샘플을 2일 동안 진공건조하였다.
9.7.3 IN105 의 R-형 결정형 Zn 착물 제조
25% 유기물을 함유하는 15mg/mL 조(crude) IN105 용액은 1M HCl을 이용하여 조정하여 pH 3.47이 되게하였다. 고체 페놀을 40-60℃ 수조에서 용해시키고, 0.218mL를 반응 플라스크(flask)에 첨가하였다. 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 0.4mL를 상기 반응물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH를, 1M NaOH를 이용하여 최종 pH 6.6이 될 때까지 조정하였다. 상기 pH를 조정하는 동안, 다음의 pH 값에서 10mL 분액을 취하였다(pulled): 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4 및 6.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 침상결정(needle-like crystals)을 현미경으로 관찰하였다.
9.7.4 30% 유기물을 함유하는 IN105 의 R-형 결정형 Zn 착물 제조
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물의 새로운 15mg/mL 용액을 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH를 1M HCl을 이용하여 2.81로 조정하였다. 액화 페놀 0.04OmL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 4% 산화 ZnCl2 용액 0.40OmL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 50% NH4OH를 이용하여 3.7 내지 5.4로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 1mL 분액을 취하였다: 4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.0~5.2에서의 침상결정을 나타낸다( 도 5 참조).
9.7.5 100 mM 암모늄 아세테이트 버퍼에서 IN105 의 R-형 결정형 Zn 착물 제조(30, 20 및 10% EtOH )
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물의 새로운 15mg/mL 용액을 10OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, 상기 pH를, 5M HCl을 이용하여 2.8로 조정하였다. 액화 페놀 0.04OmL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 4% 산화 ZnCl2 용액 0.40OmL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.9 내지 5.6으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.5mL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4~4.8에서의 침상결정을 나타낸다.
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물의 새로운 15mg/mL 용액을 10OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.8로 조정하였다. 액화 페놀 0.04OmL 및 95% EtOH 2.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 4% 산화 ZnCl2 용액 0.40OmL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.9 내지 5.6으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.5mL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.8 ~ 5.4에서의 침상결정을 나타낸다.
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물의 새로운 15mg/mL 용액을 10OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, 상기 pH는 5M HCl을 이용하여 2.8로 조정하였다. 액화 페놀 0.04OmL 및 95% EtOH 1.15mL를 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 4% 산화 ZnCl2 용액 0.40OmL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.8 내지 5.6으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.5 mL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 5.0 ~ 5.6에서의 침상결정을 나타낸다.
9.7.6 20% 유기물의 IN105 과 0.1 및 0.2% 페놀의 R-형 결정형 Zn 착물 제조
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물의 새로운 15mg/mL 용액을 10OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 3.0으로 조정하였다. 액화 페놀 0.01OmL 및 95% EtOH 2.5mL를 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 4% 산화 ZnCl2 용액 0.40OmL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH를 5M NH4OH를 이용하여 3.2 내지 5.6으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.5 mL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4 ~ 5.4에서의 침상결정을 나타내었다.
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물의 새로운 15mg/mL 용액을 10OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH를 5M HCl을 이용하여 3.0으로 조정하였다. 액화 페놀 0.02OmL 및 95% EtOH 2.5mL를 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 4% 산화 ZnCl2 용액 0.40OmL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 이후, 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.3 내지 5.6으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 10 mL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4 ~ 5.2에서의 침상결정을 나타내었다.
9.7.7 8.0g 스케일, pH 4.8 및 실온에서 IN105 의 R-형 결정형 Zn 착물의 제조
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물의 새로운 15mg/mL 용액을 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.0으로 조정하였다. 액화 페놀 2.13mL 및 95% EtOH 225mL를 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 4% 산화 ZnCl2 용액 21.3mL는 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 4.8으로 조정하였다. 상기 용액은 교반하지 않고 24시간 동안 둔 다음, 결정을 수득하였다. 침상결정을 T=0에서의 현미경 사진에서 관찰하였다.
상기 결정은 상기 반응 혼합물을 6x250mL 원심분리관으로 분리함으로써 수득하였다. 상기 관을 8분 동안 10,000 RPM으로 회전시킨 다음, 상청액을 따라내었다. 이후, 각각의 관에 차가운 H20 10mL를 첨가한 다음, 상기 6개의 관을 2개의 관으로 통합하였다. 상기 원심분리 공정을 차가운 물로 한번 더 반복하고, 차가운 EtOH로 두번 더 반복하였다. 상기 결정을 이후, 탁상용 냉동건조기로 2일 동안 건조하였다. 상기 공정은 출발 물질에 대하여 93% 수율을(w/w) 창출하였다.
9.7.8 1.5g 스케일, pH 4.8 및 실온에서 IN105 의 R-형 결정형 Zn 착물의 제조
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물(IN105)의 새로운 용액을 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼 100mL에 고체 IN105 1.52g을 용해시켜, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl/5M NH4OH를 이용하여 pH 2.8로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해시켰다. 용해된 페놀 400μL 및 95% EtOH 42.5mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 ZnCl2 용액 4mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 생성되는 용액을, 그후 5M NH4OH를 이용하여 pH 4.8로 조정하였다. 상기 용액을 교반하지 않고 48시간 동안 둔 다음, 결정을 수득하였다. 침상결정 형성을 21시간 후에 현미경으로 관찰하였다.
상기 결정은 상기 반응 슬러리(slurry)를 4x50mL 원심분리관에 분리함으로써 수득하였다. 상기 관은 초기의 8분 동안 1000 RPM으로 회전시킨 다음, 상청액은 따라내었다. 각 관의 결정은 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x5mL로 세척한 후, 8분 동안 3000 RPM으로 회전하였다. 상청액은 그후에 따라내었다. 상기 세척/회전 절차를 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x5mL를 이용하여 반복한 후, 얼음같이 차가운 EtOH의 분액 1x5mL를 이용하여 반복하였다. 상기 결정을 그후 밤새 진공 건조기에서 건조시켰다. 상기 공정은 시작물질에 대해 73%(w/w) 수율을 창출하였다.
9.7.9 1.5g 스케일, pH 4.4 및 실온에서 IN105 의 R-형 결정형 Zn 착물의 제조
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물(IN105)의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼 100mL에 고체 IN105 1.50g을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.6으로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해시켰다. 용해된 페놀 400μL 및 95% EtOH 42.5mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 ZnCl2 용액 4mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 생성되는 용액을 그후 5M NH4OH를 이용하여 pH 4.4로 조정하였다. 상기 반응물을 교반하지 않고 22시간 동안 둔 다음, 결정을 수득하였다. 침상결정 혼합물의 형성 및 침전물을 2시간 후에 현미경으로 관찰하였다. 상기 반응 혼합물이 완전히 결정화되는 것을 21시간 후에 현미경으로 관찰하였다.
상기 결정은 상기 반응 슬러리(slurry)를 1x250mL 원심분리관으로 이송함으로써 수득하였다. 상기 관을 초기의 8분 동안 10,000 RPM으로 회전시킨 다음, 상청액은 따라내었다. 각 관의 결정은 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x20mL로 세척한 후, 8분 동안 10,000 RPM으로 회전시켰다. 상청액은 그후에 따라내었다. 상기 세척/회전 절차를 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x20mL를 이용하여 반복한 후, 얼음같이 차가운 EtOH의 분액 2x20mL를 이용하여 반복하였으며, 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x20mL를 이용하여 마지막으로 반복하였다. 상기 결정을 그후 밤새 진공 건조기에서 건조하였다. 상기 공정은 시작물질에 비하여 67%(w/w) 수율을 창출하였다.
9.7.10 8.0g 스케일, pH 4.8 및 실온에서 IN105 의 R-형 결정형 Zn 착물의 제조
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물(IN105)의 새로운 용액을 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼 533mL에 고체 IN105 7.98g을 용해시켜, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.4로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해시켰다. 용해된 페놀 2.13mL 및 95% EtOH 225mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 21.3mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 생성되는 용액을 그후 5M NH4OH를 이용하여 pH 4.8로 조정하였다. 상기 용액을 교반하지 않고 21시간 동안 둔 다음, 결정을 수득하였다. 상기 반응 혼합물이 완전히 결정화되는 것을 2시간 후에 현미경으로 관찰하였다.
상기 결정은 상기 반응 슬러리(slurry)를 6x250mL 원심분리관으로 분리함으로써 수득하였다. 상기 관을 초기의 8분 동안 10,000 RPM으로 회전시킨 다음, 상청액은 따라내었다. 각 관의 결정을 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x10mL로 세척한 후, 8분 동안 10,000 RPM으로 회전하였다. 상청액은 그후에 따라내었다. 상기 세척/회전 절차를 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x10mL를 이용하여 반복한 후, 얼음같이 차가운 EtOH의 분액 2x10mL를 이용하여 반복하였으며, 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x10mL를 이용하여 마지막으로 반복하였다. 상기 결정을 그후 2일 동안 진공 건조기에서 건조하였다. 상기 공정은 시작물질에 비하여 87%(w/w) 수율을 창출하였다.
9.7.11 10.0g 스케일, pH 4.8 및 실온에서 IN105 의 R-형 결정형 Zn 착물의 제조
MPEG3 프로피오닐(propionyl) 인슐린 화합물(IN105)의 새로운 용액을 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼 670mL에 고체 IN105 10.06g을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.6으로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해시켰다. 용해된 페놀 2.7mL 및 95% EtOH 285mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 27mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 생성되는 용액은 그후 5M NH4OH를 이용하여 pH 4.8로 조정하였다. 상기 용액은 교반하지 않고 21시간 동안 둔 다음, 결정을 수득하였다. 상기 반응 혼합물이 완전히 결정화되는 것을 2.5시간 후에 현미경으로 관찰하였다.
상기 결정은 상기 반응 슬러리(slurry)를 6x250mL 원심분리관으로 분리함으로써 수득하였다. 상기 관을 초기의 10℃에서 8분 동안 10,000 RPM으로 회전시킨 다음, 상청액은 따라내었다. 각 관의 결정은 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x10mL로 세척하고, 2x250mL 원심분리관으로 통합한 후, 10℃에서 8분 동안 10,000 RPM으로 회전시켰다. 상청액은 그후에 따라내었다. 상기 세척/회전 절차를 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x30mL를 이용하여 반복한 후, 얼음같이 차가운 EtOH의 분액 2x30mL를 이용하여 반복하였으며, 얼음같이 차가운 H20의 분액 1x30mL를 이용하여 마지막으로 반복하였다. 상기 결정을 그후 3일 동안 벤치톱(benchtop) 냉동 건조기에서 건조하였다. 상기 공정은 시작물질에 비하여 89%(w/w) 수율을 창출하였다.
9.8 유기용매를 이용한 HIM2 의 결정형 Zn 착물의 제조 및 분석
9.8.1 HIM2 의 R-형 Zn 착물의 제조
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.95로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 3.5mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 600μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.14 내지 6.0으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4( 도 6 참조), 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4( 도 6B 참조), 5.6, 5.8, 6.0. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4에서의 침상결정을 나타낸다. 상기 4.6-6.0의 pH 범위는 다양한 모양 및 크기의 고체와 같은 큰 결정형을 나타낸다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.95로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 3.5mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 400μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.22 내지 6.0으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2( 도 7A 참조), 5.4, 5.6, 5.8, 6.0. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.2-6.0 에서 다양한 모양 및 크기의 고체와 같은 결정형을 나타낸다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.95로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 3.5mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 200μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.19 내지 6.0으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0( 도 7B 참조), 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4-6.0에서 다양한 모양 및 크기의 고체와 같은 결정형을 나타낸다. 4.8-5.2의 상기 pH 범위는 더욱 균일한 침상결정을 나타낸다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.95로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 2.6mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 600μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.04 내지 6.0으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4( 도 8A 참조), 5.6, 5.8, 6.0. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.6-5.4에서의 평평한, 눈송이 모양 결정을 나타낸다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.95로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 2.6mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 400μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.05 내지 6.0으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0( 도 8B 참조), 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 5.0에서 침상결정, pH 5.0에서 결정 모양 고체 및 pH 5.4에서 평평한, 눈송이 모양 결정을 나타낸다.
Rxn 6 HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.95로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 2.6mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 200μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.09 내지 6.0으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.2, 4.4, 4.6, 4.8( 도 9A 참조), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.8-5.6에서 침상결정 및 결정 모양 고체를 나타낸다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.76으로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 250μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.97 내지 5.8으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.6-5.8에서의 결정 모양 침전물을 나타낸다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.76으로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 200μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.06 내지 5.8으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4( 도 9B 참조), 5.6, 5.8. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.6-5.6에서결정 모양 침전물을 나타내었다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.76으로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 150μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.09 내지 5.8으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4( 도 9B 참조), 5.6, 5.8. 상기 샘플을 교반 하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 5.0-5.2에서 다양한 모양 및 크기의 결정을 나타내었다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.76으로 조정하였다. 액화 페놀 40μL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 100μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.09 내지 5.8으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0( 도 10A 참조), 5.2, 5.4( 도 10B 참조), 5.6, 5.8. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 5.0에서의 침상결정 및 pH 5.2-5.6에서의 결정형 물질의 다양한 모양 및 크기를 나타내었다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.76으로 조정하였다. 액화 페놀 20μL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 250μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.08 내지 5.8으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.8-5.8에서의 결정모양 침전물을 나타내었다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.76으로 조정하였다. 액화 페놀 20μL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 200μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.05 내지 5.8으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 매우 작은 결정모양 고체를 나타내었다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.76으로 조정하였다. 액화 페놀 20μL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 200μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.05 내지 5.8으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 매우 작은 결정모양 고체를 나타내었다.
HIM2의 새로운 15mg/mL 용액은 25OmM 암모늄 아세테이트 버퍼(ammonium acetate buffer)에서 제조하였고, pH는 5M HCl을 이용하여 2.76으로 조정하였다. 액화 페놀 20μL 및 95% EtOH 4.25mL를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 4% 산화 ZnCl2 용액 100μL를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.06 내지 5.8으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 500μL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 매우 작은 결정모양 고체를 나타내었다.
9.9 HIM2 및 IN105 와 아연의 공결정화
9.9.1 HIM2 및 IN105 의 R-형 공결정화 Zn 착물의 제조
9.9.2 50:50 ( HIM2 : IN105 )
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 37.3mg 및 IN105 36.4mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.84로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 80μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.19 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4 및 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 4시간 동안 두었다. 4시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4~5.6에서의 다양한 크기와 모양의 결정을 나타낸다.
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 37.1mg 및 IN105 35.9mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 3.03으로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.38 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0( 도 11A 참조), 5.2( 도 11B 참조), 5.4 및 5.6( 도 12A 참조). 상기 샘플을 교반하지 않고 4시간 동안 두었다. 4시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.6~5.6에서의 대부분 짧은 침상 결정을 나타낸다.
9.9.3 70:30 ( HIM2 : IN105 )
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 53.4mg 및 IN105 23.2mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.62로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 80μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.02 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2( 도 12B 참조), 5.4 및 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 1시간 동안 두었다. 1시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4~5.6에서의 다양한 크기 및 모양의 결정 모양 침전물을 나타낸다.
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 53.6mg 및 IN105 24.5mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.89로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.28 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2( 도 13A 참조), 5.4 및 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 1시간 동안 두었다. 1시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.6~4.8에서의 대부분 다양한 크기 및 모양의 결정 모양 침전물 및 pH 5.0~5.4많은 수의, 소형 침상결정을 나타낸다.
9.9.4 30:70( HIM2 : IN105 )
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 23.3mg 및 IN105 54.7mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.84로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 80μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.27 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4 및 5.6. 상기 샘플을 교 반하지 않고 1시간 동안 두었다. 1시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4~5.0에서의 대부분 다양한 크기 및 모양의 결정 모양 침전물 및 pH 5.2~5.6에서의 적은 수의 침상결정을 나타낸다.
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 24.8mg 및 IN105 54.9mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 3.09로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 3.47 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4 및 5.6( 도 13B 참조). 상기 샘플을 교반하지 않고 1시간 동안 두었다. 1시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.4~5.0에서의 대부분 다양한 원크기의 결정 모양 침전물 및 pH 5.2~5.6에서의 다양한 모양 및 크기의 결정을 나타낸다.
9.9.5 HIM2 및 IN105 의 R-형 공결정화 Zn 착물의 제조
9.9.6 50:50 ( HIM2 : IN105 )
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 37.4mg 및 IN105 35.9mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.60로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용 해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.15 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4 및 5.6( 도 13B 참조). 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.6~5.6에서의 다양한 모양 및 크기의 고체결정을 나타낸다.
9.9.7 70:30( HIM2 : IN105 )
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 57.0mg 및 IN105 24.5mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.43으로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.92 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6( 도 14A 참조), 4.8, 5.0, 5.2, 5.4 및 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 5.0~5.2에서의 침상결정을 나타낸다.
9.9.8 30:70 ( HIM2 : IN105 )
HIM2 및 IN105의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 24.1mg 및 IN105 53.8mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.35로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.60 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0( 도 14B 참조), 5.2, 5.4 및 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 5.0~5.2에서의 침상결정을 나타낸다.
9.9.9 HIM2 및 인간 인슐린의 R-형 공결정화 Zn 착물의 제조
9.9.10 50:50 ( HIM2 :인슐린)
HIM2 및 인슐린의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 39.2mg 및 인슐린 36.7mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 2.53으로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.82 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2( 도 15A 참조), 5.4 및 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 5.2~5.4에서의 다양한 모양 및 크기의 결정 유사 고체를 나타낸다. 다수 개의 작은 침상결정은 pH 5.6에서 관찰하였다.
9.9.11 70:30 ( HIM2 :인슐린)
HIM2 및 인슐린의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 56.5mg 및 인슐린 20.2mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 3.23으로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.82 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2( 도 15A 참조), 5.4 및 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 5.2~5.6에서의 다양한 모양 및 크기의 결정 유사 고체를 나타낸다.
9.9.12 30:70 ( HIM2 :인슐린)
HIM2 및 인슐린의 새로운 용액은 pH 7.5의 25OmM 암모늄 아세테이트 4mL에 HIM2 21.8mg 및 인슐린 49.2mg을 용해하여, 제조하였다. 상기 용액은 5M HCl을 이용하여 pH 3.23으로 조정하였다. 고체 페놀을 40-60℃의 따뜻한 수조에 용해하였 다. 용해된 페놀 16μL 및 95% EtOH 1.75mL는 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 그후 4% 산화 수성 ZnCl2 용액 40μL를 상기 반응 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액의 pH는 5M NH4OH를 이용하여 2.93 내지 5.60으로 조정하고, 다음 각각의 목적 pH에서 0.500mL 분액을 취하였다: 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4( 도 15B 참조) 및 5.6. 상기 샘플을 교반하지 않고 24시간 동안 두었다. 24시간 후에 촬영한 현미경 사진은 pH 4.8에서의 평평한 눈송이 모양 결정을 나타내었다. pH 5.0에서, 침상 및 눈송이 모양 결정의 혼합이 존재한다. pH 5.2-5.6에서 다수 개의 작은 침상결정을 관찰하였다.
10 Zn 착물의 수성 용해도( Aqueous Solubility of Zn Complexes )
0.1 M 인산완충식염수(Phosphate Buffer Saline)(PBS, 여과됨(filtered), pH = 7.4) 200μL를 1 mL 원뿔형 반응용기에 넣었다. 상기 용기에 소량의 샘플을 서서히 첨가하여, 포화되게 하였다. 주기적으로, 상기 용액을 와동시켰다(vortexed). 포화되면, 상기 용기를 소규모 원심분리관에 넣고, 상기 샘플을 RT에서 3분동안 2000RPM으로 원심분리하였다. 원심분리 후에, 상기 샘플 10μL를 상청액에서 제거하고, 완충액 490μL에서 희석시켰다(0.1M PBS). 상기 희석된 샘플을 HPLC를 이용하여 분석하여, 농도를 측정하였다.
접합체 용해도 Zn 페놀
IN105 ~26mg/mL N/A N/A
ZnIN105 15mg/mL ~ 20mg/mL 0.44% 0.76%
ZnIN105 ~24mg/mL 0.61% 1.11%
ZnIN105 15mg/mL ~ 20mg/mL 0.63% 1.04 %
11 Zn IN105 착물의 시험관내 ( in vitro ) 효소 내성 실험
인슐린 화합물 접합체(IN105)를 10mM의 소듐 포스페이트 버퍼(pH 약 7.4)에서 제조하고, 농도를 HPLC로 측정하였다(약 0.6 mg/m L의 모 화합물과 접합체 사이의 당량몰을 비교를 할 수 있도록, 상기 용액을 버퍼로 희석하였다). 친유화된 키모트립신 효소를 1mM HCl에서 현탁하여, 농도가 약 7.53 U/mL로 되게하였다. 각 샘플의 1.53 mL 분액을 상기 샘플관에 첨가하고, 0.850 mL 분액은 제어관에 첨가하였다. 샘플들을 각 샘플당(per) 4개의 제어관과 함께 두 번 테스트하였다. 분액을 15분동안 열혼합기(thermomixe)에서 37℃로 배양하였다. 그후 키모트립신 효소 17μL를 각 샘플 관에 첨가하였다. 1mM HCl 5μL를 각 제어관에 첨가하였다. 상기의 첨가 직후, 200μL를 상기 샘플관 및 제어관에서 제거하고, 미리 원심분리관으로 분액된, 1% TFA 50μL에 넣었다. 상기 샘플은 T=0로 나타났다.
인슐린 화합물(Zn 프리(free)), IN105(Zn 프리(free)) 및 인슐린 화합물(일반적인 인슐린 화합물)에서 상기 샘플링(sampling) 절차를 아래의 간격으로 반복하였다: 0, 2, 5, 8, 12, 15, 및 30분. 상기 제어절차를 아래의 간격으로 반복하였다: 0, 8, 15, 30분. T-형 및 R-형 샘플에서, 상기 절차를 아래의 간격으로 반복하였다: 0, 5, 8, 12, 30, 40 및 60분. Zn 착물에서 상기 제어 절차를 아래의 간격으로 반복하였다: 0, 12, 40 및 60분. 샘플을 -20℃에서 저장하고 난 뒤, HPLC로 분석할 수 있다. HPLC를 작동하여 각 다이제스트(digest)에서 각각 T=0분일 때에 비하여 분해율(percent degradation)을 측정하였다. 잔여율(percent remaining)의 자 연로그(natural log)를 시간에 대하여 도표화하였고(plot), 선형회귀(linear regression)를 각 다이제스트(digest)에 대하여 실행하였다(run). 반감기를 다음 식을 이용하여 계산하였다: t1 /2 = -0.693/기울기(slope).
0.6 mg / ml 단백질 에서 결과
샘플 반감기(T half) 아연 함량 페놀 함량
인슐린 화합물
(아연 프리)		 4.9분 0.0 --
IN 105
(아연 프리)		 12.5분 0.0 --
IN 105
(아연 프리)		 11.1분 0.0 --
인슐린 화합물, USP
(일반적인 인슐린 화합물)		 11.6분 0.3 내지 1 % w/w --
IN 105
(R-형 아연 착물)		 55.3분 1.85 % w/w 2.37 % w/w
IN 105
(T-형 아연 착물)		 54.8분 1.88 % w/w --
12 제형 실험( formulation examples )
12.1 액체 제형 실험( Liquid Formulation Examples )
12.1.1 R6 형 Zn - HIM2 완충액 연구를 위한 완충용액
성분 용액 1mL 내의 양
2염기성 소듐 포스페이트 1.88 mg
인슐린 성분 3.7 mg (100 유닛)
글리세롤 16.0 mg
페놀(또는 m-크레졸) 3.0 mg
아연 0.037mg (인슐린 1% w/w)*
pH 7.4 ~ 7.8**
* 염화아연을 첨가하여 인슐린 3.7mg/ml당 아연의 양을 0.037mg/ml으로 조정 및 아연 HIM2 고체에서 아연 함량을 기초로 하여 조정
** pH는 10% HCl 및/또는 10% 수산화나트륨으로 조정할 수 있다
12.1.2 카프르산 / 라우린산 제형 경구 액체 희석제의 제조
필요한 분량 약 60%의 멸균수(sterile water)를 적합한 용기로 옮겼다. 적합한 양(하기 표에 표시된 것처럼)의 트로메탄민(tromethamine), 트롤아민(trolamine), 시트르산 무수물(citric acid anhydrous), 및 수산화 나트륨 펠렛(sodium hydroxide pellets)을 상기 용기에 첨가하고, 잘 혼합하여 용해시켰다. 21 ~ 25℃(또는 실온)로 온도를 조정하고, 상기 액체의 pH를 측정하였다. 1N 수산화나트륨 또는 1N 염산(hydrochloric acid)을 이용하여 필요한 만큼 pH를 7.7~7.9로 조정하였다. 그후 핫플레이트(hotplate)에서 가열하여 45 ~ 50℃로 온도를 조정하고, 상기 온도를 유지하였다. 그후 상기 가열된 용액에 카프르산을 첨가하고, 혼합하여, 상기 카프르산을 용해시켰다. 온도를 21~25℃(또는 실온)로 조정하고, 상기 액체의 pH를 측정하였다. 필요하다면, 상기 pH를 1N 수산화 나트륨 또는 1N 염산을 이용하여 pH를 7.7~7.9로 조정하였다. 그후, 상기 용액을 5분 동안 혼합하였다. 적절한 양의 멸균수를 필요한 용량의 100%가 되도록 첨가하고, 혼합하였다.
성분 백분율(% w/v)
트로메타민(Tromethamine) 4.24
트롤아민(Trolamine) 5.22
시트르산 무수물(Citric Acid Anhydrous) 6.72
수산화 나트륨 펠렛(Sodium Hydroxide Pellets) 1.88
카프르산(Capric Acid) 0.50
라우린산(Laurie Acid) 0.50
수산화 나트륨(Sodium Hydroxide), 1N 필요하다면 pH 7.7~7.9로 조정
염산(Hydrochloric Acid), 1N 필요하다면 pH 7.7~7.9로 조정
멸균수 필요한 용량으로 희석
IN105, HIM2 또는 ZnHIM2는 투약 연구에서 적합한 농도를 수득하는데 필요한 양만큼 무게를 측정하고, 예를 들어, IN105(단백질) 1mg을 제형 1mL와 결합시켜, 제형에서 1mg/mL IN105를 수득하였다.
12.1.3 올레산/ 카프르산 / 라우린산 / 콜레이트 제형 경구 액체 희석제의 제조
R-형 Zn HIM2의 경구 액체 제형을 다음 표에 표시된 성분을 가지도록 제조하였다:
성분 백분율(% w/v)
트로메타민 4.24
트롤아민 5.22
시트르산 무수물 6.72
수산화 나트륨 펠렛 1.88
나트륨 콜레이트(sodium cholate) 3.00
올레산 1.00
카프르산 0.50
라우린산 0.50
수크라로스(sucralose) 용액, 25% 0.80
딸기향(strawberry flavor) 0.40
수산화 나트륨, 1N 필요하다면 pH 7.7~7.9로 조정
염산, 1N 필요하다면 pH 7.7~7.9로 조정
멸균수 필요한 용량으로 희석
경구 액체 샘플을 R-형 Zn HIM2(ZnHIM2-R)과 당량인 1 mg/mL 단백질으로 함유하도록 제조하였다. 상기 ZnHIM2-R을 냉각기(-20℃)에서 꺼내고, 건조기에 넣고, 실온에 이르도록 하였다. ZnHIM2-R 당량인 1 mg/mL 단백질을 다음과 같이 경구 액체 희석용액으로 제조하였다. ZnHIM2-R 6.4mg의 무게를 측정하였다. 그후, 경구 액체 희석제 5.0mL를 용기로 옮기고, 부드럽게 휘저어(swirl), 혼합하였다. 상기 용액을 약 45분 동안 두어 용해시켰다. 최종 용액은 현탁액이었다(탁한 외관). 복용하기 전에, 상기 용액을 60초 동안 부드럽게 휘저어 상기 용액이 균질 용액이 되도록 하였다. ZnHIM2-R에서, 상기 단백질 함량은 78.6%이고, 1 mg/mL 단백질 당량이 며, 양(quantity) = 5mL이다. ZnHIM2-R의 양 = {(1 mg/mL)/(0.786)} x (5.0 mL) = 6.4 mg. ZnHIM2-R 농도 = (6.4 mg)/(5.0 mL) = 1.28 mg/mL (단백질 함량에 대하여 1 mg/mL으로 조정된 당량).
12.1.4 카프르산 제형의 제조
필요한 분량의 약60%의 멸균수(sterile water)를 적합한 용기로 옮겼다. 적합한 양(하기 표에 표시된 것처럼)의 트로메탄민(tromethamine), 트롤아민(trolamine), 시트르산 무수물(citric acid anhydrous), 및 수산화 나트륨 펠렛(sodium hydroxide pellets)을 상기 용기에 첨가하고, 잘 혼합하여 용해시켰다. 21 ~ 25℃(또는 실온)로 온도를 조정하고, 상기 액체의 pH를 측정하였다. 1N 수산화나트륨 또는 1N 염산(hydrochloric acid)을 이용하여 필요한 만큼 pH를 7.7~7.9로 조정하였다. 그후 핫플레이트(hotplate)에서 가열하여 45 ~ 50℃로 온도를 조정하고, 상기 온도를 유지하였다. 그후 상기 가열된 용액에 카프르산을 첨가하고, 혼합하여, 상기 카프르산을 용해시켰다. 온도를 21~25℃(또는 실온)로 조정하고, 상기 액체의 pH를 측정하였다. 필요하다면, 상기 pH를 1N 수산화 나트륨 또는 1N 염산을 이용하여 pH를 7.7~7.9로 조정하였다. 그후, 상기 용액을 5분 동안 혼합하였다. 적절한 양의 멸균수를 필요한 용량의 100%가 되도록 첨가하고, 혼합하였다.
성분 % w/v
트로메타민 4.24
트롤아민 5.22
시트르산 무수물 6.72
수산화 나트륨 펠렛 1.88
카프르산 0.9, 1.5, 3.0 또는 6.0
수산화 나트륨, 1N 필요하다면 pH 조정
염산, 1N 필요하다면 pH 조정
멸균수 필요한 용량
IN105는 투약 연구에서 적합한 농도를 수득하는데 필요한 양만큼 무게를 측정하고, 예를 들어, IN105(단백질) 1mg을 제형 1mL와 결합시켜, 제형에서 1mg/mL IN105를 수득하였다.
12.1.5 인산완충액 제형의 카프레이트 ( caprate ) 및/또는 라우레이트 ( laurate )
pH 7.8 또는 8.2인, 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼 제조하였다. 모노소듐 포스페이트 모노하이드레이트(Monosodium Phosphate Monohydrate) 1.17g을 1-L 플라스크로 옮겼다. 멸균수 약 500mL를 첨가하고 잘 혼합하여 용해시켰다. 그후, 소듐 포스페이트 디베이직 헵타하이드레이트(Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate) 24.58g을 첨가하고 잘 섞어 용해시켰다. 멸균수와 함께 분량을 희석시켜, 잘 섞었다. 0.22 ㎛ 여과기를 통하여 여과하였다. 1N HCl 또는 1N NaOH를 이용하여 pH 7.8 또는 8.2로 조정하였다.
IN105에서, pH 7.8 또는 8.2인 적절한 양의 pH 포스페이트 버퍼의 60%를 적당한 용기로 옮겨담았다. 그후, 계산된 양의 카프레이트을 첨가하고, 3% w/v의 최종 용액을 생성하여, 잘 섞어 용해시켰다. 그후 1N HCl 또는 1N NaOH를 이용하여 pH 7.8 또는 8.2로 조정하였다. pH 7.8 또는 8.2인 포스페이트 버퍼와 함께 적절한 용량(예를 들어, 100mL)으로 희석하였다.
성분 % w/v
소듐 카프레이트 3.0
pH 7.8 또는 8.2인 100mM 소듐 포스페이트 버퍼 QS to 100%
BN-054에서, 적합한 용기에서 pH 7.8인, 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼 400 g의 무게를 측정하였다. 소듐 카프레이트 9.7g 및 소듐 라우레이트 11.1g을 첨가하고, 잘 섞어 용해시켰다. pH 7.8인 100mM 소듐 포스페이트 버퍼을, 적절한 양으로 첨가하여, 총중량 500g이 되도록 하였다.
성분 % w/w
소듐 카프레이트 1.94
소듐 라우레이트 2.22
pH 7.8인 100mM 소듐 포스페이트 버퍼 QS to 100%
12.1.6 아르기닌 또는 트롤아민을 가지는 액체 제형
pH 7.8인 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼를 제조하였다. 모노소듐 포스페이트 모노하이드레이트(Monosodium Phosphate Monohydrate) 1.17g을 1-L 플라스크로 옮겼다. 멸균수 약 500m를 첨가하고 잘 혼합하여 용해시켰다. 그후, 소듐 포스페이트 디베이직 헵타하이드레이트(Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate) 24.58g을 첨가하고 잘 섞어 용해시켰다. 멸균수와 함께 분량을 희석시켜, 잘 섞었다. 0.22 ㎛ 여과기를 통하여 여과하였다. 1N HCl 또는 1N NaOH를 이용하여 pH 7.8로 조정하였다.
pH 7.8인 적절한 양의 pH 포스페이트 버퍼의 60%를 적당한 용기로 옮겨담았다. 적절한 양(하기 표에 나타난 바와 같이)의 아르기닌 또는 트롤아민을 상기 용기에 첨가하고, 잘 섞어 용해시켰다. 그후, 계산된 양의 카프레이트을 첨가하고, 3% w/v의 최종 용액을 생성하여, 잘 섞어 용해시켰다. 그후 1N HCl 또는 1N NaOH를 이용하여 pH 7.8로 조정하였다. pH 7.8인 포스페이트 버퍼와 함께 적절한 용량(예를 들어, 100mL)으로 희석하였다.
성분 % w/v
소듐 카프레이트 3.0
아르기닌 또는 트롤아민 0.4 또는 1.2
pH 7.8인 100mM 소듐 포스페이트 버퍼 QS to 100%
IN105는 투약 연구에서 적합한 농도를 수득하는데 필요한 양만큼 무게를 측정하고, 예를 들어, IN105(단백질) 1mg을 제형 1mL와 결합시켜, 제형에서 1mg/mL IN105를 수득하였다.
12.1.7 카프릴산을 가지는 액체 제형( Liquid Formulation with Caprylic Acid )
필요한 분량의 약 60%의 멸균수(sterile water)의 적합한 용기로 옮겼다. 적합한 양(하기 표에 표시된 것처럼)의 트로메탄민(tromethamine), 트롤아민(trolamine), 시트르산 무수물(citric acid anhydrous), 및 수산화 나트륨 펠렛(sodium hydroxide pellets)을 상기 용기에 첨가하고, 잘 혼합하여 용해시켰다. 21 ~ 25℃(또는 실온)로 온도를 조정하고, 상기 액체의 pH를 측정하였다. 1N 수산화나트륨 또는 1N 염산(hydrochloric acid)을 이용하여 필요한 만큼 pH를 7.7~7.9로 조정하였다. 그후 핫플레이트(hotplate)에서 가열하여 45 ~ 50℃로 온도를 조정하고, 상기 온도를 유지하였다. 그후 상기 가열된 용액에 카프릴산을 첨가하고, 혼합하여, 상기 카프릴산을 용해시켰다. 온도를 21~25℃(또는 실온)로 조정하고, 상기 액체의 pH를 측정하였다. 필요하다면, 상기 pH를 1N 수산화 나트륨 또는 1N 염 산을 이용하여 pH를 7.7~7.9로 조정하였다. 그후, 상기 용액을 5분 동안 혼합하였다. 적절한 양의 멸균수를 필요한 용량의 100%가 되도록 첨가하고, 혼합하였다.
성분 % w/v
트로메타민 4.24
트롤아민 5.22
시트르산 무수물 6.72
수산화 나트륨 펠렛 1.88
카프릴산 3.0
수산화 나트륨, 1N 필요하다면 pH 조정
염산, 1N 필요하다면 pH 조정
멸균수 필요한 용량
IN105는 투약 연구에서 적합한 농도를 수득하는데 필요한 양만큼 무게를 측정하고, 예를 들어, IN105(단백질) 1mg을 제형 1mL와 결합시켜, 제형에서 1mg/mL IN105를 수득하였다.
12.1.8 리놀렌산을 가지는 액체 제형
pH 7.8인, 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼 준비. 모노소듐 포스페이트 모노하이드레이트(Monosodium Phosphate Monohydrate) 1.17g을 1-L 플라스크로 옮겼다. 멸균수 약 500m를 첨가하고 잘 혼합하여 용해시켰다. 그후, 소듐 포스페이트 디베이직 헵타하이드레이트(Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate) 24.58g을 첨가하고 잘 섞어 용해시켰다. 멸균수와 함께 분량을 희석시켜, 잘 섞었다. 0.22 ㎛ 여과기를 통하여 여과하였다. 1N HCl 또는 1N NaOH를 이용하여 pH 7.8로 조정하였다.
pH 7.8인 적절한 양의 pH 포스페이트 버퍼의 60%를 적당한 용기로 옮겨담았다. 그후, 계산된 양의 리놀렌산 나트륨염(linoleic acid sodium salt)을 첨가하고, 3% w/v의 최종 용액을 생성하여, 잘 섞어 용해시켰다. 그후 1N HCl 또는 1N NaOH를 이용하여 pH 7.8로 조정하였다. pH 7.8인 포스페이트 버퍼와 함께 적절한 용량(예를 들어, 100mL)으로 희석하였다.
성분 % w/v
리놀렌산 나트륨염 3.0
pH 7.8인 100mM 소듐 포스페이트 버퍼 QS to 10%
12.1.9 카프르산 및 라운린산 액체 제형의 제조
필요한 분량의 멸균수(sterile water)의 약 60%를 적합한 용기로 옮겼다. 적합한 양(하기 표에 표시된 것처럼)의 트로메탄민(tromethamine), 트롤아민(trolamine), 시트르산 무수물(citric acid anhydrous), 및 수산화 나트륨 펠렛(sodium hydroxide pellets)을 상기 용기에 첨가하고, 잘 혼합하여 용해시켰다. 21 ~ 25℃(또는 실온)로 온도를 조정하고, 상기 액체의 pH를 측정하였다. 1N 수산화나트륨 또는 1N 염산(hydrochloric acid)을 이용하여 필요한 만큼 pH를 7.7~7.9로 조정하였다. 그후 핫플레이트(hotplate)에서 가열하여 45 ~ 50℃로 온도를 조정하고, 상기 온도를 유지하였다. 그후 상기 가열된 용액에 카프르산 및 라우린산을 첨가하고, 혼합하여, 상기 카프르산 및 라우린산을 용해시켰다. 온도를 21~25℃(또는 실온)로 조정하고, 상기 액체의 pH를 측정하였다. 필요하다면, 상기 pH를 1N 수산화 나트륨 또는 1N 염산을 이용하여 pH를 7.7~7.9로 조정하였다. 그후, 상기 용액을 5분 동안 혼합하였다. 적절한 양의 멸균수를 필요한 용량의 100%가 되도록 첨가하고, 혼합하였다.
성분 % w/v
트로메타민 4.24
트롤아민 5.22
시트르산 무수물 6.72
수산화 나트륨 펠렛 1.88
카프르산 0, 0.1 또는 0.9
라우린산 0, 0.9 또는 0.1
1N 수산화 나트륨 필요하다면 pH 조정
1N 염산 필요하다면 pH 조정
멸균수 필요한 용량
IN105는 투약 연구에서 적합한 농도를 수득하는데 필요한 양만큼 무게를 측정하고, 예를 들어, IN105(단백질) 1mg을 제형 1mL와 결합시켜, 제형에서 1mg/mL IN105를 수득하였다.
12.2 고체 복용제형 실험( Solid Dosage Formulation Examples )
12.2.1 Nobex - IN105 -[854]-를 이용한 카프레이트 / 라우레이트 고체 복용제형의 제조 및 용해 프로파일
소듐 카프레이트 58mg, 소듐 라우레이트 57 mg, 마니톨 286mg, 소듐 스타크 글리코레이트(sodium starch glycolate) 30mg 및 Nobex-IN105 6mg(단백질)을 중량지(weight paper)에 옮기고, 완전히 혼합하였다. 상기 혼합물을 약 350 psi로 가압 및 압착하여 타블렛을 생성하였다.
타블렛당 카프레이트 58 mg 및 라우레이트 57 mg인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 Nobex - IN105 -[854]
성분 타블렛 당 mg
소듐 카프레이트 58
소듐 라우레이트 57
마니톨 286
익스플로탭(explotab)(소듐 스타크 글리코레이트) 30
Nobex-IN105(단백질) 6
상기 용해 테스트를 USP 기구 2 용해유닛(USP apparatus 2 dissolution unit)을 이용하여 수행하였다. 매질은 물이고, 패들(paddle) 속도 50 rpm 이며, 상기 매질의 부피는 500mL였다. 상기 용해 샘플은 구배 시스템(gradient system)을 이용하여 HPLC로 측정하였다. 상기 유동상은 0.1% TFA(유동상 A)를 가지는 물 및 0.1% TFA(유동상 B)를 가지는 아세토니트릴이었다. 이용되는 상기 구배는 다음과 같았다: 0분 100% 유동상 A, 11분 65% 유동상 A, 15분 20% 유동상 A, 16분 20% 유동상 A, 17분 100% 유동상 A. 파장은 214 nm이고, 컬럼(column)은 C18(150x2mm)이었다. 아래의 표 및 그래프는 Zn-IN105(단백질) 6mg, 마니톨 286mg, 소듐 카프레이트 58mg, 소듐 라우레이트 57mg, 및 소듐 스타크 글리코레이트(익스플로탭) 30 mg을 함유하는 Nobex-Zn-IN105 타블렛 제형 [854]에 대한 용해 테스트에서 수득된 용해 데이터를 요약한 것이다.
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [854]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 IN105 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 71 72 72
10 86 94 90
15 87 96 92
30 89 96 93
45 90 96 93
60 87 96 92
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [854]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 카프레 이트 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 98 93 96
10 102 104 103
15 101 104 103
30 102 105 104
45 102 104 103
60 102 105 104
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [854]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 라우레 이트 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 72 75 74
10 90 89 90
15 91 90 91
30 88 91 90
45 89 91 90
60 91 90 91
12.2.2 타블렛당 카프레이트 143 mg 및 라우레이트 140 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 제조
제형 Nobex - IN105 -[856]의 제조
소듐 카프레이트 143mg, 소듐 라우레이트 140 mg, 마니톨 150mg, 소듐 스타크 글리코레이트(sodium starch glycolate) 30mg 및 Nobex-IN105 6mg(단백질)을 중량지(weght paper)에 옮기고, 완전히 혼합하였다. 상기 혼합물을 약 350 psi로 가압 및 압착하여 타블렛을 생성하였다.
타블렛당 카프레이트 143 mg 및 라우레이트 140 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 Nobex - IN105 -[856]
성분 타블렛 당 mg
소듐 카프레이트 143
소듐 라우레이트 140
마니톨 150
익스플로탭(explotab)(소듐 스타크 글리코레이트) 30
Nobex-IN105(단백질) 6
상기 용해 테스트를 USP 기구 2 용해유닛(USP apparatus 2 dissolution unit)을 이용하여 수행하였다. 매질은 물이고, 패들(paddle) 속도 50 rpm 이며, 상기 매질의 부피는 500mL였다. 상기 용해 샘플은 구배 시스템(gradient system)을 이용하여 HPLC로 측정하였다. 상기 유동상은 0.1% TFA(유동상 A)를 가지는 물 및 0.1% TFA(유동상 B)를 가지는 아세토니트릴이었다. 이용되는 상기 구배는 다음과 같았다: 0분 100% 유동상 A, 11분 65% 유동상 A, 15분 20% 유동상 A, 16분 20% 유동상 A, 17분 100% 유동상 A. 파장은 214 nm이고, 컬럼(column)은 C18(150x2mm)이었다. 아래의 표 및 그래프는 Zn-IN105(단백질) 6mg, 마니톨 150mg, 소듐 카프레이트 143mg, 소듐 라우레이트 140mg, 및 소듐 스타크 글리코레이트(익스플로탭) 30 mg을 함유하는 Nobex-Zn-IN105 타블렛에 대한 용해 테스트에서 수득된 용해 데이터를 요약한 것이다.
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [856]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 IN105 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 43 31 37
10 66 53 60
15 81 72 77
30 98 97 98
45 98 99 99
60 96 98 97
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [856]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 카프레 이트 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 36 32 34
10 68 57 63
15 89 79 84
30 105 103 104
45 105 103 104
60 105 104 105
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [856]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 라우레 이트 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 35 25 30
10 61 44 53
15 74 61 68
30 93 88 91
45 93 91 92
60 93 92 93
12.2.3 타블렛당 카프레이트 143 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 제조
제형 Nobex - IN105 -[859]의 제조
소듐 카프레이트 143mg, 마니톨 150mg, 소듐 스타크 글리코레이트(sodium starch glycolate) 30mg 및 Nobex-IN105 6mg(단백질)을 중량지(weght paper)에 옮기고, 완전히 혼합하였다. 상기 혼합물을 약 350 psi로 가압 및 압착하여 타블렛을 생성하였다.
타블렛당 카프레이트 143 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 Nobex - IN105 -[859]
성분 타블렛 당 mg
소듐 카프레이트 143
마니톨 150
익스플로탭(explotab)(소듐 스타크 글리코레이트) 30
Nobex-IN105(단백질) 6
상기 용해 테스트를 USP 기구 2 용해유닛(USP apparatus 2 dissolution unit)을 이용하여 수행하였다. 매질은 물이고, 패들(paddle)속도 50 rpm이며, 상기 매질의 부피는 500mL였다. 상기 용해 샘플은 구배 시스템(gradient system)을 이용하여 HPLC로 측정하였다. 상기 유동상은 0.1% TFA(유동상 A)를 가지는 물 및 0.1% TFA(유동상 B)를 가지는 아세토니트릴이었다. 이용되는 상기 구배는 다음과 같았다: 0분 100% 유동상 A, 11분 65% 유동상 A, 15분 20% 유동상 A, 16분 20% 유동상 A, 17분 100% 유동상 A. 파장은 214 nm이고, 컬럼(column)은 C18(150x2mm)이었다. 아래의 표 및 그래프는 Zn-IN105(단백질) 6mg, 마니톨 150mg, 소듐 카프레이트 143mg, 및 소듐 스타크 글리코레이트(익스플로탭) 30 mg을 함유하는 Nobex-Zn-IN105 타블렛에 대한 용해 테스트에서 수득된 용해 데이터를 요약한 것이다.
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [859]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 IN105 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 11 26 19
10 63 58 61
15 84 80 82
30 86 88 87
45 88 88 88
60 87 89 88
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [859]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 카프레 이트 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 61 43 52
10 93 72 83
15 99 95 97
30 99 100 100
45 99 100 100
60 99 100 100
12.2.4 타블렛당 카프레이트 286 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 제조
제형 Nobex - IN105 -[860]의 제조
소듐 카프레이트 286mg, 마니톨 150mg, 소듐 스타크 글리코레이트(sodium starch glycolate) 30mg 및 Nobex-IN105 6mg(단백질)을 중량지(weght paper)에 옮기고, 완전히 혼합하였다. 상기 혼합물을 약 350 psi로 가압 및 압착하여 타블렛을 생성하였다.
타블렛당 카프레이트 286 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 Nobex - IN105 -[860]
성분 타블렛 당 mg
소듐 카프레이트 286
마니톨 150
익스플로탭(explotab)(소듐 스타크 글리코레이트) 30
Nobex-IN105(단백질) 6
상기 용해 테스트를 USP 기구 2 용해유닛(USP apparatus 2 dissolution unit)을 이용하여 수행하였다. 매질은 물이고, 패들(paddle)속도 50 rpm이며, 상기 매질의 부피는 500mL였다. 상기 용해 샘플은 구배 시스템(gradient system)을 이용하여 HPLC로 측정하였다. 상기 유동상은 0.1% TFA(유동상 A)를 가지는 물 및 0.1% TFA(유동상 B)를 가지는 아세토니트릴이었다. 이용되는 상기 구배는 다음과 같았다: 0분 100% 유동상 A, 11분 65% 유동상 A, 15분 20% 유동상 A, 16분 20% 유동상 A, 17분 100% 유동상 A. 파장은 214 nm이고, 컬럼(column)은 C18(150x2mm)이었다. 아래의 표 및 그래프는 Zn-IN105(단백질) 6mg, 마니톨 150mg, 소듐 카프레이트 286mg, 및 소듐 스타크 글리코레이트(익스플로탭) 30 mg을 함유하는 Nobex-Zn-IN105 타블렛에 대한 용해 테스트에서 수득된 용해 데이터를 요약한 것이다.
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [860]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 IN105 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 28 19 24
10 53 44 49
15 70 68 69
30 92 90 91
45 92 92 92
60 92 93 93
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [860]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 카프레 이트 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 29 35 32
10 52 66 59
15 70 84 77
30 99 99 99
45 99 99 99
60 99 100 100
12.2.5 타블렛당 카프레이트 100 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 제조
제형 Nobex - IN105 -[861]의 제조
소듐 카프레이트 100mg, 마니톨 150mg, 소듐 스타크 글리코레이트(sodium starch glycolate) 25mg 및 Nobex-IN105 6mg(단백질)을 중량지(weght paper)에 옮기고, 완전히 혼합하였다. 상기 혼합물을 약 350 psi로 가압 및 압착하여 타블렛을 생성하였다.
타블렛당 카프레이트 100 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 Nobex - IN105 -[861]
성분 타블렛 당 mg
소듐 카프레이트 100
마니톨 150
익스플로탭(explotab)(소듐 스타크 글리코레이트) 30
Nobex-IN105(단백질) 6
상기 용해 테스트를 USP 기구 2 용해유닛(USP apparatus 2 dissolution unit)을 이용하여 수행하였다. 매질은 물이고, 패들(paddle)속도 50 rpm 이며, 상기 매질의 부피는 500mL였다. 상기 용해 샘플은 구배 시스템(gradient system)을 이용하여 HPLC로 측정하였다. 상기 유동상은 0.1% TFA(유동상 A)를 가지는 물 및 0.1% TFA(유동상 B)를 가지는 아세토니트릴이었다. 이용되는 상기 구배는 다음과 같았다: 0분 100% 유동상 A, 11분 65% 유동상 A, 15분 20% 유동상 A, 16분 20% 유동상 A, 17분 100% 유동상 A. 파장은 214 nm이고, 컬럼(column)은 C18(150x2mm)이었다. 아래의 표 및 그래프는 Zn-IN105(단백질) 6mg, 마니톨 150mg, 소듐 카프레이트 100mg, 및 소듐 스타크 글리코레이트(익스플로탭) 25 mg을 함유하는 Nobex-Zn- IN105 타블렛에 대한 용해 테스트에서 수득된 용해 데이터를 요약한 것이다.
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [861]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 IN105 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 77 41 59
10 94 84 89
15 96 90 93
30 95 91 93
45 95 91 93
60 97 89 93
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [861]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 % 카프레이트
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 97 77 87
10 101 99 100
15 101 103 102
30 101 103 102
45 101 104 103
60 101 104 103
12.2.6 타블렛당 카프레이트 150 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 제조
제형 Nobex - IN105 -[862]의 제조
소듐 카프레이트 150mg, 마니톨 150mg, 크로스카멜로스 소듐(croscarmellose sodium) 25mg 및 Nobex-IN105 6mg(단백질)을 중량지(weght paper)에 옮기고, 완전히 혼합하였다. 상기 혼합물을 약 350 psi로 가압 및 압착하여 타블렛을 생성하였 다.
타블렛당 카프레이트 150 mg 인 고체 복용형태( 타블렛 ) 제형 Nobex - IN105 -[862]
성분 타블렛 당 mg
소듐 카프레이트 150
마니톨 150
익스플로탭(explotab)(크로스카멜로스 소듐) 30
Nobex-IN105(단백질) 6
상기 용해 테스트를 USP 기구 2 용해유닛(USP apparatus 2 dissolution unit)을 이용하여 수행하였다. 매질은 물이고, 패들(paddle)속도 50 rpm이며, 상기 매질의 부피는 500mL였다. 상기 용해 샘플은 구배 시스템(gradient system)을 이용하여 HPLC로 측정하였다. 상기 유동상은 0.1% TFA(유동상 A)를 가지는 물 및 0.1% TFA(유동상 B)를 가지는 아세토니트릴이었다. 이용되는 상기 구배는 다음과 같았다: 0분 100% 유동상 A, 11분 65% 유동상 A, 15분 20% 유동상 A, 16분 20% 유동상 A, 17분 100% 유동상 A. 파장은 214 nm이고, 컬럼(column)은 C18(150x2mm)이었다. 아래의 표 및 그래프는 Zn-IN105(단백질) 6mg, 마니톨 150mg, 소듐 카프레이트 150mg, 및 크로스카멜로스 소듐(익스플로탭) 25 mg을 함유하는 Nobex-Zn-IN105 타블렛에 대한 용해 테스트에서 수득된 용해 데이터를 요약한 것이다.
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [862]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 IN105 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 76 41 59
10 93 87 90
15 95 99 97
30 96 98 97
45 97 98 98
60 98 97 98
Nobex - Zn - IN105 타블렛 [862]의 용해 프로파일에 대한 데이터 요약, 용해된 카프레 이트 %
샘플 시간
(분)		 베셀(vessel) 1
(용해 %)		 베셀(vessel) 2
(용해 %)		 평균
(용해 %)
5 84 51 68
10 98 88 93
15 98 97 98
30 98 98 98
45 98 98 98
60 98 98 98
13 시험관내 효소 저항 실험( In vitro Enzyme Resistance Examples )
인슐린 화합물 접합체(HIM2)를 10mM의 소듐 포스페이트 버퍼(pH 약 7.4)에서 제조하고, 농도를 HPLC로 측정하였다(용액을 상기 버퍼로 희석하고 모(parent)와 접합체 사이의 당량몰 비교를 할 수 있었다 ~0.6 mg/mL )(the solutions are diluted with buffer so that equimolar comparisons can be made between parent and conjugates ~0.6 mg/mL). 친유화된 키모트립신 효소를 1mM HCl에서 현탁하여, 농도가 약 7.53 U/mL로 되게하였다. 각 샘플의 1.53 mL 분액을 상기 샘플 관에 첨가하고, 0.850 mL 분액은 제어관에 첨가하였다. 샘플들을 각 샘플당(per) 4개의 제어관과 함께 두 번 테스트하였다. 분액을 15분동안 열혼합기(thermomixe)에서 37℃ 로 배양(incubate)하였다. 그후 키모트립신 효소 17μL를 각 샘플 관에 첨가하였다. 1mM HCl 5μL를 각 제어관에 첨가하였다. 상기의 첨가 직후, 200μL를 상기 샘플관 및 제어관에서 제거하고, 미리 원심분리관으로 분액된, 1% TFA 50μL에 넣었다. 상기 샘플은 T=0로 나타났다.
인슐린(Zn 프리(free)), HIM2(Zn 프리(free)) 및 인슐린(일반적인 인슐린 화합물)에서 상기 샘플링(sampling) 절차를 아래의 간격으로 반복하였다: 0, 2, 5, 8, 12, 15, 및 30분. 상기 제어절차를 아래의 간격으로 반복하였다: 0, 8, 15, 30분. T-형 및 R-형 샘플에서, 상기 절차를 아래의 간격으로 반복하였다: 0, 5, 8, 12, 30, 40 및 60분. Zn 착물에서 상기 제어 절차를 아래의 간격으로 반복하였다: 0, 12, 40 및 60분. 샘플을 -20℃에서 저장하고 난 뒤, HPLC로 분석할 수 있다. HPLC를 작동하여 각 다이제스트(digest)에서 각각 T=0분일 때에 비하여 분해율(percent degradation)을 측정하였다. 잔여율(percent remaining)의 자연로그(natural log)를 시간에 대하여 도표화하였고(plot), 선형회귀(linear regression)를 각 다이제스트(digest)에 대하여 실행하였다(run). 반감기를 다음 식을 이용하여 계산하였다: t1 /2 = -0.693/기울기(slope).
0.6 mg / ml 단백질 에서 결과
샘플 반감기(T half) 아연 함량 페놀 함량
인슐린
(아연 프리)		 7~9분 -- --
HIM2
(아연 프리)		 12~15분 -- --
인슐린, USP
(일반적인 인슐린 화합물)		 26~29분 0.3 ~ 1 % w/w --
HIM2
(R-형 아연 착물)		 51~78분 1.1 % w/w 0.1 ~ 0.25 % w/w
HIM2
(T-형 아연 착물)		 51분 0.55 % w/w -
HIM2
(R-형 아연/프로타민 착물)		 95~120분 2.0 ~ 2.1 % w/w 5.3 ~ 6.2 % w/w
DICON-1
(R-형 아연 착물)		 24~26분 ND ND
0.3 mg / ml 단백질 에서 결과
샘플 반감기(T half) 아연 함량 페놀 함량
인슐린
(아연 프리)		 4~5분 -- --
HIM2
(아연 프리)		 7~9분 -- --
인슐린, USP
(일반적인 인슐린 화합물)		 7~8분 0.4~ 1 % w/w --
HIM2
(R-형 아연 착물)		 19~21분 1.1 % w/w 0.1 ~ 0.25 % w/w
HIM2
(T-형 아연 착물)		 12~15분 0.55 % w/w --
14 생체내 실험( In vivo Examples )
14.1 장기간에 걸친 쥐의 혈당 분석( MBGA : Mouse Blood Glucose Assay )
5마리의 암컷 CF-I 쥐 여섯 쌍의 복용 그룹에 인슐린 화합물 접합체(테스트 아티클(article)) 또는 재조합 인간 인슐린 중 어느 하나를 피하주사로 주입하였다. 상기 테스트 아티클을 0.1% w/w 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 함유하는 포스페이트 버퍼(0.01M, pH 약7.4)로 재구성하고, 100, 66.6, 43.3, 30, 20, 및 13.3 μg/kg로 복용하게 하였다. 인슐린은 0.1% w/w 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 함유하는 포스페이트 버퍼(0.01M, pH 약7.4)로 재구성하고, 50, 33.3, 21.7, 15, 10, 및 6.7 μg/kg로 복용하게 하였다. 대퇴부(thigh) 및 성기(groin)에 의해 형성된 포켓(pocket)에 피하 복용 후, 동물은 실온에서 30분 동안 그들의 우리로 되돌아가 있었고, 그후 급속히 마비되어, 결국에 출혈하였다. 혈액샘플을 포도당 분석을 위한 헤파린 튜브(heparin tubes)에 모았다. 포도당 분석이 지연되면, 상기 관을 냉수에 저장하고 분석 전에 실온으로 다시 데웠다.
플라즈마 포도당를, 제조사의 지시에 따라 각각의 사용날짜의 시작부분에 눈금이 조정되어 있는, 글루코메터(glucometer)(예를 들어, One Touch®Basic; Lifescan)로 측정하였다. 상기 인슐린 화합물 접합체의 유효성을 이후, 인간 인슐린 반응에서 도출된 표준 곡선과 연계하여 계산하였다. 재조합 인간 인슐린이 27.4 IU/mg의 유효성을 가진다는 가정을 기초로 계산을 하였다.
결과는 도 16~20 에 나타난 바와 같다. 도 16 은 HIM2에 대한 MBGA 생물학적 유효성 프로파일을 나타난다. 도 17 은 Zn-HIM2 인슐린 화합물 생성물 R-형에 대한 MBGA 생물학적 유효성 프로파일을 나타난다. 도 18 은 Zn-HIM2 인슐린 화합물 생성물 T-형에 대한 MBGA 생물학적 유효성 프로파일을 나타난다. 도 19 는 프로타민을 가지는 Zn-HIM2 인슐린 화합물 생성물에 대한 MBGA 생물학적 유효성 프로파일을 나타난다. 도 20 은 투약 후 30 및 90분에서 R-형 프로타민 착물의 포도당 저하 효과를 나타낸다. 상기 결과는 HIM2의 생물학적 유효성이 Zn++과의 착물화에 의해 상당 히 감소되지 않는다는 것을 나타낸다. 상기 R-형 프로타민 착물( 도 17[7] 참조)은 90분 보다는 30분에서 포도당이 더 많이 감소함을 나타낸다.
더욱이, 도 21~24 는 아래의 구조를 가지는 IN-186, IN-192, IN-190, IN-191, IN-189, IN-178, IN-193, IN- 194, IN-185, IN- 196 및 IN-197에 대한 MBGA 생물학적 유효성 프로파일을 나타낸다.
Bl 단일접합체, IN -186:
Figure 112007014591843-pct00058
B29 단일접합체, IN -194:
Figure 112007014591843-pct00059
B29 단일접합체, IN - 197:
Figure 112007014591843-pct00060
B29 단일접합체, IN -178:
Figure 112007014591843-pct00061
B29 단일접합체, IN -190:
Figure 112007014591843-pct00062
B29 단일접합체, IN -196:
Figure 112007014591843-pct00063
B29 단일접합체, IN -191:
Figure 112007014591843-pct00064
B29 단일접합체, IN - 189:
14.2 개 클램프 연구( Dog Clamp Studies )
14.2.1 초기 HIM2 연구( Initial HIM2 Studies )
개(n=3 또는 6)를 고동맥(femoral artery)에 도관(catheter)을 위치시킴으로써 외과적으로(이소프루란 마취(isoflurane anesthesia)) 준비하였다. 상기 동물을 밤새 단식시킨 후에 16~17일 동안 회복하도록 하여, 의식있는 상태에서 연구하였다. 60분의 안정기(equilibration period) 후에, 상기 약물을 구강으로 주입한 뒤, 20분의 제어기(control period)가 두었다. Zn++-HIM2 R-형 인슐린 화합물을, 실시예 에서 나타난 바와 같이 제조한, 완충용액에서 테스트하였다. 더욱이, R-형 및 NPH- 형 착물을, 실시예에서 나타난 바와 같이 제조된, 카프레이트 및 라우레이트을 함유하는 경구 액체 제형에서 테스트하였다.
3개의 테스트 샘플 모두 한번의 복용량 수준으로만 테스트하였다(상기 복용량은 이전의 실험 결과를 기초로 하여 결정하였다). 상기 플라즈마 포도당 수준은 그후, 4시간 동안 다리 정맥을 통한 D-20의 주입에 의하여 정상혈당치에서 클램프(clamped)하였다. 혈액샘플(4 ml)을 인슐린 화합물 및 C-펩타이드인, 포도당의 측정을 위하여 -20, 0, 5, 10, 20, 30, 45, 90, 120, 180 및 240분에서 취하였다(taken). 동맥혈 샘플은 상기 플라즈마 포도당 수준을 클램프하는데 필요한 만큼 수득하였다. 총 72ml의 혈액을 각각의 실험에서 사용하였다.
다음의 측정을 수행하였다: 포도당 주입속도, 인슐린 화합물 농도, C-펩타이드 농도, 및 플라즈마 C-펩타이드 수준(내인성 인슐린 화합물 방출의 측정을 허용하는). 정상혈당을 유지하는데 필요한 상기 포도당 주입속도는 인슐린 화합물 실행의 지표(index)를 제공한다.
상기 실험에 이어서, 상기 상기 도관(catheter)의 자유말단(free end)을 피하에 파묻고, 상기 개를 다른 테스트 아티클이 사용되는 다른 연구에 앞서 2주 동안 회복하도록 하였다. 동물은 복용을 위하여 선택적으로 선택하였으며, 총3번 이용하였다. 개는 총 6마리를 이용하였다.
도 25 및 26 은 상기 결과를 나타낸다.
14.2.2 초기 IN105 연구
상기 연구는 건조 중량을 기초로 34% 단백질, 46% 탄수화물, 14.5% 지방 및 5.5% 섬유질의 음식물을 섭취하고, 6일동안 밤새 단식한 의식있는 잡종개에게 수행하였다. (1)실험전 약 3주 외에, 기술된 바와 같이 각 동물에게는 고동맥에 실리스틱 도관을 주입하였다. 실험 당일에 상기 도관을 국부 동맥 하의 피하 포켓에서 제거하였다. 테스트 아티클: Nobex-IN105 (Lot.# KJ-173-095 & KJ-173-116)을 1.0 mg/ml 농도의 경구 지방산 제형(Nobex-IN-[753]-040422)으로 제조하였다. 각각의 개는 Nobex-IN105(1.0 mg/ml@0.25 ml/kg 복용량) 0.25 mg/kg를 경구 복용하였다. Nobex-IN105를 t=0에서 제공하였고, 포도당(D-20)은 정상혈당을 유지하기 위하여 두부 정맥(cephalic vein)을 통하여 주입하였다. 동맥혈은 미리 기술한 바와 같이(1) 인슐린 및 포도당의 측정을 위하여 뽑아낸다(drawn). 상기 실험을 완성한 후, 상기 동맥 도관을 초기 외과수술(initial surgery)에서처럼 피하에 묻었다.
상기 실험 동안에, 한 마리에 개는 복용 직후 구토하였고, 복용량의 일부만이 투여되었다. 따라서, 상기 실험으로부터의 결과를 상기 개에서 수득한 데이터를 가지고(with) 및 데이터 없이(without) 작성하였다.
Nobex-IN105의 경구 투여에 다음에, 동맥 플라즈마 인슐린 수준은, 옥외에서 사육되는 동물(Oral-2i)을 포함하는 여섯마리의 개 모두에서 상승하였다. 평균 동맥 인슐린은 6.0±1.4μU/ml (6.3±1.7μU/ml, n=5)에서 투여 후 10분에 최고치인 109.4±31.4μU/ml(127.8±30.1μU/ml, n=5)로 상승하였고, 그후 감소하여 150분 까지 개 전체는 기준 인슐린 수준으로 되돌아갔다( 도 27 및 28 ).
정상혈당을 포도당 주입으로 유지하였다. 상기 포도당 주입 속도는 동맥 인 슐린에서 더 큰 상승을 하는 동물이 가장 큰 정상혈당을 유지하기 위해 요구된다( 도 27 및 28 ). 상기 포도당 주입 속도곡선(AUCO-240) 아래의 평균 면적은 578.5±144.5 mg/kg/min (669.4±137.7 mg/kg/min, n=5)이다.
14.2.3 고체 제형( Solid Formulations )
포도당-클램프 모델(glucose-clamp model)을 이용하는 제형 스크리닝 연구(formulation screening studies)는 건조 중량을 기초로 34% 단백질, 46% 탄수화물, 14.5% 지방 및 5.5% 섬유질의 음식물을 섭취한, 밤새 단식한 의식있는 잡종개에게 수행하였다. 실험전 약 3주 외에(참조 1) 기술된 바와 같이 각 동물에게는 고동맥에 실리스틱 도관을 주입하였다. 실험 날에 상기 도관을 국부 동맥 하의 피하 포켓에서 제거하였다. 상기 테스트 아티클에 다른 액체 제형에 1.0 mg/ml Zn IN105를 함유하고 또는 캡슐(capsule) 또는 타블렛마다 5~6mg의 IN105를 포함시켰다. 각 실험에서 각각의 개는 약 0.25 mg/kg의 경구 액상 복용을 하거나 또는 5 또는 6mg의 IN105를 함유하는 캡슐 또는 타블렛을 연속적으로 두번 복용하되, 첫번째는 t=0에서, 두번째는 t=120분에 복용하였다. 포도당(D-20)은 정상혈당을 유지하기 위하여 두부 정맥(cephalic vein)을 통하여 주입하였다. 효과가 120분 이상 지속될 때, 연구시간을 복용 후에 연장하였다. 동맥혈은 미리 기술한 바와 같이(참조 1) 인슐린, 포도당 및 C-펩타이드의 측정을 위하여 뽑아내었다. 상기 실험을 완성한 후, 상기 동맥 도관을 피하 조직 속으로 대체하였다.
용액 및 고체 복용형태인 제형을 다른 수준의 지방산, 완충제, 희석제 및 붕 괴제와 함께 제조하였다. 변이를 최소화하기 위하여, 상기 액체 및 고체 제형은 IN105 및 각각의 부형제(카프르산, 라우린산, 카프릴산, 미스트린산, 리놀렌산)를 동일한 수준으로 함유하고, 따라서 지방산 함량, 완충제, 희석제(마니톨 또는 미세 결정 셀룰로스), 및/또는 붕괴제(익스플로탭)의 상대적인 양만을 변화시킨다. 상기 포도당 주입 속도 및 IN105 흡수(플라즈마 인슐린 면역반응) 데이터는 각각 복용되는 제형으로 계산되고 비교된다.
초기에, 실험은 최적화된 액체 제형(참조 2)을 고체 복용형태로 보다 용이하게 전화되는 액체 제형으로 단순화 및 정제하기 위하여 수행하였다. 이것은, 더 이상 필요로하지 않는 버퍼 성분(시트르산, 트롤아민, 트로메타민, 수산화 나트륨)을 제거함으로써 뿐만 아니라, 자유 지방산을 상응하는 나트륨염(예를 들어, 소듐 카프레이트에 의해 치환된 카프르산)으로 치환함으로써 수행하였다. 더욱이, 리놀렌산, 카프릴산 및 미리스트린산과 같은 다른 지방산 및 아미노산, 아르기닌의 효과는 IN105의 흡수에 대한 이들의 효과에 대하여 측정되었다.
원형(prototype)의 초기세트가 실험당 1~2 마리의 개를 사용하여 스크린(screen)한 다음에, 제형과 개별 동물 간의 다양성 및 항상성을 더 좋게 결정하는 개에서 원형의 제형은 거의 선택되지 않았고, 거의 테스트되지 않았다.
용해 방법이 개선되었고, 용해 연구가 IN105 및 지방산 함량의 용해 프로파일을 측정하기 위한 다양한 후보 제형에 대하여 수행되었다.
결과
상기 초기 실험에서, 추가적인 부형제 없이 포스페이트 버퍼에서 3% w/v 카프르산 나트륨염의 IN105를 복용한 개는 트롤아미/시트르산/트로메타민/수산화 나트륨 완충액에서 3% w/v 카프르산을 함유하는 최적화된 액체 제형을 복용했을 때와 유사한 반응을 나타낸다(도 29~30). 이것은 상기 지방산형태의 나트륨염이 상기 산 형태와 유사하게 작용하며, 상기 추가적인 완충성분은 상기 제형에 영향을 주지 않는다는 것을 입증하는 것이다.
3% 카프레이트를 3% 카프릴산 또는 3% 리놀렌산으로 대체하는 택일적인 지방산을 평가하는 분리 연구에서, 상기 어떠한 대안택도 현저한 효과를 나타내지 않는다. 카프릴산의 사용은 포도당의 저급 내지 중급 수준의 포도당에 대한 요구를 야기시킨 반면, 린놀렌산의 사용은 효과의 결핍을 암시하는 어떠한 포도당 주입을 필요로 하는 결과를 야기시키지 않았다. 두 개의 제형 모두 비교적 낮은 수준의 동맥 인슐린을 나타내었다. 아르기닌을 함유하는 액체 제형은 GIR 또는 IN105 수준상에 어떠한 장점도 나타내지 않았다.
주요 연구에서, 고체 제형은 경질의 젤라틴 캡슐로 채원진 파우더 혼합물 및 Carver Press를 이용하여 수동으로 압착한 타블렛으로서 측정되었다. IN105(인슐린 당량, 0.25mg/Kg)과 카프레이트 57mg / 라우레이트 57mg의 파우더 혼합물인, 상기 캡슐은 첫번째 복용에서 120분까지 현저한 효과를 나타내지 않았고, 두번째 복용에서, 현저한 효과는, 수준이 0~120분에서 기준선 이상일 때 GIR 과 IN105 흡수가 공존하면서, 관찰되었다. 상기 데이터는 캡슐 복용형태의 IN105에서 다양하면서도 잠재력있는 지연된 반응을 암시한다. 용해는 시험관내(in-vitro)/생체내(in-vivo) 상 호공존이 거의 없다고 할지라도 타블렛에 비하여 캡슐에 의해 약간 지연되었을 뿐이다.
초기 원형 타블렛 스크리닝 연구에서, IN105 6mg 및 마니톨 150mg, 라우레이트 143mg을 가지는 또는 가지지 않는 카프레이트 143mg을 가지는 소듐 스타크 글리코레이트 30mg을 함유하는 타블렛은 카프레이트 54mg 또는/및 라우레이트 54mg을 가지는 동일한 타블렛보다 현저하게 높은 GIR 및 IN105 흡수를 나타내었다 (도 31, 32, 및 33) . 이것은 카프레이트 및 라우레이트 수준의 증가에 비하여 더 높은 GIR 및 IN105 수준의 복용반응을 나타낸다. 상기 표는 IN105로 채워진 캡슐에 대하여 빠르고 항상성 있는 GIR 반응 시간을 나타내었다. 더욱이, 상기 IN105 타블렛은 인슐린을 복용한 모든 개에서 동맥 플라즈마가 증감함을 나타내어TEK.
일련이 마지막 연구에서, 세 가지의 원형 타블렛 제형(제형 [856]은 카프레이트 143mg 및 라우레이트 140mg을 함유하고, 제형 [860]은 카프레이트 286mg를 함유하며, 제형 [862]는 카프레이트 150mg를 함유함)은 성능의 항상성을 평가하도록 5마리의 개(각 제형에 대하여 3 마리의 다른 개)에서 측정을 위하여 선택되었다( 도 34~37 ). 동맥 플라즈마 인슐린 수준은 전제 3마리의 개 및 카프레이트 150mg 또는 280mg 중 하나 또는 카프레이트/라우레이트 143mg/140mg을 함유하는 타블렛으로 제형화되는 IN105 6mg(인슐린 당량)의 경구 투여에 이어서 상응하는 GIR 반응을 가지는 전체 18 복용량(3마리 개 x 3 타블렛 x 2 복용량)에서 상승하였다( 도 31~32 및 38~42 ). 평균(n=2)인, 카프레이트 타블렛 150mg 및 280mg을 가지는 C-펩타이드 수준(ng/ml)은 첫번째 복용 중에 0.30±0.05에서 0.22±0.02로 감소하 였고, 두번째 복용중에 0.1±0.05에서 0.02±0.0으로 감소하였으며, 140mg/140mg 카프레이트/라우레이트 타블렛을 가지는 C-펩타이드 수준은 첫번째 복용 중에 0.21 ±0.05 내지 0.05±0.02을 나타내었고, 두번째 복용 중에 0.18±0.05 내지 0.18±0.01을 나타내었다. 이는 외인성 IN105 인슐린의 결과로서 췌장으로부터 C-펩타이드 분비의 억제를 나타낸다.
IN105의 전체 세가지 원형 타블렛 제형은, 다른 날(on different days)을 포함하여, 복용 중의(among) 및 개 내의(within) 및 사이의(between), IN105 흡수 및 생성되는 포도당 주입 속도의 일치하는 수준을 나타내었다.
6마리의 개 세트(set)가 사용된, 최종 연구 동안에, 한마리 개(개 #3)는 모든 액상 및 고체 복용에 대해 반응을 거의 나타내지 않았다. 상기 결과를 보다 정확하게 나타내기 위하여, 상기 데이터는 개 #3에서의 결과와 함께(with) 및 개 #3에서의 결과를 배제하고(without) 나타내었다. 완전하게 복용하지 못한(불량한 위관영양공급(bad gavage), 구토 등) 개 또는 내인성 인슐린을 가지는 개로부터 수득한 데이터는 생략하였다.
용해 연구: 타블렛 및 캡슐의 대표적인 샘플은 용해 테스트의 대상이 되었다(상기에 기술됨).
논의( Discussion )
상기 연구는 마니톨 및 나트륨 녹말 글리코산 붕괴제(the disintegrant sodium starch glycolate)와 함께 카프레이트 또는 카프레이트 및 라우레이트를 함 유하는 원형 IN105 타블렛 및 경구로 이송된 IN105 (약 0.25 mg/kg) 6mg을 함유하는 원형 IN105 타블렛이 정상혈당을 유지하는 포도당 주입을 필요로 하는 동맥 플라즈마 인슐린의 현저하고 항상적인 상승을 초래한다는 것을 입증한다.
상기 원형 타블렛은 적어도 동일한 수준의 카프레이트 또는 라우레이트를 함유하는 액상 체형 만큼 또는 더 많이 개선돈 IN105 수준 및 GIR 속도를 야기한다. 상기 원형 타블렛 형태는 경구 액체 제형의 흡수 프로파일을 유지한다. 상기 선택되는 원형 타블렛 제형의 상대적인 경구 생물학적 효율(예를 들어, 280mg 및 150mg 카프레이트 함유 타블렛, n=6, GIR= 496±17 및 500±75에서 AUC)은 액체 제형(예를 들어, 3% w/v 카프르산 액체 제형, n=5, GIR= 182±92 및 198±119에서 AUC)보다 더 크게 나타난다.
상기 데이터는 마니톨과 함께 오직 지방산으로서 소듐 카프레이트 및 붕괴제인 소듐 스타크 글리코레이트을 함유하는 타블렛이 임상 연구에 사용할 고체 복용 형태의 추가적인 개선에 유용할 것이라는 것을 암시한다. 데이터는 또한 선택되는 원형 카프레이트 타블렛 형태(150mg 또는 286mg의 소듐 카프레이트)로 IN105의 경구 투약 이후에 인슐린 수준이 복용 후 20분 경에 Tmax로 서서히 최고조에 달하고, 둘 다 복용시에, 약 59.0±20.1 및 62.9±25.4 μUnits/ml의 Cmax로 서서히 최고조에 달한다는 것을 암시한다. 상기 플라즈마 인슐린 수준은 10~15분 동안 Cmax수준의 근처에 향상되어 남아있고, 각각의 복용 후에 120분에 걸쳐서 기초수준 이상으로 남아있다. 상기 GIR은, 양쪽 복용시에 30~40분에서 또는 30~40분 근처에서 모두 Tmax에 도달하고 평균 8.4±1.99 및 7.41±2.18 mg/kg/min GIR Cmax에 도달하는, 상기 타블렛을 이용하여 정상혈당을 유지하는 것을 필요로한다. 상기 타블렛 복용 형태는 더 큰 GIR Cmax(7.4~8.4 대 4.5~5.4)를 필요로 하고, 정상혈당을 유지하는 더 긴 지속시간(100~120분 대 60~90분) 동안 포도당 주입을 필요로 하며, 그후 최적화된 액체 제형을 필요로 하였다.
분석적인(historical) SQ 및 직관적인(inhaled) 인슐린의 동백 플라즈마 인슐린 수준과 비교하여, 상기 원형 타블렛은 SQ 및 직관적인 이송과 유사한 최대 인슐린 수준을 제공하는 것으로 나타나고, 직관적인 인슐린과 동일한 인슐린 프로파일과 동일성이 있다( 도 34~37 ).
상기 원형 타블렛 실험은, 선택된 원형 타블렛이 타블렛 압착을 이용하여 생성할 수 있는 임상적 제형을 생산하는데 중점을 두는 부가적인 개선과 함께 IN105의 추가적인 평가를 위한 고체 복용 제형으로서 적합하다는 것을 암시한다.
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본 명세서는 참조를 용이하게 할 목적으로 주제별로 섹션으로 분리된다. 섹션 및 머리말 주제는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 바가 아니다. 연기에 설명되는 구현예는 본 발명의 많은 측면 및 기원을 구체화고자 하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 바가 아니다.

Claims (353)

  1. 다음을 포함하는 착물:
    변형 모이어티(modifying moiety)에 접합되는 천연 인슐린(native insulin) 또는 인슐린 폴리펩타이드 유사체를 포함하는 인슐린 접합체(conjugate), 상기 변형 모이어티는 친유성 성분과 결합된 PEG 성분을 형성하는 2 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 서브유닛(polyethylene glycol subunits)(OCH2OCH2)을 포함하며, 상기 친유성 성분은 알킬이고, 상기 변형 모이어티는 B-사슬의 C-말단의 5 아미노산 내의 리신에 접합함으로써 단일 접합체를 형성함, 및
    양이온,
    여기서, 상기 인슐린 접합체는 Zn++, Mn++, Ca++, Fe++, Ni++, Cu++, Co++ 및 Mg++로 구성된 2가 양이온으로 착물화됨.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 폴리펩타이드 유사체는 천연 프로인슐린(native proinsulin) 화합물, 인공 프로인슐린(artificial proinsulin) 화합물; 프로인슐린 화합물 및 상기 프로인슐린 화합물의 C-말단(C-terminus) 또는 N-말단(N-terminus)에 접합된 리더 펩타이드(leader peptide) 또는 캐리어 단백질(carrier protein)을 포함하는 프리-프로인슐린(pre-proinsulin) 화합물; 및 미니프로인슐린(miniproinsulin) 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 착물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인슐린 폴리펩타이드 유사체는 절단가능한(cleavable) 또는 절단불가능한(non-cleavable) 리더 펩타이드를 가지는 것을 특징으로 하는 착물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변형 모이어티는 Lys B29에서 결합된 것을 특징으로 하는 착물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 접합체가 상응하는 비접합 인슐린보다 더욱 친수성 또는 더욱 양친매성이 되도록 선택되는 것을 특징으로 하는 착물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 접합체의 친수성도(hydrophilicity)는 아연의 첨가에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 착물.
  7. 제6항에 있어서, 다음을 특징으로 하는 착물:
    상기 변형 모이어티는 상기 인슐린 접합체가 상응하는 비접합 인슐린보다 동일 또는 더욱 용해성이 되도록 선택됨; 및
    상기 인슐린 접합체의 수용해도는 아연의 첨가에 의해 감소됨.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 접합체는 상응하는 모 인슐린 화합물(parent insulin compound)에 대하여 1 또는 1 미만의 상대적인 지질 친화도(lipophilicity)를 가지는 것을 특징으로 하는 착물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, pH 7.4에서 상기 양이온-인슐린 접합체 착물의 용해도는 상기 인슐린 접합체의 용해도보다 작거나, 동일하거나 또는 큰 것을 특징으로 하는 착물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 착물은 고체인 것을 특징으로 하는 착물.
  16. 제1항에 있어서, 다음을 특징으로 하는 착물:
    (a) pH 7.4에서 상기 양이온-인슐린 접합체 착물의 용해도는 pH 7.4에서 상기 인슐린 접합체의 용해도보다 현저하게 작고, 및
    (b) 상기 양이온-인슐린 접합체는 pH 5.8 ~ 8.5의 범위의 수용액에서 1 g/L보다 많이 용해됨.
  17. 제1항에 있어서, 다음을 특징으로 하는 착물:
    (a) 상기 착물은 프로타민(protamine)을 포함하는 R-형 Zn 착물이고; 및
    (b) pH 7.4에서, 상기 착물의 수용해도는 10 ~ 110g/L, 20 ~ 85g/L, 또는 30 ~ 70g/L임.
  18. 제1항에 있어서, 다음을 특징으로 하는 착물:
    (a) 상기 착물은 프로타민을 포함하는 T-형 Zn 착물이고; 및
    (b) pH 7.4에서, 상기 착물의 수용해도는 10 ~ 150g/L, 20 ~ 130g/L, 30 ~ 110g/L, 또는 35 ~ 60g/L임.
  19. 삭제
  20. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 화합물 접합체는 pI ± 2.5와 동일한 pH의 수용액에서 결정을 생성하는 것을 특징으로 하는 착물.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제1항에 있어서, 일 변형 모이어티는 카바메이트 결합(carbamate bond)을 형성하도록 인슐린의 자유(free) 아미노기와 결합되는 것을 특징으로 하는 착물.
  25. 제1항에 있어서, 다음을 특징으로 하는 착물:
    (a) 상기 인슐린은 자유 히드록시기(hydroxyl group)를 포함하고, 및
    (b) 일 변형 모이어티는 카르복실(carboxyllic), 에테르(ether), 또는 카보네이트(carbonate) 결합을 형성하도록 상기 자유 히드록시기와 결합됨.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제1항에 있어서, 상기 양이온 성분은 Zn++인 것을 특징으로 하는 착물.
  29. 제1항에 있어서, 인슐린 접합체 대 양이온 성분의 몰비(molar ratio)는 1:1 ~ 1:100, 1:2 ~ 1:12, 또는 1:2 ~ 1:7인 것을 특징으로 하는 착물.
  30. 제1항에 있어서, 키모트립신(chymotrypsin)의 분해(degradation)에 대한 상기 착물화된 인슐린 접합체의 저항은 상응하는 비착물화된(uncomplexed) 인슐린 접합체의 키모트립신 분해보다 큰 것을 특징으로 하는 착물.
  31. 제1항에 있어서, 키모트립신(chymotrypsin)의 분해(degradation)에 대한 상기 착물화된 인슐린 접합체의 저항은 상응하는 착물화되었으나 접합되지 않은(unconjugated) 인슐린 접합체의 키모트립신 분해보다 큰 것을 특징으로 하는 착물.
  32. 제1항에 있어서, 상기 변형 모이어티는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 착물:
    Figure 112013028139326-pct00202
    ,
    여기서, n은 1~4이고, m은 2~5임;
    Figure 112013028139326-pct00203
    ;
    Figure 112013028139326-pct00204
    ;
    Figure 112013028139326-pct00205
    ;
    Figure 112013028139326-pct00206
    ;
    Figure 112013028139326-pct00207
    ;
    Figure 112013028139326-pct00208
    ;
    Figure 112013028139326-pct00209
    ;
    Figure 112013028139326-pct00210
    ;
    Figure 112013028139326-pct00211
    ;
    Figure 112013028139326-pct00212
    ;
    Figure 112013028139326-pct00213
    ;
    Figure 112013028139326-pct00214
    ;
    Figure 112013028139326-pct00215
    ;
    Figure 112013028139326-pct00216
    ;
    Figure 112013028139326-pct00217
    ;
    Figure 112013028139326-pct00218
    ;
    Figure 112013028139326-pct00219
    ; 및
    Figure 112013028139326-pct00220
    .
  33. 삭제
  34. 제1항 내지 제7항, 제9항, 제14항 내지 제18항, 제20항, 제24항, 제25항 및 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항의 착물 중 적어도 하나의 약학적으로 유효한 양을 포함하는 인간의 인슐린 결핍증 치료용 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 인슐린 접합체 또는 비접합 인슐린을 포함하는 두 번째 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 제34항에 있어서, 상기 착물의 인슐린 접합체가 다른 인슐린 화합물 또는 다른 인슐린 접합체를 포함하는 하나 이상의 착물을 포함하는 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 다른 인슐린 접합체는 다른 용해도, 다른 순환 반감기(ciculation half life), 및 다른 변형 모이어티로 구성된 군에서 선택되는 다른 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 착물 중 하나는 속효성 프로파일(rapid-acting profile)을 가지고; 상기 착물 중 다른 하나는 중간-지속성 프로파일(medium-to-long acting profile)을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 착물 중 하나는 염기성(basal) 인슐린 제어에 적합한 프로파일을 가지며; 및 상기 착물 중 다른 하나는 식사 후(post-prandial) 포도당 제어에 적합한 프로파일을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제35항에 있어서, 상기 조성물은 HIM2, 인슐린 및 IN105로 구성된 군에서 선택되는 적어도 두 개의 성분의 공-결정인 것을 특징으로 하는 조성물로,
    여기서, 상기 HIM2는 다음의 구조를 가지며:
    Figure 112013028139326-pct00221
    상기 IN105는 다음의 구조를 가지는 것을 특징으로 함:
    Figure 112013028139326-pct00222
    .
  43. 제35항에 있어서, 상기 조성물은 식후 포도당 제어 또는 밤사이(overnight) 염기성 인슐린 제어에 적합한 PK/PD 프로파일을 가지는 공-결정인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제35항에 있어서, 상기 조성물은 비접합 인슐린을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제34항에 있어서, 착물화제(complexing agent)를 추가로 포함하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 착물화제는 프로타민(protamines), 설펜(surfen), 글로빈 단백질(globin proteins), 스페르민(spermine), 스페르민 알부민(spermidine albumin), 아미노산(amino acids), 카르복시산(carboxylic acids), 다중양이온 폴리머 화합물(polycationic polymer compounds), 양이온성 폴리펩타이드(cationic polypeptides), 폴리리신(polylysine), 음이온성 폴리펩타이드(anionic polypeptides), 뉴클레오티드(nucleotides), 및 안티센스(antisense)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제34항에 있어서, 상기 조성물은 프로타민이 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
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  49. 제34항에 있어서, 상기 조성물은 파우더 형태의 양이온-인슐린 접합체 고체 및 하나 이상의 부가적인 약학적으로 허용가능한 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제34항에 있어서, 건조상태에서 양이온-인슐린 접합체 고체는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    71% w/w 이상의 인슐린 접합체, 및
    0.5 ~ 4% w/w의 Zn++, 및 선택적으로 0.1 ~ 5% w/w의 페놀(phenol).
  51. 제49항에 있어서, 페놀, m-크레졸(cresol) 및 파라벤(paraben)으로 구성된 군에서 선택되는 안정화제를 포함하는 하는 조성물.
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  54. 제34항에 있어서, 상기 조성물은 경구(oral), 경구 복용(oral ingestion), 비경구(parenteral), 구강(buccal), 설하(sublingual), 경비(nasal), 흡입(inhalation) 및 경피(transdermal)로 구성된 군에서 선택되는 경로로 전달하기 위하여 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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