DE69914934T2

DE69914934T2 - Stabile, wässrige insulin-präparate ohne phenol und cresol

Info

Publication number: DE69914934T2
Application number: DE69914934T
Authority: DE
Inventors: Svend Havelund; Niels Kaarsholm
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-11-18
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2019-11-17
Also published as: DE69914934D1; WO2000029013A1; JP2002529514A; ATE259653T1; EP1131089B1; AU1263400A; EP1131089A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft stabile, wässrige Insulin-Formulierungen ohne Phenol und m-Cresol, die zur pulmonalen Verabreichung und zur Verabreichung, bei welcher Phenol und m-Cresol unerwünscht sind, geeignet sind und dem Patienten einen größeren Komfort bereitstellen.
Hintergrund der Erfindung
Diabetes ist ein allgemeiner Begriff für Störungen bei Menschen mit überschüssiger Harnausscheidung wie bei Diabetes mellitus und Diabetes insipdus. Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselstörung, bei welcher die Fähigkeit zur Glukoseverwertung mehr oder weniger vollständig verloren geht. Etwa 2% aller Menschen leiden an Diabetes.
Seit der Einführung von Insulin in den Zwanziger-Jahren wurden große Fortschritte gemacht, wodurch die Behandlung von Diabetes mellitus verbessert wurde. Zur Unterstützung der Vermeidung von extremen Blutzuckergehalten führen Diabetespatienten häufig eine Mehrfachinjektionstherapie durch, wobei Insulin mit jeder Mahlzeit verabreicht wird.
In Lösung ist das Selbstverbindungsmuster von Insulin eine komplexe Funktion von Proteinkonzentration, Metallionen, pH-Wert, Ionenstärke und Lösungsmittelzusammensetzung. Für die gegenwärtig verwendeten löslichen Präparate, die U100-Insulin, Zinkionen, ein isotonisches Mittel und phenolische Konservie rungsmittel enthalten, müssen die folgenden Gleichgewichte berücksichtigt werden. 6In ↔ 3In₂ 3In₂ + 2Zn²⁺ ↔ In₆(T₆) T₆ ↔ T₃R₃ ↔ R₆
Die bekannten Zersetzungsmuster von Insulin schließen a) Fibrillenbildung, b) Desamidierungen an A21 und B3, c) Dimerisierungen über Transamidierung oder Bildung von Schiff'scher Base, d) Disulfidumformungsreaktionen ein.
Gemäß Brange (Stability of Insulin, Kluwer Academic Press, 1994) verläuft jede dieser Zersetzungsreaktionen im monomeren Zustand viel schneller als im hexameren Zustand. Deshalb ist es das effizienteste Mittel zum Stabilisieren von Insulin-Präparaten, dass das vorstehende Gleichgewicht so weit wie möglich nach rechts verschoben wird. Zusätzlich zu diesem allgemeinen Massenaktivierungseffekt wird ferner die Reaktivität von ausgewählten Resten in Abhängigkeit ihrer direkten Beteiligung an der Konformationsumformung T → R modifiziert. Folglich ist die Reaktivität von B3Asn im R-Zustand viel niedriger (wenn der Rest in einer α-Helix vorliegt) als im T-Zustand.
Die Zwischenumwandlung zwischen T₆- T₃R₃- und R₆-Konformationen von zwei Zink-Insulin-Hexameren wird durch Ligandbindung an den T₃R₃- und R₆-Formen moduliert. Anionen wie Chlorid weisen eine Affinität für die vierte Koordinationsposition in den Metallionen von T₃R₃ und R₆ auf, während sich Konservierungsmittel wie Phenol an hydrophobe Taschen binden, die in der Nähe der Oberflächen der T₃R₃- und R₆-Formen lokalisiert sind (Derewenda, Nature 338, 594, 1989 und Brzovic, Biochemistry 33, 130557, 1994). Durch die Verwendung von Co²⁺-Insulin zeigte sich, dass die vereinte Wirkung von Anionen und Phenolbindung beim Stabilisieren des R₆-Zustands besonders effizient ist (Brader, Trends Biochem. Sci. 30, 6636, 1991 und Bloom, J. Mol. Biol. 245, 324, 1995). Weiterhin zeigte sich sowohl für Zn²⁺- als auch für Co²⁺-Insulin, dass Phenol beim Indu zieren des R-Zustands im Insulin-Hexamer viel effizienter als m-Cresol ist (Wollmer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 903, 1987 und Choi, Biochemistry 32, 11638, 1993). Den R-Zustand induzierende Phenolderivate mit hoher Affinität sind 7-Hydroxyindol (Dodoson, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 345, 153, 1993), Resorcinol und 2,6- und 2,7-Dihydroxynaphthalin (Bloom, J. Mol. Biol. 245, 324, 1995).
Die physikalische Denaturierung von Insulin ist als Fibrillenbildung bekannt. Im Fibrillenzustand verlängerte Peptidketten liegen parallel oder antiparallel und sind miteinander durch Wasserstoff verbunden, wodurch sie sogenannte β-Strukturlagen oder β-gefaltete Lagen sind. Fibrillen stellen gewöhnlich den niedrigsten Energiezustand des Proteins bereit, und nur strenge Bedingungen wie eine starke Base können eine Wiederbildung von diesem Zustand zum ursprünglichen Zustand von korrekt gefaltetem Protein ermöglichen. Die Bildungsgeschwindigkeit von Fibrillen fördernde Faktoren sind Temperaturerhöhung, Erhöhung des Oberflächenbereichs zwischen der Flüssigkeits- und der Luftphase und für zinkfreies Insulin Konzentrationserhöhung. Für hexameres Zink-Insulin sinkt die Bildungsgeschwindigkeit von Fibrillen mit der Konzentrationserhöhung. Es wird angenommen, dass die Bildung von Fibrillen über Monomerisierung von Insulin verläuft. Insulin-Fibrillen weisen das Erscheinungsbild von Gelen oder Niederschlägen auf.
Insulinderivate mit Kürzungen im C-Ende der B-Kette, z. B. Des-Pentapeptid-(B26-B30)-Insulin und Des-Octapeptid-(B23-B30)-Insulin neigen mehr zur Bildung von Fibrillen als menschliches Insulin. Insulinanaloga, die sich leicht von der hexameren Einheit zu der monomeren Form aufspalten, z. B. das menschliche AspB28- Insulin und das menschliche LysB28-ProB29-Insulin neigen gleichermaßen mehr zur Fibrillenbildung als menschliches Insulin.
Der ursprüngliche Insulinzustand wird durch Herbeiführen der die hexamere Einheit stabilisierenden Bedingungen, d. h. die Gegenwart von Zinkionen (2–4 Zink/Hexamer), Phenol (0,1–0,5% G/V) und Natriumchlorid (5–150 mM) stabilisiert.
Die Zugabe von Mitteln, die die Oberflächenspannung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche reduzieren, reduzieren ferner die Neigung zur Fibrillenbildung. Folglich fanden Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und Copolymere davon mit mittleren Molekulargewichten von etwa 1800 als Stabilisatoren in konzentrierten Insulinlösungen für Insulinpumpen Verwendung (Grau, 1982 in: Neue Insuline (Hrsgb. Petersen, Schlüter & Kerp), Freiburger Graphische Betriebe, S. 411–419 und Thurow 1981: Patent DE2952119A1). Für eine umfassende Übersicht über die physikalische Stabilität von Insulin siehe Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publisher, S. 18–23.
Der Hauptteil der chemischen Zersetzung von Insulin in Präparaten geschieht aufgrund von Reaktionen, an welcher die Carboxamidfunktion des Asparaginrests, insbesondere der Reste B3 und A21 beteiligt ist. Eine Hydrolyse der Amidgruppen führt zu Desamido-Derivaten und eine Transamidierung, an welcher eine Aminogruppe von einem anderen Molekül beteiligt ist, zu kovalent gebundenen Dimeren und nach ähnlichen Folgereaktionen zu Trimeren und höheren Polymeren.
In saurer Lösung ist AsnA21 am reaktivsten, was zu AspA21-Insulin führt (Sundby, J. Biol. Chem. 237, 3406, 1962). In rohem Insulin vom Ursprung Rind und Schwein, das durch saure Ethanolextraktion erhalten wird, waren die am reichlichsten vorhandenen isolierten Dimere an Asp21-GlyA1 und AspA21-PheB1 gebunden (Helbig 1976, Insulindimere aus der B-Komponente von Insulinpräparationen, Thesis at the Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule, Aachen).
In neutraler Lösung, die die bevorzugte Ausführungsform von Insulin-Präparaten für Injektionstherapie ist, ist AsnB3 der empfänglichste Rest. Zersetzungspro dukte schließen AspB3-Insulin, AspB3-GlnB4-Isopeptidinsulin und Dimere und höhere Polymere, in welchen AspB3 die Carbonyleinheit einer Peptidbindung mit einer Aminogruppe eines anderen Moleküls bereitstellt, ein. Für eine umfassende Übersicht über die chemische Stabilität von Insulin siehe Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publisher, S. 23–36.
Die die hexamere Einheit stabilisierenden Bedingungen der physikalischen Stabilität, d. h. die Gegenwart von Zinkionen (2–4 Zink/Hexamer), Phenol (0,1–0,5 G/V) und Natriumchlorid (5–150 mM) senken die Bildungsgeschwindigkeit von Zersetzungsprodukten während der Lagerung bei neutralem pH-Wert.
Ein anderer Polymerisationsreaktionstyp wird beobachtet, wenn die die hexamere Einheit stabilisierenden Bedingungen nicht berücksichtigt werden. Folglich sind in Abwesenheit von Zink, Phenol und Natriumchlorid und unter Verwendung einer Temperatur von 50°C Disulfid-gebundene Polymere mit hohem Molekulargewicht die gebildeten vorherrschenden Produkte. Der Bildungsmechanismus ist eine wechselseitige Disulfidumformungsreaktion, die sich aus der β-Eliminierung der Disulfide ergibt (Brems, Protein Engineering 5, 519, 1992).
Die Löslichkeit von Insulin ist eine Funktion von pH-Wert, Metallionenkonzentration, Ionenstärke, phenolischen Substanzen, Lösungsmittelzusammensetzung (Polyole, Ethanol und andere Lösungsmittel), Reinheit und Spezies (Rind, Schwein, Mensch, andere Analoga). Für eine Übersicht siehe Brange: Galenics of Insulin, Spriner-Verlag 1987, S. 18 und 46.
Die Löslichkeit von Insulin ist bei pH-Werten nahe seinem isoelektrischen pH-Wert, d. h. im pH-Bereich von 4,0–7,0 gering. Hoch konzentrierte Lösungen von Schweine-Insulin (5000 U/ml ~30 mM) führten einen sauren pH-Wert herbei (Galloway, Diabetes Care 4, 366, 1981), jedoch ist das Insulin in der Formulierung aufgrund einer Desamidierung an AsnA21 äußerst instabil. Bei neutralem pH-Wert können hoch konzentrierte Lösungen von zinkfreiem Insulin hergestellt werden, jedoch sind diese aufgrund einer hohen Polymerisations- und Desamidierungsgeschwindigkeit an AsnA21 instabil. Es wurde berichtet, dass Phenol umfassende Schweine-Zink-Insulinlösungen bei Konzentrationen von 1000 U/ml bei erhöhter Temperatur physikalisch stabil sind, jedoch übersättigt werden, wenn die Temperatur auf 4°C gesenkt wird (Brange und Havelund in Artifical Systems for Insulin Delivery, Brunetti et al. Hrsgb. Raven Press, 1983).
Zur Reduzierung der Unbequemlichkeit von Insulininjektionen wurde große Aufmerksamkeit auf alternative Verabreichungswege gelenkt (für eine Übersicht siehe Brange und Langkjaer in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders und Hendren, Hrsgb.; Plenum Press 1997). Pulmonalfreisetzung scheint darunter am Vielversprechendsten zu sein (Service, Science 277, 1199, 1997). Insulin kann als Aerosol in Form eines Trockenpulvers oder als zerstäubte Tröpfchen einer Insulinlösung verabreicht werden. Die Effizienz kann durch trainiertes Atmen (Gouda, US-Patent 5,743,250) und Zugabe eines Absorptionsverbesserers (Baekstroem, US-Patent 5,747,445) oder Proteasehemmers (Okumura, Int. J. Pharm. 88, 63, 1992) verbessert werden.
Es zeigte sich, dass die Bioverfügbarkeit einer zerstäubten konzentrierten Insulinlösung (500 U/ml) verglichen mit einer subkutanen Injektion bei 20–25% liegt (Elliot, Austr. Paediatr. J. 23, 293, 1987). Unter Verwendung von 30–50 μl Insulinlösung pro Sprühstoß muss die Insulinlösung 5–20 mal konzentrierter als die übliche Konzentration von 0,6 mM sein. Unter Verwendung eines Einzeldosisbehälters, z. B. einer Blisterpackung (Gonda, US-Patent 5,743,250) erübrigt sich die Notwendigkeit eines Konservierungsmittels. Die meisten Insulinformulierungen sind mit toxischem, Schleimhaut reizendem und unangenehm riechendem Phenol und m-Cresol konserviert (US-Patent 5,474,978). Jedoch verursacht das Weglassen von Phenolen Stabilitätsprobleme. Zusätzlich zu der bakteriostatischen Wirksamkeit wirken die Phenole in Verbindung mit Zinkionen als physikalisch-chemische Stabilisatoren von Insulin. Somit wird es bevorzugt, Insulin- Formulierungen zur Inhalation mit minimaler Phenolkonzentration herzustellen werden oder Phenol durch verträglichere Stellvertreter zu ersetzen.
Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Der wie hier verwendete Begriff „Analogon von menschlichem Insulin" (und ähnliche Ausdrücke) bedeutet menschliches Insulin, in welchem eine oder mehrere Aminosäuren weggelassen und/oder durch andere Aminosäuren, einschließlich nicht kodierbare Aminosäuren ersetzt wurden, oder menschliches Insulin, das zusätzliche Aminosäuren, d. h. mehr als 51 Aminosäuren umfasst.
Der wie hier verwendete Begriff „Derivat von menschlichem Insulin" (und andere ähnliche Ausdrücke) bedeutet menschliches Insulin oder ein Analogon davon, in welchem mindestens ein organischer Substituent an eine oder mehrere Aminosäuren gebunden ist.
Der Begriff „nicht-phenolische Substanz" bedeutet eine organische Verbindung, die kein Strukturfragment enthält, das aus einem Benzolring besteht, an welchem eine Hydroxygruppe gebunden ist.
Der Begriff „Stabilisator" bedeutet eine Substanz, die wie Phenol und m-Cresol wirkt, indem sie die R₆-Konformation der zwei Zink-Insulin-Hexameren induziert.
Der Begriff „Phenol-Imitator" bedeutet eine nicht-phenolische Substanz, die die R₆-Konformation der zwei Zink-Insulin-Hexameren induzieren kann.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine stabile Insulin-Formulierung bereitzustellen, die zur pulmonalen Verabreichung verwendbar ist und einen größeren Komfort für den Patienten ohne Verschlechterung der physikalischen und chemischen Stabilität aufweist.
Weiterhin ist es eine Aufgabe der Erfindung, eine stabile Insulin-Formulierung zur Verabreichung mit unerwünschter Gegenwart von Phenol und m-Cresol in Einzeldosisbehältern ohne ein Konservierungsmittel oder in Mehrfachdosisbehältern mit anderen Konservierungsmitteln bereitzustellen.
Diese Aufgaben wurden unerwartet durch Bereitstellen einer Insulin-Formulierung erzielt, in welcher herkömmlich in Insulin-Formulierungen verwendetes Phenol und m-Cresol durch eine nicht-phenolische Substanz ersetzt wurde, die wie Phenol und m-Cresol wirkt, indem sie die R₆-Konformation von zwei Zink-Insulin-Hexameren induziert. Diese Verbindungen werden nachfolgend als Stabilisatoren bezeichnet.
Unerwarteterweise wurden solche Stabilisatoren unter den nicht-toxischen und angenehm riechenden oder geruchslosen Substanzen gefunden, die aus der Gruppe von Monoterpenen, insbesondere bicylcischen Monoterpenolen wie Borneol und Isopinocampheol, tricyclischen aliphatischen Alkoholen wie 1-Adamantanol und Purinen wie Purin und Adenin ausgewählt sind.
Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung eine wässrige Insulin-Formulierung, umfassend menschliches Insulin oder ein Analogon oder ein Derivat davon, Zinkionen und einen nicht-phenolischen Stabilisator, der die R₆-Konformation der zwei Zink-Insulin-Hexameren induzieren kann.
Weiterhin können die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Stabilisatoren in Insulinlösungen zur Pumpenbehandlung oder zur Injektion ohne Zugabe eines Konservierungsmittels oder in Kombination mit anderen Konservierungsmitteln als Phenol und m-Cresol verwendet werden.
Bevorzugte Ausführungsformen
Der nicht-phenolische Stabilisator ist vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus bi- oder tricyclischen aliphatischen Alkoholen und Purinen ausgewählt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der nicht-phenolische Stabilisator ein bicyclischer aliphatischer Alkohol, vorzugsweise ein Monoterpenol, stärker bevorzugt Isopinocamphenol, 2,3-Pinadiol, Myrtanol, Borneol, Norborneol oder Fenchol.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der nicht-phenolische Stabilisator ein tricyclischer aliphatischer Alkohol, vorzugsweise 1-Adamantanol.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der nicht-phenolische Stabilisator ein Purin, vorzugsweise Purin, Adenin, Guanin oder Hypoxanthin.
Alle der vorstehend erwähnten nicht-phenolischen Stabilisatoren wurden als nicht-toxisch und angenehm riechend oder geruchlos befunden.
Die Insulin-Formulierung umfasst vorzugsweise mindestens 3 Moleküle des nicht-phenolischen Stabilisators pro sechs Moleküle Insulin, vorzugsweise bis zu 50 mM der nicht-phenolischen Substanz.
Die Insulin-Formulierung enthält vorzugsweise 0,3 bis 20 mM, vorzugsweise 0,6 bis 15 mM, stärker bevorzugt 3 bis 15 mM menschliches Insulin oder eines Analogons oder eines Derivats davon.
Die Stabilität der Insulin-Formulierung wird weiter verbessert, wenn die Chloridkonzentration unter 50 mM, vorzugsweise unter 30 mM und stärker bevorzugt im Bereich von 5 bis 20 mM gehalten wird.
Eine bemerkenswerte Stabilität der Insulin-Formulierung wird erhalten, wenn sie mindestens 10 mM beliebiger anderer Anionen als Chlorid und Acetat umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Insulin eine geringe Menge an Phosphatpuffer, vorzugsweise bis zu 5 mM Phosphat umfassen.
Insulin-Formulierungen der Erfindung, die 2,0 bis 4,5 Zn²⁺-Ionen, vorzugsweise 2,5 bis 3,5 Zn²⁺-Ionen pro sechs Moleküle Insulin umfassen, sind sehr stabil.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst die Insulin-Formulierung der Erfindung 2,5 bis 4,5 Zn²⁺-Ionen, vorzugsweise 3 bis 4 Zn²⁺-Ionen pro sechs Moleküle Insulin.
Überraschenderweise ist es möglich, ohne Verminderung der Löslichkeit von Insulin relativ hohe Konzentrationen an Zwitterionen wie Glycylglycin und Glycin der Insulin-Formulierung der Erfindung zuzusetzen. Glycylglycin wirkt bei neutralem pH-Wert als Puffer und erhöht weiterhin bei neutralem bis basischem pH-Wert die Auflösungsgeschwindigkeit von Zink-Insulin aufgrund eines mäßigen Zink-Chelat-bildenden Effekts. Ebenso kann Glycylglycin während der Lagerungszeit als Radikalfänger für Aminreaktionen wirken. Folglich umfasst die Insulin-Formulierung der Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ferner 5 bis 150 mM eines zwitterionischen Amins, vorzugsweise Glycylglycin oder Glycin.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Insulin-Formulierung ein zwitterionisches Amin, das aus der Gruppe, bestehend aus BICINE, TRICINE und BIS-TRIS ausgewählt ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Insulin-Formulierung ein zwitterionisches Amin, das aus Good'schem Puffer ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Insulin-Formulierung der Erfindung ferner 5 bis 50 mM Trishydroxymethylaminomethan, das bei neutralem pH-Wert als Puffer und als Radikalfänger für Amin-reaktive Verbindungen wirkt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Insulin-Formulierung der Erfindung zwischen 0,001 Gew.-% und 1 Gew.-% eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise Tween 20 Proloxamer 188. Ein nichtionisches Detergens kann zum Stabilisieren von Insulin gegen Fibrillenbildung während Lagerung und Zerstäubung zugesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das verwendet Insulin menschliches Insulin.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das verwendete Insulin ein Analogon von menschlichem Insulin, in welchem Position B28 Asp, Lys, Leu, Val oder Ala und Position B29 Lys oder Pro oder menschliches Des(B28-B30)-, Des(B27)- oder Des(B30)- Insulin ist.
Die bevorzugten Analoga von menschlichem Insulin sind diejenigen, in welchen B28 Asp, Lys, Leu, Val oder Ala und Position B29 Lys oder Pro ist, oder menschliches Des(B28-B30)-, Des(B27)- oder Des(B30)-Insulin.
Die bevorzugten Analoga von menschlichem Insulin sind diejenigen, in welchen B28 Asp oder Lys und Position B29 Lys oder Pro ist, vorzugsweise menschliches Insulin Asp^B28 oder menschliches Insulin Lys^B28Pro^B29.
Das Insulinanalogon kann auch aus denjenigen ausgewählt werden, die allgemein sowie spezifisch in EP 885 961 offenbart sind (wie menschliches Insulin (B3)Lys, (B28)Ile, (A21)Gly).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Insulin aus der Gruppe von löslichen, lang wirkenden Insulinderivaten wie Derivaten von menschlichem Insulin mit einem oder mehreren lipophilen Substituenten, vorzugsweise acylierten Insulinen ausgewählt.
Das Insulinderivat gemäß dieser Ausführungsform ist vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem Insulin B29-N^∊-myristoyl-des(B30), menschlichem Insulin B29-N^∊-palmitoyl-des(B30), menschlichem Insulin B29-N^∊-myristoyl, menschlichem Insulin B29-N^∊-palmitoyl, menschlichem Insulin B28-N^∊-myristoyl-Lys^B28Pro^B29, menschlichem Insulin B28-N^∊-palmitoyl-Lys^B28Pro^B29, menschlichem Insulin B30-N^∊-myristoyl-Thr^B29Lys^B30, menschlichem Insulin B30-N^E-palmitoyl-Thr^B29Lys^B30, menschlichem Insulin B29-N^∊-(N-palmitoyl-γ-glutamyl)-des(B30), menschlichem Insulin B29-N^∊-(N-lithocholyl-γ-glutamyl)-des(B30), menschlichem Insulin B29-N^∊-(ω-carboxyheptadecanoyl)-des(B30) und menschlichem Insulin B29-N^∊-(ω-carboxyheptadecanoyl) ausgewählt.
Das besonders bevorzugte Insulinderivat ist menschliches Insulin B29-N^∊-myristoyl-des(B30) oder menschliches Insulin B29-N^∊-(N-lithocholyl-γ-glutamyl)-des(B30).
Die vorstehend erwähnten löslichen, lang wirkenden Insulinderivate binden Albumin und waren dazu bestimmt, eine konstante Grundzufuhr an Insulin bereitzu stellen (Markussen, Diabetologia 39, 281, 1996). Eine subkutane Verabreichung ein- oder zweimal täglich stellt die erforderliche Grundfreisetzung an Insulin sicher, wohingegen verschiedene tägliche Inhalationen unter Verwendung von pulmonalen Verabreichung, vorzugsweise in Verbindung mit Mahlzeiten befürwortet werden.
Die Insulinderivate weisen einen verzögerten Wirkungsbeginn auf und können folglich die sehr schnelle Erhöhung des normalerweise mit pulmonalen Verabreichung verbundenen Plasmainsulins kompensieren. Durch umsichtige Auswahl des Insulintyps ermöglicht die vorliegende Erfindung die Einstellung des Timings, um das gewünschte Insulinprofil zu erhalten.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Insulin-Formulierung ein Insulinanalogon oder menschliches Insulin, sowie ein Insulinderivat.
Das Insulin-Präparat der vorliegenden Erfindung weist vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 8,5, stärker bevorzugt 7,4 bis 7,9 auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Insulin-Formulierung für Diabetes des Typs I oder II, umfassend die Verabreichung (vorzugsweise durch pulmonale Verabreichung) an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, einer Insulin-Formulierung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Insulin-Formulierung in Verbindung mit Mahlzeiten verabreicht.
Diese Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht als Beschränkung angesehen werden sollen.
BEISPIEL 1
27,5 ml einer 21 mM Insulin-Stammlösung wurde durch Lösen von 3,707 g zinkfreiem menschlichem Insulin in 14 ml Wasser und Zugabe von 2888 μl 0,1 M ZnCl₂ und 7 ml Wasser vor Einstellen des pH-Werts auf 7,7 durch 0,2 M NaOH und schließlich Zugabe von Wasser auf 27,5 ml unter Berechnen des spezifischen Volumens von Insulin als 0,7 μl/mg hergestellt. Die Stammlösung wurde filtriert. Ein Präparat aus 3,5 ml 15 mM Insulin wurde dann durch Zugabe von 23 μl 2,3 M Stabilisator in Ethanol, 49 μl 0,5 M Glycylglycin und 35 μl 1%igem Tween 20 und Wasser auf 3,5 ml hergestellt. Die Lösung wurde anschließend mit Medium, enthaltend 15 mM Natriumchlorid, 7 mM Glycylglycin, 0,01%iges Tween 20, pH 7,5, auf 12,9, 6,3 und 0,6 mM Insulin verdünnt und bei 5°C zur visuellen Begutachtung gelagert. Die Bezugslösung wurde in derselben Weise, jedoch ohne Zugabe eines Stabilisators hergestellt. Die chemische Stabilität der Insulinlösung wurde bei 37°C für zwei Konzentrationen, 3 und 15 mM, durch Bestimmung von kovalentem Insulinpolymer durch Größenausschlusschromatografie verfolgt. Die Analyse von Insulinpolymer wurde auf Waters PROTEIN PAK 125 (250 × 8 mm) mit einem Eluenten, enthaltend 2,5 M Essigsäure, 4 mM L-Arginin und 20% (V/V) Acetonitril, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. und bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die Bestimmung wurde mit einem abstimmbaren Absorptionsdetektor (Waters 486) bei 276 nm durchgeführt. Die Insulinvolumina betrugen 8 und 3 ml für 3 bzw. 15 mM Insulinlösungen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
BEISPIEL 2
3,26 g menschliches Insulin (0,4 Äquivalente Zn²⁺ pro Insulin) wurden in 18 ml Wasser auf einem Eisbad dispergiert, 490 μl 0,5 M Glycylglycin und 1628 μl Natzriumhydroxid (3,1 Äquivalente) wurden zugesetzt, und dies wurde über Nacht bei 5°C gerührt. 613 μl 0,1 M Zinkchlorid (0,1 Äquivalente Zn) wurden dann der Lösung zugesetzt, der pH-Wert wurde durch 410 μl 1 M Salzsäure (0,8 Äquivalente Chlorid) auf 7,5 und das Volumen durch Wasser auf 25 ml eingestellt. Schließlich wurde die Stammlösung von 21 mM Insulin filtriert. Zu 3,75 ml der Stammlösung wurden 50 μl 1%iges Tween 20, 650 μl Stabilisator und 630 μl Wasser gegeben, um 5 ml 15 mM Insulin-Formulierung zu erhalten. Schließlich wurde das Präparat mit Medium, enthaltend Natriumchlorid, Glycylglycin und Detergens, unter Erhalt von 12,9, 6 und 3 mM menschliches Insulin verdünnt und bei 5°C für visuelle Begutachtung gelagert. Die chemische Stabilität von 3 und 15 mM Insulinlösungen wurden bei 37°C durch Bestimmung von kovalentem Insulinpolymer durch Größenausschlusschromatografie verfolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargelegt.
BESTIMMUNG VON R₆-KONFORMATION
Die Induktion von R₆-Zustand durch einen vorgegebenen Liganden wird durch die Konzentrationsabhängigkeit des Auftretens von 1H-NMR-Resonanzen im Bereich von 5,0–6,5 ppm bei einer Ligandtitration von Zink-Insulin-Hexameren wie von Brzovic, P. S., Choi, W. E., Borchardt, D., Kaarsholm, N. C. & Dunn, M. F. (1994) Biochemistry 33, 13057–13069 beschrieben gemessen.
In einer anderen Ausführungsform kann die relative Effizienz, durch welche ein vorgegebener Ligand den R₆-Zustand induziert, durch spektrofotometrische Titration unter Verwendung des Indikators 4-Hydroxy-3-nitrobenzoesäure wie von Huang, S. T., Choi, W. E., Bloom, C., Leuenberger, M % Dunn, M. F. (1997) Biochemistry 36, 9878–9888 beschrieben geschätzt werden. Der Endpunkt der spektrofotometrischen Titration soll mindestens 50% der Absorption zeigen, die durch Titration mit Phenol z. B. bei Bedingungen von 3 mM Insulin, 1 mM Zinkacetat, 10 mM Natriumchlorid, 0,2 mM 4-Hydroxy-3-nitrobenzoesäure, 50 mM Trisperchlorat, pH 8,0 bei 23°C oder z. B. vergleichbar bei Bedingungen von 9 mM Insulin, 4,5 mM Zink als Chlorid, 15 mM Gesamtchlorid, 0,15 mM 4-Hydroxy-3-nitrobenzoesäure, 7 mM Diglycin, pH 7,5 bei 23°C, gemessen bei 443 nm, als Endpunkt erhalten wurde.
Tabelle 1. Stabilität von menschlichem Insulin bei äquimolaren Konzentrationen von nicht-phenolischen Stabilisatoren gemäß Beispiel 1 (0,5 Zn²⁺/Insulin, 15 mM NaCl, 7 mM Glycylglycin, 0,01%iges Tween 20 und pH 7,5)
Tabelle 2. Stabilität von menschlichem Insulin bei äquimolaren Konzentrationen von nicht-phenolischen Stabilisatoren gemäß Beispiel 2 (0,5 Zn²⁺/Insulin, 15 mM NaCl, 7 mM Glycylglycin, 0,01%iges Tween 20 und pH 7,5)

Claims

Wässrige Insulin-Formulierung, umfassend menschliches Insulin oder ein Analogon oder ein Derivat davon, Zinkionen und einen nicht-phenolischen Stabilisator, der die R₆-Konformation der beiden Zink-Insulin-Hexameren induzieren kann.
Wässrige Insulin-Formulierung nach Anspruch 1, wobei die nicht-phenolische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus bi- oder tricyclischen aliphatischen Alkoholen und Purinen.
Wässrige Insulin-Formulierung nach Anspruch 2, umfassend einen bicyclischen aliphatischen Alkohol, vorzugsweise einen Monoterpenol, stärker bevorzugt Isopinocampheol, 2,3-Pinandiol, Mynanol, Borneol, Norborneol oder Fenchol.
Wässrige Insulin-Formulierung nach Anspruch 2, umfassend einen tricyclischen aliphatischen Alkohol, vorzugsweise 1-Adamantanol.
Wässrige Insulin-Formulierung nach Anspruch 2, umfassend ein Purin, vorzugsweise Purin, Adenin, Guanin oder Hypoxanthin.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend mindestens drei Moleküle der nicht-phenolischen Substanz pro sechs Moleküle Insulin, vorzugsweise bis zu 50 mM nicht-phenolische Substanz.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend 0,3 bis 20 mM, vorzugsweise 0,6 bis 15 mM, stärker bevorzugt 3 bis 15 mM menschliches Insulin oder eines Analogons oder eines Derivats davon.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend weniger als 50 mM, vorzugsweise weniger als 30 mM Chlorid.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend weniger als 10 mM eines anderen Anions, das von Chlorid und Acetat verschieden ist.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend bis zu 5 mM Phosphat.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend 2,0 bis 4,5 Zn²⁺-Ionen, vorzugsweise 2,5 bis 3,5 Zn²⁺-Ionen pro sechs Moleküle Insulin.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiter umfassend 3 bis 150 mM eines zwitterionischen Amins.
Insulin-Formulierung nach Anspruch 12, wobei das zwitterionische Amin Glycylglycin oder Glycin ist.
Insulin-Formulierung nach Anspruch 12, wobei das zwitterionische Amin BICINE, TRICINE oder BIS-TRIS ist.
Insulin-Formulierung nach Anspruch 12, wobei das zwitterionische Amin ein Puffer, ausgewählt aus Good's Puffern ist.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiter umfassend 5 bis 50 mM Trishydroxymethylaminomethan.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiter umfassend zwischen 0,001 Gew.-% und 1 Gew.-% eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise Tween 20 oder Poloxamer 188.
Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend menschliches Insulin.
Insulin-Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend ein Analogon von menschlichem Insulin, wobei Position B28 Asp, Lys, Leu, Val oder Ala und Position B29 Lys oder Pro ist, oder menschliches Des(B28-B30)-, Des(B27)- oder Des(B30)-Insulin.
Insulin-Präparat nach Anspruch 19, umfassend ein Analogon von menschlichem Insulin, wobei Position B28 Asp oder Lys und Position B29 Lys oder Pro ist, vorzugsweise menschliches Insulin Asp^B28 oder menschliches Insulin Lys^B28Pro^B29.
Insulin-Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend ein Derivat von menschlichem Insulin mit einem oder mehreren lipophilen Substituenten, vorzugsweise ein acyliertes Insulin.
Insulin-Präparat nach Anspruch 21, wobei das Insulin-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem Insulin B29-N^∊-myristoyl-des(B30), menschlichem Insulin B29-N^∊-palmitoyl-des(B30), menschlichem Insulin B29-N^∊-myristoyl, menschlichem Insulin B29-N^∊-palmitoyl, menschlichem Insulin B28-N^∊-myristoyl-Lys^B28Pro^B29, menschlichem Insulin B28-N^∊-palmitoyl-Lys^B28Pro^B29, menschlichem Insulin B30-N^∊-myristoyl-Thr^B29Lys^B30, menschlichem Insulin B30-N^∊-palmitoyl- Thr^B29Lys^B30, menschlichem Insulin B29-N^∊-(N-palmitoyl-γ-glutamyl)-des(B30), menschlichem Insulin B29-N^∊-(N-lithocholyl-γ-glutamyl)-des(B30), menschlichem Insulin B29-N^∊-(ω-carboxyheptadecanoyl)-des(B30) und menschlichem Insulin B29-N^∊-(ω-carboxyheptadecanoyl).
Insulin-Präparat nach Anspruch 22, wobei das Insulin-Derivat menschliches Insulin B29-N^∊-myristoyl-des(B30) oder menschliches Insulin B29-N^∊-(N-lithocholyl-γ-glutamyl)-des(B30) ist.
Insulin-Präparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend ein Insulin-Analogon oder menschliches Insulin sowie ein Insulin-Derivat.
Verwendung einer Insulin-Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes des Typs I oder des Typs II.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Insulin-Formulierung in Verbindung mit Metallen verabreicht werden muss.
Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Insulin-Formulierung durch Pulmonalfreisetzung verabreicht werden muss.