JPWO2004033475A1

JPWO2004033475A1 - チロシナーゼ活性調整剤、その製法、及びそれを含有する外用剤

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Publication number: JPWO2004033475A1
Application number: JP2005501026A
Authority: JP
Inventors: 常盤　豊; 豊常盤; 北川　優; 優北川; 賢二吉野; 柳谷　周作; 周作柳谷; 楽　隆生; 隆生楽; 哲造戸谷; 博巳嶋川
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: US7754864B2; EP1550667A1; AU2003272968A8; WO2004033475A1; EP1550667A4; US20060052318A1; JP2008214361A; JP4803557B2; AU2003272968A1; JP4168170B2; JP2008200054A; JP4892660B2

Abstract

本発明は、チロシナーゼ阻害活性又は促進活性を有する化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性調整剤及び該活性調整剤を含む外用剤、また該化合物の製造方法を開示するものである。

Description

本発明は、チロシナーゼ阻害活性又は促進活性を有する化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性調整剤及び該活性調整剤を含む外用剤に関する。また、該化合物の製造方法に関する。
詳しくは、本発明は、チロシナーゼ阻害活性を有する新規アルブチンエステル化合物、該化合物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤及び該阻害剤を含む外用剤に関する。また、本発明は、ウンデシレン酸又はその塩或いはそのエステル誘導体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤および該阻害剤を含む外用剤に関する。また、本発明は、アスコルビン酸又はその誘導体を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤並びに該チロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤に関する。また、本発明は、該チロシナーゼ阻害剤又は促進剤の有効成分となり得る化合物の製造に適した酵素によるエステル化物の製造方法に関する。

チロシナーゼの阻害活性を有する化合物として、アルブチンやコウジ酸などの天然物が化粧品などの分野において美白剤としてよく用いられている（例えば、薬学雑誌、１１２（４）、ｐｐ．２７６−２８２、１９９２、薬学雑誌、１１５（８）、ｐｐ．６２６−６３２、１９９５、バイオインダストリー、１１（４）、２０６、１９９４、及びＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１、１１、ｐｐ．１９２６−１９２８、１９９７参照）。しかしながら、化粧品などの皮膚外用剤として用いる場合には、親水性が高く、皮膚吸収性が悪いなどの欠点があり、疎水性を高めたアルブチン誘導体や他の化合物の開発が望まれていた。アルブチン誘導体としては、脱色剤としてアルブチンのフェノール部分をエステル化した化合物が知られている（特開平１１−７１２２５号公報）。また、脱色化粧料として、アルブチンの６位をヒドロキシエステル化した化合物が知られている（特開平５−１９４１８１号公報）。さらに、リパーゼによるアルブチンとケイ皮酸ビニルのエステル交換反応によって、アルブチンの６位が位置選択的にエステル化された化合物も報告されている（バイオサイエンスバイオテクノロジーアンドバイオケミストリー（ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、６１、１１、ｐｐ．１９２６−１９２８、１９９７）。しかしながら、アルブチン誘導体のチロシナーゼ阻害作用又はそれに起因する美白効果については明確になっておらず、未だ満足のいく誘導体は得られていなかった。
ウンデシレン酸は炭素数１１の不飽和脂肪酸であり、人の皮膚に含まれる成分であって、皮膚の清浄作用の主役を努めている。工業的にはひまし油の熱分解で得られる。ウンデシレン酸、その塩又はその誘導体は、抗真菌作用が知られており、皮膚洗浄料として使用し得ることが報告されている（特開２００２−１１４６６９号公報）。また最近では、トレハロースエステルが化粧品素材として開発されている（特開２００１−２７８７５２号公報及び特開平５−１３７９９４号公報）。しかしながら、ウンデシレン酸またはその塩、或いはそのエステル誘導体のチロシナーゼ阻害作用についてはこれまでにまったく知られていなかった。
一方、老化現象の一つである白髪の発生メカニズムについては、メラニン色素が角化細胞に転送されなくなることにより生じることが知られている。このため、白髪防止剤の開発を目的として、チロシナーゼの活性促進成分やメラニン産生促進成分の検索が主になされてきた。具体的には、天然物等の抽出液や各種物質の白髪防止作用を探索することあるいは種々の化合物を有効成分として用いることなどが試みられてきた。例えば、メラニン生成促進剤として、ω−アルコキシカルボニルアルキルアンモニウム及び／又はその塩、ω−アルコキシカルボニルアルキルトリアルキルアンモニウム及び／又はその塩が有効であることが提案されている（特開平７−３１６０４８号公報）。また、アデノシン誘導体（特開平６−３０５９４０号公報）やジヒドロペオール誘導体（特開２００２−３３８１号公報）が提案されている。しかしながら、これらの化学物質は、安全性の点で不安がある。また、オウレンの水又はエタノール抽出物を有効成分とする白髪防止剤が提案されている（特開平５−７８２２２号公報）。また、コックル、ミドリガイ、カキ等の貝類のエッセンスからなるメラニン生成促進剤が提案されている（特開平７−２８５８７４号公報）。また、スギナ、スイカズラ、ヒキオコシ、ブドウ、ヘチマ、セイヨウニワトコ、ブッチャーブルーム及びタイソウから選ばれる１種若しくは２種以上、又はその抽出物を有効成分とする白髪防止剤が提案されている（特開平１１−１２４３１８号公報）。また、シメジ科、ハリタケ科、サルノコシカケ科、カンゾウタケ科、キコブタケ科、ノボリリュウ科、モエギタケ科及びハラタケ科からなる群より選択される担子類の培養液又は菌体の抽出液群のメラニン生成亢進成分の１種又は２種以上を配合した頭髪料が提案されている（特開平７−３１６０２６号公報）。また、ピパーメチシクム及び／又は抽出物がメラニン産生促進効果を発揮することが提案されている（特開平１１−１８９５４１号公報）。更に、ウブゲグサ属、アミジグサから選択される１種又は２種以上の海藻の抽出物（特開平１０−３３０２１８号公報）、オタネニンジン、田七人参、タンジン、ユッカ、ビワ、キンギンカ、サルサから選ばれる１種又は２種以上の抽出物（特開２００１−２８８０９８号公報）、イチジク若しくはクワ又はそれらの抽出物（特開２００２−４７１３０号公報）がメラニン産生促進効果を有することが確認されている。しかし、植物や動物成分の抽出物は、原料入手が困難であるため、その製造に制約があり、また原料の含有量も一定でなく、性能も不安定であった。そのため、十分なチロシナーゼ活性促進効果やメラニン産生促進効果を有する化合物の開発が望まれていた。
一方、上記に挙げられるようなエステル化合物の製造に適用し得る酵素的エステル化反応は、原料が疎水性のアルコールと脂肪酸の場合には、食品工業で既に実用化されている技術である（バイオインダストリー、１９、ｐ．６２−７１（２００２））。しかし、親水性で、疎水性の有機溶媒には溶けにくい化合物を原料に用いる場合、収量が低く、実際の製造には使用しにくい反応であった。例えば、有機溶媒に対して可溶性の酵素を用いて、オクタンやヘキサン等の有機溶媒中で、ショ糖エステルを製造する方法が報告されている（特開平８−２４５６８０号公報）。しかし、それらの溶媒にはショ糖が溶けにくいため、収率は高くない。一方、糖質やプリンヌクレオシドなどが高い溶解性を示す溶媒としては、ＤＭＳＯやＤＭＦがある。例えばショ糖は、ＤＭＳＯに対しては約４０％の濃度で溶解する（アドバンスオブカーボハイドレートケミストリーアンドバイオケミストリー、２７、ｐ．８５−１２５（１９７２））。また、プリンヌクレオシド、例えばグアノシンは、ＤＭＳＯを５０％以上含むＤＭＦ中で溶ける。しかし、ＤＭＦやＤＭＳＯのような非プロトン性有機溶媒を用いると、一般的に加水分解酵素は失活しやすくなり、反応が困難になると考えられていた（特開平９−２７１３８７号公報及び特開平８−９９８７号公報参照）。従って、親水性の化合物が高い溶解性を有する溶媒中でも高い活性を有する酵素が求められていた。これまでにＤＭＦなどの溶媒で活性を有するものとして、バチルス属由来やストレプトマイセス属由来のプロテアーゼは見出されている（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティ、１１０、ｐ．５８４−５８９（１９８８））。しかし、糖類やヌクレオシドが可溶な溶媒中で高い活性を保持する他の酵素は、これまでに知られていなかった。

本発明は、チロシナーゼ阻害活性又は促進活性を有する化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性調整剤及び該活性調整剤を含む外用剤、並びに該化合物の製造に適用し得るエステル化物の製造方法に関する。
以下、本発明の内容について、詳細に説明する。
Ｉ．本発明の第１の好ましい実施形態としては、チロシナーゼ阻害活性がアルブチンに比べて有意に高く、かつ、皮膚吸収性の向上したアルブチンエステル化合物及びその製造方法が提供される。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、アルブチンの６位に疎水性置換基を導入することにより、阻害活性がアルブチンに比べて高まることを見出し、更に検討を重ねて本発明を開発するに至った。
即ち、本発明には、以下のアルブチンエステル化合物、チロシナーゼ活性阻害剤、外用剤及びアルブチンエステル化合物の製造方法が含まれる。
１−１．一般式（１）で表されるアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒａは疎水性基を示す。］
１−２．一般式（２）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
１−３．一般式（３）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
１−４．一般式（４）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
１−５．一般式（５）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
１−６．一般式（６）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｒ_２はアルキル基、又はアリール基を示す。］
１−７．一般式（７）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５はそれぞれ単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｘは１〜６の繰り返し単位を示す。］
１−８．一般式（８）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
１−９．一般式（９）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
１−１０．一般式（１０）で表される１−１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
１−１１．１−１〜１−１０のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の１種又は２種以上を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
１−１２．１−１１に記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤。
１−１３．下記一般式（１１）〜（１９）のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステル化反応させる工程を有するアルブチンエステル化合物の製造方法。好ましくは、下記一般式（１１）〜（１９）のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステル化反応させる工程を有する、一般式（１）〜（１０）で表されるアルブチンエステル化合物の製造方法。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換アルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は、単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｒ_２はアルキル基、又はアリール基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５はそれぞれ単結合、アルキレン基又はアリーレン基を示す。Ｘは１〜６の繰り返し単位を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
１−１４．酵素触媒存在下でエステル化反応させる１−１３に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
１−１５．化学触媒存在下でエステル化反応させる１−１３に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
１−１６．エステル化反応させる工程が、脱水処理を行いながらエステル化反応させる工程である１−１３〜１−１５のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
１−１７．エステル化反応工程後、エステル化反応液中の未反応カルボン酸誘導体を、非極性有機溶媒を用いて抽出して分離する工程、次いで、過剰の水を加えて未反応アルブチンを抽出して分離するともにアルブチンエステル化合物を沈殿させる工程を有する１−１３〜１−１６のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
以下、本発明の第１の実施形態について更に詳しく説明する。
本発明におけるアルブチンエステル化合物は、アルブチンの６位に疎水性基を導入した化合物である。具体的には、一般式（１）〜（１０）で表される化合物である。
本発明のアルブチンエステル化合物は、アルブチンとカルボン酸類をエステル化反応させることによって製造することができる。ここでカルボン酸類とは、カルボン酸、ジカルボン酸又はそれらの誘導体をいう。
以下、アルブチンエステル化合物の製造について具本的に示す。
一般式（２）の化合物
一般式（２）の化合物は、アルブチンに、下記一般式（１１）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１１）で表されるカルボン酸誘導体としては、例えば、アクリル酸誘導体、１０−ウンデシレン酸誘導体を挙げることができる。
一般式（３）の化合物
一般式（３）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１２）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１２）で表されるカルボン酸誘導体としては、例えば、メタアクリル酸誘導体を挙げることができる。
一般式（４）の化合物
一般式（４）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１３）のカルボン酸又はジカルボン酸誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１３）で表されるジカルボン酸誘導体としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スペリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フタル酸等のジカルボン酸から誘導される化合物、例えばアジピン酸ジビニルを挙げるこどができる。
一般式（５）の化合物
一般式（５）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１４）のジカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は６〜２１、好ましくは８〜１２であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１４）で表されるジカルボン酸誘導体としては、具体的には、スペリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フタル酸等のジカルボン酸又はそれらジカルボン酸から誘導される化合物を挙げることができる。
一般式（６）の化合物
一般式（６）の化合物は、アルブチンに、下記一般式（１５）のカルボン酸又はジカルボン酸誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｒ_２はアルキル基、又はアリール基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
Ｒ_２はアルキル基、アリール基を示す。アルキル基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８である。具体的には、メチル、エチル等の直鎖のアルキル基、イソプロピル基等の分岐鎖を有するアルキル基が挙げられる。アリール基としては、フェニル基等を挙げることができる。
一般式（１５）で表されるジカルボン酸誘導体としては、具体的には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スペリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フタル酸等のジカルボン酸から誘導される化合物を挙げることができる。
一般式（７）の化合物
一般式（７）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１６）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５はそれぞれ単結合、アルキレン基又はアリーレン基を示す。Ｘは１〜６の繰り返し単位を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜２１、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１６）で表されるカルボン酸又はその誘導体としては、具体的には、デセン酸、ミリストレイン酸、ペンタデセン酸、パルミトレイン酸、ヘキサデカトリエン酸、ヘプタデセン酸、ヘプタデカジエン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、γ？リノレン酸、オクタデカテトラエン酸、イコセン酸、イコサジエン酸、イコサトリエン酸、イコサテトラエン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコセン酸、ドコサジエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコセン酸又は該カルボン酸から誘導される化合物を挙げることができる。
一般式（８）の化合物
一般式（８）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１７）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１７）で表されるカルボン酸誘導体としては、具体的には、ピバリン酸から誘導される化合物等を挙げることができる。
一般式（９）の化合物
一般式（９）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１８）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１８）で表されるカルボン酸誘導体としては、具体的には、ベンゾイル酸から誘導される化合物を挙げることができる。
一般式（１０）の化合物
一般式（１０）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１９）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１９）で表されるカルボン酸としては、具体的には、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸から誘導さる化合物を挙げることができる。
上記の方法において、アルブチンと、一般式（１１）〜（１９）で表される化合物とのエステル化反応は、酵素触媒存在下又は化学触媒存在下で行うことが好ましい。
酵素触媒としては、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ等、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、シュードモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ、カンジダアンタクティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔｅｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプロテアーゼやストレプトマイセスエスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）由来のプロテアーゼ等を挙げることができる。このうち特にカンジダアンタクティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔｅｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ、バチルスサブチリス（ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプロテアーゼを用いることが好ましい。
化学触媒としては、例えば、酸、アルカリ、ピリジン誘導体等の従来公知のものを使用することができる。より具体的には、ｐ−トルエンスルホン酸、ナトリウムアルコキシド、チタニウムアルコキシド、ジメチルアミノピリジン、塩酸、硫酸、酢酸亜鉛、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ジシクロヘキシルカルバミン等を挙げることができる。
上記の方法においては、酵素触媒存在下にエステル化反応させる方法が、アルブチンの６位に対する選択性に優れる点から、好適である。特にカンジダアンタクティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔｅｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼやバチルスサブチリス（ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプロテアーゼを用いる反応が好ましい。
前記のような酵素触媒を用いてアルブチンエステルを製造する場合、反応温度は０〜１００℃、好ましくは３０〜５０℃である。反応時間は、１〜３４０時間、好ましくは２４〜１７０時間である。溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、アセトン、ジオキサン等を単独または２種類以上組み合わせて用いることができる。また、原料となるカルボン酸、ジカルボン酸又はそれらの誘導体自体を溶媒として使用することも可能である。反応溶媒中のアルブチンの濃度は１〜４０重量％、好ましくは１〜１０重量％である。また、酵素の使用割合は、反応溶媒に対して、０．１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。また、アルプチン１モルに対して、カルボン酸、ジカルボン酸又はそれらの誘導体を０．５〜１０モル、好ましくは、１〜５モル程度使用するのが好ましい。
一方、化学触媒を用いてアルブチンエステルを製造する場合、反応温度は０〜１００℃、好ましくは４０〜５０℃である。反応時間は、１〜４８時間、好ましくは１〜２４時間である。溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、アセトン、ジオキサンを単独または２種類以上組み合わせて用いることができる。反応溶媒中のアルブチンの濃度は１〜４０重量％、好ましくは１〜１０重量％である。また、化学触媒の使用割合は、反応溶媒に対して、０．１〜５重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。また、アルブチン１モルに対して、カルボン酸、ジカルボン酸又はそれらの誘導体を０．５〜１０モル、特に、１〜５モル程度使用するのが好ましい。
本発明においては、原料に用いるカルボン酸類として、末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物を用いることが好ましい。末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物は安価であり、また、エステル化反応において、副生してくる物質が水である、という利点がある。原料にエステル化合物等を用いる場合には、反応中に着色物質が生成しやすく、カラム処理などの精製処理が必要であるが、原料として末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物を用いる場合には、このような問題がない。
原料として末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物を用いて、アルブチンとエステル化反応させると、水が副生してくるが、エステル化反応は可逆的な反応であるので、効率的にエステル化反応を行うために、脱水処理を行いながら反応を行うことが好ましい。脱水処理の方法は特に限定されず、従来公知の方法等を適宜用いることができる。例えば、減圧により脱水処理を行う方法、乾燥した不活性ガスを通気させて脱水処理を行う方法、モレキュラーシーブスなどの無機化合物に水を選択的に吸着させて脱水処理を行う方法などを例示するこができる。反応スケールが小さい場合にはモレキュラーシーブスを用いて脱水処理を行う方法が簡単であり、好ましい。モレキュラーシーブスの形状は特に限定されるものではなく、例えば粉末、ペレット状のものなどを用いることができる。モレキュラーシーブスの使用量は反応液に対して０．１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％である。
これらの反応後、従来公知の適当な分離精製処理を施して、反応生成物から、アルブチンの６位に疎水性基が導入された化合物を分離することによって、本発明のアルブチンエステル化合物を取得することができる
分離精製手段としては、例えば、高速液体クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーのような公知のクロマトグラフィー手段を用いることができる。カラムの種類や移動相溶媒等の条件は適宜選択することができる。
また、溶液抽出や溶解性に基づく分別沈殿などの分離手段も用いることができる。例えば、非極性有機溶媒を用いてエステル化反応液中の未反応カルボン酸誘導体を抽出、分離した後、過剰の水を加えて未反応アルブチンを抽出、分離するともにアルブチンエステル化合物を沈殿させ、必要に応じ、これらの抽出、分離及び沈殿を行う工程を繰り返した後、沈殿したアルブチンエステル化合物を回収することによって本発明のアルブチンエステル化合物を取得することができる。
非極性溶媒としては、例えば、シクロヘキサン、エチルエーテル、石油エーテル等が挙げられる。中でも、シクロヘキサンが好ましい。
過剰の水とは、原料のアルブチン化合物に対して重量で２０倍程度である。
上記のようにして得られる一般式（１）〜（１０）で表されるアルブチンエステル化合物を有効成分として用いることによりチロシナーゼ阻害剤を得ることができる。
該チロシナーゼ阻害剤において、上記一般式（１）〜（１０）で表されるアルブチンエステル化合物は、１種単独で用いてもよく、また２種以上の混合物として用いてもよい。
チロシナーゼ阻害剤は、該一般式（１）〜（１０）で表されるアルブチンエステル化合物をそのまま用いて又は適当な担体と混合して、公知の方法に従って製剤化することにより得ることができる。
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、化粧料、皮膚外用剤、医薬、食品、魚介類養殖用飼料等に配合したり、食品の処理に使用したりすることができる。例えば化粧料に配合して美白作用を有する化粧品とすることができる。また、メラニンの生成による変色を起こしやすい食品の変色防止等のため、その食品に添加したり、表面処理に使用したりすることができる。
また、該チロシナーゼ阻害剤を含有させて外用剤とすることもできる。特に、皮膚外用剤、好ましくは美白用の皮膚外用剤として、好適に用いることができる。
本発明の皮膚外用剤においては、上述の一般式（１）〜（１０）で表されるアルブチンエステル化合物を１種単独で又は２種以上混合して配合することができる。
外用剤は、上記チロシナーゼ阻害剤を適当な担体と混合し、公知の方法に従って製造することにより得ることができる。
外用剤には、他に一般に用いられる各種成分、例えば、水性成分、粉末成分、保湿剤、界面活性剤、防腐剤、増粘剤、紫外線吸収剤及び香料等を配合することができる。
外用剤の剤型としては、例えば、軟膏剤、クリーム、乳液、リニメント剤及びローション剤等を挙げることができる。
上記外用剤において、アルブチンエステル化合物の含有割合は、チロシナーゼ阻害効果を奏する有効量程度である。その含有割合は、外用剤全体に対し、０．００１〜１０％重量％程度、好ましくは、０．００５〜５重量％程度である。
外用剤の適用方法は、例えば、顔、首、腕及び手等のシミ、ソバカス等のでき易い部位もしくは患部、日焼けし易い部位もしくは日焼けした部位等に、１日１回〜数回、適当量塗布すれば良い。
本発明に係るアルブチンエステル化合物は、疎水性基を導入することで皮膚吸収性が向上しており、アルブチンと比較してチロシナーゼ阻害活性が顕著に高められている。更に、本発明に係るアルブチンエステル化合物は、糖エステル構造に基づくと考えられる幅広い抗菌作用、フェノール性水酸基に基づくと考えられるラジカル消去能、並びにエステル部の疎水性とアルブチン部の親水性に基づくと考えられる界面活性作用も有する。
これらの性質により、本発明のアルブチンエステル化合物は、チロシナーゼ阻害剤、又は皮膚外用剤などの有効成分として、化粧品や医薬分野において有効に利用することができる。
ＩＩ．本発明の第２の好ましい実施形態としては、ウンデシレン酸またはその塩、或いはその誘導体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤、又該チロシナーゼ阻害剤を含有する外用剤、特に、チロシナーゼ阻害剤を含有する美白化粧料が提供される。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ウンデシレン酸またはその塩、あるいはウンデシレン酸の糖エステルがチロシナーゼ阻害活性を有することを見出し、更に検討を重ねた。
本発明には、以下のチロシナーゼ阻害剤及び外用剤が含まれる。
２−１．下記一般式（２０）

［式中、Ｒｂは水素または一個の水酸基を除いた糖残基を示す。］
で表されるウンデシレン酸またはその塩あるいはそのエステル誘導体からなるチロシナーゼ阻害剤。
２−２．Ｒｂが一個の水酸基を除いた糖残基である２−１に記載のチロシナーゼ阻害剤。
２−３．Ｒｂが水素であるウンデシレン酸またはその塩からなる２−１に記載のチロシナーゼ阻害剤。
２−４．２−１〜２−３のいずれかに記載のチロシナーゼ阻害剤を含む外用剤。
２−５．外用剤が美白化粧料である２−４に記載の外用剤。
以下、本発明の第２の実施形態について更に詳しく説明する。
ウンデシレン酸またはその塩、あるいはその誘導体
ウンデシレン酸またはその塩は公知物質である。
ウンデシレン酸の塩としては、ウンデシレン酸のナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、銅、ジエタノールアミン、アンモニウム、ジメチルアミン、トリメチルアミン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ステアリルジメチルアミンなどの塩が挙げられる。
これらの塩は、ウンデシレン酸とアルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、その他の金属酸化物ないし各種アミンを、水、アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなど）、ＴＨＦ、エーテル、アセトニトリルなどから選ばれる１種以上の溶媒中で混合することにより調製することができる。
Ｒｂは、水素、又は一個のの水酸基を除いた糖残基を示す。Ｒｂが糖残基である場合、Ｒｂ−ＯＨは、単糖、二糖、三糖または糖アルコールなどの糖化合物を示す。
Ｒｂ−ＯＨで表される糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、リボース、アラビノース、キシロース、ラムノース等の単糖類、マルトース、ラクトース、イソマルトース、セルビオース、ゲンチオビオソース、スクロース、トレハロース、イソコージビオース、ラミナリビオース、ニゲロース、サンブビオース、ネオヘスペリドース等の二糖類、マルトトリオース、イソマルトトリオース、セロトリオース、ラフィノース及びゲンチオトリオース等の三糖類、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールおよびイノシトールなどの糖アルコールが挙げられる。好ましい糖としては、スクロース、トレハロースが挙げられる。
本発明のウンデシレン酸エステルは、特開２０００−６５２９０号公報に記載の方法に従い、酵素触媒の存在下、ウンデシレン酸メチルエステル、ウンデシレン酸エチルエステルなどのエステルを糖残基と反応させて、エステル交換することにより、得ることができる。
触媒として用いられる酵素としては、バチルス属由来のアルカリ性プロテアーゼ、カンジダアンタクティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔｅｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼなどが挙げられる。
上述のウンデシレン酸またはその塩、或いはそのエステル誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物、またはそれらの２種以上の混合物を有効成分として用いることにより、チロシナーゼ阻害剤を得ることができる。
チロシナーゼ阻害剤は、ウンデシレン酸又はその塩あるいはそのエステル誘導体の１種または２種以上を、そのまま用いて又は適当な担体と混合して、公知の方法に従って製剤化することにより得ることができる。
また、チロシナーゼ阻害剤は、美白化粧料、医薬、食品、魚介類養殖用飼料等に配合したり、食品の処理に使用したりすることができる。すなわち、チロシナーゼ阻害によってメラニンの生成を抑制することから、化粧料に配合して美白作用を有する化粧品などにすることができる。また、メラニンの生成による変色を起こしやすい食品の変色防止等のため、その食品に添加したり表面処理に使用したりすることができる。ウンデシレン酸は皮膚に本来含まれる成分であり、その安全性は確立されており、ウンデシレン酸またはその塩を有する食品を摂取することにより、安心して皮膚の美白効果を期待することができる。
上述の一般式（２０）で表されるウンデシレン酸またはその塩あるいはウンデシレン酸糖エステル誘導体からなる群から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤を含有させて外用剤とすることもできる。
外用剤は、皮膚外用剤、特に美白化粧料として好適に用いることができる。外用剤は、公知の製剤技術を用いて製造することができる。
また、外用剤には、他に一般に用いられる各種成分、例えば、水性成分、粉末成分、保湿剤、界面活性剤、防腐剤、増粘剤、紫外線吸収剤及び香料等を配合することができる。
外用剤に配合されるウンデシレン酸またはその塩あるいはウンデシレン酸糖エステルの含有割合は、チロシナーゼ阻害効果を奏する有効量程度である。その含有割合は、外用剤全体に対し、通常０．００１〜１０重量％、好ましくは０．００５〜５重量％、より好ましくは０．０１〜３重量％、特に好ましくは０．１〜１重量％程度である。
外用剤の形態は特に限定されず、例えば、軟膏、クリーム、乳液、リニメント剤及びローション剤等の形態に調製され得る。
本発明の外用剤の適用方法は、適宜設定し得るが、例えば、顔、首、腕及び手等のシミ、ソバカス等のでき易い部位もしくは患部、日焼けのし易い部位もしくは日焼けした部位に、１日１回〜数回、適当量塗布すれば良い。
本発明は、ウンデシレン酸と二糖のエステル体が、チロシナーゼ阻害活性をアルブチンと異なる作用で顕著に高めることを見出し、該作用によるチロシナーゼ阻害剤を提供するものである。すなわち、本発明において、チロシナーゼ作用は、モノフェノールの１，２−ジフェノール（カテコール）への水酸化作用とカテコールのｏ−キノンへの酸化反応を触媒しているが、アルブチンは前者のモノフェノールの水酸化反応を効率的に阻害し、ウンデシレン酸糖エステルは後者のカテコールへの酸化反応を阻害することにより、アルブチンとは異なるメカニズムでチロシナーゼを阻害していることが見出された。具体的には、図６に示されるようにアルブチンはフェノール基質の方をよく阻害しているのに対し、図５に示されるようにウンデシレン酸糖エステルはカテコール基質、フェノール基質を共に阻害している。これらのメカニズムを図示すると図９のようになる。
このような作用により、本発明におけるウンデシレン酸又はその塩あるいはエステル誘導体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤は、外用剤、特に皮膚外用剤や美白化粧料として、化粧品や医薬分野において有効に利用することができる。
ＩＩＩ．本発明の第３の好ましい実施形態としては、アスコルビン酸又はその誘導体を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤、及び該チロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤、特に白髪改善及び白髪防止に顕著な効果を有する外用剤が提供される。
本発明者らは、アスコルビン酸及びアスコルビン酸誘導体が、低濃度において、優れたチロシナーゼ活性促進効果を発現することを見いだし、更に鋭意検討を重ねた。
本発明には、以下のチロシナーゼ活性促進剤及び該チロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤が含まれる。
３−１．アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤。
３−２．アスコルビン酸誘導体が、アスコルビン酸脂肪酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステル又はその脂肪酸エステル又はそれらの塩、アスコルビン酸グルコシド又はその脂肪酸エステル、及びアスコルビン酸硫酸エステル又はその脂肪酸エステル又はそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種である３−１に記載のチロシナーゼ活性促進剤。
３−３．３−１又は３−２に記載のチロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤。
３−４．３−１又は３−２に記載のチロシナーゼ活性促進剤を含有する頭髪用外用剤。好ましくは、白髪防止又は白髪改善のための頭髪用外用剤。
３−５．３−１又は３−２に記載のチロシナーゼ活性促進剤を含有する皮膚用外用剤。好ましくは、皮膚黒化又は皮膚の抗白斑治療のための皮膚用外用剤。
３−６．アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体の含有量が外用剤全体の０．００００１〜１０重量％である３−３〜３−５のいずれかに記載の外用剤。
３−７．チロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤であって、アスコルビン酸の含有量が外用剤全体の０．０００１〜１重量％である３−３〜３−５のいずれかに記載の外用剤。
３−８．チロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸リン酸エステル及びアスコルビン酸グルコシドからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤であって、該化合物の含有量が外用剤全体の０．００１〜１０重量％である３−３〜３−５のいずれかに記載の外用剤。
３−９．チロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸の脂肪酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステルの脂肪酸エステル及びアスコルビン酸グルコシドの脂肪酸エステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤であって、該化合物の含有量が外用剤全体の０．００００１〜０．１重量％である３−３〜３−５のいずれかに記載の外用剤。
以下、本発明の第３の実施形態について更に詳しく説明する。
本発明のチロシナーゼ活性促進剤は、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体を有効成分とする。該チロシナーゼ活性促進剤において、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体は、１種単独で用いてもよく、また２種以上を混合して用いてもよい。
アスコルビン酸は、水溶性の生体内抗酸化物質であり、ビタミンＣとも呼ばれ、生体内あるいは細胞内の様々な場所で様々な標的分子に対してその機能を発揮している。アスコルビン酸には、Ｌ−体、Ｄ−体があるが、本発明のアスコルビン酸としては、Ｌ体が用いられる。
また、アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸の２、３、５及び６位の少なくとも１つの水酸基に置換基を有するものであって、チロシナーゼ活性促進効果を有するものが用いられる。
具体的に、アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸脂肪酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステル又はその脂肪酸エステル又はそれらの塩、アスコルビン酸グルコシド又はその脂肪酸エステル、及びアスコルビン酸硫酸エステル又はその脂肪酸エステル又はそれらの塩等が挙げられる。特に生体内に吸収された後、アスコルビン酸を生成するものが好ましい。
アスコルビン酸誘導体における脂肪酸、具体的にはアスコルビン酸脂肪酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステルの脂肪酸エステル、アスコルビン酸グルコシドの脂肪酸エステル、及びアスコルビン酸硫酸エステルの脂肪酸エステルにおいて用いられる脂肪酸には、飽和又は不飽和の脂肪酸、また、直鎖状又は分枝状の脂肪酸が包含され、その種類は特に限定されない。脂肪酸の炭素数も特に限定されないが、通常炭素数１〜２４、好ましくは８〜２０、より好ましくは１０〜１８のものが用いられる。
アスコルビン酸脂肪酸エステルとしては、アスコルビン酸の２、３、５及び６位の少なくとも１つの水酸基と脂肪酸を反応させてエステル化した化合物が挙げられる。例えば、アスコルビン酸−６−パルミテート、アスコルビン酸−２，６−パルミテート、アスコルビン酸−６−ステアレートなどが挙げられる。
アスコルビン酸リン酸エステルとしては、例えば、アスコルビン酸の２位の水酸基にリン酸がエステル化したアスコルビン酸−２−リン酸エステルなどが挙げられる。
アスコルビン酸リン酸エステルの塩としては、アスコルビン酸リン酸エステルの塩、具体的には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などが挙げられる。より具体的には、アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム塩、アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩などが挙げられる。
アスコルビン酸リン酸エステルの脂肪酸エステルとしては、アスコルビン酸リン酸エステルの水酸基に脂肪酸が更にエステル化した化合物、例えばアスコルビン酸−２−リン酸−６−パルミテート、アスコルビン酸−２−リン酸−６−ラウレート、アスコルビン酸−２−リン酸−６−ステアレートなどが挙げられる。
また、アスコルビン酸リン酸エステルの脂肪酸エステルの塩としては、例えば、アスコルビン酸−２−リン酸−６−パルミテートナトリウム塩、アスコルビン酸−２−リン酸−６−ラウレートマグネシウム塩などが挙げられる。
アスコルビン酸グルコシドとしては、例えば、アスコルビン酸の２位の水酸基にグルコースがグルコシド結合したアスコルビン酸−２−グルコシドなどが挙げられる。
アスコルビン酸グルコシドの脂肪酸エステルとしては、アスコルビン酸グルコシドに脂肪酸が更にエステル化した化合物、例えばアスコルビン酸−２−グルコシド−６−パルミテート、アスコルビン酸−２−グルコシド−６−ステアレート、アスコルビン酸−２−グルコシド−６−ラウレートなどが挙げられる。
アスコルビン酸硫酸エステルとしては、例えば、アスコルビン酸の２位の水酸基に硫酸がエステル化したアスコルビン酸−２−硫酸エステルなどが挙げられる。
アスコルビン酸硫酸エステルの塩としては、アスコルビン酸硫酸エステルの塩、具体的には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などが挙げられる。
アスコルビン酸硫酸エステルの脂肪酸エステルとしては、アスコルビン酸硫酸エステルの水酸基に脂肪酸が更にエステル化した化合物、例えば、アスコルビン酸−２−硫酸−６−パルミテート、アスコルビン酸−２−硫酸−６−ステアレート、アスコルビン酸−２−硫酸−６−ラウレートなどが挙げられる。
このうち、特にアスコルビン酸脂肪酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステルの脂肪酸エステル、アスコルビン酸グルコシド、及びアスコルビン酸グルコシドの脂肪酸エステルが、安定性が高く、チロシナーゼ活性促進作用に優れる点で好ましい。
本発明におけるチロシナーゼ活性促進剤の有効成分であるアスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体は、有効量で用いることによって、優れたチロシナーゼ活性促進効果を奏する。
チロシナーゼは、チロシンを基質にして、その水酸化反応と生じたＤＯＰＡの酸化反応を触媒するが、水酸化反応時にアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体が水素供与体として働くことにより、チロシナーゼ活性を促進するものと考えられる。
そして、該アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体を含有するチロシナーゼ活性促進剤は、経皮的に吸収されて毛根部位に達し、メラノサイトに働いて、優れたメラニン産生促進作用を示す。
このような性質により、本発明のアスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤は、優れたメラニン産生促進効果を発揮する。
本発明のチロシナーゼ活性促進剤は、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体を、そのまま用いて又は適当な担体と混合させて、公知の製法に従って製剤化することにより得ることができる。
また、該チロシナーゼ活性促進剤を含有成分として用いて外用剤を得ることもできる。外用剤は、適宜公知の製法に従って、上記チロシナーゼ活性促進剤を所望の成分又は適当な担体と混合することにより、得ることができる。
該外用剤は、優れたチロシナーゼ活性促進作用又はメラニン産生促進作用を有し、例えば、頭髪用外用剤又は皮膚用外用剤として利用することができる。また、中脳黒質のようなメラニン産生細胞に作用するパーキンソン病の治療用外用剤としても使用することができる。
頭髪用外用剤としては、具体的には、白髪防止、白髪改善又は頭髪褐色化のための頭髪用外用剤が挙げられる。
頭髪用外用剤の種類は特に限定されず、例えば、シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、ヘアパック、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアスプレー、発毛剤、染毛剤、養毛剤等として用いることができる。外用剤の形態も特に限定されず、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ジェル状、固形状等、種々の形態で用いることができる。
皮膚用外用剤としては、具体的には、皮膚の抗白斑治療、皮膚褐色化又は皮膚黒化のための皮膚用外用剤が挙げられる。
皮膚用外用剤の種類は、特に限定されず、例えば、ローション、乳液、クレンジングクリーム、栄養クリーム、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、ボディローション、ハンドクリーム、レッグクリーム、洗顔料、ボディソープ、ボディシャンプー等として用いることができる。外用剤の形態も特に限定されず、ローション状、液状、クリーム状、ジェル状、乳液状、固形状等の形態で用いることができる。
外用剤には、チロシナーゼ活性促進剤の効力を高めるのに有効な任意の助剤又は公知の添加剤を適宜配合することができる。例えば、流動パラフィン、ワセリン等の炭化水素類、カルナバワックス、モクロウ等のロウ類、オリーブ油、ホホバ油等の油脂類、オクタデシルパルミテート、ネオペンチルグリコールジイソオクタネート等のエステル類、ステアリン酸、パルミチン酸等の高級脂肪酸類、セチルアルコール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類、ノニオン、アニオン、カチオン、両性等の界面活性剤、天然あるいは合成の香料や色素、パラベン類、グルコン酸クロルヘキシジン等の防腐剤、ビタミンＥ、ビタミンＰ等のビタミン類、ＢＨＴ等の抗酸化剤、ベンゾフェノン、アミノ安息香酸等の紫外線吸収剤、エタノール、プロパノール等のアルコール類、クエン酸塩、酢酸塩等のｐＨ調節剤、及び各種目的に応じた薬効成分などを適宜配合することができる。
外用剤におけるチロシナーゼ活性促進剤の含有割合は、チロシナーゼ活性促進作用を奏する有効量程度であり、該含有割合は、使用態様及びに含有成分の種類に応じて適宜調整される。
頭髪用外用剤として用いる場合、チロシナーゼ活性促進剤の含有量は、外用剤全体に対し、０．００００１〜１０重量％程度、好ましくは、０．０００１〜０．１重量％程度である。また皮膚用外用剤として用いる場合、チロシナーゼ活性促進剤の含有量は外用剤全体に対し、０．００００１〜１０重量％程度、好ましくは０．０００１〜０．１重量％程度である。
チロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤である場合、アスコルビン酸の含有量は、外用剤全体に対し、０．０００１〜１重量％程度、好ましくは０．００１〜１重量％程度、より好ましくは０．０１〜１重量％程度、更に好ましくは０．１〜１重量％程度である。アスコルビン酸は皮膚からはほとんど吸収されないため、細胞内の濃度を有効量と考えられる１０^−４Ｍ又はそれ以下の濃度とする場合、アスコルビン酸の、チロシナーゼ活性促進剤の組成物全体における濃度は、０．０００１〜１重量％程度と考えられる。
チロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸リン酸エステル及びアスコルビン酸グルコシドからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤である場合、該化合物の含有量は、外用剤全体に対し、０．００１〜１０重量％程度、好ましくは０．０１〜１０重量％程度、より好ましくは０．０１〜１重量％程度、更に好ましくは０．１〜１重量％程度である。アスコルビン酸リン酸エステルやグルコシド体は、アスコルビン酸よりも安定性が高く、アスコルビン酸に比べて皮膚透過性乃至吸収性が増している。このため、細胞内の濃度を活性化作用が見られる有効量と考えられる１０^−２Ｍ〜１０^−４Ｍ程度とする場合、アスコルビン酸リン酸エステルやグルコシド体の、チロシナーゼ活性促進剤の組成物全体における濃度は、０．００１〜１０重量％程度と考えられる。
またチロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸の脂肪酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステルの脂肪酸エステルおよびアスコルビン酸グルコシドの脂肪酸エステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤である場合、該化合物の含有量は、外用剤全体に対し、０．００００１〜０．１重量％程度、好ましくは０．０００１〜０．１重量％程度、より好ましくは０．００１〜０．１重量％程度、更に好ましくは０．０１〜０．１重量％程度である。アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体の脂肪酸エステルは、安定性が高く、皮膚透過性はかなり高くなっていると考えられる。このため、細胞内の濃度を有効量と考えられる１０^−４Ｍ以下程度とする場合、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体の脂肪酸エステルの、チロシナーゼ活性促進剤の組成物全体における濃度は、０．００００１〜０．１重量％程度と考えられる。
本発明によれば、安全性が高く、製造コストが安価なアスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体を有効成分として、優れたチロシナーゼ活性促進作用又はメラニン産生促進作用を有するチロシナーゼ活性促進剤及び外用剤が提供される。
従来、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体は、メラニン生成抑制剤として用いられていたが、本発明により、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体が、チロシナーゼ活性促進剤及びチロシナーゼ活性促進作用を奏する製剤又は外用剤の有効成分として用い得ることが明らかとなった。
本発明に係るチロシナーゼ活性促進剤は、安全性が高く、安価で製造することができ、優れたチロシナーゼ活性化作用及びメラニン産生促進作用を奏する。また、該チロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤も、優れたチロシナーゼ活性化作用及びメラニン産生促進作用を奏する。
本発明に係るチロシナーゼ活性促進剤及び該チロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤は、チロシナーゼ活性促進又はメラニン産生促進を目的として、化粧品、医療等の分野において有効に利用できる。例えば、白髪防止用、白髪改善用などの頭髪用外用剤、また、皮膚黒化用、皮膚の抗白斑治療用などの皮膚用外用剤として、有効に利用できる。
ＩＶ．本発明の第４の好ましい実施形態としては、糖類やヌクレオシドが可溶な溶媒中での酵素によるエステル化物の製造方法が提供される。
本発明者らは、カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼタイプＡが非プロトン性有機溶媒中で高い活性を有することを見出した。更に、反応基質としてショ糖を用いた場合には、特に選択性の高い反応が行われることも見出し、これらの知見に基づき、鋭意検討を重ねた。
即ち、本発明には、以下のエステル化物の製造方法が含まれる。
４−１．カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼタイプＡの存在下、非プロトン性有機溶媒中で、水酸基を有する化合物と脂肪酸又はその誘導体とをエステル化させるエステル化物の製造方法。
４−２．非プロトン性有機溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びジメチルホルムアミドとジメチルホキシドとの混合溶媒からなる群から選ばれるいずれかである４−１に記載のエステル化物の製造方法。
４−３．水酸基を有する化合物が糖類、ヌクレオシド類、糖アルコール類、又は水酸基を有するアミノ酸からなる群から選ばれる１種又は２種以上である４−１又は４−２に記載のエステル化物の製造方法。
４−４．水酸基を有する化合物が糖類である４−３に記載のエステル化物の製造方法。
４−５．水酸基を有する化合物がショ糖であって、エステル化物が下記一般式（２１）で表される化合物である４−１に記載のエステル化物の製造方法。

（式中、Ｒｃは炭素数１〜２４の脂肪酸残基を示す。）
以下、本発明の第４の実施形態について更に詳しく説明する。
第４の実施形態に係るエステル化物の製造方法は、カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼタイプＡの存在下、非プロトン性有機溶媒中で、水酸基を有する化合物と脂肪酸又はその誘導体とをエステル化させることを特徴とする。
ここで、エステル化とは、エステルを合成することを意味し、エステル化反応及びエステル交換反応が含まれる。具体的には、カルボン酸とアルコールとの反応（Ｒ’−ＣＯＯＨ＋Ｒ”−ＯＨ→Ｒ’−ＣＯＯ−Ｒ”）、エステルとアルコールとの反応（Ｒ’−ＣＯＯ−Ｒ”＋Ｒ’’’−ＯＨ→Ｒ’−ＣＯＯ−Ｒ’’’）などが含まれる。
リパーゼ
該エステル化物の製造方法では、酵素触媒として、カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼタイプＡを用いる。
カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼには、タイプＡとタイプＢが存在する。本発明者らは、このうち、リパーゼタイプＡが、非プロトン性有機溶媒中で高い活性を有する、優れた酵素触媒であることを見出した。
本発明を適用すれば、有機溶媒に溶けにくい、水酸基を有する化合物を基質とする反応についても、高い収率で生成物を得ることが可能になる。
リパーゼＡは、発酵後のリパーゼから、例えば、ゲルろ過により調製して得ることができる。また、リパーゼＡをコードする遺伝子により、組み換えＤＮＡ技術を用いて産生することもできる。リパーゼタイプＡの使用割合は、溶媒に対して、０．１〜２０重量％程度、好ましくは０．１〜１０重量％程度である。
リパーゼタイプＡを用いる反応の反応温度は適宜設定し得るが、通常１０〜１００℃程度、好ましくは３０〜５０℃程度である。
非プロトン性有機溶媒
本発明の方法は、非プロトン性有機溶媒中で行う。
非プロトン性有機溶媒の種類は、特に限定されないが、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルイソプロピルアミド、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリジノンジプロピルスルホキシドあるいはそれらの混合溶媒等が挙げられる。
このうち、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又はジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシドとの混合溶媒が、生成収率が高い点で好ましい。特にジメチルスルホキシドが好ましい。混合溶媒の割合は適宜設定できるが、ジメチルスルホキシドの割合が６０％以上、好ましくは８０％以上であるものが好ましい。
水酸基を有する化合物
本発明における水酸基を有する化合物としては、水酸基を一個以上有している化合物であれば、特に限定されない。例えば、糖類、ヌクレオシド類、糖アルコール類、水酸基を有するアミノ酸などを適用することができる。
糖類としては、単糖、少糖、多糖およびそれらの加水分解生成物等の天然糖ならびに合成糖が挙げられる。また、これらの置換体や誘導体、例えば、アミノ糖、硫黄糖、ウロン酸等が挙げられる。また、これらの溶媒和物等が挙げられる。
単糖としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はアスコルビン酸等の炭素数２〜８個の化合物、好ましくは５〜７個の化合物が挙げられる。
少糖としては、例えば、トレハロース又はその二水和物、スクロース（ショ糖）、マルトース、セロビオース、ラクトース等の二糖、ラフィノース等の三糖、マンノオリゴ糖、マルトオリゴ糖等のオリゴ糖が挙げられる。
多糖としては、例えば、セルロース、デンプン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、マンナン、キシラン、プルラン等が挙げられる。
なかでも、コストや反応溶媒に対する溶解性の点から、単糖および少糖が好ましく、少糖としては特に二糖が好ましい。具体的には、グルコース、トレハロースおよびスクロースが好ましく、特にスクロースが好ましい。
ヌクレオシド類としては、例えば、アデノシン、グアノシン、シトシン、チミン及びウラシルの各塩基にデオキシリボース又はリボースが結合した化合物又はその誘導体等が挙げられる。
糖アルコール類としては、例えば、グリセロール、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、イノシトールが挙げられる。
また、水酸基を有するアミノ酸としては、セリン、スレオニン、チロシンが挙げられる。
これらの化合物は、１種を単独で用いてもよく、また２種以上を併用して用いてもよい。
反応溶媒中の水酸基を有する化合物の濃度は、０．０１〜１Ｍ、好ましくは０．１〜０．５Ｍ程度である。
脂肪酸又はその誘導体
本発明において用いられる脂肪酸又はその誘導体の種類は所望に応じて適宜設定し得る。
脂肪酸としては、飽和または不飽和の脂肪族モノカルボン酸、ジカルボン酸、およびカルボン酸を分子内に３個以上有するポリカルボン酸等が挙げられる。脂肪酸の炭素数は、通常１〜２４、好ましくは、６〜１８である。
脂肪族モノカルボン酸としては、例えば、カプロン酸，ソルビン酸，カプリル酸，カプリン酸，ラウリン酸，ミリスチン酸，パルミトレイン酸，パルミチン酸，ステアリン酸，イソステアリン酸，オレイン酸，リノール酸，リノレン酸，ペンタデカン酸，エイコサン酸，ドコサン酸，ドコセン酸，アラキドン酸，リシノレイン酸，ジヒドロキシステアリン酸等が挙げられる。中でも、パルミチン酸，ステアリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリル酸が好ましい。
また、ジカルボン酸としては、例えば、アジピン酸、セバチン酸等が挙げられる。なかでも、ジビニルエステルとした場合に重合性モノマーが得られることから、飽和または不飽和の脂肪族ジカルボン酸、特にアジピン酸が好ましい。
また脂肪酸の誘導体としては、上記脂肪酸とアルコールとの反応から得られる脂肪酸エステルや脂肪酸の酸無水物などが挙げられる。脂肪酸エステルとしては、例えば、脂肪酸のビニルエステル、低級アルキルエステル、ハロゲン化低級アルキルエステル等が挙げられる。なかでも、エステル交換反応の脱離基として優れていることから、ビニルエステルが好ましい。
なお、ここでいう「低級アルキル」とは、炭素数１〜６個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基を意味し、「ハロゲン化低級アルキル」とは、少なくとも１個のハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）で置換された前記低級アルキルを意味する。脂肪酸の誘導体の具体例としては、上記脂肪酸のビニルエステル、メチルエステル、エチルエステル、トリフルオロエチルエステルおよびトリクロロエチルエステル、アジピン酸およびセバチン酸のジビニルエステルが挙げられる。
なかでも、反応性の点から、カプロン酸ビニル、カプリル酸ビニル、ラウリン酸ビニル、ミリスチン酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニル、ウンデシレン酸ビニル、オレイン酸ビニル、およびアジピン酸ジビニルが好ましい。
これらの脂肪酸又はその誘導体は、１種単独で用いてもよく、また２種以上を併用して用いてもよい。また、これらの脂肪酸又はその誘導体は、水酸基，カルボニル基フェニル基、ハロゲン基等の置換基で適宜置換されたものでも良い。
上記脂肪酸又はその誘導体の濃度は適宜設定し得るが、通常、水酸基を有する化合物１モルに対して、１〜１０モル、好ましくは１．２〜４モル程度である。
ショ糖エステル
該エステル化物の製造方法において、水酸基を有する化合物として、スクロース（ショ糖）を用いた場合には、スクロースの２位の二級水酸基が特異的にエステル化された化合物が得られる。
具体的には、カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼタイプＡの存在下、非プロトン性有機溶媒中で、スクロースと脂肪酸又はその誘導体とをエステル化させた場合、下記一般式で表される化合物が得られる。

（式中、Ｒｃは炭素数１〜２４の脂肪酸残基を示す。）
非プロトン性有機溶媒としては、前記した溶媒を適宜使用し得るが、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び、ジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシドとの混合溶媒が好ましく用いられる。特にジメチルスルホキシドが好ましい。
脂肪酸又はその誘導体としては、前記脂肪酸又はその誘導体として例示した化合物などを所望に応じて適宜使用し得るが、特に、アジピン酸ジビニル、カプロン酸ビニル、カプリン酸ビニル、ラウリン酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニルが反応性の点で好適に用いられる。
従来実用化されているショ糖エステルは化学触媒法で製造されたもので、モノ、ジ、トリエステルの混合物である。しかもスクロースの１’位、６位、６’位の一級水酸基に脂肪酸エステルが置換している。このため、親水性が低く、可溶化や乳化における水溶性が不十分である。これに対し、本発明を用いれば、２位の水酸基が選択的にエステル化されたモノエステル化合物が高収率で取得できる。また、本発明を用いれば、２位の二級水酸基のみが特異的にエステル化されたショ糖エステルを、高純度含有物の形で、複雑な工程を要さずに取得することができる
本発明の方法により得られる２位の水酸基が選択的にエステル化されたショ糖エステルは、食品、化粧品、シャンプー、リンス、医薬、農薬、洗浄剤などの分野における乳化剤や界面活性剤等として好適に用いることができる。
本発明のエステル化物の製造方法によれば、水溶性が高い化合物を原料とする場合でも、エステル化物を効率よく取得することができる。特に本発明に係るエステル化物の製造方法は、化学合成が難しく、酵素による選択的な反応が求められるエステル化物の製造に、好適に用いられる。

図１は、モレキュラーシーブスを添加して、アルブチンエステルを製造する場合において、アルブチン転化率（反応率）の経時変化を、モレキュラーシーブスの濃度を種々に変化させて、測定した結果を示す図面である。分析はＨＰＬＣを用いて行った。
図２は、モレキュラーシーブスを添加して、アルブチンエステルを製造する場合において、アルブチン転化率（反応率）の経時変化を、アルブチンの濃度を種々に変化させて、測定した結果を示す図面である。分析はＨＰＬＣを用いて行った。
図３は、マッシュルーム由来チロシナーゼに対する、アルブチン及び実施例１で得得られるアルブチンエステル化合物の阻害活性を評価した結果を示す図面である。
図４は、マウスメラノーマ細胞を用いて、アルブチン及び実施例１で得られたアルブチンエステル化合物のメラニン産生抑制作用を評価した結果を示す図面である。
図５は、実施例２−１と実施例２−４で行われたピロカテコールあるいはフェノールを基質にしたときのウンデシレン酸トレハロースエステルのチロシナーゼ阻害活性の評価を示す図である。−○−Ｃａｔｅｃｈｏｌ（カテコール）はピロカテコールを基質にした場合、−●−Ｐｈｅｎｏｌ（フェノール）はフェノールを基質にした場合の測定結果を示す。
図６は、比較例２−１と比較例２−３で行われたカテコールあるいはフェノールを基質にした場合におけるアルブチンのチロシナーゼ阻害活性の評価を示す図である。−○−Ｃａｔｅｃｈｏｌ（カテコール）はピロカテコールを基質にした場合、−●−Ｐｈｅｎｏｌ（フェノール）はフェノールを基質にした場合の測定結果を示す。
図７は、実施例２−１及び２−３と比較例２−２で行われたカテコールを基質にしたときのチロシナーゼ阻害活性の評価を示す図である。
図８は、実施例２−５と比較例２−４で行われたフェノールを基質にしたときのチロシナーゼ阻害活性の評価を示す図である。
図９は、チロシナーゼに対するアルブチン及びウンデシレン酸の阻害活性を図示した図面である。アルブチンは主にモノフェノールの水酸化反応を阻害し、ウンデシレン酸誘導体はジフェノールの酸化反応を阻害する。
図１０は、アスコルビン酸及びアスコルビン酸誘導体のチロシナーゼ活性促進率を調べた結果を示した図面である。
図１１は、ショ糖０．２５Ｍ、アジピン酸ジビニル１Ｍを溶かしたＤＭＦあるいはＤＭＳＯに、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（ＣＡＬ−Ａ）あるいはカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＢ（ＣＡＬ−Ｂ）を添加し、４０℃で２４時間反応した後のエステル体への変換率を示す図面である。○はリパーゼタイプＡの変換率を、●はリパーゼタイプＢの変換率を示す。
図１２のＡは、ショ糖（０．１２５Ｍ）とアジピン酸ジビニル（０．５Ｍ）を含んだＤＭＦとＤＭＳＯの混合溶液中にカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（ＣＡＬ−Ａ）を添加し、ＤＭＦとＤＭＳＯの混合割合を変えて、３０℃で２４時間撹拌したときのスクロースエステルへの変換率を示す図面である。図１２のＢは、ショ糖（０．１２５Ｍ）とアジピン酸ジビニル（０．５Ｍ）を含んだＤＭＦとＤＭＳＯの混合溶液中にカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＢ（ＣＡＬ−Ｂ）を添加し、ＤＭＦとＤＭＳＯの混合割合を変えて、３０℃で７日間撹拌したときのスクロースエステルへの変換率を示す図面である。
図１３は、マルトース０．２５Ｍ、アジピン酸ジビニル１Ｍを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）の各溶媒に溶かし、カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼタイプＡ（ＣＡＬＡ）及びタイプＢ（ＣＡＬＢ）をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ添加し、４０℃で２４時間攪拌後のエステル体への変換率を示す図面である。

以下、本発明をより詳しく説明するため実施例及び比較例を挙げるが、本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１−１

アルブチン６．８ｇ、１０−ウンデシレン酸ビニルエステル２１ｇ、水３．８ｇを含むジメチルホルムアミド７２．６ｍｌにバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプロテアーゼ０．５ｇ（ナガセケムテックス社製）を添加し、３０℃、１３０ｒｐｍにて一週間撹拌した。変換率は８０％であった。生成物をＴＬＣで調べたところ、ほぼモノエステルのみが生成していることが分かった。酵素反応液をろ過して、酵素粉末を除去した後、反応液を減圧濃縮しＤＭＦを除去した。これをシリカゲル１００ｇを充填したカラムに添加し、クロロホルム：メタノール（８：１）で溶出し、生成物を集め、濃縮し、６−Ｏ−（１０−ウンデシレノイル）アルブチンの結晶を得た。収率は６２％であった。１３Ｃ−ＮＭＲ：δ１０１．６（Ｃ１），７６．４（Ｃ２），７３．２（Ｃ３），７０．１（Ｃ４），７３．７（Ｃ５），６３．４（Ｃ６），１１５．５，１１７．７，１５０．２１５２．４（ｐｈｅｎｏｌ），１７２．８（Ｃ＝Ｏ），１１４．６，１３８．９（ＣＨ＝ＣＨ_２），２４．４，２８．３，２８．５，２８．７，３３．２，３３．６（ＣＨ_２）Ａｎａｌ．ＣａｌｃｄｆｏｒＣ_２３Ｈ_３４Ｏ_８（４３８）：Ｃ，６３．０１；Ｈ，７．７６，Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６３．１６；Ｈ，７．７５．
同様の方法で、各種脂肪族カルボン酸ビニルとアルブチンのバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプロテアーゼ存在下での反応を行った。その結果を表１−１に示す。

実施例１−２

アルブチン２．８ｇ、アジピン酸ジビニル９．５ｇをピリジン４０．５ｍｌに溶解し、ストレプトマイセスエスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）由来のアルカリ性プロテアーゼ５ｇ（東洋紡績社製）を添加し、３０℃、１３０ｒｐｍにて４日間撹拌した。生成物をＴＬＣで調べたところ、モノエステルのみが生成していることが分かった。酵素反応液をろ過して、酵素粉末を除去した後、反応夜を減圧濃縮し、ピリジンを除去した。これをシリカゲル１００ｇを充填したカラムに添加し、ヘキサン：酢酸エチルエステル（４：１）で溶出し、生成物を集め、濃縮し、６−Ｏ−（ビニルアジポイル）アルブチンの結晶を得た。単離収率は８５％であった。Ｈ−ＮＭＲ：δ１．５５６（４Ｈ，ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２−），２．３２０（２Ｈ，ｍ，−ＣＯＣＨ_２−），２．４３０（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ_２ＣＯ−），３．１２−３．２９（３Ｈ，ｍ，Ｈ−２，３，４），３．５０８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），４．０７０（１Ｈ，ｑ，Ｈ−６），４．３１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６），４．６４０（１Ｈ，ｄｄ，＝ＣＨ_２），４．６７５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．９００（１Ｈ，ｄｄ，＝ＣＨ_２），５．１１−５．３２（３Ｈ，ｍ，ＯＨ−２，３，４），６．６６（２Ｈ，ｍ，φ），６．８３（２Ｈ，ｍ，φ），７．２１（１Ｈ，ｑ，−ＣＨ＝）
また、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、Ｎ−メチル−２−ピロリドン中でも上記と同様の反応条件で反応を行った。原料アルブチンは速やかにエステル化され、ＴＬＣ分析からこれらの溶媒中ではモノエステルが主生成物として検出されたが、ピリジン中と異なり、ジ、トリ、テトラエステルも生成することが分かった。

実施例１−３

アルブチン６．８ｇ、１０−ウンデシレン酸ビニルエステル２１ｇを含む７６．２ｍｌに４−ピロリジノピリジン１ｇ（和光純薬社製）を添加し、８０℃、１３０ｒｐｍにて２４時間撹拌した。生成物をＴＬＣで調べたところ、モノ、ジ、トリ、ポリエステルが生成していることが分かった。反応液を減圧濃縮しＤＭＦを除去した。これをシリカゲル１００ｇを充填したカラムに添加し、クロロホルム：メタノール（８：１）で溶出し、モノエステルを集め、濃縮し、６−Ｏ−（１０−ウンデシレノイル）アルブチンの結晶を得た。収率は１０％であった。１３Ｃ−ＮＭＲ：δ１０１．６（Ｃ１），７６．４（Ｃ２），７３．２（Ｃ３），７０．１（Ｃ４），７３．７（Ｃ５），６３．４（Ｃ６），１１５．５，１１７．７，１５０．２１５２．４（ｐｈｅｎｏｌ），１７２．８（Ｃ＝Ｏ），１１４．６，１３８．９（ＣＨ＝ＣＨ_２），２４．４，２８．３，２８．５，２８．７，３３．２，３３．６（ＣＨ_２）Ａｎａｌ．ＣａｌｃｄｆｏｒＣ_２３Ｈ_３４Ｏ_８（４３８）：Ｃ，６３．０１；Ｈ，７．７６，Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６３．０６；Ｈ，７．８１．
同様の方法で、各種脂肪族カルボン酸ビニルとアルブチンの４−ピロリジノピリジン存在下での反応を行った。結果を表１−２に示す。

実施例１−４

アルブチン０．３ｇ、アジピン酸ジビニル１ｇをＤＭＦ４ｍｌに溶解し、ジメチルアミノピリジン１０ｍｇを添加し、８０℃で３時間撹拌した。生成物をＴＬＣで調べたところ、モノ、ジ、トリ、テトラエステルが生成していることが分かった。反応液を減圧濃縮しＤＭＦを除去した。これをシリカゲル１００ｇを充填したカラムに添加し、クロロホルム：メタノール（８：１）で溶出し、モノエステルを集め、濃縮し、６−Ｏ−（ビニルアジポイル）アルブチンの結晶を得た。収率は２１％であった。

実施例１−５

三角フラスコにアルブチン３２７ｍｇ、１０−ウンデシレン酸８８５ｍｇを４．０ｍｌの１，４−ジオキサン／ＤＭＳＯ（＝９：１）混合溶媒に溶解し、次いで活性化したモレキュラーシーブス４Ａを０．４ｇ入れた後、カンジダアンタクティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔｅｒｃｔｉｃａ）由来の固定化リパーゼ（ノボザイムズ社製）４０ｍｇを添加し、４０℃、１３０ｒｐｍにて１週間撹拌した。なお、モレキュラーシブスの活性化は電子レンジを用いた簡便法で行った。すなわち、フラスコに入れたモレキュラーシブス４Ａを電子レンジで１分ほど加熱し、直後に、真空ポンプで減圧下室温まで放冷し、この操作を３回繰り返した。酵素反応生成物をＴＬＣで調べたところモノエステルのみが生成していることが分かった。酵素反応液を濾過して、酵素とモレキュラーシーブスを除去した後、反応液を減圧濃縮した。これに４ｍｌメタノールと２．５ｍｌの水を加え、さらにヘキサン５ｍｌを添加して未反応のウンデシレン酸をヘキサン層に抽出した。ヘキサンによる抽出操作を６回繰り返した後、水層をエバポレーターにて濃縮した。この濃縮液に８ｍＬの水を添加して白色沈殿を生じさせた後、遠心分離によって上清を廃棄した。この水抽出操作を３回繰り返して未反応のアルブチン、およびＤＭＳＯを除去した。回収した白色沈殿物を減圧乾燥し、２８７ｍｇの粉体を得た。
この精製物を、１００％酢酸エチルを用いてＴＬＣ分析した結果、未反応１０−ウンデシレン酸が除去され、単一のエステル化合物が得られていることを確認した。この精製物のＮＭＲ分析を行ったところ、実施例１−１で得られたエステル化合物と同一で６−Ｏ−（１０−ウンデシレノイル）アルブチンであることが確認された。
得られたエステル化合物の収率は９１％であった。また、本実施例の方法は、シリカゲルカラムによる精製が必要なく、簡便であった。

実施例１−６

三角フラスコにアルブチン３３ｍｇ、１０−ウンデシレン酸８９ｍｇを４．０ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解し、次いで活性化したモレキュラーシーブス４Ａを０〜１５重量％入れた後、カンジダアンタクティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔｅｒｃｔｉｃａ）由来の固定化リパーゼ（ノボザイムズ社製）４０ｍｇを添加し、４０℃、１３０ｒｐｍにて１週間撹拌した。なお、モレキュラーシブスの活性化は実施例１−５と同じ方法で行った。アルブチン転化率の経時変化をＨＰＬＣ分析により測定した。ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。装置：島津ＬＣ−１０、カラム：ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｅ−８０、移動相溶媒：アセトニトリル／水（＝９０：１０）、流速：１．０ｍｌ、検出：示差屈折。
結果を図１に示す。脱水剤であるモレキュラーシーブスを添加することによって、アルブチン転化率（反応率）が顕著に向上した。また、モレキュラーシーブスの添加濃度が多くなるほど転化率は上昇した。

実施例１−７

アルブチンを５５ｍｇ〜８７２ｍｇ（０．０５Ｍ〜０．８Ｍ）、１０−ウンデシレン酸をアルブチンの４倍モル量としたこと以外は、実施例１−６と同じ方法で酵素反応を行った。アルブチン転化率の経時変化をＨＰＬＣ分析により測定した。結果を図２に示す。また、アルブチンの濃度が多くなるほど反応速度は速くなり、０．６Ｍ以上では変わらない値を示した。
評価１：プロリンを用いたチロシナーゼ阻害活性評価
本発明のアルブチンエステル化合物のチロシナーゼ阻害活性について、プロリンを用いた方法で測定した（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７９，３７５−３８１，１９８９）。ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した０．７４９ＭのＬ−プロリン４０μｌ、０．０３７Ｍの１，２−ジヒドロキシベンゼン４０μｌ、種々の濃度の実施例１−１で得られた６−Ｏ−（１０−ウンデシレノイル）アルブチン溶液１．４１ｍｌを吸光度用キュベット中で撹拌した。ついで、３５０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ（マッシュルーム由来、ＳＩＧＭＡ）溶液を１０μｌ加え、撹拌下、吸光度の変化を１０秒間５２５ｎｍで測定した。同様の条件でアルブチンについても測定した。結果を図３に示す。
図３の結果に示されるように、アルブチンの６位の炭素における水酸基がエステル化されたアルブチン化合物のチロシナーゼ阻害活性は、エステル化されていないアルブチンに比べて顕著に向上していることが明らかとなった。
評価２：マウスメラノーマ細胞を用いたメラニン産生抑制作用の評価
Ｄ−ＭＥＭ１０％ＦＣＳ培地１５ｍｌを入れた７５ｃｍ^２培養フラスコに３．６×１０^５個のマウスメラノーマ細胞（Ｂ１６細胞）を添加、３７℃、５％炭酸ガス下にて一晩培養して細胞を接着させた後、種々の濃度の実施例１−１で得られた６−Ｏ−（１０−ウンデシレノイル）アルブチンまたはアルブチンを溶かした０．１％ＤＭＳＯ含有Ｄ−ＭＥＭ１０％ＦＣＳ培地１５ｍｌと培地交換し、同条件にてさらに２日間培養した。次いで同培地１５ｍｌと培地交換を行い、同条件にてさらに２日間培養を行った。培養後、細胞を回収し、細胞の湿重量を測定した。湿重量測定後、細胞ペレットをＭｉｌｌｉＱ水に懸濁、総容量を７００μｌとした。これを１５ｍｉｎの超音波破砕した後、７００μｌの６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加・混合し、細胞の完全溶解・メラニン抽出を行い、吸光度（４０５ｎｍ）で測定を行った。尚、実験は３回行い、結果はその平均値として求めた。細胞当たりのメラニン生産性はＡ４０５測定値／細胞湿重量（μｇ）で表した。アルブチン未添加時の細胞当たりのメラニン生産性を１００％として各濃度のアルブチンウンデシレン酸またはアルブチンのメラニン生産抑制作用を求めた。結果を図４に示す。
図４に示されるように、メラノーマ細胞を用いたメラニン産生阻害作用を調べた結果、アルブチンウンデシレン酸はアルブチンに比べて約１００倍高い阻害作用を示した。

実施例２−１

ウンデシレン酸糖エステルのチロシナーゼ阻害活性について、プロリンを用いた方法で測定した（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７９，３７５−３８１，１９８９）。すなわちｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した０．７４９ＭのＬ−プロリン４０μｌ、０．０３７Ｍのピロカテコール４０μｌ、種々の濃度のトレハロースウンデシレン酸エステル（Ｔｒｅ−Ｕｎｄｅ）溶液１．４１ｍｌを吸光度用キュベット中で撹拌した。ついで、３５０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ（マッシュルーム由来、ＳＩＧＭＡ）溶液を１０μｌ加え、撹拌下、吸光度の変化を３分間５２５ｎｍで測定し、チロシナーゼを阻害することを確認した。結果を図５に示す。

実施例２−２

実施例２−１で示した方法と同様の方法で、ウンデシレン酸（Ｕｎｄｅ）のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻害することを確認した。結果を図７に示す。

実施例２−３

実施例２−１で示した方法と同様の方法でスークロースウンデシレン酸エステル（Ｓｕｃ−Ｕｎｄｅ）のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻害することを確認した。結果を図７に示す。
比較例２−１
実施例２−１で示した方法と同様に、ピロカテコールを基質として、アルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻害することを確認した。結果を図６に示す。
比較例２−２
実施例２−１で示した方法と同様にトレハロースジウンデシレン酸エステル（Ｔｒｅ−ｄｉ−Ｕｎｄｅ）のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻害しないことを確認した。結果を図７に示す。

実施例２−４

ウンデシレン酸糖エステルのチロシナーゼ阻害活性について、ピロカテコールを用いた方法を改良してフェノールを基質に測定した。ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した０．７４９ＭのＬ−プロリン４０μｌ、０．０３７Ｍのフェノール４０μｌ、種々の濃度のトレハロースウンデシレン酸エステル（Ｔｒｅ−Ｕｎｄｅ）溶液１．４１ｍｌを吸光度用キュベット中で撹拌した。ついで、３５０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ（マッシュルーム由来、ＳＩＧＭＡ）溶液を１０μｌ加え、撹拌下、吸光度の変化を１５分間５２５ｎｍで測定し、吸光度の増加を抑えること、すなわちチロシナーゼを阻害することを確認した。結果を図５に示す。

実施例２−５

実施例２−４で示した方法と同様にスークロースウンデシレン酸エステル（Ｓｕｃ−Ｕｎｄｅ）のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻害することを確認した。結果を図８に示す。
比較例２−３
実施例２−４で示した方法と同様にアルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻害することを確認した。結果を図６に示す。
比較例２−４
実施例２−４で示した方法と同様に、フェノールを基質として、トレハロースオレイン酸エステル（Ｔｒｅ−Ｏｌｅ）のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻害しないことを確認した。結果を図８に示す。

実施例３−１

アスコルビン酸及びアスコルビン酸誘導体を被験物質とし、それらのチロシナーゼ活性化促進作用について、フェノールを基質にしてプロリン存在下で測定した。
すなわち、フェノールはチロシナーゼにより水酸化され、このときに水素供与体を必要とする。生成したピロカテコールはチロシナーゼにより酸化されてオルトキノン体を生成する。このオルトキノンの生成をプロリン存在下で定量することにより、チロシナーゼ活性を測定した。
具体的には、次のように測定した。ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衡液に溶解した０．７４９ＭのＬ−プロリン４０μｌ、０．０３７Ｍのフェノール４０μｌ及び種々の濃度の被験物質溶液１．４１ｍｌを、吸光度用キュベット中で撹拌した。ついで、３５０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ（マッシュルーム由来、ＳＩＧＭＡ）溶液を１０μｌ加え、撹拌下、吸光度の変化を１５分間５２５ｎｍで測定し、チロシナーゼ活性を測定した。
チロシナーゼ活性促進率は被験物質未添加時のチロシナーゼ活性に対して、何％阻害或いは促進したかで表した。チロシナーゼ活性促進率１００％とはチロシナーゼ活性が被験物質未添加時に比べて２倍になっていることを示す。
被験物質として、アスコルビン酸としては、Ｌ−アスコルビン酸（和光純薬番号：０１６−０４８０５）を用いた。アスコルビン酸誘導体としては、下記構造式で表されるアスコルビン酸−２−グルコシド（和光純薬番号：０７４−０４５８１）、アスコルビン酸−２−リン酸エステル（アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（和光純薬番号：０１３−１２０６１）を使用）及びアスコルビン酸−６−パルミテート（和光純薬番号：０１１−１３６６２）を用いた。

測定した結果を図１０に示す。
図１０に示されるように、アスコルビン酸は、１０^−３Ｍ〜１０^−１Ｍの濃度でチロシナーゼの阻害作用が見られたが、１０^−４Ｍ以下の濃度において逆にチロシナーゼ活性促進作用が見られた。
また、アスコルビン酸脂肪酸エステルであるアスコルビン酸パルミチン酸エステルにおいては、１０^−４Ｍ以下の濃度でチロシナーゼ活性促進作用が見られた。
また、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸グルコシドでは１０^−２Ｍ〜１０^−４Ｍの濃度でチロシナーゼ活性促進作用が見られた。

実施例４−１

スクロース０．２５Ｍ、アジピン酸ジビニル１Ｍを溶かしたジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）あるいはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、４０℃で２４時間反応後のエステル体への変換率を調べた。反応液のＨＰＬＣ分析よりほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。
ＨＰＬＣの分析条件を以下に示す。
カラム：ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｅ−８０
溶離液：アセトニトリル／水（３／１）
検出：示差屈折
比較例４−１
実施例１において、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）に代えて、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＢ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ２，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ｂ）を用いる以外は、実施例４−１と同様の操作を行って、エステル体の変換率を調べた。
実施例４−１と比較例４−１におけるエステル体の変換率の結果を図１１に示す。図１１に示されるように、リパーゼタイプＡは、ＤＭＦやＤＭＳＯ中においてリパーゼタイプＢに比べて高い活性を示すことが明らかとなった。特にＤＭＳＯ中において、その効果は顕著であった。

実施例４−２

スクロース０．１２５Ｍとアジピン酸ジビニル０．５Ｍを含んだＤＭＦとＤＭＳＯの混合溶液中にカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ）（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ＤＭＦとＤＭＳＯの混合割合を適宜変えて、３０℃で２４時間撹拌したときのスクロースエステルへの変換率を調べた。反応液のＨＰＬＣ分析よりほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。
ＨＰＬＣの分析条件を以下に示す。
カラム：ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｅ−８０
溶離液：アセトニトリル／水（３／１）
検出：示差屈折
比較例４−２
スクロース０．１２５Ｍとアジピン酸ジビニル０．５Ｍを含んだＤＭＦとＤＭＳＯの混合溶液中にカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＢ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ２，ｌｙｏ）（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ＤＭＦとＤＭＳＯの混合割合を適宜変えて、３０℃で７日間撹拌したときの、スクロースのエステル体への変換率を調べた。反応液のＨＰＬＣ分析よりほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。ＨＰＬＣの分析条件は、実施例４−２と同様とした。
実施例４−２と比較例４−２におけるエステル体の変換率の結果を図１２に示す。図１２に示されるように、リパーゼタイプＡ（ＣＡＬ−Ａ）は、ＤＭＦとＤＭＳＯの混合溶媒中においてリパーゼタイプＢ（ＣＡＬ−Ｂ）に比べて高い活性を示すことが明らかとなった。特にリパーゼタイプＡはＤＭＳＯの混合割合が多いほど、その効果は顕著であった。

実施例４−３

マルトース０．２５Ｍ、アジピン酸ジビニル１Ｍを、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）の各溶媒に溶かし、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）を１０ｍｇ／ｍｌ添加し、４０℃で２４時間攪拌後のエステル体への変換率を調べた。反応液のＨＰＬＣ分析よりほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。
ＨＰＬＣの分析条件を以下に示す。
カラム：ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｅ−８０
溶離液：アセトニトリル／水（３／１）
検出：示差屈折
比較例４−３
実施例４−３において、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）に代えて、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＢ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ２，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ｂ）を用いる以外は同様の操作を行ってエステル体の変換率を調べた。
実施例４−３と比較例４−３におけるエステル体の変換率を調べた結果を図１３に示す。図１３に示されるように、マルトースの場合においても、リパーゼタイプＡはタイプＢと異なり、各非プロトン性有機溶媒中において顕著な反応性を示した。

実施例４−４

スクロース６．４２ｇ（０．１２５Ｍ）およびカプロン酸ビニル１０．７ｇ（０．５Ｍ）を溶かしたジメチルホルムアミド１５０ｍｌにカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）５００ｍｇを加えて懸濁した。この酵素反応液を３０℃にて１３０ｒｐｍで２４時間撹拌した。反応液について、実施例４−１と同様の分析条件でＨＰＬＣ分析を行い、ほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。
また反応液のＴＬＣ分析から生成物は一つであることを確認した。反応液中の不溶物を濾過で除去し、エバポレーターで減圧濃縮後、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１２：１）でエステル体を単離精製し、白色結晶として６．５ｇ（収率７９％）を得た。^１３ＣＮＭＲ分析から、スクロースの２位にカプロン酸残基が導入されたスクロース２−カプロン酸エステルの生成が確認された。
^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ_ｄ６）：ｄ８８．７０（Ｃ１）、７２．９９（Ｃ２）、７０．０５（Ｃ３）、６９．８３（Ｃ４）、７２．５６（Ｃ５）、６０．３１（Ｃ６）、６１．１４（Ｃ１’）、１０４．２３（Ｃ２’）、７５．３（Ｃ３’）、８２．６３（Ｃ４’）、７３．７５（Ｃ５’）、６２．３２（Ｃ６’）。

実施例４−５

スクロース６．４２ｇ（０．１２５Ｍ）およびカプリル酸ビニル１２．８ｇ（０．５Ｍ）を溶かしたジメチルホルムアミド１５０ｍｌにカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）５００ｍｇを加えて懸濁した。この酵素反応液を３０℃にて１３０ｒｐｍで２４時間撹拌した。反応液について、実施例４−１と同様の分析条件でＨＰＬＣ分析を行い、ほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。反応液から不溶物を濾過により除去後、濃縮しシリカゲル１００ｇを詰めたカラムを用いて、クロロホルム：メタノール（１２：１，ｖ／ｖ）で溶出した。白色結晶として６．８ｇ（収率６８％）を得た。^１３ＣＮＭＲ分析から、スクロースの２位にカプリル酸残基が導入されたスクロース２−カプリル酸エステルの生成が確認された。
^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ_ｄ６）：ｄ８８．７１（Ｃ１）、７２．９６（Ｃ２）、７０．０５（Ｃ３）、６９．８５（Ｃ４）、７２．５５（Ｃ５）、６０．３５（Ｃ６）、６１．１３（Ｃ１’）、１０４．２５（Ｃ２’）、７５．２７（Ｃ３’）、８２．６２（Ｃ４’）、７３．８０（Ｃ５’）、６２．３９（Ｃ６’）。

実施例４−６

スクロース６．４２ｇ（０．１２５Ｍ）およびカプリン酸ビニル１５ｇ（０．５Ｍ）を溶かしたジメチルホルムアミド１５０ｍｌにカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）５００ｍｇを加えて懸濁した。この酵素反応液を３０℃にて１３０ｒｐｍで３日間撹拌した。反応液について、実施例４−１と同様の分析条件でＨＰＬＣ分析を行い、ほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。実施例４−５と同様の方法で生成物を単離し、白色結晶として６．０ｇ（収率６４％）を得た。^１３ＣＮＭＲ分析から、スクロースの２位にカプリン酸残基が導入されたスクロース２−カプリン酸エステルの生成が確認された。
^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ_ｄ６）：ｄ８８．７２（Ｃ１）、７２．９４（Ｃ２）、７０．０７（Ｃ３）、６９．８６（Ｃ４）、７２．５３（Ｃ５）、６０．３４（Ｃ６）、６１．２１（Ｃ１’）、１０４．３０（Ｃ２’）、７５．２７（Ｃ３’）、８２．５９（Ｃ４’）、７３．７８（Ｃ５’）、６２．３７（Ｃ６’）。

実施例４−７

スクロース６．４２ｇ（０．１２５Ｍ）およびラウリン酸ビニル１７ｇ（０．５Ｍ）を溶かしたジメチルホルムアミド１５０ｍｌにカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）５００ｍｇを加えて懸濁した。この酵素反応液を３０℃にて１３０ｒｐｍで３日間撹拌した。反応液について、実施例４−１と同様の分析条件でＨＰＬＣ分析を行い、ほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。実施例４−５と同様の方法で生成物を単離し、白色結晶として６．９ｇ（収率７０％）を得た。^１３ＣＮＭＲ分析から、スクロースの２位にラウリン酸残基が導入されたスクロース２−ラウリン酸エステルの生成が確認された。
^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ_ｄ６）：ｄ８８．８０（Ｃ１）、７２．９５（Ｃ２）、７０．１０（Ｃ３）、６９．８８（Ｃ４）、７２．５５（Ｃ５）、６０．３３（Ｃ６）、６１．１９（Ｃ１’）、１０４．３０（Ｃ２’）、７５．３１（Ｃ３’）、８２．６２（Ｃ４’）、７３．８３（Ｃ５’）、６２．３５（Ｃ６’）。

実施例４−８

スクロース２．１４ｇ（０．２５Ｍ）およびアジピン酸ジビニル５ｇ（１Ｍ）を溶かしたジメチルスルホキシド２５ｍｌにカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ，Ｌ５，ｌｙｏ：ＣＡＬ−Ａ）２５０ｍｇを加えて懸濁した。この酵素反応液を３０℃にて１３０ｒｐｍで２日間撹拌した。反応液について、実施例４−１と同様の分析条件でＨＰＬＣ分析を行い、ほぼ定量的にスクロースがエステル体へ変換されていることを確認した。実施例４−５と同様の方法で生成物を単離し、白色結晶として２．６ｇ（収率８１％）を得た。^１３ＣＮＭＲ分析から、スクロースの２位にビニルアジピン酸残基が導入されたスクロース２−ビニルアジピン酸エステルの生成が確認された。
^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ_ｄ６）：ｄ８８．７０（Ｃ１）、７２．９９（Ｃ２）、７０．０５（Ｃ３）、６９．８３（Ｃ４）、７２．５６（Ｃ５）、６０．３１（Ｃ６）、６１．１４（Ｃ１’）、１０４．２８（Ｃ２’）、７５．３０（Ｃ３’）、８２．６３（Ｃ４’）、７３．７５（Ｃ５’）、６２．３２（Ｃ６’）、２３．４９，３２．７６，３３．１８（−ＣＨ_２−）、９８．１２，１４１．２６（−Ｃ＝Ｃ−）、１７０．３３，１７２．６２（−Ｃ＝Ｏ）。
比較例４−４
実施例４−８において、カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来リパーゼタイプＡ（リパーゼＡ）に代えて、ムコールジャバニカス（Ｍｕｃｏｒｊａｖａｎｉｃｕｓ）由来リパーゼ（リパーゼＭ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来リパーゼ（リパーゼＡ’）、及びカンジダシリンドラセ（Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来リパーゼ（リパーゼＡＹ）を用いる以外は同様の操作を行って、スクロースのエステル体の変換率を調べた。
実施例４−８と比較例４−４における各リパーゼを用いた場合のスクロース２−ビニルアジピン酸エステルへの変換率を表４−１に示す。

表４−１に示されるように、他の微生物由来のリパーゼとの比較においても、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプＡが顕著な変換率を示すことが確認された。

産業上の利用の可能性

本発明により、チロシナーゼ阻害活性又は促進活性を有する化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性調整剤、及び該活性調整剤を含む外用剤が提供される。また、該化合物の製造方法が提供される。
具体的には、チロシナーゼ阻害活性を有する新規アルブチンエステル化合物、該化合物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤及び該阻害剤を含む外用剤が提供される。
また、ウンデシレン酸又はその塩或いはそのエステル誘導体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤および該阻害剤を含む外用剤が提供される。
また、アスコルビン酸又はその誘導体を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤並びに該チロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤が提供される。
また、上記チロシナーゼ阻害剤又は促進剤の有効成分となる化合物の製造に適用し得る、酵素によるエステル化物の製造方法に関する。
本発明における新規アルブチンエステル化合物は、アルブチンの６位の水酸基に疎水性基を導入することにより、アルブチンと比較して、チロシナーゼ阻害活性が顕著に高まっている。また、該化合物は、疎水性基を導入することで皮膚吸収性が向上している。更に、糖エステル構造に基づくと考えられる幅広い抗菌作用、フェノール性水酸基に基づくと考えられるラジカル消去能、並びにエステル部の疎水性とアルブチン部の親水性に基づくと考えられる界面活性作用も有している。
そして、該化合物を有効成分とする本発明のチロシナーゼ阻害剤及び該阻害剤を含む外用剤は、顕著なチロシナーゼ活性阻害作用を示し、皮膚外用剤、美白用化粧剤、添加剤等として、化粧品や医薬分野において有効に利用することができる。
また、本発明において、ウンデシレン酸と二糖のエステル体は、チロシナーゼ阻害活性をアルブチンと異なる作用で顕著に高めることが見いだされた。すなわち、チロシナーゼ作用は、モノフェノールの１，２−ジフェノール（カテコール）への水酸化作用とカテコールのｏ−キノンへの酸化反応を触媒しているが、アルブチンは前者のモノフェノールの水酸化反応を効率的に阻害し、ウンデシレン酸その塩又はそのエステル誘導体は後者のカテコールへの酸化反応を阻害することにより、アルブチンとは異なるメカニズムでチロシナーゼを阻害していることが見いだされた。
特に、ウンデシレン酸のエステル誘導体は、疎水性基を導入することで皮膚吸収性が向上している。更に、ウンデシレン駿基に基づくと考えられる幅広い抗菌作用、並びにエステル部の疎水性とアルブチン部の親水性に基づくと考えられる界面活性作用も有する。
そして、該性質を有するウンデシレン酸又はその塩或いはそのエステル誘導体を有効成分とする本発明のチロシナーゼ阻害剤および該阻害剤を含む外用剤は、化粧品、美白化粧料、添加剤等として、化粧品や医薬分野において有効に利用することができる。
また、本発明において、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体が、優れたチロシナーゼ活性促進作用及びメラニン産生促進作用を有することが見出された。
従来、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体は、メラニン生成抑制剤として用いられていたが、本発明により、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体が、チロシナーゼ活性促進作用及びメラニン産生促進作用を有することが明らかとなった。
また、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体は、安価で製造することができ、安全性も高い。
該性質を有するアスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体を有効成分とする本発明のチロシナーゼ活性促進剤吸び該促進剤を含有する外用剤は、安全性が高く、安価で製造することができ、優れたチロシナーゼ活性化作用及びメラニン産生促進作用を奏するものである。
本発明のチロシナーゼ活性促進剤及び該促進剤を含有する外用剤は、化粧品や医薬分野において有用に使用することができ、例えば、白髪防止又は白髪改善のための頭髪用製剤又は外用剤、或いは、皮膚黒化又は皮膚の抗白斑治療のための皮膚用製剤又は外用剤などとして、利用できる。
また、本発明においては、水酸基を有する化合物も原料に用いることができ、しかも収率の高い、エステル化物の酵素的製造方法が見出された。
従来の酵素的エステル交換反応は、主に疎水性有機溶媒中で行われていたが、本発明において、特定の酵素を用いることにより、ＤＭＳＯ等の非プロトン性有機溶媒中で酵素によるエステル化が可能になることが見出された。このため、水酸基を有する化合物を有する化合物が高い溶解性を有する溶媒中で、該化合物を原料に用いて、高い収率でエステル化物を得ることが何能になった。
また、本発明のエステル化物の製造方法において、水酸基を有する化合物としてショ糖を用いることにより、ショ糖の２位の水酸基が特異的にエステル化されたエステル化物が得られることが明らかになった。
従来、ショ糖脂肪酸エステルは、１’位、６位、６’位の一級水酸基がエステル化したモノ、ジ、トリエステル化合物の混合物として主に得られていたが、本発明を用いれば、２位の二級水酸基のみが特異的に選択されたショ糖モノエステル化合物を高純度で取得することが可能となる。
本発明の製造方法を用いて得られるショ糖エステル化合物は、親水性が高く、可溶化性、乳化性、安定性等において優れた特性を有するものであり、食品、化粧品、シャンプー、リンス、医薬、農薬、洗浄剤などの分野における乳化剤や界面活性剤等として好適に用いることができる。
本発明のエステル化物の製造方法は、疎水性有機溶媒には溶けにくい水酸基を有する化合物を原料に用いるエステル化物の製造、並びに、化学合成が難しく、酵素による選択的な反応が求められるエステル化物の製造において、特に優れた手段を提供するものである。

Claims

一般式（１）で表されるアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒａは疎水性基を示す。］
一般式（２）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（３）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（４）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（５）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（６）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｒ_２はアルキル基、又はアリール基を示す。］
一般式（７）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５はそれぞれ単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｘは１〜６の繰り返し単位を示す。］
一般式（８）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（９）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（１０）で表される請求項１に記載のアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
請求項１〜１０のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の１種又は２種以上を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
請求項１１に記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤。
下記一般式（１１）〜（１９）のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステル化反応させる工程を有するアルブチンエステル化合物の製造方法。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換アルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｒ_２はアルキル基、又はアリール基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５はそれぞれ単結合、アルキレン基又はアリーレン基を示す。Ｘは１〜６の繰り返し単位を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
酵素触媒存在下でエステル化反応させる請求項１３に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
化学触媒存在下でエステル化反応させる請求項１３に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
エステル化反応させる工程が、脱水処理を行いながらエステル化反応させる工程である請求項１３に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
エステル化反応工程後、エステル化反応液中の未反応カルボン酸誘導体を、非極性有機溶媒を用いて抽出して分離する工程、次いで、過剰の水を加えて未反応アルブチンを抽出して分離するともにアルブチンエステル化合物を沈殿させる工程を有する請求項１３に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
下記一般式（２０）

［式中、Ｒｂは水素または一個の水酸基を除いた糖残基を示す。］
で表されるウンデシレン酸またはその塩あるいはそのエステル誘導体かちなるチロシナーゼ阻害剤。
Ｒｂが一個の水酸基を除いた糖残基である請求項１８に記載のチロシナーゼ阻害剤。
Ｒｂが水素であるウンデシレン酸またはその塩からなる請求項１８に記載のチロシナーゼ阻害剤。
請求項１８に記載のチロシナーゼ阻害剤を含む外用剤。
外用剤が美白化粧料である請求項２１に記載の外用剤。
アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤。
アスコルビン酸誘導体が、アスコルビン酸脂肪酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステル又はその脂肪酸エステル又はそれらの塩、アスコルビン酸グルコシド又はその脂肪酸エステル、及びアスコルビン酸硫酸エステル又はその脂肪酸エステル又はそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２３に記載のチロシナーゼ活性促進剤。
請求項２３に記載のチロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤。
頭髪用外用剤である請求項２５に記載の外用剤。
皮膚用外用剤である請求項２５に記載の外用剤。
アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体の含有量が外用剤全体の０．００００１〜１０重量％である請求項２５に記載の外用剤。
チロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤であって、アスコルビン酸の含有量が外用剤全体の０．０００１〜１重量％である請求項２５に記載の外用剤。
チロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸リン酸エステル及びアスコルビン酸グルコシドからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤であって、該化合物の含有量が外用剤全体の０．００１〜１０重量％である請求項２５に記載の外用剤。
チロシナーゼ活性促進剤がアスコルビン酸の脂肪酸エステル、アスコルビン酸リン酸エステルの脂肪酸エステル及びアスコルビン酸グルコシドの脂肪酸エステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とするチロシナーセ活性促進剤であって、該化合物の含有量が外用剤全体の０．００００１〜０．１重量％である請求項２５に記載の外用剤。
カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼタイプＡの存在下、非プロトン性有機溶媒中で、水酸基を有する化合物と脂肪酸又はその誘導体とをエステル化させるエステル化物の製造方法。
非プロトン性有機溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びジメチルホルムアミドとジメチルホキシドとの混合溶媒からなる群から選ばれるいずれかである請求項３２に記載のエステル化物の製造方法。
水酸基を有する化合物が糖類、ヌクレオシド類、糖アルコール類、及び水酸基を有するアミノ酸からなる群から選ばれる１種又は２種以上である請求項３２に記載のエステル化物の製造方法。
水酸基を有する化合物が糖類である請求項３４に記載のエステル化物の製造方法。
水酸基を有する化合物がショ糖であって、エステル化物が下記一般式（２１）で表される化合物である請求項３２に記載のエステル化物の製造方法。

（式中、Ｒｃは炭素数１〜２４の脂肪酸残基を示す。）