JP4168170B2

JP4168170B2 - アルブチンエステル化合物及びその製造方法

Info

Publication number: JP4168170B2
Application number: JP2005501026A
Authority: JP
Inventors: 豊常盤; 優北川; 賢二吉野; 周作柳谷; 隆生楽; 哲造戸谷; 博巳嶋川
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2008-10-22
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: US20060052318A1; JP2008214361A; US7754864B2; JPWO2004033475A1; EP1550667A1; AU2003272968A1; WO2004033475A1; JP4803557B2; AU2003272968A8; JP4892660B2; EP1550667A4; JP2008200054A

Description

【技術分野】
本発明は、チロシナーゼ阻害活性を有する新規アルブチンエステル化合物、該化合物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤及び該阻害剤を含む外用剤に関する。
【背景技術】
チロシナーゼの阻害活性を有する化合物として、アルブチンやコウジ酸などの天然物が化粧品などの分野において美白剤としてよく用いられている（例えば、非特許文献１〜４参照）。しかしながら、化粧品などの皮膚外用剤として用いる場合には、親水性が高く、皮膚吸収性が悪いなどの欠点があり、疎水性を高めたアルブチン誘導体や他の化合物の開発が望まれていた。アルブチン誘導体としては、脱色剤としてアルブチンのフェノール部分をエステル化した化合物が知られている（特許文献１）。また、脱色化粧料として、アルブチンの６位をヒドロキシエステル化した化合物が知られている（特許文献２）。さらに、リパーゼによるアルブチンとケイ皮酸ビニルのエステル交換反応によって、アルブチンの６位が位置選択的にエステル化された化合物も報告されている（非特許文献４）。しかしながら、アルブチン誘導体のチロシナーゼ阻害作用又はそれに起因する美白効果については明確になっておらず、未だ満足のいく誘導体は得られていなかった。
【特許文献１】
特開平１１−７１２２５号公報
【特許文献２】
特開平５−１９４１８１号公報）
【非特許文献１】
薬学雑誌、１１２（４）、ｐｐ．２７６−２８２、１９９２
【非特許文献２】
薬学雑誌、１１５（８）、ｐｐ．６２６−６３２、１９９５
【非特許文献３】
バイオインダストリー、１１（４）、２０６、１９９４
【非特許文献４】
Biosci. Biotech. Biochem.、６１、１１、ｐｐ．１９２６−１９２８、１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、チロシナーゼ阻害活性がアルブチンに比べて有意に高く、かつ、皮膚吸収性の向上したアルブチンエステル化合物及びその製造方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、アルブチンの6位に疎水性置換基を導入することにより、阻害活性がアルブチンに比べて高まることを見出し、更に検討を重ねて本発明を開発するに至った。
即ち、本発明には、以下のアルブチンエステル化合物、チロシナーゼ活性阻害剤、外用剤及びアルブチンエステル化合物の製造方法が含まれる。
１−２．一般式（２）で表されるアルブチンエステル化合物。
一般式（２）
【化１】

[式中、R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
１−３．一般式（３）で表されるアルブチンエステル化合物。
一般式（３）
【化２】

[式中、R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
１−４．一般式（４）で表されるアルブチンエステル化合物。
一般式（４）
【化３】

[式中、R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
１−５．一般式（５）で表されるアルブチンエステル化合物。
一般式（５）
【化４】

[式中、R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
１−６．一般式（６）で表されるアルブチンエステル化合物。
一般式（６）
【化５】

[式中、R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。R₂はアルキル基、又はアリール基を示す。]
１−８．一般式（８）で表されるアルブチンエステル化合物。
一般式（８）
【化６】

[式中、R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
１−１１．１―２〜１−６及び１−８のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の１種又は２種以上を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
１−１２．１―１１に記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤。
１−１３．下記一般式（１１）〜（１５）及び（１７）のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステル化反応させる工程を有するアルブチンエステル化合物の製造方法。好ましくは、下記一般式（１１）〜（１５）及び（１７）のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステル化反応させる工程を有する、一般式（２）〜（６）及び（８）で表されるアルブチンエステル化合物の製造方法。
一般式（１１）
A-OCO-R₁-CH=CH₂
[式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
一般式（１２）
A-OCO-R₁-C(CH₃)=CH₂
[式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
一般式（１３）
A-OCO-R₁-COOCH=CH₂
［式中、Aは水素、置換又は非置換アルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（１４）
A-OCO-R₁-COOH
[式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は、単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
一般式（１５）
A-OCO-R₁-COO-R₂
[式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。R_２はアルキル基、又はアリール基を示す。]
一般式（１７）
A-OCO-R₁-C(CH₃)₃
[式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。] 。
１−１４．酵素触媒存在下でエステル化反応させる１−１３に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
１−１５．化学触媒存在下でエステル化反応させる１−１３に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
１−１６．エステル化反応させる工程が、脱水処理を行いながらエステル化反応させる工程である１−１３〜１−１５のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
１−１７．エステル化反応工程後、エステル化反応液中の未反応カルボン酸誘導体を、非極性有機溶媒を用いて抽出して分離する工程、次いで、過剰の水を加えて未反応アルブチンを抽出して分離するともにアルブチンエステル化合物を沈殿させる工程を有する１−１３〜１−１６のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
以下、本発明の実施形態について更に詳しく説明する。
本発明におけるアルブチンエステル化合物は、アルブチンの６位に疎水性基を導入した化合物である。具体的には、一般式（２）〜（６）及び（８）で表される化合物である。
本発明のアルブチンエステル化合物は、アルブチンとカルボン酸類をエステル化反応させることによって製造することができる。ここでカルボン酸類とは、カルボン酸、ジカルボン酸又はそれらの誘導体をいう。
以下、アルブチンエステル化合物の製造について具体的に示す。
一般式（２）の化合物
一般式（２）の化合物は、アルブチンに、下記一般式（１１）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。
一般式（１１）
A-OCO-R₁-CH=CH₂
［式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１１）で表されるカルボン酸誘導体としては、例えば、アクリル酸誘導体、１０−ウンデシレン酸誘導体を挙げることができる。
一般式（３）の化合物
一般式（３）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１２）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。
一般式（１２）
A-OCO-R₁-C(CH₃)=CH₂
[式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。]
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１２）で表されるカルボン酸誘導体としては、例えば、メタアクリル酸誘導体を挙げることができる。
一般式（４）の化合物
一般式（４）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１３）のカルボン酸又はジカルボン酸誘導体を反応させることによって合成することができる。
一般式（１３）
A-OCO-R₁-COOCH=CH₂
［式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１３）で表されるジカルボン酸誘導体としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スペリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フタル酸等のジカルボン酸から誘導される化合物、例えばアジピン酸ジビニルを挙げることができる。
一般式（５）の化合物
一般式（５）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１４）のジカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。
一般式（１４）
A-OCO-R₁-COOH
［式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は６〜２１、好ましくは８〜１２であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１４）で表されるジカルボン酸誘導体としては、具体的には、スペリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フタル酸等のジカルボン酸又はそれらジカルボン酸から誘導される化合物を挙げることができる。
一般式（６）の化合物
一般式（６）の化合物は、アルブチンに、下記一般式（１５）のカルボン酸又はジカルボン酸誘導体を反応させることによって合成することができる。
一般式（１５）
A-OCO-R₁-COO-R₂
［式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。R_２はアルキル基、又はアリール基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
R₂はアルキル基、アリール基を示す。アルキル基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８である。具体的には、メチル、エチル等の直鎖のアルキル基、イソプロピル基等の分岐鎖を有するアルキル基が挙げられる。アリール基としては、フェニル基等を挙げることができる。
一般式（１５）で表されるジカルボン酸誘導体としては、具体的には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スペリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フタル酸等のジカルボン酸から誘導される化合物を挙げることができる。
一般式（８）の化合物
一般式（８）の化合物は、アルブチンに下記一般式（１７）のカルボン酸又はその誘導体を反応させることによって合成することができる。
一般式（１７）
A-OCO-R₁-C(CH₃)₃
［式中、Aは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基、R₁は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
アルキレン基の炭素数は１〜１６、好ましくは２〜８であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に限定されない。具体的には、メチレン、エチレン等の直鎖のアルキレン基、エチルエチレン、イソプロピレン等の分岐鎖を有するアルキレン基等を挙げることができる。アリーレン基としてはフェニレン基等を挙げることができる。
一般式（１７）で表されるカルボン酸誘導体としては、具体的には、ピバリン酸から誘導される化合物等を挙げることができる。
上記の方法において、アルブチンと、一般式（１１）〜（１５）及び（１７）で表される化合物とのエステル化反応は、酵素触媒存在下又は化学触媒存在下で行うことが好ましい。
酵素触媒としては、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ等、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、シュードモナスセパシア（Pseudomonas cepacia）由来のリパーゼ、カンジダアンタクティカ（Candida anterctica）由来のリパーゼ、バチルスサブチリス（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼやストレプトマイセスエスピー（Streptomyces sp.）由来のプロテアーゼ等を挙げることができる。このうち特にカンジダアンタクティカ（Candida anterctica）由来のリパーゼ、バチルスサブチリス（bacillus subtilis）由来のプロテアーゼを用いることが好ましい。
化学触媒としては、例えば、酸、アルカリ、ピリジン誘導体等の従来公知のものを使用することができる。より具体的には、p-トルエンスルホン酸、ナトリウムアルコキシド、チタニウムアルコキシド、ジメチルアミノピリジン、塩酸、硫酸、酢酸亜鉛、ピリジン、4-ピロリジノピリジン、ジシクロヘキシルカルバミン等を挙げることができる。
上記の方法においては、酵素触媒存在下にエステル化反応させる方法が、アルブチンの６位に対する選択性に優れる点から、好適である。特にカンジダアンタクティカ（Candida anterctica）由来のリパーゼやバチルスサブチリス（bacillus subtilis）由来のプロテアーゼを用いる反応が好ましい。
前記のような酵素触媒を用いてアルブチンエステルを製造する場合、反応温度は0〜100℃、好ましくは30〜50℃である。反応時間は、1〜340時間、好ましくは24〜170時間である。溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、アセトン、ジオキサン等を単独または2種類以上組み合わせて用いることができる。また、原料となるカルボン酸、ジカルボン酸又はそれらの誘導体自体を溶媒として使用することも可能である。反応溶媒中のアルブチンの濃度は1〜40重量％、好ましくは1〜10重量％である。また、酵素の使用割合は、反応溶媒に対して、0.1〜20重量％、好ましくは0.1〜1重量％である。また、アルブチン1モルに対して、カルボン酸、ジカルボン酸又はそれらの誘導体を0.5〜10モル、好ましくは、1〜5モル程度使用するのが好ましい。
一方、化学触媒を用いてアルブチンエステルを製造する場合、反応温度は0〜100℃、好ましくは40〜50℃である。反応時間は、1〜48時間、好ましくは1〜24時間である。
溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、アセトン、ジオキサンを単独または2種類以上組み合わせて用いることができる。反応溶媒中のアルブチンの濃度は1〜40重量％、好ましくは1〜10重量％である。また、化学触媒の使用割合は、反応溶媒に対して、0.1〜5重量％、好ましくは0.1〜1重量％である。また、アルブチン1モルに対して、カルボン酸、ジカルボン酸又はそれらの誘導体を0.5〜10モル、特に、1〜5モル程度使用するのが好ましい。
本発明においては、原料に用いるカルボン酸類として、末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物を用いることが好ましい。末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物は安価であり、また、エステル化反応において、副生してくる物質が水である、という利点がある。原料にエステル化合物等を用いる場合には、反応中に着色物質が生成しやすく、カラム処理などの精製処理が必要であるが、原料として末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物を用いる場合には、このような問題がない。
原料として末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物を用いて、アルブチンとエステル化反応させると、水が副生してくるが、エステル化反応は可逆的な反応であるので、効率的にエステル化反応を行うために、脱水処理を行いながら反応を行うことが好ましい。脱水処理の方法は特に限定されず、従来公知の方法等を適宜用いることができる。例えば、減圧により脱水処理を行う方法、乾燥した不活性ガスを通気させて脱水処理を行う方法、モレキュラーシーブスなどの無機化合物に水を選択的に吸着させて脱水処理を行う方法などを例示するこができる。反応スケールが小さい場合にはモレキュラーシーブスを用いて脱水処理を行う方法が簡単であり、好ましい。モレキュラーシーブスの形状は特に限定されるものではなく、例えば粉末、ペレット状のものなどを用いることができる。モレキュラーシーブスの使用量は反応液に対して０．１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％である。
これらの反応後、従来公知の適当な分離精製処理を施して、反応生成物から、アルブチンの６位に疎水性基が導入された化合物を分離することによって、本発明のアルブチンエステル化合物を取得することができる
分離精製手段としては、例えば、高速液体クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーのような公知のクロマトグラフィー手段を用いることができる。カラムの種類や移動相溶媒等の条件は適宜選択することができる。
また、溶液抽出や溶解性に基づく分別沈殿などの分離手段も用いることができる。例えば、非極性有機溶媒を用いてエステル化反応液中の未反応カルボン酸誘導体を抽出、分離した後、過剰の水を加えて未反応アルブチンを抽出、分離するともにアルブチンエステル化合物を沈殿させ、必要に応じ、これらの抽出、分離及び沈殿を行う工程を繰り返した後、沈殿したアルブチンエステル化合物を回収することによって本発明のアルブチンエステル化合物を取得することができる。
非極性溶媒としては、例えば、シクロヘキサン、エチルエーテル、石油エーテル等が挙げられる。中でも、シクロヘキサンが好ましい。
過剰の水とは、原料のアルブチン化合物に対して重量で２０倍程度である。
上記のようにして得られる一般式（２）〜（６）及び（８）で表されるアルブチンエステル化合物を有効成分として用いることによりチロシナーゼ阻害剤を得ることができる。
該チロシナーゼ阻害剤において、上記一般式（２）〜（６）及び（８）で表されるアルブチンエステル化合物は、１種単独で用いてもよく、また２種以上の混合物として用いてもよい。
チロシナーゼ阻害剤は、該一般式（２）〜（６）及び（８）で表されるアルブチンエステル化合物をそのまま用いて又は適当な担体と混合して、公知の方法に従って製剤化することにより得ることができる。
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、化粧料、皮膚外用剤、医薬、食品、魚介類養殖用飼料等に配合したり、食品の処理に使用したりすることができる。例えば、化粧料に配合して美白作用を有する化粧品とすることができる。また、メラニンの生成による変色を起こしやすい食品の変色防止等のため、その食品に添加したり、表面処理に使用したりすることができる。
また、該チロシナーゼ阻害剤を含有させて外用剤とすることもできる。特に、皮膚外用剤、好ましくは美白用の皮膚外用剤として、好適に用いることができる。
本発明の皮膚外用剤においては、上述の一般式（２）〜（６）及び（８）で表されるアルブチンエステル化合物を１種単独で又は２種以上混合して配合することができる。
外用剤は、上記チロシナーゼ阻害剤を適当な担体と混合し、公知の方法に従って製造することにより得ることができる。
外用剤には、他に一般に用いられる各種成分、例えば、水性成分、粉末成分、保湿剤、界面活性剤、防腐剤、増粘剤、紫外線吸収剤及び香料等を配合することができる。
外用剤の剤型としては、例えば、軟膏剤、クリーム、乳液、リニメント剤及びローション剤等を挙げることができる。
上記外用剤において、アルブチンエステル化合物の含有割合は、チロシナーゼ阻害効果を奏する有効量程度である。その含有割合は、外用剤全体に対し、0.001〜10％重量％程度、好ましくは、0.005〜5重量％程度である。
外用剤の適用方法は、例えば、顔、首、腕及び手等のシミ、ソバカス等のでき易い部位もしくは患部、日焼けし易い部位もしくは日焼けした部位等に、１日１回〜数回、適当量塗布すれば良い。
本発明に係るアルブチンエステル化合物は、疎水性基を導入することで皮膚吸収性が向上しており、アルブチンと比較してチロシナーゼ阻害活性が顕著に高められている。更に、本発明に係るアルブチンエステル化合物は、糖エステル構造に基づくと考えられる幅広い抗菌作用、フェノール性水酸基に基づくと考えられるラジカル消去能、並びにエステル部の疎水性とアルブチン部の親水性に基づくと考えられる界面活性作用も有する。
【発明の効果】
本発明のアルブチンエステル化合物は、チロシナーゼ阻害剤、又は皮膚外用剤などの有効成分として、化粧品や医薬分野において有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明をより詳しく説明するため実施例及び比較例を挙げるが、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１−１
アルブチン6.8g、10-ウンデシレン酸ビニルエステル21g、水3.8gを含むジメチルホルムアミド72.6mlにバチルスサブチリス（Bacillus subtilis ）由来のプロテアーゼ0.5g（ナガセケムテックス社製）を添加し、30℃、130rpmにて一週間撹拌した。変換率は80%であった。生成物をTLCで調べたところ、ほぼモノエステルのみが生成していることが分かった。酵素反応液をろ過して、酵素粉末を除去した後、反応液を減圧濃縮しDMFを除去した。これをシリカゲル100gを充填したカラムに添加し、クロロホルム：メタノール（8:1）で溶出し、生成物を集め、濃縮し、6-O-(10-ウンデシレノイル)アルブチンの結晶を得た。収率は62%であった。13C-NMR:δ101.6 (C1), 76.4 (C2), 73.2 (C3), 70.1 (C4), 73.7 (C5), 63.4 (C6), 115.5, 117.7, 150.2 152.4 (phenol), 172.8 (C=O), 114.6, 138.9 (CH=CH₂), 24.4, 28.3, 28.5, 28.7, 33.2, 33.6 (CH₂) Anal. Calcd for C₂₃H₃₄O₈(438) : C, 63.01; H, 7.76, Found: C, 63.16; H, 7.75.
同様の方法で、各種脂肪族カルボン酸ビニルとアルブチンのバチルスサブチリス（Bacillus subtilis ）由来のプロテアーゼ存在下での反応を行った。その結果を表１―１に示す。
【表１】

実施例１−２
アルブチン2.8g、アジピン酸ジビニル9.5gをピリジン40.5mlに溶解し、ストレプトマイセスエスピー（Streptomyces sp.）由来のアルカリ性プロテアーゼ5g（東洋紡績社製）を添加し、30℃、130rpmにて４日間撹拌した。生成物をTLCで調べたところ、モノエステルのみが生成していることが分かった。酵素反応液をろ過して、酵素粉末を除去した後、反応液を減圧濃縮し、ピリジンを除去した。これをシリカゲル100gを充填したカラムに添加し、ヘキサン：酢酸エチルエステル（4:1）で溶出し、生成物を集め、濃縮し、6-O-(ビニルアジポイル)アルブチンの結晶を得た。単離収率は85%であった。H-NMR:δ1.556 (4H,m,-CH₂CH₂-), 2.320(2H,m,-COCH₂-), 2.430 (2H, t, -CH₂CO-), 3.12-3.29 (3H, m, H-2,3,4), 3.508 (1H, m, H-5), 4.070 (1H, q, H-6), 4.310 (1H, dd, H-6), 4.640 (1H, dd, =CH₂), 4.675 (1H, d, H-1), 4.900 (1H, dd, =CH₂), 5.11-5.32 (3H, m, OH-2,3,4), 6.66 (2H, m, φ), 6.83 (2H, m, φ), 7.21(1H, q, -CH=)
また、DMF、DMSO、N-メチル-2-ピロリドン中でも上記と同様の反応条件で反応を行った。原料アルブチンは速やかにエステル化され、TLC分析からこれらの溶媒中ではモノエステルが主生成物として検出されたが、ピリジン中と異なり、ジ、トリ、テトラエステルも生成することが分かった。
実施例１−３
アルブチン6.8g、10-ウンデシレン酸ビニルエステル21gを含む76.2mlに４-ピロリジノピリジン1g（和光純薬社製）を添加し、80℃、130rpmにて24時間撹拌した。生成物をTLCで調べたところ、モノ、ジ、トリ、ポリエステルが生成していることが分かった。反応液を減圧濃縮しDMFを除去した。これをシリカゲル100gを充填したカラムに添加し、クロロホルム：メタノール（8:1）で溶出し、モノエステルを集め、濃縮し、6-O-(10-ウンデシレノイル)アルブチンの結晶を得た。収率は10%であった。13C-NMR:δ101.6 (C1), 76.4 (C2), 73.2 (C3), 70.1 (C4), 73.7 (C5), 63.4 (C6), 115.5, 117.7, 150.2 152.4 (phenol), 172.8 (C=O), 114.6, 138.9 (CH=CH₂), 24.4, 28.3, 28.5, 28.7, 33.2, 33.6 (CH₂) Anal. Calcd for C₂₃H₃₄O₈(438) : C, 63.01; H, 7.76, Found: C, 63.06; H, 7.81.
同様の方法で、各種脂肪族カルボン酸ビニルとアルブチンの4-ピロリジノピリジン存在下での反応を行った。結果を表１−２に示す。
【表２】

実施例１−４
アルブチン0.3g、アジピン酸ジビニル1gをDMF4mlに溶解し、ジメチルアミノピリジン10ｍｇを添加し、80℃で3時間撹拌した。生成物をTLCで調べたところ、モノ、ジ、トリ、テトラエステルが生成していることが分かった。反応液を減圧濃縮しDMFを除去した。これをシリカゲル100gを充填したカラムに添加し、クロロホルム：メタノール（8:1）で溶出し、モノエステルを集め、濃縮し、6-O-(ビニルアジポイル)アルブチンの結晶を得た。収率は21%であった。
実施例１−５
三角フラスコにアルブチン327mg、10-ウンデシレン酸885mgを4.0mlの1,4-ジオキサン／DMSO（＝9：1）混合溶媒に溶解し、次いで活性化したモレキュラーシーブス4Aを0.4g入れた後、カンジダアンタクティカ（Candida anterctica）由来の固定化リパーゼ（ノボザイムズ社製）40mgを添加し、40℃、130rpmにて１週間撹拌した。なお、モレキュラーシブスの活性化は電子レンジを用いた簡便法で行った。すなわち、フラスコに入れたモレキュラーシブス４Aを電子レンジで１分ほど加熱し、直後に、真空ポンプで減圧下室温まで放冷し、この操作を３回繰り返した。酵素反応生成物をTLCで調べたところモノエステルのみが生成していることが分かった。酵素反応液を濾過して、酵素とモレキュラーシーブスを除去した後、反応液を減圧濃縮した。これに4mlメタノールと2.5mlの水を加え、さらにヘキサン5mlを添加して未反応のウンデシレン酸をヘキサン層に抽出した。ヘキサンによる抽出操作を６回繰り返した後、水層をエバポレーターにて濃縮した。この濃縮液に８ｍＬの水を添加して白色沈殿を生じさせた後、遠心分離によって上清を廃棄した。この水抽出操作を３回繰り返して未反応のアルブチン、およびDMSOを除去した。回収した白色沈殿物を減圧乾燥し、287mgの粉体を得た。
この精製物を、100%酢酸エチルを用いてTLC分析した結果、未反応10-ウンデシレン酸が除去され、単一のエステル化合物が得られていることを確認した。この精製物のNMR分析を行ったところ、実施例１―１で得られたエステル化合物と同一で6-O-(10-ウンデシレノイル)アルブチンであることが確認された。
得られたエステル化合物の収率は91％であった。また、本実施例の方法は、シリカゲルカラムによる精製が必要なく、簡便であった。
実施例１−６
三角フラスコにアルブチン33mg、10-ウンデシレン酸89mgを4.0mlの1,4-ジオキサンに溶解し、次いで活性化したモレキュラーシーブス4Aを0〜15重量％入れた後、カンジダアンタクティカ（Candida anterctica）由来の固定化リパーゼ（ノボザイムズ社製）40mgを添加し、40℃、130rpmにて１週間撹拌した。なお、モレキュラーシブスの活性化は実施例１−５と同じ方法で行った。アルブチン転化率の経時変化をHPLC分析により測定した。HPLC分析条件は次の通りである。装置：島津LC-10、カラム：TSK gel Amide-80、移動相溶媒：アセトニトリル／水(＝90：10)、流速：1.0ml、検出：示差屈折。
結果を図１に示す。脱水剤であるモレキュラーシーブスを添加することによって、アルブチン転化率（反応率）が顕著に向上した。また、モレキュラーシーブスの添加濃度が多くなるほど転化率は上昇した。
実施例１−７
アルブチンを55mg〜872ｍｇ（0.05M〜0.8M）、10-ウンデシレン酸をアルブチンの4倍モル量としたこと以外は、実施例１−６と同じ方法で酵素反応を行った。アルブチン転化率の経時変化をHPLC分析により測定した。結果を図２に示す。また、アルブチンの濃度が多くなるほど反応速度は速くなり、０．６Ｍ以上では変わらない値を示した。
評価１：プロリンを用いたチロシナーゼ阻害活性評価
本発明のアルブチンエステル化合物のチロシナーゼ阻害活性について、プロリンを用いた方法で測定した（Analytical Biochemistry, 179, 375-381, 1989）。pH7.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶解した0.749MのL-プロリン40μl、0.037Mの1,2-ジヒドロキシベンゼン40μl、種々の濃度の実施例１−１で得られた6-O-(10-ウンデシレノイル)アルブチン溶液1.41mlを吸光度用キュベット中で撹拌した。ついで、350μg/mlのチロシナーゼ（マッシュルーム由来、SIGMA）溶液を10μl加え、撹拌下、吸光度の変化を10秒間525nmで測定した。同様の条件でアルブチンについても測定した。結果を図３に示す。
図３の結果に示されるように、アルブチンの6位の炭素における水酸基がエステル化されたアルブチン化合物のチロシナーゼ阻害活性は、エステル化されていないアルブチンに比べて顕著に向上していることが明らかとなった。
評価２：マウスメラノーマ細胞を用いたメラニン産生抑制作用の評価
D-MEM 10%FCS培地15mlを入れた75cm²培養フラスコに3.6×10⁵個のマウスメラノーマ細胞（B16細胞）を添加、37℃、5%炭酸ガス下にて一晩培養して細胞を接着させた後、種々の濃度の実施例１−１で得られた6-O-(10-ウンデシレノイル)アルブチンまたはアルブチンを溶かした0.1%DMSO含有D-MEM 10%FCS培地15mlと培地交換し、同条件にてさらに2日間培養した。次いで同培地15mlと培地交換を行い、同条件にてさらに2日間培養を行った。培養後、細胞を回収し、細胞の湿重量を測定した。湿重量測定後、細胞ペレットをMilliQ水に懸濁、総容量を700μlとした。これを15minの超音波破砕した後、700μlの6N 水酸化ナトリウム水溶液を添加・混合し、細胞の完全溶解・メラニン抽出を行い、吸光度（405nm）で測定を行った。尚、実験は３回行い、結果はその平均値として求めた。細胞当たりのメラニン生産性はA405測定値／細胞湿重量（μg）で表した。アルブチン未添加時の細胞当たりのメラニン生産性を100%として各濃度のアルブチンウンデシレン酸またはアルブチンのメラニン生産抑制作用を求めた。結果を図４に示す。
図４に示されるように、メラノーマ細胞を用いたメラニン産生阻害作用を調べた結果、アルブチンウンデシレン酸はアルブチンに比べて約１００倍高い阻害作用を示した。
【産業上の利用可能性】
本発明における新規アルブチンエステル化合物は、アルブチンの6位の水酸基に疎水性基を導入することにより、アルブチンと比較して、チロシナーゼ阻害活性が顕著に高まっている。また、該化合物は、疎水性基を導入することで皮膚吸収性が向上している。更に、糖エステル構造に基づくと考えられる幅広い抗菌作用、フェノール性水酸基に基づくと考えられるラジカル消去能、並びにエステル部の疎水性とアルブチン部の親水性に基づくと考えられる界面活性作用も有している。
そして、該化合物を有効成分とする本発明のチロシナーゼ阻害剤及び該阻害剤を含む外用剤は、顕著なチロシナーゼ活性阻害作用を示し、皮膚外用剤、美白用化粧剤、添加剤等として、化粧品や医薬分野において有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】モレキュラーシーブスを添加して、アルブチンエステルを製造する場合において、アルブチン転化率（反応率）の経時変化を、モレキュラーシーブスの濃度を種々に変化させて、測定した結果を示す図面である。分析はHPLCを用いて行った。
【図２】モレキュラーシーブスを添加して、アルブチンエステルを製造する場合において、アルブチン転化率（反応率）の経時変化を、アルブチンの濃度を種々に変化させて、測定した結果を示す図面である。分析はHPLCを用いて行った。
【図３】マッシュルーム由来チロシナーゼに対する、アルブチン及び実施例１で得られるアルブチンエステル化合物の阻害活性を評価した結果を示す図面である。
【図４】マウスメラノーマ細胞を用いて、アルブチン及び実施例１で得られたアルブチンエステル化合物のメラニン産生抑制作用を評価した結果を示す図面である。

Claims

一般式（２）で表されるアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（３）で表されるアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（４）で表されるアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（５）で表されるアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
一般式（６）で表されるアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｒ_２はアルキル基、又はアリール基を示す。］
一般式（８）で表されるアルブチンエステル化合物。

［式中、Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
６−Ｏ−（１０−ウンデシレノイル）アルブチンを有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
請求項７に記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤。
下記一般式（１１）〜（１５）及び（１７）のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステル化反応させる工程を有するアルブチンエステル化合物の製造方法。

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換アルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。Ｒ_２はアルキル基、又はアリール基を示す。］

［式中、Ａは水素、置換又は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ_１は単結合、アルキレン基、又はアリーレン基を示す。］
酵素触媒存在下でエステル化反応させる請求項９に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
化学触媒存在下でエステル化反応させる請求項９に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
エステル化反応させる工程が、脱水処理を行いながらエステル化反応させる工程である請求項９に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。
エステル化反応工程後、エステル化反応液中の未反応カルボン酸誘導体を、非極性有機溶媒を用いて抽出して分離する工程、次いで、過剰の水を加えて未反応アルブチンを抽出して分離するともにアルブチンエステル化合物を沈殿させる工程を有する請求項９に記載のアルブチンエステル化合物の製造方法。