JP5761743B2 - 皮膚外用剤 - Google Patents
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Description
式1で表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする。
(式1中、R1は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルであり、R 2は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を表す。)
式11乃至13のいずれかで表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする。
(材料植物)
沖縄県で採取したシノブノキ(Grevillea robusta A. Cunn.)を用いた。
(旋光度)
旋光度はP−1030(日本分光工業)デジタル旋光度計を用いて測定した。測定溶媒及び温度は各測定値に付記した。
(核磁気共鳴(NMR)スペクトル)
JEOL α−400(日本電子)核磁気共鳴装置を使用して測定した(共鳴周波数:1H NMR:400MHz、13C NMR:100MHz)。いずれも溶媒中のDシグナルをinternal lock signalとした。ケミカルシフト値の表示は内部標準物質テトラメチルシラン(TMS)からのδ値(ppm)で示し、1H NMRスペクトルにおける結合定数は括弧内にHz単位で記した。
(質量分析(MS))
HR−ESI−MSはQSTAR XL(Applied Biosystems)質量分析装置を使用した。
(赤外吸収(IR)スペクトル)
赤外吸収スペクトルはHORIBA FT−710(堀場製作所)分光光度計を使用し、フィルム法にて試料を調製し測定した。
(紫外吸収(UV)スペクトル)
JASCO V−520(日本分光工業)分光光度計を使用し、層長1cmの石英製セルを用いて測定した。測定溶媒はメタノールを用いた。
(カラムクロマトグラフィー)
順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、70−230meshのsilica gel(Merck)を使用した。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、Cosmosil75 C18OPN(NacalaiTesque)を使用した。
(高速液体クロマトグラフィー)
分取用カラムにInertsil ODS(6.0×250mm)を使用し、検出にUV975(日本分光工業)、RI−930(日本分光工業)、溶媒にメタノール−水系を用いて、流速1.6ml/minで、紫外部吸収の検出波長は254nmで行った。
(液滴向流クロマトグラフィー)
液滴向流クロマトグラフィーには、本体に液滴向流クロマトグラフ EYELA DCC−3000(東京理科機械)を使用した。分離部は内径2mm×長さ40cmのカラム管300本からなり、溶媒は固定相にクロロホルム:メタノール:水:1−プロパノール=9:12:8:2の下層を、移動相にその上層を用いて液滴上昇法にて溶出した。溶出液は5gを1フラクションとして分取した。
(簿層クロマトグラフィー(TLC))
TLCプレートとして厚さ0.25mmのsilica gel 60 F254(Merck)を使用し、クロロホルム:メタノール:水=15:6:1の混合溶媒を展開溶媒とした。プレート上のスポットはUV(254nm)照射及び10%硫酸を噴霧後、加熱し呈色させ検出した。
図1及び図2に示すスキームにしたがって、シノブノキから化合物を抽出、単離、精製した。まず、シノブノキの乾燥葉(6.37kg)をメタノールで3回(4.5L)抽出し、3.0Lに濃縮した後、ヘキサン3.0Lで抽出した。メタノール層を濃縮後、水3.0Lで懸濁し、酢酸エチル、ブタノールをそれぞれ3.0Lで連続的に抽出、濃縮し、ヘキサン層(32.6g)、酢酸エチル層(160g)、ブタノール層(405g)、水層(475g)を得た。
20〜25%メタノール溶出画分のフラクション46〜52(3.84g)を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10%メタノール1L→50%メタノール1L;linear gradient)にかけ、フラクション42〜51(198mg)、フラクション70〜98(477mg)、フラクション62〜69よりCpd6(187mg)を得た。
得られたフラクション42〜51(198mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション8〜11(19.9mg)を得た。得られたフラクション8〜11(19.9mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:1)で精製し、その保持時間3.5分のピークからCpd7(4.0mg)を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション70〜98(477mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション51〜57よりCpd9(17.0mg)を得た。
25〜40%メタノール溶出画分のフラクション53〜66(2.19g)を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10%メタノール1L→50%メタノール1L;linear gradient)にかけ、フラクション10〜15(31.0mg)を得た。得られたフラクション10〜15(31.0mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:9)で精製し、その保持時間11.5分のピークからCpd16(11.8mg)を得た。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた8〜10%メタノール溶出画分のフラクション48〜52(13.1g)のうち1.87gを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10%メタノール1L→50%メタノール1L;linear gradient)にかけ、フラクション83〜96(682mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション41〜51よりCpd27(620mg)を、フラクション52〜58よりCpd11(75.4mg)を得た。
そのうち、フラクション66〜80(164mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション17〜25よりCpd11(43.8)を得た。逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション89〜99(544mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション35〜43よりCpd27(433mg)を得た。
そのうち、フラクション69〜87(176mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション17〜22よりCpd10(70.0mg)を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション88〜99(204mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション20〜24(27.2mg)とフラクション25〜28(38.5mg)とフラクション39〜46よりCpd28(35.6mg)を得た。
そのうち、フラクション20〜24(27.2mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:3)で精製し、その保持時間15分のピークからCpd1(7.9mg)を得た。液滴向流クロマトグラフィーで得られたフラクション25〜28(38.5mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:3)で精製し、その保持時間13分のピークからCpd18(8.8mg)を、その保持時間16分のピークからCpd1(3.7mg)を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション133〜159(435mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション24〜29よりCpd23(227mg)とフラクション30〜33(52.9mg)を得た。そのうち、フラクション30〜33(52.9mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=7:13)で精製し、その保持時間19分のピークからCpd8(6.2mg)を得た。
そのうち、フラクション70〜88(273mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション12〜18(130mg)とフラクション19〜23(64.7mg)をえた。
そのうち、フラクション12〜18(130mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:4)で精製し、その保持時間10分のピークからフラクション1(33.8mg)を、その保持時間13分のピークからフラクション2(27.7mg)を得た。
そのうち、フラクション1(33.8mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:4)で精製し、その保持時間10分のピークからCpd20(3.8mg)を、その保持時間13分のピークからCpd20(5.4mg)を得た。
高速液体クロマトグラフィーで得られたフラクション2(27.7mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:4)で精製し、その保持時間10分のピークからCpd20(8.7mg)を、その保持時間13分のピークからCpd2(7.0mg)を、残渣から11.2mgを得た。
高速クロマトグラフィーで得られたフラクション2(7.0mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:4)で精製し、その保持時間8分のピークからCpd4(1.0mg)を、その保持時間13分のピークからCpd20(4.5mg)を得た。
高速クロマトグラフィーで得られた残渣(11.2mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:4)で精製し、その保持時間8分のピークからCpd4(0.9mg)を得た。
液滴向流クロマトグラフィーで得られたフラクション19〜23(64.7mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション14〜16からCpd5(12.2mg)を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション100〜115(458mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション23〜27よりCpd3(175mg)とフラクション15〜22(130mg)とフラクション28〜35(66.1mg)を得た。
そのうち、フラクション15〜22(130mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:4)で精製し、その保持時間45分のピークからCpd12(18.8mg)を得た。
そのうち、フラクション28〜35(66.1mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=3:17)で精製し、その保持時間35分のピークからCpd29(20.9mg)を得た。
得られたフラクション130〜144(198mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション11〜15(70.9mg)を得、さらにそれを高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=3:7)で精製し、その保持時間18分のピークからCpd19(20.1mg)を得た。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた8〜10%メタノール溶出画分のフラクション40〜47(10.2g)のうち1.80gを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10%メタノール1L→50%メタノール1L;linear gradient)にかけ、フラクション147〜164(1.04mg)を得た。
フラクション147〜164(1.04mg)のうち656mgを液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション83〜93(20.3mg)とフラクション99〜108よりCpd13(224mg)を得た。
フラクション83〜93(20.3mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=1:1)で精製し、その保持時間9分のピークからCpd17(9.3mg)を得た。
そのうち、フラクション158〜170(525mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション92〜114(264mg)を得た。フラクション92〜114(264mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=3:7)で精製し、その保持時間10分のピークからCpd27(5.0mg)を、その保持時間12分のピークからCpd22(2.0mg)を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション171〜180(297mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション37〜40よりCpd26(19.5mg)とフラクション41〜51(153mg)を得た。
得られたフラクション41〜51(153mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=3:11)で精製し、その保持時間8分のピークからCpd15(11.8mg)を得た。
フラクション129〜138(167mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション21〜27よりCpd23(23.9mg)を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション175〜182(170mg)を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション28〜35(31.6mg)を得た。
得られたフラクション28〜35(31.6mg)を高速液体クロマトグラフィー(メタノール:水=2:3)で精製し、その保持時間24分のピークからCpd14(11.8mg)を得た。
上記のようにして単離したCpd10〜Cpd28を用い、メラニン産生抑制活性試験及びチロシナーゼ活性阻害試験を行った。
抑制率(%)=
[1−(Asample−Ablank)/(Acontrol−Ablank)]×100
Ablank:cell−free wellの吸光度
Acontrol:DMSOのみ
抑制率(%)=
[1−(Asample−Ablank)/(Acontrol−Ablank)]×100
Ablank:チロシナーゼ添加前の吸光度
Acontrol:DMSOのみ
メラニン産生抑制活性試験の結果を表7に示す。
Claims (3)
- 式1で表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする皮膚外用剤。
(式1中、R1は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルであり、R 2は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を表す。) - 式11乃至13のいずれかで表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする皮膚外用剤。
- 前記化合物がシノブノキから抽出された化合物である、
ことを特徴とする請求項2に記載の皮膚外用剤。
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