JPH04500162A - 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規ｄｎａ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法 - Google Patents

組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規ｄｎａ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２３、請求項２２に記載の酵母細胞。
２４、請求項２２又は２３で記載された細胞が培養され、タンパク質が培地から 回収される、異種タンパク質の製造方法。
２５、　細胞が酵母細胞である、請求項２４に記載の方法。
２６、タンパク質がヒルジンである、請求項２４又は２５に記載の方法。
２７、タンパク質が昆虫デフエンジンである、請求項２４又は２５に記載の方法 。
明　細　書 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコー ドする配列として新規ＤＮＡ断片の適用、発現カモ２ト、形質転換酵母及びそれ に対応するタンパク質の製造方法 本発明は、新規ＤＮＡ断片、及び真核（動物又は植物）又は原核（細菌）細胞、 更に詳しくはサツカロミセス（Ｓｉｃｃｈａ＋ｏｍ、７ｃｅｓ）株のような酵母 による異種タンパク質の分泌に関して有用なシグナルペプチドについてコードす るＤＮＡ断片としてのそれらの用途に関する。
組換えＤＮＡ技術による異種タンパク質の製造に際して通常追求される目的の１ つは、異種タンパク質を合成する細胞の培地中に分泌される産物の産生である。
実際上、特に大量産生用として産業上重要なタンパク質の製造の場合において、 それが成熟形として産生されるタンパク質について望ましい性質を留めているこ と、即ちタンパク質に融合されて留まっているいずれのアミノ酸又は付加ペプチ ド配列もないことが望ましい。更に、回収及び精製操作を容易化させるためには それが培地中に分泌されることが有利である。
細胞、特に真核細胞から分泌されるタンパク質は、成熟タンパク質に相当する断 片（活性形）と、ｐｒｅ”断片として知られ、シグナルペプチドとも称され、細 胞によるタンパク質の分泌メカニズムに関与するＮ末端断片とを含むポリペプチ ド前駆体の形で極めて一般的に合成される。加えて、このポリペプチド前駆体は “ｐｒｏ”断片と称される１以上の付加断片も含むことができる。
後者の場合において、ポリペプチド前駆体は“ｐｒｅｐｒｏ”前駆体又は第一前 駆体とも称される。
“ｐｒｏ″断片は大多数の場合においてシグナルペプチドと成熟タンパク質に相 当する断片との間に挿入されるが、但しこれは絶対的ルールではない。
シグナルペプチドは（１）細胞膜中へのタンパク質の挿入、（２）細胞膜を介す るタンパク質の移動又は（３）小胞体を介するタンパク質の分泌目的のため細胞 の小胞体中へのタンパク質の侵入を開始させる。シグナルペプチドがその機能を 果たすと、通常タンパク質加水分解開裂により分断されて、第一前駆体と同様に 生物活性を有しないか又は成熟タンパク質の完全生物活性を有しない“ｐｒｏ” 前駆体と称される第二前駆体あるいは成熟タンパク質を遊離する。
“ｐｒｏ”断片はそれがタンパク質の活性を阻止又は修正しているかぎり有用で あり、それによってタンパク質で生じうる毒性作用から細胞を保護できるか又は 生じうる修正もしくは分解からタンパク質を保護できる。それは分泌メカニズム にもある程度関与しうる。分泌プロセスの最後において、第二前駆体のｐｒｏ” 断片はタンパク質分解開裂により分断されて成熟タンパク質（活性形）を遊離す る。
・ｐｒｅ”断片と“ｐｒｏ”断片との結合部並びに“ｐｒｏ”断片と成熟タンパ ク質に相当する断片との結合部に、タンパク質が合成される細胞のプロテアーゼ の１つによって認識されるタンパク質分解開裂部位が存在する。このタンパク質 分解開゛裂部位は、“ｐｒｏ”前駆体においてプロテアーゼに接近可能であるが 、但しそれが成熟タンパク質に相当する断片中に存在する場合には接近不可能な ２．３又はそれ以上のアミノ酸の配列（以下、タンパク質分解配列と称される） から通常なる。明らかに３つのケースが可能であり、“ｐｒｅ”及び“ｐｒｏ” 断片の結合に関し以下で説明されている一一プロチアーゼは配列の開始部で切断 し、したがってタンパク質分解配列は“ｐｒｏ”断片で読取られねばならない； ・プロテアーゼは配列の末端で切断し、したがってタンパク質分解配列は“ｐｒ ｅ”断片で読取られねばならない；又は −プロテアーゼは配列の中間で切断し、したがってタンパク質分解配列は“ｐｒ ｅ”及び“ｐｒｏ”双方の断片で読取られねばならない。
これらの考慮事項は、“ｐｒｏ”断片と成熟タンパク質に相当する断片との結合 部に位置する開裂部位にも当然同様に該当する。
遺伝子工学法による合成前駆体の組立てのために可能なアプローチは、天然断片 （即ち自然界に存在する）を用いること、断片と組合せて新しいタンパク質分解 開裂部位を再形成させるようにあるアミノ酸又は新しいタンパク質分解開裂部位 を適切な箇所に挿入することであるが、この新しい開裂部位は合成前駆体が発現 される細胞のプロテアーゼの１つにより当然認識される。
合成タイプ及び前記分泌方法に関する例は、α因子（ＭＦα１又はＭＦα２遺伝 子でコードされる）とも称されるα性フェロモンＳ、セレビシアエ（Ｓ、　ｃｅ ＋ｅｖｉ＋１ａｅ）酵母のケースで説明される。α因子は）ｉｕｒｊａｎ及びＨ ｅ　ｒ　ｓｋｏｗｉ　ｌｚ、　Ｃｅ　ｌ　ｌ　（１９８２）　３０　：９３３で 記載されるように実際上“ｐｒｅｐｒｏ”前駆体の形で合成される。α因子の前 駆体の“ｐｒｅ”断片のアミノ酸配列はＭｅｔ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐ＋ｏ−３ｅ ｒ−１１ｅ−Ｐｂｅ−Ｔｂｒ−Ａｌｘ−Ｖａ　１−ＬｅＩＩ−Ｐｈｅ−＾１ａ− ＾１ａ−３ｅｒ−Ｓｅ＋−Ａｌｘ−Ｌｃｕ−Ａｌａであり、一方α因子の前駆体 の”ｐ　ｒ　ｏ”断片の場合は＾Ｉｔ−Ｐ＋ｏ−Ｍａｌ−人５ｎ−Ｔｂｒ−Ｔｂ ｒ−丁ｂｒ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−Ｔｂｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｒ ｏ−＾１ａ−Ｇｉｎ−＾Ｉａ−Ｖｉｌ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔ７ｒ−５ｅｔ−＾＋ ｐ−Ｌｃｕ−Ｇｌｕ−Ｇ１７−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａ ｌ−Ｌｅｏ−Ｐ＋ｏ−Ｐｂｅ−８ｃｒ−＾５ｎ−５ｅｔ−Ｔｂｒ−Ａｓ＊−＾５ ｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−！１ｔ−Ａｓｎ−Ｔｈ＋−Ｔｂ＋−１１ ｅ−＾Ｉａ−８ｅｒ−１１ｅ−Ａｌａ−Ａｌｘ−Ｌ７ｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＧＩ ７−Ｖａｌ−９ｅｒ−Ｌ！ｕ−Ａｓｐである。
意外にも、Ｎ末端がアミノ酸配列：　Ａｔｇ−Ｐｈｅ−３ｅｔ−Ｔｂｒ−Ｔｈｒ −Ｌｅｕ−＾１ｌ−Ｔｈｒ−＾１１−＾１ａ−Ｔｈｒ−Ａｌｘ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ −Ｐｈｅ−７ｂ＋−Ａｌａ−３ｅｔ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ａ１１を有する 酵母酵素の前駆体のＮ末端及びこのＮ末端の異なる変異体は異種タンパク質の分 泌に関するシグナルペプチドとして用−゛うることがここに判明した。“異種タ ンパク質”とは、宿主細胞で自然に産生されないか又は宿主細胞に由来しない配 列でコードされたタンパク質を意味する。
これによれば、本発明の主題は、アミノ酸配列がアミノ酸配列（１）又は（ｌｌ ）、好ましくは配列（１１）と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％ の相同度を示すペプチドについてコードする単離されたＤＮＡ断片である。配列 （１）及び（１１）は下記のとおりである：（１）＾ｒｇ−Ｐｂｅ−Ｓｅｒ−Ｔ ｂ＋−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｂｒ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｔｂｒ−＾１ｘ−Ｌ ｅｏ−Ｐｂｅ−Ｐｂｅ−Ｔｈｒ−＾１ｘ−３ｅｔ−Ｇｌｎ；（Ｉ　Ｉ）　Ａｒｇ −Ｐｈ！−Ｓｅ　ｒ−Ｔｈ　＋−Ｔｂｒ−Ｌｅｌｌ−Ａ１ｇ−Ｔｈ　＋−Ａ　ｌ 　ａ−Ａｔ　ａ−Ｔｂ　ｒ−Ａｌｘ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｂｒ−Ａｌｌ −３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖｘｌ−Ｓｅ＋−Ａｌａ　０“単離されたＤＮＡ断片”とは 、特にＫｉｅｂｌ　＆　Ｔａｎｎ化１、　ＢｘｃＬ、　Ｎｏｙ　１９ｇ９．１７ に６２５９で記載されるように、３′末端がβ−１，３−グルカナーゼ活性を有 する酵素についてコードするＤＮＡ断片と共有結合で結合されていないＤＮＡ断 片を意味する。
更に詳しくは、本発明のＤＮＡ断片は下記アミノ酸配列（ＩＩＩ）・ （ＩＩＩ）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｔｂｒ−Ｔｈｒ−Ｒ４−山−Ｔｈ＋−Ａｌａ−山 −Ｔｂｒ−山−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｂｒ−Ａｌａ−Ｒ５−Ｒ６＋０　１ ５　１９ 〔上記式中Ｒ１はＡｒｇ及びＬＹ；から選択されるアミノ酸である；Ｒ及びＲ６ は各々独立してＡｌａ　、Ａｓｎ　、Ｃｙｓ　。
Ｇｌｎ　５Ｇ１７　、Ｈｉｓ　、　ｌｔｅ　、　Ｌｅｕ　、　Ｍｅｔ　、Ｐｂｅ 　５Ｐｒｏ、ｂｒ　、　Ｔｈｒ　ＳＴ＋ｐ　５Ｔ７ｒ及びＭａｌから選択される アミノ酸である；Ｒ及びＲ５は各々独立して川、Ｇｌｙ　。
Ａｓｎ　、Ｐｒｏ及びＳｅｔから選択されるアミノ酸である；Ｒ４はＶｓｌ　、 Ｌｅａ　、　Ａｌｉ　、Ｃ７ｓ　、　Ｐｈｅ　、　Ｉｌｅ及びＭｅｔから選択さ れるアミノ酸である〕 を含むペプチドについてコードする。
好ましくは、本発明のＤＮＡ断片は下記アミノ酸配列（ＩＶ）： （ＩＶ）　Ｒ１−Ｒ２−Ｒａ　”Ｔｂｒ−Ｔｈｒ−Ｒ４−Ａｌａ−Ｔｈｒ−由一 山−Ｔｈｒ−山−Ｌｅａ−Ｐｂｅ−Ｐｈｅ−Ｔｂｒ−＾１ａ−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７ 〔上記式中Ｒ１はＡｒｇ及びＬｙｓから選択されるアミノ酸である；Ｒ及びＲ６ は各々独立して山、Ａｓｎ　、　Ｃｙｓ　。
Ｇｉｎ　５ＧＩ７　、　Ｈｉｓ　−、ｌｌｅ　、　Ｌｅｌｌ、Ｍｅｔ　、Ｐｈｅ 　、　Ｐｒｏ　。
Ｓｔｒ　、　Ｔｂｒ　５ＴＩｐ−、Ｔ７ｒ及びＬａｉから選択されるアミノ酸で ある；Ｒ及びＲ５は各々独立して＾呻、ｃｌｙ　ｓ八＄”　ｓ　Ｐｒｏ及びＳｅ ｔから選択されるアミノ酸である；Ｒ４はＭａｌ　、Ｌｅｌｌ、山、Ｃ７ｓ　５ Ｐｈｅ　ｓ　ＩＩｇ及びＭｅｔから選択されるアミノ酸である；Ｒ７はタンパク 質分解配列である。Ｒ７は好ましくはタンパク質分解配列Ｒｓ　−Ｒ−Ｒである （式中Ｒ８は山、Ｖａｌ　％　Ｓｅｒ　ｓ　ＣＨ−。
ＧＩ７　、　Ｉｌｅ　、　Ｌｅｅ及びＴｈｒから選択されるアミノ酸であるｉ　 Ｒ９はＡ１１、Ａｒｇ　５Ｃｙｓ　、Ｇｌｎ　、　ＧＩ７　、　ｆｌｉｔ　ｓ山 、Ｌｅａ　、　Ｍｅｔ　、Ｐｈｅ　、　Ｐｒｏ　ＳＳｅ＋　、　Ｔｂｒ　５Ｔｔ ｐ　、丁７ｒ及びＶｘｌから選択されるアミノ酸である；ＲｌｏはＡｌｇ　、Ｃ ７ｓ　。
Ｇ１７５Ｌｅｅ　、Ｐｒｏ　、　Ｇｌｎ　、　Ｓｔｒ及びＴｂｒから選択される アミノ酸である）〕 を含むペプチドについてコードする。
本発明によると、好ましいＤＮＡ断片は下記アミノ酸配列ｍ、（ｖｌ）、（Ｖｌ ｌ）及び（Ｗｉｌｌ）から選択されルアミノ酸配列を含むペプチドについてコー ドする：（Ｖ）　Ａｒｇ−Ｐｈｅ−９ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅａ−＾１ｍ− Ｔｂｔ−＾１ｇ−Ａｌａ−丁ｈ＋−＾１ｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｂｒ− Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｎ；（ｖ＋）＾＋ｇ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｔｂｒ−Ｔｂ＋− Ｖａｌ−＾１ａ−Ｔｈ＋−＾１１−＾１ａ−Ｔｈ＋−＾１ｘ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ− Ｐｂｅ−Ｔｂｒ−Ａｌａ−５ｕ−Ｇｌｎ；（Ｖｌｌ）Ａｒｇ−Ｐｂｅ−３ｅｔ− Ｔｂｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌｉ−Ｔｈｒ−＾１ｍ−＾１ｉ−Ｔｈｒ−山−Ｌｅ ｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｂｒ−山−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｒ７（式中Ｒ７は前記と同 義である）；及び （Ｗｉｌｌ）　Ａｔｇ−Ｐｈ！−Ｓｅ＋−ＴｈｒＴｈｒ−Ｖｘｌ−Ａｌａ−Ｔｈ ｒ−Ａ１１−＾１ａ−Ｔｂｒ−山−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｂｅ−Ｔｂｒ−山−Ｓｅ ＋−Ｇｌｎ−Ｒ（式中Ｒ７は前記と同義である）。
絶対的に好ましくは、Ｒ７はＲ８カ由１、Ｒ９がＳｅｒ及びＲｌＧが山の配列で ある。
非常に特に好ましくは、本発明のＤＮＡ断片はそのヌクレオチド配列として下記 配列（ＩＸ）、（Ｘ）　、（ＸＩ）及び（Ｘｌｌ）のうち１つを有している： （ＩＸ）　ＣＧＴ　ＴＴＣＴＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＧＴＣＧＣＴ　ＡＣＴ　Ｇ ＣＡ　ＧＣＴ　ＡＣＴＧＣＧ　ＣＴＡ　ＴＴＴ　ＨＣＡＣＡ　ＧＣＣＴＣＣＣＡ Ａ（Ｘ）　ＣＧＴ　ＴＴＣＴＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＣＴＣＧＣＴ　ＡＣＴ　Ｇ ＣＡ　ＧＣＴ　ＡＣＴＧＣＧ　ＣＴＡ　ＴＴＴ　ＴＴＣＡＣＡ　ＧＣＣＴＣＣＣ ＡＡ（ＸＩ）　ＣＧＴ　ＴＴＣＴＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＧＴＣＧＣＴ　ＡＣＴ 　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＡＣＴＧＣＧ　ＣＴＡ　丁ＴＴ　ＴＴＣＡＣＡ　ＧＣＣＴＣ ＣＣＡＡ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＣＴ（Ｘｌｌ）　ＣＧＴ　ＴＴＣＴＣＴ　ＡＣＴ 　ＡＣＡ　ＣＴＣＧＣＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＡＣＴＧＣＧ　ＣＴＡ　Ｔ ＴＴ　ＴＴＣＡＣＡ　ＧＣＣＴＣＣＣＡＡ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＣＴ本発明のＤ ＮＡ断片でコードされるペプチドは、３位のアミノ酸と１８位のアミノ酸との間 にα−へリックス構造を有する疎水性領域を含んでいる。この構造はシグナルペ プチドとしてそれらを使用に適したものにさせる上で役立つ。シグナル配列の疎 水性部分は、主にアミノ酸＾Ｉｎ　、Ｃ７ｓ　、　Ｐｈｅ　、　ｌｌｅ　、　Ｌ ｅａ　、　Ｍｅｔ及びＶａｌから構成されることが知られている。したがって、 アミノ酸の一部修正でシグナルペプチドがその役割を果たしうる能力に修正を起 こさないことを予測することも可能になる。
したがってもう１面において、本発明は異種タンパク質が合成される宿主細胞で の異種タンパク質の分泌に関して有用なシグナルペプチドについてコードするＤ ＮＡ断片として本発明のＤＮＡ断片の適用を提案している。
一般的に言えば、本発明は原核又は真核細胞、好ましくは後者で実施される。真 核細胞とは、例えば哺乳動物又は酵母細胞である。絶対的に好ましくは、本発明 の断片でコードされるシグナルペプチドを用いた異種タンパク質の分泌は、例え ばサツカロミセス属、更に詳しくはＳ。
セレビシアエ種の酵母細胞で実施される。
当然ながら、シグナルペプチドについてコードするＤＮＡ断片として本発明のＤ ＮＡ断片は翻訳開始コドン、通常メチオニンについてコードするコドン、特ニＡ ＴＧによって前置される。
本発明のＤＮＡ断片はタンパク質発現用カセットの組立てに用いてもよいが、そ の断片は開始コドンで前置されており、単独であるか又は他の成分、例えば“ｐ ｒｏ”断片と組合されている。これらのＤＮＡ断片は当業者に公知の技術による オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いた化学合成で製造してもよい。
本発明は、異種タンパク質のシグナルペプチドについてコードするＤＮＡＷｆｒ 吟として本発明のＤＮＡ断片を含む異種タンパク質発現用カセットにも関する。
詳しくは、成熟異種タンパク質の分泌に必要な情報を含んだ本発明の発現カセッ トは、少なくとも。
ａ）転写及び翻訳開始シグナルを含むＤＮＡ断片ｂ）本発明のＤＮＡ断片及び　 ・ Ｃ）成熟異種タンパク質についてコードするＤＮＡＥ片（翻訳終結コドン含有） を順次含んでいる。
東−変異体において、断片ｂ）と断片Ｃ）との結合部に、発現及び分泌プロセス の最後に成熟タンパク質を遊離させるようなタンパク質分解開裂部位につ（・て コ・・ドするＤＮＡ配列が存在するかぎり、断片ｂ）は断片Ｃ）と枠内で直接融 合させてよい。好ましくは、タンパク質分解開裂部位についてコードするＤＮＡ 配列は断片ｂ）上で読取られる。
第二変異体において、本発明の発現カセットは“ｐｒｏ”ペプチド断片について コードするＤＮＡ断片ｂ’りを更に含んでいる。一方で断片ｂ）及びｂ’）　と 他方で断片ｂ’）及びＣ）との結合部にタンパク質分解開裂部位についてコード するＤＮＡ配列が存在するかぎり、この断片ｂ’）は断片ｂ）及び断片Ｃ）と枠 内で融合される。
多数の断片ｂ’）が本発明のカセットで使用可能である。
特に、様々な断片ｂ’）が合成で組立てられる。例えば、α因子の前駆体の“ｐ ｒｏ”断片についてコードするＤＮＡ断片からの合成断片ト′）の組立ては以下 で記載されている。この配列は全体でも又は一部として用いてもよい。具体例に おいて、この配列は“ｐｒｏ”断片中３〜４２位のアミノ酸についてコードする 部分、即ちＡｌａ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌ　７−Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｐｂ　ｅ−１１ ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈ　ｒ＝Ｔｈ　＋−１１ｅ−Ａ　Ｉ　ａ−３ｅ　ｒ−１１ｅ−Ａ ｌｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｏ−Ｇｌｕ−ＧＩｙＪ’ａｌ−３ｕ−Ｌｅｉ−Ａｓ ｐについＣコードする配列の欠失後に用いられる。断片ｂＭを形成させるため、 後者のＤＮＡ配列の後に（１）タンパク質分解開裂部位を含むペプチド又は（２ ）タンパク質分解開裂部位についてコードする配列を続けるが、後者の態様が好 ましい。最も詳シ、＜は、後者の開裂部位はＬｙｓ−Ａｒｇ又はＡｔａ−ＡＢで あるが、これはＫＥＸ２遺伝子でコードされかつジペプチドＬｙｓ−Ａ＋Ｈ又は ＾ｒｇ−ＡｒｇのＣ末端で切断する酵母ｙｓｃＦエンドペプチダーゼで認識され る。要するに、具体的断片ｂ’）はＡｔａ−Ｐｒｏ’−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｓｈ−Ｔ）＋＋−Ｔ）ｕ−！Ｉｅ−Ａｌａ−８ｅｔ−１１ｅ −Ａｌａ−＾１ａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖｌ−３ｅ＋−４ｅｎ− Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｔａに〜・）いてコードする。
配列ａ）は、断片（′−）でコードされる異種タンパク質を合成する上で望まし 、い細胞内Ｃ機能性であるプロモーター、好まＩ７＜は酵母内で機能性であるプ ロモータ・−を特に含んでいる。例えば、ＰＧＫ、ＥＮＯｌ及びＭＦαｊプロモ ー　ター又＋、！　Ｐ　）Ｉ　Ｏ５及びＧ　Ａ　Ｉ、　］のような誘導プロモー ターのように、異種タンパク質についてフードする遺伝子の転写で機能性が確認 された酵母の構成プロモーターが挙げられる。例えば酵母のＭ　Ｆａｌ遺伝子の 要素が登用カセットで用いられる場合には、λ１Ｆα］遺伝子のプロモーターが 使用可能である。
最後に、発現カセットは好ましくは酵母内で機能性である転写終結シグナルを含 むＤＮＡ断片ｄ）、例えばＰＧＫ遺伝子の断片も含むことができる。
一般的に言えば、本発明の発現カセットは原核又は真核細胞、好ましくは哺乳動 物又は酵母細胞のような真核細胞中に導入されるが、酵母細胞が特に最も好まし い。
この導入は酵母のゲノムに直接導入される組込み用構造中に又は自己複製プラス ミド中にカセットを入れて、双方のケースで形質転換細胞を得るように実施して もよい。
プラスミドが自律的である場合には、分布及び複製のための要素、例えば酵母の ２μプラスミドの場合のような複製源を含む。加えて、プラスミドはｕ　ｒ　ａ 　３又は１ｅｕ２酵母を補完するＵＲＡ３又はＬＥＵ２遺伝子のような選択要素 を含んでいてもよい。特に、欠失されたそのプロモーターからのＵＲＡ３遺伝子 （ＵＲＡ３−　ｄ）が有利に用いられる。
これらのプラスミドは、プラスミドがシャトルプラスミドでなければならない場 合、細菌内でそれらを複製するための要素、例えばｐＢＲ３２２の場合のような 複製源、ＡｍｐＲのような選択マーカー遺伝子及び／又は当業者に公知の他の要 素も含んでいてよい。
前記のように、本発明はプラスミドに挿入された又は細胞のゲノムに組込まれた いずれかの（１）本発明のＤＮＡ断片又は（２）本発明の発現カセットにより形 質転換された細胞にも関する。
プロモーターがＭＦα１遺伝子の場合であるとき、形質転換された酵母細胞はＭ ＡＴα接合型であることが好ましい。例えば、適切な選択圧力で酵母内にプラス ミドを維持するためプラスミドで補完された遺伝子型ｕｒａ３又は１ｅｕ２の株 が用いられる。
ｊ：Ｌ後に、本発明の主題は本発明の細胞が培養されてタンパク質が培地から回 収されることを特徴とする異種タンパク質の製造方法である。このプロセスはい かなる異種タンパク質の製造にも適用される。これらのタンパク質の中では、ヒ ルジン又はデフエンジン類、例えばデフエンジンＡが特に挙げられる。
更に詳しくは、本発明は本発明の形質転換酵母株からの成熟形ヒルジンの分泌方 法に関する。
本発明は最も具体的にはヒルジンの産主にうまく適用され、この理由から本発明 について説明する例の１つはこのタンパク質に関する。実際上、主供給源が医用 ヒルの唾液腺であるヒルジンがトロンビンの非常に特異的かつ非常に有効な阻害 剤である。したがって、それは、臨床的使用上非常に高純度の産物を要求し、こ のため遺伝子工学産生用の有利な候補である、非常に有利な治療剤である。
ＨＶＩ、ＨＶ２及びＨＶ３と命名されたヒルジンのいくつかの自然変異体が同定 された。次いで、これらの自然変異体及び他の類似体が例えば本出願人名の欧州 特許公開ＥＰ−Ａ−２００．６５５号及びＥＰ−Ａ−２７３゜８００号明細書で 記載されているように種々の宿主細胞中で遺伝子工学によって産生された。大腸 菌（Ｅｓｃｂｅ＋ｉｃｈｉｍ　ｃｏｌｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ））及びＳ、セレビシア エ属の酵母で合成されたヒルジンの比較では、大腸菌で合成されたヒルジ〉が細 胞内に留まり、このため非常に多数の大腸菌ポリペプチドから精製されねばなら ないことを示した。したがって、成熟形で分泌されるヒルジンを得るように酵母 内でヒルジン遺伝子を発現させ、ヒトに対して発熱原性又は毒性の物質を酵母で 産生させないことが特に有利である。
このため本発明はすべてのヒルジン分子、即ちヒルジンの自然変異体自体又は１ 以上の変異を生じたが抗血栓活性を留めたヒルジンにも関するが、後者のタイプ の変異体はアナログと称される。下記例は既に記載された特許公開ＥＰ−Ａ−２ ７３．８０００号明細書で記載されているｒＨＶ２Ｌｙｓ４７　（４７位のアミ ノ酸Ａｓｐがアミノ酸Ｌｙｓに変異した組換え変異体ＨＶ２）と命名されたアナ ログについて更に詳細に関する。
本発明はデフエンジン類の産生にも関する。フォルミシン類としても知られるデ フエンジン類は、グラム陽性微生物に対して殺菌活性を有するある昆虫双翅類の 血リンパから本来抽出されるペプチドである。これらのデフエンジン類は欧州特 許出願ＥＰ−Ａ−３４９，４５１号明細書で更に詳細に記載されている。デフエ ンジンＡはその配列としてＡｌｘ−Ｔｂ＋−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｉ− ３ｅｒ−ＧＩＹ−Ｔｂ＋−Ｇｌ７−１１ｅ−＾＄ｎ−旧５−５ｅｔ−Ａｌｔ−Ｃ ７ｓ−＾１ｌ−Ａｌｌ−旧５−Ｃ７ｓ−ＬｅＩｌ−Ｌｅｙ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　Ｉ　 ７−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌ７−Ｇｌ　ｙ−Ｔ　７　ｒ−Ｃｙ　５−Ａｓ　ｎ−Ｇ 　ｌ　７−Ｌ７５−Ｇｌ７−Ｖｓ　ｌ−Ｃ７ｓ１−Ｃ７ｓ−Ｖａｔ−Ｃ７ｓ−Ａ ｒを有する基本ペプチドである。デフエンジンＢは３２位のアミノ酸のみがデフ エンジンＡと異なり、アルギニンがグリシンに代わっている。
下記例で本発明の他の特徴及び利点を明らかにできる。
これらの例は下記図面で説明される。
−図１はプラスミドｐＴ０２９５８の概略構造について示す。
一図２はベクターＭ１３ＴＧ３８３９及びＭｌ　３ＴＧ３８４１の概略構造につ いて示す。Ｍ１３７Ｇ３８３９の場合に端部の斜線枠はＭ１３ＴＧ１０３、Ｍ１ ３ＴＧ３８４１の場合はＭ１３７Ｇ３１４９に相当する。
−図３はベクターＭ１３７Ｇ３８４５の概略構造について示す。斜線枠はＭ１３ ７Ｇ３１４９に相当する。
−図４はプラスミドｐＴＧ３８２８の概略構造について示す。
一図５はプラスミドｐＴＧ３８６４の概略構造についｐＴＧ３８６７、ｐＴＧ３ ｇ９４及び ｐＴＧ３８８４の組立て Ａ、ベクターＭ１３７Ｇ３８４５の組立てプラスミドｐＴ０２９５８　（図１） は欧州特許公開ＥＰ−Ａ−２５２．８５４号明細書で記載されたプラスミドｐＴ Ｇ１８３３とほとんど異ならず、ｒＨＶ２Ａｓｐ４７に関するコード配列を有す る。プラスミドｐＴＧ２９５８は人工的に導入されるＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ制 限部位を含んでいない。プラスミドｐＴＧ２９５８は以下を含んでいるニ ーＭＦα１遺伝子の５′領域に相当する１２１７塩基対（プロモーター、シグナ ルペプチドについてコードする配列、“ｐｒｏ”領域及びペプチドＬｙｓ−Ａｒ ｇについてコードする配列を含む）及び４塩基対（Ｂｇｌｌ＋’部位；フレノウ 処理）の断片 −ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７の相補的ＤＮＡを含む２３４塩基対の断片 一酵母のＰＧＫターミネータ−を含む２４３塩基対の断片 −特にこのプラスミドの複製源及びアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２ のＰｖｕｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片（２２９２塩基対） −ＰｓｔＩ部位に挿入された欠失形として酵母のＬＥＵ２遺伝子を含む酵母（Ｂ 形）の２μプラスミドのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ！Ｉ断片 一酵母のＵＲＡ３遺伝子のＨｉ　ｎｄｌｌｌ　−Ｓｍａ　Ｉ断ＬＥＵ−２ｄ、２ μ及びＵＲＡ３配列を有するベクターｐＴＧ２９５８のＮｅｏ　Ｉ−Ｎｃｏ　Ｉ 断片を欧州特許公開ＥＰ−Ａ−２６８．５０１号明細書で記載されたｐＴＣ２３ Ｑ　ＯのＮＣＯ！　’　Ｆ！　ＣＯ■断片で置き換えるが、これはプロモーター が欠失されたＵＲＡ３遺伝子（ＵＲＡ３−　ｄ）及び２μプラスミドの配列を有 しており、ｐＴＧ２８７７を生じる。
ベクターＭ１３ＴＧ３８３９　（図２）をＭ１３７Ｇ１０３　［Ｋｉｅｎ７．Ｍ 、　Ｐ、、　ｅｌＩ＋、　（１９Ｈ）Ｇｅｎｅ、　２６．９１−９９３から誘導 し、ｐＴＧ２８７７のＨｉ　ｎｄｌｌｌ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片を同部位に導入 する。５ａｌＩ制限部位を下記オリゴヌクレオチド：　５’　ＣＡＡＴＧ＾ＡＡ ＡＡＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＡＡＴＣＡＴＡＧを用いた特定変異誘発によりｒ ＨＶ２Ｌｙｓ４７についてコードする領域の翻訳終結コドンから下流でこのベク ター内に導入し、Ｍ１３ＴＧ３８３９Ｓａｌｌを得る。次いでｓｐｈ　Ｉ制限部 位を下記オリゴヌクレオチド：５’　ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＡＧ＾＾ＴＴＧＧＣ ＡＴＧＣＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＧを用いた特定変異誘発により発 現カセットから上流で導入すると同時にＵＲＡ３−　ｄ配列を除き、Ｍ１３７Ｇ ３８４０を得る。
ベクターＭ　１３　ＴＧ　１３１　（Ｋｉｅｎ７．Ｍ、Ｐ、、　ｅｌ　１１．　 （１９１１３）Ｇｅｎｅ、　２６．９］−９９）をＰｓｔｌで開裂させ、末端を ＤＮＡポリメラージーのフレノウ断片による処理でプラント化し、しかる後それ を自らと再結合させ、Ｍ１３７Ｇ３１６０を得る。次いでこのベクターをＳｍａ 　Ｉ及びＥ。ｏＲＶで開裂し、しかる後再結合させ、Ｍ１３７Ｇ３１４９を得る 。
ｒＩ！Ｖ２ＬｙＳ４７発現カセット（転写終結配列なし）を有するＭ１３７Ｇ３ ８４０　（前記）の５ｐｈＩ−ｓｐｈ　Ｉ断片をＭ１３７Ｇ３１４９のｓｐｈ　 Ｉ　−５ｐｈ　Ｉ部位に導入し、Ｍ１３７Ｇ３８４１を得る（図２）。
ＭＦα１の前駆体の“ｐｒｏ”断片における３〜４２位のアミノ酸についてコー ドする配列を特定変異誘発でＭ１３ＴＧ３１４９から除去し、Ｓｍａ　Ｉ制限部 位を下記オリゴヌクレオチド： ５’　ＣＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴ ＾＾ＡＴを用いて導入し、欠失“ｐｒｏ”配列と以下称されるものを得る。
Ｍ１３ＴＧ３８４２をこれにより得る。α因子の前駆体のＡＴＧを破壊するＢａ ｒｎＨＩ制限部位を下記オリゴヌクレオチド： ５′＾ＡＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＴ＾＾ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣ＾ ＾ＴＴＴＴＴＡでの特定変異誘発によりこのベクター内に導入する。これでＭ１ ３７Ｇ３８４３を得る。リン酸化後、下記オリゴヌクレオチド： ５’　ＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣ丁ＡＣＡＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣ ＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＧＣＧＡＴＧ　 ５’及び ５’ＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＣＧ ＴＣＧＡＴＧＡＣＧＣＧＡＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＣＧＧＡＧＧＧＴＴＣＡＡＡＧ ＴＣＧＡＣＧＡＧＧＧ５’　をＢａｍＨＩ及びＳｍａ　Ｉで切断されたベクター Ｍ１３７Ｇ３８４３内に挿入し、それによってＡＴＧのない配列ｘ１を導入する 。ＡＴＧを復元するため、ＢａｍＨ１部位を下記オリゴヌクレオチド： ５′＾ＡＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣＴ ＡＣＡＧＴＣを用いた特定変異誘発により除去し、以下を含むベクターＭ１３７ Ｇ３８４５　（図３）を得るニ ー断片ａ）としてＭＦα１遺伝子のプロモーター、次いでＡＴＧコドン 一断片ｂ）として配列ｘ１ 一断片り’）としてＭＦα１遺伝子の欠失“ｐｒｏ”配列、次いでＬ７ｓ−Ａ＋ １についてコードするコドン−断片Ｃ）としてｒＨＶ２Ｌｙｓ４７についてコー ドする配列 一ベクターＭ１３７Ｇ３１４９の一部 Ｂ、プラスミドｐＴＧ３８６４の組立て欧州特許公開ＥＰ−Ａ−２５２，８５４ 号明細書で記載されたプラスミドｐＴＧ８４８をＢｇｌｌｌで切断し、しかる後 再結合させ、ｐＴＧ２８８６を得る。ｐＴＧ２８８６の大Ｈｉｎｄｌｌｌ　−Ｅ ｃｏＲＩ断片をＴ４リガーゼの存在下でＳ、セレビシアエの２μプラスミドの配 列を有するプラスミドｐ　Ｆ　Ｌ　１　（Ｐｕｅｎｔ、　Ｓ、Ａ、　ｔｌ　ａｌ 。
（１９８５）Ｙｕｓ＋、　１．８３−１３８）の２．１ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ　− ＥｃｏＲＩ断片に結合させ、プラスミドｐＴＧ２８８６ＬＥＵ２−　ｄＳＵＲＡ ３−　ｄを得る。次いで欧州特許公開ＥＰ−Ａ−２５８，５０１号明細書で記載 されたＵＲＡ３−ｄ遺伝子を有するプラスミドｐＴＧ２８００の０．９ｋｂＨｉ ｎｄｌｌｌ断片をこのプラスミドのＨｉｎｄ１１１部位に挿入し、ｐＴＧ２８８ ６ＵＲＡ３−ｄ１デルタＬＥＵ２−ｄを得る。次いでいくつかの制限部位を有す るＭｌ　３ＴＧ１３１　（Ｋｉｅｎ７．Ｍ、Ｐ、、ｃｌ　ａｔ。
（１９８３）　Ｇｅｎｅ、　２６．９１−９９３のＳｍａ　Ｉ　−Ｂｇ　ＩＩＩ 断片をこのプラスミドに導入し、以下を有するｐＴＧ３８２８（図４）を得るニ ープロモーターが欠失したＵＲＡ３遺伝子の配列（ＵＲＡ３−　ｄ）　− 一本ケースにおいて異種タンパク質ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７の発現用要素を挿入しう るＭ１３ＴＧ１３１由来の制限部位 一酵母のＰＧＫ遺伝子の転写ターミネーターー大腸菌内で複製及び選択しうるｐ 　ＢＨ３２２の断片−酵母内での複製及び分裂エネルギー等分配に必要な構造要 素を有する２μプラスミドの断片ベクターＭ１３７Ｇ３８４５　（図３）の５ｐ ｈｌ−３ａｌＩ断片をｓｐｈ　Ｉ及び５ａｌＩで消化されたプラスミドｐＴＧ３ ８２８に導入し、発現ベクターｐＴ６３８６４を得る（図５）。
Ｃ０発現ベクターｐＴＧ３８６７の組立てＭＦα１遺伝子の前駆体についてコー ドする配列を完全に除去するため、下記オリゴヌクレオチド：５’　ＧＣＣＴＣ ＣＣＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＣＧＴＡＴＡＣＡＧＡＣＴＧＣを用いた特 定変異誘発をＭ１３７Ｇ３８４５　（図３）で行い、ベクターＭ１３７Ｇ３８４ ６を得る。コノベクターの５ｐｈｌ−８ａｌＩ断片をｓｐｈ　Ｉ及び５ａｌＩで 消化されたプラスミドｐＴＧ３８２８　（図４）に導入して、発現ベクターｐＴ Ｇ３８６７を得る。このベクターでは、配列Ｘ１及びｒＨＶ２Ｌｙｓ４７につい てコードする配列が隣接している。このプラスミドの概略構造を得るためには、 図５においてＭＦα１の欠失”ｐｒｏ”配列を除去するだけでよい。
Ｄ８発現ベクターｐＴＧ３８９４の組立てＳｍａ１部位を、下記オリゴヌクレオ チド：　、５’　ＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＴＡ ＣＡＡＣＡＧＡ＾１こよるＭＬ３ＴＧ３８４１　（図２）での特定変異誘発でα 因子の前駆体の“ｐｒｏ”断片についてコードする配列内に作成し、Ｍ１３７Ｇ ３８６９を得る。次いでこのベクターをｓｐｈ　＋及びＳｍａ　Ｉで消化し、小 断片を単離し、Ｍ１３７Ｇ３８４５　（図３）の大Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｓｍａ　Ｉ断 片に結合させ、ベクターＭ１３７Ｇ３８９１を得る。このベクターの５ｐｈｌ− ３ａｌＩ断片をｓｐｈ　Ｉ及び５ａｌＩ部位で開かれたプラスミドｐＴＧ３８２ ８（図４）に導入して、α因子の前駆体の変異“ｐｒＱ”配列を含んだ発現ベク ターｐＴＧ３８９４を得る。このブラフ、ミドの概略構造を得るためには、図５ においてＭＦα１の欠失“ｐｒｏ”配列を変異″ｐｒｏ”配列に代えるだけでよ い。
Ｅ１発現ベクターｐＴＧ３８８４の組立て配列ｘＩを下記オリゴヌクレオチド： ５′６丁ＴＴＣＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＴＣＧＣＴＡＣＴＧＣを用いたＭ１３７Ｇ ３８４５での特定変異誘発により修正する。単一塩基の修正で配列Ｘ目を得、シ グナルペプチドのアミノ酸Ｒ４としてバリンからロイシンへの置換えを誘導する 。それによりバクテリオファージＭ１３ＴＧ３８４．６を得る。
Ｍ１３ＴＧ３８４６の５ｐｈｌ−８ａｌＩ断片をｓｐｈ　Ｉ及び５ａｌＩ部位で 開かれたプラスミドｐＴＧ３８２８　（図４）に導入して、以下を含む発現ベク ターｐＴＧ３８８４を得るニ ープロモーターが欠失したＵＲＡ３遺伝子の配列（ＵＲＡ３−　ｄ） 一断片ａ）としてＭＦα１のプロモーター、次いでＡＴＧコドン 一断片ｂ）として配列Ｘ１ｌ −断片り’）としてＭＦα１遺伝子の欠失”ｐｒｏ”配列、次いでＬｙｓ−Ａｕ ｇについてコードするコドン−断片Ｃ）としてｒＨＶ２Ｌｙｓ４７についてコー ドする配列 一酵母のＰＧＫについてコードする遺伝子のターミネータ− −ｐＢＲ３２２の断片 一２μプラスミドの断片 例２二用いられるプラスミドに関する培養上澄でのｒＨＶ２Ｌｙｓ４７の産生 遺伝子型ＭＡＴａ、ｕｒａ３−２５１、−３７３、−３２８．１ｅｕ２−３、− １１２、ｈ　ｉ　ｓ　３、ｐｅｐ４〜３のプッカロミセス・セレビシアエ種の酵 母株ヲ酢酸Ｉ）チウム法［Ｎｏ、　Ｉｌ、　！Ｉ　Ｐ！、　、　１．　Ｒａｃｊ ｅｔｉｏ！、（１９８３＞　１５３：１６１１によりプラスミドｐ　Ｔ　Ｇ　３ ８６４、ｐＴＧ３８６７、ｐＴＧ３８９４及びｐＴＧ３８８４で形質転換させ、 ｔＪｒａ″′原栄養体を選択する。次いでそれらをエルシンマイヤー中の選択培 地（酵母窒素ベース０．７％、カザミノ酸０．５％及びグルコース１％）上３０ ℃で培養する。４８時間の培養後、細胞及び上澄を遠心で分離し１、。
トロコノビン阻害活性を比色試験〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈ＋ｉｎ ｇｅ＋　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の合成基質クロモザイムＴＨでのタンパク質分解活 性〕により上澄で調べる。表１はアッセイの結果について示すが、多値は２回の 独立実験の平均値に相当する。ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７活性は＾Ｔυ／ｍｌ上澄で示 されている。
表１ プラスミド、−□−−−−コ山Ｖ１ ｐＴＧ３８９４　４０ ｐＴ６３８６４　・　５０ ｐＴ０３８６７　１３０ ｐＴ０３８８４　１２５ ずべ°Ｃのケースにおいて、抗トロンビン活性が検出される。このため酵母から 産生されるｒＨＶ２Ｌｙｓ４７タンパク質は上澄中に放出されている。更に、そ れは活性形で分泌される。最良の結果はｐ　Ｔ　Ｇ　３８８４及びｐＴＧ３８６ ７で形質転換された株で得られる。
１澄のタン・々り質含量はＨＰＬＣで分析する。得られる主ピークはｒＨ１ノ２ Ｌｙｓ４７（その６５アミノ酸形として）の場合にぴったりと一致し２Ｎ末端配 列の決定で正確に合成された分子の産生を確認しうる。
Ａ、ｆｆ、虫デフエンジンＡについてコードするＤ　Ｎ　Ａ配列の合成 合成はＫｐｎｌ付着端により組立てられた２一つのブロックで行う。第一ブロッ クは１〜３と番号付けられた３つのオリゴヌクレオチドからなり、第ニブロック は４〜９と番号付けられた６つのオリゴヌクレオチドからなる。
それらオリゴヌクレオチドの配列及び位置（表の最後のライン；円はオリゴヌク レオチドの５′部分を表す）は表２で示されている。
表２ 合液を９５℃で３分間加熱し、しかる後２時間かけてＨｉｎｄｌｌｌ　＋ｌ　Ｋ ｐｎ１ ６．７．８及び９を用い、下記方法で行う・−オリゴヌクレオチド５．６．７及 び８を最初それらの５′末端でリン酸化して、組立て時のポリマー形成を回避す る。これらオリゴヌクレオチドの各々につき１００１００ｐを３２Ｐ標識ＡＴＰ 　７３．　３μｍｏｌ　（５０００Ｃｉ／ａ＋ｍｏｌ）を含有したｐＨ７−５の ６０μＭ）リスＨＣｌ。
１０μＭＭｇＣ１２及び８μＭジチオスレイトール（リン酸緩衝液）の最終容量 ２０μ！中ポリヌクレオチドキナ一ゼ２単位で処理する。３７℃で１５分間のイ ンキュベート後、未標識ＡＴＰ５μｎｏｔを加える。
−３７℃で３０分間のインキュベート後、７５ｐＩＩｏｌのオリゴヌクレオチド ５．６．７及び８を混合し、９５℃で３分間加熱し、しかる後オリゴヌクレオチ ド４及び９を最終容量９０μｍａｔの前記リン酸緩衝液に加える。混前記バクテ リオファージＭ１３ＴＧ３８４６　（例１の３７℃まで徐々に冷却させる。
−これらのハイブリッド形成オリゴヌクレオチド２５ｐｍｏ　Ｉを１５℃で１時 間Ｔ４リガーゼ処理に付す。次いでこの反応混合液（１ｐｍｏｌ）をＥｃｏＲＩ 及びＫｐｎｌで処理（１５℃で１時間）されたバクテリオファージＭ１３ＴＧ１ ３１　［ＫｉｅＢ、Ｍ、Ｐ、ｅｌ　ｘｌ、（１９８３）Ｇｅｎｅ、　２６．９１ −９９　）　５０　ｎＨに加える。結合混合物を大腸菌株Ｊ　Ｍ　１０３　（Ｍ ｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ｒｔ　ａｔ、　（１９８１）Ｎｕｅｌｅｉｃ＾ｃｉｄ　 Ｒｅｓ、、　９．３０９　）のコンピテント細胞を形質転換させるために用いる 。望ましい配列を有するクローンを単離するが、これはＭ１３７Ｇ３８２１と称 される。
第ニブロックの合成ではオリゴヌクレオチド１．２及び３を用い、第一ブロック の合成に関して記載された場合と同様の操作に従い行う。このケースにおいては 、オリゴヌクレオチド２のみをその５′末端でリン酸化させる。
この第ニブロックをバクテリオファージＭ１３ＴＧ３８２１のＨｉｎｄｌｌｌと ＫｐｎＩとの間の部位に組込んでクローニングし、デフエンジンＡについてコー ドするＤＮＡ配列（図５）を有するクローンを単離するが、これはＭ１３７Ｇ３ ８４９と称される。
Ｂ、デフエンジンＡ発現用プラスミドｐＴＧ４８３９の組立て Ｅ）の１０４５塩基対のＳｐｈ　Ｉ　−Ｓｍａ　Ｉ断片を既にｓｐｈ　Ｉ及びＳ ｍａ　Ｉで消化された前記ベクターＭ１３７０３８６９　（例１のＤ）に移す。
以下を有するベクターＭ１３ＴＧ４８０３　ニ ーＭＦα１遺伝子のプロモーター、次いでＡＴＧコドン 一配列Ｘｌ＋ −ＭＦα１遺伝子の変異“ｐｒｏ”配列、次いでＬｙｓ−Ａｒｇについてコード するコドン −ｒＨＶ２Ｌｙ　ｓ　４７についてコードする配列をそれによって得る。
−ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７についてコードする配列を昆虫デフエンジンＡについてコ ードする配列で置換えるため１、Ｈｉｎｄｌ！１部位を下記配列のオリゴヌクレ オチド：５’　ＧＡＡＧＧＧＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡ＾を用いてＭＦα１ の変異“ｐｒｏ”についてコードする配列中に導入する。次いでデフエンジンＡ についてコードする合成配列を有する前記Ｍ１３ＴＧ３８４９のＨｔｎｄｌｌｌ 　−ＢａｍＨＩ断片を既にＨｉｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩで処理されたこのベク ター中に導入して、ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７についてコードする配列を除去する。
Ｍ１３ＴＧ４８１３の５ｐｈＩ−８ａｌＩ断片をＳｐｈ　ｒ及び５ａｌＩ部位で 開かれたプラスミドｐＴＧ３８２８　（図４）中に導入して、以下を含む発現ベ クターｐＴＧ４８３９を得る： プロモーターが欠失したＵＲＡ３遺伝子の配列（ＵＲＡ３−　ｄ） ？ｖＸＦ　ａ”１遺伝子のブロモ−クー、次いてＡ　Ｔ　Ｇ配列Ｘｌ＋ ＭＦα１遺伝子の変異”ｐｒｏ”配列、次いでＬｙｓ−ＡＢについてコードする コドン 昆虫デフエンジンＡについてコードする合成配列酵母のＰＧＫについてコードす る遺伝子のターミネータ− ｐＢＲ３２２の断片 ２μプラスミドの断片 例４：培養上澄におけるデフエンジンＡの産生遺伝子型Ｍ　Ａ　Ｔ　ａ、ｕｒａ ３２５１、−３７３、−３２８．１ｅｕ２−３、−１１２、ｈｉｓ３、ｐｅｐ４ ３のサツカロミセス・セレビシアエ種の酵母株を酢酸リチウム法［１ｔｏ、　Ｈ ，ｅｌ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂａｃｌｃ＋ｉｏ１．　（１９８３）　１５３：１ ６３］によりプラスミドｐＴＧ４８３９・で形質転換させ、Ｕｒａ　原栄養体を 選択する。次いでそれらをエルシンマイヤー中の選択培地（酵母窒素ベース０． 　７％、カサミノ酸０．５％及びグルコース１％）上３０℃で培養する。４８時 間の培養後、細胞及び上澄を遠心で分離し、上澄を２２μフイルターで濾過し、 しかる後セブ・バク（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）　０１８カートリツジに通す。結合物質 を水中６０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸で溶出し、真空下で乾 燥させる。次いで、デフエンジンＡ抗菌活性をＬａｍｂｅｎｔ　ｅｔ　８１．　 （１９Ｂ９）ＰＮＡＳ、　８６：２６２−２６６で記載された操作に従−・細菌 微生物〔ミク：コ・ンカス、ルテウス（Ｍｉｃ＋ｏｃｏｃｃｕｓ　ＩｕｔｅｕＳ ））で播種された寒天又はアガロース上でブレーティング（ｐｌａｔｉＢ）試験 により調べる。
プラスミドｐＴＧ４８３’９で形質転換された酵母の上澄において、抗菌活性が 実際に検出される。このためその酵母から産生されたデフエンジンＡタンパク質 は上澄中に排出されている。更に、それは活性形で分泌される。
上澄のタンパク質含量はＨＰＬＣで分析する。得られた主ピークは昆虫デフエン ジンＡの場合にぴったりと一致し、タンパク質配列の決定で正確に合成された分 子の産生を確認しうる。
ＩＧ−１ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. １．アミノ酸配列が下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）のアミノ酸配列： （Ｉ）【配列があります】 （ＩＩ）【配列があります】 と少なくとも６０％の相同度を示すペプチドについてコードする単離されたＤＮ Ａ断片。
  2. ２．アミノ酸配列が下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）のアミノ酸配列： （Ｉ）【配列があります】 （ＩＩ）【配列があります】 と少なくとも８０％の相同度を示すペプチドについてコードする、請求項１に記 載のＤＮＡ断片。
  3. ３．下記アミノ酸配列（ＩＩＩ）： （ＩＩＩ）【配列があります】 〔上記式中Ｒ１はＡｉｇ及びＬｙｓから選択されるアミノ酸である；Ｒ２及びＲ ６は各独立してＡｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌ ｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｔ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌか ら選択されるアミノ酸である；Ｒ３及びＲ５は各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ａ ｓｎ、Ｐｒｏ及びＳｅｒから選択されるアミノ酸である；Ｒ４はＹａｌ、Ｌｅｕ 、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ及びＭｅｔから選択されるアミノ酸である〕 を含むペプチドについてコードする、請求項１又は２に記載のＤＮＡ断片。
  4. ４．下記アミノ酸配列（ＩＶ）： （ＩＶ）【配列があります】 〔上記式中Ｒ１はＡｒｇ及びＬｙｓから選択されるアミノ酸である；Ｒ２及びＲ ６は各々独立してＡｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、 Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌ から選択されるアミノ酸である；Ｒ３及びＲ５は各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｙ、 Ａｓｎ、Ｐｒｏ及びＳｅｔから選択されるアミノ酸である；Ｒ４はＶａｌ、Ｌｅ ｕ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ及びＭｅｔから選択されるアミノ酸である ；Ｒ７はタンパク質分解配列である〕 を含むペプチドについてコードする、請求項１又は２に記載のＤＮＡ断片。
  5. ５．Ｒ７がタンパク質分解配列Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０：〔上記式中Ｒ８はＡｌａ、 Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＴｈｒから選択されるア ミノ酸である；Ｒ９はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ ｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶ ａｌから選択されるアミノ酸である；Ｒ１０はＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ 、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ及びＴｈｒから選択されるアミノ酸である〕 である、請求項４に記載のＤＮＡ断片。
  6. ６．下記アミノ酸配列（Ｖ）及び（ＶＩ）：（Ｖ）【配列があります】 （ＶＩ）【配列があります】 から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドについてコードする、請求項１又は ２に記載のＤＮＡ断片。
  7. ７．下記式（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）のアミノ酸配列：（ＶＩＩ）【配列があ ります】 （式中Ｒ７はタンパク質分解配列である）；及び（ＶＩＩＩ）【配列があります 】 （式中Ｒ７はタンパク質分解配列である）；から選択されるアミノ酸配列を含む ペプチドについてコードする、請求項１、２、４又は５に記載のＤＮＡ断片。
  8. ８．Ｒ７がＶａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａである式（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）のアミ ノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドについてコードする、請求 項７に記載のＤＮＡ断片。
  9. ９．異種タンパク質が合成される細胞での異種タンパク質の分泌に関して有用な シグナルペプチドについてコードするＤＮＡ断片として、請求項１〜８のいずれ か一項で記載されたＤＮＡ断片の適用。
  10. １０．ＤＮＡ断片が異種タンパク質が合成される酵母細胞での異種タンパク質の 分泌に関して有用なシグナルペプチドについてコードする、請求項９に記載のＤ ＮＡ断片の適用。
  11. １１．少なくとも： ａ）転写及び翻訳開始シグナルを含むＤＮＡ断片ｂ）請求項１〜８のいずれか一 項で記載されたＤＮＡ断片及び ｃ）成熟異種タンパク質についてコードするＤＮＡ断片 を含んだ異種タンパク質の発現用カセット。
  12. １２．“ｐｒｏ”ペプチド断片についてコードするＤＮＡ断片ｂ′）を更に含む 、請求項１１に記載のカセット。
  13. １３．配列として【配列があります】 を有する“ｐｒｏ”ペプ チド断片についてコードするＤＮＡ断片ｂ′）を含む、請求項１２に記載のカセ ット。
  14. １４．断片ａ）が酵母細胞で機能性のプロモーター及びＡＴＧ翻訳開始コドンを 含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のカセット。
  15. １５．ＤＮＡ断片ｃ）がヒルジンについてコードする、請求項１１〜１４のいず れか一項に記載の発現カセット。
  16. １６．ＤＮＡ断片ｃ）がヒルジン変異体ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７についてコードする 、請求項１５に記載の発現カセット。
  17. １７．ＤＮＡ断片ｃ）が昆虫デフェンシンについてコードする、請求項１１〜１ ４のいずれか一項に記載の発現カセット。
  18. １８．ＤＮＡ断片ｃ）がデフェンシンＡについてコードする、請求項１７に記載 の発現カセット。
  19. １９．請求項１１〜１８のいずれかで記載された発現カセットを含むプラスミド ベクター。
  20. ２０．酵母の２μプラスミドの断片を含む、請求項１９に記載のプラスミドベク ター。
  21. ２１．選択遺伝子としてプロモーターが欠失されたＵＲＡ３遺伝子を含む、請求 項１９又は２０に記載のプラスミドベクター。
  22. ２２．請求項１９〜２１のいずれかで記載されたプラスミドベクターで形質転換 された又は請求項１１〜１８のいずれかで記載された発現カセットをゲノム中に 組み込んだ細胞。
  23. ２３．請求項２２に記載の酵母細胞。
  24. ２４．請求項２２又は２３で記載された細胞が培養され、タンパク質が培地から 回収される、異種タンパク質の製造方法。
  25. ２５．細胞が酵母細胞である、請求項２４に記載の方法。
  26. ２６．タンパク質がヒルジンである、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. ２７．タンパク質が昆虫デフェンシンである、請求項２４又は２５に記載の方法 。
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