JP5642042B2 - アンジオポエチン−２に対する抗体およびそれらの使用 - Google Patents

アンジオポエチン−２に対する抗体およびそれらの使用 Download PDF

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Description

本出願は、２００４年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６０／６３８,３５４号明細書および２００５年８月２５日出願の米国仮特許出願第６０／７１１,２８９号明細書の優先権を主張するものであり、それらは参照により本明細書中に援用される。
技術分野
本発明は、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に対するモノクローナル抗体およびかかる抗体の使用に関する。より詳細には、本発明は、Ａｎｇ−２に対する完全ヒトモノクローナル抗体およびこれらの抗体の使用に関する。本発明の態様は、かかる抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞系にも関する。記載される抗体は、Ａｎｇ−２の活性および／または過剰産生に関連した疾患に関する診断および治療において有用である。
背景
血管形成は、既存の血管から新たな毛細血管を形成するプロセスであり、かつ胚形成、正常な生理的成長、修復、および腫瘍拡大における必須の構成要素である。種々の因子がｉｎ ｖｉｔｒｏでの内皮細胞（ＥＣ）応答およびｉｎ ｖｉｖｏでの血管成長を調節可能であるが、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーメンバーおよびアンジオポエチンのみがほぼ単独に血管ＥＣに対して作用すると考えられている。Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000)。
アンジオポエチンは、血管内皮内に選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリーであるＴｉｅに対するリガンドとして発見された。Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000)。今ではアンジオポエチンのファミリーメンバーが４種確定している。アンジオポエチン−３および−４（Ａｎｇ−３およびＡｎｇ−４）は、マウスおよびヒトにおける同じ遺伝子座の広範に分岐した対応物を表す場合がある。Kim et al., FEBS Let, 443:353-56 (1999); Kim et al., J Biol Chem 274:26523-28 (1999)。Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２は、組織培養実験においてそれぞれ作動物質および拮抗物質として最初に同定された。Davis et al., Cell 87:1161-69 (1996); Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)。既知のアンジオポエチンのすべては主にＴｉｅ２に結合し、かつＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の双方は３ｎＭ（Ｋｄ）の親和性でＴｉｅ２に結合する。Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)。Ａｎｇ−１はＥＣの生存を支持しかつ内皮の完全性を促進することが判明した一方（Davis et al., Cell 87:1161-69 (1996); Kwak et al., FEBS Lett 448:249-53 (1999); Suri et al., Science 282:468-71 (1998); Thurston et al., Science 286: 2511-14 (1999); Thurston et al., Nat. Med. 6:460-63 (2000)）、Ａｎｇ−２は逆の作用を有し、かつ生存因子ＶＥＧＦまたは塩基性線維芽細胞成長因子の非存在下で血管の不安定化および退縮を促進した。Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)。しかし、Ａｎｇ−２機能の多数の研究はより複雑な状況を示唆している。Ａｎｇ−２は、血管出芽と血管退縮の双方で役割を果たす、血管リモデリングにおける複雑な調節物質でありうると仮定される。Ａｎｇ−２におけるかかる役割を支持すると、発現分析では、Ａｎｇ−２が血管形成出芽の成熟した環境（ａｄｕｌｔ ｓｅｔｔｉｎｇｓ）においてＶＥＧＦとともに速やかに誘導される一方、Ａｎｇ−２は血管退縮の環境におけるＶＥＧＦの非存在下で誘導されることが示される。Holash et al., Science 284:1994-98 (1999); Holash et al., Oncogene 18:5356-62 (1999)。Ａｎｇ−２は、コンテキストに依存する役割に応じてＡｎｇ−１によって活性化される同じ内皮特異的な受容体Ｔｉｅ−２に結合するが、その活性化に対してコンテキストに依存する作用を有する。Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)。
角膜の血管形成アッセイでは、Ａｎｇ−１とＡｎｇ−２の双方が類似の作用を有し、ＶＥＧＦとの相乗作用によって新しい血管の成長が促進されたことが判明している。Asahara et al., Circ. Res. 83:233-40 (1998)。Ａｎｇ−２がまたｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて高濃度で血管形成を促進しうるという観察により、内皮での用量依存的応答があった可能性が高まった。Kim et al., Oncogene 19:4549-52 (2000)。Ａｎｇ−２は、高濃度ではＰＩ−３キナーゼおよびＡｋｔ経路を介するＴｉｅ２の活性化による血清欠乏状態のアポトーシスの間での内皮細胞におけるアポトーシスの生存因子として作用する。Kim et al., Oncogene 19:4549-52 (2000)。
他のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、持続的な暴露の間、Ａｎｇ−２の作用がＴｉｅ２に対する拮抗物質から作動物質へと次第にシフトし、その後の時点で血管形成および新血管の安定化に直接寄与しうることが示唆された。Teichert-Kuliszewska et al., Cardiovasc. Res. 49:659-70 (2001)。さらに、もしＥＣがフィブリンゲル上で培養される場合にはＡｎｇ−２によるＴｉｅ２の活性化も観察されたが、これはおそらくはＡｎｇ−２の活性がＥＣの分化状態に左右されうることを示唆した。Teichert-Kuliszewska et al., Cardiovasc. Res. 49:659-70 (2001)。三次元コラーゲンゲル内で培養される微小血管ＥＣでは、Ａｎｇ−２はまた、Ｔｉｅ２の活性化を誘発しかつ毛細管様構造の形成を促進しうる。Mochizuki et al., J. Cell. Sci. 115:175-83 (2002)。血管成熟のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとしての３−Ｄ球状の共培養の使用では、ＥＣと間葉細胞との間の直接的接触がＶＥＧＦへの応答性を無効にする一方、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ−２の存在が出芽を誘発することが示された。Korff et al., Faseb J. 15:447-57 (2001)。エトー（Ｅｔｏｈ）らは、Ｔｉｅ２を構成的に発現するＥＣ、ＭＭＰ−１、−９およびｕ−ＰＡの発現がＶＥＧＦの存在下でＡｎｇ−２によって強力に上方制御されることを示した。Etoh, et al., Cancer Res. 61:2145-53 (2001)。ｉｎ ｖｉｖｏ瞳孔膜モデルでは、ロボブ（Ｌｏｂｏｖ）らは、Ａｎｇ−２が、内因性ＶＥＧＦの存在下で、毛細管直径の急速な拡大、基底膜のリモデリング、内皮細胞の増殖および遊走を促進し、かつ新血管の出芽を刺激することを示した。Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11205-10 (2002)。それに対し、Ａｎｇ−２は内因性ＶＥＧＦを伴わない場合、内皮細胞死および血管退縮を促進する。Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11205-10 (2002)。同様に、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルでは、バルコーツイ（Ｖａｊｋｏｃｚｙ）らは、多細胞集合体が、宿主および腫瘍内皮細胞によるＶＥＧＦＲ−２とＡｎｇ−２との同時発現を介する血管形成出芽によって血管成長を起こすことを示した。Vajkoczy et al., J. Clin. Invest. 109:777-85 (2002)。このモデルは、成長する腫瘍において樹立した微小血管系が連続的なリモデリングを特徴とし、それは推定ではＶＥＧＦおよびＡｎｇ−２の発現によって媒介されることを明らかにした。Vajkoczy et al., J. Clin. Invest. 109:777-85 (2002)。
Ｔｉｅ−２およびアンジオポエチン−１に関するノックアウトマウス試験は、類似の表現型を示し、かつアンジオポエチン−１刺激性のＴｉｅ２リン酸化が、発生する血管のリモデリングおよび安定化を媒介し、血管形成および内皮細胞−支持細胞の接着維持の間に血管成熟を促進することを示唆している（Dumont et al., Genes ＆ Development, 8:1897-1909 (1994); Sato, Nature, 376:70-74 (1995); (Thurston, G. et al., 2000 Nature Medicine: 6, 460-463)）。アンジオポエチン−１の役割は、成人において保持され、その場合、広範かつ構成的に発現されると考えられている（Hanahan, Science, 277:48-50 (1997); Zagzag, et al., Exp Neurology, 159:391-400 (1999)）。それに対し、アンジオポエチン−２の発現は、主としてアンジオポエチン−１の構成的な安定化または成熟機能を遮断すると考えられる血管リモデリング部位に限局され、それにより血管が出芽シグナルに対してより応答性を示しうる塑性状態に戻りかつそれを維持しうる（Hanahan, 1997; Holash et al., Oncogene 18:5356-62 (1999); Maisonpierre, 1997）。病理学的血管形成におけるアンジオポエチン−２の発現に関する研究では、多数の腫瘍タイプが血管におけるアンジオポエチン−２の発現を呈することが判明している（Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)）。機能的研究では、アンジオポエチン−２がマウス異種移植片モデルにおける腫瘍成長の増大に伴う腫瘍血管形成および付随するアンジオポエチン−２の過剰発現に関与することが示唆される（Ahmad, et al., Cancer Res., 61:1255-1259 (2001)）。他の研究では、アンジオポエチン−２の過剰発現と腫瘍での血管分布過多とが関連づけられている（Etoh, et al., Cancer Res. 61:2145-53 (2001); Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124-29 (2002)）。
近年、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２および／またはＴｉｅ−２が、有望な抗癌治療の標的として提示されている。例えば米国特許第6166185号明細書、米国特許第5650490号明細書および米国特許第5814464号明細書は、それぞれ抗−Ｔｉｅ−２リガンドおよび受容体抗体について開示している。可溶性のＴｉｅ−２を用いた研究によると、齧歯類における腫瘍の数および大きさが減少することが報告された（Lin, 1997；Lin, 1998）。ジーメスター（Ｓｉｅｍｅｓｔｅｒ）ら（１９９９年）は、Ｔｉｅ−２の細胞外ドメインを発現するヒトメラノーマ細胞系を作製し、これらをヌードマウスに注射し、可溶性のＴｉｅ−２が腫瘍成長および腫瘍血管形成の顕著な阻害をもたらすことを報告した。アンジオポエチン−１とアンジオポエチン−２の双方がＴｉｅ−２に結合すると仮定しても、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２またはＴｉｅ−２が抗癌療法として魅力的な標的であるか否かについてはこれらの研究からは明らかでない。しかし、効果的な抗−アンジオポエチン−２療法が異常な血管形成に進行が左右される癌などの疾患の治療に有益であると考えられ、この場合、そのプロセスの遮断が疾患の進行の予防につながる可能性がある(Folkman, J., Nature Medicine. 1: 27-31 (1995)。さらに、一部のグループは、アンジオポエチン−２に結合する抗体の使用について報告しており、例えば、米国特許第6,166,185号明細書および米国特許出願公開第2003/0124129A1号明細書を参照のこと。アンジオポエチン−２の局所発現の作用に関する研究では、アンジオポエチン−１／Ｔｉｅ−２シグナルに対する拮抗作用から緊密な血管の構造が緩まり、ＥＣがＶＥＧＦを例とする血管形成誘導因子由来の活性化シグナルに暴露されることが示されている（Hanahan, 1997）。このアンジオポエチン−１の阻害に起因する血管形成促進作用は、抗−アンジオポエチン−１療法が有効な抗癌治療ではなかったことを示す。
Ａｎｇ−２は、血管リモデリングが生じている部位での発達段階で発現される。Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)。成体個体では、Ａｎｇ−２の発現は、血管リモデリングの部位、ならびにグリオーマ、Osada et al., Int. J. Oncol. 18:305-09 (2001); Koga et al., Cancer Res. 61:6248-54 (2001)、肝細胞癌、Tanaka et al., J. Clin. Invest. 103:341-45 (1999)、胃癌、Etoh, et al., Cancer Res. 61:2145-53 (2001); Lee et al., Int. J. Oncol. 18:355-61 (2001)、甲状腺腫瘍、Bunone et al., Am J Pathol 155:1967-76 (1999), 非小細胞肺癌、Wong et al., Lung Cancer 29:11-22 (2000)、結腸癌、Ahmad et al., Cancer 92:1138-43 (2001)、および前立腺癌、Wurmbach et al., Anticancer Res. 20:5217-20 (2000)を含む高度に血管が発達した腫瘍内に限局される。一部の腫瘍細胞がＡｎｇ−２を発現することが判明している。例えば、Tanaka et al., J. Clin. Invest. 103:341-45 (1999)では、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の１２個のうちの１０個の標本においてＡｎｇ−２ ｍＲＮＡが検出された。エリス（Ｅｌｌｉｓ）らのグループは、Ａｎｇ−２が腫瘍上皮において遍在的に発現されることを報告した。Ahmad et al., Cancer 92:1138-43 (2001)。他の研究者らは、類似の研究成果を報告した。Chen et al., J. Tongji Med. Univ. 21:228-30, 235 (2001)。 Sfilogoi et al., Int. J. Cancer 103:466-74 (2003)では、保管されたヒト乳癌標本におけるＡｎｇ−２ ｍＲＮＡレベルの検出により、Ａｎｇ−２ ｍＲＮＡが側副リンパ節浸潤、短い無病期間および全生存の悪さに有意に関連していることが報告された。Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124-29 (2002)は、全体で２３６例の、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における病理病期ＩからＩＩＩＡの各患者についてレビューした。彼らは、免疫組織化学を用いて１６.９％のＮＳＣＬＣ患者がＡｎｇ−２陽性であることを見出した。Ａｎｇ−２陽性腫瘍における微細血管密度は、Ａｎｇ−２陰性の場合よりも有意に高い。ＶＥＧＦの発現が高い場合に限り、Ａｎｇ−２のかかる血管形成作用が見られた。さらに、Ａｎｇ−２の発現が陽性であることは、術後生存の悪さを予測するための重要な因子であった。Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124-29 (2002)。しかし、彼らは、Ａｎｇ−１発現と微細血管密度の間に有意な相関を全く見出さなかった。Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124-29 (2002)。これらの結果は、Ａｎｇ−２が数種類の癌を有する予後の悪い患者の指標であることを示唆している。
最近、Ａｎｇ−２ノックアウトマウスモデルを用い、ヤンコポーロス（Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ）のグループは、Ａｎｇ−２が出生後の血管形成において必要であることを報告した。Gale et al., Dev. Cell 3:411-23 (2002)。彼らは、Ａｎｇ−２−／−マウスでは眼の硝子体脈管構造での徐々にプログラムされた退縮が生じず、それらの網膜血管が網膜中心動脈から外部に出芽できないことを示した。Gale et al., Dev. Cell 3:411-23 (2002)。彼らはまた、Ａｎｇ−２の欠失がリンパ脈管構造のパターニングおよび機能において深刻な欠陥をもたらすことを見出した。Gale et al., Dev. Cell 3:411-23 (2002)。Ａｎｇ−１を用いて遺伝的に救出することにより、血管形成ではなくリンパ上の欠陥が修復される。Gale et al., Dev. Cell 3:411-23 (2002)。
ピーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ）および彼の同僚らは、マウスモデルでは、可溶性のＴｉｅ２は、組換えタンパク質としてまたはウイルス発現ベクター内で送達される場合、マウスの乳癌およびメラノーマのｉｎ ｖｉｖｏでの成長を阻害することを報告した。Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8829-34 (1998); Lin et al., J. Clin. Invest. 100:2072-78 (1997)。そのように治療された腫瘍組織内の血管密度は顕著に低下した。さらに、可溶性のＴｉｅ２は、腫瘍細胞条件培地によって刺激されたラット角膜において血管形成を遮断した。Lin et al., J. Clin. Invest. 100:2072-78 (1997)。さらに、イスナー（Ｉｓｎｅｒ）および彼のチームは、Ａｎｇ−２のＶＥＧＦへの添加により、血管新生がＶＥＧＦ単独の場合よりも有意に長くかつ周辺に促進されることを示した。Asahara et al., Circ. Res. 83:233-40 (1998)。過剰な可溶性のＴｉｅ２受容体がＡｎｇ−２によるＶＥＧＦ誘発性の新血管新生の調節を阻害した。Asahara et al., Circ. Res. 83:233-40 (1998)。 Siemeister et al., Cancer Res. 59:3185-91 (1999)では、ヌードマウス異種移植片の場合、異種移植片におけるＦｌｔ−１またはＴｉｅ２の細胞外リガンド−結合ドメインの過剰発現が、他方によって補償されえない経路の有意な阻害をもたらすことは、ＶＥＧＦ受容体経路およびＴｉｅ２経路がｉｎ ｖｉｖｏでの血管形成プロセスに不可欠な２つの独立したメディエーターとして考えられるべきであることを示唆する。Siemeister et al., Cancer Res. 59:3185-91 (1999)。これは、White et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5028-33 (2003)といったより最近の出版物によって証明されている。彼らの研究では、ラット角膜マイクロポケット血管形成モデルにおいて、Ａｎｇ−２に特異的に結合および阻害するヌクレアーゼ抵抗性ＲＮＡアプタマーが、ｂＦＧＦによって誘発される新血管新生を顕著に阻害することが実証された。
要約
本発明の実施形態は、アンジオポエチン−２に特異的に結合し、そこで腫瘍血管形成を阻害して腫瘍成長を低下させる標的結合物質に関する。これを実現可能にする機構が、Ａｎｇ−２のその受容体Ｔｉｅ２への結合の阻害、Ａｎｇ−２誘発性のＴｉｅ２のシグナル伝達の阻害、またはＡｎｇ−２のクリアランスの増加のいずれかを含む可能性があるとともにこれらに限定されず、これによりＡｎｇ−２の有効濃度が低下する。
本発明の一実施形態である標的結合物質は、Ａｎｇ−２に結合しかつＡｎｇ−２のＴｉｅ２への結合を阻止する完全ヒト抗体である。さらに本発明の別の実施形態は、Ａｎｇ−２およびＡｎｇ−１に結合しかつＡｎｇ−２誘発性のＴｉｅ２リン酸化も阻害する完全ヒトモノクローナル抗体である。抗体は、１００ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭもしくは５ｐＭ未満のＫｄでＡｎｇ−２に結合しうる。
抗体は、表１１に示される配列の１つを有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖アミノ酸配列を含みうる。当業者が容易にＣＤＲの決定を行うことができる点は注目される。例えば、Kabat et al.,「免疫学的対象のタンパク質の配列」, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3を参照のこと。
本発明の一実施形態は、下記により詳細に考察される、Ａｎｇ−２に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体３．３．２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−７２５８）、３．１９．３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−７２６０）および５．８８．３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−７２５９）を含む。
さらに別の実施形態は、Ａｎｇ−２に結合しかつ表１２に示される配列の１つを含むＣＤＲを有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。特定の実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
さらなる実施形態は、Ａｎｇ−２に結合し、かつ表１１に示されるＣＤＲ配列の１つを有する重鎖アミノ酸配列および表１２に示されるＣＤＲ配列の１つを有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。特定の実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明のさらなる実施形態は、Ａｎｇ−２への結合において本発明の完全ヒト抗体と交差競合する抗体、好ましくは表１１に示されるＣＤＲ配列の１つを有する重鎖アミノ酸配列および表１２に示されるＣＤＲ配列の１つを有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。本発明のさらなる実施形態は、本発明の完全ヒト抗体と同じＡｎｇ−２上のエピトープに結合する抗体、好ましくは表１１に示されるＣＤＲ配列の１つを有する重鎖アミノ酸配列および表１２に示されるＣＤＲ配列の１つを有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。
本発明のさらなる実施形態は、アンジオポエチン−２に特異的に結合する、規範的クラス１に対応する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を含むヒトモノクローナル抗体を含む。本明細書において提供される抗体は、規範的クラス３に対応する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、規範的クラス２に対応する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、規範的クラス１に対応する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および規範的クラス１に対応する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）も含みうる。
本発明は、抗−Ａｎｇ−２抗体を患者由来の生体試料と接触させるステップと、該試料における該抗体とＡｎｇ−２の間の結合レベルを検出するステップと、を含む、患者試料におけるアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）レベルをアッセイするための方法をさらに提供する。より特定の実施形態では、生体試料は血液である。
他の実施形態では、本発明は、抗体またはそれの機能断片、および医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。
本発明のさらなる実施形態は、新生物または非新生物疾患に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の治療有効用量を投与するステップと、を含む、血管形成関連疾患を患う動物を有効に治療する方法を含む。
治療可能な血管形成関連疾患は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆道癌（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および扁平上皮癌などの新生物疾患を含みうる。
本発明のさらなる実施形態は、動物におけるアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）誘発性の血管形成を阻害する方法を含む。これらの方法は、Ａｎｇ−２誘発性の血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、Ａｎｇ−２に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の治療有効用量を該動物に投与するステップと、を含む。
本発明のさらなる実施形態は、動物における血管形成関連疾患の治療のための薬剤の調製における、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用を含む。治療可能な血管形成関連疾患は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および扁平上皮癌などの新生物疾患を含みうる。
さらなる実施形態では、本明細書に記載のアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に特異的に結合するモノクローナル抗体を、動物におけるアンジオポエチン−２誘発性の血管形成の有効治療のための薬剤の調製において使用してもよい。
本明細書に記載の本発明の実施形態は、Ａｎｇ−２に結合しかつＡｎｇ−２の機能に作用するモノクローナル抗体に関する。他の実施形態は、Ａｎｇ−２に対する高結合親和性、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＡｎｇ−２に対する中和能、およびＡｎｇ−２誘発性の血管形成に対する阻害能を含む、治療的観点から見て所望の特性を備えた完全ヒト抗−Ａｎｇ−２抗体および抗−Ａｎｇ−２抗体製剤に関する。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗体は、極めて高い親和性（Ｋｄ）でＡｎｇ−２に結合する。例えば、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３もしくは１０−１４Ｍ未満であるがこれらに限定されないＫｄまたはこれらの任意の範囲もしくは値でＡｎｇ−２に結合可能なヒト、ウサギ、マウス、キメラまたはヒト化抗体である。本明細書に記載のように、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）および／またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって親和性および／または結合活性の測定値を測定してもよい。
したがって、本明細書に記載の一実施形態は、Ａｎｇ−２に結合する単離抗体またはそれらの抗体の断片を含む。当該技術分野で既知のように、抗体は、有利には、例えばポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および／または完全ヒト抗体であってもよい。本明細書に記載の本発明の実施形態は、これらの抗体を産生する細胞も提供する。
本発明の別の実施形態は、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−３およびアンジオポエチン−４を含むがこれらに限定されない他のアンジオポエチン−２ファミリーメンバーに結合する完全ヒト抗体である。本明細書におけるさらなる実施形態は、Ａｎｇ−２を伴うＴｉｅ２への結合において本発明の完全ヒト抗体と交差競合する抗体である。本発明の一実施形態では、抗体は、アンジオポエチン−２に結合してそれを中和させ、かつアンジオポエチン−１にも結合してそれを中和させる。
本発明の実施形態が抗体の任意の特定の形態または生成または産生の方法に限定されないことは理解されるであろう。例えば、抗−Ａｎｇ−２抗体は、完全長抗体（例えば、無傷のヒトＦｃ領域を有する）または抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２）でありうる。さらに、抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマ、あるいは抗体をコードする１つもしくは複数の遺伝子で形質転換または形質移入されている組み換え的に産生された細胞から作製されうる。
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードする単離核酸分子、抗−Ａｎｇ−２抗体をコードする単離核酸分子を有するベクターまたはかかる核酸分子のいずれかで形質転換された宿主細胞を含む。さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子が発現されて抗−Ａｎｇ−２抗体が産生された後、抗体が回収されるという条件下で宿主細胞を培養することによって抗体を産生する方法である。本発明の実施形態が、抗体産生のために宿主細胞に形質移入される場合の、抗体またはその断片の収量増加のために最適化される核酸配列を含む、本発明の抗体または抗体断片をコードする任意の核酸分子も含むことは認識されるべきである。
本明細書におけるさらなる実施形態は、哺乳動物をヒトＡｎｇ−２またはその断片、および１つもしくは複数のオルソロガス配列またはそれらの断片で免疫することによってＡｎｇ−２に対する高親和性抗体を産生する方法を含む。
他の実施形態は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する単離抗体の生成および同定に基づく。Ａｎｇ−２は、新生物疾患などの血管形成関連疾患において高レベルに発現される。Ａｎｇ−２の生物学的活性を阻害することにより、Ａｎｇ−２誘発性の血管形成および他の所望の作用が阻止されうる。
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のように調製された抗体が患者試料中でのＡｎｇ−２レベルを検出するのに用いられる、疾患または症状を診断する方法を含む。一実施形態では、患者試料は血液または血清である。さらなる実施形態では、リスク因子の同定、疾患の診断および疾患のステージングのための方法が示され、それは抗−Ａｎｇ−２抗体を使用したＡｎｇ−２の過剰発現の同定に関与する。
本発明の別の実施形態は、血清または細胞を抗−Ａｎｇ−２抗体と接触させ、その後にＡｎｇ−２の存在を検出することによる、細胞内でのＡｎｇ−２の発現に関連した症状を診断するための方法を含む。好ましい症状は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、唾液腺癌、および結腸直腸癌などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない血管形成関連疾患を含む。
別の実施形態では、本発明は、哺乳類の組織内、細胞内、または体液中のアンジオポエチン−２およびアンジオポエチンファミリーメンバーを検出し、血管形成関連疾患のスクリーニングを行うためのアッセイキットを含む。キットは、アンジオポエチン−２に結合する抗体および抗体とアンジオポエチン−２（もし存在する場合）との反応を示すための手段を含む。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、Ａｎｇ−２に結合する抗体は標識される。別の実施形態では、抗体は標識されていない一次抗体であり、かつキットは一次抗体を検出するための手段をさらに含む。一実施形態では、手段は抗免疫グロブリンの標識二次抗体を含む。好ましくは、抗体は蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。
さらに別の実施形態は、患者におけるＡｎｇ−２の発現に関連した疾患または症状を、患者に抗−Ａｎｇ−２抗体の有効量を投与することによって治療するための方法を含む。抗−Ａｎｇ−２抗体を単独投与するかあるいは追加抗体、化学療法薬または放射線療法と併用投与してもよい。例えば、血管形成を遮断するＡｎｇ−２抗体のモノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナル混合物を腫瘍細胞増殖に対する直接阻害を示す薬剤と併用投与してもよい。方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施してもよく、好ましくは患者はヒト患者である。好ましい実施形態では、方法は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、唾液腺癌、および結腸直腸癌などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない血管形成関連疾患の治療に関する。
別の実施形態では、本発明は、容器を含む製造物品を提供する。容器は、抗−Ａｎｇ−２抗体を含有する組成物、およびＡｎｇ−２の過剰発現によって特徴づけられる血管形成関連疾患を治療するのに組成物の使用が可能であることを示す添付文書またはラベルを含む。
一部の実施形態では、抗−Ａｎｇ−２抗体の患者への投与後、除去剤の投与により血液から循環する過剰な抗体が除去される。
さらに別の実施形態は、血管形成関連疾患などの疾患の治療のための薬剤の調製における抗−Ａｎｇ−２抗体の使用である。一実施形態では、血管形成関連疾患は、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌などの癌を含む。別の実施形態では、血管形成関連疾患は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、肉腫、頭頚部癌、中皮腫、胆道癌（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および膠芽細胞腫などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない。
Ａｎｇ−２は、血管形成の重要な「オンスイッチ（ｏｎ−ｓｗｉｔｃｈ）」である。したがって、この分子に対して拮抗することは、病態生理学的な進行を阻害し、それにより様々な血管形成依存性疾患に対する強力な治療として作用すると期待される。固形腫瘍およびそれらの転移に加え、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫などの血液悪性腫瘍は血管形成依存性でもある。過剰な血管成長は極めて多くの非新生物疾患に寄与する。これらの非新生物性の血管形成依存性疾患は、アテローム硬化症、血管腫、血管内皮腫、血管線維腫、血管奇形（例えば遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）、またはオスラー・ウェーバー症候群）、いぼ、化膿性肉芽腫、多毛症、カポジ肉腫、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、乾癬、不正子宮出血、卵胞嚢胞、卵巣過剰刺激、子宮内膜症、呼吸困難、腹水、透析患者における腹膜硬化症、腹部手術に起因する接着形成、肥満、関節リウマチ、滑膜炎、骨髄炎、パンヌス成長、骨棘、血友病関節、炎症性および感染性プロセス（例えば肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、肝再生、肺高血圧、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、白質軟化、血管新生緑内障、角膜移植片血管新生、トラコーマ、甲状腺炎、甲状腺腫脹、ならびにリンパ増殖性疾患を含む。
図面の簡単な説明
Ａｎｇ−２ ｍＡｂがＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で異所的に発現されるＡｎｇ−２誘発性のＴｉｅ２リン酸化を阻害することを示すウエスタンブロットである。 抗−Ａｎｇ−２モノクローナル抗体のＡｎｇ−２誘発性のＴｉｅ２リン酸化の阻害に対する用量−応答関連性を示す線グラフである。 Ａｎｇ−１（上のグラフ）とＡｎｇ−２（下のグラフ）のＴｉｅ２への結合に対するｍＡｂ３．１９．３またはＴｉｅ２／Ｆｃを使用した用量依存的な阻害を示す線グラフである。 Ｅａｈｙ９２６内皮細胞上でのアンジオポエチン−１刺激性のＴｉｅ−２リン酸化のｍＡｂ３．１９．３による阻害を示すウエスタンブロットである。この系では、アンジオポエチン−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化の阻害が観察される。抗体濃度はｎＭで示される。 Ｅａｈｙ９２６内皮細胞上でのアンジオポエチン−１刺激性のＴｉｅ−２リン酸化のｍＡｂ３．１９．３による阻害を示す線グラフである。ＩＣ５０＝９９ｎＭ。ｘ軸はｍＡｂ３．１９．３の濃度であり、ｙ軸は応答を示す。 ヒトＡｎｇ−２およびＡｎｇ−２４４３のタンパク質構造の概略図である。上の数はアミノ酸配列を意味する（Injune et al., (2000) JBC 275: 18550から引用された図）。 マウス／ヒトキメラ分子のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。（ＳｔｕＩ−ＴｆｉＩ断片としてクローン化された）ヒト残基３１０〜４００を下線で示す。 ヒトＡｎｇ−１（配列番号２）、ヒトＡｎｇ−２（配列番号３）、およびマウスＡｎｇ−２（配列番号４）タンパク質のアミノ酸配列比較である。Ａｎｇ−２キメラ分子の融合点および点突然変異は太字で記されている。 図８−１の続きである。 マウスＡｎｇ−１（配列番号５）、ヒトＡｎｇ−１（配列番号２）、マウスＡｎｇ−２（配列番号４）、およびヒトＡｎｇ−２（配列番号３）のアミノ酸配列比較である。矢印は疎水性のリーダー配列における切断部位を示す。矢印はコイルドコイルおよびフィブリノーゲン様ドメインの限界を規定する。黒丸は保存システイン残基を示す（画像はMaisonpierre et al., 1997, Science 277:55から引用）。 用量−応答関連性におけるマウスの交差反応性を示す線グラフである。モノクローナル抗体クローン５．２．１、５．２８．１、３．１９．３および３．３１．２が示される。 ヒト（黒三角）とマウス（黒四角）双方のＡｎｇ−２のヒトＴｉｅ２への結合に対するｍＡｂ３．１９．３を使用した用量依存的な阻害を示す線グラフである。 ＭＣＦ−７細胞誘発性の血管形成に対する抗体の作用の棒グラフ分析である。血管端部の数に対する抗−Ａｎｇ−２抗体の作用を示し、ここでｘ軸は実験群を示し、ｙ軸は血管端部の平均数（＋／−ＳＤ）を示す。 ＭＣＦ−７細胞誘発性の血管形成に対する抗体の作用の棒グラフ分析である。血管長に対する抗−Ａｎｇ−２抗体の作用を示し、ここでｘ軸は実験群を示し、ｙ軸は平均血管長（＋／−ＳＤ）を示す。 Ａ４３１細胞系を用いたヒト皮膚扁平上皮癌のマウス異種移植片モデルにおいて試験された抗−Ａｎｇ−２モノクローナル抗体クローン３．１９．３の抗腫瘍作用を示す線グラフである。ｘ軸は腫瘍細胞移植後日数を示し、ｙ軸はｃｍ３単位での平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭを示す。黒三角は抗−Ａｎｇ−２モノクローナル抗体クローン３．１９．３が注射されたマウスの移植後腫瘍体積測定値を示し、黒丸はイソタイプ対照抗体ＰＫ１６．３．１が注射されたマウスの移植後腫瘍体積測定値を示す。 ヒト結腸腺癌ＬｏＶｏ異種移植片モデルにおける腫瘍成長の阻止を示す線グラフであり、ここでは腫瘍サイズがマウスの０．５、２、および１０ｍｇ／ｋｇでの治療に適応されるかまたはイソタイプ対照を適応とする。ｘ軸は腫瘍細胞移植後日数を示し、ｙ軸はｃｍ３単位での平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭを示す。 ヒト結腸腺癌ＳＷ４８０異種移植片モデルにおけるｍＡｂの腫瘍成長阻害作用を示す線グラフである。 ＨＴ２９異種移植片モデルにおける腫瘍成長の阻止を示す線グラフである。ｘ軸は腫瘍細胞移植後日数を示し、ｙ軸はｃｍ３単位での平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭを示す。 Ｃａｌｕ−６異種移植片モデルにおける腫瘍成長の阻止を示す線グラフであり、ここでは腫瘍サイズがマウスの１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂクローン３．３．２、３．１９．３またはイソタイプ対照抗体での治療に適応される。 ＩｇＧ対照または１０ｍｇ／ｋｇの３．１９．３ｍＡｂで治療されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウス由来の腫瘍におけるＣＤ３１＋染色の濃度を示す棒グラフである。閾値法およびマニュアルグリッドカウンティング法からの結果が示される。
詳細な説明
本明細書に記載の本発明の実施形態は、Ａｎｇ−２に結合するモノクローナル抗体に関する。一部の実施形態では、抗体はＡｎｇ−２に結合し、かつＡｎｇ−２のその受容体であるＴｉｅ２への結合を阻害する。他の本発明の実施形態は、完全ヒト抗−Ａｎｇ−２抗体、および治療的に有用な抗体製剤を含む。かかる抗−Ａｎｇ−２抗体製剤は、好ましくは、Ａｎｇ−２に対する強い結合親和性、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｎｇ−２に対する中和能、およびｉｎ ｖｉｖｏでのＡｎｇ−２誘発性の血管形成に対する阻害能を含む所望の治療的特性を有する。
本発明の一実施形態は、Ａｎｇ−２に結合しかつそれを中和するがＡｎｇ−１に結合しない抗体を含む。別の実施形態では、抗体は、Ａｎｇ−２とＡｎｇ−１の双方に結合しても中和するのはＡｎｇ−２のみである。別の実施形態では、抗体はＡｎｇ−２とＡｎｇ−１の双方に結合しかつＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の双方のＴｉｅ２への結合を中和する。
本発明の実施形態は、抗−Ａｎｇ−２抗体の単離された結合断片も含む。好ましくは、結合断片は完全ヒト抗−Ａｎｇ−２抗体由来である。典型的な断片は、下記により詳細に記載されるように、Ｆｖ、Ｆａｂ’または他の周知の抗体断片を含む。本発明の実施形態は、Ａｎｇ−２に対する完全ヒト抗体を発現する細胞も含む。細胞の例として、ハイブリドーマ、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞の変異体（例えばＤＧ４４）およびＡｎｇ−２に対する抗体を産生するＮＳ０細胞などの組み換え的に作製される細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞の変異体についてのさらなる情報は、Andersen and Reilly (2004) Current Opinion in Biotechnology 15, 456-462（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に見出されうる。
さらに、本発明の実施形態は、疾患の治療を目的としたこれらの抗体の使用方法を含む。抗−Ａｎｇ−２抗体は、Ａｎｇ−２媒介性のＴｉｅ２シグナル形質導入を阻止することによって血管形成を阻害する場合に有用である。この阻害作用の機構は、Ａｎｇ−２のその受容体Ｔｉｅ２への結合からの阻害、Ａｎｇ−２誘発性のＴｉｅ２シグナル伝達の阻害、またはＡｎｇ−２のクリアランスの増加による、Ｔｉｅ−２への結合におけるＡｎｇ−２の有効濃度の低下を含みうる。この阻害機構を介して治療可能な疾患は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌および腫瘍などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない。
本発明の他の実施形態は、生物学的試料中のＡｎｇ−２の量を特異的に測定するための診断アッセイを含む。アッセイキットは、かかる抗体を検出するために必要な標識を有する抗−Ａｎｇ−２抗体を含みうる。これらの診断アッセイは、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、唾液腺癌、および結腸直腸癌などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない血管形成関連疾患のスクリーニングにとって有用である。
本発明の一態様によると、Ｔｉｅ−２のＡＴＰ−結合部位に結合しない、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。
本発明の別の態様によると、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２に結合する、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。
本発明の別の態様によると、化合物でない、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。
一実施形態では、アンジオポエチン−１拮抗活性およびアンジオポエチン−２拮抗活性が１分子内に含まれる、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。それ以外の実施形態では、アンジオポエチン−１拮抗活性およびアンジオポエチン−２拮抗活性が２分子以上の分子内に含まれる場合の拮抗剤が提供される。
一実施形態では、
ｉ）Ｔｉｅ−２受容体、
ｉｉ）アンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２、
ｉｉｉ）Ｔｉｅ−２受容体−アンジオポエチン−１複合体、または
ｉｖ）Ｔｉｅ−２受容体−アンジオポエチン−２複合体、
あるいはこれらの任意の組み合わせ
に結合しうる、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。
一実施形態では、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤は、アンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２および／またはＴｉｅ−２に結合することにより、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２媒介性のＴｉｅ−２シグナル形質導入を阻止し、それにより血管形成を阻害しうる。この阻害の作用機構は、
ｉ）拮抗剤のアンジオポエチン−１への結合およびアンジオポエチン−１のその受容体であるＴｉｅ−２への結合の阻害、ならびに／あるいは
ｉｉ）拮抗剤のアンジオポエチン−２への結合およびアンジオポエチン−２のその受容体であるＴｉｅ−２への結合の阻害、ならびに／あるいは
ｉｉｉ）アンジオポエチン−１および／もしくはアンジオポエチン−２のクリアランスの増加により、Ｔｉｅ−２への結合に使用可能なアンジオポエチン−１および／もしくはアンジオポエチン−２の有効濃度が低下すること、あるいはアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対して拮抗するのに十分である、これらの任意の組み合わせ、を含みうる。
理論的考察に縛られることを望むことなく、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗作用を可能にする機構は、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の受容体Ｔｉｅ−２への結合の阻害、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２誘発性のＴｉｅ−２シグナル伝達の阻害、またはアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２のクリアランスの増加による、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の有効濃度の低下を含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、抗体である、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。好ましくは、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでアンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗することが可能である。好ましくは、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。より好ましくは抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくは抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。最も好ましくは、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体３．１９．３である。
一実施形態では、完全ヒトモノクローナル抗体３．１９．３と同じ１つもしくは複数のエピトープに結合する抗体が提供される。
本発明の一実施形態では、アンジオポエチン−１に結合しかつアンジオポエチン−１のＴｉｅ−２への結合を阻止する完全ヒト抗体が提供される。本発明のさらに別の実施形態は、アンジオポエチン−１に結合しかつアンジオポエチン−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体は１ナノモラー（ｎＭ）未満のＫｄでアンジオポエチン−１に結合する。より好ましくは、抗体は５００ピコモラー（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は１００ピコモラー（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は３０ピコモラー（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は２０ｐＭ未満のＫｄで結合する。さらにより好ましくは、抗体は１０もしくは５ｐＭ未満のＫｄで結合する。
本発明の一実施形態では、アンジオポエチン−２に結合しかつアンジオポエチン−２のＴｉｅ−２への結合を阻止する完全ヒト抗体が提供される。本発明のさらに別の実施形態は、アンジオポエチン−２に結合しかつアンジオポエチン−２誘発性のＴｉｅ２リン酸化を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体は１ナノモラー（ｎＭ）未満のＫｄでアンジオポエチン−２に結合する。より好ましくは、抗体は５００ピコモラー（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は１００ピコモラー（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は３０ピコモラー（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は２０ｐＭ未満のＫｄで結合する。さらにより好ましくは、抗体は１０もしくは５ｐＭ未満のＫｄで結合する。
一実施形態では、上記の抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマが提供される。好ましくは、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生する。より好ましくは、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体３．１９．３、３．３．２または５．８８．３の軽鎖および／または重鎖を産生する。あるいは、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体３．１９．３、３．３．２または５．８８．３と同じ１つもしくは複数のエピトープに結合する抗体を産生する。
一実施形態では、上記の抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子が提供される。好ましくは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子が提供される。より好ましくは、完全ヒトモノクローナル抗体３．１９．３の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子が提供される。
本発明の一実施形態では、上で定義された抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする、上記の１つもしくは複数の核酸分子を有するベクターが提供される。
本発明の一実施形態では、上記ベクターを含む宿主細胞が提供される。あるいは、宿主細胞は２つ以上のベクターを含みうる。
さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子の発現による抗体産生後に抗体が回収されるという条件下で宿主細胞の培養によって抗体を産生する方法である。
本発明の一実施形態では、上記抗体をコードする少なくとも１個の核酸分子を少なくとも１個の宿主細胞に形質移入させるステップと、該宿主細胞内で核酸分子を発現させるステップと、該抗体を単離するステップと、を含む、抗体を作製する方法が提供される。
本発明の別の態様によると、上記の拮抗剤を投与するステップを含む、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する方法が提供される。方法は、疾患関連血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。
本発明の別の態様によると、上記抗体を投与するステップを含む、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する方法が提供される。方法は、疾患関連血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。
別の態様によると、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤の治療有効用量を投与するステップを含む、哺乳動物における疾患関連血管形成を治療する方法が提供される。方法は、疾患関連血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。
別の態様によると、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップを含む、哺乳動物における疾患関連血管形成を治療する方法が提供される。方法は、疾患関連血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。抗体を単独投与するか、あるいは追加抗体、化学療法薬または放射線療法と併用投与してもよい。
別の態様によると、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤の治療有効用量を投与するステップを含む、哺乳動物における癌を治療する方法が提供される。方法は、癌に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する拮抗剤の治療有効量を投与するステップと、を含みうる。拮抗剤を単独投与するか、あるいは追加抗体、化学療法薬または放射線療法と併用投与してもよい。
別の態様によると、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップを含む、哺乳動物における癌を治療する方法が提供される。方法は、癌に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。抗体を単独投与するか、あるいは追加抗体、化学療法薬または放射線療法と併用投与してもよい。
本発明の別の態様によると、疾患関連血管形成の治療における薬剤の製造における、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤の使用が提供される。
本発明の別の態様によると、疾患関連血管形成の治療における薬剤の製造における、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に拮抗する抗体の使用が提供される。
好ましい実施形態では、本発明は、Ｔｉｅ−２受容体のみまたはそれに部分的に依存する腫瘍を有する患者における、アンジオポエチン−１またはアンジオポエチン−２に拮抗する場合での使用に特に適する。
本発明の別の実施形態は、哺乳類の組織内、細胞内、または体液中でのアンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２を検出して血管形成関連疾患をスクリーニングするためのアッセイキットを含む。キットは、アンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２に結合する抗体、および抗体とアンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２との反応を、それが存在する場合には、示すための手段を含む。抗体は、モノクローナル抗体でありうる。一実施形態では、アンジオポエチン−２に結合する抗体は標識される。別の実施形態では、抗体は標識されていない一次抗体であり、キットは一次抗体を検出するための手段をさらに含む。一実施形態では、手段は抗免疫グロブリンである標識二次抗体を含む。好ましくは、抗体は蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。
抗−Ａｎｇ−２抗体に関するさらなる実施形態、特徴などが、より詳細に下記に提供される。
配列リスト
本発明の実施形態は、下記の表１中に列挙される特異的な抗−Ａｎｇ−２抗体を含む。この表では、各抗−Ａｎｇ−２抗体の識別番号が対応する重鎖および軽鎖遺伝子の配列番号とともに報告される。
各抗体には１つまたは２つの小数点によって分かれた２つもしくは３つの番号を含む識別番号が与えられている。大部分の抗体については、１つの小数点によって分かれた２つの識別番号のみが列挙される。
しかし、ある場合には１つの抗体における数種のクローンが調製された。クローンは親配列と同一の核酸およびアミノ酸配列を有するが、２番目の小数点の右側の番号によって示されるクローン番号によってそれらを別々に挙げることが可能である。したがって、例えば、抗体５．３５の核酸およびアミノ酸配列は、抗体５．３５．１、５．３５．２および５．３５．３の配列と同一である。
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定義
本明細書中で用いられる科学技術用語は、他に定義されない限り、当業者によって共通に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって他が必要とされない限り、単数の用語が複数を含み、かつ複数の用語が単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載の、細胞および組織培養、分子生物学、タンパク質化学およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションと関連して用いられる命名法やそれらの技術は、当該技術分野で周知でありかつ共通に用いられるものである。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換においては、標準の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）が用いられる。製造業者の仕様に従い、または当該技術分野で共通に成就した技術として、または本明細書に記載のように、酵素反応および精製技術が実施される。上記の技術および手順は、一般に、当該技術分野に周知の従来の方法に従い、かつ本明細書全体を通して言及および考察される様々な一般的な参考文献やより詳細な参考文献に記載のように実施される。例えば、参照により本明細書中に援用される、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001))を参照のこと。本明細書に記載の、分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学と関連して用いられる命名法や、それらの実験手順および技術は、当該技術分野では周知でかつ共通に用いられるものである。化学合成、化学分析、薬剤調製、製剤、および送達、ならびに患者の治療においては、標準の技術が用いられる。
以下の用語は、本開示に準じて用いられる際、他に指示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
拮抗剤は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、またはこれらの結合体もしくは融合タンパク質でありうる。ＲＮＡｉのレビューの場合には、Milhavet O, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev. 2003 Dec;55(4):629-48. Review.)、およびアンチセンスの場合には、Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE. 2003 Oct 28;2003(206):pe47.)を参照のこと。
疾患関連血管形成は、腫瘍関連血管形成を例とする、任意の異常な望ましくないまたは病的な血管形成でありうる。血管形成関連疾患は、白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫などの非固形腫瘍を含み、かつメラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、膠芽細胞腫、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、胃癌、脳／ＣＮＳ癌、頭頸部癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、睾丸癌、卵巣癌、皮膚癌、頚部癌、肺癌、筋肉癌、神経癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、外陰癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胸膜／腹膜癌、唾液腺癌、ならびに扁平上皮腫瘍などの固形腫瘍も含むがこれらに限定されない。
化合物は約２０００ダルトン未満の分子量を有する任意の小分子量化合物を示す。
「Ａｎｇ−２」という用語はアンジオポエチン−２分子を示す。
「中和」という用語は、抗体に言及される場合、抗体における標的抗原の活性を除去するかまたは有意に減弱させる能力に関する。したがって、「中和」抗−Ａｎｇ−２抗体は、Ａｎｇ−２の活性を除去するかまたは有意に減弱させることが可能である。中和Ａｎｇ−２抗体は、例えばＡｎｇ−２のその受容体Ｔｉｅ２への結合を遮断することによって作用しうる。Ｔｉｅ２媒介性のシグナル形質導入は、この結合の遮断によって有意にまたは完全に除去される。理想的には、Ａｎｇ−２に対する中和抗体は血管形成を阻害する。
本明細書中で用いられる「単離ポリヌクレオチド」という用語は、その天然環境から単離されているポリヌクレオチドを意味するものとする。かかるポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成物でありうる。単離ポリヌクレオチドは、好ましくは、天然では会合するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合されることがない。単離ポリヌクレオチドは、天然では連結されない別のポリヌクレオチドに作動可能に連結されうる。さらに単離ポリヌクレオチドは、好ましくは天然でより大きな配列の一部として存在することはない。
本明細書中で示される「単離タンパク質」という用語は、その天然環境から単離されているタンパク質を意味する。かかるタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、または合成起源あるいはそれらの一部の組み合わせに由来する場合があり、「単離タンパク質」は、その起源または由来源に基づいて、（１）天然に見出されるタンパク質と会合しないか、（２）マウスタンパク質を例とする同源由来の他のタンパク質を含有しないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）天然に生じることがない。
「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド配列における天然タンパク質、断片または類似体を示すための一般名称として本明細書中で用いられる。それ故、天然タンパク質、断片および類似体は、ポリペプチドに属する種である。本発明に従う好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子とκまたはλ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子とを含む組み合わせによって形成される抗体分子、およびその逆、ならびにそれらの断片および類似体を含む。本発明に記載の好ましいポリペプチドはまた、ヒト重鎖免疫グロブリン分子またはそれらの断片のみを含みうる。
対象に適用される、本明細書中で用いられる「天然」という用語は、対象を天然に見出しうるという事実を示す。例えば、天然資源から単離可能でありかつ実験室または実験室以外で意図的に人手による修飾を受けていない、（ウイルスを含む）生物に内在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然である。
本明細書中で用いられる「作動可能に連結される」という用語は、成分がその意図に沿うように機能することを可能にする関連性の中にあるように示される成分の位置を示す。例えば、コーディング配列に「作動可能に連結される」対照配列は、対照配列に適合可能な条件下でコーディング配列の発現が行われるような方法で連結される。
本明細書中で用いられる「対照配列」という用語は、連結対象のコーディング配列の発現およびプロセシングを有効にするかまたはそれらに作用するのに必要なポリヌクレオチド配列を示す。かかる対照配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物におけるかかる対照配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物におけるかかる対照配列は一般にプロモーター、エンハンサー、イントロン、転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列、ならびに５’および’３非翻訳領域を含みうる。「対照配列」という用語は、最小限、存在が発現およびプロセシングに必須であるすべての成分を含むことが意図され、さらにリーダー配列および融合パートナー配列を例とする、存在が有利な追加成分を含んでもよい。
本明細書中で示される「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドかもしくはデオキシヌクレオチドといった少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの高分子形態またはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾形態、あるいはＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖を意味する。同用語はＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。
本明細書中で示される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然および非天然の連結によって相互に連結された天然および修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００もしくはそれ未満の長さの塩基を含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長および最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子変異体の構築における使用では二本鎖でありうるが、例えばプローブにおいては通常、一本鎖である。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドでありうる。
本明細書中で示される「天然ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書中で示される「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖類などを有するヌクレオチドを含む。本明細書中で示される「オリゴヌクレオチド連結」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al.米国特許第5,151,510号明細書; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)（これらの開示は参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて検出用標識を含んでもよい。
本明細書中で示される「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびこれらの断片は、非特異的核酸に対する大量の検出可能な結合を最小にするハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。極めて厳しい条件を採用することで、当該技術分野で既知であり本明細書中で考察される選択的ハイブリダイゼーション条件を得ることが可能である。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体断片と目的の核酸配列との間の核酸配列の相同性は少なくとも８０％になり、より典型的には、相同性は少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％および１００％に高まることが好ましい。
２つのアミノ酸配列は、もしそれらの配列間に部分的または完全な同一性が存在する場合には「相同」である。例えば、８５％の相同性とは、２つの配列におけるマッチングが最大であるように整列される場合、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。マッチングの最大化においては、（マッチングする２つの配列のいずれかにおける）ギャップが許容され、５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。あるいは、この用語が本明細書中で用いられる際、好ましくは２つのタンパク質配列（または少なくとも長さが約３０個のアミノ酸のポリペプチド配列由来のポリペプチド配列）は、もしそれらが、変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティを伴うＡＬＩＧＮプログラムを用いて（標準偏差単位で）５を上回るアラインメントスコアを有する場合、相同である。Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972))およびand Supplement 2からこの巻まで, pp. 1-10を参照のこと。２つの配列またはそれらの部分は、より好ましくは、もしそれらのアミノ酸がＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列される場合に５０％よりも大きいかもしくはそれと等しい同一性を示すならば相同である。２つのオルソロガスな配列内には相同性の異なる領域がありうるということは理解されるべきである。例えば、マウスおよびヒトのオルソログの機能部位は、非機能領域よりも高度の相同性を有しうる。
「〜に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に対して相同である（すなわち、同一であるが、厳密な進化的関連性はない）、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するように本明細書中で用いられる。
それに対し、「〜に相補的である」という用語は、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に対して相同であることを意味するように本明細書中で用いられる。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「実質的同一性」といった用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の配列の関連性を示すのに用いられる。「参照配列」は配列比較における基準として用いられる規定された配列である。参照配列は、例えば配列リスト内に与えられる完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントのようなより大きな配列のサブセットであるか、あるいは完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含みうる。一般に、参照配列は、少なくとも１８ヌクレオチド長または６アミノ酸長であり、少なくとも２４ヌクレオチド長または８アミノ酸長であることが多く、かつ少なくとも４８ヌクレオチド長または１６アミノ酸長であることが多い。２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の各々は、（１）２つの分子間での類似する配列（すなわち完全ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部）を含み、かつ（２）２つのポリヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間での異なる配列をさらに含みうることから、２つ（もしくはそれより多く）の分子間での配列比較は、典型的には２つの分子の配列を「比較ウインドウ」にわたり比較することによって行われ、配列類似性の局所領域が同定および比較される。本明細書中で用いられる「比較ウインドウ」は、少なくとも約１８個の隣接ヌクレオチド位置または約６個のアミノ酸の理論上のセグメントを示し、ここではポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は少なくとも１８個の隣接ヌクレオチド配列または６個のアミノ酸配列の参照配列と比較され、かつポリヌクレオチド配列の比較ウインドウ内部分は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて（付加または欠失を含まない）参照配列と比べて２０％以下の付加、欠失、置換など（すなわちギャップ）を含みうる。比較ウインドウを整列するための配列の最適なアラインメントを、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）アルゴリズム、Needleman and Wunsch J. MoI. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７.０におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ.、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ（商標）もしくはＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（登録商標）ソフトウェアパッケージ）、または検査によって行うことが可能であり、様々な方法によって得られる最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたり最高の百分率の相同性が得られる）が選択される。
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が比較ウインドウにわたり同一である（すなわちヌクレオチド単位または残基単位を基準）ことを意味する。用語「配列同一性の百分率」は、比較ウインドウにわたり２つの最適に整列された配列を比較し、マッチング位置の数を得るように同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵもしくはＩ）またはアミノ酸残基における両配列内に存在する位置の数を判定し、マッチング位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で除し、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。本明細書中で用いられる「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が、少なくとも１８個のヌクレオチド（６個のアミノ酸）位置、高頻度には少なくとも２４〜４８個のヌクレオチド（８〜１６個のアミノ酸）位置からなる比較ウインドウにわたる参照配列と比べ、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、かつ配列同一性の百分率が、参照配列を、比較ウインドウにわたる参照配列の合計で２０％以下に及ぶ欠失または付加を含みうる配列と比較することによって計算されるといったポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示すことを意味する。参照配列は、より大きな配列のサブセットでありうる。
本明細書中で用いられるように、２０種の従来のアミノ酸およびそれらの略称は従来の用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸、α−，α−２基置換された（ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来アミノ酸などの非天然アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）は、本発明のポリペプチドに適する成分でもありうる。非従来アミノ酸の例として、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸ならびにイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で用いられるポリペプチド表記では、標準の用法および慣例に従い、左方向はアミノ末端方向、右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、他に特定されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左末端は５’末端、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は転写方向と称され、ＲＮＡと同じ配列を有しかつＲＮＡ転写物の５’から５’末端へのＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有しかつＲＮＡ転写物の３’から３’末端へのＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称される。
ポリペプチドに適用される「実質的同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に整列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸置換物分だけ異なる。保存的アミノ酸置換物は、類似の側鎖を有する残基間の交換可能性を示す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群はセリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
本明細書中で考察されるように、アミノ酸配列における変異が、本明細書に記載の抗体または免疫グロブリン分子に対する少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％の配列同一性を維持するという条件で、本発明によって包含されるものとして、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな変異についての検討がなされる。特に、保存的アミノ酸置換について検討がなされる。保存的置換物は、側鎖に関連しているアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に、（１）酸性＝アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンといったファミリーに分かれる。より好ましいファミリーでは、セリンおよびトレオニンが脂肪族−ヒドロキシファミリーであり；アスパラギンおよびグルタミンがアミド含有ファミリーであり；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが脂肪族ファミリーであり；かつフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸塩とグルタミン酸塩、トレオニンとセリンといった単独の置換、あるいはアミノ酸と構造的に関連したアミノ酸との類似の置換が、特にもし置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、生成分子の結合機能または特性に対して顕著な作用を有しないと予想することは理にかなっている。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより容易に判定されうる。アッセイについては本明細書中に詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者によって容易に調製されうる。断片または類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近辺に生じる。構造および機能ドメインを、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公開または非公開の配列データベースと比較することによって同定してもよい。好ましくは、コンピュータ化された比較方法を用いることで、既知の構造および／または機能を有する他のタンパク質内に生じる配列モチーフまたは予測されたタンパク質の高次構造ドメインが同定される。既知の三次元構造内に折り畳むタンパク質配列を同定するための方法は既知である。Bowie et al. Science 253:164 (1991)。したがって、これらの例は、当業者が本明細書に記載の抗体に従う構造および機能ドメインを定めるのに使用可能な配列モチーフおよび高次構造を認識できることを示している。
好ましいアミノ酸置換物は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減する、（２）酸化に対する感受性を低減する、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（４）結合親和性を変更する、かつ（５）かかる類似体の他の物理化学的または機能的特性を付与または改良するものである。類似体は、天然ペプチド配列以外の配列の様々な突然変異タンパク質を含みうる。例えば、（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外部のポリペプチド部分における）天然配列において単一または複数のアミノ酸置換物（好ましくは保存的アミノ酸置換物）が得られうる。保存的アミノ酸置換により、親配列の構造的特徴が実質的に変化することがあってはならない（例えば、アミノ酸の交換により、親配列内に存在するヘリックスが破壊されたり、親配列を特徴づける他のタイプの二次構造が破壊される傾向があってはならない。）当該技術分野で既知のポリペプチドの二次および三次構造の例が、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); およびThornton et at. Nature 354:105 (1991)において記載され、これらの各々は参照により本明細書中に援用される。
本明細書中で用いられる「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを示すが、これは残存するアミノ酸配列が、例えば完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然配列内の対応する位置に一致する場合である。断片は、典型的には少なくとも５、６、８もしくは１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、通常は少なくとも５０アミノ酸長、およびさらにより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書中で用いられる「類似体」という用語は、推定されるアミノ酸配列の一部に対する実質的同一性を有し、かつ（１）適切な結合条件下でのＡｎｇ−２への特異的結合、（２）適切なＡｎｇ−２結合に対する遮断能、または（３）Ａｎｇ−２活性に対する阻害能といった特性のうちの少なくとも１つを有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを示す。典型的には、ポリペプチド類似体は天然配列に対して保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類似体は、典型的には少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長かまたはそれより長く、また多くは完全長の天然ポリペプチドと同じ長さでありうる。
製薬業界では、鋳型ペプチドの特性に類似した特性を有する非ペプチド薬として、一般にペプチド類似体が用いられる。非ペプチド化合物のこれらのタイプは、「ペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｏ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称される。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)は、参照により本明細書中に援用される。かかる化合物は、コンピュータ化された分子モデリングを活用して開発されることが多い。治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチドミメティクスを使用することで、同等な治療効果または予防効果が得られる可能性がある。一般に、ペプチドミメティクスは、ヒト抗体などの模範的なポリペプチド（すなわち生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、当該技術分野で周知の方法により、場合によって−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ならびに−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される連結によって交換された１つもしくは複数のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１つもしくは複数のアミノ酸と同じタイプのＤ−アミノ酸との系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いることで、より安定なペプチドが生成されうる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異体を含む制限ペプチドが、当該技術分野で既知の方法（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)、参照により本明細書中に援用される。）、例えばペプチドを環化する分子内ジスルフィドブリッジを形成可能な内部システイン残基を付加することによって生成されうる。
本明細書中で用いられるように、「抗体」という用語は、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面形状および荷電分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインからなるポリペプチドまたはポリペプチド群を示す。抗体は、典型的には２つの同一のポリペプチド鎖対合体を含む四量体形態を有し、各対合体は１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖対合体の可変領域が抗体結合部位を形成する。
本明細書中で用いられるように、「標的結合物質」は、優先的に標的部位に結合する抗体またはその結合断片である。一実施形態では、標的結合物質は、１つの標的部位のみに対して特異的である。他の実施形態では、標的結合物質は、２つ以上の標的部位に対して特異的である。一実施形態では、標的結合物質はモノクローナル抗体であり、かつ標的部位はエピトープでありうる。
組換えＤＮＡ技術あるいは無傷抗体の酵素切断または化学切断により、抗体の「結合断片」が生成される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体を含む。「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」抗体または「二機能（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」抗体以外の抗体が有する結合部位の各々は同一であると理解されている。過剰な抗体が抗受容体に結合される受容体の量を（ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイにおける測定として）少なくとも約２０％、４０％、６０％もしくは８０％、およびより通常では約８５％を超える分だけ減少させる場合、抗体は受容体の抗受容体に対する接着を実質的に阻害する。
抗体は、単独のまたは既知の技術によってもたらされる他のアミノ酸配列と組み合わされた、オリゴクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−移植抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗−イディオタイプ抗体、および可溶性もしくは結合形態で標識可能な抗体、ならびにそれらの断片、変異体または誘導体でありうる。抗体は、任意の種由来でありうる。抗体という用語は、本発明の抗体の結合断片も含み、典型的な断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディー）およびジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）を含む。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合を可能にする任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面群（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）からなり、常ではないが特異的な三次元構造的特性ならびに特異的な荷電特性を有しうる。抗体は、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下および最も好ましくは１０ｎＭ以下である場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
「作用物質」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生体物質からなる抽出物を意味するように本明細書中で用いられる。
Ａｎｇ−２ポリペプチドに関する「活性のある」または「活性」は、天然Ａｎｇ−２ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するＡｎｇ−２ポリペプチドの一部を示す。本明細書中で用いられる場合の「生物学的」とは、天然Ａｎｇ−２ポリペプチドの活性から得られる生物学的機能を示す。好ましいＡｎｇ−２生物学的活性は、例えばＡｎｇ−２誘発性の血管形成を含む。
本明細書中で用いられる場合の「哺乳動物」は、哺乳動物と考えられる任意の動物を示す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
パパイン酵素による抗体の消化は、抗原−結合活性を全く有しないが結晶化能を有する、「Ｆａｂ」断片および「Ｆｃ」断片としても知られる２個の同一の抗原−結合断片をもたらす。ペプシン酵素による抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままで２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原の架橋能を有する。
本明細書中で用いられる場合の「Ｆｖ」は、抗原−認識部位と抗原−結合部位の双方を保持する抗体の最小断片を示す。
本明細書中で用いられる場合の「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体の断片を示す。
「ｍＡｂ」という用語はモノクローナル抗体を示す。
本明細書中で用いられる場合の「リポソーム」は、本発明のＡｎｇ−２ポリペプチドまたはかかるＡｎｇ−２ポリペプチドに対する抗体を含みうる薬剤の哺乳動物への送達にとって有用でありうる小さい小胞を示す。
本明細書中で用いられる「標識する」または「標識された」は、ポリペプチドに対する検出可能成分の添加、例えば、放射性標識、蛍光標識、化学発光またはビオチニル基標識される酵素標識を示す。放射性同位体または放射性核種は３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉを含み、蛍光標識はローダミン、ランタノイドの燐光体またはＦＩＴＣを含み、かつ酵素標識は西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含みうる。
本明細書中で用いられる「医薬作用物質または薬剤」という用語は、患者に適切に投与される場合に所望の治療効果を誘発可能な化学化合物または組成物を示す。本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))（参照により本明細書中に援用される）に例示された当該技術分野での従来の用法に準じて用いられる。
本明細書中で用いられるように、「実質的に純粋な」とは、対象種が支配的な存在する種であり（すなわち、モルを基準としてそれは組成物中の任意の他の単独種よりも豊富に存在する）、かつ好ましくは、実質的に精製画分が、存在するすべての高分子種のうちの（モル基準で）少なくとも約５０％が対象種に含まれる場合の組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する高分子種全体のうちの約８０％超、より好ましくは約８５％超、９０％超、９５％超、および９９％超を含むことになる。最も好ましくは、対象種は本質的に同質になるまで精製され（従来の検出方法によっては組成物中で汚染物質種を検出できない）、この場合、組成物は本質的に単一の高分子種からなる。
「患者」という用語は、ヒト被験者および獣医用（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）被験者を含む。
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および／もしくは定常領域を有する抗体に関連する問題の一部を回避する。かかるマウスまたはラットの誘導タンパク質の存在により、患者によって抗体の速やかなクリアランスまたは抗体に対する免疫応答の生成がもたらされうる。マウスまたはラット由来の抗体の利用を回避するため、齧歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生することを意図した機能性ヒト抗体遺伝子座の齧歯類、他の哺乳動物または動物への導入を介し、完全ヒト抗体を産生することが可能である。
完全ヒト抗体を産生するための一方法は、高々１０００ｋｂであってそれより小さい大きさの生殖系で構成されたヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の断片を含むように設計されているマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の使用によるものである。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)およびGreen and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)を参照のこと。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株は、アブジェニックス（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）（フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）、カリフォルニア州）から入手可能である。
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の作製については、さらに考察され、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第07/466,008号明細書、１９９０年１１月８日に出願された米国特許出願第07/610,515号明細書、１９９２年７月２４日に出願された米国特許出願第07/919,297号明細書、１９９２年７月３０日に出願された米国特許出願第07/922,649号明細書、１９９３年３月１５日に出願された米国特許出願第08/031,801号明細書、１９９３年８月２７日に出願された米国特許出願第08/112,848号明細書、１９９４年４月２８日に出願された米国特許出願第08/234,145号明細書、１９９５年１月２０日に出願された米国特許出願第08/376,279号明細書、１９９５年４月２７日に出願された米国特許出願第08/430,938号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第08/464,584号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第08/464,582号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第08/463,191号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第08/462,837号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第08/486,853号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第08/486,857号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第08/486,859号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第08/462,513号明細書、１９９６年１０月２日に出願された米国特許出願第08/724,752号明細書、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第08/759,620号明細書、２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願公開第2003/0093820号明細書、および米国特許第6,162,963号明細書、米国特許第6,150,584号明細書、米国特許第6,114,598号明細書、米国特許第6,075,181号明細書および米国特許第5,939,598号明細書、ならびに日本特許第3 068 180 B2号明細書、日本特許第3 068 506 B2号明細書および日本特許第3 068 507号明細書において示されている。１９９６年６月１２日に公開された欧州特許第0 463 151B1号明細書、１９９４年２月３日に公表された国際公開第94/02602号パンフレット、１９９６年１０月３１日に公表された国際公開第96/34096号パンフレット、１９９８年６月１１日に公表された国際公開第98/24893号パンフレット、２０００年１２月２１日に公表された国際公開第00/76310号パンフレットも参照のこと。上で引用した特許、出願、および参考文献の各々の開示は、本明細書によってそれらの全体が参照により援用される。
代替アプローチでは、ジェンファーム・インターナショナル（ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含むその他は、「小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを採用している。小遺伝子座アプローチでは、外来Ｉｇ遺伝子座がＩｇ遺伝子座由来の断片（個々の遺伝子）の封入を通して模倣される。したがって、１つもしくは複数のＶＨ遺伝子、１つもしくは複数のＤＨ遺伝子、１つもしくは複数のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および通常は第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）は、動物への挿入のためにコンストラクト内に形成される。このアプローチは、米国特許第5,545,807号明細書(Surani et al.)および米国特許第5,545,806号明細書、米国特許第5,625,825号明細書、米国特許第5,625,126号明細書、米国特許第5,633,425号明細書、米国特許第5,661,016号明細書、米国特許第5,770,429号明細書、米国特許第5,789,650号明細書、米国特許第5,814,318号明細書、米国特許第5,877,397号明細書、米国特許第5,874,299号明細書、および米国特許第6,255,458号明細書（各々、Lonberg and Kay）、米国特許第5,591,669号明細書および米国特許第6,023,010号明細書（Krimpenfort and Berns）、米国特許第5,612,205号明細書、米国特許第5,721,367号明細書および米国特許第5,789,215号明細書（Berns et al.）、米国特許第5,643,763号明細書（Choi and Dunn）および１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願第07/574,748号明細書、１９９０年８月３１日に出願された米国特許出願第07/575,962号明細書、１９９１年１２月１７日に出願された米国特許出願第07/810,279号明細書、１９９２年３月１８日に出願された米国特許出願第07/853,408号明細書、１９９２年６月２３日に出願された米国特許出願第07/904,068号明細書、１９９２年１２月１６日に出願された米国特許出願第07/990,860号明細書、１９９３年４月２６日に出願された米国特許出願第08/053,131号明細書、１９９３年７月２２日に出願された米国特許出願第08/096,762号明細書、１９９３年１１月１８日に出願された米国特許出願第08/155,301号明細書、１９９３年１２月３日に出願された米国特許出願第08/161,739号明細書、１９９３年１２月１０日に出願された米国特許出願第08/165,699号明細書、１９９４年３月９日に出願された米国特許出願第08/209,741号明細書（GenPharm International）において記載され、これらの開示内容は本明細書によって参照により援用される。欧州特許第0546073(B1)号明細書、国際公開第92/03918号パンフレット、国際公開第92/22645号パンフレット、国際公開第92/22647号パンフレット、国際公開第92/22670号パンフレット、国際公開第93/12227号パンフレット、国際公開第94/00569号パンフレット、国際公開第94/25585号パンフレット、国際公開第96/14436号パンフレット、国際公開第97/13852号パンフレットおよび国際公開第98/24884号パンフレット、ならびに米国特許第5,981,175号明細書も参照のこと（これらの開示内容は本明細書によってそれらの全体が参照により援用される）。さらに、Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994)、Taylor et al., (1994), およびTuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996)を参照のこと（これらの開示内容は本明細書によってそれらの全体が参照により援用される）。
キリン（Ｋｉｒｉｎ）は、マイクロセル融合により染色体の大きな切片または染色体全体が導入されている、マウスからのヒト抗体の産生についても明示している。欧州特許第773 288号明細書および欧州特許第843 961号明細書（その開示内容は参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。さらに、キリン（Ｋｉｒｉｎ）のＴｃマウスとメダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ）の小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）（Ｈｕｍａｂ）マウスとの異種交配の結果であるＫＭ（商標）−マウスが得られている。これらのマウスは、キリン（Ｋｉｒｉｎ）マウスのヒトＩｇＨトランスクロモゾーム（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）およびジェンファーム（Ｇｅｎｐｈａｒｍ）マウスのκ鎖トランス遺伝子を有している(Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102)。
ヒト抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって産生してもよい。適切な例として、ファージディスプレイ（ＣＡＴ、モルフォシス（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ダイアクス（Ｄｙａｘ）、バイオサイト（Ｂｉｏｓｉｔｅ）／メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ゾーマ（Ｘｏｍａ）、シンフォジェン（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ）、アレクション（Ａｌｅｘｉｏｎ）（前プロリフェロン（Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ））、アファームド（Ａｆｆｉｍｅｄ））リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイなどが挙げられるがこれらに限定されない。
抗体の調製
本明細書に記載の抗体は、下記のようにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用により調製された。そこでは、かかるマウスはヒト免疫グロブリン分子および抗体の産生能を有し、かつマウス免疫グロブリン分子および抗体の産生能が欠けている。この実施のために用いられる技術は、本明細書中の背景技術のセクションに開示される特許、出願、および参考文献にて開示されている。しかし、特にマウスおよびマウスからの抗体のトランスジェニックな生成の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第08/759,620号明細書および１９９８年６月１１日に公表された国際公開第98/24893号パンフレットおよび２０００年１２月２１日に公表された国際公開第00/76310号パンフレットにおいて開示されており、これらの開示内容は本明細書によって参照により援用される。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)（その開示内容は本明細書によって参照により援用）も参照のこと。
かかる技術の使用により、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産生されている。本質的にマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系に目的抗原（例えばＡｎｇ−２）を免疫し、リンパ節細胞（Ｂ細胞など）を高度免疫したマウスから回収し、回収したリンパ球を骨髄性細胞系と融合して不死ハイブリドーマ細胞系を調製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択し、目的抗原に特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞系を同定する。本明細書では、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２に特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞系の作製のための方法が提供される。さらに本明細書では、かかる細胞系によって産生される抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の分析を含む、かかる抗体の特徴づけについて提供される。
あるいは、骨髄腫細胞との融合によってハイブリドーマを産生する代わりに、Ｂ細胞を直接アッセイしてもよい。例えば、ＣＤ１９＋ Ｂ細胞を、高度免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスから単離し、抗体分泌形質細胞内で増殖および分化する状態にしてもよい。次いで、細胞上清から得た抗体におけるＡｎｇ−２免疫原に対する反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。上清におけるＡｎｇ−２の断片に対する免疫反応性についてもスクリーニングするならば、さらに抗体を、Ａｎｇ−２に対する機能目的のドメインへの結合における異なる抗体をマッピングすることが可能であろう。Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−３またはＡｎｇ−４、他の関連するヒトケモカイン、ならびにラット、マウス、およびカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）などの非ヒト霊長動物、種の交差反応性を判定するためのＡｎｇ−２のオルソログに対してスクリーニング可能である。目的抗体を含有するウェルから得たＢ細胞は、個体または貯蔵されたウェル由来のハイブリドーマを作製するための融合を含む様々な方法、あるいはＥＢＶへの感染または既知の不死化遺伝子による形質移入の後適切な培地に蒔くことによって不死化されうる。あるいは、所望の特異性を有する単一の形質細胞が分泌する抗体が次いで、Ａｎｇ−１またはＡｎｇ−２に特異的な溶血プラークアッセイ（例えば、Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)を参照）を用いて単離される。溶解に対して標的化した細胞は、好ましくはＡｎｇ−２抗原でコーティングしたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）である。アンジオポエチン−１にも拮抗しうる抗体についてのスクリーニングでは、上記方法を同様に用い、アンジオポエチン−２をアンジオポエチン−１と置換してもよい。
目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含有するＢ細胞培養物の存在下でのプラークの形成は、目的の形質細胞周囲のヒツジ赤血球に特異的なＡｎｇ−ｌ／Ａｎｇ−２媒介性の溶解を示す。プラークの中心における単一の抗原特異的な形質細胞を単離可能であり、抗体の特異性をコードする遺伝子情報が単一の形質細胞から単離される。逆転写後にＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用い、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングしてもよい。次いで、かかるクローニングしたＤＮＡをさらに適切な発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常ドメインを含むかかるｐｃＤＮＡベクターに挿入してもよい。次いで、生成したベクターを、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞を例とする宿主細胞に形質移入し、かつ、転写を誘発するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するものとして改変した従来の栄養培地内で培養してもよい。
一般に、融合ハイブリドーマによって産生された抗体は、完全ヒトκまたはλ軽鎖を有するヒトＩｇＧ２重鎖であった。本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖およびＩｇＧ２重鎖を有する。抗体は、ＩｇＧ１を含む他のヒトイソタイプでもありうる。抗体は、典型的には、固相および溶相技術によって測定される場合、約１０−６〜約１０−１２Ｍもしくはそれ未満のＫｄを有する高い親和性を有していた。少なくとも１０−１１ＭのＫＤを有する抗体がＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２の活性を阻害することが好ましい。
理解されているように、抗体をハイブリドーマ細胞系以外の細胞系内で発現させてもよい。特定の抗体をコードする配列を用いて適切な哺乳類宿主細胞を形質転換してもよい。例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクター）にパッケージングするステップと、宿主細胞にウイルス（またはベクター）を形質導入するステップとを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法、あるいは米国特許第4,399,216号明細書、第4,912,040号明細書、第4,740,461号明細書および第4,959,455号明細書（これらの特許は本明細書によって参照によりその中に援用される）によって例示された当該技術分野で既知の形質移入方法により、形質転換を行ってもよい。用いられる形質転換方法は、形質転換対象の宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入するための方法は、当該技術分野では周知であり、デキストラン媒介性の形質移入、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性の形質移入、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションを含む。
発現のための宿主として使用可能な哺乳類細胞系は、当該技術分野では周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および多数の他の細胞系を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手できる多数の不死化細胞系を含む。特定の好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有しかつ構成的なＡｎｇ−２結合特性を有する抗体を産生するかの判定によって選択される。
ｍＡｂにおけるアンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の活性に対する有意な中和能に基づき（下記実施例にて示されるとおり）、これらの抗体は、アンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２の発現に起因する症候および症状の治療において治療効果を有することになる。特定の実施形態では、本明細書における抗体および方法は、アンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２誘発性の血管形成に起因する症候の治療に関する。
本発明の別の態様によると、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、拮抗剤は抗体を含む。本発明の別の態様によると、アンジオポエチン−２の生物学的活性に対する拮抗剤と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、拮抗剤は抗体を含む。
抗−Ａｎｇ−２抗体は患者試料中でのＡｎｇ−２の検出において有用であることから、本明細書に記載の病状に対する診断として有用である。さらに、（下記実施例にて示されるとおり）Ａｎｇ−２活性に対するそれらの有意な中和能に基づき、抗−Ａｎｇ−２抗体は、Ａｎｇ−２の発現に起因する徴候および症状の治療において治療効果を有する。特定の実施形態では、本明細書における抗体および方法は、Ａｎｇ−２誘発性の血管形成に起因する徴候の治療に関する。さらなる実施形態は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌および膵臓癌などの新生物疾患を含む血管形成関連疾患を治療するための本明細書に記載の抗体および方法の使用を含む。
治療投与および製剤
本発明の実施形態は、疾患に対する治療にとって有用なＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の双方に結合する１つもしくは複数の抗−Ａｎｇ−２抗体の無菌医薬製剤を含む。かかる製剤であれば、Ａｎｇ−２またはＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２のその受容体Ｔｉｅ２への結合が阻害されることにより、例えば血清または組織のＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２が異常に高まる場合の病的状態が有効に治療されることになる。抗−Ａｎｇ−２抗体は、好ましくはＡｎｇ−２を強力に中和させるのに十分な親和性を有し、かつ好ましくはヒトにおける低頻度の投与を可能にするのに十分な作用の持続時間を有する。抗−Ａｎｇ−１／Ａｎｇ−２抗体は、好ましくはＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２を強力に中和させるのに十分な親和性を有し、かつ好ましくはヒトにおける低頻度の投与を可能にするのに十分な作用の持続時間を有する。作用の持続時間の延長により、皮下または筋肉内注射などの交互の非経口経路による投与計画において頻度を低下させ、便宜性を向上させることができる。
無菌製剤を、例えば抗体の凍結乾燥および再構成の前後における無菌濾過膜を通す濾過によって作製することが可能である。抗体は通常、凍結乾燥形態でまたは溶液中に保存されることになる。治療用抗体組成物は、一般に、皮下注射針で貫通可能なストッパーなどの製剤の回収を可能にするアダプタを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルを例とする、無菌のアクセスポートを具備する容器内に置かれる。
抗体の投与経路は、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、髄腔内、吸入もしくは病変内経路あるいは下記のような徐放系による注射または注入といった既知の方法に従う。抗体は、好ましくは注入またはボーラス注射により連続投与される。
治療的に使用されるべき抗体の有効量は、例えば治療目標、投与経路および患者の症状に依存することになる。したがって、治療者が最適な治療効果を得るという必要に応じて用量を滴定（ｔｉｔｅｒ）しかつ投与経路を変更することは好ましい。典型的には、臨床医は所望の効果を実現する用量に至るまで抗体を投与することになる。この治療の進捗は、従来のアッセイまたは本明細書に記載のアッセイによって容易に監視される。
本明細書に記載の抗体を医薬的に許容される担体を有する混合物中で調製してもよい。この治療組成物を静脈内にまたは経鼻的もしくは経肺的に、好ましくは液体もしくは粉末エアロゾル（凍結乾燥）として投与してもよい。要望どおり、組成物の非経口投与または皮下投与も可能である。治療組成物が全身投与される場合、それは無菌で、パイロジェンを含まず、ｐＨ、等張性および安定性について十分に配慮した非経口的に許容される溶液である必要がある。これらの条件は当業者には知られている。つまり、本明細書に記載の化合物の製剤剤形が、所望の精製度を有する化合物を生理学的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、保存または投与用に調製される。かかる物質は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、トリスＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸性塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの酸化防止剤；ポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリジノンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオンならびに／あるいはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳまたはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を含む。
注射用の無菌組成物を、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003))に記載のような従来の薬務に従って調合してもよい。例えば、水またはゴマ、ピーナッツもしくは綿実油のような天然植物油またはオレイン酸エチルのような合成脂肪の媒体または同様のものなどの媒体中の活性化合物の溶解または懸濁が望ましい場合がある。公認された薬務により、緩衝液、保護剤、抗酸化剤などを混合してもよい。
徐放性製剤の適切な例として、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性基質が挙げられ、この場合の基質は成形物品、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例として、ポリエステル、Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277およびLanger, Chem. Tech., (1982) 12:98-105によって記載されたヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号明細書、EP58,481号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体（Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556）、非分解性エチレン−酢酸ビニル(Langer et al., supra)、ＬＵＰＲＯＮ Ｄｅｐｏｔ（商標）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP133,988号明細書）が挙げられる。
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが１００日を超えて分子を放出可能である一方、特定のヒドロゲルはタンパク質をより短期間に放出する。カプセル化タンパク質が体内に長期間残存する場合、それらは３７℃での水分に暴露される結果として変性するかまたは凝集し、生物学的活性の低下および免疫原性の起こり得る変化を招く可能性がある。関与する機構によるタンパク質の安定化のために合理的な戦略を考え出してもよい。例えば、もし凝集機構がジスルフィド交換による分子間でのＳ−Ｓ結合の形成であることが発見される場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥化、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマー基質組成物の作製によって安定化が得られる可能性がある。
徐放性組成物は、懸濁液中で結晶を維持可能な適切な調合物に懸濁される抗体の結晶製剤も含む。これらの製剤は、皮下または腹腔内に注射される場合、徐放効果をもたらしうる。他の組成物はリポソームによる捕捉抗体も含む。かかる抗体を含有するリポソームは、米国特許第DE3,218,121号明細書；Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034;EP52,322号明細書；EP36,676号明細書；EP88,046号明細書；EP143,949号明細書；EP142,641号明細書；日本特許出願83-118008号明細書；米国特許第4,485,045号明細書および第4,544,545号明細書；ならびにEP102,324号明細書といったそれ自体既知の方法によって調製される。
所定の患者に対する抗体製剤の用量は、重症度および疾患タイプ、体重、性別、食事、投与時間および経路、他の薬剤および他の臨床に関連する因子を含む、薬剤の作用を変更することで知られる様々な因子を考慮する担当医によって決定されることになる。治療有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法またはｉｎ ｖｉｖｏ方法によって決定されうる。
治療的に使用されるべき、本明細書に記載の抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路および患者の症状に依存することになる。したがって、最適な治療効果を得るという必要に応じて用量を滴定しかつ投与経路を変更することが治療者にとって好ましい。典型的な１日用量は、上記の因子に依存すれば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇまたはそれより多い範囲でありうる。典型的には、臨床医は所望の効果が得られる用量に達するまで治療用抗体を投与することになる。この治療の進捗は、従来のアッセイまたは本明細書に記載のように容易に監視される。
本明細書における組成物および方法に従う治療実体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）が製剤中に混合される適切な担体、賦形剤、および他の作用物質とともに投与されることで、移動、送達、耐性などの改善が可能になることは理解されるであろう。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）など）を含有する脂質（陽イオンまたは陰イオン）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油および油中水エマルジョン、エマルジョンのカルボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物を含む。製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が投与経路に生理的適合性および耐性を示すと仮定すると、上記混合物のいずれかは本発明による治療および療法において適切でありうる。Baldrick P.「医薬賦形剤の開発：前臨床的ガイダンスに対する必要性」Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)、Wang W.「固体タンパク質医薬品の凍結乾燥および開発」 Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000)、Charman WN「脂質、脂肪親和性薬および経口薬の送達−いくつかの新しい概念」 J Pharm Sci .89(8):967-78 (2000)、Powell et al. 「非経口製剤用賦形剤の概要」 PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、および薬剤師に周知の製剤、賦形剤および担体に関する追加情報についてのそれらの中の引用文献も参照のこと。
併用
本明細書中で定められる抗血管形成治療は、唯一の治療として適用されうる、または、本発明の化合物に加え、従来の手術、放射線療法または化学療法を含みうる。かかる化学療法は、抗腫瘍物質の以下のカテゴリのうちの１つもしくは複数を含みうる。
（ｉ）細胞増殖抑制剤、例として、抗エストロゲン（例えばモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、エストロゲン受容体ダウンレギュレータ（例えばフルベストラント）、抗アンドロゲン（例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨ拮抗薬またはＬＨＲＨ作動薬（例えばゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、プロゲステロン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害薬（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエクスメスタン）およびフィナステリドなどの５＊レダクターゼの阻害剤など。
（ｉｉ）癌細胞浸潤を阻害する作用物質（例えば、マリマスタットのようなメタロプロテアーゼ阻害剤およびウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）。
（ｉｉｉ）成長因子機能の阻害剤、例えばかかる阻害剤は、成長因子抗体、成長因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）[ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（商標）]および抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）[Ｃ２２５]）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば表皮成長因子ファミリーの阻害剤（例えば、Ｎ（３クロロ４フルオロフェニル）７メトキシ６（３モルホリノプロポキシ）キナゾリン４アミン（ゲフィニチブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ＡＺＤｌ８３９）、Ｎ（３エチニルフェニル）６，７ビス（２メトキシエトキシ）キナゾリン４アミン（エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ＯＳＩ７７４）および６アクリルアミドＮ（３クロロ４フルオロフェニル）７（３モルホリノプロポキシ）キナゾリン４アミン（ＣＩ１０３３）などのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤）、例えば血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤、ならびに例えば肝実質細胞成長因子ファミリーの阻害剤を含む。
（ｉｖ）例えば、血管内皮成長因子の作用を阻害する血管形成阻害薬（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシツマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）[アヴァスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（商標）]、抗−ＫＤＲ抗体および抗−ｆｌｔ１抗体などの抗血管内皮成長因子受容体抗体、例えば国際公開第97/22596号パンフレット、国際公開第97/30035号パンフレット、国際公開第97/3285号パンフレット、国際公開第98/13354号パンフレット、国際公開第00/47212号パンフレットおよび国際公開第01/32651号パンフレットの中に開示された化合物）および他の機構によって機能する化合物（例えばリノマイド、インテグリンａｖｂ３機能阻害剤およびアンギオスタチン）。
（ｖ）コンブレタスタチン（Ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）Ａ４などの血管障害剤（ｖａｓｃｕｌａｒ ｄａｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）および国際公開第99/02166号パンフレット、国際公開第00/40529号パンフレット、国際公開第00/41669号パンフレット、国際公開第01/92224号パンフレット、国際公開第02/04434号パンフレットおよび国際公開第02/08213号パンフレットの中に開示された化合物。
（ｖｉ）例えば、抗ｒａｓアンチセンスのＩＳＩＳ２５０３など、上に列挙した標的に特異的なアンチセンス療法。
（ｖｉｉ）例えば異常ｐ５３、異常ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常遺伝子を交換するためのアプローチ、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロリダクターゼ酵素を用いたＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および例えば多剤耐性遺伝子療法など、患者の化学療法または放射線療法に対する耐性を増強するためのアプローチを含む遺伝子療法アプローチ。
（ｖｉｉｉ）例えば、インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインの形質移入など、患者腫瘍細胞の免疫原性を増強するためのエクスビボおよびｉｎ ｖｉｖｏアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを低下させるためのアプローチ、サイトカインが形質移入された樹状細胞などの形質移入された免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカインが形質移入された腫瘍細胞系を用いるアプローチ、ならびに抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを含む免疫療法アプローチ。
本発明の一実施形態では、本発明の抗血管形成治療は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の作用を阻害する作用物質と併用される（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシツマブ（アヴァスチン（登録商標））、抗−ＫＤＲ抗体および抗−ｆｌｔｌ抗体などの抗血管内皮成長因子受容体抗体、国際公開第97/22596号パンフレット、国際公開第97/30035号パンフレット、国際公開第97/3285号パンフレット、国際公開第98/13354号パンフレット、国際公開第00/47212号パンフレットおよび国際公開第01/32651号パンフレットの中に開示された化合物）および他の機構によって機能する化合物（例えばリノマイド、インテグリンａｖｂ３機能阻害剤およびアンギオスタチン）；本発明の別の実施形態では、本発明の抗血管形成治療薬は、血管内皮成長因子受容体ＫＤＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する併用剤（例えばＡＺＤ２１７１またはＡＺＤ６４７４）である。ＡＺＤ２１７１に関するさらなる詳細は、Wedge et al (2005) Cancer Research. 65(10):4389-400において見出されうる。ＡＺＤ６４７４に関するさらなる詳細は、Ryan & Wedge (2005) British Journal of Cancer. 92 Suppl 1:S6-13において見出されうる。いずれの発行物もそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。本発明の別の実施形態では、完全ヒト抗体３．１９．３、３．３．２または５．８８．３は単独で併用されるかあるいはアヴァスチン（商標）、ＡＺＤ２１７１またはＡＺＤ６４７４と併用される。
かかる併用治療は、治療における個々の成分の同時、順次または分割投与を介して行われうる。かかる組合せ製品は、本発明の化合物、またはそれらの医薬的に許容される塩を上記の用量範囲内で、かつ他の医薬活性物質をその認可された用量範囲内で用いている。
実施例
行われた実験および得られた結果を含む以下の実施例は、あくまでも図示目的で提供され、本明細書における教示の際の限定として解釈されるべきではない。
実施例１ 免疫および滴定（ＴＩＴＥＲＩＮＧ）
免疫
抗原としてＲ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ミネソタ州、カタログ番号６２３−ＡＭ／ＣＦ）から入手した組換えヒトＡｎｇ−２を使用した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株ＸＭＧ２およびＸＭＧ４（３Ｃ−１株）、アブジェニックス（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）、フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）、カリフォルニア州）を順次免疫することにより、Ａｎｇ−２に対するモノクローナル抗体を発現させた。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物を、すべての注射において足蹠経路を介して免疫した。各注射の全容量は、１マウス当たり５０μｌ、１足蹠当たり２５μｌであった。１回目の注射をパイロジェンを含まないダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中の２．３５μｇの組換えヒトＡｎｇ−２（ｒｈＡｎｇ−２、カタログ番号６２３−ＡＭ／ＣＦ；ロット番号ＢＮ０２３２０２Ａ）で行い、１マウス当たり１０μｇのＣｐＧ（ＩｍｍｕｎＥａｓｙ Ｍｏｕｓｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ１５μｌ、カタログ番号３０３１０１；ロット番号１１５５３０４２；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））と１：１ｖ／ｖで混合した。次いで、パイロジェンを含まないＤＰＢＳ中の２．３５μｇのｒｈＡＮＧ−２で６回追加免疫し、１マウス当たり２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲル、カタログ番号１４５２−２５０、バッチ番号８９３７、ＨＣＩバイオセクター（ＨＣＩ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ））および１０μｇのＣｐＧとの混合後、アジュバントなしでパイロジェンを含まないＤＰＢＳ中の２．３５μｇのｒｈＡｎｇ−２で最後の追加免疫を行った。このプロトコルでは、０、３、６、１０、１３、１７、２０および２４日目にＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスを免疫し、２９日目に融合した。
力価による収集のための動物の選択
免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス由来の血清中の抗−Ａｎｇ−２抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。つまり、組換えＡｎｇ−２（１μｇ／ｍｌ）を、Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ 炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６ ＮａＨＣＯ３ ８．４ｇ／Ｌ）中、Ｃｏｓｔａｒ Ｌａｂｃｏａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅの９６ウェルプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、アクトン（Ａｃｔｏｎ）、マサチューセッツ州）上に４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを、バイオテック（Ｂｉｏｔｅｋ）製プレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次いで、プレートを、２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサール）でブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。１時間のブロッキング後、プレートをバイオテック（Ｂｉｏｔｅｋ）製プレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液で３回洗浄した。Ａｎｇ−２で免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスまたはナイーブＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物由来の血清を、初期希釈率１：１００から希釈率１：３での０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液で２通りに滴定した。最後のウェルを空のままにした。これらのプレートを室温で２時間インキュベートし、次いでプレートをバイオテック（Ｂｉｏｔｅｋ）製プレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液で３回洗浄した。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃに特異的な西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州）との結合抗体を最終濃度１μｇ／ｍｌで添加して、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをバイオテック（Ｂｉｏｔｅｋ）製プレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液で３回洗浄した。
洗浄後、ＴＭＢ発色基質（ＢｉｏＦｘ ＢＳＴＰ−０１００−０１）の添加により、１０〜２０分間または陰性対照ウェルが呈色し始めるまでプレートを展開した。次いで、停止溶液（ＴＭＢ（ＢｉｏＦｘ ＢＳＴＰ−０１００−０１）用の６５０ｎＭ停止試薬、１ボトル当たりＨ２Ｏ１００ｍｌで再構成）の添加によってＥＬＩＳＡを停止した。６５０ｎｍでの光学濃度から判定した各ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物に特異的な力価を以下の表２および３に示す。力価値は血清の最大希釈の逆数であり、この場合、ＯＤの読み取り値はバックグラウンドの２倍である、したがって、その数の増加に伴い、Ａｎｇ−２に対する液性免疫応答が増大した。
Figure 0005642042
Figure 0005642042
実施例２
リンパ球、Ｂ細胞単離物、融合物の回収およびハイブリドーマの作製
免疫マウスを頚部脱臼により犠牲にし、排出リンパ節を収集し、各コホートから貯蔵した。リンパ球様細胞をＤＭＥＭ中で粉砕によって分離して細胞を組織から放出させ、細胞をＤＭＥＭに懸濁した。細胞を計数し、リンパ球１億個当たり０．９ｍｌのＤＭＥＭを細胞ペレットに添加して細胞をゆっくりではあるが完全に再懸濁した。細胞１億個当たりＣＤ９０＋磁気ビーズ１００μｌを使用し、細胞を磁気ビーズとともに４℃で１５分間インキュベートすることによって細胞を標識した。最大１０８個の陽性細胞（または最大２ｘ１０９個の全細胞）を含有する磁気標識した細胞懸濁液をＬＳ＋カラム上に負荷し、カラムをＤＭＥＭで洗浄した。流出液全体をＣＤ９０−陰性画分（これら細胞の大部分がＢ細胞であると予想された）として収集した。
上から得た洗浄された濃縮したＢ細胞と、ＡＴＣＣのカタログ番号ＣＲＬ１５８０(Kearney et al., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550)から購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇの８，６５３個の細胞とを１：１の比率で混合することによって融合を行った。細胞混合物を８００×ｇでの遠心分離により緩徐にペレット化した。上清を完全に除去した後、細胞をプロナーゼ溶液（カルバイオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、カタログ番号５３７０２；ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）２〜４ｍＬで２分間だけ処理した。次いで、ＦＢＳ３〜５ｍｌを添加して酵素活性を停止させ、電気細胞融合溶液（ＥＣＦＳ、０．３Ｍスクロース、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｓ７９０３、０．１ｍＭ酢酸マグネシウム、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、 カタログ番号Ｍ２５４５、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、 カタログ番号Ｃ４７０５）を用いて懸濁液を全容量４０ｍｌに調節した。遠心分離後、上清を除去し、細胞をＥＣＦＳ４０ｍｌに再懸濁した。この洗浄ステップを繰り返し、さらに細胞をＥＣＦＳに再懸濁して濃度を２ｘ１０６個の細胞／ｍｌにした。
フュージョンジェネレーター（ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅｔｒａｔｏｒ）（モデルＥＣＭ２００１、ジェネトロニック（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）を使用し、電気細胞融合を行った。以下の器具の設定値を用い、使用した融合チャンバの大きさは２．０ｍｌであった。
アラインメント条件：電圧５０Ｖ、時間５０秒
電圧３０００Ｖ、時間３０μ秒で膜破壊
融合後の保持時間：３秒
ＥＣＦ後、無菌条件下で融合チャンバから細胞懸濁液を注意深く取り出し、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＯＰＩ（オキサロ酢酸塩、ピルビン酸塩、ウシインスリン）（すべてシグマ（Ｓｉｇｍａ）製）およびＩＬ−６（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を補充した同容量のハイブリドーマ培地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨ バイオサイエンシーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、１５％ＦＢＳ（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を含む無菌チューブに移した。細胞を３７℃で１５〜３０分間インキュベートし、次いで４００×ｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心した。細胞を、少容量のハイブリドーマ選択培地（０．５×ＨＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ培地）に緩徐に再懸濁し、９６ウェルプレート当たり全部で５×１０６個のＢ細胞および１ウェル当たり２００μｌの最終プレーティングに基づき、より多くのハイブリドーマ選択培地によって容量を適切に調節した。細胞を緩徐に混合し、９６ウェルプレートにピペッティングし、成長させておいた。７日または１０日目、培地の半分を除去し、細胞にハイブリドーマ選択培地を補充した。
実施例３
ＥＬＩＳＡによる候補抗体の選択
培養の１４日後、ハイブリドーマ上清におけるＡｎｇ−２に特異的なモノクローナル抗体についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレート（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、カタログ番号１２−５６５−１３６）を、コーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、ＮａＨＣＯ３ ８．４ｇ／Ｌ）中の５０μｌ／ウェルのヒトＡｎｇ−２（２μｇ／ｍｌ）でコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサール）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清と陽性および陰性対照とを添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。全体を通して用いた陽性対照はＡｎｇ−２で免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス、ＸＭＧ２ Ａｎｇ−２ グループ１、足蹠（ｆｐ）Ｎ１６０−７由来の血清であり、陰性対照はＫＬＨで免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス、ＸＭＧ２ ＫＬＨ グループ１、足蹠（ｆｐ）Ｌ６２７−６由来の血清であった。
インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの検出抗体のヤギ抗−ｈｕＩｇＧＦｃ−ＨＲＰ（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ）、カタログ番号Ｈ１０５０７）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。二次スクリーニングでは、ＩｇＧとＩｇκの双方における完全ヒト組成物を明らかにするため、一次スクリーニングにおける陽性を２通りにスクリーニングし、ここでは一方がｈＩｇＧ検出用、他方がヒトＩｇκ軽鎖検出用（ヤギ抗−ｈＩｇκ−ＨＲＰ（サザン・バイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、カタログ番号２０６０−０５））であった。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂ．カタログ番号ＴＭＳＫ−０１００−０１）を添加し、プレートを約１０分間（陰性対照ウェルがようやく呈色し始めるまで）展開させておいた。次いで、５０μｌ／ウェルの停止溶液（ＴＭＢ停止溶液、（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂ．、カタログ番号ＳＴＰＲ−０１００−０１）を添加し、ＥＬＩＳＡプレートリーダー上でプレートを４５０ｎｍで読み取った。Ａｎｇ−２に対して１８５種の完全ヒトＩｇＧκ抗体を認めた。
Ａｎｇ−１と交差反応する抗体を除外するため、ＥＬＩＳＡアッセイにて結合したすべての抗体におけるＡｎｇ−１への結合についてＥＬＩＳＡによりカウンタースクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレート（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、カタログ番号１２−５６５−１３６）を、コーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、ＮａＨＣＯ３ ８．４ｇ／Ｌ）中、５０μｌ／ウェルの組換えＡｎｇ−１（２μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から入手、カタログ番号２９３−ＡＮ−０２５／ＣＦ）でコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベートした。ここに記載の実験条件下で組換えＡｎｇ−１分子をＥＬＩＳＡプレート上に固定化した際、Ａｎｇ−１に結合する抗体は全く見出されなかった。しかし、ここに記載のカウンタースクリーニングは技術的制約を有する。第１に、抗体は系物質由来であってもクローン化ハイブリドーマ由来ではない。系のほんの一部の割合（％）を占めるにすぎない、特定のクローン由来の結合シグナルは、検出感度の閾値未満に収まりうる。第２に、抗原における特定のエピトープは、抗原の固定化によって誘発されるわずかな高次構造上の変化に起因し、この実験における抗体から逃れる可能性がある。これらのあらゆる理由を踏まえ、クローン抗体およびＢｉａｃｏｒｅシステムを用い、各抗体のＡｎｇ−１に対する交差反応性についてさらに検討した（実施例８参照）。実施例８に記載のように、１種のクローン（ｍＡｂ３．１９．３）が事実上、ヒト組換えＡｎｇ−１に対する強い交差反応性を有することが判明した（実施例８、９および１２）。
実施例４ ＡＮＧ−２のＴＩＥ２に対する結合の阻害
上で考察したように、Ａｎｇ−２はＴｉｅ２受容体への結合によってその生物学的効果を発揮する。Ａｎｇ−２／Ｔｉｅ２結合を阻害するモノクローナル抗体を、改良されたＥＬＩＳＡを用いた競合結合アッセイによって同定した。使用したｍＡｂは、Ａｎｇ−２に特異的なハイブリドーマプールの消耗させた上清５０ｍｌからの微量精製（ｍｉｃｒｏ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）産物であった（実施例３参照）。９６ウェルのＮｕｎｃ Ｉｍｍｐｌａｔｅｓ（商標）を、４℃で一晩インキュベートすることにより、４μｇ／ｍｌの組換えヒトＴｉｅ２／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、カタログ番号３１３−ＴＩ−１００）１００μｌでコーティングした。Ｓｋａｎ（商標）Ｗａｓｈｅｒ ３００ Ｓｔａｔｉｏｎ（スカトロン（ＳＫＡＴＲＯＮ））で、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてプレートを４回洗浄した。ウェルをＡＢＸ−ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、０．０１％チメロサール）１００μｌによって１時間ブロッキングした。
１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化組換えヒトＡｎｇ−２（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）カタログ番号ＢＴ６２３）を、１００μｇ／ｍｌの抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂを有する場合または有しない場合として、各ウェルに添加した。プレートを室温で非結合分子が洗い落とされるまでの２時間インキュベートした。次いで、結合したビオチン化Ａｎｇ−２を、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体を１：２００で用い、室温で３０分間インキュベートすることによって検出した。２回洗浄後、結合したストレプトアビジンをＨＲＰ基質（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号ＤＹ９９８）によって検出した。プレートを、反応終了のために４５０停止溶液（１００μｌ／ウェル、ＢｉｏＦＸ、カタログ番号ＢＳＴＰ−０１００−０１）を添加するまでの３０分間インキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓリーダーにより、４５０ｎｍでの光吸光度を測定した。
Ａｎｇ−２よりも１０倍モル過剰な可溶性組換えＴｉｅ２／Ｆｃ融合タンパク質を陽性対照として用いた。この濃度で、Ｔｉｅ２／Ｆｃは、Ａｎｇ−２の固定化されたＴｉｅ２への結合を８０％阻害した。恣意的な判断基準としてこれを用いると、Ａｎｇ−２に結合するｍＡｂの１７５種のうちの７４種が阻害活性を示した。操作の便宜上、後続するハイブリドーマのクローニング用に上位２７種の中和物を選択した。
以下の標準の手順により、限界希釈法を用いて各ハイブリドーマをクローニングした。各ハイブリドーマから３種の姉妹クローンを収集した。各クローンにおいて、上記のように、ＥＬＩＳＡを用いて上清におけるヒトＡｎｇ−２への結合およびＡｎｇ−１への対結合について試験し、各抗体がＡｎｇ−２のみに特異的であることを保証した。消耗させた上清中のＩｇＧ濃度を測定し、各ハイブリドーマ由来の３種の姉妹クローンの中でも最高の収量を有する１種のクローンをＩｇＧ精製のために選択した。さらなる特徴づけを意図して、各上清から０．５〜１ｍｇのＩｇＧを精製した。
ｍＡｂにおけるＡｎｇ−２のＴｉｅ２への結合に対する阻害活性を定量化するため、競合結合アッセイを用い、上位２７種の候補由来の精製ｍＡｂにおける力価を測定した。ｍＡｂの各濃度を２通りに試験した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）グラフィックソフトウェアを用いたカーブフィッティングにより、濃度−応答の関連性を見出した（非線形、Ｓ字形曲線）。ソフトウェアにより、最大阻害（有効性）およびＩＣ５０（効力）を計算した。さらに検討するため、相対的に高い有効性と効力の双方を示す１０種のモノクローナル抗体を選択した。これらの１０種のｍＡｂの有効性および効力について表４に列挙する。
Figure 0005642042
実施例５
抗体のビニング（ＢＩＮＮＩＮＧ）
いずれの抗−Ａｎｇ−２抗体であれば相互に交差競合し、Ａｎｇ−２上の同じエピトープに結合する可能性が高いかを判定するため、エピトープビニングを行った。ビニングプロセスについては、米国特許出願公開第20030175760号明細書だけでなくJia et al., J. Immunol. Methods, (2004) 288:91-98にも記載され、いずれも全体が参照により援用される。つまり、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）のウェブサイト上に提供されているタンパク質共役プロトコルに従い、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）製ビーズをマウス抗−ｈｕＩｇＧ（ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）＃５５５７８４）と共役させた。以下の手順を用い、未知の一次抗体に共役するのに前共役したビーズを調製し、光からビーズを保護した。未知の各上清に対して別々のチューブを使用した。公式（ｎＸ２＋１０）×５０μｌ（式中、ｎ＝試料の総数）を用い、必要とされる上清容量を計算した。このアッセイでは、０．１μｇ／ｍｌの濃度を用いた。ビードストックを緩徐にボルテックスし、上清中で１ウェル当たり５０μｌ中で２５００個の各ビードまたは０．５×１０５個のビーズ／ｍｌの濃度に希釈した。
試料を、暗所で室温の振とう機上で一晩インキュベートした。
フィルタープレートを１ウェル当たり洗浄緩衝液２００μｌを添加することにより予め湿らせ、次いで吸引した。各ビード５０μｌをフィルタープレートの各ウェルに添加した。１００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液を添加して吸引することにより、試料を１回洗浄した。５０μｌ／ウェルの抗原および対照をフィルタープレートに添加した。プレートを覆い、暗所の振とう機上で１時間インキュベートし、次いで試料を３回洗浄した。次いで、５０μｌ／ウェルの未知の二次抗体を添加した。一次抗体に対して０．１μｇ／ｍｌの濃度を用いた。次いで、プレートを、暗所で室温の振とう機上で２時間インキュベートし、次いで試料を３回洗浄した。１：５００に希釈した５０μｌ／ウェルのビオチン化マウス抗−ヒトＩｇＧ（ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）＃５５５７８５）を添加し、試料を、暗所、室温での振とう下で１時間インキュベートした。
試料を３回洗浄した。希釈率１：１０００での５０μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＰＥを添加し、試料を、暗所、室温での振とう下で１５分間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎｅｘ １００上で２回の洗浄サイクルを実施した後、試料を３回洗浄した。各ウェル内の内容物をブロッキング緩衝液８０μｌに再懸濁した。数回のピペッティングにより試料を注意深く混合し、ビーズを再懸濁した。次いで、試料をＬｕｍｉｎｅｘ １００上で分析した。結果を以下の表５に示す。
Figure 0005642042
実施例６ ＢＩＡＣＯＲＥ分析を用いた抗−ＡＮＧ−２抗体親和性の測定
２７種の精製モノクローナル抗体の低分解能スクリーニング
標識不要の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）すなわちＢｉａｃｏｒｅを利用して抗原に対する抗体親和性を測定した。このため、ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に高密度のヤギ抗−ヒト抗体表面を通常のアミンカップリングを用いて調製した。すべての精製したｍＡｂを、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１０ｍｇ／ｍＬのカルボキシメチルデキストランを含有するＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液で約８μｇ／ｍｌに希釈した。ｍＡｂのベースラインの安定化のために、４２秒の接触時間および５分の洗浄時間を用いて分かれた表面上で各ｍＡｂを捕捉した。
９０．９ｎＭのＡｎｇ−２を全表面にわたって１分間注射した後、１０分間解離させた。Ａｎｇ−２注射の直前に対照フローセルからのシグナルを差し引きかつ緩衝液のベースラインドリフトを差し引くことにより２回参照される結合データを用意した。各ｍＡｂに対するＡｎｇ−２結合データを各表面上に捕捉されたｍＡｂの量に対して正規化し、２７種のｍＡｂについての正規化し、ドリフト補正した応答について判定した。データを１：１の相互作用モデルにグローバルに適合させ、結合速度を判定した。２５℃でのＡｎｇ−２結合の速度分析結果を以下の表に挙げる。ｍＡｂを親和性の最高から最低までランク付けしている。
Figure 0005642042
ｍＡｂ５．１０１および５．８６を除くすべてのｍＡｂに対するｋｄ結果の直後のアスタリスクは、これらのｋｄが遅いオフレートデータのオーダー値の特徴に対する最適な推定値として一定に保持されたことを示す。これらの試料における適合モデルでは、比較的短い解離時間を超えるオフレートにおいて測定可能な変化は全く検出されず、それ故、オンレートデータを適合させるのにｋｄが一定である必要があった。それらに対するデータは、約１０−６秒−１のオーダーのｋｄでのシミュレーションではｋｄもよく適合することから、相互作用は上記報告よりも１０倍またはそれより強い可能性があることを示した。
１００ｐＭ未満の親和性を有するｍＡｂを用いた高分解能の速度実験のため、通常は解離データを４〜６時間測定する。捕捉されたｍＡｂ表面からドリフトのアーチファクトを伴わずに測定可能な最大の解離時間は２０分である。高親和性ｍＡｂにより、かかる比較的短時間にわたってほぼ無視できるシグナル減衰が測定されることから、ｋｄ推定値は２桁分だけ変化しうる。
実施例７ ＢＩＡＣＯＲＥ分析を用いた抗−ＡＮＧ−２抗体親和性の判定
３種の精製モノクローナル抗体を用いたＡｎｇ−２培地／高分解能スクリーニング
精製したｍＡｂｓ５．１６、５．３５および５．４１を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中で約８μｇ／ｍｌに希釈した。次いで、希釈した各ｍＡｂを異なるフローセル表面（ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ）上に通常のアミンカップリングを用いて固定化した。
オンレートデータ取得のため、９０．９〜０．７１ｎＭの範囲内の８つの濃度（２倍希釈物）のＡｎｇ−２を、２回の参照を意図した分散型の数回の緩衝液注射で無作為に３通りに９０秒間注射した後、４分間解離させた。各注射サイクルの後に１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５の９秒間パルスを２回施し、抗体表面を再生した。
オフレートデータ取得のため、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液中の３種の９０．９ｎＭのＡｎｇ−２試料を上記のように注射し、８時間にわたり解離データを記録した。試料の注射を３回の無注射サイクルと交互に行った。上記のように再生を行った。
ＣＬＡＭＰ（David G. Myszka and Thomas Morton (1998) 「ＣＬＡＭＰ（著作権）：バイオセンサー動的データ解析プログラム（ａ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｋｉｎｅｔｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ）」 TIBS 23, 149-150）を用い、データを質量移動を伴う１：１相互作用モデルにグローバルに適合させた。得られる結合定数を以下の表７に示す。
Figure 0005642042
８時間の解離時間にわたり有意なシグナル減衰を測定した。ＣＬＡＭＰに８時間の解離データを用いると、各ｍＡｂに対するｋｄをより合理的に推定することができる。ここでは５．１６と５．３５の双方に対するｋｄは約１０−６秒−１である。
次いで、以下の実施例８に記載のように、ｍＡｂのＡｎｇ−１に対する親和性の測定により、抗体のＡｎｇ−１に対する交差反応性について検討した。
実施例８ ＢＩＡＣＯＲＥ分析を用いた抗−ＡＮＧ−１抗体親和性の判定
ｍＡｂのＡｎｇ−１に対する親和性の測定により、抗体のＡｎｇ−１に対する交差反応性についてさらに検討した。オンレートおよびオフレートの判定のため、ＥＬＩＳＡに基づく対結合に記載のように（実施例３）Ａｎｇ−１を固定化する代わりに、Ａｎｇ−２ ｍＡｂをＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定化して溶液中のＡｎｇ−１を注射した。この実験では、下記のように３．３．２、３．３１．２、５．１６．３、５．８６．１、５．８８．３および３．１９．３を含む６種のｍＡｂを試験し、それらがＡｎｇ−１といかに強く交差反応するかを判定した。
６種の精製モノクローナル抗体の中分解能スクリーニング
標識不要の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）すなわちＢｉａｃｏｒｅ２０００機器を利用し、Ａｎｇ−１に対する抗体親和性を測定した。このため、ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に高密度のヤギα−ヒト抗体表面を通常のアミンカップリングを用いて調製した。作製実験において、精製したｍＡｂ（クローン３．１９．３、３．３．２、５．８８．３、５．８６．１、３．３１．２、５．１６．３）を、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液で約２．５〜３．５μｇ／ｍｌに希釈した。各ｍＡｂに対する捕捉レベルは約１５０ＲＵであった。各捕捉サイクルの後に５分間の洗浄を行い、ｍＡｂのベースラインを安定化させた。
ランニング緩衝液で８７．４ｎＭに希釈した単一のＡｎｇ−１試料を、あらゆる捕捉表面にわたって１分間注射した。Ａｎｇ−１がｍＡｂ３．１９．３に結合することが判明したが、５種のｍＡｂに対する結合については全く明らかでなかった。ｍＡｂ捕捉レベルを５００〜６００ＲＵをはるかに超えるレベルまで上昇させかつ３８０ｎＭのＡｎｇ−１を１分間注射することにより、この実験を繰り返した。ｍＡｂ３．１９．３がＡｎｇ−１に結合することが再び判明した
Ａｎｇ−１だけがｍＡｂ３．１９．３に対する結合活性を示したであったことから、このｍＡｂのＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の双方に対する親和性を判定した。Ａｎｇ−１が上記発生実験の間に遅いオフレートを示したことから、中分解能の捕捉実験はｋｄを正確に推定するに十分なオフレートデータを記録しなかったのであろう。結果的には、高分解能のＢｉａｃｏｒｅ条件下でＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２のｍＡｂ３．１９．３に対する結合を測定した。
実施例９
高分解能ＢＩＡＣＯＲＥ分析を用いたＭＡＢ３．１９．３のＡＮＧ−１およびＡＮＧ−２に対する親和性の判定
精製したｍＡｂ３．１９．３を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中で１２．５μｇ／ｍｌに希釈した。次いで、ｍＡｂをフローセル１〜３（ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ）上に通常のアミンカップリングを用いて固定化し、フローセル４を参照フローセルとしておいた。
オンレートデータ取得のため、（１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液中）３９．８〜０．３１ｎＭの範囲内の８つの濃度（２倍希釈物）のＡｎｇ−１を、２回の参照を意図した分散型の数回の緩衝液注射で無作為に３通りに９０秒間（１００μＬ／分の流速で）注射した後、４分間解離させた。各注射サイクルの後に１０ｍＭ ＮａＯＨの６秒間パルスを施し、抗体表面を再生した。
オフレートデータ取得のため、３種の１９．９ｎＭのＡｎｇ−１試料を上記のように注射し、６時間にわたり解離データを記録した。試料の注射を３回の無注射サイクルと交互に行った。上記のように再生を行った。
ＣＬＡＭＰ（David G. Myszka and Thomas Morton (1998) 「ＣＬＡＭＰ（著作権）：バイオセンサー動的データ解析プログラム」 TIBS 23, 149-150）を用い、データを質量移動に対する項目を含めた１：１相互作用モデルにグローバルに適合させた。
精製したＭＡｂ３．１９．３を用いたＡＮＧ−２の高分解能Ｂｉａｃｏｒｅ試験
精製したｍＡｂ３．１９．３を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で１２．５μｇ／ｍｌに希釈した。次いで、ｍＡｂをフローセル１〜３（ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ）上に通常のアミンカップリングを用いて固定化し、フローセル４を参照フローセルにしておいた。
オンレートデータ取得のため、（１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液中）３０．０〜０．２３ｎＭの範囲内の８つの濃度（２倍希釈物）のＡｎｇ−２を、２回の参照を意図した分散型の数回の緩衝液注射で無作為に３通りに９０秒間（１００μＬ／分の流速で）注射した後、４分間解離させた。各注射サイクルの後に１５ｍＭ ＮａＯＨの６秒間パルスを施し、抗体表面を再生した。
オフレートデータ取得のため、３種の１５．０ｎＭのＡｎｇ−２試料を上記のように注射し、６時間にわたり解離データを記録した。試料の注射を３回の無注射サイクルと交互に行った。長い各オフレート注射サイクルの後に１５ｍＭ ＮａＯＨの６秒間パルスを施し、各表面を再生した。
ＣＬＡＭＰ（David G. Myszka and Thomas Morton (1998) 「ＣＬＡＭＰ（著作権）：バイオセンサー動的データ解析プログラム」 TIBS 23, 149-150）を用い、データを質量移動に対する項目を含めた１：１相互作用モデルにグローバルに適合させた。
結果および考察：ＭＡｂ３．１９．３を用いたＡＮＧ−１およびＡＮＧ−２の高分解能Ｂｉａｃｏｒｅ試験
各抗原を用いて２つの別々の実験を行った。結果を以下の表８に示す。
Figure 0005642042
上記表におけるＡｎｇ−２に対するｋｄ値は、ＣＬＡＭＰソフトウェアに適合する１：１相互作用モデルの間には一定に保持されたことからアスタリスクが付いている。Ａｎｇ−２実験において記録された解離シグナルが全く有意ではなかったことから、最適なオフレート推定値は、Ｋｄを１×１０−６秒−１で一定に保つことであった。Ａｎｇ−２に対する長いオフレートデータは、実際にはデータ取得の６時間を超える上昇傾向を示した。この傾向は、２つの異なる機器を「スーパークリーン（ｓｕｐｅｒ ｃｌｅａｎ）」維持プロトコルに従った上でそれらを用い、２つの異なるセンサチップ上で反復された。ｍＡｂ３．１９．３のＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２に対する結合親和性をより正確に測定するため、さらなる実験（実施例１０参照）を実施し、ｍＡｂ３．１９．３のこれらの抗原に対するＫｄを測定した。
興味深いことに、ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ（実施例３）において、Ａｎｇ−１をＥＬＩＳＡプレート上に固定化した場合、ｍＡｂ３．１９．３はＡｎｇ−１に結合しなかった。この矛盾に対しては、Ａｎｇ−１をプラスチック表面上に固定化した際、ｍＡｂ３．１９．３の結合にとって重要なわずかなエピトープが適切に暴露されなかったという説明が考えられる。しかし、Ａｎｇ−１がＢｉａｃｏｒｅ実験条件下など、液相中に存在した際、このエピトープはｍＡｂ３．１９．３に接近可能になり、結合が生じた。
実施例１０ 高分解能ＫＩＮＥＸＡ（結合平衡除外アッセイ（ＫＩＮＥＴＩＣ ＥＸＣＬＵＳＩＯＮ ＡＳＳＡＹ））を用いたＭＡＢ３．１９．３のヒトＡＮＧ−２に対する親和性の判定
高分解能Ｂｉａｃｏｒｅを用いてｍＡｂ３．１９．３のヒトＡｎｇ−２に対する親和性を測定した際（実施例９）、解離シグナルが全く有意でないことが判明した。Ａｎｇ−２に対する長いオフレートデータは、データ取得の６時間にわたり上昇傾向を示す。このため、より信頼性の高いＫｄ値を得ることを目標に、ＫｉｎＥｘＡ技術を用いてｍＡｂ３．１９．３のヒトＡｎｇ−２に対する結合のＫＤを測定した。このため、ＫｉｎＥｘＡ３０００機器を利用した。第１に、１ｍＬ（約２７１μｇ）のストック用Ａｎｇ−２（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ロット番号ＢＮＯ３２５１０Ａ）を、１０ｍＬの脱塩カラム（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ） Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）ポリアクリルアミドカラム、６０００分子量カットオフ、ロット番号ＧＦ９７９６５）を用いて１×ＰＢＳ、ｐＨ７．０に緩衝液交換した。Ｃ．ニック・ペース（Ｃ．Ｎｉｃｋ Ｐａｃｅ）によって記載されたタンパク質濃度測定方法（Pace et al.,Protein Science, Vol.4: 2411-2423, 1995）を用いて貯蔵した画分の濃度を測定すると１．７μＭであった。第２に、２００ｍｇのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、ロット番号２０６−０１）ビーズを４５０μＬ（約１２２μｇ）のストック用Ａｎｇ−２と２４℃で一晩共役させた。次いで、ビーズを遠心し、ブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で１回洗浄し、再度遠心し、次いでブロッキング緩衝液中、２４℃で１時間インキュベートした。ブロッキング後、ビーズを標準のＫｉｎＥｘＡビード用リザーバのバイアル内のＨＢＳ緩衝液（０．０１Ｍヘペス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）約３０ｍＬで希釈し、機器上に置いた。
Ｋｄで制御される適定
ｍＡｂ３．１９．３結合部位を有する２５．３ｐＭの濃度の１２種の溶液を、Ａｎｇ−２の濃度を増加させることにより適定した。試料調製のために緩衝液を交換したＡｎｇ−２を用いた。各溶液における全容量は２５ｍＬであり、それを約２４℃で５日間平衡状態にした。容積測定用のガラス器具を使用して適定溶液を調製し、Ａｎｇ−２の濃度を５．０９ｎＭ〜９９．３ｆＭに変化させた。これらの溶液の分析用に用いたＫｉｎＥｘＡ機器の方法はＰＭＭＡビーズがガラス製キャピラリーに詰め込まれるビードパッキングステップからなり、平衡化溶液を、２通りに０．２５ｍＬ／分で６分間（１．５ｍＬ）、ビードカラムに貫流させた。次いで、３．４ｎＭの蛍光標識したＣｙ−５ヤギ抗−ヒト（Ｆｃ特異的）ポリクローナル抗体を、０．５ｍＬ／分で１分間、ビードパック（ｂｅａｄ ｐａｃｋ）に貫流させて遊離結合部位をビーズ上に捕捉させてｍＡｂを標識した。ビードパックからの蛍光放射を、６２０ｎｍで励起した上で６７０ｎｍで測定した。生成される蛍光測定値を、添付のＫｉｎＥｘＡソフトウェアパッケージ（バージョン１．０．３、セパダイン（Ｓａｐｉｄｙｎｅ，Ｉｎｃ．））を用い、全抗原濃度に対する「％遊離ｍＡｂ結合部位」に変換した。ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用い、生成されるＫＤで制御される適定曲線を、ドリフト補正因子を含めた１：１平衡等温線に適合させた。データに最適に適合するＫＤの値は８６．４ｐＭであり、下側および上側の９５％信頼限界はそれぞれ６４．３ｐＭおよび９８．７ｐＭであった。ｍＡｂで制御される適定曲線は実行しなかった。
実施例１１
ＨＥＫ２９３細胞内で異所的に発現されるＡＮＧ−２誘発性のＴＩＥ２リン酸化の遮断
上で考察したように、Ｔｉｅ２は内皮細胞に特異的な受容体チロシンキナーゼである。血管内皮細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、Ａｎｇ−１がＴｉｅ２リン酸化を誘発する一方で、Ａｎｇ−２はＡｎｇ−１によって誘発された受容体のリン酸化を阻害することが示される。しかし、Ｔｉｅ２が線維芽細胞内など、異所的に発現される場合、Ａｎｇ−２は、アンジオポエチン−２への長期の暴露または高濃度のアンジオポエチン−２への暴露を含む（がこれらに限定されない）特定の条件下でＴｉｅ２リン酸化を誘発することも可能である。
Ａｎｇ−２誘発性のＴｉｅ２リン酸化は、受容体がＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で発現される場合にも生じる。抗−Ａｎｇ−２ ｍＡｂにおけるＡｎｇ−２誘発性のＴｉｅ２リン酸化に対する遮断能を、ヒトＴｉｅ２受容体を形質移入したＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いて試験した。Ｔｉｅ２ ｃＤＮＡを有するプラスミドベクターｐＯＲＫ／ｐＢＳ−ＳＫをＡＴＣＣから入手した（カタログ番号６９００３、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）配列ＢＣ０３３５１４）。ヌクレオチド配列決定によってｃＤＮＡの正確さ（ａｃｃｕｒａｃｙ）を確認した。ヒトＴｉｅ２をコードする３３７５ｂｐのｃＤＮＡを含む３．９ｋｂの断片をＥｃｏＲＩ消化によってベクターから取り出した。この断片を、標準の手順に従ってＥｃｏＲＩで消化したｐＣＲ３．１ベクターに適切な方向でサブクローニングした。選択したプラスミドを標準プロトコルによって増幅して精製した。
上記手順によって得たコンストラクトを含むＴｉｅ２を、リン酸カルシウム形質移入方法によってＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入した。１×１０６個のＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下、１％ゼラチンをコーティングした１００ｍｍの組織培養皿内で成長させた。形質移入までの２〜３時間、細胞に新鮮培地を供給した。１０μｇのプラスミドＤＮＡを２４８ｍＭリン酸カルシウム溶液に溶解した。標準の手順を用いて形質移入を行った。０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８におけるインキュベーションにより、安定なトランスフェクタントを選択した。検出用にマウス抗−Ｔｉｅ２ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ カタログ番号ＭＡＢ３１３）およびヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＰＥ結合抗体（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ）、カタログ番号Ｍ３０００４−４）を使用したＦＡＣＳ分析により、Ｔｉｅ２を発現する安定なトランスフェクタントを同定した。
Ｔｉｅ２リン酸化アッセイを行うため、ＨＥＫ２９３Ｆ／Ｔｉｅ−２トランスフェクタントを、３７℃、５％ＣＯ２下の完全培地を有する、密度が２×１０６個の細胞／プレートの６０ｍｍの細胞培養皿内でサブコンフルエント状態に至るまで成長させた。各プレート内の完全培地を２ｍｌの無血清培地に交換した。細胞をさらに１６時間インキュベートした。次いで、培地を再び２ｍｌの無血清培地に交換した。さらに２時間インキュベートした後、細胞を０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｓ６５０８）で２０分間処理した。細胞を、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下または非存在下でＡｎｇ−２（２μｇ／ｍｌ）で処理した。処理を２通りに行った。Ａｎｇ−２処理を施さない陰性対照を含めた。プレートを１０分間氷上に置く間、細胞をバナジウム酸塩を含有する氷冷ＴＢＳですすぎ、３００μｌ／プレートの冷却ＮＰ−４０溶解緩衝液（５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．２、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭピロリン酸塩、５０ｍＭ ＮａＦ、１％ＮＰ４０、１００Ｕ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１ｍＭオルトバナジウム酸塩、１０μＭロイペプチンおよび１０μＭペプスタチンＡを補充）で溶解させた。処理した細胞をプレートから氷上で予備冷却したマイクロチューブにこすり落とした。
細胞ライセートを短時間、超音波処理し、卓上用微量遠心管内で１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心した。上清を新しいマイクロチューブ内に収集し、１〜５μｇの抗−Ｔｉｅ２ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））を上清に添加した後、４℃で２時間ゆっくりと振とうした。５０μｌのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ピアース（ＰＩＥＲＣＥ） カタログ番号２０３３３）を混合物に添加し、ロッキングプラットフォーム上で４℃で少なくとも３時間インキュベートした。１２，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって複合体を収集した。上清を注意深く除去した後、複合体を４分間の遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃）により溶解緩衝液で２回洗浄した。ペレットを、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴの１ｍＭを含有する２×電気泳動試料用緩衝液（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号ＬＣ−２６７６）５０μｌに再懸濁し、５分間の遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃）前に５分間沸騰させた。上清を新しいチューブに移した。
試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（例えば、４〜２０％トリス−グリシンゲル、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号ＥＣ６０２５）のウェルに負荷した。トリス−グリシン緩衝液系において電気泳動を行った。電気泳動後、標準プロトコルに従い、ゲルをＰＶＤＦ膜（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号ＬＣ２００５）上にブロットした。振とう下、室温で１時間のインキュベーションにより、チロシンリン酸化を、１μｇ／ｍｌの４Ｇ１０抗−ホスホチロシン抗体（アップステート（Ｕｐｓｔａｔｅ）、カタログ番号０５−３２１）とプローブした後、１×ＴＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ）で３回洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼと結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、カタログ番号ｓｃ−２３０２）とともに希釈率１：１０，０００、室温で１時間インキュベートすることによって結合抗体を検出した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ系（ピアース（ＰＩＥＲＣＥ） カタログ番号３４０７５）を用いて化学発光反応を高めた。次いで、ブロットをＲｅｓｔｏｒｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアース（ＰＩＥＲＣＥ）、カタログ番号２１０５９）を用いて剥離し、ＲＴＫに対して特異的な抗体と再プローブして試料負荷の質について検証した。
ヒトＴｉｅ２がＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で異所的に発現される場合、Ｔｉｅ２の自己リン酸化を検出できないことを発見した。Ａｎｇ−２（２μｇ／ｍｌ）処理に応答し、特異的ｍＡｂによって免疫沈降したＴｉｅ２由来のリン酸化チロシン（４Ｇ１０）に対するｍＡｂにより、チロシンリン酸化の有意なレベルを検出した。試験したすべての抗−Ａｎｇ−２ ｍＡｂが１００μｇ／ｍｌの濃度でＴｉｅ２リン酸化に対する明らかな阻害を示す一方、イソタイプ対照ｍＡｂは阻害作用を有しなかった（図１）。図１に示していないモノクローナル抗体５．１０３．１は類似の阻害作用を有した。
Ａｎｇ−２ ｍＡｂにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｎｇ−２誘発性のＴｉｅ２リン酸化に対する阻害能をランク付けするため、Ｔｉｅ２リン酸化を検出するためのＥＬＩＳＡに基づく定量可能な方法を確立した。つまり、細胞ライセートを、様々な濃度のｍＡｂとともにＡｎｇ−２で処理したＨＥＫ２９３Ｆ／Ｔｉｅ２トランスフェクタントから作製した。ライセート由来のＴｉｅ２全体を、マウス抗−ｈＴｉｅ−２ ｍＡｂでコーティングした９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート内で捕捉した。一次抗体４Ｇ１０−ＨＲＰ（アップステート（Ｕｐｓｔａｔｅ）から購入）およびＨＲＰ基質溶液を用い、リン酸化されたＴｉｅ２を検出した。６５０ｎｍでのＯＤをＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーによって測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）グラフィックソフトウェアを用いたカーブフィッティングにより、濃度−応答の関連性を見出した（非線形、Ｓ字形曲線）。図２に示すように、最大阻害（有効性）およびＩＣ５０（効力）を計算した。以下の表９に示されるように、ＥＣ５０を計算した。
Figure 0005642042
上で報告したように、ｍＡｂ３．１９．３がＡｎｇ−１と交差反応することが判明した。しかし、初期実験の結果では、ｍＡｂ３．１９．３によりアンジオポエチン−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化が阻害されることは判明しなかった。Ａｎｇ−２がＨＵＶＥＣ内でＴｉｅ２リン酸化を誘発しない一方、受容体がＨＥＫ２９３細胞内で異所的に発現される場合には確実なＴｉｅ２リン酸化を誘発するという事実から明らかなように、Ｔｉｅ２の異所的な発現が、異なるリガンドによる活性化に対するその感受性に作用しうることは注目に値する。
これらの結果を考慮し、ｍＡｂ３．１９．３がＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の双方の細胞結合性のＴｉｅ２に対する結合を阻害可能か否かについてより十分に検討するため、さらに実験を行った。さらに、以下の実施例１２に記載のように、ｍＡｂ３．１９．３によるアンジオポエチン−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化の阻害についてより詳細に検討した。
実施例１２
ＭＡＢ３．１９．３はアンジオポエチン−１のＴＩＥ−２に対する結合およびＡＮＧ−１誘発性のＴＩＥ２リン酸化を阻害する
ｍＡｂ３．１９．３はヒトＡｎｇ−１と交差反応する（実施例８および９）。しかし初期実験では、ｍＡｂ３．１９．３がＡｎｇ−１によって誘発されるＴｉｅ２リン酸化を阻害しないことが示された。（１）確固たるＴｉｅ２リン酸化シグナルを生成するのに、生理的濃度を大幅に上回る高濃度のＡｎｇ−１が必要とされうる；または（２）ＨＥＫ２９３内でのＴｉｅ２の異所的な発現によるＴｉｅ２の高次構造上の変化によって異なるリガンドに対するその感受性が変化しうるといった点により、矛盾を説明することが可能である。これらの仮定を試験するため、ｍＡｂ３．１９．３を、低濃度のＡｎｇ−１またはＡｎｇ−２（３ｎＭ）が細胞表面のＴｉｅ２に結合する場合の結合アッセイにおいて試験した。この実験では、ｍＡｂ３．１９．３がＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の結合をいずれも阻害することが判明した。第２に、不死化内皮細胞（ＥＡ．ｈｙ９２６／Ｂ３）を用い、Ａｎｇ−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化について検討した。下記により詳細に記載されるように、この実験結果は、ｍＡｂ３．１９．３がＡｎｇ−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化を用量依存的に阻害することを示している。
ＨＥＫ２９３Ｆ／Ｔｉｅ２トランスフェクタントを、収集前に培養フラスコ内で９５％コンフルエント状態になるまで成長させておいた。ＦＡＣＳ緩衝液中で４００万個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、次いで９６−ウェルのポリプロピレンプレートに１ウェル当たり５０μｌで分注した。指示濃度を有するｍＡｂ３．１９．３を細胞懸濁液に添加した。次いで、組換えヒトＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２の溶液を細胞懸濁液に添加した後、室温で２時間インキュベートした。プレートを１，２００ｒｐｍで５分間遠心することによって細胞を洗浄し、吸引によって上清を除去し、細胞を１ウェル当たり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。洗浄手順を２回繰り返した。次いで細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２μｇ／ｍｌに希釈したマウス抗−６Ｘ−ヒスチジン抗体１００μｌに懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、１００μｌのＰＥと結合したヤギ抗−マウス−ＩｇＧに懸濁し、それをＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈し、室温で３０分間インキュベートした。試料の容量をＦＡＣＳ緩衝液で３００μｌにし、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いて測定した。
結果を図３に図示し、表１０にまとめる。示すとおり、可溶性のＴｉｅ２／Ｆｃがリガンドを遮断することによってＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の双方の結合を用量依存的に阻害した一方で、イソタイプ対照ｍＡｂのＰＫ１６．３．１はいずれのリガンドの結合においても全く効果を有しなかった。ｍＡｂ３．１９．３は、Ａｎｇ−１とＡｎｇ−２の双方に対する濃度依存性の阻害を示した。興味深いことに、参照としてのＴｉｅ２／Ｆｃの効力に伴い、ｍＡｂ３．１９．３におけるＡｎｇ−２への結合能はＡｎｇ−１へのそれよりも高かった。
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これらの結果は、ｍＡｂ３．１９．３がヒトＡｎｇ−１に結合するだけでなく、受容体Ｔｉｅ２に対するその結合を遮断することを示した。さらに下記に示すように、これは不死化内皮細胞内でのＡｎｇ−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化の阻害により確認された。
ｍＡｂ３．１９．３におけるＡｎｇ−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化に対する阻害活性について以下のように定量した。図４および５に示すように、ｍＡｂは、抗体濃度の上昇に伴い、Ｔｉｅ２リン酸化の阻害を明らかに増大させることを示した。用量応答曲線のプロットにより、９９ｎＭでのＩＣ５０の計算値が得られる。
アンジオポエチン−１リガンド刺激性のＴｉｅ−２受容体リン酸化アッセイ
容量２ｍｌのＤＭＥＭ；ＨＡＴ；１０％ＦＣＳ中の２．５×１０５個のＥＡ．ｈｙ９２６細胞／ウェルを用い、ＥＡ．ｈｙ９２６／Ｂ３細胞を６つのウェルプレートに播種し、標準の哺乳類細胞の成長条件下で３日間インキュベートした。
成長培地を（ＦＣＳを含有しない）ＤＭＥＭ２ｍｌに交換し、細胞を全部で２時間にわたり血清飢餓にした。試験化合物をＤＭＥＭ；１％ＦＣＳで所望の最終濃度の２倍まで希釈した。血清飢餓にして１時間４０分後、培地を細胞から除去し、１ｍｌの試験化合物希釈物に交換した。同様に、処理していない対照化合物も処理することで、１００％のリガンド刺激の標準を示す試料が得られた。
インキュベーションをさらに１０分間継続した後、ＤＭＥＭ溶液中の１０ｍＭオルトバナジウム酸塩１００μｌを各ウェルに添加し、各ウェルにて最終濃度１ｍＭのオルトバナジウム酸塩を得た。次いで、２時間にわたる血清飢餓期間の最後の１０分間、細胞をインキュベートした。
一旦２時間の血清飢餓期間が終了すると、１ｍｌのアンジオポエチン−１（ＤＭＥＭで適切な濃度に希釈、１ｍＭのオルトバナジウム酸塩を含有）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。
次いで、６つのウェルプレートを、氷冷金属プレート上に置いて冷却した（それを氷上で保持した）。細胞培地を除去し、細胞層を５ｍｌの冷ＰＢＳ；１ｍＭのオルトバナジウム酸塩で洗浄した。１ｍｌの氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭトリス ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ４０、０．５％ＤＯＣ、１ｍＭオルトバナジウム酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、３０μｌ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン）を各ウェルに添加し、氷上に１０〜２０分間放置した。細胞をセルリフター（ｃｅｌｌ ｌｉｆｔｅｒ）を使用してプレートからこすり落とし、ライセート溶液全体を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、氷上で保持した。次いで、試料を１３０００ｒｐｍ、４℃で３分間回転させ、後続の全ステップを４℃で実施した。
（グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）から入手した低タンパク質を結合するポリプロピレン製マイクロタイタープレート内での）ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号２３２２５）のために各ライセート５０μｌを保持した。キットに付属の標準アッセイ条件を用いてタンパク質濃度を測定した。さらに各試料ライセート８００μｌを、免疫沈降（ＩＰ）に備えた新たな２ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。１５μｌ（３ｍｇ）の抗Ｐ−Ｙ（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ） カタログ番号Ｅ２２０３）をライセートに添加し、６００μｌのＭａｇｎａｂｉｎｄビーズ（ヤギ抗マウスＩｇＧ、ピアース（ＰＩＥＲＣＥ） カタログ番号２１３５４）を添加する前に４℃で２時間インキュベートしておいた。Ｍａｇｎａｂｉｎｄビーズを以下のように調製した。必要容量を１５ｍｌの円錐チューブに移した。次いで、磁場の存在下にチューブを置き、液体を除去した。新しいＰＢＳを元の容量を用いて添加し、ビーズを再懸濁した。このプロセスを２回繰り返した。次いで、ライセート含有溶液をビーズと混合し、チューブを回転ミキサー上、４℃で一晩回転したままにした。
試料を磁気に約１分間暴露し、液体を注意深く除去した。溶解緩衝液１ｍｌを添加し、チューブを５分間回転させて洗浄した。洗浄ステップを２回繰り返した。液体を完全に除去し、ビーズを１２μｌの熱い（９４℃）２×ラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）ローディング緩衝液＋ｂＭＥに再懸濁し、次いで室温で１５分間静置しておいた。チューブを磁気に１分間暴露し、ビーズから単離した液体をＰＡＧＥ／ＳＤＳゲル上で分析した。
試料を、１５ウェルで４〜１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥ／ＭＯＰＳゲルを用いたＰＡＧＥ／ＳＤＳゲル（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ））を用いて分析した。スロットごとに各免疫沈降物全部で１２μｌを負荷した。ゲルを２００Ｖ／１２０ｍＡ／２５ワットで５５分間走らせ、次いで試料を、５０Ｖ／２５０ｍＡで１時間３０分、ニトロセルロース膜上でウエスタンブロットした。次いで、全ブロットを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％Ｍａｒｖｅｌで、室温で１時間処理し、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。
ウサギ抗Ｔｉｅ−２抗体（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ） カタログ番号Ｃ１３０３）を０．５％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１：５００に希釈し、１２．５ｍｌを各ブロットに添加し、４℃で一晩放置した。次いで、ブロットをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ヤギ抗ウサギ−ＰＯＤ（ダコ（Ｄａｋｏ） カタログ番号Ｐ０４４８）（０．５％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１：５０００に希釈）を各ブロットに添加し、室温で１時間放置した。ブロットをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、各ブロットを、１２．５ｍＬ（同容量の溶液ＡおよびＢ）のＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（ピアース（ＰＩＥＲＣＥ） カタログ番号３４０８０）で１０分間展開した。ブロットをＸ線カセットに移し、フィルムに露光した（５秒／１５秒／３０秒／６０秒／１５０秒露光）。図４は、このアッセイの結果を示すウエスタンブロットである。この系では、ｍＡｂ３．１９．３によるアンジオポエチン−１刺激性のＴｉｅ２リン酸化の阻害について観察した。
次いで、各試料におけるフィルム上に見られる像をＦｌｕｏｒＳ ＢｉｏＲａｄイメージアナライザーシステムを用いて評価した。ピクセル密度をＯＤ／ｍｍ２として測定し、容量率（％）で表した。容量率（％）の結果を、ＢＣＡアッセイを用いて測定したタンパク質濃度および免疫沈降において用いられる各試料のライセート容量を用いた１ｍｇのタンパク質／免疫沈降物に正規化した。各試料のリン酸化率（％）を、各ゲル上の未処理の対照試料を１００％のリン酸化値として計算し、各試料の阻害率（％）を１００％のリン酸化値（それは０％の阻害率を示す）に対して計算した。図５はこれらの値のグラフ表示であり、アンジオポエチン−１刺激性のＴｉｅ２リン酸化の阻害におけるＩＣ５０が９９ｎＭであることを示す。
これらのデータを総合すれば、この系ではｍＡｂがアンジオポエチン−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化を阻害することが示される。
実施例１３
ＡＮＧ−２抗体の構造分析
抗体の可変重鎖および可変軽鎖を配列決定し、それらのＤＮＡ配列を決定した。抗−Ａｎｇ−２抗体についての完全な配列情報を、ガンマ鎖とκ鎖の各々の組み合わせについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する配列リスト内に提供する。可変重鎖配列を分析し、ＶＨファミリー、Ｄ−領域配列およびＪ−領域配列を決定した。次いで、配列を翻訳して一次アミノ酸配列を決定し、かつ生殖系ＶＨ、ＤおよびＪ−領域配列と比較して体性超変異について評価した。
表１１は、抗体重鎖領域をそれらの同族の生殖系重鎖領域と比較した表である。表１２は、抗体κ軽鎖領域をそれらの同族の生殖系軽鎖領域と比較した表である。
免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）領域は、Ｂ細胞の個体発生の間に機能的な可変領域（ＶＨＤＪＨまたはＶＫＪＫ）に連結される複数の生殖系ＤＮＡセグメントによってコードされる。Ａｎｇ−２に対する抗体応答の分子的および遺伝的多様性について詳細に試験した。これらのアッセイは、抗−Ａｎｇ−２抗体に特異的ないくつかのポイントを明らかにした。
Ａｎｇ−２に特異的な１５２種の別々の抗体の分析により、抗体が２１種の異なる生殖系ＶＨ遺伝子由来であるという判定結果を得た。それらのうちの１１２種はＶＨ３ファミリー由来であり、４６種の抗体はＶＨ３−３３遺伝子セグメント由来である。表１１および１２はこの分析結果を示す。
各ハイブリドーマから収集した姉妹クローン内のアミノ酸配列が同一であることが理解されるべきである。例えば、ｍＡｂ３．１９．３における重鎖および軽鎖配列は、ｍＡｂ３．１９および３．１９．１における表１１および１２に示される配列と同一である。
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実施例１４ 抗体の規範的クラスの判定
チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）らは、各免疫グロブリン鎖の超可変領域に対する「規範的クラス（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃｌａｓｓ）」の観点における抗体構造について記載している（J MoI Biol. 1987 Aug 20; 196(4):901-17）。種々の免疫グロブリンのＦａｂおよびＶＬ断片の原子構造を分析し、それらのアミノ酸配列とそれらの抗原結合部位の三次元構造の関連性について判定した。チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）らは、主として超可変領域の主鎖高次構造を担う残基が、それらのパッキング、水素結合あるいは特異なファイ、プサイまたはオメガ高次構造をとる能力を通じて相対的に少ないことを見出した。これらの残基が超可変領域内および保存されたβ−シートフレームワーク内の部位に存在することが判明した。チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）らは、未知の構造を有する免疫グロブリンの配列を調べることにより、多数の免疫グロブリンが、既知の構造の１つに大きさが類似する超可変領域および観察された高次構造を担う部位に追加的に含まれる同一の残基を有することを示している。
彼らの発見は、これらの超可変領域が既知の構造における高次構造に近い構造を有することを意味した。超可変領域のうちの５種については、高次構造のレパートリーが比較的少数の別々の構造クラスに限定されるように見られた。これらの共通に生じる超可変領域の主鎖高次構造は「規範的構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」と称された。チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）らによるさらなる研究（Nature 1989 Dec 21-28; 342(6252):877-83）およびその他（Martin, et al. J MoI Biol. 1996 Nov 15; 263(5):800-15）は、抗体の超可変領域の６種のうちの少なくとも５種における主鎖高次構造のレパートリーが少ないことを確認した。
上記の各抗体のＣＤＲにおける規範的クラスを判定するためにそれらを分析した。知られているように、規範的クラスが、抗体軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とともに抗体重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２に限り割り当てられている。下記の表（表１３）は分析結果をまとめている。規範的クラスデータは、*ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３の形態であり、ここで「ＨＣＤＲ」は重鎖ＣＤＲを示しかつ「ＬＣＤＲ」は軽鎖ＣＤＲを示す。したがって、例えば、１−３−２−１−５の規範的クラスは、規範的クラス１に分類されるＨＣＤＲ１、規範的クラス３に分類されるＨＣＤＲ２、規範的クラス２に分類されるＬＣＤＲ１、規範的クラス１に分類されるＬＣＤＲ２、および規範的クラス５に分類されるＬＣＤＲ３を有する抗体を示す。
抗体内のアミノ酸と各々の規範的クラスとして定義されたアミノ酸における同一性が７０％もしくはそれより大きい場合の特定の規範的クラスに対して割り当てを行った。同一性が７０％未満である場合、規範的クラスの割り当てをアスタリスク（「*」）としてマークし、各ＣＤＲの長さおよびデータの全体性に基づいて適切な規範的クラスの最良の推定がなされたことが示される。同じＣＤＲの長さを有するマッチングする規範的クラスが全くない場合、規範的クラスの割り当てを「Ｙ」としてマークする。各抗体に対して定義されたアミノ酸について、例えば上記のチョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）らによる記事の中に見出すことができる。表１３では、各Ａｎｇ−２抗体における規範的クラスデータが報告される。
Figure 0005642042
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表１４は、１クラス当たりの抗体の数に関する分析である。左カラム内に指定した特定の規範的クラスを有する抗体の数を右カラムに示す。
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実施例１５ ＡＮＧ−２抗体のエピトープマッピング
Ａｎｇ−２の活性を中和する２７種の抗体の結合ドメインを分析した。
組換えヒトＡｎｇ−２をＲ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（６２３−ＡＮ）から購入した。直接ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにおいて、ヤギ抗−ヒトＡｎｇ−２ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ） ＡＦ６２３）におけるｒｈＡｎｇ−２に対する認識能に応じて選択した。ポリクローナル抗体を、ＨＲＰと結合したストレプトアビジンで検出するためにビオチン化した。
すべての制限酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから供給を受け、製造業者の使用説明書に従って使用した。スピンミニカラム（ｓｐｉｎ ｍｉｎｉ ｃｏｌｕｍｎｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）を使用してすべてのプラスミドＤＮＡを精製した。クローニングおよび部位特異的変異誘発を目的として使用されるオリゴヌクレオチドプライマーをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）オペロン（Ｏｐｅｒｏｎ）によって合成した。
抗体：２７種のハイブリドーマ由来のヒト抗Ａｎｇ−２抗体を、ｒｈＡｎｇ−２のその受容体への結合に対するそれらの阻害能に基づいて選択した。抗体を以下の表１５に挙げる。
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２７種の中和抗−Ａｎｇ−２抗体のドットブロットでのエピトープの特徴づけ
バイオドット（Ｂｉｏ−Ｄｏｔ）精密濾過ユニットを使用し、ＲｈＡｎｇ−２（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））をその天然または還元形態でニトロセルロース膜上にスポットした。ヒトＡｎｇ−２に対して産生されたすべてのヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は還元形態ではない非還元型Ａｎｇ−２に結合しており、これはすべてのｍＡｂがタンパク質の還元時には明らかに破壊される高次構造のエピトープを認識することを示した。
Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２タンパク質のクローニングおよび発現
ｍＡｂとＡｎｇ−２との相互作用における構造的基礎をより十分に理解するため、１組のキメラＡｎｇ−１／Ａｎｇ−２分子を用いた。このアプローチでは、血管形成のファミリーメンバーが構造的に関連するという事実が利用される。
Ａｎｇ−２およびＡｎｇ−１がそれらのタンパク質配列において６０％の相同性しか示さないが、両者はアミノ末端のコイルドコイルドメインとカルボキシル末端のフィブリノーゲン様ドメインとからなる同じ分子構造を共有する。
ヒトＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２のクローニング
２つの選択的スプライシングを受けた形態のヒトＡｎｇ−２ ｃＤＮＡをヒト臍静脈内皮細胞系（ＨＵＶＥＣ）から増幅した。Ａｎｇ−２に特異的なプライマーを用いたＨＵＶＥＣ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により、完全長Ａｎｇ−２（１４９１ｂｐ）と１３３０塩基対の変異体Ａｎｇ−２４４３の双方が現れた(Injune et al., (2000) JBC 275: 18550)。Ａｎｇ−２４４３は、エクソンＢおよびコイルドコイルドメインの欠失部分（アミノ酸９６〜１４８）の選択的スプライシングによって生成された変異体である。図６に示すように、両Ａｎｇ−２ ｃＤＮＡをｐＣＲ３．１発現ベクターにクローニングし、２９３Ｆ細胞内で発現させた。ヒト乳腺細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１から抽出した全ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ヒトＡｎｇ−１ ｃＤＮＡを得た。１．５ＫｂのｃＤＮＡをｐＣＲ３．１発現ベクターにクローニングし、一時的に形質移入された２９３Ｆ細胞の上清中で発現を検出した。
ＥＬＩＳＡ
抗体捕捉ＥＬＩＳＡを用い、Ａｎｇ−２およびＡｎｇ−１ ｃＤＮＡの一時的形質移入から生成した上清への２７種のｍＡｂの結合について試験した。Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−２４４３およびＡｎｇ−１を、ヒトＡｎｇ−２またはＡｎｇ−１（各々）に対するヤギポリクローナル抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと結合させた。上位２７種のヒトモノクローナル抗体の結合を、ＨＲＰと結合したヤギ抗−ヒト抗体とそれに続く比色用の西洋わさびペルオキシダーゼ基質（増加させたＫ−Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質、ネオゲン（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて検出した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの吸光度をマイクロプレートオートリ−ダー上にて４５０ｎｍで測定した。
２９３Ｆ細胞の形質移入
２９３Ｆヒト胚腎細胞を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地内の１０％ウシ胎仔血清中に維持した。リン酸カルシウムを用い、２９３Ｆ細胞を一時的に形質移入した。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析のため、７２時間時点で培地を収集し、濾過した。
すべての２７種の抗体はＡｎｇ−２／Ａｎｇ−２４４３抗原に特異的に結合することが判明した。ヒトＡｎｇ−１との交差反応性は全く検出されなかった。Ａｎｇ−２４４３タンパク質配列において欠失している、Ａｎｇ−２のコイルドコイルドメインにおけるアミノ酸９６〜１４８を、２７種の各抗体に対する結合ドメインとして除外した。
Ａｎｇ−１／Ａｎｇ−２キメラ分子の構築
インフレーム融合物のアンジオポエチンキメラタンパク質を構築するため、ヒトＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２遺伝子に共通の制限切断部位を用いた。
ヒトＡｎｇ−１／２ ＢｓｍＩ、Ａｎｇ−２／１ ＢｓｍＩ、Ａｎｇ−１／２ ＳｓｐＩおよびＡｎｇ−２／１ ＳｓｐＩの４種のコンストラクトを作製した。すべてのタンパク質を、ヒトＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２に対するポリクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって測定される検出可能なレベルで発現および分泌させた。
アミノ酸連結点は以下の位置にある。
ＢｓｍＩ−１１７（Ａｎｇ−２）／１１９（Ａｎｇ−１）
ＳｓｐＩ−３５３（Ａｎｇ−２）／３５４（Ａｎｇ−１）
１個のアミノ酸の違いは、ヒトＡｎｇ−２では４９６個の残基が存在のに対してヒトＡｎｇ−１では４９７個の残基が存在することに起因する。すべてのコンストラクトを、２９３Ｆ細胞内で発現させ、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２に対するヤギ抗−ヒトポリクローナル抗体を用いて検出した。上位２７種の抗体におけるキメラＡｎｇ−１／２分子に対する結合能について試験した。すべての２７種の抗体は、Ａｎｇ−１／２ ＢｓｍＩコンストラクトのみに結合するという類似パターンを示した。これらの実験結果は、すべての抗体に対する結合ドメインが残基１１７〜４９６の範囲に存在し、エピトープがアミノ酸３５３近傍にあるＳｓｐＩ融合Ａｎｇタンパク質内で破壊される場合にはフィブリノーゲン結合ドメイン内に存在する可能性が最も高いことを示す。
マウス／ヒトＡｎｇ−２キメラ分子の構築
Ａｎｇ−２とＡｎｇ−１が共有するアミノ酸同一性が約５５％であることから、キメラ分子のクローニング用に用いられる共通の制限部位を見出すことは困難であった。マウスおよびヒトにおけるＡｎｇ−２はより類似性があり、約８５％の配列相同性を有する。ｐＣＭＣｓｐｏｒｔ発現ベクター内でクローニングされるマウスＡｎｇ−２ ｃＤＮＡをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。２７種の選択した抗体における組換えマウスＡｎｇ−２との免疫反応性について試験した。２７種のうちの６種がマウスＡｎｇ−２と交差反応し、ここではヒトＡｎｇ−２に対するそれらの免疫反応性は１００％であった。これはマウス抗原がヒトＡｎｇ−２の免疫反応性の大部分を保持することを示している（データを表１６にまとめる）。
大部分の抗体がヒトＡｎｇ−２抗原に特異的に結合しかつマウスＡｎｇ−２と交差反応しないという知見に基づき、エピトープマッピングにおいてヒト−マウスキメラ系を選択した。Ａｎｇ−２の様々なｃＤＮＡコンストラクトを作製し、哺乳類発現ベクターにクローニングした。
マウス／ヒトＡｎｇ−２のコンストラクトを、共通のＳｔｕＩ制限部位を用いて作製し、残基３１１でアミノ酸連結点を有するフィブリノーゲン結合ドメイン内に位置づけた。ヒトＡｎｇ−２に特異的なすべてのｍＡｂはマウス／ヒトＡｎｇ−２ ＳｔｕＩに結合することができ、これは結合ドメインが残基３１１〜４９６の範囲のフィブリノーゲン結合ドメイン内に存在することを示す。結合ドメインの範囲を制限するため、マウスＡｎｇ−２ ｃＤＮＡ内のマウス配列をヒト断片ＳｔｕＩ−ＴｆｉＩに交換した新規コンストラクトを調製した（図９）。
ヒトＡｎｇ−２に特異的なすべての抗体はＥＬＩＳＡでは陽性シグナルを示し、ヒトＡｎｇ−２に対するそれらの免疫反応性が１５〜１００％であった。表１７に示すように、固有のＶＨ遺伝子として５．３５．１（ＶＨ３−２０）および５．２８．１（ＶＨ３−４３）を使用した２種の抗体の結合ドメインをアミノ酸３１０〜４００の領域にマッピングした。
マウスＡｎｇ−２と交差反応する抗体は１００％の反応性を示すと予想され、それらをマウス／ヒトキメラコンストラクトを用いてマッピングすることができなかった。
部位特異的変異誘発
異なる抗体の結合部位に関与する重要な残基を定めるため、ヒトＡｎｇ−２の数個の残基を変異させ、ＥＬＩＳＡアッセイにより抗体群全体の結合についてスクリーニングした。
ＥＬＩＳＡによって検出された直接結合が親和性における中小程度の違いに対して感受性を示さないことから、単一のアミノ酸の置換後に観察される結合上の変化が大きいと、抗体と相互作用する主要な部位が同定される可能性が高い。さらに、ヒトＡｎｇ−２に対するポリクローナル抗体は各コンストラクトとの１００％の反応性を維持し、これは変異誘発の手続きによってＡｎｇ−２分子を通じて広範な構造変化が全く誘導されなかったことを示す。位置３４５（Ｖ３４５Ｍ）でのＶａｌからＭｅｔ、位置３７５（Ｈ３７５Ｑ）でのＨｉｓからＧｌｎへの２つの独立した変化は、２７種の抗体全部によって無視されたが、これはこれらの残基が反応性を示さないかまたはエピトープの高次構造上の変化にとって２つ以上のアミノ酸の置換を必要とすることを示す。位置３６５および３６７での２つの残基の変化により、単一の抗体Ｍａｂ５．３５．１の結合が劇的に変化した。５．３５．１の配列分析では、ＶＨ３−２０の固有の使用および重鎖および軽鎖の両鎖上の固有のＣＤＲ３が示された。図８では、Ａｎｇ−２キメラ分子のすべての融合点および点突然変異が強調されている。図９は、マウスＡｎｇ−１（配列番号５）、ヒトＡｎｇ−１（配列番号２）、マウスＡｎｇ−２（配列番号４）、およびヒトＡｎｇ−２（配列番号３）のアミノ酸配列を比較したものである。矢印は疎水性のリーダー配列における切断部位を示す。矢印は、コイルドコイルおよびフィブリノーゲン様ドメインの境界を規定する。黒丸は保存システイン残基を示す（画像はメゾンピエール（Maisonpierre et al., 1997, Science 277:55）から取得）。
すべてのＡｎｇ−２分子に対する結合データを以下の表１６にまとめる。
Figure 0005642042
Figure 0005642042
配列分析ソフトウェアツールを用い、かつ生殖系データベースに対するＶＨ遺伝子のアラインメントにより、ＩｇＨおよびＩｇＬ配列の配列分析を行った。ソフトウェアでは、Ｄ因子、リーディングフレーム、Ｎ領域挿入、Ｐヌクレオチド付加、ヌクレオチド欠損およびＣＤＲ３の長さも評価される。ＣＲ６４に特異的な２７種の別々の抗体の分析では、７種の生殖系ＶＨ遺伝子のみが得られ、それらの１０種は同じＶＨ１ファミリー由来であった。中和抗体の選択では、同じＩｇ ＶＨを発現する抗体および場合によって同じＶＨＤＪＨの再配列ならびにＨ鎖およびＬ鎖の対合体が保存されることが示された。この知見は、任意の所定のエピトープにおいて生殖系レパートリーの数種のメンバーのみを用いることで対応するパラトープが形成され、かつ各抗原エピトープにおいて限定された数のＬ−およびＨ−鎖遺伝子が対をなすことで特異的なパラトープが形成されうることを示唆している。
異なるモノクローナル抗体による類似のＶＨ、ＶＫおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）構造の反復使用は、すべてのＡｎｇ−２に対する中和活性がフィブリノーゲン様ドメインに限定されかつプロコピオ（Ｐｒｏｃｏｐｉｏ）らによって公表された研究(1999, JBC 274: 30196)と一致しているという事実と関連があり、これはＡｎｇ−２のＴｉｅ２に対する作用がフィブリノーゲン様ドメインと関連があることを示している。エピトープマッピングデータは、モノクローナル抗体がフィブリノーゲン様ドメインの大部分を含む広範な界面を介してＡｎｇ−２に結合することを示す。
実施例１６ マウスＡＮＧ−２との交差反応性の判定
ＥＬＩＳＡにより、抗−ヒトＡｎｇ−２ ｍＡｂのマウスＡｎｇ−２に対する交差反応性について試験した。このため、マウスＡｎｇ−２発現ベクターを構築し、真核細胞に一時的に形質移入してマウスＡｎｇ−２を生成した。
マウスアンジオポエチン−２（ｍＡｎｇ−２）発現コンストラクトを、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅコンソーシアム（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（ワールドワイドウェブｉｍａｇｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖを参照）の販売業者であるリサーチ・ジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）から入手した。マウスＡｎｇ−２ ｃＤＮＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＢＣ０２７２１６、ＩＭＡＧＥ：３４９４５６６）は、肺腫瘍ライブラリであるライブラリＮＣＩ_ＣＧＡＰ_Ｌｕ２９から得た。ｃＤＮＡをＳａｌＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）部位を介してｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）にクローニングし、それは４９６個のアミノ酸の完全長マウスＡｎｇ−２（ｍＡｎｇ−２）オープンリーディングフレーム、ならびに全体で２４７１塩基対に及ぶ５’および３’非翻訳フランキング領域を含んだ。
リン酸カルシウム法を用い、１０μｇの上記ｍＡｎｇ−２プラスミドをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入した。前日に、約１×１０６個のＨＥＫ２９３Ｆ細胞を１０ｃｍの組織培養プレート上に播種した。形質移入の５時間後または一晩経ってから培地を変え、細胞をもう２〜３日成長させた後、分泌されたｍＡｎｇ−２タンパク質を含有する上清を収集した。Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から得たポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ６２３）を用いたＥＬＩＳＡにより、ｍＡｎｇ−２の発現を確認した。
９６−ウェルのヌンク（Ｎｕｎｃ）製Ｉｍｍｐｌａｔｅに各ウェル内のＨＥＫ２９３Ｆ／マウスＡｎｇ−２トランスフェクタント１００μｌから収集した条件培地でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした後、Ｓｋａｎ Ｗａｓｈｅｒ ３００ステーション（スカトロン（ＳＫＡＴＲＯＮ））でリン酸塩緩衝生理食塩水を用いて４回洗浄した。ウェルを、ＡＢＸ−ブロック緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、０．０１％チメロサール、ＰＢＳ中）１００μｌによって１時間ブロッキングした。適切な濃度を有しかつブロッキング緩衝液で希釈した抗−Ａｎｇ−２ ｍＡｂを１００μｌ／ウェルの容量を有するウェルに添加し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。ｍＡｂおよびそれらの各希釈物を２通りに試験した。２回洗浄後、結合ｍＡｂを、ヤギ抗−ヒトＦｃ−ＨＰＰＯと結合した抗体（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ）、コードＨ１０５０７）を室温で１時間にわたり１／１，０００に希釈したものによって検出した。発色反応の検出を設定するため、ＰＢＳを用いてウェルを３回洗浄後、ＴＭＢ基質（ＴＭＢ−マイクロウェル、ＢｉｏＦＸ、カタログ番号ＴＭＳＫ−１０００−０１）１００μｌを添加した。６５０の停止溶液（１００μｌ／ウェル、ＢｉｏＦＸ、カタログ番号ＢＳＴＰ−０１００−０１）を添加して反応を終了させる前に、プレートを３０分間インキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓリーダーにより、６５０ｎｍでの光吸光度を測定した。
このアッセイでは、上位２７種の中和ｍＡｂを試験した。光吸光度によると、モノクローナル抗体３．１９．３、３．３８、５．２．１、５．５２．１、５．５６．１および５．７８．１が実験条件下でマウスＡｎｇ−２に結合可能であることが示された。確認のため、ＥＬＩＳＡによって各結合抗体を滴定した。ｍＡｂのＬｏｇ濃度（μｇ／ｍｌ）に対してプロットした平均ＯＤの６５０ｎｍ（±Ｓ．Ｄ．）値を図１０に示す。クローン５．２．１、５．２８．１、３．１９．３および３．３１．２を同図に示す。モノクローナル抗体５．２．１および３．１９．３はマウスＡｎｇ−２に用量依存的に結合し、約１０μｇ／ｍｌで飽和に達した（図１０）。これら２種のｍＡｂの結合曲線は、Ｓ字状の典型的な用量−応答の関連性曲線であった。クローン５．２．１および３．１９．３を除くと、試験抗体の濃度範囲内では用量依存性および飽和が観察されなかった。この結果に基づき、ｍＡｂ５．２．１および３．１９．３のみがマウスＡｎｇ−２に対する交差反応性を有すると見られた。
実施例１７
マウスＡＮＧ−２のヒトＴＩＥ２に対する結合の阻害
モノクローナル抗体３．１９．３を、マウスＡｎｇ−２のヒトＴｉｅ２への結合に対するその阻害能をさらに試験するために選択した。このため、ＥＬＩＳＡプレートを４μｇ／ｍｌのｈＴｉｅ２／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））１００μｌ／ウェルでコーティングし、ウェルを通常どおり４℃で一晩ブロッキングした。上記の２９３Ｔ／ｍＡｎｇ−２トランスフェクタントの培養上清中で組換えマウスＡｎｇ−２（ｍＡｎｇ−２）を用いた。様々な濃度でｍＡｂ３．１９．３を有するｍＡｎｇ−２を含有する上清１００μｌを予備コーティングしたウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。
対照として、抗体と混合した組換えヒトＡｎｇ−２（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））も含めた。ｍＡｂの各濃度を３通りに試験した。結合したマウスおよびヒトＡｎｇ−２を、マウスＡｎｇ−２と交差反応するヤギ抗−ヒトＡｎｇ−２ポリクローナル抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、カリフォルニア州）を用いて検出し、二次ウサギ抗−ヤギＩｇＧ−ＨＲＰと共役させた。ＨＲＰ基質の添加から３０分後にＯＤ６５０を測定した。ｍＡｂ３．１９．３がヒトおよびマウスＡｎｇ−２のヒトＴｉｅ２への結合を用量依存的に阻害することが発見された（図１１）。
実施例１８ サル脈管構造との交差反応性の判定
Ａｎｇ−２が血管形成性の内皮細胞内で特異的に発現されることから、サル由来のこれらの細胞を、各抗体がサルＡｎｇ−２と交差反応するか否かを間接的に判定するための一方法として、抗−Ａｎｇ−２抗体で免疫組織化学染色を行った。
サル由来の内皮細胞に富む卵巣組織を用いたこの実験において、実施例４（表４）に記載のように選択した上位１０種の中和ｍＡｂについて試験した。完全に乾燥させた６μｍの冷凍サル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）卵巣組織切片を４℃のアセトンで５分間固定した。スライドをＰＢＳで３回洗浄後、組織の内因性ペルオキシターゼを０．３％Ｈ２Ｏ２で１０分間ブロッキングした。次いで、組織をＰＢＳで洗浄し、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗−ヒトＩｇＧ Ｆａｂで１５分間ブロッキングした。組織切片をＰＢＳで再洗浄後、１０％正常ヤギ血清で１０分間処理した。血清を除去後、１０種の抗−Ａｎｇ−２ ｍＡｂの各々（１０μｇ／ｍｌ）を切片に適用し、２時間インキュベートした。結合したＡｎｇ−２ ｍＡｂを、１５分間で１０μｇ／ｍｌのマウス抗−ヒトＩｇＧを用いて検出した後、ペルオキシターゼと結合したヤギ抗−マウスＩｇＧとともに３０分間インキュベートした。最適な結果を得るため、顕微鏡観察下でＡＥＣ−基質系（ダコ（ＤＡＫＯ）、カタログ番号３４６４）を用いて染色した。
全部で１０種のｍＡｂが卵巣組織内の血管形成における血管内皮細胞を染色する一方、イソタイプ対照ｍＡｂは染色しないことが判明した。これにより、表４からの１０種のｍＡｂがサルＡｎｇ−２と交差反応することが示された。
実施例１９ マトリゲルプラグアッセイにおいてＭＡＢ３．１９．３はｉｎ ｖｉｖｏで血管形成を阻害する
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗−Ａｎｇ−２モノクローナル抗体の抗血管形成の可能性を評価するため、マトリゲルプラグの血管形成アッセイを実施した。ＭＣＦ−７細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されるか、または免疫不全マウスに異種移植片として移植される場合、Ａｎｇ−２を産生することが判明した。ＭＣＦ−７をマトリゲルに混合し、ヌードマウスに皮下移植する場合、成長する頑丈な血管がゲルになることが判明した。マトリゲルプラグモデルを樹立するため、体重範囲が１８〜２０ｇの６〜８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、マサチューセッツ州）を使用した。Ａｎｇ−２抗体を有する場合または有しない場合での２×１０６個のＭＣＦ−７細胞を有する全体で０．５ｍＬのマトリゲル、あるいは（マトリゲル単独、Ｔｉｅ２／Ｆｃ、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４イソタイプ対照、ならびに抗−ＶＥＧＦ ｍＡｂを含む）対照作用物質をヌードマウスの右脇腹に皮下注射した。各試験群においてマウス５匹を使用した。すべての試験ｍＡｂを１００μｇ／ｍｌの濃度に調節した。
７日後、マトリゲルプラグを収集し、血管密度についてスコアリングした。このため、深麻酔下でマウスの頚部を脱臼させた。皮膚弁の被覆を除去することにより、マトリゲルプラグが暴露された。次いでマトリゲルプラグを取り出し、次いでデジタル画像を記録した。マトリゲルプラグを注意深く切除し、２つの部分に切断した。一方の部分をＴｉｓｓｕｅＴｅｋで急速凍結し、もう一方を緩衝化ホルマリンに固定した。次いで、両部分を切片化のためにパラフィン包埋した。各マウス由来の切片を５〜７μｍ厚で３つに切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。次いで、切片を位相差顕微鏡下で検査した。代表的な顕微鏡写真を記録し[２枚のフレーム（１００倍および４００倍）]、内皮細胞および血管の浸潤を記録した。
冷凍マトリゲルプラグをＣｒｙｏｃｕｔミクロトームで切片化した（１０μｍ切片）。マウス１匹当たり２つの別々の切片を作製し、染色に使用した。切片をＢＳＡ（０．１％）でブロッキングし、次いでマウスに反応性を示すモノクローナル抗体で治療した。ＣＤ３１をフィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）（製造業者によって推奨された希釈物）に結合させた。完全な洗浄後、切片を抗退色試薬（ａｎｔｉ−ｆａｄｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｖｅｃｔａ Ｓｈｉｅｌｄ）の下に置き、赤色フィルタを用いてＵＶ顕微鏡下で観察した。代表的なデジタル画像を取得した（２枚の画像、１００倍および２００倍の倍率）。核をＤＡＰＩで対比染色した。ＣＤ３１染色の免疫蛍光画像をスケルチナイゼーション（Ｓｋｅｌｅｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）プログラムによって分析した。データを処理することで、各群における平均血管密度、節および長さが得られた。結果は、血管端部の数（図１２Ａ）および血管長（図１２Ｂ）に対する抗−Ａｎｇ−２抗体の作用を示す、図１２Ａおよび１２Ｂに見出されうる。
この実験は、マトリゲルに混合したＭＣＦ−７細胞が、マトリゲル単独の場合と比べて有意なレベルで血管形成を誘発可能であることを示した。誘発された血管形成を、陽性対照の抗−ＶＥＧＦ抗体により阻害することができた。血管形成は可溶性の組換えＴｉｅ２／Ｆｃタンパク質によっても有意に阻害され、これはＭＣＦ−７細胞により産生されたＡｎｇ−２がこのモデルにおいて血管形成における役割を果たすことを示唆している。Ｔｉｅ２／Ｆｃは、任意のＡｎｇ−２への結合により、ＭＣＦ−７細胞に暴露されるＡｎｇ−２のレベルを有効に低下させることになった。
ＩｇＧ２イソタイプの陰性対照抗体ＰＫ１６．１．３が血管形成にいかにして影響を与えるかは明白ではないが、この抗体は一部の異種移植片モデルでは腫瘍成長に干渉する場合があることも判明した（データは示さず）。ＩｇＧ４イソタイプ対照抗体は、このモデルでは血管形成に対する作用を全く有しなかった。図１２Ａおよび１２Ｂに示すように、クローン５．８８．３、３．３．２、３．１９．３および５．２８．１は血管形成を有意に阻害する一方（Ｐ＜０．０５、ＶａｓｃｕｌｏＧｅｎにより実施したｔ−検定）、その他が有する作用は少なめであった。
Ａｎｇ−２が腫瘍内の内皮細胞によって発現されることから、自己分泌型血管形成因子と考えられていることは周知である。しかし、Ａｎｇ−２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで多種の腫瘍細胞によって発現されることも判明している。ここで試験されたｍＡｂは、３．１９．３を除いてマウスＡｎｇ−２と交差反応しない。このｉｎ ｖｉｖｏモデルでは、ｍＡｂは、マウスＡｎｇ−２ではなくＭＣＦ−７細胞によって産生されたヒトＡｎｇ−２に限り中和した。これらのｍＡｂの阻害作用は、腫瘍に発現されるＡｎｇ−２が傍分泌型血管形成因子でありうることを示唆している。ｍＡｂにおける全体的な抗血管形成活性は、部分的には、血管内皮に発現されるＡｎｇ−２の中和に加えて腫瘍Ａｎｇ−２の中和が原因であった。
実施例２０ Ａ４３１プリベンショナル（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｌ）異種移植片モデルにおけるＭＡＢ３．１９．３の治療有効性の判定
抗−Ａｎｇ−２ ｍＡｂクローン３．１９．３はマウスＡｎｇ−２に結合しただけでなく、マウスＡｎｇ−２のヒトＴｉｅ２への結合を阻害した。このモノクローナル抗体の抗腫瘍活性を、Ａ４３１細胞系の使用により、ヒト皮膚扁平上皮癌のマウス異種移植片モデルにおいて試験した。
Ａ４３１細胞を、通常どおりフラスコ内で細胞がサブコンフルエント状態に至るまで培養した。免疫不全６〜８週齢雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ／ｎｕ／ｎｕ）をモデル構築のために用いた。Ａ４３１細胞を収集し、マトリゲルに懸濁した。５×１０６個の細胞を含有する細胞懸濁液をマウスの脇腹に皮内注射した。マウスを、１群当たりマウス１１匹を含む異なる群に無作為化した。同日、マウスに０．５ｍｇのｍＡｂ３．１９．３またはイソタイプ対照抗体を腹腔内注射し、その後は週に２回注射した。各腫瘍の寸法を週に２回測定した。腫瘍の容量を容量＝長さ×（幅）２×０．５（ｃｍ３）として計算した。
図１３に図示するように、ｍＡｂ３．１９．３は、Ａ４３１異種移植片の腫瘍成長を著しく遅延させた。イソタイプ対照群の平均腫瘍体積が実験終了時には約１．５ｃｍ３に達した一方で、治療群における成長速度は１０日後に顕著に低下し、平均腫瘍体積は終了時には約０．５ｃｍ３であった。２３日後、Ｔ／Ｃ（治療／対照）の容量比は１／３であり、これは成長が６６％阻害されたことを示す。
結果は、ｍＡｂ３．１６．３が、この実験で使用した用量で、マウスＡｎｇ−２に結合しかつこのリガンドのその受容体Ｔｉｅ２への結合を遮断することにより、ヌードマウスにおけるＡ４３１異種移植片の成長を著しく遅延させることができたことを示唆している。マトリゲルプラグアッセイにより示されたように、モノクローナル抗体の抗腫瘍作用が宿主における血管形成の阻害に起因するという可能性は高い。さらに実施例２２では、抗血管形成に関する作用機序を、腫瘍内の微小血管密度（ＭＶＤ）を薬力学的マーカーとして用いて明示する。
ｍＡｂ３．１９．３の作用機序は、Ａｎｇ−２／Ｔｉｅ２結合およびそれに続くシグナル伝達におけるその遮断に限定されない場合がある。実施例７に示したように、このｍＡｂは、Ａｎｇ−１に結合し、Ａｎｇ−１のＴｉｅ２への結合を遮断することも判明している。興味深いことに、ｍＡｂはＡｎｇ−１誘発性のＴｉｅ２リン酸化も遮断する。Ａｎｇ−１が血管成熟に関与することは知られている。Ａｎｇ−１のＴｉｅ２への結合における阻害についてｍＡｂ３．１９．３の効力をＡｎｇ−２に対して比較する場合（実施例１２）、ｍＡｂ３．１９．３が主としてＡｎｇ−２の拮抗剤であることは明白である。任意の特定の理論に縛られないとして、Ａｎｇ−２およびＡｎｇ−１からのシグナル伝達の２通りの遮断によって血管形成、ひいては腫瘍成長が傷害される可能性がある
実施例２１
樹立した異種移植片モデルにおいてＭＡＢ３．１９．３は腫瘍成長を阻害する
Ａｎｇ−２は血管形成内皮細胞によって上方制御され、多種の腫瘍の進行と相関する。Ａｎｇ−２／Ｔｉｅ２結合を遮断するモノクローナル抗体が血管形成を阻害し、それ故に腫瘍成長を阻害しうると仮定することは理にかなっている。この実験では、抗−Ａｎｇ−２ ｍＡｂの治療有効性を実証した。ｍＡｂ３．１９．３が交差反応しかつマウスＡｎｇ−２／Ｔｉｅ２のシグナル伝達を中和することから、このｍＡｂを選択し、腫瘍成長を阻害するｉｎ ｖｉｖｏでの有効性について実証した。
抗−Ａｎｇ−２ ｍＡｂ３．１９．３が樹立した腫瘍も阻害するか否かを試験するため、Ａ−４３１以外の腫瘍であるヒト結腸腺癌ＬｏＶｏ異種移植片モデルを用いた。ｍＡｂ３．１９．３の用量０．５、２および１０ｍｇ／ｋｇを週に２回、腹腔内投与した。平均容量０．２ｃｍ３の腫瘍が樹立されるまで、治療を開始しなかった。これらの樹立した腫瘍においては、ｍＡｂ３．１９．３はまた、イソタイプ対照と比べて阻害作用を示した。図１４Ａは、０．５および２ｍｇ／ｋｇ（ｐ値がそれぞれ０．０２２および０．０２７）で７９％の阻害が得られたことを示し、かつ腫瘍成長に対して１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．００６）で７５％阻害されることが判明した。
平均容量０．２ｃｍ３に至るまでの成長を可能にしたヒト結腸腺癌ＳＷ４８０のさらなる異種移植片モデルにて、腫瘍成長阻害作用を再現した。ｍＡｂ３．１９．３が０．５ｍｇ／ｋｇで顕著な作用を有する点は不明であったが、腫瘍移植の５３日後、ｍＡｂは２および１０ｍｇ／ｋｇ（それぞれｐ＝０．００３および０．００６）で腫瘍成長を６０％阻害した（図１４Ｂ）。
上記結果を要約すると、３つの試験モデルにおいて、抗−Ａｎｇ−２ ｍＡｂ３．１９．３は腫瘍成長を顕著に阻害した。興味深いことに、ＬｏＶｏとＳＷ４８０の双方はヒトＡｎｇ−２を発現する。しかし、ヒトＡｎｇ−２が腫瘍細胞によって発現されるという事実に反し、マウスＡｎｇ−２との交差反応性を全く有しない他の２種のｍＡｂは、腫瘍成長に対して顕著な阻害活性を示さなかった（データは示さず）。これらの結果は、宿主Ａｎｇ−２の拮抗剤が血管形成および腫瘍成長の遮断に必要であることを意味する。
上で考察したように、Ｍａｂ３．１９．３はＡｎｇ−１と交差反応する。しかし、ｍＡｂ３．１９．３のＡｎｇ−１／Ｔｉｅ２結合に対する効力は、Ａｎｇ−２／Ｔｉｅ２結合に対する効力よりもずっと低かった（実施例１２）。このため、これらのモデルにて見られる治療有効性が主としてＡｎｇ−２拮抗作用に起因すると結論づけることは理にかなっている。しかし、モデルにてｉｎ ｖｉｖｏでのＡｎｇ−１の遮断を完全に除外することはできないと思われる。諸実験の全過程を通して、体重減少または出血などの明らかな毒性作用は全く観察されなかった。
実施例２２
さらなる腫瘍異種移植片モデルにおけるＭＡＢ３．１９．３のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性 ９種の異なる腫瘍細胞系を用いたヒト癌のマウス異種移植片モデルにおいて、３．１９．３モノクローナル抗体の抗腫瘍活性を試験した。
結腸腺癌（Ｌｏｖｏ、ＳＷ４８０、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６）、扁平上皮癌（Ａ４３１）、肺癌（Ｃａｌｕ−６）および乳腺癌（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞を、細胞がサブコンフルエント状態に至るまで、フラスコ内で通常どおり培養した。モデルを構築するため、免疫不全７〜１０週齢雌マウスを使用した。細胞を収集し、マトリゲルに懸濁し、次いで各マウスに皮下注射した。次いで、マウスをマウス１０〜１２匹を含むコホートに無作為化した。マウスに０．５ｍｇのｍＡｂ３．１９．３またはイソタイプ対照抗体を腹腔内注射し、その後は週に２回注射した。すべての実験において、イソタイプ対照抗体治療を含めた。各腫瘍の寸法を週に２回測定した。腫瘍の容量を容量＝長さ×（幅）２×０．５（ｃｍ３）として計算した。ＨＴ２９（図１５Ａ）およびＣａｌｕ６（図１５Ｂ）の異種移植片において、腫瘍成長阻害のグラフ比較を示す。
表１８に見られるように、ｍＡｂ３．１９．３は、試験対象の全部で７種の異種移植片皮下モデルと、用量および計画が最適化されていない同所性の両モデルとにおいて顕著な活性を示した。
Figure 0005642042
ＣＤ３１＋の血管染色濃度を介し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍組織を分析した。閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）法およびマニュアルグリッドカウンティング（ｍａｎｕａｌ ｇｒｉｄ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）法により、ＣＤ３１の染色濃度を測定した。１群当たり１１の腫瘍および１腫瘍当たり少なくとも２０枚の画像を分析した。図１５Ｃに見られるように、３．１９．３抗体によるマウスの治療により、ＣＤ３１の染色濃度が対照ＩｇＧ抗体の場合と比べて４０％低下した。これは双方の計数法で統計的に有意であり、片側Ｔ−検定によって閾値（ｐ＜０．０１５）およびマニュアルグリッドカウンティング（ｐ＜０．００００４）であった。Ｃｏｌｏ２０５およびＨＣＴ１１６異種移植片については、エクスビボにおける組織上で類似するＣＤ３１＋血管の計数を行った。これらの試料はまた、ＣＤ３１＋血管において同様の有意な低下を示した。
実施例２３ 血管形成関連疾患の治療における抗−ＡＮＧ−２抗体の使用
様々な固形腫瘍を有するヒト患者における抗−Ａｎｇ−１および抗−Ａｎｇ−２抗体治療のｉｎ ｖｉｖｏでの作用を判定するため、ヒト患者に有効量の抗−Ａｎｇ−１および抗−Ａｎｇ−２抗体を定期的に投与する。治療の間では一周期ごとに、ヒト患者を監視し、腫瘍成長が阻害されるか否かを判定する。治療後、抗−Ａｎｇ−１および抗−Ａｎｇ−２抗体による治療を受けている患者が、腫瘍の縮小、進行までの時間の遅延または生存期間の延長を含む（がこれらに限定されない）事柄のうちの１つもしくは複数において、治療を受けていない患者と比べて相対的に改善を有することが判明している。
実施例２４
診断物質としての抗−ＡＮＧ−２抗体の使用
試料中でのＡｎｇ−２抗原の検出
試料中でＡｎｇ−１またはＡｎｇ−２抗原を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を構築することが可能である。アッセイでは、９６−ウェルマイクロタイタープレートまたは３８４−ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートのウェルに、数時間かけてＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２に特異的な一次完全ヒトモノクローナル抗体を吸着される。固定化抗体は、試験試料中に存在しうる抗原のいずれかに対する捕捉抗体としての機能を果たす。ウェルをすすぎ、乳タンパク質またはアルブミンなどのブロッキング剤で処理し、分析物の非特異的吸着を阻止する。
次いで、ウェルを抗原を含有すると考えられる試験試料または標準量の抗原を含有する溶液で処理する。かかる試料は、例えば、病理学的診断に有用と考えられる循環抗原レベルを有すると考えられる被験者から採取した血清試料でありうる。
試験試料または標準試料をすすぎ落としてから、ビオチンとの結合によって標識された二次完全ヒトモノクローナル抗−Ａｎｇ−１抗体および抗−Ａｎｇ−２抗体でウェルを処理する。モノクローナルまたはマウスもしくは他の種を由来とするものであっても使用可能である。標識した抗−Ａｎｇ−１および抗−Ａｎｇ−２抗体は、検出抗体としての機能を果たす。過剰な二次抗体をすすぎ落としてから、アビジンと結合した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および適切な発色基質でウェルを処理する。試験試料中の抗原の濃度を、標準試料から作成される標準曲線との比較によって判定する。
このＥＬＩＳＡアッセイは、試験試料中のＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２抗原の検出において高度に特異的かつ極めて感受性の高いアッセイを提供する。
患者におけるＡｎｇ−２抗原濃度の測定
ヒト血清中のＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２レベルを定量するため、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築する。サンドイッチＥＬＩＳＡから得た２種の完全ヒトモノクローナル抗−Ａｎｇ−２抗体は、Ａｎｇ−２分子上の異なるエピトープを認識する。あるいは、マウスもしくは他の種を由来とするモノクローナル抗体の使用が可能である。ＥＬＩＳＡは以下のように行われうるが必ずしも以下のようではない。２μｇ／ｍＬの濃度でのコーティング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の捕捉抗−Ａｎｇ−２抗体５０μＬをＥＬＩＳＡプレート（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））上にコーティングする。４℃で一晩インキュベーション後、プレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサール）２００μＬで２５℃で１時間処理する。プレートを、ＰＢＳ（洗浄緩衝液、ＷＢ）中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄する。正常または患者血清（クリノミクス（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ）、バイオリクライメーション（Ｂｉｏｒｅｃｌａｉｍａｔｉｏｎ））を、ブロッキング緩衝液を含有する５０％ヒト血清で希釈する。プレートを血清試料とともに４℃で一晩インキュベート、ＷＢで洗浄し、次いで１００μＬ／ウェルのビオチン化検出抗−Ａｎｇ−２抗体とともに２５℃で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをＨＲＰ−ストレプトアビジンとともに１５分間インキュベートし、以前のように洗浄し、次いで、発色用のＨ２Ｏ２（シグマ（Ｓｉｇｍａ）製現像液）中の１００μＬ／ウェルのｏ−フェニレンジアミンで処理する。反応を５０μＬ／ウェルのＨ２ＳＯ４（２Ｍ）で停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを４９２ｎｍで用いて分析する。血清試料中のＡｎｇ−２抗原の濃度を、４つのパラメータカーブフィッティングプログラムを用いた精製Ａｎｇ−２抗原の希釈物との比較によって計算する。
参照による援用
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書中のすべての引用文献およびそれらの中の引用文献は、それらが既に引用されていない限り、本明細書によってそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。
均等物
前述の書面での明細書は、一等業者が本発明を実施できるのに十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳述し、本発明によって検討されたベストモードを記載している。しかし、前述内容が本文中にいかに詳細に現れるとしても、本発明は多数の方法で実行可能であり、かつ本発明は添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の均等物に準じて解釈される必要があることが理解されるであろう。

Claims (3)

  1. ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−７２６０（ｍＡｂ３．１９．３）として寄託されたハイブリドーマに産生される抗体の抗原結合フラグメント。
  2. 請求項１に記載の抗原結合フラグメントを含む、悪性腫瘍治療用組成物。
  3. 前記悪性腫瘍が、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞(肝臓)癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌、および扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項２に記載の悪性腫瘍治療用組成物。
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