BRPI0519596B1

BRPI0519596B1 - Agente de ligação alvejado, anticorpo monoclonal que se liga a angiopoietina-2, molécula de ácido nucleico, vetor, e, uso do agente de ligação alvejado

Info

Publication number: BRPI0519596B1
Application number: BRPI0519596-9A
Authority: BR
Inventors: Larry L. Green; Qing Zhou; Bruce A. Keyt; Xiao-Dong Yang; Stephen Charles Emery; David C. Blakey
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2004-12-21
Filing date: 2005-12-19
Publication date: 2022-01-18
Also published as: US20120052073A1; JP4884395B2; ES2371083T3; CA2595610C; JP5642042B2; WO2006068953A3; ATE521638T1; EP3699191A1; US7973140B2; ZA200705695B; CA2595610A1; WO2006068953A2; EP1838733A2; US20080267971A1; HK1109409A1; CY1112909T1; UY29288A1; BRPI0519596A2; CN105085678B; AU2005319382A1

Abstract

anticorpos direcionados à angiopoietina-2 e seus usos. são descritos anticorpos direcionados ao antígeno ang-2 e usos de tais anticorpos. particularmente, anticorpos monoclonais completamente humanos direcionados ao antígeno ang-2. seqúências de nucleotídeos que codificam, e seqúências de aminoácidos compreendendo moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente seqúências correspondendo a seqúências de cadeia pesada e leve contíguas se estendendo às regiões de estrutura e/ou regiões determinantes de complementaridade (cdrs), especificamente da fri até a fr4 ou cdrl até a cdr3. hibridomas ou outras linhagens celulares expressando tais moléculas de imunoglobulina e an- ticorpos monoclonais.

Description

[001] Esse pedido reivindica benefício para o Pedido Provisório Americana N° de Série 60/638.354, requerido em 21 de dezembro de 2004, e ao Pedido Provisório Americano N° de Série 60/711.289, requerido em 25 de agosto de 2005, os quais são aqui incomporados por referência.

CAMPO

[002] A invenção se refere a anticorpos monoclonais contra angiopoietina-2 (Ang-2) e aos usos de tais anticorpos. Mais especificamente, a invenção se refere a anticorpos monoclonais humanos completos direcionados a Ang-2 e aos usos desses anticorpos. Aspectos da invenção também se referem a hibridomas ou outras linhagens celulares expressando tais anticorpos. Os anticorpos descritos são úteis como diagnósticos e para o tratamento de doenças associadas com a atividade e/ou supemprodução de Ang-2.

ANTECEDENTES

[003] Angiogênese e o processo de formação de novos capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes e e um componente essencial da embriogênese, do crescimento fisiológico normal, reparo e expansão de tumor. Embora uma variedade de fatores possa modular as respostas celulares endoteliais (EC) in vivo e o crescimento de vasos sanguíneos in vivo, acredita- se que somente os membros da família do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e as angiopoietinas ajam quase exclusivamente nas ECs. Yancopoulos et al, Nature 407:242-48 (2000).

[004] As angiopoietinas foram descobertas como ligantes para as Tiés, uma família de tirosina quinases que seletivamente expressa no endotélio vascular. Yancopoulos et al, Nature 407: 242 - 48 (2000). Existem agora quatro membros definitivos da família angiopoietina. Angiopoietina-3 e 4 (Ang-3 e Ang-4) podem representar amplamente contrapartes divergidas do mesmo local de gene em camundongos e no homem. Kim et al, FEBS Let, 443:353-56 (1999); Kim et al, J Biol Chem 274:26523-28 (1999). Ang-1 e Ang-2 foram originalmente identificadas em experimentos de cultura de tecidos como agonista e antagonista, respectivamente. Davis et al, Cell 87: 1161-69 (1996); Maisonpierre et al, Science 277: 55-60 (1997). Todas as angiopoietinas conhecidas se ligam primariamente ao Tie2, e tanto a Ang-1 quanto a -2 se ligam ao Tie2 com uma afinidade de 3 nM (Kd). Maisonpierre et al, Science 277:55-60 (1997). Foi demonstrado que a Ang-1 sustenta a sobrevivência da EC e promove a integridade endotelial, Davis et al, Cell 87:1161-69 (1996); Kwak et al., FEBS Lett 448:249-53 (1999); Suri et al, Science 282:' 20 468-71 (1998); Thurston et al, Science 286: 2511-14 (1999); Thurston et al, Nat. Med. 6:460-63 (2000), enquanto que a Ang-2 tinha o efeito oposto e promoveu a desestabilização e regressão na ausência dos fatores de sobrevivência VEGF ou fator de crescimento de fibroblasto básico. Maisonpierre et al, Science 277:55-60 (1997). Entretanto, muitos estudos de função da Ang-2 sugeriram uma situação mais complexa. Ang-2 pode ser um regulador complexo do remodelamento vascular que desempenha um papel tanto no crescimento de vasos quanto na regressão de vasos. Sustentando tais papéis para a Ang-2, análises de expressão revelam que a Ang-2 é rapidamente induzida, juntamente com o VEGF, em grupos de adultos de crescimento angiogênico, enquanto que a Ang-2 é induzida na ausência do VEGF em grupos de regressão vascular. Holash et al, Science 284:1994-98 (1999); Holash et al, Oncogene 18: 5356-62 (1999). Consistente com o papel dependente de contexto, Ang-2 se liga ao mesmo receptor endotelial específico, Tie-2, o qual é ativado pela Ang-1, mas tem efeitos dependentes de contexto na sua ativação. Maisonpierre et al, Science 277:55-60 (1997).

[005] Ensaios de angiogênese corneana mostraram que tanto a Ang- 1 quanto a Ang-2 tinham efeitos similares, agindo sinergisticamente com o VEGF para promover o crescimento de novos vasos sanguíneos. Asahara et al, Circ. Res. 83:233-40 (1998). A possibilidade de que existia uma resposta endotelial dose-dependente foi levantada pela observação de que Ang-2, in vitro e em alta concentração, pode também ser pró-angiogênico. Kim et al, Oncogene 19:4549-52 (2000). Em concentração mais alta, Ang-2 age como um fator de sobrevivência à apoptose para células endoteliais durante a apoptose de deprivação de soro através da ativação do Tie2 através de uma PI-3 quinase e via Akt. Kim et al, Oncogene 19:4549-52 (2000).

[006] Outros experimentos in vitro sugeriram que durante a exposição sustentada, os efeitos da Ang-2 podem mudar progressivamente a partir daquele de um antagonista para um antagonista do Tie2, e em pontos de tempo posteriores, eles podem contribuir diretamente para a formação de tubo vascular e estabilização de novos vasos. Teichert-Kuliszewska et al, Cardiovasc. Res. 49:659-70 (2001). Além disso, se as ECs fossem cultivadas em gel de fibrina, a ativação do Tie2 com Ang-2 também foi observada, provavelmente sugerindo que a ação do Ang-2 poderia depender no estado de diferenciação da EC. Teichert-Kuliszewska et al, Cardiovasc. Res. 49: 659-70 (2001). Em EC rnicrovascular cultivada num gel de colágeno tridimensional, Ang-2 também pode induzir a ativação do Tie2 e promove a formação de estruturas sernelhantes ao capilar. Mochizuki et al, J. Cell. Sci. 115: 175-83 (2002). O uso de uma cocultura esferoidal 3-D como um modelo in vitro de maturação de vaso demonstrou que o contato direto entre ECs e as células rnesenquimais anula a responsividade ao VEGF, enquanto a presença do VEGF e do Ang-2 induziu o crescimento. Korff et al, Faseb J. 15:447-57 (2001). Etoh et al. demonstrou que as ECs que expressam constitutivamente Tie2, a expressão de MMP-1, -9 e u-PA foram fortemente superregulados pela Ang-2 na presença de VEGF. Etoh, et al, Cancer Res. 61:2145-53 (2001). Com um modelo de membrana pulilar in vivo, Lobov et al. mostrou que Ang-2 na presença de VEGF endógeno promove um rápido aumento no diâmetro capilar, remodelamento da lâmina basal, proliferação e migração de células endoteliais e estirnula o crescimento de novos vasos sanguíneos. Lobov et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11205-10 (2002). Por contraste, Ang-2 promove a morte celular endotelial e a regressão de vasos sem VEGF endógena. Lobov et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11205-10 (2002).

[007] Sernelhantemente, com um modelo de tumor in vivo, Vajkoczy et al. demonstrou que agregados multicelulares iniciam o crescimento vascular por crescimento angiogênico através da expressão simultânea de VEGFR-2 e da Ang-2 pelo endotélio do hospedeiro e tumoral. Vajkoczy et al, J. Clin. Invést. 9:777-85 (2002). Esse modelo ilustrou que a microvasculatura estabelecida de tumores em crescimento e caracterizada por um remodelamento contínuo, mediado de forma putativa pela expressão do VEGF e da Ang-2. Vajkoczy et al, J. Clin. Invést. 109:777-85 (2002).

[008] Estudos de camundongos nocaute de Tie-2 e Angiopoietina-1 apresentam fenótipos semelhantes e sugerem que a fosforilação do Tie-2 estimulada por angiopoietina-1 medeia o remodelamento e a estabilização do vaso em desenvolvimento, promovendo a maturação do vaso sanguíneo durante a angiogênese e a manutenção da adesão celular suportada por célula endotelial (Dumont et al, Genes & Development, 8: 1897-1909 (1994); Sato, Nature, 376:70-74 (1995); (Thurston, G. et al., 2000 Nature Medicine: 6, 460463)). Acredita-se que o papel da Angiopoietina-1 seja conservado em adultos, onde ele e expresso amplamente e constitutivamente (Hanahan, Science, 277:48-50 (1997); Zagzag, et al, Exp Neurology, 9:391-400 (1999)). Ao contrário, a expressão da Angiopoietina-2 é primariamente limitada a sítios de remodelagem vascular onde acredita-se que bloqueie a estabilização constitutiva ou a função de maturação da Angiopoietina-1, permitindo que os vasos sejam revertidos e permaneçam num estado plástico o qual pode ser mais responsivo a sinais de crescimento (Hanahan,1997; (1999);Maisonpierre, Holashetal, Oncogene 18: 5356- 62 1997). Estudos da expressão de Angiopoietina-2 em angiogênese descobriram que muitos tipos de tumores apresentam expressão de Angiopoietina-2 vascular (Maisonpierre et al, Science 277: 55- 60 (1997)). Estudos funcionais sugerem que a Angiopoietina-2 está envolvida na angiogênese tumoral e associam a superexpressão da Angiopoietina-2 com o crescimento tumoral aumentado num modelo de xenoenxerto de camundongos ((Ahmad, et al, Cancer Res.,61:1255 - 1259 (2001)) .Outros estudos associaram a superexpressão da Angiopoietina-2 com a hipervascularização de tumor (Etoh, et al, Cancer Res. 61:2145-53 (2001); Tanaka et al, Câncer Re s . 62: 7124 - 29 (2002)).

[009] Em anos recentes a Angiopoietina-1, Angiopoietina- 2 e/ou o Tie-2 foram propostos como possíveis alvos terapêuticos anti-câncer. Por exemplo US6166185, US56504 90 e US5814464, cada uma revela um ligante anti-Tie2 e anticorpos receptores. Estudos usando Tie-2 solúvel foram reportados por diminuir a quantidade e tamanho de tumores em roedores (Lin, 1997; Lin 1998). Siemester et al. (1999) gerou linhagens de células de melanoma humanos expressando o domínio extracelular do Tie-2, injetaram essas em camundongos atímicos e contaram que Tie-2 solúvel resulta na inibição significativa do crescimento tumoral e da angiogênese tumoral. Dado que tanto a Angiopoietina-1 quanta a Angiopoietina-2 se ligam ao Tie-2, não é claro a partir desses estudos se a Angiopoietina-1, Angiopoietina-2 ou o Tie-2 poderiam ser um alvo atrativo para uma terapia anti-câncer.

[0010] Entretanto, acredita-se que a terapia anti-Angiopoietina-2 eficaz seja de benefício no tratamento de doenças tais como câncer, na qual a progressão é dependente de angiogênese aberrante onde o bloqueio do processo pode levar à prevenção do avanço da doença (Folkman, J., Nature Medicine. 1: 27-31 (1995)). Além disso, alguns grupos reportaram o uso de anticorpos que se ligam a Angiopoietina-2. Ver, por exemplo, a Patente Americana N° 6.166.185 e a Públicação de Pedido de Patente Americana N° 2003/0124129 Al. O estudo do efeito da expressão focal da Angiopoietina-2 mostrou que o antagonismo do sinal Angiopoietina-1/Tie-2 afrouxa a estrutura vascular firme, por rneio disso expondo as ECs a sinais de ativação a partir de indutores de angiogênese, por exemplo, VEGF (Hanahan, 1997). Esse efeito pró-angiogênico resultante da inibição da Angiopoietina-1 indica que a terapia anti-Angiogênica-1 poderia não ser um tratamento anti-câncer eficaz.

[0011] Ang-2 é expressa durante o desenvolvimento em sítios onde o remodelamento de vasos sanguíneos está ocorrendo. Maisonpierre et al, Science 277: 55-60 (1997). Em indivíduos adultos, a expressão da Ang-2 é restrita a sítios de remodelamento vascular, assim como em tumores altamente vascularizados, incluindo glioma, Osada et al, Int. J. Oneel. 18: 305 - 09 (2001); Koga et al, Cancer Res. 61: 6248- 54 (2001), carcinoma hepatocelular, Tanaka et al, J. Clin. Invést. 103 341-45 (1999), carcinoma gástrico, Etoh, et al, Cancer Res. 61:2145-53 (2001); Lee et al, Int. J. Oncol. 18:355-61 (2001), tumor da tireoide, Bunone et al, Am J Pathol 155:1967-76 (1999), câncer de pulmão de célula nãopequena, Wong et al, Lung Cancer 29:11-22 (2000) e câncer de colon, Ahmad et al, Cancer 92: 1138-43 (2001), e próstata Wurmbach et al, Anticancer Res. 20:5217-20 (2000). Foi descoberto que algumas células tumorais expressam Ang-2. Por exemplo, Tanaka et al, J. Clin. Invést. 103: 34 1 - 45 (1999) detectou RNAm de Ang-2 em 10 de 12 espécies de carcinoma hepatocelular humano (HCC). O grupo de Ellis reportou que a Ang-2 é expressa onipresente no epitélio tumoral. Ahmad et al, Cancer 92:1138-43 (2001). Outros invéstigadores reportaram descobertas semelhantes. Chen et al, J. Tongji Med. Univ. 21:228-30, 235 (2001). Pela detecção dos níveis de RNAm de Ang-2 em espécies de câncer de seio humano arquivadas, Sfilogoi et al, Int. J. Cancer 103:466-74 (2003) reportou que o RNAm de Ang-2 está significativamente associado com invasão de nódulos linfáticos auxiliares, com um curto tempo livre de doença e com uma fraca sobrevivência geral. Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124 -29 (2002) reviu um total de 236 pacientes de câncer de pulmão de célula não- pequena (NSCLC) com estágio patológico de I a IIIA, respectivamente. Usando a imunohistoquímica, eles descobriram que 16,9% dos pacientes com NSCLC foram positivos para Ang- 2. A densidade de microvasos para o tumor positivo para Ang 2 é significativamente mais elevada do que aquela negativa para Ang-2. Tal efeito angiogênico da Ang-2 foi vista somente quando a expressão de VEGF foi elevada. Além disso, a expressão positiva da Ang-2 foi um fator significativo para predizer uma fraca sobrevivência pós- operatória. Tanaka et al, Cancer Res. 62:7124-29 (2002). Entretanto, eles não descobriram uma correlação significativa entre a expressão da Ang-1 e a densidade de microvasos. Tanaka et al, Cancer Res. 62:7124- 29 (2002). Esses resultados sugerem que a Ang-2 é um indicador de pacientes de fraca prognose com vários tipos de câncer.

[0012] Recentemente, usando um modelo de camundongo nocaute Ang-2, o grupo de Yancopoulos reportou que a Ang-2 é requerida para angiogênese pós-natal. Gale et al, Dev. Cell 3: 411-23 (2002). Eles mostraram que a regressão desenvolventemente programada da vasculatura hialóide no olho não ocorre em camundongos Ang-2-/- e seus vasos sanguíneos retinais falham ao crescer para fora da artéria retinal central. Gale et al, Dev. Cell 3: 411-23 (2002). Eles também descobriram que a anulação da Ang-2 resulta em defeitos profundos no padrão e função da vasculatura linfática. Gale et al, Dev. Cell 3:411-23 (2002). O resgate genético com Ang-1 corrige os defeitos linfáticos, mas não os defeitos angiogênicos. Gale et al, Dev. Cell 3:411-23 (2002).

[0013] Peters e seus colegas reportaram que Tie2 solúvel, quando distribuído ou como uma proteína recombinante ou num vetor de expressão viral, inibiu o crescimento in vivo de carcinoma de mamífero murino e melanoma em modelo de camundongo. Lin et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 95:8829-34 (1998); Lin et al, J. Clin. Invést.100:2072-78 (1997).

[0014] Densidades vasculares nos tecidos tumorais tratados dessa forma foram grandemente reduzidas. Além disso, Tie2 solúvel bloqueou a angiogênese nas córneas de rato estimuladas por meio condicionado a célula tumoral. Lin et al, J. Clin. Invést. 100: 2072-78 (1997). Além disso, Isner e sua equipe demonstrou que a de Ang-2 a VEGF promoveu significativamente uma neovascularidade mais longa e circunferencial do que somente o VEGF. Asahara et al, Circ. Res. 83:233-40 (1998). Excesso de receptor Tie2 solúvel impediu a nodulação da neovascularização induzida por VEGF pela Ang-2. Asahara et al, Circ. Res. 83:233-40 (1998). Siemeister et al, Cancer Res. 59: 3185-91 (1999) mostrou com xenoenxertos de camundongo atímico que a superexpressão dos domínios de ligação de ligante extracelulares ou do Flt-1 ou do Tie2 nos xeno-enxertos que resulta na inibição significativa da via não podia ser compensada pela outra, sugerindo que a via do receptor VEGF e a via do Tie2 devem ser consideradas como dois mediadores independentes essenciais para os processos de angiogênese in vivo. Siemeister et al., Cancer Res. 59:3185-91 (1999). Isso é provado por uma públicação mais recente por White et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 100:5028- 33 (2003). No seu estudo, foi demonstrado que um aptâmero de RNA resistente a nuclease que se liga especificamente e inibe a Ang-2 significativamente inibiu a neovascularização induzida por bFGF no modelo de angiogênese de microbolsa corneana de rato.

SUMARIO

[0015] Modalidades da invenção se referem a agentes de ligação alvejados que se ligam especificamente a Angiopoietina-2 e ali inibem a angiogênese tumoral e reduzem o crescimento tumoral. Mecanismos pelos quais isso pode ser conseguido incluem e não estão limitados ou à inibição de ligação da Ang-2 ao seu receptor Tie-2, inibição da sinalização Tie2 induzida pela Ang-2 ou à depuração aumentada da Ang-2, reduzindo dessa maneira a concentração efetiva de Ang-2.

[0016] Uma modalidade da invenção, o agente de ligação alvejado, e um anticorpo humano completo que se liga a Ang-2 e previne a ligação da Ang-2 ao Tie2. Ainda outra modalidade da invenção e um anticorpo monoclonal completamente humano que se liga a Ang-2 e a Ang-1, e também inibe a fosforilação do Tie2 induzida por Ang-2. O anticorpo pode se ligar a Ang- 2 com um Kd menor do que 100 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM ou 5 pM.

[0017] O anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada com uma região determinante de complementaridade (CDR) com uma das sequências mostradas na Tabela 11. É notado que os indivíduos versados na técnica podem prontamente executar determinações de PCR. Ver, por exemplo, Kabat et ah, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Públication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

[0018] Uma modalidade da invenção compreende anticorpos monoclonais completamente humanos 3.3.2 (Número de Acesso ATCC PTA- 7258), 3.19.3 (Número de Acesso ATCC PTA-7260) e .88.3 (Número de Acesso ATCC PTA-7259), os quais se ligam especificamente a Ang-2, conforme discutido em maiores detalhes abaixo.

[0019] Ainda outra modalidade e um anticorpo que se liga a Ang-2 e compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve com um CDR compreendendo uma das sequências mostradas na Tabela 12. Em certas modalidades o anticorpo e um anticorpo monoclonal completamente humano.

[0020] Uma outra modalidade e um anticorpo que se liga a Ang-2 e compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada com uma das sequências de CDR rnostradas na Tabela 11 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve com uma das sequências CDR mostradas na Tabela 12. Em certas modalidades o anticorpo e um anticorpo monoclonal completamente humano.

[0021] Uma outra modalidade da invenção é um anticorpo que compete de forma cruzada pela ligação a Ang-2 com os anticorpos completamente humanos da invenção, preferívelmente um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada com uma das sequências de CDR apresentadas na Tabela 11 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve com uma das sequências CDR mostradas na Tabela 12. Uma outra modalidade da invenção é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo na Ang-2 como um anticorpo completamente humano da invenção, preferívelmente um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada com uma das sequências CDR mostradas na Tabela 11 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve com uma das sequências CDR mostradas na Tabela 12.

[0022] Outras modalidades da invenção incluem anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a Angiopoietina-2, em que os anticorpos compreendem uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRl) correspondendo a classe canônica 1. Os anticorpos aqui fornecidos também podem incluir uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) correspondendo a classe canônica 3, uma região deterrninante de cornplementaridade de cadeia leve 1 (CDRl) correspondendo a classe canônica 2,uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) correspondendo a classe canônica 1, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) correspondendo a classe canônica 1.

[0023] A invenção fornece ainda métodos para avaliar o nível de Angiopoietina-2 (Ang-2) numa amostra de paciente, compreendendo o contato de um anticorpo anti-Ang-2 com uma amostra biológica de um paciente, e a detecção do nível de ligação entre o referido anticorpo e Ang-2 na referida amostra. Em modalidades mais específicas, a amostra biológica é sangue.

[0024] Em outras modalidades a invenção fornece composições, incluindo um anticorpo ou seu fragmento funcional, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0025] Ainda outras modalidades da invenção incluem métodos de tratamento de forma eficaz de um animal que sofre de uma doença relacionada com angiogênese, incluindo a seleção de um animal necessitado de tratamento para uma doença neoplástica ou não-neoplástica, e a administração ao referido animal de uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal completamente humano que se liga especificamente a Angiopoietina-2 (Ang-2).

[0026] Doenças relacionadas com angiogênese tratáveis podem incluindo doenças neoplásticas, tais com a melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), tumor da tireoide, câncer gástrico (estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ováriano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de colon, câncer pancreático, carcinoma esofageal, cânceres de cabeça e pescoço, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma), adenocarcinoma do intestino delgado, rnalignidades pediátricas e carcinoma epidermóide.

[0027] Modalidades adicionais da invenção incluem métodos de inibição da angiogênese induzida por Angiopoietina-2 (Ang-2) num animal. Esses métodos incluem a seleção de um animal necessitado de tratamento para a angiogênese induzida por Ang-2, e a administração ao referido animal de uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal completamente humano, em que o referido anticorpo se liga especificamente a Ang-2.

[0028] Outras modalidades da invenção incluem o uso de um anticorpo na preparação de medicamento para o tratamento de doenças relacionadas com a angiogênese num animal, em que o referido anticorpo monoclonal se liga especificamente a Angiopoietina-2 (Ang-2). Doenças relacionadas com a angiogênese tratáveis podem incluir doenças neoplásticas, tais como melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), tumor da tireoide, câncer gástrico (estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ováriano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de colon, câncer pancreático, carcinoma esofageal, cânceres de cabeça e pescoço, mesotelioma, sarcomas, colangiocarcinoma, adenocarcinoma do intestino delgado, malignidades pediátricas e carcinoma epidermóide.

[0029] Em ainda outras modalidades, os anticorpos aqui descritos podem ser usados para a preparação de um medicamento para o tratamento eficaz de angiogênese induzida por Angiopoietina-2 num animal, em que o referido anticorpo monoclonal se liga especificamente a Angiopoietina-2 (Ang-2).

[0030] Modalidades da invenção aqui descritas se referem a anticorpos monoclonais que se ligam a Ang-2 e afetam a função Ang-2. Outras modalidades se referem a anticorpos anti-Ang-2 completamente humanos e a preparações de anticorpos anti-Ang-2 com propriedades desejáveis a partir de uma perspectiva terapêutica, incluindo alta afinidade de ligação pela Ang-2, a capacidade de neutralizar Ang-2 in vitro e in vivo, e a capacidade de inibir a angiogênese induzida pela Ang-2.

[0031] Numa modalidade preferida, anticorpos aqui descritos se ligam a Ang-2 com afinidades muito altas (Kd). Por exemplo um anticorpo humano, de coelho, camundongo, quimérico ou humanizado que é capaz de se ligar a Ang-2 com um Kd menor do que, porém não limitado a 10-5 ,10-6 ,10-7, 10-8 , 10-9, 10-10 ,10-11, 10-12, 10-13 ou 10-14 M, ou qualquer faixa ou valor nesse ponto. Medições de afinidade e/ou avidez podem ser medidas por KinExA® e/ou BIACORE, conforme aqui descrito.

[0032] Concordantemente, uma modalidade aqui descrita inclui anticorpos isolados, ou fragmentos daqueles anticorpos, que se ligam a Ang- 2. Conforme é conhecido na técnica, os anticorpos podem vantajosamente ser, por exemplo, anticorpos policlonais, oligoclonais, monoclonais, quiméricos, humanizados e/ou completamente humanos. Modalidades da invenção aqui descritas também fornecem células para a produção desses anticorpos.

[0033] Outra modalidade da invenção é um anticorpo completamente humano que se liga a outros membros da família da Angiopoietina-2 incluindo, mas sem se limitar, a Angiopoietina-1, Angiopoietina-3 e Angiopoietina-4. Uma outra modalidade aqui é um anticorpo que compete de forma cruzada pela ligação ao Tie2 com Ang-2 com os anticorpos completamente humanos da invenção. Numa modalidade da invenção, o anticorpo se liga e neutraliza a Angiopoietina- 2, e também se liga e neutraliza a Angiopoietina-1.

[0034] Será percebido que modalidades da invenção não limitadas a qualquer forma particular de um anticorpo ou método de geração ou produção. Por exemplo, o anticorpo anti-Ang-2 pode ser um anticorpo de comprimento completo (por exemplo, com uma região Fc humana intacta) ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, um Fab, Fab' ou um F(ab')2). Além disso, o anticorpo pode ser produzido a partir de um hibridoma que secreta o anticorpo, ou de uma célula recombinantemente produzida que tenha sido transformada ou transfectada com um gene ou genes que codificam o anticorpo.

[0035] Outras modalidades da invenção incluem moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam qualquer um dos anticorpos aqui descritos, vetores com moléculas de ácido nucleico isoladas codificando anticorpos anti- Ang-2 ou uma célula hospedeira transformada com qualquer uma de tais moléculas de ácido nucleico. Além disso, uma modalidade da invenção é um método de produção de um anticorpo anti-Ang-2 pelo cultivo de células hospedeiras sob condições em que uma molécula de ácido nucleico e expressa para produzir o anticorpo seguido pela recuperação do anticorpo. Deve ser compreendido que as modalidades da invenção também incluem qualquer molécula de ácido nucleico a qual codifica um anticorpo ou fragmento de um anticorpo da invenção incluindo sequências de ácido nucleico otimizadas para aumentar os rendimentos dos anticorpos ou de seus fragmentos quando transfectadas em células hospedeiras para produção de anticorpos.

[0036] Uma outra modalidade aqui inclui um método de produção de anticorpos de alta afinidade à Ang-2 pela imunização de um mamífero com Ang-2 humana, ou um fragmento seu, e uma ou rnais sequências ortólogas ou fragmentos seus.

[0037] Outras modalidades são baseadas na geração e identificação de anticorpos isolados que se ligam especificamente a Ang-2. Ang-2 é expressa em níveis elevados em doenças relacionadas com angiogênese, tai como doenças neoplásticas. A inibição da atividade biológica da Ang-2 pode prevenir a angiogênese induzida pela Ang-2 e outros efeitos desejados.

[0038] Outra modalidade da invenção inclui um método de diagnosticar doenças ou condições nas quais um anticorpo preparado conforme aqui descrito é utilizado para detectar o nível de Ang-2 numa amostra de paciente. Numa modalidade, a amostra do paciente é sangue ou soro sanguíneo. Em outras modalidades, métodos para a identificação de fatores de risco, diagnose de doença e estágio da doença são apresentados, os quais envolvem a identificação da superexpressão da Ang-2 usando anticorpos anti-Ang-2.

[0039] Outra modalidade da invenção inclui um método para o diagnóstico de uma condição associada com a expressão da Ang-2 numa célula pelo contato do soro ou de uma célula com um anticorpo anti-Ang-2, e depois disso a detecção da presença de Ang-2. Condições preferidas incluem doenças relacionadas com a angiogênese incluindo, mas sem se limitar, a doenças neoplásticas, tais como melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), glioblastoma e carcinoma da tireoide, estômago, próstata, mama, ovário, bexiga, pulmão, útero, rim, cólon e pâncreas, glândula salivar e colo-retal.

[0040] Em outra modalidade, a invenção inclui um kit de ensaio para detectar Angiopoietina-2 e membros da família Angiopoietina em tecidos, células ou fluidos comporais de mamíferos para procurar por doenças relacionadas com a angiogênese. O kit inclui um anticorpo que se liga a Angiopoietina-2 e uma forma de indicação da reação do anticorpo com Angiopoietina-2, se presente. Preferívelmente o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Numa modalidade, o anticorpo que se liga a Ang-2 é marcado. Em outra modalidade o anticorpo é um anticorpo primário não-marcado e o kit inclui ainda uma forma para a detecção de anticorpo primário. Numa modalidade, os meios incluem um segundo anticorpo marcado que é uma antiimunoglobulina. Preferívelmente o anticorpo é marcado com um marcador selecionado do grupo consistindo de um fluorcromo, uma enzirna, um radionuclídeo e um material radiopaco.

[0041] Ainda outra modalidade inclui métodos para tratar doenças ou condições associadas corn a expressão da Ang-2 num paciente, pela administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti- Ang-2. O anticorpo anti-Ang-2 pode ser administrado sozinho, ou pode ser administrado em combinação com anticorpos adicionais ou droga quimioterapêutica ou terapia de radiação. Por exemplo, uma mistura monoclonal, oligoclonal ou policlonal de anticorpos Ang-2 que bloqueia angiogênese pode ser administrada em combinação com uma droga demonstrada por inibir a proliferação de células tumorais diretamente. O método pode ser efetuado in vivo e o paciente é preferívelmente um paciente humano. Numa modalidade preferida, o método envolve o tratamento de doenças relacionadas com a angiogênese incluindo, mas sem se limitar, a doenças neoplásticas, tais como melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular, glioblastoma e carcinoma da tireoide, estômago, próstata, mama, ovário, bexiga, pulmão, útero, rim, cólon e pâncreas, glândula salivar e colo-retal.

[0042] Em outra modalidade, a invenção fornece um artigo de produção incluindo um recipiente. O recipiente inclui uma composição contendo um anticorpo anti-Ang-2, e um rótulo ou encarte de embalagem indicando que a composição pode ser usada para tratar doenças relacionadas com a angiogênese caracterizadas pela superexpressão da Ang-2.

[0043] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Ang-2 é administrado a um paciente, seguido pela administração de um agente de depuração para remover o excesso de anticorpo circulante do sangue.

[0044] Ainda outra modalidade é o uso de um anticorpo anti-Ang-2 na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças tais como doenças relacionadas com a angiogênese. Numa modalidade, as doenças relacionadas com angiogênese incluem carcinoma, tal como de mama, ováriano, de estômago, endometrial, de glândula salivar, de pulmão, de rim, de colon, colo-retal, esofageal, da tireoide, pancreático, de próstata e câncer de bexiga. Em outra modalidade, as doenças relacionadas com a angiogênese incluem, mas não estão limitadas, a doenças neoplásticas, tais como melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), sarcoma, cânceres de cabeça e pescoço, mesotelioma, biliar (colangiocarcinoma), adenocarcinoma do intestino delgado, malignidades pediátricas e glioblastoma.

[0045] Ang-2 é uma importante "chave de partida" da angiogênese. Concordantemente, espera-se que o antagonismo dessa molécula iniba os procedimentos patofisiológicos, e dessa forma aja como uma terapia potente para várias doenças dependentes da angiogênese. Além dos tumores sólidos e de suas metástases, malignidades hematológicas, tais coma leucemias, linfomas e mieloma múltiplo, também são dependentes de angiogênese. O crescimento vascular excessivo contribui para vários distúrbios não- neoplásticos. Essas doenças dependentes de angiogênese não-neoplásticas incluem: aterosclerose, hemangioma, hemangioendotélioma, angiofibroma, malformações vasculares (por exemplo, Teleangiectasia Hemorrágica Hereditária (HHT), ou síndrome de Osler-Weber), verrugas, granulomas piogênicos, crescimento de pelos excessivo, sarcoma de Kaposis, cicatrizes quelóides, edema alérgico, psoríase, escorrimento uterino disfuncional, cisto folicular, hiperestimulação ovariana, endometriose, dificuldade respiratória, ascite, esclerose peritoneal em pacientes de diálise, formação de adesão resultante de cirurgia abdominal, obesidade, artrite reumatóide, sinovite, osteomielite, crescimento de infiltrações da córnea por vasos sanguíneos, osteofite, juntas hemofílicas, processos inflamatórios e infecciosos (por exemplo, hepatite, pneumonia, glomerulonefrite), asma, pólipo nasal, regeneração de fígado, hipertensão pulmonar, retinopatia de prematuridade, retinopatia diabetica, degeneração macular relacionada com a idade, leucomalacia, glaucoma neovascular, neovascularização do enxerto córneano, tracoma, tireoidite, aumento da tireoide e distúrbios linfoproliferativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0046] A Figura 1 é um Western Blot mostrando que mAbs Ang-2 inibe a fosforilação induzida pela Ang-2 do Tie2 ectopicamente expresso em células HEK293F.

[0047] A Figura 2 é um gráfico de linha da relação doseresposta de anticorpos monoclonais anti-Ang-2 na inibição da fosforilação do Tir2 induzida por Ang-2.

[0048] A Figura 3 é um gráfico de linha mostrando a inibição da ligação tanto da Ang-1 (gráfico do topo) da Ang-2(gráfico de baixo) ao Tie 2 de uma forma dose-dependente usando mAb 3.19.3 ou Tie2/Fc.

[0049] A Figura 4 é um Western blot mostrando a inibição da fosforilação estimulada por Angiopoietina-1 do Tie-2 em células endoteliais Eahy 926 pelo mAb 3.19.3. A inibição da fosforilação do Tie-2 induzida pela Angiopoietina -1 é observada nesse sistema. As concentrações dos anticorpos são apresentadas em nM.

[0050] A Figura 5 é um gráfico de linha mostrando a inibição da fosforilação estimulada pela Angiopoietina-1 do Tie-2 em células endoteliais Eahy 926 pelo mAb 3 .19. 3. A IC50 = 99 nM. O eixo x é a concentração do mAb 3.19.3 e o eixo y indica a resposta.

[0051] A Figura 6 é um diagrama esquemático de uma estrutura proteica da Ang-2 e da Ang-2243 humana. Os números de cima denotam sequências de aminoácidos (diagrama tomado de Injune et al., (2000) JBC 275:18550).

[0052] A Figura 7 mostra a sequência de aminoácidos de uma molécula quimérica de camundongo/humano (SEQ ID NO: 1). Os resíduos humanos (clonados como fragmento StuI-TfiI) 310- 400 estão sublinhados.

[0053] A figura 8 é uma comparação de sequências de amino-ácidos das proteínas Ang-1 humana (SEQ ID NO: 2), Ang- 2 humana (SEQ ID NO: 3), e da Ang-2 de camundongo (SEQ ID NO: 4). Os pontos de fusão das moléculas quiméricas Ang-2 e os pontos de mutação estão apresentados em negrito.

[0054] A Figura 9 é uma comparação de sequências de aminoácidos Ang-1 de camundongo (SEQ ID NO: 5), Ang-1 humana (SEQ ID NO: 2), Ang-2 de camundongo (SEQ ID NO: 4) e da Ang- 2 humana (SEQ ID NO: 3). A ponta da seta mostra o sítio de clivagem para sequências líderes hidrofóbicas. As setas definem os limites dos domínios do tipo fibrinogênio e da espiral enrolada. Os círculos sólidos mostram os resíduos de cisteína conservados (imagem tomada de Maisonpierre et al., 1997, Science 277:55).

[0055] A Figura 10 é um gráfico de linha demonstrando a reatividade cruzada de camundongo numa relação dose-resposta. São mostrados os clones de anticorpos monoclonais 5.2.1, .28.1, 3.19.3, e 3.31.2.

[0056] A Figura 11 é um gráfico de linha mostrando a inibição tanto da Ang-2 humana (triângulos pretos) quanto de camundongo (quadrados pretos) ao Tie2 humano de uma forma dose-dependente usando mAb 3.19.3.

[0057] A Figura 12 é uma análise de gráfico de barras do efeito dos anticorpos na angiogênese induzida por célula MCF-7. Figura 12A mostra o efeito dos anticorpos anti-Ang-2 na quantidade de terminais de vasos sanguíneos onde o eixo X indica os grupos experimentais e o eixo y indica o número médio de terminais de vasos (+/-SD). Figura 12 demonstra o efeito de anticorpos anti-Ang-2 no comprimento dos vasos sanguíneos onde o eixo x indica os grupos experimentais e o eixo y indica o comprimento de vaso médio (+/-SD).

[0058] A Figura 13 é um gráfico de linha mostrando o efeito antitumoral do clone 3.19.3 do anticorpo monoclonal anti-Ang-2, conforme testado num modelo de xenoenxerto de camundongo do carcinoma epidermóide de pele humana usando a linhagem celular A431. O eixo x indica a quantidade de dias após a implantação de célula tumoral e o eixo y indica o volume tumoral medio +/- SEM em cm3. Os triângulos pretos sólidos representam as medições do volume tumoral pósimplantação de camundongos injetados com o clone 3.19. 3 de anticorpo monoclonal anti- Ang-2; os círculos pretos sólidos representam as medições de volume de tumor pós-implantação de camundongos injetados com um anticorpo de controle de isotipo PK16. 3.1.

[0059] A Figura 14 A é um gráfico de linha mostrando a prevenção do crescimento tumoral no modelo de xenoenxerto LoVo de adenocarcinoma de colon humano com o tamanho do tumor indicado para camundongos tratados com 0, 5, 2 e 10 mg/Kg ou o controle de isotipo indicado. O eixo x indica a quantidade de dias após a implantação de célula tumoral e o eixo y indica o volume tumoral medic+/- SEM em cm3. Figura 14B é um gráfico de linha mostrando o efeito inibitório do crescimento tumoral do mAb em modelo de xenoenxerto SW480 de adenocarcinoma de colon humano.

[0060] A Figura 15 A é um gráfico de linha mostrando a prevenção do crescimento tumoral no modelo de xenoenxerto HT29. O eixo x indica a quantidade de diasa pós a implantação de célula tumoral e o eixo y indica o volume tumoral médio +/- SEM em cm3. Figura 15B é um gráfico de linha mostrando a prevenção do crescimento tumoral no modelo de xenoenxerto Calu-6 com tamanho de tumor indicado para camundongos tratados com 10 mg/Kg de clone mAb 3.3.2 ou 3.19. 3 ou com anticorpo de controle de isotipo. Figura 15C é um gráfico de barras indicando a densidade do manchamento de CD31+ em tumores de camundongos com tumor MDA- MB-231 tratados ou com controle de IgG ou com mAb 3.19.3 10 mg/Kg. Os resultados de ambos os limiares e os métodos de contagem de grade manuais estão apresentados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0061] Modalidades da invenção aqui descritas se referem a anticorpos monoclonais que se ligam a Ang-2. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam aAng-2 e inibem a ligação da Ang-2 ao seu receptor, Tie2. Outras modalidades da invenção incluem os anticorpos anti-Ang-2 completamente humano e preparações de anticorpos que são terapeuticamente úteis. Tais preparações de anticorpos anti-Ang-2 preferívelmente tern propriedades terapêuticas desejáveis, incluindo uma forte afinidade de ligação pela Ang-2, a capacidade de neutralizar a Ang-2 in vitro e a capacidade de inibir angiogênese induzida por Ang-2 in vivo.

[0062] Uma modalidade da invenção inclui um anticorpo que se liga a e neutraliza Ang-2, mas não se liga a Ang-1. Em outra modalidade, o anticorpo se liga tanto a Ang-2 quanto a Ang-1, mas somente neutraliza a Ang-2. Em outra modalidade, o anticorpo se liga tanto aAng-2 quanto a Ang- 1, e neutraliza a ligação tanto da Ang-1 quanto da Ang-2 ao Tie2.

[0063] Modalidades da invenção também incluem fragmentos de ligação isolados de anticorpos anti-Ang-2. Preferívelmente, os fragmentos de ligação são derivados de anticorpos anti-Ang-2 completamente humanos. Fragmentos exemplares incluem Fv, Fab' ou outros fragmentos de anticorpos bem conhecidos, conforrne descrito em ma iores detalhes abaixo. Modalidades da invenção também incluem células que expressam anticorpos completamente humanos contra Ang-2. Exemplos de células incluem hibridomas, ou células recombinantemente criadas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), variantes das células CHO (por exernplo DG44) e células NSO que produzem anticorpos contra Ang-2. Informação adicional sobre variantes das células CHO podem ser encontradas em Andersen e Reilly (2004) Current Opinion in Biotechnology 15, 456-462, o qual é aqui incorporado na sua totalidade por referência.

[0064] Além disso, modalidades da invenção incluem métodos de uso desses anticorpos para tratar doenças. Anticorpos Anti-Ang-2 são úteis para prevenir transdução de sinal de Tie2 mediada por Ang-2, inibindo dessa forma a angiogênese. O mecanisrno de ação dessa inibição pode incluir a inibição da Ang-2 da ligação ao seu receptor, Tie2, inibição da sinalização do Tie2 induzida por Ang-2 ou a depuração aumentada de Ang-2 nesse ponto, abaixando a concentração efetiva de Ang-2 para a ligação ao Tie-2. Doenças que são tratáveis através desse mecanismo de inibição incluem, mas não estão limitadas, a doenças neoplásticas, tais como melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), glioblastoma e cânceres e tumores da tireoide, estômago, próstata, mama, ovário, bexiga, pulmão, útero, rim, colon e pâncreas, glândula salivar e colo-retal.

[0065] Outras modalidades da invenção incluem ensaios de diagnóstico para determinar especificamente a quantidade de Ang-2 numa amostra biológica. O kit de ensaio pode incluir anticorpos anti-Ang-2 juntamente com os marcadores necessários para detectar tais anticorpos. Esses ensaios de diagnóstico são úteis para procurar por doenças relacionadas com a angiogênese incluindo, mas sem se limitar, a doenças neoplásticas, tais como melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), glioblastoma e carcinoma da tireoide, estômago, próstata, mama, ovário, bexiga, pulmão, útero, rim, colon e pâncreas, glândula salivar e colo-retal.

[0066] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2, em que o agonista não se liga ao sítio de ligação de ATP do Tie-2.

[0067] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina- 1 e da Angiopoietina-2, em que o antagonista se liga a Angiopoietina-1 e a Angiopoietina -2.

[0068] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina- 1 e da Angiopoietina-2, em que o antagonista não é um composto.

[0069] Numa modalidade é fornecido um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2, em que a atividade antagonista da Angiopoietina-1 e a atividade agonista da Angiopoietina-2 está compreendida numa molécula. Numa modalidade alternativa, é fornecido um antagonista em que a atividade antagonista da Angiopoietina-1 e a atividade antagonista da Angiopoietina-2 está compreendida em mais de uma molécula.

[0070] Numa modalidade, é fornecido um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2, em que o antagonista pode se ligar: i) ao receptor Tie-2; ii) a Angiopoietina-1 e/ou a Angiopoietina-2; iii) ao complexo receptor Tie2-Angiopoietina-1; ou iv) ao complexo receptor Tie2-Angiopoietina-2, ou qualquer combinação desses.

[0071] Numa modalidade o antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2 podem se ligar a Angiopoietina-1 e/ou a Angiopoietina-2 e/ou ao Tie2 e, dessa forma, prevenir a transdução de sinal Tie-2 mediada pela Angiopoietina-1 e pela Angiopoietina-2, inibindo dessa forma a angiogênese. O mecanismo de ação dessa inibição pode incluir: i) ligação do antagonista a Angiopoietina-1 e inibição da ligação da Angiopoietina -1 ao seu receptor, Tie- 2, e/ou ii) ligação do antagonista a Angiopoietina-2 e inibição da ligação da Angiopoietina-2 ao seu receptor, Tie- 2, e/ou iii) aumento da depuração da Angiopoietina-1 e/ou Angiopoietina-2, dessa maneira abaixando a concentração eficaz de Angiopoietina-1 e/ou Angiopoietina-2 disponível para a ligação ao Tie2, ou qualquer combinação desses, suficiente para antagonizar a atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2.

[0072] Sem desejar estar ligado por considerações teóricas, mecanismos pelos quais o antagonismo da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2 pode ser alcançado incluem, mas não estão limitados, a inibição da ligação da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina- 2 ao receptor Tie2, inibição da sinalização do Tie-2 induzida pela Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2 ou depuração aumentada da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2, dessa forma reduzindo a concentração efetiva de Angiopoietina-1 e de Angiopoietina-2.

[0073] Numa modalidade, é fornecido um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina -2, em que o antagonista é um anticorpo. Preferívelmente, o anticorpo é capaz de antagonizar a atividade biológica da Angiopoietina-1 e/ou da Angiopoietina-2 in vitro e in vivo.

[0074] Preferívelmente, o anticorpo é um anticorpo policlonal ou monoclonal. Mais preferívelmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal e, mais preferívelmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal completamente humano. Mais preferívelmente, o anticorpo é o anticorpo monoclonal completamente humano 3.19.3.

[0075] Numa modalidade, é fornecido um anticorpo o qual se liga ao mesmo epítopo ou epítopos como anticorpo monoclonal completamente humano 3.19.3.

[0076] Numa modalidade da invenção é fornecido um anticorpo completamente humano que se liga a Angiopoietina-1 e previne a ligação da Angiopoietina-1 ao Tie-2. Ainda outra modalidade da invenção é um anticorpo monoclonal completamente humano que se liga a Angiopoietina-1 e inibe a Fosforilação do Tie-2 induzida por Angiopoietina-1. Numa modalidade, o anticorpo se liga a Angiopoietina-1 com um KD menor do que 1 nanomolar (nM). Mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 500 picomolar (pM). Mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 100 picomolar (pM). Mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 30 picomolar (pM). Mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 20 pM. Ainda mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 10 ou 5 pM.

[0077] Numa modalidade da invenção, é fornecido um anticorpo completamente humano que se liga a Angiopoietina-2 e previne a ligação da Angiopoietina-2 ao Tie-2. Ainda outra modalidade da invenção é um anticorpo monoclonal completamente humano que se liga a Angiopoietina-2 e inibe a fosforilação do Tie-2 induzida por Angiopoietina-2. Numa modalidade, o anticorpo se liga a Angiopoietina-2 com um KD menor do que 1 nanomolar (nM). Mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 500 picomolar (pM).

[0078] Mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 100 picomolar (pM). Mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 30 picomolar (pM). Mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 20 pM. Ainda mais preferívelmente, o anticorpo se liga com um KD menor do que 10 ou 5 pM.

[0079] Numa modalidade é fornecido um hibridoma que produz a cadeia leve e/ou a cadeia pesada do anticorpo, conforme descrito acima. Preferívelmente, o hibridoma produz a cadeia leve e/ou a cadeia pesada de um anticorpo monoclonal completamente humano. Mais preferívelmente, o hibridoma produz a cadeia leve e/ou a cadeia pesada do anticorpo monoclonal completamente humano 3.19.3, 3.3.2 ou 5.88.3. Alternativamente, o hibridoma produz um anticorpo o qual se liga ao mesmo epítopo ou epítopos como o anticorpo monoclonal completamente humano 3.19.3, 3.3.2 ou 5.88.3.

[0080] Numa modalidade é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada do anticorpo conforme descrito acima. Preferívelmente, é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo monoclonal completamente humano. Mais preferívelmente, é fornecido uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada do anticorpo monoclonal completamente humano 3.19.3.

[0081] Numa modalidade da invenção é fornecido um vetor compreendendo uma molécula ou moléculas de ácido nucleico conforme descrita acima, em que o vetor codifica uma cadeia levee/ou uma cadeia pesada de um anticorpo, conforme definido acima.

[0082] Numa modalidade da invenção é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um vetor conforme descrito acima. Alternativamente, a célula hospedeira pode compreender mais de um vetor.

[0083] Além disso, uma modalidade da invenção é um método de produção de um anticorpo pelo cultivo de células hospedeiras sob condições em que uma molécula de ácido nucleico é expressa para produzir o anticorpo, seguido pela recuperação do anticorpo.

[0084] Numa modalidade da invenção é fornecido um método para fazer um anticorpo compreendendo a transfecção de pelo menos uma célula hospedeira com pelo menos uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo conforme descrito acima, expressando a molécula de ácido nucleico na referida célula hospedeira e isolando o referido anticorpo.

[0085] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de antagonismo da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2, compreendendo a administração de um antagonista conforme descrito acima. O método pode incluir a seleção de um animal necessitado de tratamento para angiogênese relacionada com doença, e a administração ao referido animal de uma dose terapeuticamente efetiva de um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2.

[0086] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de antagonismo da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2, compreendendo a administração de um anticorpo conforme descrito acima. O método pode incluir a seleção de um animal necessitado de tratamento para angiogênese relacionada com doença, e a administração ao referido animal de uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo o qual antagoniza a atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2.

[0087] De acordo com outro aspecto é fornecido um método de tratamento de angiogênese relacionada com doença num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina- 2. O método pode incluir a seleção de um animal necessitado de tratamento para angiogênese relacionada com doença, e a administração ao referido animal de uma dose terapeuticamente eficaz de um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2.

[0088] De acordo com outro aspecto é fornecido um método de tratamento de angiogênese relacionada com doença num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo o qual antagoniza a atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2. O método pode incluir a seleção de um animal necessitado de tratamento para Angiogênese relacionada com doença, e a administração ao referido animal de dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo o qual antagoniza a atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2. O anticorpo pode ser administrado sozinho, ou ele pode ser administrado em combinação com anticorpos adicionais ou droga quimioterapêutica ou terapia de radiação.

[0089] De acordo com outro aspecto é fornecido um método de tratamento de câncer num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2. O método pode incluir a seleção de um animal necessitado de tratamento para câncer, e a administração ao referido animal de uma dose terapeuticamente eficaz de um antagonista o qual antagoniza a atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2. O antagonista pode ser administrado sozinho, ou pode ser administrado em combinação com anticorpos ou pode ser administrado em combinação com anticorpos adicionais ou droga quimioterapêutica ou terapia de radiação.

[0090] De acordo com outro aspecto é fornecido um método de tratamento de câncer num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo o qual antagoniza a atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2. O método pode incluir a seleção de um animal necessitado de tratamento para câncer, e a administração ao referido animal de uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo o qual antagoniza a atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2.

[0091] O antagonista pode ser administrado sozinho, ou pode ser administrado em combinação com anticorpos adicionais ou droga quimioterapêutica ou terapia de radiação.

[0092] De acordo com outro aspecto da invenção é fornecido o uso de um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina- 2 paraa produção de um medicamento para o tratamento da angiogênese relacionada com doença.

[0093] De acordo com outro aspecto da invenção é fornecido o uso de um anticorpoo qual antagoniza a atividade biológica da Angiopoietina- 1 e da Angiopoietina-2 para a produção de um medicamento para o tratamento da angiogênese relacionada com doença.

[0094] Numa modalidade preferida a presente invenção articularmente adequada para uso no antagonismo da Angiopoietina- 1 ou da Angiopoietina-2, em pacientes com um tumor o qual é dependente sozinho, ou em parte, no receptor Tie- 2 Outra modalidade da invenção inclui um kit de ensaio para detectar Angiopoietina-1 e/ou Angiopoietina-2 em tecidos, células ou fluidos comporais de mamíferos, para procurar por doenças relacionadas com angiogênese. O kit inclui um anticorpo que se liga a Angiopoietina-1 e/ou a Angiopoietina-1 e uma forma de indicar a reação do anticorpo com Angiopoietina-1 e/ou Angiopoietina-2, se presente. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. Numa modalidade, o anticorpo que se liga a Angiopoietina-2 é marcado. Em outra modalidade o anticorpo é um anticorpo primário não-marcado e o kit inclui ainda uma forma de detectar o anticorpo primário. Numa modalidade, o instrumento inclui um segundo anticorpo marcado que é uma antiimunoglobulina. Preferívelmente, o anticorpo é marcado com um marcador selecionado do grupo consistindo de um fluorcromo, uma enzima, um radionuclideo e um material radiopaco.

[0095] Outras modalidades, características e semelhantes considerando anticorpos anti-Ang-2 estão fornecidos em detalhes adicionais abaixo.

Listagem de sequências

[0096] Modalidades da invenção incluem os anticorpos anti-Ang-2 específicos listados abaixo na Tabela 1. Essa tabela reporta o número de identificação de cada anticorpo anti-Ang-2, juntamente com o número da SEQ ID dos genes de cadeia levee de cadeia pesada correspondentes.

[0097] A cada anticorpo foi dado um número de identificação que inclui ou dois ou três números separados por um ou dois pontos decimais. Para a maioria dos anticorpos, somente dois números de identificação, separados por um ponto decimal, estão listados.

[0098] Entretanto, em alguns casos, vários clones de um anticorpo foram preparados. Embora os clones tenham as sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos idênticas como a sequência de origem, eles também podem estar listados separadamente, com o número do clone indicado pelo número da direita de um segundo ponto decimal. Consequentemente, por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos do anticorpo 5.35 são idênticas às sequências do anticorpo 5.35.1, 5.35.2 e 5.35.3. Tabela 1

Definições

[0099] A não ser que seja definido de outra forma, termos científicos e técnicos aqui usados devem ter os significados que são comumente entendidos pelos indivíduos versados na técnica. Além disso, a não ser que seja requerido de outra forma pelo contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular. Geralmente, nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de cultura celular e de tecidos, biologia molecular e hibridização e química de oligo-ou polinucleotídeo e proteína aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica.

[00100] Técnicas padrões são usadas para DNA recombinante, siéntese de oligonucleotídeos e transformação e cultivo de tecido (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são efetuadas de acordo com as específicações do fabricante ou como comumente realizado na técnica ou como aqui descrito. As técnicas precedentes e procedimentos são geralmente efetuados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas pela presente especificação. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)), o qual e aqui incorporado por referência. As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos laboratoriais e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados na técnica. Técnicas padrões são usadas para síntese química, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e distribuição, e tratamento de pacientes.

[00101] Conforme utilizado de acordo com a presente descoberta, os seguintes termos, a não ser que indicados de outra forma, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados: Um antagonista pode ser um polipeptídeo, ácido nucleico, carboidrato, lipídeo, composto de peso molecular pequeno, um oligonucleotídeo, um oligopeptídeo, MA interferencia (MAi), anti-sentido, uma proteína recombinante, um anticorpo ou conjugados ou suas proteínas de fusão. Para uma revisão de MAi ver Milhavet O, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev. Dez 2003; 55(4):629-48. Revisão.) e antisentido ver Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE. 28 de outubro de 2003; 2003 (206): pe47).

[00102] Angiogênese relacionada com doença pode ser qualquer angiogênese anormal, indesejavel ou patológica, por exemplo angiogênese relacionada com tumor. Doenças relacionadas com angiogênese incluem, mas não estão limitadas, a tumores não-sólidos tais como leucemia, mieloma múltiplo ou linfoma e também tumores sólidos tais como melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), glioblastoma, carcinoma da tireóide, ducto biliar, osso, cérebro /SNC, cabeça e pescoço, hepático, gástrico, estômago, próstata, mama, renal, testicular, ovariano, pele, cervical, pulmão, músculo, neuronal, esofageal, bexiga, pulmão, uterine, vulval, endometrial, rim, colo-retal, pancreático, das membranas pleural/peritoneal, da glândula salivar e tumores epidermóides.

[00103] Um composto se refere a qualquer composto de peso molecular pequeno com um peso molecular de menos do que cerca de 2.000 Daltons.

[00104] O termo "Ang-2" se refere à molécula Angiopoietina-2.

[00105] O termo "neutralizante", quando se referindo a um anticorpo, se refere à capacidade de um anticorpo eliminar, ou significativamente reduzir a atividade de um antígeno alvo. Concordantemente, um anticorpo anti-Ang-2 "neutralizante" é capaz de eliminar ou significativamente reduzir a atividade de Ang-2. Um anticorpo Ang-2 neutralizante pode, por exemplo, agir pelo bloqueio da ligação da Ang-2 ao seu receptor Tie2. Pelo bloqueio dessa ligação, a transdução de sinal mediada pelo Tie2 e significativamente, ou completamente eliminada. Idealmente, um anticorpo neutralizante contra a Ang-2 inibe a angiogênese.

[00106] O termo "polinucleotídeo isolado”, conforme aqui utilizado, deve significar um polinucleotídeo que foi isolado de seu ambiente de ocorrência natural. Tais polinucleotídeos podem ser genômicos, de DNAc ou sintéticos. Polinucleotídeos isolados preferívelmente não estão associados com todo ou uma porção dos polinucleotídeos que eles se associam na natureza. Os polinucleotídeos isolados podem estar operativamente ligados a outro polinucleotídeo que não esteja ligado na natureza. Além disso, polinucleotídeos isolados preferívelmente não ocorrem na natureza como parte de uma sequência maior.

[00107] O termo "proteína isolada" aqui referido significa uma proteína que foi isolada de seu ambiente de ocorrência natural. Tais proteínas podem ser derivadas de DNA genômico, de DNAc, de DNA recombinante, de RNA recombinante ou de origem sintética ou alguma combinação destes, a qual em virtude de sua origem, ou fonte de derivação, a "proteína isolada" (1) não está associada com proteínas encontradas na natureza, (2) está livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, livre de proteínas de murino, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou ( 4) não ocorre na natureza.

[00108] O termo "polipeptídeo" é aqui utilizado como um termo genérico para se referir a proteína natural, fragmentos ou análogos de uma sequência de polipeptídeo. Dessa forma, proteína natural, fragmentos e análogos são espécies do gênero polipeptídeo. Polipeptídeos preferidos de acordo com a invenção compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada humana e as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve capa humana, assim como moléculas de anticorpo formadas por combinações compreendendo as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada com as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve, tais como as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve lambda ou capa, e vice-versa, assim como fragmentos e seus análogos. Polipeptídeos preferidos, de acordo com a invenção, também podem compreender somente as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada humana ou seus fragmentos.

[00109] O termo "de ocorrência natural", conforme aqui utilizado, conforme aplicado a um objeto, se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência de polinucleotídeo que é presente num organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e o qual não tenha sido intencionalmente modificado pelo homem no laboratório ou, de outra forma, e de ocorrência natural.

[00110] O termo "operativamente ligado", conforme aqui utilizado, se refere às posições dos componentes assim descritos que estão numa relação que os permitem funcionar na sua maneira pretendida. Por exemplo, uma sequência de controle "operativamente ligada" a uma sequência codificante de tal forma que a expressão da sequência codificante e alcançadas as condições compatíveis com as sequências de controle.

[00111] O termo "sequência de controle", conforme aqui utilizado, se refere a sequências de polinucleotídeos que são necessárias ou para efetuar ou para afetar a expressão e processamento de sequências codificantes para as quais elas estão conectadas. A natureza de tais sequências de controle diferem, dependendo do organismo hospedeiro; em procariotos, tais sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossomal e sequência de terminação de transcrição; em eucariotos, geralmente, tais sequências de controle podem incluir promotores, intensificadores, introns, sequências de terminação de transcrição, sequências de sinal de poliadenilação e regiões não-traduzidas 5’ e 3’. O termo "sequências de controle" pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento, e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa por exemplo, sequências líderes e sequências de parceria de fusão.

[00112] O termo "polinucleotídeo", conforme aqui referido, significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, sejam ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo, ou hetero-duplexes de RNA- DNA. O termo inclui formas de filamento único e duplo de DNA.

[00113] O termo"oligonucleotídeo" de ocorrência natural referido aqui e modificados inclui ligados juntos por ligações de ocorrência natural e de ocorrência não-natural. Oligonucleotídeos são subconjunto de polinucleotídeos geralmente compreendendo um comprimento de 200 bases ou menos. Preferívelmente, oligonucleotídeos são de 10 a 60 bases de comprimento e, mais preferívelmente,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases em comprimento. 01igonucleotídeos são geralmente de filamento único, por exemplo, para sondas; embora oligonucleotídeos possam ser de filamento duplo, por exemplo, para uso na construção de um gene mutante. Oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos ou de sentido ou de anti- sentido.

[00114] O termo "nucleotídeos de ocorrência natural" aqui referido inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeos modificados" referido aqui inclui nucleotídeos com grupos de açucares modificados ou substituídos e semelhantes. O termo "ligações de oligonucleotídeos" referido aqui inclui ligações de oligonucleotídeos tais como uma fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato e semelhantes. Ver, por exemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Câncer Drug Design 6:539 (1 991) ; Zon et al. Oligonúcleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press,Oxford England(1991)); Stecetal. Patente Americana N° 5.151.510; Ohlmanne Peyman Chemical Reviews 90:543(1990), as descobertas dos quais são por meio disto incorporadas por referência. Um oligonucleotídeo pode incluir um marcador para detecção, caso desejado.

[00115] O termo "hibridiza seletivamente" aqui referido significa se ligar de maneira detectável e específica. Polinucleotídeos, oligonucleotídeos e seus fragmentos hibridizam seletivamente a filamentos de ácido nucleico sob condições de lavagem e hibridização que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não-específicos. Condições de alta estringência podem ser usadas para alcancar condições de hibridização seletivas conforme conhecido na técnica e aqui discutido. Geralmente, a homologia de sequência de ácidos nucleicos entre os polinucleotídeos, oligonucleotídeos ou fragmentos de anticorpo e uma sequência de ácido nucleico de interesse será de pelo menos 80%, e mais tipicamente com homologias preferívelmente crescentes de pelo menos 85%, 90%, 95%, 99%, e 100%.

[00116] Duas sequências de aminoácidos são "homólogas " se houver uma identidade parcial ou completa entre as suas sequências. Por exemplo, 85% de homologia significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências estão alinhadas para emparelhamento máxima. Intervalos (em qualquer uma das duas sequências sendo emparelhadas) são deixados no emparelhamento máxima; comprimentos de intervalo de 5 ou menos são preferidos com 2 ou menos sendo mais preferido. Altemativamente e preferívelmente, duas sequências de proteína (ou sequências de polipeptídeos derivados delas de pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, como esse termo e aqui utilizado, se elas tiverem uma pontuação de alinhamento de mais de 5 (em unidades de desvio padrão) usando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade de intervalo de 6 ou mais. Ver Dayhoff, M.O., em Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e Suplemento 2 desse volume, pp. 1 10. As duas sequências ou suas partes são mais preferívelmente homólogas se seus aminoácidos são mais ou iguais a 50% idênticos quando otimamente alinhados usando o programa ALIGN. Deve ser percebido que podem haver regiões que se diferem em duas sequências ortólogas. Por exemplo, os sítios funcionais de ortólogos humano e de camundongo podem ter um grau mais alto de homologia do que regiões não-funcionais.

[00117] O termo "corresponde a" é aqui utilizado para significar que uma sequência de polinucleotídeos é homóloga (isto é, é idêntica, não estritamente evolutivamente relacionada) a todas ou a uma porção de uma sequência de polinucleotídeo de referência, ou que uma sequência de polipeptídeo é idêntica a uma sequência de polipeptídeo de referência.

[00118] Em contra distinção, o termo "complementar a" é aqui utilizado para significar que a sequência complementar e homóloga a toda ou a uma porção de uma sequência de polinucleotídeo de referência. Para ilustração, a sequência de nucleotídeos"TATAC"corresponde a sequência de referência "TATAC" e é complementar a uma sequência de referência "GTATA".

[00119] Os seguintes termos são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "porcentagem de identidade de sequência" e "identidade substâncial. Uma "sequência de referência" é uma sequência definida como uma base para uma comparação de sequência. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de um DNAc de comprimento completo ou uma sequência de genes dada numa listagem de sequência ou pode compreender um DNAc completo ou uma sequência de genes. Geralmente, uma sequência de referência e pelo menos 18 nucleotídeos ou 6 aminoácidos de comprimento, frequententemente pelo menos 24 nucleotídeos ou 8 aminoácidos de comprimento, e geralmente pelo menos 48 nucleotídeos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos podem cada um compreender uma sequência (isto é, uma porção do polinucleotídeo completa ou sequência de aminoácidos) que e similar entre as duas moléculas, e (2) podem ainda compreender uma sequência que seja divergente entre os tais polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos, as comparações de sequência entre duas (ou mais) moléculas são tipicamente efetuadas pela comparação de sequências das duas moléculas sobre uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", conforme aqui utilizado, se refere a um segmento conceitual de pelo menos cerca de 18 posições de nucleotídeos contíguas ou cerca de 6 aminoácidos, em que a sequência de polinucleotídeos ou sequência de aminoácidos é comparada com uma sequência de referência de pelo menos 18 nucleotídeos contíguos ou 6 sequências de aminoácidos e em que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode incluir adições, anulações, substituições e semelhantes (isto é, intervalos) de 20 por cento ou menos em comparação com a sequência de referência (a qual não compreende adições ou anulações) para o alinhamento ótimo das duas sequências. O alinhamento ótimo das sequências para o alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Programas de Computador Wisconsin Genetics Versão 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), pacotes de programas de computador GENEWORKS™, ou MACVECTOR®) ou por inspeção, e o melhor alinhamento (isto é, resultante na porcentagem mais elevada de homologia sobre a janela de comparação) gerada pelos vários métodos e selecionado.

[00120] O termo "identidade de sequência" significa que dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos são idênticos (isto é, numa base de nucleotídeo-por-nucleotídeo ou de resíduo-por-resíduo) sobre a janela de comparação. O termo "porcentagem de identidade de sequência” é calculado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando a quantidade de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir a quantidade de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para fornecer a porcentagem de identidade de sequência. Os termos "identidade substâncial", conforme aqui utilizado, denota uma característica de um polinucleotídeo ou sequência de aminoácidos, em que o polinucleotídeo ou aminoácido compreende uma sequência que tem pelo menos 85 por cento de identidade de sequência, preferívelmente pelo menos 90 a 95 por cento de identidade de sequência, mais preferívelmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência, em comparação com uma sequência de referência sobre uma janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleotídeos (6 aminoácidos), frequentemente sobre uma janela de pelo menos 24-48 nucleotídeos (8-16 aminoácidos), em que a porcentagem de identidade de sequência é calculada pela comparação da sequência de referência coma sequência a qual pode incluir anulações ou adições, as quais totalizam 20 por cento ou menos da sequência de referência sobre a janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconj unto de uma sequência maior.

[00121] Conforme aqui utilizado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Ver Immunology-A Synthesis (2a Edição, E. S. Golube D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), a qual é incorporada aqui por referência. Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não-naturais, tais como aminoácidos α-,α-dissubstituidos, N- alquilaminoácidos, ácido lático e outros aminoácidos não-convencionais também podem ser componentes adequados para polipeptídeos da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não-convencionais incluem: 4- hidroxiprolina, Y—carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil-lisin, ε-N-acetilcisteina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilistidina, 5- hidroxilisina, o-N-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Numa notação de polipeptídeos aqui usada, a direção de canhota é a direção à esquerda e a direção aminoterminal é a direção à direita e a direção carboxi terminal, de acordo com o uso e com a convenção padrão.

[00122] Similarmente, a não ser que seja especificado de outra forma, a extremidade à esquerda das sequências de polinucleotídeos de filamento único é a extremidade 5'; a direção à esquerda das sequências de polinucleotídeos de duplo filamento è referida como a direção 5'. A direção da adição de 5' para 3’ dos transcritos de RNA nascentes é referida como a direção de transcrição: regiões de sequência no filamento de DNA com a mesma sequência que o RNA e as quais são 5' a extremidade 5' do transcrito de RNA são referidas como "sequências a montante"; regiões de sequência de filamento de DNA com a mesma sequência que o RNA e as quais são 3' a extremidade 3' do transcrito de RNA são referidas como "sequências a jusante".

[00123] Conforme aplicado a polipeptídeos, o termo "identidade substâncial" significa que duas sequências de peptídeos, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de intervalo predefinidos, compartilham pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, preferívelmente pelo menos 90 por cento de identidade de sequência, mais preferívelmente pelo menos 95 por cento de identidade de sequência, e mais preferívelmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência. Preferívelmente, posições de resíduos que não são idênticas diferem per substituições de aminoácidos conservativas. Substituições de aminoácidos conservativas se referem à permutabilidade de resíduos com cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas e glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais hidroxialifáticas e serina e treonina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo amida e a asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas e a fenilalanina, tirosina e o triptofano; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais básicas e a lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre e cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservativos preferidos são: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutâmico-aspártico e asparagina-glutamina.

[00124] Conforme aqui discutido, variações menores nas sequências de aminoácidos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são contempladas como sendo englobadas pela presente invenção, contanto que as variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 75%, mais preferívelmente pelo menos 80%, 90%, 95% e mais preferívelmente 99% de identidade de sequência em relação aos anticorpos ou moléculas de imunoglobulina aqui descritas. Particularmente, substituições de aminoácidos conservativas são contempladas. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem numa família de aminoácidos que tem cadeias laterais relacionadas. Aminoácidos genéticamente codificados estão geralmente divididos em famílias: (1)ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) não-polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar descarregado = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Famílias mais preferidas são: serina e treonina são uma família hidroxialifática; asparagina e glutamina são uma família contendo amida; alanina, valina, leucina e isoleucina são uma família alifática; e fenilalanina, triptofano e tirosina são uma família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um efeito maior na função de ligação ou nas propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido num sítio estrutural. Se uma mudança de aminoácido resulta num peptídeo funcional pode ser prontamente determinado pela análise da atividade específica do derivado polipeptídico. Análises são descritas aqui em detalhes. Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser prontamente preparadas pelos indivíduos versados na técnica. Terminais amino-e carboxi de fragmentos ou análogos ocorrem próximos dos limites de domínios funcionais. Domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados da sequência de nucleotídeo e/ou aminoácido em relação a bancos de dados de sequências públicas ou proprietárias. Preferívelmente, métodos de comparação computadorizada são usados para identificar porções de sequências ou domínios de conformação de proteína previstos que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecida. Métodos para identificar sequências de proteínas que se dobram numa estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Dessa forma, os exemplos precedentes demonstram que os indivíduos versados na técnica podem reconhecer porções de sequências e conformações estruturais que podem ser usadas para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com os anticorpos aqui descritos.

[00125] Substituições de aminoácidos preferidas são aquelas as quais: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade por ligação para formar complexos proteicos, (4) alteram afinidades de ligação, e (4) conferem ou modificam outras propriedades funcionais ou físico-químicas de tais análogos. Análogos podem incluir várias muteínas de uma sequência diferente da sequência peptídica de ocorrência natural. Par exemplo, substituições de aminoácidos individuais ou múltiplas (preferívelmente substituições de aminoácidos conservativas) podem ser feitas na sequência de ocorrência natural (preferívelmente na porção do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) que formam os contatos intermoleculares. Uma substituição de aminoácido conservativa não deve alterar substancialmente as características estruturais da sequência de origem (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve tender a quebrar uma hélice que ocorra na presente sequência, ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracterize a sequência de origem). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeos reconhecidos na técnica estão descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.Y.(1991)); e Thomtonetat. Nature 354:105(1991), as quais são aqui incorporadas por referência.

[00126] O termo "fragmento de polipeptídeo", conforme aqui utilizado, se refere a um polipeptídeo que tem uma anulação aminoterminal e/ou carboxiterminal, mas onde a sequência de aminoácido restante é idêntica às posições correspondentes na sequência de ocorrência natural deduzida, por exemplo, a partir de uma sequência de DNA de comprimento inteiro. Fragmentos tipicamente têm pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, preferívelmente pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, mais preferívelmente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, geralmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, e ainda mais preferívelmente pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. O termo "análogo”, conforme aqui utilizado, se refere a polipeptídeos as quais são compreendidos de um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que tem identidade substâncial a uma portão de uma sequência de aminoácidos deduzida e a qual tenha pelo menos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica a uma Ang-2, sob condições de ligação adequadas, (2) capacidade de bloquear a ligação da Ang-2 apropriada, ou (3) capacidade de inibir a atividade da Ang-2. Tipicamente, análogos de polipeptídeos compreendem uma substituição de aminoácido conservativa (ou adição ou anulação) em relação à sequência de ocorrência natural. Análogos tipicamente são de pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, preferívelmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento ou mais longos, e podem geralmente ser tão longos quanto um polipeptídeo de ocorrência natural de comprimento completo.

[00127] Análogos de peptídeo são comumente usados na indústria farmacêutica como drogas não-peptídicas com propriedades analogas aquelas do peptídeo molde. Esses tipos de compostos não-peptídicos são nomeados "peptideomiméticos " ou "peptidomiméticos". Fauchere, J Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber e Freidinger TINS p.392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), os quais são aqui incorporados por referência. Tais compostos são geralmente desenvolvidos com a ajuda de modelagem molecular computadorizada. Peptideomiméticos que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um equivalente terapêutico ou um equivalente profilático. Geralmente, peptideomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipeptídeo paradigma (isto é, um polipeptídeo que tem uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica), tal como um anticorpo humano , mas tem uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionadado grupo consistindo de: - CH2NH- ,- CH2S- ,- CH2 - CH2-, -CH=CH- ( cis e trans), - COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO- , por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar da L-lisina) pode ser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, peptídeos reprimidos compreendendo uma sequência de consenso ou uma variação da sequência de consenso substancialmente idêntica pode ser gerada por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), aqui incorporado por referência); por exemplo, pela adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfeto intramoleculares as quais ciclizam o peptídeo.

[00128] Conforme aqui utilizado, o termo "anticorpo" se refere a um peptídeo ou grupo de polipeptídeos que são compreendidos de pelo menos um domínio de ligação que é formado a partir do dobramento de cadeias polipeptídicas com espaços de ligação tridimensionais com formas de superfície interna e distribuições de carga complementares as características de um determinante antigênico de um antígeno. Um anticorpo tipicamente tem uma forma tetramérica, compreendendo dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par com uma cadeia "leve" e uma cadeia "pesada". As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam um sítio de ligação de anticorpo.

[00129] Conforme aqui utilizado, um "agente de ligação alvejado" é um anticorpo, ou seu fragmento de ligação, que preferívelmente se liga a um sítio alvo. Numa modalidade, o agente de ligação alvejado e específico para somente um sítio alvo. Em outras modalidades, o agente de ligação alvejado é específico para mais de um sítio alvo. Numa modalidade, o agente de ligação alvo pode ser um anticorpo monoclonal e o sítio alvo pode ser um epítopo.

[00130] "Fragmentos de ligação" de um anticorpo são produzidos por técnicas de DNA recombinantes, ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv e anticorpos de cadeia única. Um anticorpo diferente de um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é entendido por ter cada um dos seus sítios de ligação idênticos. Um anticorpo substancialmente inibe a adesão de um receptor a um contra-receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao contra-receptor por pelo menos cerca de 20%, 40%, 60% ou 80%, e mais geralmente mais do que cerca de 85% (conforme medido num ensaio de ligação competitivo in vitro).

[00131] Um anticorpo pode ser oligoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo CDR- enxertado, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo catalitico, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo completamente humano, um anticorpo antiidiotípico e anticorpos que podem ser marcados na forma solúvel ou ligada, assim como seus fragmentos, variantes ou derivados, quer sozinhos ou em combinação com outras sequências de aminoácidos fomecidas por técnicas conhecidas. Um anticorpo pode ser de qualquer espécie. O termo anticorpo também inclui fragmentos de ligação dos anticorpos da invenção; fragmentos exemplares incluem Fv, Fab, Fab’, anticorpo de filamento único (svFC), região variável dimérica (Diacorpo (Diabody)) e região variável estabilizada por dissulfeto (dsFv).

[00132] O termo "epítopo" inclui qualquer proteína determinante capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Determinantes epitópicos geralmente consistem de agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e podem, mas não sempre, ter características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. E dito que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação é < 1 μM, preferívelmente < 100 nM e mais preferívelmente < 10 nM.

[00133] O termo "agente" é aqui utilizado para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato feito de materiais biológicos.

[00134] "Ativo" ou "atividade" em relação ao polipeptídeo Ang-2 se refere a uma porção do polipeptídeo Ang-2 que tem uma atividade biológica ou imunológica de um polipeptídeo natural Ang-2. "Biológico", quando aqui utilizado, se refere a uma função biológica que resulta da atividade do polipeptídeo Ang-2 natural. Uma atividade biológica Ang-2 preferida inclui, por exemplo, angiogênese induzida por Ang-2.

[00135] "Mamífero", quando aqui utilizado, se refere a qualquer animal que é considerado um mamífero. Preferívelmente, o mamífero é humano.

[00136] Digestão de anticorpos com a enzima, papaína, resulta em dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, conhecidos também como fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc", sem atividade de ligação a antígeno, mas com a capacidade de cristalizar. A digestão dos anticorpos com a enzima, pepsina, resulta no fragmento F(ab')2 no qual os dois braços da molécula de anticorpo permanecem ligados e compreende dois sítios de ligação de antígenos. O fragmento F(ab')2 ter na capacidade de ligar de forma cruzada o antígeno.

[00137] "Fv", quando aqui utilizado, se refere ao fragmento mínimo de um anticorpo que retém tanto o sítio de reconhecimento de antígeno quanto o sítio de ligação de antígeno.

[00138] "Fab", quando aqui utilizado, se refere a um fragmento de um anticorpo que compreende o domínio constante da cadeia levee o domínio CHl da cadeia pesada.

[00139] O termo "mAb" se refere a anticorpo monoclonal.

[00140] "Lipossoma", quando aqui utilizado, se refere a uma pequena vesícula que pode ser útil para a distribuição de drogas que podem incluir o polipeptídeo Ang-2 da invenção ou anticorpos a tal polipeptídeo Ang-2 a um mamífero.

[00141] "Marcador" ou "marcado", conforme aqui utilizado, se refere a adição de uma porção detectável a um polipeptídeo, por exemplo, um radiomarcador, um marcador fluorescente, um marcador enzimático quimioluminescentemente marcado ou um grupo biotinil. Radioisótopos ou 3 14 15 35 90 99 111 125 131 radionuclídeos podem incluir H, C, N, S, Y, Tc, In, I, I, marcadores fluorescentes podem incluir rodamina, substâncias fosforescentes lantanídicas ou FITC e marcadores enzimáticos podem incluir peroxidase de rabano silvestre, B-galactosidase, luciferase e fosfatase alcalina.

[00142] O termo "droga ou agente farmacêutico", conforme aqui utilizado, se refere a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando propriamente administrado a um paciente. Outros termos químicos são usados de acordo com o uso convencional da técnica, conforme exemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, São Francisco (1985)) (incorporado aqui por referência).

[00143] Conforme aqui utilizado, "substancialmente puro" significa que a espécie de um objeto é a espécie predominante presente (isto é, numa base molar é a mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição), e preferívelmente uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie de objeto compreende pelo menos cerca de 50 por cento (numa base molar) de todas as espécies macro moleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura irá compreender mais de cerca de 80 por cento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, mais preferívelmente mais do que cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Mais preferívelmente, a espécie de objeto é purificada até a homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente de uma única espécie macromolecular.

[00144] O termo "paciente" inclui indivíduos humanos e veterinários.

Anticorpos humanos e humanização de anticorpos

[00145] Um método para gerar anticorpos completamente humanos e através do uso de raças de XenoMouse® de camundongos que tenham sido projetadas para conter até, porém não menos do que fragmentos configurados da linhagem germinativa de 1.000 Kb do local da cadeia pesada humana e do local da leve capa.Ver Mendez etal.Nature Genetics 15:146- 6 (1997) e Greene Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). As raças de XenoMouse® estão disponíveis da Abgenix, Inc. (Fremont, CA).

[00146] A produção de raças de XenoMouse® de camundongos é adicionalmente discutida e delineada nos Pedidos de Patente Americana Nos de série 07/466.008, requerido em 12 de Janeiro de 1990, 07/610.515, requerido em 8 de novembro de 1990, 07/919.297, requerido em 24 de julho de 1992, 07/922.649, requerido em 30 de julho de 1992, 08/031.801, requerido em 15 de março de 1993, 08/112.848, requerido em 27 de agosto de 1993,08/234.145, requerido em 28 de abril de 1994, 08/376.279, requerido em 20 de janeiro de 1995, 08/430.938, requerido em 27 de abril de 1995, 08/464.584, requerido em 5 de junho de 1995, 08/464.582, requerido em 5 de junho de 1995, 08/463.191, requerido em 5 de junho de 1995, 08/462.837, requerido em 5 de junho de 1995, 08/486.853, requerido em 5 de junho de 1995, 08/486.857, requerido em 5 de junho de 1995, 08/486.859, requerido em 5 de junho de 1995, 08/462.513, requerido em 5 de junho de 1995, 08/724. 752, requerido em 2 de outubro de 1996, 08/759. 620, requerido em 3 de dezembro de 1996, Publicação Americana 2003/0093820, requerida em 30 de novembro de 2001 e Patentes Americanas Nos 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 e 5.939.598, e Patentes Japonesas Nos 3 068 180 B2, 3068 506 B2 e 3 068 507 B2. Ver também a Patente Europeia N° EP 0 463 151 B1, concedida publicação em 12 de junho de 1996, Pedido de Patente Internacional N° WO 94/02602, publicado em 3 de fevereiro de 1994, Pedido de Patente Internacional N° WO 96/34096, publicado em 31 de outubro de 1996, WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998, WO 00/76310, publicado em 21 de dezembro de 2000. As descobertas de cada uma das patentes, pedidos e referências acima citados são por meio disto incorporadas por referência na sua totalidade.

[00147] Numa tentativa altemativa, outros, incluindo GenPharm Intemational, Inc., utilizaram uma tentativa "minilocal" (mini1ocus). Na tentativa minilocal, um local de Ig exógeno é mimetizado através da inclusão de pedaços (genes individuais) do local Ig. Dessa forma, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH, uma região constante um, e geralmente uma segunda região constante (preferívelmente uma região constante gama) são formadas num constructo para inserção num animal. Essa tentativa é descrita na Patente Americana N° 5.545.807, para Surani et al, e nas Patentes Americanas N°s 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 e 6.255.458, cada uma para Lenberg e Kay, Patente Americana N°s 5.591.669 e 6.023.010, para Krimpenfort e Bems, Patentes Americanas N°s 5.612.205, 5.721.367 e 5.789.215, pra Bems et al, e Patente Americana N° 5.643.763, para Choi e Dunn, e Pedidos de Patente Americana da GenPharm Intemational N°s de Série 07/574.748, requerido em 29 de agosto de 1990, 07/575.962, requerido em 31 de agosto de 1990, 07/810.279, requerido em 17 de dezembro de 1991, 07/853.408, requerido em 18 de março de 1992, 07/904.068, requerido em 23 de junho de 1992, 07/990.860, requerido em 16 de dezembro de 1992, 08/053.131, requerido em 26 de abril de 1993, 08/096.762, requerido em 22 de julho de 1993, 08/155.301, requerido em 18 de novembro de 1993, 08/161.739, requerido em 3 de dezembro de 1993, 08/165.699, requerido em 10 de dezembro de 1993, 08/209.741, requerido em 9 de marc;o de 1994, as descobertas dos quais são por meio disto incorporadas por referência. Ver também a Patente Europeia N° 0 546 073 Bl, os pedidos de Patente Intemacionais N°s WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO93/12227, WO94/00569, WO94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 e WO 98/24884 e a Patente Americana N° 5.981.175, as descobertas das quais são por meio disso incorporadas por referência na sua totalidade. Ver ainda Taylor et al, 1992, Chen et al, 1993, Tuaillon et al, 1993, Choi et al, 1993, Lonberg et al, (1994), Taylor et al, (1994) e Tuaillon et al, (1995), Fishwild et al, (1996), as descobertas dos quais são por meio disto incorporadas por referência nas suas totalidades.

[00148] Kirin também demonstrou a geração de anticorpos humanos de camundongos nos quais, através de fusão de microcélula, grandes pedaços de cromossomos, ou cromossomos inteiros foram introduzidos. Ver Pedidos de Patente Europeia N°s 773 288 e 843 961, as descobertas dos quais são por meio disto incorporadas por referência. Adicionalmente foram gerados camundongos KM™, os quais são o resultado da procriação cruzada de camundongos Tc de Kirin com camundongos minilocais de Medarex (Humab). Esses camundongos possuem o transcromossomo IgH humano do camundongo Kirin e o transgene da cadeia capa dos camundongos Genpharm (Ishida et al, Cloning Stem Cells, (2002) 4: 91-102).

[00149] Anticorpos humanos também podem ser derivados por métodos in vitro. Exemplos adequados incluem, mas não estão limitados, a exposição de fago (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed), exposição de ribossomo (CAT), exposição de levedura e semelhantes.

Preparação de anticorpos

[00150] Anticorpos, conforme aqui descritos, foram preparados através do uso da tecnologia de XenoMouse®, conforme descrito abaixo. Tais camundongos, dessa forma, são capazes de produzir moléculas de imunoglobulinas humanas e anticorpos que são deficientes na produção de anticorpos e moléculas de imunoglobulina de murino. Tecnologias utilizadas para alcançar o mesmo estão reveladas nas patentes, pedidos e referências revelados na seção prática aqui. Particularmente, entretanto, uma modalidade preferida da produção de transgene de camundongos e anticorpos disto é revelada no Pedido de Patente Americana N° de série 08/759.620, requerido em 3 de dezembro de 1996, e nos Pedidos de Patentes Intemacionais N°s de Série WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998, e WO 00/76310, publicado em 21 de dezembro de 2000, as descobertas dos quais são por meio disto incorporadas por referência. Ver também Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), a descoberta do qual é por meio disso incorporada por referência.

[00151] Através do uso de tal tecnologia, anticorpos monoclonais completamente humanos em relação a uma variedade de antígenos foram produzidos. Essencialmente, linhagens de camundongos XenoMouse® são imunizados com um antígeno de interesse (por exemplo, Ang-2), células linfáticas (tais como células B) são recuperadas de camundongos hiperimunizados, e os linfócitos recuperados são fundidos com uma linhagem celular do tipo mielóide para preparar linhagens celulares de hibridoma imortais. Essas linhagens celulares de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produziram anticorpos específicos para o antígeno de interesse. Aqui fornecidos estão os métodos para a produção de múltiplas linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para a Ang-1 e para a Ang-2. Além disso, são aqui fomecidas a caracterização dos anticorpos produzidos por tais linhagens celulares, incluindo análises de sequências de nucleotídeos e de aminoácidos das cadeias pesada e leve de tais anticorpos.

[00152] Alternativamente, ao invés de ser fundido com células de mieloma para gerar hibridomas, células B podem ser diretamente analisadas. Por exemplo, células CD19+ B podem ser isoladas a partir de camundongos XenoMouse® hiperimunes e deixadas proliferar e se diferenciar em células de plasma secretoras de anticorpos. Anticorpos dos sobrenadantes celulares são, dessa forma, testados por ELISA para reatividade contra o imunógeno Ang-2. Os sobrenadantes também podem ser testados para imunorreatividade contra fragmentos de Ang-2 para adicionalmente mapear os diferentes anticorpos para ligação a domínios de interesse funcional na Ang-2. Os anticorpos podem também ser testados contra Ang-1, Ang-3 ou Ang-4, outra quimiocinas humanas relacionadas e contra ortólogos de Ang-2 de rato, de camundongo e de primatas NaOHumanos, tais como macacos cinomolgo, o último para determinar reatividade cruzada de espécies. Células B de poços contendo anticorpos de interesse podem ser imortalizadas por vários métodos, incluindo fusão para fazer hibridomas ou a partir de poços individuais ou a partir de poços reunidos, ou por infecção com EBV ou transfecção por genes imortalizados conhecidos e, a seguir, pelo plaqueamento em meio adequado. Alternativamente, células de plasma individuais secretando anticorpos com as especificidades desejadas são, a seguir, isoladas usando um ensaio de placa hemolítica específico para Ang-1 ou Ang-2 (ver, por exemplo, Babcook et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)). Células alvejadas para lise são preferívelmente células hemácias de ovelhas (SRBCs), revestidas com o antígeno Ang-2. Na busca por um anticorpo também capaz de antagonizar a Angiopoietina-1, os métodos acima podem ser igualmente usados substituindo a Angiopoietina-2 com a Angiopoietina-1.

[00153] Na presença de uma cultura de células B contendo células plasmáticas secretando a imunoglobulina de interesse e complemento, a formação de uma placa indica lise mediada por Ang-1/Ang-2 específica das células hemácias de ovelha ao redor da célula plasmática de interesse. A célula plasmática antígeno-específico individual no centro da placa pode ser isolada e a informação genética que codifica a especificidade do anticorpo é isolada da célula plasmática individual. Usando a transcrição reversa seguido por PCR (PCR-RT), o DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo pode ser clonado. Tal DNA clonado pode, dessa forma, ser ainda inserido num vetor de expressão adequado, preferívelmente vetor cassete tal como DNApc, mais preferívelmente tal vetor DNApc contendo os domínios constantes da cadeia pesada e leve de imunoglobulina. O vetor gerado pode, dessa forma, ser transfectado em células hospedeiras, por exemplo, células HEK293, células CHO e cultivado em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para induzir transcrição, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

[00154] Em geral, anticorpos produzidos pelos hibridomas fundidos foram cadeias pesadas de IgG2 humanas com cadeias leves lambda ou capa completamente humanas. Anticorpos descritos aqui possuem cadeias pesadas IgG4 humanas, assim como cadeias pesadas IgG2. Anticorpos podem também ser de outros isotipos humanos, incluindo IgGl. Os anticorpos possuíam altas afinidades, tipicamente possuindo um Kd de cerca de 10-6 até 10-2 M ou inferior, quando medido por técnicas de fases sólida e de fase de solução. Anticorpos possuindo um KD de pelo menos 10-11 M são preferidos para inibir a atividade da Ang-1 e/ou da Ang-2.

[00155] Conforme será percebido, anticorpos podem ser expressos em em linhagens celulares diferentes das linhagens celulares de hibridoma. Sequências que codificam anticorpos particulares podem ser usadas para transformar uma célula hospedeira de mamífero adequada. A transformação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, empacotamento do polinucleotídeo num vírus (ou num vetor viral) e a transdução de uma célula hospedeira com vírus (ou vetor) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, conforme exemplificado pelas Patentes Americanas Nos 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455 (cujas patentes são por meio disso incorporadas por referência). O procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Métodos para introduzir polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção precipitação de fosfato de cálcio, mediada por dextrana, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) nos lipossomas e microinjeção direta do DNA no núcleo.

[00156] Linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiras para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de células imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo mas sem se limitar as células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de hamster jovem (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humana (por exemplo, Hep G2), células de rim epitelial humano 293 e uma variedade de outras linhagens celulares. Linhagens celulares de preferência particular são selecionadas através da determinação na qual linhagens celulares tem altos níveis de expressão e produzem anticorpos com propriedades de ligação de Ang-2 constitutivas.

[00157] Baseando-se na capacidade dos mAbs de neutralizar significativamente a atividade da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2 (conforme demonstrado nos Exemplos abaixo), esses anticorpos terão os efeitos terapêuticos no tratamento de sintomas e condições resultantes da expressão da Angiopoietina-1 e/ou da Angiopoietina-2. Em modalidades específicas, os anticorpos em todos aqui se referem ao tratamento de sintomas resultantes da angiogênese induzida pela Angiopoietina-1 e/ou pela Angiopoietina-2.

[00158] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-1 e da Angiopoietina-2 e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa modalidade o antagonista compreende um anticorpo. De acordo com outro aspecto da invenção, é fomecida uma composição farmacêutica compreendendo um antagonista da atividade biológica da Angiopoietina-2, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa modalidade, o antagonista compreende um anticorpo.

[00159] Anticorpos anti-Ang-2 são úteis na detecção da Ang-2 em amostras de pacientes e, concordantemente, são úteis como diagnósticos para estados de doença conforme aqui descrito. Além disso, baseando-se na sua capacidade de neutralizar significativamente a atividade da Ang-2 (conforme demonstrado nos Exemplos abaixo), anticorpos anti-Ang-2 tem efeitos terapêuticos no tratamento de sintomas e condições resultantes da expressão da Ang-2. Em modalidades específicas, os anticorpos e métodos aqui se referem ao tratamento dos sintomas resultantes da angiogênese induzida por Ang-2. Outras modalidades envolvem o uso dos anticorpos e métodos aqui descritos para tratar doenças relacionadas com angiogênese, incluindo doenças neoplásticas, tais coma melanoma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), tumor da tireóide, câncer gástrico (estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de colon e câncer pancreático.

Administração terapêutica e Formulações

[00160] Modalidades da invenção incluem formulações farmaceuticamente estéreis de anticorpos anti-Ang-2 ou anticorpos os quais se ligam tanto a Ang-1 quanta a Ang-2 que são úteis como tratamentos para doenças.Tais formulações poderiam inibir a ligação da Ang-2 ou Ang-1 e Ang-2 ao seu receptor Tie2 dessa forma tratando efetivamente condições patológicas onde, por exemplo, Ang-1 e/ou Ang-2 de soro ou tecido está normalmente elevado. Anticorpos anti-Ang-2 preferívelmente possuem afinidade adequada para neutralizar potêncialmente Ang-2, e preferívelmente tem uma duração adequada de ação para permitir a dosagem não-frequente em humanos. Anticorpos anti-Ang-1/Ang-2 preferívelmente possuem afinidade adequada para neutralizar potêncialmente Ang-1 e Ang-2, e preferívelmente tem uma duração de ação adequada para permitir a dosagem não-frequente em humanos. Uma duração de ação prolongada irá permitir cronogramas de dosagem menos frequentes e mais convenientes pela altemancia de vias parenterais, tais como injeção subcutânea ou intramuscular.

[00161] Formulações estéreis podem ser criadas, por exemplo, por infiltração através de membranas de filtração estéreis, antes de ou após a liofilização e reconstituição do anticorpo. O anticorpo será normalmente estocado na forma liofilizada ou em solução. Composições de anticorpo terapêuticas geralmente são colocadas num recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa um frasco de solução intravenosa com um adaptador que permite a recuperação da formulação, tal como uma tampa furável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00162] A via de administração de anticorpo está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, injeção ou infusão por vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intrarterial, intratecal, inalatória ou intralesional, ou por sistemas de liberação sustentada conforme notado abaixo. O anticorpo é preferívelmente administrado continuamente por infusão ou por injeção de bolo.

[00163] Uma quantidade eficaz de anticorpo a ser empregado terapeuticamente irá depender, por exemplo, dos objetivos terapêuticos, da via de administração e da condição do paciente. Concordantemente é preferível que o terapeuta titule a dosagem e modifique a via de administração conforme requerido para obter o efeito terapêutico ótimo. Tipicamente, o clínico irá administrar anticorpo até que uma dosagem seja alcançada que atinja o efeito desejado. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por ensaios convencionais ou pelos ensaios aqui descritos.

[00164] Anticorpos, conforme aqui descritos, podem ser preparados numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Essa composição terapêutica pode ser administrada intravenosamente ou através do nariz ou pulmão, preferívelmente como um líquido ou aerossol em pó (liofilizado). A composição também pode ser administrada parenteralmente ou subcutaneamente, conforme desejado. Quando administrada sistematicamente, a composição terapêutica deve ser estéril, livre de pirogênio e em solução parenteralmente aceitável tendo sido feita consideração para o pH, isotonicidade e estabilidade. Essas condições são conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Resumidamente, as formulações de dosagem dos compostos aqui descritos são preparadas para estocagem ou administração pela mistura do composto com o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis. Tais materiais são não-tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampo estais como Tris HCl, fosfato, citrato, acetato e outros sais de ácidos orgânicos; anti-oxidantes tais como ácido ascórbico; peptídeos de pelo molecular baixo (menos de cerca de dez resíduos) tais como poliarginina, proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais com a polivinilpirrolidinona; aminoácidos tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico ou arginina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo celulose ou seus derivados, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; alcoois de açúcar, tais coma manitol ou sorbitol; contra-ions, tais como tensoativos de sódio e/ ou não-iônicos tais como TWEEN, PLURONICS ou polietilenoglicol.

[00165] Composições estéreis para injeção podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional conforme descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)). Por exemplo, dissolução ou suspensão do composto ativo num veículo, tal como água ou óleo vegetal de ocorrência natural, tal como sésamo, amendoim ou óleo de semente de algodão ou um veículo graxo sintético como oleato de etila ou semelhante pode ser desejado. Tampões, conservantes, antioxidantes e semelhantes podem ser incorporados de acordo com a prática farmacêutica aceita.

[00166] Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietilmetacrilato), conforme descrito por Langer et al, J. Biomed Mater. Res., (1981) 15: 167-277 e Langer, Chem. Tech., (1982) 12: 98 105, ou álcool (poli)vinílico, poliactídeos (Patente Americana N° 3.773.919, EP 58.481), copolímeros do ácido Lglutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556), etileno-acetato de vinila não-degradável (Langer et al, acima), copolímeros do ácido lático-ácido glicólico degradáveis, tais como o LUPRON DepotTM (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico (EP 133.988).

[00167] Enquanto os polímeros, tais como tileno-acetato de vinila e ácido lático-ácido glicólico capacitam a liberação das moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando proteínas encapsuladas permanecem no corpo por um tempo maior, elas podem desnaturar ou se agregar como resultado de exposição a umidade à 37°C, resultando em perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para a estabilização de proteína, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto como sendo a formação de ligação S-S intermolecular através de permuta de bissulfeto, a estabilização pode ser alcançada pela modificação dos resíduos de sulfidrila, liofilização a partir de soluções ácidas, controle do conteúdo de umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específicas.

[00168] Composições de liberação sustentada também incluem preparações de cristais do anticorpo suspenso em formulações adequadas capazes de manter os cristais em suspensão. Essas preparações, quando injetadas subcutaneamente ou intraperitonealmente, podem produzir um efeito de liberação sustentada. Outras composições também incluem anticorpos lipossomicamente apanhados. Lipossomas contendo tais anticorpos são preparados por métodos conhecidos per se: Patente Americana N° DE 3.218.121; Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; 142.641; Pedido de Patente Japonesa 83 - 118008; Patentes Americanas Nos 4. 485. 045 e 4. 544. 545; e EP 102. 324.

[00169] A dosagem da formulação do anticorpo para um dado paciente será determinada pelo clínico atendente, levando-se em consideração vários fatores conhecidos por modificar a ação de drogas incluindo a severidade e tipo de doença, peso corporal, sexo, dieta, tempo e via de administração, outras medicações e outros fatores clínicos relevantes. Dosagens terapeuticamente eficazes podem ser determinadas por métodos in vitro ou por métodos in vivo.

[00170] Uma quantidade eficaz dos anticorpos, aqui descrita, como sendo empregada terapeuticamente irá depender, por exemplo, dos objetivos terapêuticos, da via de administração e da condição do paciente. Concordantemente é preferível para o terapeuta titular a dosagem e modificar a via de administração conforme requerido para obter o efeito terapêutico ótimo. Uma dose diária típica deve variar de cerca de 0,001 mg/Kg até 100 mg/Kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Tipicamente o clínico irá administrar o anticorpo terapêutico até que a dosagem seja alcançada e que atinja o efeito desejado. O progresso dessa terapia e facilmente monitorado por ensaios convencionais ou conforme aqui descrito.

[00171] Será percebido que a administração de entidades terapêuticas de acordo com as composições e métodos aqui será administrada com veículos, excipientes e outros agentes adequados que são incorporados em formulações para proporcionar transferência, distribuição, tolerância e semelhantes melhoradas. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, unglientos, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeo (catiônico ou aniônico) (tais como Lipofectin™), conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, emulsões carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semi-sólidos e misturas semi-sólidas contendo carbowax. Qualquer uma das misturas precedentes pode ser apropriada em tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, com a condição de que o ingrediente ativo na formulação não seja inativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Ver também Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol. 32 (2) :210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203 (1- 2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pha r m Sci .89(8):967-78(2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) e as citações nesse ponto para informação adicional relacionada com formulações, excipientes e veículos bem conhecidos para os químicos farmacêuticos.

Combinações

[00172] O tratamento anti-angiogênico aqui definido pode ser aplicado como uma terapia exclusiva ou pode envolver, além dos compostos da invenção, cirurgia convencional ou radioterapia ou quimioterapia. Tal quimioterapia pode incluir uma ou mais das seguintes categorias de agentes antitumorais: (i) agentes citostáticos tais como antiestrógenos (por exemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno e iodoxifeno), infrarreguladores do receptor de estrogênio (por exemplo fulvestrant) , antiandrogênios (por exemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida e acetato de ciproterona), antagonistas do LHRH ou agonistas do LHRH (por exemplo goserelina, leuprorelina e buserelina), progestógenos (por exemplo acetate de megestrol),inibidoresda aromatase (por exemplo como anastrazol, letrozol, vorazol e exemestano) e inibidores da 5* redutase, tal como finasteride; (ii) agentes os quais inibem a invasão de células cancerígenas (por exemplo, inibidores da metaloproteinase como marimastat e inibidores da função do receptor do ativador de plasminogenio uroquinase); (iii) inibidores da função do fator de crescimento, por exemplo tais inibidores incluem anticorpos do fator de crescimento, anticorpos do receptor do fator de crescimento (por exemplo o anticorpo anti erbb2 trastuzumab [Herceptin™] e o anticorpo anti erbb1 cetuximab [C225]), inibidores da farnesil transferase, inibidores da tirosina quinase e inibidores da serina/treonina quinase, por exemplo inibidores da família de fatores de crescimento epidérmico (por exemplo inibidores da família EGFR da tirosina quinase, tais como N-(3-cloro-4-fluorfenil)-7-metóxi-6- (3-morfolinopropóxi) guinazolin-4-amina (gefitinib, AZD1839), N-(3-eti-nilfenil)-6,7-bis (2- metoxietóxi)quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI774) e 6-acrilamido-N-( 3 - cloro-4-fluorfenil)-7(3-morfo linopropóxi) quinazolin-4-amina (CI 1033)), por exemplo inibidores da família de fator de crescimento derivado plaquetário e, por exemplo, inibidores da família de fator de crescimento de hepatócito; (iv) agentes antiangiogênicos, tais como aqueles os quais inibem os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (por exemplo, o anticorpo anti-fator de crescimento celular endotelial vascular bevacizumab [Avastin™], anticorpos anti-receptor do fator de crescimento endotelial anti- vascular, tais como anticorpos anti-KDR e anticorpos anti-flt1, compostos tais como aqueles revelados nos Pedidos de Patentes Intemacionais Nos WO 97 /22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO00/47212 e WO 01/32651) e compostos que atuam por outros mecanismos (por exemplo linomida, inibidores da função da integrina avb3 e angiostatina). (v) agentes de dano vascular, tais como Combretastatina A4 e compostos revelados nos Pedidos de Patentes Internacionais WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 e WO 02/08213; (vi) terapias anti-sentido, por exemplo aquelas as quais são direcionadas para os alvos listados acima, tais como ISIS 2503 e anti-sentido anti-ras; (vii) tentativas de terapia de gene, incluindo, por exemplo, tentativas de substituir genes aberrantes tais como p53 aberrante ou BRCA1 ou BRCA2 aberrante, tentativas GDEPT (terapia de promedicamento de enzima direcionada a gene), tais como aquelas usando citosina desaminase, timidina quinase ou uma enzima da nitrorredutase bacteriana e tentativas de aumentar a tolerância do paciente a quimioterapia ou radioterapia, tais como terapia de gene de resistência a múltiplas drogas; e (viii) tentativas de imunoterapia, incluindo por exemplo tentativas ex vivo e in vivo de aumentar a imunogenicidade de células tumorais do paciente, tais como transfecção com citocinas tais como interleucina 2, interleucina 4 ou fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, tentativas de diminuir a anergia da célula T, tentativas usando células imunes transfectadas, tais como células dendríticas transfectadas de citocina, tentativas usando linhagens de células tumorais transfectadas de citocina e tentativas usando anticorpos idiotípicos.

[00173] Numa modalidade da invenção os tratamentos antiangiogênicos da invenção são combinados com agentes os quais inibem os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), (por exemplo o anticorpo anti-fator de crescimento celular endotelial vascular bevacizumab (Avastin®), os anticorpos anti-receptor do fator de crescimento endotelial anti-vascular, tais como os anticorpos anti-KDR e anticorpos anti-flt1, compostos tais como aqueles revelados nos Pedidos de Patente Internacional WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO00/47212 e WO 01/32651) e compostos que funcionam por outros mecanismos (por exemplo linomida, inibidores da função de integrina avb3 e angiostatina); em outra modalidade da invenção os tratamentos anti-angiogênicos da invenção são agentes combinados os quais inibem a atividade da tirosina quinase do receptor do fator de crescimento endotelial vascular, KDR (por exemplo AZD2171 ou AZD6474). Detalhes adicionais no AZD2171 podem ser encontrados em Wedge et al (2005) Cancer Research. 65 (10): 4389- 400. Detalhes adicionais no AZD6474 podem ser encontrados em Ryan & Wedge (2005) British Joumal of Câncer. 92 Suppl l:S6-13. Ambas as publicações são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades. Em outra modalidade da invenção os anticorpos completamente humanos 3.19.3, 3.3.2 ou 5.88.3 são combinados sozinhos ou em combinação com Avastin, AZD2171 ou AZD6474.

[00174] Tal tratamento conjunto pode ser alcançado através da dosagem simultânea, sequencial ou separada dos componentes individuais do tratamento. Tais produtos de combinação empregam os compostos dessa invenção, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, na faixa de dosagem descrita anteriormente e o outro agente farmaceuticamente ativo na sua faixa de dosagem aprovada.

EXEMPLOS

[00175] Os seguintes exemplos, incluindo os experimentos conduzidos e os resultados alcançados são fornecidos para propósitos ilustrativos somente e não são para serem construídos como limitantes nos ensinamentos aqui contidos.

EXEMPLO 1 IMUNIZAÇÃO.E TITULAÇÃO Imunização

[00176] Ang-2 recombinante humana obtida da R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN Cat. N° 623-AM/CF) foi usada como um antígeno. Anticorpos monoclonais contra Ang-2 foram desenvolvidos pela imunização sequencial de camundongos XenoMouse® (raça de Xeno Mouse XMG2 e XMG4 (raça 3C-l), Abgenix, Inc. Fremont, CA). Animais XenoMouse foram imunizados através do coxim do pé para todas as injeções. O volume total de cada injeção foi de 50 μL por camundongo, 25 μL pelo coxim do pé. A primeira injeção foi com 2,35 μg de Ang-2 recombinante humana (rhAng-2, cat#623-AM/CF; lote #BN023202A) em PBS da Dulbecco livre de pirogênio (DPBS) e mistura com 1:1 v/v com 10 μg de CpG (15 μL de Adjuvante de Camundongo ImmunEasy, catálogo # 303101; lote #11553042; Qiagen) por camundongo. Os próximos 6 impulsos foram com 2,35μg de rhANG-2 em DPBS livre de pirogênio, misturados com 25 μg de Adju-Phos (gel de fosfato de alumínio, catálogo #1452-250, lote #8937, HCI Biosector) e 10 μg de CpG por camundongo, seguido por um impulso final de 2,35 μg de rhAng-2 em DPBS livre de pirogênio, sem adjuvante. Os camundongos XenoMouse foram imunizados nos dias 0, 3, 6, 10, 13,17,20 e 24 para esse protocolo e as fusões foram efetuadas no dia 29.

Seleção de animais para coleta por título

[00177] Títulos de anticorpo anti-Ang-2 no soro a partir de camundongos XenoMouse imunizados foram determinados por ELISA. Resumidamente, Ang-2 recombinante (1 μg/mL) foi revestido em placa de 96 poços de poliestireno de ligação universal Costar Labcoat (Coming, Acton, MA) de um dia para o outro em quatro graus em tampão de revestimento de antígeno (tampão carbonato 0,1 M, NaHCO3 pH 9,6, 8m4 g/L. No próximo dia, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (Tween 20 0, 05% em 1 x PBS) usando um lavador de placas Biotek. As placas foram, a seguir, bloqueadas com 200 μL/poço de tampão de bloqueio (BSA 0, 5%, Tween 20 0,1%, Timerosal em 1 x PBS) e incubadas em temperatura ambiente por 1 h. Depois de 1 hora de bloqueio, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem usando um lavador de placas Biotek. Soro ou de camundongos XenoMouse imunizados com Ang-2 ou animais XenoMouse cândidos foram titulados em tampão BSA/PBS, 5% em diluições 1:3 em duplicata a partir de uma diluição inicial de 1:100. 0 último poço foi deixado em branco. Essas placas foram incubadas em temperatura ambiente por 2 h, e as placas foram a seguir lavadas 3 vezes com um tampão de lavagem usando um lavador de placas Biotek. Um anticorpo conjugado de peroxidase de rabano silvestre Fc-específica de IgG de cabra anti-humana (HRP, Pierce, Rockford, IL) foi adicionado na concentração final de l μg/mL e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. A seguir as placas foram lavadas 2 vezes com tampão de lavagem usando um lavador de placas Biotek.

[00178] Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas com a adição de substrato cromogênico TMB (BioFx BSTP-0100-01) por 10-20 min ou até os poços de controle negativo começassem apresentar coloração. A seguir o ELISA foi interrompido pela adição de Solução de Parada (reagente de Parada 650 nM para o TMB (BioFx BSTP-0100-01), reconstituído com 100 mL de H20 por garrafa. O título específico de cada animal XenoMouse foi determinado a partir da densidade ótica a 650 nM e e mostrado nas Tabelas 2 e 3 abaixo. O valor do título é o recíproco da maior diluição de soro com uma leitura de OD duas vezes daquela do fundo. Dessa forma, quanta maior o número, maior foi a resposta imune humoral a Ang-2. Tabela 2 Grupo 1: 10 camundongos (raça XMG2)

* NC = raça xmg2, ova gp2, fp PC = cabra AB, anti-huAng-2 (R&D Systems, N° de catálogo AF623) 1 mg/ml Tabela 3 Grupo 2: 10 camundongos (raça XMG4)

* NC = 3c-l N128-3 *PC= cabra AB, anti-huAng-2 (R&D Systems, N° de catálogo AF623) 1 mg/ml

EXEMPLO 2 RECUPERAÇÃO DE LINFÓCITOS, ISOLAMENTOS DE CÉLULAS-B, FUSÕES E GERAÇÃO DE HIBRIDOMAS

[00179] Camundongos imunizados foram sacrificados por deslocamento da cervical, e os nodos da linfa drenada foram coletados e reunidos de cada grupo. As células linfóides foram dissociadas pela moagem em DMEM para liberar as células dos tecidos e as células foram suspensas em DMEM. As células foram contadas, e 0,9 mL de DMEM por 100 milhões de linfócitos foi adicionado ao pelete celular para ressuspender as células cuidadosamente, porém completamente. Usando 100 μL de contas magnéticas CD90+ por 100 milhões de células, as células foram marcadas pela incubação das células com as contas magnéticas a 4°C por 15 minutos. A suspensão celular magneticamente marcada contendo até 108 células positivas (ou até 2 x 109 de células totais) foi carregada numa coluna LS+ e a coluna foi lavada com DMEM. O efluente total foi coletado como a fração CD90- negativa (foi esperado que a maioria dessas células fossem células B).

[00180] A fusão foi efetuada pela mistura de células B enriquecidas lavadas de cima e células P3X63Ag8.653 de mieloma não-secretórias compradas da ATCC, cat.#CRL1580 (Keamey et al, J. Immuno l. 123, 1979, 1548-1550) numa proporção de 1:1. A mistura celular foi gentilmente peletizada por centrifugação a 800 x g. Depois da remoção completa do sobrenadante, as células foram tratadas com 2-4 mL de solução de Pronase (CalBiochem, cat. # 53702; 0.5 mg/ml em PBS) por não mais do que 2 minutos. A seguir, 3-5 mL de FBS foi adicionado para parar a atividade enzimática e a suspensão foi ajustada para o volume total de 40 mL usando solução de fusão celular elétrica (ECFS, sacarose 0,3 M, Sigma, Cat# S7903, acetato de magnésio 0,1 mM, Sigma, Cat# M2545 , acetato de cálcio 0,1 mM, Sigma, Cat# C4705). O sobrenadante foi removido depois da centrifugação e as células foram ressuspensas em ECFS 40 mL. Esse passo de lavagem foi repetido e as células novamente foram ressuspensas em ECFS até uma concentração de 2 x 106 células/mL.

[00181] A eletrofusão de células foi efetuada usando um gerador de fusão (modeloECM2001, Genetronic, Inc., São Diego, CA). O tamanho da camara de fusão usada foi de 2,0 mL, usando os seguintes ajustes instrumentais: Condição de alinhamento:voltagem:50 v, tempo:50 seg. Membrana quebrando em: voltagem:3000 V, tempo:30 μseg Tempo de espera pós-fusão: 3 seg.

[00182] Depois do ECF, as suspensões celulares foram cuidadosamente removidas a partir da câmara de fusão sob condições estéreis e transferidas num tubo estéril contendo o mesmo volume de Meio de Cultura de Hibridoma (DMEM, JRH Biosciences), FBS 15% (Hyclone), suplementado com L-glutamina, pen/strep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos da Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). As células foram incubadas por 15-30 minutos a 37°C, e a seguir centrifugadas a 400xg (1000 rpm) por cinco minutos. As células foram gentilmente ressuspensas num pequeno volume de Meio de Seleção de Hibridoma (Meio de Cultura de Hibridoma suplementado com 0,5x HA (Sigma,cat. # A9666), e o volume foi ajustado apropriadamente com mais Meio de Seleção de Hibridoma, baseando-se no plaqueamento final de 5 x 106 células B totais por placa de 96 poços e 200 μL por poço. As células foram misturadas gentilmente e pipetadas em placas de 96 poços e deixadas crescer. No dia 7 a 10, metade do meio foi removido, e as células foram realimentadas com Meio de Seleção de Hibridoma.

EXEMPLO 3 SELEÇÃO DE ANTICORPOS CANDIDATAS POR ELISA

[00183] Depois de 14 dias de cultivo, os sobrenadantes do hibridoma foram testados para anticorpos monoclonais Ang-2 específicos. As placas de ELISA (Fisher, Cat. N° 12-565-136) foram revestidas com 50 μL/poço de Ang-2 humana (2 μg/mL em Tampão de Revestimento (Tampão Carbonato 0,1 M, pH 9,6, NaHC03 8,4 g /L) ,a seguir incubadas a 4°C de um dia para o outro. Depois da incubação, as placas foram lavadas com Tampão de Lavagem (Tween200, 05% em PBS) 3 vezes. 200 μL/poço de tampão de bloqueio (BSA 0,5%, Tween20 0,1%, Timerosal 0,01% em PBS lx) foram adicionados e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 1 hora. Depois da incubação, as placas foram lavadas com Tampão de Lavagem três vezes. 50 μL/poço de sobrenadantes de hibridoma, e controles positivos e negativos foram adicionados e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 2 horas. O controle positivo usado do começo ao fim foi soro do camundongo XenoMouse imunizado com Ang-2, Grupo 1 Ang-2 XMG2, coxim do pé (fp) N160-7, e o controle negativo foi soro do camundongo XenoMouse KLH-imunizado, Grupo 1 XMG2 KLH, coxim do pé (fp) L627- 6.

[00184] Depois da incubação, as placas foram lavadas três vezes com Tampão de Lavagem. 100 μL/poço de anticorpo de detecção de cabra anti- huIgGFc-HRP (Caltag, N° Cat H10507), foram adicionados e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 1 hora. Na triagem secundária, os positivos na primeira triagem foram testados em dois grupos, um para a detecção de hIgG e o outro para a detecção de cadeia leve capa de Ig humana (HRP-capa anti-hIg de cabra (Southern Biotechnology, N° CAT 2 060-05) para demonstrar a composição completamente humana tanto para o IgG quanto para o capa de Ig. Depois da incubação as placas foram lavadas três vezes com Tampão de Lavagem. 100 μL/poco de TMB (BioFX Lab. Cat. N° TMSK-0100-01) foram adicionados e as placas foram deixadas desenvolver por cerca de 10 minutos (até que os poços de controle negativo mal começassem a apresentar cor). 50 μL/poço de solução de parada (Solução de Parada TMB, (BioFX Lab. N° Cat. STPR-0100-01) foram então adicionados e as placas lidas num leitor de placa de ELISA a 450 nm. Houve 185 anticorpos capa IgG completamente humanos contra Ang-2.

[00185] Todos os anticorpos que se ligaram no ensaio de ELISA foram testados para a contagem para ligação a Ang-1 por ELISA para excluir aqueles que reagiram cruzadamente com a Ang-1. As placas de ELISA (Fisher, N° CAT 12-565-136) foram revestidos com 50 μL/poco de Ang-1 recombinante (2 μg/mL, obtidos da R&D Systems, Cat. # 293-NA-025/CF) em Tampão de Revestimento (Tampão Carbonato 0,1 M, pH 9,6 NaHCO3 8,4 g/L), a seguir incubadas a 4°C de um dia para o outro. Sob as condições experimentais aqui descritas, quando a molécula Ang-1 recombinante foi imobilizada na placa de ELISA, nenhum anticorpo foi encontrado se ligando a Ang-1. Entretanto, a varredura de contagem aqui descrita tem limitações técnicas. Primeiramente, os anticorpos derivam de materiais de linhagem, mas não de um hibridoma clonado. Sinais de ligação de um clone particular, o qual somente considera uma porcentagem menor da linhagem, podem cair abaixo do limiar de sensibilidade de detecção. Segundo certos epítopos no antígeno podem se ocultar dos anticorpos nesse experimento devido as pequenas alterações conformacionais induzidas pela imobilização do antígeno. Por todas essas razões, a reatividade cruzada de cada anticorpo a Ang-1 foi adicionalmente examinada usando anticorpos clonados e o sistema BiaCore (ver Exemplo 8). Conforme descrito no Exemplo 8, um clone (mAB 3.19.3) foi de fato descoberto como tendo uma forte reatividade cruzada em relação a Ang-1 recombinante humana (Exemplos 8, 9 e 12).

EXEMPLO 4 INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DA ANG-2 AO TIE2

[00186] Conforme discutido acima, Ang-2 exerce seu efeito biológico pela ligação ao receptor Tie2. Anticorpos monoclonais que inibiram a ligação Ang-2/Tie2 foram identificados por um ensaio de ligação competitiva usando um ELISA modificado. Os mAbs usados foram produtos da micropurificação de 50 mL de sobrenadantes exaustivos das reuniões de hibridoma que foram específicos para Ang-2 (ver Exemplo 3). Nunc Implates™ de 96 poços foram revestidos com 100 μL de proteína de fusão Tie2/Fc humana recombinante (R&D Systems, Inc., N° CAT 313-TI-100) em 4 μg/mL pela incubação de um dia para o outro a 4°C. As placas foram lavadas quatro vezes usando Salina Tamponada com Fosfato (PBS) com uma estação lavadora Skan™ Washer 300 (SKATRON). Os poços foram bloqueados por 100 μL de tampão de bloqueio ABX (BSA 0,5%, Tween 0,1%, Timerosal 0,01% em PBS) por 1 hora.

[00187] Ang-2 humana recombinante biotinilada (R&D Systems, Inc. N° CAT BT623) e 100 ng/mL foi adicionada em cada poço com ou sem o mAbs anti-Ang-2 a 100 μg/mL. As placas foram incubadas em temperatura ambiente por duas horas antes de as moléculas não ligadas serem removidas por lavagem. Ang-2 biotinilada ligada foram, a seguir, detectadas usando 100 μL/poço de conjugado estreptavidina-HRP a 1:200 pela incubação a temperatura ambiente por meia hora. Depois de lavar duas vezes, a estreptavidina ligada foi detectada pelo substrato HRP (R&D Systems, Cat. N° DY998). As placas foram incubadas por 30 minutos antes de solução de parada 450 (100 μL/poço, BioFX, Cat# BSTP-0100-01) ser adicionado para terminar a reação. A absorvância de luz a 450 nm foi determinada por um leitor Spectramax Plus.

[00188] A proteína de fusão Tie2/Fc recombinante solúvel em excesso molar de 10 vezes em relação a Ang-2 foi usada como um controle positivo. Nessa concentração, Tie2/Fc inibiu a ligação da Ang-2 ao Tie2 imobilizado por 80%. Com esse como um critério arbitrário, 74 de 175 Ang-2 que se ligam aos mAbs apresentaram atividade inibitória. Para conveniência de operação, os 27 maiores neutralizadores foram selecionados para subsequente clonagem de hibridoma.

[00189] Cada hibridoma foi clonado usando um método de diluição limitado pelos seguintes procedimentos padronizados. Três clones irmãos foram coletados de cada hibridoma. Para cada clone, o sobrenadante foi testado usando ligação a Ang-2 humana e a contagem de ligação Ang-1, conforme descrito acima, para assegurar que cada anticorpo foi somente específico para a Ang-2. As concentrações de IgG nos sobrenadantes exaustivos foram determinadas, e um clone com o rendimento mais alto dentre os três clones irmãos de cada hibridoma foi selecionado para a purificação de IgG. 0,5 a 1 mg de IgG foi purificado de cada sobrenadante para caracterização adicional.

[00190] Para quantificar as atividades inibitórias dos mAbs na ligaçãoda Ang-2 ao Tie2, o título foi determinado para mAbs purificados dos 27 candidatos principais usando um ensaio de ligação competitiva. Cada concentraçãodo mAb foi testada em duplicata. A relação concentração- resposta foi encontrada pelo ajuste de curva usando o programa de computador gráfico Graphpad Prism (não-linear, curva sigmoidal). A inibição máxima (eficácia) e a IC50 (potência) foram calculadas pelo programa de computador. Dez anticorpos monoclonais que exibiram tanto alta eficácia quanto potência relativa foram selecionados para investigação adicional. A eficácia e potência desses 10 mAbs estão listadas na Tabela 4. Tabela 4 Eficácia e potência dos 10 mAbs principais

*Eficácia é expressa como a proporção de Ang-2 ligada com mAbs (30 μg/mL) contra sem mAbs.

EXEMPLO 5 ARMAZENAGEM DE ANTICORPOS

[00191] O armazenamento de epítopos foi efetuado para determinar quais dos anticorpos anti-Ang-2 poderiam competir de maneira cruzada um com o outro, e dessa forma foram propensos a se ligar ao mesmo epítopo na Ang-2. O processo de armazenagem e descrito no Pedido de Patente Americana N° 20030175760, também descrito em Jia et al., J. Immunol. Methods, (2004) 288:91-98, ambos os quais são incorporados por referência na sua totalidade. Resumidamente, contas Luminex foram acopladas com anti-huIgG de camundongo (Pharmingen# 555784) após o protocolo de acoplamento de proteína fornecido no sítio da rede da Luminex. Contas preacopladas foram preparadas para o acoplamento com anticorpo desconhecido primário usando o seguinte procedimento, protegendo as contas da luz. Tubos individuais foram usados para cada sobrenadante desconhecido. O volume de sobrenadante necessário foi calculado usando a seguinte fórmula: (nX2+10) x 50 μl (onde n = número total de amostras). Uma concentração de 0,1 μg/mL foi usada nesse ensaio. O estoque de contas foi gentilmente submetido ao vortex e diluído no sobrenadante até uma concentração de 2500 de cada conta em 50 μL por poço ou 0,5 x 105 contas/mL.

[00192] As amostras foram incubadas num agitador no escuro em temperatura ambiente de um dia para o outro.

[00193] A placa do filtro foi pré-umedecida pela adição de 200μL de tampão de lavagem por poço, a qual foi a seguir aspirada. 50μL de cada conta foram adicionados a cada poço da placa de filtro. As amostras foram lavadas uma vez pela adição de 100μL de tampão de lavagem por poço e pela aspiração. Antígeno e controles foram adicionados a placa de filtro em 50 μL/poço. A placa foi coberta, incubada no escuro por 1 hora num agitador e as amostras foram lavadas 3 vezes. Um segundo anticorpo desconhecido foi, a seguir, adicionado a 50 μL/poço. Uma concentração de 0,1 μg/mL foi usada para o anticorpo primário. A placa foi, a seguir, incubada no escuro por 2 horas em temperatura ambiente num agitador, e a seguir as amostras foram lavadas 3 vezes. 50μL/poço de IgG antihumana de camundongo biotinilada (Pharmingen #555785) diluído a 1:500 foi adicionado, e as amostras foram incubadas no escuro por 1 hora com agitação em temperatura ambiente.

[00194] As amostras foram lavadas 3 vezes. 50 μL/poço de estreptavidina-PE numa diluição de 1:1000 foi adicionado, e as amostras foram incubadas no escuro por 15 minutos com agitação em temperatura ambiente. Depois de correr dois ciclos de lavagem no Luminex 100, as amostras foram lavadas 3 vezes. Os conteúdos em cada poço foram ressuspensos em 80 μL de tampão de bloqueio. As amostras foram cuidadosamente misturadas por pipetagem várias vezes para ressuspender as contas. As amostras foram, a seguir, analisadas no Luminex. Os resultados estão apresentados abaixo na Tabela 5. Tabela 5 Armazenagem para os 24 principais dos anticorpos Ang-2 positivos no ensaio funcional

*/Nota: mAb 5.56 teve um padrão de ligação semelhante que aquele do 3.38 e 5.103 com diferenças menores e um sinal muito mais baixo.

EXEMPLO 6 DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DO ANTICORPO ANTI-ANG-2 USANDO ANÁLISE BIACORE Varredura de baixa resolução de 27 anticorpos monoclonais purificados

[00195] A ressonância de plasmônio de superfície sem marcador (SER), ou Biacore, foi utilizada para medir a afinidade de anticorpo para o antígeno. Para esse propósito, uma superfície de anticorpo anti-humano de cabra de alta densidade sobre uma pastilha CMS Biacore foi preparada usando amino acoplamento de rotina. Todos os mBas purificados foram diluídos para aproximadamente 8 μg/mL em HBS-P correndo tampão contendo 100 μg/mL de BSA e 10 mg/mL de carboximetildextrana. Cada mAb foi capturado numa superfície separada usando um tempo de contato de 42 segundos, e uma lavagem de 5 minutos para estabilização da linha de base do mAb.

[00196] Ang-2 foi injetada a 90,9 nM sobre todas as superfícies por um minuto, seguido por uma dissociação de 10 minutos. Foi preparado dado de ligação de referência duplicada pela subtração do sinal de uma célula de fluxo de controle e subtraindo o desvio da linha de base de um tampão injetado exatamente antes da injeção de Ang-2. Dados de ligação de Ang-2 para cada mAb foram normalizados para a quantidade de mAb capturado em cada superfície, e as respostas com desvio corrigido, normalizadas para os 27 mAbhs foram determinadas. Dados foram ajustados globalmente a um modelo de interação 1:1 para determinar as cinéticas de ligação. Os resultados da análise de cinética da ligação da Ang-2 a 25°C estão listados na tabela abaixo. Os mAbs estão classificados da mais alta para a mais baixa afinidade. Tabela 6 Varredura Biacore debaixa resolução para Ang-2 dos 27 anticorpos monoclonais purificados

[00197] Os asteriscos próximos dos resultados de kd para todos os mAbs, exceto para os mAbs 5.101 e 5.86, indicam que esses kds foram mantidos constantes como a melhor estimativa para a ordem de magnitude característica de dados de taxa de desassociação lenta. O modelo de ajuste para essas amostras não detectou alteração mensurável na taxa de desassociação sobre o tempo de dissociação relativamente curto e, dessa forma, requereu que o kd fosse constante para se ajustar aos dados de taxa de associação. Os dados daqueles kds indicados também se ajustaram bem num estímulo como kd na ordem de 10-6 s-1, consequentemente as interações podem ser 10 vezes ou mais fortes do que a reportada acima.

[00198] O dado de dissociação é normalmente medido 4-6 horas para experimentos cinéticos de alta resolução com mAbs com afinidades sub-100 pM. O tempo de dissociação máximo que pode ser medido em artefatos de desvio de uma superfície mAb capturada e de 20 minutos. Aproximadamente o decréscimo de sinal negligível é medido sobre um tempo relativamente curto com mAbs de alta afinidade de forma que o kd estimado possa variar tanto quanto por duas ordens de magnitude.

EXEMPLO.7 DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DO ANTICORPO ANTI-ANG-2 USANDO ANÁLISE BIACORE Varredura do meio Ang-2/ Alta resolução com três anticorpos monoclonais purificados

[00199] mAbs purificados 5.16, 5.35 e 5.41 foram diluídos para aproximadamente 8 μg/mL em acetato de sódio 10 mM, pH 5,0. Cada mAB diluído foi, a seguir, imobilizado numa superfície celular de fluxo diferente (pastilha Biacore CMS) usando amino acoplamento de rotina.

[00200] Para a aquisição de dados de taxa de associação, oito concentrações (diluições de 2 vezes) variando de 90.9-0,71 nM de Ang-2 foram aleatoriamente injetadas por 90 segundos em triplicata com várias injeções de tampão intercaladas para referenciamento duplo, seguido por uma dissociação de quatro minutos. As superfícies do anticorpo foram regeneradas com dois pulsos de 9 segundos de glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 depois de cada ciclo de injeção.

[00201] Para a aquisição de dados de taxa de desassociação, três amostras de Ang-2 90.9 nM em tampão de corrida HBS-P contendo 100 μg/mL de BSA foram injetadas conforme descrito acima e os dados de dissociação foram registrados durante oito horas. As injeções de amostra alternaram com três ciclos de injeção de branco. A regeneração foi efetuada conforme descrito acima.

[00202] Os dados foram globalmente ajustados para um modelo de interação 1:1 com transporte de massa usando CLAMP (David G. Myszka e Thomas Morton (1998) "CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program," TIBS 23, 149-150). As constantes de ligação resultantes estão mostradas na Tabela 7 abaixo. Tabela 7 Resolução do meio Ang-2 da varredura Biacore de 3 anticorpos monoclonais purificados

[00203] O descimento de sinal significativo foi medido durante o tempo de dissociação de 8 horas. Como dado de dissociação de oito horas, CLAMP foi capaz de estimar de maneira mais sensata o kd para cada mAb. Aqui os kds tanto para 5.16 quanto para 5.35 estão na faixa de 10-6 s-1.

[00204] A reatividade cruzada de anticorpos para a Ang-1 foi, a seguir, investigada pela medição da afinidade dos mAbs para a Ang-1, conforme descrito abaixo no Exemplo 8.

EXEMPLO 8 DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE ANTICORPO ANTI-ANG-1 USANDO ANÁLISE BIACORE

[00205] A reatividade cruzadados anticorpos para a Ang-1 foi ainda investigada pela medição da afinidade dos mAbs em relação a Ang-1. Ao invés de imobilizar a Ang-1, conforme descrito na counter-binding baseada em ELISA (Exemplo 3). mAbs de Ang-2 foram imobilizados para as pastilhas biacore CMS, e Ang-1 em solução foi injetada para a determinação da taxa de associação e da taxa de desassociação. Seis mAbs, incluindo 3.3.2, 3.31.2, 5.16.3, 5.86.1, 5.88.3 e 3.19.3 foram testados nesse experimento conforme descrito abaixo para determinar o quão fortemente eles reagem de forma cruzada com Ang-1.

Varredura de resolução de meio de seis anticorpos monoclonais purificados

[00206] Ressonância de plasmônio de superfície sem marcador (SPR), ou uma instrumentação Biacore 2000, foi utilizada para medir a afinidade de anticorpo para a Ang-1. Para esse propósito, uma superfície de anticorpo α- humano de cabra de alta densidade sobre uma pastilha de Biacore CMS foi preparada usando o amino acoplamento de rotina. Para experimentos de desenvolvimento, mAbs purificados (clones 3.19.3, 3.3.2, 5.88.3, 5.86.1, 3.31.2, 5.16.3) foram diluídos até aproximadamente 2, 5-3, 5 μg/mL em tampão de corrida HBS-P contendo 100 μg/mL de BSA. O nível de captura para cada mAb foi de aproximadamente 150 RU. Uma lavagem de 5 minutos seguiu cada ciclo de captura para estabilizar a linha base do mAb.

[00207] Uma amostra individual de Ang-1 diluída para 87,4 nM no tampão de corrida foi injetada por um minuto sobre todas as superfícies de captura. Nenhuma ligação foi evidente para cinco mAbs, embora descobriu- se que a Ang-1 se liga ao mAb3.19.3. Esse experimento foi repetido pelo aumento dos níveis de captura mAb ao poço acima de 500-600 RU e injetando Ang-1 380 nM por um minuto. Descobriu-se novamente que o mAb 3.19.3 se liga a Ang-1.

[00208] Devido ao fato da Ang-1 somente ter mostrado atividade de ligação para o mAb 3.19.3, a afinidade desse mAb tanto para a Ang-1 quanto para a Ang-2 foi determinada. Uma vez que a Ang-1 apresentou uma lenta taxa de desassociação durante os experimentos de desenvolvimento acima, um experimento de captura de resolução média poderia não ter registrado dados de taxa de desassociação suficientes para estimar com precisão o kd. Como resultado, a ligação da Ang-1 e da Ang-2 ao mAb 3.19.3 foi medida sob condições Biacore de alta resolução.

EXEMPLO 9 DETERMINA AO DA AFINIDADE DO MAB 3.19.3 PARA A ANG-1 EA ANG-2 USANDO ANÁLISE BIACORE DE ALTA RESOLUÇÃO

[00209] mAb 3.19.3 purificado foi diluído para 12,5 μg/mL em acetato de sódio 10 mM, pH 4,0. O mAb foi, a seguir, imobilizado em células de fluxo 1-3 (pastilha Biacore CMS) usando amino acoplamento de rotina, deixando a célula de fluxo 4 como a célula de fluxo de referência.

[00210] Para a aquisição de dados de taxa de associação, oito concentrações (diluições de 2 vezes) variando de 39,8 - 0,31nM de Ang-1 (em tampão de corrida HBS-P contendo 100 μg/mL de BSA) foram aleatoriamente injetadas por 90 segundos (100μL/min, taxa de fluxo) em triplicata com várias injeções de tampão interespaçadas para referenciamento duplo, seguido por uma dissociação de quatro minutos. As superfícies do anticorpo foram regeneradas com um pulso de 6 segundos de NaOH 10 mM depois de cada ciclo de injeção.

[00211] Para a aquisição de dados de taxa de desassociação, três amostras de Ang-1 19,9 nM foram injetadas conforme descrito acima e os dados de dissociação foram registrados por mais de seis horas. As injeções de amostra alternaram em três ciclos de injeções de branco. A regeneração foi efetuada conforme descrito acima.

[00212] Os dados foram globalmente ajustados para um modelo de interação 1:1 com um termo para o transporte de massa incluído usando CLAMP (David G. Myszka e Thomas Morton (1998) "CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program," TIBS 23, 14 9- 1 50 ).

Estudo de Biacore de Alta Resolução de ANG-2 com MAb 3.19.3 purificado

[00213] mAb 3.19.3 purificado foi diluído para 12,5 μg/mL em acetato de sódio 10 mM, pH 4, 0. 0 mAb foi, a seguir, imobilizado em células de fluxo 1-3 (pastilha Biacore CMS) usando amino acoplamento de rotina, deixando a célula de fluxo 4 como a célula de fluxo de referência.

[00214] Para a aquisição de dados de taxa de associação, oito concentrações (diluições de 2 vezes) variando de 30,0 - 0,23 nM de Ang-2 (em tampão de corrida HBS-P contendo 100 μg/mL de BSA) foram aleatoriamente injetadas por 90 segundos (100 μL/min, taxa de fluxo) em triplicata com varias injeções de tampão interespaçadas para referenciamento duplo, seguido por uma dissociação de quatro minutos. As superfícies do anticorpo foram regeneradas com um pulso de 6 segundos de NaOH 15 mM depois de cada ciclo de injeção.

[00215] Para a aquisição de dados de taxa de desassociação, conforme três amostras de Ang-2 15,0 nM foram injetadas descrito acima e os dados de dissociação foram registrados por mais de seis horas. As injeções de amostra alternaram com três ciclos de injeções de branco. Cada superfície foi regenerada com um pulso de 6 segundos de NaOH mM, depois de cada longo ciclo de injeção de "taxa de desassociação".

[00216] Os dados foram globalmente ajustados para um modelo de interação 1:1 com um termo para o transporte de massa incluído usando CLAMP (David G. Myszka e Thomas Morton (1998) "CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program," TIBS 23, 149-150) .

Resultados e discussão: Estudo Biacore de Alta Resolução ANG-1 e ANG-2 com MAb 3.19.3

[00217] Dois experimentos independentes correram com cada antígeno. Os resultados estão apresentados na Tabela 8 abaixo. Tabela 8 Resultados de Biacore de Alta Resolução de ligação da Ang-1 e da Ang-2 ao mAb 3.19.3 purificado

[00218] Os kds para a Ang-2 na tabela acima estão em asterisco porque esses valores foram mantidos constantes durante o modelo de ajuste de interação 1:1 no programa de computador CLAMP. Não houve sinal de dissociação significativo registrado para os experimentos de Ang-2, de forma que a melhor estimativa da taxa de desassociação foi manter o kd constante a 1 x 10-6 seg-1. O dado longo da taxa de desassociação para a Ang-2 de fato apresentou uma tendência a montante durante as seis horas de aquisição de dados. Essa tendência foi repetida em duas pastilhas de sensor diferentes com dois instrumentos diferentes depois de ambos os instrumentos terem sido submetidos a um protocolo de manutenção "super completo". Para medir mais precisamente a afinidade de ligação do mAb 3.19.3 para a Ang-1 e para a Ang-2, um outro experimento (Ver Exemplo 10) correu para determinar o Kd do mAb 3.19.3 para esses antígenos.

[00219] Interessantemente, com mAb 3.19.3 não se ligou ao Ang-1 no ensaio de ligação baseado em ELISA (Exemplo 3) quando o Ang-1 foi imobilizado na placa de ELISA. A explicação provável para essa discrepância é que quando o Ang-1 foi imobilizado na superfície dos plásticos, um tênue epítopo crítico para a ligação do mAb 3.19.3 não foi exposto apropriadamente. Entretanto, quando o Ang-1 estava na fase líquida, tal com a nas condições experimentais Biacore, esse epítopo ficou acessível para o mAb 3.19.3 e ocorreu a ligação.

EXEMPLO 10 DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DO MAB 3.19.3 PARA A ANG-2 HUMANA USANDO KINEXA (ENSAIO DE EXCLUSÃO CINÉTICA) DE ALTA RESOLUÇÃO

[00220] Quando a afinidade do mAb 3 .19. 3 para a Ang-2 humana foi medida usando Biacore de alta resolução (Exemplo 9), foi descoberto que não havia sinal de dissociação significativo. O longo dado da taxa de desassociação para a Ang-2 mostra uma tendência a montante durante as seis horas de aquisição de dados. Por causa disso, o Kd da ligação do mAb 3.19.3 a Ang-2 humana foi determinado usando a tecnologia KinExA, como objetivo de obter um valor de Kd mais confiável. Para esse propósito, um instrumento KinExA 3000 foi utilizado. Primeiramente, 1mL (~ 271 μg) de Ang-2 estoque (R&D Systems, Inc., Lote# BNO32510A) foi trocado de tampão para 1 x PBS, pH 7,0 usando uma coluna dessalinizadora de 10 mL (coluna de poliacrilamida Pierce D-Salt™, exclusão de peso molecular de 6000, Lote # GF97965). A concentração das frações reunidas foi determinada como sendo 1, 7 μM usando o método de determinação de concentração de proteína descrito por C. Nick Pace (Pace, et al., Protein Science, Vol. 4: 24112423, 1995). Em segundo lugar, 200 mg de contas de metacrilato de polimetila (PMMA, Late# 206-01) foram acopladas com 450 μL (~ 122 μg) de Ang-2 estoque de um dia para o outro a 24°C. As contas foram, a seguir, centrifugadas e lavadas uma vez com tampão de bloqueio (1 x PBS, 10 mg/mL de BSA), novamente centrifugadas e a seguir incubadas no tampão de bloqueio por uma hora a 24°C. Depois do bloqueio, as contas foram diluídas em aproximadamente 30 mL de tampão HBS (Hepes 0,01 M, NaCl 0,15 M, pH 7,4) num frasco reservatório de leito KinExA padrão e colocado no instrumento.

Titulação controlada por Kd

[00221] Doze soluções contendo uma concentração de sítio de ligação de mAb 3.19.3 de 25,3 pM foram tituladas com concentrações crescentes de Ang-2. A Ang-2 trocada com tampão foi usada para as preparações de amostra. Cada solução tinha um volume total de 25 mL e foi deixada equilibrar por 5 dias a ~ 24°C. As soluções de titulação foram preparadas usando vidraria volumétrica e as concentrações de Ang-2 variaram de 5,09 nM a 99,3 FM. O método do instrumento KinExA usado para a análise dessas soluções consistiu de um passo de empacotamento de contas no qual as contas PMMA foram empacotadas num capilar de vidro, e as soluções equilibradas fluiram através da coluna de contas a 0,25 mL/min por 6 min (1,5 mL) em duplicata. Subsequententemente, um anticorpo policlonal anti- humano de cabra Cy-5 marcado fluorescentemente (Fc específico) a 3,4 nM fluiu através do pacote de contas por 1 min a 0,5 mL/min para marcar o mAb com sítios de ligação livres capturados nas contas. A emissão de fluorescência do pacote de contas foi medida a 670 nm com excitação a 620 nm. As medições de fluorescência resultantes foram convertidas em "% de sítios de ligação de mAb livres" contra a concentração de antígeno total usando o pacote de programas de computador KinExA associado (versão 1.0.3, Sapidyne, Inc.). A curva de titulação controlada por Kd resultante foi ajustada com o programa de computador KinExA para uma isoterma de equilíbrio 1:1 com um fator de correção de desvio incluído. O valor do Kd que ajusta o dado otimamente foi 86,4 pM com os limites de confiança de 95% inferior e superior a 64,3 pM e 98,7 pM, respectivamente. Uma curva de titulação controlada por mAb não foi efetuada.

EXEMPLO.11 BLOQUEIO DA FOSFORILAÇÃO DE TIE INDUZIDA POR ANG-2 ECTOPICAMENTE.EXPRESSA.EM CÉLULAS HEK293

[00222] Conforme discutido acima, Tie2 é um receptor tirosina quinase específico de célula endotelial. Experimentos in vitro com as células endoteliais vasculares mostram que a Ang-1 induza fosforilação do Tie2, enquanto que a Ang-2 inibe a fosforilação do receptor induzida pela Ang-1. Entretanto, quanto o Tie2 é expresso ectopicamente, tal como em fibroblastos, Ang-2 também é capaz de induzir a fosforilação do Tie2 sob certas condições, incluindo, mas sem se limitar a exposição prolongada a Angiopoietina-2 ou a exposição a altas concentrações de Angiopoietina-2.

[00223] Fosforilação do Tie2 induzida por Ang-2 também ocorre quando o receptor é expresso em células HEK293F. A capacidade dos mAbs anti-Ang-2 de bloquear a fosforilação do Tie2 induzida por Ang-2 foi examinada usando células HEK293F transfectadas com o receptor Tie2 humano. O vetor de plasmídeo pORK/pBS-SK com um DNAc de Tie2 foi obtido da ATCC (N° CAt 69003, sequência Genbank BC033514). A precisão do DNAc foi confirmada pelo sequenciamento de nucleotídeos. Um fragmento de 3,9 Kb contendo um DNAc de 3375 pb que codifica o Tie2 humano foi removido do vetor por digestão EcoRI. Esse fragmento foi subclonado na orientação própria num vetor pCR3.1 digerido com EcoRI, seguindo procedimentos padronizados. O plasmídeo selecionado foi amplificado e purificado por protocolos padronizados.

[00224] O constructo contendo Tie2 obtido nos procedimentos acima foi transfectado em células HEK293F pelo método de transfecção de fosfato de cálcio. 1 x 106 células HEK293F cresceram em placas de cultivo de tecido de 100 mm revestidas com gelatina 1% a 37°C com CO2 a 5%. As células foram alimentadas com meio fresco por 2-3 horas antes da transfecção. 10 μg do DNA plasmidico foi dissolvido em solução de fosfato de cálcio 248 mM. A transfecção foi efetuada usando procedimentos padronizados. Transfectantes estáveis foram selecionados pela incubação em G418 0,5 mg/mL. Transfectantes estáveis expressando o Tie2 foram identificados por análise de FACS usando mAb anti-Tie2 de camundongo (R&D Cat. N° MAB313) e um anticorpo conjugado IgG-PE anti-camundongo de cabra (Caltag, N° Cat M30004-4) para detecção.

[00225] Para efetuar o ensaio de fosforilação de Tie2, transfectantes HEK293F/Tie2 cresceram em placas de cultura de células de 60 mm numa densidade de 2 x 106 células/placa com meio completo a 37°C com 5% de CO2 até eles alcançarem a subconfluência. O meio completo em cada placa foi substituído com 2 mL de meio livre de soro. As células foram incubadas por 16 horas adicionais. Subsequentemente, o meio foi substituído novamente com 2 mL de meio livre de soro. Depois de uma incubação de 2 h adicional, as células foram tratadas com ortovanadato de sódio 0,1 mM (Sigma, N° Cat S 6508) por minutos. As células foram tratadas com Ang-2 (2 μg/mL) na •presenca ou ausência de mAbs a100μg/mL. Os tratamentos foram efetuados em duplicata. Um controle negativo sem tratamento com Ang-2 foi incluído. As células foram rinsadas com TBS gelado contendo vanadato e lisadas com 300 μL/placa de tampão de lise NP-40 esfriado (Hepes 50 mM, pH 7,2, suplementado com NaCl 0,15 M, glicerol 10%, pirofosfato 10 mM, NaF 50 mM, NP40 1%, aprotinina 100 U/mL, PMSE' 1 mM, ortovanadato 0,1 mM, peupeptina 10 μMe pepstatina A 10 μM), enquanto colocando as placas em gelo por 10 minutos. As células tratadas foram fragmentadas das placas num microtubo pre-esfriado em gelo.

[00226] Os lisatos de células foram brevemente submetidos ao ultrasom e centrifugados a 12.000 x g por 10 minutos a 4°C num tubo de centrífuga de mesa. Os sobrenadantes foram coletados em microtubos frescos, e 1-5 μg de mAb anti-Tie2 (R&D Systems, Inc.) foram adicionados ao sobrenadante, seguido por agitação suave por 2 horas a 4°C.50μL de Proteína A Imobilizada Imunopura (PIERCE Cat. N° 20333) foi adicionado a mistura, e incubado por pelo menos 3 horas a 4°C numa plataforma de agitação. Os complexos foram coletados por centrifugação a 12.000 x g por 10 minutos. Depois da remoção cuidadosa do sobrenadante, os complexos foram lavados duas vezes com o tampão de lise por centrifugação (12.000 x g, 4°C) por 4 minutos. Os péletes foram ressuspensos em 50 μL de tampão amostra de eletroforese 2 X (Invitrogen, N°Cat LC-2676) com 1 mM de J3- mercaptoetanol ou DTT, e submetidos a ebulição por 5 minutos antes de serem centrifugados (12.000 x g, 4°C) por 5 minutos. Os sobrenadantes foram transferidos para tubes frescos.

[00227] As amostras foram carregadas nos poços de um gel SDS- PAGE (por exemplo, 4-20% de gel Tris-glicina, Invitrogen, N° Cat EC 6025). A eletroforese foi efetuada num sistema de tampão Tris-glicina. Depois da eletroforese, o gel foi manchado numa membrana PVDF (Invitrogen, N° Cat. LC 2005) depois de um protocolo padrão. A fosforilação da tirosina foi sondada com anticorpo anti-fosforotirosina 4G10 a 1 μg/mL (Upstate, N° Cat. 05-321) pela incubação por 1 hora em temperatura ambiente com agitação, e seguido por lavagem com 1 x TBST (TBS com 0,1% de Tween- 20) três vezes. Os anticorpos ligados foram detectados por incubação com IgG anti camundongo de cabra conjugado com peroxidase de rabano silvestre (Santa Cruz, N° Cat sc-2302), numa diluição 1: 10,000 por 1 hora em temperatura ambiente, seguido pela reação de quimio luminescência aumentada usando o sistema de Substrato de Duração Estendida SuperSignal West Dura (PIERCE N° Cat. 34075). Subsequentemente, a mancha foi tirada com Tampão de retirada de Westem Blot Restore (PIERCE, N° CAt 21059) e ressondada com anticorpos específicos contra RTK para verificar a qualidade da carga da amostra.

[00228] Foi descoberto que quando o Tie 2 humano foi expresso ectopicamente nas células HEK293F, a autofosforilação do Tie2 não foi detectável. Em resposta ao tratamento com Ang-2 (2 μg/mL), um nivel significativo de fosforilação de tirosina foi detectado por um mAb para a tirosina fosforilada (4G10) do Tie2 imunoprecipitado pelo mAb específico. Numa concentração de 100 μg/mL, todos os mAbs anti-Ang-2 testados apresentaram inibjção óbvia da fosforilação do Tie2, enquanto que o mAb controle de isotipo não teve o feito inibitório (Figura 1). O anticorpo monoclonal 5.103. 1, o qual não é mostrado na Figura 1, tem um efeito inibitório similar.

[00229] Para classificar a potência dos mAbs de Ang-2 para inibir a fosforilação do Tie2 induzida por Ang-2 in vitro, um método quantificável baseado em ELISA para detectar a fosforilação do Tie2 foi estabelecido. Resumidamente, os lisatos de célula foram feitos a partir de transfectantes de HEK293F/Tie2 que foram tratados com Ang-2 com os mAbs em várias concentrações. Tie2 total do lisato foi capturado na placa de ELISA de 96 poços que foi revestida com mAb anti Tie-2 de camundongo. O Tie2 fosforilado foi detectado usando anticorpo primário 4G10-HRP (comprado da Upstate) e a solução de substrato HRP. OD a 650 nm foi determinada por um leitor SpectraMax. A relação concentração-resposta foi encontrada pelo ajuste da curva usando o programa de computador gráfico Graphpad Prism'D- 1 (não-linear, curva Sigmoidal). A inibição máxima (eficácia) e a IC50 (potência) foram calculadas conforme mostrado na Figura 2. A EC50 foi calculada conforme mostrado abaixo na Tabela 9. Tabela 9

[00230] Conforme reportado acima, foi descoberto que o mAb 3.19.3 reagiu de forma cruzada coma Ang-1. Entretanto, os resultados dos experimentos iniciais não encontraram inibição da fosforilação do Tie-2 induzida pela Angiopoietina-1 pelo mAb 3.19.3. É conveniente notar que a expressão ectópica do Tie2 pode afetar a sua suscetibilidade a ativação por diferentes ligantes, conforme evidenciado pelo fato de que a Ang-2 não induz a fosforilaçãodo Tie2 em HUVECs, enquanto que ela induz a fosforilação do Tie2 robusta quando o receptor e ectopicamente expresso em células HEK293.

[00231] Em vista desses resultados outros experimentos foram efetuados para investigar mais completamente se o mAb 3.19.3 foi capaz de inibir a ligação tanto da Ang-1 e da Ang-2 ao Tie ligado a célula. Além disso, a fosforilação do Tie2 induzida pela Angiopoietina-1 pelo mAb3.19.3 foi investigada em maiores detalhes conforme descrito no Exemplo 12 abaixo.

EXEMPLO.12 MAB 3.19.3 INIBE A LIGAÇÃO DA ANGIOPOIETINA AO TIE-2 E A FOSFORILAÇÃO DO TIE2 INDUZIDA PELA ANG-1

[00232] O mAb 3.19.3 reage de forma cruzada com a Ang-1 humana (Exemplos 8 e 9). Entretanto, os experimentos iniciais indicaram que o mAb 3.19.3 não inibe a fosforilação do Tie2 induzida por Ang-1. A discrepância pode ser explicada pelo seguinte: (1) alta concentração da Ang-1, a qual está muito abaixo da concentração fisiológica, pode ser necessária para gerar um sinal de fosforilação do Tie2 robusto; ou (2) a expressão ecotópica do Tie2 em HEK293 pode alterar a conformação do Tie2, e dessa forma mudar a sua suscetibilidade a diferentes ligantes. Para testar essas hipóteses, o mAb 3.19.3 foi testado num ensaio de ligação onde uma baixa concentração de Ang-1 ou Ang-2 (2nM) se ligou a superfície celular do Tie2. Foi descoberto que o mAb 3.19.3 inibiu a ligação tanto da Ang-1 quanto da Ang-2 nesse experimento. Em segundo lugar, células endoteliais imortalizadas (EA.hy926/ B3) foram usadas para investigar a fosforilação do Tie2 induzida por Ang-1. Os resultados desse experimento, conforme descrito em maiores detalhes abaixo, demonstram que o mAb 3.19.3 inibe a fosforilação do Tie2 induzida pela Ang-1 de uma forma dose-dependente.

[00233] Transfectantes HEK293F/Tie2 foram deixados crescer até 95% de confluência em frascos de cultura antes de serem colhidos. Suspensões celulares de 4 milhões de células/mL em tampão FACS foram preparadas, e a seguir aliquotadas para uma placa de polipropileno de 96 poços com 50 uL por poço. Os mAb 3.19.3 com as concentrações indicadas foram adicionados na suspensão celular. Subseqtientemente, foram adicionadas soluções de Ang-1 e Ang-2 humanas recombinantes na suspensão celular, seguido pela incubação em temperatura ambiente por 2 horas. As células foram lavadas por centrifugação da placa a 1.200 rpm por 5 minutos, removendo o sobrenadante por aspiração e ressuspendendo as células com 200 μL por poço de tampão FACS. Os procedimentos de lavagem foram repetidos duas vezes. As células foram, a seguir, suspensas com 100 μL de anticorpo Anti-6X-histidina de camundongo diluído para 2 μg/mL em tampão FACS, e incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois da lavagem, as células foram suspensas em 100 μL de IgG anti-camundongo de cabra conjugada com PE, o qual foi diluído 1:100 em tampão FACS, para incubação em temperatura ambiente por 30 minutos. O volume das amostras foi levado para 300 μL com tampão FACS, e medido com FACS Calibur.

[00234] Os resultados estão ilustrados na Figura 3 e resumidos na Tabela 10. Conforme mostrado, Tie2/Fc solúvel inibiu de forma dose- dependente a ligação tanto da Ang-1 quanto da Ang-2 pelo bloqueio dos ligantes, enquanto o mAb de controle de isotipo, PKl 6.3.1, não teve efeito na ligaçãode cada ligante. O mAb3.19.3 mostrou a inibição dependente de concentração tanto da Ang-1 quanto da Ang-2. Interessantemente, com a potência do Tie2/Fc como referência, a potência do mAb 3.19.3 para a ligação da Ang-2 foi mais alta do que aquela da Ang-1. Tabela 10

[00235] Esses resultados indicaram que o mAb 3.19.3 não somente se ligou a Ang-1 humana, mas também bloqueou sua ligação ao receptor Tie2. Isso foi posteriormente confirmado pela inibição da fosforilação do Tie2 induzida pela Ang-1 em células endoteliais imortalizadas conforme descrito abaixo.

[00236] A atividade inibitória do mAb 3.19. 3 na fosforilação do Tie2 induzida pela Ang-1 foi quantificada como se segue. O mAb mostrou uma inibição crescente óbvia da fosforilação do Tie2 com concentração de anticorpo crescente, conforme mostrado nas Figuras 4 e 5. Um gráfico dessa curva de dose-resposta levou ao cálculo de uma IC50 de 99 nM.

Ensaio de fosforilação do receptor Tie-2 estimulada pelo ligante angiopoietina-1

[00237] Células EA.hy926/B3 foram semeadas em placas de seis poços usando 2,5 x 105 células EA.hy926 por poço num volume de 2 mL de DMEM; HAT; FCS 10% e incubadas por 3 dias sob condições de crescimento de células de mamíferos padrões.

[00238] O meio de crescimento foi substituído com 2 mL de DMEM (sem FCS) e as células foram privadas de soro por um total de 2 horas. Os compostos de teste foram diluídos em DMEM; FCS 1% até duas vezes a concentração final desejada. Depois de 1 hora e 40 minutos de privação de soro, o meio foi removido das células e substituído com 1 mL de diluições de composto de teste. Semelhantemente, controles tratados sem composto também progrediram para fornecer amostras que representassem padrões de estimulação de ligante a 100%.

[00239] A incubação continuou por mais 10 minutos depois do que 100 μL de uma solução de ortovanadato 10 mM em DMEM foi adicionada a cada poço para obter uma concentração final de ortovanadato de 1 mM em cada poço. As células foram, a seguir, incubadas pelos últimos 10 minutos do período de privação de soro de 2 horas.

[00240] Uma vez completo o período de privação de soro de 2 horas, 1 mL de Angiopoietina-1 (diluída até a concentração apropriada em DMEM e contendo ortovanadato 1mM) foi adicionado a cada poço e incubado a 37°C por mais 10 minutos.

[00241] A(s) placa(s) de 6 poços foram, a seguir, esfriadas pela colocação numa placa de metal gelada (ela própria mantida em gelo). O meio celular foi removido e a camada de células foi lavada com 5 mL de PBS gelado; ortovanadato 1 mM. Um mL de tampão de lise gelado (Tris 20 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, SDS 0,1%, NP40 1%, DOC 0,5%, ortovanadato 1 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, apronitina 30μL/mL, pepstatina μg/mL, leupeptina 10 μg/mL) foi adicionado a cada poço e deixado em gelo por 10-20 minutos. As células foram fragmentadas da placa usando uma alça celular e a solução de lisato inteira transferida para um tubo de Eppendorf de 1,5 mL e mantida em gelo. As amostras foram, a seguir, giradas por 3 minutos a 13.000 rpm a 4 °C e todos os passos subsequentes foram executados a 4°C.

[00242] 50 μL de cada lisato foram mantidos para o ensaio de proteína BCA (Pierce, N° Cat 23225) (em placas de microtitulação de polipropileno de baixa ligação de proteína da Greiner). A concentração de proteína foi determinada usando as condições de ensaio padrões fornecidas com o kit. Mais 800 μL de cada lisato de amostra foram transferidos para um tubo de Eppendorf de 2 mL fresco no preparo para a imuno precipitação (IP). 15 μL (3 mg) de anti P-Y (Santa Cruz, N° Cat E2203) foram adicionados aos lisados e deixados incubar por 2 horas a 4°C antes da adição de 600 μL das contas Magnabind (IgG anti-camundongo de cabra, Pierce N° CAT 21354). As contas Magnabind foram preparadas como se segue: o volume requerido foi transferido para tubos cônicos de 15 mL. Os tubos foram, a seguir, colocados na presença de um campo magnético e o líquido foi removido. PBS fresco foi adicionado usando o volume original, e as contas foram ressuspensas. Esse processo foi repetido duas vezes. A solução contendo lisato foi, a seguir, misturada com as contas e os tubos foram deixados rodando de um dia para o outro a 4°C num misturador de rotor.

[00243] As amostras foram expostas por cerca de 1 min ao magneto e o líquido foi cuidadosamente removido. 1 mL de tampão de lise foi adicionado e os tubos foram girados par 5 min para lavar. Os passos de lavagem foram repetidos duas vezes. O líquido foi completamente removido e as contas foram ressuspensas em 12 μL de tampão de carga Laemmli 2 x quente (94°C) + bME, a seguir deixado em repouso por 15 min em temperatura ambiente. Os tubos foram expostos por 1 min no magneto, e o líquido o qual separou das contas foi analisado por géis de PAGE/SOS.

[00244] As amostras foram analisadas usando géis PAGE/SOS usando BisTris NuPAGE 4-12%/géis MOPS com 15 poços (Novex). O total de 12 μL de cada imunoprecipitado foi carregado por espaço. Os géis correram a 200 V/120 m.A/25 Watts por 55 minutos e, a seguir, as amostras foram westem blotted em membrana de nitrocelulose por 1 h 30 min a 50 V/250 mA.

[00245] Todas as manchas foram, a seguir, tratadas com Marvel 5% em PBS-Tween por 1 hora em temperatura ambiente e, a seguir, lavadas com PBS-Tween.

[00246] Anticorpo anti Tie-2 de coelho (Santa Cruz, N° Cat Cl303) foi diluído em 1:500 em Marvel 0,5%/PBS-Tween e 12,5 mL foram adicionados a cada mancha e deixado a 4°C de um dia para o outro. As manchas foram, a seguir, lavadas com PBS Tween e -POD anti-coelho de cabra (Dako N° Cat P 0448) (diluição1:5000 em Marvel 0.5%/PBS-Tween) foi adicionado a cada mancha e deixado por 1 hora em temperatura ambiente. As manchas foram lavadas com PBS-Tween e cada mancha foi desensenvolvida por 10 minutos usando 12,5mL (volumes iguais de solução A e B) de Supersignal (PIERCE No Cat. 34080 As manchas foram transferidas para um cassete de raio-X e expostas ao filme (exposições de 5 seg/15 seg/30 seg/60 seg/ 150 seg). Figura 4 é um Westem blot mostrando os resultados desse ensaio. Nesse sistema, a inibição da fosforilação estimulada pela Angiopoietina-1 do Tie-2 pelo mAb 3.19.3 foi observada.

[00247] As imagens vistas no filme para cada amostra foram, a seguir, avaliadas usando o sistema analisador de imagens FluorS BioRad. A densidade de pixels foi medida como OD/mm2 e expressa em volume de porcentagem. Os resultados de volume de porcentagem foram normalizados para 1 mg de proteína/imunoprecipitação usando a concentração de proteína determinada usando o ensaio BCA e o volume de lisato de cada amostra usada na imunoprecipitação. A fosforilação porcentual de cada amostra foi calculada contra o valor de fosforilação de 100% da amostra de controle não- tratada em cada gel com a inibição de porcentagem de cada amostra sendo calculada contra o valor de fosforilação de 100%, o qual por si só representa 0% de inibição). Figura 5 e uma representação gráfica desses valores, e mostra que a IC50 para a inibição da fosforilação do Tie-2 estimulada pela Angiopoietina-1 é de 99 nM.

[00248] Tomados juntas, esses dados mostram que, nesse sistema, o mAb inibe a fosforilação do Tie2 induzida pela Angiopoietina - 1.

EXEMPLO.13 ANÁLISE ESTRUTURAL DE ANTICORPOS ANG-2

[00249] As cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis dos anticorpos foram sequenciadas para determinar as suas sequências de DNA. A informação da sequência completa para os anticorpos anti-Ang-2 é fornecida na listagem de sequência com sequências de nucleotídeos e de aminoácidos para cada combinação de cadeia gama e capa. As sequências pesadas variáveis foram analisadas para determinar a família VH, a sequência da região de sequência da região J. As sequências foram, a seguir, traduzidas para determinar a sequência de aminoácido primária e comparada com as sequências da linhagem germinativa VH, das regiões D e J para avaliar as hipermutações somáticas.

[00250] Tabela 11 é uma tabela comparando as regiões de cadeia pesada do anticorpo com a sua região da cadeia pesada da linhagem germinativa cognata. Tabela 12 e uma tabela comparando as regiões da cadeia leve capa do anticorpo com a sua região de cadeia leve da linhagem germinativa cognata.

[00251] As regiões variáveis (V) das cadeias de imunoglobulina são codificadas por múltiplos segmentos de DNA de linhagem germinativa, os quais são juntos em regiões variáveis funcionais (VH DJH ou VKJK) durante a ontogenia da célula B. A diversidade molecular e genética da resposta de anticorpo para a Ang-2 foi estudada em detalhes. Esses ensaios revelaram varies pontos específicos para os anticorpos antiAng-2.

[00252] A análise de 152 anticorpos individuais específicos para a Ang-2 resultou na determinação de que os anticorpos foram derivados de 21 diferentes genes VH de linhagem germinativa, 112 dos quais da família VH3, com 46 anticorpos sendo derivados do segmento de gene VH3-33. As Tabelas 11 e 12 mostram os resultados dessas análises.

[00253] Deve ser percebido que as sequências de aminoácidos dentre os clones irmãos de cada hibridoma são idênticos. Por exemplo, as sequências de cadeia pesada e de cadeia leve para o mAb 3.19.3 são idênticas as sequências mostradas nas Tabelas 11 e 12 para os mAbs 3.19 e 3.19.1. Tabela 11:Análise das cadeias pesadas

Tabela 12: Análise das cadeias leves

EXEMPLO.14 DETERMINAÇÃO.DE CLASSES DE ANTICORPOS CANÔNICAS

[00254] Chothia et al descreveu a estrutura de anticorpo em termos das "classes canônicas" para as regiões hipervariáveis de cada cadeia de imunoglobulina (J Mol Biol.1987 20 de agosto; 196(4): 901-17). As estruturas atômicas dos fragmentos Fab e VL de uma variedade de imunoglobulinas foram analisadas para determinar a relação entre as suas sequências de aminoácidos e as estruturas tridimensionais de seus sítios de ligação de antígeno. Chothia, et al. descobriram que existiam relativamente poucos resíduos que, através de seu empacotamento, ligação de hidrogênio ou capacidade de assumir conformações phi, psi ou Omega não-usuais, foram primariamente responsáveis pelas conformações da cadeia principal das regiões hipervariáveis. Foi descoberto que esses resíduos ocorrem em sítios nas regiões hipervariáveis e na estruturada folha neta conservada. Pelo exame das sequências das imunoglobulinas com estrutura desconhecida, Chothia etal mostrou que muitas imunoglobulinas têm regiões hipervariáveis que são semelhantes em tamanho a uma das estruturas conhecidas e continham adicionalmente resíduos idênticos nos sítios responsáveis pela conformação observada.

[00255] Sua descoberta implicou que essas regiões hipervariáveis têm conformações próximas daquelas nas estruturas conhecidas. Para cinco das regiões hipervariáveis, o repertório de conformações aparentou estar limitado a um número relativamente pequeno de classes estruturais discretas. Essas conformações da cadeia principal de ocorrência comum das regiões hipervariáveis foram nomeadas de "estruturas canônicas". Trabalho adicional de Chothia, et al. (Nature Dez 1989 21-28; 342(6252) :877-83) e outros (Martin, et al. J Mol Biol. Nov 1996 15;263(5) :800-15) confirmou que ainda existe um pequeno repertório de conformações de cadeia principal para pelo menos cinco das seis regiões hipervariáveis dos anticorpos.

[00256] Os CDRs para cada anticorpo descrito acima foram analisados para determinar as suas classes canônicas. Conforme e conhecido, classes canônicas somente foram designadas para CDRl e CDR2 da cadeia pesada de anticorpo, juntamente com CDRl, CDR2 eCDR3 da cadeialeve de anticorpo. A tabela abaixo (Tabela 13) resume os resultados das análises. Os dados da Classe Canônica estão na forma de* HCDR1 - HCDR2- L CDR1 - L CDR2 - L CDR3, em que "HCDR" se refere ao CDR de cadeia pesada e "LCDR" se refere ao CDR da cadeia leve. Dessa forma, por exemplo, uma classe canônica de 1- 3- 2- 1- 5 se refere a um anticorpo que tem um HCDR1 que cai na classe canônica 1, um HCDR2 que cai na classe canônica 3, um LCDR1 que cai na classe canônica 2, um LCDR2 que cai na classe canônica 1 e um LCDR3 que cai na classe canônica 5.

[00257] Designações foram feitas para uma classe canônica particular onde havia 70% ou mais de identidade dos aminoácidos no anticorpo com os aminoácidos definidos para cada classe canônica. Onde havia menos do que 70% de identidade, a designação da classe canônica é marcada com um asterisco ("*") para indicar que a melhor estimativa da classe canônica própria foi feita, baseando-se no comprimento de cada CDR e na totalidade dos dados. Onde não houve emparelhamento de classe canônica com o mesmo comprimento de CDR, a designação de classe canônica é marcada com um "Y". Os aminoácidos definidos para cada anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, nos artigos de Cpothia et al, referidos acima. A tabela 13 reporta os dados da classe canônica para cada um dos anticorpos Ang-2. Tabela 13 Classes canônicas dos anticorpos contra Ang-2

[00258] Tabela 14 e uma análise da quantidade de anticorpos por classe. A quantidade de anticorpos com a classe canônica particular designada na coluna da esquerda e mostrada na coluna da direita. Tabela 14 Número de anticorpos anti-Ang-2 em cada classe canonical

Notas: Aqueles com * significa que a designação foi dada para a classe de melhor emparelhamento, embora haja algumas violações nas posições definidas. Y significa que não há emparelhamento de classe canônicacom o mesmo comprimento de CDR.

EXEMPLO 15 MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE ANTICORPOS ANG-2

[00259] O domínio de ligação dos 27 anticorpos que neutralizam a atividade da Ang-2 foi analisado.

[00260] Ang-2 humana recombinante foi comprada de R&D Systems (623-AN). Anticorpos policlonais Ang-2 anti-humanos de cabra (R&D systems AF623) foram selecionados pela sua capacidade de reconhecer rhAng-2 em ELISA direto e em Westem blots. Os anticorpos policlonais foram biotinilados para anulação com conjugado de HRP - estreptavidina.

[00261] Todas as enzimas de restrição foram fomecidas pela New England Biolabs e foram usadas de acordo com as instruções do fabricante. Todos os DNAs de plasmídeo foram purificados usando minicolunas giratórias (Invitrogen, Carlsbad, CA). Iniciadores de oligonucleotídeos usados para clonagem e mutagênese direcionada a sítio foram sintetizados pela Qiagen Operon.

[00262] Anticorpos: 27 hibridomas derivados de anticorpos anti-Ang-2 humanos foram selecionados baseando-se na sua capacidade de inibir a ligação do rhAng-2 ao seu receptor. Os anticorpos estão listados abaixo na Tabela 15. Tabela 15

Caracterização de epítopo dos 27 anticorpos anti-Ang-2 neutralizantes Manchas de ponto

[00263] RhAng-2 (R&D systems) foi manchado em membrana de nitrocelulose na sua forma natural ou reduzida, usando a unidade de microfiltração Bio-Dot. Todos os anticorpos humanos monoclonais (MAbs) levantados contra a Ang-2 humana se ligaram a Ang-2 não-reduzida, mas não a forma reduzida, indicando que todos os mAbs reconhecem epítopos conformacionais, os quais são aparentemente destruídos na redução da proteína.

Clonagem e expressão das proteínas Ang-1 e Ang-2

[00264] Para melhor entender a base estrutural para a interação dos mAbs com Ang-2, um grupo de moléculas Ang-1/Ang-2 quiméricas foi usado. Essa tentativa leva vantagem do fato de que membros da família angiogênica estão estruturalmente relacionados. Embora a Ang-2 e a Ang-1 mostrem somente 60% de homologia na sua sequência de proteína, ambas compartilham a mesma estrutura modular composta de um domínio de espiral enrolado aminoterminal e de um domínio do tipo fibrinogênio carboxiterminal.

Clonagem da Ang-1 e da Ang-2 humana

[00265] Duas formas altemativamente unidas de DNAcs Ang-2 humanos foram amplificados a partir da linhagem celular endotelial da veia umbilical (HUVEC). Amplificação por PCR do DNAc da HUVEC usando iniciadores Ang-2 específicos revelou tanto o comprimento completo da Ang- 2 (1491 pb) quanto uma variante Ang-2443 de 1330 pares de base (Injune et al., (2000) JBC 275: 18550). Ang-2443 é uma variante gerada pela união altemativa do exon B e pela parte que falta do domínio espiral enrolado (aminoácidos 96-148). Ambos os DNAcs Ang-2 foram clonados no vetor de expressão pCR3.l e foram expresssos em células 293F, conforme mostrado na Figura 6. DNAc Ang-1 humano foi obtido por RT-PCR usando o RNA total extraído da linhagem de célula de mama humana MDA-MB-231. Um DNAc de 1,5 Kb foi clonado no vetor de expressão pCR3.l e a expressão foi detectada no sobrenadante das células 293F transitoriamente transfectadas.

ELISA

[00266] A ligação dos 27 mAbs aos sobrenadantes gerados de transfecção transitória dos DNAcs Ang-2 e Ang-1 foi testada usando ELISA de captura de anticorpo. Ang-2, Ang-2243 e Ang-1 foram ligados a uma placa de ELISA revestida com anticorpos policlonais de cabra contra a Ang-2 ou a Ang-1 humana (respectivamente). A ligação dos 27 principais anticorpos monoclonais humanos foi detectada com um anticorpo anti-humano de cabra conjugado com HRP, seguido pelo substrato de peroxidase de rabano silvestre colorimétrico (substrato intensificado K-Blue TMB, Neogen Corporation). A absorvância de cada poço das placas de ELISA foi medida a 450nm num autoleitor de microplaca.

Transfeção das células 293F

[00267] Células de rim embrionário humano 293F foram mantidas em 10% de soro bovino fetal em meio de eagles modificado da Dulbecco suplementado com penicilina e estreptomicina. Células 293F foram transientemente transfectadas usando fosfato de cálcio. Em 72 horas, o meio foi colhido e filtrado para análise de ELISA e de Westem Blot.

[00268] Mostrou-se que todos os 27 anticorpos se ligam especificamente aos antígenos Ang-2/Ang-2443. Nenhuma reatividade cruzada foi detectada com Ang-1 humana. Os aminoácidos 96-148 no domínio de espiral enrolada da Ang-2, os quais estão faltando na sequência de proteína Ang-2443, foram excluídos como o domínio de ligação para cada um dos 27 anticorpos.

Construção de moléculas quiméricas Ang-1/Ang-2

[00269] Sítios de clivagem de restrição comuns em genes Ang-1 e Ang-2 humanos foram usados para construção de proteínas quiméricas de Angiopoietina de fusão na estrutura.

[00270] Quatro constructos foram feitos: Ang-1/2BsmI, Ang-2/lBsmI, Ang-l/2SspI e Ang-2/1 SspI. Todas as proteínas foram expressas e secretadas em níveis detectáveis medidos por ensaio de ELISA usando anticorpos policlonais contra a Ang-1 ea Ang-2 humana.

[00271] Os pontos de junção de aminoácidos estão nas seguintes posições: BsmI - 117(Ang-2)/119(Ang-1) SspI - 353(Ang-2)/354(Ang-l).

[00272] A diferença de um aminoácido é devido à presença de 497 resíduos na Ang-1 humana em comparação com 496 resíduos na Ang-2 humana. Todos os constructos foram expressos em células 293F, e detectados por anticorpos policlonais anti-humanos de cabra contra a Ang-1 e a Ang-2. Os 27 anticorpos principais foram testados para a sua capacidade de se ligar a moléculas Ang-1/2 quiméricas. Todos os 27 anticorpos apresentaram um padrão semelhante de ligação ao constructo Ang-l/2BsmI somente. Os resultados desses experimentos indicam que o domínio de ligação para todos os anticorpos está entre os resíduos 117-496, mais possívelmente no domínio do tipo fibrinogênio, onde o epítopo é rompido nas proteínas Ang de fusão SspI ao redor do aminoácido 353.

Construção de moléculas quiméricas Ang-2 de camundongo/humana

[00273] Tendo em vista que Ang-2 compartilha ~55% de identidade de aminoácidos com a Ang-1, foi difícil encontrar um sítio de restrição comum para ser usado para a clonagem de moléculas quiméricas. Ang-2 de camundongo e humana são mais semelhantes, com cerca de 85% de homologia de sequência. DNAc de Ang-2 de camundongo clonado no vetor de expressão pCMCsport foi comprado da Invitrogen. Os 27 anticorpos selecionados foram testados para a sua imunorreatividade com Ang-2 de camundongo recombinante. Seis dos 27 reagiram de forma cruzada com Ang-2 de camundongo com 100% da sua imunorreatividade em Ang-2 humana, indicando que o antígeno de murino retém a maior parte da sua imunorreatividade da Ang-2 humana (dados estão resumidos na Tabela 16).

[00274] O sistema quimérico humano-camundongo foi escolhido para o mapeamento de epítopo baseando-se nas descobertas de que a maioria dos anticorpos se liga especificamente ao antígeno Ang-2 humano e não reagem de forma cruzada com Ang-2 de camundongo. Vários constructos de DNA cda Ang-2 foram gerados e clonados num vetor de expressão de mamífero.

[00275] Constructos da Ang-2 de camundongo/humana foram feitos usando o sítio de restrição comum StuI, localizado no domínio de ligação de fibrinogênio, com o ponto de junção de aminoácido no resíduo 311. Todos os mAbs específicos para a Ang-2 humana foram capazes de se ligar a Ang-2 de camundongo/humana StuI, indicando que o domínio de ligação está no domínio de ligação de fibrinogênio entre os resíduos 311-496. Para se restringir ao domínio de ligação, um novo constructo foi preparado no qual o fragmento humano StuITfiI substituiu a sequência do camundongo no DNAc da Ang-2 de camundongo (Figura 9).

[00276] Todos os anticorpos específicos para a Ang-2 humana mostraram um sinal de ELISA positivo, com 15-100% da sua imunorreatividade na Ang-2 humana. O domínio de ligação dos dois anticorpos com o emprego de um único gene VH 5.35.1 (VH3-20) e 5.28.1 (VH3-43), conforme mostrado na Tabela 17, foi mapeado para uma região entre os aminoácidos 310 - 400.

[00277] Esperou-se que os anticorpos que reagem de forma cruzada com a Ang-2 de camundongo mostrassem 100% e reatividade e não poderiam ser mapeados usando constructos quiméricos camundongo/humano.

Mutagênese direcionada a sítio

[00278] Para definir os resíduos importantes envolvidos no sítio de ligação de diferentes anticorpos, alguns resíduos da Ang-2 humana foram modificados, e triados contra o painel inteiro de anticorpos para a ligação pelo ensaio de ELISA.

[00279] Devido ao fato da ligação direta detectada por ELISA não ser sensível a pequenas e moderadas diferenças de afinidade, grandes mudanças na ligação observada depois da substituição de um único aminoácido provavelmente identificam sítios chaves que interagem com o anticorpo. Além disso, anticorpos policlonais contra a Ang-2 humana mantêm 100% de reatividade com cada constructo, indicando que o procedimento de mutagenêse não introduz quaisquer alterações estruturais amplas através da molécula de Ang-2. Duas alterações independentes de Val para Met na posição 345 (V345M) e His para Gln na posição 375 (H375Q) foram ignoradas por todos os 27 anticorpos, indicando que esses resíduos não são reativos, ou que as alterações nos epítopos conformacionais requerem mais do que uma única substituição de aminoácidos. A alteração dos dois resíduos nas posições 365 e 367 alteraram dramaticamente a ligação do anticorpo individual, Mab.35.1. A análise de sequência do 5.35.1 mostrou um uso único do VH3-20 e do único CDR3 tanto nas cadeias pesada e leve. Todos os pontos de fusão das moléculas quiméricas Ang-2 e mutações pontuais estão destacados na Figura 8. Figura 9 é uma comparação da sequência de aminoácidos da Ang-1 de camundongo (SEQ ID NO: 5), Ang-1 humana (SEQ ID NO: 2), Ang-2 de camundongo (SEQ ID NO: 4) e Ang-2 humana (SEQ ID NO: 3). A cabeça da seta mostra o sítio de clivagem para as sequências líderes hidrofóbicas. As setas definem os limites dos domínios em espiral enrolado e inclinado ao fibrinogênio. Os círculos sólidos mostram os resíduos de cisteína conservados (imagem tomada de Maisonpierre et al.,1997, Science 277:55).

[00280] Os dados de ligação a todas as moléculas de Ang-2 estão resumidos abaixo na Tabela 16. Tabela 16

[00281] Os dados são apresentados como o porcentual de liga ao em comparação com a Ang-2 humana. Tabela 17 Análise de sequência e reatividade cruzada com Ang-2 de camundongo

[00282] A análise de sequência das sequências IgH e IgL foi feita usando ferramentas do programa de computador de análise de sequência, e pelo alinhamento dos genes VH a um banco de dados de linhagens germinativas. O programa de computador também avaliou elementos D, a estrutura de leitura, inserção da região N, a adição de nucleotídeo P, a perda de nucleotídeos e o comprimento do CDR3. A análise de 27 anticorpos individuais específicos ao CR64 produziram somente 7 linhagens germinativas de genes VH, 10 das quais da mesma família VH1. A seleção de anticorpos neutralizantes mostrou que os anticorpos expressando a mesma Ig VH, e em alguns casos, os mesmos rearranjos de VHDJH, e que pares de cadeia H e L foram conservados. Essa descoberta sugere que, para um dado epítopo, somente alguns membros do repertório da linhagem germinativa são usados para formar o paratopo correspondente, e para cada epítopo antigênico um número limitado de genes de cadeia L- e H- podem parear para formar um parátopo específico.

[00283] O uso recorrente de estruturas VH, VK e regiões determinantes de complementaridade (CDR) por diferentes anticorpos monoclonais está ligado ao fato de que toda a atividade neutralizante da Ang-2 é restrita ao domínio do tipo fibrinogênio, e está de acordo com o trabalho publicado por Procopio et al (1999, JBC 274: 30196), mostrando que o efeito daAng-2 no Tie2 está ligado ao domínio do tipo fibrinogênio. O dado de mapeamento de epítopo indica que os anticorpos monoclonais se ligam a Ang-2 através de uma ampla interface que inclui a maioria dos domínios do tipo fibrinogênio.

EXEMPLO.16 DETERMINAÇÃO DA REATIVIDADE CRUZADA COM ANG-2 DE CAMUNDONGO

[00284] A reatividade cruzada dos mAbs de Ang-2 anti-humanos para o Ang-2 de camundongo foi testada por ELISA. Para esse propósito, um vetor de expressão de Ang-2 de camundongo foi construído, e células eucarióticas foram transfectadas transitoriamente para produzir Ang-2 de camundongo.

[00285] O constructo de expressão de Angiopoietina-2 de camundongo (mAng-2) foi obtido da Research Genetics, um distribuidor do consórcio I.M.A.G.E. (ver a rede mundial em image.llnl.gov). DNAc Ang-2 de camundongo (N° de Acesso Genbank BC027216, IMAGE:3494566) foi derivado da biblioteca NCI_CGAP_Lu29, a qual é uma biblioteca de tumor de pulmão. O DNAc foi clonado no vetor de expressão pCMV-SPORT6 (Invitrogen Carlsbad, CA), através dos sítios SalI(5') e NotI(3') e continha a estrutura de leitura aberta (mAng-2) do comprimento total da Ang-2 de camundongo de 496 aminoácidos, assim como as regiões flanqueadoras não- traduzidas 5' e 3' para um total de 2471 pares de base.

[00286] Dez μg do plasmídeo mAng-2 acima foram transfectados para células HEK293F usando o método do fosfato de cálcio. Aproximadamente 1 x 10 6 células HEK293F foram semeadas numa placa de cultura de tecido de 10 cm no dia anterior. O meio foi alterado depois de 5 horas ou transfecção de um dia para o outro e as células cresceram durante outros 2 - 3 dias antes de os sobrenadantes contendo a proteína mAng-2 secretada ser coletada. A expressão de mAng-2 foi confirmada por ELISA usando um anticorpo policlonal obtido da R&D Systems (N° de catálogo AF623).

[00287] Immplates™ Nunc de 96 poços foram revestidos com meio condicionado coletado de transfectantes Ang-2 de HEK293F/camundongo, 100 μL em cada poço. As placas foram incubadas a 4°C de um dia para o outro, seguido pela lavagem de quatro vezes usando Salina de Tampão Fosfato com uma estação Skan Washer 300 (SKATRON). Os poços foram bloqueados par 100 μL de tampão de bloqueio ABX (BSA 0,5%, Tween 0,1%, Timerosal 0,01% em PBS) por 1 hora.

[00288] mAbs Anti-Ang-2 com concentrações apropriadas e diluídos no tampão de bloqueio foram adicionados nos poços com um volume de 100 μL/poço, e incubados em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora. Os mAbs e cada um dos diluídos foram testados em duplicata. Depois de lavar duas vezes, os mAbs ligados foram detectados por anticorpo FcHPPO- conjugado anti-humano de cabra (Caltag, Código H10507), em diluição 1/1.000 em temperatura ambiente por uma hora. Para ajustar a detecção da reação cromogênica, 100 μL de substrato TMB (micropoço TMB, BioFX, N° Cat TMSK-1000-01) foi adicionado depois da lavagem dos poços três vezes usando PBS. As placas foram incubadas por 30 minutos antes da solução de parada 650 (100 μL/poço, BioFX, N° Cat BSTP-0100-01 foi adicionado para terminar a reação. A absorvância de luz a 650nm foi determinada por um leitor Spectramax Plus.

[00289] Os 27 principais mAbs neutralizantes foram testados nesse ensaio. A absorvância de luz demonstrou que anticorpos monoclonais 3.19.3, 3.38, 5.2.1, 5.52.1, 5.56.1 e 5.78.1 foram capazes de se ligar a Ang-2 de camundongos sob as condições experimentais. Para confirmação, cada anticorpo de ligação foi titulado por ELISA. Os valores da média da OD 650 nm (± S.D.) foram colocados num gráfico contra o log da concentração de mAbs (μg/mL) e estão mostrados na Figura 10. Os clones 5.2.1, 5.28.1, 3.19.3 e 3.31.2 estão mostrados na figura. Os anticorpos monoclonais 5.2.1 e 3.19.3 se ligam ao Ang-2 de camundongo de uma forma dose-dependente, alcançando a saturação em cerca de 10 μg/mL (Figura 10). As curvas de ligação desses dais mAbs foram curvas de relação dose resposta sigmoidal típicas. A dose-dependência e a saturação não foram observadas na faixa de concentração de anticorpo testada, exceto para os clones 5.2.1 e 3.19.3. Baseando-se nesse resultado, parece que somente os mAbs 5.2.1 e 3.19.3 tem reatividade cruzada para a Ang-2 de camundongo.

EXEMPLO.17 INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DA ANG-2 DE MURINO AO TIE2 HUMANO

[00290] O anticorpo monoclonal 3.19.3 foi selecionado para testagem adicional de sua capacidade de inibir a ligação da Ang-2 de camundongo ao Tie2 humano. Para esse propósito, uma placa de ELISA foi revestida com 4 μg/mL de hTie2/Fc (R&D Systems, Inc.) a 100 μL/poço, e os poços foram bloqueados como de rotina a 4 °C de um dia para o outro. A Ang-2 de camundongo recombinante (mAng-2) no sobrenadante da cultura dos transfectantes 293T/mAng-2 descritos acima foi empregada. 100 μL de mAng-2 contendo sobrenadante com mAb 3. 19.3 em várias concentrações foram adicionados nos poços pré-revestidos, e incubados em temperatura ambiente por 1 h.

[00291] Como um controle, a Ang-2 humana recombinante (R&D Systems, Inc.) misturada com o anticorpo também foi incluída. Cada concentração do mAb foi testada em triplicata. As Ang-2 humana e de camundongo ligada foram detectadas usando um anticorpo policlonal Ang-2 anti-humano de cabra (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) que reagem de forma cruzada com Ang-2 de camundongo, acopladas com uma IgG-HRP anti-cabra de coelho secundária. OD650 foi determinada 30 minutos depois de o aubstrato HRP ter sido adicionado. Foi descoberto que o mAb 3.19.3 inibiu a ligação tanto da Ang-2 humana quanto de camundongo para o Tie2 humano de uma forma dose-dependente (Figura 11).

EXEMPLO.18 DETERMINÇÃO DA REATIVIDADE CRUZADA COM VASCULATURA DE MACACO

[00292] Devido ao fato da Ang-2 ser especificamente expressa em células endoteliais angiogênicas, essas células de macacos foram imunoistoquimicamente manchadas com anticorpos anti-Ang-2 como uma forma de determinar indiretamente se cada anticorpo reagiu de forma cruzada com a Ang-2 de macaco.

[00293] Os 10 principais mAbs neutralizantes selecionados conforme descrito no Exemplo 4 (Tabela 4) foram examinados nesse experimento usando tecido ovariano rico em células endoteliais de macacos. Seções de tecido ovariano de macaco (macaco cinomolgo) congelado de 6 μm completamente congeladas foram fixadas com acetona, a 4°C, por 5 minutos. Depois da lavagem das superfícies três vezes com PBS, a peroxidase endógena dos tecidos foi bloqueada com 0,3% de H2O2 por 10 minutos. Subsequentemente, os tecidos foram lavados com PBS e bloqueados com 10 μg/mL de IgG Fab anti-humano de cabra por 15 minutos. As seções teciduais foram lavadas novamente com PBS, seguido pelo tratamento com soro de cabra normal a 10% por 10 minutos. Depois de drenar o soro, cada um dos 10 mAbs anti-Ang-2 (10 μg/mL) foram aplicados a seções e incubados por 2 horas. Os mAbs Ang-2 ligados foram detectados com 10 μg/mL de IgG anti- humano de camundongo por minutos, seguido pela incubação com IgG anti- camundongo de cabra conjugada com peroxidase por 30 minutos. O manchamento foi efetuado usando o sistema de substrato ACE (DAKO, N° CAT 3464) sob observação microscópica para resultado ótimo.

[00294] Descobriu-se que todos os 10 mAbs mancham as células endoteliais vasculares angiogênicas do tecido ovariano; enquanto que os mAbs de controle de isotipo não mancham. Isso demonstrou que os 10 mAbs da Tabela 4 poderiam reagir de forma cruzada com Ang-2 de macaco.

EXEMPLO 19 MAB 3.19.3 INIBE A ANGIOGÊNESE IN VIVO NO ENSAIO DE TAMPÃO MATRIGEL

[00295] Para avaliar o potencial anti-angiogênico in vivo de anticorpos monoclonais anti-Ang-2, um ensaio de angiogênese de tampão Matrigel foi conduzido. Descobriu-se que células MCF-7 produzem a Ang-2 quando cultivadas in vitro, ou implantadas num camundongo imunodeficiente como um xenoenxerto. Quando MCF-7 foi incorporada no Matrigel e implantada subcutaneamente em camundongos atímicos, foi encontrada uma vasculatura robusta em crescimento no gel. Para estabelecer o modelo de tampão MAtrigel, camundongos BALB/c/nu/nu femeas, de 6-8 semanas de idade, com pesos corporais variando de 18 a 20 g (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram empregados. Um total de 0,5 mL de Matrigel contendo 2 x 106 células MCF-7, com ou sem anticorpos Ang-2, ou agentes de controle (incluindo somente o Matrigel, controles de isotipo Tie2/Fc, IgG2 e IgG4, e mAb anti-VEGF) foram injetados subcutaneamente no flanco do camundongo atímico. Cinco camundongos foram usados para cada grupo de teste. Todos os mAbs testados foram ajustados até uma concentração de 100 μg/mL.

[00296] Depois de sete dias, os tampões de Matrigel foram colhidos e pontuados quanto a densidade de vasos sanguíneos. Para esse propósito, o deslocamento cervical dos camundongos sob anestesia profunda foi efetuado. Os tampões de Matrigel foram expostos através da remoção da aba da pele de cobertura. Os tampões Matrigel foram, a seguir, removidos e imagens digitais foram, a seguir, registradas. Os tampões de Matrigel foram ressecados cuidadosamente e cortados em duas partes. Uma parte foi congelada rapidamente em TissueTek e a outra foi fixada em formalina tamponada. Ambas as partes foram, a seguir, embebidas em parafina para cortar. Três seções de 5 a 7 μm de espessura de cada camundongo foram cortadas e manchadas com hematoxilina e eosina. As seções foram, então, examinadas sob um microscópio de contraste de fase. Fotomicrografias representativas foram registradas [dois quadros (100 x e 400 x)] e a infiltração do vaso sanguíneo e a célula endotelial foram registrados.

[00297] Os tampões de Matrigel congelados foram divididos (seções de 10 μm) num micrótomo Cryocut. Foram feitas duas seções independentes por camundongo e usadas para manchamento. As seções foram bloqueadas com BSA (0,1%) e, a seguir, tratadas com anticorpo monoclonal reativo a camundongo. CD31 conjugado a Ficoeritina (diluições conforme recomendações do fabricante). Depois de lavagens completas, as seções foram montadas sob reagente anti-desbotamento (Vecta Shield) e observadas sob um microscópio de UV usando um filtro vermelho. Imagens digitais representativas foram capturadas (duas imagens com um aumento de 100 x e 200 x). Os núcleos foram contramanchados com DAPI. As imagens de imunofluorescência do manchamento CD31 foram analisadas pelo programa Skeletinizaiton. Os dados foram processados para fomecer a densidade de vasos média, o nodo e o comprimento para cada grupo. Os resultados podem ser encontrados nas Figuras 12A e 12B, as quais mostram o efeito dos anticorpos anti-Ang-2 na quantidade de extremidades de vasos sanguíneos (Figura 12A) e comprimento de vaso sanguíneo (Figura 12B).

[00298] Esse experimento demonstrou que, em comparação com o Matrigel sozinho, as células MCF-7 que foram incorporadas no Matrigel foram capazes de induzir um nivel significativo de angiogênese. A angiogênese induzida poderia ser inibida por um controle positivo de anticorpo anti-VEGF. A angiogênese também foi significativamente inibida pela proteína Tie2/Fc recombinante solúvel, sugerindo que a Ang-2 produzida pelas células MCF-7 desempenha um papel na angiogênese nesse modelo. Pela ligação a qualquer Ang-2, o Tie2/Fc poderia reduzir efetivamente o nivel de Ang-2 que é exposto as células MCF-7.

[00299] Não está claro como o anticorpo de controle negativo do isotipo IgG2, PK 16.1.3, impactou na angiogênese, embora esse anticorpo também se descobriu que esse anticorpo interfere ocasionalmente com o crescimento tumoral em alguns modelos de xenoenxerto (dados não apresentados) O anticorpo de controle de isotipo IgG4 não teve um efeito na angiogênese nesse modelo. Conforme visto nas Figuras 12A e 12B, os clones 5.88.3, 3.3.2, 3.19.3 e 5.28.1 inibiram significativamente a angiogênese (P < 0,05, teste t efetuado por VasculoGen), enquanto outros tiveram menos efeitos.

[00300] É bem estabelecido que a Ang-2 é expressa por células endoteliais no tumor, e dessa forma tem sido considerada um fator angiogênico que estimula a própria célula. Entretanto, também se descobriu que a Ang-2 é expressa por muitos tipos de células tumorais in vitro e in vivo. Exceto o 3.19.3, os mAbs testados aqui não reagem de forma cruzada com Ang-2 de camundongo. Nesse modelo in vivo, os mAbs somente neutralizaram Ang-2 humana produzida pela célula MCF-7, mas não a Ang-2 de camundongo. O efeito inibitório desses mAbs sugere que a Ang-2 expressa em tumor pode ser um fator de angiogênese que estimula células vizinhas. A atividade antiangiogênica total do mAb foi parcialmente atribuível à neutralização do tumor Ang-2, Além da neutralização da Ang-2 expressa por endotélio vascular.

EXEMPLO 20 DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA TERAPÊUTICA DO MAB 3.19.3 EM MODELO DE XENOENXERTO PREVENTIVO A431

[00301] Clone 3.19.3 de mAb anti-Ang-2 não somente se ligou a Ang- 2 de camundongo, mas também inibiu a ligação da Ang-2 de camundongo ao Tie2 humano. A atividade antitumoral desse anticorpo monoclonal foi testada num modelo de xeno enxerto de camundongo do carcinoma epidermóide de pele humana pelo uso da linhagem celular A431.

[00302] As células A431 foram cultivadas em frascos como a rotina até que as células alcançassem a subconfluência. Camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (Balb/c/nu/nu) foram empregados para desenvolvimento de modelo. As células A431 foram colhidas e suspensas em Matrigel. Uma suspensão celular contendo 5 x 106 células foi injetada intradermicamente no flanco do camundongo. Os camundongos foram aleatorizados em diferentes grupos, cada um contendo 11 camundongos. No mesmo dia, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 0,5 mg de mAb 3.19.3, ou anticorpo de controle de isotipo, e duas vezes por semana depois disso. As dimensões de cada tumor foram medidas duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como: Volume= Comprimento x (largura)2 x 0,5 (cm3) .

[00303] Conforme ilustrado na Figura 13, mAb 3.19.3 atrasou significativamente o crescimento tumoral do xenoenxerto A431. O volume de tumor médio do grupo de controle do isotipo alcançou cerca de 1,5 cm3 no final do experimento, enquanto a taxa de crescimento do grupo tratado ficou significativamente mais lenta depois do Dia 10, e foi cerca de 0,5 cm3 no final. No Dia 23, a ration de volume de T/C (tratamento/ controle) e 1/3, indicando uma inibição de 66% do crescimento.

[00304] Os resultados sugerem que na dosagem usada nesse experimento, pela ligação a Ang-2 de camundongo e pelo bloqueio da ligação desse ligante ao seu receptor Tie2, o mAb 3.16.3 foi capaz de atrasar significativamente o crescimento do xenoenxerto A431 em camundongos atimicos. É provável que o efeito antitumoral do anticorpo monoclonal seja devido a inibição da angiogênese no hospedeiro, conforme demonstrado pelos ensaios de tampão Matrigel. Usando a Densidade de microvasos (MVD) no tumor como um marcador fármaco dinâmico, o mecanismo de ação em relação a antiangiogênese e adicionalmente demonstrado no Exemplo 22.

[00305] O mecanismo de ação do mAb 3.19.3 pode não estar limitado ao bloqueio da associaçãoAng-2/Tie2 e à consequente sinalização. Conforme indicado no Exemplo 7, esse mAb também se descobriu que se liga a Ang-1 e bloqueia a ligação da Ang-1 ao Tie2. Interessantemente, o mAb também bloqueia a fosforilação ao Tie2 induzida pela Ang-1. É sabido que a Ang-1 está envolvida na maturação de vasos. Ao comparar a potência do mAb 3.19.3 para a sua inibição na ligação da Ang-1 contra a Ang-2 ao Tie2 (Exemplo 12), é evidente que a mAb 3.19.3 é predominantemente um antagonista da Ang-2. Sem estar ligado a qualquer teoria particular, é possível que um bloqueio duplo de sinalização da Ang-2 e da Ang-1 evite a angiogênese e, consequentemente, o crescimento tumoral.

EXEMPLO.21 MAB 3.19.3 INIBE O CRESCIMENTO TUMORAL EM XENOENXERTO ESTABELECIDO

[00306] Ang-2 é suprarregulada por células endoteliais angiogênicas e é correlacionada com a progressão de muitos tipos de tumor. É sensato postular que um anticorpo monoclonal que bloqueie a ligação da associação Ang-2/Tie2 será capaz de inibir a angiogênese, e dessa forma, inibir o crescimento tumoral. Nesse experimento, a eficácia terapêutica de um mAb anti-Ang-2 foi demonstrada. Uma vez que o mAb 3.19.3 reage de forma cruzada e neutraliza a sinalização de Ang-2/Tie2 de camundongo, esse mAb foi escolhido para demonstrar a eficácia in vivo da inibição do crescimento tumoral.

[00307] Para testar se o mAb 3. 19. 3 anti-Ang-2 também inibe o tumor estabelecido, e tumores diferentes do A- 4 31, o modelo de xenoenxerto LoVo de adenocarcinoma de colon humano foi empregado. Doses de Mab 3.19.3 a 0,5, 2 e 10 mg/Kg foram administradas duas vezes por semana, intra peritonealmente. Os tratamentos não começaram até que os tumores fossem estabelecidos com um volume médico de 0,2 cm3. Nesses tumores estabelecidos, mAb 3.19.3 também demonstrou um efeito inibitório em comparação com o controle de isotipo. A Figura 14A mostra que 79% da inibição a 0,5 e 2 mg/Kg (valores de p são de 0,022 e 0,027, respectivamente) foi alcançada, e que 75% de inibição no crescimento tumoral foi encontrado (p = 0,006) a 10 mg/Kg.

[00308] O efeito inibitório de crescimento tumoral foi reproduzido num modelo de xenoenxerto adicional, adenocarcinoma de colon humano SW4 8 0, o qual foi deixado crescer até um volume médio de 0,2 cm3. Embora a 0,5 mg/Kg o mAb 3.19.3 não foi averiguado como tendo um efeito significativo, tanto em 2 quanto em 10 mg/Kg, o mAb inibiu o crescimento tumoral por 60% (p = 0,003 e 0,006, respectivamente) no Dia 53 depois do implante tumoral (Figura 14B).

[00309] Em resumo dos resultados acima, mAb 3.19.3 anti-Ang-2 inibiu significativamente o crescimento tumoral nos três modelos testados. Interessantemente, tanto o LoVo quanto o SW480 expressam Ang-2 humana. Entretanto, dois outros mAbs que não tem reatividade cruzada a Ang-2 de camundongo não mostraram atividade inibitória significativa no crescimento tumoral (dados não apresentados), apesar do fato de que a Ang-2 humana foi expressa pelas células tumorais. Esses resultados implicam que um antagonista do hospedeiro Ang-2 e requerido para bloquear a angiogênese e o crescimento tumoral.

[00310] Conforme discutido acima, Mab 3.19.3 reage de forma cruzada com a Ang-1. Entretanto, a potência do mAb 3.19.3 na associação Ang-1/Tie2 foi muito menor do que aquela na associação Ang-2/Tie2 (Exemplo 12). Por essa razão, é sensato concluir que a eficácia terapêutica vista nesses modelos é predominantemente devido ao antagonismo Ang-2. Entretanto, o bloqueio da Ang-1 in vivo nos modelos não pôde ser completamente excluído.

[00311] Durante o andamento inteiro dos experimentos, nenhum efeito tóxico óbvio, tal como perda de peso ou hemorragia, foi observado.

EXEMPLO 22 EFICÁCIA IN VIVO DO MAB 3.19.3 EM MODELOS DE XENOENXERTO DE TUMOR ADICIONAIS

[00312] A atividade antitumoral do anticorpo monoclonal 3.19.3 foi testada em modelos de xenoenxerto de camundongo em câncer humano pelo uso de 9 diferentes linhagens celulares tumorais.

[00313] Células de adenocarcinoma de colon (Lovo, SW480, Colo205, HT29, HCTl 16), carcinoma epidermóide (A431), carcinoma de pulmão (Calu-6) e adenocarcinoma de mama (MCF7, MDA-MB-231) foram cultivadas em frascos como rotina até as células alcançarem a subconfluência. Camundongos fêmeas de 7-10 semanas de idade imunodeficientes foram empregados para desenvolvimento de modelo. As células foram coletadas, suspensas em Matrigel e, a seguir, injetadas subcutaneamente em cada camundongo. Os camundongos foram, a seguir, aleatorizados em grupos contendo 10-12 camundongos. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 0,5 mg de mAb 3.19.3, ou anticorpo de controle de isotipo, e duas vezes por semana depois disso. Para todos os experimentos, o tratamento com anticorpo de controle de isotipo foi incluído. As dimensões de cada tumor foram medidas duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como: Volume = Comprimento x (largura)2 x 0,5(cm3). Comparações gráficas de inibição de crescimento tumoral são mostradas para os xenoenxertos HT29 (Figura 15A) e Calu6 (Figura 15B).

[00314] Conforme visto na Tabela16, mAb 3.19.3 mostrou atividade significativa em todos os 7 modelos subcutâneos de xenoenxerto testados e em ambos os modelos ortotópicos com dose e cronograma não-otimizados. Tabela 18 Resumo da eficácia in vivo do mAb 3.19.3

P < 0,05 em todos os casos * Inibição do crescimento estatisticamente não significativa. ND não determinado

[00315] O tecido tumoral MDA-MB-231 foi analisado através da densidade de manchamento de vaso CD31+. A densidade de manchamento CD31 foi medida pelo limiar e pelos métodos de contagem de grade manuais. Onze tumores por grupo e pelo menos 20 imagens por tumor foram analisadas. Conforme visto na Figura 15C, o tratamento de camundongos com anticorpo 3.19.3 reduziu a densidade do manchamento CD31 por 40% em comparação com um anticorpo IgG de controle. Isso foi estatisticamente significativo com ambos os métodos de contagem, contagem de grade manual (p< 0, 00004) e de limiar (p < 0, 015) pelo teste T de 1 final. Contagens de vasos CD31+ similares foram feitas em tecido ex vivo para os xenoenxertos Colo205 e HCTl16. Essas amostras também exibiram uma redução significativa similar nos vasos CD31+.

EXEMPLO 23 USOS DE ANTICORPOS ANTI-ANG-2 PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS.RELACIONADAS COM A ANGIOGÊNESE

[00316] Para determinar os efeitos in vivo do tratamento com o anticorpo anti-Ang-1 e anti-Ang-2 em pacientes humanos com vários tumores sólidos, pacientes humanos são dosados periodicamente com uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-Ang-1 e anti-Ang-2. Em momentos periódicos durante o tratamento, os pacientes humanos são monitorados para determinar se o crescimento tumoral e inibido. Após o tratamento, e descoberto que os pacientes que sofrem o tratamento com o anticorpo anti- Ang-1e anti-Ang-2, em comparação com os pacientes que não são tratados, tem melhorias relativas em um ou mais dos seguintes, incluindo, mas sem se limitar a tumores menores, tempo atrasado de progressão ou tempo mais longo de sobrevivência.

EXEMPLO 24 USO DE ANTICORPOS ANTI-ANG-2 COMO AGENTE DE DIAGNÓSTICO Detecção de Antígeno Ang-2 numa amostra

[00317] Um ensaio imunossorvente ligado a enzima para a detecção do antígeno Ang-1 ou Ang-2 numa amostra pode ser desenvolvido. No ensaio, os poços de uma placa de microtitulação, tal como uma placa de microtitulação de 96 poços ou uma placa de microtitulação de 384 poços, são adsorvidos por varias horas com um primeiro anticorpo monoclonal completamente humano direcionado contra Ang-1 e Ang-2. O anticorpo imobilizado serve como um anticorpo de captura para qualquer um dos antígenos que podem estar presentes numa amostra de teste. Os poços são rinsados e tratados com um agente de bloqueio, tal como uma proteína do leite ou albumina, para prevenir a adsorção não-específica do analito.

[00318] Subsequentemente os poços são tratados com uma amostra de teste suspeita de canter o antígeno, ou com uma solução contendo uma quantidade padrão do antígeno. Tal amostra pode ser, por exemplo, uma amostra de soro a partir de um indivíduo suspeito de ter niveis de antígeno circulante considerados como sendo diagnósticos de uma patologia.

[00319] Depois de remover por rinsagem a amostra de teste ou o padrão, os poços são tratados com um segundo anticorpo anti-Ang-1 e anti- Ang-2 monoclonal completamente humano que é marcado por conjugação com biotina. Camundongo ou outras origens de espécies monoclonais podem também ser usadas. O anticorpo anti-Ang-1 e anti-Ang-2 marcados servem como um anticorpo de detecção. Depois de remover por rinsagem o excesso do segundo anticorpo, os pocos são tratados com peroxidase de rabano silvestre conjugada com avidina (HRP) e um substrato cromogênico adequado. A concentração do antígeno nas amostras de teste e determinada pela comparação com uma curva padrão desenvolvida das amostras padrões.

[00320] O ensaio de ELISA fomece um ensaio altamente específico e muito sensível para a detecção do antígeno Ang-1 e Ang-2 numa amostra de teste.

Determinação da concentração de antígeno Ang-2 em pacientes

[00321] Um ELISA de sanduíche é desenvolvido para quantificar os níveis de Ang-1 e de Ang-2 no soro humano. Os dois anticorpos anti-Ang-2 monoclonais completamente humanos do ELISA sanduíche, reconhecem diferentes epítopos na molécula Ang-2. Alternativamente, anticorpos monoclonais de camundongo ou outras origens de espécies podem ser usados. O ELISA poderia ser, mas não é necessáriamente efetuado como se segue: 50 μL de anticorpo anti-Ang-2 de captura em tampão de revestimento (NaHCO3 0,1 M, pH 9,6) numa concentração de 2 μg/mL é revestido em placas de ELISA (Fisher). Depois da incubação a 4°C de um dia para o outro, as placas são tratadas com 200 μL de tampão de bloqueio (BSA 0,5%, Tween 0,1%, Timerosal 0,01% em PBS) por 1 hora a 25°C. As placas são lavadas (3 x) usando Tween 20 0,05% em PBS (tampão de lavagem, WB). (Clinomics, Bioreclaimation). Soro normal ou de paciente são diluídos em tampão de bloqueio contendo 50% de soro humano. As placas são incubadas com amostras de soro de um dia para o outro a 4°C, lavadas com WB e, a seguir, incubadas com 100μL/poço de anticorpo anti-Ang-2 de detecção biotinilado por 1 hora a 25°C. Depois da lavagem, as placas são incubadas com HRP- Estreptavidina por 15 minutos, lavadas como antes e, a seguir, tratadas com 100 μL/poço de o-fenilenediamina em H2O2 (solução de desenvolvimento Sigma) para geração de cor. A reação é parada com 50μL/poço de H2SO4 (2M) e analisada usando um leitor de placa de ELISA a 492 nm. A concentração do antígeno Ang-2 em amostras de soro é calculada pela comparação das diluições de antígeno Ang-2 purificado usando um programa de ajuste de curva de quatro parâmetros.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00322] Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedidos de patentes, jomais, livros texto e semelhantes, e as referências citadas nisso, até a extensão de que elas não estão prontas, são por meio disto incorporadas por referência na sua totalidade.

EQUIVALENTES

[00323] A específicação escrita precedente é considerada como sendo suficiente para capacitar um indivíduo versado na técnica para praticar a invenção. A descrição antecedente e os Exemplos detalham certas modalidades preferidas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será percebido, entretanto, que não importa o quão detalhado o antecedente pode parecer no texto, a invenção pode ser praticada de muitas formas e a invenção deve ser construída de acordo com as reivindicações em anexo e quaisquer equivalentes seus.

Claims

1. Agente de ligação alvejado que se liga à angiopoietina-2, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação alvejado é um anticorpo de comprimento completo ou um fragmento do mesmo compreendendo uma cadeia pesada variável CDR1, CDR2, e CDR3 de SEQ ID NO: 79, e uma cadeia leve variável CDR1, CDR2, e CDR3 de SEQ ID NO: 81.

2. Anticorpo monoclonal que se liga a Ang-2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia leve variável e uma cadeia pesada variável selecionada do grupo que consiste de uma sequência de cadeia leve variável compreendendo SEQ ID NO: 81 e uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo SEQ ID NO: 79.

3. Agente de ligação alvejado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ligação alvejado previne a fosforilação do Tie2.

4. Agente de 1igação alvejado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ligação alvejado se liga à angiopoietina-2 com um Kd menor do que 100 picomolar (pM) ou menor que 50 picomolar (pM).

5. Agente de ligação alvejado, de acordo com a reivindicação 1 ou da reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação alvejado é um anticorpo monoclonal.

6. Agente de ligação alvejado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ligação alvejado é um anticorpo monoclonal completamente humano.

7. Agente de ligação alvejado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ligação alvejado é mAb 3.19.3 (Número de Acesso ATCC PTA-7260).

8. Agente de ligação alvejado, de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de estar em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de codificar o agente de ligação alvejado como definindo na reivindicação 1 ou na reivindicação 2, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de SEQ ID NO: 78 ou SEQ ID NO: 80.

10. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula de ácido nucleico como definido na reivindicação 9.

11. Uso do agente de ligação alvejado, como definido na reivindicação 1 ou na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser no preparo de um medicamento para a prevenção ou o tratamento de um tumor maligno em um animal.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido animal é humano.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ligação alvejado é o anticorpo monoclonal 3.19.3 (Número de Acesso ATCC PTA-7260).

14. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido tumor maligno é selecionado do grupo consistindo de: melanoma, câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar de célula não-pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), tumor da tireóide, câncer gástrico (estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer do rim, câncer de colon, câncer pancreático e carcinoma epidermóide.

15. Uso do agente de ligação alvejado como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser no preparo de um medicamento para a prevenção ou tratamento de angiogênese induzido por angiopoietina-2 em um animal.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato do referido animal ser humano.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ligação alvejado ser um anticorpo monoclonal completamente humano.