JP2021185136A - コロナウイルスワクチン - Google Patents

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Abstract

【課題】コロナウイルス感染の予防または処置のためのＲＮＡを含む組成物を提供する。【解決手段】特定の位置にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡを含む、組成物を提供する。【選択図】なし

Description

本発明はコロナウイルス感染予防または処置のためのＲＮＡの分野に関する。特に、本発明はコロナウイルス感染に対してワクチン接種し、抗体および／またはＴ細胞応答などの有効なコロナウイルス抗原特異的免疫応答を誘発するための方法および薬剤に関する。これらの方法および薬剤は特に、コロナウイルス感染の予防または処置に有用である。ここに開示するＲＮＡの対象への投与はコロナウイルス感染に対して該対象を保護し得る。特に、ある実施態様において、本発明は対象においてコロナウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質に対する免疫応答を誘導するために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２Ｓタンパク質のエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ、すなわち、ワクチン抗原をコードするワクチンＲＮＡを対象に投与することを含む、方法に関する。ワクチン抗原をコードするＲＮＡの対象への投与は対象におけるワクチン抗原(および疾患関連抗原)に対する免疫応答を誘導するための、ワクチン抗原を提供し得る(適切な標的細胞によるＲＮＡ発現後)。
２０１９年１２月、中国の武漢で原因不明の肺炎の大流行が起こり、新規コロナウイルス(重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２；ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２)が根本原因であることが明らかとなった。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の遺伝子配列はＷＨＯで利用できるようになり、公開(ＭＮ９０８９４７.３)され、該ウイルスはベータコロナウイルスサブファミリーに分類された。配列分析により、系統樹はヒトに感染する他のコロナウイルスよりも重症急性呼吸器症候群(ＳＡＲＳ)ウイルス単離株、すなわち中東呼吸器症候群(ＭＥＲＳ)ウイルスとの密接な関係を明らかにした。２月２日、ドイツを含む２４か国で計１４,５５７症例が世界的に確認され、その後自律的な、ヒトからヒトへのウイルス拡散により、該ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の世界的蔓延となった。
コロナウイルスはスパイクタンパク質、エンベロープタンパク質(Ｅ)、膜タンパク質(Ｍ)およびヌクレオカプシドタンパク質(Ｎ)の計４構造タンパク質をコードする、プラス鎖、一本鎖ＲＮＡ((＋)ｓｓＲＮＡ)エンベロープウイルスである。スパイクタンパク質(Ｓタンパク質)は受容体認識、細胞への付着、エンドソーム経路を介する感染およびウイルスとエンドソーム膜の融合により駆動されるゲノム放出を担う。異なるファミリーメンバー間の配列は変わるが、Ｓタンパク質内に保存領域およびモチーフがあり、それによりＳタンパク質をＳ１およびＳ２の２サブドメインに分割することが可能となる。Ｓ２はその膜貫通ドメインと共に、膜融合を担うが、Ｓ１ドメインはウイルス特異的受容体を認識し、標的宿主細胞と結合する。数コロナウイルス単離株内で、受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)が同定され、Ｓタンパク質の一般構造が定義された(図１)。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するワクチンアプローチおよび治療剤は現在利用可能ではなく、まさに緊急に必要とされている。
宿主細胞認識および侵入ならびに宿主免疫系によるウイルス中和抗体の誘導におけるＳタンパク質の重要性により、ウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質およびＳ１またはＲＢＤなどのＳタンパク質のサブドメインをワクチン開発の標的と定めた。高次構造に重要な領域内の変異はより強い防御免疫応答の誘導に有益であるはずである。それ故に、数個の構築物の試験を想定した(図２)。ナイーブＳタンパク質が三量体であり、この三量体構造がタンパク質の安定性および抗原性に影響する可能性が最もあるため、安定なｇｐ１４０三量体の産生のためにＨＩＶにおいても使用され、ＳＡＲＳ ＲＢＤ構築物で機能的であるＴ４バクテリオファージフィブリチンドメインを導入する安定化構築物に基づく戦略を含めた。
概要
本発明は一般にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質を含む、アミノ酸配列、すなわち、ワクチン抗原をコードするＲＮＡ、すなわち、ワクチンＲＮＡの投与を含む、対象の免疫治療処置を包含する。故に、ワクチン抗原は対象におけるコロナウイルスＳタンパク質、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質に対する免疫応答を誘導するために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のエピトープを含む。ワクチン抗原をコードするＲＮＡは投与されると、標的抗原(コロナウイルスＳタンパク質、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質)またはその進行産物により標的とされる、免疫応答、例えば、抗体および／または免疫エフェクター細胞の誘導、すなわち、刺激、プライミングおよび／または増殖のために、抗原を提供する(適切な標的細胞によるポリヌクレオチドの発現後)。ある実施態様において、本発明により誘導される免疫応答はＢ細胞介在免疫応答、すなわち、抗体介在免疫応答である。これに加えてまたはこれとは別に、ある実施態様において、本発明により誘導される免疫応答はＴ細胞介在免疫応答である。ある実施態様において、免疫応答は抗コロナウイルス、特に抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２免疫応答である。
ここに記載するワクチンは、活性本体として一本鎖ＲＮＡを含み、これはレシピエントの細胞に侵入したら、各タンパク質に翻訳され得る。抗原配列をコードする野生型またはコドン最適化配列に加えて、ＲＮＡは安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大有効性について最適化された１以上の構造要素を含み得る(５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ(Ａ)テイル)。ある実施態様において、ＲＮＡはこれらの要素全てを含む。ある実施態様において、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ１)(ｍ２ ７,２’−ＯＧｐｐＳｐＧ)またはｍ２ ７,３’−ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’−Ｏ)ＡｐＧはＲＮＡ薬物物質の５’末端の特異的キャッピング構造として利用され得る。５’−ＵＴＲ配列として、所望により翻訳効率を上げるための最適化「コザック配列」と共に、ヒトアルファ−グロビンｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ配列が使用され得る。３’−ＵＴＲ配列として、高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続を確実にするために、コード配列とポリ(Ａ)−テイルの間に配置された「スプリット遺伝子のアミノ末端エンハンサー(amino terminal enhancer of split)」(ＡＥＳ)ｍＲＮＡ(Ｆと称される)およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ(Ｉと称される)由来の２つの配列要素(ＦＩ要素)の組み合わせが使用され得る。これらはＲＮＡ安定性および総タンパク質発現増強に寄与する配列のエクスビボ選択過程により同定された(引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１７／０６０３１４参照)。あるいは、３’−ＵＴＲはヒトベータ−グロビンｍＲＮＡの２個の反復３’−ＵＴＲであり得る。さらに、３０アデノシン残基のストレッチ、続く１０ヌクレオチドリンカー配列(ランダムヌクレオチドの)およびさらなる７０アデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長のポリ(Ａ)−テイルが使用され得る。このポリ(Ａ)−テイル配列はＲＮＡ安定性および翻訳効率を高めるために設計された。
さらに、分泌型シグナルペプチド(ｓｅｃ)を、好ましくはｓｅｃがＮ末端タグとして翻訳されるような方法で、抗原コード化領域に融合し得る。ある実施態様において、ｓｅｃはＳタンパク質の分泌型シグナルペプチドに対応する。融合タンパク質で一般に使用されるとおり、大部分がアミノ酸グリシン(Ｇ)およびセリン(Ｓ)からなる短リンカーペプチドをコードする配列を、ＧＳ／リンカーとして使用し得る。
ここに記載するワクチンＲＮＡを、投与用ＲＮＡ粒子を産生するために、タンパク質および／または脂質、好ましくは脂質と組み合わせ得る。種々のＲＮＡの組み合わせを使用するならば、投与用ＲＮＡ粒子を産生するためにこれらＲＮＡを一緒にまたは別々にタンパク質および／または脂質と組み合わせてもよい。
ある態様において、本発明はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む、組成物または医薬製剤に関する。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の免疫原性フラグメントはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は多量体複合体、特に三量体複合体を形成できる。この目的のために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列の多量体複合体、特に三量体複合体の形成を可能とするドメインを含み得る。ある実施態様において、多量体複合体形成を可能にするドメインは三量体化ドメイン、例えば、ここに記載する三量体化ドメインを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列はコドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によりコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変えない。
ある実施態様において、
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列、配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列もしくは配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は分泌型シグナルペプチドを含む。
ある実施態様において、分泌型シグナルペプチドは、好ましくはＮ末端で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに融合される。
ある実施態様において、
(ｉ) 分泌型シグナルペプチドをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii) 分泌型シグナルペプチドは配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列もしくは配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメント；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、ＲＮＡは修飾ＲＮＡ、特に安定化ｍＲＮＡである。ある実施態様において、ＲＮＡは少なくとも１個のウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、ＲＮＡは各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から独立して選択される。
ある実施態様において、ＲＮＡはウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される。
ある実施態様において、ＲＮＡは５’キャップを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、ポリＡ配列を含む。
ある実施態様において、ポリＡ配列は少なくとも１００ヌクレオチド含む。
ある実施態様において、ポリＡ配列は配列番号１４のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。
ある実施態様において、ＲＮＡは液体、固体またはそれらの組み合わせとして製剤化されているまたは製剤化されるべきである。
ある実施態様において、ＲＮＡは注射用に製剤化されているまたは製剤化されるべきである。
ある実施態様において、ＲＮＡは筋肉内投与用に製剤化されているまたは製剤化されるべきである。
ある実施態様において、ＲＮＡは粒子として製剤化されているまたは製剤化されるべきである。
ある実施態様において、粒子は脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)またはリポプレックス(ＬＰＸ)粒子である。
ある実施態様において、ＬＮＰ粒子は((４−ヒドロキシブチル)アザンジイル)ビス(ヘキサン−６,１−ジイル)ビス(２−ヘキシルデカノエート)、２−[(ポリエチレングリコール)−２０００]−Ｎ,Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびコレステロールを含む。
ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はＲＮＡとリポソームの混合により得られ得る。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はＲＮＡと脂質の混合により得られ得る。
ある実施態様において、ＲＮＡはコロイドとして製剤化されているまたは製剤化されるべきである。ある実施態様において、ＲＮＡはコロイドの分散相を形成する粒子として製剤化されているまたは製剤化されるべきである。ある実施態様において、ＲＮＡの５０％以上、７５％以上または８５％以上が分散相に存在する。ある実施態様において、ＲＮＡはＲＮＡおよび脂質を含む粒子として製剤化されているまたは製剤化されるべきである。ある実施態様において、粒子は、水相に溶解したＲＮＡを有機相に溶解した脂質に曝すことにより形成される。ある実施態様において、有機相はエタノールを含む。ある実施態様において、粒子は、水相に溶解したＲＮＡを水相に分散した脂質に曝すことにより形成される。ある実施態様において、水相に分散された脂質はリポソームを形成する。
ある実施態様において、ＲＮＡはｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡである。
ある実施態様において、組成物または医薬製剤は医薬組成物である。
ある実施態様において、組成物または医薬製剤はワクチンである。
ある実施態様において、医薬組成物は１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物をさらに含む。
ある実施態様において、組成物または医薬製剤はキットである。
ある実施態様において、ＲＮＡおよび所望により粒子形成成分は個別のバイアルに封入される。
ある実施態様において、キットは、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘導するための組成物または医薬製剤の使用上の指示をさらに含む。
ある態様において、本発明は、医薬用途のためのここに記載する組成物または医薬製剤に関する。
ある実施態様において、医薬用途は対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答の誘導を含む。
ある実施態様において、医薬用途はコロナウイルス感染の治療的または予防的処置を含む。
ある実施態様において、ここに記載する組成物または医薬製剤はヒトへの投与用である。
ある実施態様において、コロナウイルスはベータコロナウイルスである。
ある実施態様において、コロナウイルスはサルベコウイルスである。
ある実施態様において、コロナウイルスはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２である。
ある態様において、本発明は、対象にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関する。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の免疫原性フラグメントは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、多量体複合体、特に三量体複合体を形成できる。この目的のために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列の多量体複合体、特に三量体複合体の形成を可能とするドメインを含み得る。ある実施態様において、多量体複合体形成を可能にするドメインは三量体化ドメイン、例えば、ここに記載する三量体化ドメインを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列はコドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によりコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変えない。
ある実施態様において、
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列、配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列もしくは配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、分泌型シグナルペプチドを含む。
ある実施態様において、分泌型シグナルペプチドは、好ましくはＮ末端で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに融合される。
ある実施態様において、
(ｉ) 分泌型シグナルペプチドをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii) 分泌型シグナルペプチドは配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むまたは配列番号６のヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、ＲＮＡは修飾ＲＮＡ、特に安定化ｍＲＮＡである。ある実施態様において、ＲＮＡは少なくとも１個のウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、ＲＮＡは各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から独立して選択される。
ある実施態様において、ＲＮＡはウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される。
ある実施態様において、ＲＮＡはキャップを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、ポリＡ配列を含む。
ある実施態様において、ポリＡ配列は少なくとも１００ヌクレオチド含む。
ある実施態様において、ポリＡ配列は配列番号１４のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。
ある実施態様において、ＲＮＡは液体、固体またはそれらの組み合わせとして製剤化される。
ある実施態様において、ＲＮＡは注射により投与される。
ある実施態様において、ＲＮＡは筋肉内投与により投与される。
ある実施態様において、ＲＮＡは粒子として製剤化される。
ある実施態様において、粒子は脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)またはリポプレックス(ＬＰＸ)粒子である。
ある実施態様において、ＬＮＰ粒子は((４−ヒドロキシブチル)アザンジイル)ビス(ヘキサン−６,１−ジイル)ビス(２−ヘキシルデカノエート)、２−[(ポリエチレングリコール)−２０００]−Ｎ,Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびコレステロールを含む。
ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はＲＮＡとリポソームの混合により得られ得る。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はＲＮＡと脂質の混合により得られ得る。
ある実施態様において、ＲＮＡはコロイドとして製剤化される。ある実施態様において、ＲＮＡはコロイドの分散相を形成する粒子として製剤化される。ある実施態様において、ＲＮＡの５０％以上、７５％以上または８５％以上が分散相に存在する。ある実施態様において、ＲＮＡはＲＮＡおよび脂質を含む粒子として製剤化される。ある実施態様において、粒子は、水相に溶解したＲＮＡを有機相に溶解した脂質に曝すことにより形成される。ある実施態様において、有機相はエタノールを含む。ある実施態様において、粒子は、水相に溶解したＲＮＡを水相に分散した脂質に曝すことにより形成される。ある実施態様において、水相に分散された脂質はリポソームを形成する。
ある実施態様において、ＲＮＡはｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡである。
ある実施態様において、方法はコロナウイルスに対するワクチン接種のための方法である。
ある実施態様において、方法はコロナウイルス感染の治療的または予防的処置のための方法である。
ある実施態様において、対象はヒトである。
ある実施態様において、コロナウイルスはベータコロナウイルスである。
ある実施態様において、コロナウイルスはサルベコウイルスである。
ある実施態様において、コロナウイルスはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２である。
ここに記載する方法のある実施態様において、組成物はここに記載する組成物である。
ある態様において、本発明はここに記載する方法に使用するためのここに記載する組成物または医薬製剤に関する。
数ある中で、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチド(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするＳタンパク質)の少なくとも一部(例えば、エピトープであるまたはそれを含む)をコードする脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物が少なくとも１回のワクチン組成物の投与を含むレジメンにより成人対象集団に投与後７日以内に血清における該エピトープに対する検出可能な抗体力価を達成できることを示す。さらに、本発明は、そのような抗体力価の持続を示す。ある実施態様において、本発明は、対応する非修飾ｍＲＮＡで達成されるのと比較して、修飾ｍＲＮＡを使用したとき、このような抗体力価の上昇を示す。
ある実施態様において、提供されるレジメンは少なくとも１回投与を含む。ある実施態様において、提供されるレジメンは最初の投与および少なくとも１回のその後の投与を含む。ある実施態様において、最初の投与は少なくとも１回のその後の投与と同じ量である。ある実施態様において、最初の投与は全てのその後の投与と同じ量である。ある実施態様において、最初の投与は少なくとも１回のその後の投与の量と異なる。ある実施態様において、最初の投与は全てのその後の投与の量と異なる。ある実施態様において、提供されるレジメンは２回投与を含む。ある実施態様において、提供されるレジメンは２回投与からなる。
具体的実施態様において、免疫原性組成物は容器、例えば、バイアルに単回用量として製剤化される。ある実施態様において、免疫原性組成物はバイアルに多回用量製剤として製剤化される。ある実施態様において、多回用量製剤はバイアルあたり少なくとも２回分含む。ある実施態様において、多回用量製剤は、例えば、バイアルあたり２回分、３回分、４回分、５回分、６回分、７回分、８回分、９回分、１０回分、１１回分または１２回分など、バイアルあたり計２〜２０回分を含む。ある実施態様において、バイアルにおける各回分は等体積である。ある実施態様において、初回分は、その後の投与分と体積が異なる。
「安定な」多回用量製剤は許容されないレベルの微生物増殖を示さず、活性生物学的分子成分の崩壊または分解が実質的にないかまたはない。ここで使用する「安定な」免疫原性組成物は、対象に投与したとき所望の免疫応答を誘発する能力を維持している製剤を含む。
ある実施態様において、多回用量製剤は、多回用量容器への複数回または反復接種／刺入する特定の期間安定に維持される。例えば、ある実施態様において、多回用量製剤は、多回用量容器内に入れられたとき、少なくとも３日間、最大１０回使用に安定であり得る。ある実施態様において、多回用量製剤は２〜２０接種／挿入に安定なままである。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するレジメンによるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチド(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするＳタンパク質)の少なくとも一部(例えば、エピトープであるまたはそれを含む)をコードする脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物の投与は、一部対象(例えば、全対象、大部分の対象、約５０％以下、約４０％以下、約４０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下など)でリンパ球減少症をもたらし得る。数ある中で、本発明は、このようなリンパ球減少症が時間と共に回復し得ることを示す。例えば、ある実施態様において、リンパ球減少症は、約１４日、約１０日、約９日、約８日、約７日またはそれ未満の日数以内に回復する。ある実施態様において、リンパ球減少症はグレード３、グレード２またはそれ以下である。
故に、数ある中で、本発明は、成人の適切な集団に投与したとき、ここに記載するある特徴(例えば、ある効果の達成)を示すことにより特徴づけられる、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチド(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするＳタンパク質)の少なくとも一部(例えば、エピトープであるまたはそれを含む)をコードする脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物を提供する。ある実施態様において、提供される組成物は、温度が特定の閾値を超えない条件下で製造、保管、輸送、特徴づけおよび／または使用され得る。これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、提供される組成物は、製造、保管、輸送、特徴づけおよび／または使用の一部または全ての間、光から(例えば、特定波長から)保護され得る。ある実施態様において、提供される組成物の１以上の特性(例えば、サイズ、特定の部分または修飾の存在などにより評価し得る、例えば、ｍＲＮＡ安定性；脂質ナノ粒子安定性または凝集、ｐＨなどの１以上)は、投与前、製造、保管、輸送および／または使用中の１回以上の時点で評価され得るまたは評価されている。
数ある中で、本発明は、ｍＲＮＡ内のヌクレオチドが修飾されていない(例えば、天然に存在するＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ)ある提供される組成物および／またはこのような組成物に関して提供される方法が、内因性アジュバント効果により特徴づけられる(例えば、ある実施態様において成人集団であり得るまたはそれを含み得る適切な集団に投与したとき)ことを証明する。ある実施態様において、このような組成物および／または方法は抗体および／またはＴ細胞応答を誘導し得る。ある実施態様において、このような組成物および／または方法は、慣用のワクチン(例えば、タンパク質ワクチンなどの非ｍＲＮＡワクチン)と比較して、高いＴ細胞応答を誘導し得る。
これとは別にまたはこれに加えて、本発明は、ｍＲＮＡ内のヌクレオチドが修飾されている提供される組成物(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチド(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするＳタンパク質)の少なくとも一部(例えば、エピトープであるまたはそれを含む)をコードする脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物)および／またはこのような組成物に関する提供される方法が、内因性アジュバント効果を有しないまたは非修飾結果を有する以外同等な組成物(または方法)と比較して、減少した内因性アジュバント効果により特徴づけられる(例えば、ある実施態様において成人集団であり得るまたはそれを含み得る適切な集団に投与したとき)ことを証明する。これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、このような組成物(または方法)は、抗体応答および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の誘発により特徴づけられる(例えば、ある実施態様において成人集団であり得るまたはそれを含み得る適切な集団に投与したとき)。なおさらにこれとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、このような組成物(または方法)は、別のワクチン形式(例えば、ペプチドワクチン)で観察されるより高いＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導することにより特徴づけられる(例えば、ある実施態様において成人集団であり得るまたはそれを含み得る適切な集団に投与したとき)。修飾ヌクレオチドが関与するある実施態様において、このような修飾ヌクレオチドは、例えば、３’ＵＴＲ配列、抗原コード化配列および／または５’ＵＴＲ配列に存在し得る。ある実施態様において、修飾ヌクレオチドは１以上の修飾ウラシル残基および／または１以上の修飾シトシン残基であるまたはこれらを含む。
数ある中で、本発明は、提供される(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチド(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするＳタンパク質)の少なくとも一部(例えば、エピトープであるまたはそれを含む)をコードする脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物)および／または方法が、コードされるポリペプチド(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするタンパク質[例えばＳタンパク質]または、ある実施態様において、そのエピトープであり得るまたはそれを含み得るその一部)の持続発現により特徴づけられる(例えば、ある実施態様において成人集団であり得るまたはそれを含み得る適切な集団に投与したとき)ことを証明する。例えば、ある実施態様において、このような組成物および／または方法は、ヒトに投与したとき、このようなヒトからの生物学的サンプル(例えば、血清)における検出可能なポリペプチド発現を達成し、ある実施態様において、例えば、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４８時間またはそれ以上を含む、少なくとも少なくとも３６時間またはそれ以上である期間、このような発現が持続することにより特徴づけられる。
本明細書に接した当業者は、少なくとも一部(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチド(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするＳタンパク質)のエピトープであるまたはそれを含む))をコードする種々のｍＲＮＡ構築物を記載していることを理解する。本明細書に接した当業者は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の少なくとも一部、例えば少なくともＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＲＢＤ部分をコードする種々のｍＲＮＡ構築物を記載していることを特に理解する。なおさらに、本明細書に接した当業者は、本明細書が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチド(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするＳタンパク質)の少なくとも一部(例えば、エピトープであるまたはそれを含む)をコードするｍＲＮＡ構築物の特別の特徴および／または利点を記載していることを理解する。数ある中で、本明細書は、ある実施態様において、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質をコードしない、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ部分をコードするあるｍＲＮＡ構築物の驚くべきかつ有用な特徴および／または利点を特に証明している。何らかの特定の理論に拘束されることを願わないが、本明細書は、完全長未満のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質をコードする、特にこのようなＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の少なくともＲＢＤ部分をコードする提供されるｍＲＮＡ構築物が、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)としてまたはそれに使用するおよび／またはここに記載する免疫学的効果(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体および／またはＴ細胞応答(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答)の産生)の達成に特に有用および／または有効であり得ることを示唆する。
ある実施態様において、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の受容体結合部分を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)を提供し、該ＲＮＡはポリペプチドの細胞内発現に適する。ある実施態様において、このようなコードされるポリペプチドは完全Ｓタンパク質を含まない。ある実施態様において、コードされるポリペプチドは、例えば、配列番号５に示す受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。ある実施態様において、コードされるポリペプチドは配列番号２９または３１のペプチドを含む。ある実施態様において、このようなＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)はポリカチオン性ポリマー、ポリプレックス、プロテインまたはペプチドにより複合体化され得る。ある実施態様において、このようなＲＮＡは脂質ナノ粒子(例えば、ここに記載のもの)に製剤化され得る。ある実施態様において、このようなＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は免疫原性組成物(例えば、ワクチン)としてまたはそれにおいて使用するのにおよび／またはここに記載する免疫学的効果(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体および／またはＴ細胞応答(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答)の産生)の達成に特に有用および／または有効であり得る。ある実施態様において、このようなＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ヒト(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２への暴露および／または感染があることが知られているヒトおよび／またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２への暴露が知られていないヒトを含む)のワクチン接種に有用であり得る。
本明細書に接した当業者は、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質(例えば、このようなコードされるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質が少なくとも１以上のアミノ酸置換、例えば、ここに記載するプロリン置換を含み得る実施態様および／またはｍＲＮＡ配列が、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト対象にコドン最適化されている実施態様を含む)をコードする核酸配列を含む種々のｍＲＮＡ構築物を記載することをさらに認識する。ある実施態様において、このような完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質は、配列番号７に示すものであるまたはそれを含むアミノ酸配列を有し得る。なおさらに、本明細書に接した当業者は、数ある中で、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質をコードする核酸配列を含むあるｍＲＮＡ構築物の特定の特徴および／または利点を記載することを認識する。何らかの特定の理論に拘束されたくはないが、本発明は、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質をコードする提供されるｍＲＮＡ構築物が、特に対象集団(例えば、特定の年齢集団)における免疫原性組成物(例えば、ワクチン)としてまたはそのために使用するのに特に有用および／または有効であり得ることを示唆する。例えば、ある実施態様において、このようなｍＲＮＡ組成物は、若年(例えば、２５歳、２０歳、１８歳、１５歳、１０歳未満またはそれ以下)対象に特に有用であり得る；それとは別にまたはそれに加えて、ある実施態様において、このようなｍＲＮＡ組成物は、高齢対象(例えば、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳を超えるまたはそれ以上)に特に有用であり得る。具体的実施態様において、ここに提供するこのようなｍＲＮＡ構築物を含む免疫原性組成物は、少なくとも、一部対象(例えば、ある年齢群対象において)、投与レベルおよび／または投与数依存的全身反応原性(例えば、発熱、疲労、頭痛、悪寒、下痢、筋肉痛および／または関節痛など)および／または局所忍容性(例えば、疼痛、発赤および／または腫脹など)の最小から中程度の増加(例えば、３０％以下の増加、２０％以下の増加または１０％以下の増加またはそれ未満)を示す；ある実施態様において、このような反応原性および／または局所忍容性は、特に、若年年齢群(例えば、２５歳、２０歳、１８歳未満またはそれ以下)対象および／または年配(例えば、高齢)年齢群(例えば、６５〜８５歳)で観察される。ある実施態様において、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質をコードする提供されるｍＲＮＡ構築物は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染に関連する重症疾患のリスクが高い対象集団(例えば、高齢集団、例えば、６５〜８５歳群)におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体応答レベルを誘導するための、特に免疫原性組成物(例えば、ワクチン)としてまたはそれにおいて使用するのに特に有用および／または有効であり得る。ある実施態様において、本明細書に接した当業者は、数ある中で、若年および高齢年齢集団における好都合な反応原性プロファイル(例えば、ここに記載のもの)を示す完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質をコードする提供されるｍＲＮＡ構築物がここに記載する免疫学的効果(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体および／またはＴ細胞応答(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答)の産生)を達成するための免疫原性組成物(例えば、ワクチン)としてまたはそれにおいて使用するのに特に有用および／または有効であり得ることを認識する。ある実施態様において、本発明はまた、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質をコードする提供されるｍＲＮＡ構築物が、このようなｍＲＮＡ構築物を含む免疫原性組成物で免疫化し、続いてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２株に曝露させた非ヒト哺乳動物対象(例えば、アカゲザル)における、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡの早期の排除により特徴づけられるとおり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染に対する保護に特に有効であり得る。ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡのこのような早期の排除は、このようなｍＲＮＡ構築物を含む免疫原性組成物で免疫化し、続いてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２株に曝露させた非ヒト哺乳動物対象(例えば、アカゲザル)の鼻で観察され得る。
ある実施態様において、本発明は、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質(例えば、１以上のアミノ酸置換を有する完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質)をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)を提供し、該ＲＮＡはポリペプチドの細胞内発現に適する。ある実施態様において、コードされるポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、このようなＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)はポリカチオン性ポリマー、ポリプレックス、プロテイン又はペプチドにより複合体化され得る。ある実施態様において、このようなＲＮＡは脂質ナノ粒子(例えば、ここに記載のもの)に製剤化され得る。
ある実施態様において、ここに提供される免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ポリペプチドの複数の(例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０などを含む、例えば、少なくとも２以上の)免疫反応性エピトープまたはそのバリアントを含み得る。あるこのような実施態様において、このような複数の免疫反応性エピトープは複数のＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)によりコードされ得る。あるこのような実施態様において、このような複数の免疫反応性エピトープは単一ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)によりコードされ得る。ある実施態様において、複数の免疫反応性エピトープをコードする核酸配列は、単一ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)で互いにリンカー(例えば、ある実施態様においてペプチドリンカー)により離され得る。何らかの特定の理論に拘束されたくはないが、ある実施態様において、提供されるポリエピトープ免疫原性組成物(例えば、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質をコードするものを含む)は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２バリアントの遺伝的多様性を考慮して、多数のウイルスバリアントに対する保護の提供に特に有用であり得るおよび／または多様なおよび／または他の点で頑強な(例えば、永続性、例えば、１回以上投与後約５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日またはそれ以上検出可能な)中和抗体および／またはＴ細胞応答、特に、特別頑強なＴＨ１型Ｔ細胞(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞)応答を獲得する機会を増やし得る。
ある実施態様において、本発明は、提供される組成物および／または方法が単回投与で１以上の特定の治療結果(例えば、ここに記載する有効な免疫応答および／またはコードされるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメントの検出可能な発現)を達成することにより(例えば、ある実施態様において成人集団であり得るまたはそれを含み得る適切な集団に投与したとき)特徴づけられることを証明する；あるこのような実施態様において、結果を、例えば、ここに記載するｍＲＮＡワクチンの非存在下で観察されるものとの比較として、評価し得る。ある実施態様において、特定の結果は、１以上の別の戦略で必要であるより低用量で達成され得る。
ある実施態様において、本発明は単離メッセンジャーリボ核酸(ｍＲＮＡ)ポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供し、ここで、単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の受容体結合部分を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも１個の脂質ナノ粒子に製剤化される。例えば、ある実施態様において、このような脂質ナノ粒子は、２０〜６０％イオン化可能カチオン性脂質、５〜２５％非カチオン性脂質(例えば、中性脂質)、２５〜５５％ステロールまたはステロイドおよび０.５〜１５％ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ＰＥＧ−修飾脂質)のモル比を含み得る。ある実施態様において、脂質ナノ粒子に含まれるステロールまたはステロイドはコレステロールであり得るまたはそれを含み得る。ある実施態様において、中性脂質は１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(ＤＳＰＣ)であり得るまたはそれを含み得る。ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はＰＥＧ２０００ ＤＭＧであり得るまたはそれを含み得る。ある実施態様において、このような免疫原性組成物は約１mg〜１０mgまたは３mg〜８mgまたは４mg〜６mgの総脂質含有量を含み得る。ある実施態様において、このような免疫原性組成物は約５mg／mL〜１５mg／mLまたは７.５mg／mL〜１２.５mg／mLまたは９〜１１mg／mLの総脂質含有量を含み得る。ある実施態様において、このような単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、免疫原性組成物を少なくとも１回投与された対象における免疫応答の誘導のための有効量で提供される。ある実施態様において、提供される単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは完全Ｓタンパク質を含まない。ある実施態様において、免疫原性組成物において提供されるこのような単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドは自己複製ＲＮＡではない。
ある実施態様において、免疫応答は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２タンパク質(ある実施態様において、例えば、安定化融合前スパイク三量体を含む)またはそのフラグメントに対する結合抗体力価の産生を含み得る。ある実施態様において、免疫応答は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)に対する結合抗体力価の産生を含み得る。ある実施態様において、提供される免疫原性組成物は、最初の投与後検出可能な結合抗体力価を達成するために確立されており、このような提供される免疫原性組成物を受けた対象集団で、例えば、約２週間で少なくとも７０％(例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％および１００％までを含む)の抗体陽転である。
ある実施態様において、免疫応答は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２タンパク質(ある実施態様において、例えば、安定化融合前スパイク三量体を含む)またはそのフラグメントに対する中和抗体力価の産生を含み得る。ある実施態様において、免疫応答は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)に対する中和抗体力価の産生を含み得る。ある実施態様において、提供される免疫原性組成物は、適切な系(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したヒトおよび／またはその集団および／またはそのためのモデル系)で中和抗体力価を達成することが確立されている。例えば、ある実施態様において、このような中和抗体力価は、１以上のヒト集団、非ヒト霊長類モデル(例えば、アカゲザル)および／またはマウスモデルで示されている。
ある実施態様において、中和抗体力価は、適切な対照(例えば、非ワクチン接種対照対象または生存弱毒化ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチンまたはタンパク質サブユニットウイルスワクチンまたはそれらの組み合わせをワクチン接種した対象)で観察されるものに対して、Ｂ細胞のウイルス感染の減少に十分である(例えば、そうであると確立されている)力価である。あるこのような実施態様において、このような減少は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上である。
ある実施態様において、中和抗体力価は、適切な対照(例えば、非ワクチン接種対照対象または生存弱毒化ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチンまたはタンパク質サブユニットウイルスワクチンまたはそれらの組み合わせをワクチン接種した対象)で観察されるものに対して、無症候性ウイルス感染の割合の減少に十分である(例えば、そうであると確立されている)力価である。あるこのような実施態様において、このような減少は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上である。ある実施態様において、このような減少はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｎタンパク質血清学の評価により特徴づけられ得る。無症候性感染に対する顕著な保護が実生活観察によっても確認された(Dagan N. et al., N Engl J Med. 2021, doi: 10.1056/NEJMoa2101765. 印刷前のEpub. PMID: 33626250もまた参照)。
ある実施態様において、中和抗体力価は、適切な対照(例えば、非ワクチン接種対照対象または生存弱毒化ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチンまたはタンパク質サブユニットウイルスワクチンまたはそれらの組み合わせをワクチン接種した対象)で観察されるものに対して、ワクチン接種対象の上皮細胞および／またはＢ細胞とウイルスの融合の減少または遮断に十分である(例えば、そうであると確立されている)力価である。あるこのような実施態様において、このような減少は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上である。
ある実施態様において、中和抗体力価の誘導はＢ細胞数増加により特徴づけられ得て、これは、ある実施態様において形質細胞、クラススイッチＩｇＧ１およびＩｇＧ２陽性Ｂ細胞および／または胚中心Ｂ細胞を含み得る。ある実施態様において、提供される免疫原性組成物は、適切な系(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したヒトおよび／またはその集団および／またはそのためのモデル系)でこのようなＢ細胞数増加を達成することが示されている。例えば、ある実施態様において、このようなＢ細胞数増加は、１以上のヒト集団、非ヒト霊長類モデル(例えば、アカゲザル)および／またはマウスモデルで示されている。ある実施態様において、このようなＢ細胞数増加は、マウスモデルの排出リンパ節および／または脾臓で、このようなマウスモデルの提供される免疫原性組成物での免疫化後(例えば、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日後)示され得る。
ある実施態様において、中和抗体力価の誘導は、血中循環Ｂ細胞数の減少により特徴づけられ得る。ある実施態様において、提供される免疫原性組成物は、適切な系(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したヒトおよび／またはその集団および／またはそのためのモデル系)でこのような血中循環Ｂ細胞数の減少を達成することが確立されている。例えば、ある実施態様において、このような血中循環Ｂ細胞数の減少は、１以上のヒト集団、非ヒト霊長類モデル(例えば、アカゲザル)および／またはマウスモデルで示されている。ある実施態様において、このような血中循環Ｂ細胞数の減少は、マウスモデルでこのようなマウスモデルの提供される免疫原性組成物での免疫化後(例えば、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日後)示され得る。理論に拘束されることを願わないが、血中循環Ｂ細胞数減少はリンパ系区画へのＢ細胞ホーミングによるものであり得る。
ある実施態様において、提供される免疫原性組成物により誘導される免疫応答はＴ細胞数増加を含み得る。ある実施態様において、このようなＴ細胞数増加は、Ｔ濾胞性ヘルパー(ＴＦＨ)細胞数増加を含み得て、これは、ある実施態様においてＩＣＯＳ上方制御された１以上のサブセットを含み得る。当業者は、胚中心におけるＴＦＨ増殖が適応性Ｂ細胞応答に不可欠であり、またヒトにおいて、ワクチン接種後循環で生じるＴＦＨが一般に高頻度の抗原特異的抗体と相関することを理解する。ある実施態様において、提供される免疫原性組成物は、適切な系(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したヒトおよび／またはその集団および／またはそのためのモデル系)でこのようなＴ細胞数増加(例えば、ＴＦＨ細胞)を達成することが確立されている。例えば、ある実施態様において、このようなＴ細胞数増加(例えば、ＴＦＨ細胞)は、１以上のヒト集団、非ヒト霊長類モデル(例えば、アカゲザル)および／またはマウスモデルで示され得る。ある実施態様において、このようなＴ細胞数増加(例えば、例えば、ＴＦＨ細胞)は、マウスモデルの排出リンパ節、脾臓および／または血液で、このようなマウスモデルの提供される免疫原性組成物での免疫化後(例えば、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日後)示され得る。
ある実施態様において、提供される免疫原性組成物により誘導されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する防御反応は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のための適切なモデル系で確立されている。例えば、ある実施態様において、このような防御反応は、動物モデル、例えば、非ヒト霊長類モデル(例えば、アカゲザル)および／またはマウスモデルで示され得る。ある実施態様において、提供される免疫原性組成物で少なくとも１回免疫化を受けている非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル)またはその集団を、例えば、鼻腔内および／または気管内経路を介して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に曝露させる。ある実施態様において、このような暴露を、提供される免疫原性組成物で少なくとも１回の免疫化(例えば、少なくとも２回の免疫化を含む)の数週間(例えば、５〜１０週間)後に実施し得る。ある実施態様において、このような暴露は、提供される免疫原性組成物で少なくとも１回の免疫化(例えば、少なくとも２回の免疫化を含む)を受けている非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル)で検出可能なレベルのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質および／または例えば、安定化融合前スパイク三量体、Ｓ−２Ｐを含むが、これに限定されないそのフラグメントに対する抗体応答および／またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の受容体結合部分に対する抗体応答)が達成されたとき、実施し得る。ある実施態様において、防御反応は、暴露非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル)の気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)および／または鼻腔スワブにおける検出可能なウイルスＲＮＡの不在または減少により特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載する免疫原性組成物は、提供される免疫原性組成物で少なくとも１回の免疫化(例えば、少なくとも２回の免疫化を含む)を受けている暴露動物、例えば、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル)集団におけるＢＡＬおよび／または鼻腔スワブにおける検出可能なＲＮＡの非存在を示すパーセントが、非免疫化動物、例えば、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル)集団と比較して高いことにより特徴づけられ得る。ある実施態様において、ここに記載する免疫原性組成物は、提供される免疫原性組成物で少なくとも１回の免疫化(例えば、少なくとも２回の免疫化を含む)を受けている暴露動物、例えば、非ヒト(例えば、アカゲザル)集団が、非免疫化動物、例えば、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル)集団と比較して、例えば、８日以内、６日以内、４日以内などを含む１０日以内の鼻腔スワブでウイルスＲＮＡの排除を示し得ることにより特徴づけられ得る。
ある実施態様において、ここに記載する免疫原性組成物は、それを必要とする対象に投与したとき呼吸器疾患増強のリスクを実質的に増加させない。ある実施態様において、このようなワクチン関連呼吸器疾患増強は、複製の抗体依存的増強および／または不十分な中和活性およびＴｈ２に偏った応答を誘導するワクチン抗原と関連し得る。ある実施態様において、ここに記載する免疫原性組成物は、それを必要とする対象に投与したとき複製の抗体依存的増強のリスクを実質的に増加させない。
ある実施態様において、ｍＲＮＡ組成物(例えば、脂質ナノ粒子に製剤化)の単回投与は、ワクチン接種１０日以内に治療的抗体応答を誘導できる。ある実施態様において、このような治療的抗体応答は、このようなｍＲＮＡワクチンが動物モデルで０.１〜１０μgまたは０.２〜５μg用量でワクチン接種後１０日目に測定して、約１０〜１００μg／mL ＩｇＧの産生を誘導できるとき特徴づけられ得る。ある実施態様において、このような治療的抗体応答は、このようなｍＲＮＡワクチンが動物モデルで０.１〜１０μgまたは０.２〜５μgの用量でワクチン接種２０日目に測定して、約１００〜１０００μg／mL ＩｇＧを誘導する点で特徴づけられ得る。ある実施態様において、単回投与は、動物モデルで測定して、ワクチン接種１５日後１０〜２００ｐＶＮ５０力価のシュードウイルス中和力価を誘導し得る。ある実施態様において、単回投与は、動物モデルで測定して、ワクチン接種１５日後５０〜５００ｐＶＮ５０力価のシュードウイルス中和力価を誘導し得る。
ある実施態様において、ｍＲＮＡ組成物の単回投与は、ＳＡＲＳ−ＣＯＶ２免疫原性タンパク質またはそのフラグメント(例えば、スパイクタンパク質および／または受容体結合ドメイン)をコードするこのようなｍＲＮＡ構築物の非存在下で観察されるものと比較して、少なくとも５０％以上(例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上を含む)抗原特異的ＣＤ８および／またはＣＤ４ Ｔ細胞応答を拡大できる。ある実施態様において、ｍＲＮＡ組成物の単回投与は、ＳＡＲＳ−ＣＯＶ２免疫原性タンパク質またはそのフラグメント(例えば、スパイクタンパク質および／または受容体結合ドメイン)をコードするこのようなｍＲＮＡ構築物の非存在下で観察されるものと比較して、少なくとも１.５倍以上(例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上を含む)抗原特異的ＣＤ８および／またはＣＤ４ Ｔ細胞応答を拡大できる。
ある実施態様において、レジメン(例えば、ｍＲＮＡ組成物の単回投与)は、ＳＡＲＳ−ＣＯＶ２免疫原性タンパク質またはそのフラグメント(例えば、スパイクタンパク質および／または受容体結合ドメイン)をコードするこのようなｍＲＮＡ構築物の非存在下で観察されるものと比較して、少なくとも５０％以上(例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上を含む)Ｔｈ１ 表現型(例えば、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−４および／またはＩＬ−５の発現により特徴づけて)を示すＴ細胞を増殖できる。ある実施態様において、レジメン(例えば、ｍＲＮＡ組成物の単回投与)は、ＳＡＲＳ−ＣＯＶ２免疫原性タンパク質またはそのフラグメント(例えば、スパイクタンパク質および／または受容体結合ドメイン)をコードするこのようなｍＲＮＡ構築物の非存在下で観察されるものと比較して、Ｔｈ１ 表現型(例えば、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−４および／またはＩＬ−５の発現により特徴づけて)を示すＴ細胞を例えば少なくとも１.５倍以上(例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上を含む)増殖できる。ある実施態様において、Ｔ細胞表現型はＴｈ１優性サイトカインプロファイル(例えば、ＩＮＦ−ガンマ陽性および／またはＩＬ−２陽性により特徴づけられる)および／またはＩＬ−４分泌がないかまたは生物学的に重要でないものであり得るかまたは含んでよい。
ある実施態様において、ここに記載するレジメン(例えば、ｍＲＮＡ組成物の１回以上の投与)はＣＤ４＋Ｔ細胞の産生を誘導するおよび／または達成する。数ある中で、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質のＲＢＤ含有部分をコードするｍＲＮＡ組成物(例えば、加えて完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質をコードしない)がＲＢＤ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞のこのような誘導および／または産生に特に特に有用および／または有効であり得ることを証明する。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質のＲＢＤ含有部分をコードし、かつ、ある実施態様において、完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質をコードしないｍＲＮＡ組成物)により誘導されるＲＢＤ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｔｈ１優性サイトカインプロファイル(例えば、ＩＮＦ−ガンマ陽性および／またはＩＬ−２陽性により特徴づけられる)を示すおよび／またはＩＬ−４分泌がないかまたは生物学的に重要でないことを示す。
ある実施態様において、ｍＲＮＡ組成物(例えば、ここに記載のもの)を受けた対象におけるＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答(例えば、ここに記載)の特徴づけは、対象から採取したＰＢＭＣを使用するエクスビボアッセイ、例えば、実施例に記載するアッセイを使用して実施し得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物の免疫原性は、提供されるｍＲＮＡ組成物を受けた対象の血液サンプルに存在するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質に対するＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡの検出および／またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスおよび／または野生型ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスを使用する中和アッセイである血清免疫原性アッセイの１以上により評価し得る。
ある実施態様において、ｍＲＮＡ組成物(例えば、ここに記載のもの)は、１０μg〜１００μgまたは１μg〜５０μgの用量でワクチン接種後７日以内に比較的低い有害作用(例えば、グレード１〜グレード２疼痛、発赤および／または腫脹)をもたらす。ある実施態様において、ｍＲＮＡ組成物(例えば、ここに記載のもの)は、１０μg〜１００μgの用量でワクチン接種後７日以内に比較的低い全身事象の観察(例えば、グレード１〜グレード２発熱、疲労、頭痛、悪寒、嘔吐、下痢、筋肉痛、関節痛、薬物療法およびこれらの組み合わせ)をもたらす。
ある実施態様において、ｍＲＮＡ組成物は、１０〜１００μg用量または１μg〜５０μgで対象に投与したとき、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２免疫原性タンパク質またはそのフラグメント(例えば、スパイクタンパク質および／または受容体結合ドメイン)に対するＩｇＧがワクチン接種２１日１００〜１００,０００Ｕ／mLまたは５００〜５０,０００Ｕ／mLレベルで産生され得ることにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の天然に折りたたまれた三量体受容体結合タンパク質をコードする。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、コードされるバリアントがＡＣＥ２に例えば、９pM、８pM、７pM、６pM、５pM、４pMまたはそれ未満のＫｄを含む１０pMまたは未満のＫｄで結合するように、このような受容体結合タンパク質のバリアントをコードする。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、コードされるバリアントが５pMのＫｄでＡＣＥ２に結合するようにこのような受容体結合タンパク質のバリアントをコードする。ある実施態様において、ｍＲＮＡはＡＣＥ２受容体結合部位を含む三量体ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の受容体結合部分をコードする。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、コード配列がＡＣＥ２受容体結合部位を有し、ＡＣＥ２に結合する三量体タンパク質の発現を指示するように、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の受容体結合部分および三量体化ドメイン(例えば、Ｔ４フィブリチンの天然三量体化ドメイン(フォルドン))のコード配列を含む。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、ＫｄがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の単量体受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)に対するより小さいように三量体ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の受容体結合部分またはそのバリアントをコードする。例えば、ある実施態様において、ｍＲＮＡ は、ＫｄがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＲＢＤに対するより少なくとも１０倍(例えば、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍などを含む)小さいように、三量体ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の受容体結合部分またはそのバリアントをコードする。
ある実施態様において、ｍＲＮＡ(例えば、ここに記載のもの)によりコードされる三量体ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の受容体結合部分は、低温電子顕微鏡法(ｃｒｙｏＥＭ)により特徴づけして、閉鎖高次構造でＡＣＥ２およびＢ０ＡＴ１中性アミノ酸酸トランスポーターと複合体形成しているとき約３〜４オングストロームサイズを有すると決定され得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物または方法を特徴づけるおよび／またはそれにより達成される幾何平均ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価は、ＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒトパネル(例えば、発症２０〜４０日後および無症候性回復期の開始少なくとも１４日後にＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒトから得た血清パネルの、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍またはそれ以上を含む少なくとも１.５倍に達し得る。
ある実施態様において、ここに提供されるｍＲＮＡ組成物は、このような組成物(例えば、少なくとも１回投与、少なくとも２回投与など)で処置された対象が、適切な対照(例えば、そのように処置されず、合理的に同等な暴露条件下でウイルスに暴露されている同等な対象または集団に対する確立された予測レベル)と比較して、関連部位(例えば、鼻および／または肺などおよび／または感染しやすい他の何れかの組織)におけるウイルスＲＮＡの減少および／またはより短期的存在を示し得ることにより特徴づけられ得る。
ある実施態様において、ｍＲＮＡ構築物(例えば、ここに記載のもの)により発現されるＲＢＤ抗原は、例えば、免疫原性を高めるために、Ｔ４−フィブリチン由来「フォルドン」三量体化ドメインの付加により修飾され得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ある局所反応(例えば、疼痛、発赤および／または腫脹など)および／または全身事象(例えば、発熱、疲労、頭痛など)がワクチン接種後２日目に出現および／またはピークであり得ることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、ある局所反応(例えば、疼痛、発赤および／または腫脹など)および／または全身事象(例えば、発熱、疲労、頭痛など)がワクチン接種後７日目に回復し得ることにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ｍＲＮＡ組成物(例えば、ここに記載のもの)を受けた対象で通例の臨床検査値のグレード１またはそれ以上の変化または臨床検査値異常が観察されないにより特徴づけられる。このような臨床検査アッセイの例はリンパ球数、血液学的変化などを含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、最初の投与(例えば、１０〜１００μgを含むまたは１μg〜５０μgを含む)後２１日まで、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対するＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)が、ＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒト血清のパネルの６０２単位／mLと比較して２００〜３０００単位／mLまたは５００〜３０００単位／mLまたは５００〜２０００単位／mLに達し得ることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、２回目の投与(例えば、１０〜３０μgを含む；または１μg〜５０μgを含む)後７日までに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対するＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)が、例えば、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍またはそれ以上を含む、少なくとも８倍またはそれ以上に増加し得ることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、２回目の投与(例えば、１０〜３０μgを含む；または１μg〜５０μgを含む)後７日までに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対するＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)が、１５００単位／mL〜４０,０００単位／mLまたは４０００単位／mL〜４０,０００単位／mLに増加し得るにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載する抗体濃度は、最初の投与後、例えば、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日を含む少なくとも２０日またはそれ以上または２回目の後、例えば、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日またはそれ以上を含む少なくとも１０日またはそれ以上持続し得る。ある実施態様において、抗体濃度は最初の投与後３５日または２回目の投与後少なくとも１４日まで持続し得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、２回目の投与(例えば、１〜５０μgを含む)後７日目に測定したとき、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対するＩｇＧのＧＭＣが、ＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒト血清のパネルで観察される抗体濃度と比較して、例えば、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも９５％高いことを含む、少なくとも３０％高いことにより特徴づけられる。多くの実施態様において、ここに記載するＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)はＲＢＤ結合ＩｇＧのＧＭＣである。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、２回目の投与(例えば、１０〜５０μgを含む)後７日目に測定したとき、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対するＩｇＧのＧＭＣが、ＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒト血清のパネルで観察される抗体濃度と比較して、少なくとも１.１倍高い(例えば、少なくとも１.５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも１５倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも２５倍高い、少なくとも３０倍高いことを含む)ことにより特徴づけられる。多くの実施態様において、ここに記載するＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)はＲＢＤ結合ＩｇＧのＧＭＣである。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、２回目の投与後２１日目に測定して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対するＩｇＧのＧＭＣが、ＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒト血清のパネルで観察される抗体濃度と比較して、少なくとも５倍高い(例えば、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも１５倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも２５倍高い、少なくとも３０倍高いことを含む)ことによりにより特徴づけられる。多くの実施態様において、ここに記載するＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)はＲＢＤ結合ＩｇＧのＧＭＣである。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和幾何平均力価(ＧＭＴ)の増加(例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％以上)が最初の投与２１日後に観察されることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、２回目の投与(例えば、１０μg〜３０μgを含む)を受けた対象で７日後に相当大きな血清中和ＧＭＴが達成され、ＣＯＶＩＤ−１９回復期血清パネルの９４と比較して、１５０〜３００に達することにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％であることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも７０％であることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも８０％であることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも９０％であることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも９５％であることにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物は、投与少なくとも７日後(例えば、２回目の投与後)ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫応答を誘導することにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物は、投与後１４日以内(例えば、２回目の投与後)にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫応答を誘導することにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物は、ワクチン接種レジメン後少なくとも７日後ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫応答を誘導するにより特徴づけられる。ある実施態様において、ワクチン接種レジメンは最初の投与および２回目の投与を含む。ある実施態様において、最初の投与および２回目の投与は、少なくとも２１日間離して投与される。あるこのような実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫応答は、最初の投与後少なくとも２８日後に誘導される。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対する抗体の幾何平均濃度(ＧＭＣ)が、本発明のｍＲＮＡ組成物(例えば、１０〜３０μgの用量(両端を含む))を受けた対象の血清で測定して、回復期血清パネル(例えば、ここに記載のもの)におけるより実質的に高いことにより特徴づけられる。ある実施態様において、対象が２回目の投与(例えば、１回目の最初の投与２１日後)を受けている可能性があるとき、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対する抗体の幾何平均濃度(ＧＭＣ)は、該対象の血清において測定して、回復期血清パネルＧＭＣより８.０倍〜５０倍高い可能性がある。ある実施態様において、対象が２回目の投与(例えば、１回目の最初の投与２１日後)を受けている可能性があるとき、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対する抗体の幾何平均濃度(ＧＭＣ)、該対象の血清において測定して、回復期血清パネルＧＭＣと比較して、例えば、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍またはそれ以上を含む、少なくとも８.０倍またはそれ以上であり得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和幾何平均力価が、最初の投与後２８日目または２回目の投与後７日目に測定して、回復期血清パネルの中和ＧＭＴと比較して、少なくとも１.５倍またはそれ以上(例えば、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも３.５倍またはそれ以上を含む)であり得ることにより特徴づけられる。
ある実施態様において、対象に投与されるレジメンは単回投与であり得るまたはそれを含み得る。ある実施態様において、対象に投与されるレジメンは複数回投与(例えば、少なくとも２回投与、少なくとも３回投与またはそれ以上)を含み得る。ある実施態様において、対象に投与されるレジメンは最初の投与および２回目の投与を含み得て、これらは少なくとも２週間離して、少なくとも３週間離して、少なくとも４週間離してまたはそれ以上離して与えられる。ある実施態様において、このような投与は少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月またはそれ以上離し得る。ある実施態様において、投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日またはそれ以上離すなどの日数を離し得る。ある実施態様において、投与を約１〜約３週間離してまたは約１〜約４週間離してまたは約１〜約５週間離してまたは約１〜約６週間離してまたは約１〜６週間以上離して行い得る。ある実施態様において、投与を、例えば約１４〜約４８日など約７〜約６０日の期間離し得る。ある実施態様において、投与間の最小日数は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１またはそれ以上であり得る。ある実施態様において、投与間の最大日数は約６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１またはそれ以下であり得る。ある実施態様において、投与は約２１〜約２８日離し得る。ある実施態様において、投与は約１９〜約４２日離し得る。ある実施態様において、投与は約７〜約２８日離し得る。ある実施態様において、投与は約１４〜約２４日であり得る。ある実施態様において、投与は約２１〜約４２日であり得る。
ある実施態様において、特に約３週間より長い期間抗体および／またはＴ細胞力価上昇を達成することが確立された組成物について − 例えば、ある実施態様において、提供される組成物は、約３週間より長い期間抗体および／またはＴ細胞力価(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質の関連部分に特異的)上昇を達成することが確立されている − あるこのような実施態様において、投与レジメンは単回投与しか含まなくてよくまたは２回投与を含んでよく、これは、ある実施態様において、互いに約２１日または３週間より長い期間離し得る。例えば、あるこのような実施態様において、このような期間は約４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間またはそれ以上または約１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月またはそれ以上またはある実施態様において、約１年またはそれ以上であり得る。
ある実施態様において、最初の投与および２回目の投与(および／または他のその後の投与)は筋肉内注射により投与され得る。ある実施態様において、最初の投与および２回目の投与を三角筋に投与し得る。ある実施態様において、最初の投与および２回目の投与を同じ腕に投与し得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、２１日離した一連の２回投与(例えば、各０.３mL)として投与される(例えば、筋肉内注射により)。ある実施態様において、各用量は約３０μgである。ある実施態様において、各用量は３０μgより高い、例えば、約４０μg、約５０μg、約６０μgでよい。ある実施態様において、各用量は３０μgより少ない、例えば、約２０μg、約１０μg、約５μgなどであり得る。ある実施態様において、各用量は約３μgまたはそれ以下、例えば、約１μgである。あるこのような実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は１６歳以上(例えば、１６〜８５歳を含む)の対象に投与される。あるこのような実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は１８〜５５歳の対象に投与される。あるこのような実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は５６〜８５歳の対象に投与される。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は単回投与として投与される(例えば、筋肉内注射による)。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、このようなｍＲＮＡ組成物および／または方法により誘導されたＲＢＤ特異的ＩｇＧ(例えば、ポリクローナル応答)がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ結合親和性を有する対照ヒトモノクローナル抗体(例えば、J. ter Meulen et al., PLOS Med. 3, e237 (2006)に記載のＣＲ３０２２)と比較して高いＲＢＤへの結合親和性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントのパネル(例えば、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上)にわたり中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、このようなＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントはＲＢＤにおける変異(例えば、配列番号１と比較して、Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９Ｐなどであるがこれらに限定されない)および／またはスパイクタンパク質における変異(例えば、配列番号１と比較して、Ｄ６１４Ｇなどであるがこれに限定されない)を含む。当業者は、種々のスパイクバリアントおよび／またはそれを記載するリソース(例えば、the Table of mutating sites in Spike maintained by the COVID-19 Viral Genome Analysis Pipeline and found at https://cov.lanl.gov/components/sequence/COV/int_sites_tbls.com)を認識しており、本明細書に接して、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法が、ワクチン接種した対象において、このようなバリアントおよび／またはこれらの組み合わせの何れかまたは全てに関して中和活性を示す血清を誘導する能力により特徴づけられ得ることを知る。
具体的実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質のＲＢＤをコードするｍＲＮＡ組成物は、ワクチン接種した対象の血清が、ＲＢＤバリアント(例えば、配列番号１と比較して、Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９Ｐなどであるがこれらに限定されない)およびスパイクタンパク質バリアント(例えば、配列番号１と比較して、Ｄ６１４Ｇであるが、これに限定されない)を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントのパネル(例えば、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上)にわたり中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、Ｓ２サブユニットにおける中央らせん頂部でアミノ酸９８６位および９８７位の２連続プロリン置換を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質バリアントをコードするｍＲＮＡ組成物が、ワクチン接種した対象の血清がＲＢＤバリアント(例えば、配列番号１と比較して、Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９Ｐなどであるがこれらに限定されない)およびスパイクタンパク質バリアント(例えば、配列番号１と比較して、Ｄ６１４Ｇであるが、これに限定されない)を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントのパネル(例えば、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上)にわたり中和活性を示すことにより特徴づけられる。例えば、ある実施態様において、配列番号７(ＳＰ２)をコードするｍＲＮＡ組成物は、ＲＢＤバリアント(例えば、配列番号１と比較して、Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９Ｐなどであるがこれらに限定されない)およびスパイクタンパク質バリアント(例えば、配列番号１と比較して、Ｄ６１４Ｇであるが、これに限定されない)を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントの何れか一つに対して免疫応答を誘発する。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＮ５０１Ｙ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
該配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントまたは該配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＮ５０１Ｙ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失などであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Variant of Concern 202012/01」(ＶＯＣ−２０２０１２／０１；系統Ｂ.１.１.７としても知られる)に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。該バリアントは、以前英国公衆衛生庁により最初のVariant Under Investigation in December 2020(VUI - 202012/01)として名付けられたが、Variant of Concern(ＶＯＣ−２０２０１２／０１)に再分類された。ＶＯＣ−２０２０１２／０１は、英国においてＣＯＶＩＤ−１９パンデミック中の２０２０年１０月に前の月に採取したサンプルから最初に検出されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のバリアントであり、１２月半ばまでには急速に拡散し始めた。これは英国におけるＣＯＶＩＤ−１９感染率の顕著な増加と相関する；この増加は、少なくとも一部ヒト細胞におけるＡＣＥ２への結合に必要なスパイク糖タンパク質の受容体結合ドメイン内のＮ５０１Ｙ変化によるものと考えられる。ＶＯＣ−２０２０１２／０１バリアントは、１３非同義変異、４欠失および６同義変異(すなわち、タンパク質を変える１７変異と変えない６変異がある)の２３変異により定義される。ＶＯＣ ２０２０１２／０１におけるスパイクタンパク質変化は欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈを含む。ＶＯＣ−２０２０１２／０１における最も重要な変化の一つは、アミノ酸５０１位のアスパラギン(Ｎ)からチロシン(Ｙ)への変化であるＮ５０１Ｙを含む。この変異は、単独でまたはＮ末端ドメイン(ＮＴＤ)における６９／７０位の欠失と共にウイルスの感染性を増強し得る。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較して欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「５０１.Ｖ２」に対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。このバリアントは最初に２０２０年１０月のサンプルにおいて観察され、それ以降５０１.Ｖ２バリアントの３００を超える症例が南アフリカで全ゲノムシーケンス(ＷＧＳ)により確認され、その地域では２０２０年１２月にはウイルスの優性型となった。予備的結果は、このバリアントの感染性が増加している可能性を示す。５０１.Ｖ２バリアントはＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖを含む複数スパイクタンパク質変化により規定され、さらに最近集めたウイルスは、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４のさらなる変化を有する。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４に変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。該ＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＨ６９／Ｖ７０欠失を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質においてＨ６９／Ｖ７０欠失を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＹ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Variant of Concern 202012/01」(ＶＯＣ−２０２０１２／０１；系統Ｂ.１.１.７としても知られる)に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較して欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がデンマーク国立血清研究所(ＳＳＩ)によりΔＦＶＩ−スパイクとしても名付けられたＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Ｃｌｕｓｔｅｒ ５」に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。これはデンマークの北ユランで発見され、ミンク農場でミンクからヒトに拡散したと考えられている。Ｃｌｕｓｔｅｒ ５において、ウイルスのスパイクタンパク質のいくつかの異なる変異が確認されている。特異的変異は６９−７０デルタＨＶ(タンパク質の６９番目および７９番目の位置でのヒスチジン残基およびバリン残基欠失)、Ｙ４５３Ｆ(チロシン位のチロシンからフェニルアラニンへの変化)、Ｉ６９２Ｖ(イソロイシン位のイソロイシンからバリン)、Ｍ１２２９Ｉ(メチオニン位のメチオニンからイソロイシン)および所望によりＳ１１４７Ｌ(セリン位のセリンからロイシン)を含む。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較して欠失６９〜７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉおよび所望によりＳ１１４７Ｌの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質における６１４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＤ６１４Ｇ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質における６１４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントまたは該配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＤ６１４Ｇ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Variant of Concern 202012/01」(ＶＯＣ−２０２０１２／０１；系統Ｂ.１.１.７としても知られる)に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較して欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４の変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質における５０１位および６１４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異およびＤ６１４Ｇ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質における５０１位および６１４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントまたは該配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異およびＤ６１４Ｇ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Variant of Concern 202012/01」(ＶＯＣ−２０２０１２／０１；系統Ｂ.１.１.７としても知られる)に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較して欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４の変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質における４８４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＥ４８４Ｋ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質における４８４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントまたは該配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＥ４８４Ｋ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「５０１.Ｖ２」に対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４の変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。該ＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ブラジルバリアントとして知られる系統Ｂ.１.１.２４８は、Ｐ.１系統と名付けられているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のバリアントの一つであり、１７の特有のアミノ酸変化を有し、その１０がそのスパイクタンパク質にあり、Ｎ５０１ＹおよびＥ４８４Ｋを含む。Ｂ.１.１.２４８はＢ.１.１.２８が元であった。Ｅ４８４ＫはＢ.１.１.２８およびＢ.１.１.２４８両者に存在する。Ｂ.１.１.２４８は多数のＳ−タンパク質多型[Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆ]を有し、南アフリカから報告されたバリアントとある重要なＲＢＤ位置(Ｋ４１７、Ｅ４８４、Ｎ５０１)が類似する。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Ｂ.１.１.２８」に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Ｂ.１.１.２４８」に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質における５０１位および４８４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異およびＥ４８４Ｋ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質における５０１位および４８４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントまたは該配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異およびＥ４８４Ｋ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「５０１.Ｖ２」に対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４に変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。該ＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Ｂ.１.１.２４８」に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質における５０１位、４８４位および６１４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異およびＤ６１４Ｇ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質における５０１位、４８４位および６１４位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントまたは該配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異およびＤ６１４Ｇ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４の変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＬ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＬ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「５０１.Ｖ２」に対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１Ｖおよび欠失２４２〜２４４および所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６ＩおよびＫ４１７Ｎに変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。該ＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質における４１７位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＫ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質における４１７位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントまたは該配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＫ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「５０１.Ｖ２」に対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２〜２４４を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。該ＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Ｂ.１.１.２４８」に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質における４１７位および４８４位および／または５０１位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＫ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ変異およびＥ４８４Ｋおよび／またはＮ５０１Ｙ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ある実施態様において、配列番号１と比較してスパイクタンパク質における４１７位および４８４位および／または５０１位に変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントまたは該配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＫ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ変異およびＥ４８４Ｋおよび／またはＮ５０１Ｙ変異を含む１以上のＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「５０１.Ｖ２」に対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望により配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２〜２４４の変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。該ＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清がＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアント「Ｂ.１.１.２４８」に対する中和活性を示すことにより特徴づけられる。
具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、ワクチン接種した対象の血清が配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆの変異を含むＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して中和活性を示すことにより特徴づけられる。
ここに記載するＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異を含んでも含まなくてもよい。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物および／または方法は、このようなｍＲＮＡ組成物および／または方法を受けた対象の少なくとも５０％でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する保護を提供するおよび／またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の重症度を軽減することができる。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は１８〜５５歳の対象を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は５６〜８５歳の対象を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は年配対象(例えば、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳を超えるなど、例えば６５〜８５歳の対象)を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は１８〜８５歳の対象を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は１８歳以下の対象を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は１２歳以下の対象を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は１０歳以下の対象を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は青年期集団(例えば、約１２歳〜約１７歳の個体)を含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は乳児(例えば、１歳未満)を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、母親が妊娠中にこのようなここに記載するｍＲＮＡ組成物を受けた乳児(例えば、１歳未満)を含まない。何らかの特定の理論に拘束されたくはないが、実施例３１に示すラット試験は、妊娠中にこのようなｍＲＮＡ組成物を与えた雌ラットで誘導されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体応答が胎児に継承され得ることを示唆する。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、母親が妊娠中にこのようなここに記載するｍＲＮＡ組成物を受けていない乳児(例えば、１歳未満)を含む。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は妊婦を含み得る；ある実施態様において、母親が妊娠中にワクチン接種(例えば、少なくとも１回投与を受けた者または両投与を受けた者のみ)した乳児は、生後数週間、数か月または数年(例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上または１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上)の間ワクチン接種しない。これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、母親が妊娠中にワクチン接種(例えば、少なくとも１回投与を受けた者または両投与を受けた者のみ)した乳児は、生後、例えば生後数週間、数か月または数年(例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上または１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上)、ワクチン接種を減らす(例えば、低用量および／または少ない投与 − 例えば、ブースター − 回数および／または一定期間にわたる低総暴露)またはワクチン接種を減らす(例えば、一定期間にわたる低用量および／または少ない投与 − 例えば、ブースター − 回数)必要があるかもしれずない。ある実施態様において、ここに提供する組成物は妊婦を含まない集団に投与される。
ある特定の実施態様において、ここに提供する組成物は、妊娠約２４週後の最初の投与を含むレジメンにより妊婦に投与される(例えば、妊娠約２２週、２３週、２４週、２５週、２６週、２７週、２８週後またはそれ以降)；ある実施態様において、ここに提供する組成物は、妊娠約３４週前の最初の投与を含むレジメンにより妊婦に投与される(例えば、妊娠約３０週、３１週、３２週、３３週、３４週、３５週、３６週、３７週、３８週の前)。ある実施態様において、ここに提供する組成物は、妊娠約２４週(例えば、妊娠約２７週後、例えば、約２４週〜３４週または約２７週〜３４週)後の最初の投与および約２１日後の２回目の投与を含むレジメンにより妊婦に投与される；ある実施態様において、両投与は出産前に投与される。何らかの特定の理論に拘束されたくはないが、理想的には出産前の、このようなレジメン(例えば、妊娠約２４週または２７週後および所望により妊娠約３４週前の最初の投与を含む)および所望により約２１日以内の２回目の投与は、別の投与レジメン(例えば、妊娠中のどこかの時点での投与、妊娠中の投与自制および／または例えば、妊娠中１回しか投与できないような妊娠後期の投与)と比較して、安全性(例えば、早産または胎児罹病もしくは死亡のリスク軽減)および／または有効性(例えば、乳児に授けられるワクチン接種の繰り越し)の点である利点を有し得る。ある実施態様において、ここに記載するとおり(実施例３４もまた参照)、例えば、ここに記載する特定のレジメンにより、妊娠中ワクチン接種した母親から生まれた乳児は、さらにワクチン接種を必要としない可能性があるまたは生後一定期間(例えば、ここに記載するとおり)、ワクチン接種を減らす(例えば、低用量および／または少ない投与 − 例えば、ブースター − 回数および／または一定期間にわたる全体的暴露減少)必要がある可能性がある。
ある実施態様において、ここに提供する組成物は、女性がワクチンを受けた後(例えば、ワクチンの最初の投与を受けた後、ワクチンの最後の投与を受けた後など)一定期間妊娠しないよう指示される集団に投与される；あるこのような実施態様において、期間は少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間またはそれ以上であり得るかまたは少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月またはそれ以上であり得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、例えば、ここに記載する、１以上の特にハイリスクな状態または行動歴を有する１以上の集団を含む。例えば、ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、職の専門性および／または環境的暴露がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染するリスクを劇的に増加させ得る対象を含み得る(例えば、公共交通機関労働者、囚人、食料品店店員、長期療養施設入居者、食肉処理者または他の肉加工労働者、医療従事者および／または初期対応要員、例えば、緊急対応要員を含むが、これらに限定されない)。具体的実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は医療従事者および／または初期対応要員、例えば、緊急対応要員を含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、喫煙または電子タバコ喫煙(例えば、常習的喫煙または電子タバコ喫煙を含み、６か月、１２か月またはそれ以上の間)の行動歴を有するものを含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染によりかかりやすいことが特定されているある民族集団を含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染によりかかりやすいことが特定され得る血液型のある集団を含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、免疫低下対象(例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを有する者；ある免疫抑制剤を摂取している癌および移植患者；免疫抑制治療が是認されることが予測される自己免疫性疾患または他の生理学的状態(例えば、３か月以内、６か月以内またはそれ以上)；および免疫系に影響する遺伝疾患を有する者(例えば、先天性無ガンマグロブリン血症、先天性ＩｇＡ欠損症))を含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は感染性疾患を有する者を含み得る。例えば、ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団はヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)および／または肝炎ウイルス(例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ)に感染した者を含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は基礎疾患を有する者を含み得る。このような基礎疾患の例は、高血圧、心血管疾患、糖尿病、慢性呼吸器疾患、例えば、慢性肺疾患、喘息など、癌および例えば、ループス、関節リウマチ、慢性肝疾患、慢性腎疾患(例えば、ある実施態様において、６０mL／分／１.７３ｍ２未満の糸球体濾過速度(ＧＦＲ)により特徴づけられるようなステージ３またはそれより悪い)などの他の慢性疾患を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、例えば、特に約３０kg／ｍ２を超える肥満度指数(ＢＭＩ)の者を含む、過体重または肥満対象を含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物で処置する集団は、例えば、血清学または鼻腔スワブに基づきＣＯＶＩＤ−１９と先に診断されているかまたは現在のまたは先のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がある対象を含み得る。ある実施態様において、処置する集団は白人および／または非ヒスパニック／非ラテン系を含む。
ある実施態様において、あるここに記載するｍＲＮＡ組成物(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ１)は、アジア人集団(例えば、中国人集団)への投与または具体的実施態様において、年配のアジア人集団(例えば、６０歳以上、例えば、６０〜８５または６５〜８５歳)への投与のために選択され得る。
ある実施態様において、ここに提供されるｍＲＮＡ組成物は、投与前、先の感染および／または現在の感染の証拠を示さないことが判明した対象に投与するおよび／または評価する；ある実施態様において、先の感染および／または現在の感染の証拠は、対象に存在するインタクトウイルスまたは何らかのウイルス核酸、タンパク質、脂質などの証拠(例えば、血液、細胞、粘液および／または組織などのその生物学的サンプル中)および／またはそれに対する対象の免疫応答の証拠であり得るかこれを含み得る。ある実施態様において、ここに提供されるｍＲＮＡ組成物は、投与前、先の感染および／または現在の感染の証拠を示すことが判明した対象に投与するおよび／または評価する；ある実施態様において、先の感染および／または現在の感染の証拠は、対象に存在するインタクトウイルスまたは何らかのウイルス核酸、タンパク質、脂質などの証拠(例えば、血液、細胞、粘液および／または組織などのその生物学的サンプル中)および／またはそれに対する対象の免疫応答の証拠であり得るかこれを含み得る。ある実施態様において、投与１の日のＮ結合抗体試験結果陽性または核酸増幅検査(ＮＡＡＴ)結果陽性に基づき、対象は先に感染していたと考えられる。
ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、例えば悪寒、発熱、頭痛、注射部位疼痛、筋肉痛、疲労の１以上を含み得る副作用のリスクを知らされている対象に投与する；ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を、１以上のこのような副作用が生じ、軽度または中程度を超えるものであり、１日以上の期間持続するならばまたは対象が組成物の接種と関連し得ると合理的に考える何らかの重度なまたは予測不能な事象を経験するならば、医療従事者に知らせるよう要請されている対象に投与する。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、例えば、アレルギー、出血性疾患または抗凝血薬物療法摂取、母乳育児、発熱、免疫低下状態または免疫系に影響する薬物療法摂取、妊娠または妊娠を計画するなどの１以上を含み得る特定の健康状態を、医療従事者に知らせるよう要請されている対象に投与する。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を、他のＣＯＶＩＤ−１９ワクチンを受けていること、医療従事者に知らせるよう要請されている対象に投与する。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を、熱性疾患を経験する、免疫抑制剤治療を受けている、抗凝血剤治療を受けている、出血性疾患に罹患している(例えば、筋肉内注射が禁忌のもの)または妊娠および／または母乳育児／授乳の健康状態の一つを有しない対象に投与する。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を他のＣＯＶＩＤ−１９ワクチンを受けていない対象に投与する。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物のあらゆる成分にアレルギー反応を有しない対象に投与する。このようなアレルギー反応の例は、呼吸困難、顔面および／または咽頭腫脹、動悸、発疹、めまいおよび／または脱力を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を、最初の投与を受け、最初の投与に対してアレルギー反応(例えば、ここに記載のもの)がなかった対象に投与する。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物の投与を受けた後対象でアレルギー反応が生じたら、このような対象に、例えば、解熱および／または抗炎症剤などのこのようなアレルギー反応を管理および／または低減する処置などの１以上の介入を投与し得る
ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物の少なくとも１回投与を受けた対象は、２回目の投与後数日(例えば、少なくとも７日、少なくとも８日、９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日など)経過しない限りかつするまで、コロナウイルス(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２)への暴露を避けるよう指示される。例えば、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物の少なくとも１回投与を受けた対象は、２回目の投与後数日(例えば、少なくとも７日、少なくとも８日、９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日など)経過しない限りかつするまで、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染に対する予防手段(例えば、ソーシャルディスタンスの維持、マスク着用、頻繁な手洗いなど)を取るよう、指示される。従って、ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を投与する方法は、最初の投与を受け、コロナウイルス(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２)への暴露を避けるための防手段を取っていた対象へのこのようなここに提供するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物の２回目の投与を含む。
ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、例えば、ワクチンプライミングのために、それを必要とする対象の排出リンパ節に送達され得る。ある実施態様において、このような送達は提供されるｍＲＮＡ組成物の筋肉内投与により実施され得る。
ある実施態様において、異なる特定のｍＲＮＡ組成物を異なる対象集団に投与し得る；それとは別にまたはそれに加えて、ある実施態様において、異なる投与レジメンを異なる対象集団に投与し得る。例えば、ある実施態様において、特定の対象集団に投与されたｍＲＮＡ組成物は、これらの対象集団における１以上の特定の効果(例えば、効果の発生率および／または程度)により特徴づけられ得る。ある実施態様において、このような作用は、例えば力価および／または中和抗体および／またはＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞などのＴＨ１型Ｔ細胞)の持続、暴露(例えば、注射および／または経鼻曝露など)に対する保護、副作用(例えば、反応原性)の発生率、重症度および／または持続などであり得るまたはこれを含み得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物を、例えば、核酸増幅検査(ＮＡＡＴ)などの臨床検査に基づき、１０００人年あたりのＣＯＶＩＤ−１９発生率を低減することが確立されたレジメンにより投与し得る。ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物を、過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の血清学またはウイルス学的証拠がない(例えば、最後の投与を受けた後最大７日)提供されるｍＲＮＡ組成物の少なくとも１回投与を受けた対象における、核酸増幅検査(ＮＡＡＴ)などの臨床検査に基づき、１０００人年あたりのＣＯＶＩＤ−１９発生率を低減することが確立されたレジメンにより投与し得る。ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物を、１０００人年あたりの確認された重症ＣＯＶＩＤ−１９発生率を低減することが確立されたレジメンにより投与し得る。ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物を、過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の血清学またはウイルス学的証拠がない提供されるｍＲＮＡ組成物の少なくとも１回投与を受けた対象における１０００人年あたりの確認された重症ＣＯＶＩＤ−１９発生率を低減することが確立されたレジメンにより投与し得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物を、対象からの血清で測定して一定期間対照レベル(例えば、ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染／ＣＯＶＩＤ−１９回復期血清に基づき決定した対照レベル)に達するまたは超えるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対する中和抗体を産生することが確立されたレジメンおよび／または一定期間例えば、ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)内の少なくとも１以上のＭＨＣ制限(例えば、ＭＨＣクラスＩ制限)エピトープを認識するＴ細胞の誘導を含む、細胞介在免疫応答(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するＴ細胞応答)の誘導をすることが確立されたレジメンにより投与し得る。あるこのような実施態様において、期間は少なくとも２か月、３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月またはそれ以上であり得る。ある実施態様において、ワクチン誘導Ｔ細胞(例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞)により認識される１以上のエピトープは、集団における対象の、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上を含む、少なくとも５０％に存在するＭＨＣクラスＩアレルに提示され得る；あるこのような実施態様において、ＭＨＣクラスＩアレルはHLA-B*0702、HLA-A*2402、HLA-B*3501、HLA-B*4401またはHLA-A*0201であり得る。ある実施態様において、エピトープはHLA-A*0201 YLQPRTFLL；HLA-A*0201 RLQSLQTYV；HLA-A*2402 QYIKWPWYI；HLA-A*2402 NYNYLYRLF；HLA-A*2402 KWPWYIWLGF；HLA-B*3501 QPTESIVRF；HLA-B*3501 IPFAMQMAY；またはHLA-B*3501 LPFNDGVYFを含み得る。
ある実施態様において、有効性を、ワクチン接種レジメン前および途中で過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の血清学またはウイルス学的証拠がない個体における１０００人年(per 1000 person-years)あたりのＣＯＶＩＤ−１９発生率として評価する；それとは別にまたはそれに加えて、ある実施態様において、有効性を、ワクチン接種レジメン前および途中で過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の血清学またはウイルス学的証拠があるおよびない対象における１０００人年あたりのＣＯＶＩＤ−１９発生率として評価する。あるこのような実施態様において、このような発生率は、最終ワクチン接種(例えば、単回投与レジメンにおける最初の投与；２回投与レジメンにおける２回目の投与など)後一定期間内に確認されたＣＯＶＩＤ−１９例である；ある実施態様において、このような期間は、特定の日数(例えば、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日またはそれ以上)以内(すなわち、７日までおよび７日を含む)であり得る。ある実施態様において、このような期間は７日以内または１４日以内または２１日以内または２８日以内であり得る。ある実施態様において、このような期間は７日以内であり得る。ある実施態様において、このような期間は１４日以内であり得る。
ある実施態様において(例えば、有効性を評価するある実施態様において)、対象は、対象からのサンプルにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２核酸の検出、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を特異的に認識する抗体(例えば、ＳＡＲＳ−Ｃｏ−Ｖ−２スパイクタンパク質)の検出、ＣＯＶＩＤ−１９感染の１以上の症状およびこれらの組み合わせの１以上が確立されたならば、ＣＯＶＩＤ−１９感染を経験したと決定する。あるこのような実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２核酸の検出は、中鼻甲介スワブサンプルの、例えば、ＮＡＡＴ検査を含み得る。あるこのような実施態様において、関連する抗体の検出は血液サンプルまたはその一部の血清検査を含み得る。あるこのような実施態様において、ＣＯＶＩＤ−１９感染の症状は発熱、今までになかった咳嗽またはその増加、今までになかった息切れまたはその増加、悪寒、今までになかった筋肉痛またはその増加、今までになかった味覚または嗅覚喪失、咽喉炎、下痢、嘔吐およびこれらの組み合わせであり得るまたはそれを含み得る。あるこのような実施態様において、ＣＯＶＩＤ−１９感染の症状は発熱、今までになかった咳嗽またはその増加、今までになかった息切れまたはその増加、悪寒、今までになかった筋肉痛またはその増加、今までになかった味覚または嗅覚喪失、咽喉炎、下痢、嘔吐、疲労、頭痛、鼻閉または鼻汁、悪心およびこれらの組み合わせであり得るまたはそれを含み得る。あるこのような実施態様において、対象は、このような対象がこのような症状の一つを経験し、また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２核酸もしくは抗体または両方の検査で陽性であるならば、ＣＯＶＩＤ−１９感染を経験したと決定される。あるこのような実施態様において、対象は、このような対象がこのような症状の一つを経験し、また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２核酸検査で陽性であるならば、ＣＯＶＩＤ−１９感染を経験したと決定される。あるこのような実施態様において、対象は、このような対象がこのような症状の一つを経験し、また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体検査で陽性であるならば、ＣＯＶＩＤ−１９感染を経験したと決定される。
ある実施態様において(例えば、有効性を評価するある実施態様において)、対象は、このような対象が安静時の重症全身疾病の臨床徴候(例えば、１分あたり３０以上の呼吸速度、１分あたり１２５以上の心拍、室内気でsea levelで９３％以下のＳｐＯ２または３００mHg未満のＰａＯ２／ＦｉＯ２の１以上)、呼吸不全(例えば、高酸素流、非侵襲性人工呼吸、機械的人工呼吸、ＥＣＭＯの必要性の１以上)、ショックの証拠(収縮期血圧９０mmHg未満、拡張期血圧６０mmHg未満、昇圧剤必要)、顕著な急性腎臓、肝臓または神経機能障害、集中治療室入院、死亡およびこれらの組み合わせの１以上を経験したならば、重症ＣＯＶＩＤ−１９感染を経験したと決定する。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物を、(ｉ)各投与後７日までの１以上の局所反応(例えば、ここに記載のもの)；(ii)各投与後７日までの１以上の全身事象；(iii)最初の投与から最後の投与後１か月までの有害事象(例えば、ここに記載のもの)；および／または(iv)最初の投与から最後の投与後６か月までの重度有害事象(例えば、ここに記載のもの)の少なくとも１つを報告する対象のパーセンテージを減らすことが確立されたレジメンにより投与し得る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を受けた１以上の対象を、例えば、投与した組成物の成分に対する免疫応答の存在、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２または他のコロナウイルスへの暴露および／または免疫応答の証拠、何らかの有害事象などを評価するため、モニターし得る(例えば、例えば１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはそれ以上を含む、例えば１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月またはそれ以上を含む、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間またはそれ以上を含む、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上の期間)。ある実施態様において、モニターは遠隔訪問によるものであり得る。これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、モニターは直接面会であり得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物によりもたらされる処置効果は、ワクチン接種後１か月、３か月、６か月、９か月、１２か月、１８か月および／または２４か月で、(ｉ)予め決定した閾値を超えるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗Ｓ１結合抗体レベル；(ii)予め決定した閾値を超えるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗ＲＢＤ結合抗体レベル；および／または(iii)閾値レベルを超えるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２血清中和力価、例えば、ベースラインにより特徴づけられ得る。ある実施態様において、抗Ｓ１結合抗体および／または抗ＲＢＤ結合抗体レベルおよび／または血清中和力価は、幾何平均濃度(ＧＭＣ)、幾何平均力価(ＧＭＴ)または幾何平均上昇倍率(ＧＭＦＲ)により特徴づけられ得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物によりもたらされる処置効果は、例えば、ベースライン、ワクチン接種後１か月、３か月、６か月、９か月、１２か月、１８か月および／または２４か月で、予め決定した閾値を超えるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２血清中和力価を示す処置対象のパーセンテージが、このような予め決定した閾値(例えば、ここに記載のもの)を超えるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２血清中和力価を示す非処置対象のパーセンテージより高いことにより特徴づけられ得る。ある実施態様において、血清中和力価は、幾何平均濃度(ＧＭＣ)、幾何平均力価(ＧＭＴ)または幾何平均上昇倍率(ＧＭＦＲ)により特徴づけられ得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物によりもたらされる処置効果は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＮＶＡ特異的結合抗体の検出により特徴づけられ得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物によりもたらされる処置効果は、核酸増幅検査によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２検出により特徴づけられ得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物によりもたらされる処置効果は、例えば、ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)内の少なくとも１以上のＭＨＣ制限(例えば、ＭＨＣクラスＩ制限)エピトープを認識するＴ細胞の誘導を含む、細胞介在免疫応答(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するＴ細胞応答)の誘導により特徴づけられ得る。ある実施態様において、ワクチン誘導Ｔ細胞(例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞)により認識される１以上のエピトープは、集団における対象の、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上を含む、少なくとも５０％に存在するＭＨＣクラスＩアレル上に提示され得る；あるこのような実施態様において、ＭＨＣクラスＩアレルはHLA-B*0702、HLA-A*2402、HLA-B*3501、HLA-B*4401またはHLA-A*0201であり得る。ある実施態様において、エピトープはHLA-A*0201 YLQPRTFLL；HLA-A*0201 RLQSLQTYV；HLA-A*2402 QYIKWPWYI；HLA-A*2402 NYNYLYRLF；HLA-A*2402 KWPWYIWLGF；HLA-B*3501 QPTESIVRF；HLA-B*3501 IPFAMQMAY；またはHLA-B*3501 LPFNDGVYFを含み得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物の一次ワクチン有効性(ＶＥ)は、一次ＶＥ１または一次ＶＥ１および一次ＶＥ２両者が＞３０％またはそれ以上(例えば、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超えるまたはそれ以上を含む)である十分な証拠(事後確率)があるとき確立され得て、ここで、一次ＶＥは一次ＶＥ＝１００×(１−ＩＲＲ)として定義され；ＩＲＲはワクチン群のＣＯＶＩＤ−１９罹病率対プラセボ群の対応する罹病率の比として計算される。一次ＶＥ１は、ワクチン接種前感染の証拠がなかった参加者における確認されたＣＯＶＩＤ−１９に対するここに記載する予防的ｍＲＮＡ組成物のＶＥを表し、一次ＶＥ２は、ワクチン接種後の全参加者における確認されたＣＯＶＩＤ−１９に対するここに記載する予防的ｍＲＮＡ組成物のＶＥを示す。ある実施態様において、一次ＶＥ１およびＶＥ２を、２.５％の全体の第１種過誤を制御するために、連続的に評価し得る(階層的検定)。ある実施態様において、１以上のここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物が上記一次ＶＥエンドポイントを達成することが示されているとき、二次ＶＥエンドポイント(例えば、ワクチン接種前感染の証拠がなかった参加者における確認された重症ＣＯＶＩＤ−１９および全参加者における確認された重症ＣＯＶＩＤ−１９)を、例えば、上記一次ＶＥエンドポイント評価(階層的検定)に使用したのと同じ方法で、連続的に評価し得る。ある実施態様において、一次および／または二次ＶＥエンドポイントの評価は、例えば、次の(ｉ)プラセボ群で１年あたり１.０％罹病率および(ii)参加者の２０％が評価不可能となるまたは血清でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の先の感染の証拠があり、さらなる感染に免疫がある可能性があるとの仮説に基づき、ワクチン群またはプラセボ群１：１比で無作為化した少なくとも２０,０００以上の対象(例えば、少なくとも２５,０００以上の対象)に基づき得る。
ある実施態様において、１以上のここに記載するｍＲＮＡ組成物を、免疫応答の維持および／または増強継続の達成が確立されたレジメンにより投与し得る。例えば、ある実施態様において、投与レジメンは、最初の投与と、その後、所望により１回以上の投与を含み得る；ある実施態様において、このようなその後の投与の何れかの必要性、タイミングおよび／または強度を、１以上の免疫応答またはその特性の維持、増強および／または修飾のために選択し得る。ある実施態様において、投与の数、タイミングおよび／または量は、適切な集団に投与されたとき有効であると確立されている。ある実施態様において、投与の数、タイミングおよび／または量を個々の対象について調節し得る；例えば、ある実施態様において、個別の対象における免疫応答の１以上の特性を、最初の投与を受けた後少なくとも１回(および所望により１回を超えて、例えばしばしば予め選択した間隔で、一般に離れた複数回)評価し得る。例えば、抗体、Ｂ細胞および／またはＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞)および／またはそれにより分泌されるサイトカインの存在および／または特定の抗原および／またはエピトープに対する応答の特性および／または程度が評価され得る。ある実施態様において、その後の投与の必要性、タイミングおよび／または量を、このような評価に鑑みて決定し得る。
上記のとおり、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を受けた１以上の対象を、抗体、Ｂ細胞および／またはＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞)および／またはそれにより分泌されるサイトカインの存在および／または特定の抗原および／またはエピトープに対する応答の特性および／または程度の評価の実施を含む、例えば、投与した組成物の成分に対する免疫応答の存在、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２または他のコロナウイルスへの暴露および／または免疫応答の証拠、何らかの有害事象などを評価するために、何れかの特定の投与を受けてから、モニターし得る(例えば、例えば１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはそれ以上を含む、例えば１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月またはそれ以上を含む、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間またはそれ以上を含む、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上の期間)。ここに記載する組成物の投与は、１以上のこのようなモニタリング段階を含むレジメンで投与し得る。
例えば、ある実施態様において、最初の投与に対する２回目の投与(および／または先の投与に対するその後の投与)の必要性、タイミングおよび／または量を、このような２回目(またはその後の)投与が最初の(または他の先の)投与で観察される免疫応答(例えば、ここに記載のもの)の増幅または修飾を達成するように、評価、決定および／または選択する。ある実施態様において、免疫応答(例えば、ここに記載のもの)のこのような増幅は、最初の投与後に観察される免疫応答レベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上であり得る。ある実施態様において、免疫応答のこのような増幅は、最初の投与後に観察される免疫応答レベルと比較して、少なくとも１.５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍またはそれ以上であり得る。
ある実施態様において、最初の投与に対する２回目(および／または先の投与に対するその後)の投与の必要性、タイミングおよび／または量を、後続の投与が先の投与後に観察される免疫応答(例えば、ここに記載のもの)の持続性を伸ばすように、評価、決定および／または選択する；あるこのような実施態様において、持続性は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月またはそれ以上延長され得る。ある実施態様において、最初の投与後観察される免疫応答は、対象からの血清で測定してＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対する中和抗体の産生および／または細胞介在免疫応答(例えば、ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)内の少なくとも１以上のＭＨＣ制限(例えば、ＭＨＣクラスＩ制限)エピトープを認識するＴ細胞の誘導を含む、例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するＴ細胞応答の誘導)により特徴づけられ得る。ある実施態様において、ワクチン誘導Ｔ細胞(例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞)により認識される１以上のエピトープは、集団における対象の、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上を含む、少なくとも５０％に存在するＭＨＣクラスＩアレル上に提示され得る；あるこのような実施態様において、ＭＨＣクラスＩアレルはHLA-B*0702、HLA-A*2402、HLA-B*3501、HLA-B*4401またはHLA-A*0201であり得る。ある実施態様において、エピトープはHLA-A*0201 YLQPRTFLL；HLA-A*0201 RLQSLQTYV；HLA-A*2402 QYIKWPWYI；HLA-A*2402 NYNYLYRLF；HLA-A*2402 KWPWYIWLGF；HLA-B*3501 QPTESIVRF；HLA-B*3501 IPFAMQMAY；またはHLA-B*3501 LPFNDGVYFを含み得る。
ある実施態様において、最初の投与に対する２回目の投与(または先の投与に対する他のその後の投与)の必要性、タイミングおよび／または量は、このような２回目(またはその後の)投与が免疫応答の対照レベルを維持するまたは超えるように評価、決定および／または選択する；あるこのような実施態様において、対照レベルは、ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染／ＣＯＶＩＤ−１９回復期血清および／または対象から採ったＰＢＭＣサンプル(対象が無症候性であったときはＰＣＲ確認診断後、例えば、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日またはそれ以上を含む、少なくとも１４日またはそれ以上などの、例えば、少なくとも一定期間)に基づいて決定する。ある実施態様において、免疫応答は、対象からの血清で測定してＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対する中和抗体の産生および／または細胞介在免疫応答(例えば、ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)内の少なくとも１以上のＭＨＣ制限(例えば、ＭＨＣクラスＩ制限)エピトープを認識するＴ細胞の誘導を含む、例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するＴ細胞応答の誘導)により特徴づけられ得る。ある実施態様において、ワクチン誘導Ｔ細胞(例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞)により認識される１以上のエピトープは、集団における対象の、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上を含む、少なくとも５０％に存在するＭＨＣクラスＩアレル上に提示され得る；あるこのような実施態様において、ＭＨＣクラスＩアレルはHLA-B*0702、HLA-A*2402、HLA-B*3501、HLA-B*4401またはHLA-A*0201であり得る。ある実施態様において、エピトープはHLA-A*0201 YLQPRTFLL；HLA-A*0201 RLQSLQTYV；HLA-A*2402 QYIKWPWYI；HLA-A*2402 NYNYLYRLF；HLA-A*2402 KWPWYIWLGF；HLA-B*3501 QPTESIVRF；HLA-B*3501 IPFAMQMAY；またはHLA-B*3501 LPFNDGVYFを含み得る。
ある実施態様において、２回目(またはその後の)投与の必要性、タイミングおよび／または量の決定は、最初の(または他の先の)投与後(例えば、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日またはそれ以上後)対象からの血清において測定するＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)に対する中和抗体の存在および／または発現レベルおよび／または細胞介在免疫応答(例えば、ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクポリペプチドおよび／またはその免疫原性フラグメント(例えば、ＲＢＤ)内の少なくとも１以上のＭＨＣ制限(例えば、ＭＨＣクラスＩ制限)エピトープを認識するＴ細胞の誘導を含む、例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するＴ細胞応答の誘導)の評価の１以上の工程を含み得る。ある実施態様において、ワクチン誘導Ｔ細胞(例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞)により認識される１以上のエピトープは、集団における対象の、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上を含む、少なくとも５０％に存在するＭＨＣクラスＩアレル上に提示され得る；あるこのような実施態様において、ＭＨＣクラスＩアレルはHLA-B*0702、HLA-A*2402、HLA-B*3501、HLA-B*4401またはHLA-A*0201であり得る。ある実施態様において、エピトープはHLA-A*0201 YLQPRTFLL；HLA-A*0201 RLQSLQTYV；HLA-A*2402 QYIKWPWYI；HLA-A*2402 NYNYLYRLF；HLA-A*2402 KWPWYIWLGF；HLA-B*3501 QPTESIVRF；HLA-B*3501 IPFAMQMAY；またはHLA-B*3501 LPFNDGVYFを含み得る。
ある実施態様において、ここに提供するキットは、例えばある実施態様において、出荷温度、出荷時間および／または位置を提供できる、リアルタイム輸送モニタリングログ用装置を含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、ある実施態様において、単回用量容器または多回用量容器(例えば、投与用の単回用量または複数用量を保持するよう配置および構築されるおよび／またはある実施態様において保持し得る)であり得る、容器(例えばバイアルまたはシリンジ)、例えば、ガラス容器(例えばガラスバイアルまたはシリンジ)で輸送、保管および／または利用できる。ある実施態様において、多回用量容器(例えば多回用量バイアルまたはシリンジ)は２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の用量を保持するおよび／または保持し得る；ある特定の実施態様において、５用量を保持するおよび／または保持し得るように設計され得る。ある実施態様において、単回用量または多回用量容器(例えば単回用量または多回用量バイアルまたはシリンジ)は、例えば、移動および／または投与の際の幾分かの損失を可能とするため、示される用量より多い体積または量配置および構築されるおよび／または保持し得る。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、防腐剤無添加ガラス容器(例えば、防腐剤無添加ガラスバイアルまたはシリンジ、例えば、単回用量または多回用量防腐剤無添加ガラスバイアルまたはシリンジ)で輸送、保管および／または利用し得る。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、０.４５mlの凍結液体(例えば、５用量を含む)含む、防腐剤無添加ガラス容器(例えば、防腐剤無添加ガラスバイアルまたはシリンジ、例えば、単回用量または多回用量防腐剤無添加ガラスバイアルまたはシリンジ)で輸送、保管および／または利用し得る。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物および／またはそれが入れられ、輸送、保管および／または利用される容器(例えば、バイアルまたはシリンジ)は、室温未満、４℃以下、０℃以下、−２０℃以下、−６０℃以下、−７０℃以下、−８０℃以下、−９０℃以下などに維持され得る。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物および／またはそれが入れられ、輸送、保管および／または利用される容器(例えば、ウイルスまたはシリンジ)は、−８０℃〜−６０℃の温度に維持され得て、ある実施態様において、遮光される。ある態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物および／またはそれが入れられ、輸送、保管および／または利用される容器(例えば、バイアルまたはシリンジ)は、約２５℃未満の温度に維持され得て、ある実施態様において、遮光される。ある態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物および／またはそれが入れられ、輸送、保管および／または利用される容器(例えば、バイアルまたはシリンジ)は、約５℃未満(例えば、約４℃未満)の温度に維持され得て、ある実施態様において、遮光される。ある態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物および／またはそれが入れられ、輸送、保管および／または利用される容器(例えば、バイアルまたはシリンジ)は、約−２０℃の温度に維持され得て、ある実施態様において、遮光される。ある態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物および／またはそれが入れられ、輸送、保管および／または利用される容器(例えば、バイアルまたはシリンジ)は、約−６０℃以上の温度(例えば、ある実施態様において、約−２０℃以上、およびある実施態様において、約４〜５℃以上であって、何れの場合も、所望により約２５℃未満)に維持され得て、ある実施態様において、遮光されるか、または、その逆で実質的に約−２０℃未満の保管温度を達成するための積極的工程(例えば、冷却手段)が取られない。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物および／またはそれが入れられる容器(例えば、バイアルまたはシリンジ)は、耐熱材または容器および／または温度調節材と共におよび／またはその状況下で輸送、保管および／または利用される。例えば、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物および／またはそれが入れられる容器(例えば、バイアルまたはシリンジ)は、氷および／またはドライアイスおよび／または保冷材と共に輸送、保管および／または利用される。ある特定の実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物が入れられる容器(例えば、バイアルまたはシリンジ)はトレイまたは他の維持デバイスに入れられ、温度調節(例えば、氷および／またはドライアイス)材および／または保冷材とさらに接触している(または他の方法で存在下である)。ある実施態様において、提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物が入れられる複数容器(例えば、複数バイアルまたはシリンジ、例えば、ここに記載の単回使用または多回使用バイアルまたはシリンジ)は、温度調節(例えば、氷および／またはドライアイス)材および／または保冷材と同時に存在し(例えば、一般的トレイ、ラック、箱など)および一緒に包装される(または他の方法で存在下である)。一例に過ぎないが、ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物が入れられる複数容器(例えば、複数バイアルまたはシリンジ、例えば、ここに記載の単回使用または多回使用バイアルまたはシリンジ)は一般的トレイまたはラックに入れられ、複数のこのようなトレイまたはラックが、保温(例えば、断熱)シッパーにおいて温度調節材(例えば、ドライアイス)に囲まれた大箱に並べられる。ある実施態様において、温度調節材は、定期的に補充される(例えば、到着した場所で２４時間以内および／または２時間毎、４時間毎、６時間毎、８時間毎、１０時間毎、１２時間毎、１４時間毎、１６時間毎、１８時間毎、２０時間毎、２２時間毎、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎など)。好ましくは保温シッパーへの再導入は低頻度であり、望ましくは１日２回を超えて行わない。ある実施態様において、保温シッパーは、開けてから５分、４分、３分、２分または１分またはそれ以内に再び閉じなければならない。ある実施態様において、一定期間、所望により特定の温度範囲内で保温シッパーに保管されている提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は有用なままである。例えば、ある実施態様において、提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物を含むここに記載される保温シッパーが、約１５℃〜約２５℃の範囲内の温度であるまたは維持(例えば、保管)されているならば、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は１０日間まで使用できる；すなわち、ある実施態様において、１０日を超えない期間、約１５℃〜約２５℃範囲内の温度である保温シッパー内に維持されている提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は対象に投与される。これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物が約１５℃〜約２５℃の範囲内の温度に維持されている保温シッパー内であるまたは維持(例えば、保管)されているならば、１０日間まで使用できる；すなわち、ある実施態様において、１０日を超えない期間、約１５℃〜約２５℃の範囲内の温度に維持されている保温シッパーに維持されている提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は対象に投与される。
ある実施態様において、提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は凍結状態で輸送および／または保管される。ある実施態様において、提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ組成物は、ある実施態様において、防腐剤を含まない、凍結懸濁液として輸送および／または保管される。ある実施態様において、凍結ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は解凍される。ある実施態様において、解凍されたＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物(例えば、懸濁液)は、白色乃至灰白色不透明非晶質粒子を含み得る。ある実施態様において、解凍されたＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、室温以下(例えば、約３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、８℃、４℃未満など)の温度で維持(例えば、保管)されるならば、解凍後数日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日または６日)まで使用され得る。ある実施態様において、解凍されたＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、約２℃〜約８℃の温度で保管(例えば、数日間)後、使用され得る；それとは別にまたはそれに加えて、解凍されたＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、室温で解凍後数時間(例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間)以内に使用され得る。故に、ある実施態様において、解凍され、６日、５日、４日、３日、２日または１日を超えない期間、室温以下の温度およびある実施態様において、約２℃〜約８℃で維持された提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は対象に投与される。これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、解凍され、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間または１時間を超えない時間室温に維持された提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は対象に投与される。ある実施態様において、提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、濃縮状態で輸送および／または保管される。ある実施態様において、このような濃縮組成物は投与前希釈される。ある実施態様において、希釈組成物は希釈後約１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間または１時間以内に投与される；ある実施態様において、このような投与は、希釈後６時間以内である。故に、ある実施態様において、提供されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物の希釈調製物は、希釈後６時間以内に対象に投与される(例えば、ここに記載するとおり、適切な温度、例えば、室温未満、４℃以下、０℃以下、−２０℃以下、−６０℃以下、−７０℃以下、−８０℃以下などおよび一般に約２℃以上例えば約２℃〜約８℃または約２℃〜約２５℃で維持された後)。ある実施態様において、未使用組成物を希釈後数時間(例えば、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間またはそれ以下)以内に廃棄する；ある実施態様において、未使用組成物を希釈６時間以内に廃棄する。
ある実施態様において、保存、輸送または利用されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物(例えば、凍結組成物、液体濃縮組成物、希釈液体組成物など)は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日またはそれ以上、または少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間またはそれ以上、または少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月またはそれ以上の期間、−６０℃を実質的に超える温度で維持されており；あるこのような実施態様において、このような組成物は、このような期間約−２０℃を超える温度でおよび／またはこのような期間約４〜５℃までの温度で維持されて得ておよび／または約４〜５℃を超える、および所望により約２５℃の温度で、二(２)か月未満および／または所望により約一(１)か月までの期間維持され得る。ある実施態様において、このような組成物は、実質的に約４〜５℃を超える温度で、特に約２５℃またその付近の温度で、約２週間、またはある実施態様において１週間の期間、保管、輸送または利用(または他に暴露)され得ない。ある実施態様において、このような組成物は、実質的に約−２０℃を超える温度で、特に約４〜５℃またはその付近の温度で、約１２か月、１１か月、１０か月、９か月、８か月、７か月、６か月、５か月、４か月、３か月、２か月の期間、または、ある実施態様において、約８週間または６週間の期間または実質的に約２か月または、ある実施態様において、３か月または、ある実施態様において４か月を超える期間、保管、輸送または利用(または他に暴露)され得ない
ある実施態様において、保管、輸送または利用されるＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物(例えば、凍結組成物、液体濃縮組成物、希釈液体組成物など)は遮光され得る。ある実施態様において、このような組成物の光への暴露を低減または最小化するために１以上の工程をとり得る(例えば、バイアルまたはシリンジなどの容器に入れ得る)。ある実施態様において、直接日光および／または紫外線への暴露は回避される。ある実施態様において、希釈溶液は、通常の室内灯条件下取り扱いおよび／または利用され得る(例えば、室内灯への暴露を最小化または低減する特定の工程を取ることなく)。ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物の取り扱い(例えば、希釈および／または投与)中無菌技術の厳守が望まれるであることは、理解されるべきである。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、静脈内に投与(例えば、注射)されない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、皮内に投与(例えば、注射)されない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、皮下に投与(例えば、注射)されない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、静脈内、皮内または皮下の何れかに投与(例えば、注射)されない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物はその何らかの成分に過敏症であることが知られる対象に投与されない。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物が投与された対象は、アナフィラキシーの１以上の徴候がモニターされる。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物が投与された対象は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する異なるワクチンの少なくとも１回投与を先に受けている；ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物が投与された対象は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する異なるワクチンを先に受けていない。ある実施態様において、対象の体温を、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物の投与直前に測る(例えば、このような組成物の解凍、希釈および／または投与の直前または直後)；ある実施態様において、このような対象で発熱が確認されたら、投与を遅らせるかキャンセルする。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、抗凝血剤治療を受けているまたは出血性疾患または筋肉内注射が禁忌である状態に罹患しているまたは疑われる対象に投与しない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、対象が副作用およびリスクに関する組成物情報を入手するために接触した医療専門家により投与される。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)組成物は、死亡、能力障害または先天性異常／出生欠損(例えば、対象の子供)の発生、入院患者入院(現在の入院の延長を含む)、命を脅かす事象、死を防ぐための内科的または外科的介入、通常の生活機能を実施する能力の持続するまたは顕著なもしくは相当な崩壊；または個体を危険にさらす可能性があり、他の結果の一つを予防するために内科的または外科的介入(処置)が必要であり得る他の重要な医学的事象の例えば１以上を含み得る、あらゆる重度有害事象の有害事象報告の提供に同意している医療専門家により投与される。
ある実施態様において、提供されるＲＮＡ組成物は、例えば、局所反応事象の１以上の発生率が下に示す発生率を超えないことが確立されているレジメンにより、１８歳未満または１７歳未満または１６歳未満または１５歳未満または１４歳未満または１３歳未満の個体の集団に投与される：
・注射部位の疼痛(最初の投与および／または２回目の投与後７５％および／または２回目の投与後低発生率、例えば、２回目の投与後６５％)；
・注射部位の発赤(最初の投与および／または２回目の投与後５％未満)；および／または
・注射部位の腫脹(最初の投与および／または２回目の投与後５％未満)。
ある実施態様において、提供されるＲＮＡ組成物は、例えば、全身反応事象の１以上の発生率が下に示す発生率を超えないことが確立されているレジメンにより、１８歳未満または１７歳未満または１６歳未満または１５歳未満または１４歳未満または１３歳未満の個体の集団に投与される：
・疲労(最初の投与および／または２回目の投与後５５％)；
・頭痛(最初の投与および／または２回目の投与後５０％)；
・筋肉痛(最初の投与および／または２回目の投与後４０％)；
・悪寒(最初の投与および／または２回目の投与後４０％)；
・関節痛(最初の投与および／または２回目の投与後２０％)；
・発熱(最初の投与および／または２回目の投与後２５％)；
・嘔吐(最初の投与および／または２回目の投与後１０％)；および／または
・下痢(最初の投与および／または２回目の投与後１０％)。
ある実施態様において、１以上の局所反応および／または全身反応事象の１以上の症状(例えば、ここに記載)を軽減する薬物療法が、提供されるＲＮＡ組成物を投与され、局所および／または全身反応事象の１以上(例えば、ここに記載)を経験した１８歳未満または１７歳未満または１６歳未満または１５歳未満または１４歳未満または１３歳未満個体に投与される。ある実施態様において、解熱および／または疼痛薬物療法がこのような個体に投与され得る。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳタンパク質構成の概略説示。Ｓ１サブユニット内の配列は、シグナル配列(ＳＳ)および受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)からなり、ＲＢＤはヒト細胞受容体ＡＣＥ２への結合に関連するＳタンパク質内の重要なサブユニットである。Ｓ２サブユニットはＳ２プロテアーゼ開裂部位(Ｓ２’)、続く膜融合のための融合ペプチド(ＦＰ)、中央らせん(ＣＨ)ドメインを伴う７回反復領域(ＨＲ１およびＨＲ２)、膜貫通ドメイン(ＴＭ)および細胞質テイル(ＣＴ)を含む。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ワクチン開発のための予測構築物。完全および野生型Ｓタンパク質に基づき、(１)中和感受性部位を保持する安定化変異を含む第一７回反復領域(ＨＲＰ１)に近距離に変異を伴う完全タンパク質、(２)Ｓ１ドメインまたは(３)ＲＢドメイン(ＲＢＤ)のみをコードする異なる構築物を設計した。さらに、タンパク質フラグメントを安定化するために、フィブリチンドメイン(Ｆ)をＣ末端に融合させた。全構築物を、細胞膜へのゴルジ輸送を確実とするためシグナルペプチド(ＳＰ)で開始した。
ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡを使用するインフルエンザＨＡに対する抗体免疫応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを１μgのワクチン候補で２回免疫化した。ウイルス抗原特異的免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の総量をＥＬＩＳＡで測定した。抗体の機能性をＶＮＴで評価した。
ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡプラットフォームを使用するインフルエンザＨＡに対するＴ細胞応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μgのワクチン候補で、２回ＩＭ免疫化した。Ｔ細胞応答を、脾臓から回収したＴ細胞刺激に対する抗原特異的ペプチドを使用して、分析した。ＩＦＮγ放出を、ペプチド刺激後ELISpotアッセイを使用して測定した。
ＢＮＴ１６２ａ１で免疫化７日、１４日、２１日および２８日後の抗Ｓタンパク質ＩｇＧ応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μg、５μgまたは１０μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＬ０６３.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後７日、１４日、２１日および２８日目、動物を出血させ、血清サンプルを、ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｓ１(左)および抗ＲＢＤ(右)抗原特異的免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の総量について分析した。７日目、１４日目、２１日目および２８日目について、１：１００血清希釈の値をグラフに含めた。グラフの一つの点は１匹のマウスを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均＋ＳＥＭが含まれる)。
ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化７日、１４日、２１日および２８日後の抗Ｓタンパク質ＩｇＧ応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０.２μg、１μgまたは５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後７日、１４日、２１日および２８日目、動物を出血させ、血清サンプルを、ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｓ１(左)および抗ＲＢＤ(右)抗原特異的免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の総量について分析した。７日目(１：１００)、１４日目(１：３００)、２１日目(１：９００)および２８日目(１：２７００)について、異なる血清希釈をグラフに含めた。グラフの一つの点は１匹のマウスを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均＋ＳＥＭが含まれる)。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスで免疫化１４日、２１日および２８日後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスの中和。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０.２μg、１μgまたは５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後１４日、２１日および２８日目、動物を出血させ、血清をＳＡＲＳ ＣｏＶ−２シュードウイルス中和について試験した。グラフはｐＶＮ５０血清希釈(血清無しの陽性対照と比較して、感染事象の５０％減少)を示す。グラフの一つの点は１匹のマウスを表す。全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した。群サイズｎ＝８。平均＋ＳＥＭを、各群について水平バーによりひげと共に示す。ＬＬＯＱ、定量下限。ＵＬＯＱ、定量上限。
ＢＮＴ１６２ｃ１で免疫化７日、１４日および２１日後の抗Ｓタンパク質ＩｇＧ応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを０.２μg、１μgまたは５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＳ００４.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後７日、１４日および２１日目、動物を出血させ、血清サンプルを、ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｓ１(左)および抗ＲＢＤ(右)抗原特異的免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の総量について分析した。７日目(１：１００)、１４日目(１：３００)および２１日目(１：９００)について、異なる血清希釈をグラフに含めた。グラフの一つの点は１匹のマウスを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均＋ＳＥＭが含まれる)。
ＢＮＴ１６２ｃ１で免疫化１４日および２１日後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスの中和。ＢＡＬＢ／ｃマウスを０.２μg、１μgまたは５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＳ００４.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後１４日および２１日目、動物を出血させ、血清をＳＡＲＳ ＣｏＶ−２シュードウイルス中和について試験した。グラフはｐＶＮ５０血清希釈(血清無しの陽性対照と比較して、感染事象の５０％減少)を示す。グラフの一つの点は１匹のマウスを表す。全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した。群サイズｎ＝８。平均＋ＳＥＭを、各群について水平バーによりひげと共に示す。ＬＬＯＱ、定量下限。ＵＬＯＱ、定量上限。
ＬＮＰ製剤化ＲＢＬ０６３.１で免疫化７日、１４日、２１日および２８日後の抗Ｓタンパク質ＩｇＧ応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを１μg、５μgまたは１０μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＬ０６３.１で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後７日、１４日、２１日および２８日目、動物を出血させ、血清サンプルを、ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｓ１(左)および抗ＲＢＤ(右)抗原特異的免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の総量について分析した。７日目(１：１００)、１４日目(１：１００)、２１日目(１：３００)および２８日目(１：９００)について、異なる血清希釈をグラフに含めた。グラフの一つの点は１匹のマウスを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均＋ＳＥＭが含まれる)。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスで免疫化１４日、２１日および２８日後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスの中和。ＢＡＬＢ／ｃマウスを１μg、５μgまたは１０μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＬ０６３.１で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後１４日、２１日および２８日目、動物を出血させ、血清をＳＡＲＳ ＣｏＶ−２シュードウイルス中和について試験した。グラフはｐＶＮ５０血清希釈(血清無しの陽性対照と比較して、感染事象の５０％減少)を示す。グラフの一つの点は１匹のマウスを表す。全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した。群サイズｎ＝８。平均＋ＳＥＭを、各群について水平バーによりひげと共に示す。ＬＬＯＱ、定量下限。ＵＬＯＱ、定量上限。
ＢＮＴ１６２ｂ２ (ＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.１)で免疫化７日、１４日および２１日後の抗Ｓタンパク質ＩｇＧ応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを０.２μg、１μgまたは５μgのＬＮＰ−式ｔｅｄＲＢＰ０２０.１で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後７日、１４日および２１日目、動物を出血させ、血清サンプルを、ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｓ１(左)および抗ＲＢＤ(右)抗原特異的免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の総量について分析した。７日目(１：１００)、１４日目(１：３００)および２１日目(１：１１００)について、異なる血清希釈をグラフに含めた。グラフの一つの点は１匹のマウスを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均＋ＳＥＭが含まれる)。
ＢＮＴ１６２ｂ２(ＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.１)で免疫化１４日および２１日後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスの中和。ＢＡＬＢ／ｃマウスを０.２μg、１μgまたは５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.１で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後１４日および２１日目、動物を出血させ、血清をＳＡＲＳ ＣｏＶ−２シュードウイルス中和について試験した。グラフはｐＶＮ５０血清希釈(血清無しの陽性対照と比較して、感染事象の５０％減少)を示す。グラフの一つの点は１匹のマウスを表す。全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した。群サイズｎ＝８。平均＋ＳＥＭを、各群について水平バーによりひげと共に示す。ＬＬＯＱ、定量下限。ＵＬＯＱ、定量上限。
ＬＮＰ製剤化ＲＢＳ００４.２で免疫化７日、１４日および２１日後の抗Ｓタンパク質ＩｇＧ応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを０.２μg、１μgまたは５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＳ００４.２で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後７日、１４日および２１日目、動物を出血させ、血清サンプルを、ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｓ１(左)および抗ＲＢＤ(右)抗原特異的免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の総量について分析した。７日目(１：１００)、１４日目(１：３００)および２１日目(１：９００)について、異なる血清希釈をグラフに含めた。グラフの一つの点は１匹のマウスを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均＋ＳＥＭが含まれる)。
ＬＮＰ製剤化ＲＢＳ００４.２で免疫化１４日および２１日後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスの中和。ＢＡＬＢ／ｃマウスを０.２μg、１μgまたは５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＳ００４.２で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後１４日および２１日目、動物を出血させ、血清をＳＡＲＳ ＣｏＶ−２シュードウイルス中和について試験した。グラフはｐＶＮ５０血清希釈(血清無しの陽性対照と比較して、感染事象の５０％減少)を示す。グラフの一つの点は１匹のマウスを表す。全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した。群サイズｎ＝８。平均＋ＳＥＭを、各群について水平バーによりひげと共に示す。ＬＬＯＱ、定量下限。ＵＬＯＱ、定量上限。
スクリーニング過程におけるＡＬＣ−０３１５活性。
野生型(ＷＴ)またはＡｐｏＥノックアウトＣ５７Ｂｌ／６マウスに、ＡｐｏＥ３存在下または非存在下筋肉内投与後、動物の右(注射部位)、背面(注射部位)および腹部(肝臓へのドレナージ)側のルシフェラーゼ発現をモニターした。ルシフェラーゼ発現を、投与４時間、２４時間、７２時間および９６時間後、XenoLight D-Luciferin Redijectを使用して検出した。
野生型(ＷＴ)またはＡｐｏＥノックアウトＣ５７Ｂｌ／６マウスにＡｐｏＥ３存在下(ＫＯ＋)または非存在下(ＫＯ)静脈内(ＩＶ)および筋肉内(ＩＭ)投与後のルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼ発現を投与４時間後XenoLight D-Luciferin Redijectを使用して検出した。
ＲＮＡの一般的構造。５’キャップ、５’および３’非翻訳領域、内因性分泌型シグナルペプチドとＧＳリンカーを伴うコード配列およびポリ(Ａ)テイルを備えたＲＮＡワクチンの一般的構造の略図。個々の要素は、各配列長に対して真に正確な長さで記載されていないことに留意すること。ＵＴＲ＝非翻訳領域；ｓｅｃ＝分泌型シグナルペプチド；ＲＢＤ＝受容体結合ドメイン；ＧＳ＝グリシン−セリンリンカー。
ＲＮＡの一般的構造。５’キャップ、５’および３’非翻訳領域、内因性分泌型シグナルペプチドとＧＳリンカーを伴うコード配列およびポリ(Ａ)テイルを備えた薬物物質ＲＮＡの一般的構造の略図。個々の要素は、各配列長に対して真に正確な長さで記載されていないことに留意すること。ＧＳ＝グリシン−セリンリンカー；ＵＴＲ＝非翻訳領域；Ｓｅｃ＝分泌型シグナルペプチド；ＲＢＤ＝受容体結合ドメイン。
ＲＮＡの一般的構造。５’キャップ、５’および３’非翻訳領域、ベネズエラウマ脳炎脳炎ウイルス(ＶＥＥＶ)ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼレプリカーゼおよび内因性分泌型シグナルペプチドとＧＳリンカーを備えたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原のコード配列およびポリ(Ａ)テイルのＲＮＡワクチンの一般的構造の略図。個々の要素は、各配列長に対して真に正確な長さで記載されていないことに留意すること。ＵＴＲ＝非翻訳領域；Ｓｅｃ＝分泌型シグナルペプチド；ＲＢＤ＝受容体結合ドメイン；ＧＳ＝グリシン−セリンリンカー。
ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化２８日後のELISpot分析。ＢＡＬＢ／ｃマウスを１μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化２８日後、マウスを屠殺し、脾細胞を調製した。ELISpotアッセイを、ＭＡＣＳソートＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して実施した。Ｔ細胞をＳタンパク質またはＲＢＤ特異的重複ペプチドプールで刺激し、ＩＦＮ−γ分泌を測定して、Ｔ細胞応答を評価した。グラフの１つの点は１匹のマウスの個々のスポットカウントを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均が含まれる)。
ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化１２日後の再刺激脾細胞上清におけるサイトカイン濃度。ＢＡＬＢ／ｃマウスを５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化１２日後、マウスを屠殺した。脾細胞を調製し、Ｓタンパク質特異的重複ペプチドプールで刺激した。刺激４８時間後、上清を集め、サイトカイン濃度を決定した。グラフの１つの点は１匹のマウスの個々のサイトカイン濃度を表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均が含まれる)。
ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化７日後のＰＢＭＣにおけるＴ細胞イムノフェノタイピング。ＢＡＬＢ／ｃマウスを５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化７日後、マウスを出血させた。ＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析をＴ細胞で実施した。Ｔ細胞は生存可能ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞として定義された。さらなるフェノタイピングマーカーを図に含める。Ｔｆｈ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞からゲーティングされ、ＣＤ４＋Ｔ−ｂｅｔ−ＧＡＴＡ３−ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＰＤ−１＋ＣＸＣＲ５＋細胞として定義された。グラフの１つの点は１匹のマウスの個々の細胞分画を表す(群サイズｎ＝８；群についての平均が含まれる)。
ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化１２日後の排出リンパ節におけるＢ細胞イムノフェノタイピング。ＢＡＬＢ／ｃマウスを５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.３で１回ＩＭ免疫化した。免疫化１２日後、マウスを屠殺した。リンパ球のフローサイトメトリー分析をＢ細胞で実施した。活性化Ｂ細胞は、単一、生存可能リンパ球内にゲーティングされ、ＩｇＤ−Ｄｕｍｐ(ＣＤ４、ＣＤ８、Ｆ４／８０、ＧＲ−１)−細胞として定義された。形質細胞はＣＤ１３８＋Ｂ２２０ｌｏｗ／ー細胞として定義された。スイッチングされたＢ細胞は非形質細胞からゲーティングされ、ＣＤ１９＋ＣＤ１３８−ＩｇＭ−として定義された。胚中心(ＧＣ)Ｂ細胞はスイッチングされたＢ細胞からゲーティングされ、ＣＤ１９＋ＩｇＭ−ＣＤ３８−ＣＤ９５＋細胞として定義され、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについてゲーティングされた。グラフの１つの点は１匹のマウスの個々の細胞分画を表す(群サイズｎ＝８；群についての平均が含まれる)。
ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡ ＲＢＰ０２０.１で免疫化２８日後のELISpot分析。ＢＡＬＢ／ｃマウスを５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.１で１回ＩＭ免疫化した。免疫化２８日後、マウスを屠殺し、脾細胞を調製した。ELISpotアッセイを、ＭＡＣＳソートＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して実施した。Ｔ細胞をＳタンパク質特異的重複ペプチドプールで刺激し、ＩＦＮ−γ分泌を測定して、Ｔ細胞応答を評価した。グラフの１つの点は１匹のマウスの個々のスポットカウントを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均が含まれる)。
ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡ ＲＢＰ０２０.１で免疫化２８日後の再刺激脾細胞上清におけるサイトカイン濃度。ＢＡＬＢ／ｃマウスを５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＰ０２０.１で１回ＩＭ免疫化した。免疫化２８日後、マウスを屠殺した。脾細胞を調製し、Ｓタンパク質特異的重複ペプチドプールで刺激した。刺激４８時間後、上清を集め、サイトカイン濃度を決定した。グラフの１つの点は１匹のマウスの個々のサイトカイン濃度を表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均が含まれる)。
ＬＮＰ製剤化ｓａＲＮＡ ＲＢＳ００４.２で免疫化２８日後のELISpot分析。ＢＡＬＢ／ｃマウスを５μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＳ００４.２で１回ＩＭ免疫化した。免疫化２８日後、マウスを屠殺し、脾細胞を準備した。ELISpotアッセイを、ＭＡＣＳソートＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して実施した。Ｔ細胞をＳタンパク質特異的重複ペプチドプールで刺激し、ＩＦＮ−γ分泌を測定して、Ｔ細胞応答を評価した。グラフの１つの点は１匹のマウスの個々のスポットカウントを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均が含まれる)。
ＬＮＰ製剤化ｓａＲＮＡ ＲＢＳ００４.２で免疫化２８日後の再刺激脾細胞上清におけるサイトカイン濃度。ＢＡＬＢ／ｃマウスを１μgのＬＮＰ製剤化ＲＢＳ００４.２で１回ＩＭ免疫化した。免疫化２８日後、マウスを屠殺した。脾細胞を準備し、Ｓタンパク質特異的重複ペプチドプールで刺激した。刺激４８時間後、上清を集め、サイトカイン濃度を決定した。グラフの１つの点は１匹のマウスの個々のサイトカイン濃度を表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均が含まれる)。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳタンパク質構成の図式的概観およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ワクチン開発のための新規構築物。野生型Ｓタンパク質に基づき、Ｔ４フィブリチン三量体化ドメイン(Ｆ)および自発性膜貫通ドメイン(ＴＭ)に融合するＲＢＤフラグメントをコードする２つの異なる膜貫通アンカーＲＢＤベースのワクチン構築物を設計した。構築物(１)はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシグナルペプチド(ＳＰ；Ｓタンパク質のＡＡ１〜１９)から開始し、構築物(２)はヒトＩｇ重鎖シグナルペプチド(ｈｕＳｅｃ)から開始して、細胞膜へのゴルジ輸送を確認にした。
膜貫通アンカーＲＢＤベースのワクチン構築物をコードするＬＮＰ−Ｃ１２製剤化ｍｏｄＲＮＡで免疫化６日、１４日および２１日後の抗Ｓタンパク質ＩｇＧ応答。ＢＡＬＢ／ｃマウスを４μgのＬＮＰ−Ｃ１２処方膜貫通アンカーＲＢＤベースのワクチン構築物(ＢＮＴ１６２ｂ３ｃ／ＢＮＴ１６２ｂ３ｄのサロゲート)で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後６日、１４日および２１日目、動物を出血させ、血清サンプルを、ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｓ１(左)および抗ＲＢＤ(右)抗原特異的免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の総量について分析した。６日目(１：５０)、１４日目(１：３００)および２１日目(１：９００)について、異なる血清希釈をグラフに含めた。グラフの一つの点は１匹のマウスを表し、全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した(群サイズｎ＝８；群についての平均＋ＳＥＭが含まれる)。
膜貫通アンカーＲＢＤベースのワクチン構築物をコードするＬＮＰ−Ｃ１２製剤化ｍｏｄＲＮＡで免疫化６日、１４日および２１日後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスの中和。ＢＡＬＢ／ｃマウスを４μgのＬＮＰ−Ｃ１２処方膜貫通アンカーＲＢＤベースのワクチン構築物(ＢＮＴ１６２ｂ３ｃ／ＢＮＴ１６２ｂ３ｄのサロゲート)で１回ＩＭ免疫化した。免疫化後６日、１４日および２１日目、動物を出血させ、血清をＳＡＲＳ ＣｏＶ−２シュードウイルス中和について試験した。グラフはｐＶＮ５０血清希釈(血清無しの陽性対照と比較して、感染事象の５０％減少)を示す。グラフの一つの点は１匹のマウスを表す。全てのマウスサンプルをデュプリケートで測定した。群サイズｎ＝８。平均＋ＳＥＭを、各群について水平バーによりひげと共に示す。ＬＬＯＱ、定量下限。ＵＬＯＱ、定量上限。
アカゲザルにおけるＢＮＴ１６２ｂ１の免疫原性およびヒト回復期血清との比較。アカゲザルを、０および２１日目に３０μgまたは１００μgのＢＮＴ１６２ｂ１またはプラセボ(０.９％ＮａＣｌ)でＩＭ免疫化した。血清を免疫化前ならびに免疫化後１４日、２１日、２８日および３５日に得た；ＰＢＭＣを免疫化前ならびに後１４日および４２日に得た。ＣＯＶＩＤ−１９患者からの血清を発症２０〜４０日後および無症候性回復期少なくとも１４日後に得た。ａ、免疫化後示す時間後に採血したアカゲザル血清(ｎ＝６／群、プラセボ群の全測定時点は‘対照’下に示す)およびヒト回復期血清(ｎ＝６２)のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓの組み換えＳ１プロテアーゼフラグメントに対するＩｇＧ結合の幾何平均濃度。ｂ、アカゲザル血清(ｎ＝６／群、プラセボ群の全測定時点は‘対照’下に示す)およびヒト回復期血清(ｎ＝３８)のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２幾何平均５０％中和力価。Ｐ値は両側一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定により決定した。ｃ、４２日目のアカゲザルＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦ(ＴＨ１)、ＩＬ−２１またはＩＬ−４(ＴＨ２)サイトカインを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。Ｐ値を両側クラスカル・ウォリス検定、続くダンの多重比較検定により決定した。各データ点は個々の動物に対応する。
治験集団の概要
全用量レベルでワクチン接種７日以内に報告された局所反応。応答型注射部位(局所)反応は、注射部位疼痛(軽度＝活動を妨げない；中程度＝活動を妨害する；重症＝日常的活動が阻止される；グレード４＝救急処置室来院または入院)および発赤および腫脹(軽度＝直径２.５〜５.０cm；中程度＝直径５.５〜１０.０cm；重症＝直径＞１０.０cm；グレード４＝発赤について壊死または剥脱性皮膚炎および腫脹について壊死)であった。データは、各ワクチン接種後１４日、電子日記の使用により集めた。
ａ：ワクチン接種１後７日以内に報告された全身性事象：全用量レベル；ｂ：ワクチン接種２後７日以内に報告された全身性事象：１０μgおよび３０μg用量レベル。応答型全身事象は、悪心／嘔吐(軽度＝活動を妨げないまたは２４時間で１〜２回；中程度＝活動を幾分妨げるまたは２４時間で＞２回；重症＝日常的活動が阻止されるまたは経静脈水分投与が必要；グレード４＝降圧ショックのため救急処置室来院または入院)、下痢(軽度、２４時間に２〜３回軟便；中程度、２４時間に４〜５回軟便；重度、２４時間に≧６回軟便；グレード４＝救急処置室来院または入院)、頭痛(軽度＝活動を妨げない；中程度＝＞２４時間の非麻薬性鎮痛剤の反復使用または活動を幾分妨げる；重症＝顕著、麻薬性鎮痛剤の何らかの使用または日常的活動を妨げる；グレード４＝救急処置室来院または入院)、疲労／疲労(軽度＝活動を妨げない；中程度＝活動を幾分妨げる；重症＝顕著；日常的活動を妨げる；グレード４＝救急処置室来院または入院)、筋肉痛(注射部位以外の領域で生じる疼痛；軽度＝活動を妨げない；中程度＝活動を幾分妨げる；重症＝顕著；日常的活動を妨げる；グレード４＝救急処置室来院または入院)、関節痛(軽度＝活動を妨げない；中程度＝活動を幾分妨げる；重症＝顕著；日常的活動を妨げる；グレード４＝救急処置室来院または入院)および発熱(軽度＝１００.４°Ｆ〜１０１.１°Ｆ[３８.０℃〜３８.４℃]；中程度＝１０１.２°Ｆ〜１０２.０°Ｆ[３８.５℃〜３８.９℃]；重症＝１０２.１°Ｆ〜１０４.０°Ｆ[３９.０℃〜４０.０℃]；グレード４＝＞１０４.０°Ｆ[＞４０.０℃])。
ＢＮＴ１６２ｂ１の免疫原性 − １回または２回投与後のＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣおよびＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ５０％中和力価。１５名の群の対象を、示す用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１(ｎ＝１２)またはプラセボ(Ｐ、ｎ＝３)で１日目(全用量レベルおよびプラセボ)および２１日目(１０μgおよび３０μg用量レベルおよびプラセボ)で免疫化した。血清を免疫化前(１日目)および最初の免疫化７日、２１日および２８日後に得た。ヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清(ＨＣＳ)(ｎ＝３８)を発症２０〜４０日後および無症候性回復期少なくとも１４日後に得た。ａ、組み換えＲＢＤ結合ＩｇＧのＧＭＣ。定量下限(ＬＬＯＱ)１.１５(点線)。ｂ、５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和ＧＭＴ。各データ点は１血清サンプルを表し、各垂直バーは幾何平均と９５％信頼区間を表す。
ＢＮＴ１６２ｂ１はヒトにおける強力なＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する。ＢＮＴ１６２はＴ細胞：ＩＮＦγ ELISpotエクスビボ；試験対象８中８でＴ細胞応答を誘導した。ここで、対象は、１０μg ＢＮＴ１６２ｂ１；ＣＥＦ：ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ・ミックス、ＣＥＦＴ：ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ、破傷風ＣＤ４ Ｔ細胞エピトープ・ミックスでプライム／ブーストワクチン接種した。
ＢＮＴ１６２ｂ１はＩｇＧ濃度を誘導した。対象を、１日目(全用量レベル)および２２日目(６０μg以外全用量レベル)ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化した(ｎ＝１２／群、１０μgおよび５０μgコホートについてｎ＝１１で２２日目から)。血清を１日目(プレプライム)および８日、２２日(プレブースト)、２９日および４３日目に得た。全用量レベルの投与前応答を合わせた。ヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清(ＨＣＳ、ｎ＝３８)を、ＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後およびドナーがもはや症状がなくなった時に得た。定量下限(ＬＬＯＱ＝１.１５)未満のＲＢＤ結合ＩｇＧ濃度について、ＬＬＯＱ／２値をプロットした。矢頭はワクチン接種を示す。市松模様のバーは、ブースト免疫化を実施しなかったことを示す。バーを越える値は幾何平均と９５％信頼区間である。提出時、４３日目データは５０μgコホートの５対象および６０μgコホートの全対象について保留された。
ＢＮＴ１６２ｂ１誘導ウイルス中和力価。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図３９におけると同じである。ａ、免疫化対象およびＣＯＶＩＤ−１９回復期患者(ＨＣＳ)におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価(ＶＮＴ５０)。定量下限(ＬＬＯＱ)＝２０未満の値について、ＬＬＯＱ／２値をプロットした。矢頭は免疫化の日を示す。市松模様のバーは、ブースト免疫化を実施しなかったことを示す。幾何平均(バーを越える値)と９５％信頼区間。提出時、４３日目データは、５０μgコホートの５対象および６０μgコホートの全対象まだ入手できなかった、ｂ、ＲＢＤ結合ＩｇＧ幾何平均濃度(ＧＭＣ)(図３９におけるとおり)と２９日目ＶＮＴ５０(全評価可能対象血清)の相関。ノンパラメトリック・スピアマン相関。ｃ、１６ ＲＢＤ変異体および１優性スパイクタンパク質バリアントＤ６１４Ｇを含む１７ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質バリアントを示すシュードウイルスパネルにわたるシュードウイルス５０％中和力価(ｐＶＮＴ５０)(用量レベル１０μg、３０μgおよび５０μg、ｎ＝各１〜２；２９日目)。定量下限(ＬＬＯＱ)＝４０。幾何平均。
ＢＮＴ１６２ｂ１誘導ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の頻度および強度。ワクチン接種スケジュールは図３９におけるとおりである。１日目(Ｐｒｅ)および２９日目(Ｐｏｓｔ、ブースト７日後)(１μgおよび５０μg、ｎ＝各８；１０μgおよび３０μg、ｎ＝各１０)に得たＰＢＭＣはＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターに対して富化され、直接エクスビボＩＦＮγ ELISpotでの評価のために、ワクチンコード化ＲＢＤを表す重複ペプチドプールで一夜別々に刺激された。共通病原Ｔ細胞エピトーププールＣＥＦ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスＨＬＡクラスＩエピトープ)およびＣＥＦＴ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス、破傷風毒素ＨＬＡクラスIIエピトープ)は一般的Ｔ細胞反応性の評価に役立ち、培地は陰性対照として役立った。各ドットは、培地のみ対照から減算後の１治験対象のデュプリケートウェルからの標準化平均スポット数を表す。ａ、ワクチン接種後データ点上の比率は、用量コホートあたり試験対象の総数内の検出可能なＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を有する対象数。ｂ、１０μgコホート対象の例示的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ELISpot。ｃ、全プライム／ブーストワクチン接種した対象におけるＲＢＤ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびそのベースラインＣＥＦＴ−およびＣＥＦ特異的Ｔ細胞応答。ｄ、用量コホート１０μg〜５０μgのＶＮＴ５０(図４０ａにおけるとおり)とＣＤ４＋Ｔ細胞応答(図４１におけるとおり)の相関(１μgおよび５０μg、ｎ＝各８；１０μgおよび３０μg、ｎ＝各１０)。ノンパラメトリック・スピアマン相関。
ＢＮＴ１６２ｂ１誘導Ｔ細胞のサイトカイン分極。ワクチン接種スケジュールおよびＰＢＭＣサンプリングは図４１におけるとおりである。ワクチン接種したおよびＣＯＶＩＤ−１９から回復したドナーのＰＢＭＣ(ＨＣＳ ｎ＝６；(ｃ)における)を一夜ワクチンコード化ＲＢＤである重複ペプチドプールで刺激し、フローサイトメトリー(ａ〜ｃ)およびビーズベースのイムノアッセイ(ｄ)で評価した。ａ、１０μgコホート対象のサイトカイン産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の例示的疑似カラーフローサイトメトリープロット。ｂ、総サイトカイン産生ＲＢＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の分画として示すサイトカインを産生するＲＢＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびｃ、同じサブセットの総循環Ｔ細胞の分画として示すサイトカインを産生するＲＢＤ特異的ＣＤ８＋(左)またはＣＤ４＋(右)Ｔ細胞。３０μgコホートからの１ＣＤ４非応答者(＜０.０２％総サイトカイン産生Ｔ細胞)および１ＣＤ８非応答者(＜０.０１％総サイトカイン産生Ｔ細胞)は(ｂ)で除外した。データ点上の値は、全用量コホートにわたる平均画分である。ｄ、５０μgコホートからのＰＢＭＣ。各ドットは、１治験対象についてのＤＭＳＯ対照を減算したデュプリケートウェルからの平均を表す。定量下限(ＬＬＯＱ)はＴＮＦについて６.３pg／mL、ＩＬ−１βについて２.５pg／mLおよびＩＬ−１２ｐ７０について７.６pg／mLであった。平均(ｂ)。
ワクチン接種および評価のスケジュール
応答型有害事象。対象を１日目(全用量レベル)および２２日目(６０μg以外全用量レベル)に示す用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化した(ｎ＝１２／群、２２日目からの１０μgおよび５０μgコホートについてｎ＝１１)。ａ、ｂ、日(１〜９日、２２〜３０日)およびコホートによる局所(ａ)または全身反応(ｂ)を有する対象数。有害事象のグレード判定は、ＦＤＡ推奨に従い実施した(U.S. Department of Health and Human Services, Administration, F. and D. & Research, C. for B. E. and. Toxicity grading scale for healthy adult and adolescent volunteers enrolled in preventive vaccine clinical trials. (2007)。https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/toxicity-grading-scale-healthy-adult-and-adolescent-volunteers-enrolled-preventive-vaccine-clinicalで入手可能)。
薬力学的マーカー。対象を１日目(全用量レベル)および２２日目(６０μg以外全用量レベル)に示す用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化した。ａ、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)レベルの動態およびｂ、リンパ球数の動態。点線は、対照範囲の上限および下限を示す。定量下限(ＬＬＯＱ＝０.３)未満の値について、ＬＬＯＱ／２値をプロットした(ａ)。
抗体とＴ細胞応答の相関。対象を１日目(全用量レベル)および２２日目(６０μg以外全用量レベル)に示す用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化した。ａ、２９日目のＲＢＤ特異的ＩｇＧ応答(図３９ａから)とＣＤ４＋Ｔ細胞応答の相関。(１μgおよび５０μg、ｎ＝各８；１０μgおよび３０μg、ｎ＝各１０)。ノンパラメトリック・スピアマン相関。ｂ、用量コホート１０μg〜５０μgの２９日目のＣＤ４＋対ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の相関(図４１におけるとおり)(１μgおよび５０μg、ｎ＝各８；１０μgおよび３０μg、ｎ＝各１０)。パラメトリック・ピアソン相関。ｃ、２９日目のＲＢＤ特異的ＩｇＧ応答(図３９ａから)とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の相関(１μgおよび５０μg、ｎ＝各８；１０μgおよび３０μg、ｎ＝各１０)。ノンパラメトリック・スピアマン相関。
図４２に示すデータのフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略。治験対象ＰＢＭＣサンプルにおけるＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−４分泌Ｔ細胞同定のためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。ａ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、単一、生存可能リンパ球内でゲーティングした。ｂ、ｃ、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−４(ｂ)およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγおよびＩＬ−２(ｃ)のゲーティング。
ＢＮＴ１６２ｂ１ １８〜５５歳：各投与後局所反応
ＢＮＴ１６２ｂ１ １８〜５５歳：各投与後全身性事象
ＢＮＴ１６２ｂ１ ６５〜８５歳：ＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣ
ＢＮＴ１６２ｂ１ ６５〜８５歳：５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和ＧＭＴ
ＢＮＴ１６２ｂ２ １８〜５５歳：各投与後局所反応
ＢＮＴ１６２ｂ２ １８〜５５歳：各投与後全身性事象
ＢＮＴ１６２ｂ２ ６５〜８５歳：各投与後局所反応
ＢＮＴ１６２ｂ２ ６５〜８５歳：各投与後全身性事象
ＢＮＴ１６２ｂ２ １８〜５５歳：Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣ
ＢＮＴ１６２ｂ２ １８〜５５歳：５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和ＧＭＴ
ＢＮＴ１６２ｂ２ ６５〜８５歳：Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣ
ＢＮＴ１６２ｂ２ ６５〜８５歳：５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和ＧＭＴ
マウスにおけるＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｔ細胞応答。ＢＮＴ１６２ｂ２または緩衝液でＩＭ免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、完全長Ｓペプチド・ミックスまたは陰性対照(ａ、右の無関係ペプチド)；(ａ、左)および(ｃ)はペプチド無し)でエクスビボ再刺激した。Ｐ値を両側対応のあるｔ検定により決定した。(ａ)５μg ＢＮＴ１６２ｂ２でマウス(ｎ＝８／群)免疫化１２日後に集めた脾細胞のＩＦＮγ ELISpot(左)。１μg ＢＮＴ１６２ｂ２でマウス(ｎ＝８マウス／群)免疫化２８日後の単離脾ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ ELISpot(中央および右)。(ｂ)フローサイトメトリーにより決定した、５μg ＢＮＴ１６２ｂ２または緩衝液(対照)で免疫化したマウス(ｎ＝８／群)の脾細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞特異的サイトカイン放出。Ｓペプチド特異的応答をバックグラウンド(ペプチド無し)に対して補正する。(ｃ)ビーズベースのマルチプレックス解析により決定した、１μg ＢＮＴ１６２ｂ２でマウス(ｎ＝８／群、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３について、Ｓペプチド刺激サンプルについてのroutの検定[Ｑ＝１％]により１つの外れ値を除いたためｎ＝７)免疫化２８日後に得た脾細胞によるサイトカイン産生。
１０μg ＢＮＴ１６２ｂ２をワクチン接種した５対象のＩＦＮγ ELISpotデータ。１０６細胞あたりワクチン接種前(Ｐｒｅ)および２９日目(Ｐｏｓｔ − ブースト７日後)のデュプリケートからのバックグラウンド減算スポット数。Ｔ細胞応答分析を、検証済エキソビボＩＦＮγ ELISpotアッセイを使用するＧＣＬＰ準拠法により実施した。全試験をデュプリケートで実施し、陰性および陽性対照(培地のみおよび抗ＣＤ３)を含んだ。さらに、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)およびインフルエンザウイルス由来のペプチドエピトープを陽性対照として使用した。ＣＤ４またはＣＤ８枯渇ＰＢＭＣを、プレコートしたELISpotプレート(Mabtech)でスパイク糖タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分をカバーする重複ペプチドで、１６〜２０時間刺激した。エクスビボＴ細胞応答の分析のために、結合ＩＦＮγをアルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体で可視化した。プレートRobot ELISPOT ReaderをRobot ELISPOT Readerを使用して走査し、ImmunoCapture V6.3またはAID ELISPOT 7.0ソフトウェアにより分析した。スポット数を各デュプリケートについて平均値として要約した。Ｔ細胞数を、Ｓプール１およびＳプール２で刺激後検出されたスポット数の和として計算した。ペプチドにより刺激されたＴ細胞応答を、Moodie et al.(Moodie Z. et al., J Immunol Methods 315, 2006,121-32; Moodie Z. et al., Cancer Immunol Immunother 59, 2010, 1489-501)による、２つの統計検定に基づき(分布形によらないリサンプリング)、培地のみ陰性対照とインキュベートしたエフェクターとELISpot data analysis Tool(ＥＤＡ)を使用して比較し、そうして、疑陽性率を制御しながら感度を維持した。ＣＭＶ、ＥＢＶおよびインフルエンザウイルスからの陽性対照ペプチドに対して前および２９日目Ｔ細胞応答に顕著な変化は観察されなかった(示していない)。
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＩＦＮγ ELISpotデータ例。ＩＦＮγ ELISpotを、免疫化前および１０μg ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の２９日後(投与２の７日後)の対象から得たＰＢＭＣを使用して、図６１におけるとおり実施した。ＨＬＡクラスＩおよびクラスIIペプチドプールＣＥＦ(サイトメガロウイルス[ＣＭＶ]、エプスタイン・バーウイルス[ＥＢＶ](投与２の７日後)およびインフルエンザウイルス、ＨＬＡクラスＩエピトープ・ミックス)およびＣＥＦＴ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスおよび破傷風毒素ＨＬＡクラスII細胞エピトープ・ミックス)を、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞反応性の評価のためのベンチマーク対照として使用した。
ＢＮＴ１６２ｂ２誘発およびベンチマークＩＮＦγ ELISpot応答の比較。１日目および２２日目に１０μgのＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した５対象から得た２９日目(投与２の７日後)のＰＢＭＣサンプルのＩＦＮγスポット数。ＣＥＦ(ＣＭＶ、ＥＢＶおよびインフルエンザウイルスＨＬＡクラスＩエピトープ・ミックス)およびＣＥＦＴ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスおよび破傷風毒素ＨＬＡクラスII細胞エピトープ・ミックス)を、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞反応性の評価のためのベンチマーク対照として使用した。水平線は中央値を示す。
免疫原の設計および特徴づけ。ａ、ＢＮＴ１６２ｂ１の構造。ＲＮＡの線図(左)およびＬＮＰの模式図(右)。ＵＴＲ、非翻訳領域；ＳＰ、シグナルペプチド。ｂ、ネガティブ染色ＲＢＤフォルドン三量体の電子顕微鏡の代表的２Ｄクラス平均。ボックスエッジ：３７nm。ｃ、ＲＢＤ単量体へのＡＣＥ２細胞外ドメイン結合の集中的精密化後の３.２４ÅでのＡＣＥ２／Ｂ０ＡＴ１／ＲＢＤフォルドン三量体複合体の密度地図。サブユニットによる表面色分け。密度に対して精密化したリボンモデルはＲＢＤ−ＡＣＥ２結合界面を示し、おそらく極性相互作用に介在する残基をラベルした。
マウス免疫原性。ａ〜ｃ、ＢＡＬＢ／ｃマウス(ｎ＝８／群)０.２μg、１μgまたは５μgのＢＮＴ１６２ｂ１または緩衝液で筋肉内(ＩＭ)免疫化した。各群幾何平均±９５％ＣＩ、Ｐ値を２８日目に非免疫化(０μg；ｎ＝８)ベースライン血清と比較した(ダネットの多重比較検定を使用する混合効果分析の多重比較)(ａ、ｃ)。ａ、ＥＬＩＳＡにより決定した、免疫化７日、１４日、２１日および２８日後に得た血清におけるＲＢＤ結合ＩｇＧ応答。０日目について、無作為化動物のプレスクリーニングを実施した(ｎ＝４)。ｂ、５μg ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化２８日後の血清からの固定化マウスＩｇＧに対するＨｉｓタグ付ＲＢＤの結合動態の代表的表面プラズモン共鳴センサーグラム(ｎ＝８)。実際の結合(緑色)および１：１結合モデルへのデータの最良フィット(黒色)。ｃ、ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス５０％血清中和力価(ｐＶＮＴ５０)。ｄ〜ｆ、ＢＮＴ１６２ｂ１または緩衝液(対照)でＩＭ免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、完全長Ｓペプチド・ミックスまたは陰性対照((ｄ、左)および(ｅ、ｆ)はペプチド無し；(ｄ、右)は無関係ペプチド)でエクスビボ再刺激した。Ｐ値を両側対応のあるｔ検定により決定した。ｄ、５μg ＢＮＴ１６２ｂ１(左)でマウス(ｎ＝８／群)免疫化１２日後に集めた脾細胞のＩＦＮγ ELISpot。１μg ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化２８日後の単離脾ＣＤ４＋Ｔ細胞(ｎ＝７、グラブス検定により１つの外れ値除去、α＝０.０５)またはＣＤ８＋Ｔ細胞(ｎ＝８)のＩＦＮγ ELISpot(中央および右)。ｅ、フローサイトメトリーにより決定した、５μg ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化したマウス(ｎ＝８／群)の脾細胞によるＴ細胞特異的サイトカイン放出。Ｓペプチド特異的応答をバックグラウンド(ペプチド無し)に対して補正する。ｆ、ビーズベースのマルチプレックス解析により決定した、０.２μg ＢＮＴ１６２ｂ１でマウス(ｎ＝８／群)免疫化２８日後に得た脾細胞によるサイトカイン産生。
アカゲザルにおけるＢＮＴ１６２ｂ１の免疫原性およびヒト回復期血清との比較。ａ、ｂ、雄性アカゲザル２〜４歳(ｎ＝６／群)を３０μgまたは１００μgのＢＮＴ１６２ｂ１または緩衝液で０日目および２１日目にＩＭ免疫化し、血清を免疫化前および１４日、２１日、２８日、３５日および４２日後に得た。ヒト回復期血清(ＨＣＳ)を、ＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後および急性ＣＯＶＩＤ−１９症状が解消した時のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染患者から得た(ｎ＝３８)。バーを越える値は幾何平均を示す。ａ、組み換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤに結合するＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)。点線はプラセボ群について全時点の血清の幾何平均を示す(１.７２Ｕ／mL)。全ての時点の群ＩｇＧ力価を、一元配置ＡＮＯＶＡとダネットの多重比較補正を使用してＨＣＳサンプルに対する統計学的有意について分析し、統計学的有意が３０μg用量レベル群(２８日目、ｐ＜０.０００１；３５日目、ｐ＝０.００１６)および１００μg用量レベル群(２８日、３５日および４２日目、全ｐ＜０.０００１)で確認された。ｂ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価(ＶＮＴ５０)。点線はプラセボ群について全時点の血清の幾何平均を示す(１０.３１Ｕ／mL)。全ての時点についての群ＶＮＴ５０を、一元配置ＡＮＯＶＡとダネットの多重比較補正を使用してＨＣＳサンプルに対する統計学的有意について分析し、統計学的有意が３０μg用量レベル群(２８日目、ｐ＜０.０００１)および１００μg用量レベル群(２８日目および３５日目、両者ｐ＜０.０００１；４２日目、ｐ＝０.００７)で確認された。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露後の非免疫化および免疫化アカゲザルにおけるウイルスＲＮＡ。アカゲザル(ｎ＝６／群)を、図６６に記載するとおり、０日目および２１日目に１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１または緩衝液(対照)で免疫化した。２回目の免疫化４１〜４８日後、動物を、ＩＮおよびＩＴ経路に等しく分けた１×１０６総pfuのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に暴露した。３非免疫化同年齢雄性アカゲザルを、細胞培養培地(Sentinel)に暴露した。ウイルスＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより検出した。データ点上の比率は、群内の全動物内のウイルスＲＮＡ陽性動物数である。ａ、暴露前および３日および６日後に得た気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)におけるウイルスＲＮＡ。６日目、対照とＢＮＴ１６２ｂ１免疫化動物間のウイルス負荷は、統計的に有意であった(ｐ＝０.０１３１)。ｂ、暴露前および暴露１日、３日および６日後に得た鼻腔スワブにおけるウイルスＲＮＡ。３日目、対照とＢＮＴ１６２ｂ１免疫化動物間のウイルス負荷は、統計的に有意であった(ｐ＝０.０２２９)。点線は検出下限(ＬＬＯＤ)を示す。陰性検体をＬＬＯＤの1/2に設定した。Ｐ値を二項応答(暴露後検出不可能なウイルス負荷を成功として、暴露後測定可能なウイルス負荷を失敗として)のカテゴリー分析により決定した。
ＢＮＴ１６２ｂ１およびｂ２ Ｖ８免疫化は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２で暴露後アカゲザルにおけるウイルスＲＮＡを減少させる；ｂ２は鼻からの早期の排除を示す
例示的パンデミック供給製品包装概要
ワクチン接種時点の例示的ワクチン保管および取り扱い
多回用量製剤の例
幾何平均力価および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイ − ＮＴ５０ −フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均力価および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイ − ＮＴ５０ −フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均力価および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイ − ＮＴ５０ −フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均力価および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイ − ＮＴ５０ −フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均濃度および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルアッセイ − フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均濃度および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルアッセイ − フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳、ＢＮＴ１６２ｂ１ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均濃度および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１結合ＩｇＧレベルアッセイ − フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均濃度および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１結合ＩｇＧレベルアッセイ − フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均濃度および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１結合ＩｇＧレベルアッセイ − フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均濃度および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１結合ＩｇＧレベルアッセイ − フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均濃度および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルアッセイ − フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 評価可能免疫原性集団
幾何平均濃度および９５％ＣＩ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルアッセイ − フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 評価可能免疫原性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告局所反応 −フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告局所反応 −フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告局所反応 −フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告局所反応 −フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告全身性事象 −フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告全身性事象 −フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ１ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告全身性事象 −フェーズ１、２回投与、２１日離す − １８〜５５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告全身性事象 −フェーズ１、２回投与、２１日離す − ６５〜８５歳 − ＢＮＴ１６２ｂ２ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告局所反応、年齢群１８〜５５歳 −フェーズ２ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告局所反応、年齢群５６〜８５歳 −フェーズ２ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告全身性事象、年齢群１８〜５５歳 −フェーズ２ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告全身性事象、年齢群５６〜８５歳 −フェーズ２ − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告局所反応、年齢群１８〜５５歳 − フェーズ２／３の約６０００対象 − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告局所反応、年齢群５６〜８５歳 − フェーズ２／３の約６０００対象 − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告全身性事象、年齢群１８〜５５歳 − フェーズ２／３の約６０００対象 − 安全性集団
各投与後７日以内の最大重症度による対象報告全身性事象、年齢群５６〜８５歳 − フェーズ２／３の約６０００対象 − 安全性集団
投与１後最初のＣＯＶＩＤ−１９出現の累積発生曲線 − 投与１全入手可能有効性集団
ＢＮＴ１６２ｂ２ − 例示的機能的５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価(ＶＮ５０)。若年成人(１８〜５５歳)および高齢成人(５６〜８５歳)を、１日目および２２日目ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した(ｎ＝１２／群)。血清を、若年成人から１日目(ベースライン)および８日目、２２日目(プレブースト)、２９日目、４３日目、５０日目および８５日目に得た。血清を高齢成人から１日目(ベースライン)および８日目、２２日目および２９日目に得た。ヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清(ＨＳＣ、ｎ＝３８)を、診断確認少なくとも１４日後およびドナーがもはや症状がなくなった時に得た。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価(ＶＮ５０力価)と９５％信頼区間を１μg、３μg、１０μg、２０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した若年成人および２０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した高齢成人で示す。検出限界(ＬＯＤ)より小さい値を０.５＊ＬＯＤとしてプロットする。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。水平点線はＬＯＤを表す。ＶＮ５０＝５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価；ＨＣＳ＝ヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清。
ＢＮＴ１６２ｂ１ − 機能的５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価(ＶＮ５０)のベースラインからの例示的増加倍率。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図３９におけると同じである(ｎ＝１２／群)。ＶＮ５０力価のベースラインからの幾何平均増加倍率(ＧＭＦＩ)と９５％信頼区間を、１μg、１０μg、３０μg、５０μgまたは６０μg ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化した若年参加者(１８〜５５歳)について示す。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。投与２は６０μg用量群で実施しなかった。水平点線は抗体陽転(seroconversion)の閾値を表す(増加倍率≧４)。ＶＮ５０＝５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価。
ＢＮＴ１６２ｂ２ − 機能的５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価(ＶＮ５０)のベースラインからの例示的増加倍率。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図１０１におけると同じである。ＶＮ５０力価のベースラインからの幾何平均増加倍率(ＧＭＦＩ)と９５％信頼区間を(Ａ)１μg、３μg、１０μg、２０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した若年参加者(１８〜５５歳)および(Ｂ)２０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した年配参加者(５６〜８５歳)について示す。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。水平点線は抗体陽転の閾値を表す(増加倍率≧４)。ＶＮ５０＝５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価。
ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化後にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＧＭＴ抗体陽転した参加者の例示的頻度。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図３９におけると同じである(ｎ＝１２／群)。５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価(ＶＮ５０)に関する抗体陽転を１μg、１０μg、３０μg、５０μgまたは６０μg ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化した若年参加者(１８〜５５歳)について示す。抗体陽転は、ベースラインと比較した機能的抗体応答の最小４倍増加として定義される。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。投与２は６０μg用量群で実施しなかった。ＧＭＴ＝幾何平均力価。
ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化後にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＧＭＴ抗体陽転した参加者の例示的頻度。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図１０１におけると同じである。５０％ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価(ＶＮ５０)に関する抗体陽転を(Ａ)１μg、３μg、１０μg、２０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２を投与された若年参加者(１８〜５５歳)および(Ｂ)２０μg ＢＮＴ１６２ｂ２を投与された年配参加者(５６〜８５歳)について示す。抗体陽転は、ベースラインと比較した機能的抗体応答の最小４倍増加として定義される。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。ＧＭＴ＝幾何平均力価。
ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化後のＳ１結合抗体濃度のベースラインからの例示的増加倍率。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図３９におけると同じである(ｎ＝１２／群)。Ｓ１結合抗体濃度のベースラインからの幾何平均増加倍率(ＧＭＦＩ)と９５％信頼区間を１μg、１０μg、３０μg、５０μgまたは６０μg ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化した若年参加者(１８〜５５歳)について示す。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。投与２は６０μg用量群で実施しなかった。水平点線は抗体陽転の閾値を表す(増加倍率≧４)。
ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化後のＳ１結合抗体濃度のベースラインからの例示的増加倍率。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図１０１におけると同じである。Ｓ１結合抗体濃度におけるベースラインからの幾何平均増加倍率(ＧＭＦＩ)と９５％信頼区間を(Ａ)１μg、３μg、１０μg、２０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した若年参加者(１８〜５５歳)および(Ｂ)２０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した年配参加者(５６〜８５歳)について示す。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。水平点線は抗体陽転の閾値を表す(増加倍率≧４)。
ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化後Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣ抗体陽転した参加者の例示的頻度。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図３９におけると同じである(ｎ＝１２／群)。Ｓ１結合抗体ＧＭＣに関する抗体陽転を１μg、１０μg、３０μg、５０μgまたは６０μg ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化した若年参加者(１８〜５５歳)について示す。抗体陽転をベースラインと比較したＳ１結合ＩｇＧ ＧＭＣ応答の少なくとも４倍増加として定義する。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。投与２は６０μg用量群で実施しなかった。ＧＭＣ＝幾何平均濃度。
ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化後Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣ抗体陽転した参加者の例示的頻度。ワクチン接種スケジュールおよび血清サンプリングは図１０１におけると同じである。Ｓ１結合抗体ＧＭＣに関する抗体陽転を(Ａ)１μg、３μg、１０μg、２０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した若年参加者(１８〜５５歳)および(Ｂ)２０μg ＢＮＴ１６２ｂ２を投与された年配参加者(５６〜８５歳)について示す。抗体陽転をベースラインと比較したＳ１結合ＩｇＧ ＧＭＣ応答の少なくとも４倍増加として定義する。矢頭はベースライン(投与１前、１日目)および投与２(２２日目)を示す。ＧＭＣ＝幾何平均濃度
ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した若年参加者からのＳ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞から産生されたサイトカイン産生の例示的結果。種々の用量のＢＮＴ１６２ｂ２で処置した参加者の血液から単離した末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)細胞分画をベースライン(投与１前)および投与１２９日(±３日)後に集め、分析した。参加者は、１μg(ｎ＝８)、３μg(ｎ＝９)、１０μg(ｎ＝１０)、２０μg(ｎ＝９)または３０μg(ｎ＝１０)を投与された若年参加者(１８〜５５歳)を含んだ。棒グラフは算術平均と９５％信頼区間を示す。サイトカイン産生を、ＩＦＮγ、ＩＬ−２またはＩＬ−４について陽性の全ＣＤ４＋Ｔ細胞の画分を合計し、この合計を１００％に設定し、その各特異的サイトカイン産生サブセットの分画を計算することにより計算した。１μgコホートからの２参加者、３μgコホートからの１参加者および１０μgコホートからの１参加者をこの分析から除外した(総サイトカイン産生ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度＜０.０３％)。ＩＦＮ＝インターフェロン；ＩＬ＝インターロイキン；若年参加者＝参加者１８〜５５歳；Ｓタンパク質＝ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質。
ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した年配参加者からのＳ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞から産生されたサイトカイン産生の例示的結果。種々の用量のＢＮＴ１６２ｂ２で処置した参加者の血液から単離した末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)細胞分画をベースライン(投与１前)および投与１２９日(±３日)後に集め、分析した。参加者は、１０μg(ｎ＝１１)、２０μg(ｎ＝８)または３０μg(ｎ＝９)を投与された年配参加者(５６〜８５歳)を含んだ。棒グラフは算術平均と９５％ＣＩを示す。サイトカイン産生を、ＩＦＮγ、ＩＬ−２またはＩＬ−４について陽性の全ＣＤ４＋Ｔ細胞の画分を合計し、この合計を１００％に設定し、その各特異的サイトカイン産生サブセットの分画を計算することにより計算した。１０μgコホートからの６参加者および２０μgコホートからの１参加者をこの分析から除外した(総サイトカイン産生ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度＜０.０３％)。ＩＦＮ＝インターフェロン；ＩＬ＝インターロイキン；年配参加者＝参加者５６〜８５歳；Ｓタンパク質＝ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質。
ＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｔ細胞応答の発生率および強度。１日目(プライム前)および２９日目(ブースト７日後)得たＰＢＭＣ(用量コホート１μg、１０μgおよび２０μg、ｎ＝各９；３０μg、ｎ＝１０)はＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターについて富化され、直接エクスビボＩＦＮγ ELISpotの評価のために、一夜、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ(Ｎ末端プールＳプール１およびＲＢＤおよびＣ末端Ｓプール２)の野生型配列の異なる部分を代表する３つの重複ペプチドプールで、別々に刺激された。共通病原Ｔ細胞エピトーププールＣＥＦ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスの免疫優性ＨＬＡクラスＩエピトープ)およびＣＥＦＴ(免疫優性ＨＬＡクラスIIエピトープＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス、破傷風毒素)を対照として使用した。細胞培養培地は陰性対照として役立った。各ドットは培地のみ対照から減算後の１治験参加者についてデュプリケートウェルからの正規化平均スポット数を表す(ａ、ｃ)。ａ、各用量コホートの抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答。用量コホートあたり試験した参加者数の総数に対する２９日目にＴ細胞応答が検出可能であった参加者数が提供される。２０μg用量コホートからの２参加者のスポット数データは正規化できず、プロットしなかった。ｂ、３０μg用量コホート参加者のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ELISpotの例。ｃ、いずれかのＳペプチドプールが認識された全参加者におけるＳ特異的Ｔ細胞応答およびそのベースラインＣＥＦＴ−およびＣＥＦ特異的Ｔ細胞応答。水平バーは中央値を示す。
ＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｓ特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞。１日目(プライム前)および２９日目(ブースト７日後)に得たＰＢＭＣ由来の免疫化参加者のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター富化画分(１μg、１０μgおよび２０μg用量コホート、ｎ＝各９；３０μg用量コホート、ｎ＝１０)を、直接エクスビボＩＦＮγ ELISpotでの評価のために、野生型ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓをカバーする２つの重複ペプチドプール(Ｓプール１およびＳプール２)で一夜刺激した(ａ〜ｃ)。各ドットは培地のみ対照から減算後の１治験参加者についてデュプリケートウェルからの正規化平均スポット数を表す。参加者あたりのＳプール１およびＳプール２に対するＴ細胞応答を合わせた。２０μg用量コホートからの２参加者のスポット数データは正規化できず、プロットしなかった。２９日目(ブースト７日後)ワクチン接種した参加者(用量コホート１μg、ｎ＝７；１０μgおよび３０μg、ｎ＝１０；２０μg、ｎ＝９)からのＰＢＭＣを上記のとおり刺激し、フローサイトメトリーにより分析した(ｄ, ｅ)。ａ、各用量コホートのＳ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答。用量コホートあたり試験した参加者総数に対する２９日目Ｔ細胞応答が検出可能であった参加者数が提供される。ｂ、Ｓの異なる部分に対する評価可能ベースラインデータがある参加者(ＣＤ４＋についてｎ＝３４およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答についてｎ＝３７)のワクチン誘導応答のマッピング。デノボ誘導または増幅応答をＢＮＴ１６２ｂ２誘導応答として分類する；応答無しまたはワクチン接種により増幅されなかった現存の応答をワクチン応答無し(ｎｏｎｅ)として分類する。ｃ、Ｓプール２に対する現存の応答を有するまたは有しない個体のＳプール１に対する応答強度。１μg用量コホートからのデータは、この用量コホートでＳプール２に対するベースライン応答が存在しなかったため、除外する。水平バーは各群の中央を表す。ｄ、３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２でプライム／ブーストワクチン接種した参加者からのサイトカイン産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の疑似カラーフローサイトメトリープロットの例。ｅ、ワクチン誘導Ｓ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度対ＩＬ４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞。ＩＣＳ刺激を、Ｓプール１とＳプール２のペプチド混合物を使用して実施した。各データ点は１治験参加者を表す(１μg用量コホート、ｎ＝８；２０μg用量コホート、ｎ＝８；１０μgおよび３０μg、ｎ＝各１０)。Ｓプール２に対する現存のＣＤ４＋Ｔ細胞応答が強い２０μg用量コホートからの１参加者を除外した。ｆ、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を、図１１６で分析した３参加者についてｐＭＨＣクラスＩ多量体染色(ＣＤ８＋の％多量体＋)、ＩＣＳおよびELISpot(ＣＤ８＋の％ＩＦＮγ＋)により決定した。Ｓプール１とＳプール２のシグナルを統合した。
抗体とＴ細胞応答の相関。データを、２９日目から全プライム／ブーストワクチン接種した参加者(用量コホート１、１０μg、２０μgおよび３０μg)についてプロットし、Ｔ細胞応答が検出不可能であった参加者のデータ点(白丸；ｂ,ｃ)は相関分析から除外した。ａ、Ｓ１特異的ＩｇＧ応答とＳ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の相関。ｂ、Ｓ特異的ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の相関。ｃ、Ｓ１特異的ＩｇＧ応答とＳ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の相関。
ＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｔ細胞のサイトカイン分極。１日目(プライム前)および２９日目(ブースト７日後)(用量コホート１μg、ｎ＝８；１０μgおよび３０μg、ｎ＝各１０；２０μg、ｎ＝９)およびＣＯＶＩＤ−１９回復ドナー(ＨＣＳ、ｎ＝１８；ｃ,ｄ)から得たＰＢＭＣを、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓの野生型配列の異なる部分を表す３つの重複ペプチドプール(Ｎ末端プールＳプール１[ａａ１〜６４３]およびＲＢＤ[Ｓのａａ ３２７〜５２８に融合したａａ１〜１６]およびＣ末端Ｓプール２[ａａ ６３３〜１２７３])で一夜刺激し、フローサイトメトリーにより分析した。ａ、Ｓプール１に応答する３０μg用量コホート参加者からのサイトカイン産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の疑似カラーフローサイトメトリープロットの例。ｂ、Ｓプール１およびＳプール２に応答する総サイトカイン産生Ｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の画分としての示すサイトカインを産生するＳ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞。ＣＤ４非応答者(＜０.０３％総サイトカイン産生Ｔ細胞：１μg、ｎ＝２[Ｓプール１]およびｎ＝１[Ｓプール２]；１０μg、ｎ＝１)を除外した。算術平均と９５％信頼区間。ｃ、Ｓ特異的ＣＤ４＋(Ｓプール１、Ｓプール２およびＲＢＤ)およびｄ、同じサブセットの総循環Ｔ細胞の画分としての示すサイトカインを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞(Ｓプール１、Ｓプール２およびＲＢＤ)。データ点上の値は用量コホートあたりの平均画分を示す。参加者ＰＢＭＣを単一インスタンスとして試験した(ｂ〜ｄ)。
単一エピトープレベルでのＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｔ細胞の特徴づけ。３名のワクチン接種した参加者(用量コホート１０μg、ｎ＝１；３０μg、ｎ＝２)の１日目(プライム前)および２９日目(ブースト７日後)得たＰＢＭＣを各個のｐＭＨＣクラスＩ多量体カクテルで染色し、フローサイトメトリーによりＴ細胞エピトープ特異性(ａ)および表現型(ｂ；参加者３からの例；YLQPRTFLL)を分析した。ドットプロット上のペプチド配列はｐＭＨＣクラスＩ多量体エピトープ特異性を示し、ドットプロット上の数字はＳ内のエピトープに対応するアミノ酸を示す。ｃ、同定されたＭＨＣクラスＩ制限エピトープのＳ内の局在化。
組み換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質１ドメインに対する抗体応答を検出するための例示的コホート血清のＥＬＩＳＡスクリーニング分析。ＥＬＩＳＡを、ＢＮＴ１６２ｃ１で２回の免疫化(１日目および８日目プライム／ブースト)１０日後またはＢＮＴ１６２ａ１、ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２の３回投与(１／８／１５日目にプライム／ブースト)１７日後に集めた血清サンプルを使用して実施し、抗体応答の誘導を分析した。血清サンプルをＳ１タンパク質に対して試験した。ｎ＝２０マウス／群の群平均ΔＯＤ値が、１：１００〜１：２４,３００範囲の血清希釈のドットにより示される。
組み換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質ＲＢＤドメインに対する抗体応答を検出するための例示的コホート血清のＥＬＩＳＡスクリーニング分析。ＥＬＩＳＡを、ＢＮＴ１６２ｃ１で２回免疫化(１日目および８日目プライム／ブースト)１０日後またはＢＮＴ１６２ａ１、ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２の３回投与(１／８／１５日目にプライム／ブースト)１７日後に集めた血清サンプルを使用して実施し、抗体応答の誘導を分析した。血清サンプルをＲＢＤドメインに対して試験した。ｎ＝２０マウス／群の群平均ΔＯＤ値が１：１００〜１：２４,３００範囲の血清希釈のドットにより示される。
ｐＶＮ５０力価としてプロットした例示的コホート血清のシュードウイルス中和活性。血清サンプルを、動物の最初の免疫化後１０日目(ＢＮＴ１６２ｃ１、ｓａＲＮＡ)または１７日目(他の全コホート)に集め、ウイルス中和抗体の力価をシュードウイルスベースの中和試験(ｐＶＮＴ)により決定した。５０％シュードウイルス中和をもたらす各個のＶＮＴ力価(ｐＶＮ５０)をドットにより示す；群平均値は水平バーにより示す(±ＳＥＭ、平均の標準誤差)。
参加者におけるＲＢＤおよびＳ１に対するウイルス中和抗体および特異的結合抗体応答。ＲＢＤ＝受容体結合ドメイン。ＧＭＴ＝幾何平均力価。血清サンプルを、若年成人群においてワクチン接種前(１日目)およびプライムワクチン接種８日、２２日、２９日および４３日後におよび高齢成人群でワクチン接種前(１日目)およびプライムワクチン接種２２日、２９日および４３日後に得た。ヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清のパネル(ｎ＝２４)を、ＣＯＶＩＤ−１９患者でＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後に得た。(Ａ)ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体のＧＭＴ。(Ｂ)ＥＬＩＳＡにより測定したＲＢＤに対する結合抗体のＧＭＴ。(Ｃ)Ｓ１に対する抗体のＥＬＩＳＡ ＧＭＴ。各点は１血清サンプルを表し、各垂直バーは幾何平均と９５％ＣＩを表す。
ＩＦＮ−γ ELISpotにより測定した参加者のワクチン接種前後のＴ細胞応答。ＩＦＮ＝インターフェロン。ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞。Ｓ１ペプチドプールは、ＲＢＤを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクのＮ末端半分をカバーする。Ｓ２ペプチドプールは、ＲＢＤを含まないＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクのＣ末端をカバーする。ＣＥＦペプチドプールは、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびインフルエンザウイルスからの３２ ＭＨＣクラスＩ制限ウイルスペプチドからなる。パネルＡは、１８〜５５歳の若年参加者の１日目、２９日目および４３日目のＩＦＮ−γを分泌する特異的Ｔ細胞数を示す。パネルＢは、６５〜８５歳の年配参加者の１日目、２９日目および４３日目のＩＦＮ−γを分泌する特異的Ｔ細胞数を示す。
武漢または系統Ｂ.１.１.７スパイクタンパク質を担持するＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュードウイルスに対するＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンレシピエントからの１６血清の５０％シュードウイルス中和力価。Ｎ＝８ 各々４３日目(投与２の２１日後)採決した若年成人(１８〜５５歳；三角で示す)および高齢成人(５６〜８５歳；丸で示す)からの代表的血清。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質を担持するＶＳＶシュードウイルスの産生の略図。(１)ＨＥＫ２９３／Ｔ１７細胞へのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓ発現プラスミドのトランスフェクション。(２)ゲノムにＶＳＶ−Ｇを欠き(ＶＳＶΔＧ)、レポーター遺伝子をコードするＶＳＶ−Ｇ補完入力ウイルスでのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ発現細胞の感染。(３)抗ＶＳＶ−Ｇ抗体の付加による残存ＶＳＶ−Ｇ補完入力ウイルス中和により、生存ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のサロゲートとしてのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓシュードタイプ化ＶＳＶΔＧを生じる。
読み出し情報としてＧＦＰ感染細胞を使用するＶｅｒｏ ７６細胞に対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２武漢対照株および系統Ｂ.１.１.７スパイク−シュードタイプ化ＶＳＶの力価測定。
ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン接種および血清サンプリングのスキーム。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２系統Ｂ.１.１.７と武漢対照株スパイク−シュードタイプ化ＶＳＶ間のｐＶＮＴ５０比のプロット。三角は若年成人(１８〜５５歳)からの血清を表し、丸は高齢成人(５６〜８５歳)からの血清を表す。血清は４３日目(投与２の２１日後)に採った。
武漢Ｈｕ−１対照、系統Ｂ.１.１.２９８または系統Ｂ.１.３５１スパイクタンパク質を担持するＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュードウイルスに対するＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンレシピエントからの１２血清の５０％シュードウイルス中和力価(ｐＶＮＴ５０)。Ｎ＝１２ ２９日目または４３日目(投与２の７日または２１日後)に採った３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した若年成人からの血清を試験した。幾何平均力価が示される。武漢Ｈｕ−１対照シュードウイルスと系統Ｂ.１.１.２９８または系統Ｂ.１.３５１シュードウイルスの中和の差異の統計学的有意を、ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定により計算した。両側ｐ値が報告される。ｎｓ、有意ではない；＊＊＊、Ｐ＜０.００１；ＬＬＯＱ、定量下限。
Ｎ５０１およびＹ５０１ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンレシピエントからの２０血清の５０％プラーク減少中和力価。７血清(三角で示す)をワクチンの２回目の投与２週間後に採った；１３血清(丸で示す)を２回目の投与４週間後に採った。
Ｎ５０１Ｙ置換のダイアグラム。Ｌ − リーダー配列；ＯＲＦ − オープンリーディングフレーム；ＲＢＤ − 受容体結合ドメイン；Ｓ − スパイク糖タンパク質；Ｓ１ − ＳのＮ末端フーリン開裂フラグメント；Ｓ２ − ＳのＣ末端フーリン開裂フラグメント；Ｅ − エンベロープタンパク質；Ｍ − 膜タンパク質；Ｎ − 核タンパク質；ＵＴＲ − 非翻訳領域。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのＮ５０１およびＹ５０１ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のプラーク形態。
ＢＮＴ１６２ワクチン接種および血清サンプリングのスキーム。
Ｙ５０１ウイルスとＮ５０１ウイルス間のＰＲＮＴ５０比のプロット。三角は２回目の投与２週間後に採った血清を表す；丸は２回目の投与４週間後に採った血清を表す。
操作された変異。ヌクレオチドおよびアミノ酸位置が示される。欠失は点線で表す。変異体ヌクレオチドは赤色である。Ｌ、リーダー配列；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ＲＢＤ、受容体結合ドメイン；Ｓ、スパイク糖タンパク質；Ｓ１、ＳのＮ末端フーリン開裂フラグメント；Ｓ２、ＳのＣ末端フーリン開裂フラグメント；Ｅ、エンベロープタンパク質；Ｍ、膜タンパク質；Ｎ、核タンパク質；ＵＴＲ、非翻訳領域。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上のＷＴ(ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０)、変異体Ｎ５０１Ｙ、Δ６９／７０＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４ＧおよびＥ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のプラーク形態。
ＢＮＴ１６２ワクチン接種および血清サンプリングのスキーム。
野生型(ＷＴ)および変異体ＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する２０のＢＮＴ１６２ｂ２−ワクチン接種したヒト血清のＰＲＮＴ５０。(ａ)ＷＴ(ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０)および変異体Ｎ５０１Ｙ。(ｂ)ＷＴおよびΔ６９／７０＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ。(ｃ)ＷＴおよびＥ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ。７(三角)および１３(丸)血清は、それぞれワクチン接種の２回目の投与２週間および４週間後に採った。ＷＴおよび変異体ウイルスに対する異なるＰＲＮＴ５０を有する血清を線で結ぶ。(ａ)における結果は１実験から；(ｂ)および(ｃ)における結果は他の一組の実験からである。各データ点はデュプリケートアッセイ結果の平均である。
変異体ウイルスに対する中和ＧＭＴ対ＷＴウイルスに対するＧＭＴの比。三角はワクチン接種の２回目の投与２週間後に採った血清を表す；丸は２回目のワクチン接種の投与４週間後に採った血清を表す。
操作されたスパイク置換および欠失の略図。臨床単離株ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０のゲノムおよび配を、本試験で野生型ウイルスとして使用した。英国Ｂ.１.１.７、ブラジルＰ.１および南アフリカＢ.１.３５１分化系列からの変異が示される。欠失は点線で示す。変異ヌクレオチドは赤色である。ヌクレオチドおよびアミノ酸位置が示される。Ｌ − リーダー配列；ＯＲＦ − オープンリーディングフレーム；ＲＢＤ − 受容体結合ドメイン；Ｓ − スパイク糖タンパク質；Ｓ１ − ＳのＮ末端フーリン開裂フラグメント；Ｓ２ − ＳのＣ末端フーリン開裂フラグメント；Ｅ −エンベロープタンパク質；Ｍ − 膜タンパク質；Ｎ − ヌクレオタンパク質；ＵＴＲ − 非翻訳領域。
ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０および変異体ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２’ｓのプラーク形態。プラークアッセイは６ウェルプレートでＶｅｒｏ Ｅ６細胞で実施した。
ＢＮＴ１６２免疫化および血清採取のスキーム。
ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンの２回投与後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のバリアント株の血清中和。ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンの２回目の投与２週間(丸)または４週間(三角)後の１５治験参加者から得た２０サンプルを使用する５０％プラーク減少中和試験(ＰＲＮＴ５０)の結果を示す。変異体ウイルスは、ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０への、Ｂ.１.１.７、Ｐ.１.、またはＢ.１.３５１分化系列の変異の完全セットまたはＢ.１.３５１系列(Ｂ.１.３５１−Δ２４２−２４４＋Ｄ６１４ＧおよびＢ.１.３５１−ＲＢＤ−Ｄ６１４Ｇ)のＳ遺伝子変異のサブセットの操作により得た。各データ点は、示すウイルスに対して血清サンプルで得た幾何平均ＰＲＮＴ５０を示し、表３１に詳述するとおり反復実験のデータを含む。ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０のデータは３実験；Ｂ.１.１.７−スパイク、Ｂ.１.３５１−Δ２４２−２４４＋Ｄ６１４ＧおよびＢ.１.３５１−ＲＢＤ−Ｄ６１４Ｇウイルスは各１実験；およびＰ.１−スパイクおよびＢ.１.３５１−スパイクウイルスは各２実験からである。各実験において、中和力価をデュプリケートアッセイで決定し、幾何平均を取った。ＬＯＤ：検出限界。
ＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｔ細胞応答の持続性。１日目(プライム前)、２９日目、８５日目および１８４日目(それぞれブースト７日、９週間および２３週間後)に得たＰＢＭＣを、エクスビボＩＦＮγ ELISpotで分析した(詳細はＧＡ−ＲＢ−０２２−０１Ａ参照)。共通病原体Ｔ細胞エピトーププールＣＥＦ(ＣＭＶ、ＥＢＶおよびインフルエンザウイルスＨＬＡクラスＩエピトープ)およびＣＥＦＴ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスおよび破傷風毒素ＨＬＡクラスIIエピトープ)は一般的Ｔ細胞反応性を助けるのに役立ち、細胞培養培地は陰性対照として役立った。各ドットは、１治験対象について完全長ｗｔ Ｓタンパク質に対応する２ペプチドプールで刺激したデュプリケートウェルからの正規化平均スポット数の、培地のみ対照から減じた後の総和を表す。ワクチン接種後データ点を超える比率は用量コホートおよび時点あたりの試験対照の総数内での検出可能ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を有する対照数である。
特異的ワクチンｍＲＮＡシグナル(赤色)を、デュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイにおけるｍｏｄＶ９プローブを使用して注射６時間後ＬＮで検出する。ワクチンは、大部分被膜下洞(ＬＮにおける９位および５位)およびＢ細胞卵胞(ＬＮにおける１２位および１位)に局在化する。樹状細胞をＣＤ１１ｃ染色(ターコイズ、上図)により可視化し、その一部のみワクチンを取り込む。ＣＤ１６９＋マクロファージ(被膜下洞マクロファージ、ターコイズ、中央図)の大部分はワクチンに陽性である。Ｂ細胞(ＣＤ１９＋、ターコイズ、下図)はワクチンシグナルを示す２番目に多い集団である。
特異的ワクチンｍＲＮＡシグナル(赤色)を、デュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイにおけるｍｏｄＶ９プローブを使用して注射６時間後脾臓で検出する。ワクチンシグナルの大部分は白髄で検出される。樹状細胞をＣＤ１１ｃ染色(ターコイズ、上図)により可視化し、その一部のみワクチンを取り込む。Ｆ４／８０＋マクロファージ(ターコイズ、中央図)のわずかな部分がワクチンを取り込む。Ｂ細胞(ＣＤ１９＋、ターコイズ、下図)は、ワクチンシグナルを示す主要集団である。
安定性データ例。ある安定性試験からのデータ例(例えば、実施例４２参照)を、Ｓ１スパイクタンパク質に反応性の抗体を特徴づけるＥＬＩＳＡにより評価して、示す濃度および温度条件でＢＮＴ１６２ｂ２ ＬＮＰの調製物について示す。
配列の記載
次の表は、ここに記載される特定の配列の表を提供する。
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詳細な記載
本発明を下に詳述するが、本発明は、特定の方法、プロトコールおよび試薬は変わり得るため、これらに限定されないことが理解される。ここで使用される用語は特定の実施態様を説明する目的しかなく、添付する特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解される。特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。
好ましくはここで使用する用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に定義されるとおりである。
本発明の実施は、特に断らない限り、当分野における文献で説明される、化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組み換えＤＮＡ技術の慣用の方法を使用する(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照)。
下記において、本発明の要素が記載される。これらの要素は特定の実施態様と共に列記されるが、しかしながら、これらは何らかの方法で、何らかの数を組み合わされ、さらなる実施態様を作り得ると解釈されるべきである。種々に記載した例および実施態様は、明確に記載した実施態様にのみ本発明が限定されると解釈してはならない。この記載は、明確に記載した実施態様と何らかの数の開示された要素を組み合わせる実施態様を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、全ての記載した要素のあらゆる並べ替えおよび組み合わせが、文脈に反しない限り、この記載により開示されると考えられるべきである。
用語「約」は、おおよそまたは近似を意味し、ここに示す数値または範囲の状況において、ある実施態様において、記載されるまたは請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％または±３％を意味する。
本発明を記載する文脈(特に特許請求の範囲における文脈)における単数表現は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈される。ここでの値の範囲の列挙は、単に該範囲内の各個々の値を言う省略方法として用いることが意図される。ここで特に断らない限り、各個々の値が、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に包含される。ここに記載する全ての方法は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、任意の適当な順番で実施し得る。ここに提供される任意かつ全ての例または例示的用語(例えば、「など」)は、単に本発明をより良く説明することを意図し、特許請求の範囲の範囲に限定を付すものではない。本明細書のあらゆる用語は、本発明の実施に必要な何らかの特許請求されていない要素を示すと解釈してはならない。
特に断らない限り、用語「含む」は、本明細書で、「含む」により導入される一覧のメンバーに加えて、さらなるメンバーが所望により存在し得ることを示すために使用される。しかしながら、用語「含む」がさらなるメンバーが存在する可能性を含まない本発明の特定の実施態様として考えられ、すなわち、この実施態様の目的で、「含む」は「からなる」または「から本質的になる」の意味を有するとして理解される。
いくつかの文献がこの明細書を通して引用されている。ここに引用される文献の各々(全特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、指示など)は、前記であれ後記であれ、引用によりその全体として本明細書に包含させる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有していなかったことを認めたものと解釈されるものではない。
定義
次に、本発明の全態様に適用される定義を提供する。次の用語は、特に断らない限り次の意味を有する。何らかの未定義の用語は、当分野で認識される意味を有する。
ここで使用する「減少」、「低減」、「阻害」または「損なう」などの用語は、好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％またはそれ以上のレベルの全体的減少または全体的減少を引き起こす能力に関する。これらの用語は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわち、０へのまたは本質的に０への減少を含む。
「増加」、「増強」または「超える」などの用語は、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％またはそれ以上の増加または増強に関する。
本開示により、用語「ペプチド」はオリゴおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合により互いに結合した約２以上、約３以上、約４以上、約６以上、約８以上、約１０以上、約１３以上、約１６以上、約２０以上および最大約５０、約１００または約１５０の連続アミノ酸を含む、物質をいう。用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、大型ペプチド、特に少なくとも約１５０アミノ酸を有するペプチドをいうが、用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ここでは通常同義で使用される。
「治療タンパク質」は、対象に治療有効量で提供されたとき、対象の状態または疾患状態に正のまたは有利な効果を有する。ある実施態様において、治療タンパク質は治療的または緩和的性質を有し、疾患または障害の１以上の症状の改善、緩和、軽減、逆転、発症遅延または重症度低減のために投与し得る。治療タンパク質は予防的性質を有し得て、このような疾患の発症遅延またはこのような疾患または病態の重症度低減のために使用し得る。用語「治療タンパク質」はタンパク質またはペプチド全体を含み、その治療活性フラグメントも意味し得る。タンパク質の治療活性バリアントも含み得る。治療活性タンパク質の例は、ワクチン接種用抗原およびサイトカインなどの免疫刺激剤を含むが、これらに限定されない。
アミノ酸配列(ペプチドまたはタンパク質)に関連する「フラグメント」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短くなっているアミノ酸配列を表す配列をいう。Ｃ末端で短くなっているフラグメント(Ｎ末端フラグメント)は、例えばオープンリーディングフレームの３’末端を欠く切断オープンリーディングフレームの翻訳によって得られ得る。Ｎ末端で短くなっているフラグメント(Ｃ末端フラグメント)は、例えば、切断オープンリーディングフレームが翻訳開始に働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠く切断オープンリーディングフレームの翻訳によって得られ得る。アミノ酸配列のフラグメントは、アミノ酸配列の例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％アミノ酸残基を含む。アミノ酸配列のフラグメントは、好ましくはアミノ酸配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０または少なくとも１００連続アミノ酸を含む。
ここでの「バリアント」は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然に存在するまたは野生型(ＷＴ)アミノ酸配列であってよくまたは野生型アミノ酸配列の修飾体であり得る。好ましくはバリアントアミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾、例えば、親と比較して１〜約２０アミノ酸修飾および好ましくは１〜約１０または１〜約５アミノ酸修飾を有する。
ここでの「野生型」または「ＷＴ」または「天然」は、アレルバージョンを含む、天然にみられるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列を有する。
本発明の目的で、アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。用語「バリアント」は、全変異体、スプライスバリアント、翻訳後修飾バリアント、高次構造、アイソフォーム、アレルバリアント、種バリアントおよび種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。用語「バリアント」は、特に、アミノ酸配列のフラグメントを含む。
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列に１または２またはそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定部位に挿入されるが、ランダム挿入と得られた産物の適切なスクリーニングも可能である。アミノ酸付加バリアントは、１以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上アミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失バリアントは、配列の１以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上アミノ酸の除去により特徴づけられる。欠失はタンパク質のどの位置でもよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端短縮化バリアントとも称される。アミノ酸置換バリアントは、配列における少なくとも１個の残基が除去され、その位置に他の残基が挿入されることにより特徴づけられる。相同タンパク質またはペプチドで保存されていないアミノ酸配列の位置および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のものに置換する修飾が好ましい。好ましくはペプチドおよびタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は保存的アミノ酸変化、すなわち、類似荷電または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖に関連するアミノ酸ファミリーの一つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リシン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)および非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)アミノ酸の４ファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、まとめて芳香族アミノ酸と分類されることもある。ある実施態様において、保存的アミノ酸置換は、次のグループ内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、スレオニン；
リシン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、あるアミノ酸配列と該あるアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列の間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％。類似性または同一性の程度は、好ましくは、対照アミノ酸配列の長さ全体の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域に対して示される。例えば、対照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなるならば、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００アミノ酸、ある実施態様において、連続アミノ酸に対して示される。ある実施態様において、類似性または同一性の程度は、対照アミノ酸配列の長さ全体に対して示される。配列類似性、好ましくは配列同一性決定のためのアラインメントは、当分野で知られるツールで、好ましくは最良配列アラインメントを使用して、例えば、Alignを使用して、標準設定で使用して、好ましくはEMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5で実施できる。
「配列類似性」は、同一または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２個のアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２個の核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。
用語「％同一」、「％同一性」または類似の用語は、特に、比較する配列と最適アラインメントで同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージをいう。該パーセンテージは純粋に統計であり、２配列間の差異は、必ずしも、比較する配列の全体にわたり、無作為に分布されているとは限らない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して、最適アラインメント後、配列を比較することにより実施される。比較のための最適アラインメントは、手動でまたはSmith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムの助けを借りて、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443による局所相同性アルゴリズムの助けを借りて、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444による類似性サーチアルゴリズムの助けを借りてまたは該アルゴリズムを使用するコンピュータープログラム(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST NおよびTFASTA )の助けを借りて、実施し得る。ある実施態様において、２つの配列のパーセント同一性は、United States National Center for Biotechnology Information(ＮＣＢＩ)ウェブサイト(例えばblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq)で利用可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定する。ある実施態様において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムで使用されるアルゴリズムパラメータは、(ｉ)予測閾値設定１０；(ii)ワードサイズ設定２８；(iii)クエリー範囲の最大マッチ設定０；(iv)マッチ／ミスマッチスコア設定１、−２；(ｖ)ギャップ・コスト設定線形；および(vi)低複雑性領域用フィルターの使用を含む。ある実施態様において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで使用されるアルゴリズムパラメータは、(ｉ)予測閾値設定１０；(ii)ワードサイズ設定３；(iii)クエリー範囲の最大マッチ設定０；(iv)マトリクス設定ＢＬＯＳＵＭ６２；(ｖ)ギャップ・コスト設定 存在：１１伸長：１；および(vi)条件的組成的スコアマトリクス調節を含む。
パーセンテージ同一性は、比較する配列が対応する同一位置数を決定し、この数を比較する位置数(例えば、対照配列における位置数)で除し、この結果を１００倍することにより得る。
ある実施態様において、類似性または同一性の程度は、対照配列の長さ全体の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域に対して示される。例えば、対照核酸配列が２００ヌクレオチドからなるならば、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００ヌクレオチド、ある実施態様において、連続ヌクレオチドに対して示される。ある実施態様において、類似性または同一性の程度は対照配列の長さ全体に対して示される。
相同アミノ酸配列は、本開示により、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を示す。
ここに記載するアミノ酸配列バリアントは、例えば、組み換えＤＮＡ操作により、当業者により容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Sambrook et al. (1989)に詳述される。さらに、ここに記載するペプチドおよびアミノ酸バリアントは、例えば、固相合成および類似の方法などにより、既知ペプチド合成技術の助けを借りて、容易に製造され得る。
ある実施態様において、アミノ酸配列(ペプチドまたはタンパク質)のフラグメントまたはバリアントは、好ましくは「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」である。アミノ酸配列の「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」なる用語は、それが由来するアミノ酸配列と同一または類似の１以上の機能的性質を示すあらゆるフラグメントまたはバリアントに関し、すなわち、機能的に等価である。抗原または抗原性配列に関して、ある特定の機能は、フラグメントまたはバリアントが由来するアミノ酸配列により示される１以上の免疫原性活性である。ここで使用する用語「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」は、特に親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸が変えられ、なお、親分子または配列の機能の１以上、例えば、免疫応答の誘導を満たすことができる、アミノ酸配列を含むバリアント分子または配列をいう。ある実施態様において、親分子または配列のアミノ酸配列の修飾は、分子または配列の特徴に顕著に影響しないまたは改変しない。異なる実施態様において、機能的フラグメントまたは機能的バリアントの機能は、減少していてよいが、なお顕著に存在し、例えば、機能的バリアントの免疫原性は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施態様において、機能的フラグメントまたは機能的バリアントの免疫原性は親分子または配列と比較して増強され得る。
指定のアミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)「由来の」アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)は、最初のアミノ酸配列の起源をいう。好ましくは、特定のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列は、特定の配列またはそのフラグメントに同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列は、特定の配列またはそのフラグメントのバリアントであり得る。例えば、ここで使用するのに適する抗原は、天然配列の望ましい活性を維持しながら、それらが由来する天然に存在するまたは天然配列と配列が異なるように変えられ得ることは、当業者に理解される。
ここで使用する「指示材」または「指示」は、本発明の組成物および方法の有用性の伝達に使用できる、刊行物、記録、ダイアグラムまたは表現のための何らかの他の媒体を含む。本発明のキットの指示材は、例えば、本発明の組成物を含む容器に添付されまたは組成物を含む容器と共に輸送され得る。あるいは指示材は、指示材と組成物がレシピエントにより協同的使用されることを意図して、容器と別々に輸送され得る。
「単離」は、天然状態から変えられたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同核酸またはペプチドは「単離」されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞などの非天然環境で存在できる。
本発明の状況での「組み換え」なる用語は、「遺伝子操作を介する製造」を意味する。好ましくは、本発明の状況での組み換え核酸などの「組み換え物体」は天然に存在しない。
ここで使用する用語「天然に存在する」は、物体が天然に見られ得るとの事実をいう。例えば、生物(ウイルスを含む)に存在し、天然源から単離でき、実験室で人為的に修飾されていないペプチドまたは核酸は天然に存在する。
ここで使用する「生理学的ｐＨ」は、約７.５のｐＨをいう。
用語「遺伝子修飾」または単に「修飾」は、核酸での細胞のトランスフェクションを含む。用語「トランスフェクション」は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本発明の目的で、用語「トランスフェクション」はまた細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みも含み、ここで、細胞は対象、例えば、患者に存在し得る。故に、本発明により、ここに記載する核酸のトランスフェクションのための細胞はインビトロまたはインビボに存在でき、例えば、細胞は患者の臓器、組織および／または生命体の一部を形成し得る。本発明により、トランスフェクションは、一過性でも安定的でもよい。トランスフェクションのいくつかの適用に関して、トランスフェクトされた遺伝子材料が一過性にのみ発現されるならば、十分である。ＲＮＡを、そのコードするタンパク質を一過性に発現するように、細胞にトランスフェクトし得る。トランスフェクション過程で導入された核酸が通常核ゲノムに統合されないため、外来核酸は有糸分裂を介して希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅が可能である細胞は、希釈率が大きく減少する。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望まれるならば、安定なトランスフェクションを行うべきである。このような安定なトランスフェクションは、トランスフェクションのためのウイルスベースの系またはトランスポゾンベースの系を使用して達成され得る。一般に、抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。ＲＮＡを、細胞がそのコードするタンパク質を一過性に発現するように、トランスフェクトし得る。
用語「抗体陽転」は、ワクチン接種前から投与２の１か月後における４倍以上の上昇を含む。
コロナウイルス
コロナウイルスは、エンベロープ、プラス鎖、一本鎖ＲＮＡ((＋) ｓｓＲＮＡ)ウイルスである。既知ＲＮＡウイルスの中で、最大のゲノム(２６〜３２kb)を有し、系統学的に４属(α、β、γおよびΔ)に分類され、ベータコロナウイルスはさらに４分化系列(Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ)に細分される。コロナウイルスは、広範なトリおよびヒトを含む哺乳動物種に感染する。一部ヒトコロナウイルスは、一般に軽度呼吸器疾患を引き起こすが、重症度は乳児、高齢および免疫不全者で大きくなり得る。各々ベータコロナウイルス分化系列ＣおよびＢに属する中東呼吸器症候群コロナウイルス(ＭＥＲＳ−ＣｏＶ)および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(ＳＡＲＳ−ＣｏＶ)は高度病原性である。両ウイルスとも、ここ１５年以内に動物リザーバーからヒト集団に出現し、高致死率の大流行を引き起こした。非定型肺炎(コロナウイルス疾患２０１９；ＣＯＶＩＤ−１９)を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス−２(ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２)の大流行が２０１９年１２月半ばに中国で発生し、国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態にまで発展した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２(ＭＮ９０８９４７.３)はベータコロナウイルス系統Ｂに属する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶと少なくとも７０％配列類似性を有する。
一般に、コロナウイルスは４構造タンパク質、すなわち、エンベロープ(Ｅ)、膜(Ｍ)、ヌクレオカプシド(Ｎ)およびスパイク(Ｓ)を有する。ＥおよびＭタンパク質はウイルス集合に重要な機能を有し、Ｎタンパク質はウイルスＲＮＡ合成に必要である。重要な糖タンパク質は、ウイルス結合および標的細胞への侵入を担う。Ｓタンパク質は、一本鎖不活性前駆体として合成され、産生細胞でフューリン様宿主プロテアーゼにより２つの非共有結合的結合したサブユニット、Ｓ１およびＳ２に開裂される。Ｓ１サブユニットは、宿主細胞受容体を認識する受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。Ｓ２サブユニットは融合ペプチド、２つの７回反復領域および膜貫通ドメインを含み、その全て、大型高次構造再構成を行うことにより、ウイルスと宿主細胞膜の融合に介在するのに必要である。Ｓ１およびＳ２サブユニットは、大型融合前スパイクを形成するために三量体化する。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳ前駆体タンパク質は、Ｓ１(６８５ ａａ)およびＳ２(５８８ ａａ)サブユニットにタンパク分解的に開裂される。Ｓ１サブユニットは宿主アンギオテンシン−変換酵素２(ＡＣＥ２)受容体を介して感受性細胞のウイルス侵入に介在する受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)からなる。
抗原
本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡの使用を含む。故に、ＲＮＡは、対象におけるコロナウイルスＳタンパク質、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質に対する免疫応答を誘導するために、少なくともエピトープＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはその免疫原性バリアントを含むペプチドまたはタンパク質をコードする。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメント(すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質)を含むアミノ酸配列は、ここでは「ワクチン抗原」、「ペプチドおよびタンパク質抗原」、「抗原分子」または単に「抗原」とも称される。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、ここでは「抗原性ペプチドまたはタンパク質」または「抗原性配列」とも称される。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２コロナウイルス完全長スパイク(Ｓ)タンパク質は１２７３アミノ酸からなる(配列番号１参照)。特定の実施態様において、配列番号１の完全長スパイク(Ｓ)タンパク質は、プロトタイプ融合前高次構造が安定化されるような方法で修飾される。融合前高次構造の安定化は、完全長スパイクタンパク質のＡＳ残基９８６および９８７の２連続プロリン置換の導入により得られ得る。特に、スパイク(Ｓ)タンパク質安定化タンパク質バリアントは、アミノ酸残基９８６位がプロリンに交換され、かつアミノ酸残基９８７位もプロリンに交換される方法で得られる。ある実施態様において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアントは配列番号７に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ここに記載するワクチン抗原は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のスパイクタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメントを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列、配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列もしくは配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列のフラグメントもしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列、配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列もしくは配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜３８１９のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１または７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクＳ１フラグメント(Ｓ１)(ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニット)、そのバリアントまたはそのフラグメントを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０４９のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０４９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０４９のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０４９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０４９のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１７〜６８３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド４９〜２０５５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)、そのバリアントまたはそのフラグメントを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列、そのバリアントまたはそのフラグメントはここでは「ＲＢＤ」または「ＲＢＤドメイン」とも称する。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９〜１５８４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様よって、シグナルペプチドは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質に直接的にまたはリンカーを介して融合される。従って、ある実施態様において、シグナルペプチドは、上記ワクチン抗原に含まれるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメント(抗原性ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列に融合する。
このようなシグナルペプチドは、一般に約１５〜３０アミノ酸長を示し、好ましくは、限定されないが抗原性ペプチドまたはタンパク質のＮ末端に位置する配列である。ここに定義するシグナルペプチドは、好ましくは、ＲＮＡによりコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の既定の細胞内コンパートメント、好ましくは細胞表面、小胞体(ＥＲ)またはエンドソーム−リソソームコンパートメントへの輸送を可能とする。ある実施態様において、ここで定義するシグナルペプチド配列は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のシグナルペプチド配列、特に配列番号１のアミノ酸１〜１６または１〜１９のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、それらに限定されない。
ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜４８のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜５７のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜５７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜５７のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜５７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜５７のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１〜１９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ここで定義するシグナルペプチド配列は、免疫グロブリンのシグナルペプチド配列、例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域のシグナルペプチド配列をさらに含むが、それらに限定されず、ここで、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンであり得る。特に、ここで定義するシグナルペプチド配列は、配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む配列を含む。
ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４〜１１９、配列番号３２のヌクレオチド５４〜１１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４〜１１９のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド５４〜１１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４〜１１９のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
このようなシグナルペプチドは、好ましくはコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の分泌を促進するために使用される。より好ましくはここに定義されるシグナルペプチドは、ここに定義されるコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質に融合される。
従って、特に好ましい実施態様において、ここに記載するＲＮＡは抗原性ペプチドまたはタンパク質およびシグナルペプチドをコードする少なくとも１個のコード領域を含み、該シグナルペプチドは、好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質、より好ましくはここに記載する抗原性ペプチドまたはタンパク質のＮ末端に融合される。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１または７のアミノ酸配列、配列番号１または７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸配列もしくは配列番号１または７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１または７のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１または７のアミノ酸配列、配列番号１または７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸配列もしくは配列番号１または７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１または７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号７のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列のフラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１５、１６、１９、２０、２４または２５のヌクレオチド配列、配列番号１５、１６、１９、２０、２４または２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１５、１６、１９、２０、２４または２５のヌクレオチド配列もしくは配列番号１５、１６、１９、２０、２４または２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１５、１６、１９、２０、２４または２５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０４９のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０４９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０４９のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０４９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０４９のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１〜６８３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０５５のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０５５のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド１〜２０５５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１〜６８５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号４のヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号４のヌクレオチド配列もしくは配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４〜７１６のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド５４〜７１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４〜７１６のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド５４〜７１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４〜７１６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１〜２２１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４〜７２５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４〜７２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４〜７２５のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド５４〜７２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４〜７２５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１〜２２４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様よって、三量体化ドメインは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質に、直接的にまたはリンカーを介して融合される。従って、ある実施態様において、三量体化ドメインは、上記ワクチン抗原(これは上記のとおり所望によりシグナルペプチドに融合し得る)に含まれる、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメント(抗原性ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列に融合される。
このような三量体化ドメインは、好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に位置するが、これに限定されない。ここに定義する三量体形成ドメインは、好ましくはＲＮＡによりコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の三量体化を可能とする。ここに定義する三量体化ドメインの例は、Ｔ４フィブリチンの天然三量体化ドメインであるフォルドンを含むが、これに限定されない。Ｔ４フィブリチン(フォルドン)のＣ末端ドメインはフィブリチン三量体構造の形成に必須であり、人工三量体化ドメインとして使用され得る。ある実施態様において、ここに定義する三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む配列を含むが、それらに限定されない。ある実施態様において、ここに定義する三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む配列を含むが、それらに限定されない。
ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、ｉ)配列番号１１のヌクレオチド７〜８７のヌクレオチド配列、配列番号１１のヌクレオチド７〜８７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１１のヌクレオチド７〜８７のヌクレオチド配列もしくは配列番号１１のヌクレオチド７〜８７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、ｉ)配列番号１１のヌクレオチド７〜８７のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、ｉ)配列番号１１のヌクレオチド配列、配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１１のヌクレオチド配列もしくは配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、ｉ)配列番号１１のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
このような三量体化ドメインは、好ましくはコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の三量体化を促進するために使用される。より好ましくはここに定義する三量体化ドメインはここに定義する抗原性ペプチドまたはタンパク質に融合される。
従って、特に好ましい実施態様において、ここに記載するＲＮＡは抗原性ペプチドまたはタンパク質およびここに定義する三量体化ドメインをコードする少なくとも１個のコード領域を含み、該三量体化ドメインは、抗原性ペプチドまたはタンパク質、より好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に融合される。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号６のヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列もしくは配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列、配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列もしくは配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１８のアミノ酸配列もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４〜８２４のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド５４〜８２４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４〜８２４のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド５４〜８２４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４〜８２４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１〜２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４〜８３３のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４〜８３３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４〜８３３のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド５４〜８３３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４〜８３３のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１〜２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１〜８２４のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド１１１〜８２４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１〜８２４のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド１１１〜８２４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１〜８２４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸２０〜２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０〜８３３のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド１２０〜８３３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０〜８３３のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド１２０〜８３３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０〜８３３のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸２３〜２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様よって、膜貫通ドメインドメインは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質に、直接的にまたはリンカー(例えばグリシン/セリンリンカー)を介して融合される。従って、ある実施態様において、膜貫通ドメインは、上記ワクチン抗原(これは上記のとおり所望によりシグナルペプチドおよび／または三量体化ドメインに融合していてよい)に含まれるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメント(抗原性ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列に融合される。
このような膜貫通ドメインは、好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に位置するが、これに限定されない。好ましくはこのような膜貫通ドメインは、存在するならば、三量体化ドメインのＣ末端に位置するが、これに限定されない。ある実施態様において、三量体化ドメインはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質と膜貫通ドメインの間に存在する。
ここに定義する膜貫通ドメインは、好ましくはＲＮＡによりコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の細胞膜への固定を可能とする。
ある実施態様において、ここに定義する膜貫通ドメイン配列は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の膜貫通ドメイン配列、特に配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、それらに限定されない。
ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９〜３７６２のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９〜３７６２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９〜３７６２のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９〜３７６２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９〜３７６２のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４〜９８６のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド５４〜９８６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４〜９８６のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド５４〜９８６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４〜９８６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１〜３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４〜９９５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４〜９９５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４〜９９５のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド５４〜９９５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４〜９９５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１〜３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１〜９８６のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド１１１〜９８６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１〜９８６のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド１１１〜９８６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１〜９８６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸２０〜３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０〜９９５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド１２０〜９９５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０〜９９５のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド１２０〜９９５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０〜９９５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸２３〜３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列もしくは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２７のヌクレオチド配列、配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２７のヌクレオチド配列もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列もしくは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２７のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、上記ワクチン抗原は、上記ワクチン抗原に含まれるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメント(抗原性ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列からなるまたは本質的にそれからなるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２コロナウイルススパイク(Ｓ)タンパク質の連続配列を含む。ある実施態様において、上記ワクチン抗原は、２２０アミノ酸、２１５アミノ酸、２１０アミノ酸または２０５アミノ酸を超えないＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２コロナウイルススパイク(Ｓ)タンパク質の連続配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ＢＮＴ１６２ｂ１(ＲＢＰ０２０.３)、ＢＮＴ１６２ｂ２(ＲＢＰ０２０.１またはＲＢＰ０２０.２)としてここに記載されるヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ここでＲＢＰ０２０.２として記載されるヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２１のヌクレオチド配列、配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２１のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号１９または２０のヌクレオチド配列、配列番号１９または２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号１９または２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ここで使用する用語「ワクチン」は、対象への接種により免疫応答を誘導する組成物をいう。ある実施態様において、誘導された免疫応答は防御免疫を提供する。
ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡは対象の細胞で発現され、抗原分子を提供する。ある実施態様において、抗原分子の発現は細胞表面または細胞外間隙内で生じる。ある実施態様において、抗原分子はＭＨＣの状況で提示される。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡは対象の細胞で一過性に発現される。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、特に抗原分子をコードするＲＮＡの筋肉内投与後、筋肉における抗原分子をコードするＲＮＡの発現が生じる。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、脾臓における抗原分子をコードするＲＮＡの発現が生じる。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、抗原提示細胞、好ましくは特化された抗原提示細胞における抗原分子をコードするＲＮＡの発現が生じる。ある実施態様において、抗原提示細胞は樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、肺および／または肝臓における抗原分子をコードするＲＮＡの発現は生じないまたは本質的に生じない。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、脾臓における抗原分子をコードするＲＮＡの発現は、肺の発現量の少なくとも５倍である。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、リンパ節および／または脾臓へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、投与後６時間以降および好ましくは最大６日までまたはそれ以上、リンパ節および／または脾臓で検出可能である。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、Ｂ細胞卵胞、被膜下洞および／またはＴ細胞帯、特にリンパ節のＢ細胞卵胞および／または被膜下洞へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋)、被膜下洞マクロファージ(ＣＤ１６９＋)および／またはＴ細胞帯の樹状細胞(ＣＤ１１ｃ＋)およびリンパ節の中間洞、特にＢ細胞(ＣＤ１９＋)および／またはリンパ節の被膜下洞マクロファージ(ＣＤ１６９＋)へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、脾臓白髄へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、Ｂ細胞、ＤＣ(ＣＤ１１ｃ＋)、特にＢ細胞周囲の物および／または脾臓のマクロファージ、特にＢ細胞および／またはＤＣ(ＣＤ１１ｃ＋)へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。
ある実施態様において、ワクチン抗原はリンパ節および／または脾臓、特に上記リンパ節および／または脾臓の細胞で発現される。
本開示により使用するのに適するペプチドおよびタンパク質抗原は、一般に免疫応答を誘導するためのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のエピトープまたはその機能的バリアントを含むペプチドまたはタンパク質を含む。ペプチドまたはタンパク質またはエピトープは、標的抗原、すなわちそれに対する免疫応答が誘導される抗原に由来し得る。例えば、ペプチドもしくはタンパク質抗原または該ペプチドもしくはタンパク質抗原内に含まれるエピトープは、標的抗原または標的抗原のフラグメントもしくはバリアントであり得る。標的抗原はコロナウイルスＳタンパク質、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質であり得る。
抗原分子またはその進行産物、例えば、そのフラグメントは、免疫エフェクター細胞により運搬されるＢＣＲまたはＴＣＲなどの抗原受容体または抗体に結合し得る
ペプチドおよびタンパク質抗原、すなわち、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの投与により本発明により対象に提供されるペプチドおよびタンパク質抗原は、好ましくは、ペプチドまたはタンパク質抗原が提供される対象における免疫応答、例えば、液性および／または細胞性免疫応答の誘導をもたらす。該免疫応答は好ましくは標的抗原、特にコロナウイルスＳタンパク質、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質に対する。故に、ワクチン抗原は標的抗原、そのバリアントまたはそのフラグメントを含み得る。ある実施態様において、このようなフラグメントまたはバリアントは標的抗原と免疫学的に等価である。本開示の文脈において、用語「抗原のフラグメント」または「抗原のバリアント」は、免疫応答の誘導をもたらす薬剤を意味し、その免疫応答は抗原、すなわち標的抗原を標的とする。故に、ワクチン抗原は標的抗原に対応し得るまたは含み得る、標的抗原のフラグメントに対応し得るまたは含み得るまたは標的抗原またはそのフラグメントと相同である抗原に対応し得るまたは含み得る。故に、本開示により、ワクチン抗原は標的抗原の免疫原性フラグメントまたは標的抗原の免疫原性フラグメントと相同であるアミノ酸配列を含み得る。本発明の「免疫原性抗原のフラグメント」は、好ましくは標的抗原に対する免疫応答を誘導できる抗原のフラグメントに関する。ワクチン抗原は組み換え抗原であり得る。
用語「免疫学的に等価」は、例えば、免疫学的効果のタイプに関して、同じまたは本質的に同じ免疫学的性質を示すおよび／または同じまたは本質的に同じ免疫学的効果を発揮する、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子を意味する。本開示において、用語「免疫学的に等価」は、好ましくは免疫化に使用する抗原または抗原バリアントの免疫学的効果または性質に関して使用する。例えば、アミノ酸配列は、該アミノ酸配列が、対象の免疫系に曝されたとき、対照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導するならば、該対照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。
ここで使用する「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されている、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の状態をいう。活性化は、シグナル伝達経路の開始、誘導されるサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能とも関連し得る。用語「活性化免疫エフェクター細胞」は、数ある中で、細胞分裂を行っている免疫エフェクター細胞をいう。
用語「プライミング」は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞がその特異的抗原と初めて接触し、エフェクターＴ細胞などのエフェクター細胞への分化が引き起こされる、過程をいう。
用語「クローン増殖」または「増殖」は、特定の主体が繁殖する過程をいう。本発明において、本用語は、好ましくは免疫エフェクター細胞が抗原により刺激され、増殖し、該抗原を認識する特異的免疫エフェクター細胞が増幅される、免疫学的応答の状況で使用する。好ましくはクローン増殖は免疫エフェクター細胞の分化を誘導する。
用語「抗原」は、免疫応答がそれに対して産生され得るエピトープを含む薬剤に関する。用語「抗原」は、特に、タンパク質およびペプチドを含む。ある実施態様において、抗原は、免疫系細胞、例えば樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞により提示される。抗原またはＴ細胞エピトープなどのその進行産物は、ある実施態様において、Ｔ細胞またはＢ細胞受容体または抗体などの免疫グロブリン分子により結合される。従って、抗原またはその進行産物は、特に抗体またはＴリンパ球(Ｔ細胞)と反応し得る。ある実施態様において、抗原はコロナウイルスＳタンパク質、例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質などのウイルス抗原であり、エピトープはそのような抗原に由来する。
用語「ウイルス抗原」は、抗原性性質を有する、すなわち個体に免疫応答を誘導できる、あらゆるウイルス成分をいう。ウイルス抗原はコロナウイルスＳタンパク質、例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質であり得る。
用語「細胞表面に発現される」または「細胞表面と結合する」は、抗原などの分子が細胞の原形質膜と結合し、位置し、ここで、該分子の少なくとも一部が該細胞の細胞外間隙に面し、例えば、該細胞の外側に位置する抗体により、該細胞外面から接近可能であることを意味する。この状況で、一部は、好ましくは少なくとも４、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸である。結合は直接的でも間接的でもよい。例えば、結合は、１以上の膜貫通ドメイン、１以上の脂質アンカーによる、または、細胞の原形質膜の外側小葉に見られ得る何らかの他のタンパク質、脂質、サッカリドまたは他の構造との相互作用によるものであり得る。例えば、細胞表面と結合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であってよくまたは膜貫通タンパク質である他のタンパク質との相互作用により細胞表面と結合するタンパク質であってよい。
「細胞表面」または「細胞の表面」は、当分野でのその通常の意味に従い使用され、故に、タンパク質および他の分子による結合のために接近可能である細胞の外側を含む。抗原は、細胞表面に位置するならば、該細胞の表面で発現され、例えば、該細胞に添加された、抗原特異的抗体による結合のために接近可能である。
本発明における用語「細胞外部分」または「エキソドメイン」は、細胞の細胞外間隙に面し、好ましくは、例えば、該細胞の外側に位置する抗体などの結合分子により、該細胞の外側から接近可能である、タンパク質などの分子の一部をいう。好ましくは本用語は、１以上の細胞外ループまたはドメインまたはそのフラグメントをいう。
用語「エピトープ」は、免疫系により認識される抗原などの分子の一部またはフラグメントをいう。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体により認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続または不連続部分を含み得て、約５〜約１００、例えば約５〜約５０、より好ましくは約８〜約３０、最も好ましくは約８〜約２５アミノ酸長であり得て、例えば、エピトープは好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。ある実施態様において、エピトープは約１０〜約２５アミノ酸長である。用語「エピトープ」はＴ細胞エピトープを含む。
用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子の状況で提示されたとき、Ｔ細胞により認識されるタンパク質の一部またはフラグメントをいう。用語「主要組織適合遺伝子複合体」および略語「ＭＨＣ」はＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスII分子を含み、全脊椎動物に存在する遺伝子の複合体をいう。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または罹患細胞のシグナル伝達に重要であり、ここで、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープと結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体により認識されるようにそれらを提示する。ＭＨＣによりコードされるタンパク質は、細胞表面に発現され、自己抗原(細胞自体からのペプチドフラグメント)および非自己抗原(例えば、侵入微生物のフラグメント)両者をＴ細胞に提示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは一般に約８〜約１０アミノ酸長であるが、より長いまたは短いペプチドが有効であり得る。クラスII ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは一般に約１０〜約２５アミノ酸長であり、特に約１３〜約１８アミノ酸長であるが、より長いまたは短いペプチドが有効であり得る。
ペプチドおよびタンパク質抗原は例えば、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸または５０アミノ酸長を含む、２〜１００アミノ酸であり得る。ある実施態様において、ペプチドは５０アミノ酸より大きくてよい。ある実施態様において、ペプチドは１００アミノ酸より大きくてよい。
ペプチドまたはタンパク質抗原は、ペプチドまたはタンパク質に対する抗体およびＴ細胞応答を進展させる免疫系の能力を誘導または増加できるあらゆるペプチドまたはタンパク質であり得る。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、免疫エフェクター細胞により認識可能である。好ましくは、ワクチン抗原は、免疫エフェクター細胞により認識されたら、適切な共刺激シグナル存在下、ワクチン抗原を認識する抗原受容体を運搬する免疫エフェクター細胞の刺激、プライミングおよび／または増殖を誘導できる。本発明の実施態様の状況において、ワクチン抗原は、好ましくは細胞表面、好ましくは抗原提示細胞に提示されているかまたは提示される。ある実施態様において、抗原は、ウイルス感染細胞などの罹患細胞により提示される。ある実施態様において、抗原受容体は、ＭＨＣの状況で提示される抗原のエピトープに結合するＴＣＲである。ある実施態様において、ＴＣＲの結合は、Ｔ細胞により発現されたおよび／またはＴ細胞上で抗原提示細胞などの細胞により抗原に対して提示されたとき刺激、該Ｔ細胞のプライミングおよび／または増殖をもたらす。ある実施態様において、ＴＣＲの結合は、Ｔ細胞により発現されたおよび／または罹患細胞に提示される抗原に対してＴ細胞で提示されたとき、罹患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、ここで、該Ｔ細胞は、好ましくは細胞毒性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出する。
ある実施態様において、抗原受容体は、抗原におけるエピトープに結合する抗体またはＢ細胞受容体である。ある実施態様において、抗体またはＢ細胞受容体は抗原の天然エピトープに結合する。
核酸
ここで使用する用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組み換えにより産生されたおよび化学合成された分子などのＤＮＡおよびＲＮＡを含むことを意図する。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。ＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡ(ＩＶＴ ＲＮＡ)または合成ＲＮＡを含む。本発明では、ポリヌクレオチドは好ましくは単離されている。
核酸はベクターに含まれ得る。ここで使用する用語「ベクター」は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルスまたはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクターまたは細菌人工染色体(ＢＡＣ)、酵母人工染色体(ＹＡＣ)またはＰ１人工染色体(ＰＡＣ)などの人工染色体ベクターを含む、当業者に知られるあらゆるベクターを含む。該ベクターは、発現およびクローニングベクターを含む。発現ベクターはプラスミドならびにウイルスベクターを含み、一般に所望のコード配列と、特定の宿主生物(例えば、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳動物)またはインビトロ発現系で操作可能に結合したコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般にある所望のＤＮＡフラグメントの操作および増幅に使用され、所望のＤＮＡフラグメントの発現に必要な機能的配列を欠き得る。
本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、該ワクチン抗原を産生するよう処理された、抗原提示対象の細胞などの細胞で発現される。
ここに記載する核酸は組み換えおよび／または単離分子であり得る。
本発明において、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施態様において、ＲＮＡはリボヌクレオチド残基の全てまたは大部分を含む。ここで使用する「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドをいう。ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより産生されたＲＮＡならびに１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により天然に存在するＲＮＡと異なる修飾ＲＮＡを包含し、これらに限定されない。このような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端への非ヌクレオチド物質の付加をいい得る。ここでは、ＲＮＡのヌクレオチドが化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることもまた意図される。本発明に関して、これらの改変ＲＮＡは天然に存在するＲＮＡのアナログと考慮される。
本発明のある実施態様において、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関連するメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)である。当分野で確立されているとおり、ｍＲＮＡは、一般に５’非翻訳領域(５’−ＵＴＲ)、ペプチドコード領域および３’非翻訳領域(３’−ＵＴＲ)を含む。ある実施態様において、ＲＮＡはインビトロ転写または化学合成により産生される。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写により産生され、ここで、ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸をいう。
ある実施態様において、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡ(ＩＶＴ−ＲＮＡ)であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得られ得る。転写制御用プロモーターは、あらゆるＲＮＡポリメラーゼのあらゆるプロモーターであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングおよびインビトロ転写のための適切なベクターへのその導入を含む。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得られ得る。
本発明のある実施態様において、ＲＮＡは「レプリコンＲＮＡ」または単に「レプリコン」、特に「自己複製ＲＮＡ」または「自己増幅性ＲＮＡ」である。ある特に好ましい実施態様において、レプリコンまたは自己複製ＲＮＡはｓｓＲＮＡウイルス、特にアルファウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスに由来するまたはそれ由来の要素を含む。アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的代表である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する(アルファウイルスライフサイクルのレビューのためにJose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856を参照のこと)。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、一般に１１,０００〜１２,０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、一般に５’キャップおよび３’ポリ(Ａ)テイルを有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質(ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与)および構造タンパク質(ウイルス粒子を形成)をコードする。ゲノムに一般に２つのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)がある。４非構造タンパク質(ｎｓＰ１−ｎｓＰ４)は、一般にゲノムの５’末端付近で始まる第一ＯＲＦにより一緒にコードされ、一方アルファウイルス構造タンパク質は、第一ＯＲＦの下流に見られ、ゲノムの３’末端付近に伸びる第二ＯＲＦにより一緒にコードされる。一般に、第一ＯＲＦは第二ＯＲＦより大きく、比はおおよそ２：１である。アルファウイルスに感染した細胞において、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝子情報は、真核生物メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ；Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124)を模倣するＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルスライフサイクル早期に、(＋)鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質(ｎｓＰ１２３４)をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャーＲＮＡのように直接作用する。アルファウイルス由来ベクターは、外来遺伝子情報の標的細胞または標的生物への送達について提案されている。単純なアプローチで、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換えられる。アルファウイルスベースのトランス複製系は、２つの別々の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子は該レプリカーゼをトランスで複製できる(故に、トランス複製系と命名)。トランス複製は、ある宿主細胞におけるこれら核酸分子の両方の存在を必要とする。レプリカーゼによりトランスで複製されることができる核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能とするため、あるアルファウイルス配列要素を含まなければならない。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡは修飾ヌクレオシドを有し得る。ある実施態様において、ＲＮＡは少なくとも１個の(例えば、全)ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
ここで使用する用語「ウラシル」は、ＲＮＡの核酸に出現し得る核酸塩基の一つをいう。ウラシルの構造は次のとおりである。
Figure 2021185136
ここで使用する用語「ウリジン」は、ＲＮＡに存在し得るヌクレオシドの一つをいう。ウリジンの構造は次のとおりである。
Figure 2021185136
ＵＴＰ(ウリジン５’−三リン酸)は次の構造を有する。
Figure 2021185136
シュード−ＵＴＰ(シュードウリジン５’−三リン酸)は次の構造を有する。
Figure 2021185136
「シュードウリジン」は、ウラシルが窒素−炭素グリコシド結合の代わりに炭素−炭素結合を介してペントース環に結合している、ウリジンの異性体である修飾ヌクレオシドの一例である。
他の例示的修飾ヌクレオシドは、次の構造を有するＮ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１Ψ)である。
Figure 2021185136
Ｎ１−メチル−シュード−ＵＴＰは次の構造を有する。
Figure 2021185136
他の例示的修飾ヌクレオシドは、次の構造を有する５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)である。
Figure 2021185136
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ中の１以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。
ある実施態様において、ＲＮＡは少なくとも１個のウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、ＲＮＡは各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から独立して選択される。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはＮ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)を含む。ある実施態様において、ＲＮＡは１を超えるタイプの修飾ヌクレオシドを含んでよく、修飾ヌクレオシドは独立してシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)およびＮ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはＮ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)を含む。
ある実施態様において、ＲＮＡ中の１以上の、例えば、全てのウリジンを置き換える修飾ヌクレオシドは、３−メチル−ウリジン(ｍ３Ｕ)、５−メトキシ−ウリジン(ｍｏ５Ｕ)、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン(ｓ２Ｕ)、４−チオ−ウリジン(ｓ４Ｕ)、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン(ｈｏ５Ｕ)、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン(例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン)、ウリジン５−オキシ酢酸(ｃｍｏ５Ｕ)、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル(ｍｃｍｏ５Ｕ)、５−カルボキシメチル−ウリジン(ｃｍ５Ｕ)、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(ｃｈｍ５Ｕ)、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(ｍｃｈｍ５Ｕ)、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(ｍｃｍ５Ｕ)、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン(ｍｃｍ５ｓ２Ｕ)、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン(ｎｍ５ｓ２Ｕ)、５−メチルアミノメチル−ウリジン(ｍｎｍ５Ｕ)、１−エチル−シュードウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン(ｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン(ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ)、５−カルバモイルメチル−ウリジン(ｎｃｍ５Ｕ)、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕ)、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン(ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン(τｍ５Ｕ)、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン(τｍ５ｓ２Ｕ)、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン)、５−メチル−２−チオ−ウリジン(ｍ５ｓ２Ｕ)、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン(ｍ１ｓ４ψ)、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン(ｍ３ψ)、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン(Ｄ)、ジヒドロシュードウリジン、５,６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン(ｍ５Ｄ)、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−(３−アミノ−３−カルボキシプロピル)ウリジン(ａｃｐ３Ｕ)、１−メチル−３−(３−アミノ−３−カルボキシプロピル)シュードウリジン(ａｃｐ３ψ)、５−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(ｉｎｍ５Ｕ)、５−(イソペンテニルアミノメチル)−２−チオ−ウリジン(ｉｎｍ５ｓ２Ｕ)、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン(Ｕｍ)、５,２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン(ｍ５Ｕｍ)、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン(ψｍ)、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｓ２Ｕｍ)、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｍｃｍ５Ｕｍ)、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｎｃｍ５Ｕｍ)、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕｍ)、３,２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン(ｍ３Ｕｍ)、５−(イソペンテニルアミノメチル)−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｉｎｍ５Ｕｍ)、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−(２−カルボメトキシビニル)ウリジン、５−[３−(１−Ｅ−プロペニルアミノ)ウリジンまたは当分野で知られるあらゆる他の修飾ウリジンの何れか１以上であり得る。
ある実施態様において、ＲＮＡは他の修飾ヌクレオシドを含むまたはさらなる修飾ヌクレオシド、例えば、修飾シチジンを含む。例えば、ある実施態様において、ＲＮＡにおいて、５−メチルシチジンは、部分的にまたは完全に、好ましくは完全にシチジンの代わりとなる。ある実施態様において、ＲＮＡは５−メチルシチジンならびにシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される１以上を含む。ある実施態様において、ＲＮＡは５−メチルシチジンおよびＮ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)を含む。ある実施態様において、ＲＮＡは各シチジンの代わりに５−メチルシチジンおよび各ウリジンの代わりにＮ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)を含む。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡは５’キャップを含む。ある実施態様において、本発明のＲＮＡはキャップされていない５’−三リン酸を有しない。ある実施態様において、ＲＮＡは５’−キャップアナログにより修飾され得る。用語「５’キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られる構造をいい、一般に５’−から５’−三リン酸結合を介してｍＲＮＡに結合したグアノシンヌクレオチドからなる。ある実施態様において、このグアノシンは７位でメチル化される。ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップアナログを付すことは、５’キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写により達成できまたはキャッピング酵素を使用して転写後ＲＮＡに付加し得る。
ある実施態様において、ＲＮＡのための構成要素キャップは、次の構造を有するｍ２ ７,３’−ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’−Ｏ)ＡｐＧ(ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ｍ２’−ＯＡｐＧと称することもある)である。
Figure 2021185136
下記は、ＲＮＡおよびｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ｍ２’−ＯＡｐＧを含む例示的キャップ１ ＲＮＡである。
Figure 2021185136
下記は他の例示的キャップ１ ＲＮＡ(キャップアナログ無し)である。
Figure 2021185136
ある実施態様において、ＲＮＡは、ある実施態様において、下記構造を有するキャップアナログ抗逆転キャップ(ＡＲＣＡキャップ(ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)Ｇ))を使用して、「キャップ０」構造で修飾される。
Figure 2021185136
下記はＲＮＡおよびｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)Ｇを含む例示的キャップ０ ＲＮＡである。
Figure 2021185136
ある実施態様において、「キャップ０」構造は、下記構造を有するキャップアナログベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(ｍ２ ７,２’ＯＧ(５’)ｐｐＳｐ(５’)Ｇ)を使用して、産生される。
Figure 2021185136
下記はベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(ｍ２ ７,２’ＯＧ(５’)ｐｐＳｐ(５’)Ｇ)およびＲＮＡを含む例示的キャップ０ ＲＮＡである。
Figure 2021185136
ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡの「Ｄ１」ジアステレオマーまたは「ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ１)」は、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー(ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ２))と比較してＨＰＬＣカラムで最初に溶出する、故に保持時間が短い、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡのジアステレオマーである(引用によりここに包含させるＷＯ２０１１／０１５３４７参照)。
特に好ましいキャップは、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ１)(ｍ２ ７,２’−ＯＧｐｐＳｐＧ)またはｍ２ ７,３’−ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’−Ｏ)ＡｐＧである。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡは５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲを含む。用語「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、ＤＮＡ分子における転写されるが、アミノ酸配列に翻訳されない領域またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子における対応する領域に関する。非翻訳領域(ＵＴＲ)はオープンリーディングフレームの５’(上流)(５’−ＵＴＲ)および／またはオープンリーディングフレームの３’(下流)(３’−ＵＴＲ)に存在し得る。５’−ＵＴＲは、存在するならば、タンパク質コード化領域の開始コドンの上流である５’末端に位置する。５’−ＵＴＲは、５’キャップ(存在するならば)の下流であり、例えば５’キャップに直接隣接する。３’−ＵＴＲは、存在するならば、タンパク質コード化領域の停止コドンの下流である３’末端に位置するが、用語「３’−ＵＴＲ」は、好ましくはポリ(Ａ)配列を含まない。故に、３’−ＵＴＲは、ポリ(Ａ)配列(存在するならば)の上流であり、例えばポリ(Ａ)配列に直接隣接する。
ある実施態様において、ＲＮＡは配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’−ＵＴＲを含む。
ある実施態様において、ＲＮＡは配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’−ＵＴＲを含む。
特に好ましい５’−ＵＴＲは配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい３’−ＵＴＲは配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡは３’−ポリ(Ａ)配列を含む。
ここで使用する用語「ポリ(Ａ)配列」または「ポリＡテイル」は、一般にＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の中断されていないまたは中断された配列をいう。ポリ(Ａ)配列は当業者に知られ、ここに記載するＲＮＡにおける３’−ＵＴＲに続き得る。中断されていないポリ(Ａ)配列は、連続アデニル酸残基により特徴づけられる。本来は、中断されていないポリ(Ａ)配列が典型的である。ここに開示するＲＮＡは、転写後鋳型非依存的ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの遊離３’末端に結合されたポリ(Ａ)配列またはＤＮＡによりコードされ、鋳型依存的ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるポリ(Ａ)配列を有し得る。
約１２０個のＡヌクレオチドのポリ(Ａ)配列が、トランスフェクトされた真核生物細胞におけるＲＮＡのレベルおよびポリ(Ａ)配列の上流(５’)に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されたタンパク質のレベルに有益に影響することが示されている(Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017)。
ポリ(Ａ)配列はどんな長さでもよい。ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個または少なくとも１００個および５００個まで、４００個まで、３００個まで、２００個までまたは１５０個までのＡヌクレオチド、および、特に、約１２０個のＡヌクレオチドを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。この状況で、「本質的にからなる」は、ポリ(Ａ)配列の大部分のヌクレオチド、一般に、ポリ(Ａ)配列におけるヌクレオチド数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドがＵヌクレオチド(ウリジル酸)、Ｇヌクレオチド(グアニル酸)またはＣヌクレオチド(シチジル酸)などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることが可能であることを意味する。この状況で、「からなる」は、ポリ(Ａ)配列における全ヌクレオチド、すなわち、ポリ(Ａ)配列のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。用語「Ａヌクレオチド」または「Ａ」は、アデニル酸をいう。
ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列はＲＮＡ転写中、例えば、インビトロ転写ＲＮＡの調製中、コード鎖に相補的な鎖における反復ｄＴヌクレオチド(デオキシチミジル酸)を含むＤＮＡ鋳型に基づき、結合される。ポリ(Ａ)配列をコードするＤＮＡ配列(コード鎖)はポリ(Ａ)カセットと称される。
ある実施態様において、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ(Ａ)カセットは、ｄＡヌクレオチドから本質的になるが、４ヌクレオチド(ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ)のランダム配列により中断される。このようなランダム配列は５〜５０、１０〜３０または１０〜２０ヌクレオチド長であり得る。このようなカセットは、引用によりここに包含させるＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示される。ＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示されるあらゆるポリ(Ａ)カセットが本発明において使用され得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド(ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ)が等しく分布しているランダム配列で中断され、例えば、５〜５０ヌクレオチド長のポリ(Ａ)カセットは、ＤＮＡレベルで、大腸菌中のプラスミドＤＮＡの一定した増殖を示し、ＲＮＡレベルで、ＲＮＡ安定性および翻訳効率の支持に関する有益な性質が含まれることにさらに関する。結果として、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ分子に含まれるポリ(Ａ)配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド(Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ)のランダム配列で中断される。このようなランダム配列は５〜５０、１０〜３０または１０〜２０ヌクレオチド長であり得る。
ある実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは３’末端でポリ(Ａ)配列に隣接せず、すなわち、ポリ(Ａ)配列は３’末端でＡ以外のヌクレオチドでマスクされずまたは後続されていない。
ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および５００まで、４００まで、３００まで、２００までまたは１５０までヌクレオチドを含み得る。ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は、本質的に少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および５００まで、４００まで、３００まで、２００までまたは１５０までヌクレオチドからなり得る。ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および５００まで、４００まで、３００まで、２００までまたは１５０までヌクレオチドからなり得る。ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は少なくとも１００ヌクレオチド含む。ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は、約１５０ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は、約１２０ヌクレオチドを含む。
ある実施態様において、ＲＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド配列または配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリ(Ａ)配列を含む。
特に好ましいポリ(Ａ)配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。
本開示により、ワクチン抗原は、好ましくは、一本鎖、５’キャップｍＲＮＡとして投与され、それは、該ＲＮＡを投与される対象の細胞に入ると、各タンパク質に翻訳される。好ましくはＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性を最適化する構造要素を含む(５’キャップ、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、ポリ(Ａ)配列)。
ある実施態様において、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ１)は、ＲＮＡの５’末端で特異的キャッピング構造として利用される。ある実施態様において、ｍ２ ７,３’−ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’−Ｏ)ＡｐＧは、ＲＮＡの５’末端で特異的キャッピング構造として利用される。ある実施態様において、５’−ＵＴＲ配列はヒトアルファ−グロビンｍＲＮＡに由来し、所望により翻訳効率を高めるための最適化‘コザック配列’を有する。ある実施態様において、「分割のアミノ末端エンハンサー」(ＡＥＳ)ｍＲＮＡ(Ｆと称する)およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ(Ｉと称する)由来の２つの配列要素(ＦＩ要素)の組み合わせが、高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続を確実にするためにコード配列とポリ(Ａ)配列の間に配置される。ある実施態様において、ヒトベータ−グロビンｍＲＮＡ由来の２個の反復３’−ＵＴＲが、高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続を確実にするために、コード配列とポリ(Ａ)配列の間に配置される。ある実施態様において、３０アデノシン残基のストレッチ、続く１０ヌクレオチドリンカー配列および他の７０アデノシン残基からなる１１０ヌクレオチド長のポリ(Ａ)配列が使用される。このポリ(Ａ)配列はＲＮＡ安定性および翻訳効率を高めるために設計された。
本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ワクチン抗原を提供するために処置される対象の細胞で発現される。本発明の全態様のある実施態様において、ＲＮＡは対象の細胞で一過性に発現される。本発明の全態様のある実施態様において、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原の発現は細胞表面である。本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原はＭＨＣの状況で発現され、提示される。本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原の発現は細胞外間隙においてであり、すなわち、ワクチン抗原は分泌される。
本発明において、用語「転写」は、ＤＮＡ配列でコードされる遺伝子がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
本発明により、用語「転写」は「インビトロ転写」を含み、ここで、用語「インビトロ転写」は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、無細胞系で、好ましくは適切な細胞抽出物を使用してインビトロ合成される過程に関する。好ましくはクローニングベクターが転写物の産生に適用される。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと称され、本発明により用語「ベクター」に包含される。本発明により、本発明において使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ(ＩＶＴ−ＲＮＡ)であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得られ得る。転写の制御のためのプロモーターは、あらゆるＲＮＡポリメラーゼのあらゆるプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの具体例は、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターにより制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングにより得て、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することができる。ｃＤＮＡはＲＮＡの逆転写により得られ得る。
ＲＮＡに関して、用語「発現」または「翻訳」は、細胞のリボソームにおける過程に関し、それにより、ｍＲＮＡ鎖がペプチドまたはタンパク質を製造するようアミノ酸配列の集合を指示する。
ある実施態様において、例えば、ＲＮＡ脂質粒子として製剤化された、ここに記載するＲＮＡの投与後、該ＲＮＡの少なくとも一部は標的細胞に送達される。ある実施態様において、該ＲＮＡの少なくとも一部は標的細胞のサイトゾルに送達される。ある実施態様において、ＲＮＡは標的細胞により翻訳されて、それがコードするペプチドまたはタンパク質を産生する。ある実施態様において、標的細胞は脾細胞である。ある実施態様において、標的細胞は、脾臓における専門抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。ある実施態様において、標的細胞は樹状細胞またはマクロファージである。ここに記載するＲＮＡ脂質粒子などのＲＮＡ粒子を、このような標的細胞のＲＮＡへの送達に使用し得る。従って、本発明はまた、対象にここに記載するＲＮＡ粒子を投与することを含む、対象における標的細胞にＲＮＡを送達する方法にも関する。ある実施態様において、ＲＮＡは、標的細胞のサイトゾルに送達される。ある実施態様において、ＲＮＡは、該ＲＮＡによりコードされるペプチドまたはタンパク質を産生するように、標的細胞により翻訳される。
「コードする」は、ヌクレオチド(すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)の既定の配列またはアミノ酸の規定配列およびそれ由来の生物学的性質を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として作用する、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の固有の性質をいう。故に、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を生ずるならば、該タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方をタンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードするといい得る。
ある実施態様において、本発明により投与されるワクチン抗原をコードするＲＮＡは非免疫原性である。免疫刺激剤をコードするＲＮＡは、本発明により投与されて、アジュバント効果を提供し得る。免疫刺激剤をコードするＲＮＡは標準ＲＮＡまたは非免疫原性ＲＮＡであり得る。
ここで使用する用語「非免疫原性ＲＮＡ」は、例えば、哺乳動物への投与により免疫系による応答を誘導しないか、非免疫原性ＲＮＡに非免疫原性を与える修飾および処理を受けていない点でのみ異なる同じＲＮＡにより誘導されるより、すなわち、標準ＲＮＡ(ｓｔｄＲＮＡ)により誘導されるより、弱い応答を誘導するＲＮＡをいう。ある好ましい実施態様において、ここでは修飾ＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)とも称する非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ介在活性化を抑制するための修飾ヌクレオシドのＲＮＡへの取り込みおよび二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の除去により、非免疫原性とされる。
修飾ヌクレオシドを取り込むことにより非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にすることについて、あらゆる修飾ヌクレオシドを、ＲＮＡの免疫原性の低減または抑制する限り、使用し得る。特に好ましいのは、自然免疫受容体のＲＮＡ介在活性化を抑制する修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾核酸塩基を含むヌクレオシドでの１以上のウリジンの置換を含む。ある実施態様において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。ある実施態様において、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３−メチル−ウリジン(ｍ３Ｕ)、５−メトキシ−ウリジン(ｍｏ５Ｕ)、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン(ｓ２Ｕ)、４−チオ−ウリジン(ｓ４Ｕ)、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン(ｈｏ５Ｕ)、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン(例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン)、ウリジン５−オキシ酢酸(ｃｍｏ５Ｕ)、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル(ｍｃｍｏ５Ｕ)、５−カルボキシメチル−ウリジン(ｃｍ５Ｕ)、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(ｃｈｍ５Ｕ)、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(ｍｃｈｍ５Ｕ)、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(ｍｃｍ５Ｕ)、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン(ｍｃｍ５ｓ２Ｕ)、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン(ｎｍ５ｓ２Ｕ)、５−メチルアミノメチル−ウリジン(ｍｎｍ５Ｕ)、１−エチル−シュードウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン(ｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン(ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ)、５−カルバモイルメチル−ウリジン(ｎｃｍ５Ｕ)、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕ)、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン(ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン(τｍ５Ｕ)、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン(τｍ５ｓ２Ｕ)、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン)、５−メチル−２−チオ−ウリジン(ｍ５ｓ２Ｕ)、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン(ｍ１ｓ４ψ)、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン(ｍ３ψ)、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン(Ｄ)、ジヒドロシュードウリジン、５,６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン(ｍ５Ｄ)、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−(３−アミノ−３−カルボキシプロピル)ウリジン(ａｃｐ３Ｕ)、１−メチル−３−(３−アミノ−３−カルボキシプロピル)シュードウリジン(ａｃｐ３ ψ)、５−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(ｉｎｍ５Ｕ)、５−(イソペンテニルアミノメチル)−２−チオ−ウリジン(ｉｎｍ５ｓ２Ｕ)、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン(Ｕｍ)、５,２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン(ｍ５Ｕｍ)、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン(ψｍ)、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｓ２Ｕｍ)、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｍｃｍ５Ｕｍ)、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｎｃｍ５Ｕｍ)、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕｍ)、３,２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン(ｍ３Ｕｍ)、５−(イソペンテニルアミノメチル)−２’−Ｏ−メチル−ウリジン(ｉｎｍ５Ｕｍ)、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−(２−カルボメトキシビニル)ウリジンおよび５−[３−(１−Ｅ−プロペニルアミノ)ウリジンからなる群から選択される。ある特に好ましい実施態様において、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)または５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)、特にＮ１−メチル−シュードウリジンである。
ある実施態様において、１以上のウリジンの修飾核酸塩基を含むヌクレオシドでの置換は、ウリジンの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の置換を含む。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写(ＩＶＴ)によるｍＲＮＡの合成中、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を含む相当量の異常産物が、酵素の非通常性活性により産生される。ｄｓＲＮＡは炎症性サイトカインを誘導し、タンパク質合成阻害に至るエフェクター酵素を活性化する。ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔性または多孔性Ｃ−１８ポリスチレン−ジビニルベンゼン(ＰＳ−ＤＶＢ)マトリクスを使用するイオン対逆相ＨＰＬＣにより、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去され得る。あるいはｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡを特異的に加水分解し、それによりＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ夾雑物を除去する大腸菌ＲＮａｓｅIIIを使用する酵素ベースの方法が使用され得る。さらに、ｄｓＲＮＡはセルロース物質を使用してｓｓＲＮＡから分離され得る。ある実施態様において、ＲＮＡ調製物をセルロース物質と接触させ、ｓｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡのセルロース物質への結合を可能とし、ｓｓＲＮＡのセルロース物質への結合を可能としない条件下で、セルロース物質から分離する。
ここで使用する用語「除去する(remove)」または「除去(removal)」は、ｄｓＲＮＡなどの第二物質の集団の近くから分離される非免疫原性ＲＮＡなどの第一物質の集団などの特徴をいい、ここで、第一物質の集団は必ずしも第二物質がないものではなく、第二物質の集団は必ずしも第一物質がないものではない。しかしながら、第二物質の集団の除去により特徴づけられる第一物質の集団は、第一および第二物質が分離されていない混合物と比較して、第二物質の含有量が測定できるほどに低い。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡからのｄｓＲＮＡの除去は、非免疫原性ＲＮＡ組成物におけるＲＮＡの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０.５％未満、０.３％未満または０.１％未満がｄｓＲＮＡであるようなｄｓＲＮＡの除去を含む。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがないまたは本質的にない。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物を含む。例えば、ある実施態様において、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物は、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が実質的にない。ある実施態様において、精製調製物は、他の全ての核酸分子(ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど)に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％または少なくとも９９.９％一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡより効率的に細胞で翻訳される。ある実施態様において、翻訳は、非修飾対応物に対して２倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、３倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、４倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、５倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、６倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、７倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、８倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、９倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、１０倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、１５倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、２０倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、５０倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、１００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、２００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、５００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、１０００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、２０００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、係数は１０〜１０００倍である。ある実施態様において、係数は１０〜１００倍である。ある実施態様において、係数は１０〜２００倍である。ある実施態様において、係数は１０〜３００倍である。ある実施態様において、係数は１０〜５００倍である。ある実施態様において、係数は２０〜１０００倍である。ある実施態様において、係数は３０〜１０００倍である。ある実施態様において、係数は５０〜１０００倍である。ある実施態様において、係数は１００〜１０００倍である。ある実施態様において、係数は２００〜１０００倍である。ある実施態様において、翻訳は、任意の他の顕著な量または量の範囲まで増強される。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡより有意に低い自然免疫原性を示す。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、非修飾対応物より２倍低い自然免疫応答を示す。ある実施態様において、自然免疫原性は、３倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、４倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、５倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、６倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、７倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、８倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、９倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、１０倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、１５倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、２０倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、５０倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、１００倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、２００倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、５００倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、１０００倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、２０００倍の因数まで低減される。
用語「有意に低い自然免疫原性を示す」は、自然免疫原性の検出可能な低減をいう。ある実施態様において、本用語は、非免疫原性ＲＮＡの有効量が検出可能な自然免疫応答を誘発することなく投与できるような低減をいう。ある実施態様において、本用語は、非免疫原性ＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生を検出可能に減少させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく、非免疫原性ＲＮＡを繰り返し投与できるような低減をいう。ある実施態様において、低減は、非免疫原性ＲＮＡが非免疫原性ＲＮＡによりコードされるタンパク質の出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく、繰り返し投与できるようなものである。
「免疫原性」は、ヒトまたは他の動物の体内で免疫応答を誘発するＲＮＡなどの外来物質の能力である。自然免疫系は、比較的非特異的および即時である免疫系の成分である。これは、適応免疫系と共に脊椎動物免疫系の二つの主成分の一つである。
ここで使用する「内因性」は、生物、細胞、組織または系内からのまたはそこで産生されるあらゆる物質をいう。
ここで使用する用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系外からのまたはそこで産生されるあらゆる物質をいう。
ここで使用する用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
ここで使用する用語「結合」、「融合する」または「融合」は相互交換可能に使用される。これらの用語は、２以上の要素または成分またはドメインを一緒に合わせることをいう。
コドン最適化／Ｇ／Ｃ含有量の増加
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列はコドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によりコードされ。これはまた、コード配列の１以上の配列領域がコドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列の対応する配列領域と比較して増加している実施態様も含む。ある実施態様において、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変えない。
用語「コドン最適化」は、好ましくは、核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を変えることがない、宿主生物の典型的コドン使用頻度を反映するために核酸分子のコード領域におけるコドンの改変をいう。本発明において、コード領域は、好ましくは、ここに記載するＲＮＡ分子を使用して処置される対象における最適発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、細胞におけるｔＲＮＡの出現の異なる頻度によっても翻訳効率が決定されるとの発見に基づく。故に、ＲＮＡの配列は、しばしば存在するｔＲＮＡが「稀なコドン」の代わりに利用可能となるようにコドンを修飾し得る。
本発明のある実施態様において、ここに記載するＲＮＡのコード領域のグアノシン／シトシン(Ｇ／Ｃ)含有量は野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含有量と比較して増加しており、ここで、該ＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されない。ＲＮＡ配列のこの修飾は、翻訳されるべき何らかのＲＮＡ領域の配列が、そのｍＲＮＡの効率的翻訳に重要であるとの事実に基づく。Ｇ(グアノシン)／Ｃ(シトシン)含有量が増加した配列は、Ａ(アデノシン)／Ｕ(ウラシル)含有量が増加した配列より安定である。数コドンが一つのおよび同じアミノ酸をコードする(いわゆる遺伝子コードの縮重)との事実に関して、安定性のための最も都合よいコドンが決定され得る(いわゆる代替コドン使用頻度)。ＲＮＡによりコードされるアミノ酸に依存して、野生型配列と比較してＲＮＡ配列の修飾について種々の可能性がある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、同じアミノ酸をコードするが、Ａおよび／またはＵを含まないまたはＡおよび／またはＵヌクレオチドの含有量が低い他のコドンにこれらコドンを置換することにより修飾され得る。
種々の実施態様において、ここに記載するＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％またはそれ以上増加される。
ＲＮＡ投与の実施態様
ある実施態様において、ここに記載する組成物または医薬製剤は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む。同様に、ここに記載する方法はこのようなＲＮＡの投与を含む。
ここで使用する活性プラットフォームは、好ましくは最小ワクチン用量で防御免疫化を達成するための、頑強な中和抗体および付随的／随伴性Ｔ細胞応答を誘導する抗原コードＲＮＡワクチンに基づく。投与されるＲＮＡは好ましくはインビトロ転写ＲＮＡである。
３つの異なるＲＮＡプラットフォーム、すなわち非修飾ウリジン含有ｍＲＮＡ(ｕＲＮＡ)、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)および自己増幅性ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)が特に好ましい。ある特に好ましい実施態様において、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。
ここに記載するとおり、迅速なワクチン開発のための新規かつ強力なアプローチよびシステムを表す、これらプラットフォームの各々の実施態様をここで評価する(例えば、実施例２参照)。この記載するアプローチおよびシステムは、顕著でおよび効率的な成功を達成し、抗原(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１タンパク質および／またはそのＲＢＤ)配列の準備から有効な臨床候補の数カ月以内での開発を可能とした(ここに記載するとおり、関連配列情報(例えば、GenBank: MN908947.3)は２０２０年１月に入手可能となった)。ここに記載するアプローチおよびシステムで具現化される洞察および利点は、例えば、迅速で、効率的かつ有効な開発を達成するための種々の戦略の１以上の特性を直接比較する能力を含む。とりわけ、本発明は、ワクチン開発のより典型的戦略に伴う問題の原点を特定する洞察を包含する。さらに、ここに含まれる発見は、特に迅速なワクチン開発に多様な利点および利益を確立し、大流行(pandemic)時に特に有利であるのは明らかである。
ここに記載するとおり、ある実施態様において、ワクチン候補を、コードされる抗原(例えば、Ｓ１タンパク質)またはその一部(例えば、ＲＢＤ)に対するモデル生物(例えば、マウス；例えば、実施例２)で誘導される抗体力価について評価する。ある実施態様において、ワクチン候補を、誘導抗体のシュードウイルス中和(例えば、実施例２参照)活性について評価する。ある実施態様において、ワクチン候補は、誘導されるＴ細胞応答の性質により特徴づけられる(例えば、ＴＨ１対ＴＨ２特徴；例えば、実施例４参照)。ある実施態様において、ワクチン候補は、１を超えるモデル生物で評価される(例えば、実施例２、実施例４など参照)。
以下で、これら３つの異なるＲＮＡプラットフォームの実施態様を記載し、ここで、その要素を説明するとき使用されるある用語は次の意味を有する。
Ｓ１Ｓ２タンパク質／Ｓ１Ｓ２ ＲＢＤ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の各抗原をコードする配列。
ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４：ベネズエラウマ脳炎脳炎ウイルス(ＶＥＥＶ)ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼレプリカーゼおよびサブゲノムプロモーターと複製および翻訳を支持する保存配列要素をコードする野生型配列。
ｖｉｒＵＴＲ：サブゲノムプロモーターの部分ならびに複製および翻訳支持配列要素をコードするウイルス非翻訳領域。
ｈＡｇ−コザック：翻訳効率を高めるための最適化「コザック配列」を有するヒトアルファ−グロビンｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ配列。
Ｓｅｃ：Ｓｅｃは、新生ポリペプチド鎖の小胞体への転座を導く内因性Ｓ１Ｓ２タンパク質分泌シグナルペプチド(ｓｅｃ)に対応する。
グリシン−セリンリンカー(ＧＳ)：短リンカーペプチドをコードする配列は、融合タンパク質で一般に使用されるとおり、大部分アミノ酸グリシン(Ｇ)およびセリン(Ｓ)からなる。
フィブリチン：人工三量体化ドメインとして使用されるＴ４フィブリチン(フォルドン)の部分配列。
ＴＭ：ＴＭ配列はＳ１Ｓ２タンパク質の膜貫通部分に対応する。
ＦＩ要素：３’−ＵＴＲは、「分割のアミノ末端エンハンサー」(ＡＥＳ)ｍＲＮＡ(Ｆと称する)およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ(Ｉと称する)由来の２つの配列要素の組み合わせである。これらは、ＲＮＡ安定性に寄与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択過程で同定された。
Ａ３０Ｌ７０：樹状細胞におけるＲＮＡ安定性および翻訳効率を増強するために設計されたｓ３０アデノシン残基のストレッチ、続く１０ヌクレオチドリンカー配列および他の７０アデノシン残基からなる１１０ヌクレオチド長のポリ(Ａ)テイル。
一般に、ここに記載するワクチンＲＮＡは、５’から３’で、次の構造の一つを含み得る。
キャップ−５’−ＵＴＲ−ワクチン抗原コード化配列−３’−ＵＴＲ−ポリ(Ａ)
または
ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ１)−ｈＡｇ−コザック−ワクチン抗原コード化配列−ＦＩ−Ａ３０Ｌ７０。
一般に、ここに記載するワクチン抗原は、Ｎ末端からＣ末端で、次の構造の一つを含み得る。
シグナル配列−ＲＢＤ−三量体形成ドメイン
または
シグナル配列−ＲＢＤ−三量体形成ドメイン−膜貫通ドメイン。
ＲＢＤおよび三量体形成ドメインはリンカー、特にアミノ酸配列GSPGSGSGSを有するリンカーなどのＧＳリンカーにより隔離され得る。三量体形成ドメインおよび膜貫通ドメインはリンカー、特にアミノ酸配列GSGSGSを有するリンカーなどのＧＳリンカーにより隔離され得る。
シグナル配列はここに記載するシグナル配列であり得る。ＲＢＤはここに記載するＲＢＤドメインであり得る。三量体形成ドメインはここに記載する三量体化ドメインであり得る。膜貫通ドメインはここに記載する膜貫通ドメインであり得る。
ある実施態様において、
シグナル配列は配列番号１のアミノ酸１〜１６または１〜１９のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ＲＢＤは配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
三量体形成ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む；および
膜貫通ドメインは、配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、
シグナル配列は配列番号１のアミノ酸１〜１６または１〜１９のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１〜２２のアミノ酸配列を含む、
ＲＢＤは配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列を含む、
三量体形成ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３〜２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列を含む；および
膜貫通ドメインは、配列番号１のアミノ酸１２０７〜１２５４のアミノ酸配列を含む。
上記ＲＮＡまたは上記ワクチン抗原をコードするＲＮＡは非修飾ウリジン含有ｍＲＮＡ(ｕＲＮＡ)、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)または自己増幅性ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)であり得る。ある実施態様において、上記ＲＮＡまたは上記ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。
非修飾ウリジンメッセンジャーＲＮＡ(ｕＲＮＡ)
非修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｕＲＮＡ)薬物物質の活性本体は、細胞に挿入したとき翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。コロナウイルスワクチン抗原をコードする配列(すなわちオープンリーディングフレーム)に加えて、各ｕＲＮＡは、好ましくは安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大有効性のために最適化された共通構造要素(５’キャップ、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、ポリ(Ａ)テイル)を含む。好ましい５’キャップ構造はベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ１)(ｍ２ ７,２’−ＯＧｐｐＳｐＧ)である。好ましい５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲはそれぞれ配列番号１２のヌクレオチド配列および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。好ましいポリ(Ａ)テイルは配列番号１４の配列を含む。
このプラットフォームの異なる実施態様は次のとおりである。
Figure 2021185136
図１９は抗原コード化ＲＮＡの一般的構造を模式化する。
ＲＢＬ０６３.１のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
Figure 2021185136
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ＲＢＬ０６３.２のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
Figure 2021185136
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Figure 2021185136
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ＲＢＬ０６３.３のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
Figure 2021185136
Figure 2021185136
Figure 2021185136
ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)
ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)薬物物質の活性本体は、同様に細胞への挿入により翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。コロナウイルスワクチン抗原をコードする配列(すなわちオープンリーディングフレーム)に加えて、各ｍｏｄＲＮＡは、ｕＲＮＡとしてＲＮＡの最大有効性を最適化するための共通構造要素(５’キャップ、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、ポリ(Ａ)テイル)を含む。ＵＲＮＡと比較して、ｍｏｄＲＮＡはウリジンの代わりに１−メチル−シュードウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造はｍ２ ７,３’−ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’−Ｏ)ＡｐＧである。好ましい５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲはそれぞれ配列番号１２のヌクレオチド配列および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。好ましいポリ(Ａ)テイルは配列番号１４の配列を含む。さらなる精製工程が、インビトロ転写反応中に産生されるｄｓＲＮＡ夾雑物を減少させるためにｍｏｄＲＮＡに適用される。
このプラットフォームの異なる実施態様は次のとおりである。
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図２０は抗原コード化ＲＮＡの一般的構造を模式化する。
ＲＢＰ０２０.１のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
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ＲＢＰ０２０.２のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
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ＲＢＰ０２０.３のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
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ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)プラットフォームのさらなる実施態様は次のとおりである。
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自己増幅性ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)
自己増幅性ｍＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)薬物物質の活性本体は、細胞に侵入したとき自己増幅し、その後コロナウイルスワクチン抗原が翻訳される、一本鎖ＲＮＡである。好ましくは単一タンパク質をコードするｕＲＮＡおよびｍｏｄＲＮＡとは対照的に、ｓａＲＮＡのコード領域は２つのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む。５’−ＯＲＦは、ベネズエラウマ脳炎脳炎ウイルス(ＶＥＥＶ)ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ(レプリカーゼ)などのＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼをコードする。レプリカーゼＯＲＦが３’でサブゲノムプロモーターおよび抗原をコードする第二ＯＲＦに続く。さらに、ｓａＲＮＡ ＵＴＲは、自己増幅に必要な５’および３’保存配列要素(ＣＳＥ)を含む。ｓａＲＮＡは、ｕＲＮＡとしてＲＮＡの最大有効性を最適化するための共通構造要素(５’キャップ、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、ポリ(Ａ)テイル)を含む。好ましくはｓａＲＮＡはウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造はベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ１)(ｍ２ ７,２’−ＯＧｐｐＳｐＧ)である。
ｓａＲＮＡの細胞質送達はアルファウイルス様ライフサイクルを開始させる。しかしながら、ｓａＲＮＡはゲノムパッケージングまたは細胞侵入に必要であるアルファウイルス構造タンパク質をコードせず、それ故に複製コンピテントウイルス粒子の産生は、不可能である可能性は極めて低い。複製は、ＤＮＡを産生する何らかの中間工程に関与しない。ｓａＲＮＡの使用／取り込みは、それ故には、標的細胞内のゲノム組込みまたは他の永久遺伝子修飾のリスクがない。さらに、ｓａＲＮＡ自体、ｄｓＲＮＡ中間体の認識を介する自然免疫応答の効率的活性化により、その持続的複製を阻止する。
このプラットフォームの異なる実施態様は次のとおりである。
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図２１は抗原コード化ＲＮＡの一般的構造を模式化する。
ＲＢＳ００４.１のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
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ＲＢＳ００４.２のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
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ＲＢＳ００４.３のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
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ＲＢＳ００４.４のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列を、太字で示す個々の配列要素と共に示す。さらに、翻訳されたタンパク質の配列を、コードヌクレオチド配列の下に斜体で示す(＊＝停止コドン)。
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ある実施態様において、ここに記載するワクチンＲＮＡは配列番号１５、１６、１７、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、３０および３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。特に好ましいここに記載するワクチンＲＮＡは、配列番号１５、１７、１９、２１、２５、２６、３０および３２からなる群から、例えば配列番号１７、１９、２１、２６、３０および３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
ここに記載するＲＮＡは好ましくは脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)に製剤化される。ある実施態様において、ＬＮＰはカチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質；およびＲＮＡを含む。ある実施態様において、カチオン性脂質はＡＬＣ−０３１５、中性脂質はＤＳＰＣ、ステロイドはコレステロールおよびポリマーコンジュゲート脂質はALC-0159である。好ましい投与方法は筋肉内投与、より好ましくは筋肉内投与用水性凍結保護物質緩衝液のそれである。製剤は好ましくは筋肉内投与用の水性凍結保護物質緩衝液中のＲＮＡ脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)に製剤化された防腐剤無添加、無菌分散体である。
種々の実施態様において、製剤は、下記成分を、好ましくは下記割合または濃度で含む。
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[１] ＡＬＣ−０３１５＝((４−ヒドロキシブチル)アザンジイル)ビス(ヘキサン−６,１−ジイル)ビス(２−ヘキシルデカノエート)／６−[Ｎ−６−(２−ヘキシルデカノイルオキシ)ヘキシル−Ｎ−(４−ヒドロキシブチル)アミノ]ヘキシル２−ヘキシルデカノエート
[２] ALC-0159＝２−[(ポリエチレングリコール)−２０００]−Ｎ,Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド／２−[２−(ω−メトキシ(ポリエチレングリコール２０００)エトキシ]−Ｎ,Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド
[３] ＤＳＰＣ＝１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
q.s.＝quantum satis(十分であり得るのと同程度)
ＡＬＣ−０３１５：
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 ALC-0159：
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 ＤＳＰＣ：
Figure 2021185136
 コレステロール：
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ある実施態様において、ｍＲＮＡ対総脂質の比(Ｎ／Ｐ)は６.０〜６.５、例えば約６.０または約６.３である。
核酸含有粒子
ワクチン抗原をコードするＲＮＡなどのここに記載する核酸は、粒子として製剤化して投与され得る。
本開示の文脈において、用語「粒子」は、分子または分子複合体により形成される構造化された主体に関する。ある実施態様において、用語「粒子」は、媒体に分散されたミクロまたはナノサイズ小型構造などのミクロまたはナノサイズ構造に関する。ある実施態様において、粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物を含む粒子などの核酸含有粒子である。
ポリマーおよび脂質などの正に荷電した分子と負に荷電した核酸の間の静電気的相互作用が粒子形成に関与する。これは、核酸粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。ある実施態様において、核酸粒子はナノ粒子である。
本明細書において使用する、「ナノ粒子」は、非経腸投与に適する平均直径を有する粒子をいう。
「核酸粒子」を、核酸の目的の標的部位(例えば、細胞、組織、臓器など)への送達に使用できる。核酸粒子は、少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質、プロタミンなどの少なくとも１個のカチオン性ポリマーまたはそれらの混合物および核酸から形成され得る。核酸粒子は脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)ベースのおよびリポプレックス(ＬＰＸ)ベースの製剤を含む。
何らかの理論に拘束されることを意図しないが、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／またはカチオン性ポリマーは核酸と一体となって凝集体を形成し、この凝集がコロイド的に安定な粒子をもたらすと考えられる。
ある実施態様において、ここに記載する粒子はカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の少なくとも１個の脂質または脂質様物質、カチオン性ポリマー以外の少なくとも１個のポリマーまたはそれらの混合物をさらに含む。
ある実施態様において、核酸粒子は１を超えるタイプの核酸分子を含み、ここで、核酸分子の分子パラメータはモル質量または分子構造、キャッピング、コード領域または他の特性などの基礎的構造要素に関して等、互いに類似しても異なってもよい。
ここに記載する核酸粒子は、ある実施態様において、約３０nm〜約１０００nm、約５０nm〜約８００nm、約７０nm〜約６００nm、約９０nm〜約４００nmまたは約１００nm〜約３００nmの範囲である平均直径を有し得る。
ここに記載する核酸粒子は、約０.５未満、約０.４未満、約０.３未満または約０.２またはそれ未満の多分散性指数を示し得る。例として、核酸粒子は約０.１〜約０.３または約０.２〜約０.３の範囲の多分散性指数を示し得る。
ＲＮＡ脂質粒子に関して、Ｎ／Ｐ比は、脂質における窒素基対ＲＮＡにおけるリン酸基数の比を示す。これは、窒素原子(ｐＨに依存して)が、通常正電荷であり、リン酸基が負電荷であるため、電荷比と相関する。Ｎ／Ｐ比は、荷電平衡が存在するとき、ｐＨに依存する。脂質製剤は、正に荷電したナノ粒子がトランスフェクションに好都合であると考えられるため、しばしば４より大きく、１２までのＮ／Ｐ比で形成される。この場合、ＲＮＡはナノ粒子に完全に結合すると考えられる。
ここに記載する核酸粒子は、少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーからコロイドを得て、核酸粒子を得るために該コロイドと核酸を混合することを含み得る、広範な方法を使用して、製造できる。
ここで使用する用語「コロイド」は、分散した粒子が沈降しない均一混合物のタイプに関する。混合物中の不溶性粒子は顕微鏡的であり、粒子径は１〜１０００ナノメートルである。混合物はコロイドまたはコロイド性懸濁液と称し得る。用語「コロイド」は、混合物中の粒子のみをいい、懸濁液全体を言わないこともある。
少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーを含むコロイドの調製について、リポソーム小胞の調製に慣用的に使用される方法が適用され、適切に適合される。リポソーム小胞調製のために最も一般的に使用される方法は次の基礎的段階を共有する：(ｉ)有機溶媒への脂質溶解、(ii)得られた溶液の乾燥および(iii)乾燥脂質の水和(種々の水性媒体を使用)。
フィルム水和方法において、脂質をまず適当な有機溶媒に溶解し、フラスコの底に薄膜を生じるよう乾燥させる。得られた脂質フィルムを、リポソーム分散体を産生するのに適する水性媒体を使用して水和する。さらに、さらなる小型化工程が含まれ得る。
水相と脂質を含む有機相の間の油中水型エマルジョンの形成を含む、逆相蒸発は、リポソーム小胞調製のためのフィルム水和の別の方法である。系均質化のために、この混合物の短時間音波処理が必要である。減圧下の有機相の除去により、乳状ゲルが生じ、これはその後リポソーム懸濁液に変わる。
用語「エタノール注入技術」は、脂質を含むエタノール溶液を、針をとおして水溶液に迅速に注入する過程をいう。この行為は、脂質を溶液中に分散させ、脂質構造形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成を促進する。一般に、ここに記載するＲＮＡリポプレックス粒子は、コロイド性リポソーム分散体へのＲＮＡの付加により得られ得る。エタノール注入技術を使用して、このようなコロイド性リポソーム分散体は、ある実施態様において、次のとおり形成される：カチオン性脂質およびさらなる脂質などの脂質を含むエタノール溶液を、撹拌下水溶液に注入する。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡリポプレックス粒子は、押し出しの工程を用いず得られ得る。
用語「押し出す」または「押し出し」は、固定された、横断面プロファイルを有する粒子の製造をいう。特に、粒子を規定細孔のフィルターを篩過させる、粒子の小型化をいう。
無有機溶媒特徴を有する他の方法も、コロイドの調製のために本発明により使用され得る。
ＬＮＰは、一般に、イオン化可能カチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイドおよびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)−脂質などのポリマーコンジュゲート脂質の４成分を含む。各成分は搭載物保護を担い、有効細胞内送達を可能とする。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を、水性緩衝液中の核酸と迅速に混合することにより調製され得る。
用語「平均直径」は、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用してデータ分析した、動的レーザー光散乱法(ＤＬＳ)により測定した粒子の平均流体力学的直径をいい、これは、結果として、長さ寸法および無次元である多分散性指数(ＰＩ)と共にいわゆるＺ平均を提供する(Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321)。ここで粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、Ｚ平均のこの値と同義的に使用される。
「多分散性指数」は、好ましくは「平均直径」の定義に記載したいわゆるキュムラント分析による動的光散乱法測定に基づいて計算される。ある前提下、ナノ粒子のアンサンブルのサイズ分布の指標として解釈され得る。
種々のタイプの核酸含有粒子が以前に粒子形態の核酸の送達に適すると記載されている(例えばKaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60)。非ウイルス核酸送達媒体について、核酸のナノ粒子カプセル封入は核酸を分解から物理的に保護し、特定の化学により、細胞性取り込みおよびエンドソーム脱出を助け得る。
本発明は、核酸、核酸粒子を形成するように核酸と結合した少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーを含む粒子およびこのような粒子を含む組成物を記載する。核酸粒子は、該粒子に非共有結合相互作用により異なる形態で複合体化される核酸を含み得る。ここに記載する粒子はウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、細胞にウイルス性に感染できない。
適当なカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質およびカチオン性ポリマーは核酸粒子を形成するものであり、用語「粒子形成成分」または「粒子形成剤」に含まれる。用語「粒子形成成分」または「粒子形成剤」は、核酸粒子を形成するように核酸と結合するあらゆる成分に関する。このような成分は、核酸粒子の一部であり得る何らかの成分を含む。
カチオン性ポリマー
高度な化学柔軟性を考慮して、ポリマーは、ナノ粒子ベースの送達に一般に使用される物質である。一般に、カチオン性ポリマーは、負に荷電した核酸をナノ粒子に静電的に濃縮するために使用される。これらの正に荷電した基は、しばしば５.５〜７.５のｐＨ範囲でプロトン化の状態が変化し、エンドソーム破裂をもたらすイオン不均衡に至ると考えられるアミンからなる。ポリ−１−リシン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーなどのポリマーは、全て核酸送達に適用され、ここでのカチオン性ポリマーとして適する。さらに、一部研究者らは、特に核酸送達のためのポリマーを合成している。ポリ(β−アミノエステル)は、特に、合成の容易さおよび生分解性により、核酸送達のために広範に使用されている。このような合成ポリマーも、ここでのカチオン性ポリマーとして適する。
ここで使用する「ポリマー」は、その通常の意味を有し、すなわち、共有結合により結合した１以上の反復単位(単量体)を含む、分子構造である。反復単位は全で同一であってよくまたはある場合、１を超えるタイプの反復単位がポリマー内に存在してよい。ある場合、ポリマーは生物学的にもたらされ、すなわち、タンパク質などのバイオポリマーである。ある場合、さらなる部分、例えばここに記載するようなターゲティング部分もポリマーに存在できる。
１を超えるタイプの反復単位がポリマーに存在するならば、ポリマーは「コポリマー」といい得る。ここで使用されるポリマーはコポリマーであり得ることは理解される。コポリマーを形成する反復単位は、任意の形式で配置される。例えば、反復単位は、無作為の順番で、交互の順番でまたは「ブロック」コポリマー、すなわち、各々第一反復単位(例えば、第一ブロック)を含む１以上の領域および各々第二反復単位(例えば、第二ブロック)を含む１以上の領域などを含むものとして配置され得る。ブロックコポリマーは、２(ジブロックコポリマー)、３(トリブロックコポリマー)またはそれ以上の数の異なるブロックを有し得る。
ある実施態様において、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、一般に適度な濃度で顕著な細胞死を引き起こさないポリマーである。ある実施態様において、生体適合性ポリマーは生分解性である、すなわち、ポリマーは、体内等の生理学的環境内で化学的および／または生物学的に分解できる。
ある実施態様において、ポリマーはプロタミンまたはポリアルキレンイミン、特にプロタミンであり得る。
用語「プロタミン」は、アルギニンに富み、種々の動物(魚等)の精子細胞で体性ヒストンの代わりに特にＤＮＡと関係して見られる比較的低分子量の種々の何らかの強塩基性タンパク質をいう。特に、用語「プロタミン」は、強塩基性であり、水に可溶性であり、熱で凝固せず、加水分解により主にアルギニンを産生する、魚精子でみられるタンパク質をいう。精製された形態では、インスリン長時間作用型製剤でおよびヘパリンの抗凝血作用を中和するために使用される。
本開示により、ここで使用する用語「プロタミン」は、天然または生物学的供給源から得られたまたはそれ由来のあらゆるプロタミンアミノ酸配列(そのフラグメントを含む)および該アミノ酸配列またはそのフラグメントの多量体形態ならびに人工であり、特に特別な目的で設計され、天然または生物学的供給源から単離され得ない(合成)ポリペプチドを含むことを意図する。
ある実施態様において、ポリアルキレンイミンはポリエチレンイミンおよび／またはポリプロピレンイミン、好ましくはポリエチレンイミンを含む。好ましいポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン(ＰＥＩ)である。ＰＥＩの平均分子量は、好ましくは０.７５・１０２〜１０７Da、好ましくは１０００〜１０５Da、より好ましくは１００００〜４００００Da、より好ましくは１５０００〜３００００Da、さらにより好ましくは２００００〜２５０００Daである。
本発明により好ましいのは、直鎖状ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)などの直鎖状ポリアルキレンイミンである。
ここでの使用が意図されるカチオン性ポリマー(ポリカチオン性ポリマーを含む)は、静電的に核酸と結合できるあらゆるカチオン性ポリマーを含む。ある実施態様において、ここでの使用が意図されるカチオン性ポリマーは、例えば核酸と複合体を形成することによりまたは核酸が封入または被包されている小胞を形成することにより、核酸が結合できる、あらゆるカチオン性ポリマーを含む。
ここに記載する粒子は、カチオン性ポリマー以外のポリマー、すなわち、非カチオン性ポリマーおよび／またはアニオン性ポリマーも含み得る。まとめて、アニオン性および中性ポリマーがここでは非カチオン性ポリマーと称される。
脂質および脂質様物質
用語「脂質」および「脂質様物質」は、１以上の疎水性部分または基および所望によりまた１以上の親水性部分または基を含む分子として、ここで広く定義される。疎水性部分および親水性部分を含む分子は、しばしば両親媒性物質とも称される。脂質は、通常水にほとんど溶けない。水性環境で、両親媒性質により、分子は組織化された構造および種々の相に自己集合可能となる。これらの相の一つは、水性環境で小胞、多重膜／単層リポソームまたは膜に存在するため、脂質二重層からなる。疎水性は、１以上の芳香族、シクロ脂肪族またはヘテロ環基で置換されている、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基を含むが、これらに限定されない非極性基の包含により付与される。親水性基は、極性および／または荷電基であり、炭水化物、リン酸、カルボン酸、硫酸、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシルおよび他の類似基を含み得る。
ここで使用する用語「両親媒性」は、極性部分および非極性部分両方を有する分子をいう。しばしば、両親媒性化合物は、長い疎水性テイルに結合した極性頭部を有する。ある実施態様において、極性部分は水に可溶性であるが、非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は形式上正電荷または形式上負電荷を有し得る。あるいは極性部分は形式上陽性および負電荷両方を有し得て、双性イオンまたは分子内塩であり得る。本開示の目的で、両親媒性化合物は、１個または複数の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。
用語「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」は、構造的および／または機能的に脂質に関係するが、厳密な意味での脂質とは考えられ得ない物質に関する。例えば、本用語は、水性環境で小胞、多重膜／単層リポソームまたは膜に存在するため両親媒性層を形成でき、親水性部分および疎水性部分両方に界面活性剤または合成化合物を含む、化合物を含む。一般的にいうと、本用語は、脂質と類似してもしていなくてもよい、種々の構造構成の親水性部分および疎水性部分を含む、分子をいう。ここで使用する用語「脂質」は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、脂質および脂質様物質両方を包含すると考えられる。
両親媒性層に包含され得る両親媒性化合物の具体例は、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質を含み得るが、これらに限定されない。
ある実施態様において、両親媒性化合物は脂質である。用語「脂質」は、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることにより特徴づけられる、有機化合物群をいう。一般に、脂質は脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド(ケトアシルサブユニットの縮合由来)、ステロール脂質およびプレノール脂質(イソプレンサブユニットの縮合由来)の８カテゴリーに分割され得る。用語「脂質」は脂肪の同義語として使用されることもあるが、脂肪はトリグリセリドと称される脂質のサブグループである。脂質はまた脂肪酸およびその誘導体(トリ、ジ、モノグリセリドおよびリン脂質を含む)ならびにコレステロールなどのステロール含有代謝物などの分子も包含する。
脂肪酸または脂肪酸残基は、カルボン酸基で終わる炭化水素鎖からなる多様な分子群である；この配置により、分子は極性、親水性末端および水に不溶性である非極性、疎水性末端を有する。一般に４〜２４炭素長の炭素鎖は飽和でも不飽和でもよく、酸素、ハロゲン、窒素および硫黄を含む官能基に結合し得る。脂肪酸が二重結合を含むならば、分子の配置に顕著に影響するｃｉｓまたはｔｒａｎｓ幾何異性のいずれかの可能性がある。Ｃｉｓ−二重結合は脂肪酸鎖を屈曲させ、鎖に二重結合が多いほど、その影響は、複雑である。脂肪酸カテゴリーの他の主要な脂質クラスは、脂肪エステルおよび脂肪アミドである。
グリセロ脂質は、一、二および三置換グリセロールであり、トリグリセリドと称されるグリセロールの脂肪酸トリエステルが最も知られる。用語「トリアシルグリセロール」は、「トリグリセリド」と同義的に使用されることがある。これらの化合物において、グリセロールの３個のヒドロキシル基は、一般に異なる脂肪酸により、各々エステル化される。グリセロ脂質のさらなるサブクラスは、グリコシド結合によりグリセロールに結合した１以上の糖残基の存在により特徴づけられる、グリコシルグリセロールである。
グリセロリン脂質は、エステル結合により２個の脂肪酸由来「テイル」に結合したおよびリン酸エステル結合により１個の「頭部」基に結合したグリセロールコアを含む、両親媒性分子(疎水性と親水性両方の領域を含む)である。通常、リン脂質(スフィンゴミエリンもリン脂質として分類されるが)と称されるグリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン(別名ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチン)、ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥまたはＧＰＥｔｎ)およびホスファチジルセリン(ＰＳまたはＧＰＳｅｒ)である。
スフィンゴ脂質は、共通構造性質、スフィンゴイド塩基主鎖を共有する、化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要なスフィンゴイド塩基は一般にスフィンゴシンと称される。セラミド(Ｎ−アシル−スフィンゴイド塩基)は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、一般に１６〜２６炭素原子鎖長の飽和または単不飽和である。哺乳動物の主要なホスホスフィンゴ脂質はスフィンゴミエリン(セラミドホスホコリン)であり、一方昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを有し、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭部基を有する。グリコスフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基へのグリコシド結合により結合した１以上の糖残基からなる分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純および複雑グリコスフィンゴ脂質である。
コレステロールおよびその誘導体またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に、膜脂質の重要な成分である。
サッカロ脂質は、脂肪酸が糖主鎖に直接結合し、膜二重層と適合性である構造を形成する化合物をいう。サッカロ脂質において、単糖は、グリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール主鎖に置き換わる。最も知られるサッカロ脂質は、グラム陰性細菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的リピドＡ分子は、７個もの脂肪−アシル鎖で誘導体化されるグルコサミンの二糖である。大腸菌の増殖に必要な最小リポ多糖は、２個の３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸(Ｋｄｏ)残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサ−アシル化二糖であるＫｄｏ２−リピドＡである。
ポリケチドは、古典的酵素ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特性を共有する反復および多モジュール酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合化により合成される。それらは、動物、植物、細菌、真菌および海洋供給源からの二次代謝物および天然産物の大部分を占め、構造多様性が大きい。多くのポリケチドは環状分子であり、その主鎖はしばしばグリコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化または他の過程によりさらに修飾される。
本開示により、脂質および脂質様物質はカチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択したｐＨで非荷電または中性双性イオン形態で存在する。
カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質
ここに記載する核酸粒子は、粒子形成剤として少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含み得る。ここでの使用が意図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、静電的に核酸に結合できる、あらゆるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。ある実施態様において、ここでの使用が意図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、例えば核酸と複合体を形成することによりまたは核酸が封入または被包されている小胞を形成することにより、核酸と結合できる。
ここで使用する「カチオン性脂質」または「カチオン性脂質様物質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質をいう。カチオン性脂質または脂質様物質は、静電気的相互作用により負に荷電した核酸に結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシルまたはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分および一般に正電荷を有する脂質の頭部基を有する。
ある実施態様において、カチオン性脂質または脂質様物質は、あるｐＨ、特に酸性ｐＨで正味の正電荷のみ有し、一方、生理学的ｐＨなどの異なる、好ましくは高いｐＨで好ましくは正味の正電荷を有しない、好ましくは電荷を有しない、すなわち、中性である。このイオン化可能の挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助けることにより有効性が増強され、毒性が低減すると考えられる。
本発明の目的で、このような「カチオンにイオン化可能な」脂質または脂質様物質は、状況に反しない限り、用語「カチオン性脂質または脂質様物質」に含まれる。
ある実施態様において、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、正に荷電されまたはプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子(Ｎ)を含む頭部基を含む。
カチオン性脂質の例は、１,２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＡＰ)；Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ジオレイルオキシプロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)、３−(Ｎ−(Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル)コレステロール(ＤＣ−Ｃｈｏｌ)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(ＤＤＡＢ)；１,２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン(ＤＯＤＡＰ)；１,２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；１,２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＤＡＣ)、１,２−ジステアリルオキシ−Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン(ＤＳＤＭＡ)、２,３−ジ(テトラデコキシ)プロピル−(２−ヒドロキシエチル)−ジメチルアザニウム(ＤＭＲＩＥ)、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン(ＤＭＥＰＣ)、１,２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＭＴＡＰ)、１,２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド(ＤＯＲＩＥ)および２,３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、１,２−ジリノレイルオキシ−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、１,２−ジリノレニルオキシ−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロパン(ＤＬｅｎＤＭＡ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ＤＯＧＳ)、３−ジメチルアミノ−２−(コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ)−１−(ｃｉｓ,ｃｉｓ−９,１２−オクタデカジエンオキシ)プロパン(ＣＬｉｎＤＭＡ)、２−[５’−(コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ)−３’−オキサペントキシ)−３−ジメチル−１−(ｃｉｓ,ｃｉｓ−９’,１２’−オクタデカジエンオキシ)プロパン(ＣｐＬｉｎＤＭＡ)、Ｎ,Ｎ−ジメチル−３,４−ジオレイルオキシベンジルアミン(ＤＭＯＢＡ)、１,２−Ｎ,Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン(ＤＯｃａｒｂＤＡＰ)、２,３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ,Ｎ−ジメチルプロピルアミン(ＤＬｉｎＤＡＰ)、１,２−Ｎ,Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ)、１,２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＣＤＡＰ)、２,２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−[１,３]−ジオキソラン(ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ)、２,２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−[１,３]−ジオキソラン(ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ)、２,２−ジリノレイル−４−(２−ジメチルアミノエチル)−[１,３]−ジオキソラン(ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ)、ヘプタトリアコンタ−６,９,２８,３１−テトラエン−１９−イル−４−(ジメチルアミノ)ブタノエート(ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ)、Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(テトラデシルオキシ)−１−プロパンアミニウムブロマイド(ＤＭＲＩＥ)、(±)−Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(ｃｉｓ−９−テトラデセニルオキシ)−１−プロパンアミニウムブロマイド(ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ)、(±)−Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(ドデシルオキシ)−１−プロパンアミニウムブロマイド(ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ)、(±)−Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(テトラデシルオキシ)−１−プロパンアミニウムブロマイド(ＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ)、Ｎ−(２−アミノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(テトラデシルオキシ)−１−プロパンアミニウムブロマイド(βＡＥ−ＤＭＲＩＥ)、Ｎ−(４−カルボキシベンジル)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(オレオイルオキシ)プロパン−１−アミニウム(ＤＯＢＡＱ)、２−({８−[(３β)−コレスト−５−エン−３−イルオキシ]オクチル}オキシ)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−[(９Ｚ,１２Ｚ)−オクタデカ−９,１２−ジエン−１−イルオキシ]プロパン−１−アミン(オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ)、１,２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン(ＤＭＤＡＰ)、１,２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン(ＤＰＤＡＰ)、Ｎ１−[２−((１Ｓ)−１−[(３−アミノプロピル)アミノ]−４−[ジ(３−アミノ−プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]−３,４−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(ＭＶＬ５)、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン(ＤＯＥＰＣ)、２,３−ビス(ドデシルオキシ)−Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルプロパン−１−アンモニウムブロマイド(ＤＬＲＩＥ)、Ｎ−(２−アミノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(テトラデシルオキシ)プロパン−１−アミニウムブロマイド(ＤＭＯＲＩＥ)、ジ((Ｚ)−ノナ−２−エン−１−イル) ８,８’−((((２(ジメチルアミノ)エチル)チオ)カルボニル)アザンジイル)ジオクタノエート(ＡＴＸ)、Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(ドデシルオキシ)プロパン−１−アミン(ＤＬＤＭＡ)、Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(テトラデシルオキシ)プロパン−１−アミン(ＤＭＤＭＡ)、ジ((Ｚ)−ノナ−２−エン−１−イル)−９−((４−(ジメチルアミノブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(Ｌ３１９)、Ｎ−ドデシル−３−((２−ドデシルカルバモイル−エチル)−{２−[(２−ドデシルカルバモイル−エチル)−２−{(２−ドデシルカルバモイル−エチル)−[２−(２−ドデシルカルバモイル−エチルアミノ)−エチル]−アミノ}−エチルアミノ)プロピオンアミド(リピドイド９８Ｎ１２−５)、１−[２−[ビス(２−ヒドロキシドデシル)アミノ]エチル−[２−[４−[２−[ビス(２ヒドロキシドデシル)アミノ]エチル]ピペラジン−１−イル]エチル]アミノ]ドデカン−２−オール(リピドイドＣ１２−２００)を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約１０mol％〜約１００mol％、約２０mol％〜約１００mol％、約３０mol％〜約１００mol％、約４０mol％〜約１００mol％または約５０mol％〜約１００mol％を構成し得る。
さらなる脂質または脂質様物質
ここに記載する粒子はまたカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の脂質または脂質様物質、すなわち、非カチオン性脂質または脂質様物質(非カチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む)も含み得る。まとめて、アニオン性および中性脂質または脂質様物質をここでは非カチオン性脂質または脂質様物質と称する。イオン化可能／カチオン性脂質または脂質様物質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分の付加による核酸粒子の製剤の最適化は、粒子安定性および核酸送達の有効性を増強し得る。
核酸粒子の全体的電荷に影響してもしなくてもよいさらなる脂質または脂質様物質を取り込み得る。ある実施態様において、さらなる脂質または脂質様物質は非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば、１以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。ここで使用する「アニオン性脂質」は、選択したｐＨで負に荷電したあらゆる脂質をいう。ここで使用する「中性脂質」は、選択したｐＨで非荷電または中性双性イオン形態で存在する多数の脂質種の何れかをいう。好ましい実施態様において、さらなる脂質は、(１)リン脂質、(２)コレステロールまたはその誘導体；または(３)リン脂質とコレステロールまたはその誘導体の混合物の中性脂質成分の一つを含む。コレステロール誘導体の例は、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル−２’−ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル−４’−ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびその誘導体およびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
使用され得る具体的リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンを含むが、これらに限定されない。このようなリン脂質は、特にジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルフタチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８:０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)、ジフィタノイル−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)およびさらに異なる疎水性鎖を有するホスファチジルエタノールアミン脂質を含む。
ある好ましい実施態様において、さらなる脂質はＤＳＰＣまたはＤＳＰＣおよびコレステロールである。
ある実施態様において、核酸粒子はカチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。
ある実施態様において、ここに記載する粒子は、ペグ化脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。用語「ペグ化脂質」は、脂質部分およびポリエチレングリコール部分両方を含む分子をいう。ペグ化脂質は当分野で知られる。
理論に拘束されることを願わないが、少なくとも１個のさらなる脂質の量と比較した少なくとも１個のカチオン性脂質の量は、核酸の荷電、粒子径、安定性、組織選択性および生物活性などの重要な核酸粒子特徴に影響し得る。従って、ある実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質対少なくとも１個のさらなる脂質のモル比は約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２または約３：１〜約１：１である。
ある実施態様において、非カチオン性脂質、特に中性脂質(例えば、リン脂質および／またはコレステロールの１以上)は、粒子に存在する総脂質の約０mol％〜約９０mol％、約０mol％〜約８０mol％、約０mol％〜約７０mol％、約０mol％〜約６０mol％または約０mol％〜約５０mol％を構成し得る。
リポプレックス粒子
本発明のある実施態様において、ここに記載するＲＮＡはＲＮＡリポプレックス粒子に存在し得る。
本開示の文脈において、用語「ＲＮＡリポプレックス粒子」は、脂質、特にカチオン性脂質およびＲＮＡを含む粒子に関する。正に荷電したリポソームと負に荷電したＲＮＡの間の静電気的相互作用は複合体化およびＲＮＡリポプレックス粒子の自発的形成をもたらす。正に荷電したリポソームは、一般にＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質およびＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成される。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はカチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的実施態様において、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。
ある実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質対少なくとも１個のさらなる脂質のモル比は約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２または約３：１〜約１：１である。特定の実施態様において、モル比は約３：１、約２.７５：１、約２.５：１、約２.２５：１、約２：１、約１.７５：１、約１.５：１、約１.２５：１または約１：１であり得る。例示的実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質対少なくとも１個のさらなる脂質のモル比は約２：１である。
ここに記載するＲＮＡリポプレックス粒子は、ある実施態様において、約２００nm〜約１０００nm、約２００nm〜約８００nm、約２５０〜約７００nm、約４００〜約６００nm、約３００nm〜約５００nmまたは約３５０nm〜約４００nmの範囲である平均直径を有する。特定の実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００nm、約２２５nm、約２５０nm、約２７５nm、約３００nm、約３２５nm、約３５０nm、約３７５nm、約４００nm、約４２５nm、約４５０nm、約４７５nm、約５００nm、約５２５nm、約５５０nm、約５７５nm、約６００nm、約６２５nm、約６５０nm、約７００nm、約７２５nm、約７５０nm、約７７５nm、約８００nm、約８２５nm、約８５０nm、約８７５nm、約９００nm、約９２５nm、約９５０nm、約９７５nmまたは約１０００nmの平均直径を有する。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０nm〜約７００nmの範囲の平均直径を有する。他の実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００nm〜約５００nmの範囲の平均直径を有する。例示的実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００nmの平均直径を有する。
ここに記載するＲＮＡリポプレックス粒子およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経腸投与後、特に静脈内投与後、標的組織へのＲＮＡの送達に有用である。ＲＮＡリポプレックス粒子は、エタノール中の脂質溶液を水または適当な水相に注入することにより得られ得るリポソームを使用して調製され得る。ある実施態様において、水相は酸性ｐＨを有する。ある実施態様において、水相は、例えば、約５mM量の酢酸を含む。リポソームは、リポソームとＲＮＡの混合によるＲＮＡリポプレックス粒子の調製に使用され得る。ある実施態様において、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は少なくとも１個のカチオン性脂質および少なくとも１個のさらなる脂質を含む。ある実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質は１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)および／または１,２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン(ＤＯＴＡＰ)を含む。ある実施態様において、少なくとも１個のさらなる脂質は１,２−ジ−(９Ｚ−オクタデセノイル)−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、コレステロール(Ｃｈｏｌ)および／または１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(ＤＯＰＣ)を含む。ある実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質は１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)を含み、少なくとも１個のさらなる脂質は１,２−ジ−(９Ｚ−オクタデセノイル)−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(ＤＯＰＥ)を含む。ある実施態様において、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)および１,２−ジ−(９Ｚ−オクタデセノイル)−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(ＤＯＰＥ)を含む。
脾臓ターゲティングＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に包含させるＷＯ２０１３／１４３６８３に記載される。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓組織または脾細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を優先的に標的とするために使用し得ることが判明している。従って、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が生じる。故に、本発明のＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓でのＲＮＡの発現のために使用し得る。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子投与後、肺および／または肝臓へのＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は生じないまたは本質的に生じない。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子投与後、脾臓における専門的抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が生じる。故に、本発明のＲＮＡリポプレックス粒子を、このような抗原提示細胞でのＲＮＡの発現のために使用し得る。ある実施態様において、抗原提示細胞は樹状細胞および／またはマクロファージである。
脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡなどの核酸は脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)の形で投与される。ＬＮＰは、１以上の核酸分子が結合するまたは１以上の核酸分子が被包される粒子を形成できるあらゆる脂質を含み得る。
ある実施態様において、ＬＮＰは１以上のカチオン性脂質および１以上の安定化脂質を含む。安定化脂質は中性脂質およびペグ化脂質を含む。
ある実施態様において、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に被包されたまたは結合したＲＮＡを含む。
ある実施態様において、ＬＮＰは、カチオン性脂質の４０〜５５モルパーセント、４０〜５０モルパーセント、４１〜４９モルパーセント、４１〜４８モルパーセント、４２〜４８モルパーセント、４３〜４８モルパーセント、４４〜４８モルパーセント、４５〜４８モルパーセント、４６〜４８モルパーセント、４７〜４８モルパーセントまたは４７.２〜４７.８モルパーセントを構成する。ある実施態様において、ＬＮＰは、カチオン性脂質の約４７.０モルパーセント、４７.１モルパーセント、４７.２モルパーセント、４７.３モルパーセント、４７.４モルパーセント、４７.５モルパーセント、４７.６モルパーセント、４７.７モルパーセント、４７.８モルパーセント、４７.９モルパーセントまたは４８.０モルパーセントを構成する。
ある実施態様において、中性脂質は、５〜１５モルパーセント、７〜１３モルパーセントまたは９〜１１モルパーセントの範囲の濃度で存在する。ある実施態様において、中性脂質は約９.５モルパーセント、１０モルパーセントまたは１０.５モルパーセントの濃度で存在する。
ある実施態様において、ステロイドは、３０〜５０モルパーセント、３５〜４５モルパーセントまたは３８〜４３モルパーセントの範囲の濃度で存在する。ある実施態様において、ステロイドは、約４０モルパーセント、４１モルパーセント、４２モルパーセント、４３モルパーセント、４４モルパーセント、４５モルパーセントまたは４６モルパーセントの濃度で存在する。
ある実施態様において、ＬＮＰは、ポリマーコンジュゲート脂質の１〜１０モルパーセント、１〜５モルパーセントまたは１〜２.５モルパーセントを構成する
ある実施態様において、ＬＮＰは、４０〜５０モルパーセントのカチオン性脂質；５〜１５モルパーセントの中性脂質；３５〜４５モルパーセントのステロイド；１〜１０モルパーセントのポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に被包されたまたは結合したＲＮＡを含む。
ある実施態様において、モルパーセントは、脂質ナノ粒子に存在する脂質の総モルに基づき、決定される。
ある実施態様において、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥおよびＳＭからなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。
ある実施態様において、ステロイドはコレステロールである。
ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。ある実施態様において、ペグ化脂質は次の構造
Figure 2021185136
 〔式中、Ｒ１２およびＲ１３は各々独立して１０〜３０炭素原子を含む直鎖状または分岐鎖状、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖は所望により１以上のエステル結合で中断されており；そしてｗは３０〜６０の平均値を有する。〕
を有するまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体である。ある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３は各々独立して１２〜１６炭素原子を含む、直鎖状、飽和アルキル鎖である。ある実施態様において、ｗは４０〜５５の範囲の平均値を有する。ある実施態様において、平均ｗは約４５である。ある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３は各々独立して約１４炭素原子を含む、直鎖状、飽和アルキル鎖であり、ｗは約４５の平均値を有する。
ある実施態様において、ペグ化脂質は、例えば、下記構造を有する、DMG-PEG 2000である。
Figure 2021185136
ある実施態様において、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式(III)
Figure 2021185136
 〔式中、
Ｌ１またはＬ２の一方は−Ｏ(Ｃ＝Ｏ)−、−(Ｃ＝Ｏ)Ｏ−、−Ｃ(＝Ｏ)−、−Ｏ−、−Ｓ(Ｏ)ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ(＝Ｏ)Ｓ−、ＳＣ(＝Ｏ)−、−ＮＲａＣ(＝Ｏ)−、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ−、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ−、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ−または−ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ−であり、Ｌ１またはＬ２の他方は−Ｏ(Ｃ＝Ｏ)−、−(Ｃ＝Ｏ)Ｏ−、−Ｃ(＝Ｏ)−、−Ｏ−、−Ｓ(Ｏ)ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ(＝Ｏ)Ｓ−、ＳＣ(＝Ｏ)−、−ＮＲａＣ(＝Ｏ)−、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ−、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ−、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ−または−ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ−または直接結合であり；
Ｇ１およびＧ２は各々独立して非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキレンまたはＣ１−Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３はＣ１−Ｃ２４アルキレン、Ｃ１−Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルケニレンであり；
ＲａはＨまたはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１およびＲ２は各々独立してＣ６−Ｃ２４アルキルまたはＣ６−Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または−ＮＲ５Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４であり；
Ｒ４はＣ１−Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５はＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；そして
ｘは０、１または２である。〕
の構造を有するまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体である。
式(III)の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は、次の構造(IIIＡ)または(IIIＢ)
Figure 2021185136
 〔式中、
Ａは３〜８員シクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり；
Ｒ６は、各々の場合、独立してＨ、ＯＨまたはＣ１−Ｃ２４アルキルであり；
ｎは１〜１５の範囲の整数である。〕
の一方を有する。
式(III)の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は構造(IIIＡ)を有し、他の実施態様、脂質は構造(IIIＢ)を有する。
式(III)の他の実施態様において、脂質は、構造(IIIＣ)または(IIIＤ)：
Figure 2021185136
 〔式中、ｙおよびｚは各々独立して１〜１２の範囲の整数である。〕
の一つを有する。
式(III)の前記実施態様の何れにおいても、Ｌ１またはＬ２の一方は−Ｏ(Ｃ＝Ｏ)−である。例えば、ある実施態様において、Ｌ１およびＬ２の各々は−Ｏ(Ｃ＝Ｏ)−である。前記の何れかのある異なる実施態様において、Ｌ１およびＬ２は各々独立して−(Ｃ＝Ｏ)Ｏ−または−Ｏ(Ｃ＝Ｏ)−である。例えば、ある実施態様において、Ｌ１およびＬ２の各々は−(Ｃ＝Ｏ)Ｏ−である。
式(III)のある異なる実施態様において、脂質は、構造(IIIＥ)または(IIIＦ)
Figure 2021185136
 の一つを有する。
式(III)の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は、構造(IIIＧ)、(IIIＨ)、(IIIＩ)または(IIIＪ)
Figure 2021185136
 の一つを有する。
式(III)の前記実施態様のいくつかにおいて、ｎは２〜１２、例えば２〜８または２〜４の範囲の整数である。例えば、ある実施態様において、ｎは３、４、５または６である。ある実施態様において、ｎは３である。ある実施態様において、ｎは４である。ある実施態様において、ｎは５である。ある実施態様において、ｎは６である。
式(III)の前記実施態様のあるその他において、ｙおよびｚは各々独立して２〜１０の範囲の整数である。例えば、ある実施態様において、ｙおよびｚは各々独立して４〜９または４〜６の範囲の整数である。
式(III)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ６はＨである。前記実施態様のその他において、Ｒ６はＣ１−Ｃ２４アルキルである。他の実施態様において、Ｒ６はＯＨである。
式(III)のある実施態様において、Ｇ３は非置換である。他の実施態様において、Ｇ３は置換である。種々の異なる実施態様において、Ｇ３は直鎖状Ｃ１−Ｃ２４アルキレンまたは直鎖状Ｃ１−Ｃ２４アルケニレンである。
式(III)のある他の前記実施態様において、Ｒ１またはＲ２または両方はＣ６−Ｃ２４アルケニルである。例えば、ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して次の構造
Figure 2021185136
 〔式中、Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、各場合、独立してＨまたはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；そして
ａは２〜１２の整数であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびａは、Ｒ１およびＲ２が各々独立して６〜２０炭素原子を含むように、選択される。〕
を有する。例えば、ある実施態様において、ａは５〜９または８〜１２の範囲の整数である。
式(III)の前記実施態様のいくつかにおいて、少なくとも１回のＲ７ａはＨである。例えば、ある実施態様において、Ｒ７ａは各場合Ｈである。前記の他の異なる実施態様において、少なくとも１回のＲ７ｂはＣ１−Ｃ８アルキルである。例えば、ある実施態様において、Ｃ１−Ｃ８アルキルはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルまたはｎ−オクチルである。
式(III)の種々の実施態様において、Ｒ１またはＲ２または両方は、構造
Figure 2021185136
 の一つを有する。
式(III)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ３はＯＨ、ＣＮ、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｒ４である。ある実施態様において、Ｒ４はメチルまたはエチルである。
種々の異なる実施態様において、式(III)のカチオン性脂質は、下表に示す構造の一つを有する。
式(III)の代表的化合物。
Figure 2021185136
Figure 2021185136
Figure 2021185136
Figure 2021185136
Figure 2021185136
ある実施態様において、ＬＮＰは式(III)の脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。ある実施態様において、式(III)の脂質は化合物III−３である。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。ある実施態様において、ステロイドはコレステロールである。ある実施態様において、ペグ化脂質はALC-0159である。
ある実施態様において、カチオン性脂質は、ＬＰＮに約４０〜約５０モルパーセントの量で存在する。ある実施態様において、中性脂質は、ＬＰＮに約５〜約１５モルパーセントの量で存在する。ある実施態様において、ステロイドは、ＬＰＮに約３５〜約４５モルパーセントの量で存在する。ある実施態様において、ペグ化脂質は、ＬＰＮに約１〜約１０モルパーセントの量で存在する。
ある実施態様において、ＬＮＰは、約４０〜約５０モルパーセントの量の化合物III−３、約５〜約１５モルパーセントの量のＤＳＰＣ、約３５〜約４５モルパーセントの量のコレステロールおよび約１〜約１０モルパーセントの量のALC-0159を含む。
ある実施態様において、ＬＮＰは、約４７.５モルパーセントの量の化合物III−３、約１０モルパーセントの量のＤＳＰＣ、約４０.７モルパーセントの量のコレステロールおよび約１.８モルパーセントの量のALC-0159を含む。
種々の異なる実施態様において、カチオン性脂質は下表に示す構造の一つを有する。
Figure 2021185136
ある実施態様において、ＬＮＰは、上記表に示すカチオン性脂質、例えば、式(Ｂ)または式(Ｄ)のカチオン性脂質、特に式(Ｄ)のカチオン性脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。ある実施態様において、ステロイドはコレステロールである。ある実施態様において、ペグ化脂質はDMG-PEG 2000である。
ある実施態様において、ＬＮＰは、イオン化可能脂質様物質(リピドイド)であるカチオン性脂質を含む。ある実施態様において、カチオン性脂質は次の構造を有する。
Figure 2021185136
Ｎ／Ｐ値は好ましくは少なくとも約４である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は４〜２０、４〜１２、４〜１０、４〜８または５〜７の範囲である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は約６である。
ここに記載するＬＮＰは、ある実施態様において、約３０nm〜約２００nmまたは約６０nm〜約１２０nm範囲の平均直径を有し得る。
ＲＮＡターゲティング
本発明のある態様は、ここに開示するＲＮＡ(例えば、ワクチン抗原および／または免疫刺激剤をコードするＲＮＡ)の標的化送達を含む。
ある実施態様において、本発明は、肺ターゲティングを含む。肺ターゲティングは、投与されるＲＮＡがワクチン抗原をコードするＲＮＡであるならば、特に好ましい。ＲＮＡは、例えば、ここに記載する粒子、例えば、脂質粒子として製剤化され得るＲＮＡを、吸入により投与することにより、肺に送達され得る。
ある実施態様において、本発明は、リンパ系、特に二次リンパ系臓器、より具体的には脾臓のターゲティングを含む。リンパ系、特に二次リンパ系臓器、より具体的には脾臓のターゲティングは、投与されるＲＮがワクチン抗原をコードするＲＮＡであるならば、特に好ましい。
ある実施態様において、標的細胞は脾細胞である。ある実施態様において、標的細胞は、脾臓における専門的抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓における樹状細胞である。
「リンパ系」は循環系の一部であり、リンパを運搬するリンパ管のネットワークを含む、免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ性臓器、リンパ管の伝導ネットワークおよび循環リンパからなる。一次または中枢リンパ系臓器は、未成熟前駆細胞細胞からリンパ球を産生する。胸腺および骨髄は一次リンパ系臓器を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ系臓器は、成熟ナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始させる。
ＲＮＡは、ＲＮＡが注射用ナノ粒子製剤を形成するためのカチオン性脂質および所望によりさらなるまたはヘルパー脂質を含むリポソームに結合する、いわゆるリポプレックス製剤により、脾臓に送達され得る。リポソームは、エタノール中の脂質溶液を水または適当な水相に注入することにより得られ得る。ＲＮＡリポプレックス粒子は、リポソームとＲＮＡの混合により調製され得る。脾臓ターゲティングＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に包含させるＷＯ２０１３／１４３６８３に記載される。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓組織または脾細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を優先的に標的とするために使用し得ることが判明している。従って、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が生じる。故に、本発明のＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓でのＲＮＡの発現のために使用し得る。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子投与後、肺および／または肝臓へのＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は生じないまたは本質的に生じない。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子投与後、脾臓における専門的抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が生じる。故に、本発明のＲＮＡリポプレックス粒子を、このような抗原提示細胞でのＲＮＡの発現のために使用し得る。ある実施態様において、抗原提示細胞は樹状細胞および／またはマクロファージである。
本発明のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１個のカチオン性脂質に存在する電荷およびＲＮＡに存在する電荷の和である。電荷比少なくとも１個のカチオン性脂質に存在する正電荷対ＲＮＡに存在する負電荷の比である。少なくとも１個のカチオン性脂質に存在する正電荷対ＲＮＡに存在する負電荷の電荷比は次の式により計算される：電荷比＝[(カチオン性脂質濃度(mol))×(カチオン性脂質の正電荷の総数)]／[(ＲＮＡ濃度(mol))×(ＲＮＡの負電荷の総数)]。
ここに記載する脾臓ターゲティングＲＮＡリポプレックス粒子は、生理学的ｐＨで、好ましくは約１.９：２〜約１：２または約１.６：２〜約１：２または約１.６：２〜約１.１：２の正電荷対負電荷の電荷比などの正味の負電荷を有する。特定の実施態様において、生理学的ｐＨで、ＲＮＡリポプレックス粒子の正電荷対負電荷の電荷比は約１.９：２.０、約１.８：２.０、約１.７：２.０、約１.６：２.０、約１.５：２.０、約１.４：２.０、約１.３：２.０、約１.２：２.０、約１.１：２.０または約１：２.０である。
免疫刺激剤を、対象に肝臓または肝臓組織へのＲＮＡの優先的送達のための製剤の免疫刺激剤をコードするＲＮＡを投与することにより、対象に投与し得る。特に、大量の免疫刺激剤の発現が望ましいおよび／または特に相当量での免疫刺激剤の全身における存在が望ましいまたは必要であるならば、このような標的臓器または組織へのＲＮＡの送達は好ましい。
ＲＮＡ送達系は、肝臓に固有の優先度を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性ナノ粒子、特に脂質ナノ粒子、例えばリポソーム、ナノミセルおよびバイオコンジュゲートの親油性リガンドに付随する。肝臓蓄積は、肝臓脈管構造または脂質代謝(リポソームおよび脂質またはコレステロールコンジュゲート)の不連続性質が原因である。
肝臓へのインビボＲＮＡの送達のために、薬物送達系を、ＲＮＡを、その分解を防止しながら肝臓に輸送するために使用し得る。例えば、ポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)被覆表面およびｍＲＮＡ含有コアからなるポリプレックスナノミセルが、生理学的条件下、ナノミセルがＲＮＡの優れたインビボ安定性を提供するため、有用な系である。さらに、密集ＰＥＧ柵からなるポリプレックスナノミセル表面により提供されるステルス性質は、宿主免疫防御を効率的に回避させる。
肝臓ターゲティングのための適当な免疫刺激剤の例は、Ｔ細胞増殖および／または維持に関与するサイトカインである。適当なサイトカインの例は、ＩＬ２またはＩＬ７、フラグメントおよびそのバリアントおよび延長ＰＫサイトカインなどのこれらのサイトカイン、フラグメントおよびバリアントの融合タンパク質を含む。
他の実施態様において、免疫刺激剤をコードするＲＮＡを、リンパ系、特に二次リンパ系臓器、より具体的には脾臓に優先的にＲＮＡを送達するための製剤により投与し得る。特に、この臓器または組織における免疫刺激剤の存在が望まれるが(例えば、免疫応答を誘導するため、特にサイトカインなどの免疫刺激剤がＴ細胞プライミング中または常在免疫細胞の活性化に必要であるとき)、特に相当量で免疫刺激剤が全身性に存在することが望まれない(例えば、免疫刺激剤が全身毒性を有するため)ならば、このような標的組織への免疫刺激剤の送達が好ましい。
適当な免疫刺激剤の例は、Ｔ細胞プライミングに関与するサイトカインである。適当なサイトカインの例は、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β、フラグメントおよびそのバリアントおよび延長ＰＫサイトカインなどのこれらのサイトカイン、フラグメントおよびバリアントの融合タンパク質を含む。
免疫刺激剤
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは非免疫原性であり得る。このおよび他の実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、免疫刺激剤または免疫刺激剤をコードするＲＮＡと共投与され得る。ここに記載する方法および薬剤は、免疫刺激剤が薬物動態修飾基に結合している(以後「延長薬物動態(ＰＫ)」免疫刺激剤と称する)ならば、特に有効である。ここに記載する方法および薬剤は、免疫刺激剤が免疫刺激剤をコードするＲＮＡの形態で投与されるであるならば、特に有効である。ある実施態様において、該ＲＮＡは、全身利用能のために肝臓に標的化される。肝細胞は効率的にトランスフェクトされ得て、大量のタンパク質を産生できる。
「免疫刺激剤」は、免疫系の成分、特に免疫エフェクター細胞の何れかの活性化誘導または活性増加により、免疫系を刺激するあらゆる物質である。免疫刺激剤は炎症誘発性であり得る。
ある態様により、免疫刺激剤はサイトカインまたはそのバリアントである。サイトカインの例は、インターフェロン−アルファ(ＩＦＮ−α)またはインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)などのインターフェロン、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５およびＩＬ２３などのインターロイキン、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子を含む。他の態様により、免疫刺激剤はＡＰＣトール様受容体アゴニストまたは共刺激／細胞付着膜タンパク質などのアジュバント型免疫刺激剤を含む。トール様受容体アゴニストの例は、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＡＭ−１などの共刺激／付着タンパク質を含む。
サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要な小タンパク質(約５〜２０kDa)のカテゴリーである。その放出は、それら周辺の細胞の挙動に影響する。サイトカインは、免疫調節因子として自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび腫瘍壊死因子を含むが、一般にホルモンまたは増殖因子は含まない(用語に一部重複はあるが)。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および肥満細胞などの免疫細胞ならびに内皮細胞、線維芽細胞および種々の間質細胞を含む広範な細胞により産生される。あるサイトカインは、１を超えるタイプの細胞により産生され得る。サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系に特に重要である；サイトカインは液性および細胞ベースの免疫応答のバランスを調節し、特定の細胞集団の成熟、増殖および反応性を制御する。あるサイトカインは、複雑な方法で他のサイトカインの作用を増強または阻害する。
本開示により、サイトカインは天然に存在するサイトカインまたは機能的フラグメントまたはそのバリアントであり得る。サイトカインはヒトサイトカインであってよく、かつ脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れかに由来してよい。ある特に好ましいサイトカインはインターフェロン−αである。
インターフェロン
インターフェロン(ＩＦＮ)は、ウイルス、細菌、寄生虫およびまた腫瘍細胞などのいくつかの病原体の存在に応答して宿主細胞により産生および放出される、一群のシグナル伝達タンパク質である。典型的シナリオにおいて、ウイルス感染細胞はインターフェロンを放出し、近隣細胞の抗ウイルス防御を高めさせる。
シグナル伝達で経る受容体のタイプにより、インターフェロンは一般にＩ型インターフェロン、II型インターフェロンおよびIII型インターフェロンの３クラスに分類される。
全Ｉ型インターフェロンは、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ−α／β受容体(ＩＦＮＡＲ)として知られる特異的細胞表面受容体複合体に結合する。
ヒトに存在するＩ型インターフェロンはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮκおよびＩＦＮωである。一般に、体が、侵入してきたウイルスを認識したとき、Ｉ型インターフェロンが産生される。それらは線維芽細胞および単球により産生される。放出されたら、Ｉ型インターフェロンは標的細胞の特異的受容体に結合し、それによりウイルスがそのＲＮＡおよびＤＮＡを産生し、複製することを阻止するタンパク質の発現に至る。
ＩＦＮαタンパク質は、主に形質細胞様樹状細胞(ｐＤＣ)により産生される。主にウイルス感染に対する自然免疫に関与する。その合成を担う遺伝子は、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１と称される１３サブタイプに入る。これらの遺伝子は、染色体９上のクラスターに一緒に見られる。
ＩＦＮβタンパク質は線維芽細胞により多量に産生される。主に自然免疫応答に関与する抗ウイルス活性を有する。ＩＦＮβ１およびＩＦＮβ３の２タイプのＩＦＮβが記載されている。天然および組み換え形態のＩＦＮβ１は抗ウイルス、抗細菌および抗癌性質を有する。
II型インターフェロン(ヒトにおけるＩＦＮγ)は免疫インターフェロンとしても知られ、ＩＬ１２により活性化される。さらに、II型インターフェロンは、細胞毒性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞により放出される。
III型インターフェロンは、ＩＬ１０Ｒ２(ＣＲＦ２−４とも称される)およびＩＦＮＬＲ１(ＣＲＦ２−１２とも称される)からなる受容体複合体を介してシグナル伝達する。Ｉ型およびII型ＩＦＮよりも最近になって発見されたが、最近の情報は、あるタイプのウイルスまたは真菌感染におけるIII型ＩＦＮの重要性を示す。
一般に、Ｉ型およびII型インターフェロンは免疫応答の制御および活性化を担う。
本開示により、Ｉ型インターフェロンは好ましくはＩＦＮαまたはＩＦＮβ、より好ましくはＩＦＮαである。
本開示により、インターフェロンは天然に存在するインターフェロンまたは機能的フラグメントまたはそのバリアントであり得る。インターフェロンはヒトインターフェロンであってよく、かつ脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れかに由来してよい。
インターロイキン
インターロイキン(ＩＬ)は、顕著な構造特性に基づき、４つの主要な群に分割され得る、一群のサイトカイン(分泌型タンパク質およびシグナル分子)である。しかしながら、それらのアミノ酸配列類似性はむしろ弱い(一般に１５〜２５％同一性)。ヒトゲノムは５０を超えるインターロイキンおよび関連タンパク質をコードする。
本開示により、インターロイキンは天然に存在するインターロイキンまたは機能的フラグメントまたはそのバリアントであり得る。インターロイキンはヒトインターロイキンであってよく、かつ脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れかに由来してよい。
延長ＰＫ基
ここに記載する免疫刺激剤ポリペプチドは、免疫刺激剤部分および異種ポリペプチド(すなわち、免疫刺激剤ではないポリペプチド)を含む融合またはキメラポリペプチドとして調製され得る。免疫刺激剤は、循環半減期を延長する延長ＰＫ基に融合させ得る。延長ＰＫ基の非限定的例は下に記載される。サイトカインなどの免疫刺激剤またはそのバリアントの循環半減期を延長させる他のＰＫ基も本発明に適用可能であることは、理解されるべきである。ある実施態様において、延長ＰＫ基は血清アルブミンドメイン(例えば、マウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン)である。
ここで使用する用語「ＰＫ」は「薬物動態」の略語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝および排出を含む、化合物の性質を包含する。ここで使用する「延長ＰＫ基」は、生物学的活性分子に融合したときまたは一緒に投与されたとき、生物学的活性分子の循環半減期を延長させる、タンパク質、ペプチドまたは部分をいう。延長ＰＫ基の例は、血清アルブミン(例えば、ＨＳＡ)、免疫グロブリンＦｃまたはＦｃフラグメントおよびそのバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアントおよびヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)結合剤を含む(米国公開番号２００５／０２８７１５３および２００７／０００３５４９に開示のとおり)。他の例示的延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、Kontermann, Expert Opin Biol Ther, 2016 Jul;16(7):903-15に開示される。ここで使用する「延長ＰＫ」免疫刺激剤は、延長ＰＫ基と組み合わせた免疫刺激剤部分をいう。ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤は、免疫刺激剤部分が延長ＰＫ基に結合または融合した融合タンパク質である。
ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独(すなわち、延長ＰＫ基に融合していない免疫刺激剤)に対して延長している。ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独の血清半減期に対して少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、４００％、６００％、８００％または１０００％長い。ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独の血清半減期より少なくとも１.５倍、２倍、２.５倍、３倍、３.５倍、４倍、４.５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍または５０倍大きい。ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間または２００時間である。
ここで使用する「半減期」は、例えば、天然機構による分解および／または排除または隔離のため、ペプチドまたはタンパク質などの化合物の血清または血漿濃度がインビボで５０％減少するのにかかる時間をいう。ここで使用するのに適する延長ＰＫ免疫刺激剤は、インビボで安定化され、その半減期が、例えば、分解および／または排除または隔離に耐える血清アルブミン(例えば、ＨＳＡまたはＭＳＡ)への融合により延長される。半減期は、薬物動態分析などのそれ自体知られるあらゆる方法で決定され得る。適当な技術は当業者には明らかであり、例えば、一般に適当な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適当に投与し；該対象から一定間隔で血液サンプルまたは他のサンプルを集め；該血液サンプル中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定し；そしてこうして得られたデータ(プロット)から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算する過程を含み得る。さらなる詳細は、例えば、Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996)などの標準的手引きに提供される。Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)にも言及し得る。
ある実施態様において、延長ＰＫ基は、血清アルブミンまたはそのフラグメントまたは血清アルブミンもしくはそのフラグメントのバリアント(本発明の目的でその全ては用語「アルブミン」に含まれる)を含む。ここに記載するポリペプチドは、アルブミン融合タンパク質を形成するようにアルブミン(またはそのフラグメントまたはバリアント)に融合され得る。このようなアルブミン融合タンパク質は、米国公開２００７００４８２８２に開示される。
ここで使用する「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１分子の治療タンパク質、特に免疫刺激剤などのタンパク質への少なくとも１分子のアルブミン(またはそのフラグメントまたはバリアント)の融合により形成されたタンパク質をいう。アルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、インフレームでアルブミンをコードするポリヌクレオチドに連結された核酸の翻訳により産生され得る。治療タンパク質およびアルブミンは、アルブミン融合タンパク質の一部として、各々アルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」(例えば、「治療タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」)と呼ばれ得る。高度に好ましい実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも１分子の治療タンパク質(治療タンパク質の成熟形態を含むが、それに限定されない)および少なくとも１分子のアルブミン(アルブミンの成熟形態を含むが、それに限定されない)を含む。ある実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、投与ＲＮＡの標的臓器の細胞、例えば肝細胞などの宿主細胞により処理され、循環に分泌される。ＲＮＡの発現のために使用される宿主細胞の分泌経路に出現する新生アルブミン融合タンパク質の処理は、シグナルペプチド開裂；ジスルフィド結合の形成；適切な折りたたみ；炭水化物の付加および処理(例えば、ＮおよびＯ結合グリコシル化など)；特異的タンパク分解性開裂；および／または多量体タンパク質への集合を含み得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、特にＮ末端にシグナルペプチドを有する、処理されていない形態でＲＮＡによりコードされ、細胞による分泌後、好ましくは特にシグナルペプチドが開裂されている処理された形態で存在する。最も好ましい実施態様において、「処理された形態のアルブミン融合タンパク質」は、Ｎ末端シグナルペプチド開裂を受けたアルブミン融合タンパク質産物をいい、ここでまた「成熟アルブミン融合タンパク質」ともいう。
好ましい実施態様において、治療タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合していないときの同じ治療タンパク質の血漿安定性と比較して、高い血漿安定性を有する。血漿安定性は、一般に治療タンパク質がインビボで投与され、血流に運び込まれるときと、治療タンパク質が分解され、血流から最終的に体から治療タンパク質を浄化する腎臓または肝臓などの臓器に浄化されるときの間の期間をいう。血漿安定性は、血流中の治療タンパク質の半減期の観点で計算される。血流中の治療タンパク質の半減期は、当分野で知られる一般的アッセイにより容易に決定され得る。
ここで使用する「アルブミン」は、まとめてアルブミンタンパク質またはアミノ酸配列またはアルブミンの１以上の機能的活性(例えば、生物学的活性)を有するアルブミンフラグメントもしくはバリアントをいう。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアント、特に成熟形態のヒトアルブミンまたは他の脊椎動物からのアルブミンまたはそのフラグメントまたはこれら分子のバリアントをいう。アルブミンは、脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れか、例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンは、トリおよびサケを含むが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療タンパク質部分と異なる動物からでよい。
ある実施態様において、アルブミンは、ＵＳ５,８７６,９６９、ＷＯ２０１１／１２４７１８、ＷＯ２０１３／０７５０６６およびＷＯ２０１１／０５１４７８９に記載のものなどヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)またはそのフラグメントもしくはバリアントである。
用語、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)およびヒトアルブミン(ＨＡ)はここでは相互交換可能に使用される。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」は広義であり、ヒト血清アルブミン(ならびにそのフラグメントおよびバリアント)ならびに他の種からのアルブミン(ならびにそのフラグメントおよびバリアント)を含む。
ここで使用する、治療タンパク質の治療的活性または血漿安定性延長に十分なアルブミンのフラグメントは、非融合状態の血漿安定性と比較して、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分の血漿安定性が延長または拡張されるように、タンパク質の治療的活性または血漿安定性を安定化または延長するために長さまたは構造が十分であるアルブミンのフラグメントをいう。
アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、アルブミン配列の完全長を含んでよく、または治療的活性または血漿安定性を安定化またはできる１以上のそのフラグメントを含んでよい。このようなフラグメントは１０以上アミノ酸長であり得て、アルブミン配列からの約１５、２０、２５、３０、５０以上連続アミノ酸であり得るかまたはアルブミンの特異的ドメインの一部または全てを含み得る。例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインにかかるＨＳＡの１以上のフラグメントが使用され得る。好ましい実施態様において、ＨＳＡフラグメントは成熟形態のＨＳＡである。
一般的にいうと、アルブミンフラグメントまたはバリアントは少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。
本開示により、アルブミンは天然に存在するアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアントであり得る。アルブミンはヒトアルブミンであってよく、かつ脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れかに由来してよい。
好ましくはアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミンおよびＣ末端部分として治療タンパク質を含む。あるいはＣ末端部分としてアルブミンおよびＮ末端部分として治療タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質もまた使用され得る。他の実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端およびＣ末端両方に融合した治療タンパク質を有する。好ましい実施態様において、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療タンパク質は同じ治療タンパク質である。他の好ましい実施態様において、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療タンパク質は異なる治療タンパク質である。ある実施態様において、異なる治療タンパク質はいずれもサイトカインである。
ある実施態様において、治療タンパク質は、ペプチドリンカーを介してアルブミンに連結される。融合部分間のリンカーペプチドは、部分間の大きな物理的分離を提供し、故に、例えば、その同族受容体への結合のための、治療タンパク質部分の利用可能性を最大化し得る。リンカーペプチドは、柔軟またはより硬いようにアミノ酸からなり得る。リンカー配列はプロテアーゼによりまたは化学的に切断可能であり得る。
ここで使用する用語「Ｆｃ領域」は、天然免疫グロブリンの、その２つの重鎖の各Ｆｃドメイン(またはＦｃ部分)により形成される部分をいう。ここで使用する用語「Ｆｃドメイン」は、単一免疫グロブリン(Ｉｇ)重鎖の部分またはフラグメントをいい、ここで、ＦｃドメインはＦｖドメインを含まない。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、パパイン開裂部位のすぐ上流のヒンジ領域で開始し、抗体のＣ末端で終了する。従って、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジ(例えば、上部、中央および／または下部ヒンジ領域)ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはバリアント、部分またはそのフラグメントの少なくとも１個を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン(すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン)を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合したヒンジドメイン(またはその一部)を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合したＣＨ２ドメイン(またはその一部)を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン(またはその一部)およびＣＨ３ドメイン(またはその一部)からなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン(またはその一部)およびＣＨ３ドメインからなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン(またはその一部)およびＣＨ２ドメイン(またはその一部)からなる。ある実施態様において、ＦｃドメインはＣＨ２ドメインの少なくとも一部(例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部)を欠く。ここでのＦｃドメインは、一般に免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全てまたは一部を含む、ポリペプチドをいう。これは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン全体ならびに、例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含むこのようなペプチドのフラグメントを含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体を含むが、これらに限定されない、あらゆる種および／またはあらゆるサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは天然ＦｃおよびＦｃバリアント分子を含む。ここに示すとおり、天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインからアミノ酸配列が変化するように、あらゆるＦｃドメインが修され得ることは、当業者に理解される。ある実施態様において、Ｆｃドメインのエフェクター機能(例えば、ＦｃγＲ結合)は減少している。
ここに記載するポリペプチドのＦｃドメインは、種々の免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。他の例では、Ｆｃドメインは一部ＩｇＧ１分子および一部ＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域を含み得る。他の例では、Ｆｃドメインは一部ＩｇＧ１分子および一部ＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
ある実施態様において、延長ＰＫ基は、ＦｃドメインまたはそのフラグメントまたはＦｃドメインもしくはそのフラグメントのバリアント(本発明の目的でその全ては用語「Ｆｃドメイン」に含まれる)を含む。Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。本発明における使用に適するＦｃドメインは、多数の異なる供給源から得られ得る。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。ある実施態様において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１定常領域由来である。しかしながら、Ｆｃドメインが、例えば、齧歯類(例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット)または非ヒト霊長類(例えばチンパンジー、マカク)種を含む、他の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることは、理解される。
さらに、Ｆｃドメイン(またはそのフラグメントまたはバリアント)は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むあらゆる免疫グロブリンクラスおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むあらゆる免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。
多様なＦｃドメイン遺伝子配列(例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列)が、公的に利用可能な受託機関の形で入手可能である。特定のエフェクター機能を欠くおよび／または免疫原性を減少させるための特定の修飾を有するＦｃドメイン配列を含む定常領域ドメインが選択され得る。抗体の多くの配列および抗体をコードする遺伝子は公開されており、適当なＦｃドメイン配列(例えばヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３配列またはそのフラグメントもしくはバリアント)は、これら配列から、当分野で認識されている技術を使用してもらされ得る。
ある実施態様において、延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＵＳ２００５／０２８７１５３、ＵＳ２００７／０００３５４９、ＵＳ２００７／０１７８０８２、ＵＳ２００７／０２６９４２２、ＵＳ２０１０／０１１３３３９、ＷＯ２００９／０８３８０４およびＷＯ２００９／１３３２０８に記載されるもののような、血清アルブミン結合タンパク質である。ある実施態様において、延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＵＳ７,１７６,２７８およびＵＳ８,１５８,５７９に開示のトランスフェリンである。ある実施態様において、延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＵＳ２００７／０１７８０８２、ＵＳ２０１４／０２２００１７およびＵＳ２０１７／０１４５０６２に開示されるもののような、血清免疫グロブリン結合タンパク質である。ある実施態様において、延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＵＳ２０１２／００９４９０９に開示のもののような、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン(Ｆｎ)ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質の製造方法もＵＳ２０１２／００９４９０９に開示される。Ｆｎ３ベースの延長ＰＫ基の非限定的例は、Ｆｎ３(ＨＳＡ)、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。
ある態様において、本発明における使用に適する延長ＰＫ免疫刺激剤は、１以上のペプチドリンカーを用い得る。ここで使用する用語「ペプチドリンカー」は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における２以上のドメイン(例えば、延長ＰＫ部分および免疫刺激剤部分)を接続するペプチドまたはポリペプチド配列をいう。例えば、ペプチドリンカーを、免疫刺激剤部分のＨＳＡドメインへの接続に使用し得る。
延長ＰＫ基を例えば免疫刺激剤と融合するのに適するリンカーは当分野で周知である。例示的リンカーはグリシン−セリン−ポリペプチドリンカー、グリシン−プロリン−ポリペプチドリンカーおよびプロリン−アラニンポリペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、リンカーはグリシン−セリン−ポリペプチドリンカー、すなわち、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドである。
上記異種ポリペプチドに加えてまたはその代わりに、ここに記載する免疫刺激剤ポリペプチドは、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含み得る。マーカーまたはレポーター遺伝子の例は、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ(ＨＰＨ)、チミジンキナーゼ(ＴＫ)、β−ガラクトシダーゼおよびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＸＧＰＲＴ)を含む。
医薬組成物
ここに記載する薬剤は医薬組成物または医薬で投与でき、何らかの適当な医薬組成物の形態で投与され得る。
ある実施態様において、ここに記載する医薬組成物は、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答の誘導のための免疫原性組成物である。例えば、ある実施態様において、免疫原性組成物はワクチンである。
本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡなどのここに記載する成分は、薬学的に許容される担体を含み得るおよび所望により１以上のアジュバント、安定化剤などを含み得る医薬組成物で投与され得る。ある実施態様において、医薬組成物は治療的処置または予防的処置のため、例えば、コロナウイルス感染の処置または予防に使用するためである。
用語「医薬組成物」は、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物と共に、治療上有効な薬剤を含む製剤に関する。該医薬組成物は、対象への該医薬組成物の投与により、疾患または障害の処置、予防または重症度低減に有用である。医薬組成物は当分野で医薬製剤としても知られる。
本発明の医薬組成物は、１以上のアジュバントを含み得るまたは１以上のアジュバントと共に投与され得る。用語「アジュバント」は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン(例えば、フロイントアジュバント)、鉱物化合物(例えばミョウバン)、細菌産物(例えば百日咳菌由来毒素)または免疫刺激複合体などの不均一な化合物群を含む。アジュバントの例は、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧ オリゴデオキシヌクレオチド、増殖因子およびサイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインを含むが、これらに限定されない。サイトカインはＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−ａであり得る。さらに知られるアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバントまたはMontanide(登録商標)ISA51などの油である。本発明における使用に適する他のアジュバントは、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドを含む。
本発明の医薬組成物は、一般に「薬学的有効量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
用語「薬学的に許容される」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性性をいう。
用語「薬学的有効量」または「治療有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量をいう。特定の疾患の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患経過の阻止に関する。これは、疾患進行の減速および、特に、疾患進行妨害または逆転を含む。疾患の処置における所望の反応は、該疾患または該状態の発症遅延または発症予防でもあり得る。ここに記載する組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重大さ、年齢、生理学的状態、体格および体重を含む患者の各個のパラメータ、処置の期間、付随的治療のタイプ(存在するならば)、具体的投与経路および類似の因子による。従って、ここに記載する組成物を投与する用量は、種々のこのようなパラメータにより得る。初期用量で患者の応答が不十分である場合、高用量(または異なる、より局在化された投与経路により達成される、効果としての高用量)が使用され得る。
本発明の医薬組成物は、塩、緩衝液、防腐剤および所望により他の治療剤を含み得る。ある実施態様において、本発明の医薬組成物は１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物を含む。
本発明の医薬組成物で使用するのに適する防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールを含むが、これらに限定されない。
ここで使用する用語「添加物」は、本発明の医薬組成物に存在し得るが、活性成分ではない物質をいう。添加物の例は、担体、結合剤、希釈剤、滑沢剤、濃厚剤、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、乳化剤、緩衝液、風味剤または着色剤を含むが、これらに限定されない。
用語「希釈剤」は、希釈および／または菲薄化剤に関する。さらに、用語「希釈剤」は、流体、液体または固体懸濁液および／または混合媒体の何れか１以上を含む。適当な希釈剤の例は、エタノール、グリセロールおよび水を含む。
用語「担体」は、医薬組成物の投与を促進、増強または可能にするために、活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分をいう。ここで使用する担体は、対象への投与に適する、適合性の固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質の１以上であり得る。適当な担体は、無菌水、リンゲル、乳酸リンゲル、無菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシ−プロピレンコポリマーを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、本発明の医薬組成物は等張食塩水を含む。
治療的使用のための薬学的に許容される担体、添加物または希釈剤は医薬分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)に記載される。
医薬担体、添加物または希釈剤は、意図される投与経路および標準薬務に関して選択され得る。
ある実施態様において、ここに記載する医薬組成物は静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。ある実施態様において、医薬組成物局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与は、消化管を介する吸収が関与する経腸投与または非経腸投与を含み得る。ここで使用する「非経腸投与」は、静脈内注射によるなどの、消化管を介する以外の何らかの方法での投与をいう。好ましい実施態様において、医薬組成物は筋肉内投与用に製剤化される。他の実施態様において、医薬組成物は全身投与、例えば、静脈内投与用に製剤化される。
ここで使用する用語「共投与」は、異なる化合物または組成物(例えば、抗原をコードするＲＮＡおよび免疫刺激剤をコードするＲＮＡ)が同じ患者に投与される過程を意味する。異なる化合物または組成物は、同時、本質的に同時または逐次的に投与され得る。
ここに記載する医薬組成物および製品は、例えば、０.５０mg／mLの濃度で、注射用溶液の凍結濃縮物として提供され得る。ある実施態様において、注射用溶液の調製のために、製剤を解凍し、例えば、１工程希釈方法で、等張塩化ナトリウム溶液(例えば、０.９％ＮａＣｌ、食塩水)で希釈する。ある実施態様において、静菌性塩化ナトリウム溶液(例えば、０.９％ＮａＣｌ、食塩水)は希釈剤として使用できない。ある実施態様において、希釈製剤は灰白色懸濁液である。最終注射用溶液の濃度は、投与される各用量レベルにより変わる。
ある実施態様において、微生物汚染のリスクによりおよび調製過程の複数用量アプローチを考慮して、調整開始後６時間以内に投与を実施する。ある実施態様において、この６時間の間、調製、取り扱いおよび移動のための室温ならびに保存のための２〜８℃の２つの条件が許容される。
ここに記載する組成物は、例えば、所望の温度の維持のために冷却システム(例えば、ドライアイスであり得るまたはそれを含み得る)を利用して、温度制御条件、例えば、約４〜５℃以下、約−２０℃以下、−７０℃±１０℃(例えば、−８０℃〜−６０℃)の温度条件下、輸送および／または保管され得る。ある実施態様において、ここに記載する組成物は温度制御保温シッパーで輸送される。このようなシッパーは、各積荷の位置および温度を追跡するためＧＰＳ可能熱センサーを含み得る。組成物は、例えば、ドライアイスの再充填により保管され得る。
処置
本発明は、有効量のここに記載するコロナウイルスワクチン抗原をコードするＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、対象におけるコロナウイルスに対する適応免疫応答を誘導するための方法および薬剤を提供する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象にコロナウイルス、コロナウイルス感染またはコロナウイルスに関連する疾患もしくは障害に対する免疫を提供する。本発明は、故に、コロナウイルスに関連する感染、疾患または障害を処置または予防するための方法および薬剤を提供する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、コロナウイルスに関連する感染、疾患または障害を有する対象に投与される。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、コロナウイルスに関連する感染、疾患または障害の対象を発症するリスクがある対象に投与される。例えば、ここに記載する方法および薬剤は、コロナウイルスに接触するリスクがある対象に投与され得る。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、コロナウイルスが流行している地理的領域に居住している、そこに旅行するまたは旅行することが予測される対象に投与される。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、コロナウイルスが流行している地理的領域に居住している、そこに旅行するまたは旅行することが予測される他人と接触しているまたは接触が予測される対象に投与される。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、仕事を介してまたはその他接触によりコロナウイルスに曝されていることが知られている対象に投与される。ある実施態様において、コロナウイルスはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２である。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２および／またはその抗原もしくはエピトープまたはそれと交差反応性のものへの先の暴露および／または感染の証拠がある対象に投与される。例えば、ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、抗体において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質の１以上のエピトープと反応性のＢ細胞および／またはＴ細胞が検出可能および／または検出されている対象に投与される。
ワクチンとして有用である組成物について、組成物は、細胞、組織または対象(例えば、ヒト)でコロナウイルス抗原に対する免疫応答を誘導しなければならない。ある実施態様において、組成物は、細胞、組織または対象(例えば、ヒト)でコロナウイルス抗原に対する免疫応答を誘導する。いくつかの例で、ワクチンは哺乳動物における防御免疫応答を誘導する。本発明の治療的化合物または組成物は、疾患または障害を有するまたは発症するリスクがある(または疑われる)対象に予防的(すなわち、疾患または障害を予防するため)または治療的(すなわち、疾患または障害を処置するため)に投与され得る。このような対象は、標準臨床的方法を使用して同定され得る。本開示の文脈において、予防投与は、疾患または障害が予防されるあるいは進行が遅延されるように、疾患の明白な臨床的症状が顕在化する前に行う。医学分野の状況において、用語「予防」は、疾患による死亡または罹病の負担を減少させるあらゆる活性を含む。予防は一次、二次および三次予防レベルで生じ得る。一次予防は疾患の発症の回避であるのに対して、二次および三次レベルの予防は、疾患進行および症状出現の予防ならびに機能回復および疾患関連合併症軽減による既に確立された疾患の負の影響の軽減を目的とする活性を含む。
本発明は、提供される組成物の種々の特徴(例えば、実施例２参照;またそれ以降の実施例参照)およびヒトで有効なワクチンについてパラメータをさらに確立する。
ある実施態様において、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの投与は単回投与で実施されまたは複数投与によりブーストされ得る。
ある実施態様において、１回あたり、０.１μg〜３００μg、０.５μg〜２００μgまたは１μg〜１００μg、例えば約１μg、約３μg、約１０μg、約３０μg、約５０μgまたは約１００μgのここに記載するＲＮＡの量が投与され得る。ある実施態様において、本発明は、単回投与での投与を想起する。ある実施態様において、本発明は、プライミング用量、続く１以上のブースター用量での投与を想起する。ブースター投与または最初のブースター投与は、プライミング用量の投与７〜２８日または１４〜２４日後に投与され得る。
ある実施態様において、１回あたり、６０μgまたはそれ以下、５０μgまたはそれ以下、４０μgまたはそれ以下、３０μgまたはそれ以下、２０μgまたはそれ以下、１０μgまたはそれ以下、５μgまたはそれ以下、２.５μgまたはそれ以下または１μgまたはそれ以下のここに記載するＲＮＡの量が投与され得る。
ある実施態様において、１回あたり、少なくとも０.２５μg、少なくとも０.５μg、少なくとも１μg、少なくとも２μg、少なくとも３μg、少なくとも４μg、少なくとも５μg、少なくとも１０μg、少なくとも２０μg、少なくとも３０μgまたは少なくとも４０μgのここに記載するＲＮＡの量が投与され得る。
ある実施態様において、１回あたり、０.２５μg〜６０μg、０.５μg〜５５μg、１μg〜５０μg、５μg〜４０μgまたは１０μg〜３０μgのここに記載するＲＮＡの量が投与され得る。
ある実施態様において、１回あたり、約３０μgのここに記載するＲＮＡの量が投与される。ある実施態様において、このような用量の少なくとも２回が投与される。例えば、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡワクチンの有効性(例えば、２回投与、ここで、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得て、例えば、１回あたり約３０μgの量で投与される)は、２回目の投与７日後開始(例えば、２回目を１回目の投与２１日後に投与したならば、１回目の投与２８日後開始)して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０または少なくとも９５％である。ある実施態様において、このような有効性は、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳またはそれ以上の集団で観察される。ある実施態様において、少なくとも６５歳、例えば６５〜８０歳、６５〜７５歳または６５〜７０歳の集団で２回目の投与７日後開始(例えば、２回目を１回目の投与２１日後に投与したならば、１回目の投与２８日後開始)するここに記載するＲＮＡワクチンの有効性(例えば、２回投与、ここで、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得て、例えば、１回あたり約３０μgの量で投与される)は、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％または少なくとも９５％である。このような有効性は、最大１か月、２か月、３か月、６か月またはそれより長い期間にわたり観察され得る。
ある実施態様において、ワクチン有効性は、感染の証拠を有する対象数のパーセント減少として定義される(ワクチン接種した対象対ワクチン接種していない対象)。
ある実施態様において、有効性を、ＣＯＶＩＤ−１９の潜在的症例についての調査を介して評価する。何らかの時点で、患者がここでの目的での急性呼吸器疾病を発症したならば、患者はＣＯＶＩＤ−１９疾病を有する可能性があると考えられ得る。評価は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検出するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)試験を使用して試験し得る、鼻腔(中鼻甲介)スワブを含み得る。さらに、地域の標準治療試験からの臨床情報および結果が評価され得る。
ある実施態様において、有効性評価は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２関連症例の定義を利用でき、ここで：
・ 確認されたＣＯＶＩＤ−１９：症状がある期間中またはその前後４日以内の次の症状の少なくとも１つの存在およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＮＡＡＴ(核酸増幅ベースの試験)陽性：発熱；今までになかった咳嗽またはその増加；今までになかった息切れまたはその増加；悪寒；今までになかった筋肉痛またはその増加；今までになかった味覚または嗅覚喪失；咽喉炎；下痢；嘔吐。
これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、有効性評価は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２関連症例の定義を利用でき、ここで、ＣＤＣにより定義される次のさらなる症状の１以上が考慮され得る：疲労；頭痛；鼻閉または鼻汁；悪心。
ある実施態様において、有効性評価は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２関連重症症例の定義を利用できる
・ 確認された重症ＣＯＶＩＤ−１９：確認されたＣＯＶＩＤ−１９および次の少なくとも１つの存在：安静時の重症全身疾病の臨床徴候(例えば、ＲＲ≧３０呼吸／分、ＨＲ≧１２５心拍／分、室内気でsea levelでＳｐＯ２≦９３％またはＰａＯ２／ＦｉＯ２＜３００mmHg)；呼吸不全(高流酸素、非侵襲性人工呼吸、機械的人工呼吸またはＥＣＭＯが必要として定義される)；ショックの証拠(例えば、ＳＢＰ＜９０mmHg、ＤＢＰ＜６０mmHgまたは昇圧剤必要)；顕著な急性腎臓、肝臓または神経性機能不全；ＩＣＵ入院；死亡。
これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、ＣＯＶＩＤ−１９の臨床症状がない患者には血清学的定義が使用され得る：例えば、確認されたＣＯＶＩＤ−１９がなく、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する抗体陽転確認：例えば、先にＮ結合抗体結果陰性であった患者のＮ結合抗体結果陽性。
ある実施態様において、次のアッセイの何れかまたは全てが血清サンプルで実施され得る：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイ；Ｓ１結合ＩｇＧレベルアッセイ；ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルアッセイ；Ｎ結合抗体アッセイ。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は小児集団に投与される。種々の実施態様において、小児集団は、１８歳未満、例えば、５〜１８歳未満、１２〜１８歳未満、１６〜１８歳未満、１２〜１６歳未満または５〜１２歳未満の対象を含むまたはそれからなる。種々の実施態様において、小児集団は、５歳未満、例えば、２〜５歳未満、１２〜２４か月齢未満、７〜１２か月齢未満または６か月齢未満の対象を含むまたはそれからなる。
ある実施態様において、小児集団は、１６〜１８歳未満対象および／または１２〜１６歳未満対象を含む１２〜１８歳未満の対象を含むまたはそれからなる。この実施態様において、処置は２１日離れた２回ワクチン接種を含んでよく、ここで、ある実施態様において、ワクチンを、例えば、筋肉内投与により、１回あたり３０μg ＲＮＡ量で投与する。
ある実施態様において、小児集団は、１２〜１８歳未満対象および／または５〜１２歳未満対象を含む５〜１８歳未満の対象を含むまたはそれからなる。この実施態様において、処置は２１日離れた２回ワクチン接種を含んでよく、ここで、種々の実施態様において、ワクチンを、例えば、筋肉内投与により、１回あたり１０μg、２０μgまたは３０μg ＲＮＡ量で投与する。
ある実施態様において、小児集団は、２〜５歳未満の対象、１２〜２４か月齢未満の対象、７〜１２か月齢未満の対象、６〜１２か月齢未満の対象および／または６か月齢未満の対象を含む５歳未満の対象を含むまたはそれからなる。この実施態様において、処置は、例えば、２１〜４２日離れた、例えば、２１日離れた２回ワクチン接種を含んでよく、ここで、種々の実施態様において、ワクチンを、例えば、筋肉内投与により、１回あたり１０μg、２０μgまたは３０μg ＲＮＡ量で投与する。
ある実施態様において、小児集団で記載されるｍＲＮＡ組成物(例えば、ここに記載)の有効性を、ここに記載する種々の測定基準により評価し得る(例えば、過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の血清学またはウイルス学的証拠がない対象における１０００人年あたりのＣＯＶＩＤ−１９発生率；例えば、２回目の投与７日後に測定したＳＡＲＳ ＣｏＶ−２中和力価の幾何平均比(ＧＭＲ)などを含むが、これらに限定されない)。
ある実施態様において、ここに記載する小児集団(例えば、１２〜１６歳未満)は、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えば、ｍＲＮＡ)投与後、多系炎症性症候群(ＭＩＳ)(例えば、心臓、肺、腎臓、脳、皮膚、眼および／または消化器臓器などの体の様々な部位の炎症など)の出現についてモニターし得る。小児におけるＭＩＳの例示的症状は、発熱、腹痛、嘔吐、下痢、頸部痛、発疹、目の充血、過度の疲労感およびこれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。
ある実施態様において、上記の投与されるＲＮＡは、ここでＢＮＴ１６２ｂ１(ＲＢＰ０２０.３)、ＢＮＴ１６２ｂ２(ＲＢＰ０２０.１またはＲＢＰ０２０.２)として記載されるヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。ある実施態様において、上記の投与されるＲＮＡは、ここでＲＢＰ０２０.２として記載されるヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。
ある実施態様において、上記の投与されるＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２１のヌクレオチド配列、配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、上記の投与されるＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２１のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、上記の投与されるＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号１９または２０のヌクレオチド配列、配列番号１９または２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、上記の投与されるＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号１９または２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、上記の投与されるＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、上記の投与されるＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、投与されるＲＮＡは、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、１回あたり約３０μg量で投与される。ある実施態様において、このような用量の少なくとも２回が投与される。例えば、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡで処置する集団は、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳または少なくとも６５歳の対象を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡで処置する集団は、５５〜９０歳、６０〜８５歳または６５〜８５歳の対象を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。
ある実施態様において、複数回の投与間の期間は少なくとも７日、少なくとも１４日または少なくとも２１日である。ある実施態様において、複数回の投与間の期間は７日〜２８日、例えば１４日〜２３日である。
ある実施態様において、５回を超えない、４回を超えないまたは３回を超えないここに記載するＲＮＡが対象に投与され得る。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、医薬品の使用と関連する有害事象(ＡＥ)、すなわち、患者における何らかの医療上好ましくない事象、例えば、何らかの好ましくないおよび意図されない徴候、症状または疾患の発生が、医薬品と関連するものであれしないものであれ、程度が軽度または中程度であるように(例えば、用量、投与頻度および／または投与回数のレジメンで)投与される。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、有害事象(ＡＥ)が、例えば、パラセタモールまたは鎮痛、解熱(熱さまし)および／または抗炎症効果を提供する他の薬物、例えば、非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)、例えば、アスピリン、イブプロフェンおよびナプロキセンでの処置などでの介入により管理され得るように投与される。ＮＳＡＩＤには分類されないパラセタモールまたは「アセトアミノフェン」は弱い抗炎症効果を発揮し、本発明により鎮痛剤として投与され得る。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象におけるコロナウイルス、コロナウイルス感染またはコロナウイルスに関連する疾患または障害に対する中和効果を提供する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるコロナウイルスを遮断または中和する免疫応答を誘導する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるコロナウイルスを遮断または中和するＩｇＧ抗体などの抗体の産生を誘導する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＡＣＥ２へのコロナウイルスＳタンパク質の結合を遮断または中和する免疫応答を誘導する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＡＣＥ２へのコロナウイルスＳタンパク質の結合を遮断または中和する抗体の産生を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、少なくとも５００Ｕ／ml、１０００Ｕ／ml、２０００Ｕ／ml、３０００Ｕ／ml、４０００Ｕ／ml、５０００Ｕ／ml、１００００Ｕ／ml、１５０００Ｕ／ml、２００００Ｕ／ml、２５０００Ｕ／ml、３００００Ｕ／mlまたはそれ以上の幾何平均濃度(ＧＭＣ)のＩｇＧ抗体などのＲＢＤドメイン結合抗体を誘導する。ある実施態様において、ＲＢＤドメイン結合抗体のＧＭＣ上昇は、少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、１か月間、３か月間、６か月間、１２か月間またはそれ以上持続する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、少なくとも１００Ｕ／ml、２００Ｕ／ml、３００Ｕ／ml、４００Ｕ／ml、５００Ｕ／ml、１０００Ｕ／ml、１５００Ｕ／mlまたはそれ以上の幾何平均力価(ＧＭＴ)のＩｇＧ抗体などの中和抗体を誘導する。ある実施態様において、中和抗体のＧＭＴ上昇は少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、１か月間、３か月間、６か月間、１２か月間またはそれ以上持続する。
ここで使用する用語「中和」は、抗体などの結合剤が受容体結合タンパク質などのウイルスの生物学的活性部位に結合し、それにより細胞のウイルス感染を阻害する、事象をいう。コロナウイルス、特にコロナウイルスＳタンパク質に関して、ここで使用する用語「中和」は、抗体などの結合剤がＳタンパク質のＲＢＤドメインに結合し、それにより細胞のウイルス感染を阻害する、事象をいう。特に、用語「中和」は、結合剤が目的のウイルスの病原性(例えば細胞に感染する能力)を排除するまたは顕著に減少させる事象をいう。
抗原性暴露に応答して産生される免疫応答のタイプは、一般に応答に関与するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞のサブセットにより区別され得る。免疫応答は、広義にはＴｈ１およびＴｈ２の２タイプに分割され得る。Ｔｈ１免疫活性化はウイルスなどの細胞内感染のために最適化され、一方Ｔｈ２免疫応答は液性(抗体)応答のために最適化される。Ｔｈ１細胞は、インターロイキン２(ＩＬ−２)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦα)およびインターフェロンガンマ(ＩＦＮγ)を産生する。Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生する。Ｔｈ１免疫活性化は、多くの臨床的状況で最も高度に望まれる。Ｔｈ２または液性免疫応答誘発に特化したワクチン組成物は、一般に大部分のウイルス疾患に有効ではない。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＴｈ１介在免疫応答を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＴｈ１介在免疫応答で典型的なサイトカインプロファイルを誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるインターロイキン２(ＩＬ−２)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦα)および／またはインターフェロンガンマ(ＩＦＮγ)の産生を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるインターロイキン２(ＩＬ−２)およびインターフェロンガンマ(ＩＦＮγ)の産生を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＴｈ２介在免疫応答を誘導または促進しないまたはＴｈ１介在免疫応答の誘導または促進と比較して、顕著に低い程度で対象におけるＴｈ２介在免疫応答を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＴｈ２介在免疫応答で典型的なサイトカインプロファイルを誘導または促進しないまたはＴｈ１介在免疫応答で典型的なサイトカインプロファイルの誘導または促進と比較して、顕著に低い程度で対象におけるＴｈ２介在免疫応答で典型的なサイトカインプロファイルを誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１３の産生を誘導または促進しないまたは対象におけるインターロイキン２(ＩＬ−２)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦα)および／またはインターフェロンガンマ(ＩＦＮγ)の誘導または促進と比較して、顕著に低い程度で対象におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１３の産生を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、ＩＬ−４の産生を誘導または促進しないまたは対象におけるインターロイキン２(ＩＬ−２)およびインターフェロンガンマ(ＩＦＮγ)の誘導または促進と比較して、顕著に低い程度で対象におけるＩＬ−４の産生を誘導または促進する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象における、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどの異なるＳタンパク質バリアントのパネルを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、異なるＳタンパク質バリアントのパネルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上のＳタンパク質バリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、ＲＢＤドメインにアミノ酸修飾を有するバリアントおよび／またはＲＢＤドメイン外にアミノ酸修飾を有するバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３２１位(Ｑ)に対応するアミノ酸がＳであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３２１位(Ｑ)に対応するアミノ酸がＬであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３４１位(Ｖ)に対応するアミノ酸がＩであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３４８位(Ａ)に対応するアミノ酸がＴであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３５４位(Ｎ)に対応するアミノ酸がＤであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３５９位(Ｓ)に対応するアミノ酸がＮであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３６７位(Ｖ)に対応するアミノ酸がＦであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３７８位(Ｋ)に対応するアミノ酸がＳであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の３７８位(Ｋ)に対応するアミノ酸がＲであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４０８位(Ｒ)に対応するアミノ酸がＩであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４０９位(Ｑ)に対応するアミノ酸がＥであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４３５位(Ａ)に対応するアミノ酸がＳであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４３９位(Ｎ)に対応するアミノ酸がＫであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４５８位(Ｋ)に対応するアミノ酸がＲであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４７２位(Ｉ)に対応するアミノ酸がＶであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４７６位(Ｇ)に対応するアミノ酸がＳであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４７７位(Ｓ)に対応するアミノ酸がＮであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の４８３位(Ｖ)に対応するアミノ酸がＡであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の５０８位(Ｙ)がＨであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の５１９位(Ｈ)に対応するアミノ酸がＰであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸がＧであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象における、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応する位置に変異を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。
配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応する位置に変異を含む該Ｓタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)および２４４(Ｌ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、ＶＯＣ−２０２０１２／０１を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、５０１.Ｖ２を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置にこれら変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ−＞Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１の６９位(Ｈ)および７０位(Ｖ)に対応する位置に欠失を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)および７０位(Ｖ)に対応する位置に欠失を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)および１２２９(Ｍ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、ＶＯＣ−２０２０１２／０１を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、「Ｃｌｕｓｔｅｒ ５」を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置にこれら変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：欠失６９〜７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉおよび所望によりＳ１１４７Ｌ。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象における、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。
ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の次の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)および１２２９(Ｍ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、ＶＯＣ−２０２０１２／０１を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次のＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖおよび所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４に対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１の５０１位(Ｎ)および６１４位(Ｄ)に変異を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹであり、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。
ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)および６１４位(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の次の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)および１２２９(Ｍ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、ＶＯＣ−２０２０１２／０１を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の欠失６９〜７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈに対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次のＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖおよび所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４に対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象における、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応する位置に変異を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。
ある実施態様において、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の次の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、４１７(Ｋ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。ある実施態様において、配列番号１の６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、５０１.Ｖ２を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ−＞Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、「Ｂ.１.１.２８」を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、「Ｂ.１.１.２４８」を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１の５０１位(Ｎ)および４８４位(Ｅ)に変異を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹであり、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。
ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)および４８４位(Ｅ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の次の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、４１７(Ｋ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。ある実施態様において、配列番号１の６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、５０１.Ｖ２を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ−＞Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、「Ｂ.１.１.２４８」を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１の５０１位(Ｎ)、４８４位(Ｅ)および６１４(Ｄ)に変異を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹであり、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫであり、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。
ある実施態様において、配列番号１の位置５０１位(Ｎ)、４８４位(Ｅ)および６１４位(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の次の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、４１７(Ｋ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。ある実施態様において、配列番号１の６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２〜２４４。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１の２４２位(Ｌ)、２４３位(Ａ)および２４４位(Ｌ)に対応する位置に欠失を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)、２４３位(Ａ)および２４４位(Ｌ)に対応する位置に欠失を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の次の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、４１７(Ｋ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。ある実施態様において、配列番号１の６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、５０１.Ｖ２を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１Ｖおよび欠失２４２〜２４４および所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６ＩおよびＫ４１７Ｎ。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ−＞Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象における、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応する位置に変異を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。
ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の次の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、５０１.Ｖ２を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２〜２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ−＞Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、「Ｂ.１.１.２４８」を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１の４１７位(Ｋ)および４８４位(Ｅ)および／または５０１(Ｎ)に変異を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮであり、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫであるおよび／または配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴであり、配列番号１の４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫであるおよび／または配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。
ある実施態様において、配列番号１の４１７位(Ｋ)および４８４位(Ｅ)および／または５０１位(Ｎ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、１以上のさらなる変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１の次の６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)の位置に対応する位置の変異から選択され得る。ある実施態様において、配列番号１の６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１の６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１の８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１の２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１の７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸が欠失される。ある実施態様において、配列番号１の４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１の６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１の１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１の１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１の２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１の６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１の１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１の１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、５０１.Ｖ２を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望によりＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２〜２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ−＞Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、「Ｂ.１.１.２４８」を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象において、配列番号１における次の対応する位置に次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ここで使用する用語「・・・位に対応するアミノ酸」は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、特に配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置番号に対応するアミノ酸位置番号をいう。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアントなどの他のコロナウイルスＳタンパク質バリアントにおける対応するアミノ酸位置は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、特に配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにより判明し得る。配列または配列のセグメントをアラインし、それにより本発明によるアミノ酸位置に対する配列における対応する位置を決定する方法は当分野で周知であると考えられる。ALIGN、ClustalWまたは類似のものなどの標準配列アラインメントプログラムが、一般にデフォルト設定で使用され得る。
ある実施態様において、抗体応答により標的とされる種々のＳタンパク質バリアントのパネルは、上記Ｑ３２１Ｓ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｓ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９ＰおよびＤ６１４Ｇバリアントからなる群から選択される少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上のＳタンパク質バリアントを含む。ある実施態様において、抗体応答により標的とされる種々のＳタンパク質バリアントのパネルは、上記Ｑ３２１Ｓ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｓ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９ＰおよびＤ６１４Ｇバリアントからなる群からの全Ｓタンパク質バリアントを含む。
ある実施態様において、抗体応答により標的とされる種々のＳタンパク質バリアントのパネルは、上記Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９ＰおよびＤ６１４Ｇバリアントからなる群から選択される少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上のＳタンパク質バリアントを含む。ある実施態様において、抗体応答により標的とされる種々のＳタンパク質バリアントのパネルは、上記Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９ＰおよびＤ６１４Ｇバリアントからなる群からの全Ｓタンパク質バリアントを含む。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントについてここに記載した変異の１以上を含む。ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応する位置に変異を含む。ある実施態様において、配列番号１の５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、ＶＯＣ−２０２０１２／０１、５０１.Ｖ２、Ｃｌｕｓｔｅｒ ５およびＢ.１.１.２４８からなる群から選択されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２バリアントのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の全変異などの１以上の変異を含む。ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１の８０位にアラニン置換、２１５位にグリシン置換、４８４位にリシン置換、５０１位にチロシン置換、７０１位にバリン置換、１８位にフェニルアラニン置換、２４６位にイソロイシン置換、４１７位にアスパラギン置換、６１４位にグリシン置換、２４２〜２４４位に欠失をならびに９８７位および９８６位にプロリン置換を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、細胞介在免疫応答(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答)を誘導する。ある実施態様において、Ｔ細胞は、LPFNDGVYF、GVYFASTEK、YLQPRTFLL、QPTESIVRF、CVADYSVLY、KCYGVSPTK、NYNYLYRLF、FQPTNGVGY、IPFAMQMAY、RLQSLQTYV、GTHWFVTQR、VYDPLQPEL、QYIKWPWYIおよびKWPWYIWLGFからなる群から選択される１以上のエピトープ(例えば、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープ)を認識する。ある実施態様において、エピトープYLQPRTFLLを認識するＴ細胞が誘導される。ある実施態様において、エピトープNYNYLYRLFを認識するＴ細胞が誘導される。ある実施態様において、エピトープQYIKWPWYIを認識するＴ細胞が誘導される。ある実施態様において、エピトープKCYGVSPTKを認識するＴ細胞が誘導される。ある実施態様において、エピトープRLQSLQTYVを認識するＴ細胞が誘導される。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、Ｔ細胞のこのような誘導を達成するレジメンにより投与される。
ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、例えば、２回のここに記載するＲＮＡ投与後(ここで、２回目の投与は、１回目の投与後約２１日で投与され得る)、１５週以降、１６週以降、１７週以降、１８週以降、１９週以降、２０週以降、２１週以降、２２週以降、２３週以降、２４週以降または２５週以降検出可能な細胞介在免疫応答(例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答)を誘導する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、細胞介在免疫応答のこのような誘導を達成するレジメンにより投与される。
ある実施態様において、例えば、ここに記載する量およびレジメンで例えば、２１日離して、投与される、例えば、１回あたり３０μgの２回投与で、投与され得る、ここに記載するＲＮＡを使用する、ここに記載するコロナウイルスに対するワクチン接種は、一定期間後、例えば、コロナウイルス感染に対する保護の減少が観察されたら、最初のワクチン接種に使用したのと同じまたは異なるワクチンを使用して繰り返し得る。このようなある期間は少なくとも６か月、１年、２年などであり得る。ある実施態様において、最初のワクチン接種に使用したとの同じＲＮＡが２回目またはさらなるワクチン接種で使用されるが、低用量または低投与頻度である。例えば、最初のワクチン接種は投与あたり約３０μgの用量を使用するワクチン接種を含んでよく、ここで、ある実施態様において、このような用量の少なくとも２回が投与され(例えば、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得る)、２回目またはさらなるワクチン接種は投与あたり約３０μgより少ない用量を使用するワクチン接種を含んでよく、ここで、ある実施態様において、このような用量の一つのみが投与される。ある実施態様において、最初のワクチン接種で使用されたのと異なるＲＮＡが２回目またはさらなるワクチン接種で使用され、例えば、ＢＮＴ１６２ｂ２が最初のワクチン接種について使用され、ＢＮＴ１６２Ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ３が２回目またはさらなるワクチン接種で使用される。
ある実施態様において、ワクチン接種レジメンは、少なくとも２回のここに記載のＲＮＡ、例えば、２回のここに記載のＲＮＡ(ここで、２回目の投与は１回目の投与後約２１後に投与し得る)を使用する第１のワクチン接種および単回投与または複数回投与、例えば、２回のここに記載のＲＮＡを使用する第２のワクチン接種を含む。種々の実施態様において、第２のワクチン接種を、第１のワクチン接種、例えば、最初の２回投与レジメンの投与３〜２４か月、６〜１８か月、６〜１２か月または５〜７か月後に投与する。第２のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量は、第１のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量と異なっても等しくてもよい。ある実施態様において、第２のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量は第１のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量に等しい。ある実施態様において、第２のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量および第１のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量は約３０μg／回である。ある実施態様において、第１のワクチン接種に使用したのと同じＲＮＡを第２のワクチン接種に使用する。ある実施態様において、第１のワクチン接種および第２のワクチン接種で使用するＲＮＡはＢＮＴ１６２ｂ２である。ある実施態様において、第１のワクチン接種で使用したのと異なるＲＮＡが第２のワクチン接種で使用される。ある実施態様において、第１のワクチン接種で使用されるＲＮＡはＢＮＴ１６２ｂ２であり、第２のワクチン接種で使用されるＲＮＡは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２バリアント株、例えば、ここに記載する株のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質をコードするＲＮＡである。ある実施態様において、第１のワクチン接種で使用されるＲＮＡはＢＮＴ１６２ｂ２であり、第２のワクチン接種で使用されるＲＮＡは、第２のワクチン接種時優性なまたは迅速に広がっているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２バリアント株のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質をコードするＲＮＡである。ある実施態様において、第１のワクチン接種で使用されるＲＮＡはＢＮＴ１６２ｂ２であり、第２のワクチン接種で使用されるＲＮＡは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントについてここに記載する変異の１以上を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードする、ＲＮＡである。ある実施態様において、第１のワクチン接種で使用されるＲＮＡはＢＮＴ１６２ｂ２であり、第２のワクチン接種で使用されるＲＮＡは、ＶＯＣ−２０２０１２／０１、５０１.Ｖ２、Ｃｌｕｓｔｅｒ ５およびＢ.１.１.２４８からなる群から選択されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２バリアントのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の１以上の変異、例えば全変異を含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡである。ある実施態様において、第１のワクチン接種で使用されるＲＮＡは、配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、第２のワクチン接種で使用されるＲＮＡは、配列番号１の８０位にアラニン置換、２１５位にグリシン置換、４８４位にリシン置換、５０１位にチロシン置換、７０１位にバリン置換、１８位にフェニルアラニン置換、２４６位にイソロイシン置換、４１７位にアスパラギン置換、６１４位にグリシン置換、２４２〜２４４位に欠失ならびに９８６位および９８７位にプロリン置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＲＮＡである。
ある実施態様において、ワクチン接種レジメンは、約２１日離して投与する、配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＲＮＡの２用量を使用する第１のワクチン接種および第１のワクチン接種、すなわち、最初の２回投与レジメン、約６〜１２か月後、配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＲＮＡの単回投与または複数回投与を使用する第２のワクチン接種を含む。ある実施態様において、各ＲＮＡ用量は、３０μg ＲＮＡを含む。
ある実施態様において、ワクチン接種レジメンは、約２１日離して投与する、配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＲＮＡの２用量を使用する第１のワクチン接種および第１のワクチン接種、すなわち、最初の２回投与レジメン、約６〜１２か月後、配列番号１の８０位にアラニン置換、２１５位にグリシン置換、４８４位にリシン置換、５０１位にチロシン置換、７０１位にバリン置換、１８位にフェニルアラニン置換、２４６位にイソロイシン置換、４１７位にアスパラギン置換、６１４位にグリシン置換、２４２〜２４４位に欠失ならびに９８６位および９８７位にプロリン置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＲＮＡの単回投与または複数回投与を使用する第２のワクチン接種を含む。ある実施態様において、各ＲＮＡ用量は、３０μg ＲＮＡを含む。
ある実施態様において、第２のワクチン接種は、免疫応答のブースト(boost)をもたらす。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡは他のワクチンと共投与される。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物はインフルエンザワクチンと共投与される。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物および他の注射用ワクチンは別の時点で投与される。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物は他の注射用ワクチンと同時に投与される。あるこのような実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物および少なくとも１個の他の注射用ワクチンは異なる注射部位に投与される。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物を同じシリンジで何らかの他のワクチンと混合しない。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物は、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するワクチン接種の一部として他のコロナウイルスワクチンと組み合わせない。
用語「疾患」は、個体の体に影響する異常状態をいう。疾患は、しばしば特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染性疾患などもともと外部起源からの因子により引き起こされる得るかまたは自己免疫性疾患など内部機能不全により引き起こされ得る。ヒトにおいて、「疾患」は、しばしば罹患している個体の疼痛、機能不全、窮迫、社会問題もしくは死亡または該個体と接している者に類似の問題を引き起こすあらゆる状態を指すようにより広義に使用される。この広義では、傷害、能力障害、障害、症候群、感染症、単発症状、異常な挙動ならびに構造および機能の異型のバリエーションを含むこともあるが、他の状況および他の目的で、これらは識別可能なカテゴリーと考えられ得る。疾患は、通常、多くの疾患の罹患および疾患を有しながらの生活が、人生観および人格を変え得るため、個体に身体的だけでなく、感情的にも影響する。
本発明において、用語「処置」、「処置する」または「治療的介入」は、疾患または障害などの状態と戦うことを目的とする、対象の管理およびケアに関する。本用語は、症状または合併症の軽減、疾患、障害または状態の進行遅延、症状および合併症の軽減または緩和および／または疾患、障害または状態の治癒または排除ならびに状態の予防のための治療上有効な化合物の投与など、対象が有しているある状態のための処置の全スペクトラムを含むことを意図し、ここで、予防は、疾患、状態または障害と戦うことを目的とする個体の管理およびケアとして理解され、症状または合併症の発症を予防するための活性化合物の投与を含む。
用語「治療的処置」は、個体の健康状態を改善するおよび／または寿命を延長(増加)させる、あらゆる処置に関する。該処置は、個体の疾患の排除、個体における疾患進展の停止または減速、個体における疾患進展の阻止または減速、個体における症状の頻度または重症度の低減および／または疾患を現在有するまたは先に有していた個体における再発低減であり得る。
用語「予防的処置」または「防止的処置」は、個体での疾患の発症を予防することを意図する、あらゆる処置に関する。用語「予防的処置」または「防止的処置」は、ここで、相互交換可能に使用される。
用語「個体」および「対象」は、ここで、相互交換可能に使用される。これらは疾患または障害を有し得るまたは感受性があるが、該疾患または障害を有しても有していなくてもよいヒトまたは他の哺乳動物(例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類)をいう。多くの実施態様において、個体はヒトである。特に断らない限り、用語「個体」および「対象」は特定の齢を意味せず、故に成人、高齢者、小児および新生児を含む。ある実施態様において、用語「対象」は、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳またはそれ以上のヒトを含む。ある実施態様において、用語「対象」は、少なくとも６５歳、例えば６５〜８０歳、６５〜７５歳または６５〜７０歳のヒトを含む。本発明の実施態様において、「個体」または「対象」は「患者」である。
用語「患者」は、処置を意図する個体または対象、特に罹患個体または対象を意味する。
本発明のある実施態様において、コロナウイルスに対する免疫応答の提供およびコロナウイルス感染の予防または処置が目標である。
あるエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡを含む医薬組成物を、対象における該エピトープを含む抗原に対する免疫応答を誘導するために対象に投与でき、これは治療的または部分的にもしくは完全に予防的であり得る。当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の一つは、疾患に対する免疫防御的反応が、処置する疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープで対象を免疫化することにより生じるとの事実に基づくことを知っている。従って、ここに記載する医薬組成物は、免疫応答の誘導または増強のために適用可能である。ここに記載する医薬組成物は、故に、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。
ここで使用する「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体的応答をいい、細胞性免疫応答および／または液性免疫応答をいう。免疫系は、脊椎動物のより原始的な自然免疫系および獲得または適応免疫系に分けられ、その各々液性および細胞性成分を含む。
「細胞介在免疫」、「細胞性免疫」、「細胞性免疫応答」または類似の用語は、抗原の発現により特徴づけられる、特にクラスＩまたはクラスII ＭＨＣを伴う抗原の提示により特徴づけられる、細胞に向けられた細胞性応答を含むことを意味する。細胞性応答は、免疫エフェクター細胞、特に「ヘルパー」または「キラー」として作用するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称する)は、免疫応答の制御に中心的役割を有し、キラー細胞(細胞毒性Ｔ細胞、細胞溶解Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される)は、ウイルス感染細胞などの罹患細胞を殺し、さらなる罹患細胞の発生を予防する。
免疫エフェクター細胞は、ワクチン抗原に応答するあらゆる細胞を含む。このような応答性は、活性化、分化、増殖、生存および／または１以上の免疫エフェクター機能の指標を含む。細胞は、特に、溶解能を有する細胞、特にリンパ系細胞を含み、好ましくはＴ細胞、特に、好ましくは細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞およびリンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞から選択される、細胞毒性リンパ球である。活性化により、これら細胞毒性リンパ球の各々は標的細胞の破壊を誘発する。例えば、細胞毒性Ｔ細胞は、次の手段の何れかまたは両方により標的細胞の破壊を誘発する。まず、活性化により、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイムおよびグラニュライシンなどの細胞毒を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは標的細胞に細孔を作り、グランザイムが細胞に入り、細胞質でカスパーゼカスケードを誘発し、細胞のアポトーシス(プログラム細胞死)を誘導する。第二に、アポトーシスは、Ｔ細胞と標的細胞間のＦａｓ−Ｆａｓリガンド相互作用により誘導され得る。
本発明において用語「エフェクター機能」は、例えば、ウイルスなどの病原因子の中和および／またはウイルス感染細胞などの罹患細胞の死滅をもたらす、免疫系の成分が介在するあらゆる機能を含む。ある実施態様において、本発明のエフェクター機能は、Ｔ細胞介在エフェクター機能である。このような機能は、ヘルパーＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)の場合、サイトカインの放出および／またはＣＤ８＋リンパ球(ＣＴＬ)および／またはＢ細胞の活性化、ＣＴＬの場合、例えば、アポトーシスまたはパーフォリン介在細胞溶解による細胞、すなわち、抗原の発現により特徴づけられる細胞の排出、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生および抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。
本発明において用語「免疫エフェクター細胞」または「免疫反応性細胞」は、免疫反応中エフェクター機能を発揮する細胞に関する。ある実施態様において、「免疫エフェクター細胞」は、細胞上にＭＨＣの状況で提示されるまたは細胞表面に発現され、免疫応答に介在する抗原などの抗原と結合できる。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞(細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞)、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞を含む。本発明において、好ましくは「免疫エフェクター細胞」はＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。本発明により、用語「免疫エフェクター細胞」は、適当な刺激で免疫細胞(例えばＴ細胞、特にＴヘルパー細胞または細胞溶解Ｔ細胞)に成熟できる細胞も含む。免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未成熟および成熟Ｔ細胞および未成熟および成熟Ｂ細胞を含む。抗原に暴露されたときのＴ細胞前駆体の細胞溶解Ｔ細胞への分化は、免疫系のクローン選択に類似する。
「リンパ系細胞」は、細胞性免疫応答などの免疫応答を産生できる細胞またはこのような細胞の前駆細胞であり、リンパ球、好ましくはＴリンパ球、リンパ芽球および形質細胞を含む。リンパ系細胞は、ここに記載する免疫エフェクター細胞であり得る。好ましいリンパ系細胞は、Ｔ細胞である。
用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」はここでは相互交換可能に使用され、Ｔヘルパー細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)および細胞溶解Ｔ細胞を含む細胞毒性Ｔ細胞(ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞)を含む。用語「抗原特異的Ｔ細胞」または類似の用語は、該Ｔ細胞が標的とし、好ましくはＴ細胞のエフェクター機能が発揮される、抗原を認識するＴ細胞に関する。
Ｔ細胞は、リンパ球として知られる白血球細胞群に属し、細胞介在免疫に中心的役割を有する。Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球タイプと、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)と称される細胞表面上の特殊な受容体の存在により区別され得る。胸腺は、Ｔ細胞の成熟を担う主要な臓器である。Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、各々別個の機能を有する。
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中で、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫過程における他の白血球細胞を助ける。これらの細胞は、表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞(ＡＰＣ)表面に発現されるＭＨＣクラスII分子により、ペプチド抗原と共に提示されたとき、活性化される。活性化されたら、迅速に分裂し、活性免疫応答を制御または支援するサイトカインと称される小タンパク質を分泌する。
細胞毒性Ｔ細胞は、ウイルスに感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。これらの細胞は、表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、体のほぼ全ての細胞の表面に提示されるＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することにより標的を認識する。
大部分のＴ細胞は、数タンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を有する。Ｔ細胞のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)分子に結合し、標的細胞表面に提示される、免疫原性ペプチド(エピトープ)と相互作用できる。ＴＣＲの特異的結合は、Ｔ細胞内でシグナルカスケードを誘発し、増殖および成熟エフェクターＴ細胞への分化に至る。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ(ＴＣＲαおよびＴＣＲβ)遺伝子から産生され、α−およびβ−ＴＣＲ鎖と称される２つの別々のペプチド鎖からなる。γδ Ｔ細胞(ガンマデルタＴ細胞)は、表面に別個のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を有するＴ細胞の小サブセットを表す。しかしながら、γδ Ｔ細胞において、ＴＣＲは１つのγ鎖および１つのδ鎖からなる。このＴ細胞群は、αβ Ｔ細胞ほど一般的ではない(総Ｔ細胞の２％)。
「液性免疫」または「液性免疫応答」は、分泌型抗体、補体タンパク質およびある抗微生物ペプチドなどの細胞外流体でみられる巨大分子が介在する免疫の側面である。細胞介在免疫と対照的である。抗体を含むその側面は、しばしば抗体介在免疫と呼ばれる。
液性免疫は、Ｔｈ２活性化およびサイトカイン産生、胚中心形成およびアイソタイプスイッチング、親和性成熟および記憶細胞産生を含む、抗体産生およびそれに付随するアクセサリー過程をいう。これは病原体中和、古典的補体活性化ならびに食作用および病原体排出のオプソニン促進を含む、抗体のエフェクター機能とも称される。
液性免疫応答において、まず、Ｂ細胞が骨髄で成熟し、細胞表面で多数提示されるＢ細胞受容体(ＢＣＲ)が獲得される。これらの膜結合タンパク質複合体は、抗原検出に特異的な抗体である。各Ｂ細胞は、抗原と結合する特有の抗体を有する。成熟Ｂ細胞は骨髄からリンパ節または他のリンパ性臓器に遊走し、そこで、病原体と遭遇し始める。Ｂ細胞が抗原に遭遇したとき、抗原は受容体に結合し、エンドサイトーシスによりＢ細胞内部に取り込まれる。抗原はまたＭＨＣ−IIタンパク質により処理され、Ｂ細胞の表面に提示される。Ｂ細胞はヘルパーＴ細胞(ＴＨ)が複合体と結合するのを待つ。この結合はＴＨ細胞を活性化し、次いで、サイトカインを放出し、Ｂ細胞の迅速な分裂を誘導し、Ｂ細胞の多数の同一クローンを産生する。これらの娘細胞は形質細胞または記憶細胞となる。記憶Ｂ細胞はここでは不活性のままである；後に、これら記憶Ｂ細胞が再感染により同じ抗原に遭遇したとき、分裂し、形質細胞を形成する。他方で、形質細胞は多数の抗体を産生し、これは、循環系に自由に放出される。これらの抗体は抗原と遭遇し、それらと結合する。これは、宿主と外来細胞の化学的相互作用を妨害するか、適切な機能を邪魔する抗原性部位間に架橋を形成でき、またはそれらの存在はそれらを攻撃および貪食するようにマクロファージまたはキラー細胞を誘引する。
用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む、免疫グロブリンを含む。各重鎖は重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順番で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃｌｑ)を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。抗体は抗原と結合、好ましくは特異的に結合する。
Ｂ細胞により発現される抗体は、ＢＣＲ(Ｂ細胞受容体)または抗原受容体と称されることがある。タンパク質のこのクラスに含まれる５メンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、消化器分泌物ならびに呼吸器および泌尿生殖器管の粘液分泌物などの身体分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、大部分の対象の一次免疫応答で産生される主免疫グロブリンである。凝集、補体固定および他の抗体応答に最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは、抗体機能が知られていないが、抗原受容体として役立ち得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの暴露により肥満細胞および好塩基球からメディエーターを放出させることにより、即時過敏症に介在する免疫グロブリンである。
ここで使用する「抗体重鎖」は、天然に存在する高次構造の抗体分子に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいう。
ここで使用する「抗体軽鎖」は、天然に存在する高次構造の抗体分子に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいい、κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
本発明は、保護的、防止的、予防的および／または治療的であり得る免疫応答を意図する。ここで使用する「免疫応答の誘導[または誘導する]」は、特定の抗原に対する免疫応答が誘導に存在しなかったことを示し、または誘導前特定の抗原に対する免疫応答が基底レベルで存在し、それが誘導後増強されたことを示し得る。それ故に、「免疫応答の誘導[または誘導する]」は、「免疫応答の増強[または増強する]」を含む。
用語「免疫療法」は、免疫応答の誘導または増強による疾患または状態の処置に関する。用語「免疫療法」は、抗原免疫化または抗原ワクチン接種を含む。
用語「免疫化」または「ワクチン接種」は、例えば、治療的または予防的理由のために、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与する過程をいう。
用語「マクロファージ」は、単球の分化により産生される貪食細胞のサブグループをいう。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物により活性化されるマクロファージは外来病原体を非特異的に貪食し、病原体を分解させる加水分解性および酸化的攻撃により、マクロファージ内で殺す。分解タンパク質からのペプチドがマクロファージ細胞表面で提示され、そこで、Ｔ細胞により認識され得て、Ｂ細胞表面上の抗体と直接相互作用でき、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化ならびに免疫応答のさらなる刺激をもたらす。マクロファージは、抗原提示細胞のクラスに属する。ある実施態様において、マクロファージは脾マクロファージである。
用語「樹状細胞」(ＤＣ)は、抗原提示細胞のクラスに属する貪食細胞の他のサブタイプをいう。ある実施態様において、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞はまず未成熟樹状細胞に形質転換される。これらの未成熟細胞は、高食作用性活性および低Ｔ細胞活性化能により特徴づけられる。未成熟樹状細胞は、常にウイルスおよび細菌などの病原体について周囲環境をサンプリングする。それらが提示可能抗原と遭遇したら、成熟樹状細胞に活性化され、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、タンパク質を小片に分解し、成熟したらこれらフラグメントをＭＨＣ分子を使用して細胞表面に提示させる。同時に、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として作用する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化させる能力が大きく増強される。それらはまた樹状細胞を血流を介する脾臓へのまたはリンパ系を介するリンパ節への移動を誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７も上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルと並行して、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を、それらに抗原を提示することにより活性化させる。故に、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞関連免疫応答を能動的に誘導できる。ある実施態様において、樹状細胞は脾樹状細胞である。
用語「抗原提示細胞」(ＡＰＣ)は、細胞表面上(または表面で)少なくとも１個の抗原または抗原性フラグメントを表示、獲得および／または提示できる多様な細胞の細胞をいう。抗原提示細胞は専門抗原提示細胞と非専門抗原提示細胞に分けられ得る。
用語「専門抗原提示細胞」は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスII(ＭＨＣクラスII)分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上でＭＨＣクラスII分子複合体と相互作用するならば、抗原提示細胞はＴ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。専門抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
用語「非専門抗原提示細胞」は、ＭＨＣクラスII分子を構成的に発現しないが、インターフェロン−ガンマなどのあるサイトカインにより刺激されたときに発現する抗原提示細胞に関する。例示的、非専門抗原提示細胞は、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞を含む。
「抗原処理」は、抗原の、該抗原のフラグメントである進行産物への分解(例えば、タンパク質のペプチドへの分解)および特異的Ｔ細胞への抗原提示細胞などの細胞による提示のためのＭＨＣ分子とこれらのフラグメントの１以上の(例えば、結合による)会合をいう。
用語「抗原が関与する疾患」は、抗原が関与するあらゆる疾患、例えば抗原の存在により特徴づけられる疾患をいう。抗原が関与する疾患は感染性疾患であり得る。上記のとおり、抗原はウイルス抗原などの疾患関連抗原であり得る。ある実施態様において、抗原が関与する疾患は、好ましくは、細胞表面に抗原を発現する細胞が関与する疾患である。
用語「感染性疾患」は、個体間または生物間で伝染し得て、微生物病原体により引き起こされるあらゆる疾患(例えば感冒)をいう。感染症は当分野で知られ、例えば、それぞれウイルス、細菌および寄生虫が原因であるウイルス性疾患、細菌性疾患または寄生虫性疾患を含む。これに関連して、感染性疾患は、例えば、肝炎、性行為感染症(例えばクラミジアまたは淋病)、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群(ＳＡＲＳ)、鳥インフルエンザおよびインフルエンザであり得る。
ある例示的実施態様は次のとおりである。
１. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対して免疫化する方法であって：
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチドの少なくともエピトープをコードする脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物を、７日以内に血清で該エピトープに対する検出可能な抗体力価の達成が確立されたレジメンにより投与することを含み、該レジメンが少なくとも１回の組成物の投与を含む、方法。
２. レジメンが組成物の少なくとも２回投与を含む、実施態様１の方法。
３. レジメンが組成物の少なくとも２回投与からなる、実施態様１の方法。
４. 最初の投与がその後の１以上の投与と異なる量である、実施態様２または実施態様３の方法。
５. 最初の投与が、その後の投与の一定期間前に投与され、該期間が少なくとも１週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年またはそれ以上である、実施態様１または実施態様４の方法。
６. レジメンが成人の適切な集団に投与したとき有害事象の発生率が６０％未満であることが確立されているものである、実施態様１〜６の何れかの方法。
７. レジメンが中程度を超える重症度の局所注射部位反応を約１／７５より大きな発生率で誘発しないことが確立されているものである、実施態様６の方法。
８. 各用量が、例えば、５０μgを超えない、４０μgを超えない、３０μgを超えない、２０μgを超えない、１０μgを超えない、５μgを超えない、２.５μgを超えない、１μgを超えない用量を含む、６０μgを超えないまたはそれ以下である、実施態様１〜７の何れかの方法。
９. 各用量が、例えば、少なくとも２μg、少なくとも５μg、少なくとも１０μg、少なくとも２０μg、少なくとも３０μg、少なくとも４０μgまたはそれ以上を含む少なくとも１μgまたはそれ以上である、実施態様１〜８の何れかの方法。
１０. 脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含む、方法であって、ここで、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードし、ここで、組成物は対象にＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ Ｓ−タンパク質特異的免疫応答を誘発する有効量で投与され、ここで、有効量は、対照組成物(例えば、対照ＲＮＡワクチンまたは組成物)と比較して少なくとも２倍(例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍を含む)低用量で対象に殺菌免疫を提供するのに十分である、方法。
１１. 脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含む、方法であって、ここで、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードし、ここで、組成物は、ＳＡＲＳ−ＣＯＶ２への暴露後２日またはそれ以上(例えば、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日またはそれ以上を含む)で、対照に対して、対象に少なくとも８０％のウイルス負荷減少に有効量で投与され、ここで、対照は対照組成物(例えば、対照ＲＮＡワクチンまたは組成物)を投与された対象におけるウイルス負荷である、方法。
１２. 脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含む、方法であって、ここで、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードし、ここで、組成物は対象にＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ Ｓ−タンパク質特異的免疫応答を誘発する有効量で投与され、ここで、ＲＮＡワクチンの有効性が非ワクチン接種対照対象に対して少なくとも８０％である、方法。
１３. 有効量が投与１〜７２時間後に対象の血清で測定して検出可能なレベルのＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを生じるのに十分である、実施態様１０〜１２の何れかの方法。
１４. 有効量が、投与１〜７２時間後の対象の血清で測定してＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ Ｓタンパク質に対する中和抗体により産生される１,０００〜１０,０００中和力価を産生するのに十分である、実施態様１０〜１２の何れかの方法。
１５. 対象で産生される抗ＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ Ｓタンパク質抗体力価が対照と比較して少なくとも１log増加され、ここで、対照はＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２に対するワクチンを投与されていない対象において産生される抗ＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ Ｓタンパク質抗体力価である、実施態様１０〜１４の何れかの方法。
１６. 対象で産生される抗ＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ Ｓタンパク質抗体力価が対照と比較して少なくとも２倍増加され、ここで、対照はＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２に対するワクチンを投与されていない対象において産生される抗ＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ Ｓタンパク質抗体力価である、実施態様１０〜１５の何れかの方法。
１７. 投与が筋肉内注射により実施される、実施態様１〜１６の何れかの方法。
１８. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がコードするポリペプチドの少なくともエピトープをコードする脂質ナノ粒子封入ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)を含む免疫原性組成物であって、該ワクチン組成物が少なくとも１回のワクチン組成物の投与を含むレジメンにより成人対象集団に投与後７日以内に血清における該エピトープに対する検出可能な抗体力価を達成することが確立されているものである、免疫原性組成物。
１９. ＲＮＡにおけるウリジンの少なくとも８０％が化学修飾されている、実施態様１８の免疫原性組成物。
２０. ＲＮＡにおけるウリジン１００％が化学修飾されている、実施態様１８または１９の免疫原性組成物。
２１. ５’末端キャップが７ｍＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ＮｌｍｐＮｐである、実施態様１８〜２０の何れかの免疫原性組成物。
２２. 組成物の脂質ナノ粒子がカチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む、実施態様１８〜２１の何れかの免疫原性組成物。
２３. 組成物の脂質ナノ粒子がモル比で約２０〜６０％カチオン性脂質、０.５〜１５％ＰＥＧ修飾脂質、２５〜５５％ステロールおよび５〜２５％非カチオン性脂質を含む、実施態様１８〜２２の何れかの免疫原性組成物。
２４. カチオン性脂質がイオン化可能カチオン性脂質であり、非カチオン性脂質が中性脂質であり、ステロールがコレステロールである、実施態様２２または２３の免疫原性組成物。
２５. カチオン性脂質が２,２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−[１,３]−ジオキソラン(ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ)、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート(ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ)およびジ((Ｚ)−ノナ−２−エン−１−イル) ９−((４−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエートからなる群から選択される、実施態様２２または２３の何れかの免疫原性組成物。
２６. ＲＮＡが５’末端キャップおよび化学修飾を含み、ＲＮＡが脂質ナノ粒子として製剤化されているまたは製剤化される、実施態様１８〜２５の何れかの免疫原性組成物。
２７. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントがシグナルペプチドに結合される、実施態様１８〜２６の何れかの免疫原性組成物。
２８. シグナルペプチドがＨｕＩｇＧｋシグナルペプチド(METPAQLLFLLLLWLPDTTG)；ＩｇＥ重鎖イプシロン−１シグナルペプチド(MDWTWILFLVAAATRVHS)；日本脳炎ＰＲＭシグナル配列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS)およびＶＳＶｇタンパク質シグナル配列(MKCLLYLAFLFIGVNCA)からなる群から選択される、実施態様２７の免疫原性組成物。
２９. インビボでＴ細胞を活性化することにより対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に脂質ナノ粒子封入修飾ヌクレオシドｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、ここで、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードし、それにより対象においてＳＡＲＳ−ＣＯＶ２による感染に対してＴ細胞がインビボで活性化されるものである、方法。
３０. 対象においてＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に脂質ナノ粒子封入修飾ヌクレオシドｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、ここで、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードし、ここで、組成物は対応する非修飾ｍＲＮＡを含む組成物と比較して増加したＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ポリペプチドまたはそのフラグメントの産生を誘導するものである、方法。
３１. 対象においてＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に脂質ナノ粒子封入修飾ヌクレオシドｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、ここで、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードし、ここで、組成物は、対応する非修飾ｍＲＮＡを含む組成物と比較して増加した抗体力価を誘導するものである、方法。
３２. 対象においてＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２に対する免疫応答を誘導する方法であって、脂質ナノ粒子封入修飾ヌクレオシドｍＲＮＡを含む組成物を対象に少なくとも１回投与することを含み、ここで、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードし、ここで、組成物は、組成物の投与前のＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２に対する抗体力価と比較して、増加した抗体力価を最初の投与７日後対象で誘発するものである、方法。
３３. 対象においてＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２に対する免疫応答を誘導する方法であって、脂質ナノ粒子封入修飾ヌクレオシドｍＲＮＡを含む組成物を対象に少なくとも１回投与することを含み、ここで、ｍＲＮＡはＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードし、ここで、組成物は、対応する非修飾ｍＲＮＡを含む組成物と比較して、増加した抗体力価を最初の投与７日後対象で誘発するものである、方法。
３４. ｍＲＮＡが９０％以上の純度で存在する、実施態様２９〜３３の何れかの方法。
３５. 組成物がＳＡＲＳ−ＣＯＶ２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントをコードする非修飾ＲＮＡをさらに含まない、実施態様２９〜３４の何れかの方法。
３６. 組成物が少なくとも２回投与され、最初の投与と２回目の投与が少なくとも７日離される、実施態様２９〜３５の何れかの方法。
３７. 対象がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染のリスクがある、実施態様２９〜３６の何れかの方法。
３８. 対象が心血管疾患の処置を受けている、実施態様２９〜３７の何れかの方法。
３９. 対象が糖尿病の処置を受けている、実施態様２９〜３７の何れかの方法。
４０. 対象が慢性心肺疾患の処置を受けている、実施態様２９〜３７の何れかの方法。
４１. 対象が慢性腎疾患の処置を受けている、実施態様２９〜３７の何れかの方法。
４２. 免疫応答が少なくとも約３０日間持続する、実施態様２９〜４１の何れかの方法。
４３. 免疫応答が少なくとも約６０日間持続する、実施態様２９〜４２の何れかの方法。
４４. 免疫応答が少なくとも約１８０日間持続する、実施態様２９〜４３の何れかの方法。
４５. 免疫応答がウイルス中和力価を含む、実施態様２９〜４４の何れかの方法。
４６. 対象が少なくとも１８歳である、実施態様２９〜４５の何れかの方法。
４７. 用量が１００μg以下のｍＲＮＡを含む、実施態様２９〜４６の何れかの方法。
４８. 用量が１００μg以下のｍＲＮＡを含み、組成物が少なくとも１００μgのｍＲＮＡを含む組成物により誘発される免疫応答より大きな免疫応答を誘発する、実施態様２９〜４７の何れかの方法。
４９. 用量が約３０μgのｍＲＮＡを含む、実施態様２９〜４８の何れかの方法。
５０. 免疫応答がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質の受容体結合ドメインに対する抗体を含む、実施態様２９〜４９の何れかの方法。
５１. 免疫応答がＲＢＤ結合ＩｇＧを含む、実施態様２９〜５０の何れかの方法。
５２. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはそのフラグメントが受容体結合ドメインを含む、実施態様２９〜５０の何れかの方法。
５３. ａ)脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物；およびｂ)温度監視システムを含む、キット。
５４. 温度監視システムが温度センサーおよびディスプレーを含み、ここで、組成物の温度が約−８０℃を超える温度に達したとき、温度監視システムが表示または警告をする実施態様５３のキット。
５５. 温度監視システムが温度センサーおよびディスプレーを含み、ここで、組成物の温度が約−６０℃を超える温度に達したとき、温度監視システムが表示または警告をする実施態様５３のキット。
５６. ａ)脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物；およびｂ)光センサーを含む、キット。
５７. 光センサーが、光への暴露に反応し、感光部材の物性を変化させるように構成された感光部材を含む、実施態様５６のキット。
５８. 組成物が少なくとも２回投与され、最初の投与と２回目の投与が少なくとも１４日離される、実施態様２９〜３５の何れかの方法。
５９. 組成物が少なくとも２回投与され、最初の投与と２回目の投与が少なくとも２１日離される、実施態様２９〜３５の何れかの方法。
６０. 用量が約１０μgのｍＲＮＡを含む、実施態様２９〜４８の何れかの方法。
６１. 組成物が少なくとも２回投与され、最初の投与と２回目の投与が少なくとも２８日離される、実施態様２９〜３５の何れかの方法。
６２. ｍＲＮＡが配列番号３、配列番号５および配列番号７の何れかのアミノ酸配列をコードする、実施態様２９〜３５の何れかの方法。
６３. 免疫原性組成物を少なくとも１回投与された対象における免疫応答の誘導の有効量で、カチオン性脂質を含む少なくとも１個の脂質ナノ粒子に製剤化されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の受容体結合部分を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸(ｍＲＮＡ)ポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物であって、ここで、単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドが自己複製ＲＮＡではない、免疫原性組成物。
６４. 脂質ナノ粒子がさらに非カチオン性脂質、ステロールおよびＰＥＧ修飾脂質の何れかを含む、実施態様６３の免疫原性組成物。
６５. 免疫原性組成物を少なくとも１回投与された対象における免疫応答の誘導の有効量で、モル比で２０〜６０％イオン化可能カチオン性脂質、５〜２５％非カチオン性脂質、２５〜５５％ステロールおよび０.５〜１５％ＰＥＧ修飾脂質を含む少なくとも１個の脂質ナノ粒子に製剤化されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の受容体結合部分を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む単離メッセンジャーリボ核酸(ｍＲＮＡ)ポリヌクレオチドを含み、単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドは自己複製ＲＮＡではない、実施態様６３の免疫原性組成物。
６６. ポリペプチドが完全Ｓタンパク質を含まない、実施態様６３の免疫原性組成物。
６７. ポリペプチドがＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む、実施態様６３の免疫原性組成物。
６８. ポリペプチドが配列番号５を含む、実施態様６３の免疫原性組成物。
６９. ポリペプチドが配列番号２９または３１を含む、実施態様６３の免疫原性組成物。
７０. ポリペプチドが配列番号３を含む、実施態様６３の免疫原性組成物。
７１. ポリペプチドが配列番号７を含む、実施態様６３の免疫原性組成物。
７２. 単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドがさらに５’末端キャップ、７ｍＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ＮｌｍｐＮｐを含む、実施態様６３〜７１の何れかの免疫原性組成物。
７３. オープンリーディングフレームにおけるウラシルの少なくとも８０％がＮ１−メチル−シュードウリジンまたはＮ１−エチル−シュードウリジンから選択される化学修飾されている、実施態様６３〜７２の何れかの免疫原性組成物。
７４. 化学修飾がウラシルの５位である、実施態様６３〜７３の何れかの免疫原性組成物。
７５. ワクチン接種した対象における免疫原性組成物の有効性が、免疫原性組成物の単回投与後、非ワクチン接種対象と比較して少なくとも６０％である、実施態様６３〜７４の何れかの免疫原性組成物。
７６. ワクチン接種した対象における免疫原性組成物の有効性が、免疫原性組成物の単回投与後、非ワクチン接種対象と比較して少なくとも７０％である、実施態様７５の免疫原性組成物。
７７. ワクチン接種した対象における免疫原性組成物の有効性が、免疫原性組成物の単回投与後、非ワクチン接種対象と比較して少なくとも８０％である、実施態様７５の免疫原性組成物。
７８. ワクチン接種した対象における免疫原性組成物の有効性が、免疫原性組成物の単回投与後、非ワクチン接種対象と比較して少なくとも９０％である、実施態様７５の免疫原性組成物。
７９. 有効量が、免疫原性組成物で少なくとも１回ワクチン接種した対象で投与１〜７２時間後の血清で測定して検出可能なレベルのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の受容体結合部分を含むポリペプチドを生じるのに十分である、実施態様６３〜７８の何れかの免疫原性組成物。
８０. 有効量が、免疫原性組成物で少なくとも１回ワクチン接種した対象で投与１〜７２時間後の血清で測定してＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の受容体結合部分を含む抗原性ポリペプチドに対する中和抗体により産生される１,０００〜１０,０００中和力価を生じるのに十分である、実施態様６３〜７９の何れかの免疫原性組成物。
８１. １,０００〜１０,０００中和力価がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２関連疾患の抗体依存性感染増強(ＡＤＥ)の非存在下で産生される、実施態様８０の免疫原性組成物。
８２. 有効量が免疫原性組成物関連呼吸器疾患増強(ＥＲＤ)を誘導しない、実施態様６３〜８１の何れかの免疫原性組成物。
８３. 有効量が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス感染後の非ワクチン接種対象の肺におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡ量と比較して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス感染後対象の肺のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡ量を減少させる、実施態様６３〜８２の何れかの免疫原性組成物。
８４. 有効量が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス感染３日後の対象の肺におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡ量と比較して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス感染少なくとも３日後の対象の肺におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡ量を減少させる、実施態様６３〜８２の何れかの免疫原性組成物。
８５. 有効量が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスに感染後の非ワクチン接種対象の鼻腔スワブサンプルにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡ量と比較して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスに感染後の対象の鼻腔スワブサンプルにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡ量を減少させる、実施態様６３〜８２の何れかの免疫原性組成物。
８６. 有効量が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス感染１日後の対象の鼻腔スワブサンプルにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡ量と比較して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス感染３日後の対象の鼻腔スワブサンプルにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスＲＮＡ量を増加させない、実施態様６３〜８２の何れかの免疫原性組成物。
８７. 免疫原性組成物を少なくとも１回ワクチン接種した対象で産生された抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体力価が対照と比較して少なくとも１log増加され、ここで、対照がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫原性組成物を投与されていない対象で産生された抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体力価である、実施態様６３〜８７の何れかの免疫原性組成物。
８８. 免疫原性組成物を少なくとも１回ワクチン接種した対象で産生された抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体力価が対照と比較して少なくとも２倍増加され、ここで、対照がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫原性組成物を投与されていない対象で産生された抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体力価である、実施態様６３〜８７の何れかの免疫原性組成物。
８９. 有効量が総用量２μg〜１００μgである、実施態様６３〜８８の何れかの免疫原性組成物。
９０. 有効量が総用量１００μgである、実施態様８９の免疫原性組成物。
９１. 有効量が総用量２０μg〜５０μgである、実施態様８９の免疫原性組成物。
９２. 有効量が総用量１０μg〜３０μgである、実施態様８９の免疫原性組成物。
９３. 有効量が総用量１０μgである、実施態様８９の免疫原性組成物。
９４. 有効量が総用量２０μgである、実施態様８９の免疫原性組成物。
９５. 有効量が総用量３０μgである、実施態様８９の免疫原性組成物。
９６. 組成物が単回用量バイアルに製剤化される、実施態様６３〜９５の何れかの免疫原性組成物。
９７. 組成物が多回用量バイアルに製剤化される、実施態様６３〜９５の何れかの免疫原性組成物。
９８. 対象への有効量の免疫原性組成物の筋肉内投与が対象における中和抗体力価を誘導する、実施態様６３〜９７の何れかの免疫原性組成物。
９９. 中和抗体力価が、非ワクチン接種対照対象の中和抗体力価と比較してまたは生存弱毒化ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチンまたはタンパク質サブユニットウイルスワクチンをワクチン接種した対象の中和抗体力価と比較してＢ細胞のウイルス感染を少なくとも５０％減少させるのに十分である、実施態様９８の免疫原性組成物。
１００. 中和抗体力価が免疫原性組成物の３回より少ない投与後に対象において誘導される、実施態様９８または９９の免疫原性組成物。
１０１. 中和抗体力価および／またはＴ細胞免疫応答が非ワクチン接種対照対象の中和抗体力価と比較して、無症候性ウイルス感染の割合を減少させるのに十分である、実施態様９８〜１００の何れかの免疫原性組成物。
１０２. 中和抗体力価および／またはＴ細胞免疫応答が対象におけるウイルス潜伏の予防に十分である、実施態様９８〜１０１の何れかの免疫原性組成物。
１０３. 中和抗体力価が対象の上皮細胞および／またはＢ細胞へのウイルスの融合の遮断に十分である、実施態様９８〜１０２の何れかの免疫原性組成物。
１０４. 対象への有効量の免疫原性組成物の筋肉内投与が対象におけるＴ細胞免疫応答を誘導する、実施態様６３〜１０３の何れかの免疫原性組成物。
１０５. Ｔ細胞免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を含む、実施態様１０４の免疫原性組成物。
１０６. コードされるポリペプチドが対象の細胞表面に提示される、実施態様６３〜１０５の何れかの免疫原性組成物。
１０７. 対象に実施態様６３〜１０６の何れかの免疫原性組成物を投与することを含む方法であって、ここで、免疫原性組成物が対象における免疫応答の誘導のために有効量で対象に投与される、方法。
１０８. 免疫応答が配列番号５と比較してＲＢＤに変異を有するＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２ウイルスに対して誘導される、実施態様１０７の方法。
１０９. 免疫応答が配列番号１と比較してスパイクタンパク質に変異を有するＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２ウイルスに対して誘導される、実施態様１０７の方法。
１１０. 免疫応答が配列番号１と比較してＲＢＤにＱ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８ＨおよびＨ５１９Ｐの何れかの変異を有するＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２ウイルスに対して誘導される、実施態様１０８または１０９の方法。
１１１. 免疫応答が配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＤ６１４Ｇ変異を有するＳＡＲｓ−ＣｏＶ−２ウイルスに対して誘導される、実施態様１０９の方法。
１１２. 免疫原性組成物が対象に毎年投与される、実施態様１０７の方法。
１１３. 所望により(ポリ)カチオン性ポリマー、ポリプレックス、タンパク質またはペプチドと複合体化したＲＮＡであって、(ａ)ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の受容体結合部分を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む；および(ｂ)ポリペプチドの細胞内発現に適する、ＲＮＡ。
１１４. ポリペプチドが完全Ｓタンパク質を含まない、実施態様１１３のＲＮＡ。
１１５. ＲＮＡがさらに５’末端キャップ、７ｍＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ＮｌｍｐＮｐを含む、実施態様１１３または１１４のＲＮＡ。
１１６. オープンリーディングフレームにおけるウラシルの少なくとも８０％がＮ１−メチル−シュードウリジンまたはＮ１−エチル−シュードウリジンから選択される化学修飾されている、実施態様１１３〜１１５の何れかのＲＮＡ。
１１７. 化学修飾がウラシルの５位である、実施態様１１３〜１１６の何れかのＲＮＡ。
１１８. ヒトにおいて免疫応答を誘導するかまたはヒトにワクチン接種するために使用する、実施態様１１３〜１１７の何れかのＲＮＡ。
１１９. ヒトがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に曝されていることが知られているヒトを含む、実施態様１１８の使用のためのＲＮＡ。
１２０. ヒトがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２により感染していることが知られているヒトを含む、実施態様１１８の使用のためのＲＮＡ。
１２１. ヒトがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２への暴露が知られていないヒトを含む、実施態様１１８の使用のためのＲＮＡ。
１２２. ヒトにワクチン接種するための、実施態様１１３〜１１７の何れかのＲＮＡの使用。
１２３. ヒトがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に曝されていることが知られているヒトを含む、実施態様１２２の使用。
１２４. ヒトがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２により感染していることが知られているヒトを含む、実施態様１２２の使用。
１２５. ヒトがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２への暴露が知られていないヒトを含む、実施態様１２２の使用。
１２６. 実施態様６３〜１０６の何れかの免疫原性組成物を含む、単回用量製剤。
１２７. １バイアルに実施態様６３〜１０６の何れかの免疫原性組成物を含む、多回用量製剤。
１２８. バイアルあたり少なくとも２回分含む、実施態様１２６の製剤。
１２９. バイアルあたり計２〜１２回分含む、実施態様１２６の製剤。
１３０. 各回分が等体積である、実施態様１２６〜１２９の何れかの製剤。
１３１. 各製剤がバイアルに総体積１〜３mLで含まれる、実施態様１２６〜１３０の何れかの製剤。
１３２. 免疫原性組成物が凍結されている、実施態様１２６〜１３１の何れかの製剤。
１３３. 実施態様６３〜１０６の何れかの免疫原性組成物を含む、予充填ワクチン送達デバイス。
さらなるある例示的実施態様：
１. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む、組成物または医薬製剤。
２. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の免疫原性フラグメントがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む、実施態様１に記載の組成物または医薬製剤。
３. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列がコドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によりコードされ、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加が好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変えない、実施態様１または２に記載の組成物または医薬製剤。
４.
(ｉ)
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡが配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド９７９〜１５８４、配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド９７９〜１５８４と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド９７９〜１５８４または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド９７９〜１５８４と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントが配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有する免疫原性フラグメントのアミノ酸配列を含む、
実施態様１〜３の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
５.
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡが配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜２０５５、配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜２０５５と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜２０５５または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜２０５５と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントが配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有する免疫原性フラグメントのアミノ酸配列を含む、
実施態様１〜４の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
６.
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡが配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜３８１９、配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜３８１９と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜３８１９または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜３８１９と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントが配列番号１もしくは７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列、配列番号１もしくは７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１もしくは７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列または配列番号１もしくは７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有する免疫原性フラグメントのアミノ酸配列を含む、
実施態様１〜５の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
７. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列が分泌型シグナルペプチドを含む、実施態様１〜６の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
８. 分泌型シグナルペプチドが、好ましくはＮ末端でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに融合する、実施態様７に記載の組成物または医薬製剤。
９.
(ｉ) 分泌型シグナルペプチドをコードするＲＮＡが配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド１〜４８、配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド１〜４８と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド１〜４８または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド１〜４８と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) 分泌型シグナルペプチドが配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む、
実施態様７または８に記載の組成物または医薬製剤。
１０.
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡが配列番号６のヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列もしくは配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントが配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有する免疫原性フラグメントのアミノ酸配列を含む、
実施態様１〜９の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
１１. ＲＮＡがウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む、実施態様１〜１０の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
１２. 修飾ヌクレオシドがシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される、実施態様１１に記載の組成物または医薬製剤。
１３. ＲＮＡが５’キャップを含む、実施態様１〜１２の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
１４. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡが配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ ＵＴＲを含む、実施態様１〜１３の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
１５. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡが配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ ＵＴＲを含む、実施態様１〜１４の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
１６. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡがポリＡ配列を含む、実施態様１〜１５の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
１７. ポリＡ配列が少なくとも１００ヌクレオチド含む、実施態様１６に記載の組成物または医薬製剤。
１８. ポリＡ配列が配列番号１４のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、実施態様１６または１７に記載の組成物または医薬製剤。
１９. ＲＮＡが液体、固体またはそれらの組み合わせとして製剤化されているまたは製剤化される、実施態様１〜１８の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
２０. ＲＮＡが注射用に製剤化されているまたは製剤化される、実施態様１〜１９の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
２１. ＲＮＡが筋肉内投与用に製剤化されているまたは製剤化される、実施態様１〜２０の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
２２. ＲＮＡが粒子として製剤化されているまたは製剤化される、実施態様１〜２１の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
２３. 粒子が脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)またはリポプレックス(ＬＰＸ)粒子である、実施態様２２に記載の組成物または医薬製剤。
２４. ＬＮＰ粒子が((４−ヒドロキシブチル)アザンジイル)ビス(ヘキサン−６,１−ジイル)ビス(２−ヘキシルデカノエート)、２−[(ポリエチレングリコール)−２０００]−Ｎ,Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびコレステロールを含む、実施態様２３に記載の組成物または医薬製剤。
２５. ＲＮＡリポプレックス粒子がＲＮＡとリポソームの混合により得られる、実施態様２３に記載の組成物または医薬製剤。
２６. ＲＮＡがｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡである、実施態様１〜２５の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
２７. 医薬組成物である、実施態様１〜２６の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
２８. ワクチンである、実施態様１〜２７の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
２９. 医薬組成物が１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物をさらに含む、実施態様２７または２８に記載の組成物または医薬製剤。
３０. キットである、実施態様１〜２６の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
３１. ＲＮＡおよび所望により粒子形成成分が別のバイアルにある、実施態様３０に記載の組成物または医薬製剤。
３２. 対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答の誘導のために組成物または医薬製剤を使用するための指示をさらに含む、実施態様３０または３１に記載の組成物または医薬製剤。
３３. 医薬用途のための、実施態様１〜３２の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
３４. 医薬用途が対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を誘導することを含む、実施態様３３に記載の組成物または医薬製剤。
３５. 医薬用途がコロナウイルス感染の治療的または予防的処置を含む、実施態様３３または３４に記載の組成物または医薬製剤。
３６. ヒトに投与するための、実施態様１〜３５の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
３７. コロナウイルスがベータコロナウイルスである、実施態様３２〜３６の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
３８. コロナウイルスがサルベコウイルスである、実施態様３２〜３７の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
３９. コロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２である、実施態様３２〜３８の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
４０. 対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、方法。
４１. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質の免疫原性フラグメントがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む、実施態様４０に記載の方法。
４２. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列がコドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によりコードされ、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加が好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変えない、実施態様４０または４１に記載の方法。
４３.
(ｉ)
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡが配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド９７９〜１５８４、配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド９７９〜１５８４と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド９７９〜１５８４または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド９７９〜１５８４と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントが配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７〜５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有する免疫原性フラグメントのアミノ酸配列を含む、
実施態様４０〜４２の何れかに記載の方法。
４４.
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡが配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜２０５５、配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜２０５５と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜２０５５または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜２０５５と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントが配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７〜６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有する免疫原性フラグメントのアミノ酸配列を含む、
実施態様４０〜４３の何れかに記載の方法。
４５.
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡが配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜３８１９、配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜３８１９と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜３８１９または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９〜３８１９と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントが配列番号１もしくは７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列、配列番号１もしくは７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１もしくは７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列または配列番号１もしくは７のアミノ酸１７〜１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有する免疫原性フラグメントのアミノ酸配列を含む、
実施態様４０〜４４の何れかに記載の方法。
４６. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列が分泌型シグナルペプチドを含む、実施態様４０〜４５の何れかに記載の方法。
４７. 分泌型シグナルペプチドが、好ましくはＮ末端でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに融合する、実施態様４６に記載の方法。
４８.
(ｉ) 分泌型シグナルペプチドをコードするＲＮＡが配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド１〜４８、配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド１〜４８と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド１〜４８または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド１〜４８と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) 分泌型シグナルペプチドが配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む、
実施態様４６または４７に記載の方法。
４９.
(ｉ) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡが配列番号６のヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列もしくは配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するフラグメントのヌクレオチド配列を含む；および／または
(ii) ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントが配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有する免疫原性フラグメントのアミノ酸配列を含む、
実施態様４０〜４８の何れかに記載の方法。
５０. ＲＮＡがウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む、実施態様４０〜４９の何れかに記載の方法。
５１. 修飾ヌクレオシドがシュードウリジン(ψ)、Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１ψ)および５−メチル−ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される、実施態様５０に記載の方法。
５２. ＲＮＡがキャップを含む、実施態様４０〜５１の何れかに記載の方法。
５３. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡが配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ ＵＴＲを含む、実施態様４０〜５２の何れかに記載の方法。
５４. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡが配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ ＵＴＲを含む、実施態様４０〜５３の何れかに記載の方法。
５５. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡがポリＡ配列を含む、実施態様４０〜５４の何れかに記載の方法。
５６. ポリＡ配列が少なくとも１００ヌクレオチド含む、実施態様５５に記載の方法。
５７. ポリＡ配列が配列番号１４のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、実施態様５５または５６に記載の方法。
５８. ＲＮＡが液体、固体またはそれらの組み合わせとして製剤化される、実施態様４０〜５７の何れかに記載の方法。
５９. ＲＮＡが注射により投与される、実施態様４０〜５８の何れかに記載の方法。
６０. ＲＮＡが筋肉内投与により投与される、実施態様４０〜５９の何れかに記載の方法。
６１. ＲＮＡが粒子として製剤化される、実施態様４０〜６０の何れかに記載の方法。
６２. 粒子が脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)またはリポプレックス(ＬＰＸ)粒子である、実施態様６１に記載の方法。
６３. ＬＮＰ粒子が((４−ヒドロキシブチル)アザンジイル)ビス(ヘキサン−６,１−ジイル)ビス(２−ヘキシルデカノエート)、２−[(ポリエチレングリコール)−２０００]−Ｎ,Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびコレステロールを含む、実施態様６２に記載の方法。
６４. ＲＮＡリポプレックス粒子がＲＮＡとリポソームの混合により得られる、実施態様６２の何れかに記載の方法。
６５. ＲＮＡがｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡである、実施態様４０〜６４の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
６６. コロナウイルスに対するワクチン接種のための方法である、実施態様４０〜６５の何れかに記載の方法。
６７. コロナウイルス感染の治療的または予防的処置のための方法である、実施態様４０〜６６の何れかに記載の方法。
６８. 対象がヒトである、実施態様４０〜６７の何れかに記載の方法。
６９. コロナウイルスがベータコロナウイルスである、実施態様４０〜６８の何れかに記載の方法。
７０. コロナウイルスがサルベコウイルスである、実施態様４０〜６９の何れかに記載の方法。
７１. コロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２である、実施態様４０〜７０の何れかに記載の方法。
７２. 組成物が実施態様１〜３９の何れかに記載の組成物である、実施態様４０〜７１の何れかに記載の方法。
７３. 実施態様４０〜７２の何れかに記載の方法に使用するための、実施態様１〜３９の何れかに記載の組成物または医薬製剤。
ここに記載する文献および試験の引用は、前記の何れかが関連する先行技術であることを認めることを意図するものではない。これらの文献の内容としてのすべての記載は、出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これら文献の内容の正確性について承認するものではない。
次の記載は、当業者が種々の実施態様を製造および使用することを可能とするために示す。特定のデバイス、技術および適用の記載は単なる例として提供される。ここに記載する例への種々の修飾が当業者には容易に認識され、ここに定義される一般的原理を、種々の実施態様の精神および範囲から逸脱することなく他の例および適用に適用し得る。故に、種々の実施態様は、ここに記載し、示す例に限定されることを意図せず、むしろ、特許請求の範囲を構成する範囲に従う。
実施例１：モデル抗原としてインフルエンザヘマグルチニン(ＨＡ)を使用するインビボ免疫原性
ここに記載するコロナウイルスワクチンとして使用するＲＮＡプラットフォームの能力を、モデル抗原としてインフルエンザＨＡを使用する広範な免疫原性およびウイルス暴露試験の実施により試験した。本試験は、抗原特異的酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)試験およびウイルス中和(ＶＮＴ)アッセイを適用する機能的試験により決定された抗体応答の誘導を調査した。一つの試験は、インフルエンザＨＡをコードするｍｏｄＲＮＡ−ＬＮＰワクチンを使用するＬＮＰ製剤の能力を評価した。マウスに１μgのＬＮＰ製剤化インフルエンザＨＡ ｍｏｄＲＮＡを０日および２８日にＩＭ注射した。１４日目、２８日目および４９日目、血液サンプルを採り、免疫原性について試験した。分析は、血清における極めて高い力価の抗原特異的ＩｇＧおよび高ウイルス中和活性をもたらす高抗体免疫応答を示した(図３)。さらに、強いＴｈ１ ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答(図４)がｍｏｄＲＮＡワクチンにより誘導された。
実施例２：コロナウイルスワクチン候補の免疫原性試験
一次薬力学的試験を、次の表に示すワクチン候補の免疫原性を試験するためにＢＡＬＢ／ｃマウスで実施した。
Figure 2021185136

このように、明らかなとおり、複数フォーマットの態様を並行して評価した。この記載するアプローチおよびシステムは、顕著かつ効率的な成功を達成し、抗原(例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１タンパク質および／またはそのＲＢＤ)配列の提供から数カ月以内での有効な臨床候補の開発を可能とした(ここに記載するとおり、関連配列情報(例えば、GenBank: MN908947.3)は２０２０年１月に入手可能となった)。
試験において、各８匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの４群を、３つの異なる用量の動物実験物質または緩衝液(対照群；表３参照)で１回免疫化した。臨床治験物質は食塩水で希釈するが、動物実験物質は３００mMスクロースを含むＰＢＳで希釈した。これは該物質自体の保存緩衝液であるため、試験品は、計画される臨床治験で使用されるワクチンを表す。免疫化を、２０μL用量体積を使用してＩＭで与えた。
Figure 2021185136

免疫化動物の血液を７日目、１４日目、２１日目および２８日目に集め、ＥＬＩＳＡおよびシュードウイルスベースの中和アッセイ(ｐＶＮＴ)により抗体免疫応答について分析した。
組み換えＳ１サブユニットまたはＲＢＤに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓ特異的抗体応答をＥＬＩＳＡにより検出した。簡潔には、高タンパク質結合９６ウェルプレート(MaxiSorp ELISA plates, VWR International GmbH, Cat. No. 7341284)を、ウェルあたり１００μLコーティング緩衝液(５０mM炭酸ナトリウム−重炭酸緩衝液、ｐＨ９.６)中１００ng組み換えＳ１サブユニット(Sino Biological Inc., Cat. No. 40591-V08H)またはＲＢＤ(Sino Biological Inc., Cat. No. 40592-V02H)で一夜、４℃で被覆した。プレートを、３００μL／ウェルの０.０１％Ｔｗｅｅｎ ２０(Carl Roth GmbH & Co. KG, Cat. No. 9127.1)添加１×リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、VWR International GmbH, Cat. No. 0780-10L)で３回洗浄し、マイクロプレートシェーカーで１時間、３７℃で１×カゼイン遮断緩衝液(Sigma-Aldrich GmbH, Cat. No. B6429-500ml)２５０μL／ウェルで遮断した。プレートを、再び３００μL／ウェルの０.０１％Ｔｗｅｅｎ ２０添加１×ＰＢＳで３回洗浄し、マイクロプレートシェーカーで１時間、３７℃で１×カゼイン遮断緩衝液で希釈したマウス血清サンプルとインキュベートした。プレートを３００μL／ウェルの０.０１％Ｔｗｅｅｎ ２０添加１×ＰＢＳで３回洗浄し、その後マイクロプレートシェーカーでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体(Jackson ImmunoResearch Ltd., Cat. No. 115-036-071；１×カゼイン遮断緩衝液中１：７５００希釈)と４５分間、３７℃でインキュベートした。プレートを３００μL／ウェルの０.０１％Ｔｗｅｅｎ ２０添加１×ＰＢＳで３回洗浄し、１００μL／ウェルのＴＭＢ基質(Biotrend Chemiekalien GmbH, Cat. No. 4380A)を加えた。プレートを８分間、室温でインキュベートし、１００μL ２５％硫酸(VWR International GmbH, Cat. No. 1007161000)を加えて反応停止させた。プレートをマイクロプレートリーダーで読み、４５０nmの記録吸光度を６２０nMの対照吸光度で減じた。
ワクチン候補に対する機能的抗体応答をｐＶＮＴにより検出した。ｐＶＮＴは、ＶＳＶエンベロープ糖タンパク質Ｇの遺伝子情報を欠くが、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む複製欠損水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)を使用する。ＶＳＶ／ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルスは、公開されたプロトコールに従い産生した(Hoffmann et al., Cell, 2020; PMID 32142651)。シュードタイプウイルスはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質を担持し、これは細胞侵入に介在する。それ故に、シュードウイルスは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓに結合する中和抗体により不活性化され得る。この不活性化をインビトロ方法により分析できる。
簡潔には、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ、Sigma-Aldrich GmbH, Cat. No. F7524)を添加した１５０μL／ウェルのＤＭＥＭ(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 61965059)中、ウェルあたり４×１０４ Ｖｅｒｏ ７６細胞(ATCC(登録商標)CRL-1587TM)を、９６ウェルプレート(Greiner Bio-One GmbH, Cat. No. 655160)に播種した。細胞を４〜６時間、３７℃および７.５％ＣＯ２でインキュベートした。同時に、マウス血清サンプルを、２倍希釈工程でＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中１：６から１：７６８まで希釈した。希釈血清サンプルを等体積の力価測定し、予め希釈したＶＳＶ／ＳＡＲＳ ＣｏＶ−２シュードウイルス上清と混合し、１：１２から１：１５３６までの範囲の血清希釈とした。シュードウイルス／血清希釈混合物を５分間、ＲＴで７５０rpmのマイクロプレートシェーカーでインキュベートし、撹拌せずにＲＴでさらに５分間インキュベーションした。５０μL／ウェルシュードウイルス／血清希釈混合物を、ウェルあたり２００感染単位(ＩＵ)に対応するシュードウイルス体積を適用して播種したＶｅｒｏ−７６細胞に加えた。血清サンプルの各希釈を、デュプリケートウェルで試験した。細胞を、１６〜２４時間、３７℃および７.５％ＣＯ２でインキュベートした。マウス血清非存在下でシュードウイルスとインキュベートしたＶｅｒｏ ７６細胞を陽性対照として使用した。シュードウイルス無しでインキュベートしたＶｅｒｏ ７６細胞を陰性対照として使用した。インキュベーション後、細胞培養プレートをインキュベーターから出し、IncuCyte Live Cell Analysis system(Essen Bioscience)に入れ、分析前に３０分間インキュベートした。明視野およびＧＦＰ蛍光の全ウェル走査を、４倍対物レンズを使用して実施した。中和力価を計算するために、ウェルあたりの感染ＧＦＰ陽性細胞数をシュードウイルス陽性対照と比較した。０.５倍したシュードウイルス陽性対照の平均値はシュードウイルス中和５０％(ｐＶＮ５０)を表す。このカットオフを下回る平均値の血清サンプルは、それぞれ＞５０％ウイルス中和活性を示す。
ＢＮＴ１６２ａ１(ＲＢＬ０６３.３)の免疫原性試験
ＢＮＴ１６２ａ１をコードするＬＮＰ製剤化ｕＲＮＡワクチンの能力を精査するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表３に概説するとおり１回ＩＭで免疫化した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、抗体免疫応答に焦点を絞り調査する。
最初の免疫化７日、１４日、２１日および２８日後のＥＬＩＳＡデータは、Ｓ１タンパク質および受容体結合ドメインに対する早期の用量依存的免疫活性化を示す(図５)。
ＢＮＴ１６２ｂ１(ＲＢＰ０２０.３)の免疫原性試験
ＢＮＴ１６２ｂ１をコードするＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡワクチンの能力を精査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表３に概説するとおり１回ＩＭで免疫化した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、抗体免疫応答に焦点を絞り調査する。
最初の免疫化７日、１４日、２１日および２８日後のＥＬＩＳＡデータは、Ｓ１タンパク質および受容体結合ドメインに対する早期の用量依存的免疫活性化を示す(図６)。免疫化１４日、２１日および２８日後に得た血清、特に１μgまたは５μg ＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化したマウスからの血清は高ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス中和を示し、ＩｇＧ抗体力価の強い増加と相関する(図７)。
ＢＮＴ１６２ｃ１(ＲＢＳ００４.３)の免疫原性試験
ＢＮＴ１６２ｃ１をコードするＬＮＰ製剤化ｓａＲＮＡワクチンの能力を精査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表３に概説するとおり１回ＩＭで免疫化した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、抗体免疫応答に焦点を絞り調査する。
最初の免疫化７日、１４日および２１日後のＥＬＩＳＡデータは、Ｓ１タンパク質および受容体結合ドメインに対する早期の用量依存的免疫活性化を示す(図８)。免疫化１４日および２１日後に得た血清は用量依存的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス中和活性を示す(図９)。
ウイルスＳタンパク質−Ｖ８(配列番号７、８)をコードするＬＮＰ製剤化ｕＲＮＡ(ＲＢＬ０６３.１)の免疫原性試験
ウイルスＳタンパク質−Ｖ８(ＲＢＬ０６３.１)をコードするＬＮＰ製剤化ｕＲＮＡワクチンの能力を精査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表３に概説するとおり１回ＩＭで免疫化した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、抗体免疫応答に焦点を絞り調査する。
最初の免疫化７日、１４日、２１日および２８日後のＥＬＩＳＡデータは入手可能であり、Ｓ１タンパク質および受容体結合ドメインに対する早期の用量依存的免疫活性化を示す(図１０)。免疫化１４日、２１日および２８日後に得た血清は用量依存的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス中和活性を示す(図１１)。
ＢＮＴ１６２ｂ２(ＲＢＰ０２０.１)の免疫原性試験
ワクチンＢＮＴ１６２ｂ２(ＲＢＰ０２０.１)の能力を精査するために、構築物の免疫原性を調査した。この目的で、免疫応答を抗体免疫応答に焦点を絞って分析するＢＡＬＢ／ｃマウスでの用量漸増試験が開始された。
最初の免疫化７日、１４日および２１日後のＥＬＩＳＡデータは入手可能であり、Ｓ１タンパク質および受容体結合ドメインに対する早期の用量依存的免疫活性化を示す(図１２)。免疫化１４日および２１日後に得た血清は用量依存的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス中和活性を示す(図１３)。
ウイルスＳタンパク質−Ｖ９(配列番号７、９)をコードするＬＮＰ製剤化ｓａＲＮＡ(ＲＢＳ００４.２)の免疫原性試験
Ｖ９をコードするＬＮＰ製剤化ｓａＲＮＡワクチンの能力を精査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表３に概説するとおり１回ＩＭで免疫化した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、抗体免疫応答に焦点を絞り調査する。
最初の免疫化７日、１４日および２１日後のＥＬＩＳＡデータは入手可能であり、Ｓ１タンパク質および受容体結合ドメインに対する早期の用量依存的免疫活性化を示す(図１４)。免疫化１４日および２１日後に得た血清は用量依存的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス中和活性を示す(図１５)。
上記データは、全試験プラットフォーム(ワクチンＢＮＴ１６２ａ１、ＢＮＴ１６２ｂ１、ＢＮＴ１６２ｂ２およびＢＮＴ１６２ｃ１を含む)のインビボでの三量体化ドメイン(「Ｖ５」)および変異完全長Ｓタンパク質(「Ｖ８」／「Ｖ９」)を有するＲＢＤ両者に対する免疫応答を示す。抗体免疫応答は、ＥＬＩＳＡによりごく初期に(すなわち、免疫化後７日目)既にみられた。重要なことに、誘導された抗体は、インビトロでＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２シュードウイルス感染を効率的に中和できた。また、ｍｏｄＲＮＡプラットフォーム(ＢＮＴ１６２ｂ１、ＢＮＴ１６２ｂ２)およびｓａＲＮＡプラットフォーム(ＢＮＴ１６２ｃ１)を使用したときの０.２μg／マウスのごく低免疫化用量を使用する抗体応答の誘導は、ワクチン候補の高い能力を示す。
マウスで、ＢＮＴ１６２ｂ２は同一ＲＮＡプラットフォームでコードされるＢＮＴ１６２ｂ１と比較して、高い抗原特異的力価を誘導した。予想通り、マウスにおける抗原に対する免疫原性はＲＮＡプラットフォーム間で異なる。マウスで、抗原特異的抗体誘導に基づく最も免疫原性のプラットフォームはｍｏｄＲＮＡであり、ｓａＲＮＡが続く。ｕＲＮＡプラットフォームは最低抗原特異的抗体力価を誘導する。
実施例３：製剤の選択
ＬＮＰ送達系は、一般にインビボに局所投与後、種々の細胞型のサイトゾルに治療用核酸を効率的かつ安全に送達するために開発された。初期の製剤研究は、有望ないくつかのＬＮＰ製剤およびルシフェラーゼをコードするサロゲートＲＮＡで実施された。実験の目的は、インビボでのＬＮＰにより送達されるＲＮＡの有効性に対する種々のイオン化可能カチオン性脂質の効果を相関させることであった。製剤はＲＮＡカプセル封入効率、見掛けのｐＫａ、ＬＮＰサイズおよび多分散性の点で比較された。
スクリーニングしたカチオン性脂質の中で、ＡＬＣ−０３１５は、粒子径、均一性およびＲＮＡカプセル封入効率に関して適当な物理的特徴を示した。
これに基づき、ＡＬＣ−０３１５／ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＡＬＣ−０１５９プロトタイプをインビボスクリーニングに供した。図１６に示す結果は、ルシフェラーゼ(Ｌｕｃ)ＲＮＡを使用する２個の独立したパイロットバッチのインビボ試験を要約する。結果は、内部ベンチマーク(ＡＬＣ−０２１８)と比較して改善されたＡＬＣ−０３１５プロトタイプの能力を示す。これらの試験に基づき、ＡＬＣ−０３１５は強度に強力なカチオン性脂質として同定され、さらなる製品開発試験に進めた。
上記製剤スクリーニング方法は、主に肝臓への送達をもたらす静脈内投与を含む。肝細胞へのＬＮＰ取り込みの機構は、ＬＮＰへの内因性アポリポタンパク質の結合、続く、例えば低密度リポタンパク質受容体を介する受容体介在エンドサイトーシスにより駆動される。筋肉内投与で同じ機構が関与するかを調査するために、ＡＬＣ−０３１５を含むＬｕｃ ＲＮＡ含有ＬＮＰを、組み換えヒトＡｐｏＥ３存在下または非存在下、ＡｐｏＥノックアウトマウスに静脈内(０.３mg／kg)および筋肉内(０.２mg／kg)注射した。対照として、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを異なる投与経路によっても処置した。ＲＮＡ−ＬＮＰを、投与前、組み換えヒトＡｐｏＥ３(１mg封入ｍＲＮＡと１mg ＡｐｏＥ３)と１時間、室温(ＲＴ)でプレインキュベートした。Ｌｕｃ発現を投与４時間、２４時間、７２時間および９６時間後にモニターした(図１７)。
マウスに静脈内投与したとき、Ｌｕｃ発現は野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで検出された。ＡｐｏＥノックアウトマウスで、Ｌｕｃ発現は顕著に減少したが、外因性ＡｐｏＥとプレインキュベートしたとき、Ｌｕｃ発現は野生型マウスの類似する発現レベルまで回復した(図１８)。
マウスモデルを使用するインビボＬｕｃ発現実験は、静脈内投与と類似の機構が筋肉内投与の場合のＲＮＡ−ＬＮＰ取り込みに関与し、これは、肝細胞だけでなく、投与部位に局所的な細胞にも当てはまることを示した。
インビボ実験で最終ＡＬＣ−０３１５／ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＡＬＣ−０１５９の筋肉内投与後、体内分布に関連する最小ドレナージ、免疫原性(ワクチン活性)および忍容性が確認された。
実施例４：コロナウイルスワクチン候補の免疫原性試験
ワクチン候補に対する機能的細胞性免疫応答を、ＩＦＮ−γ ELISpotＰＬＵＳキット(Mabtech, Cat. No. 3321-4APT-2)を使用するELISpotアッセイにより検出した。簡潔には、ワクチン接種後２８日目に動物を屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓を、シリンジのプランジャーおよび７０μMセルストレイナー(Greiner Bio-One GmbH, Cat. No. 542070)を使用して機械的に分離させた。脾細胞を過剰の体積のＤＰＢＳ(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 14190-094)で洗浄し、続いて３００×ｇで６分間、ＲＴで遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、赤血球を赤血球溶解緩衝液(１５４mM ＮＨ４Ｃｌ、１０mM ＫＨＣＯ３、０.１mM ＥＤＴＡ)を５分間、ＲＴで用いて溶解させた。過剰の体積のＤＰＢＳで反応を停止させた。もう１回の洗浄工程後、細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液(Gibco, Cat. No. 11140-035)、１％ピルビン酸ナトリウム(Gibco, Cat. No. 11360-039)、０.５％ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco, Cat. No. 15140-122)を添加したＲＰＭＩ １６４０培地(Gibco, Cat. no. 61870-010)に再懸濁し、再び７０μm細胞メッシュを篩過させ、計数した。ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者の指示に従いＣＤ８ａまたはＣＤ４ ＭＡＣＳ(登録商標)マイクロビーズ(Miltenyi Biotec, Cat. No. 130-117-044および130-117-043)を使用して脾細胞懸濁液から単離した。並行して、９６ウェルELISpotプレートをＰＢＳで洗浄し、培地(１０％ＦＢＳ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム、０.５％ペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ １６４０培地)で少なくとも３０分間、３７℃で遮断した。１００μL培地中１×１０５ ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、その後ＩＦＮ−γ ELISpotアッセイで５０μLペプチド溶液(無関係対照ペプチドＡＨ１(２μg／mL；配列：SPSYVYHQF)、PepMixTM SARS-CoV-2 S-RBD(ペプチドあたり０.０２５μg／mL；ＪＰＴ、カスタマイズ)またはPepMixTM SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質(ペプチドあたり０.１μg／mL；JPT, Cat. No. PM-WCPV-S-2)および５０μLの自己骨髄由来樹状細胞の添加により再刺激した。各条件をデュプリケートで試験した。プレートを、一夜、５％ＣＯ２の３７℃加湿インキュベーターでインキュベートし、約１８時間後、細胞をプレートから除いた。ＩＦＮ−γスポットを製造業者のプロトコールに従い、検出した。２〜３時間層流下にプレートを乾燥後、ELISpotプレートリーダー(ImmunoSpot(登録商標)S6 Core Analyzer, CTL)を使用して、ウェル当たりのスポット数を計数し、分析した。
ELISpotアッセイに加えて、Luminex分析を実施して、検出されたＴ細胞応答のＴＨ１またはＴＨ２性質に関する情報を得た。１００μL １０％ＦＢＳ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム、０.５％ペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ １６４０培地中５×１０５脾細胞を、９６ウェル平底細胞培養プレートに移した。１００μL 無関係対照ペプチドＡＨ１(２μg／mL；配列：SPSYVYHQF)またはPepMixTM SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質(ペプチドあたり０.１μg／mL；JPT, Cat. No. PM-WCPV-S-2)を加えた。プレートを４８時間インキュベートし、その後サイトカインプロファイリングのために上清を採取した。再刺激脾細胞の上清におけるサイトカイン濃度を、製造業者の指示に従いビーズベースのＴＨ１／ＴＨ２ ProcartaPlexイムノアッセイ(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. EPX110-20820-901)を使用して、決定した。Bioplex200 System(Biorad)で蛍光を測定し、ProcartaPlex Analyst 1.0ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific)で分析した。次の検体を測定した：ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１２ｐ７０；ＩＬ−１３；ＩＬ−１ベータ；ＩＬ−２；ＩＬ−４；ＩＬ−５；ＩＬ−６；ＴＮＦアルファ；ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＬ−１８。
イムノフェノタイピングのために、フローサイトメトリー分析を実施した。簡潔には、５０μLの採血したての血液からの赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液(Gibco)で溶解し、細胞をフロー緩衝液(２％ＦＣＳ、２mM ＥＤＴＡ(何れもSigma)および０.０１％ナトリウムアジド(Morphisto)添加ＤＰＢＳ(Gibco))中、固定可能生死判定色素(eBioscience)および抗ＣＸＣＲ５(ラットＩｇＧ２ａ)抗体でＦｃブロック(何れもBD Bioscience)存在下、２０分間、室温で染色した。フロー緩衝液中、抗ラットＩｇＧ２ａビオチンで２０分間、２〜８℃で染色後、フロー緩衝液で希釈したBrilliant Stain Buffer Plus(BD Bioscience)中のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＸＣＲ５、ＣＤ１９およびストレプトアビジンに対する抗体で細胞を２０分間、２〜８℃で細胞外的に染色した。細胞を２％RotiHistofix(Roth)で１５分間、室温で固定した。細胞をPerm緩衝液(ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セット、eBioscience)に再懸濁し、一夜、２〜８℃でインキュベートした。透過性細胞を、Ｆｃブロックで１０分間、２〜８℃で細胞内的に処理し、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ(BD Bioscience)抗体で３０分間、２〜８℃で染色した。細胞をフロー緩衝液に再懸濁し、BD Symphony A3フローサイトメーター(BD Bioscience)に捕捉し、FLOWJo 10.6.2で分析した。
排出リンパ節におけるマウスＢ細分類のために、２.５×１０５リンパ節細胞をＦｃブロックで１５分間処理し、Brilliant Stain緩衝液(BD Bioscience)中、ＣＤ１９、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＩｇＤ、ＣＤ１３８、ＩｇＭ、ＣＤ３８、ＣＤ９５／ＦＡＳ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＣＤ７３、ＧＲ−１、Ｆ４／８０、ＣＤ４、ＣＤ８に対する抗体で２０分間、２〜８℃で細胞外的に染色した。細胞を２％RotiHistofixで固定し、一夜、２〜８℃でインキュベートした。
ＢＮＴ１６２ｂ１(ＲＢＰ０２０.３)の免疫原性試験
ＢＮＴ１６２ｂ１をコードするＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡワクチンの能力を精査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表３に概説するとおり１回ＩＭで免疫化した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、細胞性免疫応答に焦点を絞ることにより調査した。
無関係ペプチドＡＨ１で刺激後ではなく、Ｓタンパク質またはＲＢＤ特異的ペプチドプールで刺激後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞何れも、ＩＦＮ−γ ELISpotアッセイでＩＦＮ−γ応答を示した(図２２)。Luminex分析で、ペプチド刺激後のサイトカイン産生が、ＴＨ１駆動免疫応答を示す検体で確認された(図２３)。
免疫化７日後の血液の免疫表現型分析(図２４)は、循環Ｔ濾胞性ヘルパー細胞(Ｔｆｈ)および活性化Ｔ細胞の顕著な増加を確認した。免疫化後１２日目、免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスからの排出リンパ節を精査し、Ｂ細胞亜集団分析を実施した(図２５)。Ｂ細胞の顕著な増加がリンパ節で、検出可能な数の形質細胞、クラススイッチングされたＢ細胞およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ陽性胚中心Ｂ細胞と共にみられた。血液および排出リンパ節何れにおいても、適応免疫応答の活性化および成熟が確認された。
ウイルスＰ２−Ｓタンパク質Ｖ８(ＲＢＰ０２０.１)をコードするＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡの免疫原性試験
ＲＢＰ０２０.１をコードするＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡワクチンの能力を精査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表３に概説するとおり１回ＩＭで免疫化した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、細胞性免疫応答に焦点を絞ることにより調査した。
無関係ペプチドＡＨ１で刺激後ではなく、Ｓタンパク質特異的ペプチドプールで刺激後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞何れもＩＦＮ−γ ELISpotアッセイでＩＦＮ−γ応答を示した(図２６)。Luminex分析で、ペプチド刺激後のサイトカイン産生が、ＴＨ１駆動免疫応答を示す検体で確認された(図２７)。
ウイルスＰ２−Ｓタンパク質Ｖ９(ＲＢＳ００４.２)をコードするＬＮＰ製剤化ｓａＲＮＡの免疫原性試験
ＲＢＳ００４.２をコードするＬＮＰ製剤化ｓａＲＮＡワクチンの能力を精査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表３に概説するとおり１回ＩＭで免疫化した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、細胞性免疫応答に焦点を絞ることにより調査した。
無関係ペプチドＡＨ１で刺激後ではなく、Ｓタンパク質特異的ペプチドプールで刺激後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞何れもＩＦＮ−γ ELISpotアッセイでＩＦＮ−γ応答を示した(図２８)。Luminex分析で、ペプチド刺激後のサイトカイン産生が、ＴＨ１駆動免疫応答を示す検体で確認された(図２９)。
ＢＮＴ１６２ｂ３バリアントＢＮＴ１６２ｂ３ｃおよびＢＮＴ１６２ｂ３ｄの免疫原性試験
膜貫通アンカーＲＢＤベースのワクチン抗原(図３０に図解；ＢＮＴ１６２ｂ３ｃ(１)およびＢＮＴ１６２ｂ３ｄ(２))の潜在能力に関する考えを得るために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを４μg ＬＮＰ−Ｃ１２製剤化ｍＲＮＡまたは対照として緩衝液で１回ＩＭ免疫化した。非臨床的ＬＮＰ−Ｃ１２製剤化ｍＲＮＡを、ＢＮＴ１６２ｂ３バリアントＢＮＴ１６２ｂ３ｃおよびＢＮＴ１６２ｂ３ｄのサロゲートとして使用した。ＲＮＡワクチンの免疫原性を、抗体免疫応答に焦点を絞ることにより調査した。
最初の免疫化６日、１４日および２１日後のＥＬＩＳＡデータは、Ｓ１タンパク質および受容体結合ドメインに対する早期の用量依存的免疫活性化を示す(図３１)。免疫化６日、１４日および２１日後に得た血清は高ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス中和を示し、ＩｇＧ抗体力価の増加と相関した(図３２)。
実施例５：非ヒト霊長類(ＮＨＰ)におけるコロナウイルスワクチン候補の免疫原性試験
群あたり６匹のアカゲザルを、０日目および２１日目に３０μgまたは１００μgのＢＮＴ１６２ｂ１または緩衝液でＩＭ免疫化した。最初の投与後１４日までに、組み換えＳ１に結合する抗体は容易に検出可能であり、２８日目までＳ１結合抗体のレベルは、アッセイの定量上限(１０,０００Ｕ／mL)を超えた。比較のために、発症後得られた６２のヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清のＳ１結合抗体を分析した。２つのＮＨＰ群をとおして全時点で４２２Ｕ／mLのヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清の平均を有意に超えた(図３３ａ)。何れかの用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１で免疫化したアカゲザルからの血清のＶＮＴ幾何平均力価(ＧＭＴ)は１回免疫化後１４日目まで検出可能であり、２８日目までに７６８(３０μg用量レベル)または１,７１４(１００μg)の幾何平均に達した(図３３ｂ)。中和ＧＭＴは、３５日目(ブースト１４日後)２８２(３０μg)および９７５(１００μg)であった(図３３ｂ)。４２日目にＳペプチド・ミックスで刺激した血液サンプルからのＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析は、ＴＨ１サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＮＦαの顕著な分泌を確認した。さらに、ＩＬ−２１分泌は有意に増加した。ＩＬ−２１はＢ細胞活性化、増殖および形質細胞産生ならびにＴｆｈの産生に重要な役割を有することが知られている。対照的に、顕著な量のＴＨ２サイトカインＩＬ−４は検出されなかった(図３３ｃ)。要約するとかつマウスで得られた結果と並べて、ＢＮＴ１６２ｂ１は、ＴＨ１偏向免疫応答を伴う早期親和性成熟する高抗体免疫を誘導した。
まとめると、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質からの三量体受容体結合ドメインをコードするメチル−ヌクレオシドｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡが非ヒト霊長類で保護的であることが示された。
実施例６：１８〜５５歳健常成人におけるＣＯＶＩＤ−１９ ＲＮＡワクチン候補(ＢＮＴ１６２ｂ１)の安全性、忍容性および免疫原性を報告するフェーズ１／２治験
三量体化ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク糖タンパク質ＲＢＤ抗原をコードする脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)製剤化、ヌクレオシド修飾、ｍＲＮＡワクチン候補であるＢＮＴ１６２ｂ１１０μg、３０μgまたは１００μgの２回接種について無作為化した健常成人のプラセボ対照、評価者盲検用量漸増治験からの安全性、忍容性および免疫原性を報告する。局所反応および全身事象は用量依存的であり、一般に軽度乃至中程度かつ一過性であった。ＲＢＤ結合ＩｇＧ濃度およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価は用量レベルと共におよび２回目の投与後増加した。幾何平均中和力価はＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒト血清パネルの１.８〜２.８倍に達した。
現在臨床治験されているＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン候補はヌクレオシド１−メチル−シュードウリジン修飾ＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)を含み、中和抗体の中心標的である、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクの受容体結合ドメインをコードする。ＢＮＴ１６２ｂ１により発現されるＲＢＤ抗原は、免疫原性を増加するために、Ｔ４フィブリチン由来「フォルドン」三量体化ドメインの付加により修飾されている。このＲＮＡワクチン候補は、ドイツおよび米国で並行して協調的試験がされている。ここで、米国試験で得たデータを提供する。
方法
試験設計および参加者：このフェーズ１／２、無作為化、プラセボ対照、評価者盲検式治験は、種々のＢＮＴ１６２ ｍＲＮＡワクチン候補の上行性用量レベルの安全性、忍容性および免疫原性を評価するために米国で実施された。３用量レベル(１０μg、３０μgまたは１００μg)のＢＮＴ１６２ｂ１候補の評価を米国の２か所で実施した。この試験は、各用量レベルでのセンチネルコホートからのデータのレビュー後、進行および用量漸増を行うセンチネルコホート設計を利用した。１８〜５５歳の健常男性および非妊娠女性が登録された。重要な除外基準は、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスに感染したことが知られている個体；免疫低下個体および自己免疫性疾患の病歴を有する個体；ＣＯＶＩＤ−１９重症化リスクが高い個体；先のＣＯＶＩＤ−１９との臨床的または微生物学的診断；ＣＯＶＩＤ−１９予防を意図する薬物療法を受けた；以前の何らかのコロナウイルスワクチンのワクチン接種；および治験ワクチン接種前２４時間以内の鼻腔スワブＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＮＡＡＴ陽性を含んだ。
最終プロトコールおよびインフォームドコンセント書類は、この治験に参加する試験センター各々の施設内審査委員会により承認され、この治験は全医薬品規制調和国際会議(ＩＣＨ)臨床試験の実施の基準(ＧＣＰ)ガイドラインおよびヘルシンキ宣言の倫理的原則に従い実施された。署名され、日付が記載されたインフォームドコンセントがあらゆる治験特異的活動を実施する前に必要であった。
エンドポイント：治験のプライマリーエンドポイントは、ワクチン接種後７日以内の即座の局所反応、全身事象ならびに解熱および／または疼痛薬物療法の使用を報告した参加者の割合、最後の投与後１か月間のＡＥおよびワクチン接種後６か月間のＳＡＥおよびワクチン接種後１週間で臨床検査値異常を呈したセンチネルコホート参加者の割合およびベースラインと投与１の１日および７日後および投与２と投与２の７日後の臨床検査評価のグレード判定シフトを含んだ。二次エンドポイントは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和幾何平均力価(ＧＭＴ)；投与１の７日および２１日後および投与２の７日および１４日後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１結合ＩｇＧおよびＲＢＤ結合ＩｇＧ幾何平均濃度(ＧＭＣ)；幾何平均上昇倍率(ＧＭＦＲ)、ベースラインからの４倍以上の上昇および各時点のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２血清中和ＧＭＴ対ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原結合抗体ＧＭＣの幾何平均比(ＧＭＲ)を含んだ。
方法：試験参加者を、双方向のウェブベースの応答技術システムを使用してワクチン群に無作為に割り当て、各群は１５参加者からなった(１２は活性ワクチンレシピエントおよび３はプラセボレシピエント)。参加者は２回０.５mL用量のＢＮＴ１６２ｂ１またはプラセボを受け、三角筋に筋肉内注射により投与された。
ＢＮＴ１６２ｂ１は、三量体化ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク糖タンパク質ＲＢＤ抗原をコードする適正製造基準(ＧＭＰ)グレードｍＲＮＡ薬物物質を含む。ｍＲＮＡをｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤として脂質と製剤化する。ワクチンをＩＭ注射用緩衝化液体溶液として提供し、−８０℃で保管した。プラセボは注射用無菌食塩水溶液であった(０.９％塩化ナトリウム注射、０.５mL用量)。
全参加者の安全性評価は、即時ＡＥについてワクチン接種後４時間観察(各センチネル群でワクチン接種した最初の５参加者)および３０分間観察(残りの参加者)を含んだ。安全性評価は、ワクチン接種後７日までの電子日記(e-diary)での即座の局所反応(発赤、腫脹および注射部位の疼痛)、全身事象(発熱、疲労、頭痛、悪寒、嘔吐、下痢、筋肉痛および関節痛)および解熱および／または疼痛薬物療法の使用の自己報告、ワクチン接種１か月後までの即座ではないＡＥおよび最後のワクチン接種後６か月までのＳＡＥの報告も含んだ。血液学および化学評価を、スクリーニング時、投与１の１日および７日後および投与２の７日後に実施した。
プロトコールは、全センチネル−コホート参加者について安全性停止規則を規定した。内部審査委員会(ＩＲＣ)および外部データモニタリング委員会(ＥＤＭＣ)の両者が全安全性データを審査した。
免疫原性検査：５０mLの血液を、免疫原性評価(ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２血清中和アッセイ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１特異的ＩｇＧ直接Luminexイムノアッセイ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ特異的ＩｇＧ直接Luminexイムノアッセイおよび非ワクチン抗原(ＮＶＡ)Ｉｇ直接Luminexイムノアッセイ)のために各治験ワクチン接種前、投与１の７日および２１日後および投与２の７日、１４日、１か月および６か月後に採った。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイは、逆遺伝学によりレスキューされ、ウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム７へのmNeonGreen(ｍＮＧ)遺伝子の挿入により操作された、先に記載されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２株(ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０)を使用した。このレポーターウイルスは、野生型ウイルスに類似するプラーク形態および区別不可能な増殖曲線を産生する。熱不活性化血清の連続希釈をレポーターウイルスと１時間、３７℃でインキュベートし、その後Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞単層に接種した。感染巣を、Hoechst 33342溶液付加により接種１６〜２４時間後の蛍光により検出し、Cytation 7 Cell Imaging Multi-Mode Readerで計数した。
統計分析：治験のセンチネルコホートのサンプルサイズは、統計仮説検査に基づかなかった。一次安全性客観的は、各ワクチン群について局所反応、全身事象、異常血液学および化学検査値パラメータおよびＡＥおよびＳＡＥの記述要約統計により評価した。３力価アプローチを、ＡＥの要約に使用した。二次免疫原性目標は、種々の時点での記述的要約であった。
結果
２０２０年５月４日から２０２０年６月１９日の間、７６対象をスクリーニングし、４５参加者を無作為化し、ワクチン接種した。用量レベル(１０μg、３０μgまたは１００μg)あたり１２参加者に、０日目および２１日目にＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン接種し、９参加者はプラセボを受けた(図３４)。治験集団は１８〜５５歳の健常男性および非妊娠女性参加者からなり、平均年齢３５.４歳であった(最小１９歳および最大５４歳)。全体として、５１.１％の参加者は男性であり、４８.９％は女性であった。大部分の参加者は白人(８２.２％)および非ヒスパニック／非ラテン系(９３.３％)であった。
安全性および忍容性
いずれかのワクチン接種７日後、注射部位の疼痛が最も高頻度の局所反応であり、投与１後１０μgの５８.３％(７／１２)および３０μgおよび１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１群の１００.０％(１２／１２各)およびプラセボレシピエントの２２.２％(２／９)でならびに、投与２後１０μgおよび３０μg用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントで各８３.３％および１００.０％で報告された。全局所反応１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後重症疼痛を報告した１名以外、軽度または中程度の重症度であった。
ワクチン接種７日後報告された最も一般的な全身事象は、ＢＮＴ１６２ｂ１およびプラセボレシピエント両者で軽度乃至中程度疲労および頭痛であった。全身性事象は、用量レベルと共に増加し、２回目の投与後の対象で多数報告された(１０μgおよび３０μg群)。投与１後、３８.０℃以上の発熱が１００μg群のＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントの５０.０％(６／１２)および１０μgおよび３０μg群各々の参加者の８.３％(１／１２)で報告された。投与２後、１０μg群の参加者の８.３％(１／１２)および３０μg群の参加者の７５.０％(９／１２)が３８.０℃以上の発熱を報告した。グレード４全身事象または発熱は報告されなかった(図３５および３６)。大部分の局所反応および全身事象はワクチン接種後２日目がピークであり、７日目までに解消した。反応原性プロファイルに基づき、初期１００μg用量を受けた参加者は第２のワクチン接種を受けなかった。
有害事象は１０μgまたは３０μgのＢＮＴ１６２ｂ１を受けた参加者の５０.０％(６／１２)、１００μgのＢＮＴ１６２ｂ１を受けた参加者の５８.３％(７／１２)およびプラセボレシピエントの１１.１％(１／９)で報告された。２参加者が重症ＡＥを報告し、一方は３０μg用量レベル(ワクチン接種２日後グレード３発熱)および他方は１００μg用量レベルでった(ワクチン接種１日後睡眠障害)。関連ＡＥはＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントの２５％(３／１２)〜５０％(６／１２)およびプラセボを受けた１１.１％(１／６)で報告された。重度有害事象は報告されなかった。
通例の臨床検査値のグレード１以上の変化または臨床検査値異常は、いずれかのＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン接種後、大部分の対象で観察されなかった。大部分の顕著な変化は、ＢＮＴ１６２ｂ１をそれぞれ１０μg、３０μgまたは１００μg受けた参加者の８.３％(１／１２)、４５.５％(５／１１)および５０.０％(６／１２)のリンパ球数低減であった。１０μg(８.３％)および３０μg(９.１％)用量レベルの各１参加者および１００μg用量レベル(３３.３％)の４参加者は、リンパ球のグレード３低減があった。投与１の１〜３日後採血した血液で示されたこれらの血液学的変化は、ワクチン接種６〜８日後正常に戻った。ワクチン接種後の検査値の変化のいずれも、臨床所見を伴わなかった。さらに、グレード２好中球減少症が、１０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１の２回目の投与６〜９日後、各１参加者で示された。好中球数はこれら対象で回復しなかったが、次の治験を続け、好中球減少症の有害事象または臨床症状は今日まで報告されていない。
免疫原性
ＲＢＤ結合ＩｇＧ濃度およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価を、ベースラインおよびＢＮＴ１６２ｂ１の最初の投与７日および２１日後および２回目の投与７日後(２８日目)採った血清で評価した(図３７ａ)。最初の投与後２１目までに(全３用量レベルで)、ＲＢＤ結合ＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)は５３４〜１,７７８単位／mLであり、それに対して、ＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒト血清のパネルは６０２単位／mLであった。２回目の投与後７日目までに(１０μgおよび３０μg用量レベルで)、ＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣは４,８１３〜３０,２０７単位／mLに増加した。１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１の最初の投与を受けた参加者が２回目の投与を受けなかったため、２回目の投与非存在下での抗体応答の発展は評価できず、この投与群の参加者で最初の投与２１日後を超えるＲＢＤ結合抗体濃度のさらなる増加はなかった。高度に上昇したＲＢＤ結合抗体濃度は、１０μgおよび３０μg用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１を受けた参加者で３５日目(２回目の投与２週間後)まで持続した。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和幾何平均力価(ＧＭＴ)の中程度の増加が投与１の２１日後観察された(図３７ｂ)。相当大きな血清中和ＧＭＴは、２回目の１０μgまたは３０μg用量を受けた参加者で７日後に達成され、１６８〜２６７に達し、それに対し、ＣＯＶＩＤ−１９回復期血清パネルでは９４であった。
考察
ＲＮＡベースのワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１は、安全かつ忍容性が良好であった。全用量レベルでｍＲＮＡベースのワクチンについて先に観察されたものに一致する忍容性および安全性プロファイルが示された。明確な用量レベル応答が、１８〜５５歳成人で投与１および２後観察された。反応原性は２回目の投与後一般に高かったが、症状は出てから数日以内に解消した。１００μg用量レベルでの最初の投与の忍容性プロファイルに基づき、１００μg群に無作為化された参加者は第２のワクチン接種を受けなかった。一過性リンパ球低減(グレード１〜３)がワクチン接種後数日以内に観察された；しかしながら、リンパ球数は、全参加者で６〜８日以内にベースラインに戻った。これらの臨床検査値異常は臨床所見を伴わなかった。ワクチン接種後のリンパ球減少症は、リンパ球の組織への一過性の移動により説明される可能性が高い。
頑強な免疫原性は、ＢＮＴ１６２ｂ１でワクチン接種後観察された。ＲＢＤ結合ＩｇＧ濃度を２１日目に検出し、２１日目のブースター投与７日後実質的に増加した。最初の投与後、ワクチン接種した参加者のＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣ(１０μg用量レベル)は、発症２０〜４０日後および無症候性回復期の開始少なくとも１４日後のＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒトからの３８血清のパネルで観察されたものに類似した。３０μgおよび１００μg用量レベルコホートから採った血清において、ＧＭＣは回復期血清パネルより実質的に高かった。１０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１でブースターワクチン接種(投与２)後、ＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣは、回復期血清パネルＧＭＣより８.０倍〜５０倍高かった。
ワクチン接種した参加者からの血清を、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイについても試験した。中和力価は、全用量レベルで２１日目に測定可能であった。２８日目(ブースター投与７日後)、相当なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価が観察された。１０μgおよび３０μgブースターワクチン接種(投与２)後のウイルス中和ＧＭＴは、それぞれ回復期血清パネルの中和ＧＭＴより１.８倍および２.８倍高かった。１００μg用量レベルコホートはブーストしなかったため、第２ワクチン接種後の免疫原性についての対応するデータは入手可能ではない。
ＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン候補のこれらの臨床所見は極めて励みになるものであり、ＣＯＶＩＤ−１９を予防するための予防ワクチンの速やかな利用可能性の機会を最大にするための開発の加速とリスク時の製造を支持する強い証拠を提供する。
実施例７：同時の抗体ならびにＣＯＶＩＤ−１９ ＲＮＡワクチンにより誘発されるＴ細胞およびサイトカイン応答
この実施例では、１８〜５５歳健常成人の非無作為化オープンラベルフェーズＩ／II治験からのＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン接種の抗体およびＴ細胞応答の特徴づけを提供する。２１日離して投与した１μg、１０μg、３０μgおよび５０μgのＢＮＴ１６２ｂ１の２回投与は、付随する抗体および頑強なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発した。全対象は強力な抗体応答を示し、ＩｇＧ濃度はＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒト血清で観察されたものを有意に超えた。４３日目、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２血清中和幾何平均力価は、ＣＯＶＩＤ−１９回復期ヒト血清のパネルと比較して０.７倍(１μg)〜３.３倍(５０μg)の範囲であり、多様なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントに対して広く活性であった。抗ウイルス性質を有する免疫刺激サイトカインであるインターフェロン(ＩＦＮ)γは高頻度のＲＢＤ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔおよび多数のＣＤ４＋Ｔ細胞で産生された。ＴＨ１免疫細胞プロファイルを強化するＩＬ−１２ｐ７０はＲＢＤ刺激免疫細胞で検出された。ＢＮＴ１６２ｂ１ ｍＲＮＡワクチンによる頑強なＲＢＤ特異的抗体、Ｔ細胞および好都合なサイトカイン応答は、ＣＯＶＩＤ−１９に対する複数の有益な保護的機構の可能性を示唆する。
材料および方法
臨床治験設計
治験ＢＮＴ１６２−０１(ＮＣＴ０４３８０７０１ − ドイツ治験)は、上行性用量レベルの種々の筋肉内投与ＢＮＴ１６２ ｍＲＮＡワクチン候補の安全性、忍容性および免疫原性を評価するための、進行中の、ヒトで最初の、フェーズＩ／II、オープンラベル用量設定臨床治験である。１８〜５５歳の健常男性および非妊婦(５６〜８５歳を加えるように補正)が適格である。重要な除外基準は、ＣＯＶＩＤ−１９の先の臨床的または微生物学的診断；ＣＯＶＩＤ−１９を予防するための薬物療法を受けた；以前何れかのコロナウイルスワクチンでワクチン接種された；スクリーニング来院時ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ血清試験陽性；および治験ワクチン接種前２４時間以内の鼻腔スワブＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＮＡＡＴ陽性；ＣＯＶＩＤ−１９重症化リスクが高い者；免疫低下個体、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスでの感染が知られる者および自己免疫性疾患の病歴を有する者を含んだ。本治験のプライマリーエンドポイントは、安全性および免疫原性であった。
ここに報告する治験のパートでは、５用量レベル(１μg、１０μg、３０μg、５０μgまたは６０μg)のＢＮＴ１６２ｂ１候補を、用量漸増および漸減設計で用量レベルあたり１２健常ボランティアでドイツの１か所で評価した。センチネル投与を各用量漸増コホートで実施した。このコホートおよび用量漸増の進行は、安全性審査委員会によるデータレビューが必要であった。対象は、１日目にＢＮＴ１６２ｂ１プライム投与および２２±２日目にブースト用投与を受けた。抗体アッセイ用血清を１日目(プライム前)、８±１日目(プライム後)、２２±２日目(ブースト前)、２９±３日および４３±４日目(ブースト後)に得た。Ｔ細胞試験用ＰＢＭＣを１日目(プライム前)および２９±３日目(ブースト後)に得た。１０μgの１対象および５０μg用量コホートの１対象は、同意撤回および個人的理由により、ブースト免疫化前に治験から離れた。
示すデータはＢＮＴ１６２ｂ１免疫化コホートのみを含み、種々の時点で記述的に要約されるワクチン誘導免疫原性(二次エンドポイント)の分析に焦点を絞った、２０２０年７月１３日データ抽出日の予備的分析に基づく。データ入手可能な全参加者を、免疫原性分析に含めた。
治験を、ヘルシンキ宣言および臨床試験の実施の基準ガイドラインに従い、かつ独立した倫理委員会(Ethik-Kommission of the Landesaerztekammer Baden-Wuerttemberg, Stuttgart, Germany)および所轄規制当局(Paul-Ehrlich Institute, Langen, Germany)の承認の下、ドイツで実施した。全対象は、インフォームドコンセント書面を提出した。
ＲＮＡの製造
ＢＮＴ１６２ｂ１は三量体化ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク糖タンパク質ＲＢＤ抗原をコードする、製造管理および品質管理の基準(ＧＭＰ)グレードｍＲＮＡ薬物物質を含む。ＲＮＡは、ウリジン−５’−三リン酸(ＵＴＰ)の代わりに、１−メチルシュードウリジン−５’−三リン酸(ｍ１ＹＴＰ；Thermo Fisher Scientific)の存在下、インビトロ転写によりＤＮＡ鋳型から産生される。キャッピングは、トリヌクレオチドキャップ１アナログ((ｍ２ ７,３’−Ｏ)Ｇｐｐｐ(ｍ２’−Ｏ)ＡｐＧ；TriLink)を使用する共転写により実施される。抗原コード化ＲＮＡは、ヒト樹状細胞においてＲＮＡ安定性および翻訳効率を増加させる配列要素を含む(Holtkamp, S. et al., Blood 108, 4009-4017 (2006); Orlandini von Niessen, A. G. et al., Mol. Ther. 27, 824-836 (2019))。ｍＲＮＡを、ＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を得るために脂質と製剤化する。ワクチンを、ＩＭ注射用緩衝化液体溶液として輸送および供給し、−８０℃で保管した。
タンパク質およびペプチド
１１ａａが重複し、ＢＮＴ１６２ｂ１コードＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤの配列全体をカバーする１５量体ペプチドのプールを、フローサイトメトリー、ＩＦＮγ ELISpotおよびサイトカインプロファイリングのためのＰＢＭＣのエクスビボ刺激のために使用した。ＣＥＦ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス；ＨＬＡクラスＩエピトープペプチドプール)およびＣＥＦＴ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス、破傷風毒素；ＨＬＡクラスIIエピトープペプチドプール)(両者ともJPT Peptide Technologies)を、一般的Ｔ細胞反応性の対照として使用した。
ヒト回復期血清およびＰＢＭＣパネル
ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染／ＣＯＶＩＤ−１９回復期血清(ｎ＝３８)を、１８〜８３歳の対象から、ＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後かつ対象が無症候であるときに得た。血清ドナーは症候性感染症を有していたか(ｎ＝３５)または入院していた(ｎ＝１)。血清を、Sanguine Biosciences(Sherman Oaks, CA)、MT Group(Van Nuys, CA)およびPfizer Occupational Health and Wellness(Pearl River, NY)から得た。ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染／ＣＯＶＩＤ−１９回復期ＰＢＭＣサンプル(ｎ＝６)を、４１〜７９歳対象から、ＰＣＲ確認診断４５〜５９日後かつ対象が無症候であるときに得た。ＰＢＭＣドナーは無症候性／軽度感染症であったか(ｎ＝４；臨床スコア１および２)または入院していた(ｎ＝２；臨床スコア４および５)。血液サンプルをFrankfurt University Hospital(Germany)から得た。
細胞培養および初代細胞単離
Ｖｅｒｏ細胞(ATCC CCL-81)およびＶｅｒｏ Ｅ６細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８６)を、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Sigma-Aldrich)を添加されたGlutaMAXTM(Gibco)含有ダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)で培養した。細胞株を、受領後ならびに増殖および凍結保存前、マイコプラズマ汚染について試験した。末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をFicoll-Hypaque(Amersham Biosciences)密度勾配遠心分離により単離し、その後の分析前に凍結保存した。
ＲＢＤ結合ＩｇＧ抗体アッセイ
Ｃ末端AvitagTM(Acro Biosystems)を含む組み換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤをストレプトアビジン被覆Luminexマイクロスフェアに結合させた。熱不活性化対象血清を１：５００、１：５,０００および１：５０,０００希釈した。一夜、２〜８℃で振盪しながらインキュベーション後、プレートを、０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有溶液で洗浄した。二次蛍光標識ヤギ抗ヒトポリクローナル抗体(Jackson Labs)を、振盪しながら９０分間、室温で加え、その後プレートを、０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有溶液でさらに１回洗浄した。データを、Luminexリーダーを使用して中央蛍光強度(ＭＦＩ)として捕捉し、任意に１００Ｕ／mL濃度に割り当てた対照標準曲線を使用し、血清希釈因子を考慮してＵ／mL抗体濃度に変換した。何れかのサンプルの結果の少なくとも１つが標準曲線の使用可能な範囲内に入る可能性を上げるために、３希釈を使用した。アッセイ結果は、Ｕ／mLのＩｇＧで報告された。最終アッセイ結果は、アッセイ範囲内の有効なアッセイ結果をもたらす全サンプル希釈の幾何平均濃度として表す。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイ
中和アッセイは、逆遺伝学によりレスキューされ、ウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム７へのmNeonGreen(ｍＮＧ)遺伝子の挿入により操作された、先に記載されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２株(ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０)を使用した(Xie, X. et al., Cell Host Microbe 27, 841-848.e3 (2020))。このレポーターウイルスは、野生型ウイルスに類似するプラーク形態および区別不可能な増殖曲線を産生する。ウイルスマスターストック(２×１０７PFU／mL)を、先に記載されたとおり、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で増殖させた(Xie, X. et al., Cell Host Microbe 27, 841-848.e3 (2020))。熱不活性化血清の連続希釈を、レポーターウイルスと１時間、３７℃でインキュベートし(Ｖｅｒｏ単層の約１０〜３０％感染率を得るため、０.５の最終感染効率(ＭＯＩ)のために２×１０４PFU／ウェル)、その後Ｖｅｒｏ ＣＣＬ８１細胞単層を(８,０００〜１５,０００細胞／ウェルが目標)９６ウェルプレートに接種して、感染細胞の正確な定量を可能とした。総細胞数／ウェルを核染色(Hoechst 33342)により計数し、蛍光ウイルス感染巣を、Cytation 7 Cell Imaging Multi-Mode Reader(Biotek)とGen5 Image Prime version 3.09を用いて、接種１６〜２４時間後検出した。力価を、各連続血清希釈でパーセント中和の４パラメータ(４ＰＬ)ロジスティックフィットを作成することにより、GraphPad Prism version 8.4.2で計算した。５０％中和力価(ＶＮＴ５０)は、蛍光ウイルス巣の５０％減少をもたらす希釈の内挿された逆数として報告された。
ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントシュードウイルス中和アッセイ
ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュード粒子産生および中和アッセイを先に記載されたとおり実施した(Baum, A. et al., Science, eabd0831 (2020). doi:10.1126/science.abd0831)。簡潔には、ヒトコドン最適化ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク(GenBank: MN908947.3)を合成し(Genscript)、発現プラスミドにクローン化した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２完全なゲノム配列をＧＩＳＡＩＤヌクレオチドデータベース(https://www.gisaid.org)からダウンロードした(最終アクセス２０２０年８月２４日)。配列をキュレートし、スパイクコード化遺伝子の遺伝的多様性を、カスタムパイプラインを使用して高品質ゲノム配列ンにわたり評価した。アミノ酸置換を、部位特異的変異導入を使用してスパイク発現プラスミドにクローン化した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞(ATCC CRL-3216)を播種し(培養培地：１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ；Life Technologies)およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン(Life Technologies)添加ＤＭＥＭ高グルコース(Life Technologies))、製造業者のプロトコールに従い、翌日リポフェクタミンＬＴＸ(Life Technologies)を使用してスパイク発現プラスミドでトランスフェクトした。３７℃でトランスフェクション２４時間後、細胞を、感染効率１でOpti-MEM(Life Technologies)に希釈したＶＳＶΔＧ：ｍＮｅｏｎ／ＶＳＶ−Ｇウイルスで感染させた。細胞を１時間、３７℃でインキュベートし、残留導入ウイルスを除去するために洗浄し、感染培地(０.７％低ＩｇＧ ＢＳＡ(Sigma)、ピルビン酸ナトリウム(Life Technologies)および０.５％ゲンタマイシン(Life Technologies)添加ＤＭＥＭ高グルコース)で重層した。２４時間、３７℃の後、ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュード粒子を含む上清を集め、３０００×ｇで５分間遠心分離して浄化させ、さらに使用するまで−８０℃で保管した。
シュードウイルス中和アッセイのために、Ｖｅｒｏ細胞(ATCC CCL-81)を９６ウェルプレートで培養培地に播種し、アッセイ使用前(２４時間後)に約８５％コンフルエンスに到達させた。血清を、感染培地で１：４０希釈から開始して１：２連続希釈した。ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュード粒子を、アッセイでの蛍光焦点単位(ｆｆｕ)カウントが約１０００となるよう感染培地で１：１希釈した。血清希釈を、シュード粒子と１：１で３０分間、室温で混合し、その後Ｖｅｒｏ細胞に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。上清を除き、ＰＢＳ(Gibco)で置き換え、蛍光巣を、SpectraMax i3プレートリーダーとMiniMaxイメージングサイトメーター(Molecular Devices)を使用して、定量した。中和力価を、各連続血清希釈のパーセント中和の４パラメータロジスティック(４ＰＬ)フィットを作成することにより、GraphPad Prism version 8.4.2で計算した。５０％シュードウイルス中和力価(ｐＶＮＴ５０)は、蛍光ウイルス巣の５０％減少をもたらす希釈の内挿された逆数として報告された。
ＩＦＮγ ELISpot
ＩＦＮγ ELISpot分析を、ＣＤ４＋枯渇およびＣＤ８＋Ｔ細胞富化(ＣＤ８＋エフェクター)またはＣＤ８＋枯渇およびＣＤ４＋Ｔ細胞富化(ＣＤ４＋エフェクター)ＰＢＭＣを使用して、エクスビボ(増殖のためにさらにインビトロ培養することなく)で実施した。陽性対照(抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＣＤ３−２(１：１,０００；Mabtech))と共に試験をデュプリケートで実施した。ＩＦＮγ特異的抗体(ELISpotProキット、Mabtech)でプレコートした多スクリーンフィルタープレート(Merck Millipore)をＰＢＳで洗浄し、２％ヒト血清アルブミン(CSL-Behring)含有X-VIVO 15培地(Lonza)で１〜５時間ブロックした。３.３×１０５／ウェルのエフェクター細胞を、ワクチンコード化ＲＢＤを表す重複ペプチドプールで１６〜２０時間刺激した。結合ＩＦＮγを、アルカリホスファターゼと直接コンジュゲートした二次抗体と、続くＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質(ELISpotProキット、Mabtech)とのインキュベーション使用により可視化した。プレートをAID Classic Robot ELISPOT Readerを使用して走査し、ImmunoCapture V6.3(Cellular Technology Limited)またはAID ELISPOT 7.0ソフトウェア(AID Autoimmun Diagnostika)で分析した。スポット数は各デュプリケートの平均値として示した。ペプチドにより刺激されたＴ細胞応答を、疑陽性の制御を維持しながら、感受性をもたらすために、Moodie et al.(Moodie, Z., et al., J. Immunol. Methods 315, 121-32 (2006); Moodie, Z. et al., Cancer Immunol. Immunother. 59, 1489-501 (2010))による２統計検定(分布によらない再サンプリング)に基づき、社内ELISpot data analysis Tool(ＥＤＡ)を使用して培地のみ陰性対照とインキュベートしたエフェクターと比較した。
抗ＣＤ３抗体刺激に対して応答したスポット数により反映される多様なサンプル品質を説明するために、正規化方法を適用して、個体間のスポット数／応答強度の直接比較を可能とした。この依存性は、ノイズ成分含むベイズモデルを有する対数線形様式にモデル化された(未発表)。頑強な正規化のために、各正規化をモデルから１０００回サンプリングし、中央を標準化スポット数値として取った。モデルの尤度：ｌｏｇλＥ＝α ｌｏｇλＰ＋ｌｏｇβｊ＋σε、ここで、λＥはサンプルの標準化スポット数であり、αは全陽性対照λＰで共通な安定因子(正規分布)であり、βｊはサンプルｊ特異的成分(正規分布)であり、σεはノイズ成分であり、その中でσはコーシー分布であり、εはスチューデントのｔ分布である。βｊは、各サンプルが異なるバッチとして処理されることを確実にする。
フローサイトメトリー
サイトカイン産生Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン染色により同定した。解凍され、２μg／mL ＤＮＡｅＩ(Roche)添加OpTmizer培地中で４時間休息させたＰＢＭＣを、GolgiPlug(ＢＤ)存在下、ワクチンでコードされるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤを表すペプチドプール(２μg／mL／ペプチド；JPT Peptide Technologies)で１８時間、３７℃で再刺激した。対照をＤＭＳＯ含有培地で処理した。細胞を、フロー緩衝液(２％ＦＣＳ(Biochrom)、２mM ＥＤＴＡ(Sigma-Aldrich)添加ＤＰＢＳ(Gibco))中、生存能および表面マーカーについて、２０分間、４℃で染色した。その後、サンプルを、製造業者(BD Biosciences)の指示に従い固定し、Cytofix/Cytopermキットを使用して、透過処理した。細胞内染色をPerm／Wash緩衝液で３０分間、４℃で実施した。サンプルをFACS VERSE装置(BD Biosciences)で獲得し、FlowJo software version 10.5.3(FlowJo LLC, BD Biosciences)で分析した。ＲＢＤ特異的サイトカイン産生を、ＤＭＳＯ含有培地で得られた値を減ずることにより、バックグラウンドに対して補正した。負の値を０と設定した。図４２ｂのサイトカイン産生を、ＩＦＮγ、ＩＬ−２またはＩＬ−４について陽性の全ＣＤ４＋Ｔ細胞の画分を合計し、この合計を１００％に設定し、その各特異的サイトカイン産生サブセットの分画を計算することにより計算した。
サイトカインプロファイリング
ヒトＰＢＭＣを、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤペプチドプール(２μg／mL ペプチドあたり最終濃度)で４８時間再刺激した。ＤＭＳＯ含有培地での刺激は陰性対照として役立った。上清のＴＮＦ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ７０の濃度を、製造業者の指示に従い、ビーズベースの、11-plex TH1/TH2 human ProcartaPlex immunoassay(Thermo Fisher Scientific)を使用して決定した。蛍光をBioplex200 system(Bio-Rad)で測定し、ProcartaPlex Analyst 1.0 software(Thermo Fisher Scientific)で分析した。ＲＢＤ特異的サイトカイン産生を、ＤＭＳＯ含有培地で得られた値を減ずることにより、バックグラウンドに対して補正した。負の値を０と設定した。
結果
治験設計および分析セット
２０２０年４月２３日から２０２０年５月２２日の間、６０名の対象をＢＮＴ１６２ｂ１でワクチン接種した。１μg、１０μg、３０μgおよび５０μg用量レベルあたり１２名の参加者は１日目に最初の投与を受け、２２日目にブーストされ、１２名の参加者は１日目のみ６０μgプライム用量を受けた(図４３)。治験集団は、等しい性別分布の平均年齢４１歳(範囲１９〜５５歳)の健常男性および非妊娠女性からなった。大部分の参加者は白人(９６.７％)であり、１名アフリカ系アメリカ人および１名アジア人対象(各１.７％)であった。予備的データ分析は免疫原性に焦点を絞った(表４)。
Figure 2021185136

抗体分析：値は、ウイルス中和アッセイを実施した対象数を示した。括弧内の値ＲＢＤ結合ＩｇＧ抗体アッセイを実施した対象数を示す。Ｔ細胞分析：値は、ＩＦＮγ ELISpotを実施した対象数を示した。括弧内の値はフローサイトメトリーを実施した対象数を示す。Ｎ／Ａ：入手可能ではないサンプル。
簡潔には、重度有害事象(ＳＡＥ)、予想外の毒性および関連ＡＥによる中止はなかった。大部分の報告された応答型ＡＥは、全身性および注射部位反応、主に疼痛および圧痛の症状などの、一般に免疫化後最初の２４時間以内に発症するワクチン反応原性の徴候および症状であった(図４４)。発熱、悪寒、頭痛、筋肉および関節痛および注射部位反応などの症状は大部分強度が軽度または中程度であり、時折の重症(グレード３)ＡＥがあった。全ＡＥは、大部分発症２４時間以内に自然に解消され、単純な手段(例えばパラセタモール)により管理できた。最初の投与後報告された反応原性に基づき、最初に６０μg用量を受けた参加者は、２回目の６０μg用量を受けなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン接種後通例の臨床検査値で関連する変化は生じなかったが、炎症性マーカーＣ反応性タンパク質(ＣＲＰ)の一過性増加および血液リンパ球数の一過性減少が、ワクチン接種した対象で用量依存的方法で観察された(図４５)。ＲＮＡワクチンでの以前の臨床経験に基づき、後者は、リンパ球自然免疫刺激関連一過性再分布が起因する可能性がある(Kamphuis, E., et al., Blood 108, 3253-61 (2006))。
ワクチン誘導抗体応答
ＲＢＤ結合ＩｇＧ濃度およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価を、プライムのみ受けた６０μgコホート以外、ベースライン、ＢＮＴ１６２ｂ１プライム投与７日および２１日後(８日目および２２日目)およびブースト投与７日および２１日後(２９日目および４３日目)に評価した(図３９)。
１μg用量を受けた対象を含む全対象は、強力な、用量依存的ワクチン誘導抗体応答を示した。プライミング投与２１日後(１〜５０μg範囲の４用量レベル)、ＲＢＤ結合ＩｇＧの幾何平均濃度(ＧＭＣ)は、用量依存的に約２６５〜１,６７２Ｕ／mLであった(図３９)。ブースト投与７日後(２９日目)、１〜５０μg ＢＮＴ１６２ｂ１で処置した対象のＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣは、約２,０１５〜２５,００６Ｕ／mLに用量依存的に強く増加した。Ａｔ４３日目(ブースト２１日後)、ＲＢＤ結合抗体ＧＭＣは、ＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン接種した個体で約３,９２０〜２２,７００Ｕ／mLの範囲であり、それに対して、ＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後得た３８名のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染回復期患者(１８〜８３歳)からの血清のパネルでの測定は約６０２Ｕ／mLであった。プライム投与のみの６０μg用量コホートで、ＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣは２９日目までに約１,０５８Ｕ／mLであり、抗体力価ブーストのための２回目の投与の必要性を示した。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体幾何平均力価(ＧＭＴ)は、プライミング投与２１日後用量依存的様式で軽度に増加した(図４０ａ)。実質的に高い血清中和ＧＭＴがブースト投与７日後に達成され、約３６(１μg用量レベル)、約１５８(１０μg用量レベル)、約３０８(３０μg用量レベル)および約５７８(５０μg用量レベル)に達し、対照的に回復期血清パネルでは約９４であった。４３日目(ブースト２１日後)、用量レベルに応じて、中和抗体ＧＭＴは約６２(１μg用量)までさらに増加するか、約１２６(１０μg用量)で比較的安定であるかまたは約１５７(３０μg用量)および約３０９(５０μg用量)にわずかに減少した。中和抗体ＧＭＴはＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣと強く相関した(図４０ｂ)。まとめると、中和抗体力価は、主としてＢＮＴ１６２ｂ１を用いる米国治験で先に報告された範囲であった。
さらに、２回目の投与７日後までに、ワクチン接種した対象の血清は、１６ＲＢＤ変異体(Baum, A. et al., Science, eabd0831 (2020). doi:10.1126/science.abd0831)および１優性スパイクバリアントＤ６１４Ｇ(Baum, A. et al., Science, eabd0831 (2020). doi:10.1126/science.abd0831)を含む、公的に入手可能なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２配列で同定された１７ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントのパネルにわたり、広い中和活性を示した(図４０ｃ)。
ワクチン誘導Ｔ細胞応答
ＢＮＴ１６２ｂ１免疫化対象のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、１μg〜５０μg用量コホートにわたる３６対象からのＰＢＭＣを用いて、直接エクスビボＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴを使用してプライムワクチン接種前(１日目)およびプライム後２９日目(ブーストワクチン接種７日後)特徴づけした(図４１)。このアッセイで、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターワクチンコード化ＲＢＤの完全長配列を表す重複ペプチドで一夜刺激した。
３６対象中、３４(９４.４％、１０μg以上のＢＮＴ１６２ｂ１で処置した全対象を含む)は、ＲＢＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を搭載した。強度は個体間で変わり、最強ＣＤ４ Ｔ細胞応答は同じ対象のサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)、インフルエンザウイルスおよび破傷風毒素由来免疫優性ペプチドのパネルに対して観察された記憶応答の１０倍を超えた(図４１ａ〜ｃ)。少数のＲＢＤ反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞がすでに存在し、ワクチン接種後有意に増加した１対象以外(５０μg用量コホートで標準化平均スポット数６３から１,５１９)、ベースラインでＣＤ４＋Ｔ細胞応答は検出不可能であった。ＲＢＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強度は、分子内援助の概念に一致して(Sette, A. et al., Immunity 28, 847-58 (2008))、ＲＢＤ結合ＩｇＧおよびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価両方と正に相関した(図４１ｄ、図４６ａ)。ＣＤ４＋応答がなかった２対象は、いずれも検出可能なＶＮＴ５０力価がなかった(図４１ｄ)。
ワクチン誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞応答について、ある強い応答は対象の大部分で搭載され(２９／３６、８０.６％)(図４１ａ)、同じ対象のＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスおよび破傷風毒素に対する記憶応答とほぼ同等であった(図４１ｂ、ｃ)。ＲＢＤ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の強度は、ワクチン誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞応答と正に相関したが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価と有意な相関はなかった(図４６ｂ、ｃ)。
注目すべきことに、１μg ＢＮＴ１６２ｂ１で、免疫原性率は低いが(６／８応答対象)、一部対象のワクチン誘導ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の強度は、５０μg ＢＮＴ１６２ｂ１とほぼ同程度高かった(図４１ａ)。ＲＢＤ特異的Ｔ細胞の機能性および極性化を評価するために、ワクチン抗原の刺激に応答して分泌されるサイトカインを、１８名のＢＮＴ１６２ｂ１免疫化対象のワクチン接種前後のＰＢＭＣでＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−４特異的抗体を用いる細胞内染色(ＩＣＳ)により決定した。ＲＢＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＦＮγ、ＩＬ−２または両者を分泌したが、ＩＬ−４は分泌しなかった(図４２ａ〜ｃ)。同様に、ＲＢＤ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分画もＩＬ−２を分泌した。
ＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン接種により得られた総循環Ｔ細胞内のＲＢＤ特異的Ｔ細胞の平均分画は、ＣＯＶＩＤ−１９から回復した６対象で観察されるより実質的に高かった。ＲＢＤ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度は、総末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞の数パーセントに達した(図４２ｃ)。ワクチン接種した５対象のサブグループからの重複ＲＢＤペプチドでのＰＢＭＣ刺激エクスビボの上清の分析は、炎症促進性サイトカインＴＮＦ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ７０の類似した放出を示した(図４２ｄ)。
まとめると、これらの所見は、ＢＮＴ１６２ｂ１はほぼ全対象で、ＴＨ１極性化ヘルパー応答を有する、機能的および炎症促進性ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す。
考察
ウイルス侵入に対抗するための協調的免疫応答を表す、同時の中和抗体産生、ウイルス特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化およびＩＦＮγなどの免疫調節サイトカインの頑強な放出が観察された(レビューのためにVabret, N. et al., Immunity 52, 910-941 (2020))。ＩＦＮγは、いくつかの抗ウイルス応答の重要なサイトカインを表す。実際、ＩＦＮγ活性障害に関連するＩＦＮγ遺伝子多型を有する患者は、ＳＡＲＳに対する感受性が５倍増加したことが示されている(Chong, W. P. et al., BMC Infect. Dis. 6, 82 (2006))。また、ＩＦＮγは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２複製を阻害するためにＩ型インターフェロンと相乗的に作用する(Sainz, B., et al., Virology 329, 11-7 (2004))。ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγの頑強な産生は、抗ウイルスおよび免疫増強性質両方を備えた好都合な免疫応答を示す。
重要なことに、ＩＬ−４ではなく、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２ｐ７０の検出は、好都合なＴＨ１プロファイルと有害な可能性のあるＴＨ２免疫応答の非存在を示す。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１生存者で示されるようなコロナウイルスに対する長く持続する免疫に貢献し得て、ここで、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫は６〜１１年持続した(Vabret, N. et al., Immunity 52, 910-941 (2020)；Ng, O.-W. et al., Vaccine 34, 2008-14 (2016))。
無症候性ウイルス暴露の数例は、抗体陽転がない細胞性免疫応答と関連しており、ＳＡＲＳ−Ｃｏｖ−２特異的Ｔ細胞が中和抗体がなくても疾患管理に関連する可能性を示す(Gallais, F. et al. (2020). doi:medRxiv: 10.1101/2020.06.21.20132449)。ほぼ全てのワクチン接種したボランティアは、高強度Ｔ細胞応答のみを補足するＴ細胞増殖前に実施した、エクスビボELISpotアッセイで検出してＲＢＤ特異的Ｔ細胞応答を搭載した。Ｔ細胞応答強度は対象間で相当変化したが、１μg〜５０μgの用量範囲でＴ細胞応答強度の明確な用量依存性は観察されず、Ｔ細胞の刺激および頑強な増殖は最低ｍＲＮＡコード化免疫原レベルで達成されるはずであることが示された。
治験はＲＢＤ結合ＩｇＧおよび中和応答の用量依存性を確認し、米国治験の１０μgおよび３０μg用量レベルの先の所見を再現し、中和抗体力価が５０μgのプライム／ブーストレジメンによりさらに増加されることを示す。
重要な観察は、わずか１μgの用量レベルでのＢＮＴ１６２ｂ１の２回注射が、回復期血清で観察されるより高いＲＢＤ結合ＩｇＧレベルおよび４３日目までなお増加する血清中和抗体力価を誘導できることである。保護的中和抗体力価の強度は知られていないことを考慮し、１μgコホートにおける一部対象で観察された相当なＴ細胞応答を前提として、相当な割合の個体が、このこの最低治験用量レベルからでさえ利益を受け得るとの見込みが支持され得る。
純粋なＲＢＤ特異的免疫は、この小さなドメインの一アミノ酸変化によりウイルスにより回避されやすいと考えられるはずである。しかしながら、１６が循環株でみられるのと異なるＲＢＤバリアントを有するスパイクを使用して細胞に入り、１つが優性スパイクバリアントＤ６１４Ｇを使用する、１７シュードタイプ化ウイルスの中和は、この懸念の可能性を低める。
実施例８：ステージ１のＣＯＶＩＤ−１９ワクチンＢＮＴ１６２からの安全性および免疫原性データの要約
この実施例は、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン候補のさらなる安全性および免疫原性データを提供する。これらの安全性および忍容性データならびに免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)結合および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２(ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２)中和力価データは、これらワクチン候補のステージ１米国治験の米国参加者からのものである。
ＢＮＴ１６２ｂ１について、下記のことが観察される。
１０μg〜３０μg用量レベルで、反応原性(特に全身事象)が、１８〜５５歳および６５〜８５歳参加者で用量レベルを上げると増加した。反応原性(特に全身事象)は、投与１と比較して投与２後増加した。
ＢＮＴ１６２ｂ２について、下記のことが観察される。
反応原性の用量レベルおよび投与数依存的増加は、いずれの年齢群でも最小乃至中程度であった。全ての入手可能なデータに基づき、ＢＮＴ１６２ｂ２(および特に配列番号２０)で観察された反応原性プロファイルは、かなり好都合である。
投与２後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和応答に焦点を絞ったここに示す免疫原性データにより、次のとおり結論づけられ得る。
ＢＮＴ１６２ｂ１について、２８日目(投与２の７日後)：
１０μgおよび３０μg投与量での免疫化後誘発された中和抗体応答(ここで、データは両年齢群で入手可能である)は、６５〜８５歳群と比較して１８〜５５歳成人で高い。６５〜８５歳群で、２０μgおよび３０μg投与量後の中和抗体応答は、２０μg用量レベルで数値的には高いが、類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２(特に、配列番号２０)について、２８日目(投与２の７日後)：
２０μg投与量後の中和抗体応答(ここで、データは両年齢群で入手可能である)は、６５〜８５歳群と比較して、１８〜５５歳群で高かった。１８〜５５歳群で、中和抗体応答は、１０μg用量レベルと比較して２０μgを受けた後高かった。図５６のＳ１ ＩｇＧ結合抗体データおよび３０μg用量レベルが細胞であった用量レベル間の投与１後応答比較は、結合抗体のレベルが中和抗体レベルと良好に相関するため、投与２後３０μg用量レベルで中和抗体レベルが同様に高い可能性を示唆する。６５〜８５歳群で、２０μgおよび３０μg用量後の中和抗体応答は、３０μg用量レベルで高かった。
データは、全体的に、ＢＮＴ１６２ｂ１とＢＮＴ１６２ｂ２の投与２後の類似の中和抗体応答を示す。
ＢＮＴ１６２ｂ１の安全性および忍容性
１８〜５５歳群
この年齢群の安全性データは、投与２後、一部データしか現在入手可能ではない２０μg(および内部審査委員会(ＩＲＣ)の推奨で２回目の投与をしていない１００μg)以外、全用量レベルで投与２後入手可能である。局所反応は図４８に示す。全身性事象は図４９に示す。
ＢＮＴ１６２ｂ１の免疫原性
６５〜８５歳群
この年齢群で免疫原性データは全用量レベルについて投与２後入手可能である。ＲＢＤ結合ＩｇＧ幾何平均濃度(ＧＭＣ)は図５０に示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和幾何平均力価(ＧＭＴ)は図５１に示す。
ＢＮＴ１６２ｂ２の安全性および忍容性
１８〜５５歳群
この年齢群の安全性データは、投与２後全用量レベルで入手可能である。局所反応は図５２に示す。全身性事象は図５３に示す。
６５〜８５歳群
この年齢群の安全性データは、投与２後全用量レベルで入手可能である、しかしながら、１０μg用量レベルのデータは一部のみである。局所反応は図５４に示す。全身性事象は図５５に示す。
ＢＮＴ１６２ｂ２の免疫原性
１８〜５５歳群
この年齢群で免疫原性データは３０μg用量レベルは投与１後ならびに１０μgおよび２０μg用量レベルで投与２後入手可能である。Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣは図５６に示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和ＧＭＴは図５７に示す。
６５〜８５歳群
この年齢群で免疫原性データは、２０μgおよび３０μg用量レベルで投与２後入手可能である。Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣは図５８に示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和ＧＭＴは図５９に示す。
結論
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２(および特に配列番号２０)の局所忍容性プロファイルおよび免疫応答データは、２候補間で類似する。ＢＮＴ１６２ｂ２(特に配列番号２０)は、好都合な全身反応原性プロファイルを示し得る(特に６５〜８５歳群で)。ＢＮＴ１６２ｂ２(特に配列番号２０)の用量レベルを選択するとき、６５〜８５歳群でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体応答レベルは、疾患重症化のリスクが最高であるこの年齢群の中和抗体応答を最大化するよう重みを付けることができる。この治験での２０μgおよび３０μg年配成人コホートの中和抗体レベルを比較して、３０μg用量レベルは、２０μgコホートより高い中和抗体レベルを示した(図５９)。ＧＭＴ９４のヒト回復期血清パネル(ＨＣＳ)の中和抗体レベルと比較して、３０μg用量レベルのＧＭＴはＨＣＳのＧＭＴの１.６倍であった；２０μg用量レベルのＧＭＴはＨＣＳのＧＭＴの０.９倍であった。故に、いずれも、ヒト回復期血清パネルと少なくとも同等な中和抗体力価を示した。３８ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染／ＣＯＶＩＤ−１９回復期血清を、ＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後かつ参加者が無症候であるときに１８〜８３歳参加者から得た。血清ドナーの大部分は症候性感染症を有し(３５／３８)、１名は入院していた。血清を、Sanguine Biosciences(Sherman Oaks, CA)、MT Group(Van Nuys, CA)およびPfizer Occupational Health and Wellness(Pearl River, NY)から得た。さらに、年配(図５８、投与２後)および若年(図５６、投与１後)成人コホート両者のＳ１−ＩｇＧ抗体結合濃度も、３０μg用量レベルの選択を支持した。ＢＮＴ１６２ｂ２のドイツ試験で作成された予備的ヒトＴ細胞データは、ＲＮＡプラットフォームで期待される頑強なＣＤ４＋およびＣＤ８＋を確認する。これらの考察と共に、フェーズ２ｂ／３に進むための３０μg用量レベルでのＢＮＴ１６２ｂ２(特に配列番号２０が、この用量および構築物の使用が、若年および年配成人でＣＯＶＩＤ−１９に対する保護を提供する可能性のある、好都合な反応原性プロファイルおよび頑強免疫応答の最適な組み合わせを提供するため、提案される。
実施例９：ＣＯＶＩＤ−１９ワクチンＢＮＴ１６２の免疫学
１８〜８５歳成人でフェーズ２／３に進むための支持として、ここに提供されるのは、マウスでおよびＢＮＴ１６２での治験に登録されたヒトでのＢＮＴ１６２ｂ２免疫化後のＴ細胞応答を要約する非臨床的および臨床的データである。次の免疫原性データが提供される。
１. 予備的および未監査マウス免疫原性データ：ＩＦＮγ ELISpot(図６０)、細胞内サイトカイン染色およびＢＮＴ１６２ｂ２免疫化後産生されたサイトカインのLuminex定量。
２. ドイツ治験(ＢＮＴ１６２−０１)から：１８〜５５歳参加者の１０μg用量レベルでの最初の投与前および投与２の７日後のＢＮＴ１６２ｂ２についてのＩＦＮγ ELISpot(図６１、図６２、図６３)。
マウスでのＢＮＴ１６２ｂ２に対するＴ細胞応答
４群の８雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、動物あたり０.２μg、１μgまたは５μg用量のＢＮＴ１６２ｂ２(特に配列番号２０)または緩衝液単独(対照群)で、筋肉内(ＩＭ)注射により０日目に免疫化した。１２日目および２８日目、脾臓を脾細胞単離のために採取し、ＩＦＮγ ELISpotアッセイを使用してＴ細胞応答を分析した。Luminexアッセイおよび細胞内サイトカイン染色(ＩＣＳ)を、サイトカイン応答を評価するために実施した。両ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞表現型の脾細胞の高い分画が、完全長Ｓペプチド・ミックスでエクスビボ再刺激したとき、免疫化１２日目および２８日目にＢＮＴ１６２ｂ２免疫化マウスから単離され、ELISpotおよびフローサイトメトリーアッセイで強力な抗原特異的ＩＦＮγおよびＩＬ−２応答を示した(図６０ａおよびｂ)。２８日目に採取し、完全長Ｓペプチドプールで刺激した脾細胞は、マルチプレックスイムノアッセイで高レベルのＴＨ１サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮγと対応して最小レベルのＴＨ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を生じた(図６０ｃ)。
ドイツ治験からのＢＮＴ１６２ｂ２に対するヒトにおけるＴ細胞応答
ＢＮＴ１６２ｂ２(特に配列番号２０)でのヒト免疫化により誘発されるＴ細胞表現型を評価するために、ＩＦＮγ ELISpotをドイツ治験の参加者から得た末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)で実施した。
ＩＦＮγ ELISpot
ワクチン誘導Ｔ細胞応答を、投与１前および２９日目(投与２の７日後)対象から得たＣＤ４またはＣＤ８枯渇ＰＢＭＣを使用して、決定した。ＩＦＮγ ELISpotデータを、１日目および２２日目に１０μgのＢＮＴ１６２ｂ２(特に配列番号２０)で免疫化した５対象について作成した。ワクチン接種後スパイク特異的エクスビボＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、それぞれ５／５(１００％)対象で観察された。全応答は、ワクチン接種前サンプルで最小または検出不可能であった。応答は、ワクチンが誘発したと考えられる(図６１、図６２、図６３)。
Ｓペプチドプール１(受容体結合ドメイン[ＲＢＤ]を含むスパイクのＮ末端部分)およびＳペプチドプール２(スパイクのＣ末端部分)刺激によるＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン誘発、抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスおよび破傷風毒素に対する同じ対象の記憶応答と同等かまたは高かった(図６３)。
結論
ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン候補のこれらのデータは、前臨床モデルおよびｍｏｄＲＮＡ(ヌクレオシド修飾)プラットフォームで免疫化したヒトから得られた先の結果を確認する。データは、ｍｏｄＲＮＡが相当なＴｈ１型ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す。
実施例１０：三量体ＡＲＳ−ＣｏＶ−２受容体結合ドメインＲＮＡワクチンは、非ヒト霊長類で高度に免疫原性かつ保護的である
ここで、ＢＮＴ１６２ｂ１ワクチン候補の設計および非臨床的開発を報告する。有効な筋肉内送達のために脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)に被包された、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の構造的に安定な、三量体化受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)をコードするヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、マウスで強力な抗体およびＴＨ１支配細胞性免疫応答を誘導する。ＢＮＴ１６２ｂ１の１回投与によるマウスの免疫化は、シュードウイルス中和力価の相当な用量レベル依存的増加および強いＩＦＮγ陽性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。アカゲザルでのＢＮＴ１６２ｂ１のプライム−ブーストワクチン接種は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２回復期ヒト血清パネルの２.６〜６.０倍である確実なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和幾何平均力価を誘導した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染性暴露により、免疫化マカクは、鼻および肺においてウイルスＲＮＡが存在しないか、または存在するのが非免疫化対照マカクより短期であった。
材料および方法
倫理記述。
全マウス試験は、BioNTech SEで実施し、プロトコールは地元当局(地元委員会委員会)におり承認され、ＦＥＬＡＳＡ推奨に従い、German Animal Welfare Act and Directive 2010/63/EUに基づき実施した。異論のない健康状態の動物のみ、試験過程で選択した。
非ヒト霊長類(ＮＨＰ)試験のための免疫化は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC, Animal Assurance #: 000452)により承認されたUniversity of Louisiana at Lafayette-New Iberia Research Center(ＮＩＲＣ)で実施した。研究は、USDA Animal Welfare Act and Regulations and the NIH Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules, and Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratoriesに従った。全課程を、規制および確立されたガイドラインに従い、これら動物で実施し、Institutional Animal Care and Use Committeeによりまたは倫理審査過程でレビューされた。ＮＨＰ試験のための感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露は、Southwest National Primate Research Centerで実施した。動物畜産はAAALAC International and the NIH Guide for the Care of Use of Laboratory Animalsの推奨する標準に従った。この試験は、Texas Biomedical Research Institute Animal Care and Use Committeeにより承認された。
タンパク質およびペプチド試薬。
マウスＩｇＧ１定常領域との精製組み換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ融合体をウェスタンブロットの標的として使用し、ヒトＦｃタグ(何れもSino Biological)でタグ付けして、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ特異的ＩｇＧを検出するＥＬＩＳＡで使用した。ヒスチジンタグ(Sino Biological)を有する精製組み換えＲＢＤを表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)スペクトロスコピーに使用した。Ｓタンパク質の重複１５量体ペプチドプールをELISpot、サイトカインプロファイリングおよび細胞内サイトカイン染色に使用した。ペプチド対照(SPSYVYHQF、ｇｐ７０ ＡＨ−１由来(Slansky, J. E. et al., Immunity 13, 529-538, 2000))をELISpotアッセイで対照として使用した。全ペプチドをJPT Peptide Technologiesから得た。
ヒト回復期血清。
ヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清(ｎ＝３８)を、ＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後かつ参加者が無症候であったときに１８〜８３歳ドナーから得た。血清ドナーは、症候性感染症を有していたか(３５／３８)または入院していた(１／３８)。血清を、Sanguine Biosciences(Sherman Oaks, CA)、MT Group(Van Nuys, CA)およびPfizer Occupational Health and Wellness(Pearl River, NY)から得た。
細胞培養。
ヒト胚腎臓(ＨＥＫ)２９３Ｔ／１７およびＶｅｒｏ−７６細胞(いずれもＡＴＣＣ)を、１０％ウシ胎児血清(Sigma-Aldrich)添加GlutaMAXTM(Gibco)含有ダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)で培養した。細胞株を、受領後、増殖および凍結保存前にマイコプラズマ汚染について試験した。Ｖｅｒｏ Ｅ６およびＶｅｒｏ ＣＣＬ８１(何れもＡＴＣＣ)細胞を、２％HyCloneウシ胎児血清および１００Ｕ／mL アオカビ／ストレプトマイシン(Gibco)含有ＤＭＥＭ(Gibco)で培養した。Expi293FTM細胞をExpi293TM培地で増殖し、ExpiFectamineTM293を使用して一過性にトランスフェクトした(全てThermo Fisher Scientificから)。
インビトロ転写ＲＮＡの製造
ＲＮＡ合成の鋳型を産生するために、シグナルペプチド(ＳＰ、アミノ酸１〜１６)、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ ＲＢＤ(GenBank：ＭＮ９０８９４７)およびＴ４フィブリチン三量体化モチーフ(‘フォルドン’)からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、ＲＮＡ安定性および翻訳効率を改善するための主鎖配列要素を有する出発プラスミドベクターにクローン化した(Orlandini von Niessen, A. G. et al., Mol Ther 27, 824-836; 2019; Holtkamp, S. et al., Blood 108, 4009-4017, 2006)。非コード主鎖要素は、Ｔ７プロモーターから５’および３’ ＵＴＲまでの領域に加えてリンカー(Ａ３０ＬＡ７０、１０ヌクレオチド)により中断されたポリ(Ａ)テイル(１００ヌクレオチド)を含んだ。ＤＮＡを精製し、分光光度的に定量し、ウリジン−５’−三リン酸(ＵＴＰ)の代わりにトリヌクレオチドキャップ１アナログ((ｍ２ ７,３’−Ｏ)Ｇｐｐｐ(ｍ２’−Ｏ)ＡｐＧ；TriLink)およびＮ１−メチルシュードウリジン−５’−三リン酸(ｍ１ΨＴＰ；Thermo Fisher Scientific)の存在下、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロ転写した(Grudzien-Nogalska, E. et al., Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 969, 55-72, 2013)。ＲＮＡを磁性粒子を使用して精製したBerensmeier, S., Appl.Microbiol.Biotechnol. 73, 495-504, 2006)、完全性をマイクロフルイディックキャピラリ電気泳動(Agilent Fragment Analyser)により評価し、濃度、ｐＨ、浸透圧、エンドドキシンレベルおよびバイオバーデンを決定した。
ＲＮＡの脂質−ナノ粒子製剤。
精製ＲＮＡを、イオン化可能カチオン性脂質のエタノール性脂質混合物を使用してＬＮＰに製剤化し、ダイアフィルトレーションにより水性緩衝系に移動させて、先に記載されたものに類似するＬＮＰ組成物を得た(Maier, M. A. et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 1570-1578, 2013)。ＢＮＴ１６２ｂ１を、−７０℃で、０.５mg／mL濃度で保管した。
ｍＲＮＡトランスフェクション。
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、１８時間インキュベーションにより、トランスフェクション試薬混合ＢＮＴ１６２ｂ１ ＲＮＡまたはＢＮＴ１６２ｂ１でトランスフェクトした。非ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡ(ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーに１μg、免疫蛍光に２.５μg)をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地(Thermo Fisher Scientific)で希釈し、製造業者(RiboJuice, Merck Millipore)の指示に従い、トランスフェクション試薬と混合した。
ウェスタンブロット分析。
ＢＮＴ１６２ｂ１ ＲＮＡをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞のライセートを、１０％Mini-Protean TGXプレキャストポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad)を用いる変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。ニトロセルロース膜(Carl Roth)への移動を、半乾燥移動系(Trans-Blot Turbo Transfer System, Bio-Rad)を使用して実施した。ブロットしたタンパク質を、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｓの組み換えＳ１フラグメントに対して誘導させた一次ウサギポリクローナル抗体(SinoBiological)および二次抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)コンジュゲート抗体(Sigma Aldrich)で検出した。ブロットを、SuperSignal West Femto chemiluminescent substrate (Thermo Fisher Scientific)で展開し、Image Lab software version 5.0を使用するBio-Rad ChemiDoc systemで造影した。
免疫蛍光。
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)で固定し、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)／０.２％Triton X-100で透過処理した。遊離結合部位をブロックし、細胞をＳ１サブユニットを認識するウサギポリクローナル抗体(SinoBiological)および抗ウサギＩｇＧ二次抗体(Jackson ImmunoResearch)または標識コンカナバリンＡ(Invitrogen)とインキュベートした。ＤＮＡをHoechst(Life Technologies)で染色した。Leica SP8共焦点顕微鏡で画像を獲得した。
フローサイトメトリー。
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を固定可能生死判定色素(eBioscience)で染色した。固定(Fixation Buffer, Biolegend)後、細胞を透過処理(Perm Buffer, eBioscience)し、モノクローナルＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクＳ１抗体(SinoBiological)で染色した。細胞をBD FACSDiva software version 8.0.1を使用してFACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)に獲得し、FlowJo software version 10.6.2(FlowJo LLC, BD Biosciences)で分析した。
末梢血でのマウスＴ細胞分析のために、５０μLの採血したての血液から赤血球を溶解させ(ACK lysing buffer, Gibco)、細胞をフロー緩衝液(２％ＦＣＳ、２mM ＥＤＴＡ[いずれもSigma]および０.０１％ナトリウムアジド[Morphisto]添加ＤＰＢＳ[Gibco])中Ｆｃブロックの存在下、固定可能生死判定色素(eBioscience)および一次抗体で染色した。フロー緩衝液中二次ビオチン結合抗体で染色後、細胞を、フロー緩衝液で希釈したBrilliant Stain Buffer Plus(BD Bioscience)中、直接標識抗体およびストレプトアビジンで表面マーカーを細胞外染色した。細胞を２％RotiHistofix(Carl Roth)で固定化し、一夜透過処理(Perm緩衝液、ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セット、eBioscience)した。透過性細胞をＦｃブロックで細胞内処理し、Perm緩衝液中、転写因子に対する抗体で染色した。
リンパ系組織でのマウスＴ細胞分析のために、１×１０６リンパ節および４×１０６脾細胞を、直接標識抗体で生存能および細胞外抗原について染色した。細胞を２％RotiHistofixで洗浄し、一夜固定した(Ｆｉｘ／Perm緩衝液、ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セット、eBioscience)。細胞内染色を血液Ｔ細胞染色について記載のとおり実施した。リンパ系組織でのマウスＢ細分類のために、２.５×１０５リンパ節および１×１０６脾細胞をＦｃブロックで処理し、血液Ｔ細胞染色について記載のとおり生存能および細胞外抗原を染色し、２％RotiHistofixで一夜固定した。Ｔ細胞におけるマウス細胞内サイトカイン染色について、１×１０６リンパ節および４×１０６脾細胞を、GolgiStopおよびGolgiPlug(何れもBD Bioscience)存在下、５時間０.２μg／mL 最終濃度／ペプチドの完全長Ｓペプチド・ミックスでエクスビボ再刺激した。細胞を、リンパ系Ｔ細胞染色について記載のとおり生存能および細胞外抗原を染色した。細胞を２％RotiHistofixで固定し、一夜透過処理した。細胞内染色を血液Ｔ細胞染色について記載のとおり実施した。
マウス細胞を、それぞれBD FACSDiva software version 9.1または8.0.1.1を使用して、BD Symphony A3またはBD Celesta(Ｂ細分類)フローサイトメーター(BD Bioscience)に獲得し、FlowJo 10.6(FlowJo LLC, BD Biosciences)で分析した。
タンパク質発現および精製。
生化学および構造分析のためにＢＮＴ１６２ｂ１によりコードされるＲＢＤフォルドンを発現するために、ＲＮＡコード配列に対応するＤＮＡをpMＣＧ１３０９ベクターにクローン化した。Ｃ末端Ｈｉｓ−１０およびＡｖｉタグを有するヒトＡＣＥ２のアミノ酸１〜６１５をコードするプラスミドを、Expi293F細胞におけるＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン(ＡＣＥ２ ＰＤ)の一過性発現のために産生した。ＡＣＥ２／Ｂ０ＡＴ１複合体をExpi293F細胞の２つのプラスミドの共発現により産生しており、その一方はＡＣＥ２アミノ酸１〜１７、続くヘマグルチニンおよびＳｔｒｅｐ IIタグおよびＡＣＥ２アミノ酸１８〜８０５をコードし、他方はメチオニン、続くＦＬＡＧタグおよびヒトＢ０ＡＴ１のアミノ酸２〜６３４を含む。
分泌型ＡＣＥ２ ＰＤを、Nickel Excel resin(GE Healthcare)を使用して、続いてＰＢＳ中Superdex200 10/30カラム(GE Healthcare)上のゲル濾過クロマトグラフィーにより、条件付け細胞培養培地から単離した。１mLの４％ビーズ状アガロースあたり約５mgの精製ＡＣＥ２ ＰＤが、AminoLink Plus resin(Thermo Fisher Scientific)を使用するアミンカップリングにより、共有結合した。ＲＢＤ三量体を、ＡＣＥ２ ＰＤ架橋アガロースとの親和性捕捉により条件付け培地から精製し、３Ｍ ＭｇＣｌ２で樹脂から精製した。透析後、タンパク質を、１０％グリセロール含有ＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水(ＨＢＳ)中、Superdex200 10/300カラムを使用するゲル濾過により濃縮および精製した。ＡＣＥ２／Ｂ０ＡＴ１複合体の精製は、先に記載の方法に基づいた(Yan, R. et al., Science (New York, N.Y.) 367, 1444-1448, 2020)。ＡＣＥ２／Ｂ０ＡＴ１／ＲＢＤ三量体複合体を形成するために、ＡＣＥ２／Ｂ０ＡＴ１アリコートを、ＡＣＥ２／Ｂ０ＡＴ１サイズ排除クロマトグラフィー緩衝液(２５mM Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１５０mM ＮａＣｌ、０.０２％グリコジオスゲニン)で希釈した精製ＲＢＤフォルドンと、ＲＢＤ三量体対ＡＣＥ２プロモーター３：１モル比で合わせた。４℃で３０分間インキュベーション後、サンプルを濃縮し、Superose 6 Increase 10/300 GLカラムで分離した。複合体を含むピークフラグメントを集め、濃縮した。
表面プラズモン共鳴スペクトロスコピー。
マウスＲＢＤ特異的血清ＩｇＧの結合動態を、Biacore T200デバイス(Cytiva)でＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液(BR100669, Cytiva)を用いて２５℃で決定した。ＣＭ５センサーチップマトリクスのカルボキシル基を１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロライド(ＥＤＣ)およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)の混合物で活性化し、アミン基と反応させる活性エステルを形成した。抗マウス−Ｆｃ−抗体(Jackson ImmunoResearch)を、約１０,０００応答単位(ＲＵ)の固定化レベルまで共有結合カップリングさせるために、１０mM 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５(３０μg／mL)で希釈した。センサー表面の遊離Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、エタノールアミンで不活性化した。
マウス血清をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１：５０希釈し、固定化抗体を補足するための活性フローセルに３０秒間１０μL／分で適用し、一方対照フローセルを緩衝液で処理した。ＲＢＤ−Ｈｉｓ(Sino Biological Inc.)への捕捉マウスＩｇＧ抗体の結合分析を、多サイクル動態学的方法で、１.５６２５〜５０nM範囲の濃度を使用して実施した。１８０秒の結合時間が、４０μL／分の一定流速の６００秒の解離時間および最終再生工程に続いた。結合動態を包括的動態学的フィットモデル(１：１ラングミュア、Biacore T200 Evaluation Software Version 3.1, Cytiva)を使用して計算した。
バイオレイヤー干渉法。
ＲＢＤフォルドンのＡＣＥ２−ＰＤへの結合を、２５℃で１０mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、１５０mM ＮａＣｌおよび１mM ＥＤＴＡからなる緩衝液中、Octet RED384(ForteBio)上のバイオレイヤー干渉法により測定した。Ａｖｉタグ付ヒトＡＣＥ２ ＰＤをストレプトアビジン被覆センサーに固定化した。結合データを、ＲＢＤ三量体の濃度シリーズについて結合は１０分間および解離は１５分集めた。データを、対照減算し、０.９６より大きなＲ２値で１：１結合モデルにフィットさせ、Octet Data Analysis Software v10.0(ForteBio)を使用して結合の動態および親和性を分析した。相互作用の解離速度(ｋｄ)は、本装置の測定限界より低く、結合親和性(ＫＤ)を１×１０−６ｓ−１の推定解離速度ｋｄを使用して、推定した。
ネガティブ染色サンプルの電子顕微鏡。
精製ＲＢＤ三量体タンパク質の４μLを、フォルムバールおよび非晶質炭素(Ted Pella)を重層したグロー放電銅グリッドに適用した。染色を、製造業者のプロトコールに従いNano-W organotungstate stain(Nanoprobes)で実施し、サンプルを、２００kVで操作するFEI TF-20顕微鏡で、６２,０００倍の倍率および−２.５μmのデフォーカスを使用して造影した。顕微鏡写真を、CTFFIND-4.1を使用してRELIONでコントラスト伝達関数補正された(Rohou, A. & Grigorieff, N., Journal of structural biology 192, 216-221, 201)。小さな手動で選んだデータセットを、自動ピッキングのための２Ｄ対照を作成するために使用した。得られた粒子セットを、RELION 3.0.6で２Ｄ分類に付した(Zivanov, J. et al., eLife 7; 10.7554/eLife.42166 (2018))。
低温電子顕微鏡。
４μL中、６mg／mLの精製ＡＣＥ２／Ｂ０ＡＴ１／ＲＢＤ三量体複合体を、残存空気中にグロー放電させた、金Quantifoil R1.2/1.3 200メッシュグリッドを、Pelco Easiglowを使用して、３０秒間、２０mAで適用した。サンプルを、−３の力で、５秒間Vitrobot Mark IVを使用してブロットし、その後液体窒素で冷却した液体エタンに注入した。合わせて、７,４５５顕微鏡写真を、Gatan K2 Summit直接電子検出器を備えた３００keVで操作する、Titan Krios上で単一グリッドから、検体レベルで１６５,０００倍の倍率で、０.４３５Åの拡大ピクセルサイズでの超解像モードで得た。データを、−１.２〜−３.４μmのデフォーカス範囲で、１.３０ｅ−／Å２／フレームについて６秒暴露にわたり４０フレームに分割された、総電子線量５２.０６ｅ−／Å２で集めた。最初のモーション補正をWarp(Tegunov, D. & Cramer, P., Nature methods 16, 1146-1152, 2019)で実施し、その間超解像データをビン分割して、ピクセルサイズ０.８７Åを得た。補正顕微鏡写真をRELION 3.1-BETA(Zivanov, J. et al., eLife 7; 10.7554/eLife.42166 (2018))に、CTFFIND-4.1(Rohou, A. & Grigorieff, N., Journal of structural biology 192, 216-221, 201)でのＣＴＦ概算のためにインポートした。粒子を、RELIONにより実装されているLaPlacian-of-Gaussian粒子ピッキングアルゴリズムを使用ピックし、４５０ピクセルのボックスサイズで抽出した。２Ｄ分類により得られた対照を第二ラウンドの対照ベースの自動ピッキングに使用し、７１５,３５６粒子のデータセットを得た。粒子不均一性を、２８０nmのマスクサイズで２Ｄおよび３Ｄ分類でノイズ除去し、各ＲＢＤ三量体における非ＡＣＥ２結合ＲＢＤコピーをノイズ除去し、８７,４８７粒子のセットを得て、これをＣ２対称性で３.７３Åに緻密化した。粒子からミセルおよびＢ０ＡＴ１密度を減じた後の緻密化は、３.２４Åのマップを改善させる。PDB ID 6M17(Yan, R. et al., Science (New York, N.Y.) 367, 1444-1448, 2020)からの原子モデルは、３.２４Å密度にフィットさせた剛体であり、次いで、Coot(Emsley, P. et al., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 486-501, 2010)で構築されたマニュアルと交互のPhenix(Adams, P. D. et al., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 213-221, 2010)における実空間緻密化を使用して、密度に柔軟性フィットさせた。顕微鏡SerialEM software version 3.8.0 betaを使用して画像獲得のために操作した(Mastronarde, D. N., Journal of structural biology 152, 36-51, 2005)。バイオレイヤー干渉法データをOctet Data Acquisition software version 10.0.0.87で集め、処理を、ForteBio Data Analysis software version 10.0を使用して実施した。
免疫化。
マウス。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス(Janvier；８〜１２週齢)を、群に無作為に割り当てた。ＢＮＴ１６２ｂ１をＰＢＳ、３００mMスクロースまたは食塩水(０.９％ＮａＣｌ)で希釈し、イソフルラン麻酔下、２０μL体積で腓腹筋にＩＭ注射した。
アカゲザル(Macaca mulatta)。雄性アカゲザル(２〜４歳)を無作為に割り当て、０日目および２１日目に左四頭筋にＩＭ注射により投与される、０.５mL体積のＢＮＴ１６２ｂ１または食塩水プラセボ対照を与えた。血清およびＰＢＭＣのための血液を、NIRC Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された動物プロトコール２０１７−８７２５−０２３に従い集めた。動物を、採血および免疫化中ケタミンＨＣｌ(１０mg／kg；ＩＭ)で麻酔し、適切な鎮静についてモニターした。
アカゲザルのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２接種物を、予めTexas Biomedical Research Institute (San Antonio, Texas)で調製され、単回使用バイアルに等分され、−７０℃で保管した２.１×１０６PFU／mLのストックから得た。作業ウイルスストックを、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０単離株(BEI Resourcesから４継代シードストック購入；NR-52281)の２つの継代から産生した。ウイルスは、ディープシークエンシングによりＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と確認され、公開配列(GenBank accession number MN985325.1)と同一であった。
ＢＮＴ１６２ｂ１免疫化(ｎ＝６)および同齢食塩水対照免疫化(ｎ＝６)雄性アカゲザル(対照)を、先に記載のとおり、鼻腔内(ＩＮ；０.２mL)および気管内(ＩＴ；０.２mL)経路に等しく分けた、１×１０６プラーク形成単位のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０単離株に曝した(Singh, D. K. et al., SARS-CoV-2 infection leads to acute infection with dynamic cellular and inflammatory flux in the lung that varies across nonhuman primate species, 2020)。暴露を２回目の免疫化４１〜４８日後実施した。別の年齢および性別適合非免疫化センチネル群(ｎ＝３)は、１０％ＦＣＳ ＩＮ(０.２mL)およびＩＴ(０.２mL)添加ＤＭＥＭのみ受けた。暴露約２週間前、動物を、Southwest National Primate Research Center (SNPRC; San Antonio, TX)の動物バイオセイフティーレベル３(ＡＢＳＬ−３)施設に移した。動物を、直腸温、体重および身体検査について委員会認定獣医臨床医により定期的にモニターされた。検体採取を記載のとおり、チレタミンゾラゼパム(Telazol)麻酔下に実施した(Singh, D. K. et al., SARS-CoV-2 infection leads to acute infection with dynamic cellular and inflammatory flux in the lung that varies across nonhuman primate species, 2020)。鼻腔スワブを、マカクから接種０日、１日、３日および６日後に集め、ウイルス力価を評価した。気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)を２０mLの食塩水を４回注入することにより、暴露前週ならびに接種後３日目および６日目に実施した。これらの洗液を集め、等分し、−７０℃で凍結保管した。
逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検出および定量するために、ウイルスＲＮＡを、先に記載のとおり鼻腔スワブおよびＢＡＬ検体から抽出し(Mehra, S. et al., The Journal of infectious diseases 207, 1115-1127, 2013; Gautam, U. S. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 115, E62-E71; 2018; Joosten, S. A. et al., PLoS pathogens 6, e1000782, 2010)、先に記載されているとおりＲＴ−ｑＰＣＲで試験した(Singh, D. K. et al., SARS-CoV-2 infection leads to acute infection with dynamic cellular and inflammatory flux in the lung that varies across nonhuman primate species, 2020)。簡潔には、１０μg 酵母ｔＲＮＡおよび１×１０３PFUのＭＳ２ファージ(大腸菌バクテリオファージＭＳ２、ＡＴＣＣ)を解凍した各サンプルに加え、ＲＮＡ抽出を、NucleoMag Pathogen kit(Macherey-Nagel)を使用して実施した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＴ−ｑＰＣＲを、QuantStudio 3 instrument(Applied Biosystems)でＣＤＣ開発2019-nCoV_N1アッセイを使用して抽出ＲＮＡで実施した。陽性のカットオフ(検出限界、ＬＯＤ) は、反応(８００ＧＥ／mL)あたり１０遺伝子等価(ＧＥ)で確立された。サンプルをデュプリケートで試験した。６日目、対照群からの１ＢＡＬ検体およびＢＮＴ１６２ｂ１免疫化群からの鼻腔スワブからの１日目は、反復測定で、ＬＬＯＤの何れかの側のウイルスＲＮＡレベルを有した。これらの検体は、不確定として定義され、グラフおよび分析から除外した。
組織調製物。
マウス。末梢血を、イソフルラン麻酔下、後眼窩静脈叢または顔面静脈から集めた。血液を５分間、１６.０００×ｇで遠心分離し、血清を下流アッセイに即時に使用するかまたは−２０℃で保管した。脾臓単一細胞懸濁液を、３mLシリンジ(BD Biosciences)のプランジャーを使用して、７０μmセルストレイナー(BD Falcon)の表面に組織を連続的に打ち付けることにより、ＰＢＳ中で調製した。赤血球を低張溶解により除去した。膝窩、鼠径および腸骨リンパ節をプールし、小片に切断し、コラゲナーゼＤ(１mg／mL；Roche)で消化させ、セルストレイナーを篩過させた。
アカゲザル(Macaca mulatta)。血清およびＰＢＭＣのための血液を、NIRC Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された動物プロトコール2017-8725-023に従い集めた。
ＲＢＤ結合ＩｇＧ抗体アッセイ。
マウス血清について、MaxiSorpプレート(Thermo Fisher Scientific)を、炭酸ナトリウム緩衝液中組み換えＲＢＤ(１００ng／１００μL)で被覆し、結合ＩｇＧをＨＲＰコンジュゲート二次抗体およびＴＭＢ基質(Biotrend)を使用して検出した。データ採取を、BioTek Epoch readerおよびGen5 software version 3.0.9を使用して実施した。濃度分析のために、特定のサンプルのシグナルを、アイソタイプ対照の標準曲線と相関させた。アカゲザルおよびヒト血清について、Ｃ末端AvitagTM(Acro Biosystems)を含有組み換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤストレプトアビジン被覆Luminexマイクロスフェアに結合させた。血清に存在する結合したアカゲザルまたはヒト抗ＲＢＤ抗体を蛍光標識ヤギ抗ヒトポリクローナル二次抗体(Jackson ImmunoResearch)で検出した。データをBioplex200 system(Bio-Rad)を使用して中央蛍光強度(ＭＦＩ)として捕捉し、任意に１００Ｕ／mL濃度に割り当てた、抗体枯渇ヒト血清で希釈された５つのプールされたヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清サンプル(ＰＣＲ診断１４日より後得た)からなる対照標準曲線で、血清希釈因子を考慮して、Ｕ／mL抗体濃度に変換した。
ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクバリアントシュードウイルス中和。
ＶＳＶ−Ｇ(ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰ)ではなく、ＧＦＰをコードする組み換え複製欠損水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)ベクターを、公開されたシュードタイピングプロトコールによりＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質でシュードタイプ化した(Berger Rentsch, M. & Zimmer, G., PLoS ONE 6, e25858, 2011; Lester, S. et al., Access Microbiology 1, 20290, 2019)。簡潔には、Ｃ末端細胞質１９アミノ酸が切断されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ(ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓ−ＣΔ１９)を発現するようトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７単層をＶＳＶΔＧ−ＧＦＰベクターで接種した。１時間、３７℃でインキュベーション後、接種物を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後抗ＶＳＶ−Ｇ抗体(クローン８Ｇ５Ｆ１１、Kerafast Inc.)添加培地を加えて、残存入力ウイルスを中和した。ＶＳＶ／ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス含有中程度を接種２０時間後回収し、０.２μmフィルター処理し、−８０℃で保管した。
Ｖｅｒｏ−７６細胞を９６ウェルプレートに播種した。マウス血清サンプルの連続希釈を調製し、１０分間、室温でＶＳＶ／ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス懸濁液(４.８×１０３感染単位[ＩＵ]／mL)とプレインキュベートし、その後Ｖｅｒｏ−７６細胞に混合物を映した。接種Ｖｅｒｏ−７６細胞を２０時間、３７℃でインキュベートした。プレートをIncuCyte Live Cell Analysis system(Sartorius)に入れ、３０分間インキュベートして、その後分析した(IncuCyte 2019B Rev2 software)。明視野およびＧＦＰ蛍光の全ウェル走査を、４倍対物レンズを使用して実施した。５０％シュードウイルス中和力価(ｐＶＮＴ５０)は、無血清シュードウイルス陽性対照の平均と比較して、ウェルあたりＧＦＰ陽性感染細胞数を５０％減少させる最初の血清希釈の逆数として報告された。各血清サンプル希釈はデュプリケートで試験した。
ヒト回復期およびアカゲザル血清によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイ逆遺伝学によりレスキューされ、ウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム７へのmNeonGreen(ｍＮＧ)遺伝子の挿入により操作された、先に記載されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２株(ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０)を使用した(Xie, X. et al., Cell host & microbe 27, 841-848.e3, 2020)。このレポーターウイルスは、野生型ウイルスに類似するプラーク形態および区別不可能な増殖曲線を産生する。ウイルスマスターストックは、先に記載のとおりＶｅｒｏ Ｅ６細胞で増殖させた(Lester, S. et al., Access Microbiology 1, 20290, 2019)。ヒト回復期血清検体を試験するとき、蛍光中和アッセイは、慣用のプラーク減少中和アッセイと同等な結果を生じた。熱不活性化血清の連続希釈を、レポーターウイルス(２×１０４PFU／ウェル)と１時間、３７℃でインキュベートして、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ８１単層の約１０〜３０％感染率を得て、その後９６ウェルプレートでＶｅｒｏ ＣＣＬ８１細胞単層(８,０００〜１５,０００細胞／ウェルが目標)で接種して、感染細胞の正確な定量を可能とした。総細胞数／ウェルを核染色(Hoechst 33342)により計数し、蛍光ウイルス感染巣を、Cytation 7 Cell Imaging Multi-Mode Reader(Biotek)とGen5 Image Prime version 3.09を用いて、接種１６〜２４時間後検出した。力価を、各連続血清希釈でパーセント中和の４パラメータ(４ＰＬ)ロジスティックフィットを作成することにより、GraphPad Prism version 8.4.2で計算した。５０％中和力価(ＶＮＴ５０)は、蛍光ウイルス巣の５０％減少をもたらす希釈の内挿された逆数として報告された。
ＩＦＮγ ELISpot。
ELISpotアッセイを、製造業者(Mabtech)の指示に従い、マウスＩＦＮγ ELISpotＰＬＵＳキットで実施した。計５×１０５脾細胞を、エクスビボで完全長Ｓペプチド・ミックス(０.１μg／mL 最終濃度／ペプチド、ＪＰＴ)または対照(ｇｐ７０−ＡＨ１[SPSYVYHQF](Slansky, J. E. et al., Immunity 13, 529-538, 2000)、ＪＰＴ、４μg／mL；コンカナバリンＡ(ＣｏｎＡ)、Sigma、２μg／mL)で再刺激した。ストレプトアビジン−ＡＬＰおよびBCIP/NBT-plus基質を加え、スポットをELISpotプレートリーダー(ImmunoSpot(登録商標)S6 Core Analyzer, CTL)を使用して計数した。スポット数を、ImmunoCapture Image Aquision Software V7.0およびImmunoSpot 7.0.17.0 Professionalを使用して、評価した。Ｔ細胞分類について、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造業者の指示に従いＭＡＣＳマイクロビーズ(CD8a [Ly-2], Miltenyi Biotec)を使用して、脾細胞懸濁液から単離した。フロースルーをＣＤ４＋Ｔ細胞源として利用した。ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、その後完全長Ｓペプチド・ミックス(０.１μg／mL 最終濃度／ペプチド)または対照として培地を負荷した同系骨髄由来樹状細胞で再刺激した。単離Ｔ細胞サブセットの純度をフローサイトメトリーで決定して、１×１０５ ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのスポット数を計算した。
サイトカインプロファイリング。
マウス脾細胞を、完全長Ｓペプチド・ミックス(０.２μg／mL 最終濃度／ペプチド)または培地のみで４８時間再刺激した。上清中のＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−５の濃度を、製造業者の指示に従い、ビーズベースの、11-plex TH1/TH2 mouse ProcartaPlex multiplex immunoassay(Thermo Fisher Scientific)を使用して決定した。蛍光をBioplex200 system(Bio-Rad)で測定し、ProcartaPlex Analyst 1.0 software(Thermo Fisher Scientific)で分析した。
統計および再現性。
予定された群およびサンプルサイズ(ｎ)について統計方法を使用しなかった。全実験を１回実施した。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析について報告されたＰ値を、PROC GENMOD from SAS(登録商標)9.4を使用して処置および日にちの効果をロジット・リンクさせた二項応答(暴露後ウイルスＲＮＡが検出不可能であるのを成功として、暴露後ウイルスＲＮＡが測定可能であるのを失敗として)についてカテゴリー分析により決定した。暴露後特定日数後のサンプル(ＢＡＬについて３日目および６日目；鼻腔スワブについて１日目、３日目および６日目)を分析に含めた。不確定結果をこの分析から除外した。全ての残りの分析をGraphPad Prism 8.4を使用して実施した。
結果
Ｃ末端でＴ４フィブリチンの天然三量体化ドメイン(フォルドン)に融合するＲＢＤをコードする、ＬＮＰカプセル化Ｎ１−メチル−シュードウリジン(ｍ１Ψ)ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡからなる、ＢＮＴ１６２ｂ１なる名称のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ワクチンを設計した(Meier, S. et al., Journal of molecular biology 344, 1051-1069, 2004)(図６４ａ)。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓシグナルペプチド(ＳＰ)は、三量体ＲＢＤのＥＲ転座および分泌を可能とする。ＲＮＡのｍ１Ψ修飾は、自然免疫センシングを減弱させ、最適化非コード配列要素と共に、インビボでのＲＮＡ翻訳を増加させる(Orlandini von Niessen, A. G. et al., Mol Ther 27, 824-836, 2019; Kariko, K. et al., Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 16, 1833-1840, 2008)。
プラスミドＤＮＡ鋳型からのＴ７ポリメラーゼによりインビトロ転写されたＢＮＴ１６２ｂ１ ＲＮＡは、その計算された１２６２ヌクレオチド長に一致する、単一の、鋭いピークのマイクロフルイディックキャピラリ電気泳動プロファイルを有し、純度および完全性を示す(データ示していない)。ＢＮＴ１６２ｂ１ ＲＮＡトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞のライセートのウェスタンブロット分析は、ＲＢＤがＲＮＡから発現され、２９.４６kDaの計算された重量に一致する見掛けの分子量を有したことを示す(データ示していない)。トランスフェクト細胞におけるタンパク質発現および分泌経路の小胞体局在化は、それぞれフローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡で確認された(データ示していない)。
構造特徴づけのために、三量体化ＲＢＤを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞でＢＮＴ１６２ｂ１ ＲＮＡのコード配列に対応するＤＮＡから発現させ、アガロースビーズに固定化したＡＣＥ２ペプチダーゼドメインでの親和性捕捉により、精製した。三量体化ＲＢＤは、高親和性(５pM ＫＤ)でヒトＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン(ＰＤ)に結合し、これは、単量体ＲＢＤで報告されたＫＤ５.０９nMの約１,０００倍であり、多量体結合のアビディティー効果に一致する(データ示していない)。ＲＢＤフォルドンの三量体価およびその柔軟性は、ネガティブ染色検体の電子顕微鏡(ＥＭ)により可視化され、これは高次構造の範囲を確認する(図６４ｂ)。ＲＢＤフォルドンの柔軟性により、高分割での直接構造分析は不可能であるが、ＲＢＤドメインは、ＡＣＥ２とＢ０ＡＴ１中性アミノ酸トランスポーターの複合体への結合により固定化され、その複合体が先に報告された閉高次構造であったとき、ＡＣＥ２が付き添う(Yan, R. et al., Science (New York, N.Y.) 367, 1444-1448, 2020)。ＲＢＤフォルドン／ＡＣＥ２／Ｂ０ＡＴ１三元複合体のサイズおよび対称性は、低温電子顕微鏡法(ｃｒｙｏＥＭ)による画像再生を助け、複合体におけるＲＢＤドメインの構造は、３.２４Å分解能で決定された(図６４ｃ)。ＲＢＤの１コピーが各結合三量体について分割された。分割されたＲＢＤとＡＣＥ２細胞外ドメインの間の結合界面を、先に報告された構造にフィットさせ、良好に一致することが示された(He, Y. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 324, 773-781, 2004; Yi, C. et al., Cellular & molecular immunology; 10.1038/s41423-020-0458-z, 2020)。ＡＣＥ２への高親和性結合およびＡＣＥ２との複合体での良好に分割された構造は、組み換えＲＢＤフォルドンが確かに多くのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体により標的化されるＡＣＥ２結合部位を表すことを示す(Brouwer, P. J. M. et al., Science (New York, N.Y.); 10.1126/science.abc5902 (2020); Zost, S. J. et al., Nature medicine; 10.1038/s41591-020-0998-x (2020))。
ＢＮＴ１６２ｂ１誘導ＢおよびＴ細胞免疫応答を、０.２μg、１μgまたは５μg ＢＮＴ１６２ｂ１または緩衝液単独で１回筋肉内(ＩＭ)免疫化後のＢＡＬＢ／ｃマウスでの一連の実験により特徴づけした。ＲＢＤ特異的血清ＩｇＧは全用量レベルで用量依存的方法で急速に発展し、約２１日目にプラトーであった(５μg用量レベルで１.６３±０.１３mg／mL；図６５ａ)。ワクチン誘導ＩｇＧは、高ＲＢＤ結合親和性(幾何平均ＫＤ ４８.０pM)と高オンレート(幾何平均ｋｏｎ １.７２×１０６／Ｍｓ)および低オフレート(幾何平均Ｋｏｆｆ ８.２７×１０−５／ｓ；図６５ｂ)を有した。マウス血清でのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和活性を、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)ベースのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス中和アッセイにより測定した。平均５０％シュードウイルス中和力価(ｐＶＮＴ５０)は、０.２μg、１μgおよび５μg用量レベルでそれぞれ２８日目に１０２、１９２および１,０５６まで免疫化後一定に増加した(図６５ｃ)。
完全長Ｓペプチド・ミックスでエクスビボ再刺激したとき、免疫化１２日目および２８日目ＢＮＴ１６２ｂ１免疫化マウスから単離された両ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞表現型の脾細胞の高い分画は、ELISpotアッセイで強力な抗原特異的ＩＦＮγ−応答を示した(図６５ｄ)。完全長Ｓペプチド刺激バルク脾細胞およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットも、１２日目に高ＩＦＮγ産生および顕著なＩＬ−２応答を示したが、フローサイトメトリーサイトカイン放出分析でＩＬ−４応答ははるかに低く、ＴＨ１表現型応答が示される(図６５ｅ)。ＴＨ１表現型は持続し、２８日目に採取し、完全長Ｓペプチドプールで刺激した総脾細胞は、マルチプレックスイムノアッセイで高レベルのＩＬ−２およびＩＦＮγを産生するが、ＴＨ２サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−５の量は検出不可能である(図６５ｆ)。
ＢＮＴ１６２ｂ１または緩衝液でマウスを免疫化１２日後に得られた排出リンパ節(ｄＬＮ)および脾臓で、ＢＮＴ１６２ｂ１を受けたマウスからのサンプルにおいて観察されるＢ細胞(形質細胞、クラススイッチングされたＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ陽性Ｂ細胞および胚中心Ｂ細胞を含む)数ははるかに高かった(データ示していない)。免疫化７日後得られた血液で、循環Ｂ細胞数は、Ｂ細胞のリンパ系区画へのホーミングによるものである可能性が高いが、緩衝液免疫化マウスより低かった(データ示していない)。ＢＮＴ１６２ｂ１免疫化マウスからのｄＬＮも、Ｔ細胞数、胚中心の形成に必須の役割を有することが知られる、ＩＣＯＳ上方制御を伴うサブセットを含む、特にＴ濾胞性ヘルパー(ＴＦＨ)細胞の数の上昇を示した(Hutloff, A., Oncotarget 6, 21785-21786, 2015)(データ示していない)。ＴＦＨ細胞のＢＮＴ１６２ｂ１誘導上昇は、脾臓および血液でも検出された(データ示していない)。まとめると、これらのデータは、ＢＮＴ１６２ｂ１によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ特異的中和抗体力価およびＴＨ１駆動Ｔ細胞応答の強力なおよび同時の誘導を示す。筋肉内投与ＢＮＴ１６２ｂ１は、ワクチン応答に参加するためのリンパ球の血液からリンパ系組織への遊走と共に、能力のあるワクチンプライミングのために免疫教育された部位としてｄＬＮに送達されると考えられる。
次に、ＢＮＴ１６２ｂ１の免疫原性を２〜４歳雄性アカゲザルで試験した。６匹の群を、０日目および２１日目に３０μgまたは１００μgのＢＮＴ１６２ｂ１または食塩水対照でＩＭ免疫化した。ＲＢＤ結合ＩｇＧは、一回免疫化後１４日目まで容易に検出可能であり、レベルはブースト用量を与えた２１日目までさらに増加した(図６６ａ)。２回目の免疫化７日後(２８日目)、幾何平均ＲＢＤ結合ＩｇＧ濃度(ＧＭＣ)は２０,９６２単位(Ｕ)／mL(３０μg用量レベル)および４８,５７５Ｕ／mL(１００μg用量レベル)であった。比較のために、３８のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２回復期ヒト血清のパネルのＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣは６０２Ｕ／mLであり、１回または２回投与後の免疫化アカゲザルのＧＭＣより有意に低かった。確実なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイ(Muruato, A. E. et al., bioRxiv : the preprint server for biology; 10.1101/2020.05.21.109546, 2020)で測定した５０パーセント中和力価(ＶＮＴ５０)は、アカゲザル血清で一回免疫化１４日後まで検出可能であり、ブースト７日後７６８(３０μg用量レベル)または１,７１４(１００μg用量レベル)の幾何平均力価(ＧＭＴ)に達した(２８日目、図６６ｂ)。３０μg用量レベルで２４７および１００μg用量レベルで５６４の頑強な中和ＧＭＴは少なくとも４２日目まで持続した(直近試験時点)。比較のために、ヒト回復期血清パネルの５０％中和ＧＭＴは９３.６であった。
１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１または緩衝液対照で２回免疫化を受けたアカゲザル(ｎ＝６)群を、鼻腔内および気管内経路に等しく分けた１×１０６プラーク形成単位のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２(株ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０)に２回目の免疫化４１〜４８日後暴露した(Singh, D. K. et al. SARS-CoV-2 infection leads to acute infection with dynamic cellular and inflammatory flux in the lung that varies across nonhuman primate species, 2020)。３非免疫化、齢適合、雄性アカゲザル(センチネル)を、細胞培養培地に偽暴露した。暴露時、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価はＢＮＴ１６２ｂ１免疫化動物で２０８〜１,１８５の範囲であり、対照免疫化およびセンチネル群の動物で検出不可能であった。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＮＡを、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ｑＰＣＲ)により気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)および鼻腔スワブサンプルで測定した。全ＢＡＬおよび鼻腔スワブサンプルは感染因子暴露前に得て、センチネル動物から得た全ては検出可能なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＮＡがなかった(図６７)。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露３日後、ウイルスＲＮＡは、５／６対照免疫化および２／６ ＢＮＴ１６２ｂ１免疫化動物のＢＡＬ流体で検出された(図６７ａ)。暴露後６日目まで、全６匹のＢＮＴ１６２ｂ１免疫化マカクの肺に検出可能なウイルスＲＮＡはなかった；対照免疫化マカクの３匹はＢＡＬ流体に高レベルのウイルスＲＮＡがあり、２匹は明確なおよび１匹は不確定なＲＴ−ｑＰＣＲ結果であった。解剖時(暴露７〜２３日後)、何れの動物からのＢＡＬ流体でもウイルスＲＮＡは検出不可能であった。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露後、ウイルスＲＮＡは、各時点で対照免疫化群の鼻腔スワブで検出された：２匹の動物が暴露後１日目、３匹の動物が暴露後３日目および６日目(図６７ｂ)および２匹が動物解剖時(示していない)。ＢＮＴ１６２ｂ１免疫化動物において、全鼻腔スワブは１日目陰性または不確定であり、全て３日目および解剖時陰性であった；６日目、２匹のスワブは陽性であり、非免疫化アカゲザルと比較してウイルスＲＮＡ検出がより一過性であることを示す。ＢＮＴ１６２ｂ１免疫化動物および対照免疫化動物でのウイルスＲＮＡが検出可能な動物の割合の差は、統計的に有意である(ｐ＝ＢＡＬについて０.００３７および鼻腔スワブについて０.０２１２)。暴露動物は全て顕著な疾病の臨床的または放射線徴候を示さず、２〜４歳雄性アカゲザル暴露モデルがＣＯＶＩＤ−１９疾患モデルではなく、主にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の感染モデルであることが示された。
考察
三量体ＲＢＤ抗原をコードするＬＮＰ製剤化ｍ１Ψヌクレオシド修飾ｍＲＮＡであるＢＮＴ１６２ｂ１が、マウスおよびアカゲザルで高度に免疫原性であり、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に暴露されたアカゲザルの感染を制限することを示した。ＲＢＤフォルドンコード配列は、高親和性でＡＣＥ２に結合し、構造的にインタクトなＡＣＥ２受容体結合部位を有する柔軟な、三量体タンパク質の発現を指示する。一つの重要な発見は、マウスで、単回のマイクログラム以下の免疫化が、最近報告されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ワクチン候補の範囲内であるまたはそれを超える、高中和抗体力価を迅速に誘導することである(van Doremalen, N. et al., bioRxiv : the preprint server for biology; 10.1101/2020.05.13.093195 (2020); Corbett, K. S. et al., bioRxiv : the preprint server for biology; 10.1101/2020.06.11.145920 (2020))。両者ともＴＨ１偏向およびＴＦＨ産生方向に歪める強いＣＤ４＋および強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ワクチン候補により誘導される強力な保護能力を含意し得る(Pardi, N. et al., The Journal of Experimental Medicine 215, 1571-1588, 2018)。胚中心でのＴＦＨ増殖は、適応性Ｂ細胞応答の産生に不可欠である。ヒトにおいて、ワクチン接種後循環で生じるＴＦＨは、高頻度の抗原特異的抗体と相関された(Farooq, F. et al., Scientific reports 6, 27944, 2016)。ＢＮＴ１６２ｂ１での免疫化は、Ｂ細胞およびＴＦＨ細胞の血液から、抗原提示が生じる場所であるリンパ系組織への再分布を誘導する。
他の顕著な発見は、アカゲザルで、三量体ＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ ＲＢＤフォルドンをコードするｍ１Ψヌクレオシド修飾ｍＲＮＡの２回投与が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２回復期ヒト血清パネルのＧＭＴの８.２〜１８.２倍であるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和ＧＭＴを誘導したことである。非ヒト霊長類での結果は、急性ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の前臨床モデルにおけるワクチンの高い能力およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露に対する保護の能力を確認する。
実施例１１：融合前−安定なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＳをコードするＲＮＡワクチンはマウスおよび非ヒト霊長類で高度に免疫原性である
ここで、ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンで免疫化したマカクのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染因子暴露を報告する。
材料および方法
インビトロ転写ＲＮＡの製造。
ＲＮＡ合成用鋳型を産生するために、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐアミノ酸交換された完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質(GenBank：MN908947)をコードするＤＮＡフラグメントを、ＲＮＡ安定性および翻訳効率を改善するための主鎖配列要素を有する出発プラスミドベクターにクローン化した(Orlandini von Niessen, A. G. et al., Mol Ther 27, 824-836, 2019; Holtkamp, S. et al., Blood 108, 4009-4017, 2006)。非コード主鎖要素は、Ｔ７プロモーターから５’および３’ ＵＴＲまでの領域に加えてリンカー(Ａ３０ＬＡ７０、１０ヌクレオチド)により中断されたポリ(Ａ)テイル(１００ヌクレオチド)を含んだ。ＤＮＡを精製し、分光光度的に定量し、ウリジン−５’−三リン酸(ＵＴＰ)の代わりにトリヌクレオチドキャップ１アナログ((ｍ２ ７,３’−Ｏ)Ｇｐｐｐ(ｍ２’−Ｏ)ＡｐＧ；TriLink)およびＮ１−メチルシュードウリジン−５’−三リン酸(ｍ１ΨＴＰ；Thermo Fisher Scientific)の存在下、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロ転写した(Grudzien-Nogalska, E. et al., Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 969, 55-72, 2013)。ＲＮＡを磁性粒子を使用して精製した(Berensmeier, S., Appl.Microbiol.Biotechnol. 73, 495-504, 2006)、完全性をマイクロフルイディックキャピラリ電気泳動(Agilent Fragment Analyser)により評価し、濃度、ｐＨ、浸透圧、エンドドキシンレベルおよびバイオバーデンを決定した。
ＲＮＡの脂質−ナノ粒子製剤。
精製ＲＮＡを、イオン化可能カチオン性脂質のエタノール性脂質混合物を使用してＬＮＰに製剤化し、ダイアフィルトレーションにより水性緩衝系に移動させて、先に記載されたものに類似するＬＮＰ組成物を得た(Maier, M. A. et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 1570-1578, 2013)。ＢＮＴ１６２ｂ２を、−７０℃で、０.５mg／mL濃度で保管した。
免疫化。
雄性アカゲザル(２〜４年)を無作為に割り当て、０日目および２１日目に左四頭筋にＩＭ注射により投与される、０.５mL体積のＢＮＴ１６２ｂ２または食塩水プラセボ対照を与えた。血清およびＰＢＭＣのための血液を、NIRC Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された動物プロトコール２０１７−８７２５−０２３に従い集めた。動物を、採血および免疫化中ケタミンＨＣｌ(１０mg／kg；ＩＭ)で麻酔し、適切な鎮静についてモニターした。
アカゲザルのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２接種物を、予めTexas Biomedical Research Institute(San Antonio, Texas)で調製され、単回使用バイアルに等分され、−７０℃で保管した２.１×１０６PFU／mLのストックから得た。作業ウイルスストックを、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０単離株(BEI Resourcesから４継代シードストック購入；NR-52281)の２つの継代から産生した。ウイルスは、ディープシークエンシングによりＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と確認され、公開配列(GenBank accession number MN985325.1)と同一であった。
ＢＮＴ１６２ｂ２免疫化(ｎ＝６)および同齢食塩水対照免疫化(ｎ＝６)雄性アカゲザル(対照)を、先に記載のとおり、鼻腔内(ＩＮ；０.２mL)および気管内(ＩＴ；０.２mL)経路に等しく分けた、１×１０６プラーク形成単位のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０単離株に曝した(Singh, D. K. et al. SARS-CoV-2 infection leads to acute infection with dynamic cellular and inflammatory flux in the lung that varies across nonhuman primate species (2020))。暴露を２回目の免疫化４１〜４８日後実施した。別の齢および性別適合非免疫化センチネル群(ｎ＝３)は、１０％ＦＣＳ ＩＮ(０.２mL)およびＩＴ(０.２mL)添加ＤＭＥＭのみ受けた。暴露約２週間前、動物を、Southwest National Primate Research Center(SNPRC; San Antonio, TX)のＡＢＳＬ−３施設に移した。動物を、直腸温、体重および身体検査について委員会認定獣医臨床医により定期的にモニターされた。検体採取を記載のとおり、チレタミンゾラゼパム(Telazol)麻酔下に実施した(Singh, D. K. et al. SARS-CoV-2 infection leads to acute infection with dynamic cellular and inflammatory flux in the lung that varies across nonhuman primate species (2020))。鼻腔スワブを、マカクから接種０日、１日、３日および６日後に集め、ウイルス力価を評価した。気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)を２０mLの食塩水を４回注入するすことにより、暴露前週ならびに接種後３日目および６日目に実施した。これらの線液を集め、等分し、−７０℃で凍結保管した。
逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を、本質的に実施例１０に記載のとおり、ＮＨＰで検出および定量した。
結果
結果は、ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンＢＮＴ１６２ｂ２が、１回投与後ＩｇＧ応答を誘発して免疫原性であり、２回目の投与によりブーストされたことを示した。これらは用量−応答も示した。３０μg ＢＮＴ１６２で、中和幾何平均力価は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ−２を有するヒト患者の回復期血漿でみられるのと同等であり、約１８倍過剰の１００μg用量で投与７日後約８倍高く、最後の免疫化５週間後このベンチマークより３.３倍高いままであることが判明した。サルで、応答は、ＩＬ−４応答ではなく、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２が応答するＴｈ１優性としても特徴づけられた。ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞性応答は、サルでもまた観察された。このような細胞性免疫応答は、強力にＴｈ１に偏ったＣＤ４＋Ｔ細胞応答と同時のインターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)＋ＣＤ８＋Ｔ細胞応答として特徴づけられた。
１００μg ＢＮＴ１６２ｂ２または緩衝液対照で２回免疫化を受けたアカゲザル(ｎ＝６)群を、先に記載のとおり、鼻腔内および気管内経路に等しく分けた１×１０６プラーク形成単位のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２(株ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０)に２回目の免疫化４１〜４８日後暴露した(Singh, D. K. et al. SARS-CoV-2 infection leads to acute infection with dynamic cellular and inflammatory flux in the lung that varies across nonhuman primate species, 2020)。３非免疫化、齢適合、雄性アカゲザル(センチネル)を、細胞培養培地に偽暴露した。暴露時、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価はＢＮＴ１６２ｂ２免疫化動物で２０４〜９３８の範囲であり、対照免疫化およびセンチネル群の動物で検出不可能であった。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＮＡを、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ｑＰＣＲ)により気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)および鼻腔スワブサンプルで測定した。全ＢＡＬおよび鼻腔スワブサンプルは感染因子暴露前に得て、センチネル動物から得た全ては検出可能なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＮＡがなかった(図６８)。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露３日後、ウイルスＲＮＡは、５／６対照免疫化および２／６ ＢＮＴ１６２ｂ２免疫化動物のＢＡＬ流体で検出された(図６８)。暴露後６日目まで、全６匹のＢＮＴ１６２ｂ２免疫化マカクの肺に検出可能なウイルスＲＮＡはなかった；対照免疫化マカクの３匹はＢＡＬ流体に高レベルのウイルスＲＮＡがあり、２匹は明確なおよび１匹は不確定なＲＴ−ｑＰＣＲ結果であった。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露後、ウイルスＲＮＡは、各時点で対照免疫化群の鼻腔スワブで検出された：２匹の動物が暴露後１日目、３匹の動物が暴露後３日目および６日目(図６８)。ＢＮＴ１６２ｂ２免疫化動物で、全鼻腔スワブは３日目および６日目陰性であった。
肺組織で、対照サルは、コンピュータ断層撮影走査でのスコア増加により示される肺疾患の証拠があり、１０日目のスコアが３日目より低い点で、回復が示唆された；対照的に、ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンＢＮＴ１６２ｂ２を与えたサルのスコアは低かった。肺組織の顕微鏡的分析は、肺炎症が対照とＢＮＴ１６２ｂ２免疫化サルで類似し、呼吸器疾患増強の証拠はなかったことを示す。
考察
非ヒト霊長類での結果は、融合前高次構造に捕捉されたＳ抗原をコードするＬＮＰ製剤化ｍ１Ψヌクレオシド修飾ｍＲＮＡである、ＢＮＴ１６２ｂ２の、急性ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の前臨床モデルにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２暴露に対する効力および能力を示す。
実施例１２：保存、輸送および投与準備
この実施例は、注射用のＢＮＴ１６２ｂ２濃縮物の多回用量バイアルの保存、輸送および投与準備を説明する。
図６９に示すとおり、一次包装の段階で、２mlタイプの１ガラス、防腐剤無添加、多回用量バイアル(ＭＤＶ)が使用され、ここで、ＭＤＶは０.４５ml凍結液体製剤を含み、バイアルあたり５用量である。二次包装の段階で、単一トレイに、トレイあたり９７５用量など、１９５バイアルが入る。トレイ(ホワイトボックス)寸法は、２２９×２２９×４０mmである。三次包装の段階で、最小１トレイ(９７５用量)(または５トレイ(最大４８７５用量)まで)、運搬用大箱に積む。運搬用大箱を２３Kgのドライアイスペレット(１０mm〜１６mmペレット)に沈める。保温シッパー寸法は次のとおりである。内部寸法：２４５mm×２４５mm×２４１mm；外部寸法：４００mm×４００mm×５６０mm。保温シッパーの総重量は約３５Kgである。
種々のサイズの超低温(ＵＬＴ)冷凍庫が市販されている。図７０は、小量保存(約９０リットル；約３０Ｋ用量(左))および大量保存(約５００リットル；約２００Ｋ用量(右))の例を示す。保温シッパーは、開けずに１５℃〜２５℃温度で保管したとき、最大１０日間ＵＬＴ(例えば、−９０℃〜−６０℃)を維持し、このような保存期間は、ドライアイスを容器の上部に定期的に再充填することによりさらに伸ばすことができる。受領して、開けた後、２４時間以内に箱にドライアイスを再充填しなければならない(２３Kgのドライアイスペレット(１０mm〜１６mmペレット))。保温シッパーは、５日毎に再氷冷しなければならない。保温シッパーを１日２回を超えて開けないことが推奨される。保温シッパーは、開けた後１分以内(またはそれ以下)に閉じなければならない。ワクチンは、解凍後２℃〜８℃で２日までまたは室温で最大２時間まで保管できる。希釈後の使用期限は６時間である。
図７１は、防腐剤無添加であり、投与前に解凍および希釈すべき凍結濃縮溶液を含む、ＢＮＴ１６２ｂ２の５用量バイアルの例示的投与準備を示す。準備工程は次のとおりである。
注射用ＢＮＴ１６２ｂ２濃縮物の５用量バイアルを、凍結保存されたその大箱から出し、約３０分間、室温(例えば、２５℃まで)で解凍させる。ある実施態様において、ＢＮＴ１６２ｂ２のこのような多回用量バイアルを、例えば、５日間まで、冷蔵庫(例えば、２℃〜８℃)で解凍し、保管し得る。室温で解凍されたバイアルは２時間以内に希釈するか、冷蔵庫に移さなければならない。非希釈バイアルは、冷蔵庫で４８時間まで保管し得る。解凍済バイアルを再凍結してはならない。保存中、室内灯への暴露を最小限にし、直接日光および紫外線光への暴露を避ける。解凍済バイアルは室内灯条件で取り扱うことができる。
解凍後かつ使用前、バイアルが室温に平衡化されていることを確認し、１０回穏やかに逆さにして混合する。振らない。
無菌技術を使用して、使い捨て除菌用綿棒でバイアルストッパーを浄化し、次いで、バイアルに１.８mLの０.９％塩化ナトリウム注射、ＵＳＰを入れることにより、ＢＮＴ１６２ｂ２の解凍済バイアルを希釈する。２１ゲージまたはそれより細い針が推奨される。しかしながら、当業者は、ある実施態様において、太い針が使用され得ることを理解する。例えば、ある実施態様において、２０、１９、１８、１７、１６、１５またはそれより広い針が使用され得る。
希釈剤を加えるとき、バイアルに圧がかかっているの感じることがある。針をバイアルから抜く前に、空の希釈剤シリンジに１.８mLの空気を引き抜くことにより、確実にバイアル圧を平衡化する。
希釈バイアルを１０回穏やかに逆さにして混合する。振らない。
希釈日と時間を、ＢＮＴ１６２ｂ２バイアルラベルの適切な場所に記録する。希釈時から６時間が期限である。希釈多回用量バイアルは２℃〜２５℃で保管される。冷凍しない。凍結したら廃棄する。
無菌技術を使用して、使い捨て除菌用綿棒でバイアルストッパーを浄化し、０.３mLの希釈投与溶液を、筋肉内注射に適する針を備えた新しい無菌投与シリンジに引き抜く。投与溶液の損失を避けるために、バイアルにまだ針があるときに、気泡を除くための調節をすべきである。可能であれば、用量を引き抜き、投与するのに同じ針を使うことが推奨される。投与用に第二の針が必要であるならば、針交換中の投与溶液の損失を避けるために、最初の針を除く前に、シリンジプランジャーを、小量の空気がシリンジに入るまで押し戻す。用量のあらゆる損失を防止するために、投与針の準備に注意すること。
各さらなる用量について、新しい無菌シリンジおよび針を使用し、確実にバイアルストッパーを各引き抜き前に防腐剤で浄化する。調製済シリンジはすぐに投与しなければならない。すぐに投与され得ないならば、最初のバイアル希釈から６時間以内に投与しなければならない。投与前、シリンジの最終注射体積を確実に０.３mLとする。
実施例１３：ＣＯＶＩＤ−１９に対するワクチン候補は、フェーズ３治験の初回中間解析で成功を収めた
ＢＮＴ１６２ｂ２のフェーズ３臨床治験は、現在まで４３,０００を超える参加者が登録されており、ほぼ３９,０００名が２０２０年１１月８日時点でワクチン候補の２回目の投与を受けた。約４２％の世界的参加者および３０％の米国参加者は、人種的(例えば、白人、黒人またはアフリカ系アメリカ人、アメリカインディアンまたはアラスカ原住民、アジア人、ハワイ先住民または他の太平洋諸島住民、多人種を含む)および民族的(例えば、ヒスパニック／ラテン系および非ヒスパニック／非ラテン系を含む)に多様なバックグラウンドである。治験は登録が続けられており、計１６４の確認されたＣＯＶＩＤ−１９が蓄積されたときの最終分析まで続くことが予測される
ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ２は、フェーズ３治験からの初回中間解析で成功を収めた。ワクチン候補は、初回中間有効性解析で先のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない参加者で、ＣＯＶＩＤ−１９予防に９０％を超える有効性が判明した。解析は、治験参加者で確認されたＣＯＶＩＤ−１９の９４例を評価した。重度安全性懸念は観察されなかった。
２０２０年１１月４日に集めたＣＯＶＩＤ−１９ワクチンフェーズ３治験の一連の結果は、ＢＮＴ１６２ｂ２がＣＯＶＩＤ−１９を予防する能力の証拠を提供する。ワクチン接種した個体とプラセボを受けた個体に分けた場合２回目の投与７日後９０％を超えるワクチン有効率が示される。特に、結果の早期解析は、３週間離してワクチン注射を２回を受けた個体は、プラセボを受けた者より、ＣＯＶＩＤ−１９の有症例が９０％少なかった。これは、２用量スケジュールからなるワクチン接種の開始２８日後に保護が達成されることを確認する。
予備的なこのようなデータは、次の表を含む。
Figure 2021185136
Figure 2021185136
実施例１４：有効性および免疫原性評価
有効性結果
過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない参加者のＣＯＶＩＤ−１９に対するＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン有効性は、プロトコールおよびＳＡＰ後少なくとも６２症例の自然増加後実施した初回中間解析で証明された。このセクションに示す一次有効性結果は中間解析のものである。
最初の一次有効性エンドポイント(２回目の投与を受ける７日後の前に過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の血清学またはウイルス学的証拠がない参加者で中央研究所または地元で確認されたＮＡＡＴに基づくＣＯＶＩＤ−１９発生率)についてＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン有効性のみ解析し、この中間解析で示す。
最初の一次有効性エンドポイント
評価可能有効性集団に含まれる参加者で、３２,２７９参加者(１６,０６１はＢＮＴ１６２ｂ２群および１６,２１８はプラセボ群)は、２回目の投与７日後までＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の感染の証拠がなかった。ＢＮＴ１６２ｂ２群で４ ＣＯＶＩＤ−１９症例があり、対してプラセボ群で９０ ＣＯＶＩＤ−１９症例が報告された。これらのデータにより、ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン有効性は９５.５％と推定される。＞９９.９９％の事後確率は、＞９９.５％の事前に指定された中間解析成功基準に合った(表７)。ワクチン有効性の９５％信用区間は８８.８％〜９８.４％であり、現在観察されるデータに鑑み、真のＶＥがこの区間に入る確率が９５％であることが示された。また、真のＶＥ＞８６.０％である事後確率は９９.５％であり、ＶＥ＞８８.８％は９７.５％であることも記す。
Figure 2021185136
 全入手可能有効性集団に基づく同じ一次有効性エンドポイントでのＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン有効性は９５.７％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２およびプラセボ群でそれぞれ４症例および９３症例があった。
投与２評価可能有効性集団でサブグループによるＶＥの臨床的に意義のある差異は年齢群、国、民族性、性別または人種で観察されず、ＶＥは、９１.２％〜１００.の範囲と推定される(表８)。
Figure 2021185136
重症ＣＯＶＩＤ−１９症例
重症ＣＯＶＩＤ−１９症例は、初回中間解析用の２０２０年１１月４日のデータカットオフ時点で、全てプラセボ群でフェーズ３の計７参加者で報告された(表９)。これらの症例中５例は投与１と投与２の間に報告され、投与２の７日後より前に報告された例はなく、２症例は少なくとも投与２の７日後報告された。
Figure 2021185136
有効性結論
最初の一次有効性目標は、成功基準を満たした。ＢＮＴ１６２ｂ２は、投与２の７日後まで感染の証拠がない参加者で、８８.８％〜９８.４％の２側９５％信用区間で９５.５％のワクチン有効性および利用可能なデータで３０％を超える条件付けして、真のワクチン有効性の事後確率＞９９.９９％であった。
全７重症ＣＯＶＩＤ−１９症例(投与１後)は、中間解析カットオフ日時点でプラセボ群で観察された。
免疫原性結果
フェーズ１
このフェーズ１中間臨床治験報告(ＣＳＲ)は、両成人年齢群で１０μg、２０μgおよび３０μg用量レベルでのＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン候補の投与２後最大１か月間、１００μg用量レベル(若年年齢群のみ)でＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後最大７週間まで免疫原性結果を提供する。
１０μgおよび３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１について、若年年齢群(１８〜５５歳)で投与１の７日後時点の結果のみが解析され、提供される。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価 − フェーズ１
ＧＭＴ
全体として、両年齢群でＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエント両者について、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴは、投与１後２１日目まで穏やかに増加し、投与２の７日後実質的に増加した。一般に、年配年齢群におけるＧＭＴは、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエント両方で、大部分の時点で若年年齢群のＧＭＴより幾分低い傾向にあった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴは、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後２１日目まで穏やかに増加し、投与２の７日後(２８日目)実質的に増加し、１０μgおよび２０μg用量群と比較して高いＧＭＴが３０μg用量群で観察された(図７２)。ＧＭＴは全用量群で投与２の１４日後(３５日目)増加したが、ＧＭＴ投与２の１か月後(５２日目)低減し、５２日目にＧＭＴは投与１後の早期時点より実質的に高いままであった。
１００μg用量群で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴはＢＮＴ１６２ｂ１投与１後２１日目まで穏やかに増加し、５２日目までにほぼベースライン値まで低減した。
一般に類似の傾向が年配年齢群で観察され、１０μg用量群と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ１の２０μgおよび３０μg用量群で高いＧＭＴが観察された(図７３)。
類似する傾向がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ９０％中和ＧＭＴについて観察された。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
若年および年配年齢群についてＢＮＴ１６２ｂ１後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％および９０％中和力価のＲＣＤＣは、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与２の７日後までに大部分の参加者が応答したことを示す。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴは、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後２１日目まで穏やかに増加し、投与２の７日後(２８日目)実質的に増加し、１０μgおよび２０μg用量群と比較して高いＧＭＴが３０μg用量群で観察された(図７４)。ＧＭＴは、ＢＮＴ１６２ｂ２投与２の１４日後(３５日目)および投与２の１か月後(５２日目)低減した；しかしながら、ＧＭＴは投与１後の早期時点より実質的に高いままであった。
類似する傾向が年配年齢群で一般に観察され、２０μgおよび１０μg用量群と比較して３０μg用量群で高いＧＭＴが観察された(図７５)。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴは投与２の７日後増加し、１０μgおよび２０μg用量群で類似し、３０μg用量群で高かった。投与２の１か月後、ＧＭＴは投与１後の早期時点より実質的に高いままであった。年配年齢群で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴは、若年年齢群のＧＭＴより一般に低かった。
類似する傾向がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ９０％中和ＧＭＴについて観察された。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
若年および年配年齢群のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％および９０％中和力価のＲＣＤＣは、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２の７日後までに大部分の参加者が応答したことを示す。
ＧＭＦＲ
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエント両者および両年齢群について、ワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)までのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＦＲは、投与１後の各ＧＭＦＲと比較して実質的に高かった。年配年齢群のＧＭＦＲは、両ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントで、若年年齢群より一般に低かった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)までのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＦＲは、全用量群でＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後の早期時点でのＧＭＦＲと比較して実質的に高く、３０μg用量群でＧＭＦＲは最高であった。投与２の１か月後、ＧＭＦＲは、投与１後の早期時点より高いままであった。
１００μg用量群で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＦＲは、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１の５２日後まで実質的に増加しなかった。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)までのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＦＲは、２０μgおよび３０μg用量群でＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後早期時点のＧＭＦＲと比較して実質的に高く、ＧＭＦＲは２０μg用量群で最高であった。ＧＭＦＲは、投与１後の早期時点のＧＭＦＲと比較して、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与２の１か月後(５２日目)、２０μgおよび３０μg用量群で高いままであった。
類似する傾向が、若年年齢群でおよび年配年齢群でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ９０％中和力価のＧＭＦＲについて観察された。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)までのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＦＲは、全用量群でＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後早期時点のＧＭＦＲと比較して実質的に高く、ＧＭＦＲは２０μgおよび３０μg用量群で類似し、最高であった。ＧＭＦＲは、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の２１日後のＧＭＦＲと比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２の１か月後まで高いままであった。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)までのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＦＲは、全用量群でＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後の早期時点のＧＭＦＲと比較して実質的に高く、３０μg用量群でＧＭＦＲは最高であった。ＧＭＦＲは、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の２１日後のＧＭＦＲと比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２の１か月後まで高いままであった。
類似する傾向は、若年および年配年齢群でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ９０％中和力価のＧＭＦＲについて観察された。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
４倍以上の上昇を達成した参加者数(％)
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエント両者および両年齢群について、１０μg ＢＮＴ１６２ｂ１用量群の年配参加者以外、大部分の参加者は、ワクチン接種から投与２の７日後まで、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種前から投与１の２１日後まで、１０μg用量群の全参加者および２０μgおよび３０μg用量群の３以下の参加者はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成しなかった。ＢＮＴ１６ｂ１のワクチン接種前から投与２の７日後および１か月後の両方まで、１０μg、２０μgおよび３０μg用量群の参加者の大部分のまたは全員は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種前から投与１の２１日後まで、３０μg用量群での１参加者のみが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した。ＢＮＴ１６ｂ１のワクチン接種前から投与２の７日後および１か月後の両方まで、１０μg群の２以下の参加者および２０μgおよび３０μg用量群の９〜１１参加者は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与１の２１日後まで、１０μg用量群の２(１８.２％)参加者、２０μg用量群の３(２５.０％)参加者および３０μg群で０が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した。ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与２の７日後まで、全参加者が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成し、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２の１か月後まで維持された。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与１の２１日後まで、参加者はあらゆる用量群でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成しなかった。ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与２の７日後まで、１０(８３.３％)、９(８１.８％)および１０(９０.９％)参加者が、１０μg、２０μgおよび３０μg用量群でそれぞれＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した。ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与２の１か月後まで、９(７５.０％)、６(５４.５％)および１１(１００.０％)参加者が、１０μg、２０μgおよび３０μg用量群でそれぞれＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原特異的結合抗体レベル − フェーズ１
ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＲＢＤをコードする。この候補の各用量レベルおよび年齢群でのＲＢＤ結合ＩｇＧ応答をこのセクションで述べる。ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルを、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＰ２ Ｓをコードする候補ＢＮＴ６２ｂ２でも評価した。
ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ２は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＰ２ Ｓをコードする。この候補の各用量レベルおよび年齢群でのＳ１結合ＩｇＧ応答をこのセクションで述べる。Ｓ１結合ＩｇＧレベルを、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＲＢＤをコードする候補ＢＮＴ６２ｂ１でも評価した。
ＧＭＣ
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエント両者および両年齢群について、ＲＢＤ−およびＳ１結合ＧＭＣは投与１の２１日後までに実質的に増加し、投与２の７日後までさらに増加した。応答は、５２日目まで維持された。年配年齢群のＧＭＣは、ＲＢＤおよびＳ１両結合ＩｇＧレベルについて２０μg ＢＮＴ１６２ｂ１用量群の２８日目以外、若年年齢群のＧＭＣより一般に低かった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、ＲＢＤ結合ＧＭＣは、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１の２１日後まで実質的に増加し、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与２の７日後(２８日目)にさらに増加し、１０μgおよび２０μg用量群と比較して、３０μg用量群で高いＧＭＣが観察された(図７６)。投与２の１か月後(５２日目)、ＧＭＣは、投与１後の早期時点より実質的に高いままであった。
１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１群で、ＲＢＤ結合ＧＭＣはＢＮＴ１６２ｂ１後２１日まで実質的に増加し、７日目ＧＭＣと比較して、５２日目まで高いままであった。
年配年齢群で、ＲＢＤ結合ＧＭＣは、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１の２１日後まで実質的に増加し、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与２の７日後(２８日目)にさらに増加し、１０μg群と比較して、２０μgおよび３０μg用量群で高いＧＭＣが観察された(図７７)。投与２の１か月後(５２日目)、ＧＭＣは、投与１後の早期時点より実質的に高いままであった。
Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣ結果 ｆｏｒ ＢＮＴ１６２ｂ１は、若年(図７８)および年配年齢群(図７９)および１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１群で観察されたＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣに類似した。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＲＢＤおよびＳ１結合ＩｇＧレベルのＲＣＤＣは、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１の２１日後までに大部分の参加者が応答したことを示す。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、Ｓ１結合ＧＭＣは、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の２１日後まで実質的に増加し、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２の７日後(２８日目)まで実質的に増加し、１０μg用量群と比較して２０μgおよび３０μg用量群で高いＧＭＣが観察された(図８０)。投与２の１か月後(５２日目)、ＧＭＣは、投与１後の早期時点より実質的に高いままであった。
類似する傾向が年配年齢群で観察され、１０μgおよび２０μg用量群と比較して、３０μg用量群で高いＳ１結合ＧＭＣが観察された(図８１)。
ＢＮＴ１６２ｂ２のＲＢＤ結合ＩｇＧ ＧＭＣ結果は、若年(図８２)および年配年齢群(図８３)で観察されたＳ１結合ＩｇＧ ＧＭＣに類似した。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２後のＲＢＤおよびＳ１結合ＩｇＧレベルのＲＣＤＣは、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の２１日後までに大部分の参加者が応答したことを示す。
ＧＭＦＲ
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントおよび両年齢群について、ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルのＧＭＦＲおよびＳ１結合ＩｇＧレベルのＧＭＦＲは、ワクチン接種前から投与１の２１日後まで実質的に高く、ワクチン接種前から投与２の７日後まで大きなＧＭＦＲが観察された。
ＢＮＴ１６２ｂ１
ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルのＧＭＦＲＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種から投与１後２１日目(投与２前)まで実質的に高く、１０μg、２０μgおよび３０μg用量群で、若年および年配年齢群でＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)まで大きなＧＭＦＲが観察された。ＧＭＦＲは、１０μg、２０μgおよび３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１群で、両年齢群で投与１後早期時点と比較して、ワクチン接種前から投与２の１か月後まで実質的に高いままであった。
１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１群で、ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルのＧＭＦＲは、ＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種前から２１日目まで実質的に高く、７日目ＧＭＦＲと比較して５２日目まで高いままであった。
類似する傾向は、ＢＮＴ１６２ｂ１についてＳ１結合ＩｇＧレベルのＧＭＦＲで観察された。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２
Ｓ１結合ＩｇＧレベルのＧＭＦＲＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種から投与１後２１日目(投与２前)まで実質的に高く、１０μg、２０μgおよび３０μg用量群で、若年および年配年齢群でＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)まで大きなＧＭＦＲが観察された。ＧＭＦＲは、全ＢＮＴ１６２ｂ２群で、両年齢群で投与１後早期時点と比較して、ワクチン接種前から投与２の１か月後まで実質的に高いままであった。
類似する傾向は、ＢＮＴ１６２ｂ２のＲＢＤ結合ＩｇＧレベルのＧＭＦＲについて観察された。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
４倍以上の上昇を達成した参加者数(％)
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントおよび両年齢群について、若年２０μg ＢＮＴ１６２ｂ１群の１参加者以外、全参加者は、ワクチン接種前から投与２の７日後までＳ１−およびＲＢＤ結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成した。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種前から投与１の２１日後まで、全用量群にわたる全参加者(２０μg用量群の１以外)は、ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成した。２０μg用量群の全参加者は、ワクチン接種前から投与２の１４日後(３５日目)までＲＢＤ結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成した。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１のワクチン接種前から投与１の２１日後まで、２０μgおよび３０μg用量群の全参加者および１０μg用量群の８(７２.７％)参加者は、ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成した。１０μg用量群の全参加者は、ワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)までＲＢＤ結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成した。
類似する傾向は、ＢＮＴ１６２ｂ１のＳ１結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成する参加者で、一般に観察された。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与１の２１日後まで、各用量群の全参加者は、Ｓ１結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成した。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種前から投与１の２１日後まで、１０μgおよび３０μg用量群の全参加者および２０μg用量群の１１(９１.７％)参加者は、Ｓ１結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成した。２０μg用量群の全参加者は、ワクチン接種前から投与２の７日後(２８日目)までＳ１結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成した。
類似する傾向は、ＢＮＴ１６２ｂ２についてＲＢＤ結合ＩｇＧレベルの４倍以上の上昇を達成する参加者で一般に観察された。
全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、若年および年配年齢群で評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原特異的結合抗体レベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価のＧＭＲ
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントについて、ＲＢＤまたはＳ１結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲは、各年齢群で類似した中和力価に比して、より頑強なＲＢＤ−またはＳ１結合レベルを示す。
ＢＮＴ１６２ｂ１
１０μg、２０μgまたは３０μgで投与１の２１日後、ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲは若年年齢群で≦０.０３５および年配年齢群で≦０.１８３であった。投与２の１４日後、ＧＭＲは若年年齢群で≦０.０３２および年配年齢群で≦０.０１８であった。
１００μg用量群について、ＧＭＲは投与１の２１日後０.０１８および投与１の３５日後０.０１４であった。
Ｓ１結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲは、ＢＮＴ１６２ｂ１投与後、若年および年配年齢群のＲＢＤ結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲに類似した。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２
投与１の２１日後、Ｓ１結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲは若年年齢群で≦０.０３５および年配年齢群で≦０.１２４であった。投与２の１４日後、ＧＭＲは若年年齢群で≦０.０４０および年配年齢群で≦０.０３７であった。
若年および年配年齢群の全ての利用可能な免疫原性集団の結果は、評価可能免疫原性集団で観察されたものに類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２ ＧＭＲの評価
若年年齢群で投与１の２１日後、ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲはＢＮＴ１６２ｂ１後≦０.０３５およびＢＮＴ１６２ｂ２後≦０.０５４であった。投与２の１４日後、ＧＭＲはＢＮＴ１６２ｂ１後≦０.０３２およびＢＮＴ１６２ｂ２後≦０.０４６であった。
年配年齢群で投与１の２１日後、ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲはＢＮＴ１６２ｂ１後≦０.１８３およびＢＮＴ１６２ｂ２後≦０.１９６であった。投与２の１４日後、ＧＭＲはＢＮＴ１６２ｂ１後≦０.０１８およびＢＮＴ１６２ｂ２後≦０.０４３であった。
若年年齢群で投与１の２１日後、Ｓ１結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲはＢＮＴ１６２ｂ１後≦０.０６１およびＢＮＴ１６２ｂ２後≦０.０３５であった。投与２の１４日後、ＧＭＲはＢＮＴ１６２ｂ１後≦０.０３５およびＢＮＴ１６２ｂ２後≦０.０４０であった。
年配年齢群で投与１の２１日後、Ｓ１結合ＩｇＧレベルに対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＲはＢＮＴ１６２ｂ１後≦０.３２８およびＢＮＴ１６２ｂ２後≦０.１２４であった。投与２の１４日後、ＧＭＲはＢＮＴ１６２ｂ１後≦０.０２２およびＢＮＴ１６２ｂ２後≦０.０３７であった。
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２を評価する免疫原性結果のフェーズ１要約
一般に、中程度の中和免疫応答が、最初の投与後若年および年配年齢群両者で観察された。はるかにより頑強な免疫応答が、若年および年配年齢群両者で全用量レベルでＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２の２回目の投与７日後に観察された。試験した最後に時点での抗体レベルは、なおベースラインを実質的に超えた。
若年年齢群：
投与２の７日後、２０μgおよび３０μg用量群のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴは、ＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントよりＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントで高かった。ＧＭＴは、両レシピエントで１０μg用量群で類似した。投与２の１か月後(５２日目)、ＧＭＴはＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエント両者で、投与１後の早期時点より実質的に高いままであった。
ワクチン接種前から投与２の７日後まで、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＦＲは、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントについて３０μg用量レベルで実質的に高かった。
ワクチン接種前から投与２の７日後まで、ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２を受けた３０μg用量レベルの全参加者は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した。
年配年齢群：
投与２の７日後、３０μg用量群のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴは、ＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントよりＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントで高かった。投与２の１か月後(５２日目)、３０μg用量群のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和ＧＭＴは、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエント両者で類似した。
ワクチン接種前から投与２の７日後まで、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価のＧＭＦＲは、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントについて３０μg用量レベルで実質的に高かった。
ワクチン接種前から投与２の７日後まで、３０μg用量レベルでＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２を受けた大部分の参加者が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ５０％中和力価の４倍以上の上昇を達成した。
フェーズ１免疫原性結論
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２両者は、ＧＭＴ、ＧＭＦＲ、中和力価の４倍以上の上昇を達成した参加者の割合およびＲＣＤＣに基づき、若年および年配成人において投与２の７日後頑強なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体応答を誘発した。中和抗体応答は５２日目まで維持され、対応する年齢および用量群で候補間は類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２両者は、ＧＭＣ、ＧＭＦＲおよびＩｇＧ抗原特異的結合の４倍以上の上昇を達成した参加者の割合に基づき、投与２の７日後抗原結合ＩｇＧレベルの相当な上昇を誘発した。応答は、５２日目まで維持された。
１００μg用量群で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体応答は、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後３週間まで徐々に増加したが、中和抗体応答は、投与１後７週間までにベースラインに類似するレベルに戻った。
これらのデータは、２回連続ワクチン接種の必要性を支持する。
フェーズ２
免疫原性は、治験のフェーズ２部分の探索的エンドポイントである。
フェーズ３
免疫原性は、治験のフェーズ３部分の二次(１２〜１５歳対１６〜２５歳)および探索的エンドポイントである。
実施例１５：安全性評価
この中間ＣＳＲで、フェーズ１の全参加者およびフェーズ２／３の最初の６６１０参加者(フェーズ２からの３６０参加者を含む)は、e-diaryを使用して、局所反応および全身事象を報告した。フェーズ２／３の計１１２５参加者が、投与１の日のＮ結合抗体治験結果陽性または核酸増幅検査(ＮＡＡＴ)結果陽性と定義される、ベースラインＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２陽性として同定された；この中で、５４５がＢＮＴ１６２ｂ２を受け、５８０がプラセボを受けた。
フェーズ１
安全性データはカットオフ日カットオフ日(２０２０年８月２４日)まで入手可能であり、投与１または投与２に関して種々の時点で要約される。両成人年齢群のフェーズ１ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２の安全性結果を、１０μg、２０μgおよび３０μg用量レベルで投与２の１か月後(またはデータカットオフ日)まで示す。若年年齢群の１００μg用量レベルでのＢＮＴ１６２ｂ１の安全性結果は、データカットオフ日に基づき投与１の３週間後または投与２前まで示す。１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１を受けた１８〜５５歳群参加者は、ＩＲＣ決定により１００μg ＢＮＴ１６２ｂ２の２回目の投与を受けなかったことに注意。
局所反応 − フェーズ１
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２レシピエント両者および両年齢群について、注射部位の疼痛が最も高頻度な局所反応であった。紅斑および腫脹は、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびＢＮＴ１６２ｂ１群で低頻度で生じた。ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２群両方で、局所反応の頻度は若年年齢群と比較して年配年齢群で低く、用量の増加に伴い局所反応の頻度が高くなる傾向であった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、注射部位の疼痛は、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後７日以内に最も高頻度で報告された局所反応であった。用量レベルが１０μgから３０μgに増えるに連れて、プラセボ群で０と比較して、注射部位の疼痛(５８.３％〜１００.０％、それぞれ７および１２参加者)の頻度の増加が観察された(図８４)。紅斑は３０μg用量群の２(１６.７％)参加者で報告され、腫脹は２０μg用量群の３(２５.０％)参加者および３０μg用量群の２(１６.７％)参加者で報告された。１００μg用量群で、注射部位の疼痛(１２[１００.０％]参加者)、腫脹(５[４１.７％]参加者)および発赤(４[３３.３％]参加者)が報告され、１[８.３％]参加者は重症注射部位疼痛を有した(注：ＩＲＣ決定により、投与２を１０μg用量レベルの参加者で遅れて投与した)。
ＢＮＴ１６２ｂ１の若年年齢群で投与２後７日以内に、注射部位の疼痛は最も高頻度で報告された局所反応のままであり、プラセボ群(２[２２.２％]参加者と比較して３０μg用量群で１２(１００.０％)参加者に達し、一方発赤を有する参加者の割合(２[１６.７％]参加者)および腫脹(３[２５.０％]参加者)は３０μg用量群で最高であった(図８４)。プラセボ群で発赤または腫脹は報告されなかった。
年配年齢群で、注射部位の疼痛は、プラセボ群(１[１１.１％]参加者)と比較して、２０μgおよび３０μg用量群(各１１[９１.７％]参加者)両者でＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後７日以内に最も高頻度で報告された局所反応であった(図８５)。発赤は報告されず、最も高頻度の腫脹(２[１６.７％]参加者)は３０μg群であった。プラセボ群で発赤または腫脹は報告されなかった。
年配年齢群でＢＮＴ１６２ｂ１の投与２後７日以内に、注射部位の疼痛は、２０μgおよび３０μg用量群(各９[７５.０％]参加者)で最も高頻度で報告された局所反応であった。腫脹(３[２５.０％]参加者)の頻度は３０μgで最大であり、一方発赤(各１[８.３％]参加者)は２０μgおよび３０μg用量群で報告された。プラセボ群で発赤または腫脹は報告されなかった。
１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の局所反応の重症度は軽度または中程度であり、グレード４局所反応は報告されなかった。
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントおよび両年齢群について、注射部位の疼痛(５８.３％〜１００.０％)が最も高頻度な局所反応であり、発赤(０％〜１６.７％)および腫脹(０％〜２５.０％)は低頻度で生じた。顕著なことに、局所反応の頻度は若年年齢群と比較して年配年齢群で低く、用量の増加に伴い局所反応の頻度が高くなる傾向であった。
若年年齢群で、注射部位の疼痛の中央発症日は、用量１０μg〜３０μgにわたり何れかの用量のＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ１ １００μgの投与１後の１.０日目(ワクチン接種日)であった。発赤および腫脹の中央発症日は、全用量群で１.０日目〜３.０日目であった。
年配年齢群で、注射部位の疼痛の中央発症日は、全用量群でＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後の１.０日目(ワクチン接種日)であり、２０μgおよび３０μg用量群で投与２後であった(中央発症日は１０μg用量群投与２後１.５日目)。各投与２後の１参加者の４日目(２０μg用量群)および５日目(３０μg用量群)の発赤以外、報告された発赤または腫脹の他の全ての局所反応は、全用量群で１.０日目〜３.０日目であった。
局所反応は、若年年齢群でおよび年配年齢群で用量レベルにわたり１.０〜４.０日の中央期間で解消した。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、注射部位の疼痛は、投与１後７日以内に最も高頻度で報告された局所反応であり、３０μg用量群で最大であった(１１[９１.７％]参加者)(図８６)。１[８.３％]参加者は３０μgの投与１後重症注射部位疼痛を有した。大部分の参加者は腫脹および発赤を報告しなかった。投与２後、注射部位の疼痛は、プラセボ群(２[２２.２％]参加者)と比較して、２０μgおよび３０μg用量群で最も高頻度で報告された局所反応(８３.３％、各１０参加者)のままであった。プラセボを含むあらゆる用量群で、発赤および腫脹を報告した参加者はなかった。
年配年齢群で、注射部位の疼痛は全用量群でＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後７日以内に報告され、３０μg用量群で最大であったが(７５.０％、９参加者)、あらゆる群で発赤および腫脹は報告されなかった(図８７)。局所反応はプラセボ群で報告されなかった。投与２後、プラセボ群(９[１１.１％]参加者)に対して、注射部位の疼痛(８[６６.７％]参加者)は３０μg群で報告された；ＢＮＴ１６２ｂ２またはプラセボ参加者で発赤および腫脹の報告はなかった。
１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の局所反応の重症度は軽度または中程度であり、グレード４局所反応は報告されなかった。
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントおよび両年齢群について、注射部位の疼痛が最も高頻度な局所反応であった(３３.３％〜９１.７％)および発赤(０％〜８.３％)および腫脹(０％〜１６.７％)は低頻度であった。局所反応の頻度は若年年齢群と比較して年配年齢群で低く、用量の増加に伴い局所反応の頻度が高くなる傾向であった。
若年年齢群で、局所反応の中央発症日は、あらゆる用量レベルでＢＮＴ１６２ｂ２の何れかの投与後１.０日目(ワクチン接種日)から２.０日目であった。年配年齢群で、局所反応の中央発症日は、あらゆる用量レベルでＢＮＴ１６２ｂ２の何れかの投与後１.０日目(ワクチン接種日)〜２.０日目であった。局所反応は、用量レベルにわたり若年および年配年齢群で１.０〜２.０日の中央期間で一般に解消した。
全身性事象 − フェーズ１
全体として、７日以内投与１後、疲労は若年および年配両ＢＮＴ１６２ｂ１群および年配ＢＮＴ１６２ｂ２群で一般に最も高頻度で報告された全身事象であった；一方頭痛および疲労は、若年ＢＮＴ１６２ｂ２用量群で最も高頻度で報告された。全体として、投与２後７日以内、頭痛は若年および年配両ＢＮＴ１６２ｂ１群で最も高頻度で報告された全身事象であり、疲労は若年および年配両ＢＮＴ１６２ｂ２群で最も高頻度で報告された全身事象であった。悪寒は、投与２後一般に高頻度で報告され、ＢＮＴ１６２ｂ２群よりＢＮＴ１６２ｂ１群で高頻度であった。発熱は、年配ＢＮＴ１６２ｂ２群より若年ＢＮＴ１６２ｂ１群で投与２後高頻度で報告された。ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２両レシピエントについて、１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の全身事象の重症度は軽度または中程度であり、グレード４全身事象は報告されなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、疲労ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後７日以内に最も高頻度で報告された全身事象であり、プラセボ群(２[２２.２％]参加者)に対してそれぞれ１０μg、２０μgおよび３０μg用量群の４(３３.３％)、８(６６.７％)および６(５０.０％)参加者で報告された(図８８)。頭痛(６[５０.０％]参加者)および悪寒(７[５８.３％]参加者)は３０μg用量群で報告され、≦１(８.１％)参加者は３０μgまでの各群で発熱を報告した。プラセボ群で、頭痛(１[１１.１％])参加者)が報告され、発熱または悪寒の報告はなかった。１００μg用量群で、３０μg用量群と比較して高頻度で報告された：疲労(１０[８３.３％]参加者)、頭痛(９[７５.０％]参加者)、悪寒(１０[８３.３％]参加者)および発熱(６[５０.０％]参加者)。
ＢＮＴ１６２ｂ１の若年年齢群で投与２後７日以内に、頭痛は最も高頻度で報告された全身事象であり、プラセボ群で０に対し、全３０μg用量群の１２(１００.０％)参加者で報告され、一方疲労および悪寒はそれぞれ３０μg用量群の１０(８３.３％参加者)および８(６６.７％)参加者で報告された。発熱は、２０μgおよび３０μg用量群でそれぞれ１７％および７５％の参加者で報告された。プラセボ群で、２(２２.２％)参加者が疲労を報告し、発熱および悪寒の報告はなかった。
年配年齢群で、疲労ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後７日以内に最も高頻度で報告された全身事象であり、プラセボ群で４(４４.４％)参加者に対し、２０μgおよび３０μg用量群の７(５８.３％)および６(５０.０)％の参加者がそれぞれ疲労を報告した(図８９)。頭痛(６[５０.０％]参加者)および悪寒(２[１６.７％]参加者)は３０μg用量群で報告され、発熱(３[２５.０％]参加者)は３０μg用量群でのみ報告された。プラセボ群で、悪寒(２[２２.２％]参加者)が報告され、頭痛または発熱の報告はなかった。各１参加者は重症筋肉痛(２０μg用量群)および重症疲労(３０μg用量群)を報告した(前者の疼痛は帯状疱疹発症に関連した)。
年配年齢群でＢＮＴ１６２ｂ１の投与２後７日以内に、頭痛は、プラセボ群(１[１１.１％]参加者)と比較して２０μgおよび３０μg用量群(各９[７５.０％]参加者)で報告された最も高頻度の全身事象であった。悪寒は、２０μgおよび３０μg用量群で、それぞれ７(５８.３％)および４(３３.３％)参加者で報告された。発熱は２０μg用量群の６(５０.０％)参加者および３０μg用量群の４(３３.３％)参加者で報告され、１参加者が＞３８.９℃〜４０.０℃の発熱を報告した。プラセボ群で、疲労(２[２２.２％]参加者)が報告され、発熱および悪寒の報告はなかった。
１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の全身事象の重症度は軽度または中程度であり、グレード４全身事象は報告されなかった。年配年齢群で、各投与後の即座の全身事象は、若年年齢群で観察されるより軽度かつ低頻度であった。
全身性事象は、１００μg用量群で投与１後最高頻度および／または重症度であった。解熱／疼痛薬物療法の使用も、両年齢群で用量レベルおよび投与回数の増加につれて増加した。これらの理由のため、ＩＲＣは、若年年齢群参加者が１００μgのＢＮＴ１６２ｂ１の２回目の投与を受けないことを決定した。
若年年齢群で、用量１０μg〜３０μgにわたる何れかの用量のＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ１ １００μgの投与１後の大部分の全身事象の中央発症日は１.０日目〜２.０日目であった。大部分の全身事象は、１.０〜２.０日の中央期間で一般に解消した。疲労について、投与１後の中央期間は、３０μg用量群の２.０日に対して、１０μg用量群で４.０日であった。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１何れかの投与後および全用量群にわたり大部分の全身事象の中央発症日は１.０日目〜３.５日目であった。大部分の全身事象は、１.０〜３.０日の中央期間で一般に解消した。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、頭痛(４[３３.３％]〜６[５０.０％]参加者)および疲労(３[２５.０％]〜５[４１.７％]参加者)は、プラセボ群(各３[３３.３％]参加者)と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後７日以内に最も高頻度で報告された全身事象であった(図９０)。発熱(２[１６.７％]参加者)および悪寒(４[３３.３％]参加者)は３０μg用量群でのみ報告された。片頭痛の先の病歴を有する３０μg群の１参加者は、投与１後７日目に重症片頭痛を報告した。
ＢＮＴ１６２ｂ２の若年年齢群で投与２後７日以内に、疲労は、プラセボ群(５[５５.６％]参加者)と比較して、２０μgおよび３０μg用量群(それぞれ７[５８.３％]および９[７５.０％]参加者)で最も高頻度で報告された全身事象であった。頭痛(８[６６.７％]参加者)、悪寒(７[５８.３％]参加者)および筋肉痛(７[５８.３％]参加者)および発熱(２[１６.７％]参加者)は３０μg用量群で報告された。この事象の中で、疲労(５[５５.６％]参加者)、頭痛(１[１１.１％]参加者)および悪寒(１[１１.１％]参加者)はプラセボ群で報告され、筋肉痛の報告はなかった。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後７日以内に最も高頻度で報告された全身事象は、プラセボ群(２[２２.２％]参加者)に対して、２０μgおよび３０μg用量群(それぞれ４[３３.３％]および３[２５.０％]参加者)で疲労であった(図９１)。頭痛(３[２５.０％]参加者)、悪寒(２[１６.７％]参加者)および筋肉痛(１[８.３％]参加者)は２０μg用量群で最大であった。この事象の中で、頭痛(１[１１.１％]参加者)および筋肉痛(２[２２.２％]参加者)のみがプラセボ群で報告された。発熱は報告されなかった。
年配年齢群でＢＮＴ１６２ｂ２の投与２後７日以内に、疲労は、プラセボ群(１[１１.１％]参加者)と比較して、２０μgおよび３０μg用量群(それぞれ６[５０.０％]および５[４１.７％]参加者)で最も高頻度の全身事象のままであった。頭痛は２０μgおよび３０μg用量群(それぞれ４[３３.３％]および３[２５.０％]参加者)で報告され、一方筋肉痛および悪寒は３０μg用量群(それぞれ３[２５.０％]および２[１６.７％]参加者)で報告された。発熱(１[８.３％]参加者)は３０μg用量群で報告された。この事象の中で、頭痛および筋肉痛はプラセボ群で報告された(各１[１１.１％]参加者)。
１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の全身事象の重症度は軽度または中程度であり、グレード４全身事象は報告されなかった。
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２の何れかの投与後のおよびあらゆる用量群にわたる大部分の全身事象の中央発症日は１.０日目〜４.０日目であった。大部分の全身事象は、１.０〜２.５日の中央期間で一般に解消した。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２の何れかの投与後およびあらゆる用量レベルのあらゆる全身事象の中央発症日は、５.５日目の中央発症日であった１０μg用量群投与１後の全身事象以外、１.５日目〜２.０日目であった。大部分の全身事象は、１.０〜３.０日の中央期間で一般に解消した。
有害事象 − フェーズ１
有害事象の要約 − フェーズ１
投与１から２０２０年８月２４日のデータカットオフ日までの全ＡＥを、投与１から投与２前までのＡＥが要約されるＮＴ１６２ｂ１ １００μg群以外、各ワクチン候補および年齢の全用量レベルについて要約に含めた。
全体として、若年(４１.７％〜５０.０％)および年配(２５.０％〜５８.３％)ＢＮＴ１６２ｂ１群および若年ＢＮＴ１６２ｂ２群(３３.３％〜４１.７％)と比較して、年配ＢＮＴ１６２ｂ２群(８.３％〜２５.０％)で投与１後少なくとも１つのＡＥを報告する参加者が少なかった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、３０μgまでのＢＮＴ１６２ｂ１投与１後、プラセボ群で２(２２.２％)と比較して、５(４１.７％)〜６(５０％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告した。関連ＡＥは、ＢＮＴ１６２ｂ１用量レベルの増加と共に増加した(２５.０％〜５０.０％)；６(５０％)参加者が３０μg用量群で少なくとも１関連ＡＥを報告した。１(８.３％)参加者が３０μg用量群で重症ＡＥ(発熱)を報告した。
１００μg用量群で、プラセボ群で１(３３.３％)参加者に対して、８(６６.７％)参加者がＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後〜投与２前に少なくとも１つのＡＥを報告した。６(５０.０％)参加者が少なくとも１関連ＡＥを有し、１(８.３％)参加者が重症ＡＥ(睡眠障害)を報告した。
年配群で、各３(２５.０％)参加者(３０μg用量群)および７(５８.３％)参加者(１０μgおよび２０μg用量群)が、プラセボ群で４(４４.４％)参加者と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後少なくとも１つのＡＥを報告した。２(１６.７％)〜４(３３.３％)参加者が少なくとも１関連ＡＥを報告し、２０μg用量群で最高頻度であった。各１参加者が２０μg(帯状疱疹)および３０μg(疲労)用量群で重症ＡＥを報告した。
何れの年齢群でも、ＳＡＥ、中止にいたるＡＥまたは死亡は報告されなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、プラセボ群で２(２２.２％)と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後、４(３３.３％)〜５(４１.７％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告した。２(１６.７％)〜４(３３.３％)参加者が少なくとも１関連ＡＥを報告し、２０μg用量群で最高頻度であった。１参加者は３０μg用量群で重症ＡＥ(片頭痛)を報告した。
年配群で、プラセボ群で２(２２.２％)と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後、１(８.３％)〜３(２５.０％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告した。１(８.３％)参加者のみが、少なくとも１関連ＡＥを報告した(２０μg用量群)。各１参加者は、３０μg用量群(筋肉痙攣)およびプラセボ群(神経根症)で重症ＡＥを報告した。
何れの年齢群でも、ＳＡＥ、中止にいたるＡＥまたは死亡は報告されなかった。
有害事象の解析 − フェーズ１
器官別大分類および基本語による有害事象 − フェーズ１
投与１後３週間または投与１から投与２前までのＡＥを要約するＢＮＴ１６２ｂ１ １００μg群以外、全群で投与１から投与２の１か月後までのＡＥを含むＳＯＣおよびＰＴによるＡＥを、このセクションで要約した。
一般的障害および投与部位状態が年配ＢＮＴ１６２ｂ１群および若年ＢＮＴ１６２ｂ２群で最も一般的に報告されたＳＯＣであった。最も一般的に報告されたＳＯＣは若年ＢＮＴ１６２ｂ１群で消化器障害および年配ＢＮＴ１６２ｂ２群で神経系障害であった。一般に、大部分のＰＴは、用量群あたり２以下の参加者で報告された。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１から投与２の１か月後まで、消化器障害は、３０μgまでのＢＮＴ１６２ｂ１群で最も一般的に報告されたＳＯＣであった(各用量群２[１６.７％]参加者)。２０μg用量群のみ、知覚異常(３[２５.０％])が、ＰＴによる最も一般的なＡＥであった。他の全てのＡＥは、プラセボ群を含む用量群あたり、２以下の参加者で報告された。
１００μg用量群で、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１から投与１３週間後まで、精神障害が最も一般的に報告されたＳＯＣ(３[２５.０％]参加者)であり、睡眠障害(３[２５％]参加者)が、ＰＴによる最も一般的なＡＥであった。他の全てのＡＥは、プラセボ群を含み、２以下の参加者で報告された。
年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１から投与２の１か月後まで、一般的障害および投与部位状態はＢＮＴ１６２ｂ１群で最も一般的に報告されたＳＯＣであり、計６参加者で報告された：１０μg用量群の１(８.３％)参加者、２０μg用量群の２(１６.７％)参加者および３０μg用量群の３(２５.０％)参加者。ＰＴによる何らかのＡＥは、用量群あたり１参加者を超えては報告されなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、一般的障害および投与部位状態は最も一般的に報告されたＳＯＣであった。これらの事象は注射部位疼痛および注射部位紅斑を含んだ。ＰＴによる何らかのＡＥは、用量群あたり１参加者を超えては報告されなかった。
年配年齢群で、神経系障害は最も一般的に報告されたＳＯＣであり、３０μg群(坐骨神経痛)およびプラセボ群(神経根症)で各１参加者で報告された。ＰＴによる何らかのＡＥは、用量群あたり１参加者を超えては報告されなかった。
関連有害事象 − フェーズ１
全体として、一般的障害および投与部位状態は、若年および年配ＢＮＴ１６２ｂ１群および若年ＢＮＴ１６２ｂ２群でも一般的に報告されたＳＯＣであった。年配ＢＮＴ１６２ｂ２群で、１(８.３％)参加者で報告された悪心のみが関連ＡＥであった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、一般的障害および投与部位状態は最も一般的に報告されたＳＯＣであった(注射部位疼痛、発熱、悪寒、疲労および注射部位腫脹)。３０μg用量群の各２(１６.７％)参加者が頻脈および発熱の関連ＡＥを報告した。他の全ての関連ＡＥは、用量群あたり２以下の参加者で報告された。
１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１群で、精神障害は最も一般的に報告されたＳＯＣであった。３(２５.０％)参加者が精神障害として睡眠障害を報告した。他の全ての関連ＡＥは、各２以下の参加者で報告された。
年配年齢群で、一般的障害および投与部位状態は最も一般的に報告されたＳＯＣであった(疲労、注射部位痣、注射部位疼痛および末梢腫脹)。ＰＴによる何らかの関連ＡＥは、用量群あたり１参加者を超えては報告されなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、一般的障害および投与部位状態は最も一般的に報告されたＳＯＣであった(注射部位疼痛および注射部位紅斑)。ＰＴによる何らかの関連ＡＥは、プラセボ群を含む用量群あたり１参加者を超えては報告されなかった。
年配年齢群で、２０μg用量群の１(８.３％)参加者のみ、悪心のＡＥを報告した。
即時有害事象 − フェーズ１
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、１参加者が、２０μg ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後知覚異常の即時ＡＥを報告した。１００μg群で、投与１後即時ＡＥを報告した参加者はいなかった。
年配年齢群で、１参加者が、１０μg ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１後眼知覚異常の即時ＡＥを報告した。
ＢＮＴ１６２ｂ１の投与２後即時ＡＥを報告する参加者は何れの年齢群でもいなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後、３参加者が即時ＡＥを報告した：注射部位紅斑(１０μg用量群)、無味覚(２０μg用量群)および注射部位疼痛(３０μg用量群)。ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２後、１参加者が味覚障害の即時ＡＥを報告した(２０μg用量群)。
何れの用量のＢＮＴ１６２ｂ２でも年配年齢群で何らかの即時ＡＥを報告する参加者はいなかった。
重症有害事象 − フェーズ１
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、１参加者が投与２の２日後発熱(１０２.４°Ｆ)の重症ＡＥを報告し(３０μg用量群)、１参加者が投与１の１日後睡眠障害の重症ＡＥを報告した(１００μg用量群)。両ＡＥは、治験担当医により、試験介入に関連すると決定された。
年配年齢群で、２参加者が重症ＡＥを報告した：投与１の２日後の帯状疱疹(２０μg用量群、ＢＮＴ１６２ｂ１と無関係と考えられる)および投与２の１日後の疲労(３０μg用量群、ＢＮＴ１６２ｂ１に関連すると考えられる)。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、片頭痛の病歴のある１参加者投与１の７日後重症片頭痛を報告した(３０μg用量群、無関係と考えられる)。年配年齢群で、２参加者が重症ＡＥを報告した：投与２の２日後筋肉痙攣(３０μg用量群、ＢＮＴ１６２ｂ２と無関係と考えられる)および投与１の３日後(プラセボ)、試験介入と無関係と考えられる神経根症。
死亡、重篤有害事象、安全性関連参加者中止および他の顕著な有害事象 − フェーズ１
死亡 − フェーズ１
この中間ＣＳＲで２０２０年８月２４日のデータカットオフ日までにフェーズ１参加者で死亡した者はいなかった。
重篤有害事象 − フェーズ１
この中間ＣＳＲに含まれる期間中、何らかのＳＡＥを報告するフェーズ１参加者はいなかった。
安全性関連参加者中止 − フェーズ１
この中間ＣＳＲで２０２０年８月２４日のデータカットオフ日までに治験中止に至る何らかのＡＥを有するフェーズ１参加者はいなかった。
他の顕著な有害事象 − フェーズ１
特に興味深いＡＥは、この治験のフェーズ１で定義されなかった。
他の安全性評価 − フェーズ１
重症ＣＯＶＩＤ−１９疾病 − フェーズ１
２０２０年８月２４日のデータカットオフ日までフェーズ１参加者でＣＯＶＩＤ−１９症例の報告はなかった。
妊娠 − フェーズ１
２０２０年８月２４日のデータカットオフ日まで、あらゆるフェーズ１参加者で妊娠の報告はなかった。
死亡、重篤有害事象、安全性関連参加者中止および他の顕著な有害事象の解析および考察 − フェーズ１
この中間ＣＳＲに含まれる期間中、何れの年齢群でもＳＡＥ、中止に至るＡＥまたは死亡は報告されなかった。
臨床検査評価 − フェーズ１
全体として、投与１の１〜３日後、若年および年配ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２群で一過性リンパ球低減(＜０.８×ＬＬＮ)があり、これは投与１後６〜８日で正常に戻った。大部分のシフトは正常またはグレード１からグレード１、２または３リンパ球数減少であり、これは投与１後６〜８日で正常に戻り、全年齢および用量群で観察された。正常からグレード１(若年ＢＮＴ１６２ｂ１群)またはグレード２(年配ＢＮＴ１６２ｂ２群)好中球低減のシフトも観察されたが、低頻度であった。
全体として、報告された他の臨床検査値異常または臨床検査結果のシフトは低頻度であった。リンパ球数低減の発生率は、ＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントと比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントで低かった。臨床所見を伴う臨床検査値異常はなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、一過性リンパ球低減(＜０.８×ＬＬＮ)の臨床検査値異常がそれぞれＢＮＴ１６２ｂ１ １０μg、２０μgまたは３０μgの投与１の１〜３日後参加者の１(８.３％)、４(３３.３％)および６(５４.５％)で観察され、これは投与１後６〜８日で正常に戻った。正常からグレード３リンパ球数減少へのシフトは、１０μgおよび３０μg用量群の各１参加者および２０μg用量群の２(１６.７％)参加者で観察された。投与１の６〜８日後にグレード３リンパ球数減少は観察されなかった。投与１後、正常からグレード２好中球低減へのシフトがプラセボ群の１(１１.１％)参加者で観察され、投与１の１９〜２３日後には観察されなかった。投与２の６〜８日後、好中球低減のシフトが１０μg用量群(グレード１からグレード２)および３０μg用量群(正常からグレード２)の各１参加者で観察された。両参加者は、投与２の約１か月後の計画外来院時グレード１にシフトした。
１００μg ＢＮＴ１６２ｂ１群で、一過性リンパ球低減(＜０.８×ＬＬＮ)の臨床検査値異常が投与１の１〜３日後９(７５.０％)参加者で観察され、これは投与１後６〜８日で正常に戻った。正常からグレード３リンパ球数減少へのシフトが投与１の１〜３日後４(３３.３％)参加者で観察され、これは投与１後６〜８日で正常に戻った。正常からグレード１好中球低減へのシフトが投与１の６〜８日後３(２５.０％)参加者で観察され、投与１の１９〜２３日後までに正常に戻った。
年配年齢群で、一過性リンパ球低減(＜０.８×ＬＬＮ)の臨床検査値異常が、ＢＮＴ１６２ｂ１ １０μg、２０μgまたは３０μgの投与１の１〜３日後それぞれ１(８.３％)、３(２５.０％)および２(１６.７％)参加者でも観察され、これは投与１後６〜８日で正常に戻った。ＢＮＴ１６２ｂ１の投与１の１〜３日後、正常からグレード３またはグレード４リンパ球数減少へのシフトがそれぞれ３０μgおよび１０μg用量群の各１(８.３％)参加者で観察され、何れも投与１の６〜８日後までに正常に戻った。
全体として、報告された他の臨床検査値異常または臨床検査結果のシフトは低頻度であった。臨床所見を伴う異常はなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、一過性リンパ球低減(＜０.８×ＬＬＮ)の臨床検査値異常ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の１〜３日後２０μgおよび３０μg用量群の各１(８.３％)参加者で観察され、これは投与１後６〜８日で正常に戻った。ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の１〜３日後、正常からグレード１リンパ球数減少へのシフトがそれぞれ１０μg、２０μgおよび３０μg用量群の３(２５.０％)、２(１６.７％)および４(３３.３％)参加者で観察され、正常からグレード２リンパ球数減少のシフトが２０μgおよび３０μg用量群の各１(８.３％)参加者で観察された。投与１の６〜８日後までに、グレード２またはグレード３リンパ球数減少は観察されなかった。
年配年齢群で、一過性リンパ球低減(＜０.８×ＬＬＮ)の臨床検査値異常が全用量レベルにわたりＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の１〜３日後各１(８.３％)参加者で観察され、これは投与１後６〜８日で正常に戻った。正常からグレード３(１０μg用量群)およびグレード１からグレード３(３０μg用量群)リンパ球数減少のシフトが投与１後各１(８.３％)参加者で観察された。正常からグレード２好中球低減へのシフトが投与１の１〜３日後２０μg用量群の２(１６.７％)参加者で観察され、投与１の６〜８日後までにグレード２へのシフトは観察されなかった。正常からグレード２好中球低減へのシフトが投与１の６〜８日後１０μg用量群の１(８.３％)参加者で観察された。投与１の１９〜２３日後まで、あらゆる用量群でグレード２好中球低減へのシフトは観察されなかった。
全体として、報告された他の臨床検査値異常または臨床検査結果のシフトは低頻度であった。リンパ球数低減の発生率は、ＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントと比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントで低かった。臨床所見を伴う臨床検査値異常はなかった。
身体検査所見 − フェーズ１
全体として、両年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ１よりＢＮＴ１６２ｂ２後で、身体検査中に示される異常が少なかった。異常は一般に投与１の１〜３日後観察され、大部分は、四肢、筋骨格系または皮膚であった。
ＢＮＴ１６２ｂ１
若年年齢群で、ベースライン身体検査中に異常は示されなかった。全体として、無作為化後、大部分の異常は１０μg、２０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１(９[２０.０％]参加者)の投与１の１〜３日後および投与２の６〜８日後(７[１５.６％]参加者)観察された。３０μg用量群で、最大６(５０.０％)参加者が投与１の１〜３日後異常を有し、大部分の異常は四肢であった。
１００μg用量群で、１(８.３％)参加者のみベースライン時に異常を有した。投与１から投与１の３週間後まで、９(７５.０％)参加者はＢＮＴ１６２ｂ１の１〜３日後異常を有し、大部分の異常は四肢であった。
年配年齢群で、ベースライン身体検査中５(１１.１％)参加者で異常が示され、あらゆる用量群で２以下の参加者であった。全体として、無作為化後、大部分の異常はＢＮＴ１６２ｂ１の投与１の１〜３日後観察された(１５[３３.３％]参加者)。２０μgおよび３０μg用量群で、６(５０.０％)および４(３３.３％)参加者が投与１の１〜３日後異常を有し、大部分の異常は筋骨格系または四肢が関与した。
身体検査で臨床的に重要な所見はなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２
若年年齢群で、ベースライン身体検査中５(１１.１％)参加者で異常が示され、あらゆる用量群で２以下の参加者であった。全体として、無作為化後、大部分の異常は１０μg、２０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１の１〜３日後(５[１１.１％]参加者)および投与２の６〜８日後(４[８.９％]参加者)観察され、大部分は四肢または皮膚の異常であった。
年配年齢群で、ベースライン身体検査中３０μg用量群の１(８.３％)参加者で異常が示された。無作為化後、全体的にあらゆる用量群２以下の参加者が、あらゆる来院窓中の身体検査で異常を有した。
ベースライン時身体検査で臨床的に重要な所見はなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２を評価する安全性結果のフェーズ１要約
全体として、反応原性事象は忍容性が良好であり、短期であった(中央期間１.０〜４.０日)。全参加者は、２回目の投与を受けに再来した。反応原性事象の結果としての全ＡＥは、後遺症なく解消した。
両年齢群の局所反応について、注射部位の疼痛(５８.３％〜１００.０％)、発赤(０％〜１６.７％)および腫脹(０％〜２５.０％)がＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントで報告され、これは、ＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントでより高頻度であった：注射部位の疼痛(３３.３％〜９１.７％)、発赤(０％〜８.３％)および腫脹(０％〜１６.７％)。一般に、局所反応の頻度は、用量レベルの増加と共に高くなることが観察された。
局所反応の頻度は、若年年齢群と比較して年配年齢群で低かった。最も高頻度に報告された局所反応である注射部位の疼痛の頻度は、若年年齢群で３０μgのＢＮＴ１６２ｂ１後(投与１および投与２両者で１００.０％)および３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２(投与１および投与２各９１.７％および８３.３％)と比較して、年配年齢群で３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１後(９１.７％および７５.０％)および３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２後(投与１および投与２各７５.０％および６６.７％)と低かった。
年配年齢群のＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントは、年配年齢群のＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントと比較して、低頻度の局所反応が被告された。年配３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２群で、注射部位の疼痛は、年配３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１群投与１後(９１.７％)および投与２(７５.０％)より投与１後(７５.０％)および投与２(６６.７％)で低かった。
投与１または投与２の両年齢群での一般的全身事象は、３０μgまでのＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントで疲労(１６.７％〜８３.３％)、頭痛(２５.０％〜１００％)、悪寒(８.３％〜６６.７％)、発熱(０％〜７５.０％)および筋肉痛(８.３％〜７５.０％)であり、これは、３０μgまでのＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントより高頻度であった：疲労(８.３％〜７５.０％)、頭痛(０％〜６６.７％)、悪寒(０％〜５８.３％)、発熱(０％〜１６.７％)および筋肉痛(０％〜５８.３％)。一般に、頻度の全身事象は、用量レベルの増加と共に高くなることが観察された。
頻度の全身事象は、若年年齢群と比較して年配年齢群で低かった。疲労の頻度は、若年年齢群でそれぞれ投与１および投与２の３０μgのＢＮＴ１６２ｂ１後(５０.０％および８３.３％)および３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２後(４１.７％および７５.０％)と比較して、年配年齢群で３０μgのＢＮＴ１６２ｂ１後(５０.０％および６６.７％)および３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２後(それぞれ投与１および投与２で２５.０％および４１.７％)で低かった。
年配年齢群のＢＮＴ１６２ｂ２レシピエントは、年配年齢群のＢＮＴ１６２ｂ１レシピエントと比較して低頻度の全身事象が報告された。疲労の頻度は、年配３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１群(それぞれ投与１および投与２で５０.０％および６６.７％)より年配３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２群(それぞれ投与１および投与２で２５.０％および４１.７％)で低かった。
大部分のＡＥの重症度は軽度または中程度であった。大部分の関連ＡＥは、e-diaryで報告された応答型反応原性事象に類似した。数重症ＡＥが報告されたが、試験介入に関連するとは考えられなかった。
ＳＡＥ、死亡またはＡＥによる中止はなかった。
リンパ球の一過性低減が投与１の１〜３日後全年齢および用量群で観察され、これは投与１の６〜８日後までに解消した。
身体検査で臨床的に重要な所見はなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２は、ＢＮＴ１６２ｂ１と比較して好都合な反応原性および安全性プロファイルを示し、それによりフェーズ２／３開発のためにＢＮＴ１６２ｂ２を選択した。
フェーズ１安全性結論
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２の全試験用量(１０μg、２０μgおよび３０μg)は、反応原性プロファイルにより最初の投与後中止したＢＮＴ１６２ｂ１ １００μg以外、安全かつ忍容性が良好であった。
反応原性は、一般に投与１より投与２後高かった。
局所および全身反応原性の頻度は、特に２回目の投与後、ＢＮＴ１６２ｂ１と比較してＢＮＴ１６２ｂ２が一般に低かった。
高齢成人でのＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２両者の各投与後の反応原性事象は、若年成人で観察されるより軽度かつ低頻度であった。反応原性事象の大部分の重症度は軽度または中程度であった。
大部分のＡＥは軽度または中程度であった。ＳＡＥまたはＡＥによる中止はなかった。
全体として、ＢＮＴ１６２ｂ１を受けた参加者よりＢＮＴ１６２ｂ２を受けた参加者で経験するＡＥが少なく、ＢＮＴ１６２ｂ２ 年配年齢群の参加者が経験するＡＥが最も少なかった。ＢＮＴ１６２ｂ２後年配年齢群で数重症ＡＥが観察され、全て試験介入に無関係と考えられた。
臨床検査評価は、投与１後全年齢および用量群で観察されるリンパ球の一過性低減を示し、これは数日以内に解消し、他の臨床的後遺症と何ら関係せず、臨床的に関連すると考えられなかった。
３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２を、この用量および構築物が好都合な反応原性プロファイルおよび頑強免疫応答の最適な組み合わせを提供したため、治験のフェーズ２／３部分に進めることを選択した。
フェーズ２
安全性データはデータカットオフ日(２０２０年９月２日)まで入手可能であり、フェーズ２の３６０参加者についてデータカットオフ日まで要約する。フェーズ２の全参加者は、e-diaryを使用して、局所反応および全身事象を報告した。
局所反応 − フェーズ２
ＢＮＴ１６２ｂ２の１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の局所反応の重症度は軽度または中程度であり、グレード４(命を脅かす可能性のある)局所反応は報告されなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、注射部位の疼痛は、若年年齢群(図９２)で年配年齢群(図９３)より高頻度で報告され、頻度は、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２と比較して、投与１後類似であり、若年年齢群(それぞれ８５.２％対８０.２％)および年配年齢群(それぞれ７０.7％対72.％)であった。プラセボ群で、注射部位の疼痛は、投与１および投与２後若年および年配年齢群で類似の頻度(７.８％対１０.２％)で報告された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、発赤および腫脹は、投与１後若年および年配年齢群で類似した。投与２後、頻度の発赤および腫脹は、若年年齢群(それぞれ３.５％および３.５％)より年配年齢群(それぞれ７.７％および１２.１％)でわずかに高かった。プラセボ群で、年配年齢群の１参加者のみが投与１後発赤を報告し、腫脹の報告はなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者(年配年齢群)は投与１後重症注射部位疼痛を報告し、若年年齢群の１参加者は投与２後重症注射部位疼痛を報告した。ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者(年配年齢群)は投与２後重症発赤を報告した
全体として、年齢群にわたり、注射部位の疼痛が最も高頻度な局所反応であり、投与２後増加せず、発赤および腫脹は、投与１および投与２後一般に類似の頻度であった。
年齢群にわたり、何れの用量後のＢＮＴ１６２ｂ２群の局所反応は中央発症日１.０日目〜３.０日目(１.０日目はワクチン接種日であった)を有し、範囲は、若年および年配年齢群で一般に類似した。年齢群にわたり、ＢＮＴ１６２ｂ２の何れかの投与後、局所反応は１.０〜３.０日の中央期間後解消し、これは、若年および年配年齢群で一般に類似した。
全身性事象 − フェーズ２
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、全身事象は、年配群(図９５)と比較し若年群(図９４)でより高頻度で報告され、重症度が高く、頻度および重症度は投与回数と共に増加した(投与１対投与２)。嘔吐および下痢は例外であり、嘔吐は両年齢群で低頻度および類似であり、嘔吐および下痢は各投与後類似した。若年および年配ＢＮＴ１６２ｂ２群の全身事象の頻度(投与１対投与２)を下に列記する。
疲労：若年群(５０.０％対５９.３％)に対して年配群(３５.９％対５２.７％)
頭痛：若年群(３１.８％対５１.２％)に対して年配群(２７.２％対３６.３％)
筋肉痛：若年群(２３.９％対４５.３％)に対して年配群(１４.１％対２８.６％)
悪寒：若年群(９.１％対４０.７％)に対して年配群(７.６％対２０.９％)
関節痛：若年群(９.１％対１７.４％)に対して年配群(４.３％対１６.５％)
発熱：若年群(３.４％対１７.４％)に対して年配群(０.０％対１１.０％)。
嘔吐：両年齢群および何れかの投与後類似した。
下痢：年配群で低頻度で報告され、各投与後類似した。
全身性事象は、いくつかの例外があるが、両年齢群および投与で、ＢＮＴ１６２ｂ２群よりプラセボ群で一般に低頻度で報告された。若年年齢群で、投与１後の発熱、頭痛、悪寒、嘔吐および下痢および投与２後の嘔吐は、プラセボ群とＢＮＴ１６２ｂ２群で類似の頻度で報告された(図９４)。年配年齢群で、投与１後の嘔吐、下痢、筋肉痛および関節痛および投与２後の嘔吐および下痢は、プラセボ群とＢＮＴ１６２ｂ２群で類似の頻度で報告された(図９５)。
解熱／疼痛薬物療法の使用は、両投与後年配年齢群でわずかに低頻度であったが、両年齢群で全体的に投与１後と比較して投与２後増加した。解熱／疼痛薬物療法の使用は、ＢＮＴ１６２ｂ２群よりプラセボ群で低頻度であった。
１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の全身事象の重症度は軽度または中程度であり、グレード４(命を脅かす可能性のある)全身事象は報告されなかった。年齢群にわたり、重症全身事象は、全体としてＢＮＴ１６２ｂ２の投与２後のみ報告され、発熱(１.１％)、疲労(４.０％)、頭痛(２.８％)、悪寒(２.３％)および筋肉痛(１.７％)を含んだ。
年齢群にわたり、ＢＮＴ１６２ｂ２の両投与後の全身事象は、中央発症日２.０日目〜３.０日目(１.０日目はワクチン接種日であった)であり、範囲は若年および年配年齢群で類似した。年齢群にわたり、この群何れかの投与後の全身事象は、１日の中央期間で解消し、これは若年および年配年齢群で類似した。投与１後に生じる全身事象の期間と、投与２後に生じるものと比較して、明確な差はなかった。
有害事象 − フェーズ２
有害事象の要約 − フェーズ２
少なくとも１つのＡＥを報告した参加者数は、プラセボ群と比較してＢＮＴ１６２ｂ２群で類似し、これは、若年および年配年齢群の２ワクチン群で一般に類似した(それぞれ表１０および表１１)。
２重症事象がＢＮＴ１６２ｂ２ 若年年齢群の２参加者で報告された：筋肉痛(ＡＥ)および胃腺癌(ＳＡＥ)。胃腺癌のＳＡＥは、投与１を受けた２３日後発症した。何れの事象も、治験担当医により試験介入に無関係と評価された。
投与２の７日後からデータカットオフ日(２０２０年９月２日)まで、さらに何らかのＡＥを報告した参加者はいない。
Figure 2021185136
Figure 2021185136
有害事象の解析 − フェーズ２
器官別大分類および基本語による有害事象 − フェーズ２
表１２は、ＳＯＣおよびＰＴによる投与１から投与２の７日後までの少なくとも１つのＡＥを報告した参加者数を示す。
少なくとも１つのＡＥを報告した参加者数は、投与１から投与２の７日後のプラセボ群と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２群で類似した。
若年年齢群で、それぞれＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群で８(９.１％)および１０(１１.１％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告した。年配年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ４(４.３％)および８(８.９％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告した。
全体として、投与２の７日後までに報告された大部分のＡＥは、消化器障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で３[１.７％]およびプラセボ群で２[１.１％])、一般的障害および投与部位状態(ＢＮＴ１６２ｂ２群で３[１.７％]およびプラセボ群で７[３.９％])および筋骨格および結合組織障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で３[１.７％]およびプラセボ群で１[０.６％])のＳＯＣであった。
ＰＴによる最も高頻度で報告されたＡＥは若年ＢＮＴ１６２ｂ２群で注射部位疼痛(３[３.４％])であり、これは、局所反応期間中投与１のワクチン接種日で全て生じた。２事象は３日以内に解消し、１事象は１１後解消した。ＰＴによる他の全てのＡＥは、各ワクチン群で２以下の参加者で報告された。
年配ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者は、上部左腕三角筋領域に挫傷のＡＥを有し、これは、治験担当医により試験介入に関連すると評価された。
Figure 2021185136
関連器官別大分類および基本語による有害事象 − フェーズ２
投与１から投与２の７日後まで治験担当医により試験介入に関連すると評価されたＡＥを有する参加者数は低頻度であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群で類似した。ＢＮＴ１６２ｂ２群内で、若年および年配年齢群の参加者の類似の割合が、関連ＡＥを報告した。大部分の治験担当医評価関連ＡＥは、一般的障害および投与部位状態のＳＯＣにおける反応原性事象であり、プラセボ群と比較して全体的にＢＮＴ１６２ｂ２群の参加者で類似の割合で報告され、注射部位疼痛はＢＮＴ１６２ｂ２若年年齢群で最も高頻度かつ排他的に報告されたＰＴであった。
即時有害事象 − フェーズ２
ＢＮＴ１６２ｂ２ ３０μgの何れの投与またはプラセボ後即時ＡＥはなかった。
重度または命を脅かす有害事象 − フェーズ２
２参加者(何れもＢＮＴ１６２ｂ２若年年齢群)は、筋肉痛(ＡＥ)および胃腺癌(ＳＡＥ)の重症事象を報告した。筋肉痛を報告した参加者は肩甲骨筋肉痛を有し、それは投与２の２日後に始まり、データカットオフ時継続していた。何れの事象も、治験担当医により試験介入に無関係と評価された。
死亡、重篤有害事象、安全性関連参加者中止および他の顕著な有害事象 − フェーズ２
死亡 − フェーズ２
この中間ＣＳＲで２０２０年９月２日のデータカットオフ日まで死亡したフェーズ２参加者はいなかった。
重篤有害事象 − フェーズ２
１参加者は、投与１から投与２の７日後ＳＡＥを有した(表１３)。ＢＮＴ１６２ｂ２若年年齢群の１参加者は、投与１の２３日後胃腺癌のＳＡＥを有し、これは、治験担当医により試験介入に無関係であると評価された(表１３)。ＳＡＥはデータカットオフ時継続し、参加者は、ＳＡＥにより治験を中止した。
投与２の７日後からデータカットオフ日(２０２０年９月２日)まで、何らかのＳＡＥを報告するさらなる参加者はいなかった。
Figure 2021185136
安全性関連参加者中止 − フェーズ２
胃腺癌のＳＡＥを報告したＢＮＴ１６２ｂ２若年年齢群の参加者は、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後２３日目に治験を中止した。
安全性関連参加者中止の注釈 − フェーズ２
データカットオフ日(２０２０年９月２日)までＳＡＥにより治験を中止したフェーズ２参加者の注釈が提供された。
他の顕著な有害事象 − フェーズ２
特に興味深いＡＥは、この治験のフェーズ２で定義されなかった；しかしながら、標的医学事象を治験を通してモニターした。
死亡、重篤有害事象、安全性関連参加者中止および他の顕著な有害事象の解析および考察 − フェーズ２
２０２０年９月２日のデータカットオフ日まで、胃腺癌のＳＡＥにより若年年齢群(ＢＮＴ１６２ｂ２群)の１参加者が治験を中止したが、これは、治験担当医により試験介入に無関係であると評価された。
フェーズ２安全性結論
年齢群にわたり、局所反応は、各回後一般に類似の頻度であり、全身事象は、一般に投与１と比較して投与２後頻度および重症度が増加した。局所および全身反応原性事象は忍容性が良好であり、短期であった。
高齢成人で各ＢＮＴ１６２ｂ２投与後の反応原性事象は、一般に若年成人で観察されるより軽度かつ低頻度であった。反応原性事象の大部分の重症度は軽度または中程度であった。グレード４事象は報告されなかった。
参加者のＡＥは低頻度であり、大部分のＡＥの重症度は軽度または中程度であった。治験担当医により関連すると評価されたＳＡＥまたはＡＥによる中止はなかった。
３６０参加者で評価したＢＮＴ１６２ｂ２ ３０μg後の反応原性およびＡＥプロファイルは、フェーズ１でＢＮＴ１６２ｂ２ ３０μg後観察された安全性プロファイルに一致した。
３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２は、投与２の７日後まで安全かつ忍容性が良好であった。
フェーズ２／３
この中間ＣＳＲで、フェーズ３の安全性結果は、２０２０年１０月６日の安全性データカットオフ日まで３６,８５５青年後期および成人参加者(１６〜９１歳)を含んだ。ＡＥ要約は、参加者が投与２の１か月後の来院を終えているかいないかにかかわらず、報告されたあらゆるＡＥを含んだ。最初の６６１０成人参加者(１８〜８５歳、フェーズ２の３６０参加者を含んだ)は、e-diaryを使用して、局所反応および全身事象を報告し、少なくとも投与２の１か月後まで安全性データを要約した。
治験のフェーズ２／３部分の間、ワクチン疾患増強の理論的関係についての停止規則が、同等以上に極度の有害重症症例分割の観察される１側確率が５％以下であるならば、ワクチンおよびプラセボレシピエントの同じ真の発生率を仮定して、発動させ、この確率が１１％未満であるならば、アラート条件を発現させた。アームあたり約１８,０００で、治験の少なくとも１つの有害事象を検出する確率は＞８３％であることに注意する。
局所反応 − フェーズ２／３
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、注射部位の疼痛は、若年年齢群(図９６)で年配年齢群(図９７)より高頻度で報告され、頻度は、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２と比較して、投与１後類似であり、若年年齢群(それぞれ８５.3％対７９.５％)および年配年齢群(それぞれ７１.7％対６６.６％)であった。プラセボ群で、用量１および２後の注射部位の疼痛は、年配年齢群(それぞれ８.８％および７.７％)より若年年齢群(それぞれ１３.８％および１１.９％)でわずかに高頻度で報告された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、頻度の発赤および腫脹は、用量１および２後若年および年配年齢群で類似した。頻度の発赤は、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２と比較して、投与１後類似であり、若年年齢群(それぞれ４３％対５.４％)および年配年齢群(それぞれ４.５％対６.６％)であった。頻度の腫脹は、ＢＮＴ１６２ｂ２の投与２と比較して、投与１後類似であり、若年年齢群(それぞれ５.５％対５.９％)および年配年齢群(それぞれ６.５％対７.０％)であった。プラセボ群で、発赤および腫脹は、用量１および２後若年(≦０.８％)および年配(≦１.３％)年齢群で低頻度で報告された。
全体として、年齢群にわたり、注射部位の疼痛投与２後増加せず、発赤および腫脹は、投与１および投与２後一般に類似の頻度であった。重症局所反応(≦０.８％)は、全体的に何れの投与後のＢＮＴ１６２ｂ２群でも低頻度で報告されたが、若年群でより高頻度で生じた。１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の局所反応の重症度は軽度または中程度であり、グレード４局所反応は報告されなかった。
サブグループ解析
国、性別、人種または民族性による局所反応の臨床的に意味のある差は観察されなかった。
年齢群にわたり、何れの用量後のＢＮＴ１６２ｂ２群の局所反応は中央発症日１.０日目〜３.０日目(１.０日目はワクチン接種日であった)を有し、範囲は若年および年配年齢群で類似した。年齢群にわたり、何れかの投与後のこの群の局所反応は中央期間１.０〜２.０日で解消し、これは、若年および年配年齢群で類似した。
全身性事象 − フェーズ２／３
全身性事象は、年配群(図９９)と比較して若年群(図９８)で頻度および重症度が一般に増加し、頻度および重症度は投与回数と共に増加した(投与１対投与２)。嘔吐および下痢は例外であり、嘔吐は両年齢群で低頻度および類似であり、嘔吐および下痢は各投与後類似した。若年および年配ＢＮＴ１６２ｂ２群の全身事象の頻度(投与１対投与２)を下に列記する。
疲労：若年群(４９.０％対６１.６％)に対して年配群(３４.３％対５１.２％)
頭痛：若年群(４２.９％対５３.１％)に対して年配群(２５.４％対３９.５％)
筋肉痛：若年群(２２.０％対３８.６％)に対して年配群(１４.０％対２８.５％)
悪寒：若年群(１４.４％対３６.５％)に対して年配群(６.２％対２２.８％)
関節痛：若年群(１０.９％対２２.４％)に対して年配群(８.３％対１８.９％)
発熱：若年群(３.７％対１６.６％)に対して年配群(１.４％対１１.５％)。
嘔吐：両年齢群および何れかの投与後類似した。
下痢：年配群で低頻度で報告され、各投与後類似した。
全身性事象は、いくつかの例外があるが、両年齢群および投与で、ＢＮＴ１６２ｂ２群よりプラセボ群で一般に低頻度で報告された。若年年齢群で、発熱および関節痛(投与１後)および嘔吐および下痢(投与１および投与２後)がプラセボ群およびＢＮＴ１６２ｂ２群で類似の頻度で報告された(図９８)。年配年齢群で、発熱および関節痛(投与１後)および嘔吐および下痢(投与１および投与２後)がプラセボ群およびＢＮＴ１６２ｂ２群で類似の頻度で報告された(図９９)。
解熱／疼痛薬物療法の使用は、両投与後若年年齢群(２８.１％〜４５.８％)より年配年齢群(２０.１％〜３７.４％)でわずかに低頻度であり、薬物療法使用は、両年齢群で投与１後と比較して投与２後増加した。解熱／疼痛薬物療法の使用は、ＢＮＴ１６２ｂ２群よりプラセボ群で低頻度でり、若年および年配プラセボ群投与１および投与２後類似した(９.８％〜１３.７％)。
ＢＮＴ１６２ｂ２の投与１後の年齢群にわたる重症全身事象は、一般に投与２後より低頻度であった：発熱(０.１％対０.８％)、疲労(０.８％対３.７％)、頭痛(０.５％対１.９％)、悪寒(０.２％対１.７％)、筋肉痛(０.３％対１.６％)および関節痛(０.１％対０.６％)。下痢および嘔吐頻度は一般に類似した。
プラセボ群で、重症発熱が投与１および投与２後で類似の頻度(０.１％)で報告された。若年ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者は、投与２の２日後のみ４１.２℃の発熱を報告し、報告期間の他の全ての日に熱はなかった。
１回目および２回目の投与後および両年齢群で、大部分の全身事象の重症度は軽度または中程度であり、グレード４(命を脅かす可能性のある)全身事象は、ＢＮＴ１６２ｂ２群で１参加者で１日だけの発熱(４１.２℃)以外、報告されなかった。
サブグループ解析
全身事象で国、民族性、性別または人種で臨床的に意味のある差は観察されなかった。
年齢群にわたり、大部分の全身事象の中央発症日は、ＢＮＴ１６２ｂ２の何れかの投与後２.０日目(１.０日目はワクチン接種日であった)であり、範囲は若年および年配年齢群で類似した。年齢群にわたり、全ての全身事象は１.０日の中央期間で解消し、これは若年および年配年齢群で類似した。
有害事象 − フェーズ２／３
この中間ＣＳＲで、最初の６６１０成人参加者(フェーズ２の３６０参加者を含んだ)は、少なくとも投与２の１か月後まで安全性データを要約した。カットオフ日(２０２０年１０月６日)までの全３６,８５５参加者のＡＥ要約は、参加者が投与２の１か月後の来院を終えているかいないかにかかわらず、報告された何らかの事象を含んだ。データカットオフ日時点で、少なくとも１つのコード化されていないプロトコール逸脱用語を有する参加者のパーセンテージ(≦０.７％)は小さかった。
有害事象の要約 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者 − フェーズ２／３
表１４は、投与１から投与２の１か月後まで少なくとも１つのＡＥを報告した最初の６６１０参加者の要約を示す。
少なくとも１つのＡＥを報告した参加者数は、プラセボ群と比較してＢＮＴ１６２ｂ２群で類似した。中止に至る重症ＡＥ、ＳＡＥおよびＡＥは、両群でそれぞれ≦１.１％、０.５％および０.２％報告された。
若年および年配年齢群で、投与１から投与２の１か月後までの少なくとも１つのＡＥを報告した参加者数は、ＢＮＴ１６２ｂ２群および対応するプラセボ群で類似した。若年および年配年齢群の関連ＡＥ、中止に至る重症ＡＥ、ＳＡＥおよびＡＥの率も、対応するプラセボ群と類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群に投与１からデータカットオフ日まで少なくとも１つのＡＥを報告した最初の６６１０参加者は、投与２の１か月後の対応する群と類似した(表１４)。投与２の１か月後からデータカットオフ日まで、若年年齢群のさらに４参加者(３がＢＮＴ１６２ｂ２および１がプラセボ)および年配年齢群のさらに１０参加者(３がＢＮＴ１６２ｂ２および７がプラセボ)少なくとも１つのＡＥを報告した。いずれの群でもさらなる関連ＡＥ、重症ＡＥ、ＳＡＥまたは中止に至るＡＥは報告されなかった。
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全参加者 − フェーズ２／３
投与１からデータカットオフ日まで、少なくとも１つのＡＥを報告した全参加者数は、プラセボ群と比較してＢＮＴ１６２ｂ２群で高かった。中止に至る重症ＡＥ、ＳＡＥおよびＡＥは、両群でそれぞれ≦０.８％、０.３％および０.１％報告された。関連ＡＥによる中止は、ＢＮＴ１６２ｂ２群で６参加者およびプラセボ群で４参加者報告された。
３フェーズ３参加者死亡：ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者および２参加者プラセボ群。死亡したＢＮＴ１６２ｂ２群の参加者は、動脈硬化症のＳＡＥの経験があり、これは、治験担当医により試験介入に無関係であると評価された。
若年年齢群で、少なくとも１つのＡＥを報告した参加者数は、ＢＮＴ１６２ｂ２およびプラセボ群でそれぞれ１９２０(１８.１％)および８８０(８.３％)であった。年配年齢群で、少なくとも１つのＡＥを報告した参加者数は、ＢＮＴ１６２ｂ２およびプラセボ群でそれぞれ１１６６(１４.９％)および５８２(７.４％)であった。
有害事象の解析 − フェーズ２／３
器官別大分類および基本語による有害事象 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者 − フェーズ２／３
このプログラムで同定された層(Tier)１ ＡＥはなかった。
投与１から投与２の１か月後報告された層２ ＡＥ(何れかのワクチン群で事象率≧１.０％と定義[ＰＴレベル])はなかった。
全体的に投与２の１か月後までに報告された大部分のＡＥは反応原性であり、一般的障害および投与部位状態(ＢＮＴ１６２ｂ２群で８１[２.４％]およびプラセボ群で５７[１.７％])、筋骨格および結合組織障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で８１[２.４％]およびプラセボ群で５６[１.７％])、感染症および寄生(ＢＮＴ１６２ｂ２群で５６[１.７％]およびプラセボ群で４８[１.５％])および消化器障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で５４[１.６％]およびプラセボ群で４１[１.２％])のＳＯＣであった(表１５)。若年ＢＮＴ１６２ｂ２群で、これらのＳＯＣのＡＥ率は、一般的障害および投与部位状態(５４[３.０％])、筋骨格および結合組織障害(５３[３.０％])、感染症および寄生(３１[１.７％])および消化器障害(３２[１.８％])であった。年配ＢＮＴ１６２ｂ２群で、これらのＳＯＣのＡＥ率は、一般的障害および投与部位状態(２７[１.８％])、筋骨格および結合組織障害(２８[１.８％])、感染症および寄生(２５[１.６％])および消化器障害(２２[１.４％])であった。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、全体的にＰＴによる最も高頻度に報告されたＡＥは、注射部位疼痛(３０[０.９％])、頭痛(３０[０.９％])および疲労(２７[０.８％])(表１５であり、この期間中(投与１から投与２の１か月後まで)このＡＥの大部分は、e-diary １週間報告期間中報告された。これらＰＴの大部分は若年年齢群で報告された：頭痛(２１[１.２％])および疲労(１７[１.０％])。注射部位疼痛は、若年(１６[０.９％])および年配(１４[０.９％])年齢群で類似の頻度で報告された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、６が若年年齢群でおよび４が年配年齢群で１０(０.３％)参加者がリンパ節腫脹のＡＥを報告し、プラセボ群で０であった；１(０.１％)は男性であり、９(０.５％)は女性であった。リンパ節腫脹のＡＥは、腕および首領域で生じた(腋窩、左腋窩、左副鎖骨、左鎖骨上、両側性頸部または不特定リンパ節)。大部分のリンパ節腫脹事象は、ワクチン接種後２〜４日以内に報告された(２事象はワクチン接種８日後報告された)。事象の５つは４日以上継続し、３事象は１２〜１６日継続し、２事象はデータカットオフ日時点で継続した。
若年年齢群で、投与１の１３日後血管浮腫のＡＥ(両眼)および過敏症(アレルギー発作[この報告時点でさらに入手可能な情報なし]、試験介入と無関係)が各１参加者(ＢＮＴ１６２ｂ２群)で報告され、薬物過敏症のＡＥ(経口ペニシリン反応)が１参加者(プラセボ)で報告された。これらの事象は治験担当医により試験介入に関連すると評価されなかった。年配プラセボ群の１参加者で穿孔虫垂炎と比較して、若年ＢＮＴ１６２ｂ２群の３参加者は、虫垂炎を報告した；全て、治験担当医により試験介入と無関係と評価された。
Figure 2021185136
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全参加者 − フェーズ２／３
データカットオフ日までの全３６,８５５参加者で、ＢＮＴ１６２ｂ２群で計１２１(０.７％)参加者およびプラセボ群で５１(０.３％)参加者で少なくとも１つのコード化されていないプロトコール逸脱用語があった。その結果、コード化されていないプロトコール逸脱用語もＳＯＣおよびＰＴにより要約する他のＡＥ表に示す。
投与１からデータカットオフ日まで、少なくとも１つのＡＥを報告した全参加者数は、プラセボ群(１４６２[７.９％])と比較してＢＮＴ１６２ｂ２群(３０８６[１６.８％])で高かった。投与１からデータカットオフ日まで全参加者で報告された大部分のＡＥは反応原性であり、一般的障害および投与部位状態(ＢＮＴ１６２ｂ２群で１９４１[１０.５％]およびプラセボ群で４３８[２.４％])、筋骨格および結合組織障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で７４２[４.０％]およびプラセボ群で２２７[１.２％])および神経系障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で５６７[３.１％]およびプラセボ群で２５１[１.４％])のＳＯＣであった。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、ＰＴによる最も高頻度で報告されたＡＥは、注射部位疼痛(１２２２[６.６％])、発熱(５０４[２.７％])、疲労(４８１[２.６％])、頭痛(４７０[２.６％])、悪寒(４５８[２.５％])および筋肉痛(４５４[２.５％])であった。これらＰＴの大部分は若年年齢群で報告された：注射部位疼痛(７８７[７.４％])、発熱(３５１[３.３％])、疲労(３０９[２.９％])、頭痛(３０３[２.９％])、悪寒(３１６[３.０％])および筋肉痛(３０４[２.９％])。
最初の６６１０参加者以外、反応原性に関連する事象は、e-diaryを使用はもはや報告されず、その代わりＡＥとして報告された。それ故に、事後解析は、投与１からデータカットオフ日までの全体的参加者で観察されたが、最初の６６１０参加者で投与１から投与２の１か月後まで観察されなかったＡＥの不均衡が反応原性事象に帰するかを評価するため実施した。本解析は、反応原性報告期間を表す各投与後７日以内に報告されたＡＥを試験した。多くのＡＥが一般的障害および投与部位状態、筋骨格および結合組織障害および神経系障害のＳＯＣで報告され、反応原性事象と一致するＡＥを含み、各投与から１か月まで生じるのとは逆にこの期間中に生じるならば、反応原性に起因するはずであるため、本期間を選択した。
投与１から投与１の７日後まで(データカットオフ日時点)、ＢＮＴ１６２ｂ２群で１４９４(８.１％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告し、これは、データカットオフ日までに少なくとも１つのＡＥを報告した３０８６[１６.８％]参加者の総数の約半分を占めた。プラセボ群で、投与１から投与１の７日後まで、データカットオフ日までに少なくとも１つのＡＥを報告した１４６２(７.９％)参加者の総数と比較して、５５５(３.０％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告した。
投与２から投与２の７日後まで(データカットオフ日時点)、ＢＮＴ１６２ｂ２群で１１６５(６.３％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告し、これは、データカットオフ日までに少なくとも１つのＡＥを報告した３０８６[１６.８％]参加者の総数の約３８％を占めた。投与２から投与２の７日後まで、ＢＮＴ１６２ｂ２群よりプラセボ群でＡＥを報告する参加者が少なかった。プラセボ群で、投与２から投与２の７日後まで、データカットオフ日までに少なくとも１つのＡＥを報告した１４６２(７.９％)参加者と比較して、２６８(１.５％)参加者が少なくとも１つのＡＥを報告した。
ＡＥは、投与１から投与１の７日後まで一般的障害および投与部位状態(ＢＮＴ１６２ｂ２群で１１２７[６.１％]およびプラセボ群で２５１[１.４％])のＳＯＣで報告され、データカットオフ日までに、総数の半分を超える参加者がこのＳＯＣの少なくとも１つのＡＥを報告することを表した(ＢＮＴ１６２ｂ２群で１９４１[１０.５％]およびプラセボ群で４３８[２.４％])。筋骨格および結合組織障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で２５２[１.４％]およびプラセボ群で７６[０.４％])および神経系障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で２２０[１.２％]およびプラセボ群で１１５[０.６％])も一般に報告され、これらのＳＯＣのＡＥを報告する参加者の小さな割合を占めた。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、ＰＴにより投与１から投与１の７日後まで最も高頻度で報告されたＡＥは、注射部位疼痛(８８１[４.８％])、疲労(２３１[１.３％])、頭痛(１８１[１.０％])、筋肉痛(１４７[０.８％])、発熱(１１０[０.６％])および悪寒(１００[０.５％])だった。これらＰＴの大部分は若年年齢群で報告された：注射部位疼痛(５６６[５.３％])、疲労(１５３[１.４％])、頭痛(１１８[１.１％])、筋肉痛(９９[０.９％])、発熱(８２[０.８％])および悪寒(７５[０.７％])。投与１から投与１の７日後まで報告された注射部位疼痛(８８１[４.８％])は、このＰＴでＡＥを報告した総参加者の大きな割合を占めた(１２２２[６.６％])。
ＡＥは、投与２から投与２の７日後まで一般的障害および投与部位状態(ＢＮＴ１６２ｂ２群で８２８[４.５％]およびプラセボ群で９３[０.５％])、筋骨格および結合組織障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で３７７[２.０％]およびプラセボ群で３８[０.２％])および神経系障害(ＢＮＴ１６２ｂ２群で２９４[１.６％]およびプラセボ群で４０[０.２％])のＳＯＣで報告された。投与２から投与２の７日後まで報告された筋骨格および結合組織障害および神経系障害は、これらのＳＯＣで少なくとも１つのＡＥを報告した総参加者数の少なくとも半分を占めた。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、ＰＴにより投与２から投与２の７日後まで最も高頻度で報告されたＡＥは、発熱(３７５[２.０％])、悪寒(３２７[１.８％])、注射部位疼痛(３１３[１.７％])、筋肉痛(２８２[１.５％])、頭痛(２５８[１.４％])および疲労(２２７[１.２％])であった。これらＰＴの大部分は若年年齢群で報告された：発熱(２５１[２.４％])、悪寒(２１６[２.０％])、筋肉痛(１８５[１.７％])、注射部位疼痛(１８３[１.７％])、頭痛(１５４[１.５％])および疲労(１３４[１.３％])。投与２から投与２の７日後まで報告されたこれらＰＴの大部分のＡＥは、これらＰＴでＡＥを報告した参加者の総数の少なくとも半分を占めた：発熱(５０４[２.７％])、悪寒(４５８[２.５％])、筋肉痛(４５４[２.５％])、頭痛(４７０[２.６％])および疲労(４８１[２.６％])。
全体として、投与１から投与１の７日後までおよび投与２から投与２の７日後まで報告されたＡＥは、主として反応原性事象に起因した。この観察は、プラセボ群と比較してＢＮＴ１６２ｂ２群で全体的に観察されたＡＥが高い割合であることを合理的に説明する。
投与１からデータカットオフ日まで、ＢＮＴ１６２ｂ２群で、最初の６６１０参加者(１０[０.３％])の報告を含み、計４４(０.２％)参加者がリンパ節腫脹のＡＥを報告した。データカットオフ日まで、ＢＮＴ１６２ｂ２群でさらに３４参加者およびプラセボ群でさらに４参加者がリンパ節腫脹のＡＥを報告した。ＢＮＴ１６２ｂ２群で、リンパ節腫脹は、ラセボ群で４(０.０％)プ(若年年齢群で３および年配年齢群１)と比較して、若年年齢群で３４(０.３％)および年配年齢群で１０(０.１％)報告された。リンパ節腫脹は、大部分は腕および首領域で起こり、大部分の事象は左腋窩リンパ節で報告された。投与２後、投与１または投与２の≦３日後生じたほとんどのリンパ節腫脹事象はグレード１またはグレード２の重症度であり、４８事象中３２は、データカットオフ日までに解消した。若年ＢＮＴ１６２ｂ２年齢群の１参加者で、グレード１リンパ節腫脹(右腋窩リンパ節腫脹)は即時ＡＥであり、これは投与１後生じ、データカットオフ日時継続した。
若年年齢群で、ＢＮＴ１６２ｂ２(ＳＡＥ)およびプラセボ群の各１参加者でＣＯＶＩＤ−１９疑いのＡＥがあった。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、６参加者は、試験介入に関連すると評価された、免疫化反応(ワクチン反応または全身性ワクチン反応[この報告時、さらなる情報は入手可能ではなかった])を報告した。３参加者が、プラセボ群１参加者での薬物過敏症に加えて、ＢＮＴ１６２ｂ２群で薬物過敏症を報告した。薬物過敏症(アレルギー反応)はＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者で関連すると評価され、薬物過敏症(薬物アレルギーまたはジピロンに対するアレルギー反応)は、ＢＮＴ１６２ｂ２群の２参加者で試験介入と無関係と評価された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群(若年年齢群で１４および年配年齢群で５)の１９(０.１％)参加者が少なくとも１つのワクチン合併症(大部分は、反応原性事象の記述的であった)を報告し、対してプラセボ群で０であった。全て試験介入に関連すると評価され、ワクチン接種後筋肉痛、発熱、体の痛み、頭痛、悪寒、悪心、有害反応、関節痛、疲労、痛み、筋肉痛み、倦怠感および左肩痛を含んだ。大部分の事象はグレード１であり、ワクチン接種３日以内に始まり、１〜３日間継続した。
最初の６６１０参加者の虫垂炎(プラセボ群の１穿孔性虫垂炎を含む)を有する４参加者に加えて、全参加者の投与１からデータカットオフ日までＢＮＴ１６２ｂ２群でさらに３参加者が虫垂炎(穿孔性虫垂炎の１参加者を含む)を報告した。それ故に、ＢＮＴ１６２ｂ２群で計６参加者が虫垂炎(１穿孔性虫垂炎を含む)を報告し、若年年齢群で４および年配年齢群で２およびプラセボ群(年配年齢群)で１参加者が虫垂炎(穿孔)を報告した。全事象は重度であるかまたは命を脅かすものであり、試験介入に関連すると評価されたものはなかった。
関連器官別大分類および基本語による有害事象 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者 − フェーズ２／３
投与１から投与２の１か月後まで、治験担当医により関連と評価された少なくとも１つのＡＥをＢＮＴ１６２ｂ２群で１３５(４.１％)参加者が報告し、プラセボ群で６８(２.１％)参加者が少なくとも１つの関連ＡＥを報告した。大部分の関連ＡＥは、反応原性事象であり、一般的障害および投与部位状態のＳＯＣ(ＢＮＴ１６２ｂ２群で６９[２.１％]およびプラセボ群で４０[１.２％])であった。
１０参加者中８で報告されたリンパ節腫脹のＡＥは、治験担当医により試験介入に関連すると評価された。
全参加者 − フェーズ２／３
投与１からデータカットオフ日まで、ＢＮＴ１６２ｂ２群で２３０３(１２.５％)参加者およびプラセボ群で５９３(３.２％)参加者が治験担当医により関連すると評価された少なくとも１つのＡＥを報告し、最初の６６１０参加者の関連ＡＥを含めた。大部分の関連ＡＥは、反応原性事象および一般的障害および投与部位状態のＳＯＣ(ＢＮＴ１６２ｂ２群で１８６９[１０.１％]およびプラセボ群で３６５[２.０％])であった。
ＢＮＴ１６２ｂ２群の４４参加者中３０およびプラセボ群の４参加者中２で報告されたリンパ節腫脹のＡＥは、治験担当医により試験介入に関連すると評価された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、この報告時時点で入手可能な全情報に基づき、以下のことが示される。
６参加者は、試験介入に関連すると評価された免疫化反応(ワクチン反応または全身性ワクチン反応)を報告した。大部分の参加者で、免疫化反応は投与２の１日または２日後生じ、２日または３日継続し(１参加者は、データカットオフ日回復途上であった)、重症度はグレード１またはグレード２であった。１参加者で、免疫化反応(全身性ワクチン反応)は投与１の２日後(グレード１)生じ、２日間継続し、投与２の１日後(グレード３)生じ、４日間継続した。
１参加者が薬物過敏症(アレルギー反応)、蕁麻疹(アレルギー反応)および頭痛の各ＡＥを報告し、それらは全てグレード２であり、治験担当医により試験介入に関連すると評価された。薬物過敏症および蕁麻疹のＡＥはいずれも投与１の１日後までに生じ、同日に解消した。頭痛のＡＥはワクチン接種後翌日に生じ、４日間継続した。
即時有害事象 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者 − フェーズ２／３
投与１後、≦０.３％の参加者が即時ＡＥを報告した。大部分の即時ＡＥは一般的障害および投与部位状態のＳＯＣであり、注射部位反応に関連する事象(注射部位疼痛、注射部位紅斑および注射部位腫脹)であった。
投与２後、各群で０.１％の参加者が即時ＡＥを報告した。大部分の即時ＡＥは一般的障害および投与部位状態のＳＯＣであり、注射部位反応に関連する事象(注射部位疼痛、注射部位知覚過敏および注射部位掻痒)であった。
ＢＮＴ１６２ｂ２の何れかの投与後、ワクチンに対する即時アレルギー反応を報告した参加者はいなかった。
全参加者 − フェーズ２／３
投与１後、各群の０.３％の参加者が即時ＡＥを報告した。大部分の即時ＡＥは、一般的障害および投与部位状態のＳＯＣであり、大部分の事象は注射部位反応に関連し、注射部位疼痛最も高頻度で報告された(ＢＮＴ１６２ｂ２群で４０[０.２％]参加者およびプラセボ群で２７(０.１％)参加者)。１参加者は、投与１後リンパ節腫脹の即時ＡＥを有した。他の全ての即時ＡＥは、ＢＮＴ１６２ｂ２群で各３以下の参加者で報告された。
投与２後、各群で０.１％の参加者が即時ＡＥを報告した。大部分の即時ＡＥは一般的障害および投与部位状態のＳＯＣであり、大部分の事象は注射部位反応であり、注射部位疼痛最も高頻度で報告された(ＢＮＴ１６２ｂ２群で１０[０.１％]参加者およびプラセボ群で７[０.０％]参加者)。他の全ての即時ＡＥは、各２以下の参加者で報告された。
ＢＮＴ１６２ｂ２の何れかの投与後、ワクチンに対する即時アレルギー反応を報告した参加者はいなかった。
重度または命を脅かす有害事象 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者 − フェーズ２／３
投与１から投与２の１か月後まで、報告された重症ＡＥは、ＢＮＴ１６２ｂ２群で３５(１.１％)参加者およびプラセボ群で１９(０.６％)で報告された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で４(０.１％)参加者およびプラセボ群で７(０.２％)参加者は、投与１から投与２の１か月後まで、少なくとも１つの命を脅かすＡＥを有した。これらの事象は治験担当医により試験介入に関連すると評価されなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で：
フェーズ２の１参加者は、先のセクションに記載した胃腺癌(ＳＡＥ)の重症事象を有した。
２参加者は、虫垂炎の重症事象を有した：１事象は投与１の９日後始まり、他の事象は投与２の１５日後(ＳＡＥ)始まり、治験担当医により試験介入に関連しないと評価された。
１参加者は、投与１の７日後虫垂炎および腹膜膿瘍の２つの命を脅かすＡＥを有した(何れもＳＡＥ)；何れの事象も、治験担当医により試験介入に無関係と評価された。
１参加者は、貧血、うっ血性心不全、腹部癒着、敗血症、低カリウム血症、精神状態変化、急性腎臓傷害および急性呼吸不全(全ＳＡＥ)の８重症事象を有した。これらの事象のいずれも、治験担当医により試験介入に関連しないと評価された。
全参加者 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者についてのものを含む報告されたデータカットオフ日まで重症ＡＥは、ＢＮＴ１６２ｂ２群で１４２[０.８％]参加者およびプラセボ群で７０(０.４％)で報告された。さらなる事象は次のものを含んだ。
ＢＮＴ１６２ｂ２群の２参加者は、各虫垂炎の重症事象を有した：１事象は投与１の１７日後始まり他の事象は投与１の１１日後(ＳＡＥ)始まり、治験担当医により試験介入に関連しないと評価された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者は投与１後同日穿孔虫垂炎の重症事象(ＳＡＥ)を有し、これは、治験担当医により試験介入に無関係であると評価された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群の９参加者(０.０％)およびプラセボ群で１２(０.１％)参加者は、最初の６６１０参加者について記載したものを含み、投与１からデータカットオフ日までに少なくとも１つの命を脅かすＡＥを有した。これらの事象は治験担当医により試験介入に関連すると評価されなかった。
死亡、重篤有害事象、安全性関連参加者中止および他の顕著な有害事象 − フェーズ２／３
死亡− フェーズ２／３
２０２０年１０月６日のデータカットオフ日までにフェーズ３参加者(ＢＮＴ１６２ｂ２群で１およびプラセボ群で２)で３名が死亡した。これらの死亡は最初の６６１０参加者ではなく(表１４)、いずれも治験担当医により試験介入に関連すると評価されなかった。
年配ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者は、投与１の４日後動脈硬化症のグレード４ ＳＡＥを経験し、投与１の１５日後に死亡した。
若年プラセボ群の１参加者は、投与１の８日後評価不能事象(起源不明[この報告時、さらなる情報は入手可能ではなかった)のグレード４ ＳＡＥを経験し、同じ日に死亡した。
年配プラセボ群の１参加者は、投与２の１５日後出血性卒中のグレード４ ＳＡＥを経験し、投与２の３５日後に死亡した。
死亡の経緯
データカットオフ日(２０２０年１０月６日)までに死亡した参加者の経緯を示す。
重篤有害事象 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者 − フェーズ２／３
投与１から投与２の１か月後まで、少なくとも１つのＳＡＥを報告する参加者数は、ＢＮＴ１６２ｂ２群(１８(０.５％])およびプラセボ群(１７[０.５％])で類似した(表１６)。ＳＡＥのいずれも、治験担当医により試験介入に関連すると評価されなかった。大部分のＳＡＥについてのＰＴは、１参加者のみにより報告された(虫垂炎のＳＡＥを３参加者が報告した)。
投与１から投与２の１か月後まで、若年および年配年齢群で少なくとも１つのＳＡＥを報告する参加者数は類似した。
ＢＮＴ１６２ｂ２群：
２参加者は、各虫垂炎のＳＡＥを有した：１事象は投与１の９日後始まり、他の事象は投与２の１５日後始まった。
１参加者は、投与１の７日後、各虫垂炎および腹膜膿瘍のＳＡＥであり、命を脅かすと考えられた。いずれの事象も１７日間継続した。
１参加者は、投与１の１７日後、貧血、うっ血性心不全、腹部癒着、敗血症、低カリウム血症、精神状態変化、急性腎臓傷害および急性呼吸不全(全て重度であった)の８ＳＡＥを有した。腹部癒着および急性呼吸不全のＳＡＥは、それぞれ２日間および１４日間継続した。その他全てのＡＥは１９日間継続した。
１参加者は、蜂に刺されたため投与２の９日後アナフィラキシー反応のＳＡＥを有し、これは命を脅かすと考えられた。事象は同日に解消した。
プラセボ群で、１参加者は、それぞれ投与２の１３日および１５日後、穿孔性虫垂炎および腹膜炎の各ＳＡＥを有した(何れも重度)。両事象は、それぞれ４日間および５日間継続した。
投与２の１か月後からデータカットオフ日まで、これら最初の６６１０参加者について、さらなるＳＡＥの報告はなかった。
Figure 2021185136
Figure 2021185136
全参加者 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者について記載したものを含み、投与１からデータカットオフ日まで、少なくとも１つのＳＡＥを報告する参加者数は、ＢＮＴ１６２ｂ２群(６３[０.３％])およびプラセボ群(４９[０.３％])(表１７)で類似した。さらなる事象は、次のものを含んだ。
ＢＮＴ１６２ｂ２群で、ＳＡＥを有する若年年齢群の２参加者は、それぞれ治験担当医により試験介入に関連すると評価された：
１参加者は、投与１の１３日後リンパ節腫脹のＳＡＥ(右腋窩)を有し、データカットオフ時点で解消しなかった。参加者は、湿疹および局所クリサボロール使用の関連する病歴がある４８歳女性であり、ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンを左三角筋に投与され、右腋窩疼痛およびリンパ節腫脹を有した。右腕に傷害はなく、発熱も類似の出来事の病歴もなかった。彼女のＷＢＣは正常であり、正常リンパ球数であり、右腋窩超音波は、４肥大リンパ節を示した(最大２.５×１.１×２.４cm)。生検を実施し、正常であり、リンパ腫または他の癌のマーカーはないと報告された。腫瘍学(および可能であれば反復して超音波)のフォローアップ来院が３か月間隔で計画された。
１参加者は、投与２後、ワクチン投与(ＳＩＲＶＡ、肩関節包内またはその近辺に誤って投与)に関連する肩傷害のＳＡＥを有し、それは、データカットオフ時点で回復途中であった。
投与１からデータカットオフ日まで、ＢＮＴ１６２ｂ２群の計６参加者が、虫垂炎のＳＡＥを報告した。これら虫垂炎のＳＡＥのうち３は最初の６６１０参加者で生じた。さらなる３つの虫垂炎のＳＡＥは、ＢＮＴ１６２ｂ２群で試験介入に関連すると評価されなかった他の特定のＳＡＥと共に下に記載する：
２参加者は、各虫垂炎のＳＡＥを有した：１事象は投与１の１７日後始まり、３日間継続し(若年年齢群)、他の事象は投与１の１１日後始まり、５日間継続した(年配年齢群)。
年配年齢群の１参加者は、投与１後同日穿孔性虫垂炎のＳＡＥを有し、データカットオフ時解消途中であった。
若年年齢群の１参加者は、投与２後同日ＣＯＶＩＤ−１９疑いのＳＡＥを有し、６日間継続した。鼻腔スワブ結果は陰性であった。
Figure 2021185136
Figure 2021185136
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重篤有害事象経緯 − フェーズ２／３
投与２の１か月後の来院が終わり、データカットオフ日(２０２０年１０月６日)まで治験担当医により試験介入に関連すると評価されたＳＡＥを報告するフェーズ３参加者の経緯が提供された。
安全性関連参加者中止 − フェーズ２／３
最初の６６１０参加者 − フェーズ２／３
投与１から投与２の１か月後まで、ＢＮＴ１６２ｂ２群で６(０.２％)参加者およびプラセボ群で５(０.２％)参加者がＡＥにより中止し(表１８)、投与２の１か月後からデータカットオフ日までこれら参加者のさらなる中止は報告されなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ２群における興味深い中止：
２参加者は、、治験担当医により試験介入に関連すると評価されたＡＥにより中止した。若年年齢群の１参加者は、投与１の８日後筋肉痛のＡＥを有し、それは、データカットオフ時点で回復途中であった。年配年齢群の１参加者は、投与１の２日後掻痒のＡおよび頻脈のＡＥおｗ有した；両事象とも１日の期間であり、いずれも重度であった。
各３参加はＳＡＥを有し、治験を中止した：若年年齢群(胃腺癌)および年配年齢群(冠動脈疾患および冠動脈解離)。
プラセボ群における興味深い中止：
１参加者(若年年齢群)は、投与１の２日後ワクチンに対するアレルギー(試験介入)のＡＥおよび紅斑性皮疹ＡＥにより中止した；両ＡＥは１８日後解消し、いずれも、治験担当医により試験介入に関連すると評価された。
年配群の１参加者はＳＡＥ(冠動脈閉塞)を有し、治験担当医により関連しないと評価され、治験を中止した。
年配群の１参加者は、投与１の１０日後蕁麻疹のＡＥにより治験を中止した。事象は同日に解消し、治験担当医により試験介入に関連しないと評価された。
Figure 2021185136
全参加者 − フェーズ２／３
投与１からデータカットオフ日まで、ＢＮＴ１６２ｂ２群で１８(０.１％)参加者およびプラセボ群で１４(０.１％)参加者がＡＥにより中止した。最初の６６１０参加者で記載した中止に加えて、他の中止は次のものを含んだ。
若年ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者は、投与１の１３日後治験担当医により試験介入に関連すると評価されたおよびリンパ節腫脹のＳＡＥ(右腋窩)を有し、中地し、データカットオフ時点で解消しなかった。
若年年齢群の３参加者(ＢＮＴ１６２ｂ２で１およびプラセボで２)は投与１後妊娠し、中止した。
若年プラセボ群の１参加者は、投与１の３９日後妊娠検査陽性(妊娠中暴露)であり、中止した。
安全性関連参加者中止の経緯 − フェーズ２／３
データカットオフ日(２０２０年１０月６日)までの何らかの治験の中止に至るＡＥを有するフェーズ２／３参加者の経緯が提供された。
他の顕著な有害事象 − フェーズ２／３
特に興味深いＡＥは、この治験のフェーズ２／３で規定しなかった；しかしながら、標的医学事象を治験を通してモニターした。
他の安全性評価 − フェーズ２／３
重症ＣＯＶＩＤ−１９疾病 − フェーズ２／３
２０２０年１１月４日の有効性中間解析カットオフ日時点で、全７の重症ＣＯＶＩＤ−１９症例がプラセボ群で報告された。
妊娠 − フェーズ２／３
２０２０年１０月６日のデータカットオフ日までフェーズ３参加者５名で妊娠が報告された：ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者およびプラセボ群の４参加者。不全自然流産がプラセボ群の１参加者で生じた。
妊娠についての経緯が提供された。
死亡、重篤有害事象、安全性関連参加者中止および他の顕著な有害事象の解析および考察 − フェーズ２／３
２０２０年１０月６日のデータカットオフ日まで、ＳＡＥ数はＢＮＴ１６２ｂ２群(６３[０.３％])およびプラセボ群(４９[０.３％])で類似した。ＢＮＴ１６２ｂ２群の２参加者が報告したＳＡＥは、治験担当医により試験介入に関連すると評価された。
ＢＮＴ１６２ｂ２群(１８[０.１％])およびプラセボ群(１４[０.１％])でＡＥにより中止した参加者は数名であった。
３死亡例(ＢＮＴ１６２ｂ２群で１およびプラセボ群で２)があった；死亡のいずいれも、治験担当医により試験介入に関連すると評価されなかった。
フェーズ２／３安全性結論
年齢群にわたり、局所反応は、各回後一般に類似の頻度であり、全身事象は、一般に投与１と比較して投与２後頻度および重症度が増加した。局所および全身反応原性事象は忍容性が良好であり、短期であった(中央期間１.０〜２.０日)。
高齢成人で各ＢＮＴ１６２ｂ２投与後の反応原性事象は、一般に若年成人で観察されるより軽度かつ低頻度であった。反応原性事象の大部分の重症度は軽度または中程度であった。投与２の１日後始まり、１日間持続したＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者の発熱以外、グレード４事象は報告されなかった。
６６１０参加者で評価したＢＮＴ１６２ｂ２ ３０μg後の反応原性およびＡＥプロファイルは、フェーズ１およびフェーズ２でＢＮＴ１６２ｂ２ ３０μg後観察された安全性プロファイルに一致した。
ＢＮＴ１６２ｂ２群の１６.８％の参加者でＡＥが報告され、大部分のＡＥの重症度は軽度または中程度であった。データカットオフ日時点で、ＢＮＴ１６２ｂ２群でＡＥを有する参加者数は、プラセボ群(７.９％)と比較して多く、解析により、各投与７日以内に報告されたＡＥとして反応原性事象に起因した。
データカットオフ日時点で、ＢＮＴ１６２ｂ２群(リンパ節腫脹およびワクチン投与に関連する肩傷害(ＳＩＲＶＡ、肩関節包内またはその近辺に誤って投与)で２関連ＳＡＥがあり、関連ＡＥのため６中止があった。ＢＮＴ１６２ｂ２群(動脈硬化症)で１名の死亡およびプラセボ群で２名の死亡があり、試験介入に関連すると評価されなかった。
全体として、３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２は、投与レジメンによる投与２の１か月後まで測定したとき、忍容性が良好であった。
実施例１６：全一次有効性エンドポイントを満たす、ＣＯＶＩＤ−１９ワクチンのフェーズ３治験の結論
継続中のフェーズ３治験の最終有効性解析実施後、ｍＲＮＡベースのＣＯＶＩＤ−１９ワクチン、ＢＮＴ１６２ｂ２、は、治験の全一次有効性エンドポイントを満たした。データの解析は、先のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染がない参加者(最初の一次目標)、ならびに先のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染があるおよびない参加者(第二一次目標)で９５％(ｐ＜０.０００１)ワクチン有効率を示し、何れの場合も最初の投与２８日後、２回目の投与７日後から測定した。最初の一次目標解析は、ＣＯＶＩＤ−１９の１７０症例に基づき、プラセボ群でＣＯＶＩＤ−１９の１６２症例が確認され、対して、ＢＮＴ１６２ｂ２群で８症例であった。有効性は、年齢、性別、人種および民族性人口統計にわたり一貫した。６５歳を超える成人で観察された有効性は９４％を超えた。
治験でＣＯＶＩＤ−１９の１０重症例が観察され、その症例の９はプラセボ群で生じ、１はＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン接種群であった。ワクチンに関連する重度安全性懸念は報告されなかった。フェーズ２／３治験の１８歳以上の少なくとも８,０００参加者の無作為化サブセットからなる最終解析の非盲検反応原性データのレビューは、ワクチンが忍容性が良好であり、大部分の応答型有害事象はワクチン接種後短期に解消した。１回目または２回目の投与後２％以上の頻度の唯一のグレード(重度)応答型有害事象は、投与２後疲労３.８％および頭痛２.０％であった。先に共有された結果に一致した、高齢成人は、ワクチン接種後応答型有害事象の報告が少なくかつ軽度である傾向にあった。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２陽性参加者の局所反応原性プロファイル全体として反応原性サブセットのものに一致した；同様に、‘全対象’のＡＥデータの比較において、ベースライン陽性参加者で安全性プロファイルが悪いことを示すものはなかった。実際、ベースライン陽性参加者で安全性プロファイルが悪いことを示すものはなかった；それ故に、ＢＮＴ１６２ｂ２を、ＣＯＶＩＤ−１９病歴またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２血清状態と無関係に使用できる。
さらに、米国食品医薬品局(ＦＤＡ)で緊急使用許可(ＥＵＡ)に必要な安全性マイルストーンは達成された。
最終有効性解析マークに到達したこの最初の世界的治験結果は、ＣＯＶＩＤ−１９に対する高い割合の保護が最初の３０μg投与後極めてすぐに達成できることを示し、ＢＮＴ１６２が早期保護を提供する可能性が強調される。
まとめると：
・一次有効性解析は、ＣＯＶＩＤ−１９に対してＢＮＴ１６２ｂ２は９５％有効であり、最初の投与２８日後から始まったことを示した；ＣＯＶＩＤ−１９の１７０の確認された症例が評価され、プラセボ群でで１６２が観察されたのに対し、ワクチン群で８であった
・有効性は、年齢、性別、人種および民族性人口統計にわたり一貫した；６５歳を超える成人の観察された有効性は９４％であった
・米国食品医薬品局(ＦＤＡ)で緊急使用許可(ＥＵＡ)に必要な安全性マイルストーンは達成された
・データは、ワクチンが登録された４３,０００を超える参加者の全集団で忍容性が良好であったことを示す；重度安全性懸念は観察されなかった；２％を超える頻度の唯一のグレード３有害事象は、疲労３.８％および頭痛２.０％であった
実施例１７：投与１後確認されたＣＯＶＩＤ−１９の全症例
ＣＯＶＩＤ−１９の多数の確認された症例は、投与２の７日後より前に生じたまたは評価可能有効性集団から除外された参加者またはワクチン接種レジメン前または途中で感染の証拠を有した参加者で生じたため、評価可能有効性集団の最初のプライマリーエンドポイントの解析で捕捉していない。
投与１後の何らかの時点で生じたＣＯＶＩＤ−１９の全報告を表１９に示し、これは、ワクチン接種レジメン前または途中での感染の証拠にかかわらず、投与１全入手可能有効性(修飾治療企図)集団の全参加者の症例の要約を提供する。これら参加者の中で、ＣＯＶＩＤ−１９の５０症例は、ＢＮＴ１６２ｂ２群で投与１後生じ、対してプラセボ群で２７５症例であった(表１９)。顕著なことに、ＢＮＴ１６２ｂ２群で、大部分の症例は投与２前に生じた。投与１後生じた確認されたＣＯＶＩＤ−１９に対する推定ＶＥは８２％(２側９５％ＣＩ：７５.６％、８６.９％)であり、投与１後であるが、投与２前に生じた確認されたＣＯＶＩＤ−１９の推定ＶＥは５２.４％(２側９５％ＣＩ：２９.５％、６８.４％)であった。
Figure 2021185136
保護の早期発生は、投与１全入手可能有効性(修飾治療企図)集団に基づく全ワクチン接種参加者の最初の投与１後のＣＯＶＩＤ−１９発症の累積発生率を示す、図１００から容易にわかる。疾患発症投与１の約１４日後までＢＮＴ１６２ｂ２とプラセボは同じ線に見え、その時点で曲線が分かれ、プラセボ群で症例は一定して累積されていき、一方ＢＮＴ１６２ｂ２群で事実上平らなままである。
プラセボおよびワクチンレシピエントの経時的ＣＯＶＩＤ−１９症例累積発生率は、推定中央潜伏期５日の約９日後である投与１の１４日後に別れはじめ、免疫化の部分的保護的効果の早期発生を示す。投与１と投与２の間の期間、観察されたワクチン有効性は５２％であり、最初の投与２の７日後、９１％に達し、少なくとも投与２の７日後に生じるＣＯＶＩＤ−１９の完全有効性に達する。
実施例１８：二次有効性結果 − 最終解析
投与２後１４日以内に生じるＣＯＶＩＤ−１９に対するワクチン有効性− 最終解析
ワクチン接種前感染の証拠がなかった参加者
この有効性エンドポイントについて、投与２の１４日後より前に何らかの病気での来院時のＮＡＡＴ結果陽性または不明の参加者は、有効性評価に含めなかった。
ワクチン接種レジメン前および途中でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない参加者で、少なくとも投与２の１４日後生じる確認されたＣＯＶＩＤ−１９に対するＶＥは９４.２％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ８症例および１３９症例であった。３０％を超える真のＶＥについて＞９９.９９％の事後確率は、このエンドポイントで＞９８.６％の事前に指定された成功基準を満たした。ワクチン有効性の９５％信用区間は８８.７％〜９７.２％であり、利用可能なデータを考慮して真のＶＥは少なくとも８８.７％であり、９７.５％確率であることが示された。
ワクチン接種前感染の証拠があるまたはない参加者
ワクチン接種レジメン前および途中でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の倉庫があるまたはない参加者で、少なくとも投与２の１４日後生じる確認されたＣＯＶＩＤ−１９に対するＶＥは９４.４％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ８症例および１４４症例であった。３０％を超える真のＶＥについて＞９９.９９％の事後確率は、このエンドポイントで＞９８.６％の事前に指定された成功基準を満たした。ワクチン有効性の９５％信用区間は８９.１％〜９７.３％であり、利用可能なデータを考慮して、真のＶＥは少なくとも８９.１％であり、９７.５％確率であることが示された。
重症ＣＯＶＩＤ−１９症例に対するワクチン有効性 − 最終解析
重症ＣＯＶＩＤ−１９に対する有効性(投与２の７日以上後)
ワクチン接種レジメン前および途中で感染の証拠がない参加者
この有効性エンドポイントについて、投与２の７日後より前に何らかの病気での来院時のＮＡＡＴ結果陽性または不明の参加者は、有効性評価に含めなかった。
ワクチン接種レジメンの前および途中で重症ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない参加者で、少なくとも投与２の７日後に生じる重症ＣＯＶＩＤ−１９に対する推定ＶＥは６６.４％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ１症例および３症例であった。３０％を超える真のワクチン有効性についての事後確率は７４.２９％であり、これは、治験で投与２後観察された重症例が少なかったため、このエンドポイントについて＞９８.６％の事前に指定された成功基準を満たさなかった。
ワクチン接種レジメンの前および途中で感染の証拠があるまたはない参加者
投与２の７日後の前に重症ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠があるまたはない参加者で、少なくとも投与２の７日後に生じる重症ＣＯＶＩＤ−１９に対するＶＥは６６.３％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ１症例および３症例であった。３０％を超える真のワクチン有効性についての事後確率は７４.１９％である。
投与１後重症ＣＯＶＩＤ−１９の確認された全症例 − 全入手可能集団
全入手可能有効性集団の参加者で、投与１後ＢＮＴ１６２ｂ２群で１症例のＣＯＶＩＤ−１９が生じ、対してプラセボ群で９症例であった。投与１後生じる重症ＣＯＶＩＤ−１９に対する推定ＶＥは８８.９％(２側９５％ＣＩ：２０.１％、９９.７％)であり、少なくとも投与２の７日後重症ＣＯＶＩＤ−１９に対して７５.０％の推定ＶＥであった。
重症ＣＯＶＩＤ−１９に対する有効性(投与２の１４日以上後)
ワクチン接種レジメン前および途中で感染の証拠がない参加者(１４日) − 重度
ワクチン接種レジメンの前および途中で重症ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない参加者で、少なくとも投与２の１４日後に生じる重症ＣＯＶＩＤ−１９に対する推定ＶＥは６６.４％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ１症例および３症例であった。３０％を超える真のワクチン有効性についての事後確率は７４.３２％である。
ワクチン接種レジメン前または途中で感染の証拠があるまたはない参加者(１４日) − 重度
ワクチン接種相前および途中で重症ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠があるまたはない参加者で、少なくとも投与２の１４日後に生じる重症ＣＯＶＩＤ−１９に対するＶＥは６６.３％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ１症例および３症例であった。３０％を超える真のワクチン有効性についての事後確率は７４.１８％である。
ＣＤＣ定義によるＣＯＶＩＤ−１９症例に対するワクチン有効性 − 最終解析
ＣＤＣ定義症状に基づくＣＯＶＩＤ−１９に対する有効性(投与２の７日以上後)
ワクチン接種レジメン前および途中でＣＤＣ定義感染の証拠がない参加者−７日
ワクチン接種レジメン前および途中でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない参加者で、少なくとも投与２の７日後に生じるＣＤＣ定義ＣＯＶＩＤ−１９に対するＶＥは９５.１％(２側９５％ＣＩ：９０.２％、９７.９％)であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ８症例および１６５症例であった。
ワクチン接種レジメンの前および途中でＣＤＣ定義感染の証拠があるまたはない参加者 − ７日
ワクチン接種レジメン前および途中でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠があるまたはない参加者で、少なくとも投与２の７日後に生じるＣＤＣ定義ＣＯＶＩＤ−１９に対するＶＥは９４.７％(２側９５％ＣＩ：８９.８％〜９７.６％)であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ９症例および１７２症例であった。
ＣＤＣ定義症状に基づくＣＯＶＩＤ−１９に対する有効性(投与２の１４日以上後)
ワクチン接種レジメン前および途中でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠があるまたはない参加者で、ＣＤＣ定義ＣＯＶＩＤ−１９に生じる少なくとも投与２の１４日後に対するＶＥは、少なくとも投与２の７日後で生じるものに類似した。
実施例１９：有効性結論 − 最終解析
最終有効性解析で、ワクチン接種レジメン前および途中でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない参加者で、少なくとも投与２の７日後に生じる確認されたＣＯＶＩＤ−１９に対するＶＥは９５.０％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群で８ ＣＯＶＩＤ−１９症例に対し、プラセボ群で１６２ ＣＯＶＩＤ−１９症例であった。ワクチン有効性の９５％信用区間は９０.３％〜９７.６％であった。第二のプライマリーエンドポイントについて、少なくとも投与２の７日後ワクチン接種レジメン前および途中でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない参加者に生じる確認されたＣＯＶＩＤ−１９に対するＶＥは９４.６％であり、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群でそれぞれ９症例および１６９症例であった。３０％を超える真のＶＥについて＞９９.９９％の事後確率は、このエンドポイントで＞９８.６％の事前に指定された成功基準を満たした。ワクチン有効性の９５％信用区間は８９.９％〜９７.３％であり、利用可能なデータを考慮して、真のＶＥは少なくとも８９.９％であり、９７.５％確率であったことを示す。
観察されたＶＥは、「その他全て」人種群(８９.３％ＶＥ)およびブラジル(８７.７％ＶＥ)以外、全サブグループＶＥは＞９３％であり、年齢、性別、人種／民族性および国のサブグループにわたり最初の一次有効性エンドポイントで極めて高かった。
計１０症例の重症ＣＯＶＩＤ−１９が投与１後生じ、ＢＮＴ１６２ｂ２群で１症例であり、対してプラセボ群で９症例であった。
全参加者(ワクチン接種レジメン前または途中での感染の証拠にかかわらず)で５０症例のＣＯＶＩＤ−１９がＢＮＴ１６２ｂ２群で投与１後生じ、対してプラセボ群で２７５症例であり、投与１後で生じる確認されたＣＯＶＩＤ−１９に対する８２％(９５％ＣＩ：７５.６％、８６.９％)の推定ＶＥが示された。
保護の早期発生は、疾患発症トラックが投与１の約１４日後までＢＮＴ１６２ｂ２とプラセボの線が一緒であり、その時点で曲線が分かれ、プラセボ群で症例は一定して累積されていき、一方ＢＮＴ１６２ｂ２後実質的に平らなままである、累積発生率曲線から容易に明らかである。
結論として、最終有効性結果は、統計サブグループにまたがるものを含み、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の先の感染の証拠がない参加者で、３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２がＣＯＶＩＤ−１９に対する保護を提供することを示し、観察された大部分は重症例のプラセボ群であった。
評価した統計集団の詳細を下表２０および２１に示す。
Figure 2021185136
Figure 2021185136
実施例２０：ＢＮＴ１６２ｂ２での免疫化に対して若青年期集団の応答に関するある観察
実施例１３〜１９に記載する臨床治験で、若年青年期集団で次のものが観察された。
若青年期の局所反応
若青年期１２〜１５歳(Ｎ＝１００；ＢＮＴ１６２ｂ２群で４９およびプラセボ群で５１)は、反応原性サブセットの予備的データに寄与し、別々に解析した。この年齢群で、注射部位の疼痛はＢＮＴ１６２ｂ２群で最も高頻度の即座の局所反応であり、投与１後プラセボ群で１７.６％に対し、７１.４％の参加者で報告された。疼痛の発生率は、ＢＮＴ１６２ｂ２群およびプラセボ群で投与２後減少した(５８.７％対８.７％まで減少)。紅斑は、投与１後ＢＮＴ１６２ｂ２群の１参加者および投与２後２参加者で報告され、いずれの投与後もプラセボ群で０であった。腫脹は、ＢＮＴ１６２ｂ２群の投与１後２参加者および投与２後３参加者で報告され、プラセボ群で投与１後１参加者および投与２後０であった。大部分の局所反応の重症度は軽度乃至中程度であった。２重症反応がいずれもＢＮＴ１６２ｂ２群で報告された：重症発赤および重症注射部位の疼痛。
若青年期の全身反応
若青年期１２〜１５歳(Ｎ＝１００；ＢＮＴ１６２ｂ２群で４９およびプラセボ群で５１)は、反応原性サブセットの予備的データに寄与し、別々に解析した。大部分の全身事象(群にわたり低発生率であった嘔吐および下痢以外)は、プラセボ群よりＢＮＴ１６２ｂ２群で高い発生率で報告された。しかしながら、投与２後と比較して、投与１後発生率または重症度が増加する明確な傾向はなかった。この年齢群で、投与２と比較して、投与１後の大部分の頻繁な即座の全身事象は(投与１対投与２)：
・疲労：ＢＮＴ１６２ｂ２(４９.０％対５０.０％)に対してプラセボ(２５.５％対６.５％)
・頭痛：ＢＮＴ１６２ｂ２(４２.９％対４５.７％)に対してプラセボ(３５.３％対２１.７％)
・筋肉痛：ＢＮＴ１６２ｂ２(２２.４％対３０.４％)に対してプラセボ(１３.７％対４.３％)
・悪寒：ＢＮＴ１６２ｂ２(３０.６％対２８.３％)に対してプラセボ(７.８％対８.７％)
・関節痛：ＢＮＴ１６２ｂ２(１２.２％対１７.４％)に対してプラセボ(９.８％対６.５％)
・発熱：ＢＮＴ１６２ｂ２(１４.３％対１９.６％)に対してプラセボ(０％対０％)
・嘔吐：両群で類似の頻度で報告され、各投与後類似した
下痢：両群で類似の頻度で報告され、各投与後類似した。
若青年期の大部分の全身事象の重症度は軽度乃至中程度であった。重症事象は両群で比較的低頻度であり、いずれの投与後も１または２参加者を超えては生じなかった。
若年青年期群で使用された解熱／疼痛薬物療法使用は、投与１と比較して投与２後少し増え(３０.６％対４１.３％)、プラセボ群の使用より高かった(９.８％対１３％)。
まとめると、年配年齢群(例えば、１６〜８５歳など１６歳以上)で観察されたとおり、若青年期１２〜１５歳で投与後反応原性は大部分軽度乃至中程度および短期であり、有害事象プロファイルは、何ら重度安全性懸念を示唆しなかった。
下記実施例２１〜２４は、中和抗体応答および／または細胞介在免疫応答が、例えば、２０μg、１０μg、３μgなど、３０μg以下の１以上の用量の投与を含む、例えば投与レジメンを含む、ここに記載する種々の投与レジメンにより投与したここに記載するｍＲＮＡ組成物(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２を含む)で達成されることをさらに確認する。数ある中で、これら実施例２１〜２４で提供されるデータは、あるここに記載するｍＲＮＡ組成物(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２を含む)の３μg以上の１以上の用量の投与による、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫応答(例えば、ここに記載のもの)の誘導をさらに確認する。
本明細書を読んだ当業者は、数ある中で、種々のここに記載するｍＲＮＡ組成物の投与が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する中和抗体を含む免疫応答をできることを認める；あるこのような組成物(すなわち、中和抗体を誘導するおよび／またはＴ細胞応答などの細胞介在免疫応答を誘導するもの)が、特に誘導されたこのような中和抗体および／または細胞介在免疫応答を有する霊長類生物を含む、さらに、ヒトを含む生物において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染および／またはＣＯＶＩＤ１９病気の発生率を減少させる防御免疫応答を誘導することがさらに確認される。ある実施態様において、あるこのような組成物(例えば、ここに記載)は例えば、、最初の投与後観察された１０症例の重症ＣＯＶＩＤ−１９のうち１のみで証明されるとおり、ワクチン介在疾患増強を有意に誘導しないことも確認される。実際、本明細書は、このような組成物が、例えば、重症ＣＯＶＩＤ−１９疾患に対して、効率的にヒトにワクチン接種できることも示す(例えば、実施例１３〜１９に含まれる臨床治験結果参照)。
実施例２１：機能的抗体応答についての免疫原性試験
実施例７に記載した臨床治験において、ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン接種後、次のことが健常若年成人(１８〜５５歳)および高齢成人(５６〜８５歳)で観察された。１μg、３μg、１０μg、２０μgまたは３０μgを、若年成人に２１日離して２回投与した。２０μgを、年配成人に２１日離して２回投与した。若年成人コホートについての機能的抗体データを、用量群１μgおよび３μgについて最初の投与後５０日目までおよび用量群１０μg、２０μgおよび３０μgについて８５日目まで決定した。年配成人に投与したＢＮＴ１６２ｂ２について、データは、最初の投与後２９日目まで入手可能である。
１８〜５５歳参加者のＢＮＴ１６２ｂ１投与後のウイルス中和抗体ＧＭＴ(中和ＧＭＴ)および９５％信頼区間については図４０を参照のこと。
１８〜５５歳若年参加者および５６〜８５歳年配参加者のＢＮＴ１６２ｂ２投与後のウイルス中和抗体ＧＭＴ(中和ＧＭＴ)および９５％信頼区間については図１０１(５０％中和力価)を参照のこと。
機能的抗体力価データのベースラインからの幾何平均増加倍率(ＧＭＦＩ)は、図１０２(ＢＮＴ１６２ｂ１)および図１０３(ＢＮＴ１６２ｂ２)に示す。
ＢＮＴ１６２ｂ１を投与した参加者は、強力な用量依存的抗体応答を示した。投与１の２１日後である２２日目、ウイルス中和抗体ＧＭＴは、１μg、１０μg、３０μgおよび５０μg用量群で用量依存的方法で増加した。２９日目(投与２の７日後)、中和ＧＭＴは、強力な、用量レベル依存的ブースター応答を示した。１回、６０μg用量群で、中和ＧＭＴは低レベルのままであり、機能的抗体力価を増加させるためにブースター投与が必要であることが示された。
４３日目(ＢＮＴ１６２ｂ１の投与２の２１日後)、中和ＧＭＴは低減した(１μg用量レベル以外)。４３日目、ウイルス中和ＧＭＴは、ＣＯＶＩＤ−１９ ＨＣＳパネルの０.７倍(１μg)〜３.６倍(５０μg)であった。
ＣＯＶＩＤ−１９ ＨＣＳパネルは、確認された診断後少なくとも１４日後かつ個体が無症状であったとき、１８〜８５歳の個体から採った３８ヒトＣＯＶＩＤ−１９ ＨＣＳ血清からなる。血清ドナーは、大部分は症候性感染症(３５／３８)を有し、１名は入院していた。血清を、Sanguine Biosciences(Sherman Oaks, CA)、MT Group(Van Nuys, CA)およびPfizer Occupational Health and Wellness(Pearl River, NY)から得た。
ＢＮＴ１６２ｂ２を投与された参加者は、ＢＮＴ１６２ｂ２により誘導された強力な抗体応答を示した。ウイルス中和ＧＭＴは投与１の２１日後(２２日目)検出され、≧３μgのＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した若年参加者(１８〜５５歳)および２０μg ＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化した年配参加者(５６〜８５歳)で、投与２の７日後(２９日目)まで実質的に増加した。２９日目ウイルス中和ＧＭＴは、若年および年配成人の２０μg用量レベルコホートで同等あった。１μg ＢＮＴ１６２ｂ２の最低処置用量は、１８〜５５歳参加者で最小中和応答を誘発した。
４３日目(ＢＮＴ１６２ｂ２２回投与２１日後)、若年成人コホートのウイルス中和ＧＭＴは３μg、２０μgおよび３０μg用量レベルで低減した。その後、２９日目〜４３日目の中和ＧＭＴで、中和ＧＭＴは若年成人用量群１０μg、２０μgおよび３０μgで８５日目(２回投与６３日後)まで安定であり、ＣＯＶＩＤ−１９ ＨＣＳパネルの１.３倍〜１.９倍であった。
この状況での抗体陽転は、ベースラインと比較した抗体ＧＭＴの最低４増加倍率として定義される。抗体陽転した参加者の割合を、図１０４(ＢＮＴ１６２ｂ１)および１０５(ＢＮＴ１６２ｂ２)に示す。
３０μg以上のＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２の投与１を投与された全参加者は、投与２の７日または２１日後(２９日目または４３日目)までに抗体陽転した。３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２を投与された全参加者は、８５日目までのフォローアップをとおして血清反応陽性のままであった。
実施例２２：結合抗体濃度についての免疫原性試験
実施例７に記載した臨床治験において、ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン接種後、次のことが健常若年成人(１８〜５５歳)および高齢成人(５６〜８５歳)で観察された。結合抗体濃度データは、１μg、１０μg、３０μg、５０μgまたは６０μg を１日目(全用量レベル)および２２日目(６０μg以外全用量レベル)に投与されたＢＮＴ１６２ｂ１投与１８〜５５歳若年参加者で４３日目まで入手可能であった(ｎ＝１２／群)。
ＢＮＴ１６２ｂ２投与参加者について、データは、１μg、３μg、１０μg、２０μgまたは３０μg投与１８〜５５歳若年参加者および２０μgを１日および２２日目に投与した５６〜８５歳年配参加者で入手可能であった(ｎ＝１２／群)。若年参加者用量群の結合抗体濃度データは、用量群１μgおよび３μgで５０日目までおよび用量群１０μg、２０μgおよび３０μgで８５日目まで入手可能であった。ＢＮＴ１６２ｂ２投与年配参加者について、データは２９日目まで入手可能である。
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２投与後の結合抗体濃度のベースラインからの増加倍率を、それぞれ図１０６および図１０７に示す。
ＢＮＴ１６２ｂ１を投与した参加者は、投与１の２１日後(２２日目)ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク(Ｓ)タンパク質１サブユニットに対する強力な用量依存的抗体応答を示した。投与２の７日後(２９日目)、Ｓ１結合免疫グロブリン(ＩｇＧ)ＧＭＣは、強力な、用量依存的ブースター応答を示した。１回のみ投与した６０μg用量群で、Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣは低いままであり、抗体濃度増加のためにブースター投与が必要であることが示された。
ＢＮＴ１６２ｂ１の投与２の２１日後(４３日目)、Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣは低減したが(１μg用量群以外)、全治験用量でＣＯＶＩＤ−１９ ＨＳＣパネルを明らかに超えた。
ＢＮＴ１６２ｂ２投与参加者は、投与１の２１日後(２２日目)強いＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｓ１結合ＩｇＧ応答を示し、１μgおよび１０μg用量レベル間のみの用量依存的応答の証拠があった。Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣは、投与２の７日後(２９日目)までに相当なブースター応答を示した。２９日目、Ｓ１結合ＩｇＧ ＧＭＣは、２０μg用量レベルで若年および年配参加者間で同等であった。
全用量レベルコホートにわたり、抗体レベルは経時的に低減したが、Ｓ１結合抗体ＧＭＣは、８５日目(投与２の６３日後；１０〜３０μg用量レベル)、ＣＯＶＩＤ−１９ ＨＣＳパネルで観察されるより十分高かった(図１０７)。
ほぼ全てのＢＮＴ１６２ｂ１−およびＢＮＴ１６２ｂ２免疫化参加者が、投与１の２１日後(２２日目)にはＳ１結合抗体応答について抗体陽転していた。ＢＮＴ１６２ｂ１の投与で抗体陽転した参加者の割合を図１０８におよびＢＮＴ１６２ｂ２の割合を、図１０９に示す。標的抗原としてＲＢＤドメインのみを使用して類似する観察がされた。
実施例２３：例示的細胞介在免疫応答：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答
実施例７に記載した臨床治験において、ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン接種後、次のことが健常若年成人(１８〜５５歳)および高齢成人(５６〜８５歳)で観察された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答データは、ＢＮＴ１６２ｂ１を受けた、１μg、３μg、１０μg、２０μg、３０μg、５０μgまたは６０μgの用量レベル(注：６０μg用量群では投与２は与えなかった)の７０若年参加者および１０μg、２０μgまたは３０μgの用量レベルの２７年配参加者の９７治験参加者でならびに１μg、３μg、１０μg、２０μgまたは３０μg(４７若年参加者)または１０μg、２０μgまたは３０μg(年配参加者)の用量レベルでＢＮＴ１６２ｂ２を受けた７６参加者から入手可能であった。
ＢＮＴ１６２ｂ１は全年配参加者(２７中２７[１００％])を組む、投与１および投与２を受けた大部分の参加者(８８中８６[９７.７％])で強いＲＢＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導し；ＣＤ８＋応答は、若年参加者の６１中４７(７７.０％)および年配参加者の２７中２１(７７.７％)で誘導された。対照的に、Ｔ細胞応答は低頻度で検出され、６０μg用量群で投与１のみ受けた９若年参加者で強度が低く、ブースター投与の重要性が示された。
ＢＮＴ１６２ｂ２は、投与された若年または年配参加者全て(７６中７６[１００％])で、強いＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導した；ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、若年参加者の４５／４７(９５.７％)および年配参加者の２４／２９(８２.８％)で誘導された。年配参加者でＣＤ８＋免疫原性率がわずかに低いにも関わらず、ＢＮＴ１６２ｂ２誘導応答の強度は、３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２を受けた若年参加者で誘導されたものと同等であった。これらのＴ細胞応答は、非ＲＢＤ配列を含む抗原の種々の部分に対するものであり、両年齢群でのＢＮＴ１６２ｂ２による多エピトープ応答の誘導が示された。
ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２の２回投与は、ＢＮＴ１６２ｂ１で両年齢群および全用量レベルにわたりＴ細胞応答の発生率および強度の相当な増加に至った。一方、ＢＮＴ１６２ｂ２により誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強度も、種々の用量レベルにわたり類似し、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の強度は、３０μg用量レベルで最高であった。最強ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を有した参加者は、同じ参加者でサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルスおよび破傷風毒素からの免疫優性ペプチドに対する同じ参加者で観察された記憶応答の１０倍を超えた。同じ参加者は、上記ウイルス抗原に対する記憶応答と同等であった強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答も有した。
ワクチン接種後観察されたＲＢＤおよびＳタンパク質特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、デノボでＢＮＴ１６２ｂ１により９７.５％の参加者およびＢＮＴ１６２ｂ２で１００％の参加者で誘導された。ワクチン接種後観察されたＲＢＤおよびＳタンパク質特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、デノボで、ＢＮＴ１６２ｂ１で９５.５％の参加者およびＢＮＴ１６２ｂ２で９６.６％の参加者で誘導された。
実施例２４：例示的細胞介在免疫応答：機能的および炎症誘発性ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞応答
実施例７に記載した臨床治験において、ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン接種後、次のことが健常若年成人(１８〜５５歳)および高齢成人(５６〜８５歳)で観察された。Ｔ細胞に対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはＲＢＤタンパク質のデノボ誘導が、細胞内サイトカイン染色(ＩＣＳ)を使用して確認された。ＢＮＴ１６２ｂ１について実施例７に記載するとおり、類似する細胞介在免疫応答が、下記のとおりＢＮＴ１６２ｂ２でも観察された。
例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質またはＲＢＤに対するＩＦＮγ産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２両者により頑強に誘導された。ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２両者で明確な用量依存性は観察されなかった。年配参加者でＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２投与後誘導されたサイトカイン応答は、若年参加者と応答パターンおよび強度が大部分同一であった。
ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２は、ほぼ全参加者で多機能的および炎症誘発性ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。インターフェロン(ＩＦＮ)γ、インターロイキン(ＩＬ)−２が検出され。ＩＬ−４はなかったことは、好都合なＴｈ１プロファイルおよび有害な可能性のあるＴｈ２免疫応答の非存在を示す。
ＢＮＴ１６２ｂ２に関して、ベースライン(投与１前)およびＢＮＴ１６２ｂ２投与１後２９±３日に集めた治験参加者の血液から単離した末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)画分を解析した。これは、計７４治験参加者のデータを含む。
用量群あたりの１８〜５５歳若年参加者：１μg(ｎ＝８)、３μg(ｎ＝９)、１０μg(ｎ＝１０)、２０μg(ｎ＝９)、３０μg(ｎ＝１０)。
用量群あたりの５６〜８５歳年配参加者：１０μg(ｎ＝１１)、２０μg(ｎ＝８)、３０μg(ｎ＝９)。
ワクチン誘導ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ特異的Ｔ細胞の機能性および極性化を、それぞれワクチンコード化ＲＢＤおよび野生型ＳＡＲＳ ＣｏＶ−２タンパク質の完全長配列を表す重複ペプチドでの刺激に応答したサイトカインＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の細胞内蓄積により評価した。対照として、ウイルス学的に確認された１８のＣＯＶＩＤ−１９回復期患者からのＰＭＢＣを使用した。
ＢＮＴ１６２ｂ２(用量範囲１〜３０μg)の２回投与は、分析した両年齢群でワクチン特異的Ｔ細胞応答を誘導した(図１１０および１１１)。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質特異的Ｔ細胞応答試験を、Ｓタンパク質のＮ末端領域からの重複ペプチドを含むＳプール１(構造ドメインと同等ではない)およびＳタンパク質のＣ末端領域を含むＳプール２の２つの異なるペプチドプールで実施した。ＢＮＴ１６２ｂ２を投与された７４参加者で分析したＳ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−２または両者を分泌するＴｈ１サイトカインプロファイルにより特徴づけられた。
Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４分泌Ｔ細胞は、Ｓペプチドサブプール刺激に対する応答でほとんど検出不可能であった(平均画分：２０μgおよび３０μg成人コホートでそれぞれ０.０１％および０.０２％の抗原特異的循環ＣＤ４＋Ｔ細胞；Ｓタンパク質サブプール１およびサブプール２で別に刺激)。Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は７４の分析した参加者中６１(成人：４６中４０参加者および年配成人：２８中２１参加者)でＩＦＮγを分泌し、ＩＬ−２分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞も検出可能であった。Ｓタンパク質のＮ末端ドメインをターゲティングするＳ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分は、２０μgおよび３０μg若年参加者用量群で総末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞の最大１％および３０μg年配参加者用量群で最大２.４％に達した。Ｓタンパク質のＣ末端領域に対する現存のＣＤ８＋Ｔ細胞応答は７４中１７投与参加者で観察された(範囲：０.０７〜５.５９％ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞)。１７中６参加者で、これらの現存の応答は、ＢＮＴ１６２ｂ２投与によりわずかに増幅された。
全体として、Ｓ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均画分は、ＣＯＶＩＤ−１９から回復した１８患者で観察されたより実質的に高かった(例えば、３０μg投与参加者のＳタンパク質プール１ ＩＦＮγ ＣＤ８＋応答は１２.５倍高かった)。重要なことに、臨床的に目標とされる３０μg用量群で、年配参加者でＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン接種後誘導されたサイトカイン応答若年参加者と応答パターンおよび強度が大部分同一であった。
ＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｔ細胞応答、特にＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＲＢＤに限定されず、Ｓタンパク質の非ＲＢＤ領域の明白なおよび強いＴ細胞認識が観察された。
ＢＮＴ１６２ｂ２は、ほぼ全参加者で多機能的および炎症誘発性ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。ヘルパー応答のＴｈ１極性化は、抗原特異的(野生型ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質ペプチドプール)再刺激による頑強なＩＦＮγ／ＩＬ−２およびわずかなＩＬ−４産生により特徴づけられた。
実施例２５：ＢＮＴ１６２ｂ２により誘導されるあるＴ細胞応答
ドイツ治験(治験ＢＮＴ１６２−０１；ＮＣＴ０４３８０７０１)で観察されたＢＮＴ１６２ｂ２での免疫化により誘導されたあるＴ細胞応答を記載する実施例２３および２４に加えて、本実施例は、１９〜５５歳参加者の１、１０μg、２０μgおよび３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２でのプライム−ブーストワクチン接種のＴ細胞応答の詳細な特徴づけ、例えば、ここに記載するＣＯＶＩＤ−１９ワクチンにより誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されるエピトープの最初の同定を含む、免疫原性をさらに示す。何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、対象で応答が誘導されたエピトープの同一性および／または特定のエピトープまたはエピトープの組み合わせに対する応答は、ワクチン投与により提供される免疫応答および／または免疫保護の１以上の特性(例えば、有効性および／または期間)に影響し得ることは注意すべきである。ある実施態様において、投与レジメンは、１以上の特定のエピトープを認識する免疫応答の１以上の特性、例えば、応答の存在および／またはレベル(例えば、Ｔ細胞および／または抗体)をモニタリングする１以上の工程を含み得る。ある実施態様において、次の用量の必要性、タイミングおよび／または強度は、このようなモニタリングに照らして決定され得る。
さらに下記のとおり、本実施例は、一部、数ＢＮＴ１６２ｂ２誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されるエピトープが、頻繁なＭＨＣアレルに提示されたとき、ペプチドＭＨＣ多量体を使用して同定されたこと；およびＣＤ８＋Ｔ細胞は０.０１〜３％の循環ＣＤ８＋Ｔ細胞に達する単一特異性で早期分化エフェクター−記憶表現型であったことを示す。何らかの特定の理論に拘束されること意図しないが、「エフェクター−記憶」表現型を示す細胞が長期保護を提供し得ることは注意すべきである。
本実施例はまた、ＢＮＴ１６２ｂ２を受けたある参加者が現存のＴ細胞応答を有したことも示す。故に、数ある中で、この実施例は、ここに記載する組成物および特にＢＮＴ１６２ｂ２が、潜在的に同じウイルス−すなわち、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２および／またはその抗原またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ２スパイクタンパク質と１以上のエピトープを共有する他の抗原を含む１以上の関連ウイルスに既に曝されている対象においても、十分に有用であり得ることを確認する。
ワクチン誘導Ｔ細胞応答の含有率および強度
十分な末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)が入手可能であった３７のＢＮＴ１６２ｂ２免疫化参加者のＴ細胞応答を、ワクチン接種前(１日目)およびブースター投与７日後(２９日目)に、直接エクスビボＩＦＮγ酵素結合免疫スポット(ELISpot)アッセイにより分析した(図１１２および図１１３)。当業者は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓタンパク質がａシグナルペプチド(ａａ１〜１３)、Ｎ末端Ｓ１プロテアーゼフラグメント(ａａ１４〜６８５)およびＣ末端Ｓ２プロテアーゼフラグメント(ａａ６８６〜１２７３)からなり；Ｓ１が宿主受容体に結合するＲＢＤ(ａａ３１９〜５４１)を含み、Ｓ２がウイルスエンベロープと細胞膜の融合に介在することを理解する。Ｓタンパク質に対する反応性をデコンボリューションするために、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターを、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓの野生型配列の種々の部分を表す重複ペプチド、すなわちＮ末端プール‘Ｓプール１’(ａａ１〜６４３)および‘ＲＢＤ’(Ｓのａａ３２７〜５２８に融合したａａ１〜１６)およびＣ末端‘Ｓプール２’(ａａ６３３〜１２７３)で一夜刺激した。
示す用量の何れかでＢＮＴ１６２ｂ２でブーストした７日後、頑強に増殖したＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が全３７参加者で検出可能であった(図１１２ａ、図１１３ａ)。このうち３４参加者で、ワクチン接種前ＰＢＭＣと比較ができた。３４対象中３０(８８.２％)が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の両Ｓプール１およびＳプール２に対するデノボ(ベースラインで存在しなかった)ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を有した。１参加者は、プール２に対してのみデノボ応答を有した。残りの３参加者は、Ｓプール１および低数の現存のＳプール２反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するデノボ応答を有した。この３参加者中２で、Ｓプール２に対する現存の応答は、ワクチン接種により増幅され(それぞれワクチン接種前９１および１８８スポット／１０６細胞からワクチン接種後１３９１および９６５スポット)、一方３参加者中１で、Ｓプール２に対する現存の応答は安定なままであった(５３〜１４０スポット／１０６細胞)。これらのデータは、参加者の９４.１％(３２／３４)で、ＢＮＴ１６２ｂ２の２回投与が、Ｓの両Ｎ末端およびＣ末端部分、故にＲＢＤ外側のエピトープに対するポリエピトープＣＤ４＋Ｔ細胞応答(デノボまたは増幅)を誘導する(図１１３ｂ)。
用量レベル１０μg以上で、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強度は用量依存的ではないように見えたが、個体間で変わった。最強応答者で、Ｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、共通ウイルスおよびリコール抗原(サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルスおよび破傷風毒素から)に対する個々の記憶応答の１０倍を超えた(図１１２ｂ,ｃ)。
ワクチン誘導性Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、３７中３４ワクチン接種参加者(９１.９％)で観察された。大部分は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)およびインフルエンザウイルス(図１１２ｂ,ｃ)に対する各個の記憶応答と同等の強力な応答(図１１２ａ、図１１３ａ)であった。デノボＳ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は３３参加者で誘導され、これらは、Ｓプールの両方(２２参加者)または一方(１０参加者はＳプール１および２参加者はＳプール２)に対してであり、非ＲＢＤ Ｓ特異的Ｔ細胞を含むポリエピトープ応答の優位性を示した(図１１３ｂ)。７参加者で、Ｓプール２に対する現存のＣＤ８＋Ｔ細胞応答が検出され、ワクチン接種でさらなる増強はなかった。この７中６参加者は、プール１のＳに対する同時のデノボ応答を有し、強度はＳプール２に対する現存の応答がない個体で観察されたものと差はなかった(図１１３ｃ)。注目すべきことに、検出可能なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を有する３４参加者でＳプール１に対する最強応答(第３四分位点より高い)は、現存のＳプール２特異的応答がないもので観察された。
Ｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強度はＳ１結合ＩｇＧと正に相関し(図１１４ａ)、分子内援助の概念に一致し(例えば、抗原の１エピトープに対するＣＤ４応答は、同じ抗原のエピトープに対するＣＤ８応答の発生を指示し得る)、Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の強度とも一致した(図１１４ｂ)。Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答はＳ１結合ＩｇＧとも正に相関し(図１１４ｃ)、液性および細胞性適応免疫の収束性発生を指示した。
ワクチン誘導Ｔ細胞応答の極性化
Ｓ特異的Ｔ細胞の機能性および極性化を評価するために、Ｓプール１、Ｓプール２およびＲＢＤプールでの刺激に応答して分泌されたサイトカインを、異なる用量を受けた３７のＢＮＴ１６２ｂ２免疫化参加者でワクチン接種前後のＰＢＭＣのＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−４特異的応答について細胞内染色(ＩＣＳ)により決定した。ワクチン誘導、Ｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の相当部分がＩＦＮγ、ＩＬ−２または両者を分泌し、一方ＴＨ２サイトカインＩＬ−４を分泌するＴ細胞は、辛うじて検出可能であった(図１１５ａ−ｃ、図１１３ｄ−ｅ)。ワクチン誘導Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、大部分はＩＦＮγおよび低レベルのＩＬ−２を、Ｓプール１およびＳプール２刺激に対する応答で分泌した。Ｓプール１に特異的なＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分が、最大約１％の総末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞を構成した(図１１５ｄ)。注目すべきことに、分析した参加者の一部(２０μg用量コホートでｎ＝３および３０μg用量コホートでｎ＝３)は現存のＳプール２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、６参加者中５で、ワクチン接種後さらなる増幅はなかった。強い現存のＳプール２特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が１参加者(２０μg用量コホート)で検出可能であった(図１１５ｃ)。
両アッセイ系で、完全ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓを含むペプチドプールに応答するＣＤ４＋ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン産生は、ＲＢＤペプチドプールに対する応答を超え、ＢＮＴ１６２ｂ２により誘導されるＴ細胞応答のポリエピトープ性質をさらに確認した。総循環Ｔ細胞内のＢＮＴ１６２ｂ２誘導Ｓ特異的ＩＦＮγ＋またはＩＬ−２＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均画分は、ＣＯＶＩＤ−１９から回復した１８対照対象(ＨＣＳ)で検出されたより高かった(図１１５ｃ,ｄ)。
ＢＮＴ１６２ｂ２での免疫化により観察されたＣＤ８＋Ｔ細胞のエピトープ特異性および表現型
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、２１日離した２回投与(例えば、１０μg／用量または３０μg／用量)の２用量レジメンでワクチン接種した３参加者のエピトープレベルで特徴づけした。
参加者から集めたワクチン接種前後の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、フローサイトメトリー解析のために個別化ペプチド／ＭＨＣ多量体染色カクテルで染色した。２３(４がHLA-B*0702、１９がHLA-A*2402)、１４(HLA-B*3501)および２３(７がHLA-B*4401、１６がHLA-A*0201)の多様なペプチド／ＭＨＣアレル対を、参加者１、２および３それぞれで使用し、そうして、ポリエピトープＴ細胞応答の包括的捕捉よりむしろ、可能性のある反応性の選択したセットをプローブした。各参加者について、複数エピトープに対するデノボ誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞反応性が同定され、Ｓタンパク質の完全長にわたり拡散した計８までの異なるエピトープ／ＭＨＣ対が加えられた(図１１６ａ、ｃ)。エピトープ特異的Ｔ細胞応答強度は、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の０.０１〜３.０９％の範囲であり、最も深い増殖が、HLA-A*0201 YLQPRTFLL(ＣＤ８＋の３.０９％多量体＋)、HLA-A*2402 QYIKWPWYI(ＣＤ８＋の１.２７％多量体＋)およびHLA-B*3501 QPTESIVRF(ＣＤ８＋の０.１７％多量体＋で観察された。ELISpotおよび細胞内染色(ＩＣＳ)で決定したこれら個体の完全Ｓタンパク質に対するバルクＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞応答と比較して、ｐＭＨＣテクノロジーが細胞性免疫応答の真の程度により有用であり得ることが示される(図１１３ｆ)。
同定されたｐＭＨＣ多量体＋Ｓ抗原経験ＣＤ８＋Ｔ細胞特異性の表現型検査は、ＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＡの低発現および共刺激分子ＣＤ２８およびＣＤ２７の高発現により特徴づけされる、早期分化エフェクター記憶表現型を確認した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−１など同族活性化と関連するマーカーも発現する(図１１６ｂ)。
考察
適応免疫系のエフェクターは、ウイルス感染症防御に相補的役割を有する。中和抗体は、防御の最前線であるが、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)は中和抗体が接近できない細胞内コンパートメントからのウイルス排除に貢献する。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の同族援助、記憶産生ならびに間接的(例えばＩＦＮγ経由)または直接(ＭＨＣクラスII発現標的細胞に対する)細胞毒性活性の提供を含む、免疫編成機能を有する。
この実施例は、ＢＮＴ１６２ｂ２のワクチン接種が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ特異的中和抗体(他の実施例に記載するとおり)、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＩＦＮγなどの免疫調節サイトカインとの協調的免疫応答を誘導することを示す。
ＢＮＴ１６２ｂ２をワクチン接種した全参加者は、エクスビボELISpotアッセイで検出して、デノボＳ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を生じ、ほぼ９２％の参加者がＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じた。Ｔ細胞応答強度は個体間で変わり、明確な用量依存性は示されなかった。最低用量の１μg ＢＮＴ１６２ｂ２でさえ、ワクチン接種参加者の大部分は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頑強な増殖を示した。Ｔ細胞応答はＳタンパク質のＲＢＤ、Ｓ１およびＳ２領域に対し、複数の独立したＭＨＣ ＩおよびIIエピトープの免疫認識を示す。
ＢＮＴ１６２ｂ２誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＩＦＮγおよびＩＬ−２の発現と低レベルのみのＩＬ−４は、ＴＨ１プロファイルおよび有害な可能性のあるＴｈ２免疫応答の非存在を示した。
Ｓタンパク質のＳ１サブユニットに対する全ＣＤ８＋Ｔ細胞応答はデノボであり、ベースラインで検出されなかったが、Ｓ２サブユニットに対する現存の免疫応答は数個体で同定された。Ｓ１フラグメントの対応する季節性コロナウイルス配列に対する配列類似性は、Ｓ２フラグメントより低い；理論に拘束されることを意図しないが、この発見は、現存の交差反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出され得ることを示すことが提案される。
ペプチドＭＨＣ(ｐＭＨＣ)多量体テクノロジーにより、ワクチン誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されるＳタンパク質エピトープの同定と、各エピトープ特異的Ｔ細胞の直接定量が可能となった。各参加者の累積Ｔ細胞頻度は、ELISpotおよびＩＣＳアッセイで測定された全体的Ｔ細胞応答を超え、これらのアッセイは、ポリエピトープ応答の真の強度を少なく見積もることが示された。当業者は、単一ペプチド解析がペプチドプールで刺激した機能的Ｔ細胞アッセイと比較して、多数の免疫原性エピトープ競合があり、Ｔ細胞頻度が高くなることを知っている。誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞の高い割合が早期分化エフェクター記憶細胞であった。この都合よい表現型は迅速に応答する能力を有するが、ＩＦＮγ産生の能力には限界があり、故に機能的Ｔ細胞アッセイで検出される可能性は低い。感染個体がＣＤ８＋Ｔ細胞を生じるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓのエピトープは同定され、当分野で知られているが(例えば、Shomuradova et al., Immunity (2020) doi:10.1016/j.immuni.2020.11.004;およびPeng et al. Nat. Immunol. 21, 1336-1345 (2020)参照)、ここに提供するデータは、ＣＯＶＩＤ−１９ワクチン誘導Ｔ細胞により認識されるエピトープを初めて示した。注目すべきことに、この試験で同定された免疫優性ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限ペプチドYLQPRTFLLは、回復期ＣＯＶＩＤ−１９患者で先に記載されている。Ｉｄ。
材料および方法
タンパク質およびペプチド。
１１アミノ酸(ａａ)により重複し、共に野生型ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ(ａａ１〜６４３を特徴とするＳプール１、ａａ６３３〜１２７３を特徴とするＳプール２)の配列全体をカバーする１５量体ペプチドの２プールおよびＮ末端に融合したＳのシグナルペプチド(ａａ１〜１６)を伴うＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤ(ａａ３２７〜５２８)をカバーする１プールを、フローサイトメトリーおよびＩＦＮγ ELISpotのためのＰＢＭＣのエクスビボ刺激に使用した。ＣＥＦ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス；ヒト白血球抗原[ＨＬＡ]クラスＩエピトープペプチドプール)およびＣＥＦＴ(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス、破傷風毒素；ＨＬＡクラスIIエピトープペプチドプール)を、一般Ｔ細胞反応性の対照としておよび記憶Ｔ細胞応答の強度のベンチマークのために使用した。全ペプチドをJPT Peptide Technologiesから得た。
ヒト回復期血清およびＰＢＭＣパネル。
ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染／ＣＯＶＩＤ−１９回復期血清(ｎ＝３８)を、ＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後かつ参加者が無症候であったときに１８〜８３歳ドナーから得た。ドナーの平均年齢は４５歳であった。ドナーのサブグループの中和ＧＭＴは次のとおりであった。症候性感染症、９０(ｎ＝３５)；無症候性感染症、１５６(ｎ＝３)；入院、６１８(ｎ＝１)。血清を、Sanguine Biosciences(Sherman Oaks, CA)、MT Group(Van Nuys, CA)およびPfizer Occupational Health and Wellness(Pearl River, NY)から得た。ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染／ＣＯＶＩＤ−１９回復期ＰＢＭＣサンプル(ｎ＝１８)を、２２〜７９歳ドナーからＰＣＲ確認診断３０〜６２日後、ドナーが無症候であったときに採取した。ＰＢＭＣドナーは、無症候性または軽度感染症(ｎ＝１６、臨床スコア１および２)であるかまたは入院していた(ｎ＝２、臨床スコア４および５)。血液サンプルを、Frankfurt University Hospitalから得た。
一次細胞単離。
ＰＢＭＣを、Ficoll-PaqueTM PLUS(Cytiva)密度勾配遠心分離により単離し、解析前に凍結保存した。
ＩＦＮγ ELISpot。
ＩＦＮγ ELISpot解析は、ＣＤ４＋枯渇およびＣＤ８＋Ｔ細胞富化(ＣＤ８＋エフェクター)またはＣＤ８＋枯渇およびＣＤ４＋Ｔ細胞富化(ＣＤ４＋エフェクター)ＰＢＭＣを使用して、エクスビボ(増殖のためにさらにインビトロ培養することなく)で実施した。試験を、陽性対照(抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＣＤ３−２[１：１,０００；Mabtech])と共にデュプリケートで実施した。ＩＦＮγ特異的抗体(ELISpotProキット、Mabtech)でプレコートした多スクリーンフィルタープレート(Merck Millipore)をＰＢＳで洗浄し、２％ヒト血清アルブミン(CSL-Behring)含有Ｘ−ＶＩＶＯ １５培地(Lonza)で１〜５時間ブロックした。ウェルあたり３.３×１０５エフェクター細胞を、１６〜２０時間、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓの野生型配列(Ｎ末端プールプール１[ａａ１〜６４３]およびＲＢＤ[ａａ３２７〜５２８に融合したａａ１〜１６]およびＣ末端Ｓプール２[ａａ６３３〜１２７３])の異なる部分を表す３重複ペプチドプールで刺激した。結合ＩＦＮγを、アルカリホスファターゼに直接コンジュゲートした二次抗体を使用して、続いて５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)／ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)基質(ELISpotProキット、Mabtech)を使用して、可視化した。プレートをAID Classic Robot ELISPOT Readerを使用して走査し、AID ELISPOT 7.0ソフトウェア(AID Autoimmun Diagnostika)いより分析した。スポット数は各デュプリケートの平均値として示した。ペプチドにより刺激されたＴ細胞応答を、疑陽性に対する制御を維持しながら、感受性を提供するために、２つの統計検定(分布によらない再サンプリング)に基づき、社内ELISpot data analysis Tool(ＥＤＡ)を使用して陰性対照としての培地のみとインキュベートしたエフェクターと比較した。
抗ＣＤ３抗体刺激に対して応答したスポット数により反映される多様なサンプル品質を説明するために、正規化方法が提供され、個体間のスポット数および応答強度の直接比較を可能とした。この依存性は、ノイズ成分含むベイズモデルを有する対数線形様式にモデル化された(未発表)。頑強な正規化のために、各正規化をモデルから１０００回サンプリングし、中央を標準化スポット数値として取った。モデルの尤度：ｌｏｇλＥ＝α ｌｏｇλＰ＋ｌｏｇβｊ＋σε、ここで、λＥはサンプルの標準化スポット数であり；αは全陽性対照λＰで共通な安定因子(正規分布)であり；βｊは、サンプルｊ特異的成分(正規分布)；およびσεはノイズ成分であり、その中でσはコーシー分布であり、εはスチューデントのｔ分布である。βｊは、各サンプルが異なるバッチとして処理されることを確実にする。
フローサイトメトリー。
サイトカイン産生Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン染色により同定した。解凍し、２μg／mL ＤＮａｓｅ Ｉ(Roche)添加OpTmizer培地で４時間休止させたＰＢＭＣを、GolgiPlug(ＢＤ)存在下、１８時間、３７℃でELISpotセクションに記載するペプチドプールのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓの野生型配列の種々の部分(２μg／mL／ペプチド；JPT Peptide Technologies)で再刺激した。対照をＤＭＳＯ含有培地で処理した。細胞を、フロー緩衝液(２％ＦＢＳ[Biochrom]、２mMエチレンジアミン四酢酸[ＥＤＴＡ；Sigma-Aldrich]添加ＤＰＢＳ[Gibco])中、２０分間、４℃で生存能および表面マーカー(ＣＤ３ ＢＶ４２１、１：２５０；ＣＤ４ ＢＶ４８０、１：５０；ＣＤ８ ＢＢ５１５、１：１００；全BD Biosciences)で染色した。その後、サンプルを、製造業者(BD Biosciences)の指示に従い、Cytofix/Cytopermキットを使用して、固定し、透過処理した。細胞内染色(ＣＤ３ ＢＶ４２１、１：２５０；ＣＤ４ ＢＶ４８０、１：５０；ＣＤ８ ＢＢ５１５、１：１００；ＩＦＮγ ＰＥ−Ｃｙ７、１：５０[ＨＣＳについて]；ＩＦＮγ ＢＢ７００、１：２５０[参加者について]；ＩＬ−２ ＰＥ、１：１０；ＩＬ−４ ＡＰＣ、１：５００；全BD Biosciences)をPerm／Wash緩衝液で３０分間、４℃で実施した。サンプルを蛍光活性化セルソーター(ＦＡＣＳ)ＶＥＲＳＥ装置(BD Biosciences)に上獲得し、FlowJo software version 10.6.2(FlowJo LLC, BD Biosciences)で分析した。ＳおよびＲＢＤ特異的サイトカイン産生を、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)含有培地で得られた値を減ずることにより、バックグラウンドに対して補正した。負の値を０と設定した。図１１６ｂのサイトカイン産生を、ＩＦＮγ、ＩＬ−２またはＩＬ−４について陽性の全ＣＤ４＋Ｔ細胞の画分を合計し、この合計を１００％に設定し、その各特異的サイトカイン産生サブセットの分画を計算することにより計算した。疑似カラープロット軸は、ｌｏｇ１０スケールである。
ペプチド／ＭＨＣ多量体染色。
多量体解析用ＭＨＣ−クラスＩエピトープを選択するために、マススペクトロメトリーベースの結合および提示予測因子(例えば、Abelin et al., Immunity 46, 315-326 (2017); and Poran et al., Genome Med. 12, 70 (2020)に記載のとおり)を、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のGenBank対照配列(accession: NC_045512.2, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512)由来のスパイク糖タンパク質からの８〜１２アミノ酸長ペプチド配列に適応し、欧州集団で＞５％頻度の１８のＭＨＣ−クラス−Ｉアレルと対合させた。上位予測エピトープが、結合パーセントランク(≦１％)および提示スコア(≧１０−２.２)の閾値の設定により同定され、＞９０％純度のペプチド合成について考慮された。ｐＭＨＣ複合体をeasYmerテクノロジー(easYmer(登録商標)キット、ImmuneAware Aps)で再折り畳みし、複合体形成を、製造業者の指示に従いビーズベースのフローサイトメトリーアッセイで検証した。コンビナトリアルラベリングを、サンプルあたり最大１０の異なるＴ細胞集団の検出を可能とするため、５つの異なる蛍光ラベルの２色組み合わせを利用する、Ｔ細胞の抗原特異性の精査に使用した。四量体化について、ストレプトアビジン(ＳＡ)蛍光色素コンジュゲートを加えた：ＳＡ ＢＶ４２１、ＳＡ ＢＶ７１１、ＳＡ ＰＥ、ＳＡ ＰＥ−Ｃｙ７、ＳＡ ＡＰＣ(全BD Biosciences)。ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン接種３参加者について、個別化ｐＭＨＣ多量体染色カクテルは、最大１０ｐＭＨＣ複合体からなり、各ｐＭＨＣ複合体は特有の２色組み合わせによりコードされた。ＰＢＭＣ(２×１０６)を、２０分間、室温でエクスビボで染色し、各ｐＭＨＣ多量体カクテルはBrilliant Staining Buffer Plus(BSB Plus[BD HorizonTM])中最終濃度４nMであった。表面および生存能染色を、３０分間、４で℃ＢＳＢ Ｐｌｕｓ添加フロー緩衝液(ＤＰＢＳ[Gibco]と２％ＦＢＳ[Biochrom]、２mM ＥＤＴＡ[Sigma-Aldrich])中で実施した(CD3 BUV395、1:50; CD45RA BUV563、1:200; CD27 BUV737、1:200; CD8 BV480、1:200; CD279 BV650、1:20; CD197 BV786、1:15; CD4 BB515、1:50; CD28 BB700、1:100; CD38 PE-CF594、1:600; HLA-DR APC-R700、1:150; 全BD Biosciences; DUMP channel:CD14 APC-eFluor780、1:100; CD16 APC-eFluor780、1:100; CD19 APC-eFluor780、1:100; 固定可能生死判定色素eFluor780、1:1,667; 全ThermoFisher Scientific)。細胞を、１５分間、４℃で１×Stabilization Fixative(ＢＤ)で固定化し、ＦACSymphonyTM Ａ３フローサイトメーター(BD Biosciences)上に獲得し、FlowJo software version 10.6.2(FlowJo LLC, BD Biosciences)で分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞反応性は、２ｐＭＨＣ多量体色のみで標識されたクラスター集団が観察されたとき陽性と考えた。
実施例２６：再感染の可能性を示唆する証拠
プライマリーエンドポイントは、ＣＯＶＩＤ−１９疾患の先の証拠がない個体の評価であり、ワクチン接種前感染の証拠を有する参加者で確認されたＣＯＶＩＤ−１９の症例はごく少数であった(しかしながら、ワクチン群と比較して、プラセボ群で多症例があった)。しかしながら、表２２〜２３に示す利用可能なデータは、限定的であるが、先に感染した個体がＣＯＶＩＤ−１９(すなわち、再感染)のリスクがあり、ワクチン接種から利益が得られることを示唆する。
Figure 2021185136
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実施例２７：ある脂質添加物の薬物動態(ＰＫ)および吸収、分布、代謝および排泄(ＡＤＭＥ)解析
本実施例は、ここに記載するワクチン組成物に使用した脂質の種々の評価した特徴(例えば、ＰＫ／ＡＤＭＥ特徴)を記載する。何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、脂質成分のこのような特徴は、一般におよび／または特定の状況(例えば、特定のレジメンに従いおよび／または特定の集団に投与したときなど)有効性を含む、投与したワクチンの関連する特性(例えば、分布、発現など)に寄与し得ることは注意すべきである。
吸収
ラットでナノ粒子製剤のＡＬＣ−０３１５およびＡＬＣ−０３１９の静脈内(ＩＶ)ボーラス注射後の１回投与ＰＫ試験を実施し、脂質添加物ＡＬＣ−０３１５およびＡＬＣ−０１５９のＰＫおよび代謝を評価した。この試験は、サロゲートルシフェラーゼＲＮＡを含むＬＮＰを使用し、脂質組成は、ＡＬＣ−０１５９およびＡＬＣ−０３１５のインビボ性質を試験するため、ＢＮＴ１６２ｂ２と同一であった。
ＡＬＣ−０１５９の濃度は、この２週間試験中、血漿および肝臓でそれぞれ約８０００倍および＞２５０倍低下した。ＡＬＣ−０３１５について、血漿および肝臓からの分子の排出はゆっくりであったが、濃度は血漿および肝臓でそれぞれ２週間で約７０００倍および４倍低下した。全体として、血漿および肝臓の見掛けの終末相ｔ1/2は、両組織で類似し、ＡＬＣ−０１５９およびＡＬＣ−０３１５でそれぞれ２〜３日および６〜８日であった。血漿の見掛けの終末相ｔ1/2は、ＬＮＰとして分布していた組織から、排除される血漿に戻る、各脂質の再分布を表す可能性がある。
代謝
ＡＬＣ−０３１５およびＡＬＣ−０１５９のインビトロ代謝を、マウス、ラット、サルおよびヒトの血液、肝臓ミクロソーム、Ｓ９画分および肝細胞で評価した。インビボ代謝を、ＰＫ試験からのラット血漿、尿、糞便および肝臓サンプルで試験した。ＡＬＣ−０３１５およびＡＬＣ−０１５９の代謝は、インビトロおよびインビボで比較的ゆっくり起こるように見える。ＡＬＣ−０３１５およびＡＬＣ−０１５９は、それぞれエステルおよびアミド官能基の加水分解性代謝により代謝されると観察され、加水分解性代謝が評価した種にわたり観察される。
排泄
排泄試験は、尿または糞便で未変化物質がほとんどまたは全く検出されなかったため、５０％のＡＬＣ−０１５９が糞便に未変化で排泄され、代謝がＡＬＣ−０３１５の排出に役割を有することを示すと考えられた。
ラットＰＫ試験からの尿、糞便および血漿の調査は、ＡＬＣ−０３１５の一連のエステル開裂産物を同定した。何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、これは、インビボでこの分子に作用する一次排除機構を表す可能性があることが提案される。インビトロで、ＡＬＣ−０１５９は、アミド官能基の加水分解性代謝によりゆっくり代謝された。
実施例２８：投与ワクチン組成物の分布解析
ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンＢＮＴ１６２ｂ２のインビボ体内分布を、マウスをモデル系として使用して評価し、サロゲートレポーターとしてのルシフェラーゼ発現を評価した。タンパク質発現は、マウスでＢＮＴ１６２ｂ２のようなＬＮＰ製剤でルシフェラーゼをコードするＲＮＡのＩＭ注射を受けた後に注射部位に、かつ少ない程度でより短期的に、肝臓に検出された。ルシフェラーゼ発現は、注射６時間後注射部位で同定され、９日目までにほぼベースラインレベルに減少した。肝臓での発現も、注射６時間後存在し、注射４８時間後に検出されなかった。評価した肝臓以外の全ての組織は、用量の１％以下を含んだ。
実施例２９：種々の投与レジメンの反復投与毒性試験
ＧＬＰ遵守反復投与試験を、ＢＮＴ１６２ｂ２を含むＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンの免疫原性および毒性を評価するためにラットで実施した。
ある試験で、雄性および雌性Wistar Hanラットに、ここに記載するワクチン組成物を与えた；種々のＲＮＡプラットフォーム(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ２)に基づく組成物を、各１週間離して３回(投与１日、８日および１５日)後脚にＩＭ注射して試験した。異なる用量(１０μg、３０μgおよび１００μg)を試験した；低用量を、２０〜７０μlの単回注射として与え、一方最高用量(１００μg)および対照を各１００μlの２注射(各後脚に１回)として与えた。対照は、ワクチン製品の保存緩衝液に対応するリン酸緩衝化食塩水／３００mMスクローであった。各群は、１８雄性および１８雌性ラットであり、１０が主試験、５が回復群および３がサイトカイン解析用のさらなる動物として割り当てられた。回復期間は、最後の投与後３週間であった。検視を、試験１７日目、最後の投与約４８時間および３週間回復期間後に実施した。
予定外の死亡は観察されなかった。
投与は忍容性が良好と考えられ、全身毒性の徴候は何ら示されなかった；投与後数時間体温のわずかな上昇と、同じ期間にわたる体重のわずかな現象があったが、有害と考える強度ではなかった。
局所炎症性反応が筋肉内注射部位で観察された。示された注射部位変化は浮腫、紅斑および硬結であり、最初と比較して、２回目および／または３回目投与でより重度かつより高頻度であった；しかしながら、これらは、次の投与前には解消しており、３週間回復終了時には完全に回復した。
注射部位の巨視的所見は、硬結または肥厚であり、時折痂皮形成を伴い、これはほぼ全ラットで顕著であった。これは、炎症および様々な線維症、浮腫および筋線維変性と顕微鏡的に相関した。注射部位の炎症は、循環白血球細胞および急性相タンパク質(フィブリノーゲン、アルファ−２マクログロブリンおよびアルファ−１酸糖タンパク質)上昇を伴った。
炎症は、時折注射部位に隣接する組織まで拡大した。投与の最後に明らかな排出(腸骨)リンパ節肥大があった。これは、胚中心の細胞性増加および排出(腸骨)リンパ節の形質細胞増加と関連付けられ、投与ワクチンに対する予測された免疫応答であった。
脾臓肥大および脾臓重量増加は、造血増加と顕微鏡的に関連づけられ、造血増加は、骨髄でも明らかであった。これらの所見は、ワクチンに対する免疫／炎症性応答に二次的である可能性がある。
回復期間終了時、注射部位は正常であり、臨床的病理所見および巨視的観察は解消しており、顕微鏡で注射部位の回復の証拠があった。
門脈肝細胞の顕微鏡的空胞化は投与相後存在した。この観察は回復期間後なかった。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＡＴ)の上昇はなかった。全ワクチン接種したラットでガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ(ＧＧＴ)の上昇したが、ガンマ−ＧＴ活性増加を説明する胆汁うっ滞または肝胆道傷害に一致する巨視的または顕微鏡的所見はなく、３週間回復期間終了時完全に解消した。空胞化は、おそらく、ＬＮＰにおけるペグ化脂質の肝臓分布と関連する。血清サイトカイン濃度の変化は見られなかった。
眼および聴覚性評価に影響はなく、見掛けまたは行動にもなかった；特に、歩調は正常であり、見られた変化がラットの可動性に影響しないことを意味した。血清サイトカイン濃度にワクチン関連変化は見られなかった。
免疫原性試験は、ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチン(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ２ ｖ８などのＢＮＴ１６２ｂ２を含む)は、Ｓ１フラグメントおよび受容体結合ドメインに対するＳＡＲＳ ＣｏＶ−２スパイクタンパク質に特異的ＩｇＧ抗体応答を誘発した。中和抗体応答もシュードウイルス中和アッセイでワクチンで観察された
ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図１１７および１１８(図に示すとおり１７日目または１０日目から)に示し、最上部の線はＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンＢＮＴ１６２ｂ２であり、他の線はここに記載する異なる構築物を使用した他のＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンである：類似の結果が３８日目に示された(ここでは示していない)。これらは、Ｖｅｒｏ ７６細胞を使用するＶＳＶ／ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２−Ｓシュードウイルス中和試験でみられた中和活性に置き換えられた(図１１９)：類似の結果が３８日目で示された(ここでは示していない)。この試験で試験したワクチンは、抗原特異的抗体力価が高いほどまたより明白なウイルス中和効果を有した。
ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチン(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ２)は忍容性が良好であり、注射部位および排出リンパ節炎症性変化を起こし、骨髄および脾臓で造血を増加させ、臨床的病理変化は、注射部位の免疫応答または炎症に一致した。
本明細書を読んだ当業者は、この実施例の所見が、ここに記載する種々のｍＲＮＡ構築物および／または脂質ナノ粒子の投与に際して予測される典型と考え得る。
実施例３０：３用量レジメンの毒性および免疫原性試験
ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチン(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ２)投与ラットで毒性を評価するための試験を実施した。この試験は優良試験所規範に適合した。
雄性および雌性Wistar Hanラットに、ＢＮＴ１６２ｂ２を、各１週間離して３回(投与１日、８日および１５日)後脚にＩＭ注射した。検視を、試験１７日目、最後の投与約４８時間および３週間回復期間後に実施した。ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンＢＮＴ１６２ｂ２は０.５mg／mlで投与され、用量体積は６０μlであり、投与あたり３０μgを与えた。対照ラットは食塩水を与えた。
血液を、評価中種々の時点で、投与前および途中およびまた回復中に採って、ワクチン成分に対する抗体応答を評価した。
ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチン(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ２)を与えた全ラットは、計画された検視まで生存した：臨床徴候の変化は示されず、または体重変化は示されなかった。４日目および１１日目食物摂取量減少(対照の０.８３倍まで)があり、
対照と比較して、投与後１日目(最大０.５４℃)、８日目(最大０.９８℃)および１５日目(最大１.０３℃)の平均体温上昇があった。
注射部位で、１日目浮腫および紅斑の例があり(最大わずかな浮腫および極めてわずかな紅斑)、８(最大中程度浮腫およびきわめてわずかな紅斑)および１５(最大中程度浮腫およびきわめてわずかな紅斑)があり、８日目および１５日の投与前に完全に解消し、示されなかった。
血液検査は、４日目および１７日目、高い白血球細胞(対照の最大２.９５倍)を示し主に好中球(対照の最大６.８０倍)、単球(対照最大３.３０倍)および大型非染色細胞ＬＵＣ(対照の最大１３.２倍)およびわずかに高い好酸球および好塩基球を含んだ。白血球細胞は、４日目と比較して１７日目で高かった。両方の性別で４日目に網状赤血球の一過性低下(対照の０.２７倍まで)があり、雌性のみ１７日目網状赤血球が高かった(対照の最大１.３１倍)。赤血球量パラメータ低下(対照の０.９０倍まで)が４日目および１７日目にあった。４日目および１７日目、Ａ：Ｇ比が低下した(０.８２倍まで)。対照と比較して高いフィブリノーゲンが１７日目(最大２.４９倍)示され、急性相応答に一致した。急性相タンパク質アルファ−１−酸糖タンパク質(１７日目最大３９倍)およびアルファ−２マクログロブリン(１７日目最大７１倍)が４日目および１７日目に上昇し、雄性で濃度が高かった。尿検査パラメータで変化はなかった。
検視で、ワクチン接種したラットで絶対的および相対的脾臓重量が高かった(雄性で最大１.４２倍および雌性で１.６２倍)。他の臓器で重量変化はなかった。巨視的所見は、ワクチン接種したラットの少数での排出リンパ節肥大および淡い／暗い硬い注射部位であった。投与は、何ら全身毒性を誘導することなく忍容性であり、全ての変化炎症性応答および免疫活性化に一致した：所見は、脂質ナノ粒子カプセル化ｍＲＮＡワクチン投与に一般に関連するものに一致する。
実施例３１：生殖毒性
ＢＮＴ１６２ｂ２を含むＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンを与えた雌性ラットでの生殖毒性を評価するため、試験を実施した。雌性ラットに、ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチン(例えば、ＢＮＴ１６２ｂ２)をヒト臨床的用量(例えば、３０μg ＲＮＡ／投与日)で２回与え、その後交尾を開始させ、妊娠中２回与えた。ＣＯＶＩＤ−１９ ｍＲＮＡワクチンを、Ｆ０雌性Wistarラットに交尾開始２１日および１４日前(それぞれＭ−２１およびＭ−１４)に筋肉内(ＩＭ)投与し、次いで妊娠(ＧＤ)９日目およびＧＤ２０に、計４回投与した。サブグループは、ＧＤ２１に中止し、他の(同腹仔)群は出産後(ＰＮＤ)２１日に中止した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体力価は、大部分の雌で交尾(Ｍ−１４)直前、大部分の雌性および胎児は妊娠末期(ＧＤ２１)および大部分の出生児は授乳末期(ＰＮＤ２１)に見られた。各投与後、体重増加および食物消費の一過性減少があった。発情周期または繁殖力指数への影響は観察されなかった。一方、着床前死亡が増加(約２倍)した(対照と比較して)、ワクチン接種した群で観察された着床前死亡パーセントは、歴史的対照データ範囲内(５.１％〜１１.５％)であった。胎児で(計ｎ＝２１雌親／同腹仔から)、腹壁破裂、口／顎奇形、右側大動脈弓および／または頸部椎骨異常がごく低発生率であった。骨格所見に関して、暴露群は、対照群レベルと同等の仙骨前方椎弓過剰腰部肋骨、過剰腰部短肋骨、尾側椎骨数＜５があった。生後仔に有害効果の徴候はなかった(ＰＮＤ２１で終了)。
この試験は、繁殖力および早期胚形成に顕著な有害効果がないことを示す。
実施例３２：若年および年配中国人成人におけるＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ ＢＮＴ１６２ｂ１ ｍＲＮＡワクチンの安全性および免疫原性：無作為化、プラセボ対照、評価者盲検相Ｉ試験
本実施例は、１４４健常中国人参加者のフェーズＩ試験検査ＢＮＴ１６２ｂ１の初期結果を報告する。ＢＮＴ１６２ｂ１はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク糖タンパク質受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)をコードし、ここに記載するいくつかのＲＮＡベースのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ワクチン候補の一つである。
本実施例は、特に観察された安全性プロファイルを報告し、ここで、＞３９℃発熱が報告された唯一のグレード３有害事象であった。１０μgまたは３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１のプライム−ブーストワクチン接種は、若年(１８〜５９歳)および年配(６５〜８５)中国人成人両者で頑強な抗体およびＴ細胞応答を誘導した。両用量レベルは、４１日後抗体陽転を誘導した：１０μgおよび３０μg用量群の若年参加者のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２血清中和抗体の幾何平均力価は、ＣＯＶＩＤ−１９から回復した患者の回復期血清の１.９倍および２.１倍であった；そして年配参加者は０.７倍および１.３倍であった。ＲＢＤ抗原暴露に対するインターフェロン−γ Ｔ細胞応答は、プラセボ群よりＢＮＴ１６２ｂ１を受けた参加者で有意に高かった
反応原性増加およびより好都合なワクチン誘発ウイルス中和応答が、若年および年配中国人成人両者で３０μg用量のＢＮＴ１６２ｂ１に関係した。
特に健常、若年および高齢中国人参加者へのワクチン接種に関する、ＢＮＴ１６２ｂ１について本実施例で提供される安全性および免疫原性データは、１０μgおよび３０μg用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１ワクチンでのプライム−ブーストワクチン接種が、１８〜５５歳の若年成人および６５〜８５歳の高齢成人両者で強い液性および細胞性免疫原性応答を誘導し、頑強なＲＢＤ特異的抗体およびＴ細胞応答が若年および年配参加者両者で、プライム−ブーストワクチン接種後少なくとも２８日以内に見られた。この試験のある所見は、例えば、米国およびドイツ集団でも観察されたような、ＢＮＴ１６２ｂ１の忍容性プロファイルの態様をさらに確認する。
方法
無作為化、プラセボ対照、評価者盲検フェーズ１試験を１４４の１８〜５９歳健常若年成人および６５〜８５歳の高齢成人で、中国江蘇省台州で実施した。適格な参加者を、筋肉内注射として投与する１０μgまたは３０μg用量いずれかのＢＮＴ１６２ｂ１またはプラセボの２１日離す２回投与を受けるように無作為化した。試験参加者、研究者らおよび検査スタッフは、投与される処置に対して盲検的であった。一次安全性エンドポイントは、ワクチン接種後１４日以内に生じる注射部位の局所反応または全身有害反応およびブーストワクチン接種後２８日までに生じる有害事象であった。ワクチンより誘導されたウイルス中和抗体および抗原特異的結合抗体および細胞性免疫応答の免疫原性エンドポイントを、予定した時点で測定した。
結果
試験設計および解析セット
１８〜５５歳または６５〜８５歳の計２９６成人を、中国江蘇省のTaizhou vaccine clinical research centerでスクリーニングした。１４４の適格な参加者が治験参加に同意し、１０μgまたは３０μgでの２１日離すプライムおよびブースト投与のＢＮＴ１６２ｂ１または２回プラセボを受けるために１：１：１に無作為化した。プライミング用量後、６５〜８５歳の２参加者がブースト投与投与を中止した(１名１０μg、１名３０μg)。参加者の人口統計特徴を表２４に示す。処置群で若年参加者の平均年齢は３７.９〜４２.０歳の範囲および年配参加者の平均年齢は６８.５〜７０.７歳の範囲であり、処置群にわたり性別分布は等しかった。参加者の病歴または現存の基礎障害は、年配参加者でベースライン時示された高血圧以外、処置群にわたり類似した。
観察された安全性および忍容性データ
投与完了後１４日以内に、１０μg ＢＮＴ１６２ｂ１用量群の若年参加者の２１(８８％)および３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１用量群の若年参加者の２４(１００％)が少なくとも１つの応答型有害反応を報告し、対して、若年参加者プラセボ群で１７％のであった(表２５Ａ〜２５Ｂ)。反応原性は用量レベル依存的であり、大部分は３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１用量群で明白であった。報告された最も一般的な応答型有害反応は、注射部位疼痛、発熱、頭痛、疲労、倦怠感、関節痛、筋肉痛悪寒であった。有害事象は一過性であり、単純な標準処置で管理され、または自然に解消した。報告された有害反応の大部分の重症度は軽度または中程度であり、各ＢＮＴ１６２ｂ１投与後最初の７日以内に解消した。重症(グレード３)と段階分けされた注射部位反応はなかった。ワクチン接種に関連するグレード３全身有害反応の全ては発熱であり、大部分は若年参加者で観察された。年配年齢群の１男性参加者が、３０μgのプライムＢＮＴ１６２ｂ１用量投与後注射部位の疼痛および掻痒を伴う突発性グレード３発熱を経験し、選択的にブーストワクチン接種投与を中止した。
治験中、事前に指定された治験中止ルールは満たさなかった。６７歳参加者の１重度有害事象のみ報告され(自動車事故による上腕骨骨折であり、該参加者はブースト投与を受けるのを避けた)、これはワクチンまたは治験過程に関連するとは考えられなかった。ワクチン接種後注射部位有害反応の全体的頻度はＢＮＴ１６２ｂ１プライムおよびブースト投与後で、同等であった。発熱、頭痛、疲労および倦怠感などのある全身性有害反応は、若年成人でプライム投与後よりＢＮＴ１６２ｂ１ブースト投与のほうが一般的であった。若年参加者とは対照的に、高齢参加者は、ＢＮＴ１６２ｂ１ブースト投与後反応原性増加を示さなかった。
ＢＮＴ１６２ｂ１投与前後種々の処置群にわたる参加者で血圧および呼吸数の変化は報告されなかった。ワクチン接種２４時間後の体温および心拍数の一過性増加が若年および年配参加者両者、特に３０μg用量群で示された。ベースラインからの最も一般的な検査値異常は、一過性リンパ球および血小板数低減およびＣ反応性タンパク質増加であった。全臨床検査値異常は、限定された過程を経て、臨床症状なしに短期間で解消した。これらのデータは、他の集団で報告されたある所見に一致する(例えば、本明細書の他の箇所に記載)。
ワクチン誘導抗体応答
全参加者は、ベースライン(１日目、ワクチン接種前)時血清学的陰性であり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和抗体ならびにＲＢＤおよびＳ１タンパク質結合抗体の解析により８日目、２２日目、２９日目および４３日目に抗体陽転についてモニターした。ワクチン接種参加者のＢＮＴ１６２ｂ１誘導抗体応答を、２８ ＣＯＶＩＤ−１９患者からＰＣＲ確認診断少なくとも１４日後得られたヒトＣＯＶＩＤ−１９回復期血清のパネルと比較した。最高中和力価は４３日目に観察され(すなわち、ＢＮＴ１６２ｂ１ブースト投与２１日後)、このアジア人参加者群における２９日目後の継続的上方傾向が示され、他の集団で報告されたものと比較してこのアジア人集団の年配参加者で４３日目にさらなる増加が考えられ、この対象集団でピーク力価に速く達し、その後沈降を示す。４３日目、１０μgおよび３０μg ＢＮＴ１６２ｂ１用量レベル両方は、顕著なウイルス中和抗体応答をＢＮＴ１６２ｂ１プライム投与後誘導し、これは２回目のＢＮＴ１６２ｂ１投与後ブーストされ、１０μgおよび３０μg用量群それぞれ、若年参加者で幾何平均力価(ＧＭＴ)２３２.９(９５％ＣＩ １５１.３〜３５８.５)および２５４.０(１８４.６〜３４９.４)ならびに年配参加者で８０.０(４９.２〜１３０.２)および１６０.０(９６.７〜２６４.６)であった(図１２０)。１０μgおよび３０μg用量群の若年参加者のウイルス中和応答は、回復期血清のパネルのＧＭＴの１.９倍および２.１倍であった(ＧＭＴ、１１９.９；９５％ＣＩ、７０.４〜２０３.９)。年配参加者で、対応する比率は、それぞれ１０μgおよび３０μg用量群で０.７倍および１.３倍であった。全若年レシピエントは４３日目に抗体陽転陽性を示し、抗体陽転率は４３日目の年配レシピエントでそれぞれ１０μg用量で９１％および３０μg用量で９６％であった。３０μg用量を受けた参加者は、１０μg用量を受けたものより幾分高いウイルス中和抗体応答を有すると考えられた。しかしながら、６５〜８５歳年配参加者は、一般に１８〜５５歳若年参加者より遅いウイルス中和応答および低いピーク応答を示した。
同様に、両用量のＢＮＴ１６２ｂ１は、プライム−ブーストレジメン後参加者で高レベルのＳ１およびＲＢＤ結合ＩｇＧを誘導した。ワクチンレシピエントで全時点にわたるワクチン接種後Ｓ１およびＲＢＤ結合ＩｇＧレベルは、年齢および用量群に関係なく中和力価と高度に相関し、それぞれ相関計数０.８５および０.７９(ｐ＜０.０００１)であった。
ワクチン誘導Ｔ細胞応答
ＢＮＴ１６２ｂ１での免疫化個体のワクチン誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)で直接エクスビボＩＦＮγ酵素結合免疫スポット(ELISpot)アッセイを使用して、プライミングワクチン接種前(１日目)、２９日目(ブーストワクチン接種７日後)および４３日目(ブーストワクチン接種２１日後)特徴づけした。２９日目、Ｓｐ１ペプチドプール(ＲＢＤを包含)に対する特異的ＩＦＮ−γ ELISpot応答は、プラセボ群よりＢＮＴ１６２ｂ１を受けた参加者で有意に高かった(図１２１)。１８〜５５歳若年参加者は、１０μgワクチン接種を受けたもので、１０５ ＰＢＭＣあたり平均スポット形成細胞２２７.５(９５％ＣＩ、１４６.５〜３０８.５)および３０μgワクチン接種を受けたもので２２３.５(１８１.２〜２６５.９)であった。年配参加者６５〜８５歳で、２用量群にわたり、ワクチン接種後平均１５６.５(８４.１〜２２９.０)および１７１.９(１１３.４〜２３０.３)のわずかに低いスポット形成細胞が観察された。４３日目、プライム−ブーストＢＮＴ１６２ｂ１レジメンを受けた若年参加者は、２９日目でみられたのと比較して、Ｓ１特異的ＩＦＮ−γ ELISpot応答が軽度低減する傾向にあった；年配参加者でこの時点で血液サンプルを集めておらず、このデータは利用可能ではない。ＢＮＴ１６２ｂ１とプラセボ群で、Ｓｐ２ペプチドプール(ＢＮＴ１６２ｂ１によりコードされるＲＢＤのペプチドを含まない)に対するＩＦＮ−γ ELISpot応答の差は観察されず、両用量群でＣＤ８＋Ｔ細胞に対するわずかな非特異的応答が観察された。
考察
この実施例に記載する治験は、複数領域での他のＢＮＴ１６２ワクチン候補と並行して中国で実施された１４。治験の一つの焦点は、アジア人集団におけるｍＲＮＡワクチンの安全性および免疫原性のデータの確立であった。この実施例は、中国人集団およびさらに若年および年配中国人集団おけるこのようなｍＲＮＡワクチンの安全性および免疫原性プロファイル両方の初めての評価を報告する。
これは、健常成人中国人集団に投与したＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤをコードする修飾ＲＮＡベースのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１の臨床試験の予備的報告である。ＢＮＴ１６２ｂ１は、ＢＮＴ１６２ｂ２(同じヌクレオシド修飾プラットフォーム由来のＳタンパク質をコードするｍｏｄＲＮＡ)と同様、強力なワクチン誘導抗体応答および強いＴ細胞応答を誘導する。ＢＮＴ１６２ｂ１およびＢＮＴ１６２ｂ２候補両方の臨床的安全性および免疫原性は、ドイツ(若年成人；ＢＮＴ１６２−０１)および米国(若年成人および６５〜８５歳高齢成人；ＢＮＴ１６２−０２)集団両方で健常成人に対して評価されている。若年成人群で、７日以内の重症局所反応原性ＡＥは、ドイツ試験(ＢＮＴ１６２−０１)試験と比較して、米国試験(ＢＮＴ１６２−０２)および現在の試験(ＢＮＴ１６２−０３)で少なかった。７日以内の全身反応原性ＡＥは、治験にわたり、広く類似した。投与２後２８日以内の全身性ＡＥ(関連性と無関係)は、ＢＮＴ１６２−０１治験と比較して、ＢＮＴ１６２−０２およびＢＮＴ１６２−０３治験でわずかに高かった。
高齢成人群で、７日以内の重症局所反応原性ＡＥは治験にわたり類似した。７日以内の全身反応原性ＡＥは、ＢＮＴ１６２−０１およびＢＮＴ１６２−０２治験と比較して、ＢＮＴ１６２−０３治験でわずかに低かった。投与２後２８日以内の全身性ＡＥ(関連性と無関係)は、ＢＮＴ１６２−０２治験と比較してＢＮＴ１６２−０３治験でわずかに高かったが、重症ＡＥは低かった。まとめると、ＢＮＴ１６２−０１、ＢＮＴ１６２−０２およびＢＮＴ１６２−０３治験のＢＮＴ１６２ｂ１安全性プロファイルの比較解析は、３０μgで一般に同等なプロファイルおよび全身反応原性を示した／年配集団は、非アジア人に対してアジア人集団で安全性プロファイルが幾分良好であった。故に、ここで報告された所見は、ドイツおよび米国で実施した臨床治験からのＢＮＴ１６２ｂ１および他のＲＮＡベースのワクチン候補での報告をさらに補い、かつ広げる７,８,１５。
この治験の理論的根拠は、ドイツおよび中国人集団間の内因性および外因性差異が、この新規タイプワクチンに対する忍容性または免疫応答に何らかの影響があるかの評価であった。治験で観察された健常中国人成人におけるワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１の安全性プロファイルは、局所および全身反応による重症反応原性の点で、他の集団で報告されたより良好であると考えられた７,１５。体形、内因性抗体レパートリーが影響し得る。ＢＮＴ１６２ｂ１の反応原性は用量依存的であった。有害事象の頻度増加が、特に若年参加者で、プライムワクチン接種後と比較して、ブーストワクチン接種投与後観察された。年配成人は若年参加者より有害反応発生率が低かった。グレード３発熱がそれぞれ３０μg用量を受けた若年参加者の１７％および年配参加者の８％で報告された。ほぼ全ての重症発熱反応は一過性であり、自然治癒した。１参加者は、注射部位疼痛、掻痒症および掻痒が付随する、温度記録があるまたはない突発性発熱または寒冷不耐性を有して、プライム投与投与の反応によりブーストワクチン接種を中断し、２週間を超えて継続し、ヒドロコルチゾンブチレート軟膏塗布後解消した。薬力学的マーカーとしての一過性リンパ球数低減は、大部分は３０μg用量レベルのＢＮＴ１６２ｂ１の若年レシピエントで観察され、これは、自然免疫刺激によるリンパ球のリンパ系組織への再分布によるものであった１６。
ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１の両用量は、特異的液性および細胞性免疫応答誘発に有効であり、若年および年配成人両方で２回目ワクチン接種の抗体力価の明確なブースト効果が判明した。プライム−ブーストレジメンに従い３０μg用量で投与されたＢＮＴ１６２ｂ１は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対するウイルス中和抗体の観点で最適レベルの免疫応答を誘発し、これは、年齢に関係なく、ヒト回復期血清サンプルのパネルより高かった。中国人参加者の液性応答は、特有の時間的パターンを示し、両年齢群で４３日目にピークであった。参加者数は少なく、測定の起こり得る方法的差異が観察された結果に影響している可能性はあるが、ここで報告された所見は、ワクチンに対する応答の集団的差異があり得ることを示唆する。
ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１がＲＢＤの三量体バージョンをコードする修飾ＲＮＡワクチンであるため、本実施例で報告された治験のワクチンレシピエントは、Ｓ１ペプチドプール(ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスからの１６６の１５量体Ｓ１ペプチドを含む)に特異的な顕著なＴ細胞応答を示すが、Ｓ２ペプチドプールには示さなかった。結果は、ＢＮＴ１６２ｂ１により誘発される細胞性応答が抗原特異的であったことを示した。それに反して、ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ２スペクトラムは他のＲＮＡベースのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ワクチンと異なし、誘導されるＴ細胞応答はＳ１およびＳ２ペプチドプール両者を認識し得る１５。それにも関わらず、データは、３０μg用量のＢＮＴ１６２ｂ１が、健常中国人成人で強い液性および細胞介在応答を誘発できる高度に免疫原性であったことを示した。
当業者は、小サンプルサイズおよび１８歳以上の年齢制限が、本実施例で観察された所見の決定的な厳密さを制限し得ることを認める。それにも関わらず、ここに記載する予防的ＲＮＡワクチンがワクチン接種の新規アプローチを代表することを考えると、特定の集団(例えば、小児および青年期集団)を含む安全性評価は特に価値がある。また、ここに記載するワクチン候補により誘導される血清中和応答とヒト回復期血清パネルとの比較は、ワクチンの有意義な評価を提供するが、ＣＯＶＩＤ−１９に対して保護するのに必要な血清学免疫のレベルはまた厳密に確立されていない１７。当業者はまた異なる治験で使用したヒト回復期血清パネルが研究室間で標準化されておらず、故に患者特徴および採取時点の分布が異り得て、結果の直接比較(例えば、種々のワクチン候補の特徴づけおよび／または種々の回復期血清に対するワクチン候補の特徴づけ)は、情報価値のあるものではないかもしれない。
まとめると、本実施例に記載の結果は、ＲＮＡベースのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１の用量依存的安全性および良好な免疫原性プロファイルを確認し、ドイツおよび米国治験のＢＮＴ１６２ｂ１の先の所見をさらに拡大する７,８,１５。反応原性増加ならびにより好都合なワクチン誘発ウイルス中和応答が若年および年配成人両方で３０μgのＢＮＴ１６２ｂ１に関連して見られた。対照的に、同じプラットフォームから製造された他のワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ２ｄは、より好都合な安全性プロファイルを示した８。ＢＮＴ１６２ｂ１は、比較的小さいＲＢＤ免疫原をコードし、完全長スパイク免疫原をコードするＢＮＴ１６２ｂ２と比較して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の可能性のある抗原性ドリフトに対してあまり頑強ではない狭いスペクトラムの中和抗体を誘導する１８。候補ＢＮＴ１６２ｂ２が、６５歳を超える参加者での有効性減少なく、参加者のＣＯＶＩＤ−１９の予防に９５％を超えて有効であったことは注目に値する１９。
方法
治験設計および参加者
この無作為化、プラセボ対照、評価者盲検フェーズＩ治験を、中国江蘇省台州で健常１８〜５９歳若年成人および６５〜８５歳高齢成人で実施した。参加者は、スクリーニング来院時の病歴、身体検査および臨床検査により確立された、全体的健康状態良好であった。男性および女性両方を含み、治験中避妊薬使用に同意した。妊娠または授乳中の参加者は除外した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対してＩｇＭ／ＩｇＧ抗体の市販迅速診断キット(中国、珠海、麗珠試剤有限公司製)または咽頭スワブ核酸診断試験の検査(中国、上海、復星医薬製)でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２試験陽性であった参加者を除外した。胸部ＣＴ走査に存在するＣＯＶＩＤ−１９の特徴的画像はさらなる除外基準であった。コントロール不良糖尿病および高血圧などの重度心血管疾患または慢性状態、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を有する参加者は除外した。インフォームドコンセント書面を、治験開始前、各参加者から得た。
治験を、ヘルシンキ宣言および臨床治験の実施の基準に従い実施した。治験プロトコールは、中国国家薬品監督管理局および江蘇省疾病予防管理センターの施設内治験審査委員会により審査および承認された。
無作為化および盲検
適格な１８〜５５歳参加者を若年年齢群に登録し、６５歳以上８５歳以下の年配参加者を年配年齢群に登録した。参加者を、低用量ＢＮＴ１２６ｂ１または高用量ＢＮＴ１２６ｂ１またはプラセボを受けるように１：１：１比で無作為化した。参加者を、ウェブベースの対話型応答テクノロジー(ＩＲＴ)システムを使用して、性別により層化した。独立した統計学者によりＳＡＳソフトウェア(version 9.4)を使用して封鎖無作為化リストが作成された。
認定非盲検薬剤師が、ＩＲＴシステムによる参加者の割り当てによりワクチンまたはプラセボを調製し、看護師が治験薬を参加者に投与した。非盲検スタッフは、治験にこれ以上参加せず、割り当て情報の他者への開示を禁止された。他の全ての治験担当医、参加者、検査スタッフおよびスポンサーは、治験の間盲検式のままであった。
ワクチンおよびワクチン接種
三量体化ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク糖タンパク質ＲＢＤ抗原をコードする製造管理および品質管理の基準(ＧＭＰ)グレードｍＲＮＡ薬物物質に従い投与されるＢＮＴ１６２ｂ１は、ＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を得るよう、脂質と製剤された。ワクチンは、例えば、ここに記載するとおり、筋肉内注射用緩衝化液体溶液として輸送および供給され、−８０℃で保管された。
低用量および高用量ＢＮＴ１２６ｂ１はそれぞれ１０μgおよび３０μg活性成分を含み、プラセボは市販食塩水溶液であった。各参加者は、１０μg／０.５mlまたは３０μg／０.５mlのワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ１またはプラセボ０.５mlのプライム−ブースト投与レジメンを、２１日離して、三角筋に受けた。
安全性および免疫原性のモニタリング
各参加者は、プライムワクチン接種前および２４時間後の血液サンプルを得るためおよび再び臨床検査のためにブーストワクチン接種前および８日後、ワクチン投与後少なくとも６時間治験場所に留まることを要求された。体温、血圧、心拍および呼吸数を含むバイタルサインを、ベースラインならびにワクチン接種１時間、３時間および６時間後測定した。ワクチン接種後あらゆる有害事象を、ブースト投与の投与２８日後まで、日記を使用して、参加者により文書化された。若年群参加者がまず登録され、ワクチン接種を受けた。年配年齢群の登録は、プライムワクチン接種の最初の１４日後若年年齢群の予備的安全性データ評価後開始した。有害事象の重症度および検査値異常変化を、中国国家食品医薬品局２０および米国食品医薬品局(ＦＤＡ)２１により発行されたスケールの両者により等級付けする。
血清およびＰＢＭＣをワクチン接種前、ブースト投与後８日目および／または２２日目に集め、ＲＢＤおよびスパイク糖タンパク質１に対する特異的ＩｇＧ抗体応答、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する中和抗体およびＴ細胞応答の測定を促進した。
全ての報告された有害事象は治験担当医により審査された。有害事象は、ワクチン候補と関連する可能性小、可能性大または確実として分類した。
ヒト回復期血清
中和力価は、細胞変性効果から少なくとも５０％の細胞を保護する、最高サンプル希釈の逆数である。２４回復期ヒト血清サンプルのパネルは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染から回復した１８〜７０歳(平均年齢４５.８歳)のドナーから得た；サンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応確認診断少なくとも１４日後および症状後得た。これら患者の疾患重症度は、非症候性(ｎ＝３、１３％)、軽度(ｎ＝８、３３％)、中程度(ｎ＝１０、４２％)または重症(ｎ＝３、１３％)で変わった。
ドナーのサブグループの中和幾何平均力価(ＧＭＴ)は次のとおりであった。非症候性感染の３ドナーについて４０；軽度感染の８ドナーについて９１.９；中程度感染について１６０；および重症感染の３ドナーについて２２６.３。パネルの各血清サンプルは異なるドナーからであった。故に、血清サンプルの大部分は、中程度Ｃｏｖｉｄ−１９の人から得た。回復期血清サンプルを、比較値としてこの治験の参加者から得られた血清サンプルと並んで試験した。
ＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＢＤおよびＳ１に対する結合抗体応答を評価した。
マイクロ中和アッセイ
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス株ベータＣｏＶ／ＪＳ０２／ヒト／２０２０(ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１１９５２)でバイオセイフティーレベル３研究室(ＢＳＬ−３)で観察された細胞障害に基づくマイクロ中和アッセイによる血清のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２特異的中和抗体を検出した。
ELISpot
ペプチドに対する特異的Ｔ細胞応答を、Mabtech(Nacka Strand, Stockholm, Sweden)により製造された市販エキソビボインターフェロン−γ(ＩＮＦ−γ)酵素結合Immunospot(ELISpot)キットを使用して、評価した２２。ＰＢＭＣを、新鮮な血液サンプルから単離し、測定前、異なる重複ペプチドプールで刺激した。ＲＢＤを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクのＮ末端半分をカバーするＳ１ペプチドプールおよびＲＢＤを含まないＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクのＣ末端をカバーするＳ２ペプチドプールをこの治験で使用した２３。ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびインフルエンザウイルスからの３２ ＭＨＣクラスＩ制限ウイルスペプチドからなるペプチドプール(ＣＥＦペプチドプール)を、Ｔ細胞反応性全般(ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２特異的ではない２４)を評価するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激に使用した。
結果
この治験の一次および二次目標は、健常中国人成人における候補ワクチンＢＮＴ１６２ｂ１の安全性および免疫原性評価であった。安全性評価のプライマリーエンドポイントは、ワクチン接種後１４日以内の注射部位の応答型局所反応または全身有害反応およびブースト投与を受けて２８日後までの免疫化後の有害事象の発生率であった。ワクチン接種２４時間または７日後までのベースラインからの何らかの臨床検査値異常および生じた何らかの重度有害事象(ＳＡＥ)も記録した。
免疫原性の二次エンドポイントは、各ワクチン接種後８日、２２日に測定した幾何平均力価(ＧＭＴ)、抗体陽転率およびウイルス中和抗体の増加倍率および１またはＲＢＤに結合するＥＬＩＳＡ ＩｇＧ抗体であった。抗体陽転は、ベースラインまたはベースライン力価が検出限界未満ならば下限値の抗体力価の４倍以上の増加と定義される。ＥＬＩＳＡのための血清希釈は１：１００で開始し、一方マイクロ中和アッセイの希釈は１：１０で開始した。
ブースト投与後８日目および２２日目の１×１０５／ウェル濃度でのＰＢＭＣ中のインターフェロンガンマ(ＩＦＮ−γ)分泌をする陽性細胞数の観点での細胞性免疫応答を、探索的エンドポイントとして探索した。
統計解析
この治験の総サンプルサイズは１４４参加者であり、各年齢群の２４参加者が各処置群に含まれた。ワクチン接種後８％の有害反応発生の仮定に基づき、各用量群の２４参加者における少なくとも１つの事象の観察の確率は８６.５％であった。
少なくとも１回の治験ワクチンを受けた全無作為化参加者は安全性解析に含めた。安全性エンドポイントは、観察期間中の有害反応または事象の頻度(％)と９５％信頼区間(ＣＩ)として記載した。カイ二乗またはフィッシャー正確を使用して、群にわたる有害反応または事象を有する参加者の割合を比較した。少なくとも１回のワクチン接種を受け、ワクチン接種前または後の血清測定結果がある全参加を、免疫原性解析に含めた。免疫学的エンドポイントは、特定の時点で記述的に要約され、対数変換抗体力価についてＡＮＯＶＡまたは非正規分布データについてウィルコクソンの順位和検定を使用して、群にわたり比較した。各用量群の参加者の中和抗体応答を、ＰＣＲ確認されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染を有した患者と比較した。検出下限より低い何らかの血清値は、該値の半分と設定し(ＥＬＩＳＡについて１：５０およびマイクロ中和アッセイについて１：５)、一方最高希釈力価を超える値は、計算のため最高希釈の値を割り当てた。ＲＢＤまたはＳ１特異的ＥＬＩＳＡ抗体および中和抗体のピアソン相関解析を実施して、種々のアッセイにおける応答間の相関を評価した。
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実施例３３：ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン誘発血清によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２系統Ｂ.１.１.７シュードウイルスの中和
２０２０年９月、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２バリアントＢ.１.１.７が英国で検出され、その後有病率が増加し、感染性の増強が示され、他の国および大陸に拡散した。Ｂ１.１.７は、スパイクタンパク質に一連の変異を有する：ΔＨ６９／Ｖ７０、ΔＹ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。これらの一つ、Ｎ５０１Ｙは、受容体結合部位に位置するため、特に懸念された；この変異を有するスパイクは、その細胞受容体、ＡＣＥ−２により強固に結合する；そしてこの変異を有するウイルスは、マウスを含む宿主範囲が増加した。各々循環株でみられる異なる変異を有するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓを担持する１９シュードウイルスは、ＢＮＴ１６２ｂ２免疫血清により、非変異体シュードウイルスと同程度効率的に中和された。次の治験は、ＵＫバリアントスパイク変異の完全セットを有するウイルスも、ＢＮＴ１６２ｂ２免疫血清により効率的に中和されることを示す。
武漢対照株または系統Ｂ.１.１.７株スパイクタンパク質を担持するＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュードウイルスを産生した。３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２でブースター免疫化２１日後、８若年(１８〜５５歳)および８高齢成人(５６〜８５歳)から採った先に報告された治験(Sahin U. et al., medRxiv 2020.12.09.20245175; doi: https://doi.org/10.1101/2020.12.09.20245175)の１６参加者の血清を、５０％シュードウイルス中和アッセイ(ｐＶＮＴ５０；図１２２)によりＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２武漢および系統Ｂ.１.１.７スパイク−シュードタイプ化ＶＳＶの中和について試験した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２系統Ｂ.１.１.７スパイク−シュードタイプ化ＶＳＶに対する血清の５０％中和ＧＭＴ対武漢対照スパイク−シュードタイプ化ＶＳＶに対する比は０.７９であり、２つのシュードウイルスに対する中和活性に生物学的有意差がないことが示された。
ＢＮＴ１６２ｂ２免疫血清によるＢ.１.１.７スパイクを担持するシュードウイルスの保存された中和は、ＵＫバリアントウイルスがＢＮＴ１６２ｂ２介在保護を回避しないことを示唆する。さらに、シュードタイプ中和およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和アッセイが良好に一致するため、非複製シュードウイルス系の使用は、研究の潜在的な制限になるとは予想されない。
材料および方法
ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓバリアントシュードウイルス産生
ＶＳＶ−糖タンパク質(ＶＳＶ−Ｇ)ではなく緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)およびルシフェラーゼをコードする組み換え複製欠損水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)ベクターを、公開されたシュードタイピングプロトコール(図１２３)(PMID:21998709)に従い、武漢対照株(NCBI Ref:43740568)または懸念される変異株(ＶＯＣ)−２０２０１２／０１(別名ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２系統Ｂ.１.１.７)由来のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク(Ｓ)でシュードタイプ化した。簡潔には、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓを発現するようトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７単層を、ＶＳＶ−Ｇ補完ＶＳＶΔＧベクターで接種した。１時間、３７℃でインキュベーション後、接種物を除去した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後抗ＶＳＶ−Ｇ抗体(クローン８Ｇ５Ｆ１１、Kerafast Inc.)添加培地を残存ＶＳＶ−Ｇ補完入力ウイルスを中和するために加えた。ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュードタイプ含有中程度を接種２０時間後採取し、０.２μmフィルター処理し、−８０℃で保管した。中和試験使用前、シュードウイルスバッチを、Ｖｅｒｏ ７６細胞で力価測定し、パーセント感染細胞をフローサイトメトリーで決定した(図１２４)。個別の力価を、mLあたりの形質導入単位(ＴＵ)で計算した。武漢対照株または系統Ｂ.１.１.７株スパイクタンパク質を担持するＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュードウイルスの産生は、類似する力価をもたらした(表２６)。
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血清検体および中和アッセイ
免疫化および血清採取レジメンを図１２５に模式的に説明する。中和力価測定のために、各血清を培養培地で２倍連続希釈し、最初の希釈は１：２０(希釈範囲１：２０〜１：２５６０)であった。ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓ粒子を、アッセイで１００ＴＵを得るために培養培地で希釈した。血清希釈を、３０分間、室温でシュードウイルスと１：１混合し、その後、９６ウェルプレートでＶｅｒｏ ７６細胞単層に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。上清を除去し、細胞をルシフェラーゼ試薬(Promega)で溶解した。発光を記録し、中和力価を各連続血清希釈のパーセント中和の４パラメータロジスティック(４ＰＬ)フィットを作成することにより、GraphPad Prism version 9で計算した。５０％シュードウイルス中和力価(ｐＶＮＴ５０)は、発光の５０％減少をもたらす希釈の補間された逆数として報告された。中和力価の表を提供する(表２７)。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２系統Ｂ.１.１.７および武漢対照株スパイク−シュードタイプ化ＶＳＶに対するｐＶＮＴ５０の各血清の比を図１２６にプロットする。
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実施例３４：妊婦におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＮＡワクチン投与の例示的レジメン
本実施例は、妊婦(例えば、１８歳以上の健常妊婦)におけるここに記載するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＲＮＡワクチン(特に、この実施例では、ＢＮＴ１６２ｂ２)の投与の例示的レジメンを記載する。
妊婦は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染およびＣＯＶＩＤ−１９を獲得するリスクにある。妊娠は、呼吸器感染症の感受性増加とその後の呼吸不全への急速な進行に至り得る妊娠中の生理学的変化のため、重症ＣＯＶＩＤ−１９のリスクを増加させ得る。さらに、ＣＯＶＩＤ−１９を有する妊婦の早産、帝王切開出産、胎児仮死および新生児集中治療を必要とする乳児の率が高いことが報告されている。
本実施例は、ＢＮＴ１６２ｂ２を妊婦および／またはこのような妊婦から生まれた乳児に投与に用い得るあるプロトコールを記載し、また実施し得るある評価および／または達成し得る結果も記載する。例えば、この実施例は、妊婦および乳児におけるＢＮＴ１６２ｂ２の安全性を評価する治験を記載する；妊婦におけるＢＮＴ１６２ｂ２の免疫原性、乳児への抗体の移動および乳児における抗体移動の動態も評価する。
数ある中で、本実施例は、妊娠２４〜３４週目にワクチン接種した１８歳以上の母親参加者に投与したときの、予防的ＢＮＴ１６２ｂ２の安全性および忍容性を評価する治験を記載する。何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、本実施例は、この期間内に開始したワクチン接種が特定の利点を提供し得ることを提案する。妊娠中のどこかの時点でのワクチン接種(例えば、“Israel Recommends COVID Vaccination in All Stages of Pregnancy, Updating Guidelines” Haaretz February 1, 2021参照)から妊娠中のワクチン接種自制を提案するその他(例えば、WHO Strategic Advisory Group recommendation参照)の範囲にわたる提案を認識して、本実施例は、妊婦が妊娠約２４〜約３４週またはある実施態様において約２７〜約３４週でワクチンの最初の投与を受け、２回目の投与を約２１日後、理想的には出産前に受ける、特定のレジメンを記載する。
何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、本実施例は、このレジメンに従うワクチン接種が、例えば、妊娠初期の免疫化母性免疫応答への暴露に起因し得る、例えば、胎児のリスクを低減することを提案する。さらに、なお何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、本実施例は、提供されるワクチン接種スケジュールが、少なくとも２回が出産に投与されたとき、特定の利益を提供し得ることを提案する。数ある中で、本実施例は、提供されるレジメンが特に有益なリスク／ベネフィットバランスを提供し得ることを提案する。数ある中で、本発明は、妊婦の免疫化により、特に本実施例に記載するレジメンによる免疫化により提供され得る利益が、ある実施態様において、出産後にも担持され得る免疫を乳児に付与し得えて、これは出産後少なくとも数日、数週間、数か月または数年(例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上または１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年または５年)乳児への免疫化の必要性を低減することを教示する。故に、ある実施態様において、ここに記載するとおり、例えば、ここに記載する特定のレジメンにより、妊娠中ワクチン接種した母親から生まれた乳児がさらにワクチン接種を必要としない可能性があるまたは生後一定期間(例えば、ここに記載するとおり)、ワクチン接種を減らす(例えば、低用量および／または少ない投与回数−例えば、ブースター−および／または一定期間にわたる全体的暴露減少)必要がある可能性がある。
例えば、各ワクチン群で少なくとも１回の治験介入を受けた母親参加者で、(ｉ)各投与後７日までの局所反応；(ii)各投与後７日までの全身事象；(iii)投与１〜投与２の１か月後までのＡＥ；(iv)投与１〜出産１か月後までのＳＡＥを報告する母親参加者のパーセンテージが推定される。これとは別にまたはこれに加えて、ある重要なプロトコール基準(評価可能母親参加者)を満たし、過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の血清学またはウイルス学的証拠がない(２回目の投与を受けた後最大１か月)母親参加者で、(ｖ)投与２の１か月後、非妊婦と比較した妊婦のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２中和力価の幾何平均の比により推定されるＧＭＲが評価され得る。
なおさらにこれとは別にまたはこれに加えて、重要なプロトコール基準(評価可能参加者)を満たすおよび／または過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の血清学またはウイルス学的証拠(投与２を受けた７日後より前)があるまたはない(例えば、あるまたはない者別々にまたは無関係に)母親参加者は、(vi)１００×(１−ＩＲＲ)[プラセボに対する活性ワクチン比]が評価され得る。
なおさらにそれとは別にまたはそれに加えて、次の１以上が評価され得る。
− 各ワクチン群で重要なプロトコール基準(評価可能母親参加者)を満たす母親参加者で、(ａ)ベースライン(投与１前)、投与２の２週間後、投与２の１か月後および出産６か月後のＧＭＣ／ＧＭＴ、(ｂ)ベースラインから投与２の２週間後、投与２の１か月後および出産６か月後のＧＭＦＲ；
− 各ワクチン群から少なくとも１回の治験介入を受けた母親参加者から生まれた乳児で、(ａ)特異的出生転帰；(ｂ)出生〜１か月齢までのＡＥ；(ｃ)６か月齢までのＳＡＥおよびＡＥＳＩ(主要な先天性異常、精神発達遅延)を有する乳児のパーセンテージ；
− 各ワクチン群からの評価可能母親参加者から生まれた乳児で、(ａ)出生時および出産６か月後のＧＭＣおよびＧＭＦＲ；
− ＢＮＴ１６２ｂ２(初期無作為化時および出産１か月後)を受けた母親参加者で、(ａ)フォローアップの１０００人年あたり発生率；
− 初期無作為化時ＢＮＴ１６２ｂ２を受け、先のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がない母親参加者で、(ａ)フォローアップの１０００人年の発生率；
− 各ワクチン群からの評価可能母親参加者の各サブセットで、(ａ)確認されたＣＯＶＩＤ−１９；(ｂ)確認された重症ＣＯＶＩＤ−１９；(ｃ)ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染したが、ＣＯＶＩＤ−１９は確認されない；(ｄ)ベースライン時、投与２の１か月後および出産６か月後のＧＭＣ／ＧＭＴおよびＧＭＦＲ；
− 評価可能母親参加者で、(ａ)ベースライン時および投与２前のＧＭＣ／ＧＭＴ；(ｂ)ベースライン〜投与２前のＧＭＦＲ；
− 各ワクチン群からの母親参加者から生まれた乳児で、母乳育児状態に基づき：(ａ)出生時および出産６か月後のＧＭＣおよびＧＭＦＲ；
− 各ワクチン群から少なくとも１回の治験介入を受けた母親参加者から生まれた乳児において、母乳育児状態に基づき、(ａ)出生〜１か月齢までのＡＥ；(ｂ)６か月齢までのＳＡＥおよびＡＥＳＩ(主要な先天性異常、精神発達遅延)を有する乳児のパーセンテージ；
− 各ワクチン群からの母親参加者から生まれた乳児において、(ａ)確認されたＣＯＶＩＤ−１９を有する乳児参加者の発生率；
− 各ワクチン群からの母親参加者から馬得た乳児において、(ａ)ＭＩＳ−Ｃの発生率。
ある実施態様において、最初の投与は、妊娠２７〜３４週目の妊婦への投与と、続く約２１日後の２回目の投与である。ある実施態様において、最初の投与は、妊娠２４〜３４週の妊婦への投与と、続く約２１日後の２回目の投与である。ある実施態様において、参加者母親は、最大約６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月またはそれ以上の期間評価される(例えば、治験開始後、最初の投与後、２回目の投与後および／または乳児出生後)。
ある実施態様において、１以上の(例えば、２)ワクチン用量が投与された母親(例えば、２回投与が妊娠中になされた)から生まれた乳児を、最大約１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月またはそれ以上の期間評価する(例えば、治験開始後、最初の投与後、２回目の投与後および／または乳児出生後)。
ある実施態様において、用量は、ここに記載する３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２である。
ある実施態様において、ワクチン性能の評価を、あらゆる年齢または特定年齢範囲(例えば、１８歳以上)の妊婦集団で行う。ある実施態様において、ワクチン性能の評価は、単胎妊娠の女性集団で行う。
ある実施態様において、妊娠期間は、最終月経期間、超音波検査、身体検査および／またはこれらの組み合わせの１以上により評価する。ある実施態様において、妊娠期間は、超音波により決定される。ある実施態様において、妊娠期間は２以上評価を考慮して、決定される(例えば、妊娠の異なる時間、例えば、異なる三半期に実施される２以上の超音波)。
ある実施態様において、ワクチン性能の評価を、妊娠少なくとも１８週目に実施された超音波検査で顕著な胎児異常が観察されない(例えば、認可された治験担当医による評価)；ＨＩＶ、梅毒および／またはＨＢＶ検査またはこれらの組み合わせの陰性確認；妊娠前ＢＭＩ≦４０kg／ｍ２の１以上により特徴づけされる集団で行う。
ある実施態様において、ワクチン性能の評価を、認可された治験担当医の合理的な判断により対象がワクチンに不適であると合理的に判断される、ワクチン接種のリスクまたはその他を増加させ得る医学的または精神状態を有する；ＣＯＶＩＤ−１９の先の臨床的または微生物学的診断；ワクチンに関連する重症有害反応および／またはワクチンの何らかの成分に対する重度アレルギー反応(例えば、アナフィラキシー)の病歴；免疫不全が知られるまたは疑われる；出血性素因または長期出血に関連する状態、妊娠性高血圧または妊娠高血圧腎症・子癇、胎盤異常、羊水過多または羊水過少、顕著な出血または凝血障害、妊娠性糖尿病、現在の妊娠の早産の１以上の徴候または早産予防のために現在の妊娠で介入(医学的／外科的)を受けている、先の死産または新生児死亡、先の低出生時体重または早期分娩、少なくとも３流産の先の病歴、５を超える先の妊娠数または遺伝子障害または主要な先天性異常が知られる先の乳児、以前何れかのコロナウイルスワクチンでワクチン接種された、ＣＯＶＩＤ−１９予防を意図する薬物療法を受けた、液／血漿製品または免疫グロブリンを治験介入６０日投与前に受けたまたは出産時に血受ける予定(あらゆる時点で与えてよい抗Ｄ免疫グロブリン(例えば、ＲｈｏＧＡＭ)が１つの例外)、現在のアルコール濫用または違法薬物使用、免疫抑制治療(例えば、癌または自己免疫性疾患のためにまたはワクチン接種後採血により受けることが計画されている細胞毒性剤または全身コルチコステロイドを含む)での処置を受けている参加者、治験エントリー前２８日以内および／または治験参加中の治験介入を含む他の治験の参加、ＬＮＰを含む治験介入を含む他の治験の先の参加、現在の熱性疾患、現在のＣＯＶＩＤ−１９感染の症状、先の１４日以内に何らかの季節性または汎発性インフルエンザワクチンを受けた、治験介入投与後７日までに何らかの季節性または汎発性インフルエンザワクチンを受ける予測、先の１４日以内に破傷風、ジフテリアおよび／または百日咳含有ワクチンを受けた、治験介入投与後７日までに破傷風、ジフテリアおよび／または百日咳含有ワクチンを受ける予測、投与前２８日以内に短期(＜１４日)全身コルチコステロイドを受けた(吸入／噴霧、関節内、嚢内または局所(皮膚または眼)コルチコステロイドは許容される)、１以上により特徴づけられる対象を含まない集団でおこなう。
ある実施態様において、ここに記載するワクチン接種した母親は、ワクチン接種に関連する症状を処置するために、例えば、解熱または他の疼痛薬物療法を摂取し得るまたは接種を開始し得る。これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、母親は、既存の安定な状態の処置に必要な薬物療法および／またはコルチコステロイドの吸入、局所または局在性注射を摂取し得るまたは接種を開始し得る。
ある実施態様において、ここに記載するワクチン接種した母親は、特に妊娠が早期分娩のリスクがあるならば、１以上の出産前コルチコステロイドを与え得る。ある実施態様において、コルチコステロイドはグルココルチコイドである。ある実施態様において、コルチコステロイドは、ベタメタゾンまたはプロゲステロンまたはそれらの混合物である。
ある実施態様において、この実施例に記載するワクチン接種は、例えば、同等なワクチン接種していない(例えば、プラセボを受けた)集団で観察されたものに対して、母親および／またはそこから生まれた乳児相対的におけるＣＯＶＩＤ−１９疾患(および／または実証されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染)または重症ＣＯＶＩＤ−１９疾患の発生率を減少させる。ある実施態様において、母親は、ＣＯＶＩＤ−１９疾患の少なくとも１症状(発熱；今までになかった咳嗽またはその増加；今までになかった息切れまたはその増加；今までになかった筋肉痛またはその増加；今までになかった味覚または嗅覚喪失；咽喉炎；下痢；嘔吐；および／またはある実施態様において、疲労、頭痛、鼻閉または鼻汁、悪心)が存在するならばおよび症候性期間中または期間４日前後に中央研究所または地元の検査施設(許容される検査を使用)でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＮＡＡＴ検査陽性であるならば、ＣＯＶＩＤ−１９疾患を有すると考えられる。ある実施態様において、母親は、確認されたＣＯＶＩＤ−１９を有し、次の１以上が存在するならば、重症ＣＯＶＩＤ−１９疾患を有すると考えられる。
− 安静時の重症全身疾病の臨床徴候(ＲＲ≧３０呼吸／分、ＨＲ≧１２５心拍／分、室内気でsea levelでＳｐＯ２≦９３％またはＰａＯ２／ＦｉＯ２＜３００mmHg)；
− 呼吸不全(高流酸素、非侵襲性人工呼吸、機械的人工呼吸またはＥＣＭＯが必要と定義)；
− ショックの証拠(ＳＢＰ＜９０mmHg、ＤＢＰ＜６０mmHgまたは昇圧剤必要)；
− 顕著な急性腎臓、肝臓または神経性機能不全＊；
− ＩＣＵ入院；
− 死亡。
ある実施態様において、乳児は、少なくとも１つの症状(発熱、今までになかった咳嗽またはその増加、今までになかった息切れまたはその増加、下痢、嘔吐；および／またはある実施態様において、鼻閉または鼻汁、食欲不振または摂食不良、腹痛／疝痛)が存在するならばおよび症候性期間中または期間４日前後に中央試験室または地元の検査施設(許容される検査を使用)でＳＡＲＳ−ＣＯＶ−２ ＮＡＡＴ試験結果陽性の１以上であるならば、ＣＯＶＩＤ−１９疾患を有すると考えられる。ある実施態様において、乳児は、確認されたＣＯＶＩＤ−１９を有し、次の１以上が存在するならば、重症ＣＯＶＩＤ−１９疾患を有すると考えられる
(ｉ)安静時の重症全身疾病の臨床徴候：
− ＲＲ(呼吸／分)：出生〜１週齢まで＞５０、１週齢〜１か月齢まで≧４０、１か月〜６か月齢まで≧３４；
− ＨＲ(心拍／分)：＞１８０；
− 室内気でＳｐＯ２≦９２％または≧９２％維持に＞５０％ＦｉＯ２からまたはＰａＯ２／ＦｉＯ２＜３００mmHg２４；
(ii) 呼吸不全(経鼻ＣＰａＰ／ＢｉＰａＰ、非侵襲性人工呼吸、機械的人工呼吸またはＥＣＭＯを含む高流酸素が必要と定義)；
(iii) ショックの証拠または心不全：
− ＳＢＰ(mmHg)(年齢の＜第５パーセンタイル)：
＋ 出生〜１週齢＜６５、１週齢〜１か月齢＜７５、１か月〜６か月齢＜１００；
または
− 正常範囲にＢＰを維持するために血管作動性薬物が必要；
(iv) 顕著な急性腎不全：血清クレアチニン年齢のＵＬＮの＞２倍またはベースラインクレアチニンの２倍増加；
(ｖ) 顕著なＧＩ／肝不全：総ビリルビン＞４mg／ｄＬまたはＡＬＴ年齢のＵＬＮの２倍；
(vi) 顕著な神経性機能不全：グラスゴー・コーマ・スケールスコア＜１１または異常ベースラインからグラスゴー・コーマ・スケールスコア≧３点低減を伴う精神状態の急性変化
；
(vii) ＩＣＵ入院；
(viii) 死亡。
ある実施態様において、多系炎症性症候群の発生率は、母親がここに記載するとおりワクチン接種した乳児で有意に増加しない(例えば、母親がワクチン接種していないおよび／またはここに記載するプロトコールでワクチン接種しなかった同等な集団に相対的)。ある実施態様において、乳児は、
− 乳児が発熱(２４時間以上３８.０℃以上または２４時間以上継続する主観的発熱の報告)；および
− ＣＲＰ上昇、ＥＳＲ、フィブリノーゲン、プロカルシトニン、Ｄ−ダイマー、フェリチン、ＬＤＨまたはＩＬ−６、好中球上昇、リンパ球減少および低アルブミンの１以上を含むが、これらに限定されない炎症の検査値証拠(地元の検査値範囲による)；および
− 多系(≧２)臓器関与がある、入院を必要とする臨床的に重症な疾病の証拠(重症疾患いついて上記した定義)、：
〇 心臓(例えば、ショック、トロポニン上昇、ＢＮＰ上昇、異常心エコー図、不整脈)；
〇 腎臓(例えば、急性腎臓傷害または腎不全)；
〇 呼吸器(例えば、肺炎、ＡＲＤＳ、肺塞栓症)；
〇 血液(例えば、Ｄ−ダイマー上昇、血栓形成傾向または血小板減少症)；
〇 ＧＩ／肝臓(例えば、ビリルビン上昇、肝酵素上昇または下痢)；
〇 皮膚(例えば、発疹、皮膚粘膜病変)；
〇 神経(例えば、ＣＶＡ、無菌髄膜炎、脳症)；および
− 別の説得力のある診断がない；および
− 乳児がＲＴ−ＰＣＲ、血清学または抗原試験で現在のまたは最近のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染に陽性であると決定される；または
− 乳児が発症前４週間以内にＣＯＶＩＤ−１９暴露
ならば、多系炎症性症候群と考えらえる。
ある実施態様において、ここに記載する母親のワクチン接種は、乳児期早期分娩罹病率発生率を実質的に増加させない。
ある実施態様において、母親がここに記載するとおりワクチン接種した乳児のＣＯＶＩＤ−１９疾患(および／または実証されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染)の発生率は、母親がこのようなワクチン接種しなかった乳児に対して減少する。ある実施態様において、母親がここに記載するとおりワクチン接種した乳児のＣＯＶＩＤ−１９疾患(および／または実証されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染)の発生率は、生後直接ワクチン接種した乳児と同等である。
ある実施態様において、ここに記載するワクチン接種は、次の一次または副次評価項目基準の１以上を達成する。
主要評価項目基準：
１. 次の事象を報告する母親参加者のパーセンテージ：局所反応
電子日記で自己報告された注射部位疼痛、発赤および腫脹
[タイムフレーム：投与１および投与２の後７日まで]
２. 全身事象を報告する母親参加者のパーセンテージ
電子日記で自己報告された発熱、疲労、頭痛、悪寒、嘔吐、下痢、筋肉痛の新規出現または悪化および関節痛の新規出現または悪化。
[タイムフレーム：投与１および投与２の後７日まで]
３. 有害事象を報告する母親参加者のパーセンテージ
治験実施機関スタッフによる聞き取り
[タイムフレーム：投与１から投与２の１か月後まで]
４. 重度有害事象を報告する母親参加者のパーセンテージ
治験実施機関スタッフによる聞き取り
[タイムフレーム：投与１から出産６か月後まで]
５. 過去のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠がないＣ４５９１００１治験の妊娠していない女性参加者と比較した妊婦の免疫応答の非劣性の証明。
妊婦におけるＳＡＲＳ ＣｏＶ ２中和力価の幾何平均対妊娠していない女性参加者
の比により推定されるＧＭＲ
[タイムフレーム：投与２の１か月後まで]
６. 先のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染の証拠があるおよびないＣ４５９１００１治験の妊娠していない女性参加者と比較した妊婦における免疫応答の非劣性の証明
妊婦におけるＳＡＲＳ ＣｏＶ ２中和力価の幾何平均対妊娠していない女性参加者の比により推定されるＧＭＲ
[タイムフレーム：投与２の１か月後まで]
副次評価項目基準：
７. ワクチン接種前感染の証拠がない参加者における確認されたＣＯＶＩＤ １９に対する有効性の評価
１０００人年のフォローアップ
[タイムフレーム：投与２の７日後まで]
８. 先の感染の証拠がない参加者における確認されたＣＯＶＩＤ １９に対する有効性の評価。
１０００人年のフォローアップ
[タイムフレーム：投与２の７日後まで]
実施例３５：ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン誘導ヒト血清によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２系統Ｂ.１.１.２９８(デンマーク株；別名、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２／ｈｕ／ＤＫ／ＣＬ−５／１(Ｃｌｕｓｔｅｒ ５))およびＢ.１.３５１(南アフリカ株；別名、２０Ｈ／５０１Ｙ.Ｖ２(501.V2))シュードウイルスの中和
３０μg ＢＮＴ１６２ｂ２でブースター免疫化７日または２１日後に採取した先に報告されたドイツフェーズ１／２治験における１２若年成人参加者の血清を、５０％中和アッセイ(ｐＶＮＴ５０)によりＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２武漢Ｈｕ−１(対照)、南アフリカ系統Ｂ.１.３５１(ＳＡ株)およびデンマークミンク関連系統Ｂ.１.１.２９８(ＤＮＫ株)スパイクタンパク質シュードタイプ化ＶＳＶの中和について試験した。ＳＡ株スパイクタンパク質は、武漢対照と比較して、次のアミノ酸変化を有する：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、ΔＬ２４２−２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ。ＤＮＫ株スパイクタンパク質は、武漢対照と比較して次のアミノ酸変化を有する：Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉ。
ＢＮＴ１６２ｂ２免疫血清は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２武漢Ｈｕ−１シュードタイプ化対照とほぼ同じ効率で、ＤＮＫ株シュードウイルスを中和した。中和力価の低減(５倍)を、武漢Ｈｕ−１シュードタイプ化対照に対する力価と比較したとき、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２系統Ｂ.１.３５１シュードウイルスで測定した。重要なことに、全ての試験したＢＮＴ１６２ｂ２免疫血清はなお中和することが可能であり、完全な回避は示されなかった(図１２７)。
材料および方法：
ＶＳＶ−糖タンパク質(ＶＳＶ−Ｇ)ではなく緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)およびルシフェラーゼ(Ｌｕｃ)をコードする組み換え複製欠損ＶＳＶベクターを、公開されたシュードタイピングプロトコールに従い、武漢−Ｈｕ−１単離株ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク(Ｓ)(GenBank：ＱＨＤ４３４１６.１)、デンマークミンク関連系統Ｂ.１.１.２９８のＳタンパク質に見られる４変異(Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉ)を担持するバリアントまたは南アフリカ系統Ｂ.１.３５１ Ｓタンパク質でみられる１０変異(Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Δ２４２／２４３／２４４、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ)を担持するバリアントを用いてシュードタイプ化した。簡潔には、Ｃ末端細胞質１９アミノ酸が切断された各ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２(ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓ(ＣΔ１９))を発現するようトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７単層に、ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰ／Ｌｕｃベクターを接種した。１時間、３７℃でインキュベーション後、接種物を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後抗ＶＳＶ−Ｇ抗体(クローン８Ｇ５Ｆ１１、Kerafast)添加培地を加えて、残存入力ウイルスを中和した。ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２シュードウイルス含有培地を接種２０時間後集め、０.２μmフィルター処理し、−８０℃で保管した。
シュードウイルス中和アッセイのために、９６ウェルあたり４０,０００ Ｖｅｒｏ ７６細胞を播種した。血清を１：１０希釈(希釈範囲１：１０〜１：２,５６０)で開始して、培養培地で１：２連続希釈した。ＶＳＶ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２−Ｓシュード粒子をアッセイにおける約１,０００ＴＵのアッセイにおける蛍光焦点単位(ffu)カウントのために培養培地で希釈した。血清希釈物を、３０分間、室温でシュードウイルスと１：１で混合し、その後９６ウェルプレートのＶｅｒｏ ７６細胞単層に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。上清を除去し、細胞をルシフェラーゼ試薬(Promega)で溶解させた。発光を記録し、中和力価を各連続血清希釈のパーセント中和の４パラメータロジスティック(４ＰＬ)フィットを作成することにより、GraphPad Prism version 9で計算した。５０％シュードウイルス中和力価(ｐＶＮＴ５０)を、発光を５０％減少させる希釈の補間された逆数として報告した。
実施例３６：ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン誘発血清によるＮ５０１Ｙ変異体ＡＲＳ−ＣｏＶ−２の中和
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の急速に拡大しているバリアントが、英国および南アフリカで発生している(Volz E. et al. Report 42 - Transmission of SARS-CoV-2 Lineage B.1.1.7 in England: Insights from linking epidemiological and genetic data. https://www.imperial.ac.uk/mrc-global-infectious-disease-analysis/covid-19/report-42-sars-cov-2-variant/; Tegally H. et al. Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lineage with multiple spike mutations in South Afric. medRxiv 2020. https://doi.org/10.1101/2020.12.21.20248640)。これらのバリアントは、ウイルス中和抗体の重要な標的であるＳ糖タンパク質に複数変異を有する。これらの急速に拡大しているバリアントは、スパイクＮ５０１Ｙ置換を共有する。この変異は、細胞侵入のためのウイルス受容体結合部位に位置し、受容体(アンギオテンシン変換酵素２)に対する結合を増加させ、ウイルスが宿主範囲を拡大してマウスに感染可能となるため、特に懸念される(Gu H. et al. Adaptation of SARS-CoV-2 in BALB/c mice for testing vaccine efficacy. Science 2020;369:1603-7; Chan K.K. et al. An engineered decoy receptor for SARS-CoV-2 broadly binds protein S sequence variants. Cold Spring Harbor Laboratory 2020.doi: 10.1101/2020.10.18.344622)。
ＢＮＴ１６２ｂ２コード化スパイク抗原の遺伝的背景も提供するＮ５０１臨床株ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０の遺伝的背景で同質遺伝子的Ｙ５０１ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を産生した。３週間離して２回の３０μg用量のＢＮＴ１６２ｂ２で免疫化２週間または４週間後に採取した先に報された治験(Walsh E.E. et al. Safety and Immunogenicity of Two RNA-Based Covid-19 Vaccine Candidates. N Engl J Med 2020; Polack F.P. et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Eng. J Med 2020. DOI: 10.1056/NEJMoa2034577)の２０参加者の血清を、５０％プラーク減少中和アッセイ(ＰＲＮＴ５０；図１２８)によるＮ５０１およびＹ５０１ウイルスの中和について試験した。Ｙ５０１ウイルスに対する血清の５０％中和ＧＭＴ対Ｎ５０１ウイルスのそれの比は１.４６であり、Ｙ５０１スパイクを有するウイルスに対して中和活性の減少がないことが示された。
材料および方法
同質遺伝子的ウイルスの構築
Ｎ５０１またはＹ５０１スパイクタンパク質を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の同質遺伝子的対を構築した(図１２９)。Ｎ５０１Ｙ変異は、臨床株ＷＡ１(2019-nCoV/USA_WA1/2020)の感染性ｃＤＮＡクローンを使用するウイルスゲノムのヌクレオチド２３,０６３でのＡからＴへの置換により産生した(Xie X. et al. An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 2020;27:841-8 e3)。先に報告された変異導入プロトコール(Plante J.A. et al. Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness. Nature 2020)に従い、＞１０７プラーク形成単位(PFU)／mlの力価でＮ５０１およびＹ５０１ウイルスを回収した。２つのウイルスは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で類似のプラーク形態を展開させた(図１３０)。
血清検体および中和アッセイ
免疫化および血清採取レジメンを図１３１に模式的に記載する。中和力価測定のために、各血清を、最初の希釈が１：４０(希釈範囲１：４０〜１：１２８０)で培養培地で２倍連続希釈した。希釈血清を１００PFUのＮ５０１またはＹ５０１ウイルスと３７℃で１時間インキュベートし、その後、血清−ウイルス混合物を６ウェルプレートでＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層に接種した。慣用の(非蛍光)プラーク減少中和アッセイを実施して、先に報告されたとおり血清介在ウイルス抑制を定量した(Muruato A.E. et al. A high-throughput neutralizing antibody assay for COVID-19 diagnosis and vaccine evaluation. Nat Commun 2020;11:4059)。ウイルスプラークの＞５０％抑制する最小血清希釈を、ＰＲＮＴ５０として定義する。中和力価の表を提供する(表２８)。Ｎ５０１およびＹ５０１ウイルスに対する各血清のＰＲＮＴ５０比を図１３２にプロットする。
Figure 2021185136
実施例３７：ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン誘発血清によるスパイク６９／７０欠失、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の中和
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の急速に拡大しているバリアントが英国(ＵＫ)、南アフリカ(ＳＡ)および他の地域で発生している(Volz E. et al. CMe. Report 42 - Transmission of SARS-CoV-2 Lineage B.1.1.7 in England: Insights from linking epidemiological and genetic data. https://wwwimperialacuk/mrc-global-infectious-disease-analysis/covid-19/report-42-sars-cov-2-variant/ 2021; Tegally H. et al. e. Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lineage with multiple spike mutations in South Africa medRxiv 2020. :https://doi.org/10.1101/2020.12.21.20248640)。これらのバリアントは、ウイルス中和抗体の重要な標的であるスパイク糖タンパク質に複数変異を有する。出現しているスパイク変異は、これらの新しい株に対するワクチン有効性の懸念をもたらしている。本試験の目標は、ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン誘導中和に対するＵＫ株およびＳＡ株由来の複数の重要なスパイク変異の影響を試験することである。
新たに出現している英国(ＵＫ)および南アフリカ(ＳＡ)バリアント(ＵＫおよびＳＡからのＮ５０１Ｙ；ＵＫからの６９／７０−欠失＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ；およびＳＡからのＥ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ)の重要なスパイク変異を含む３つのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を設計した。３変異体ウイルスに対する２０のＢＴＮ１６２ｂ２−ワクチン接種したヒト血清の中和幾何平均力価(ＧＭＴ)は、親ウイルスに対するＧＭＴの０.８１〜１.４６倍であり、２回ＢＮＴ１６２ｂ２により誘発される血清による中和に対する変異効果は小さいことが示された。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の感染性ｃＤＮＡクローン(Xie X. et al. An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 2020;27:841-8 e3)を使用して、臨床株ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０の遺伝的背景上に３スパイク変異体ウイルスを操作した(図１３３)。(ｉ)変異体Ｎ５０１Ｙウイルスは、ＵＫおよびＳＡバリアント両者が共有するＮ５０１Ｙ変異を含む。この変異は、細胞侵入のためのウイルス受容体結合部位に位置し、受容体(アンギオテンシン変換酵素２)に対する結合を増加させ、ウイルスが宿主範囲を拡大してマウスに感染可能となる(Xie X. et al. An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 2020;27:841-8 e3; Wrapp D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 2020;367:1260-3)。(ii)変異体Δ６９／７０＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇウイルスは、ＵＫバリアントから２つのさらなる変化を含む：アミノ酸６９および７０欠失(Δ６９／７０)およびＤ６１４Ｇ置換。アミノ酸６９および７０はスパイクＳ１フラグメントのＮ末端ドメインに位置し、これら残基の欠失は、スパイクの高次構造をアロステリックに変化させ得る(Wrapp D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 2020;367:1260-3)。Ｄ６１４Ｇ変異は、世界中の循環株において優性である(Plante JA et al. Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness. Nature 2020; Korber B. et al. Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike: Evidence that D614G Increases Infectivity of the COVID-19 Virus. Cell 2020)。(iii)変異体Ｅ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇウイルスは、同様にウイルスＲＢＤに位置するＥ４８４Ｋ置換を含む。Ｅ４８４Ｋ置換単独で、数モノクローナル抗体に対する耐性が付与される(Ku Z. et al. Molecular determinants and mechanism for antibody cocktail preventing SARS-CoV-2 escape. Nat Commun 2021;12:469; Baum A. et al. Antibody cocktail to SARS-CoV-2 spike protein prevents rapid mutational escape seen with individual antibodies. Science 2020;369:1014-8)。野生型ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０株と比較して、３変異体ウイルスは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で類似のプラーク形態を示した(図１３４)。
３週間離れた２回３０μg用量のＢＮＴ１６２ｂ２投与により免疫化した２週間または４週間に採取した先に報告された臨床治験(Walsh EE et al. Safety and Immunogenicity of Two RNA-Based Covid-19 Vaccine Candidates. N Engl J Med 2020; Polack FP et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. N Engl J Med 2020)における２０参加者からのヒト血清のパネルで試験した(図１３５)。各血清を、５０％プラーク減少中和アッセイ(ＰＲＮＴ５０；表２９および３０)により野生型ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０株および３変異体ウイルスの中和について試験した。
Figure 2021185136
Figure 2021185136
全血清は、野生型と変異体ウイルスで等価な中和力価を示し、差は≦４倍であった(図１３６)。顕著なことに、２０血清中、１０が、野生型ウイルスに対する力価の２倍である中和力価を変異体Δ６９／７０＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇウイルスに対して有し(図１３６ｂ)、一方２０血清中６が野生型ウイルスに対する力価の半分である中和力価を変異体Ｅ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇウイルスに対して有した(図１３６ｃ)。Ｎ５０１Ｙ、Δ６９／７０＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４ＧおよびＥ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇウイルスに対する血清の中和ＧＭＴ対ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０ウイルスに対するＧＭＴ比は、それぞれ１.４６、１.４１および０.８１であった(図１３７)。
回復期または免疫化後血清によるバリアントＡＲＳ−ＣｏＶ−２または対応するシュードウイルス中和の他の最近の報告(Wibmer CK et al. SARS-CoV-2 501Y.V2 escapes neutralization by South African COVID-19 donor plasma. bioRxiv 2021:doi: https://doi.org/10.1101/2021.01.18.427166; Wang Z. et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. bioRxiv 2021:doi: https://doi.org/10.1101/2021.01.15.426911)に一致して、ＳＡバリアントからの３変異(Ｅ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ)を有するウイルスに対する血清パネルの中和ＧＭＴは、Ｎ５０１ＹウイルスまたはＵＫバリアントからの３変異(Δ６９／７０＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ)を有するウイルスに対する中和ＧＭＴよりわずかに低かった。しかしながら、この試験におけるウイルスの何れかに対する中和ＧＭＴの差の程度は、インフルエンザワクチンで株変更が必要となる可能性のサインとして使用されているヘマグルチニン阻害力価の４倍差と比較して、小さかった(Smith DJ et al. Mapping the antigenic and genetic evolution of influenza virus. Science 2004;305:371-6)。
方法
同質遺伝子的ウイルスの構築。３つの組み換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２変異体(Ｎ５０１Ｙ、Δ６９／７０−Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ、Ｅ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｄ６１４Ｇ ｉｎスパイクタンパク質)を、先に報告された(Plante JA et al. Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness. Nature 2020)ＰＣＲベースの変異導入プロトコールに従い、臨床株ＷＡ１(2019-nCoV/USA_WA1/2020)由来の感染性ｃＤＮＡクローン(Xie X. et al. An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 2020;27:841-8 e3)の遺伝的背景上に調製した。完全長感染性ｃＤＮＡを、インビトロでライゲートし、完全長ウイルスＲＮＡを転写するための鋳型として使用した。変異体ウイルス(Ｐ０)を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞から２日目にインビトロＲＮＡ転写物のエレクトロポレーション後、回収した。Ｐ１ウイルスを、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で１回Ｐ０ウイルスを継代させることにより、ストックとして採取した。Ｐ１ウイルスの力価を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上のプラークアッセイにより決定した。Ｐ１ウイルスのゲノム配列を、サンガーシーケンシングにより検証した。詳細なプロトコールが最近報告された(Xie X. et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols 2021:https://doi.org/10.1038/s41596-021-00491-8)。
血清検体および中和アッセイ。免疫化および血清採取レジメンを図１３５に模式的に示す。慣用の(非蛍光)プラーク減少中和アッセイを実施して、先に報告されたとおり血清介在ウイルス抑制を定量した(Muruato AE et al. A high-throughput neutralizing antibody assay for COVID-19 diagnosis and vaccine evaluation. Nat Commun 2020;11:4059)。簡潔には、各血清を、最初の希釈が１：４０(希釈範囲１：４０〜１：１２８０)で培養培地で２倍連続希釈した。希釈血清を１００プラーク形成単位の野生型または変異体ウイルスと３７℃で１時間インキュベートし、その後、血清−ウイルス混合物を６ウェルプレートでＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層に接種した。３７℃で１時間感染させた後、２％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)および１％ペニシリン／ストレプトマイシン(Ｐ／Ｓ)を含むダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)中の２mlの２％Seaplaque寒天(Lonza)を細胞に加えた。２日間インキュベーション後、２％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓおよび０.０１％ニュートラルレッド(Sigma)を含むＤＭＥＭ中の２mlの２％Seaplaque寒天(Lonza)を、第一層の上部に加えた。さらに１６時間、３７℃でインキュベーション後、プラーク数をカウントした。プラークカウントの５０％を阻害する最小血清希釈を、５０％プラーク減少中和力価(ＰＲＮＴ５０)として定義する。各血清はデュプリケートで試験した。ＰＲＮＴ５０アッセイをUniversity of Texas Medical Branchのバイオセイフティーレベル−３施設で実施した。
実施例３８：ＢＮＴ１６２ｂ２誘導血清の中和活性
Ｓ遺伝子に変異を有する英国(Ｂ.１.１.７系統)、南アフリカ(Ｂ.１.３５１系統)およびブラジル(Ｐ.１系統)で最初に検出された新たな、伝染性の高いＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２バリアントが、世界的に広がっている。ＢＮＴ１６２ｂ２により誘導される中和に対する影響を分析するため、３つの新規分化系列それぞれからのＳ変異を、２０２０年１月のウイルスからの比較的早期に単離されたＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０に操作した(図１３８)。その後、５つの組み換えウイルスを作成した。第一は、Ｂ.１.１.７系統(Ｂ.１.１.７−スパイク)のＳ遺伝子で見られる全変異を有し、第二はＰ.１系統(Ｐ.１−スパイク)のＳ遺伝子で見られる全変異を有し、第三はＢ.１.３５１系統(Ｂ.１.３５１−スパイク)のＳ遺伝子で見られる全変異を有し、第四はＢ.１.３５１系統に見られるＮ末端ドメイン欠失および世界的に優性なＤ６１４Ｇ置換(Ｂ.１.３５１−Δ２４２−２４４＋Ｄ６１４Ｇ)を有し、そして第五は受容体結合部位のＢ.１.３５１系統からの３変異(Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ)およびＤ６１４Ｇ置換(Ｂ.１.３５１−ＲＢＤ＋Ｄ６１４Ｇ)を有する。Ｂ.１.３５１−ＲＢＤ＋Ｄ６１４Ｇウイルスで変異しているアミノ酸残基はＰ.１系統ウイルスでも変異しているものであるが、Ｐ.１系統ウイルスにおいて、Ｋ４１７はアスパラギンではなくスレオニンに置換されている。全変異体ウイルスは、１ミリリットルあたり１０７プラーク形成単位を超える感染性ウイルス力価を産生した。Ｂ.１.１.７−スパイクおよびＢ.１.３５１−スパイクウイルスは、他のウイルスより小さいプラークを形成した(図１３９)。
２回３０μgのＢＮＴ１６２ｂ２投与２週間または４週間後(最初の免疫化後３週間後実施)、ピボタル試験(Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med 2020; 383: 2603-15; Walsh EE et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. N Engl J Med 2020; 383: 2439-50)の１５参加者から得ていた２０血清サンプルを使用して、５０％プラーク減少中和試験(ＰＲＮＴ５０)を実施した(図１４０)。全血清サンプルは、ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０を効率的に中和し、ほぼ全て１：４０より高い力価を有した。ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０、Ｂ.１.１.７−スパイク、Ｐ.１−スパイク、Ｂ.１.３５１−スパイク、Ｂ.１.３５１−Δ２４２−２４４＋Ｄ６１４ＧおよびＢ.１.３５１−ＲＢＤ＋Ｄ６１４Ｇウイルスに対する幾何平均中和力価は、それぞれ５３２、６６３、４３７、１９４、４８５および３３１であった(図１４１および表３１)。故に、ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０の中和と比較して、Ｂ.１.１.７−スパイクおよびＰ.１−スパイクウイルスの中和はおおよそ等価であり、Ｂ.１.３５１−スパイクウイルスの中和はなお頑強ではあるものの、約２.７倍低かった。このデータは、Ｂ.１.３５１−スパイク変異一式を有するウイルスに対する中和力価が、変異のいずれか一部を有するウイルスに対するより低いこととも一致し、受容体結合部位における変異(Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ)が、スパイクタンパク質におけるＮ末端ドメインの２４２〜２４４欠失より中和に影響することを示唆する。
ＢＮＴ１６２ｂ２誘導血清によるＢ.１.１.７−スパイクおよびＰ.１−スパイクウイルスの中和がＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０の中和とおおよそ等価であるため、中和データは、ＵＫまたはブラジルで最初に検出されたバリアントに対してＢＮＴ１６２ｂ２は保護し続けることを強く支持する。Ｂ.１.３５１系統ウイルスに対する保護も、このバリアントに対する中和力価が幾分低いが、なお頑強であり、強い有効性がピボタルＣ４５９１００１有効性治験ですでに観察されているとき、１回ＢＮＴ１６２ｂ２後に観察されるかろうじて検出可能な力価よりはるかに高いことを鑑みて、予測される(Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med 2020;383:2603-15; Walsh EE et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. N Engl J Med 2020;383:2439-50; Sahin U et al. BNT162b2 induces SARS-CoV-2-neutralising antibodies and T cells in humans. December 11, 2020 (https://www.-medrxiv.-org/-content/-10.-1101/-2020.-12.-09.-20245175v1). preprint)。さらに、Ｔ細胞免疫も保護に関与し得て(Liao M et al. Single-cell landscape of bronchoalveolar immune cells in patients with COVID-19. Nature Medicine 2020)、ＢＮＴ１６２ｂ２免疫化は複数バリアントを認識するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する(Skelly DT et al. Vaccine-induced immunity provides more robust heterotypic immunity than natural infection to emerging SARS-CoV-2 variants of concern. Research Square 2021)。
材料および方法
同質遺伝子的ウイルスの構築。スパイク変異を有する全組み換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２(図１３８)を、臨床株ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０由来の感染性ｃＤＮＡクローン(Xie X et al. An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 2020;27:841-8 e3)の遺伝的背景上に調製した。先に報告された(Plante JA et al. Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness. Nature 2020. doi: 10.1038/s41586-020-2895-3; Xie X et al. Neutralization of SARS-CoV-2 spike 69/70 deletion, E484K and N501Y variants by BNT162b2 vaccine-elicited sera. Nat Med 2021. doi: 10.1038/s41591-021-01270-4)ＰＣＲベースの変異誘発プロトコールを使用して、変異をスパイク遺伝子に導入した。完全長感染性ｃＤＮＡをライゲートし、インビトロで完全長ウイルスＲＮＡを転写するための鋳型として使用した。元のウイルスストック(Ｐ０)を、インビトロ転写ＲＮＡのエレクトロポレーション２日後Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞から回収した。Ｐ０ウイルスを、中和アッセイ用Ｐ１ウイルスを産生するためにさらに１ラウンドＶｅｒｏ Ｅ６細胞で増殖させた。Ｐ１ウイルスの力価を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のプラークアッセイにより測定した(図１３９)。Ｐ１ウイルスの完全スパイク配列をサンガーシーケンシングにより、ＵＳＡ−ＷＡ１／２０２配列から意図するヌクレオチド変化のみ有することを確認した。上記実験の詳細なプロトコールが最近報告された(Xie X et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols 2021:https://doi.org/10.1038/s41596-021-00491-8)。
血清検体および中和アッセイ。図１４０は、免疫化および血清採取スキームを記載する。慣用の５０％プラーク減少中和試験(ＰＲＮＴ５０)を実施して、先に報告されたとおり血清介在ウイルス抑制を定量した(Muruato AE et al. A high-throughput neutralizing antibody assay for COVID-19 diagnosis and vaccine evaluation. Nat Commun 2020;11:4059)。簡潔には、各血清を、最初の希釈が１：４０(希釈範囲１：４０〜１：１２８０)で培養培地で２倍連続希釈した。希釈血清を１００PFUのＵＳＡ−ＷＡ１／２０２０または変異体ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２とインキュベートした。３７℃で１時間インキュベート後、血清−ウイルス混合物を、前日に６ウェルプレートに予め播種したＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層に接種した。ウイルスプラークの５０％を阻害する最小血清希釈を、ＰＲＮＴ５０として定義する。中和力価を表３１に示す。
Figure 2021185136
実施例３９：ＢＮＴ１６２ｂ２誘導ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の持続性
用量レベル１０〜３０μgにわたる２４対象の一部で、８５日目および１８４日目(それぞれブースト後９週間および２３週間後)に集めたサンプルを、ＢＮＴ１６２ｂ２により誘導されるＴ細胞応答の持続性を決定するために分析した。１８４日目および最初の縮小後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞両応答は、試験した３用量レベルにわたり大部分の個体で検出可能であった。１０μg ＢＮＴ１６２ｂ２をワクチン接種した４年配成人対象で観察されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答の動力学は、若年成人対象で観察されたものと同等であり、Ｓタンパク質特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞がブーストワクチン接種２３週間後全４対象でなお検出可能であった。ＢＮＴ１６２ｂ２誘導ＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答は、抗原記憶応答リコールより高いかまたはその範囲内であった(図１４２)。
実施例４０：ＢＮＴ１６２ｂ２により誘導されるＣＤ８ Ｔ細胞により認識されるＭＨＣ−Ｉ結合エピトープ
ＭＨＣクラスＩ多量体テクノロジーを使用して、Ｓタンパク質の全長にわたり広がり、共通ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂアレルの組み合わせにより提示される数エピトープが、ＢＮＴ１６２−ｂ２により誘導されたＣＤ８＋ Ｔ細胞により認識されると同定された(ブーストワクチン接種７日後測定)。あるペプチド／ＨＬＡ組み合わせは、１を超える対象でみられた。
Figure 2021185136
実施例４１：ＢＮＴ１６２ｂ２投与後の組織学的所見
古典的発色性免疫組織化学(ＩＨＣ)および発色性二重ＩＨＣ−ＩＳＨ(インサイチュハイブリダイゼーション)実験を実施して、注射６時間および６日後のマウス組織におけるＢＮＴ１６２ｂ２の生体分布を調査した。
プロトコール
採取後、組織を４％RotiHistofixで一夜、４℃で固定し、Leica Tissue Processorで脱水後パラフィン蝋に包埋させる。発色性ＩＨＣを実施する。スパイクタンパク質を、抗スパイク２マウスモノクローナル抗体(Genetex)で検出する。デュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイを、Advanced Cell DiagnosticsからのDocument MK 51-149に基づくそれ自体確立されたプロトコールに従い、その会社のキットおよび試薬を使用して、実施する。ＩＳＨのためのＢＮＴ１６２ｂ２プローブ(ｍｏｄＶ９)は、ＴＲＯＮにより提供された配列に基いてAdvanced Cell Diagnosticsによりカスタム設計される。免疫細胞マーカーＣＤ１１ｃ(Cell Signaling)、ＣＤ１９(Cell Signaling)、ＣＤ１６９(Thermo Fisher)およびＦ４／８０(Cell Signaling)のＩＨＣプロトコールはＴＲＯＮに位置し、本プロジェクトのデュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイに適用される。 Vectra Polaris Multispectral Slide Scanner microscope(Akoya Bioscience)を使用して画像を取得し、PhenoChart software(Akoya Bioscience)で分析する。
結果
図１４３に見られるとおり、特異的ワクチンｍＲＮＡシグナル(赤色)は、デュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイでｍｏｄＶ９プローブを使用して、注射６時間後リンパ節(ＬＮ)で検出される。ワクチンは大部分被膜下洞(９位および５位のＬＮ)およびＢ細胞卵胞(１２位および１位のＬＮ)に局在化した。樹状細胞をＣＤ１１ｃ染色(ターコイズ、上図)により可視化し、その一部のみワクチンを取り込む。ＣＤ１６９＋マクロファージ(被膜下洞マクロファージ、ターコイズ、中央図)の大部分はワクチンに陽性である。Ｂ細胞(ＣＤ１９＋、ターコイズ、下図)はワクチンシグナルを示す２番目に多い集団である。
特異的ワクチンｍＲＮＡシグナルは、たとえごく少量でも、デュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイでｍｏｄＶ９プローブを使用して注射６日後ＬＮでなお検出可能である(データは示していない)。一部ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣおよび被膜下洞マクロファージはワクチンに夭逝である。検出されるワクチンシグナルの大部分はＢ細胞(ＣＤ１９＋)である。
図１４４に見られ得るとおり、特異的ワクチンｍＲＮＡシグナル(赤色)は、デュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイでｍｏｄＶ９プローブを使用して、注射６時間後脾臓で検出される。ワクチンシグナルの大部分は白髄で検出される。樹状細胞をＣＤ１１ｃ染色(ターコイズ、上図)により可視化し、その一部のみワクチンを取り込む。Ｆ４／８０＋マクロファージ(ターコイズ、中央図)のわずかな部分がワクチンを取り込む。Ｂ細胞(ＣＤ１９＋、ターコイズ、下図)は、ワクチンシグナルを示す主要集団である。
特異的ワクチンｍＲＮＡシグナルは、たとえごく少量でも、デュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイでｍｏｄＶ９プローブを使用して注射６日後脾臓でなお検出可能である(データは示していない)。検出されるワクチンシグナルはＢ細胞(ＣＤ１９＋)のみである。ＤＣおよびマクロファージは注射６日後ワクチンシグナルを示さない。
６時間後、マウス抗Ｓ２マウスモノクローナル抗体を使用して、筋肉、特にある筋肉繊維および結合組織筋周膜でシグナルが検出された。ＬＮで、Ｔ細胞帯でスパイクタンパク質を発現する細胞を検出した(データは示していない)。
６日後、マウス抗Ｓ２マウスモノクローナル抗体を使用して、筋肉でスパイク発現は検出不可能であった。対照的に、ＬＮはワクチンを発現する細胞で満たされていた(データは示していない)。
発色性ＩＨＣ実験において、非特異的染色でＳ２マウスモノクローナル抗体は検出されない。
要約
極めて強いワクチンシグナルが注射６時間後排出ＬＮおよび脾臓で検出される。ＬＮで、ワクチンは大部分Ｂ細胞卵胞および被膜下洞で検出され、あるシグナルがＴ細胞帯でも検出される。デュアルＩＨＣ−ＩＳＨで、実際、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋)および被膜下洞マクロファージ(ＣＤ１６９＋)がワクチンを取り込む主要細胞であることが示された。Ｔ細胞帯における樹状細胞(ＣＤ１１ｃ＋)および中間洞もワクチンを取り込む。６日後、あるワクチンｍＲＮＡは排出ＬＮでなお見ることができる。６日後Ｔ細胞帯で観察されるシグナルは樹状細胞(ＣＤ１１ｃ＋)である。あるＢ細胞およびＬＮマクロファージもこの段階でなおあるワクチンを有する。
注射６時間後採取した脾臓の分析は、ほぼ確実に血流を介して、ワクチンが６時間以内に既に脾臓に達する。シグナルは、Ｂ細胞およびＴ細胞が主要集団を形成する場所である白髄に位置し、Ｔ細胞への抗原提示が白髄で起こる。デュアルＩＨＣ−ＩＳＨアッセイを用いて、Ｂ細胞の大部分がワクチンを取り込むことを示す。Ｂ細胞周囲の多くのＤＣ(ＣＤ１１ｃ＋)も陽性である。６日後、シグナルはＢ細胞に制限される。
ＩＨＣプロトコールは、ワクチンで処理した／していない細胞ペレット上の抗スパイクＳ２マウスモノクローナル抗体を使用するスパイクタンパク質発現検出のために確立される。特異的シグナルがＢＮＴ１６２ｂ２で処理した細胞でのみ検出される。非特異的染色は、試験したナイーブ組織で見られなかった。筋肉で、スパイク発現が注射６時間後、筋肉繊維および結合組織筋周膜で検出される。６日後、染色は筋肉で検出不可能である。対照的に、大量のスパイク発現がＬＮ、特にＴ細胞帯で注射６日後見られる。
実施例４２：安定性試験。
種々の濃度(例えば、０.５mg／mL、１mg／mLおよび２mg／mL)のＢＮＴ１６２ｂ２製剤の安定性評価が実施されており、種々の温度(例えば、−７０℃[例えば、−７０±１０℃]、−２０℃[例えば、−２０±５℃]、＋５℃[例えば、５±３℃]、または＋２５℃[例えば、２５±２℃])および／または種々の期間(例えば、０.５か月、１か月、２か月、３か月、４か月およびある場合１以上の間の期間(例えば、１.５か月、２.５か月など)で保管する組成物の評価が含まれている。
例示的試験において、０日目に２０μLの適切な製剤をマウスに(単脚)注射する。投与１４日、２１日および２８日後に採決し、血清を産生した；脾臓を２８日目に単離した。
血清でＳ１タンパク質にまたはＲＢＤドメインに特異的に結合する抗体の存在を検出するため、ＥＬＩＳＡを実施した。図１４５は、示される温度条件で、示される期間、保管されていた示される製剤を注射したマウスからの２８日血清で得たＳ１ ＥＬＩＳＡ結果例を示す。図１４５を参照して見られるとおり、全ての保管サンプルは、一(１)か月保管後、良好にかつ合理的に同等に機能した。二(２)または三(３)か月保管後、＋２５℃で保管したサンプルで活性のいくらかの低下が観察されたが、−７０℃、−２０℃、＋５℃で保管したサンプルは、顕著な性能を維持した。
いくつかの時点で、外観、ＲＮＡ含量、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡ封入、脂質含量(全体的および／または個々の成分および／またはそれらの比)、粒子径、粒子多分散指数、インビトロ発現能など)などの１以上のパラメータを評価した；さらなるまたは別のパラメータを評価してよいまたは評価している。
例示的観察は、＋２５℃での保管が、数ある中で、ＲＮＡ完全性の顕著な減少が観察されたため、約２週間より長い期間、好ましくは約１週間を超えて推奨されないことを含む。少なくとも一部例で、抗体を誘導する顕著な能力が、インビトロ発現能が実質的に減少したとき維持されたことも観察された。特に約３か月保管または約４か月後の多分散指数指数の変化が、＋５℃以上で保管した製剤で、低温で保管されたものより大きいことが観察された。

Claims (28)

  1. 配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡを含む、組成物。
  2. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントが配列番号７に少なくとも８０％同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
  3. ＲＮＡが一部または全ウリジン残基の修飾ウリジン残基による置換により修飾された修飾ＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
  4. ＲＮＡが全または全リジン残基のＮ１−メチル−シュードウリジン置換により修飾される、請求項３に記載の組成物。
  5. ＲＮＡがカチオン性にイオン化可能な脂質、リン脂質、コレステロールおよびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)−脂質を含む脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項１に記載の組成物。
  6. リン脂質がステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)であるまたはそれを含む、請求項５に記載の組成物。
  7. カチオン性にイオン化可能な脂質が次の構造
    Figure 2021185136
     〔式中、
    Ｇ１およびＧ２は各々独立して非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキレンまたはＣ１−Ｃ１２アルケニレンであり；
    Ｇ３はＣ１−Ｃ２４アルキレン、Ｃ１−Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルケニレンであり；
    Ｒ１およびＲ２は各々独立してＣ６−Ｃ２４アルキルまたはＣ６−Ｃ２４アルケニルであり；
    Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または−ＮＲ５Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４であり；
    Ｒ４はＣ１−Ｃ１２アルキルであり；
    Ｒ５はＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。〕
    を有するまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体である、請求項５に記載の組成物。
  8. Ｒ１またはＲ２または両者が次の構造：
    Figure 2021185136
     を有する、請求項７に記載の組成物。
  9. カチオン性にイオン化可能な脂質が次の構造
    Figure 2021185136
     を有する、請求項５に記載の組成物。
  10. 中性脂質が総脂質の５〜１５molパーセントの濃度範囲で存在する、請求項１に記載の組成物。
  11. カチオン性にイオン化可能な脂質が総脂質の４０〜５５molパーセントの濃度範囲で存在する、請求項１に記載の組成物。
  12. ステロイドが総脂質の３０〜５０molパーセントの濃度範囲で存在する、請求項１に記載の組成物。
  13. (ＰＥＧ)−脂質が総脂質の１〜１０molパーセントの濃度範囲で存在する、請求項１に記載の組成物。
  14. 脂質ナノ粒子が４０〜５５molパーセントのカチオン性にイオン化可能な脂質；５〜１５molパーセントの中性脂質；３０〜５０molパーセントのステロイド；および１〜１０molパーセントのＰＥＧ−脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
  15. ＲＮＡが５’キャップ、５’ ＵＴＲ、３’ ＵＴＲおよびポリＡ配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  16. ポリＡ配列が少なくとも１００個のＡヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. ポリＡ配列が中断されたＡヌクレオチド配列である、請求項１５に記載の組成物。
  18. ＲＮＡが５’キャップを含む、請求項１に記載の組成物。
  19. さらに少なくとも１つの塩および／または凍結保護物質を含み、凍結保護物質がスクロースであるまたはそれを含む、請求項１に記載の組成物。
  20. 組成物が、０.２μg〜５μg ＲＮＡの用量を投与されたマウス対象からの血清が、投与７日後オープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドに対する抗体の産生を示すことにより特徴づけられる、請求項１に記載の組成物。
  21. 組成物が、１μg〜５μg 修飾ＲＮＡを投与されたマウス対象からの血清が、投与１４日後にシュードウイルス中和活性を示すことにより特徴づけられる、請求項１に記載の組成物。
  22. ＲＮＡが、組成物中１回分あたり１μg〜１００μgの範囲内の量で存在する、請求項１に記載の組成物。
  23. 配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードする完全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡを含む組成物を投与することによりワクチン接種する方法。
  24. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントが配列番号７に少なくとも８０％同一性を有する、請求項２３に記載の方法。
  25. １回分が１μg〜１００μgの範囲内の量のＲＮＡを含む、請求項２３に記載の方法。
  26. 投与が筋肉内投与によるものである、請求項２３に記載の方法。
  27. 対象に１回目の投与後一定期間後に少なくとも２回目の投与をすることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  28. ２回目を該投与７〜２８日後に投与する、請求項２７に記載の方法。
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