JP2023522715A - 細胞ワクチンプラットフォーム及び使用方法 - Google Patents

Abstract

宿主免疫応答を誘発するための、ワクチン免疫ウイルスオプソニン化プラットフォームなどの細胞ワクチンプラットフォームが開示される。宿主免疫応答を刺激するための細胞ワクチンプラットフォームを作製及び使用する方法も開示される。いくつかの実施形態は、（ａ）少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、（ｂ）貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する細胞表面タンパク質、または前記細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする外因性核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、外因性核酸と、を含む、遺伝子操作されたヒト細胞を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本国際ＰＣＴ出願は、２０２０年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０１３，３８７号、及び２０２０年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０５６，４６０号に対する優先権及び利益を主張し、その内容は、その全体が参照により組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年４月１９日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、１９９８２７－７５７６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは４０，８４０バイトである。

現在のワクチン開発戦略は、宿主の免疫応答を誘発し、永続的な抗原特異的抗体と記憶リンパ球の産生を誘導するために、免疫刺激アジュバントと組み合わせた弱毒化または不活化された微生物病原体の送達に主に依存している。ただし、これらの戦略は、抗原曝露の非生理学的方法と非生理学的アジュバントに依存しており、ワクチンに必要な免疫応答を十分に生成できない可能性がある。したがって、生理学的免疫応答をより厳密に模倣し、調節する新規なワクチン戦略が必要である。

参照による援用
本明細書におけるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各個の刊行物、特許、または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。本明細書における用語と、援用された参照における用語との間に矛盾がある場合には、本明細書における用語を優先する。

本明細書に提供されるのは、とりわけ、細胞ワクチン、同種異系ユニバーサルワクチン生成細胞、及びそれを生成及び使用するための方法である。

いくつかの実施形態は、（ａ）少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、（ｂ）貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する細胞表面タンパク質、または前記細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする外因性核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、外因性核酸と、を含む、遺伝子操作されたヒト細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上での発現を阻害する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、前記ゲノム破壊を欠いている同等の細胞と比較して、ＨＬＡまたはＭＨＣ媒介Ｔ細胞活性化及び／または増殖の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、前記ゲノム破壊を欠いている同等の細胞と比較して、ＨＬＡまたはＭＨＣ媒介Ｔ細胞活性化及び／または増殖を減少させる。いくつかの実施形態では、前記同等の細胞は、前記ゲノム破壊を欠くヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記同等の細胞は、前記ＨＬＡ遺伝子を発現するヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記同等の細胞は、前記破壊を欠く前記遺伝子操作されたヒト細胞を含む。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上の前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の発現を完全に阻害する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子における前記ゲノム破壊は、少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子における前記ゲノム破壊を伴わない同等の細胞の投与と比較して、対象への前記遺伝子操作されたヒト細胞の投与時にＨＬＡまたはＭＨＣ媒介Ｔ細胞活性化または増殖の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子における前記ゲノム破壊は、少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子における前記ゲノム破壊を伴わない同等の細胞と比較して、ＨＬＡまたはＭＨＣ媒介Ｔ細胞活性化または増殖の減少をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子にある。いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、またはβ－ミクログロブリン遺伝子である。いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子はβ－ミクログロブリン遺伝子である。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子にある。いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子である。

いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子は、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＲＦＸＡＰ遺伝子、またはＲＦＸＡＮＫ遺伝子である。いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡ遺伝子はＣＩＩＴＡ遺伝子である。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ遺伝子または前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊、及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子または前記ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊を含む。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ転写調節因子遺伝子におけるゲノム破壊、及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ転写調節因子におけるゲノム破壊を含む。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、自然免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態では、前記結合は、前記ＮＫ細胞の細胞溶解活性の活性化をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記細胞表面タンパク質は、ＮＫ細胞の表面に発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体に特異的に結合するリガンドである。いくつかの実施形態では、前記細胞表面タンパク質は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２（ネクチン－２）、Ｂ７－Ｈ６、Ｎｅｃｌ－２、及び免疫グロブリンＦｃからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、前記細胞表面タンパク質は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンドである。いくつかの実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞活性化リガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２（ネクチン－２）、Ｂ７－Ｈ６、及びＮｅｃｌ－２からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、前記細胞は、貪食細胞または細胞溶解性免疫細胞の表面上に発現される受容体に結合する分泌タンパク質、または前記分泌タンパク質の機能的断片または機能的変異体をコードする外因性核酸を含み、前記タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞に向かって前記免疫細胞を引き付ける。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、外因性タンパク質、その抗原性断片、または自殺遺伝子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記外因性タンパク質は微生物タンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、寄生虫、または原生動物のタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ニドウイルス目のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、コロナウイルス科のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、オルトコロナウイルス亜科のものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、サルベコウイルス亜属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号１のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスのものである。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、幹細胞から分化したものである。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、上皮細胞または内皮細胞である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、癌細胞ではない。
いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、放射線照射されている。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、幹細胞である。

いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、インビトロ、インビボ、またはその両方で増殖することができない。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、ワクチンで使用するためのものである。

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのゲノム破壊は、エンドヌクレアーゼによって媒介される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのゲノム破壊は、エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系によって媒介され、前記ｇＲＮＡは、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列を含む。

いくつかの実施形態は、（ａ）少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、（ｂ）貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、核酸と、（ｃ）外因性抗原タンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸と、を含む、遺伝子操作されたヒト細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、前記外因性抗原タンパク質またはその抗原性断片は、微生物タンパク質またはその抗原性断片である。いくつかの実施形態では、前記外因性抗原タンパク質は、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、寄生虫、または原生動物のタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ニドウイルス目のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、コロナウイルス科のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、オルトコロナウイルス亜科のものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、サルベコウイルス亜属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号１のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスに由来する。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、幹細胞から分化したものである。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、上皮細胞または内皮細胞である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、癌細胞ではない。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、放射線照射されている。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、自然免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態は、本明細書に開示される遺伝子操作されたヒト細胞の集団を提供する。

いくつかの実施形態は、本明細書に開示される前記遺伝子操作されたヒト細胞、及び賦形剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に開示される組成物、または遺伝子操作されたヒト細胞を含む単位剤形を提供する。

いくつかの実施形態は、遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を作製する方法を提供し、前記方法は、ヒト幹細胞の集団を得ることと、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子においてゲノム破壊を誘導することと、貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸を導入することであって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、導入することと、を含み、これにより、遺伝子操作された幹細胞の集団が生成される。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記細胞の表面上での発現を阻害する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質と相互作用するのに十分な期間、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記細胞の表面上での発現を阻害する。

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのゲノム破壊は、エンドヌクレアーゼによって媒介される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのゲノム破壊は、エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系によって媒介され、前記ｇＲＮＡは、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、一本鎖ＤＮＡ切断、または二本鎖ＤＮＡ切断である。

いくつかの実施形態では、前記方法は、微生物タンパク質、またはその抗原性断片をコードする核酸を導入することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、または寄生虫タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

いくつかの実施形態では、前記方法は、前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を分化させることを含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、上皮細胞または内皮細胞に分化する。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、自然免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態は、最終分化した遺伝子操作されたヒト細胞の集団を作製する方法を提供し、前記方法は、ヒト幹細胞の集団を得ることと、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子、または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子においてゲノム破壊を誘導することと、貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸を導入することであって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらし、それによって遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を産生する、導入することと、前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を、最終分化した遺伝子操作されたヒト細胞の集団に分化させることと、を含む。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団は、上皮細胞または内皮細胞に分化する。

いくつかの実施形態は、微生物に対してヒト対象を免疫化する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される前記遺伝子操作されたヒト細胞、本明細書に開示される前記組成物、または本明細書に開示される前記医薬組成物を前記対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態は、微生物に対してヒト対象を免疫化する方法を提供し、前記方法は、遺伝子操作されたヒト細胞の集団を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子操作されたヒト細胞の集団は、（ａ）少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、（ｂ）貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、核酸と、（ｃ）微生物タンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸と、を含む。

いくつかの実施形態では、前記結合は、前記遺伝子操作されたヒト細胞の集団の少なくとも一部の免疫細胞媒介性溶解または貪食作用をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記投与することは、前記対象が前記微生物に対する適応免疫応答を開始することをもたらす。

いくつかの実施形態では、前記投与することは、前記微生物タンパク質またはその抗原性断片に特異的に結合するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記投与することは、前記微生物タンパク質またはその抗原性断片に特異的に結合するＢ細胞受容体を発現するＢ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記投与することは、前記微生物タンパク質またはその抗原性断片に特異的に結合する循環抗体の増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質またはその抗原性断片は、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、または寄生虫タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、コロナウイルス科のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号１のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、及びそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスに由来する。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞の集団は、筋肉内または皮下に投与される。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、自然免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、自殺遺伝子をさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む。

いくつかの実施形態は、対象を免疫化する方法を提供し、前記方法は、遺伝子操作された哺乳動物細胞の集団を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞の集団は、（ａ）少なくとも１つのＭＨＣ遺伝子またはＭＨＣ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊であって、前記破壊は、前記破壊を有しない前記遺伝子操作されたヒト細胞と比較してＴ細胞増殖の活性化の減少をもたらす、ゲノム破壊と、（ｂ）貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、核酸と、を含む。

いくつかの実施形態では、前記免疫化は抗原に特異的であり、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞は、当該抗原またはその断片をコードする核酸をさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記免疫化は抗原に特異的であり、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞は、当該抗原またはその断片をさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記活性化は、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞の集団の少なくとも一部の免疫細胞媒介性溶解または貪食作用をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記投与は、前記対象が前記抗原に対する適応免疫応答を開始することをもたらす。いくつかの実施形態では、前記投与は、前記抗原のペプチドを特異的に結合するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、前記投与は、前記抗原のペプチドを特異的に結合するＢ細胞受容体を発現するＢ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、前記投与は、前記抗原に特異的に結合する循環抗体の増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記抗原は、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作された哺乳動物細胞の細胞質内で発現される。

いくつかの実施形態では、前記抗原は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、コロナウイルス科のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、またはデルタコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号１のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含む群から選択されるウイルスに由来する。

いくつかの実施形態では、前記抗原は、がんまたは腫瘍に関連するタンパク質またはペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、前記抗原は、ネオ抗原を含む。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された細胞の集団は、筋肉内または皮下に投与される。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、自然免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞は、自殺遺伝子をさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞は、遺伝子操作されたヒト細胞を含み、前記ＭＨＣ遺伝子はＨＬＡ遺伝子を含む。
［図面の簡単な説明］

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲で詳細に記述されている。本発明の特徴及び利点のさらなる理解は、本発明の原理が利用される説明的実施形態を記述する以下の詳細な説明と、添付の図面とを参照することによって得られるであろう。

アミノ酸配列ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓｐｉｋｅ（Ｓ）タンパク質、及びその中の個々のドメインを示す（配列番号１）。

本明細書に記載の細胞ワクチンプラットフォームの例示的なワークフローを示すフローチャートである。

本明細書に記載のワクチン細胞を表す。

ウイルス感染に対する免疫応答の例示的な図である。 本明細書で提供される組成物を使用したワクチン接種から生じる例示的な応答を示す。ユニバーサルワクチン細胞（ＵＶＣ）は、中和抗体の産生と持続的な細胞性免疫のために、免疫系の自然な生理的で強力な活性化を誘発するように遺伝子操作された、抗原を搭載した生細胞をインビボで送達する。ＵＶＣは、自然免疫細胞によるロバストな溶解を介して自己補助特性を持ち、ウイルス感染に対する自然の宿主応答と同様の細胞及び抗体免疫応答を活性化し、自然な生理的免疫を再現することができる。

ＮＫ細胞上の例示的な阻害受容体及び活性化受容体、ならびに標的細胞上のそれらの同族リガンドを示す。これらの受容体のいずれか１つは、本明細書に記載のワクチン細胞によって異所的にまたは内因的に発現され得る。

ＮＫ細胞がプラットフォーム細胞、例えばＭＨＣ－Ｉ成分を欠く細胞を、異物、ウイルス感染または病原性のいずれかとして認識し、それらを細胞溶解の標的とすることを示す例示的な概略図である。

プラットフォーム細胞、例えばＣＲＩＳＰＲノックアウトＢ２Ｍ（ＭＨＣクラスＩ複合体の構成要素）ｉＰＳＣ細胞が、ＩＦＮｇ刺激後でさえもＭＨＣＩの消失発現を示すことを示す。

Ａは、本明細書に記載のＢ２Ｍ欠損プラットフォーム細胞が、対照ｉＰＳ細胞と比較してＭＨＣミスマッチＴ細胞の増殖を活性化できないことを示し、本明細書に記載の細胞の有効性を実証する。Ｂは、ＣＤ３１＋ＣＤ１４４＋内皮細胞に分化したプラットフォーム細胞の７日目のフローサイトメトリープロットを示す。

表５のＮＫ活性化リガンドを過剰発現する、本明細書に記載のプラットフォーム細胞由来内皮細胞の、トランスフェクションの４８時間後に取得したフローサイトメトリープロットを示す。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（全長及びスパイクＳ１サブユニット）の変異体を発現する内皮細胞の溶解時に、両方のタンパク質抗原変異体が豊富に検出され、ワクチン細胞数の用量依存的な増加を示したことを示す。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及びスパイクタンパク質構造の概略図である。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞殺傷アッセイを示す。エフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）比を増加させた時の、Ｋ５６２細胞またはｉＰＳＣ由来内皮細胞（プラットフォーム細胞から分化した）のいずれかの死滅標的細胞の割合を示す。

ユニバーサルワクチン細胞（ＵＶＣ）の概略図である。ＵＶＣは、Ｂ２Ｍ遺伝子座に欠失を含み（ＫＯ－Ｂ２Ｍ）、ＭＨＣ－Ｉ欠損となる。ＵＶＣはまた、２つのノックイン（ＫＩ）構築物を含む。１つのＫＩ構築物はＵＶＣの細胞表面でＮＫリガンドＭＩＣＡを発現し、もう１つのＫＩ構築物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及びヌクレオカプシドリンタンパク質を細胞内で発現する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドリンタンパク質の全長アミノ酸配列（配列番号５４）を示す。

Ｔ２Ａペプチド切断配列によって接続された、ＵＶＣにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（ＳＰＩＫＥ）タンパク質及びヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）の発現カセットの概略図を示す。構築物は、ＥＦ１ａプロモーターによって駆動される。

ヌクレオカプシドリンタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム全体で最高密度のエピトープを有することを示している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム全体の機能的エピトープの分布がプロットされている。各バーは、１つの検証済みエピトープを表す。Ｘ軸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦｅｏｍｅ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎ ｆｒａｍｅ－ｏｍｅ）での位置を示す。バーの塗りつぶしはそのＭＨＣ制限を示し、バーの高さはエピトープを認識するＭＨＣ一致患者の割合を示す。スクリーンデータにおけるエピトープの凝集能が閾値（健常対照におけるすべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２断片の濃縮の平均＋２ＳＤ）を超えた場合、患者はエピトープに対して陽性とみなされた。わかりやすくするために、重複するエピトープは隣接するバーとしてプロットされている。

ＯＲＦ１ａｂがすべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦの中で最もエピトープを有することを示す。各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦのエピトープ数がプロットされている。積み上げ棒グラフはＯＲＦあたりの免疫優性エピトープの数を示し、バーの塗りつぶしは各エピトープのＭＨＣ制限を示す。ＭＨＣの塗りつぶしの符号は、図１４Ｃのものと同じである。

ＵＶＣが高レベルのＮＫリガンドＭＩＣＡを発現するが、ＭＨＣ－Ｉをまったく発現しないことを示している。パネルＡは、ＵＶＣ及び親人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）におけるＮＫリガンドＭＩＣＡのフローサイトメトリー分析を示す。Ｘ軸は、ＭＩＣＡタンパク質の蛍光強度を示す。Ｙ軸は、細胞の数を示す。細胞の種類を示す領域の塗りつぶしは、プロットの右側に表示される。パネルＢは、ＵＶＣ及び親ｉＰＳＣにおけるＭＨＣ－Ｉの発現のフローサイトメトリー分析を示す。Ｘ軸は、ＭＨＣ－１（ＨＬＡサブタイプＡ、Ｂ、またはＣ）の蛍光強度を示す。Ｙ軸は、細胞の数を示す。

ＭＨＣ－Ｉ欠損ＵＶＣがインビトロでサルＮＫ細胞によるロバストな細胞溶解を誘発することを示す。カルセインＡＭ（ＣＡＭ）染色を含むフローサイトメトリーによるナチュラルキラー細胞毒性アッセイを使用して、ＮＫ細胞の存在下でＵＶＣの細胞毒性の量を測定した。Ｘ軸は、エフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）比を示す。Ｙ軸は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性の割合（％）を示す。ＭＨＣ－Ｉ欠損内皮細胞（ＫＯ ＥＣ）は、野生型ＥＣ（ＷＴ ＥＣ）のそれと比較して、マカクＮＫ細胞と混合した場合により高い細胞毒性を示した。ＫＯ ＥＣとＷＴ ＥＣの両方がＵＶＣ ｉＰＳＣから分化した。

図１７Ａ及び図１７Ｂは、追加のＮＫリガンドがＭＨＣ－Ｉ欠損ＵＶＣに対するＮＫ細胞応答を増加させることを示す。図１７Ａは、追加のＮＫリガンドが、ＭＨＣ－Ｉ欠損ＵＶＣに応答して、ＮＫ細胞におけるサイトカインの発現を増加させ得ることを示している。細胞内サイトカイン染色アッセイを使用して、ＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａ、ＭＩＰ１－β、ＩＦＮ－γ、またはＴＮＦ－αの発現を測定した。応答するすべてのＮＫ細胞の概要を右端に表示する。Ｘ軸は、リガンドを発現しないＫＯ－ＵＶＣ（ＫＯ）、ＭＩＣＡ（ＫＯ－ＭＩＣＡ）、ＭＩＣＢ、（ＫＯ－ＭＩＣＢ）、またはＵＬＢＰ１（ＫＯ－ＵＬＢＰ１）がリストされている。Ｙ軸は、ＫＯ－ＵＶＣに応答するＮＫ細胞の割合（％）を示す。各ポイントは、試験された個々の動物を表す。 図１７Ａ及び図１７Ｂは、追加のＮＫリガンドがＭＨＣ－Ｉ欠損ＵＶＣに対するＮＫ細胞応答を増加させることを示す。図１７Ｂは、追加のＮＫリガンドがＮＫ細胞において複数のサイトカインの発現を誘導させ得ることを示している。Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ（ＳＰＩＣＥ）を使用して、ＮＫ細胞の多次元サイトカイン反応を分析した。円弧と円グラフの塗りつぶしの凡例を下部に表示している。

図１８Ａ及び図１８Ｂは、ＵＶＣ ｉＰＳＣにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のロバストな発現を示す。図１８Ａは、ＵＶＣ ｉＰＳＣの約半数がスパイクタンパク質を発現したことを示す。フローサイトメトリー分析を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の発現を測定した。Ｘ軸とＹ軸は、それぞれスパイクタンパク質の蛍光染色強度及び前方散乱高ＦＳＣ－Ｈを示している。ＭＩＣＡ（ＭＩＣＡ＋）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（スパイク＋）の両方を発現するように操作されたＭＨＣ－Ｉ欠損（Ｂ２Ｍ－／－）ＩＰＳＣの約４８．５％は、ＭＩＣＡのみを発現するように操作された対照ＩＰＳＣのわずか約０．４１％と比較して、スパイクタンパク質の高レベル発現を有していた。 図１８Ａ及び図１８Ｂは、ＵＶＣ ｉＰＳＣにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の強い発現を示す。図１８Ｂは、ＵＶＣ ｉＰＳＣにおけるスパイクタンパク質の発現レベルが、スパイクタンパク質発現プラスミドで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における発現量と同等であったことを示す。細胞表面フロー分析を用いて、ＨＥＫ２９３細胞及びＵＶＣ ｉＰＳＣにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の発現を測定した。Ｘ軸及びＹ軸は、スパイクタンパク質の蛍光染色強度及び細胞数をそれぞれ示す。

図１９Ａ及び図１９Ｂは、６匹のサルについて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（図１９Ａ）または全長スパイクタンパク質（図１９Ｂ）の両方について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその受容体結合ドメインを発現するＵＶＣによるワクチン接種後０、２、６、及び８週目における抗体ＥＬＩＳＡの結果を示し、ＮＨＰモデルにおけるＵＶＣの機能テストを実証する。 図１９Ａ及び図１９Ｂは、６匹のサルについて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（図１９Ａ）または全長スパイクタンパク質（図１９Ｂ）の両方の受容体結合ドメインについて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその受容体結合ドメインを発現するＵＶＣによるワクチン接種後０、２、６、及び８週目における抗体ＥＬＩＳＡの結果を示し、ＮＨＰモデルにおけるＵＶＣの機能テストを実証する。

以下の説明及び実施例は、本発明の実施形態を詳細に説明する。本発明が本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、変化し得ることを理解されたい。当業者においては、本発明の範囲内に含まれる本発明の多数の変形及び修正があることが理解される。
定義

参照数値及びその文法的等価物に関する本明細書で使用される用語「約」及びその文法的等価物は、その値からプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含み得る。例えば、「約１０」という量には、９～１１までの量が含まれる。参照数値に関連する用語「約」は、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の値の範囲を含むこともできる。

本明細書で使用される用語「ワクチン」及びその文法的等価物は、感染症に対する宿主免疫応答を誘発する薬剤を指す。

本明細書で使用される用語「細胞ワクチン」及びその文法的等価物は、宿主免疫系に抗原を曝露するために細胞を利用するワクチン剤を指す。

本明細書で使用される用語「標的細胞」または「標的細胞株」及びそれらの文法的等価物は、特定のタイプの病原体抗原のキャリアとして本明細書に記載される選択された細胞株を指す。

本明細書で使用される用語「活性化」または「活性化する」及びその文法的等価物は、細胞が休止状態から活性状態に移行するプロセスを指すことができる。

本明細書で使用される用語「抗原」及びその文法的等価物は、１つまたは複数の受容体または抗体によって結合され得る、１つまたは複数のエピトープまたは結合部位を含む分子を指す。例えば、抗原が提示されると、抗原は宿主の免疫系を刺激して、細胞性抗原特異的免疫応答または体液性抗体応答を誘発することができる。抗原はまた、それ自体で、または別の分子または他の分子と組み合わせて存在する場合に、細胞性及び／または体液性応答を誘発する能力を有し得る。

本明細書で使用される「操作された細胞」及びその文法上等価物は、外因性核酸またはアミノ酸配列を含む、または内因性核酸配列における変化、付加、または欠失を含む細胞を指す。

本明細書で論じる「自然免疫系」とは、非自己病原体に対する防御の最前線が、対象の自然免疫応答または非特異的免疫応答であることを指す。自然免疫応答は、病原体に対する物理的、化学的及び細胞的防御からなる。本明細書に記載の「自然免疫細胞」は、一般に、自然免疫応答に関与する貪食性または細胞溶解性免疫細胞を指す。具体的には、これらの貪食性または細胞溶解性免疫細胞には、単球（マクロファージに発達する）、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びマスト細胞が含まれる。

本明細書で使用される用語「構築物」及びその文法的等価物は、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。

本明細書で使用される用語「ベクター」及びその文法的等価物は、標的細胞への外来遺伝物質の送達または移入を指示することができる任意の核酸構築物を指し、そこで複製及び／または発現させることができる。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状分子または環状分子であり得る。ベクターは、組み込み型または非組み込み型のいずれかであり得る。

本明細書で使用される用語「組み込み」及びその文法的等価物は、細胞ゲノムに安定に挿入される構築物の１つ以上のヌクレオチド、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合で連結されたヌクレオチドを指す。

本明細書で使用される用語「導入遺伝子」及びその文法上の等価物は、細胞に移入される遺伝子または遺伝物質を指す。例えば、導入遺伝子は、細胞に導入される遺伝子を含むＤＮＡのストレッチまたはセグメントであり得る。導入遺伝子は、操作された細胞において、ＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、タンパク質）を産生する能力を保持することができる。導入遺伝子は、異なる核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡから構成することができる。導入遺伝子は、組換えアームを含むことができる。導入遺伝子は、操作された部位を含むことができる。

用語「ＣＲＩＳＰＲ」、「ＣＲＩＳＰＲ系」、または「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系」及びそれらの文法的等価物は、ヌクレアーゼ機能性（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＤＮＡ及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合する非コードＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ）を含むことができる。例えば、Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ．ａｌ，“ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：３４７－３５５（２０１４）を参照されたく、また、例えば、Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｃｅｌｌ １５７（６）：１２６２－１２７８（２０１４）を参照されたい。

本明細書で使用される用語「配列」及びその文法的等価物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線形、環状、または分岐であり得、かつ、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得るヌクレオチド配列を指す。配列は変異する可能性がある。配列は、任意の長さ、例えば、２～１，０００，０００ヌクレオチド長以上（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値）、例えば、約１００～１０，０００ヌクレオチド、または約２００～５００ヌクレオチドであり得る。

本明細書で使用される場合、用語「リプログラミング」または「脱分化」または「分化能の増大」または「発生能の増大」は、細胞の分化能を増大させるか、または細胞をより分化していない状態に脱分化させる方法を指す。例えば、分化能が増大した細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より発生的柔軟性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化できる）。換言すれば、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞よりも分化していない状態にある細胞である。

本明細書で使用される場合、用語「分化」は、特殊化されていない（「コミットされていない」）細胞または特殊化の程度が低い細胞が、例えば血液細胞または筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞または分化誘導された細胞は、細胞の系列内でより特殊化された（「コミットされた」）位置を取った細胞である。用語「コミットされた」は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下では、特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、通常の状況下では、異なる細胞型に分化すること、または分化の程度が低い細胞型に戻すことができない点まで分化経路で進行した細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「多能性」は、細胞が体または体細胞のすべての系統を形成する能力を指す（すなわち、胚本体）。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の３つの胚葉のそれぞれからの細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全または部分的な多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）に至るまでの発生能の連続である。

本明細書で使用される場合、用語「人工多能性幹細胞」、つまりｉＰＳＣは、幹細胞が、誘導または変化された分化した成人、新生児または胎児細胞から産生される、すなわち、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の３つの胚葉または真皮層のすべての組織に分化することができる細胞にリプログラミングされることを意味する。産生されたｉＰＳＣは、自然界に存在する細胞を指すものではない。

本明細書で使用される場合、用語「ユニバーサルワクチン細胞」「ＵＶＣ」は、本明細書に記載のワクチン組成物を指す。ワクチン組成物は、本明細書で提供される細胞を含むことができる。

本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、外胚葉、内胚葉及び中胚葉の３つの一次胚葉のすべての誘導体の発生中に生じる。それらは胚体外膜または胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。

本明細書で使用される場合、用語「多分化能幹細胞」は、１つまたは複数の胚葉（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の細胞に分化する発生能を有する細胞を指すが、３つすべてではない。したがって、多分化能細胞は「部分的分化細胞」とも呼ばれる。多分化能細胞は当技術分野で周知であり、多分化能細胞の例には、例えば造血幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が挙げられる。「多分化能」とは、ある細胞が特定の系統で多くの種類の細胞を形成し得るが、他の系統の細胞は形成しないことを示す。例えば、多分化能造血細胞は、様々な種類の血液細胞（赤血球、白血球、血小板など）を形成できるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、用語「多分化能」は、全能性及び多能性よりも低い程度の発生能を有する細胞の状態を指す。

多能性は、部分的に、細胞の多能性特性を評価することによって決定することができる。多能性の特徴には、（ｉ）多能性幹細胞の形態、（ｉｉ）無制限の自己再生の可能性、（ｉｉｉ）それだけには限定されないがＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＱ ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／またはＣＤ５０を含む多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つすべての体細胞系統（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成、が挙げられるが、これらに限定されない。

２種類の多能性がこれまでに説明されている：後期胚盤胞のエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した多能性の「プライム」または「準安定」状態、及び初期／着床前胚盤胞の内部細胞塊に類似した多能性の「ナイーブ」または「基底」状態。両方の多能性状態が上記のような特徴を示すが、ナイーブ状態または基底状態はさらに、（ｉ）女性細胞におけるＸ染色体の前不活性化または再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性及び生存率の改善、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な減少、（ｉｖ）発生調節遺伝子プロモーター上のＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の減少、（ｖ）プライム状態の多能性細胞に対する分化マーカーの発現低下、を示す。外因性の多能性遺伝子を体細胞に導入し、発現させ、次いでサイレンシングするか、または得られた多能性細胞から除去する細胞リプログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性のプライム状態の特徴を有すると見られる。標準的な多能性細胞培養条件下では、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限り、プライム状態のままであり、ここで、基底状態の特徴が観察される。

「多能性因子」または「リプログラミング因子」は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、限定するものではないが、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子が含まれる。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子及び小分子リプログラミング剤が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「多能性幹細胞形態学」は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、形状が丸くて小さく、核対細胞質比が高く、核小体の顕著な存在、及び典型的な細胞間の間隔を有することを特徴とする。

概要
本開示は、とりわけ、あらゆる病原体に対するロバストで、安全で、高度に拡張可能な細胞ワクチンの開発を可能にする、現在のシステムよりも明確な利点を提供する新規な細胞ワクチンプラットフォームを提供する。微生物に対するワクチン接種に使用される標準的なワクチンは、ウイルス、脂質ナノ粒子、または核酸を利用する。これらの標準的なワクチンとは異なり、細胞性ワクチンは、免疫原性抗原を生理学的に関連する方法で送達するという明確な利点を提供し、対象が自然に感染した場合と同様に宿主免疫細胞が抗原と結合することを可能にする。さらに、細胞成分は、ロバストな免疫応答及び免疫記憶の発達を促進するために、自然免疫系の細胞を刺激し、誘引し、及び動員するアポトーシス体のインビボ作成を介して固有のアジュバントとして作用する可能性が高い。細胞ワクチンは、感染細胞の免疫細胞溶解の自然なプロセスを実際に「模倣」するため、抗原は侵入する病原体に対する自然獲得免疫を介して行われるのとまったく同じ方法で免疫系に送達される。したがって、いくつかの実施形態は自己アジュバント性である。

がん細胞株系の細胞ワクチンは現在開発中である。しかしながら、これらの他の細胞ワクチンとは異なり、本開示は、遺伝子操作された新規の細胞ワクチンを提供し、これにより、がん細胞株の生物学の自然の偶然とは対照的に、死滅するように設計された「理想的な」標的細胞の正確な作成が可能になる。標的細胞によって発現される細胞表面受容体は、宿主自然免疫系の定義された細胞による「標的化された」溶解（すなわち、ＭＨＣの不在及び「ｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ」シグナルの獲得、ならびに細胞溶解細胞及び食細胞に対する「ｋｉｌｌ－ｍｅ」シグナルの標的化発現）のために特異的に設計される。

本開示の実施形態は、インビトロで分化させることができる幹細胞（例えば人工多能性幹細胞）を利用する細胞ワクチンプラットフォームを提供する。幹細胞（例えば、ｉＰＳＣｓ）の使用は、安定して一貫した細胞産物の大量生産に操作されたワクチンのストックを永続的に増殖させる能力を保持しながら、いかなるタイプの形質転換癌細胞を使用する必要もないため、有益である。定義された、最終分化した安定した細胞系列（上皮細胞または皮膚樹状「ランゲルハンス」細胞など）への分化は、ワクチンががん型細胞からさらに離れ、送達されるレシピエント組織からの細胞型と同じ細胞型を設計することを可能にする。

本明細書においてさらに提供されるのは、「ＡＰＣ擬態」が存在するように、幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）から上皮（樹状）抗原提示細胞（ＡＰＣ）に分化した遺伝子操作された細胞を含むワクチンである。ワクチンのいくつかの実施形態は、宿主患者の天然ＭＨＣ特異的ＡＰＣ／自然免疫系に提示されるＭＨＣヌル及びＮＫ／Ｍｏ自然免疫＋ＡＰＣを含む。そのため、ワクチンは、本発明のユニバーサルワクチン細胞（ＵＶＣ）の皮膚への皮内／ＳＱ注射後、及びワクチン注射後の体内のＡＰＣの最前線部位に、持続的な免疫を付与するために、優れたより安全な免疫抗原反応及び中和Ａｂ産生を生成する必要がある。

表１は、細胞ワクチンとウイルスベクター系ワクチンとの間のさらなる比較、及び細胞系ワクチンの例示的な利点を提供する。

いくつかの実施形態において、本明細書では、（ａ）少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、（ｂ）貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する細胞表面タンパク質、または前記細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする外因性核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、外因性核酸と、を含む、遺伝子操作されたヒト細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記細胞の表面上での発現を阻害する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、ＮＫ細胞の表面上に発現されるタンパク質と相互作用するのに十分な期間、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上での発現を阻害する。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子にある。いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、またはβ－ミクログロブリン遺伝子である。いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子はβ－ミクログロブリン遺伝子である。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子にある。いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子である。

いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子は、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＲＦＸＡＰ遺伝子、またはＲＦＸＡＮＫ遺伝子である。いくつかの実施形態では、前記ＨＬＡ遺伝子はＣＩＩＴＡ遺伝子である。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ遺伝子または前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊、及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子または前記ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊を含む。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ転写調節因子遺伝子におけるゲノム破壊、及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ転写調節因子におけるゲノム破壊を含む。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、自然免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態では、前記結合は、前記ＮＫ細胞の細胞溶解活性の活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、前記細胞表面タンパク質は、ＮＫ細胞の表面に発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体に特異的に結合するリガンドである。いくつかの実施形態では、前記細胞表面タンパク質は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２（ネクチン－２）、Ｂ７－Ｈ６、Ｎｅｃｌ－２、及び免疫グロブリンＦｃからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞表面タンパク質は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンドである。いくつかの実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞活性化リガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２（ネクチン－２）、Ｂ７－Ｈ６、及びＮｅｃｌ－２からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、前記細胞は、貪食細胞または細胞溶解性免疫細胞の表面上に発現される受容体に結合する分泌タンパク質、または前記分泌タンパク質の機能的断片または機能的変異体をコードする外因性核酸を含み、前記タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞に向かって前記免疫細胞を引き付ける。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、外因性タンパク質、その抗原性断片、または自殺遺伝子をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記外因性タンパク質は、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記外因性タンパク質は、外因性抗原タンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、微生物タンパク質、またはその抗原性断片をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、がんもしくは腫瘍関連タンパク質、またはその抗原性断片をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記がんまたは腫瘍関連タンパク質は、新生抗原またはその抗原性断片を含む。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、寄生虫、または原生動物のタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ニドウイルス目のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、コロナウイルス科のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、オルトコロナウイルス亜科のものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、サルベコウイルス亜属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号１のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスのものである。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、幹細胞から分化したものである。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、上皮細胞または内皮細胞である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、癌細胞ではない。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、放射線照射されている。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、インビトロ、インビボ、またはその両方で増殖することができない。

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのゲノム破壊は、エンドヌクレアーゼによって媒介される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのゲノム破壊は、エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系によって媒介され、前記ｇＲＮＡは、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書では、（ａ）少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、（ｂ）貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、核酸と、（ｃ）外因性タンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸と、を含む、遺伝子操作されたヒト細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、前記外因性タンパク質またはその抗原性断片は、微生物タンパク質またはその抗原性断片である。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、当技術分野で知られている技術を使用して、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または他の方法で遺伝子操作されたヒト細胞に挿入される。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、寄生虫、または原生動物のタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ニドウイルス目のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、コロナウイルス科のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、オルトコロナウイルス亜科のものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、サルベコウイルス亜属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号１のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスのものである。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、幹細胞から分化したものである。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、上皮細胞または内皮細胞である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、癌細胞ではない。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、放射線照射されている。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、自然免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞の集団を含む組成物が本明細書に提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子操作されたヒト細胞を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子操作されたヒト細胞を含む医薬組成物を含む、単位剤形を提供する。

いくつかの実施形態において、本明細書では、遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を作製する方法を提供し、前記方法は、ヒト幹細胞の集団を得ることと、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子、または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子においてゲノム破壊を誘導することと、貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸を導入することであって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、導入することと、を含み、それによって遺伝子操作された幹細胞の集団を産生する。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記細胞の表面上での発現を阻害する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質と相互作用するのに十分な期間、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記細胞の表面上での発現を阻害する。

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのゲノム破壊は、エンドヌクレアーゼによって媒介される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのゲノム破壊は、エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系によって媒介され、前記ｇＲＮＡは、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列を含む、いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、一本鎖ＤＮＡ切断または二本鎖ＤＮＡ切断である。

いくつかの実施形態では、前記方法は、微生物タンパク質、またはその抗原性断片をコードする核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、または寄生虫タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記方法は、がんまたは腫瘍関連タンパク質、ネオ抗原、またはその抗原性断片をコードする核酸を導入することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を分化させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、上皮細胞または内皮細胞に分化する。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞が自然免疫細胞である、請求項７９～９３のいずれか一項に記載の前記遺伝子操作されたヒト細胞。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態において、本明細書では、遺伝子操作されたヒト分化細胞の集団を作製する方法を提供し、前記方法は、ヒト幹細胞の集団を得ることと、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子、または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子においてゲノム破壊を誘導することと、貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸を導入することであって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、導入することと、それによって遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を産生し、及び、前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を、最終分化した遺伝子操作されたヒト細胞の集団に分化させることと、を含む。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団は、上皮細胞または内皮細胞に分化する。

いくつかの実施形態において、本明細書では、微生物に対してヒト対象を免疫化する方法を提供し、前記方法は、前記対象に、本明細書に記載の前記遺伝子操作されたヒト細胞、本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞を含む組成物、または本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞を含む医薬組成物を、前記対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書では、微生物に対してヒト対象を免疫化する方法を提供し、前記方法は、遺伝子操作されたヒト細胞の集団を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子操作されたヒト細胞の集団は、（ａ）少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、（ｂ）貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性もしくは細胞溶解活性の活性化をもたらす、核酸と、（ｃ）微生物タンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸と、を含む。

いくつかの実施形態では、前記結合は、前記遺伝子操作されたヒト細胞の集団の少なくとも一部の免疫細胞媒介性溶解または貪食作用をもたらす。

いくつかの実施形態では、前記投与することは、前記対象が前記微生物に対する適応免疫応答を開始することをもたらす。いくつかの実施形態では、前記投与することは、前記微生物タンパク質のペプチドを特異的に結合するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、前記投与することは、前記微生物タンパク質のペプチドを特異的に結合するＢ細胞受容体を発現するＢ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、前記投与することは、前記微生物タンパク質を特異的に結合する循環抗体の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、または寄生虫タンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、コロナウイルス科のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号１のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスタンパク質は、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスのものである。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された細胞の集団は、筋肉内または皮下に投与される。

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、自然免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である。いくつかの実施形態では、前記自然免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態では、前記ヒト細胞は、自殺遺伝子、例えば、細胞内活性を欠くかまたは低いレベルを示すが、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２結合抗体などの薬剤を投与することによって標的化され得る、切断されたＥＧＦＲまたは切断されたＨＥＲ２遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む。

プラットフォーム
本明細書では、とりわけ、ワクチンで使用するための遺伝子改変プラットフォーム細胞を含むワクチンプラットフォームを提供する。具体的には、本明細書に記載のプラットフォーム細胞は、同種異系ワクチンプラットフォームとしての使用を容易にするための、１つ以上のＭＨＣ遺伝子（または特にヒト細胞の場合はＨＬＡ遺伝子）の破壊によって遺伝子改変された胚性幹細胞または多能性幹細胞などの幹細胞である。本明細書に記載のプラットフォーム細胞は、ウイルス抗原などの特定の抗原に合わせた特定のワクチンに関連する外因性タンパク質またはその抗原性断片を発現するように改変することができる。

いくつかの実施形態では、プラットフォーム細胞は、少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊を含み、貪食性または細胞溶解性免疫細胞、例えば自然免疫細胞に結合し、免疫細胞の活性（例えば、貪食作用、細胞溶解活性、炎症誘発性サイトカイン分泌）を刺激する外因性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、プラットフォーム細胞は、貪食細胞または細胞溶解性免疫細胞をプラットフォーム細胞（またはプラットフォーム細胞から設計されたワクチン細胞）に引き付ける分泌外因性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、プラットフォーム細胞は、貪食性または細胞溶解性免疫細胞に結合する外因性細胞表面タンパク質をその表面に発現及び分泌するか、または提示する。

プラットフォーム細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるプラットフォーム細胞は、操作された幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はマウスまたは非ヒト霊長類細胞である。場合によっては、ｉＰＳなどの細胞は、上皮（外胚葉はｉＰＳに由来する）、ＡＰＣ（ランゲルハンス、樹状細胞）、またはそれらの組み合わせに分化することができる。

ＨＬＡ改変：
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプラットフォーム細胞は、少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記細胞の表面上での発現を阻害する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、自然免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質と相互作用するのに十分な期間、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上での発現を阻害する。

いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、例えば、本明細書に記載の操作された細胞を投与される対象において、またはエクスビボアッセイにおいて、前記ＨＬＡ遺伝子を発現する別の細胞と比較して、ＨＬＡまたはＭＨＣ媒介性Ｔ細胞活性化及び／または増殖の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、前記ゲノム破壊は、例えば、本明細書に記載の操作された細胞を投与された対象において、またはエクスビボアッセイにおいて、前記ゲノム破壊を欠く同等の細胞と比較して、より少ないＨＬＡまたはＭＨＣ媒介Ｔ細胞応答をもたらす。

場合によっては、プラットフォーム細胞は、ＨＬＡ欠損になるように操作された幹細胞である可能性があり得る。ＨＬＡ欠損細胞は、ＨＬＡクラスＩ欠損、またはＨＬＡクラスＩＩ欠損、またはその両方であり得る。特定の実施形態では、ＨＬＡ欠損細胞は、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体及び／またはＨＬＡクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現を欠くか、またはもはや維持しないか、またはレベルが低下した細胞を指し、減少または減少したレベルは、他の細胞または合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低い。

ＨＬＡクラスＩ欠損は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失もしくはゲノム破壊、またはβ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子及びタパシンを含むが、これらに限定されないＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の欠失、破壊、または発現レベルの低下によって達成され得る。いくつかの実施形態では、破壊されたＨＬＡクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子である。

ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５及びＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失、破壊または減少によって達成され得る。いくつかの実施形態では、破壊されたＨＬＡクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子である。

いくつかの実施形態において、本明細書では、ｉＰＳＣなどのＨＬＡ欠損幹細胞であるプラットフォーム細胞を提供し、ＨＬＡ欠損幹細胞は、限定されないが、分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリンまたはパラクリン）、走化性、及び細胞傷害活性の改善に関連するタンパク質（例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４１ＢＢ、ＤＡＰＩＯ、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ｚ、４１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、及びＰＤＬ１）を発現する遺伝子を導入することによってさらに改変される。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ遺伝子または前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊、及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子または前記ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたヒト細胞は、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ転写調節因子遺伝子におけるゲノム破壊、及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ転写調節因子におけるゲノム破壊を含む。

いくつかの実施形態では、プラットフォーム細胞は、細胞表面にＨＬＡ Ｉタンパク質を全く発現しない。いくつかの実施形態では、前記細胞は、細胞表面にＨＬＡ ＩＩタンパク質を全く発現しない。いくつかの実施形態では、前記細胞は、細胞表面にＨＬＡ ＩまたはＨＬＡ ＩＩタンパク質を全く発現しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプラットフォーム細胞は、ＨＬＡが適合しない対象に投与された場合に、対象によって免疫応答が開始されるのに十分なＨＬＡ Ｉタンパク質を細胞表面に発現しない。いくつかの実施形態では、プラットフォーム細胞は、ＨＬＡが適合しない対象に投与された場合に、対象によって免疫応答が開始されるのに十分なＨＬＡ ＩＩタンパク質を細胞表面に発現しない。

自然免疫細胞活性の刺激：
本明細書に記載のプラットフォーム細胞は、ＮＫ細胞、樹状細胞、好中球、マクロファージまたはマスト細胞などの自然免疫細胞に結合する外因性タンパク質を発現するように操作され、自然免疫細胞の活性（例えば、細胞溶解活性、炎症誘発性サイトカイン分泌）を刺激する。

いくつかの実施形態では、プラットフォーム細胞は、ＮＫ細胞、樹状細胞、好中球、マクロファージまたはマスト細胞などの自然免疫細胞に結合する外因性タンパク質をコードする核酸を含み、自然免疫細胞の活性（例えば、トロゴサイトーシス）を刺激する。

自然免疫細胞の活性化は、脱顆粒／活性化マーカー（ＣＤ１０７ａ、ＣＤ６３、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６９、）、グランザイムＢ、ＩＦＮｇ、ＭＩＰ－１ｂ、パーフォリン、ＴＮＦａ、またはこれらの任意の組み合わせのレベルのうちの少なくとも１つを分析することによって決定することができる。活性化はまた、イメージング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、定量ＰＣＲ、またはそれらの任意の組み合わせによって決定することができる。

ＮＫ細胞：
ＮＫ細胞は、他の細胞の表面に発現しているタンパク質を認識する複数の活性化及び阻害性受容体を発現する。正常な健常細胞は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のリガンドとして作用してＮＫ細胞の自己耐性に寄与するＭＨＣクラスＩ分子を表面上で発現する。病原体感染細胞は表面ＭＨＣクラスＩ発現を失い、ＮＫ細胞における抑制シグナルの低下をもたらす。ＤＮＡ損傷反応または老化プログラムなどのウイルス感染に関連する細胞ストレスは、感染細胞の受容体を活性化するためのリガンドを上方制御する。その結果、ＮＫ細胞における活性化受容体からのシグナルは、直接的にＮＫ細胞媒介細胞傷害性を介して、または間接的に炎症誘発性サイトカインの分泌を介して、ＮＫ細胞の活性化及び標的細胞の排除に向けてバランスをシフトさせる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプラットフォーム及びワクチン細胞は、１つまたは複数のＮＫ細胞活性化リガンドを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプラットフォーム及びワクチン細胞は、ＮＫ細胞阻害リガンドの発現を減少または排除するように遺伝子操作される。

完全なＮＫ細胞活性化は、標的細胞の表面に発現される１つ以上のＮＫ細胞リガンドによるＮＫ細胞活性化受容体の認識を必要とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプラットフォーム細胞は、ＮＫ細胞によるプラットフォーム細胞の認識及び溶解を増強するように操作される。いくつかの場合では、プラットフォーム細胞は、１つまたは複数のＮＫ細胞活性化リガンドを発現する（または過剰発現する）ように操作される。例えば、一実施形態では、細胞は、細胞ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｎｅｃｌ－２、または表２に列挙される任意の他のリガンドを細胞表面上で発現するように操作することができるか、またはＮＫ細胞に結合するのに十分なそれらの１つ以上の機能ドメインを発現することができる。ＮＫ細胞活性化リガンド、またはそれからのＮＫ細胞結合ドメインを発現させるために、リガンドまたはドメインをコードする外因性遺伝子を導入するように細胞を遺伝子操作することができる（例えば、本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の方法を使用）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞は、表２の少なくとも１つのリガンド、またはその変異体、またはそれからのドメインを発現する。

さらに、ＮＫ細胞は、標的細胞上の阻害性リガンドに結合してＮＫ細胞の活性化を阻害する阻害性受容体を発現する。ＮＫ細胞阻害性受容体は、その細胞質尾部に存在する免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を介してシグナルを伝達する。リガンドが結合すると、ＩＴＩＭはリン酸化を受け、Ｓｒｃ相同性含有チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）、ＳＨＰ－２、及び脂質ホスファターゼＳＨ２ドメイン含有イノシトール－５－ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）などのホスファターゼをリクルートし、活性化シグナルをさらに中和する。ＮＫ細胞阻害性シグナル伝達の間、ホスファターゼＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２はＩＴＡＭ担持Ｖａｖ－１分子を脱リン酸化し、下流のシグナル伝達を防止する。表３は、阻害受容体及び標的細胞上で発現されるそれらに対応するリガンドの例示的なリストを提供する。そのような受容体及びリガンドは、当技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の標的細胞は、１つまたは複数のＮＫ細胞阻害性リガンドを発現しないように（または発現を減少させるように）細胞を操作することによって、ＮＫ細胞によるそれらの認識及び溶解を増強するように操作される。例えば、一実施形態では、細胞は、細胞表面上の１つまたは複数のＨＬＡクラスＩ分子または表３に列挙される任意の他のリガンドにおけるゲノム破壊を誘導するように操作され得る。本明細書に記載のプラットフォーム及びワクチン細胞は、ＮＫ細胞阻害性リガンドをコードする遺伝子の任意の１つまたは任意の組み合わせ、例えば、表３に列挙されたものをノックアウトするように操作され得る。

抗体のオプソニン化を増加または模倣してＡＤＣＣ及び／または貪食作用を増加させる
いくつかの実施形態では、プラットフォーム細胞は、インビボでの貪食作用及び／またはＡＤＣＣ活性の増加を媒介するためにエクスビボでオプソニン化される。いくつかの実施形態では、細胞は、表面上で追加の外因性タンパク質を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞表面に多数の外因性タンパク質を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、細胞が抗体でコーティングされるように外因性タンパク質に結合する抗体（例えば、抗原結合ドメイン及びＦｃドメインを含む）とエクスビボで接触される。細胞のオプソニン化は、それぞれ貪食細胞（例えば、マクロファージ）及びＮＫ細胞による、貪食作用及び／またはＡＤＣＣの増加を媒介することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボでのオプソニン化を増加させるためにエクスビボで操作される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＣＨ２ドメインが細胞膜の近位にあり、ＣＨ３ドメインが細胞膜の遠位にあるように、細胞の表面にＦｃドメインを発現するように操作される。

貪食作用の刺激
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、貪食細胞に結合し、貪食細胞の活性（例えば、貪食作用）を刺激する外因性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、貪食細胞に結合し、貪食細胞の活性（例えば、貪食作用）を刺激するタンパク質をコードする外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、貪食細胞は、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、または好中球である。いくつかの実施形態では、外因性タンパク質は、ホスファチジルセリン、カルレティキュリン、及びｃ１ｑからなる群から選択される。

いくつかの場合では、アポトーシスを受けている細胞は、貪食細胞をそれらに向かって引き付けるために、分子、いわゆる「ｆｉｎｄ－ｍｅ」シグナル（「ｃｏｍｅ－ｔｏ－ｇｅｔ－ｍｅ」シグナルとも称される）を分泌する。これらのシグナルのいずれか及びすべてを、本明細書で提供される細胞に組み込むことができる。Ｓ１Ｐ（スフィンゴシン－１－リン酸）、ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）、ヌクレオチド（ＡＴＰまたはＵＴＰ）及びＣＸ３ＣＬ１（ＣＸ３Ｃモチーフケモカインリガンド１；フラクタルキン）を含む、アポトーシス細胞によって放出される４つの代表的な「ｆｉｎｄ－ｍｅ」シグナルが同定されている。それらは、それぞれ貪食細胞表面上のＳ１ＰＲ、Ｇ２Ａ、Ｐ２Ｙ２及びＣＸ３ＣＲに結合し、アポトーシス細胞への食細胞遊走を促進する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプラットフォーム細胞は、細胞の貪食作用を阻害する少なくとも１つの遺伝子におけるゲノム破壊を含む。いくつかの実施形態では、破壊は、ＣＤ４７及びＣＤ３１からなる群から選択される遺伝子のものである。

免疫細胞のリクルートメント
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、免疫細胞に結合し、免疫細胞をプラットフォーム細胞に引き付ける外因性タンパク質を発現及び分泌するプラットフォーム細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞に結合し、免疫細胞、例えば自然免疫細胞または適応免疫細胞をプラットフォーム細胞に引き付ける分泌剤をコードする外因性核酸を含む。

いくつかの実施形態では、外因性タンパク質はサイトカインまたはケモカインである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、Ｓ１Ｐ（スフィンゴシン－１－リン酸）、ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）、ヌクレオチド（ＡＴＰまたはＵＴＰ）及びＣＸ３ＣＬ１（ＣＸ３Ｃモチーフケモカインリガンド１；フラクタルキン）、ＣＸ３ＣＬ１、並びにＩＣＡＭ３からなる群から選択される。ＩＬ－８／ＣＸＣＬ８ケモカインは、ＣＴＬ及び単球をリクルートすると見られるＣＣＬ２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０への好中球遊走にとって重要であると思われる。

遺伝子改変の方法
プラットフォーム細胞またはワクチン細胞の遺伝子改変（例えば、導入遺伝子のノックインまたは望ましくない遺伝子のノックアウト）は、例えば、限定されないが、エンドヌクレアーゼ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化された規則的で間隔の空いた短い回文反復関連９）を含むがこれに限定されない）など、任意の既知の遺伝子工学技術によって達成することができる。

ＣＲＩＳＰＲ系
本明細書に記載の遺伝子操作された細胞を作製する方法は、ＮＫ細胞阻害リガンドのノックアウト及びＮＫ細胞活性化リガンドのノックインを含むがこれらに限定されない、ＣＲＩＳＰＲ系を利用することができる。

ＣＲＩＳＰＲ系には少なくとも５つの型があり、そのすべてに、ＲＮＡ及びＣａｓタンパク質が組み込まれている。Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型は、ｃｒＲＮＡに相補的な核酸を切断できるマルチＣａｓタンパク質複合体を組み立てる。Ｉ型及びＩＩＩ型はどちらも、処理されたｃｒＲＮＡをマルチＣａｓタンパク質複合体に組み立てる前に、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ処理を必要とする。ＩＩ型及びＶ型のＣＲＩＳＰＲ系は、少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体を形成した単一のＣａｓタンパク質で構成される。

ＣＲＩＳＰＲ系の一般的なメカニズムと最近の進歩は、Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）；Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２２－８２６（２０１３）；Ｃｈｕ，ＶＴ ｅｔ ａｌ．“Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，５４３－５４８（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０，１－１３（２０１５）；Ｍａｋａｒｏｖａ，ＫＳ ｅｔ ａｌ，“Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，１－１５（２０１５）で論じられている。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成相補性（プロトスペーサーとも呼ばれる）、及び２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される、標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方により決定される位置で起こる。例えば、操作された細胞は、ＣＲＩＳＰＲ系、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系を使用して生成され得る。本明細書で開示される方法において使用されるＣａｓ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒するＣａｓ９であり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９または任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の２０ヌクレオチドにハイブリダイズする標的部位配列であって、標的配列の２０ヌクレオチドの後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する標的部位配列において、二本鎖切断を生成することができる。

ＣＲＩＳＰＲ系は、任意の手段を用いて細胞または細胞集団に導入することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションによって導入され得る。エレクトロポレーションは、例えば、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行うことができる。エレクトロポレーションのパラメータを調節して、トランスフェクション効率及び／または細胞生存率を最適化することができる。エレクトロポレーションデバイスは、指数関数的減衰、時定数及び方形波などの複数の電気波形パルス設定を有することができる。すべての細胞型には、適用されるパルスパラメータ（例えば、電圧、キャパシタンス、及び抵抗）に依存する独自の最適な電界強度（Ｅ）がある。最適な電界強度の適用は、膜貫通電圧の誘導を介して電気透過反応を引き起こし、核酸が細胞膜を通過することを可能にする。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションパルス電圧、エレクトロポレーションパルス幅、パルス数、細胞密度、及びチップタイプは、トランスフェクション効率及び／または細胞生存率を最適化するために調整され得る。

Ｃａｓタンパク質
ベクターは、Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列における片鎖または両方の鎖の切断を指示する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的ＤＮＡ配列における両鎖の切断を媒介する（例えば、標的ＤＮＡ配列中に二本鎖切断を作り出す）。

Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらのホモログ、またはそれらの修飾バージョンが挙げられる。いくつかの実施形態では、触媒的に死んだＣａｓタンパク質を使用することができる（例えば、触媒的に死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９））。未改変のＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＣａｓ９をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、触媒的に死んでいる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、触媒的に死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードする。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９ＨｉＦｉなどの高忠実度Ｃａｓタンパク質であり得る。

Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）はゲノム工学のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして一般的に使用されているが、すべての標的切除部位にとって最良のエンドヌクレアーゼではない可能性がある。例えば、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列（５’ＮＧＧ３’）はヒトゲノム全体に豊富に存在するが、ＮＧＧ配列は改変のために所望の遺伝子を標的とするように正しく配置されていない可能性がある。いくつかの実施形態では、異なるエンドヌクレアーゼを使用して、特定のゲノム標的を標的とし得る。いくつかの実施形態では、非ＮＧＧ ＰＡＭ配列を含む合成ＳｐＣａｓ９由来変異体が使用され得る。さらに、様々な種に由来する他のＣａｓ９オルソログが同定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」は、同様に本開示で有用であり得る種々のＰＡＭ配列と結合する。例えば、ＳｐＣａｓ９の比較的大きなサイズ（およそ４ｋｂのコード配列）は、ＳｐＣａｓ９ ｃＤＮＡを有するプラスミドが細胞で効率的に発現されない場合があることを意味する。逆に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列は、ＳｐＣａｓ９よりおよそ１キロベース短く、細胞で効率的に発現される可能性がある。ＳｐＣａｓ９と同様に、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、哺乳動物細胞のインビトロ及びマウスのインビボで標的遺伝子を改変することができる。

Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の代替物は、哺乳動物細胞で切断活性を示すＣｐｆ１ファミリーのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含み得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なり、Ｃｐｆ１媒介性ＤＮＡ切断により、短い３’オーバーハングを伴う二本鎖切断を得る。Ｃｐｆ１の交互切断パターンは、遺伝子編集の効率を増加させ得る、従来の制限酵素クローニングと類似した、指向性遺伝子移入の可能性を開き得る。上記のＣａｓ９変異体及びオルソログと同様に、Ｃｐｆ１も、ＣＲＩＳＰＲによって標的とされ得る部位の数を、ＳｐＣａｓ９が好むＮＧＧ ＰＡＭ部位を欠いているＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムに拡大し得る。

１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端もしくはその付近に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のＮＬＳを含むか、カルボキシル末端もしくはその付近に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のＮＬＳを含むか、またはこれらの任意の組み合わせ（例えば、アミノ末端の１つまたは複数のＮＬＳ及びカルボキシル末端の１つまたは複数のＮＬＳ）を含むことができる。１つより多いＮＬＳが存在する場合、各々は、単一のＮＬＳが、１つより多くのコピーに存在し、及び／または、１つもしくは複数のコピーに存在する１つもしくは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在し得るように、その他から独立して選択され得る。ＮＬＳは、ポリペプチド鎖内の任意の場所、例えば、Ｎ末端またはＣ末端付近に位置し得る。例えば、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から、ポリペプチド鎖に沿って１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸以内、またはおよそその距離以内に存在し得る。場合により、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から、５０アミノ酸以上、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００アミノ酸以内、またはおよそその距離以内に存在し得る。

任意の機能的濃度のＣａｓタンパク質が細胞に導入され得る。例えば、１５マイクログラムのＣａｓ ｍＲＮＡが細胞に導入され得る。他の場合では、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、０．５マイクログラム～１００マイクログラムで導入されてもよい。Ｃａｓ ｍＲＮＡは、０．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラムから導入されてもよい。

いくつかの実施形態では、二本鎖切断またはゲノム切断を導入するために、二重ニッカーゼ手法が使用され得る。Ｃａｓタンパク質を、いずれかのヌクレアーゼドメイン内の既知のアミノ酸で変異させ、これにより、１つのヌクレアーゼドメインの活性を欠失させ、一本鎖切断を生成することが可能なニッカーゼＣａｓタンパク質を生成することができる。向かい合った鎖を標的とする２つの特異なガイドＲＮＡと共にニッカーゼを利用すると、標的部位内に二本鎖切断（ＤＳＢ）が生成され得る（多くの場合、「二重ニック」または「二重ニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲ系と称される）。２つのオフターゲットニックがＤＳＢを引き起こすほど近接して生成される可能性は低いため、この手法は、標的特異性を増加させることができる、

ガイディングポリ核酸（ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）
ガイディングポリ核酸（またはガイドポリ核酸）は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）またはＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり得る。ガイディングポリ核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ガイディングポリ核酸は、一本鎖の領域と二本鎖の領域を含み得る。ガイディングポリ核酸は、二次構造を形成することもできる。

いくつかの実施形態では、前記ガイド核酸はｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、標的部位を特定し、切断のためにＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を特定された標的ＤＮＡにガイドするガイド配列を含む。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成相補性（プロトスペーサーとも呼ばれる）、及び２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される、標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方により決定される位置で起こる。同様に、ｇＲＮＡは標的ＤＮＡに特異的であり、ヌクレアーゼと複合体を形成してその核酸切断活性を指示することができる。

いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、２つのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの一部（例えば、機能性部分）の融合により形成されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠いている。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡまたはプロトスペーサー配列とハイブリダイズする。

いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、２０ヌクレオチドまたは約２０ヌクレオチドの核酸配列を標的とする。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０以上のヌクレオチド、または約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０以上のヌクレオチドの核酸配列を標的とする。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、ＰＡＭから約１塩基対～約２０塩基対離れたゲノム領域を結合する。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、ＰＡＭから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大約２０塩基対離れたゲノム領域を結合する。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、ＰＡＭから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基対離れたゲノム領域を結合する。

ガイドＲＮＡはまた、二次構造を形成するｄｓＲＮＡ二本鎖領域を含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）及びループを含むことができる。ループ及びステムの長さは様々であり得る。例えば、ループは、約３～約１０ヌクレオチドの範囲の長さであり得、ステムは、約６～約２０塩基対の範囲の長さであり得る。ステムは、１～約１０ヌクレオチドのバルジを１つまたは複数含み得る。第２の領域の全長は、約１６～約６０ヌクレオチドの範囲の長さであり得る。例えば、ループは、４ヌクレオチドまたはおよそその長さであってもよく、ステムは、１２塩基対またはおよそその長さであってもよい。ｄｓＲＮＡ二本鎖領域は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質と複合体を形成することができるタンパク質結合セグメントを含むことができる。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質またはその任意の誘導体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するよう、ｇＲＮＡと予め複合体化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＰ複合体は、編集を媒介するために細胞に導入される。

いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは改変されている。改変は、化学的変化、合成的改変、ヌクレオチドの付加、及び／またはヌクレオチドの除去を含み得る。改変は、ＣＲＩＳＰＲゲノム操作を強化することもできる。改変は、ｇＲＮＡのキラリティーを変更できる。いくつかの実施形態では、キラリティーは、改変後に均一または立体的に純粋であり得る。いくつかの実施形態では、改変は、前記ｇＲＮＡの安定性を高める。

いくつかの実施形態では、改変は化学的改変である。改変は、５’アデニル酸、５’グアノシン－三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’改変、５’－５’改変、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－０－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－三リン酸、及び５－メチルシチジン－５’－三リン酸、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択することができる。

いくつかの実施形態では、前記改変は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、１～１０、１～５、または１～３個のホスホロチオエートを含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。例えば、いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、Ｎ末端の３～５ヌクレオチド、Ｃ末端の３～５ヌクレオチド、またはその両方の間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

いくつかの実施形態では、改変は、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート付加である。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２個の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートを含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、１～１０、１～５、または１～３個の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートを含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートを含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。例えば、いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、Ｎ末端の３～５ヌクレオチド、Ｃ末端の３～５ヌクレオチド、またはその両方の間に、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

ｇＲＮＡは、任意の機能的濃度で導入され得る。いくつかの実施形態では、０．５マイクログラム～１００マイクログラムの前記ｇＲＮＡが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、０．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラムの前記ｇＲＮＡが細胞に導入される。

その他のエンドヌクレアーゼ
当技術分野で知られている他のエンドヌクレアーゼ系の遺伝子編集系を使用して、本明細書に記載の操作された細胞を作製することができる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系及びＴＡＬＥＮ系。

ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」または「ＺＦＢＤ」は、１つまたは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合するポリペプチドドメインである。ジンクフィンガーは、ジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０個のアミノ酸からなるドメインであり、その構造は亜鉛イオンの配位によって安定化される。ジンクフィンガーの例としては、Ｃ_２Ｈ_２ジンクフィンガー、Ｃ_３Ｈジンクフィンガー、及びＣ_４ジンクフィンガーが挙げられるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガードメインは、その設計／構成が主に合理的な基準（例えば、置換規則、ならびに既存のＺＦＮ設計及び結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用）に由来する、天然に発生しないドメインである。「選択された」ジンクフィンガードメインは、その産生が、主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験的プロセスに由来する、天然に存在しないドメインである。当技術分野で最もよく知られているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合物である。

ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、または「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合を担うＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインである。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染中にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体によって分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、ＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的ＤＮＡ配列に結合し、トランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン特異性は、反復可変ジ残基（ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置の多型を含む不完全な３４アミノ酸反復のエフェクター可変数に依存する。当技術分野で最もよく知られているＴＡＬＥＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへの融合物である。

本明細書に記載の方法において使用される標的ヌクレアーゼの別の例は、目的のＤＮＡ配列に対して特異性を有するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン）に融合したヌクレアーゼ活性を有するスポイルポリペプチドを含むポリペプチドである、標的化スポイルヌクレアーゼである。本発明に適した標的化ヌクレアーゼのさらなる例には、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴｉ、及びＷＯ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９Ｏ１－１が挙げられるが、これらに限定されない。

エンドヌクレアーゼの使用を介してゲノム編集することを含む、前述の方法のいずれか１つは、ゲノム破壊をもたらし得る。ゲノム破壊は、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の減少または排除をもたらすのに十分であり得る。いくつかの場合では、ゲノム破壊は、細胞ゲノムへの外因性導入遺伝子の組み込みを指すこともできる。このような場合、外因性導入遺伝子も検出することができる。ゲノム破壊は、試験した細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％において検出することができる。検出は、配列決定によるゲノムレベル、ｍＲＮＡレベル、またはタンパク質レベルで破壊を評価することによって実行することができる。適切な方法には、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、フローサイトメトリー、イメージング、ＥＬＩＳＡ、ＮＧＳ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの場合では、タンパク質の発現を、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集を使用しない同等の方法と比較して、約１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、７０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、５００倍、または約１０００倍まで減少させることができる。

導入遺伝子
本明細書に記載のプラットフォームまたはワクチン細胞にノックインされる外因性タンパク質またはポリペプチドをコードする導入遺伝子ポリ核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状または環状形態で細胞に導入され得る。導入遺伝子配列（複数可）は、環状または線状の形態で細胞に導入され得るＤＮＡミニサークル内に含まれ得る。線状形態で導入される場合、導入遺伝子配列の末端は、任意の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加することができ、及び／または自己相補的オリゴヌクレオチドを片末端または両末端に連結することができる。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法は、末端アミノ基（複数可）の付加、及び修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用を含むが、これらに限定されない。

導入遺伝子は、組換えアームに隣接することができる。いくつかの例では、組換えアームは、導入遺伝子を所望の組み込み部位に標的化する相補的領域を含むことができる。導入遺伝子はまた、挿入が内因性遺伝子を破壊するようにゲノム領域に組み込むこともできる。導入遺伝子は、任意の方法、例えば、非組換え末端結合及び／または組換え指向性修復によって組み込まれ得る。導入遺伝子は、二本鎖切断が修復される組換えイベント中にも組み込むことができる。導入遺伝子は、相同組換えエンハンサーを使用して組み込むこともできる。例えば、エンハンサーは、二本鎖切断を修復するために相同性指向修復が行われるように、非相同末端結合を遮断することができる。

導入遺伝子は、アームとその相補的配列との間の相同性の程度が２つの間の相同組換えを可能にするのに十分である場合、組換えアームに隣接することができる。例えば、アームとその相補配列との間の相同性の程度は、５０％以上であり得る。２つの相同非同一配列は、任意の長さであり得、それらの非相同の程度は、単一ヌクレオチド程度に小さくてもよく（例えば、標的化された相同組換えによるゲノム点変異の修正のため）、または１０キロベース以上程度に大きくてもよい（例えば、染色体における所定の異所部位での遺伝子の挿入のため）。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同一の長さである必要はない。

ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子等のさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、導入遺伝子ポリヌクレオチドは、裸の核酸として、またはリポソームもしくはポロキサマー等の薬剤と複合体化された核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。導入遺伝子を送達することができるウイルスは、ＡＡＶウイルスであり得る。

導入遺伝子は、概して、その発現が組み込み部位で内因性プロモーターによって、すなわち、導入遺伝子が挿入される内因性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入され得る。導入遺伝子は、プロモーター及び／あるいはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導的もしくは組織／細胞特異的プロモーターを含んでもよい。ミニサークルベクターは、導入遺伝子をコードすることができる。

導入遺伝子は、内因性遺伝子のすべてもしくは一部が発現するか、またはまったく発現しないように、内因性遺伝子に挿入することができる。例えば、本明細書に記載されるような導入遺伝子は、例えば導入遺伝子との融合として、内因性配列の一部（導入遺伝子のＮ末端側及び／またはＣ末端側）またはいずれも発現しないように、内因性遺伝子座に挿入することができる。他の場合では、導入遺伝子（例えば、内因性遺伝子のためなどの追加的コード配列を有するか、または有しない）は、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。

内因性配列（内因性であるか、または導入遺伝子の一部である）が導入遺伝子とともに発現されるときに、内因性配列は、全長配列（野生型もしくは変異体）または部分的配列であることができる。内因性配列は機能的である。これらの全長または部分的配列の機能の非限定的な例には、導入遺伝子（例えば、治療用遺伝子）によって発現されるポリペプチドの血清半減期を延長させること、及び／または担体の役割を果たすことが挙げられる。

さらに、発現に必要とされないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチド及び／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含んでもよい。

細胞組成：
本明細書に記載のプラットフォーム細胞は、必要に応じてワクチン細胞で使用するために長期間保存することができる。具体的には、これらの細胞は、冷凍または凍結保存されたときに安定である適切な組成物に組み込むことができる。いくつかの場合では、プラットフォーム細胞として使用される操作された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の多能性を維持するための組成物が提供される。いくつかの場合では、組成物は、（ｉ）操作されたｉＰＳＣプラットフォーム細胞、及び（ｉｉ）多能性維持組成物、例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物を含む。いくつかの実施形態では、プラットフォーム細胞は、リプログラミング操作された非多能性細胞から得られ、得られたｉＰＳＣは、操作された非多能性細胞内の選択された部位における同じ標的組み込み及び／またはイン／デルを含む。いくつかの実施形態では、操作されたｉＰＳＣは、１つまたは複数の選択された部位において、１つまたは複数の標的組み込み、及び／または、イン／デルを導入することによって、クローン性ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣのプールを操作することによって得られる。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣは、１つまたは複数の選択された部位において、１つまたは複数の標的組み込み、及び／または、イン／デルを、１つまたは複数のリプログラミング因子及び任意にＴＧＦＰ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及び／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触しているリプログラミング非多能性細胞のプールに導入することによる、ゲノム操作から得られる。

組成物の操作されたプラットフォーム細胞は、安全スイッチタンパク質、標的モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、または非多能性細胞がリプログラムされたｉＰＳＣまたはその派生細胞の生着、トラフィッキング、ホーミング、生存率、自己再生、持続性、及び／または生存を促進するタンパク質をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチド、及び／または、標的モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の調節と調整、または非多能性細胞がリプログラムされたｉＰＳＣまたはその派生細胞の生着、トラフィッキング、ホーミング、生存率、自己複製、持続性、及び／または生存を抑制するタンパク質に関連した１つまたは複数の内因性遺伝子におけるイン／デルを含むことができる。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチドまたはタンパク質をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、ＣＡＱＵＢＣ、または他の構成的、誘導的、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む１つまたは複数の外因性プロモーター、または（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩＩ、ベータ２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含むプラットフォーム細胞内の選択された部位に含まれる１つ以上の内因性プロモーターに、作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、組成物は、選択された部位で二本鎖切断を導入するための選択部位認識が可能な１つまたは複数のエンドヌクレアーゼをさらに含む。

ワクチン細胞
本明細書に記載のワクチン細胞は、外因性微生物タンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸を含むように、または前記外因性微生物タンパク質またはその抗原性断片を発現するように、前記細胞をさらに操作することによって作製される。それにより、ワクチン細胞は、対象に投与されると、前記外因性微生物タンパク質に対して特異的に免疫応答を誘導する。

したがって、一態様において、本明細書では、ｉ）少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊、ｉｉ）貪食性または細胞溶解性の自然免疫細胞に結合し、自然免疫細胞の活性（例えば、貪食作用、細胞溶解活性、炎症誘発性サイトカイン分泌）を刺激する外因性タンパク質の発現、及びｉｉｉ）外因性微生物タンパク質またはその抗原性断片を発現、を含む遺伝子操作された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ワクチン細胞は、本明細書に記載の抗原発現構築物を含む。

本明細書に記載のワクチン細胞は、対象への投与及び微生物タンパク質の送達に適した任意の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記プラットフォーム細胞から分化している。いくつかの実施形態では、前記細胞は、プラットフォーム細胞から分化し、前記プラットフォーム細胞は幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、上皮細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、内皮細胞である。

分化の方法
いくつかの実施形態では、ワクチン細胞は、プラットフォーム細胞から分化し、前記プラットフォーム細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣは、上皮細胞または内皮細胞に分化する。特定の態様において、ｉＰＳＣは、レシピエントＴ細胞に対して本質的に低い免疫原性を有する細胞型に分化し、分化した細胞がＮＫ細胞媒介ワクチン接種の集中的標的となることを可能にする。特定のさらなる態様において、ｉＰＳＣは、抗体または小分子の投与によって細胞を標的とするために活性化され得る、キルタグまたは自殺スイッチ遺伝子を提示するように操作される。

多能性幹細胞の分化には、培養液中の刺激剤や細胞の物理的状態の変化などの培養系の変化が必要である。最も伝統的な戦略は、系列特異的分化を開始するための一般的かつ重要な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」は、その３次元領域内に多数の系統を生じさせるため、胚の発生を模倣することが示されている３次元クラスターである。通常数時間から数日の分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化するように誘発された凝集多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢに発達し、その時点で、典型的には数日～数週間、分化を継続するためにさらに処理される。ＥＢ形成は、多能性幹細胞を細胞の３次元多層クラスター中で互いに近接させることによって開始され、典型的には、これは、多能性細胞を液滴中に沈降させること、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈降させること、または機械的に撹拌させること含むいくつかの方法の１つによって達成される。ＥＢ発生を促進するために、多能性幹細胞凝集体は、多能性培養維持培地中で維持された凝集体が適切なＥＢを形成しないため、さらなる分化手がかりを必要とする。したがって、多能性幹細胞凝集体は、選択した系列に向かって惹起する手がかりを提供する分化培地に移される必要がある。多能性幹細胞のＥＢ系の培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスター内で適度な増殖を伴う分化細胞集団（外胚葉、中胚葉及び内胚葉胚葉）の生成をもたらす。しかし、ＥＢは細胞分化を促進することが証明されているが、三次元構造の細胞が環境からの分化の手がかりに一貫して暴露されないため、異なる分化状態の不均一な細胞を生じさせる。さらに、ＥＢは作成と維持に手間がかかる。また、ＥＢを介した細胞分化は、細胞増殖が穏やかで、これも分化効率の低下の一因となる。

本明細書に記載される操作されたｉＰＳＣは、生体材料足場を用いて分化することができる。生体材料足場は、材料の本質的な特性、ならびに材料への特定の化学的及び物理的手がかりの組み込みに応じて、内部に播種された幹細胞の生存率及び分化を促進する。天然及び合成の生体材料の両方が、所望の組織型への幹細胞分化を制御するための生理活性足場を生成するための出発点として役立つことができる。これらの足場はいくつかの異なる形態を取ることができ、それぞれに独自の特徴を有する。これらの足場は、特定の製剤がより良い細胞生存を可能にする新規ハイブリッド材料を得るために組み合わせることもできる。適切な生体材料足場として、ヒドロゲル、エレクトロスピニング足場、タンパク質系の生体材料（例えば、コラーゲン、フィブリン、シルク、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチン）を用いたナノ及びマイクロ粒子、多糖類系の生体材料（例えば、アガロース、アルギン酸塩、ヒアルロン酸塩、キトサン、セルロース及びその誘導体ならびに脱細胞化細胞外マトリックス）、合成生体材料（例えば、乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリピロール（Ｐｐｙ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））、及びセラミック系の生体材料が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法は、同等の方法と比較して毒性を低減することができる。いくつかの場合では、毒性は約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、３００倍、５００倍、８００倍、１０００倍低減することができる。

細胞型
いくつかの場合では、方法は、ｉＰＳ細胞を分化させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）を上皮細胞に分化させることができる。いくつかの場合では、ｉＰＳ細胞は、皮膚上皮細胞、肺上皮細胞、消化管上皮細胞、肺胞上皮細胞、口上皮細胞、膣上皮細胞、腎上皮細胞、腎管上皮細胞、気道上皮細胞、膀胱上皮細胞、尿路上皮細胞、血管上皮細胞、脳上皮細胞、心臓上皮細胞、耳上皮細胞、舌上皮細胞、頸部上皮細胞、前立腺上皮細胞、乳房上皮細胞、子宮上皮細胞、気管上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、結腸上皮細胞、または肝上皮細胞に分化することができる。

ＡＰＣ擬態
いくつかの場合では、ｉＰＳ細胞を上皮（樹状）抗原提示細胞（ＡＰＣ）に分化させることができる。ｉＰＳ細胞を樹状細胞に分化させることにより、ＡＰＣ模倣を達成し、それによってワクチンにＭＨＣヌル及び／またはＮＫ／Ｍｏ自然免疫＋ＡＰＣを対象の天然ＭＨＣ特異的ＡＰＣ／自然免疫系に提示することができる。これは、優れた及び／またはより安全な免疫抗原反応及び／または中和Ａｂ産生をもたらし、それによって投与後の持続的な免疫を付与することができる。その他の場合では、ｉＰＳ細胞は皮膚、肺、またはＧＩ／腸上皮細胞に分化することができ、したがって宿主免疫系への免疫原の自然な生理学的提示を可能にする。これは、標準的な皮下及び皮内及び他の皮膚及び皮膚系のワクチン送達方法に加えて、肺へのワクチン直接送達の肺適用及び／または経口投与経路（ｐ．ｏ．）のためのワクチン適用を容易に及び／または増強し得る。

抗原発現構築物
本明細書において提供されるのは、抗原発現構築物及び前記構築物を含む操作された細胞である。いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、外因性タンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記外因性タンパク質は、外因性抗原タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記構築物は、２つ以上の外因性タンパク質またはその抗原性断片を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、前記外因性タンパク質は微生物タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記微生物タンパク質は、ウイルス、細菌、寄生虫、または原生動物タンパク質である。

ＣＯＶＩＤ－１９
いくつかの実施形態では、微生物タンパク質はウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ニドウイルス目のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、コロナウイルス科のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、サルベコウイルス亜属のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２株のウイルスのものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞ワクチンは、コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を治療するために使用される。中国の湖北省武漢で最初に報告された重度の呼吸器疾患として、ＣＯＶＩＤ－１９はＣＯＶＩＤ－２０１９、２０１９新型コロナウイルス、または２０１９－ｎＣｏＶとしても知られている。

ＣＯＶＩＤ－１９疾患は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムは配列決定されており、遺伝子の順序（５’から３’）は、レプリカーゼＯＲＦ１ａｂ、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、メンブレン（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）である。Ｗｕ，Ｆ．，Ｚｈａｏ，Ｓ．，Ｙｕ，Ｂ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｓｏｎｇ，Ｚ．，Ｈｕ，Ｙ．，Ｔａｏ，Ｚ．，Ｔｉａｎ，Ｊ．Ｐｅｉ，Ｙ．，Ｙｕａｎ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｄａｉ，Ｆ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｅ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｎａｔｕｒｅ ５７９，２６５－２６９（２０２０）（その全内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、高密度にグリコシル化されたスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）を利用して宿主細胞に侵入する。コロナウイルススパイクタンパク質は、ウイルス膜を宿主細胞膜と融合させるために実質的な構造再構成を受ける準安定前融合立体構造で存在する三量体クラスＩ融合タンパク質である。このプロセスは、Ｓ１サブユニットが宿主細胞受容体に結合するときにトリガーされる。受容体結合は融合前三量体を不安定化し、Ｓ１サブユニットの脱落及びＳ２サブユニットの安定した融合後立体構造への移行をもたらす。宿主細胞受容体を結合するために、Ｓ１の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、受容体結合の決定基を一時的に隠すかまたは露出させるヒンジ状の立体構造変化を受ける。これらの２つの状態は、「ダウン」コンフォメーション及び「アップ」コンフォメーションと呼ばれ、ダウンは受容体アクセス不能状態に対応し、アップは受容体アクセス可能状態に対応し、安定性が低いと考えられている。Ｓタンパク質の不可欠な機能のために、それは抗体媒介性中和の標的を表し、融合前Ｓ構造の特性評価はワクチンの設計と開発を導くための原子レベルの情報を提供するであろう。Ｗｒａｐｐ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｎ．，Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｋ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｊ．，Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．，Ａｂｉｏｎａ，Ｏ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．＆ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．，Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０１９－ｎＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＳＣＩＥＮＣＥ，１３ ＭＡＲ ２０２０：１２６０－１２６３（その全内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩから取得）：
＞ＹＰ＿００９７２４３９０．１ 表面糖タンパク質［重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２］
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（配列番号１）。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は約１，２７３個のアミノ酸で構成され、いくつかのドメインを含んでいる。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ｘｉａ，Ｓ．，Ｚｈｕ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｍ．，Ｌａｎ，Ｑ．，Ｘｕ，Ｗ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｙｉｎｇ，Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｚ．，Ｊｉａｎｇ，Ｓ．＆Ｌｕ，Ｌ．，Ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ２０１９－ｎＣｏＶ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＨＲ１ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０２０）。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４２３－０２０－０３７４－２。スパイクタンパク質には以下が含まれる：シグナル配列（ＳＳ）；Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ、１４－３０５ａａ）；受容体結合ドメイン（ＲＢＤ、３１９－５４１ａａ）；Ｓ１／Ｓ２プロテアーゼ切断部位（Ｓ１／Ｓ２，Ｒ６８５／Ｓ６８６）；融合ペプチド（ＦＰ，Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．から７８８－８０６ａａ、Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．から８１６－８３３ａａ）；ヘプタッドリピート１（ＨＲ１、９１２－９８４ａａ）；中央ヘリックス（ＣＨ，Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．から９８６－１０３５ａａ）；コネクタドメイン（ＣＤ，Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．から１０７６－１１４１ａａ）；ヘプタッドリピート２（ＨＲ２，１１６３－１２１３ａａ）；膜貫通ドメイン（ＴＭ、１２１４－１２３７ａａ）；及び細胞質尾部（ＣＴ、１２３８－１２７３ａａ）。

ＮＴＤ配列：
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳ（配列番号２）。

ＲＢＤ配列：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦ（配列番号３）。

ＴｈｅＦＢ配列：
ＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬ（配列番号４）（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．）またはＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦ（配列番号５）（Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．）。

ＨＲ１配列：
ＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬ（配列番号６）。

ＣＨ配列：
ＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧ（配列番号７）。

ＣＤ配列：
ＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬ（配列番号８）。

ＨＲ２配列：
ＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰ（配列番号９）。

ＴＭ配列：
ＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭ（配列番号１０）。

ＣＴ配列：
ＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（配列番号１１）。

いくつかの実施形態では、前記抗原発現構築物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１に対して、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗原発現構築物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するタンパク質、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００アミノ酸長であるそれらの抗原断片をコードする核酸配列を含む。

Ｓ遺伝子とその領域の系統学的及び遺伝的比較解析では、株間でわずかなばらつきが見られた。ＷＨＣＶ（ＷＨ－Ｈｕｍａｎ １コロナウイルス：Ｗｕ ｅｔ ａｌ．において同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株）のＲＢＤ配列は、ヒトＡＣＥ２受容体を細胞侵入に使用することができる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（７３．８～７４．９％アミノ酸同一性）、及びＲｓ４８７４株、Ｒｓ７３２７株及びＲｓ４２３１株（７５．９～７６．９％アミノ酸同一性）を含むＳＡＲＳ様ＣｏＶのものと、より密接に関連していた。さらに、ＷＨＣＶ由来のスパイクタンパク質のＲＢＤは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来のスパイクタンパク質のＲＢＤよりも１アミノ酸だけ長かった。以前に決定されたヒトＡＣＥ２と複合体化したＳＡＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質のＲＢＤの結晶構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）２ＡＪＦ）が、領域４３３～４３７及び４６０～４７２がヒトＡＣＥ２と直接相互作用し、したがって種の特異性を決定する上で重要である可能性があることを明らかにした。したがって、Ｓタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効なワクチンの開発のための主要な標的である。いくつかの実施形態では、本出願の発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む構築物でトランスフェクトされた生細胞を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞ワクチンを開発する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードする核酸配列：
＞ＮＣ＿０４５５１２．２：２１５６３－２５３８４ 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２単離Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１、全ゲノム（遺伝子ＩＤ：４３７４０５６８）
ＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＣＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＡＣＴＴＧＧＴＴＣＣＡＴＧＣＴＡＴＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＡＡＣＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＣＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＣＴＡＣＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＴＧＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＣＴＡＧＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＡＴＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＧＧＧＡＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＡＡＧＣＡＣＡＣＧＣＣＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡＧＴＧＣＧＴＧＡＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＴＴＡＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＧＴＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＴＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＴＣＣＴＡＴＡＴＡＡＴＴＣＣＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＣＴＡＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡＡＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＣＡＧＧＣＴＧＣＧＴＴＡＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＣＴＡＡＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＡＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＧＧＣＣＧＧＴＡＧＣＡＣＡＣＣＴＴＧＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴＡＣＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＡＡＧＴＣＴＡＣＴＡＡＴＴＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＡＧＴＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＧＡＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＡＡＣＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＡＣＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＡＡＴＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＴＡＣＣＣＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＴＧＣＧＣＴＡＧＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＧＣＡＣＧＴＡＧＴＧＴＡＧＣＴＡＧＴＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＣＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＡＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＡＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＴＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＧＧＣＣＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＧＡＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＧＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＴＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＡＧＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＣＧＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＴＧＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＧＴＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＡＡＡＴＴＧＡＴＡＧＧＴＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＣＡＴＡＴＧＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＡＴＣＡＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＴＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＴＣＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＴＴＡＧＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＣＡＡＴＧＡＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＴＣＴＣＴＣＡＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＡＣＡＴＴＴＧＧＣＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＧＧＣＴＴＧＡＴＴＧＣＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＴＴＡＣＡＣＡＴＡＡ（配列番号１２）。核酸配列を構築物に組み込む場合、上記の配列をコドン最適化することができる。

いくつかの場合では、本明細書で提供される構築物に組み込まれる核酸配列を改変することができる。改変は、シーケンスの切り捨てを含むことができる。例えば、改変は、細胞質尾部の欠失、膜貫通ドメインの欠失、フリン切断部位の欠失、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。改変はまた、配列の付加を含むことができる。付加は、三量体化タグ、導入遺伝子配列、及び両方を含むことができる。いくつかの場合では、改変はまた、変異、例えばプロリン変異を含むことができる。１、２、３、４、５、６、７、８、９、または約１０までの変異など、任意の数の改変を導入することができる。

その他の病原体
いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ヘルペスウイルス、カリシウイルス、肝炎ウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、ラクロス脳炎、カリフォルニア脳炎、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、チクングニアウイルスまたはノロウイルスの微生物タンパク質（またはその抗原性断片）をコードする核酸を含む。

いくつかの場合では、インフルエンザ抗原ペプチドが利用され得る。インフルエンザウイルスの抗原は、ヒトまたは非ヒトであり得る。いくつかの場合では、使用されるインフルエンザウイルス抗原は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型及び／またはＤ型に由来する。いくつかの場合では、インフルエンザウイルス抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ（ビクトリア）、またはＢ（山形）である。いくつかの場合では、インフルエンザウイルス抗原は、ブタ、トリ、コウモリ、ウシ、イヌ、ウマ、家禽、ネコなどの非ヒト種に由来し得る。

いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、以下のウイルス科のいずれかからのウイルス由来の微生物タンパク質（またはその抗原性断片）をコードする核酸を含む：アレナウイルス科、アルテリウイルス科、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バルナウイルス科、ビルナウイルス科、ブロモウイルス科、ブニアウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス、カーラウイルス、カウリモウイルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスなどのコロナウイルス）、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ダイアントウイルス、エナモウイルス、フィロウイルス科（例えば、マールブルグウイルス及びエボラウイルス（ＥＢＯＶ）（例えば、ザイール、レストン、コートジボワール、またはスーダン株）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス１、デングウイルス２、デングウイルス３、及びデングウイルス４）、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科（例えば、ヒトヘルペスウイルス１、３、４、５、及び６、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、チクングニアウイルス、ハンタウイルス、ハイポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポトリックスウイルス科、マイクロウイルス科、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ（例えばＨ１Ｎ１）、Ｂ及びＣ）、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科（例えば、はしか、おたふくかぜ、及びヒト呼吸器合胞体ウイルス）、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、及びアフトウイルス））、ポックスウイルス科（例えば、ワクシニア及び天然痘ウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１及びＨＩＶ２などのレンチウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）、トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）、トティウイルス科。好適なウイルス抗原には、デングタンパク質Ｍ、デングタンパク質Ｅ、デングＤ１ＮＳ１、デングＤ１ＮＳ２、及びデングＤ１ＮＳ３の全部または一部も含まれる。ウイルス抗原は、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、すなわち単純ヘルペス１型及び２型；肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、及びＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス；パラインフルエンザ、水痘帯状疱疹、ＪＣウイルス、西ナイルウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバー、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、馬脳炎、ＢＫウイルス、マラリア、ＭｕＬＶ、ＶＳＶ、ＨＴＬＶ、日本脳炎、黄熱病、リフトバレー熱、及びリンパ性脈絡膜髄膜炎などの特定の株に由来し得る。

いくつかの場合では、抗原はコロナウイルスからのものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶである。いくつかの場合では、ウイルスペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体由来のものであり得る。いくつかの場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体は、Ｂ．１．１．７（またはＵ．Ｋ．変異体）、Ｂ．１．１．２０７、Ｃｌｕｓｔｅｒ５、Ｂ．１．３５１（またはＲＳＡ変異体）、Ｐ．１（またはブラジル変異体）、Ｂ．１．６１７（またはインド変異体）、Ｂ．１５２５、ＮＳ３、ＷＩＶ０４／２０１９、またはＣＡＬ．２０Ｃを含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｂ．１．６１７変異体は、Ｅ１５４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｌ４５２Ｒ、Ｐ６８１Ｒ、Ｑ１０７１Ｈ、またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含むスパイクタンパク質における変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体は、系列Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４、Ａ．５、Ａ．６、Ｂ．１、Ｂ．２、Ｂ．３、Ｂ．４、Ｂ．５、Ｂ．６、Ｂ．７、Ｂ．８、Ｂ．９、Ｂ．１０、Ｂ．１１、Ｂ．１２、Ｂ．１３、Ｂ．１４、Ｂ．１５、またはＢ．１６を含む。

いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルス、トゴトウイルス及びクアランジャウイルスのうちの１つまたは複数のウイルス由来の微生物タンパク質（またはその抗原性断片）をコードする核酸を含む。例示的なＡ型インフルエンザウイルスサブタイプには、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、及びＨ７Ｎ７が含まれる。例示的なインフルエンザウイルス抗原には、ヘマグルチニン（ＨＡ１及びＨＡ２サブユニットなど）、ノイラミニダーゼ、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２ＰＡ及びＰＢ１－Ｆ２のうちの１つまたは複数など）、逆転写酵素、カプシドタンパク質、非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＥＰなど）、核タンパク質、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２など）、及び細孔タンパク質などの、１つまたは複数のタンパク質または糖タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、インフルエンザＡウイルス抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）もしくはノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質、またはＨＡもしくはＮＡの断片のうちの１つ以上を含む（ヘマグルチニンＨＡｌ糖タンパク質の抗原部位を含む）。例示的な実施形態では、ＭＤＮＰは、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ＨＡタンパク質をコードするＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、１つ以上のエボラウイルス、例えばザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）、タイフォレストエボラウイルス（ＴＡＦＶ）、レストンエボラウイルス（ＲＥＳＴＶ）、及びブンディブギョエボラウイルス（ＢＤＢＶ）のウイルス由来の微生物タンパク質（またはその抗原性断片）をコードする核酸を含む。例示的な実施形態では、ＭＤＮＰは、ザイールエボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）、またはザイールエボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）の１つ以上の断片をコードする、ｒｅｐＲＮＡなどのＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、フラビウイルス属の１つまたは複数のウイルス、例えば、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）由来の微生物タンパク質（またはその抗原性断片）をコードする核酸を含む。

いくつかの場合では、細胞ワクチンにおいて複数の核酸が発現される。例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個を細胞ワクチンに含むことができる。場合によっては、少なくとも２つが細胞ワクチンによって発現され、それらは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びインフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）由来である。

いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、ポックスウイルス科、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉｄ、ブルセラ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ、下痢原性Ｅ．ｃｏｌｉ、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、腸内細菌科、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、カンピロバクター属菌、サルモネラ菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅまたはシゲラ属菌の微生物タンパク質（またはその抗原性断片）をコードする核酸を含む。

いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉまたはＢａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓの微生物タンパク質（またはその抗原性断片）をコードする核酸を含む。

いくつかの実施形態において、ワクチンに利用される別の病原体由来のペプチドまたはその断片は、表４からの任意の配列に対して約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有することができる。

がんペプチド
いくつかの実施形態では、抗原発現構築物は、がんまたは腫瘍に関連するペプチド（またはその断片）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、全長タンパク質またはその断片もしくは誘導体をコードする。例示的なペプチドは、新生抗原または腫瘍タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはその断片は、７０７－ＡＰ、ビオチン化分子、ａ－アクチニン－４、ａｂｌ－ｂｃｒ ａｌｂ－ｂ３（ｂ２ａ２）、ａｂｌ－ｂｃｒ ａｌｂ－ｂ４（ｂ３ａ２）、アジポフィリン、ＡＦＰ、ＡＩＭ－２、アネキシンＩＩ、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ｂ－カテニン、ｂｃｒ－ａｂｌ、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ１９０（ｅ１ａ２）、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ２１０（ｂ２ａ２）、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ２１０（ｂ３ａ２）、ＢＩＮＧ－４、ＣＡＧ－３、ＣＡＩＸ、ＣＡＭＥＬ、ＣＩＳＨ、カスパーゼ－８、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ－４、ＣＥＡ、ＣＬＣＡ２、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ－１０、ＤＡＭ－６、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥＬＦ２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－Ｂ３、ｅｒｂ－Ｂ４、ＥＳ－ＥＳＯ－１ａ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＦＧＦ－５、ＦＮ、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７Ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇｐ１００、ｇｐ７５、Ｈｅｒ－２、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２（ＦＧＦ６）、ＨＳＴ－２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ＫＤＲ、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ＲＡＳ、Ｌ１細胞接着分子、ＬＡＧＥ－１、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ルイスＹ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－１０、ＭＡＧＥ－１２、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン－Ａ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＡＲＴ－２、ＭＣ１Ｒ、Ｍ－ＣＳＦ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン、ＮＡ８８－Ａ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＰＭ／ＡＬＫ、Ｎ－ＲＡＳ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＡ１、ＯＧＴ、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＯＳ－９、Ｐポリペプチド、Ｐ１５、Ｐ５３、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＧＥ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、ＳＯＸ１０、ＳＳＸ－２、サバイビン、サバイビン－２Ｂ、ＳＹＴ／ＳＳＸ、ＴＡＧ－７２、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦａＲＩＩ、ＴＧＦｂＲＩＩ、ＴＰ１、ＴＲＡＧ－３、ＴＲＧ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＲＰ－２－６ｂ、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ１、α－葉酸受容体、κ－軽鎖、またはそれらの任意の組み合わせの内の少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、ペプチドはネオ抗原ペプチドを含む。例えば、ネオ抗原は、ＥＲＢＢ２ＩＰにおけるＥ８０５Ｇ変異を含むゲノム配列から生成されたポリペプチドから生じるペプチドであり得る。ネオ抗原及びネオエピトープは、全エクソームシーケンシングによって同定することができる。場合によっては、ネオ抗原またはネオエピトープペプチドを生じさせる変異を含むことができる遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＣＯ１ １９９７、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＬＰＰＬ２、ＡＮＡＰＣ１、ＡＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲ、ＡＲ－ｖ７、ＡＳＣＬ２、β２Μ、ＢＲＡＦ、ＢＴＫ、Ｃ１５ＯＲＦ４０、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ６、ＣＮＯＴ１、ＣＴ４５Ａ５、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＤＣＴ、ＤＫＫ４、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１ＤＰ３、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ２Ｂ３、ｅｎｖ、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＳＲ１、ＥＳＲＰ１、ＦＡＭ１１ＩＢ、ＦＧＦＲ３、ＦＲＧ１Ｂ、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ１０、ＧＡＴＡ３、ＧＢＰ３、ＨＥＲ２、ＩＤＨ１、ＪＡＫ１、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＭＡＮ１、ＭＡＢＥＢ１６、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＣ１、ＭＥＫ、ＭＬＡＮＡ、ＭＬＬ２、ＭＭＰ１３、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＲＡＳ、ＮＹ－ＥＳＯ、ＰＡＧＥ２、ＰＡＧＥ５、ＰＤＧＦＲａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＭＥＬ、ｐｏｌタンパク質、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＢＭ２７、ＲＮＦ４３、ＲＰＬ２２、ＲＵＮＸ１、ＳＥＣ３１Ａ、ＳＥＣ６３、ＳＦ３Ｂ１、ＳＬＣ３５Ｆ５、ＳＬＣ４５Ａ２、ＳＭＡＰ１、ＳＭＡＰ１、ＳＰＯＰ、ＴＦＡＭ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＡＰ５、ＴＰ５３、ＴＴＫ、ＴＹＲ、ＵＢＲ５、ＶＨＬ、ＸＰＯＴであり得る。

いくつかの実施形態では、ペプチド（複数可）またはその断片（複数可）は、ポリペプチド、核酸配列から産生されたポリペプチド、またはＡ１ＣＦ、ＡＢＩ１、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＳＬ３、ＡＣＳＬ６、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＤＮ、ＡＦＦ１、ＡＦＦ３、ＡＦＦ４、ＡＫＡＰ９、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＤＨ２、ＡＬＫ、ＡＭＥＲ１、ＡＮＫ１、ＡＰＣ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＨＧＥＦ１０、ＡＲＨＧＥＦ１０Ｌ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＮＴ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＦ１、ＡＴＩＣ、ＡＴＭ、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＬ９Ｌ、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＣＲ、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ６、ＢＬＭ、ＢＭＰ５、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＩＰ１、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＢＵＢ１Ｂ、Ｃ１５ｏｒｆ６５、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＬＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＤＣ６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＤ２０９、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１１、ＣＤＨ１７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＰ８９、ＨＣＨＤ７、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＥＫ２、ＣＨＩＣ２、ＣＨＳＴ１１、ＣＩＣ、ＣＩＩＴＡ、ＣＬＩＰ１、ＣＬＰ１、ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ１、ＣＮＢＤ１、ＣＮＢＰ、ＣＮＯＴ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＮＴＲＬ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＰＥＢ３、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＮＫＬ１、ＣＲＴＣ１、ＣＲＴＣ３、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＮＮＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＮＮＤ１、ＣＴＮＮＤ２、ＣＵＬ３、ＣＵＸ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＬＤ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＳＬＴＲ２、ＤＡＸＸ、ＤＣＡＦ１２Ｌ２、ＤＣＣ、ＤＣＴＮ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＲ２、ＤＤＸ１０、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＧＣＲ８、ＤＩＣＥＲ１、ＤＮＡＪＢ１、ＤＮＭ２、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲＯＳＨＡ、ＥＢＦ１、ＥＣＴ２Ｌ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＬＦ４、ＥＬＫ４、ＥＬＬ、ＥＬＮ、ＥＭＬ４、ＥＰ３００、ＥＰＡＳ１、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ７、ＥＰＳ１５、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＮＫ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、ＥＺＲ、ＦＡＭ１３１Ｂ、ＦＡＭ１３５Ｂ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＡＭ４７Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＳ、ＦＡＴ１、ＦＡＴ３、ＦＡＴ４、ＦＢＬＮ２、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＲＬ４、ＦＥＮ１、ＦＥＳ、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＨ、ＦＨＩＴ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ９、ＦＬＣＮ、ＦＬＩ１、ＦＬＮＡ、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＮＢＰ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＲ１、ＦＳＴＬ３、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＳ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＬＩ１、ＧＭＰＳ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＧＰＣ３、ＧＰＣ５、ＧＰＨＮ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＭ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＥＹ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＯＯＫ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＳ４、ＩＳＸ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＡＺＦ１、ＪＵＮ、ＫＡＴ６Ａ、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＡＴ７、ＫＣＮＪ５、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＤＳＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ６、ＫＬＫ２、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＮＬ１、ＫＮＳＴＲＮ、ＫＲＡＳ、ＫＴＮ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＡＳＰ１、ＬＣＫ、ＬＣＰ１、ＬＥＦ１、ＬＥＰＲＯＴＬ１、ＬＨＦＰＬ６、ＬＩＦＲ、ＬＭＮＡ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＰＰ、ＬＲＩＧ３、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＳＭ１４Ａ、ＬＹＬ１、ＬＺＴＲ１、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＬＴ１、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＤＳ２、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＤ１２、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＧＭＴ、ＭＩＴＦ、ＭＫＬ１、ＭＬＦ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬＴ１、ＭＬＬＴ１０、ＭＬＬＴ１１、ＭＬＬＴ３、ＭＬＬＴ６、ＭＮ１、ＭＮＸ１、ＭＰＬ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＩ２、ＭＳＮ、ＭＴＣＰ１、ＭＴＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ４、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＨ１１、ＭＹＨ９、ＭＹＯ５Ａ、ＭＹＯＤ１、Ｎ４ＢＰ２、ＮＡＢ２、ＮＡＣＡ、ＮＢＥＡ、ＮＢＮ、ＮＣＫＩＰＳＤ、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＲ１、ＮＣＯＲ２、ＮＤＲＧ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＩＮ、ＮＫＸ２－１、ＮＯＮＯ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＮＴ５Ｃ２、ＮＴＨＬ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＮＵＭＡ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＮＵＴＭ１、ＮＵＴＭ２Ａ、ＮＵＴＭ２Ｂ、ＯＬＩＧ２、ＯＭＤ、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＢＰＣ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、ＰＡＬＢ２、ＰＡＴＺ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＢＸ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＭ１、ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＤＬ１、ＰＥＲ１、ＰＨＦ６、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＬＣＧ１、ＰＭＬ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＧ、ＰＯＴ１、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＦＩＢＰ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＣＣ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＤＭ２、ＰＲＥＸ２、ＰＲＦ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＰＲＲＸ１、ＰＳＩＰ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＫ６、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ１３、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＢ、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＴ、ＰＷＷＰ２Ａ、ＱＫＩ、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＣ１、ＲＡＤ１７、ＲＡＤ２１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＬＧＤＳ、ＲＡＮＢＰ２、ＲＡＰ１ＧＤＳ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ１５、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＦＷＤ３、ＲＧＰＤ３、ＲＧＳ７、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＨ、ＲＭＩ２、ＲＮＦ２１３、ＲＮＦ４３、ＲＯＢＯ２、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ５、ＲＰＮ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、Ｓ１００Ａ７、ＳＡＬＬ４、ＳＢＤＳ、ＳＤＣ４、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＡＦ２、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＥＰＴ５、ＳＥＰＴ６、ＳＥＰＴ９、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＰ４、ＳＧＫ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ３ＧＬ１、ＳＨＴＮ１、ＳＩＲＰＡ、ＳＩＸ１、ＳＩＸ２、ＳＫＩ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＣ１Ａ、ＳＭＯ、ＳＮＤ１、ＳＮＸ２９、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２１、ＳＯＸ９、ＳＰＥＣＣ１、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＲＣ、ＳＲＧＡＰ３、ＳＲＳＦ２、ＳＲＳＦ３、ＳＳ１８、ＳＳ１８Ｌ１、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＳＴＡＧ１、ＳＴＡＧ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ１１、ＳＴＲＮ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２ ＳＹＫ、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＥＡ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＣ、ＴＥＲＴ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＦＧ、ＴＦＰＴ、ＴＦＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３、ＴＭＥＭ１２７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＣ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰＭ３、ＴＰＭ４、ＴＰＲ、ＴＲＡＦ７、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＰ１１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＲ５、ＵＳＰ４４、ＵＳＰ６、ＵＳＰ８、ＶＡＶ１、ＶＨＬ、ＶＴＩ１Ａ、ＷＡＳ、ＷＤＣＰ、ＷＩＦ１、ＷＮＫ２、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＴＲ１、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＰＯ１、ＹＷＨＡＥ、ＺＢＴＢ１６、ＺＣＣＨＣ８、ＺＥＢ１、ＺＦＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＭＹＭ３、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ３８４、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ５２１、ＺＮＲＦ３、ＺＲＳＲ２、またはそれらの任意の組み合わせの内の少なくとも１つに由来するネオ抗体に由来する。

送達の方法
本明細書に記載の抗原発現構築物は、構成的かつ予測可能な発現のために、任意の適切な手段、例えば、セーフハーバー部位などのゲノム工学を介して指定された部位で細胞ゲノムに潜在的に安定的に組み込まれる手段によって、標的細胞に送達することができる。抗原発現構築物は、好ましいゲノム位置に標的化することができる。場合によっては、抗原発現構築物を細胞ゲノムに安定して組み込むことができる。場合によっては、抗原発現構築物は、セーフハーバー部位、ＭＨＣ遺伝子座、ＴＣＲ遺伝子座、ＨＬＡ遺伝子座、阻害性受容体遺伝子座、及びそれらの任意の組み合わせに組み込まれる。セーフハーバーの非限定的な例には、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ ＳＩＴＥ（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２、ＥＴＣ．）、ＣＣＲ５、またはＲｏｓａ２６が挙げられる。いくつかの場合では、抗原発現構築物は一過性に発現される。従来のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を用いて、核酸を細胞に導入することができる。核酸の非ウイルス送達方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、金ナノ微粒子送達、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質－核酸接合体、ネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で強化されたＤＮＡの取込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を用いたソノポレーションを核酸の送達に使用することもできる。

非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、及びリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと錯体形成された核酸、及びｍＲＮＡの送達を含むことができる。

一実施形態では、抗原発現構築物は、細胞内にエレクトロポレーションされる。いくつかの実施形態では、抗原発現構築物はｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは前記細胞にエレクトロポレーションされる。さらなる例示的な核酸送達システムには、ＡＭＡＸＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍｄ．）、ＭＡＸＣＹＴＥ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照）によって提供されるものが含まれる。リポフェクション試薬は市販されている（例えば：ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）及びＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対してであり得る。

本明細書に記載の病原体タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドを含む組成物は、１つまたは複数のタンパク質をコードする配列を含むベクターを用いて送達することができる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない任意のベクター系を使用することができる。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含むことができる。

自殺遺伝子
場合によっては、本明細書で提供される細胞は、「キルスイッチ」自殺遺伝子のゲノム組込みを含むことができる。自殺遺伝子は、自殺遺伝子を含む細胞を選択的に殺す薬剤で処理することにより、細胞の除去を可能にすることができる。細胞に自殺遺伝子を含めることにより、本明細書で提供される細胞を治療に利用する際の安全性を高めることもできる。

いくつかの場合では、自殺遺伝子が細胞産物に組み込まれ得る。自殺遺伝子は、有害事象、注入された細胞の自己反応性、感染の根絶などの場合に遺伝子改変細胞の排除を可能にする。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、ランダムなゲノム位置、または標的遺伝子座（例えば、代謝遺伝子座、ＤＮＡ／ＲＮＡ複製遺伝子座、セーフハーバー、ＭＨＣ遺伝子座、ＨＬＡ遺伝子座、ＴＣＲ遺伝子座、枯渇遺伝子座、阻害性受容体遺伝子座（ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ｔｉｍ３、ＣＩＳＨなど）に導入される。セーフハーバーの非限定的な例には、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ ＳＩＴＥ（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２、ＥＴＣ．）、ＣＣＲ５、またはＲｏｓａ２６が挙げられる。場合によっては、自殺遺伝子は、外因性プロモーターによって駆動され得るか、または組み込み遺伝子座の内因性プロモーターを利用することができる。

様々な自殺遺伝子が当技術分野で知られており、本明細書で提供される細胞組成物で利用することができる。例示的な自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル、シトシンデアミナーゼ／５－フルオロシトシン、ニトロレダクターゼ／ＣＢ１９５４、カルボキシペプチダーゼＧ２／ナイトロジェンマスタード、シトクロムＰ４５０／オキサザホスホリン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ／６－メチルプリンデオキシリボシド（ＰＮＰ／ＭＥＰ）、（ＨＲＰ／ＩＡＡ）、及びこれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼ－９遺伝子である（米国付与前特許公開番号第ＵＳ２０１３／００７１４１４号を参照されたく、当該自殺遺伝子は参照により本明細書に組み込まれる）。他の自殺遺伝子は、次のいずれか１つまたは複数をコードする遺伝子を含む：本明細書で説明されるように、医薬品グレード抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体のための立体構造的にインタクトな結合エピトープ、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）；ＥＧＦＲｔ、カスパーゼポリペプチド（例えば、ｉＣａｓｐ９；Ｓｔｒａａｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５：４２４７－４２５４，２００５；Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．．／．Ｍｅｄ．３６５：１６７３－１６８３，２０１１；Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．ｐｉｉ：Ｓ０３０１－４７２Ｘ（１６）３０５１３－６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２０１６．０７．０１１）、ＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２４：１２７７－１２８７，２０１４）、ａ １０－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔａｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃ－ｍｙｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍｙｃ）（Ｋｉｅｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：６２３－６２８，２００８）、及びＲＱＲなどのマーカー／安全スイッチポリペプチド（ＣＤ２０＋ＣＤ３４；Ｐｈｉｌｉｐ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫであり、ガンシクロビルの導入による細胞の排除を可能にする。この遺伝子はまた、レシピエント／宿主に局在する細胞に陽電子放射断層撮影法を用いて遺伝子改変細胞を画像化するために使用され得る。自殺遺伝子はまた、化学的に誘導されたカスパーゼ、小分子／化学的に誘導された二量体化剤（ＣＩＤ）によって誘導される二量体化であり得る。自殺遺伝子はまた、選択可能な表面マーカー（ＣＤ１９またはＣＤ２０またはＣＤ３４またはＥＧＦＲまたはＬＮＧＦＲなど）であってもよく、これにより、抗体依存性細胞傷害、補体カスケードなどによる抗体の導入によって細胞を除去することが可能になる。

いくつかの場合では、自殺遺伝子を、本明細書に提供されるウイルス抗原ペプチドを含むベクター内に含めることができる。他の場合では、自殺遺伝子は、例えばＣＲＩＳＰＲ系、ウイルス系、エレクトロポレーション、トランスフェクション、形質導入、及びそれらの任意の組み合わせを用いて、細胞に別に導入される。いくつかの場合では、自殺遺伝子が標的遺伝子座にノックインされる。

対象へのワクチン接種方法
一態様において、本明細書では、対象において病原体に対する適応免疫応答を誘導するように調整された本明細書に記載のワクチン細胞の集団を投与することにより、前記病原体に対して前記対象を免疫化する方法が提供される（例えば、前記ワクチン細胞は、前記病原体のタンパク質または抗原断片を含む）。

いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、または寄生虫である。

いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルスである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスは、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ヘルペスウイルス、カリシウイルス、肝炎ウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、ラクロス脳炎、カリフォルニア脳炎、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、チクングニアウイルスまたはノロウイルスである。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスはニドウイルス目である。いくつかの実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス科のものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスは、ベータコロナウイルス属のものである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスは、サルベコウイルス亜属のものである。いくつかの実施形態では、上記ウイルスは、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のものである。いくつかの実施形態では、上記ウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のものである。いくつかの実施形態では、上記ウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のものである。

いくつかの実施形態では、前記病原体は細菌である。いくつかの実施形態では、前記細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、ポックスウイルス科、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉｄ、ブルセラ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ、下痢原性Ｅ．ｃｏｌｉ、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、腸内細菌科、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、カンピロバクター属菌、サルモネラ菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅまたはシゲラ属菌である。

いくつかの実施形態では、前記病原体は寄生虫である。いくつかの実施形態では、前記寄生虫は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉまたはＢａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓである。

本明細書に記載の細胞ワクチンは、当技術分野で周知の任意の適切な送達経路によって投与することができ、限定するものではないが、筋肉内注射、皮内注射、静脈内注射または皮下注射が含まれる。いくつかの実施形態では、前記ワクチンは局所的に投与される。いくつかの実施形態では、前記ワクチンは全身的に投与される。いくつかの実施形態では、前記ワクチンは、エピネフリンの在宅送達に使用されるようなペン型注射器デバイスを使用して投与され、ワクチンの自己投与を可能にするために使用され得る。いくつかの場合では、ワクチンは皮内／ＳＱ注射後によって投与される。

いくつかの実施形態では、ワクチンは局所的に投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは皮下投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは患者によって自己投与される。

いくつかの場合では、ワクチンは肺系を介して投与される。いくつかの場合では、ワクチンは吸入される。いくつかの場合では、ワクチンは吸入によって投与される。いくつかの場合では、ワクチンは吸入され、肺に到達することができる。いくつかの場合では、ワクチンは吸入され、気道に到達することができる。いくつかの場合では、ワクチンは経口投与される。いくつかの場合では、ワクチンは経口投与され、消化管に到達することができる。いくつかの場合では、ワクチンは消化器系を介して経口摂取され得る。いくつかの場合では、ワクチンは皮膚に塗布される。いくつかの場合では、ワクチンは皮膚を通して投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは皮膚注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは皮内注射によって投与される。このような送達装置の使用は、パンデミック時に必要となるような大規模な予防接種キャンペーンに特に適し得る。

キット
本明細書に記載の組成物はいずれもキットに含まれてもよい。非限定的な例では、ワクチンはキットに含まれていてもよく、任意の種類の細胞がキットに含まれていてもよく、及び／またはワクチン及び／または細胞を操作するための試薬がキット内に提供されてもよい。成分は、適切な容器手段で提供される。

キットは、適切に分割された組成物を含み得る。キットの構成要素は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器手段を含み、その中に構成要素を入れることができ、好ましくは適切に分割される。キットに複数の構成要素がある場合、キットは一般に、追加の構成要素を別々に入れることができる第２、第３、またはその他の追加の容器も含む。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせがバイアルに含まれてもよい。キットはまた、典型的には、商業販売のために構成要素を厳重に封じ込めるための手段を含むであろう。このような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形のプラスチック容器が含まれ得る。

しかしながら、キットの構成要素は乾燥粉末（複数可）として提供されてもよい。試薬及び／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。溶媒はまた、別の容器手段で提供され得ることが想定される。

本開示の好ましい実施形態を示し、本明細書に記載しているが、そのような実施形態が、例示として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。そして、当業者は、本開示から逸脱せずに、数多くの変形、変更及び置換を思いつくであろう。本開示を実施する際には、本明細書に記載されている本開示の実施形態に対する様々な代替物を用い得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれにより包含されることが意図されている。

実施例１．ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子の両方をノックアウトするためのｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲ遺伝子操作。
親ｉＰＳ細胞株を、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの発現に不可欠な遺伝子（Ｂ２ＭやＣＩＩＴＡなど）を標的とするｇＲＮＡと予め複合化したＣａｓ９タンパク質を用いて、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション系を使用してトランスフェクトする。細胞をトランスフェクションから回収し、完全な増殖培地中で７２時間増殖させた後、ＰＣＲ及び改変領域全体にわたるシーケンシングによる標的遺伝子座を分析する。ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩの損失を、ＩＦＮｇで刺激されたｉＰＳＣ細胞（及びこれらのｉＰＳ細胞から生成された分化細胞）におけるフローサイトメトリーにより、表面発現にて確認する。図７。

さらなる実験では、２つの異なるドナーからの対照細胞またはＢ２Ｍノックアウトプラットフォーム細胞を、Ｔ細胞と共に培養する。ＭＨＣＩ欠損ｉＰＳＣ細胞は、対照ｉＰＳ細胞と比較して、ＭＨＣミスマッチＴ細胞の増殖を活性化することができない（図８Ａ）。さらなる実験では、改変細胞のＮＫ細胞死滅を測定して、ＭＨＣＩの非存在下での細胞溶解の上昇を実証する。
実施例２．重要なＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子または溶解関連遺伝子をゲノムに組み込む実施例１からのＭＨＣヌルｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲ遺伝子操作

活性化リガンド遺伝子
ＭＨＣヌルｉＰＳ細胞を、自然免疫細胞の刺激、活性化、または動員のための導入遺伝子を運ぶｒＡＡＶテンプレートのプラスミド系ＤＮＡドナーのいずれかを標的組み込みするために、ゲノムの領域を標的とするＣａｓ９及びｇＲＮＡ複合体でトランスフェクトする。標的部位には、ゲノムセーフハーバー部位、またはゲノム切断及びドナーテンプレートの挿入を介して不活性化される自然免疫細胞の刺激、活性化または動員を抑制または阻害する遺伝子が含まれる。ドナーテンプレートは、構成的プロモーター及びターミネーター配列を有するリガンドのｃＤＮＡを発現するように設計されている。

溶解遺伝子
ＭＨＣヌルｉＰＳプラットフォーム細胞を、自然免疫細胞によって認識される溶解シグナル（例示的シグナルは表５）のための導入遺伝子を運ぶｒＡＡＶテンプレートのプラスミド系ＤＮＡドナーのいずれかを標的組み込みするために、ゲノムの領域を標的とするＣａｓ９及びｇＲＮＡ複合体でトランスフェクトする。ＭＨＣ－Ｉの欠如に加えて、ＮＫ細胞のなどの自然免疫細胞は、ＮＫ細胞の表面のＮＫＧ２Ｄ受容体と相互作用する細胞表面リガンドの形の二次活性化シグナル（表５のものなど）によって効果的に活性化され、標的ｉＰＳ細胞を殺すことができる。標的部位には、ゲノムセーフハーバー部位、またはゲノム切断及びドナーテンプレートの挿入を介して不活性化される自然免疫細胞の刺激、活性化または動員を抑制または阻害する遺伝子が含まれる。ドナーテンプレートは、構成的プロモーター及びターミネーター配列を有するリガンドのｃＤＮＡを発現するように設計されている。

プラットフォーム細胞からの内皮細胞の生成
内皮系列に向かって分化させるために、ｉＰＳ細胞をビトロネクチンコーティングプレート上で増殖させ、Ｂ２７（－インスリン）、グルタマックス、ペネシリン／ストレプトマイシン含有のＲＰＭＩのベース培地を、０～２日目に６μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、及び１００μｇ／ｍｌ ＡＡ２Ｐ（ステージ１）、続いて２～７日目に５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ１６５＋２０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ＋１０μＭ ＳＢ４３１５４２（ステージ２）で供給した。ＣＤ３１＋ＣＤ１４４＋内皮細胞に対する７日目のフローサイトメトリーの結果を図８Ｂに示す。

トランスフェクションの４８時間後のフローサイトメトリーを、ＮＫ活性化リガンドを過剰発現するｉＰＳＣ由来の内皮細胞で取得し、データを図９に示す。

実施例３．ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質または所望の修飾を有するＳ１サブユニット発現構築物を用いた、プラットフォーム細胞などの操作された細胞ワクチン細胞のトランスフェクション。

Ｌｏｎｚａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｅｏｎ、またはその他の脂質系のトランスフェクションを使用して、スパイクタンパク質またはＳ１サブユニットのｃＤＮＡを発現するＤＮＡドナー（プラスミド、線状ＤＮＡまたはｒＡＡＶドナー）を細胞ワクチン細胞（ｉＰＳＣまたは分化細胞）にトランスフェクトした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体を発現する内皮細胞を溶解し、ＥＬＩＳＡによりスパイクタンパク質抗原について溶解液を分析した。両方のタンパク質抗原変異体を豊富に検出することができ、ワクチン細胞数とともに用量依存的な増加を示した（図１０）。

例示的な戦略では、スパイク抗原変異体発現構築物をコードするＤＮＡ配列を、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子工学を使用してＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に挿入する。
実施例４．実施例３におけるトランスフェクト細胞とドナー由来ＮＫ細胞との共培養及び標準的なエクスビボＮＫ殺傷アッセイによる抗原搭載ワクチン細胞のＮＫ媒介性細胞溶解の分析及び／または共焦点イメージングによる殺傷の分析。

細胞ワクチン細胞は、様々なエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で数日間、ＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞と共培養される。ＮＫを介した細胞溶解は、ＣｙＱＵＡＮＴ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して測定し、プレートリーダーを使用して生細胞と死細胞を測定する。ＮＫ細胞の脱顆粒も、フローサイトメトリーによるＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現の分析によって測定する。

別のアッセイでは、ＮＫ細胞殺傷アッセイを行う２４時間前に、ｉＰＳ由来内皮細胞（プラットフォーム細胞から分化）をＴＲＹＰＬＥで採取し、ｇｅｌｔｒｅｘコーティングされた９６ウェルプレートのウェルに播種し（２ｘ１０^４／ウェル）、ステージ２内皮分化培地で一晩インキュベートした。アッセイの当日、Ｋ５６２細胞を９６ウェルプレートに播種し（２ｘ１０^４／ウェル）、内皮細胞及びＫ５６２細胞の両方をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ色素で染色した。初代ＮＫ細胞を０、０．２５：１、１．２５：１、２．５：１、または５：１で２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５を有する１０％ＦＣＳのＲＰＭＩを含むウェルに添加し、４時間インキュベートした。次いで、７ＡＡＤ染色を用いて試料をフローサイトメーターにかけ、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ標的集団内の死細胞を同定した（図１２）。

このデータは、ＭＨＣ－Ｉの非存在下での効果的なＮＫ細胞の殺傷を実証している。ＭＨＣ－Ｉ欠損、ｉＰＳＣ由来内皮細胞（プラットフォーム細胞から分化）の細胞溶解殺傷を測定するＮＫ細胞アッセイは、ＮＫ死滅のためのゴールドスタンダードＫ５６２細胞株と同等であるロバストで用量依存的な溶解を示す。プラットフォーム細胞またはそれから分化または誘導された細胞は、ＮＫ活性化リガンドを発現するように操作して、この標的細胞溶解をさらに増強し、インビボで投与された場合にロバストかつ迅速な細胞溶解を確実にすることができる。
実施例５．操作されたワクチン細胞と操作されていない細胞との比較

ＮＫ媒介性殺傷及び脱顆粒アッセイを上記のように実施し、細胞ワクチン細胞（ｉＰＳＣ及び分化細胞）を、自然免疫系またはＭＨＣ Ｉ＆ＩＩノックアウトのいずれかを活性化するリガンドの操作なしの同じ細胞型と比較する。
実施例６．ＮＫ細胞媒介溶解時の培養培地中のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質の検出

細胞ワクチン細胞によって発現された、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質の放出（図１１の例示的な概略図）が、スパイクタンパク質特異的ＥＬＩＳＡキット（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．ｃｏｍ／ｅｌｉｓａ－ｋｉｔｓ／ｃｏｖ－ｓｐｉｋｅ－ｋｉｔ４０５９１に提供されるものなど）を用いて、上清中に検出される。

非ヒト霊長類研究
１０匹の成体アカゲザル（６～１２歳）に、合計１．１×１０^６ＰＦＵ（グループ１；Ｎ＝３）、１．１×１０^５ＰＦＵ（グループ２；Ｎ＝３）、または１．１×１０^４ＰＦＵ（グループ３；Ｎ＝３）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、鼻腔内（ＩＮ）経路により１ｍｌ、及び気管内（ＩＴ）経路により１ｍｌ接種する。１０匹の同等のアカゲザルが対照接種を受ける。ウイルスチャレンジに続いて、ウイルスＲＮＡレベルを、気管支肺胞洗浄液や鼻スワブなどの複数の解剖学的区画においてＲＴ－ＰＣＲによって評価する。

ＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質に対する結合抗体応答、及び疑似ウイルス中和アッセイ及び生ウイルス中和アッセイの両方を用いた中和抗体（ＮＡｂ）応答を評価することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的体液性及び細胞性免疫応答を動物において検出する。抗体応答は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、融合前Ｓ外部ドメイン（Ｓ）、及びヌクレオカプシド（Ｎ）に対して評価する。さらに、抗体依存性補体沈着（ＡＤＣＤ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、抗体依存性好中球貪食作用（ＡＤＮＰ）、抗体依存性ＮＫ細胞脱顆粒（ＮＫ ＣＤ１０７ａ）及びサイトカイン分泌（ＮＫ ＭＩＰ１β、ＮＫ ＩＦＮγ）の様々な免疫応答の存在を評価する。
実施例７．ＳＡＲ－ＣｏＶ－２に対するユニバーサルワクチン細胞（ＵＶＣ）

図１３に示すように、ＵＶＣはＭＨＣ－Ｉ欠損（Ｂ２Ｍ ＫＯ）であり、ＭＨＣ－ＩＩを発現しない。ＭＨＣ－Ｉの発現の欠如は、ＮＫ細胞によるＵＶＣの溶解を増強する。ＮＫリガンドＭＩＣＡの発現もまた、ＮＫ細胞結合及びＵＶＣ細胞分解をさらに増強する。ＵＶＣは、細胞内ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及びヌクレオカプシドタンパク質を高レベルで発現する。ＮＫ細胞による細胞溶解時に、これらのタンパク質は免疫微小環境に放出される。

ＵＶＣはＭＨＣ－ＩＩを発現せず、任意のペプチド（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ペプチド）を任意のレシピエント免疫細胞に提示することを防ぎ、ＩＦＮγによって刺激されないようにする。

ワクチン接種部位で、ＵＶＣは自然免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）を活性化してそれ自体の溶解を誘発する。スパイク及びヌクレオカプシドタンパク質は、ＵＶＣのアポトーシスに続いて放出される。ＵＶＣアポトーシス体の貪食作用及び飲作用は、ＡＰＣがスパイクタンパク質及びヌクレオカプシドペプチドを、ＭＨＣ提示を介して適応免疫系に提示することを可能にする。ＵＶＣは、完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び完全長ヌクレオプラスミドタンパク質の両方を発現する。適応免疫系によるロバストな応答を確実にするために、ＵＶＣは、破壊されたフューリン切断部位及び２つのプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するように操作される。このスパイクタンパク質をコードする塩基配列を配列番号５３に示す。

フリン切断部位を含まないＲＳＡスパイクタンパク質のｃＤＮＡ－配列番号５３
ＡＴＧＧＣＡＴＴＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＣＴＧＧＴＴＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＡＣＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＧＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＣＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＣＴＣＧＴＧＣＧＧＧＧＡＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＧＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧＡＣＡＣＣＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＡＡＴＣＣＡＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＣＣＡＡＴＡＴＣＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＣＣＧＴＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＣＴＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＣＡＡＡＣＧＴＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＧＴＧＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＡＣＴＧＣＴＡＣＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＡＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＣＧＧＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＣＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＴＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＴＡＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＡＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＴＡＣＧＡＧＴＧＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＴＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＧＣＧＡＴＡＧＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＧＡＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＣＣＣＧＡＴＣＣＴＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＴＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＴＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＣＧＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＴＣＧＧＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＣＡＧＡＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＧＴＴＡＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＡＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＴＧＡＣＡＴＡＣＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＣＴＴＴＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＣＡＴＴＧＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＴＴＣＴＡＣＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＣＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧＣＧＧＡＡＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＧＧＡＣＴＧＡＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡＴＧＡ

これらの改変により、スパイクタンパク質は、その複数のサブユニットが宿主内で解離するため、無傷で自然な細胞表面活性構造を維持することができる。ヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列を図１４Ａまたは配列番号５４に示す。

ＧｅｎＢａｎｋ：ＱＨＤ４３４２３．２ 配列番号：５４
ＭＳＤＮＧＰＱＮＱＲＮＡＰＲＩＴＦＧＧＰＳＤＳＴＧＳＮＱＮＧＥＲＳＧＡＲＳＫＱＲＲＰＱＧＬＰＮＮＴＡＳＷＦＴＡＬＴＱＨＧＫＥＤＬＫＦＰＲＧＱＧＶＰＩＮＴＮＳＳＰＤＤＱＩＧＹＹＲＲＡＴＲＲＩＲＧＧＤＧＫＭＫＤＬＳＰＲＷＹＦＹＹＬＧＴＧＰＥＡＧＬＰＹＧＡＮＫＤＧＩＩＷＶＡＴＥＧＡＬＮＴＰＫＤＨＩＧＴＲＮＰＡＮＮＡＡＩＶＬＱＬＰＱＧＴＴＬＰＫＧＦＹＡＥＧＳＲＧＧＳＱＡＳＳＲＳＳＳＲＳＲＮＳＳＲＮＳＴＰＧＳＳＲＧＴＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫＫＫＫＡＤＥＴＱＡＬＰＱＲＱＫＫＱＱＴＶＴＬＬＰＡＡＤＬＤＤＦＳＫＱＬＱＱＳＭＳＳＡＤＳＴＱＡ

図１４Ｂに示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及びヌクレオカプシドタンパク質の最大発現を駆動し、確保するために、ＥＦ１ａプロモーターを使用する。１：１の発現比を維持するために、２つのタンパク質を、それらを連結するＴ２Ａペプチド切断配列を用いて同じ転写産物から発現させる。
実施例８．多価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＶＣ設計

Ｋｕｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔ－Ｓｃａｎ：Ａ Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”２０１９，Ｃｅｌｌ，１７８：１０１６－１０２８．ｅ３（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、Ｔ－Ｓｃａｎと呼ばれる全ゲノムスクリーニング技術を、偏りのない方法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＣＤ８＋Ｔ細胞認識の全体的なランドスケープを決定するために使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、単一のＨＬＡ対立遺伝子を発現するように操作された標的細胞（修飾ＨＥＫ２９３細胞）の全ゲノムライブラリーと共培養した。ライブラリ中の各標的細胞はまた、ユニークなコロナウイルス由来６１アミノ酸（ａａ）タンパク質断片を発現した。これらの断片を標的細胞によって自然に処理し、適切なペプチドエピトープを細胞表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に表示した。ＣＤ８＋Ｔ細胞が共培養で標的に遭遇すると、細胞傷害性顆粒を標的細胞に分泌し、標的のアポトーシスを誘導した。その後、初期のアポトーシス細胞を共培養から単離し、発現カセットを配列決定し、タンパク質断片の同一性を明らかにした。まれに認識される標的細胞の選別と分離を最適化するために、標的細胞は、前述のようにグランザイムＢ（ＧｚＢ）活性化蛍光レポーター、ならびに初期アポトーシス細胞の外膜へのホスファチジルセリンの迅速かつ効率的な輸送を駆動する、スクランブラーゼ酵素ＸＫＲ８のＧｚＢ活性化バージョンを発現するように操作した。その後、初期アポトーシス細胞を、アネキシンＶによる磁気活性化セルソーティング、及びそれに続く蛍光レポーターによる蛍光活性化ソーティングによって濃縮した。

２０ａａステップでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１１のすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体にタイルされた６１ａａタンパク質断片のライブラリ。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の既知の遺伝的多様性を捉えるために、２０２０年３月１５日時点で報告されていた１０４の分離株、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのＯＲＦ（ＯＲＦｅｏｍｅ）の完全なセット、及び風邪を引き起こす４つの風土病コロナウイルス（ベータコロナウイルスＨＫＵ１及びＯＣ４３及びアルファコロナウイルスＮＬ６３及び２２９Ｅ）からのすべてのタンパク質コード変異体が含まれていた。ＣＭＶ、ＥＢＶ、及びインフルエンザウイルスからの既知の免疫優性抗原を陽性対照として含めた。我々のスクリーニングで内部複製を提供するための一意のヌクレオチドバーコードを持つ各タンパク質断片は、４３，４２０クローンの最終ライブラリサイズのために１０回表された。

図１４Ｃに示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、ＯＲＦ１ａｂ、Ｓ、Ｎ、Ｍ、及びＯＲＦ３ａを含む多くのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に対する広範な反応性が観察された。図１４Ｄに示すように、２９個のエピトープのうち３個がスパイクタンパク質に位置していた。ほとんどのエピトープ（２９個中１５個）はＯＲＦ１ａｂに位置し、エピトープの最も高い密度はＮタンパク質に位置していた。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、及びＨＬＡ－Ａ＊２４：０２についてはＳタンパク質中の共有エピトープが観察されたが、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、またはＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２については観察されなかった。Ｓタンパク質のＲＢＤにおける唯一の再発反応（ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１上のＫＣＹ）。
実施例９：ＣＲＩＳＰＲ操作ＵＶＣにおける遺伝子発現

ＵＶＣにおける様々なタンパク質の発現レベルを調べた。

ＣＲＩＳＰＲを用いて、ＮＫリガンドＭＩＣＡをＵＶＣゲノム内でノックアウトし、Ｂ２Ｍ遺伝子座をノックアウトしてＭＨＣ－Ｉの発現を除去した。フローサイトメトリー分析を、ＵＶＣ及び親ｉＰＳＣにおけるＭＩＣＡ及びＭＨＣ－Ｉの発現量を調べるために使用した。図１５に示すように、ＵＶＣ集団中のほとんどの細胞は、対照親ＩＰＳＣと比較して、ＭＩＣＡの高レベル発現及びＭＨＣ－Ｉの最小発現を示した。
実施例１０：ＮＫ細胞によるＵＶＣの効果的な溶解

ＵＶＣは、ＮＫ細胞による効果的な溶解を誘導することができる。

ＵＶＣの細胞溶解を測定するために、ＮＫ細胞のカルセインＡＭ（ＣＡＭ）染色を用いたフローサイトメトリー系のＮＫ細胞傷害性アッセイを使用し、これはＪａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ－Ｂａｓｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ．”２０１２，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．Ｗｉｎｔｅｒ；４２（１）：４２－９に記載され、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。マカクＮＫ細胞（エフェクター）をＣＡＭで染色し、ＵＶＣ ＩＰＳｃ由来の標的細胞として一定数のＭＨＣ－Ｉ欠損（Ｂ２Ｍ ＫＯ）内皮細胞（ＥＣ）とともに播種した。細胞を１：１または５：１のＥ：Ｔ比で混合した。野生型ＥＣを対照として用いた。ＣＡＭ染色による前方散乱プロファイルを使用して、ＮＫ細胞とＥＣ細胞を区別した。ヨウ化プロピジウムを使用して、死んだＥＣ細胞の量を検出した。細胞傷害性の割合は、ＥＣ細胞の総量における死細胞の割合としてスコア化した。図１６に示すように、ＮＫ細胞は、いずれのＥ：Ｔ比においても、ＷＴ－ＥＣの溶解量よりもＢ２Ｍ ＫＯ－ＥＣにおいて増加した溶解量を誘導した。

したがって、ＵＶＣは、サルＮＫ細胞によってインビトロで有効な溶解を誘導することができる。
実施例１１：ＮＫリガンドによるＮＫ細胞からのさらなる応答

ＮＫリガンドは、ＮＫ細胞から追加の応答を誘導することができる。

ＮＫリガンドがＮＫ細胞を増加させることができることを示すために、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を用いて、ＭＨＣ－Ｉ欠損ＵＶＣ（ＫＯ）、ＭＩＣＡ発現構築物をトランスフェクトしたＵＶＣ（ＫＯ－ＭＩＣＡ）、ＭＩＣＢ発現構築物でトランスフェクトしたＵＶＣ（ＫＯ－ＭＩＣＢ）、またはＵＬＢＰ１発現構築物でトランスフェクトしたＵＶＣ（ＫＯ－ＵＬＢＰ１）におけるＣＤ１０７ａ、ＭＩＰ１－β、ＩＦＮ－γ、またはＴＮＦ－αの発現を決定した。ヌクレオフェクションを、ＵＶＣをトランスフェクトするために使用した。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ構築物の場合、トランスフェクション効率は約４０～７０％であった。発現構築物は、トランスフェクトされたＵＶＣにおけるそれぞれのＮＫリガンドの高レベル発現を促進した。図１７Ａに示すように、ＫＯ－ＭＩＣＡはＣＤ１０７ａまたはＭＩＰ１－β発現を有するＮＫ細胞の総量を増加させ、一方、ＫＯ－ＭＩＣＡはＣＤ１０７ａ発現を有するＮＫ細胞の総量をＫＯのそれと比較して増加させた。図１７Ｂに例示されるように、ＳＰＩＣＥ分析は、ＵＶＣに応答する場合、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢは複数のサイトカインを発現するＮＫ細胞の量も増加させることを示している。ＮＫリガンドの添加により、ＭＨＣ－Ｉ欠損ＵＶＣに対するＮＫ細胞の応答が増加する。
実施例１２：ＵＶＣ細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の細胞表面発現

ＵＶＣは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のロバストな発現を有する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ノックイン構築物及び構築されたＭＩＣＡノックインは、Ｂ２Ｍノックアウト（Ｂ２ｍ－／－）されたＵＶＣ ｉＰＳＣのゲノムに組み込まれた。図１８Ａに示すように、操作されたＵＶＣ ｉＰＳＣ集団のほぼ半分は、大量のスパイクタンパク質を発現した。図１８Ｂに示すように、ＵＶＣ ｉＰＳＣにおけるスパイクタンパク質発現のレベルは、スパイクタンパク質発現構築物の一過性トランスフェクションを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に類似していた。

多価抗原（例えば、配列番号５３に列挙されるＲＳＡ変異体などの他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体スパイクタンパク質、または配列番号５４に列挙されるヌクレオプラスミドタンパク質などの他のタンパク質）もまた、ＵＶＣにおいて操作され得る。
実施例１３：ＵＶＣ非ヒト霊長類（ＮＨＰ）パイロット－１試験

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して陰性の６匹のサルに、Ｂ２Ｍノックアウト、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、その変異体またはドメインを発現するＭＩＣＡノックインＵＶＣを投与した。図１９Ａ及び図１９Ｂは、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（図１９Ａ）及び全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（図１９Ｂ）の両方について、ワクチン接種後０、２、６、及び８週間に実施された抗体ＥＬＩＳＡの結果を示す。

ＲＢＤ特異的及び全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的結合抗体は、Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，８１２－８１７（２０２０）及びＹｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，８０６－８１１（２０２０）に既述されるように、ＥＬＩＳＡによって評価した。簡単にまとめると、９６ウェルプレートを、１×ＤＰＢＳ中の１μｇ ｍｌ^－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤまたは全長タンパク質（Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，ＭａｓｓＣＰＲ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、プレートを洗浄バッファー（１×ＤＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で１回洗浄し、室温で２～３時間、ウェルあたり３５０μｌのカゼインブロックでブロッキングした。インキュベート後、ブロック溶液を廃棄し、プレートをブロット乾燥させた。カゼインブロックで希釈した熱不活化血清の段階希釈物をウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした後、さらに３回の洗浄と、暗所、室温で抗マカクＩｇＧ ＨＲＰ（ＮＩＨ ＮＨＰ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）の１：１，０００希釈液と共に１時間インキュベートした。次いで、プレートを３回洗浄し、１００μｌのＳｅｒａＣａｒｅ ＫＰＬ ＴＭＢ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｓｔａｒｔ溶液を各ウェルに添加した。プレートの展開を、１ウェルあたり１００μｌのＳｅｒａＣａｒｅ ＫＰＬ ＴＭＢ停止溶液の添加によって停止した。ＶｅｒｓａＭａｘまたはＯｍｅｇａマイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでの吸光度を記録した。

Claims (157)

1. 遺伝子操作されたヒト細胞であって、
   ａ．少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、
   ｂ．貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する細胞表面タンパク質、または前記細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする外因性核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性または細胞溶解活性の活性化をもたらす、前記外因性核酸と、
   を含む、前記遺伝子操作されたヒト細胞。
2. 前記ゲノム破壊が、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上での発現を阻害する、請求項１に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
3. 前記ゲノム破壊が、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上での発現を完全に阻害する、請求項２に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
4. 前記ゲノム破壊が、ＨＬＡクラスＩ遺伝子にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
5. 前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、またはβ－ミクログロブリン遺伝子である、請求項４に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
6. 前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子が、β－ミクログロブリン遺伝子である、請求項５に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
7. 前記ゲノム破壊が、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
8. 前記ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子が、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子である、請求項７に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
9. 前記ＨＬＡ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子が、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＲＦＸＡＰ遺伝子、またはＲＦＸＡＮＫ遺伝子である、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
10. 前記ＨＬＡ遺伝子がＣＩＩＴＡ遺伝子である、請求項９に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
11. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ遺伝子、または前記ＨＬＡクラスＩ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊、及び、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子、または前記ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の前記少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊を含む、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
12. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ転写調節因子遺伝子におけるゲノム破壊、及び、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ転写調節因子におけるゲノム破壊を含む、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
13. 前記免疫細胞が自然免疫細胞である、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
14. 前記自然免疫細胞が、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である、請求項１３に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
15. 前記自然免疫細胞がＮＫ細胞である、請求項１４に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
16. 前記結合が、前記ＮＫ細胞の細胞溶解活性の活性化をもたらす、請求項１５に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
17. 前記細胞表面タンパク質が、ＮＫ細胞の表面に発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体に特異的に結合するリガンドである、請求項１４または１５に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
18. 前記細胞表面タンパク質が、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２（ネクチン－２）、Ｂ７－Ｈ６、Ｎｅｃｌ－２、及び免疫グロブリンＦｃからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
19. 前記細胞表面タンパク質が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンドである、請求項１４または１５に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
20. 前記ナチュラルキラー細胞活性化リガンドが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２（ネクチン－２）、Ｂ７－Ｈ６、及びＮｅｃｌ－２からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の遺伝子操作ヒト細胞。
21. 前記細胞は、貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面上に発現される受容体に結合する分泌タンパク質、または前記分泌タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする外因性核酸を含み、前記タンパク質は、前記遺伝子操作されたヒト細胞に向かって前記免疫細胞を引き付ける、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
22. 外因性タンパク質、その抗原性断片、または自殺遺伝子をコードする核酸をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
23. 前記外因性タンパク質が微生物タンパク質を含む、請求項２２に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
24. 前記微生物タンパク質が、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
25. 前記微生物タンパク質が、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される、請求項２３に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
26. 前記微生物タンパク質が、ウイルス、細菌、寄生虫、または原生動物のタンパク質である、請求項２３または２５に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
27. 前記微生物タンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項２６に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
28. 前記ウイルスタンパク質が、ニドウイルス目のウイルスのものである、請求項２７に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
29. 前記ウイルスタンパク質が、コロナウイルス科のウイルスのものである、請求項２７または２８に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
30. 前記ウイルスタンパク質が、オルトコロナウイルス亜科のウイルスのものである、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
31. 前記ウイルスタンパク質が、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
32. 前記ウイルスタンパク質が、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである、請求項３１に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
33. 前記ウイルスタンパク質が、サルベコウイルス亜属のウイルスのものである、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
34. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
35. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
36. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
37. 前記ウイルスタンパク質が、配列番号１のスパイクタンパク質である、請求項２７～３６のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
38. 前記ウイルスタンパク質が、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である、請求項２７～３６のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
39. 前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスのものである、請求項２７に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
40. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、幹細胞から分化したものである、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
41. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項４０に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
42. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項４０に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
43. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、上皮細胞または内皮細胞である、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
44. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、がん細胞ではない、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
45. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、放射線照射されている、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
46. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、幹細胞である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
47. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項４６に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
48. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項４７に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
49. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、インビトロ、インビボ、またはその両方で増殖することができない、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
50. ワクチンでの使用のための、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
51. 前記少なくとも１つのゲノム破壊が、エンドヌクレアーゼによって媒介される、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
52. 前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項５１に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
53. 前記少なくとも１つのゲノム破壊が、エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系によって媒介され、前記ｇＲＮＡは、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子、または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列を含む、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
54. 遺伝子操作されたヒト細胞であって、
    ａ．少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、
    ｂ．貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性または細胞溶解活性の活性化をもたらす、前記核酸と、
    ｃ．外因性抗原性タンパク質、またはその抗原性断片をコードする核酸と、
    を含む、前記遺伝子操作されたヒト細胞。
55. 前記外因性抗原性タンパク質またはその抗原性断片が、微生物タンパク質またはその抗原性断片である、請求項５４に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
56. 前記外因性抗原性タンパク質が、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む、請求項５５に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
57. 前記微生物タンパク質が、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される、請求項５５に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
58. 前記微生物タンパク質が、ウイルス、細菌、寄生虫、または原生動物のタンパク質である、請求項５５または５７に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
59. 前記微生物タンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項５８に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
60. 前記ウイルスタンパク質が、ニドウイルス目のウイルスのものである、請求項５９に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
61. 前記ウイルスタンパク質が、コロナウイルス科のウイルスのものである、請求項５９または６０に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
62. 前記ウイルスタンパク質が、オルトコロナウイルス亜科のウイルスのものである、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
63. 前記ウイルスタンパク質が、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
64. 前記ウイルスタンパク質が、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである、請求項６３に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
65. 前記ウイルスタンパク質が、サルベコウイルス亜属のウイルスのものである、請求項５９～６４のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
66. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
67. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである、請求項５９～６６のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
68. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である、請求項５９～６７のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
69. 前記ウイルスタンパク質が、配列番号１のスパイクタンパク質である、請求項５９～６８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
70. 前記ウイルスタンパク質が、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である、請求項５９～６８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
71. 前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスに由来する、請求項５９に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
72. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、幹細胞から分化したものである、請求項５４～７１のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
73. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項７２に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
74. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項７３に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
75. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、上皮細胞または内皮細胞である、請求項５４～７４のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
76. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、がん細胞ではない、請求項５４～７５のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
77. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、放射線照射されている、請求項５４～７６のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
78. ワクチンでの使用のための、請求項５４～７７のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
79. 前記免疫細胞が自然免疫細胞である、請求項５４～７８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
80. 前記自然免疫細胞が、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である、請求項７９に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
81. 前記自然免疫細胞がＮＫ細胞である、請求項８０に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
82. 請求項１～８１のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞の集団を含む組成物。
83. 請求項１～８１のいずれか一項に記載の前記遺伝子操作されたヒト細胞、または請求項８２に記載の前記組成物、及び賦形剤を含む医薬組成物。
84. 請求項８２または８３に記載の前記組成物を含む単位剤形。
85. 遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を作製する方法であって、前記方法は、
    ヒト幹細胞の集団を得ることと、
    少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子においてゲノム破壊を誘導することと、
    貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸を導入することであって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性または細胞溶解活性の活性化をもたらす、前記導入することと、
    を含み、これにより、遺伝子操作された幹細胞の集団を産生する、前記方法。
86. 前記ゲノム破壊が、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記細胞の表面上での発現を阻害する、請求項８５に記載の方法。
87. 前記ゲノム破壊が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質と相互作用するのに十分な期間、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質の前記細胞の表面上での発現を阻害する、請求項８５または８６に記載の方法。
88. 前記少なくとも１つのゲノム破壊が、エンドヌクレアーゼによって媒介される、請求項８５～８７のいずれか一項に記載の方法。
89. 前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項８８に記載の方法。
90. 前記少なくとも１つのゲノム破壊が、エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系によって媒介され、前記ｇＲＮＡは、前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列を含む、請求項８５～８９のいずれか一項に記載の方法。
91. 前記ゲノム破壊が、一本鎖ＤＮＡ切断または二本鎖ＤＮＡ切断である、請求項８５～９０のいずれか一項に記載の方法。
92. 微生物タンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸を導入することをさらに含む、請求項８５～９１のいずれか一項に記載の方法。
93. 前記微生物タンパク質が、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む、請求項９２に記載の方法。
94. 前記微生物タンパク質が、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される、請求項９２に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
95. 前記微生物タンパク質が、ウイルス、細菌、または寄生虫タンパク質である、請求項９２または９４に記載の方法。
96. 前記微生物タンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項９５に記載の方法。
97. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項８５～９６のいずれか一項に記載の方法。
98. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項９７に記載の方法。
99. 前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を分化させることをさらに含む、請求項８５～９８のいずれか一項に記載の方法。
100. 前記細胞が、上皮細胞または内皮細胞に分化する、請求項９９に記載の方法。
101. 前記免疫細胞が自然免疫細胞である、請求項８５～１００のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
102. 前記自然免疫細胞が、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である、請求項１０１に記載の方法。
103. 前記自然免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１０２に記載の方法。
104. 最終分化した遺伝子操作されたヒト細胞の集団を作製する方法であって、前記方法は、
     ヒト幹細胞の集団を得ることと、
     少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子または前記ＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子においてゲノム破壊を誘導することと、
     貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸を導入することであって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性または細胞溶解活性の活性化をもたらし、それによって、遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を産生する、前記導入することと、
     前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団を、最終分化した遺伝子操作されたヒト細胞の集団に分化させること、
     を含む、前記方法。
105. 前記遺伝子操作されたヒト幹細胞の集団が、上皮細胞または内皮細胞に分化する、請求項１０４に記載の方法。
106. ヒト対象を微生物に対して免疫化する方法であって、前記方法は、請求項１～８１のいずれか一項に記載の前記遺伝子操作されたヒト細胞、請求項８２に記載の前記組成物、または請求項８３に記載の前記医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
107. ヒト対象を微生物に対して免疫化する方法であって、前記方法は、遺伝子操作されたヒト細胞の集団を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子操作されたヒト細胞の集団は、
     ａ．少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊と、
     ｂ．貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性または細胞溶解活性の活性化をもたらす、前記核酸と、
     ｃ．微生物タンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸と、
     を含む、前記方法。
108. 前記結合が、前記遺伝子操作されたヒト細胞の集団の少なくとも一部の免疫細胞媒介性溶解または貪食作用をもたらす、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記投与することが、前記対象が前記微生物に対する適応免疫応答を開始することをもたらす、請求項１０７または１０８に記載の方法。
110. 前記投与することが、前記微生物タンパク質またはその抗原性断片に特異的に結合するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす、請求項１０７～１０９のいずれか一項に記載の方法。
111. 前記投与することが、前記微生物タンパク質またはその抗原性断片に特異的に結合するＢ細胞受容体を発現するＢ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす、請求項１０７～１１０のいずれか一項に記載の方法。
112. 前記投与が、前記微生物タンパク質またはその抗原性断片に特異的に結合する循環抗体の増加をもたらす、請求項１０７～１１１のいずれか一項に記載の方法。
113. 前記微生物タンパク質またはその抗原性断片が、前記遺伝子操作されたヒト細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作されたヒト細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作されたヒト細胞の細胞質内で発現される、請求項１０７～１１２のいずれか一項に記載の方法。
114. 前記微生物タンパク質が、ウイルス、細菌、または寄生虫タンパク質である、請求項１０７～１１３のいずれか一項に記載の方法。
115. 前記微生物タンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項１１４に記載の方法。
116. 前記ウイルスタンパク質が、コロナウイルス科のウイルスのものである、請求項１１５に記載の方法。
117. 前記ウイルスタンパク質が、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルス属のウイルスのものである、請求項１１５～１１６のいずれか一項に記載の方法。
118. 前記ウイルスタンパク質が、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである、請求項１１５～１１７のいずれか一項に記載の方法。
119. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである、請求項１１５～１１８のいずれか一項に記載の方法。
120. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである、請求項１１５～１１９のいずれか一項に記載の方法。
121. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である、請求項１１５～１２０のいずれか一項に記載の方法。
122. 前記ウイルスタンパク質が、配列番号１のスパイクタンパク質である、請求項１１５～１２１のいずれか一項に記載の方法。
123. 前記ウイルスタンパク質が、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である、請求項１１５～１２１のいずれか一項に記載の方法。
124. 前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、及びそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるウイルスに由来する、請求項１１５に記載の方法。
125. 前記遺伝子操作されたヒト細胞の集団が、筋肉内または皮下に投与される、請求項１０７～１２４のいずれか一項に記載の方法。
126. 前記免疫細胞が、自然免疫細胞である、請求項１０７～１２５のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヒト細胞。
127. 前記自然免疫細胞が、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である、請求項１２６に記載の方法。
128. 前記自然免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１２７に記載の方法。
129. 前記遺伝子操作されたヒト細胞が、自殺遺伝子をさらに含む、請求項１０７～１２８のいずれか一項に記載の方法。
130. 前記微生物タンパク質が、配列番号５４に対して少なくとも約８５％の配列同一性を含むヌクレオカプシドリンタンパク質を含む、請求項１０７に記載の方法。
131. 対象を免疫化する方法であって、前記方法は、遺伝子操作された哺乳動物細胞の集団を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞の集団は、
     ａ．少なくとも１つのＭＨＣ遺伝子またはＭＨＣ遺伝子の少なくとも１つの転写調節因子におけるゲノム破壊であって、前記破壊を有しない前記遺伝子操作されたヒト細胞と比較して、Ｔ細胞増殖の活性化の低下をもたらす、前記ゲノム破壊と、
     ｂ．貪食性もしくは細胞溶解性免疫細胞の表面に発現するタンパク質に結合する外因性細胞表面タンパク質、または前記外因性細胞表面タンパク質の機能的断片もしくは機能的変異体をコードする核酸であって、前記結合は、前記免疫細胞の貪食活性または細胞溶解活性の活性化をもたらす、前記核酸と、
     を含む、前記方法。
132. 前記免疫化が、抗原に特異的であり、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞が、前記抗原またはその断片をコードする核酸をさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
133. 前記免疫化が、抗原に特異的であり、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞が、前記抗原またはその断片をさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
134. 前記活性化が、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞の集団の少なくとも一部の免疫細胞媒介性溶解または貪食作用をもたらす、請求項１３１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
135. 前記投与が、前記対象が前記抗原に対する適応免疫応答を開始することをもたらす、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
136. 前記投与が、前記抗原のペプチドを特異的に結合するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす、請求項１３２～１３５のいずれか一項に記載の方法。
137. 前記投与が、前記抗原のペプチドを特異的に結合するＢ細胞受容体を発現するＢ細胞の活性化及び／または増殖の増加をもたらす、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
138. 前記投与が、前記抗原に特異的に結合する循環抗体の増加をもたらす、請求項１３２～１３７のいずれか一項に記載の方法。
139. 前記抗原が、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞によって分泌されるか、前記遺伝子操作された哺乳動物細胞の表面上で発現されるか、または前記遺伝子操作された哺乳動物細胞の細胞質内で発現される、請求項１３２～１３８のいずれか一項に記載の方法。
140. 前記抗原が、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫タンパク質である、請求項１３２～１３９のいずれか一項に記載の方法。
141. 前記ウイルスタンパク質が、コロナウイルス科のウイルスのものである、請求項１４０に記載の方法。
142. 前記ウイルスタンパク質が、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、またはデルタコロナウイルス属のウイルスのものである、請求項１４０～１４１のいずれか一項に記載の方法。
143. 前記ウイルスタンパク質が、ベータコロナウイルス属のウイルスのものである、請求項１４０～１４１のいずれか一項に記載の方法。
144. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２種のウイルスのものである、請求項１４１～１４３のいずれか一項に記載の方法。
145. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２株のウイルスのものである、請求項１４１～１４４のいずれか一項に記載の方法。
146. 前記ウイルスタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のスパイクタンパク質である、請求項１４１～１４５のいずれか一項に記載の方法。
147. 前記ウイルスタンパク質が、配列番号１のスパイクタンパク質である、請求項１４１～１４６のいずれか一項に記載の方法。
148. 前記ウイルスタンパク質が、配列番号５３によってコードされるスパイクタンパク質である、請求項１４１～１４６のいずれか一項に記載の方法。
149. 前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メガウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、Ｂ型肝炎、水痘帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、狂犬病、天然痘、ＨＩＶ、ハンタウイルス、デング熱、ロタウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、チクングニアウイルス、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを含む群から選択されるウイルスに由来する、請求項１４０に記載の方法。
150. 前記抗原が、がんまたは腫瘍に関連するタンパク質またはペプチドを含む、請求項１３２～１３９のいずれか一項に記載の方法。
151. 前記抗原が、ネオ抗原を含む、請求項１５０に記載の方法。
152. 前記遺伝子操作された細胞の集団が、筋肉内または皮下に投与される、請求項１３１～１５１のいずれか一項に記載の方法。
153. 前記免疫細胞が、自然免疫細胞である、請求項１３１～１５２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
154. 前記自然免疫細胞が、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、または好酸球である、請求項１５３に記載の方法。
155. 前記自然免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１５３に記載の方法。
156. 前記遺伝子操作された哺乳動物細胞が、自殺遺伝子をさらに含む、請求項１３１～１５５のいずれか一項に記載の方法。
157. 前記遺伝子操作された哺乳動物細胞が遺伝子操作されたヒト細胞を含み、前記ＭＨＣ遺伝子がＨＬＡ遺伝子を含む、請求項１３１～１５６のいずれか一項に記載の方法。

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