JP2022535006A - 増殖ｔ細胞アッセイ - Google Patents

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Abstract

個別化がんワクチンを含むワクチンの治療有効性を評価するためのアッセイを提供する。改善されたｍＲＮＡワクチンも提供する。

Description

関連出願
本願は、２０１９年５月３１日に出願した米国特許仮出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／８５５，７１８号に対して、米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく優先権を主張するものであり、その仮出願の内容全体は、参照により、本明細書に援用される。
プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクターまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をベースとする核酸ワクチンは、がん療法、アレルギー療法及び遺伝子置換療法を含むいくつかの臨床用途について評価されてきており、感染症に対するワクチンとして有効であることが実証されている。修飾ｍＲＮＡワクチンは、安全で拡張可能であり、的確な抗原設計をもたらすので、ここ１０年にわたり、かなり注目されている。修飾ｍＲＮＡワクチンは、ウイルスベクターと関連する、既存免疫の問題を回避するとともに、ＤＮＡワクチンよりも強力とみられる。個別化ｍＲＮＡワクチンは特に、がん治療に有益である可能性がある。
米国特許仮出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／８５５，７１８号
いくつかの態様では、本発明は、Ｔ細胞集団において、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を検出する方法であり、その方法は、Ｔ細胞集団のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）を行うこと（そのＩＶＳが、そのＴ細胞を強化培地で培養することと、その培養したＴ細胞を、ネオアンチゲンで成熟させた自己樹状細胞（ＤＣ）で刺激することと、その刺激したＴ細胞を増殖させて、増殖Ｔ細胞の集団を作製することを含む）と、その増殖Ｔ細胞を、ネオアンチゲンで成熟させた自己ＤＣで再刺激することと、その再刺激したＴ細胞を解析して、抗原特異的Ｔ細胞を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、その強化培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－２及びＩＬ－７を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞を強化培地で約２４時間培養してから、ネオアンチゲンで成熟させた自己ＤＣで刺激する。いくつかの実施形態では、刺激したＴ細胞を１２～１６日間または１４日間増殖させる。別の実施形態では、刺激したＴ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－７を含む培地で２日間培養しながら増殖させてから、ＩＬ－２を含む培地で１２日間培養しながら増殖させる。
いくつかの実施形態では、再刺激したＴ細胞は、フローサイトメトリーを用いて解析する。
いくつかの実施形態では、そのＴ細胞集団は、患者のＰＢＭＣから精製したｐａｎ Ｔ細胞の試料である。いくつかの実施形態では、患者のＰＢＭＣは、想定治療処置のベースライン時に、患者へのアフェレーシスによって得る。別の実施形態では、患者のＰＢＭＣは、想定治療処置の実施から７日後に、患者へのアフェレーシスによって得る。いくつかの実施形態では、その想定治療処置は、個別化がんワクチンである。その個別化がんワクチンは、３～５０個のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームを１つ以上有するｍＲＮＡであってよく、そのペプチドエピトープのそれぞれは、脂質ナノ粒子製剤で調合された個別化がん抗原である。
いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の出現頻度のパーセント（％ｆｒｅｑ）として測定する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑが、ベースラインと比べて３倍以上であることにより、Ｔ細胞集団が、Ｔ細胞活性化の閾値レベルを上回っていることが示される。
いくつかの実施形態では、個別化がんワクチンを接種した患者において、Ｔ細胞活性化の解析を行い、その解析に基づき、個別化がんワクチンを再調合し、その患者に、その再調合した個別化がんワクチンを投与する。いくつかの実施形態では、その再調合した個別化がんワクチンは、その患者に最初に投与した個別化がんワクチンには含まれないネオアンチゲンを少なくとも１つ含む。
いくつかの実施形態では、がんワクチンによる治療処置を受けた患者において、Ｔ細胞活性化の解析を行い、その解析に基づき、治療処置を修正する。いくつかの実施形態では、その治療処置を修正する。いくつかの実施形態では、その治療処置の投与スケジュールを修正する。いくつかの実施形態では、その患者に、併用療法を実施する。
本発明の別の態様では、個別化がんワクチンを提供する。そのワクチンは、８～５０個のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームを１つ以上有するｍＲＮＡであり、そのペプチドエピトープのそれぞれは、脂質ナノ粒子製剤で調合されたネオアンチゲンであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、そのネオアンチゲンの少なくとも８個で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した。
いくつかの実施形態では、そのＩＶＳアッセイは、本明細書に記載されているようなアッセイである。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、そのネオアンチゲンの少なくとも８０％で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、そのネオアンチゲンの少なくとも９０％で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した。別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、そのネオアンチゲンのすべてで、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した。
本発明の別の態様では、哺乳動物患者に、その患者にワクチン接種をするのに有効な量で、本明細書に記載されているワクチン組成物を投与することによって、患者にワクチンを接種する方法を提供する。
本開示の各制限は、本開示の様々な実施形態を網羅することができる。したがって、いずれか１つの要素、または複数の要素を組み合わせたものに関する、本開示の各制限は、本開示の各態様に含めることができると想定される。本開示は、その適用の際に、下記の説明で定められているか、または図面に示されている構成要素の構築及び構成の詳細に限定されない。本開示は、他の実施形態が可能であるとともに、様々な方法で実施または実行できる。
添付の図面は、縮尺どおりに描いたわけではない。図面では、各種の図に示されている同一またはほぼ同一の構成要素はそれぞれ、同様の数字で表されている。わかりやすくするために、すべての図面で、すべての構成要素にラベルが付されているわけではない。
例示的なヒト患者で行った免疫モニタリングアッセイの概略図を示している。 Ａ～Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）を行ったＴ細胞を、ネオアンチゲンペプチドプールパルスＤＣで再刺激した結果を示している。Ａは、刺激に用いた抗原プールごとに、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の％ｆｒｅｑを示している棒グラフである。Ｂは、ＣＤ８及びＩＦＮγに関するフローサイトメトリーデータのドットブロットの結果を示している。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）を行ったＴ細胞を、個々のネオアンチゲンペプチドパルスＤＣで再刺激した結果を示している。刺激に用いた個々の抗原ごとに、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の％ｆｒｅｑを示している棒グラフである。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）を行ったＴ細胞を、個々のネオアンチゲンペプチドパルスＤＣで再刺激した結果を示している。ＣＤ８及びＩＦＮγに関するフローサイトメトリーデータのドットブロットの結果を示している。 Ａ～Ｃは、２つの先行技術アッセイ（Ａ及びＢ）、ならびに本発明のアッセイ（Ｃ）を用いた場合のアッセイ感度の差を示している。
ワクチンのような医薬の有効性を評価するための、免疫ベースの新規アッセイを提供する。この新規アッセイは、既存のアッセイと比べて、感度を数倍向上させ、治療処置に改善点をいくつかもたらす。本明細書に開示されている高感度アッセイは、抗原特異的な免疫活性化の従来型の評価よりも、抗原ベースの免疫療法の有効性を速く評価するのに有用である。例えば、がんワクチン療法では、ワクチンの投与を受けてから１週間以内、さらにはそれよりも短い期間で、ワクチンに対する患者の免疫応答を評価し得る。本発明のアッセイの感度により、実施者は、その療法を継続するか、その療法を修正するか、その療法に追加を行うか、またはその療法を中止するかを判断する目的で、１つのワクチン抗原または複数のワクチン抗原が、患者において、抗原特異的Ｔ細胞ベースの十分な免疫応答を起こしているかを評価可能になる。また、本発明のアッセイによって作られるデータにより、最初のワクチンで用いた抗原の機能性に基づき、異なる抗原による修正型ワクチンを作製可能になる。
本発明で開示するアッセイは、ペプチドパルス樹状細胞（ＤＣ）：Ｔ細胞アッセイであり、このアッセイでは、まず、Ｔ細胞をペプチドプールパルスＤＣで刺激してから、長期の増殖期間、すなわち１４日間の経過後に、ネオアンチゲンプール及び／または個々のネオアンチゲンのレベルのペプチドでパルスしたＤＣで再刺激する。このアッセイの刺激／増殖段階は、本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）Ｔ細胞アッセイという。このアッセイは、患者試料に対してこれまで行ってきたアッセイとは、抗原特異的応答を測定する前にＴ細胞の刺激／増殖を行う点、及び解析技法（すなわち、ＥＬＩＳｐｏｔの代わりに、フローサイトメトリーを用いて、抗原特異的応答を測定する）の点の両方で異なる。本明細書に記載されているアッセイ（下パネル）を、ＥＬＩＳｐｏｔベースのアッセイ（上２つのパネル）と比較して描いた概略図が、図１に示されている。
図１の下パネルに示されているように、ベースライン、及び複数のネオアンチゲンをコードするｍＲＮＡワクチンの投与から７日後に、アフェレーシスによって得た、患者のＰＢＭＣから、ｐａｎ Ｔ細胞を精製する。続いて、そのＴ細胞をＩＬ－２添加培地で２４時間培養してから、事前に成熟させてペプチドプールに暴露した自己単球由来ＤＣで、ＩＬ－２含有培地において再刺激する。その後、Ｔ細胞を２日間、ＩＬ－２及びＩＬ－７において増殖し、さらに１２日間、ＩＬ－２において増殖し、このＴ細胞増殖プロセスは、ネオアンチゲンの存在下で行う（ＩＶＳ）。ＩＶＳ後、細胞を、新たに解凍及び成熟させた自己ＤＣであって、ペプチドプールまたは個々のネオアンチゲンに暴露した自己ＤＣで再刺激する。例示されているケースでは、各ネオアンチゲンに対して２５ｍｅｒの最小エピトープを用いて、ＤＣをパルスする。
ヒト患者には、ネオアンチゲンをいくつか有する個別化コンカテマーがんワクチンをコードするｍＲＮＡを接種した。ベースライン（０日目）及びそのワクチンコンストラクトの投与から７日後に、血液を患者から採取した。図１に概括されているこれらの３つのアッセイのそれぞれを用いて、抗原特異的なＴ細胞活性化に関するデータを作成した。Ｔ細胞に対してＩＶＳを行ったところ、ＤＣ：Ｔ細胞共培養法によって、ｅｘ ｖｉｖｏＴ細胞を用いて以前に報告されたデータと比べて、応答の有意な増大が観察された。ＩＶＳ Ｔ細胞集団は、例えば１４日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を行って、ネオアンチゲン特異的なＴ細胞クローンを増殖させてある。この方法は、採取した試料に存在するネオアンチゲン特異的Ｔ細胞を増幅させたので、アッセイに対する感度を有意に上昇させた。
ＩＶＳ Ｔ細胞をペプチドパルスＤＣで再刺激した結果を、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．によって測定したものが、図２Ａ～４Ｃに示されているとともに、実施例に記載されている。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果、及び抗原特異的なＴ細胞応答を、両方の直接ペプチド再刺激ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した結果も行った。
このアッセイにおける出現頻度（％）の評価は、ベースライン、及び閾値レベルに対するレベルまたは活性化を確立するのに有用である。ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋の％ｆｒｅｑの抗原特異的応答が、ベースラインと比べて少なくとも３倍である場合に、抗原は、有意な抗原特異的免疫応答を起こしたとみなす。
増殖Ｔ細胞を、ペプチド（ネオアンチゲン）プールでパルスしたＤＣで再刺激したところ、４回目のワクチン投与から７日後における、ベースラインに対する変化倍率は、ネオアンチゲンプール番号１１～１６での２倍から、ネオアンチゲンプール番号６～１０での１６．４倍までに及んだ。４つのペプチドプールのうちの３つでは、４回目のワクチン投与から７日後、ベースラインと比べて、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が３倍超上昇した。興味深いことに、ペプチドプール１６～２０で再刺激したところ、この時点に、この患者に関して試験したすべてのアッセイ形式において、応答が最も高くなり（図４Ａ～Ｃ）、応答を個々のネオアンチゲンレベルに対してデコンボリューションしたところ、ネオアンチゲン１６に対する単一の応答によって駆動されたとみられる（図３Ａ～Ｂ）。それぞれ異なるアッセイ形式で得られた結果を相互に比較する方法を理解することで、全血採取により、ｅｘ ｖｉｖｏでネオアンチゲン特異的応答を測定するための、より感度の高いアッセイの開発につながる可能性がある。
これらの結果から、個々のネオアンチゲンレベルで応答を起こす能力が立証される。患者のワクチンに含めた２０個のネオアンチゲンのうちの１８個が、クラスＩ（ＣＤ８）Ｔ細胞の応答を誘発すると予測された。クラスＩネオアンチゲンと予測されたもの１８個のうちの１０個では、Ｃ４Ｄ８における、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した。
そのデータから、免疫原性ネオエピトープを予測し、そのネオエピトープをワクチンに組み込む能力に関して、最も詳細な知見が得られ（クラスＩエピトープと予測されたものの５５％が、４回目の投与後に、ベースラインと比べて、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の３倍以上の増加を誘発した）、そのプラットフォームが、ヒトにおいて、ネオアンチゲン特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する能力が示されている。
治療剤
いくつかの実施形態では、対象または患者を治療剤で治療する。本発明のアッセイを用いて、対象または患者において、特定の時間、用量、組み合わせなどにおける治療剤の有効性を評価し得る。そのアッセイから得られた情報を用いて、その療法を改変できる。例えば、有効な抗原特異的免疫応答を起こしていないことが示された場合には、その療法を中止するか、または例えば、１つ以上の抗原、用量、投与経路、療法の長さ、組み合わせなどを変更することによって改変するかしてよい。場合によっては、本発明のアッセイを用いて得られた情報に基づき、新たなワクチンを設計する。このようなワクチンは、本発明の範囲内に含まれる。
すなわち、いくつかの実施形態では、治療処置は、がんワクチンのようなワクチンである。ワクチンとしては、ペプチドベースのワクチン、核酸ワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ）、及び加熱死生物のような全菌体ワクチンが挙げられる。
本開示の実施形態は、１つ以上の抗原をコードするポリヌクレオチドが担体に調合されたものを含むＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。本発明で提供するようなｍＲＮＡワクチンを用いて、ＤＮＡワクチンの接種に伴う多くのリスクなしに、細胞性免疫及び／または液性免疫を含むバランスのとれた免疫応答を誘導し得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む。本開示のｍＲＮＡワクチンは、担体を含む。「担体」という用語は、投与を容易にする目的で、ｍＲＮＡと組み合わせる天然または合成の有機成分または無機成分を示す。
すなわち、本発明は、ｍＲＮＡワクチンに関するものである。そのｍＲＮＡワクチンは、ペプチドベースのワクチンまたはＤＮＡワクチンに代わる特有の医薬を提供する。そのｍＲＮＡワクチンが細胞に送達されると、細胞内の機構によって、ｍＲＮＡが処理されてポリペプチドになり、その後、その機構が、そのポリペプチドを処理して、感染症または腫瘍に対する免疫応答を刺激できる免疫感受性断片にする。
本明細書に記載されているワクチンは、抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、がんもしくは感染症に対する免疫応答を誘導できる免疫原性断片）を少なくとも１つコードするオープンリーディングフレームを有するリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む。本明細書で使用する場合、「オープンリーディングフレーム」という用語は、「ＯＲＦ」と略称され、ｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域のうち、ポリペプチドをコードするセグメントまたは領域を指す。ＯＲＦは、重複しないフレーム内コドンの連続的な領域を含み、開始コドンから始まり、終止コドンで終わり、リボソームによって翻訳される。
本発明のワクチンは、従来型または個別化されたがんワクチンまたは感染症ワクチンであってよい。従来型のがんワクチンは例えば、がんまたは腫瘍に広く、または特定の種類のがんまたは腫瘍に見られることが知られているがん抗原を含むワクチンである。腫瘍細胞内でまたは腫瘍細胞によって発現する抗原は、「腫瘍関連抗原」という。特定の腫瘍関連抗原は、非がん細胞でも発現することもあれば、発現しないこともある。当該技術分野においては、多くの腫瘍変異が知られている。個別化ワクチンは例えば、腫瘍に特異的な既知のがん抗原、または各対象に特異的ながん抗原（ネオエピトープ、患者特異的エピトープまたは患者特異的抗原という）を１つ以上コードするＲＮＡを含んでよい。「患者特異的ながん抗原」は、特定の患者の腫瘍で発現するものとして特定されている抗原である。患者特異的ながん抗原は典型的に、腫瘍試料に広く存在してもよいし、存在しなくてもよい。非がん細胞で発現しないか、非がん細胞で発現することがまれであるか、または非がん細胞での発現が、がん細胞での発現と比べて十分に低下しており、ワクチン接種によって誘導される免疫応答を誘導する腫瘍関連抗原は、ネオエピトープという。
本発明のｍＲＮＡワクチンは、抗原を１つ以上含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上の抗原で構成される。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、１０００個以内、９００個以内、５００個以内、１００個以内、７５個以内、５０個以内、４０個以内、３０個以内、２０個以内または１００個以内のがん抗原で構成される。さらに別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、抗原を３～１００個、５～１００個、１０～１００個、１５～１００個、２０～１００個、２５～１００個、３０～１００個、３５～１００個、４０～１００個、４５～１００個、５０～１００個、５５～１００個、６０～１００個、６５～１００個、７０～１００個、７５～１００個、８０～１００個、９０～１００個、５～５０個、１０～５０個、１５～５０個、２０～５０個、２５～５０個、３０～５０個、３５～５０個、４０～５０個、４５～５０個、１００～１５０個、１００～２００個、１００～３００個、１００～４００個、１００～５００個、５０～５００個、５０～８００個、５０～１，０００個または１００～１，０００個有する。
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチン及びワクチン接種法は、特異的変異に基づくエピトープもしくは抗原（ネオエピトープ）と、がん－生殖細胞遺伝子によって発現されるエピトープもしくは抗原（複数の患者で見られる腫瘍に共通の抗原）、または感染性物質を含む。
抗原決定基としても知られるエピトープとは、本明細書で使用する場合、適切な状況において、免疫系によって、具体的には、抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞によって認識される抗原部分である。エピトープには、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープが含まれる。Ｂ細胞エピトープは、特異的抗体産生Ｂ細胞による認識に必要となるペプチド配列である。Ｂ細胞エピトープとは、抗原の領域のうち、抗体によって認識される特異的領域を指す。エピトープに結合する抗体部分は、パラトープという。エピトープは、構造及びパラトープとの相互作用に基づき、立体構造エピトープまたは線状エピトープであり得る。線状エピトープ、すなわち連続的なエピトープは、タンパク質の特定の領域の一次アミノ酸配列によって定義される。抗体と相互作用する配列は、タンパク質上で順次、互いに隣り合った位置にあり、エピトープは通常、単一のペプチドによって模倣できる。立体構造エピトープは、天然型のタンパク質の立体構造によって定義されるエピトープである。これらのエピトープは、連続的なエピトープであっても非連続的なエピトープであってもよく、すなわち、そのエピトープの構成要素は、そのタンパク質の、異なる部分に位置でき、それらの構成要素は、折り畳まれた天然型のタンパク質構造では、互いに近くなる。
Ｔ細胞エピトープは、ＡＰＣ上のタンパク質と連携して、特異的Ｔ細胞による認識に必要となるペプチド配列である。Ｔ細胞エピトープは、細胞内で処理され、ＡＰＣの表面に提示され、その際、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩを含むＭＨＣ分子に結合している。ペプチドエピトープは、エピトープに適するいずれかの長さであってよい。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、９～３０個のアミノ酸である。別の実施形態では、その長さは、９～２２個、９～２９個、９～２８個、９～２７個、９～２６個、９～２５個、９～２４個、９～２３個、９～２１個、９～２０個、９～１９個、９～１８個、１０～２２個、１０～２１個、１０～２０個、１１～２２個、２２～２１個、１１～２０個、１２～２２個、１２～２１個、１２～２０個、１３～２２個、１３～２１個、１３～２０個、１４～１９個、１５～１８個または１６～１７個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープと、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも１０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも２０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも３０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも４０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも１０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも２０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも３０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも４０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩエピトープ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープの比率は、約１０％：約９０％、約２０％：約８０％、約３０％：約７０％、約４０％：約６０％、約５０％：約５０％、約６０％：約４０％、約７０％：約３０％、約８０％：約２０％、約９０％：約１０％というＭＨＣクラス１：ＭＨＣクラスＩＩエピトープから選択した比率である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ：ＭＨＣクラスＩエピトープの比率は、約１０％：約９０％、約２０％：約８０％、約３０％：約７０％、約４０％：約６０％、約５０％：約５０％、約６０％：約４０％、約７０％：約３０％、約８０％：約２０％、約９０％：約１０％というＭＨＣクラスＩＩエピトープ：ＭＨＣクラスＩエピトープから選択した比率である。いくつかの実施形態では、がんワクチンのペプチドエピトープの少なくとも１つは、Ｂ細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、がんワクチンのＴ細胞エピトープは、アミノ酸を８～１１個含む。いくつかの実施形態では、がんワクチンのＢ細胞エピトープは、アミノ酸を１３～１７個含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＭＨＣクラスＩエピトープで特に有用である。
Ａ．ｍＲＮＡ
本発明の例示的な態様は、ｍＲＮＡワクチンを特徴とする。本明細書に記載されているのは、特定の生物学的作用を発揮するように設計したｍＲＮＡワクチンである。本発明の例示的なワクチンは、該当する１つの特定の抗原をコードするｍＲＮＡ（または及び該当する複数の抗原をコードする１つのｍＲＮＡもしくは複数のｍＲＮＡ）であって、任意に、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡの有効な送達を促すように設計した追加の成分とともに調合したｍＲＮＡを特徴とする。例示的な態様では、本発明のワクチンは、該当する抗原（複数可）をコードする１つのｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡであって、ポリマー成分もしくは脂質成分と複合化したｍＲＮＡ、または特定の態様では、リポソーム、あるいは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入したｍＲＮＡを特徴とする。ｍＲＮＡの化学修飾により、本発明におけるワクチンの特定の望ましい特性を促進でき、例えば、そのワクチンに対する免疫応答の種類に影響を及ぼすことができる。例えば、ｍＲＮＡの適切な化学修飾により、ｍＲＮＡ成分に対する望ましくない自然免疫応答を軽減でき、及び／または該当する１つの抗原もしくは複数の抗原の所望のタンパク質発現レベルを促すことができる。本発明の上記のような特徴のさらなる説明は、下記に示されている。
１．化学修飾ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、化学修飾核酸塩基を含む。本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。その修飾ポリヌクレオチドは、化学修飾及び／または構造修飾されていることができる。本発明のポリヌクレオチドが、化学修飾及び／または構造修飾されている場合には、そのポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称することができる。
本開示は、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを提供する。本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用し、その用語には、ヌクレオチドのポリマーを含むあらゆる化合物及び／または物質、あるいはその誘導体または類似体が含まれる。これらのポリマーは、「ポリヌクレオチド」と称する場合が多い。したがって、本明細書で使用する場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、同等のものであり、同義的に使用される。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リボ型の構造を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ型の構造を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含む）、またはこれらのハイブリッドが挙げられるが、これらに限らない。本明細書で使用する場合、「核酸塩基」（あるいは「ヌクレオチド塩基」または「含窒素塩基」）という用語は、核酸に見られる複素環式化合物プリンまたはピリミジンを指し、天然のプリン及びピリミジンの誘導体または類似体のうち、核酸またはその一部もしくはセグメントの特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を向上させるいずれの誘導体または類似体も含まれる。アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシルは、天然の核酸で主に見られる核酸塩基である。当該技術分野において知られており、及び／または本明細書に記載されているような他の天然、非天然及び／または合成の核酸塩基を核酸に組み込むことができる。ヌクレオシド／ヌクレオチド：本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」という用語は、糖分子（例えば、ＲＮＡではリボース、もしくはＤＮＡではデオキシリボース）またはその誘導体もしくは類似体が、核酸塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）、またはその誘導体もしくは類似体（これらも、本明細書では「核酸塩基」という）に共有結合しているものを含むが、ヌクレオシド間結合基（例えばリン酸基）を含まない化合物を指す。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間結合基（例えばリン酸基）、またはその誘導体、類似体もしくは修飾体のうち、核酸またはその一部もしくはセグメントの化学的特性及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を向上させるいずれかの誘導体、類似体もしくは修飾体に共有結合しているヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、いずれかの有用な方法、例えば、化学物質、酵素または組み換えによる方法によって合成して、修飾ヌクレオシドまたは非天然ヌクレオシドを１つ以上含めることができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオシドが連結した１つの領域または複数の領域を含む。このような領域は、様々な骨格結合を有する。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であることができ、この場合には、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むことになる。
本発明で開示する修飾ポリヌクレオチドは、様々な別個の修飾を含むことができる。いくつかの実施形態では、その修飾ポリヌクレオチドは、（任意に異なる）ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を１つ、２つまたはそれを超える数含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチドは、１つ以上の所望の特性、例えば、非修飾ポリヌクレオチドと比べて、細胞内で、タンパク質発現が改善する特性、免疫原性が低減される特性または分解が低減される特性を示すことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造修飾されており、すなわち、核酸構造の修飾を１つ以上含む。本明細書で使用する場合、「構造」修飾とは、ヌクレオチド自体に対する有意な化学修飾のない状態で、ポリヌクレオチドにおいて、連結された２つ以上のヌクレオシドが挿入、欠失、複製、反転またはランダム化されている修飾である。さらに、「核酸構造」という用語（「ポリヌクレオチド構造」と同義的に使用する）は、核酸（例えばｍＲＮＡ）を構成する、連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の原子の配置もしくは編成、化学的構成成分、要素、モチーフ及び／または配列を指す。この用語は、核酸の２次元状態または３次元状態も指す。したがって、「ＲＮＡ構造」という用語は、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）を構成する、連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の原子の配置もしくは編成、化学的構成成分、要素、モチーフ及び／または配列を指し、及び／またはＲＮＡ分子の２次元状態及び／または３次元状態を指す。核酸構造はさらに、本明細書において、構成の複雑性の上昇に基づき、「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」及び「三次構造」という４つの構成カテゴリーに分類できる。構造修飾を行うには、化学結合を破壊して再形成する必要があるので、構造修飾は、化学的性質の改変であり、すなわち、化学修飾である。しかしながら、構造修飾により、異なる配列のヌクレオチドが得られることになる。例えば、「ＡＴＣＧ」というポリヌクレオチドは、化学修飾して、「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」にできる。同じポリヌクレオチドを「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造修飾できる。この場合には、「ＣＣ」というジヌクレオチドを挿入することで、ポリヌクレオチドへ構造修飾が行われている。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、化学修飾されている。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドに関しては、「化学修飾」または適宜に「化学的に修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）またはシチジン（Ｃ）というリボヌクレオシド、またはデオキシリボヌクレオシドにおいて、それらの位置、パターン、割合または集団の１つ以上での修飾を指す。概して、本明細書では、これらの用語は、天然の５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されていない。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じタイプのヌクレオシドのすべてもしくはいずれかの均一な化学修飾を有するか、同じタイプのヌクレオシドのすべてもしくはいずれかにおいて、同じ開始時修飾を単に漸減することによって施される修飾群を有するか、または同じタイプのヌクレオシドのすべてもしくはいずれかの、測定した割合の化学修飾を有するが、ランダムに組み込まれていることができる（すべてのウリジンが、ウリジン類似体、例えばシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンに置き換えられているなど）。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチド全体にわたり、２つ、３つまたは４つの同じタイプのヌクレオシドの均一な化学修飾を有することができる（すべてのウリジン及びすべてのシトシンなどが、同じ方法で修飾されているなど）。
修飾ヌクレオチド塩基の対合には、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシルまたはグアノシン－シトシンという塩基対のみならず、ヌクレオチド及び／または非標準的な塩基もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチドの間で形成される塩基対も含まれ、水素結合ドナー及び水素結合アクセプターの配置により、非標準的な塩基と標準的な塩基の間、または相補的である２つの非標準的な塩基構造の間で水素結合が可能になる。このような非標準的な塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーのいずれの組み合わせも、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。
別段の断りのない限り、本願で示されているポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列では「Ｔ」と書かれているが、その配列がＲＮＡを表す場合には、「Ｔ」は「Ｕ」に置き換わることは当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）には、少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれを超える数）の修飾核酸塩基を組み合わせたものが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、化学修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、その化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その１つ以上のｍＲＮＡは、完全に修飾されている。
いくつかの実施形態では、その少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（Ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン、α－チオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、２，６－ジアミノプリン、（Ｉ），１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、２，８－ジメチルアデノシン、２－ゲラニルチオウリジン、２－リシジン、２－セレノウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－５，６－ジヒドロウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、３－メチルシュードウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－アミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－アミノメチル－２－セレノウリジン、５－アミノメチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－シアノメチルウリジン、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、７－アミノカルボキシプロピル－デメチルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８－メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジン、Ｎ６－ホルミルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環状Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル－キューオシン、メチル化中間体ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、ゲラニル化５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、ゲラニル化５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、Ｑｂａｓｅ、ｐｒｅＱ０ｂａｓｅ、ｐｒｅＱ１ｂａｓｅ及びこれらを２つ以上組み合わせたのものからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、上記の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれを超える数）を組み合わせたものを含む。
２．ｍＲＮＡフランキング領域
特定の態様では、本開示は、抗原またはその機能的断片を１つ以上コードする核酸分子、具体的にはポリヌクレオチドを提供する。本開示のいくつかの実施形態において有益と考えることができる特徴は、そのポリヌクレオチドの領域によってコードすることができ、そのような領域は、ポリペプチドをコードする領域の上流（５’側）もしくは下流（３’側）、またはポリペプチドをコードする領域内にあることができる。これらの領域は、タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列最適化の前及び／または後に、ポリヌクレオチドに組み込むことができる。ポリヌクレオチドは、５’フランキング領域及び３’フランキング領域の両方を含む必要はない。このような特徴の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、オリゴ（ｄＴ）配列及び検出可能なタグが挙げられるが、これらに限らず、ＸｂａＩ認識部を有することができる複数のクローニング部位を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域及び／または３’ＵＴＲ領域は、フランキング領域として供給できる。複数の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲは、フランキング領域に含めることができ、同じであることも、異なる配列であることもできる。フランキング領域のいずれかの部分を配列最適化でき（いずれの部分も配列最適化しないことも含む）、いずれも独立して、配列最適化の前及び／または後に、１つ以上の異なる構造修飾または化学修飾を含むことができる。
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、開始コドンの前（５’ＵＴＲの場合）、及び終止コドンの後（３’ＵＴＲの場合）にある、ポリヌクレオチドの核酸部分であって、翻訳されない部分である。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、本発明のポリヌクレオチド（例えばリボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらを組み合わせたもの）をさらに含む。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドにおけるコード領域と同種のものであることも、異種のものであることもできる。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、抗原ポリペプチドをコードするＯＲＦと同種のものである。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、抗原ポリペプチドをコードするＯＲＦと異種のものである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲまたはその機能的断片を２つ以上含み、そのそれぞれは、同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲまたはその機能的断片を２つ以上含み、そのそれぞれは、同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、その５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらをいずれかに組み合わせたものは、配列が最適化されている。
いくつかの実施形態では、その５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらをいずれかに組み合わせたものは、化学修飾核酸塩基、例えば５－メトキシウラシルを少なくとも１つ含む。
ＵＴＲは、調節的な役割、例えば、安定性、局在化及び／または翻訳効率の増減をもたらす特徴を有することができる。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織または生物に投与でき、常法を用いて、１つ以上の調節的な特徴を測定できる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの機能的断片は、完全長５’ＵＴＲの調節的な特徴を１つ以上含み、または３’ＵＴＲの機能的断片は、完全長３’ＵＴＲの調節的な特徴を１つ以上含む。
特異的な標的器官で豊富に発現する遺伝子で典型的に見られる特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生性を促進できる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチンまたは第ＶＩＩＩ因子のように、肝臓で発現するもののｍＲＮＡの５’ＵＴＲを導入すると、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を促進できる。同様に、他の組織特異的なｍＲＮＡに由来する５’ＵＴＲを用いて、その組織での発現を向上させることは、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ハーキュリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞（例えばＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）で可能である。
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴または特性を有する転写産物ファミリーから選択されている。例えば、コードされるポリペプチドは、タンパク質（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在性、起源または発現パターンを共有するタンパク質）のファミリーに属することができ、それらのタンパク質は、特定の細胞、組織、または場合によっては発生中において発現するものである。その遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを、同じファミリーまたは異なるファミリーのタンパク質の、いずれかの他のＵＴＲに入れ替えて、新たなポリヌクレオチドを作ることができる。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、異種のものであることができる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種から得ることができる。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種から得ることができる。
共有国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開番号ＷＯ／２０１４／１６４２５３、参照により、その全体が本明細書に援用される）には、本発明のポリヌクレオチドで、ＯＲＦに対するフランキング領域として使用できる例示的なＵＴＲのリストが示されている。
本願の例示的なＵＴＲとしては、α－グロビンまたはβ－グロビンのようなグロビン（例えば、クセノプスグロビン、マウスグロビン、ウサギグロビンまたはヒトグロビン）、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナル、ＣＹＢＡ（例えばヒトシトクロムｂ－２４５αポリペプチド）、アルブミン（例えばヒトアルブミン７）、ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）、ウイルス（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デングウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶ前初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルスまたはオオムギ黄萎ウイルスＰＡＶ）、熱ショックタンパク質（例えばｈｓｐ７０）、翻訳開始因子（例えばｅｌＦ４Ｇ）、グルコース輸送体（例えばｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））、アクチン（例えば、ヒトαアクチンまたはヒトβアクチン）、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、クエン酸回路酵素、トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠損したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ）、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）、リボソームタンパク質（例えば、ヒトリボソームタンパク質またはマウスリボソームタンパク質（例えばｒｐｓ９など））、ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１、またはミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）、成長ホルモンｅ（例えば、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ））、伸長因子（例えば伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲンα２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲンα１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲンα２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲンα１（Ｃｏｌ６Ａ１））、リボプリン（例えばリボプリンＩ（ＲＰＮＩ））、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えばＬＲＰ１）、カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えばＮｎｔ１）、カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）、プロコラーゲン－リシン，２－オキソグルタル酸５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）、及びヌクレオビンディン（例えばＮｕｃｂ１）の核酸配列から得られる１つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、β－グロビン５’ＵＴＲ、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ、シトクロムｂ－２４５αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ、非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム、デングウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ、ｅＩＦ４Ｇ ５’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１ ５’ＵＴＲ、これらの機能的断片、及びこれらをいずれかに組み合わせたものからなる群から選択されている。
いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、β－グロビン３’ＵＴＲ、ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ、アルブミン３’ＵＴＲ、成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ、ＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ、α－グロビン３’ＵＴＲ、ＤＥＮ ３’ＵＴＲ、オオムギ黄萎ウイルスＰＡＶ（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）３’ＵＴＲ、伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ、ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β－ｍＲＮＡ）３’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１ ３’ＵＴＲ、ＭＥＦ２Ａ ３’ＵＴＲ、β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ ３’ＵＴＲ、これらの機能的断片、及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている。
本発明のポリヌクレオチドには、いずれかの遺伝子またはｍＲＮＡから得られる野生型ＵＴＲを組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ＵＴＲでは、例えば、ＯＲＦに対するＵＴＲの配向もしくは位置を変更することによって、または、追加のヌクレオチドを加えるか、ヌクレオチドを欠失させるか、ヌクレオチドを置き換えるか、もしくはヌクレオチドを転移させることによって、野生型または天然型のＵＴＲに対して改変を加えて、バリアントＵＴＲを作製できる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、または１つ以上のヌクレオチドが、ＵＴＲの末端に付加されているか、またはＵＴＲの末端から除去されているバリアントを利用できる。
加えて、１つ以上の合成ＵＴＲを、１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用できる。例えば、Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２、及びａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／で入手可能な配列（これらの内容はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。ＵＴＲまたはその一部は、それらの選択元である転写産物と同じ配向で配置することもできるし、または配向もしくは位置を改変することもできる。すなわち、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、反転させたり、短くしたり、長くしたり、または他の１つ以上の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと組み合わせたりできる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、多重のＵＴＲ、例えば、二重、三重または四重の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重のＵＴＲは、同じＵＴＲを２コピー、連続して、または実質的に連続して含む。例えば、二重のβ－グロビン３’ＵＴＲを使用できる（ＵＳ２０１０／０１２９８７７（その内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＵＴＲのいずれか１つから選択した５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。本発明のポリヌクレオチドは、特徴を組み合わせたものを含むことができる。例えば、ＯＲＦは、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ、及び／またはポリＡテールを鋳型によって付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲに隣接させることができる。５’ＵＴＲは、同じＵＴＲ及び／または異なるＵＴＲに由来する第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含むことができる（例えば、ＵＳ２０１０／０２９３６２５（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。
他の非ＵＴＲ配列を、本発明のポリヌクレオチド内の領域またはサブ領域として使用できる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことができる。イントロン配列を組み込むと、タンパク質の産生量及びポリヌクレオチドの発現レベルを上昇させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりに、またはＵＴＲに加えて、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９－１９３（その内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりに、ＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、合成５’ＵＴＲを、非合成３’ＵＴＲと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、１つの翻訳エンハンサーエレメントまたは複数の翻訳エンハンサーエレメント（総称して「ＴＥＥ」といい、ポリヌクレオチドから作られるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す）も含むことができる。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンの間に配置できる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
一態様では、ＴＥＥは、ＵＴＲにおける保存されたエレメントのうち、キャップ依存性翻訳またはキャップ非依存性翻訳（ただし、これらに限らない）のような核酸翻訳活性を促進できるエレメントである。
非限定的な一例では、ＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’リーダーにおけるＴＥＥ配列を含む。Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００４ １０１：９５９０－９５９４（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＥＥを１コピーまたは複数コピー含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおけるＴＥＥは、１つ以上の配列セグメント内に編成することができる。配列セグメントは、本明細書に示されているＴＥＥを１つ以上有することができ、そのＴＥＥはそれぞれ、１コピー以上で存在する。複数の配列セグメントが翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合には、それらのセグメントは、均質であることも、不均質であることもできる。すなわち、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド内の複数の配列セグメントは、本明細書に示されているＴＥＥのうちの同じ種類もしくは異なる種類のＴＥＥ、同じコピー数もしくは異なるコピー数の各ＴＥＥ、及び／または同じ編成もしくは異なる編成のＴＥＥを各配列セグメント内に有することができる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＴＥＥを少なくとも１つ含む５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、ベクター系または核酸ベクターなど（ただし、これらに限らない）のモノシストロン配列で組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、本明細書に記載されているＴＥＥまたはその一部分を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲのＴＥＥは、５’ＵＴＲに配置したＴＥＥと同じ及び／または異なることができる。
いくつかの実施形態では、２つのＴＥＥ配列を引き離すスペーサーは、当該技術分野において知られている他の配列のうち、本発明のポリヌクレオチドの翻訳を調節できる配列、例えば、本明細書に記載されているｍｉＲ配列（例えばｍｉＲ結合部位）を含むことができる。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を引き離す目的で用いる各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列（例えばｍｉＲ結合部位）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列を本発明のポリヌクレオチドに組み込むと、ステムループ領域の形状を変化させることができ、それにより、翻訳量を増加及び／または減少させることができる。例えば、Ｋｅｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０ １２（１０）：１０１４－２０（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
本明細書に記載されているｍＲＮＡワクチンは、いくつかの点が、現行のワクチンよりも優れている。いくつかの態様では、本発明のワクチンは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に調合されている。ＬＮＰの使用により、化学修飾ｍＲＮＡワクチンまたは非修飾ｍＲＮＡワクチンを効果的に送達可能になる。ＬＮＰに調合した修飾ｍＲＮＡワクチン及び非修飾ｍＲＮＡワクチンのいずれも、従来のワクチンよりも、かなりの程度優れている。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、従来のワクチンよりも、少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１，０００倍優れている。
いくつかの態様では、本発明のワクチンは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に調合されている。ＬＮＰの使用により、化学修飾ｍＲＮＡワクチンまたは非修飾ｍＲＮＡワクチンを効果的に送達可能になる。ＬＮＰに調合した修飾ｍＲＮＡワクチン及び非修飾ｍＲＮＡワクチンのいずれも、従来のワクチンよりも、かなりの程度優れている。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、従来のワクチンよりも、少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１，０００倍優れている。
一連の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質（イオン化可能なカチオン性脂質など）を含む脂質、構造脂質、リン脂質及びｍＲＮＡを含む。本明細書に記載されている各ＬＮＰは、本明細書に記載されているｍＲＮＡ用の調合剤として使用し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質、ＰＥＧ修飾脂質、リン脂質及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのモル比は、イオン化可能な脂質が約２０～６０％、リン脂質が約５～２５％、構造脂質が約２５～５５％、ＰＥＧ修飾脂質が約０．５～１５％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのモル比は、イオン化可能な脂質が約５０％、ＰＥＧ修飾脂質が約１．５％、構造脂質が約３８．５％、リン脂質が約１０％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのモル比は、イオン化可能な脂質が約５５％、ＰＥＧ脂質が約２．５％、構造脂質が約３２．５％、リン脂質が約１０％である。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質またはカチオン性脂質であり、リン脂質は、中性脂質であり、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのモル比は、イオン化可能な脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ＝５０：３８．５：１０：１．５である。
本明細書に記載されているイオン化可能な脂質（例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）のいずれかを有する脂質）は、ワクチンを哺乳動物の細胞または器官に送達するための脂質ナノ粒子組成物で使用するのに有益な場合がある。いくつかの実施形態では、そのイオン化可能な脂質は、以下の式（Ｉ）を有する脂質であって、
Figure 2022535006000002
 式中、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択されており、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３が、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択されており、そのＱが、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択されており、各ｎが独立して、１、２、３、４及び５から選択されており、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択されており、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択されており、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択されており、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択されている脂質、
あるいはその塩または立体異性体である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式中、
Ｒ１が、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択されており、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３が、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択されており、そのＱが、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択されており、各ｎが独立して、１、２、３、４及び５から選択されており、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択されており、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択されている化合物、
あるいはその塩または立体異性体であって、そのアルキル基及びアルケニル基が、直鎖もしくは分岐鎖であってよい化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲまたは－ＣＱ（Ｒ）２である場合には、（ｉ）ｎが、１、２、３、４もしくは５であるときに、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）ｎが、１もしくは２であるときに、Ｑが、５員、６員もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない化合物を含む。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択されており、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３が、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択されており、そのＱが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員のヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ及びＣ１－３アルキルから選択した１つ以上の置換基で置換されている５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択されており、各ｎが独立して、１、２、３、４及び５から選択されており、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択されており、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択されており、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択されており、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択されている化合物、
あるいはその塩または立体異性体を含む。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択されており、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３が、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択されており、そのＱが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員のヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ及びＣ１－３アルキルから選択した１つ以上の置換基で置換されている５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択されており、各ｎが独立して、１、２、３、４及び５から選択されており、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択されており、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択されている化合物、
あるいはその塩または立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１が、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択されており、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３が、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択されており、そのＱが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびに－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２からなる群から選択されており、各ｎが独立して、１、２、３、４及び５から選択されており、Ｑが、５～１４員の複素環であるとともに、（ｉ）Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱであり、そのｎが１もしくは２であるか、（ｉｉ）Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、そのｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２である場合には、Ｑが、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択されており、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択されており、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択されており、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択されている化合物、
あるいはその塩または立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１が、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択されており、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３が、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択されており、そのＱが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択されており、各ｎが独立して、１、２、３、４及び５から選択されており、Ｑが、５～１４員の複素環であるとともに、（ｉ）Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱであり、そのｎが、１もしくは２であるか、（ｉｉ）Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、そのｎが、１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２である場合には、Ｑが、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択されており、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択されている化合物、
あるいはその塩または立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択されており、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３が、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択されており、そのＱが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびに－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択されており、各ｎが独立して、１、２、３、４及び５から選択されており、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択されており、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択されており、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択されており、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択されており、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択されており、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択されている化合物、
あるいはその塩または立体異性体を含む。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、下記の式（ＩＡ）の化合物、
Figure 2022535006000003
 またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４及び５から選択されており、ｍは、５、６、７、８及び９から選択されており、Ｍ１は、結合手またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換のＣ１－３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱであり、そのＱは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択されている。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、下記の式（ＩＩ）の化合物、
Figure 2022535006000004
 またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４及び５から選択されており、Ｍ１は、結合手またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換のＣ１－３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱであり、そのｎは、２、３または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択されており、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択されている。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、下記の式（ＩＩａ）の化合物、
Figure 2022535006000005
 またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上記のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、下記の式（ＩＩｂ）の化合物、
Figure 2022535006000006
 またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上記のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、下記の式（ＩＩｃ）の化合物、
Figure 2022535006000007
 またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上記のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、下記の式（ＩＩｅ）の化合物、
Figure 2022535006000008
 またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上記のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、下記の式（ＩＩｄ）の化合物、
Figure 2022535006000009
 またはその塩であり、式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択されており、ｎは、２、３及び４から選択されており、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ５、Ｒ６及びｍは、上で定義したとおりである。
本明細書で使用する場合、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、炭素原子を１つ以上（例えば、炭素原子を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれを超える数）含む直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。
「Ｃ１－１４アルキル」という表記は、炭素原子を１～１４個含む直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意に置換されていることができる。
本明細書で使用する場合、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、炭素原子を２つ以上（例えば、炭素原子を２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれを超える数）と、二重結合を少なくとも１つ含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
「Ｃ２－１４アルケニル」という表記は、炭素原子を２～１４個と、二重結合を少なくとも１つ含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基は、二重結合を１つ、２つ、３つ、４つまたはそれを超える数含むことができる。例えば、Ｃ１８アルケニルは、二重結合を１つ以上含むことができる。二重結合を２つ含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であることができる。アルケニル基は、任意に置換されていることができる。
本明細書で使用する場合、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子からなる環を１つ以上含む単環系または多環系を意味する。環は、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員、１４員または１５員の環であることができる。
「Ｃ３－６炭素環」という表記は、炭素原子を３～６個有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、二重結合を１つ以上含むことができ、芳香族（例えばアリール基）であることができる。炭素環の例としては、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基及び１，２－ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意に置換されていることができる。
本明細書で使用する場合、「複素環」または「複素環式基」という用語は、環を１つ以上含む単環系または多環系であって、少なくとも１つの環が、ヘテロ原子を少なくとも１つ含む。ヘテロ原子は例えば、窒素原子、酸素原子または硫黄原子であることができる。環は、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員または１２員の環であることができる。複素環は、二重結合を１つ以上含むことができ、芳香族（例えばヘテロアリール基）であることができる。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル及びイソキノリル基が挙げられる。複素環は、任意に置換されていることができる。
本明細書で使用する場合、「生分解性基」とは、患者において脂質代謝の高速化を促進できる基である。生分解性基は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基及びヘテロアリール基であることができるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、「アリール基」とは、芳香族環を１つ以上含む炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール基」とは、芳香族環を１つ以上含む複素環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基のいずれも、任意に置換されていることができる。例えば、Ｍ及びＭ’は、任意に置換されたフェニル、オキサゾール及びチアゾールからなる非限定的な群から選択できる。本明細書内の式では、Ｍ及びＭ’は独立して、上記の生分解性基のリストから選択できる。
アルキル基、アルケニル基及びシクリル基（例えば、カルボシクリル基及びヘテロシクリル基）は、別段の定めのない限り、任意に置換されていることができる。任意の置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、－ＯＨ）、エステル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、あるいはＣ＝Ｏによって表される）、ハロゲン化アシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｘ（そのＸは、臭化物、フッ化物、塩化物及びヨウ化物から選択したハロゲン化物である））、炭酸塩（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、－ＯＲ）、アセタール（例えば、－Ｃ（ＯＲ）２Ｒ”“（その各ＯＲは、同じであることも異なることもできるアルコキシ基であり、Ｒ”“は、アルキル基またはアルケニル基である））、リン酸塩（例えば、Ｐ（Ｏ）４ ３－）、チオール（例えば、－ＳＨ）、スルホキシド（例えば、－Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、－Ｃ（Ｓ）Ｈ）、硫酸塩（例えば、Ｓ（Ｏ）４ ２－）、スルホニル（例えば、－Ｓ（Ｏ）２－）、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ２または－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、－Ｎ３）、ニトロ（例えば、－ＮＯ２）、シアノ（例えば、－ＣＮ）、イソシアノ（例えば、－ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、－ＮＲ２、－ＮＲＨまたは－ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨまたは－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈまたは－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、ならびにシクリル基（例えば、カルボシクリル基またはヘテロシクリル基）からなる群から選択できるが、これらに限らない。
上記のいずれにおいても、Ｒは、本明細書に定義されているようなアルキル基またはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体がさらに、例えば、本明細書に定義されているような１個、２個、３個、４個、５個または６個の置換基で置換されていることができる。例えば、Ｃ１－６アルキル基はさらに、本明細書に記載されているような１個、２個、３個、４個、５個または６個の置換基で置換されていることができる。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）及び（ＩＩｅ）のいずれか１つの化合物は、該当する場合、下記の特徴の１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択されており、そのＱは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員の芳香族または非芳香族の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ならびに－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲからなる群から選択されており、各ｎは独立して、１、２、３、４及び５から選択されている。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択されており、そのＱは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員のヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ及びＣ１－３アルキルから選択した１つ以上の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルからなる群から選択されており、各ｎは独立して、１、２、３、４及び５から選択されている。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択されており、そのＱは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択されており、各ｎは独立して、１、２、３、４及び５から選択されており、Ｑが、５～１４員の複素環であるとともに、（ｉ）Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱであり、そのｎが、１もしくは２であるか、（ｉｉ）Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、そのｎが、１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２である場合には、Ｑは、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかである。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択されており、そのＱは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択されており、各ｎは独立して、１、２、３、４及び５から選択されている。
別の実施形態では、Ｒ４は、非置換のＣ１－４アルキル、例えば非置換のメチルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物であって、式中、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、そのＱが、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、３、４及び５から選択されている化合物を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物であって、式中、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択されており、そのＱが、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、１、２、３、４及び５から選択されている化合物を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物であって、式中、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３が、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、そのＱが、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、３、４及び５から選択されている化合物を提供する。
ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されているか、またはＲ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、複素環もしくは炭素環を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル及びＣ５－２０アルケニルからなる群から選択されている。
別の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択されている。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ＊ＹＲ”及び－ＹＲ”から選択されている。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１２アルキルである。例えば、Ｒ”は、Ｃ３アルキルであることができる。例えば、Ｒ”は、Ｃ４－８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８アルキル）であることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ８アルキルである。別の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ９アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１４アルキルである。別の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、リノレイルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、分岐鎖状（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン－５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イルまたはヘプタデカン－９－イル）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、
Figure 2022535006000010
 である。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、非置換のＣ５－２０アルキルまたはＣ５－２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換されたＣ５－２０アルキルまたはＣ５－２０アルケニルである（例えば、１－シクロプロピルノニルのように、Ｃ３－６炭素環で置換されている）。
別の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ”Ｍ’Ｒ’である。
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、－Ｒ＊ＹＲ”及び－ＹＲ”から選択されている。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ３－８シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ６－１０アリールである。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ１アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ４－９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８またはＣ９アルキル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ４アルキル及びＣ４アルケニルから選択されている。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ５アルキル及びＣ５アルケニルから選択されている。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ６アルキル及びＣ６アルケニルから選択されている。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ７アルキル及びＣ７アルケニルから選択されている。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ９アルキル及びＣ９アルケニルから選択されている。
別の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１１アルキル及びＣ１１アルケニルから選択されている。別の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル及びＣ１８アルケニルから選択されている。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、分岐鎖状（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン－５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イルまたはヘプタデカン－９－イル）である。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、
Figure 2022535006000011
 である。
ある特定の実施形態では、Ｒ’は、非置換のＣ１－１８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換されたＣ１－１８アルキル（例えば、１－シクロプロピルノニルのように、Ｃ３－６炭素環で置換されたＣ１－１５アルキル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキルまたはＣ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキルまたはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｍ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｍ’は、－ＯＣ（Ｏ）－である。
別の実施形態では、Ｍ’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾール及びチアゾールからなる群から選択されていることができる。
いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－である。
別の実施形態では、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾール及びチアゾールからなる群から選択されていることができる。
いくつかの実施形態では、Ｍは、Ｍ’と同じである。別の実施形態では、Ｍは、Ｍ’とは異なる。
いくつかの実施形態では、各Ｒ５は、Ｈである。特定のこのような実施形態では、各Ｒ６も、Ｈである。
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。別の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピルまたはｉ－プロピル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５－１４アルキルまたはＣ５－１４アルケニルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２アルキルである。別の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５アルキルである。別の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ７アルキルである。
別の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、異なる。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１－７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６もしくはＣ７アルキル）、またはＣ９アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７または９である。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択されている。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環及び複素環からなる群から選択されている。
ある特定の実施形態では、Ｑは、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、置換または非置換の５～１０員のヘテロアリールであり、例えば、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２－アミノ－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン－９－イル（もしくはグアニン－９－イル）、アデニン－９－イル、シトシン－１－イルまたはウラシル－１－イルである。ある特定の実施形態では、Ｑは、置換された５～１４員のヘテロシクロアルキル、例えば、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ及びＣ１－３アルキルから選択した１つ以上の置換基で置換された５～１４員のヘテロシクロアルキルである。例えば、Ｑは、４－メチルピペラジニル、４－（４－メトキシベンジル）ピペラジニルまたはイソインドリン－２－イル－１，３－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、非置換もしくは置換のＣ６－１０アリール（フェニルなど）、またはＣ３－６シクロアルキルである。
いくつかの実施形態では、ｎは、１である。別の実施形態では、ｎは、２である。さらなる実施形態では、ｎは、３である。ある特定の別の実施形態では、ｎは、４である。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）２ＯＨであることができる。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）３ＯＨであることができる。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）４ＯＨであることができる。例えば、Ｒ４は、ベンジルであることができる。例えば、Ｒ４は、４－メトキシベンジルであることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、任意に、例えばＯＨ、ハロ、Ｃ１－６アルキルなどで置換されたシクロヘキシルであることができる。例えば、Ｒ４は、２－ヒドロキシシクロヘキシルであることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈである。
いくつかの実施形態では、Ｒは、非置換のＣ１－３アルキルまたは非置換のＣ２－３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３であることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒは、置換されたＣ１－３アルキル、例えば、ＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択したヘテロ原子を１つ以上有する５～１４員の芳香族または非芳香族の複素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、芳香族または非芳香族のいずれかである任意に置換されたＣ３－２０炭素環（例えば、Ｃ３－１８炭素環、Ｃ３－１５炭素環、Ｃ３－１２炭素環またはＣ３－１０炭素環）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、Ｃ３－６炭素環を形成する。別の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、シクロヘキシル基またはフェニル基のようなＣ６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、その複素環またはＣ３－６炭素環は、（例えば、同じ環原子、または隣接しているかもしくは隣接していない環原子が）１つ以上のアルキル基で置換されている。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、Ｃ５アルキル置換基を１つ以上有するシクロヘキシル基またはフェニル基を形成できる。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３によって形成される複素環またはＣ３－６炭素環は、炭素環基で置換されている。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、シクロヘキシルで置換されているシクロヘキシル基またはフェニル基を形成できる。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、シクロヘプチル基、シクロペンタデカニル基またはナフチル基のようなＣ７－１５炭素環を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択されている。いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）及び複素環からなる群から選択されている。別の実施形態では、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン及びプリンからなる群から選択されている。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、フェニル基のようなＣ３－６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、その複素環またはＣ３－６炭素環は、（例えば、同じ環原子、または隣接しているかもしくは隣接していない環原子が）１つ以上のアルキル基で置換されている。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらと結合している原子と一体となって、Ｃ５アルキル置換基を１つ以上有するフェニル基を形成できる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、２０１７年３月２３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ／２０１７／０４９２４５に開示されている化合物１～２３２、及びその塩もしくは立体異性体のいずれかから選択したイオン化可能なアミノ脂質を有する。
イオン化可能な脂質は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定的な群から選択できる。これらに加えて、イオン化可能なアミノ脂質も、環状アミン基を含む脂質であることができる。
本明細書に開示されている医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質、またはこれらを組みわせたものを含むことができる。概して、リン脂質は、リン脂質部分と、１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択できる。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択できる。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進できる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の、負に帯電したリン脂質１つ以上と相互作用できる。リン脂質が膜に融合することで、脂質含有組成物（例えばＬＮＰ）の、１つ以上の要素（例えば治療剤）がその膜に通過できるようにして、例えば、その１つ以上の要素を標的組織に送達可能にできる。
分岐、酸化、環化及びアルキンを含む修飾及び置換を天然のリン脂質種に施したものを含む非天然のリン脂質種も企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化されているか、または１つ以上のアルキンに架橋していることができる。適切な反応条件下では、アルキン基は、アジドに暴露されると、銅触媒による付加環化を起こすことができる。このような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して、膜透過性もしくは細胞認識性を促進するか、ナノ粒子組成物を、標的化部分もしくはイメージング部分（例えば色素）のような有用な成分に結合させるのに有用であることがある。
リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸のようなグリセロリン脂質が挙げられるが、これらに限らない。リン脂質には、スフィンゴミエリンのようなスフィンゴリン脂質も含まれる。
ある特定の実施形態では、本発明において有用であるか、または有用な可能性のあるリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体または変種である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用であるか、または有用な可能性のあるリン脂質は、修飾リン脂質頭部（例えば修飾コリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾頭部を有するリン脂質は、修飾４級アミンを有するＤＳＰＣまたはその類似体である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用であるか、または有用な可能性のあるリン脂質は、修飾尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明において有用であるか、または有用な可能性のあるリン脂質は、修飾尾部を有するＤＳＰＣまたはその類似体である。本明細書に記載されているように、「修飾尾部」は、短縮または伸長した脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つ以上のメチレンが、環状の基もしくはヘテロ原子基、またはこれらがいずれかに組み合わさった基によって置き換えられている脂肪族鎖を有する尾部であってよい。
ある特定の実施形態では、本発明のリン脂質の代わりに、代替的な脂質が用いられている。
本明細書に開示されているＬＮＰは、構造脂質を１つ以上含むことができる。本明細書で使用する場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、ステロール部分を含む脂質も指す。
構造脂質を脂質ナノ粒子に組み込むと、その粒子内の他の脂質の凝集を低減させる助けとなる場合がある。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、α－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド及びこれらの混合物を含む群（ただし、これらに限らない）から選択されていることができる。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義する場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドの一種である。ある特定の実施形態では、その構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、その構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、その構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、その構造脂質は、α－トコフェロールである。
一実施形態では、本明細書に開示されている医薬組成物の脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロールのようなステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示されている脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロールのようなステロール）の量は、約２５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％または約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示されている脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロールのようなステロール）の量は、約２４ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％または約３９ｍｏｌ％である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロールのようなステロール）の量は、少なくとも約２０ｍｏｌ％、２１ｍｏｌ％、２２ｍｏｌ％、２３ｍｏｌ％、２４ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％、２６ｍｏｌ％、２７ｍｏｌ％、２８ｍｏｌ％、２９ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５１ｍｏｌ％、５２ｍｏｌ％、５３ｍｏｌ％、５４ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、５６ｍｏｌ％、５７ｍｏｌ％、５８ｍｏｌ％、５９ｍｏｌ％または６０ｍｏｌ％である。
本明細書に開示されている医薬組成物の脂質組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を１つ以上含むことができる。
本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミド複合体（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。このような脂質は、ＰＥＧ化脂質ともいう。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥという脂質であることができる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質としては、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトレオイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が挙げられるが、これらに限らない。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール及びこれらの混合物からなる群から選択されている。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分としては、長さが約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４～約Ｃ１６である脂質部分が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ－ＮＨ２は、サイズが約１０００ダルトン、２０００ダルトン、５０００ダルトン、１０，０００ダルトン、１５，０００ダルトンまたは２０，０００ダルトンである。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
一実施形態では、本明細書に記載されている脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含むことができる。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ脂質は、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４ Ａ２号（参照により、これらの全体は、本明細書に援用される）に記載されているものなど、当該技術分野において知られている。
一実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２／０９９７５５号（その内容は、参照により、全体が本明細書に援用される）に記載されているＰＥＧ化脂質であることができる。本明細書に記載されているこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれも、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾してよい。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で概括的に定義する場合、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」ともいう）とは、脂質上にヒドロキシル（－ＯＨ）基を１つ以上有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を１つ以上含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
一実施形態では、本明細書に開示されている医薬組成物の脂質組成物におけるＰＥＧ脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％または約１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示されている脂質組成物におけるＰＥＧ脂質の量は、約２ｍｏｌ％である。一実施形態では、本明細書に開示されている脂質組成物におけるＰＥＧ脂質の量は、約１．５ｍｏｌ％である。
一実施形態では、本明細書に開示されている脂質組成物におけるＰＥＧ脂質の量は、少なくとも約０．１ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％、０．６ｍｏｌ％、０．７ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、０．９ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、１．１ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％、１．３ｍｏｌ％、１．４ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％、１．６ｍｏｌ％、１．７ｍｏｌ％、１．８ｍｏｌ％、１．９ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、２．１ｍｏｌ％、２．２ｍｏｌ％、２．３ｍｏｌ％、２．４ｍｏｌ％、２．５ｍｏｌ％、２．６ｍｏｌ％、２．７ｍｏｌ％、２．８ｍｏｌ％、２．９ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、３．１ｍｏｌ％、３．２ｍｏｌ％、３．３ｍｏｌ％、３．４ｍｏｌ％、３．５ｍｏｌ％、３．６ｍｏｌ％、３．７ｍｏｌ％、３．８ｍｏｌ％、３．９ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、４．１ｍｏｌ％、４．２ｍｏｌ％、４．３ｍｏｌ％、４．４ｍｏｌ％、４．５ｍｏｌ％、４．６ｍｏｌ％、４．７ｍｏｌ％、４．８ｍｏｌ％、４．９ｍｏｌ％または５ｍｏｌ％である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
本明細書に開示されている医薬組成物の脂質組成物は、上記の成分に加えて、成分を１つ以上含むことができる。例えば、その脂質組成物は、透過性増強剤分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば表面活性剤）またはその他の成分を１つ以上含むことができる。例えば、透過性増強剤分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であることができる。炭水化物としては、単糖（例えばグルコース）と、多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を挙げることができる。
本明細書に開示されている医薬組成物を封入するか、または部分的に封入する目的で、ポリマーを含有及び／または使用することができる（例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物）。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であることができる。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル及びポリアリレートから選択されていることができるが、これらに限らない。
脂質組成物とポリヌクレオチドとの比は、約１０：１～約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）の範囲であることができる。
いくつかの実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であることができる。いくつかの実施形態では、脂質組成物と、治療剤をコードするポリヌクレオチドとのｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
一実施形態では、本明細書に記載されている脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）を、脂質：ポリヌクレオチド重量比５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１もしくは７０：１、または５：１～約１０：１、約５：１～約１５：１、約５：１～約２０：１、約５：１～約２５：１、約５：１～約３０：１、約５：１～約３５：１、約５：１～約４０：１、約５：１～約４５：１、約５：１～約５０：１、約５：１～約５５：１、約５：１～約６０：１、約５：１～約７０：１、約１０：１～約１５：１、約１０：１～約２０：１、約１０：１～約２５：１、約１０：１～約３０：１、約１０：１～約３５：１、約１０：１～約４０：１、約１０：１～約４５：１、約１０：１～約５０：１、約１０：１～約５５：１、約１０：１～約６０：１、約１０：１～約７０：１、約１５：１～約２０：１、約１５：１～約２５：１、約１５：１～約３０：１、約１５：１～約３５：１、約１５：１～約４０：１、約１５：１～約４５：１、約１５：１～約５０：１、約１５：１～約５５：１、約１５：１～約６０：１もしくは約１５：１～約７０：１など（ただし、これらに限らない）の範囲もしくはこれらの比のうちいずれかで含むことができる。
一実施形態では、本明細書に記載されている脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを約０．１ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌ（０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌなどであるが、これらに限らない）、または２．０ｍｇ／ｍｌ超の濃度で含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として調合されている。したがって、本開示は、（ｉ）本明細書に記載されているような式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物のような送達剤を含む脂質組成物と、（ｉｉ）抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含むナノ粒子組成物も提供する。このようなナノ粒子組成物では、本明細書に開示されている脂質組成物は、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封じ込めることができる。
ナノ粒子組成物は典型的には、マイクロメートル以下ほどの大きさであり、脂質二重層を含むことができる。ナノ粒子組成物としては、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば脂質ベシクル）及びリポプレックスが挙げられる。例えば、ナノ粒子組成物は、直径が５００ｎｍ以下である、脂質二重層を有するリポソームであることができる。
ナノ粒子組成物としては、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム及びリポプレックスが挙げられる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含むベシクルである。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画によって分離された２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化されており、及び／または互いに架橋されていることができる。脂質二重層は、リガンド、タンパク質またはチャネルを１つ以上含むことができる。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質、ＰＥＧ修飾脂質、リン脂質及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのモル比は、イオン化可能な脂質が約２０～６０％、リン脂質が約５～２５％、構造脂質が約２５～５５％、ＰＥＧ修飾脂質が約０．５～１５％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのモル比は、イオン化可能な脂質が約５０％、ＰＥＧ修飾脂質が約１．５％、構造脂質が約３８．５％、リン脂質が約１０％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのモル比は、イオン化可能な脂質が約５５％、ＰＥＧ脂質が約２．５％、構造脂質が約３２．５％、リン脂質が約１０％である。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質であり、リン脂質は、中性脂質であり、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのモル比は、イオン化可能な脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ脂質＝５０：３８．５：１０：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、多分散性値が０．４未満である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性のｐＨにおいて、中性の正味電荷を持つ。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均直径が５０～１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均直径が８０～１００ｎｍである。
本明細書で概括的に定義する場合、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性の特性を有する小分子を指す。脂質は、天然に存在するものでも合成のものでもよい。脂質のクラスの例としては、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質及びポリケチド、ならびにプレノール脂質が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの例では、いくつかの脂質の両親媒性により、水性媒体中でリポソーム、ベシクルまたは膜が形成される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン化可能な脂質を含み得る。本明細書で使用する場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味であり、帯電部分を１つ以上含む脂質を指してよい。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、正に帯電していても負に帯電していてもよい。イオン化可能な脂質は、正に帯電していてよく、その場合、その脂質は、「カチオン性脂質」と称することができる。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質分子は、アミン基を含んでよく、イオン化可能なアミノ脂質と称することができる。本明細書で使用する場合、「帯電部分」は、形式電荷を有する化学部分、例えば、形式電荷が一価（＋１または－１）、二価（＋２または－２）、三価（＋３または－３）などである化学部分である。帯電部分は、アニオン性（すなわち、負に帯電した部分）またはカチオン性（すなわち、正に帯電した部分）であってよい。正に帯電した部分の例としては、アミン基（例えば、一級、二級及び／または三級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基及びイミジゾリウム基が挙げられる。特定の実施形態では、帯電部分は、アミン基を含む。負に帯電した基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、サルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。帯電部分の電荷は、場合によっては、環境条件によって変化する可能性があり、例えば、ｐＨが変化すると、その部分の電荷が変化し、及び／またはその部分が帯電するか、もしくはその部分の帯電が解消されることがある。概して、分子の電荷密度は、所望に応じて選択してよい。
「帯電」または「帯電部分」という用語は、分子上で「部分負電荷」または「部分正電荷」が見られることを指さないことを理解されたい。「部分負電荷」及び「部分正電荷」という用語は、当該技術分野における通常の意味とする。「部分負電荷」は、極性化する結合のうち、電子密度が、その結合部分の一方の原子に引き寄せられ、原子上に部分負電荷が生じるようになる結合を官能基が含む場合に発生する。当業者は概して、このように極性化できる結合を認識するであろう。
いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質であり、当技術分野では「イオン化可能なカチオン性脂質」ということもある。一実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、リンカー構造を介して連結された正に帯電した親水性頭部及び疎水性尾部を有してよい。
これらに加えて、イオン化可能な脂質は、環状アミン基を含む脂質であってもよい。
一実施形態では、イオン化可能な脂質は、国際公開第ＷＯ２０１３／０８６３５４号及び同第ＷＯ２０１３／１１６１２６号（そのそれぞれの内容は、参照により、全体が本明細書に援用される）に記載されているイオン化可能な脂質から選択してもよいが、これらに限らない。
一実施形態では、脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２／１７０８８９号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているような切断可能な脂質であってよい。一実施形態では、脂質は、当該技術分野において知られている方法及び／または国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号（そのそれぞれの内容は、参照により、全体が本明細書に援用される）に記載されているような方法によって合成したものであってよい。
ナノ粒子組成物は、様々な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を使用して、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を調べることができる。動的光散乱法または電位差法（例えば電位差滴定法）を使用して、ゼータ電位を測定できる。動的光散乱法を使用して、粒子サイズを求めることもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの計器を使用して、粒子サイズ、多分散性指数、ゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特性を測定することもできる。
ナノ粒子組成物は、様々な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を使用して、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を調べることができる。動的光散乱法または電位差法（例えば電位差滴定法）を使用して、ゼータ電位を測定できる。動的光散乱法を使用して、粒子サイズを求めることもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの計器を使用して、粒子サイズ、多分散性指数、ゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特性を測定することもできる。
ナノ粒子のサイズは、炎症（これに限らない）などの生物学的反応に対抗するのを助けることができるか、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を高めることができる。
本明細書で使用する場合、ナノ粒子組成物に関する「サイズ」または「平均サイズ」とは、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
一実施形態では、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、直径が約１０～約１００ｎｍ（約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ及び／または約９０～約１００ｎｍなどであるが、これらに限らない）の脂質ナノ粒子内に調合する。
一実施形態では、そのナノ粒子は、直径が約１０～５００ｎｍである。一実施形態では、そのナノ粒子は、直径が１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超である。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ以下）である。
ナノ粒子組成物は、比較的均質であることができる。多分散性指数を使用して、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒子サイズ分布を示すことができる。多分散性指数が小さい（例えば０．３未満である）ことにより、概して、粒子サイズ分布が狭いことが示される。ナノ粒子組成物は、多分散性指数が約０～約０．２５（０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４または０．２５など）であることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているナノ粒子組成物の多分散性指数は、約０．１０～約０．２０であることができる。
方法：ＬＮＰ内にネオアンチゲンをいくつか有する個別化コンカテマーがんワクチンをコードするｍＲＮＡで、ヒト患者を処置した。その患者から、ベースライン（０日目）、及びワクチンコンストラクトの４回目を投与してから７日後に、血液を採取した。図１に概括されている３つの各アッセイを用いて、抗原特異的なＴ細胞活性化に関するデータを作成した。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＰＯＴ及びフローサイトメトリーのような既知の技法を用いて評価し得る。Ｔ細胞に対してＩＶＳを行ったところ、ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞を用いた過去の報告データと比べて、応答の有意な増大が、ＤＣ：Ｔ細胞共培養法によって観察された。ＩＶＳ Ｔ細胞集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで１４日間刺激して、ネオアンチゲン特異的なＴ細胞クローンを増殖させた。
このアッセイで評価した時点は、ベースライン、及びワクチンの４回目を投与してから７日後であった。このアッセイでは、ペプチドプールパルスＤＣ、及び個々のネオアンチゲンに対応するペプチドでパルスしたＤＣという２つのＤＣ条件を試験した。アッセイがこのように複雑であることから、ＬＯＤ及びＬＬＯＱのようなパラメーターを求めるのは困難とみられるので、ベースラインに対して、％ｆｒｅｑ．の変化倍率が３であることを用いて、結果が好ましいことを示すこととする。個々のネオアンチゲンでパルスしたＤＣで再刺激した後のＣＤ８＋ＩＦＮγ＋の結果は、図３Ａ～Ｂに示されている。
結果：
４回目のワクチンを投与してから７日後に採取したＰＢＭＣ試料において、Ｔ細胞を、ネオアンチゲンペプチドプールでパルスしたＤＣで再刺激した後に、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋の％ｆｒｅｑ．の上昇が、ベースラインの２～１６．４倍の範囲であることが観察され（図２Ａ～Ｂ及び下記の表１）、ペプチドプール１６～２０において、Ｃ４Ｄ８におけるＣＤ８＋ＩＦＮγ＋の％ｆｒｅｑ．が最も高かった（Ｃ４Ｄ８において２７．１％であったのに対して、ベースラインでは６．１７％）。
Figure 2022535006000012
これらの結果は、患者試料において、個々のネオアンチゲンレベルでのＴ細胞応答を初めて調べたものであり、ワクチン設計及び治療処置に関する広範な知見をもたらすものである。患者に投与したワクチンに含めた２０個のネオアンチゲンのうち１８個が、クラスＩ（ＣＤ８）Ｔ細胞応答を誘発すると予測され、そのうちの３個は、クラスＩＩとの親和性もあると予測された（すなわち、ＣＤ４Ｔ細胞を刺激する可能性があると予測された）。クラスＩネオアンチゲンと予測された１８個のうちの１０個は、その時点におけるネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて少なくとも３倍に上昇した（図３Ａ～Ｂ及び表１において、＊によって示されている）。予想どおり、クラスＩＩネオアンチゲンと予測された２個は、Ｃ４Ｄ８におけるＣＤ８＋ＩＦＮγ＋の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて上昇しなかった。
この時点におけるＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．を、ベースラインと比べて３倍以上上昇させたすべてのネオアンチゲンでは、結合性は５００ｎＭ未満と予測されたが、クラスＩネオアンチゲンと予測された８個のうち、同じ時点において、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の産生量が、ベースラインと比べて３倍超とならなかった２個では、結合性は５００ｎＭ未満にはならないと予測された（下記の表２）。加えて、複数の予測結合剤を有するネオアンチゲンであって、Ｃ４Ｄ８におけるネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞がベースラインと比べて３倍以上となったネオアンチゲンは、Ｃ４Ｄ８におけるネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞がベースラインと比べて３倍未満となったネオアンチゲンの２倍であった（４個対２個、表２）。ワクチンに含めたネオアンチゲンの特徴（結合性予測値、バリアントＲＮＡ発現性）と、ネオアンチゲンがＴ細胞応答を駆動する能力との相関関係は、今後、患者用ワクチンに含めるべき最良のネオアンチゲンを定義する特質が何であるかを我々が知る助けとなり得る。
Figure 2022535006000013
実施形態
下記の項には、本発明の様々な態様及び実施形態が含まれる。
１．Ｔ細胞集団において、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を検出する方法であって、
Ｔ細胞の集団のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）を行うことであって、前記ＩＶＳが、前記Ｔ細胞を強化培地で培養することと、培養した前記Ｔ細胞を、ネオアンチゲンで成熟させた自己樹状細胞（ＤＣ）で刺激することと、刺激した前記Ｔ細胞を増殖させて、増殖Ｔ細胞の集団を作製することを含む、前記行うことと、
前記増殖Ｔ細胞を、ネオアンチゲンで成熟させた自己ＤＣで再刺激することと、
再刺激した前記Ｔ細胞を解析して、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を検出することと、
を含む前記方法。
２．前記強化培地が、ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－２及びＩＬ－７を含む、第１項に記載の方法。
３．前記Ｔ細胞を前記強化培地で約２４時間培養してから、ネオアンチゲンで成熟させた自己ＤＣで刺激する、第２項に記載の方法。
４．前記刺激したＴ細胞を１２～１６日間増殖させる、第１項に記載の方法。
５．前記刺激したＴ細胞を１４日間増殖させる、第１項に記載の方法。
６．ＩＬ－２及びＩＬ－７を含む培地で２日間培養しながら、前記刺激したＴ細胞を増殖させてから、ＩＬ－２を含む培地で１２日間培養しながら増殖させる、第５項に記載の方法。
７．フローサイトメトリーを用いて、前記再刺激したＴ細胞を解析する、第１～６項のいずれか１項に記載の方法。
８．前記Ｔ細胞集団が、患者のＰＢＭＣから精製したｐａｎ Ｔ細胞の試料である、第１項に記載の方法。
９．前記患者のＰＢＭＣを、想定治療処置のベースライン時に、前記患者へのアフェレーシスによって得る、第８項に記載の方法。
１０．前記患者のＰＢＭＣを、想定治療処置の実施から７日後に、前記患者へのアフェレーシスによって得る、第８項に記載の方法。
１１．前記想定治療処置が、個別化がんワクチンである、第９～１０項のいずれか１項に記載の方法。
１２．前記個別化がんワクチンが、３～５０個のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームを１つ以上有するｍＲＮＡであり、前記ペプチドエピトープのそれぞれが、脂質ナノ粒子製剤で調合された個別化がん抗原である、第１１項に記載の方法。
１３．前記抗原特異的Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の出現頻度のパーセント（％ｆｒｅｑ）として測定する、第１項に記載の方法。
１４．前記ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑが、ベースラインと比べて３倍以上であることにより、Ｔ細胞集団が、Ｔ細胞活性化の閾値レベルを上回っていることが示される、第１３項に記載の方法。
１５．個別化がんワクチンを接種した患者において、前記Ｔ細胞活性化の解析を行い、前記解析に基づき、個別化がんワクチンを再調合し、前記患者に、再調合した前記個別化がんワクチンを投与する、第１～１４項のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記再調合した個別化がんワクチンが、前記患者に最初に投与した前記個別化がんワクチンには含まれないネオアンチゲンを少なくとも１つ含む、第１５項に記載の方法。
１７．がんワクチンによる治療処置を受けた患者において、前記Ｔ細胞活性化の解析を行い、前記解析に基づき、前記治療処置を修正する、第１～１５項のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記治療処置の用量を修正する、第１７項に記載の方法。
１９．前記治療処置の投与スケジュールを修正する、第１７項に記載の方法。
２０．前記患者に、併用療法を実施する、第１７項に記載の方法。
２１．８～５０個のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームを１つ以上有するｍＲＮＡを含む個別化がんワクチンであって、前記ペプチドエピトープのそれぞれが、脂質ナノ粒子製剤で調合されたネオアンチゲンであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、前記ネオアンチゲンの少なくとも８個で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した、前記ワクチン。
２２．前記ＩＶＳアッセイが、第１～２０項のいずれか１項に記載の方法である、第２１項に記載のワクチン。
２３．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、前記ネオアンチゲンの少なくとも８０％で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した、第２１項に記載のワクチン。
２４．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、前記ネオアンチゲンの少なくとも９０％で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した、第２１項に記載のワクチン。
２５．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、前記ネオアンチゲンのすべてで、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した、第２１項に記載のワクチン。
均等物
本明細書において、本発明のいくつかの実施形態を記載及び例示してきたが、当業者は、本明細書に記載されている機能を発揮し、及び／または本明細書に記載されている結果及び／または１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／または構造を容易に想定するであろうし、そのような変形形態及び／または修正形態はそれぞれ、本明細書に記載されている、本発明の実施形態の範囲内とみなす。より広くは、本明細書に記載されているすべてのパラメーター、寸法、材料及び構成が、例示的なものと意図されており、実際のパラメーター、寸法、材料及び／または構成は、本発明の教示内容を利用する具体的な１つの用途または複数の用途によって決まることを当業者は容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載されている、本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験に過ぎない実験を用いて、それらの均等物を確認できるであろう。したがって、上記の実施形態は、例として示されているに過ぎず、添付の請求項及びそれらの均等物の範囲内で、本発明の実施形態を、具体的に記載及び特許請求されているのとは別段の形で実施し得ることを理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載されている個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／または方法のそれぞれに対するものである。加えて、上記のような特徴、システム、物品、材料、キット及び／または方法の２つ以上をいずれかに組み合わせたものは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／または方法が、互いに矛盾しない場合には、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定義及び使用されているような定義はいずれも、辞書の定義、参照により援用される文書内の定義、及び／または定義されている用語の通常の意味よりも優先されると理解されたい。
本明細書に開示されているいずれの参照文献、特許及び特許出願も、そのそれぞれが引用される主題に関連して参照することにより援用され、場合によっては、その文書の全体が含まれる場合もある。
「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、本明細書及び請求項で使用する場合、明らかに反対の記載がない限りは、「少なくとも１つ」を意味すると理解されたい。
「及び／または」という語句は、本明細書及び請求項で使用する場合、接続されている要素の「一方または両方」、すなわち、ある場合には、並列のものとして存在し、別の場合には、選言的なものとして存在する要素を意味すると理解されたい。「及び／または」が付されて列挙されている複数の要素も、同じ形式で解釈するものとし、すなわち、それらの要素のうちの「１つ以上」が、上記のように接続される。「及び／または」の節によって具体的に特定される要素以外に、他の要素が任意に存在してもよく、具体的に特定されているそれらの要素との関連性の有無にはかかわらない。すなわち、非限定的な例としては、「Ａ及び／またはＢ」という言い回しは、「含む」のようなオープンエンドな語とともに使用する場合、一実施形態では、Ａのみ（任意に、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態では、Ｂのみ（任意に、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意に、他の要素を含む）を指すことができるなどである。
本明細書及び請求項で使用する場合、「または」は、上で定義したとおりの「及び／または」と同じ意味であると理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」あるいは「及び／または」は、包括的なものとして、すなわち、数多くの要素またはリストの要素のうちの少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、任意に、列挙されていない追加の項目も含むものとして解釈するものとする。「～のうちの１つのみ」もしくは「～のうちのきっかり１つ」、または請求項で使用されているときの「～からなる」など、明らかに反対の記載のある用語のみ、数多くの要素またはリストの要素のうちのきっかり１つの要素を含むことを指す。概して、「または」という用語は、本明細書で使用する場合、「いずれか」、「～のうちの１つ」「～のうちの１つのみ」または「～のうちのきっかり１つ」のような排他用語が付されているときに、排他的な択一（すなわち、「どちらか一方であり、両方ではない」）を示すと解釈するものとする。「～から本質的になる」は、請求項で使用されている場合には、特許法の分野で使用されている通常の意味とする。
本明細書及び請求項で使用する場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という語句は、その要素のリスト内の要素のいずれか１つ以上から選択した少なくとも１つの要素を意味すると理解されたいが、その要素のリスト内に具体的に列挙されているすべての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むわけではなく、その要素のリスト内の要素をいずれかに組み合わせたものを除外しない。この定義では、「少なくとも１つ」という語句の対象となる要素のリスト内で具体的に特定されている要素以外の要素が、具体的に特定されている要素との関連性の有無にかかわらず、任意に存在してよいことも認められる。すなわち、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（あるいは同様に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、あるいは同様に、「Ａ及び／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ａが少なくとも１つ（２つ以上を任意に含む）であり、Ｂが存在しない（かつ、任意にＢ以外の要素を含む）ことを指すことができ、別の実施形態では、Ｂが少なくとも１つ（２つ以上を任意に含む）であり、Ａが存在しない（かつ、任意にＡ以外の要素を含む）ことを指すことができ、さらに別の実施形態では、Ａが少なくとも１つ（２つ以上を任意に含む）であり、Ｂが少なくとも１つ（２つ以上を任意に含む）である（かつ、任意に他の要素を含む）ことを指すことができるなどである。
明らかに反対の記載がない限りは、本発明で特許請求する方法のうち、２つ以上の工程または行為を含むいずれの方法においても、その方法の工程または行為の順序は必ずしも、その方法の工程または行為が記載されている順序に限定されないことも理解されたい。
請求項及び上記の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する」、「～で構成される」などのすべての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、含むがそれに限定されないことを意味すると理解されたい。Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１１１．０３に定められているように、「～からなる」という移行句のみが、クローズド移行句であるものとし、「～から本質的になる」という移行句のみが、セミクローズト移行句であるものとする。本書において、オープンエンド移行句（例えば「含む」）を用いて記載されている実施形態は、代替的な実施形態では、そのオープンエンド移行句によって記載されている特徴「からなる」とともに、その特徴「から本質的になる」ものとしても企図されることは言うまでもない。例えば、本開示に、「Ａ及びＢを含む組成物」と記載されている場合には、本開示では、代替的な実施形態である「Ａ及びＢからなる組成物」ならびに「Ａ及びＢから本質的になる組成物」も企図される。

Claims (22)

  1. Ｔ細胞集団において、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を検出する方法であって、
    Ｔ細胞の集団のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）を行うことであって、前記ＩＶＳが、前記Ｔ細胞を強化培地で培養することと、培養した前記Ｔ細胞を、ネオアンチゲンで成熟させた自己樹状細胞（ＤＣ）で刺激することと、刺激した前記Ｔ細胞を増殖させて、増殖Ｔ細胞の集団を作製することを含む、前記行うことと、
    前記増殖Ｔ細胞を、ネオアンチゲンで成熟させた自己ＤＣで再刺激することと、
    再刺激した前記Ｔ細胞を解析して、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を検出することであって、個別化がんワクチンを接種した患者において、Ｔ細胞活性化の解析を行い、前記解析に基づき、前記個別化がんワクチンを再調合し、前記患者に、再調合した前記個別化がんワクチンを投与する、前記検出することと、
    を含む前記方法。
  2. 前記再調合した個別化がんワクチンが、前記患者に最初に投与した前記個別化がんワクチンには含まれないネオアンチゲンを少なくとも１つ含む、請求項１に記載の方法。
  3. がんワクチンによる治療処置を受けた患者において、前記Ｔ細胞活性化の解析を行い、前記解析に基づき、前記治療処置を修正する、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記治療処置の用量を修正する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記治療処置の投与スケジュールを修正する、請求項３に記載の方法。
  6. 前記患者に、併用療法を実施する、請求項３に記載の方法。
  7. 前記強化培地が、ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－２及びＩＬ－７を含み、任意に、前記Ｔ細胞を前記強化培地で約２４時間培養してから、ネオアンチゲンで成熟させた自己ＤＣで刺激する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記刺激したＴ細胞を１２～１６日間増殖させる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. フローサイトメトリーを用いて、前記再刺激したＴ細胞を解析する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記Ｔ細胞集団が、患者のＰＢＭＣから精製したｐａｎ Ｔ細胞の試料である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記患者のＰＢＭＣが、想定治療処置のベースライン時に、前記患者へのアフェレーシスによって得たものである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記患者のＰＢＭＣが、想定治療処置の実施から７日後に、前記患者へのアフェレーシスによって得たものである、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記想定治療処置が、個別化がんワクチンである、請求項１１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記個別化がんワクチンが、３～５０個のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームを１つ以上有するｍＲＮＡであり、前記ペプチドエピトープのそれぞれが、脂質ナノ粒子製剤で調合された個別化がん抗原である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記抗原特異的Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の出現頻度のパーセント（％ｆｒｅｑ）として測定する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑが、ベースラインと比べて３倍以上であることにより、Ｔ細胞集団が、Ｔ細胞活性化の閾値レベルを上回っていることが示される、請求項１５に記載の方法。
  17. ８～５０個のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームを１つ以上有するｍＲＮＡを含む個別化がんワクチンであって、前記ペプチドエピトープのそれぞれが、脂質ナノ粒子製剤で調合されたネオアンチゲンであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、前記ネオアンチゲンの少なくとも８個で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した、前記ワクチン。
  18. 前記ＩＶＳアッセイが、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法である、請求項１７に記載のワクチン。
  19. 前記ＩＶＳアッセイが、患者から得たＴ細胞集団を強化培地で培養することと、培養した前記Ｔ細胞を、ネオアンチゲンで成熟させた自己樹状細胞（ＤＣ）で刺激することと、刺激した前記Ｔ細胞を増殖させて、増殖Ｔ細胞の集団を作製することと、前記増殖Ｔ細胞を、ネオアンチゲンで成熟させた自己ＤＣで再刺激することと、再刺激した前記Ｔ細胞を解析して、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を検出することを含む、請求項１７に記載のワクチン。
  20. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、前記ネオアンチゲンの少なくとも８０％で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した、請求項１７に記載のワクチン。
  21. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、前記ネオアンチゲンの少なくとも９０％で、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した、請求項１７に記載のワクチン。
  22. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）アッセイにおいて、前記ネオアンチゲンのすべてで、ネオアンチゲン特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％ｆｒｅｑ．が、ベースラインと比べて３倍超上昇した、請求項１７に記載のワクチン。
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