KR20220154740A - 간 성상 세포로 치료제의 지질 나노입자 전달을 위한 양이온성 지질 - Google Patents

간 성상 세포로 치료제의 지질 나노입자 전달을 위한 양이온성 지질 Download PDF

Info

Publication number
KR20220154740A
KR20220154740A KR1020227035403A KR20227035403A KR20220154740A KR 20220154740 A KR20220154740 A KR 20220154740A KR 1020227035403 A KR1020227035403 A KR 1020227035403A KR 20227035403 A KR20227035403 A KR 20227035403A KR 20220154740 A KR20220154740 A KR 20220154740A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mol
lipid
compound
alkyl
alkynyl
Prior art date
Application number
KR1020227035403A
Other languages
English (en)
Inventor
제임스 헤이예스
큐 몽 램
리처드 제이. 홀랜드
Original Assignee
제네반트 사이언시즈 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제네반트 사이언시즈 게엠베하 filed Critical 제네반트 사이언시즈 게엠베하
Publication of KR20220154740A publication Critical patent/KR20220154740A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/16—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/20—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/52—Esters of acyclic unsaturated carboxylic acids having the esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/533—Monocarboxylic acid esters having only one carbon-to-carbon double bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/62—Halogen-containing esters
    • C07C69/63—Halogen-containing esters of saturated acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/62—Halogen-containing esters
    • C07C69/65—Halogen-containing esters of unsaturated acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명의 소정의 실시형태는 치료제를 예를 들어 간 성상 세포로 전달하기 위한 지질 나노입자를 제조하는 데 유용한 지질을 제공한다.

Description

간 성상 세포로 치료제의 지질 나노입자 전달을 위한 양이온성 지질
관련 출원(들)의 상호 참조
본 특허 출원은 2020년 3월 17일에 출원된 미국 출원 제62/990,939호의 우선권의 이익을 주장하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
양이온성 지질-함유 나노입자는 다양한 치료제의 전달에 사용되고 있다. 현재, 이들 나노입자의 양이온성 지질 성분의 제조와 연관된 어려움 및 비용은 전달 비히클로서 상업용 개발에 대한 이의 매력을 제한할 수 있다. 따라서, 지질 나노입자로 혼입될 수 있는 추가적인 양이온성 지질에 대한 수요가 있다. 예를 들어, 덜 비싸고 더 효과적인 공정을 사용하여 제조될 수 있는 양이온성 지질에 대한 수요가 있다. 예를 들어, 간 섬유증의 치료를 위해 간 성상 세포로 치료제를 전달하기 위한 특징을 갖는 지질 나노입자에 대한 수요가 또한 있다.
본 발명은 간 성상 세포에 지질 나노입자로 혼입될 때 핵산과 같은 활성제 또는 치료제를 전달하는 데 효과적인 양이온성 지질을 제공한다.
따라서, 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염이 본원에 제공된다:
Figure pct00001
상기 식 중,
R1은 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
R2는 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
R3은 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
R4는 (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 (C3-C15)알키닐이고, (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 C3-C15)알키닐은 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
각각의 Ra 및 Rb는 H 및, 할로 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; Ra 및 Rb는 이들이 부착된 질소와 함께 취해져 아지리딘, 아제타딘, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴리노 및 티오모르폴리노로 이루어진 군으로부터 선택된 고리를 형성하고, 고리는 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
질환을 치료하기 위해 예를 들어 간 성상 세포에 치료제를 특이적으로 전달하기 위해 이러한 화합물을 포함하는 지질 입자, 및 지질 입자를 사용하는 방법이 또한 제공된다.
도 1. 도 1은 RELN:GAPD mRNA 비에 의해 표시된 것과 같이 비교자 지질(화합물 100; 중간) 및 PBS(왼쪽)와 비교된 것과 같은 본 발명의 대표적인 지질(오른쪽)의 활성을 도시한다. 본 발명의 대표적인 지질은 0.1 mg/kg에서 훌륭한 넉다운을 갖는다.
도 2. 도 2는 RELN:GAPD mRNA 비에 의해 표시된 것과 같이 비교자 지질(화합물 100; 중간) 및 PBS(왼쪽)와 비교된 것과 같은 본 발명의 대표적인 지질(오른쪽)의 활성을 도시한다. Balb/C 마우스(n=4)에서의 LNP의 IV 투여 후 48시간에 reelin mRNA 넉다운이 제시된다. 본 발명의 대표적인 지질은 4배 더 낮은 용량에서 비교자 지질과 동등한 효력을 갖는다.
도 3. 도 3은 RELN:GAPD mRNA 비에 의해 표시된 것과 같이 비교자 지질(화합물 100; 중간 3가지 0.03, 1, 3 결과) 및 PBS(왼쪽)와 비교된 것과 같은 본 발명의 대표적인 지질(오른쪽 3가지 0.03, 1, 3 결과)의 활성을 도시한다. Balb/C 마우스(n=4)에서의 LNP의 IV 투여 후 24시간에 reelin mRNA 넉다운이 제시된다. 본 발명의 대표적인 지질은 0.03 mg/kg의 낮은 용량에서 비교자 지질보다 유의미하게 더 강력하다. 포화 활성은 1 mg/kg 용량 및 초과에서 지질 둘 다에 대해 관찰되었다.
도 4. 도 4는 간 효소 수치(ALT/AST)에 의해 표시된 것과 같이 비교자 지질(화합물 100; 중간 3가지 0.03, 1, 3 결과) 및 PBS(왼쪽)와 비교된 것과 같은 본 발명의 대표적인 지질(오른쪽 3가지 0.03, 1, 3 결과)의 내약성을 도시한다. 이들 수치는 Balb/C 마우스(n=4)에서의 LNP의 IV 투여 후 24시간에 혈청에서 측정된다. 본 발명의 대표적인 지질은 유의미하게 더 강력하고, 비교자 지질에 비해 약간 더 높은 간 효소 수치를 오직 보여주었다.
도 5. 도 5는 본 발명의 대표적인 지질(오른쪽) 및 PBS(왼쪽)를 포함하는 성상 세포-표적화 LNP와 비교된 간세포-유도된 LNP(화합물 101과 함께; 중간)의 활성을 도시한다. 헤파토센트릭(hepatocentric) LNP는 0.01 mg/kg에서의 간세포 표적(TTR)의 최고의 넉다운을 보여주지만, 성상 세포-표적화 LNP는 0.025 mg/kg에서의 성상 세포 표적(RELN)의 최고의 넉다운을 보여준다. 활성은 Balb/C 마우스(n=4)에서의 LNP의 IV 투여 후 48시간에 표적 mRNA:GAPD mRNA 비에 의해 측정된다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염이 본원에 제공된다:
Figure pct00002
상기 식 중,
R1은 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
R2는 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
R3은 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
R4는 (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 (C3-C15)알키닐이고, (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 C3-C15)알키닐은 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
각각의 Ra 및 Rb는 H 및, 할로 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; Ra 및 Rb는 이들이 부착된 질소와 함께 취해져 아지리딘, 아제타딘, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴리노 및 티오모르폴리노로 이루어진 군으로부터 선택된 고리를 형성하고, 고리는 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 Rb는 H 및, 할로 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 Rb는 H 및 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, Ra 및 Rb 중 적어도 하나는 할로로 치환된다.
소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 Rb는 H 및 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, Ra 및 Rb 중 적어도 하나는 하이드록시로 치환된다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C5-C25)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C5-C25)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C5-C25)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C5-C20)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C5-C20)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C5-C20)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C10-C20)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C10-C20)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R1은 (C10-C20)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R1은 4-데센-1-일 또는 8,10-헵타데카디엔-1-일이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C5-C25)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C5-C25)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C5-C25)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C5-C20)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C5-C20)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C5-C20)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C10-C20)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C10-C20)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R2는 (C10-C20)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R2는 4-데센-1-일이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C5-C25)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C5-C25)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C5-C25)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C5-C20)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C5-C20)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C5-C20)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C10-C20)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C10-C20)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R3은 (C10-C20)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R3은 4-데센-1-일이다.
소정의 실시형태에서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C15)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C15)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C15)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C10)알킬이다.
소정의 실시형태에서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C10)알케닐이다.
소정의 실시형태에서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C10)알키닐이다.
소정의 실시형태에서, R4는 (C3-C10)알킬, (C3-C10)알케닐 또는 (C3-C10)알키닐이고, (C3-C10)알킬, (C3-C10)알케닐 및 (C3-C10)알키닐은 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된다.
소정의 실시형태에서, R4는 (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 (C3-C15)알키닐이고, (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 및 C3-C15)알키닐은 클로로, 브로모 또는 요오도로 치환된다.
소정의 실시형태에서, R4는 (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 (C3-C15)알키닐이고, (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 및 C3-C15)알키닐은 -NRaRb로 치환된다.
소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 Rb는 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 Rb는 할로 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나는 할로로 치환된다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나는 하이드록시로 치환된다.
소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 Rb는 메틸이다.
소정의 실시형태에서, R4는 5-(N,N-디메틸아미노)펜트-1-일이다.
소정의 실시형태에서, 하기 화합물, 또는 이의 염이 본원에 제공된다:
Figure pct00003
또는
Figure pct00004
상기 식 중,
각각의 Ra 및 Rb는 H 및, 할로 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; Ra와 Rb는 이들이 부착된 질소와 함께 취해져 아지리딘, 아제타딘, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴리노 및 티오모르폴리노로 이루어진 군으로부터 선택된 고리를 형성하고, 고리는 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 Rb는 H 및, 할로 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나는 할로로 치환된다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나는 하이드록시로 치환된다.
소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 화합물로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염이 본원에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 화합물을 포함하는 지질 입자가 본원에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 화합물은 실시예에 기재된 것과 같은 화합물로부터 선택된다.
본원에 기재된 것과 같은 화합물을 포함하는 지질 입자가 본원에 또한 제공된다.
소정의 실시형태에서, 지질 입자는 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 지질 입자는 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 추가로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 지질 입자는 치료제를 추가로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 치료제는 핵산 치료제이다.
소정의 실시형태에서, 치료제는 간섭 RNA 제제이다.
소정의 실시형태에서, 치료제는 siRNA이다.
소정의 실시형태에서, 치료제는 mRNA이다.
소정의 실시형태에서, 핵산 치료제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 핵산은 적어도 하나의 2'-O-메틸(2'OMe) 뉴클레오타이드를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 비양이온성 지질은 콜레스테롤 또는 이의 유도체이다.
소정의 실시형태에서, 비양이온성 지질은 콜레스테롤이다.
소정의 실시형태에서, 비양이온성 지질은 인지질을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 비양이온성 지질은 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)이다.
소정의 실시형태에서, 접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체이다.
소정의 실시형태에서, PEG-지질 접합체는 PEG-디미리스틸옥시프로필(PEG-DMA) 접합체이다.
본원에 기재된 것과 같은 화합물 또는 지질 입자를 포함하는 조성물이 본원에 또한 제공된다.
본원에 기재된 것과 같은 화합물 또는 지질 입자, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 또한 제공된다.
치료제의 생체내 전달을 위한 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 것과 같은 지질 입자를 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
포유류에 대한 치료제의 생체내 전달에 사용하기 위한 본원에 기재된 것과 같은 지질 입자가 또한 제공된다.
포유류에 대한 치료제의 생체내 전달을 위한 약제를 제조하기 위한 본원에 기재된 것과 같은 지질 입자의 용도가 또한 제공된다.
질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 포유류 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 것과 같은 지질 입자를 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 간 섬유증이다.
소정의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비알코올성 지방간염(NASH: non-alcoholic steatohepatitis)이다.
소정의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 알코올성 지방간염(ASH: alcoholic steatohepatitis)이다.
소정의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 간 섬유증 연관된 비알코올성 지방간염(NASH) 또는 알코올성 지방간염(ASH)이다.
간 성상 세포(HSC)를 본원에 기재된 것과 같은 지질 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내 HSC에 치료제를 전달하는 방법이 또한 제공된다.
간 섬유증은 만성 간 손상 동안 세포외 기질의 과도한 축적에 의해 야기된다. 간 성상 세포(HSC)의 활성화는 간 섬유화 동안 핵심 단계이다. HSC, 예를 들어 활성화된 HSC에 대한 치료제의 표적화된 전달은 간 섬유증의 성공적인 치료에 중요할 수 있다. 다수의 단백질 마커는 활성화된 HSC에서 과발현되는 것으로 발견되었고, 이의 리간드는 다양한 항섬유제를 특이적으로 전달하도록 사용된다. (예를 들어, Chen et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2019, 370 (3) 695-702 참조). 그러나, 다른 시스템, 예컨대 지질 나노입자(LNP)를 사용한 치료제의 전달은 치료제를 HSC로 전달하기 위한 다른 수단으로서 필요하다.
간 섬유증은 간에서의 비정상적으로 많은 양의 반흔 조직의 형성에 의해 야기된다. 간 섬유증은 간이 손상된 세포를 보수하고 대체하려고 시도할 때 발생한다. 다양한 장애 및 약물은 간을 손상시키고 섬유증을 야기할 수 있다.
비알코올성 지방 간 질환(NAFLD)은 트리글리세라이드가 간에서 축정하는 병태이다. 비알코올성 지방간염(NASH)은 NAFLD의 유형이다. NASH는 염증성 변화 및 간 세포 손상과 연관된다. NASH는 간 질환의 주요 원인이고, 간 섬유증, 간경변 및 간세포 암종(HCC)으로 대개 진행한다. 비알코올성 지방간염(NASH) 및 알코올성 지방간염(ASH)은 유사한 병리학 및 조직병리학을 갖지만, 상이한 병인론 및 전염병학을 갖는다. NASH 및 ASH는 비알코올성 지방 간 질환(NAFLD) 및 알코올성 지방 간 질환(AFLD)의 진행된 병기이다. 알코올성 지방간염(ASH)은 간의 섬유증뿐만 아니라 과도한 연장된 알코올 사용에 의해 초래된 간 조직의 가능한 괴사를 특징으로 하는 만성 진행성 간 질환이다. 알코올 대사가 남성에서 여성보다 더 낮으므로, 여성은 질환에 더 감수성이다.
간 섬유증은 간 기능이상의 중요한 기저 원인이고 사망률을 예측한다. 간경변 및 HCC로의 진행은 최종적인 간부전으로 이어이지고, 이에 따라 간 이식이 필요하다. NASH-관련 섬유증(F2 및 후기)의 현재 US 유병률은 약 3.8 백만명의 환자이다. 의사는 통상적으로 NAFLD 및 NASH를 치료하기 위해 체중 감소를 추천하였다. 체중 감소가 간, 염증 및 섬유증에서 지방을 감소시킬 수 있지만, NAFLD 및 NASH를 치료하기 위한 의학은 승인되지 않았다. 구체적으로는, 의약은 간 섬유증을 치료하기 위해 승인되지 않았다. (Clin Liver Dis. 2008 Nov;12(4):733-46, N Engl J Med. 2017 Nov 23;377(21):2063-2072, J Hepatol. 2017 Dec;67(6):1265-127) 따라서, 새로운 치료학적 치료 옵션은 전달 옵션을 포함하고, 예를 들어 NASH 또는 ASH의 맥락에서 간 섬유증의 치료에 필요하다.
정의
하기 정의는 달리 기재되지 않는 한 사용된다: 알킬, 알케닐, 알키닐 등은 직쇄 기 및 분지 기 둘 다를 나타내지만; 개별 라디칼, 예컨대 프로필의 언급은 오직 직쇄 라디칼, 분지된 사슬 이성질체, 예컨대 구체적으로 언급되는 이소프로필을 포함한다.
용어 "알킬"은 홀로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 기술되지 않는 한, 지정된 탄소 원자의 수를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다(즉, C5-25은 5개 내지 25개의 탄소를 의미함). 예는 (C5-C20)알킬, (C3-C15)알킬, (C10-C20)알킬 및 (C3-C10)알킬을 포함한다. 일 실시형태에서, 알킬 기는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 탄소 원자를 갖는다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, t-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, 및 더 고차의 동족체 및 이성질체를 포함한다.
용어 "알케닐"은 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 이중 결합을 갖는 불포화 알킬 라디칼을 지칭한다. 이러한 불포화 알킬 기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐) 및 더 고차의 동족체 및 이성질체를 포함한다. 일 실시형태에서, 알켄은 4-데센-1-일이다. 일 실시형태에서, 알켄은 4-데센-1-일 또는 8,10-헵타데카디엔-1-일이다.
용어 "알키닐"은 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 삼중 결합 및 선택적으로 1개 이상의 이중 결합을 갖는 불포화 알킬 라디칼을 지칭한다. 일 실시형태에서, 알키닐은 1개 이상의 삼중 결합을 갖고, 이중 결합을 갖지 않는다. 다른 실시형태에서, 알키닐은 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 삼중 결합 및 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 이중 결합을 갖는다. 이러한 불포화 알킬 기의 예는 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 더 고차의 동족체 및 이성질체를 포함한다.
용어 "알콕시"는 산소 원자("옥시")를 통해 분자의 나머지에 부착된 알킬 기를 지칭한다.
용어 "사이클로알킬"은 3개 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 부분 불포화 (비-방향족) 모든 탄소 고리(예를 들어, (C3-C8)카보사이클)를 지칭한다.
용어 "헤테로사이클"은 고리에서 탄소 이외의 적어도 하나의 원자를 갖는 단일 포화 또는 부분 불포화 고리를 지칭하고, 여기서 원자는 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이와 같이, 상기 용어는 약 1개 내지 6개의 탄소 원자 및 고리에서 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 약 1개 내지 3개의 이종원자의 단일 포화 또는 부분 불포화 고리(예를 들어, 3원, 4원, 5원, 6원, 7원 또는 8원 고리)를 포함한다. 황 및 질소 원자는 또한 이의 산소화된 형태로 존재할 수 있다. 예시적인 헤테로사이클은 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 피페라지닐 및 피페리디닐을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 것과 같이 용어 "알콕시카보닐"은 기 (알킬)-O-C(=O)-를 지칭하고, 여기서 용어 알킬은 본원에 정의된 의미를 갖는다.
본원에 사용된 것과 같이 용어 "알카노일옥시"는 기 (알킬)-C(=O)-O-를 지칭하고, 여기서 용어 알킬은 본원에 정의된 의미를 갖는다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "이종원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 규소(Si)를 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 것과 같이 화학 구조에서 결합을 가로지르는 물결선 "
Figure pct00005
"은 물결 결합이 분자의 나머지에 대한 화학 구조에서 가로지르는 결합의 부착점을 나타낸다.
용어 "간섭 RNA" 또는 "RNAi" 또는 "간섭 RNA 서열"은 간섭 RNA가 표적 유전자 또는 서열과 동일한 세포에 있을 때 (예를 들어, 간섭 RNA 서열에 상보성인 mRNA의 분해를 매개하거나 이의 번역을 억제함으로써) 표적 유전자 또는 서열의 발현을 감소하거나 억제할 수 있는 단일-가닥 RNA(예를 들어, 성숙 miRNA) 또는 이중-가닥 RNA(즉, 듀플렉스 RNA, 예컨대 siRNA, aiRNA 또는 pre-miRNA)를 지칭한다. 간섭 RNA는 이와 같이 표적 mRNA 서열 또는 2개의 상보성 가닥 또는 단독의 자가-상보성 가닥에 의해 형성된 이중-가닥 RNA에 상보성인 단일-가닥 RNA를 지칭한다. 간섭 RNA는 표적 유전자 또는 서열과 실질적인 또는 완전한 동일성을 가질 수 있거나, 미스매치(즉, 미스매치 모티프)의 영역을 포함할 수 있다. 간섭 RNA의 서열은 전장 표적 유전자, 또는 이의 하위서열에 상응할 수 있다.
간섭 RNA는 "소형-간섭 RNA" 또는 "siRNA", 예를 들어 약 15개 내지 60개, 15개 내지 50개, 또는 15개 내지 40개(듀플렉스)의 뉴클레오타이드 길이, 더 통상적으로 약 15개 내지 30개, 15개 내지 25개, 또는 19개 내지 25개(듀플렉스)의 뉴클레오타이드 길이의 간섭 RNA를 포함하고, 바람직하게는 약 20개 내지 24개, 21개 내지 22개, 또는 21개 내지 23개(듀플렉스)의 뉴클레오타이드 길이이다(예를 들어, 이중-가닥 siRNA의 각각의 상보성 서열은 15개 내지 60개, 15개 내지 50개, 15개 내지 40개, 15개 내지 30개, 15개 내지 25개, 또는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 20개 내지 24개, 21개 내지 22개, 또는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이이고, 이중-가닥 siRNA는 약 15개 내지 60개, 15개 내지 50개, 15개 내지 40개, 15개 내지 30개, 15개 내지 25개, 또는 19개 내지 25개의 염기 쌍 길이, 바람직하게는 약 18개 내지 22개, 19개 내지 20개, 또는 19개 내지 21개의 염기 쌍 길이임). siRNA 듀플렉스는 약 1개 내지 약 4개의 뉴클레오타이드 또는 약 2개 내지 약 3개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행 및 5' 포스페이트 말단을 포함할 수 있다. siRNA의 예는 제한 없이 하나의 가닥은 센스 가닥이고 다른 것은 상보성 안티센스 가닥인 2개의 별개의 가닥 분자으로부터 어셈블링된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 분자; 센스 영역 및 안티센스 영역이 핵산-기반 또는 비-핵산-기반 링커에 의해 연결된 단일 가닥 분자로부터 어셈블링된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 분자; 자가-상보성 센스 영역 및 안티센스 영역을 갖는 헤어핀 2차 구조를 갖는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 분자; 및 원형 폴리뉴클레오타이드가 활성 이중-가닥 siRNA 분자를 생성하기 위해 생체내 또는 시험관내 가공될 수 있는, 2개 이상의 루프 구조 및 자가-상보성 센스 영역 및 안티센스 영역을 갖는 줄기를 갖는 원형 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
바람직하게는, siRNA는 화학적으로 합성된다. siRNA는 또한 이. 콜라이 RNase III 또는 다이서(Dicer)에 의한 더 긴 dsRNA(예를 들어, 약 25개 초과의 뉴클레오타이드 길이의 dsRNA)의 절단에 의해 생성될 수 있다. 이 효소는 dsRNA를 생물학적 활성 siRNA로 가공한다(예를 들어, Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002); Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:14236 (2002); Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1):4-6 (2003); Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003); Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001); 및 Robertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968) 참조). 바람직하게는, dsRNA는 적어도 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개, 200개, 300개, 400개 또는 500개의 뉴클레오타이드 길이이다. dsRNA는 1000개, 1500개, 2000개, 5000개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 이것 초과만큼 길 수 있다. dsRNA는 전체 유전자 전사체 또는 부분 유전자 전사체를 암호화할 수 있다. 소정의 경우에, siRNA는 플라스미드(예를 들어, 헤어핀 루프와 듀플렉스로 자동으로 폴딩하는 서열로서 전사됨)에 의해 암호화될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "미스매치 모티프" 또는 "미스매치 영역"은 표적 서열과 100% 상보성을 갖지 않는 간섭 RNA(예를 들어, siRNA, aiRNA, miRNA) 서열의 부분을 지칭한다. 간섭 RNA는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 이것 초과의 미스매치 영역을 가질 수 있다. 미스매치 영역은 인접할 수 있거나, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다. 미스매치 모티프 또는 영역은 단일 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
활성제 또는 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)의 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 원하는 효과, 예를 들어 간섭 RNA의 부재 하에 검출된 정상 발현 수준과 비교하여 표적 서열의 발현의 억제; 또는 단백질이 발현된 유기체에서 바람직한 생물학적 효과를 야기하는 단백질의 양의 mRNA-유도된 발현을 생성하기에 충분한 양이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현의 억제는 대조군에 대한 간섭 RNA에 의해 얻은 값이 약 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 0%일 때 달성된다. 다른 실시형태에서, 발현된 단백질은 신체 내에 세포형에서 보통 발현된 단백질의 활성 형태이고, mRNA의 치료학적으로 유효량은 건강한 개체의 세포형에서 보통 발현된 단백질의 양의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%)인 암호화된 단백질의 양을 생성하는 양이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하기 위한 적합한 검정은 예를 들어 당업자에게 공지된 기법을 사용한 단백질 또는 RNA 수준의 검사, 예컨대 도트 블롯, 노던 블롯, 인시츄 혼성화, ELISA, 면역침전, 효소 기능뿐만 아니라 당업자에게 공지된 표현형 검정을 포함한다.
간섭 RNA에 의해 면역 반응을 "감소시킨다", "감소하는", "저하시킨다" 또는 "저하시키는"에 의해 소정의 간섭 RNA(예를 들어, 변형된 간섭 RNA)에 대한 면역 반응의 검출 가능한 감소를 의미하도록 의도된다. 변형된 간섭 RNA에 의한 면역 반응의 감소의 양은 비변형된 간섭 RNA의 존재 하에 면역 반응의 수준에 대해 결정될 수 있다. 검출 가능한 감소는 비변형된 간섭 RNA의 존재 하에 검출된 면역 반응보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 이것 초과로 낮을 수 있다. 간섭 RNA에 대한 면역 반응의 감소는 통상적으로 시험관내 반응자 세포에 의한 사이토카인 생성(예를 들어, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6 또는 IL-12)의 감소 또는 간섭 RNA의 투여 후 포유류 대상체의 혈청에서의 사이토카인 생성의 감소에 의해 측정된다.
mRNA에 의해 면역 반응을 "감소시킨다", "감소하는", "저하시킨다" 또는 "저하시키는"에 의해 소정의 mRNA(예를 들어, 변형된 mRNA)에 대한 면역 반응의 검출 가능한 감소를 의미하도록 의도된다. 변형된 mRNA에 의한 면역 반응의 감소의 양은 비변형된 mRNA의 존재 하에 면역 반응의 수준에 대해 결정될 수 있다. 검출 가능한 감소는 비변형된 mRNA의 존재 하에 검출된 면역 반응보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 이것 초과로 낮을 수 있다. mRNA에 대한 면역 반응의 감소는 통상적으로 시험관내 반응자 세포에 의한 사이토카인 생성(예를 들어, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6 또는 IL-12)의 감소 또는 mRNA의 투여 후 포유류 대상체의 혈청에서의 사이토카인 생성의 감소에 의해 측정된다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "반응자 세포"는 면역자극성 간섭 RNA, 예컨대 비변형된 siRNA와 접촉될 때 검출 가능한 면역 반응을 생성하는 세포, 바람직하게는 포유류 세포를 지칭한다. 예시적인 반응자 세포는 예를 들어 수지상 세포, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 비장세포, 및 기타를 포함한다. 검출 가능한 면역 반응은 예를 들어 사이토카인 또는 성장 인자, 예컨대 TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF, 및 이들의 조합의 생성을 다포함한.
"실질적인 동일성"은 엄격한 조건 하에 기준 서열에 혼성화하는 서열, 또는 기준 서열의 규정된 영역에 비해 규정된 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 지칭한다.
"엄격한 혼성화 조건"이라는 구절은 핵산이 다른 서열이 아니라 통상적으로 핵산의 복잡한 혼합물에서 이의 표적 서열에 혼성화하는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-특이적이고, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology―Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 내지 10℃ 낮도록 선택된다. Tm은 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형에서 (정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 표적 서열에 혼성화하는 온도이다(표적 서열이 과도하게 존재하면서, Tm에서, 프로브의 50%는 평형에서 점유됨). 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 또한 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경의 적어도 2배, 바람직하게는 배경 혼성화의 10배이다.
예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 65℃에서의 0.2×SSC, 및 0.1% SDS에서의 세척과 함께 50% 포름아미드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서의 항온처리, 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서의 항온처리. PCR을 위해, 약 36℃의 온도는 낮은 엄격성 증폭에 통상적이지만, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃로 변할 수 있다. 높은 엄격성 PCR 증폭에 대해, 약 62℃의 온도가 통상적이지만, 높은 엄격성 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃의 범위일 수 있다. 높은 엄격성 증폭 및 낮은 엄격성 증폭 둘 다에 대한 통상적인 사이클 조건은 30초 내지 2분 동안 90℃ 내지 95℃의 변성 단계, 30초 내지 2분 지속하는 어닐링 단계 및 1분 내지 2분 동안 약 72℃의 연장 단계를 포함한다. 낮은 엄격성 증폭 반응 및 높은 엄격성 증폭 반응에 대한 프로토콜 및 가이드라인은 예를 들어 Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)에 제공된다.
엄격한 조건 하에 서로에 혼성화하지 않는 핵산은 이것이 암호화하는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하면 여전히 실질적으로 동일하다. 핵산의 카피가 유전 코드에 의해 허용된 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성될 때 예를 들어 이것이 발생한다. 이러한 경우에, 핵산은 통상적으로 보통의 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다. 예시적인 "보통의 엄격한 혼성화 조건"은 37℃에서의 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 완충액 중의 혼성화, 및 45℃에서의 1×SSC 중의 세척을 포함한다. 양성 혼성화는 배경의 적어도 2배이다. 당업자는 대안적인 혼성화 및 세척 조건이 유사한 엄격성의 조건을 제공하도록 사용될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 혼성화 매개변수를 결정하기 위한 추가적인 가이드라인은 많은 참고문헌, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.에 제공된다.
2개 이상의 핵산의 맥락에서 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적인 동일성"은, 비교 윈도우, 또는 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정된 것과 같은 지정된 영역에 대해 최대 관련성에 대해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나 동일한 뉴클레오타이드의 규정된 퍼센트(예를 들어, 규정된 영역에 걸쳐 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성)를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 이 정의는, 문맥이 나타낼 때, 또한 비슷하게 서열의 보체를 지칭한다. 바람직하게는, 실질적인 동일성은 적어도 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개 또는 60개의 뉴클레오타이드 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열 및 기준 서열은 컴퓨터로 입력되고, 필요하면 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 대안적인 프로그램이 지정될 수 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수에 기초하여 기준 서열에 대해 시험 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 것과 같이 "비교 윈도우"는 약 5개 내지 약 60개, 보통 약 10개 내지 약 45개, 더 보통 약 15개 내지 약 30개로 이루어진 군으로부터 선택된 다수의 인접한 위치 중 임의의 하나의 분절에 대한 지칭을 포함하고, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접한 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬의 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)의 유사성 분석을 위한 조사에 의해, 이들 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터 실행에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각 검사(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (1995 supplement) 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 각각 Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 발명의 핵산에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 본원에 기재된 매개변수와 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공중에게 이용 가능하다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 측정은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 일치가 우연히 발생하는 확률의 표시를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 가장 작은 합계 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면, 핵산은 기준 서열과 유사하다고 여겨진다.
본원에 사용된 것과 같이 용어 "핵산"은 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 적어도 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 함유하는 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. DNA는 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, 예비-응축된 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이들 군의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. RNA는 siRNA, 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, 바이러스 RNA (vRNA), 자가-증폭 RNA, 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산은 합성, 자연 발생, 및 비자연 발생이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드 및 펩타이드-핵산(PNA)을 포함한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특징을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오솔로그, SNP, 및 상보성 서열뿐만 아니라 명확히 표시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로는, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). "뉴클레오타이드"는 당 데옥시리보스(DNA) 또는 리보스(RNA), 염기 및 포스페이트 기를 함유한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트 기를 통해 함께 연결된다. "염기"는 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 사이토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체를 추가로 포함하는 푸린 및 피리미딘, 및 새로운 반응성 기, 예컨대 비제한적인 예로서 아민, 알코올, 티올, 카복실레이트 및 알킬할라이드를 두는 변형을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 푸린 및 피리미딘의 합성 유도체를 포함한다.
용어 "유전자"는 폴리펩타이드 또는 전구체 폴리펩타이드의 제조에 필요한 부분 길이 또는 전체 길이 암호화 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 것과 같이 "유전자 산물"은 RNA 전사체 또는 폴리펩타이드와 같은 유전자의 산물을 지칭한다.
용어 "지질"은 비제한적인 예로서 지방 산의 에스테르를 포함하고 물 중에 불용성이지만, 많은 유기 용매 중에 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물의 군을 지칭한다. 이들은 보통 적어도 3개의 종류로 나눠진다: (1) 지방 및 오일뿐만 아니라 왁스를 포함하는 "단순한 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "화합물 지질"; 및 (3) "유래된 지질", 예컨대 스테로이드.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "LNP"는 지질-핵산 입자 또는 핵산-지질 입자(예를 들어, 안정한 핵산-지질 입자)를 지칭한다. LNP는 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질) 및 핵산으로 제조된 입자를 나타내고, 핵산(예를 들어, siRNA, aiRNA, miRNA, ssDNA, dsDNA, ssRNA, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), dsRNA, mRNA, 자가-증폭 RNA, 또는 간섭 RNA 또는 mRNA가 전사된 플라스미드를 포함하는 플라스미드)이 지질 내에 캡슐화된다. 일 실시형태에서, 핵산은 지질에서 적어도 50% 캡슐화되고; 일 실시형태에서, 핵산은 지질에서 적어도 75% 캡슐화되고; 일 실시형태에서, 핵산은 지질에서 적어도 90% 캡슐화되고; 일 실시형태에서, 핵산은 지질에서 완전히 캡슐화된다. LNP는 통상적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질 접합체)를 함유한다. LNP는 전신 적용을 위해 극도로 유용하고, 이것이 정맥내(i.v.) 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내면서, 이것은 원위 부위(예를 들어, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위)에서 축적할 수 있고, 이것은 형질주입된 유전자의 발현 또는 이 원위 부위에서의 표적 유전자 발현의 침묵화를 매개할 수 있다.
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 통상적으로 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 내지 약 90 nm의 평균 직경을 갖고, 실질적으로 비독성이다. 게다가, 핵산은, 본 발명의 지질 입자에 존재할 때, 수성 용액 중에 뉴클레아제에 의한 분해에 저항적이다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 공보 제20040142025호 및 20070042031호에 기재되어 있고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 것과 같이, "캡슐화된 지질"은 전체 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 둘 다를 갖는 활성제 또는 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)을 제공하는 지질 입자를 지칭할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 (예를 들어, SPLP, pSPLP, LNP, 또는 다른 핵산-지질 입자를 형성하도록) 지질 입자에서 완전히 캡슐화된다.
용어 "지질 접합체"는 지질 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 지칭한다. 이러한 지질 접합체는 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), PEG-지질 접합체, 예컨대 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG, 디아실글리세롤에 커플링된 PEG, 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG, 세라미드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 양이온성 PEG 지질, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티를 포함하여 PEG를 지질에 커플링하기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 비-에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다.
용어 "양극성 지질"은 부분적으로 지질 재료의 소수성 부분이 소수성 상으로 배향하지만, 친수성 부분이 수성 상을 향해 배항하는 임의의 적합한 재료를 지칭한다. 친수성 특징은 극성 또는 하전된 기, 예컨대 탄수화물, 포스페이트, 카복실릭, 설페이토, 아미노, 설프하이드릴, 니트로, 하이드록실, 및 다른 유사한 기의 존재로부터 유래된다. 소수화도는 비제한적인 예로서 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로사이클릭 기(들)에 의해 치환된 이러한 기를 포함하는 비극성 기의 포함에 의해 부여될 수 있다. 양극성 화합물의 예는 인지질, 아미노지질 및 스핑고지질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
인지질의 대표적인 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 인이 결여된 다른 화합물, 예컨대 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤 및 베타베타-아실옥시산이 또한 양극성 지질로 지정된 군 내에 있다. 추가적으로, 상기 기재된 양극성 지질은 트리글리세라이드 및 스테롤을 포함하는 다른 지질과 혼합될 수 있다.
용어 "천연 지질"은 선택된 pH에서 비하전된 또는 천연 양쪽성 형태로 존재하는 임의의 다수의 지질 종을 지칭한다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질은 예를 들어 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드 및 디아실글리세롤을 포함한다.
용어 "비양이온성 지질"은 임의의 양극성 지질뿐만 아니라 임의의 다른 천연 지질 또는 음이온성 지질을 지칭한다.
용어 "음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 음으로 하전된 임의의 지질을 지칭한다. 이들 지질은 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 및 천연 지질에 연결된 다른 음이온성 변형 기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "양이온성 지질"은 본원에 기재된 것과 같은 화학식 (I)의 화합물을 지칭한다.
용어 "소수성 지질"은 비제한적인 예로서 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로사이클릭 기(들)에 의해 선택적으로 치환된 이러한 기를 포함하는 비극성 기를 갖는 화합물을 지칭한다. 적합한 예는 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N-N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "융해성"은 세포의 막과 융해하는 지질 입자, 예컨대 LNP의 능력을 지칭한다. 막은 세포소기관, 예를 들어 엔도솜, 핵 등을 둘러싸는 혈장 막 또는 막들일 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "수성 용액"은 전체로서 또는 부분적으로 물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "유기 지질 용액"은 전체로서 또는 부분적으로 지질을 갖는 유기 용매를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 것과 같이, "원위 부위"는 인접한 모세관 층으로 제한되지 않고, 유기체에 걸쳐 광범위하게 분포된 부위를 포함하는 물리적으로 분리된 부위를 지칭한다.
핵산-지질 입자, 예컨대 LNP와 관련하여 "혈청 안정한"은 입자가 유리 DNA 또는 RNA를 상당히 분해하는 혈청 또는 뉴클레아제 검정에 대한 노출 후 상당히 분해되지 않는다는 것을 의미한다. 적합한 검정은 예를 들어 표준 혈청 검정, DNAse 검정 또는 RNAse 검정을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이 "전신 전달"은 유기체 내에 활성제 또는 치료제, 예컨대 간섭 RNA 또는 mRNA의 광범위한 생물분포로 이어지는 지질 입자의 전달을 지칭한다. 일부 투여 기법은 다른 것이 아니라 소정의 제제의 전신 전달로 이어질 수 있다. 전신 전달은 제제의 유용한, 바람직하게는 치료학적 양이 신체의 대부분의 부분에 노출된다는 것을 의미한다. 광범위한 분포를 얻는 것은 일반적으로 투여의 부위에 원위인 질환 부위에 도달하기 전에 제제가 (예컨대, 제1 통과 장기(간, 폐 등)에 의해 또는 신속한, 비특이적 세포 결합에 의해) 신속히 분해되거나 제거되지 않게 하는 혈액 수명을 요한다. 지질 입자의 전신 전달은 예를 들어 정맥내, 피하 및 복강내를 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 지질 입자의 전신 전달은 정맥내 전달에 의한다.
본원에 사용된 것과 같이 "국소 전달"은 유기체 내에 직접적인 표적 부위로의 활성제 또는 치료제, 예컨대 간섭 RNA 또는 mRNA의 전달을 지칭한다. 예를 들어, 제제는 질환 부위, 예컨대 종양 또는 다른 표적 부위, 예컨대 염증의 부위 또는 표적 장기, 예컨대 간, 심장, 췌장, 신장, 및 기타에 대한 직접 주사에 의해 국소로 전달될 수 있다.
용어 "포유류"는 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 햄스터, 기니아 피그, 토끼, 가축, 및 기타와 같은 임의의 포유류 종을 지칭한다.
용어 "암"은 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 질환의 종류의 임의의 구성원을 지칭한다. 상기 용어는 악성, 양성, 연조직, 또는 고형이든 모든 공지된 암 및 싱생물 병태, 및 전이전 및 전이후 암을 포함하는 모든 병기 및 등급의 암을 포함한다. 상이한 암 유형의 예는 폐암, 대장암, 결장암, 항문암, 담관암, 소장암, 위(위장)암, 식도암; 담낭암, 간암, 췌장암, 충수암, 유방암, 난소암; 자궁경부암, 전립선암, 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종), 중추 신경계의 암, 교모세포종, 피부암, 림프종, 융모막암종, 두경부암, 골원성 육종 및 혈액암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 간암의 특정 유형의 비제한적인 예는 간세포 암종(HCC), 속발성 간암(예를 들어, 일부 다른 비-간암 세포형의 전이에 의해 야기됨), 및 간모세포종을 포함한다. 본원에 사용된 것과 같이, "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다.
용어 "음이온성 전구체 기"는 생리학적 pH에서 이온을 형성할 수 있는 기를 포함한다. 예를 들어, 상기 용어는 기 -CO2H, -O-P(=O)(OH)2, -OS(=O)2(OH), -O-S(=O)(OH) 및 -B(OH)2를 포함한다. 일 실시형태에서, 음이온성 전구체는 -CO2H이다.
특정 실시형태에서, PEG-C-DMA는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00006
상기 식 중, n은 생성된 중합체 사슬이 약 1000 내지 약 3000의 분자량을 갖도록 선택된다. 다른 실시형태에서, n은 생성된 중합체 사슬이 약 2000의 분자량을 갖도록 선택된다. PEG-C-DMA는 Heyes et al, Synthesis and Characterization of Novel Poly (Ethylene Glycol)-lipid Conjugates Suitable for use in Drug Delivery," Journal of Controlled Release, 2006에 의해 그리고 미국 특허 제8,936,942호에 기재된 것과 같이 제조될 수 있다.
실시형태의 설명
본 발명은 하나 이상의 활성제 또는 치료제를 포함하는 신규의, 혈청-안정한 지질 입자, 지질 입자를 제조하는 방법, 및 (예를 들어, 질환 또는 장애의 치료를 위해) 지질 입자를 전달하고/하거나 투여하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 활성제 또는 치료제; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol% 내지 약 85 mol%를 포함하는 하나 이상의 양이온성 지질; (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 13 mol% 내지 약 49.5 mol%를 포함하는 하나 이상의 비양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%를 포함하는 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 접합된 지질을 포함하는 지질 입자를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 활성제 또는 치료제; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol% 내지 약 85 mol%를 포함하는 하나 이상의 양이온성 지질; (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 13 mol% 내지 약 49.5 mol%를 포함하는 하나 이상의 비양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol% 내지 약 2 mol%를 포함하는 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 접합된 지질을 포함하는 지질 입자를 제공한다.
소정의 실시형태에서, 지질 입자에서의 활성제 또는 치료제가 예를 들어 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의한 효소 분해에 수성 용액 중에 저항적이도록 활성제 또는 치료제는 지질 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된다. 소정의 다른 실시형태에서, 지질 입자는 인간과 같은 포유류에 실질적으로 비독성이다.
일부 실시형태에서, 활성제 또는 치료제는 핵산을 포함한다. 소정의 경우에, 핵산은 예를 들어 siRNA, aiRNA, miRNA와 같은 간섭 RNA 분자, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 소정의 다른 경우에, 핵산은 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 플라스미드, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드와 같은 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 소정의 경우에, 핵산은 mRNA 분자를 포함한다.
다른 실시형태에서, 활성제 또는 치료제는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 소정의 경우에, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 예를 들어 다중클론 항체, 단일클론 항체, 항체 단편; 인간화된 항체, 재조합 항체, 재조합 인간 항체, Primatized™ 항체와 같은 항체, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 소정의 다른 경우에, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 사이토카인, 성장 인자, 아폽토시스 인자, 분화-유도 인자, 세포-표면 수용체, 리간드, 호르몬, 소분자(예를 들어, 작은 유기 분자 또는 화합물), 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
일 실시형태에서, 활성제 또는 치료제는 siRNA를 포함한다. 일 실시형태에서, siRNA 분자는 약 15개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 약 15개 내지 60개, 15개 내지 50개, 15개 내지 40개, 15개 내지 30개, 15개 내지 25개 또는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 뉴클레오타이드 길이)의 이중-가닥 영역을 포함한다. 본 발명의 siRNA 분자는 시험관내 및/또는 생체내 표적 서열의 발현을 침묵화할 수 있다.
일부 실시형태에서, siRNA 분자는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 바람직한 실시형태에서, siRNA 분자는 이중-가닥 영역에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 이것 초과의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 경우에, siRNA는 이중-가닥 영역에서의 약 1% 내지 약 100%(예를 들어, 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 이중-가닥 영역에서의 약 25% 미만(예를 들어, 약 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만) 또는 약 1% 내지 약 25%(예를 들어, 약 1% 내지 25%, 5% 내지 25%, 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 20% 내지 25%, 또는 10% 내지 20%)의 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, siRNA 분자는 비제한적인 예로서 2'-O-메틸(2'OMe) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'F) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸)(MOE) 뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA) 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, siRNA는 예를 들어 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-사이토신 뉴클레오타이드와 같은 2'OMe 뉴클레오타이드(예를 들어, 2'OMe 푸린 및/또는 피리미딘 뉴클레오타이드), 및 이들의 혼합물을 포함한다. 소정의 경우에, siRNA는 2'OMe-사이토신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, siRNA는 헤어핀 루프 구조를 포함한다.
siRNA는 siRNA 분자의 이중-가닥 영역의 하나의 가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스) 또는 가닥 둘 다에서 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드는 siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역에서 선택적 위치에서 변형된다. 우리딘 뉴클레오타이드 변형과 관련하여, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서의 우리딘 뉴클레오타이드의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 이것 초과는 변형된 우리딘 뉴클레오타이드, 예컨대 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서의 모든 우리딘 뉴클레오타이드는 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드이다. 구아노신 뉴클레오타이드 변형과 관련하여, 센스 및/또는 안티센스 가닥에서의 구아노신 뉴클레오타이드의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 이것 초과는 변형된 구아노신 뉴클레오타이드, 예컨대 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서의 모든 구아노신 뉴클레오타이드는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, siRNA 서열에서의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 이것 초과의 5'-GU-3' 모티프는 예를 들어 5'-GU-3' 모티프를 제거하도록 미스매치를 도입함으로써 및/또는 변형된 뉴클레오타이드 예컨대 2'OMe 뉴클레오타이드를 도입함으로써 변형될 수 있다. 5'-GU-3' 모티프는 siRNA 서열의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두에 있을 수 있다. 5'-GU-3' 모티프는 서로에 인접할 수 있거나, 대안적으로, 이들은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 덜 면역자극성이다. 이러한 실시형태에서, 감소된 면역자극성 특성을 갖는 변형된 siRNA 분자는 유리하게는 표적 서열에 대한 RNAi 활성을 보유한다. 다른 실시형태에서, 변형된 siRNA 분자의 면역자극성 특성 및 표적 유전자 발현을 침묵화하는 이의 능력은 예를 들어 siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역 내와 같은 siRNA 서열 내에 최소 및 선택적 2'OMe 변형의 도입에 의해 균형화되거나 최적화될 수 있다. 소정의 경우에, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 덜 면역자극성이다. 변형된 siRNA 분자 및 상응하는 비변형된 siRNA 분자의 면역자극성 특성이 예를 들어 포유류에서의 전신 투여 또는 적절한 지질-기반 전달 시스템(예컨대, 본원에 개시된 LNP 전달 시스템)을 사용한 포유류 반응자 세포의 형질주입 후 약 2시간 내지 약 12시간에 INF-α 및/또는 IL-6 수준을 측정함으로서 결정될 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명확할 것이다.
소정의 실시형태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA의 것의 10배 이하인 IC50(즉, 최대절반 억제 농도)을 갖는다(즉, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA의 IC50의 10배 이하인 IC50을 가짐). 다른 실시형태에서, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA 서열의 것의 3배 이하의 IC50을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA의 것의 2배 이하의 IC50을 갖는다. 용량-반응 곡선이 생성될 수 있고, 변형된 siRNA 및 상응하는 비변형된 siRNA에 대한 IC50 값이 당업자에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다는 것이 당업자에게 명확해질 것이다.
또 다른 실시형태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA 서열에 비해 표적 서열의 발현의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 침묵화할 수 있다.
일부 실시형태에서, siRNA 분자는 예를 들어 이중-가닥 영역의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서 포스페이트 골격 변형을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, siRNA는 예를 들어 이중-가닥 영역의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 이것 초과의 포스페이트 골격 변형을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, siRNA는 포스페이트 골격 변형을 포함하지 않는다.
추가의 실시형태에서, siRNA는 예를 들어 이중-가닥 영역의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 또 추가의 실시형태에서, siRNA는 예를 들어 이중-가닥 영역의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 이것 초과의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, siRNA는 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
소정의 경우에, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서의 이중-가닥 영역의 3'-말단에서의 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드가 아니다. 소정의 다른 경우에, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서의 이중-가닥 영역의 3'-말단 근처에서의(예를 들어, 3'-말단의 1개, 2개, 3개 또는 4개 뉴클레오타이드 내의) 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드가 아니다.
본원에 기재된 siRNA 분자는 이중-가닥 영역의 하나의 측 또는 양측에서 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 가질 수 있거나, 이중-가닥 영역의 하나의 측 또는 양측에서 오버행이 결여될 수 있다(즉, 무딘 말단을 가짐). 바람직하게는, siRNA는 이중-가닥 영역의 각각의 측에서 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 갖는다. 소정의 경우에, 안티센스 가닥에서의 3' 오버행은 표적 서열에 상보성을 갖고, 센스 가닥에서의 3' 오버행은 표적 서열의 상보성 가닥에 상보성을 갖는다. 대안적으로, 3' 오버행은 표적 서열 또는 이의 상보성 가닥에 상보성을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 3' 오버행은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드, 예컨대 2'-데옥시(2'H) 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 3' 오버행은 데옥시티미딘(dT) 및/또는 우리딘 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 이중-가닥 영역의 하나의 말단 또는 말단 둘 다에서의 3' 오버행에서의 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 상기 기재되어 있고, 2'OMe 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'F 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-2-MOE 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, siRNA의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 존재하는 3' 오버행에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드는 예를 들어 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-사이토신 뉴클레오타이드와 같은 2'OMe 뉴클레오타이드(예를 들어, 2'OMe 푸린 및/또는 피리미딘 뉴클레오타이드), 및 이들의 혼합물을 포함한다.
siRNA는 표적 유전자 발현을 침묵화하는 비변형된 및/또는 변형된 siRNA 서열의 적어도 하나 또는 칵테일(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 이것 초과)을 포함할 수 있다. siRNA의 칵테일은 동일한 영역 또는 도메인(예를 들어, "핫 스팟") 및/또는 하나 이상의 표적 유전자의 상이한 영역 또는 도메인에 지시된 서열을 포함할 수 있다. 소정의 경우에, 표적 유전자 발현을 침묵화하는 1개 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 이것 초과)의 변형된 siRNA는 칵테일에 존재한다. 소정의 다른 경우에, 표적 유전자 발현을 침묵화하는 1개 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 이것 초과)의 비변형된 siRNA 서열은 칵테일에 존재한다.
일부 실시형태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상보성인 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부에 100% 상보성인 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 추가의 실시형태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부에 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
추가의 실시형태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 추가적인 실시형태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부에 100% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 발명의 지질 나노입자에서, 양이온성 지질은 본원에 기재된 것과 같은 화학식 (I)의 화합물로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol% 내지 약 90 mol%, 약 30 mol% 내지 약 85 mol%, 약 30 mol% 내지 약 80 mol%, 약 30 mol% 내지 약 75 mol%, 약 30 mol% 내지 약 70 mol%, 약 30 mol% 내지 약 65 mol%, 또는 약 30 mol% 내지 약 60 mol%를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 mol% 내지 약 90 mol%, 약 40 mol% 내지 약 85 mol%, 약 40 mol% 내지 약 80 mol%, 약 40 mol% 내지 약 75 mol%, 약 40 mol% 내지 약 70 mol%, 약 40 mol% 내지 약 65 mol%, 또는 약 40 mol% 내지 약 60 mol%를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 55 mol% 내지 약 90 mol%, 약 55 mol% 내지 약 85 mol%, 약 55 mol% 내지 약 80 mol%, 약 55 mol% 내지 약 75 mol%, 약 55 mol% 내지 약 70 mol%, 또는 약 55 mol% 내지 약 65 mol%를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 60 mol% 내지 약 90 mol%, 약 60 mol% 내지 약 85 mol%, 약 60 mol% 내지 약 80 mol%, 약 60 mol% 내지 약 75 mol%, 또는 약 60 mol% 내지 약 70 mol%를 포함할 수 있다.
더 또 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 65 mol% 내지 약 90 mol%, 약 65 mol% 내지 약 85 mol%, 약 65 mol% 내지 약 80 mol%, 또는 약 65 mol% 내지 약 75 mol%를 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 70 mol% 내지 약 90 mol%, 약 70 mol% 내지 약 85 mol%, 약 70 mol% 내지 약 80 mol%, 약 75 mol% 내지 약 90 mol%, 약 75 mol% 내지 약 85 mol%, 또는 약 80 mol% 내지 약 90 mol%를 포함할 수 있다.
추가적인 실시형태에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 (적어도) 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 또는 90 mol%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)를 포함할 수 있다.
본 발명의 지질 입자에서, 비양이온성 지질은 예를 들어 하나 이상의 음이온성 지질 및/또는 중성 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 비양이온성 지질은 하기 중성 지질 성분 중 하나를 포함한다: (1) 콜레스테롤 또는 이의 유도체 (2) 인지질; 또는 (3) 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물.
콜레스테롤 유도체의 예는 콜레스타놀, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스타놀, 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-하이드록시부틸 에테르, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르의 합성은 본원에 기재되어 있다.
인지질은 비제한적인 예로서 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레이올-포스파티딜글리세롤(POPG), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 및 이들의 혼합물을 포함하는 중성 지질일 수 있다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 인지질은 DPPC, DSPC, 또는 이들의 혼합물이다.
일부 실시형태에서, 비양이온성 지질(예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 60 mol%, 약 15 mol% 내지 약 60 mol%, 약 20 mol% 내지 약 60 mol%, 약 25 mol% 내지 약 60 mol%, 약 30 mol% 내지 약 60 mol%, 약 10 mol% 내지 약 55 mol%, 약 15 mol% 내지 약 55 mol%, 약 20 mol% 내지 약 55 mol%, 약 25 mol% 내지 약 55 mol%, 약 30 mol% 내지 약 55 mol%, 약 13 mol% 내지 약 50 mol%, 약 15 mol% 내지 약 50 mol% 또는 약 20 mol% 내지 약 50 mol%를 포함할 수 있다. 비양이온성 지질이 인지질 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체의 혼합물일 때, 혼합물은 입자에 존재하는 총 지질의 약 40, 50, 또는 60 mol% 이하를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 비양이온성 지질(예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 49.5 mol%, 약 13 mol% 내지 약 49.5 mol%, 약 15 mol% 내지 약 49.5 mol%, 약 20 mol% 내지 약 49.5 mol%, 약 25 mol% 내지 약 49.5 mol%, 약 30 mol% 내지 약 49.5 mol%, 약 35 mol% 내지 약 49.5 mol%, 또는 약 40 mol% 내지 약 49.5 mol%를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 비양이온성 지질(예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 45 mol%, 약 13 mol% 내지 약 45 mol%, 약 15 mol% 내지 약 45 mol%, 약 20 mol% 내지 약 45 mol%, 약 25 mol% 내지 약 45 mol%, 약 30 mol% 내지 약 45 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 45 mol%를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 비양이온성 지질(예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 40 mol%, 약 13 mol% 내지 약 40 mol%, 약 15 mol% 내지 약 40 mol%, 약 20 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 30 mol% 내지 약 40 mol%를 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 비양이온성 지질(예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 35 mol%, 약 13 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 35 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 또는 약 25 mol% 내지 약 35 mol%를 포함할 수 있다.
훨씬 추가의 실시형태에서, 비양이온성 지질(예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 13 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 13 mol% 내지 약 25 mol%, 또는 약 15 mol% 내지 약 25 mol%를 포함할 수 있다.
추가적인 실시형태에서, 비양이온성 지질(예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 총 지질의 (적어도) 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 mol%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)를 포함할 수 있다.
소정의 바람직한 실시형태에서, 비양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 31.5 mol% 내지 약 42.5 mol%의 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함한다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 인지질-유리 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 37 mol%로 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 인지질-유리 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol% 내지 약 45 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 35 mol% 내지 약 45 mol%, 약 40 mol% 내지 약 45 mol%, 약 32 mol% 내지 약 45 mol%, 약 32 mol% 내지 약 42 mol%, 약 32 mol% 내지 약 40 mol%, 약 34 mol% 내지 약 45 mol%, 약 34 mol% 내지 약 42 mol%, 약 34 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45 mol%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)의 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
소정의 다른 바람직한 실시형태에서, 비양이온성 지질은 (i) 입자에 존재하는 총 지질의 약 4 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질; 및 (ii) 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol% 내지 약 40 mol%의 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 7 mol%의 DPPC 및 약 34 mol%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 비양이온성 지질은 (i) 입자에 존재하는 총 지질의 약 3 mol% 내지 약 15 mol%, 약 4 mol% 내지 약 15 mol%, 약 4 mol% 내지 약 12 mol%, 약 4 mol% 내지 약 10 mol%, 약 4 mol% 내지 약 8 mol%, 약 5 mol% 내지 약 12 mol%, 약 5 mol% 내지 약 9 mol%, 약 6 mol% 내지 약 12 mol%, 약 6 mol% 내지 약 10 mol%, 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 mol%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)의 인지질; 및 (ii) 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol% 내지 약 45 mol%, 약 30 mol% 내지 약 45 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 35 mol% 내지 약 45 mol%, 약 40 mol% 내지 약 45 mol%, 약 28 mol% 내지 약 40 mol%, 약 28 mol% 내지 약 38 mol%, 약 30 mol% 내지 약 38 mol%, 약 32 mol% 내지 약 36 mol%, 또는 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45 mol%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)의 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함한다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 비양이온성 지질은 (i) 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 30 mol%의 인지질; 및 (ii) 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 30 mol%의 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%의 DPPC 및 약 20 mol%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 비양이온성 지질은 (i) 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 약 12 mol% 내지 약 28 mol%, 약 14 mol% 내지 약 26 mol%, 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 mol%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)의 인지질; 및 (ii) 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 약 12 mol% 내지 약 28 mol%, 약 14 mol% 내지 약 26 mol%, 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 mol%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)의 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함한다.
접합된 지질
본 발명의 지질 입자(예를 들어, 간섭 RNA, 예컨대 siRNA 또는 mRNA를 예를 들어 포함하는 LNP)에서, 접합된 지질은 예를 들어 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체, 폴리아미드(ATTA)-지질 접합체, 또는 이들의 혼합물. 하나의 바람직한 실시형태에서, 핵산-지질 입자는 PEG-지질 접합체 또는 ATTA-지질 접합체 중 어느 하나를 포함한다. 접합된 지질은 예를 들어 PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG 디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), 또는 이들의 혼합물을 포함하는 PEG-지질을 포함할 수 있다. PEG-DAA 접합체는 PEG-디라우릴옥시프로필(C12), PEG-디미리스틸옥시프로필(C14), PEG-디팔미틸옥시프로필(C16), PEG-디스테아릴옥시프로필 (C18), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 추가 PEG-지질 접합체는 mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-카보모일글리세라이드(PEG-C-DOMG)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. PEG-C-DOMG의 합성은 2008년 12월 31일에 출원된 PCT 출원 PCT/US08/88676호에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 또 추가의 PEG-지질 접합체는 제한 없이 1-[8'-(1,2-디미리스토일-3-프로파녹시)-카복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카바모일-w-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)(2 KPEG-DMG)을 포함한다. 2 KPEG-DMG의 합성은 미국 특허 제7,404,969호에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 PEG-지질 접합체의 PEG 모이어티는 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤의 평균 분자량을 포함할 수 있다. 소정의 경우에, PEG 모이어티는 약 750 달톤 내지 약 5,000 달톤(예를 들어, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤, 약 1,500 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 2,000 달톤 등)의 평균 분자량을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, PEG 모이어티는 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤의 평균 분자량을 갖는다.
소정의 경우에, 접합된 지질(예를 들어, PEG-지질 접합체)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.1 내지 약 10%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)를 포함할 수 있다. 소정의 경우에, 접합된 지질(예를 들어, PEG-지질 접합체)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.1 mol% 내지 약 2 mol%, 약 0.5 mol% 내지 약 2 mol%, 약 1 mol% 내지 약 2 mol%, 약 0.6 mol% 내지 약 1.9 mol%, 약 0.7 mol% 내지 약 1.8 mol%, 약 0.8 mol% 내지 약 1.7 mol%, 약 1 mol% 내지 약 1.8 mol%, 약 1.2 mol% 내지 약 1.8 mol%, 약 1.2 mol% 내지 약 1.7 mol%, 약 1.3 mol% 내지 약 1.6 mol%, 약 1.4 mol% 내지 약 1.5 mol%, 또는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 mol%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)를 포함할 수 있다.
본 발명의 지질 입자에서, 활성제 또는 치료제는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화될 수 있어서, 효소 분해로부터 활성제 또는 치료제를 보호한다. 바람직한 실시형태에서, 핵산, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA) 또는 mRNA를 포함하는 LNP는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어서, 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호한다. 소정의 경우에, LNP에서의 핵산은 적어도 약 20분, 30분, 45분 또는 60분 동안 37℃에서 뉴클레아제에 대한 입자의 노출 후 실질적으로 분해되지 않는다. 소정의 다른 경우에, LNP에서의 핵산은 적어도 약 30, 45, 또는 60분 또는 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간 또는 36시간 동안 37℃에서 혈청 중에 입자의 항온처리 후 실질적으로 분해되지 않는다. 다른 실시형태에서, 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산, 예컨대 siRNA)는 입자의 지질 부분과 복합체화된다. 본 발명의 제형의 이익 중 하나는 지질 입자 조성물이 인간과 같은 포유류에게 실질적으로 비독성이라는 것이다.
용어 "완전히 캡슐화된"은 지질 입자에서의 활성제 또는 치료제가 유리 DNA, RNA 또는 단백질을 상당히 분해하지 않는 혈청 또는 뉴클레아제 또는 프로테아제 검정에 대한 노출 후 상당히 분해되지 않는다는 것을 나타낸다. 완전히 캡슐화된 시스템에서, 입자에서의 활성제 또는 치료제의 바람직하게는 약 25% 미만은 유리 활성제 또는 치료제의 100%를 보통 분해하는 치료에서 분해되고, 입자에서의 활성제 또는 치료제의 더 바람직하게는 약 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만은 분해된다. 핵산 치료제의 맥락에서, 완전 캡슐화는 Oligreen® 검정에 의해 결정될 수 있다. Oligreen®은 용액 중의 올리고뉴클레오타이드 및 단일-가닥 DNA 또는 RNA를 정량화하기 위한 고민감성 형광 핵산 염색(Invitrogen Corporation; Carlsbad, Calif.로부터 입수 가능)이다. "완전히 캡슐화된"은 또한 지질 입자가 혈청 안정하다는 것을 나타내고, 즉 이것은 생체내 투여 시 이의 성분 부분으로 신속히 분해하지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 복수의 지질 입자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, LNP) 조성물을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산)는 지질 입자(예를 들어, LNP)의 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)가 이것 내에 캡슐화된 활성제 또는 치료제를 갖도록, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된다.
통상적으로, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 약 1 내지 약 100의 지질:활성제(예를 들어, 지질:핵산) 비(질량/질량 비)를 갖는다. 일부 경우에, 지질:활성제(예를 들어, 지질:핵산) 비(질량/질량 비)는 약 1 내지 약 50, 약 2 내지 약 25, 약 3 내지 약 20, 약 4 내지 약 15, 또는 약 5 내지 약 10의 범위이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자는 약 5 내지 약 15, 예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)의 지질:활성제(예를 들어, 지질:핵산) 비(질량/질량 비)를 갖는다.
통상적으로, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 약 40 nm 내지 약 150 nm의 평균 직경을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 약 40 nm 내지 약 130 nm, 약 40 nm 내지 약 120 nm, 약 40 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 120 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 120 nm, 약 60 nm 내지 약 110 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 약 60 nm 내지 약 80 nm, 약 70 nm 내지 약 120 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm, 또는 80 nm 미만(또는 이의 임의의 분획 또는 이것 내의 범위)의 평균 직경을 갖는다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시형태에서, LNP는 (a) 하나 이상의 비변형된 및/또는 변형된 핵산 분자(예를 들어, 표적 유전자 발현을 침묵화하는 간섭 RNA, 예컨대 siRNA, aiRNA, miRNA; 또는 표적 단백질 발현을 초래하는 mRNA); (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 56.5 mol% 내지 약 66.5 mol%를 포함하는 양이온성 지질; (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 31.5 mol% 내지 약 42.5 mol%를 포함하는 비양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 1 mol% 내지 약 2 mol%를 포함하는 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함한다. LNP의 이 구체적인 실시형태는 일반적으로 본원에서 "1:62" 제형이라 칭해진다. 바람직한 실시형태에서, 양이온성 지질은 DLinDMA 또는 DLin-K-C2-DMA("XTC2")이고, 비양이온성 지질은 콜레스테롤이고, 접합된 지질은 PEG-DAA 접합체이다. 이것이 1:62 제형의 바람직한 실시형태이지만, 당업자는 다른 양이온성 지질, 비양이온성 지질(다른 콜레스테롤 유도체를 포함) 및 접합된 지질이 본원에 기재된 것과 같은 1:62 제형에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 다른 구체적인 실시형태에서, LNP는 (a) 하나 이상의 비변형된 및/또는 변형된 핵산 분자(예를 들어, 표적 유전자 발현을 침묵화하는 간섭 RNA, 예컨대 siRNA, aiRNA, miRNA; 또는 표적 단백질 발현을 생성시키는 mRNA); (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 52 mol% 내지 약 62 mol%를 포함하는 양이온성 지질; (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 36 mol% 내지 약 47 mol%를 포함하는 비양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 1 mol% 내지 약 2 mol%를 포함하는 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함한다. LNP의 이 구체적인 실시형태는 일반적으로 본원에서 "1:57" 제형이라 칭해진다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 양이온성 지질은 DLinDMA 또는 DLin-K-C2-DMA("XTC2")이고, 비양이온성 지질은 인지질(예컨대, DPPC) 및 콜레스테롤의 혼합물이고, 인지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 9 mol%(예를 들어, 약 7.1 mol%)를 포함하고, 콜레스테롤(또는 콜레스테롤 유도체)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 32 mol% 내지 약 37 mol%(예를 들어, 약 34.3 mol%)를 포함하고, PEG-지질은 PEG-DAA(예를 들어, PEG-cDMA)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 양이온성 지질은 DLinDMA 또는 DLin-K-C2-DMA("XTC2")이고, 비양이온성 지질은 인지질(예컨대, DPPC) 및 콜레스테롤의 혼합물이고, 인지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 15 mol% 내지 약 25 mol%(예를 들어, 약 20 mol%)를 포함하고, 콜레스테롤(또는 콜레스테롤 유도체)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 15 mol% 내지 약 25 mol%(예를 들어, 약 20 mol%)를 포함하고, PEG-지질은 PEG-DAA(예를 들어, PEG-cDMA)이다. 이것이 1:57 제형의 바람직한 실시형태이지만, 당업자는 다른 양이온성 지질, 비양이온성 지질(다른 인지질 및 다른 콜레스테롤 유도체를 포함) 및 접합된 지질이 본원에 기재된 것과 같은 1:57 제형에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
바람직한 실시형태에서, 1:62 LNP 제형은 인지질-비함유이고 약 1.5 mol%의 PEG-cDMA(또는 PEG-IDSA), 약 61.5 mol%의 DLinDMA(또는 XTC2) 및 약 36.9 mol%의 콜레스테롤(또는 이의 유도체)를 포함하는 3-성분 시스템이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 1:57 LNP 제형은 약 1.4 mol%의 PEG-cDMA(또는 PEG-cDSA), 약 57.1 mol%의 DLinDMA(또는 XTC2), 약 7.1 mol%의 DPPC 및 약 34.3 mol%의 콜레스테롤(또는 이의 유도체)을 포함하는 4-성분 시스템이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 1:57 LNP 제형은 약 1.4 mol%의 PEG-cDMA(또는 PEG-cDSA), 약 57.1 mol%의 DLinDMA(또는 XTC2), 약 20 mol%의 DPPC 및 약 20 mol%의 콜레스테롤(또는 이의 유도체)을 포함하는 4-성분 시스템이다. 이들 LNP 제형이 표적 제형이고, LNP 제형에 존재하는 지질(양이온성 및 비양이온성 둘 다)의 양 및 존재하는 지질 접합체의 양이 변할 수 있다고 이해되어야 한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 세포를 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP)와 접촉시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산)를 세포로 도입하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 세포는 포유류에 있고, 포유류는 인간이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP)를 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 하나 이상의 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산)의 생체내 전달을 위한 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 투여 방식은 경구, 비강내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 병변내, 기관애, 피하 및 진피내를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 포유류 대상체는 인간이다.
일 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 총 주사된 용량의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%는 주사 후 약 8시간, 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간에 혈장에 존재한다. 다른 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 총 주사된 용량의 약 20%, 30%, 40% 초과 및 약 60%, 70% 또는 80%만큼은 주사 후 약 8시간, 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간에 혈장에 존재한다. 소정의 경우에, 복수의 입자의 약 10% 초과는 투여 후 약 1시간에 포유류의 혈장에 존재한다. 소정의 다른 경우에, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 존재는 입자의 투여 후 적어도 약 1시간에 검출 가능하다. 소정의 실시형태에서, 활성제 또는 치료제, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA) 또는 mRNA의 존재는 (예를 들어, 폐, 간, 종양, 또는 염증의 부위에서) 투여 후 약 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 또는 96시간에 세포에서 검출 가능하다. 다른 실시형태에서, 활성제 또는 치료제, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)에 의한 표적 서열의 발현의 하향조절은 투여 후 약 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 또는 96시간에 검출 가능하다. 또 다른 실시형태에서, 활성제 또는 치료제, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)에 의한 표적 서열의 발현의 하향조절은 종양 세포에서 또는 염증의 부위에서의 세포에서 우선적으로 발생한다. 추가의 실시형태에서, 투여의 부위에 근위 또는 원위인 부위에서의 세포에서의 또는 폐, 간 또는 종양의 세포에서의 활성제 또는 치료제, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 존재 또는 효과는 투여 후 약 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 또는 96시간에, 또는 약 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 19일, 20일, 22일, 24일, 26일 또는 28일에 검출 가능하다. 다른 실시형태에서, 활성제 또는 치료제, 예컨대 mRNA 또는 자가-증폭 RNA에 의한 표적 서열의 발현의 상향조절은 투여 후 약 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 또는 96시간에 검출 가능하다. 또 다른 실시형태에서, 활성제 또는 치료제 예컨대 mRNA 또는 자가-증폭 RNA에 의한 표적 서열의 발현의 상향조절은 종양 세포에서 또는 염증의 부위에서의 세포에서 우선적으로 발생한다. 추가의 실시형태에서, 투여의 부위에 근위 또는 원위인 부위에서의 세포에서의 또는 폐, 간 또는 종양의 세포에서의 활성제 또는 치료제, 예컨대 mRNA 또는 자가-복제 RNA의 존재 또는 효과는 투여 후 약 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 또는 96시간에, 또는 약 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 19일, 20일, 22일, 24일, 26일 또는 28일에 검출 가능하다. 추가적인 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 비경구로 또는 복강내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 간섭 RNA 서열(예를 들어, siRNA)을 포함하는 하나 이상의 핵산의 치료학적 전달을 위한 방법에 특히 유용하다. 특히, 본 발명의 목적은 하나 이상의 표적 핵산 서열 또는 관심 유전자의 전사 및/또는 번역을 하향조절하거나 침묵화함으로써 포유류 (예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 영장류, 예컨대 인간, 침팬지 또는 당나귀)에서의 질환 또는 장애의 치료를 위한 시험관내 및 생체내 방법을 제공하는 것이다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 방법은 포유류 대상체의 간 및/또는 종양에 대한 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 생체내 전달에 유용하다. 소정의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 유전자의 발현 및/또는 과발현과 연관되고, 유전자의 발현 또는 과발현은 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)에 의해 감소된다. 소정의 다른 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 치료학적 유효량은 포유류에게 투여될 수 있다 일부 경우에, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)는 LNP로 제형화되고, 입자는 이러한 치료를 요하는 환자에게 투여된다. 다른 경우에, 세포는 환자로부터 제거되고, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)는 (예를 들어, 본원에 기재된 LNP를 사용하여) 시험관내 전달되고, 세포는 환자로 재주사된다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 침묵화하는 비대칭 간섭 RNA(aiRNA) 분자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, LNP) 및 표적 유전자 발현을 침묵화하기 위한 이러한 입자를 사용하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, aiRNA 분자는 약 10개 내지 약 25개의 (염기 페어링된) 뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥 (듀플렉스) 영역을 포함하고, aiRNA 분자는 5' 및 3' 오버행을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고, aiRNA 분자는 표적 유전자 발현을 침묵화할 수 있다.
소정의 경우에, aiRNA 분자는 약 12개 내지 20개, 12개 내지 19개, 12개 내지 18개, 13개 내지 17개, 또는 14개 내지 17개의 (염기 페어링된) 뉴클레오타이드 길이, 더 통상적으로 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 (염기 페어링된) 뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥(듀플렉스) 영역을 포함한다. 소정의 다른 경우에, 안티센스 가닥에서의 5' 및 3' 오버행은 표적 RNA 서열에 상보성인 서열을 포함하고, 선택적으로 비표적화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥에서의 각각의 5' 및 3' 오버행은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, aiRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드, 2'F 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-MOE 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, aiRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함한다. 비제한적인 예로서, 2'OMe 뉴클레오타이드는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 침묵화하는 마이크로RNA(miRNA) 분자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, LNP) 및 표적 유전자 발현을 침묵화하기 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, miRNA 분자는 약 15개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 길이를 포함하고, miRNA 분자는 표적 유전자 발현을 침묵화할 수 있다.
소정의 경우에, miRNA 분자는 약 15개 내지 50개, 15개 내지 40개, 또는 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 더 통상적으로 약 15개 내지 25개 또는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이를 포함하고, 바람직하게는 약 20개 내지 24개, 21개 내지 22개, 또는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이이다. 바람직한 실시형태에서, miRNA 분자는 관심 RNA 서열을 표적화하는 성숙 miRNA 분자이다.
일부 실시형태에서, miRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드, 2'F 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-MOE 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, miRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함한다. 비제한적인 예로서, 2'OMe 뉴클레오타이드는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 하나 이상의 mRNA 분자의 치료학적 전달을 위한 방법에 유용하다. 특히, 본 발명의 하나의 목적은 하나 이상의 표적 단백질의 발현을 통한 포유류(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 영장류, 예컨대 인간, 침팬지 또는 당나귀)에서의 질환 또는 장애의 치료를 위한 시험관내 및 생체내 방법을 제공하는 것이다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 방법은 포유류 대상체에 대한 하나 이상의 mRNA 분자의 생체내 전달에 유용하다. 소정의 다른 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 치료학적 유효량은 포유류에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 mRNA 분자는 LNP로 제형화되고, 입자는 이러한 치료를 요하는 환자에게 투여된다. 다른 경우에, 세포는 환자로부터 제거되고, 하나 이상의 mRNA 분자는 (예를 들어, 본원에 기재된 LNP를 사용하여) 시험관내 전달되고, 세포는 환자로 재주사된다.
다른 실시형태에서, mRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드, 2'F 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-MOE 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 관련 양태에서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 침묵화하는 마이크로RNA(miRNA) 분자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, LNP) 및 표적 유전자 발현을 침묵화하기 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
그러므로, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 혈관외 부위에 접근을 초래하는 약력학적 거동에 필요한 크기로 순환에서 안정하고 표적 세포 집단에 도달할 수 있기 때문에, 이는 대상체(예를 들어, 포유류, 예컨대 인간)에 대한 활성제 또는 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 예컨대 siRNA, aiRNA, 및/또는 miRNA; 또는 mRNA)의 투여에 사용하기에 유리하고 적합하다.
활성제
활성제(예를 들어, 치료제)는 세포, 조직, 장기 또는 대상체에 원하는 효과를 발휘할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 포함한다. 이러한 효과는 예를 들어 생물학적, 생리학적, 및/또는 화장품학적일 수 있다. 활성제는 비제한적인 예로서 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 소분자, 및 이들의 혼합물을 포함하는 분자 또는 화합물의 임의의 유형일 수 있다. 핵산의 비제한적인 예는 간섭 RNA 분자(예를 들어, siRNA, aiRNA, miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, mRNA, 자가-증폭 RNA, 플라스미드, 리보자임, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 예는 제한 없이 항체(예를 들어, 다중클론 항체, 단일클론 항체, 항체 단편; 인간화된 항체, 재조합 항체, 재조합 인간 항체, Primatized™ 항체), 사이토카인, 성장 인자, 아폽토시스 인자, 분화-유도 인자, 세포-표면 수용체 및 이의 리간드, 호르몬, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 소분자의 예는 작은 유기 분자 또는 화합물, 예컨대 당업자에게 공지된 임의의 종래의 제제 또는 약물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 활성제는 치료제, 또는 이의 염 또는 유도체이다. 치료제 유도체는 자체가 치료학적으로 활성일 수 있거나, 이것은 추가의 변형 시 활성이 되는 전구약물일 수 있다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 치료제 유도체는 비변형된 제제와 비교하여 치료학적 활성의 약간 또는 전부를 보유하지만, 다른 실시형태에서, 치료제 유도체는 치료학적 활성이 결여되지만, 추가의 변형 시 활성이 되는 전구약물이다.
핵산
소정의 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자는 핵산과 회합되어 핵산-지질 입자(예를 들어, LNP)를 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 핵산은 지질 입자에서 완전히 캡슐화된다. 본원에 사용된 것과 같이, 용어 "핵산"은, 일반적으로 올리고뉴클레오타이드라 칭하는 60개 이하의 뉴클레오타이드를 함유하는 단편 및 폴리뉴클레오타이드라 칭하는 더 긴 단편으로, 임의의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 약 15개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 길이이다. 핵산은 본 발명의 지질 입자에서 단독으로, 또는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 소분자 예컨대 종래의 약물을 포함하는 본 발명의 지질 입자와 조합되어(예를 들어, 공동투여) 투여될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 자연-발생 염기, 당 및 당간 (골격) 연결로 이루어진 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 단량체의 중합체 또는 올리고머를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 또한 유사하게 작용하는 비-자연 발생 단량체, 또는 이의 부분을 포함하는 중합체 또는 올리고머를 포함한다. 이러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제의 존재 하에 예를 들어 향상된 세포 흡수, 감소된 면역원성 및 증가된 안정성과 같은 특성 때문에 자연적 형태에 비해 대개 바람직하다.
올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 데옥시리보올리고뉴클레오타이드 또는 리보올리고뉴클레오타이드로 분류된다. 데옥시리보올리고뉴클레오타이드는 교대하는, 비분지된 중합체를 형성하도록 이 당의 5' 및 3' 탄소에서 포스페이트에 공유 결합된 데옥시리보스라 불리는 5-탄소 당으로 이루어진다. 리보올리고뉴클레오타이드는 5-탄소 당이 리보스인 유사한 반복 구조로 이루어진다.
본 발명에 따라 지질-핵산 입자에 존재하는 핵산은 공지된 핵산의 임의의 형태를 포함한다. 본원에 사용된 핵산은 단일-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드일 수 있다. 이중-가닥 DNA의 예는 본원에 기재되어 있고, 예를 들어 구조적 유전자, 제어 및 종결 영역을 포함하는 유전자, 및 자가-복제 시스템, 예컨대 바이러스 또는 플라스미드 DNA를 포함한다. 이중-가닥 RNA의 예는 본원에 기재되어 있고, 예를 들어 siRNA 및 다른 RNAi 제제, 예컨대 aiRNA 및 pre-miRNA를 포함한다. 단일-가닥 핵산은 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 성숙 miRNA, 및 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 핵산은 일반적으로 핵산의 특정 형태에 따라 다양한 길이일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 플라스미드 또는 유전자는 약 1,000개 내지 약 100,000개의 뉴클레오타이드 잔기 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이의 범위일 수 있다. 다양한 관련 실시형태에서, 단일-가닥, 이중-가닥 및 삼중-가닥 둘 다인 올리고뉴클레오타이드는 약 10개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 약 15개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 약 20개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 또는 약 20개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 길이의 길이의 범위일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(또는 이의 가닥)는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화하거나 이에 상보성이다. 본원에 사용된 것과 같이 용어 "특이적으로 혼성화 가능한" 및 "상보성"은 DNA 또는 RNA 표적과 올리고뉴클레오타이드 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 상보성 정도를 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드가 특이적으로 혼성화 가능한 이의 표적 핵산 서열에 100% 상보성일 필요가 없다고 이해된다. 바람직한 실시형태에서, 표적 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드의 결합이 이용성의 소실 또는 이로부터의 발현을 야기하도록 표적 서열의 정상 기능을 방해할 때 올리고뉴클레오타이드는 특이적으로 혼성화 가능하고, 특이적 결합이 원해지는 조건 하에, 예를 들어, 생체내 검정 또는 치료학적 치료의 경우에 생리학적 조건 하에, 또는 시험관내 검정의 경우에 검정이 수행되는 조건 하에 비-표적 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드의 비-특이적 결합을 피하도록 충분한 상보성 정도가 있다. 이와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 이것이 표적화하는 또는 이것이 특이적으로 혼성화하는 유전자 또는 mRNA 서열의 영역과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 이것 초과의 염기 치환을 포함할 수 있다.
siRNA
본 발명의 핵산-지질 입자의 siRNA 성분은 관심 표적 유전자의 발현을 침묵화할 수 있다. siRNA 듀플렉스의 각각의 가닥은 통상적으로 약 15개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 소정의 실시형태에서, siRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 siRNA는 일반적으로 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 덜 면역자극성이고, 관심 표적 유전자에 대한 RNAi 활성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 변형된 siRNA는 적어도 하나의 2'OMe 푸린 또는 피리미딘 뉴클레오타이드, 예컨대 2'OMe-구아노신, 2'OMe-우리딘, 2'OMe-아데노신, 및/또는 2'OMe-사이토신 뉴클레오타이드를 함유한다. 바람직한 실시형태에서, 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 변형된다. 변형된 뉴클레오타이드는 siRNA의 하나의 가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스) 또는 가닥 둘 다에 존재할 수 있다. siRNA 서열은 오버행(예를 들어, Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) 또는 Nykδnen et al., Cell, 107:309 (2001)에 기재된 것과 같은 3' 또는 5' 오버행)을 가질 수 있거나, 오버행이 결여될 수 있다(즉, 무딘 말단을 가짐).
변형된 siRNA는 일반적으로 siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역에서의 약 1% 내지 약 100%(예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, siRNA의 이중-가닥 영역에서의 뉴클레오타이드의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 이것 초과는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, siRNA의 이중-가닥 영역에서의 뉴클레오타이드의 약 25% 미만(예를 들어, 약 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만)은 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, siRNA의 이중-가닥 영역에서의 뉴클레오타이드의 약 1% 내지 약 25%(예를 들어, 약 1% 내지 25%, 2% 내지 25%, 3% 내지 25%, 4% 내지 25%, 5% 내지 25%, 6% 내지 25%, 7% 내지 25%, 8% 내지 25%, 9% 내지 25%, 10% 내지 25%, 11% 내지 25%, 12% 내지 25%, 13% 내지 25%, 14% 내지 25%, 15% 내지 25%, 16% 내지 25%, 17% 내지 25%, 18% 내지 25%, 19% 내지 25%, 20% 내지 25%, 21% 내지 25%, 22% 내지 25%, 23% 내지 25%, 24% 내지 25% 등) 또는 약 1% 내지 약 20%(예를 들어, 약 1% 내지 20%, 2% 내지 20%, 3% 내지 20%, 4% 내지 20%, 5% 내지 20%, 6% 내지 20%, 7% 내지 20%, 8% 내지 20%, 9% 내지 20%, 10% 내지 20%, 11% 내지 20%, 12% 내지 20%, 13% 내지 20%, 14% 내지 20%, 15% 내지 20%, 16% 내지 20%, 17% 내지 20%, 18% 내지 20%, 19% 내지 20%, 1% 내지 19%, 2% 내지 19%, 3% 내지 19%, 4% 내지 19%, 5% 내지 19%, 6% 내지 19%, 7% 내지 19%, 8% 내지 19%, 9% 내지 19%, 10% 내지 19%, 11% 내지 19%, 12% 내지 19%, 13% 내지 19%, 14% 내지 19%, 15% 내지 19%, 16% 내지 19%, 17% 내지 19%, 18% 내지 19%, 1% 내지 18%, 2% 내지 18%, 3% 내지 18%, 4% 내지 18%, 5% 내지 18%, 6% 내지 18%, 7% 내지 18%, 8% 내지 18%, 9% 내지 18%, 10% 내지 18%, 11% 내지 18%, 12% 내지 18%, 13% 내지 18%, 14% 내지 18%, 15% 내지 18%, 16% 내지 18%, 17% 내지 18%, 1% 내지 17%, 2% 내지 17%, 3% 내지 17%, 4% 내지 17%, 5% 내지 17%, 6% 내지 17%, 7% 내지 17%, 8% 내지 17%, 9% 내지 17%, 10% 내지 17%, 11% 내지 17%, 12% 내지 17%, 13% 내지 17%, 14% 내지 17%, 15% 내지 17%, 16% 내지 17%, 1% 내지 16%, 2% 내지 16%, 3% 내지 16%, 4% 내지 16%, 5% 내지 16%, 6% 내지 16%, 7% 내지 16%, 8% 내지 16%, 9% 내지 16%, 10% 내지 16%, 11% 내지 16%, 12% 내지 16%, 13% 내지 16%, 14% 내지 16%, 15% 내지 16%, 1% 내지 15%, 2% 내지 15%, 3% 내지 15%, 4% 내지 15%, 5% 내지 15%, 6% 내지 15%, 7% 내지 15%, 8% 내지 15%, 9% 내지 15%, 10% 내지 15%, 11% 내지 15%, 12% 내지 15%, 13% 내지 15%, 14% 내지 15% 등)는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 예를 들어, siRNA의 하나 또는 둘 다의 가닥이 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드에서 선택적으로 변형될 때, 생성된 변형된 siRNA는 약 30% 미만의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 변형된 뉴클레오타이드) 또는 약 1% 내지 약 30%의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 1% 내지 30%, 2% 내지 30%, 3% 내지 30%, 4% 내지 30%, 5% 내지 30%, 6% 내지 30%, 7% 내지 30%, 8% 내지 30%, 9% 내지 30%, 10% 내지 30%, 11% 내지 30%, 12% 내지 30%, 13% 내지 30%, 14% 내지 30%, 15% 내지 30%, 16% 내지 30%, 17% 내지 30%, 18% 내지 30%, 19% 내지 30%, 20% 내지 30%, 21% 내지 30%, 22% 내지 30%, 23% 내지 30%, 24% 내지 30%, 25% 내지 30%, 26% 내지 30%, 27% 내지 30%, 28% 내지 30%, 또는 29% 내지 30% 변형된 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
siRNA 서열의 선택
적합한 siRNA 서열은 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 확인될 수 있다. 통상적으로, Elbashir et al., Nature, 411:494-498 (2001) 및 Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001)에 기재된 방법은 Reynolds et al., Nature Biotech., 22(3):326-330 (2004)에 제시된 합리적인 설계 규착과 조합된다.
일반적으로, 관심 표적 유전자로부터의 수송체의 AUG 시작 코돈의 뉴클레오타이드 서열 3'는 디뉴클레오타이드 서열에 대해 스캐닝된다(예를 들어, AA, NA, CC, GG 또는 UU, 여기서 N=C, G 또는 U임)(예를 들어, Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001) 참조). 디뉴클레오타이드 서열의 바로 3'의 뉴클레오타이드는 잠재적인 siRNA 서열(예를 들어, 표적 서열 또는 센스 가닥 서열)로서 확인된다. 통상적으로, 디뉴클레오타이드 서열의 바로 3'의 19개, 21개, 23개, 25개, 27개, 29개, 31개, 33개, 35개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드는 잠재적인 siRNA 서열로서 확인된다. 일부 실시형태에서, 디뉴클레오타이드 서열은 AA 또는 NA 서열이고, AA 또는 NA 디뉴클레오타이드의 바로 3'의 19개의 뉴클레오타이드는 잠재적인 siRNA 서열로서 확인된다. siRNA 서열은 보통 표적 유전자의 길이를 따라 상이한 위치에서 이격된다. siRNA 서열의 침묵화 효율을 추가로 향상시키기 위해, 잠재적인 siRNA 서열은 예를 들어 표적 세포 또는 유기체에서 다른 암호화 서열과 상동성의 영역을 함유하지 않는 부위를 확인하도록 분석될 수 있다. 예를 들어, 약 21개의 염기 쌍의 적합한 siRNA 서열은 통상적으로 표적 세포 또는 유기체에서 암호화 서열에 상동성의 16개 내지 17개 초과의 인접한 염기 쌍을 갖지 않을 것이다. siRNA 서열이 RNA Pol III 프로모터로부터 발현되면, 4개 초과의 인접한 A 또는 T가 결여된 siRNA 서열이 선택된다.
잠재적인 siRNA 서열이 확인되면, 상보성 서열(예를 들어, 안티센스 가닥 서열)이 설계될 수 있다. 잠재적인 siRNA 서열은 또한 당해 분야에 공지된 다양한 기준을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 이의 침묵화 효율을 향상시키기 위해, siRNA 서열은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 서열을 확인하도록 합리적인 설계 알고리즘에 의해 분석될 수 있다: (1) 약 25% 내지 약 60% G/C의 G/C 함량; (2) 센스 가닥의 15번 내지 19번 위치에서의 적어도 3개의 A/U; (3) 내부 반복부 무; (4) 센스 가닥의 19번 위치에서의 A; (5) 센스 가닥의 3번 위치에서의 A; (6) 센스 가닥의 10번 위치에서의 U; (7) 센스 가닥의 19번 위치에서의 G/C 무; 및 (8) 센스 가닥의 13번 위치에서의 G 무. 각각의 이들 특징의 적합한 값을 배정하고 siRNA의 선택에 유용한 알고리즘을 도입하는 siRNA 설계 도구는 예를 들어 http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNA에서 발견될 수 있다. 당업자는 상기 특징 중 하나 이상을 갖는 서열이 잠재적인 siRNA 서열로서 추가의 분석 및 시험을 위해 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
추가적으로, 하기 기준 중 하나 이상을 갖는 잠재적인 siRNA 서열은 대개 siRNA로서 제거될 수 있다: (1) 행에서 동일한 염기의 4개 이상의 스트레치를 포함하는 서열; (2) G의 동종중합체를 포함하는 서열(예를 들어, 이들 중합체의 구조 특성으로 인해 가능한 비특이적 효과를 감소시키기 위해; (3) 삼중 염기 모티프(예를 들어, GGG, CCC, AAA 또는 TTT)를 포함하는 서열; (4) 행에서 7개 이상의 G/C의 스트레치를 포함하는 서열; 및 (5) 내부 폴드-백(fold-back) 구조를 생성시키는 후보 내에 4개 이상의 염기의 직접 반복부를 포함하는 서열. 그러나, 당업자는 상기 특징 중 하나 이상을 갖는 서열이 잠재적인 siRNA 서열로서 추가의 분석 및 시험을 위해 여전히 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 잠재적인 siRNA 서열은 예를 들어 Khvorova et al., Cell, 115:209-216 (2003); 및 Schwarz et al., Cell, 115:199-208 (2003)에 기재된 것과 같은 siRNA 듀플렉스 비대칭에 기초하여 추가로 분석될 수 있다. 다른 실시형태에서, 잠재적인 siRNA 서열은 예를 들어 Luo et al., Biophys. Res. Commun., 318:303-310 (2004)에 기재된 것과 같은 표적 부위에서 2차 구조에 기초하여 추가로 분석될 수 있다. 예를 들어, 염기-페어링 및 줄기-루프의 형태의 더 적은 2차 구조가 존재하는 표적 부위에서 접근가능성을 선호하는 siRNA 서열을 선택하도록 Mfold 알고리즘(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi에서 입수 가능)을 사용하여 표적 부위에서의 2차 구조가 모델링될 수 있다.
잠재적인 siRNA 서열이 확인되면, 서열은 예를 들어 시험관내 사이토카인 검정 또는 생체내 동물 모델을 사용하여 임의의 면역자극성 특성의 존재에 대해 분석될 수 있다. GU-농후 모티프(예를 들어, 5'-GU-3',5'-UGU-3',5'-GUGU-3',5'-UGUGU-3' 등)와 같은 siRNA 서열의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서의 모티프는 서열이 면역자극성인지의 표시를 또한 제공할 수 있다. siRNA 분자가 면역자극성인 것으로 발견되면, 이것은 이후 본원에 기재된 것과 같은 이의 면역자극성 특성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 비제한적인 예로서, siRNA가 면역자극성 또는 비-면역자극성 siRNA인지를 결정하기 위해 세포가 검출 가능한 면역 반응을 생성하게 하는 조건 하에 siRNA 서열은 포유류 반응자 세포와 접촉할 수 있다. 포유류 반응자 세포는 미경험 포유류(즉, siRNA 서열의 유전자 산물과 이전에 접촉하지 않은 포유류) 유래일 수 있다. 포유류 반응자 세포는 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 대식세포, 및 기타일 수 있다. 검출 가능한 면역 반응은 예를 들어 TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-6, IL-12와 같은 사이토카인 또는 성장 인자, 또는 이들의 조합의 생성을 포함할 수 있다. 이후, 면역자극성인 것으로 확인된 siRNA 분자는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 변형된 뉴클레오타이드로 대체함으로써 이의 면역자극성 특성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역에서의 약 30% 미만(예를 들어, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만)의 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 2'OMe 뉴클레오타이드로 대체될 수 있다. 이후, 변형된 siRNA는 이의 면역자극성 특성이 감소되거나 무효화된다는 것을 확인시켜 주도록 상기 기재된 것과 같은 포유류 반응자 세포와 접촉할 수 있다.
면역 반응을 검출하기 위한 적합한 시험관내 검정은 David 등(미국 특허 제4,376,110호)의 이중 단일클론 항체 샌드위치 면역검정 기법; 단일클론-다중클론 항체 샌드위치 검정(Wide et al., in Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970)); Gordon 등(미국 특허 제4,452,901호)의 "웨스턴 블롯" 방법; 표지된 리간드의 면역침전(Brown et al., J. Biol. Chem., 255:4980-4983 (1980)); 예를 들어 Raines et al., J. Biol. Chem., 257:5154-5160 (1982)에 의해 기재된 것과 같은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA); 형광색소의 사용을 포함하는 면역세포화학 기법(Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39:477 (1980)); 및 활성의 중화(Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2396-2400 (1984))를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 기재된 면역검정 이외에, 미국 특허 제3,817,827호; 제3,850,752호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 및 제4,098,876호에 기재된 것을 포함하는 다수의 다른 면역검정이 이용 가능하다. 이들 참고문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
면역 반응을 검출하기 위한 생체내 모델의 비제한적인 예는 예를 들어 Judge et al., Mol. Ther., 13:494-505 (2006)에 기재된 것과 같은 생체내 마우스 사이토카인 유도 검정을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 검정은 하기와 같이 수행될 수 있다: (1) siRNA는 측면 꼬리 정맥에서 표준 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있고; (2) 혈액은 투여 후 약 6시간에 심장 천자에 의해 수집되고 사이토카인 분석을 위해 혈장에 대해 가공될 수 있고; (3) 사이토카인은 제조사의 지시에 따라 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 정량화될 수 있다(예를 들어, 마우스 및 인간 IFN-α(PBL Biomedical; 뉴저지주 피스카타웨이); 인간 IL-6 및 TNF-α(eBioscience; 캘리포니아주 샌 디에고); 및 마우스 IL-6, TNF-α 및 IFN-γ(BD Biosciences; 캘리포니아주 샌 디에고)).
사이토카인 및 성장 인자에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 다수의 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하고, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) 및 Harlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1999) 참조). 단일클론 항체의 생성은 이전에 기재되어 있고, 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다(Buhring et al., in Hybridoma, Vol. 10, No. 1, pp. 77-78 (1991)). 일부 방법에서, 단일클론 항체는 검출을 촉진하기 위해 (예를 들어, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출 가능한 임의의 조성물에 의해) 표지된다.
siRNA 분자의 생성
siRNA는 예를 들어 하나 이상의 단리된 소형-간섭 RNA(siRNA) 듀플렉스로서, 더 긴 이중-가닥 RNA(dsRNA)로서, 또는 DNA 플라스미드에서 전사 카세트로부터 전사된 siRNA 또는 dsRNA로서를 포함하여 몇몇 형태로 제공될 수 있다. siRNA 서열은 오버행(예를 들어, Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) 또는
Figure pct00007
et al., Cell, 107:309 (2001)에 기재된 것과 같은 3' 또는 5' 오버행)을 가질 수 있거나, 오버행이 결여될 수 있다(즉, 무딘 말단을 갖기 위해).
RNA 집단은 긴 전구체 RNA를 제공하도록 사용될 수 있거나, 선택된 표적 서열에 실질적인 또는 완전한 동일성을 갖는 긴 전구체 RNA는 siRNA를 제조하도록 사용될 수 있다. RNA는 당업자에게 잘 공지된 방법에 따라 세포 또는 조직으로부터 단리되고/되거나, 합성되고/되거나, 클로닝될 수 있다. RNA는 혼합된 집단(세포 또는 조직으로부터 수득되거나, cDNA로부터 전사되거나, 공제되거나, 선택되는 등)일 수 있거나, 단일 표적 서열을 나타낼 수 있다. RNA는 자연 발생(예를 들어, 조직 또는 세포 샘플로부터 단리됨)이거나, (예를 들어, T7 또는 SP6 중합효소 및 PCR 산물 또는 클로닝된 cDNA를 사용하여) 시험관내 합성되거나, 화학적으로 합성될 수 있다.
dsRNA를 형성하기 위해, 합성 RNA를 위해, 보체는 또한 dsRNA를 형성하도록 시험관내 전사되고 혼성화된다. 자연 발생 RNA 집단이 사용되면, RNA 보체는 예를 들어 RNA 집단에 상응하는 cDNA를 전사함으로써, 또는 RNA 중합효소를 사용함으로써 (예를 들어, 이. 콜라이 RNAse III 또는 다이서에 의한 분해에 대해 dsRNA를 형성하기 위해) 또한 제공된다. 이후, 전구체 RNA는 분해를 위해 이중 가닥 RNA를 형성하도록 혼성화된다. dsRNA는 대상체에게 직접 투여될 수 있거나, 투여 전에 시험관내 분해될 수 있다.
RNA를 단리하고, RNA를 합성하고, 핵산을 혼성화하고, cDNA 라이브러리를 제조하고 스크리닝하고, PCR을 수행하기 위한 방법은 PCR 방법(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990) 참조)처럼 당해 분야에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); 상기 Sambrook 외 문헌; 상기 Ausubel 외 문헌 참조). 발현 라이브러리는 또한 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 용도의 일반 방법을 개시하는 추가적인 기본 텍스트는 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)를 포함한다. 이들 참고문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
바람직하게는, siRNA는 화학적으로 합성된다. 본 발명의 siRNA 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지된 임의의 다양한 기법, 예컨대 Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); 및 Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997)에 기재된 것을 사용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 합성은 흔한 핵산 보호 및 커플링 기, 예컨대 5'-말단에서 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서 포스포르아미다이트를 사용한다. 비제한적인 예로서, 소규모 합성은 0.2 μmol 규모 프로토콜을 사용하여 Applied Biosystems 합성장치에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 0.2 μmol 규모에서의 합성은 Protogene(캘리포니아주 팔로 알토)로부터의 96웰 플레이트 합성장치에서 수행될 수 있다. 그러나, 더 크거나 더 작은 합성 규모는 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성에 적합한 시약, RNA 탈보호를 위한 방법 및 RNA 정제를 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
siRNA 분자는 또한 탠덤 합성 기법을 통해 합성될 수 있고, 여기서 가닥 둘 다는 절단 가능한 링커에 의해 분리된 단일 연속 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 가닥으로서 합성되고, 이 절단 가능한 링커는 siRNA 듀플렉스를 형성하도록 혼성화하는 별개의 단편 또는 가닥을 제공하도록 후속하여 절단된다. 링커는 폴리뉴클레오타이드 링커 또는 비-뉴클레오타이드 링커일 수 있다. siRNA의 탠덤 합성은 다중웰/다중플레이트 합성 플랫폼뿐만 아니라 뱃치 반응기, 합성 컬럼, 및 기타를 사용하는 대규모 합성 플랫폼 둘 다에 용이하게 적응될 수 있다. 대안적으로, siRNA 분자는 2개의 구별되는 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있고, 여기서 하나의 올리고뉴클레오타이드는 siRNA의 센스 가닥을 포함하고, 다른 것은 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들어, 각각의 가닥은 별도로 합성되고 합성 및/또는 탈보호 후 혼성화 또는 결찰에 의해 함께 연결될 수 있다. 소정의 다른 경우에, siRNA 분자는 단일 연속 올리고뉴클레오타이드 단편으로서 합성될 수 있고, 여기서 자가-상보성 센스 영역 및 안티센스 영역은 헤어핀 2차 구조를 갖는 siRNA 듀플렉스를 형성하도록 혼성화한다.
siRNA 서열의 변형
소정의 양태에서, siRNA 분자는 이중-가닥 영역에서 2개의 가닥 및 적어도 1개의 변형된 뉴클레오타이드를 갖는 듀플렉스를 포함하고, 각각의 가닥은 약 15개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 길이이다. 유리하게는, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 덜 면역자극성이지만, 표적 서열의 발현을 침묵화하는 능력을 보유한다. 바람직한 실시형태에서, siRNA 분자로 도입된 화학 변형의 정도는 siRNA의 면역자극성 특성의 감소 또는 무효화와 RNAi 활성의 보유 사이의 균형을 맞춘다. 비제한적인 예로서, 관심 유전자를 표적화하는 siRNA 분자는 표적 유전자 발현을 침묵화하는 이의 능력을 보유하면서 siRNA에 의해 생성된 면역 반응을 제거하기 위해 siRNA 듀플렉스 내에 선택적 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드에서 최로소 변형(예를 들어, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만 변형)될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 변형된 뉴클레오타이드의 예는 2'-O-메틸(2'OMe), 2'-데옥시-2'-플루오로(2'F), 2'-데옥시, 5-C-메틸, 2'-O-(2-메톡시에틸)(MOE), 4'-티오, 2'-아미노 또는 2'-C-알릴 기를 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어 Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984)에 기재된 것과 같은 노던(Northern) 구성을 갖는 변형된 뉴클레오타이드는 siRNA 분자에 사용하기에 또한 적합하다. 이러한 변형된 뉴클레오타이드는 제한 없이 잠금 핵산(LNA) 뉴클레오타이드(예를 들어, 2'-O, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오타이드), 2'-O-(2-메톡시에틸)(MOE) 뉴클레오타이드, 2'-메틸-티오-에틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'F) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-클로로(2'Cl) 뉴클레오타이드 및 2'-아지도 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 경우에, 본원에 기재된 siRNA 분자는 하나 이상의 G-클램프 뉴클레오타이드를 포함한다. G-클램프 뉴클레오타이드는 변형된 사이토신 유사체를 지칭하고, 변형은 듀플렉스 내에 상보성 구아닌 뉴클레오타이드의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 및 후그스틴(Hoogsteen) 면 둘 다를 수소 결합시키는 능력을 부여한다(예를 들어, Lin et al., J. Am. Chem. Soc., 120:8531-8532 (1998) 참조). 게다가, 예를 들어 C-페닐, C-나프틸, 다른 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카복사미드 및 니트로아졸 유도체, 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌 및 6-니트로인돌과 같은 뉴클레오타이드 염기 유사체(예를 들어, Loakes, Nucl. Acids Res., 29:2437-2447 (2001) 참조)를 갖는 뉴클레오타이드는 siRNA 분자로 혼입될 수 있다.
소정의 실시형태에서, siRNA 분자는 하나 이상의 화학 변형, 예컨대 말단 캡 모이어티, 포스페이트 골격 변형, 및 기타를 추가로 포함할 수 있다. 말단 캡 모이어티의 예는 제한 없이 인버티드 데옥시 비염기성 잔기, 글리세릴 변형, 4',5'-메틸렌 뉴클레오타이드, 1-(β-D-에리쓰로푸라노실) 뉴클레오타이드, 4'-티오 뉴클레오타이드, 카보사이클릭 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오타이드, L-뉴클레오타이드, α-뉴클레오타이드, 변형된 염기 뉴클레오타이드, 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오타이드, 비사이클릭 3',4'-세코 뉴클레오타이드, 비사이클릭 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오타이드, 비사이클릭 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오타이드, 3'-3'-인버티드 뉴클레오타이드 모이어티, 3'-3'-인버티드 비염기성 모이어티, 3'-2'-인버티드 뉴클레오타이드 모이어티, 3'-2'-인버티드 비염기성 모이어티, 5'-5'-인버티드 뉴클레오타이드 모이어티, 5'-5'-인버티드 비염기성 모이어티, 3'-5'-인버티드 데옥시 비염기성 모이어티, 5'-아미노-알킬 포스페이트, 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트, 6-아미노헥실 포스페이트, 1,2-아미노도데실 포스페이트, 하이드록시프로필 포스페이트, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'-포스포르아미데이트, 5'-포스포르아미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'-포스페이트, 5'-아미노, 3'-포스포로티오에이트, 5'-포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및 브리징 또는 비-브리징 메틸포스포네이트 또는 5'-머캅토 모이어티(예를 들어, 미국 특허 제5,998,203호; Beaucage et al., Tetrahedron 49:1925 (1993))를 포함한다. 포스페이트 골격 변형(예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 생성시킴)의 비제한적인 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 모르폴리노, 아미데이트, 카바메이트, 카복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 설포네이트, 설폰아미드, 설파메이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈 및 알킬실릴 치환을 포함한다(예를 들어, Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995)에서 Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties; Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)에서 Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides 참조). 이러한 화학 변형은 siRNA의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 가닥 둘 다의 5'-말단 및/또는 3'-말단에서 발생할 수 있다. 이들 참고문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, siRNA 분자의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 약 1개 내지 약 4개(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 2'-데옥시 리보뉴클레오타이드 및/또는 변형된 및 비변형된 뉴클레오타이드의 임의의 조합을 갖는 3'-말단 오버행을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드 및 siRNA 분자로 도입될 수 있는 화학 변형의 유형의 추가 예는 예를 들어 영국 특허 GB 제2,397,818 B호 및 미국 특허 공보 제20040192626호, 제20050282188호 및 제20070135372호에 기재되어 있고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 siRNA 분자는 siRNA의 하나의 가닥 또는 가닥 둘 다에서 하나 이상의 비-뉴클레오타이드를 선택적으로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것과 같이, 용어 "비-뉴클레오타이드"는 당 및/또는 포스페이트 치환을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위 대신에 핵산 사슬로 혼입될 수 있고, 남은 염기가 이의 활성을 나타내게 하는 임의의 기 또는 화합물을 지칭한다. 기 또는 화합물은 흔히 인정된 뉴클레오타이드 염기, 예컨대 아데노신, 구아닌, 사이토신, 우라실 또는 티민을 함유하지 않고 따라서 1'-위치에서 염기가 결여된다는 점에서 비염기성이다.
다른 실시형태에서, siRNA의 화학 변형은 접합체를 siRNA 분자에 부착시키는 것을 포함한다. 접합체는 예를 들어 생분해성 링커와 같은 공유 부착을 통해 siRNA의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3'-말단에서 부착될 수 있다. 접합체는 또한 예를 들어 카바메이트 기 또는 다른 연결 기를 통해 siRNA에 부착될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공보 제20050074771호, 제20050043219호 및 제20050158727호 참조). 소정의 경우에, 접합체는 세포로의 siRNA의 전달을 촉진하는 분자이다. siRNA에 부착하기에 적합한 접합체 분자의 에는 제한 없이 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤, 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민(HSA), 지방 산, 카로테노이드, 테프펜, 담즙산, 엽산염(예를 들어, 엽산, 엽산염 유사체 및 이의 유도체), 당(예를 들어, 갈락토스, 갈락토사민, N-아세틸 갈락토사민, 글루코스, 만노스, 프럭토스, 푸코스 등), 인지질, 펩타이드, 세포 흡수를 매개할 수 있는 세포 수용체를 위한 리간드, 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 공보 제20030130186호, 제20040110296호 및 제20040249178호; 미국 특허 제6,753,423호 참조). 다른 예는 미국 특허 공보 제20050119470호 및 제20050107325호에 기재된 친유성 모이어티, 비타민, 중합체, 펩타이드, 단백질, 핵산, 소분자, 올리고사카라이드, 탄수화물 클러스터, 인터칼레이터, 소홈 결합제, 절단제 및 가교결합제 접합체 분자를 포함한다. 또 다른 예는 미국 특허 공보 제20050153337호에 기재된 2'-O-알킬 아민, 2'-β-알콕시알킬 아민, 폴리아민, C5-양이온성 변형된 피리미딘, 양이온성 펩타이드, 구아니디늄 기, 아미디니늄 기, 양이온성 아미노산 접합체 분자를 포함한다. 추가 예는 미국 특허 공보 제20040167090호에 기재된 소수성 기, 막 활성 화합물, 세포 침투 화합물, 세포 표적화 신호, 상호작용 변형제 및 입체 안정화제 접합체 분자를 포함한다. 추가의 예는 미국 특허 공보 제20050239739호에 기재된 접합체 분자를 포함한다. 사용된 접합체의 유형 및 siRNA 분자에 대한 접합의 정도는 RNAi 활성을 유지하면서 siRNA의 개선된 약동학적 프로파일, 생체이용률, 및/또는 안정성에 대해 평가될 수 있다. 그러므로, 당업자는 임의의 다양한 잘 공지된 시험관내 세포 배양 또는 생체내 동물 모델을 사용하여 개선된 특성 및 완전한 RNAi 활성을 갖는 것을 확인하기 위해 이것에 부착된 다양한 접합체를 갖는 siRNA 분자를 스크리닝할 수 있다. 상기 기재된 특허 문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
표적 유전자
소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 핵산-지질 입자의 핵산 성분(예를 들어, siRNA)은 관심 유전자의 번역(즉, 발현)을 하향조절하거나 침묵화하기 하기 사용될 수 있다. 관심 유전자는 바이러스 감염 및 생존과 연관된 유전자, 대사 질환 및 장애(예를 들어, 간 질환 및 장애)와 연관된 유전자, 종양형성 및 세포 형질전환(예를 들어, 암)과 연관된 유전자, 혈관형성 유전자, 면역조절제 유전자, 예컨대 염증성 반응 및 자가면역 반응과 연관된 것, 리간드 수용체 유전자 및 신경퇴행성 장애와 연관된 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, 관심 유전자는 간세포에서 발현된다.
바이러스 감염 및 생존과 연관된 유전자는 세포에서 결합하고 들어가고 복제하기 위해 바이러스에 의해 발현된 것을 포함한다. 만성 바이러스 질환과 연관된 바이러스 서열은 특히 관심있다. 특히 관심 있는 바이러스 서열은 필로바이러스(Filovirus), 예컨대 에볼라 바이러스(Ebola virus) 및 마르부르크 바이러스(Marburg virus)(예를 들어, Geisbert et al., J. Infect. Dis., 193:1650-1657 (2006) 참조); 아레나바이러스(Arenavirus), 예컨대 라싸 바이러스(Lassa virus), 주닌 바이러스(Junin virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 구아나리토 바이러스(Guanarito virus) 및 사비아 바이러스(Sabia virus)(Buchmeier et al., Arenaviridae: the viruses and their replication, In: FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (2001)); 인플루엔자 바이러스, 예컨대 인플루엔자 A, B 및 C 바이러스(예를 들어, Steinhauer et al., Annu Rev Genet., 36:305-332 (2002); 및 Neumann et al., J Gen Virol., 83:2635-2662 (2002) 참조); 간염 바이러스(예를 들어, Hamasaki et al., FEBS Lett., 543:51 (2003); Yokota et al., EMBO Rep., 4:602 (2003); Schlomai et al., Hepatology, 37:764 (2003); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2783 (2003); Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2014 (2003); 및 FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (2001) 참조); 인간 면역결핍 바이러스(HIV)(Banerjea et al., Mol. Ther., 8:62 (2003); Song et al., J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA, 289:1494 (2003); Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:183 (2003)); Herpes viruses (Jia et al., J. Virol., 77:3301 (2003)); 및 Human Papilloma Viruses (HPV) (Hall et al., J. Virol., 77:6066 (2003); Jiang et al., Oncogene, 21:6041 (2002))의 서열을 포함한다.
침묵화될 수 있는 예시적인 필로바이러스 핵산 서열은 구조적 단백질을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, VP30, VP35, 핵단백질(NP), 중합효소 단백질(L-pol)) 및 막-연관 단백질(예를 들어, VP40, 당단백질(GP), VP24)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 에볼라 바이러스에 대한 완전한 게놈 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 NC―002549; AY769362; NC―006432; NC―004161; AY729654; AY354458; AY142960; AB050936; AF522874; AF499101; AF272001; 및 AF086833에 기재되어 있다. 에볼라 바이러스 VP24 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 U77385 및 AY058897에 기재되어 있다. 에볼라 바이러스 L-pol 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 X67110에 기재되어 있다. 에볼라 바이러스 VP40 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 AY058896에 기재되어 있다. 에볼라 바이러스 NP 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 AY058895에 기재되어 있다. 에볼라 바이러스 GP 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 AY058898; Sanchez et al., Virus Res., 29:215-240 (1993); Will et al., J. Virol., 67:1203-1210 (1993); Volchkov et al., FEBS Lett., 305:181-184 (1992); 및 미국 특허 제6,713,069호에 기재되어 있다. 추가적인 에볼라 바이러스 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 L11365 및 X61274에 기재되어 있다. 마르부르크 바이러스에 대한 완전한 게놈 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 NC―001608; AY430365; AY430366; 및 AY358025에 기재되어 있다. 마르부르크 바이러스 GP 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 AF005734; AF005733; 및 AF005732에 기재되어 있다. 마르부르크 바이러스 VP35 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 AF005731 및 AF005730에 기재되어 있다. 추가적인 마르부르크 바이러스 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 X64406; Z29337; AF005735; 및 Z12132에 기재되어 있다. 에볼라 바이러스 및 마르부르크 바이러스 핵산 서열을 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 미국 특허 공보 제20070135370호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
침묵화될 수 있는 예시적인 인플루엔자 바이러스 핵산 서열은 핵단백질(NP), 기질 단백질(M1 및 M2), 비구조적 단백질(NS1 및 NS2), RNA 중합효소(PA, PB1, PB2), 뉴라미니다제(NA) 및 헤마글루티닌(HA)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 인플루엔자 A NP 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 NC-004522; AY818138; AB166863; AB188817; AB189046; AB189054; AB189062; AY646169; AY646177; AY651486; AY651493; AY651494; AY651495; AY651496; AY651497; AY651498; AY651499; AY651500; AY651501; AY651502; AY651503; AY651504; AY651505; AY651506; AY651507; AY651509; AY651528; AY770996; AY790308; AY818138; 및 AY818140에 기재되어 있다. 인플루엔자 A PA 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 AY818132; AY790280; AY646171; AY818132; AY818133; AY646179; AY818134; AY551934; AY651613; AY651610; AY651620; AY651617; AY651600; AY651611; AY651606; AY651618; AY651608; AY651607; AY651605; AY651609; AY651615; AY651616; AY651640; AY651614; AY651612; AY651621; AY651619; AY770995; 및 AY724786에 기재되어 있다. 인플루엔자 바이러스 핵산 서열을 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 미국 특허 공보 제20070218122호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
침묵화될 수 있는 예시적인 간염 바이러스 핵산 서열은 전사 및 번역에 관여된 핵산 서열(예를 들어, En1, En2, X, P) 및 구조적 단백질(예를 들어, C 및 C-관련 단백질을 포함하는 코어 단백질, S, M 및/또는 L 단백질을 포함하는 캡시드 및 외피 단백질, 또는 이의 단편)을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, 상기 FIELDS VIROLOGY 참조)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 침묵화될 수 있는 예시적인 C형 간염 바이러스(HCV) 핵산 서열은 5'-비번역된 영역(5'-UTR), 3'-비번역된 영역(3'-UTR), 다단백질 번역 개시 코돈 영역, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열, 및/또는 코어 단백질, E1 단백질, E2 단백질, p7 단백질, NS2 단백질, NS3 프로테아제/헬리카제, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질, 및/또는 NS5B RNA-의존적 RNA 중합효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. HCV 게놈 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 NC―004102(HCV 유전자형 1a), AJ238799(HCV 유전자형 1b), NC―009823(HCV 유전자형 2), NC―009824(HCV 유전자형 3), NC―009825(HCV 유전자형 4), NC―009826(HCV 유전자형 5) 및 NC―009827(HCV 유전자형 6)에 기재되어 있다. A형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들어 Genback 수탁 번호 NC-001489에 기재되어 있고; B형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들어 Genback 수탁 번호 NC-003977에 기재되어 있고; D형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들어 Genback 수탁 번호 NC-001653에 기재되어 있고; E형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들어 Genback 수탁 번호 NC-001434에 기재되어 있고; G형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들어 Genback 수탁 번호 NC-001710에 기재되어 있다. 바이러스 감염 및 생존과 연관된 유전자를 암호화하는 서열의 침묵화는 바이러스 병태를 치료하기 위해 사용된 종래의 제제의 투여와 조합되어 편리하게 사용될 수 있다. 간염 바이러스 핵산 서열을 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 미국 특허 공보 제20060281175호, 제20050058982호 및 제20070149470호; 미국 특허 제7,348,314호; 및 2009년 3월 20일에 출원된 미국 가출원 제61/162,127호(이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨)에 기재된 것을 포함한다.
대사 질환 및 장애(예를 들어, 간이 표적인 장애 및 간 질환 및 장애)와 연관된 유전자는 예를 들어 이상지질혈증(예를 들어, 간 X 수용체, 예컨대 LXRα 및 LXRβ(Genback 수탁 번호 NM―007121), 파르네소이드 X 수용체(FXR)(Genback 수탁 번호 NM―005123), 스테롤-조절 요소 결합 단백질(SREBP), 부위-1 프로테아제(SIP), 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소-A 환원효소(HMG 조효소-A 환원효소), 아포지단백 B(ApoB)(Genback 수탁 번호 NM―000384), 아포지단백 CIII(ApoC3)(Genbank 수탁 번호 NM―000040 및 NG―008949 영역: 5001.8164) 및 아포지단백 E(ApoE)(Genbank 수탁 번호 NM―000041 및 NG―007084 영역: 5001.8612)); 및 당뇨병(예를 들어, 글루코스 6-포스파타제)에서 발현된 유전자(예를 들어, Forman et al., Cell, 81:687 (1995); Seol et al., Mol. Endocrinol., 9:72 (1995), Zavacki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:7909 (1997); Sakai et al., Cell, 85:1037-1046 (1996); Duncan et al., J. Biol. Chem., 272:12778-12785 (1997); Willy et al., Genes Dev., 9:1033-1045 (1995); Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272:3137-3140 (1997); Janowski et al., Nature, 383:728-731 (1996); 및 Peet et al., Cell, 93:693-704 (1998) 참조)을 포함한다. 당업자는 대사 질환 및 장애(예를 들어, 간이 표적인 질환 및 장애 및 간 질환 및 장애)와 연관된 유전자가 간 자체에서 발현된 유전자뿐만 아니라 다른 장기 및 조직에서 발현된 유전자를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 대사 질환 및 장애와 연관된 유전자를 암호화하는 서열의 침묵화는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용된 종래의 제제의 투여와 조합되어 편리하게 사용될 수 있다. ApoB 유전자를 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 미국 특허 공보 제20060134189호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. ApoC3 유전자를 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 2009년 1월 26일에 출원된 미국 가출원 제61/147,235호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
종양형성 및 세포 형질전환(예를 들어, 암 또는 다른 신생물)과 연관된 유전자 서열의 예는 유사분열 키네신, 예컨대 Eg5(KSP, KIF11; Genback 수탁 번호 NM-004523); 세린/트레오닌 키나제, 예컨대 폴로-유사 키나제 1(PLK-1)(Genback 수탁 번호 NM-005030; Barr et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 5:429-440 (2004)); 티로신 키나제, 예컨대 WEE1(Genbank 수탁 번호 NM-003390 및 NM-001143976); 아폽토시스의 억제제, 예컨대 XIAP(Genback 수탁 번호 NM-001167); COP9 시그날로솜 아단위, 예컨대 CSN1, CSN2, CSN3, CSN4, CSN5(JAB1; Genback 수탁 번호 NM-006837); CSN6, CSN7A, CSN7B 및 CSN8; 유비퀴틴 리가제, 예컨대 COP1(RFWD2; Genbank 수탁 번호 NM-022457 및 NM-001001740); 및 히스톤 디아세틸라제, 예컨대 HDAC1, HDAC2(Genback 수탁 번호 NM-001527), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9 등을 포함한다. Eg5 및 XIAP 유전자를 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 2007년 5월 29일에 출원된 미국 특허 출원 제11/807,872호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. PLK-1 유전자를 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 미국 특허 공보 제20050107316호 및 제20070265438호; 및 2008년 12월 23일에 출원된 미국 특허 출원 제12/343,342호에 기재된 것을 포함하고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. CSN5 유전자를 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 2008년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/045,251호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
종양형성 및 세포 형질전환과 연관된 유전자 서열의 추가 예는 전좌 서열, 예컨대 MLL 융합 유전자, BCR-ABL(Wilda et al., Oncogene, 21:5716 (2002); Scherr et al., Blood, 101:1566 (2003)), TEL-AML1, EWS-FLI1, TLS-FUS, PAX3-FKHR, BCL-2, AML1-ETO 및 AML1-MTG8(Heidenreich et al., Blood, 101:3157 (2003)); 과발현된 서열, 예컨대 다중약물 내성 유전자(Nieth et al., FEBS Lett., 545:144 (2003); Wu et al, Cancer Res. 63:1515 (2003)), 사이클린(Li et al., Cancer Res., 63:3593 (2003); Zou et al., Genes Dev., 16:2923 (2002)), 베타-카테닌(Verma et al., Clin Cancer Res., 9:1291 (2003)), 텔로머라제 유전자(Kosciolek et al., Mol Cancer Ther., 2:209 (2003)), c-MYC, N-MYC, BCL-2, 성장 인자 수용체(예를 들어, EGFR/ErbB1(Genbank 수탁 번호 NM―005228, NM―201282, NM―201283 및 NM―201284; 또한, Nagy et al. Exp. Cell Res., 285:39-49 (2003), ErbB2/HER-2(Genbank 수탁 번호 NM―004448 및 NM―001005862), ErbB3(Genbank 수탁 번호 NM―001982 및 NM―001005915) 및 ErbB4(Genbank 수탁 번호 NM―005235 및 NM―001042599); 및 돌연변이된 서열, 예컨대 RAS(Tuschl and Borkhardt, Mol. Interventions, 2:158 (2002)에서 검토됨)를 포함한다. EGFR 유전자를 표적화하는 siRNA 분자의 비제한적인 예는 2007년 5월 29일에 출원된 미국 특허 출원 제11/807,872호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
DNA 보수 효소를 암호화하는 서열의 침묵화는 화학치료제의 투여와 조합되어 사용된다(Collis et al., Cancer Res., 63:1550 (2003)). 종양 이동과 연관된 단백질을 암호화하는 유전자는 또한 관심 있는 표적 서열, 예를 들어 인테그린, 설렉틴 및 금속단백분해효소이다. 상기 예는 배타적이 아니다. 당업자는 종양형성 또는 세포 형질전환, 종양 성장 또는 종양 이동을 수월하게 하거나 촉진하는 임의의 전체 또는 부분 유전자 서열이 주형 서열로서 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
혈관형성 유전자는 새로운 혈관의 형성을 촉진할 수 있다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)(Reich et al., Mol. Vis., 9:210 (2003)) 또는 VEGFR이 특히 관심 있다. VEGFR을 표적화하는 siRNA 서열은 예를 들어 GB 제2396864호; 미국 특허 공보 제20040142895호; 및 CA 제2456444호에 기재되어 있고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
항혈관형성 유전자는 신혈관화를 억제할 수 있다. 이 유전자는 혈관신생이 질환의 병리학적 발생에서 역할을 하는 암을 치료하는 데 특히 유용하다. 항혈관형성 유전자의 예는 엔도스타틴(예를 들어, 미국 특허 제6,174,861호 참조), 안지오스타틴(예를 들어, 미국 특허 제5,639,725호 참조) 및 VEGFR2(예를 들어, Decaussin et al., J. Pathol., 188: 369-377 (1999) 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 면역조절제 유전자는 하나 이상의 면역 반응을 조절하는 유전자이다. 면역조절제 유전자의 예는 제한 없이 사이토카인, 예컨대 성장 인자(예를 들어, TGF-α, TGF-β, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, GM-CSF, SCF 등), 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12(Hill et al., J. Immunol., 171:691 (2003))), IL-15, IL-18, IL-20 등), 인터페론(예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ 등) 및 TNF를 포함한다. Fas 및 Fas 리간드 유전자는 또한 관심 있는 면역조절제 표적 서열이다(Song et al., Nat. Med., 9:347 (2003)). 조혈 및 림프구 세포에서 2차 신호전달 분자를 암호화하는 유전자, 예를 들어 Tec 패밀리 키나제, 예컨대 브루톤 티로신 키나제(Btk)(Heinonen et al., FEBS Lett., 527:274 (2002))가 또한 본 발명에 포함된다.
세포 수용체 리간드는 수용체가 관여된 생리학적 경로(예를 들어, 글루코스 수준 조절, 혈액 세포 발생, 유사분열유도(mitogenesis) 등)를 조절(예를 들어, 억제, 활성화 등)하도록 세포 표면 수용체(예를 들어, 인슐린 수용체, EPO 수용체, G-단백질 커플링된 수용체, 티로신 키나제 활성을 갖는 수용체, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체 등)에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 세포 수용체 리간드의 예는 사이토카인, 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 에리쓰로포이에틴(EPO), 인슐린, 글루카곤, G-단백질 결한 수용체 리간드 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 트리뉴클레오타이드 반복부(예를 들어, CAG 반복부)의 확장을 암호화하는 주형은 트리뉴클레오타이드 반복부의 확장에 의해 생긴 신경퇴행성 장애, 예컨대 척수구근 근위축증 및 헌팅턴병에서 병원성 서열을 침묵화하는 데 사용된다(Caplen et al., Hum. Mol. Genet., 11:175 (2002)).
유전자의 발현을 하향조절하거나 침묵화하기 위해 핵산(예를 들어, siRNA)에 의해 표적화될 수 있는 소정의 다른 표적 유전자는 액틴, 알파 2, 평활근, 대동맥(ACTA2), 알코올 탈수소효소 1A(ADH1A), 알코올 탈수소효소 4(ADH4), 알코올 탈수소효소 6(ADH6), 아프민(Afamin)(AFM), 안지오텐시노겐(AGT), 세린-피루베이트 아미노전환효소(AGXT), 알파-2-HS-당단백질(AHSG), 알도-케토 환원효소 패밀리 1 구성원 C4(AKR1C4), 혈청 알부민(ALB), 알파-1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체(AMBP), 안지오포이에틴-관련 단백질 3(ANGPTL3), 혈청 아밀로이드 P-성분(APCS), 아포지단백 A-II(APOA2), 아포지단백 B-100(APOB), 아포지단백 C3(APOC3), 아포지단백 C-IV(APOC4), 아포지단백 F(APOF), 베타-2-당단백질 1(APOH), 아쿠아포린-9(AQP9), 담즙산-CoA:아미노산 N-아실전환효소(BAAT), C4b-결합 단백질 베타 사슬(C4BPB), LINC01554에 의해 코팅된 추정상 미규명된 단백질(C5orf27), 보체 인자 3(C3), 보체 인자 5(C5), 보체 성분 C6(C6), 보체 성분 C8 알파 사슬(C8A), 보체 성분 C8 베타 사슬(C8B), 보체 성분 C8 감마 사슬(C8G), 보체 성분 C9(C9), 칼모듈린 결합 전사 활성자 1(CAMTA1), CD38(CD38), 보체 인자 B(CFB), 보체 인자 H-관련 단백질 1(CFHR1), 보체 인자 H-관련 단백질 2(CFHR2), 보체 인자 H-관련 단백질 3(CFHR3), 카나비노이드 수용체 1(CNR1), 셀룰로플라스민(CP), 카복시펩티다제 B2(CPB2), 결합 조직 성장 인자(CTGF), C-X-C 모티프 케모카인 2(CXCL2), 사이토크롬 P450 1A2(CYP1A2), 사이토크롬 P450 2A6(CYP2A6), 사이토크롬 P450 2C8(CYP2C8), 사이토크롬 P450 2C9(CYP2C9), 사이토크롬 P450 패밀리 2 서브패밀리 D 구성원 6(CYP2D6), 사이토크롬 P450 2E1(CYP2E1), 필로퀴논 오메가-하이드록실라제 CYP4F2(CYP4F2), 7-알파-하이드록시콜레스트-4-엔-3-온 12-알파-하이드록실라제(CYP8B1), 디펩티딜 펩티다제 4(DPP4), 응고 인자 12(F12), 응고 인자 II(트롬빈)(F2), 응고 인자 IX(F9), 피브리노겐 알파 사슬(FGA), 피브리노겐 베타 사슬(FGB), 피브리노겐 감마 사슬(FGG), 피브리노겐-유사 1(FGL1), 플라빈 함유 모노옥시게나제 3(FMO3), 플라빈 함유 모노옥시게나제 5(FMO5), 그룹-특이적 성분(비타민 D 결합 단백질)(GC), 성장 호르몬 수용체(GHR), 글리신 N-메틸전환효소 (GNMT), 히알우로난 결합 단백질 2(HABP2), 헵시딘 미생물 펩타이드(HAMP), 하이드록시산 산화효소(글리콜레이트 산화효소) 1(HAO1), HGF 활성제(HGFAC), 합토글로빈-관련 단백질; 합토글로빈(HPR), 헤모펙신(HPX), 히스티딘-농후 당단백질(HRG), 하이드록시스테로이드(11-베타) 탈수소효소 1(HSD11B1), 하이드록시스테로이드(17-베타) 탈수소효소 13(HSD17B13), 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H1(ITIH1), 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H2(ITIH2), 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H3(ITIH3), 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H4(ITIH4), 프리칼리크레인(KLKB1), 락테이트 탈수소효소 A(LDHA), 간 발현된 미생물 펩타이드 2(LEAP2), 백혈구 세포-유래 케모탁신 2(LECT2), 지단백질(a)(LPA), 만난-결합 렉틴 세린 펩티다제 2(MASP2), S-아데노실메티오닌 합성효소 이소폼 유형-1(MAT1A), NADPH 산화효소 4(NOX4), 폴리 [ADP-리보스] 중합효소 1(PARP1), 파라옥소나제 1(PON1), 파라옥소나제 3(PON3), 비타민 K-의존적 단백질 C(PROC), 레티놀 탈수소효소 16(RDH16), 혈청 아밀로이드 A4, 구성적 (SAA4), 세린 탈수효소(SDS), 세르핀 패밀리 A 구성원 1(SERPINA1), 세르핀 A11(SERPINA11), 칼리스타틴(SERPINA4), 코르티코스테로이드-결합 글로불린(SERPINA6), 안티트롬빈-III(SERPINC1), 헤파린 보인자 2(SERPIND1), 세르핀 패밀리 H 구성원 1(SERPINH1), 용질 담체 패밀리 5 구성원 2(SLC5A2), 나트륨/담즙산 동시수송체(SLC10A1), 용질 담체 패밀리 13 구성원 5(SLC13A5), 용질 담체 패밀리 22 구성원 1(SLC22A1), 용질 담체 패밀리 25 구성원 47(SLC25A47), 용질 담체 패밀리 2, 촉진된 글루코스 수송체 구성원 2(SLC2A2), 나트륨-커플링된 중성 아미노산 수송체 4(SLC38A4), 용질 담체 유기 음이온 수송체 패밀리 구성원 1B1(SLCO1B1), 스핑고미엘린 포스포디에스터라제 1(SMPD1), 담즙염 설포전환효소(SULT2A1), 티로신 아미노전환효소(TAT), 트립토판 2,3-디옥시게나제(TDO2), UDP 글루쿠로노실전환효소 2 패밀리, 폴리펩타이드 B10 (UGT2B10), UDP 글루쿠로노실전환효소 2 패밀리, 폴리펩타이드 B15(UGT2B15), UDP 글루쿠로노실전환효소 2 패밀리, 폴리펩타이드 B4(UGT2B4) 및 비트로넥틴(VTN)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
치료학적 목적을 위한 임의의 상기 기재된 유전자의 발현을 침묵화하는 것에서의 이의 이용성 이외에, 본원에 기재된 소정의 핵산(예를 들어, siRNA)은 조사 및 개발 분야뿐만 아니라 진단학적, 예방학적, 예후적, 임상학적 및 다른 건강관리 분야에서 또한 유용하다. 비제한적인 예로서, 소정의 핵산(예를 들어, siRNA)은 관심 유전자가 치료학적 표적일 가능성을 갖는지를 시험하는 것에 관한 표적 검정 연구에 사용될 수 있다. 소정의 핵산(예를 들어, siRNA)은 잠재적인 치료학적 표적으로서 유전자를 발견하는 것을 목표로 한 표적 확인 연구에 또한 사용될 수 있다.
CRISPR
표적화된 게놈 편집은 틈새(niche) 기술인 것에서부터 많은 생물학적 조사자에 의해 사용된 방법으로 진행되었다. 이 진행은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR: clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat) 기술의 출현에 의해 크게 힘을 입는다(예를 들어, Sander et al., Nature Biotechnology, 32(4), 347-355, Supplementary Information 포함 (2014) 및 국제 공보 WO 제2016/197132호 및 WO 제2016/197133호 참조). 따라서, HBV와 같은 질환을 치료하기 위해 CRISPR 기술과 조합되어 사용될 수 있는 개선(예를 들어, 지질 나노입자 및 이의 제제)이 본원에 제공된다. CRISPR을 사용하기 위한 표적과 관련하여, CRISPR 기술에 사용된 가이드 RNA(gRNA)는 특이적으로 확인된 서열, 예를 들어 HBV 게놈의 예를 들어 표적 유전자를 표적화하도록 설계될 수 있다. 이러한 표적 서열의 예는 국제 공보 WO 제2016/197132호에 제공된다. 추가로, 국제 공보 WO 제2013/151665호(예를 들어, 표 6 참조; 문헌은 특히 표 6, 및 연관된 서열 목록을 포함하여 구체적으로 참조로 포함됨)는 mRNA 발현 작제물의 맥락에서 청구된 약 35,000개의 mRNA 서열을 기재한다. 본 발명의 소정의 실시형태는 임의의 이들 서열의 발현을 표적화하기 위한 CRISPR 기술을 이용한다. 본 발명의 소정의 실시형태는 본원에 기술된 표적 유전자의 발현을 표적화하기 위한 CRISPR 기술을 또한 이용할 수 있다.
aiRNA
siRNA와 같이, 비대칭 간섭 RNA(aiRNA)는 RNA-유도된 침묵화 복합체(RISC)를 동원하고, 안티센스 가닥의 5' 말단에 대해 10번 내지 11번 뉴클레오타이드 사이의 표적 서열의 서열-특이적 절단을 매개함으로써 포유류 세포에서 다양한 유전자의 효과적인 침묵화로 이어질 수 있다(Sun et al., Nat. Biotech., 26:1379-1382 (2008)). 통상적으로, aiRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 짧은 RNA 듀플렉스를 포함하고, 듀플렉스는 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단에서 오버행을 함유한다. 센스 가닥이 상보성 안티센스 가닥과 비교할 때 말단 둘 다에서 더 짧으므로, aiRNA는 일반적으로 비대칭이다. 일부 양태에서, aiRNA 분자는 siRNA 분자에 사용된 것과 유사한 조건 하에 설계되고 합성되고 어닐링될 수 있다. 비제한적인 예로서, aiRNA 서열이 선택될 수 있고, siRNA 서열을 선택하기 위해 상기 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 다양한 길이(예를 들어, 약 10개 내지 25개, 12개 내지 20개, 12개 내지 19개, 12개 내지 18개, 13개 내지 17개, 또는 14개 내지 17개의 염기 쌍, 더 통상적으로 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 염기 쌍)의 aiRNA 듀플렉스는 관심 mRNA를 표적화하기 위해 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단에서 오버행과 설계될 수 있다. 소정의 경우에, aiRNA 분자의 센스 가닥은 약 10개 내지 25개, 12개 내지 20개, 12개 내지 19개, 12개 내지 18개, 13개 내지 17개, 또는 14개 내지 17개의 뉴클레오타이드 길이, 더 통상적으로 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 소정의 다른 경우에, aiRNA 분자의 안티센스 가닥은 약 15개 내지 60개, 15개 내지 50개, 또는 15개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이, 더 통상적으로 약 15개 내지 30개, 15개 내지 25개, 또는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고, 바람직하게는 약 20개 내지 24개, 21개 내지 22개, 또는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 실시형태에서, 5' 안티센스 오버행은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 이것 초과의 비표적화 뉴클레오타이드(예를 들어, "AA", "UU", "dTdT" 등)를 함유한다. 다른 실시형태에서, 3' 안티센스 오버행은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 이것 초과의 비표적화 뉴클레오타이드(예를 들어, "AA", "UU", "dTdT" 등)를 함유한다. 소정의 양태에서, 본원에 기재된 aiRNA 분자는 예를 들어 이중-가닥(듀플렉스) 영역 및/또는 안티센스 오버행에서 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, aiRNA 서열은 siRNA 서열에 대해 상기 기재된 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, aiRNA 분자는 예를 들어 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드와 같은 2'OMe 뉴클레오타이드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
소정의 실시형태에서, aiRNA 분자는 siRNA 분자의 안티센스 가닥에 상응하는 안티센스 가닥, 예를 들어 본원에 기재된 siRNA 분자 중 하나를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, aiRNA 분자는 예를 들어 바이러스 감염 및 생존과 연관된 유전자, 대사 질환 및 장애와 연관된 유전자, 종양형성 및 세포 형질전환과 연관된 유전자, 혈관형성 유전자, 면역조절제 유전자, 예컨대 염증성 반응 및 자가면역 반응과 연관된 것, 리간드 수용체 유전자 및 신경퇴행성 장애와 연관된 유전자와 같은 임의의 상기 기재된 표적 유전자의 발현을 침묵화하도록 사용될 수 있다.
miRNA
일반적으로, 마이크로RNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 약 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 RNA 분자이다. miRNA는 이것이 전사된 DNA로부터 유전자에 의해 암호화되지만, miRNA는 단백질(비-암호화 RNA)로 번역되지 않고; 대신에, 각각의 1차 전사체(pri-miRNA)는 pre-miRNA라 불리는 짧은 줄기-루프 구조 및 마지막으로 기능성 성숙 miRNA로 가공된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA(mRNA) 분자에 부분적으로 또는 완전히 상보성이고, 이의 주기능은 유전자 발현을 하향조절하는 것이다. miRNA 분자의 확인은 예를 들어 Lagos-Quintana et al., Science, 294:853-858; Lau et al., Science, 294:858-862; 및 Lee et al., Science, 294:862-864에 기재되어 있다.
miRNA를 암호화하는 유전자는 가공된 성숙 miRNA 분자보다 훨씬 더 길다. miRNA는 처음에 캡 및 poly-A 꼬리를 갖는 1차 전사체 또는 pri-miRNA로서 전사되고, 세포 핵에서 pre-miRNA로 공지된 짧은 ∼70-뉴클레오타이드 줄기-루프 구조로 가공된다. 이 가공은 뉴클레아제 드로샤(Drosha) 및 이중-가닥 RNA 결합 단백질 파샤(Pasha)로 이루어진 마이크로프로세서 복합체로 공지된 단백질 복합체에 의해 동물에서 수행된다(Denli et al., Nature, 432:231-235 (2004)). 이후, 이 pre-miRNA는 RNA-유도된 침묵화 복합체(RISC)의 형성을 또한 개시하는 엔도뉴클레아제 다이서와의 상호작용에 의해 세포질에서 성숙 miRNA로 가공된다(Bernstein et al., Nature, 409:363-366 (2001). DNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 어느 하나는 miRNA를 생성시키는 주형으로서 작용할 수 있다.
다이서가 pre-miRNA 줄기-루프를 절단할 때, 2개의 상보성 짧은 RNA 분자가 형성되지만, 오직 하나는 RISC 복합체로 통합된다. 이 가닥은 가이드 가닥으로 공지되어 있고, 5' 말단의 안정성을 기준으로 RISC 복합체에서 촉매 활성 RNase인 아르고너트 단백질에 의해 선택된다(Preall et al., Curr. Biol., 16:530-535 (2006)). 항-가이드 또는 패신저 가닥으로 공지된 남은 가닥은 RISC 복합 기질로서 분해된다(Gregory et al., Cell, 123:631-640 (2005)). 활성 RISC 복합체로의 통합 후, miRNA는 이의 상보성 mRNA 분자와 염기 쌍을 이루고, 표적 mRNA 분해 및/또는 번역 침묵화를 유도한다.
포유류 miRNA 분자는 보통 표적 mRNA 서열의 3' UTR에서의 부위에 상보성이다. 소정의 경우에, 표적 mRNA에 대한 miRNA의 어닐링은 단백질 번역 기계를 차단함으로써 단백질 번역을 억제한다. 소정의 다른 경우에, 표적 mRNA로의 miRNA의 어닐링은 RNA 간섭(RNAi)과 유사한 과정을 통해 표적 mRNA의 절단 및 분해를 촉진한다. miRNA는 표적화된 mRNA에 상응하는 게놈 부위의 메틸화를 또한 표적화할 수 있다. 일반적으로, miRNA는 총체적으로 miRNP라 칭하는 단백질의 보체와 연관되어 작용한다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 miRNA 분자는 약 15개 내지 100개, 15개 내지 90개, 15개 내지 80개, 15개 내지 75개, 15개 내지 70개, 15개 내지 60개, 15개 내지 50개, 또는 15개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이, 더 통상적으로 약 15개 내지 30개, 15개 내지 25개, 또는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고, 바람직하게는 약 20개 내지 24개, 21개 내지 22개, 또는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이이다. 소정의 다른 양태에서, miRNA 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, miRNA 서열은 siRNA 서열에 대해 상기 기재된 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, miRNA 분자는 예를 들어 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드와 같은 2'OMe 뉴클레오타이드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, miRNA 분자는 예를 들어 바이러스 감염 및 생존과 연관된 유전자, 대사 질환 및 장애와 연관된 유전자, 종양형성 및 세포 형질전환과 연관된 유전자, 혈관형성 유전자, 면역조절제 유전자, 예컨대 염증성 반응 및 자가면역 반응과 연관된 것, 리간드 수용체 유전자 및 신경퇴행성 장애와 연관된 유전자와 같은 임의의 상기 기재된 표적 유전자의 발현을 침묵화하도록 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 관심 mRNA를 표적화하는 miRNA의 활성을 차단하는 하나 이상의 제제는 본 발명의 지질 입자(예를 들어, 핵산-지질 입자)를 사용하여 투여된다. 차단제의 예는 입체 차단 올리고뉴클레오타이드, 잠금 핵산 올리고뉴클레오타이드, 및 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 차단제는 miRNA 또는 표적 mRNA에 대한 miRNA 결합 부위에 직접 결합할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드
일 실시형태에서, 핵산은 관심 있는 표적 유전자 또는 서열에 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 또는 "안티센스"는 표적화된 폴리뉴클레오타이드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 선택된 서열에 상보성인 DNA 또는 RNA의 단일 가닥이다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 RNA에 결합함으로써 상보성 RNA 가닥의 번역을 방지한다. 안티센스 DNA 올리고뉴클레오타이드는 특이적, 상보성 (암호화 또는 비암호화) RNA를 표적화하도록 사용될 수 있다. 결합이 발생하면, 이 DNA/RNA 하이브리드는 효소 RNase H에 의해 분해될 수 있다. 특정 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 10개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 용어는 또한 원하는 표적 유전자에 정확히 상보성이 아닐 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 같이, 본 발명은 비-표적 특이적-활성이 안티센스에 의해 발견된 경우, 또는 표적 서열과 하나 이상의 미스매치를 함유하는 안티센스 서열이 특정 사용에 가장 바람직한 경우에 사용될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단백질 합성의 효과적이고 표적화된 억제제인 것으로 나타났고, 결과적으로 표적화된 유전자에 의해 단백질 합성을 특이적으로 억제하도록 사용될 수 있다. 단백질 합성을 억제하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능은 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 폴리갈락타우로나제 및 무스카린 2형 아세틸콜린 수용체의 합성은 이들의 각각의 mRNA 서열에 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다(미국 특허 제5,739,119호 및 제5,759,829호 참조). 더욱이, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약물 내성 유전자(MDR1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABAA 수용체 및 인간 EGF에 의해 나타났다(Jaskulski et al., Science, 240:1544-6 (1988); Vasanthakumar et al., Cancer Commun., 1:225-32 (1989); Penis et al., Brain Res Mol Brain Res., 15; 57:310-20 (1998); 및 미국 특허 제5,801,154호; 제5,789,573호; 제5,718,709호 및 제5,610,288호 참조). 더욱이, 다양한 비정상 세포 증식, 예를 들어 암을 억제하고 이를 치료하기 위해 사용될 수 있는 안티센스 작제물이 또한 기재되어 있다(미국 특허 제5,747,470호; 제5,591,317호; 및 제5,783,683호 참조). 이들 참고문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 소정의 표적 서열에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열의 선택은 선택된 표적 서열의 분석 및 2차 구조, Tm, 결합 에너지 및 상대 안정성의 결정에 기초한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이합체, 헤어핀 또는 숙주 세포에서 표적 mRNA에 대한 특이적 결합을 감소시키거나 금지하는 다른 2차 구조를 형성하는 이의 상대적인 불능에 기초한다. mRNA의 고도로 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈에서의 또는 근처에서의 영역 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보성인 서열을 포함한다. 이 2차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려사항은 예를 들어 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어(Molecular Biology Insights)의 v.4 및/또는 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어(Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997))를 사용하여 수행될 수 있다.
리보자임
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 핵산-지질 입자는 리보자임과 연관된다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 보유하는 특이적 촉매 도메인을 갖는 RNA-단백질 복합체이다(Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:8788-92 (1987); 및 Forster et al., Cell, 49:211-20 (1987) 참조). 예를 들어, 아주 많은 리보자임은 높은 정도의 특이성으로 포스포에스테르 이동 반응을 촉매화하여서, 올리고뉴클레오타이드 기질에서 몇몇 포스포에스테르 중 오직 하나를 대개 절단한다(Cech et al., Cell, 27:487-96 (1981); Michel et al., J. Mol. Biol., 216:585-610 (1990); Reinhold-Hurek et al., Nature, 357:173-6 (1992) 참조). 이 특이성은 기질이 화학 반응 전에 리보자임의 내부 가이드 서열("IGS")에 대한 특이적 염기-페어링 상호작용을 통해 결합한다는 요건에 기인한다.
천연-발생 효소 RNA 분자의 적어도 6개의 기본적 변종이 현재 공지되어 있다. 각각은 생리학적 조건 하에 트랜스로 RNA 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉매화할 수 있다(그리고 이와 같이 다른 RNA 분자를 절단할 수 있다). 일반적으로, 효소 핵산은 표적 RNA에 대한 제1 결합에 의해 작용한다. 이러한 결합은 표적 RNA를 절단하도록 작용하는 분자의 효소 부분에 매우 근접하게 유지된 효소 핵산의 표적 결합 부분을 통해 발생한다. 이와 같이, 효소 핵산은 처음에 상보성 염기-페어링을 통해 표적 RNA를 인식하고 이후 이에 결합하고, 정확한 부위에 결합되면, 표적 RNA를 절단하도록 효소적으로 작용한다. 이러한 표적 RNA의 전략적 절단은 암호화된 단백질의 합성을 지시하는 이의 능력을 파괴할 것이다. 효소 핵산이 결합되고 이의 RNA 표적이 절단된 후, 이것은 다른 표적에 대해 조사하도록 그 RNA로부터 방출되고, 반복적으로 새로운 표적에 결합하고 절단할 수 있다.
효소 핵산 분자는 예를 들어 해머헤드, 헤어핀, 간염 δ 바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RNaseP RNA(RNA 가이드 서열과 연관되어), 또는 뉴로스포라(Neurospora) VS RNA 모티프에서 형성될 수 잇다. 해머헤드 모티프의 구체적인 예는 예를 들어 Rossi et al., Nucleic Acids Res., 20:4559-65 (1992)에 기재되어 있다. 헤어핀 모티프의 예는 예를 들어, EP 제0360257호, Hampel et al., Biochemistry, 28:4929-33 (1989); Hampel et al., Nucleic Acids Res., 18:299-304 (1990); 및 미국 특허 제5,631,359호에 기재되어 있다. 간염 δ 바이러스 모티프의 예는 예를 들어 Perrotta et al., Biochemistry, 31:11843-52 (1992)에 기재되어 있다. RNaseP 모티프의 예는 예를 들어 Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849-57 (1983)에 기재되어 있다. 뉴로스포라 VS RNA 리보자임 모티프의 예는 예를 들어 Saville et al., Cell, 61:685-96 (1990); Saville et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8826-30 (1991); Collins et al., Biochemistry, 32:2795-9 (1993)에 기재되어 있다. 그룹 I 인트론의 예는 예를 들어 미국 특허 제4,987,071호에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 사용된 효소 핵산 분자의 중요한 특징은 이것이 표적 유전자 DNA 또는 RNA 영역 중 하나 이상에 상보성인 특이적 기질 결합 부위를 갖는다는 것, 및 이것이 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 그 기질 결합 부위 내에 또는 주위에 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 것이다. 이와 같이, 리보자임 작제물은 본원에 언급된 특이적 모티프로 제한될 필요는 없다. 이들 참고문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
임의의 폴리뉴클레오타이드 서열에 표적화된 리보자임을 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 리보자임은 예를 들어 PCT 공보 WO 제93/23569호 및 WO 제94/02595호에 기재된 것과 같이 설계될 수 있고, 이들 내에 기재된 것과 같이 시험관내 및/또는 생체내 처리되도록 합성된다. 이들 PCT 공보의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
리보자임 활성은 리보자임 결합 아암의 길이를 변경하거나, 혈청 리보뉴클레아제에 의한 이의 분해를 막는 변형(예를 들어, PCT 공보 WO 제92/07065호, WO 제93/15187호, WO 제91/03162호 및 WO 제94/13688호; EP 제92110298.4호; 및 미국 특허 제5,334,711호 참조, 이들은 효소 RNA 분자의 당 모이어티에 이루어질 수 있는 다양한 화학 변형을 기재하며, 이들의 개시내용은 각각 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨), 세포에서의 이의 효능을 향상시키는 변형, 및 RNA 합성 시간을 짧게 하고 화학 요건을 감소시키기 위한 스템 II 염기의 제거를 갖는 리보자임을 화학적으로 합성함으로써 최적화될 수 있다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드
본 발명의 지질 입자와 연관된 핵산은 인간과 같은 포유류일 수 있는 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드(ISS; 단일- 또는 이중-가닥)를 포함하는 면역자극성일 수 있다. ISS는 예를 들어 헤어핀 2차 구조(Yamamoto et al., J. Immunol., 148:4072-6 (1992) 참조), 또는 CpG 모티프로 이어지는 소정의 회문뿐만 아니라 다른 공지된 ISS 특징을 포함한다(예컨대, 멀티-G 도메인; PCT 공보 WO 제96/11266호 참조, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
면역자극성 핵산은 이것이 면역 반응을 유발하기 위해 표적 서열에 특이적으로 결합하고 이의 발현을 감소시키는 것이 필요하지 않을 때 비서열 특이적인 것으로 여겨진다. 이와 같이, 소정의 면역자극성 핵산은 자연-발생 유전자 또는 mRNA의 영역에 상응하는 서열을 포함할 수 있지만, 이것은 비-서열 특이적 면역자극성 핵산인 것으로 여전히 여겨질 수 있다.
일 실시형태에서, 면역자극성 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 CpG 디뉴클레오타이드는 비메틸화되거나 메틸화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역자극성 핵산은 메틸화된 사이토신을 갖는 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 단일 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, CpG 디뉴클레오타이드에서의 사이토신은 메틸화된다. 대안적인 실시형태에서, 핵산은 적어도 2개의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, CpG 디뉴클레오타이드에서의 적어도 하나의 사이토신은 메틸화된다. 추가의 실시형태에서, 서열에 존재하는 CpG 디뉴클레오타이드에서의 각각의 사이토신은 메틸화된다. 다른 실시형태에서, 핵산은 복수의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, CpG 디뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 메틸화된 사이토신을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 예는 2008년 12월 31일에 출원된 PCT 출원 PCT/US08/88676호, PCT 공보 WO 제02/069369호 및 WO 제01/15726호, 미국 특허 제6,406,705호, 및 Raney et al., J. Pharm. Exper. Ther., 298:1185-92 (2001)에 기재되어 있고, 이들의 개시내용은 각각 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 CpG 모티프에서 포스포디에스테르 ("PO") 골격 또는 포스포로티오에이트("PS") 골격, 및/또는 적어도 하나의 메틸화된 사이토신 잔기를 갖는다.
mRNA
소정의 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 mRNA 분자(예를 들어, mRNA 분자의 칵테일)이다.
mRNA에 대한 변형
본 발명의 실행에 사용된 mRNA는 1개, 2개, 또는 2개 초과의 뉴클레오사이드 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 mRNA는 상응하는 비변형된 mRNA에 비해 mRNA가 도입된 세포에서 감소된 분해를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불랄린, 5-아자-제불랄린, 5-메틸-제불랄린, 5-아자-2-티오-제불랄린, 2-티오-제불랄린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘을 포함한다.
다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 2-아미노푸린, 2, 6-디아미노푸린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노푸린, 7-데아자-8-아자-2-아미노푸린, 7-데아자-2,6-디아미노푸린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노푸린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐l아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5'-0-(1--티오포스페이트)-아데노신, 5'-0-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5'-0-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-0-(1-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-0-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘이다. α-티오 치환된 포스페이트 모이어티는 비천연 포스포로티오에이트 골격 연결을 통해 RNA 중합체에 안정성을 부여하도록 제공된다. 포스포로티오에이트 RNA는 증가된 뉴클레아제 내성 및 후속하여 세포 환경에서 더 긴 반감기를 갖는다. 포스포로티오에이트 연결된 핵산은 세포 선천성 면역 분자의 더 약한 결합/활성화를 통해 선천성 면역 반응을 또한 감소시키는 것으로 예상된다.
소정의 실시형태에서, 예를 들어 단백질 생성의 정확한 시기가 원해지면 세포로 도입된 변형된 핵산을 세포내로 분해시키는 것이 바람직하다. 이와 같이, 본 발명은 세포 내에 지시된 방식으로 작용될 수 있는 분해 도메인을 함유하는 변형된 핵산을 제공한다.
다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함한다.
변형된 핵산의 선택적인 성분
추가의 실시형태에서, 변형된 핵산은 일부 실시형태에서 유리할 수 있는 다른 선택적인 성분을 포함할 수 있다. 이 선택적인 성분은 비번역된 영역, 코작 서열, 인트론 뉴클레오타이드 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 캡 및 폴리A 꼬리를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 5' 비번역된 영역(UTR) 및/또는 3' UTR이 제공될 수 있고, 여기서 어느 하나 또는 둘 다는 하나 이상의 상이한 뉴클레오사이드 변형을 독립적으로 함유할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 뉴클레오사이드 변형은 또한 번역 가능한 영역에 존재할 수 있다. 코작(Kozak) 서열을 함유하는 핵산이 또한 제공된다.
추가적으로, 핵산으로부터 절제될 수 있는 하나 이상의 인트론 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산이 제공된다.
비번역된 영역(UTR)
유전자의 비번역된 영역(UTR)은 전사되지만 번역되지 않는다. 5' UTR은 전사 시작 부위에서 시작하고, 시작 코돈으로 계속하지만, 시작 코돈을 포함하지 않는 반면; 3' UTR은 중단 코돈 직후 시작하고, 전사 종결 신호까지 계속한다. 핵산 분자의 안정성 및 번역의 면에서 UTR이 하는 조절 역할에 대한 성장하는 증거가 있다. UTR의 조절 특징은 분자의 안정성을 증가시키기 위해 본 발명에 사용된 mRNA로 혼입될 수 있다. 구체적인 특징은 이것이 원치 않는 장기 부위에 잘못 지시되는 경우에 전사체의 제어된 하향조절을 보장하도록 또한 혼입될 수 있다.
5' 캡핑
mRNA의 5' 캡 구조는 핵 배출에 관여되어, mRNA 안정성을 증가시키고 mRNA 캡 결합 단백질(CBP)에 결합하고, 이는 성숙 사이클릭 mRNA 종을 형성하기 위해 CBP와 폴리(A) 결합 단백질의 회합을 통해 세포에서의 mRNA 안정성 및 번역 역량의 원인이다. 캡은 mRNA 스플라이싱 동안 5' 근위 인트론 제거의 제거를 추가로 돕는다.
내인성 mRNA 분자는 5'-말단 캡핑될 수 있어서 말단 구아노신 캡 잔기와 mRNA 분자의 5'-말단 전사된 센스 뉴클레오타이드 사이에 5'-ppp-5'-트리포스페이트 연결을 생성한다. 그다음 이 5'-구아닐레이트 캡은 메틸화되어 N7-메틸-구아닐레이트 잔기를 생성할 수 있다. mRNA의 5' 말단의 말단 및/또는 말단전 전사된 뉴클레오타이드의 리보스 당은 선택적으로 또한 2'-0-메틸화될 수 있다. 구아닐레이트 캡 구조의 가수분해 및 절단을 통한 5'-탈캡핑은 분해를 위해 mRNA 분자와 같은 핵산 분자를 표적화할 수 있다.
IRES 서열
내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 함유하는 mRNA는 또한 본 발명의 실행에서 유용하다. IRES는 단독의 리보솜 결합 부위로서 작용할 수 있거나, mRNA의 다수의 리보솜 결합 부위의 하나로서 작용할 수 있다. 하나 초과의 기능성 리보솜 결합 부위를 함유하는 mRNA는 리보솜("멀티시스트론성 mRNA")에 의해 독립적으로 번역된 몇몇 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. mRNA에 IRES가 제공될 때, 제2 번역 가능한 영역이 추가로 선택적으로 제공된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 IRES 서열의 예는 제한 없이 피코르나바이러스(예를 들어 FMDV), 페스트 바이러스(CFFV), 폴리오 바이러스(PV), 뇌심근염 바이러스(ECMV), 수족구병 바이러스(FMDV), C형 간염 바이러스(HCV), 고전적 돼지열 바이러스(CSFV), 쥣과 백혈병 러스(MLV), 유인원 면역 결핍 바이러스(S1V) 또는 귀뚜라미 마비병 바이러스(CrPV)로부터의 것을 포함한다.
Poly-A 꼬리
RNA 가공 동안, 아데닌 뉴클레오타이드(poly-A 꼬리)의 긴 사슬은 안정성을 증가시키기 위해 mRNA 분자와 같은 폴리뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다. 전사 직후, 전사체의 3' 말단은 3' 하이드록실을 유리시키도록 절단될 수 있다. 이후, poly-A 중합효소는 RNA에 아데닌 뉴클레오타이드의 사슬을 부가한다. 폴리아데닐화라 불리는 공정은 100개 내지 250개 잔기 길이일 수 있는 poly-A 꼬리를 부가한다.
일반적으로, poly-A 꼬리의 길이는 30개 초과의 뉴클레오타이드 길이이다. 다른 실시형태에서, poly-A 꼬리는 35개 초과의 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 적어도 또는 약 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 120개, 140개, 160개, 180개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 2,000개, 2,500개 및 3,000개 초과의 뉴클레오타이드)이다.
이 맥락에서 poly-A 꼬리는 변형된 mRNA보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과의 길이일 수 있다. poly-A 꼬리는 또한 이것이 속하는 변형된 핵산의 분획으로서 설계될 수 있다. 이 맥락에서, poly-A 꼬리는 변형된 mRNA의 총 길이 또는 변형된 mRNA의 총 길이 빼기 poly-A 꼬리의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 초과일 수 있다.
mRNA 분자의 생성
RNA를 단리하고, RNA를 합성하고, 핵산을 혼성화하고, cDNA 라이브러리를 제조하고 스크리닝하고, PCR을 수행하기 위한 방법은 PCR 방법(미국 특허 제4,683,195호 및 미국 특허 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990) 참조)처럼 당해 분야에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) 참조). 발현 라이브러리는 당업자에게 또한 잘 공지되어 있다. 본 발명의 용도의 일반 방법을 개시하는 추가적인 기본 텍스트는 Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)를 포함한다. 이들 참고문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
암호화된 폴리펩타이드
본원에 기재된 핵산-지질 입자의 mRNA 성분은 관심 폴리펩타이드를 발현하도록 사용될 수 있다. 인간에서의 소정의 질환은 단백질이 보통 존재하고 활성인 세포형에서 기능성 단백질의 부재 또는 손상에 의해 야기된다. 기능성 단백질은 예를 들어 암호화 유전자의 전사 불활성으로 인해 또는 단백질이 완전히 또는 부분적으로 비기능성이게 하는 암호화 유전자에서의 성숙의 존재로 인해 완전히 또는 부분적으로 부재할 수 있다. 단백질의 완전 불활성 또는 부분 불활성에 의해 야기된 인간 질환의 예는 X-연관성 중증 복합 면역부전증(X-SCID: X-linked severe combined immunodeficiency) 및 부신백질이영양증(X-ALD)을 포함한다. X-SCID는 면역계 내의 B 세포 및 T 세포의 발생 및 성숙에 관여된 몇몇 인터류킨에 대한 수용체의 성분인 공통 감마 사슬 단백질을 암호화하는 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이에 의해 야기된다. X-ALD는 ABCD1이라 불리는 퍼옥시좀 막 수송체 단백질 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이에 의해 야기된다. X-ALD로 고통받는 개체는 정신 장해 또는 손상으로 이어질 수 있는 다양한 증상을 야기하는 신체에 걸친 조직에서의 장쇄 지방 산의 매우 높은 수준을 갖는다.
단백질이 보통 존재하고 활성인 세포형에서 기능성 단백질의 부재 또는 손상에 의해 야기된 일부 질환을 치료하기 위해 유전자 치료를 사용하도록 시도가 이루어졌다. 유전자 치료는 통상적으로 질환 있는 사람에 대한 영향받은 단백질의 기능성 형태를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터의 도입 및 질환을 치료하기 위한 기능성 단백질의 발현을 수반한다. 이제까지는, 유전자 치료는 제한된 성공으로 충족되었다. 추가적으로, LNP를 사용하여 mRNA를 전달하는 소정의 양태는 예를 들어 국제 공보 WO 제2018/006052호 및 WO 제2015/011633호에 기재되어 있다.
그러므로, 기능성 단백질의 완전한 부재 또는 부분 부재에 의해 야기된 질환을 겪는 인간 내의 단백질의 기능성 형태를 발현하기 위한 개선의 계속적인 필요성이 있고, 예를 들어 치료에 대한 면역 반응을 덜 촉발할 수 있는 방법 및 조성물을 통한 핵산(예를 들어, mRNA)의 개선된 전달에 대한 수요가 있다. 본 발명의 소정의 실시형태는 본 맥락에서 유용하다. 이와 같이, 소정의 실시형태에서, 폴리펩타이드의 발현은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다. 본 발명의 소정의 조성물 및 방법은 인간 신체 내에 기능성 폴리펩타이드의 부재, 또는 감소된 수준에 의해 야기된 인간 질환을 치료하기 위해 유용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 소정의 조성물 및 방법은 예를 들어 암을 치료하기 위한 백신 항원을 발현하는 데 유용할 수 있다.
자가-증폭 RNA
소정의 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 자가-증폭 RNA 분자이다. 자가-증폭 RNA(sa-RNA)는 또한 자가-복제 RNA, 복제-유능 RNA, 레플리콘 또는 RepRNA라 칭해질 수 있다. 자가-증폭 mRNA라 칭하는 RepRNA는, 양성-가닥 바이러스로부터 유래될 때, 적어도 하나의 구조적 유전자가 결여된 바이러스로부터 생성되고; 이것은 감염성 자손 바이러스를 생성하지 않으면서 번역하고 복제할 수 있다(그러므로 "자가-증폭"). 소정의 실시형태에서, RepRNA 기술은 원하는 관심 항원을 암호화하는 유전자 카세트를 삽입하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 알파바이러스 게놈은 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 나눠진다: 제1 ORF는 RNA 의존적 RNA 중합효소(복제효소)에 대해 단백질을 암호화하고, 제2 ORF는 구조적 단백질을 암호화한다. sa-RNA 백신 작제물에서, 바이러스 구조적 단백질을 암호화하는 ORF는 임의의 선택 항원으로 대체될 수 있지만, 바이러스 복제효소는 백신의 통합 부분으로 남고, 면역화 후 RNA의 세포내 증폭을 추진한다.
다른 활성제
소정의 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자와 연관된 활성제는 하나 이상의 치료학적 단백질, 폴리펩타이드, 또는 소형 유기 분자 또는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 치료학적 유효 제제 또는 약물의 비제한적인 예는 종양학 약물(예를 들어, 화학치료제 약물, 호르몬 치료제, 면역치료제, 방사선치료제 등), 지질-저하제, 항바이러스 약물, 소염 화합물, 항우울제, 자극제, 진통제, 항생제, 산아 제한 의약, 해열제, 혈관확장제, 항혈관형성, 세포혈관제, 신호 전달 억제제, 심혈관 약물, 예컨대 항부정맥제, 호르몬, 혈관수축제 및 스테로이드를 포함한다. 이 활성제는 본 발명의 지질 입자에서 단독으로, 또는 핵산, 예컨대 간섭 RNA 또는 mRNA를 포함하는 본 발명의 지질 입자와 조합되어(예를 들어, 공동투여) 투여될 수 있다.
화학치료제 약물의 비제한적인 예는 백금계 약물(예를 들어, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카보플라틴, 스피로플라틴, 이프로플라틴, 사트라플라틴 등), 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 클로로암부실, 부술판, 멜팔란, 메클로르에타민, 우라무스틴, 티오테파, 니트로소우레아 등), 항대사물질(예를 들어, 5-플루오로우라실(5-FU), 아자티오프린, 메토트렉세이트, 류코보린, 카페시타빈, 사이타리빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 젬시타빈, 페메트렉세드, 랄티트렉세드 등), 식물 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 포도필로톡신, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀 등), 토포아이소머라제 억제제(예를 들어, 이리노테칸(CPT-11; Camptosar), 토포테칸, 암사크린, 에토포사이드(VP16), 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드 등), 항종양 항생제(예를 들어, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신 등), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 제피티닙(Iressa®), 수니티닙(Sutent®; SU11248), 에를로티닙(Tarceva®; OSI-1774), 라파티닙(GW572016; GW2016), 카네르티닙(CI 1033), 세막시닙(SU5416), 바탈라닙(PTK787/ZK222584), 소라페닙(BAY 43-9006), 이마티닙(Gleevec®; STI571), 다사티닙(BMS-354825), 레플루노미드(SU101), 반데타닙(ZactimaTM; ZD6474) 등), 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 유도체, 이의 유사체, 및 이들의 조합을 포함한다.
종래의 호르몬 치료제의 예는 제한 없이 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손), 피나스테라이드, 아로마타제 억제제, 타목시펜 및 고세렐린뿐만 아니라 다른 고나도트로핀-방출 호르몬 효능제(GnRH)를 포함한다.
종래의 면역치료제의 예는 면역자극제(예를 들어, 바실러스 칼메트-게렝(BCG), 레바미솔, 인터류킨-2, 알파-인터페론 등), 단일클론 항체(예를 들어, 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-HLA-DR 및 항-VEGF 단일클론 항체), 면역독소(예를 들어, 항-CD33 단일클론 항체-칼리키아마이신 접합체, 항-CD22 단일클론 항체-슈도모나스 외독소 접합체 등) 및 방사면역치료(예를 들어, 111In, 90Y 또는 131I 등에 접합된 항-CD20 단일클론 항체)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
종래의 방사선치료제의 예는 종양 항원에 대해 지시된 항체에 선택적으로 접합된 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At 및 212Bi와 같은 방사성핵종을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 추가적인 종양학 약물은 알케란, 알로푸리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, araC, 삼산화비소, 벡사로텐, biCNU, 카르무스틴, CCNU, 셀레콕십, 클라드리빈, 사이클로스포린 A, 사이토신 아라비노사이드, 사이톡산, 덱스라족산, DTIC, 에스트라무스틴, 엑스메스탄, FK506, 겜투주맙-오조가마이신, 히드레아, 하이드록시우레아, 이다루비신, 인터페론, 레트로졸, 류스타틴, 류프로라이드, 리트레티노인, 메가스트롤, L-PAM, 메스나, 메톡살렌, 미트라마이신, 질소 머스타드, 파미드로네이트, 페가데마제, 페노스타틴, 포피머 나트륨, 프레드니손, 리툭산, 스트렙토조신, STI-571, 텍소테레, 테모졸라미드, VM-26, 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신 및 벨반을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 종양학 약물의 다른 예는 엘리프티신 및 엘리프티신 유사체 또는 유도체, 에포틸론, 세포내 키나제 억제제 및 캄프토테신이다.
상승된 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 및/또는 포도당과 연관된 지질 질환 또는 장애를 치료하기 위한 지질-강하제의 비제한적인 예는 스타틴, 피브레이트, 에제티미브, 티아졸리딘디온, 니아신, 베타-차단제, 니트로글리세린, 칼슘 길항제, 어유, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
항바이러스 약물의 예는 아바카비르, 아시클로비르, 아시클로비르, 아데포비르, 아만타딘, 암프레나비르, 아르비돌, 아타자나비르, 아트리플라, 시도포비르, 콤비비르, 다루나비르, 델라비르딘, 디다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르타이드, 엔테카비르, 진입 억제제, 팜시클로비르, 고정 용량 조합, 포미비르센, 포삼프레나비르, 포스카르네트, 포스포네트, 융합 억제제, 간시클로비르, 이바시타빈, 이뮤노비르, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비르, 이노신, 인테그라제 억제제, 인터페론 III형(예를 들어, IFN-λ 분자, 예컨대 IFN-λ1, IFN-λ2 및 IFN-λ3), 인터페론 II형(예를 들어, IFN-γ), 인터페론 I형(예를 들어, IFN-α, 예컨대 PEG화 IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω 및 IFN-ζ), 인터페론, 라미부딘, 로피나비르, 로비리드, MK-0518, 마라비록, 모록시딘, 넬피나비르, 네비라핀, 넥사비르, 뉴클레오사이드 유사체, 오셀타미비르, 펜시클로비르, 페라미비르, 플레코나릴, 포도필로톡신, 프로테아제 억제제, 역전사효소 억제제, 리바비린, 리만타딘, 리토나비르, 사퀴나비르, 스타부딘, 상승작용 향상제, 테노포비르, 테노포비르 디소프록실, 티프라나비르, 트리플루리딘, 트리지비르, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비르, 발간시클로비르, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비르, 지도부딘, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 유도체, 이의 유사체, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
지질 입자
본 발명의 지질 입자는 통상적으로 활성제 또는 치료제, 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 입자에서의 활성제 또는 치료제가 예를 들어 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의한 효소 분해에 수성 용액 중에 저항적이도록 활성제 또는 치료제는 지질 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 지질 입자는 인간과 같은 포유류에 실질적으로 비독성이다. 본 발명의 지질 입자는 통상적으로 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 내지 약 90 nm의 평균 직경을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자는 하나 이상의 핵산 분자, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA, aiRNA, 및/또는 miRNA) 또는 mRNA; 양이온성 지질(예를 들어, 화학식 I, II, 및/또는 III의 양이온성 지질); 비양이온성 지질(예를 들어, 단독의 콜레스테롤 또는 하나 이상의 인지질과 콜레스테롤의 혼합물); 및 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질(예를 들어, 하나 이상의 PEG-지질 접합체)을 포함하는 혈청-안정한 핵산-지질 입자(LNP)이다. LNP는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 이것 초과의 비변형된 및/또는 변형된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,753,613호; 제5,785,992호; 제5,705,385호; 제5,976,567호; 제5,981,501호; 제6,110,745호; 및 제6,320,017호; 및 PCT 공보 WO 제96/40964호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 각각의 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
비양이온성 지질
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)에서 사용된 비양이온성 지질은 안정한 복합체를 생성할 수 있는 임의의 다양한 천연 비하전된, 양쪽성 또는 음이온성 지질일 수 있다.
비양이온성 지질의 비제한적인 예는 인지질, 예컨대 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜글리세롤(POPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질이 또한 사용될 수 있다. 이 지질의 아실 기는 바람직하게는 C10-C24 탄소 사슬을 갖는 지방 산으로부터 유래된 아실 기, 예를 들어 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일이다.
비양이온성 지질의 추가 예는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 및 이의 유도체, 예컨대 콜레스타놀, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스타놀, 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-하이드록시부틸 에테르, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)에 존재하는 비양이온성 지질는 콜레스테롤 또는 이의 유도체, 예를 들어 인지질-비함유 지질 입자 제형을 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)에 존재하는 비양이온성 지질은 하나 이상의 인지질, 예를 들어 콜레스테롤-비함유 지질 입자 제형을 포함하거나 이들로 이루어진다. 추가의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)에 존재하는 비양이온성 지질은 하나 이상의 인지질과 콜레스테롤의 혼합물 또는 이의 유도체를 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 발명에 사용하기에 적합한 비양이온성 지질의 다른 예는 예를 들어 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤리시놀레이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴 중합체, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥실레이트화된 지방 산 아미드, 디옥타데실디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린 및 기타와 같은 비인 함유 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 비양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 13 mol% 내지 약 49.5 mol%, 약 20 mol% 내지 약 45 mol%, 약 25 mol% 내지 약 45 mol%, 약 30 mol% 내지 약 45 mol%, 약 35 mol% 내지 약 45 mol%, 약 20 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 30 mol% 내지 약 40 mol%를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 인지질-비함유 지질 입자에 존재하는 콜레스테롤은 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol% 내지 약 45 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 약 35 mol% 내지 약 45 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 40 mol%를 포함한다. 비제한적인 예로서, 인지질-유리 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 37 mol%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다.
소정의 다른 실시형태에서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 함유하는 지질 입자에 존재하는 콜레스테롤은 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 40 mol%를 포함한다. 비제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 34 mol%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 함유하는 지질 입자에 존재하는 콜레스테롤은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 또는 약 17 mol% 내지 약 23 mol%를 포함한다. 비제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다.
지질 입자가 인지질과 콜레스테롤의 혼합물 또는 콜레스테롤 유도체를 함유하는 실시형태에서, 혼합물은 입자에 존재하는 총 지질의 약 40, 45, 50, 55, 또는 60 mol% 이하를 포함할 수 있다. 소정의 경우에, 혼합물에서의 인지질 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 약 2 mol% 내지 약 12 mol%, 약 4 mol% 내지 약 10 mol%, 약 5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 5 mol% 내지 약 9 mol%, 또는 약 6 mol% 내지 약 8 mol%를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 7 mol%(예를 들어, 약 34 mol%의 콜레스테롤과의 혼합물로)의 인지질, 예컨대 DPPC 또는 DSPC를 포함할 수 있다. 소정의 다른 경우에, 혼합물에서의 인지질 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 또는 약 17 mol% 내지 약 23 mol%를 포함할 수 있다. 다른 비제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%(예를 들어, 약 20 mol%의 콜레스테롤과의 혼합물로)의 인지질, 예컨대 DPPC 또는 DSPC를 포함할 수 있다.
지질 접합체
양이온성 지질 및 비양이온성 지질 이외에, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 지질 접합체를 포함한다. 접합된 지질은 이것이 입자의 응집을 방지한다는 것에서 유용하다. 적합한 접합된 지질은 PEG-지질 접합체, ATTA-지질 접합체, 양이온성-중합체-지질 접합체(CPL), 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, 입자는 CPL과 함께 PEG-지질 접합체 또는 ATTA-지질 접합체 중 어느 하나를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 지질 접합체는 PEG-지질이다. PEG-지질의 예는 예를 들어 PCT 공보 WO 제05/026372호에 기재된 것과 같은 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(PEG-DAA), 예를 들어 미국 특허 공보 제20030077829호 및 제2005008689호에 기재된 것과 같은 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(PEG-DAG), 예를 들어 미국 특허 제5,885,613호에 기재된 것과 같은 인지질에 커플링된 PEG, 예컨대 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), 세라미드에 접합된 PEG, 콜레스테롤에 접합된 PEG 또는 이의 유도체, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 특허 문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 추가 PEG-지질은 제한 없이 PEG-C-DOMG, 2 KPEG-DMG, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
PEG는 2개의 말단 하이드록실 기를 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형 수용성 중합체이다. PEG는 이의 분자량에 의해 분류된다; 예를 들어, 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 2000, 및 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 5000. PEG는 Sigma Chemical Co. 및 다른 회사로부터 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들어 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 숙시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES) 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카보닐(MePEG-IM)을 포함한다. 다른 PEG, 예컨대 미국 특허 제6,774,180호 및 제7,053,150호에 기재된 것(예를 들어, mPEG (20 KDa) 아민)은 본 발명의 PEG-지질 접합체를 제조하는 데 또한 유용하다. 이들 특허의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 게다가, 모노메톡시폴리에틸렌글리콜아세트산(MePEG-CH2COOH)은 예를 들어 PEG-DAA 접합체를 포함하는 PEG-지질 접합체를 제조하는 데 특히 유용하다.
본원에 기재된 PEG-지질 접합체의 PEG 모이어티는 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤의 범위의 평균 분자량을 가질 수 있다. 소정의 경우에, PEG 모이어티는 약 750 달톤 내지 약 5,000 달톤(예를 들어, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤, 약 1,500 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 2,000 달톤 등)의 평균 분자량을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, PEG 모이어티는 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤의 평균 분자량을 갖는다.
소정의 경우에, PEG는 알킬, 알콕시, 아실, 또는 아릴 기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르 함유 링커 모이어티를 포함하여 PEG를 지질에 커플링하기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 링커 모이어티는 비-에스테르 함유 링커 모이어티이다. 본원에 사용된 것과 같이, 용어 "링커 모이어티를 함유하는 비에스테르"는 카복실산 에스테르 결합(-OC(O)-)을 함유하지 않는 링커 모이어티를 지칭한다. 적합한 비-에스테르 함유 링커 모이어티는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카보닐(-C(O)-), 카바메이트 (-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 디설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 숙시닐(-(O)CCH2CH2C(O)-), 숙신아미딜(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 디설파이드뿐만 아니라 이들의 조합(예컨대, 카바메이트 링커 모이어티 및 아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, 카바메이트 링커는 PEG를 지질에 커플링하도록 사용된다.
다른 실시형태에서, 에스테르 함유 링커 모이어티는 PEG를 지질에 커플링하도록 사용된다. 적합한 에스테르 함유 링커 모이어티는 예를 들어 카보네이트(-OC(O)O-), 숙시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 추가 PEG-지질 접합체는 하기 화학식의 화합물, 또는 이의 염을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:
A-B-C
상기 식 중,
A는 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C3-C8)사이클로알킬(C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, (C1-C6)알카노일, (C1-C6)알콕시카보닐, (C1-C6)알킬티오 또는 (C2-C6)알카노일옥시이고, 임의의 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C3-C8)사이클로알킬(C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, (C1-C6)알카노일, (C1-C6)알콕시카보닐, (C1-C6)알킬티오 및 (C2-C6)알카노일옥시는 하나 이상의 음이온성 전구체 기로 치환되고, 임의의 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C3-C8)사이클로알킬(C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, (C1-C6)알카노일, (C1-C6)알콕시카보닐, (C1-C6)알킬티오 및 (C2-C6)알카노일옥시는 할로, 하이드록실, (C1-C3)알콕시, (C1-C6)알카노일, (C1-C3)알콕시카보닐, (C1-C3)알킬티오 또는 (C2-C3)알카노일옥시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
B는 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 사슬이고;
C는 -L-Ra이고;
L은 직접 결합, -C(O)O-, -C(O)NRb-, -NRb-, -C(O)-, -NRbC(O)O-, -NRbC(O)NRb-, -S-S-, -O-, -(O)CCH2CH2C(O)- 및 -NHC(O)CH2CH2C(O)NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ra는 분지된 (C10-C50)알킬 또는 분지된 (C10-C50)알케닐이고, 분지된 (C10-C50)알킬 또는 분지된 (C10-C50)알케닐의 하나 이상의 탄소 원자는 -O-로 대체되었고;
각각의 Rb는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬이다.
접합된 지질은 예를 들어 화학식 A-PEG-디아실글리세롤(DAG), A-PEG 디알킬옥시프로필(DAA), A-PEG-인지질, A-PEG-세라미드(Cer)의 화합물을 포함하는 PEG-지질, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있고, A는 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C3-C8)사이클로알킬(C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, (C1-C6)알카노일, (C1-C6)알콕시카보닐, (C1-C6)알킬티오 또는 (C2-C6)알카노일옥시이고, 임의의 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C3-C8)사이클로알킬(C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, (C1-C6)알카노일, (C1-C6)알콕시카보닐, (C1-C6)알킬티오 및 (C2-C6)알카노일옥시는 하나 이상의 음이온성 전구체 기로 치환되고, 임의의 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C3-C8)사이클로알킬(C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, (C1-C6)알카노일, (C1-C6)알콕시카보닐, (C1-C6)알킬티오 및 (C2-C6)알카노일옥시는 할로, 하이드록실, (C1-C3)알콕시, (C1-C6)알카노일, (C1-C3)알콕시카보닐, (C1-C3)알킬티오 또는 (C2-C3)알카노일옥시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다. A-PEG-DAA 접합체는 A-PEG-디라우릴옥시프로필(C12), A-PEG-디미리스틸옥시프로필(C14), A-PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 또는 A-PEG-디스테아릴옥시프로필(C18), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
변하는 사슬 길이 및 포화도의 다양한 아실 사슬 기를 갖는 포스파티딜에탄올아민은 지질 접합체를 형성하도록 PEG에 접합될 수 있다. 이러한 포스파티딜에탄올아민은 상업적으로 입수 가능하거나, 당업자에게 공지된 종래의 기법을 사용하여 단리되거나 합성될 수 있다. C10 내지 C20의 범위의 탄소 사슬 길이를 갖는 포화된 또는 불포화된 지방 산을 함유하는 포스파티딜에탄올아민이 바람직하다. 단일-불포화된 또는 이불포화된 지방 산 및 포화된 지방 산과 불포화된 지방 산의 혼합물을 갖는 포스파티딜에탄올아민을 또한 사용할 수 있다. 적합한 포스파티딜에탄올아민은 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE) 및 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "ATTR" 또는 "폴리아미드"는 제한 없이 미국 특허 제6,320,017호 및 제6,586,559호에 기재된 화합물을 지칭하고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 이들 화합물은 하기 식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00008
상기 식 중, R은 수소, 알킬 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고; R1은 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이거나; 선택적으로, R 및 R1 및 이들이 결합된 질소는 아지도 모이어티를 형성하고; R2는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 아릴 및 아미노산의 측쇄로부터 선택된 군의 구성원이고; R3은 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 머캅토, 하이드라지노, 아미노 및 NR4R5로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 알킬이고; n은 4 내지 80이고; m은 2 내지 6이고; p는 1 내지 4이고; q는 0 또는 1이다. 다른 폴리아미드가 본 발명의 화합물에 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다.
용어 "디아실글리세롤"은 R1 및 R2인 2개의 지방 아실 사슬을 갖는 화합물을 지칭하는데, 이들의 둘 다는 독립적으로 에스테르 연결에 의해 글리세롤의 1-위치 및 2-위치에 결합된 2개 내지 30개의 탄소를 갖는다. 아실 기는 포화되거나 변하는 정도의 불포화를 가질 수 있다. 적합한 아실 기는 라우릴(C12), 미리스틸(C14), 팔미틸(C16), 스테아릴(C18) 및 이코실(C20)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, R1 및 R2는 동일하고, 예를 들어 R1 및 R2는 둘 다 미리스틸(예를 들어, 디미리스틸)이고, R1 및 R2는 둘 다 스테아릴(예를 들어, 디스테아릴) 등이다. 디아실글리세롤은 하기 일반 식을 갖는다:
Figure pct00009
용어 "디알킬옥시프로필"은 R1 및 R2인 2개의 알킬 사슬을 갖는 화합물을 지칭하고, 이들의 둘 다는 독립적으로 2개 내지 30개의 탄소를 갖는다. 알킬 기는 포화되거나 변하는 정도의 불포화를 가질 수 있다. 디알킬옥시프로필은 하기 일반 식을 갖는다:
Figure pct00010
바람직한 실시형태에서, PEG-지질은 하기 식을 갖는 PEG-DAA 접합체이다:
Figure pct00011
상기 식 중, R1 및 R2는 독립적으로 선택되고, 약 10개 내지 약 22개의 탄소 원자를 갖는 긴-사슬 알킬 기이고; PEG는 폴리에틸렌글리콜이고; L은 상기 정의된 것과 같은 비-에스테르 함유 링커 모이어티 또는 에스테르 함유 링커 모이어티이다. 긴-사슬 알킬 기는 포화 또는 불포화될 수 있다. 적합한 알킬 기는 라우릴(C12), 미리스틸(C14), 팔미틸(C16), 스테아릴(C18) 및 이코실(C20)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, R1 및 R2는 동일하고, 예를 들어 R1 및 R2는 둘 다 미리스틸(예를 들어, 디미리스틸)이고, R1 및 R2는 둘 다 스테아릴(예를 들어, 디스테아릴) 등이다.
상기 화학식 VII에서, PEG는 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤의 범위의 평균 분자량을 갖는다. 소정의 경우에, PEG는 약 500 달톤 내지 약 5,000 달톤(예를 들어, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤, 약 1,500 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 2,000 달톤 등)의 평균 분자량을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, PEG는 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEG는 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴로 선택적으로 치환될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 말단 하이드록실 기는 메톡시 또는 메틸 기로 치환된다.
바람직한 실시형태에서, "L"은 비-에스테르 함유 링커 모이어티이다. 적합한 비-에스테르 함유 링커는 아미도 링커 모이어티, 아미노 링커 모이어티, 카보닐 링커 모이어티, 카바메이트 링커 모이어티, 우레아 링커 모이어티, 에테르 링커 모이어티, 디설파이드 링커 모이어티, 숙신아미딜 링커 모이어티, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, 비-에스테르 함유 링커 모이어티는 카바메이트 링커 모이어티(예를 들어, PEG-C-DAA 접합체)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 비-에스테르 함유 링커 모이어티는 아미도 링커 모이어티(예를 들어, PEG-A-DAA 접합체)이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 비-에스테르 함유 링커 모이어티는 숙신아미딜 링커 모이어티(예를 들어, PEG-S-DAA 접합체)이다.
특정 실시형태에서, PEG-지질 접합체는
Figure pct00012
; 및
Figure pct00013
로부터 선택된다.
일 실시형태에서, n은 생성된 중합체 사슬이 약 2000의 분자량을 갖도록 선택된다.
PEG-DAA 접합체는 당업자에게 공지된 표준 기법 및 시약을 사용하여 합성된다. PEG-DAA 접합체가 다양한 아미드, 아민, 에테르, 티오, 카바메이트 및 우레아 연결을 함유할 것이라고 인식될 것이다. 당업자는 이 결합을 형성하기 위한 방법 및 시약이 잘 공지되고 용이하게 이용 가능하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992); Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989); 및 Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5th ed. (Longman 1989)를 참조한다. 존재하는 임의의 작용기가 PEG-DAA 접합체의 합성에서 상이한 점에 보호 및 탈보호를 요할 수 있다고 또한 이해될 것이다. 당업자는 이러한 기법이 잘 이해된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991)을 참조한다.
바람직하게는, PEG-DAA 접합체는 디라우릴옥시프로필 (C12)-PEG 접합체, 디미리스틸옥시프로필 (C14)-PEG 접합체, 디팔미틸옥시프로필 (C16)-PEG 접합체 또는 디스테아릴옥시프로필 (C18)-PEG 접합체이다. 당업자는 다른 디알킬옥시프로필이 본 발명의 PEG-DAA 접합체에 사용될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
상기 이외에, PEG 대신에 다른 친수성 중합체가 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명확할 것이다. PEG 대신에 사용될 수 있는 적합한 중합체의 예는 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 유도체화된 셀룰로스, 예컨대 하이드록시메틸셀룰로스 또는 하이드록시에틸셀룰로스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다중양이온성 모이어티에 대한 전하는 전체 입자 모이어티 주위에 분포될 수 있거나, 대안적으로, 이것은 입자 모이어티의 하나의 특정 부위, 예를 들어 전하 스파이크에서 전하 밀도의 별개의 농도일 수 있다. 전하 밀도가 입자에 분포되면, 전하 밀도는 균등하게 분포되거나 비균등하게 분포될 수 있다. 다중양이온성 모이어티의 전하 분포의 모든 변형은 본 발명에 의해 포함된다.
지질 "A" 및 비면역원성 중합체 "W"는 다양한 방법에 의해 및 바람직하게는 공유 부착에 의해 부착될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법은 "A" 및 "W"의 공유 부착에 사용될 수 있다. 적합한 연결은 아미드, 아민, 카복실, 카보네이트, 카바메이트, 에스테르 및 하이드라존 연결을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 연결을 유발하기 위해 "A" 및 "W"가 상보성 작용기를 가져야 한다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 하나는 지질에 있고 다른 것은 중합체에 있는 이들 2개의 기의 반응은 원하는 연결을 제공할 것이다. 예를 들어, 활성 에스테르를 형성하도록 지질이 디아실글리세롤이고 말단 하이드록실이 예를 들면 NHS 및 DCC로 활성화되고, 이후 아미노 기를 함유하는 중합체, 예컨대 폴리아미드와 반응할 때(예를 들어, 미국 특허 제6,320,017호 및 제6,586,559호 참조, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨), 아미드 결합은 2개의 기 사이에 형성할 것이다.
소정의 경우에, 다중양이온성 모이어티는 칼슘을 복합체화하기 위한 표적화 리간드 또는 킬레이팅 모이어티와 같은 부착된 리간드를 가질 수 있다. 바람직하게는, 리간드가 부착된 후, 양이온성 모이어티는 양전하를 유지한다. 소정의 경우에, 부착된 리간드는 양전하를 갖는다. 적합한 리간드는 반응성 작용기를 갖는 화합물 또는 장치를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 지질, 양친매성 지질, 담체 화합물, 생물친화도 화합물, 생물재료, 생물중합체, 생체의학 장치, 분석적으로 검출 가능한 화합물, 치료학적 활성 화합물, 효소, 펩타이드, 단백질, 항체, 면역 자극제, 방사선표지, 형광원, 비오틴, 약물, 합텐, DNA, RNA, 폴리사카라이드, 리포솜, 비로솜, 미셀, 면역글로불린, 작용기, 다른 표적화 모이어티 또는 독소를 포함한다.
지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)는 통상적으로 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%, 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 1 mol% 내지 약 10 mol%, 약 0.6 mol% 내지 약 1.9 mol%, 약 0.7 mol% 내지 약 1.8 mol%, 약 0.8 mol% 내지 약 1.7 mol%, 약 0.9 mol% 내지 약 1.6 mol%, 약 0.9 mol% 내지 약 1.8 mol%, 약 1 mol% 내지 약 1.8 mol%, 약 1 mol% 내지 약 1.7 mol%, 약 1.2 mol% 내지 약 1.8 mol%, 약 1.2 mol% 내지 약 1.7 mol%, 약 1.3 mol% 내지 약 1.6 mol%, 또는 약 1.4 mol% 내지 약 1.5 mol%를 포함한다.
당업자는 지질 접합체의 농도가 사용된 지질 접합체 및 핵산-지질 입자가 융해성이 되는 속도에 따라 변할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
지질 접합체의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 접합체가 핵산-지질 입자에서 교환하는 속도 및 결국 핵산-지질 입자가 융해성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 예를 들면, PEG-포스파티딜에탄올아민 접합체 또는 PEG-세라미드 접합체가 지질 접합체로서 사용될 때, 핵산-지질 입자가 융해성이 되는 속도는 예를 들어 지질 접합체의 농도를 변화시킴으로써, PEG의 분자량을 변화시킴으로써, 또는 포스파티딜에탄올아민 또는 세라미드에 대한 아실 사슬 기의 사슬 길이 및 포화도를 변화시킴으로써 변할 수 있다. 게다가, 예를 들어, pH, 온도, 이온 강도 등을 포함하는 다른 변수는 핵산-지질 입자가 융해성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어하도록 사용될 수 있다. 핵산-지질 입자가 융해성이 되는 속도를 제어하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 본 개시내용을 읽을 시 당업자에게 명확해질 것이다.
지질 입자의 제조
활성제 또는 치료제, 예컨대 핵산 분자가 지질 이중층에 캡슐화되고 분해로부터 보호된 본 발명의 지질 입자, 예를 들어 LNP는 비제한적인 예로서 연속 혼합 방법 또는 직접 희석 공정을 포함하는 임의의 방법에 의해 형성될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 I, II, 및 III의 지질, 또는 이들의 조합이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 비양이온성 지질은 에그 스핑고미엘린(ESM), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린(DPPC), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 14:0 PE(1,2-디미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE)), 16:0 PE(1,2-디팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE)), 18:0 PE(1,2-디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)), 18:1 PE(1,2-디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)), 18:1 트랜스 PE(1,2-디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE)), 18:0-18:1 PE(1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE)), 16:0-18:1 PE(1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE)), 폴리에틸렌 글리콜계 중합체(예를 들어, PEG 2000, PEG 5000, PEG-변형된 디아실글리세롤 또는 PEG-변형된 디알킬옥시프로필), 콜레스테롤, 또는 이들의 조합이다.
소정의 실시형태에서, 본 발명은 연속 혼합 방법, 예를 들어 제1 저장소에서 핵산, 예컨대 간섭 RNA 또는 mRNA를 포함하는 수성 용액을 제공하는 것, 제2 저장소에서 유기 지질 용액을 제공하는 것, 및 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)을 캡슐화하는 리포솜을 실질적으로 순간적으로 제조하도록 유기 지질 용액이 수성 용액과 혼합하도록 수성 용액을 유기 지질 용액과 혼합하는 것을 포함하는 공정을 통해 제조된 LNP를 제공한다. 이 공정 및 이 공정을 수행하기 위한 장치는 미국 특허 공보 제20040142025호에 자세히 기재되어 있고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
지질 및 완충액 용액을 혼합 환경으로, 예컨대 혼합 챔버에서 연속하여 도입하는 작용은 완충액 용액에 의한 지질 용액의 연속 희석을 야기하여서, 혼합 시 실질적으로 즉각적으로 리포솜을 제조한다. 본원에 사용된 것과 같이, "지질 용액을 완충액 용액으로 연속하여 희석하는"이라는 구절(및 변형어)은 일반적으로 지질 용액이 베시클 생성을 유발하는 충분한 힘으로 수화 공정에서 충분히 신속하게 희석된다는 것을 의미한다. 핵산을 포함하는 수성 용액을 유기 지질 용액과 혼합함으로써, 유기 지질 용액은 핵산-지질 입자를 제조하기 위해 완충액 용액(예를 들어, 수성 용액)의 존재 하에 연속 단계식 희석을 겪는다.
연속 혼합 방법을 사용하여 형성된 LNP는 통상적으로 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집하지 않고, 균일한 입자 크기를 달성하도록 선택적으로 크기화된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 리포솜 용액을 형성하는 것 및 희석 완충액의 제어된 양을 함유하는 수집 용기로 리포솜 용액을 즉시 및 직접 도입하는 것을 포함하는 직접 희석 공정을 통해 제조된 LNP를 제공한다. 바람직한 양태에서, 수집 용기는 희석을 수월하게 하도록 수집 용기의 내용물을 교반하도록 구성된 하나 이상의 부재를 포함한다. 일 양태에서, 수집 용기에 존재하는 희석 완충액의 양은 이것에 도입된 리포솜 용액의 부피와 실질적으로 동일하다. 비제한적인 예로서, 45% 에탄올에서의 리포솜 용액은 희석 완충액의 동일한 부피를 함유하는 수집 용기로 도입될 때 유리하게는 더 작은 입자를 생성할 것이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 희석 완충액을 함유하는 제3 저장소가 제2 혼합 영역에 유체 커플링된 직접 희석 공정을 통해 제조된 LNP를 제공한다. 이 실시형태에서, 제1 혼합 영역에서 형성된 리포솜 용액은 제2 혼합 영역에서 희석 완충액과 즉시 및 직접 혼합된다. 바람직한 양태에서, 제2 혼합 영역은 리포솜 용액 및 희석 완충액 흐름이 반대의 180° 흐름으로서 만나도록 배열된 T-연결기를 포함하지만; 예를 들어, 약 27° 내지 약 180°의 더 얕은 각도를 제공하는 연결기가 사용될 수 있다. 펌프 기구는 제2 혼합 영역으로의 완충액의 제어 가능한 흐름을 전달한다. 일 양태에서, 제2 혼합 영역에 제공된 희석 완충액의 흐름 속도는 제1 혼합 영역으로부터 이것에 도입된 리포솜 용액의 흐름 속도와 실질적으로 동일하도록 제어된다. 이 실시형태는 유리하게는 제2 혼합 영역에서 리포솜 용액과 혼합하는 희석 완충액의 흐름, 및 따라서 또한 제2 혼합 공정에 걸쳐 완충액에서의 리포솜 용액의 농도의 더 많은 제어를 허용한다. 희석 완충액 흐름 속도의 이러한 제어는 유리하게는 감소된 농도에서 작은 입자 크기 형성을 허용한다.
이 공정 및 이 직접 희석 공정을 수행하기 위한 장치는 미국 특허 공보 제20070042031호에 자세히 기재되어 있고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
직접 희석 공정을 사용하여 형성된 LNP는 통상적으로 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집하지 않고, 균일한 입자 크기를 달성하도록 선택적으로 크기화된다.
필요하면, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 리포솜을 크기화하는 데 이용 가능한 임의의 방법에 의해 크기화될 수 있다. 입자 크기의 원하는 크기 범위 및 비교적 좁은 분포를 달성하도록 크기화가 수행될 수 있다.
몇몇 기법은 원하는 크기로 입자를 크기화하기 위해 이용 가능하다. 리포솜에 사용되고 동등하게 본 입자에 동등하게 적용 가능한 하나의 크기화 방법은 미국 특허 제4,737,323호에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 욕 또는 프로브 음파처리에 의한 입자 현탁액의 음파처리는 약 50 nm 미만의 크기의 입자로 진행적 크기 감소를 생성한다. 균질화는 더 큰 입자를 더 작은 입자로 단편화하기 위한 전단 에너지에 의존하는 다른 방법이다. 통상적인 균질화 절차에서, 입자는 선택된 입자 크기, 통상적으로 약 60 내지 약 80 nm가 관찰될 때까지 표준 에멀션 균질화기를 통해 재순환된다. 방법 둘 다에서, 입자 크기 분포는 종래의 레이저-빔 입자 크기 구별 또는 QELS에 의해 모니터링될 수 있다.
작은-기공 폴리카보네이트 막 또는 비대칭 세라믹 막을 통한 입자의 압출은 또한 비교적 잘 한정된 크기 분포로 입자 크기를 감소시키기 위한 효과적인 방법이다. 통상적으로, 현탁액은 원하는 입자 크기 분포가 달성될 때까지 1회 이상 막을 통해 순환된다. 입자는 점진적 크기 감소를 달성하기 위해 성공적으로 더 작은-기공 막을 통해 압출될 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP에서의 핵산은 예를 들어 미국 특허 출원 제09/744,103호에 기재된 것처럼 예비응축되고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 본 조성물을 사용하여 세포의 리포펙션을 가져오도록 유용한 비-지질 다중양이온을 첨가하는 것을 추가로 포함할 것이다. 적합한 비-지질 다중양이온의 예는 헥사디메트린 브로마이드(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis., USA의 브랜드명 POLYBRENE®으로 판매됨) 또는 헥사디메트린의 다른 염을 포함한다. 다른 적합한 다중양이온은 예를 들어 폴리-L-오르니틴, 폴리-L-아르기닌, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 폴리알릴아민 및 폴리에틸렌이민의 염을 포함한다. 이들 염의 첨가는 바람직하게는 입자가 형성된 후이다.
일부 실시형태에서, 형성된 LNP에서의 핵산 대 지질 비(질량/질량 비)는 약 0.01 내지 약 0.2, 약 0.02 내지 약 0.1, 약 0.03 내지 약 0.1, 또는 약 0.01 내지 약 0.08의 범위일 것이다. 출발 재료의 비는 또한 이 범위 내에 해당한다. 다른 실시형태에서, LNP 제제는 10 mg의 총 지질당 약 400 μg의 핵산 또는 약 0.01 내지 약 0.08 및 더 바람직하게는 50 μg의 핵산당 1.25 mg의 총 지질에 상응하는 약 0.04의 핵산 대 지질 질량비를 사용한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 입자는 약 0.08의 핵산:지질 질량비를 갖는다.
다른 실시형태에서, 형성된 LNP에서의 지질 대 핵산 비(질량/질량비)는 약 1 (1:1) 내지 약 100 (100:1), 약 5 (5:1) 내지 약 100 (100:1), 약 1 (1:1) 내지 약 50 (50:1), 약 2 (2:1) 내지 약 50 (50:1), 약 3 (3:1) 내지 약 50 (50:1), 약 4 (4:1) 내지 약 50 (50:1), 약 5 (5:1) 내지 약 50 (50:1), 약 1 (1:1) 내지 약 25 (25:1), 약 2 (2:1) 내지 약 25 (25:1), 약 3 (3:1) 내지 약 25 (25:1), 약 4 (4:1) 내지 약 25 (25:1), 약 5 (5:1) 내지 약 25 (25:1), 약 5 (5:1) 내지 약 20 (20:1), 약 5 (5:1) 내지 약 15 (15:1), 약 5 (5:1) 내지 약 10 (10:1), 약 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (7:1), 8 (8:1), 9 (9:1), (10:1), 11 (11:1), 12 (12:1), 13 (13:1), 14 (14:1), 15 (15:1), 16 (16:1), 17 (17:1), 18 (18:1), 19 (19:1), 20 (20:1), 21 (21:1), 22 (22:1), 23 (23:1), 24 (24:1), 25 (25:1), 26 (26:1), 27 (27:1), 28 (28:1), 29 (29:1) 또는 30 (30:1)의 범위일 것이다. 출발 재료의 비는 또한 통상적으로 이 범위 내에 해당한다.
이전에 기술된 것과 같이, 접합된 지질은 CPL을 추가로 포함할 수 있다. LNP-CPL(CPL-함유 LNP)을 제조하기 위한 다양한 일반 방법이 본원에 기술된다. 2가지 일반 기법은 예를 들어 미리 형성된 LNP로의 CPL의 삽입인 "삽입후" 기법 및 CPL이 예를 들어 LNP 형성 단계 동안 지질 혼합물에 포함된 "표준" 기법을 포함한다. 후삽입 기법은 주로 LNP 이중층 막의 외부 면에서 CPL을 갖는 LNP를 생성시키는 반면, 표준 기법은 내부 면 및 외부 면 둘 다에서 CPL을 갖는 LNP를 제공한다. 상기 방법은 인지질로부터 제조된 베시클(콜레스테롤을 함유할 수 있음) 및 또한 PEG-지질(예컨대, PEG-DAA 및 PEG-DAG)을 함유하는 베시클에 특히 유용하다. LNP-CPL을 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,705,385호; 제6,586,410호; 제5,981,501호; 제6,534,484호; 및 제6,852,334호; 미국 특허 공보 제20020072121호; 및 PCT 공보 WO 제00/62813호에 교시되어 있고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
LNP를 생성하기 위한 다른 방법은 예를 들어 미국 특허 제9,005,654호 및 PCT 공보 WO 제2007/012191호에서 발견될 수 있고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
키트
본 발명은 또한 키트 형태의 지질 입자(예를 들어, LNP)를 제공한다. 키트는 지질 입자의 다양한 요소(예를 들어, 활성제 또는 치료제, 예컨대 핵산 및 입자의 개별 지질 성분)를 보유하기 위해 구분된 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 엔도솜 막 탈안정화제(예를 들어, 칼슘 이온)를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 통상적으로 이의 재수화 및 투여에 대한 설명과 함께 바람직하게는 탈수된 형태로 본 발명의 지질 입자 조성물을 함유한다.
본원에 설명된 것과 같이, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 관심 있는 특정 조직, 장기 또는 종양을 우선적으로 표적화하도록 맞춤될 수 있다. 소정의 경우에, LNP와 같은 지질 입자의 우선적인 표적화는 입자 자체의 조성을 제어함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 실시예 11에 기재된 것과 같이, 1:57의 PEG-cDSA LNP 제형이 간의 바깥에서 종양을 우선적으로 표적화하도록 사용될 수 있는 반면, 1:57의 PEG-cDMA LNP 제형은 간(간 종양을 포함)을 우선적으로 표적화하도록 사용될 수 있다는 것이 발견되었다.
소정의 다른 경우에, 입자의 표적화를 추가로 향상시키기 위해 지질 입자의 표면에 부착된 표적화 모이어티를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 표적화 모이어티(예를 들어, 항체, 단백질 등)를 지질(예컨대, 본 입자에 사용된 것)에 부착하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
지질 입자의 투여
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 형성되면 세포로의 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산, 예컨대 간섭 RNA 또는 mRNA)의 도입에 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 세포로 활성제 또는 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)을 도입하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 기재된 것과 같은 입자를 처음에 형성하고 이후 세포에 대한 활성제 또는 치료제의 전달이 발생하기에 충분한 시간 기간 동안 입자를 세포와 접촉시킴으로써 시험관내 또는 생체내 수행된다.
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 이것이 혼합되거나 접촉된 거의 임의의 세포형에 흡착될 수 있다. 입자가 흡착되면 세포의 일부에 의해 내포작용되거나, 지질을 세포막과 교환하거나, 세포와 융합할 수 있다. 입자의 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산) 부분의 이동 또는 혼입은 이들 경로 중 임의의 하나를 통해 발생할 수 있다. 특히, 융합이 발생할 때, 입자 막은 세포막으로 통합되고, 입자의 내용물은 세포내 유체와 조합된다.
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 단독으로 또는 투여 경로 및 표준 약학 실행에 따라 선택된 약제학적으로-허용 가능한 담체(예를 들어, 생리학적 식염수 또는 포스페이트 완충액)와의 혼합물로 투여될 수 있다. 일반적으로, 노르말 완충 식염수(예를 들어, 135 내지 150 mM NaCl)는 약제학적으로-허용 가능한 담체로서 사용될 것이다. 지질은 또한 안정화하도록 동결될 수 있다. 예를 들어, 지질은 pH 8의 트리스(Tris) 완충액 중 높은 염 농도(예를 들어, 500 mM NaCl)에서 -20C에서 저장될 수 있다. 추가의 예로서, 지질은 pH 8의 트리스 완충액 중 수크로스와 말토스의 혼합물에서 -80C 저장에서 또한 저장될 수 있다. 다른 적합한 담체는 향상된 안정성을 위한 당단백질, 예컨대 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함하는 예를 들어 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 및 기타를 포함한다. 추가의 적합한 담체는 예를 들어 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)에 기재되어 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드, 및 기타를 포함한다. "약제학적으로-허용 가능한"이라는 구절은 인간에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 집합체 및 조성물을 지칭한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 입자 형성 후에 첨가된다. 이와 같이, 입자가 형성된 후, 입자는 약제학적으로-허용 가능한 담체, 예컨대 노르말 완충 식염수로 희석될 수 있다.
약제학적 제형에서의 입자의 농도는 예를 들어 약 0.05중량% 미만으로부터, 보통 또는 적어도 약 2 내지 5중량%에서, 약 10 내지 90 중량%정도까지 많이 광범위하게 변할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라 주로 유체 부피, 점도 등에 의해 선택될 것이다. 예를 들어, 농도는 치료와 연관된 유체 로드를 낮추도록 증가될 수 있다. 이는 죽상동맥경화증-연관된 울혈성 심부전 또는 중증 고혈압을 갖는 환자에서 특히 바람직할 수 있다. 대안적으로, 자극성 지질로 구성된 입자는 투여의 부위에서 염증을 줄이도록 낮은 농도로 희석될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 잘 공지된 멸균 기법에 의해 멸균화될 수 있다. 수성 용액은 사용을 위해 패키징되거나 무균 조건 하에 여과되고, 동결건조되고, 동결건조된 제제는 투여 전에 무균 수성 용액과 조합된다. 상기 조성물은 생리학적 조건을 근사화하는 데 필요한 약제학적으로-허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 긴장성 조정제 및 기타, 예를 들어 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화칼슘을 함유할 수 있다. 추가적으로, 입자 현탁액은 저장 시 자유-라디칼 및 지질-과산화적 손상에 대해 지질을 보호하는 지질-보호제를 포함할 수 있다. 친유성 자유-라디칼 켄쳐, 예컨대 알파토코페롤 및 수용성 철-특이적 킬레이터, 예컨대 페리옥사민이 적합하다.
생체내 투여
생체내 치료를 위한 전신 전달, 예를 들어 순환과 같은 신체 시스템을 통한 원위 표적 세포로의 치료학적 핵산의 전달은 PCT 공보 WO 제05/007196호, WO 제05/121348호, WO 제05/120152호 및 WO 제04/002453호에 기재된 것과 같은 핵산-지질 입자를 사용하여 달성되고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 또한 혈청에서 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호하고, 비면역원성이고, 크기가 작고, 반복 투여에 적합한 완전히 캡슐화된 지질 입자를 제공한다.
생체내 투여를 위해, 투여는 예를 들어 주사, 경구 투여, 흡입(예를 들어, 비강내 또는 기관내), 피부경유 적용 또는 직장 투여에 의해 당해 분야에 공지된 임의의 방식으로 일 수 있다. 투여는 단일 용량 또는 분할 용량을 통해 달성될 수 있다. 약제학적 조성물은 비경구로, 예를 들어 관절내, 정맥내로, 복강내, 피하로 또는 근육내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 볼루스 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여된다(예를 들어, 미국 특허 제5,286,634호 참조). 세포내 핵산 전달은 또한 Straubringer et al., Methods Enzymol., 101:512 (1983); Mannino et al., Biotechniques, 6:682 (1988); Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989); 및 Behr, Acc. Chem. Res., 26:274 (1993)에 기술되어 있다. 지질계 치료제를 투여하는 또 다른 방법은 예를 들어 미국 특허 제3,993,754호; 제4,145,410호; 제4,235,871호; 제4,224,179호; 제4,522,803호; 및 제4,588,578에 기술되어 있다. 지질 입자는 질환의 부위에서의 직접 주사에 의해 또는 질환의 부위로부터 먼 부위에서의 주사에 의해 투여될 수 있다(예를 들어, Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71 (1994) 참조). 상기 기재된 참고문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 조성물은, 단독이든 또는 다른 적합한 성분과 조합되든, 흡입(예를 들어, 비강내 또는 기관내)을 통해 투여되는 에어로졸 제형(예를 들어, 이들은 "분무화(nebulized)"될 수 있음)으로 제조될 수 있다(Brigham et al., Am. J. Sci., 298:278 (1989) 참조). 에어로졸 제형은 가압된 허용 가능한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소, 및 기타에 놓일 수 있다.
소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비강내 스프레이, 흡입, 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 핵산 조성물을 비강 에어로졸 스프레이를 통해 폐로 직접 전달하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,756,353호 및 미국 특허 제5,804,212호에 기재되어 있다. 마찬가지로, 비강내 마이크로입자 수지 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물을 사용한 약물의 전달(미국 특허 제5,725,871호)은 또한 약제학적 분야에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스의 형태의 경점막 약물 전달은 미국 특허 제5,780,045호에 기재되어 있다. 상기 기재된 특허의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, (관절에서) 관절내, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제형이 의도된 수혜자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 본 발명의 실행에서, 조성물은 바람직하게는 예를 들어 정맥내 점적에 의해, 경구로, 국소로, 복강내로, 베시클내로 또는 척추강내로 투여된다.
일반적으로, 정맥내로 투여될 때, 지질 입자 제형은 적합한 약제학적 담체로 제형화된다. 많은 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 제형은 예를 들어 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)에서 확인된다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 및 기타가 사용될 수 있고, 향상된 안정성을 위한 당단백질, 예컨대 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다. 일반적으로, 노르말 완충 식염수(135-150 mM NaCl)는 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 것이지만, 다른 적합한 담체가 충분할 것이다. 이 조성물은 종래의 리포솜 멸균 기법, 예컨대 여과에 의해 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 생리학적 조건을 근사화하는 데 필요한 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 긴장성 조정제, 습윤제 및 기타, 예를 들어 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다. 이 조성물은 상기 언급된 기법을 사용하여 멸균될 수 있거나, 대안적으로 이것은 멸균 조건 하에 제조될 수 있다. 생성된 수성 용액은 사용을 위해 패키징되거나 무균 조건 하에 여과되고, 동결건조되고, 동결건조된 제제는 투여 전에 무균 수성 용액과 조합된다.
소정의 분야에서, 본원에 개시된 지질 입자는 개체에 대한 경구 투여를 통해 전달될 수 있다. 입자는 부형제와 혼입될 수 있고, 섭취용 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 환제, 로젠지, 엘릭시르, 마우스워시, 현탁액, 경구 스프레이, 시럽, 웨이퍼 및 기타의 형태로 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,641,515호, 제5,580,579호 및 제5,792,451호 참조, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 이 경구 투여 형태는 또한 하기를 함유할 수 있다: 결합제, 젤라틴; 부형제, 활택제, 및/또는 착향료. 단위 투여 형태가 캡슐일 때, 이것은 상기 기재된 재료 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 재료는 코팅으로서 또는 달리 투여 단위의 물리적 형태를 개질하기 위해 존재할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태를 제조하는 데 사용된 임의의 재료는 약제학적으로 순수하고 사용된 양에서 실질적으로 비독성이어야 한다.
통상적으로, 이 경구 제형은 적어도 약 0.1% 이상의 지질 입자를 함유할 수 있지만, 입자의 백분율은 물론 변할 수 있고, 편리하게는 총 제형의 중량 또는 부피의 약 1% 또는 2% 내지 약 60% 또는 70% 또는 이것 초과 사이일 수 있다. 물론, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물에서의 입자의 양은 화합물의 임의의 소정의 단위 용량에서 적합한 투여량이 얻어지는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 유통기한과 같은 인자뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항은 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이고, 그러므로, 다양한 투여량 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
경구 투여에 적합한 제형은 (a) 액체 용액, 예컨대 희석제, 예컨대 물, 식염수 또는 PEG 400에 현탁된 패키징된 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)의 유효량; (b) 액체, 고체, 과립 또는 젤라틴으로서 미리결정된 양의 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)을 각각 함유하는 캡슐, 사세 또는 정제; (c) 적절한 액체 중의 현탁액; 및 (d) 적합한 에멀션으로 이루어질 수 잇다. 정제 형태는 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 미정질 셀룰로스, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 탈크, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 및 다른 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제, 착향료, 염료, 붕괴제, 및 약제학적 상용성 담체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 수크로스와 같은 향에서의 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)뿐만 아니라 젤라틴 및 글리세린과 같은 불활성 기제에서의 치료제를 포함하는 파스틸, 또는 치료제 이외에 당해 분야에 공지된 담체를 함유하는 수크로스 및 아카시아 에멀션, 겔 및 기타를 포함할 수 있다.
이의 용도의 다른 예에서, 지질 입자는 광범위한 국소 투여 형태로 혼입될 수 있다. 예를 들면, LNP와 같은 핵산-지질 입자를 함유하는 현탁액은 겔, 오일, 에멀션, 국소 크림, 페이스트, 연고, 로션, 폼, 무스, 및 기타로서 제형화되고 투여될 수 있다.
본 발명의 지질 입자의 약제학적 제제를 제조할 때, 빈 입자 또는 외부 표면과 연관된 핵산과 같은 치료제를 갖는 입자를 감소시키거나 제거하기 위해 정제된 입자의 분량을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 다양한 숙주에서 실행될 수 있다. 바람직한 숙주는 포유류 종, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간 및 침팬지뿐만 아니라 다른 비인간 영장류), 개과, 고양이과, 말과, 소과, 양과, 염소과, 설치류(예를 들어, 래트 및 마우스), 토끼목 및 돼지과를 포함한다.
투여된 입자의 양은 치료제(예를 들어, 핵산) 대 지질의 비, 사용된 특정 치료제(예를 들어, 핵산), 치료되는 질환 또는 장애, 환자의 연령, 체중 및 컨디션, 및 임상의의 판단에 따라 달라질 것이지만, 일반적으로 체중의 킬로그램당 약 0.01 내지 약 50 mg, 바람직하게는 체중의 kg당 약 0.1 및 약 5 mg, 또는 투여(예를 들어, 주사)당 약 108 내지 1010개의 입자일 것이다.
시험관내 투여
시험관내 분야를 위해, 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)의 전달은 식물 또는 동물 기원, 척추동물 또는 비척추동물이든, 및 임의의 조직 또는 유형의 것이든 배양물에서 성장된 임의의 세포에 대한 것일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 동물 세포, 더 바람직하게는 포유류 세포, 및 가장 바람직하게는 인간 세포이다.
세포와 지질 입자 사이의 접촉은, 시험관내 수행될 때, 생물학적으로 상용성인 배지에서 수행한다. 입자의 농도는 특정 분야에 따라 광범위하게 변하지만, 일반적으로 약 1 μmol 내지 약 10 mmol이다. 지질 입자에 의한 세포의 치료는 일반적으로 약 1 내지 48시간, 바람직하게는 약 2 내지 4시간의 시간의 기간 동안 생리학적 온도(약 37℃)에서 수행된다.
바람직한 실시형태의 하나의 군에서, 지질 입자 현탁액은 약 103 내지 약 105 세포/ml, 더 바람직하게는 약 2×104 세포/ml의 세포 밀도를 갖는 60% 내지 80% 포화 플레이팅된 세포에 첨가된다. 세포에 첨가되는 현탁액의 농도는 바람직하게는 약 0.01 내지 0.2 μg/ml, 더 바람직하게는 약 0.1 μg/ml이다.
엔도솜 방출 매개변수(ERP: Endosomal Release Parameter) 검정을 사용하여, 본 발명의 LNP 또는 다른 지질 입자의 전달 효율이 최적화될 수 있다. ERP 검정은 미국 특허 공보 제20030077829호에 자세히 기재되어 있고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 더 특히, ERP 검정의 목적은 엔도솜 막과의 결합/흡수 또는 융합/엔도솜 막의 탈안정화에 대한 이의 상대 효과에 기초하여 다양한 양이온성 지질 및 LNP의 헬퍼 지질 성분의 효과를 구별하는 것이다. 이 검정은 LNP 또는 다른 지질 입자의 각각의 성분이 어떻게 전달 효율에 영향을 미치는지를 정량적으로 결정하게 하여서, LNP 또는 다른 지질 입자를 최적화한다. 보통, ERP 검정은 리포터 단백질(예를 들어, 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP) 등)의 발현을 측정하고, 일부 경우에, 발현 플라스미드에 최적화된 LNP 제형은 또한 간섭 RNA 또는 mRNA를 캡슐화하는 데 적절할 것이다. 다른 경우에, ERP 검정은 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 존재 또는 부재 하에 표적 서열의 전사 또는 번역의 하향조절을 측정하도록 적응될 수 있다. 다른 경우에, ERP 검정은 mRNA의 존재 또는 부재 하에 표적 단백질의 발현을 측정하도록 적응될 수 있다. 다양한 LNP 또는 다른 지질 입자의 각각에 대해 ERP를 비교함으로써, 최적화된 시스템, 예를 들어 LNP 또는 세포에서 가장 큰 흡수를 갖는 다른 지질 입자를 용이하게 결정할 수 있다.
지질 입자의 전달을 위한 세포
본 발명의 조성물 및 방법은 생체내 및 시험관내 매우 다양한 세포형을 치료하기 위해 사용된다. 적합한 세포는 예를 들어 조혈 전구체 (줄기) 세포, 섬유아세포, 각질형성세포, 간세포, 내피 세포, 골격 및 평활근 세포, 골아세포, 뉴런, 휴지 림프구, 말단 분화된 세포, 느린 또는 비순환 1차 세포, 실질 세포, 림프구 세포, 상피 세포, 골 세포, 및 기타를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 활성제 또는 치료제, 예컨대 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA) 또는 mRNA)는 예를 들어, 폐암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 항문암 세포, 담관암 세포, 소장암 세포, 위(위장)암 세포, 식도암 세포, 담낭암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 충수암 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 전립선암 세포, 신장암 세포, 중추 신경계의 암 세포, 교모세포종 종양 세포, 피부암 세포, 림프종 세포, 융모막암종 종양 세포, 두경부암 세포, 골원성 육종 종양 세포 및 혈액암 세포와 같은 암 세포에 전달된다.
하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA) 또는 mRNA)를 캡슐화하는 LNP와 같은 지질 입자의 생체내 전달은 임의의 세포형의 세포를 표적화하는 데 적합하다. 방법 및 조성물은 예를 들어 개과, 고양이과, 말과, 소과, 양과, 염소과, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트 및 기니아 피그), 토끼목, 돼지과 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지 및 인간)와 같은 포유류를 포함하는 매우 다양한 척추동물의 세포와 사용될 수 있다.
세포의 조직 배양이 필요할 수 있는 정도로, 이것은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd Ed., Wiley-Liss, New York (1994), Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977), 및 이것에 인용된 문헌은 세포의 배양에 일반 가이드를 제공한다. 세포 현탁액이 또한 사용되지만, 배양된 세포 시스템은 대개 세포의 단일층의 형태일 것이다.
지질 입자의 검출
일부 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간 또는 이것 초과 시간에 대상체에서 검출 가능하다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 입자의 투여 후 약 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 60시간, 72시간 또는 96시간, 또는 약 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 19일, 22일, 24일, 25일 또는 28일에 대상체에서 검출 가능하다. 입자의 존재는 대상체로부터의 세포, 조직 또는 다른 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 입자는 예를 들어 입자의 직접 검출, 치료학적 핵산, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA) 서열 또는 mRNA 서열의 검출, 관심 있는 표적 서열의 검출(예를 들어, 관심 서열의 발현 또는 감소된 발현을 검출함으로써), 또는 이들의 조합에 의해 검출될 수 있다.
입자의 검출
본 발명의 지질 입자, 예컨대 LNP는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 라벨은 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 지질 입자의 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 매우 다양한 라벨은 필요한 선택도, 지질 입자 성분과의 접합의 용이성, 안정성 요건 및 이용 가능한 기기장치 및 폐기 제공에 따라 라벨의 선택에 의해 사용될 수 있다. 적합한 라벨은 스펙트럼 라벨, 예컨대 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 Oregon Green™; 로다민 및 유도체, 예컨대 텍사스 레드, 테트라로디민 이소티오시아네이트(TRITC) 등, 디곡시제닌, 비오틴, 피코에리쓰린, AMCA, CyDyes™ 및 기타; 방사선표지, 예컨대 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 33P 등; 효소, 예컨대 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타제 등; 스펙트럼 비색 라벨, 예컨대 콜로이드성 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱 비드, 예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 라벨은 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 검출될 수 있다.
핵산의 검출
핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)은 당업자에게 잘 공지된 임의의 다수의 수단에 의해 본원에서 검출되고 정량화된다. 핵산의 검출은 사우던 분석, 노던 분석, 겔 전기영동, PCR, 방사선표지, 섬광 계수 및 친화도 크로마토그래피와 같은 잘 공지된 방법에 의해 진행할 수 있다. 추가적인 분석 생화학 방법, 예컨대 분광광도법, 라디오그래피(radiography), 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC) 및 과학산 크로마토그래피가 또한 사용될 수 있다.
핵산 혼성화 형식의 선택은 중요하지 않다. 다양한 핵산 혼성화 형식은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 흔한 형식은 샌드위치 검정 및 경쟁 또는 변위 검정을 포함한다. 혼성화 기법은 일반적으로 예를 들어 "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach," Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985)에 기재되어 있다.
혼성화 검정의 민감도는 검출되는 표적 핵산을 증대시키는 핵산 증폭 시스템의 사용을 통해 향상될 수 있다. 분자 프로브로서 사용하기 위한 서열을 증폭하기 위해 또는 후속하는 서브클로닝을 위해 핵산 단편을 생성하기 위해 적합한 시험관내 증폭 기법이 공지되어 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), Qβ-복제효소 증폭 및 다른 RNA 중합효소 매개된 기법(예를 들어, NASBA™)을 포함하는 이러한 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자를 지시하기에 충분한 기법의 예는 Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000); 및 Ausubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (2002);뿐만 아니라 미국 특허 제4,683,202호; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990), C&EN 36; The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990); Lomell et al., J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Landegren et al., Science, 241:1077 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990); Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringer et al., Gene, 89:117 (1990); 및 Sooknanan and Malek, Biotechnology, 13:563 (1995)에서 확인된다. 시험관내 증폭된 핵산을 클로닝하는 개선된 방법은 미국 특허 제5,426,039호에 기재되어 있다. 당해 분야에 기재된 다른 방법은 핵산 서열 기반 증폭(NASBA™, Cangene, Mississauga, Ontario) 및 Qβ-복제효소 시스템이다. 이 시스템은 오직 선택 서열이 존재할 때 PCR 또는 LCR 프라이머가 연장되거나 결찰되도록 설계된 돌연변이체를 직접 확인하도록 사용될 수 있다. 대안적으로, 선택 서열은 일반적으로 예를 들어 비특이적 PCR 프라이머를 사용하여 증폭되고, 증폭된 표적 영역은 후에 돌연변이를 나타내는 특이적 서열에 대해 프로빙될 수 있다. 상기 기재된 문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어 시험관내 증폭 방법에서 프로브로서 사용하기 위한, 유전자 프로브, 또는 억제제 성분으로서 사용하기 위한 핵산은 통상적으로 Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984)에 기재된 것과 같은 예를 들어 자동 합성장치를 사용하여 Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22:1859 1862 (1981)에 의해 기재된 고상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성된다. 폴리뉴클레오타이드의 정제는, 필요한 경우, 통상적으로 자연적 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 Pearson et al., J. Chrom., 255:137 149 (1983)에 기재된 것과 같은 음이온 교환 HPLC에 의해 수행된다. 합성 폴리뉴클레오타이드의 서열은 Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499에서의 Maxam 및 Gilbert (1980)의 화학 분해 방법을 사용하여 검증될 수 있다.
전사의 수준을 결정하기 위한 대안적인 수단은 인시츄 혼성화이다. 인시츄 혼성화 검정은 잘 알려져 있고, 일반적으로 Angerer et al., Methods Enzymol., 152:649 (1987)에 기재되어 있다. 인시츄 혼성화 검정에서, 세포는 고체 지지체, 통상적으로 유리 슬라이드에 고정된다. DNA가 프로빙되면, 세포를 열 또는 알칼리로 변성한다. 이후, 세포는 표지되는 특정 프로브의 어닐링을 허용하도록 보통의 온도에서 혼성화 용액과 접촉한다. 프로브는 바람직하게는 방사선동위원소 또는 형광 리포터로 표지된다.
실시예
본 발명은 구체적인 실시예에 의해 더 자세히 기재될 것이다. 하기 실시예는 예시 목적을 위해 제공되고, 임의의 방식으로 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다. 당업자는 본질적으로 동일한 결과를 생성하도록 변하거나 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수를 용이하게 인식할 것이다.
실시예 1
Figure pct00014
반응식 1
(Z)-데크-4-엔-1-일 메탄설포네이트(1)의 합성
Figure pct00015
DCM(400 mL, 0.67 M) 중의 (4Z)-데크-4-엔-1-올(42 g, 268.8 mmol) 및 TEA(32.6 g, 45.3 mL, 0.72 g/mL, 322.5 mmol)의 냉각된 용액(0℃)에 메탄설포닐 클로라이드(32.3 g, 21.8 mL, 282.2 mmol)를 30분에 걸쳐 적가하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 완료 시 반응물을 포화 중탄산나트륨(2 x 250mL)으로 세척하고, 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축 건조시켰다. 생성물을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
(Z)-운데크-5-엔니트릴(2)의 합성
Figure pct00016
N,N-디메틸포름아미드(268.8 mL, 1 M) 중의 (4Z)-데크-4-엔-1-일 메탄설포네이트 1(63 g, 268.8 mmol)의 용액에 NaCN(39.5 g, 806.5 mmol)을 첨가하였다. 용액을 100℃에서 밤새 가열하였다. 완료 시 반응물을 냉각시키고, EtOAc(300 mL)와 H2O(600 mL)에 분배하였다. 수성 상을 EtOAc(2 x 200 mL)로 추출하고, 합한 유기물을 염수(3 x 250 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축 건조시켰다. 잔류물을 처음에 헥산(500 mL)으로, 이어서 헥산 중의 5% 에틸 아세테이트(1500 mL)로 용리하는 실리카의 플러그(8" 길이 x 3" 폭)를 통해 플러싱하여 (5Z)-운데크-5-엔니트릴 2(36 g, 217.8 mmol, 81.0%)를 무색의 오일로서 제공하였다.
에틸 (Z)-운데크-5-에노에이트(3)의 합성
Figure pct00017
무수 에탄올 중의 (5Z)-운데크-5-엔니트릴 2(36 g, 217.8 mmol)의 용액에 포화까지 0℃에서 HCl 가스로 버블링하였다. 용액을 밤새 80℃로 가열하였다. 완료 시 용액을 실온으로 냉각시키고, 이후 농축 건조시켰다. 황색의 오일을 에틸 아세테이트(400 mL)에 용해시키고, 포화 중탄산나트륨(1 x 250 mL) 및 염수(1 x 250 mL)로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔(헥산 중 0-10% 에틸 아세테이트)에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 에틸 (5Z)-운데크-5-에노에이트 3(36 g, 77.8%)을 무색의 오일로서 제공하였다.
(6Z,16Z)-12-하이드록시도코사-6,16-디엔-11-온(4)의 합성
Figure pct00018
무수 톨루엔(100 mL, 0.38 M) 중의 나트륨 금속(4.33 g, 188.4 mmol)의 용액에 클로로트리메틸실란(17.2 g, 20.1 mL, 158.2 mmol)을 천천히 첨가하였다. 용액을 40℃로 가열하고, 이후 톨루엔(25 mL) 중의 에틸 (5Z)-운데크-5-에노에이트 3(8 g, 37.7 mmol)의 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 용액을 1.5시간 동안 환류시키고, 이후 얼음물 욕에서 0℃로 냉각시켰다. 남은 미반응 나트륨 및 고체를 톨루엔 린스에 의해 셀라이트를 통해 여과시켰다. 용액은 염화암모늄(200 mL), 이어서 1M HCl(50 mL)로 산성이 되었다. 톨루엔 층을 분리하고, 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (6Z,16Z)-12-하이드록시도코사-6,16-디엔-11-온 4(3.5 g, 55.2%)의 합성을 무색의 오일로서 제공하였다.
(Z)-운데크-5-엔산(5)의 합성
Figure pct00019
1:1:1의 메탄올, THF 및 물(60 mL) 중의 에틸 (5Z)-운데크-5-에노에이트 5(5 g, 23.5 mmol)의 용액에 수산화리튬(1.12 g, 47.1 mmol)을 첨가하였따. 용액을 실온에서 밤새 교반하고, 이후 농축 건조시키고 물 중의 5% HCl(50 mL)로 산성화시켰다. 용액을 에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 추출하고, 합한 추출물을 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축 건조시켜 (5Z)-운데크-5-엔산 5(4.1 g, 94.5%)를 무색의 오일로서 제공하였다.
(6Z,16Z)-12-옥소도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트(6)의 합성
Figure pct00020
에틸 아세테이트(25 mL) 중의 (6Z,16Z)-12-하이드록시도코사-6,16-디엔-11-온 4(3.4 g, 10.1 mmol), N-에틸디이소프로필아민(2.61 g, 3.53 mL, 20.2 mmol) 및 (5Z)-운데크-5-엔산 5(2.05 g, 11.1 mmol)의 냉각된 용액(0℃)에 에틸 아세테이트 중의 50% T3P 용액(3.22 g, 6.43 mL, 50 w/v %, 10.1 mmol)을 적가하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC는 무반응을 나타냈다. 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(3.84 g, 10.102 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(0.03 g, 0.20 mmol)을 첨가하고, 밤새 80C로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, EtOAc로 희석하고, 이후 포화 중탄산나트륨으로 1시간 동안 격렬히 교반하였다. 에틸 아세테이트를 분리하고, 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 0-5% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 (6Z,16Z)-12-옥소도코사-6,16-디엔-11-일 (5Z)-운데크-5-에노에이트 6(3.5 g, 68.9%)을 담황색의 오일로서 제공하였다.
(6Z,16Z)-12-(l1-옥시다네일)도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트(7)의 합성
Figure pct00021
무수 메탄올(20 mL, 0.36 M) 및 THF(10 mL, 0.72 M) 중의 (5Z,15Z)-10-옥소헤니코사-5,15-디엔-11-일 (5Z)-운데크-5-에노에이트 6(3.5 g, 7.16 mmol)의 냉각된 용액(0C)에 수소화붕소나트륨(1.36 g, 35.8 mmol)을 30분에 걸쳐 천천히 부분으로 첨가하였다. 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 이후 물(5 mL)로 천천히 켄칭하고 농축시켰다. 남은 수성 용액을 물(50 mL)로 희석하고, 이후 EtOAc(2 x 75 mL)로 추출하고, 황산 마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축 건조시켰다. 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 0-50% 에틸 아세테이트)에 의한 정제는 (5Z,15Z)-10-하이드록시헤니코사-5,15-디엔-11-일 (5Z)-운데크-5-에노에이트 7(2.1 g, 59.8%)을 무색의 오일로서 제공하였다.
(6Z,16Z)-12-((6-브로모헥사노일)옥시)도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트(8)의 합성
Figure pct00022
디클로로메탄(10 mL, 0.198 M) 중의 (6Z,16Z)-12-하이드록시도코사-6,16-디엔-11-일 (5Z)-운데크-5-에노에이트 7(1 g, 1.98 mmol), 6-브로모헥산산(502 mg, 2.58 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(979 mg, 2.58 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민(768 mg, 1038 μL, 0.74 g/mL, 5.9 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 완료 시 용액을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고. 포화 중탄산나트륨(2 x 100 mL)으로 세척하고, 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축 건조시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 0-10% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 (6Z,16Z)-12-((6-브로모헥사노일)옥시)도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트 8(1.2 g, 88.8%)을 무색의 오일로서 제공하였다.
(6Z,16Z)-12-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트(9)의 합성
Figure pct00023
에탄올(6.6 mL, 2 M, 13.2 mmol) 중의 디메틸아민 중의 (6Z,16Z)-12-[(6-브로모헥사노일)옥시]도코사-6,16-디엔-11-일 (5Z)-운데크-5-에노에이트 8(900 mg, 1.32 mmol)의 용액을 밀봉 반응 용기에서 밤새 90℃로 가열하였다. 완료 시 용액을 포화 중탄산나트륨에 붓고, 30분 동안 교반하였다. 용액을 에틸 아세테이트(3 x 75 mL)로 추출하고, 합한 추출물을 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축 건조시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 중 0-10% MeOH)에 의해 정제하여 (6Z,16Z)-12-{[6-(디메틸아미노)헥사노일]옥시}도코사-6,16-디엔-11-일 (5Z)-운데크-5-에노에이트 9(440 mg, 51.6%)를 담황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 5.45 - 5.23 (m, 6H), 5.04 - 4.93 (m, 2H), 2.47 - 2.21 (m, 12H), 2.46 - 2.26 (m, 12H), 1.73 - 1.46 (m, 10H), 1.43 - 1.18 (m, 25H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 9H).
Figure pct00024
화합물 10-12를 (6Z,16Z)-12-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트 9와 유사한 절차를 사용하여 합성하였다.
메틸 (Z)-도데크-5-에노에이트(13)의 합성
Figure pct00025
0℃에서의 무수 메탄올(100 mL, 0.4 M) 중의 시스-5-도데센산(8 g, 40.3 mmol)의 용액에 온도를 10℃ 아래로 유지시키면서 ~15분에 걸쳐 티오닐 클로라이드(9.6 g, 5.9 mL, 80.7 mmol)를 적가하였다. 완료 시 용액을 농축 건조시키고, 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
(7Z,17Z)-13-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)테트라코사-7,17-디엔-12-일 (Z)-도데크-5-에노에이트(14)의 합성
Figure pct00026
화합물 14를 에스테르 13으로부터 시작하여 (6Z,16Z)-12-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트 9와 유사한 절차를 사용하여 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 5.47 - 5.21 (m, 6H), 5.04 - 4.95 (m, 2H), 2.40 - 2.22 (m, 12H), 2.12 - 1.93 (m, 13H), 1.74 - 1.60 (m, 4H), 1.59 - 1.47 (m, 7H), 1.43 - 1.22 (m, 33H), 0.93 - 0.83 (m, 9H).
12-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)도코산-11-일 운데카노에이트(15)의 합성
Figure pct00027
메탄올(20 mL, 0.037 M) 중의 (6Z,16Z)-12-{[6-(디메틸아미노)헥사노일]옥시}도코사-6,16-디엔-11-일 (5Z)-운데크-5-에노에이트 9(475 mg, 0.75 mmol)의 용액에 탄소상 10% 팔라듐(50 mg)을 첨가하였다. 용액을 수소 하에 실온에서 밤새 격렬히 교반하였다. 완료 시 용액을 셀라이트를 통해 여과시키고, 농축 건조시켜 12-{[6-(디메틸아미노)헥사노일]옥시}도코산-11-일 운데카노에이트 15(168 mg, 35.0%)를 무색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 5.02 - 4.90 (m, 2H), 2.49 (br s, 2H), 2.44 - 2.36 (m, 6H), 2.36 - 2.22 (m, 6H), 1.69 - 1.56 (m, 6H), 1.55 - 1.40 (m, 4H), 1.40 - 1.09 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 9H).
Figure pct00028
반응식 2
(6Z,16Z)-12-옥소도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트(16)의 합성
Figure pct00029
DCM(100 mL, 0.238 M) 중의 (6Z,16Z)-12-하이드록시도코사-6,16-디엔-11-온 4(8 g, 23.77 mmol), 6-브로모헥산산(5.56 g, 28.5 mmol), N-에틸디이소프로필아민(6.14 g, 8.3 mL, 47.5 mmol), 디사이클로헥실카보디이미드(5.89 g, 28.5 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(73 mg, 0.59 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 완료 시 용액을 농축 건조시키고, 생성된 오일 잔류물을 헥산에 용해시키고, 우레아 부산물을 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 농축 건조시키고, 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 0-10% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 (6Z,16Z)-12-옥소도코사-6,16-디엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 16(12.0 g, 98.3%)을 담황색의 오일로서 제공하였다.
(6Z,16Z)-12-옥소도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트(17)의 합성
Figure pct00030
화합물 17을 (6Z,16Z)-12-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트 9와 유사한 절차를 사용하여 합성하여 무색의 오일(4.3 g, 38.5%)을 제공하였다.
(6Z,16Z)-12-하이드록시도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트(18)의 합성
Figure pct00031
화합물 18을 (6Z,16Z)-12-(l1-옥시다네일)도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트 7과 유사한 절차를 사용하여 합성하여 담황색의 오일(1.2 g, 28.4%)을 제공하였다.
(6Z,16Z)-12-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)도코사-6,16-디엔-11-일 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트 19의 합성
Figure pct00032
화합물 19를 (6Z,16Z)-12-옥소도코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트 6과 유사한 절차를 사용하여 합성하여 19를 담황색의 오일(171 mg, 27.6 %)로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 5.43 - 5.22 (m, 8H), 5.04 - 4.92 (m, 2H), 2.76 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.48 - 2.22 (m, 12H), 2.09 - 1.93 (m, 12H), 1.69 - 1.49 (m, 12H), 1.41 - 1.19 (m, 32H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 9H).
Figure pct00033
화합물 20-22를 (6Z,16Z)-12-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)코사-6,16-디엔-11-일 (Z)-운데크-5-에노에이트 19와 유사한 방식으로 합성하였다.
따라서, 본 발명의 소정의 실시형태는 예를 들어 실시예 1 및/또는 하기 표에서 본원에 도시된 화합물, 또는 이의 염 중 어느 하나에 관한 것이다.
Figure pct00034
Figure pct00035
실시예 2
실험
일반적 제형화 절차:
지질 용액은 PEG-접합된 지질, 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤 및 인지질(예를 들어, DSPC)의 4개의 성분을 함유하였다. 기재된 것과 같은 지질 정체 및 몰비를 사용하여 지질 스톡을 제조하였다. siRNA를 대략 10:1 내지 20:1의 총 지질 대 siRNA 중량비에서 지질 나노입자(LNP)를 제조하도록 100 mM 아세테이트, pH 4 완충액에 희석하였다. 동일 부피의 지질 및 핵산 용액을 T-connector를 통해 400 mL/분의 유속으로 블렌딩하고, PBS, pH 7.4로 희석하였다. 이후, 에탄올을 제거하고, 외부 완충액을 투석에 의해 Tris/NaCl 완충액으로 대체하였다. 투석 후, 제형을 VivaSpin 집중장치 유닛(MWCO 100,000)을 사용하여 농축시키고, 0.2 μm 기공 무균 필터를 통해 여과시켰다. RiboGreen 검정에 의해 핵산 농도를 결정하였다. Malvern Nano Series Zetasizer를 사용하여 입자 크기 및 다분산도를 결정하였다.
활성 평가:
일반적으로, HSC-LNP의 활성을 측정하기 위해 암컷 Balb/C 마우스(5주령 내지 8주령)에 0.025 mg/kg로 LNP 제형을 정맥내로 주사하였다. 주사 바로 전에, siRNA LNP 스톡을 여과시키고, 필요한 투입 농도로 희석하였다. 투여후 48시간(종료 시점)에, 동물을 케타민/자일라진의 치사 용량으로 안락사시켰다. 간의 왼쪽 측엽의 절반을 1.5 mL의 RNALater에 수집하고, 2℃ 내지 8℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 대략 20 내지 25 mg의 간 조각을 균질화하고, 간 용해물을 QuantiGene Assay에 사용하여, 마우스 표적 mRNA 및 GAPDH 발현의 상대 수준을 시험한다. 각각의 동물로부터의 데이터는 검정에 사용된 간 중량으로, 및 이어서 GAPDH 신호에 대해 정규화되고; 데이터는 각각의 그룹의 % 평균 넉다운으로 보고된다(여기서 PBS 대조군 그룹은 100% 유전자 발현, 0% 넉다운이다).
내약성 평가:
일반적으로, HSC-LNP의 내약성을 평가하기 위해 암컷 Balb/C 마우스(5주령 내지 8주령)에 ~0.03 내지 3 mg/kg로 LNP 제형을 정맥내로 주사하였다. 주사 바로 전에, siRNA LNP 스톡을 여과시키고, 필요한 투입 농도로 희석하였다. 처리후 2시간에, (ELISA에 의한 사이토카인 분석을 위해) 혈액을 꼬리 닉을 통해 수집하고 혈장으로 가공하였다. 종료 시점(투여후 24시간)에, 혈액을 심장 천자(표적 ≥ 800 μL)에 의해 수집하고, CRES 15 패널 분석(CBC/Diff & Clin Chem 분석)을 위해 IDEXX로 보냈다.
간단히, 혈액(~300 uL)을 EDTA 모세관채혈관에 수집하고, K2EDTA 전혈 샘플을 혼합하도록 10회 뒤집고, 혈액학 분석을 위해 동일 자 선적을 기다리도록 4℃에서 즉시 저장하였다. 남은 혈액 부피(~500 uL)를 혈청 분리기 관에 수집하고, SST 샘플을 혼합하도록 5회 뒤집고, 이후 실온에서 1시간 내지 1.5시간 동안 응고되게 하였다. 혈액 샘플을 원심분리하고, 임상 화학 분석을 위해 혈청을 수집하였다.
실험에서 하기 화합물을 사용하였다.
화합물 (100)
Figure pct00036
화합물 (101)
Figure pct00037
본원에 기재된 실험 및 도면에서 하기 화합물을 본 발명의 대표적인 화합물로서 사용하였다.
Figure pct00038
하기 siRNA 서열은 5'에서 3'로 사용되었다:
RELN:
S: GGucucAAGccAcucGuuudTsdT
AS: AAACGAGUGGCUUGAGACCdTsdT
범례:
대문자: 비변형된 뉴클레오타이드
소문자: 2'-OMe 변형
s: PS (포스포로티오에이트 연결)
TTR:
S: uGCUCUAUAAACCGUguUAGC
AS: UAACACgGUUUAuAGAgCAAG
범례:
대문자: 비변형된 리보뉴클레오타이드
소문자: 2'-OMe 변형
요약하면, 본원에 제시된 결과에 의해 입증된 것과 같이, 본원에 기재된 지질은 치료제가 HSC로 전달될 수 있고 내약성이 우수한 것을 포함하는 예를 들어 간 섬유증의 치료에 사용될 수 있는 간 성상 세포에 치료제를 전달하기에 중요한 여러 품질을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> GENEVANT SCIENCES GMBH <120> CATIONIC LIPIDS FOR LIPID NANOPARTICLE DELIVERY OF THERAPEUTICS TO HEPATIC STELLATE CELLS <130> 08750.008WO1 <140> PCT/US2021/022201 <141> 2021-03-12 <150> 62/990,939 <151> 2020-03-17 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ggucucaagc cacucguuut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2 aaacgagugg cuugagacct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ugcucuauaa accguguuag c 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 uaacacgguu uauagagcaa g 21

Claims (73)

  1. 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염:
    Figure pct00039

    상기 식 중,
    R1은 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
    R2는 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
    R3은 (C5-C25)알킬, (C5-C25)알케닐 또는 (C5-C25)알키닐이고;
    R4는 (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 (C3-C15)알키닐이고, (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 C3-C15)알키닐은 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
    각각의 Ra 및 Rb는 H 및, 할로 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; Ra 및 Rb는 이들이 부착된 질소와 함께 취해져 아지리딘, 아제타딘, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴리노 및 티오모르폴리노로 이루어진 군으로부터 선택된 고리를 형성하고, 고리는 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환됨.
  2. 제1항에 있어서, R1은 (C5-C25)알킬인, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R1은 (C5-C25)알케닐인, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R1은 (C5-C25)알키닐인, 화합물.
  5. 제1항에 있어서, R1은 (C5-C20)알킬인, 화합물.
  6. 제1항에 있어서, R1은 (C5-C20)알케닐인, 화합물.
  7. 제1항에 있어서, R1은 (C5-C20)알키닐인, 화합물.
  8. 제1항에 있어서, R1은 (C10-C20)알킬인, 화합물.
  9. 제1항에 있어서, R1은 (C10-C20)알케닐인, 화합물.
  10. 제1항에 있어서, R1은 (C10-C20)알키닐인, 화합물.
  11. 제1항에 있어서, R1은 4-데센-1-일 또는 8,10-헵타데카디엔-1-일인, 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C5-C25)알킬인, 화합물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C5-C25)알케닐인, 화합물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C5-C25)알키닐인, 화합물.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C5-C20)알킬인, 화합물.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C5-C20)알케닐인, 화합물.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C5-C20)알키닐인, 화합물.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C10-C20)알킬인, 화합물.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C10-C20)알케닐인, 화합물.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 (C10-C20)알키닐인, 화합물.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 4-데센-1-일인, 화합물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C5-C25)알킬인, 화합물.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C5-C25)알케닐인, 화합물.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C5-C25)알키닐인, 화합물.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C5-C20)알킬인, 화합물.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C5-C20)알케닐인, 화합물.
  27. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C5-C20)알키닐인, 화합물.
  28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C10-C20)알킬인, 화합물.
  29. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C10-C20)알케닐인, 화합물.
  30. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 (C10-C20)알키닐인, 화합물.
  31. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 4-데센-1-일인, 화합물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C15)알킬인, 화합물.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C15)알케닐인, 화합물.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C15)알키닐인, 화합물.
  35. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C10)알킬인, 화합물.
  36. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C10)알케닐인, 화합물.
  37. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 (C3-C10)알키닐인, 화합물.
  38. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 (C3-C10)알킬, (C3-C10)알케닐 또는 (C3-C10)알키닐이고, (C3-C10)알킬, (C3-C10)알케닐 및 (C3-C10)알키닐은 클로로, 브로모, 요오도 및 -NRaRb로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된, 화합물.
  39. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 (C3-C15)알키닐이고, (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 및 C3-C15)알키닐은 클로로, 브로모 또는 요오도로 치환된, 화합물.
  40. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 또는 (C3-C15)알키닐이고, (C3-C15)알킬, (C3-C15)알케닐 및 C3-C15)알키닐은 -NRaRb로 치환된, 화합물.
  41. 제40항에 있어서, 각각의 Ra 및 Rb는 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
  42. 제40항에 있어서, 각각의 Ra 및 Rb는 메틸인, 화합물.
  43. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 5-(N,N-디메틸아미노)펜트-1-일인, 화합물.
  44. 하기 화합물, 또는 이의 염:
    Figure pct00040

    또는
    Figure pct00041

    상기 식 중,
    각각의 Ra 및 Rb는 H 및, 할로 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; Ra 및 Rb는 이들이 부착된 질소와 함께 취해져 아지리딘, 아제타딘, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴리노 및 티오모르폴리노로 이루어진 군으로부터 선택된 고리를 형성하고, 고리는 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환됨.
  45. 본원에 기재된 것과 같은 화합물로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 지질 입자.
  47. 제46항에 있어서, 비양이온성 지질을 추가로 포함하는, 지질 입자.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 추가로 포함하는, 지질 입자.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제를 추가로 포함하는, 지질 입자.
  50. 제49항에 있어서, 치료제는 핵산 치료제인, 지질 입자.
  51. 제50항에 있어서, 치료제는 간섭 RNA 제제인, 지질 입자.
  52. 제51항에 있어서, 치료제는 siRNA인, 지질 입자.
  53. 제50항에 있어서, 치료제는 mRNA인, 지질 입자.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 치료제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 지질 입자.
  55. 제54항에 있어서, 적어도 하나의 2'-O-메틸(2'OMe) 뉴클레오타이드를 포함하는, 지질 입자.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 비양이온성 지질은 콜레스테롤 또는 이의 유도체인, 지질 입자.
  57. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 비양이온성 지질은 콜레스테롤인, 지질 입자.
  58. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 비양이온성 지질은 인지질을 포함하는, 지질 입자.
  59. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 비양이온성 지질은 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는, 지질 입자.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)인, 지질 입자.
  61. 제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체인, 지질 입자.
  62. 제61항에 있어서, PEG-지질 접합체는 PEG-디미리스틸옥시프로필(PEG-DMA) 접합체인, 지질 입자.
  63. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 조성물.
  64. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항의 지질 입자, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  65. 치료제의 생체내 전달을 위한 방법으로서, 상기 방법은 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항의 지질 입자를 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  66. 포유류에 대한 치료제의 생체내 전달에 사용하기 위한, 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항의 지질 입자.
  67. 포유류에 대한 치료제의 생체내 전달을 위한 약제를 제조하기 위한, 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항의 지질 입자의 용도.
  68. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 포유류 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서,
    치료학적 유효량의 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항의 지질 입자를 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 질환 또는 장애는 간 섬유증인, 방법.
  70. 제68항에 있어서, 질환 또는 장애는 비알코올성 지방간염(NASH: non-alcoholic steatohepatitis)인, 방법.
  71. 제68항에 있어서, 질환 또는 장애는 알코올성 지방간염(ASH: alcoholic steatohepatitis)인, 방법.
  72. 제68항에 있어서, 질환 또는 장애는 간 섬유증 연관된 비알코올성 지방간염(NASH) 또는 알코올성 지방간염(ASH)인, 방법.
  73. 간 성상 세포(HSC)를 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항의 지질 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내 간 성상 세포(HSC)에 치료제를 전달하는 방법.
KR1020227035403A 2020-03-17 2021-03-12 간 성상 세포로 치료제의 지질 나노입자 전달을 위한 양이온성 지질 KR20220154740A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062990939P 2020-03-17 2020-03-17
US62/990,939 2020-03-17
PCT/US2021/022201 WO2021188389A2 (en) 2020-03-17 2021-03-12 Cationic lipids for lipid nanoparticle delivery of therapeutics to hepatic stellate cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220154740A true KR20220154740A (ko) 2022-11-22

Family

ID=77772142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227035403A KR20220154740A (ko) 2020-03-17 2021-03-12 간 성상 세포로 치료제의 지질 나노입자 전달을 위한 양이온성 지질

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230150926A1 (ko)
EP (1) EP4121018A2 (ko)
JP (1) JP2023518944A (ko)
KR (1) KR20220154740A (ko)
WO (1) WO2021188389A2 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114105799B (zh) * 2022-01-25 2022-05-10 中山大学附属第七医院(深圳) 一种氨基脂质及其制备方法和应用
WO2024026308A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Massachusetts Institute Of Technology COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF THE SIGNAL REGULATORY PROTEIN ALPHA (SIRPα) GENE

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7871967B2 (en) * 2007-02-12 2011-01-18 Chevron U.S.A. Inc. Diester-based lubricants and methods of making same
US20130085091A1 (en) * 2011-09-29 2013-04-04 Chevron U.S.A. Inc. Industrial oil comprising a bio-derived ester
AU2016209295B2 (en) * 2015-01-21 2021-08-12 Genevant Sciences Gmbh Methods, compositions, and systems for delivering therapeutic and diagnostic agents into cells
CN111031809A (zh) * 2018-03-16 2020-04-17 陶氏环球技术有限责任公司 食物中的泡沫控制

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021188389A3 (en) 2021-10-28
EP4121018A2 (en) 2023-01-25
JP2023518944A (ja) 2023-05-09
WO2021188389A2 (en) 2021-09-23
US20230150926A1 (en) 2023-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20180092848A1 (en) Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2020097520A1 (en) Cationic lipids containing silicon
US20110313017A1 (en) Snalp formulations containing polyoxazoline-dialkyloxypropyl conjugates
US20220072154A1 (en) Negatively charged peg-lipid conjugates
WO2023144798A1 (en) Ionizable cationic lipids for lipid nanoparticles
CN117479963A (zh) Peg脂质和脂质纳米粒子
US20230150926A1 (en) Cationic lipids for lipid nanoparticle delivery of therapeutics to hepatic stellate cells
US20230139594A1 (en) Cationic lipids for lipid nanoparticle delivery of therapeutics to hepatic stellate cells
CA3118557C (en) Negatively charged peg-lipid conjugates
US20240065982A1 (en) Lipid nanoparticles for delivering therapeutics to lungs