JP2020519277A

JP2020519277A - 細胞の操作のための材料及び方法並びに免疫腫瘍学におけるその使用

Info

Publication number: JP2020519277A
Application number: JP2019562274A
Authority: JP
Inventors: アレクサンダーテレットジョナサン; カライツィディスデメトリオス; クラインローレンス
Original assignee: クリスパーセラピューティクスアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2020-07-02
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: ZA201906923B; US20180325955A1; US20210252060A1; PH12019502529A1; US11135247B2; IL270415B1; US20210108174A1; US10881689B2; SA519410518B1; US20230044761A1; US10736919B2; US20190314414A1; AU2018367896A1; US20190365809A1; MX2019013514A; BR112019023608A2; WO2019097305A3; EP3621981A2; ZA202006500B; US20200405764A1

Abstract

細胞表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトを発現するように操作されたゲノム編集細胞を作製するための材料及び方法、並びに細胞における１つ以上の免疫腫瘍学関連遺伝子の発現、機能、又は活性を調節するゲノム編集のための材料及び方法、並びに操作されたゲノム編集細胞を使用して患者を治療するための材料及び方法。

Description

関連出願
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１７年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５０５，６４９号明細書、２０１７年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／５０８，８６２号明細書、２０１７年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５３８，１３８号明細書、２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６７，０１２号明細書、２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６７，００８号明細書、２０１７年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５８３，７９３号明細書、２０１８年３月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６３９，３３２号明細書、２０１８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／６４８，１３８号明細書、及び２０１８年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／６５５，５１０号明細書の利益を主張するものであり、これらの各々は参照により全体として本明細書に援用される。

一部の態様において、本願は、細胞表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトを発現するように操作されたゲノム編集細胞を作製するための材料及び方法を提供する。他の態様において、本願は、細胞における１つ以上の免疫腫瘍学関連遺伝子の発現、機能、又は活性を調節するゲノム編集のための材料及び方法を提供する。更に他の態様において、本願は、エキソビボ及びインビボの両方で、ゲノム編集された操作された細胞を使用して患者を治療するための材料及び方法を提供する。

配列表の参照による援用
本願はコンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：Ｃ１５４２７００００ＷＯ００−ＳＥＱ−ＨＪＤ；１．１９ＭＢ−ＡＳＣＩＩテキストファイル；作成日２０１８年５月１１日）を含み、これは全体として参照により本明細書に援用され、本開示の一部をなす。

ゲノム操作とは、生体の遺伝情報（ゲノム）を標的化して特異的に修飾するための戦略及び技法を指す。ゲノム操作は、特に人間の健康に関する領域において、例えば有害な突然変異を持つ遺伝子の修正又は遺伝子機能の探索に幅広い適用可能性があるため、活発な研究分野である。トランス遺伝子を生細胞に挿入するために開発された初期の技術は、多くの場合にゲノムへの新規配列の挿入位置がランダムである性質により制限された。ゲノムへのランダムな挿入は、隣接遺伝子の正常な調節を破壊することになり、意図せぬ重大な効果につながり得る。更に、２つの異なる細胞において配列が同じ箇所に挿入されるであろう保証がないことに伴い、ランダムな組込み技術は再現性をほとんど提供しない。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、及びＭｅｇａＴＡＬなどの一般的なゲノム操作戦略はＤＮＡの特異的な範囲の修飾を可能にし、従って初期の技術と比較すると修正又は挿入の精度は上がっている。これらのプラットフォームは高度な再現性を提供するが、依然として制限はある。

遺伝的障害に対処しようとする世界中の研究者及び医療専門家の努力にも関わらず、及び前出のゲノム操作手法の有望さにも関わらず、再生医学及び／又は免疫腫瘍学関連の適応疾患が関わる細胞療法治療を支援する安全且つ有効な万能ドナー細胞の開発が長年にわたり切実に必要とされ続けている。

本明細書には、一部の実施形態において、ある種の悪性腫瘍の治療に使用される細胞、方法、及び組成物（例えば、核酸、ベクター、医薬組成物）が提供される。本開示の遺伝子編集技術は、一部の態様において、ＣＤ１９、ＣＤ７０、又はＢＣＭＡ抗原を発現する腫瘍細胞を標的とする免疫細胞療法の操作に使用される。意外にも、本開示の方法により操作された免疫細胞療法は、インビボで腫瘍容積を未治療の対照と比べて一部の実施形態では少なくとも８０％低下させる能力を有する。本明細書に提供されるとおりの動物モデルからのデータは、操作された免疫細胞療法が、一部の実施形態において、検出可能な腫瘍細胞の存在をインビボ投与の僅か３０日後に消失させ、これらの動物モデルにおける効果は細胞療法の単回投与後に少なくとも６６日間持続することを実証する。更に、一部の実施形態において、本開示の操作された免疫細胞療法は、対象の生存率を未治療の対照と比べて少なくとも５０％上昇させる能力を有する。

更にまた、これらの細胞は宿主対移植片病及び移植片対宿主病の両方を遮断するように操作され、これにより細胞は、同種異系細胞移植治療法としての使用に好適となる。

更に、本明細書に提供される遺伝子コンストラクト及び方法は、一部の実施形態において、インビボでの投与前に細胞集団の精製又は集積が必要でない十分に高い遺伝子修飾効率での免疫細胞集団の操作に使用し得る。例えば、本開示の例示的な操作された細胞集団の免疫細胞の少なくとも８０％がＴ細胞受容体α定常遺伝子及びβ２ミクログロブリン遺伝子の両方の表面発現を欠いており、免疫細胞の少なくとも５０％はまた目的の（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ７０、又はＢＣＭＡを標的とする）特定のキメラ抗原受容体を発現する。

従って、本明細書には、一部の態様において、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子と、破壊されたβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子とを含む操作されたＴ細胞を含む細胞集団が提供され、ここで操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、且つ検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、及び／又は操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。

他の態様は、（ｉ）抗ＣＤ７０抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含むＣＡＲをコードする核酸の挿入によって破壊されたＴＲＡＣ遺伝子と、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子とを含む操作されたＴ細胞を含む細胞集団を提供し、ここで操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、且つ検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、及び／又は操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。

更に他の態様は、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含むＣＡＲをコードする核酸の挿入によって破壊されたＴＲＡＣ遺伝子と、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子とを含む操作されたＴ細胞を含む細胞集団を提供し、ここで操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、且つ検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、及び／又は操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。

本開示の一部の態様は、同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞の作製方法を提供し、この方法は、（ａ）Ｔ細胞を含む組成物に、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターとを送達することであって、ＣＡＲが（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含み、ＣＡＲをコードする核酸に、ＴＲＡＣ遺伝子座に対する左及び右相同性アームが隣接すること、及び（ｂ）同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製することを含む。

本開示の他の態様は、同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞の作製方法を提供し、この方法は、（ａ）Ｔ細胞を含む組成物に、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターとを送達することであって、ＣＡＲが（ｉ）抗ＣＤ７０抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含み、ＣＡＲをコードする核酸に、ＴＲＡＣ遺伝子座に対する左及び右相同性アームが隣接すること、及び（ｂ）同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製することを含む。

本開示の更に他の態様は、同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞の作製方法を提供し、この方法は、（ａ）Ｔ細胞を含む組成物に、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターとを送達することであって、ＣＡＲが（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含み、ＣＡＲをコードする核酸に、ＴＲＡＣ遺伝子座に対する左及び右相同性アームが隣接すること、及び（ｂ）同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製することを含む。

一部の実施形態において、操作されたＴ細胞は未精製及び／又は未集積である。一部の実施形態において、細胞集団は未精製及び／又は未集積である。

一部の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体断片は抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ抗体断片である。一部の実施形態において、抗ＣＤ７０抗体断片は抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ抗体断片である。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体断片は抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ抗体断片である。

一部の実施形態において、抗体断片（例えばｓｃＦｖ断片）はヒト化である。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９抗体断片は配列番号１３３３のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又はヒト化抗ＣＤ１９抗体断片は配列番号１３３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９抗体断片は、配列番号１５９５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９抗体断片は、配列番号１５９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ７０抗体断片は配列番号１４７５又は１４７６のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又はヒト化抗ＣＤ７０抗体断片は配列番号１４９９又は１５００のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ７０抗体断片は、配列番号１５９２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ７０抗体断片は、配列番号１５９３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体断片は配列番号１４７９又は１４８５のヌクレオチド配列によってコードされ、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体断片は配列番号１５０３又は１５０９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体断片は、配列番号１５８９又は１５２４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体断片は、配列番号１５９０又は１５２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

一部の実施形態において、ＣＡＲのエクトドメインは、シグナルペプチド、任意選択でＣＤ８シグナルペプチドを更に含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９抗体断片とＣＤ８膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメイン、任意選択でＣＤ８ヒンジドメインを更に含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造配置：抗ＣＤ１９抗体断片を含むエクトドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含む。

一部の実施形態において、ＣＡＲ（抗ＣＤ１９ＣＡＲ）は配列番号１３１６のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又はＣＡＲは配列番号１３３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ（抗ＣＤ７０ＣＡＲ）は配列番号１４２３、１４２４、又は１２７５のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又はＣＡＲは配列番号１４４９、１４５０、又は１２７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ（抗ＢＣＭＡＣＡＲ）は配列番号１４２７、１４２８、１４３４、又は１４３５のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又はＣＡＲは配列番号１４５３、１４５４、１４６０、又は１４６１のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、操作されたＴ細胞の少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％）は検出可能なレベルのＴＣＲ及び／又はＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。

一部の実施形態において、操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％）は検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。

一部の実施形態において、操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％）は検出可能なレベルのＣＡＲを発現し、且つ検出可能な（例えばフローサイトメトリーによって検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質又はＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。

一部の実施形態において、操作されたＴ細胞をＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すると、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％）の溶解が生じる。一部の実施形態において、操作されたＴ細胞をＣＤ７０＋Ｂ細胞と共培養すると、ＣＤ７０＋Ｂ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％）の溶解が生じる。一部の実施形態において、操作されたＴ細胞をＢＣＭＡ＋Ｂ細胞と共培養すると、ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％）の溶解が生じる。

一部の実施形態において、操作されたＴ細胞はＣＤ１９＋細胞の存在下でインターフェロンγを産生する。一部の実施形態において、操作されたＴ細胞はＣＤ７０＋細胞の存在下でインターフェロンγを産生する。一部の実施形態において、操作されたＴ細胞はＢＣＭＡ＋細胞の存在下でインターフェロンγを産生する。

一部の実施形態において、操作されたＴ細胞は、サイトカイン刺激、成長因子刺激、又は抗原刺激の非存在下では増殖しない。

一部の実施形態において、細胞集団は、破壊されたプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）遺伝子を更に含む。一部の実施形態において、操作されたＴ細胞の少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％）は検出可能なレベルのＰＤ１表面タンパク質を発現しない。

一部の実施形態において、細胞集団は、破壊された細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子を更に含む。一部の実施形態において、操作されたＴ細胞の少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％）は検出可能なレベルのＣＴＬＡ−４表面タンパク質を発現しない。

一部の実施形態において、細胞集団は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質）を更に含む。

一部の実施形態において、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号８３〜１５８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号７〜８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする。一部の実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡはいずれか１つの配列番号４５８〜５０６のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号４０９〜４５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする。一部の実施形態において、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号７６のヌクレオチド配列を標的とする。一部の実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号４６６のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号４１７のヌクレオチド配列を標的とする。

一部の実施形態において、細胞集団は、ＰＤ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡを更に含む。一部の実施形態において、ＰＤ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号１０８３〜１２７４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９１〜１０８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする。一部の実施形態において、ＰＤ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号１０８６のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＰＤ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号８９４のヌクレオチド配列を標的とする。

一部の実施形態において、細胞集団は、ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡを更に含む。一部の実施形態において、ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号１２８９〜１２９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号１２７８〜１２８７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする。一部の実施形態において、ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号１２９２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡは配列番号１２８１のヌクレオチド配列を標的とする。

一部の実施形態において、細胞集団の操作されたＴ細胞は、非修飾Ｔ細胞と比べて配列番号７６のヌクレオチド配列の欠失を含む。

一部の実施形態において、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、少なくとも１ヌクレオチド塩基対の挿入及び／又は少なくとも１ヌクレオチド塩基対の欠失を含む。

一部の実施形態において、操作されたＴ細胞の破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、配列番号１５６０；配列番号１５６１；配列番号１５６２；配列番号１５６３；配列番号１５６４；及び配列番号１５６５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態において、細胞の少なくとも１６％は、配列番号１５６０のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；細胞の少なくとも６％は、配列番号１５６１のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；細胞の少なくとも４％は、配列番号１５６２のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；細胞の少なくとも２％は、配列番号１５６３のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；細胞の少なくとも２％は、配列番号１５６４のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；及び細胞の少なくとも２％は、配列番号１５６５のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含む。

一部の実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型６型（ＡＡＶ６）ベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは配列番号１３５４〜１３５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは配列番号１３５４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは配列番号１３５８〜１３６０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは配列番号１３６０のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは配列番号１３６５、１３６６、１３７２、又は１３７３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは配列番号１３６６又は１３７３のヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は請求項１３９０〜１３９３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は配列番号１３９０のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は配列番号１３９４〜１３９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は配列番号１３９６のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は配列番号１４０１、１４０２、１４０８、又は１４０９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は配列番号１４０２又は１４０９のヌクレオチド配列を含む。この明細書に記載される発明は、本概要に要約される例に限定されないことが理解される。様々な他の態様が本明細書に記載及び例示される。

本明細書に開示及び説明される細胞表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトを発現するように操作されたゲノム編集細胞を作製するための材料及び方法、並びにゲノム編集された操作された細胞を使用して患者を治療するための材料及び方法の様々な態様は、添付の図を参照することにより更に良く理解することができる：

ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示すグラフである。図２Ａ及び図２Ｂは、ＣＤ３−ε（ＣＤ３Ｅ）遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）の順位付けしたリストを示す一連のグラフである。図２Ａ及び図２Ｂは、ＣＤ３−ε（ＣＤ３Ｅ）遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）の順位付けしたリストを示す一連のグラフである。Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示すグラフである。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示す一連のグラフである。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示す一連のグラフである。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示す一連のグラフである。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示す一連のグラフである。図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、ＰＤ１遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示す一連のグラフである。図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、ＰＤ１遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示す一連のグラフである。図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、ＰＤ１遺伝子を標的とするＩＶＴｇＲＮＡ及び２９３細胞におけるそのそれぞれの活性（％インデル）を順位付けしたリストを示す一連のグラフである。図６Ａ及び図６Ｂは、対照と比較したときのＴＣＲａ又はＣＤ３εヌルヒトＴ細胞によるＰＨＡ−Ｌに対する反応性の欠如、しかしＰＭＡ／イオノマイシンに対する正常な反応を示すフローサイトメトリープロットの一連の画像である。図６Ａは、対照及び遺伝子編集ヒトＴ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９のレベル（上のパネル）及びＣＦＳＥ（増殖歴を特徴付ける）のレベル（下のパネル）を示し、図６Ｂは、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）及びＩＦＮｇ１のレベルを示し（左のパネル）、並びにＩＬ−２及びＴＮＦのレベル（右のパネル）を示す。図６Ａ及び図６Ｂは、対照と比較したときのＴＣＲａ又はＣＤ３εヌルヒトＴ細胞によるＰＨＡ−Ｌに対する反応性の欠如、しかしＰＭＡ／イオノマイシンに対する正常な反応を示すフローサイトメトリープロットの一連の画像である。図６Ａは、対照及び遺伝子編集ヒトＴ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９のレベル（上のパネル）及びＣＦＳＥ（増殖歴を特徴付ける）のレベル（下のパネル）を示し、図６Ｂは、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）及びＩＦＮｇ１のレベルを示し（左のパネル）、並びにＩＬ−２及びＴＮＦのレベル（右のパネル）を示す。ＣＩＩＴＡ又はＲＦＸ−５遺伝子に対するＲＮＰを含むＲＮＰによる初代ヒトＴ細胞の処理後にフローサイトメトリーによって測定したＭＨＣ−ＩＩ表面発現の喪失を示す一連のグラフである。１、２又は３個のいずれかの遺伝子を単独で、又は同時に（多重編集）標的とするＲＮＰで初代ヒトＴ細胞を処理した後のフローサイトメトリーによって測定したときの表面タンパク質喪失レベルを示すグラフである。対照及びＲＮＰ（ＰＤ１ｓｇＲＮＡを含む）を含む初代ヒトＴ細胞におけるＰＭＡ／イオノマイシン処理後のフローサイトメトリーによるＰＤ１の表面レベルを示すグラフである。ＡＡＶＳ１遺伝子座内のゲノム部位を標的とするＣａｓ９／ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体によって引き起こされたＤＮＡ二本鎖切断の相同組換え修復を受けた細胞からＰＣＲによって増幅したＤＮＡのＡｇｉｌｅｎｔＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ分析から生成された画像である。修復は、ＲＮＰ切断部位を囲む相同性アームが隣接したＧＦＰ発現カセットを含むドナー鋳型により促進され、ＡＡＶ６ウイルスによって送達された。ＲＮＰなし対照及びＡＡＶドナー鋳型との相同性を有しない異なるゲノム遺伝子座を標的とするＲＮＰもまた示される。初代ヒトＴ細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とする個別的なＲＮＰ及びＡＡＶ６送達したドナー鋳型によるＨＤＲ誘導後に同時のＴＣＲａ及びＢ２Ｍの喪失並びにＧＦＰの発現を有した単一Ｔ細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。対照並びにＡＡＶＳ１、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍを標的とするＲＮＰで治療した３個体の生物学的ドナーからの細胞におけるＧＦＰ陽性（ＲＮＰ／ＡＡＶＨＤＲに関するリードアウト）である細胞のパーセンテージを定量化するグラフである。ＨＤＲはまた、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡによってＴＲＡＣ⁻Ｂ２Ｍ^＋又はＴＲＡＣ⁻Ｂ２Ｍ⁻にされた細胞のゲートでも定量化する。もう１つの遺伝子の発現がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ６送達ドナー鋳型によって調節される同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞の図式的描画である。この描画は、ＨＤＲによって媒介されるとおりの標的遺伝子座の範囲内又はその近傍におけるＣＡＲコンストラクトのノックインに伴う１つ以上の標的遺伝子の調節を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ６送達ドナー鋳型によって作製されるＭＨＣ−Ｉ発現を欠く同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞の図式的描画である。この描画は、ＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＡＲコンストラクトのノックイン（ＨＤＲによって媒介される）に伴うＴＲＡＣ遺伝子のノックアウトを示す。この描画はまた、Ｂ２Ｍ遺伝子中の部位の欠失も示す。Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断の修復及び部位特異的トランス遺伝子挿入用のドナーＤＮＡ鋳型の送達のためのＡＡＶウイルスの作製に使用されるＡＡＶコンストラクトのモデル図式の概略的表現である。ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの同時三重ノックアウトを実証するためのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ処理したヒトＴ細胞からのＤＮＡに関するＴＩＤＥ分析を示すグラフである。ＲＮＰ処理には、ＴＣＲａ（ＴＲＡＣ）、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡの組み合わせが含まれた。ＡＡＶＳ１遺伝子座（ＡＡＶＳ１ＲＮＰ＋ＣＴＸ１３１）又はＴＲＡＣ遺伝子座（ＴＲＡＣＲＮＰ＋ＣＴＸ−１３８）に挿入された抗ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトを発現するＴ細胞が共培養アッセイにおいてＲａｊｉリンパ腫細胞を溶解させる能力（左のパネル）及びＲａｊｉリンパ腫細胞の存在下でインターフェロンγ（ＩＦＮｇ又はＩＦＮγ）を産生する能力（右のパネル）を示す一連のグラフである。Ｋ５６２細胞と共培養したＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶによって生成された抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在下でのインターフェロンγ（ＩＦＮｇ）産生の欠如を実証する一連のグラフである（左のパネル）。ＩＦＮｇ産生レベルは、ＣＤ１９を過剰発現するように設計されたＫ５６２細胞と共培養したとき、ＡＡＶＳ１遺伝子座（ＡＡＶＳ１ＲＮＰ＋ＣＴＸ１３１）又はＴＲＡＣ遺伝子座（ＴＲＡＣＲＮＰ＋ＣＴＸ−１３８）のいずれかから抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔの存在下で増加する（右のパネル）。細胞がＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに対するＲＮＰで処理され、且つＴＲＡＣ遺伝子座に対する相同配列が隣接したＣＡＲコンストラクトを含むドナー鋳型によって媒介されるＣＡＲコンストラクトの部位特異的組込み及び発現を送達するベクターに感染したときのみ単一細胞がＣＡＲコンストラクトを発現し、且つＴＣＲ及びＢ２Ｍの表面発現を欠くことを実証する一連のフローサイトメトリープロットである。ＣＡＲ^＋ＴＣＲ⁻Ｂ２Ｍ⁻であるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の正常な比率を実証する一連のフローサイトメトリープロットである。図１７Ｂのフローサイトメトリー実験のレプリケートにおけるＣＤ４及びＣＤ８発現の比率を要約するドットプロットである。ＣＡＲ^＋ＴＣＲ⁻Ｂ２Ｍ⁻の４つのレプリケート及び４つの対照レプリケートを分析した。対照と比較してＣＡＲ^＋ＴＣＲ⁻Ｂ２Ｍ⁻ Ｔ細胞の産生においてＣＤ４及びＣＤ８頻度は変化しないままである。電気穿孔及びＡＡＶ６感染の８日後に計数した生細胞数を示すグラフである。［図１８Ａ］Ｋ５６２と指示細胞との共培養におけるＩＦＮｇ産生の欠如を実証するグラフである。［図１８Ｂ］Ｔ細胞をＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞と共培養したとき、Ｂ２Ｍのノックアウト有り又は無しでＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれた抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するように作られた細胞においてのみＩＦＮｇ産生が増加することを実証するグラフである。［図１８Ｃ］ＣＤ１９＋Ｒａｊｉリンパ腫細胞株と指示のとおり処理したＴ細胞との共培養におけるＩＦＮｇ産生の増加を実証するグラフである。ＴＣ１細胞による治療後のＮＯＧＲａｊｉマウスにおける腫瘍容積（ｍｍ^３）の統計的に有意な減少（ｐ＝０．００７）を示すグラフである。治療を受けていないＮＯＧＲａｊｉマウスと比較したＴＣ１細胞で治療したＮＯＧＲａｊｉマウスの生存率の増加を実証する生存曲線グラフである。［図２１Ａ］ＮＯＧＲａｊｉマウスにおいてＴＣ１細胞が持続することを実証する一連のフローサイトメトリープロットである。［図２１Ｂ］対照（未治療のＮＯＧＲａｊｉマウス又はＮＯＧマウス）と比較してＴＣ１で治療したＮＯＧＲａｊｉマウスにおいてＴＣ１細胞が脾臓Ｒａｊｉ細胞を選択的に根絶することを実証するグラフである。この効果は、ＴＣ１で治療したＮＯＧＲａｊｉマウスにおける対照と比較した脾臓質量の低下として示される。ＴＣ１治療により２匹の独立したＮＯＧＲａｊｉマウスにおいて持続的脾臓ＴＣ１細胞が編集されることを実証する一連のフローサイトメトリープロットである。ＴＣ１細胞がインビトロでサイトカイン非依存的成長を呈しないことを実証するグラフである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ６送達ドナー鋳型によって作製されるＭＨＣ−Ｉ発現を欠くＣＡＲ−Ｔ細胞の図式的描画である。この描画は、ＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＡＲコンストラクトのノックイン（ＨＤＲによって媒介される）に伴うＴＲＡＣ遺伝子のノックアウトを示す。この描画はまた、Ｂ２Ｍ遺伝子中の部位の欠失も示す。Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断の修復及び部位特異的トランス遺伝子挿入用のドナーＤＮＡ鋳型の送達のためのＡＡＶウイルスの作製に使用されるＡＡＶコンストラクトの概略的表現である。ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＣＴＸ−１４５ドナー鋳型をＴ細胞に送達するＡＡＶ６を使用したＴＲＡＣ⁻ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の作製を実証するフローサイトメトリーデータである。ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＣＴＸ−１４５ドナー鋳型をＴ細胞に送達するＡＡＶ６を使用して生成したＴＲＡＣ⁻ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８サブセット比率の維持を示す。ＴＲＡＣ遺伝子座に二本鎖切断を誘導するＲＮＰがあるときに限ったＣＤ７０ＣＡＲコンストラクトの発現を実証するフローサイトメトリーデータである。ＣＤ７０ＣＡＲコンストラクトの発現はエピソームＡＡＶ６ベクターでは起こらない。ＴＣＲ及びＢ２Ｍ欠失を有するＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔの作製を示すフローサイトメトリーデータである。続いて機能アッセイに使用したＫ５６２−ＣＤ７０細胞からのＣＤ７０の発現増加を示すフローサイトメトリーデータからのヒストグラムである。細胞株パネルにおける天然ＣＤ７０発現レベルを示すグラフである。データはＲａｊｉ細胞におけるＣＤ７０発現に対して正規化している。ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の存在下におけるＣＤ７０発現Ｋ５６２細胞（ＣＤ７０−Ｋ５６２）の％細胞溶解率（左のパネル）及びＣＤ７０発現Ｋ５６２細胞（ＣＤ７０−Ｋ５６２）と相互作用するときに限ったＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌（右のパネル）を示すグラフである。 [図２９Ｂ]ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞と共培養したときに限った、ＣＤ７０陰性Ｎａｌｍ６細胞においてはない、ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＲＡＣ−ＣＤ７０ＣＡＲ＋）からのＩＦＮγ分泌を示すグラフである。[図２９Ｃ]ＣＤ７０発現標的細胞の非存在下でＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が単独で存在するときにのみ「自己」刺激に起因してＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＲＡＣ−ＣＤ７０ＣＡＲ＋）がＩＦＮγを分泌しないことを示すグラフである。ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣＲ−ＣＡＲ＋）と相互作用したＣＤ７０＋発現標的細胞（Ｒａｊｉ）のみにおけるグランザイムＢ活性を実証するフローサイトメトリーデータである。ＣＤ７０特異的細胞死滅を実証する細胞死滅データのグラフである。ＴＲＡＣ−ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が腎細胞癌由来細胞株の細胞溶解を誘導する（２４時間及び４８時間時点）ことを示すグラフである。ＴＣＲ欠損抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ７０ＣＡＲ＋）が、ＴＣＲ−細胞（対照）と比較したとき、様々なＣＤ７０発現のＲＣＣ細胞株パネルに対して細胞死滅活性を呈する（２４時間時点）ことを実証するグラフである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ６送達ドナー鋳型によって作製されるＭＨＣ−Ｉ発現を欠くＣＡＲ−Ｔ細胞の図式的描画である。この描画は、ＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＡＲコンストラクトのノックイン（ＨＤＲによって媒介される）に伴うＴＲＡＣ遺伝子のノックアウトを示す。この描画はまた、Ｂ２Ｍ遺伝子中の部位の欠失も示す。Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断の修復及び部位特異的トランス遺伝子挿入用のドナーＤＮＡ鋳型の送達のためのＡＡＶウイルスの作製に使用されるＡＡＶコンストラクトの概略的表現である。抗ＢＣＭＡＣＡＲＡＡＶドナー鋳型の概略的設計。ＣＴＸ１５２及びＣＴＸ１５４の両方とも、バイシストロニックｍＲＮＡからＣＡＲ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を共発現するように設計された。ＣＴＸ−１５２ＣＡＲ＝ＶＨ−ＶＬ；ＣＴＸ−１５４ＣＡＲ＝ＶＬ−ＶＨ。ＴＣＲ及びＢ２Ｍ欠失を有する抗ＢＣＭＡ（ＣＴＸ１５２及びＣＴＸ１５４）ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−ＢＣＭＡＣＡＲ＋細胞）の作製を示すフローサイトメトリーデータである。ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子はＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いて破壊し、ＣＡＲコンストラクトは相同組換え修復を用いてＴＲＡＣ遺伝子座に挿入した。ＦＡＣＳによって測定したとき、Ｔ細胞の約７７％がＴＣＲ−／Ｂ２Ｍ−であった（上のパネル）。ＣＡＲ＋細胞はＧＦＰ発現及び組換えＢＣＭＡ結合に関して両方ともに陽性であった（下のパネル）。これらのＣＡＲＴ細胞は実施例１５に記載される方法により作製した。ｘ軸及びｙ軸は対数目盛で示す。［図３３Ａ］ＢＣＭＡを発現するＲＰＭＩ８２２６細胞をＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ− ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞で処理すると細胞傷害が生じ、一方、非修飾Ｔ細胞（ＲＮＰ／ＡＡＶなし）で処理すると最小限の細胞傷害しか示されないことを示すグラフである。［図３３Ｂ］抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞からの高レベルのＩＦＮγ分泌及び非修飾Ｔ細胞（ＲＮＰ／ＡＡＶなし）からの最小限の分泌を示すグラフである。両方のプロットとも同じ細胞傷害性実験からのものである。インターフェロンγは実施例１８に記載される方法により測定した。表面ＣＤ１９ＣＡＲ発現とＨＤＲ頻度との間の強い相関を示すグラフである（Ｒ^２＝０．８８）。これは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を用いたＴ細胞のＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトの部位特異的組込み及び高発現レベルを示す。［図３５Ａ］ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞と相互作用したＣＤ１９＋発現標的細胞（Ｎａｌｍ６）のみにおけるグランザイムＢ活性を実証するフローサイトメトリーデータである。［図３５Ｂ］ＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞と培養したときＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞が高レベルのＩＦＮγを分泌することを示すグラフである。［図３５Ｃ］ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞がＮａｌｍ６細胞を低いＴ細胞対標的細胞比で選択的に死滅させることを示す細胞死滅データのグラフである。ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の作製時におけるＣＤ７０を発現する細胞のパーセンテージを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ又はＣＤ７０ＣＡＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の比率を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。プロットの上のパネルは図３６ＡからのＣＤ７０−細胞集団に対応する。プロットの下のパネルは図３６ＡからのＣＤ７０＋細胞集団に対応する。Ａ４９８腎細胞癌細胞株、加えてＴＲＡＣ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を皮下注射したＮＯＧマウスの治療後３１日目における腫瘍容積（ｍｍ^３）の減少を示すグラフである。全てのＮＯＧマウス群に５×１０^６細胞／マウスを注射した。群１はＴ細胞治療を受けなかった。群２のマウスは１０日目に１×１０^７細胞／マウスのＴＲＡＣ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞で静脈内治療した。群３のマウスは１０日目に２×１０^７細胞／マウスのＴＲＡＣ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞で静脈内治療した。Ａ４９８腎細胞癌細胞株、加えてＴＲＡＣ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を皮下注射したＮＯＧマウスの治療後の腫瘍容積（ｍｍ^３）減少を示すグラフである。両方のＮＯＧマウス群に５×１０^６細胞／マウスを注射した。対照群はＴ細胞治療を受けず、試験群のマウスは１０日目に２×１０^７細胞／マウスのＴＲＡＣ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞で静脈内治療した。ＰＤ１の表面発現が低いか、又はないかのいずれか（それぞれＰＤ１^ＬＯ及びＰＤ１^ＫＯ）である、ＣＡＲを発現し且つＴＣＲ及びＢ２Ｍの表面発現を欠く抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞の作製を実証する一連のフローサイトメトリープロットである。好ましい抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＡＲを発現し、且つＴＣＲ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１の表面発現を欠く。フローサイトメトリーによって測定したときの各遺伝子編集の編集効率を示す棒グラフである。測定は、図３８Ａの下段に示す細胞集団からとった。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）のＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座に実現した高編集率を示すグラフである。遺伝子編集の機能的結果であるＴＣＲ及びＭＨＣＩの表面発現を測定し、編集パーセンテージとしてｙ軸上にプロットした。ＴＲＡＣ遺伝子座からのＣＡＲの高効率の（例えば５０％超の）部位特異的組込み及び発現が検出された。これらのデータは、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞の生成効率（ｅｆｆｉｃｉｃｉｅｎｃｙ）が５０％を超えることを実証している。編集後８日におけるヒト初代Ｔ細胞、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）の一連のフローサイトメトリープロットである。このグラフは、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの表面発現の低下を示す。ＴＣＲ／ＭＨＣＩ二重ノックアウト細胞は高レベルのＣＡＲトランス遺伝子を発現する（下のパネル）。精製ビーズによるＴＣ１細胞のネガティブ選択がＴＣＲ陽性細胞の低下につながる（右のパネル）。ＣＤ１９の発現を欠くＫ５６２細胞と共培養したときにはない、ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞と共培養したときのＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）におけるＩＦＮγ産生の統計的に有意な増加を実証するグラフである。この実験は図１８Ｂの方法によりトリプリケートで実施した。統計的分析はＡＮＯＶＡによってチューキーの多重比較検定を用いて実施した。図４２Ａ及び図４２Ｂは、１日目に治療を受けなかった対照マウスと比較した、４日目にＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）で治療したＮＯＧＲａｊｉマウス（図４２Ａ）又はＮＯＧＮａｌｍ６マウス（図４２Ｂ）の生存の増加を実証する生存曲線グラフである。これは、一部には、図２０の変法レプリケート実験であった。レンチウイルスベクターにパッケージングしたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）又はＣＡＲ−ＴドナーＤＮＡ鋳型によるＮａｌｍ６腫瘍細胞の処理後の細胞溶解データを示すグラフである。両方の処理がパーセント細胞溶解率の点で同程度の効力を生じた。別個の実験で測定した対照ＴＣＲ⁻ＣＡＲ⁻Ｔ細胞は細胞溶解活性を示さなかった。ドナーＤＮＡ鋳型から作製したＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）の一貫したパーセンテージを示すドットプロットである。加えて、ＴＣ１作製は、＞８０％ＴＣＲ−／Ｂ２Ｍ−二重ノックアウト及び精製後＞９９．６％ＴＣＲ−の追加的な属性と相まって、他のレンチウイルスＣＡＲ−Ｔ産物よりも均一で一貫している。［図４５Ａ］ＢＣＭＡを発現するＲＰＭＩ８２２６の処理が、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ− ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞からの高レベルのＩＦＮγ分泌及び非修飾Ｔ細胞（ＴＣＲ＋ＣＡＲ−）からの最小限の分泌を引き起こす（４：１Ｔ細胞：ＲＰＭＩ−８２２６比）ことを示すグラフである。インターフェロンγは実施例１８に記載される方法により測定した。［図４５Ｂ］ＢＣＭＡを発現するＲＰＭＩ８２２６細胞をＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ− ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞で処理すると、細胞溶解及び細胞傷害が生じることを示すグラフである。図４６Ａ〜図４６Ｃは、抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現Ｕ−２６６及びＲＰＭＩ８２２６細胞に対して特異的細胞傷害性を示すことを実証するデータのグラフである。ＣＴＸ１５２及びＣＴＸ１５４抗ＢＣＭＡＣＡＲコンストラクトを発現した同種異系Ｔ細胞（ＴＲＡＣ−、Ｂ２Ｍ−）はＵ−２６６（図４６Ａ）及びＲＭＰＩ８２２６（図４６Ｂ）細胞の存在下でＩＮＦγを発現し、それらの溶解を誘導したが、一方、ＣＡＲを欠く同種異系Ｔ細胞及び非修飾Ｔ細胞は最小限の活性しか示さなかった。ＣＴＸ１５２及びＣＴＸ１５４は、ＢＣＭＡ発現を欠くＫ５６２細胞に対して特異的細胞傷害性を示さなかった（図４６Ｃ）。図４６Ａ〜図４６Ｃは、抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現Ｕ−２６６及びＲＰＭＩ８２２６細胞に対して特異的細胞傷害性を示すことを実証するデータのグラフである。ＣＴＸ１５２及びＣＴＸ１５４抗ＢＣＭＡＣＡＲコンストラクトを発現した同種異系Ｔ細胞（ＴＲＡＣ−、Ｂ２Ｍ−）はＵ−２６６（図４６Ａ）及びＲＭＰＩ８２２６（図４６Ｂ）細胞の存在下でＩＮＦγを発現し、それらの溶解を誘導したが、一方、ＣＡＲを欠く同種異系Ｔ細胞及び非修飾Ｔ細胞は最小限の活性しか示さなかった。ＣＴＸ１５２及びＣＴＸ１５４は、ＢＣＭＡ発現を欠くＫ５６２細胞に対して特異的細胞傷害性を示さなかった（図４６Ｃ）。図４７Ａ〜図４７Ｂは、ＢＣＭＡを発現する細胞の存在下で他の抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞がインターフェロンγを特異的に分泌することを実証するデータのグラフである。抗ＢＣＭＡＣＡＲ発現を示すグラフである。同種異系ＣＡＲＴ細胞は先述のとおり生成した。抗ＢＣＭＡＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＢＣＭＡを結合した、続いてＦＡＣＳによりストレプトアビジン−ＡＰＣを使用して検出された細胞の割合を決定することにより測定した。図４９Ａ〜図４９Ｃは、ＣＡＲを発現する抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞がＲＰＭＩ−８２２６細胞に対して強力に細胞傷害性であることを実証するデータのグラフである。ＣＡＲコンストラクトは、ＲＰＭＩ−８２２６細胞を死滅させるその能力に関して判定した。全てのＣＡＲＴ細胞がエフェクター細胞に対して強力に細胞傷害性であった一方、ＣＡＲを欠く同種異系Ｔ細胞は細胞傷害性をほとんど示さなかった。遺伝子編集後２１日目にＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の健康が維持されることを実証するフローサイトメトリープロットを示す。細胞を低消耗マーカー、ＬＡＧ３及びＰＤ１（左のグラフ）、並びに低老化（ｓｅｎｅｎｓｃｅｎｃｅ）マーカー、ＣＤ５７（右のグラフ）に関してアッセイした。ＴＣＲ陰性細胞集団の更なる集積なしに遺伝子編集細胞の９５．５％がＴＣＲ陰性であることを実証するフローサイトメトリーグラフを示す。集積／精製後は９９．５％を超える遺伝子編集細胞がＴＣＲ陰性である。遺伝子編集後１週間におけるβ２Ｍ及びＴＲＡＣ発現の代表的なＦＡＣＳプロット（左）及びＴＲＡＣ遺伝子座へのノックイン後のＣＡＲ発現の代表的なＦＡＣＳプロット（右）を示す。遺伝子編集後に観察されたＴＣＲ及びＭＨＣ−Ｉの両方の表面発現の低下を示すグラフである。これは、高ＣＡＲ発現と併せて、６０％を超える細胞が所望の修飾全て（ＴＣＲ−／β２Ｍ−／ＣＡＲ＋）を有することにつながる。同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞の作製がＣＤ４及びＣＤ８比率を維持することを示すグラフである。同種異系ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞がエキソビボ拡大に関してサイトカイン依存性を維持することを示すグラフである。図５４Ａは、同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞が４時間細胞死滅アッセイにおいてＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓを効率的且つ選択的に死滅させる一方、ＢＣＭＡ陰性白血病株Ｋ５６２は免れさせることを実証するグラフを示す。図５４Ｂは、細胞がまた、ＭＭ．１Ｓ細胞による誘導にのみ応答して上方制御されるＴ細胞活性化サイトカインＩＦＮγ及びＩＬ−２を選択的に分泌することを示すグラフである。検出限界を下回る値は白抜きのデータ点として示す。抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞を追加的なＭＭ細胞株：（図５４Ｃ）ＲＰＭＩ−８２２６（２４時間アッセイ）及び（図５４Ｄ）Ｈ９２９（４時間アッセイ）に曝露したときもまた、強力な細胞死滅が観察された。図５４Ａは、同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞が４時間細胞死滅アッセイにおいてＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓを効率的且つ選択的に死滅させる一方、ＢＣＭＡ陰性白血病株Ｋ５６２は免れさせることを実証するグラフを示す。図５４Ｂは、細胞がまた、ＭＭ．１Ｓ細胞による誘導にのみ応答して上方制御されるＴ細胞活性化サイトカインＩＦＮγ及びＩＬ−２を選択的に分泌することを示すグラフである。検出限界を下回る値は白抜きのデータ点として示す。抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞を追加的なＭＭ細胞株：（図５４Ｃ）ＲＰＭＩ−８２２６（２４時間アッセイ）及び（図５４Ｄ）Ｈ９２９（４時間アッセイ）に曝露したときもまた、強力な細胞死滅が観察された。皮下ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍異種移植片モデルにおいて同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍を根絶することを示すグラフである。１×１０７ＲＰＭＩ−８２２６細胞をＮＯＧマウスに皮下注射し、続いて接種１０日後にＣＡＲ−Ｔ細胞を静脈内注射した。いずれの時点においてもマウスにＧｖＨＤの臨床徴候は認められなかった。各群Ｎ＝５。ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子座において高編集率が実現し、それによりＴＣＲ及びＭＨＣ−Ｉの表面発現が減少することを実証するグラフである。ＴＲＡＣ遺伝子座からの極めて効率的なＣＡＲの部位特異的組込み及び発現もまた検出された。データは３つの健常ドナーからのものである。同種異系抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴＣＲ−β２Ｍ−ＣＡＲ＋）の作製がＣＤ４及びＣＤ８比率を維持することを実証するグラフである。同種異系抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴＣＲ−β２Ｍ−ＣＡＲ＋）がＣＤ７０＋ＭＭ．１Ｓ多発性骨髄腫由来細胞株に対して強力な細胞傷害性を示すことを実証するグラフである。多重編集によってＴＣＲ及びＭＨＣ−Ｉの表面発現の減少並びに高いＣＡＲ発現が生じたことを示すグラフである。多重編集された抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞においてＣＤ４／ＣＤ８比が依然として同様であることを示すグラフである。は、多重編集された抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞が多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後の成長に関して依然としてサイトカイン依存的であることを示すグラフである。抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞が４時間細胞死滅アッセイにおいてＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓを効率的且つ選択的に死滅させる一方、ＢＣＭＡ陰性白血病株Ｋ５６２は免れさせることを示すグラフである。細胞がまた、ＢＣＭＡ＋ＭＭ．１Ｓ細胞による誘導にのみ応答して上方制御されるＴ細胞活性化サイトカインＩＦＮγ及びＩＬ−２も選択的に分泌することを示すグラフである。培養下で１週間後に二重又は三重ノックアウト（ＫＯ）抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞間にＬａｇ３消耗マーカーの変化は認められないことを示すグラフである。しかしながら、培養下で４週間後には、三重ＫＯ抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞でＬａｇ３消耗マーカー発現が低下した。ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右相同性アームが隣接する４−１ＢＢ共刺激ドメインを有する抗ＣＤ７０ＣＡＲを含むＣＴＸ−１４５ｂ（配列番号１３６０）の概略図である。正常な比率のＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットが、ＴＲＡＣ及びＢ２ＭｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＣＴＸ１４５ｂＡＡＶ６で処理した細胞からのＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋画分を維持することを示すグラフである。初代ヒトＴ細胞におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ及び抗ＣＤ７０ＣＡＲコンストラクトを含有するＡＡＶ６送達ドナー鋳型（ＣＴＸ−１４５及びＣＴＸ−１４５ｂ）による効率的なトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを実証するグラフである。ＰＤ１、ＴＲＡＣ及びＢ２ＭｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＣＴＸ−１４５ｂＡＡＶ６で処理した細胞からのＰＤ１−／ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋画分において正常な比率のＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットが維持されることを実証するグラフである。２４時間コインキュベートした後にＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞が腎細胞癌由来細胞株（Ａ４９８細胞）の強力な細胞死滅を実証したことを示すグラフである。ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞及びＰＤ１−／ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞がＣＤ７０発現付着腎細胞癌（ＲＲＣ）由来細胞株ＡＣＨＮの強力な細胞死滅を３：１比のＴ細胞：標的細胞でＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインを伴い誘導したことを示すグラフである。編集されたＴ細胞における抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８対４−１ＢＢ）ＣＡＲ発現を示すグラフである。ＭＭ．１Ｓ細胞及びＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８又は４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞による細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。ＭＭ．１Ｓ細胞（左）又はＫ５６２細胞（右）及びＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８又は４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌試験の結果を示すグラフを含む。ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ−８２２６細胞（左上）、Ｈ９２９細胞（右上）、Ｕ２６６１細胞（左下）、又はＫ５６２細胞（右下）と共に使用した細胞死滅アッセイの結果を示すグラフを含む。ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞の存在下におけるＲＰＭＩ−８２２６細胞（左上）、Ｕ２２６１細胞（右上）、Ｈ９２９細胞（左下）、又はＫ５６２細胞（右下）によるＩＦＮ−γ刺激試験を示すグラフを含む。ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞の存在下におけるＲＰＭＩ−８２２６細胞（左上）、Ｕ２２６１細胞（右上）、Ｈ９２９細胞（左下）、又はＫ５６２細胞（右下）によるＩＬ−２刺激試験を示すグラフを含む。ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８）ＣＡＲ＋Ｔ細胞又はＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ−１−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８）ＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与したＲＰＭＩ−８２２６皮下腫瘍マウスモデルにおける腫瘍容積を示すグラフを含む。ＭＭ．１Ｓ細胞又はＫ５６２細胞の存在下におけるＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞又はＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ−１−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞による細胞傷害性（左）、ＩＦＮ−γ刺激（中央）、及びＩＬ−２刺激試験の結果を示すグラフを含む。ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋又はＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと共に、腎細胞癌マウスモデルにおいて抗腫瘍活性を呈することを示すグラフを含む。

配列表の簡単な説明
配列番号１〜３はｓｇＲＮＡ骨格配列である（表１）。
配列番号４〜６はホーミングエンドヌクレアーゼ配列である。
配列番号７〜８２はＴＲＡＣ遺伝子標的配列である（表４）。
配列番号８３〜１５８はＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である（表４）。
配列番号１５９〜２８３はＣＤ３Ｅ遺伝子標的配列である（表５）。
配列番号３８４〜４０８はＣＤ３Ｅ遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である（表５）。
配列番号４０９〜４５７はＢ２Ｍ遺伝子標的配列である（表６）。
配列番号４５８〜５０６はＢ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である（表６）。
配列番号５０７〜６９８はＣＩＩＴＡ遺伝子標的配列である（表７）。
配列番号６９９〜８９０はＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である（表７）。
配列番号８９１〜１０８２はＰＤ１遺伝子標的配列である（表８）。
配列番号１０８３〜１２７４はＰＤ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である（表８）。
配列番号１２７５はＣＴＸ−１４５ｂのＣＡＲのヌクレオチド配列である（表３６）。
配列番号１２７６はＣＴＸ−１４５ｂのＣＡＲのアミノ酸配列である（表３６）。
配列番号１２７７〜１２８７はＣＴＬＡ−４遺伝子標的配列である（表１０）。
配列番号１２８８〜１２９８はＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である（表１０）。
配列番号１２９９はＴＲＡＣ遺伝子標的配列である（表１１）。
配列番号１３００はＰＤ１遺伝子標的配列である（表１１）。
配列番号１３０１及び１３０２はＡＡＶＳ１標的配列である（表１１）。
配列番号１３０３及び１３０５はＣＤ５２標的配列である（表１１）。
配列番号１３０５〜１３０７はＲＦＸ５標的配列である（表１１）。
配列番号１３０８はＡＡＶＳ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である。
配列番号１３０９〜１３１１はＲＦＸ５遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である。
配列番号１３１２はＣＤ５２遺伝子を標的とするｇＲＮＡスペーサー配列である。
配列番号１３１３〜１３３８は抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の生成用のドナー鋳型成分配列である（表１２を参照）。
配列番号１３３９は４−１ＢＢ共刺激ドメインのヌクレオチド配列である。
配列番号１３４０は４−１ＢＢ共刺激ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１３４１はリンカー配列である。
配列番号１３４２〜１３４７はＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、及びＡＡＶＳ１に対する化学的に修飾された及び未修飾のｓｇＲＮＡ配列である（表３２を参照）。
配列番号１３４８〜１３８６は様々なドナー鋳型のｒＡＡＶ配列である（表３４を参照）。
配列番号１３８７〜１４２２は様々なドナー鋳型の左相同性アーム（ＬＨＡ）から右相同性アーム（ＲＨＡ）までの配列である（表３５を参照）。
配列番号１４２３〜１４４８は本開示のドナー鋳型のＣＡＲヌクレオチド配列である（表３６を参照）。
配列番号１４４９〜１４７４は本開示のドナー鋳型によってコードされるＣＡＲアミノ酸配列である（表３７を参照）。
配列番号１４７５〜１４９８は本開示のＣＡＲのｓｃＦｖ核酸配列である（表３８を参照）。
配列番号１４９９〜１５２２は本開示のＣＡＲによってコードされるｓｃＦｖアミノ酸配列である（表３９を参照）。
配列番号１５２３〜１５３１は抗ＢＣＭＡ軽鎖及び重鎖配列である（表３９を参照）。
配列番号１５３２〜１５５３は本開示のプラスミド配列である。
配列番号１５５４〜１５５９はｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプライマー配列である（表２５を参照）。
配列番号１５６０〜１５６５はＢ２Ｍ遺伝子における遺伝子編集された配列である（表１２．３）。
配列番号１５６６〜１５７３はＴＲＡＣ遺伝子における遺伝子編集された配列である（表１２．４）。
配列番号１５７４及び１５７５はＰＤ１に対する化学的に修飾された及び未修飾のｓｇＲＮＡ配列である（表３２を参照）。
配列番号１５７６〜１５７７はＩＴＲ配列である（表１２）。
配列番号１５７８〜１５８２はＣＴＸ−１３９．１〜ＣＴＸ−１３９．３に使用される左相同性アーム及び右相同性アームのヌクレオチド配列である（表１２）。
配列番号１５８６はＣＤ８シグナルペプチド配列である（表１２）。
配列番号１５８７及び１５８８はＴＲＡＣに対する化学的に修飾された及び未修飾のｓｇＲＮＡ配列（エクソン１＿Ｔ７）である（表３２を参照）。
配列番号１５８９〜１５９７は重鎖、軽鎖及びリンカー配列、例えば抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ７０、及び抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ分子である（表３９）。
配列番号１５９８は抗ＣＤ１９ＣＡＲのリーダーペプチド配列である（表１２）。
配列番号１５９９はリンカーのないＣＤ８ａ膜貫通配列である（表１２）。
配列番号１６００はＣＤ８ａペプチド配列である。
配列番号１６０１はＣＤ２８共刺激ドメインペプチド配列である。
配列番号１６０２はＣＤ３−ゼータ共刺激ドメインペプチド配列である。

治療手法
ＣＲＩＳＰＲ編集細胞、例えばＣＲＩＳＰＲ編集Ｔ細胞などには、複数の疾患状態に治療用途があり得る。非限定的な例として、本開示に提供される核酸、ベクター、細胞、方法、及び他の材料は、癌、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の治療に有用である。

遺伝子編集は、レンチウイルス送達及び組込みを通じた標的遺伝子発現カセットの導入など、既存の又は可能性のある療法に優る重要な改善をもたらす。遺伝子活性及び／又は発現を調節する遺伝子編集には、正確なゲノム修飾及び低い有害作用、並びに正常な発現レベルの回復及び一時的制御という利点がある。

本明細書に提供される材料及び方法は、標的遺伝子の活性の調節において有用である。例えば、標的遺伝子は、宿主対移植片反応に関連する遺伝子配列、移植片対宿主反応に関連する遺伝子配列、免疫抑制因子（例えば：チェックポイント阻害因子）をコードする遺伝子配列、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。

標的遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＣＤ３イプシロン（ｅｐｉｓｏｌｏｎ）（ＣＤ３ε）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される移植片対宿主反応に関連する遺伝子配列であってもよい。ＴＲＡＣ及びＣＤ３εはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分である。遺伝子編集によってこれらを破壊すると、Ｔ細胞は移植片対宿主病を引き起こす能力を奪われることになる。

標的遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される宿主対移植片反応に関連する遺伝子配列であってもよい。Ｂ２ＭはＭＨＣＩ複合体の共通の（不変の）成分である。遺伝子編集によってこれを取り除くと宿主対治療用同種異系Ｔ細胞反応が防止され、同種異系Ｔ細胞の持続性の増加につながり得る。ＣＩＩＴＡ及びＲＦＸ５は、ＭＨＣＩＩ遺伝子の発現に必要な転写調節複合体の成分である。遺伝子編集によってこれらを破壊すると宿主対治療用同種異系Ｔ細胞反応が防止され、同種異系Ｔ細胞の持続性の増加につながり得る。

標的遺伝子は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイント阻害因子をコードする遺伝子配列であってもよい。ＰＤＣＤ１（ＰＤ１）及びＣＴＬＡ４は、活性化Ｔ細胞において上方制御される免疫チェックポイント分子であり、Ｔ細胞応答を弱め又は停止させる働きをする。遺伝子編集によってこれらを破壊すれば、より持続性の高い及び／又は強力な治療用Ｔ細胞応答につながり得る。

標的遺伝子は、細胞の薬理学的調節に関連する配列であってもよい。例えば、ＣＤ５２は、リンパ枯渇治療用抗体アレムツズマブの標的である。遺伝子編集によってＣＤ５２を破壊すると、治療用Ｔ細胞がアレムツズマブ抵抗性となり、これはある種の癌セッティングで有用となり得る。

上記の遺伝子の欠失は、小規模（＜５）〜中規模（＞５０）スクリーニングで選択されたガイドＲＮＡによって実現することができる。本明細書に提供される例は、標的遺伝子の破壊、例えば遺伝子発現及び／又は機能の低下又は消失を生じさせるインデルの作成に有用な様々な標的領域及びｇＲＮＡの選択を更に例示する。本明細書に提供される例は、ゲノム（ｇｅｎｏｎｅ）へのドナー鋳型の挿入を促進するＤＳＢの作成に有用な様々な標的領域及びｇＲＮＡの選択を更に例示する。移植片対宿主病、宿主対移植片病（ｈｏｓｔｖｅｒｓｕｓｇｒａｐｈｄｉｓｅａｓｅ）及び／又は免疫抑制に関連する標的遺伝子の例。一部の態様において、ガイドＲＮＡは、本明細書に開示される配列を含むｇＲＮＡである。

本方法は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９を使用することによりゲノム遺伝子座に挿入されるキメラ抗原受容体コンストラクト（ＣＡＲ）を使用して二本鎖切断を誘導し、それが切断部位の周囲に相同性を有するＡＡＶ６送達ドナー鋳型を使用したＨＤＲによって修復される。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン又はＴ細胞活性化ドメインに連結した抗体の抗原結合ドメインを含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチド（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））である。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞特異性及び応答性をＭＨＣの制約を受けない形で選択の標的に向かってリダイレクトする能力を有する。ＭＨＣの制約を受けない抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞には抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力が付与され、ひいては主要な腫瘍エスケープ機構が回避される。更に、ＣＡＲは、Ｔ細胞における発現時に、有利には内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量化しない。

本明細書に提供される材料及び方法は、標的遺伝子の少なくとも一部分を永久に欠失させて、ＣＡＲをコードする核酸を挿入することにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を標的遺伝子の遺伝子座又はその近傍にノックインする。本明細書に提供される材料及び方法で使用されるＣＡＲは、（ｉ）抗原認識領域を含むエクトドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含む。ＣＡＲをコードする核酸はまた、プロモーター、１つ以上の遺伝子調節エレメント、又はこれらの組み合わせも含み得る。例えば、遺伝子調節エレメントは、エンハンサー配列、イントロン配列、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、及び／又はこれらの組み合わせであってもよい。

相同組換え修復（ＨＤＲ）によって挿入されるドナーは、アニーリングを可能にする小型又は大型隣接相同性アームを有する修正された配列を含む。ＨＤＲは、ＤＳＢ修復時に鋳型として供給された相同ＤＮＡ配列を使用する本質的に誤りのない機構である。相同組換え修復（ＨＤＲ）率は突然変異と切断部位との間の距離に応じて変わり、そのためオーバーラップした又はすぐ近くの標的部位を選ぶことが重要である。鋳型は、相同性領域が隣接した余分な配列を含んでもよく、又はゲノム配列と異なる配列を含んで、ひいては配列編集を可能にしてもよい。

標的遺伝子は対象の免疫応答に関連してもよく、ここでは標的遺伝子の発現の破壊によって免疫応答が調節されることになる。例えば、標的遺伝子に小さい挿入又は欠失を作成する、及び／又は標的遺伝子の少なくとも一部分（ａｐｒｏｔｉｏｎ）を永久に欠失させる、及び／又は標的遺伝子に外因性配列を挿入すると、標的遺伝子の発現を破壊することができる。標的遺伝子配列は、宿主対移植片反応に関連してもよく、移植片対宿主反応に関連する遺伝子配列、チェックポイント阻害因子をコードする遺伝子配列、及び／又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。

移植片対宿主（ＧＶＨ）反応に関連する標的遺伝子としては、例えば、ＴＲＡＣ、ＣＤ３イプシロン（ｅｐｉｓｏｌｏｎ）（ＣＤ３ε）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。これらの遺伝子の少なくとも一部分を永久に欠失させる、これらの遺伝子に小さい挿入又は欠失を作成する、及び／又はＣＡＲをコードする核酸を挿入すると、対象のＧＶＨ反応を低下させることができる。ＧＶＨ反応の低下は部分的であっても、又は完全であってもよい。

宿主対移植片（ＨＶＧ）反応に関連する標的遺伝子としては、例えば、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びこれらの組み合わせが挙げられる。これらの遺伝子の少なくとも一部分を永久に欠失させる、これらの遺伝子に小さい挿入又は欠失を作成する、及び／又はＣＡＲをコードする核酸を挿入すると、対象のＨＶＧ反応を低下させることができる。ＨＶＧ反応の低下は部分的であっても、又は完全であってもよい。

免疫抑制に関連する標的遺伝子としては、例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、及びこれらの組み合わせなどのチェックポイント阻害因子が挙げられる。これらの遺伝子の少なくとも一部分を永久に欠失させる、これらの遺伝子に小さい挿入又は欠失を作成する、及び／又はＣＡＲをコードする核酸を挿入すると、対象の免疫抑制を低下させることができる。免疫抑制の低下は部分的であっても、又は完全であってもよい。

標的遺伝子は細胞の薬理学的調節に関連してもよく、ここでは標的遺伝子の発現の破壊によって細胞の１つ又は薬理学的特性が調節されることになる。

細胞の薬理学的調節に関連する標的遺伝子としては、例えばＣＤ５２が挙げられる。これらの遺伝子の少なくとも一部分を永久に欠失させる、これらの遺伝子に小さい挿入又は欠失を作成する、及び／又はＣＡＲをコードする核酸を挿入すると、細胞の１つ又は薬理学的特性を正又は負に調節することができる。細胞の１つ又は薬理学的特性の調節は部分的であっても、又は完全であってもよい。例えば、これらの遺伝子の少なくとも一部分を永久に欠失させること及びＣＡＲをコードする核酸を挿入することにより、ＣＡＲＴ細胞に正の影響を及ぼし、又は別様にその生存を可能にすることができる。或いは、これらの遺伝子の少なくとも一部分を永久に欠失させること及びＣＡＲをコードする核酸を挿入することにより、ＣＡＲＴ細胞に負の影響を及ぼし、又は別様にそれを死滅させることができる。

ＣＡＲをコードする核酸コンストラクトに使用されるドナー鋳型はまた、ミニ遺伝子又はｃＤＮＡも含み得る。例えば、ミニ遺伝子又はｃＤＮＡは、細胞の薬理学的調節に関連する遺伝子配列を含み得る。遺伝子配列はＨｅｒ２をコードしてもよい。

Ｈｅｒ２遺伝子配列は、ＣＡＲコンストラクトをコードする核酸が挿入される遺伝子座と標的遺伝子中の異なる遺伝子座又はゲノム中の異なる遺伝子座に永久に挿入することができる。

本明細書には、標的遺伝子に小さい挿入又は欠失を誘導して標的遺伝子の破壊（例えば：遺伝子発現及び／又は機能の低下又は消失）を生じさせるＤＳＢに至る方法が提供される。

また、本明細書には、標的遺伝子の範囲内又はその近傍にＤＢＳを作成する、及び／又はそれを永久に欠失させる方法、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡによって標的配列に二本鎖切断（又は２つの適切なｓｇＲＮＡを使用して一対の二本鎖切断）を誘導することにより、ＣＡＲコンストラクトをコードする核酸コンストラクトを遺伝子に挿入する方法、及びドナーＤＮＡ鋳型を提供して相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘導する方法も提供される。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型は、短鎖一本鎖オリゴヌクレオチド、短鎖二本鎖オリゴヌクレオチド、長鎖一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。これらの方法は、各標的に対するｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡ分子を使用する。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡは、対応する領域に対する相同性アームを有する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態において、相同性アームは、ＴＲＡＣ（ｃｈｒ１４：２２２７８１５１〜２２５５３６６３）、ＣＤ３ε（ｃｈｒ１１：１１８３０１５４５〜１１８３１９１７５）、Ｂ２Ｍ（ｃｈｒ１５：４４７０８４７７〜４４７２１８７７）、ＣＩＩＴＡ（ｃｈｒ１６：１０８７４１９８〜１０９３５２８１）、ＲＦＸ５（ｃｈｒ１：１５１３３７６４０〜１５１３５０２５１）、ＰＤ１（ｃｈｒ２：２４１８４６８８１〜２４１８６１９０８）、ＣＴＬＡ−４（ｃｈｒ２：２０３８６４７８６〜２０３８７６９６０）、ＣＤ５２（ｃｈｒ１：２６３１４９５７〜２６３２３５２３）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ｃｈｒ１９：５５０８７９１３〜５５１２０５５９）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子のヌクレアーゼ標的領域に向けられる。

本明細書には、標的ｃＤＮＡ又はミニ遺伝子（１つ以上のエクソン及びイントロン又は天然若しくは合成イントロンを含む）を対応する遺伝子の遺伝子座にノックインする方法が提供される。これらの方法は、標的遺伝子の第１のエクソン及び／又は第１のイントロンを標的とする一対のｓｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡは、選択されたＨｅｒ２遺伝子のヌクレアーゼ標的領域に対する相同性アームを有する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡである。

本明細書には、１）標的遺伝子の範囲内又はその近傍にＤＳＢを作成して小さい挿入、欠失又は突然変異を誘導すること、２）標的遺伝子又は標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の範囲内又はその近傍を欠失させて、ノックインＣＡＲコンストラクトをコードする核酸を標的遺伝子又は標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の範囲内又はその近傍にＨＤＲによって挿入すること、又は３）標的遺伝子の範囲内又はその近傍にＤＳＢを作成し、ＨＤＲによって標的遺伝子の範囲内又はその近傍に核酸コンストラクトを挿入することによる、ゲノム操作ツールを使用してゲノムに永久的な変化を作成するための細胞的方法（例えば、エキソビボ又はインビボ）方法が提供される。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼなど、エンドヌクレアーゼを使用してエクソンの１つ以上又はその一部分を永久に欠失させ、挿入し、編集し、修正し、又は置換し（即ち、コード配列及び／又はスプライシング配列の範囲内又はその近傍における突然変異）、又は標的遺伝子若しくは標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列のゲノム遺伝子座に挿入する。このように、本開示に明らかにされる例は、単回の治療で（可能性のある療法を患者の生涯にわたって送達するのでなく）遺伝子のリーディングフレーム又は野生型配列を回復し、又はその他、遺伝子を修正する。

本明細書には、医学的病態を有する患者を治療する方法が提供される。かかる方法の一態様は、エキソビボ細胞ベース療法である。例えば、末梢血単核球が患者から単離される。次に、それらの細胞の染色体ＤＮＡが、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集される。最後に、ゲノム編集細胞が患者に植え込まれる。

また、本明細書には、対象の腫瘍容積を低下させる方法も提供され、この方法は、本開示の細胞（例えば、操作されたＴ細胞）の集団を含むある用量の医薬組成物を対象に投与すること、及び対象の腫瘍容積を対照（例えば、未治療の対象）と比べて少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％）低下させることを含む。

更に本明細書には、対象の生存率を増加させる方法が提供され、この方法は、本開示の細胞（例えば、操作されたＴ細胞）の集団を含むある用量の医薬組成物を対象に投与すること、及び対象の生存率を対照（例えば、未治療の対象）と比べて少なくとも５０％％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％）増加させることを含む。

一部の実施形態において、本組成物は１×１０^５〜１×１０^６細胞を含む。一部の実施形態において、本医薬組成物は１×１０^５〜２×１０^６細胞を含む。例えば、本組成物は１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、又は２×１０^６を含み得る。一部の実施形態において、本医薬組成物は１×１０^５〜５×１０^５細胞、５×１０^５〜１×１０^６細胞、又は５×１０^５〜１．５×１０^６細胞を含む。

エキソビボ細胞ベース療法の別の態様は、例えば、ドナーからＴ細胞を単離することを含み得る。次に、それらの細胞の染色体ＤＮＡが、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集される。最後に、ゲノム編集細胞が患者に植え込まれる。

特定の態様において、Ｔ細胞は２個体以上のドナーから単離される。それらの細胞が、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集される。最後に、ゲノム編集細胞が患者に植え込まれる。

エキソビボ細胞療法手法の一つの利点は、投与前に療法薬の総合的分析を行うことが可能なことである。ヌクレアーゼベース療法薬には、あるレベルのオフターゲット効果がある。遺伝子修正をエキソビボで実施することにより、修正後の細胞集団を植え込む前に完全に特徴付けることが可能になる。本開示は、修正された細胞のゲノム全体をシーケンシングして、オフターゲット効果があるならば、それが患者にとって最小限のリスクを伴うゲノム位置にあるよう確実にすることを含む。更に、クローン集団を含む特異的細胞集団を植え込む前に単離することができる。

かかる方法の別の実施形態はまた、インビボベース療法も含む。この方法では、患者の細胞の染色体ＤＮＡが、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集される。一部の実施形態において、細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせなど、Ｔ細胞である。

また、本明細書には、細胞の標的遺伝子をゲノム編集によって編集するための細胞的方法も提供される。例えば、患者又は動物から細胞が単離される。次に、細胞の染色体ＤＮＡが、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集される。

本明細書に提供される方法は、一部の実施形態において、以下のうちの１つ又は組み合わせを含む：１）標的遺伝子又は標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の範囲内又はその近傍にインデルを作成すること、２）標的遺伝子又は標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の範囲内又はその近傍を欠失させること、３）ノックインＣＡＲコンストラクトをコードする核酸を標的遺伝子又は標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の範囲内又はその近傍にＨＤＲ又はＮＨＥＪによって挿入すること、又は４）標的遺伝子の少なくとも一部分の欠失、及び／又は標的ｃＤＮＡ又はミニ遺伝子（１つ以上のエクソン又はイントロン又は天然若しくは合成イントロンを含む）をノックインすること、又は外因性標的ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列又はその断片を遺伝子の遺伝子座に導入すること。

ノックイン戦略では、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）においてドナーＤＮＡ鋳型を利用する。いずれの戦略におけるＨＤＲも、１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用することによってゲノムの特異的部位に１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）を作ることにより達成し得る。

例えば、ノックイン戦略は、標的遺伝子の１番目の又は他のエクソン及び／又はイントロンの上流又はそこを標的とするｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ）又は一対のｓｇＲＮＡを使用して標的ｃＤＮＡ又はミニ遺伝子（天然又は合成エンハンサー及びプロモーター、１つ以上のエクソン、及び天然又は合成イントロン、及び天然又は合成３’ＵＴＲ及びポリアデニル化シグナルを含む）を遺伝子の遺伝子座にノックインすることを含む。ドナーＤＮＡは、標的遺伝子のヌクレアーゼ標的領域に対する相同性アームを有する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであってもよい。例えば、ドナーＤＮＡは、ＴＲＡＣ（ｃｈｒ１４：２２２７８１５１〜２２５５３６６３）、ＣＤ３ε（ｃｈｒ１１：１１８３０１５４５〜１１８３１９１７５）、Ｂ２Ｍ（ｃｈｒ１５：４４７０８４７７〜４４７２１８７７）、ＣＩＩＴＡ（ｃｈｒ１６：１０８７４１９８〜１０９３５２８１）、ＲＦＸ５（ｃｈｒ１：１５１３３７６４０〜１５１３５０２５１）、ＰＤ１（ｃｈｒ２：２４１８４６８８１〜２４１８６１９０８）、ＣＴＬＡ−４（ｃｈｒ２：２０３８６４７８６〜２０３８７６９６０）、ＣＤ５２（ｃｈｒ１：２６３１４９５７〜２６３２３５２３）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ｃｈｒ１９：５５０８７９１３〜５５１２０５５９）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子のヌクレアーゼ標的領域に対する相同性アームを有する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであってもよい。

例えば、欠失戦略は、一部の態様において、１つ以上のエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡを使用して標的遺伝子の１つ以上のイントロン、エクソン、調節領域、標的遺伝子の部分的セグメント又は標的遺伝子配列全体を欠失させることを含む。

別の例として、欠失戦略は、一部の態様において、１つ以上のエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡを使用して１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の核酸を欠失させて、小さい挿入又は欠失（インデル）を生じさせることを含む。

上記のゲノム編集戦略に加えて、別の例示的編集戦略は、調節配列における編集によって標的遺伝子の発現、機能、又は活性を調節することを含む。

上記に挙げた編集選択肢に加え、Ｃａｓ９又は同様のタンパク質を使用してエフェクタードメインの標的を、編集に同定され得る同じ標的部位、又はエフェクタードメインの有効範囲内にある追加的な標的部位に向けることができる。標的遺伝子の発現を改変するために様々なクロマチン修飾酵素、メチラーゼ又はデメチラーゼ（ｄｅｍｅｔｈｌｙａｓｅ）を使用し得る。１つの可能性は、突然変異が活性低下につながる場合、標的タンパク質の発現を増加させることである。この種のエピジェネティック調節は、特に起こり得るオフターゲット効果の点で限られているため、幾らか有利である。

コード配列及びスプライシング配列における突然変異に加えて、幾つもの種類のゲノム標的部位が存在する。

転写及び翻訳の調節は、細胞タンパク質又はヌクレオチドと相互作用する幾つもの異なるクラスの部位が関わるとされている。多くの場合に転写因子又は他のタンパク質のＤＮＡ結合部位が、部位の役割を研究するための突然変異又は欠失の標的となり得るが、それらはまた、遺伝子発現を変化させるための標的にもなり得る。部位は非相同末端結合ＮＨＥＪ又は相同組換え修復（ＨＤＲ）による直接的なゲノム編集を通じて付加することができる。転写因子結合のゲノムシーケンシング、ＲＮＡ発現及びゲノムワイド研究の利用が増し、それらの部位がどのように発生上の又は一時的な遺伝子調節につながるかを同定できる可能性が増している。これらの制御系は直接的であることもあり、又は複数のエンハンサーからの活性を統合する必要があり得る広範な協調的調節を伴うこともある。転写因子は、典型的には６〜１２ｂｐ長の縮重ＤＮＡ配列に結合する。個々の部位がもたらす特異性レベルは低く、結合及び機能的帰結には複合的相互作用及び規則が関与していることが示唆される。縮重性の低い結合部位ほど単純な調節手段を提供し得る。人工転写因子は、ゲノム中に類似配列が少なく且つオフターゲット切断の可能性が低い、より長い配列を指定するように設計することができる。この種の結合部位はいずれも、遺伝子調節若しくは発現の変化が可能となるように突然変異させ、欠失させ、又は更には作成することができる（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。

これらの特徴を有する別のクラスの遺伝子調節領域は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは、転写後遺伝子調節において重要な役割を果たす非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、全哺乳類タンパク質コード遺伝子のうちの３０％の発現を調節し得る。二本鎖ＲＮＡによる特異的且つ強力な遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）が、追加的な小さい非コードＲＮＡと共に発見された（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。遺伝子サイレンシングに重要な非コードＲＮＡの最も大きいクラスがｍｉＲＮＡである。哺乳類では、ｍｉＲＮＡは初めに長いＲＮＡ転写物として転写され、それが転写単位、タンパク質イントロンの部分、又は他の転写物に分かれ得る。この長い転写物は、不完全に塩基対合したヘアピン構造を含むプライマリｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。このｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが、Ｄｒｏｓｈａが関わる核中にあるタンパク質複合体であるマイクロプロセッサによって１つ以上の短い前駆ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に切断される。

ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、成熟１９〜２５ヌクレオチドｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖に輸送される２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する約７０ヌクレオチド長の短いステムループである。低い塩基対合安定性のｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に負荷され得る。パッセンジャーガイド鎖（^＊印が付される）は機能性であり得るが、通常は分解される。成熟ｍｉＲＮＡは、主に３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に見られる標的ｍＲＮＡの部分的に相補的な配列モチーフにＲＩＳＣをテザー係留し、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ１３６，２１５−２３３（２００９）；Ｓａｊ，Ａ．＆Ｌａｉ，Ｅ．Ｃ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＧｅｎｅｔＤｅｖ２１，５０４−５１０（２０１１））。

ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期及び成長制御において、並びに哺乳類及び他の多細胞生物の事実上全ての生物学的経路において重要である。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期調節、アポトーシス及び幹細胞分化、造血、低酸素症、筋肉発生、神経形成、インスリン分泌、コレステロール代謝、加齢、ウイルス複製及び免疫応答にも関与する。

単一のｍｉＲＮＡが数百の異なるｍＲＮＡ転写物を標的とし得る一方、個々の転写物が多くの異なるｍｉＲＮＡの標的となり得る。最新リリースのｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．２１）においては２８６４５個を超えるマイクロＲＮＡがアノテートされている。一部のｍｉＲＮＡは複数の遺伝子座によってコードされ、そのうちの一部は、タンデムに共転写されたクラスターから発現する。こうした特徴により、複数の経路及びフィードバック制御を伴う複雑な調節ネットワークが実現する。ｍｉＲＮＡは、それらのフィードバック及び調節回路の不可欠な部分であり、タンパク質産生を限度内に保つことにより遺伝子発現の調節の助けとなり得る（Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｈ．＆Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ２４，１３３９−１３４４（２０１０）；Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＧｅｎｅｔＤｅｖ２７，１−６（２０１４））。

ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現に関連する多数のヒト疾患においても重要である。この関連性は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を強調する。最近のｍｉＲＮＡ欠失研究では、ｍｉＲＮＡが免疫応答の調節と関連付けられている（Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７，３７６−３８１（２００７））。

ｍｉＲＮＡはまた癌との強い関連も有し、様々な種類の癌において役割を果たし得る。幾つもの腫瘍でｍｉＲＮＡが下方制御されることが分かっている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期調節及びＤＮＡ損傷応答など、主要な癌関連経路の調節において重要であり、従って診断に使用され、臨床で標的とされている。マイクロＲＮＡは血管新生のバランスをきめ細かに調節し、全てのマイクロＲＮＡを枯渇させる実験では腫瘍血管新生が抑制されることになる（Ｃｈｅｎ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ２８，１０５４−１０６７（２０１４））。

タンパク質コード遺伝子について明らかにされているとおり、ｍｉＲＮＡ遺伝子はまた、癌で起こる後成的変化も受ける。多くのｍｉＲＮＡ遺伝子座がＣｐＧ島に関連し、ＤＮＡメチル化によってその調節機会を高めている（Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．，Ｓｔｒｅｓｅｍａｎｎ，Ｃ．，Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ，Ｂ．＆Ｌｙｋｏ，Ｆ．ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ６，１００１−１００５（２００７））。これらの研究の大多数は、後成的にサイレンシングされたｍｉＲＮＡを明らかにするためにクロマチンリモデリング薬物による治療を用いている。

ＲＮＡサイレンシングにおけるその役割に加えて、ｍｉＲＮＡはまた翻訳も活性化することができる（Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＧｅｎｅｔＤｅｖ２７，１−６（２０１４））。これらの部位をノックアウトすると標的遺伝子の発現の低下につながり得る一方、これらの部位を導入すると発現が増加し得る。

個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性に重要なシード配列（マイクロＲＮＡの塩基２〜８）の突然変異により最も効果的にノックアウトすることができる。この領域の切断と、続くＮＨＥＪによる修復誤りにより、標的部位への結合が遮断されるためｍｉＲＮＡ機能を効果的に無効化し得る。ｍｉＲＮＡはまた、パリンドローム配列に隣接する特別なループ領域の特異的ターゲティングによっても阻害することが可能であり得る。触媒不活性Ｃａｓ９もまたｓｈＲＮＡ発現の阻害に使用することができる（Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ４，３９４３（２０１４））。ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防ぐため、ｍｉＲＮＡのターゲティングに加えて、結合部位もまた標的化して突然変異させることができる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞
キメラ抗原受容体とは、腫瘍細胞が発現する抗原を認識してそれに結合するように操作される人工の免疫細胞受容体を指す。概して、ＣＡＲはＴ細胞向けに設計され、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）複合体のシグナル伝達ドメインと抗原認識ドメイン（例えば、抗体の単鎖断片（ｓｃＦｖ）又は他の抗体断片）とのキメラである（Ｅｎｂｌａｄｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８−５０５）。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲＴ細胞と称される。ＣＡＲは、Ｔ細胞特異性及び反応性をＭＨＣの制約を受けない形で選択の標的に向かってリダイレクトする能力を有する。ＭＨＣの制約を受けない抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞には抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力が付与され、ひいては主要な腫瘍エスケープ機構が回避される。更に、ＣＡＲは有利には、Ｔ細胞における発現時に内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量化しない。

ＣＡＲには４世代があり、その各々が異なる成分を含む。第１世代ＣＡＲは抗体由来のｓｃＦｖをヒンジ及び膜貫通ドメインによってＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインにつなぎ合わせる。第２世代ＣＡＲは追加的なドメイン、例えばＣＤ２８、４−１ＢＢ（４１ＢＢ）、又はＩＣＯＳを取り入れて共刺激シグナルを供給する。第３世代ＣＡＲは、ＴｃＲＣＤ３−ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメインを含む。第３世代共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の組み合わせを含み得る。ＣＡＲは、一部の実施形態において、一般に単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来するエクトドメイン（例えばＣＤ３ζ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにＣＤ３Ζ及び／又は共刺激分子に由来する１つ（第１世代）、２つ（第２世代）、又は３つ（第３世代）のシグナル伝達ドメインを有するエンドドメインを含む（Ｍａｕｄｅｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７−４０２３；ＫａｋａｒｌａａｎｄＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，ＣａｎｃｅｒＪ．２０１４；２０（２）：１５１−１５５）。

ＣＡＲは、典型的にはその機能特性が異なる。Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、会合時、Ｔ細胞を活性化し、その増殖を誘導することになるが、アネルギー（体の防御機構による反応の欠如、末梢リンパ球トレランスの直接的な誘導をもたらす）につながり得る。リンパ球は、それが特異的抗原に応答できないとき、アネルギー性であると考えられる。第２世代ＣＡＲでは共刺激ドメインが加わったことにより、修飾Ｔ細胞の複製能力及び持続性が改善された。同様の抗腫瘍効果がインビトロでＣＤ２８又は４−１ＢＢＣＡＲによって観察されるが、前臨床インビボ研究からは、４−１ＢＢＣＡＲが優れた増殖及び／又は持続性を生じ得ることが示唆される。臨床試験からは、これらの第２世代ＣＡＲが両方ともインビボで実質的なＴ細胞増殖の誘導能を有することが示唆されるが、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＡＲの方がより長く持続するように見える。第３世代ＣＡＲは複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせて（共刺激）効力を増強する。

一部の実施形態において、キメラ抗原受容体は第１世代ＣＡＲである。他の実施形態において、キメラ抗原受容体は第２の世代ＣＡＲである。更に他の実施形態において、キメラ抗原受容体は第３世代ＣＡＲである。

ＣＡＲは、一部の実施形態において、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖなどの抗体）を含む細胞外（エクト）ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞質（エンド）ドメインとを含む。

エクトドメイン。エクトドメインは、ＣＡＲのなかで細胞外液に露出している領域であり、一部の実施形態では、抗原結合ドメイン、及び任意選択でシグナルペプチド、スペーサードメイン、及び／又はヒンジドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、短いリンカーペプチド（例えば、配列番号１５９１、１５９４、又は１５９７のいずれか１つ）でつながった免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）の軽鎖及び重鎖を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。リンカーは、一部の実施形態において、可動性のためのグリシン及びセリンのストレッチ並びに溶解度向上のためのグルタミン酸及びリジンのストレッチを有する親水性残基を含む。単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、実際には抗体の断片ではなく、むしろ、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドでつながった免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、可動性のためグリシンリッチであるとともに溶解度のためセリン又はスレオニンリッチであり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端につなぐか、又はその逆かのいずれであってもよい。このタンパク質は、定常領域が除去され、且つリンカーが導入されているにも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。一部の実施形態において、本開示のｓｃＦｖはヒト化である。他の実施形態において、ｓｃＦｖは完全ヒトである。更に他の実施形態において、ｓｃＦｖはキメラ（例えば、マウス及びヒト配列の）である。一部の実施形態において、ｓｃＦｖは抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ（ＣＤ７０に特異的に結合する）である。本明細書に提供されるとおり使用し得る抗ＣＤ７０ｓｃＦｖタンパク質並びに重鎖及び／又は軽鎖の非限定的な例としては、配列番号１４９９（ｓｃＦｖ）、１５００（ｓｃＦＶ）、１５９２（重鎖）、又は１５９３（軽鎖）のいずれか１つを含むものが挙げられる。

シグナルペプチドは、ＣＡＲ結合の抗原特異性を増強し得る。シグナルペプチドは、抗体、限定はされないがＣＤ８など、並びにエピトープタグ、限定はされないがＧＳＴ又はＦＬＡＧなどに由来することができる。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１５９８）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１５８６）が挙げられる。他のシグナルペプチドが使用されてもよい。

一部の実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメイン又はヒンジドメインが位置する。スペーサードメインは、膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインにポリペプチド鎖で連結する働きをする任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。ヒンジドメインは、ＣＡＲに、若しくはそのドメインに可動性を提供し、又はＣＡＲの、若しくはそのドメインの立体障害を防ぐ働きをする任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。一部の実施形態において、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、最大３００アミノ酸（例えば、１０〜１００アミノ酸、又は５〜２０アミノ酸）を含み得る。一部の実施形態において、１つ以上のスペーサードメインがＣＡＲの他の領域に含まれてもよい。一部の実施形態において、ヒンジドメインはＣＤ８ヒンジドメインである。他のヒンジドメインが使用されてもよい。

膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性αヘリックスである。膜貫通ドメインはＣＡＲの安定性を提供する。一部の実施形態において、本明細書に提供されるとおりのＣＡＲの膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインである。他の実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインである。更に他の実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ８及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。本明細書に提供されるとおり他の膜貫通ドメインが使用されてもよい。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、任意選択で５’リンカーを含むＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。

エンドドメイン。エンドドメインは、受容体の機能的末端である。抗原認識後、受容体はクラスター化し、細胞にシグナルが送られる。最も一般的に用いられるエンドドメイン成分はＣＤ３−ゼータであり、これは３つのＩＴＡＭを含む。これは抗原の結合後にＴ細胞に活性化シグナルを送る。多くの場合、ＣＤ３−ゼータは完全にコンピテントな活性化シグナルを提供しないものであってよく、従って共刺激シグナル伝達が用いられる。例えば、増殖／生存シグナルを送るため、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）と共にＣＤ２８及び／又は４−１ＢＢが使用されてもよい。従って、一部の実施形態において、本明細書に提供されるとおりのＣＡＲの共刺激分子はＣＤ２８共刺激分子である。他の実施形態において、共刺激分子は４−１ＢＢ共刺激分子である。一部の実施形態において、ＣＡＲはＣＤ３ζ及びＣＤ２８を含む。他の実施形態において、ＣＡＲはＣＤ３−ゼータ及び４−１ＢＢを含む。なおも他の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び４−１ＢＢを含む。本明細書において使用し得る共刺激分子の非限定的な例としては、配列番号１３７７（ＣＤ３−ゼータ）、配列番号１３３６（ＣＤ２８）、及び／又は配列番号１３３９（４−１ＢＢ）のヌクレオチド配列によってコードされるものが挙げられる。

ヒト細胞
本明細書に記載及び例示されるとおり、遺伝子編集の主要な標的はヒト細胞である。例えば、初代ヒトＴ細胞、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋が編集されてもよい。これらは末梢血単核球単離から単離することができる。

遺伝子編集は、標的表面タンパク質発現の変化並びにＰＣＲ及び／又はシーケンシングによるＤＮＡ解析によって確認することができる。

編集された細胞は選択的優位性を有し得る。ＭＨＣ−Ｉ及び／又はＭＨＣ−ＩＩ並びにＰＤＣＤ１又はＣＴＬＡ４ノックアウトＴ細胞は患者においてより長く持続し得る。

編集された細胞は、オフターゲット遺伝子編集並びに転座に関してアッセイすることができる。こうした細胞はまた、サイトカイン不含培地で成長する能力に関しても試験することができる。編集された細胞が低いオフターゲット活性及び最小限の転座を呈するとともに、サイトカイン不含培地で成長する能力がない場合、それは安全と見なされることになる。

初代ヒトＴ細胞は、ｌｅｕｋｏｐａｋから単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離することができる。Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体カップリングナノ粒子又はビーズでの処理によって拡大することができる。活性化Ｔ細胞に、ｓｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９を含有する１つ又は複数のＲＮＰを電気穿孔することができる。細胞は次に、ＨＤＲに必要な場合には、例えばＣＡＲコンストラクトをコードする核酸の挿入用のドナー鋳型ＤＮＡを含有するＡＡＶ６ウイルスで処理することができる。細胞は次に、液体培養で１〜２週間拡大させることができる。ＴＣＲ陰性細胞が必要な場合、編集された細胞を例えばＭＡＣＳなどの抗体／カラムベースの方法によって選択することができる。

治療すべき医学的病態を有しない、又はそれを有する疑いがないドナーに由来する同種異系細胞で遺伝子編集を実施することにより、患者に安全に再導入することのできる、且つ患者の疾患に関連する１つ以上の臨床状態を改善するのに有効な細胞集団を有効に生じる細胞を生成することが可能である。

必要としている患者に由来する、従って既に完全に免疫学的に適合した自己細胞で遺伝子編集を実施することにより、患者に安全に再導入することのできる、且つ患者の疾患に関連する１つ以上の臨床状態を改善するのに有効な細胞集団を有効に生じる細胞を生成することが可能である。

前駆細胞（本明細書では幹細胞とも称される）は、増殖能力及びより多くの前駆細胞を生じる能力の両方を有し、ひいては多数の母細胞を生成する能力を有し、ひいては母細胞が分化した又は分化可能な娘細胞を生じることができる。娘細胞それ自体は、親の発生能を有する１つ以上の細胞もまた保持しつつ、増殖して、続いて１つ以上の成熟細胞型に分化する子孫を産生するように誘導することができる。次に用語「幹細胞」は、特定の状況下でより特殊化した又は分化した表現型に分化する能力又は潜在能を有し、且つある状況下では実質的に分化することなく増殖する能力を保持している細胞を指す。一態様において、用語の前駆細胞又は幹細胞は、その後代（子孫）が、例えば胚細胞及び組織の発育上の多様化において起こるとおりの完全に個別化した性質の獲得により、分化によって多くの場合に異なる方向に特殊化する一般化された母細胞を指す。細胞分化は、典型的には多くの細胞分裂を通じて起こる複合的な過程である。分化細胞は、それ自体が多能性細胞に由来する多能性細胞に由来し得る等となる。これらの多能性細胞の各々は幹細胞と見なされ得るが、各々が生じ得る細胞型の範囲は大きく異なり得る。一部の分化細胞はまた、より高い発生能の細胞を生じる能力も有する。かかる能力は天然であってもよく、又は様々な因子による処理を受けて人工的に誘導されてもよい。多くの生物学的例では、幹細胞はまた、２つ以上の異なる細胞型の子孫を産生することができるため「多分化能」でもあるが、これは「幹細胞性」であることの要件ではない。

自己再生は、幹細胞のもう一つの重要な側面である。理論上、自己再生は、２つの主要な機構のいずれか一方により起こり得る。幹細胞は非対称に分裂し、一方の娘細胞が幹細胞状態を保持して、他方の娘細胞が他の何らか異なる特異的機能及び表現型を発現し得る。或いは、集団中の幹細胞の一部が２つの幹細胞に対称に分裂し、従って全体として集団中に一部の幹細胞を維持する一方で、集団中の残りの細胞は分化した子孫のみを生じ得る。概して、「前駆細胞」は、より原始的な（即ち、完全に分化した細胞と比べて発生経路又は発育に沿ってより早い段階にある）細胞表現型を有する。多くの場合に、前駆細胞はまた、顕著な又は極めて高い増殖能も有する。前駆細胞は、発生経路に応じて、並びに細胞が発生及び分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞型を生じることも、又は単一の分化細胞型を生じることもある。

細胞個体発生の文脈では、形容詞「分化した」又は「分化している」は相対的な用語である。「分化した細胞」は、それが比較の対象としている細胞よりも発生経路上更に先まで発育している細胞である。従って、幹細胞は系統限定的前駆細胞に分化することができ（筋前駆細胞など）、ひいてはこれが経路上更に先の他の前駆細胞型に分化して（筋形成細胞など）、次に、ある種の組織型で特徴的な役割を果たす、且つ更なる増殖能を保持していることも、又は保持していないこともある筋細胞などの末期分化細胞に至り得る。

用語「造血前駆細胞」は、赤血球系（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）又は赤血球（ｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌ：ＲＢＣ））、骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板、及び樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含めた全ての血球細胞型を生じる幹細胞系統の細胞を指す。

末梢血単核球の単離
末梢血単核球は、当該技術分野において公知の任意の方法により単離されてもよい。例えば、白血球は、液体試料から遠心及び細胞培養によって単離し得る。

ＧＣＳＦによる患者の治療
患者は、任意選択で、当該技術分野において公知の任意の方法において顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）で治療されてもよい。一部の実施形態において、ＧＣＳＦはプレリキサホル（Ｐｌｅｒｉｘａｆｌｏｒ）と併用して投与される。

動物モデル
有効性試験には、ＮＯＧ又はＮＳＧマウスを使用することができる。これらのマウスにヒトリンパ腫細胞株を移植し、続いて編集ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞を移植することができる。リンパ腫細胞の喪失／防止は、編集Ｔ細胞の有効性を示すものであり得る。

ＴＣＲ編集Ｔ細胞の安全性は、ＮＯＧ又はＮＳＧマウスで評価することができる。これらのマウスに移植されたヒトＴ細胞は致死性の異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得る。遺伝子編集によってＴＣＲを除去すれば、この種のＧＶＨＤは軽減されるはずである。

ゲノム編集
ゲノム編集とは、概して、ゲノムのヌクレオチド配列を好ましくは正確な又は予め決められた方法で修飾するプロセスを指す。本明細書に記載されるゲノム編集方法の例には、部位特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの正確な標的位置でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断し、それによりゲノム内の特定の位置に一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ切断を作成する方法が含まれる。かかる切断は、近年ではＣｏｘｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２１（２），１２１−３１（２０１５）によりレビューされたとおり、相同組換え修復（ＨＤＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの天然の内因性細胞プロセスによって修復されてもよく、通常はそれによって修復される。これらの２つの主要なＤＮＡ修復プロセスは、代替的経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪでは、二本鎖切断によって生じるＤＮＡ末端が直接つなぎ合わされるが、時にヌクレオチド配列の喪失又は追加を伴い、それが遺伝子発現を破壊又は増強し得る。ＨＤＲでは、切断点に定義付けられたＤＮＡ配列を挿入するための鋳型として相同配列、又はドナー配列が利用される。相同配列は姉妹染色分体などの内因性ゲノムにあってもよい。或いは、ドナーは、ヌクレアーゼ切断遺伝子座と高い相同性の領域を有するが、切断された標的遺伝子座に取り込まれ得る追加的な配列又は欠失を含めた配列変化もまた含み得る、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド又はウイルスなどの外因性核酸であってもよい。第３の修復機構は、「代替的ＮＨＥＪ」とも称されるマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり、ここで遺伝的結果は、切断部位に小さい欠失及び挿入が起こり得る点でＮＨＥＪと同様である。ＭＭＥＪでは、ＤＮＡ切断部位に隣接する数塩基対の相同配列を用いてより有利なＤＮＡ末端結合修復結果がドライブされ、最近の報告ではこのプロセスの分子機構が更に解明されている；例えば、ＣｈｏａｎｄＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ５１８，１７４−７６（２０１５）；Ｋｅｎｔｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５）；Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５１８，２５４−５７（２０１５）；Ｃｅｃｃａｌｄｉｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５２８，２５８−６２（２０１５）を参照のこと。一部の例では、ＤＮＡ切断部位における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復結果を予測することが可能であり得る。

これらのゲノム編集機構の各々を用いて所望のゲノム改変を作成することができる。ゲノム編集プロセスのステップは、標的遺伝子座において意図される突然変異の部位の可能な限り近くに１つ又は２つのＤＮＡ切断（後者は二本鎖切断として、又は２つの一本鎖切断として）を作成することである。これは、本明細書に記載及び例示されるとおり、部位特異的ポリペプチドの使用によって実現することができる。

ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムＤＮＡに二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存的修復又は非相同末端結合又は代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）又はマイクロホモロジー媒介末端結合）を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同性鋳型の必要性なく、切断された標的核酸を修復することができる。これは時に標的核酸の切断部位に小さい欠失又は挿入（インデル）を生じさせることがあり、遺伝子発現の破壊又は改変につながり得る。ＨＤＲは、相同性修復鋳型、又はドナーが利用可能な場合に起こり得る。相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同な配列を含む。概して姉妹染色分体が、細胞によって修復鋳型として使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的上、修復鋳型は多くの場合に、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、又はウイルス核酸など、外因性核酸として供給される。外因性ドナー鋳型では、隣接相同性領域間に追加的な核酸配列（トランス遺伝子など）又は修飾（単一又は複数の塩基変化又は欠失など）を導入して、標的遺伝子座に追加的な又は改変された核酸配列もまた取り込まれるようにすることが一般的である。ＭＭＥＪでは、切断部位に小さい欠失及び挿入が起こり得る点でＮＨＥＪと同様の遺伝的結果が生じる。ＭＭＥＪでは、切断部位に隣接する数塩基対の相同配列を用いて有利な末端結合ＤＮＡ修復結果がドライブされる。一部の例では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復結果を予測することが可能であり得る。

従って、一部の実施形態では、非相同末端結合又は相同組換えのいずれかを用いて標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列が挿入される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書ではドナーポリヌクレオチド（又はドナー又はドナー配列又はポリヌクレオチドドナー鋳型）と呼ばれる。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部分が標的核酸切断部位に挿入される。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは外因性ポリヌクレオチド配列、即ち天然では標的核酸切断部位に存在しない配列である。

ＮＨＥＪ及び／又はＨＤＲに起因する標的ＤＮＡの修飾は、例えば、突然変異、欠失、改変、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付加、トランス遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座及び／又は遺伝子突然変異につながり得る。ゲノムＤＮＡを欠失させて非天然核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。

ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的間隔の短鎖パリンドロームリピート）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノムに見出すことができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ある種の免疫系として働くことによりウイルス及びファージなどの外来性侵入者から原核生物を防御する助けとなる産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能には３つの段階：ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への新規配列の組込み、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、及び外来性侵入核酸のサイレンシングがある。５種類のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が同定されている。

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、「リピート」と称される幾つもの短い反復配列を含む。発現時、リピートは二次構造（例えばヘアピン）を形成し、及び／又は構造化されていない一本鎖配列を含むことができる。リピートは通常はクラスター化して存在し、種間で異なることが多い。リピートは、「スペーサー」と称されるユニークな介在配列を間に挟んで規則的な間隔を置き、そのためリピート−スペーサー−リピート遺伝子座構成となる。スペーサーは既知の外来性侵入配列と同一であるか、又は高い相同性を有する。スペーサー−リピート単位はｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードし、これがプロセシングされて成熟型のスペーサー−リピート単位になる。ｃｒＲＮＡは、標的核酸のターゲティングに関与する「シード」又はスペーサー配列を含む（原核生物における天然に存在する形態では、スペーサー配列が外来性侵入核酸を標的化する）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’又は３’末端に位置する。

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物においてバイオジェネシス及びｃｒＲＮＡ機能の干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は相同性二次及び／又は三次構造を含む。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
天然でのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｃｒＲＮＡバイオジェネシスには、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは内因性ＲＮアーゼＩＩＩによって修飾され、次にｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ中のｃｒＲＮＡリピートにハイブリダイズする。内因性ＲＮアーゼＩＩＩが動員されてｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが切断される。切断されたｃｒＲＮＡはエキソリボヌクレアーゼのトリミングに供され、成熟ｃｒＲＮＡ形態（例えば、５’トリミング）を生じる。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたまま残り、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡが部位特異的ポリペプチド（例えばＣａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡがこの複合体を標的核酸にガイドし、この標的核酸は、それにｃｒＲＮＡがハイブリダイズすることができるものである。ｃｒＲＮＡが標的核酸にハイブリダイズすると、Ｃａｓ９が標的核酸切断のため活性化される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される。天然では、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えばＣａｓ９）による標的核酸への結合を促進するのに不可欠である。ＩＩ型システム（Ｎｍｅｎｉ又はＣＡＳＳ４とも称される）はＩＩ−Ａ型（ＣＡＳＳ４）及びＩＩ−Ｂ型（ＣＡＳＳ４ａ）に更に細分される。Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがＲＮＡプログラム可能ゲノム編集に有用であることを示したとともに、国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレットは、部位特異的遺伝子編集に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの数多くの例及び応用を提供する。

Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステム
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型システムと比べて幾つかの重要な違いがある。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。実際に、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは追加的なトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡの必要なく成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは４２〜４４ヌクレオチド長の短い成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、各成熟ｃｒＲＮＡが１９ヌクレオチドのダイレクトリピートで始まり、その後に２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。対照的に、ＩＩ型システムの成熟ｃｒＲＮＡは２０〜２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、その後に約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートが続く。また、Ｃｐｆ１はＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体は短いＴリッチＰＡＭが前にある標的ＤＮＡを効率的に切断することになり、これはＩＩ型システムで標的ＤＮＡの後にＧリッチＰＡＭがあるのと対照的である。従って、Ｖ型システムはＰＡＭから離れた点で切断し、一方、ＩＩ型システムはＰＡＭに隣接する点で切断する。加えて、ＩＩ型システムと対照的に、Ｃｐｆ１は、４又は５ヌクレオチドの５’オーバーハングを伴い付着末端型のＤＮＡ二本鎖切断によってＤＮＡを切断する。ＩＩ型システムは平滑末端二本鎖切断によって切断する。ＩＩ型システムと同様に、Ｃｐｆ１は予測ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いており、これはＩＩ型システムと対照的である。

Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチド及びプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Ｆｏｎｆａｒａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，４２：２５７７−２５９０（２０１４）の図１にあるＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子の命名方式は、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、大々的な書き換えを被っている。Ｆｏｎｆａｒａ、前掲の図５は、様々な種由来のＣａｓ９ポリペプチドについてのＰＡＭ配列を提供している。

部位特異的ポリペプチド
部位特異的ポリペプチドは、ゲノム編集においてＤＮＡの切断に使用されるヌクレアーゼである。部位特異的なもの（ｔｈｅｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）は、１つ以上のポリペプチド、又はポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡのいずれかとして細胞又は患者に投与されてもよい。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムのコンテクストでは、部位特異的ポリペプチドはガイドＲＮＡに結合することができ、次にはガイドＲＮＡが、ポリペプチドの対象となる標的ＤＮＡ中の部位を特定する。本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの実施形態において、部位特異的ポリペプチドはＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼである。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは複数の核酸切断（即ちヌクレアーゼ）ドメインを含む。２つ以上の核酸切断ドメインがリンカーによって一体に連結されてもよい。例えば、リンカーは可動性リンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０アミノ酸長又はそれ以上を含む。

天然に存在する野生型Ｃａｓ９酵素は２つのヌクレアーゼドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣドメインを含む。本明細書では、「Ｃａｓ９」は、天然に存在するＣａｓ９及び組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨ又はＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び／又はＲｕｖＣ又はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。

ＨＮＨ又はＨＮＨ様ドメインはＭｃｒＡ様の折り畳みを含む。ＨＮＨ又はＨＮＨ様ドメインは２つの逆平行βストランド及びαヘリックスを含む。ＨＮＨ又はＨＮＨ様ドメインは金属結合部位（例えば二価カチオン結合部位）を含む。ＨＮＨ又はＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の一方の鎖（例えば、ｃｒＲＮＡの標的となる鎖の相補鎖）を切断することができる。

ＲｕｖＣ又はＲｕｖＣ様ドメインはＲＮアーゼＨ又はＲＮアーゼＨ様の折り畳みを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨドメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方への作用を含め、多様な一組の核酸ベースの機能に関与する。ＲＮアーゼＨドメインは、複数のαヘリックスに囲まれた５つのβストランドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ又はＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは金属結合部位（例えば二価カチオン結合部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ又はＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、標的核酸の一方の鎖（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を切断することができる。

部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムＤＮＡに二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存的修復（ＨＤＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）又はマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同性鋳型の必要性なく、切断された標的核酸を修復することができる。これは時に標的核酸の切断部位に小さい欠失又は挿入（インデル）を生じさせることがあり、遺伝子発現の破壊又は改変につながり得る。ＨＤＲは、相同性修復鋳型、又はドナーが利用可能な場合に起こり得る。相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同な配列を含む。概して姉妹染色分体が、細胞によって修復鋳型として使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的上、修復鋳型は多くの場合に、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、又はウイルス核酸など、外因性核酸として供給される。外因性ドナー鋳型では、隣接相同性領域間に追加的な核酸配列（トランス遺伝子など）又は修飾（単一又は複数の塩基変化又は欠失など）を導入して、標的遺伝子座に追加的な又は改変された核酸配列もまた取り込まれるようにすることが一般的である。ＭＭＥＪでは、切断部位に小さい欠失及び挿入が起こり得る点でＮＨＥＪと同様の遺伝的結果が生じる。ＭＭＥＪでは、切断部位に隣接する数塩基対の相同配列を用いて有利な末端結合ＤＮＡ修復結果がドライブされる。一部の例では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復結果を予測することが可能であり得る。

従って、一部の実施形態では、相同組換えを用いて標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列が挿入される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書ではドナーポリヌクレオチド（又はドナー又はドナー配列）と呼ばれる。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部分が標的核酸切断部位に挿入される。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは外因性ポリヌクレオチド配列、即ち天然では標的核酸切断部位に存在しない配列である。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型例示的部位特異的ポリペプチド［例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書の配列番号８又はＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，３９（２１）：９２７５−９２８２（２０１１）］、及び様々な他の部位特異的ポリペプチドと少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と１０連続アミノ酸にわたって少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含む。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型例示的部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）のヌクレアーゼドメインと少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と１０連続アミノ酸にわたって多くても：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含む。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメインにおける１０連続アミノ酸にわたって少なくとも：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含む。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメインにおける１０連続アミノ酸にわたって多くても：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含む。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメインにおける１０連続アミノ酸にわたって少なくとも：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含む。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメインにおける１０連続アミノ酸にわたって多くても：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含む。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、修飾された形態の野生型例示的部位特異的ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾された形態の野生型例示的部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低下させる突然変異を含む。一部の実施形態において、修飾された形態の野生型例示的部位特異的ポリペプチドは、野生型例示的部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の核酸切断活性を有する。一部の実施形態において、修飾された形態の部位特異的ポリペプチドは実質的な核酸切断活性を有しない。部位特異的ポリペプチドが、実質的な核酸切断活性を有しない修飾された形態であるとき、それは本明細書では「酵素的に不活性」と称される。

一部の実施形態において、修飾された形態の部位特異的ポリペプチドは、それが標的核酸上に一本鎖切断（ＳＳＢ）を（例えば、二本鎖標的核酸の糖−リン酸骨格の１つのみを切断することにより）誘導し得るような突然変異を含む。一部の実施形態において、突然変異により、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上における核酸切断活性が９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満になる。一部の実施形態において、突然変異により、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上が、標的核酸の相補鎖を切断する能力は保持しているが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力は低下したものになる。一部の実施形態において、突然変異により、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上が、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は保持しているが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力は低下したものになる。例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６など、野生型例示的化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基が、複数の核酸切断ドメイン（例えばヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上を不活性化するように突然変異される。突然変異させる残基は、野生型例示的化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドの残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６に対応することができる（例えば、配列及び／又は構造アラインメントによって決定されるとおり）。突然変異の非限定的な例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ又はＮ８５６Ａが挙げられる。当業者は、アラニン置換以外の突然変異が好適であり得ることを認識するであろう。

一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生じさせるため、Ｄ１０Ａ突然変異が、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わされる。一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生じさせるため、Ｈ８４０Ａ突然変異が、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わされる。一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生じさせるため、Ｎ８５４Ａ突然変異が、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わされる。一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生じさせるため、Ｎ８５６Ａ突然変異が、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＤ１０Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わされる。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と称される。

ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９のニッカーゼ変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を増加させることができる。野生型Ｃａｓ９は、典型的には、標的配列における特定の約２０ヌクレオチド配列（内因性ゲノム遺伝子座など）とハイブリダイズするように設計された単一のガイドＲＮＡによってガイドされる。しかしながら、ガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間には幾つかのミスマッチが許容され得るため、標的部位における要求される相同性の長さを例えば１３ｎｔほどの短い相同性に有効に低下させて、それにより標的ゲノムにおける別の場所でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合及び二本鎖核酸切断−オフターゲット切断としても知られる−の可能性を高めることができる。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体は各々が１本の鎖のみを切断するため、二本鎖切断を作成するには、一対のニッカーゼがごく近接して標的核酸の逆鎖上に結合し、それにより二本鎖切断と同等の一対のニックを作成する必要がある。これには、２つの別個のガイドＲＮＡ−各ニッカーゼに１つずつ−がごく近接して標的核酸の逆鎖上に結合しなければならないという要件がある。この要件のため、二本鎖切断が起こるのに必要な相同性の最小長さが本質的に二倍になり、ゲノムの別の場所で２つのガイドＲＮＡ部位が−それらが存在する場合に−二本鎖切断の形成を可能にするのに十分に互いに近接している可能性は低く、従ってそこで二本鎖切断イベントが起こるであろう可能性は低下する。当該技術分野で記載されるとおり、ニッカーゼはまた、ＮＨＥＪに対してＨＤＲを促進するためにも使用することができる。ＨＤＲは、所望の変化を有効に媒介する特異的ドナー配列を用いてゲノムの標的部位に選択の変化を導入するために使用することができる。遺伝子編集に使用される様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの説明については、例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット、及びＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３２，３４７−３５５（２０１４）、及びそこに引用される参考文献を参照することができる。

企図される突然変異には、置換、付加、及び欠失、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。一部の実施形態において、突然変異により、突然変異するアミノ酸はアラニンに変換される。一部の実施形態において、突然変異により、突然変異するアミノ酸は別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、又はアルギニン）に変換される。一部の実施形態において、突然変異により、突然変異するアミノ酸は非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換される。一部の実施形態において、突然変異により、突然変異するアミノ酸はアミノ酸模倣体（例えば、ホスホミメティクス）に変換される。一部の実施形態において、突然変異は保存的突然変異である。例えば、突然変異により、突然変異するアミノ酸は、突然変異するアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、コンホメーション、及び／又は回転異性体に類似したアミノ酸に変換される（例えば、システイン／セリン突然変異、リジン／アスパラギン突然変異、ヒスチジン／フェニルアラニン突然変異）。一部の実施形態において、突然変異により、リーディングフレームのシフト及び／又は未成熟終止コドンの生成が生じる。一部の実施形態において、突然変異により、遺伝子の調節領域又は１つ以上の遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子座に変化が生じる。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異した、酵素的に不活性な、及び／又は条件的に酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は核酸を標的とする。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異した、酵素的に不活性な、及び／又は条件的に酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）はＤＮＡを標的とする。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異した、酵素的に不活性な、及び／又は条件的に酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）はＲＮＡを標的とする。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは１つ以上の非天然配列を含む（例えば、部位特異的ポリペプチドは融合タンパク質である）。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、及び２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含む。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含む。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメインを含み、ここで核酸切断ドメインの一方又は両方は、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９からのヌクレアーゼドメインと少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）、及び非天然配列（例えば核局在化シグナル）又は部位特異的ポリペプチドを非天然配列に連結するリンカーを含む。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方又は両方に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低下させる突然変異を含む。

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み、ここでヌクレアーゼドメインのうちの一方はアスパラギン酸１０の突然変異を含み、及び／又はヌクレアーゼドメインのうちの一方はヒスチジン８４０の突然変異を含み、及びこの突然変異は１つ又は複数のヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低下させる。

一部の実施形態において、１つ以上の部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼは、一緒になってゲノムの特異的遺伝子座において１つの二本鎖切断を達成する２つのニッカーゼ、又は一緒になってゲノムの特異的遺伝子座において２つの二本鎖切断を達成する、若しくはそれを生じさせる４つのニッカーゼを含む。或いは、１つの部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ゲノムの特異的遺伝子座において１つの二本鎖切断を達成する。

ゲノムターゲティング核酸
本開示は、関連するポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を標的核酸内の特異的標的配列に向けさせることのできるゲノムターゲティング核酸を提供する。ゲノムターゲティング核酸はＲＮＡであってもよい。ゲノムターゲティングＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは少なくとも、目的の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とを含む。ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列とが互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は部位特異的ポリペプチドに結合し、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとが複合体を形成することになる。一部の実施形態において、ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合のおかげで複合体に標的特異性を付与する。従ってゲノムターゲティング核酸は部位特異的ポリペプチドの活性を指図する。

例示的ガイドＲＮＡは、その標的配列のゲノム位置及び関連するエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）切断部位に伴い配列番号８３〜１５８、２８４〜４０８、４５８〜５０６、６９９〜８９０、１０８３〜１２７６、１２８８〜１２９８、及び１３０８〜１３１２におけるスペーサー配列を含む。当業者は理解するとおり、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列と相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、配列番号８３〜１５８、２８４〜４０８、４５８〜５０６、６９９〜８９０、１０８３〜１２７６、１２８８〜１２９８、及び１３０８〜１３１２におけるスペーサー配列の各々は、単一のＲＮＡキメラ又はｃｒＲＮＡに（対応するｔｒａｃｒＲＮＡと共に）まとめることができる。Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２−６０７（２０１１）を参照のこと。

一部の実施形態において、ゲノムターゲティング核酸は二重分子ガイドＲＮＡである。一部の実施形態において、ゲノムターゲティング核酸は単一分子ガイドＲＮＡである。

二重分子ガイドＲＮＡは２本のＲＮＡ鎖を含む。第１の鎖は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含む。

ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含む。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部は、ガイドＲＮＡに追加的な機能性（例えば安定性）を与えるエレメントを含み得る。単一分子ガイドリンカーは最小ＣＲＩＳＰＲリピート及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結してヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部は１つ以上のヘアピンを含む。

Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びスペーサー配列を含む。

ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド超のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７〜３０ヌクレオチドの様々な長さのスペーサー配列を含み得る（表１を参照）。

ｓｇＲＮＡは、表１の配列番号１にあるように、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まないものであり得る。ｓｇＲＮＡは、表１の配列番号１、２、又は３にあるように、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１個のウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２個のウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に３個のウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に４個のウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に５個のウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に６個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に７個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に８個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。

ｓｇＲＮＡは未修飾でも、又は修飾されていてもよい。例えば、修飾されたｓｇＲＮＡは１つ以上の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。

例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムにおいて使用されるガイドＲＮＡ、又は他の小型ＲＮＡは、以下に例示され、及び当該技術分野において記載されるとおり、化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順は絶えず拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの手順によるかかるＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長さが増して１００ヌクレオチドほどを大きく超えるようになると、一層難題となる傾向がある。より大きい長さのＲＮＡの生成に用いられる一つの手法は、一体にライゲートした２つ以上の分子を作製することである。Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなど、はるかに長いＲＮＡは、より容易には酵素的に生成される。ＲＮＡの化学合成及び／又は酵素的生成の最中又はその後に、当該技術分野で記載されるとおり、各種のＲＮＡ修飾、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性又は程度を低下させ、及び／又は他の属性を増強する修飾を導入することができる。

スペーサー伸長配列
ゲノムターゲティング核酸の一部の例では、スペーサー伸長配列が活性を修飾し、安定性を提供し、及び／又はゲノムターゲティング核酸の修飾用の位置を提供し得る。スペーサー伸長配列はオンターゲット又はオフターゲット活性又は特異性を修飾し得る。一部の実施形態において、スペーサー伸長配列が提供される。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、又は７０００ヌクレオチド又はそれ以上を超える長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００ヌクレオチド又はそれ以上に満たない長さを有し得る。一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は１０ヌクレオチド長未満である。一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は１０〜３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は３０〜７０ヌクレオチド長である。

一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含む。一部の実施形態において、部分は核酸ターゲティング核酸の安定性を減少又は増加させる。一部の実施形態において、部分は転写ターミネーターセグメント（即ち転写終結配列）である。一部の実施形態において、部分は真核細胞で機能する。一部の実施形態において、部分は原核細胞で機能する。一部の実施形態において、部分は真核細胞及び原核細胞の両方で機能する。好適な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節及び／又はタンパク質及びタンパク質複合体による接触可能性の調節を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（即ちヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化させる配列、追跡を提供する修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接的なコンジュゲーション、蛍光検出を促進する部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列等）、及び／又はタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含めた、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾又は配列が挙げられる。

スペーサー配列
ｇＲＮＡはスペーサー配列を含む。スペーサー配列は、目的の標的核酸の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義付ける配列（例えば２０塩基対配列）である。「標的配列」はＰＡＭ配列に隣接し、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）によって修飾される配列である。「標的核酸」は二本鎖分子である：一方の鎖が標的配列を含んで「ＰＡＭ鎖」と称され、他方の相補鎖が「非ＰＡＭ鎖」と称される。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する標的配列の逆相補体にハイブリダイズすることを認識している。従って、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ等価物である。例えば、標的配列が５’−ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号７６）である場合、このときｇＲＮＡスペーサー配列は５’−ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ−３’（配列番号１５２）である。ｇＲＮＡのスペーサーはハイブリダイゼーション（即ち塩基対合）によって目的の標的核酸と配列特異的に相互作用する。従ってスペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に応じて異なる。

本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、システムに使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’側に位置する標的核酸中の領域にハイブリダイズするように設計される。スペーサーは標的配列と完全にマッチしてもよく、又はミスマッチを有してもよい。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ中においてそれが認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸中において、配列５’−ＮＲＧ−３’［式中、ＲはＡ又はＧのいずれかを含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、及びＮは、スペーサー配列が標的とする標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。

一部の実施形態において、標的核酸配列は２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、標的核酸は２０ヌクレオチド未満を含む。一部の実施形態において、標的核酸は２０ヌクレオチド超を含む。一部の実施形態において、標的核酸は少なくとも：５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチド又はそれ以上を含む。一部の実施形態において、標的核酸は多くても：５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチド又はそれ以上を含む。一部の実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭの１番目のヌクレオチドのすぐ５’側にある２０塩基を含む。例えば、

を含む配列において、標的核酸は、Ｎに対応する配列［式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、及び下線のＮＲＧ配列が化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＰＡＭである］を含む。

一部の実施形態において、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有する。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ又は少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔであってもよい。一部の実施形態において、スペーサー配列は２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、スペーサーは１９ヌクレオチドを含む。

一部の実施形態において、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％である。一部の実施形態において、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、多くても約３０％、多くても約４０％、多くても約５０％、多くても約６０％、多くても約６５％、多くても約７０％、多くても約７５％、多くても約８０％、多くても約８５％、多くても約９０％、多くても約９５％、多くても約９７％、多くても約９８％、多くても約９９％、又は１００％である。一部の実施形態において、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、標的核酸の相補鎖の標的配列の最も５’側の６連続ヌクレオチドにわたって１００％である。一部の実施形態において、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、約２０連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。一部の実施形態において、スペーサー配列及び標的核酸の長さは１〜６ヌクレオチドだけ異なり、これは１つ又は複数のバルジと考えられてもよい。

一部の実施形態において、スペーサー配列はコンピュータプログラムを用いて設計することができる。コンピュータプログラムは、予測融解温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテクスト、クロマチン接触可能性、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一又は同様であるが、ミスマッチ、挿入又は欠失の結果として１つ以上のスポットが異なる配列のゲノム発生頻度）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を用いることができる。

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列
一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、参照ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｃｒＲＮＡ）と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列である。

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることのできるヌクレオチドを含む。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、二重鎖、即ち塩基対合した二本鎖構造を形成する。一体となって、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部が最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の相補性を含む。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と多くても約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の相補性を含む。

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は約９ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は約１２ヌクレオチド長である。

一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一である。

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列である。

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含む。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とは、二重鎖、即ち塩基対合した二本鎖構造を形成する。一体となって、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピートは部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％相補的である。

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ又は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔ長であってもよい。一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約９ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約１２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．、前掲に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡｎｔ２３〜４８からなる。

一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一又は１００％同一である。

一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は二重らせんを含む。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド又はそれ以上を含む。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド又はそれ以上を含む。

一部の実施形態において、二重鎖はミスマッチを含む（即ち、二重鎖の２本の鎖が１００％相補的でない）。一部の実施形態において、二重鎖は少なくとも約１、２、３、４、又は５又はミスマッチを含む。一部の実施形態において、二重鎖は多くても約１、２、３、４、又は５又はミスマッチを含む。一部の実施形態において、二重鎖は２個以下のミスマッチを含む。

バルジ
一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖に「バルジ」がある。バルジは、二重鎖内にあるヌクレオチドのうち対合していない領域である。一部の実施形態において、バルジは二重鎖による部位特異的ポリペプチドへの結合に寄与する。一部の実施形態において、バルジは、二重鎖の片側に非対合５’−ＸＸＸＹ−３’を含み［式中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは、逆鎖上のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成し得るヌクレオチドを含む］、二重鎖の他方の側に非対合ヌクレオチド領域を含む。二重鎖の２つの側にある非対合ヌクレオチドの数は異なり得る。

一部の実施形態において、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に非対合プリン（例えばアデニン）を含む。一部の実施形態において、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の非対合５’−ＡＡＧＹ−３’を含む［式中、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成し得るヌクレオチドを含む］。

一部の実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の非対合ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、多くても１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の非対合ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは１個の非対合ヌクレオチドを含む。

一部の実施形態において、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個又はそれ以上の非対合ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個又はそれ以上の非対合ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、二重鎖の第２の側（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）のバルジは４個の非対合ヌクレオチドを含む。

一部の実施形態において、バルジは少なくとも１つのゆらぎ対合を含む。一部の実施形態において、バルジは多くても１つのゆらぎ対合を含む。一部の実施形態において、バルジは少なくとも１個のプリンヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、バルジは少なくとも３個のプリンヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、バルジ配列は少なくとも５個のプリンヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、バルジ配列は少なくとも１個のグアニンヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、バルジ配列は少なくとも１個のアデニンヌクレオチドを含む。

ヘアピン
様々な実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列における最小ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側に１つ以上のヘアピンが位置する。

一部の実施形態において、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖における最後の対合ヌクレオチドから少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０ヌクレオチド又はそれ以上３’側から始まる。一部の実施形態において、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖における最後の対合ヌクレオチドの多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド又はそれ以上３’側から始まる。

一部の実施形態において、ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０連続ヌクレオチド又はそれ以上を含む。一部の実施形態において、ヘアピンは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５連続ヌクレオチド、又はそれ以上を含む。

一部の実施形態において、ヘアピンはＣＣジヌクレオチド（即ち２連続シトシンヌクレオチド）を含む。

一部の実施形態において、ヘアピンは、二重鎖化したヌクレオチド（例えば、一体にハイブリダイズした、ヘアピン内のヌクレオチド）を含む。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖内のＧＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＣＣジヌクレオチドを含む。

ヘアピンのうちの１つ以上は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用することができる。

一部の実施形態では、２つ以上のヘアピンがあり、他の実施形態では３つ以上のヘアピンがある。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することができる。一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約１４ヌクレオチドの長さを有する。

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一である。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、又は１００％同一である。

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は２つ以上の二重鎖化した領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズした領域）を含む。一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は２つの二重鎖化した領域を含む。

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はステムループ構造を含む。一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡにおけるステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０ヌクレオチド又はそれ以上を含む。一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡにおけるステムループ構造は、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド又はそれ以上を含む。一部の実施形態において、ステムループ構造は機能性部分を含む。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、又はエクソンを含み得る。一部の実施形態において、ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の機能性部分を含む。一部の実施形態において、ステムループ構造は、多くても約１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の機能性部分を含む。

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列におけるヘアピンはＰ−ドメインを含む。一部の実施形態において、Ｐ−ドメインはヘアピンに二本鎖領域を含む。

ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡが単一分子ガイドのコンテクストにあるか、それとも二重分子ガイドのコンテクストにあるかに関わらず、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列が提供される。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、又は４００ヌクレオチド超の長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は約２０〜約５０００ヌクレオチド又はそれ以上の長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１０００ヌクレオチド超の長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００ヌクレオチド又はそれ以上に満たない長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１０００ヌクレオチド未満の長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１０ヌクレオチド長未満を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１０〜３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は３０〜７０ヌクレオチド長である。

一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は機能性部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含む。一部の実施形態において、機能性部分は転写ターミネーターセグメント（即ち転写終結配列）を含む。一部の実施形態において、機能性部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの全長を有する。一部の実施形態において、機能性部分は真核細胞で機能する。一部の実施形態において、機能性部分は原核細胞で機能する。一部の実施形態において、機能性部分は真核細胞及び原核細胞の両方で機能する。

好適なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長機能性部分の非限定的な例としては、３’ポリ−アデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節及び／又はタンパク質及びタンパク質複合体による接触可能性の調節を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（即ちヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化させる配列、追跡を提供する修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接的なコンジュゲーション、蛍光検出を促進する部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列等）、及び／又はタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含めた、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾又は配列が挙げられる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列はプライマー結合部位又は分子インデックス（例えばバーコード配列）を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１つ以上のアフィニティータグを含む。

単一分子ガイドリンカー配列
一部の実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカー配列は約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．、前掲では、単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が使用された、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）。例示的リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することができる。一部の実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカーは４〜４０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、又は７０００ヌクレオチド又はそれ以上である。一部の実施形態において、リンカーは、多くても約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、又は７０００ヌクレオチド又はそれ以上である。

リンカーは種々の配列の任意のものを含むが、ガイドＲＮＡの他の部分との相同性領域が広範囲に及ぶ配列は、ガイドの他の機能性領域に干渉し得る分子内結合を引き起こす可能性があり、一部の例ではリンカーはそうした配列を含まないであろう。Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．、前掲では、単純な４ヌクレオチド配列−ＧＡＡＡ−が使用されたが、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）、より長い配列を含め、数多くの他の配列を同様に使用することができる。

一部の実施形態において、リンカー配列は機能性部分を含む。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、又はエクソンを含め、１つ以上の特徴を含み得る。一部の実施形態において、リンカー配列は少なくとも約１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の機能性部分を含む。一部の実施形態において、リンカー配列は多くても約１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の機能性部分を含む。

標的遺伝子の範囲内又はその近傍にある１つ以上の核酸又はエクソンの欠失、挿入、又は調節によって、及び対応する標的遺伝子の遺伝子座へのｃＤＮＡ、発現ベクター、又はミニ遺伝子のノックインによって細胞を編集するゲノム操作戦略
一部のゲノム操作戦略は、標的ＤＮＡを欠失させること及び／又はｃＤＮＡ、発現ベクター、又はミニ遺伝子（１つ以上のエクソン及びイントロン又は天然若しくは合成イントロンを含む）をノックインすること及び／又は一部又は全ての標的イントロンによって分断されたｃＤＮＡを対応する遺伝子の遺伝子座にノックインすることを含む。これらの戦略は、疾患状態を治療し、及び／又は緩和する。これらの戦略は、よりカスタマイズされた手法を必要とし得る。ＨＤＲ効率はドナー分子のサイズに反比例し得るため、これは有利である。また、サイズ制限のあるウイルスベクター分子、例えば、有効なドナー鋳型送達手段であることが示されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）分子にドナー鋳型が収まり得ることも期待される。また、非限定的な例として、血小板及び／又はエキソソーム又は他の微小胞を含めた、サイズ制限のある他の分子にドナー鋳型が収まり得ることも期待される。

相同組換え修復は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は相同組換えである。ＨＤＲには、一本鎖アニーリング及び代替的ＨＤＲを含め、更なる経路がある。ゲノム操作ツールは、研究者が細胞相同組換え経路を操作してゲノムに部位特異的修飾を作成することを可能にする。トランスで提供される合成ドナー分子を用いて細胞が二本鎖切断を修復できることが分かっている。従って、特異的突然変異の近傍に二本鎖切断を導入し、好適なドナーを提供することにより、ゲノムに標的とする変化を作ることができる。特異的切断により、相同ドナー単独を受け取る１０^６個の細胞につき１個の比率を１，０００倍超上回ってＨＤＲ率が増加する。特定のヌクレオチドにおける相同組換え修復（ＨＤＲ）率は切断部位までの距離の関数であり、従ってオーバーラップする又は最も近い標的部位を選択することが重要である。インサイチューでの修正では残りのゲノムが乱されないままであるため、遺伝子編集は遺伝子付加と比べて利点を提供する。

ＨＤＲによる編集用に供給されるドナーは著しく異なるが、概して、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にする小さい又は大きい隣接相同性アームを伴う意図された配列を含む。導入される遺伝子変化に隣接する相同性領域は、３０ｂｐ以下であるか、又はプロモーター、ｃＤＮＡ等を含有し得る数キロベースにも上る大きいカセットであり得る。一本鎖及び二本鎖の両方のオリゴヌクレオチドドナーが使用されている。これらのオリゴヌクレオチドはサイズが１００ｎｔ未満〜数ｋｂを上回るまでの範囲に及び、しかし更に長いｓｓＤＮＡもまた生成及び使用することができる。多くの場合に、ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、及びミニサークルを含め、二本鎖ドナーが使用される。一般に、ＡＡＶベクターがドナー鋳型の極めて有効な送達手段であることが分かっているが、個々のドナーについてのパッケージング制限は＜５ｋｂである。ドナーの活性転写によりＨＤＲが３倍に増加したことから、プロモーターを含めると変換が増加し得ることが指摘される。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は遺伝子発現及びＨＤＲを減少させた。

Ｃａｓ９などの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、いずれか一方のヌクレアーゼドメインを不活性化させたことにより一方のＤＮＡ鎖のみの切断を生じさせるニッカーゼ変異体が存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから、又は標的範囲に隣接するニッカーゼ対を使用して導くことができる。ドナーは、一本鎖、ニック入り、又はｄｓＤＮＡであってもよい。

ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼと共に供給されるか、又は独立に、種々の異なる方法、例えばトランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、又はウイルス形質導入によって供給されてもよい。ＨＤＲへのドナーの利用可能性を高めるため、様々なテザー係留オプションが提案されている。例としては、ドナーをヌクレアーゼに取り付けること、近くに結合するＤＮＡ結合タンパク質に取り付けること、又はＤＮＡ末端結合又は修復に関与するタンパク質に取り付けることが挙げられる。

修復経路の選択は、細胞周期に影響を与えるものなど、幾つもの培養条件、又はＤＮＡ修復及び関連タンパク質のターゲティングが指針となり得る。例えば、ＨＤＲを増加させるため、ＫＵ７０、ＫＵ８０又はＤＮＡリガーゼＩＶなど、重要なＮＨＥＪ分子を抑制することができる。

ドナーが存在しない場合、ＤＮＡ切断からの末端又は異なる切断からの末端は、接合部に塩基対合がほとんど又は全くなくＤＮＡ末端がつなぎ合わされる幾つかの非相同修復経路を用いてつなぎ合わされ得る。標準的なＮＨＥＪに加えて、代替的ＮＨＥＪなど、同様の修復機構がある。２つの切断がある場合、介在するセグメントが欠失し得るか、又は逆位になり得る。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部での挿入、欠失又は突然変異につながり得る。

ＮＨＥＪを用いて、染色体及びドナー分子の両方のヌクレアーゼ切断後にヒト細胞株の定義付けられた遺伝子座に遺伝子発現カセットが挿入された（Ｃｒｉｓｔｅａ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１１０：８７１−８８０（２０１２）；Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．＆Ｙａｎｇ，Ｙ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ２３，５３９−５４６（２０１３））。

ＮＨＥＪ又はＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＲの両方を用いる部位特異的遺伝子挿入が行われている。恐らくはイントロン／エクソン境界を含むある種のセッティングにおいて、組み合わせ手法が適用可能であり得る。ＮＨＥＪはイントロンにおけるライゲーションに効力を発揮し得る一方、エラーフリーのＨＤＲはコード領域に良好に適し得る。

標的遺伝子は幾つものエクソンを含む。エクソンのうちの任意の１つ以上又は近隣のイントロンが標的となり得る。或いは、様々な医学的病態に関連する様々な突然変異があり、これは標的を不活性化させるという共通の効果を持つ挿入、欠失、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト及び他の突然変異の組み合わせである。不活性な標的を回復させるため、これらの突然変異のうちの任意の１つ以上が修復されてもよい。別の選択肢として、ゲノム又は標的遺伝子にｃＤＮＡコンストラクト、発現ベクター、又はミニ遺伝子（天然又は合成エンハンサー及びプロモーター、１つ以上のエクソン、及び天然又は合成イントロン、及び天然又は合成３’ＵＴＲ及びポリアデニル化シグナルを含む）がノックインされてもよい。一部の実施形態において、本方法は、ｃＤＮＡコンストラクト、発現ベクター、又はミニ遺伝子をノックインするためポリヌクレオチドドナー鋳型からの新規配列の取込みの促進に使用することができる１つのｇＲＮＡ又は１対のｇＲＮＡを提供し得る。

本方法の一部の実施形態は、一方のｇＲＮＡが１つ以上の突然変異の５’末端で切断し、且つ他方のｇＲＮＡが１つ以上の突然変異の３’末端で切断して遺伝子を２回切断することにより、ポリヌクレオチドドナー鋳型からの新規配列の挿入による１つ以上の突然変異の置換を促進する欠失を作り出すｇＲＮＡ対を提供し、又は欠失によって突然変異アミノ酸又はそれに隣接するアミノ酸（例えば未成熟終止コドン）が除去され、機能タンパク質の発現につながるか、又はオープンリーディングフレームが回復し得る。切断は、各々がゲノムにＤＳＢを作る１対のＤＮＡエンドヌクレアーゼによるか、又は一体となってゲノムにＤＳＢを作る複数のニッカーゼによって達成されてもよい。

或いは、本方法の一部の実施形態は、ポリヌクレオチドドナー鋳型からの新規配列の挿入による１つ以上の突然変異の置換を促進する１つの二本鎖切断を１つ以上の突然変異の周りに作り出す１つのｇＲＮＡを提供する。二本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は一体となってゲノムにＤＳＢを作り出す複数のニッカーゼによって作られてもよく、又は単一のｇＲＮＡが欠失につながってもよく（ＭＭＥＪ）、これによって突然変異体アミノ酸（例えば、未成熟終止コドン）が除去され、機能タンパク質の発現につながるか、又はオープンリーディングフレームが回復し得る。

標的遺伝子内の例示的修飾には、特定のｃ突然変異から上流又は下流に３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満の領域内など、上記で言及した突然変異の範囲内又はその近傍（その近位）における置換が含まれる。標的遺伝子に比較的幅広い種類の突然変異があることを所与とすれば、上記で言及した置換の数多くの変形例（限定なしに、より大きい並びにより小さい欠失を含む）が標的遺伝子の回復を生じさせると予想し得ることが理解されるであろう。

かかる変異体は、問題の特定の突然変異よりも５’及び／又は３’方向に大きい、又はいずれかの方向に小さい置換を含む。従って、特異的置換に関連して「近く」又は「近接」とは、所望の置換境界（本明細書ではエンドポイントとも称される）に関連するＳＳＢ又はＤＳＢ遺伝子座が、指示される参照遺伝子座から約３ｋｂ未満の領域内にあり得ることが意図される。一部の実施形態において、ＳＳＢ又はＤＳＢ遺伝子座はより近接し、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、又は０．１ｋｂ以内にある。小さい置換の場合、所望のエンドポイントは参照遺伝子座にあるか、又はそれ「に隣接している」のであり、隣接しているとは、エンドポイントが参照遺伝子座から１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、又は約１０ｂｐ〜５ｂｐ未満にあることが意図される。

より大きい又は小さい置換を含む実施形態は、標的タンパク質活性が回復する限り、同じ利益を提供するものと予想される。従って、本明細書に記載及び例示される置換の多くの変形例が医学的病態の改善に有効であろうことが予想される。

別のゲノム操作戦略はエクソン欠失を含む。特異的エクソンの標的化した欠失は、単一の治療用カクテルによる大規模な患者サブセットの治療に魅力的な戦略である。欠失は、単一のエクソン欠失又は複数のエクソン欠失のいずれであってもよい。複数のエクソン欠失の方がより多くの患者に達し得るが、欠失が大規模になると、サイズの増加に伴い欠失効率は大きく低下する。従って、欠失範囲は４０〜１０，０００塩基対（ｂｐ）のサイズであり得る。例えば、欠失は、４０〜１００；１００〜３００；３００〜５００；５００〜１，０００；１，０００〜２，０００；２，０００〜３，０００；３，０００〜５，０００；又は５，０００〜１０，０００塩基対のサイズの範囲であってもよい。

欠失は、遺伝子発現の上方制御につながるエンハンサー、プロモーター、１番目のイントロン、及び／又は３’ＵＴＲに起こってもよく、及び／又は調節エレメントの欠失を通じて起こってもよい。

欠失後にプレｍＲＮＡが適切にプロセシングされることを確実にするため、周りのスプライシングシグナルを欠失させることができる。スプライシングドナー及びアクセプターは、概して隣接イントロンの１００塩基対以内にある。従って、一部の実施形態において、方法は、目的の各エクソン／イントロンジャンクションに対して約±１００〜３１００ｂｐを切断するあらゆるｇＲＮＡを提供し得る。

ゲノム編集戦略のいずれについても、遺伝子編集はシーケンシング又はＰＣＲ分析によって確認することができる。

標的配列選択
特定の参照遺伝子座に対する５’境界及び／又は３’境界の位置のシフトを用いると遺伝子編集の特定の適用が促進又は増強され、適用は、一部には、本明細書に更に記載及び例示されるとおりの、編集に選択されるエンドヌクレアーゼシステムに依存する。

かかる標的配列選択の第１の非限定的な例では、多くのエンドヌクレアーゼシステムが、ＣＲＩＳＰＲＩＩ型又はＶ型エンドヌクレアーゼの場合におけるＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置のＰＡＭ配列モチーフ要件など、潜在的な標的切断部位の初期選択の指針となる規則又は基準を有する。

標的配列選択又は最適化の別の非限定的な例では、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組み合わせについてのオフターゲット活性の頻度（即ち選択の標的配列以外の部位に起こるＤＳＢの頻度）がオンターゲット活性の頻度と比べて評価される。一部の実施形態において、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、他の細胞と比べて選択的優位性を有し得る。選択的優位性の例示的な、しかし非限定的な例には、向上した複製率、持続性、ある種の条件に対する抵抗性、患者への導入後のインビボでの生着成功率又は持続性の向上、及びその他の、かかる細胞の数又は生存能力の維持又は増加に関連する属性など、属性の獲得が含まれる。他の実施形態において、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞の同定、選別又は他の選択に用いられる１つ以上のスクリーニング方法によってポジティブ選択されてもよい。選択的優位性及び定方向選択の両方の方法が、修正に関連する表現型を利用し得る。一部の実施形態において、意図した細胞集団の選択又は精製に用いられる新規表現型を作成する第２の修飾を作成するため、細胞が２回以上編集されてもよい。かかる第２の修飾は、選択可能又はスクリーニング可能マーカー用の第２のｇＲＮＡを加えることにより作成されてもよい。一部の実施形態では、ｃＤＮＡを含み、また選択可能なマーカーも含むＤＮＡ断片を使用して、細胞を所望の遺伝子座で正しく編集することができる。

具体的な場合において任意の選択的優位性を適用可能であるか、それとも任意の定方向選択を適用すべきかに関わらず、適用の有効性を高めるため、及び／又は所望の標的以外の部位で望ましくない改変が起こる可能性を減らすため、標的配列選択はまた、オフターゲット頻度の検討が指針となる。本明細書及び当該技術分野において更に記載及び例示されるとおり、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似性及び相違性、並びに用いられる詳細なエンドヌクレアーゼを含め、幾つもの要因の影響を受ける。オフターゲット活性の予測を助けるバイオインフォマティクスツールが利用可能であり、高頻度でかかるツールはまた、最もオフターゲット活性の可能性が高い部位の同定にも用いることができ、次にはそれを実験的セッティングで評価して、オンターゲット活性に対するオフターゲットの相対頻度を判定することができ、それにより相対的にオンターゲット活性が高い配列の選択が可能になる。かかる技法の例示的な例は本明細書に提供され、及び当該技術分野では他の例も公知である。

標的配列選択の別の態様は相同組換えイベントに関する。相同性領域を共有する配列は、介在配列の欠失を生じさせる相同組換えイベントの焦点となり得る。かかる組換えイベントは、染色体及び他のＤＮＡ配列の正常な複製経過中に起こり、またある時には、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合など、ＤＮＡ配列が合成されているときにも起こり、ＤＳＢは正常な細胞複製サイクルの中で常時起こるが、様々なイベント（紫外光及びその他のＤＮＡ切断誘導物質など）の発生又はある種の薬剤の存在（様々な化学的誘導物質など）によってもまた増強され得る。多くのかかる誘導物質がＤＳＢをゲノムに無差別に発生させ、正常細胞においてはＤＳＢは常時誘導され、修復されている。修復時、元の配列は完全な忠実度で再構成され得るが、しかしながら、一部の実施形態ではＤＳＢ部位に小さい挿入又は欠失（「インデル」と称される）が導入される。

ＤＳＢはまた、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼシステムの場合のように、具体的な位置に特異的に誘導されてもよく、これを用いて選択の染色体位置に定方向の又は優先的な遺伝子修飾イベントを引き起こすことができる。ＤＮＡ修復（並びに複製）のコンテクストで相同配列が組換えを受け易い傾向は、幾つもの状況で利用することができ、所望の染色体位置に目的の配列を、但し「ドナー」ポリヌクレオチドの使用によって挿入するために相同組換え修復が用いられるＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集システムの一つの適用の基礎である。

特定の配列間の相同性領域は、僅か１０塩基対以下を含み得る小さい「マイクロホモロジー」領域であってもよいもので、これもまた所望の欠失をもたらすために使用することができる。例えば、隣接配列とマイクロホモロジーを呈する部位に単一のＤＳＢが導入される。かかるＤＳＢの正常な修復経過の中で、高頻度で起こる結果は、ＤＳＢ及び同時の細胞修復過程によって組換えが促進される結果としての介在配列の欠失である。

しかしながら、状況によっては、相同性領域内の標的配列を選択すると、遺伝子融合（欠失がコード領域にあるとき）を含め、はるかに大きい欠失が生じることもまたあり、具体的な状況を所与としてこれが所望されることも、又は所望されないこともある。

本明細書に提供される例は、標的タンパク質活性の調節を生じさせる置換を誘導するように設計されるＤＳＢを作成するための様々な標的領域の選択、並びにオンターゲットイベントと比べてオフターゲットイベントが最小限となるように設計されるかかる領域内における特異的標的配列の選択を更に例示する。

核酸修飾
一部の実施形態において、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、例えば活性、安定性又は特異性の増強、送達の改変、宿主細胞における自然免疫応答の低下、又は本明細書に更に記載するとおりの、及び当該技術分野において公知の他の増強のため、個々に、又は組み合わせて用いることのできる１つ以上の修飾を含む。

一部の実施形態において、修飾されたポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて使用され、その場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイド又は二重分子ガイドのいずれか）及び／又は細胞に導入されるＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ又はＲＮＡが、以下に説明及び例示するとおり修飾されてもよい。かかる修飾されたポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて、任意の１つ以上ゲノム遺伝子座の編集に使用することができる。

かかる使用の非限定的な例示を目的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを用いると、ガイドＲＮＡの修飾は、単一分子ガイドであっても、又は二重分子であってもよいガイドＲＮＡとＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成又は安定性を増強するために用いることができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、又はそれに代えて、ゲノム編集複合体とゲノムにおける標的配列との間の相互作用の惹起、安定性又は動態を増強するために用いることもでき、それを用いて、例えばオンターゲット活性を増強することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、又はそれに代えて、特異性、例えば他の（オフターゲット）部位における効果と比較したときのオンターゲット部位における相対ゲノム編集率を増強するために用いることもできる。

修飾はまた、又はそれに代えて、例えば、細胞に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその抵抗性を増加させて、それにより細胞におけるその半減期の増加を生じさせることによりガイドＲＮＡの安定性を増加させるために用いることができる。ガイドＲＮＡ半減期を増強する修飾は、編集しようとする細胞へのＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの導入が、エンドヌクレアーゼを生成するため翻訳される必要があるＲＮＡを介する態様において特に有用であることもあり、なぜなら、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期の増加を用いて、ガイドＲＮＡとコードされるＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとが細胞に共存する時間を増加させることができるためである。

修飾はまた、又はそれに代えて、細胞に導入されるＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性又は程度を低下させるために用いることができる。かかる応答は、以下及び当該技術分野において記載されるとおりの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含め、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のコンテクストで十分に特徴付けられているものであり、ＲＮＡの半減期の低下及び／又はサイトカイン若しくは免疫応答に関連する他の因子の誘発と関連付けられる傾向がある。

また、細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに、限定なしに、ＲＮＡの安定性を（細胞に存在するＲＮアーゼによるその分解の増加によるなど）増強する修飾、結果として生じる産物（即ちエンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する修飾、及び／又は細胞に導入されるＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性又は程度を低下させる修飾を含め、１種以上の修飾が作られてもよい。

前述のもの及びその他など、修飾の組み合わせも同様に用いることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、ガイドＲＮＡに１種以上の修飾（上記に例示されるものを含む）が作られてもよく、及び／又はＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに１種以上の修飾（上記に例示されるものを含む）が作られてもよい。

例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて使用されるガイドＲＮＡ、又は他の小型ＲＮＡは、以下に例示され、及び当該技術分野において記載されるとおりの、幾つもの修飾の容易な取込みを可能にする化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順は絶えず拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの手順によるかかるＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長さが増して１００ヌクレオチドほどを大きく超えるようになると、一層難題となる傾向がある。より大きい長さの化学的に修飾されたＲＮＡの生成に用いられる一つの手法は、一体にライゲートした２つ以上の分子を作製することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするものなど、はるかに長いＲＮＡは、より容易には酵素的に生成される。酵素的に作製されるＲＮＡで用いるのに利用可能な修飾の種類は概して少ないが、それでもなお、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性又は程度を低下させ、及び／又は以下及び当該技術分野で更に説明されるとおりの他の属性を増強するために用いることのできる修飾があり；及び新種の修飾が常時開発されている。

各種の修飾、特により小型の化学的に合成されるＲＮＡで高頻度に用いられるものの例示として、修飾は、糖の２’位で修飾された１つ以上のヌクレオチド、一部の実施形態では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、又は２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース上の２’−フルオロ、２’−アミノ又は２’Ｏ−メチル修飾、脱塩基残基、又はＲＮＡの３’末端における逆位塩基を含む。かかる修飾はオリゴヌクレオチドにルーチンで取り込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、２’−デオキシオリゴヌクレオチドと比べて所与の標的に対するＴｍがより高い（即ち、標的結合親和性がより高い）ことが示されている。

幾つものヌクレオチド及びヌクレオシド修飾が、それを取り込むオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ消化耐性を天然オリゴヌクレオチドと比べて高めることが示されている；こうした修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも長い間インタクトに生き残る。修飾オリゴヌクレオチドの具体的な例としては、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間連結又は短鎖ヘテロ原子又は複素環式糖間連結を含むものが挙げられる。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、並びにヘテロ原子骨格、特にＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２、ＣＨ，〜Ｎ（ＣＨ_３）〜Ｏ〜ＣＨ_２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ_２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２、ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２及びＯ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２骨格［ここで天然リン酸ジエステル骨格はＯ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨと表される］）；アミド骨格［ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒｅｔａｌ．，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８：３６６−３７４（１９９５）を参照］；モルホリノ骨格構造（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎａｎｄＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここでオリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル骨格はポリアミド骨格に置き換えられ、ヌクレオチドはポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している、Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１，２５４，１４９７を参照）を有するものである。リン含有連結としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及びその他の、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート類を含むホスホルアミデート類、チオノホスホロアミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、及びボラノホスフェート類であって、通常の３’−５’連結を有するもの、これらの２’−５’連結類似体、及びヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’又は２’−５’から５’−２’に連結されている逆極性を有するものが挙げられる；米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９６号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３０６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；及び同第５，６２５，０５０号明細書（これらの各々は、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。

モルホリノベースのオリゴマー化合物について、ＢｒａａｓｃｈａｎｄＤａｖｉｄＣｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３−４５１０（２００２）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ３０，Ｉｓｓｕｅ３，（２００１）；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４（２００２）；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６−２２０（２０００）；Ｌａｃｅｒｒａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１−９５９６（２０００）；及び１９９１年６月２３日に取得された米国特許第５，０３４，５０６号明細書に記載されている。

シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体について、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５−８６０２（２０００）に記載されている。

そこにリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結（一部がヌクレオシドの糖部分で形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸塩及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２成分部分を有する他のものを含む；米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，２６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書（これらの各々は、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。

１つ以上の置換糖部分、例えば２’位における以下のうちの１つもまた含まれ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_３Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、又はＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３［式中、ｎは１〜約１０である］；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ_３；ＯＣＦ_３；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ_３；ＳＯ_２ＣＨ_３；ＯＮＯ_２；ＮＯ_２；Ｎ_３；ＮＨ_２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ開裂基；レポーター群；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基；又はオリゴヌクレオチド及び同様の特性を有する他の置換基の薬力学的特性を改良する基。一部の実施形態において、修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−０−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））（Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）が挙げられる。他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−０−ＣＨ_３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾がまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位に作られてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、シクロブチル類など、ペントフラノシル基の代わりに糖模倣体を有してもよい。

一部の実施形態において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、即ち骨格が、新規の基に置き換えられる。適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのため、塩基単位は維持される。一つのかかるオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格がアミド含有骨格、例えばアミノエチルグリシン骨格に置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許は、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書を含む。ＰＮＡ化合物の更なる教示については、Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）を参照することができる。

ガイドＲＮＡはまた、それに加えて又は代えて、核酸塩基（多くの場合に当該技術分野では単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用されるとき、「非修飾」又は「天然」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、天然核酸ではまれにしか又は一過性にしか見られない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン類、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、及び多くの場合に当該技術分野では５−Ｍｅ−Ｃと称される）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌＨＭＣ）、並びに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ（ａｍｉｎｏａｌｋｌｙａｍｉｎｏ））アデニン又は他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５−７７（１９８０）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当該技術分野において公知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンもまた含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎＣｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換の実施形態である。

修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン（ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなど、他の合成及び天然核酸塩基を含む。

更に、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、‘ＴｈｅＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅＡｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’，ｐａｇｅｓ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈｅｔａｌ．，ＡｎｇｅｗａｎｄｌｅＣｈｅｍｉｅ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ’，１９９１，３０，ｐａｇｅ６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，ｐａｇｅｓ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅａ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものを含む。これらの核酸塩基の特定のものは、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。それらとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びに２−アミノプロピルアデニンを含むＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ，‘ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換の態様、更により詳細には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせたときの態様である。修飾核酸塩基については、米国特許第３，６８７，８０８号明細書、並びに同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０２号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，６８１，９４１号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；同第５，７６３，５８８号明細書；同第５，８３０，６５３号明細書；同第６，００５，０９６号明細書；及び米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号明細書に記載されている。

このように、用語「修飾された」は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、又はガイドＲＮＡとエンドヌクレアーゼとの両方に取り込まれる非天然の糖、リン酸、又は塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチドの全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、単一のオリゴヌクレオチドに、又は更にはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに、前述の修飾のうちの２つ以上が取り込まれてもよい。

一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／又はエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（又はＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取込みを増強する１つ以上の部分又はコンジュゲートに化学的に連結される。かかる部分は、限定はされないが、コレステロール部分などの脂質部分［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６（１９８９）］；コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３−１０６０（１９９４）］；チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６−３０９（１９９２）及びＭａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５−２７７０（１９９３）］；チオコレステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０：５３３−５３８（１９９２）］；脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２５９：３２７−３３０（１９９０）及びＳｖｉｎａｒｃｈｕｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９−５４（１９９３）］；リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）及びＳｈｅａｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８：３７７７−３７８３（１９９０）］；ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９−９７３（１９９５）］；アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）］；パルミチル部分［（Ｍｉｓｈｒａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９−２３７（１９９５）］；又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３−９３７（１９９６）］を含む。米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書及び同第５，６８８，９４１号明細書もまた参照のこと。

糖及び他の部分を使用して、カチオン性ポリソーム及びリポソームなど、ヌクレオチドを含むタンパク質及び複合体を特定の部位に標的化することができる。例えば、肝細胞特異的トランスファーがアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）によって媒介されてもよい；例えば、Ｈｕ，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＰｅｐｔＬｅｔｔ．２１（１０）：１０２５−３０（２０１４）を参照のこと。当該技術分野において公知の、及び常時開発される他のシステムを使用して、この場合に有用な生体分子及び／又はその複合体を目的の特定の標的細胞に標的化することができる。

これらのターゲティング部分又はコンジュゲートは、第一級又は第二級ヒドロキシル基など、官能基に共有結合的に結合するコンジュゲート基を含み得る。本開示のコンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。薬力学的特性を増強する基としては、本開示の文脈では、取込みを改良する基、分解に対する抵抗性を増強する基、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を増強する基としては、本開示の文脈では、本開示の化合物の取込み、分布、代謝又は排出を改良する基が挙げられる。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号明細書、及び米国特許第６，２８７，８６０号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に開示されている。コンジュゲート部分としては、限定はされないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウムｌ，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書及び同第５，６８８，９４１号明細書を参照のこと。

それほど化学合成に適していない、且つ典型的には酵素合成によって作製される、より長いポリヌクレオチドもまた、様々な手段によって修飾することができる。かかる修飾には、例えば、ある種のヌクレオチド類似体の導入、分子の５’又は３’末端における特定の配列又は他の部分の取込み、及び他の修飾が含まれ得る。例示として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは約４ｋｂ長であり、インビトロ転写によって合成することができる。このｍＲＮＡに修飾を適用することにより、例えば、その翻訳又は安定性を増加させることができ（細胞による分解に対するその抵抗性を増加させることによるなど）、又は外因性ＲＮＡ、特にＣａｓ９をコードするものなどのより長いＲＮＡの導入後に細胞で観察されることの多い自然免疫応答を誘発するＲＮＡの傾向を低下させることができる。

数多くのかかる修飾が、ポリＡテール、５’キャップ類似体（例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基の使用（プソイドＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）又はＮ６−メチル−ＡＴＰなど）、又はホスファターゼ処理による５’末端リン酸の除去など、当該技術分野において記載されている。これら及び他の修飾は当該技術分野において公知であり、ＲＮＡの新規修飾が常時開発されている。

修飾ＲＮＡの商業的供給業者は、例えば、ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ−ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＩｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ及び他多数を含め、数多くある。ＴｒｉＬｉｎｋによって記載されるとおり、例えば、５−メチル−ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼ安定性の増加、翻訳の増加又は自然免疫受容体とインビトロ転写ＲＮＡとの相互作用の低下など、望ましい特徴を付与することができる。５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、並びにプソイドＵＴＰ及び２−チオ−ＵＴＰもまた、以下で参照するＫｏｒｍａｎｎｅｔａｌ．及びＷａｒｒｅｎｅｔａｌ．による発表に示されるとおり、翻訳を増強しつつ、培養下及びインビボで自然免疫刺激を低下させることが示されている。

インビボで送達される化学修飾ｍＲＮＡを使用して治療効果の向上を実現できることが示されている；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９，１５４−１５７（２０１１）を参照のこと。かかる修飾は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性の増加及び／又はその免疫原性の低下のために使用することができる。プソイドＵ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ及び５−メチル−Ｃなどの化学修飾を使用すると、ウリジン及びシチジン残基の僅か４分の１をそれぞれ２−チオ−Ｕ及び５−メチル−Ｃに置換するだけで、マウスにおいてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介性のｍＲＮＡ認識の大幅な減少が生じたことが分かった。自然免疫系の活性化の低下により、こうした修飾を用いてインビボでのｍＲＮＡの安定性及び寿命を有効に増加させることができる；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎｅｔａｌ．、前掲を参照のこと。

また、自然抗ウイルス応答を回避するように設計された修飾を取り込んだ合成メッセンジャーＲＮＡを反復投与することにより、分化したヒト細胞を多能性に再プログラム化できることも示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照のこと。一次再プログラム化タンパク質として働くかかる修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラム化するのに効率的な手段であり得る。かかる細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称され、５−メチル−ＣＴＰ、プソイドＵＴＰ及びアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）を取り込んだ酵素的に合成されたＲＮＡを使用して細胞の抗ウイルス応答を有効に逃れ得ることが分かった；例えば、Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．、前掲を参照のこと。

当該技術分野において記載されるポリヌクレオチドの他の修飾としては、例えば、ポリＡテールの使用、５’キャップ類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）の付加、５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の修飾、又はホスファターゼ処理による５’末端リン酸の除去が挙げられ−、新規手法が常時開発されている。

本明細書で使用される修飾ＲＮＡの生成に適用可能な幾つもの組成物及び技法が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含め、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾に関連して開発されている。ｓｉＲＮＡは、それがｍＲＮＡ干渉によって遺伝子サイレンシングに及ぼす効果が概して一過性であり、それにより反復投与が必要になり得るため、インビボで特定の課題を提示する。加えて、ｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳類細胞は、多くの場合にウイルス感染の副産物であるｄｓＲＮＡを検出して中和するように進化した免疫応答を有する。従って、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介することのできる哺乳類酵素、例えば、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）、及び潜在的にレチノイン酸誘導性の遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、並びにかかる分子に応答してサイトカインの誘導を惹起することのできるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８など）がある；例えば、Ａｎｇａｒｔｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０−４６８（２０１３）；Ｋａｎａｓｔｙｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２０（３）：５１３−５２４（２０１２）；Ｂｕｒｎｅｔｔｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＪ．６（９）：１１３０−４６（２０１１）；ＪｕｄｇｅａｎｄＭａｃＬａｃｈｌａｎ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ１９（２）：１１１−２４（２００８）によるレビュー；及びそこに引用される文献を参照のこと。

多種多様な修飾が、ＲＮＡ安定性の増強、自然免疫応答の低下、及び／又は本明細書に記載されるとおりの、ヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用であり得る他の利益の実現のため開発され、適用されている；例えば、ＷｈｉｔｅｈｅａｄＫＡｅｔａｌ．，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７−９６（２０１１）；ＧａｇｌｉｏｎｅａｎｄＭｅｓｓｅｒｅ，ＭｉｎｉＲｅｖＭｅｄＣｈｅｍ，１０（７）：５７８−９５（２０１０）；Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａｅｔａｌ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ．，１２（２）：１５８−６７（２０１０）；Ｄｅｌｅａｖｅｙｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍＣｈａｐｔｅｒ１６：Ｕｎｉｔ１６．３（２００９）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８（４）：３０５−１９（２００８）；Ｆｕｃｉｎｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＴｈｅｒ２２（３）：２０５−２１０（２０１２）；Ｂｒｅｍｓｅｎｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＧｅｎｅｔ３：１５４（２０１２）によるレビューを参照のこと。

上述のとおり、修飾ＲＮＡの商業的供給業者は幾つもあり、その多くはｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された修飾に特化している。文献に報告される様々な知見に基づき種々の手法が提供される。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ１１：１２５−１４０（２０１２）によって報告されるとおり、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するため非架橋酸素から硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）への置換が広範に用いられていることを注記している。リボースの２’位の修飾は、二重鎖安定性（Ｔｍ）を増加させつつインターヌクレオチドリン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善することが報告されており、これはまた免疫活性化からの保護を提供することも示されている。中程度のＰＳ骨格修飾と小さい十分に許容される２’置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との組み合わせは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４３２：１７３−１７８（２００４）によって報告されるとおり、インビボでの適用に極めて安定性の高いｓｉＲＮＡと関連付けられており；及び２’−Ｏ−メチル修飾は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１９：１９１−２０２（２００９）によって報告されるとおり、安定性の改善に有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導の減少に関連して、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロによる特定の配列の修飾が、概してサイレンシング活性は維持しつつ、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を低下させることが報告されている；例えば、Ｊｕｄｇｅｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４−５０５（２００６）；及びＣｅｋａｉｔｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０−１０８（２００７）．を参照のこと。２−チオウラシル、プソイドウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、及びＮ６−メチルアデノシンなどの追加的な修飾もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫効果を最小限に抑えることが示されている；例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３：１６５−１７５（２００５）を参照のこと。

同様に当該技術分野において公知であり、且つ市販されているとおり、本明細書で使用するＲＮＡなどのポリヌクレオチドに対し、例えば、コレステロール、トコフェロール及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー及びアプタマーを含め、その送達及び／又は細胞による取込みを増強することのできる幾つものコンジュゲートを適用することができる；例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１−８０９（２０１３）によるレビュー、及びそこに引用される文献を参照のこと。

コドン最適化
一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の標的ＤＮＡを含む細胞において発現させるため、当該技術分野において標準的な方法によりコドン最適化される。例えば、意図される標的核酸がヒト細胞にある場合、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドがＣａｓ９ポリペプチドの産生に使用されることが企図される。

ゲノムターゲティング核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
ゲノムターゲティング核酸は部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸ガイド型ヌクレアーゼ）と相互作用し、それにより複合体を形成する。ゲノムターゲティング核酸が部位特異的ポリペプチドを標的核酸にガイドする。

ＲＮＰ
部位特異的ポリペプチド及びゲノムターゲティング核酸は、各々が別個に細胞又は患者に投与されてもよい。他方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体化されてもよい。予め複合体化された材料が、次には細胞又は患者に投与されてもよい。かかる予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られる。

核酸コードシステム成分
本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／又は本開示の方法の態様を実行するのに必要な任意の核酸又はタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／又は本開示の方法の態様を実行するのに必要な任意の核酸又はタンパク質分子をコードする核酸はベクター（例えば組換え発現ベクター）を含む。

用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加的な核酸セグメントをライゲートすることのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクター（例えばＡＡＶ）であり、ここでは追加的な核酸セグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。ある種のベクターは、それが導入される宿主細胞において自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、従って宿主ゲノムと共に複製する。

一部の実施形態において、ベクターは、それが作動可能に連結される核酸の発現を指図する能力を有する。かかるベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」、又は更に単純に「発現ベクター」と称され、これらは同等の機能を果たす。

用語「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列がそのヌクレオチド配列の発現を許容する形で１つ又は複数の調節配列に連結されていることを意味する。用語「調節配列」は、例えば、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。かかる調節配列は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くの宿主細胞型でヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、及びある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。当業者によれば、発現ベクターの設計が、標的細胞の選択、所望の発現レベルなどといった要因に依存し得ることが理解されるであろう。

企図される発現ベクターとしては、限定はされないが、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルスをベースとするウイルスベクター、及びレトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルスなどに由来するベクター）及び他の組換えベクターが挙げられる。真核標的細胞に企図される他のベクターとしては、限定はされないが、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。真核標的細胞に企図される更なるベクターとしては、限定はされないが、ベクターが挙げられる。宿主細胞と適合性がある限り、他のベクターが用いられてもよい。

一部の実施形態において、ベクターは１つ以上の転写及び／又は翻訳制御エレメントを含む。利用される宿主／ベクター系に応じて、幾つもの好適な転写及び翻訳制御エレメントの任意のものが、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含め、発現ベクターに用いられてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、ウイルス配列又はＣＲＩＳＰＲ機構の成分のいずれか又は他のエレメントを不活性化する自己不活性化ベクターである。

好適な真核生物プロモーター（即ち、真核細胞で機能性のプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子−１プロモーター（ＥＦ１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーがニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したものを含むハイブリッドコンストラクト、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、及びマウスメタロチオネイン−Ｉからのものが挙げられる。

Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して使用されるガイドＲＮＡを含め、小さいＲＮＡを発現させるためには、例えばＵ６及びＨ１を含め、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの様々なプロモーターが有利であり得る。かかるプロモーターについての説明及びその使用を増強するためのパラメータは当該技術分野において公知であり、更なる情報及び手法が常時記載されている；例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ−ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照のこと。

発現ベクターはまた、翻訳開始用のリボソーム結合部位及び転写ターミネーターも含み得る。発現ベクターはまた、発現の増幅に適切な配列も含み得る。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合した、ひいては融合タンパク質をもたらす非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。

一部の実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーター等）である。一部の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。一部の実施形態において、プロモーターは空間的に制限された及び／又は時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）である。

一部の実施形態において、本開示のゲノムターゲティング核酸及び／又は部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のため送達媒体の中又はその表面上にパッケージングされる。企図される送達媒体としては、限定はされないが、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられる。当該技術分野で記載されるとおり、種々のターゲティング部分を用いてかかる媒体と所望の細胞型又は位置との優先的相互作用を増強することができる。

細胞への本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸の導入は、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接のマイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などによって行うことができる。

送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及び／又は１つ又は複数のエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、当該技術分野において公知のウイルス又は非ウイルス送達媒体によって送達することができる。或いは、１つ又は複数のエンドヌクレアーゼポリペプチドは、電気穿孔又は脂質ナノ粒子など、当該技術分野において公知のウイルス又は非ウイルス送達媒体によって送達されてもよい。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、単独か、又は１つ以上のガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体化されるかのいずれかで、１つ以上のポリペプチドとして送達されてもよい。

ポリヌクレオチドは、限定はされないが、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正電荷ペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ融合タンパク質複合体を含めた非ウイルス送達媒体によって送達されてもよい。一部の例示的非ウイルス送達媒体について、ＰｅｅｒａｎｄＬｉｅｂｅｒｍａｎ，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１８：１１２７−１１３３（２０１１）に記載されている（これはｓｉＲＮＡ用の非ウイルス送達媒体に焦点を置いているが、これは他のポリヌクレオチドの送達にもまた有用である）。

ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞又は患者に送達されてもよい。

ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、又は２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。或いは、ナノ粒子は、１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、又は２５〜６０ｎｍのサイズの範囲であってもよい。

ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、又は中性脂質でできていてもよい。融合性リン脂質ＤＯＰＥ又は膜成分コレステロールなどの中性脂質が、「ヘルパー脂質」としてトランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を増強するためＬＮＰに含まれてもよい。カチオン性脂質の制限としては、低い安定性及び急速なクリアランスに起因する低い有効性、並びに炎症反応又は抗炎症反応の発生が挙げられる。

ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、又は疎水性脂質及び親水性脂質の両方を含んでもよい。

当該技術分野において公知の任意の脂質又は脂質の組み合わせを使用してＬＮＰを作製し得る。ＬＮＰの作製に使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ−ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０である。

ＬＮＰを作製するために、脂質はいかなるモル比で組み合わされてもよい。加えて、ＬＮＰを作製するために、１つ又は複数のポリヌクレオチドが１つ又は複数の脂質と幅広いモル比で組み合わされてもよい。

これまでに述べたとおり、部位特異的ポリペプチド及びゲノムターゲティング核酸は、各々が別個に細胞又は患者に投与されてもよい。他方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体化されてもよい。予め複合体化された材料が、次には細胞又は患者に投与されてもよい。かかる予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られる。

ＲＮＡはＲＮＡ又はＤＮＡと特異的相互作用を形成する能力を有する。この特性は多くの生物学的過程で利用されているが、これはまた、核酸リッチな細胞環境において無差別な相互作用となるリスクも伴う。この問題の一つの解決法はリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成であり、ここではＲＮＡがエンドヌクレアーゼと予め複合体化される。ＲＮＰの別の利益は分解からのＲＮＡの保護である。

ＲＮＰにおけるエンドヌクレアーゼは修飾されていても、又は非修飾であってもよい。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡは修飾されていても、又は非修飾であってもよい。数多くの修飾が当該技術分野において公知であり、使用することができる。

エンドヌクレアーゼとｓｇＲＮＡとは、概して１：１のモル比で組み合わされてもよい。或いは、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、概して１：１：１のモル比で組み合わされてもよい。しかしながら、ＲＮＰの作製には幅広いモル比を用いることができる。

組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが送達に用いられてもよい。送達しようとするポリヌクレオチドを含むパッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子の作製技法は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの作製には、単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞と称される）の中に以下の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個の（即ちその中にない）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が存在する必要がある。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、限定はされないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３及びＡＡＶｒｈ．７４を含め、組換えウイルスが由来することのできる任意のＡＡＶ血清型からのものであってもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲと異なるＡＡＶ血清型からのものであってもよい。シュードタイプｒＡＡＶの作製が、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。表２を参照のこと。

パッケージング細胞の作成方法は、ＡＡＶ粒子作製に必要な全ての成分を安定に発現する細胞株を作成することを含む。例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個のＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）などの手順によるか、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）によって細菌プラスミドに導入されている。パッケージング細胞株は次に、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、且つｒＡＡＶの大規模作製に好適であることである。好適な方法の他の例では、プラスミドよりむしろアデノウイルス又はバキュロウイルスを利用してｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子がパッケージング細胞に導入される。

ｒＡＡＶ作製の一般的原理については、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）にレビューされている。様々な手法が、Ｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９８８Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎｅｔａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ１３：１２４４−１２５０；Ｐａｕｌｅｔａｌ．（１９９３）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：６０９−６１５；Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．（１９９６）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：１１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。

ＡＡＶベクター血清型は標的細胞型に合致させることができる。例えば、以下の例示的細胞型は、数ある中でも特に、指示されるＡＡＶ血清型によって形質導入されてもよい。表３を参照のこと。

アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。かかるウイルスベクターとしては、限定はされないが、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パポーバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓｒ）、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、標的遺伝子の１つ又は２つの遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡは、各々が脂質ナノ粒子に別個に製剤化されるか、又は全てが１つの脂質ナノ粒子に共製剤化され、又は２つ以上の脂質ナノ粒子に共製剤化される。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に製剤化され、一方でｓｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡはＡＡＶベクターで送達される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡとは脂質ナノ粒子に共製剤化され、一方でドナーＤＮＡはＡＡＶベクターで送達される。

Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして又はタンパク質として送達する選択肢が利用可能である。ガイドＲＮＡは同じＤＮＡから発現させることができ、又はＲＮＡとして送達することもできる。ＲＮＡは、その半減期が改変され若しくは向上するように、又は免疫応答の可能性若しくは程度が低下するように化学的に修飾することができる。エンドヌクレアーゼタンパク質は送達前にｇＲＮＡと複合体化することができる。ウイルスベクターは効率的な送達を可能にし；分割バージョンのＣａｓ９及びＣａｓ９のより小さいオルソログを、ＨＤＲ用のドナーについてできるのと同じく、ＡＡＶにパッケージングすることができる。これらの成分の各々を送達することのできる様々な非ウイルス送達方法もまた存在し、又は非ウイルス方法及びウイルス方法をタンデムで利用することができる。例えば、ナノ粒子を使用してタンパク質及びガイドＲＮＡを送達することができ、一方でＡＡＶを使用してドナーＤＮＡを送達することができる。

エキソソーム
リン脂質二重層が結合する一種の微小胞であるエキソソームを使用して、核酸を特異的組織に送達することができる。体内の多くの異なる種類の細胞が天然でエキソソームを分泌する。エキソソームは、エンドソームが陥入して多胞性エンドソーム（ＭＶＥ）を形成すると細胞質内に形成される。ＭＶＥが細胞膜と融合すると、エキソソームが細胞外空間に分泌される。３０〜１２０ｎｍの直径の範囲で、エキソソームは様々な分子をある細胞から別の細胞へと細胞間コミュニケーションの形態でシャトル輸送することができる。マスト細胞など、天然でエキソソームを産生する細胞は、特異的組織を標的とする表面タンパク質を有するエキソソームを産生するように遺伝子改変することができ、或いはエキソソームは血流から単離することができる。操作されたエキソソームの中に電気穿孔によって特異的核酸を置くことができる。全身的に導入されると、エキソソームは核酸を特異的標的組織に送達することができる。

遺伝子修飾細胞
用語「遺伝子修飾細胞」とは、ゲノム編集によって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを使用して）導入された少なくとも１つの遺伝子修飾を含む細胞を指す。本明細書の一部の例（例えば、エキソビボの例）において、遺伝子修飾細胞は遺伝子修飾前駆細胞である。本明細書の一部の例において、遺伝子修飾細胞は遺伝子修飾Ｔ細胞である。外因性ゲノムターゲティング核酸及び／又はゲノムターゲティング核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝子修飾細胞が本明細書で企図される。

用語「対照処理済み集団」は、ゲノム編集成分の追加を除けば同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、コンフルエンシー、フラスコサイズ、ｐＨ等で処理された細胞集団を記載する。標的遺伝子又はタンパク質発現又は活性の回復の測定には、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば標的タンパク質のウエスタンブロット分析又は標的ｍＲＮＡの定量化を用いることができる。

用語「単離細胞」は、それが当初見出されていた生物から取り出された細胞、又はかかる細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞はインビトロで、例えば限定条件下又は他の細胞の存在下に培養される。任意選択で、細胞は後に第２の生物に導入されるか、又はそれ（又はそれが子孫となった元の細胞）が単離された元の生物に再導入される。

単離細胞集団に関連して用語「単離集団」は、混合又は異種細胞集団から取り出され、且つ分離された細胞集団を指す。一部の実施形態において、単離集団は、細胞が単離され又は集積された元の異種集団と比較したとき実質的に純粋な細胞集団である。一部の実施形態において、単離集団は、ヒト前駆細胞の単離集団、例えば、ヒト前駆細胞及びヒト前駆細胞が由来した元の細胞を含む異種細胞集団と比較したとき実質的に純粋なヒト前駆細胞集団である。

用語「実質的に増強された」は、特定の細胞集団に関連して、既存のレベル又は参照レベルと比べて特定の種類の細胞の出現が、例えば医学的病態を改善するためのかかる細胞の所望のレベルに応じて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍又はそれ以上増加する細胞集団を指す。

用語「実質的に集積された」は、特定の細胞集団に関連して、全細胞集団を構成する細胞に関して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％又はそれ以上の細胞集団を指す。

用語「実質的に集積された」又は「実質的に純粋な」は、特定の細胞集団に関連して、全細胞集団を構成する細胞に関して少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の純度の細胞集団を指す。即ち、用語「実質的に純粋な」又は「本質的に精製された」は、前駆細胞集団に関連して、本明細書でこれらの用語により定義されるとおりの前駆細胞でない細胞が約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、又は１％未満より少数しか含まれない細胞集団を指す。

患者に細胞を植え込む
本開示のエキソビボ方法の別のステップは、細胞を患者に植え込むことを含む。この植込みステップは、当該技術分野において公知の任意の植込み方法を用いて達成し得る。例えば、遺伝子修飾細胞が患者の血中に直接注入されるか、又は他の形で患者に投与されてもよい。遺伝子修飾細胞は、選択されたマーカーを使用してエキソビボで精製されてもよい。

薬学的に許容可能な担体
本明細書で企図される前駆細胞を対象に投与するエキソビボ方法は、前駆細胞を含む治療組成物の使用を含む。

治療組成物は、細胞組成物と共に生理学的に許容可能な担体、及び任意選択で、その中に活性成分として溶解又は分散させた、本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つの追加的な生物活性剤を含有する。一部の実施形態において、治療組成物は、そのように所望されない限り、哺乳類又はヒト患者に治療目的で投与されたときに実質的に免疫原性でない。

一般に、本明細書に記載される前駆細胞は、薬学的に許容可能な担体と共に懸濁液として投与される。当業者は、細胞組成物に使用されるべき薬学的に許容可能な担体が、対象に送達しようとする細胞の生存能を実質的に妨げる量の緩衝剤、化合物、凍結保存剤、保存剤、又は他の薬剤を含まないであろうことを認識するであろう。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜完全性の維持を可能にする浸透圧緩衝液、及び任意選択で、細胞生存能を維持し又は投与時の生着を増強するための栄養素を含み得る。かかる製剤及び懸濁液は当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載されるとおりの前駆細胞との使用向けにルーチンの実験を用いて適合させることができる。

細胞組成物はまた、乳化させるか、又はリポソーム組成物として提供することもでき、但し乳化手順が細胞生存能に悪影響を与えないものとする。細胞及び任意の他の活性成分は、薬学的に許容可能で活性成分と適合性のある、且つ本明細書に記載される治療的方法における使用に好適な量の賦形剤と共に混合することができる。

細胞組成物に含まれる追加的な薬剤には、その中の成分の薬学的に許容可能な塩が含まれ得る。薬学的に許容可能な塩としては、例えば塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸などと形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインのような有機塩基などから誘導することができる。

生理学的に許容可能な担体は当該技術分野において周知である。例示的液体担体は、活性成分及び水の他にいかなる材料も含有しないか、又は生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水などの両方を含有する滅菌水溶液である。なおも更に、水性担体は、２つ以上の緩衝塩、並びに塩化ナトリウム及びカリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール及び他の溶質などを含有することができる。液体組成物はまた、水に加えて、及び水の他に、液相も含有することができる。かかる追加的な液相の例はグリセリン、綿実油などの植物油、及び水−油エマルションである。特定の障害又は病態の治療において有効な細胞組成物中に使用される活性化合物の量は、障害又は病態の性質に依存することになり、標準的な臨床技法により決定することができる。

投与及び有効性
用語「投与する」、「導入する」及び「移植する」は、１つ又は複数の所望の効果が生じるように、傷害又は修復部位などの所望の部位において導入された細胞の少なくとも部分的な局在化を生じさせる方法又は経路によって細胞、例えば前駆細胞を対象の体内に入れるという文脈で同義的に使用される。細胞、例えば前駆細胞、又は分化したその子孫は、植え込まれた細胞又は細胞の成分の少なくとも一部が生存し続ける対象における所望の位置への送達を生じさせる任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば２４時間ほどの短期間から、数日間、数年間に至るまでの長期間、又は更には患者の一生涯、即ち長期生着であってもよい。例えば、本明細書に記載される一部の態様では、有効量の筋原前駆細胞が腹腔内又は静脈内経路などの全身投与経路によって投与される。

用語「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」は、本明細書では同義的に使用され、診断、治療又は療法が所望される任意の対象を指す。一部の態様において、対象は哺乳類である。一部の態様において、対象はヒトである。

用語「ドナー」は、患者ではない個体を指して使用される。一部の実施形態において、ドナーは、治療すべき医学的病態を有しない、又はそれを有する疑いがない個体である。一部の実施形態において、複数のドナー、例えば２個体以上のドナーが使用されてもよい。一部の実施形態において、使用される各ドナーが、治療すべき医学的病態を有しない、又はそれを有する疑いがない個体である。

予防的に提供される場合、本明細書に記載される前駆細胞は、医学的病態の任意の症状に先立って、例えば、γ／δＴ細胞拡大によるα／βＴ細胞リンパ球減少症、重症サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、自己免疫、慢性皮膚炎症、好酸球増加症、発育不良、リンパ節腫大、脾腫大、下痢及び肥大肝の発症前に対象に投与することができる。従って、造血前駆細胞集団の予防的投与は医学的病態を防ぐ働きをする。

治療的に提供される場合、造血前駆細胞は、医学的病態の症状又は徴候の発生時に（又は発生後に）、例えば疾患の発生を受けて提供される。

一部の実施形態において、本明細書に記載される方法により投与されるＴ細胞集団は、１個体以上のドナーから入手された同種異系Ｔ細胞を含む。一部の実施形態において、投与される細胞集団は、同種異系血球細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、胚性幹細胞、又は人工胚性幹細胞であってもよい。「同種異系」は、１個体以上の同じ種の異なるドナーから入手された細胞、細胞集団、又は細胞を含む生体試料を指し、ここでは１つ以上の遺伝子座の遺伝子がレシピエントと同一でない。例えば、対象に投与される造血前駆細胞集団、又はＴ細胞集団は、１個体以上の無関係のドナー、又は１個体以上の非同一同胞に由来することができる。一部の実施形態では、遺伝的に同一のドナー（例えば、一卵性双生児）から入手されたものなど、同系細胞集団が使用されてもよい。一部の実施形態では、細胞は自己細胞であり；即ち、細胞（例えば：造血前駆細胞、又はＴ細胞）が対象から入手又は単離され、且つ同じ対象に投与され、即ちドナーとレシピエントとが同じである。

用語「有効量」は、医学的病態の少なくとも１つ又はそれ以上の徴候又は症状の予防又は緩和に必要な前駆細胞又はその子孫の集団の量を指し、例えば医学的病態を有する対象を治療するため所望の効果をもたらすのに十分な量の組成物に関する。従って用語「治療有効量」は、医学的病態を有する又はそのリスクがある対象など、典型的な対象への投与時に特定の効果を促進するのに十分な前駆細胞又は前駆細胞を含む組成物の量を指す。有効量にはまた、疾患の症状の発症を予防し又は遅延させ、疾患の症状の経過を変化させ（例えば限定はされないが、疾患の症状の進行を減速させ）、又は疾患の症状を好転させるのに十分な量も含まれ得る。いずれの場合にも、適切な「有効量」は当業者によってルーチンの実験を用いて決定され得ることが理解される。

本明細書に記載される様々な態様における使用について、前駆細胞の有効量は、少なくとも１０^２個の前駆細胞、少なくとも５×１０^２個の前駆細胞、少なくとも１０^３個の前駆細胞、少なくとも５×１０^３個の前駆細胞、少なくとも１０^４個の前駆細胞、少なくとも５×１０^４個の前駆細胞、少なくとも１０^５個の前駆細胞、少なくとも２×１０^５個の前駆細胞、少なくとも３×１０^５個の前駆細胞、少なくとも４×１０^５個の前駆細胞、少なくとも５×１０^５個の前駆細胞、少なくとも６×１０^５個の前駆細胞、少なくとも７×１０^５個の前駆細胞、少なくとも８×１０^５個の前駆細胞、少なくとも９×１０^５個の前駆細胞、少なくとも１×１０^６個の前駆細胞、少なくとも２×１０^６個の前駆細胞、少なくとも３×１０^６個の前駆細胞、少なくとも４×１０^６個の前駆細胞、少なくとも５×１０^６個の前駆細胞、少なくとも６×１０^６個の前駆細胞、少なくとも７×１０^６個の前駆細胞、少なくとも８×１０^６個の前駆細胞、少なくとも９×１０^６個の前駆細胞、又はその倍数を含む。前駆細胞は１個体以上のドナーに由来し、又は自己供給源から入手される。本明細書に記載される一部の例において、前駆細胞は、それを必要としている対象への投与前に培養下で拡大される。

医学的病態を有する患者の細胞に発現する機能的標的のレベルの緩やかな漸進的上昇は、疾患の１つ以上の症状の改善、長期生存の増加、及び／又は他の治療に伴う副作用の低減に有益であり得る。かかる細胞をヒト患者に投与したとき、機能的標的のレベル上昇を生じさせる造血前駆細胞が存在することが有益である。一部の実施形態において、対象の有効な治療により、治療される対象の全標的に対して少なくとも約３％、５％又は７％の機能的標的が生じる。一部の実施形態において、機能的標的は全標的の少なくとも約１０％になり得る。一部の実施形態において、機能的標的は全標的の少なくとも約２０％〜３０％になり得る。同様に、著しく上昇したレベルの機能的標的を有する細胞の比較的限定されたサブ集団であっても、その導入は様々な患者において有益であってよく、これは、ある状況では正常化した細胞が罹患細胞と比べて選択的優位性を有することが理由である。しかしながら、機能的標的レベルが上昇した造血前駆細胞は、レベルが中程度であっても、患者における医学的病態の１つ以上の側面の改善に有益であり得る。一部の実施形態において、かかる細胞が投与される患者における造血前駆細胞の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又はそれ以上が、機能的標的レベルの上昇を生じるものである。

「投与された」は、少なくとも部分的に所望の部位における細胞組成物の局在化を生じさせる方法又は経路による対象への前駆細胞組成物の送達を指す。細胞組成物は、対象において有効な治療を生じさせる任意の適切な経路によって投与することができ、即ち投与によって対象における所望の位置への送達が生じ、そこで送達された組成物の少なくとも一部、即ち少なくとも１×１０^４個の細胞が所望の部位へとある期間送達される。投与様式としては、注射、注入、点滴、又は摂取が挙げられる。「注射」としては、限定なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。一部の実施形態において、経路は静脈内である。細胞の送達には、注射又は注入による投与が行われてもよい。

細胞は全身投与される。語句「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」及び「末梢投与された」は、標的部位、組織、又は器官への直接投与以外の前駆細胞集団の投与であって、代わりにそれが対象の循環系に入り、従って代謝及び他の同様の過程に曝されるような投与を指す。

医学的病態の治療用組成物を含む治療の有効性は、熟練した臨床医が決定することができる。しかしながら、治療は、一例に過ぎないが、機能的標的レベルの徴候又は症状のうちのいずれか１つ又は全てが有益な形で変化した（例えば、少なくとも１０％の増加した）場合、又は他の臨床的に認められている疾患の症状又はマーカーが向上又は改善した場合に「有効な治療」と見なされる。有効性はまた、入院又は医学的介入の必要性によって評価したとき個体が悪化しないこと（例えば、疾患の進行が止まる又は少なくとも減速する）によって測定されてもよい。こうした指標の測定方法は当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載される。治療には、個体又は動物（一部の非限定的な例としては、ヒト、又は哺乳類が挙げられる）における疾患の任意の治療が含まれ、（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を止める、又は減速させること；又は（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の軽減を生じさせること；及び（３）症状の発症可能性を予防又は低減することが含まれる。

本開示に係る治療は、個体における機能的標的の量を増加させることにより、医学的病態に関連する１つ以上の症状を改善する。医学的病態に典型的に関連する初期徴候としては、例えば、γ／δＴ細胞拡大に伴うα／βＴ細胞リンパ球減少症、重症サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、自己免疫、慢性皮膚炎症、好酸球増加症、発育不良、リンパ節腫大、脾腫大、下痢及び肥大肝の発症が挙げられる。

キット
本開示は、本明細書に記載される方法を実施するためのキットを提供する。キットは、ゲノムターゲティング核酸、ゲノムターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／又は本明細書に記載される方法の態様の実施に必要な任意の核酸又はタンパク質分子、又はこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。

一部の実施形態において、キットは、（１）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（２）部位特異的ポリペプチド又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、及び（３）１つ又は複数のベクター及び／又はポリペプチドを再構成及び／又は希釈するための試薬を含む。

一部の実施形態において、キットは、（１）ベクターであって、（ｉ）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター；及び（２）ベクターを再構成及び／又は希釈するための試薬を含む。

上記のキットのいずれかの一部の実施形態において、キットは単一分子ガイドゲノムターゲティング核酸を含む。上記のキットのいずれかの一部の実施形態において、キットは二重分子ゲノムターゲティング核酸を含む。上記のキットのいずれかの一部の実施形態において、キットは２つ以上の二重分子ガイド又は単一分子ガイドを含む。一部の実施形態において、キットは、核酸ターゲティング核酸をコードするベクターを含む。

上記のキットのいずれかにおいて、キットは、所望の遺伝子修飾に影響を及ぼすため挿入されるポリヌクレオチドを更に含む。

キットの成分は別個の容器内にあってもよく、又は単一の容器に組み合わされてもよい。

上記に記載されるいずれのキットも、１つ以上の追加的な試薬を更に含むことができ、ここでかかる追加的な試薬は、緩衝液、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを細胞に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのインビトロ産生用の試薬、シーケンシング用のアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成用緩衝液、希釈用緩衝液などであってもよい。一部の実施形態において、キットはまた、オンターゲット結合若しくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡ切断の促進若しくは増強、又はターゲティング特異性の向上に使用することのできる１つ以上の成分も含む。

上述の成分に加えて、キットは、方法を実施するためのキットの成分の使用説明書を更に含む。方法の実施説明書は、概して好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基材に印刷されてもよい。説明書は、キットにおいて添付文書として存在する、キットの、若しくはその成分の容器のラベル表示に存在する（即ち、包装又は部分的包装に関連付けられる）等であってもよい。説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等に存在する電子記憶データファイルとして存在することができる。一部の例では、実際の説明書はキットに存在するのではなく、説明書を遠隔配布源から（例えばインターネット経由で）入手する手段を提供することができる。この場合の一例は、そこで説明書を閲覧することのできる、及び／又はそこから説明書をダウンロードすることのできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、このような説明書を入手する手段も好適な基材に記録することができる。

ガイドＲＮＡ製剤
本開示のガイドＲＮＡは、詳細な投与様式及び剤形に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などの薬学的に許容可能な賦形剤と共に製剤化される。ガイドＲＮＡ組成物は、概して生理的に適合性のあるｐＨを実現するように製剤化され、製剤及び投与経路に応じて約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲をとる。一部の実施形態において、ｐＨは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調整される。一部の実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つの化合物の治療有効量を、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と共に含む。任意選択で、本組成物は本明細書に記載される化合物の組み合わせを含み、又は細菌増殖の処理若しくは予防に有用な第２の活性成分（例として、及び限定なしに、抗細菌剤又は抗微生物剤）を含んでもよく、又は本開示の試薬の組み合わせを含んでもよい。

好適な賦形剤としては、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子など、大型の、ゆっくりと代謝される巨大分子を含む担体分子が挙げられる。他の例示的賦形剤としては、抗酸化剤（例として、及び限定なしに、アスコルビン酸）、キレート剤（例として、及び限定なしに、ＥＤＴＡ）、糖質（例として、及び限定なしに、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例として、及び限定なしに、油、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール）、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを挙げることができる。

他の可能な治療手法
遺伝子編集は、特異的配列を標的とするように操作されたヌクレアーゼを使用して行うことができる。現在までのところ、４つの主要なタイプのヌクレアーゼ：メガヌクレアーゼ及びその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムがある。これらのヌクレアーゼプラットフォームは、特にＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの特異性がタンパク質−ＤＮＡ相互作用を通じたものである一方、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用が主としてＣａｓ９をガイドするとおり、設計の難しさ、ターゲティング密度及び作用様式が異なる。Ｃａｓ９切断はまた、隣接モチーフ、ＰＡＭも必要とし、ＰＡＭはＣＲＩＳＰＲシステム毎に異なる。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９はＮＲＧＰＡＭを用いて切断し、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴ及びＮＮＮＮＧＣＴＴを含むＰＡＭを有する部位で切断することができる。幾つもの他のＣａｓ９オルソログが、別のＰＡＭに隣接するプロトスペーサーを標的とする。

本開示の方法においては、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することができる。しかしながら、治療標的部位など、本明細書に記載される教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、又はＭｅｇａＴＡＬなど、他の形態のエンドヌクレアーゼに対して、又はヌクレアーゼの組み合わせを用いて適用することが可能である。しかしながら、本開示の教示をかかるエンドヌクレアーゼに適用するためには、とりわけ、特異的標的部位に向けられるタンパク質を操作することが必要となり得る。

追加的な結合ドメインをＣａｓ９タンパク質に融合して特異性を高めてもよい。こうしたコンストラクトの標的部位は、同定されたｇＲＮＡによって指定される部位に位置付け得るが、ジンクフィンガードメインの場合のように、追加的な結合モチーフが必要であり得る。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合、メガヌクレアーゼをＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインに融合することができる。メガヌクレアーゼドメインは特異性を増加させ、切断をもたらすことができる。同様に、不活性化又はデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を切断ドメインに融合することができ、融合したＤＮＡ結合ドメインにｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位及び隣接する結合部位が必要であり得る。これには恐らくは、触媒不活性化に加えて、追加的な結合部位のない結合を減少させるためのｄＣａｓ９の何らかのプロテインエンジニアリングが必要になり得る。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインがＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結したものを含むモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能するため、一対のＺＦＮが対向するＤＮＡ鎖上のコグネイト標的「ハーフ部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）」配列に、それらの間に正確な間隔を置いて結合して触媒活性ＦｏｋＩ二量体の形成を可能にするように操作されなければならない。それ自体は本質的に配列特異性を有しないＦｏｋＩドメインが二量化すると、ゲノム編集における開始ステップとしてＺＦＮハーフ部位間にＤＮＡ二本鎖切断が生成される。

各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には豊富なＣｙｓ２−Ｈｉｓ２構成の３〜６個のジンクフィンガーを含み、各フィンガーが標的ＤＮＡ配列の一方の鎖上にあるヌクレオチドのトリプレットを主に認識するが、４番目のヌクレオチドとの交差鎖相互作用もまた重要であり得る。ＤＮＡとの主要な接触をなす位置にあるフィンガーのアミノ酸が変わると、所与のフィンガーの配列特異性が変わる。従って、４フィンガージンクフィンガータンパク質は１２ｂｐ標的配列を選択的に認識することになり、ここで標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット優先性の混合体であるが、トリプレット優先性は隣接フィンガーによって様々な程度に影響を受け得る。ＺＦＮの重要な側面は、単に個々のフィンガーを修飾することによってＺＦＮをほぼいかなるゲノムアドレスにも容易に再標的化できる点であり、しかしながらこれを上手く行うには相当の熟練が要求される。ＺＦＮのほとんどの適用で４〜６個のフィンガーのタンパク質が使用され、これはそれぞれ１２〜１８ｂｐを認識する。従って、一対のＺＦＮが、ハーフ部位間の５〜７ｂｐスペーサーを含まずに、典型的には２４〜３６ｂｐの組み合わされた標的配列を認識することになる。結合部位は、１５〜１７ｂｐを含め、より大きいスペーサーで更に分離することができる。設計過程で反復配列又は遺伝子ホモログが除外されると仮定すれば、この長さの標的配列はヒトゲノムにおいてユニークである可能性が高い。それにも関わらず、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡ相互作用はその特異性に関して絶対ではないため、実にオフターゲット結合及び切断イベントが、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体、又はＺＦＮのいずれか一方のホモ二量体のいずれかとして起こる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量化界面を操作して、互いとのみ二量化することのできる、自己二量化はしない、絶対ヘテロ二量体変異体としても知られる「プラス」及び「マイナス」変異体を作成することにより有効に取り除かれている。絶対ヘテロ二量体を強制することにより、ホモ二量体の形成が妨げられる。これにより、ＺＦＮ並びにこうしたＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性は大いに高まった。

種々のＺＦＮベースのシステムが当該技術分野において記載されており、その修飾は常時報告され、数多くの参考文献が、ＺＦＮの設計の指針とするため用いられる規則及びパラメータについて記載している；例えば、Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６（６）：２７５８−６３（１９９９）；ＤｒｅｉｅｒＢｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．３０３（４）：４８９−５０２（２０００）；ＬｉｕＱｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７７（６）：３８５０−６（２００２）；Ｄｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８０（４２）：３５５８８−９７（２００５）；及びＤｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７６（３１）：２９４６６−７８（２００１）を参照のこと。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、モジュラーヌクレアーゼのもう一つのフォーマットに相当し、これによれば、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、且つ一対のＴＡＬＥＮがタンデムで働いて標的化したＤＮＡ切断を実現する。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインの性質及び関連する標的ＤＮＡ配列認識特性である。ＴＡＬＥＮＤＮＡ結合ドメインは、当初植物細菌病原体キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＴＡＬＥにおいて記載されたものであるＴＡＬＥタンパク質に由来し、３３〜３５アミノ酸リピートのタンデムアレイを含み、各リピートが、典型的に最大２０ｂｐ長であって、最大４０ｂｐの合計標的配列長さとなる標的ＤＮＡ配列中の単一の塩基対を認識する。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２位及び１３位に２アミノ酸だけを含む反復可変二残基（ＲＶＤ）によって決まる。塩基グアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、主に４つのＲＶＤ：それぞれＡｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ及びＡｓｎ−Ｇｌｙによって認識される。これはジンクフィンガーと比べてはるかに単純な認識コードを成し、従ってヌクレアーゼ設計上、後者に優る利点を呈する。それにも関わらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用はその特異性の点で絶対でなく、ＴＡＬＥＮもまた、オフターゲット活性を低下させるため、ＦｏｋＩドメインの絶対ヘテロ二量体変異体の使用から利益が得られている。

その触媒機能が不活性化されるＦｏｋＩドメインの更なる変異体が作成されている。ＴＡＬＥＮ対又はＺＦＮ対のいずれかの片方が不活性ＦｏｋＩドメインを含む場合、標的部位においてはＤＳＢでなく、むしろ一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが起こることになる。この結果は、Ｃａｓ９切断ドメインの一方が不活性化されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」突然変異体を使用するのと同等である。ＤＮＡニックを用いてＨＤＲによるゲノム編集をドライブすることができ、しかしＤＳＢと比べて効率が低い。主な利益は、ＮＨＥＪ媒介性の修復誤りを受け易いＤＳＢと異なり、オフターゲットニックが迅速且つ正確に修復される点である。

種々のＴＡＬＥＮベースのシステムが当該技術分野において記載されており、その修飾が常時報告されている；例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０９−１２（２００９）；Ｍａｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３５（６０６９）：７１６−９（２０１２）；及びＭｏｓｃｏｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０１（２００９）を参照のこと。「ゴールデンゲート」プラットフォームをベースとするＴＡＬＥＮの使用、又はクローニングスキームが複数のグループによって記載されている；例えば、Ｃｅｒｍａｋｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３９（１２）：ｅ８２（２０１１）；Ｌｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３９（１４）：６３１５−２５（２０１１）；Ｗｅｂｅｒｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ．６（２）：ｅ１６７６５（２０１１）；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＪＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓ４１（６）：３３９−４７，Ｅｐｕｂ２０１４Ｍａｙ１７（２０１４）；及びＣｅｒｍａｋＴｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．１２３９：１３３−５９（２０１５）を参照のこと。

ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有し、且つＤＮＡを高い特異性で−多くの場合にゲノム中のユニークな部位で−切断する配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＨＥには、その構造によって分類されるとおりの、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号４）、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号５）、Ｈｉｓ−Ｃｉｓボックス、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ（配列番号６）、及びＶｓｒ様を含む少なくとも６つの公知のファミリーがあり、これらは、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア及びファージを含めた広範囲の宿主に由来する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥは、ゲノム編集の初めのステップとして標的遺伝子座にＤＳＢを作成するために用いることができる。加えて、一部の天然の及び操作されたＨＥはＤＮＡの単一の鎖のみを切断し、それにより部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きい標的配列及びそれがもたらす特異性により、ＨＥは部位特異的ＤＳＢを作成するのに魅力的な候補となっている。

種々のＨＥベースのシステムが当該技術分野において記載されており、その修飾が常時報告されている；例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔｅｔａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２４（８）：６６３−８０（２０１４）；ＢｅｌｆｏｒｔａｎｄＢｏｎｏｃｏｒａ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．１１２３：１−２６（２０１４）；ＨａｆｅｚａｎｄＨａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ５５（８）：５５３−６９（２０１２）によるレビュー；及びそこに引用される文献を参照のこと。

ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼの更なる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと触媒活性ＨＥとの融合体を用いるものであり、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性、並びにＨＥの切断配列特異性の両方を利用する；例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌｅｔａｌ．，ＮＡＲ４２：２５９１−２６０１（２０１４）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｇ３４：１１５５−６５（２０１４）；及びＢｏｉｓｓｅｌａｎｄＳｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１−９６（２０１５）を参照のこと。

更なる変形例では、ＭｅｇａＴｅｖ構成は、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）とＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＴｅｖＩに由来するヌクレアーゼドメイン（Ｔｅｖ）との融合体である。２つの活性部位はＤＮＡ基質上で約３０ｂｐ離れて位置し、適合性のない付着末端を有する２つのＤＳＢを生成する；例えば、Ｗｏｌｆｓｅｔａｌ．，ＮＡＲ４２，８８１６−２９（２０１４）を参照のこと。既存のヌクレアーゼベース手法の他の組み合わせが進化し、本明細書に記載される標的化したゲノム修飾の実現において有用となるであろうことが予想される。

ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ又はｄＣｐｆ１−Ｆｏｋ１及び他のヌクレアーゼ
上記に記載されるヌクレアーゼプラットフォームの構造的特性と機能的特性とを組み合わせると、固有の欠陥の一部を潜在的に解消し得る更なるゲノム編集手法がもたらされる。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは、典型的には単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを作成する。ターゲティングの特異性は、標的ＤＮＡとワトソン・クリック型塩基対合を起こすガイドＲＮＡ中の２０又は２２ヌクレオチド配列（加えて、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９の場合には隣接するＮＡＧ又はＮＧＧＰＡＭ配列中の追加的な２塩基）によって左右される。かかる配列は、ヒトゲノム中でユニークであるのに十分に長く、しかしながら、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対でなく、時に著しい無差別さが、特に標的配列の５’側の半分において許容され、特異性を左右する塩基の数が事実上減少する。これに対する一つの解決法は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１触媒機能を完全に不活性化し−ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合機能のみを保持して−、代わりにＦｏｋＩドメインを不活性化Ｃａｓ９に融合することとされている；例えば、Ｔｓａｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ３２：５６９−７６（２０１４）；及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７−８２（２０１４）を参照のこと。ＦｏｋＩは触媒活性になるためには二量化しなければならないため、２つのＦｏｋＩ融合体が二量体を形成してＤＮＡを切断するようにそれらを近接して係留するには、２つのガイドＲＮＡが必要である。本質的にこれによって組み合わされる標的部位の塩基の数が二倍になり、従ってＣＲＩＳＰＲベースのシステムによるターゲティングのストリンジェンシーは増加する。

更なる例として、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと、Ｉ−ＴｅｖＩなど、触媒活性ＨＥとの融合体は、オフターゲット切断が更に低減され得ることを見込んで、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性、並びにＩ−ＴｅｖＩの切断配列特異性の両方を利用するものである。

追加的な態様
本明細書には、非限定的な例として、癌、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患など、医学的病態の治療に用いられ得る、標的遺伝子の範囲内又はその近傍にある１つ以上の核酸又はエクソン又は標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の欠失、挿入、又はその発現若しくは機能の調節、又はｃＤＮＡ、発現ベクター、又はミニ遺伝子のノックインにより、ゲノムに永久的な変化を作成するためのエキソビボ及びインビボ方法において使用される核酸、ベクター、細胞、方法、及び他の材料が提供される。また、本明細書には、かかる方法を実施するための成分、キット、及び組成物も提供される。また、かかる方法によって作製される細胞も提供される。

以下のパラグラフもまた本開示に包含される：

１．ノックインキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトをコードする単離核酸であって、ノックインＣＡＲコンストラクトが、（ｉ）抗原認識領域を含むエクトドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸に作動可能に連結された標的遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を含む、単離核酸。

２．プロモーター、１つ以上の遺伝子調節エレメント、又はこれらの組み合わせを更に含む、パラグラフ１の単離核酸。

３．１つ以上の遺伝子調節エレメントが、エンハンサー配列、イントロン配列、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ２の単離核酸。

４．標的遺伝子が、宿主対移植片反応に関連する遺伝子配列、移植片対宿主反応に関連する遺伝子配列、チェックポイント阻害因子をコードする遺伝子配列、又はこれらの任意の組み合わせを含む、パラグラフ１〜３のいずれか１つの単離核酸。

５．移植片対宿主反応に関連する遺伝子配列が、ＴＲＡＣ、ＣＤ３イプシロン（ｅｐｉｓｏｌｏｎ）（ＣＤ３ε）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ４の単離核酸。

６．宿主対移植片反応に関連する遺伝子配列が、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ４の単離核酸。

７．チェックポイント阻害因子をコードする遺伝子配列が、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ４の単離核酸。

８．標的遺伝子が、細胞の薬理学的調節に関連する配列を含む、パラグラフ１〜３のいずれか１つの単離核酸。

９．標的遺伝子がＣＤ５２である、パラグラフ８の単離核酸。

１０．調節が正又は負である、パラグラフ８の単離核酸。

１１．調節がＣＡＲＴ細胞の生存を可能にする、パラグラフ８の単離核酸。

１２．調節がＣＡＲＴ細胞を死滅させる、パラグラフ８の単離核酸。

１３．ミニ遺伝子又はｃＤＮＡを更に含む、パラグラフ１の単離核酸。

１４．ミニ遺伝子又はｃＤＮＡが、細胞の薬理学的調節に関連する遺伝子配列を含む、パラグラフ１３の単離核酸。

１５．遺伝子配列がＨｅｒ２をコードする、パラグラフ１４の単離核酸。

１６．標的遺伝子が、ＴＲＡＣ、ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ５２、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を含む、パラグラフ４の単離核酸。

１７．標的遺伝子が、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１からなる群から選択される遺伝子を含む、パラグラフ４の単離核酸。

１８．標的遺伝子が、ＴＲＡＣ、ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ５２、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む、パラグラフ４の単離核酸。

１９．標的遺伝子が、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む、パラグラフ４の単離核酸。

２０．ドナー鋳型が一本鎖又は二本鎖のいずれかのポリヌクレオチドである、パラグラフ１〜１９のいずれか１つの単離核酸。

２１．標的遺伝子の一部分が、ＴＲＡＣ、ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ５２、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ２０の単離核酸。

２２．標的遺伝子の一部分が、ＴＲＡＣの一部分、Ｂ２Ｍの一部分、及び／又はＰＤ１の一部分を含む、パラグラフ２０の単離核酸。

２３．抗原認識ドメインがＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、又はこれらの組み合わせを認識する、パラグラフ１〜２２のいずれか１つの単離核酸。

２４．抗原認識ドメインがＣＤ１９を認識する、パラグラフ１〜２２のいずれか１つの単離核酸。

２５．抗原認識ドメインがＣＤ７０を認識する、パラグラフ１〜２２のいずれか１つの単離核酸。

２６．抗原認識ドメインがＢＣＭＡを認識する、パラグラフ１〜２２のいずれか１つの単離核酸。

２７．抗原認識ドメインがｓｃＦＶである、パラグラフ１〜２６のいずれか１つの単離核酸。

２８．ｓｃＦＶが、配列番号１３３３を含む核酸配列又は配列番号１３３４を含むアミノ酸配列によってコードされる抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである、パラグラフ２７の単離核酸。

２９．ｓｃＦＶが、
１）配列番号１４７５を含む核酸配列又は配列番号１４９９を含むアミノ酸配列によってコードされる、又は
２）配列番号１４７６を含む核酸配列又は配列番号１５００を含むアミノ酸配列によってコードされる
抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである、パラグラフ２７の単離核酸。

３０．ｓｃＦＶが、
１）配列番号１４７７〜１４９８を含む核酸配列又は配列番号１５０１〜１５２２を含むアミノ酸配列によってコードされる、又は
２）配列番号１４８５を含む核酸配列又は配列番号１５０９を含むアミノ酸配列によってコードされる
抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである、パラグラフ２７の単離核酸。

３１．共刺激ドメインがＣＤ２８共刺激ドメイン又は４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、パラグラフ１〜３０のいずれか１つの単離核酸。

３２．エンドドメインがＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）ドメインを更に含む、パラグラフ１〜３１のいずれか１つの単離核酸。

３３．エクトドメインがシグナルペプチドを更に含む、パラグラフ１〜３２のいずれか１つの単離核酸。

３４．エクトドメインが抗原認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジを更に含む、パラグラフ１〜３３のいずれか１つの単離核酸。

３５．ヒンジがＣＤ８ヒンジ領域を含む、パラグラフ３４の単離核酸。

３６．抗原認識ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、ヒンジ領域がＣＤ８ヒンジ領域を含み、及びエンドドメインがＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζドメインを含むか、又は４−１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζドメインを含む、パラグラフ１〜３５のいずれか１つの単離核酸。

３８．ＣＡＲコンストラクトが、Ｎ末端からＣ末端に以下の構造配置：抗原認識ドメインｓｃＦｖ＋ＣＤ８ヒンジ＋膜貫通ドメイン＋ＣＤ２８共刺激ドメイン＋ＣＤ３ζドメイン、又は抗原認識ドメインｓｃＦｖ＋ＣＤ８ヒンジ＋膜貫通ドメイン＋４−１ＢＢ共刺激ドメイン＋ＣＤ３ζドメインを有する、パラグラフ１〜３６のいずれか１つの単離核酸。

３９．ドナー鋳型配列が、配列番号１３８７〜１４２２からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ１〜３８のいずれかの単離核酸。

４０．ドナー鋳型配列が配列番号１３９０の配列を含む、パラグラフ１〜３８のいずれかの単離核酸。

４１．ドナー鋳型配列が、配列番号１３９４〜１３９６からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ１〜３８のいずれかの単離核酸。

４２．ドナー鋳型配列が、配列番号１３９７〜１４２２からなる群から選択される配列、例えば、配列番号１３９８、１４０１、１４０２、１４０８、又は１４０９を含む、パラグラフ１〜３８のいずれかの単離核酸。

４３．パラグラフ１〜４２のいずれか１つの単離核酸を含むベクター。

４４．ベクターがＡＡＶである、パラグラフ４２のベクター。

４５．ＡＡＶベクターがＡＡＶ６ベクターである、パラグラフ４３又は４４のベクター。

４６．ベクターが、配列番号１３４８〜１３８６からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む、パラグラフ４３又は４４のベクター。

４７．ベクターが、配列番号１３５４のＤＮＡ配列を含む、パラグラフ４３又は４４のベクター。

４８．ベクターが、配列番号１３５８〜１３６０からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む、パラグラフ４２又は４３のベクター。

４９．ベクターが、配列番号１３６２、１３６５、１３６６、１３７２、及び１３７３からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む、パラグラフ４２又は４３のベクター。

５０．パラグラフ４３〜４９のいずれかのベクターを含む単離細胞。

５１．細胞がＴ細胞である、パラグラフ５０の単離細胞。

５２．Ｔ細胞が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである、パラグラフ５１の単離細胞。

５３．遺伝子を編集するための１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、
（ａ）ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｂ）Ｂ２Ｍ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号４５８〜５０６の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｃ）ＣＩＩＴＡ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号６９９〜８９０の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｄ）ＣＤ３ε遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号２８４〜４０８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；又は
（ｅ）ＰＤ１遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１０８３〜１２７４の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ
からなる群から選択される１つ以上のｇＲＮＡ。

５４．１つ以上のｇＲＮＡが１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、パラグラフ５３の１つ以上のｇＲＮＡ。

５５．１つ以上のｇＲＮＡ又は１つ以上のｓｇＲＮＡが１つ以上の修飾ｇＲＮＡ又は１つ以上の修飾ｓｇＲＮＡである、パラグラフ５３又は５４の１つ以上のｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ。

５６．パラグラフ５３〜５５のいずれか１つの１つ以上のｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡと１つ以上の部位特異的ポリペプチドとを含むリボ核タンパク質粒子。

５７．１つ以上の部位特異的ポリペプチドが１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼである、パラグラフ５６のリボ核タンパク質粒子。

５８．１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその相同体、天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化された、又は修飾されたバージョン、及びこれらの組み合わせである、パラグラフ５７のリボ核タンパク質粒子。

５９．１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のｇＲＮＡ又は１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合体化される、パラグラフ５７又は５８のリボ核タンパク質粒子。

６０．パラグラフ１〜４２のいずれか１つの単離核酸とパラグラフ５６〜５９のいずれか１つの１つ以上のリボ核タンパク質粒子とを含む組成物。

６１．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

６２．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

６３．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

６４．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

６５．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

６６．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

６７．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

６８．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

６９．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ６０の組成物。

７０．ドナー鋳型が一本鎖又は二本鎖のいずれかのポリヌクレオチドである、パラグラフ６１〜６９のいずれか１つの組成物。

７１．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ６０、６１、６４、６７又は７０のいずれか１つの組成物。

７２．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、Ｂ２Ｍ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号４５８〜５０６の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ６０、６２、６５、６８又は７０のいずれか１つの組成物。

７３．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、ＰＤ１遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１０８３〜１２７４の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ６０、６３、６６、６９又は７０のいずれか１つの組成物。

７４．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、Ｂ２Ｍ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号４５８〜５０６の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ７１又は７３の組成物。

７５．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、ＰＤ１遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１０８３〜１２７４の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ７１又は７２の組成物。

７６．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ７２又は７３の組成物。

７７．パラグラフ４３〜４９のいずれか１つのベクターと、パラグラフ５６〜５９のいずれか１つの１つ以上のリボ核タンパク質粒子とを含む組成物。

７８．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

７９．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

８０．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

８１．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

８２．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

８３．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

８４．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

８５．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

８６．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ７７の組成物。

８７．ドナー鋳型が一本鎖又は二本鎖のいずれかのポリヌクレオチドである、パラグラフ７８〜８６のパラグラフいずれか１つの組成物。

８８．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ７７、７８、８１、８４又は８７のいずれか１つの組成物。

８９．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、Ｂ２Ｍ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号４５８〜５０６の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ７７、７９、８２、８５又は８７のいずれか１つの組成物。

９０．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、ＰＤ１遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１０８３〜１２７５の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ７７、８０、８３、８６又は８７のいずれか１つの組成物。

９１．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、Ｂ２Ｍ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号４５８〜５０６の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ８８又は９０の組成物。

９２．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、ＰＤ１遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１０８３〜１２７５の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ８８又は８９の組成物。

９３．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ８９又は９０の組成物。

９４．ドナー鋳型が配列番号１３８７及び１３９０からなる群から選択される配列を含み、及びｇＲＮＡが、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含むＴＲＡＣ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡである、パラグラフ７７、７８、８１、８４、８７、８８又は９３のいずれか１つの組成物。

９５．ドナー鋳型が配列番号１３９４〜１３９６からなる群から選択される配列を含み、及びｇＲＮＡが、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含むＴＲＡＣ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡである、パラグラフ７７、７８、８１、８４、８７、８８又は９３のいずれか１つの組成物。

９６．ドナー鋳型が配列番号１３９８、１４００、１４０１、１４０２、１４０８、及び１４０９からなる群から選択される配列を含み、及びｇＲＮＡが、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含むＴＲＡＣ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡである、パラグラフ７７、７８、８１、８４、８７、８８又は９３のいずれか１つの組成物。

９７．配列番号１３４４又は１３４５の配列を含むＢ２Ｍ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ９４〜９６のいずれか１つの組成物。

９８．ドナー鋳型が配列番号１３８７及び１３９０からなる群から選択される配列を含み、及びｇＲＮＡが、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含むＢ２Ｍ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡである、パラグラフ７７、７９、８２、８５、８７、８９、９１のいずれか１つの組成物。

９９．ドナー鋳型が配列番号１３９４及び１３９５からなる群から選択される配列を含み、及びｇＲＮＡが、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含むＢ２Ｍ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡである、パラグラフ７７、７９、８２、８５、８７、８９、９１のいずれか１つの組成物。

１００．ドナー鋳型が配列番号１３９８及び１４００からなる群から選択される配列を含み、及びｇＲＮＡが、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含むＢ２Ｍ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡである、パラグラフ７７、７９、８２、８５、８７、８９、９１のいずれか１つの組成物。

１０１．パラグラフ１〜４２のいずれか１つの単離核酸と、パラグラフ５６〜５９のいずれか１つの１つ以上のリボ核タンパク質粒子とを含む単離細胞。

１０２．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１０３．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１０４．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ１９を認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１０５．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１０６．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１０７．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＣＤ７０を認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１０８．標的遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＴＲＡＣ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１０９．標的遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＢ２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１１０．標的遺伝子がＰＤ１遺伝子であり、抗原認識領域がＢＣＭＡを認識し、及びドナー鋳型がＰＤ１遺伝子の少なくとも一部分を含む、パラグラフ１０１の単離細胞。

１１１．ドナー鋳型が一本鎖又は二本鎖のいずれかのポリヌクレオチドである、パラグラフ１０２〜１１０のいずれか１つの単離細胞。

１１２．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ１０１、１０２、１０５、１０８又は１１１のいずれか１つの単離細胞。

１１３．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、Ｂ２Ｍ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号４５８〜５０６の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ１０１、１０３、１０６、１０９又は１１１のいずれか１つの単離細胞。

１１４．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、ＰＤ１遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１０８３〜１２７４の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む、パラグラフ１０１、１０４、１０７、１１０又は１１１のいずれか１つの単離細胞。

１１５．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、Ｂ２Ｍ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号４５８〜５０６の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ１１２又は１１４の単離細胞。

１１６．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、ＰＤ１遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１０８３〜１２７４の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ１１２又は１１３の単離細胞。

１１７．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを更に含む、パラグラフ１１３又は１１４の単離細胞。

１１８．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が２つ以上の異なるリボ核タンパク質粒子集団を含む、パラグラフ１０１〜１１８のいずれか１つの単離細胞。

１１９．１つ以上のリボ核タンパク質粒子が、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、
（ａ）ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｂ）Ｂ２Ｍ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号４５８〜５０６の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｃ）ＣＩＩＴＡ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、ＣＩＩＴＡ遺伝子を編集するための配列番号６９９〜８９０の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｄ）ＣＤ３ε遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号２８４〜４０８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｅ）ＰＤ１遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１０８３〜１２７４の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｆ）ＴＲＡＣ遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１２９９の核酸配列を含むスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｇ）ＣＴＬＡ−４遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１２７７の核酸配列を含むスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｈ）ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１３０１〜１３０２の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；
（ｉ）ＣＤ５２遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１３０３〜１３０４の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ；及び
（ｊ）ＲＦＸ５遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡであって、配列番号１３０５〜１３０７の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ
からなる群から選択される２つ以上の異なるリボ核タンパク質粒子集団とを含む、パラグラフ１１８の単離細胞。

１２０．パラグラフ１〜４２の単離核酸及びそのうちの１つと、パラグラフ５６〜５９のいずれか１つの１つ以上のリボ核タンパク質粒子の第１の集団とを含む単離細胞であって、単離核酸が第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍にある遺伝子座でゲノムに挿入され、その結果、第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍における永久欠失及びＣＡＲをコードする単離核酸の挿入が生じる、単離細胞。

１２１．単離細胞が、パラグラフ５６〜５９のいずれか１つの１つ以上のリボ核タンパク質粒子の第２の集団を更に含み、１つ以上のリボ核タンパク質粒子の第１の集団が、第１の標的遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡを含み、及び１つ以上のリボ核タンパク質粒子の第２の集団が、第２の異なる標的遺伝子を編集するための１つ以上のｇＲＮＡを含む、パラグラフ１２０の単離細胞。

１２２．パラグラフ１〜４２のいずれか１つの核酸によってコードされるキメラ抗原受容体を発現する、且つＴＲＡＣ、ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＰＤ１、及びＣＴＬＡ−４から選択される１つ以上の遺伝子に欠失を含む、単離細胞。

１２３．パラグラフ１〜４２のいずれか１つの核酸によってコードされるキメラ抗原受容体を発現する、且つＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１のうちの１つ以上に欠失を含む、単離細胞。

１２４．パラグラフ１〜４２のいずれか１つの核酸によってコードされるキメラ抗原受容体を発現する、且つＴＲＡＣに欠失を含む、単離細胞。

１２５．Ｂ２Ｍに欠失を更に含む、パラグラフ１２４の単離細胞。

１２６．Ｂ２Ｍ及びＰＤ１に欠失を更に含む、パラグラフ１２４の単離細胞。

１２７．キメラ抗原受容体がＴＲＡＣ遺伝子座から発現する、パラグラフ１０１〜１２６のいずれか１つの単離細胞。

１２８．キメラ抗原受容体が、配列番号１３３４、１４９９、１５００、１５０１、及び１５０２からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ１２７の単離細胞。

１２９．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、配列番号１３１６、１４２３、１４２４、１４２５及び１４２６からなる群から選択されるＣＡＲをコードする配列を含む、パラグラフ１２７の単離細胞。

１３０．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、配列番号１３３８、１４４９、１４５０、１４５１及び１４５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、パラグラフ１２７の単離細胞。

１３１．配列番号１３４８、１３５４、１３５８、１３５９、１３６２及び１３６４からなる群から選択される核酸を含むベクターがトランスフェクトされた、且つＴＲＡＣ、ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＰＤ１、及びＣＴＬＡ−４から選択される１つ以上の遺伝子に欠失を更に含む単離細胞。

１３２．配列番号１３４８、１３５４、１３５８、１３５９、１３６２及び１３６４からなる群から選択される核酸を含むベクターがトランスフェクトされた、且つＴＲＡＣに欠失を更に含む単離細胞。

１３３．配列番号１３４８、１３５４、１３５８、１３５９、１３６２及び１３６４からなる群から選択される核酸を含むベクターがトランスフェクトされた、且つＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに欠失を更に含む単離細胞。

１３４．配列番号１３４８、１３５４、１３５８、１３５９、１３６２及び１３６４からなる群から選択される核酸を含むベクターがトランスフェクトされた、且つＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１に欠失を更に含む単離細胞。

１３５．核酸配列が、ＴＲＡＣ遺伝子に永久に挿入されてＴＲＡＣ遺伝子発現を破壊するドナー鋳型を含む、パラグラフ１２７〜１３４のいずれか１つの単離細胞。

１３６．Ｂ２Ｍ遺伝子に欠失を更に含む、パラグラフ１３５の単離細胞。

１３７．ＰＤ１遺伝子に欠失を更に含む、パラグラフ１３６の単離細胞。

１３８．パラグラフ１３１〜１３７のいずれか１つの単離細胞であって、
ａ）１つ以上のリボ核タンパク質粒子がＴＲＡＣ標的遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、ＴＲＡＣ遺伝子に永久欠失が生じ、リボ核タンパク質粒子が、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含む１つ以上のｓｇＲＮＡと、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとを含み；及び
ｂ）１つ以上のリボ核タンパク質粒子がＢ２Ｍ標的遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、Ｂ２Ｍ遺伝子に永久欠失が生じ、リボ核タンパク質粒子が、配列番号１３４４又は１３４５の配列を含む１つ以上のｓｇＲＮＡと、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとを含む、単離細胞。

１３９．単離細胞であって、以下を含み：
ａ）パラグラフ１〜４２のいずれか１つの単離核酸、単離核酸はＴＲＡＣ遺伝子の範囲内又はその近傍の遺伝子座で相同組換えによってゲノムに挿入され、その結果、ＴＲＡＣ遺伝子の範囲内又はその近傍に永久欠失が生じる；
ｂ）第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍における永久欠失、第２の標的遺伝子はＢ２Ｍである；
ｃ）ＴＲＡＣ遺伝子へのＣＡＲをコードする単離核酸の挿入、ＣＡＲはＣＤ１９抗原認識ドメインを含む；及び
ｄ）ＣＡＲが細胞の表面に発現する、
単離細胞。

１４０．単離細胞であって、以下を含み：
ａ）パラグラフ１〜４２のいずれか１つの単離核酸、単離核酸はＴＲＡＣ遺伝子の範囲内又はその近傍の遺伝子座で相同組換えによってゲノムに挿入され、その結果、ＴＲＡＣ遺伝子の範囲内又はその近傍に永久欠失が生じる；
ｂ）第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍における永久欠失、第２の標的遺伝子はＢ２Ｍである；
ｃ）ＴＲＡＣ遺伝子へのＣＡＲをコードする単離核酸の挿入、ＣＡＲはＣＤ７０抗原認識ドメインを含む；及び
ｄ）ＣＡＲが細胞の表面に発現する、
単離細胞。

１４１．単離細胞であって、以下を含み：
ａ）パラグラフ１〜４２のいずれか１つの単離核酸、単離核酸はＴＲＡＣ遺伝子の範囲内又はその近傍の遺伝子座で相同組換えによってゲノムに挿入され、その結果、ＴＲＡＣ遺伝子の範囲内又はその近傍に永久欠失が生じる；
ｂ）第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍における永久欠失、第２の標的遺伝子はＢ２Ｍである；
ｃ）ＴＲＡＣ遺伝子へのＣＡＲをコードする単離核酸の挿入、ＣＡＲはＢＣＭＡ抗原認識ドメインを含む；及び
ｄ）ＣＡＲが細胞の表面に発現する、
単離細胞。

１４２．第３の標的遺伝子の範囲内又はその近傍に永久欠失を更に含み、第３の標的遺伝子がＰＤ１である、パラグラフ１３９〜１４１のいずれか１つの単離細胞。

１４３．パラグラフ１３９〜１４２のいずれか１つの単離細胞であって、
ａ）単離核酸が、配列番号１３４８、１３５４、１３５８、１３５９、１３６２及び１３６４のヌクレオチド配列を含み；
ｂ）１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８３〜１５８から選択されるスペーサー配列を含み、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼがＴＲＡＣ遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、ＴＲＡＣ遺伝子に永久欠失が生じ；及び
ｃ）１つ以上のｇＲＮＡが配列番号４５８〜５０６から選択されるスペーサー配列を含み、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼがＢ２Ｍ遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、Ｂ２Ｍ遺伝子に永久欠失が生じる、
単離細胞。

１４４．パラグラフ１４３の単離細胞であって、
ａ）単離核酸が、配列番号１３４８〜１３５７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；
ｂ）１つ以上のリボ核タンパク質粒子がＴＲＡＣ標的遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、ＴＲＡＣ標的遺伝子に永久欠失が生じ、リボ核タンパク質粒子が、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含む１つ以上のｓｇＲＮＡと、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとを含み；及び
ｃ）１つ以上のリボ核タンパク質粒子がＢ２Ｍ標的遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、Ｂ２Ｍ標的遺伝子に永久欠失が生じ、リボ核タンパク質粒子が、配列番号１３４４又は１３４５の配列を含む１つ以上のｓｇＲＮＡと、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとを含む、
単離細胞。

１４５．パラグラフ１４３の単離細胞であって、
ａ）単離核酸が、配列番号１３５８及び１３５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；
ｂ）１つ以上のリボ核タンパク質粒子がＴＲＡＣ標的遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、ＴＲＡＣ標的遺伝子に永久欠失が生じ、リボ核タンパク質粒子が、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含む１つ以上のｓｇＲＮＡと、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとを含み；及び
ｃ）１つ以上のリボ核タンパク質粒子がＢ２Ｍ標的遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、Ｂ２Ｍ標的遺伝子に永久欠失が生じ、リボ核タンパク質粒子が、配列番号１３４４又は１３４５の配列を含む１つ以上のｓｇＲＮＡと、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとを含む、
単離細胞。

１４６．パラグラフ１４３の単離細胞であって、
ａ）単離核酸が、配列番号１３６２及び１３６４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；
ｂ）１つ以上のリボ核タンパク質粒子がＴＲＡＣ標的遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、ＴＲＡＣ標的遺伝子に永久欠失が生じ、リボ核タンパク質粒子が、配列番号１３４２又は１３４３の配列を含む１つ以上のｓｇＲＮＡと、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとを含み；及び
ｃ）１つ以上のリボ核タンパク質粒子がＢ２Ｍ標的遺伝子において１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を達成することにより、Ｂ２Ｍ標的遺伝子に永久欠失が生じ、リボ核タンパク質粒子が、配列番号１３４４又は１３４５の配列を含む１つ以上のｓｇＲＮＡと、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとを含む、
単離細胞。

１４７．パラグラフ１０１〜１４６のいずれか１つの単離細胞を含む医薬組成物。

１４８．遺伝子編集細胞を作製する方法であって、（ｉ）パラグラフ１〜４２のいずれか１つのノックインキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトをコードする単離核酸、（ｉｉ）１つ以上のｓｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップであって、第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍において１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）が達成されることにより、ａ）第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍における、第１の標的遺伝子の発現又は機能に影響を及ぼす永久欠失であって、任意選択でＰＡＭ又はｓｇＲＮＡ標的配列にある、且つ任意選択で２０ヌクレオチド欠失である永久欠失、ｂ）第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍へのＣＡＲコンストラクトの挿入、及び、ｃ）細胞の表面上でのＣＡＲの発現が生じるステップを含む方法。

１４９．細胞の１つ以上の生物学的活性の調節方法であって、（ｉ）パラグラフ１〜４２のいずれか１つのノックインキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトをコードする単離核酸、（ｉｉ）１つ以上のｓｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップであって、第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍において１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）が達成されることにより、ａ）第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍における、第１の標的遺伝子の発現又は機能に影響を及ぼす永久欠失であって、任意選択でＰＡＭ又はｓｇＲＮＡ標的配列にある、且つ任意選択で２０ヌクレオチド欠失である永久欠失、ｂ）第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍へのＣＡＲコンストラクトの挿入、及び、ｃ）細胞の表面上でのＣＡＲの発現が生じるステップを含む方法。

１５０．ｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼがリボ核タンパク質粒子を形成する、パラグラフ１４８又は１４９の方法。

１５１．１つ以上のｇＲＮＡ及び１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップであって、第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍において１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）が達成されることにより、第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍に第２の標的遺伝子の発現又は機能に影響を及ぼす永久欠失が生じるステップを更に含む、パラグラフ１４８〜１５０のいずれか１つの方法。

１５２．ｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼがリボ核タンパク質粒子を形成する、パラグラフ１５１の方法。

１５３．永久欠失により、１つ以上の生物学的活性の調節が生じる、パラグラフ１４８〜１５２のいずれか１つの方法。

１５４．生物学的活性の調節が、第１の標的遺伝子、第２の標的遺伝子、任意選択で第３の標的遺伝子、又はこれらの組み合わせの生物学的活性のノックアウトを含む、パラグラフ１５３の方法。

１５５．生物学的活性が、宿主対移植片反応、移植片対宿主反応、免疫チェックポイント反応、免疫抑制、又はこれらの任意の組み合わせである、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１５６．生物学的活性が移植片対宿主反応であり、及び第１の標的遺伝子、第２の標的遺伝子、又はこれらの組み合わせが、ＴＲＡＣ、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１５７．生物学的活性が宿主対移植片反応であり、及び第１の標的遺伝子、第２の標的遺伝子、又はこれらの組み合わせが、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１５８．生物学的活性がチェックポイント阻害因子であり、及び第１の標的遺伝子、第２の標的遺伝子、又はこれらの組み合わせが、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１５９．生物学的活性が細胞生存の増加又は細胞生存能の増強であり、及び第１の標的遺伝子、第２の標的遺伝子、又はこれらの組み合わせが、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１６０．遺伝子が、ＣＡＲＴの薬理学的対照を調節する配列をコードする、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１６１．遺伝子がＣＤ５２をコードする、パラグラフ１６０の方法。

１６２．調節が正又は負である、パラグラフ１６０の方法。

１６３．調節がＣＡＲＴ細胞の生存を可能にする、パラグラフ１６０の方法。

１６４．調節がＣＡＲＴ細胞を死滅させる、パラグラフ１６０の方法。

１６５．第１の標的遺伝子、第２の標的遺伝子、又はこれらの組み合わせが、ＴＲＡＣ、ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ５２、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を含む、パラグラフ１５３、１５４、又は１６３のいずれか１つの方法。

１６６．第１の標的遺伝子、第２の標的遺伝子、又はこれらの組み合わせが、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１及びこれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む、パラグラフ１５３、１５４、又は１６３のいずれか１つの方法。

１６７．第１の標的遺伝子、第２の標的遺伝子、又はこれらの組み合わせが、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１を含む、パラグラフ１５３、１５４、又は１６３のいずれか１つの方法。

１６８．ドナー鋳型が一本鎖又は二本鎖のいずれかのポリヌクレオチドである、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１６９．標的遺伝子の一部分が、ＴＲＡＣ、ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ５２、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１６８の方法。

１７０．標的遺伝子の一部分が、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１６９の方法。

１７１．標的遺伝子の一部分がＴＲＡＣの一部分を含む、パラグラフ１６９の方法。

１７２．標的遺伝子の一部分がＴＲＡＣの一部分及び／又はＢ２Ｍの一部分を含む、パラグラフ１６９の方法。

１７３．標的遺伝子の一部分がＴＲＡＣの一部分、Ｂ２Ｍの一部分、及び／又はＰＤ１の一部分を含む、パラグラフ１６９の方法。

１７４．１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のｇＲＮＡ、任意選択で１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合体化される、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１７５．ドナー鋳型がウイルスベクターによって送達される、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１７６．ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、パラグラフ１７５の方法。

１７７．ＡＡＶベクターがＡＡＶ６ベクターである、パラグラフ１７６の方法。

１７８．細胞が初代ヒトＴ細胞である、パラグラフ１５３又は１５４の方法。

１７９．初代ヒトＴ細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離される、パラグラフ１７８の方法。

１８０．細胞が同種異系である、パラグラフ１７８又は１７９の方法。

１８１．１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその相同体、天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化された、又は修飾されたバージョン、及びこれらの組み合わせである、パラグラフ１４８〜１８０のいずれか１つの方法。

１８２．１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、パラグラフ１８１の方法。

１８３．１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を細胞に導入することを含む、パラグラフ１８２の方法。

１８４．１つ以上のポリヌクレオチド又は１つ以上のＲＮＡが１つ以上の修飾ポリヌクレオチド又は１つ以上の修飾ＲＮＡである、パラグラフ１８１又は１８２の方法。

１８５．ＤＮＡエンドヌクレアーゼがタンパク質又はポリペプチドである、パラグラフ１８４の方法。

１８６．医学的病態を有する患者を治療するためのエキソビボ方法であって、
ｉ）患者からＴ細胞を単離するステップ；
ｉｉ）Ｔ細胞の標的遺伝子又はＴ細胞の標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の範囲内又はその近傍で編集するステップ；及び
ｉｉｉ）ゲノム編集されたＴ細胞を患者に植え込むステップ
を含む方法。

１８７．医学的病態を有する患者を治療するためのエキソビボ方法であって、
ｉ）ドナーからＴ細胞を単離するステップ；
ｉｉ）Ｔ細胞の標的遺伝子又はＴ細胞の標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の範囲内又はその近傍で編集するステップ；及び
ｉｉｉ）ゲノム編集されたＴ細胞を患者に植え込むステップ
を含む方法。

１８８．単離するステップが、細胞分画遠心、細胞培養、及びこれらの組み合わせを含む、パラグラフ１８６又は１８７の方法。

１８９．医学的病態を有する患者を治療するための方法であって、
ｉ）Ｔ細胞の１つ以上の標的遺伝子、又はＴ細胞の標的遺伝子の調節エレメントをコードする１つ以上の他のＤＮＡ配列の範囲内又はその近傍で編集するステップ；及び
ｉｉ）ゲノム編集されたＴ細胞を患者に植え込むステップ
を含む方法。

１９０．編集するステップが、（ｉ）パラグラフ１〜４２のいずれか１つのノックインキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトをコードする単離核酸、（ｉｉ）１つ以上のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼをＴ細胞に導入することを含み、第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍において１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）が達成されることにより、ａ）第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍における、第１の標的遺伝子の発現又は機能に影響を及ぼす永久欠失であって、任意選択でＰＡＭ又はｓｇＲＮＡ標的配列にある、且つ任意選択で２０ヌクレオチド欠失である永久欠失、ｂ）第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍におけるＣＡＲコンストラクトの挿入、及び、ｃ）細胞の表面上でのＣＡＲの発現が生じる、パラグラフ１８６〜１８９のいずれか１つの方法。

１９１．１つ以上のｇＲＮＡ及び１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップであって、第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍において１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）が達成されることにより、第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍に第２の標的遺伝子の発現又は機能に影響を及ぼす永久欠失が生じるステップを更に含む、パラグラフ１９０の方法。

１９２．植え込むステップが、ゲノム編集されたＴ細胞を移植、局所注射、又は全身注入、又はこれらの組み合わせによって患者に植え込むことを含む、パラグラフ１８９〜１９１のいずれか１つの方法。

１９３．Ｔ細胞が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである、パラグラフ１８９〜１９２のいずれか１つの方法。

１９４．医学的病態が癌である、パラグラフ１８９〜１９３のいずれか１つの方法。

１９５．癌が、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、慢性リンパ球性白血病（Ｃ−ＣＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、甲状腺癌、鼻咽腔癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、黒色腫、卵巣癌、膠芽腫、子宮頸癌、又は多発性骨髄腫である、パラグラフ１９４の方法。

１９６．医学的病態を有する患者を治療するためのインビボ方法であって、患者の細胞における第１の標的遺伝子、又は標的遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列を編集するステップを含み、編集するステップが、（ｉ）パラグラフ１〜４２のいずれか１つのノックインキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトをコードする単離核酸、（ｉｉ）１つ以上のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼをＴ細胞に導入することを含み、第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍において１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）が達成されることにより、ａ）第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍における、第１の標的遺伝子の発現又は機能に影響を及ぼす永久欠失であって、任意選択でＰＡＭ又はｓｇＲＮＡ標的配列にある、且つ任意選択で２０ヌクレオチド欠失である永久欠失、ｂ）第１の標的遺伝子の範囲内又はその近傍におけるＣＡＲコンストラクトの挿入、及び、ｃ）細胞の表面上でのＣＡＲの発現が生じる、方法。

１９７．１つ以上のｇＲＮＡ及び１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップであって、第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍において１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）が達成されることにより、第２の標的遺伝子の範囲内又はその近傍に第２の標的遺伝子の発現又は機能に影響を及ぼす永久欠失が生じるステップを更に含む、パラグラフ１９６の方法。

１９８．Ｔ細胞が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである、パラグラフ１９６又は１９７の方法。

１９９．医学的病態が癌である、パラグラフ１９６〜１９８のいずれか１つの方法。

２００．癌が、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、慢性リンパ球性白血病（Ｃ−ＣＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、甲状腺癌、鼻咽腔癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、黒色腫、卵巣癌、膠芽腫、子宮頸癌、又は多発性骨髄腫である、パラグラフ１８０の方法。

２０１．配列番号１３４８〜１３５７からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸。

２０２．配列番号１３５８〜１３５９からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸。

２０３．配列番号１３６１〜１３６４からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸。

２０４．対象の癌の治療方法であって、パラグラフ１０１〜１４６のいずれか１つの単離細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法。

２０５．対象の腫瘍容積を低下させる方法であって、パラグラフ１０１〜１４６のいずれか１つの単離細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法。

２０６．癌を有する対象の生存を増加させる方法であって、パラグラフ１０１〜１４６のいずれか１つの単離細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法。

２０７．単離核酸が、配列番号１３４８〜１３５７、１３５８〜１３５９、１３６２及び１３６４からなる群から選択される核酸配列を含む、パラグラフ６０〜１００のいずれか１つの組成物。

２０８．ドナー鋳型が、配列番号１３９０、１３９４〜１３９５、１３９８及び１４００からなる群から選択される配列を含み、及びｇＲＮＡが、配列番号１３４２の配列を有するＴＲＡＣ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡである、パラグラフ６０〜１００又は２０７のいずれか１つの組成物。

２０９．ドナー鋳型が、配列番号１３９０、１３９４〜１３９５、１３９８及び１４００からなる群から選択される配列を含み、ｇＲＮＡが、配列番号１３４２の配列を有するＴＲＡＣ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡ及び配列番号１３４４の配列を有するＢ２Ｍ遺伝子を編集するためのｓｇＲＮＡである、パラグラフ６０〜１００、２０７、又は２０８のいずれか１つの組成物。

用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、本発明にとって必須の組成物、方法、及びそのそれぞれの１つ又は複数の構成要素に関して使用されるが、更に未だ特定されていない要素の包含も、それが必須であるか否かに関わらず受け入れる。

用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」は、所与の態様に必須の要素を指す。この用語は、その発明の当該の態様の基本的な及び新規の又は機能的な特性に実質的に影響を与えない追加的な要素の存在を許容する。

用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」は、本明細書に記載されるとおりの組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素を指し、これはその態様の当該の説明に記載されていないいかなる要素も排除する。

単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形への言及を含む。

本明細書において提示されるある種の数値には、その前に用語「約」が付く。用語「約」は、用語「約」が前に付く数値、並びに近似的にその数値である数値に文字上の裏付けを提供するために使用され、即ち、近似的な記載されていない数値が、それが提示される文脈においては、具体的に記載される数値の実質的な均等物である数であり得る。用語「約」は、記載される数値の±１０％以内の数値を意味する。

本明細書において数値範囲が提示されるとき、その範囲の下限と上限との間にある各中間値、その範囲の上限及び下限である値、及びその範囲と共に明記される全ての値が本開示の範囲内に包含されることが企図される。範囲の下限及び上限の範囲内で可能な全ての部分範囲もまた本開示によって企図される。

本発明は、本発明の例示的な非限定的態様を提供する以下の実施形態を参照することにより一層完全に理解されるであろう。

本実施例は、標的タンパク質活性を回復するゲノム遺伝子座における突然変異の永久的修正、又は異種遺伝子座における発現につながる、本明細書において「ゲノム修飾」と称される定義付けられた治療的ゲノム欠失、挿入、又は置換を標的遺伝子又はその近傍に作成するための、例示的ゲノム編集技法としてのＣＲＩＳＰＲシステムの使用について記載する。定義付けられた治療的修飾の導入は、本明細書に記載及び例示されるとおりの様々な医学的病態の改善可能性に向けた新規治療戦略に相当する。

実施例１−ｇＲＮＡのスクリーニング
コグネイトＤＮＡ標的領域を編集可能な幅広いｇＲＮＡを同定するため、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを行った。スペーサー配列を骨格配列に取り込んで完全長ｓｇＲＮＡを生成した。骨格配列の例は表１に示す。遺伝子破壊に使用すべきスペーサー配列のリストを作成するため、各標的遺伝子について、タンパク質コードエクソン、特に開始ＡＴＧスタートコドンを含むもの及び／又は決定的に重要なタンパク質ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、細胞外ドメイン等）をコードするものを選択した。関連性のあるゲノム配列を、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用した分析にかけた。得られたｇＲＮＡのリストを、配列のユニークさ（ゲノムの他の場所に完全なマッチを有しないｇＲＮＡのみをスクリーニングした）及び予測されるオフターゲット効果が最小限であることに基づき約２００個のｇＲＮＡのリストに絞り込んだ。この一組のｇＲＮＡをインビトロ転写し、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にメッセンジャーＭａｘを使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、及び分解によるインデルのトラッキング（ＴｒａｃｋｉｎｇｏｆＩｎｄｅｌｓｂｙＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ：ＴＩＤＥ）分析を用いて編集効率を判定した。結果は図１〜図５及び以下の表に示す。

当該技術分野においては、ＰＡＭ配列に隣接するＤＮＡ標的（例えばゲノム）配列の文脈でｇＲＮＡスペーサー配列を記載することが慣習的である。しかしながら、本明細書における方法及び組成物で使用される実際のｇＲＮＡスペーサー配列がＤＮＡ標的配列の等価物であることは理解される。例えば、ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）を含むと記載されるＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー配列は、実際はＲＮＡスペーサー配列ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２）を含む。

ＴＲＡＣｇＲＮＡスクリーニング
ＴＲＡＣについては、最初の３つのタンパク質コードエクソンを含むゲノムセグメントをｇＲＮＡ設計ソフトウェアの入力として使用した。ゲノムセグメントはまた、隣接スプライス部位アクセプター／ドナー配列も含んだ。所望のｇＲＮＡは、１つ又は複数のフレーム外／機能喪失アレルにつながるＴＲＡＣのアミノ酸配列を破壊するコード配列における挿入又は欠失につながり得るものであった。ＴＲＡＣを標的とする全７６個のインシリコで同定されたｇＲＮＡスペーサーをＩＶＴスクリーニングに使用した。７３個がＴＩＤＥ分析によって計測可能なデータを生じた。９個のｇＲＮＡ配列が、二次スクリーニングに好適であり得る５０％を上回るインデルパーセンテージを生じた。

配列番号１５２を含むＴＲＡＣｇＲＮＡの相同性依存評価により、このガイドがオフターゲット部位で０．５％未満のインデル頻度を有したことが示された。このデータが、更なる分析にこの特定のＴＲＡＣｇＲＮＡを選択する指針となった。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは配列番号８３〜１５８のいずれか１つの配列を含み、又は配列番号７〜８２のいずれか１つの配列を標的とする。

ＣＤ３ε ｇＲＮＡスクリーニング
ＣＤ３ε（ＣＤ３Ｅ）については、５つのタンパク質コードエクソンを含むゲノムセグメントをｇＲＮＡ設計ソフトウェアの入力として使用した。ゲノムセグメントはまた、隣接スプライス部位アクセプター／ドナー配列も含んだ。所望のｇＲＮＡは、１つ又は複数のフレーム外／機能喪失アレルにつながるＣＤ３Ｅのアミノ酸配列を破壊するコード配列における挿入又は欠失につながり得るものであった。ＣＤ３Ｅを標的とする１２５個のインシリコで同定されたｇＲＮＡスペーサーをＩＶＴスクリーニングに使用した。１２０個がＴＩＤＥ分析によって計測可能なデータを生じた。９個のｇＲＮＡ配列が、二次スクリーニングに好適であり得る５０％を上回るインデルパーセンテージを生じた。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは配列番号２８４〜４０８のいずれか１つの配列を含み、又は配列番号１５９〜２８３のいずれか１つの配列を標的とする。

Ｂ２ＭｇＲＮＡスクリーニング
Ｂ２Ｍについては、最初の３つのタンパク質コードエクソンを含むゲノムセグメントをｇＲＮＡ設計ソフトウェアの入力として使用した。ゲノムセグメントはまた、隣接スプライス部位アクセプター／ドナー配列も含んだ。所望のｇＲＮＡは、１つ又は複数のフレーム外／機能喪失アレルにつながるＢ２Ｍのアミノ酸配列を破壊するコード配列における挿入又は欠失につながり得るものであった。Ｂ２Ｍを標的とする全４９個のインシリコで同定されたｇＲＮＡスペーサーをＩＶＴスクリーニングに使用した。全てのｇＲＮＡがＴＩＤＥ分析によって計測可能なデータを生じた。８個のｇＲＮＡ配列が、二次スクリーニングに好適であり得る５０％を上回るインデルパーセンテージを生じた。

配列番号４６６を含むＢ２ＭｇＲＮＡの相同性依存評価により、このガイドがオフターゲット部位で０．５％未満のインデル頻度を有したことが示された。このデータが、更なる分析にこの特定のＢ２ＭｇＲＮＡを選択する指針となった。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは配列番号４５８〜５０６のいずれか１つの配列を含み、又は配列番号４０９〜４５７のいずれか１つの配列を標的とする。

ＣＩＩＴＡｇＲＮＡスクリーニング
ＣＩＩＴＡについては、３型プロモーターの下流のＡＴＧエクソン、ＩＶ型プロモーター／選択的エクソン１、及び次の３つの下流エクソン（ここではエクソン３〜エクソン５と称される）を含むゲノムセグメントをｇＲＮＡ設計ソフトウェアへの入力として使用した（ＣＩＩＴＡ遺伝子アノテーションについては、Ｍｕｈｌｅｔｈａｌｅｒ−Ｍｏｔｔｅｔｅｔａｌ．，１９９７．ＥＭＢＯＪ．１０，２８５１−２８６０を参照のこと）。これらのゲノムセグメントは、タンパク質コード領域及び隣接したスプライシングアクセプター／ドナー部位並びに潜在的遺伝子発現調節エレメントを含んだ。所望のｇＲＮＡは、１つ又は複数のフレーム外／機能喪失アレルにつながるＣＩＩＴＡのアミノ酸配列を破壊するコード配列における挿入又は欠失につながり得るものであった。ゲノムの他の場所に完全なマッチのないｇＲＮＡのみをスクリーニングした。ＣＩＩＴＡを標的とする合計約２７４個のｇＲＮＡスペーサー（インシリコで同定された）から、１９６個のｇＲＮＡスペーサーがＩＶＴスクリーニングに選択された。１８０個のｓｇＲＮＡがＴＩＤＥ分析によって計測可能なデータを生じた。８１個のｇＲＮＡ配列が、二次スクリーニングに好適であり得る５０％を上回るインデルパーセンテージを生じた。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは配列番号６９９〜８９０のいずれか１つの配列を含み、又は配列番号５０７〜６９８のいずれか１つの配列を標的とする。

ＰＤ１ｇＲＮＡスクリーニング
ＰＤＣＤ１（ＰＤ１）については、最初の３つのタンパク質コードエクソンを含むゲノムセグメントをｇＲＮＡ設計ソフトウェアの入力として使用した。ゲノムセグメントはまた、隣接スプライス部位アクセプター／ドナー配列も含んだ。所望のｇＲＮＡは、１つ又は複数のフレーム外／機能喪失アレルにつながるＰＤＣＤ１のアミノ酸配列を破壊するコード配列における挿入又は欠失につながり得るものであった。ＰＤＣＤ１を標的とする１９２個のインシリコで同定されたｇＲＮＡスペーサーをＩＶＴスクリーニングに使用した。１９０個がＴＩＤＥ分析によって計測可能なデータを生じた。４０個のｇＲＮＡ配列が、二次スクリーニングに好適であり得る５０％を上回るインデルパーセンテージを生じた。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは配列番号１０８３〜１２７５のいずれか１つの配列を含み、又は配列番号８９１〜１０８２のいずれか１つの配列を標的とする配列を含む。

ＳｐＣａｓ９／ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＴ細胞におけるＰＤ１スクリーニング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＴ細胞における更なる分析に、５個のＰＤ１ｇＲＮＡを選択した。５個のガイドのうち３個が陽性対照（ＰＤ１対照）より良好な性能（より高いインデルパーセンテージ）を示した。意外にも、最も高いインデルパーセンテージ（編集頻度）を生じさせたガイド（ガイド２）が最も大きいレベルのＰＤ１タンパク質発現ノックダウンを生じさせたわけではなかった（ガイド３〜５との比較−表９を参照）。

表９のＰＤ１ｇＲＮＡの相同性依存評価により、ＰＤ１ガイド５（配列番号１２７６を含む）がオフターゲット部位に２０％のインデル頻度を有した一方、ＰＤ１ガイド４（配列番号１０８６）がオフターゲット部位に２．０％未満のインデル頻度を有したことが示された。このデータが、更なる分析にＰＤ１ガイド４を選択する指針となった。

Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４スクリーニング
１００万個のＴ細胞に１０００ｐｍｏｌｇＲＮＡ及び２００ｐｍｏｌＣａｓ９タンパク質を電気穿孔した。電気穿孔後４８〜７２時間で、細胞をＰＭＡ／イオノマイシンカクテル溶液で刺激し、同時にＣＴＬＡ４抗体（１：１００希釈、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３４９９０７）で染色した。刺激後４時間で、ＦＡＣＳ分析のため細胞を収集した。２個体の異なるドナーを使用した（ドナー４６及びドナー１３）。タンパク質発現をフローサイトメトリーによって測定した。結果を表１０に示す。ガイド５（スペーサー配列番号１２９２を含む）を使用すると、一貫して最も低いタンパク質発現となった（例えば、８．６％）。ガイド２（スペーサー配列番号１２９０を含む）及びガイド９（スペーサー配列番号１２９７を含む）を使用してもまた、低いタンパク質発現となった（それぞれ１１．９％及び１２．２％）。

実施例２−細胞における遺伝子型及び表現型レベルでの遺伝子ノックアウト
本例は、初代ヒトＴ細胞における遺伝子型及び表現型レベルでの移植片対宿主（ＧＶＨ）又は宿主対移植片（ＨＶＧ）又は免疫チェックポイント遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による効率的なノックアウトを実証する。

ＥａｓｙＳｅｐＤｉｒｅｃｔヒトＴ細胞単離キット（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用して末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）から初代ヒトＴ細胞を単離した。細胞を０．５×１０^６細胞／ｍＬで大型フラスコにプレーティングした。ヒトＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を再懸濁し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞に加えた。５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ＮＪ）、及び１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＩＬ−７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を補足したＸ−ｖｉｖｏ１５造血無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で細胞をヒトＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共に１：１のビーズ対細胞比でインキュベートした。３日後、細胞を１５ｍＬチューブに移し、そのチューブを磁石上に５分間置くことによってビーズを取り除いた。次に細胞を移し、ペレット化し、０．５×１０^６細胞／ｍＬでプレーティングした。

ビーズを取り除いてから３日後、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（プログラムＥ０１１５）（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）及びヒトＴ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用してＴ細胞を電気穿孔した。ヌクレオフェクション混合物は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液、１０^６細胞、１μＭＣａｓ９（Ｆｅｌｄａｎ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）、及び５μＭ２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）修飾ｓｇＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏＴｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有した（Ｈｅｎｄｅｌｅｔａｌ．，２０１５：ＰＭＩＤ：２６１２１４１５に記載されるとおり）。ＭＳ修飾は５’末端及び３’末端の両方の３つのヌクレオチドに取り込んだ。安定したＣａｓ９：ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）形成を可能にするため、ヌクレオフェクション混合物を加える前にＣａｓ９をｓｇＲＮＡと１：５のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比で３７℃で１０分間プレインキュベートした。多重編集実験のため、個々にｓｇＲＮＡと予め複合体化した各１μＭ（最終濃度）のＣａｓ９を電気穿孔緩衝液混合物に加えた。各実験の典型的な対照には、以下が含まれた：非電気穿孔細胞、ＲＮＰのない１回のモック処理、Ｃａｓ９単独による１回の処理及びトランスフェクション効率をモニタするためのＭＳ修飾ＡＡＶＳ１ｓｇＲＮＡによる１回の処理。ヌクレオフェクション後、細胞を３７℃で４〜７日間インキュベートし、表面タンパク質発現に関してはフローサイトメトリーにより、及びゲノムＤＮＡ上の挿入又は欠失（インデル）に関しては分解によるインデルのトラッキング（ＴｒａｃｋｉｎｇｏｆＩｎＤｅｌｓｂｙＤｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ：ＴＩＤＥ）により分析した。

ＴＩＤＥは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）によって決まる標的遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集を迅速に評価するウェブツールである。２つの標準的なキャピラリーシーケンシング反応からの定量的配列トレースデータに基づき、ＴＩＤＥソフトウェアが編集有効性を定量化し、標的細胞プールのＤＮＡにおける優勢なタイプの挿入及び欠失（インデル）を同定する。

この例及び以下の例では、ＲＮＰによって送達したｓｇＲＮＡを試験した。ｓｇＲＮＡ配列は、２０ヌクレオチドスペーサー配列（各例で指示される）と、それに続く骨格配列を含む。表１１は、Ｃａｓ９タンパク質と複合体化したとき初代ヒトＴ細胞に指示のインデル％を生じさせた合成の修飾された形態のｓｇＲＮＡとして使用した、指示遺伝子に特異的な標的配列を一覧にする。表１１は、指示遺伝子を標的とする合成の及び／修飾されたｓｇＲＮＡ配列（ＲＮＰとして送達した）についての初代ヒトＴ細胞におけるインデル頻度及び標的配列を一覧にする。

骨格配列の例は表１に示す。

実施例３−細胞におけるＴＣＲ成分の編集
本例は、ＴＣＲ成分（ＴＣＲａ及びＣＤ３ε）を編集することの初代ヒトＴ細胞におけるインビトロでの機能的影響を実証する。この結果は図６Ａ及び図６Ｂに示す。

フローサイトメトリー実験のため、電気穿孔後４〜６日で約０．５×１０^６〜１×１０^６個のＲＮＰトランスフェクト細胞を培養物から取り出し、清浄なエッペンドルフ管に移した。細胞を１，２００ｒｐｍで５分間遠心することによりペレット化し、１００μＬＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）に再懸濁した。細胞を染色するため、試料に適切な抗体カクテルを加え、続いて室温で１０〜１５分間インキュベートした。ＵｌｔｒａＣｏｍｐｅＢｅａｄｓ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してコンペンセーション対照を、必要な場合には特異的コンジュゲート抗体と共に調製した。コンペンセーションビーズを実験に使用した個々の特異的一次抗体によって１：１００で約５分間染色した。染色した試料（コンペンセーション対照を含む）を１ｍＬＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１，２００ｒｐｍで遠心し、吸引して緩衝液を取り除いた。コンペンセーションビーズを２００μＬＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、セルストレーナーキャップ（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を備えた５ｍＬＦＡＣＳチューブに通した。１：１０００７ＡＡＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含有する２００μＬＦＡＣＳ緩衝液に細胞試料を再懸濁し、セルストレーナーキャップを備えた５ｍＬＦＡＣＳチューブに通した。次にＮｏｖｏＣｙｔｅＡＣＥＡ３０００フローサイトメーター（ＡＣＥＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）で自動コンペンセーションソフトウェアを使用して試料を調べ、データをＦｌｏｗｊｏ１０．１ｒ５で分析した。使用した抗体には、ＢＶ５１０抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＥ抗ヒトＴＣＲαβ（ＢＷ２４２／４１２、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）、ＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ８（ＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、及びＡＰＣ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。

理論によって拘束されるものではないが、治療用Ｔ細胞のＴＣＲを破壊する理由は、こうしたＴ細胞が上流刺激を通じてＴＣＲにシグナルを送らないため、従ってレシピエントペプチド／抗原と反応せず、しかしＴＣＲノックアウト後であっても下流ＴＣＲシグナル伝達に応答するその能力は維持し得ることであった。フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔａｎｉｎ）（ＰＨＡ）及びホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシンは、インビトロＴ細胞活性化に一般的に使用される２つの刺激レジメンであるが、これらは互いに異なる機構で作用する。ＰＨＡは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体並びに他のグリコシル化膜タンパク質の架橋結合によって細胞を活性化するマイトジェンレクチンである。逆に、ＰＭＡ／イオノマイシンは、ＴＣＲ下流経路を直接活性化することによりＴ細胞を刺激して、表面受容体刺激の必要性を回避する。従って、ＴＣＲ／ＣＤ３欠損Ｔ細胞は、ＰＭＡ／イオノマイシンに応答するが、ＰＨＡには応答しないものと予想された。

ＴＣＲ除去Ｔ細胞の機能を評価するため、初代ヒトＴ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集してＴＣＲ成分ＴＣＲα又はＣＤ３εを破壊し、２つの刺激レジメンで処理し、以下に記載する一連のアッセイを用いて活性化、増殖、脱顆粒、及びサイトカイン産生に関して試験した。初めに初代ヒトＴ細胞に、Ｃａｓ９又はＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１３０１））、ＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６））、若しくはＣＤ３ε（ＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣ（配列番号２２６））を標的とするＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体を電気穿孔した。トランスフェクションの６日後、細胞をＣＤ３ε染色し、ＣＤ３εレベルが低い又は存在しない細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって評価した。結果から、Ｃａｓ９：ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ又はＣａｓ９：ＣＤ３ε ｓｇＲＮＡのトランスフェクションによってＣＤ３の表面提示が大きく低下したことが示された。Ｃａｓ９：ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９：ＣＤ３ε ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞におけるＣＤ３⁻集団は、それぞれ８９％及び８１％であった一方、Ｃａｓ９単独又はＣａｓ９：ＡＡＶＳ１ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞では、そのパーセンテージは１０％及び５％であった。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集細胞が欠損ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を有したことが確認された。これらの細胞を、続くアッセイ実験における評価用の入力として供した。本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡスペーサー（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ（配列番号１３０８））、ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））、及びＣＤ３ε ｇＲＮＡスペーサー（ＧＧＧＣＡＣＵＣＡＣＵＧＧＡＧＡＧＵＵＣ（配列番号３５１））。

ＣＤ６９活性化アッセイ
ＣＤ６９は、マイトジェン及び抗原刺激に対するＴ細胞応答性の代用マーカーであり、Ｔ細胞活性化の尺度として用いられている。トランスフェクションの７日後、細胞をＰＨＡ−Ｌ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）又はＰＭＡ／イオノマイシンのいずれかで刺激し、更に２日間成長させた。次に細胞をＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ６９抗体（Ｌ７８、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）で染色し、ＣＤ６９のレベルをフローサイトメトリーによってアッセイした（図６Ａ）。ＰＨＡ処理もＰＭＡ／イオノマイシン処理も受けなかった対照細胞ではＣＤ６９発現がほとんどなかったことから、Ｔ細胞活性化がなかったことが示唆される。インタクトなＴＣＲ／ＣＤ３複合体を含む細胞（モックトランスフェクト群［−］、Ｃａｓ９単独群、及びＣａｓ９：ＡＡＶＳ１ｓｇＲＮＡトランスフェクト群）は、程度は様々ながら、ＰＨＡ処理後又はＰＭＡ／イオノマイシン処理後のいずれにおいてもＣＤ６９の誘導発現を呈した。対照的に、Ｃａｓ９：ＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）を標的とする）で処理した細胞も、Ｃａｓ９：ＣＤ３ε（ＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣ（配列番号２２６）を標的とする）で処理した細胞も、ＰＨＡ処理後に誘導ＣＤ６９発現を示さなかったことから、これらの細胞内でＴＣＲ／ＣＤ３ε複合体が破壊されたことが指摘される。しかしながら、両方の処理群とも、ＰＭＡ／イオノマイシン処理後にＣＤ６９の強力な発現を呈した（図６Ａ）。このことから、ＴＣＲ／ＣＤ３欠損Ｔ細胞はＴＣＲアゴニストに対する応答の鈍化を示すが、ＴＣＲの下流のシグナルによって活性化される能力は保持したことが実証された。

ＣＦＳＥ増殖アッセイ
ＴＣＲ／ＣＤ３欠損細胞における細胞増殖を更に調べるため、ＴＣＲ／ＣＤ３欠損細胞におけるＰＨＡ及びＰＭＡ／イオノマイシンに対する応答を評価した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）は、リンパ球増殖のモニタリングに使用される細胞透過性フルオレセイン系色素である。トランスフェクション後、細胞を５００ｎＭＣＦＳＥによって３７℃で１５分間標識した。洗浄後、細胞を血清及びサイトカイン不含培地に４日間プレーティングした。ＣＦＳＥレベルをフローサイトメトリーによってＦＩＴＣチャンネルで測定した（図６Ａ）。ＰＨＡ処理もＰＭＡ／イオノマイシン処理も受けなかった対照細胞は、非分裂細胞で予想されるＣＦＳＥ強度を示した。モックトランスフェクト細胞（Ｃａｓ９単独）及びＣａｓ９：ＡＡＶＳ１ｓｇＲＮＡトランスフェクト群ではＰＨＡ処理及びＰＭＡ／イオノマイシン処理の両方がＣＦＳＥ強度のシフトを引き起こしたことから、細胞表面ＴＣＲ及びＣＤ３を有する細胞において細胞増殖が刺激されることが指摘される。予想どおり、Ｃａｓ９：ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）を標的とする）、及びＣａｓ９：ＣＤ３ε ｓｇＲＮＡ（ＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣ（配列番号２２６）を標的とする）トランスフェクト細胞はＰＨＡ処理後に細胞増殖を呈しなかったが、ＰＭＡ／イオノマイシン処理後には強力な増殖を呈した。この結果は、Ｃａｓ９：ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９：ＣＤ３ε ｓｇＲＮＡ処理がＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通じた細胞シグナル伝達を破壊するという本発明者らの以前の観察と一致した。

ＣＤ１０７ａ及び細胞内サイトカインのフローサイトメトリー判定
他の２つのＴ細胞活性化イベント、脱顆粒及びサイトカイン産生についてもまた、フローサイトメトリーを用いて調べた。トランスフェクト細胞は、血清及びサイトカイン不含培地中で未処理、ＰＨＡ処理又はＰＭＡ処理のいずれかであった。一斉に、細胞をＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）及びＰＥ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ１０７ａ抗体（Ｈ４Ａ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）と共にインキュベートした。処理の４時間後、細胞を以下の抗体、抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ８（ＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、及びＡＰＣ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）で表面染色し、ＢＤＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＰｌｕｓキット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）を使用して固定及び透過処理した。最後に、細胞を細胞内サイトカインに関してＦＩＴＣ抗ヒトＴＮＦα抗体（Ｍａｂ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＡＰＣマウス抗ヒトＩＦＮγ抗体（２５７２３．１１、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）、及びＰＥラット抗ヒトＩＬ−２抗体（ＭＱ１−１７Ｈ１２、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）で染色し、洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。

表面発現ＣＤ１０７ａは、刺激後のＣＤ８＋Ｔ細胞脱顆粒のマーカーである。ＰＨＡ処理もＰＭＡ／イオノマイシン処理も受けていなかった対照細胞は、最小限のＣＤ１０７表面発現しか示さなかった。モックトランスフェクト群、Ｃａｓ９単独群、及びＣａｓ９：ＡＡＶＳ１ｓｇＲＮＡトランスフェクト群ではＰＨＡ処理及びＰＭＡ／イオノマイシン処理の両方がＣＤ１０７ａ発現を誘導した。この場合もやはり、ＴＣＲα又はＣＤ３ε欠損細胞は、ＰＨＡ処理後にはベースレベルのＣＤ１０７ａ発現を示したが、ＰＭＡ／イオノマイシン処理後にＣＤ１０７ａ発現レベルは大きく上昇した（図６Ｂ）。このことから、ＰＭＡ／イオノマイシンはＴＣＲ／ＣＤ３欠損細胞において脱顆粒を誘導可能であったが、ＰＨＡは可能でなかったことが実証された。

同様に、モックトランスフェクト、Ｃａｓ９単独、及びＣａｓ９：ＡＡＶＳ１ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞では、ＰＨＡ処理後又はＰＭＡ／イオノマイシン処理後のいずれにおいても細胞内サイトカインＴＮＦ、ＩＦＮγ、及びＩＬ−２のレベルの亢進が観察された（図６Ｂ）。

まとめると、これらの実験から、細胞増殖、脱顆粒及びエフェクターサイトカイン産生によって示されるとおり、遺伝子編集細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体が破壊されるとともに、ＴＣＲ／ＣＤ３欠損細胞ではＴＣＲの下流のシグナル伝達がインタクトなまま保たれることが実証された。

実施例４−細胞におけるＭＨＣＩＩ成分の編集
本例は、ＭＨＣＩＩ成分（ＣＩＩＴＡ又はＲＦＸ５）を編集することの初代ヒトＴ細胞におけるインビトロでの機能的影響を実証する。結果は図７に示す。

初代ヒトＴ細胞に、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１３０１））、Ｂ２Ｍ（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７））、ＣＩＩＴＡ（ＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＡＴＡＧＡＡＧ（配列番号５４６））、ＲＦＸ５−１（ＴＡＣＣＴＣＧＧＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡ（配列番号１３０５））、ＲＦＸ５−５（ＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧ（配列番号１３０６））、及びＲＦＸ５−１０（ＡＴＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＣＴＴＧＧ（配列番号１３０７））を標的とする合成ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰをトランスフェクトした。トランスフェクション後４〜６日で細胞をＰＭＡ／イオノマイシンによって一晩処理し、ＭＨＣ−ＩＩの表面レベルをフローサイトメトリー（Ｔｕ３９、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって評価した。試験試料当たりのＭＨＣ−ＩＩ誘導の量（蛍光強度中央値［ＭＦＩ］によって評価される）を、対照（ＡＡＶＳ１）トランスフェクト細胞に存在するＭＨＣ−ＩＩの量に対して正規化した（図７）。トランスフェクション及びＰＭＡ／イオノマイシン誘導後に残ったＭＨＣ−ＩＩ＋細胞のパーセンテージが左のパネルに示される。データは、それぞれ単一又は二重ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞について、４又は３個体の生物学的ドナーからのものである。統計的有意性はＡＮＯＶＡとチューキーの事後補正を用いて評価した。

加えて、Ｃａｓ９と、ＣＩＩＴＡ又はＲＦＸ５を標的とするｓｇＲＮＡとを含有するＲＮＰが、誘導された初代ヒトＴ細胞におけるＭＨＣ−ＩＩの表面レベルを減少させる。

本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡスペーサー（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ（配列番号１３０８））；Ｂ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））；ＣＩＩＴＡｇＲＮＡスペーサー（ＧＧＵＣＣＡＵＣＵＧＧＵＣＡＵＡＧＡＡＧ（配列番号７３８））、ＲＦＸ５−１ｇＲＮＡスペーサー（ＵＡＣＣＵＣＧＧＡＧＣＣＵＣＵＧＡＡＧＡ（配列番号１３０９））、ＲＦＸ５−５ｇＲＮＡスペーサー（ＵＧＵＧＣＵＣＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＵＵＧ（配列番号１３１０））、及びＲＦＸ５−１０ｇＲＮＡスペーサー（ＡＵＣＡＡＡＧＣＵＣＧＡＡＧＧＣＵＵＧＧ（配列番号１３１１））。

実施例５−細胞における免疫チェックポイント成分の編集
初代ヒトＴ細胞に、ＰＤ−１（ＣＧＣＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣ（配列番号９１６）を標的とし且つ配列番号１１０８のスペーサー配列）を含む合成ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰ又は対照をトランスフェクトした。トランスフェクションの４〜６日後に細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで処理し、ＰＤ−１の表面レベルをフローサイトメトリー（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＢＶ４２１コンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって評価した。試験試料当たりのＰＤ１誘導量（蛍光強度中央値［ＭＦＩ］によって評価される）を、未治療の対照トランスフェクト細胞に存在するＰＤ１の量に対して正規化した。データは、それぞれ単一又は二重ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞について、３個体の生物学的ドナーからのものである。統計的有意性はスチューデントｔ検定を用いて評価した。

加えて、Ｃａｓ９と、ＰＤ１を標的とするｓｇＲＮＡとを含有するＲＮＰが、誘導された初代ヒトＴ細胞における表面ＰＤ１レベルを減少させる。

実施例６−細胞における多重編集
本例は、初代ヒトＴ細胞における効率的な多重編集及び標的タンパク質ノックアウトを実証する。結果は図８に示す。

初代ヒトＴ細胞に、指示遺伝子を標的とする合成ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰをトランスフェクトした。同じ細胞における２つ以上の遺伝子及びそのタンパク質産物のノックアウト（多重編集）のため、個々にｓｇＲＮＡと予め複合体化した各１μＭ（最終濃度）のＣａｓ９をヌクレオフェクション混合物に加えた。指示タンパク質の表面レベルをトランスフェクションの４〜６日後にフローサイトメトリーによって測定した。使用した抗体には、ＢＶ５１０抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＥ抗ヒトＴＣＲαβ（ＢＷ２４２／４１２、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）、ＡＰＣ抗ヒトＢ２Ｍ（２Ｍ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ５２（０９７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が含まれる。各記号が個々の生物学的ドナーからのデータであり、ここでは試験ＲＮＰ処理細胞を対照ＲＮＰ処理細胞と比較している。統計的有意性はスチューデントｔ検定によって評価した。

本例で使用したガイドを、それぞれの標的及びスペーサー配列と共に以下に挙げる：
ＴＲＡＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）；
ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２）
Ｂ２ＭＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７）；
ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６）
ＣＤ３ε ＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣ（配列番号２２６）；
ＧＧＧＣＡＣＵＣＡＣＵＧＧＡＧＡＧＵＵＣ（配列番号３５１）；
ＣＤ５２ＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧ（配列番号１３０３）
ＵＵＡＣＣＵＧＵＡＣＣＡＵＡＡＣＣＡＧＧ（配列番号１３１２）
ＣＩＩＴＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＡＴＡＧＡＡＧ（配列番号５４６）
ＧＧＵＣＣＡＵＣＵＧＧＵＣＡＵＡＧＡＡＧ（配列番号７３８）
ＡＡＶＳ１ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１３０１）
ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ（配列番号１３０８）

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した三重ノックアウトの実現可能性を評価するため、初代Ｔ細胞（５×１０^６）に、３つの別個の遺伝子：ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及びＣＩＩＴＡを標的とする予め形成したＲＮＰをトランスフェクトした。ＡＡＶＳ１を標的とするｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰを陰性対照として供した。４日後、細胞を半分ずつ２つに分けた：一方の半分は抗ＣＤ３／抗Ｂ２Ｍビオチン抗体で処理し、続いてストレプトアビジンマイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して精製し、他方の半分は処理しないままとした。精製した（ｐｕｒ）及び未精製の（ｕｎ）細胞を両方ともＴＩＤＥによって分析した。ＴＩＤＥ分析から、この手法により対照群と比較して約３６％の三重ノックアウトインデル頻度が生じたことが示され、単一の実験でＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰを使用して３つの遺伝子を同時にノックアウトすることが可能であることがＤＮＡレベルで判明した（図１５）。

加えて、図１５のデータは、Ｃａｓ９：合成ｓｇＲＮＡ（ＲＮＰ）をトランスフェクトした初代ヒトＴ細胞で効率的な単一、二重、及び三重遺伝子ノックアウトを達成し得ることを実証している。

実施例７−細胞におけるＨＤＲ媒介性トランス遺伝子挿入
本例は、ＡＡＶ６ドナーＤＮＡ鋳型を伴うＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ媒介性二本鎖ゲノムＤＮＡ切断による相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いた初代ヒトＴ細胞における効率的なトランス遺伝子挿入を実証する。

実施例２に記載されるとおり、初代ヒトＴ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。３日後にビーズを取り除いた。４日目、Ｔ細胞（５×１０^６）にＣａｓ９単独又はＣａｓ９：ＡＡＶＳ１ｓｇＲＮＡ（ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１３０１）を標的とする）ＲＮＰを電気穿孔した。トランスフェクションの４５分後、１×１０^６個のＣａｓ９処理又はＲＮＰ処理細胞をモック形質導入するか（対照）、ＭＮＤ−ＧＦＰカセットが隣接する４００（ＨＡ４００）又は７００（ＨＡ７００）ｂｐのいずれかの長さのＡＡＶＳ１相同性アームを有するＡＡＶ６−ＭＮＤ−ＧＦＰウイルスベクターで形質導入するかのいずれかとした（図１０）。ＡＡＶ６による形質導入は５０，０００ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩで実施した。陰性対照として、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７）を標的とする）を含有するＲＮＰを細胞にトランスフェクトした。ＡＡＶ６−ＭＮＤ−ＧＦＰウイルスはＢ２Ｍゲノム切断部位の周りの相同性を含まないため、Ｂ２ＭＲＮＰ処理細胞で観察される任意の組込みは、非ＨＤＲ媒介性挿入の結果であり得た。ＡＡＶＳ１による切断後にＧＦＰ発現が観察された一方、Ｂ２Ｍガイドの使用ではバックグラウンドを上回るものは観察されなかったことから、非ＨＤＲ媒介性挿入はないことが指摘される。

ＡＡＶ６／ＲＮＰ媒介性ＨＤＲの効率を評価するため、ＰＣＲ分析（図１１）を実施した。ＲＮＰ切断部位に隣接するフォワード及びリバースプライマーを使用して２．３ｋｂの領域を増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離した。４ｋｂのバンドが、ＨＤＲの結果としての遺伝子座へのＭＮＤ−ＧＦＰ配列（１．７ｋｂ）の挿入を示す。ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするＲＮＰの存在下においてのみ４ｋｂバンドが明らかであったことから、ＨＤＲによるトランス遺伝子の挿入の成功が指摘される。ＡＡＶＳ１遺伝子座に対する７００ｂｐの隣接相同性アーム（ＨＡ７００）を含むＭＮＤ−ＧＦＰコンストラクトは、４００ｂｐの相同性アーム（ＨＡ４００）よりも効率的なＨＤＲにつながるように見えた。これらのデータは、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ及びＡＡＶ６送達ドナーＤＮＡ鋳型によって初代ヒトＴ細胞へのトランス遺伝子挿入のターゲティングを実施することの実現可能性を実証している。本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡスペーサー（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ（配列番号１３０８））；及びＢ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））。

実施例８−細胞におけるＨＤＲ媒介性同時トランス遺伝子挿入
本例は、初代ヒトＴ細胞におけるＨＤＲを促進するためのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（二本鎖切断誘導用）及びＡＡＶ６送達ドナー鋳型による効率的なトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを実証する。

初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズで活性化した（上記のとおり）。３日後、活性化ビーズを取り除いた。翌日、５×１０^６細胞に、ＡＡＶＳ１（１つのＲＮＰ）、ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ（２つの別個に複合体化したＲＮＰ）、又はＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ＋ＡＡＶＳ１（３つの別個に複合体化したＲＮＰ）のいずれかを標的とするｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ複合体を電気穿孔した。電気穿孔の１時間後、細胞に、ＭＮＤ−ＧＦＰカセットに隣接する７００ｂｐの長さのＡＡＶＳ１相同性アームを有するＡＡＶ６−ＭＮＤ−ＧＦＰウイルスベクター（ＡＡＶ６（ＨＡ７００−ＧＦＰ）を感染させるか、又は感染させなかった（図１１）。操作後７日で細胞を以下の抗体、ＰＥ抗ヒトＴＣＲαβ（ＢＷ２４２／４１２、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）、ＡＰＣ抗ヒトＢ２Ｍ（２Ｍ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＧＦＰ検出で染色することによりフローサイトメトリーによって分析した。ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍを標的とするＲＮＰで処理した細胞は、ＡＡＶ６−ＨＡ７００−ＧＦＰに感染させたとき、単一ノックアウト又は二重ノックアウトのいずれの細胞においてもＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ表面発現の喪失を示したが、ＧＦＰ発現の喪失は示さなかった。ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ処理細胞にＡＡＶ６−ＨＡ７００−ＧＦＰと共にＡＡＶＳ１を標的とするＲＮＰも電気穿孔したとき、単一ノックアウト及び二重ノックアウトの両方の細胞でＧＦＰ発現は明らかで、これはＭＮＤ−ＧＦＰトランス遺伝子のＨＤＲ媒介性部位特異的挿入を示すものであった。最後に、ＡＡＶＳ１単一ＲＮＰトランスフェクト細胞は高レベルのトランス遺伝子発現を示したが、ＴＣＲ又はＢ２Ｍ表面発現の喪失は示さなかった。３個体の互いに異なる生物学的ドナーから単離した活性化Ｔ細胞で同じ実験を繰り返した（図１２）。このデータは、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰの誘導による二本鎖切断及び続くＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型（切断部位との相同性を含む）からのＨＤＲによる高効率トランス遺伝子挿入が、最大２つの標的遺伝子の同時ノックアウトと、続く単一細胞レベルでの表面タンパク質発現の喪失と共に起こり得ることを示している。

本例で使用したガイドは、以下の配列を標的とする：
ＴＲＡＣ：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）
Ｂ２Ｍ：ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７）
ＡＡＶＳ１：ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１３０１）

本明細書で使用されるｓｇＲＮＡ配列：ＴＲＡＣ配列番号６８６、Ｂ２Ｍ配列番号６８８及びＡＡＶＳ１配列番号６９０、及び以下のとおり修飾することができる：ＴＲＡＣ配列番号６８５、Ｂ２Ｍ配列番号６８７及びＡＡＶＳ１配列番号６８９。本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡスペーサー（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ（配列番号１３０８））；ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））；及びＢ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））。

実施例９−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性のＴＣＲ及びＭＨＣＩ成分ノックアウト並びにキメラ抗原受容体コンストラクトの発現
本例は、ＴＣＲ及びＭＨＣＩの発現を欠く、且つＣＤ１９＋癌を標的とするキメラ抗原受容体を発現する同種異系ヒトＴ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６による作製について記載する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって生成される同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞の概略的描画を図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＴＣＲａ定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のコード配列を破壊（ノックアウト［ＫＯ］）した。この破壊によってＴＣＲの機能喪失がもたらされ、遺伝子編集されたＴ細胞が非アロ反応性且つ同種異系移植に好適なものとなり、移植片対宿主病のリスクが最小限となる。ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖切断を、キメラ抗原受容体カセット（±遺伝子発現用の調節エレメント）が隣接するＴＲＡＣ遺伝子座に対する右及び左相同性アームを含むＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型による相同組換え修復によって修復した。宿主対移植片（宿主対ＣＡＲ−Ｔ）を低下させ、及び同種異系ＣＡＲ−Ｔ産物の持続性を可能にするため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分によってＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。まとめると、これらのゲノム編集により、それぞれＧＶＨ及びＨＶＧ病を低下させるＴＣＲ及びＭＨＣＩの喪失に加えて、ＣＤ１９＋癌を標的とするＣＡＲの表面発現（ＴＲＡＣ遺伝子座から発現する）を有するＴ細胞が生じる。

Ｃａｓ９誘発性部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断のＨＤＲによるＣＡＲ発現カセットの標的化したゲノム挿入を促進するためドナー鋳型を担持するＡＡＶベクター（ｖｅｔｏｒ）ゲノムの概略図を図１４に示す。

ＣＴＸ−１３１（配列番号１３４８）は、その発現がＭＮＤプロモーターによってドライブされる、且つピコルナウイルス２Ａ配列によって任意の潜在的下流転写物（この例ではＧＦＰが示される）に翻訳的に連結されている、合成３’ポリアデニル化配列（ｐＡ）を有するＣＡＲ（ＦＭＣ６３−ＣＤ８［ｔｍ］−ＣＤ２８［共刺激ドメイン］−ＣＤ３ｚ）コンストラクト（配列番号１３１６）を含む。ＣＴＸ−１３１は、ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるゲノムＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的部位に隣接する相同性アームを含む。ＣＴＸ−１３２（配列番号１３４９）はこのコンストラクトと同じだが、ＡＡＶＳ１に対する相同性アームを欠くバージョンである。

ＣＴＸ−１３３（配列番号１３５０）は、その発現がＥＦ１ａプロモーターによってドライブされる、且つピコルナウイルス２Ａ配列によって任意の潜在的下流転写物（この例ではＧＦＰが示される）に翻訳的に連結されている、合成３’ポリアデニル化配列（ｐＡ）を有するＣＡＲ（ＦＭＣ６３−ＣＤ８［ｔｍ］−ＣＤ２８［共刺激ドメイン］−ＣＤ３ｚ）コンストラクト（配列番号１３１６）を含む。ＣＴＸ−１３３は、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノムＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的部位に隣接する相同性アームを含む。ＣＴＸ−１３４（配列番号１３５１）はこのコンストラクトと同じだが、ＴＲＡＣに対する相同性アームを欠くバージョンである。ＣＴＸ−１３８（配列番号１３５４）は、２Ａ−ＧＦＰ配列を欠くバージョンのＣＴＸ−１３３であり、及び５００ｂｐ隣接相同性アームが８００ｂｐ隣接相同性アームに置き換えられている。ＣＴＸ−１３９（配列番号１３５５）は、ＴＲＡＣ左相同性アームを６７８ｂｐ相同性アーム（ＴＲＡＣ−ＬＨＡ（６８０ｂｐ））に置き換えたバージョンのＣＴＸ−１３８である。

ＣＴＸ−１４０（配列番号１３５６）は、その発現が内因性ＴＣＲ調節エレメントによってドライブされる、且つピコルナウイルス２Ａ配列によって任意の潜在的上流ＴＣＲａ転写物に翻訳的に連結されている、合成３’ポリアデニル化配列（ｐＡ）を有するＣＡＲ（ＦＭＣ６３−ＣＤ８［ｔｍ］−ＣＤ２８［共刺激ドメイン］−ＣＤ３ｚ）コンストラクト（配列番号１３１６）を含む。ＣＴＸ−１４０は、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノムＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的部位に隣接する相同性アームを含む（ＣＴＸ−１３３、ＣＴＸ−１３８、及びＣＴＸ−１３９とは異なる）。ＣＴＸ−１４１（配列番号１３５７）はＣＴＸ−１４０コンストラクトと同じバージョンであり、また任意の潜在的下流配列にも追加的な２Ａ配列によって翻訳的に連結されている（この例ではＧＦＰが示される）。

ＣＴＸ−１３９．１コンストラクト（配列番号１５８３）はＣＴＸ−１３９コンストラクトと同様のバージョンであり、しかしながら左相同性アーム（ＬＨＡ）配列が代替的８００ｂｐＴＲＡＣ−ＬＨＡに置き換えられており、相同組換え時に一層大きい欠失を作成する。ＣＴＸ−１３９．２はＣＴＸ１３９．１と同様であり、しかし相同配列をエクソン１＿Ｔ７ガイド切断部位のより近くに持っていくが、エクソン１＿Ｔ７ガイド標的配列が欠損している伸長２０ｂｐＬＨＡ及び１０５ｂｐＲＨＡを有する。ＣＴＸ−１３９．３はＣＴＸ−１３９．２と同様で、追加的な２１ｂｐがＬＨＡに付加され且つ２０ｂｐがＲＨＡに付加されている。ＣＴＸ−１３９．２は全てのエクソン１＿Ｔ７ガイド標的配列を含むが、対応するＰＡＭ配列に突然変異を有する。

ＣＴＸ−１３５（配列番号１３５２）は、その発現が内因性ＣＤ３Ｅ調節エレメントによってドライブされる、且つピコルナウイルス２Ａ配列によって任意の潜在的下流転写物（この例ではＧＦＰが示される）に翻訳的に連結されている、合成３’ポリアデニル化配列（ｐＡ）を有するＣＡＲ（ＦＭＣ６３−ＣＤ８［ｔｍ］−ＣＤ２８［共刺激ドメイン］−ＣＤ３ｚ）コンストラクト（配列番号１３１６）を含む。ＣＴＸ−１３５は、ＣＤ３Ｅ遺伝子座におけるゲノムＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的部位に隣接する７００ｂｐ相同性アームを含む。ＣＴＸ−１３６（配列番号１３５３）はＣＴＸ−１３５の一つのバージョンであるが、ＣＤ３Ｅに対する相同性アームを欠いている。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性のＴＣＲ及びＭＨＣＩ成分ノックアウト、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトの発現、及び保持されるエフェクター機能
本例は、ＴＣＲ及びＭＨＣＩの発現を欠く、ＣＤ１９＋癌を標的とするキメラ抗原受容体を発現する、及びＴ細胞エフェクター機能を保持している同種異系ヒトＴ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６による作製について記載する。

Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＡによる相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いた初代ヒトＴ細胞におけるトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを上記の実施例８及び９に記載したとおり実施した。初めに初代ヒトＴ細胞に、ＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６））、Ｂ２Ｍ１（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７））、又はＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１３０１））を標的とするＣａｓ９又はＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体を電気穿孔した。本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡスペーサー（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ（配列番号１３０８））；ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））；及びＢ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））。

Ｔ細胞染色を上記の実施例３に記載したとおり実施し、但し１：５希釈のビオチン標識された抗マウスＦａｂ_２抗体（１１５−０６５−００６、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓ）によって細胞を４℃で３０分間染色した点は変更した。次に細胞を洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートで染色した。フローサイトメトリー結果は図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。

次に、操作された細胞がＲａｊｉリンパ腫細胞を溶解する能力、及びインターフェロンγ（ＩＦＮｇ又はＩＦＮγ）を産生する能力を細胞死滅アッセイ及びＥＬＩＳＡを用いて分析した。簡潔に言えば、細胞死滅アッセイ及びＥＬＩＳＡは、黒色壁付き９６ウェルプレート、１００ｕｇスタウロスポリン（Ｆｉｓｈｅｒ１２８５１００Ｕ）、細胞刺激カクテル（ＰＭＡ）（Ｆｉｓｈｅｒ５０１１２９０３６）、トリパンブルー（Ｆｉｓｈｅｒ１５２５００６１）、ＰＢＳ、及びＲａｊｉ培地（１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＳｉｇｍａＦ４１３５−５００ＭＬ、１５Ｌ１１５））及びＲＰＭＩ１６４０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ６１８７００３６））又はＫ５６２培地（１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＳｉｇｍａＦ４１３５−５００ＭＬ、１５Ｌ１１５）及びＩＭＤＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２４４００６１）を使用して実施した。

Ｔ細胞及びＣＡＲ−Ｔ試料を４．０×１０^５／１００μＬの希釈となるように適切なＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、ルシフェラーゼ発現細胞を１．０×１０^５／１００ｕＬで再懸濁した。再懸濁後、全ての試料を示されるとおりウェル当たり２００ｕＬの最終容積でプレーティングした。プレートを一晩インキュベートし、２４時間後、プレートを１０分間スピンダウンした。３０μＬの上清培地を収集し、新しいプレートでのＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ（ＲＤＳｙｓｔｅｍｓＳＩＦ５０）に使用した。次に残りのプレート容積をルシフェラーゼアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ６ＲＴ０６６５）に使用した。

ＡＡＶＳ１遺伝子座（ＡＡＶＳ１ＲＮＰ＋ＣＴＸ−１３１）又はＴＲＡＣ遺伝子座（ＴＲＡＣＲＮＰ＋ＣＴＸ−１３８）のいずれかから抗ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトを発現するＴ細胞は、共培養アッセイにおいてＲａｊｉリンパ腫細胞を溶解させることが可能であった（図１６Ａ、左パネル）。ＣＡＲ−Ｔ細胞はＲａｊｉリンパ腫細胞の存在下でインターフェロンγ（ＩＦＮγ又はＩＦＮｇ）を産生することが可能であったが、ＣＡＲ陰性対照は可能でなかった（図１６Ａ、右パネル）。ＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶによって生成された抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９発現陰性の細胞株であるＫ５６２細胞と共培養したとき、ＩＦＮγを産生しなかった。Ｋ５６２をＣＤ１９を過剰発現するように作製して、ＡＡＶＳ１遺伝子座（ＡＡＶＳ１ＲＮＰ＋ＣＴＸ−１３１）又はＴＲＡＣ遺伝子座（ＴＲＡＣＲＮＰ＋ＣＴＸ−１３８）のいずれかから抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養すると、ＣＡＲ−Ｔ発現細胞はＩＦＮγ産生を誘導した。図１６Ｂ（左のパネル）は、抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ１９を欠くＫ５６２細胞においてＩＦＮγを誘導しないことを示す。しかしながら、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞においては、抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＦＮγレベルが刺激される（図１６Ｂ、右パネル）。

図１７Ａは、ＣＡＲコンストラクトを発現し且つＴＣＲ及びＢ２Ｍの表面発現を欠くように操作された単一細胞が、細胞をＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに対するＲＮＰで処理し、且つＴＲＡＣ遺伝子座に対する相同配列が隣接したＣＡＲコンストラクトを含むドナー鋳型によって媒介されるＣＡＲコンストラクトの部位特異的組込み及び発現を送達するＡＡＶ６（ＣＴＸ−１３８）に感染させたときのみ、それを行ったことを実証する。図１７Ｂ及び図１７Ｃに示されるとおり、ＣＡＲ^＋ＴＣＲ⁻Ｂ２Ｍ⁻であるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の正常な比率が観察された。操作された細胞は、図１７Ｄに示されるとおり、電気穿孔及びＡＡＶ６感染の８日後に生存能を有したままであった。

図１８Ａ及び図１８Ｂは、操作された細胞が、Ｔ細胞をＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞と共培養したとき、Ｂ２Ｍのノックアウトを含む又は含まないＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれた抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するようにされた細胞においてのみ、インターフェロンγ（ＩＦＮｇ又はＩＦＮγ）を産生し、その産生レベルを増加させたことを実証する。図１８Ｃは、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉリンパ腫細胞株と指示のとおり処理したＴ細胞との共培養における増加したＩＦＮγ産生を実証する。

種々のＴＲＡＣｓｇＲＮＡを有するｒＡＡＶコンストラクトを使用したＣＡＲ発現
本例は、ＴＣＲ及びＭＨＣＩの発現を欠く且つキメラ抗原受容体を発現する同種異系ヒトＴ細胞においてドナー設計及びガイド選択がＣＡＲ発現に及ぼす効果について記載する。細胞は以下のｓｇＲＮＡを使用して調製した：ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー「エクソン１＿Ｔ３２」：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２）；ｓｇＲＮＡ（配列番号１３４５）；ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー「エクソン１＿Ｔ７」（ＧＡＧＡＡＵＣＡＡＡＡＵＣＧＧＵＧＡＡＵ（配列番号８８）；ｓｇＲＮＡ（配列番号１５８８）、及び以下の表に示すｒＡＡＶコンストラクト。

ＡＡＶコンストラクトに使用される相同性アームは、一層効率的にｇＲＮＡと対になり及び／又はトランス遺伝子挿入後に標的遺伝子座（例えば：ＴＲＡＣ遺伝子座）に欠失又は突然変異を誘導するように設計することができる。例えば、相同性アームは、１つ以上のスペーサー配列に隣接してＨＤＲによるトランス遺伝子挿入後に１つ又は複数のスペーサー配列の欠失が生じるように設計することができる（例えば：ＣＴＸ−１３８）。或いは、相同性アームは、塩基対変化を生じさせてＰＡＭ又はスペーサー配列に突然変異を生成するＴＲＡＣ配列の改変を伴い設計することができる。特定のガイドＲＮＡと対になった特異的ガイド設計は、ＣＡＲ発現を向上させ得る。

実施例１０−Ｔ細胞におけるオンターゲットインデルプロファイルの分析
以下のガイドを使用した遺伝子編集後にＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座のオンターゲットアンプリコン分析を行った：
Ｂ２Ｍスペーサー：ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６）；ｓｇＲＮＡ（配列番号１３４３
ＴＲＡＣスペーサー：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２）；ｓｇＲＮＡ（配列番号１３４５）

遺伝子編集後、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞におけるＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座の周りのオンターゲットアンプリコン分析を行った。

２×ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔｓｔａｒｔＭａｓｔｅｒｍｉｘ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して初期ＰＣＲを実施した。５０ｎｇの入力ｇＤＮＡを３００ｎＭの各プライマーと組み合わせた。ＴＲＡＣ遺伝子座についてはＴＲＡＣ＿Ｆ及びＴＲＡＣ＿Ｒプライマーを対にし、Ｂ２Ｍ遺伝子座の増幅にはＢ２Ｍ＿Ｆ及びＢ２Ｍ＿Ｒプライマーを対にした（表＃＃）。

ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／ＣＡＲ＋Ｔ細胞を生じさせるための遺伝子編集後におけるＴ細胞集団中のＢ２Ｍ遺伝子座の分析の結果、Ｂ２Ｍ遺伝子座において以下のインデル頻度及び編集された遺伝子配列が得られる（欠失はダッシュ記号とし、及び挿入は太字である）。

ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／ＣＡＲ＋Ｔ細胞を生じさせるための遺伝子編集後におけるＴ細胞集団中のＴＲＡＣ遺伝子座の分析の結果、ＣＡＲ挿入のないＴ細胞のＴＲＡＣ遺伝子座において以下のインデル頻度及び編集された遺伝子配列が得られる（欠失はダッシュ記号とし、及び挿入は太字である）。

実施例１１−Ｂ細胞悪性腫瘍に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による部位特異的同種異系ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞の作製
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は、ＣＤ１９陽性悪性腫瘍の治療に向けた移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の可能性が低下し且つ拒絶反応の可能性が低下した抗ＣＤ１９同種異系キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）の開発に適用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの効率は、予めスクリーニングされた健常ドナーからの均一なＣＡＲ−Ｔ産物の迅速な作製を可能にし、従って患者への効率的な送達のための「既製」療法として開発できる可能性がある。ＣＤ１９を標的とする自己ＣＡＲ−Ｔ療法薬はＢ細胞悪性腫瘍において目覚ましい奏効を示しているが、現在のところ多大な個別化された製造労力を要し、製造不良を被り得る。加えて、こうした自己ＣＡＲ−Ｔはレトロウイルス又はレンチウイルスを使用して作製され、それらについての組込みのばらつきのある性質が不均一な産物につながり得る。遺伝子編集技術で生成された部位特異的ＣＡＲ組込みを伴う同種異系又は「既製」ＣＡＲ−Ｔ産物は、自己産物に見られるこうした重要な難題のうちの幾つかに対処し得る。

初代ヒトＴ細胞においてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術を利用して、多重ゲノム編集によって同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）及びＡＡＶ６送達ドナー鋳型による相同組換え修復（ＨＤＲ）を利用することにより、単一Ｔ細胞におけるＣＡＲの部位特異的組込み及び同時の多重遺伝子編集のためのロバストなシステムが開発されている。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集技術では、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を大幅に減じることを目的とした、健常ドナーからのヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ表面発現の約９８％の低下を伴うＴＣＲα遺伝子（ＴＲＡＣ）の定常領域の高頻度ノックアウトが実現した。全体的な効力の増加につながる可能性のある患者における持続性の増加を目的とした、β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子の高頻度ノックアウトもまた達成することができた。約８０％のＴ細胞で、いかなる後続の抗体ベースの精製又は集積もなしにＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ二重ノックアウト頻度が達成されている。Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウトに加えて、ＡＡＶ６送達ドナー鋳型を使用した相同組換え修復によって作製された、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子座の範囲内からＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞が、一貫して高効率で作製されている。この部位特異的ＣＡＲ組込みは、可能性のあるＣＤ３^＋ＣＡＲ^＋細胞のアウトグロースから保護し、ＧＶＨＤのリスクを更に低減する一方、レトロウイルス又はレンチウイルス送達機構に関連する挿入突然変異誘発のリスクもまた低減する。このような操作された同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９依存的Ｔ細胞サイトカイン分泌及び強力なＣＤ１９特異的癌細胞溶解を示す。

本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムによるゲノム編集を用いて、ＣＤ１９発現ヒト癌の患者に対して強力且つ特異的な抗癌効果を実証する同種異系又は「既製」ＣＡＲ−Ｔ細胞産物（例えば：ＴＣ１）を効率的に作成することが可能である。より具体的には、及び本明細書において実証されるとおり、高効率編集（例えば、５０％超のＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞効率（ｅｆｆｉｃｉｃｉｅｎｃｙ））（図３９）、ＣＤ１９特異的エフェクター機能（図３５及び図４１）を呈し、ＣＤ１９^＋白血病又はリンパ腫細胞をインビトロ及びインビボで死滅させ（図３５及び図４２）、及びサイトカインの非存在下で増殖しない（図２３）同種異系抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ産物（図４０）の作製。加えて、オフターゲットプロファイルは、開発中の他の遺伝子編集Ｔ細胞療法薬からの結果と一致している。

実施例１２−ＮＯＧマウスでの皮下Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓＬｙｍｐｈｏｍａ）腫瘍異種移植片モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を決定するための用量漸増試験
本例では、ＮＯＧマウスにおける皮下Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓＬｙｍｐｈｏｍａ）腫瘍異種移植片モデルに対するＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を判定した。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＡによる相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いた初代ヒトＴ細胞におけるトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを上記の実施例８〜１０に記載したとおり実施して、ＴＣＲ及びＢ２Ｍ表面発現を欠く細胞を作製し、同時に抗ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトを発現させた（ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞）。初めに初代ヒトＴ細胞にＣａｓ９又はＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）及びＢ２Ｍ１（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７））を標的とするＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体を電気穿孔した。ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖切断を、キメラ抗原受容体カセット（±遺伝子発現用の調節エレメント）に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座に対する右及び左相同性アームを含有するＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型（ＣＴＸ−１３８；配列番号６７５）による相同組換え修復によって修復した。結果として得られた修飾Ｔ細胞（ＴＣ１）はＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋である。ＣＤ１９＋リンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ）によって引き起こされる疾患を修飾ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞が改善する（ａｍｅｌｅｒｉｏｔｅ）能力について、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）が採用している方法を用いてＮＯＧマウスで判定した。端的には、試験開始の５〜７日前、換気付きマイクロアイソレーターケージで無菌条件下に維持した１２匹の５〜８週齢雌ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスを個別に飼育した。１日目にマウスは５×１０^６個のＲａｊｉ細胞／マウスの皮下接種を受けた。マウスを表１３に示されるとおりの３つの治療群に更に分割した。８日目（Ｒａｊｉ細胞の接種から７日後）、表１３に従い治療群２及び群３がＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）の単回２００μｌ静脈内投与を受けた。本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））；及びＢ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））。

腫瘍容積及び体重を測定し、腫瘍容積が≧５００ｍｍ^３になったとき個々のマウスを安楽死させた。

１８日目までに、データは、ＴＣ１細胞に応答して、未治療のマウスと比較したとき腫瘍容積の統計的に有意な減少を示す（図１９）。腫瘍容積に対する効果は用量依存的であった（表１４）；高用量のＴＣ１細胞を投与されたマウスは、低用量のＴＣ１細胞又は無治療のいずれを投与したマウスと比較したときも、腫瘍容積の有意な低下を示した。治療群では生存の増加もまた観察された（表１４）。

上記に記載したＣＴ１に加えて、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し且つＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子の二重ノックアウトを更に含む更なる修飾Ｔ細胞が、本明細書に記載される本例及び他の例での使用に企図される。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞の特定の実施形態において、ＴＲＡＣ欠失は、本明細書に記載されるＴＲＡＣスペーサー配列のいずれか１つを使用して達成し得る。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞の特定の実施形態において、β２Ｍ欠失は、本明細書に記載されるＢ２Ｍスペーサー配列のいずれか１つを使用して達成し得る。

実施例１３−ＮＯＧマウスでの静脈内播種モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞有効性の評価
静脈内播種Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓＬｙｍｐｈｏｍａ）腫瘍異種移植片モデル
本例では、ＮＯＧマウスにおけるＲａｊｉヒトバーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓＬｙｍｐｈｏｍａ）腫瘍細胞株を使用した静脈内播種モデル（播種モデル）を使用してＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞の有効性を更に実証した。このモデルに使用したＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）の生成については上記の実施例に説明しており、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）が採用している且つ本明細書に記載される方法を用いて播種モデルで判定した。端的には、試験開始の５〜７日前、換気付きマイクロアイソレーターケージで無菌条件下に維持した２４匹の５〜８週齢雌ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスを個別に飼育した。試験の開始時、マウスを表１５に示されるとおりの５つの治療群に分割した。１日目に群２〜５のマウスが０．５×１０^６個のＲａｊｉ細胞／マウスの静脈内注射を受けた。マウスに静脈内接種して播種性疾患をモデル化した。８日目（Ｒａｊｉ細胞の注射から７日後）、表１５に従い治療群３〜５がＴＣ１細胞の単回２００μｌ静脈内投与を受けた。

試験の経過中はマウスを毎日モニタし、体重を週２回測定した。有意なエンドポイントは死亡前後までの時間であり、Ｔ細胞生着の効果もまた評価した。試験の全ての群について動物死亡率及び死亡までの時間を記録した。マウスは瀕死状態に至る前に安楽死させた。マウスは、以下の基準のうちの１つ以上を満たした場合に瀕死と定義され、犠牲にされ得る：
２０％以上の体重減少が１週間を超える期間にわたって持続する；
摂食、飲水、移動並びに排尿及び／又は排便能力など、正常な生理学的機能を妨げる腫瘍；
過度の体重減少（＞２０％）につながる長引く過度の下痢；又は
持続的な喘鳴及び呼吸窮迫。

動物はまた、虚脱、背弯姿勢、完全麻痺／不全麻痺、腹部膨張、潰瘍、膿瘍、発作及び／又は出血など、臨床所見により定義されるとおりの長引く又は過度の疼痛又は窮迫があった場合にも瀕死と見なした。

皮下異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）モデル（実施例１２）と同様に、播種モデルは、図２０に示されるとおり、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）で治療したマウスにおいて統計的に有意な生存優位性を明らかにした、ｐ＜０．０００１。播種モデルにおいてＴＣ１治療が生存に及ぼす効果はまた用量依存的であった（表１６）。

上記に記載した静脈内播種モデルを使用して第２の実験を行った。

１日目に群２〜４のマウスが０．５×１０^６個のＲａｊｉ細胞／マウスの静脈内注射を受けた。マウスに静脈内接種して播種性疾患をモデル化した。４日目（Ｒａｊｉ細胞の注射から３日後）、表１７に従い治療群２〜４がＴＣ１細胞の単回２００μｌ静脈内投与を受けた。

この場合もやはり、播種モデルは、図４２Ａに示されるとおり、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）で治療したマウスにおいて統計的に有意な生存優位性を明らかにした、ｐ＝０．００１６。播種モデルにおいてＴＣ１治療が生存に及ぼす効果はまた用量依存的であった（表１８）。

ＴＣ１治療に対する脾臓応答の判定
Ｒａｊｉ注射の２〜３週間後にマウスから脾臓を採取し、脾臓におけるＴＣ１細胞の持続性及びＲａｊｉ細胞の根絶に関して組織をフローサイトメトリーによって判定した。

フローサイトメトリー分析手順
脾臓をＣチューブ内の３ｍＬの１×ＤＰＢＳＣＭＦに移し、ＭＡＣＳＯｃｔｏＤｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用して解離させた。試料を１００ミクロンスクリーンに通して１５ｍＬコニカルチューブに移し、遠心し（１７００ｒｐｍ、５分、中断有りＡＲＴ）、１ｍＬの１×ＤＰＢＳＣＭＦに再懸濁することにより、ＧｕａｖａＰＣＡを使用してカウントした。骨髄を遠心し、１ｍＬの１×ＤＰＢＳＣＭＦに再懸濁することにより、ＧｕａｖａＰＣＡを使用してカウントした。細胞を１×ＤＰＢＳＣＭＦ中に１０×１０^６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁することによりフローサイトメトリー染色した。

標本（５０μＬ）を１ｍＬ１×ＰｈａｒｍＬｙｓｅに加え、室温（ＲＴ）で１０〜１２分間インキュベートした。試料を遠心し、次に１×ＤＰＢＳＣＭＦで１回洗浄した。試料を５０μＬの１×ＤＰＢＳに再懸濁し、ヒト及びマウスＴｒｕＳｔａｉｎと共にＲＴで１０〜１５分間インキュベートした。試料を１ｍＬ１×ＤＰＢＳＣＭＦで１回洗浄し、５０μＬの１×ＤＰＢＳＣＭＦに再懸濁することにより染色した。表面抗体を加え、細胞を暗所下ＲＴで１５〜２０分間インキュベートし、次に１ｍＬ１×ＤＰＢＳＣＭＦで洗浄した。次に試料を１２５μＬの１×ＤＰＢＳＣＭＦに再懸濁することによりフローサイトメーターで収集した。

細胞は以下の表面抗体パネルで染色した：

電子的ゲーティング（Ｐｌ＝全白血球）によって前方散乱対側方散乱に基づき細胞集団を決定した。初期機器セットアップ時にＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＵｌｔｒａＣｏｍｐビーズを使用して、１つのチャンネルから別のチャンネルへのスピルオーバーに対処するためのコンペンセーションを実施した。フローサイトメーターは、各チューブに１０，０００ＣＤ４５＋イベントを収集するように設定した。フローサイトメトリーによるデータ収集はＦＡＣＳＣａｎｔｏｌｌ（商標）フローサイトメーターを使用して実施した。データはＢＯＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（バージョン６．１．３又は８．０．１）を使用して収集した。フローサイトメトリーデータ分析は、各細胞型の相対的割合を計測するために作成されるグラフ表示であるフローサイトグラムの形態であった。

本例は、ＴＣ１細胞治療後に、治療上有益なＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞が脾臓で持続し、組織からＲａｊｉ細胞を選択的に根絶することを実証する（図２１Ａ）。加えて、ＴＣ１細胞による治療は細胞集団のＲａｊｉ誘導性の増加を呈しない（図２１Ｂ）。更に、図２２は、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞で治療したマウスの脾臓における残存ヒト細胞がＣＤ８＋であることを示している。このＣＤ８＋Ｔ細胞はまたＣＤ３陰性でもあり、このモデルにおける持続性のＴ細胞がＴＣＲ／ＣＤ３陰性のままであって、従って編集されていることを証明している。

静脈内播種Ｎａｌｍ−６ヒト急性リンパ芽球性白血病腫瘍異種移植片モデル
本例では、ＮＯＧマウスにおけるＮａｌｍ−６ヒト急性リンパ芽球性白血病腫瘍細胞株を使用した静脈内播種モデル（播種モデル）を使用してＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞の有効性を更に実証した。このモデルに使用したＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）の生成については上記の実施例に説明しており、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）が採用している且つ本明細書に記載される方法を用いて播種モデルで判定した。端的には、試験開始の５〜７日前、換気付きマイクロアイソレーターケージで無菌条件下に維持した２４匹の５〜８週齢雌ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスを個別に飼育した。試験の開始時、マウスを表２０に示されるとおりの５つの治療群に分割した。１日目に群２〜４のマウスが０．５×１０^６個のＮａｌｍ６細胞／マウスの静脈内注射を受けた。マウスに静脈内接種して播種性疾患をモデル化した。４日目（Ｎａｌｍ６細胞の注射から３日後）、表２０に従い治療群２〜４がＴＣ１細胞の単回２００μｌ静脈内投与を受けた。

試験の経過中は上記に記載されるとおりマウスを毎日モニタし、体重を週２回測定した。

Ｒａｊｉ静脈内播種モデル（上記）と同様に、Ｎａｌｍ６モデルもまた、図４２Ｂに示されるとおり、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）で治療したマウスにおいて統計的に有意な生存優位性を示した、ｐ＝０．０００４。ＴＣ１治療がＮａｌｍ６播種モデルの生存に及ぼす効果はまた用量依存的であった（表２１）。

実施例１４−ＴＣ１増殖はサイトカイン依存性である
ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞、ＴＣ１の作製により望ましくないオフターゲット編集が生じ、有害な特性を有する細胞が生成され得る。こうした有害な特性の１つは、無制御な細胞成長であり得る。この実験では、本発明者らは、ＴＣ１細胞がサイトカイン及び／又は血清の非存在下で成長する能力を評価した。

作製後約２週間で１×１０^６個のＴＣ１細胞をプレーティングした（０日目）。完全培地、サイトカイン（ＩＬ−２及びＩＬ−７）不含５％ヒト血清、又は血清及びサイトカインを含まない基本培地のいずれかにおけるプレーティング後７及び１４日で生細胞数を計数した。サイトカインを含まない培養液にプレーティングした細胞は１４日の時点で検出されなかったことから、ゲノム編集に起因したいかなる潜在的オフターゲット効果も、ＴＣ１細胞に成長因子非依存的成長／増殖をもたらさなかったことが示唆される。図２３に示されるとおり、ＴＣ１細胞はサイトカインの存在下（例えばサイトカインを含有する完全培地）においてのみ増殖し、血清単独の存在下では増殖しなかった。従って、インビボでは、ＴＣ１細胞は任意のオフターゲットゲノム編集に起因したサイトカイン、成長因子又は抗原刺激の非存在下では成長しない可能性が高い。

実施例１５−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性のＴＣＲ及びＭＨＣＩ成分ノックアウト及びＣＤ７０キメラ抗原受容体コンストラクトの発現
本例は、ＴＣＲ、又はＴＣＲ及びＭＨＣＩの発現を欠く、且つＣＤ７０＋癌を標的とするキメラ抗原受容体を発現する同種異系ヒトＴ細胞の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６による作製について記載する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって生成される同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞の概略的描画を図２４Ａに示す。

上記の実施例９と同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＴＣＲａ定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のコード配列を破壊（ノックアウト［ＫＯ］）した。この破壊によってＴＣＲの機能喪失がもたらされ、遺伝子編集されたＴ細胞が非アロ反応性且つ同種異系移植に好適なものとなり、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクが最小限となる。ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖切断を、キメラ抗原受容体カセット（±遺伝子発現用の調節エレメント）が隣接するＴＲＡＣ遺伝子座に対する右及び左相同性アームを含むＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型による相同組換え修復によって修復した。宿主対移植片（ＨＶＧ）（例えば：宿主対ＣＡＲ−Ｔ）を低下させ、及び同種異系ＣＡＲ−Ｔ産物の持続性を可能にするため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を使用してＢ２Ｍ遺伝子もまた破壊した。まとめると、これらのゲノム編集により、それぞれＧＶＨＤ及びＨＶＧを低下させるＴＣＲ及びＭＨＣＩの喪失に加えて、ＣＤ７０＋癌を標的とするＣＡＲの表面発現（ＴＲＡＣ遺伝子座から発現する）を有するＴ細胞が生じる。このＴ細胞は、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞と称することができる。

以下の例に記載する特定の実験のため、単一ノックアウトＴＲＡＣ−ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞もまた作製及び試験した。

Ｃａｓ９誘発性部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断のＨＤＲによるＣＡＲ発現カセットの標的化したゲノム挿入を促進するためドナー鋳型を担持する組換えＡＡＶウイルスの作製用ＤＮＡプラスミドコンストラクトの概略図を図２４Ｂに示す。

ＣＴＸ−１４２及びＣＴＸ−１４５はＣＴＸ−１３８に由来するが、抗ＣＤ１９ｓｃＦＶコード領域の代わりに抗ヒトＣＤ７０ｓｃＦＶコード領域を含むようにＣＡＲが修飾されている（図２４Ｂ）；加えて、このＣＡＲは、ＣＴＸ−１３８によってコードされるＣＡＲと比較したとき別のシグナルペプチド（例えば：ＣＤ８；ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１５８６））を含むように修飾される。ＣＴＸ−１４２及びＣＴＸ−１４５はＣＴＸ−１３８に由来するが、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖコード領域が抗ヒトＣＤ７０ｓｃＦｖコード領域に置き換えられている（図２４Ｂ）。ＣＴＸ−１４２とＣＴＸ−１４５とは、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の向きが異なる。ＣＴＸ−１４２（配列番号１３５８）は、その発現がＥＦ１ａプロモーターによってドライブされる合成３’ポリアデニル化配列（ｐＡ）を伴う抗ＣＤ７０ＣＡＲコンストラクト（抗ＣＤ７０Ａ：ＣＤ８［シグナルペプチド］−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＤ８［ｔｍ］−ＣＤ２８［共刺激ドメイン］−ＣＤ３ｚ）（配列番号１４２３）を含む。ｓｃＦｖは、ＶＬ鎖がＶＨ鎖のアミノ端側にあるように構築される。ＣＴＸ−１４２（配列番号１３５８）はまた、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノムＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的部位に隣接する８００ｂｐ相同性アームも含む。ＣＴＸ−１４５（配列番号１３５９）はＣＴＸ−１４２と同様であるが、しかしながら抗ＣＤ７０ＣＡＲコンストラクト（抗ＣＤ７０ＣＡＲコンストラクト（抗ＣＤ７０Ｂ：ＣＤ８［シグナルペプチド］−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＤ８［ｔｍ］−ＣＤ２８［共刺激ドメイン］−ＣＤ３ｚを含む）（配列番号１４２４）はＶＨ鎖とＶＬ鎖との向きが入れ替わり、ＶＨがＶＬのアミノ端側（ａｎｉｍｏｔｅｒｍｉｎａｌ）にある。

記載されるとおり（本明細書）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ成分で抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞を作製した。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＡによる相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いた初代ヒトＴ細胞におけるトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを上記の実施例８及び９に記載したとおり実施した。初めに初代ヒトＴ細胞に、Ｃａｓ９又はＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）；ｓｇＲＮＡ（配列番号１３４３）含有及びＢ２Ｍ１（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７）；ｓｇＲＮＡ（配列番号１３４５）含有を標的とするＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体を電気穿孔した。本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））；及びＢ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））。

ｓｇＲＮＡ配列は以下のとおり修飾することができる：ＴＲＡＣ配列番号１３４２、Ｂ２Ｍ配列番号１３４５。

ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖切断を、ＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型（ＣＴＸ−１４２又はＣＴＸ−１４５）による相同組換え修復によって修復した。

実施例１６−ＴＲＡＣ−ＣＤ７０ＣＡＲ＋及びＴＲＡＣ−Ｂ２Ｍ−ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞を作成するための細胞におけるＨＤＲ媒介性同時トランス遺伝子挿入
本例は、初代ヒトＴ細胞におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（二本鎖切断誘導用）及びＣＤ７０ＣＡＲコンストラクトを含有するＡＡＶ６送達ドナー鋳型（ＣＴＸ−１４２又はＣＴＸ−１４５）による効率的なトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを実証する。

初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズで活性化した（先に実施例２に記載したとおり）。３日後、活性化ビーズを取り除いた。翌日、ＴＲＡＣ単独、又はＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ（２つの別個に複合体化したＲＮＰ）のいずれかを標的とするｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ複合体を細胞に電気穿孔した。操作の７日後、先に本明細書及び実施例２に記載したとおり、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。

本例で使用したガイドは、以下を標的とする：
ＴＲＡＣ：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）；及びＴＲＡＣｓｇＲＮＡ（配列番号１３４３）を含む
Ｂ２Ｍ：ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７）；及びＢ２ＭｓｇＲＮＡ（配列番号１３４５）を含む

本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））；及びＢ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））。

ｓｇＲＮＡ配列は以下のとおり修飾することができる：ＴＲＡＣ配列番号１３４２、Ｂ２Ｍ配列番号１３４４。

図２５Ａは、ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＣＴＸ−１４５ＡＡＶ６で処理した細胞がより高いレベルのＣＡＲコンストラクトの発現を生じた一方、ＴＲＡＣｓｇＲＮＡＲＮＰ及びＣＴＸ−１４２ＡＡＶ６で処理した細胞がＣＤ７０ＣＡＲ発現細胞の作製においてそれほど有効でなかったことを示している。図２５Ｂは、ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＣＴＸ−１４５ＡＡＶ６で処理した細胞からのＴＲＡＣ陰性ＣＡＲ＋画分で維持された正常な比率のＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞サブセットを実証し、遺伝子操作された抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の発現がＴ細胞サブセットの比率に影響を与えることが示唆される。

加えて、ＣＴＸ−１４５をコードするＡＡＶ６単独を感染させた細胞は、高レベルの抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現しない。抗ＣＤ７０ＣＡＲの表面発現には、ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰによって誘導される二本鎖切断及び続くＣＴＸ−１４５ドナー鋳型を使用したＨＤＲによる修復が必要である（図２６）。従って、ＣＴＸ−１４５コンストラクトはＴＲＡＣ遺伝子への組込み後にのみ発現し、ＴＲＡＣＲＮＰ及びＡＡＶベクターの両方で処理しなかった細胞では発現しないものと思われる。

図２７は、上記に記載される方法を用いたＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれたトランス遺伝子からのＣＤ７０ＣＡＲの同時発現を伴うＴＣＲ及びＢ２Ｍ表面発現を欠く単一ヒトＴ細胞（ＴＣＲ−／Ｂ２Ｍ−ＣＤ７０ＣＡＲ＋）の作製の成功を実証する。

ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞の作製時には、ＣＤ７０を発現する細胞のパーセンテージをトラッキングした。０日目ではＣＤ７０を発現するＴ細胞の割合は低く、主としてＣＤ４＋である（図３６Ａ）。これらの割合は、ＣＤ７０ＣＡＲ＋になる細胞を除き、ＡＡＶ６による電気穿孔／感染の４日後にも一貫している。ＣＤ７０ＣＡＲ＋培養物は、ＣＤ７０を発現する細胞を欠く。抗ＣＤ７０−ＣＡＲ＋培養物におけるＣＤ７０発現の欠如と併せたＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞の高い頻度は、ＣＤ７０＋Ｔ細胞が抗ＣＤ７０−ＣＡＲＴ細胞の標的として働き、それが抗ＣＤ７０−ＣＡＲ−Ｔ細胞の拡大と併せたＣＤ７０＋Ｔ細胞の兄弟殺しにつながることを示唆している（図３６Ｂ−上のパネルは図３６ＡからのＣＤ７０−細胞に対応する；下のパネルは図３６ＡからのＣＤ７０＋細胞に対応する）。

実施例１７−ＣＤ７０発現細胞株の生成
ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるヒトＣＤ７０ｃＤＮＡ並びにピューロマイシン発現カセット（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）をコードするレンチウイルス粒子にＫ５６２細胞を感染させた。細胞を２ｍｇ／ｍＬピューロマイシンで４〜７日間選択し、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート抗ＣＤ７０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５５１１５）を使用してＣＤ７０表面発現に関してアッセイした。図２８Ａは、ＣＤ７０を過剰発現するＫ５６２細胞（ＣＤ７０＋Ｋ５６２）における親Ｋ５６２細胞と比較した高いＣＤ７０表面発現、及びＲａｊｉ細胞株に発現する天然ＣＤ７０と同等の発現レベルを実証する。

他の細胞株のパネルもまたＣＤ７０表面発現に関してフローサイトメトリーを用いて試験した：Ｎａｌｍ６（リンパ系）、２９３（胚腎臓）、ＡＣＨＮ（腎臓）、Ｃａｋｉ−２（腎臓）、Ｒａｊｉ（リンパ系）、Ｃａｋｉ−１（腎臓）、Ａ４９８（腎臓）、及び７８６−Ｏ（腎臓）。結果は図２８Ｂに示す。このアッセイでは、Ｒａｊｉ、Ｃａｋｉ−１及びＡ４９８細胞株が最も高いＣＤ７０表面発現レベルを呈した。これらの細胞株及びＣＤ７０発現Ｋ５６２細胞を使用してＴＣＲ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋及びＴＣＲ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋のエフェクター機能及び特異性を判定することができる。

実施例１８−ＣＤ７０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞におけるエフェクター機能の判定
ＣＤ７０ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞によるインターフェロンγ刺激
操作された細胞が標的細胞においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する能力について、上記及び実施例１０に記載するとおりＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。

ＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれたＣＤ７０ＣＡＲを発現する遺伝子修飾されたＴ細胞の特異性をインビトロＥＬＩＳＡアッセイで判定した。細胞共培養の上清からＩＦＮγを測定した。ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞のみが、ＣＤ７０＋Ｋ５６２と培養したとき高レベルのＩＦＮγを分泌する。表面ＣＤ７０を過剰発現するように操作しなかったＫ５６２細胞と共にＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞を培養したとき、ＩＦＮγ分泌は検出されなかった（図５Ａ）（４：１のＣＡＲ−Ｔ細胞対標的比）。

同様に、ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞はＩＦＮγ ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞のみを刺激し、ＣＤ７０−Ｎａｌｍ６細胞は刺激しなかった（図２９Ｂ）（２：１のＣＡＲ−Ｔ細胞対標的比）。ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、標的細胞の非存在下で単独で培養したとき検出可能なレベルのＩＦＮγを分泌しなかった（図２９Ｃ）。

グランザイムＢアッセイ
ＴＲＡＣ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞のエフェクター機能を更に評価するため、代用細胞溶解アッセイで標的細胞における細胞内グランザイムＢレベルを測定した。グランザイムＢ＋である標的細胞にパーフォリン含有膜細孔を形成させて、続いて細孔からグランザイムＢを注入してＴＲＡＣ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞によるアポトーシスを惹起した。Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ７０陽性細胞）又はＮａｌｍ６細胞（ＣＤ７０陰性細胞）のいずれかで、製造者の指示（ＯｎｃｏｉｍｍｕｎｉｎＩｎｃ．）に従いＧｒａｎＴｏｘｉＬｕｘアッセイを実施した。蛍光標識した標的細胞をグランザイムＢ（ＧｒａｎｚｙｍｂｅＢ）基質中において試験Ｔ細胞と２：１の比（例えば：ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋：標的細胞）で３７℃で２時間共培養した。次に細胞を洗浄し、グランザイムＢ（ＧｒａｎｚｙｍｂｅＢ）活性が陽性の標的細胞の％をフローサイトメトリーによって定量化した。他の対照試験細胞もまた同様の比で判定した（未編集Ｔ細胞（ＴＲＣ＋）及びＴＲＡＣ⁻ Ｔ細胞）。図２９Ｂは、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ７０＋）のみにおける、及びＮａｌｍ６細胞（ＣＤ７０⁻）にはないＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞による効率的なグランザイムＢ挿入及び活性を示す。試験した他の対照細胞は、いずれの標的細胞型においてもグランザイムＢ挿入及び活性を誘導しなかった。従って、ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞はＣＤ７０陽性標的細胞の溶解を誘導することができる。

接着性腎細胞癌における細胞死滅アッセイ−ＣＤ２８共刺激のコンテクストにおいて
ＣＤ７０ＣＡＲを発現するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞がＣＤ７０発現接着性腎細胞癌（ＲＲＣ）由来細胞株を死滅させる能力を評価するため、細胞死滅アッセイを考案した。接着細胞を９６ウェルプレートにおいてウェル当たり５０，０００細胞で播種し、３７℃で一晩放置した。翌日、Ｔ細胞を標的細胞が入ったウェルに２：１の比で加えた。指示されるインキュベーション期間の後、Ｔ細胞を培養物から吸引によって取り出し、プレートの各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて残存生細胞の数を評価した。次にプレートリーダーを使用してウェル当たりの放たれる光量を定量化した。ＴＲＡＣ⁻ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞は７２時間のコインキュベーション後に腎細胞癌由来細胞株の強力な細胞死滅を誘導し（図３０Ａ）、一方で対照試験細胞（対照Ｔ細胞：ＴＣＲ＋又はＴＲＡＣ−）は効果を有しなかった。予想どおり、ＴＲＡＣ⁻ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞は、ＣＤ７０陰性ヒト胎児腎臓由来細胞株（ＨＥＫ２９３又は２９３）を溶解させるいかなる能力も呈しなかった。スタウロスポリン（Ｔｏｃｒｉｓ）を陽性対照として使用して、小分子によって誘導される細胞死滅レベルが試験した３つの標的細胞型間で同等であったことを示した。これらの結果は、ＴＲＡＣ⁻ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞によって誘導される細胞溶解が、表面ＣＤ７０を発現する標的細胞に特異的であることを実証する。加えて、ＣＤ７０ＣＡＲを発現するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞は、一連のＣＤ７０発現腎細胞癌由来細胞株の強力な細胞溶解を呈した（図３０Ｂ及び図３０Ｃ）。

抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞における共刺激ドメイン４１Ｂｂ及びＣＤ２８の判定
ＣＴＸ１４５ｂ（配列番号１３６０）はＣＴＸ１４５に由来し、ここではＣＤ２８［共刺激ドメイン］が４１ＢＢ［共刺激ドメイン］に置き換えられている（図６１）。４−１ＢＢドメイン配列は以下である

ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（アミノ酸−配列番号１３４０）

ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ二重ノックアウト抗４１ＢＢ−ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞の効率的な作成
本例は、初代ヒトＴ細胞におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（二本鎖切断誘導用）及びＣＤ７０ＣＡＲコンストラクトを含有するＡＡＶ６送達ドナー鋳型（ＣＴＸ−１４５ｂ（配列番号１３６０））による効率的なトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを実証する。同種異系ヒトＴ細胞の作製は、実施例１６に記載されるとおりである。高い効率は、ＡＡＶ６送達ドナー鋳型ＣＴＸ−１４５（配列番号１３５９）及びＣＴＸ１４５ｂを使用したとき同様である（対照（ドナー鋳型なし）での２．３８％ＣＡＲ＋細胞と比較して、ＣＴＸ−１４５を使用すると８９．７％ＣＡＲ＋細胞、それに対してＣＴＸ−１４５ｂを使用すると８８．６％ＣＡＲ＋細胞）。

図６２は、ＴＲＡＣ及びＢ２ＭｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＣＴＸ−１４５ｂＡＡＶ６で処理した細胞からのＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０（４−１ＢＢ共刺激）ＣＡＲ＋画分において維持された正常な比率のＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞サブセットを実証し、４−１ＢＢ共刺激ドメインを有する抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞の発現がＴ細胞サブセットの比率に有意な影響を及ぼさないことが示唆される。

４−１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激ドメインを含む、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ三重ノックアウト抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞の効率的な作製
本例は、初代ヒトＴ細胞におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（二本鎖切断誘導用）及び抗ＣＤ７０ＣＡＲコンストラクトを含有するＡＡＶ６送達ドナー鋳型（ＣＴＸ−１４５又はＣＴＸ−１４５ｂ）による効率的なトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを実証する。同種異系ヒトＴ細胞の作製は、実施例２４に記載されるとおりであり、ここではＣＴＸ−１３８がＣＴＸ−１４５（ＣＤ２８共刺激）又はＣＴＸ−１４５ｂ（４−１ＢＢ共刺激）に置き換えられた。

高い効率は、ＡＡＶ６送達ドナー鋳型を使用したとき同様であった（ＣＴＸ−１４５及びＣＴＸ１４５ｂを比較）（図６３）。操作されたＴ細胞の８０％が、ＣＤ２８共刺激ドメインを有する抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現した一方、８２％が、４−１ＢＢ共刺激ドメインを有する抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現した。

図６４は、ＰＤ１、ＴＲＡＣ及びＢ２ＭｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＣＴＸ−１４５ｂＡＡＶ６で処理した細胞からのＰＤ１−／ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋画分において正常な比率のＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞サブセットが維持されたことを示し、遺伝子操作されたＴ細胞における４−１ＢＢ共刺激ドメインを有する抗ＣＤ７０ＣＡＲの発現がＴ細胞サブセットの比率に有意な影響を及ぼさないことが示唆される。

接着性腎細胞癌における細胞死滅アッセイ
抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞がＣＤ７０発現接着性腎細胞癌（ＲＲＣ）由来細胞株を死滅させる能力を評価するため、上記に記載したとおり細胞死滅アッセイを考案した。ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞は、両方の共刺激ドメインＣＤ２８及び４１ＢＢのコンテクストで、対照試験細胞（対照Ｔ細胞：ＴＣＲ＋）と比較して２４時間のコインキュベーション後に腎細胞癌由来細胞株（Ａ４９８細胞）の強力な細胞死滅を実証した（図６５）。ＰＤ１−／ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞は、４−１ＢＢ共刺激ドメインで（二重ＫＯ細胞と比較して）Ａ４９８細胞の同様の強力な細胞死滅を誘導したが、ＣＤ２８共刺激ドメインでは効力が低くなった（図６５）。

図６６は、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０（４−１ＢＢ又はＣＤ２８）ＣＡＲ＋細胞及びＰＤ１−／ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０（４−１ＢＢ又はＣＤ２８）ＣＡＲ＋細胞が、３：１の比のＴ細胞：標的細胞でＣＤ７０発現接着性腎細胞癌（ＲＲＣ）由来細胞株ＡＣＨＮの強力な細胞死滅を誘導したことを示す。

実施例１９−抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性のＴＣＲ及びＭＨＣＩ成分ノックアウト及びＢＣＭＡキメラ抗原受容体コンストラクトの発現
本例は、ＴＣＲ、又はＴＣＲ及びＭＨＣＩの発現を欠く、且つＢＣＭＡ＋癌を標的とするキメラ抗原受容体を発現する同種異系ヒトＴ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６による作製について記載する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって生成される同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞の概略的描画を図３１Ａに示す。

上記の実施例９及び１５と同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＴＣＲａ定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のコード配列を破壊（ノックアウト［ＫＯ］）した。この破壊によってＴＣＲの機能喪失がもたらされ、遺伝子編集されたＴ細胞が非アロ反応性且つ同種異系移植に好適なものとなり、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクが最小限となる。ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖切断を、キメラ抗原受容体カセット（±遺伝子発現用の調節エレメント）が隣接するＴＲＡＣ遺伝子座に対する右及び左相同性アームを含むＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型による相同組換え修復によって修復した。宿主対移植片（ＨＶＧ）（例えば：宿主対ＣＡＲ−Ｔ）を低下させ、及び同種異系ＣＡＲ−Ｔ産物の持続性を可能にするため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分によってＢ２Ｍ遺伝子もまた破壊した。まとめると、これらのゲノム編集により、それぞれＧＶＨＤ及びＨＶＧを低下させるＴＣＲ及びＭＨＣＩの喪失に加えて、ＢＣＭＡ＋癌を標的とするＣＡＲの表面発現（ＴＲＡＣ遺伝子座から発現する）を有するＴ細胞が生じる。このＴ細胞は、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋細胞と称することができる。

以下の例に記載する特定の実験のため、単一ノックアウトＴＲＡＣ−ＢＣＭＡＣＡＲ＋細胞もまた作製及び試験した。

Ｃａｓ９誘発性部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断のＨＤＲによるＣＡＲ発現カセットの標的化したゲノム挿入を促進するためドナー鋳型を担持する組換えＡＡＶウイルスの作製用ＤＮＡプラスミドコンストラクトの概略図を図３１Ｂに示す。

ＣＴＸ−１５３（配列番号１３６２）及びＣＴＸ−１５５（配列番号１３６４）はＣＴＸ−１４５に由来するが、ＣＴＸ−１４５の抗ＣＤ７０ｓｃＦｖコード領域が抗ヒトＢＣＭＡｓｃＦｖコード領域に置き換えられている（図３１Ｂ及び図１４）。ＣＴＸ−１５２（配列番号１３６１）及びＣＴＸ−１５４（配列番号１３６３）は、それぞれＣＴＸ−１５３及びＣＴＸ−１５５とピコルナウイルス２Ａ及びＧＦＰ配列の付加が異なる。ＣＴＸ−１５２、ＣＴＸ−１５３、ＣＴＸ−１５４、及びＣＴＸ−１５５は全て、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノムＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的部位に隣接する相同性アームを含む。ＣＴＸ−１５２及びＣＴＸ−１５３は８００ｂｐ相同性アームを含み、一方ＣＴＸ−１５４（配列番号１３６３）及びＣＴＸ−１５５は５００ｂｐ相同性アームを含む（図３１Ｂ）。ＣＴＸ−１５２（配列番号１３６１）とＣＴＸ−１５４とは、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の向きが互いに異なる。ＣＴＸ−１５２（配列番号１３６１）は、その発現がＥＦ１ａプロモーターによってドライブされる合成３’ポリアデニル化配列（ｐＡ）を伴う抗ＢＣＭＡＣＡＲコンストラクト（抗ＢＣＭＡ（ヌクレオチド配列（配列番号１４２５）；アミノ酸配列（配列番号１４５１））：ＣＤ８［シグナルペプチド］−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＤ８［ｔｍ］−ＣＤ２８［共刺激ドメイン］−ＣＤ３ｚ）を含む。ｓｃＦｖは、ＶＨ鎖がＶＬ鎖のアミノ端側にあるように構築される。ＣＴＸ−１５４はＣＴＸ−１５２と同様であるが、しかしながら抗ＢＣＭＡＣＡＲコンストラクト（抗ＢＣＭＡＣＡＲコンストラクト（抗ＢＣＭＡ（ヌクレオチド配列（配列番号１４２６）；アミノ酸配列（配列番号１４５２）：ＣＤ８［シグナルペプチド］−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＤ８［ｔｍ］−ＣＤ２８［共刺激ドメイン］−ＣＤ３ｚを含む）はＶＨ鎖及びＶＬ鎖の向きが入れ替わり、ＶＬがＶＨのアミノ端側（ａｎｉｍｏｔｅｒｍｉｎａｌ）にある。

抗ＢＣＭＡｓｃＦｖの構築に使用したＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれＢＣＭＡ＿ＶＨ１（配列番号１５２３）及びＢＣＭＡ＿ＶＬ１（配列番号１５２５）である。これらの鎖はマウス抗体に由来した。ヒト化バージョンのＶＨ配列が構築されており（配列番号１５２４）、２つのヒト化バージョンのＶＬ配列が構築されている（配列番号１５２６及び１５２７）。これらを使用して、上記に記載した方法を用いてヒト化抗ＢＣＭＡコンストラクトｓｃＦｖＢＣＭＡ−３、ｓｃＦｖＢＣＭＡ−４、ｓｃＦｖＢＣＭＡ−５及びｓｃＦｖＢＣＭＡ−６（配列番号１５０３〜１５０６）を構築した。これらのｓｃＦｖのいずれか１つを使用して先述のとおりのＣＡＲコンストラクトを構築することができる。ヒト化ｓｃＦｖＣＡＲコンストラクトはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４１）のリンカー配列を有する。

上記に記載した方法を用いて更なる抗ＢＣＭＡｓｃＦｖを構築した。例えば、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖ＢＣＭＡ＿ＶＨ２（配列番号１５２８）及びＢＣＭＡ＿ＶＬ２（配列番号１５２９）を使用して抗ＢＣＭＡｓｃＦｖを構築することができる。これらの可変鎖を使用して抗ＢＣＭＡコンストラクトｓｃＦｖＢＣＭＡ−７（ＶＨ−ＶＬ；配列番号１５０７）及びｓｃＦｖＢＣＭＡ−８（ＶＬ−ＶＨ；配列番号１５０８）を構築した。これらのｓｃＦｖのいずれか１つを使用して先述のとおりのＣＡＲコンストラクトを構築することができる。

別の例において、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖ＢＣＭＡ＿ＶＨ３（配列番号１５３０）及びＢＣＭＡ＿ＶＬ３（配列番号１５３１）を使用して抗ＢＣＭＡｓｃＦｖを構築した。具体的には、これらの可変鎖を使用して抗ＢＣＭＡコンストラクトｓｃＦｖＢＣＭＡ−９（ＶＨ−ＶＬ；配列番号１５１３）及びｓｃＦｖＢＣＭＡ−１０（ＶＬ−ＶＨ；配列番号１５１４）を構築した。これらのｓｃＦｖのいずれか１つを使用して先述のとおりのＣＡＲコンストラクトを構築することができる。記載（本明細書に）されるとおりのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ成分で抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を作製した。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＡによる相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いた初代ヒトＴ細胞におけるトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを上記の実施例８及び９に記載したとおり実施した。初めに初代ヒトＴ細胞に、Ｃａｓ９又はＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）；ｓｇＲＮＡ（配列番号１３４３）及びＢ２Ｍ１（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７）；ｓｇＲＮＡ（配列番号１３４５）を標的とするＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体を電気穿孔した。

ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖切断を、ＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型（ＣＴＸ−１５２、又はＣＴＸ−１５４）による相同組換え修復によって修復した。

抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による高効率多重編集
多重編集によってＴＣＲ及びＭＨＣ−Ｉの表面発現の低下、並びに高いＣＡＲ発現が生じた。６０％を超えるＴ細胞が、全３つ（ＴＣＲ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋）又は４つ（ＴＣＲ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋）の所望の修飾を有した（図５８Ａ）。二重又は三重ノックアウトで同程度の編集効率が観察された。多重編集された抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞において、ＣＤ４／ＣＤ８比は同程度のままであった（図５８Ｂ）。多重編集された抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞は、多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後の成長に関してサイトカイン依存性のままであった（図５８Ｃ）。

本例では、以下のｇＲＮＡスペーサー配列を使用した：
ＴＲＡＣ：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２）
Ｂ２Ｍ：ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６）
ＰＤ１：ＣＵＧＣＡＧＣＵＵＣＵＣＣＡＡＣＡＣＡＵ（配列番号１０８６）

本例で使用したドナー鋳型は、配列番号１４３４を含む抗ＢＣＭＡＣＡＲを含む配列番号１４０８（ＣＴＸ−１６６のＬＨＡ〜ＲＨＡ）であった。

多重編集された抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞は抗癌特性の向上を示す
抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞が４時間細胞死滅アッセイでＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓを効率的且つ選択的に死滅させた一方、ＢＣＭＡ陰性白血病株Ｋ５６２は免れさせた（図５９Ａ）。二重及び三重ノックアウト多重編集間で低いＴ細胞濃度ほど応答の違いが顕著であった。細胞はまた、ＢＣＭＡ＋ＭＭ．１Ｓ細胞による誘導にのみ応答して上方制御されるＴ細胞活性化サイトカインＩＦＮγ及びＩＬ−２も選択的に分泌した（図５９Ｂ）。

ＰＤ１ＫＯは長期インビトロ培養においてＬａｇ３消耗マーカーの発現を低下させる
培養下で１週間後に二重（ＴＣＲ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋）又は三重（ＴＣＲ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋）ＫＯ抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞の間でＬａｇ３消耗マーカーの変化は観察されなかった。しかしながら、培養下で４週間後、三重ＫＯ抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞においてＬａｇ３発現が低下したことから、ＰＤ１ＫＯを有する細胞が消耗しにくかったことが指摘される。

表２４に提供されるコンストラクトの任意の１つについて、ＣＡＲのｓｃＦｖ断片が表２４に掲載される任意の他のｓｃＦｖ断片に置換されてもよいことが理解されなければならない。

実施例２５−ＴＲＡＣ−Ｂ２Ｍ−ＢＣＭＡＣＡＲ＋細胞を作成するための細胞におけるＨＤＲ媒介性同時トランス遺伝子挿入
本例は、初代ヒトＴ細胞におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（二本鎖切断誘導用）及びＢＣＭＡＣＡＲコンストラクトを含有するＡＡＶ６送達ドナー鋳型（ＣＴＸ−１５２又はＣＴＸ−１５４）による効率的なトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを実証する。

初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズで活性化した（先に実施例２に記載したとおり）。３日後、活性化ビーズを取り除いた。翌日、ＴＲＡＣ又はＢ２Ｍ（２つの別個に複合体化したＲＮＰ）を標的とするｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ複合体を細胞に電気穿孔した。操作の７日後、先に本明細書及び実施例２に記載したとおり、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。

本例で使用したガイドは、以下を標的とする：
ＴＲＡＣ：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）；及びＴＲＡＣｓｇＲＮＡ（配列番号６８６）を含む
Ｂ２Ｍ：ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７）；及びＢ２ＭｓｇＲＮＡ（配列番号６８８）を含む

ＦＡＣＳ分析から、ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ及びＢ２ＭｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰによる処理後に７７％のＴ細胞がＴＲＡＣ−、Ｂ２Ｍ−であったことが実証された（図３２−上のパネル）。加えて、遺伝子編集細胞は、陽性ＧＦＰ発現及び組換えＢＣＭＡ結合からも明らかなとおり、ＣＡＲコンストラクトを発現した（図３２−下のパネル）。

図３２は、上記に記載される方法を用いたＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれたトランス遺伝子からのＢＣＭＡＣＡＲ（ＴＣＲ−／Ｂ２Ｍ−ＢＣＭＡＣＡＲ＋）の同時発現を伴うＴＣＲ及びＢ２Ｍ表面発現を欠く単一ヒトＴ細胞の作製の成功を実証する。

実施例２１−ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞におけるエフェクター機能の判定
ＢＣＭＡ発現細胞における細胞死滅アッセイ
ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞が浮遊細胞株を死滅させる能力を評価するため、フローサイトメトリーベースの細胞死滅アッセイを設計した。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞（使用したＣＡＲの表については実施例１９を参照）を、ＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣカタログ番号ＡＴＣＣ−１５５）ヒト形質細胞腫標的細胞株の細胞、ＢＣＭＡ発現Ｕ−２６６細胞株の細胞、又はＢＣＭＡを発現しないＫ５６２細胞株の細胞（まとめて「標的細胞」と称される）と共培養した。標的細胞を５μＭｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、洗浄し、及び様々な比のＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞との共培養下（０．１：１〜８：１Ｔ細胞対標的細胞）、Ｕ字型底の９６ウェルプレートのウェル当たり５０，０００標的細胞で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを洗浄し、１：５００希釈の５ｍｇ／ｍＬＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を含有する２００μＬの培地に培地を交換した（死細胞／瀕死細胞の計数のため）。最後に、各ウェルに２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。次に細胞をフローサイトメトリーによって処理した。

次に、分析したフローサイトメトリーデータから１μＬ当たりの標的細胞を計算した：
細胞／μＬ＝（（生存標的細胞イベント数）／（ビーズイベント数））×（（ロットの割り付けビーズカウント（ビーズ／５０μＬ））／（試料容積））

標的細胞総数は、細胞／μＬ×細胞総容積の乗算によって計算した。

次にパーセント細胞溶解率を以下の式により計算した：
％細胞溶解率＝（１−（（試験試料の標的細胞総数）／（対照試料の標的細胞総数））×１００

図３３Ａ、図４５Ｂ、及び図４６Ｂ（左のグラフ）は、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞がＲＰＭＩ８２２６細胞を低いＴ細胞対ＢＣＭＡ発現標的細胞比で選択的に死滅させたことを示し；図４６Ａ（左のグラフ）は、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞がＵ−２６６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１９６（商標））を選択的に死滅させたことを示し；及び図４６Ｃ（左のグラフ）は、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞がＫ５６２細胞（ＢＣＭＡ発現を欠く）に対して特異的毒性を示さなかったことを示す。これらの結果は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現形質細胞腫細胞株において強力な細胞溶解を誘導することを示している。

ＢＣＭＡＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞によるインターフェロンγ刺激
操作された細胞が標的細胞においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する能力について、上記並びに実施例１０及び１８に記載するとおりＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。

ＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれた抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現する遺伝子修飾されたＴ細胞の特異性をインビトロＥＬＩＳＡアッセイで判定した。細胞共培養の上清からＩＦＮγを測定した。ＲＰＭＩ８２２６細胞を、抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞、又は対照と培養した。図３３Ｂは、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＴＸ１５２又はＣＴＸ１５４を発現する細胞）が、抗ＢＣＭＡＣＡＲ（ＲＮＰ／ＡＡＶなし）を発現しないＴ細胞と比較して、ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣカタログ番号ＡＴＣＣ−１５５）細胞と培養したときより高いレベルのＩＦＮγを分泌することを実証する（０．２：１、１：１、２：１、及び４：１のＣＡＲ−Ｔ細胞対標的比）。同様に、図４６Ｂ（右のグラフ）及び図４７Ｂは、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞が、対照と比較してＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣカタログ番号ＡＴＣＣ−１５５）細胞と培養したときより高いレベルのＩＦＮγを分泌することを実証する。図４６Ａ（右のグラフ）は、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞もまた、Ｕ−２６６細胞と培養したときより高いレベルのＩＦＮγを分泌することを示す。対照的に、図４６Ｃ（右のグラフ）及び図４７Ａは、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞が、Ｋ５６２細胞（ＢＣＭＡを発現しない細胞）と培養したときＩＦＮγを分泌しないことを示す。従って、本開示の抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞はＩＦＮγを産生するのみならず、ＢＣＭＡ発現細胞の存在下ではそれを特異的に行う。

実施例２２−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によって作製されたＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＨＤＲ頻度の評価
ＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＡＲコンストラクト（ＣＴＸ−１３８）の組込み効率を測定するため、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイを設計した。ｄｄＰＣＲアッセイに使用したプライマー及びプローブを表２５に示す。配列番号１５５４〜１５５６を使用してＣＡＲコンストラクトの組込みを検出し、配列番号１５５７〜１５５９を使用して対照参照ゲノム領域を増幅した。

ｄｄＰＣＲ反応に４０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用し、ドロップレットを生成し、次に表２６及び表２７に示される条件下でサーモサイクラーにかけた。

フローサイトメトリーによってＣＤ１９ＣＡＲ＋染色された細胞のパーセンテージを、４つの健常ドナーＴＲＡＣ−Ｂ２Ｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞からの組み込まれたＣＡＲコンストラクトに関して陽性であった細胞のパーセンテージに対してプロットした（図３４）。ｄｄＰＣＲ結果はＣＤ１９ＣＡＲ発現とＨＤＲ頻度との間の強い相関を示し（Ｒ^２＝０．８８）、本発明者らがＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を用いてＴ細胞のＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトの部位特異的組込み及び高発現レベルを実現したことを示すものである。

実施例２３−Ｂ−ＡＬＬ細胞株に対するＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクター機能の判定
本例では、Ｎａｌｍ６ヒトＢ−ＡＬＬ細胞株と共培養したときのＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクター機能を評価した。

グランザイムＢアッセイ
ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクター機能を更に評価するため、代用細胞溶解アッセイで標的細胞における細胞内グランザイムＢレベルを測定した。グランザイムＢ分泌を実施例１８に記載されるとおり評価した。ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞又は対照細胞をＮａｌｍ６細胞株と共培養した。図３５Ａに示すとおり、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｎａｌｍ６ヒトＢ−ＡＬＬ細胞株と４：１の比で共培養すると効率的なグランザイムＢ挿入を呈し、これはＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞がＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６Ｂ−ＡＬＬ細胞株の溶解を誘導できることを示している。

ＣＤ１９ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞によるインターフェロンγ刺激
操作された細胞が標的細胞においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する能力について、本明細書及び実施例１０のとおりＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。

細胞共培養の上清からＩＦＮγを測定した。図３５Ｂに示されるとおり、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞と培養したとき高レベルのＩＦＮγを分泌する。

浮遊細胞株の細胞死滅アッセイ
ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞が浮遊細胞株を死滅させる能力を評価するため、フローサイトメトリーベースの細胞死滅アッセイを設計した。細胞をＮａｌｍ６ヒトＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）標的細胞株と共培養した。Ｎａｌｍ６標的細胞を５μＭｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、洗浄し、及び様々な比のＴ細胞との共培養下（０．１：１〜８：１Ｔ細胞対標的細胞）、Ｕ字型底の９６ウェルプレートのウェル当たり５０，０００標的細胞で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを洗浄し、１：５００希釈の５ｍｇ／ｍＬＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を含有する２００μＬの培地に培地を交換した（死細胞／瀕死細胞の計数のため）。最後に、各ウェルに２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。次に細胞をフローサイトメトリーによって処理した。

次に、分析したフローサイトメトリーデータから１μＬ当たりの細胞を計算した：
細胞／μＬ＝（（生存標的細胞イベント数）／（ビーズイベント数））×（（ロットの割り付けビーズカウント（ビーズ／５０μＬ））／（試料容積））

細胞総数は、細胞／μＬ×細胞総数の乗算によって計算した。

次にパーセント細胞溶解率を以下の式により計算した：
％細胞溶解率＝（１−（（試験試料の標的細胞総数）／（対照試料の標的細胞総数））×１００。

図３５Ｃは、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞が低いＴ対標的細胞比でＮａｌｍ６細胞を選択的に死滅させたことを示す。これらの結果は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞が、ＣＤ１９を発現する急性リンパ芽球性白血病細胞株において強力な細胞溶解を誘導することを示している。

実施例２４−ＰＤ１、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ三重ノックアウト抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞の作成
本例は、ＴＣＲ、ＭＨＣＩ、及びＰＤ１の発現を欠く且つＣＤ１９＋癌を標的とするキメラ抗原受容体を発現する同種異系ヒトＴ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６による作製について記載する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を上記のとおり使用して（例えば、実施例８〜１０及び１２を参照）、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１の発現を欠くと同時にＣＤ１９を標的とするＣＡＲコンストラクト（ＣＴＸ−１３８；配列番号６７５）を使用したＴＲＡＣ遺伝子座からの発現を伴うヒトＴ細胞を作成した。本例では、ＴＲＡＣ（例えば：配列番号７６）、Ｂ２Ｍ（例えば：配列番号４１７及びＰＤ１（ＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＴ（配列番号９１６））を標的とするｓｇＲＮＡを含有する３つの異なるＲＮＰ複合体を活性化Ｔ細胞に電気穿孔した。本実施例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））；Ｂ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））；及びＰＤ１ｇＲＮＡスペーサー（ＣＵＧＣＡＧＣＵＵＣＵＣＣＡＡＣＡＣＡＵ（配列番号１０８６））。電気穿孔から約１週間後、細胞は未処理のままとするか、又はＰＭＡ／イオノマイシンで一晩処理するかのいずれかとした。翌日、細胞をフローサイトメトリー用に処理した。図５８Ａは、ＰＤ１ｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰで処理した細胞のみが、一晩のＰＭＡ／イオノマイシン処理に応答してＰＤ１表面レベルを上方制御しないことを示す。

実施例２５−ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効性：ＮＯＧマウスにおける皮下腎細胞癌腫瘍異種移植片モデル
ＮＯＧマウスに５×１０^６個のＡ４９８腎細胞癌細胞を皮下注射した。接種後１０日目、マウスは未治療のままとするか、又は１×１０^７若しくは２×１０^７個の抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療用量を静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射するかのいずれかとした。試験期間中（３１日）、２日毎に腫瘍容積を測定した。抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の注射は、両方の用量で腫瘍容積の減少につながる（図３７）。これらのデータは、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞がインビボでＣＤ７０＋腎臓癌腫瘍を退縮させることができることを示す。

Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＡによる相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いた初代ヒトＴ細胞におけるトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを上記の実施例１６に記載したとおり実施して、ＴＣＲ表面発現を欠く細胞を作製すると同時に抗ＣＤ７０ＣＡＲコンストラクトを発現させた（ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞）。初めに初代ヒトＴ細胞に、Ｃａｓ９又はＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）を標的とするＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体；ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））を電気穿孔した。ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖切断を、キメラ抗原受容体カセット（±遺伝子発現用の調節エレメント）が隣接するＴＲＡＣ遺伝子座に対する右及び左相同性アームを含有するＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型（ＣＴＸ−１４５；配列番号１３５９）による相同組換え修復によって修復した。結果として得られた修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋である。修飾ＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＣＤ７０＋腎癌細胞株によって引き起こされる疾患を改善する能力について、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）が採用している方法を用いてＮＯＧマウスで判定した。端的には、試験開始の５〜７日前、換気付きマイクロアイソレーターケージで無菌条件下に維持した１２匹の５〜８週齢雌ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスを個別に飼育した。１日目にマウスは５×１０^６個のＡ４９８腎癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。マウスを表２６に示されるとおりの３つの治療群に更に分割した。１０日目（Ａ４９８細胞の接種の９日後）、表２６に従い治療群２及び群３がＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞の単回２００μｌ静脈内投与を受けた。

２日毎に腫瘍容積を測定した。１８日目までに、両方の用量で抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞による治療が腫瘍容積の減少を示し始めた（図３７）。腫瘍容積は試験期間にわたって減少し続けた。これらのデータは、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞がインビボでＣＤ７０＋腎臓癌腫瘍を退縮させることができることを実証する。

実施例２６．−抗ＢＣＭＡＣＡＲ発現及び細胞傷害性
同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を上記に記載されるとおり生成した。抗ＢＣＭＡＣＡＲ発現は、ビオチン化ＢＣＭＡに結合し、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣを使用したＦＡＣＳにより検出された細胞の割合を決定することにより測定した（図４７）。

次に抗ＢＣＭＡＣＡＲコンストラクトについて、ＲＰＭＩ−８２２６細胞を死滅させるその能力を判定した。≧１０％発現の抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞は全て、エフェクター細胞に対して強力な細胞傷害性であった一方、ＣＡＲを欠く同種異系Ｔ細胞は細胞傷害性をほとんど示さなかった（図４８）。

実施例２７．−遺伝子編集後の細胞の健康維持
同種異系抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を上記に記載されるとおり生成した。遺伝子編集の２１日後、以下のプロトコルを用いることにより指示マーカーの発現に関して細胞を染色した：
以下の抗体によって細胞を４℃で３０分間染色する。
抗マウスＦａｂ２ビオチン１１５−０６５−００６（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓ）１：５
細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄する。
１００μＬの細胞に１μｇの正常マウスＩＧＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ５００−Ｍ００）を室温で１０分間加える。
細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。
以下のカクテルによって細胞を室温で１５分間染色する。

本例で使用した抗体は以下のとおりである：

このデータは、遺伝子編集後２１日目にＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の健康が維持されている（細胞は正常な（編集されていない）細胞として挙動する）ことを示す。

実施例２８．−集積前及び集積後の遺伝子編集細胞におけるＴＣＲ遺伝子型の比較
ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞（ＴＣ１）細胞を作製し、ＴＣＲａｂ抗体及びＰｒｏｄｉｇｙシステム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して枯渇させた。９５．５％ＴＣＲａｂ⁻細胞の出発入力から、全集団中＞９９．５％純度のＴＣＲａｂ⁻細胞が実現した。

実施例２９．−同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞ターゲティング
本例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を用いた同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞の生成を実証する。高効率編集が達成され、６０％を超える細胞が３つの所望の編集を有した。ＣＡＲ−Ｔ細胞は正常なＣＤ４／ＣＤ８比、並びに特徴的なサイトカイン依存性を維持し、ＣＡＲ挿入からの異常な緊張性シグナル伝達も、編集プロセスに起因する形質転換も起こらなかったことが示唆される。ＣＡＲ−Ｔ細胞はＢＣＭＡ発現細胞に遭遇した後、ＢＣＭＡ^＋細胞を選択的に死滅させ、Ｔ細胞活性化サイトカインを分泌した。ＣＡＲ−Ｔ細胞は皮下ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍異種移植片モデルにおいてＭＭ細胞を根絶させたことから、インビボでの強力な活性が裏付けられる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による高効率ゲノム編集
実施例１９に記載される方法を用いてＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋細胞を生成した。図５２Ａは、遺伝子編集後１週間におけるβ２Ｍ及びＴＲＡＣ発現のＦＡＣＳプロット（左）及びＴＲＡＣ遺伝子座へのノックイン後のＣＡＲ発現の代表的なＦＡＣＳプロット（右）を示す。図５２Ｂは、遺伝子編集後におけるＴＣＲ及びＭＨＣ−Ｉの両方の表面発現の減少を示すグラフである。これは、高ＣＡＲ発現と併せて、６０％を超える細胞が所望の修飾全てを有することにつながる（ＴＣＲ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋）。

編集後のＴ細胞ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比
遺伝子編集後２週間で、以下のプロトコルを用いることにより指示マーカーの発現に関してＴＣＲ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋細胞を染色した：
以下の抗体によって細胞を４℃で３０分間染色する。
組換えビオチン化ヒトＢＣＭＡ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＢＣ７−Ｈ８２Ｆ０、１００ｎＭの濃度
細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。
以下のカクテルによって細胞を室温で１５分間染色する。

本実施例で使用した抗体はＣＤ４及びＣＤ８であった（表２７を参照）。このデータから、編集されたＴ細胞が未編集のＴ細胞と同じＣＤ４＋／ＣＤ８＋比を有したことが示された（データは図示せず）。

編集及び抗ＢＣＭＡＣＡＲノックインから２週間後、成長培地から血清及び／又はサイトカインを取り除いた。予想どおり、サイトカインの非存在下ではＴ細胞のそれ以上の増殖は観察されなかった（図５３）。加えて、Ｔ細胞は長期インビトロ培養後に増殖の低下を示した。

同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞はインビトロで強力且つ特異的な活性を示す
ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ．１Ｓ）を選択的に死滅させる能力を評価するため、実施例２１に記載されるアッセイと同様の、フローサイトメトリーベースの細胞死滅アッセイを設計した。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞（使用したＣＡＲの表については実施例１９を参照）をＢＣＭＡ発現ＭＭ．１Ｓ多発性骨髄腫細胞株の細胞又はＢＣＭＡを発現しないＫ５６２細胞株の細胞（まとめて「標的細胞」と称される）と共培養した。

図５４Ａは、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞がＭＭ．１Ｓ細胞を選択的に死滅させたが、Ｋ５６２細胞（ＢＣＭＡ発現を欠く）に対しては特異的毒性を示さなかったことを示す。これらの結果は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫細胞株において強力な細胞溶解を誘導することを示している。

操作されたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞が標的細胞に応答してインターフェロンγ（ＩＦＮγ）及びＩＬ−２を産生する能力について、上記並びに実施例１０、１８、及び２１に記載されるとおり、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。

ＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれた抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現する遺伝子修飾されたＴ細胞の特異性をインビトロＥＬＩＳＡアッセイで判定した。細胞共培養の上清からのＩＦＮγ及びＩＬ−２を測定した。ＭＭ．１Ｓ細胞を、抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞、又は対照と培養した。図５４Ｂは、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＴＸ１６６を発現する細胞）が、抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現しないＴ細胞（未編集のＴ細胞）と比較してＭＭ．１Ｓ細胞と培養したときより高いレベルのＩＦＮγ及びＩＬ−２を分泌することを実証する。対照的に、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｋ５６２細胞（ＢＣＭＡを発現しない細胞）と培養したときＩＦＮγ又はＩＬ−２を分泌しない。

ＭＭ．１Ｓと比較してより高いレベルのＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９を加えて細胞死滅アッセイを繰り返した（図５４Ｃ）。図５４Ｄは、ＭＭ１ｓ細胞と比較してＨ９２９細胞の死滅の加速が観察されたことを示す（Ｄ）。細胞死滅効率は１：１のエフェクター対Ｔ細胞比を用いて示される。

従って、本開示の抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞はＩＦＮγ及びＩＬ−２を産生するのみならず、ＢＣＭＡ発現細胞の存在下ではそれを特異的に行う。

同種異系抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞はインビボで強力な活性を示す
本例では、ＮＯＧマウスにおける皮下ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍異種移植片モデルに対するＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を評価した。端的には、試験開始の５〜７日前、換気付きマイクロアイソレーターケージで無菌条件下に維持した１２匹の５〜８週齢雌ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスを個別に飼育した。１日目にマウスは１０×１０^６個のＲＰＭＩ−８２２６細胞／マウスの皮下接種を受けた。マウスを２つの治療群に更に分割した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞の接種から１０日後、第１の治療群（Ｎ＝５）が１０×１０^６個の編集されたＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞の単回２００μｌ静脈内投与を受け、第２の治療群（Ｎ＝５）が２０×１０^６個の編集されたＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞の単回２００μｌ静脈内投与を受けた。

腫瘍容積及び体重を測定し、腫瘍容積が≧５００ｍｍ^３になったとき個々のマウスを安楽死させた。１８日目までに、データは、未治療のマウスと比較したとき、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞に応答した腫瘍容積の統計的に有意な減少を示す（図５５）。

ＰＤ１、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ三重ノックアウト抗ＢＣＭＡＣＡＲ−Ｔ細胞
本例は、ＴＣＲ、ＭＨＣＩ、及びＰＤ１の発現を欠く且つＢＣＭＡ＋癌を標的とするキメラ抗原受容体を発現する同種異系ヒトＴ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６による作製について記載する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を上記のとおり使用して（例えば、実施例８〜１０及び１２を参照）、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１の発現を欠くと同時にＢＣＭＡを標的とするＣＡＲコンストラクト（配列番号１４３４）を使用したＴＲＡＣ遺伝子座からの発現を伴うヒトＴ細胞を作成した。この例では、ＴＲＡＣ（例えば、ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー配列番号１５２）、Ｂ２Ｍ（例えば、Ｂ２ＭｇＲＮＡスペーサー配列番号４６６）及びＰＤ１（例えば、ＰＤ１ｇＲＮＡスペーサー配列番号１０８６）を標的とするｓｇＲＮＡを含有する３つの異なるＲＮＰ複合体を活性化Ｔ細胞に電気穿孔した。電気穿孔から約１週間後、細胞は未処理のままとするか、又はＰＭＡ／イオノマイシンで一晩処理するかのいずれかとした。翌日、細胞をフローサイトメトリー用に処理した。図３８は、ＰＤ１ｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰで処理した細胞のみが、一晩のＰＭＡ／イオノマイシン処理に応答してＰＤ１表面レベルを上方制御しないことを示す。

実施例３０．−同種異系抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞ターゲティング
同種異系抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための高効率ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集
本例は、初代ヒトＴ細胞におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（二本鎖切断誘導用）及びＣＤ７０ＣＡＲコンストラクト（配列番号１４２４）を含有するＡＡＶ６送達ドナー鋳型による効率的なトランス遺伝子挿入及び同時の遺伝子ノックアウトを実証する。ここに記載される実験は、実施例１６に記載されるものと同様である。

本例で使用したガイドは、以下を標的とする：
ＴＲＡＣ：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号７６）；ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ（配列番号６８６）
Ｂ２Ｍ：ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号４１７）；ＴＲＡＣｓｇＲＮＡ（配列番号６８８）。

本例で使用したｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１５２））；及びＢ２ＭｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号４６６））。図５６Ａは、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子座において高編集率が実現した結果、ＴＣＲ及びＭＨＣ−Ｉの表面発現が減少したことを示す。ＴＲＡＣ遺伝子座からの抗ＣＤ７０ＣＡＲの極めて効率的な部位特異的組込み及び発現もまた検出された。データは３つの健常ドナーからのものである。図５６Ｂは、同種異系抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴＣＲ−β２Ｍ−ＣＡＲ＋）の産生がＣＤ４及びＣＤ８比率を維持することを示す。

抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞は多発性骨髄腫細胞を死滅させる
ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞がＣＤ７０発現多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ．１Ｓ）を死滅させる能力を評価するため、実施例２１及び２９に記載されるアッセイと同様の、フローサイトメトリーベースの細胞死滅アッセイを設計した。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞をＢＣＭＡ発現ＭＭ．１ｓ多発性骨髄腫細胞株の細胞と共培養した。図５７は、同種異系抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＴＣＲ−β２Ｍ−ＣＡＲ＋）がＭＭ．１Ｓ多発性骨髄腫由来細胞株に対して強力な細胞傷害性を示すことを示す。

実施例３１．−抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８）ＣＡＲ及び抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲの比較
ＣＡＲ発現
ＣＤ２８共刺激ドメイン（ＣＴＸ−１６０又はＣＴＸ−１６６によってコードされる）又は４−１ＢＢ共刺激ドメイン（ＣＴＸ１６０ｂ又はＣＴＸ１６６ｂによってコードされる）のいずれかを有する同種異系ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ＋細胞を上記に記載されるとおり生成した。抗ＢＣＭＡＣＡＲ発現は、ビオチン化ＢＣＭＡに結合し、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣを使用したＦＡＣＳにより検出された細胞の割合を決定することにより測定した（図６７）。６０％を超える細胞が細胞表面にＣＡＲを発現した。

細胞傷害性
同じＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８対４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ．１Ｓ）を選択的に死滅させるを評価するため、実施例２１に記載されるアッセイと同様の、フローサイトメトリーベースの細胞死滅アッセイを設計した。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞をＢＣＭＡ発現ＭＭ．１Ｓ多発性骨髄腫細胞株の細胞と共培養した。

図６８は、全てのＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞がＭＭ．１Ｓ細胞を死滅させたことを示す。これらの結果は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫細胞株において強力な細胞溶解を誘導することを示している。

インターフェロンγ分泌
操作されたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８対４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞が標的細胞に応答してインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する能力について、上記並びに実施例１０、１８、及び２１に記載されるとおりＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。

遺伝子修飾されたＴ細胞の特異性をインビトロＥＬＩＳＡアッセイで判定した。細胞共培養の上清からＩＦＮγを測定した。ＭＭ．１Ｓ細胞を、抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞、又は対照と培養した。図６９は、全てのＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞が、抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現しないＴ細胞（未編集のＴ細胞）と比較してＭＭ．１Ｓ細胞と培養したときより高いレベルのＩＦＮγを分泌することを実証する。対照的に、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｋ５６２細胞（ＢＣＭＡを発現しない細胞）と培養したときＩＦＮγ又はＩＬ−２を分泌しない。

従って、本開示の抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞はＩＦＮγを産生するのみならず、ＢＣＭＡ発現細胞の存在下ではそれを特異的に行う。

細胞死滅アッセイ
ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞が浮遊細胞株を死滅させる能力を評価するため、フローサイトメトリーベースの細胞死滅アッセイを設計した。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ−８２２６（ＡＴＣＣカタログ番号ＡＴＣＣ−１５５）ヒト形質細胞腫標的細胞株の細胞、ＢＣＭＡ発現Ｕ−２６６細胞株の細胞、多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９の細胞、又はＢＣＭＡを発現しないＫ５６２細胞株の細胞（まとめて「標的細胞」と称される）と共培養した。標的細胞を５μＭｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、洗浄し、及び様々な比のＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞との共培養下（０．１：１〜８：１Ｔ細胞対標的細胞）、Ｕ字型底の９６ウェルプレートのウェル当たり５０，０００標的細胞で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを洗浄し、１：５００希釈の５ｍｇ／ｍＬＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を含有する２００μＬの培地に培地を交換した（死細胞／瀕死細胞の計数のため）。最後に、各ウェルに２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。次に細胞をフローサイトメトリーによって処理した。

図７０は、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞がＲＰＭＩ８２２６細胞、Ｕ−２６６細胞、及びＨ９２９細胞を選択的に死滅させ、Ｋ５６２細胞（ＢＣＭＡ発現を欠く）に対する特異的毒性はなかったことを示す。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現形質細胞腫細胞株において強力な細胞溶解を誘導することを示している。

インターフェロンγ及びＩＬ−２刺激
ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞が標的細胞においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する能力について、上記並びに実施例１０及び１８に記載するとおりＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。

ＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれた抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現する遺伝子修飾されたＴ細胞の特異性をインビトロＥＬＩＳＡアッセイで判定した。細胞共培養の上清からのＩＦＮγ及びＩＬ−２を測定した。標的ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２２６１、Ｈ９２９、又はＫ５６２細胞を、抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞、又は対照と培養した。図７３及び図７４は、ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞が、Ｋ５６２細胞株を除き、抗ＢＣＭＡＣＡＲを発現しないＴ細胞（ＲＮＰなし）と比較して、標的細胞株の各々と（０．５：１、１：１、１．５：１、２：１、及び２．５：１のＣＡＲ−Ｔ細胞対標的比で）培養したときより高いレベルのＩＦＮγ（図７１）及びＩＬ−２（図７２）を分泌することを実証する。従って、本開示のＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＩＦＮγ及びＩＬ−２を産生するのみならず、ＢＣＭＡ発現細胞の存在下ではそれを特異的に行う。

ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用して、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ−１−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して上記と同様の試験を繰り返した。編集された細胞について、細胞傷害性、ＩＦＮ−γ刺激、及びＩＬ−２刺激に関してＭＭ．１Ｓ細胞又はＫ５６２細胞でアッセイした。結果は図７４に図示し、ここでは編集された細胞がＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞株において特異的に強力な細胞溶解を誘導し、及びＢＣＭＡ発現細胞の存在下で特異的にＩＦＮγ及びＩＬ−２を産生することが示される（図７４）。

実施例３２−ＰＤ−１ノックアウトのコンテクストにおける抗ＢＣＭＡＣＡＲについてのインビボ腫瘍モデル
ＮＯＧマウスにおける皮下ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍異種移植片モデルに対するＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８共刺激）ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ−１−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８共刺激）ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効性を判定した。端的には、試験開始の５〜７日前、換気付きマイクロアイソレーターケージで無菌条件下に維持した３５匹の５〜８週齢雌ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスを個別に飼育した。１日目にマウスは１０×１０^６個のＲＰＭＩ−８２２６細胞／マウスの皮下接種を受けた。ＲＰＭＩ−８２２６細胞の接種から１０日後、マウスを６つの治療群に分割し（Ｎ＝５）、表３０に指示するとおり投与した。

腫瘍容積及び体重を測定し、腫瘍容積が≧５００ｍｍ^３になったとき個々のマウスを安楽死させた。１８日目までに、データは、未治療のマウスと比較したとき、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８共刺激）ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ−１−／抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２８共刺激）ＣＡＲ＋Ｔ細胞に応答した腫瘍容積の統計的に有意な減少を示す（図７３）。

実施例３３−ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと併せたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞又はＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効性：ＮＯＧマウスにおける皮下腎細胞癌腫瘍異種移植片モデル
ＮＯＧマウスに５×１０^６個のＡ４９８腎細胞癌細胞を皮下注射した。腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したとき、マウスは未治療のままとするか、又は１×１０^７個の抗ＣＤ７０ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療用量を静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射するかのいずれかとした。試験期間中、２日毎に腫瘍容積を測定した。抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の注射は腫瘍容積の減少につながり（図７５）、その後腫瘍は再び成長する。これらのデータは、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと併せたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−又はＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、インビボでＣＤ７０＋腎臓癌腫瘍に対して同様の抗腫瘍活性を有することを示す。

抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を上記の実施例１８に記載されるとおり生成した。更に実施例２５に記載されるものと同様にインビボ研究を行った。ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと併せた修飾ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ−又はＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＣＤ７０＋腎癌細胞株によって引き起こされる疾患を改善する能力について、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）が採用している方法を用いてＮＯＧマウスで判定した。端的には、試験開始の５〜７日前、換気付きマイクロアイソレーターケージで無菌条件下に維持した５〜８週齢雌ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスを個別に飼育した。１日目にマウスは５×１０^６個のＡ４９８腎癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。マウスを表３１に示されるとおりの５つの治療群に更に分割した。腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したとき、表３１に従い治療群２、３、４及び５がＴＲＡＣ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞の単回２００μｌ静脈内投与を受けた。

２日毎に腫瘍容積を測定した。これらのデータは、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと併せたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−又はＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞がインビボでＣＤ７０＋腎臓癌腫瘍に対して同様の抗腫瘍活性を有することを実証する。

図７５は、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと併せたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−又はＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を有するＡ４９８腎細胞癌細胞株を皮下注射したＮＯＧマウスの治療後の腫瘍容積（ｍｍ^３）の同様の減少を示すグラフである。全てのＮＯＧマウス群について５×１０^６細胞／マウスで注射した。群１はＴ細胞治療を受けなかった。群２のマウスは、腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したとき、１×１０^７細胞／マウスのＣＤ２８共刺激ドメインと併せたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞によって静脈内治療した。群３のマウスは、腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したとき、２×１０^７細胞／マウスのＣＤ２８共刺激ドメインと併せたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞によって静脈内治療した。群３のマウスは、腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したとき、１×１０^７細胞／マウスの４１ＢＢ共刺激ドメインと併せたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞によって静脈内治療した。群４のマウスは、腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したとき、２×１０^７細胞／マウスの４１ＢＢ共刺激ドメインと併せたＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞によって静脈内治療した。

説明的な例に関する注記
本開示は、本発明の様々な態様及び／又はその潜在的な適用可能性を説明するため様々な具体的な態様の記載を提供するが、当業者には変形例及び改良例が想起されるであろうことが理解される。従って、本明細書に記載される１つ又は複数の発明は、少なくともそれが特許請求されるのと同程度に広義であるものと理解されるべきであり、本明細書に提供される特定の説明的態様によってより狭義に定義されるものと理解されてはならない。

本明細書に特定される任意の特許、刊行物、又は他の開示資料は、特に指示されない限り全体として本明細書に参照によって援用されるが、但し、援用された資料が既存の記載、定義、表明、又は本明細書に明示的に示される他の開示資料と矛盾しない範囲に限るものとする。従って、及び必要がある範囲において、本明細書に示されるとおりの明示的開示が、参照によって援用される任意の矛盾する資料に優先する。本明細書に参照によって援用されると言われるが、既存の定義、表明、又は本明細書に示される他の開示資料と矛盾する任意の資料、又はその一部は、当該の援用される資料と既存の開示資料との間に矛盾が生じない範囲に限り援用される。本出願人らは、参照によって本明細書に援用される任意の主題、又はその一部が明示的に記載されるように本明細書を補正する権利を留保する。

Claims

（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子；及び
破壊されたβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子
を含む操作されたＴ細胞
を含む細胞集団であって、前記操作されたＴ細胞の少なくとも７０％が検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、且つ検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、及び／又は前記操作されたＴ細胞の少なくとも５０％が検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、細胞集団。
前記操作されたＴ細胞が未精製及び／又は未集積である、請求項１に記載の細胞集団。
前記細胞集団が未精製及び／又は未集積である、請求項１又は２に記載の細胞集団。
前記抗ＣＤ１９抗体断片が抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記抗ＣＤ１９抗体断片がヒト化抗ＣＤ１９抗体断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記抗ＣＤ１９抗体断片が配列番号１３３３のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記抗ＣＤ１９抗体断片が配列番号１３３４のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＣＤ１９抗体断片が、配列番号１５９５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む；及び／又は
前記抗ＣＤ１９抗体断片が、配列番号１５９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲの前記エクトドメインが、シグナルペプチド、任意選択でＣＤ８シグナルペプチドを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが、前記抗ＣＤ１９抗体断片と前記ＣＤ８膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメイン、任意選択でＣＤ８ヒンジドメインを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造配置：抗ＣＤ１９抗体断片を含む前記エクトドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、前記ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含む前記エンドドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが配列番号１３１６のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記ＣＡＲが配列番号１３３８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％が検出可能なレベルのＣＡＲを発現する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも５０％が検出可能なレベルのＣＡＲを発現し、且つ検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質又はＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞をＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すると、前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％の溶解が生じる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞がＣＤ１９＋細胞の存在下でインターフェロンγを産生する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞が、サイトカイン刺激、成長因子刺激、又は抗原刺激の非存在下では増殖しない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞集団。
破壊されたプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）遺伝子を更に含み、任意選択で前記操作されたＴ細胞の少なくとも８０％が検出可能なレベルのＰＤ１表面タンパク質を発現しない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞集団。
破壊された細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子を更に含み、任意選択で前記操作されたＴ細胞の少なくとも８０％が検出可能なレベルのＣＴＬＡ−４表面タンパク質を発現しない、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質を更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号８３〜１５８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７〜８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡがいずれか１つの配列番号４５８〜５０６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４０９〜４５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、
請求項１９に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７６のヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号４６６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４１７のヌクレオチド配列を標的とする、
請求項２０に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡを更に含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８３〜１２７４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９１〜１０８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項２２に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９４のヌクレオチド配列を標的とする、請求項２３に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡを更に含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２８９〜１２９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２７８〜１２８７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項２５に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２９２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２８１のヌクレオチド配列を標的とする、請求項２６に記載の細胞集団。
前記細胞集団の操作されたＴ細胞が非修飾Ｔ細胞と比べて前記ＴＲＡＣ遺伝子における配列番号７６のヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記破壊されたＢ２Ｍ遺伝子が、少なくとも１ヌクレオチド塩基対の挿入及び／又は少なくとも１ヌクレオチド塩基対の欠失を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の破壊されたＢ２Ｍ遺伝子が、配列番号１５６０；配列番号１５６１；配列番号１５６２；配列番号１５６３；配列番号１５６４；及び配列番号１５６５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の細胞集団。
前記細胞の少なくとも１６％が、配列番号１５６０のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも６％が、配列番号１５６１のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも４％が、配列番号１５６２のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６３のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６４のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；及び前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６５のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含む、請求項３０に記載の細胞集団。
対象の腫瘍容積を低下させる方法であって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の細胞集団を含むある用量の医薬組成物を前記対象に投与すること、及び前記対象の腫瘍容積を対照と比べて少なくとも５０％低下させることを含み、及び任意選択で前記組成物が１×１０^５〜１×１０^６細胞の前記集団を含む、方法。
対象の生存率を増加させる方法であって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の細胞集団を含むある用量の医薬組成物を前記対象に投与すること、及び前記対象の生存率を対照と比べて少なくとも５０％増加させることを含み、任意選択で前記組成物が１×１０^５〜１×１０^６細胞の前記集団を含む、方法。
前記対照が未治療の対象である、請求項３２又は３３に記載の方法。
同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞に：
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと、
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターと
を送達することであって、前記ＣＡＲが、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含み、前記ＣＡＲをコードする前記核酸に、前記ＴＲＡＣ遺伝子座に対する左及び右相同性アームが隣接すること；及び
（ｂ）同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製すること
を含む方法。
前記抗ＣＤ１９抗体断片が抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ抗体断片である、請求項３５に記載の方法。
前記抗ＣＤ１９抗体断片がヒト化抗ＣＤ１９抗体断片である、請求項３５又は３６に記載の方法。
前記抗ＣＤ１９抗体断片が配列番号１３３３のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記抗ＣＤ１９抗体断片が配列番号１３３４のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＣＤ１９抗体断片が、配列番号１５９５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む；及び／又は
前記抗ＣＤ１９抗体断片が、配列番号１５９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、
請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲの前記エクトドメインが、シグナルペプチド、任意選択でＣＤ８シグナルペプチドを更に含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、前記抗ＣＤ１９抗体断片と前記ＣＤ８膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメイン、任意選択でＣＤ８ヒンジドメインを更に含む、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造配置：抗ＣＤ１９抗体断片を含む前記エクトドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、前記ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含む前記エンドドメインを含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが配列番号１３１６のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記ＣＡＲが配列番号１３３８のアミノ酸配列を含む、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号８３〜１５８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７〜８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡがいずれか１つの配列番号４５８〜５０６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４０９〜４５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、
請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７６のヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号４６６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４１７のヌクレオチド配列を標的とする、
請求項４３に記載の方法。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）遺伝子を標的とするｇＲＮＡを前記組成物に送達することを更に含む、請求項３５〜４４のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８３〜１２７４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９１〜１０８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項４５に記載の方法。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９４のヌクレオチド配列を標的とする、請求項４６に記載の方法。
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子を標的とするｇＲＮＡを前記組成物に送達することを更に含む、請求項３５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２８９〜１２９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２７８〜１２８７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項４８に記載の方法。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２９２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２８１のヌクレオチド配列を標的とする、請求項４９に記載の方法。
前記ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択で化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、任意選択でＡＡＶ血清型６型（ＡＡＶ６）ベクターである、請求項３５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが配列番号１３５４〜１３５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが配列番号１３５４のヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載の方法。
前記ドナー鋳型が請求項１３９０〜１３９３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項３５〜５４のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー鋳型が配列番号１３９０のヌクレオチド配列を含む、請求項５５に記載の方法。
請求項３５〜５６のいずれか一項に記載の方法によって作製される同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞。
配列番号１３９０〜１３９３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むように修飾されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
前記ＴＲＡＣ遺伝子が配列番号１３９０のヌクレオチド配列を含むように修飾される、請求項５８に記載の操作されたＴ細胞。
破壊されたβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を更に含む、請求項５８又は５９に記載の操作されたＴ細胞。
非修飾Ｔ細胞と比べてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と配列番号７６のヌクレオチド配列の欠失とを含むように修飾されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を含むように操作されたＴ細胞。
破壊されたβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を更に含む、請求項６１に記載の操作されたＴ細胞。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を操作する方法であって、
（ａ）前記Ｔ細胞に
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ；及び
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型
を送達することであって、前記核酸に前記ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右相同性アームが隣接し、及び前記ＴＲＡＣ遺伝子への前記ドナー鋳型の相同組換え（ｈｏｍｏｌｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が前記ＣＡＲの挿入及び前記ＴＲＡＣ遺伝子における欠失及び／又は突然変異を生じさせること；及び
（ｂ）ＣＡＲＴ細胞を作製すること
を含む方法。
前記欠失が２０ヌクレオチド塩基対欠失である、請求項６３に記載の方法。
目的の分子を含むＴ細胞を操作する方法であって、
（ａ）前記Ｔ細胞に
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡであって、配列番号１５２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ；及び
目的の分子をコードする核酸を含むドナー鋳型
を送達することであって、前記核酸に前記ＴＲＡＣ遺伝子に対する左アーム及び右相同性アームが隣接し、前記左相同性アームが配列番号１３２５を含み且つ前記右相同性アームが配列番号１３２６を含み、及び前記ＴＲＡＣ遺伝子への前記ドナー鋳型の相同組換え（ｈｏｍｏｌｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が前記目的の分子の挿入、及び任意選択で前記ＴＲＡＣ遺伝子における欠失を生じさせること；及び
（ｂ）前記目的の分子を含むＴ細胞を作製すること
を含む方法。
目的の分子を含むＴ細胞を操作する方法であって、
（ａ）前記Ｔ細胞に
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡであって、配列番号８３〜１５８のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ；及び
目的の分子をコードする核酸を含むドナー鋳型
を送達することであって、前記核酸に前記ＴＲＡＣ遺伝子に対する左アーム及び右相同性アームが隣接し、前記左相同性アームが配列番号１３２２、１３２４、１３２５、１３２７、１５７８、１５７９、又は１５８１を含み且つ前記右相同性アームが配列番号１３２３、１３２６、１３２８、１５８０、又は１５８２を含み、及び前記ＴＲＡＣ遺伝子への前記ドナー鋳型の相同組換え（ｈｏｍｏｌｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が前記目的の分子の挿入、及び任意選択で前記ＴＲＡＣ遺伝子における欠失及び／又は突然変異を生じさせること；及び
（ｂ）前記目的の分子を含むＴ細胞を作製すること
を含む方法。
（ｉ）抗ＣＤ７０抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子；及び
破壊されたβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子
を含む操作されたＴ細胞
を含む細胞集団であって、前記操作されたＴ細胞の少なくとも７０％が検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、且つ検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、及び／又は前記操作されたＴ細胞の少なくとも５０％が検出可能なレベルのＣＡＲを発現する、細胞集団。
前記操作されたＴ細胞が未精製及び／又は未集積である、請求項６７に記載の細胞集団。
前記細胞集団が未精製及び／又は未集積である、請求項６７又は６８に記載の細胞集団。
前記抗ＣＤ７０抗体断片が抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ抗体断片である、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記抗ＣＤ７０抗体断片がヒト化抗ＣＤ７０抗体断片である、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記抗ＣＤ７０抗体断片が配列番号１４７５又は１４７６のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記抗ＣＤ７０抗体断片が配列番号１４９９又は１５００のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＣＤ７０抗体断片が、配列番号１５９２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む；及び／又は
前記抗ＣＤ７０抗体断片が、配列番号１５９３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲの前記エクトドメインが、シグナルペプチド、任意選択でＣＤ８シグナルペプチドを更に含む、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが、前記抗ＣＤ７０抗体断片と前記ＣＤ８膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメイン、任意選択でＣＤ８ヒンジドメインを更に含む、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造配置：抗ＣＤ７０抗体断片を含む前記エクトドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、前記ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含む前記エンドドメインを含む、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが配列番号１４２３、１４２４、又は１２７５のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記ＣＡＲが配列番号１４４９、１４５０、又は１２７６のアミノ酸配列を含む、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、請求項６７〜７６のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％が検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、請求項６７〜７７のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも５０％が検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現し、且つ検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質又はＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、請求項６７〜７８のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞をＣＤ７０＋Ｂ細胞と共培養すると、前記ＣＤ７０＋Ｂ細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％の溶解が生じる、請求項６７〜７９のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞がＣＤ７０＋細胞の存在下でインターフェロンγを産生する、請求項６７〜８０のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞が、サイトカイン刺激、成長因子刺激、又は抗原刺激の非存在下では増殖しない、請求項６７〜８１のいずれか一項に記載の細胞集団。
破壊されたプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）遺伝子を更に含み、任意選択で前記操作されたＴ細胞の少なくとも８０％が検出可能なレベルのＰＤ１表面タンパク質を発現しない、請求項６７〜８２のいずれか一項に記載の細胞集団。
破壊された細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子を更に含み、任意選択で前記操作されたＴ細胞の少なくとも８０％が検出可能なレベルのＣＴＬＡ−４表面タンパク質を発現しない、請求項６７〜８３のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質を更に含む、請求項６７〜８４のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号８３〜１５８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７〜８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡがいずれか１つの配列番号４５８〜５０６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４０９〜４５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、
請求項８５に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７６のヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号４６６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４１７のヌクレオチド配列を標的とする、
請求項８６に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡを更に含む、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８３〜１２７４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９１〜１０８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項８８に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９４のヌクレオチド配列を標的とする、請求項８９に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡを更に含む、請求項８４〜９０のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２８９〜１２９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２７８〜１２８７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項９１に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２９２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２８１のヌクレオチド配列を標的とする、請求項９２に記載の細胞集団。
前記細胞集団の操作されたＴ細胞が、非修飾Ｔ細胞と比べて配列番号７６のヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項６７〜９３のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記破壊されたＢ２Ｍ遺伝子が、少なくとも１ヌクレオチド塩基対の挿入及び／又は少なくとも１ヌクレオチド塩基対の欠失を含む、請求項６７〜９４のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の破壊されたＢ２Ｍ遺伝子が、配列番号１５６０；配列番号１５６１；配列番号１５６２；配列番号１５６３；配列番号１５６４；及び配列番号１５６５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項９５に記載の細胞集団。
前記細胞の少なくとも１６％が、配列番号１５６０のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも６％が、配列番号１５６１のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも４％が、配列番号１５６２のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６３のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６４のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；及び前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６５のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含む、請求項９６に記載の細胞集団。
対象の腫瘍容積を低下させる方法であって、請求項６７〜９７のいずれか一項に記載の細胞集団を含むある用量の医薬組成物を前記対象に投与すること、及び前記対象の腫瘍容積を対照と比べて少なくとも５０％低下させることを含み、任意選択で前記組成物が１×１０^５〜１×１０^６細胞の前記集団を含む、方法。
対象の生存率を増加させる方法であって、請求項６７〜９８のいずれか一項に記載の細胞集団を含むある用量の医薬組成物を前記対象に投与すること、及び前記対象の生存率を対照と比べて少なくとも５０％増加させることを含み、任意選択で前記組成物が１×１０^５〜１×１０^６細胞の前記集団を含む、方法。
前記対照が未治療の対象である、請求項９８又は９９に記載の方法。
同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞を含む組成物に、
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと；
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと；
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと；
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターと
を送達することであって、前記ＣＡＲが、（ｉ）抗ＣＤ７０抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含み、前記ＣＡＲをコードする前記核酸に、ＴＲＡＣ遺伝子座に対する左及び右相同性アームが隣接すること、及び
（ｂ）同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製すること
を含む方法。
前記抗ＣＤ７０抗体断片が抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１０１に記載の方法。
前記抗ＣＤ７０抗体断片がヒト化抗ＣＤ７０抗体断片である、請求項１０１又は１０２に記載の方法。
前記抗ＣＤ７０抗体断片が配列番号１４７５又は１４７６のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記抗ＣＤ７０抗体断片が配列番号１４９９又は１５００のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＣＤ７０抗体断片が、配列番号１５９２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む；及び／又は
前記抗ＣＤ７０抗体断片が、配列番号１５９３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、
請求項１０１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲの前記エクトドメインが、シグナルペプチド、任意選択でＣＤ８シグナルペプチドを更に含む、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、前記抗ＣＤ７０抗体断片と前記ＣＤ８膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメイン、任意選択でＣＤ８ヒンジドメインを更に含む、請求項１０１〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造配置：抗ＣＤ７０抗体断片を含む前記エクトドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、前記ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含む前記エンドドメインを含む、請求項１０１〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが配列番号１４２３、１４２４、又は１２７５のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記ＣＡＲが配列番号１４４９、１４５０、又は１２７６のアミノ酸配列を含む、請求項１０１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号８３〜１５８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７〜８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡがいずれか１つの配列番号４５８〜５０６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４０９〜４５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、
請求項１０１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７６のヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号４６６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４１７のヌクレオチド配列を標的とする、
請求項１０９に記載の方法。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）遺伝子を標的とするｇＲＮＡを前記組成物に送達することを更に含む、請求項１０１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８３〜１２７４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９１〜１０８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項１１１に記載の方法。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９４のヌクレオチド配列を標的とする、請求項１１２に記載の方法。
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子を標的とするｇＲＮＡを前記組成物に送達することを更に含む、請求項１０１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２８９〜１２９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２７８〜１２８７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項１１４に記載の方法。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２９２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２８１のヌクレオチド配列を標的とする、請求項１１５に記載の方法。
前記ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択で化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１０１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、任意選択でＡＡＶ血清型６型（ＡＡＶ６）ベクターである、請求項１０１〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが配列番号１３５８〜１３６０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１１８に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが配列番号１３６０のヌクレオチド配列を含む、請求項１１９に記載の方法。
前記ドナー鋳型が配列番号１３９４〜１３９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１０１〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー鋳型が配列番号１３９６のヌクレオチド配列を含む、請求項１２１に記載の方法。
請求項１０１〜１２２のいずれか一項に記載の方法によって作製される同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞。
配列番号１３９４〜１３９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むように修飾されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
前記ＴＲＡＣ遺伝子が配列番号１３９６のヌクレオチド配列を含むように修飾される、請求項１２４に記載の操作されたＴ細胞。
破壊されたβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を更に含む、請求項１２４又は１２５に記載の操作されたＴ細胞。
（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子；及び
破壊されたβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子
を含む操作されたＴ細胞
を含む細胞集団であって、前記操作されたＴ細胞の少なくとも７０％が検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、且つ検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、及び／又は前記操作されたＴ細胞の少なくとも５０％が検出可能なレベルのＣＡＲを発現する、細胞集団。
前記操作されたＴ細胞が未精製及び／又は未集積である、請求項１２７に記載の細胞集団。
前記細胞集団が未精製及び／又は未集積である、請求項１２７又は１２８に記載の細胞集団。
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１２７〜１２９のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片がヒト化抗ＢＣＭＡ抗体断片である、請求項１２７〜１３０のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が配列番号１４７９又は１４８５のヌクレオチド配列によってコードされる、又は前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が配列番号１５０３又は１５０９のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が、配列番号１５８９又は１５２４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む；及び／又は
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が、配列番号１５９０又は１５２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、
請求項１２７〜１３１のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲの前記エクトドメインが、シグナルペプチド、任意選択でＣＤ８シグナルペプチドを更に含む、請求項１２７〜１３２のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが、前記抗ＢＣＭＡ抗体断片と前記ＣＤ８膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメイン、任意選択でＣＤ８ヒンジドメインを更に含む、請求項１２７〜１３３のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造配置：抗ＢＣＭＡ抗体断片を含む前記エクトドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、前記ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含む前記エンドドメインを含む、請求項１２７〜１３４のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記ＣＡＲが配列番号１４２７、１４２８、１４３４、又は１４３５のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記ＣＡＲが配列番号１４５３、１４５４、１４６０、又は１４６１のアミノ酸配列を含む、請求項１２７〜１３５のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、請求項１２７〜１３６のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％が検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、請求項１２７〜１３６のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも５０％が検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現し、且つ検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質又はＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、請求項１２７〜１３８のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞をＢＣＭＡ＋Ｂ細胞と共培養すると、前記ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％の溶解が生じる、請求項１２７〜１３９のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞がＢＣＭＡ＋細胞の存在下でインターフェロンγを産生する、請求項１２７〜１４０のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞が、サイトカイン刺激、成長因子刺激、又は抗原刺激の非存在下では増殖しない、請求項１２７〜１４１のいずれか一項に記載の細胞集団。
破壊されたプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）遺伝子を更に含み、任意選択で前記操作されたＴ細胞の少なくとも８０％が検出可能なレベルのＰＤ１表面タンパク質を発現しない、請求項１２７〜１４２のいずれか一項に記載の細胞集団。
破壊された細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子を更に含み、任意選択で前記操作されたＴ細胞の少なくとも８０％が検出可能なレベルのＣＴＬＡ−４表面タンパク質を発現しない、請求項１２７〜１４３のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質を更に含む、請求項１２７〜１４４のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号８３〜１５８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７〜８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡがいずれか１つの配列番号４５８〜５０６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４０９〜４５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、
請求項１４５に記載の細胞集団。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７６のヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号４６６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４１７のヌクレオチド配列を標的とする、
請求項１４６に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡを更に含む、請求項１４４〜１４７のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８３〜１２７４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９１〜１０８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項１４８に記載の細胞集団。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９４のヌクレオチド配列を標的とする、請求項１４９に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とするｇＲＮＡを更に含む、請求項１４４〜１５０のいずれか一項に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２８９〜１２９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２７８〜１２８７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項１５１に記載の細胞集団。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２９２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２８１のヌクレオチド配列を標的とする、請求項１５２に記載の細胞集団。
前記細胞集団の操作されたＴ細胞が、非修飾Ｔ細胞と比べて配列番号７６のヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１２７〜１５３のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記破壊されたＢ２Ｍ遺伝子が、少なくとも１ヌクレオチド塩基対の挿入及び／又は少なくとも１ヌクレオチド塩基対の欠失を含む、請求項１２７〜１５４のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記操作されたＴ細胞の破壊されたＢ２Ｍ遺伝子が、配列番号１５６０；配列番号１５６１；配列番号１５６２；配列番号１５６３；配列番号１５６４；及び配列番号１５６５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１５５に記載の細胞集団。
前記細胞の少なくとも１６％が、配列番号１５６０のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも６％が、配列番号１５６１のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも４％が、配列番号１５６２のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６３のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６４のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含み；及び前記細胞の少なくとも２％が、配列番号１５６５のヌクレオチドを含むように編集されたＢ２Ｍ遺伝子を含む、請求項１５６に記載の細胞集団。
対象の腫瘍容積を低下させる方法であって、請求項１２７〜１５７のいずれか一項に記載の細胞集団を含むある用量の医薬組成物を前記対象に投与すること、及び前記対象の腫瘍容積を対照と比べて少なくとも５０％低下させることを含み、任意選択で前記組成物が１×１０^５〜１×１０^６細胞の前記集団を含む、方法。
対象の生存率を増加させる方法であって、請求項１２７〜１５８のいずれか一項に記載の細胞集団を含むある用量の医薬組成物を前記対象に投与すること、及び前記対象の生存率を対照と比べて少なくとも５０％増加させることを含み、任意選択で前記組成物が１×１０^５〜１×１０^６細胞の前記集団を含む、方法。
前記対照が未治療の対象である、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞を含む組成物に、
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと；
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと；
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと；
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターと
を送達することであって、前記ＣＡＲが（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗体断片を含むエクトドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインと任意選択でＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含み、前記ＣＡＲをコードする前記核酸に、ＴＲＡＣ遺伝子座に対する左及び右相同性アームが隣接すること、及び
（ｂ）同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞を作製すること
を含む方法。
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１６１に記載の方法。
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片がヒト化抗ＢＣＭＡ抗体断片である、請求項１６１又は１６２に記載の方法。
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が配列番号１３３３のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が配列番号１３３４のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が、配列番号１５８９又は１５２４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む；及び／又は
前記抗ＢＣＭＡ抗体断片が、配列番号１５９０又は１５２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、
請求項１６１〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲの前記エクトドメインが、シグナルペプチド、任意選択でＣＤ８シグナルペプチドを更に含む、請求項１６１〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、前記抗ＢＣＭＡ抗体断片と前記ＣＤ８膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメイン、任意選択でＣＤ８ヒンジドメインを更に含む、請求項１６１〜１６５のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造配置：抗ＢＣＭＡ抗体断片を含む前記エクトドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、前記ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ｚ共刺激ドメインとを含む前記エンドドメインを含む、請求項１６１〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが配列番号１３１６のヌクレオチド配列によってコードされる、及び／又は前記ＣＡＲが配列番号１３３８のアミノ酸配列を含む、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号８３〜１５８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７〜８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡがいずれか１つの配列番号４５８〜５０６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４０９〜４５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、
請求項１６１〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号７６のヌクレオチド配列を標的とする；及び／又は
Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号４６６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号４１７のヌクレオチド配列を標的とする、
請求項１６９に記載の方法。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）遺伝子を標的とするｇＲＮＡを前記組成物に送達することを更に含む、請求項１６１〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８３〜１２７４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９１〜１０８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項１７１に記載の方法。
ＰＤ１遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１０８６のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号８９４のヌクレオチド配列を標的とする、請求項１７２に記載の方法。
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子を標的とするｇＲＮＡを前記組成物に送達することを更に含む、請求項１６１〜１７３のいずれか一項に記載の方法。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２８９〜１２９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２７８〜１２８７のいずれか１つのヌクレオチド配列を標的とする、請求項１７４に記載の方法。
ＣＴＬＡ−４遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１２９２のヌクレオチド配列を含む、及び／又は配列番号１２８１のヌクレオチド配列を標的とする、請求項１７５に記載の方法。
前記ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択で化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１６１〜１７６のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、任意選択でＡＡＶ血清型６型（ＡＡＶ６）ベクターである、請求項１６１〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが配列番号１３６５、１３６６、１３７２、又は１３７３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１７８に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが配列番号１３６６又は１３７３のヌクレオチド配列を含む、請求項１７９に記載の方法。
前記ドナー鋳型が配列番号１４０１、１４０２、１４０８、又は１４０９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１６１〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー鋳型が配列番号１４０２又は１４０９のヌクレオチド配列を含む、請求項１８１に記載の方法。
請求項１６１〜１８２のいずれか一項に記載の方法によって作製される同種異系移植に好適な操作されたＴ細胞。
配列番号１３９０〜１３９３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むように修飾されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
前記ＴＲＡＣ遺伝子が配列番号１３９０のヌクレオチド配列を含むように修飾される、請求項１８４に記載の操作されたＴ細胞。
破壊されたβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を更に含む、請求項１８４又は１８５に記載の操作されたＴ細胞。