JP2020018314A - 修飾ｆｇｆ−２１ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

【課題】少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を用いて選択可能に修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの提供。【解決手段】非天然にコードされるアミノ酸を１つ以上含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチドであって以下を含む。翻訳後修飾を１つ以上含んでいる。リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子と連結されている。水溶性ポリマーと連結されている。二官能性ポリマー、二官能性リンカー、または少なくとも１つのさらなるＦＧＦ−２１ポリペプチドと連結されている。上記水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。【選択図】なし

Description

〔関連出願に対する相互参照〕
本出願は、米国仮特許出願第６０／９２１，２９７号（２００７年３月３０日出願）および米国仮特許出願第６０／９８８，０６０号（２００７年１１月１４日出願）に対する優先権およびこれらの利益を主張するものである（これらの明細書および開示事項は、完全に本明細書に組み込まれる）。
〔発明の分野〕
本発明は、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を用いて選択可能に修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドに関する。
線維芽細胞成長因子は、成長期の組織および成熟した組織において広く発現されている大きなポリペプチドである（Baird et al., Cancer Cells, 3:239-243, 1991）。そして、線維芽細胞成長因子は、多様な生理学的機能（脈管形成、有糸分裂生起、パターン形成、細胞分化、代謝調節および組織損傷の修復が挙げられる）において重要な役割を果たしている（McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. MoI. Biol. 59:135-176, 1998；Burgess, W. H. et al., Annu. Rev. Biochem. 58:575-606 (1989)）。典型的な線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）であるＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、線維芽細胞にとってのミトゲンとして、もともと脳および下垂体から単離された。ＦＧＦ−３は、マウス乳がんウイルスによる活性化にとっての通常の標的であると同定された（Dickson et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 638:18-26 (1991)）。ＦＧＦ−４〜ＦＧＦ−６は、腫瘍遺伝子産物として同定された（Yoshida et al., Ann. NY Acad. Sci. 638:27-37 (1991)；Goldfarb et al., Ann. NY Acad. Sci 638:38-52 (1991)；Coulier et al., Ann. NY Acad. Sci. 638:53-61 (1991)）。ＦＧＦ−１０は、相同性に基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってラットの肺から同定された（Yamasaki et al., J. Biol. Chem. 271 :15918-15921 (1996)）。ＦＧＦ−１１〜ＦＧＦ−１４（ＦＧＦ相同因子（ＦＨＦｓ）１〜４）は、ランダムｃＤＮＡ配列決定、データベース検索、および相同性に基づくＰＣＲの組合せによって同定された（et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9850-9857 (1996)）。ＦＧＦ−１５は、ホメオドメイン腫瘍性タンパク質の下流標的として同定された（McWhirter et al., Development 124:3221-3232 (1997)）。ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７およびＦＧＦ−１８は、相同性に基づくＰＣＲによってラットの心臓および胎児からそれぞれ同定された（Miyake et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 243:148-152 (1998)；Hoshikawa et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244:187-191 (1998)；Ohbayashi et al., J. Biol. Chem. 273:18161-18164 (1998)）。ＦＧＦ−１９は、データベース検索によってヒトの胎児の脳から同定された（Nishimura et al., Biochim. Biophys. Acta 1444:148-151 (1999)）。それらは、３０％以下から６０％のアミノ酸同一性を有する１２０以下のアミノ酸残基のコアを有している。
動物モデル、過剰発現、および天然に生じる変異の分析によって、広範な疾患に線維芽細胞成長因子およびそれらの受容体が関連すると見做されている（例えば、Wilkie et al., Current Biology, (1995) 5:500-507；Pugh-Humphreys et al, In: The Cytokine Handbook, A. Thomson ed, 2nd edition, Academic Press, Harcourt Brace & co. publishers, London, pp 525- 566）。これは、活性の調節が治療に利用され得ることを示唆している。例えば、化合物スラミンによる線維芽細胞成長因子−２の阻害によって、マウスにおける血管新生および腫瘍の成長が抑制される（Pesenti et al., British Journal of Cancer, 66:367-372）。また、線維芽細胞成長因子は、脈管形成（Lyons, M. K., et al., Brain Res. (1991) 558:315-320）、傷の治癒（Uhl, E., et al., Br. J. Surg. (1993) 80:977-980, 1993）、星膠症（astrogliosis）、グリア細胞の増殖および分化（Biagini, G. et al., Neurochem. Int. (1994) 25:17-24）、脳血管拡張（Tanaka, R. et al., Stroke (1995) 26:2154-2159）、ならびに神経栄養性／神経調節性の過程に作用している。
また、線維芽細胞増殖因子は、多様な正の作用（脳虚血の予後を改善するための血流およびカルシウムからの保護が挙げられる）を有している（Mattson, M. P. et al., Semin. Neurosci. (1993) 5:295-307；Doetrocj. W. D. et al., J. Neurotrauma (1996) 13:309- 316）。主要なＦＧＦの処理によって、基本的に心筋虚血における新生脈管形成が促進される（Schumacher et al., Circulation (1998) 97: 645-650）。主要なＦＧＦによって機能的な回復が増強され、かつ局所性脳梗塞に続く神経出芽が促進される（Kawamata et al., Proc.Natl. Acad. Sci.(1997) 94 (15):8179-84）。公開された文献によれば、ＦＧＦファミリーは少なくとも２２の構成要素からなる（Reuss et al., Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)）。
線維芽細胞成長因子−２１（ＦＧＦ−２１）は、肝臓において選択的に発現されると報告されている（参照によって本明細書に組み込まれる、Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206 (2000)；国際公開第０１／３６６４０号パンフレット；および国際公開第０１／１８１７２号パンフレット）。また、ＦＧＦ−２１は、虚血性血管疾患、傷の治癒、ならびに肺性の障害、気管支の障害もしくは肺胞細胞の障害に関連する疾患および他の多くの障害にとっての処置について説明されている。ＦＧＦ−２１は、主として肝臓、腎臓および筋肉組織において発現される（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書の実施例２を参照すればよい）。ＦＧＦ−２１遺伝子は、３つのエキソンから構成され、かつ染色体１９上に位置している。ＦＧＦ−２１は、他のＦＧＦｓとは異なり増殖性作用および腫瘍形成作用を有していない（Genome Biol. 2001;2(3):REVIEWS3005）。
参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００１００１２６２８号明細書には、ヒトＦＧＦ−２１のヌクレオチド配列およびタンパク質配列が記載されている（米国特許出願公開第２００１００１２６２８号明細書の配列番号１および２のそれぞれを参照すればよい）。ｓｂｇＦＧＦ−１９と呼ばれている上述の公開物における配列番号２は、長さが２０９アミノ酸であり、かつＮ末端に２８アミノ酸のリーダー配列を含んでいる。本明細書において配列番号３として示されているヒトＦＧＦ−２１配列は、米国特許出願公開第２００１００１２６２８号明細書の配列番号２と同じ配列である。この配列は、１７４位にプロリン（Ｐ）を有する単一のヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を有している。以降において、この配列を“ＦＧＦ−２１の２０９アミノ酸のＰ−フォーム”と呼ぶ。
参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，７１６，６２６号明細書において、ヒトＦＧＦ−２１および他の動物（特にマウスおよびラット）における相同的なタンパク質について述べられている。マウスＦＧＦ（米国特許第６，７１６，６２６号明細書の配列番号１として示されている）は、肝臓において強く発現され、かつ精巣および胸腺において発現された。これによって、ヒトＦＧＦ−２１が、肝疾患および／または精巣の機能障害もしくは胸腺に由来する細胞の機能障害の進行および回復に関与することが示唆された。米国特許第６，７１６，６２６号明細書の配列番号４は、長さが２０９アミノ酸であり、かつＮ末端に２８アミノ酸のリーダー配列を含んでいる。本明細書において配列番号６として示されているヒトＦＧＦ−２１配列は、米国特許第６，７１６，６２６号明細書の配列番号４と同じ配列である。この配列は、１７４位にロイシン（Ｌ）を有する単一のヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を有している。以降において、この配列を“ＦＧＦ−２１の２０９アミノ酸のＬ−フォーム”と呼ぶ。
参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書には、ヒトＦＧＦ−２１について述べられている。また、この文献には、長さが２０８アミノ酸であり（米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書の配列番号２を参照すればよい）、かつＮ末端に２８アミノ酸のリーダー配列を含んでいる配列が示されている。本明細書において配列番号７として示されているヒトＦＧＦ−２１配列は、米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書の配列番号２と同じ配列である。この配列は、１７３位にロイシン（Ｌ）を有する単一のヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を有している。これ以降において、この配列を“ＦＧＦ−２１の２０８アミノ酸のＬ−フォーム”と呼ぶ。
ＦＧＦ−２１は、インスリンの存在および非存在においてマウス３Ｔ３−Ｌ１の脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激すること、ならびにｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、および８週齢の大人のＺＤＦラットにおいて、満腹時血糖および空腹時血糖と、トリグリセリド濃度と、グルカゴン濃度とを用量依存的に低減させることが示されている。このように、糖尿病および肥満を処置する療法としてＦＧＦ−２１の使用に関する基礎が示されている（Kharitonenkov et al. J Clin Invest. 2005 Jun;l 15(6): 1627-35および参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット）。また、Kharitonenkov et al. J Clin Invest. 2005 Jun;l 15(6): 1627-35には、ヒトＦＧＦ−２１を発現する遺伝子導入マウスが、低血糖であり、インスリン感受性であり、かつ食餌によって誘導される肥満に抵抗性であることが示されている。また、Kharitonenkov et al. Endocrinology（印刷中）には、ＦＧＦ−２１が、糖尿病のアカゲザルにおいてグルコース、トリグリセリド、インスリンおよびグルカゴンを低下させることが示されている。
さらに、ＦＧＦ−２１は、危篤状態にある患者の病的状態の緩和および死亡率の低減に有効であることが示されている（参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第０３／０５９２７０号パンフレット）。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０１７６６３１号明細書において、ＦＧＦ−２１は全体的な代謝状態に影響することについて記載されている。これによって、ＦＧＦ−２１は、非感染性の病理的原因から生じる全身性炎症反応症候群と同様に敗血症に対する身体のストレス応答時に生じ得る、副次的な悪影響を相殺し得る。したがって、ＦＧＦ−２１は、危篤状態の患者における病的状態の緩和および死亡率の低減を目的として使用され得る。危篤状態の患者は、医師、看護および呼吸管理を組織的かつ継続的に必要とする、生理学的に不安定な患者を含む。この種の介護は、一定した治療の監視および状態調節（titration）をもたらすために、細部にまで特別な注意を払う必要がある。危篤状態の患者は、生理学的な代償不全の危険性がある患者を含む。したがって、当該患者は、不都合な出来事を予防するために徹底した介護チームが即座の処置を施し得るように、絶え間ない監視を必要とする。危篤状態の患者には、監視および生命維持に関する特別な必要性がある。当該監視および生命維持は、継続的に状態が調節された（titrated）介護をもたらし得るチームによって提供されなければならない。
ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１ポリペプチドについて、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットに記載されている。国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットに記載されているＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１８１アミノ酸のポリペプチドである。国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットの配列番号１に示されている成熟型、野生型または未処理のヒトＦＧＦ−２１配列は、リーダー配列を欠いている。このヒトＦＧＦ−２１は、マウスＦＧＦ−２１（７９％以下のアミノ酸同一性）およびラットＦＧＦ−２１（８０以下のアミノ酸同一性）と高い同一性を有している。本明細書において配列番号５として示されているヒトＦＧＦ−２１配列は、国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットの配列番号１と同じ配列である。この配列は、１４６位にロイシン（Ｌ）を有する単一のヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を有している。当業者であれば、本明細書に記載の使用を目的とするヒトＦＧＦ−２１配列と十分な相同性を有する、代替可能な哺乳類ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列または類似物、変異体もしくは誘導体を容易に使用し得る。
本明細書において配列番号１として示されているヒトＦＧＦ−２１配列は、１４６位にプロリン（Ｐ）を有する単一のヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を有している。配列番号１のＮ末端にＨｉｓタグがついたバージョンは、本明細書において配列番号２として示されている。
国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットには、ＦＧＦ−２１化合物の特定の残基に対する、１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合的な連結について記載されている。生成される化合物は、ＰＥＧ付加された生物学的に活性なＦＧＦ−２１化合物であった。当該ＦＧＦ−２１化合物は、未処理のＦＧＦ−２１と比べて、延長された排出半減期および低減されたクリアランスを有していた。種々の位置においてシステインと置換することによって、少なくとも１つのＰＥＧ分子の連結が可能になった。１つ以上のリジン残基（５６、５９、６９および１２２）におけるＰＥＧ付加について説明されている。
ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１化合物は、障害（２型糖尿病、肥満症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、グルコース過敏症、高血糖症、および代謝症候群が挙げられる）を有する対象の処置に有用であろう。ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１化合物を有することは、以下の２つの理由から特に有利であろう。２つの理由は、より長い循環半減期を可能にすることによって有効性を増強し得ること、および必要な用量が少ないことである。また、この２つの理由によって、そのような療法を必要とする対象に対する利便性、および必要な投与量を患者が服薬遵守する見込みの両方が向上する。代謝症候群は、以下のような徴候のうちの少なくとも３つの集合と定義され得る。当該徴候は、腹部の脂肪（ほとんどの人において４０インチ以上のウエスト）；高い血糖（空腹時に少なくとも１デシリットルごとのミリグラム数（ｍｇ／ｄＬ）が１１０）；高いグリセリド（血流において少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ）；低いＨＤＬ（４０ｍｇ／ｄＬ未満）；および１３０／８５より高い血圧である。
親水性ポリマーであるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略す）の、共有結合性の連結は、多くの生体活性分子の水溶性、生体利用効率、血清中の半減期、もしくは治療半減期を増強する方法、免疫原性もしくは生物活性を調節する方法、または循環時間を延長する方法である。当該生物学的に活性な分子としては、タンパク質、ペプチド、および特に疎水性の分子が挙げられる。製薬用途、人工移植用途、ならびに生物適合性、毒性がないことおよび免疫原性がないことが重要である他の用途において、ＰＥＧは広範に使用されている。所望されるＰＥＧの特性を最大化するために、単一または複数のＰＥＧ分子の分子量および水和状態は、ＰＥＧポリマーの連結と典型的に関連する有利な特性を付与するために十分に高くなければならない。当該特性は、例えば、向上された水溶性および循環時間、一方で親分子の生物活性に悪影響を与えないことである。
ＰＥＧ誘導体は、反応性の化学官能性基、Ｎ末端部分および糖鎖部分を介して生物学的に活性な分子に対してしばしば連結される。当該化学官能性基は、例えば、リジン残基、システイン残基およびヒスチジン残基である。治療的ＦＧＦ−２１化合物の調合物に関する研究がなされているが、多くの理由について問題を有している。その理由の１つは、タンパク質および他の分子が、しばしばポリマーの連結に利用可能な反応性部位を限られた数しか有していないという理由である。しばしば、ポリマー連結を介する修飾にとって最も好適な部位は、受容体結合に受容な役割を果たしており、かつ分子の生物活性保持に必要である。結果として、生物学的に活性な分子上にあるそのような反応性の部位に対するポリマー鎖の無差別な連結は、しばしばポリマー修飾分子の生物活性の有意な低減または完全な消失さえ引き起こす（R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271 :21969-21977）。標的分子に所望される利点の付与とって十分なポリマーの分子量を有する接合体を形成するために、従来技術の試みは、典型的に標的分子に対してポリマーの多数のアームを無作為につなげることに関連している。これによって、親分子の生物活性が低減または完全に消失さえ生じるおそれが増大する。
タンパク質に対するＰＥＧ誘導体の連結に関する部位を形成する反応性部位は、タンパク質構造によって決定される。タンパク質（酵素が挙げられる）は、一般構造Ｈ２Ｎ−−ＣＨＲ−−ＣＯＯＨを有するαアミノ酸の種々の配列から構成されている。１つのアミノ酸のαアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）は、隣接するアミノ酸のカルボキシル部分（−−ＣＯＯＨ）に対して結合されてアミド結合を形成している。アミド結合は、−−（ＮＨ−−ＣＨＲ−−ＣＯ）ｎ−−（ここで、下付き文字の“ｎ”は、数百または数千であり得る）として表され得る。Ｒによって表される断片は、タンパク質の生物活性およびＰＥＧ誘導体の連結にとっての部位を含み得る。
例えば、アミノ酸リジンの場合、α位だけでなくε位に−−ＮＨ２部分が存在している。ε位の−−ＮＨ２は、塩基性ｐＨの条件下における反応に関して必要がない。ＰＥＧを有するタンパク質誘導体化の分野における技術の多くは、タンパク質に存在するリジン残基のε位の−−ＮＨ２に対する連結を目指したＰＥＧ誘導体の開発を対象にしている（"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17）。しかし、これらのＰＥＧ誘導体は、タンパク質の表面に存在するしばしば非常に多くのリジン残基の中から選択的にＰＥＧ誘導体を組み込み得ないという、一般的な制限を有する。これは、ある場合において実際に大きな制限であり得る。例えば、リジン残基が、酵素活性部位に存在していてタンパク質の活性に重要である場合、例えば、またはリジン残基が、受容体結合部位のように他の生体分子とタンパク質の相互作用を媒介する役割を果たす場合などである。
タンパク質のＰＥＧ付加する方法に存在する別の等しく重要な問題は、ＰＥＧ誘導体が、所望される反応以外の所望されない副反応を受け得ることである。ヒスチジンは、構造的に−−Ｎ（Ｈ）と表される反応性のイミノ部分を含んでいる。しかし、ε位の−−ＮＨ２と反応する化学反応性の多くの種はまた、−−Ｎ（Ｈ）と反応し得る。同様に、アミノ酸システインの側鎖は、構造的に−−ＳＨと表される自由なスルフィドリル基を有している。また、いくつかの例において、ε位の−−ＮＨ２を対象とするＰＥＧ誘導体は、システイン、ヒスチジンまたは他の残基と反応する。これは、ＰＥＧ誘導体化生物学的に活性な分子の複雑で不均一な混合物、および標的化されている生物学的に活性な分子の活性を破壊する危険性を生じ得る。タンパク質内の単一の部位に化学的な官能基が導入されることを可能にするＰＥＧ誘導体を開発することが望まれている。したがって、当該ＰＥＧ誘導体において、タンパク質表面における明確かつ予測可能な特定の部位において、生物学的に活性な分子に対する１つ以上のＰＥＧポリマーの選択的な結合が可能になる。
リジン残基に加えて、他のアミノ酸側鎖（システイン、ヒスチジンおよびＮ末端が挙げられる）を標的とする活性化ＰＥＧ試薬の開発に向けて、当該技術における多大な試みがなされている。例えば、"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17および参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，２８１号明細書を参照すればよい。システイン残基は、部位特異的変異生成および当該技術において公知の他の技術を用いてタンパク質の構造に部位特異的に導入され得る。そして、生成する自由なスルフィドリル部分は、チオール反応性の官能基を有するＰＥＧ誘導体と反応し得る。しかし、この試みは、自由なスルフィドリル基の導入が生成するタンパク質の発現、フォールディングおよび安定性を悪化させ得る点において、複雑である。したがって、タンパク質に対して１つ以上のＰＥＧポリマーを選択的に結合可能であると同時に、スルフィドリル基およびタンパク質に通常に見られる官能基と同時に適合性である（すなわち、所望されない副反応しない）化学官能基を、ＦＧＦ−２１に導入する方法が所望される。
当該分野における実験から分かるように、タンパク質の側鎖（特にリジンアミノ酸側鎖におけるＮＨ２部分、およびシステイン側鎖における−−ＳＨ部分）に対する連結用に開発されているこれらの多くの誘導体は、これらの合成および使用において問題があることが分かっている。これらのうちのいくつかは、タンパク質と不安定な結合を形成する。この不安定な結合は加水分解を受けるので、変質するか、分解されるか、またはそうでなければ水性環境（例えば、血流）において不安定である。これらのうちのいくつかはより安定な結合を形成するが、結合が形成される前に加水分解を受ける。つまり、タンパク質が連結され得る前に、ＰＥＧ誘導体における反応性基が不活性化され得るという意味である。これらのうちのいくつかは、多少の毒性を有しているので、インビボにおける使用に好適ではない。これらのうちのいくつかは、実際に有用であるには反応が遅過ぎる。これらのうちのいくつかは、タンパク質の活性を担う部位に連結することによってタンパク質の活性を消失させる。これらのうちのいくつかは、連結する部位に関して特異的ではないので、所望の活性を消失させ、かつ生成物の再現性がない。ポリ（エチレングリコール）部分を用いたタンパク質の修飾と関連する課題を克服するために、より安定なＰＥＧ（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０２，４９８号明細書）、あるいは分子および表面におけるチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，２８１号明細書）が開発されている。安定な化学結合を形成するために選択的に反応することが求められるまで、生理学的環境において化学的に不活性なＰＥＧ誘導体に対する、当該分野における明らかな必要性がある。
最近、タンパク質の部位特異的修飾に関連する多くの制限の克服を可能にする、タンパク質科学における全体に新たな技術が報告されている。新たな構成要素が、原核生物の大腸菌（E. coli）（例えば、L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500）、および真核生物の酵母（S. cerevisiae）（例えば、J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)）のタンパク質生合成機構に対して加えられている。これらの構成要素は、特に、インビボにおけるタンパク質に対する遺伝的にコードされないアミノ酸の組み込みを可能にしている。新規な化学的、物理的または生物学的特性を有する多くの新たなアミノ酸（光親和性標識し、かつ光異性化可能なアミノ酸、光架橋（photocrosslinking）アミノ酸（例えば、Chin, J. W., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024；およびChin, J. W., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027を参照すればよい）、ケトアミノ酸、重原子含有アミノ酸、および糖鎖付加アミノ酸が挙げられる）が、この方法論を用いて、アンバーコドンＴＡＧに応じてE. coliおよび酵母においてタンパク質に対して効率的かつ高い忠実度を有して組み込まれている。例えば、J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(1 1):1135-1137；J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:1 1020-1 1024；およびL. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1 : 1-1 1を参照すればよい。参考文献のすべては、参照によってその全体が組み込まれる。これらの研究は、タンパク質に見られず、遺伝的にコードされる一般的な２０のアミノ酸に見られる官能基のすべてに対して不活性であり、かつ効率的にかつ選択的に反応して安定な共有結合を形成するために使用され得る化学官能基（例えば、ケトン基、アルキン基およびアジド部分）を、選択的かつ日常的に導入することが可能であることを証明している。
遺伝的にコードされないアミノ酸をタンパク質に組み込む能力は、天然に生じる官能基（例えば、リジンのイプシロン−ＮＨ２、システインのスルフィドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基など）にとっての有益な代替物を提供できる化学官能基の導入を可能にする。ある種の化学官能基は、一般的な２０の遺伝的にコードされるアミノ酸に見られる官能基に対して不活性であるが、明確にかつ効率的に反応して安定な結合を形成することについて知られている。例えば、アジド基およびアセチレン基は、触媒量の銅が存在する水性条件においてヒュイゲン（Huisgen）［３＋２］付加環化反応を受けることが当該技術において知られている。例えば、Tornoe, et al., (2002) J. Ore. Chem. 67:3057-3064；およびRostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41 :2596-2599を参照すればよい。例えば、タンパク質構造にアジド部分を導入することによって、タンパク質に見られるアミン、スルフィドリル、カルボキシル基およびヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、アセチレン部分と速やかにかつ効率的に反応して付加環化生成物を形成する官能基を組み込むことができる。重要なことに、アセチレン部分のアセチレン部分の非存在下において、アジドは化学的に不活性のままであり、かつ他のタンパク質側鎖の存在および生理学的条件において非反応性を維持する。
本発明は、特にＦＧＦ−２１ポリペプチドの活性および生成と関連する問題に対処するものであり、また向上された生物学的または薬理的な特性（例えば、向上された治療的半減期）を有するＦＧＦ−２１ポリペプチドの生成に対処するものである。
本発明は、天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子に連結されている。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、さらなるＦＧＦ−２１ポリペプチドの少なくとも１つ、二官能性ポリマー、または二官能性リンカーに連結されている。
いくつかの実施形態において、上記天然にコードされていないアミノ酸が水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態において、上記水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記天然にコードされていないアミノ酸がリンカーを用いて水溶性ポリマーに連結されているか、または上記水溶性ポリマーに対して結合されている。いくつかの実施形態において、上記ポリ（エチレングリコール）分子は、二官能性ポリマーである。いくつかの実施形態において、上記二官能性ポリマーは、第２のポリペプチドと連結されている。いくつかの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる水溶性ポリマーに連結されているアミノ酸を少なくとも２つ含んでいる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸は、天然にコードされていないアミノ酸である。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置の１つ以上に組み込まれている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、配列番号３４〜３６における１位より前（すなわち、Ｎ末端）からＣ末端までの１つ以上の位置に組み込まれている。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：１０位、５２位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に組み込まれている。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：１０位、５２位、７７位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に組み込まれている。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：８７位、７７位、８３位、７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に組み込まれている。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に組み込まれている。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸は、配列番号３、４、６、７または他のＦＧＦ−２１配列のリーダー配列またはシグナル配列に組み込まれている。いくつかの実施形態において、リーダー配列は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３または４４から選択され得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１分泌コンストラクトは、配列番号３９、４０、４１、４２、４３または４４から選択されるリーダー配列を有するｐＶＫ７ａｒａ（Ｎｄｅ／Ｅｃｏ）にクローン化されている。
いくつかの実施形態において、以下の位置の１つ以上における非天然に生じるアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。当該位置としては、これらに限定されないが、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６１位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、配列番号３４〜３６における１位より前（すなわち、Ｎ末端）からＣ末端までの１つ以上の位置における非天然に存在するアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態において、以下の位置の１つ以上における非天然に存在するアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。当該位置としては、これらに限定されないが、１０位、５２位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、以下の位置の１つ以上における非天然に存在するアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置としては、これらに限定されないが、１０位、５２位、７７位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、以下の位置の１つ以上における非天然に存在するアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。当該位置としては、これらに限定されないが、８７位、７７位、８３位、７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、以下の位置の１つ以上における非天然に存在するアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。当該位置としては、これらに限定されないが、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、配列番号３、４、６、７、３９、４０、４１、４２、４３または他のＦＧＦ−２１配列のリーダー配列またはシグナル配列における、非天然に存在するアミノ酸の１つ以上が、水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態において、配列番号３、４、６、７または他のＦＧＦ−２１配列のリーダー配列またはシグナル配列における、非天然に存在するアミノ酸１つ以上が、水溶性ポリマーに連結されている。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体または結合パートナーに対するＦＧＦ−２１ポリペプチド親和性を調節する、置換、付加または欠失を含んでいる。当該結合パートナーとしては、これらに限定されないが、ｔ１ポリペプチド、小分子または核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の安定性と比べた場合に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの安定性を向上させる、置換、付加または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の免疫原性と比べた場合に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの免疫原性を調節する、置換、付加または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の血清半減期または循環時間と比べた場合に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの血清半減期または循環時間を調節する、置換、付加または欠失を含んでいる。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の水溶性と比べた場合に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの水溶性を増強させる、置換、付加または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の可溶性と比べた場合に、宿主細胞において生成されるＦＧＦ−２１ポリペプチドの可溶性を増強させる、置換、付加または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の発現または合成と比べた場合に、宿主細胞におけるＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現またはインビトロにおける合成を増強させる、置換、付加または欠失を含んでいる。この置換を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アゴニスト活性を維持し、かつ宿主細胞における発現レベルを維持しているか、または向上している。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１のプロテアーゼ耐性と比べた場合に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増強させる、置換、付加または欠失を含んでいる。米国特許第６，７１６，６２６号明細書において、置換されてプロテアーゼによる切断を変更し得る見込みのある部位として、これらに限定されないが、プロリンから２残基以内の一塩基部位が挙げられることが示された。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１と相互作用している受容体の活性と比べた場合に、ＦＧＦ−２１受容体のシグナル伝達活性を調節する、置換、付加または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の結合と比べた場合に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの他の分子（例えば、受容体）に対する結合を調節する、置換、付加または欠失を含んでいる。
ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１ポリペプチドの適合性と比べた場合に、薬学的な保存剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）とのＦＧＦ−２１ポリペプチドの適合性を増強させる、置換、付加または欠失を含んでいる。この増強された適合性によって、保存中にタンパク質の物理化学的性質および生物活性を維持している、保存用の薬学的調合物の調製が可能になる。参照によってその全体が組み込まれる国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットには、増強された薬学的安定性を有するＦＧＦ−２１変異体の例について述べられている。当該ＦＧＦ−２１変異体の例は、国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットの配列番号１の４２位のグリシン、５４位のグルタミン、７７位のアルギニン、８１位のアラニン、８６位のロイシン、８８位のフェニルアラニン、１２２位のリジン、１２５位のヒスチジン、１２６位のアルギニン、１３０位のプロリン、１３１位のアルギニン、１３９位のロイシン、１４５位のアラニン、１４６位のロイシン、１５２位のイソロイシン、１５４位のアラニン、１５６位のグルタミン、１６１位のグリシン、１６３位のセリン、１７０位のグリシン、または１７２位のセリンのうちの１つが、荷電アミノ酸および／または極性アミノ酸（無電荷）を用いて置換された変異体である。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当該ポリペプチドにおける対応する位置にこれらの置換を１つ以上含み得、および／または他の置換、付加もしくは欠失を１つ以上含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸は、以下の位置：４２位のグリシン、５４位のグルタミン、７７位のアルギニン、８１位のアラニン、８６位のロイシン、８８位のフェニルアラニン、１２２位のリジン、１２５位のヒスチジン、１２６位のアルギニン、１３０位のプロリン、１３１位のアルギニン、１３９位のロイシン、１４５位のアラニン、１４６位のプロリン／ロイシン、１５２位のイソロイシン、１５４位のアラニン、１５６位のグルタミン、１６１位のグリシン、１６３位のセリン、１７０位のグリシン、１７２位のセリン（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に置換されている。１つ以上の非天然アミノ酸は、以下の位置：９１位のグルタミン酸、１３１位のアルギニン、１０８位のグルタミン、７７位のアルギニン、７２位のアルギニン、８７位のヒスチジン、８６位のロイシン、１２６位のアルギニン、１１０位のグルタミン酸、８３位のチロシン、１４６位のプロリン、１３５位のアルギニン、９６位のアルギニン、３６位のアルギニン（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に置換されている。
国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットには、増強された薬学的安定性を有するＦＧＦ−２１の付加的な変異体について記載されている。当該変異体は、ＦＧＦ−２１における以下のアミノ酸：１９位のアルギニン、２０位のチロシン、２１位のロイシン、２２位のチロシン、２３位のスレオニン、２４位のアスパラギン酸、２５位のアスパラギン酸、２６位のアラニン、２７位のグルタミン、２８位のグルタミン、３１位のアラニン、３３位のロイシン、３５位のイソロイシン、３７位のロイシン、４１位のバリン、４２位のグリシン、４３位のグリシン、５０位のグルタミン酸、５４位のグルタミン、５８位のロイシン、６２位のバリン、６６位のロイシン、６７位のグリシン、６９位のリジン、７２位のアルギニン、７３位のフェニルアラニン、７６位のグルタミン、７７位のアルギニン、７９位のアスパラギン酸、８０位のグリシン、８１位のアラニン、８２位のロイシン、８４位のグリシン、８５位のセリン、９０位のプロリン、９２位のアラニン、９４位のセリン、９５位のフェニルアラニン、１００位のロイシン、１０２位のアスパラギン酸、１０４位のチロシン、１０７位のチロシン、１０９位のセリン、１１０位のグルタミン酸、１１５位のプロリン、１１７位のヒスチジン、１１８位のロイシン、１１９位のプロリン、１２１位のアスパラギン、１２２位のリジン、１２３位のセリン、１２４位のプロリン、１２５位のヒスチジン、１２６位のアルギニン、１２７位のアスパラギン酸、１２９位のアラニン、１３０位のプロリン、１３２位のグリシン、１３４位のアラニン、１３５位のアルギニン、１３７位のロイシン、１３８位のプロリン、または１３９位のロイシン（国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットの配列番号１を参照すればよい）の２つ以上に対するシステインの置換を含んでいる。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当該ポリペプチドにおける対応する位置においてこれらの置換を１つ以上含み得、および／または他の置換、付加もしくは欠失を１つ以上含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸は、以下の位置：１９位のアルギニン、２０位のチロシン、２１位のロイシン、２２位のチロシン、２３位のスレオニン、２４位のアスパラギン酸、２５位のアスパラギン酸、２６位のアラニン、２７位のグルタミン、２８位のグルタミン、３１位のアラニン、３３位のロイシン、３５位のイソロイシン、３７位のロイシン、４１位のバリン、４２位のグリシン、４３位のグリシン、５０位のグルタミン酸、５４位のグルタミン、５８位のロイシン、６２位のバリン、６６位のロイシン、６７位のグリシン、６９位のリジン、７２位のアルギニン、７３位のフェニルアラニン、７６位のグルタミン、７７位のアルギニン、７９位のアスパラギン酸、８０位のグリシン、８１位のアラニン、８２位のロイシン、８４位のグリシン、８５位のセリン、９０位のプロリン、９２位のアラニン、９４位のセリン、９５位のフェニルアラニン、１００位のロイシン、１０２位のアスパラギン酸、１０４位のチロシン、１０７位のチロシン、１０９位のセリン、１１０位のグルタミン酸、１１５位のプロリン、１１７位のヒスチジン、１１８位のロイシン、１１９位のプロリン、１２１位のアスパラギン、１２２位のリジン、１２３位のセリン、１２４位のプロリン、１２５位のヒスチジン、１２６位のアルギニン、１２７位のアスパラギン酸、１２９位のアラニン、１３０位のプロリン、１３２位のグリシン、１３４位のアラニン、１３５位のアルギニン、１３７位のロイシン、１３８位のプロリン、または１３９位のロイシンの１つ以上に置換されている（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）。
国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットには、天然に存在するジスルフィド結合に加えて、改変されたジスルフィド結合をＣｙｓ７５−Ｃｙｓ９３に有するＦＧＦ−２１の特定の変異体についてさらに記載されている。改変されたジスルフィド結合は、Ｇｌｎ７６Ｃｙｓ−ＳｅｒｌＯ９Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ｓｅｒ８５Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ７３Ｃｙｓ−Ｃｙｓ９３、Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１２５Ｃｙｓ、Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０４Ｃｙｓ、Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ、Ｓｅｒ９４Ｃｙｓ−Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１１５Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ、Ａｓｎ１２１Ｃｙｓ−Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１００Ｃｙｓ−Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ９５Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０７Ｃｙｓ、Ａｒｇ１９ＣｙｓＰｒｏ１３８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２０Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３７Ｃｙｓ、Ａｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｓｐ７９Ｃｙｓ、Ｐｒｏ９０Ｃｙｓ−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５０Ｃｙｓ−Ｌｙｓ６９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ａｓｐ２５Ｃｙｓ、Ａｌａ３１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ、Ｖａｌ４１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ５８Ｃｙｓ−Ｖａｌ６２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５４Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６６Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ−Ａｒｇ７２Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、Ａｒｇ７２Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、またはＡｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｌａ８１Ｃｙｓ（ここで、番号は国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットの配列番号１に基づいて付されている）である。改変されたジスルフィド結合を有するさらなる変異体は、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ；Ａｓｐ２４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１３５Ｃｙｓ；Ｌｅｕｌ１８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１３０Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ；Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１１９Ｃｙｓ；Ｇｌｙ８０Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ；Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ；Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ａｒｇ１２６Ｃｙｓ；Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ；Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ；Ｇｌｎ２７Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ；Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ；ｏｒ Ａｓｐ２５Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ（ここで、番号は国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットの配列番号１に基づいて付されている）である。改変されたジスルフィド結合を有するさらなる変異体は、Ｌｅｕ１１ｌ８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ；Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ；Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ；Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ／Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ（ここで、番号は国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットの配列番号１に基づいて付されている）である。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、は、当該ポリペプチドにおける対応する（複数の）位置にこれらの置換を１つ以上含み得、および／または他の置換、付加もしくは欠失を１つ以上含み得る。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当該ポリペプチドにおける対応する（複数の）位置（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にこれらの置換を１つ以上含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号３４〜３６における１位より前（すなわち、Ｎ末端）からＣ末端までの対応する位置にこれらの置換を１つ以上含み得る。
国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットには、ＰＥＧ付加されたＦＧＦ−２１の付加的な変異体について記載されている。これらの変異体は、以下の置換：Ｄ２５Ｃ、Ｄ３８Ｃ、Ｌ５８Ｃ、Ｋ５９Ｃ、Ｐ６０Ｃ、Ｋ６９Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｈ８７Ｃ、Ｅ９１Ｃ、Ｅ１０１Ｃ、Ｄ１０２Ｃ、Ｌ１１４Ｃ、Ｌ１１６Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｐ１３０Ｃ、Ｐ１３３Ｃ、Ｐ１４０Ｃのうちの１つを有していた。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当該ポリペプチドにおける対応する位置にこれらの置換を１つ以上含み得、および／または他の置換、付加もしくは欠失を１つ以上含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸は、以下の位置：のうちの１つ以上に置換されている２５位、３８位、５８位、５９位、６０位、６９位、７９位、８７位、９１位、１０１位、１０２位、１１４位、１１６位、１２２位、１２６位、１３０位、１３３位、１４０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号３４〜３６における１位より前（すなわち、Ｎ末端）からＣ末端までの対応する位置にこれらの置換を１つ以上含み得る。
国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットには、以下の位置：１９位、２１位、２６位、２８位、２９位、３０位、３６位、３９位、４２位、５０位、５６位、６１位、６４位、６５位、６８位、７０位、７１位、７７位、８１位、８５位、８６位、９０位、９２位、９４位、９８位、１０７位、１０８位、１１２位、１１３位、１２３位、および１２４位におけるシステイン置換について記載されている。国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットには、以下の位置：２４位、２７位、３７位、４０位、４４位、４６位、４９位、５７位、８８位、８９位、１０６位、１１０位、１１１位、１１５位、１２０位、および１３９位におけるシステイン置換について記載されている。国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットには、以下の位置：１８位、４５位、４７位、４８位、７８位、８３位、９９位、１０３位、１２５位、１２８位、１３１位、１３２位、および１３８位におけるシステイン置換について記載されている。国際公開第０５／０９１９４４号パンフレットには、以下の位置：２５位、３８位、５８位、５９位、６０位、６９位、７９位、８７位、９１位、１０１位、１０２位、１１４位、１１６位、１２２位、１２６位、１３０位、１３３位、および１４０位におけるシステイン置換について記載されている。
いくつかの実施形態において、１つ以上の改変された結合が１つ以上の非天然アミノ酸を用いて形成されている。分子内の結合は、多くの方法において形成され得る。当該方法としては、これらに限定されないが、好適な条件下における、タンパク質にある２つのアミノ酸の間の反応（１つまたは両方のアミノ酸が非天然アミノ酸であり得る）；リンカー、ポリマーまたは他の分子を用いた、好適な条件下における２つのアミノ酸（いずれも天然にコードされ得るか、または非天然にコードされ得る）の反応などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸または非天然に存在するアミノ酸を１つ以上用いられ得る。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸が少なくとも１つの置換に用いられていることを条件として、ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおけるアミノ酸置換には、天然に存在するアミノ酸または非天然に存在するアミノ酸が用いられ得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸を１つ以上用いられ得、かつ少なくとも１つの置換は、天然にコードされていないアミノ酸を任意に用いられる。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含んでいる。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はカルボニル基を含んでいる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造：
Figure 2020018314
（ここで、ｎが０〜１０であり；Ｒ１がアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２がＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；かつＲ３がＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ４がアミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）
を有している。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はアミノオキシ基を含んでいる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はヒドラジド基を含んでいる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はヒドラジン基を含んでいる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸残基はセミカルバジド基を含んでいる。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸残基はアジド基を含んでいる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造：
Figure 2020018314
（ここで、ｎが０〜１０であり；Ｒ１がアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず；ＸがＯ、ＮまたはＳであるか、または存在せず；ｍが０〜１０であり；Ｒ２がＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、かつＲ３がＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）
を有している。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はアルキン基を含んでいる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造：
Figure 2020018314
（ここで、ｎが０〜１０であり；Ｒ１がアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；ＸがＯ、ＮまたはＳであるか、または存在せず；ｍが０〜１０であり；Ｒ２がＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３がＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）
を有している。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニストまたは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニストまたは逆アゴニストは、水溶性ポリマーに連結されている天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニストまたは逆アゴニストは、天然にコードされていないアミノ酸および１つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマー、あるいは生物学的に活性な分子を含んでいる。
また、本発明は、ストリンジェントな条件下において配列番号８〜１４に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでいる、単離された核酸を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下において配列番号８〜１４に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでいる、単離された核酸を提供する（ここで、当該ポリヌクレオチドは少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）。また、本発明は、配列番号１〜７のように示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる、単離された核酸を提供する。また、本発明は、配列番号１〜７のように示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる、単離された核酸を提供する（ここで、当該ポリヌクレオチドは天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上有している）。多くのポリヌクレオチドが本発明のポリペプチドのいずれかをコードし得ることは、当業者に容易に理解される。
いくつかの実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンからなる群から選択される。
また、本発明は、水溶性ポリマーに連結されているＦＧＦ−２１ポリペプチドを製造する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる単離されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを、当該天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含んでいる水溶性ポリマーと接触させることを包含する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、一般的な２０のアミノ酸のいずれに対して非反応性の水溶性ポリマーに対して反応性である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、一般的な２０のアミノ酸のいずれに対して非反応性のリンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子に対して反応性である。
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されているＦＧＦ−２１ポリペプチドは、カルボニル含有アミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を含んでいるポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって、作製されている。いくつかの実施形態において、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されているＦＧＦ−２１ポリペプチドは、カルボニル基を含んでいるポリ（エチレングリコール）を、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるポリペプチドと反応させることによって、作製されている。ここで、当該天然にコードされていないアミノ酸は、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を含んでいる。
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されているＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アルキン含有アミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを、アジド部分を含んでいるポリ（エチレングリコール）と反応させることによって、作製されている。いくつかの実施形態において、アジド基またはアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）と連結されている。
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されているＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを、アルキン部分を含んでいるポリ（エチレングリコール）と反応させることによって、作製されている。いくつかの実施形態において、アジド基またはアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）に連結されている。
いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａまでの分子量を有している。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａまでの分子量を有している。
いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は分枝状のポリマーである。いくつかの実施形態において、分枝状のポリ（エチレングリコール）のそれぞれの分枝は、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａまでの分子量を有している。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結されている水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれている天然にコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれている天然にコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル部分を含んでおり、かつ水溶性ポリマーは、アミノオキシ部分、ヒドラジド部分、ヒドラジン部分またはセミカルバジド部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれている天然にコードされていないアミノ酸残基はアルキン部分を含んでおり、かつ水溶性ポリマーはアジド部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれている天然にコードされていないアミノ酸残基はアジド部分を含んでおり、かつ水溶性ポリマーはアルキン部分を含んでいる。
また、本発明は、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチド、および薬学的に受容可能な担体を含んでいる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。
また、本発明は、セレクターコドンを含んでおり、かつＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる細胞を提供する。いくつかの実施形態において、当該細胞は、ＦＧＦ−２１ポリペプチド内に天然にコードされていないアミノ酸を置換する直交性の（orthogonal）ＲＮＡシンセターゼおよび／または直交性のｔＲＮＡを含んでいる。
また、本発明は、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを製造する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、セレクターコドンと、直交性のＲＮＡシンセターゼと、直交性のｔＲＮＡとを含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする単一または複数のポリヌクレオチドを含んでいる細胞を、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる該ＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現を可能にする条件下にて培養すること；ならびに当該細胞および／または培養培地から上記ＦＧＦ−２１ポリペプチドを精製することを包含している。
また、本発明は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療半減期、血清半減期または循環時間を向上させる方法を提供する。また、本発明は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの免疫原性を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける天然に存在するアミノ酸のいずれか１つ以上を天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上によって置換すること、および／またはリンカー、ポリマーもしくは生物学的に活性な分子に対してＦＧＦ−２１ポリペプチドを連結することを包含している。
また、本発明は、本発明のＦＧＦ−２１分子の有効量を用いて、処置を必要としている患者を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチド、および薬学的に受容可能な担体を含んでいる薬学的組成物の治療有効量を、患者に投与することを包含している。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。
また、本発明は、天然にコードされていないアミノ酸によって置換されている少なくとも１つのアミノ酸性を除いて、配列番号１〜７に示される配列または任意の他のＦＧＦ−２１ポリペプチド配列を含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを提供する。また、本発明は、配列番号１、２、４および５として示される配列を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含んでいる。
また、本発明は、配列番号１〜７に示される配列もしくは任意の他のＦＧＦ−２１ポリペプチド配列を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチド、および薬学的に受容可能な担体を含んでいる薬学的組成物を提供する（ここで、少なくとも１つのアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸によって置換されている）。また、本発明は、配列番号１〜７に示される配列を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチド、および薬学的に受容可能な担体を含んでいる薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は糖部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは糖部分を介して上記ポリペプチドと連結されている。いくつかの実施形態において、リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子は、糖部分を介してＦＧＦ−２１ポリペプチドと連結されている。
また、本発明は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結されている水溶性ポリマーを含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを提供する。当該水溶性ポリマーは、単一のアミノ酸における共有結合によって、ＦＧＦ−２１ポリペプチドと連結されている。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。いくつか実施形態において、水溶性ポリマーと連結されているアミノ酸は、上記ポリペプチドに存在する天然にコードされていないアミノ酸である。
本発明は、少なくとも１つのリンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを提供する（ここで、当該リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子は、当該ポリペプチドにリボソームによって組み込まれている天然にコードされていないアミノ酸の官能基を介して、当該ポリペプチドに連結されている）。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドはＰＥＧ付加されている。また、本発明は、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上と連結されているリンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子を含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを提供する（ここで、当該天然にコードされていないアミノ酸は、あらかじめ選択された部位にリボソームによって、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれている）。
本発明の範囲には、ＦＧＦ−２１のコード領域と隣接しているＦＧＦ−２１のリーダー配列またはシグナル配列、この他にＦＧＦ−２１のコード領域と隣接しているＦＧＦ−２１の異種のリーダー配列またはシグナル配列が含まれる。選択される異種のリーダー配列またはシグナル配列は、宿主細胞によって認識されかつプロセシングされる（例えば、分泌するための宿主の分泌系によって認識されかつプロセシングされて、シグナルペプチダーゼによっておそらく切断される）配列であるべきである。本発明のリーダー配列は、以下：配列番号３および配列番号６に由来する２ロイシンリーダー（１〜２８のアミノ酸位置）、配列番号４および配列番号７に由来する２ロイシンリーダー（１〜２７のアミノ酸位置）、配列番号２に由来するＨｉｓタグ（１〜１０のアミノ酸位置）、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４のうちから選択される。本発明のＦＧＦ−２１を用いた健康状態または障害を処置する方法は、シグナルペプチドもしくはリーダーペプチド有するか、または有しないＦＧＦ−２１を用いて処置することを含むことが意図される。
また、本発明は、脂肪細胞におけるグルコース取り込みの増大を誘導する方法を提供する（ここで、当該方法は、グルコース取り込みの増大を誘導する有効量のＦＧＦ−２１を脂肪細胞に対して投与することを包含している）。当該グルコース取り込みの増大は、より急速かつ効率的なグルコースの利用によるエネルギー消費の増加を引き起こし得る。
他の実施形態において、非天然に存在するアミノ酸を１つ以上含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドの他の分子（ＰＥＧが挙げられる）に対する接合は、非天然アミノ酸に対する接合を利用した固有の化学反応によって、実質的に精製されたＦＧＦ−２１を提供する。天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上含んでいるＦＧＦ−２１の他の分子（例えば、ＰＥＧ）に対する接合は、実質的に精製されたＦＧＦ−２１を提供する接合段階の前または後に実施される、他の精製技術とともに実施され得る。
ＦＧＦ−２１アンバー変異および対応するＦＧＦ−１９における部位を示す図である。 ヒトＦＧＦ−１９の構造を示す図である。 ＦＧＦ−２１アンバー変異および対応するＦＧＦ−２における部位を示す図である。 ヒトＦＧＦ−１９の構造を示す図である。 Ｎ末端のＨｉｓタグ付きＦＧＦ−２１の発現および７つのアンバー部位における抑制を示す図である。 Ｎ末端のＨｉｓタグ付きＦＧＦ−２１の発現および７つのアンバー部位における抑制に由来するＢＰＥＲの上清サンプルを示す図である。 ＦＧＦ−２１変異体である３０Ｋ ＰＥＧ−３９１、３０Ｋ ＰＥＧ−４７７、３０Ｋ ＰＥＧ−Ｒ１３１、３０Ｋ ＰＥＧ−Ｑ１０８、ＨＩＳ−ＦＧＦ−２１（Ｈｉｓタグつきの野生型）の系列希釈に関するＥＣ５０を算出するシグマプロットを示す図である。 リスト化された各ＰＥＧ付加変異体に関する活性の損失倍率の平均を示す図である。 大腸菌において発現されたＨｉｓタグなしのＦＧＦ−２１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 （Ａ）はＦＧＦ−２１−Ｙ８３ｐＡＦ溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すずであり、（Ｂ）はタグなしのＦＧＦ−２１−Ｙ８３ｐＡＦのＱ ＨＰ溶出のクロマトグラムを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータを示す図である。 ｐＶＫ１０−ＦＧＦ−２１ベクターのマップを示す図である。 ｐＶＫ１０−ＦＧＦ−２１ベクターの配列を示す図である。 ラットにおけるＮ−６Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ−２１の３つの投与量の血清中濃度−時間特性、および皮下または静脈内のいずれかに０．２５ｍｇ／ｋｇが投与されたＮ−Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ−２１の血清中濃度―時間特性を示す図である。 （Ａ）は、図２７ａ−Ｃｍａｘにおける試験物質の血清中濃度に対する投与量の関係を示す図であり、（Ｂ）は、試験物質の末梢半減期に対する投与量の関係を示す図であり、（Ｃ）は、血清中濃度ＡＵＣに対する投与量の関係を示す図である。 （Ａ）は、ラットにおけるＰＰ ＷＴ ＦＧＦ−２１の３つの投与量の血清中濃度−時間特性を示す図であり、（Ｂ）は、皮下または静脈内のいずれかに０．２５ｍｇ／ｋｇが投与されたＰＰ ＷＴ ＦＧＦ−２１の血清中濃度―時間特性を示す図である。 （Ａ）は、Ｃｍａｘにおける試験物質の血清中濃度に対する投与量の関係を示す図であり、（Ｂ）は、試験物質の末梢半減期に対する投与量の関係を示す図であり、（Ｃ）は、血清中濃度ＡＵＣに対する投与量の関係を示す図である。 （Ａ）は、ラットの皮下に０．５ｍｇ／ｋｇを投与したＰＰ ＷＴ ＦＧＦ２１対Ｎ６−Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ２１に関して算出された末梢半減期の比較を示す図であり、（Ｂ）は、ラットの皮下に０．５ｍｇ／ｋｇを投与したＰＰ ＷＴ ＦＧＦ２１対Ｎ６−Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ２１に関して算出されたＣｍａｘ値の比較を示す図であり、（Ｃ）は、ラットの皮下に０．５ｍｇ／ｋｇを投与したＰＰ ＷＴ ＦＧＦ２１対Ｎ６−Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ２１に関して算出されたＡＵＣｉｎｆの比較を示す図である。 （Ａ）は、図３１ａ−１０のＰＥＧ付加Ｎ６−ＨｉｓタグつきＦＧＦ２１異性体のＰＫ特性を示す図であり、（Ｂ）は、図３１ｂ−０．２５ｍｇ／ｋｇを皮下注射後のＰＥＧ付加ＦＧＦ２１異性体に関する吸収特性を示す図であり、（Ｃ）は、０．２５ｍｇ／ｋｇを皮下注射後のＰＥＧ付加ＦＧＦ２１異性体に関する排出特性を示す図である。 図３２−２０ｋＤａ ＰＥＧ付加および３０ｋＤａ ＰＥＧ付加の薬物動態比較を示す図である。 ０．２５ｍｇ／ｋｇの２０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９１（Ｎ６―Ｈｉｓ）ＦＧＦ２１を用いて静脈内または皮下のいずれかに投与されたラットに関する、血漿中濃度の時間曲線を示す図である。 大腸菌におけるＦＧＦ−２１の分泌を示す２つのゲルを示す図である。
〔図面の簡単な説明〕
図１−ＦＧＦ−２１アンバー変異および対応するＦＧＦ−１９における部位が示されている。
図２−ヒトＦＧＦ−１９の構造が示されている。
図３−ＦＧＦ−２１アンバー変異および対応するＦＧＦ−２における部位が示されている。
図４−ヒトＦＧＦ−１９の構造が示されている。
図５−Ｎ末端のＨｉｓタグ付きＦＧＦ−２１の発現および７つのアンバー部位における抑制が示されている。
図６−Ｎ末端のＨｉｓタグ付きＦＧＦ−２１の発現および７つのアンバー部位における抑制に由来するＢＰＥＲの上清サンプルが示されている。
図７ａ−ＦＧＦ−２１変異体である３０Ｋ ＰＥＧ−３９１、３０Ｋ ＰＥＧ−４７７、３０Ｋ ＰＥＧ−Ｒ１３１、３０Ｋ ＰＥＧ−Ｑ１０８、ＨＩＳ−ＦＧＦ−２１（Ｈｉｓタグつきの野生型）の系列希釈に関するＥＣ５０を算出するシグマプロット。
図７ｂ−リスト化された各ＰＥＧ付加変異体に関する活性の損失倍率の平均を示す表。
図８−大腸菌において発現されたＨｉｓタグなしのＦＧＦ−２１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
図９−（Ａ）ＦＧＦ−２１−Ｙ８３ｐＡＦ溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ｂ）タグなしのＦＧＦ−２１−Ｙ８３ｐＡＦのＱ ＨＰ溶出のクロマトグラム。
図１０−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１１−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１２−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１３−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１４−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１５−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１６−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１７−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１８−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図１９−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図２０−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図２１−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図２２−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図２３−実施例２８から得られたラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性のデータ。
図２４−ｐＶＫ１０−ＦＧＦ−２１ベクターのマップ。
図２５−ｐＶＫ１０−ＦＧＦ−２１ベクターの配列。
図２６ａ−ラットにおけるＮ−６Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ−２１の３つの投与量の血清中濃度−時間特性。ラットは試験物質の皮下投与を受けた。１群ごとにＮ＝４の動物。記号は測定された血清中濃度の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。
図２６ｂ−皮下または静脈内のいずれかに０．２５ｍｇ／ｋｇが投与されたＮ−Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ−２１の血清中濃度―時間特性。ラットは試験物質の皮下投与を受けた。１群ごとにＮ＝４の動物。記号は測定された血清中濃度の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。合計の生体利用効率は８７％以下である。
図２７ａ−Ｃｍａｘにおける試験物質の血清中濃度に対する投与量の関係。Ｃｍａｘ値は、実測値が理論的ではないと報告されている。処置群ごとにＮ＝４の動物。直線回帰値は、傾きが３４８．５±９１．２２の０．５９である。
図２７ｂ−試験物質の末梢半減期に対する投与量の関係。処置群ごとにＮ＝４の動物。０．２５ｍｇ／ｋｇ以上におけるクリアランスの明らかな飽和のために、直線回帰値は算出できなかった。
図２７ｃ−血清中濃度ＡＵＣに対する投与量の関係。ＡＵＣ値は、実測値が無限大に対して算出されると報告されている。処置群ごとにＮ＝４の動物。直線回帰値は、傾きが１０７９±１９４．１の０．７５である。
図２８ａ−ラットにおけるＰＰ ＷＴ ＦＧＦ−２１の３つの投与量の血清中濃度−時間特性。ラットは試験物質の皮下投与を受けた。１群ごとにＮ＝４の動物。記号は測定された血清中濃度の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。
図２８ｂ−皮下または静脈内のいずれかに０．２５ｍｇ／ｋｇが投与されたＰＰ ＷＴ ＦＧＦ−２１の血清中濃度―時間特性。ラットは試験物質の皮下投与を受けた。１群ごとにＮ＝４の動物。記号は測定された血清中濃度の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。合計の生体利用効率は６５％以下である。
図２９ａ−Ｃｍａｘにおける試験物質の血清中濃度に対する投与量の関係。Ｃｍａｘ値は、実測値が理論的ではないと報告されている。処置群ごとにＮ＝４の動物。直線回帰値は、傾きが４５４．２±４２．４２の０．９２である。
図２９ｂ−試験物質の末梢半減期に対する投与量の関係。処置群ごとにＮ＝４の動物。０．１２５ｍｇ／ｋｇ以上におけるクリアランスの明らかな飽和のために、直線回帰値は算出できなかった。
図２９ｃ−血清中濃度ＡＵＣに対する投与量の関係。ＡＵＣ値は、実測値が無限大に対して算出されると報告されている。処置群ごとにＮ＝４の動物。直線回帰値は、傾きが１５８５±１３７．１の０．９３である。
図３０ａ−ラットの皮下に０．５ｍｇ／ｋｇを投与したＰＰ ＷＴ ＦＧＦ２１対Ｎ６−Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ２１に関して算出された末梢半減期の比較。両側ｔ検定を用いて算出されたｐ値は、０．７７１５である。群ごとにＮ＝３〜４の動物。
図３０ｂ−ラットの皮下に０．５ｍｇ／ｋｇを投与したＰＰ ＷＴ ＦＧＦ２１対Ｎ６−Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ２１に関して算出されたＣｍａｘ値の比較。両側ｔ検定を用いて算出されたｐ値は、０．７６５２である。群ごとにＮ＝３〜４の動物。
図３０ｃ−ラットの皮下に０．５ｍｇ／ｋｇを投与したＰＰ ＷＴ ＦＧＦ２１対Ｎ６−Ｈｉｓ ＷＴ ＦＧＦ２１に関して算出されたＡＵＣｉｎｆの比較。両側ｔ検定を用いて算出されたｐ値は、０．４３７２である。
図３１ａ−１０のＰＥＧ付加Ｎ６−ＨｉｓタグつきＦＧＦ２１異性体のＰＫ特性。
図３１ｂ−０．２５ｍｇ／ｋｇを皮下注射後のＰＥＧ付加ＦＧＦ２１異性体に関する吸収特性。
図３１ｃ−０．２５ｍｇ／ｋｇを皮下注射後のＰＥＧ付加ＦＧＦ２１異性体に関する排出特性。
図３２−２０ｋＤａ ＰＥＧ付加および３０ｋＤａ ＰＥＧ付加の薬物動態比較。
図３３−０．２５ｍｇ／ｋｇの２０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９１（Ｎ６―Ｈｉｓ）ＦＧＦ２１を用いて静脈内または皮下のいずれかに投与されたラットに関する、血漿中濃度の時間曲線。それぞれの動物に対して単回投与が行われた。記号は測定された血漿中濃度の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。合計の生体利用効率は３０％以下である。
図３４−大腸菌におけるＦＧＦ−２１の分泌を示す２つのゲル。第２のゲルにおける周辺質に放出される可溶性画分によって証明されるように、ＯｍｐＡ、ＭａｌＥおよびＳｔＩＩが非常に良好に機能した、使用されたリーダーを示している。
〔定義〕
本発明が本明細書に記載されている特定の方法論、手順、細胞株、構築物、および試薬に制限されず、従って変更し得ることは、理解されるべきである。また、本明細書において使用される専門用語が、特定の実施形態のみを説明ことを目的としており、かつ添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図しないことは、理解されるべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるときに、単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、文脈が別のものを明確に示している場合を除いて、複数を指すことを含む。従って例えば、“ＦＧＦ−２１”または“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”に対する言及は、１つ以上の当該タンパク質に対する言及であり、かつ当業者に知られるこれらの等価物などを含む。
他に明示されていない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者に通常に理解されるような、同じ意味を有する。任意の方法、装置、および物質、本明細書に記載されているそれらの類似物または等価物が、本発明の実践または試験に使用され得るが、好ましい方法、装置および材料は、これから説明される。
本明細書に述べられている公報および特許は、例えば、現在、説明されている本発明と関連して使用され得る公報に説明されている構築物および方法論を説明し、かつ開示することを目的として、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書において議論される公報は、本願の出願日の前における開示内容を単に規定される。本明細書において、発明者が、先の発明によって当該開示に先立つために、または任意の他の理由によって、権利を与えられないという承認として解釈されるべきではない。
“実質的に精製された”という用語は、天然に存在する環境（すなわち、天然の細胞、またはＦＧＦ−２１ポリペプチドが組換え的に産生される場合における宿主細胞）において見られるような、当該タンパク質と付随するか、または相互作用する化合物を実質的にまたはほとんど含み得ない、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを指す。細胞性物質を実質的に含み得ないＦＧＦ−２１ポリペプチドとしては、混入しているタンパク質が、（乾燥重量として）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である、タンパク質の調製物が挙げられる。ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたはこれらのバリアントが、宿主細胞において組換え的に産生される場合に、タンパク質は、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％もしくはそれ未満において存在し得る。ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたはこれらのバリアントが、宿主細胞において組換え的に産生される場合に、タンパク質は、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌもしくはそれ未満において培養培地に存在し得る。従って、本発明の方法によって産生されるときの、“実質的に精製された”ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、適切な方法（例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動）によって決定されるときの、少なくとも約３０％、少なくとも３５約％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の精製度合い、詳細には少なくとも約７５％、８０％、８５％の精製度合い、そしてより詳細には少なくとも約９０％の精製度合い、少なくとも約９５％の精製度合い、少なくとも約９９％またはそれ以上の精製度合いを有する。
“組換え宿主細胞”または“宿主細胞”は、挿入に使用される方法（例えば、直接的な取り込み、形質導入、ｆ−交配（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）、または組換え宿主細胞を作り出すために使用される他の公知の方法）にかかわらず、外来性のポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来性のポリヌクレオチドは、組み込まれないベクター（例えば、プラスミド）として維持され得るか、または宿主のゲノムに組み込まれ得る。
本明細書において使用されるときに、“培地”または“培養液”という用語は、任意の宿主細胞（細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳類宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物宿主細胞、E. coli、またはシュードモナス属の宿主細胞が挙げられる）、および細胞内容物を支持し得るか、または含有し得る任意の培養培地、溶液、固体、半固体、または固定支持を含む。従って、上記当該用語は、宿主細胞が培養されている培地（例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチドが分泌されている培地（増殖段階の前または後のいずれかにおける培地））を包含し得る。また、上記当該用語は、“ＦＧＦ−２１”ポリペプチドが細胞内において産生され、かつ宿主細胞が溶解されるか、または崩壊させられてＦＧＦ−２１ポリペプチドを放出するといった場合に、宿主細胞溶解液を含有する緩衝液または試薬を包含し得る。
タンパク質の折りたたみに関して本明細書において使用されるときに、“還元剤”は、還元状態においてジスルフィド結合を維持し、かつ分子内または分子間のジスルフィド結合を還元する、任意の化合物または物質として定義される。好適な還元剤としては、これらに限定されないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元グルタチオンが挙げられる。広範な還元剤が本発明の方法および組成物における使用に好適であることは、当業者にとって直ちに明らかになる。
タンパク質の折りたたみに関して本明細書において使用されるときに、“酸化剤”は、酸化される化合物から電子を除去できる、任意の化合物または物質として定義される。好適な酸化剤としては、これらに限定されないが、酸化グルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化ジチオスレイトール、酸化エリスレイトール、および酸素が挙げられる。広範な酸化剤が本発明の方法における使用に好適であることは、当業者にとって直ちに明らかになる。
“抗糖尿病薬”という用語は、任意のグルコース代謝疾患もしくはこれらの任意の合併症の処置、予防、またはその重症度の低減に有用な任意の薬剤を意味する。当該合併症としては、本明細書に記載の障害、疾患、または合併症のいずれかが挙げられる。抗糖尿病薬としては、インスリン、チアゾリジンジオン、スルフォニルウレア、安息香酸誘導体、またはα−グルコシダーゼ阻害剤などが挙げられる。主成分の一部であり得る他の一般的な種類の抗糖尿病薬としては（引用符内にある定義された用語）：公式の米国薬局方または公式の国民医薬品集（またはこれらに対する補足いずれか）に承認された“医薬品”；合衆国法典の第２１編に使用されているとおりの、米国のＦＤＡによって認可された“新薬”および“新規動物薬”；米国または海外において政府団体の認可を必要とする任氏の薬（“認可薬”）；米国法典の第２１編第３５５条の（ａ）に従うように規制当局の認可を必要とする任意の薬（“規制当局の認可薬”）；米国法典の第２１編第３７９条の（ｇ）の下におけるヒューマンドラッグの適用を条件としているか、または条件としていた、任意の薬剤（“ヒューマンドラッグ（human drug）”）が挙げられる（この定義にとっての法的な規定に対する出典のすべては、本願の出願日の時点における当該規定を指す）。本明細書において使用されるときに本発明の抗糖尿病薬は、少なくとも１０％の変化だけＨｂＡ１ｃレベルを低減し得ることが好ましく、本明細書において使用されるときに本発明の抗糖尿病薬は、少なくとも５０％の変化だけＨｂＡ１ｌｃレベルを低減し得ることがより好ましい。抗糖尿病薬としては、インスリン増強作用物が挙げられる。インスリン増強作用物としては、例えば、インスリンの分泌または活性をさらに増強する、タウリン、αリポ酸、桑の抽出物、クロム、グルタミン、エニコステンマ リットラーレ ブルーメ（Enicostemma littorale Blume）、スコパリア ドゥルシス（Scoparia dulcis）、タラゴンの抽出物、アンドログラフィス パニクラータ（Andrographis paniculata）、イソマルト、トレハロースまたはＤ−マンノースが挙げられる。
本明細書において使用されるときに、“変性剤（denaturing agent）”“変性剤（denaturant）”は、タンパク質の可逆的な変性を引き起こす、任意の化合物または物質として定義される。変性剤または変性剤の強さは、特定の変性剤または変性剤の性質および濃度の両方によって決定される。好適な変性剤または変性剤は、カオトロープ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、または当該試薬の２つ以上の組合せであり得る。好適なカオトロープとしては、これらに限定されないが、尿素、グアジニン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。有用な界面活性剤としては、これらに限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム、またはポリオキシエチレンエーテル（例えば、TweenまたはＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）といった強力な界面活性剤、サルコシル（Sarkosyl）、穏やかな非イオン性界面活性剤（例えば、ジギトニン）、Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムといった穏やかなカチオン性界面活性剤、穏やかなイオン性界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウム）または両性イオン性界面活性（これらに限定されないが、スルホベタイン（ツヴァイッタージェント）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパン硫酸塩（ＣＨＡＰＳ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる）が挙げられ得る。アセトニトリル、低級アルカノール（特にエタノールまたはイソプロパノールといったＣ２−Ｃ４アルカノール）、または低級アルカンジオール（特にエチレングリコールといったＣ２−Ｃ４アルカンジオール）といった、水混和性の有機溶媒が、変性剤として使用され得る。本発明において有用なリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールといった天然に存在するリン脂質であり得るか、またはジヘキサノイルホスファチジルコリンもしくはジヘプタノイルホスファチジルコリンといった合成リン脂質誘導体またはバリアントであり得る。
本明細書において使用されるときに“リフォールディング”は、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、不適切に折りたたまれた状態または変性された状態から、ジスルフィド結合に関して本来の立体構造または適切に折りたたまれた立体構造に変形させる、任意の過程、反応または方法を説明する。
本明細書において使用されるときに“コフォールディング（cofolding）”は、お互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを採用し、かつ変性されたポリペプチドまたは不適切に折りたたまれたポリペプチドの、本来の適切に折りたたまれたポリペプチドへの変形を結果として生じる、リフォールディングの過程、反応、または方法を特に指す。
本明細書において使用されるときに“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”、“線維芽細胞増殖因子”または“ＦＧＦ−２１”ならびにこれらのハイフンの付いていない様式は、線維芽細胞増殖因子２１の少なくとも１つの生物活性を有するこれらのポリペプチドおよびタンパク質だけでなく、これらのＦＧＦ−２１類似物、ＦＧＦ−２１アイソフォーム、ＦＧＦ−２１模倣物、ＦＧＦ−２１断片、ハイブリッドＦＧＦ−２１タンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、相同物、糖鎖付加様式バリアント、バリアント、スプライシングバリアント、ならびに突然変異タンパク質を含む。当該これらのＦＧＦ−２１類似物、ＦＧＦ−２１アイソフォーム、ＦＧＦ−２１模倣物、ＦＧＦ−２１断片、ハイブリッドＦＧＦ−２１タンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、相同物、糖鎖付加様式バリアント、バリアント、スプライシングバリアント、ならびに突然変異タンパク質は、同じ生物活性であるかにかかわらず、そしてさらにこれらの合成または製造の方法にかかわらない。これらの合成または製造の方法としては、これらに限定されないが、組換え法（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは核酸の他の形態から産生される）、インビボ法、インビトロ法、核酸分子の微量注入法、合成方法、遺伝子導入法、および遺伝子活性化法が挙げられる。“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”および“ＦＧＦ−２１”は、アミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を１つ以上有するＦＧＦ−２１ポリペプチドを包含する。
天然に存在するＦＧＦ−２１の多種多様な位置における置換について述べられている。置換としては、これらに限定されないが、薬物の安定性を調節する置換、アゴニスト活性を増強させる置換、プロテアーゼ耐性を向上させる置換、ポリペプチドをアンタゴニストに転換する置換などが挙げられる。これらの置換は、“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”または“ＦＧＦ−２１”という用語によって包含される。
リーダー配列を欠失するＦＧＦ−２１の配列については、本明細書における配列番号１、配列番号２および配列番号５を参照すればよい。リーダー配列を有するＦＧＦ−２１の配列については、本明細書における配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号７を参照すればよい。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１〜７またはＦＧＦ−２１ポリペプチドの他の任意の配列と実質的に同一である。ＦＧＦ−２１の多様な多形性が確認されている。ロイシンまたはプロリンは、米国特許出願公開第２００１００１２６２８号明細書および米国特許第６，７１６，６２６号明細書において同じ位置に記載されている。１アミノ酸（ロイシン）だけ異なるＮ末端のリーダー配列またはシグナル配列が、米国特許第６，７１６，６２６号明細書および米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書に示されている。ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２１ポリペプチド（変異体が挙げられる）をコードする核酸分子、ならびにＦＧＦ−２１ポリペプチドを発現し、かつ精製する方法は、よく知られている。これらの核酸分子および方法としては、これらに限定されないが、米国特許第６，７１６，６２６号明細書；米国特許出願公開第２００５／０１７６６３１号明細書、米国特許出願公開第２００５／００３７４５７号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１８５４９４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０２５９７８０号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１６４７１３号明細書および米国特許出願公開第２００１／００１２６２８号明細書；国際公開第０１／３６６４０号パンフレット；国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット；国際公開第０３／０５９２７０号パンフレット；国際公開第０４／１１０４７２号パンフレット；国際公開第０５／０６１７１２号パンフレット；国際公開第０５／０７２７６９号パンフレット；国際公開第０５／０９１９４４号パンフレット；国際公開第０５／１１３６０６号パンフレット；国際公開第０６／０２８５９５号パンフレット；国際公開第０６／０２８７１４号パンフレット；国際公開第０６／０５０２４７号パンフレット；国際公開第０６／０６５５８２号パンフレット；国際公開第０６／０７８４６３号パンフレットに記載のものが挙げられる。これらの文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
また、“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”という用語は、天然に存在するＦＧＦ−２１の薬学的に受容可能な塩およびプロドラッグ、ならびに天然に存在するＦＧＦ−２１の薬学的に受容可能な塩、多形体、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性バリアントおよび立体異性体のプロドラッグだけでなく、天然に存在するＦＧＦ−２１のアゴニストバリアント、模倣物バリアントおよびアンタゴニストバリアントならびにこれらのポリペプチド融合物を含む。アミノ末端、カルボキシル末端またはその両方に追加のアミノ酸を有する融合物は、“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”という用語に包含される。例示的な融合物としては、これらに限定されないが、例えば、メチオニルＦＧＦ−２１、精製用の融合物（ポリヒスチジンまたはアフィニティーエピトープとの融合物が挙げられる）、血清アルブミン結合ペプチドとの融合物、および血清タンパク質（例えば、血清アルブミン）との融合物が挙げられる。上記メチオニルＦＧＦ−２１において、メチオニンが、リーダーペプチドもしくはシグナルペプチドまたはこれらの部分を欠いているＦＧＦ−２１の成熟形態の組換え発現から生じるＦＧＦ−２１のＮ末端に対して連結されている（メチオニンが、組換え発現から生じるＦＧＦ−２１のＮ末端に対して連結されている）。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，３７３号明細書には、新規タンパク質を選択する方法について記載されている。新規タンパク質は、例えば、それぞれの受容体分子に対する変更された結合特性を有する成長ホルモンおよび抗体断片バリアントである。当該方法は、糸状ファージＭ１３のジーンＩＩＩコートタンパク質のカルボキシ末端に対する、所望のタンパク質をコードする遺伝子の融合を包含する。ＦＧＦ−２１および１つ以上の他の分子（これに限定されないが、ケラチン生成細胞増殖因子（ＫＧＦ）が挙げられる）を備えるキメラ分子が生成され得る（Reich-Slotky, R. et al., J. Biol. Chem. 270:29813-29818 (1995)）。上記キメラ分子は、ＦＧＦ−２１分子およびＫＧＦ分子の一方または両方の特異的な領域または断片を含み得る。そのような断片のいずれかは、標準的な生化学的方法によってタンパク質から調製され得るか、または当該断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって調製され得る。ＦＧＦ−２１またはこれらの断片は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはこれらの断片を有する融合タンパク質として産生され得る。そのような融合構築物は、真核宿主細胞におけるＦＧＦ−２１またはこれらの断片の発現の増強に好適である。例示的なＨＳＡ部分は、米国特許第５，７６６，８８３号明細書および国際公開第９７／２４４４５号パンフレットに開示されているとおり、Ｎ末端のポリペプチド（１〜３６９、１〜４１９および１位のアミノ酸に始まる中程度の長さ）を含んでいる。これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。他のキメラポリペプチドとしては、ＨＳＡのＣ末端またはＮ末端のいずれかに連結されたＦＧＦ−２１またはこれらの断片を有するＨＳＡタンパク質が挙げられ得る。そのようなＨＳＡ構築物は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７６，９６９号明細書に開示されている。ＦＧＦ−２１の哺乳類細胞発現について、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットに開示されている。
種々の文献に、ポリマー接合または糖鎖付加によるポリペプチドの修飾について開示されている。“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”という用語は、ＰＥＧといったポリマーに対して接合されるポリペプチドを含み、かつシステイン残基、リジン残基または他の残基の付加的な誘導体を１つ以上包含し得る。さらに、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、リンカーまたはポリマーを備え得、ここで、リンカーまたはポリマーが接合されるアミノ酸が、本発明に係る非天然アミノ酸であり得るか、またはリジンもしくはシステインに対する結合といった当該技術において公知の技術を利用して、天然にコードされるアミノ酸に対して接合され得る。
ＦＧＦ−２１および他のポリペプチドのポリマー接合物について報告されている。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットを参照すればよい。米国特許第４，９０４，５８４号明細書には、リジンを減らしたＰＥＧ付加ポリペプチドについて開示されている。当該ポリペプチドにおいて、少なくとも１つのリジン残基が欠失されているか、または任意の他のアミノ酸残基を用いて置換されている。国際公開第９９／６７２９１号パンフレットには、タンパク質をＰＥＧと接合する方法について開示されている。ここで、当該タンパク質における少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失され、かつ当該タンパク質が、当該タンパク質に対する接合を十分に実現する条件においてＰＥＧと接触される。国際公開第９９／０３８８７には、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ付加バリアントについて開示されている。ここで、当該ポリペプチドの特定の領域に配置される非必須なアミノ酸残基とシステイン残基が置換されている。国際公開第００／２６３５４号パンフレットには、少なくとも１つのさらなる糖鎖付加部位を備える対応する親ポリペプチドと比較して、低減されたアレルゲン性を有する糖鎖付加ポリペプチドバリアントの製造方法について開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，２１８，０９２号明細書には、本来のポリペプチドと比較して少なくとも１つのさらなる炭化水素鎖を導入可能にする、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および他のポリペプチドの修飾について開示されている。
また、“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”という用語は、糖修飾化ＦＧＦ−２１（例えば、これらに限定されないが、任意のアミノ酸位置において糖修飾されたポリペプチド、当該ポリペプチドのＮ結合型またはＯ結合型の糖修飾形態）を含む。また、単一のヌクレオチド変更を含むバリアントは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物活性バリアントと見做される。さらに、スプライシングバリアントも含まれる。また、“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”という用語は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドのヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマーまたはホモマルチマーを含む。ＦＧＦ−２１ポリペプチドのヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマーまたはホモマルチマーは、１つ以上の任意のＦＧＦ−２１ポリペプチド、および任意の他のポリペプチド、タンパク質、含水炭素、ポリマー、小分子、リンカー、リガンドもしくは任意の種類の他の生物学的に活性な分子から構成される。ＦＧＦ−２１ポリペプチドのヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマーまたはホモマルチマーを構成する分子は、化学的手法によって連結されるか、または融合タンパク質として発現される。ＦＧＦ−２１ポリペプチドのヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマーまたはホモマルチマーは、例えば、生物活性をまだ維持している特定の欠失または他の修飾を含有するポリペプチド類似物を含み得る。
本明細書に記載のＦＧＦ−２１におけるアミノ酸位置に関するすべての言及は、アミノ酸位置の比較が配列番号２、３、４、５、６、７または他のＦＧＦ−２１配列に基づいている場合に、特に断りがない限り、配列番号１における位置に基づいている。例えば、配列番号１の７７位におけるアミノ酸は、アルギニンであり、かつ対応するアルギニンは、配列番号２において８７位に位置している。配列番号１における位置と対応するアミノ酸位置が、任意の他のＦＧＦ−２１分子（例えば、配列番号２、３、４、５、６および７）において容易に同定されることは、当業者にとって十分に理解される。配列番号１、２、３、４、５、６、７または任意の他のＦＧＦ−２１配列における位置と対応するアミノ酸位置が、任意の他のＦＧＦ−２１分子（例えば、ＦＧＦ−２１の融合体、バリアント、断片など）において容易に同定されることは、当業者にとって十分に理解される。例えば、ＢＬＡＳＴといった配列整列化プログラムは、配列番号１、２、３、４、５、６、７または任意の他のＦＧＦ−２１配列における位置と対応する、タンパク質における特定の位置を整列化および同定するために使用され得る。また、配列番号１、２、３、４、５、６、７または任意の他のＦＧＦ−２１配列を参照して本明細書において記載されているアミノ酸の置換、欠失または付加は、本明細書に記載されているか、または当該技術において公知の、ＦＧＦ−２１の融合体、バリアント、断片などにおける対応する位置の置換、欠失または付加を指すこと、および本発明によって明白に包含されることを意図される。
“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”または“ＦＧＦ−２１”という用語は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を有するＦＧＦ−２１ポリペプチド２を包含する。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１つ以上の非天然アミノ酸修飾とともに、１つ以上の天然アミノ酸を用いた修飾を含み得る。天然に存在するＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける多種多様なアミノ酸位置における例示的な置換が記載されている。当該置換としては、薬物の安定性を調節する置換、およびＦＧＦ−２１ポリペプチドの１つ以上の生物活性を調節する置換が挙げられる。ＦＧＦ−２１ポリペプチドの１つ以上の生物活性を調節する置換は、これらに限定されないが、例えばアゴニスト活性を増強する置換、ポリペプチドの可溶性を向上させる置換、プロテアーゼに対する感受性を低減する置換、ポリペプチドをアンタゴニストに転換する置換である。これらの置換を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドが、“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”という用語に包含される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１アンタゴニストは、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる。天然にコードされていないアミノ酸は、当該ＦＧＦ−２１アンタゴニストにおける、ＦＧＦ−２１分子の受容体結合領域に存在する。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの分子生物活性を調節する置換、付加または欠失をさらに含んでいる。例えば、上記置換、付加または欠失は、ＦＧＦ−２１の１つ以上の特性または活性を調節し得る。例えば、上記置換、付加または欠失は、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体に対する親和性を調節し得るか、循環半減期を調節し得るか、治療半減期を調節し得るか、ポリペプチドの安定性を調節し得るか、プロテアーゼによる切断を調節し得るか、投与量を調節し得るか、放出もしくは生体利用効率を調節し得るか、精製を容易にし得るか、または投与の特定の経路を改善もしくは変更し得る。同様に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリペプチドの検出（ＧＦＰが挙げられるがこれに限定されない）、精製または他の性質を向上させる、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメインもしくは他の親和性に基づく配列または連結された分子を含み得る。抗体結合ドメインとしては、ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓが挙げられる。他の親和性に基づく配列としては、ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどが挙げられる。連結された分子としては、ビオチンが挙げられる。
また、“ＦＧＦ−２１ポリペプチド”という用語は、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマーおよびへテロマルチマーを包含する。ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマーおよびへテロマルチマーは、（１）同じかもしくは異なる天然にコードされていないアミノ酸側鎖に対してか、または天然にコードされるアミノ酸に対して、天然にコードされていないアミノ酸側鎖を介して直接に連結されているか、あるいは（２）リンカーを介して間接的に連結されている。例示的なリンカーとしては、これらに限定されないが、小有機分子、種々の長さの水溶性ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）またはポリデキストラン）、または種々の長さのポリペプチドが挙げられる。
“天然にコードされていないアミノ酸”は、一般的な２０のアミノ酸の１つまたはピロールリジンまたはセレノシステインではない、アミノ酸を指す。“天然にコードされていないアミノ酸”という用語と同意語として使用される他の当該用語は、“非天然アミノ酸（non-natural amino acid）”、“非天然アミノ酸（unnatural amino acid）”、“非天然に存在するアミノ酸”、ならびに種々のこれらのハイフンで結んだ様式およびハイフンで結んでいない様式である。また、“天然にコードされていないアミノ酸”という用語は、天然にコードされるアミノ酸（これらに限定されないが、一般的な２０のアミノ酸またはピロールリジンまたはセレノシステインが挙げられる）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、転写複合体によって伸張するポリペプチド鎖に天然に組み込まれないそれらであるアミノ酸を含むが、これに限定されない。当該天然にコードされていないアミノ酸の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、およびＯ−ホスホチロシンが挙げられる。
“アミノ末端修飾基”は、ポリペプチドアミノ末端に対して連結され得る任意の分子を指す。同様に、“カルボキシル末端修飾基”は、ポリペプチドのカルボキシル末端に対して連結し得る任意の分子を指す。末端修飾基としては、これらに限定されないが、水溶性ポリマー、ペプチドまたはタンパク質（例えば、血清アルブミン、またはペプチドの血中半減期を増加させる他の分子）が挙げられる。
“官能基”、“活性部分”、“活性化基”、“離脱基”、“反応性部位”、“化学反応性部位”および“化学反応性部分”という用語は、分子の明確な定義できる部分または単位を指すために、当該技術および本明細書において使用される。当該用語は、化学の技術においてやや同義的であり、かつある機能または活性を果たし、かつ他の分子と反応性である分子の部分を示すために、本明細書において使用される。
“連結”または“リンカー”という用語は、化学反応の結果として通常に形成され、かつ典型的に共有結合である基または結合を指すために本明細書において使用される。加水分解的に安定な連結は、連結が水中において安定であり、かつ長期間（おそらく無期限に等しい）にわたって有用なｐＨ値において（これに限定されないが、生理学的条件の下に、挙げられる）水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定であるか、または分解される連結は、連結が、水または水性溶液（例えば、血液が挙げられる）において分解されることを意味する。酵素的に不安定であるか、または分解される連結は、連結が１つ以上の酵素によって分解されること意味する。当該技術において理解されるように、ＰＥＧおよび関連するポリマーは、ポリマー骨格においてか、またはポリマー骨格と１つ以上のポリマー分子の末端修飾基との間にあるリンカー基において分解される連結を含む。例えば、ＰＥＧのカルボキシル酸または活性化したＰＥＧのカルボキシル酸の、生物学的に活性な作用物質におけるアルコール基との、反応によって形成されるエステル結合は、一般的に、当該作用物質を放出する生理学的条件の下に加水分解する。他の加水分解的に分解される連結としては、これらに限定されないが、炭酸塩結合；アミンおよびアルデヒドの反応から結果として生じたイミン結合；アルコールをリン酸基と反応させることによって形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジンおよびアルデヒドの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドおよびアルコールの反応産物であるアセタール結合；蟻酸エステルおよびアルコールの反応産物であるオルトエステル結合；アミン基（これに限定されないが、ＰＥＧといったポリマーの末端におけるアミン基が挙げられる）およびペプチドのカルボキシル基によって形成されるペプチド結合；ならびにホスホラミダイト（これに限定されないが、ポリマーの末端におけるホスホラミダイトが挙げられる）およびオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。
本明細書において使用される場合に、“生物学的に活性な分子”、“生物学的に活性な部分”または“生物学的に活性な作用物”という用語は、生体（これらに限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、菌類、植物、動物およびヒトが挙げられる）に関する、生物学的な系、経路、分子、または相互作用の任意の物理的または生化学的な特性に影響を及ぼし得る、任意の分子を意味する。特に、本明細書に使用されるときの、生物学的に活性な分子としては、これらに限定されないが、ヒトもしくは他の動物における疾患の診断、治療、鎮静、処置もしくは予防、またはそうでなければヒトまたは他の動物の肉体的もしくは精神的な健康を増進することを対象にした任意の物質が挙げられる。生物学的に活性な分子の例としては、これらに限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬、ワクチン、免疫原、習慣性の強い薬、習慣性の弱い薬、炭水化物、無機の原子または分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、類毒素、毒素、真核細胞および原核細胞、ウイルス、多糖類、ウイルス、細菌細胞、昆虫細胞、動物細胞または任意の他の細胞もしくは細胞種から得られた（か、または由来する）核酸またはこれらの部分、リポソーム、微小粒子、およびミセル体が挙げられる。本発明を伴う使用に好適な生物学的に活性な作用物の分類としては、これらに限定されないが、薬物、プロドラッグ、放射性核種、画像診断薬剤、ポリマー、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス薬、抗炎症誘発因子、抗腫瘍薬、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、および微生物由来毒素などが挙げられる。
“二官能性ポリマー”は、他の部分と特異的に反応して、共有的または非共有的な結合を形成可能な２つの別個の官能基を備えるポリマーを指す。当該部分としては、これに限定されないが、アミノ酸側鎖基が挙げられる。ニ官能性リンカーは、特定の生物活性成分における官能基と反応性である１つの官能基、および第２の生物学的成分における官能基と反応性である他の官能基を有している。そして、当該ニ官能性リンカーは、第１の生物活性成分、ニ官能性リンカーおよび第２の生物活性成分を包含する接合体の形成に使用され得る。ペプチドに対して種々の化合物を結合させる多くの手法およびリンカー分子が知られている。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第１８８，２５６号明細書；米国特許第４，６７１，９５８号明細書、米国特許第４，６５９，８３９号明細書、米国特許第４，４１４，１４８号明細書、米国特許第４，６９９，７８４号明細書；米国特許第４，６８０，３３８号明細書；および米国特許第４，５６９，７８９号明細書を参照すればよい。“多官能性リンカー”は、他の部分と特異的に反応して、共有的または非共有的な結合を形成可能な２つ以上の別個の官能基を備えるポリマーを指す。当該部分としては、これに限定されないが、アミノ酸側鎖基が挙げられる。二官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さもしくは分子量であり得、かつＦＧＦ−２１に連結される１つ以上の分子と、その受容体またはＦＧＦ−２１との間に所望される特定の空間または高次構造を供給するために選択され得る。
置換基が左から右に書かれる従来の化学式によって特定される場合に、それらは、右から左に構造を記載することによって生じる化学的に同一な置換基を等しく包含する（例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は構造−ＯＣＨ２−と等価である）。
“置換基”という用語は、これに限定されないが、“非干渉性の置換基”を含む。“非干渉的な置換基”は、安定な化合物を産生するこれらの基である。安定な非干渉的な置換基またはラジカルとしては、これらに限定されないが、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アラルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルカリル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１２アルキルスルフォニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（ここで、ｍは１から８までである）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、ヘテロ環ラジカル、置換ヘテロ環ラジカル、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（ここで、ｍのそれぞれは１から８までである）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、これらの塩などが挙げられる。本明細書において使用されるときに、Ｒのそれぞれは、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、アラルキル、またはアルカリルである。
“ハロゲン”という用語は、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素を含む。
それ自身によってか、または他の置換基の一部として“アルキル”という用語は、特に断りがない限りにおいて、完全に飽和され得るか、一飽和され得るか、または多飽和され得る、直鎖状もしくは分枝状の鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはこれらの組合せを意味し、かつ所望の炭素原子数（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１から１０の炭素を意味する）を有する２価または多価のラジカルを含み得る。飽和炭化水素ラジカルの例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの、類似物および異性体といった基が挙げられる。不飽和アルキル基は１つ以上の２重結合または３重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例としては、これらに限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高級な類似物および異性体が挙げられる。また、“アルキル”という用語は、特に断りがない限りにおいて、“ヘテロアルキル”といった以下においてより詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むことを意図される。炭化水素基に限定されるアルキル基は、“ホモアルキル”と称される。
それ自身によってか、または他の置換基の一部として“アルキレン”という用語は、これらに限定されないが、構造−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−によって例示されるような、アルカンから得られる２価のラジカルを意味し、かつ“ヘテロアルキル”として以下に記載されているこれらの基をさらに包含する。典型的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４の炭素原子を有すると共に、本明細書に記載される方法および組成物の特定の実施形態であるこれらの基は、１０以下の炭素原子を有する。“低級アルキル”または“低級アルキレン”は、８以下の炭素原子を一般的に有する、より短い鎖状のアルキル基またはアルキレン基である。
“アルコキシ”、“アルキルアミノ”および“アルキルチオ”（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味において使用され、かつ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子をそれぞれ介して分子の残余部分に対して連結されるこれらのアルキル基を指す。
それ自身によってか、または他の用語との組合せにおいて、“ヘテロアルキル”という用語は、特に断りがない限りにおいて、一定の数の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つの異種原子（ここで、窒素原子および硫黄原子は任意に酸化され、かつ窒素異種原子は任意に４級化される）から構成される安定な直鎖状もしくは分枝状の鎖、または環状炭化水素ラジカルを意味する。（複数の）異種原子、Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置においてか、アルキル基が分子の残余部に対して連結される位置において位置され得る。例としては、これらに限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３−）ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。最大で２つの異種原子が、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３といったように、連続し得る。同様に、それ自身によってか、または他の置換基の一部として、“ヘテロアルキレン”という用語は、これらに限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−に例示されるような、ヘテロアルキルから得られる２価のラジカルを意味する。また、ヘテロアルキレン基に関して、同じかまたは異なる異種原子は、鎖の末端のいずれかまたは両方を占有し得る（これらに限定されないが、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、およびアミノオキシアルキレンなどが挙げられる）。まださらに、アルキレン連結基およびへテロアルキレン連結基に関して、連結基の方向は、連結基の式が書かれている方向によって意味されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’およびＲ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を意味する。
それら自身によってか、または他の用語との組合せにおいて、“シクロアルキル”および“ヘテロシクロアルキル”という用語は、特に断りがない限りにおいて、“アルキル”および“ヘテロアルキル”ぞれぞれの環状の型を表す。従って、シクロアルキルまたはへテロシクロアルキルは、飽和環結合、部分的に不飽和の環結合および完全に不飽和の環結合を包含する。付加的に、ヘテロシクロアルキルに関して、異種原子は、異種原子が分子の残余部に対して連結される位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、これらに限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、これらに限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。付加的に、当該用語は、２環式環構造および３環式環構造を包含する。同様に、それ自身によってか、または他の置換基の一部として、“ヘテロシクロアルキレン”という用語は、ヘテロシクロアルキルから得られる２価のラジカルを意味し、かつそれ自身によってか、または他の置換基の一部として、“シクロアルキレン”という用語は、シクロアルキルから得られる２価のラジカルを意味する。
本明細書において使用されるときに、“水溶性ポリマー”という用語は、水性溶媒に可溶性の任意のポリマーを指す。ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する水溶性ポリマーの連結は、変化（これらに限定されないが、増強されたかもしくは調節された血中半減期、または非修飾形態と比べて増強されたかもしくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、調節された物理的な会合特性（例えば、凝集および多量体形成）、変更された受容体結合、１つ以上の結合パートナーに対する変更された結合、ならびに変更された二量体化もしくは多量体化が挙げられる）を生じ得る。水溶性ポリマーは、特有の生物活性を有し得るか、または有し得ず、かつ他の物質に対するＦＧＦ−２１の結合用のリンカーとして利用され得る。ここで、他の物質としては、これらに限定されないが、１つ以上のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または１つ以上の生物学的に活性な分子が挙げられる。好適なポリマーとしては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはモノＣ１−Ｃ１０アリールオキシ誘導体（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，２５２，７１４号明細書に記載されている）、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（硫化デキストランが挙げられる）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共ポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、オリゴ糖、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（これらに限定されないが、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる）、スターチおよびスターチ誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびこれらの誘導体、ポリアルキレングリコールおよびこれらの誘導体、ポリビニルエチルエーテル、ならびにα−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミドなどのコポリマー、あるいはこれらの混合物が挙げられる。当該水溶性ポリマーの例としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる。
本明細書において使用されるときに、“ポリアルキレングリコール”または“ポリ（アルキレングリコール）”という用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびこれらの誘導体を指す。“ポリアルキレングリコール”という用語は、直鎖状および分枝状のポリマーの両方、および０．１ｋＤａから１００ｋＤａの間の平均分子量を包含する。他の例示的な実施形態は、例えば、株式会社シェアーウォーター（Shearwater）のカタログ“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”（２００１）といった商業的な業者のカタログに挙げられている。
“アリール”という用語は、特に断りがない限りにおいて、共に融合されるか、または共有的に結合される単環または多環（これらに限定されないが、１から３つの環が挙げられる）であり得る、多価不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味する。“ヘテロアリール”という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる選択される１から４つの異種原子を含有するアリール基（または環）（ここで、窒素原子および硫黄原子は任意に酸化され、かつ（複数の）窒素原子は任意に４級化されている）を指す。ヘテロアリール基は、異種原子を介して分子の残余部に対して連結され得る。アリール基またはへテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上述のアリール環系およびヘテロアリール環系のそれぞれに関する置換基は、以下に記載される受容可能な置換基の群から選択される。
簡潔に言うと、他の用語との組合せにおいて使用される場合の、“アリール”という用語（これらに限定されないが、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルが挙げられる）は、上記において定義されるようなアリール環およびヘテロアリール環の両方を包含する。従って、“アリールアルキル”という用語は、アリール基がアルキル基に対して連結されている、これらのラジカル（これらに限定されないが、ベンジル、フェネチル、およびピリジルメチルなどが挙げられる）であって、当該アルキル基が、炭素原子が例えば、酸素原子によって置換されているこれらのアルキル基（これに限定されないが、メチレン基が挙げられる）を含むこれらのラジカル（これらに限定されないが、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、および３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられる）を包含することを意図される。
上述の用語のそれぞれ（これらに限定されないが、“アルキル”、“ヘテロアルキル”、“アリール”および“ヘテロアリール”が挙げられる）は、示されているラジカルの置換形態および非置換形態の両方を包含することを意図される。それぞれの種類のラジカルにとっての例示的な置換基が以下に規定される。
アリールラジカルおよびへテロアリールラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびへテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれるこれらの基が挙げられる）にとっての置換基は、これらに限定されないが、０から（２ｍ’＋１）までの範囲にある数における（ここで、ｍ’は当該ラジカルにおける炭素原子の総数である）、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される多様な群の１つ以上であり得る。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれは、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（これに限定されないが、１−３のハロゲンに置換されるアリールが挙げられる）、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を独立して指す。本発明の化合物が１つ以上のＲ基を含む場合に、例えば、Ｒ基のそれぞれは、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基のそれぞれであるように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が、同じ窒素原子に連結される場合に、それらは、５−、６−、７−員環を形成するために窒素原子と組わ合せられ得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、これらに限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図される。置換基の上述の議論から、当業者は、“アルキル”という用語が、水素基以外の基（例えば、ハロアルキル基（これらに限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３が挙げられる）およびアシル（これらに限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられる））に対して結合される炭素原子を含むことを意図されることを理解する。
アルキルラジカルに関して記載される置換基と同様に、アリール基およびへテロアリール基にとっての置換基は、変更され、かつこれらに限定されないが、０から芳香族環系における空いている原子価の総数までの範囲にある数において、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択され；ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’が独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が、２つ以上のＲ基を含む場合に、例えば、Ｒ基のそれぞれは、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれであるように、独立して選択される。
本明細書において使用されるときに、“調節された血中半減期”という用語は、その非修飾形態に比べて、調節されたＦＧＦ−２１の循環半減期における正または負の変化を意味する。血中半減期は、ＦＧＦ−２１の投与後における種々の時点において血液試料を採取すること、および試料のそれぞれにおける分子の濃度を決定することによって測定される。時間と血清濃度の相関関係によって、血中半減期の算出が可能になる。増強された血中半減期は、少なくとも約２倍を好ましく有するが、例えば、十分な投与計画を可能にするか、または毒作用を避ける場合には、より小さな増強が有用であり得る。いくつかの実施形態において、増強は少なくとも約３倍、少なくとも約５倍または少なくとも約１０倍である。
本明細書において使用されるときに、“調節された治療半減期”という用語は、その非修飾形態に比べて、治療有効量のＦＧＦ−２１の半減期における正または負の変化を意味する。治療半減期は、投与後における種々の時点において分子の薬物動態特性および／または薬理学的特性を測定することによって測定される。増強された治療半減期は、特に利益をもたらす投与計画または特に利益をもたらす総投与量を好ましく可能にするか、または好ましくない影響を好ましく回避する。いくつかの実施形態において、増強された治療半減期は、増強された有効性、修飾された分子のその標的に対する増強されたかもしくは低減された結合、プロテアーゼといった酵素による分子の増強されたかもしくは低減された崩壊、あるいは非修飾分子の作用の他の要因もしくは機序の増強もしくは低減、または分子の受容体媒介クリアランスの増強もしくは低減を生じる。
核酸またはタンパク質に対して適用される場合に“単離された”という用語は、核酸またはタンパク質が、天然の状態において会合される少なくともいくつかの細胞性構成要素から遊離していることか、または核酸もしくはタンパク質がインビボもしくはインビトロにおける産物の濃度よりも濃縮されていることを表す。それは、均質な状態にあり得る。単離された物質は、乾燥状態もしくは半乾燥状態、または溶液（これに限定されないが、水性溶液が挙げられる）内のいずれかにあり得る。それは、付加的な薬学的に受容可能な担体および／または賦形剤を包含する薬学的組成物の構成要素であり得る。純度および均質性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーといった分析化学的技術を用いて、典型的に決定される。調製物に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、かつ所定の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。“精製されている”という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドに生じることを表す。特に、それは、核酸またはタンパク質が、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも９９％かそれ以上の純度であることを意味し得る。
“核酸”という用語は、１本鎖の形態または２本鎖の形態のいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオチド、またはリボヌクレオシド、ならびにこれらのポリマーを指す。特に断りがない限りにおいて、当該用語は、基準の核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドに同様の様式において代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似物を含有する、核酸を包含する。また、特に断りがない限りにおいて、当該用語は、オリゴヌクレオチド類似物（ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術において使用されるＤＮＡの類似物（ホスホロチオネート、およびホスホロアミデートなど）が挙げられる）を指す。また、特に断りがない限りにおいて、特定の核酸配列は、これらの保存的に修飾されたバリアント（これに限定されないが、変性コドン置換が挙げられる）および相補的な配列、これらと同様に明確に示されている配列を暗に包含する。特に、変性コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換される配列を、生成することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) ；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、本明細書において交換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。すなわち、ポリペプチドを対象とする記載は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、かつ逆の場合も同様である。当該用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび１つ以上の残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに対して適用される。本明細書において使用されるときに、当該用語は、任意の長さ（全長のタンパク質が挙げられる）のアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は、共有的なペプチド結合によって連結されている。
“アミノ酸”という用語は、天然に存在するアミノ酸および非天然に存在するアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式に機能するアミノ酸類似物およびアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされるアミノ酸は、一般的な２０のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）およびピロールリジンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似物は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本の化学構造を有する化合物（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフォキシド、メチオニンメチルスルフォニウム）に対して結合されているα炭素）を指す。当該類似物は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本の化学構造を維持している。アミノ酸に対する言及は、例えば、天然に存在するタンパク新生のＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、アミノ酸バリアントおよび誘導体などの科学修飾アミノ酸；例えばβアラニン、オルニチンなどの天然に存在する非タンパク新生のアミノ酸；ならびにアミノ酸の特性を示すことが当該分野に公知の性質を有する化学合成された化合物を包含する。非天然に存在するアミノ酸の例としては、これらに限定されないが、α−メチルアミノ酸（例えばα−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンおよびα−メチルヒスチジン）、付加的なメチレンを側鎖に有するアミノ酸（“ホモ”アミノ酸）、ならびにスルホン酸基と置換されているカルボン酸を側鎖に有するアミノ酸（例えばシステイン酸が挙げられる）。
アミノ酸は、本明細書において、国際純正および応用化学連合−国際生化学連合 生化学命名委員会によって推奨される、一般的に知られる３文字表記、または１文字表記のいずれかによって、示される。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け容れられている１文字符号によって示される。
“保存的に修飾されたバリアント”は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に対して適用される。特定の核酸配列に関して、“保存的に修飾されたバリアント”は、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードするか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合に実質的に同一な、それらの核酸を指す。遺伝暗号の縮重のために、非常に多数の機能的に同一な核酸が、所定のタンパク質のいずれかをコードする。実際に、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのすべては、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定される任意の位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変更せずに、記載されている対応するコドンのうちいずれかのコドンに変更され得る。このような核酸の変異は、保存的に修飾される変異の１種である、“サイレント変異である”。また、ポリペプチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列は、核酸のすべての見込みのあるサイレント変異について説明している。当業者は、核酸におけるコドンのそれぞれ（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）が修飾されて、機能的に同一な分子を産生し得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異のそれぞれは、記載されている配列のそれぞれにおいて暗に示されている。
アミノ酸配列については、当業者は、コードされるアミノ酸における単一のアミノ酸または低い割合のアミノ酸を変更するか、付加するか、もしくは欠失する核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、化学的に類似のアミノ酸との、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、またはアミノ酸の置換を結果として生じる場合に、“保存的に修飾されるバリアント”であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を規定する保存的な置換の表は、当業者に公知である。当該保存的に修飾されたバリアントは、加えて、本発明の多形バリアント、種間相同物、および対立因子を除外しない。
機能的に類似のアミノ酸を規定する保存的な置換の表は、当業者に公知である。以下の８つの群のそれぞれ：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｌ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｐ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
は、他の１つのアミノ酸に対して保存的な置換であるアミノ酸を含む（例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)を参照すればよい。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における、“同一の”または“同一性の”割合は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。配列は、以下の配列比較演算手順（または当業者に利用可能な他の演算手順）の１つを用いてか、もしくは手動の整列化および目視検査によって測定されるような比較領域または所望の領域の全体にわたって最大の一致に関して比較され、かつ整列される場合に同じである割合（すなわち、特定の領域の全体にわたって、約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性）であって、それらがアミノ酸残基またはヌクレオチドの当該割合を有する場合に、“実質的に同一”である。また、この定義は、試験配列の相補性を指す。同一性は、少なくとも約５０のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域の全体にわたってか、または７５−１００のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域の全体にわたってか、または特に特定されないが、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全体の配列にわたって存在し得る。ヒト以外の種に由来する類似物を含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド配列またはこれらの断片を有する標識化プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件においてライブラリをスクリーニングするステップ、ならびに当該ポリヌクレオチド配列を含む全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するステップを包含する処理によって取得され得る。このようなハイブリダイゼーション技術は、当業者によく知られている。
配列比較に関して、１つの配列は、比較される試験配列に対して基準配列としての役目を典型的に果たす。配列比較演算手順を用いる場合に、試験配列および基準配列はコンピュータに入力され、必要に応じて配列調整が指示され、かつ配列演算手順プログラムが指示される。初期設定のプログラム変数が使用され得るか、または代替の変数が指示され得る。それから、配列比較演算手順は、プログラム変数に基づいて基準配列と比較した、試験配列に関する配列同一性の割合を算出する。
本明細書において使用されるときに、“比較領域”は、配列が、２つの配列が最適に整列化された後における連続する位置の同じ数の基準領域に対して比較され得る、２０から６００、通常には約５０から約２００、より通常には約１００から約１５０からなる群から選択される多くの連続する位置のいずれか１つの区分に対する言及を含む。比較に関する配列の整列化の方法は、当業者にとって公知である。比較に関する配列の最適な整列化は、これらに限定されないが、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局部的な相同性演算手順、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性整列化演算手順、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性に関する検索方法、これらの演算手順のコンピュータ化された実施（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動の整列化および目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) を参照すればよい）が挙げられる演算方法によって、実施され得る。
配列同一性および配列類似性の割合の決定に好適な演算手順の一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０演算手順である（それぞれ、Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、ncbi.nlm.nih.govにおけるワールドワイドウェブにおいて利用可能な全米バイオテクノロジー情報センターを通して公然に利用可能である。ＢＬＡＳＴ演算手順の変数Ｗ、ＴおよびＸは、整列化の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド用）は、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を初期設定として、かつ両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）を初期設定として、かつＢＬＯＳＵＭ６２ 採点マトリクス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照すればよい） ５０の位置合わせ（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴ演算手順は、無効にされる“低い複雑性”のフィルタを用いて典型的に実施される。
また、ＢＬＡＳＴ演算手順は、２つの配列間の類似性の統計的な分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照すればよい）。ＢＬＡＳＴ演算手順によって与えられる類似性の指標の１つは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の適合が偶然に生じる確率の指標を提供する、最小の総和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、基準核酸に対する試験核酸の比較において最小の総和確率が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満である場合に、基準配列に対して類似であると見做される。
“〜に対して選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする”という表現は、配列が複合混合物（これらに限定されないが、全体の細胞またはライブラリのＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる）内に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において、特定のヌクレオチド配列に対してのみ結合すること、２重鎖化すること、またはハイブリダイズすることを指す。
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”という表現は、当該技術において知られるように、低いイオン強度および高い温度の条件における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、もしくは他の核酸模倣物、またはこれらの組合せのハイブリダイゼーションを指す。典型的に、ストリンジェントな条件において、プローブは、核酸の複合混合物（これらに限定されないが、全体の細胞またはライブラリのＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる）においてその標的配列に対してハイブリダイズするが、複合混合物における他の配列とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、かつことなる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範に渡る指針は、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)に見られる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度 ｐＨにおいて、特定の配列に関する熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡状態において標的配列とハイブリダイズする（標的配列がＴｍにおいて過剰に存在し、プローブの５０％が平衡状態にあるような）、温度である（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸の濃度の条件下）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン濃度、典型的に約０．０１から１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、かつ温度が短いプローブ（これらに限定されないが、１０から５０のヌクレオチドが挙げられる）に関して少なくとも約３０℃、および長いプローブ（これらに限定されないが、５０を超えるヌクレオチドが挙げられる）に関して少なくとも約６０℃である条件であり得る。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドといった不安定化剤の添加を伴って達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、肯定のシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍の、任意にバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションであり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のとおり：６５℃において０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳにおける洗浄を伴う、４２℃においてインキュベートする５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳか、または６５℃においてインキュベートする５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳであり得る。当該洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０分、またはそれ以上にわたって実施され得る。
本明細書において使用されるときに、“真核生物”という用語は、動物（これらに限定されないが、哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類などが挙げられる）、繊毛虫類、植物（これらに限定されないが、単子葉植物、双子葉植物、藻類などが挙げられる）、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物といった、真核生物界の系統学的な領域に属する生体を指す。
本明細書において使用されるときに、“非真核生物”という用語は、非真核生物の生体を指す。例えば、非真核生物の生体は、系統学的な領域の真正細菌（これらに限定されないが、エシェリキア コリ、テルムス テルモフィルス、バチルス ステアロテルモフィルス、シュードモナス フルオレセンス、シュードモナス アエルギノーザ、シュードモナス プティダなどが挙げられる）、または系統学的な領域の古細菌（これらに限定されないが、メタノコッカス ジャンナスキー、メタノバクテリウム テムモアウトトゥロフィクム、ハロバクテリウム（例えば、ハロフェラックス ボルカニーおよびハロバクテリウム種のＮＲＣ−１）、アルカエオグロブス フルギダス、ピロコッカス フリオスス、ピロコッカス ホリコシー、アエウロピルム ペルニクスなどが挙げられる）に属することができる。
本明細書において使用されるときに、“対象”という用語は、処置、観察または実験の対象である動物、いくつかの実施形態において哺乳類、および他の実施形態においてヒトを指す。動物は、コンパニオンアニマル（例えばイヌおよびネコなど）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、およびウマなど）、または実験動物（例えばラット、マウスおよびテンジクネズミなど）であり得る。
本明細書において使用されるときに、“有効量”という用語は、処置されるべき疾患、健康状態または不調の症状の１つ以上をある程度まで和らげる、投与される修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドの量を指す。本明細書に記載されている修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドは、予防処置、処置の促進および／または治療処置を目的として投与され得る。
“増強”または“増強すること”は、所望の効能を、有効性または持続期間に関して向上するか、または延ばすことを意味する。従って、治療薬の効能を増強することに関して、“増強すること”という用語は、系における他の治療薬の効能を、有効性または持続期間に関して、向上するか、または延ばすことを指す。本明細書において使用されるときに、“増強有効量”は、所望の系におけるもう１つの治療薬の効能を十分に増強する量を指す。患者に使用される場合に、この使用に有効な量は、疾患、不調もしくは健康状態の重篤度および経過、以前の治療、患者の健康状態および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。
本明細書において使用されるときに、“修飾された”という用語は、ポリペプチドの長さに対する変更、アミノ酸配列の長さに対する変更、ポリペプチドの化学構造に対する変更、ポリペプチドの翻訳同時修飾、またはポリペプチドの翻訳後修飾といった所定のポリペプチドに対してなされる、任意の改変を指す。ポリペプチドについて議論されている“（修飾された）”形態という用語は、任意に修飾されており、すなわち、議論の項目におけるポリペプチドが修飾され得るか、または修飾され得ない。
“翻訳後に修飾された”という用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれた後に当該アミノ酸に生じる、天然または非天然のアミノ酸の任意の修飾を指す。当該用語は、ほんの一例として、インビボにおける翻訳同時修飾、インビトロにおける翻訳同時修飾（例えば、細胞外における翻訳系）、インビボにおける翻訳後修飾、およびインビトロにおける翻訳後修飾を包含する。
予防的な適用において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含有する組成物は、特定の疾患、不調または健康状態に影響を受けやすいか、またはさもなければその危険性が高い患者に対して投与される。そのような量は、“予防有効量”と定義される。また、この利用において、正確な量は、患者の健康状態および体重などに依存する。日常的な実験による当該予防有効量（例えば、用量の段階的増大の臨床試験）の決定は、当業者の範囲内にあると十分に見做される。
“保護された”という用語は、ある反応条件における化学的に反応性の官能基の反応を防ぐ“保護基”または保護部分の存在を指す。保護基は、保護される化学的に反応性の基の種類に依存して変わる。例えば、化学的に反応性の基がアミンまたはヒドラジドである場合に、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）からなる群から選択され得る。化学的に反応性の基がチオールである場合に、保護基はオルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性の基がブタン酸もしくはプロピオン酸といったカルボキシル酸、またはヒドロキシル基である場合に、保護基は、ベンジル基またはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチルといったアルキル基であり得る。また、当該分野において公知の他の保護基（ＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃといった感光性基が挙げられる）が、本明細書に記載される方法および組成物においてか、または共に使用され得る。また、当該技術において公知の保護基が、本明細書に記載される方法および組成物においてか、または共に使用され得る。
ほんの一例として、封鎖基／保護基は、
Figure 2020018314
から選択され得る。
他の保護基は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999に記載されている。
治療的適用において、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、すでに疾患、健康状態または不調になっている患者に対して、疾患、不調または健康状態の症状を治療するか、または少なくとも部分的に進行を押さえるために十分な量において、患者に対して投与される。当該量は、“治療的有効量”であると定義され、かつ疾患、不調もしくは健康状態の重篤度および経過、以前の治療、患者の健康状態および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。日常的な実験によって当該治療有効量を（例えば、用量の段階的増大の臨床試験）を決定することは、当業者の範囲内にあると十分に見做される。
“処置すること”という用語は、予防的処置および／または治療的処置のいずれかを指して使用される。
本明細書に示される天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、天然に通常に見られる原子量または質量数とは異なる、原子量または質量数を有する原子によって置換された１つ以上の原子を有する同位体標識された化合物を包含し得る。本化合物に組み込まれ得る同位元素の例としては、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌのそれぞれといった、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素および塩素の同位元素が挙げられる。例えば、３Ｈおよび１４Ｃといった放射性同位元素が組み込まれている化合物である、本明細書に記載されるある特定の同位体標識された化合物は、薬物および／または基質の組織分布アッセイにおいて有用であり得る。さらに、重水素（すなわち、２Ｈ）といった同位体との置換は、より優れた代謝安定性（例えば、インビボにおける増強された半減期または低減された要求用量）を結果として生じるある治療的利点を与えることができる。
異性体のすべて（これらに限定されないが、ジアステレオ異性体、光学異体、およびこれらの混合物が挙げられる）は、本明細書において記載される組成物の一部として見做される。付加的なまたはさらなる実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、所望の効果（所望の治療効果が挙げられる）を生じるために、それから使用される代謝物の産生を必要とする生体に対する投与の後すぐに代謝される。さらなるまたは付加的な実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の活性な代謝物である。
いくつかの状況において、天然にコードされていないアミノ酸は、互変異性体として存在し得る。さらに、本明細書に記載される天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、水、およびエタノールといった薬学的に受容可能な溶媒と溶媒和された形態だけでなく、溶媒和されていない形態に存在し得る。また、溶媒和された形態は、本明細書に開示されていると見做される。当業者は、本明細書における化合物のいくつかが、種々の互変異性体において存在できることを認識する。当該互変異性体のすべては、本明細書に記載される組成物の一部と見做される。
特に断りがない限りにおいて、当業者の範囲内にある質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法が、採用される。
〔詳細な説明〕
＜Ｉ．序文＞
少なくとも１つの非天然アミノ酸を備えるＦＧＦ−２１分子が、本発明において提供される。本発明のある特定の実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの翻訳後修飾を包含する。１つの実施形態において、ＦＧＦ−２１の少なくとも１つの翻訳後修飾は、分子（これらに限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似物、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補足因子、脂肪酸、含水炭素、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖鎖、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸、生体適合物質、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規な官能基、他の分子と共有的にかもしくは非共有的に相互作用する基、光ケージド部分、化学線励起部分、光異性体化可能な部分、ビオチン、ビオチン類似物、ビオチン類似物、重元素を組み込む部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、延長された側鎖、炭素結合型の糖、酸化還元的に活性な物質、アミノチオ酸、毒性部分、同位体的標識部分、生物物理学的なプローブ、リン光基、化学発光基、電子高密度基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー転移物質、生物学的に活性な物質、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲物質、または上述のものの任意の組合せもしくは特定の反応性にとって好適であることが当業者に知られている化学方法論に利用される第１の反応性基を備える少なくとも１つの非天然アミノ酸に対して反応性の第２の基を備える、他に所望する任意の化合物もしくは物質が挙げられる）の連結を含む。例えば、第１の反応性基が、アルキニル部分（これに限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ここでまた、プロパルギル基は、ときにアセチレン部分と呼ばれる）における、が挙げられる）であり、かつ第２の反応性基が、アジド部分であり、かつ［３＋２］付加環化化学方法論が利用される。他の例において、第１の反応性基が、アジド部分（これに限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる）であり、かつ第２の反応性基がアルキニル部分である。本発明の修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドのある特定の実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾を備える、少なくとも１つの非天然アミノ酸（これに限定されないが、ケト基を含有する非天然アミノ酸が挙げられる）が、使用される（ここで、少なくとも１つの翻訳語後修飾が、糖鎖部分を備える）。ある特定の実施形態において、翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞のインビボにおいてなされる。リンカーポリマー、水溶性ポリマー、または他の分子は、ポリペプチドに対して分子を連結し得る。分子はポリペプチドに対して直接に連結され得る。
ある特定の実施形態において、タンパク質は、１つの宿主細胞によってインビボにおいてなされる少なくとも１つの修飾転写後修飾を含み、ここで、修飾転写後修飾は他の宿主によって通常になされない。ある特定の実施形態において、タンパク質は、真核細胞によってインビボにおいてなされる少なくとも１つの修飾転写後修飾を含み、ここで、修飾転写後修飾は非真核細胞によって通常になされない。修飾転写後修飾の例としては、これらに限定されないが、糖鎖付加、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、および糖脂質結合修飾などが挙げられる。１つの実施形態において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン酸結合によるアスパラギン酸に対するオリゴ糖（これに限定されないが、オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを包含する場合が挙げられる）の連結を包含する。他の実施形態において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、またはＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、セリンまたはスレオニンに対するオリゴ糖（これらに限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられる）の連結を包含する。ある特定の実施形態において、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌シグナル配列もしくは局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、および／またはＧＳＴ融合などを包含し得る。分泌シグナル配列の例としては、これらに限定されないが、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌発現用の５’最適化された真核生物の分泌シグナル配列、新規な分泌シグナル配列、ペクチン酸塩リアーゼ分泌シグナル配列、Ｏｍｐ Ａ分泌シグナル配列、およびファージの分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列の例としては、これらに限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ ＧＩＩＩおよびＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）、ならびにトランスポゾンから得られるシグナル配列ｂｌａが挙げられる。任意の当該配列は、修飾（これらに限定されないが、１つのシグナル配列を異なるシグナル配列に置換すること、あるリーダー配列を異なるリーダー配列に置換することなどが挙げられる）されてポリペプチドに所望の結果を提供し得る。
所定のタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、または１０もしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含有できる。非天然アミノ酸は、同じであるか、または異なり得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を備えるタンパク質における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる部位にあり得る）。ある特定の実施形態において、タンパク質の天然に存在する型に存在する特定のアミノ酸のすべてではないが、少なくとも１つが、非天然アミノ酸に置換されている。
本発明は、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１を基にした方法および組成物を提供する。ＦＧＦ−２１への少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸の導入は、通常に存在する２０のアミノ酸と反応しないが、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸と反応する（限定されないが、これが挙げられる）、特定の化学反応を含む接合化学的性質の適用を可能にする。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）といった水溶性ポリマーに対して、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して連結される。本発明は、ＰＥＧ誘導体を用いてタンパク質を選択的に修飾する高効率の方法を提供する。本発明は、遺伝的にコードされないアミノ酸（これらに限定されないが、天然に組み込まれる２０のアミノ酸に見られない官能基または置換基（これらに限定されないが、ケトン、アジドまたはアセチレン部分が挙げられる）を含有するこれらのアミノ酸が挙げられる）のセレクターコドンに応じたタンパク質への効率的な組み込み、および好適な反応性の分子を用いたこれらのアミノ酸の一連の修飾を含む、タンパク質を他の分子（これらに限定されないが、ポリマー、リンカーまたは生物学的に活性な分子が挙げられる）と連結することによって、タンパク質を選択的に修飾する高効率な方法を提供する。組み込まれると、それから、アミノ酸側鎖は、天然にコードされていないアミノ酸に存在する特定の官能基または置換基にとって好適であると当業者に知られる、化学方法論を利用することによって修飾され得る。多種多様な公知の化学方法論が、水溶性ポリマーをタンパク質に組み込むために、本発明における使用にとって好適である。当該方法論としては、これに限定されないが、ヒュイゲン［３＋２］付加環化反応（これらに限定されないが、アセチレン誘導体またはアジド誘導体のそれぞれとの、ヒュイゲン［３＋２］付加環化反応が挙げられる）（例えば、Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109；およびHuisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176を参照すればよい）が挙げられる。
ヒュイゲン［３＋２］付加環化法が求核置換反応よりむしろ付加環化に関するので、タンパク質は非常に高い選択性をともなって修飾され得る。反応は、室温および水性条件において、非常に良好な位置選択性（１，４＞１，５）をともなって、反応混合物に触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を添加することによって実施され得る。例えば、Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599および国際公開第０３／１０１９７２号パンフレットを参照すればよい。［３＋２］付加環化を介して本発明のタンパク質に加えられ得る分子としては、好適な官能基または置換基（これらに限定されないが、アジド誘導体またはアセチレン誘導体が挙げられる）を有する実質的に任意の分子が挙げられる。これらの分子は、アセチレン基またはアジド基を有する非天然アミノ酸のそれぞれに対して加えられ得る。アセチレン基を有する非天然アミノ酸としては、これに限定されないが、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンが挙げられる。アジド基を有する非天然アミノ酸としては、これに限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニンが挙げられる。
ヒュイゲン［３＋２］付加環化から生じる５員環は、還元性環境において一般的に不可逆的であり、かつ水性環境において長期間にわたって加水分解に対して安定である。結果として、多種多様な物質の物理的および化学的な特性が、本発明の活性ＰＥＧ誘導体をともなう厳しい水性条件において修飾され得る。さらに重要なことに、アジド部分およびアセチレン部分が互いに特異的である（そして、例えば遺伝的にコードされる一般的な２０のアミノ酸のいずれとも反応しない）ので、タンパク質は非常に高い選択性をともなって１つ以上の特定の部位において修飾され得る。
また、本発明は、ＰＥＧ誘導体の加水分解に対して安定な水溶性の誘導体を提供し、かつ１つ以上のアセチレン部分またはアジド部分を有する親水性ポリマーに関する。アセチレン部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質に選択的に導入されているアジド部分と結合する高い選択性を有する。同様に、アジド部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質に選択的に導入されているアセチレン部分と結合する高い選択性を有する。
より詳細には、アジド部分は、これらに限定されないが、アルキルアジド、アリールアジドおよびこれらのアジドの誘導体を包含する。アルキルアジドおよびアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的な反応性が維持される限りにおいて、他の置換基を含み得る。アセチレン部分は、アルキルアセチレン、アリールアセチレンおよびそれぞれの誘導体を包含する。アルキルアセチレンおよびアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的な反応性が維持される限りにおいて、他の置換基を含み得る。
本発明は、他の物質（これらに限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似物；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補足因子；脂肪酸；含水炭素；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖鎖；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体適合物質；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規な官能基；他の分子と共有的にかもしくは非共有的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線励起部分；光異性体化可能な部分；ビオチン；ビオチン類似物；ビオチン類似物；重元素を組み込む部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；延長された側鎖；炭素結合型の糖；酸化還元的に活性な物質；アミノチオ酸；毒性部分；同位体的標識部分；生物物理学的なプローブ；リン光基；化学発光基；電子高密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー転移物質；生物学的に活性な物質；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲物質；または上述のものの任意の組合せ、もしくは他に所望される任意の化合物もしくは物質が挙げられる）との、多種多様な官能基、置換基または部分を有する物質の接合体を提供する。また、本発明は、対応するアセチレンまたはアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体との、アジドまたはアセチレン部分を有する物質の接合体を包含する。例えば、アジド部分を含有するＰＥＧポリマーは、アセチレン官能性基を有する遺伝的にコードされないアミノ酸を含有するタンパク質における位置において、生物学的に活性な分子に対いて連結され得る。ＰＥＧおよび生物学的に活性な分子が連結される結合としては、これに限定されないが、ヒュイゲン［３＋２］付加環化産物が挙げられる。
ＰＥＧを用いて生体材料の表面を修飾し得ることは、当該技術において十分に確立されている。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６１０，２８１号明細書；Mehvar, R., J. Pharm Pharm ScL, 3(1):125-136 (2000)を参照すればよい。また、本発明は、１つ以上のアジド反応性部位もしくはアセチレン反応性部位を有する表面、およびヒュイゲン［３＋２］付加環化結合を介して当該表面に結合されている本発明のアジドもしくはアセチレン含有ポリマーを備えている生体材料を含む。また、生体材料および他の物質は、アジド結合またはアセチレン結合以外の結合を介してアジドまたはアセチレン活性化ポリマーに対して結合され得る。当該結合は、例えば、後の反応に利用可能なアジド部分またはアセチレン部分を残しておくための、カルボン酸、アミン、アルコールまたはチオール部分を含んでいる結合である。
本発明は、本発明のアジド含有ポリマーおよびアセチレン含有ポリマーを合成する方法を包含する。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アジドは、ポリマーの炭素原子に対して直接に結合され得る。他の方法として、アジド含有ＰＥＧ誘導体は、生成されるポリマーがその末端にアジド部分を有するように、１つの末端にアジド部分を有する連結剤を従来の活性化ポリマーに対して連結させることによって調製され得る。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アセチレンは、ポリマーの炭素原子に対して直接に結合され得る。他の方法として、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、生成されるポリマーがその末端にアセチレン部分を有するように、１つの末端にアセチレン部分を有する連結剤を従来の活性化ポリマーに対して連結させることによって調製され得る。
より詳細には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも１つの活性ヒドロキシ部分を有する水溶性ポリマーは、より反応性の高い部分を有する置換ポリマーを生成するための反応を受ける。より反応性の高い部分は、例えば、水溶性ポリマー上にあるメシレート基、トレシレート基、トシレート基またはハロゲン離脱基である。ハロゲン化スルフォニル酸、ハロゲンおよび他の離脱基を含有するＰＥＧ誘導体の調製および使用は、当業者にとって公知である。それから、生成される置換ポリマーは、ポリマーの末端においてアジド部分をより反応性の高い部分に置換するための反応を受ける。他の方法としては、少なくとも１つの活性な求核部分または求電子部分を有する水溶性ポリマーは、１つの末端にアジド部分を有する連結剤との反応を受ける。当該連結剤は、１つの末端にアジド部分を有しているので、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合が形成され、かつアジド部分がポリマーの末端に配置されることを可能にする。求核部分および求電子部分は当業者に公知であり、これらとしては、アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボン酸塩、アルデヒド、ケトンおよびチオエステルなどが挙げられる。
より詳細には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも１つの活性なヒドロキシ部分を有する水溶性ポリマーは、アセチレン部分を含有する前駆体からハロゲンまたは活性な離脱基を置換するための反応を受ける。他の方法としては、少なくとも１つの活性な求核部分または求電子部分を有する水溶性ポリマーは、１つの末端にアセチレン部分を有する連結剤との反応を受ける。当該連結剤は、１つの末端にアセチレン部分を有しているので、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合が形成され、かつアセチレン部分がポリマーの末端に配置されることを可能にする。ＰＥＧ誘導体の有機合成、調製および使用に関する、ハロゲン部分、活性化脱離基、求核部分および求電子部分の使用は、当該分野において十分に確立されている。
また、本発明は、修飾されたタンパク質に他の物質を加えるためにタンパク質を選択的に修飾する方法を提供する。他の物質としては、これに限定されないが、水溶性ポリマー（例えば、アジド部分もしくはアセチレン部分を含有するＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体）が挙げられる。アジド含有ＰＥＧ誘導体およびアセチレン含有ＰＥＧ誘導体を使用して、表面を修飾し得、分子の特性を調節し得る。ここで、当該特性としては、生体利用効率、安定性、可溶性および免疫原性の欠失が重要である。同時に、タンパク質に対してＰＥＧ誘導体をより選択的に連結させる手段は、当該技術において以前から公知であった。
＜ＩＩ．線維芽細胞成長因子＞
多種多様な細胞および組織の成長、増殖、生存および分化を促進する強力な活性活性のために、ＦＧＦは多数の異なる徴候にとって（創傷の治癒が挙げられる）の治療薬として研究され続けている。当該徴候は、例えば、筋骨格の障害（例えば、骨折、じん帯および組織の修復、腱炎、滑液胞炎など）；皮膚の障害（例えば、やけど、切り傷、裂傷、褥瘡、治癒の遅い潰瘍など）；神経の障害（例えば、神経変性疾患および脳卒中）、眼疾患（黄斑変性症などが挙げられる）の処置における心筋梗塞および心筋虚血の発症時の組織保護、修復および血管新生の誘導である。
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質は、種々の細胞種の成長および分化を調節するシグナル分子の一員に属すると、これまでに同定された。ヒトの生理および病理に対するＦＧＦタンパク質の重要性は、胚形成、血管の生成および増大、ならびに骨成長におけるそれらの重要な役割と部分的に関連する。インビトロの実験において、内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、ならびに心筋細胞および骨格筋細胞の細胞成長および細胞分化の制御におけるＦＧＦの役割が証明されている。ＦＧＦファミリーの他の一員およびそれらの生物学的役割については、Crossley et al., Development 121 :439-451 (1995)；Ohuchi et al., Development 124:2235-2244 (1997)；Gemel et al., Genomics 35:253-257 (1996)；およびGhosh et al., Cell Growth and Differentiation 7:1425- 1434 (1996)に記載されている。
また、ＦＧＦタンパク質は、がん細胞の成長における役割のために、ヒトの健康および疾患にとって重要である。例えば、ＦＧＦ−８は、乳がん細胞および前立腺がん細胞におけるアンドロゲン誘導成長因子として同定された（Tanaka et al., FEBS Lett. 363:226-230 (1995)およびP.N.A.S. 89:8928-8932 (1992)）。
通常の発生におけるＦＧＦの役割は。ＦＧＦ受容体の研究を介して部分的に解明されている。Wilke, T. et al., Dev. Dynam. 210:41-52 (1997)において、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の転写物がトリにおける胚発生の間において頭部の特定の領域に局在することが見いだされた。領域と相関する発現パターンは、クルゾン症候群、異常な膜内骨形成の状態におけるヒトＦＧＦＲの変異によって影響された。Belluardo, N. et al., Jour. Comp. Neur. 379:226-246 (1997) においてＦＧＦＲ１、２の局在について研究され、かつ脳の種々の領域における細胞特異性が見出された。さらに、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２のｍＲＮＡが脳障害の後における反応性星状膠細胞において発現され、これは脳疾患および脳障害におけるある種のＦＧＦの役割を支持している。Ozawa, K. et al., MoI. Brain Res. 41:279-288 (1996) において、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−５の発現が生後に増加すると同時に、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７およびＦＧＦ−８遺伝子が、生後の段階より後期の胎児の段階においてより高い発現を示すことが報告された。また、補足因子、クロソβ（Ｋｌｂ）は、ＦＧＦ−２１およびその受容体のシグナル伝達と関与し得る。Ｋｌｂについて、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４のＦＧＦ−２１との結合能を増強することが報告されている。Ｋｌｂは、１回膜貫通型タンパク質であるが、完全な膜貫通形態の役割は分かっていない。ＦＧＦ−２３に関して、クロソがＦＧＦ−２３の結合を増強し、かつＦＧＦ受容体のリン酸化を増強することが示されている。その上、クロソβについてＦＧＦ−２１の結合を促進することが示されている。これらについて、参照によって本明細書に組み込まれるH. Kurosu, Y. Ogawa, M. Miyoshi, M. Yamamoto, A. Nandi, K. P. Rosenblatt, M. G. Baum, S. Schiavi, M.-C. Hu, O. W. Moe, M. Kuro-o, Regulation of fibroblast growth factor-23 signaling by Klotho. J. Biol. Chem. 281, 6120-6123 (2006)を参照すればよい。
Katoh et al.（International Journal of Oncology (2006) 29:163-168）は、ＦＧＦファミリーおよびファミリーの一員の系統学的な分析について述べている。また、Katoh et al.は消化管におけるシグナル経路ネットワークについて論じている。
Plotnikov et al.（Cell (1999) 98:641-650）は、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ１）をともなったＦＧＦ−２ｂの結晶構造、およびこれらの２つの複合体の間に形成される２回対称２量体について述べている。Plotnikov et al.は、受容体の２量体化に関するモデルおよびＦＧＦおよびヘパリンによる２量体化の誘導を提唱している。
ＦＧＦファミリーのさらなる一員はこれからも発見されると思われる。ＦＧＦファミリーの新たな一員は、予測されるタンパク質配列のコンピュータを利用した２次元および３次元構造解析を通して、また特定の標的に結合する分子を特定するために設計された選択技術によって同定され得る。
このように、ＦＧＦファミリーに関する記載は、例示を目的としてほんの一例について提供されているのであって、本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術の範囲を限定するものとして提供されているのではない。本明細書におけるＦＧＦ−２１に対する言及は、ＦＧＦファミリーに属する任意の一員の例としての一般的な用語を使用することを意図される。したがって、ＦＧＦ−２１ポリペプチドおよびタンパク質に関して本明細書に記載されている修飾および化学反応は、ＦＧＦファミリーの任意の一員（本明細書に明確に挙げられているそれらが挙げられる）に対して等しく適用され得る。
＜ＩＩＩ．本発明とともに使用する一般的な組換え核酸法＞
本発明の多くの実施形態において、所定のＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする核酸は、単離され、クローン化され、かつしばしば組換え法を用いて変更される。当該実施形態は、これらに限定されないが、ＦＧＦ−２１ポリペプチドから得られるバリアント、誘導体、発現カセット、または他の配列の、タンパク質発現または生成の間を含めて使用される。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列は、異種のプロモータに対して作動可能に連結される。
天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、親ポリペプチド（これに限定されないが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、かつそれから関連する（複数の）アミノ酸残基の導入（すなわち、組み込みまたは置換）または除去（すなわち、欠失または置換）をもたらすようにヌクレオチド配列を変えている、が挙げられる）のアミノ酸配列に基づいて合成され得る。ヌクレオチド配列は、従来の方法に従った部位特異的な変異生成によって簡便に修飾され得る。代替可能に、ヌクレオチド配列は、化学合成（これらに限定されないが、オリゴヌクレオチド合成機を用いること、および好ましくは組換えポリペプチドが産生される宿主細胞に好まれるこれらのコドンを選択することによって、が挙げられる）によって調製され得る（ここで、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される）。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードする種々の小さなオリゴヌクレオチドが、合成され得、かつＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーション鎖反応によって集められ得る。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991) ；米国特許第６，５２１，４２７号明細書を参照すればよい。
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的な技術を利用する。本発明において使用する一般的な方法を開示する基本的な教科書としては、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))が挙げられる。
分子生物学的な技術について記載している一般的な教科書としては、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA （Ｂｅｒｇｅｒ）；Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 （“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) （“Ａｕｓｕｂｅｌ”））が挙げられる。これらの教科書は、変異生成、ベクター、プロモータおよび他の関連性のある多くの原理（これらに限定されないが、非天然アミノ酸、直交性のｔＲＮＡ、直交性のシンセターゼ、およびこれらの対を含むタンパク質産生用のセレクターコドンを含む、遺伝子またはポリヌクレオチドの生成と関連性のあるもの、が挙げられる）の利用について記載している。
多様な種類の変異生成が、本発明において種々の目的（これらに限定されないが、シンセターゼをコードするポリヌクレオチドを変異するため、ｔＲＮＡのライブラリを産生するため、シンセターゼのライブラリを産生するため、セレクターコドンを産生するため、所定のタンパク質またはポリペプチドにおける非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するため、が挙げられる）に使用される。変異生成としては、これらに限定されないが、部位特異的変生成、無作為点変異生成、相同性組換え、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の反復的な変異生成法、キメラ構築、鋳型を含有するウラシルを用いた変異生成、オリゴヌクレオチド特異的変異生成、ホスホロチオネート修飾ＤＮＡ変異生成、もしくはギャップ２本鎖ＤＮＡを用いた変異生成など、ＰＣＴ媒介変異生成、またはこれらの任意の組合わせが挙げられる。付加的な好適な方法としては、点不一致対、修復欠失宿主株を用いた変異生成、制限選択および制限精製、欠失変異生成、全体の遺伝子合成による変異生成、ならびに２本鎖切断修復などが挙げられる。また、これに限定されないが、キメラ構築に関する、が挙げられる変異生成が、本発明に包含される。１つの実施形態において、変異生成は、天然に存在する分子、または変更されるかもしくは変異された天然に存在する分子の公知の情報（これらに限定されないが、配列、配列比較、物理的性質、２次、３次もしくは４次の構造、または結晶構造などが挙げられる）よって導かれ得る。
本明細書に見られる教科書および例は、これらの手法について記載している。付加的な情報は、以下の公刊物および引用文献：Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)；Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996) ；Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985)；Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985)；Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986) ；Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)；Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)；Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)；Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)；Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985) ；Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985) ；Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986) ；Sayers et al., 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988) ；Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814；Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984) ；Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)；Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988) ；Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988) ；Kramer et al., Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, Cell 38:879-887 (1984) ；Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) ；Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)；Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986) ；Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)；Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)；Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988) ；Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985) ；Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985) ；Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986) ；Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993) ；Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001) ；W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994) ；およびI. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995) に見出される。上述の方法に関する付加的な詳細は、種々の変異生成方法に伴う問題を解決する有用な管理についても記載している、Methods in Enzymology Volume 154に見出され得る。
オリゴヌクレオチド（例えば、本発明の変異生成に利用（例えば、シンセターゼのライブラリを変異すること、またはｔＲＮＡを変えること）する）は、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, (1981) に記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って（例えば、Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984)に記載されているような自動化合成機を用いて）、典型的に化学合成される。
また、本発明は、直交性のｔＲＮＡ／ＲＳ対を介した非天然アミノ酸のインビボにおける組み込み用の、真核生物宿主細胞、非真核生物宿主細胞、および生体に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む構築物（これに限定されないが、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターが挙げられる）を用いて、遺伝的に改変される（これらに限定されないが、形質転換されるか、形質導入されるか、またはトランスフェクトされる、が挙げられる）。例えば、直交性のｔＲＮＡ、直交性のｔＲＮＡシンセターゼ、および誘導体化されるタンパク質に関するコーディング領域は、所望の宿主細胞において機能的な遺伝子発現制御エレメントに対して作動可能に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または接合されたポリヌクレオチドの形態であり得る。ベクターは、標準的な方法（エレクトロポレーション（Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985) ）、ウイルスベクターによる感染、および／または小さなビーズもしくは粒子のマトリクスの内部、または表面のいずれかに核酸を有する小粒子による高速弾丸侵入（high velocity ballistic penetration）（Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987) ）などが挙げられる）によって細胞および／または微生物に導入される。
改変された宿主細胞は、例えば、スクリーニング段階、プロモータの活性化または形質転換体の選択といった活性に適するように修飾された、従来の培養液において培養され得る。これらの細胞は、遺伝子導入生体において任意に培養され得る。他の有用な参考文献（これらに限定されないが、細胞の単離および培養にとって（例えば、後の核酸単離にとって）の、が挙げられる）としては、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York およびこれに引用されている参考文献；Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY；Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)ならびにAtlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLが挙げられる。
標的の核酸を細胞に導入する種々のよく知られる方法が、本発明に使用される任意の方法に利用可能である。これらとしては、ＤＮＡを含有する細菌の原形質体との受容細胞の融合、エレクトロポレーション、粒子衝撃法（projectile bombardment）、およびウイルスベクターを用いた感染（以下にさらに論じられている）などが挙げられる。細菌細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を含有するプラスミドの数を増幅するために使用され得る。細菌は、対数期まで増殖され、かつ細菌内におけるプラスミドは、当該技術において公知の種々の方法（例えば、実際には、Sambrookを参照すればよい）によって単離され得る。さらに、細菌からのプラスミドの精製にとってのキットは、市販されている（例えば、いずれもファルマシア バイオテック（Pharmacia Biotech）から得られるイージープレップ（EasyPrep）（商標）、フレキシプレップ（FlexiPrep）（商標）；ストラタジーン（Stratagene）から得られるストラタクリーン（StrataClean）（商標）；およびキアゲン（Qiagen）から得られるキアプレップ（QIAprep）（商標））。それから、単離されかつ精製されたプラスミドは、さらに操作されて他のプラスミドを産生するか、細胞のトランスフェクトに使用されるか、または関連するベクターに組み込まれて生体に感染させる。典型的なベクターは、特定の標的核酸の発現の制御に有用な、転写ターミネータおよび翻訳ターミネータ、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびにプロモータを含む。ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネータ配列を含有する遺伝的な発現カセット、真核生物もしくは原核生物もしくはこの両方におけるカセットの複製を可能にする配列（これに限定されないが、シャトルベクターが挙げられる）、および原核生物系もしくは真核生物系の両方にとっての選択マーカーを、任意に包含する。ベクターは、原核生物、真核生物または両方における複製および組み込みに好適である。例えば、Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979)；Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987)； Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995)；Ausubel, Sambrook, Berger （すべて上述されている）を参照すればよい。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣによって提供される（例えば、ＡＴＣＣによって公開されるThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds)）。また、配列決定、クローニング、および分子生物の他の局面に関する付加的な基本的な手法ならびに基礎になる論理的な考察は、Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NYに見出される。さらに、実質的にいずれの核酸（およびほとんどあらゆる標識核酸）は、任意の多様な市販の出所（例えば、ザ ミッドランド サーティファイド リエージェント カンパニー（the Midland Certified Reagent Company）（ミッドランド（Midland）、ＴＸ、ワールドワイドウェブのｍｃｒｃ．ｃｏｍにおいて利用可能である）、ザ グレート アメリカン ジーン カンパニー（The Great American Gene Company）（ロマーナ（Ramona）、ＣＡ、ワールドワイドウェブのｇｅｎｃｏ．ｃｏｍにおいて利用可能である）、エクスプレスジーン インク（ExpressGen Inc．）（シカゴ（Chicago）、ＩＬ、ワールドワイドウェブのｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍにおいて利用可能である）、オペロン テクノロジーズ インク（Operon Technologies Inc.）（アラメダ（Alameda）、ＣＡ）および多くの他社）から、特別にまたは通常に注文され得る。
（セレクターコドン）
本発明のセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構の遺伝学的なコドンの枠組みを拡張する。例えば、セレクターコドンとしては、固有の３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えば、ストップコドン（アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドン、またはオパールコドン（ＵＧＡ）が挙げられるが、これらに限定されない））、非天然コドン、４塩基以上のコドン、またはレアコドン（rare codon）などが挙げられるが、これらに限定されない。所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに導入され得るセレクターコドンの数が、広範である（少なくともＦＧＦ−２１ポリペプチドの部分を少なくともコードする単一のポリヌクレオチドにおける１つ以上、２以上、３以上、４、５、６、７、８、９、１０以上が挙げられるが、これらに限定されない）ことは、当業者にとってただちに明らかである。
１つの実施形態において、方法は、インビボにおける１つ以上の非天然アミノ酸の組み込みに用のストップコドンである、セレクターコドンの使用に関する。例えば、ストップコドン（ＵＡＧが挙げられるが、これに限定されない）を認識するＯ−ｔＲＮＡが産生され、かつ所望の非天然アミノ酸と共にＯ−ＲＳによってアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に存在する宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによって認識されない。従来の部位特異的な突然変異生成は、所定のポリペプチドにおける所定の部位に対するストップコドン（ＴＡＧが挙げられるが、これに限定されない）の導入に使用され得る。例えば、Sayers, J.R.,ら (1988), 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802を参照すればよい。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび所定のポリペプチドをコードする核酸がインビボにおいて組み合せられると、非天然アミノ酸がＵＡＧコドンに応じて組み込まれて、特定の位置に非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを生じさせる。
非天然アミノ酸のインビボにおける組み込みは、宿主細胞を大きく乱すことなくなされ得る。例えば、ＵＡＧコドンの抑制効率が、Ｏ−ｔＲＮＡ（これに限定されないが、アンバーサプレッサｔＲＮＡが挙げられる）と、（ストップコドンに対して結合し、かつリボソームからの成長しつつあるペプチドの放出を開始する）真核細胞放出因子（これに限定されないが、ｅＲＦが挙げられる）との間の競合に依存するので、抑制効率は、調節され得る（これらに限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡおよび／またはサプレッサｔＲＮＡの発現レベルを増強することによって、が挙げられる）。
また、非天然アミノ酸は、レアコドンを用いてコードされ得る。例えば、インビボタンパク質合成反応においてアルギニン濃度が低下すると、レアアルギニンコドンであるＡＧＧは、アラニンと共にアシル化される合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが証明されている。例えば、Ma et al., Biochemistry. 32:7939 (1993)を参照すればよい。この場合において、合成ｔＲＮＡは、エシェリキア コリにおいて微量種として存在する天然に存在するｔＲＮＡＡｒｇと競合する。いくつかの生体は、トリプレットコドンのすべてを使用しない。ミクロコッカス ルテウスにおける割り当てのないコドン ＡＧＡは、インビトロの転写／翻訳の抽出物におけるアミノ酸の挿入に利用されている。例えば、owal and Oliver, Nucl. Acid. Res.. 25:4685 (1997) を参照すればよい。本発明の構成要素は、インビボにおいてこれらのレアコドンを使用するために生成され得る。
また、セレクターコドンは、拡張されたコドン（４以上の塩基コドン（例えば、４、５、６以上の塩基コドン）が挙げられるが、これらに限定されない）を備える。４塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、およびＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらに限定されない。５塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、およびＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法および組成物の特徴は、フレームシフト抑圧に基づいて延長されたコドンの使用を含む。４以上の塩基コドンは、同じタンパク質に１つまたは複数の非天然アミノ酸（例として挙げられるが、これらに限定されない）を挿入可能である。例えば、突然変異されたＯ−ｔＲＮＡ（特別なフレームシフトサプレッサｔＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない）の存在下において、アンチコドンループ（少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、４以上の塩基コドンが単一のアミノ酸として読まれる。他の実施形態において、アンチコドンループは、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドン（例として挙げられるが、これらに限定されない）を翻訳可能である。見込みのある４塩基コドンが２５６あるので、複数の非天然アミノ酸は、４以上の塩基コドンを用いて、同じ細胞において翻訳され得る。Anderson et al, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology. 9:237-244；Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. MoI. Biol. 307: 755-769を参照すればよい。
例えば、４塩基コドンは、インビトロ生合成方法を用いた、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みに使用されている。例えば、Ma et al, (1993) Biochemistry. 32:7939、およびHohsaka et al, (1999) L Am. Chem. Soc. 121: 34を参照すればよい。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、化学的にアシル化された２つのフレームシフトサプレッサｔＲＮＡを用いて、インビトロにおいて、ストレプトアビジンに２−ナフチルアラニンおよびリジンＮＢＤ誘導体を同時に組み込むために使用された。例えば、Hohsaka et al, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 12194を参照すればよい。インビボにおける研究において、Moore et alは、ＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体のＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、ＧまたはＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、かつクワドルプレットＵＡＧＡが、０または−１フレームの状態に少なく翻訳して、１３から２６％効率において、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｕｅによって翻訳され得ることを見出した。例えば、Moore et al, (2000) J. MoI. Biol., 298:195を参照すればよい。１つの実施形態において、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づいて延長されたコドンは、読み過ごしのミスセンス、および他の不要な部位におけるフレームシフト抑圧を低減し得る本発明の方法および組成物に、使用され得る。
また、所定の系に関して、内在性の系が天然塩基コドンを使用しない（またはまれにしか使用しない）場合に、セレクターコドンは、天然の３塩基コドンの１つを含むことができる。例えば、これとしては、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠如している系、および／または３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
セレクターコドンは非天然塩基対を任意に含む。これらの非天然塩基対は、存在する遺伝子アルファベットをさらに拡張する。追加の塩基対の１つは、６４から１２５までトリプレットの数を増加させる。第３の塩基対の性質の例としては、安定かつ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによる高い忠実度を伴ったＤＮＡへの効率的な酵素的組み込み、および新生の非天然塩基対の合成後における効率的な連続するプライマー伸張が挙げられる。方法および組成物に適合し得る非天然塩基対の記述の例としては、例えば、Hirao et al, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182が挙げられる。また、Wu, Y., et al, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630を参照すればよい。他の関連する刊行物は、以下に載せられている。
インビボにおける使用法に関して、非天然ヌクレオシドは、膜透過性であり、かつリン酸化されて対応する３リン酸塩を形成する。その上に、増加した遺伝情報は、安定であり、かつ細胞性の酵素によって破壊されない。Bennerおよびその他によるこれまでの試みは、もっとも注目すべき例であるイソ−Ｃ：イソ−Ｇ対という、基準のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対における水素結合様式とは異なる、水素結合様式を巧く活用した。例えば、Switzer et al, (19S9) J. Am. Chem. Soc, 11 1 :8322；およびPiccirilli et al, (1990) Nature, 343:33；Kool, (2000) Curr. 0 Opin. Chem. Biol., 4:602を参照すればよい。これらの塩基は、通常、ある程度まで天然塩基と誤対合し、かつ酵素的に修復され得ない。Koolおよび共同研究者は、塩基間の疎水性パッキング相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）が水素結合と入れ替わって、塩基対の形成を生じることができることを証明した。例えば、Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602、およびGuckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825を参照すればよい。上述した条件のすべてを満たす非天然塩基対を開発する試みにおいて、Schultz、Romesbergおよび共同研究者は、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、かつ研究している。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然塩基対より安定であることが見出されており、かつEscherichia coliのＤＮＡポリメラーゼ Ｉのクレノー酵素（Klenow fragment）（ＫＦ）によって、ＤＮＡに効率的に組み込まれ得る。例えば、McMinn et al, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 11585-6；およびOgawa et al, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:3274；を参照すればよい。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に対して十分な効率性および選択性を伴って、ＫＦによって合成され得る。例えば、Ogawa et al, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803を参照すればよい。しかし、両方の塩基は、さらなる複製に対してターミネータとして作用する。近年、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対の複製に使用され得るように、発展されている。その上に、７ＡＩ自己対は複製され得る。例えば、Tae et al, (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:7439を参照すればよい。また、Ｃｕ（ＩＩ）との結合によって安定な対を形成する新規な金属塩基対であるＤｉｐｉｃ：Ｐｙが、開発されている。例えば、Meggers et al, (2000) J. Am. Chem. Soc 122:10714を参照すればよい。拡張されたコドンおよび非天然コドンが、天然コドンに対して本来的に直交であるので、本発明の非天然アミノ酸に関する方法は、この性質を活かして非天然アミノ酸用の直交化ｔＲＮＡを生成し得る。
また、翻訳回避系（translational bypassing system）が、所望のポリペプチドにおける非天然アミノ酸の組み込みに使用され得る。翻訳回避系において、大きな配列が遺伝子に組み込まれるが、タンパク質に翻訳されない。当該配列は、リボソームに当該配列を跳び越し、かつ挿入の下流にある翻訳を再開させる合図としての機能を果たす構造を含む。
ある種の実施形態において、本発明の方法および／または組成物における所定のタンパク質またはポリペプチド（またはこれらの一部）は、核酸によってコードされている。典型的に、核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくともつ２のセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、少なくとも１０またはそれ以上のセレクターコドンを備える。
所定のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、非天然アミノ酸を組込むための１つ以上のセレクターコドンを含めるために、当業者に公知の方法、および本明細書に記載されている方法を用いて、突然変異生成され得る。例えば、所定のあるタンパク質に関する核酸は、１つ以上の非天然アミノ酸の組み込みを提供する１つ以上のセレクターコドンを含めるために、突然変異される。本発明は、そのようなバリアント（例えば非天然アミノ酸を含む、突然変異体、あらゆるタンパク質の型が挙げられるが、これらに限定されない）いずれかを含む。また同様に、本発明は、対応する核酸（すなわち、１つ以上の非天然アミノ酸をコードする１つ以上のセレクターコドンを有する核酸）を含む。
所定のタンパク質（例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチド）をコードする核酸分子は、ポリペプチドの所望される任意の位置にシステインを導入する突然変異を容易にし得る。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または多種多様な他の分子を、所定のタンパク質に導入するために広く使用される。ポリペプチドの所望の位置へのシステインの組み込みに好適な方法は、当業者に公知であり（例えば、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０８，１８３号明細書に記載の方法）、かつ標準的な技術である。
＜ＩＶ．天然にコードされていないアミノ酸＞
非常に広範な天然にコードされていないアミノ酸が、本発明における使用に好適である。任意の多様な天然にコードされていないアミノ酸が、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに導入され得る。一般的に、導入された天然にコードされていないアミノ酸は、一般的な２０の遺伝的にコードされるアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）に対して化学的に、実質的に不活性である。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、一般的な２０のアミノ酸に見られない官能基と効率的かつ選択的に反応して安定な接合体を形成する側鎖官能基（これらに限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒドおよびアミノオキシ基が挙げられる）を含む。例えば、アジド官能基を含有する天然にコードされていないアミノ酸を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリマー（これに限定されないが、ポリ（エチレングリコール）が挙げられる）、または代替可能に、ヒュイゲン［３＋２］付加環化産物を形成するためのアジドおよびアルキン官能基の選択的な反応を結果として生じる安定な接合体を形成するための、アルキン部分を含有する第２のポリペプチドと反応し得る。
α−アミノ酸の一般的な構造は、以下の式Ｉ：
Figure 2020018314
のように示される。
天然にコードされていないアミノ酸は、典型的に、上述の式を有する構造のいずれかであり（ここで、Ｒ基は２０の天然アミノ酸に使用される官能基以外の任意の置換基である）、かつ本発明における利用に好適であり得る。本発明の天然にコードされていないアミノ酸が、側鎖の構造においてのみ天然アミノ酸と典型的に異なるので、天然にコードされていないアミノ酸は、それらが天然に存在するポリペプチドにおいて形成される同じ様式において、他のアミノ酸（これらに限定されないが、天然または天然にコードされていないアミノ酸が挙げられる）とアミド結合を形成する。しかし、天然にコードされていないアミノ酸は、これらを天然のアミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド−、アルケニル、アルキル、エーテル、チオール、セレノ−、スルフォニル−、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、もしくはアミノ基、またはこれらの組合わせを、任意に備える。本発明における使用に好適であり得る他の所定の非天然に存在するアミノ酸としては、これらに限定されないが、光活性化架橋を備えるアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規な官能基を有するアミノ酸、他のと共有的または非共有的に相互作用するアミノ酸、光ケージドおよび／または光異性体化アミノ酸、ビオチンまたはビオチン誘導体を備えるアミノ酸、糖置換化セリンといった糖鎖付加アミノ酸、他の炭水化物によって修飾されたアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを備えるアミノ酸、重元素置換アミノ酸、化学的に切断可能なおよび／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて延長された側鎖（これらに限定されないが、ポリエーテルまたは長鎖炭化水素（これらに限定されないが、約５または約１０を越える炭素が挙げられる）が挙げられる）を有するアミノ酸、炭素結合型の糖含有アミノ酸、酸化還元的に活性なアミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を備えるアミノ酸が挙げられる。
本発明における使用に好適であり得、かつ水溶性ポリマーとの反応に有用である例示的な天然にコードされていないアミノ酸としては、これらに限定されないが、カルボニル反応性基、アミノオキシ反応性基、ヒドラジン反応性基、ヒドラジド反応性基、セミカルバジド反応性基、アジド反応性基およびアルキン反応性基を有するアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、糖鎖部分を備える。そのようなアミノ酸の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギンおよびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、アミノ酸と糖鎖との間に天然に存在するＮ型またはＯ型の結合が、自然には通常は見られない共有結合（これらに限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテルおよびアミドなどが挙げられる）によって置換されている場合の例が挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、２−デオキシ−グルコース、および２−デオキシガラクトースといった、天然に存在するタンパク質に通常は見られない糖鎖が挙げられる。
本明細書に規定される天然にコードされていないアミノ酸の多くは、市販されている（例えば、シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）（セントルイス（St.Louis）、ＭＯ、ＵＳＡ）、ノババイオケム（Novabiochem）（EMD Biosciences部門、ダームシュタット（Darmstadt）、ドイツ）、またはペプテック（Peptech）（バーリントン（Burlington）、ＭＡ、ＵＳＡ）から得られる）。市販されていない天然にコードされていないアミノ酸は、本明細書に規定されているようにか、または当業者にとって公知の標準的な方法を用いて任意に合成される。有機合成技術に関しては、例えば、Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)；Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)；およびAdvanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)を参照すればよい。また、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書および米国特許第７，０８３，９７０号明細書を参照すればよい。また、新規な側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明における使用に好適であり得る非天然アミノ酸は、これらに限定されないが、式ＩＩおよびＩＩＩ：
Figure 2020018314
（ここで、Ｚは、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’、またはＳ−Ｒ’を典型的に備え；同じかまたは異なり得るＸおよびＹは、ＳまたはＯを典型的に備え、かつ任意に同じであるか、または異なるＲおよびＲ’は、水素だけでなく式Ｉを有する非天然アミノ酸に関して上述したＲ基にとっての置換基の同じ一覧から任意に選択される）
の構造が挙げられる修飾された骨格構造を任意に備える。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、式ＩＩおよびＩＩＩによって示されるようなアミノ基またはカルボキシル基において置換基を任意に備える。この種の非天然アミノ酸としては、これらに限定されないが、一般的な２０の天然アミノ酸または非天然アミノ酸に対応する側鎖を有する（限定されないが、これらが挙げられる）、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。さらに、α−炭素における置換基としては、これらに限定されないが、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、およびアミノブチル酸などといったＬ、Ｄ、またはα−α−２置換アミノ酸が任意に挙げられる。他の構造的な代替物としては、プロリン類似物ならびに３、４、５、６、７、８および９員環のプロリン類似物といった環状アミノ酸、これらと同様に置換β−アラニンおよびγ−アミノブチル酸といったβおよびγアミノ酸が挙げられる。
多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミンおよびフェニルアラニンといった天然アミノ酸に基づいており、かつ本発明における使用に好適である。チロシン類似物としては、これらに限定されないが、置換チロシンが、ケト基（これに限定されないが、アセチル基が挙げられる）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン基、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０の直鎖状または分枝状の炭化水素、飽和もしくは不飽和の炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはアルキニル基など（限定されないが、これらが挙げられる）を備える場合の、パラ位置換チロシン、オルト位置換チロシン、およびメタ位置換チロシンが挙げられる。さらにまた、多置換アリール環が意図される。本発明における利用に好適なグルタミン類似物としては、これらに限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。本発明における利用に好適なフェニルアラニン類似物の例としては、これらに限定されないが、置換基が、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（これに限定されないが、アセチル基が挙げられる）、ベンゾイル、またはアルキニル基など（限定されないが、これらが挙げられる）を備える場合の、パラ位置換フェニルアラニン、オルト位置換フェニルアラニン、およびメタ位置換フェニルアラニンが挙げられる。本発明における利用に好適な非天然アミノ酸の特定の例としては、これらに限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、およびｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明における使用に好適な非天然アミノ酸の変形の構造の例は、例えば、“In vivo incorporation of unnatural amino acids”と表題が付けられた国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットに規定されている。また、付加的なメチオニン類似物に関しては、参照によって本明細書に組み込まれる、Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24を参照すればよい。参照によって本明細書に組み込まれる国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号（発明の名称："Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non- natural Amino Acids and Polypeptides"）には、芳香族アミン部分（これに限定されないが、ｐ−アミノ−フェニルアラニンが挙げられる）の還元性アルキル化、および還元性アミン化について記載されている。
１つの実施形態において、非天然アミノ酸（例えば、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン）を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドの組成物が、提供される。また、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンを備える種々の組成物（これらに限定されないが、タンパク質および／または細胞が挙げられる）が、提供される。１つの局面において、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンを備える組成物は、直交性のｔＲＮＡをさらに含む。非天然アミノ酸は、直交性のｔＲＮＡに対して共有結合的に（限定されないが、これが挙げられる）結合され得る（これらに限定されないが、アミノアシル結合を介して直交性のｔＲＮＡに対して共有結合的に結合される、直交性のｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨまたは２’ＯＨに対して共有結合的に結合されるなど、が挙げられる）。
タンパク質に組み込まれ得る非天然アミノ酸を介する化学部分は、タンパク質の種々の利点および操作を提供する。ケト官能基の固有の反応性は、インビボおよびインビトロにおける、多くのヒドラジン含有試薬またはヒドロキシアミン含有試薬のいずれかを用いた、タンパク質の選択的な修飾を可能にする。非天然アミノ酸は、例えば、重水素Ｘ線構造データの位相合わせに有用であり得る。また、非天然アミノ酸を用いた重水素の部位特異的な導入は、重水素にとっての位置の選択に選択性および自由度を提供する。光反応性非天然アミノ酸（これらに限定されないが、ベンゾフェノンおよびアリールアジド（これに限定されないが、フェニルアジドが挙げられる）側鎖を有するアミノ酸が挙げられる）は、例えば、タンパク質のインビボおよびインビトロにおける効率的な光架橋を可能にする。光反応性アミノ酸の例としては、これらに限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられる。光反応性アミノ酸を有するタンパク質は、その結果、光反応性基を供給する一時的な制御の励起によって、自由自在に光架橋され得る。１つの例において、非天然アミノ酸のメチル基は、核磁気共鳴および振動顕微鏡の利用を伴う（限定されないが、これらが挙げられる）、局所的な構造および動態のプローブとして、放射線標識されたメチル基（限定されないが、これが挙げられる）に置換され得る。アルキニル官能基またはアジド官能基は、例えば、［３＋２］付加環化反応を介したタンパク質の選択的な修飾を可能にする。
アミノ末端においてポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０の天然のアミノ酸に用いられる官能基以外の任意の置換基であるＲ基、およびα−アミノ酸に通常に存在するＮＨ２基とは異なる第２の反応性基から構成され得る（式Ｉを参照すればよい）。類似の非天然アミノ酸が、カルボキシル末端において、α−アミノ酸に通常に存在するＣＯＯＨ基と異なる第２の反応性基を用いて、組み込まれ得る（式１を参照すればよい）。
本発明の非天然アミノ酸は、一般的な２０のアミノ酸において有効ではない付加的な特性を与えるために、選択され得るか、または設計され得る。例えば、非天然アミノ酸は、タンパク質（例えば、それらが組み込まれる）の生物学的特性を修飾するために、任意に設計され得るか、または選択され得る。例えば、以下の性質：毒性、体内分布、可溶性、安定性（例えば、熱、加水分解、酸化、および酵素的分解に対する耐性など）、精製および処理の容易さ、構造性質、分光性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒活性、酸化還元電位、半減期、ならびに他の分子と反応する（例えば、共有結合的にか、または非共有結合的に）能力などは、タンパク質への非天然アミノ酸の包含によって任意に修飾され得る。
（非天然アミノ酸の構造および合成：カルボニル基、カルボニル様基、マスクしたカルボニル基、保護カルボニル基およびヒドロキシルアミン基）
いくつかの実施形態において、本発明は、オキシム結合によって水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と連結されているＦＧＦ−２１を提供する。
天然にコードされていないアミノ酸の多くの種類は、オキシム結合の形成に適切である。これらとしては、カルボニル、ジカルボニル、またはヒドロキシルアミン基を含む天然にコードされていないアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。そのようなアミノ酸は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号明細書、および”Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides”と題される国際公開第２００６／０６９２４６号パンフレットに記載されている。また、天然にコードされていないアミノ酸は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０８３，９７０号明細書および米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている。
本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上の位置においてアミノ酸パラアセチルフェニルアラニンを用いて置換されている、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを利用する。ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、参照によって組み込まれるZhang, Z.et al,. Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸またはジカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。さらに、本明細書に含まれる非天然アミノ酸の限定しない例示的な合成は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，９７０号明細書の図４、２４−３４および３６−３９に示されている。
求電子性反応性基を有するアミノ酸は、とりわけ、求核付加反応を介して分子を連結するための多様な反応を可能にする。そのような求電子性反応性基のとしては、カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）、カルボニル様基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）と類似の反応性を有し、かつカルボニル基と構造的に類似している）、マスクされたカルボニル基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）に容易に変えられ得る）、または保護されたカルボニル基（脱保護によってカルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）と同様の反応性を有する）が挙げられる。そのようなアミノ酸としては、式（ＩＶ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｊは、
Figure 2020018314
であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ’’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、または保護基であるか、または２つ以上のＲ’’基が存在する場合に、２のＲ’’はヘテロシクロアルキルを任意に形成し；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか、Ｒ３とＲ４と、または２のＲ３基は、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを任意に形成するか；
または−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのカルボニル基（ジカルボニル基が挙げられる）、保護されたカルボニル基（保護されたジカルボニル基が挙げられる）、またはマスクされたカルボニル基（マスクされたジカルボニル基が挙げられる）を含む、２環式または３環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを共に形成するか；
または−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのカルボニル基（ジカルボニル基が挙げられる）、保護されたカルボニル基（保護されたジカルボニル基が挙げられる）、またはマスクされたカルボニル基（マスクされたジカルボニル基が挙げられる）を含む、単環式または２環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを共に形成し；
Ａがフェニレンであり、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｂは存在するという条件；およびＡが−（ＣＨ２）４−であり、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではないという条件；およびＡとＢとが存在せず、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｒはメチルではないという条件を有する）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（Ｖ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ａがフェニレンである場合に、Ｂは存在するという条件；およびＡが−（ＣＨ２）４−である場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではないという条件；およびＡとＢとが存在しない場合に、Ｒはメチルでないという条件と有する）
の構造を有するものが挙げられる。
さらに、式（ＶＩ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、以下のアミノ酸：
Figure 2020018314
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護基であるか、カルボキシル保護されているか、またはそれらの塩である。さらに、以下の非天然アミノ酸のいずれかが、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る）
が挙げられる。
さらに、式（ＶＩＩ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される；かつｎは０から８であり；
Ａが−（ＣＨ２）４−である場合に、Ｂは、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではないという条件を有する）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、以下のアミノ酸：
Figure 2020018314
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）が挙げられる。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかが、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
さらに、式（ＶＩＩＩ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−(アルキレンまたは置換アルキレン)−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＩＸ）：
Figure 2020018314
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ここで、Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’からなる群から選択される（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、以下のアミノ酸：
Figure 2020018314
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）が挙げられる。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかが、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
さらに、式（Ｘ）：
Figure 2020018314
（ここで、Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択され；かつｎは０から８である）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、以下のアミノ酸：
Figure 2020018314
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）が挙げられる。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかが、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
モノカルボニル構造の他に、本明細書に記載の非天然アミノ酸は、ジカルボニル基、ジカルボニル様基、マスクされたジカルボニル基、および保護されたジカルボニル基といった基を含み得る。
例えば、式（ＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸：
Figure 2020018314
（ここで、Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）
が挙げられる。
さらに、式（ＸＩＩ）：
Figure 2020018314
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ここで、Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、以下のアミノ酸
Figure 2020018314
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）。さらに、非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかが、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
さらに、式（ＸＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2020018314
（ここで、Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｓ−、−Ｓ−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり;
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ(Ｏ)kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’からなる群から選択され（ここで、Ｒ’それぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）；かつｎは０から８である）
が挙げられる。
さらに、以下のアミノ酸：
Figure 2020018314
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）が挙げられる。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかが、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
さらに、式（ＸＩＶ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；かつＬは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＩＶ−Ａ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＩＶ−Ｂ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＶ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；かつｎは、０、１、２、３、４、または５であり；かつＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＶ−Ａ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレン;
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；かつＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＶ−Ｂ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；かつＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＶＩ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；かつＬは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＶＩ−Ａ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＶＩ−Ｂ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＶＩＩ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｍは、
Figure 2020018314
であり（ここで、（ａ）は、Ａ基との結合を表し、かつ（ｂ）は、それぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、またはＲ３とＲ４と、もしくは２つのＲ３基、もしくは２つのＲ４基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する）；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、かつＲは、Ｈ，ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＶＩＩＩ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ｍは、
Figure 2020018314
であり（ここで、（ａ）は、Ａ基との結合を表し、かつ（ｂ）は、それぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルであるか、またはＲ３とＲ４と、もしくは２つのＲ３基、もしくは２つのＲ４基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する）；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、かつＲは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチド;であり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＩＸ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；かつ
Ｔ３は、Ｏ、またはＳである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＸ）：
Figure 2020018314
（ここで、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
さらに、式（ＸＸＩ）：
Figure 2020018314
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、化学的に修飾されて、反応性のカルボニル官能基、またはジカルボニル官能基を生成する。例えば、接合反応に有用なアルデヒド官能性基は、隣接するアミノ基およびヒドロキシル基を有する官能性基から生成され得る。生物学的に活性な分子がポリペプチドである場合に、例えば、Ｎ末端セリンまたはスレオニン（通常に存在し得るか、または化学的もしくは酵素的な消化を介して露出され得る）は、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな酸化的切断条件下における、アルデヒド官能性基の生成に使用され得る。例えば、Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262−268 (1992);Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3: 138−146 (1992);Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224−7230 (1994)を参照すればよい。しかし、当該技術において公知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端におけるアミノ酸に対して限定される。
本発明において、隣接するヒドロキシル基およびアミノ基を有する非天然アミノ酸は、“マスクされた”アルデヒド官能性基としてポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンに対して隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位において酸化をさせるための穏やかな条件下において、過剰なモル濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加を含む。酸化反応のｐＨは、典型的に約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液に対して、約１．５モル濃度過剰なメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に続いて、暗所における１０分間にわたるインキュベーションを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号明細書を参照すればよい。
カルボニル官能性基またはジカルボニル官能性基は、穏やかな条件の下に水性溶液においてヒドロキシルアミン含有試薬と選択的に反応して、生理学的条件下において安定な対応するオキシム連結を形成し得る。例えば、Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475−481 (1959);Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 1 17:3893− 3899 (1995)を参照すればよい。さらに、カルボニル基またはジカルボニル基の固有の反応性が、他のアミノ酸側鎖の存在下において選択的な修飾を可能にする。例えば、Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150−8151 (1996);Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138−146 (1992);Mahal, L. K., et al., Science 276:1125−1128 (1997)を参照すればよい。
（非天然アミノ酸：ヒドロキシルアミン含有アミノ酸の構造および合成）
米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号明細書は、参照によってその全体が組み込まれる。従って、米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号明細書におけるセクションＶ（“非天然アミノ酸”と題される）、パートＢ（“非天然アミノ酸（ヒドロキシアミン含有アミノ酸）の構造および合成”と題される）に与えられた開示内容は、当該開示内容が本明細書に示されているも同然に、本明細書に記載されている非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを作製する、精製する、性質決定する、および使用する方法、組成物（式Ｉ−ＸＸＸＶが挙げられる）、技術および戦略に対して完全に適用される。米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号明細書、および、”Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides”と題される国際公開第２００６／０６９２４６号パンフレットもまた、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
（非天然アミノ酸の化学合成）
本発明における使用に好適な非天然アミノ酸の多くは、例えば、シグマ（ＵＳＡ）またはアルドリッチ（Aldrich）（ミルウォーキー（Milwaukee）、ＷＩ、ＵＳＡ）から市販されている。市販されていない非天然アミノ酸は、本明細書に規定されているように、または多様な公開物に規定されているように、または当業者に公知の標準的な方法を用いて、任意に合成される。有機合成技術に関しては、例えば、Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.);Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York);およびAdvanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)を参照すればよい。非天然アミノ酸の合成について記載している付加的な公開物としては、例えば、“In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids”と題される国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット;Matsoukas et al, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669;King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc. 3315-3319;Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives ofGlutamine as Model Substrates for Anti- Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752;Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-l-methylbutyl]amino]quinolim (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170;Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5;Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866;Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246;Barton et al, (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha- aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308;およびSubasinghe et al, (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of bela-heterocyclic 2- aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-senitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7が挙げられる。また、参照によって本明細書に組み込まれる“Protein Arrays”と題される米国特許第２００４／０１９８６３７号明細書を参照すればよい。
（Ａ．カルボニル反応性基）
カルボニル反応性基を有するアミノ酸は、求核性の付加を介して分子（ＰＥＧまたは他の水溶性分子が挙げられるが、これらに限定されない）を連結するための多様な反応、または特にアルドール縮合反応を可能にする。
例示的なカルボニル含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2020018314
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、かつＲ２は単純アルキル（すなわち、メチル、エチルまたはプロピル）であり、かつケトン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、かつＲ２は単純アルキル（すなわち、メチル、エチルまたはプロピル）であり、かつケトン部分は、アルキル側鎖に対してメタ位に位置されている。
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、参照によって本明細書に組み込まれる、Zhang, Z.et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドは、化学的に修飾されて、反応性のカルボニル官能基を生成する。例えば、接合反応に有用なアルデヒド官能性基は、隣接するアミノ基とヒドロキシル基とを有する官能性基から生成され得る。生物学的に活性な分子がポリペプチドである場合に、例えば、Ｎ末端のセリンまたはスレオニン（通常に存在し得る、または化学的もしくは酵素的な消化を介して露出され得る）は、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな酸化切断条件においてアルデヒド官能性基を生成するために使用され得る。例えば、Gaertner, et ah, Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992) ;Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992) ;Gaertner et al, J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994) を参照すればよい。しかし、当該技術において公知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端におけるアミノ酸に制限される。
本発明において、隣接するヒドロキシル基とアミノ基とを有する天然にコードされていないアミノ酸アミノ酸は、“マスクされた”アルデヒド官能性基としてポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンと隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成する反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位における酸化を回避するための穏やかな反応条件において、過剰なモル濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に関する。酸化反応のｐＨは、典型的に約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチド緩衝化溶液に対する、１．５モル濃度を超えるメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に続いて、暗所における約１０分間のインキュベーションに関する。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４２３，６８５号明細書を参照すればよい。
カルボニル官能性基は、水性溶液における穏やかな条件の下に、ヒドラジン含有試薬、ヒドラジド含有試薬、ヒドロキシルアミン含有試薬、またはセミカルバジド含有試薬と選択的に反応して、生理学的条件においてそれぞれに対して安定な対応するヒドラゾン、オキシム、またはセミカルバゾン連結を形成し得る。例えば、Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959) ;Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995) を参照すればよい。さらに、カルボニル基の固有な反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下において選択的な修飾を可能にする。例えば、Cornish, V. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996) ;Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992) ;Mahal, L. K., et al, Science 276:1125-1128 (1997) を参照すればよい。
（Ｂ．ヒドラジン反応性基、ヒドラジド反応性基またはセミカルバジド反応性基）
求核性基（例えば、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド）を含む天然にコードされていないアミノ酸は、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー（限定されないが、これらが挙げられる）との接合体を形成するための多様な求電子基との反応を可能にする。
例示的なヒドラジン含有アミノ酸、ヒドラジド含有アミノ酸、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2020018314
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在しないかであり；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、または存在しないかであり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。
いくつかの実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１は存在せず、かつＸはＮである。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、かつＸは存在しない。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、かつ酸素原子は、アリール環上における芳香族貴基に対してパラに位置されている。
ヒドラジド含有アミノ酸、ヒドラジン含有アミノ酸、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、市販の供給源から利用可能である。例えば、Ｌ−グルタミン酸−γ−ヒドラジドは、シグマケミカル（Sigma Chemical）（セントルイス（St. Louis）、ＭＯ）から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製され得る。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８１，２１１号明細書を参照すればよい。
ヒドラジド、ヒドラジンまたはセミカルバジド反応性基を有する天然にコードされていないアミノ酸を含む、ポリペプチドは、アルデヒドまたは類似の化学反応性を有する他の官能基を含む多様な分子と効率的かつ選択的に反応し得る。例えば、Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)を参照すればよい。ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジド官能基の固有な反応性は、一般的な２０のアミノ酸に存在する求核性基（セリンもしくはスレオニンのヒドロキシ基、またはリジンとＮ末端とのアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない）と比較して、アルデヒド、ケトンおよび他の求電子性基に対してより著しい反応を起こさせる。
（Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸）
アミノオキシ（ヒドロキシアミンとも呼ばれる）基を含む天然にコードされていないアミノ酸は、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー（限定されないが、これらが挙げられる）との接合体を形成するための求電子性基との反応を可能にする。ヒドラジン、ヒドラジドおよびセミカルバジドと同様に、アミノオキシ基の増強された求核性は、アミノオキシ基がアルデヒドまたは類似の化学反応性を有する他の官能基と効率的かつ選択的に反応することを可能にする。例えば、Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995);H. Hang and C. Bertozzi, Ace. Chem. Res. 34: 727-736 (2001) を参照すればよい。ヒドラジン基との反応の結果は、対応するヒドラゾンであるが、これに対してオキシムは、一般的にカルボニル含有基（例えば、ケトン）とアミノオキシ基の反応から生じる。
例示的なアミノオキシを含むアミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2020018314
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、または存在せず；ｍは０−１０であり；ＹはＣ（Ｏ）であるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、かつＹは存在する。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍは０であり、かつＹは存在しない。
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に入手可能なアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリンおよびスレオニン）から容易に調製され得る。例えば、M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003) を参照すればよい。ある種のアミノオキシ含有アミノ酸（例えば、Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）ブチル酸）は、天然の供給源から単離されている（Rosenthal, G, Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)）。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
（Ｄ．アジド反応性基およびアルキン反応性基）
アジド官能基およびアルキン官能基の固有な反応性は、ポリペプチドおよび他の生体分子の選択的な修飾にとって、それらを極めて有効にさせる。有機アジド、特にアルファティックアジド、およびアルキンは、通常の反応性の化学的条件に対して一般的に安定である。特に、アジド官能基およびアルキン官能基の両方は、天然に存在するポリペプチドに見られる一般的な２０のアミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対して不活性である。しかし、非常に近づくと、アジド基およびアルキン基の“ばね荷重”性質が現れ、かつそれらは、ヒュイゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）［３＋２］付加環化反応を介して選択的かつ効率的に反応して、対応するトリアゾールを生成する。例えば、Chin J., et al, Science 301 :964-7 (2003);Wang, Q,, et al, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003) ;Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) を参照すればよい。
ヒュイゲン付加環化反応が、求核置換よりむしろ選択的な付加環化反応に関与するので（例えば、Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109;Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176を参照すればよい）、アジド含有側鎖およびアルキン含有側鎖を有する天然にコードされていないアミノ酸の組み込みは、結果として生じるポリペプチドが、天然にコードされていないアミノ酸の位置において修飾されること、を可能にする。アジド含有ポリペプチドまたはアルキン含有ポリペプチドに関する付加環化反応は、室温において水性条件の下に、Ｃｕ（ＩＩ）（触媒量のＣｕＳＯ４の形態が挙げられるが、これに限定されない）の付加によって、インシチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）においてＣｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元する触媒量の還元物質の存在下において、達成され得る。例えば、Wang, Q., et al, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003) ;Tornoe, C. W., et al, J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002) ;Rostovtsev, et al, Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002) を参照すればよい。例示的な還元物質としては、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋および印加された電位が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合において、アジドとアルキンとの間におけるヒュイゲン［３＋２］付加環化反応が所望される場合に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アルキン部分を含む天然にコードされていないアミノ酸を含み、かつ当該アミノ酸に連結されるべき水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。また代替可能に、逆反応（すなわち、アミノ酸上におけるアジド部分および水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分を用いる）が達成され得る。
また、アジド官能基は、アリールエステルを含む水溶性ポリマーと選択的に反応し、かつアリールホスフィン部分を用いて適切に機能付与されて、アミド連結を生成する。アリールホスフィン基はインシチュにおいてアジドを還元し、かつそれから結果として生じたアミンは近接するエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。例えば、E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000) を参照すればよい。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸が挙げられるが、これに限定されない）またはアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）のいずれかであり得る。
アリールエステルおよびホスフィン部分を含む、例示的な水溶性ポリマーは、以下のように示さ表され得る：
Figure 2020018314
（ここで、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、かつＲは、Ｈ、アルキル基、アリール基、置換アルキル基および置換アリール基であり得る）。例示的なＲ基としては、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ、および−ＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれは独立して、水素基、置換もしくは非置換のヘテロアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基（１−３のハロゲンと置換されたアリールが挙げられるが、これに限定されない）、置換もしくは非置換のアルキル基、アルコキシ基もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合に、例えば、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ基のそれぞれは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれであるように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結び付けられている場合に、それらは、窒素原子と組み合わさって、５員環、６員環、または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むが、これらに限定されないことが意図される。置換体の上述の議論から、当業者は、“アルキル”という用語が、水素基以外の基（例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＯＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない）およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられるが、これらに限定されない））と結合された炭素原子を含むことを意図されることを理解する。
また、アジド官能基は、チオエステルを含む水溶性ポリマーと選択的に反応し、かつアリールホスフィン部分を用いて適切に機能付与されて、アミド結合を生成し得る。アリールホスフィン基は、インシチュにおいてアジドを還元し、かつそれから結果として生じるアミンは、チオエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。チオエステル部分およびホスフィン部分を含む例示的な水溶性ポリマーは、以下のように表され得る：
Figure 2020018314
（ここで、ｎは１−１０であり、ＸはＯ、Ｎ、またはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、かつＷは水溶性ポリマーである）。
例示的なアルキン含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2020018314
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、存在せず；ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、かつアセチレン部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、かつプロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている（すなわち、プロパルギル−チロシン）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１およびＸは存在せず、かつｍは０である（すなわち、プロパリルグリシン）。
アルキン含有アミノ酸は、市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、ペプテック（Peptech）（バーリントン（Burlington）、ＭＡ）から市販されている。代替可能に、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法に従って調製され得る。例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンは、例えば、Deiters, A.et al, J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003) に記載されているように合成され得、かつ４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンは、Kayser, B., et al, Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997) に記載されているように、合成され得る。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
例示的なアジド含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2020018314
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、または存在せず；ｍは０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、かつアジド部分は、アルキル側鎖に対してパラに位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは０−４であり、Ｒ１およびＸは存在せず、かつｍ＝０である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、かつβ−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。
アジド含有アミノ酸は、商業的な供給源から入手可能である。例えば、４−アジドフェニルアラニンは、ケム−インペックスインターナショナル（Chem-Impex International）、（ウッドデール（Wood Dale）、ＩＬ）から入手され得る。市販されていないこれらのアジド含有アミノ酸に関して、アジド基は、適切な脱離基（ハロゲン化物、メシラート、トシレートが挙げられるが、これらに限定されない）の排除を介した、または適切に保護されたラクトンの開環を介した（限定されないが、これらが挙げられる）、当業者に公知の標準的な方法を用いて、比較的容易に調製され得る。例えば、Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)を参照すればよい。
（Ｅ．アミノチオール反応性基）
ベータ置換アミノチオール官能基の固有な反応性は、チアゾリジンの形成を介した、アルデヒド基を含むポリペプチドおよび他の生体分子の選択的な修飾にとって、それらを極めて有効にする。例えば、Shao and J. Tarn, J. Am. Chem. Soc. 1995, 1 17 (14) 3893-3899を参照すればよい。いくつかの実施形態において、ベータ置換アミノチオールアミノ酸は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれ得、かつそれからアルデヒド官能性基を含む水溶性ポリマーと反応し得る。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマー、薬剤接合体または他のペイロード（payload）は、チアゾリジンの形成を介したベータ置換アミノチオールアミノ酸を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結され得る。
（Ｆ．付加的な反応性基）
本発明に係るＦＧＦ−２１に組み込まれ得る、付加的な反応性基および天然にコードされていないアミノ酸は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる以下の特許出願：米国特許出願公開第２００６／0194256号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号明細書、米国特許仮出願第６０／７５５，３８８号明細書、米国特許仮出願第６０／７５５，７１１号明細書、米国特許仮出願第６０／７５５，０１８号明細書、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号明細書、国際公開第２００６／０６９２４６号パンフレット、米国特許仮出願第６０／７５３，０４１号明細書、米国特許仮出願第６０／７５３，０４０号明細書、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号明細書、米国特許仮出願第６０／８８２，８１９号明細書、米国特許仮出願第６０／８８２，５００号明細書、米国特許仮出願第６０／８７０，５９４号明細書において記載されている。また、これらの出願は、ＰＥＧまたは他のポリマーに存在し得る反応基（連結のためのヒドロキシルアミン（アミノオキシ）基が挙げられるが、これに限定されない）について言及している。
（非天然アミノ酸の細胞による取り込み）
細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質への取り込みを目的として（限定されないが、これが挙げられる）、非天然アミノ酸を設計および選択するときに典型的に考慮される１つの課題である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が細胞透過性ではあり得ないことを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の収集を介して真核細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が少しでも細胞によって取り込まれるならば、これを評価する急速なふるいが行われ得る。例えば、“Protein Arrays”と題される米国出願公開第２００４／１９８６３７号明細書（参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）、およびLiu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785 における、例えば、毒性アッセイを参照すればよい。取り込みは、多様なアッセイを用いて容易に分析されるが、細胞性の取り込み経路に受け容れられる非天然アミノ酸の設計ための代替案は、インビボにおいてアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
（非天然アミノ酸の生合成）
多くの生合成経路が、アミノ酸および他の化合物を産生するために細胞にすでに存在している。特定の非天然アミノ酸用の生合成方法は、天然（細胞内が挙げられるが、これに限定されない）に存在し得ない一方において、本明細書に記載の方法および組成物は、そのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸用の生合成経路は、新しい酵素の添加、または存在する宿主細胞経路の改変によって宿主細胞において生成され得る。追加の新しい酵素は、天然に存在する酵素または人工的に発展させた酵素であり得る。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（“In vivo incorporation of unnatural amino acids”と題される国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットにおける一例に示されるように）は、他の生物に由来する公知の酵素の組合わせの追加を基にしている。これらの酵素に関する遺伝子は、当該遺伝子を備えるプラスミドを用いた真核細胞の形質転換によって、当該細胞に導入され得る。細胞において発現される場合に、当該遺伝子は、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。任意に添加されるこの種の酵素の例は、以下の実施例において与えられる。追加の酵素の配列は、例えば、ジーンバンクに見出される。また、人工的に発展させた酵素は、同様の方法において細胞の中に加えられ得る。この方法において、細胞性機構、および細胞資源は、非天然アミノ酸を産生するために操作される。
多様な方法が、生合成経路に使用するための新規な酵素の産生、または存在する経路の発展に利用可能である。例えば、マキシゲン（Maxygen）（www.maxigen.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）によって開発されたような（限定されないが、これが挙げられる）、反復的な組換えは、新規の酵素および経路の開発に使用され得る。例えば、Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389- 391、およびStemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751を参照すればよい。同様に、ジェネンコア（Genencor）（genencor.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）によって開発されたデザインパス（DesignPath）（登録商標）は、代謝経路操作（細胞において非天然アミノ酸を作り出す経路の操作が挙げられるが、これに限定されない）に任意に使用される。この技術は、新しい遺伝子（機能的なゲノミクスを介して同定された遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに分子進化および設計の組合わせを用いて、宿主生物に存在する経路を再構築する。また、ディバーサコーポレーション（Diversa Corporation）（diversa.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）は、新しい経路を作り出すための（限定されないが、これが挙げられる）、遺伝子および遺伝子経路のライブラリを迅速にスクリーニングする技術を提供する。
典型的に、本発明の設計された生合成経路を用いて産生された非天然アミノ酸は、タンパク質の効率的な生合成に十分な濃度（天然の細胞における量が挙げられるが、これに限定されない）に産生されるが、他のアミノ酸の濃度に影響する、または細胞性の資源を使い果たす程ではない。この方法においてインビボにおいて生成される典型的な濃度は、約１０ｍＭから０．０５ｍＭである。特定の経路に関して所望される酵素の生成に使用される遺伝子を備えるプラスミドを用いて、細胞が形質転換され、かつ非天然アミノ酸が生成されると、インビボにおける選択は、リボソームタンパク質の合成および細胞増殖の両方に対して、非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、任意に使用される。
（非天然アミノ酸を有するポリペプチド）
非天然アミノ酸の組み込みは、多様な目的（タンパク質構造および／または機能の変化の修正、大きさの変更、酸性度の変更、求核性の変更、水素結合の変更、疎水性の変更、プロテアーゼ標的部位の接触性の変更、部分に対する標的化の変更（タンパク質アレイ用が挙げられるが、これらに限定されない）、生物学的に活性な分子の付加、ポリマーの付与、放射性核種の付与、血中半減期の調節、組織透過性（例えば、腫瘍）の調節、活性な輸送の調節、組織、細胞もしくは器官の特徴または分布の調節、免疫原性の調節、プロテアーゼ耐性の調節などが挙げられるが、これらに限定されない）のためになされ得る。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強されたかもしくはまったく新しい触媒的、または生物学的な性質を有し得る。例えば、以下の性質：毒性、体内分布、構造的性質、分光性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒能、半減期（血中半減期が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに他の分子との共有結合的または非共有結合的な（限定されないが、これらが挙げられる）反応能などは、タンパク質への非天然アミノ酸の含有によって任意に修飾される。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む、組成物は、新規の治療、診断、触媒酵素、産業的なタンパク質（抗体が挙げられるが、これに限定されない）、ならびにタンパク質の構造および機能に関する研究（限定されないが、これらが挙げられる）に有用である。例えば、Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652を参照すればよい。
本発明の１つの局面において、少なくとも１（少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０以上が挙げられるが、これらに限定されない）の非天然アミノ酸を有する、少なくとも１つのタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、同じであり得るか、異なり得る（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の異なる、または同じ非天然アミノ酸を含むポリペプチドにおける、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の異なる部位があり得ることが挙げられるが、これらに限定されない）。他の局面において、タンパク質に存在する特定のアミノ酸の、すべてではないが、少なくとも１つが非天然アミノ酸と置換されているタンパク質を含む。２つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質に関して、当該非天然アミノ酸は同一であり得るか、異なり得る（タンパク質が２つ以上の異なる種類の非天然アミノ酸を含み得るか、２つの同じ非天然アミノ酸を含み得ることが挙げられるが、これらに限定されない）。３つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質に関して、当該非天然アミノ酸は、同じであり得るか、異なり得るか、または少なくとも１つの非天然アミノ酸と複数の同種の非天然アミノ酸との組合せであり得る。
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質またはポリペプチドは、本発明の特徴である。また、本発明は、本発明の組成物および方法を用いて産生された少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する、タンパク質またはポリペプチドを包含する。また、賦形剤（薬学的に受容可能な賦形剤が挙げられるが、これに限定されない）は、タンパク質と共に存在し得る。
非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質またはポリペプチドを、真核細胞において産生することによって、タンパク質またはポリペプチドは、翻訳後修飾を典型的に含む。ある特定の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸、および真核細胞によってインビボにおいてなされた少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、ここで、当該翻訳後修飾は、原核細胞によってなされない。例えば、翻訳後修飾としては、糖鎖形成、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、および糖鎖形成などが挙げられるが、これらに限定されない。１つの局面において、翻訳後修飾としては、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン連結による、アスパラギンに対するオリゴ糖（（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃが挙げられるが、これに限定されない）の付加が挙げられる。真核細胞のＮ結合型オリゴ糖のいくつかの例を載せている表１を参照すればよい（付加的な残基が存在し得るが、示されていない）。他の局面において、翻訳後修飾としては、ＧａｌＮＡｃ−セリン連結もしくはＧａｌＮＡｃ−スレオニン連結、またはＧｌｃＮＡｃ−セリン連結もしくはＧｌｃＮＡｃスレオニン連結による、セリンまたはスレオニンに対するオリゴ糖（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられるが、これらに限定されない）の付加が挙げられる。
Figure 2020018314
さらにもう１つの局面において、翻訳後修飾としては、前駆体（カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン（preproparathyriod hormone）、プレプロインシュリン、プロインシュリン、プレプロオピオメラノコルチン、およびプロオピオメラノコルチンなどが挙げられるが、これらに限定されない）のタンパク質分解性のプロセシング、多サブユニットタンパク質への集合もしくは巨大分子への集合、細胞における他の部位への移動（細胞小器官（例えば、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞など）または分泌経路の通過が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。ある特定の実施形態において、タンパク質は、分泌配列または局在化配列である、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、またはＧＳＴ融合などを備える。
非天然アミノ酸の利点１つは、非天然アミノ酸が、付加的な分子の付加に使用され得る付加的な化学部分を与えることである。これらの修飾は、真核細胞もしくは原核細胞のインビボまたはインビトロにおいてなされ得る。従って、ある特定の実施形態において、翻訳後修飾は非天然アミノ酸を介する。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応を介し得る。タンパク質の選択的な修飾に現在、使用されるほとんどの反応は、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間における共有結合（α−ハロケトンのヒスチジン側鎖またはシステイン側鎖との反応が挙げられるが、これらに限定されない）の形成に関する。これらの場合における選択性は、タンパク質における求核性残基の数および接触性によって決定される。本発明のタンパク質において、より選択的な他の反応は、例えば、非天然ケトアミノ酸の、ヒドラジドまたはアミノオキシ化合物との反応に使用され得る。例えば、すべてが参照によって本明細書に組み込まれる、Cornish et al, (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151;Mahal et al, (1997) Science. 276:1125-1128;Wang et al, (2001) Science 292:498-500;Chin et al, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027;Chin et al, (2002) Proc. Natl. Acad. ScL 99: 11020-11024;Wang et al, (2003) Proc. Natl. Acad. ScL 100:56-61;Zhang et al, (2003) Biochemistry. 42:6735-6746；およびChin et al, (2003) Science. 301:964-7を参照すればよい。これは、多くの試薬（蛍光団、架橋剤、糖誘導体および細胞毒性分子が挙げられるが、これらに限定されない）を用いたほとんどあらゆるタンパク質の選択的な標識を可能にする。また、参照によって本明細書に組み込まれる、“Glycoprotein synthesis”と題される米国特許第６，９２７，０４２を参照すればよい。また、アジドアミノ酸を介した（限定されないが、これが挙げられる）翻訳後修飾は、トリアリールホスフィン試薬を用いた（限定されないが、これが挙げられる）シュタウディンガー連結を介してなされ得る。例えば、Kiick et al, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24を参照すればよい。
本発明は、タンパク質にアジド部分またはアルキニル部分（限定されないが、これらが挙げられる）を含む非天然アミノ酸の、セレクターコドンに応じた遺伝子的組み込みに関する、タンパク質の選択的な修飾のための他の高効率な方法を提供する。それから、これらのアミノ酸側鎖は、アジド誘導体またはアルキニル誘導体（限定されないが、これらが挙げられる）を別々に用いて、ヒュイゲン［３＋２］付加環化反応（限定されないが、これが挙げられる）（例えば、Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis. Vol. 4. (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109；およびHuisgen, R. in 1 ,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry. (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176を参照すればよい）によって修飾され得る。この方法は、求核性置換よりむしろ付加環化に関するので、タンパク質は極めて高い選択性を有して修飾され得る。この反応は、反応混合物に対する触媒量のＣｕ（Ｉ）塩の添加によって、水性条件の下に室温において、優れた位置選択性（１，４＞１，５）を有して達成され得る。例えば、Tornoe et al, (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064；およびRostovtsev et al, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599を参照すればよい。使用され得る他の方法は、テトラシステインモチーフを有するビス砒素化合物におけるリガンド交換である（例えば、Griffin et al, (1998) Science 281 :269-272を参照すればよい）。
［３＋２］付加環化を介して本発明のタンパク質に加えられ得る分子としては、アジド誘導体またはアルキニル誘導体を有するほとんどあらゆる分子が挙げられる。分子としては、色素、蛍光団、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（ポリエチレングリコールの誘導体が挙げられるが、これに限定されない）、光架橋剤、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、樹脂、ビーズ、もう１のタンパク質もしくはポリペプチド（もしくはそれ以上）、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない）、金属キレート剤、補足因子、脂肪酸、および炭水化物などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子は、アルキニル基（ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）またはアジド基（ｐ−アジド−フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）を別々に有する非天然アミノ酸に加えられ得る。
＜Ｖ．天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドのインビトロにおける生成＞
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然に存在する系にコードされないアミノ酸を加えるか、または置換するために、修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼを用いてインビボにおいて生成され得る。
天然に存在する系にコードされないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼを生成する方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書および米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性のシンセターゼおよびｔＲＮＡと独立して機能する（そして、このためにときに“直交性の（orthogonal）”と呼ばれる）、翻訳機構の生成に関与する。典型的に、当該翻訳系は、直交性のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。典型的に、Ｏ−ＲＳは、翻訳系における少なくとも１つの非天然に存在するアミノ酸と共にＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化し、かつＯ−ｔＲＮＡは、当該系における他のｔＲＮＡによって認識されない、少なくとも１つのセレクターコドンを認識する。従って、当該翻訳系は、コードされたセレクターコドンに応じて、当該系において産生されるタンパク質に天然にコードされていないアミノ酸を挿入して、これによってコードされたポリペプチドにおける所定の位置にアミノ酸を“置換する”。
広範な直交性のｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡは、ポリペプチドに特定の合成アミノ酸を挿入する当該技術において説明されており、かつ一般的に本発明における使用に好適である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、Wang, L.et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) 、およびZhang, Z.et al, Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)に記載されている。例示的なＯ−ＲＳまたはこれらの一部は、米国特許第７，０４５，３３７号明細書および米国特許第７，０８３，９７０号明細書（それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されている、ポリヌクレオチド配列にコードされ、かつアミノ酸配列を含む。また、Ｏ−ＲＳと共に使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書および米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対の付加的な例は、国際公開第２００５／００７８７０号パンフレット、国際公開第２００５／００７６２４号パンフレットおよび国際公開第２００５／０１９４１５号パンフレットに記載されている。
アジド特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼの系の例が、Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ用の例示的なＯ−ＲＳ配列としては、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されているように、配列番号１４−１６および２９−３２のヌクレオチド配列、ならびに配列番号４６−４８および６１−６４のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の使用に好適な例示的なＯ−ｔＲＮＡ配列としては、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，９７０号明細書に開示されているように、配列番号１−３のヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。特定の天然にコードされていないアミノ酸に対して特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼの他の例が、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている。Ｓ．セレビジアエにおいてケト含有アミノ酸およびアジド含有アミノ酸の両方を組み込む、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡについて、Chin, J. W.et al, Science 301 :964-967 (2003). に記載されている。
様々な他の直交性の対が報告されている。Ｓ．セレビジアエのｔＲＮＡおよびシンセターゼから由来する、グルタミニル系（例えば、Liu, D. R., and Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:4780-4785を参照すればよい）、アスパルチル系（例えば、Pastrnak, M.et al, (2000) HeIv. Chim. Acta 83:2277-2286を参照すればよい）、およびチロシル系（例えば、Ohno, S.et al, (1998) J. Biochem. (Tokyo. Jpn.) 124:1065-1068；およびKowal, A. K.et al, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273を参照すればよい）が、E. coliにおける非天然アミノ酸の見込みのある組み込みについて記載されている。E. coliのグルタミニルシンセターゼ（例えば、Kowal, A. K.et al, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273を参照すればよい）、およびチロシルシンセターゼ（例えば、Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) MoI. Cell. Biol. 10:1633-1641を参照すればよい）に由来する系は、Ｓ．セレビジアエにおける使用に関して記載されている。E. coliのチロシル系は、哺乳類細胞における、３−ヨード−Ｌ−チロシンのインビボにおける組み込みに使用されている。Sakamoto, K.et al, (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699を参照すればよい。
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼの使用は、天然にコードされていないアミノ酸をコードする特異的なコドンの選択に関与する。任意のコドンが使用され得るが、一般的にＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼが発現されている細胞において、まれにしか使用されないか、または決して使用されないコドンを選択することが好ましい。例えば、例示的なコドンとしては、ナンセンスコドン（例えば、ストップコドン（アンバー、オーカー、およびオパール））、４以上の塩基コドン、ならびにまれにしか使用されない、または使用されない他の天然の３塩基コドンが挙げられる。
特異的なセレクターコドンは、当該技術において公知の突然変異生成方法（部位特異的突然変異生成法、カセット突然変異生成法、制限選択突然変異生成法などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、ＦＧＦ−２１ポリヌクレオチドのコード配列における適切な位置に導入され得る。
タンパク質の生合成機構の構成要素（例えば、非天然アミノ酸を組み込むために使用され得るＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を生成する方法は、Wang, L., et al Science 292: 498-500 (2001);Chin, J. W.et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) ;Zhang, Z.et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003) に記載されている。非天然アミノ酸のインビボにおける組み込みのための方法および組成物は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている。また、生体のインビボにおける翻訳系に使用する、直交性のｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼ対を選択する方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および米国特許第７，０８３，９７０明細書に記載されている。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、“Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins”と題される国際公開第０４／０３５７４３号パンフレットには、ケトアミノ酸の組み込み用の直交性のＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、“Expanding the Eukaryotic Genetic Code”と題される国際公開第０４／０９４５９３号パンフレットには、真核宿主細胞における天然にコードされていないアミノ酸の組み込み用の直交性のＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。
少なくとも１つの組換え直交性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を産生する方法は：（ａ）第１の生物（原核生物（例えば、メタノコッカス ジャナスキー、メタノバクテリウム テルモアウトトゥロフィクム、ハロバクテリウム、エシェリキア コリ、Ａ． フンギドゥス、Ｐ． フリオシス、Ｐ． ホリコシー、Ａ． ペルニクス、またはＴ． テルモフィルスなど）または真核生物が挙げられるが、これらに限定されない）から、少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼから誘導体化された（任意に突然変異した）ＲＳのライブラリを生成すること；（ｂ）非天然アミノ酸および天然アミノ酸の存在下において直交性のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する構成要素のためのＲＳ（任意に突然変異したＲＳ）のライブラリを選択（および／またはスクリーニング）し、これによって活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールを提供すること；および／または（ｃ）非天然アミノ酸の非存在下においてＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する活性なＲＳ（突然変異体ＲＳが挙げられるが、これに限定されない）のプールを、（任意にネガティブ選択を介して）選択し、これによって少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを提供することを包含し；ここで、少なくとも１つの当該組換えＯ−ＲＳは、非天然アミノ酸と共に当該Ｏ−ＲＳを好ましくアミノアシル化する。
１つの実施形態において、ＲＳは不活性ＲＳである。不活性ＲＳは、活性なＲＳを突然変異させることによって生成され得る。例えば、不活性ＲＳは、異なるアミノ酸（アラニンが挙げられるが、これに限定されない）に対して、少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約６つ、または少なくとも約１０以上のアミノ酸を突然変異することによって生成され得る。
突然変異体ＲＳのライブラリは、当該分野において公知の多様な技術（三次元のＲＳ構造に基づいた合理的な設計、または無作為のもしくは合理的な技術におけるＲＳヌクレオチドの突然変異生成法が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて生成され得る。例えば、突然変異体ＲＳは、部位特異的突然変異生成法、無作為の突然変異生成法、多様性生成組換え突然変異、キメラ構築、合理的な設計、ならびに本明細書に記載されているか、もしくは当該技術において公知の他の方法によって、生成され得る。
１つの実施形態において、活性な構成要素（非天然アミノ酸および天然アミノ酸の存在下において直交性のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する構成要素が挙げられるが、これに限定されない）のためのＲＳ（任意に突然変異したＲＳ）のライブラリを選択（および／またはスクリーニング）することは：スクリーニングマーカー（抗生物質耐性遺伝子などが挙げられるが、これに限定されない）、および（任意に突然変異した）ＲＳのライブラリを、複数の細胞に導入すること（ここで、ポジティブ選択および／またはスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドンが挙げられるが、これらに限定されない）を備える）；選択薬剤の存在下において複数の細胞を成長させること；ポジティブ選択またはスクリーニングマーカーにおける少なくとも１つのセレクターコドンを抑圧することによって、選択薬剤および／またはスクリーニング薬剤の存在下において、生存する（または特異的な反応を示す）細胞を同定し、これによって活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールを含むポジティブに選択された細胞の一部を提供することを含む。任意に、選択薬剤および／またはスクリーニング薬剤の濃度は、変更され得る。
１つの局面において、ポジティブ選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、かつセレクターコドンは、ＣＡＴ遺伝子におけるアンバーストップコドンである。任意に、ポジティブ選択マーカーはβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、かつセレクターコドンはβ−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバーストップコドンである。他の局面において、ポジティブ選択マーカーは、蛍光もしくは発光のスクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカー（細胞表面マーカーが挙げられるが、これに限定されない）を備える。
１つの実施形態において、非天然アミノ酸の非存在下においてＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する活性なＲＳ（任意に突然変異した）に関するプールの、ネガティブ選択またはネガティブスクリーニングは：ポジティブ選択またはスクリーニングマーカーからの活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールと共に、ネガティブ選択マーカー、またはネガティブスクリーニングマーカーを、第２の生物の複数の細胞に導入すること（ここで、ネガティブ選択マーカー、またはネガティブスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない）を備える）；ならびに非天然アミノ酸、およびスクリーニング薬剤もしくは選択薬剤を補った第１の培地において生存するか、または特異的なスクリーニング反応を示すが、非天然アミノ酸およびスクリーニング薬剤もしくは選択薬剤を補っていない第２の培地において生存できないか、または特異的なスクリーニング反応を示さない細胞を同定し、これによって少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを有する生存細胞または選別された細胞を提供することを含む。例えば、ＣＡＴ同定手順は、適切なＯ−ＲＳ組換え体の決定において、ポジティブ選択および／またはネガティブ選択として任意に役割を果たす。例えば、クローンのプールは、非天然アミノ酸を有するか、または有しないＣＡＴ（少なくとも１つのセレクターコドンを備える）を含む成長プレート上において、任意に複製される。従って、非天然アミノ酸を含むプレート上において排他的に成長するコロニーは、組換えＲＳを含んでいるとみなされる。１つの局面において、選択（および／またはスクリーニング）薬剤の濃度は、変更される。いくつかの実施形態において、第１および第２の生物は異なる。従って、第１および／または第２の生物は、原核生物、真核生物、哺乳類、エシェリキア コリ、菌類、酵母、アルカエバクテリウム、ユウバクテリウム、植物、昆虫、原生生物などを任意に含む。他の実施形態において、スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光のスクリーニング、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
他の実施形態において、活性な（任意に突然変異した）ＲＳに関するプールのスクリーニングまたは選択（ネガティブ選択が挙げられるが、これに限定されない）は：ポジティブ選択の段階（ｂ）から活性な突然変異体ＲＳのプールを単離することと；ネガティブ選択マーカー、またはネガティブスクリーニングマーカー（ここで、ネガティブ選択マーカー、またはネガティブスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（少なくとも１つのセレクターコドンを備える毒性マーカー遺伝子（リボヌクレアーゼバルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない）を備える）、ならびに活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールを、第２の生物の複数の細胞に導入することと；非天然アミノ酸を補っていない第１の培地において生存するか、または特異的なスクリーニング反応を示すが、非天然アミノ酸を補った第２の培地において生存できないか、または特異的なスクリーニング反応を示さない細胞を同定し、これによって非天然アミノ酸に特異的な少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを有する生存細胞、または選別細胞を提供することとを含み、ここで、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳは天然にコードされていないアミノ酸に特異的である。１つの局面において、少なくとも１つのセレクターコドンは、約２つ以上のセレクターコドンを備える。そのような実施形態は、少なくとも１つのセレクターコドンが約２つ以上のセレクターコドンを備える場合、ならびに第１および第２の生物が異なる場合（それぞれの生物が、任意に原核生物、真核生物、哺乳類、エシェリキア コリ、菌類、酵母、アルカエバクテリウム、ユウバクテリウム、植物、昆虫、原生生物など（限定されないが、これらが挙げられる）である場合が挙げられるが、これらに限定されない）を任意に含むことができる。また、いくつかの局面は、ネガティブ選択マーカーが、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子（少なくとも１つのセレクターコドンを備える）を備える場合を含む。他の局面は、スクリーニングマーカーが蛍光もしくは発光のスクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを任意に備える場合を含む。本明細書における実施形態において、スクリーニングおよび／または選択は、スクリーニングおよび／または選択のストリンジェンシー（stringency）の変動を任意に含む。
他の実施形態において、直交性の組換えアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）少なくとも１つを産生する方法は：（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離すること；（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳから誘導体化されたＯ−ＲＳ（任意に突然変異した）の第２のセットを生成すること；ならびに（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する能力を備える突然変異したＯ−ＲＳが得られるまで、段階（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことをさらに含む。段階（ｄ）−（ｆ）は、任意に繰り返される（少なくとも２回が挙げられるが、これに限定されない）。１つの局面において、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳから誘導体化された突然変異したＯ−ＲＳの第２のセットは、突然変異生成法（無作為の突然変異生成法、部位特異的突然変異生成法、組換え、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない）によって生成され得る。
選択／スクリーニングの段階（上述した方法における、ポジティブ選択／スクリーニングの段階（ｂ）か、ネガティブ選択／スクリーニングの段階（ｃ）か、ポジティブおよびネガティブ選択／スクリーニングの段階（ｂ）および（ｃ）の両方かのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない）のストリンジェンシーは、選択／スクリーニングのストリンジェンシーの変更を任意に含む。他の実施形態において、ポジティブ選択／スクリーニングの段階（ｂ）か、ネガティブ選択／スクリーニングの段階（ｃ）か、ポジティブおよびネガティブ選択／スクリーニングの段階（ｂ）および（ｃ）の両方かのいずれかは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって検出されるか、または発光によって検出されるレポーターを使用することを含む。レポーターは、細胞表面、またはファージディスプレイなどに並び、かつ非天然アミノ酸または類似体に関する親和性、または触媒活性に基づいて選択される。１つの実施形態において、突然変異したシンセターゼは、細胞表面またはファージディスプレイなどに並ぶ。
組換え直交性のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を産生する方法は：（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１つのｔＲＮＡ（サプレッサｔＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない）から誘導体化された突然変異体ｔＲＮＡのライブラリを生成すること；（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの非存在下において、第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される（任意に突然変異した）ｔＲＮＡに関するライブラリを選択（ネガティブ選択が挙げられるが、これに限定されない）、またはスクリーニングし、これによってｔＲＮＡ（任意に突然変異した）のプールを提供すること；ならびに（ｃ）導入された直交性のＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化される構成要素に関するｔＲＮＡ（任意に突然変異した）のプールを選択またはスクリーニングし、これによって少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを提供することを含み；ここで、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、かつ第２の生物に由来するＲＳによって効率的に認識されず、かつＯ−ＲＳによって好ましくアミノアシル化される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサｔＲＮＡであり、および／または、天然および／または非天然の塩基の固有な３塩基コドンを備えるか、ナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を備えるコドン、アンバーコドン、オーカーコドン、もしくはオパールストップコドンである。１つの実施形態において、組換えＯ−ｔＲＮＡは、向上した直交性を備えている。いくつかの実施形態において、Ｏ−ｔＲＮＡが修飾を必要とせずに、第２の生物から第１の生物に任意に取り込まれることが理解される。多様な実施形態において、第１および第２の生物は、同じであるか、または異なり、かつ原核生物（メタノコッカス ジャナスキー、メタノバクテリウム テルモアウトトゥロフィクム、エシェリキア コリ、ハロバクテリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない）、真核生物、哺乳類、菌類、酵母、アルカエバクテリウム、ユウバクテリウム、植物、昆虫、原生生物など（限定されないが、これらが挙げられる）から任意に選択される。付加的に、組換えｔＲＮＡは、天然にか、または遺伝子操作を介してインビボにおいて生合成される非天然アミノ酸によって、任意にアミノアシル化される。非天然アミノ酸は、少なくとも第１または第２の生物に使われる成長培地に任意に加えられる。
１つの局面において、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによってアミノアシル化される（任意に突然変異した）ｔＲＮＡに関するライブラリの選択（ネガティブ選択が挙げられるが、これに限定されない）またはスクリーニング（段階（ｂ））は：毒性マーカー遺伝子（ここで、毒性マーカー遺伝子が、少なくとも１つのセレクターコドンを備える（または少なくとも１つのセレクターコドンを備える毒性マーカー遺伝子が、毒性薬剤もしくは静止薬剤の産生を導く遺伝子か、生物に必須の遺伝子を備える））、および（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのライブラリを、第２の生物に由来する複数の細胞に導入すること；ならびに生存細胞を選択すること（ここで、生存細胞は、少なくとも１つの直交性のｔＲＮＡまたは非機能的ｔＲＮＡを備える（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールを含む）を含む。例えば、生存細胞は、比較比率細胞密度アッセイ（comparison ratio cell density assay）を用いることによって選択され得る。
他の局面において、毒性マーカー遺伝子は、２つ以上のセレクターコドンを含み得る。当該方法の他の実施形態において、毒性マーカー遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを備えるリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子である。リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、２つ以上のアンバーコドンを任意に含み得る。
１つの実施形態において、導入された直交性のＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化される構成要素に関する（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールの選択またはスクリーニングは：ポジティブ選択マーカー遺伝子またはポジティブスクリーニングマーカー遺伝子（ここで、ポジティブマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子（少なくとも１つのセレクターコドン（例えば、少なくとも１つのアンバーストップコドン）を備えるβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）、または生物に必須の遺伝子、またはＯ−ＲＳと共に毒性薬剤の無毒化を導く遺伝子を備える）、および（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールを、第２の生物に由来する複数の細胞に導入すること；ならびに選択薬剤またはスクリーニング薬剤（抗生物質が挙げられるが、これに限定されない）の存在下において成長された、生存細胞または選択細胞を同定し、これによって少なくとも１つの組換えｔＲＮＡを備える細胞のプールを提供すること（ここで、少なくとも組換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによってアミノアシル化され、かつ少なくとも１つのセレクターコドンに応じて、ポジティブマーカー遺伝子によってコードされる転写産物にアミノ酸を挿入する）を含むことができる。他の実施形態において、選択薬剤および／またはスクリーニング薬剤の濃度は、変更される。
特定のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を生成する方法が提供される。方法は：（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１つのｔＲＮＡから誘導体化された突然変異体ｔＲＮＡのライブラリを生成すること；（ｂ）第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される（任意に突然変異した）ｔＲＮＡに関するライブラリを、第１の生物に由来するＲＳの非存在下において、ネガティブ選択またはネガティブスクリーニングし、これによって（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールを提供すること；（ｃ）導入された直交性のＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化される構成要素に関する（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールを選択またはスクリーニングし、これによって少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを提供することを含む。少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、かつ第２の生物に由来するＲＳによって効率的に認識されず、かつＯ−ＲＳによって好ましくアミノアシル化される。また、当該方法は、（ｄ）第３の生物に由来する少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）から誘導体化された（任意に突然変異した）ＲＳのライブラリを生成すること；（ｅ）少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する構成要素に関する突然変異体ＲＳのライブラリを、天然にコードされていないアミノ酸および天然アミノ酸の存在下において選択またはスクリーニングし、これによって活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールを提供すること；ならびに（ｆ）少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する活性な（任意に突然変異した）ＲＳに関するプールを、天然にコードされていないアミノ酸の非存在下において、ネガティブ選択またはネガティブスクリーニングし、これによって少なくとも１つの特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を提供すること（ここで、少なくとも１つのＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は、天然にコードされていないアミノ酸および少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡに対して特異的な、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを備える）を含む。当該方法によって産生される特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が包含される。例えば、特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対としては、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対（例えば、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳ対）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳ対、またはｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳ対などが挙げることができるが、これらに限定されない。付加的に、そのような方法は、第１および第３の生物が同じ生物（メタノコッカス ジャナスキーが挙げられるが、これに限定されない）である場合を含む。
また、第２の生物のインビボにおける翻訳系に使用するための直交性のｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼ対を選択する方法が、本発明に含まれる。当該方法は：マーカー遺伝子、第１の生物から単離されたか、誘導体化されたｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）を、第２の生物に由来する第１の細胞のセットに導入すること；第２の生物に由来する二重の細胞セットにマーカー遺伝子およびｔＲＮＡを導入すること；ならびに二重の細胞セットにおいて生存することができない第１のセットにおける生存細胞を選択すること、または二重の細胞セットにおいて特異的なスクリーニング反応を示すことができないそのような反応を示す細胞を選択すること（ここで、第１のセットおよび二重の細胞セットは、選択薬剤またはスクリーニング薬剤の存在下において成長され、ここで、生存細胞または選択細胞は、第２の生物のインビボにおける翻訳系に使用するための直交性のｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼ対を備える）を含む。１つの実施形態において、比較、および選択もしくはスクリーニングは、インビボ相補的アッセイを含む。選択薬剤またはスクリーニング薬剤の濃度は、変更され得る。
本発明の生物は、多様な生物および多様な組合せを含む。例えば、本発明の方法の第１および第２の生物は、同じであり得るか、または異なり得る。１つの実施形態において、生物は、任意に原核生物（メタノコッカス ジャナスキー、メタノバクテリウム テルモアウトトゥロフィクム、ハロバクテリウム、エシェリキア コリ、Ａ．フンギドゥス、Ｐ． フリオスス、Ｐ． ホリコシー、Ａ． ペルニクス、またはＴ． テルモフィルスなどが挙げられるが、これらに限定されない）である。代替可能に、生物は、任意に真核生物（植物（複合体植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物）が挙げられるが、これらに限定されない）、藻類、原生生物、菌類（酵母が挙げられるが、これに限定されない）、または動物（哺乳類、昆虫、節足動物などが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）などである。他の実施形態において、第２の生物は、原核生物（メタノコッカス ジャナスキー、メタノバクテリウム テルモアウトトゥロフィクム、ハロバクテリウム、エシェリキア コリ、Ａ． フンギドゥス、ハロバクテリウム、Ａ．フンギドゥス、Ｐ． フリオスス、Ｐ． ホリコシー、Ａ． ペルニクス、またはＴ． テルモフィルスなどが挙げられるが、これらに限定されない）である。代替可能に、第２の生物は、真核生物（酵母、動物細胞、植物細胞、菌類、または哺乳類細胞などが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。多様な実施形態において、第１および第２の生物は異なる。
＜ＶＩ．ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける天然にコードされていないアミノ酸の位置＞
本発明は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上の組込みを意図する。天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ポリペプチドの活性を破壊しない特定の位置に組み込まれ得る。これは、“保存的な”置換（疎水性のアミノ酸を用いた疎水性アミノ酸の置換、大きなアミノ酸を用いた大きなアミノ酸の置換、親水性のアミノ酸を用いた親水性アミノ酸の置換が挙げられるが、これらに限定されない）、および／または活性に不要な位置に非天然アミノ酸の挿入することによって達成され得る。
広範な生化学的および構造的な手法は、ＦＧＦ−２１ポリペプチド内における天然にコードされていないアミノ酸を用いた置換を目的とする、所望の部位の選択に採用され得る。ポリペプチド鎖の任意の部位が、天然にコードされていないアミノ酸を組み込むための選択に好適であり、かつ選択は、任意の目的もしくは特に所望ではない目的に関して、合理的な設計、または無作為の選択に基づき得ることは、当業者にとって容易に理解される。所望の部位の選択は、任意の所望の性質、または活性を有するＦＧＦ−２１分子を産生するためであり得る。当該任意の所望の性質または活性としては、アゴニスト、スーパーアゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合修飾物質、受容体活性修飾物質、ダイマーもしくはマルチマー形成、本来の分子と比較して活性もしくは性質に対して変化がないこと、またはポリペプチドの物理的もしくは化学的な性質（例えば、可溶性、凝集または安定性）を操作することなどが挙げられる。例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物活性に必要なポリペプチドにおける位置は、当該分野において公知の点突然変異分析、アラニン走査、生物活性に関する飽和変異生成およびスクリーニング、あるいは相同物スキャニング法を用いて同定され得る。ＦＧＦ−２１生物活性にとって重要な残基、薬物の安定性に関わる残基、抗体エピトープ、または受容体結合残基もしくはヘパリン結合残基が変異され得る。参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８０，７２３号明細書；米国特許第５，８３４，２５０号明細書；米国特許第６，０１３，４７８号明細書；米国特許第６，４２８，９５４号明細書；および米国特許第６，４５４，５６１号明細書には、標的物質と共にポリペプチドの活性に影響する活性ドメインの同定によって、ポリペプチド（例えば、ＦＧＦ−２１）の構造および機能を体系的に解析する方法について記載されている。アラニン走査突然変異生成法、または相同物スキャニング突然変異生成法によって、生物活性に重要であるとして同定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存して、天然にコードされていないアミノ酸を用いた置換にとって、良好な候補物であり得る。また代替可能に、生物活性に重要であるとして同定された部位は、この場合もやはり、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存して、天然にコードされていないアミノ酸を用いた置換にとって、良好な候補物であり得る。他の代替可能物は、ポリペプチド鎖の各位置における、天然にコードされていないアミノ酸を用いた連続する置換を簡単に行い、かつポリペプチドの活性に関する影響を観察するためのものである。天然にコードされていないアミノ酸を用いた任意のポリペプチドへの置換に関する位置を選択する、任意の手段、技術または方法が、本発明における使用に好適であることは、当業者にとってたやすく理解される。
多くのデータが、本願に表されている方法を用いて集められており、かつ見込みがあって有益な変異の部位は、本願において後ほど記載されている実施例のように、見出されて、首尾よく検証されている。また、欠失を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドの変異体の構造および活性に関するさらなる情報について、天然にコードされていないアミノ酸を用いた置換に対して寛容と思われるタンパク質の領域を決定するために調査され得る。当該変異体は、実施例において特に記載されていない調合物および／または試験に関するいくつかの詳細を包含する変異体をも含む。類似の手法において、プロテアーゼ消化およびモノクロナル抗体は、ＦＧＦ−２１受容体との結合を担うＦＧＦ−２１の領域を同定するために使用され得る。天然にコードされていないアミノ酸を用いた置換に不寛容と思われる残基が除外されて、残りの位置のそれぞれにおいて計画される置換の影響が試験され得る。モデルは、他のＦＧＦファミリーの一員およびＦＧＦ受容体の３次元結晶構造から生成され得る。プロテインデータバンク（ＰＤＢ、ｒｃｓｂ．ｏｒｇにおけるワールドワイドウェブにおいて利用可能である）は、タンパク質および核酸の巨大分子の三次元構造データを収めている、集中されたデータベースである。３次元構造データが利用できない場合には、モデルによって、ポリペプチドの２次または３次の構造を調べる状態になり得る。従って、当業者は、天然にコードされていないアミノ酸を用いて置換され得るアミノ酸の位置を、容易に同定し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリペプチドの２次構造を破壊しないタンパク質の領域に位置される、天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上含む。
天然にコードされていないアミノ酸の組み込みの例示的な残基は、受容体結合領域として見込のある領域以外にある残基であり得る。また、当該残基は、完全または部分的に溶媒にさらされ得る残基である。また、当該残基は、近傍の残基と最小の水素結合相互作用を有するか、または近傍の残基と水素結合相互作用を有しない残基である。また、当該残基は、近傍の反応性残基に対して最小にさらされ得る残基である。また、当該残基は、露出表面の１つ以上に存在し得る残基である。また、当該残基は、第２のＦＧＦ−２１、またはこれらの他の分子もしくは断片と並ぶ、単一または複数の部位であり得る残基である。また、当該残基は、ＦＧＦ−２１の３次元構造、２次構造、３次構造または４次構造によって予想されるような、自由度の高い領域または構造的に堅固な領域に存在し得る残基である。また、当該残基は、その受容体と結合するか、もしくは結合しない残基、または他の生物学的に活性な分子と結合するか、もしくは結合しない残基である。また、当該残基は
完全な構造の自由度または堅固さを所望のとおりに変更することによって、ＦＧＦ−２１自身、または１つ以上のＦＧＦ−２１を含むダイマーもしくはマルチマーの高次構造を修飾し得る残基である。
ＦＧＦタンパク質のファミリーは、結晶学によって同定されるような、通常のβ−トレフォイル（trefoil）構造またはβ−シート構造を有している（Harmer et al., Biochemistry 43:629-640 (2004)）。当業者であれば、ＦＧＦ−２１の分析によって、タンパク質の４次構造の内部に覆われているアミノ酸残基と比較して、表面に露出しているアミノ酸残基を決定可能であることを認識する。このため、表面に露出した残基であるアミノ酸を天然にコードされていないアミノ酸に置換することは本発明の一実施形態である。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における任意の位置：配列番号１の１〜１８１または対応する配列番号２〜７におけるアミノ酸に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置の１つ以上に組み込まれる。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：１０位、５２位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：１０位、５２位、７７位、１１７位、１２６位、１３１位、および１６２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：８７位、７７位、８３位、７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に組み込まれる。
１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における９１位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における１３１位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における１０８位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における７７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における８７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における８６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における１２６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における８３位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における１４６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における１３５位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における９６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。１つの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）にある。
他の実施形態において、９１位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置の１つに他の天然にコードされていないアミノ酸がある。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、９１位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置：１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つに他の天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、９１位および１３１位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、９１位および７７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、９１位および１０８位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１３１位および１０８位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１３１位および７７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１３１位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１０８位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、７７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、８７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、８６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１２６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、８３位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸がある。
他の実施形態において、９１位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置の１つ以上に他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、９１位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置：１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。
他の実施形態において、１３１位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置の１つ以上に他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、１３１位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置：１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。
他の実施形態において、１０８位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置の２つ以上に２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１ １８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、１０８位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置：１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の２つ以上に２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。
他の実施形態において、７７位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置の１つ以上に他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６１位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７に対応するおけるアミノ酸）である。他の実施形態において、７７位に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつ以下の位置：１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上に他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。
ＦＧＦ−２１またはＦＧＦファミリーの結晶構造ならびにＦＧＦ受容体とのその相互作用の調査によって、あるアミノ酸が溶媒に完全または部分的に接触可能な側鎖を有することが示され得る。これらの位置における天然にコードされていないアミノ酸の側鎖は、タンパク質表面の外、および溶媒に向かって位置し得る。いくつかの実施形態において、これらの位置の１つ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。当該位置としては、これらに限定されないが、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５，１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、これらの位置の１つにおける天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。当該位置としては、これらに限定されないが、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５，１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、これらの位置の２つ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。当該位置としては、これらに限定されないが、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５，１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、これらの位置の１つ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。当該位置としては、これらに限定されないが、１０位、５２位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態において、これらの位置：１０位、５２位、７７位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。いくつかの実施形態において、これらの位置：８７位、７７位、８３位、７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。いくつかの実施形態において、これらの位置：６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。いくつかの実施形態において、これらの位置：９１位、１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。他の実施形態において、９１位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結される。
他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が９１位にあり、かつ以下の位置の１つにおいて１つの他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１ １１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１ １９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が９１位にあり、かつ以下の位置：１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つにおいて他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が９１位にあり、かつ以下の位置において他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１ １６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が９１位にあり、かつ以下の位置：１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）において他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が９１位にあり、かつ以下の位置において２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１ １６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が９１位にあり、かつ以下の位置：１３１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）において２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。
他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１３１位にあり、かつ以下の位置の１つにおいて１つの他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１３１位にあり、かつ以下の位置：９１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つにおいて他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１３１位にあり、かつ以下の位置において他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１３１位にあり、かつ以下の位置：９１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）において他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１３１位にあり、かつ以下の位置において２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。
他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１３１位にあり、かつ以下の位置：９１位、１０８位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）において２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。
他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１０８位にあり、かつ以下の位置の１つにおいて１つの他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１０８位にあり、かつ以下の位置：９１位、１３１位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つにおいて他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１０８位にあり、かつ以下の位置おいて他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１０８位にあり、かつ以下の位置：９１位、１３１位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）において他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１０８位にあり、かつ以下の位置の２つ以上において２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が１０８位にあり、かつ以下の位置：９１位、１３１位、７７位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の２つ以上において２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。
他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が７７位にあり、かつ以下の位置の１つにおいて１つの他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が７７位にあり、かつ以下の位置：９１位、１３１位、１０８位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の１つにおいて１つの以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が７７位にあり、かつ以下の位置おいて他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が７７位にあり、かつ以下の位置：９１位、１３１位、１０８位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）において他の天然にコードされていないアミノ酸が１つ以上ある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が７７位にあり、かつ以下の位置の２つ以上において２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。当該位置は、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸が７７位にあり、かつ以下の位置：９１位、１３１位、１０８位、７２位、８７位、８６位、１２６位、１１０位、８３位、１４６位、１３５位、９６位、および３６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）の２つ以上において２つ以上の他の天然にコードされていないアミノ酸がある。ここで、他の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結されている。
他の実施形態において、９１位および１３１位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつこれらの位置の１つ以上が水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、９１位および７７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつこれらの位置の１つ以上が水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、９１位および１０８位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつこれらの位置の１つ以上が水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、１３１位および１０８位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつこれらの位置の１つ以上が水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、１３１位および７７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に天然にコードされていないアミノ酸があり、かつこれらの位置の１つ以上が水溶性ポリマーと連結されている。他の実施形態において、９１位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１３１位（配列番号１、または対応する配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１０８位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、７７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、８７位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、８６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１２６位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。他の実施形態において、８３位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）に水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸がある。
広範な天然にコードされていないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの所定の位置に対して置換され得るか、またはＦＧＦ−２１ポリペプチドの所定の位置に組み込まれ得る。一般的に、特定の天然にコードされていないアミノ酸は、その受容体を伴うＦＧＦ−２１ポリペプチドの３次元結晶構造の調査、天然にコードされていないアミノ酸に基づく保存的な置換に対する好ましさ、およびＦＧＦ−２１ポリペプチドへ導入するために所望する特定の接合化学的性質に基づいて、組み込みのために選択される。天然にコードされていないアミノ酸に基づく保存的な置換は、すなわち、Ｐｈｅ、ＴｙｓまたはＴｒｐに対するアリールに基づく天然にコードされていないアミノ酸（例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンまたはＯ−プロパルギルチロシン）の置換である。すなわち、Ｐｈｅ、ＴｙｓまたはＴｒｐに対するアリールに基づく天然にコードされていないアミノ酸（例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンまたはＯ−プロパルギルチロシン）の置換は、例えば、アルキル部分を有する水溶性ポリマーとのヒュイゲン［３＋２］環付加をもたらすこと、またはホスフィン部分を順番に組み込むアリールエステルを有する水溶性ポリマーとのアミド結合形成を望む場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入である。
１つの実施形態において、方法は、非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込むことをさらに含み、ここで、非天然アミノ酸は、第１の反応性基；および第２の反応性基を含む分子（標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、もう１のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似物、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補足因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖鎖、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規な官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、光ケージド（photocaged）部分、化学線励起可能な部分、光異性化可能な部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似物、重原子組み込み部分、化学切断可能な基、光切断可能な部分、延長された側鎖、炭素結合型の糖、酸化還元反応活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学プローブ、燐光基、化学発光基、電子密度基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー転移剤、生物学的に活性な薬剤、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノトランスミッター、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、中性子捕獲物質、または上述のものの任意の組合せ、または他の所望の化合物もしくは物質が挙げられるが、これらに限定されない）とのタンパク質の接続を含む。第１の反応性基は、第２の反応性基と反応して、［３＋２］環付加を介して非天然アミノ酸に分子を付与する。１つの実施形態において、第１の反応性基はアルキニル部分またはアジド部分であり、かつ第２の反応性基はアジド部分またはアルキニル部分である。例えば、第１の反応性基がアルキニル部分（ｐ−プロパルギルフェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）であり、かつ第２の反応性基はアジド部分である。他の例において、第１の反応性基はアジド部分（ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）であり、かつ第２の反応性基はアルキニル部分である。
いくつかの場合において、天然にコードされていないアミノ酸置換は、ＦＧＦ−２１ポリペプチド内の他の付加、置換または欠失と組み合せられて、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの他の生物学的特色に影響を及ぼす。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの安定性（タンパク質分解性の消化に対する耐性が挙げられるが、これに限定されない）を増強し得るか、またはその受容体に対するＦＧＦ−２１ポリペプチドの親和性を増強し得る。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの薬物の安定性を増強し得る。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの可溶性（E. coliまたは他の宿主細胞において発現される場合が挙げられるが、これらに限定されない）を増強し得る。いくつかの実施形態において、付加、置換または欠失は、E. coliまたは他の組換え宿主細胞における発現の後における、ポリペプチドの可溶性を増強し得る。いくつかの実施形態において、部位は、E. coliまたは他の組換え宿主細胞における発現の後における、ポリペプチドの可溶性の増強を生じる非天然アミノ酸の組み込みに関する他の部位に加えて、天然にコードされるアミノ酸、または非天然アミノ酸を用いた置換に関して選択される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの受容体、結合タンパク質、関連リガンドに対する親和性を調節するか、ＦＧＦ−２１受容体に対する結合後におけるシグナル伝達を調節するか、受容体ダイマー形成を調節（低減または増強が挙げられるが、これらに限定されない）するか、受容体ダイマーを安定化するか、循環半減期を調節するか、放出もしくは生物学的利用性を調節するか、精製を容易にするか、または特定の投与経路を改善もしくは変更する、他の付加、置換または欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、受容体に対するＦＧＦ−２１バリアントの親和性を増強する付加、置換または欠失を含む。同様に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、化学的もしくは酵素的な切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリ−Ｈｉｓが挙げられるが、これらに限定されない）もしくは他の親和性に基づく配列、または連結分子（これに限定されないが、ビオチンが挙げられる）を含み得る。当該連結分子は、検出（ＧＦＰが挙げられるが、これに限定されない）、精製、組織もしくは細胞膜を介した輸送、プロドラッグの放出もしくは活性化、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの大きさの低下またはポリペプチドの他の特色を向上させる。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の置換は、ＦＧＦ−２１アンタゴニストを生成する。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、受容体結合と関連する領域に置換されているか、または付加されている。いくつかの実施形態において、ヘパリン結合と関連する領域に置換されているか、または付加されている。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１アンタゴニストは、ＦＧＦ−２１にアンタゴニストの機能を生じさせる少なくとも１つの置換を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１アンタゴニストは、水溶性ポリマーと連結された天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる。当該天然にコードされていないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１分子の受容体結合領域に存在している。
いくつかの場合において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸が、天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上用いて置換される。いくつかの場合において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然アミノ酸に対する天然にコードされていないアミノ酸の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の置換を、さらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１における１つ以上の残基が、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上によって置換される。いくつかの場合において、非天然にコードされる残基の１つ以上は、１つ以上の低分子量の直鎖状または分枝状のＰＥＧと連結されることによって、結合親和性が増強され、かつ単一の高分子量のＰＥＧと連結される種と血清半減期が同等になる。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１の２つ以下の残基が天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上と置換されている。
＜ＶＩＩ．非真核生物および真核生物における発現＞
クローニングされたＦＧＦ−２１ポリヌクレオチドを高レベルで発現させるために、一般的に、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、直接転写にとっての強力なプロモータ、転写／翻訳ターミネータ、さらにタンパク質をコードする核酸用であれば、翻訳開始用のリボソーム結合部位を含む発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌プロモータは、当業者に公知であり、かつSambrook et alおよびAusubel et alに説明されている。
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現を目的とした細菌発現系は、例えば、E. coli、バチルス種、およびサルモネラ（Palva et al, Gene 22:229- 235 (1983)、Mosbach et al, Nature 302:543-545 (1983)）において、利用可能であるが、これらに限定されない。そのような発現系用のキットは市販されている。また、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞にとっての真核発現系は、当業者に公知であり、かつ市販もされている。直交性のｔＲＮＡおよびアミノアシル化ｔＲＮＡシンセターゼ（上述されている）を使用して、本発明のポリペプチドが発現される場合において、発現用の宿主細胞は、直交型の構成要素を使用する該宿主細胞の能力に基づいて選択される。例示的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（例えば、Ｂ． ブレビス、Ｂ． サブチリス、またはストレプトミセスが挙げられるが、これらに限定されない）、およびグラム陰性細菌（E. coli、シュードモナス フルオレセンス、シュードモナス アエルギノーザ、シュードモナス プティダ）だけでなく、酵母および他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を含む細胞は、本明細書に記載されているように使用され得る。
本発明の真核生物の宿主細胞、または非真核生物の宿主細胞は、非常に有用な量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成する能力を提供する。１つの局面において、組成物は、例えば、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質の、少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム、もしくはそれ以上を含んでいるか、またはインビボタンパク質産生方法（組換えタンパク質の産生および精製についての詳細が本明細書に与えられている）を用いて達成され得る量を任意に含んでいるが、これらに限定されない。他の局面において、タンパク質は、例えば、細胞溶解液、緩衝液、薬学的緩衝液または他の液体懸濁液（例えば、１ｎｌから１００Ｌまでの任意の量などであるが、これらに限定されない）の中に、例えば、１リットルごとに少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１ミリグラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１０ミリグラムのタンパク質、またはそれ以上の濃度において任意に組成物に存在するが、これらに限定されない。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む真核細胞におけるタンパク質の大量（通常に、インビボ翻訳が挙げられる他の方法を用いて可能な量よりも多いが、これに限定されない）の産生は、本発明の１つの特徴である。
本発明の真核生物の宿主細胞、または非真核生物の宿主細胞は、非常に有用な量に非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質は、細胞抽出物、細胞溶解液、培地、および／または緩衝液などの中に、例えば、少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル、少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル、またはそれ以上の濃度において、産生され得る。
（Ｉ．発現系、培養および単離）
任意の数の適切な発現系において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを発現させ得る。該発現系としては、例えば、酵母、昆虫、哺乳類、および細菌などが挙げられる。典型的な発現系の例を以下に示す。
酵母
本明細書で用いられるときに、“酵母”という用語は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能な、様々な酵母のいずれかものを含む。当該酵母としては、子嚢胞子を生じる（ascosporogenous）酵母（エンドミセタレス）、担子胞子を生じる（basidiosporogenous）酵母、および不完全真菌（ブラストミセス）の群に属する酵母などが挙げられるが、これらに限定されない。子嚢胞子を生じる酵母は、２のファミリー（スペルモフトラセアエおよびサッカロミセタセアエ）に分けられる。後者は、４のサブファミリー（シゾサッカロミコイデアエ（シゾサッカロミセス属など）、ナドソニオイデアエ、リポミコイダエ、およびサッカロミコイデアエ（ピチア属、クリュイベロミセス属、およびサッカロミセス属など）から構成されている。担子胞子を生じる酵母には、ロイコスポリディウム属、ロードスポリディウム属、スポリディオボルス属、フィロバシディウム属、およびフィロバシディエラ属が含まれる。不完全真菌（ブラストミセテス）の群に属する酵母は、２のファミリースポロボロミセタセアエ（スポロボロミセス属およびブレラ属など）、およびクリプトコッカセアエ（カンディダ属など）に分けられる。
本発明と一緒に使用するための特に所定のものとして、ピチア属、クリュイベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンセヌラ属、トルロプシス属、およびカンディダ属に含まれる種であり、例えば、Ｐ． パストリス、Ｐ． グイレリモンディー、Ｓ．セレビジアエ、Ｓ．カルスベルジェニス、Ｓ．ディアスタティクス、Ｓ． ドウグラシイ、Ｓ． クリュイベリ、Ｓ． ノルベンシス、Ｓ． オビフォルミス、Ｋ． ラクティス、Ｋ． フラジリス、Ｃ． アルビカンス、Ｃ． マルトーサ、およびＨ． ポリモルファが挙げられるが、これらに限定されない。
ＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現に好適な酵母の選択は、当業者の技術範囲にある。発現用の酵母宿主の選択において、好適な宿主は、例えば、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、良好な分泌能、良好な可溶化タンパク質産生、および総合的な強健さを有することが示されている酵母であり得る。酵母は、一般的に様々な供給源から入手でき、例えば、カリフォルニア大学生物物理学および医学物理学分野（Department of Biophysics and Medical Physics, University of California）のYeast Genetic Stock Center （バークレイ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）、ＣＡ）、およびthe American Type Culture Collection（“ＡＴＣＣ”）（マナッサ（Manassas）ＶＡ）などから入手できる。
“酵母宿主”または“酵母宿主細胞”という用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容物として使用し得るか、または使用されている酵母を含む。この用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け容れている元々の酵母宿主細胞の子孫を含んでいる。１つの親細胞の子孫が、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致しなくてもよいことは理解される。関連する性質（例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターなど）は、多くの酵母宿主を形質転換するために開発された。例えば、発現ベクターは、Ｓ．セレビジアエ （Sikorski et al, GENETICS (1989) 122:19、Ito et al, J. BACTERIOL. (1983) 153:163、Hinnen et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929）、Ｃ． アルビカンス（Kurtz et al, MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142）、Ｃ． マルトーサ（Kunze et al, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141）、Ｈ． ポリモルファ（Gleeson et al, J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459、Roggenkamp et al, MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302）、Ｋ． フラジリス（Das et al, J. BACTERIOL. (1984) 158:1165）、Ｋ． ラクティス（De Louvencourt et al, J. BACTERIOL. (1983) 154:737、Van den Berg et al, BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135）、Ｐ． グイレリモンディー（Kunze et al, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141）、Ｐ． パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号明細書、米国特許第４，９２９，５５５号明細書、および米国特許第４，８３７，１４８号明細書、Cregg et al, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376、シゾサッカロミセス ポンベ（Beach et al, NATURE (1982) 300:706）、およびＹ． リポリティカ（Davidow et al, CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985)、Gaillardin et al, CURR. GENET. (1986) 10:49）、Ａ． ニドゥランス（Balance et al, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89、Tilburn et al, GENE (1983) 26:205-221、およびYelton et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74）、Ａ． ニガー（Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479）、T. reesia （欧州特許出願公開第０２４４２３４号明細書）、および糸状菌（例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラディウム（国際公開第９１／００３５７号パンフレット）など）に対して開発された。なお、各文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
酵母ベクターの制御配列は、当業者に公知であり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許出願公開第０２８４０４４号明細書）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書）といった遺伝子に由来するプロモータ領域などが挙げられるが、これに限定されない。また、酸性ホスファターゼをコードしている酵母のＰＨＯ５遺伝子は、有用なプロモータ配列を提供し得る（Miyanohara et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1）。酵母宿主との使用に適切な他のプロモータ配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al, J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073）、および他の解糖系の酵素（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、およびホスホグルコースイソメラーゼ（例えば、Holland et al, BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900、Hess et al, J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149）が含まれ得る。増殖条件によって制御される転写の付加的な利点を有する、酵母の誘導性プロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素にとってのプロモータ領域を含んでいてもよい。酵母発現への使用に適切なベクターおよびプロモータが、欧州特許出願公開第００７３６５７号明細書に、さらに記載されている。
また、酵母エンハンサーを、酵母プロモータと共に用い得る。さらに、合成プロモータもまた、酵母プロモータとして機能し得る。例えば、酵母プロモータの上流活性化配列（ＵＡＳ）を、別の酵母プロモータの転写活性化領域につなぎ、合成混成プロモータを作製してもよい。混成プロモータとしては、例えば、ＧＡＰの転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号明細書、および米国特許第４，８７６，１９７号明細書を参照すればよく、これらの文献は言及によって本明細書に組み込まれる。混成プロモータの他の例としては、解糖系酵素の遺伝子（例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫ）の転写活性化領域と組み合せたＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子の調節配列から成るプロモータが挙げられる。欧州特許出願公開０１６４５５６号明細書を参照すればよい。さらに、酵母プロモータは、酵母のＲＮＡポリメラーゼとの結合能および転写開始能を有する、非酵母由来の天然に存在するプロモータを含んでいてもよい。
酵母発現ベクターの一部を構成し得る他の制御要素としては、例えば、ＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子に由来するターミネータ（Holland et al, J. BlOL. CHEM. (1981) 256:1385）が挙げられる。さらに、２μプラスミドの起点に由来する複製起点は、酵母に適切である。酵母に使用する適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。Tschumper et al, GENE (1980) 10:157、Kingsman et al, GENE (1979) 7:141を参照すればよい。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン存在下において増殖能を欠如している酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当業者に公知の技術であり、かつ通常、アルカリ性陽イオンを用いて処理されたスフェロプラスト、または無処置の酵母宿主細胞のいずれかの形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵母の形質転換は、Hsiao et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829およびVan Solingen et al, J. BACT. (1977) 130:946に記載の方法に従って、実施され得る。しかし、また、例えば、核注入、エレクトロポレーション、または原形質融合によってＤＮＡを細胞に導入する他の方法も、SAMBROOK et al, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)に通常に記載されているように、使用され得る。それから、酵母宿主細胞を当業者に公知の標準技術を用いて培養してもよい。
酵母宿主細胞において異種タンパク質を発現させる他の方法は、当業者に公知の技術である。一般的に、米国特許出願公開第２００２／００５５１６９号明細書、米国特許第６，３６１，９６９号明細書、米国特許第６，３１２，９２３号明細書、米国特許第６，１８３，９８５号明細書、米国特許第６，０８３，７２３号明細書、米国特許第６，０１７，７３１号明細書、米国特許第５，６７４，７０６号明細書、米国特許第５，６２９，２０３号明細書、米国特許第５，６０２，０３４号明細書、および米国特許第５，０８９，３９８号明細書、米国再発行特許発明第ＲＥ３７，３４３号明細書、および米国再発行特許発明第ＲＥ３５，７４９号明細書、国際公開第９９／０７８６２号パンフレット、国際公開第９８／３７２０８号パンフレット、および国際公開第９８／２６０８０号パンフレット、欧州特許出願公開第０９４６７３６号明細書、欧州特許出願公開第０７３２４０３号明細書、欧州特許出願公開第０４８０４８０号明細書、欧州特許出願公開第０４６００７１号明細書、欧州特許出願公開第０３４０９８６号明細書、欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書、欧州特許出願公開第０３２４２７４号明細書、および欧州特許出願公開第０１６４５５６明細書を参照すればよい。また、Gellissen et al, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(l-2):79-93、Romanos et al, YEAST (1992) 8(6):423-488、Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7を参照すればよい。上記文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
酵母宿主株は、当業者に公知である標準の給飼バッチ発酵方法（feed batch fermentation method）を用いて、増幅段階の間に酵母宿主株を発酵槽において成長させてもよい。上記発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路、または発現制御の様式の差異に原因して、適合されてもよい。例えば、サッカロミセス酵母宿主の発酵は、１つのグルコース飼料、複合的な窒素源（カゼイン加水分解物など）、および複数のビタミン補助物を必要としてもよい。これに対し、メチロトローフ酵母であるＰ． パストリスは、グリセロール、メタノール、および微量の無機化合物飼料を必要としてもよく、最適な成長および発現については単純なアンモニウム（窒素）塩だけを必要とする。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、Elliott et al, J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95、およびFieschko et al, BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113を参照すればよい。なお、これら文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
しかし、上記発酵方法は、用いられる酵母宿主株とは無関係な特定の共通の特徴を有していてもよい。例えば、成長限界栄養素（通常は炭素）を、発酵槽に増幅段階の間に添加して、最大限の成長を可能にしてもよい。さらに、発酵方法は、一般的に、十分な量の炭素、窒素、基本塩、リン、および他の微量栄養素（ビタミン、微量無機物、および塩など）を含むように調製された発酵培地を用いてもよい。ピチアを伴ったに使用に適切な発酵培地の例が、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、および米国特許第５，２３１，１７８号明細書に記載されている。なお、これら文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットには、酵母におけるＦＧＦ−２１の発現について記載されている。
バキュロウイルス感染昆虫細胞
“昆虫宿主”または“昆虫宿主細胞”という用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容物として使用し得るか、または使用されている昆虫をいう。この用語は、トランスフェクトされた元々の昆虫宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫が、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことは理解される。関連する性質（例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
ＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現に好適な昆虫細胞の選択は、当業者に公知である。いくつかの昆虫種は、当該分野において十分に説明されており、かつアエデス アエジプティ、ボンビックス モリ、ドロソフィラ メラノガスター、スポドプテラ フルギペルダ、およびトリコプルシア ニを含めて、市販されている。発現用の昆虫宿主の選択において、適切な宿主は、特に、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および総合的な強健さを有することが示されている宿主であり得る。昆虫は、Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California（バークレイ、ＣＡ）、およびthe American Type Culture Collection （“ＡＴＣＣ”）（マナッサ、ＶＡ）を含む、様々な供給源から通常に入手することができるが、これらに限定されない。
一般的に、バキュロウイルス−感染昆虫の発現系の構成要素は、バキュロウイルスのゲノム断片、および発現される異種遺伝子の挿入に便利な制限酵素認識部位の両方を含むトランスファーベクター（普通は細菌のプラスミド）；当該トランスファーベクターにおけるバキュロウイルスに特異的な断片に対して、相同な配列を有する（これにより、バキュロウイルスゲノムに対する異種遺伝子の相同組換えが可能になる）野生型バキュロウイルス；ならびに適切な昆虫宿主細胞および成長培地を含んでいる。ベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークの選択、または培養における細胞の成長などに用いられる材料、方法および技術は公知であり、かつこれらの技術が記載されている手引書が利用可能である。
異種遺伝子をトランスファーベクターに挿入した後に、当該ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、当該ベクターと当該ウイルスゲノムとが組み換えを起こす昆虫宿主細胞に、トランスフェクションする。パッケージングされた組換えウイルスが発現され、かつ組換え体プラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系にとっての材料および方法は、例えば、インビトロジェン Ｃｏｒｐ（チャールズバッド、ＣＡ）が提供している、キットの様式において市販されている。これらの技術は、一般的に当業者に公知であり、かつSUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)に十分に記載されている。なお、この文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。また、RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)、AUSUBEL et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)、KLNG AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)およびO’REILLY et al, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)を参照すればよい。
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた、様々な異種タンパク質の製造は、実際に、当業者に公知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号明細書、米国特許第６，３４２，２１６号明細書、米国特許第６，３３８，８４６号明細書、米国特許第６，２６１，８０５号明細書、米国特許第６，２４５，５２８号明細書、米国特許第６，２２５，０６０号明細書、米国特許第６，１８３，９８７号明細書、米国特許第６，１６８，９３２号明細書、米国特許第６，１２６，９４４号明細書、米国特許第６，０９６，３０４号明細書、米国特許第６，０１３，４３３号明細書、米国特許第５，９６５，３９３号明細書、米国特許第５，９３９，２８５号明細書、米国特許第５，８９１，６７６号明細書、米国特許第５，８７１，９８６号明細書、米国特許第５，８６１，２７９号明細書、米国特許第５，８５８，３６８号明細書、米国特許第５，８４３，７３３号明細書、米国特許第５，７６２，９３９号明細書、米国特許第５，７５３，２２０号明細書、米国特許第５，６０５，８２７号明細書、米国特許第５，５８３，０２３号明細書、米国特許第５，５７１，７０９号明細書、米国特許第５，５１６，６５７号明細書、米国特許第５，２９０，６８６号明細書、国際公開第０２／０６３０５号パンフレット、国際公開第０１／９０３９０号パンフレット、国際公開第０１／２７３０１号パンフレット、国際公開第０１／０５９５６号パンフレット、国際公開第００／５５３４５号パンフレット、国際公開第００／２００３２号パンフレット、国際公開第９９／５１７２１号パンフレット、国際公開第９９／４５１３０号パンフレット、国際公開第９９／３１２５７号パンフレット、国際公開第９９／１０５１５号パンフレット、国際公開第９９／０９１９３号パンフレット、国際公開第９７／２６３３２号パンフレット、国際公開第９６／２９４００号パンフレット、国際公開第９６／２５４９６号パンフレット、国際公開第９６／０６１６１号パンフレット、国際公開第９５／２０６７２号パンフレット、国際公開第９３／０３１７３号パンフレット、国際公開第９２／１６６１９号パンフレット、国際公開第９２／０３６２８号パンフレット、国際公開第９２／０１８０１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２８号パンフレット、国際公開第９０／１００７８号パンフレット、国際公開第９０／０２５６６号パンフレット、国際公開第９０／０２１８６号パンフレット、国際公開第９０／０１５５６号パンフレット、国際公開第８９／０１０３８号パンフレット、国際公開第８９／０１０３７号パンフレット、国際公開第８８／０７０８２号パンフレットを参照すればよい。なお、各文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、公知であり、かつ例えば、バキュロウイルスのオートグラファカリフォルニカ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、ヘルパー非依存性のウイルスベクターである昆虫の発現およびトランスファーベクターを含む。この系に由来するウイルス発現ベクターは、一般的に、異種遺伝子の発現を誘導するために、ウイルスの強力なポリへドリン遺伝子プロモータを利用する。一般的には、O’Reilly et al, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)を参照すればよい。
外来の遺伝子をバキュロウイルスのゲノムに挿入する前に、上記構成要素（プロモータ、リーダー（必要に応じて）、所定のコード配列、および転写終結配列を含んでいる）は、通常、中間置換コンストラクト（Intermediate transplacement construct）（トランスファーベクター）に集められる。中間置換コンストラクトは、細菌などの宿主において安定な維持が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド）といった、レプリコンにおいてしばしば維持される。レプリコンは１つの複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅に適切な宿主における当該レプリコンの維持を可能にする。より具体的には、プラスミドは、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177）と、E. coliにおける選択および増殖に関する、原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子と複製起点と、を含有する。
ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するために一般的に使用されるトランスファーベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知である他の多くのベクターもまた設計されており、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。ｐＶＬ９８５では、ポリヘドリン開始コドンがＡＴＧからＡＴＴに変えられ、かつＡＴＴの下流の３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング部位が導入されている（Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)を参照すればよい）。他の市販されているベクターとしては、例えば、PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)が挙げられる。
異種遺伝子を挿入した後に、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウイルスのゲノムを、昆虫細胞宿主に同時トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための方法は、当該分野において公知である。例えば、SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)、Smith et al, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156、Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31を参照すればよい。例えば、挿入は、２重交差型相同組換えによって、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子の中にあり得る。また、挿入は、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設けられた、制限酵素認識部位の中にあり得る。例えば、Miller et al, BIOESSAYS (1989) 11(4):91を参照すればよい。
トランスフェクションを、エレクトロポレーションにより達成してもよい。TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)、Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501を参照すればよい。代替可能に、リポソームを使用して、組換え発現ベクターとバキュロウイルスとを用いて昆虫細胞をトランスフェクションしてもよい。例えば、Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36、Graves et al, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050、Nomura et al, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570、Schmidt et al, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323、Siffert et al, NATURE GENETICS (1998) 18:45、TILKINS et al, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998) 、Cai et al, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263、Dolphin et al, NATURE GENETICS (1997) 17:491、Kost et al, GENE (1997) 190:139、Jakobsson et al, J. BlOL. CHEM. (1996) 271:22203、Rowles et al, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376、Reverey et al, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39) :23607- 10、Stanley et al, J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121、Sisk et al, J. VlROL. (1994) 68(2):766、およびPeng et al, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274を参照すればよい。市販されているリポソームとしては、例えば、セルフェクチン（Cellfectin）（登録商標）、およびリポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）（インビトロジェン、チャールズバッド、ＣＡ）が挙げられる。また、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いてもよい。TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)、Kitts, NAR (1990) 18(19):5667、およびMann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501を参照すればよい。
バキュロウイルス発現ベクターは、たいていは、バキュロウイルスプロモータを含んでいる。バキュロウイルスプロモータは、バキュロウイルスのＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始する任意のＤＮＡ配列である。プロモータは、コード配列の５’末端近傍にたいてい配置される、転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、バキュロウイルスのプロモータは、エンハンサーと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、存在する場合は、構造遺伝子から遠位に存在する。また、発現は、調節されてもよいし、恒常的であってもよい。
ウイルス感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモータ配列を提供する。例としては、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列（FRIESEN et al, The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)、欧州特許出願公開第０１２７８３９号明細書、および欧州特許出願公開第０１５５４７６号明細書）、およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子由来の配列（Vlak et al, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765）が挙げられる。
新しく形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、感染性の組換えバキュロウイルスにパッケージングされる。その後、成長したプラークが当業者に公知の方法により精製されもよい。Miller et al, BIOESSAYS (1989) 11(4):91、SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)を参照すればよい。
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞へ感染させるために開発されている。例えば、取り分け、アエデス アエジプティ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、ボンビックス モリ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、ドロソフィラ メラノガスター（ＡＴＣＣ番号１９６３）、スポドプテラ フルギペルダ、およびトリコプルシア ニのための組換えバキュロウイルスが開発されている。国際公開第８９／０４６，６９９号パンフレット、Wright, NATURE (1986) 321:718、Carbonell et al, J. VlROL. (1985) 56:153、Smith et al, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156を参照すればよい。一般的には、Fraser et al, IN VITRO CELL. DEV. BIOL (1989) 25:225を参照すればよい。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクターの系に用いられる細胞株としては、通常、Ｓｆ９（スポドプテラ フルギペルダ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（スポドプテラ フルギペルダ）（インビトロジェン Ｃｏｒｐ、カタログ番号11497-013 （チャールズバッド、ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（トリコプルシア ニ）、およびハイ−ファイブ（High-Five）（登録商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（トリコプルシア ニ）が挙げられるが、これらに限定されない。
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方にとっての細胞および培地は、市販されている。また、細胞培養技術は、当業者に公知である。
Ｅ． Ｃｏｌｉ、シュードモナス種、および他の原核生物
細菌における発現技術は、当業者に公知である。様々なベクターが、細菌宿主における使用に利用可能である。これらベクターは、１コピーベクター、またはコピー数が少ない多コピー型ベクター（low multicopy vectors）もしくはコピー数が多い多コピー型ベクター（high multicopy vectors）であってもよい。ベクターは、クローニングおよび／または発現に役立ち得る。ベクター、ベクターに関する豊富な文献、多くの市販のベクター、ならびにベクターとその制限酵素地図とその特徴とについて記載している手引書も同等に考慮して、本明細書では、これ以上論じる必要は無い。よく知られているように、ベクターは、通常は選択を可能にするマーカーを含んでいる。このマーカーは、細胞毒性剤への耐性、原栄養性、または免疫を提供し得るものである。しばしば、異なる特徴を提供する複数のマーカーが存在する。
細菌プロモータは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合可能な、およびコード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモータは、コード配列の５’末端近傍にたいてい配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、細菌プロモータは、オペレーターと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、ＲＮＡ合成が始まる隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複してもよい。遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合することにより、特定の遺伝子の転写を阻害し得るように、オペレーターは、負に調節される（誘導性の）転写を可能にする。恒常的発現は、負の調節エレメント（オペレーターなど）が無いときに起こり得る。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質の結合配列によりもたらされてもよい。該結合配列は、存在する場合は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列よりも遠位（５’）に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質としては、例えば、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる。このＣＡＰは、エシェリキア コリ（E. coli）のｌａｃオペロンの転写開始を助ける（Raibaud et al, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173）。したがって、制御された発現は、正または負のいずれかであってもよく、これによって転写を増強または低減させてもよい。
代謝経路の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモータを提供する。この配列としては、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Chang et al, NATURE (1977) 198:1056）、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモータ配列が挙げられる。例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモータ配列が挙げられる（Goeddel et al, Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057、Yelverton et al, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731、米国特許第４，７３８，９２１号明細書、欧州公開第０３６７７６号明細書、欧州公開第１２１７７５号明細書）。なお、これら文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。また、β−ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）のプロモータ系（Weissmann (1981) The cloning of interferon and other mistakes. In Interferon 3 (Ed. I. Gresser) ）、バクテリオファージ ラムダのＰＬ（Shimatake et al, NATURE (1981) 292:128）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号明細書）のプロモータ系も、有用なプロモータ配列を提供する（なお、これら文献は、言及によって本明細書に組み込まれる）。本発明の好ましい方法は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを高レベルに誘導するためのＴ７プロモータなどの強力なプロモータを利用する。そのようなベクターの例は、当業者に公知であり、ｐＥＴ２９のシリーズ（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））、および国際公開第９９／０５２９７号明細書に記載のｐＰＯＰベクターなどが挙げられる（なお、上記文献は、言及によって本明細書に組み込まれる）。そのような発現系は、宿主細胞の生存能力または成長パラメータに支障をきたすことなく、宿主において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを高レベルに産生する。ｐＥＴ１９（ノバゲン）は、他の公知のベクターである。
また、天然に生じない合成プロモータも、細菌プロモータとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージのプロモータの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージのプロモータのオペロン配列に結合して、合成混成プロモータを作製してもよい（米国特許第４，５５１，４３３号明細書（なお、この文献は、言及によって本明細書に組み込まれる））。例えば、ｔａｃプロモータは、ｔｒｐプロモータ配列と、ｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列とを含む混成ｔｒｐ−ｌａｃプロモータである（Amann et al, GENE (1983) 25:167、de Boer et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21）。さらに、細菌プロモータは、細菌のＲＮＡポリメラーゼとの結合能、および転写開始能を有する非細菌起源の天然に存在するプロモータを含んでいてもよい。また、非細菌起源の天然に存在するプロモータを、適合するＲＮＡポリメラーゼに結合させることによって、原核生物におけるいくつかの遺伝子を高レベルに発現させることができる。バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモータ系は、共役型プロモータ系の例である（Studier et al, J. MOL. BIOL. (1986) 189:113、Tabor et al, Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074）。さらに、混成プロモータは、バクテリオファージプロモータと、E. coliのオペレーター領域とを含んでいてもよい（欧州公開第２６７８５１号明細書）。
また、機能性プロモータ配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が、外来遺伝子を原核細胞において発現させるために有効である。E. coliにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と、該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置した、長さ３〜９ヌクレオチドの配列とを含んでいる（Shine et al, NATURE (1975) 254:34）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とE. coliの１６Ｓ ｒＲＮＡの３’との間において塩基対を形成することにより、ｍＲＮＡとリボソームとの結合を促進すると考えられている（Steitz et al Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979) ）。真核性遺伝子および原核性遺伝子を、弱いリボソーム結合部位により発現すること（Sambrook et al Expression of cloned genes in エシェリキア コリ, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989）。
“細菌宿主”または“細菌宿主細胞”という用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡにとっての受容物として使用され得るか、または使用されている細菌のことをいう。この用語は、トランスフェクションされている元々の細菌宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫が、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことは理解される。関連する性質（例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
ＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現に適切な細菌宿主の選択は、当業者に公知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、取り分け、良好な封入体形成能、低いタンパク質分解活性、および全体的に強健さを有することが示されている宿主であってもよい。細菌宿主は、一般的に、様々な供給源から入手することができ、例えば、Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California（バークレイ、ＣＡ）、およびthe American Type Culture Collection（“ＡＴＣＣ”）（マナッサ、ＶＡ）から入手することができるが、これらに限定されない。Ｋ株に由来する細菌（Ｗ３１１０など）、またはＢ株に由来する細菌（ＢＬ２１など）が、一般的に産業的／製薬的な発酵に用いられる。これらの株は、成長パラメータが、極めてよく知られており、かつ強健であるから特に有用である。さらに、これらの株は、安全性および環境的理由にとって商業的に重要な、非病原性である。好適なE. coli宿主の他の例としては、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂまたはこれらの派生物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法のもう１つ別の実施形態では、E. coli宿主は、プロテアーゼが欠失した株（ＯＭＰ−、およびＬＯＮ−が挙げられるが、これらに限定されない）である。本発明の方法のもう１つ別の実施形態では、宿主細胞株は、シュードモナス種（シュードモナス フルオレセンス、シュードモナス アエルギノーザ、およびシュードモナス プティダが挙げられるが、これらに限定されない）である。ＭＢ１０１株と命名されたシュードモナス フルオレセンスの１つの次亜種は、組換え体の製造に有用であることが知られており、治療用タンパク質の製造過程に利用可能である。シュードモナスの発現系の例としては、宿主株としてThe Dow Chemical Companyから入手可能な系が挙げられる（ミッドランド、ＭＩ（ワールドワイドウェブのdow.comにおいて利用できる））。
組換え宿主細胞株が、確立されれば（すなわち、発現コンストラクトが、宿主細胞に導入され、かつ適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離されれば）、当該組換え宿主細胞株が、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの産生に適切な条件下において培養される。当業者にとって明らかなように、組換え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現コンストラクトの性質、および宿主細胞の個性に依存する。組換え宿主株は、当業者に公知の方法を用いて培養される。組換え宿主細胞は、通常、炭素、窒素および無機塩の吸収可能な供給源、ならびに任意に、ビタミン、アミノ酸、成長因子、および当業者にとって公知の他のタンパク質性の培養補助物を含む液体培養基において一般的に培養される。また、宿主細胞の培養のための液体培養基は、望ましくない微生物および／または化合物の成長を阻害するための抗生物質、または抗真菌剤（発現ベクターを含む宿主細胞を選択するための抗生物質が挙げられるが、これに限定されない）を、任意に含み得る。
組換え宿主細胞は、バッチ式もしくは連続式のいずれかにおいて、細胞の回収（ＦＧＦ−２１ポリペプチドが細胞内に蓄積する場合に）、または培養上清の回収のいずれかを伴う、バッチ式または連続式において培養され得る。原核生物の宿主細胞における産生にとって、バッチ式培養および細胞収集が好ましい。
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、組換え系における発現の後に、普通は、精製される。ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、技術にとって公知の様々な方法によって、宿主細胞または培地から精製され得る。細菌宿主細胞において産生されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、（封入体の形態において）可溶性に乏しいか、または不溶性であり得る。本発明の１つの実施形態において、当該技術において公知の方法だけでなく、本明細書に記載された方法を利用して、アミノ酸の置換が、組換えによって製造されたタンパク質の可溶性の増加を目的として、選択されるＦＧＦ−２１ポリペプチドにおいて容易に行われ得る。不溶性のタンパク質の場合に、当該タンパク質は、宿主細胞溶解液から遠心分離によって回収され得、さらに続く細胞のホモジナイゼーション（homogenization）が行われ得る。可溶性に乏しいタンパク質の場合、化合物（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられるが、これに限定されない）は、部分的に可溶性のタンパク質の沈殿を引き起こすために加えられ得る。それから、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって好都合に回収され得る。当業者にとって公知の様々な方法により、組換え宿主細胞が崩壊またはホモジナイズされて、当該細胞内から封入体が放出され得る。宿主細胞の崩壊またはホモジナイゼーションは、よく知られる技術（酵素的細胞崩壊、超音波処理、ダウンス型ホモジナイゼーション（dounce homogenization）、または高圧放出崩壊が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて実施され得る。本発明の方法の１つの実施形態では、高圧放出技術を、E. coli宿主細胞の崩壊に使用することによって、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの封入体を放出させる。ＦＧＦ−２１ポリペプチドの封入体を取り扱うときに、繰り返しのホモジナイゼーション時間を最小化することが好都合である。これにより、可溶化、器械的なせん断またはタンパク質分解などの要因による損失を無くし、封入体の収量が最大になる。
不溶性のまたは沈殿したＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当該技術にとって公知の、適切な多くの可溶化試薬のいずれかを用いて可溶化され得る。好ましくは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、尿素またはグアジニン塩酸塩を用いて可溶化され得る。バッチの大きさが都合よく扱いやすいものを用いて、大規模なバッチが産生され得るように、可溶化されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの容積は、最小化されるべきである。組換え宿主細胞が一度に数千リットルの容積であるバッチにおいて成長され得るとき、この要因は、大規模な工業的設定において重要であり得る。また、特にヒトへの製薬利用のために大規模な工業的設定においてＦＧＦ−２１ポリペプチドを製造するとき、機械および容器か、またはタンパク質産物自体かのいずれかを損傷するおそれのある過酷な化学物質の回避は、可能であれば、避けられるべきである。穏やかな変性試薬である尿素を、過酷な変性試薬であるグアニジン塩酸塩の代わりに、ＦＧＦ−２１ポリペプチド封入体の可溶化に使用できることが、本発明の方法に示されている。尿素の使用は、ポリペプチドの製造過程および精製過程に利用されるステンレス鋼の設備に対する損傷の危険度を有為に低減すると同時に、ＦＧＦ−２１ポリペプチド封入体を効率的に可溶化する。
可溶性ＦＧＦ−２１タンパク質の場合、ＦＧＦ−２１は、細胞膜周辺腔または培地に分泌され得る。例えば、ＦＧＦ−２１は、以下のようにして、Ｗ３１１０−Ｂ２細胞の細胞膜周辺腔に分泌される。異なる８つのリーダー配列を含む構築物をコード化するプラスミドを用いてＷ３１１０−Ｂ２細胞を形質転換し、それからＯＤが約０．８に達するまで当該細胞が培養される。そして、約０．８のＯＤにおいて０．０１％のアラビノースを用いて発現が誘導される。ここで、当該８つのリーダー配列としては、配列番号３９〜４４に記載されている配列が挙げられる。細胞膜周辺腔に放出されたサンプルが、５時間後に培養物から調製される。そして、当該サンプルがゲルにかけられて（図３３）、全体の発現（溶解物の全体）および細胞周辺腔分泌（可溶性画分）を示す。
さらに、可溶性ＦＧＦ−２１は、宿主細胞の細胞質に存在し得る。精製段階を実施する前に、可溶性のＦＧＦ−２１を濃縮することが望ましいことがある。当業者に公知の標準的な技術は、細胞溶解液または培地などからの可溶性ＦＧＦ−２１の濃縮に使用され得る。また、当業者に公知の標準的な技術は、宿主細胞の崩壊、および宿主細胞の細胞質もしくは細胞膜周辺腔からの可溶性ＦＧＦ−２１の放出に使用され得る。
ＦＧＦ−２１ポリペプチドが融合タンパク質として産生されるとき、融合配列は除去され得る。融合配列の除去は、酵素的切断または化学的切断によって果たされ得る。融合配列の酵素的除去は、当業者に公知の方法を用いて果たされ得る。融合配列の除去にふさわしい酵素の選択は、融合の個性によって決定され、かつ反応条件は、当業者にとって明らかなような酵素の選択によって特定される。化学的切断は、当業者に公知の試薬（臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ、および他の試薬が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて果たされ得る。切断されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当業者に公知の方法によって、切断された融合配列から精製され得る。そのような方法は、当業者にとって明らかなように、融合配列およびＦＧＦ−２１ポリペプチドの個性および性質によって決定される。精製方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくは透析、またはこれらの任意の組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。
また、ＦＧＦ−２１は、タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、精製され得る。ＤＮＡは、当業者に公知の任意の適切な方法（例えば、沈殿またはイオン交換クロマトグラフィー）によって除去され得るが、核酸沈殿試薬（例えば、硫酸プロタミンが挙げられるが、これに限定されない）を用いた沈殿によって除去され得る。ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、標準的なよく知られた方法（遠心分離またはろ過が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、沈殿されたＤＮＡから分離され得る。ＦＧＦ−２１ポリペプチドがヒトの治療に用いられる設定、および本発明の方法が薬学的に許容可能なレベルまで宿主細胞のＤＮＡを低減する設定において、宿主核酸分子の除去は重要な要因である。
また、小規模または大規模な発酵方法は、タンパク質発現（発酵槽、振とうフラスコ、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系、および攪拌タンクバイオリアクター系が挙げられるが、これらに限定されない）に使用され得る。これらの方法のそれぞれは、バッチ処理、給飼バッチ処理、連続様式処理において実施され得る。
本発明のヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当該分野における標準的な方法を用いて、通常に回収され得る。例えば、培地または細胞溶解液は、細胞破片を除去するために遠心分離またはろ過され得る。上清は、濃縮され得るか、またはさらなる精製用の調製物を適当な状態にする適切な緩衝液において、所望の容積に希釈もしくは透析され得る。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドのさらなる精製としては、原型の形態から脱アミド化され、かつ短縮されたＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントの形態の分離が挙げられる。
以下の例示的な手法のいずれかは、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドの精製に採用され得る。当該手法は、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー（DEAE SEPHAROSEを用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（SEPHADEX G-75を用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動（chromatofocusing）；置換クロマトグラフィー；電気泳動的手法（分離用の等電点電気泳動（isoelectric focusing）が挙げられるが、これに限定されない）、差別的可溶性（differential solubility）（硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出である。
本発明のタンパク質（非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質、非天然アミノ酸を含んでいるペプチド、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質にとっての結合パートナーなどが挙げられるが、これらに限定されない）は、当業者に公知の、かつ使用される標準的な手法に従って、部分的または実質的に均質に精製される。従って、本発明のポリペプチドは、当業者に公知の任意の多くの方法（硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない）によって、回収および精製され得る。タンパク質をリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）する工程は、必要に応じて、正確に折りたたまれた成熟タンパク質を作製するときに、使用され得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の適切な方法は、高い純度が所望される場合に、最終的な精製工程において採用され得る。１つの実施形態において、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質もしくはペプチド）に対して作製された抗体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質またはペプチドの親和性に基づく精製などのための精製試薬として使用され得る。必要に応じて、部分的にまたは均質にまで精製されると、ポリペプチドは、多種多様な有用物（例えば、アッセイの構成要素、治療学、予防法、診断学、研究試薬として、および／または抗体生成用の抗原としてであるが、これらに限定されない）に関して、任意に使用される。本発明のポリペプチドに対して生成された抗体は、一般的な手順を用いてポリペプチドもしくはエピトープを有する断片、または細胞を動物に投与することによって取得され得る。動物は非ヒトの動物であることが好ましい。当業者であれば、種々の公知技術を用いて抗体を生成し得る。また、遺伝子導入されたマウスまたは他の動物（他の哺乳類が挙げられる）が、ヒト化抗体を発現するために使用され得る。上述の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するか、もしくは同定するために、またはポリペプチドを精製するために使用され得る。また、本発明のポリペプチドに対する抗体は、疾患を処置するために使用され得る。
また、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ワクチンとして使用され得る。したがって、さらなる局面において、本発明は、哺乳類における免疫応答を誘導して、上述の動物を保護する方法に関する。当該方法は、抗体および／またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞が挙げられる）を生じさせるに十分な本発明のポリペプチドを哺乳類に接種することを包含する。ここで、当該疾患は、個体においてすでに確立されているか、または確立していない。また、哺乳類における免疫応答は、ベクターを介して本発明のポリペプチドを送達することを包含する方法によって誘導され得る。当該ベクターは、本発明の疾患から上述の動物を保護する抗体を産生するような免疫応答をインビボにおいて誘導するために、ポリヌクレオチドの発現を導き、かつ上記ポリペプチドをコードしている。上記ベクターを投与する１つの方法は、粒子またはその他のものにベクターを入れた皮膜物として、所望の細胞への投与を促進することである。そのような核酸縛たーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡの混成物を備え得る。ワクチンとしての使用に関して、ポリペプチドまたは拡散ベクターは、、ワクチン調合物（組成物）として通常に提供される。調合物は、安定な担体をさらに備え得る。ポリペプチドが胃において分解され得るので、ポリペプチドは非経口的に投与（例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、または皮内注射）され得る。非経口的投与に好適な調合物は、水性および非水性の無菌の注射溶液剤；ならびに水性および非水性の無菌の懸濁物を含んでいる。当該注射溶液剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および調合物を受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る。当該懸濁物は、懸濁剤または増粘剤を含み得る。また、ワクチン調合物は、当該調合物の免疫原性を増強させる当業者に公知の免疫賦活系を含み得る。投与量は、ワクチンの特定の活性に依存し、かつ通常の実験によって容易に決定され得る。
本明細書に言及されている他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質折りたたみ方法は、当業者に公知である（例えば、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)、Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification. Academic Press, Inc. N.Y. (1990) 、Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.、Bollag et al (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY、Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England、Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England、Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY、Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY、およびWalker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJならびにこれらに引用されている参考文献に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない）。
真核生物の宿主細胞または非真核生物の宿主細胞において、非天然アミノ酸を用いて所定のタンパク質またはポリペプチドを産生することの１つの利点は、通常、該タンパク質または該ポリペプチドが、それらの本来の立体構造に折りたたまれることである。しかし、本発明のある特定の実施形態において、当業者は、合成、発現および／または精製の後に、タンパク質またはポリペプチドが、関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有することが可能であることを認識している。本発明の１つの局面において、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、任意に変性され、かつそれから復元される。これは、当該分野において公知の方法を利用して（所定のタンパク質またはポリペプチドに対するシャペロニンの添加によってか、カオトロピック剤（例えば、グアニジンＨＣｌ）にタンパク質を可溶化することによってか、またはタンパク質二硫化物異性化酵素を用いてなどが挙げられるが、これらに限定されない）果たされ得る。
一般的には、発現したポリペプチドを変性または還元して、その後に当該ポリペプチドを好ましい立体構造へとリフォールディングさせることが望ましいことがある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、および／またはシャペロニンは、所定の転写産物に加えられ得る。タンパク質の還元、変性および復元の方法は、当業者に公知である（Debinski,et al, (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065- 14070）、Kreitman and Pastan (1993) Bioconiug. Chem.. 4: 581-585、およびBuchner,et al, (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270を参照すればよい）。Debinski, et alは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元を記載している。タンパク質は、還元剤（酸化型グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含有する還元剤が挙げられるが、これらに限定されない）においてリフォールディングされ得る。リフォールディング剤は、流されるか、またはそうでなければ、移動されて、１つ以上のポリペプチドもしくは他の発現産物と接触させられ得る。また、その逆もあり得る。
ＦＧＦ−２１ポリペプチドを原核生物において産生する場合、そのように産生されるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、誤って折りたたまれることがある。このため、ポリペプチドの生物活性が、欠如または低減されていることがあり得る。タンパク質の生物活性は、“リフォールディング”によって復帰され得る。通常、誤って折りたたまれたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）およびジスルフィド結合を還元可能な還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または２メルカプトエタノール（２−ＭＥ））を用いて、ポリペプチド鎖が可溶化（ＦＧＦ−２１ポリペプチドも不溶性である場合に）、アンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）および還元されることによってリフォールディングされ得る。それから、穏やかな濃度のカオトロープ（chaotorope）において、ジスルフィド結合の強化を可能にする酸化剤（例えば、酸素、シスチンまたはシスタミン）が添加される。ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当該分野において公知の標準的な方法（例えば、米国特許第４，５１１，５０２号明細書、米国特許第４，５１１，５０３号明細書、および米国特許第４，５１２，９２２号明細書に記載の方法、これらの文献は、言及によって本明細書に組み込まれる）を用いてリフォールディングされ得る。また、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、他のタンパク質と共同して折りたたまれて、異種ニ量体または異種多量体を形成し得る。
リフォールディングまたは共同折りたたみの後に、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、さらに精製され得る。ＦＧＦ−２１ポリペプチドの精製は、当業者に公知の多様な技術（疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて果たされ得る。また、付加的な精製は、精製されたタンパク質の乾燥または沈殿の段階を含み得る。
精製の後に、ＦＧＦ−２１は、当該分野において公知の任意の多様な方法（ダイアフィルトレーションおよび透析が挙げられるが、これらに限定されない）によって、異なる緩衝液に交換され得る、および／または濃縮され得る。単一の精製タンパク質として与えられるＦＧＦ−２１は、凝集および沈殿に供され得る。
精製ＦＧＦ−２１は、少なくとも９０％の純度（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、またはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって測定されるような）、または少なくとも９５％の純度、または少なくとも９８％の純度、または少なくとも９９％の純度、またはそれ以上の純度であり得る。ＦＧＦ−２１の正確な数値的な純度に関係なく、当該ＦＧＦ−２１は、薬学的産物としての使用、またはさらなる処理（例えば、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との接合）にとって十分な純度であり得る。
ある種のＦＧＦ−２１分子は、（賦形剤、担体および安定剤、ならびに血清アルブミンなど以外の）他の活性成分もしくはタンパク質の非存在下において治療薬として使用され得るか、またはそれらは、他のタンパク質もしくはポリマーと共に複合化され得る。
一般的な精製法
様々な単離工程のいずれか１つは、ＦＧＦ−２１を含むか、または任意の単離工程から結果として生じるＦＧＦ−２１ポリペプチド混合物における、細胞溶解液、抽出物、培地、封入体、宿主細胞の細胞膜周辺腔、宿主細胞の細胞質、または他の材料に対して実施され得る。当該任意の単離工程としては、アフィニティークロマトグラフィーか、イオン交換クロマトグラフィーか、疎水性相互作用クロマトグラフィーか、ゲルろ過クロマトグラフィーか、高速液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）か、逆相ＨＰＬＣ（“ＰＲ−ＨＰＬＣ”）か、発泡床吸着（expanded bed adsorption）か、それらの任意の組合せおよび／または繰り返し、ならびに任意の適切な順序でのそれらの任意の組合せおよび／または繰り返しが挙げられる。
本明細書に記載されている技術の実施に使用される設備、および他の必要な材料は、市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、記録器、および全体のシステムが、例えば、アプライド バイオシステム（Applied Biosystems）（フォスターシティー（Foster City）、ＣＡ）、バイオラッドラボラトリー（ハーキュリーズ（Hercules）、ＣＡ）、およびアマシャムバイオサイエンス（ピスカタウェイ（Piscataway）、ＮＪ）から市販されている。また、クロマトグラフィーの材料（交換基質材料、溶剤および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない）は、そのようは企業から入手可能である。
本明細書に記載されているカラムクロマトグラフィー手法における平衡および他の工程（例えば、洗浄および溶出）は、特殊な設備（例えば、ポンプ）を用いてより速く実施され得る。市販のポンプとしては、ハイロードポンプ（HILOAD（登録商標） Pump）Ｐ−５０、ペリスタルティックポンプ（Peristaltic Pump）、ポンプＰ−９０１、およびポンプＰ−９０３（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられるが、これらに限定されない。
フラクションコレクターの例としては、レディフラック フラクションコレクター（REDIFRAC Fraction Collector）、ＦＲＡＣ−１００およびＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター、ならびにスーパーフラック フラクションコレクター（SUPERFRAC（登録商標） Fraction Collector）（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、混合器は、ｐＨ勾配および直線的な濃度勾配の形成に利用可能である。市販の混合器としては、グラジエントミキサー（Gradient Mixer）ＧＭ−１およびインラインミキサーズ（In-Line Mixers）（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられる。
クロマトグラフィー過程は、任意の市販のモニターを用いて監視され得る。そのようなモニターは、ＵＶ、ｐＨおよび導電率のような情報の収集に使用され得る。検出器の例としては、モニター（Monitor） ＵＶ−１、ユビコード（UVICORD（登録商標）） Ｓ ＩＩ、モニター ＵＶ−Ｍ ＩＩ、モニター ＵＶ−９００、モニター ＵＰＣ−９００、モニター ｐＨ／Ｃ−９００、およびコンダクティヴィティーモニター（Conductivity Monitor）（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられる。実際に、全体のシステムは、市販されている（例えば、アマシャムバイオサイエンス（ピスカタウェイ、ＮＪ）から提供されているアクタ（ＡＫＴＡ（登録商標））システムズが挙げられる）。
本発明の１つの実施形態において、例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、尿素において精製されたＦＧＦ−２１ポリペプチド結果物の第１の変性によって、還元および変性され、続いて適切なｐＨにおいて還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含む緩衝液に希釈され得る。他の実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、約２Ｍから約９Ｍの範囲にある濃度の尿素において変性され、続いて約５．０から約８．０の範囲にあるｐＨのＴＲＩＳ緩衝液に希釈される。それから、この実施形態のリフォールディング混合物は、インキュベートされ得る。１つの実施形態において、リフォールディング混合物は、室温において４から２４時間、インキュベートされる。還元されかつ変性されたＦＧＦ−２１ポリペプチド混合物は、それからさらに単離または精製され得る。
本明細書に述べられているように、第１のＦＧＦ−２１ポリペプチド混合物のｐＨは、次の任意の単離工程を実施する前に調整され得る。また、第１のＦＧＦ−２１ポリペプチド混合物、またはこれらの続きの混合物のいずれかは、当該分野において公知の技術を用いて濃縮され得る。さらに、第１のポリペプチド混合物、またはこれらの続きの混合物のいずれかを含む溶出緩衝液は、当業者に公知の技術を用いて、次の単離工程に好適な緩衝液に交換され得る。
イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーが、１つの実施形態において、そして任意の付加的な工程として、第１のＦＧＦ−２１ポリペプチド混合物に対して実施され得る。一般的に、ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS（カタログ番号１８−１１１４−２１、アマシャムバイオサイエンス（ピスカタウェイ、ＮＪ））を参照すればよい。市販のイオン交換カラムとしては、ハイトラップ（ＨＩＴＲＡＰ（登録商標））カラム、ハイプレップ（HIPREP（登録商標））カラム、およびハイロード（HILOAD（登録商標））カラム（（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ））が挙げられる。そのようなカラムは、強い陰イオン交換体（例えば、Ｑセファロースファストフロウ（Q SEPHAROSE（登録商標） Fast Flow）、Ｑセファロースハイパフォーマンス（Q SEPHAROSE（登録商標） High Performance）、およびＱセファロース（Q SEPHAROSE（登録商標））ＸＬ）；強い陽イオン交換体（例えば、ＳＰセファロースハイパフォーマンス（SP SEPHAROSE（登録商標） High Performance）、ＳＰセファロースファストフロウ（SP SEPHAROSE（登録商標） Fast Flow）、およびＳＰセファロース（SP SEPHAROSE（登録商標））ＸＬ）；弱い陰イオン交換体（例えば、デアエセファロースファストフロウ（DEAE SEPHAROSE（登録商標） Fast Flow））；および弱い陽イオン交換体（例えば、ＣＭセファロースファストフロウ（CM SEPHAROSE（登録商標） Fast Flow））（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）を利用している。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーまたは陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、実質的に精製されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを単離するために、精製過程の任意の工程において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して実施され得る。陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、任意の適切な陽イオン交換基質を用いて実施され得る。有用な陽イオン交換基質としては、繊維状の、多孔質の、非多孔質の、微粒子状の、ビーズ状の、または架橋された陽イオン交換基質材料が挙げられるが、これらに限定されない。当該陽イオン交換基質材料としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、または上述のものの何れかの混合材料が挙げられるが、これらに限定されない。
陽イオン交換基質は、強いまたは弱い陽イオン交換体を含む、任意の適切な陽イオン交換体であり得る。強い陽イオン交換体は、広いｐＨ範囲に渡ってイオン化を維持し得、かつこのようにして、広いｐＨ範囲に渡ってＦＧＦ−２１ポリペプチドと結合可能であり得る。しかし、弱い陽イオン交換体は、ｐＨに応じてイオン化を失い得る。例えば、弱い陽イオン交換体は、ｐＨが約ｐＨ４またはｐＨ５より下に低下すると、電荷を失い得る。適切な陽イオン交換体としては、荷電した官能基（例えば、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホネート（Ｓ）、またはスルホエチル（ＳＥ））が挙げられるが、これに限定されない。陽イオン交換基質は、好ましくは約２．５から約６．０のＦＧＦ−２１結合ｐＨ範囲を有する、強い陽イオン交換体であり得る。代替可能に、強い陽イオン交換体は、約２．５から約５．５のＦＧＦ−２１結合ｐＨ範囲を有し得る。陽イオン交換基質は、約３．０のＦＧＦ−２１結合ｐＨを有する強い陽イオン交換体であり得る。代替可能に、陽イオン交換基質は、好ましくは約６．０から約８．０のＦＧＦ−２１結合ｐＨ範囲を有する、強い陽イオン交換体であり得る。陽イオン交換基質は、好ましくは約８．０から約１２．５のＦＧＦ−２１結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であり得る。代替可能に、陽イオン交換体は、好ましくは約８．０から約１２．０のＦＧＦ−２１結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であり得る。
ＦＧＦ−２１を装填する前に、陽イオン交換基質は、例えば、カラム容積の数倍の希釈液、弱酸（例えば、カラム容積の４倍のｐＨ３、２０ｍＭの酢酸）を用いて、平衡化され得る。平衡化に続いて、ＦＧＦ−２１が加えられてもよく、かつカラムは、やはり弱酸（例えば、弱い酢酸溶液またはリン酸溶液）を用いた実質的に精製されたＦＧＦ−２１の溶出前に、１回から数回ほど洗浄されてもよい。例えば、カラム容積のおよそ２−４倍のｐＨ３、２０ｍＭの酢酸は、カラムの洗浄に使用され得る。また、例えば、カラム容積の２−４倍の、ｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム、または０．１Ｍの塩化ナトリウムと混合されたｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウムを用いた付加的な洗浄が、使用され得る。代替可能に、当該分野において公知の方法を用いて、陽イオン交換基質は、カラム容積の数倍の希釈液、弱塩基を用いて平衡化され得る。
代替可能に、実質的に精製されたＦＧＦ−２１は、基質からＦＧＦ−２１ポリペプチドを移動させるほど十分に低いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と、陽イオン交換基質とを接触させることによって、溶出され得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ６．０までの範囲であり得る。より詳細には、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．０までの範囲であり得る。溶出緩衝液は約３．０のｐＨを有し得る。また、溶出緩衝液の量は、広範に変化してもよく、かつ通常、カラム容積の約２倍から約１０倍の範囲にある。
陽イオン交換基質に対するＦＧＦ−２１ポリペプチドの吸着に続いて、実質的に精製されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当該基質からＦＧＦ−２１ポリペプチドを移動させるほど十分に高いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と、基質を接触させることによって溶出され得る。実質的に精製されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの高ｐＨ溶出における使用に適した緩衝液としては、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲にある、クエン酸塩、リン酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳおよびＭＥＳ緩衝液が挙げられ得るが、これらに限定されない。
逆相クロマトグラフィー
ＲＰ−ＨＰＬＣは、当業者に公知の適切なプロトコールに従って、タンパク質を精製するために、実施され得る。例えば、Pearson et al, ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982)、Rivier et al, J. CHROM. (1983) 268:112-119、Kunitani et al, J. CHROM. (1986) 359:391-402を参照すればよい。ＲＰ−ＨＰＬをＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して実施して、実質的に精製されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを単離し得る。この点に関して、多種多様な長さ（少なくともＣ３から少なくともＣ３０まで、少なくともＣ３から少なくともＣ２０まで、または少なくともＣ３から少なくともＣ１８までの長さが挙げられるが、これらに限定されない）を有するアルキル官能基を用いた、シリカ誘導体化樹脂が使用され得る。代替可能に、ポリマー化樹脂が使用され得る。例えば、スチレンポリマー樹脂である、トソハースアンバークローム（TosoHaas Amberchrome）ＣＧ１０００ｓｄ樹脂が使用され得る。また、多種多様なアルキル鎖を有するシアノ樹脂またはポリマー化樹脂が、使用され得る。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、溶媒（例えば、エタノール）を用いて洗浄され得る。ソース（Source）ＲＰカラムは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの他の例である。
イオン対化剤および有機緩和剤（例えば、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、またはエタノール）を含む適切な溶出緩衝液が、ＦＧＦ−２１ポリペプチドをＰＲ−ＨＰＬＣカラムから溶出するために、使用され得る。最も一般的に使用されるイオン対化剤の例としては、酢酸、蟻酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロブチル酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。溶出は、分離時間の短縮、およびピーク幅の縮小に好ましい勾配条件を有する、１つ以上の勾配条件または定組成条件を用いて実施され得る。他の方法は、異なる溶媒濃度範囲を有する２の勾配の使用に関する。本明細書における使用に適した溶出緩衝液の例としては、酢酸アンモニウム溶液およびアセトニトリル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して実施されてもよい。一般的に、HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS （カタログ番号１８−１０２０−９０、アマシャムバイオサイエンス、（ピスカタウェイ、ＮＪ））を参照すればよく、これは言及によって本明細書に組み込まれる。適切なＨＩＣ基質としては、アルキル置換基質もしくはアリール置換基質（例えば、ブチル置換基質、ヘキシル置換基質、オクチル置換基質、またはフェニル置換基質（アガロース基質、架橋アガロース基質、セファロース基質、セルロース基質、シリカ基質、デキストラン基質、ポリスチレン基質、ポリ（メタクリレート）基質が挙げられる））、および混合形式基質（ポリエチレンアミン樹脂基質、またはブチル置換ポリ（メタクリレート）基質もしくはフェニル置換ポリ（メタクリレート）基質が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。疎水性相互作用クロマトグラフィーに関する市販の原料としては、ハイトラップ（登録商標）、ハイプレップ（登録商標）およびハイロード（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
簡単に説明すると、装填の前に、ＨＩＣカラムは、当業者に公知の標準的な緩衝液（例えば、酢酸溶液／塩化ナトリウム溶液、または硫酸アンモニウムを含むＨＥＰＥＳ）を用いて、平衡化され得る。硫酸アンモニウムは、ＨＩＣカラム装填用の緩衝液として使用され得る。それから、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの装填した後に、カラムは、不要な物質を取り除くための標準的な緩衝液と条件とを用いて洗浄され得るが、ＦＧＦ−２１ポリペプチドはカラムに保持されている。ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、カラム容積の約３倍から約１０倍の標準的な緩衝液（例えば、とりわけ、ＥＤＴＡと平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムとを含むＨＥＰＥＳ緩衝液、または酢酸／塩化ナトリウム緩衝液）を用いて溶出され得る。また、例えば、リン酸カルシウムを用いた減少直線塩勾配は、ＦＧＦ−２１分子の溶出に使用され得る。それから、この溶出物は、例えば、ダイアフィルトレーション、または限外ろ過といったろ過によって濃縮されてもよい。ダイアフィルトレーションは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの溶出に使用される塩を除くために利用され得る。
他の精製技術
例えば、ゲルろ過（言及によって本明細書に組み込まれるGEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS（カタログ番号１８−１０２２−１８、アマシャムバイオサイエンス（ピスカタウェイ、ＮＪ））、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（好適な基質としては、ＨＡウルトロゲル（ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）、ハイリソリューション（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、ＣＨＴ セラミックヒドロキシアパタイト（Ceramic Hydroxyapatite（バイオラッド））、バイオ−ゲルＨＴＰヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HTP Hydroxyapatite（バイオラッド））が挙げられるが、これらに限定されない）、ＨＰＬＣ、発泡床吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、および凍結乾燥などを用いたさらに他の単離工程は、任意の過剰の塩を除去するために、および次の単離工程もしくは最終的な製剤の調合でさえ好適な緩衝液に交換するために、第１のＦＧＦ−２１ポリペプチド混合物、または続くこれらの混合物のいずれかに対して実施され得る。
ＦＧＦ−２１ポリペプチド（実質的に精製されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む）の収率は、当業者に公知の技術を用いて、本明細書に記載されている各工程において、観察されてもよい。また、そのような技術は、最後の単離工程の後に、実質的に精製されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの収率を評価するために使用され得る。例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの収率は、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過だけでなく、様々なアルキル鎖長を有する様々な逆相高圧液体クロマトグラフィーのいずれか（例えば、シアノＰＲ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて、観察されてもよい。
本発明の特定の実施形態において、各精製工程の後におけるＦＧＦ−２１の収率は、各精製工程にとっての開始物質におけるＦＧＦ−２１の、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％であり得る。
精製は、標準的な技術（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてか、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを用いた、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの測定によって、判定され得る。例えば、ポリクローナル抗体は、陰性対照酵母発酵および陽イオン交換回収から単離されたタンパク質に対して生成され得る。また、抗体は、宿主細胞タンパク質の汚染の存在に対するプローブに使用され得る。
ＰＲ−ＨＰＣＬ材料であるＶｙｄａｃ Ｃ４（ビダック（Vydac））は、シリカゲル粒子、Ｃ４−アルキル鎖を支持する表面からなる。タンパク質性不純物からのＦＧＦ−２１ポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度における差に基づいている。溶出は、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配を用いて実施される。調製用ＨＰＬＣは、ステンレス鋼カラム（２．８から３．２リットルのＶｙｄａｃ Ｃ４シリカゲルを用いて充填されている）を用いて実施される。ヒドロキシアパタイトウルトロゲルの溶出物は、トリフルオロ酢酸を加えることによって酸性化され、かつＶｙｄａｃ Ｃ４カラム上に装填される。洗浄および溶出について、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配が使用される。画分は、回収され、かつただちにリン酸緩衝液を用いて中性化される。ＩＰＣ限界内にあるＦＧＦ−２１ポリペプチド画分は、プールされる。
デアエセファロース（ファルマシア）材料は、セファロースビーズの表面と共有的に結合されるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基に対するＦＧＦ−２１ポリペプチドの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質が洗い流された後に、微量の不純物は、低ｐＨの酢酸緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって除去される。それから、カラムは、中性のリン酸緩衝液を用いて洗浄され、かつＦＧＦ−２１ポリペプチドは、向上されたイオン強度を有する緩衝液を用いて溶出される。カラムは、デアエセファロースファストフロウを用いて充填されている。カラム容積は、３−１０ｍｇのＦＧＦ−２１ポリペプチド／１ｍｌのゲルの範囲におけるＦＧＦ−２１ポリペプチドの装填を保障するために調節される。カラムは、水および平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）を用いて洗浄される。ＨＰＬＣ溶出物のプールされた画分は装填され、かつカラムは平衡化緩衝液を用いて洗浄される。それから、カラムは、洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）により洗浄された後に、平衡化緩衝液により洗浄される。続いて、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムから溶出され、主要な溶出プロファイルに従って、単一の画分に回収される。デアエセファロースカラムの溶出物は、特定の伝導性に調節される。結果として生じる製剤原料は、テフロン（Teflon）（登録商標）ボトルの中に無菌的にろ過され、かつ−７０℃において保存される。
採用され得る付加的な方法としては、エンドトキシンを除去する工程が挙げられるが、これに限定されない。エンドトキシンは、例えば、エシェリキア コリといったグラム陰性の宿主細胞の外膜に見られるリポ多糖（ＬＰＳｓ）である。エンドトキシンレベルを低減する方法は、当業者に公知であり、当該方法としては、シリカ支持体、ガラス粉末、またはヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ならびにこれらの方法の組合せなどが挙げられるが、これらに限定されない。修飾および付加的な方法は、汚染物（例えば、所定のポリペプチドからの共遊走タンパク質）を除去するために要求され得る。エンドトキシンレベルを測定する方法は、当業者に公知であり、かつカブトガニ血球抽出液（ＬＡＬ）アッセイを含むが、これに限定されない。エンドセーフ（Endosafe（商標））−ＰＴＳアッセイは、ＬＡＬ試薬、発色体基質、および対照標準エンドトキシンを用いて前装填されたカートリッジを利用する、手持ち式の分光光度計を伴う比色分析の単一チューブ系である。代替可能な方法としては、比濁法であり、かつ９６ウェル形式を使用する動力学的（Ｋｉｎｅｔｉｃ）ＬＡＬ法が挙げられる。
多種多様な方法および手法は、天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドの収率および純度を評価するために使用されてもよく、当該方法および手法としては、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析（ＭＬＤＩ−ＴＯＦが挙げられるが、これに限定されない）、および当業者に公知のタンパク質性質決定に関する他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
付加的な方法としては、タンパク質染色法と伴った、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティング、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析陰イオン交換、等電点電気泳動、および円偏光二色性が挙げられるが、これらに限定されない。
＜ＶＩＩＩ．代替系における発現＞
種々の戦略が、非組換え宿主細胞、変異された宿主細胞、または無細胞系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために使用されている。また、これらの系は、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドの作製における使用に好適である。Ｌｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒといった反応性の側鎖を有するアミノ酸誘導体化は、リジンのＮ２−アセチル−リジンへの転換を生じる。また、化学合成は、非天然アミノ酸を組み込むための簡単な方法を提供する。酵素的ライゲーションおよび化学的ライゲーションの最近の発展に伴って、巨大タンパク質の作製が可能である。例えば、P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000) を参照すればよい。化学的なペプチドライゲーションおよび本来の化学的ライゲーションは、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１８４，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２０８０４６号明細書、国際公開第０２／０９８９０２号パンフレット、および国際公開第０３／０４２２３５号パンフレットに記載されている。所望の非天然アミノ酸をと共に化学的にアシル化されたサプレッサｔＲＮＡが、タンパク質生合成を支持することができるインビトロ抽出物に添加される、通常のインビトロ生合成方法は、ほとんどあらゆる大きさの種々のタンパク質に１００を越える非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために、使用されている。例えば、V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); and, J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989)を参照すればよい。広範な官能基が、タンパク質の安定性、タンパク質の折りたたみ、酵素機序、およびシグナル伝達の研究を目的として、タンパク質に組み込まれている。
選択圧（selective pressure）組み込みと呼ばれる、インビボの方法が、野性体シンセターゼの乱交雑を活用するために開発された。例えば、N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999) を参照すればよい。特定の天然アミノ酸を供給する関連代謝経路が断たれている栄養要求株は、天然アミノ酸の制限された濃度を含有する最小培地において増殖される一方において、標的遺伝子の転写が抑制されている。増殖定常期に入ると、天然アミノ酸が、使い果たされ、かつ非天然アミノ酸類似物と置き換えられる。組換えタンパク質の発現の誘導は、非天然なる維持物を含有するタンパク質の蓄積を生じる。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍおよびｐ−フルオロフェニルアラニンが、タンパク質に組み込まれており、かつ容易に同定され得るＵＶスペクトルにおける２つの特性の肩を示し（例えば、C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000)を参照すればよい）；トリフルオロメチオニンは、１９Ｆ ＮＭＲによってチトオリゴ糖との相互作用を研究するための、バクテリオファージのＴ４ライソザイムにおいてメチオニンを置換するために使用されており（例えば、H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997) を参照すればよい）；かつトリフルオロロイシンは、ロイシンの代わりに組み込まれて、ロイシンジッパータンパク質の増強された熱的および化学的な安定性を生じている。例えば、Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001)を参照すればよい。さらに、セレノメチオニンおよびテルルメチオニンが、種々の組換えタンパク質に組み込まれて、Ｘ線結晶解析における位相の解像を容易にしている。例えば、W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990) ；J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1:283 (1994) ；N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995)；およびN. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997) を参照すればよい。また、アルケンまたはアルキン官能基を有するメチオニン類似物は、効率的に組み込まれて、化学的手段によるタンパク質の付加的な修飾を可能にしている。例えば、J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998)；J. C.. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122:1282 (2000)；およびK. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000) ；言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２０７号明細書；米国特許出願公開第２００２／００４２０９７号明細書を参照すればよい。
この方法の成功は、タンパク質翻訳の忠実度を保証するために一般的に必要とする、非天然アミノ酸類似物のアミノアシルｔＲＮＡによる認識に依存する。この方法の有効範囲を拡張するための１つの方法は、制限された数の場合に達成されている、アミノアシルｔＲＮＡの基質特異性を緩和することである。例えば、エシェリキア コリのフェニルアラニルシンセターゼ（ＰｈｅＲＳ）におけるＧｌｙによるＡｌａ２９４の置換が、基質結合ポケットの大きさを増し、かつｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化を生じる。M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994) を参照すればよい。この変異ＰｈｅＲＳを内部に有するエシェリキア コリ株は、フェニルアラニンの代わりに、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニンまたはｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの組み込みを可能にする。例えば、M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995)；およびN. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000)を参照すればよい。同様に、エシェリキア コリのチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸結合部位付近の点変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒは、アザチロシンがチロシンよりも効率的に組み込まれることを可能にすることを、示された。F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000) を参照すればよい。
インビボにおける非天然アミノ酸を組み込むための他の戦略は、校正機序を有するシンセターゼを修飾することである。これらのシンセターゼは、同種のアミノ酸と構造的に類似するアミノ酸を、区別できず、かつそれゆえ当該類似するアミノ酸を活性化する。この誤りは、ｔＲＮＡから誤って荷電されたアミノ酸を脱アシル化する別の部位において補正されて、タンパク質翻訳の忠実度を維持している。シンセターゼの校正活性が無効にされると、誤って活性化される構造的類似物が、編集機能を免れ得、かつ組み込まれ得る。この方法は、バリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＶａｌＲＳ）を用いて最近に証明されている。V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001) を参照すればよい。ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、アミノブチレート（Ａｂｕ）と共にｔＲＮＡＶａｌを誤ってアシル化でき；その後に、これらの非同種のアミノ酸が編集ドメインによって加水分解される。エシェリキア コリの染色体の無作為変異生成の後に、ＶａｌＲＳの編集部位に変異を有している変異体エシェリキア コリ株が、選択された。この編集欠損ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓと共にｔＲＮＡＶａｌを不正確に荷電する。また、ＡｂｕがＣｙｓ（Ｃｙｓの−ＳＨ基がＡｂｕにおいて−ＣＨ３に置換される）を立体的に集合させるので、変異体ＶａｌＲＳは、この変異体エシェリキア コリ株がＡｂｕの存在下において増殖されると、タンパク質にＡｂｕを組み込む。質量分析解析は、バリンのやく２４％が本来のタンパク質におけるバリンの位置のそれぞれにおいて、Ａｂｕに置換されることを示している。
また、固相合成法および固相半合成法は、新規のアミノ酸を含有する多くの他の合成を可能にしている。例えば、以下の刊行物および引用される参考文献：Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); and, Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994)を参照すればよい。
化学的修飾は、インビトロにおいてタンパク質に種々の非天然な側鎖（補足因子、スピン標識およびオリゴヌクレオチドが挙げられる）を導入するために、使用されている。例えば、Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966); and, Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988)を参照すればよい。
代替可能に、化学的に修飾されたアミノアシル−ｔＲＮＡを採用する生合成方法は、インビトロにおいて合成されるタンパク質に種々の生物物理的なプローブを組み込むために使用されている。以下の刊行物および引用される参考文献：Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993); and, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604-8608 (1986)を参照すればよい。
これまでに、所望のアンバーナンセンス変異を含有する遺伝子を用いて計画されたタンパク質合成反応に対して、化学的にアミノアシル化されたサプレッサｔＲＮＡを加えることによって、非天然アミノ酸がインビトロにおいて部位特異的に組み込まれ得ることは、示されている。これらの方法を用いて、特定のアミノ酸に対して栄養要求性株を用いて、一般的な２０のアミノ酸の多くを構造的に近い相同物（例えば、フェニルアラニンに対するフルオロフェニルアラニン）に置換することができる。例えば、Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)を参照すればよい。
例えば、ＵＡＧストップコドンを認識するサプレッサｔＲＮＡが、調製され、かつ非天然アミノ酸と共に化学的にアミノアシル化された。従来の部位特異的変異生成が、タンパク質遺伝子における所定の部位に、ストップコドンＴＡＧを導入するために使用された。例えば、Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988)を参照すればよい。アミノアシル化サプレッサｔＲＮＡおよび変異体遺伝子が、インビトロの転写／翻訳系において組み合せられる場合に、特定の位置においてアミノ酸を含有するタンパク質を生じさせる、非天然アミノ酸がＵＡＧコドンに応じて組み込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験およびα−ヒドロキシ酸を用いた実験は、所望のアミノ酸のみがＵＡＧコドンによって特定される位置に組み込まれ、かつこのアミノ酸が、タンパク質における任意の他の部位に組み込まれないことを証明した。例えば、Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; and, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)を参照すればよい。
ｔＲＮＡは、任意の方法または技術（これらに限定されないが、化学的または酵素的なアミノアシル化が挙げられる）よって所望のアミノ酸と共にアミノアシル化され得る。
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによってか、または他の酵素的分子（これに限定されないが、リボザイムが挙げられる）によって達成され得る。“リボザイム”という用語は、“触媒ＲＮＡ”と交換可能である。Ｃｅｃｈおよび共同研究者（Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226）は、触媒としての役割を果たす天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）の存在を証明した。しかし、これらの天然ＲＮＡ触媒は、切断およびスプライシングに関してリボ核酸基質に対してのみ役割を果たすことを示されているが、リボザイムの人工的発展の最近の成果は、種々の化学反応に対する触媒の能力範囲を拡張している。研究によって、それら自身の（２’）３’末端におけるアミノアシル−ＲＮＡを触媒することができるＲＮＡ分子（Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647）、および１つのＲＮＡ分子から他のＲＮＡ分子までアミノ酸を運ぶことができるＲＮＡ分子（Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444）が同定されている。
言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書は、リボザイムの構築方法、ならびに天然にコードされるアミノ酸および天然にコードされていないアミノ酸を伴うｔＲＮＡのアミノアシル化における、それらの利用に関して記載している。ｔＲＮＡをアミノアシル化できる酵素分子（これに限定されないが、リボザイムが挙げられる）の基材に固定化された形態は、アミノアシル化産物の効率的な親和性精製を可能にし得る。好適な基材の例としては、アガロースビーズ、セファロースビーズ、および磁性ビーズが挙げられる。アミノアシル化用の基材固定化形態の製造および利用について、言及によって本明細書に組み込まれる、Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084および米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている。
化学的アミノアシル化法としては、これらに限定されないが、アミノアシル化においてシンセターゼの利用を避けるために、Ｈｅｃｈｔおよび共同研究者（Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517）によって、かつSchultz, Chamberlin, Dougherty and others （Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34）によって紹介された方法が挙げられる。当該方法または他の化学的アミノアシル化方法が、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するために使用され得る。
触媒ＲＮＡを生成する方法は、無作為化されたリボザイム配列の別々のプールを生成すること、定方向の進化を実施すること、所望のアミノアシル化活性に関してプールをスクリーニングすること、および所望のアミノアシル化活性を示すこれらのリボザイムの配列を選択することを含み得る。
リボザイムは、アシル化活性を容易にするモチーフおよび／または領域（例えば、ＧＧＵモチーフおよびＵが豊富な領域）を備えることができる。例えば、Ｕが豊富な領域がアミノ酸基質の認識を容易にできること、およびＧＧＵモチーフがｔＲＮＡの３’末端と塩基対を形成できることは、報告されている。組み合せて、ＧＧＵモチーフおよびＵが豊富な領域は、アミノ酸およびｔＲＮＡの両方の同時認識を容易にし、かつ同時にこれによって、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化を容易にする。
リボザイムは、ｔＲＮＡＡｓｎ ＣＣＣＧと接合され、部分的に無作為化されたｒ２４ｍｉｎｉを用いたインビトロにおける選択に続いて、活性なクローンに見出されるコンセンサス配列の体系的な改変によって生成され得る。この方法によって得られる例示的なリボザイムは、“Ｆｘ３ リボザイム”と呼ばれ、かつその内容が言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されており、同種の非天然アミノ酸と共に荷電される、種々のアミノアシルｔＲＮＡの合成にとっての多方面な触媒としての機能を果たす。
基板上に対する固定化は、ｔＲＮＡの効率的な親和性精製を可能にするために使用され得る。好適な基盤の例としては、アガロース、セファロース、および磁性ビーズが挙げられる。リボザイムは、ＲＮＡのリボソーム上における３’シス−ジオールが対応するジアルデヒドを産生するために過ヨウ素酸塩を用いて酸化されて、樹脂上のＲＮＡの固定化を容易にし得るように、ＲＮＡの化学構造を利用することによって樹脂上に固定され得る。多様な種類の樹脂（安価なヒドラジド樹脂が挙げられる）が、使用され得、ここで、還元的なアミノ化が、還元的アミン化が樹脂とリボザイムとの間における相互作用を不可逆的な結合にさせる。アミノアシルｔＲＮＡは、このカラム上（on-column）の技術によって非常に容易にされ得る。Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4には、カラムに基づいたアミノアシル化系について記載されている。
アミノアシル化ｔＲＮＡの単離は、種々の方によって達成され得る。１つの好適な方法は、緩衝液（例えば、１０ｍＭのＥＤＴＡを有する酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する緩衝液、または単にＥＤＴＡ緩衝化水（ｐＨ７．０））を用いてカラムからアミノアシル化ｔＲＮＡを溶出することである。
アミノアシル化ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡが翻訳反応によって作製されるポリペプチドにおける最適な位置においてアミノアシル化されるアミノ酸を組み込むために、翻訳反応に加えられ得る。本発明のアミノアシル化ｔＲＮＡが使用され得る翻訳系の例としては、これに限定されないが、細胞溶解液が挙げられる。細胞溶解液は、投入するｍＲＮＡから得られるポリペプチドのインビボ翻訳に必要な反応成分を提供する。当該反応成分の例としては、これらに限定されないが、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子および延長因子、ならびに翻訳に関連する付加的な因子が挙げられる。付加的に、翻訳系は、処理単位（batch）翻訳または区画化翻訳であり得る。処理単位翻訳の系は、単一の区画において反応成分を組み合せる一方において、区画化翻訳の系は、翻訳効率を抑制し得る反応産物から翻訳反応成分を分ける。当該翻訳系は、市販されている。
さらに、複合された転写／翻訳系が、使用され得る。複合された転写／翻訳系は、反応成分によって次々に翻訳される対応するｍＲＮＡへの、投入するＤＮＡの転写の両方を可能にする。市販の複合された転写／翻訳の例は、ラピッドトランスレーションシステム（Rapid Translation System）（ＲＴＳ、Ｒｃｈｅ（ロシュ））である。系としては、リボソームおよび翻訳因子といった翻訳の成分を供給するE. coliの溶菌液を含有する混合物が挙げられる。付加的に、ＲＮＡポリメラーゼは、翻訳において使用するｍＲＮＡ鋳型への、挿入するＤＮＡの転写に含められる。ＲＴＳは、反応区画（供給／排泄区画および転写／翻訳区画が挙げられる）の間に挿入される膜を用いて反応成分の区画化を使用できる。
ｔＲＮＡのアミノアシル化は、他の物質（これらに限定されないが、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒抗体、および多機能タンパク質などが挙げられる）によって実施され得る。
Stephan in Scientist 2005 Oct 10; pages 30-33 には、タンパク質に天然にコードされていないアミノ酸を組み込む方法について記載されている。Lu et al. in Mol Cell. 2001 Oct;8(4):759-69には、タンパク質が、非天然アミノ酸を含有する合成ペプチドに対して化学的に連結される方法（タンパク質連結と言われる）について記載されている。
また、微量注入技術は、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みに使用されている。例えば、M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268:439 (1995) ；およびD. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000) を参照すればよい。アフリカツメガエルの卵母細胞は、インビトロにおいて作製された２つのＲＮＡ種：所定のアミノ酸位置にＵＡＧストップコドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および所望の非天然アミノ酸と共にアミノアシル化されたアンバーサプレッサｔＲＮＡを用いて共注入された。それから、卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧによって特定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法は、一般的にインビトロの系に受け容れられない、内在性膜タンパク質（integral membrane protein）の構造−機能研究を可能にしている。例としては、蛍光共鳴エネルギー転移によって距離を測定するための、タキキニン ニューロキニン−２受容体への蛍光アミノ酸の組み込み（例えば、G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996) を参照すればよい）；イオンチャネルにおける表面露出残基を同定するための、ビオチン化アミノ酸の使用（例えば、J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997) を参照すればよい）；実時間におけるイオンチャネルの立体配置の変化を観察するための、閉じ込めたチロシン類似物の使用（例えば、J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998) を参照すればよい）；およびそれらのゲート機構を調べるためにイオンチャネル骨格を変更するための、αヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999) ；およびT. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001)を参照すればよい。
インビボにおいてタンパク質に非天然アミノ酸を組み込む能力は、広範な利点（これらに限定されないが、変異タンパク質の高い収率、技術的な容易さ、細胞またはおそらくは生体における変異タンパク質を研究する見込み、ならびに治療的な処置および診断的な利用におけるこれらのタンパク質の利用が挙げられる）を提供する。種々の大きさ、酸性度、求核性、疎水性および他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含める能力は、タンパク質の機能を調べること、および新規の性質を有する新たなタンパク質もしくは生体を作り出すことの両方を目的として、タンパク質の構造を合理的かつ体系的に操作するわれわれの能力を非常に拡張できる。
パラ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み込むための１つの試みにおいて、酵母アンバーサプレッサｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡ対は、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性の、Ｐｈｅ要求性のエシェリキア コリ株において使用された。例えば、R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998) を参照すればよい。
また、無細胞（インビトロ）翻訳系を用いて、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現を得ることは、可能であり得る。翻訳系は、細胞性および無細胞であり得、かつ原核生物および真核生物であり得る。細胞性翻訳系としては、これに限定されないが、所望の核酸配列が、ｍＲＮＡに転写され得、かつｍＲＮＡが翻訳され得る透過処理された細胞および培養細胞といった、全細胞調製物が挙げられる。無細胞翻訳系は、市販されており、かつ多くの異なる種類および系がよく知られている。無細胞翻訳系の例としては、これらに限定されないが、エシェリキア コリの溶菌液といった原核生物溶菌液、ならびに大麦抽出物、昆虫細胞溶解液、ウサギの網赤血球溶解液、ウサギの卵母細胞溶解液およびヒト細胞溶解液といった真核生物溶解液が挙げられる。真核細胞の抽出物または溶解液は、結果タンパク質が糖鎖付加されるか、リン酸化されるか、またはそれとは別に修飾される場合に、当該修飾が真核生物の系においてのみ可能であるため、好ましくあり得る。これらの抽出物および溶解液のいくつかは、市販されている（プロメガ（Promega）、マディソン（Madison）、Ｗｉｓ．；ストラタジーン、ラ ジョラ（La Jolla）、 Ｃａｌｉｆ．；アマシャム（Amersham）、アーリントン ハイト（Arlington Heights）、Ｉｌｌ．；ギブコ（GIBCO）／ＢＲＬ、グランド アイランド（Grand Island）、Ｎ．Ｙ）。また、ミクロソーム膜を含有するイヌの膵臓抽出物といった膜性抽出物は、分泌型タンパク質の翻訳にとって有用に、利用可能である。鋳型としてｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）または鋳型としてＤＮＡ（インビトロ転写および翻訳を組み合せた）のいずれかを含み得るこれらの系において、インビトロ合成は、リボソームによって指揮される。相当な努力が、無細胞タンパク質発現系の発展に対して注がれている。例えば、言及によって本明細書に組み込まれる、Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001)；Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)；Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)；Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999)；およびPatnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998)；米国特許第６，３３７，１９１号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８１６６０号明細書；国際公開第００／５５３５３号パンフレット国際公開第９０／０５７８５号パンフレットを参照すればよい。天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現に適用され得る他の方法としては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が挙げられる。例えば、R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997) ；A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003) を参照すればよい。この方法において、ピューロマイシンに対して連結されたｍＲＮＡの鋳型は、リボソーム上において翻訳される。１つ以上のｔＲＮＡ分子が修飾されると、非天然アミノ酸が、同様にペプチドに組み込まれ得る。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後に、ピューロマイシンは、ペプチドのＣ末端を捕捉する。結果のｍＲＮＡ−ペプチド接合物は、インビトロアッセイにおいて興味深い性質を有することを見出されている場合に、その同一性は、ｍＲＮＡ配列から容易に明らかにされ得る。この方法において、所望の性質を有するポリペプチドを同定するために、天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドのライブラリをスクリーニングし得る。より最近に、精製成分を用いたインビトロリボソーム翻訳は、天然にコードされていないアミノ酸に置換されたペプチドの合成を可能にすることを、報告されている。例えば、A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003)を参照すればよい。
また、再生翻訳系が使用され得る。また、精製翻訳因子の混合物だけでなく、溶解液の組合せ、または開始因子−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（αまたはβ）、伸張因子 Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）、もしくは終結因子といった精製翻訳因子を補った溶解液が、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するために上手く使用されている。また、無細胞系は、転写／翻訳系と組合せら得る（ここで、言及によって本明細書によって特に組み込まれる、Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editors, Wiley Interscience, 1993) に記載されているように、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡに転写され、かつｍＲＮＡが翻訳される）。真核生物転写系において転写されるＲＮＡは、ある特定の翻訳系において有利であり得る、異核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）の形態であり得るか、または５’末端キャップ（７−メチルグアノシン）および３’末端ポリＡを尾部につないだＲＮＡの形態であり得る。例えば、キャップつきのｍＲＮＡは、網赤血球溶解液の系において高い効率を有して翻訳される。
＜ＩＸ．ＦＧＦ−２１ポリペプチドに結合された巨大分子ポリマー＞
本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドの種々の修飾は、本明細書に記載されている組成物、方法、技術および戦略を用いてもたらされ得る。これらの修飾は、ポリペプチドに対する非天然アミノ酸に対するさらなる機能性（これらに限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似物；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補足因子；脂肪酸；含水炭素；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖鎖；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体適合物質；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規な官能基；他の分子と共有的にかもしくは非共有的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線励起部分；光異性体化可能な部分；ビオチン；ビオチン類似物；ビオチン類似物；重元素を組み込む部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；延長された側鎖；炭素結合型の糖；酸化還元的に活性な物質；アミノチオ酸；毒性部分；同位体的標識部分；生物物理学的なプローブ；リン光基；化学発光基；電子高密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー転移物質；生物学的に活性な物質；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲物質；または上述のものの任意の組合せ、もしくは他に所望される任意の化合物もしくは物質が挙げられる）の組み込みを含む。本明細書に記載されている組成物、方法、技術および戦略の具体的な、非限定的な例として、以下の記載は、それらに関して本明細書に記載されている組成物、方法、技術および戦略が、他の機能性（これらに限定されないが、上記に挙げたそれらが挙げられる）を加えることにも適用可能である（必要に応じて、当業者が本明細書における開示を用いてなし得る適切な改変を伴って）という理解を含めて、非天然アミノ酸ポリペプチドに対する巨大分子を加えることを中心に扱う。
広範な巨大分子ポリマーおよび他の分子は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物学的な性質を調節するためか、および／またはＦＧＦ−２１分子に対して新たな生物学的な性質を与えるために、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結され得る。これらの巨大分子ポリマーは、天然にコードされるアミノ酸を介してか、天然にコードされていないアミノ酸、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸の任意の置換基、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸に対して加えられる任意の置換基もしくは官能基を介して、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結され得る。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間の広い範囲（限定されないが、これらが挙げられる）であり得る。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ，５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。
本発明は、ポリマー：タンパク質の接合物の実質的に均質な調整物を提供する。本明細書において使用されるときに、“実質的に均質な”は、ポリマー：ポリペプチドの接合物がタンパク質の総量の半分より多く観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質の接合物は、生物活性を有し、かつ本明細書において規定される“実質的に同質な”ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１ポリペプチド調整物は、均質な調整物の利点（例えば、１組の薬物動態に対する１組の予想における臨床的な適用における容易さ）を示すために十分に均質であるそれらである。
また、ポリマー：タンパク質の接合物分子の混合物を調製するために選択し得、かつ本明細書に規定されている利点は、混合物に含まれるモノ−ポリマー：タンパク質の接合物の比率を選択し得ることである。従って、必要に応じて、種々の数（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−など）のポリマー部分と連結した状態の様々なタンパク質の混合物を調製し得、かつ本発明の方法を用いて調製されたモノ−ポリマー：タンパク質の接合物と上記接合物を組み合せ得、かつ所定の割合のモノ−ポリマー：タンパク質の接合物を有する混合物を有し得る。
選択されるポリマーは、ポリマーが連結されるタンパク質が水性環境（例えば、生理学的環境）において沈殿しないように、水溶性ポリマーであり得る。ポリマーは、分枝状であり得るか、または非分枝状であり得る。最終産物の調製物の治療的利用に関して、ポリマーは薬学的に受容可能である。
ポリマーの例としては、これらに限定されないが、ポリエーテルおよびアルコキシキャップしたこれらの類似物（例えば、ポリオキシエチレン グリコール、ポリオキシエチレン／プロピレン グリコール、およびメトキシもしくはエトキシキャップしたこれらの類似物、特にポリオキシエチレン グリコール、また後者は、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧとして知られる）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキル エーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキル オキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキル オキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアルキル アクリルアミド、およびポリヒドロキシアルキル アクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシアルキルメタクリルアミドおよびこれらの誘導体）；疎水性ペプチド配列；多糖およびこれらの誘導体（これらに限定されないが、デキストランおよびデキストラン誘導体（例えば、カルボキシメチルデキストラン、硫酸デキストラン、アミノデキストラン）が挙げられる）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチル セルロース、ヒドロキシアルキル セルロース）；キチンおよびその誘導体（例えば、キトサン、スクシニル キトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン）；ヒアルロン酸およびその誘導体；スターチ；アルギン酸塩；硫酸コンドロイチン；アルブミン；プルランおよびカルボキシメチル プルラン；ポリアミノ酸およびこれらの誘導体（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド）；マレイン酸無水物共ポリマー（例えば、スチレン マレイン酸無水物共ポリマー、ジビニルエチルエーテル マレイン酸無水物共ポリマー）；ポリビニル アルコール；これらの共ポリマー；これらの三元ポリマー；これらの混合物；ならびに上述の誘導体が挙げられる。
タンパク質分子に対するポリエチレングリコールの比率は、反応混合物におけるそれらの濃度のように、変化する。一般的に、最適な比率（余剰の未反応のタンパク質またはポリマーが最小である反応の効率に関する）は、選択されるポリエチレングリコールの分子量によって、かつ有用な反応性基の利用可能な数に基づいて決定され得る。分子量に関連するときに、タンパク質に対して連結されるのは、典型的により分子量の高いポリマー、より少ない数のポリマー分子である。同様に、ポリマーの分枝は、これらの要素を最適化する場合に、計算に入れられるべきである。一般的に、分子量が高いほど（分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質の割合が高くなる。
本明細書において使用されるとき、およびＰＥＧ：ＦＧＦ−２１ポリペプチドの接合物について検討される場合に、“治療有効量”は、患者に対して所望の利益を与える量を指す。当該量は、個体間において変わり、かつ要素（これらに限定されないが、患者の全体的な体調および処置されるべき健康状態の根本的な原因が挙げられる）の数に依存する。ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療に使用する量は、受容可能な変化の割合を示し、かつ有益な水準において所望の応答を維持する。本組成物の治療有効量は、公然に利用可能な材料および手法を用いて当業者によって容易に確かめられ得る。
水溶性ポリマーは、任意の構造的な形態（これらに限定されないが、直鎖、分岐鎖または分枝鎖が挙げられる）であり得る。水溶性ポリマーは、典型的にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）といったポリ（アルキレングリコール）であるが、他の水溶性ポリマーもまた採用され得る。ほんの一例として、ＰＥＧは、本発明のある特定の実施形態を説明するために使用される。
ＰＥＧは、市販されているか、または当業者に公知の方法（Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161）に従って、エチレングリコールの開環重合によって調製され得る、よく知られている水溶性ポリマーである。“ＰＥＧ”という用語は、ＰＥＧの大きさまたは末端における修飾に関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、かつＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結されるときに、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
（ここで、ｎは２から１０，０００であり、Ｘは、Ｈまたは末端修飾（これらに限定されないが、Ｃ１−４アルキル、保護基、または末端官能基が挙げられる）である）
によって表され得る。
いくつかの場合において、本発明において使用されるＰＥＧは、ヒドロキシまたはメトキシを有する末端において終結する（すなわち、ＸはＨかＣＨ３である（“メトキシＰＥＧ”））。代替可能に、ＰＥＧは、これによって二官能性ポリマーを形成する、反応性基を有して終結できる。典型的な反応性基は、通常に見られる２０のアミノ酸における官能基と反応するために通常に使用されるこれらの反応性基（これらに限定されないが、マレイミド基、活性化カルボン酸塩（これに限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルが挙げられる）、活性化エステル（これらに限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ｐ−ニトロフェニルエステルが挙げられる）、およびアルデヒドが挙げられる）だけでなく、一般的な２０のアミノ酸に対して不活性であるが、天然にコードされていないアミノ酸に存在する補完的な官能基と特に反応する官能基（これらに限定されないが、アジド基、アルキン基が挙げられる）を含むことができる。ここで留意すべきは、上記式においてＹによって示されているＰＥＧの他の末端が、天然に存在するアミノ酸または天然にコードされていないアミノ酸を介してＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して直接にかまたは間接的に連結していることである。実際に、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（これらに限定されないが、リジンまたはＮ末端のイプシロンアミンが挙げられる）に対する、アミド結合、カルバメート結合または尿素結合であり得る。代替可能に、Ｙは、チオール基（これに限定されないが、システインのチオール基が挙げられる）に対するマレイミド結合であり得る。代替可能に、Ｙは、一般的な２０のアミノ酸を介して通常には接近できない残基に対する結合であり得る。例えば、ＰＥＧにおけるアジド基は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドのけるアルキン基と反応して、ヒュイゲン［３＋２］環付加産物を形成し得る。代替可能に、ＰＥＧにおけるアルキン基は、天然にコードされていないアミノ酸に存在するアジド基と反応して、同様の産物を形成し得る。いくつかの実施形態において、強い求核基（これらに限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシアミン、セミカルバジドが挙げられる）は、天然にコードされていないアミノ酸に存在するアルデヒド基またはケトン基と反応して、必要に応じていくつかの場合において適切な還元剤を用いた処理によってさらに還元される、ヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンを形成し得る。代替可能に、強い求核基は、天然にコードされていないアミノ酸を介してＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれ得、かつ水溶性ポリマーに存在するケトン基またはアルデヒド基と好適に反応するために使用され得る。
ＰＥＧに関する任意の分子量が、実際に所望されるように、約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａまたは必要に応じてそれ以上（これらに限定されないが、０．１−５０ｋＤａまたは１０−４０ｋＤａが挙げられる）まで（これらが挙げられるが、限定されない）、使用され得る。ＰＥＧの分子量は、広範（これらに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間が挙げられる）であり得る。ＰＥＧは、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。また、分枝鎖のＰＥＧ（これに限定されないが、１−１００ｋＤａ（これらに限定されないが、１−５０ｋＤａまたは５−２０ｋＤａが挙げられる）の範囲の分子量を有する鎖のそれぞれを有するＰＥＧ分子が挙げられる）が、使用され得る。分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間（これらが挙げられるが、限定されない）であり得る。分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａの間である。広範なＰＥＧが、言及によって本明細書に組み込まれる、Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog（これが挙げられるが、限定されない）に記載されている。
一般的に、ＰＥＧの少なくとも１つの末端は、天然にコードされていないアミノ酸との反応に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応にとってのアルキン部分およびアジド部分は、本明細書に記載されるような天然にコードされていないアミノ酸に対してＰＥＧを連結させるために使用され得る。天然にコードされていないアミノ酸がアジドを備える場合に、そのときＰＥＧは、ヒュイゲン［３＋２］環付加産物の形成をもたらすためのアルキン部分、またはアミド結合の形成をもたらすための活性化ＰＥＧ種（すなわち、エステル、カルボン酸塩）のいずれかを典型的に含有する。代替可能に、天然にコードされていないアミノ酸がアルキンを備える場合に、そのときＰＥＧは、［３＋２］ヒュイゲン環付加産物の形成をもたらすためのアジド部分を典型的に含有する。天然にコードされていないアミノ酸がカルボニル基を備える場合に、ＰＥＧは、対応するヒドラゾン、ヒドロキシアミン、またはセミカルバゾン結合のそれぞれをもたらすために、強力な求核基（これらに限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、またはセミカルバジド基能性基が挙げられる）を典型的に備える。他の代替物において、上記において説明される反応性基の逆の方向性が、使用され得る（すなわち、天然にコードされていないアミノ酸におけるアジド基が、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と反応され得る）。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖に存在する化学的な官能性基と反応性である、化学的な官能性基を含有する。
本発明は、いくつかの実施形態において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を備える、アジド含有ポリマーおよびアセチレン含有ポリマーを提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、広範な水溶性ポリマー（これらに限定されないが、ポリ（エチレン）グリコールおよび他の関連するポリマー（ポリ（デキストラン）およびポリ（プロピレングリコール））が挙げられる）がまた、本発明の実践における使用に好適であること、ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という用語が、そのような分子のすべてを包含しかつ含むことを意図されることは、理解されるべきである。ＰＥＧという用語としては、これに限定されないが、その形態のいずれか（これらに限定されないが、二官能性のＰＥＧ、多腕のＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、分岐状のＰＥＧ、分枝状のＰＥＧ、ぶら下がりのＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に対してぶら下がっている１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、またはこれらに分解可能な結合を有するＰＥＧが挙げられる）であるポリ（エチレングリコール）が挙げられる。
ＰＥＧは、典型的に、透明であり、無色であり、無臭であり、水溶性であり、熱に安定であり、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解されないかまたは劣化されず、かつ一般的に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性である（ＰＥＧが、損傷の原因になることなく、生きている組織または生体と共存可能であることを意味する）と見做される。より詳細には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性である（ＰＥＧが身体に免疫応答を生じさせる傾向を示さないことを意味する）。身体においていくつかの所望の機能を有する分子（例えば、生物学的に活性な分子）に対して連結される場合に、ＰＥＧは、物質をマスクする傾向にあり、かつ生体が物質の存在に寛容であり得るように任意の免疫応答を低減可能か、または除去できる。ＰＥＧ接合物は、実質的な免疫応答を生じないか、または凝固もしくは他の好ましくない影響の原因にならない傾向を示す。式−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−（ここでｎは約３から４０００、典型的に約２０から約２０００である）を有するＰＥＧは、本発明における使用に好適である。約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの分子量を有するＰＥＧは、本発明のいくつかの実施形態において、ポリマー骨格として特に有用である。ＰＥＧの分子量は、広範（これに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間が挙げられる）であり得る。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。
ポリマー骨格は、直鎖状または分枝状であり得る。分枝状のポリマー骨格は、一般的に当該技術において公知である。典型的に、分枝状のポリマーは、中心の分枝核部分および中心の分枝核に対して連結された複数の直鎖状のポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、種々のポリオール（例えば、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）に対するエチレンオキシドの付加によって調製され得る、分枝状の形態において通常に使用される。また、中心の分枝核部分は、リジンといった種々のアミノ酸から誘導体化され得る。分枝状のポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（Ｒは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、またはペンタエリスリトールといった核部分から誘導体化され、かつｍは腕の数を表す）として通常の形態において表され得る。また、多腕のＰＥＧ分子（例えば、言及によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，２２９，４９０号明細書；米国特許第４，２８９，８７２号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書；国際公開第９６／２１４６９号パンフレット；および国際公開第９３／２１２５９に号パンフレットに記載されるようなそれら）は、ポリマー骨格として使用され得る。
また、分枝状のＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（ここで、Ｙは結合基であり、かつＺは所定の長さの原子の鎖によってＣＨに対して連結される活性化末端基である）によって表される分岐状のＰＥＧの形態であり得る。
まださらなる分枝状の形態、ぶら下がりのＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿ってある、カルボキシルといった反応性基を有する。
またＰＥＧのこれらの形態に加えて、ポリマーは、骨格において弱い結合または分解可能な結合を有して、調製され得る。例えば、ＰＥＧは、ポリマー骨格に加水分解を受けやすいエステル結合を有して調製され得る。以下に示すように：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ → ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
この加水分解は、ポリマーのより低い分子量の断片への切断を結果として生じる。ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧという用語が、当該技術において公知の形態のすべて（これらに限定されないが、本明細書に開示されるそれらが挙げられる）を表すか、または含むことは、当業者によって理解される。
また、他のポリマーは、本発明における使用にとって好適である。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーであり、２から約３００の末端を有するポリマー骨格は、本発明において特に有用である。好適なポリマーの例としては、これらに限定されないが、ポリ（プロピレングリコール）（“ＰＰＧ”）、これらの共ポリマー（これに限定されないが、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共ポリマーが挙げられる）、これらの三元ポリマー、およびこれらの混合物などといった、他のポリ（アルキレングリコール）が挙げられる。ポリマー骨格のそれぞれの鎖の分子量は、変えることができるが、典型的に約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまで、しばしば約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａまでの範囲である。ポリマー骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。
当業者は、水溶性ポリマーに関して上記に挙げたものが、決して網羅的なものではなく、かつ単に例示であること、および上述のような品質を有するポリマー材料のすべてが、本発明における使用に好適であると考えらえることを認識する。
本発明のいくつかの実施形態において、ポリマー誘導体は、ポリマー骨格が、官能基を用いて官能性化されたか、または活性化された少なくとも２つの末端、おそらく約３００もの末端を有することを意味する、“多官能性”である。多官能性ポリマー誘導体としては、これに限定されないが、２つの末端（末端のそれぞれが、同じであり得るか、または異なり得る官能基に対して結合されている）を有する直鎖状のポリマーが挙げられる。
１つの実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり；
Ｂは、存在し得るかまたは存在し得ない連結部分であり；
ＰＯＬＹは、水溶性の非抗原性のポリマーであり；
Ａは、存在し得るかまたは存在し得ず、かつＢと同じであり得るか、または異なり得る連結部分であり；かつ
Ｘは第２の官能基である）
を有する。
ＡおよびＢに関する連結部分の例は、これらに限定されないが、１８まで含有する多重官能性化アルキル基を含み、かつ１−１０の間の炭素原子を含有し得る。窒素、酸素または硫黄といった異種原子は、アルキル鎖に含まれ得る。また、アルキル鎖は、異種原子において枝分かれされ得る。ＡおよびＢに関する結合部分の他の例は、これに限定されないが、１０まで含有する多重官能性化アリール基を含み、かつ５−６の間の炭素原子を含有し得る。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を用いて置換され得る。好適な連結基の他の例としては、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書に記載されているこれらの連結基が挙げられる。当業者は、連結部分に関して上記に挙げたものが、決して網羅的ではなく、かつ単に例示であること、および上述の品質を有する結合部分のすべてが、本発明における使用に好適であると考えらえることを認識する。
Ｘとしての使用に好適な官能基の例としては、これらに限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）、活性化カルボネート（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカルボネート）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性化スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボキシル酸、保護されたカルボキシル酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート、アルケン、ケトンおよびアジドなどが挙げられる。当業者によって理解されるように、選択されるＸ部分は、アジド基との反応が生じないように、アジド基とコンパティブル（compatible）であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、第２の官能基（すなわち、Ｘ）がまた、アジド部分であることを意味する同種二官能性であり得るか、または第２の官能基が異なる官能基であることを意味する異種二官能性であり得る。
“保護された”という用語は、特定の反応条件下における化学的に反応性の官能基の反応を妨げる保護基または保護部分の存在を指す。保護基は、保護される化学的に反応性の基の種類に依存して変わる。例えば、化学的に反応性の基がアミンまたはヒドラジドである場合に、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から選択され得る。化学的に反応性の基がチオールである場合に、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性の基がカルボキシル酸（例えば、ブタン酸またはプロピオン酸）またはヒドロキシル基である場合に、保護基は、ベンジル基またはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチルといったアルキル基であり得る。また、当該技術において公知の他の保護基は、本発明に使用され得る。
文献における特定の末端官能基の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−スクシニミジルカルボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、米国特許第５，４６８，４７８号明細書を参照すればよい）、アミン（例えば、Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)を参照すればよい）、ヒドラジド（例えば、Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978) を参照すればよい）、スクシニミジルプロピオネートおよびスクシニミジルブタノエート（例えば、Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997を参照すればよく；また、米国特許第５，６７２，６６２号明細書を参照すればよい）、スクシニミジルスクシネート（例えば、Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)およびJoppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979)を参照すればよい）、スクシニミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号明細書を参照すればよい）、ベンゾトリアゾールカルボネート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号明細書を参照すればよい）、グリシジルエステル（例えば、Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979)、Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)を参照すればよい）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985) を参照すればよい）、ｐ−ニトロフェニルカルボネート（例えば、Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985)；およびSartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)を参照すればよい）、アルデヒド（例えば、Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984) 、米国特許第５，８２４，７８４号明細書、米国特許第５，２５２，７１４号明細書を参照すればよい）、マレイミド（例えば、Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990) 、Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984) を参照すればよい）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば、Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993) を参照すればよい）、アクリロール（例えば、Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993) を参照すればよい）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号明細書を参照すればよい）が挙げられる。上述の参考文献および特許文献のすべては、言及によって本明細書に組み込まれる。
本発明のある特定の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｘは上述のような官能基であり；かつ
ｎは約２０から約４０００までである）
を有するポリマー骨格を備える。
他の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｗは１−１０の炭素原子を備える脂肪族または芳香族の連結部分であり；
ｎあは約２０から約４０００までであり；かつ
Ｘは上述のような官能基である）
を有するポリマー骨格を備える。ｍは１から１０である。
本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、当該技術において公知の種々の方法および／または本明細書に開示されている種々の方法によって調製され得る。以下に示されている１つの方法において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であり、第１の官能基に対して結合される第１の末端および好適な脱離基に対して結合される第２の末端を有するポリマー骨格は、アジドアニオン（好適な対イオン（ナトリウム、カリウム、およびｔｅｒｔブチルアンモニウムなどが挙げられる）と一対にされ得る）と反応させられる。脱離基は、求核置換を受け、かつアジド部分によって置換され、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーを生じる。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３ − → Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
に示されているように、本発明における使用に好適なポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ（ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、かつＸはアジド基と反応しない官能基であり、かつＬは好適な脱離基である）を有する。好適な官能基の例としては、これらに限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボキシル酸、保護されたカルボキシル酸、マレイミド、ジチオピリジン、およびビニルピリジン、およびケトンが挙げられる。好適な脱離基の例としては、これらに限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、およびトシレートが挙げられる。
本発明のアジド含有ポリマー誘導体を調製する他の方法において、アジド官能性基をを有する結合剤は、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格と接触され、ここで、上記結合剤は、ＰＥＧポリマーにおける化学的な官能性基と選択的に反応してアジド含有ポリマー誘導体産物を形成する化学的な官能性基を有し、ここで、アジドは、結合剤よってポリマー骨格から離されている。
例示的な反応手順が、以下に示されている：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ → ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、かつＸはアルコキシまたは上述のような官能基といったキャップ形成基であり；かつ
Ｍはアジド官能性基と反応しないが、Ｎの官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である）。
好適な官能基の例としては、これらに限定されないが、Ｎがアミンである場合にカルボキシル酸、カルボネートまたは活性エステルであるＭ；Ｎがヒドラジドまたはアミノオキシ部分である場合にケトンであるＭ；Ｎが求核基である場合に脱離基であるＭが挙げられる。
粗製産物の精製は、公知の方法（これに限定されないが、必要に応じてクロマトグラフィーに続く産物の沈殿が挙げられる）によって達成され得る。
より詳細な例は、アミンの１つがｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃといった保護基部分によって保護され、かつ結果として生じる１保護されたＰＥＧジアミンがアジド官能性基を有する連結部分と反応される、ＰＥＧジアミンの場合に関して、以下に示されている：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ。
この場合には、アミン基は、チオニル塩化物もしくはカルボジイミド試薬、およびＮ−ヒドロキシスクシニミドもしくはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールといった種々の活性剤を用いて、カルボキシル酸基に対して結合されて、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド担持連結部分との間にアミド結合を作り出し得る。アミド結合の形成が上手く行った後に、結果として生じるＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護されたアジド含有の誘導体は、生体活性分子を修飾するために直接に使用され得るか、または他の有用な官能基を組み込むために、さらに合成され得る。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基は、強酸を用いた処理によて加水分解されて、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成する。結果として生じるアミンは、合成の手がかりとして使用されて、有益な異種二官能性試薬にとっての、マレイミド基、活性化ジスルフィド、および活性化エステルなどといった他の有用な官能性基を組み込み得る。
異種二官能性誘導体は、ポリマーの末端のそれぞれに対して異なる分子を連結させることが所望される場合に、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、活性化された求核基（例えば、アルデヒド、ケトン、および活性化カルボネートなど）を有する分子の、ＰＥＧの１つの末端に対する連結、およびアセチレン基を有する分子の、ＰＥＧの他の末端に対する連結を可能にする。
本発明の他の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
（ここで、
ＲはＨもしくはアルキル、アルキレン、アルコキシ、またはアリールもしくは置換アリールであり得；
Ｂは、存在し得るか、または存在し得ない連結部分であり；
ＰＯＬＹは、水溶性の非抗原性ポリマーであり；
Ａは、存在し得るか、または存在し得ず、かつＢと同じであり得るか、または異なり得る連結部分であり；かつ
Ｘは第２の官能基である）
を有する。
ＡおよびＢに関する連結部分の例は、これらに限定されないが、１８まで含有する多機能化アルキル基を含み、かつ１−１０の間の炭素原子を含有し得る。窒素、酸素または硫黄といった異種原子は、アルキル鎖と共に含まれ得る。また、アルキル鎖は、異種原子において分岐され得る。ＡおよびＢに関する連結部分の例は、これらに限定されないが、１０まで含有する多機能化アルキル基を含み、かつ５−６の間の炭素原子を含有し得る。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子を用いて置換され得る。好適な連結基の他の例としては、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号明細書および米国特許第５，６４３，５７５号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書に記載されているそれらが挙げられる。当業者は、連結部分に関して上記に挙げたものが、決して網羅的なものではなく、かつ単に例示であること、および上述のような品質を有する連結部材料のすべてが、本発明における使用に好適であると考えらえることを認識する。
Ｘとしての利用に好適な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）、活性なカルボネート（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカルボネート）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性化スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボキシル酸、保護されたカルボキシル酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、ケトン、およびアセチレンが挙げられる。理解されるように、選択されるＸ部分は、アセチレン基との反応が生じないように、アセチレン基とコンパティブルであるべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、第２の官能基（すなわち、Ｘ）がまた、アセチレン部分であることを意味する同種二官能性であり得るか、または第２の官能基が異なる官能基であることを意味する異種二官能性であり得る。
本発明の他の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、
Ｘは上述のような官能基であり；
ｎは約２０から約４０００であり；かつ
ｍは１から１０の間である）
を有するポリマー骨格を備える。異種二官能性ＰＥＧポリマーのそれぞれの詳細な例が以下に示される。
本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、当業者に公知の方法および／または本明細書に開示されている方法を用いて調製され得る。１つの方法において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であり、第１の官能基に対して結合される第１の末端および好適な求核基に対して結合される第２の末端を有するポリマー骨格は、ＰＥＧにおける求核基との反応に好適であるアセチレン基および脱離基の両方を有する化合物と反応される。求核部分を有するＰＥＧポリマーおよび脱離基を有する分子が組み合せられると、脱離基は、求核置換を受け、かつ求核部分によって置換され、所望のアセチレン含有ポリマーを生じる。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ → Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
に示されるように、反応における使用に好ましいポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ（ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核部分であり、かつＸはＮｕ、Ｌまたはアセチレン官能性基と反応しない官能基である）を有する。
Ｎｕの例としては、これらに限定されないが、ＳＮ２−型機序を介して主に反応する、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィドリル、イミノ、カルボキシレート、ヒドラジド、アミノオキシ基が挙げられる。Ｎｕの付加的な例としては、求核付加反応を介して主に反応する、これらの官能基が挙げられる。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、およびトシレートおよび求核置換を受けると予想される他の基、これらと同様にケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、アルファ−ベータ不飽和カルボニル基、カルボネートおよび求核基によって付加を受けると予想される他の求核性基が挙げられる。
本発明の他の実施形態において、Ａは、１−１０の間の炭素原子の脂肪酸リンカー、または６−１４の間の炭素原子の置換アリール環である。Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、かつＬは好適な脱離基である。
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体を調製する他の方法において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有し、１つの末端に保護された官能基もしくはキャップ形成剤のいずれかを有し、かつもう一方の末端に好適な脱離基を有するＰＥＧポリマーは、アセチレンアニオンによって接触される。
例示的な反応手順は、以下に示される：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’ → Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
（ここで、
ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、かつＸはキャップ形成基（例えば、アルコキシまたは上述のような官能基）であり；かつ
Ｒ’はＨ、アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基、または置換アルキル、置換アルコキシル、置換アリールもしくは置換アリールオキシ基のいずれかである）。
上述の例において、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレンアニオンと接触されれる場合に、ＳＮ２−型置換を受けるために十分に反応性でなければならない。アセチレンアニオンによる脱離基のＳＮ２置換の達成に要求される反応条件は、当業者に公知である。
粗製産物の精製は、当該分野に公知の方法（これに限定されないが、必要に応じて、クロマトグラフィーに続く沈殿が挙げられる）によって通常に達成され得る。
水溶性ポリマーは、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結され得る。水溶性ポリマーは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸、もしくは天然にコードされていないアミノ酸もしくは天然にコードされるアミノ酸の任意の官能基もしくは置換基か、または天然にコードされていないアミノ酸もしくは天然にコードされるアミノ酸に付加された任意の官能基もしくは置換基、を介して連結され得る。代替可能に、水溶性ポリマーは、天然に存在するアミノ酸（これらに限定されないが、システイン、リジンまたはＮ末端残基のアミノ酸が挙げられる）を介して、天然にコードされていないアミノ酸を組み込んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結され得る。いくつかの場合において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の非天然アミノ酸を備え、ここで、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、（複数の）水溶性ポリマー（これらに限定されないが、ＰＥＧおよび／またはオリゴ糖が挙げられる）に対して連結される。いくつかの場合において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、水溶性ポリマーに対して連結された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を、さらに備える。いくつかの場合において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、水溶性ポリマーに対して連結された天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上、および水溶性ポリマーに対して連結された天然に存在するアミノ酸の１つ以上を備える。いくつかの場合において、本発明に使用される水溶性ポリマーは、その非接合形態と比べて、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの半減期を増強する。
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結される水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ付加または糖鎖付加の程度）は、変更された（これらに限定されないが、増強されたか、または低減された、が挙げられる）薬理的特性、薬物動態的特性、または薬力学特性（例えば、インビボにおける半減期）を与えるために、調節され得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１の半減期は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント、２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、または少なくとも約１００倍に、非修飾のポリペプチドを超えて増強される。
（強い求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体）
本発明の１つの実施形態において、カルボニル含有の天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＰＥＧ骨格に対して直接に連結されている末端のヒドラジン、ヒドロキシアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
いくつかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
いくつかの実施形態において、ヒドラジン含有ＰＥＧ誘導体またはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸは任意に、存在し得るかまたはし得ないカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）
を有する。
いくつかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
本発明の他の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アミド結合を用いてＰＥＧ骨格に連結される、末端のヒドロキシアミン、ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
いくつかの実施形態において、ヒドロキシアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
いくつかの実施形態において、ヒドラジン含有ＰＥＧ誘導体またはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸは任意に、存在し得るかまたはし得ないカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）
を有する。
いくつかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
本発明の他の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、末端のヒドラジン、ヒドロキシアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分を含有する分枝状のＰＥＧ（１０−４０ｋＤａ（そして５−２０ｋＤａであり得る）の範囲にある分子量を有する分枝状のＰＥＧのそれぞれの鎖を伴う）を用いて修飾される。
本発明の他の実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、分枝状構造を有するＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、ヒドラジン末端ＰＥＧ誘導体またはヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸは任意に、存在し得るかまたはし得ないカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）
を有する。
いくつかの実施形態において、セミカルバジド基を含有するＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは任意にＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
いくつかの実施形態において、ヒドロキシアミン基を含有するＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは任意にＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
水溶性ポリマーがＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結される程度および部位は、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体に対するＦＧＦ−２１ポリペプチドの結合を調節できる。いくつかの実施形態において、連結は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体を、平衡化結合アッセイ（例えば、ＦＧＦ−２１についてSpencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988) に記載されているとおりである）によって測定されるときに約４００ｎＭ以下のＫｄを有して、１５０ｎＭ以下のＫｄを有して、そしていくつかの場合において１００ｎＭ以下のＫｄを有して、結合するように配置される。
ポリマーの活性化およびペプチドの接合に関する、方法および化学反応は、文献に記載され、かつ当該技術において公知である。ポリマーの活性化に通常に使用される方法としては、これらに限定されないが、シアン、臭化物、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどを有する官能基の活性化が挙げられる（R. F. Taylor, (1991), Protein Immobilisation. Fundamental and Applications, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991を参照すればよい）。
ＰＥＧの官能性化および接合に関する種々の概説および研究論文が利用可能である。例えば、Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995) を参照すればよい。
また、ポリマーを活性化する方法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、および国際公開第９３／１５１８９号パンフレットに見出され得、かつ活性化ポリマーと酵素（これらに限定されないが、凝結因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素運搬タンパク質（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよび超酸化物不均化酵素（Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)）が挙げられる）との間における接合に関して見出され得る。引用された参考文献および特許文献のすべては、言及によって本明細書に組み込まれる。
天然にコードされていないアミノ酸（例えば、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）を含有するＦＧＦ−２１ポリペプチドのＰＥＧ付加（すなわち、任意の水溶性ポリマーの付加）は、任意の従来の方法によって実施される。例えば、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アルキン末端化ｍＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。簡単に言うと、過剰のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨが、室温において攪拌しながら、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ含有ＦＧＦ−２１ポリペプチドの水性溶液に対して加えられる。典型的に、水性溶液は、反応が実施されるべきｐＨ（一般的に約ｐＨ４−１０）に近いｐＫａを有する緩衝液を用いて、緩衝化される。ｐＨ７．５におけるＰＥＧ付加に好適な緩衝液の例としては、例えば、これらに限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ、およびＴＥＳが挙げられる。ｐＨは、継続的に観察され、かつ必要に応じて調節される。反応は放置されて、１−４８時間に渡って典型的に続けられる。
反応産物は、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられて、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ、ならびにブロックされていないＰＥＧが分子の両方の末端において活性化される場合に形成し、これによってＦＧＦ−２１バリアント分子を架橋し得る、ＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントの任意の高分子量複合体から、ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１ポリペプチドを分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの条件は、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムをとおり抜ける一方において、ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアント複合体が、１つ以上のＰＥＧ基に対して接合された１つのＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアント分子を含有する所望の形態の後に、溶出するような条件である。好適な条件は、所望の接合物に対する架橋化複合体の相対的な大きさに依存して変わり、かつ当業者によって容易に決定される。所望の接合物を含有する溶出物は、限外ろ過によって濃縮され、かつダイアフィルトレーションによって脱塩化される。
必要に応じて、疎水性相互作用クロマトグラフィーから得られたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当業者に公知の１つ以上の手法（これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー；アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー（これに限定されないが、デアエ セファロース（DEAE SEPHAROSE）を用いる、が挙げられる）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（これに限定されないが、セファデックス（SEPHADEX） Ｇ−７５を用いる、が挙げられる）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動手法（これに限定されないが、分離用の等電点電気泳動が挙げられる）、差異的可溶性（これに限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられる）、または抽出が挙げられる）によってさらに精製され得る。見かけの分子量は、球状タンパク質標準との比較によるＧＰＣによって、見積モル濃度れ得る（Preneta, AZ in Protein purification methods, a practical approach (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306）。ＦＧＦ−２１−ＰＥＧ接合物は、タンパク質分解（これに限定されないが、トリプシン切断が挙げられる）に続く質量分析によって評価され得る。Pepinsky RB., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):1059-66 (2001)。
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドのアミノ酸に対して連結された水溶性ポリマーは、制限されることなく、さらに誘導体化され得るか、または置換され得る。
（アジド含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の他の実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。一般的に、ＰＥＧ誘導体は、１−１００ｋＤａを有し、かついくつかの実施形態において１０−４０ｋＤａの範囲にある平均分子量を有する。
いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
他の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
本発明の他の実施形態において、アルキン含有アミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、末端アジド部分を含有する分枝状のＰＥＧ誘導体（１０−４０ｋＤａ（そして５−２０ｋＤａであり得る）の範囲にある分子量を有する分枝状のＰＥＧのそれぞれの鎖を伴う）を用いて修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸは任意に、いずれの場合においても存在し得るかまたは存在し得ない、Ｏ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）
を有する。
（アルキン含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の他の実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有する、ＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
本発明の他の実施形態において、アルキン含有の天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アミド結合を用いてＰＥＧに対して連結される末端のアジドまたは末端のアルキン部分を含有する、ＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
本発明の他の実施形態において、アジド含有アミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、末端のアルキン部分を含有する分枝状のＰＥＧ誘導体（１０−４０ｋＤａ（そして５−２０ｋＤａであり得る）の範囲にある分子量を有する分枝状のＰＥＧのそれぞれの鎖を伴う）を用いて修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＣ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸはＯ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、または存在しない）
を有する。
（ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の他の実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、活性化官能基（これらに限定されないが、エステル、カルボネートが挙げられる）を含有し、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに備える、ＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。一般的に、ＰＥＧ誘導体は、１−１００ｋＤａ、そしていくつかの実施形態において１０−４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
Figure 2020018314
（ここで、ｎは１−１０であり、ＸはＯ、ＮまたはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、かつＷは水溶性ポリマーである）
を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
Figure 2020018314
（ここで、ＸはＯ、ＮまたはＳであるか、または存在せず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、かつＲはＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリール基であり得る）。例示的なＲ基としては、これらに限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’，−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮおよび−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は互いに独立して、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（これらに限定されないが、１−３のハロゲンを用いて置換されているアリールが挙げられる）、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ、またはアルキルアリール基を指す。本発明の化合物が１つ以上のＲ基を含む場合に、例えば、Ｒ基のそれぞれは独立して、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれであるように選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に連結される場合に、それらは、窒素原子と組み合わさって、５−、６−または７−員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、これらに限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニル含むことを意図される。置換基の上述の議論から、当業者は、“アルキル”という用語が、水素基以外の基（例えば、ハロアルキル（これらに限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３が挙げられる）およびアシル（これらに限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられる））に対して結合される炭素原子を含めた基を包含することを意図される。
（他のＰＥＧ誘導体および一般的なＰＥＧ付加技術）
ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結され得る他の例示的なＰＥＧ分子だけでなく、ＰＥＧ付加方法としては、例えば、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０００１８３８号明細書；米国特許出願公開第２００２／００５２００９号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１６２９４９号明細書；米国特許出願公開第２００４／００１３６３７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０２２８２７４号明細書；米国特許出願公開第２００３／０２２０４４７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５８３３３号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１１４６４７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１０５２７５号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１０５２２４号明細書；米国特許出願公開第２００３／００２３０２３号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１５６０４７号明細書；米国特許出願公開第２００２／００９９１３３号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８６９３９号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８２３４５号明細書；米国特許出願公開第２００２／００７２５７３号明細書；米国特許出願公開第２００２／００５２４３０号明細書；米国特許出願公開第２００２／００４００７６号明細書；米国特許出願公開第２００２／００３７９４９号明細書；米国特許出願公開第２００２／０００２２５０号明細書；米国特許出願公開第２００１／００５６１７１号明細書；米国特許出願公開第２００１／００４４５２６号明細書；米国特許出願公開第２００１／００２１７６３号明細書；米国特許第６，６４６，１１０号明細書；米国特許第５，８２４，７７８号明細書；米国特許第５，４７６，６５３号明細書；米国特許第５，２１９，５６４号明細書；米国特許第５，６２９，３８４号明細書；米国特許第５，７３６，６２５号明細書；米国特許第４，９０２，５０２号明細書；米国特許第５，２８１，６９８号明細書；米国特許第５，１２２，６１４号明細書；米国特許第５，４７３，０３４号明細書；米国特許第５，５１６，６７３号明細書；米国特許第５，３８２，６５７号明細書；米国特許第６，５５２，１６７号明細書；米国特許第６，６１０，２８１号明細書；米国特許第６，５１５，１００号明細書；米国特許第６，４６１，６０３号明細書；米国特許第６，４３６，３８６号明細書；米国特許第６，２１４，９６６号明細書；米国特許第５，９９０，２３７号明細書；米国特許第５，９００，４６１号明細書；米国特許第５，７３９，２０８号明細書；米国特許第５，６７２，６６２号明細書；米国特許第５，４４６，０９０号明細書；米国特許第５，８０８，０９６号明細書；米国特許第５，６１２，４６０号明細書；米国特許第５，３２４，８４４号明細書；米国特許第５，２５２，７１４号明細書；米国特許第６，４２０，３３９号明細書；米国特許第６，２０１，０７２号明細書；米国特許第６，４５１，３４６号明細書；米国特許第６，３０６，８２１号明細書；米国特許第５，５５９，２１３号明細書；米国特許第５，７４７，６４６号明細書；米国特許第５，８３４，５９４号明細書；米国特許第５，８４９，８６０号明細書；米国特許第５，９８０，９４８号明細書；米国特許第６，００４，５７３号明細書；米国特許第６，１２９，９１２号明細書；国際公開第９７／３２６０７号パンフレット、欧州特許出願公開第２２９，１０８号明細書、欧州特許出願公開第４０２，３７８号明細書、国際公開第９２／１６５５５号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、国際公開第９４／１４７５８号パンフレット、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／２８０２４号パンフレット、国際公開第９５／００１６２号パンフレット、国際公開第９５／１１９２４， ＷＯ９５／１３０９０号パンフレット、国際公開第９５／３３４９０号パンフレット、国際公開第９６／０００８０号パンフレット、国際公開第９７／１８８３２号パンフレット、国際公開第９８／４１５６２号パンフレット、国際公開第９８／４８８３７号パンフレット、国際公開第９９／３２１３４号パンフレット、国際公開第９９／３２１３９号パンフレット、国際公開第９９／３２１４０号パンフレット、国際公開第９６／４０７９１号パンフレット、国際公開第９８／３２４６６号パンフレット、国際公開第９５／０６０５８号パンフレット、欧州特許出願公開第４３９ ５０８号明細書、国際公開第９７／０３１０６号パンフレット、国際公開第９６／２１４６９号パンフレット、国際公開第９５／１３３１２号パンフレット、欧州特許出願公開第９２１ １３１号明細書、国際公開第９８／０５３６３号パンフレット、欧州特許出願公開第８０９ ９９６号明細書、国際公開第９６／４１８１３号パンフレット、国際公開第９６／０７６７０号パンフレット、欧州特許出願公開第６０５ ９６３号明細書、欧州特許出願公開第５１０ ３５６号明細書、欧州特許出願公開第４００ ４７２号明細書、欧州特許出願公開第１８３ ５０３号明細書および欧州特許出願公開第１５４ ３１６号明細書に記載されているそれらが挙げられる。本明細書に記載されているＰＥＧ分子のいずれもが、任意の形態（これらに限定されないが、単鎖、分枝状鎖、多腕鎖、単官能性、二官能性、多官能性、またはこれらの組合せが挙げられる）において使用され得る。
付加的なポリマーおよびＰＥＧ誘導体が、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる以下の特許出願：米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号明細書、米国仮特許出願第６０／７５５，３３８号明細書、米国仮特許出願第６０／７５５，７１１号明細書、米国仮特許出願第６０／７５５，０１８号明細書、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号明細書、国際公開第２００６／０６９２４６号パンフレット、米国仮特許出願第６０／７４３，０４１号明細書、米国仮特許出願第６０／７４３，０４０号明細書、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号明細書、米国仮特許出願第６０／８８２，８１９号明細書、米国仮特許出願第６０／８８２，５００号明細書、および米国仮特許出願第６０／８７０，５９４号明細書。に説明されている。
（血清アルブミンに対する親和性の増強）
また、種々の生物学的に活性な分子が本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して融合されて、生物学的に活性な分子の半減期を調節し得る。いくつかの実施形態において、分子が本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して連結されるか、または融合されて、動物における内因性の血清アルブミンに対する親和性を増強し得る。
例えば、いくつかの場合において、ＦＧＦ−２１およびアルブミン結合配列の組換え融合体が作製される。例示的なアルブミン結合配列としては、これらに限定されないが、ストレプトコッカスのタンパク質Ｇから得られるアルブミン結合ドメイン（例えば、Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996)およびSjolander et al., J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)を参照すればよい）、または例えば、Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) に記載されているペプチドといったアルブミン結合ペプチドが挙げられる。
他の実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、脂肪酸を用いてアシル化される。いくつかの場合において、脂肪酸は血清アルブミンに対する結合を促進する。例えば、Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995) を参照すればよい。
他の実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、血清アルブミン（これに限定されないが、ヒトアルブミンが挙げられる）と直接に融合される。当業者であれば、広範な生物学的に活性な分子がまた、本発明におけるＦＧＦ−２１に対して連結されて、血清アルブミンまたは他の血清成分との結合を調節し得ることを認識する。
＜Ｘ．ＦＧＦ−２１ポリペプチドのグリコシル化＞
本発明は、糖付加残基を有する天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上組み込んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを包含する。糖付加残基は、天然（これに限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンが挙げられる）、または非天然（これに限定されないが、３−フルオロガラクトースが挙げられる）であり得る。糖は、Ｎ型もしくはＯ型の糖鎖結合（これに限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンが挙げられる）、または非天然の結合（これらに限定されないが、オキシムまたは対応するＣ型−またはＳ型のグリコシドが挙げられる）のいずれかによって、天然にコードされていないアミノ酸に対して連結され得る。
糖（これに限定されないが、グリコシルが挙げられる）部分は、インビボまたはインビトロにおいて、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して付加され得る。本発明のいくつかの実施形態において、カルボニル含有の天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、オキシム結合を介して対応する糖鎖付加ポリペプチドを生成するためのアミノオキシ基を有する、糖誘導体を用いて修飾される。天然にコードされていないアミノ酸に対して連結されると、糖は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して結合されるオリゴ糖を生成するための糖転移酵素および他の酵素を用いた処理によって、さらに合成され得る。例えば、H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003) を参照すればよい。
本発明のいくつかの実施形態において、カルボニル含有の天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アミノオキシ誘導体として調製される所定の構造を有するグリカンを用いて、直接に修飾される。当業者は、他の官能性基（これらに限定されないが、アジド、ヒドラジド、ヒドラジン、およびセミカルバジドが挙げられる）が、天然にコードされていないアミノ酸に対する糖の連結に対して使用され得ることを認識する。
本発明のいくつかの実施形態において、アジド含有またはアルキニル含有の天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、それから、アルキニルまたはアジド誘導体のそれぞれ（これらに限定されないが、が挙げられる）を用いた、ヒュイゲン［３＋２］環付加反応によって（限定されないが、これが挙げられる）、修飾される。この方法は、タンパク質が非常に高い選択性を有して修飾されることを可能にする。
＜ＸＩ．ＦＧＦ−２１の２量体および多量体＞
また、本発明は、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２１類似物の組合せ（例えば、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマーまたはへテロマルチマー（すなわち、トリマー、テトラマーなど））を提供する。ここで、天然にコードされていないアミノ酸を含有するＦＧＦ−２１は、ＦＧＦ−２１またはこれらのＦＧＦ−２１バリアントではない他のＦＧＦ−２１もしくはＦＧＦ−２１バリアントまたは任意の他のポリペプチドと、直接にか、またはリンカーを介して結合されている。モノマーと比べて増大した分子量に起因して、ＦＧＦ−２１のダイマーまたはマルチマーの接合物は、新たなまたは所望の特性を示し得る。当該特性としては、これらに限定されないが、モノマーのＦＧＦ−２１と比べて異なる薬物動態、異なる薬力学、調節された治療半減期、または調節された血清中半減期が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１のダイマーは、ＦＧＦ−２１受容体のシグナル伝達を調節する。他の実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１のダイマーまたはマルチマーは、ＦＧＦ−２１受容体のアンタゴニスト、アゴニストまたは調節因子として機能する。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１含有のダイマーまたはマルチマーに存在する１つ以上のＦＧＦ−２１分子は、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、これらに限定されないが、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド結合またはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を介して直接に連結されている。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ−２１ポリペプチド、および／または連結されたＦＧＦ−２１以外の分子は、異なる天然にコードされていないアミノ酸を含んでいて、２量体化を容易にする。これに限定されないが、第１のＦＧＦ−２１ポリペプチドの天然にコードされていないアミノ酸におけるアルキンおよび第２の分子の天然にコードされていないアミノ酸におけるアジドが、ヒュイゲン［３＋２］付加環化を介して接合されることによって、２量体化を容易にすることが挙げられる。代替可能に、ケトン含有天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチド、および／または連結されたＦＧＦ−２１以外の分子は、ヒドロキシアミン含有天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる第２のポリペプチドに対して接合される。これらのポリペプチドは、対応するオキシムの形成を介して反応させられる。
代替可能に、２つのＦＧＦ−２１ポリペプチド、および／またはＦＧＦ−２１以外の分子はリンカーを介して連結される。任意のヘテロ−またはホモ−二官能性リンカーが使用されて、同じか、または異なる１次配列を有する２つの分子、および／またはＦＧＦ−２１以外の分子を連結する。いくつかの場合において、ＦＧＦ−２１および／または連結されたＦＧＦ−２１以外の分子をつなぐためにともに使用されるリンカーは、二官能性のＰＥＧ試薬であり得る。高分子量または低分子量のリンカーが使用されて、ＦＧＦ−２１と連結された全体との間、またはもしあれば連結された全体とその結合パートナーとの間における所望の空間的関係ならびに立体配置を提供し得る。また、より長い分子長または短い分子長を有するリンカーが使用されて、ＦＧＦ−２１と連結された全体との間、またはもしあれば連結された全体とその結合パートナーとの間の所望の空間または自由度を提供し得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、ダンベル構造を有する水溶性の二官能性リンカーを提供する。当該ダンベル構造は、（ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端にあるアジド、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシアミンまたはカルボニルを含有する部分；（ｂ）ポリマー骨格の第２の末端にある少なくとも１つの第２の官能基を含んでいる。第２の官能基は、第１の官能基と同じであり得るか、または異なり得る。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、第１の官能基と反応性ではない。いくつかの実施形態において、本発明は、分枝状の分子構造の少なくとも１つのアームを含んでいる水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状の分子構造は樹状であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上のＦＧＦ−２１ポリペプチドを含んでいるマルチマーを提供する。当該ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
（ここで、ｎは約５から３０００であり、ｍは２から１０であり、Ｘは、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシアミン、アセチルまたはカルボニルを含有する部分であり得、かつＲは、Ｘと同じであるか、または異なるキャップ形成基、官能基または脱離基である）
を有する水溶性活性化ポリマーと反応させることによって形成される。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボネート、１−ベンゾイミダゾリルカルボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性化スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、およびケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
＜ＸＩＩ．ＦＧＦ−２１ポリペプチド活性、およびＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体に対するＦＧＦ−２１ポリペプチドの親和性の測定＞
ＦＧＦ−２１は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコースの取り込みを刺激し、かつインスリンに対する感受性を増強させることについて示されている。脂肪組織の代謝の研究に利用されたインビトロモデルについて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書の実施例３に示されている。２型糖尿病の特徴は、脂肪組織を含む種々の組織種におけるグルコース取り込みの不足である。したがって、ＦＧＦ−２１は、血中のグルコース濃度を低下させることによって２型糖尿病の処置にとって有用である。さらに、ＦＧＦ−２１は、より速くかつ効率的なグルコース利用によるエネルギー消費を増大させることによって、肥満の処置に有用である。また、ＦＧＦ−２１は、インスリン依存的様式において３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激することについて示されている。同様にこれは、１型糖尿病の処置に有用であることを示しいてる。米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書を参照すればよい。米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書には、ＦＧＦ−２１が、インスリンの最適下限（５ｎＭ）の濃度およびインスリン非存在下において、濃度依存的様式における３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激することについて示されている。また、ＦＧＦ−２１は、米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書に記載のエクスビボ組織モデルにおける、グルコース取り込みを誘導する。
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取り込みは、以下の方法を用いて評価され得る。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、the American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、Ｍｄ）から得られる。細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地に１０％の鉄富化ウシ胎児血清を含有する成長培地（ＧＭ）において培養される。標準的な脂肪細胞の分化について、細胞が密集状態（０日を基準にして）に達してから２日後に、細胞は、１０％のウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１μＭののデキサメタゾン、および０．５μＭのイソブチルメチルキサンチンを含有する分化培地（ＤＭ）に、４８時間にわたってさらされる。それから、細胞は、１０％のウシ胎児血清および１０μｇ／ｍｌのインスリンを含有する分化後培地に維持される。インビトロにおける作用強度は、当業者に公知であるグルコース取り込みアッセイを用いて測定され得る。インビトロにおける作用強度は、細胞を用いたアッセイにおけるＦＧＦ−２１化合物のグルコース取り込みの度合いと定義され得、かつＦＧＦ−２１化合物の生物学的作用強度の度合いである。インビトロにおける作用強度は、単回投与応答実験において５０％の活性を生じる化合物の有効濃度であるＥＣ５０と表され得る。
グルコース輸送アッセイ−インスリン依存性−
ヘキソース取り込みは、０．１ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］グルコースの蓄積によって定量され、以下のように測定される。１２ウェルプレートにおける３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞が、３７℃に温められ、０．２％のＢＳＡを含有するＫＲＰ緩衝液（１３６ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＰＯ４、０．９ｍＭのＣａＣｌ２、０．９ｍＭのＭｇＳＯ４、ｐＨ７．４）を用いて２回にわたって洗浄される。細胞は、０．２％のＢＳＡを含有するリーボビッツＬ−１５培地において、大気、３７℃において２時間にわたってインキュベートされる。細胞は、ふたたび０．２％のＢＳＡを含有するＫＲＰを用いて２回にわたって洗浄され、ワートマニンの存在または非存在（ＭｅＳＯのみ）の０．２％のＢＳＡを含有するＫＲＰにおいて、大気、３７℃において３０分にわたってインキュベートされる。それから、インスリンが１５分にわたって最終濃度１００ｎＭまで加えられ、２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］グルコースの取り込みが最後の４分間にわたって測定される。１０μＭのサイトカラシンの存在において測定される非特異的な取り込みが、すべての値から引かれる。タンパク質濃度は、ピアス社のビシンコニン酸アッセイを用いて測定される。取り込みは、各実験について３とおりまたは４とおりにおいて通常に測定される。インスリンの存在下においてＦＧＦ−２１を用いた、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の急激な前処理および持続的な前処理の影響が調査され得る。
グルコース輸送アッセイ−インスリン依存性
３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞は、９６ウェルプレートに播かれ、２週間にわたって脂肪細胞（脂肪細胞（adipocyte））に分化させられる。分化の後に、細胞は、無血清培地において飢餓状態にされ、２４時間にわたってＦＧＦ−２１を用いて処理される。処理の後に、細胞は０．１％のＢＳＡを含有するＫＲＢＨ緩衝液を用いて２回にわたって洗浄される。グルコース取り込みは、ＫＰＢＨ緩衝液における標識グルコースの存在下（インスリンなし）において実施される。ＦＧＦ−２１は、インスリンの最適下限（５ｎＭ）の濃度およびインスリン非存在下において、濃度依存的様式における３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激することについて示されている（米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書を参照すればよい）。さらに、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、エクスビボモデルにおいてグルコース取り込みを刺激することについて示され得る。
エクスビボのグルコース輸送モデルにおいて、グルコース輸送アッセイについて以下のように記載されている。クレブス−ヘンゼルリート緩衝液ストック溶液−ストック１：ＮａＣｌ（１．１６Ｍ）；ＫＣｌ（０．０４６Ｍ）；ＫＨ２ＰＯ４（０．０１１６）ＮａＨＣＯ３（０．０２５３Ｍ）。ストック２：ＣａＣｌ２（０．０２５Ｍ）；ＭｇＳＯ４（２Ｈ２Ｏ）（０．０１１６Ｍ）。ＢＳＡ：ＩＣＮコーンフラクションＶを使用（透析せずにそのまま脂肪酸なしのＢＳＡ）。培地調製：５０ｍｌのクレブスのストック１を３９５ｍｌのｄＨ２Ｏに加え、１時間にわたって９５％のＯ２／５％のＣＯ２のガスを供給する。５０ｍｌのストック２を加えて、ｄＨ２Ｏを用いて５００ｍｌにする。ＩＣＮの脂肪酸無しのＢＳＡを５００ｍｇ加える。プレインキュベーションおよびインキュベーション用の培地：３２ｍＭのマンニトール、８ｍＭのグルコース。洗浄培地：４０ｍＭのマンニトール、２ｍＭのピルビン酸塩。輸送培地：３９ｍＭのマンニトール、１ｍＭの２−ＤＧ；３２ｍＭのマンニトール。８ｍＭの３−Ｏ−ＭＧ。インスリン溶液：２０００μＵ／ｍｌまたは１３．３ｎＭの最終濃度おける（１００，０００，０００μＵ／ｍｌのブタインスリン［リリー］）。放射線標識培地調製：特定の活性（２ＤＧ＝１．５ｍＣｉ／ｍｌ；３−Ｏ−ＭＧ＝４３７μＣｉ／ｍｌ；またはマンニトール＝８μＣｉ／ｍｌ）。ラットは、体重１００ｇにつき０．１ｃｃのネンブタールを用いて麻酔される。筋組織が切除され、０．９％の生理食塩水において洗浄され、それからプレインキュベート培地（２ｍｌ）に２９℃において１時間にわたって置かれる。筋組織は、インキュベーション培地（２ｍｌ；インスリンまたは試験化合物を含むことを除いてプレインキュベーション培地と同じ）に移されて、３０分にわたって（実験条件に依存する）インキュベートされる。それから、筋組織は、洗浄培地（２ｍｌ）に移されて２９℃において１０分間にわたってインキュベートされる。筋組織は、標識培地（１．５ｍｌ）に移されて２９℃において１０分間（３−Ｏ−ＭＧ）または２０分（２ＤＧ）にわたってインキュベートされる。筋組織は、取り除かれ、重さを量られ、それからドライアイス上のポリプロピレンチューブに収納される。１０分間から１５分間にわたって７０℃のウォーターバスに置かれて、チューブごとに数分間にわたってボルテックスにかけた後、１規定のＫＯＨがチューブに加えられる。チューブは、氷上において冷却され、１規定のＨＣｌが加えられてから、よく混合される。それから、２００μｌの上清が、３つのシンチレーションバイアルに入れられて、公知の放射性と比べてシンチレーションカウンターにおいて測定される。
収縮に関して、筋組織は、プレインキュベーション／インキュベーション培地において１時間にわたって、最初にインキュベーションされる。１時間後に、各対（ラットごとに１対）の１つの筋は刺激装置にピン固定され、他の筋はインキュベーション培地の入った新しいフラスコに移される。収縮した筋は、０．１ｍ秒間にわたって連続する各刺激を有する７０Ｈｚの２００ｍ秒間にわたるパルス列によって刺激される。パルス列は、２×１０分間（間に１分間の休憩を挟む）にわたって１０〜１５Ｖ、１／秒において送られる。刺激期間の終了時に、筋は、刺激装置から取り除かれ、１０分間にわたって洗浄培地に置かれる。それから、概略について上述したように、標識培地に続く。
ＦＧＦ受容体は、当業者に公知の技術および方法を用いて調製され得る。ＦＧＦ−２１ポリペプチド活性は、標準的または公知のインビボアッセイまたはインビトロアッセイを用いて測定され得る。非天然アミノ酸を含んでいる非ＰＥＧ付加またはＰＥＧ付加のＦＧＦ−２１ポリペプチドに関して、ＦＧＦ−２１のその受容体に対する親和性は、ビアコア（BIAcore（登録商標））バイオセンサー（ファルマシア）を用いることによって測定され得る。
ＦＧＦ−２１ポリペプチドを生成するために使用される方法に関わらず、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、生物活性に関するアッセイにかけられる。生物活性に関する試験は所望の結果についての分析を可能にする。当該分析は、例えば、生物活性の増大もしくは低減（修飾したＦＧＦ−２１と比べたとき）、異なる生物活性（修飾したＦＧＦ−２１と比べたとき）、受容体もしくは結合パートナーの親和性分析、ＦＧＦ−２１自身もしくはその受容体の高次構造もしくは構造の変化（修飾したＦＧＦ−２１と比べたとき）、または血清半減期の分析である。
アッセイの方法論に関して上記にまとめた言及は網羅的ではなく、当業者であれば所望の最終結果に関する試験に有用なアッセイを認識する。
＜ＸＩＩＩ．有効性、機能的なインビボ半減期、および薬物動態パラメータ＞
本発明の重要な局面は、水溶性ポリマー部分に対するポリペプチドの接合を有するか、または有しないＦＧＦ−２１ポリペプチドの構築によって得られる、延長された生物学的半減期である。ＦＧＦ−２１ポリペプチドの血中濃度の急速な減少は、接合および非接合のＦＧＦ−２１ポリペプチドおよびこれらのバリアントを用いた処置に対する生物学的応答を評価することを重要にさせている。本発明の接合および非接合のＦＧＦ−２１ポリペプチドおよびこれらのバリアントは、例えば皮下投与または静脈内投与を介した投与の後においても血中半減期を延長し得ており、例えば、ＥＬＩＳＡ法および一次スクリーニングアッセイによる測定を可能にしている。市販の供給源から得られるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡキットが使用され得る。インビボにおける生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されているように実施される。
天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効性および機能的なインビボ半減期は、Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271(36): 21969-21977 (1996) に記載されている手順に従って決定され得る。
天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドに関する薬物動態要素は、通常のオスのスピローグダウリーマウス（処理群ごとにＮ＝５の動物）において評価され得る。動物は、静脈内に２５ｕｇ／ラットまたは皮下に５０ｕｇ／ラットの単回用量のいずれかを受け、かつおよそ５−７の血液試料が、水溶性ポリマーに対して接合されていない、天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドに関して約６時間、および天然にコードされていないアミノ酸を備え、かつ水溶性ポリマーに対して接合されているＦＧＦ−２１ポリペプチドに関して約４日の範囲に一般的に及ぶ、予め決められた時間経過に従って採られる。ＦＧＦ−２１ポリペプチドに関する薬物動態のデータは、多様な種においてよく研究されており、かつ天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドについて得られたデータに対して直接に比較され得る。Mordenti J., et al., Pharm. Res. 8(11):1351-59 (1991)を参照すればよい。
また、薬物動態の要素は、霊長類（例えば、カニクイザル）において評価され得る。典型的に、単回の注入は、皮下または静脈内かのいずれかに投与され得、かつ血中のＦＧＦ−２１の濃度は、長期間に渡って観察され得る。
本発明に係るＦＧＦ−２１ポリペプチドの特定の活性は、当該技術において公知の方法によって決定され得る。本発明に従って得られ、かつ精製されたＦＧＦ−２１ポリペプチド変異体、またはこれらの断片の生物活性は、本明細書に記載されているか、もしくは言及されている方法または当業者に公知の方法によって試験され得る。
本発明のポリペプチドは、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ：２型）、インスリン依存性糖尿病（１型）、このほかにも肥満症、不十分なグルコース除去、高血糖症および高インスリン血症などにかかっている動物の処置に使用され得る。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号明細書に示されているように、ＦＧＦ−２１は糖尿病および肥満症の動物モデルにおいて有効である。肥満症および糖尿病の種々の動物モデルにおいて代謝特性が異なるので、高インスリン血症、高血糖症および肥満症の影響を識別するために、複数のモデルの分析が試みられている。糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）および肥満（ｏｂ／ｏｂ）のマウスは、重度の肥満症、過食症、変異性の高血糖症、インスリン抵抗性、高インスリン血症および障害性の熱産生によって特徴付けられる（Coleman, Diabetes 31 :1, 1982; E. Shafrir, in Diabetes Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed. 4, 1990), pp. 299-340）。しかし、糖尿病は、ｄｂ／ｄｂモデルにおいてはるかに重篤である（Coleman, Diabetes 31 :1, 1982; E. Shafrir, in Diabetes Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed. 4, 1990), pp. 299-340）。ズッカー（ｆａ／ｆａ）ラットは、重篤な肥満、高インスリン血症およびインスリン抵抗性である（Coleman, Diabetes 31 :1, 1982; E. Shafrir, in Diabetes Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed. 4, 1990), pp. 299-340）。そして、ｆａ／ｆａ変異は、マウスのｄｂ変異のラットにおける等価物であり得る（Friedman et al., Cell 69:217-220, 1992; Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7806, 1991). ）。タビー（ｔｕｂ／ｔｕｂ）マウスは、重大な高血糖症をともなわない、肥満症、中程度のインスリン抵抗性および高インスリン血症によって特徴付けられる（Coleman et al., J. Heredity 81:424, 1990）。
また、化学的に誘導された肥満症に関するグルタミン酸１ナトリウム（ＭＳＧ）モデル（Olney, Science 164:719, 1969; Cameron et al., CIi. Exp. Pharmacol. Physiol. 5:41, 1978）が調べられ得る。当該モデルにおいて、肥満症は、遺伝的モデルよりも重篤度が低く、かつ過食症、高インスリン血症およびインスリン抵抗性を生じることなく進展する。最後に、化学的に誘導された肥満症に関するストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルは、肥満症の非存在における高血糖症の影響を調べ得る。ＳＴＺ処理動物は、インスリン不足であり、かつ重篤な高脂血症である（Coleman, Diabetes 31 :1, 1982; E. Shafrir, in Diabetes Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed. 4, 1990), pp. 299-340）。
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ｏｂ／ｏｂマウスにおける敗血症ショックにおいて評価され得る。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０１７６６３１号明細書を参照すればよい。
＜ＸＩＶ．投与および薬学的組成物＞
本発明のポリペプチド（これらに限定されないが、ＦＧＦ−２１、シンセターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸タンパク質などが挙げられる）は、好適な薬学的担体と組み合せて（限定されないが、これが挙げられる）、治療的使用に任意に採用される。当該組成物は、例えば、治療有効量の化合物、および薬学的に受容可能な担体もしくは賦形剤を備える。当該担体または賦形剤としては、これらに限定されないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／またはこれらの組合せが挙げられる。調合物は、投与形態に合わせて作製される。一般的に、タンパク質を投与する方法は、当業者に公知であり、かつ本発明のポリペプチドの投与に適用され得る。
本発明の１つ以上のポリペプチドを備える治療組成物は、当業者に公知の方法に従って、有効性を確かめ、かつ用量を評価するために、疾患の１つ以上のインビトロおよび／またはインビボにおける動物モデルにおいて、任意に試験され得る。特に、用量は、天然アミノ酸相同物に対する本明細書における非天然アミノ酸の活性、安定性またはたの好適な測定（１つ以上の非天然アミノ酸を含めるために修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの、天然アミノ酸のＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する比較）（すなわち、比較アッセイ）によって最初に決定され得る。
投与は、血液または組織細胞と最終的に接触する分子の導入に通常に使用される任意の経路による。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、１つ以上の薬学的に受容可能な担体を任意に伴って、任意の好適な様式において投与される。本発明に関する当該ポリペプチドの患者に対する投与の好適な方法が利用可能であり、そして、２つ以上の経路が特定の組成物を投与するために使用されるが、特定の経路は、他の経路よりも即時のかつ効果的な作用または反応をしばしば提供できる。
薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物よって、これと同様に組成物を投与するために使用される方法によって、部分的に決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な好適な調合物がある。
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、タンパク質またはペプチドにとって任意の好適な従来の経路（これに限定されないが、非経口的（例えば、注入（これらに限定されないが、皮下的、静脈内的、または注入もしくは点滴の任意の他の形態が挙げられる））が挙げられる）によって投与され得る。ポリペプチド組成物は、多くの経路（これらに限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、または直腸の手段が挙げられる）によって投与され得る。また、修飾されたか、または非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドの組成物は、リポソームを介して投与され得る。当該投与経路および調合物は、当業者にとって公知である。天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、単独にか、または他の好適な成分（例えば、薬学的担体）と組み合せて使用され得る。また、天然にコードされていないアミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、他の薬剤（これに限定されないが、経口の抗糖尿病薬が挙げられる）と組み合せて使用され得る。
“抗糖尿病薬”という用語は、任意のグルコース代謝疾患もしくはこれらの任意の合併症の処置、予防、またはその重症度の低減に有用な任意の薬剤を意味する。当該合併症としては、本明細書に記載の障害、疾患、または合併症のうち任意のものが挙げられる。抗糖尿病薬としては、インスリン、チアゾリジンジオン、スルフォニルウレア、安息香酸誘導体、またはα−グルコシダーゼ阻害剤などが挙げられる。主成分の一部であり得る他の一般的な種類の抗糖尿病薬としては（引用符内にある定義された用語）：公式の米国薬局方または公式の国民医薬品集（またはこれらに対するあらゆる補足）に承認された“医薬品”；合衆国法典の第２１編に使用されているとおりの、米国のＦＤＡによって認可された“新薬”および“新規動物薬”；米国または海外において政府団体の認可を必要とする任意の薬（“認可薬”）；米国法典の第２１編第３５５条の（ａ）に従うように規制当局の認可を必要とする任意の薬（“規制当局の認可薬”）；米国法典の第２１編第３７９条の（ｇ）の下におけるヒューマンドラッグの適用を条件としているか、または条件としていた、任意の薬剤（“ヒューマンドラッグ（human drug）”）が挙げられる（この定義にとっての法的な規定に対する出典のすべては、本願の出願日の時点における当該規定を指す）。２型糖尿病の管理に使用される当業者に公知の現在の薬剤または抗糖尿病薬としては、多くの分類：ビグアナイド剤、チアゾリジンジオン、スルフォニル尿素、安息香酸誘導体およびグルコシダーゼ阻害剤が挙げられる。これらの薬剤は、異なる作用様式を通常に有している。ビグアナイド剤（例えば、メトフォルミン）は、肝臓における過剰なブドウ糖新生を抑制すると考えられている。チアゾリジンジオンは、末梢におけるグルコース処理を増強することによって作用すると考えられている。スルフォニル尿素（例えば、トルブタミドおよびグルブリド）、および安息香酸誘導体（例えば、レパグリニド）は、インスリン分泌を刺激することによって血漿グルコースを低下させる。α−グルコシダーゼ阻害剤は、炭水化物を代謝させるα−グルコシダーゼを競合的に阻害することによって、炭水化物の吸収を遅延させ、かつ食後の高血糖を和らげる。さらに、ヒトへの使用がまだ認可されていない糖尿病の処置に関する多くの療法が提案されている。
糖尿病およびその前駆症候群（例えば、インスリン抵抗性）の管理に使用される、当業者に公知の現在の薬剤または抗糖尿病薬としては、化合物の５つの分類：ビグアナイド剤（例えば、メトフォルミン）；チアゾリジンジオン；スルフォニル尿素（例えば、トルブタミドおよびグルブリド）；安息香酸誘導体（例えば、レパグリニド）；およびグルコシダーゼ阻害剤が挙げられる。これらの薬剤に加えて、多くの他の療法（これに限定されないが、ＤＤＰ−４阻害剤が挙げられる）が、グルコース制御を改善するために本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドと組み合せて使用され得る。これらの抗糖尿病薬の一部は、ヒトへの使用が認可されている。臨床試験において試験された先行するＤＤＰ−４化合物としては、ビルダグリプチン（Vildagliptin）、（ガルバス（Galvus））（ＬＡＦ２３７）、シタグリプチン（Sitagliptin）（ジャヌビア（Januvia））、サクサグリプチン（Saxagliptin）およびアログリプチン（Alogliptin）が挙げられる。ジャヌビア（シタグリプチン）は、２型糖尿病の処置における単独療法またはメトフォルミンもしくはチアゾリジンジオンとの併用療法として、２００６年１０月１７日に合衆国において、認可された。第１世代のノバルティス（Novartis）の化合物１−［［［２−［（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジン（ＮＶＰ ＤＰＰ７２８）を９３人の２型糖尿病患者（平均７．４％のＨｂＡ１ｃ）に対して４週間にわたって投与することによって、４週間の試験期間にわたって血漿グルコース、およびインスリンおよびＨｂＡ１ｃレベルが低減された。Inhibition of Dipeptidyl Peptidase IV Improves Metabolic Control Over a 4- Week Study Period in Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 2002 May;25(5) :869-875を参照すればよい。また、メトフォルミン投与を受けている患者は、ＧＬＰ−１療法の開始後に相加的なグルコース低下という効能を示すことに注目されている。Additive glucose-lowering effects of glucagon-like peptide-1 and metformin in type 2 diabetes. Diabetes Care. 2001 Apr ;24(4):720-5を参照すればよい。糖尿病ではない肥満症の１０人の男性患者の研究において、メトフォルミン投与は、経口のグルコース摂取後においてＧＬＰ−１を循環させるレベルの増大と関連付けられた。そして、プールしたヒトの血漿を用いた実験において、メトフォルミン（０．１〜０．５μｇ／ｍｌ）は、ＤＤＰ−４の存在または非存在において、３７℃において３０分間のインキュベーション後にＧＬＰ−１（７〜３６）アミドの分解を有為に阻害した。この研究者らは、メトフォルミンがインビボおよびインビトロの両方におけるＧＬＰ−１の酵素分解を阻害し得る可能性を提起した。Effect of metformin on glucagon-like peptide 1 (GLP-I) and leptin levels in obese nondiabetic subjects. Diabetes Care. 2001 Mar; 24 (3): 489-94を参照すればよい。インビトロにおける生化学分析を用いたＤＤＰ−４とＧＬＰ−１分解との間の関係の分析。Demuthおよびcolleagueは、ヒトＤＤＰ−４の種々の材料を用いて、ＤＤＰ−４媒介のＧＬＰ−１分解に対してメトフォルミンが影響しないことを見出した。Metformin Effects on Dipeptidylpeptidase IV Degradation of Glucagon-like Peptide-1. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Mar 15;291(5):1302-8を参照すればよい。
糖尿病療法薬として有用なビグアナイド剤のなかでも、メトフォルミンは、特に好結果であることが証明されている。メトフォルミン（Ｎ，Ｎ−ジメチルイミドジカルボンイミディックアミド；１，１−ジメチルビグアナイド；Ｎ，Ｎ−ジメチルジビグアナイド；Ｎ’−ジメチルグアニルグアニジン）は、肝臓によるグルコース産生、およびグルコースの腸管吸収を低下させることによって作用する抗糖尿病薬である。また、メトフォルミンは、体内の他の場所にある組織のインスリン感受性を向上させる（末梢におけるグルコース取り込みおよびグルコース利用を増加させる）と考えられている。メトフォルミンは、耐糖能異常（ＩＧＴ）および２型糖尿病の被験者における耐糖能を向上させて、食事前後の血漿グルコースを低下させた。通常、メトフォルミンは、インスリンの非存在下において有効ではない（Bailey, Diabetes Care 15: 755-72 (1992)）。
メトフォルミンの有効性は、種々の試みにおいて示されている。中程度の肥満性の２型糖尿病の一研究において、メトフォルミンの単独療法またはスルフォニル尿素との併用療法の２９週間後に、ＨｂＡ１ｃレベルが８．６％から７．１％まで改善した（DeFronzo et al., New Engl. J. Med. 333:541-49 (1995)）。また、メトフォルミンは、空腹時の平均した血清中のトリグリセリド、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールの濃度を低下させ、かつ他の脂質の濃度に悪影響を示さないという血清中の脂質に対する良好な影響を示した。他の試みにおいて、メトフォルミンは、ＮＩＤＤＭ被験者における血糖制御を用量依存的に改善した。５００ｍｇおよび２０００ｍｇのメトフォルミンを毎日投与することによって、１４週間後にそれぞれ０．９％および２．０％だけＨｂＡ１ｃを低減させた（Garber et al, Am J. Med. 102:491-97 (1997)）。また、メトフォルミンは、糖尿病ではないインスリン抵抗性に対して有利な影響を有し得る。一研究において、糖尿病ではない高血圧の肥満症の女性をメトフォルミンを用いて処置することによって、血圧、空腹およびグルコースによって誘導されるインスリンフィブリノゲンを低減されることが示された（Giugliano et al, Diabetes Care 16:1387-90 (1993)）。
通常、メトフォルミンはメトフォルミンＨＣｌとして投与される。メトフォルミンのこの有用な形態および他の有用な形態は、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドを伴う使用に関して考慮される。固定用量の投与計画は、メトフォルミンＨＣｌまたは任意の他の薬理作用物を用いた糖尿病における高血糖の管理について、一般的に個人別に調節される。用量の個別化は有効性および耐薬力の両方に基づいてなされ、通常、推奨される１日投与量の最大は２５５０ｍｇを超えない。
本発明の実施における使用に考慮されるチアゾリジンジオンとしては、トログリタゾンなどが挙げられる。当該化合物は、米国特許第５，２２３，５２２号明細書、米国特許第５，１３２，３１７号明細書、米国特許第５，１２０，７５４号明細書、米国特許第５，０６１，７１７号明細書、米国特許第４，８９７，４０５号明細書、米国特許第４，８７３，２５５号明細書、米国特許第４，６８７，７７７号明細書、米国特許第４，５７２，９１２号明細書、米国特許第４，２８７，２００号明細書および米国特許第５，００２，９５３号明細書；ならびにCurrent Pharmaceutical Design 2:85-101 (1996)に記載のようによく知られている。トログリタゾンは、ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）の活性化によってグルコース輸送を能動的に増加させる経口の抗高血糖薬である。当該活性化によって、トログリタゾンは、ＧＬＵＴ４グルコース輸送体の発現を促進して、インスリンによって刺激されるグルコース取り込みの増加を生じ得る。また、トログリタゾンはブドウ糖新生、および／または解糖作用の活性化を減じさせ得る。
ＨｂＡ１ｃは、患者が増加した血中グルコースの段階に陥っている場合に、一般的により高く糖化されている量を測定する血液検査である。当該試験によって、患者にとってのここ２〜３ヶ月間における糖尿病管理が評価される。トログリタゾン療法による糖血症制御によって、おおよそ１〜２％ほどＨｂＡ１ｃが低減される（Mimura et al., Diabetes Med. 11 :685-91 (1994)；Kumar et al., Diabetologia 39:701-09 (1996)）。治療の開始後から数週間において効果が生じ得ない。また、トログリタゾンは、インスリンの必要量を低減し得る。ＮＩＤＤＭ患者の外因性インスリンを用いた１回の試験において、平均ＨｂＡ１ｃは、２００および６００ｍｇの投与量のトログリタゾンについて０．８％および１．４％だけそれぞれ低下した。インスリンの必要量は２９％以下まで低下した（Schwartz et al., New Engl. J. Med. 338:861-66 (1998)）。４００および６００ｍｇのトログリタゾンを用いたＮＩＤＤＭ糖尿病患者の他の研究において、空腹時および食後のグルコース濃度が低下し、かつ高インスリン血症の正常血糖クランプは、グルコース処理が処置前の濃度を約４５％超えることを示した（Maggs et al., Ann. Intern. Med. 128:176-85 (1998)）。
ある研究において、４００ｍｇのトログリタゾンによって、低下した糖耐性または正常な糖耐性を有する肥満症の患者においてグルコース処理率が増加した（Nolan et al., New Eng. J. Med 331 :1188-93 (1994)）。ＩＧＴおよび妊娠糖尿病の女性の他の研究において、６００ｍｇのトログリタゾンによって、インスリン恒常性が改善された（インスリン感受性の向上および循環するインスリン濃度の低下が挙げられる）が、糖耐性は変化しなかった（Berkowitz et al., Diabetes 45:172-79 (1996)）。チアゾリジンジオンは、ＮＩＤＤＭの発症を予防するか、または遅らせるために、ＮＩＤＤＭのおそれがある集団（例えば、ＰＯＣＳまたはＧＤＭの女性）に使用され得る（米国特許第５，８７４，４５４号明細書）。単独に使用される場合のトログリタゾンの有効量は、１日の投与につき約１０ｍｇから約８００ｍｇまでの範囲であり、かつ相応の範囲が本発明に置ける使用にとって考慮される。メトフォルミンとともに使用されることのほかに、トログリタゾンはインスリンおよびスルフォニル尿素剤と組み合せて使用され得る。例えば、米国特許第５，８５９，０３７号明細書を参照すればよい。
スルフォニル尿素は、膵臓からのインスリン放出を増加させて血漿グルコースを低下させることによって、一般的に作用する。特にスルフォニル尿素はＡＴＰ感受性カリウムチャネルを遮断することによって作用する。また、スルフォニル尿素グリメピリドは、ＧＬＵＴ４輸送体の輸送を刺激することによってインスリン感受性を増強させ得る。スルフォニル尿素は、ＨｂＡ１ｃが８％を超えている場合に典型的に処方される。また、米国特許第５，２５８，１８５号明細書および米国特許第４，８７３，０８０号明細書を参照すればよい。
スルフォニル尿素は、例えば、米国特許第３，４５４，６３５号明細書、米国特許第３，６６９，９６６号明細書、米国特許第２，９６８，１５８号明細書、米国特許第３，５０１，４９５号明細書、米国特許第３，７０８，４８６号明細書、米国特許第３，６６８，２１５号明細書、米国特許第３，６５４，３５７号明細書および米国特許第３，０９７，２４２号明細書に記載されているような、当業者によく知られている種類の化合物である。本発明のある実施形態において使用が予想される例示的なスルフォニル尿素（括弧内に示される典型的な一日投与量において）としては、アセトヘキサミド（約２５０から約１５００ｍｇの範囲）、クロルプロパミド（約１００から約５００ｍｇの範囲）、トラザミド（約１００から約１０００ｍｇの範囲）、トルブタミド（約５００から約３０００ｍｇの範囲）、グリクラジド（約８０から約３２０ｍｇの範囲）、グリピジド（約５から約４０ｍｇの範囲）、グリピジドＧＩＴＳ（約５から約２０ｍｇの範囲）、グリブリド（約１から約２０ｍｇの範囲）、微粉化グリブリド（約０．７５から約１２ｍｇの範囲）、グリメペリド（約１から約８ｍｇの範囲）、およびＡＧ−ＥＥ ６２３ ＺＷなどが挙げられる。グリメペリドは、インスリンとともなった使用が認可された、この種の薬剤において最初の抗糖尿病薬である。そして、グリメペリドの使用にともなう低血糖症の危険性がより少ない。
種々のα−グルコシダーゼ阻害剤が、糖尿病を処置するか、および／または予防する本発明とともに使用され得る。そのような阻害剤は、炭水化物を代謝させるα−グルコシダーゼを競合的に阻害することによって、炭水化物の吸収を遅延させ、かつ食後の高血糖を和らげる（Clissod et al., Drugs 35:214-23 (1988)）。グルコースの低下は低下したＨｂＡ１ｃレベルを介して示され得る。本発明の実施において使用が予想される例示的なα−グルコシダーゼ阻害剤としては、アカルボースおよびミグリトールなどが挙げられる。アカルボースおよびミグリトールの有効量は、１日に約２５から約３００ｍｇの範囲である。
α−グルコシダーゼ阻害剤は、スルフォニル尿素と組み合せた本発明のポリペプチドとともに使用され得る。スルフォニル尿素の単独との組合せにおけるα−グルコシダーゼ阻害剤によって、一般的に約０．５から１％までＨｂＡ１ｃレベルが低下することが示されている。さらに、α−グルコシダーゼ阻害剤によって、血中グルコースの食後の上昇を弱めることに有効であることが示されている（Lefevre et al., Drugs 44:29-38 (1992)）。
種々の安息香酸誘導体は、糖尿病を処置するか、および／または予防するために本発明のポリペプチドとともに使用され得る。また、メグリチニドとして知られるこの薬剤は、スルフォニル尿素以外のインスリン分泌促進能を有する血糖降下薬である。例えば、レパグリニドは、膵臓β細胞上にあるＡＴＰ感受性カリウムチャネルと結合することによってインスリン分泌を増大させると思われる。本発明の実施において使用が予想される例示的な安息香酸誘導体としては、レパグリニドなどが挙げられる。レパグリニドに関して、１日の有効量は約０．５から１６ｍｇの範囲であり得、レパグリニドは食前に服用され得る。
多くの薬剤が、ヒトにおける見込みのある抗糖尿病薬として現在、研究されている。そのような薬剤のいずれもが、それらが治療用途に利用可能になった場合に、代謝異常、特に糖尿病の治療および／または予防に関して、本発明のポリペプチドとともに使用され得る。
他の種類の抗糖尿病薬が、血中グルコースを調節するために修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドとともに使用され得る。本発明の付加的な実施形態において、他の種類の抗糖尿病薬は、カルニチンパルトイルトランスフェラーゼ Ｉ（ＣＰＴ−Ｉ）の阻害剤（例えば、エトモキシル）である。エトモキシルは、脂肪酸の酸化に必要なカルニチンパルトイルトランスフェラーゼ Ｉを不可逆的に阻害する。脂肪酸の酸化の産物が肝臓における糖新生を刺激するので、そのような阻害は空腹時の高血糖を緩和し得る。エトモキシルは２型糖尿病におけるインスリン感受性を改善し得る（Hormone Metab. Res. 24:115-18 (1992)）。
他の公知の抗糖尿病薬としては、インスリン調製物（例えば、ウシおよびブタの膵臓から抽出されるインスリン調製物；エシェリキア コリを用いて遺伝的に合成されたヒトインスリン調整物；亜鉛インスリン；プロタミン亜鉛インスリン；インスリンの断片または誘導体（例えば、ＩＮＳ−１）；経口インスリン調製物）、インスリン感作物質（例えば、ピオグリタゾンまたはこれらの塩（好ましくは塩酸塩）、ロシグリタゾンまたはこれらの塩（好ましくはマレイン酸塩）、ネトグリタゾン、リボグリタゾン（ＣＳ−０１１）、ＦＫ−６１４、国際公開第０１／３８３２５号パンフレットに記載の化合物、テサグリタザール（ＡＺ−２４２）、レガグリタザール（Ｎ，Ｎ−６２２）、ムラグリタザール（ＢＭＳ−２９８５８５）、エダグリタゾン（ＢＭ−１３−１２５８）、メタグリダセン（ＭＢＸ−１０２）、ナベグリタザール（ＬＹ−５１９８１８）、ＭＸ−６０５４、ＬＹ−５１０９２９、ＡＭＧ−１３１（Ｔ−１３１）、ＴＨＲ−０９２１）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、ボグリボース、アカルボース、ミグリトール、エミグリテートなど）、ビグアナイド（例えば、フェンフォルミン、メトフォルミン、ブフォルミンまたはこれらの塩（例えば、塩酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩））、インスリン分泌促進薬（スルフォニル尿素（例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリクラジド、クロプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリコピラミド、グリメピリド、グリピジド、グリブゾール）、レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニドまたはこれらのカルシウム塩水和物）、ジペプチジルペプチダーゼ ＩＶ阻害剤（例えば、ビダグリプチン（ＬＡＦ２３７）、Ｐ３２／９８、シタグリプチン（ＭＫ−４３１）、Ｐ９３／０１、ＰＴ−１００、サクサグリプチン（ＢＭＳ−４７７１１８）、Ｔ−６６６６、ＴＳ−０２１）、β３アゴニスト（例えば、ＡＪ−９６７７）、ＧＰＲ４０アゴニスト、グルカゴン様ポリペプチド（Ｉ）（ｇｌｐ Ｉ）、（ｇｌｐ ２）、もしくは他の糖尿病誘発ペプチドホルモン、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ＭＲ薬、Ｎ，Ｎ−２２１１、ＡＣ−２９９３（エキセジン−４）、ＢＩＭ−５１０７７、Ａｉｂ（８，３５）ｈＧＬＰ−１（７，３７）ＮＨ．ｓｕｂ．２、ＣＪＣ−［１３１］）、アミリンアゴニスト（例えば、プラムリンチド）、リン酸化チロシンホスファターゼ阻害剤（例えば、バナジウム酸ナトリウム）、糖新生阻害剤（例えば、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト）、ＳＧＬＵＴ（ナトリウム−グルコース共輸送体）阻害剤（例えば、Ｔ−１０９５）、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えば、ＢＶＴ−３４９８）、アジポネクチンもしくはこれらのアゴニスト、ＩＫＫ阻害剤（例えば、ＡＳ−２８６８）、レプチン耐性改善薬、ソマトスタチン受容体アゴニスト（国際公開第０１／２５２２８号パンフレット、国際公開第０３／４２２０４号パンフレット、国際公開第９８／４４９２１号パンフレット、国際公開第９８／４５２８５号パンフレット、国際公開第９９／２２７３．５号パンフレットなどに記載の化合物）、グルコキナーゼ活性化剤（例えば、Ｒ．ｓｕｐ．ｏ−２８−１６７５）、ＧＩＰ（グルコース依存インスリン分泌性ペプチド）などが挙げられる。
また、単独の、または他の好適な組成物との組合せの、非天然アミノ酸を備えるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、吸入を介して投与されるためのエアロゾル調合物（すなわち、それらは“霧状化”され得る）に作製され得る。エアロゾル調合物は、圧縮化可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、および窒素など）に配合され得る。
例えば、関節内（関節における）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下の経路といった、非経口投与に好適な調合物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および意図される受容物の血液と等張な調合物にさせる溶液を含有できる、水性および非水性の等張無菌注入溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。ＦＧＦ−２１の調合物は、容器（例えば、アンプルおよびバイアル）に密封された単回用量または多回用量において提供され得る。
非経口投与および静脈内投与は、投与の好ましい方法である。特に、天然アミノ酸相同物治療に関してすでに使用中の投与の経路（これらに限定されないが、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体、抗体断片、ＦＧＦおよび／または任意の他の薬学的送達タンパク質にとって使用される経路が挙げられる）が、現在使用中の調合物と共に、本発明のポリペプチドにとっての投与および調合物の好適な経路を提供する。
本発明に照らして、患者に投与される用量は、長期間に渡って患者に有益な治療応答または他の好適な活性を示すために十分な用途に依存する量である。用量は、特定のベクターもしくは調合物の有効性、および採用される非天然アミノ酸ポリペプチドの安定性もしくは血中半減期、および患者の状態、これらと同様に処置される患者の体重または表面積によって決定される。また、用量の大きさは、特定の患者における特定のベクター、または調合物などの投与に付随する任意の副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
疾患（これらに限定されないが、がん、遺伝疾患、糖尿病、またはＡＩＤＳなどが挙げられる）の処置または予防において投与されるベクターまたは調合物の有効量の決定において、医師は、循環血漿濃度、調合物の毒性、疾患の進行、および／または該当する場合に、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
例えば７０キログラムの患者に投与される用量は、現在使用されている治療タンパク質の用量と同等な範囲において、関連組成物の変更された活性または血中半減期に関して典型的に調節される。本発明のベクターまたは調合物は、従来公知の任意の治療（抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性物質の投与、天然アミノ酸ポリペプチドの投与、核酸の投与、ヌクレオチド類似物の投与、および生体反応調節因子の投与が挙げられる）による処置条件を補うことができる。
投与に関して、本発明の調合物は、関連調合物のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０よって、および／または患者の集団および全体的な健康状態に対して適用されるような（これが挙げられるが、限定されない）、種々の条件における非天然アミノ酸ポリペプチドの任意の副作用の観察によって、決定される割合において投与される。投与は、単回用量または分けられた用量を介して達成され得る。
調合物の注入を受ける患者が熱を出すか、寒気を覚えるか、または筋肉痛を覚える場合には、彼／彼女は、適量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、または他の痛覚／熱制御薬を受ける。注入に対する反作用（例えば、熱、筋肉痛、および悪寒）を経験する患者は、さらなる注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、または（これが挙げられるが、限定されない）ジフェンヒドラミンのいずれかを用いて前投与される。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤にすぐに反応しないひどい悪寒および筋肉痛に対して使用される。細胞注入は、反作用の重篤度に依存して速度を落とされるか、または中断される。
本発明のヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドは、哺乳類の対象に対して直接に投与され得る。投与は、対象に対するＦＧＦ−２１ポリペプチドの導入に通常に使用される経路のうちいずれかによる。本発明の実施形態に係るＦＧＦ−２１ポリペプチド組成物としては、経口、直腸、局所、吸入（これに限定されないが、エアロゾルを介した吸入が挙げられる）、頬側（これに限定されないが、舌下が挙げられる）、膣、非経口（これらに限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、間接内、胸膜内、腹腔内、大脳内、動脈内、胸膜内、または静脈内が挙げられる）、局所（すなわち、皮膚および気道の表面を含む粘膜の表面の両方）および経皮の投与に好適なそれらが挙げられるが、所定の場合のいずれかにおける最も好適な経路は、処置される性質および重篤度に依存する。投与は、局所的であるか、または全身性であるかのいずれかであり得る。化合物の調合物は、容器（例えば、アンプルおよびバイアル）に密閉された単回用量または多回用量に存在し得る。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、薬学的に受容可能な担体を伴った、単回用量の形態（これらに限定されないが、溶液、懸濁液、または乳液が挙げられる）における混合物に調製され得る。また、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、連続的な注入（これに限定されないが、浸透圧ポンプといったミニポンプを用いた注入が挙げられる）、単回の大量瞬時投与、または緩徐に放出する徐放性製剤調合物によって投与され得る。
投与に好適な調合物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および調合物に等張性を与える溶液を含有できる、水性および非水性の溶液、等張無菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および防腐剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。溶液および懸濁液は、これまでに記載したような、無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
凍結乾燥は、所定のタンパク質調製物から水を取り除く役割を果たす、タンパク質を提供する技術に通常に採用される。凍結乾燥（freeze-drying）、または凍結乾燥（lyophilization）は、乾燥される物質がまず凍結され、かつそれから氷または凍結した溶媒が真空条件における昇華によって除去される過程である。賦形剤が、凍結乾燥過程における安定性の上昇および／または保存状態における凍結乾燥産物の安定性の向上を目的として、凍結乾燥前の調合物に含められ得る。Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990)およびArakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)。
また、製薬の噴霧乾燥は、当業者に公知である。例えば、Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)を参照すればよい。小分子製薬に加えて、種々の生体物質は、噴霧乾燥されており、かつこれらとしては、酵素、血清、血漿、微生物および酵母が挙げられる。噴霧乾燥は、１段階の過程において液体の製薬調製物を高純度の粉末、ほこりのない粉末、または凝集粉に転換できるので、有用な技術である。基本的な技術は、以下の４つの段階：（ａ）供給溶液の水煙への霧状化；（ｂ）水煙−空気接触；（ｃ）水煙の乾燥；および（ｄ）乾燥空気からの乾燥産物の分離を包含する。言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２３５，７１０号明細書および米国特許第６，００１，８００号明細書には、噴霧乾燥による組換えエリスロポエチンの調製物に関して記載されている。
本発明の薬学的組成物および調合物は、薬学的に受容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を備え得る。薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物によって、これと同様に、組成物の投与に使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な好適な調合物（薬学的に受容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を任意に含む）がある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17thed. 1985）を参照すればよい）。
好適的な担体としては、これらに限定されないが、コハク酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸塩、重炭酸塩および他の有機酸を含有する緩衝液；抗酸化剤（これに限定されないが、アスコルビン酸が挙げられる）；低分子量ポリペプチド（これらに限定されないが、１０残基未満のそれらが挙げられる）；タンパク質（これらに限定されないが、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンが挙げられる）；親水性ポリマー（これに限定されないが、ポリビニルピロリドンが挙げられる）；アミノ酸（これらに限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジンもしくはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン酸塩、またはリジンが挙げられる）；単糖類、２糖類、他の糖（これらに限定されないが、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース、またはデキストリンが挙げられる）；キレート剤（これらに限定されないが、ＥＤＴＡおよびエデンテート（ｅｄｅｎｔａｔｅ）２ナトリウムが挙げられる）；２価の金属イオン（これらに限定されないが、亜鉛、コバルト、または銅が挙げられる）；糖アルコール（これらに限定されないが、マンニトールまたはソルビトールが挙げられる）；塩形成対イオン（これらに限定されないが、ナトリウムおよび塩化ナトリウムが挙げられる）；および／または非イオン性界面活性剤（これに限定されないが、トウィーン（Tween）（商標）（これらに限定されないが、トウィーン８０（ポリソルベート ８０）およびトウィーン２０（ポリソルベート ２０）、Pluronics（商標）および他のプルロン酸（これに限定されないが、および他のプルロン酸（これに限定されないが、プルロン酸 Ｆ８６（ポロオキサマー（poloxamaer）１８８）が挙げられる）が挙げられる）が挙げられる）、またはＰＥＧが挙げられる）が挙げられる。好適な界面活性剤としては、これらに限定されないが、例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（すなわち、（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ））、またはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）（すなわち、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ））、またはこれらの組合せに基づいたポリエーテルが挙げられる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、Ｒ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）およびＲ−Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）（ＢＡＳＦ Wyandotte Corp.、Wyandotte、Mich.）という商品名において市販されており、かつ言及によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２０，３５２号明細書にさらに記載されている。他のエチレン／プロピレンブロックポリマーは、好適な界面活性剤であり得る。界面活性剤または界面活性剤の組合せは、１つ以上の負荷（これに限定されないが、攪拌から生じる負荷が挙げられる）に対してＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１を安定化させるために、使用され得る。上述のうちのいくつかは、“充填剤”と呼ばれ得る。また、いくつかは、“強直性変更剤（tonicity modifier）”と呼ばれ得る。また、抗菌性防腐剤が、産物の安定性および抗菌有効性を目的として適用され得；防腐剤としては、これらに限定されないが、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、メタクレゾール、メチル／プロピル パラベン、クレゾール、およびフェノール、またはこれらの組合せが挙げられる。
また、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチド（これらに限定されないが、ＰＥＧといった水溶性ポリマーに対して連結されるそれらが挙げられる）は、徐放性の系の一部によってか、または一部として投与され得る。徐放性組成物としては、これに限定されないが、成形された品の形態（これらに限定されないが、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられる）における半透過性のポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性のマトリクスとしては、生体適合性材料から得られるもの（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982) ）、エチレンビニルアセテート（上述のLanger et al）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）、ポリラクチド（ポリ酪酸）（米国特許第３，７７３，９１９号明細書；欧州特許出願公開第５８，４８１号明細書）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド−コ−グリコリド（酪酸およびグリコリドの共ポリマー）のポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共ポリマー（Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983) ）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボキシル酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンならびにシリコン）が挙げられる。また、徐放性組成物は、リポソームに取り込まれる化合物が挙げられる。化合物を含有するリポソームは、それ自体が公知の方法によって調製される（独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書；Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；米国特許第４，６１９，７９４号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書；米国特許第５，０２１，２３４号明細書；日本国出願公開第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書および米国特許第４，５４４，５４５号明細書；および欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書）。引用された参考文献および特許文献のすべては、言及によって本明細書に組み込まれる。
リポソームに取り込まれたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、例えば、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書；Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；米国特許第４，６１９，７９４号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書；米国特許第５，０２１，２３４号明細書；日本国出願第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書および米国特許第４，５４４，５４５号明細書；および欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書に記載されている方法によって調製され得る。組成物およびリポソームの大きさは、公知であるか、または経験的に当業者によって容易に決定され得る。リポソームのいくつかの例が、例えば、Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995) ；Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): Medical Applications of Liposomes (1998)；Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): Cancer Drug Discovery and Development (2002)；Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002)；Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)に記載されている。引用された参考文献および特許文献のすべてが、言及によって本明細書に組み込まれる。
本発明に照らして、患者に対して投与される用量は、長期間に渡って対象において有益な応答を引き起こすに十分な量であるべきである。一般的に、投与ごとに非経口的に投与される、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療有効量の総計は、患者の体重の約０．０１ｕｇ／ｋｇ／日から約１００ｕｇ／ｋｇ／日まで。または約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から約１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、これは治療の自由裁量に従う。また、投与の頻度は、治療の自由裁量に従い、かつヒトにおける利用を承認されている、市販のＦＧＦ−２１ポリペプチド産物よりも、高い頻度であり得るか、または低い頻度であり得る。一般的に、本発明のＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上述の投与経路のうちのいずれかによって投与され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病薬の効果を調節する。本発明の他の実施形態において、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病薬とともに共投与され得る。本発明の他の実施形態において、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病薬を用いる処置の前に投与され得る。本発明の他の実施形態において、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病薬を用いる処置に続いて投与され得る。本発明の他の実施形態において、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、メトフォルミンと共投与され得る。本発明の他の実施形態において、本発明の修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドおよびメトフォルミンを用いた治療的処置によって、インスリンの存在または非存在において、血漿グルコースを調節するメトフォルミンの能力を増強させる。併用療法において、メトフォルミンは、スルフォニル尿素、α−グルコシダーゼ阻害剤、トログリタゾン、およびインスリンと共に使用され得る。スルフォニル尿素と組合せられたメトフォルミンは、インスリン感受性を増強させ、血漿グルコースを低下させ得る。この他に、レパグリニドをともなったメトフォルミンは、数ヶ月にわたる血糖制御の持続において、グリピジドより有効であり得、グリブリドよりも少なくとも有効であり得る。トログリタゾンをともなったメトフォルミンは、単独のいずれかの薬剤を上回ってグルコース制御を向上させる（Inzucchi et al., New. Eng. J. Med. 338:867-72 (1998)）。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、クロソβと共投与される。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上含んでいるクロソβと共投与される。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、クロソβおよび抗糖尿病薬と共投与される。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病薬と共投与される。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、以下のもの：タウリンα−リポ酸、クワの抽出物、クロム、グルタミン、エニコステンマ リットラーレ ブルーメ、スコパリア ドゥルシス、タラゴンの抽出物、およびアンドログラフィス パニクラータの１つ以上と共投与される。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、以下のもの：インスリン調製物（例えば、ウシおよびブタの膵臓から抽出されるインスリン調製物；エシェリキア コリを用いて遺伝的に合成されたヒトインスリン調整物；亜鉛インスリン；プロタミン亜鉛インスリン；インスリンの断片または誘導体（例えば、ＩＮＳ−１）；経口インスリン調製物）、インスリン感作物質（例えば、ピオグリタゾンまたはこれらの塩（好ましくは塩酸塩）、ロシグリタゾンまたはこれらの塩（好ましくはマレイン酸塩）、ネトグリタゾン、リボグリタゾン（ＣＳ−０１１）、ＦＫ−６１４、国際公開第０１／３８３２５号パンフレットに記載の化合物、テサグリタザール（ＡＺ−２４２）、レガグリタザール（Ｎ，Ｎ−６２２）、ムラグリタザール（ＢＭＳ−２９８５８５）、エダグリタゾン（ＢＭ−１３−１２５８）、メタグリダセン（ＭＢＸ−１０２）、ナベグリタザール（ＬＹ−５１９８１８）、ＭＸ−６０５４、ＬＹ−５１０９２９、ＡＭＧ−１３１（Ｔ−１３１）、ＴＨＲ−０９２１）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、ボグリボース、アカルボース、ミグリトール、エミグリテートなど）、ビグアナイド（例えば、フェンフォルミン、メトフォルミン、ブフォルミンまたはこれらの塩（例えば、塩酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩））、インスリン分泌促進薬（スルフォニル尿素（例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリクラジド、クロプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリコピラミド、グリメピリド、グリピジド、グリブゾール）、レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニドまたはこれらのカルシウム塩水和物）、ジペプチジルペプチダーゼ ＩＶ阻害剤（例えば、ビダグリプチン（ＬＡＦ２３７）、Ｐ３２／９８、シタグリプチン（ＭＫ−４３１）、Ｐ９３／０１、ＰＴ−１００、サクサグリプチン（ＢＭＳ−４７７１１８）、Ｔ−６６６６、ＴＳ−０２１）、β３アゴニスト（例えば、ＡＪ−９６７７）、ＧＰＲ４０アゴニスト、グルカゴン様ポリペプチド（Ｉ）（ｇｌｐ Ｉ）、（ｇｌｐ ２）、もしくは他の糖尿病誘発ペプチドホルモン、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ＭＲ薬、Ｎ，Ｎ−２２１１、ＡＣ−２９９３（エキセジン−４）、ＢＩＭ−５１０７７、Ａｉｂ（８，３５）ｈＧＬＰ−１（７，３７）ＮＨ．ｓｕｂ．２、ＣＪＣ−［１３１］）、アミリンアゴニスト（例えば、プラムリンチド）、リン酸化チロシンホスファターゼ阻害剤（例えば、バナジウム酸ナトリウム）、糖新生阻害剤（例えば、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト）、ＳＧＬＵＴ（ナトリウム−グルコース共輸送体）阻害剤（例えば、Ｔ−１０９５）、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えば、ＢＶＴ−３４９８）、アジポネクチンもしくはこれらのアゴニスト、ＩＫＫ阻害剤（例えば、ＡＳ−２８６８）、レプチン耐性改善薬、ソマトスタチン受容体アゴニスト（国際公開第０１／２５２２８号パンフレット、国際公開第０３／４２２０４号パンフレット、国際公開第９８／４４９２１号パンフレット、国際公開第９８／４５２８５号パンフレット、国際公開第９９／２２７３．５号パンフレットなどに記載の化合物）、グルコキナーゼ活性化剤（例えば、Ｒ．ｓｕｐ．ｏ−２８−１６７５）、ＧＩＰ（グルコース依存インスリン分泌性ペプチド）の１つ以上と組み合せて使用される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、インスリン増強作用剤との組合せにおいて使用される。インスリン増強作用剤としては、タウリンα−リポ酸、クワの抽出物、クロム、グルタミン、エニコステンマ リットラーレ ブルーメ、スコパリア ドゥルシス、タラゴンの抽出物、およびアンドログラフィス パニクラータが挙げられる。他の実施形態において、本発明は、インスリンの分泌または活性をさらに増強させるために、イソマルト、トレハロースまたはＤ−マンノースの１つ以上を備え得る。さらなる実施形態において、インスリン増強作用剤および本発明のポリペプチドは、他の抗糖尿病薬に加えて使用される。
ポリペプチドの治療有効製および本発明のポリペプチドを含む併用療法における一方向性は、患者のＨｂＡ１ｃレベルの低下によって決定され得る。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを用いる療法の開始から２ヶ月前のＨｂＡ１ｃレベルから、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを用いる療法の開始から３ヶ月前のＨｂＡ１ｃレベルから、または基準線から変化するパーセンテージとして、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％だけＨｂＡ１ｃレベルを低下させるか、少なくとも５０％変化させる。また、他の実施形態において、患者に投与される本発明のポリペプチドは、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを用いる療法の開始から２ヶ月前のＨｂＡ１ｃレベルから、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを用いる療法の開始から３ヶ月前のＨｂＡ１ｃレベルから、または基準線から変化するパーセンテージとして、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％だけＨｂＡ１ｃレベルを低下させるか、少なくとも５０％変化させる抗糖尿病薬とともに投与される。
他の実施形態において、本発明の修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、インスリンの必要量を低下させるトログリタゾンの能力を調節する。他の実施形態において、本発明の修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、トログリタゾンを用いて処置されている患者に投与される場合に、当該患者のインスリンの必要量をさらに低下させる。本発明と組み合せて使用されるトログリタゾンは、本発明のある実施形態における２型糖尿病を遅延または予防するために使用され得る。
１つの実施形態において、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、スルフォニル尿素と共投与される。本発明の他の実施形態において、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、スルフォニル尿素を用いた処置の前に投与される。本発明の他の実施形態において、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、スルフォニル尿素を用いた処置の後に投与される。本発明のいくつかの実施形態において、修飾されＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療量を用いた処置によって、血清グルコースが調節される。他の実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、血中グルコースに対するポリペプチドの影響を調節するクロソβとともに投与される。他の実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの単独使用よりも血中グルコースを低下させるクロソβとともに投与される。他の実施形態において、これらの変化はＨｂＡ１ｃ試験を用いて測定される。他の実施形態において、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドおよびクロソβは、抗糖尿病薬を用いて処置されている患者に投与されて、当該抗糖尿病薬の単独使用よりも血中グルコースを低下させる。
＜ＸＶ．本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的使用＞
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、広範な疾患の処置に有用である。
本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ：２型）、インスリン依存性糖尿病（１型）、この他に肥満症、不十分なグルコース除去、高血糖症、高インスリン血症、ＦＧＦ−２１におよび媒介され得る任意の他の疾患もしくは障害にかかっている動物を処置するために使用され得る。糖耐性障害は、グルコースに対する過剰な感受性と定義され得る。高血糖症は、血中における糖の過剰と定義される。高インスリン血症は、血中における通常よりも高濃度のインスリンと定義される。インスリン抵抗性は、通常量のインスリンが正常以下の生体応答を示す状態と定義される。ヒトの対象に関して肥満症は、所定の集団に関して理想の体重を２０％超えている体重と定義される（R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p.904-916）。
真性糖尿病は、臨床症状に基づいて２つの大きな群（すなわち、２型としても知られる、インスリン非依存性もしくは成人発症型の形態；および１型としても知られる、インスリン依存性もしくは若年発症型の形態）において特徴付けられる。臨床的に、２型の成人発症型糖尿病の大部分は、通常は４０歳を超えてから現れる疾患の臨床徴候の症状を有する肥満症である。これに対して、１型の若年発症型患者は、若年（しばしば３０歳まで）に疾患の急速な発症をともない、年齢および身長と比して体重過多ではない。しかし、１型糖尿病は任意の年齢において生じ得る。
真性糖尿病は、通常の集団においておおよそ１％の罹患率を有するヒトにおける代謝障害であり、このうちの４分の１が１型である（Foster, D. W., Harrison's Principles of Internal Medicine, Chap. 114, pp. 661-678, 10th Ed., McGraw-Hill, New York）。この疾患は、一連のホルモン誘導性の代謝系異常として現れ、種々の器官系（眼、腎臓、神経および血管）に関与する長期にわたる重篤な衰弱性の合併症を最終的に引き起こす。病理学的に、この疾患は、電子顕微鏡下における明らかになる基底膜の病変によって特徴付けられる。
インスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ：２型）は、グルコース、インスリンおよびコルチコイドが高レベルに血中を循環することによって特徴付けられる衰弱性の疾患である。２型糖尿病の発生率は、高くかつ上昇しており、全世界において死亡率、疾病率および保健医療の支出の主な原因になっている（(Amos et al., Diabetic Med. 14:S1- 85, 1997)）。
２型糖尿病の原因はよく分かっていない。２型糖尿病は、インスリンの有効性にもかかわらず過剰なグルコース産生によって特徴付けられ、かつ循環するグルコースレベルが、不十分なグルコース除去の結果として非常に高く維持される。インスリンの作用に対する標的組織の抵抗性および低下したインスリン分泌（“β細胞不全”）の両方が生じていると考えられる。グルコース恒常性に関する主要なインスリン応答性組織は、インスリンがグリコーゲン合成を刺激し、かつ糖新生を阻害する肝臓；インスリンがグルコース取り込みを刺激し、グリコーゲンがグルコース取り込みを刺激し、かつ脂肪分解を阻害する筋である。したがって、糖尿病性の障害の結果は、上昇した血中グルコース濃度、ならびに血管障害および神経障害を引き起こす長期にわたる高血糖である。
現在、２型糖尿病の処置に関して種々の薬理学的アプローチがある（Scheen et al., Diabetes Care, 22(9): 1568-1577, 1999）。それらは、以下の異なる作用様式：（１）スルフォニル尿素はインスリン分泌を基本的に刺激する；（２）ビグアナイド（メトフォルミン）は、グルコースの利用の促進、肝臓におけるグルコース産生の低減、および腸管によるグルコース産出の低下によって作用する；（３）α−グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ミグリトール）は、炭水化物の消化およびこれに続く消化管からの吸収を抑制し、かつ食後の高血糖を緩和する；（４）チアゾリジンジオン（トログリタゾン）はインスリン作用を増強して、末梢組織におけるグルコース利用を促進する；ならびに（５）インスリンは組織のグルコース利用を促進し、かつ腸管によるグルコース産生を抑制する、を介して作用する。上述の薬理学的アプローチは単独または併用療法において利用され得る。しかし、各アプローチは制限および副作用を有している。
肥満症は、現代社会において高い発生率を有し、かつ社会的な徴候だけでなく短い寿命および多くの医学的な問題（精神の軟化、皮膚病（例えば、感染）、静脈瘤、運動不耐性、真性糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧、高コレステロール血症、および冠状動脈性心臓病が挙げられる）と関連する慢性の疾患である（Rissanen et al., British Medical Journal, 301 : 835-837 (1990)）。
肥満症に関して存在する療法としては、標準的な食事療法および運動、非常な低カロリー食事療法、行動療法、食欲抑制剤、発熱剤、食物吸収阻害剤に関する薬物療法、機械装置（例えば、ジョーワイヤリング（jaw wiring）、ウエストコード（waist cords）およびバルーン）ならびに外科手術が挙げられる。
我々の社会における肥満症の高い発生率、および上述のようなそれらと関連する結果を考慮すると、肥満症の人間の体重減少に有用な見込みのある任意の治療薬は、彼らの健康に対して著しく有益な影響を有する。著しい副作用がなく肥満症の対象の総体重を彼らの理想体重に向かって低下させ、肥満症の対象の低下させた体重の維持を支援する薬物に対して、当該技術において必要性がある。
したがって、通常の、理想の体重に肥満症の対象の体重を戻すために有用な処置方式を提供することが好ましい。長期間にわたって低下した体重の維持をもたらす、肥満症に対する療法を提供することがさらに好ましい。
肥満症は、実験動物およびヒトにおいて、インスリン抵抗性および糖尿病と大いに関連性がある。実際に、肥満症およびインスリン抵抗性（後者は高インスリン血症もしくは高血糖症、または両方を伴って一般的に生じる）は、２型糖尿病の顕著な特徴である。さらに、２型糖尿病は２〜４倍の冠状動脈疾患の危険性に結びつく。これらの深刻な健康問題に対する１０年の研究にもかかわらず、肥満症およびインスリン抵抗性の病因はわかっていない。
１型糖尿病は、上昇したグルカゴンをともなって非常に低いか、または測定不能な血漿インスリンを特徴として示す。正確な病因があるにもかかわらず、１型の患者のほとんどは、患者自身の膵臓細胞を標的とする循環する抗体（インスリンに対する抗体、ランゲルハンス島細胞の細胞質に対する抗体および酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体が挙げられる）を有している。β細胞（インスリン産生細胞）を特異的に標的にする免疫応答は、１型糖尿病を引き起こす。β細胞がインスリンを分泌すると同時に、α細胞がグルカゴンを分泌するので、この特異性は上述の臨床像によって支持される。
１型糖尿病に対する現在の治療措置としては、。本来のインスリンの欠乏から生じる高血糖を最小化するための食事制限が挙げられる。インスリンの欠乏は、すなわちβ細胞が傷害された結果である。また、食事は、ホルモンの高血糖性の影響を抑えるためのインスリン投与に関して制限される。処置の形態がなんであっても、インスリンの非経口投与は、すべての１型糖尿病にとって必要である。このために“インスリン依存性”糖尿病という用語なのである。
したがって、利用可能な薬理学的アプローチよりも副作用の小さい２型糖尿病の有効的な治療法が必要である。さらに、インスリンに代わる有効な治療法が１型糖尿病の処置に有用であり得る。本発明は、末梢組織におけるグルコース取り込みを刺激し、末梢組織におけるインスリン感受性を増強させ、かつ２型糖尿病に対する現在の治療措置よりも小さい副作用を有する薬理療法を提供する。さらに、本発明は、１型糖尿病に対する代替可能な処置を提供する。さらに、本発明は、より速く効率的なグルコース利用によるエネルギー消費を増加させることによって肥満症の処置に有用である。
本発明は、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、糖耐性障害または高血糖症の１つ以上を示している哺乳類を処置する方法を提供する。当該方法は、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療有効量を上記哺乳類に投与する工程を包含している。
処置する方法は、上記動物において以下の改善：体脂肪の貯蔵量の低減、インスリン抵抗性の低下、高インスリン血糖症、糖耐性の向上、および高血糖症の緩和のうち少なくとも１つを十分に達成し得る。
他の局面において、本発明は家畜（これらに限定されないが、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウマなどが挙げられる）を処置する方法に関する。当該方法は、体脂肪の貯蔵量を低減させるために、ＦＧＦ−２１またはこれらのバリアントの有効量を投与する工程を包含している。特に動物が人間の食事の大部分を供給し、動物の脂肪は結果として人間において新規の脂肪貯蔵になり得るので、家畜における体脂肪の貯蔵量を長期間または持続的な基準において低減させることは、明らかに人間にとって相当な経済的利点である。
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２１）は、危篤状態の患者に関する病状を緩和し、かつ死亡率を低下させるために使用され得る。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０１７６６３１号明細書を参照すればよい。長期間にわたって集中的な看護を要する危篤状態の患者は、死亡の危険性および高い死亡率を有している。集中治療室（ＩＣＵ）に患者を入れる通常の原因は、感染性の発作および非感染性の病理的原因と関連する全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である。非感染性の病理的原因は、例えば、膵炎、虚血、多発外傷および組織の損傷、出血性ショック、ならびに免疫媒介性の組織損傷である。また、本発明は、感染性の発作および非感染性の病理的原因と関連する全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）にかかっている危篤状態の患者における病状を緩和し、かつ死亡率を低下させる方法を包含する。当該方法は、ＦＧＦ−２１の治療有効量を危篤状態の患者に投与する工程を包含している。ＳＩＲＳに関する障害の例としては、敗血症、膵炎、虚血、多発外傷および組織の損傷、出血性ショック、免疫媒介性の組織損傷、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、ショック、腎不全、ならびに多臓器機能障害（ＭＯＤＳ）が挙げられる。また、本発明は、呼吸困難に陥っている危篤状態の患者における病状を緩和し、かつ死亡率を低下させる方法を包含する。
ＳＩＲＳに多い合併症は、器官系の機能障害（急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、ショック、腎不全および多臓器機能障害（ＭＯＤＳ）、有害転帰の危険性を拡大する障害のすべてが挙げられる）の発生である。多くの専門化は、ある種の栄養支援が代謝の安定性の回復を助けるために危篤状態の患者にとって有益であると考えている一方において、そのような支援の有益さおよび特異性は、十分に制御された無作為の臨床試験が不足しているために、議論の余地を残している。
高血糖症およびインスリン抵抗性が栄養支援を受ける危篤状態の患者において通常であるので、いくつかのＩＣＵにおいて、供給を受ける危篤状態の患者における過剰の高血糖を処置するためにインスリンが投与される。実際に、最近の研究において、１デシリットルにつき１１０ｍｇ未満の濃度の血中グルコースを維持するために外因性のインスリンを使用することによって、糖尿病の既往歴の有無にかかわらず外科の集中治療室における危篤状態の患者に共通して、病状の緩和および死亡率の低下が実証されている（Van den Berghe, et al. N Engl J Med., 345(19):1359, 2001）。
本発明は、ＦＧＦ−２１の投与を介してこれらの危篤状態の患者において病状を緩和し、かつ死亡率を低下させる方法を包含する。本発明によって含まれる危篤状態の患者は、一般的に不安定な異化亢進状態にある。この不安定な代謝状態は、いくつかの栄養素に関連する欠乏症を引き起こし得る基質代謝の変化に起因する。一般的に脂肪および筋の酸化が促進される。
ＦＧＦ−２１の投与が病的状態および死亡率の危険性を低減し得る危篤状態の患者は、全身性炎症反応症候群または呼吸困難になっている患者であることが好ましい。病的状態の緩和は、危篤状態の患者が付加的な疾患、障害もしくは症状を生じる見込みを低減させること、または付加的な疾患、障害もしくは症状の重篤度を低減させることを意味する。例えば、病的状態の緩和は、菌血症もしくは敗血症または多臓器機能障害と関連する合併症の発生率の低下に相当し得る。
全身性炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ）は、多くの臨床症状と関連する炎症性過程を表す。全身性炎症性応答症候群としては、これらに限定されないが、以下の臨床症状：（１）３８℃以上の体温または３６℃以下の体温；（２）１分間につき９０回以上の心拍数；（３）１分間につき２０回以上の呼吸数によって示される頻呼吸、または３２ｍｍＨｇ未満のＰａＣｏ２によって示されるような呼吸亢進；ならびに（４）例えば１２０００／ｃｕ ｍｍ以上の数、４０００／ｃｕ ｍｍ未満の数、または１０％以上の好中球の存在といった白血球細胞数の変化の１つ以上が挙げられる。これらの生理的変化は、そのような異常性にとって知られている他の原因（例えば、化学療法、誘導された好中球低下症、および白血球減少症）がない状態の基準からの急激な変化を表している。
敗血症は、感染から生じるＳＩＲＳと定義される。非感染性のＳＩＲＳの病因としては、膵炎、虚血、多発外傷および組織の損傷（これらに限定されないが、挫滅および重度の熱傷が挙げられる）、出血性ショック、免疫媒介性の器官損傷、腫瘍壊死因子および他のサイトカインといった炎症過程の媒介物質の外来性投与が挙げられ得る。
敗血性ショックおよび多臓器機能障害は、ＩＣＵの環境における病的状態および死亡率に対して重要な原因をなしている。敗血症は、宿主防衛機構の一員（サイトカインネットワーク、白血球、および補体活性化経路が挙げられる）、および内細胞を含む凝固系／線溶系の活性化と関連し、かつこれに媒介される。多様な臓器の微小血管内における繊維素沈着と関連する血管内凝固症候群（ＤＩＣ）およびある度合いの他の消費性凝固障害は、敗血性／敗血症ショックの症状である。標的臓器に対する宿主防衛反応の下流効果は、多臓器機能障害（ＭＯＤＳ）の発生における主要な媒介因子であり、かつ敗血症、重度の敗血症およびショックによって併発する敗血症をともなって患者の予後不良の原因である。
呼吸困難は、患者がある種の肺の機能不全によって呼吸が困難になっている状態を示す。これらの患者は、酸素補給を用いた処置に抵抗性であり得るか、または抵抗性ではあり得ない種々の程度の低酸素症をしばしば示す。呼吸困難は、直接の肺障害によって肺機能が損なわれている患者に起こり得るか、または例えば一連の全身性過程における、直接の肺障害によって起こり得る。さらに、２次因子（例えば、慢性のアルコール中毒、慢性の肺疾患、および血清の低ｐＨ）の存在のような多素因疾患の存在によって、危険性が増大する。
直接の肺障害のいくつかの原因としては、肺炎、胃内容物の吸引、肺挫傷、脂肪塞栓、溺死の寸前、気道障害、高空、ならびに肺移植および肺塞栓摘出の後における再灌流肺水腫が挙げられる。直接の肺障害のいくつかの原因としては、ショックおよび多重の輸血をともなう敗血症、重度の外傷；心肺バイパス、薬剤の過剰な服用、急性膵炎、および血液生成物の輸血が挙げられる。
呼吸困難を引き起こすある種の肺障害は、肺性心として知られる症候群と関連している。これらの障害は、肺高血圧症と呼ばれる肺循環の昇圧を生じる慢性の低酸素症と関連している。肺高血圧症になると右心室の仕事量が増大して、拡大または肥大を引き起こす。肺性心は、右心室圧の持続的な増大、および右心室への静脈還流の低下という臨床徴候によって規定される右心室不全と一般的に表す。
また、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（肺気腫および慢性気管支炎が挙げられる）は、呼吸困難を引き起こし、かつ空気循環の妨害によって特徴付けられる。ＣＯＰＤは、第４位の死因であり、毎年１０００００人を超える命を奪っている。
急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）は、一般的に進行性であり、かつ異なる段階によって特徴付けられている。この症候群は、この障害に関する危険因子を有する患者において呼吸不全の急性の発症によって一般的に現れる。酸素補給を用いた処置に対して抵抗性の動脈の低酸素症が固有の特徴である。独立していない肺の区画に生じる肺胞の詰り、硬化、およびアテレクターゼを生じ得る。しかし、独立した領域にはかなりの炎症が生じ得る。この症候群は、持続性の低酸素症、肺胞の死腔の増加、およびさらなる肺疾患の併発をともなう線維化性肺胞炎に進行し得る。また、肺毛細管床に対する損傷から生じる肺高血圧症が発生し得る。
臨床的な肺損傷の重篤度は変化する。低い重篤度の低酸素症の患者およびより重篤な低酸素症の患者の両方が、本発明によって包含される。低い重篤度の低酸素症の患者は、吸気された酸素の画分に対する動脈酸素の分圧の割合が３００以下によって規定される。より重篤な低酸素症の患者は、吸気された酸素の画分に対する動脈酸素の分圧の割合が２００以下によって規定される。一般的に、３００以下の割合によって規定される患者は急性の肺損傷を有すると分類され、かつ２００以下の割合を有する患者は急性呼吸不全症候群にかかっていると分類される。
急性肺障害の急性期は、肺胞毛細管障壁における血管透過性の増大の結果として、タンパク質を豊富に含む水腫液の気室に対する流入によって特徴付けられる。透過性が変化する内皮の統合性の低下は、肺胞における出血を引き起こし得、肺胞空間からの水腫液の除去に影響を及ぼす通常の液体輸送を妨げ得、表面活性物質の産生および代謝回転を低下させ得、細菌性肺炎患者において敗血性ショックを引き起こし得、かつ繊維症の原因になり得る。敗血症は、急性肺障害への進行の最も高い危険性と関連している。
異化亢進を生じる敗血症といった障害において、糖新生を維持し、かつ増加したタンパク質合成に要求されるアミノ酸を遊離させるためにタンパク質分解が促進される。高血糖症が生じ得、かつ血清中に高濃度のトリグリセリドおよび他の脂質が生じ得る。
呼吸機能に障害を有する患者に関して、異化亢進は酸素消費に対する２酸化炭素の割合に影響し得る。これは、呼吸商（Ｒ／Ｑ）として知られており、かつ通常の個体において約０．８５から０．９０の間である。過剰の脂質代謝ｈ、Ｒ／Ｑを低下させる傾向を有する。一方、過剰のグルコース代謝はＲ／Ｑを上昇させる。呼吸困難の患者は、２酸化炭素の排除がしばしば困難になるため、異常に高い呼吸商を有する。
また、本発明に包含される危篤状態の患者は、ほとんどの細胞生成物の一過性の下方制御および熱ショックタンパク質の上方制御によって特徴付けられる、特定のストレス応答に陥っている。さらに、このストレス応答は、ホルモン（例えば、グルカゴン、成長ホルモン、コルチゾール、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカイン）の活性化に関与する。このストレス応答は、防御的機能を有するように見える一方において、当該応答はこれらの危篤状態の患者において付加的な代謝の不安定性を生じる。例えば、これらの特定のホルモンの活性化は、血清グルコースの上昇引き起こして、高血糖症をを生じる。さらに、心臓および他の臓器に対する損傷が、アドレナリン作用性刺激によって悪化され得る。さらに、甲状腺に変化を生じさせて、代謝活性に重大な影響をもたらし得る。
ＦＧＦ−２１の平均量は、変化し得、かつ特に有資格医師の推奨および処方に基づくべきである。ＦＧＦ−２１の正確な量は、処置される障害、処置される患者の状態、および組成物における他の成分の正確な種類のような要因に影響を受ける優先度の問題である。また、本発明は他の活性薬の治療有効量の投与を提供する。投与されるべき量は、ＦＧＦ−２１を用いた療法に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
本発明の薬学的組成物は、従来の手法において製造され得る。
以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、請求される発明を限定するものではない。
（実施例１）
本実施例は、への天然にコードされていないアミノ酸のＦＧＦ−２１に対する組み込み部位の選択にとって、多くの見込まれる一組の基準の１つを説明する。
図１は、ベクターＮＴＩ（インビトロジェン；チャールズバッド、ＣＡ）を用いて決定されるような、ＦＧＦ−２１（タンパク質受入番号 ＢＣ０１８４０４）とＦＧＦ−１９（タンパク質受入番号 ＢＡＡ７５５００）との間における配列相同性を示している。アスタリスクを用いて印を付けられているアミノ酸は、２つの分子の間における類似である。下線が付されているアミノ酸は２つのポリペプチドの間において同一である。天然にコードされるアミノ酸を天然にコードされていないアミノ酸に置換することによって、７つの異なるＦＧＦ−２１ポリペプチドが生成された。各ポリペプチドは、図１において四角を用いて印をつけた、パラ−アセチルフェニルアラニンに置換されたアミノ酸の１つを有していた。生成されたポリペプチドは、図１および図３に示されるリーダー配列を欠いており、かつ６つのヒスチジン残基を用いてＮ末端にＨｉｓタグが付けられた。配列番号１はリーダー配列なしのヒトＦＧＦ−２１（Ｐフォーム）のアミノ酸配列である。配列番号１はリーダー配列なし、Ｎ末端にＨｉｓタグつきのヒトＦＧＦ−２１（Ｐフォーム）のアミノ酸配列である。生成されたポリペプチドのそれぞれは、配列番号１の１０位、５２位、７７位、１２６位、１３１位および１６２位の１つに天然にコードされていないアミノ酸を有していた。
図２は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）（Bernstein et al. J MoI. Biol. 1997, 112, pp 535）（１ＰＷＡ）から取得されたヒトＦＧＦ−１９の構造を示しており、かつＰｙＭＯＬソフトウェア（DeLano Scientific; Palo Alto, CA）を用いて標識された。ＦＧＦ−１９のＶ３４、Ｌ７９、Ｇ１０４、Ｓ１４４、Ｋ１５５、Ｌ１６０およびＳ１９６に対応するアミノ酸が本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドにおいてパラ−アセチルフェニルアラニンと置換された。破線は元の構造において解明されなかった領域を示している。
図３は、ベクターＮＴＩ（インビトロジェン；チャールズバッド、ＣＡ）を用いて決定されるような、ＦＧＦ−２１（タンパク質受入番号 ＢＣ０１８４０４）とＦＧＦ−２（タンパク質受入番号 ＢＡＡ７５５００）との間における配列相同性を示している。アスタリスクを用いて印を付けられているアミノ酸は、２つの分子の間における類似である。下線が付されているアミノ酸は２つのポリペプチドの間において同一である。また、置換用の部位として図１に示されている７つのアミノ酸は図３において四角に囲まれている。
図４は、ＰＤＢ（１ＣＶＳ）から得られたヒトＦＧＦ−２の構造を示しており、かつＰｙＭＯＬソフトウェア（DeLano Scientific; Palo Alto, CA）を用いて標識された。グレイの構造はヒトＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ１）であり、かつ黒はヒトＦＧＦ２である。Plotnikov, AN et al. Cell. 1999 Sep 3;98(5):641-50 にはＦＧＦ受容体と結合したＦＧＦ２の結晶構造について記載されている。ＦＧＦ−２のＦ２１、Ｋ６２、Ｋ８６、Ｖ１２５、Ｋ１３４、Ｔ１３９に対応するアミノ酸は、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドにおいてパラ−セチルフェニルアラニンと置換された。破線は元の構造において解明されなかった領域を示している。
天然にコードされていないアミノ酸の組み込みに好ましい部位を選択するための他の基準の一組は以下のとおりである。タンパク質データバンクからの１０の結晶構造がＦＧＦ−２１の構造をモデル化するため使用された。１０の結晶構造は、１ＰＷＡ（ヒトＦＧＦ−１９）、１ＩＴＪ（ヒトＦＧＦ−４）、１ＮＵＮ（ヒトＦＧＦ１０−ＦＧＦ受容体２ｂ複合体）、１Ｇ８２（ＦＧＦ受容体およびヘパリンを有するヒトＦＧＦ−９ダイマー）、１ＩＨＫ（ヒトＦＧＦ−９）、１ＢＡＲ（ウシＦＧＦ−１）、１ＱＱＫ（ラットＦＧＦ−７）、１Ｋ５Ｕ（ヒトＦＧＦ−１）、１ＦＱ９（ＦＧＦ受容体およびヘパリンを有するヒトＦＧＦ−２）および２ＦＤＢ（ＦＧＦ受容体２ｃを有するヒトＦＧＦ−８ｂ）である。これらの構造にとって同等のものは、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）（Bernstein et al. J. MoI. Biol. 1997, 112, pp 535）から利用可能である。結晶構造の比較によって、それらが主要な構造においてすべて非常に類似であることが示された、しかし、Ｎ末端およびＣ末端において、これらのＦＧＦ分子の間において大きく多岐にわたることが見出され、したがって末端はモデル化できなかった。モデリングによって、２つの残基Ｙ２２およびＹ１０４が同定された。２つの残基は高度に保存され、かつ受容体結合に関与していた。また、２つの見込みのあるヘパリン結合部位Ｒ３６およびＥ３７が同定された。アミノ酸位置は、配列番号１と対応する受容体結合部位およびヘパリン結合部位に関して同定された。
その結果、（１）ＦＧＦ受容体またはヘパリンとの結合に干渉しない残基、（２）タンパク質の内部に存在しない残基、および（３）結晶構造の間において完全に一致した領域にある残基が同定された。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、これらに限定されないが、ＦＧＦ−２１の以下の位置：８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、これらに限定されないが、ＦＧＦ−２１の以下の位置：８７位、７７位、８３位、７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、これらに限定されないが、ＦＧＦ−２１の以下の位置：６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上に組み込まれる。
以下の基準は、天然にコードされていないアミノ酸の導入に適したＦＧＦ−２１の各部位を評価するために使用された。（ａ）構造解析に基づいてＦＧＦ−２１受容体の結合に干渉しない残基、（ｂ）アラニンスキャニング変異生成または相同性スキャニング変異生成によって影響されない残基、（ｃ）表面に露出しており、周囲の残基と最小のファンデルワールス相互作用または水素結合相互作用を示す残基、（ｄ）ＦＧＦ−２１バリアントにおいて欠失されているか、または可変である残基、（ｅ）天然にコードされていないアミノ酸を用いた置換によって保存的な変化を生じる残基、ならびに（ｆ）自由度の高い領域または構造的に堅固な領域のいずれかに見られる残基。
また、ＦＧＦファミリーの一員に関する付加的な構造または異なる構造（例えば、ＦＧＦ−２３および／またはＦＧＦ−１９の構造）は、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上をＦＧＦ−２１に組み込む部位を選択すために使用され得る。例えば、ヒトＦＧＦ−１９（ＰＤＢ ＩＤ ２Ｐ２３）の結晶構造、および／またはヒトＦＧＦ−１９（ＰＤＢ ＩＤ ２Ｐ２３）および／またはヒトＦＧＦ−２３（ＰＤＢ ＩＤ ２Ｐ３９）の結晶構造によって、天然にコードされていないアミノ酸をＦＧＦ−２１に組み込む部位を選択するために付加的な情報が提供され得る。そのような部位は、タンパク質の異なる領域（これらに限定されないが、Ｎ末端、Ｃ末端、受容体結合部位およびヘパリン結合部位が挙げられる）にあり得る。さらに、さらなる演算が、各タンパク質原子にとって突出の限度を評価するためのＣｘプログラム（Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18, pp 980）を用いて、ＦＧＦ−２１分子に対して実施され得る。
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：１０位、５２位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：１０位、５２位、７７位、１１７位、１２６位、１３１位、および１６２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：８７位、７７位、８３位、７２位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上は、ＦＧＦ−２１における以下の位置：６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、および１１０位（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上に組み込まれる。
（実施例２）
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドのＥ． ｃｏｉｌにおけるクローニングおよび発現の詳細について説明する。また、本実施例は、修飾されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物活性を評価する１つの方法について説明する。
ＦＧＦ−２１をクローニングする方法は当業者に公知である。ＦＧＦ−２１に関するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列、ならびに宿主細胞に対するＦＧＦ−２１のクローニングについて、その全体が参照によって本明細書組み込まれる、米国特許第６，７１６，６２６号明細書；米国特許出願公開第２００５／０１７６６３１号明細書、米国特許出願公開第２００５／００３７４５７号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１８５４９４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０２５９７８０号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１６４７１３号明細書、および米国特許出願公開第２００１／００１２６２８；国際公開第０１／３６６４０号パンフレット；国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット；国際公開第０３／０５９２７０号パンフレット；国際公開第０４／１１０４７２号パンフレット；国際公開第０５／０６１７１２号パンフレット；国際公開第０５／０７２７６９号パンフレット；国際公開第０５／０９１９４４号パンフレット；国際公開第０５／１１３６０６号パンフレット；国際公開第０６／０２８５９５号パンフレット；国際公開第０６／０２８７１４号パンフレット；国際公開第０６／０５０２４７号パンフレット；国際公開第０６／０６５５８２号パンフレット；国際公開第０６／０７８４６３号パンフレットに詳細に説明されている。
リーダー配列なしのＦＧＦ−２１のＰフォームをコードするｃＤＮＡは、配列番号８に示されている。このポリペプチドは配列番号１に示されている。
リーダー配列なしのＨｉｓタグつきＦＧＦ−２１のＰフォームをコードするｃＤＮＡは、配列番号９に示されている。このポリペプチドは配列番号２に示されている。
３つのロイシンをともに含有しているリーダー配列ありのＦＧＦ−２１のＰフォームをコードするｃＤＮＡは、配列番号１０に示されている。このポリペプチドは配列番号３に示されている。
２つのロイシンをともに含有しているリーダー配列ありのＦＧＦ−２１のＰフォームをコードするｃＤＮＡは、配列番号１１に示されている。このポリペプチドは配列番号４に示されている。
リーダー配列ありのＦＧＦ−２１のＬフォームをコードするｃＤＮＡは、配列番号１２に示されている。このポリペプチドは配列番号５に示されている。
３つのロイシンをともに含有しているリーダー配列ありのＦＧＦ−２１のＬフォームをコードするｃＤＮＡは、配列番号１３に示されている。このポリペプチドは配列番号６に示されている。
２つのロイシンをともに含有しているリーダー配列ありのＦＧＦ−２１のＬフォームをコードするｃＤＮＡは、配列番号１４に示されている。このポリペプチドは配列番号７に示されている。
直交性のｔ−ＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる導入された翻訳系は、天然にコードされていないアミノ酸を含有するＦＧＦ−２１を発現するために使用される。Ｏ−ＲＳは、天然にコードされていないアミノ酸とともにＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する。翻訳系は、コードされるセレクターコドンに応じて、天然にコードされていないアミノ酸をＦＧＦ−２１に順々に挿入する。好適なＯ−ＲＳ配列およびＯ−ｔＲＮＡ配列は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００６／０６８８０２号パンフレット（発明の名称“Compositions of Aminoacyl- tRNA Synthetase and Uses Thereof”）（Ｅ９；配列番号１５）および国際公開第２００７／０２１２９７号パンフレット（発明の名称“Compositions of tRNA and Uses Thereof ”）（Ｆ１３；配列番号１６）に記載されている。
Figure 2020018314
修飾されたＦＧＦ−２１遺伝子および直交性のアミノアシルｔＲＮＡ／ｔＲＮＡ対（所望の天然にコードされていないアミノ酸に対して特異的な）を含んでいるプラスミドを用いたＥ． ｃｏｉｌの形質転換は、天然にコードされていないアミノ酸のＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する部位特異的な組み込みを可能にする。
野性体の成熟ＦＧＦ−２１は、健康なヒトの肝臓のポリＡ＋ｍＲＮＡ（バイオチェイン）から得られるｃＤＮＡ合成反応からＰＣＲによって標準的な手順を用いて増幅され、かつｐＥＴ３０（ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ）にクローン化された。配列確認に続いて、Ｎ末端にＨＨＨＨＨＨＳＧＧ配列を含むＦＧＦ−２１が、サプレッションベクターにサブクローニングされた。サプレッションベクターは、Ｅ． ｃｏｉｌリポタンパク質プロモータ配列（Miller, J.H., Gene, 1986）に由来する合成プロモータの構成的な制御下にあるメタノコッカス ジャナスキー（Ｍｉ ｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ）に由来するアンバーサプレッサチロシルｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ、およびＥ． ｃｏｉｌのＧｌｎＲＳプロモータの制御下にある直交性のチロシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）を含んでいる。アンバー変異はクイックチェンジ変異生成手順（ストラタジーン；ラ ホーヤ、カリフォルニア）を用いて導入された。すべての構築物は確認済の配列であった。
パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）を用いた抑制
プラスミド（ｐＶＫ３−ＨｉｓＦＧＦ２１）は、Ｅ． ｃｏｉｌのＷ３１１０ Ｂ２株に形質導入された。当該プラスミドにおいて、Ｔ７ポリメラーゼの発現がラビノース誘導性プロモータの制御下にある。一昼夜培養した細菌培養物は、２Ｘ ＹＴ培養培地が入っている振とうフラスコにおいて１：１００に希釈され、ＯＤ６００が０．８になるまで３７℃において培養された。タンパク質発現は、アラビノース（最終濃度０．２％）および最終濃度が４ｍＭのパラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）の添加によって誘導された。培養物は、３７℃において４時間にわたってインキュベートされた。細胞はペレット化され、１００μｌ／ＯＤ／ｍｌのＢ−ＰＥＲ溶解緩衝液（ピアス）および１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅに再懸濁され、３７℃において３０分間にわたってインキュベートされた。細胞性物質は、遠心分離によって除去され、上清が除去された。ペレットは等量のＳＤＳタンパク質ローディング緩衝液に再懸濁された。すべてのサンプルは、ＭＥＳおよびＤＴＴを有する４〜１２％のＰＡＧＥゲルにロードされた。ＦＧＦ−２１の精製方法は、当業者に公知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、またはエレクトロスプレーイオン化質量分析などによって確認される。
Ｎ末端にＨｉｓタグをつけたＦＧＦ−２１の発現および７つのアンバー部位における抑制について図５に示されている。ＦＧＦ−２１ポリペプチドには矢印によって印が付けられている。図５は、Ｂ−ＰＥＲサンプル−レーン１：マーカー；レーン２：ＶＫ３−ＦＧＦ２１（誘導前、上清）；レーン３：ＶＫ３−ＦＧＦ２１（誘導前、ペレット）；レーン４：ＶＫ３−ＦＧＦ２１（０．２％アラビノース、ペレット）；レーン５：ＶＫ３−ＦＧＦ２１（０．２％アラビノース、上清）；レーン６：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｌ１０（０．２％アラビノース）；レーン７：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｌ５２（０．２％アラビノース）；レーン８：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｒ７７（０．２％アラビノース）；レーン９：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｈ１１７（０．２％アラビノース）；レーン１０：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｒ１２６（０．２％アラビノース）；レーン１１：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｒ１３１（０．２％アラビノース）；レーン１２：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｓ１６２（０．２％アラビノース）を示している。アミノ酸置換について表示した位置番号は、配列番号１に基づいている。
図６は、Ｂ−ＰＥＲ上清サンプル−レーン１：ＶＫ３−ＦＧＦ２１（誘導前、上清）；レーン２：ＶＫ３−ＦＧＦ２１（誘導前、ペレット）；レーン３：マーカー；レーン４：ＶＫ３−ＦＧＦ２１（０．２％アラビノース、上清）；レーン５：ＶＫ３−ＦＧＦ２１（０．２％アラビノース、ペレット）；レーン６：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｌ１０（０．２％アラビノース）；レーン７：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｌ５２（０．２％アラビノース）；レーン８：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｒ７７（０．２％アラビノース）；レーン９：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｈ１１７（０．２％アラビノース）；レーン１０：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｒ１２６（０．２％アラビノース）；レーン１１：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｒ１３１（０．２％アラビノース）；レーン１２：ＶＫ３−ＦＧＦ２１−ｐＡｃＦ−Ｓ１６２（０．２％アラビノース）を示している。アミノ酸置換について表示した位置番号は、配列番号１に基づいている。
Ｈｉｓタグつきの変異体ＦＧＦ−２１タンパク質は、当業者に公知の方法を用いて精製され得る。ＰｒｏＢｏｎｄ Ｎｉｃｋｅｌ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（インビトロジェン、チャールズバッド、ＣＡ）は、製造者によって提供された標準的なＨｉｓタグつきタンパク質の精製手法を介して使用され得る。
ｐＶＫ１０（図２４）は、図２５に示される配列を有するタグつきＦＧＦ−２１タンパク質とともに使用するために構築された。これは、Ｒ３６ａｍ変異体およびＹ８３ａｍ変異体を作製するために使用されるベクターであり、本実施例において後述されるＨｉｓタグなしのＦＧＦ−２１変異体タンパク質およびこれらの精製についてのさらなるデータがあり、かつ図面を介して示されている。
３Ｔ３−Ｌ１の脂肪細胞への分化およびグルコース取り込みアッセイ
ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物活性を定量するために、以下のアッセイが実施され得る。マウス３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＬ−１７３）は、１０％のウシ血清を含有するＤＭＥＭを入れた１０ｃｍディッシュに播種される。細胞は、７０％を超えて広がらない密度に保たれた。脂肪細胞への分化を開始するまでに、細胞は１００％の密集状態にされた（培地は２日ごとに交換されている）。細胞はカウントされて、９６ウェル／プレートに対して２５０００細胞／ウェルにおいて播かれ（また、細胞はＣｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ９６ウェル／プレートに播かれる）、さらに４８時間にわたってインキュベートされる。分化は、培養培地を除去した後に以下の培地：１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１μｌのデキサメタゾン（ＤＢＸ）、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）および０．５μｇ／ｍＬのインスリンを補ったＤＭＥＭを添加することによって誘導される。分化を誘導する他の方法は、１μＭのロシグリタゾンを用いて細胞を処理し、かつ６日間にわたってインキュベートしてから１０％のＦＢＳのＤＭＥＭに培地を交換する。この方法は、脂肪細胞に分化させるために３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞を誘導するより速い方法だからである。３つめの方法は、分化の時間を短縮させるために２つの手法を組み合せることである。
ＤＢＸ／ＩＢＭＸ／インスリン含有培地を細胞に加えた後に、細胞は４８時間にわたってインキュベートされる。培地が１０％のＦＢＳ／５μｌ／ｍＬのインスリンを含むＤＭＥＭに交換され、細胞が４８時間にわたってインキュベートされる。この後に、地が１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに交換され、培地は２日ごとに新しい培地に置き換えられる。細胞は４〜７日の間に分化する。分化した細胞は脂質滴を蓄積する。細胞はＯＩＬ ＲＥＤ Ｏを用いて染色され得る。９５％の脂肪細胞が脂質滴を含有すると、細胞はグルコース取り込みアッセイに使用される。
分化した３Ｔ３−Ｌ１は、０．１％の脂肪酸を補ったＦＢＳなしのＤＭＥＭに入れたＦＧＦ−２１（１μｇ／ｍＬ）を用いて１８時間にわたって処理されて、細胞を飢餓状態にする。それから、細胞は、０．１％のＦＡＦ−ＢＳＡを補ったクレブス−リンガー ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＫＲＨ＝０．１１８ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２．５４ｍＭのＣａＣｌ２、０．１９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ３、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）を用いて３回にわたって洗浄される。標識混合物は、０．１％のＦＡＦ−ＢＳＡのＫＨＲ緩衝液に４μＣｉ、０．１ｍＭの２−デオキシＤ−［１−３Ｈ］−グルコースを加えることによって調製される。細胞が加えられて、１時間にわたって３７℃においてインキュベートされる。反応は、２０μＭのサイトカラシン Ｂを含む氷冷したＰＢＳを用いて２回にわたって細胞を洗浄することによって停止される。プレートにいくらか残っている緩衝液を吸い取って除去する。シンチレーション液が各ウェルに加えられて、サンプルはＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒにおいてカウントされる。
グルコース取り込みを測定する他の方法は、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に２−ＮＢＤＧといった非放射性の基質を取り込ませて、蛍光プレートリーダーを用いて読み取ることことである。グルコース取り込みを測定する間接的な手法は、細胞表面におけるＧＬＵＴ１またはＧＬＵＴ４の発現を測定することである。ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４は、インスリン刺激またはＦＧＦ−２１刺激によって内部小胞から細胞表面に移動するグルコース輸送体である。生細胞に対するＥＬＩＳＡが構築され得る。
（実施例３）
本実施例において、カルボニル含有アミノ酸の導入および続くアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応について詳述する。
本実施例において、ケトン含有の天然にコードされていないアミノ酸を組み込んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを生成する方法を示す。当該天然にコードされていないアミノ酸は、後におおよそ５０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させられる。１位より前（すなわちＮ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２対応するのアミノ酸）における残基のぞれぞれは、以下の構造：
Figure 2020018314
を有する天然にコードされていないアミノ酸と個々に置換される。
ｐ−アセチル−フェニルアラニンのＦＧＦ−２１に対する部位特異的組み込み利用される配列は、上述の実施例２に記載の配列番号１（ＦＧＦ−２１）、配列番号１６もしくは１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー ｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、および配列番号１５、２９、３０もしくは３１（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５または６）である。
修飾を受けると、カルボニル含有アミノ酸を備えているＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントは、以下の形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは３であり、Ｎはおよそ５０００ＭＷである）
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させられる。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製ＦＧＦ−２１は、２５ｍＭのＭＥＳ（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ） ｐＨ６．０、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ） ｐＨ７．０、または酢酸ナトリウム（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ） ｐＨ４．５において、１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解される。溶解された精製ＦＧＦ−２１は、１０〜１００倍量のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させられ、それから１０〜１６時間にわたって室温において攪拌される（Jencks位、W. J Am. Chem. Soc. 1959位、81位、pp 475）。それから、ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１は、直後の精製および分析にとって適切な緩衝液に希釈される。
（実施例４）
アミド結合を介してＰＥＧに連結されているヒドロキシアミン基からなる、ＰＥＧとの接合。
以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒ＝メチル、ｎ＝４、Ｎ＝およそ２００００ＭＷ）
を有するＰＥＧ試薬は、実施例３に記載の手法を用いてケトンを含有する天然にコードされていないアミノ酸と結合される。反応、精製および分析の条件は実施例３に記載のとおりである。
（実施例５）
本実施例において、２つの異なる天然にコードされていないアミノ酸のＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する導入について詳述する。
本実施例は、ケトン反応性基を備えている天然にコードされていないアミノ酸を２つ以上の位置に組み込んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドの生成方法を示す。天然にコードされていないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける以下の残基：１位より前（すなわちＮ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２の対応するアミノ酸）のうち２つ以上の位置に組み込まれている。セレクターコドンが核酸内の２つの異なる部位に導入されていることを除いて、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは実施例１および２に記載のとおりに調製される。
（実施例６）
本実施例において、ヒドラジド含有ＰＥＧに対するＦＧＦ−２１ポリペプチドの接合および続くインシチュ還元について詳述する。
カルボニル含有アミノ酸を組み込んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドは、実施例２および３に記載の手法にしたがって調製される。修飾を受けると、以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒ＝メチル、ｎ＝２、Ｎ＝１００００ＭＷ、Ｘ＝カルボニル（Ｃ＝Ｏ）基）
を有するヒドラジド含有ＰＥＧは、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して接合される。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製ＦＧＦ−２１は、２５ｍＭのＭＥＳ（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ） ｐＨ６．０、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ） ｐＨ７．０、または酢酸ナトリウム（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ） ｐＨ４．５において、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解される。溶解された精製ＦＧＦ−２１は、１〜１００倍量のヒドラジド含有ＰＥＧと反応させられる。対応するヒドラゾンは、１ＭのＮａＣＭＢＨ３ストック（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）（１０〜５０ｍＭの最終濃度まで水に溶解される）の添加によって、インシチュにおいて還元される。反応は、Ｔｒｉｓの最終濃度が５０ｍＭになるまで、約ｐＨ７．６において１ＭのＴｒｉｓ（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）を添加すること、または直後の精製にとって適切な緩衝液に希釈されることによって停止させられる。
（実施例７）
本実施例において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対するアルキン含有アミノ酸の導入およびｍＰＥＧ−アジドとの誘導体化について詳述する。
以下の残基：１位より前（すなわちＮ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２の対応するアミノ酸）は、以下の天然にコードされていないアミノ酸：
Figure 2020018314
を用いてそれぞれ置換される。
ｐ−プロパルギル−チロシンのＦＧＦ−２１に対する部位特異的組み込み利用される配列は、上述の実施例２に記載の配列番号１（ＦＧＦ−２１）、配列番号１６もしくは１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー ｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、および配列番号２２、２３もしくは２４である。プロパルギルチロシンを含有するＦＧＦ−２１ポリペプチドはＥ． ｃｏｉｌにおいて発現され、実施例３に記載の条件を用いて精製される。
プロパルギルチロシンを含有するＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＰＢ緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝８）において０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解される。そして、１０〜１００倍量のアジド含有ＰＥＧが反応混合物に加えられる。それから、触媒量のＣｕＳＯ４およびＣｕワイヤが反応混合物に加えられる。混合物がインキュベート（これらに限定されないが、室温もしくは３７℃において約４時間、または４℃における一昼夜のインキュベートが挙げられる）された後に、Ｈ２Ｏが加えられ、かつ混合物は透析膜を通してろ過される。これらに限定されないが、実施例３に記載の類似の手法によって、サンプルは付加に関して分析され得る。
本実施例において、ＰＥＧは、以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、かつＮは１００００ＷＭである）
を有している。
（実施例８）
本実施例において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける巨大な疎水性アミノ酸のプロパルギルチロシンを用いた置換について詳述する。
ＦＧＦ−２１ポリペプチドの以下の領域：１位より前（すなわちＮ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２の対応するアミノ酸）に存在するＰｈｅ残基、Ｔｒｐ残基またはＴｙｒ残基は、実施例７に記載の以下の天然にコードされていないアミノ酸：
Figure 2020018314
を用いて置換される。
ＰＥＧは、アルキル含有アミノ酸を備えているＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントに対して結合される。ＰＥＧは、以下の構造：
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
を有している。結合手順は実施例７に記載の手順に従う。これによって、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントが生成される。当該天然にコードされていないアミノ酸は、天然に存在する巨大な疎水性アミノ酸の１つと等電子配置性であり、上記ポリペプチド内の異なる部位においてＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
（実施例９）
本実施例において、ＰＥＧリンカーによって隔てられたＦＧＦ−２１ポリペプチドのホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマーまたはへテロマルチマーの生成について詳述する。
実施例７において生成されたアルキン含有ＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントは、以下の構造：
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（ここで、ｎは４であり、ＰＥＧはおおよそ５０００の平均分子量を有する）
を有するＰＥＧ誘導体と反応させられて、対応するＦＧＦ−２１ポリペプチドのホモダイマーを生成する。ここで、２つのＦＧＦ−２１分子はＰＥＧによって物理的に隔てられている。類似の手法において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１つ以上の他のポリペプチドと結合されて、ヘテロダイマー、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーを形成する。結合、精製および分析胃は、実施例７および３に記載のとおりに実施される。
（実施例１０）
本実施例において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する糖部分の結合について詳述する。
実施例３に記載のように、以下の位置：１位より前（すなわちＮ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１、または配列番号２の対応するアミノ酸）の１つの残基は、以下の天然にコードされていないアミノ酸：
Figure 2020018314
を用いて置換される。
修飾を受けると、カルボニル含有アミノ酸を備えているＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ結合アミノオキシ類似物と反応させられる。ＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアント（１０ｍｇ／ｍＬ）およびアミノオキシサッカライド（２１ｍＭ）は、１００ｍＭの水性酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）において混合され、かつ７〜２６時間にわたって３７℃においてインキュベートされる。第２の糖は、糖と接合されたＦＧＦ−２１ポリペプチド（５ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートすることによって、第１の糖に対して酵素的に結合される。当該インキュベートは、ＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）およびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（０．４ｕｎｉｔ／ｍＬ）の１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）溶液を用いて４８時間にわたって周囲温度において実施される（Schanbacher et al. J Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061）。
（実施例１１）
本実施例において、ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１ポリペプチドアンタゴニストの生成について詳述する。
残基（これらに限定されないが、ＦＧＦ受容体結合に関与する残基が挙げられる）は、実施例３に記載のような以下の天然にコードされていないアミノ酸：
Figure 2020018314
を用いて置換される。
修飾を受けると、カルボニル含有アミノ酸を備えているＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントは、以下の形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒがメチルであり、ｎは４であり、Ｎは２００００ＭＷである）
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させられて、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＦＧＦ−２１ポリペプチドアンタゴニストを生成する。当該アンタゴニストは、ポリペプチド内の単一の部位においてＰＥＧ誘導体を用いて修飾されている。結合、精製および分析は実施例３のように実施される。
（実施例１２：ＦＧＦ−２１分子が直接に連結されているＦＧＦ−２１ポリペプチドのホモ２量体、ヘテロ２量体、ホモ多量体、またはへテロ多量体の生成）
アルキン含有アミノ酸を備えているＦＧＦ−２１ポリペプチバリアントは、アジド含有アミノ酸を備えている他のＦＧＦ−２１ポリペプチドバリアントに対して直接に結合され得る。類似の様式において、ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチドと結合されて、ヘテロダイマー、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーを形成し得る。結合、精製および分析は実施例３、６および７のように実施される。
（実施例１３）
ＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’（Ａ）→ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’（Ｂ）
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）は、ハロゲン化アルキル（Ａ）と反応させられて、エーテル（Ｂ）を形成する。これらの化合物において、ｎは１〜９の整数であり、かつＲ’は、直鎖状または分枝鎖状の飽和または不飽和の、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキル基またはヘテロアルキル基である。また、Ｒ’は、Ｃ３〜Ｃ７の飽和もしくは不飽和の環状アルキル基もしくは環状ヘテロアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基もしくはヘテロアリール基、または置換もしくは非置換のアルカリル基（アルキルはＣ１からＣ２０の飽和または不飽和のアルキルである）もしくはヘテロアルカリル基であり得る。典型的にＰＥＧ−ＯＨは、８００〜４００００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
（実施例１４）
２００００ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、サンバイオ）は、ＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３５ｍＬ）溶液を用いて処理された。プロパルギルブロマイドの溶液は、キシレン（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、アルドリッチ）における８０重量％溶液として溶解され、それから、触媒量のＫＩが当該溶液に加えられ、生じた混合物が加熱されて、２時間にわたって還流された。それから、水（１ｍＬ）が加えられ、溶媒が真空条件において除去された。残余物に対してＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）が加えられ、有機層が分離され、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、容積がおよそ２ｍＬまで減らされた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液は、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下して加えられた。生じた沈殿物が回収され、数回に分けて冷やしたジエチルエーテルを用いて洗浄され、かつ乾燥されてプロパルギル−Ｏ−ＰＥＧを生じた。
（実施例１５）
ＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＲ’→ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＲ’
２００００ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＯＨ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、サンバイオ）は、ＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３５ｍＬ）溶液を用いて処理された。それから、５０当量の５−ブロモ−１−ペンチン（０．５３ｍＬ、５ｍｍｏｌ、アルドリッチ）および触媒量のＫＩが混合物に加えられた。生じた混合物は、加熱されて１６時間にわたって還流された。それから、水（１ｍＬ）が加えられ、かつ溶媒が真空条件において除去された。残余物に対してＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）が加えられ、有機層が分離され、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、容積がおよそ２ｍＬまで減らされた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液は、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下して加えられた。生じた沈殿物が回収され、数回に分けて冷やしたジエチルエーテルを用いて洗浄され、かつ乾燥されて対応するアルキンを生じた。５−クロロ−１−ペンチンは類似の反応に使用され得る。
（実施例１６）
（１）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）ｍＰＥＧ＋ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
ＴＨＦ（５０ｍＬ）および水（２．５ｍＬ）における３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に対して、まず粉末の水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）が加えられ、それからキシレン（３．３６ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）における８０重量％の溶液として溶解されたプロパルギルブロマイドの溶液が加えられた。反応混合物は加熱されて６時間にわたって還流された。混合物に対して１０％のクエン酸（２．５ｍＬ）が加えられ、かつ溶媒が真空条件において除去された。残余物は、酢酸エチル（３×１５ｍＬ）を用いて抽出され、混合性の有機層が飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）を用いて洗浄され、ＭｇＳＯ４に通して乾燥され、濃縮されて３−プロパルギロキシベンジルアルコールを生じた。
塩化メタンスルフォニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）は、０℃において化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液に加えられ、反応物は１６時間にわたって冷却装置に収納された。通常の試案によって淡黄色の油状物としてメシレートがじた。この油状物（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）は、ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解され、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）が加えられた。反応混合物は加熱されて１時間にわたって還流され、それから室温まで冷却された。混合物に対して水（２．５ｍＬ）が加えられ、溶媒が真空条件において除去された。残余ｂ通は、酢酸エチル（３×１５ｍＬ）を用いて抽出され、混合性の有機層が飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）を用いて洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、濃縮されて所望の臭化物を生じた。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、サンバイオ）はＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解され、溶液はアイスバスにおいて冷却された。ＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）は、上述の臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）および触媒量のＫＩの添加に続いて、激しく攪拌しながら数分間にわたって加えられた。冷却バスが取り除かれ、生じた混合物は加熱されて１２時間にわたって還流された。水（０．１ｍＬ）が混合物に対して加えられ、かつ溶媒が真空条件において除去された。残余物に対してＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）が加えられ、有機層が分離され、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、容積が２ｍＬまで減らされた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に対して滴下して加えることによって、白色の沈殿物を生じた。白色の沈殿物が回収されて、ＰＥＧ誘導体を生じた。
（実施例１７）
ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
また、末端にアルキンを含有するポリ（エチレングリコール）ポリマーは、上記のようにアルキン官能性基を含有する反応性分子に対して、末端に官能基を含有するポリ（エチレングリコール）ポリマーを結合させることによって取得され得る。ｎは１〜１０である。Ｒ’はＨまたはＣ１〜Ｃ４の小さなアルキル基であり得る。
（実施例１８）
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ＋ＤＣＣ→ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
ペンチン酸（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）はＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解された。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）が加えられ、溶液は室温において一昼夜にわたって攪拌された。生じた粗製ＮＨＳエステル７は、さらなる精製を行わずに以下の反応に使用された。
５０００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧｄ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、サンバイオ）は、ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解され、混合物が４℃まで冷却された。ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）は、激しく攪拌しながら数回に分けて加えられた。混合物は、３時間にわたって攪拌しながら放置され、室温まで温められた。それから、水（２ｍＬ）が加えられ、溶媒が真空条件において除去された。残余物に対してＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）が加えられ、有機層が分離され、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、容積がおおよそ２ｍＬまで減らされた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液はエーテル（１５０ｍＬ）に対して滴下して加えられた、生じた沈殿物が回収され、真空条件下において乾燥された。
（実施例１９）
本実施例において、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルフォニルエステルの調製について代表例を説明する。ポリ（エチレングリコール）のメタンスルフォニルエステルは、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルフォネートまたはメシレートとも呼ばれ得る。対応するトシレートおよびハロゲン化物は、類似の手法によって調製され得る。
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３→ｍＰＥＧ−Ｎ３
１５０ｍＬのトルエンにおけるｍＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝３４００、２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）は、窒素雰囲気において２時間にわたって共沸的に蒸留され、溶液は室温まで冷却された。４０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２および２．１ｍＬの無水トリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ）が溶液に対して加えられた。溶液はアイスバスにおいて冷却され、１．２ｍの蒸留した塩化メタンスルフォニル（１５ｍｍｏｌ）が滴下して加えられた。溶液は、室温の窒素雰囲気において一昼夜にわたって攪拌され、反応は２ｍＬの無水エタノールを加えることによって抑制された。混合物は真空条件おいて蒸発させられて、主にトルエン以外の溶媒を除去し、ろ過され、ふたたび真空条件において濃縮され、それから１００ｍＬのジエチルエーテルに入れて沈殿させられた。ろ過物は、数回にわたって冷やしたジエチルエーテルを用いて洗浄され、真空条件において乾燥されてメシレートを生じた。
メシレート（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）は７５ｍＬのＴＨＦに溶解され、溶液は４℃まで冷却された。冷却した溶液に対してアジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）が加えられた。反応物は過熱されて窒素雰囲気において２時間にわたって還流された。それから、溶媒が蒸発させられ、残余物がＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を用いて希釈された。有機画分がＮａＣｌを用いて洗浄され、無水ＭｇＳＯ４に通して乾燥された。容積が２０ｍＬまで減らされ、１５０ｍＬの冷やした無水エーテルに加えることによって、生成物が沈殿させられた。
（実施例２０）
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ→Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
４−アジドベンジルアルコールは、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９８，５９５号明細書に記載の方法を用いて生成され得る。塩化メタンスルフォニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）が、ＣＨ２Ｃｌ２における４−アジドベンジルアルコールの溶液に対して０℃において加えられ、反応物は１６時間にわたって冷却装置に収納された。通常の試案によって、淡黄色の油状物としてメシレート生じた。この油状物（９．２ｍｍｏｌ）はＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解され、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）が加えられた。反応混合物は、加熱されて１時間にわたって還流され、それから室温まで冷却された。混合物に対して水（２５ｍＬ）が加えられ、溶媒が真空条件において除去された。残余物は酢酸エチル（３×１５ｍＬ）を用いて抽出され、混合性の有機層が飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）を用いて洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、濃縮されて所望の臭化物を生じた。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、サンバイオ）は、ＴＨＦ（３５ｍＬ）におけるＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を用いて処理され、臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）が触媒量のＫＩとともに混合物に対して添加された。生じた混合物が加熱されて１２時間にわたって還流された。水（１．０ｍＬ）が混合物に加えられ、溶媒が真空条件において除去された。残余物に対してＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）が加えられ、有機層が分離され、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、容積がおおよそ２ｍＬまで減らされた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に対して滴下して加えることによって沈殿物が生じた。沈殿物が回収されてｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３を生じた。
（実施例２１）
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ＋Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ→Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（ＭＷ ３４００Ｄａ、２．０ｇ）は、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１０ｍＬ）に溶解され、０℃まで冷却された。３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドプロピオネート（５当量）が激しく攪拌しながら加えられた。３時間後に２０ｍＬのＨ２Ｏが加えられ、混合物はさらに４５分間にわたって室温において攪拌された。ｐＨは０．５規定のＨ２ＳＯ４を用いて３に調節され、ＮａＣｌがおおよそ１５重量％の濃度まで加えられた。反応混合物はＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）を用いて抽出され、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、濃縮された。
（実施例２２）
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
公知の方法によって調製され、ＴＨＦにおいて−７８℃まで冷却されたリチウムアセチリドの溶液（４当量）に対して、ＴＨＦに溶解させたｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液が、激しく攪拌しながら滴下して加えられる。３時間後に反応物が室温まで温められ、反応は１ｍＬのブタノールの添加によって抑制された。それから、２０ｍＬのＨ２Ｏが加えられ、混合物が室温において４５分間にわたって攪拌された。ｐＨは０．５規定のＨ２ＳＯ４を用いて３に調整され、ＮａＣｌがおおよそ１５％の濃度まで加えられた。反応混合物はＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）を用いて抽出され、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥され、濃縮された。冷却したジエチルエーテルを用いて沈殿させた後に、生成物がろ過および真空条件における乾燥によって回収されて、１−（ｂｕｔ−３−イニロキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を生じた。
（実施例２３）
アジド含有アミノ酸およびアセチレン含有アミノ酸は、L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500, J. W. Chin et al., Science 301 :964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3(11):1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024: and, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1 :1-11に記載の方法を用いてタンパク質に対して部位特異的に組み込まれ得る。アミノ酸が組み込まれると、２ｍＭのＰＥＧ誘導体、１ｍＭのＣｕＳＯ４および１ｍｇ未満のＣｕワイヤの存在下において、ｐＨ８のリン酸緩衝液（ＰＢ）における０．０１ｍＭのタンパク質を用いて、３７℃において４時間にわたって付加環化反応が実施される。
（実施例２４）
本実施例において、ｐ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）およびｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体の合成について詳述する。
ｐＡＦのラセミ体は、Zhang, Z., Smith, B. A. C, Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746 においてこれまでに説明されている手法を用いて合成される。
ｍ−ＰＥＧヒドロキシアミン誘導体を合成するために、以下の手法が実施された。（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（０．３８２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルカルボジイミド（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ、７０ｍＬ）における溶液に対して、メトキシ−ポリエチレングリコールアミン（ｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２、７．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、Ｍｔ ３０Ｋ、バイオベクトラ）およびジイソプロピルアミン（０．１ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）が加えられた。上記溶液は、室温（ＲＴ）において１時間にわたって攪拌されている。反応物が、ＲＴにおいて４８時間にわたって攪拌され、それから約１００ｍＬまで濃縮される。混合物は冷やしたエーテル（８００ｍＬ）に対して滴下して加えられた。ｔ−Ｂｏｃ−保護された生成物が沈殿し、ろ過、３×１００ｍＬのエーテルによる洗浄によって回収される。ＤＣＭ（１００ｍＬ）に再溶解し、かつエーテル（８００ｍＬ）において２回にわたって沈殿させることによって、さらに精製される。生成物は、真空条件において乾燥されて７．２ｇが生じ、ＮＭＲおよびニンヒドリン試験によって確認された。
上述の保護された生成物（７．０ｇ）の脱Ｂｏｃは、５０％のＴＦＡ／ＤＣＭ（４０ｍＬ）において、０℃において１時間にわたって、それからＲＴにおいて１．５時間にわたって実施された。ほとんどのＴＦＡが真空条件において除去された後に、ヒドロキシアミン誘導体のＴＦＡ塩は、ジオキサン（１ｍＬ）における４規定のＨＣｌを残余物に加えることによってＨＣｌ塩に転換される。沈殿物は、ＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解され、エーテル（８００ｍＬ）において再沈殿させられる。最終生成物（６．８ｇ、９７％）は、ろ過、３×１００ｍＬのエーテルを用いた洗浄、真空条件において乾燥によって回収され、窒素雰囲気において貯蔵された。他のＰＥＧ（５Ｋ、２０Ｋ）のヒドロキシアミン誘導体は、同じ手法を用いて合成される。
（実施例２５：ＦＧＦ−２１のＷＴおよび３０Ｋ ＰＥＧ類似物によって誘導されるＥＲＫ１／２リン酸化の分析）
ポリＬｙｓ被覆プレートに１０００００細胞／ウェル（１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ）においてヒトクロソβによって安定にトランスフェクトされた２９３を播く。翌日に細胞が１００％の密度になり、培地が吸い出されて新たな培地に置き換えられ、一昼夜にわたってインキュベートされる。２４時間後に細胞は、ＦＧＦ２１ＷＴを標準として用いて、適切な３０Ｋ ＰＥＧ ＦＧＦ−２１類似物を用いて刺激される。個々の化合物のそれぞれは、１％ＢＳＡのＰＢＳにそれらを希釈することによって調製される。細胞は、インキュベーターにおいて３通りに、３７℃において１０分間にわたって処理される。１０分間後に、インキュベーション培地は各ウェルから丁寧に吸い出され、プロテーゼ／ホスファターゼ阻害剤（ＰＩカクテル、Ｎａ３ＶＮ４およびＰＭＳＦ）を含有する冷やした１倍のセルシグナリングリシス緩衝液の４０μｌが、細胞溶解物を生成するために各ウェルに加えられる。９６ウェルプレートは、２０分間にわたって氷上に置かれ、それから４００ｒｐｍにおいて１０分間にわたって遠心沈殿させられる。細胞溶解物は、−８０℃に凍結される。後者の各サンプルは融解されて、１０μｌの細胞溶解物がＭＳＤ処理プレートに加えられた。ＭＳＤ処理プレートは、ＥＲＫ１／２の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方を捕捉する抗体を用いて被覆されている。１次抗体を用いたインキュベーションを２時間にわたって行い、それからプレートを特定の緩衝液を用いて数回にわたって洗浄して２次抗体を加えた。１時間にわたってインキュベーションした後に、プレートをふたたび数回にわたって洗浄する。読み込みようの緩衝液が各ウェルに加えられる。プレートはＭＳＤ読み込み装置に移される。生成される曲線は、抗リン酸化ＥＲＫ１／２の読み込みユニットに基づいており、ＥＣ５０はシグマプロットを用いて算出される。活性の損失倍率は、３０ＫのＰＥＧ付加した特定の化合物のＥＣ５０をＷＴのＥＣ５０を用いて割ることによって算出される。
（実施例２６：細胞ＥＲＫ１／２リン酸化アッセイ（ｒＥＲＫ）の手順およびＭＳＤ分析）
２９３βクロソ−４細胞は、１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ＋０．５ｍｇ／ｍＬジェネテシンを添加したＤＭＥＭに維持された。細胞が５０〜９０％の密度に達すると、細胞は、トリプシン処理されて、１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭの入ったポリＤ−ｌｙｓ被覆の９６ウェルプレートに、１０００００細胞／ウェルにおいて播かれた。
翌日に細胞が１００％近くの密度に達すると、細胞は、培地がまだ赤いかを確かめられ、それから培地が吸い出され、ＦＧＦ−２１バリアントの希釈系列（１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）が９６ウェルプレートに対して２００ｕＬだけピペットを用いて移された。それから、９６ウェルプレートは、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに正確に５分間にわたって収納された。それから、ＦＧＦ−２１処理は完全に吸い出され、１倍のセルシグナリングリシス緩衝液、１倍のシグマのプロテアーゼ阻害剤カクテル、２ｍＭのオルトバナデート、１ｍＭのＰＭＦＳ、１倍のＭＳＤホスファターゼ阻害剤Ｉ、１倍のＭＳＤホスファターゼ阻害剤ＩＩ、１倍のＭＳＤプロテアーゼ阻害剤カクテル、２ｍＭのＭＳＤ ＰＭＳＦから新たに作製した混合物が４０ｕＬ／ウェル加えられた。ディッシュは氷上に置かれ、２５分間を置いて、これと同時にＰ２０ピペッターを用いて各ウェルの内容物を吸い上げては吐き出して、溶解物を混合する。ウェルを混合した後に、アイスバケット全体およびディッシュを残りの時間において４Ｃシェーカーに置いた。２５分後に、４℃、４００ｒｐｍにおいて１０分間にわたってプレートを遠心沈殿させた。氷上において冷やした丸底の９６ウェルプレートに上清をを移す。
ＭＳＤ分析
このアッセイは、メソスケールディスカバリーＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴアッセイシステム全細胞溶解物キット ホスホ（Ｔ／Ｙ２０２／２０４；１８５／１８７）／総量−ＥＲＫ１／２／アッセイを用いて実施された。
ＭＳＤ試薬のすべては、室温まで解答され、必要な緩衝液のすべてはキットの使用説明書にしたがって作製された。各ウェルに対して１５０ｕＬのブロッカーＡが、ホスホＥＲＫ−総ＥＲＫデュプレックスプレートに加えられ、シェーカー上において１時間にわたって室温においてブロックさせた。それから、プレートは、１６０ｕＬ／ウェルの１倍の洗浄緩衝液を用いて４回にわたって洗浄された。プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（細胞刺激のために早期に作られる）を含む１６ｕＬ／ウェルの溶解緩衝液が加えられ、１０ｕＬ／ウェルが、冷やした溶解物上清プレートからＭＳＤプレートのウェルに移された（最終的な総量は２６ｕＬ／ウェルになった）。ＭＳＤプレートは室温において３時間にわたってシェーカー上においてインキュベートされた。それから、プレートは、１６０ｕＬ／ウェルの１倍の洗浄緩衝液を用いて４回にわたって洗浄された。２５ｕＬ／ウェルの検出抗体（抗体希釈緩衝液によって５０倍に希釈された）は加えられ、室温において１時間にわたってシェーカー上においてインキュベートされた。プレートは、１６０ｕＬ／ウェルの１倍の洗浄緩衝液を用いて４回にわたってふたたび洗浄され、１倍の読み込み緩衝液が加えられた後に、プレートはＭＳＤセクタイメージャー２４００装置においてただちに読み取られた。
ＢＣＡ定量化
ピアスのＢＣＡプロテインアッセイキットが使用された。ＢＳＡ標準物質は、１倍のセルシグナリング溶解緩衝液の入った縦列に向かって２倍希釈することによって、最大濃度の２ｍｇ／ｍＬから９６ウェルプレートにおいて希釈された（ウェルの最後の１組は、ＢＳＡなしの緩衝液である）。２５ｕＬ／ウェルのＢＳＡ標準物質は、２つのマキシソープ９６ウェルプレートに、２組にわけてピペットを用いて移された。溶解物の３倍希釈が１倍のセルシグナリング溶解緩衝液においてなされ、２５ｕＬ／ウェルがマキシソープ９６ウェルプレートに加えられた。作用試薬が、ピアスのキット使用説明書にしたがって作製され、２００ｕＬがマキシソープ９６ウェルプレートの各ウェルにピペットを用いて移された。プレートは、室温においてインキュベートされ、プレートリーダー上においてλ＝５６２ｎｍにおいて読み込まれた。
データ分析
濃度はすべての溶解物についてＢＣＡキットを用いて算出された。すべての溶解物が濃度に関して同様である場合、ＭＳＤ分析を標準化しない。ＭＳＤ分析に関して、折り返し点を平均化し、標準偏差およびＣＶ値を算出する。ＦＧＦ−２１バリアントの希釈系列に関するＥＣ５０値を算出するためにシグマプロットを使用し、ＷＴのＥＣ５０に対する倍率を、バリアントを評価する基準として使用する。結果は、本願の図７ａおよび７ｂに示されている。
（実施例２７：ＦＧＦ−２１のタグ無しの下流処理）
封入体予備可溶化
細胞ペーストは、固形成分の最終濃度が１０％になるまで４℃の封入体（ＩＢ）緩衝液Ｉ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；４℃）に混合することによって再懸濁された。細胞は、合計２回にわたって再懸濁物質をマイクロフルイダイザーに通すことによって溶解された。それから、遠心分離（１００００ｇ；１５分間；４℃）されて、上清がデカントされた。ＩＢのペレットが、過分量のＩＢ緩衝液Ｉ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；４℃）に再懸濁することによって洗浄された。再懸濁された物質は、合計２回にわたって再懸濁物質をマイクロフルイダイザーに通された。それから、遠心分離（１００００ｇ；１５分間；４℃）されて、上清がデカントされた。ＩＢペレットは、１倍量の緩衝液ＩＩ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；４℃）に再懸濁された。それから、遠心分離（１００００ｇ；１５分間；４℃）されて、上清がデカントされた。それから、１／２倍量の緩衝液ＩＩ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；４℃）に再懸濁された。ＩＢは適切な容器に等分して入れられた。それから、遠心分離（１００００ｇ；１５分間；４℃）されて、上清がデカントされた。封入体は可溶化された（まだ使用しない場合には−８０℃において保存され得る）。
封入体可溶化
封入体は、可溶化緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０；８Ｍの尿素；１０ｍＭのβ−ＭＥ）において１０〜１５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に可溶化された。可溶化されたＩＢは、常に混合しながら室温において１時間にわたってインキュベートされた。不溶性の物質はろ過（０．４５ｕｍのＰＥＳフィルタ）によって除去され、追加の可溶化緩衝液を用いて希釈することによって（タンパク質濃度が高い場合に）タンパク質濃度が調節された（かならずしも必要ではない）。
リフォールディング
２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０；４℃においてタンパク質の最終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈することによってリフォールディングした。４℃において１８〜２４時間にわたってリフォールディングのために放置した。
精製
リフォールディング反応物を０．４５ｕｍのＰＥＳフィルタに通してろ過した。Ｑ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア）全体の負荷材料は、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）において平衡化された。２０ＣＶから１００％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ；ｐＨ７．５；２５０ｍＭのＮａＣｌ）の直線勾配を用いて、ＦＧＦ−２１を溶出した。モノマーのＦＧＦ−２１をプールした。
ＰＥＧ付加および精製
採取したＱ ＨＰプールおよび緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０；２Ｍの尿素；１ｍＭのＥＤＴＡに交換する。５０％の氷酢酸を用いてｐＨを４．０まで下げた。サンプルを４．０±１．０ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。サンプルに対して、モル数において１２：１過剰のＰＥＧおよび１％の最終濃度の酢酸ヒドラジド、ｐＨ４．０を加える。２８℃において４８〜７２時間にわたってインキュベートする。ＰＥＧ反応物に５０ｍＭの最終濃度のＴｒｉｓ塩基を加え、ＲＯ水を用いて１０倍に希釈する。伝導率が１ｍＳ／ｃｍを超えていること、およびｐＨが８．０〜９．０であることを確認する。ソース３０Ｑカラム（ＧＥヘルスケア）全体の負荷材料は、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）において平衡化された。２０ＣＶから１００％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ；ｐＨ７．５；２５０ｍＭのＮａＣｌ）の直線勾配を用いて、ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１を溶出した。プールしたＱ ＨＰプールおよび緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭのＮａＣｌに交換する。ＰＥＧ物質を１〜２ｍＬまで濃縮し、フィルタを０．２２ｕｍのＰＥＳフィルタを用いて殺菌する。４℃において保存する。長く保存する場合には、瞬間冷凍して−８０℃において保存する。
（実施例２８：ラットにおけるＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性）
この手順は、天然のＦＧＦ−２１化合物ＰＥＧ付加したＦＧＦ−２１化合物の薬物動態特性に関するデータ（図１１〜２３にある）を示すために使用された。これらの化合物は、カテーテルを挿入したラットにおいてアンブルックスが独自に開発した技術によって生成された。試験物質の薬物動態は、薬物投与後の特定の時点において得られた血清サンプルに由来するヒトＦＧＦ−２１に特異化されたＥＬＩＳＡによって評価された。
試験物質：
１．アンブルックス化合物のＰＥＧ−Ｒ７７ ＦＧＦ−２１は、１×ＰＢＳにおいて０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈されて使用される。
２．アンブルックス化合物のＰＥＧ−Ｙ１０４ ＦＧＦ−２１は、１×ＰＢＳにおいて０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈されて使用される。
３．アンブルックス化合物のＰＥＧ−Ｒ１２６ ＦＧＦ−２１は、１×ＰＢＳにおいて０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈されて使用される。
試験物質の質／表記：
ストック濃度＝
１．０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−Ｒ７７ ＦＧＦ−２１
１．１６ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−Ｙ１０４ ＦＧＦ−２１
１．０８ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−Ｒ１２６ ＦＧＦ−２１。
動物
研究開始時に約２５０〜２７５グラムの体重を有する１２匹のオスのスピローグ−ドーリー（ＳＤ）ラットが、アンブルックスに届く前に、外科的に取り付けられた頚動脈カテーテルを有している。動物をＣＲＬから良好な状態において受け取った。動物は、研究開始の少なくとも３日間にわたって研究区域に順化させている。ラットは、試験物質投与の当日に体重測定される。動物は、食餌および水を自由に摂取できる標準的な無菌条件に入れられた。
動物群：
すべての化合物が皮下投与される。
グループ１（ｎ＝４）：ＰＥＧ−Ｒ７７ ＳＣ注射（０．２５ｍｇ／ｋｇ）
グループ２（ｎ＝４）：ＰＥＧ−Ｙ１０４ ＳＣ注射（０．２５ｍｇ／ｋｇ）
グループ３（ｎ＝４）：ＰＥＧ−Ｒ１２６ ＳＣ注射（０．２５ｍｇ／ｋｇ）。
動物は試験物質の投与前に体重測定される。化合物は、１×体重（ＢＷ）ｕＬにおいて投与されるように調合されている。試験物質は背側肩甲領域に注射することによって皮下投与される。動物は試験物質の単回注射を受ける（時間＝０）。特定の時点（後述を参照のこと）において全血が動物から抜かれて、ＳＳＴマイクロテイナー回収チューブに集められる。血清は遠心分離前の３０分間にわたって放置して凝結させる。血清はポリプロピレンタイターチューブに移されて、マイクロストリップを用いて密閉され、ＦＧＦ−２１の血清濃度を側定するためのＥＬＩＳＡによって分析されるまで−８０℃において保存される。
データ収集／終点
各動物は完全な薬物動態タイムコースに使用される。約０．２５ｍＬの全血が頚静脈カテーテルから抜かれる。血液採取後、ただちにカテーテルは０．１ｍＬの生理食塩水を用いて洗い流される。試験物質材料を受けている動物にとっての以下の回収時点：前採血、投与から１、２、４、８、２４、３２、４８、５６、７２および９６時間目は、試験物質の予測される薬物動態特性に基づいて必要になる。
終結
研究の終了後にすべての動物を安楽死させる。
結果
結果は以下の表および本明細書に添付の図面に示されている。
Figure 2020018314
Figure 2020018314
ＰＥＧ付加化合物の増加したＴｍａｘ
ＰＥＧ付加化合物の増加したＴ１／２
ＰＥＧ付加化合物の増加したＡＵＣ
ＰＥＧ付加の部位依存的なＰＫ特性。
（実施例２９：ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１のインビボ研究）
ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１、非修飾のＦＧＦ−２１および緩衝液溶液がマウスまたはラットに投与される。非修飾のＦＧＦ−２１に比べて、本発明のＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１の優れた活性および延長された半減期が結果として示されるだろう。修飾したＦＧＦ−２１、非修飾のＦＧＦ−２１および緩衝液溶液が、同様にして、マウスまたはラットに投与される。
国際公開第２００５／０９１９４４号パンフレットには、本発明のＦＧＦ−２１化合物を用いて実施され得る薬物動態試験について記載されている。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、血管内経路または皮下経路によってマウスに投与される。動物は投与前および投与後の複数の時点において採血される。血漿は各サンプルから回収され、放射線免疫アッセイによって分析される。排出半減期が算出されて、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＦＧＦ−２１と野生型ＦＧＦ−２１または本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドの種々の形態との間において比較される、同様に、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドはカニクイザルに投与され得る。動物は投与前および投与後の複数の時点において採血される。血漿は各サンプルから回収され、放射線免疫アッセイによって分析される。
本発明のポリペプチドは、オスのＺＤＦラット（糖尿病性の肥満したラット；研究開始時点において８週齢、チャールズリバー−ＧＭＩ）に投与され得る。ラットには無制限にピューリナ５００８餌が与えられる。以下の試験群が準備される：生理食塩水：１日につき４Ｕのインスリン；１日につき５００μｇのＦＧＦ−２１ 多量（多量投与群は１回に投与され、Ｔ＝投与後の０、２、４、８および２４時間目に採血される）；１日につき１００μｇのＦＧＦ−２１；１日につき２５０μｇのＦＧＦ−２１；１日につき５００μｇのＦＧＦ−２１；５００μｇ／ｍｌのＦＧＦ−２１（１日につき１回）；非肥満、生理食塩水；非肥満、１日につき４Ｕのインスリン；非肥満、１日につき５００μｇのＦＧＦ−２１。非肥満群は糖尿病性ではない痩せているＺＤＦラットを表す。
試験期間中（７日間）において１日につき１回の注射を受ける、１日につき５００μｇの第２の群をのぞいて、化合物は皮下に（s.c.（b.i.d.））注射される。対照ラットは、溶媒（０．１ｍｌのＰＢＳ）を注射される。投与から７日後に、動物は経口の糖耐性試験に供される。グルコースおよびトリグリセリドのために、血液は麻酔なしでテイルクリップ採血によって回収される。ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、用量依存的に血漿グルコースを低下させ得る。また、痩せているＺＤＦラットは、インスリンを投与されたラットと比べて、本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドのばくろ後に高血糖症になり得ない。
ｏｂ／ｏｂ肥満症モデル
ｏｂ／ｏｂマウスモデルは、高血糖症、インスリン抵抗性および肥満症用の動物モデルである。溶媒およびインスリンの対照群と比較した、ＦＧＦ−２１ポリペプチドを用いた処理後に血漿グルコースレベルが、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定され得る。この肥満症モデルにおいて、オスのｏｂ／ｏｂマウス（７週齢）の試験群は、溶媒のみ（ＰＢＳ）、インスリン（４Ｕ／日）、またはＦＧＦ−２１ポリペプチド（５μｇ／日および２５μｇ／日）を用いて、７日間にわたって皮下（０．１ｍｌ、b.i.d.）に注射される。血液は、最初の化合物の注射から１日目、３日目、７日目、および１時間目にテイルクリップ採血によって回収され、血漿グルコースレベルが標準的な手順を用いて測定される。本発明のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、溶媒対照群と比較すると、血漿グルコースレベルを低下させる場合にブルコース取り込みを刺激する。トリグリセリドレベルは、他の分子と比べて、本発明の本発明のＦＧＦ−２１を用いた処理後において比較され得る。ポリペプチドは、複数回投与、継続的な注入または単回投与を介してマウスに投与され得る。
（実施例３０：ＦＧＦ−２１類似物の薬物動態的評価）
ＰＥＧ接合部位が異なる３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ（Ｎ６−Ｈｉｓ）ＦＧＦ−２１類似物の薬物動態特性は、ラットにおいて評価された。研究された他の要因は、ＰＥＧのＭＷおよび投与された化合物の投与量であった。いくつかの３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ（Ｎ６−Ｈｉｓ）ＦＧＦ−２１バリアントに関する生体利用効率の百分率が決定された。
動物
すべての動物実験は、動物実験委員会によって認可された手順にしたがって実施された。オスのスピローグ−ドーリーラット（１７５〜３００ｇ）がチャールズリバーラボラトリーから入手された。ラットは、１２時間の明暗周期の室内においてケージに１匹づつ収容され、実験前の少なくとも３日間にわたってアンブルックスの動物施設に順化させられた。動物には自由にピューリナげっ歯類用固形飼料５００１および水を与えた。
投与および血清回収
カテーテルは、出荷前にＣＲＬによって血液回収のために、頚静脈に外科的に取り付けられた。良好なカテーテルの開通性にしたがって、動物は投与前に処置群に割り当てられた。化合物の単回投与において、１ｍＬ／ｋｇの用量が血管内または皮下に投与される。化合物の投与濃度は、サーティフィケートオブリリース（Certificate of Release）に指定されているように、ストック濃縮物を用いてＰＢＳに希釈することによって得られた。血液サンプルは、留置カテーテルを介して種々の時点において回収され、ＳＳＴマイクロチューブに収納された。血清は遠心分離後に回収され、分析まで−８０℃に保存された。
薬物動態分析
スピローグ−ドーリーラットの血清におけるＰＥＧ−ＦＧＦ−２１の定量に関するアッセイが、アンブルックス、ラ ホーヤ、ＣＡにおいて開発された。マイクロプレートのウェルは、捕捉試薬として使用されるヤギ抗ヒトＦＧＦ−２１ＩｇＧポリクロナル抗体（ＰＡｂ；ＲｎＤシステム、クローンＡＦ２５３９）を用いて被覆される。基準（ＳＴＤ）サンプルおよび品質管理（ＱＣ）サンプルの両方が、１００％のスピローグ−ドーリーラットの血清にＰＥＧ−ＦＧＦ−２１類似物を入れることによって作製され、試験サンプルは１：１００のＩ−ブロック緩衝液を用いて前処理した後に、ウェルに加えられる。ＳＴＤサンプル、ＱＣサンプルおよび試験サンプルにおけるＦＧＦ−２１は、固定ＰＡｂによって捕捉される。未結合の物質は、ウェルを洗浄することによって除去される。ビオチンヤギ抗ヒトＦＧＦ−２１ＩｇＧ ＰＡｂ（ＲｎＤシステム、クローンＡＦ２５３９）は、洗浄段階、およびストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ；ＲｎＤシステム、カタログ番号ＤＹ９９８）の添加に続いてウェルに加えられる。ＳＡ−ＨＲＰは補足されたＦＧＦ−２１を検出するためのものである。さらなる洗浄段階の後に、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、カークガード ペリー ラボラトリー）基質溶液は、ウェルに加えられる。ＴＭＢは、ＨＲＰの存在下においてペルオキシドと反応し、最初の段階において捕捉試薬によって結合したＰＥＧ−ＦＧＦ−２１類似物の量に比例して、比色定量シグナルを生じる。色の発生は、２規定の硫酸の添加によって停止させられる。色の強度（光学密度、ＯＤ）は４５０ｎｍにおいて測定される。試験サンプルおよびＱＣに関する濃度に対するＯＤユニットの換算は、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ ｖ５ データ整理パッケージを用いて５つのパラメータの論理計算回帰モデルにしたがって回帰される、同じプレートにおける標準曲線との比較を媒介するコンピュータソフトウェアを介して実施される。
また、濃度は、２抗体サンドイッチアッセイまたは当業者に公知の他の方法によって測定され得る。濃度は、対応する投与化合物から生成された標準曲線を用いて算出された。
結論
薬物動態パラメータは、モデリングプログラム ウィンノンリン（WinNonlin）（ファーサイト、バージョン４．１）を用いて評価された。リニアアップ／ログダウン法（linear-up/log-down）の台形積分を用いた個々の動物データに関するノンコンパートメント解析が使用された。
ＷＴ Ｎ６−Ｈｉｓ ＦＧＦ−２１の薬物動態特性は、Kharitonenkov et al, 2005による報告にしたがっており、タグなしのＷＴ ＦＧＦ２１ポリペプチドと同様であった。３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ（Ｎ６−Ｈｉｓ）ＦＧＦ−２１異性体の薬物動態特性は、ＷＴ（ＰＥＧ付加なしの）ＦＧＦ２１から得られる結果と比べて、３０ｋＤａのＰＥＧ分子の付加によって有為に増強された。
ＰＥＧ付加化合物は、皮下に対して０．２５ｍｇ／ｋｇの濃度において投与された場合に、顕著に異なるＰＫ特性を示した。Ｈ８７およびＬ８６は、他の異性体と比較して、ＰＫ特性が劣る傾向にあった。さらに、Ｒ１３１およびＱ１０８のＰＥＧ３０化合物は、良好なＰＫ特性を特異的に示した。より詳細には、これらの化合物は、向上したＡＵＣ、Ｃｍａｘおよび末梢半減期を有していた。詳細な構造−活性分析が、各異性体の種々のＰＫ特性に関する構造的な説明を明らかにし得る。
ＰＥＧ分子量の比較によって、３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９１（Ｎ６−Ｈｉｓ）ＦＧＦ２１が、２０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９１（Ｎ６−Ｈｉｓ）ＦＧＦ２１と比べて循環においてわずかに大きな持続性を有していることが示された。しかし、２０ｋＤａの異性体は、２つの化合物を比べたとき、より高いＣｍａｘ値、総ＡＵＣｉｎｆを有していた。２０ｋＤａの異性体に関する生体利用効率は、３０ｋＤａバリアントの２０％と比べて、３０％であったのでわずかに良好であった。
Figure 2020018314
時間に対する血清中濃度の曲線が、ノンコンパートメント解析（ファーサイト、バージョン４．１）によって評価された。化合物ごとにＮ＝３〜４のラット。ＮＤ：実施せず。ＮＥ：評価せず。Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘに達する時間；Ｃｍａｘ：最大濃度；ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔ１／２：末梢半減期；ＡＵＣｌａｓｔ；最後の血漿サンプル／時点に対する濃度−時間曲線の下にある領域；ＡＵＣｉｎｆ：無限大まで推定された濃度−時間曲線下にある領域；ＭＲＴ：平均滞留時間；Ｃｌ／ｆ；見かけ上の総血漿除去；Ｖｚ／ｆ：末期における分布の見かけ上の体積。
Figure 2020018314
濃度に対する時間の曲線が、ノンコンパートメント解析（ファーサイト、バージョン４．１）によって評価された。ＮＤ：実施せず。ＮＥ：評価不能。Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘに達する時間；Ｃｍａｘ：最大濃度；ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔ１／２：末梢半減期；ＡＵＣｌａｓｔ；最後の血漿サンプル／時点に対する濃度−時間曲線の下にある領域；ＡＵＣｉｎｆ：無限大まで推定された濃度−時間曲線下にある領域；ＭＲＴ：平均滞留時間；Ｃｌ／ｆ；見かけ上の総血漿除去；Ｖｚ／ｆ：末期における分布の見かけ上の体積。
（実施例３１）
天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１の安全性および／または有効性の人間に対する臨床試験。
目的
皮下投与された、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ヒトＦＧＦ−２１の安全性および薬物動態を観察すること。
患者
２０〜４０歳および体重６０〜９０ｋｇの範囲にある健康な１８人の有志者が研究に加えられる。被験者は、血液学、血液生化学検査、および陰性の尿の毒物スクリーン、ＨＩＶスクリーン、およびＢ型肝炎表面抗原に関して、臨床的に有為に異常な検査値を有していない。彼らは、以下の任意の徴候：高血圧；任意の主要な血液疾患の既往歴；深刻な肝疾患、腎疾患、心疾患、胃腸疾患、代謝疾患、神経疾患の既往歴；貧血またはてんかん発作の既往歴；細菌または哺乳類由来の産物、ＰＥＧまたはヒト血清アルブミンに対する公知の感受性；カフェイン含有飲料の習慣的かつ大量の消費家；任意の他の臨床試験への関与、または試験開始までの３０日以内において輸血されたかもしくは献血された血液を有すること；試験開始までの３ヶ月以内にＦＧＦ−２１のばくろを受けたこと；試験開始までの７日以内に病気にかかったこと；ならびに試験開始までの１４日以内に試験前の身体検査または臨床検査の評価に対して有為な異常を有していることを有しているべきではない。すべての被験者は、安全性に関して評価可能であり、薬物動態分析にとってのすべての血液採取物が予定通りに採取される。すべての試験は、制度上の倫理委員会の承認および患者の同意のもとに実施される。
研究計画
これは、健康な男性の有志者における第１相の、単一施設における、非盲検の、無作為化された、２期にわたる交差試験である。１８人の被験者は、２つの処理系列群（９人の被験者／群）の１つに無作為に割り当てられる。ＦＧＦ−２１は、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１および市販の製品から選択されたものの等量を用いて、太股の上部に対して皮下注射による大量瞬時投与として、２つの別々の投与期間にわたって投与される。市販製品の投与の量および頻度は包装の表示に従う。市販緒製品を用いた付加的な投与、投与頻度または所望される他の要因は、被験者の付加的な群に含むことによって試験に加えられ得る。各投与期間は１４日間の洗い流し期間をによって分けられる。被験者は、２つの投与期間のそれぞれ（２つの投与期間に挟まれた期間ではない）について、投与前の少なくとも１２時間、および投与後の少なくとも７２時間にわたって試験施設に留めおかれる。ＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１についても同様に試験されるべき、付加的な投与、頻度または他の要因がある場合に、被験者の付加的な群が加えられ得る。ＦＧＦ−２１の試験調合物は、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１である。
血液採取
血液の系列は、ＦＧＦ−２１投与の前および後に、直接に血管に穿刺することによって引き出される。血清中のＦＧＦ−２１濃度の決定するための静脈血サンプル（５ｍＬ）は、投与の約３０、２０および１０分前（３つの基準サンプル）；投与の３０分後、１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０、および７２時間後に得られる。各血清サンプルは２つに等分される。すべての血清サンプルは−２０℃において保存される。血清サンプルはドライアイス上に乗せられる。空腹時の臨床検査試験（血液学、血清生化学、尿検査）が、１日目における初回投与の直前、４日目の朝、１６日目における投与の直前、および１９日目の朝に実施される。
生物分析法
ＥＬＩＳＡキットが血清中のＦＧＦ−２１濃度の決定に使用される。
安全性測定
生命徴候は、各投与（１日目および１６日目）の直前、各投与から６、２４、４８、および７２時間目に記録される。安全性の決定は、有害事象の発生および種類ならびに臨床検査試験の基準線からの変化に基づいている。さらに、試験前における生命徴候（血圧および身体検査の結果が挙げられる）の測定からの変化が評価される。
データ分析
投与後の血清中濃度値は、投与後の値のそれぞれから基準線のＦＧＦ−２１濃度の平均値を引くことによって、投与前のＦＧＦ−２１濃度の基準値に関して補正される。基準線のＦＧＦ−２１濃度の平均値は、投与までの１０、２０および３０分前において回収された３つのサンプルからＦＧＦ−２１レベルを平均化することによって得られる。投与前のＦＧＦ−２１濃度は、それらがアッセイの定量レベルよりも下回っている場合、平均値の算出に含められない。薬物動態パラメータは、基準線のＦＧＦ−２１濃度に関して補正された血清濃度のデータから決定される。薬物動態パラメータは、バイオバルソフト最新バージョンを用いたディジタルイクイップメントコーポレーション ＶＡＸ８６００コンピュータシステムにおけるモデル独立法によって算出される。以下の薬物動態パラメータ：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）；直線台形法を用いて算出された時点０から最後の血液サンプリング時点まで（ＡＵＣ０−７２）の濃度−時間曲線の下にある領域（ＡＵＣ）；および末梢排泄半減期（ｔ１／２）が決定された。排泄速度定数は、ログ−リニアの濃度−時間プロットの末端の直線領域における連続的な複数のデータ点の直線回帰のよって見積もられる。薬物動態パラメータの平均値、標準偏差（ＳＤ）、および変動係数（ＣＶ）が各処置について算出される。パラメータの平均の割合（保存した調合物／保存していない調合物）が算出される。
安全性の結果
有害事象の発生は、処置群を越えて等しく分配される。基準線、試験前の臨床検査試験または血圧からの臨床的に有為な変化はなく、試験前の身体検査結果および生命徴候の測定から顕著な変化はない。２つの処置群に関する安全性の特性は同様と思われる。
薬物動態の結果
天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１を受けた後の１８人の被験者全員における、各時点の血清中のＦＧＦ−２１濃度の平均−時間特性（基準線のＦＧＦ−２１レベルに関して補正されていない）が測定された。すべての被験者は、正常な生理学的範囲内の、投与前の基準線のＦＧＦ−２１濃度を有しているはずである。薬物動態パラメータは、基準線のＦＧＦ−２１濃度の平均値に関して補正された血清データから決定され、Ｃｍａｘおよびｔｍａｘが決定される。選択された任意の（複数の）臨床比較対象に関するｔｍａｘの平均は、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１に関するｔｍａｘよりも有為に短い。前臨床の（複数の）比較対象に関する末梢半減期の値は、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１に関する末梢半減期より有為に短い。
本試験は健康な男性の被験者において実施されているが、同様の吸収特性および安全性が、他の患者の集団において見込まれる。他の患者の集団は、例えば、がんまたは慢性腎不全の男性または女性の患者、小児腎不全患者、自家の先天的な生体プログラムを有する患者、緊急を要しない手術を予定している患者である。
結論として、天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１の皮下投与される単回投与は、安全であり、かつ男性の健康な被検体によって十分に許容される。有害事象の相対的な発生、臨床検査値、生命徴候および身体検査の結果に基づいて、ＦＧＦ−２１の市販の形態の安全性および天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１の安全性は、同等である。天然にコードされていないアミノ酸を備えているＰＥＧ付加ＦＧＦ−２１は、患者および保健医療提供者に対して大きな臨床有用性を提供し得る。
本明細書に記載の実施例および実施形態は、これらに鑑みて種々の改善および変更が当業者に示唆されるような単なる例示を目的としており、かつ本願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲の範囲内に含まれると理解される。個々の公開物、特許、特許出願、および／または他の文献のそれぞれについて、すべての目的において言及によって組み込まれることがあたかも記載されているのと同様に、本明細書において言及されているすべての公開物、特許、特許出願、および／または他の文献は、すべての目的において言及によってその全体が組み込まれる。
Figure 2020018314
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Claims (111)

  1. 非天然にコードされるアミノ酸を１つ以上含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  2. 翻訳後修飾を１つ以上含んでいる、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  3. リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子と連結されている、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  4. 水溶性ポリマーと連結されている、請求項３に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  5. 二官能性ポリマー、二官能性リンカー、または少なくとも１つのさらなるＦＧＦ−２１ポリペプチドと連結されている、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  6. 上記二官能性ポリマーまたは二官能性リンカーが第２のポリペプチドと連結されている、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. 上記第２のポリペプチドがＦＧＦ−２１ポリペプチドである、請求項６に記載のＦＧＦポリペプチド。
  8. 上記水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  9. 請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、上記水溶性ポリマーが該ＦＧＦ−２１ポリペプチド中に存在する非天然にコードされるアミノ酸に連結されている、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  10. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または対応する配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  11. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１０位、５２位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、１１０位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または対応する配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１０に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  12. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１０位、５２位、７７位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または対応する配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１０に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  13. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、８７位、７７位、８３位、７２位、およびこれらの任意の残基の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１０に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  14. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、１１０位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または対応する配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１０に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  15. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、配列番号３、４、６または７のリーダー配列またはシグナル配列における残基からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  16. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１位より前（すなわち、Ｎ末端）１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６１位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  17. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１０位、５２位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、１１０位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  18. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１０位、５２位、７７位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  19. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、８７位、７７位、８３位、７２位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  20. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、１１０位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  21. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、配列番号３、４、６または７のリーダー配列またはシグナル配列における残基からなる群から選択される位置にて置換されている、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  22. ＦＧＦ−２１受容体に対する親和性を調節するアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を１つ以上有している、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  23. 安定性または可溶性を向上させるアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を１つ以上有している、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  24. 組換え宿主細胞における発現、またはインビトロにおける合成を向上させるアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を１つ以上有している、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  25. 請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、該ＦＧＦ−２１ポリペプチドのプロテアーゼ耐性を向上させるアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を１つ以上有している、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  26. 上記非天然にコードされるアミノ酸がリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に対して反応性であり、当該リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子がＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける一般的な２０個のアミノ酸のいずれかに対して非反応性である、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  27. 上記非天然にコードされるアミノ酸がカルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含んでいる、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  28. 上記非天然にコードされるアミノ酸がカルボニル基を含んでいる、請求項２７に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  29. 請求項２８に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、上記非天然にコードされるアミノ酸が以下の構造：
    Figure 2020018314
     を有しており、
    ここで、ｎが０〜１０であり；Ｒ１がアルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであり；Ｒ２がＨ、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであり；Ｒ３がＨ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；かつＲ４がアミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である、
    ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  30. 上記非天然にコードされるアミノ酸がアミノオキシ基を含んでいる、請求項２７に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  31. 上記非天然にコードされるアミノ酸がヒドラジド基を含んでいる、請求項２７に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  32. 上記非天然にコードされるアミノ酸がヒドラジン基を含んでいる、請求項２７に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  33. 上記非天然にコードされるアミノ酸がセミカルバジド基を含んでいる、請求項２７に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  34. 上記非天然にコードされるアミノ酸がアジド基を含んでいる、請求項２７に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  35. 請求項３４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、上記非天然にコードされるアミノ酸が以下の構造：
    Figure 2020018314
     を有しており、
    ここで、ｎが０〜１０であり；Ｒ１がアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず；ＸがＯ、ＮまたはＳであるか、または存在せず；ｍが０〜１０であり；Ｒ２がＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、かつＲ３がＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  36. 上記非天然にコードされるアミノ酸がアルキン基を含んでいる、請求項２７に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  37. 請求項３６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、上記非天然にコードされるアミノ酸が以下の構造：
    Figure 2020018314
     を有しており、
    ここで、ｎが０〜１０であり；Ｒ１がアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；ＸがＯ、ＮまたはＳであるか、または存在せず；ｍが０〜１０であり；Ｒ２がＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３がＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である、
    ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  38. 上記水溶性ポリマーが約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を有している、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  39. 上記水溶性ポリマーが約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａの分子量を有している、請求項３８に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  40. アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を含んでいる水溶性ポリマーと、カルボニル含有アミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを反応させることによって製造されている、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  41. 上記アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基が、アミド結合を介して上記水溶性ポリマーに連結されている、請求項４０に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  42. アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を有する非天然にコードされるアミノ酸を含んでいるポリペプチドと、カルボニル基を含んでいる水溶性ポリマーを反応させることによって製造されている、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  43. アジド部分を含んでいる水溶性ポリマーと、アルキン含有アミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを反応させることによって製造されている、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  44. アルキン部分を含んでいる水溶性ポリマーと、アジド含有アミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを反応させることによって製造されている、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  45. 上記アジド基またはアルキン基がアミド結合を介して水溶性ポリマーに連結されている、請求項２７に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  46. 上記水溶性ポリマーが分枝状ポリマーまたはマルチアームポリマーである、請求項４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  47. 上記水溶性ポリマーの分枝鎖のそれぞれが約１ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を有している、請求項４６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  48. ＦＧＦ−２１アンタゴニストである、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  49. １つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子を含んでいる、請求項４８に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  50. 上記ポリマーが水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含んでいる、請求項４９に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  51. ＦＧＦ−２１受容体の活性を抑制する、請求項４８に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  52. 上記非天然にコードされるアミノ酸が糖部分を含んでいる、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  53. 上記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子が糖部分を介して上記ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結されている、請求項３に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  54. 配列番号８、９、１０、１１、１２、１３または１４に対してストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでおり、当該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる、単離された核酸。
  55. 上記セレクターコドンがアンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドンおよび４塩基コドンからなる群から選択される、請求項５４に記載の単離された核酸。
  56. 非天然にコードされるアミノ酸を含んでいる単離されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを、当該非天然アミノ酸と反応する部分を含んでいるリンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子と接触させることを包含している、請求項３に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチドを製造する、方法。
  57. 上記ポリマーが水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含んでいる、請求項５６に記載の方法。
  58. 上記非天然にコードされるアミノ酸がカルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含んでいる、請求項５６に記載の方法。
  59. 上記非天然にコードされるアミノ酸がカルボニル部分を含んでおり、上記リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子がアミノオキシ部分、ヒドラジン部分、ヒドラジド部分またはセミカルバジド部分を含んでいる、請求項５６に記載の方法。
  60. 上記アミノオキシ部分、ヒドラジン部分、ヒドラジド部分またはセミカルバジド部分がアミド結合を介して上記リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子に連結されている、請求項５９に記載の方法。
  61. 上記非天然にコードされるアミノ酸がアルキル部分を含んでおり、上記リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子がアジド部分を含んでいる、請求項５６に記載の方法。
  62. 上記非天然にコードされるアミノ酸がアジド部分を含んでおり、上記リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子がアルキン部分を含んでいる、請求項５６に記載の方法。
  63. 上記アジド部分またはアルキン部分がアミド結合を介してリンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子と連結されている、請求項５８に記載の方法。
  64. 上記ポリ（エチレングリコール）部分が約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの平均分子量を有している、請求項５７に記載の方法。
  65. 上記ポリ（エチレングリコール）部分が分枝状ポリマーまたはマルチアームポリマーである、請求項５７に記載の方法。
  66. 請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチドおよび薬学的に受容可能な担体を含んでいる、組成物。
  67. 上記非天然にコードされるアミノ酸が水溶性ポリマーと連結されている、請求項６６に記載の組成物。
  68. 請求項６６に記載の組成物の治療有効量を患者に投与することを包含する、ＦＧＦ−２１によって修飾される疾患を有する患者を処置する、方法。
  69. 請求項５４に記載の核酸を含んでいる、細胞。
  70. 直交性のｔＲＮＡシンセターゼまたは直交性のｔＲＮＡを含んでいる、請求項６９に記載の細胞。
  71. セレクターコドンと、直交性のＲＮＡシンセターゼと、直交性のｔＲＮＡとを含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする単一または複数のポリヌクレオチドを含んでいる細胞を、非天然にコードされるアミノ酸を含んでいる該ＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現を可能にする条件下にて培養すること；ならびに上記ＦＧＦ−２１ポリペプチドを精製することを包含している、非天然のコードされるアミノ酸を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドを製造する方法。
  72. ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける天然に存在するアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上を、非天然にコードされるアミノ酸の１つ以上に置換することを包含している、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの血清半減期または循環時間を調節する、方法。
  73. 配列番号８、９、１０、１１、１２、１３または１４に示される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされており、非天然にコードされるアミノ酸を少なくとも１つ含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、当該ポリヌクレオチドがセレクターコドンを含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  74. 上記非天然にコードされるアミノ酸がリンカー、ポリマー、水溶性ポリマーまたは生物学的に活性な分子に連結されている、請求項７３に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  75. 上記水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる、請求項７４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  76. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項７３に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  77. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１０位、５２位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、８７位、７７位、８３位、７２位、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、１１０位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項７６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  78. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１０位、５２位、７７位、１１７位、１２６位、１３１位、１６２位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項７６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  79. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、８７位、７７位、８３位、７２位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項７６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  80. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、６９位、７９位、９１位、９６位、１０８位、１１０位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項７６に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  81. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、配列番号３、４、６、または７のリーダー配列またはシグナル配列における残基からなる群から選択される位置にて置換されている、請求項７３に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  82. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含んでいる、請求項７３に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  83. 上記ポリ（エチレングリコール）部分が約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を有している、請求項７５に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  84. 上記ポリ（エチレングリコール）部分が分枝状ポリマーまたはマルチアームポリマーである、請求項７５に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  85. 上記（エチレングリコール）部分が約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を有している、請求項８４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  86. 請求項７３に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチドおよび薬学的に受容可能な担体を含んでいる、組成物。
  87. 組換え宿主細胞においてＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現を向上させるアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を１つ以上含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  88. 単一のアミノ酸において共有結合によって連結されている水溶性ポリマーを含んでいる、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  89. 上記水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる、請求項８８に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  90. 上記水溶性ポリマーと共有結合している上記アミノ酸が非天然にコードされるアミノ酸である、請求項８８に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  91. 上記非天然にコードされるアミノ酸がポリ（エチレングリコール）分子に連結されている、請求項１０に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  92. リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子を少なくとも１つ含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、当該リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子が、リボソームによって当該ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれている非天然にコードされるアミノ酸の官能基を介して、当該ＦＧＦ−２１ポリペプチドにつながれている、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  93. モノＰＥＧ付加されている、請求項９２に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  94. 非天然にコードされるアミノ酸の１つ以上につながれているリンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子を含んでいるＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、上記非天然にコードされるアミノ酸が、あらかじめ選択された部位にて当該ＦＧＦ−２１ポリペプチドへリボソームによって組み込まれている、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  95. 上記リンカー、ポリマーまたは生物学的に活性な分子を１つ含んでいる、請求項９４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  96. 上記ＦＧＦ−２１ポリペプチドの免疫原性を調節するアミノ酸置換、アミノ酸付加、またはアミノ酸欠失を１つ以上含んでいる、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  97. 上記ＦＧＦ−２１ポリペプチドの血清半減期または循環時間を調節するアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を１つ以上含んでいる、請求項１に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  98. ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける天然に存在するアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上を、非天然にコードされるアミノ酸の１つ以上に置換することを包含している、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの免疫原性を調節する方法。
  99. 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有している、ＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  100. 上記非天然にコードされるアミノ酸がケトン基を含んでいる、請求項１または４に記載のＦＧＦポリペプチド。
  101. 天然にコードされるアミノ酸の置換をさらに含んでいる、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  102. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、５６位、５９位、６９位および１２２位、ならびにこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  103. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、４２位、５４位、７７位、８１位、８６位、８８位、１２２位、１２５位、１２６位、１３０位、１３１位、１３９位、１４５位、１４６位、１５２位、１５４位、１５６位、１６１位、１６３位、１７０位、１７２位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  104. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、２５位、３８位、５８位、５９位、６０位、６９位、７９位、８７位、９１位、１０１位、１０２位、１１４位、１１６位、１２２位、１２６位、１３０位、１３３位、１４０位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  105. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１９位、２０位、２１，２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、３１位、３３位、３５位、３７位、４１位、４２位、４３位、５０位、５４位、５８位、６２位、６６位、６７位、６９位、７２位、７３位、７６位、７７位、７９位、８０位、８１位、８２位、８４位、８５位、９０位、９２位、９４位、９５位、１００位、１０２位、１０４位、１０７位、１０９位、１１０位、１１５位、１１７位、１１８位、１１９位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３２位、１３４位、１３５位、１３７位、１３８位、１３９位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  106. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、５９位および１２２位の残基（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  107. 以下の置換：Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）をさらに有している、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  108. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１９位、２１位、２６位、２８位、２９位、３０位、３６位、３９位、４２位、５０位、５６位、６１位、６４位、６５位、６８位、７０位、７１位、７７位、８１位、８５位、８６位、９０位、９２位、９４位、９８位、１０７位、１０８位、１１２位、１１３位、１２３位、１２４位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  109. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、２４位、２７位、３７位、４０位、４４位、４６位、４９位、５７位、８８位、８９位、１０６位、１１０位、１１１位、１１５位、１２０位、１３９位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  110. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、１８位、４５位、４７位、４８位、７８位、８３位、９９位、１０３位、１２５位、１２８位、１３１位、１３２位、１３８位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
  111. 上記非天然にコードされるアミノ酸が、２５位、３８位、５８位、５９位、６０位、６９位、７９位、８７位、９１位、１０１位、１０２位、１１４位、１１６位、１２２位、１２６位、１３０位、１３３位、１４０位、およびこれらの残基の任意の組合せ（配列番号１、または配列番号２〜７における対応するアミノ酸）からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１または４に記載のＦＧＦ−２１ポリペプチド。
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