PT2068909E - Polipéptidos fgf-21 modificados e suas utilizações - Google Patents

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fgf
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Thomas P Cujec
Roberto Mariani
Anna-Maria A Hays Putnam
William M Keefe
Nick Knudsen
Lillian Ho
Jason Pinkstaff
Vadim Kraynov
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Description

1
DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDOS FGF-21 MODIFICADOS E SUAS UTILIZAÇÕES"
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
Este pedido de patente reivindica prioridade a e beneficio de Pedido de Patente Provisório U.S. N° de Série 60/921.297, depositado em 30 de Março de 2007 e Pedido de Patente Provisório U.S. N° de Série 60/988.060, depositado em 14 de Novembro de 2007.
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a polipéptidos FGF-21 opcionalmente modificados com pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Factores de crescimento de fibroblasto são grandes polipéptidos amplamente expressos em tecidos adultos e em desenvolvimento (Baird et ai., Câncer Cells, 3:239-243, 1991) e desempenham papéis cruciais em múltiplas funções fisiológicas incluindo angiogénese, mitogénese, formação de padrões, diferenciação celular, regulação metabólica e reparação de lesão tecidual (McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59:135-176, 1998; Burgess, W. H. etal., Annu. Rev. Biochem. 58:575-606 (1989). Os factores de crescimento de fibroblastos prototípicos (FGFs), FGF-1 e FGF-2, foram originalmente isolados de cérebro e pituitária como mitogénios para fibroblastos. FGF-3 foi identificado como sendo um alvo comum para activação pelo vírus de tumor mamário de ratinho (Dickson et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 638:18-26 (1991); FGF-4 a FGF-6 foram identificados como produtos de oncogene (Yoshida et ai., Ann. NY Acad. Sei. 638:27-37 (1991); Goldfarb etal., Ann. NY Acad. Sei 638:38-52 (1991); Coulier et ai., Ann. NY Acad. Sei. 638:53-61 (1991)). FGF-10 foi identificado a partir de pulmão de rato pela reacção em cadeia de polimerase com base em homologia 2 (PCR) (Yamasaki et al. , J. Biol. Chem. 271:15918-15921 (1996)). FGF-11 a FGF-14 (FGF factores homólogos (FHFs) 1 a 4) foram identificados a partir da retina humana por uma combinação de sequenciação de ADNc aleatório, pesquisas em bases de dados e PCR com base em homologia (Smallwood et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:9850-9857 (1996)). FGF-15 foi identificado como um alvo a jusante de uma oncoproteina de homeodominio quimérico (McWhirter et ai., Development 124:3221-3232 (1997)). FGF-16, FGF-17, e FGF-18 foram identificados a partir de coração e embriões de rato por PCR com base em homologia, respectivamente (Miyake et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 243:148-152 (1998); Hoshikawa et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 187-191 (1998); Ohbayashi et al., J. Biol. Chem. 273:18161-18164 (1998)). FGF-19 foi identificado a partir de cérebro fetal humano por pesquisa em base de dados (Nishimura et al., Biochim. Biophys. Acta 1444:148-151 (1999)). Têm um núcleo de -120 resíduos de aminoácidos conservado com -30 a 60 % de identidade de aminoácidos.
Modelos animais, sobreexpressão, e análise de mutações de ocorrência natural implicam os factores de crescimento de fibroblastos e seus receptores numa ampla série de doenças (por exemplo, Wilkie et al., Current Biology, (1995) 5:500-507; Pugh-Humphreys et al, Em: The Cytokine Handbook, A. Thomson ed, 2a edição, Academic Press, Harcourt Brace & co. publishers, Londres, pp 525-566) sugerindo que a regulação de actividade poderia ser usada para o tratamento. Por exemplo, a inibição do factor de crescimento de fibroblastos-2 pelo composto Suramina previne a neovascularização e crescimento tumoral em ratinhos (Pesenti et al., British Journal of Câncer, 66:367-372). Factores de crescimento de fibroblastos também funcionam em angiogénese (Lyons, Μ. K., et al., Brain Res. (1991) 558:315-320), cicatrização de feridas (Uhl, E., et al., Br. J. Surg. (1993) 80:977-980, 1993), astrogliose, 3 proliferação e diferenciação de célula glial (Biagini, G. et al., Neurochem. Int. (1994) 25:17-24), vasodilatação cerebral (Tanaka, R. et al., Stroke (1995) 26:2154-2159), e processos neurotróficos/neuromoduladores. 0 factor de crescimento de fibroblastos também tem múltiplos efeitos positivos incluindo no fluxo sanguíneo e na protecção contra a toxicidade de cálcio para melhorar o resultado clínico em isguemia cerebral (Mattson, Μ. P. et al., Semin. Neurosci. (1993) 5:295-307; Doetrocj. W. D. et al., J. Neurotrauma (1996) 13:309-316). Tratamento com FGF básico promove a neoangiogénese em miocárdio isquémico (Schumacher et al., Circulation (1998) 97: 645-650). FGF básico potencializa recuperação funcional e promove o sproutlng neuronal após enfarte cerebral focal (Kawamata et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1997) 94 (15):8179-84). De acordo com a literatura publicada, a família de FGF consiste em pelo menos vinte e dois membros (Reuss et al., Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)). O factor de crescimento de fibroblasto 21 (FGF-21) foi descrito como sendo preferencialmente expresso no fígado (Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206 (2000); documento WO 01/36640; e documento WO 01/18172) e como um tratamento para doença vascular isquémica, cicatrização de feridas, e doenças associadas a perda de células ou função pulmonares, brônquicas ou alveolares e numerosos outros distúrbios. FGF-21 é expresso primariamente em fígado, rim, e tecido muscular (veja-se Exemplo 2 da Publicação de Patente US N° 20040259780) . O gene de FGF-21 é composto de 3 exões e está localizado no cromossoma 19. Ao contrário de outros FGFs, FGF-21 não tem efeitos proliferativos e tumorigénicos (Genome Biol. 2001; 2(3) :REVIEWS3005) . A publicação de Patente US N° 20010012628 descreve uma sequência de proteínas e de nucleótidos para FGF-21 humano (veja-se SEQ ID NO: 1 e 2, respectivamente da Publicação de 4
Patente US N° 20010012628) . A SEQ ID NO: 2 na publicação mencionada acima, denominada sbgFGF-19, tem 209 aminoácidos de comprimento e contém uma sequência líder de 28 aminoácidos no terminal N. A sequência de FGF-21 humano apresentada como SEQ ID NO: 3 no presente documento é a mesma sequência que SEQ ID NO: 2 da Publicação de Patente US N° 20010012628. Esta sequência tem um único polimorfismo de nucleótidos (SNP) com prolina (P) na posição 174, a seguir no presente documento denominado como a "forma P de 209 aminoácidos de FGF-21." A patente US N° 6.716.626 discute sobre FGF-21 humano e proteínas homólogas em outros mamíferos, particularmente ratinhos e ratos. O FGF de ratinho mostrado como SEQ ID NO: 1 de Patente US N° 6.716.626 foi altamente expresso em fígado e expresso nos testículos e timo, e sugeriu-se que FGF-21 humano pode desempenhar um papel no desenvolvimento e recuperação de doença do fígado e/ou distúrbios de função testicular ou função de células derivadas do timo. A SEQ ID NO: 4 da Patente US N° 6.716.626 tem 209 aminoácidos de comprimento e contém uma sequência líder de 28 aminoácidos no terminal N. A sequência de FGF-21 humano apresentada como SEQ ID NO: 6 no presente documento é a mesma sequência que SEQ ID NO: 4 da Patente US N° 6.716.626. Esta sequência tem um único polimorfismo de nucleótidos (SNP) com leucina (L) na posição 174, a seguir no presente documento denominado como a "forma L de 209 aminoácidos de FGF-21." A publicação de Patente US N° 20040259780 discute sobre FGF-21 humano e apresenta uma sequência que tem 208 aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO: 2 da Publicação de Patente US N° 20040259780) e contém uma sequência líder de 27 aminoácidos no terminal N. A sequência de FGF-21 humano apresentada como SEQ ID NO: 7 no presente documento é a mesma sequência que SEQ ID NO: 2 da Publicação de Patente US N° 20040259780. Esta sequência tem um único polimorfismo de nucleótidos (SNP) com leucina (L) na posição 173, no 5 presente documento após denominado como a "forma L de 208 aminoácidos de FGF-21."
Mostrou-se que o FGF-21 estimula a absorção de glicose em adipócitos 3T3-L1 de ratinho na presença e ausência de insulina, e diminui os niveis de glucagon, triglicéridos e glicemia em alimentação e em jejum, e em ratinhos ob/ob e db/db e ratos ZDF de 8 semanas de idade de uma maneira dependente da dose, assim, proporcionando a base para a utilização de FGF-21 como uma terapêutica para tratar diabetes e obesidade (documento WO 03/011213 e Kharitonenkov et ai. J Clin Invest. 2005 Jun; 115(6):1627-35). Kharitonenkov et al. J Clin Invest. 2005 Jun; 115(6): 1627-35 também mostraram que ratinhos transgénicos que expressam FGF-21 humano são hipoglicémicos, sensíveis a insulina, e resistentes a obesidade induzida por dieta. Kharitonenkov et al. Endocrinology (no prelo) também mostram que FGF-21 reduziu a glicose, triglicéridos, insulina, e glucagons em macacos Rhesus diabéticos.
Além disso, FGF-21 mostrou-se como sendo eficaz na redução da mortalidade e morbidade de pacientes criticamente doentes (documento WO 03/059270). O FGF-21 foi descrito no Pedido de Patente US 20050176631, afecta o estado metabólico geral e pode contrabalançar efeitos secundários negativos que podem ocorrer durante a resposta de stress do corpo à sépsis bem como síndrome da resposta inflamatória sistémica (SIRS) que resulta de causas patológicas não infecciosas. Assim, FGF-21 pode ser usado para reduzir a mortalidade e morbidade que ocorre em pacientes criticamente doentes. Os pacientes criticamente doentes incluem aqueles pacientes que são fisiologicamente instáveis que requerem cuidados coordenados e contínuos a nível respiratório e prestados por pessoal médico e de enfermagem. Este tipo de cuidado envolve uma atenção particular aos pormenores com a finalidade de proporcionar uma vigilância constante e titulação da terapêutica. Os 6 pacientes criticamente doentes incluem aqueles pacientes que estão em risco de descompensação fisiológica e assim requerem monitorização constante tal que a equipa de cuidado intensivo pode proporcionar intervenção imediata para prevenir ocorrências adversas. Os pacientes criticamente doentes têm necessidades especiais de monitorização e suporte de vida que precisam ser proporcionadas por uma equipa que possa proporcionar cuidado titulado continuo.
Os polipéptidos FGF-21 PEGilados são descritos no documento WO 2005/091944. O polipéptido FGF-21 descrito no documento WO 2005/091944 é um polipéptido de 181 aminoácidos. A sequência de FGF-21 humano matura, de tipo selvagem ou nativa indicada como SEQ ID NO: 1 do documento WO 2005/091944 não possui uma sequência lider. Este FGF-21 humano é altamente idêntico a FGF- 21 de ratinho (~79 % de identidade de aminoácidos) e FGF-21 de rato (~80 % de identidade de aminoácidos). A sequência de FGF-21 humano apresentada como SEQ ID NO: 5 no presente documento é a mesma sequência que SEQ ID NO: 1 do documento WO 05/091944. Esta sequência tem um único polimorfismo de nucleótidos (SNP) com leucina (L) na posição 146. Um perito com habilidade ordinária na especialidade poderia prontamente usar sequências de polipéptido FGF-21 de mamífero alternativas ou análogos, muteínas, ou derivados que têm suficiente homologia com as sequências de FGF-21 humano para as utilizações descritas no presente documento. A sequência de FGF-21 humano apresentada como SEQ ID NO: 1 no presente documento tem um único polimorfismo de nucleótidos (SNP) com prolina (P) na posição 146. Uma versão de cauda de His N-terminal de SEQ ID NO: 1 é mostrada como SEQ ID NO: 2 no presente documento. O documento WO 2005/091944 descreve a união covalente de uma ou mais moléculas de PEG a residuos particulares de um composto de FGF-21. O composto resultante foi um 7 composto de FGF-21 PEGilado biologicamente activo com uma semivida de eliminação estendida e depuração reduzida em comparação com a de FGF-21 nativo. As moléculas de PEG foram covalentemente unidas a resíduos de cisteína ou lisina. Substituições foram feitas em várias posições com cisteína para permitir a união de pelo menos uma molécula de PEG. A PEGilação num ou mais resíduos de lisina (56, 59, 69, e 122) foi descrita.
Os compostos de FGF-21 PEGilado seriam úteis no tratamento de indivíduos com distúrbios, incluindo, mas não limitados a, diabetes tipo 2, obesidade, resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, e síndrome metabólica. Seria particularmente vantajoso ter compostos de FGF-21 PEGilado que pudessem aumentar a eficácia possibilitando uma semivida de circulação mais longa e que requeresse menos doses, o que aumentaria tanto a conveniência para um indivíduo em necessidade de tal terapêutica e a probabilidade de uma adesão do indivíduo aos requisitos de dosagem. A síndrome metabólica pode ser definida como um agrupamento de pelo menos três dos seguintes sinais: gordura abdominal - na maioria dos homens, uma cintura de 40 polegadas (101,6 cm) ou maior; açúcar no sangue alto - pelo menos 110 miligramas por decilitro (mg/dL) após o jejum; triglicéridos altos -pelo menos 150 mg/dL na corrente sanguínea; HDL baixo -inferior a 40 mg/dL; e pressão sanguínea de 130/85 ou superior.
A união covalente do polímero hidrofílico poli(etileno glicol), abreviado PEG, é um método de aumento de solubilidade em água, biodisponibilidade, de aumento de semivida no soro, de aumento de semivida terapêutica, de modulação de imunogenicidade, de modulação de actividade biológica, ou de extensão do tempo de circulação de muitas moléculas biologicamente activas, incluindo proteínas, péptidos, e particularmente moléculas hidrofóbicas. O PEG em foi usado extensivamente em produtos farmacêuticos, implantes artificiais, e em outras aplicações onde a biocompatibilidade, falta de toxicidade, e falta de imunogenicidade são importantes. Com a finalidade de maximizar as propriedades desejadas de PEG, o peso molecular total e estado de hidratação do polímero ou polímeros de PEG unidos à molécula biologicamente activa devem ser suficientemente altos para conceder as características vantajosas tipicamente associadas à união de polímero de PEG, tal como solubilidade em água aumentada e maior semivida de circulação, evitando ao mesmo tempo impactos adversos na bioactividade da molécula parental.
Os derivados de PEG ligam-se com frequência a moléculas biologicamente activas através de funcionalidades químicas reactivas, tais como resíduos de lisina, cisteína e histidina, fracções de hidrato de carbono e terminal N. Tem sido realizada investigação sobre a formulação de um composto de FGF-21 terapêutico, mas tem sido problemático por muitas razões, uma das quais é porque as proteínas e outras moléculas com frequência têm um número limitado de locais reactivos disponíveis para a união de polímeros. Com frequência, os locais mais adequados para modificação via união de polímeros desempenham um significativo papel na ligação ao receptor, e são necessários para a retenção da actividade biológica da molécula. Cosequentemente, a união indiscriminada de cadeias de polímero a tais locais reactivos numa molécula biologicamente activa leva, com frequência, a uma redução significativa ou mesmo perda total de actividade biológica da molécula modificada por polímero. R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977. Para formar conjugados que têm suficiente peso molecular de polímero para conceder as vantagens desejadas a uma molécula alvo, as abordagens da técnica anterior têm tipicamente envolvido a união aleatória de numerosos braços de polímero à molécula, aumentando deste 9 modo o risco de uma redução ou mesmo perda total em bioactividade da molécula parental.
Os locais reactivos que formam os loci para união de derivados de PEG a proteínas ditam-se pela estrutura da proteína. As proteínas, incluindo enzimas, são compostas de várias sequências de alfa-aminoácidos, que têm a estrutura geral H2N--CHR--COOH. A fracção de alfa amino (H2N--) de um aminoácido junta-se à fracção de carboxilo (- COOH) de um aminoácido adjacente para formar a ligação amidas, que podem ser representadas como --(NH--CHR-CO)n—, onde o subscrito "n" pode ser igual a centenas ou milhares. 0 fragmento representado por R pode conter locais reactivos para a actividade biológica de proteína e para a união de derivados de PEG.
Por exemplo, no caso do aminoácido lisina, existe uma fracção —NH2 na posição épsilon bem como na posição alfa. A posição épsilon -NH2 está livre para a reacção sob condições de pH básico. Muita da técnica no campo de derivatização de proteínas com PEG foi direccionada ao desenvolvimento de derivados de PEG para a união à fracção —NH2 épsilon de resíduos de lisina presentes em proteínas. "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Estes derivados de PEG todos têm a limitação comum, no entanto, de não poderem ser instalados selectivamente entre os numerosos resíduos de lisina com frequência presentes nas superfícies de proteínas. Isto pode ser uma limitação significativa em casos onde um resíduo de lisina é importante para a actividade da proteína, existente num local activo da enzima, por exemplo, ou em casos onde um resíduo de lisina desempenha um papel na mediação da interacção da proteína com outras moléculas biológicas, como no caso de locais de ligação ao receptor. 10
Uma segunda e igualmente importante complicação dos métodos existentes para PEGilação de proteínas é que os derivados de PEG podem passar por reacções secundárias indesejadas com resíduos diferentes de aqueles desejados. Histidina contém uma fracção imino reactiva, representada estruturalmente como - N(H)-, mas muitas espécies quimicamente reactivas que reagem com -NH2 épsilon podem também reagir com - N(H)—. De maneira similar, a cadeia lateral do aminoácido cisteína possui um grupo sulfidrilo livre, representado estruturalmente como -SH. Em alguns casos, os derivados de PEG direccionados ao grupo —NH2 épsilon da lisina também reagem com cisteína, histidina ou outros resíduos. Isto pode criar misturas heterogéneas complexas de moléculas bioactivas derivatizadas de PEG e corre-se o risco de se destruir a actividade da molécula bioactiva alvo. Seria desejável desenvolver derivados de PEG que permitem a introdução de um grupo químico funcional num único local na proteína que possibilitaria então o acoplamento selectivo de um ou mais polímeros de PEG à molécula bioactiva em locais específicos na superfície da proteína bem definidos e previsíveis.
Além de resíduos de lisina, um esforço considerável na técnica foi direccionado para o desenvolvimento de reagentes de PEG activados que têm como alvo outras cadeias laterais de aminoácido, incluindo cisteína, histidina e o terminal N. Veja-se, por exemplo, Patente US N° 6.610.281 e "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Um resíduo de cisteína pode ser introduzido selectivamente no local na estrutura de proteínas usando mutagénese dirigida e outras técnicas conhecidas na especialidade, e a fracção de sulfidrilo livre resultante pode reagir com derivados de PEG que possuem grupos funcionais reactivos a tiol. Esta abordagem é complicada, no entanto, pois a introdução de um grupo sulfidrilo livre 11 pode complicar a expressão, enrolamento e estabilidade da proteína resultante. Assim, seria desejável ter um meio para introduzir um grupo químico funcional em FGF-21 que possibilita o acoplamento selectivo de um ou mais polímeros de PEG à proteína ao mesmo tempo que é simultaneamente compatível com (isto é, não se acopla em reacções secundárias indesejadas com) sulfidrilos e outros grupos químicos funcionais tipicamente encontrados em proteínas.
Como pode ser visto a partir de uma amostragem da técnica, muitos destes derivados que foram desenvolvidos para a união às cadeias laterais de proteínas, em particular, a fracção -- NH2 na cadeia lateral do aminoácido lisina e a fracção -SH na cadeia lateral de cisteína, têm-se revelado problemáticos na sua síntese e utilização. Alguns formam ligações instáveis com a proteína que são submetidas a hidrólise e portanto se decompõem, degradam, ou então são instáveis em ambientes aquosos, tais como na corrente sanguínea. Alguns formam ligações mais estáveis, mas são submetidas a hidrólise antes de a ligação ser formada, o que significa que o grupo reactivo no derivado de PEG pode ser inactivado antes de a proteína poder ser unida. Alguns são um pouco tóxicos e são portanto menos adequados para utilização in vivo. Alguns são muito lentos para reagir para serem úteis de maneira prática. Alguns têm como resultado uma perda de actividade da proteína por meio da união a locais responsáveis pela actividade da proteína. Alguns não são específicos nos locais aos quais se vão unir, que pode também ter como resultado uma perda de actividade desejável e uma falta de reprodutibilidade de resultados. Com a finalidade de superar os desafios associados à modificação de proteínas com fracções de poli(etileno glicol), desenvolveram-se derivados de PEG que são mais estáveis (por exemplo, Patente US 6.602.498) ou que reagem selectivamente com fracções de tiol em moléculas e superfícies (por exemplo, 12
Patente US 6.610.281). Existe claramente uma necessidade na técnica para derivados de PEG que são quimicamente inertes em ambientes fisiolóqicos até terem de reaqir selectivamente para formar ligações quimicas estáveis.
Recentemente, relatou-se uma tecnologia inteiramente nova na ciência das proteínas, que promete superar muitas das limitações associadas a modificações específicas do local de proteínas. Especificamente, novos componentes foram adicionados à maquinaria biosintética de proteínas do procariota Escherichia coli (E. coli) (por exemplo, L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) e do eucariota Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (por exemplo, J. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)), que tem possibilitado a incorporação de aminoácidos não geneticamente codificados em proteínas in vivo. Um número de novos aminoácidos com novas propriedades químicas, físicas ou biológicas, incluindo marcadores de fotoafinidade e aminoácidos fotoisomeráveis, aminoácidos de fotoreticulação (veja-se, por exemplo, Chin, J. W., et ai. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 99:11020-11024; e, Chin, J. W., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027), aminoácidos ceto, átomo pesado contendo aminoácidos, e aminoácidos glicosilados foram incorporados eficientemente e com alta fidelidade em proteínas em E. coli e em levedura em resposta ao codão âmbar, TAG, usando esta metodologia. Veja-se, por exemplo, J. W. Chin et ai., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3 (11) : 1135-1137; J. W. Chin, et ai., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; e, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Estes estudos têm demonstrado que é possível introduzir selectivamente e rotineiramente grupos químicos funcionais, tais como grupos cetona, grupos alcino e fraeções de azida, que não são encontrados em proteínas, que são quimicamente inertes a 13 todos dos grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos codificados geneticamente comuns, e que podem ser usados para reagir eficientemente e selectivamente para formar ligações covalentes estáveis. A capacidade para incorporar aminoácidos não geneticamente codificados em proteinas permite a introdução de grupos químicos funcionais que poderiam proporcionar alternativas valiosas aos grupos funcionais que ocorrem naturalmente, tais como a -NH2 épsilon de lisina, o - SH sulfidrilo de cisteína, o grupo imino de histidina, etc. Certos grupos químicos funcionais são conhecidos por serem inertes aos grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos codificados geneticamente comuns, mas reagem competentemente e eficientemente para formar ligações estáveis. Os grupos azida e acetileno, por exemplo, são conhecidos na técnica por passarem por uma reacção de cicloadição de Huisgen [3+2] em condições aquosas na presença de uma quantidade catalítica de cobre. Veja-se, por exemplo, Tornoe, et al. , (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; e, Rostovtsev, et ai., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Por meio da introdução de uma fracção de azida numa estrutura de proteína, por exemplo, é possível incorporar um grupo funcional que é quimicamente inerte a aminas, sulfidrilos, ácidos carboxílicos, grupos hidroxilo encontrados em proteínas, mas que também reage suavemente e eficientemente com uma fracção de acetileno para formar um produto de cicloadição. Importantemente, na ausência da fracção de acetileno, a azida permanece quimicamente inerte e não reativa na presença de outras cadeias laterais de proteína e sob condições fisiológicas. Nishimura et ai. (2000) BBA1492, 203-206, e o documento W001/36640 revelam a descoberta de FGF-21. O documento WOOl/1817 revela modificação química, tal como pegilação de FGF-21. O documento W02005/074546 revela polipéptidos de hormona de crescimento humana com propriedades modificadas ou 14 melhoradas. 0 documento W02006/050247 e o documento W02005/091944 revelam a modificação quimica de FGF- 21 para melhorar as propriedades do mesmo. 0 documento US 2006/194256 e o documento US 7.259.248 revelam polipéptidos modificados que compreendem aminoácidos não naturais, e métodos para preparar os mesmos. A presente invenção dirige-se, entre outras coisas, aos problemas associados à actividade e produção de polipéptidos FGF-21, e também se dirige à produção de um polipéptido FGF-21 com propriedades biológicas ou farmacológicas melhoradas, tais como semivida terapêutica melhorada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Esta invenção proporciona um polipéptido FGF-21 que compreende uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1-7, excepto que um aminoácido é substituído por um aminoácido codificado de forma não natural na posição 108 (SEQ ID NO:l ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NO: 2-7), em que um polímero solúvel em água é ligado ao aminoácido codificado de forma não natural presente no dito polipéptido FGF-21.
Em algumas formas de realização, o polipéptido FGF-21 liga-se a um linker, polímero, ou molécula biologicamente activa. Em algumas formas de realização, o polipéptido FGF-21 liga-se a um polímero bifuncional, linker bifuncional, ou pelo menos um polipéptido FGF-21 adicional. 0 aminoácido codificado de forma não natural liga-se a um polímero solúvel em água. Em algumas formas de realização, o polímero solúvel em água compreende um grupo de poli(etileno glicol). Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural é ligado ao polímero solúvel em água com um linker ou é ligado ao polímero solúvel em água. Em algumas formas de realização, a molécula de poli(etileno glicol) é um polímero 15 bifuncional. Em algumas formas de realização, o polímero bifuncional liga-se a um segundo polipéptido. Em algumas formas de realização, o segundo polipéptido é um polipéptido FGF-21.
Em algumas formas de realização, o polipéptido FGF-21 compreende pelo menos dois aminoácidos ligados a um polímero solúvel em água gue compreende uma fracção de poli(etileno glicol). Em algumas formas de realização, pelo menos um aminoácido é um aminoácido codificado de forma não natural.
Um aminoácido codificado de forma não natural é incorporado na seguinte posição em FGF-21: (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7) . Em algumas formas de realização, construções de secreção de FGF-21 são clonados em pVK7ara (Nde/Eco) com uma sequência líder escolhida a partir de SEQ ID NOs: 39, 40, 41, 42, 43, ou 44.
Em algumas formas de realização, o aminoácido de ocorrência não natural numa destas posições liga-se a um polímero solúvel em água na posição: 108 (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7).
Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a afinidade do polipéptido FGF-21 para um parceiro de ligação ou receptor de polipéptido FGF-21, incluindo, mas não limitado a, uma proteína, polipéptido, molécula pequena, ou ácido nucleico. Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que aumenta a estabilidade do polipéptido FGF-21 em comparação com a estabilidade do FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção. Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que modula a imunogenicidade do polipéptido FGF-21 em comparação com a imunogenicidade do FGF-21 16 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção. Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que modula semivida no soro ou tempo de circulação do polipéptido FGF-21 em comparação com a semivida no soro ou tempo de circulação do FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção.
Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que aumenta a solubilidade aquosa do polipéptido FGF-21 em comparação com a solubilidade aquosa do FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção. Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que aumenta a solubilidade do polipéptido FGF-21 produzido numa célula hospedeira em comparação com a solubilidade do FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção. Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que aumenta a expressão do polipéptido FGF-21 numa célula hospedeira ou aumenta a síntese in vitro em comparação com a expressão ou síntese do FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção. 0 polipéptido FGF-21 que compreende esta substituição retém actividade agonista e retém ou melhora os níveis de expressão numa célula hospedeira. Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que aumenta a resistência a proteases do polipéptido FGF-21 em comparação com a resistência a proteases do FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção. A patente US N° 6.716.626 indicou que locais potenciais que podem ser substituídos para alterar a clivagem por proteases incluem, mas não são limitados a, um local monobásico dentro de 2 resíduos de uma prolina. Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido 17 FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que modula a actividade de transdução de sinal do receptor de FGF-21 em comparação com a actividade do receptor após a interacção com o polipéptido FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção. Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que modula a sua ligação a outra molécula tal como um receptor em comparação com a ligação do polipéptido FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção.
Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 compreende uma substituição, adição, ou deleção que aumenta a compatibilidade do polipéptido FGF-21 com conservantes farmacêuticos (por exemplo, m-cresol, fenol, álcool benzílico) em comparação com a compatibilidade do FGF-21 correspondente sem a substituição, adição, ou deleção. Esta compatibilidade aumentada possibilitaria a preparação de uma formulação farmacêutica preservada que mantém as propriedades fisioquimicas e actividade biológica da proteína durante o armazenamento. 0 documento WO 2005/091944 discute os seguintes exemplos de muteínas de FGF-21 com estabilidade farmacêutica melhorada: a substituição com um aminoácido com carga e/ou polar, mas sem carga para um dos seguintes: glicina 42, glutamina 54, arginina 77, alanina 81, leucina 86, fenilalanina 88, lisina 122, histidina 125, arginina 126, prolina 130, arginina 131, leucina 139, alanina 145, leucina 146, isoleucina 152, alanina 154, glutamina 156, glicina 161, serina 163, glicina 170, ou serina 172 de SEQ ID NO: 1 do documento WO 05/091944. Um polipéptido FGF-21 da presente invenção pode incluir um ou mais destas substituições na posição correspondente no polipéptido e/ou pode incluir uma ou mais outras substituições, adições, ou deleções. Em algumas formas de realização da invenção, um ou mais aminoácidos não naturais são substituídos numa ou 18 mais das seguintes posições: glicina 42, glutamina 54, arginina 77, alanina 81, leucina 86, fenilalanina 88, lisina 122, histidina 125, arginina 126, prolina 130, arginina 131, leucina 139, alanina 145, prolina/leucina 146, isoleucina 152, alanina 154, glutamina 156, glicina 161, serina 163, glicina 170, serina 172 SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7). Em algumas formas de realização da invenção, um ou mais aminoácidos não naturais são substituídos numa ou mais das seguintes posições: glutamato 91, arginina 131, glutamina 108, arginina 77, arginina 72, histidina 87, leucina 86, arginina 126, glutamato 110, tirosina 83, prolina 146, arginina 135, arginina 96, arginina 36, (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7). O documento WO 05/091944 descreve muteínas adicionais de FGF-21 com estabilidade farmacêutica melhorada. Tais muteínas incluem a substituição de uma cisteína para dois ou mais dos seguintes em FGF-21 (veja-se SEQ ID NO: 1 do documento WO 05/091944): arginina 19, tirosina 20, leucina 21, tirosina 22, treonina 23, aspartato 24, aspartato 25, alanina 26, glutamina 27, glutamina 28, alanina 31, leucina 33, isoleucina 35, leucina 37, valina 41, glicina 42, glicina 43, glutamato 50, glutamina 54, leucina 58, valina
62, leucina 66, glicina 67, lisina 69, arginina 72, fenilalanina 73, glutamina 76, arginina 77, aspartato 79, glicina 80, alanina 81, leucina 82, glicina 84, serina LD OO prolina 90, alanina 92, serina 94, fenilalanina 95, leucina 100, aspartato 102, tirosina 104, tirosina 107, serina 109, glutamato 110 , prolina 115, histidina 117, leucina 118, prolina 119, asparagina 121, lisina 122, serina 123, prolina 124, histidina 125, arginina 126, aspartato 127, alanina 129, prolina 130, glicina 132, alanina 134, arginina 135, leucina 137, prolina 138, ou leucina 139 . Os polipéptidos FGF-21 da presente invenção podem incluir uma ou mais destas substituições na posição correspondente no 19 polipéptido e/ou pode incluir uma ou mais outras substituições, adições, ou deleções. Em algumas formas de realização da invenção, um ou mais aminoácidos não naturais são substituídos numa ou mais das seguintes posições: arginina 19, tirosina 20, leucina 21, tirosina 22, treonina 23, aspartato 24, aspartato 25, alanina 26, glutamina 27, glutamina 28, alanina 31, leucina 33, isoleucina 35, leucina 37, valina 41, glicina 42, glicina 43, glutamato 50, glutamina 54, leucina 58, valina 62, leucina 66, glicina 67, lisina 69, arginina 72, fenilalanina 73, glutamina 76, arginina 77, aspartato 79, glicina co o alanina 81, leucina 82, glicina 84, serina 85 , prolina 90, alanina 92, serina 94, „ fenilalanina 95, leucina 100, aspartato 102, tirosina 104, tirosina 107, serina 109, glutamato 110, prolina 115, histidina 117, leucina 118, prolina 119, asparagina 121, lisina 122, serina 123, prolina 124, histidina 125, arginina 126, aspartato 127, alanina 129, prolina 130, glicina 132, alanina 134, arginina 135, leucina 137, prolina 138, ou leucina 139 (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7) . O documento WO 05/091944 descreve ainda muteínas especificas de FGF-21 com ligações dissulfureto modificadas (aminoácidos substituídos com cisteina), além dos seguintes de ocorrência natural em Cys75-Cys93, são como se segue: Gln76Cys-Serl09Cys, Cys75-Ser85Cys, Cys75-Ala92Cys,
Phe73Cys-Cys93, Serl23Cys-Hisl25Cys, Aspl02Cys-Tyrl04Cys, Aspl27Cys- Glyl32Cys, Ser94Cys-GlullOCys, Proll5Cys-
Hisll7Cys, Asnl21Cys-Aspl27Cys, Phe95Cys-Tyrl07Cys, Argl9CysProl38Cys,
Gly67Cys- Arg72Cys, Ile35Cys-Gly84Cys,
Tyr22Cys-Leul37Cys,
Glu50Cys-Lys69Cys,
Gln28Cys-Gly43Cys,
Leu58Cys-Val62Cys,
Arg7 7Cys-Asp7 9Cys, Thr23Cys-Asp25Cys, Thr23Cys-Gln2 8Cys, Gln54Cys-Leu66Cys,
Leul0 OCysAspl0 2Cys, Tyr2 0Cys-Leul3 9Cys, Pro90Cys-Ala92Cys, Ala31Cys-Gly43Cys, Val41Cys-Leu82Cys, Ile35Cys-Gly67Cys, Arg72Cys-Gly84Cys, 20 ou Arg77Cys-Ala81Cys, onde a numeraçao baseia-se em SEQ ID NO: 1 do documento WO 05/091944. Muteínas adicionais com ligações dissulfureto modificadas são Tyr22Cys-Leul39Cys; Asp24Cys- Argl35Cys; Leull8Cys-Glyl32Cys; Hisll7Cys-
Prol30Cys; Gly80Cys-Argl26Cys; Gln2 7Cys-Lysl22Cys,
Hisll7Cys-Alal29Cys;Leu82Cys-Proll9Cys; Alal29Cys; Gly43Cys-Prol24Cys; Gly42Cys-
Gly42Cys-Prol2 4Cys; Gln2 8Cys-Prol2 4Cys;
Serl23Cys; Ala26Cys-Lysl22Cys; ou Asp25Cys-onde a numeração baseia-se em SEQ ID NO: 1 do documento WO 05/091944. Muteinas adicionais com ligações dissulfureto modificadas são Leull8Cys-Alal34Cys; Leu21Cys-Leu33Cys; Ala26Cys-Lysl22Cys; Leu21Cys-Leu33Cys/Leull8Cys-Alal34Cys, onde a numeração baseia-se em SEQ ID NO: 1 do documento WO 05/091944. Os polipéptidos FGF-21 da presente invenção podem incluir uma ou mais destas substituições na posição correspondente ou nas posições correspondentes no polipéptido e/ou pode incluir uma ou mais outras substituições, adições, ou deleções. Os polipéptidos FGF-21 da presente invenção podem incluir uma ou mais destas substituições na posição correspondente ou nas posições correspondentes no polipéptido (SEQ IDNO:l ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7) . Em algumas formas de realização, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção podem incluir uma ou mais destas substituições nas posições correspondentes a partir de antes de posição 1 (isto é, no terminal N) através do terminal C nas SEQ ID NOs: 34-36. O documento WO 05/091944 descreve muteinas adicionais de FGF-21 que foram PEGiladas. Estas muteinas tinham um das seguintes substituições: D25C, D38C, L58C, K59C, P60C, K69C, D79C, H87C, E91C, E101C, D102C L114C, L116C, K122C, R126C, P130C, P133C, P140C. Os polipéptidos FGF-21 da presente invenção podem incluir uma ou mais destas substituições na posição correspondente no polipéptido e/ou pode incluir uma ou mais outras substituições, adições, ou 21 deleções. Em algumas formas de realização da invenção, um ou mais aminoácidos não naturais são substituídos numa ou mais das seguintes posições: 25, 38, 58, 59, 60, 69, 79, 87, 91, 101, 102, 114, 116, 122, 126, 130, 133, 140 (SEQ ID NO: I ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7). Em algumas formas de realização da invenção, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção podem incluir uma ou mais destas substituições nas posições correspondentes a partir de antes de posição 1 (isto é, no terminal N) através do terminal C nas SEQ ID NOs: 34-36. O documento WO 05/091944 descreve cisteína substituições nas seguintes posições: 19, 21, 26, 28, 29, 30, 36, 39, 42, 50 , 56, 61, 64, 65, 68, , 70, 71, 77, 81, 85, QO OO 90, 92, 94, 98, 107, 108, 112, 113, 123, e 124. 0 documento WO 05/091944 indica substituições de cisteína nas seguintes posições: 24, 27, 37, 40, 44, 46, 49, 57, 88, 89, 106, 110, 111, 115, 120, e 139. O documento WO 05/091944 também descreve substituições de cisteína nas seguintes posições: 18, 45, 47, 48, 78, 83, 99, 103, 125, 128, 131, 132, e 138. O documento WO 05/091944 também descreve substituições de cisteína nas seguintes posições: 25, 38, 58, 59, 60, 69, 79, 87, 91, 101, 102, 114, 116, 122, 126, 130, 133, e 140.
Em algumas formas de realização, uma ou mais ligações modificadas são criadas com um ou mais aminoácidos não naturais. A ligação intramolecular pode ser criada de muitas maneiras, incluindo, mas não são limitadas a, uma reacção entre dois aminoácidos na proteína sob condições adequadas (um ou ambos aminoácidos podem ser um aminoácido não natural); uma reacção com dois aminoácidos, cada um dos quais pode ser codificado naturalmente ou codificado não naturalmente, com um linker, polímero, ou outra molécula sob condições adequadas; etc.
Em algumas formas de realização da invenção, uma ou mais substituições de aminoácido no polipéptido FGF-21 22 podem ser com um ou mais aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Em algumas formas de realização da invenção, as substituições de aminoácido no polipéptido FGF-21 podem ser com aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, com a condição de que pelo menos uma substituição seja com um aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas formas de realização da invenção, uma ou mais substituições de aminoácido no polipéptido FGF-21 podem ser com um ou mais aminoácidos de ocorrência natural, e adicionalmente pelo menos uma substituição é com um aminoácido codificado de forma não natural.
Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonilo, um grupo acetilo, um grupo aminooxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alcino.
Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonilo. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural tem a estrutura: (ÇHjXiRiCORj R3HN'^XnCOR4 em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, ou arilo substituído; R2 é H, um alquilo, arilo, alquilo substituído, e arilo substituído; e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação do terminal amino, e R4 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação do terminal carboxi.
Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo aminooxi. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo hidrazida. Em algumas formas de realização, o aminoácido 23 codificado de forma não natural compreende um grupo hidrazina. Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo semicarbazida.
Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo azida. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural tem a estrutura:
(ÇH^R^CH^Ns em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, arilo substituído ou não presente; X é O, N, S ou não presente; m é 0-10; R2 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação do terminal carboxi.
Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo alcino. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural tem a estrutura:
(ÇHiJnR^CHíLCCH em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, ou arilo substituído; X é O, N, S ou não presente; m é 0-10, R2 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação do terminal carboxi.
Em algumas formas de realização da invenção, o polipéptido é um agonista de polipéptidos FGF-21, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial, ou agonista inverso. Em algumas formas de realização da invenção, o agonista de polipéptido FGF-21, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial, ou agonista inverso compreende um aminoácido codificado de forma não natural ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas formas de realização, o polímero solúvel em água compreende uma fracção de poli(etileno glicol). Em algumas formas de realização da invenção, o agonista de polipéptido FGF-21, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial, ou agonista inverso compreende um aminoácido codificado de forma não natural e uma ou mais modificação pós-traducional, linker, polímero, ou molécula biologicamente activa. A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem um polinucleótido que híbrida sob condições restringentes a SEQ ID NO: 8-14. A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem um polinucleótido que híbrida sob condições restringentes a SEQ ID NO: 8-14 em que o polinucleótido compreende pelo menos um codão selector. A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem um polinucleótido que codifica os polipéptidos mostrados como SEQ ID NOs.: 1-7. A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem um polinucleótido que codifica os polipéptidos mostrados como SEQ ID NOs.: 1-7 com um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural. É prontamente aparente a peritos com habilidade ordinária na especialidade que um número de polinucleótidos diferentes pode codificar qualquer polipéptido da presente invenção.
Em algumas formas de realização, o codão selector é seleccionado a partir do grupo que consiste num codão âmbar, codão ocre, codão opala, um codão único, um codão raro, um codão de cinco bases, e um codão de quatro bases. A presente invenção também proporciona métodos de preparação de um polipéptido FGF-21 ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas formas de realização, o método compreende contactar um polipéptido FGF-21 isolado que 25 compreende um aminoácido codificado não naturalmente com um polímero solúvel em água que compreende uma fracção que reage com o aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipéptido FGF-21 é reactivo a um polímero solúvel em água que é de outro modo não reactivo a qualquer dos 20 aminoácidos comuns. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipéptido FGF-21 é reactivo a um linker, polímero, ou molécula biologicamente activa que é de outro modo não reactivo a qualquer dos 20 aminoácidos comuns.
Em algumas formas de realização, o polipéptido FGF-21 ligado ao polímero solúvel em água é feito por reacção de um polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido que contém carbonilo com uma molécula de poli(etileno glicol) que compreende um aminooxi, hidrazina, hidrazida ou grupo semicarbazida. Em algumas formas de realização, o grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida é ligado à molécula de poli(etileno glicol) através de uma ligação amida.
Em algumas formas de realização, o polipéptido FGF-21 ligado ao polímero solúvel em água é feito por reacção de uma molécula de poli (etileno glicol) que compreende um grupo carbonilo com um polipéptido que compreende um aminoácido codificado de forma não natural que compreende um grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida.
Em algumas formas de realização, o polipéptido FGF-21 ligado ao polímero solúvel em água é feito por reacção de um polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido que contém alcino com uma molécula de poli(etileno glicol) que compreende uma fracção de azida. Em algumas formas de realização, a azida ou grupo alcino é ligado à molécula de poli(etileno glicol) através de uma ligação amida. 26
Em algumas formas de realização, o polipéptido FGF-21 ligado ao polímero solúvel em água é feito por reacção de um polipéptido FGF-21 gue compreende um aminoácido gue contém azida com uma molécula de poli(etileno glicol) gue compreende uma fracção de alcino. Em algumas formas de realização, a azida ou grupo alcino é ligado à molécula de poli(etileno glicol) através de uma ligação amida.
Em algumas formas de realização, a molécula de poli(etileno glicol) tem um peso molecular de entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. Em algumas formas de realização, a molécula de poli(etileno glicol) tem um peso molecular de entre 0,1 kDa e 50 kDa.
Em algumas formas de realização, a molécula de poli(etileno glicol) é um polímero ramificado. Em algumas formas de realização, cada ramificação do polímero ramificado de poli(etileno glicol) tem um peso molecular de entre 1 kDa e 100 kDa, ou entre 1 kDa e 50 kDa.
Em algumas formas de realização, o polímero solúvel em água ligado ao polipéptido FGF-21 compreende uma fracção de polialquileno glicol. Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipéptido FGF-21 compreende um grupo carbonilo, um grupo aminooxi, um grupo hidrazida, uma hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alcino. Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipéptido FGF-21 compreende uma fracção de carbonilo e o polímero solúvel em água compreende um aminooxi, hidrazida, hidrazina, ou semicarbfracção de azida. Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipéptido FGF-21 compreende uma fracção de alcino e o polímero solúvel em água compreende uma fracção de azida. Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipéptido FGF-21 compreende uma 27 fracção de azida e o polímero solúvel em água compreende uma fracção de alcino. A presente invenção também proporciona composições que compreendem um polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido codificado de forma não natural e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural liga-se a um polímero solúvel em água. A presente invenção também proporciona células que compreendem um polinucleótido que codifica o polipéptido FGF-21 que compreende um codão selector. Em algumas formas de realização da invenção, as células compreendem uma sintetase de ARN ortogonal e/ou um ARNt ortogonal para substituir um aminoácido codificado de forma não natural no polipéptido FGF-21. A presente invenção também proporciona métodos de preparação de um polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas formas de realização da invenção, os métodos compreendem cultivar células que compreendem um polinucleótido ou polinucleótidos que codificam um polipéptido FGF-21, uma sintetase de ARN ortogonal e/ou um ARNt ortogonal para a reacção condições para permitir a expressão do polipéptido FGF-21; e purificar o polipéptido FGF-21 das células e/ou meio de cultura. A presente invenção também proporciona métodos de aumento de semivida terapêutica, semivida no soro ou tempo de circulação de polipéptidos FGF-21. A presente invenção também proporciona métodos de modulação da imunogenicidade de polipéptidos FGF-21. Em algumas formas de realização, os métodos compreendem substituir um aminoácido codificado de forma não natural para um aminoácido em de ocorrência natural polipéptidos FGF-21 na posição 108 (SEQ ID No:1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID Nos: 2-7) e/ou ligar o polipéptido FGF-21 a um linker, um polímero, um 28 polímero solúvel em água; ou uma molécula biologicamente activa. A presente invenção também proporciona métodos de tratamento de um paciente em necessidade de tal tratamento com uma guantidade eficaz de uma molécula de FGF-21 da presente invenção. Em algumas formas de realização da invenção, os métodos compreendem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido codificado de forma não natural e um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 aminoácido codificado de forma não natural liga-se a um polímero solúvel em água. A presente invenção também proporciona polipéptidos FGF-21 que compreendem uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1-7 ou qualquer outra sequência de polipéptido FGF-21, excepto que um aminoácido é substituído por um aminoácido codificado de forma não natural na posição 108 (SEQ ID No:l ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID Nos: 2-7). A presente invenção também proporciona polipéptidos FGF-21 que compreendem uma sequência mostrada como SEQ ID NO: 1, 2, 4, e 5. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural liga-se a um polímero solúvel em água. Em algumas formas de realização, o polímero solúvel em água compreende uma fracção de poli(etileno glicol). Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonilo, um grupo aminooxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alcino. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipéptido FGF-21 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1-7 ou qualquer outra sequência de polipéptido FGF-21, em que um aminoácido é 29 substituído por um aminoácido codificado de forma não natural na posição 108 (SEQ ID No:l ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 2-7). A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável e um FGF polipéptido que compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1-7 excepto que um aminoácido na posição 108 (SEQ ID No:1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID Nos: 2-7) é substituído por um aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas formas de realização, o aminoácido codificado de forma não natural compreende uma fracção de sacárido. Em algumas formas de realização, o polímero solúvel em água é ligado ao polipéptido via uma fracção de sacárido. Em algumas formas de realização, um linker, polímero, ou molécula biologicamente activa é ligado ao polipéptido FGF-21 via uma fracção de sacárido. A presente invenção também proporciona um polipéptido FGF-21 que compreende um polímero solúvel em água ligado por uma ligação covalente ao polipéptido FGF-21 num único aminoácido. Em algumas formas de realização, o polímero solúvel em água compreende uma fracção de poli(etileno glicol). O aminoácido covalentemente ligado ao polímero solúvel em água é um aminoácido codificado de forma não natural presente no polipéptido. A presente invenção proporciona um polipéptido FGF-21 que compreende pelo menos um linker, polímero, ou molécula biologicamente activa, em que dito linker, polímero, ou molécula biologicamente activa é unido ao polipéptido através de um grupo funcional de um aminoácido codificado de forma não natural ribossomicamente incorporado no polipéptido. Em algumas formas de realização, o polipéptido é monoPEGilado. A presente invenção também proporciona um polipéptido FGF-21 que compreende um linker, polímero, ou molécula biologicamente activa que é unido a um aminoácido codificado de forma não natural em que dito aminoácido 30 codificado de forma não natural é ribossomicamente incorporado no polipéptido em locais pré-seleccionados.
Está incluído dentro do âmbito desta invenção a sequência sinal ou líder de FGF-21 unida a uma região codificante de FGF-21, bem como uma sequência sinal heteróloga unida a um FGF-21 região codificante. A sequência sinal ou líder heteróloga seleccionada deve ser uma que seja reconhecida e processado, por exemplo, pelo sistema de secreção da célula hospedeira para segregar e possivelmente clivada por uma peptidase sinal, pela célula hospedeira. Sequências líder da presente invenção podem ser escolhidas a partir do seguinte: as três leucinas líder de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 6 (aminoácido posições 1-28), as duas leucinas líder de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 7 (posições de aminoácido 1-27), a cauda de His de SEQ ID NO: 2 (posições de aminoácido 1-10), SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44. Um método de tratamento de uma condição ou distúrbio com o FGF-21 da presente invenção pretende significar o tratamento com FGF-21 com ou sem um péptido sinal ou líder. A presente invenção também proporciona métodos de indução de um aumento na absorção de glicose em adipócito células, compreendendo o dito método administrar FGF-21 às ditas células numa quantidade eficaz para induzir um aumento na absorção de glicose. O dito aumento na absorção de glicose pode causar um aumento no gasto de energia por meio da utilização mais rápida e mais eficiente da glicose.
Em outra forma de realização, a conjugação do polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido de ocorrência não natural a outra molécula, incluindo, mas não é limitado a PEG, proporciona FGF-21 substancialmente purificado devido à reacção química única utilizada para a conjugação ao aminoácido não natural. A conjugação de FGF-21 que compreende um aminoácido codificado não naturalmente a outra molécula, tal como PEG, pode ser realizada com 31 outras técnicas de purificação realizadas antes de ou em seguida à etapa de conjugação para proporcionar FGF-21 substancialmente puro.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 - Mutações âmbar em FGF-21 e locais correspondentes em FGF-19 são mostradas.
Figura 2 - A estrutura de FGF-19 humano é mostrada.
Figura 3 - Mutações âmbar em FGF-21 e locais correspondentes em FGF-2 são mostradas.
Figura 4 - A estrutura de FGF-19 humano é mostrada.
Figura 5 - Expressão de FGF-21 com cauda de His N- terminal e supressão em 7 locais âmbar são mostradas.
Figura β - Amostras de sobrenadante de BPER da expressão de FGF-21 com cauda de His N-terminal e supressão em 7 locais âmbar são mostradas.
Figura 7a - SigmaPlot que calcula os valores de EC50 para diluições seriadas de FGF21 variantes 30K PEG-391, 30K PEG-477, 30K PEG-R131, 30K PEG-Q108, HIS-FGF21 (tipo selvagem com cauda de His).
Figura 7b - Um quadro que mostra a quantidade de perda média de actividade para cada uma das variantes de FGF21 PEGilado listadas.
Figura 8 - Uma análise de SDS-PAGE de FGF-21 sem cauda de His expresso em E. coli.
Figura 9 - (A) análise de SDS-PAGE de fracções de
eluição de FGF-21-Y83pAF. (B) Cromatograma de eluição Q HP de FGF-21-Y83pAF não marcado. (C) análise de SDS-PAGE do grupo de eluição de FGF-21-Y832pAFQ HP.
Figura 10 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos.
Figura 11 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos.
Figura 12 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. 32
Figura 13 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 14 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 15 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 16 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 17 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 18 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 19 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 20 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 21 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 22 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 23 - Dados do Exemplo 28, Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos. Figura 24 - mapa do vector pVK10-FGF21. Figura 25 - sequência de vector pVK10-FGF21. Figura 26a - Perfis de concentração no soro-tempo de três doses de N- 6His WT FGF21 em ratos. Deram -se aos ratos uma única administração de produto de teste subcutaneamente. N = 4 animais por grupo. Os símbolos indicam médias das concentrações séricas medidas, barras de erro indicam erro padrão.
Figura 26b - Perfis de concentração no soro-tempo de N-6His WT FGF21 dosificado subcutaneamente ou intravenosamente em 0,25 mg/kg. Deram-se aos ratos uma única administração de produto de teste subcutaneamente. N = 4 animais por grupo. Os símbolos indicam médias de 33 concentrações séricas medidas, barras de erro indicam erro padrão. Biodisponibilidade total é -87 %
Figura 27a - Relação de dose a concentração no soro de produto de teste em Cmax. Os valores de Cmax são relatados como observado não teórico. N = 4 animais por grupo de tratamento. 0 valor da regressão linear é 0,59 com um declive de 348,5 ± 91,22.
Figura 27b - Relação de dose a semivida terminal de produto de teste. N = 4 animais por grupo de tratamento. O valor da regressão linear poderia não ser calculado devido a uma saturação aparente de depuração acima de 0,25 mg/kg.
Figura 27c - Relação de dose a concentração no soro AUC. Os valores de AUC são relatados como observado calculado para infinidade. N = 4 animais por grupo de tratamento. O valor da regressão linear é 0,75 com um declive de 1079 ± 194,1
Figura 28a - Perfis de concentração no soro-tempo de três doses de PP WT FGF21 em ratos. Deram-se aos ratos uma única administração de produto de teste subcutaneamente. N = 4 animais por grupo. Os símbolos indicam médias de concentrações séricas medidas, barras de erro indicam erro padrão.
Figura 28b - Perfis de concentração no soro-tempo de PP WT FGF21 dosificado subcutaneamente ou intravenosamente a 0,25 mg/kg. Deram-se aos ratos uma única administração de produto de teste subcutaneamente. N = 4 animais por grupo. Os símbolos indicam médias de concentrações séricas medidas, barras de erro indicam erro padrão. A biodisponibilidade total é -65 %
Figura 29a - Relação de dose a concentração no soro de produto de teste em Cmax. Os valores de Cmax indicados são os observados e não os teóricos. N = 4 animais por grupo de tratamento. O valor da regressão linear é 0,92 com um declive de 454,2 ± 42,42. 34
Figura 29b - Relação entre a dose e a semivida terminal do produto de teste. N = 4 animais por grupo de tratamento. 0 valor da regressão linear não pode ser calculado devido a uma saturação aparente da depuração acima de 0,125 mg/kg.
Figura 29c- Relação de dose a concentração no soro AUC. Os valores de AUC são relatados como observado calculado para infinidade. N = 4 animais por grupo de tratamento. O valor da regressão linear é 0,93 com um declive de 1585 ± 137,1
Figura 30a - Comparação de semivida terminal calculada para PP versus compostos N6-His WT FGF21 dosificados em 0,5 mg/kg subcutaneamente em ratos. O valor p calculado usando um teste t bicaudal é 0,7715. N = 3-4 animais por grupo
Figura 30b - Comparação de valores de Cmax para PP versus compostos N6-His WT FGF21 dosificados a 0,5 mg/kg subcutaneamente em ratos. O valor p calculado usando um teste t bicaudal é 0,7652. N = 3-4 animais por grupo
Figura 30c - Comparação de AUCinf para PP versus compostos N6-His WT FGF21 dosificados a 0,5 mg/kg subcutaneamente em ratos. O valor p calculado usando um teste t bicaudal é 0,4372
Figura 31a - Perfis de PK de dez isómeros de FGF21 com cauda de His-N6 PEGilado.
Figura 31b - Perfis de absorção para isómeros de FGF21 PEGilado após injecção subcutânea de 0,25 mg/kg.
Figura 31c - Perfis de eliminação para isómeros de FGF21 PEGilado após injecção subcutânea de 0,25 mg/kg.
Figura 32 - Comparação farmacocinética de PEGilação de 20 e 30 kDa.
Figura 33 - Curvas de tempo de concentração plasmática para ratos dosificados intravenosamente ou subcutaneamente com 0,25 mg/kg de 20KPEG-pAF91(N6-His)FGF21. Uma única dose foi administrada a cada animal. N = 4 animais por grupo. Os símbolos indicam médias de concentrações plasmáticas 35 medidas, barras indicam desvio padrão. Biodisponibilidade total é -30 %.
Figura 34 - Dois géis que mostram a secreção de FGF21 em E. coli e que mostram os lideres usados que trabalharam muito bem em OmpA, MalE, e Stll, como foi demonstrado pela fracção solúvel de libertação periplasmática no segundo gel.
DEFINIÇÕES É para ser entendido que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos, linhas celulares, construções, e reagentes particulares descritos no presente documento e como tal podem variar. É também para ser entendido que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de descrição de formas de realização particulares somente, e não é pretendido que limite o âmbito da presente invenção, que será limitado somente pelas reivindicações anexas.
Como é usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um," "uma", e "a/o" incluem referência ao plural a não ser que o contexto indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a um "FGF-21" ou "polipéptido FGF-21" é uma referência a uma ou mais tais proteínas e inclui equivalentes do mesmo conhecidos aos peritos com habilidade ordinária na especialidade, e assim por diante. A não ser que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que comummente entendido a um perito com habilidade ordinária na especialidade ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos, e materiais similares ou equivalentes a aqueles descritos no presente documento podem ser usados na prática ou teste da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos. 36
Todas as publicações e patentes mencionadas no presente documento são para o propósito de descrição e revelação, por exemplo, as construções e metodologias que são descritas nas publicações, que poderiam ser usadas em conexão com a invenção presentemente descrita. As publicações discutidas no presente documento são proporcionadas unicamente para a sua revelação antes da data de depósito do presente pedido. Nada no presente documento é para ser interpretado como uma admissão de que os inventores não tenham direito a antedatar tal revelação por virtude de invenção anterior ou por qualquer outra razão. 0 termo "substancialmente purificado" refere-se a um polipéptido FGF-21 que pode ser substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a proteína como encontrada no seu ambiente ocorrendo naturalmente, isto é, uma célula nativa, ou célula hospedeira no caso de polipéptidos FGF-21 recombinantemente produzidos. 0 polipéptido FGF-21 que pode ser substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína que tem menos de cerca de 30 %, menos de cerca de 25 %, menos de cerca de 20 %, menos de cerca de 15 %, menos de cerca de 10 %, menos de cerca de 5 %, menos de cerca de 4 %, menos de cerca de 3 %, menos de cerca de 2 %, ou menos de cerca de 1 % (em peso seco) de proteína contaminante. Quando o polipéptido FGF-21 ou variante do mesmo é recombinantemente produzido pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente em cerca de 30 o o r cerca de 25 %, cerca de 20 o, o r cerca de 15 %, cerca de 10 o o r cerca de 5 %, cerca de 4 o, o r cerca de 3 %, cerca de 2 o o t ou cerca de 1 % ou menos do peso seco das células. Quando o polipéptido FGF-21 ou variante do mesmo é recombinantemente produzido pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente no meio de cultura em cerca de 5 g/L, cerca de 4 g/L, cerca de 3 g/L, cerca de 2 g/L, 37 cerca de 1 g/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 10 mg/L, ou cerca de 1 mg/L ou menos do peso seco das células. Assim, o polipéptido FGF-21"substancialmente purificado" como produzido pelos métodos da presente invenção pode ter um nível de pureza de pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 75 %, 80 %, 85 %, e mais especif icamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 90 %, um nível de pureza de pelo menos cerca de 95 %, um nível de pureza de pelo menos cerca de 99 % ou maior como determinado por métodos apropriados tais como análise por SDS-PAGE, RP-HPLC, SEC, e electroforese capilar.
Um "célula hospedeira recombinante" ou "célula hospedeira" refere-se a uma célula que inclui um polinucleótido exógeno, independentemente do método usado para inserção, por exemplo, captação directa, transdução, emparelhamento de f, ou outros métodos conhecidos na técnica para criar células hospedeiras recombinantes. O polinucleótido exógeno pode ser mantido como um vector não integrado, por exemplo, um plasmídeo, ou alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro.
Como é usado no presente documento, o termo "meio" ou "meios" inclui qualquer meio de cultura, solução, suporte sólido, semi-sólido, ou rígido que possa suportar ou conter qualquer célula hospedeira, incluindo células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de insecto, células hospedeiras vegetais, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamífero, células CHO, células hospedeiras procarióticas, células hospedeiras de E. coli, ou Pseudomonas, e conteúdo de célula. Assim, o termo pode abranger meio em que a 38 célula hospedeira foi crescida, por exemplo, meio em que o polipéptido FGF-21 foi segregado, incluindo meio antes de ou após uma etapa de proliferação. 0 termo também pode abranger tampões ou reagentes que contêm lisados decélulas hospedeiras, tais como no caso onde o polipéptido FGF-21 é produzido intracelularmente e a células hospedeiras são lisadas ou rompidas para libertar o polipéptido FGF-21. "Agente redutor," como é usado no presente documento com respeito a redobramento da proteína, é definido como qualquer composto ou material que mantém grupos sulfidrilo no estado reduzido e reduz pontes dissulfureto intra- ou intermolecular. Agentes redutores adequados incluem, mas não são limitados a, ditiotreitol (DTT) , 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2-aminoetanetiol) , e reduzido glutationa. É prontamente aparente a peritos com habilidade ordinária na especialidade que uma ampla variedade de agentes redutores são adequados para utilização nos métodos e composições da presente invenção. "Agente oxidante," como é usado no presente documento com respeito a redobramento da proteína, é definido como qualquer composto ou material que é capaz de retirar um electrão de um composto a ser oxidado. Agentes oxidantes adequados incluem, mas não são limitados a, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado, e oxigénio. É prontamente aparente a peritos com habilidade ordinária na especialidade que uma ampla variedade de agentes oxidantes são adequados para utilização nos métodos da presente invenção. 0 termo "agente antidiabético" deve significar qualquer fármaco que seja útil no tratamento de, prevenção, ou de outro modo redução da gravidade de qualquer glicose distúrbio de metabolismo, ou qualquer complicações do mesmo, incluindo qualquer das condições, doença, ou complicações descritas no presente documento. Agentes antidiabéticos incluem insulina, tiazolidinedionas, 39 sulfonilureas, derivados de ácido benzóico, inibidores da alfa-glucosidase, ou similares. Outras categorias gerais de agentes antidiabéticos que podem ser parte de uma composição individual incluem (com definido termos que estão entre aspas): "artigos de fármaco" reconhecido na Farmacopeia oficial dos Estados Unidos ou Formulário Nacional oficial (ou qualquer suplemento do mesmo); "fármaco novo" e "fármaco animal novo" aprovado pela FDA nos U.S. como aqueles termos são usados em Titulo 21 do Código dos Estados Unidos; qualquer fármaco que requeira aprovação de uma entidade do governo, nos U.S. ou no exterior ("fármaco aprovado"); qualquer fármaco que seja necessário obter aprovação regulatória de modo a cumprir com 21 U.S.C. §355(a) ("fármaco aprovado regulatório"); qualquer agente que é ou foi submetido a um aplicação de fármaco humano sub 21 U.S.C.. §379(g) ("fármaco humano"). (Todas as referências ao código estatutário para esta definição referem-se a tal código como dos dados originais de depósito desta aplicação.) Outros agentes antidiabéticos são revelados no presente documento, e são conhecidos aos peritos na especialidade. É preferido que a inventivas composições antidiabéticas, como é usado no presente documento, sejam capazes de reduzir os níveis de HbAlc em pelo menos um 10 % de mudança desde a avaliação inicial, e é mais particularmente preferido que as inventivas composições antidiabéticas, como é usado no presente documento, sejam capazes de reduzir os níveis de HbAlc em pelo menos um 50 % de mudança desde a avaliação inicial. Agentes antidiabéticos incluem potenciadores de insulina, tais como incluindo, mas não são limitados a, potenciadores de insulina de molécula pequena, Taurina, Ácido alfa lipóico, um extracto de Mulberry, Cromo, Glutamina, Enicostemma littorale Blume, Scoparia dulcis, um extracto de Tarragon, Andrographis paniculata, Isomalte, Trealose ou 40 D-Manose que podem ainda potenciar a secreção ou actividade de insulina. "Agente de desnaturação" ou "desnaturante, " como é usado no presente documento, é definido como qualquer composto ou material que irá causar um desdobramento reversível de uma proteína. A força de um agente de desnaturação ou desnaturante será determinada tanto pelas propriedades como pela concentração do particular agente de desnaturação ou desnaturante. Agentes de desnaturação ou desnaturantes adequados podem ser caotropos, detergentes, solventes orgânicos, solventes miscíveis em água, fosfolípidos, ou uma combinação de dois ou mais tais agentes. Caotropos adequados incluem, mas não são limitados a, ureia, guanidina, e tiocianato de sódio. Detergentes úteis podem incluir, mas não são limitados a, detergentes fortes tais como dodecilo sulfato de sódio, ou éteres de polioxietileno (por exemplo, detergentes Tween ou Triton), Sarkosilo, detergentes não iónicos suaves (por exemplo, digitonina), detergentes catiónicos suaves tais como N->2,3-(Dioleioxi)-propil-N,N,N-trimetilamónio, detergentes iónicos suaves (por exemplo, colato de sódio ou deoxicolato de sódio) ou detergentes zwiteriónicos incluindo, mas não são limitados a, sulfobetaínas (Zwittergent), sulfato de 3-(3-clolamido- propil)dimetilammonio-l-propano (CHAPS), e sulfonato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilammonio-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO). Solventes miscíveis em água orgânicostais como acetonitrilo, alcanóis de cadeia curta (especialmente alcanóis C2 - C4 tais como etanol ou isopropanol), ou alcanodióis de cadeia curta (especialmente alcanodióis C2 - C4 tais como et ileno-glicol) podem ser usados como desnaturantes. Fosfolípidos úteis na presente invenção podem ser fosfolípidos de ocorrência natural tais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, e fosfatidilinositol ou derivados ou 41 variantes de fosfolípido sintético tais como dihexanoilfosfatidilcolina ou diheptanoilfosfatidilcolina. "Redobramento," como é usado no presente documento descreve qualquer processo, reacção ou método que transforma ligação dissulfureto contendo polipéptidos de um estado dobrado de maneira inapropriada ou não dobrado a uma conformação nativo ou dobrado de maneira apropriada com respeito a pontes dissulfureto. "Codobramento," como é usado no presente documento, refere-se especificamente a processos de redobramento, reacções, ou métodos que utilizam pelo menos dois polipéptidos que interagem entre si e resultam na transformação de polipéptidos dobrados de maneira inapropriada ou não dobrados a polipéptidos nativos, dobrados de maneira apropriada.
Como é usado no presente documento, "polipéptido FGF-21," "factor de crescimento de fibroblasto 21" ou "FGF-21" e formas não separadas do mesmo devem incluir aqueles polipéptidos e proteínas que têm pelo menos uma actividade biológica de um factor de crescimento de fibroblasto 21, bem como análogos de FGF-21, isoformas FGF-21, miméticos de FGF-21, fragmentos de FGF-21, proteínas híbridas de FGF-21, proteínas de fusão, oligómeros e multímeros, homólogos, variantes de padrão de glicosilação, variantes, variantes splice, e muteínas, do mesmo, independentemente da actividade biológica do mesmo, e ainda independentemente do método de síntese ou fabrico do mesmo incluindo, mas não são limitados a, métodos recombinantes (se for produzido a partir de ADNc, ADN genómico, ADN sintético ou outra forma de ácido nucleico), in vitro, in vivo, por meio de microinjecção de moléculas de ácido nucleico, sintético, transgénico, e gene activado. 0 termo "polipéptido FGF-21" e "FGF-21" abrange polipéptidos FGF-21 que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido, adições ou deleções. 42
Substituições numa ampla variedade de posições de aminoácido em FGF-21 de ocorrência natural foram descritas. Substituições incluindo, mas não são limitadas a, aquelas que modulam estabilidade farmacêutica, aumentam actividade agonista, aumentam resistência a protease, convertem o polipéptido num antagonista, etc. e são abrangidas pelo termo" polipéptido FGF-21" ou "FGF-21."
Para sequências de FGF-21 que não possuem uma sequência líder, veja-se as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 5 no presente documento. Para sequências de FGF-21 com uma sequência líder, veja-se as SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 no presente documento. Em algumas formas de realização, os polipéptidos FGF-21 da invenção são substancialmente idênticos as SEQ ID NOs: 1-7 excepto que um aminoácido na posição 108 (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7) é substituído por um aminoácido codificado de forma não natural ou qualquer outra sequência de um polipéptido FGF-21. Múltiplos polimorfismos de FGF-21 foram identificados. Leucina ou prolina foram descritas na mesma posição na Publicação de Patente US N° 20010012628 e Patente US N° 6.716.626. Sequências sinal ou líder N-terminal que diferem em 1 aminoácido (leucina) são mostradas na Patente US N° 6.716.626 e Publicação de Patente US N° 20040259780. Moléculas de ácido nucleico que codificam FGF-21 e polipéptidos FGF-21 incluindo mutantes e métodos que expressam e purificam polipéptidos FGF-21 são bem conhecidos e incluem, mas não são limitados a, aqueles revelados na Patente US N° 6.716.626; Publicações de Patente US N° 2005/0176631, 2005/0037457, 2004/0185494, 2004/0259780, 2002/0164713, e 2001/0012628; documento WO 01/36640; documento WO 03/011213; documento WO 03/059270; documento WO 04/110472; documento WO 05/061712; documento WO 05/072769; documento WO 05/091944; documento WO 05/113606; documento WO 06/028595; documento WO 06/028714; 43 documento WO 06/050247; documento WO 06/065582; documento WO 06/078463. O termo "polipéptido FGF-21" também inclui os sais e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, e pró-fármacos dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente activos, variantes biologicamente activa e estereoisómeros do FGF-21 de ocorrência natural bem como agonista, mimético, e variantes antagonista do FGF-21 de ocorrência natural e fusões de polipéptido do mesmo. Fusões que compreendem aminoácidos adicionais na terminação amino, terminação carboxilo, ou ambos, são abrangidas pelo termo "polipéptido FGF-21." Fusões de exemplo incluem, mas não são limitados a, por exemplo, FGF-21 metionilo em que uma metionina se liga ao terminal N de FGF-21 que resulta da expressão recombinante da forma madura de FGF-21 que não possui o péptido líder ou sinal ou porção do mesmo (uma metionina liga-se à terminação N de FGF-21 que resulta da expressão recombinante), fusões para o propósito de purificação (incluindo, mas não são limitados a, a poli-histidina ou epítopos de afinidade) , fusões com péptidos que se ligam a albumina de soro e fusões com proteínas do soro tais como albumina de soro. A patente US N° 5.750.373 descreve um método para seleccionar novas proteínas tais como hormona do crescimento e variantes de fragmento de anticorpo que tem propriedades de ligação alteradas para suas respectivas moléculas receptoras. O método compreende fusionas um gene que codifica uma proteína de interesse ao domínio carboxi terminal do proteína de revestimento do gene III do fago filamentoso M13. Moléculas quiméricas que compreendem FGF-21 e uma ou mais outras moléculas, incluindo, mas não são limitados a, factor de crescimento de queratinócito (KGF) podem ser geradas (Reich-Slotky, R. et ai., J. Biol. Chem. 270: 29813-29818 (1995)). A molécula quimérica pode conter específico regiões ou fragmentos de um ou ambos do FGF-21 e moléculas KGF. Quaisquer tais 44 fragmentos podem ser preparados das proteínas por meio de métodos bioquímicos padrão, ou por meio da expressão de um polinucleótido que codifica o fragmento. 0 FGF-21, ou um fragmento do mesmo, pode ser produzido como uma proteína de fusão que compreende albumina de soro humana (HSA) ou uma porção do mesmo. Tal construções de fusão são adequadas para potenciar a expressão do FGF-21, ou fragmento do mesmo, numa célula hospedeira eucariótica. Porções HSA de exemplo incluem o polipéptido N-terminal (aminoácidos 1-369, 1-419, e comprimentos intermediários começando com aminoácido 1), como revelados na Patente US N° 5.766.883, e publicação PCT WO 97/24445. Outros polipéptidos quiméricos podem incluir uma proteína de HSA com FGF- 21, ou fragmentos da mesma, unida a cada uma das extremidades C-terminal e N-terminal da HSA. Tais construções de HSA são reveladas em Patente US N° 5.876.969. Expressão de células de mamífero de FGF-21 é descrito no documento WO 2005/091944. Várias referências revelam modificação dos polipéptidos por meio de conjugação de polímero ou glicosilação. O termo "polipéptido FGF-21" inclui polipéptidos conjugados a um polímero tal como PEG e podem ser comprendidos de um ou mais derivatizações adicionais de cisteína, lisina, ou outros resíduos. Além disso, o polipéptido FGF-21 pode compreender um linker ou polímero, em que o aminoácido ao qual o linker ou polímero é conjugado pode ser um aminoácido não natural de acordo com a presente invenção, ou pode ser conjugado a um aminoácido codificado naturalmente utilizando técnicas conhecidas na especialidade tal como acoplamento to lisina ou cisteína. A conjugação de polímero de FGF-21 e outros polipéptidos foi reportada. Veja-se, por exemplo, o documento WO 2005/091944. A patente US N° 4.904.584 revela polipéptidos depletados de lisina PEGlidados, em que pelo menos um resíduo de lisina foi deletado ou substituído com 45 qualquer outro resíduo de aminoácido. 0 documento WO 99/67291 revela um processo para conjugar uma proteína com PEG, em que pelo menos um resíduo de aminoácido na proteína é deletado e a proteína é posta em contacto com PEG sob condições suficientes para conseguir conjugação à proteína. 0 documento WO 99/03887 revela variantes PEGilados de polipéptidos que pertencem à superfamília da hormona do crescimento, em que um resíduo de cisteína foi substituído com um resíduo de aminoácido não essencial localizado numa região específica do polipéptido. O documento WO 00/26354 revela um método de produção de um variante de polipéptido glicosilado com alerginicidade reduzida, que em comparação com um polipéptido parental correspondente compreende pelo menos um local de glicosilação adicional. A patente US N° 5.218.092 revela a modificação de factor estimulante de colónia de granulócito (G-CSF) e outros polipéptidos de modo a introduzir pelo menos uma cadeia de hidrato de carbono adicional em comparação com polipéptido nativo. 0 termo "polipéptido FGF-21" também inclui FGF-21 glicosilado, tal como, mas não são limitados a, os polipéptidos glicosilados em qualquer posição de aminoácido, formas glicosiladas ligadas em N ou ligadas no do polipéptido. Variantes contendo mudanças de nucleótido único são também considerados como variantes biologicamente activos de polipéptido FGF-21. Além disso, variantes splice são também incluídas. O termo "polipéptido FGF-21" também inclui heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros, ou homomultímeros de polipéptido FGF-21 de qualquer um ou mais polipéptidos FGF-21 ou qualquer outro polipéptido, proteína, hidrato de carbono, polímero, molécula pequena, linker, ligando, ou outra molécula biologicamente activa de qualquer tipo, ligado por meios químicos ou expresso como uma proteína de fusão, bem como análogos de polipéptido contendo, por exemplo, específico deleções ou outras modificações ainda mantém actividade biológica.
Todas as referências a posições de aminoácido em FGF-21 descrito no presente documento são baseadas na posição na SEQ ID NO: 1, a não ser que de outro modo especificado (isto é, quando é indicado que a comparação baseia-se nas SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou outra sequência de FGF-21). Por exemplo, o aminoácido na posição 77 de SEQ ID NO: 1, é uma arginina e a arginina correspondente está localizado na SEQ ID NO: 2 na posição 87. Os peritos na especialidade irão apreciar que as posições de aminoácido que correspondem às posições na SEQ ID NO: 1 podem ser prontamente identificadas em qualquer outras molécula de FGF-21 tal como SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, e 7. Os peritos na especialidade irão apreciar que posições de aminoácido que correspondem às posições em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou qualquer outra sequência de FGF-21 pode ser prontamente identificadas em qualquer outras molécula de FGF-21 tal como fusões, variantes, fragmentos de FGF-21, etc. Por exemplo, programas de alinhamento de sequência tais como BLAST podem ser usados para alinhar e identificar uma posição particular numa proteína que corresponde com uma posição em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou outra sequência de FGF-21. Substituições, deleções ou adições de aminoácidos descritos no presente documento em referência a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou outra sequência de FGF-21 têm a intenção de também referem-se a substituições, deleções ou adições em posições correspondentes em fusões, variantes, fragmentos de FGF-21, etc. descritas no presente documento ou conhecidas na técnica e são expressamente abrangidas pela presente invenção. 0 termo "polipéptido FGF-21" ou "FGF-21" abrange polipéptidos FGF-21 que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido, adições ou deleções. Os polipéptidos FGF-21 da presente invenção compreendem modificações com um ou mais aminoácidos naturais juntamente com uma modificação aminoácido não natural. Substituições de exemplo numa ampla variedade de posições de aminoácido em polipéptidos FGF-21 de ocorrência natural foram descritas, incluindo, mas não são limitados a substituições que modulam a estabilidade farmacêutica, que modulam uma ou mais da actividades biológicas do polipéptido FGF-21, tal como, mas não são limitados a, aumento de actividade agonista, aumento de solubilidade do polipéptido, diminuição de susceptibilidade a protease, conversão do polipéptido num antagonista, etc. e são abrangidas pelo termo "polipéptido FGF-21." Em algumas formas de realização, o antagonista de FGF-21 compreende um aminoácido codificado de forma não natural ligado a um polímero solúvel em água que é presente numa região de ligação de receptor da molécula de FGF-21.
Em algumas formas de realização da invenção, os polipéptidos FGF-21 compreendem ainda uma adição, substituição ou deleção que modula a actividade biológica do polipéptido FGF-21. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular uma ou mais propriedades ou actividades de FGF-21. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular a afinidade para o receptor de polipéptido FGF-21, modular a semivida de circulação, modular a semivida terapêutica, modular a estabilidade do polipéptido, modular a clivagem por meio de proteases, modular dose, modular a libertação ou bio-disponibilidade, facilitar a purificação, ou melhorar ou alterar uma via particular de administração. De maneira similar, os polipéptidos FGF-21 podem compreender sequências de clivagem de protease, grupos reactivos, domínios de ligação a anticorpo (incluindo, mas não são limitados a, FLAG ou poli- His) ou outras sequências baseadas em afinidade (incluindo, mas não são limitados a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, mas não são limitados a, biotina) que melhoram a detecção 48 (incluindo, mas não são limitados a, GFP), purificação ou outros traços do polipéptido. 0 termo "polipéptido FGF-21" também abrange homodímeros, heterodimeros, homomultimeros, e heteromultimeros que são ligados, incluindo, mas não são limitados a aqueles ligados directamente via cadeias laterais de aminoácido codificado de forma não natural, às mesmas ou diferentes cadeias laterais de aminoácido codificado de forma não natural, a cadeias laterais de aminoácido codificadas de forma natural, ou indirectamente via um linker. Linkers de exemplo incluindo, mas não são limitados a, compostos orgânicos pequenos, polímeros solúveis em água de uma variedade de comprimentos tais como poli(etileno glicol) ou polidextrano, ou polipéptidos de vários comprimentos.
Um "aminoácido codificado de forma não natural" refere-se a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteina. Outros termos que podem ser usados como sinónimos com o termo "aminoácido codificado de forma não natural" são "aminoácido não natural," "aminoácido inatural," "aminoácido de ocorrência não natural," e várias versões com hífen ou sem hífen do mesmo. O termo "aminoácido codificado de forma não natural" também inclui, mas não é limitado a, aminoácidos que ocorrem pela modificação (por exemplo, modificações pós-traducional) de um aminoácido codificado naturalmente (incluindo, mas não são limitados a, os 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteina), mas não são os próprios naturalmente incorporados numa cadeia de polipéptido crescente pelo complexo de tradução. Exemplos de tal aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não são limitados a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina, e O-fosfotirosina. 49
Um "grupo de modificação do terminal amino" refere-se a qualquer molécula que pode ser unida à terminação amino de um polipéptido. De maneira similar, um "grupo de modificação do terminal carboxi" refere-se a qualquer molécula que pode ser unida à terminação carboxi de um polipéptido. Grupos de modificação terminal incluem, mas não são limitados a, vários polímeros solúveis em água, péptidos ou proteínas tais como albumina de soro, ou outras fracções que aumentam a semivida no soro de péptidos.
Os termos "grupo funcional", "fracção activa", "grupo de activação", "grupo abandonante", "local reactivo", "grupo quimicamente reactivo" e "fracção quimicamente reactiva" são usados na técnica e no presente documento para se referir a porções distintas, definível ou unidades de uma molécula. Os termos são de certa forma sinónimos na especialidade química e são usados no presente documento para indicar as porções de moléculas que realizam alguma função ou actividade e são reactivos com outras moléculas. 0 termo "ligação" ou "linker" é usado no presente documento para se referir a grupos ou ligações que normalmente são formadas como o resultado de um reacção química e tipicamente são ligações covalentes. Ligações hidroliticamente estáveis significa que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis, incluindo, mas não são limitados a, sob condições fisiológicas durante um período de tempo estendido, talvez até indefinidamente. Ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Como entendido na técnica, PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na estrutura do polímero ou no grupo linker entre a estrutura do polímero e um ou mais dos 50 grupos funcionais terminal da molécula de polímero. Por exemplo, ligações de éster formada pela reacção de ácidos carboxílicos PEG ou ácidos carboxílicos PEG activados com grupos álcool num agente biologicamente activo geralmente hidrolisam sob condições fisiológicas para libertar o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não são limitados a, ligações carbonato; ligações imina que resultam da reacção de uma amina e um aldeído; ligações de fosfato de éster formado pela reacção de um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são o produto de reacção de um hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto de reacção de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto de reacção de um formiato e um álcool; ligações de péptido formado por um grupo amina, incluindo, mas não são limitados a, numa extremidade de um polímero tal como PEG, e um grupo carboxilo de um péptido; e ligações de oligonucleótido formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não são limitados a, na extremidade de um polímero, e um grupo hidroxilo 5' de um oligonucleótido. O termo "molécula biologicamente activa", "fracção biologicamente activa" ou " agente biologicamente activo " quando é usado no presente documento significa qualquer substância que pode afectar qualquer propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, via, molécula, ou interacção com relação a a um organismo, incluindo, mas não são limitados a, vírus, bactérias, bacteriófago, transposon, prião, insectos, fungos, plantas, animais, e seres humanos. Em particular, como é usado no presente documento, moléculas biologicamente activas incluem, mas não são limitadas a, qualquer substância pretendida para diagnóstico, cura, mitigação, tratamento, ou prevenção de doença em seres humanos ou outros animais, ou para de outro modo potenciar o bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente 51 activas incluem, mas não são limitados a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequena, vacinas, imunogénios, fármacos pesados, fármacos leves, hidratos de carbono, átomos ou moléculas inorgânicas, corantes, lípidos, nucleósidos, radionuclídeos, oligonucleótidos, toxóides, toxinas, células procariótica e eucariótica, vírus, polissacáridos, ácidos nucleicos e porções dos mesmos obtidas ou derivadas de vírus, bactérias, insectos, animais ou qualquer outra célula ou tipo celular, lipossomas, micropartículas e micelas. Classes de agentes biologicamente activos que são adequados para utilização com a invenção incluem, mas não são limitados a, fármacos, pró-fármacos, radionuclídeos, agentes de obtenção de imagem, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes anti-viral, agentes anti-inflamatórios, agentes anti-tumor, agentes cardiovascular, anti-ansiedade agentes, hormonas, factores de crescimento, agentes esteróides, toxinas derivadas de micróbios, e similares.
Um "polímero bifuncional" refere-se a um polímero que compreende dois grupos funcionais diferenciados que são capazes de reagir especificamente com outras fracções (incluindo, mas não são limitados a, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligação covalente ou não covalentes. Um linker bifuncional que tem um grupo funcional reactivo com um grupo num componente biologicamente activo, particular e outro grupo reactivo com um grupo num segundo componente biológico, pode ser usado para formar um conjugado que inclui o primeiro componente biologicamente activo, o linker bifuncional e o segundo componente biologicamente activo. Muitos procedimentos e linker moléculas para a união de várias compostos a péptidos são conhecidos. Veja-se, por exemplo, Publicação de Patente Europeia No. 188,256; Patente US Nos. 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784; 4.680.338; e 4.569.789. Um "polímero multi-funcional" refere-se a um 52 polímero que compreende dois ou mais grupos funcionais diferenciados que são capazes de reagir especificamente com outras fracções (incluindo, mas não são limitados a, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalente ou não covalente. Um polímero bi-funcional ou polímero multifuncional pode ser qualquer de comprimento ou peso molecular desejado, e pode ser seleccionado para proporcionar um espaçamento ou conformação particular desejado entre uma ou mais moléculas ligadas a FGF-21 e seu receptor ou FGF-21.
Onde grupos substituintes são especificados pelas suas convencional fórmulas químicas, escritas da esquerda para a direita, igualmente abrangem os substituintes quimicamente idênticos que resultariam de escrever a estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, a estrutura -CH20- é equivalente à estrutura -OCH2-. 0 termo "substituintes" inclui, mas não é limitado a "substituintes não interferentes". "Substituintes não interferentes" são aqueles grupos que rendem compostos estáveis. Substituintes não interferentes ou radicais adequados incluem, mas não são limitados a, halo, alquilo Ci -Cio, alcenilo C2-Ci0, alcinilo C2-Ci0, alcoxi C1-C10, aralquilo C1-C12, alcarilo Ci-Ci2, cicloalquilo C3-C12, cicloalcenilo C3-Ci2, fenilo, fenilo substituído, toluoilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-Ci2, alcoxiarilo C2-Ci2, ariloxialquilo C7-Ci2, oxiarilo C7-Ci2, alquilsulf inilo Ci-C6, alquilsulfonilo C1-C10, —(CH2)m —0—(C1-C10 alquil) em que m é desde 1 até 8, arilo, arilo substituído, alcoxi substituído, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, nitroalquilo, —N02, —CN, NRC(O) — ( alquil C1-C10) , —C(0) — ( alquil C1-C10), alquilo C2-Cio tioalquilo, —C(0)0—( alquil C1-C10), —OH, — S02, = S, —COOH, —NR2, carbonilo, —C(0) — ( alquil C1-C10)-CF3,-C(0)—CF3, —C(0)NR2, —( aril Cí-CíoJ-S—( aril C6-C10), — C(0) —( aril C1-C10), —(CH2)m —0- (— (CH2) m—0— ( alquil C7- 53 C10) em que cada m é desde 1 até 8, —C(0)NR2, —C(S)NR2, — S02NR2, —NRC(O) NR2, —NRC(S) NR2, sais do mesmo, e similares. Cada R como é usado no presente documento é H, alquilo ou alquilo substituído, arilo ou arilo substituído, aralquilo, ou alcarilo. 0 termo bromo. "halogénio" inclui flúor, cloro, iodo, e 0 termo "alquilo," em si ou como parte de outro substituinte, significa, a não ser que de outro modo indicado, um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, ou cíclico, ou combinação dos mesmos, que pode ser completamente saturado, mono- ou poliinsaturado e pode incluir radicais di- e multivalentes, que tem o número de átomos de carbono designado (isto é, C1-C10 significa de um a dez carbonos). Exemplos de radicais hidrocarboneto saturado incluem, mas não são limitados a, grupos tais como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por exemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, e similares. Um grupo alquilo insaturado é um que tem um ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Exemplos de grupos alquilo insaturado incluem, mas não são limitados a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienil), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienil), etinilo, 1- e 3-propunilo, 3-butunilo, e os homólogos e isómeros de cadeia mais longa. 0 termo "alquilo," a não ser que de outro modo noted, também quer dizer que inclui aqueles derivados de alquilo definido em mais detalhe a seguir, tal como "heteroalquilo." Os grupos alquilo que são limitados a grupos hidrocarboneto são denominados "homoalquilo". 0 termo "alquileno" em si ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de um alcano, como exemplificado, mas não limitado, pelas estruturas -CH2CH2- e —CH2CH2CH2CH2-, e inclui ainda aqueles 54 grupos descritos de seguida como "heteroalquileno." Tipicamente, um grupo alquilo (ou alquileno) terá desde 1 até 24 átomos de carbono, com aqueles grupos que tem 10 ou menos átomos de carbono sendo uma forma de realização particular dos métodos e composições descritos no presente documento. Um "alquil de cadeia curta" ou "alquileno de cadeia curta" é uma cadeia mais curta grupo alquilo ou alquileno, geralmente que tem oito ou menos átomos de carbono.
Os termos "alcoxi," "alquilamino" e "alquiltio" (ou tioalcoxi) são usados em seu sentido convencional, e referem-se a aqueles grupos alquilo unidos ao restante da molécula via um átomo de oxigénio, um grupo amino, ou um átomo de enxofre, respectivamente. O termo "heteroalquilo," em si ou em combinação com outro termo, significa, a não ser que de outro modo indicado, um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada estável, ou cíclico, ou combinações dos mesmos, que consiste no número indicado de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo seleccionado a partir do grupo que consiste em O, N, Si e S, e em que os átomos de azoto e de enxofre podem opcionalmente ser oxidados e o heteroátomo de azoto pode opcionalmente ser quaternizado. 0(s) heteroátomo(s) O, N e S e Si podem ser colocados em posição qualquer interior do grupo heteroalquilo ou na posição em que o grupo alquilo é unido ao restante da molécula. Exemplos incluem, mas não são limitados a, -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,- S(0)-CH3, -CH2-CH2-S (O) 2-CH3,-CH = H—O— CH3, -Si(CH3)3, -ch2- CH = N-OCH3, e -CH = CH-N (CH3)-CH3. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, tal como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e -CH2-0-SÍ(CH3) 3. De maneira similar, o termo "heteroalquileno" em si ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de heteroalquilo, como exemplificado, mas não limitado por, -CH2-CH2-S-CH2- 55 CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno, os mesmos ou diferentes heteroátomos podem também ocupar qualquer ou ambas as terminações da cadeia (incluindo, mas não são limitados a, alquilenooxi, alquilenodioxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, aminooxialquileno, e similares). Ainda adicionalmente, para grupos de ligação alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação está implicada pela direcção em que a fórmula do grupo de ligação é escrita. Por exemplo, a fórmula C(0)2R'- representa tanto -C(0)2R'- como -R'C(0)2-·
Os termos "cicloalquil" e "heterocicloalquil", em si ou em combinação com outros termos, representam, a não ser que de outro modo indicado, versões cíclicas de "alquil" e "heteroalquil", respectivamente. Assim, um cicloalquilo ou heterocicloalquilo incluem ligações de anel saturado, parcialmente insaturado e completamente insaturado. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, um heteroátomo pode ocupar a posição em que o heterociclo está unido ao restante da molécula. Exemplos de cicloalquilo incluem, mas não são limitados a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, e similares. Exemplos de heterocicloalquilo incluem, mas não são limitados a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridil), 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morpholinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrothien-2-ilo, tetrahidro- tien-3-ilo, 1- piperazinilo, 2-piperazinilo, e similares. Adicionalmente, o termo abrange estruturas de anel bicíclico e tricíclico. De maneira similar, o termo "heterocicloalquileno" em si ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de heterocicloalquilo, e o termo "cicloalquileno" em si ou como parte de outro substituinte significa um divalente radical derivado de cicloalquilo.
Como é usado no presente documento, o termo "polímero solúvel em água" refere-se a qualquer polímero que é 56 solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água a polipéptidos FGF-21 pode resultar em mudanças incluindo, mas não são limitadas a, semivida aumentada ou modulada no soro, ou semivida aumentada ou modulada terapêutica com relação à forma não modificada, imunogenicidade modulada, características de associação física modulada tais como agregação e formação multímero, ligação alterada de receptor, ligação alterada a um ou mais parceiros de ligação, e dimerização ou multimerização de receptor alterada. 0 polímero solúvel em água pode ou pode não ter sua própria actividade biológica, e pode ser utilizado como um linker para ligar FGF-21 a outras substâncias, incluindo, mas não são limitados a um ou mais polipéptidos FGF-21, ou uma ou mais moléculas biologicamente activas. Polímeros adequados incluem, mas não são limitados a, polietileno glicol, polietileno glicol propionaldeído, derivados mono C1-C10 alcoxi ou ariloxi do mesmo (descrito em Patente US N° 5.252.714), monometoxi- polietileno glicol, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, poliaminoácidos, diviniléter, anhydride maleico, N-(2-Hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados dextrano incluindo sulfato de dextrano, óxido de polioxietilado, polissacáridos, derivados de a metilcelulose polipropilenoglicol, copolímero de polipropileno/óxido de etileno, poliol heparina, fragmentos heparina, oligossacáridos, glicanos, celulose e celulose, incluindo, mas não são limitados e carboximetil celulose, amido e derivados de amido, os polipéptidos, polialquileno glicol e derivados do mesmo, copolímeros de polialquileno glicóis e derivados do mesmo, polivinil etil éteres, e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, e similares, ou misturas dos mesmos. Exemplos de tais polímeros solúveis em água incluem, mas não são limitados a, polietileno glicol e albumina de soro. 57
Como é usado no presente documento, o termo "polialquileno glicol" ou "poli(alqueno glicol)" refere-se a polietileno glicol (polietileno glicol)), polipropileno glicol, polibutileno glicol, e derivados dos mesmos. 0 termo "polialquileno glicol" abrange polímeros tanto linear como ramificado e pesos moleculares médio de entre 0,1 kDa e 100 kDa. Outras formas de realização de exemplo são listadas, por exemplo, em catálogos de fornecedores comerciais, tais como o catálodo da Shearwater Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001). O termo "aril" significa, a não ser que de outro modo indicado, um substituinte hidrocarboneto poliinsaturado, aromático, que pode ser um único anel ou múltiplos anéis (incluindo, mas não são limitados a, desde 1 até 3 anéis) que são fusionados juntamente ou ligados covalentemente. O termo "heteroaril" refere-se a grupos arilo (ou anéis) que contêm desde um até quatro heteroátomos seleccionadod a partir de N, O, e S, em que os átomos de azoto e enxofre são opcionalmente oxidados, e o(s) átomo(s)azoto são opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroarilo pode ser unido ao restante da molécula através de um heteroátomo. Exemplos não limitativos de grupos arilo e heteroarilo incluem fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3- pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4- isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3- piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolilo, 5- indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoqui- nolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, e 6-quinolilo. Substituintes para cada um dos sistemas de anel arilo e heteroarilo notificados anteriormente são seleccionados a 58 partir do grupo de substituintes aceitáveis descritos de seguida.
Por brevidade, o termo "aril" guando é usado em combinação com outros termos (incluindo, mas não são limitados a, ariloxi, ariltioxi, arilalquil) inclui tanto anéis arilo como heteroarilo como definido anteriormente. Assim, o termo "arilalquil" tem a intenção de incluir aqueles radicais em que um grupo arilo é unido a um grupo alquilo (incluindo, mas não são limitados a, benzilo, fenetilo, piridilmetilo e similares) incluindo aqueles grupos alquilo em que um átomo de carbono (incluindo, mas não são limitado a, um grupo metileno) foi substituído por, por exemplo, um átomo de oxigénio (incluindo, mas não são limitados a, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3 —(1 — naftiloxi)propilo, e similares).
Cada um dos termos anteriores (incluindo, mas não são limitados a, "alquilo," "heteroalquilo," "aril" e "heteroaril") têm a intenção de incluir formas tanto substituídas como não substituídas do radical indicado. Os substituintes de exemplo para cada tipo de radical são proporcionados se seguida.
Substituintes para os radicais alquilo e heteroalquilo (incluindo aqueles grupos com frequência denominados como alquileno, alcenilo, heteroalquileno, heteroalcenilo, alcinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalcenilo, e heterocicloalquenil) podem ser um ou mais de uma variedade de grupos seleccionados a partir de, mas não são limitados a: -0R', = 0, = NR’, = N-OR', -NR’R", -SR', -halogénio, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R', -C0NR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R"') = NR"", -NR-C(NR'R") = NR"', -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN e -N02 num número que varia desde zero até (2m'+l), onde m' é o número total de átomos de carbono em tal um radical. R', R", R" ' e R"" cada um independentemente se referem a hidrogénio, heteroalquilo 59 substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, incluindo, mas não são limitados a, arilo substituído com 1-3 halogénios, alquilo substituído ou não substituído, grupos alcoxi ou tioalcoxi, ou grupos arilalquilo. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente seleccionado como são cada um dos grupos R', R", R'" e R'"' quando mais de um destes grupos está presente. Quando R' e R" são unidos ao mesmo átomo de azoto, podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 5, 6, ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R" tem a intenção de incluir, mas não ser limitado a, 1-pirrolidinilo e 4-morfolinilo. A partir da discussão anterior de substituintes, um perito na especialidade irá entender que o termo "alquil" tem a intenção de incluir grupos incluindo átomos de carbono ligados a grupos diferentes de grupos hidrogénio, tais como haloalquilo (incluindo, mas não são limitados a, -CF3 e -CH2CF3) e acilo (incluindo, mas não são limitados a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, - C(0)CH20CH3, e similares).
Similar aos substituintes descritos para o radical alquilo, substituintes para os grupos arilo e heteroarilo são variados e são seleccionado a partir de, mas não são limitados a: halogénio, -0R', = 0, = NR', = N-OR', -NR' R", -SR', -halogénio, -SiR'R"R'", -0C(0)R\ -C(0)R\ -C02R',- CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R'") = NR"", -NR-C(NR'R") = NR , - S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R', -CN e -N02, -R', - N3, -CH(Ph)2, fluoro (Ci-C4) alcoxi, e fluoro (Ci-C4) alquilo, num número que varia desde zero até o número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e onde R', R", R" ' e R"" são independentemente seleccionados a partir de hidrogénio, alquilo, heteroalquilo, arilo e heteroarilo. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente 60 seleccionado como são cada um dos grupos R', R", R'" e R"" quando mais de um destes grupos está presente.
Como é usado no presente documento, o termo "semivida modulada no soro" significa a mudança positiva ou negativa em semivida em circulação de um FGF-21 modificado com relação a sua forma não modificada. A semivida no soro é medida tomando amostras de sangue em várias pontos de tempo após a administração de FGF-21, e determinando a concentração dessa molécula em cada amostra. Correlação da concentração no soro com tempo possibilita o cálculo da semivida no soro. Semivida aumentada no soro de maneira desejável tem pelo menos cerca de duas vezes, mas um aumento menor pode ser útil, por exemplo, onde possibilita um regime de dosagem satisfatório ou evita um efeito tóxico. Em algumas formas de realização, o aumento é pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes. O termo "semivida modulada terapêutica" como é usado no presente documento significa a mudança positiva ou negativa na semivida da quantidade terapeuticamente eficaz de FGF-21, com relação à sua forma não modificada. A semivida terapêutica é medida medindo as propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em vários pontos de tempo após a administração. A semivida aumentada terapêutica de maneira desejável possibilita um particular regime de dosagem benéfico, uma particular dose total benéfica, ou evita um efeito indesejado. Em algumas formas de realização, a semivida terapêutica aumentada resulta de potência aumentada; ligação aumentada ou diminuída da molécula modificada a seu alvo, quebra aumentada ou diminuída da molécula por enzimas tais como proteases, ou um aumento ou diminuição em outro parâmetro ou mecanismo de acção da molécula não modificada ou um aumento ou diminuição em depuração mediada por receptor da molécula. 61 0 termo "isolado," quando aplicado a um ácido nucleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou proteína é livre de pelo menos alguns dos componentes celulares com que é associado no estado natural, ou que o ácido nucleico ou proteína foi concentrado a um nível superior à concentração de sua produção in vivo ou in vitro. Pode estar num estado homogéneo. Substâncias isoladas podem estar num estado seco ou semi-seco, ou em solução, incluindo, mas não são limitados a, um solução aquosa. Pode ser um componente de uma composição farmacêutica que compreende veículoes farmaceuticamente aceitáveis e/ou excipientes adicionais. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analítica tais como electroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto rendimento. Uma proteína que é a espécie predominante presente numa preparação é substancialmente purificada. Em particular, um gene isolado é separado de grelhas de leitura aberta que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse. 0 termo "purificado" denota que um ácido nucleico ou proteína origina substancialmente um banda num gel de electroforese. Particularmente, pode significar que o ácido nucleico ou proteína é pelo menos 85 % puro, pelo menos 90 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 99 % ou maior puro. O termo "ácido nucleico" refere-se a desoxiribonucleótidos, desoxiribonucleósidos, ribonucleósidos, ou ribonucleótidos e polímeros dos mesmos em forma de cadeia simples ou dupla. A não ser que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo conhecido análogos de nucleótidos natural que têm propriedades de ligação similares como o ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar a nucleótidos de ocorrência natural. A não ser que especificamente limitado de outro modo, o termo também 62 62 modificados mas não são de codão) e a sequência substituições refere-se a análogos de oligonucleótido incluindo PNA (peptidoácido nucleico), análogos de ADN usados em tecnologia antisense (fosforotioatos, fosforoamidatos, e similares) . A não ser que de outro modo indicado, uma sequência de ácido nucleico particular também implicitamente abrange variantes conservativamente dos mesmos (incluindo, limitados a, substituições degeneradas sequências complementares bem como explicitamente indicada. Especificamente, degeneradas de codão podem ser conseguidas pela geração de sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) codões seleccionados é substituído com base mista e/ou resíduos de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)) .
Os termos "polipéptido," "péptido" e "proteína" são usados de maneira intercambiável no presente documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Isto é, uma descrição direccionada a um polipéptido se aplica igualmente a um descrição de um péptido e uma descrição de uma proteína, e vice versa. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido de ocorrência natural bem como polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido codificado de forma não natural. Como é usado no presente documento, os termos abrangem cadeias de aminoácido de qualquer comprimento, incluindo proteínas comprimento completo, em que os resíduos de aminoácido são ligados por ligações paptídicas covalentes. O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e de ocorrência não natural, bem como análogos de aminoácido e aminoácido miméticos que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência 63 natural. Os aminoácidos codificados naturalmente são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, e valina) e pirrolisina e selenocisteina. Análogos de aminoácido refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um carbono que é ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino, e um grupo R, tal como, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, sulfónio de metionina metilo. Tal análogos têm grupos R modificados (tal como, norleucina) ou estruturas de péptido modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Referência a um aminoácido inclui, por exemplo, L-aminoácidos proteogénicos de ocorrência natural; D-aminoácidos, aminoácidos quimicamente modificados tais como variantes de aminoácido e derivados; aminoácidos de ocorrência natural não proteogénicos tais como p-alanina, ornitina, etc.; e compostos quimicamente sintetizados que tem propriedades conhecidas na técnica por ser característica de aminoácidos. Exemplos de aminoácidos de não ocorrência natural incluem, mas não são limitados a, cx-metil aminoácidos (por exemplo, α-metilo alanin), D-aminoácidos, aminoácidos semelhantes à histidina (por exemplo, 2-amino-histidina, β-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina e α-metilhistidina) , aminoácidos que tem um metileno extra na cadeia lateral ("homo" aminoácidos), e aminoácidos em que um grupo funcional ácido carboxílico na cadeia lateral é substituído com um ácido sulfónico grupo (por exemplo, ácido cisteico).
Aminoácidos podem ser denominados no presente documento por seus símbolos comummente conhecido de três letras ou pelos símbolos de uma letra recomendado pela 64
Comissão de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. Os nucleótidos, do mesmo modo, podem ser denominados por seus códigos de uma letra comummente aceitos. "Variantes modificadas conservativamente" se aplica a tanto sequências de aminoácido como de ácido nucleico. Com respeito a particular sequências de ácido nucleicos, "variantes modificadas conservativamente" refere-se a aqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácido, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam qualquer dada proteína. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado a qualquer um dos codões correspondentes descritos sem alterar o polipéptido codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas," que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácido nucleico no presente documento que codifica um polipéptido também descreve cada possível variação silente do ácido nucleico. Um perito com habilidade ordinária na especialidade irá reconhecer que cada codão num ácido nucleico (excepto AUG, que é geralmente o único codão para metionina, e TGG, que é geralmente o único codão para triptofano) podem ser modificados para proporcionar uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silente de um ácido nucleico que codifica um polipéptido é implícita em cada sequência descrita.
Como para as sequências de aminoácido, um perito com habilidade ordinária na especialidade irá reconhecer que substituições individuais, deleções ou adições a uma sequência de ácido nucleico, péptido, polipéptido, ou 65 proteína que altera, adiciona ou deleta um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é um "variante conservativamente modificadas" onde a alteração resulta na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido, ou substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Quadros substituição conservativa que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são conhecidos pelos peritos com habilidade ordinária na especialidade. Tais variantes modificadas conservativamente são além de e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies, e alelos da invenção.
Quadros substituição conservativa que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são conhecidos pelos peritos com habilidade ordinária na especialidade. Os seguintes oito grupos cada um contém aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T) ; e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (veja-se, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2a edição (Dezembro de 1993)
Os termos "idênticas" ou percentagem de "identidade," no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipéptido, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. As sequências são "substancialmente idênticas" se têm uma percentagem de resíduos de aminoácido ou nucleótidos que são iguais (isto 66 é, cerca de 60 % de identidade, cerca de 65 %, cerca de 70 o o r cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 o o r ou cerca de 95 % de identidade ao longo de uma região específica), quando comparado e alinhado para uma correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência (ou outros algoritmos disponíveis pessoas de perícia ordinária na especialidade) ou por meio de alinhamento manual e inspecção visual. Esta definição também refere-se o complemento de uma sequência de teste. A identidade pode existir ao longo de uma região que é pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleótidos em comprimento, ou ao longo de uma região que é 75-100 aminoácidos ou nucleótidos em comprimento, ou, onde não for especificado, através da totalidade da sequência de um polinucleótido ou polipéptido. Um polinucleótido que codifica um polipéptido da presente invenção, incluindo homólogos de espécies diferentes de ser humano, pode ser obtido por um processo que compreende as etapas de rastreio de uma biblioteca sob condições restringentes de hibridação com um sonda marcada que tem uma sequência de polinucleótidos da invenção ou um fragmento do mesmo, e isolar ADNc de comprimento completo e clones genómicos contendo dita sequência de polinucleótidos. Tal técnicas de hibridação são bem conhecidas pelo perito na especialidade.
Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência, a qual sequências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequência, sequências de teste e referência são introduzidas num computador, coordenadas de subsequência são desenhadas, se for necessário, e parâmetros de programa algoritmo de sequência são desenhados. Parâmetros de programa pré-definidos podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser desenhados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula a 67 percentagem de identidades de sequência para as sequências de teste relativas à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa.
Um "janela de comparação ", como é usado no presente documento, inclui referência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguas seleccionadas a partir do grupo que consiste em desde 20 até 600, usualmente de cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente de cerca de 100 a cerca de 150 em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem alinhadas optimamente. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são conhecidos pelos peritos com habilidade ordinária na especialidade. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser conduzido, incluindo, mas não são limitados a, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BE- STFIT, FASTA, e TFASTA no pacote de Software de Wisconsin Genetics, Grupo de Computador de genética, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por meio de alinhamento manual e inspecção visual (veja-se, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento)).
Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. O software para realizar análises por BLAST esta publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information disponível na 68
Internet em ncbi.nlm.nih.gov. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determina a sensibilidade e velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN (para sequências de nucleótido) usa como defaults um comprimento de palavra (W) de 11, um expectativa (E) ou 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambos cadeias. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como defaults um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (veja-se Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad Sei. USA 89:10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo de BLAST é tipicamente realizado com o filtro "baixa complexidade" desligado. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (veja-se, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787). Uma medida de similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleótido ou aminoácido ocorreriam por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade de menor soma num comparação do ácido nucleico de teste ao ácido nucleico de referência é de menos de cerca de 0,2, ou menos de cerca de 0,01, ou menos de cerca de 0,001. A frase "selectivamente (ou especificamente) híbrida a" refere-se à ligação, duplexação, ou hibridação de uma molécula somente a uma sequência de nucleótido particular sob condições restringentes de hibridação quando essa sequência está presente numa mistura complexa (incluindo, mas não são limitados a, total celular ou biblioteca ADN ou ARN) . A frase "condições restringentes de hibridação" refere-se a hibridação de sequências de ADN, ARN, PNA, ou 69 outra imitação de ácido nucleico, ou combinações dos mesmos sob condições de baixa força iónica e alta temperatura como é conhecido na técnica. Tipicamente, sob condições restringentes uma sonda hibridará a sua subsequência alvo numa mistura complexa de ácido nucleico (incluindo, mas não são limitados a, total celular ou biblioteca ADN ou ARN), mas não híbrida a outraa sequências na mistura complexa. Condições restringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Sequências mais longas hibridam especificamente a temperaturas maiores. Um guia extensivo para a hibridação de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, condições restringentes são seleccionadas para ser cerca de 5-10 °C inferiores ao ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica num pH de força iónica definida. A Tm é a temperatura (sob força iónica definida, pH, e concentração nucleica) em que 50 % das sondas complementares ao alvo hibridam com a sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, a Tm, 50 % das sondas são ocupadas em equilíbrio). Condições restringentes podem ser aqueles em que a concentração de sal é menos de cerca de 1,0 M de concentração de ião de sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de ião de sódio (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (incluindo, mas não são limitados a, 10 a 50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (incluindo, mas não são limitados a, superior a 50 nucleótidos). Condições restringentes podem também ser conseguidas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Para hibridação selectiva ou específico, um sinal positivo pode ser pelo menos duas vezes hibridação de fundo, 70 opcionalmente 10 vezes hibridação de fundo. Condições restringentes de hibridação de exemplo podem ser como segue: 50 % de formamida, 5X SSC, e 1 % de SDS, incubar a 42 °C, ou 5X SSC, 1 % de SDS, incubar a 65 C, com lavagem em 0,2X SSC, e 0,1 % de SDS a 65 C. Tais lavagens podem ser realizadas durante 5, 15, 30, 60, 120, ou mais minutos.
Como é usado no presente documento, o termo "eucariota" refere-se a organismos que pertencem ao domínio filogenético Eucarya tal como animais (incluindo, mas não são limitados a, mamíferos, insectos, répteis, pássaros, etc.), ciliados, plantas (incluindo, mas não são limitados a, monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.), fungos, leveduras, flagelados, microsporidia, protistas, etc.
Como é usado no presente documento, o termo "não eucariota" refere-se a organismos não eucarióticos. Por exemplo, um organismo não eucariótico pode pertencer ao domínio filogenético Eubacteria (incluindo, mas não são limitados a, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), ou ao domínio filogenético Archaea (incluindo, mas não são limitados a, Metanococcus jannaschii, Metanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcaniiand Halobacterium species NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.). O termo "indivíduo" como é usado no presente documento, refere-se a um animal, em algumas formas de realização da invenção um mamífero, e em outras formas de realização um ser humano, que é o objecto de tratamento, observação ou experiência. Um animal pode ser um animal de companhia (por exemplo, cães, gatos, e similares), animal de fazenda (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos, e similares) ou um animal de laboratório (por exemplo, ratos, ratinhos, cobaia, e similares). 71 0 termo "quantidade eficaz" como é usado no presente documento refere-se a aquela quantidade do polipéptido de aminoácido não natural modificado sendo administrado que aliviará em algum grau um ou mais dos sintomas da doença, condição ou distúrbio a ser tratado. Composições contendo o polipéptido de aminoácido não natural modificado descrito no presente documento pode ser administrado para tratamentos profilácticos, de potenciação, e/ou terapêuticos.
Os termos "potenciar" ou "potenciamento" significa aumentar ou prolongar em potência ou duração um efeito desejado. Assim, com relação a potenciação o efeito de agentes terapêuticos, o termo " potenciamento" refere-se à capacidade de aumentar ou prolongar, em potência ou duração, o efeito de outros agentes terapêuticos num sistema. Um "eficaz de potenciamento eficaz," como é usado no presente documento, refere-se a uma quantidade adequada para potenciar o efeito de outro agente terapêutico num sistema desejado. Quando é usado num paciente, quantidades eficazes para este uso irá depender da gravidade e curso da doença, distúrbio ou condição, terapêutica anterior, o estado de saúde do paciente e resposta aos fármacos, e o julgamento do médico responsável. 0 termo "modificados," como é usado no presente documento refere-se a qualquer mudanças feitas a um dado polipéptido, tal como mudanças ao comprimento do polipéptido, a sequência de aminoácido, estrutura química, modificação co-traducional, ou modificação pós- traducional de um polipéptido. 0 termo forma "(modificada)" significa que os polipéptidos sendo discutido são opcionalmente modificados, que é, os polipéptidos sob discussão pode ser modificada ou não modificada. 0 termo "pós-traducionamente modificados" refere-se a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural que ocorre a tal aminoácido após ter sido 72 incorporado numa cadeia de polipéptido. 0 termo abrange, como forma de exemplo somente, modificações co-traducionais in vivo, modificações co-traducionais in vitro (tal como numa sistema de tradução livre de célula), modificações pós-traducionais in vivo, e modificações pós-traducionais in vitro.
Em aplicações profiláticas, composições contendo o polipéptido FGF-21 são administradas a um paciente susceptivel a ou de outro modo em risco de um doença, distúrbio ou condição particular. Tal uma quantidade é definida como sendo um "quantidade profilacticamente eficaz." Nesta utilização, as quantidades precisas também dependem do estado de saúde do paciente, peso, e similares. É considerado bem dentro da perícia na especialidade para um determinar tal quantidades profilacticamente eficazes por experiência de rotina (por exemplo, um ensaio clínico de escalonamento de dose). 0 termo "protegido" refere-se à presença de um "grupo protector" ou fracção que previne reacção do grupo quimicamente reactivo funcional sob certas condições de reacção. 0 grupo protector variará dependendo do tipo de grupo quimicamente reactivo a ser protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reactivo for uma amina ou uma hidrazida, o grupo protector pode ser seleccionado a partir do grupo de terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Se o grupo quimicamente reactivo for um tiol, o grupo protector pode ser ortopiridildisulfureto. Se o grupo quimicamente reactivo for um ácido carboxílico, tal como ácido butanóico ou propiónico, ou um grupo hidroxilo, o grupo protector pode ser benzilo ou um grupo alquilo tal como metilo, etilo, ou terc-butilo. Outros grupos protectores conhecidos na técnica podem também ser usados em ou com os métodos e composições descritos no presente documento, incluindo grupos fotolábeis tais como Nvoc e MeNvoc. Outros grupos 73 protectores conhecidos na técnica podem também ser usados em ou com os métodos e composições descritos no presente documento. 73 Por meio de exemplo somente, grupos bloquantes/protectores podem ser seleccionado a partir de: g c* Hj Qr h O allyl Bn Cbz alloc cL HjCx ,CH, 1 HjC''” ^ (HiC),C^ (H3C)3C"Si^ Et t-butyl TBDMS Hj O (CeHsíaC—- Boc pMBn trityl acetyl SI Teoc
HjC- Me
Outros grupos protectores são descritos em Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque, NY, 1999.
Em aplicações terapêuticas, composições contendo o polipéptido de aminoácido não natural modificado são administradas a um paciente que já está a sofrer de uma doença, condição ou distúrbio, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente deter os sintomas da doença, distúrbio ou condição. Tal uma quantidade é definida como sendo um "quantidade terapeuticamente eficaz," e irá depender da gravidade e curso da doença, distúrbio ou condição, terapêutica anterior, o estado de saúde do paciente e resposta aos fármacos, e o julgamento do médico responsável. É considerado bem dentro da perícia na especialidade para um determinar tais quantidades terapeuticamente eficazes por meio de experiência de rotina (por exemplo, um ensaio clínico de escalonamento de dose). 74 0 termo "tratar" é usado para se referir a tratamentos profilácticos e/ou terapêuticos.
Os polipéptidos de aminoácido codificado de forma não natural apresentados no presente documento podem incluir compostos marcados isotopicamente com um ou mais átomos substituídos por um átomo que tem um massa atómica ou número de massa diferentes da massa atómica ou número de massa usualmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos presentes compostos incluem isótopos de hidrogénio, carbono, azoto, oxigénio, flúor e cloro, tal como 2H, 3H, 13C, 14C, 1SN, 180, 170, 35S, 18F, 36C1, respectivamente. Certos compostos marcados isotopicamente descritos no presente documento, por exemplo, aqueles em que isótopos radioactivos tais como 3H e 14C são incorporados, podem ser útil em ensaios de distribuição em tecido de fármaco e/ou substrato. Além disso, substituição com isótopos tais como deutério, isto é, 2H, pode proporcionar certas vantagens terapêuticas que resulta de maior estabilidade metabólica, por exemplo, semivida aumentada in vivo ou requerimentos de dosagem reduzidos.
Todos os isómeros incluindo, mas não são limitados a diastereómeros, enantiómeros, e misturas do mesmo são considerados como parte das composições descritas no presente documento. Em formas de realização adicionais ou ainda adicionais, os polipéptidos de aminoácido codificado de forma não natural são metabolizados após administração a um organismo em necessidade de produzir um metabolito que é então usado para produzir um efeito desejado, incluindo um efeito terapêutico desejado. Em formas de realização adicionais ou ainda adicionais são metabolitos activos de polipéptidos de aminoácido codificado de forma não natural.
Em algumas situações, polipéptidos de aminoácido codificado de forma não natural podem existir como tautómeros. Além disso, os polipéptidos de aminoácido 75 codificado de forma não natural descritos no presente documento podem existir em formas não solvatadas bem como solvatadas com solventes farmaceuticamente aceitável tais como água, etanol, e similares. As formas solvatadas são também consideradas que são revelados no presente documento. Peritos com habilidade ordinária na especialidade irão reconhecer que alguns dos compostos no presente documento podem existir em diversas formas tautoméricas. Todas as formas tautoméricas são consideradas como parte das composições descritas no presente documento. A não ser que de outro modo indicado, métodos convencionais de espectroscopia de massa, RMN, HPLC, química de proteína, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e farmacologia, dentro da perícia na especialidade são utilizados. DESCRIÇÃO DETALHADA I. Introdução um dendrímero
As moléculas de FGF-21 que compreendem um aminoácido não natural são proporcionadas na invenção. Em certas formas de realização da invenção, o polipéptido FGF-21 com um aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação pós-traducional que compreende união de uma molécula de um polímero solúvel em água. Em um forma de realização da memória descritiva, a pelo menos uma modificação pós-traducional compreende união de uma molécula incluindo, mas não são limitados a; uma etiqueta, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietileno glicol, um fotoreticulante, um radionuclídeo, um composto citotóxico, um fármaco, uma etiqueta de afinidade, uma etiqueta de fotoafinidade, um composto reactivo, uma resina, uma segunda proteína ou polipéptido ou análogo de polipéptido, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metal, um cofactor, um ácido gordo, um hidrato de carbono, um polinucleótido, um ADN, um ARN, um polinucleótido antisense, um sacárido, 76 solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucleico inibidor, um biomaterial, uma nanopartícuia, uma etiqueta de spin, um fluoróforo, uma fracção contendo metal, uma fracção radioactiva, um grupo funcional novo, um grupo que covalentemente ou não covalentemente interactua com outras moléculas, uma fracção fotoengaiolada, uma fracção excitável com radiação actinica, uma fracção fotopolimerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, uma fracção que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox activo, um tioaminoácido, uma fracção tóxica, uma fracção marcada isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso de electrões, um grupo magnético, um grupo intercalante, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente activo, uma etiqueta detectável, uma molécula pequena, um ponto quântico, um nanotransmissor, um radionucleótido, um radiotransmissor, um agente de captura de neutrão, ou qualquer combinação dos anteriores ou qualquer outro composto ou substância desejável, que compreende um segundo grupo reactivo a pelo menos um aminoácido não natural que compreende um primeiro grupo reactivo utilizando metodologia química que é conhecido a um perito com habilidade ordinária na especialidade por ser adequado para os grupos reactivos particulares. Por exemplo, o primeiro grupo reactivo é uma fracção alcinilo (incluindo, mas não são limitados a, no aminoácido não natural p-propargiloxifenilalanina, onde o grupo propargilo é também algumas vezes denominado como uma fracção de acetileno) e o segundo grupo reactivo é uma fracção azido, e metodologias químicas de cicloadição [3 + 2] são utilizadas. Em outro exemplo, o primeiro grupo reactivo é a fracção azido (incluindo, mas não são limitados a, no aminoácido não 77 natural p-azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reactivo é a fracção alcinilo. Em certas formas de realização do polipéptido FGF-21 modificado da presente invenção, pelo menos um aminoácido não natural (incluindo, mas não são limitados a, aminoácido não natural contendo um grupo ceto funcional) que compreende pelo menos uma modificação pós-traducional, é usado onde a pelo menos uma modificação pós-traducional compreende uma fracção de sacárido. Em certas formas de realização, a modificação pós-traducional é feita in vivo numa célula eucariótica ou numa célula não eucariótica. Um linker, polímero, polímero solúvel em água, ou outra molécula pode unir a molécula ao polipéptido. A molécula pode ser ligada directamente ao polipéptido.
Em certas formas de realização, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-traducional que é feita in vivo por uma célula hospedeira, onde a modificação pós-traducional não é normalmente feita por outro tipo de célula hospedeira. Em certas formas de realização, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-traducional que é feita in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação pós-traducional não é normalmente feita por uma célula não eucariótica. Exemplos de modificações pós-traducionais incluem, mas não são limitados a, glicosilação, acetilação, acilação, modificação por lípido, palmitoilação, adição de palmitado, fosforilação, modificação por ligação com glicolípido, e similares. Em uma forma de realização, a modificação pós-traducional compreende união de um oligossacárido a uma asparagina por um ligação GlcNAc-asparagina (incluindo, mas não são limitados a, onde o oligossacárido compreende (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc, e similares). Em outra forma de realização, a modificação pós-traducional compreende união de um oligossacárido (incluindo, mas não são limitados a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por um GalNAc-serina, um GalNAc-treonina, um GlcNAc-serina, ou 78 um GlcNAc-treonina ligação. Em certas formas de realização, uma proteína ou polipéptido da invenção pode compreender um sequência de secreção ou localização, uma etiqueta de epítopo, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta de polihistidina, um fusão GST, e/ou similares. Exemplos de sequências sinal de secreção incluem, mas não são limitados a, uma sequência sinal de secreção procariótica, uma sequência sinal de secreção eucariótica, uma sequência sinal de secreção eucariótica optimizada em 5' para expressão bacteriana, uma sequência sinal de secreção nova, sequência sinal de secreção pectato liase, sequência sinal de secreção Omp A, e uma sequência sinal de secreção de fago. Exemplos de sequências sinal de secreção, incluem, mas não são limitados a, STII (procariótica) , Fd GUI e M13 (fago) , Bgl2 (levedura), e a sequência sinal bla derivado de um transposon. Qualquer tal sequência pode ser modificada para proporcionar um resultado desejado com o polipéptido, incluindo, mas não são limitados a, substituir uma sequência sinal com uma sequência sinal diferente, substituir uma sequência líder com uma sequência líder diferente, etc. A proteína ou polipéptido de interesse contém um aminoácido não natural. Um de um aminoácido particular presente numa versão de ocorrência natural da proteína é substituído com um aminoácido não natural. A presente invenção proporciona métodos e composições com base em FGF-21 que compreende um aminoácido codificado de forma não natural. A introdução de um aminoácido codificado de forma não natural em FGF-21 pode permitir a aplicação de químicas de conjugação que envolve, reacções químicas específicas, incluindo, mas não são limitados a, com um aminoácido codificados de forma não natural enquanto nao reage com os 20 aminoácidos que ocorrem comummente. Em algumas formas de realização, FGF -21 que compreende 0 aminoácido codificado de forma não natural liga-se a um 79 polímero solúvel em água, tal como polietileno glicol (PEG), via a cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Esta invenção proporciona um método altamente eficiente para a modificação selectiva de proteínas com derivados de PEG, que envolve a incorporação selectiva de aminoácidos não geneticamente codificados, incluindo, mas não são limitados a, aqueles aminoácidos contendo grupos funcionais ou substituintes não encontrados nos 20 aminoácidos naturalmente incorporados, incluindo, mas não são limitados a um cetona, uma azida ou fracção de acetileno, em proteínas em resposta a um codão selector e a subsequente modificação de aqueles aminoácidos com um derivado reactivo adequado de PEG. Uma vez incorporado, as cadeias laterais de aminoácido podem então ser modificados utilizando metodologias químicas conhecidas pelos peritos com habilidade ordinária na especialidade por ser adequado para os grupos funcionais ou substituintes particulares presentes no aminoácido codificado de forma não natural. Metodologias químicas conhecidas de uma ampla variedade são adequadas para utilização na presente invenção para incorporar um polímero solúvel em água na proteína. Tais metodologias incluem, mas não são limitadas a uma reacção de cicloadição de Huisgen [3+2] (veja-se, por exemplo, Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; e, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Nova Iorque, p. 1-176) com, incluindo, mas não são limitados a, derivados de acetileno ou azida, respectivamente.
Porque o método de cicloadição [3+2] de Huisgen envolve um cicloadição em lugar de uma reacção de substituição nucleofílica, proteínas podem ser modificadas com selectividade extremamente alta. A reacção pode ser levada a cabo a temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regioselectividade (1,4 > 1,5) pela adição de 80 quantidades catalíticas de sais de Cu(I) à mistura de reacção. Veja-se, por exemplo, Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; e documento WO 03/101972. Uma molécula que pode ser adicionado a uma proteína da invenção através de uma cicloadição [3+2] inclui virtualmente qualquer molécula com um adequado grupo funcional ou substituinte incluindo, mas não limitado a um derivado de azido ou acetileno. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo acetileno, incluindo, mas não são limitados a, p-propargiloxifenilalanina, ou grupo azido, incluindo, mas não são limitados a p-azido- fenilalanina, respectivamente. O anel de cinco membros que resulta da cicloadição [3+2] de Huisgen não é geralmente reversível na redução de ambientes e é estável contra hidrólise durante períodos estendidos em ambientes aquosos. Consequentemente, as características físicas e químicas de uma ampla variedade de substâncias podem ser modificadas para a reacção que demanda condições aquosas com os derivados activos de PEG da presente invenção. Ainda mais importantemente, porque as fracções de azida e acetileno são específicas entre si (e do não, por exemplo, reagem com qualquer dos 20 aminoácidos codificados geneticamente comuns), proteínas podem ser modificadas num ou mais locais específicos com selectividade extremamente alta. A invenção também proporciona derivados solúveis em água e hidroliticamente estáveis de derivados de PEG e polímeros hidrofílico relacionados que tem uma ou mais fracções de acetileno ou de azida. os derivados de polímero PEG que contêm fracções acetileno são altamente selectivos para acoplamento com fracções de azida que foram introduzidas selectivamente em proteínas em resposta a um codão selector. De maneira similar, derivados de polímero PEG que contêm fracções de azida são altamente selectivos 81 para acoplamento com fracções acetileno que foram introduzidas selectivamente em proteínas em resposta a um codão selector.
Mais especificamente, as fracções de azida compreendem, mas não são limitadas a, alquil azidas, aril azidas e derivados destas azidas. Os derivados das alquil e aril azidas podem incluir outros substituintes contanto que a reactividade específica de acetileno seja mantida. As fracções de acetileno compreendem alquil e aril acetilenos e derivados de cada. Os derivados do alquil e aril acetilenos podem incluir outros substituintes contanto que a reactividade específica de azida seja mantida. A presente invenção proporciona conjugados de substâncias que tem uma ampla variedade de grupos funcionais, substituintes ou fracções, com outras substâncias incluindo um polímero solúvel em água. Também são revelados conjugados com, mas não limitado a uma etiqueta; um corante; um polímero; um derivado de polietileno glicol; um fotoreticulante; um radionuclídeo; um composto citotóxico; um fármaco; uma etiqueta de afinidade; uma etiqueta de fotoafinidade; um composto reactivo; uma resina; um segundo proteína ou polipéptido ou análogo de polipéptido; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um cofactor; um ácido gordo; um hidrato de carbono; um polinucleótido; um ADN; um ARN; um polinucleótido antisense; um sacárido; um dendrímero solúvel em água; uma ciclodextrina; um inhibitory ribo- ácido nucleico; um biomaterial; uma nanopartícula; uma etiqueta de spin; um fluoróforo, uma fracção contendo metal; uma fracção radioactiva; um grupo funcional novo; um grupo que covalentemente ou não covalentemente interactua com outras moléculas; uma fracção fotoengaiolada; uma fracção excitável com radiação actínica; uma fracção fotopolimerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma fracção que 82 incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox activo; um tioaminoácido; uma fracção tóxica; uma fracção marcada isotopicamente; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo denso de electrões; um grupo magnético; um grupo intercalante; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente activo; uma etiqueta detectável; uma molécula pequena; um ponto quântico; um nanotransmissor; um radionucleótido; um radiotransmissor; um agente de captura de neutrão; ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável. A presente invenção também inclui conjugados de substâncias que tem fracções de azida ou de acetileno com derivados de polímero PEG que tem as correspondentes fracções de acetileno ou de azida. Por exemplo, um polímero PEG contendo uma fracção de azida pode ser acoplado a uma molécula biologicamente activa numa posição na proteína que contém um aminoácido codificado não geneticamente que porta uma funcionalidade acetileno. A ligação pelo qual o PEG e a molécula biologicamente activa são acoplados inclui, mas não é limitado ao produto de cicloadição [3+2] de Huisgen. É bem estabelecido na técnica que PEG pode ser usado para modificar as superfícies de biomateriais (veja-se, por exemplo, Patente US 6.610.281; Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sei., 3(1):125-136 (2000)). A memória descritiva também inclui biomateriais que compreendem uma superfície que tem um ou mais locais reactivos de azida ou acetileno e um ou mais da polímeros contendo azida ou acetileno da invenção acoplados à superfície via a ligação de cicloadição [3+2] de Huisgen. Biomateriais e outras substâncias podem também ser acopladas to a derivados de polímero activados por azida ou acetileno através de uma ligação diferente da ligação de azida ou acetileno, tal como através de uma 83 ligação que compreende um ácido carboxílico, amina, álcool ou fracção tiol, para deixar a fracção de azida ou de acetileno disponível para reacções subsequentes. A memória descritiva inclui um método de sintetização dos polímeros contendo azida ou acetileno da invenção. No caso do derivado de PEG contendo azida, a azida pode ser ligada directamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, o derivado de PEG contendo azida pode ser preparados por meio da união de um agente de ligação que tem a fracção de azida numa terminação a um polímero activado convencional de modo que o polímero resultante tem a fracção de azida na sua terminação. No caso do derivado de PEG contendo acetileno, o acetileno pode ser ligado directamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, o derivado de PEG contendo acetileno pode ser preparado por meio da união de um agente de ligação que tem a fracção de acetileno numa terminação a um polímero activado convencional de modo que o polímero resultante tem a fracção de acetileno na sua terminação.
Mais especificamente, no caso da derivado de PEG contendo azida, um polímero solúvel em água que tem pelo menos uma fracção hidroxilo activa sofre uma reacção para produzir um polímero substituído que tem uma fracção mais reactiva, tal como um mesilato, tresilato, tosilato ou grupo abandonante halogénio, no memso. A preparação e utilização de derivados de PEG contendo haletos de ácido sulfonílico, átomos de halogénio e outros grupos abandonantes são conhecidos por peritos com habilidade ordinária na especialidade. 0 resultante polímero substituído então sofre uma reacção para substituir pela fracção mais reactiva uma fracção de azida na terminação do polímero. Alternativamente, um polímero solúvel em água que tem pelo menos uma fracção nucleofílica ou electrofílica activa sofre uma reacção com um agente de ligação que tem uma azida numa terminação de modo que uma ligação covalente 84 é formada entre o polímero PEG e o agente de ligação e a fracção de azida é posicionada na terminação do polímero. Fracções nucleofílicas e electrofílicas, incluindo aminas, tióis, hidrazidas, hidrazinas, álcoois, carboxilatos, aldeídos, cetonas, tioésteres e similares, são conhecidos pelos peritos com habilidade ordinária na especialidade.
Mais especificamente, no caso do derivado de PEG contendo acetileno, um polímero solúvel em água que tem pelo menos uma fracção hidroxilo activa sofre uma reacção para deslocar um halogénio ou outro grupo abandonante activado de um precursor que contém uma fracção de acetileno. Alternativamente, um polímero solúvel em água que tem pelo menos uma fracção nucleofílica ou electrofílica activa sofre uma reacção com um agente de ligação que tem um acetileno numa terminação de modo que uma ligação covalente é formada entre o polímero PEG e o agente de ligação e a fracção de acetileno é posicionada na terminação do polímero. A utilização de fracções halogénio, grupo abandonante activado, fracções nucleofílicas e electrofílicas no contexto de síntese orgânica e a preparação e uso de derivados de PEG é bem estabelecido para peritos na especialidade. A memória descritiva também proporciona um método para a modificação selectiva de proteínas para adicionar outras substâncias à proteína modificada, incluindo, mas não são limitados a polímeros solúveis em água tal como PEG e derivados de PEG contendo uma fracção de azida ou de acetileno. Os derivados de PEG contendo azida e acetileno podem ser usados para modificar as propriedades de superfícies e moléculas onde biocompatibilidade, estabilidade, solubilidade e falta da imunogenicidade são importantes, enquanto ao mesmo tempo que proporcionam um meio mais selectivo de unir os derivados de PEG a proteínas que foi anteriormente conhecido na técnica. II. Factores de crescimento de fibroblasto 85
Devido a suas actividades potentes para promover crescimento, proliferação, sobrevivência e diferenciação de uma ampla variedade de tipos de células e tecido, FGFs continuam a ser perseguidas como agentes terapêuticos para um número de diferentes indicações, incluindo cicatrização de feridas, tais como condições músculo-esqueléticas, por exemplo, fracturas ósseas, reparação ligamento e tecido, tendinite, bursite, etc.; condições da pele, por exemplo, queimaduras, cortes, lacerações, escaras, úlceras de cicatrização lenta, etc.; protecção de tecido, reparação, e a indução de angiogénese durante enfarte do miocárdio e isquemia, no tratamento de condições neurológicas, por exemplo, doença neurodegenerativa e acidente vascular cerebral, no tratamento de doença ocular, incluindo degeneração macular, e similares.
As proteínas do factor de crescimento de fibroblasto (FGF) identificado até agora pertencem a uma família de moléculas de sinalização que regulam crescimento e diferenciação de uma variedade de tipos de célula. A significância de proteínas FGF a fisiologia e patologia humana relacionam-se em parte com seus papéis chave em embriogénese, em desenvolvimento de vasos sanguíneos e crescimento, e em crescimento ósseo. Experiências in vitro têm demonstrado um papel para FGF em regular crescimento celular e divisão de células endoteliais, células vasculares de músculo liso, fibroblastos, e miócitos cardíacos e esqueléticos. Outros membros da família de FGF e seus papéis biológicos são descritos em Crossley et al.r Development 121:439-451 (1995); Ohuchi et al., Development 124:2235-2244 (1997); Gemei et al., Genomics 35:253-257 (1996); e Ghosh et al., Cell Growth and Differentiation 7:1425-1434 (1996).
Proteínas FGF são também significativas para a saúde humana e doença porque de um papel em crescimento celular em cancro. Por exemplo, FGF-8 foi identificado como um 86 factor de crescimento induzido por androgénio em células cancerosas de mama e próstata. (Tanaka et al., FEBS Lett. 363:226-230 (1995) eP.N.A.S. 89:8928-8932 (1992)). O papel de FGF em desenvolvimento normal está a ser elucidado em parte através de estudos de receptores de FGF. Wilke, T. et al., Dev. Dynam. 210:41-52 (1997) encontraram que transcriptos de FGFR1, FGFR2, e FGFR3 foram localizado em regiões especificas da cabeça durante desenvolvimento embrionário em galinhas. A expressão padrão correlacionada com áreas afectadas por mutações de FGFR humano em sindrome de Crouzon, uma condição de formação óssea intramembranosa anormal. Belluardo, N. et al., Jour. Comp. Neur. 379:226-246 (1997) estudaram localização de ARNm 1, 2, e 3 de FGFR em cérebro de rato, e encontrado especificidade celular em várias regiões do cérebro. Além disso, ARNm de FGFR1 e FGFR2 foram expressoa em células reactivas astrogliais após lesão de cérebro, suportando um papel de certos FGF em doença cerebral cérebro e dano. Ozawa, K. et al., Mol. Brain Res. 41:279-288 (1996) informou que a expressão de FGF1 e FGF-5 aumentou após o nascimento, enquanto que os genes de FGF3, FGF-6, FGF-7, e FGF-8 mostraram maior expressão em estágios embrionários tardios que em estágios pós-natais. Um cofactor, Klotho beta (Klb), pode também estar envolvido com transdução de sinal de FGF-21 e seu receptor. Klb foi reportado que aumenta a capacidade de FGFR1 e FGFR4 ligar FGF21. Klb é uma proteína transmembrana de único passo e embora o papel da forma transmembrana completa é desconhecido, foi mostrada com relação a FGF23 que Klotho melhorou a ligação de FGF23 e aumentou a fosforilação de receptor de FGF enquanto Klotho beta foi mostrada que melhora ligação de FGF-21 (H. Kurosu, Y. Ogawa, M. Miyoshi, M. Yamamoto, A. Nandi, K. P. Rosenblatt, M. G. Baum, S. Schiavi, M.-C. Hu, O. W. Moe, M. Kuro-o, Regulation of fibroblast growth factor-23 signaling por Klotho. J. Biol. Chem. 281, 6120-6123 (2006)). 87
Katoh et al. (International Journal of Oncology (2006) 29:163-168) descrevem a família de FGF e análises filogenéticas dos membros da família. Katoh et al. também discute sobre rede de via de sinalização no trato gastrointestinal.
Plotnikov et al. (Cell (1999) 98: 641-650) descrevem a estrutura cristalina de FGF2 com o receptor de FGF 1 (FGFRl) e o dímero simétrico duplo que se forma entre dois destes complexos. Plotnikov et al. proporcionam um modelo de dimerização do receptor e indução de dimerização por FGF e heparina. É provável que sejam descobertos no futuro membros adicionais da família de FGF. Podem ser identificados novos membros da família de FGF por meio da análise de estruturas secundárias e terciárias assistida por computador das sequências proteicas preditas, e por técnicas de selecção desenhadas para identificar moléculas que se ligam a um alvo particular.
Portanto, a descrição da família de FGF é proporcionada para propósitos ilustrativos e somente como exemplo e não como limite do âmbito dos métodos, composições, estratégias e técnicas descritas no presente documento. Além disso, a referência a FGF-21no presente pedido de patente pretende usar o termo genérico como exemplo de qualquer membro da família de FGF. Portanto, entende-se que as modificações e químicas descritas no presente documento com referência a polipéptidos ou proteína de FGF-21 podem ser aplicados igualmente a qualquer membro da família de FGF, incluindo os listados especificamente no presente documento. III. Métodos de ácidos nucleicos recombinantes gerais para uso com a invenção
Em numerosas formas de realização da presente divulgação, ácidos nucleicos que codificam um polipéptido FGF-21 de interesse serão isolados, clonados e com frequência alterados usando métodos recombinantes. Tais formas de realização da divulgação são usadas, incluindo mas sem limitação, para a expressão de proteínas ou durante a geração de variantes, derivados, cassetes de expressão ou outras sequências derivadas de um polipéptido FGF-21. Em algumas formas de realização da divulgação, as sequências que codificam os polipéptidos da invenção estão ligadas operativamente a um promotor heterólogo.
Uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido codificado de forma não natural pode ser sintetizada com base na sequência de aminoácidos do polipéptido precursor, incluindo mas sem limitação, tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID N°: 1-7 e mudando depois a sequência de nucleótidos para efectuar a introdução (isto é, incorporação ou substituição) ou retirada (isto é, deleção ou substituição) do resíduo ou os resíduos de aminoácidos relevantes. A sequência de nucleótidos pode ser modificada convenientemente por mutagénese dirigida de acordo com métodos convencionais. Como alternativa, a sequência de nucleótidos pode ser preparada por síntese química, incluindo mas sem limitação, usando um sintetizador de oligonucleótidos, em que os oligonucleótidos são desenhados com base na sequência de aminoácidos do polipéptido desejado, e preferentemente seleccionando os codões preferidos na célula hospedeira emque se produzirá o polipéptido recombinante. Por exemplo, podem ser sintetizados vários oligonucleótidos pequenos que codificam partes do polipéptido desejado e montados por PCR, ligação ou reacção em cadeia de ligação. Veja-se, por exemplo, Barany, et al., Proc. Natl. Acad Sei. 88 : 189-193 (1991); Patente US N° 6.521.427. A presente invenção utiliza técnicas de rotina no campo da genética recombinante. Os textos básicos que revelam os métodos gerais de uso na presente invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 89 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).
Os textos gerais gue descrevem técnicas de biologia molecular incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989 ("Sambrook") e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et ai., eds., Current Protocols, uma empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (complementado até 1999) ("Ausubel")). Estes textos descrevem mutagénese, o uso de vectores, promotores e muitos outros assuntos relevantes relacionados com, incluindo mas sem limitação, a geração de genes ou polinucleótidos que incluem codões selectores para produção de proteínas que incluem aminoácidos não naturais, ARNt ortogonais, sintetases ortogonais e pares dos mesmos.
Na invenção são usados diversos tipos de mutagénese para uma diversidade de propósitos incluindo, mas sem limitação, produzir novas sintetases ou ARNt, mutar moléculas de ARNt, mutar polinucleótidos que codificam sintetases, produzir bibliotecas de ARNt, produzir bibliotecas de sintetases, produzir codões selectores, inserir codões selectores que codificam aminoácidos não naturais numa proteína ou polipéptido de interesse. Estes incluem, mas sem limitação, mutagénese dirigida, aleatória pontual, recombinação homóloga, embaralhamento de ADN ou outros métodos de mutagénese recursivos, construção quimérica, mutagénese usando moldes que contêm uracilo, mutagénese dirigida a oligonucleótidos, mutagénese de ADN modificada por fosforotioato, mutagénese usando ADN de cadeia dupla com lacunas ou similares, mutagénese mediada por PCT ou 90 qualquer combinação dos mesmos. Os métodos adequados adicionais incluem reparação de emparelhamento erróneo pontual, mutagénese usando estirpes de hospedeiros deficientes na reparação, selecção de restrição e purificação de restrição, mutagénese de deleção, mutagénese por síntese génica total, reparação de rupturas de dupla cadeia e similares. Mutagénese incluindo, mas sem limitação, a que envolve construções quiméricas também está incluída na presente invenção. Numa forma de realização, a mutagénese pode ser guiada por informação conhecida da molécula de ocorrência natural ou molécula de ocorrência natural alterada ou mutada incluindo, mas sem limitação, sequência, comparações de sequência, propriedades físicas, estrutura secundária, terciária ou quaternária, estrutura cristalina ou similares.
Os textos e exemplos encontrados no presente documento descrevem estes métodos. Encontra-se informação adicional nas seguintes publicações e nas referências citadas nelas: Ling et ai., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254 (2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenese using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985); Botstein e Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985); Cárter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. e Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenese without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenese without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding 91 specificities, Science 242: 240-245 (1988); Zoller e Smith, Oligonucleotide-directed mutagenese using M13-derived vectors: an efficient and geral procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982); Zoller e Smith, Oligonucleotidedirected mutagenese of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Zoller e Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Taylor et ai., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et ai., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985); Nakamaye e Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et ai., 5 '-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et ai., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et ai., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer e Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without 92 enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et ai., Different base/base mesmatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mesmatch-repair system of E. coli, Cell 38: 879-887 (1984); Cárter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenese using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Cárter, Improved oligonucleotide-directed mutagenese using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh e Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the tranlocaln State of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al. , Total synthese and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar e Khorana, Total synthese and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et ai., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985); Grundstrõm et ai., Oligonucleotide-directed mutagenese by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83: 7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993); Sieber, et ai., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); e I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). Podem ser encontrados detalhes adicionais de muitos dos métodos anteriores em Methods in Enzymology Volumen 154, que também descreve 93 controlos úteis para resolução de problemas com diversos métodos de mutagénese.
Os oligonucleótidos, por exemplo, para uso em mutagénese da presente invenção, por exemplo, mutação de bibliotecas de sintetases, ou alteração de ARNt, tipicamente são sintetizados quimicamente de acordo com o método de triéster de fosforamidita de fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862, (1981), por exemplo, usando um sintetizador automático, como se descreve em Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168 (1984). A memória descritiva também se refere a células hospedeiras eucariotas, células hospedeiras não eucariotas e organismos para a incorporação in vivo de um aminoácido não natural por meio de pares de ARNt/RS ortogonais. As células hospedeiras são modificadas por engenharia genética (incluindo, mas sem limitação, por transformação, transdução ou transfecção) com os polinucleótidos da memória descritiva ou construções que incluem um polinucleótido da memória descritiva incluindo, mas sem limitação, um vector da memória descritiva que pode ser, por exemplo, um vector de clonagem ou um vector de expressão. Por exemplo, as regiões codificantes para o ARNt ortogonal, a ARNt sintetase ortogonal e a proteína a ser derivatizada são ligados operativamente a elementos de controlo da expressão génica que são funcionais na célula hospedeira desejada. O vector pode estar, por exemplo, em forma de um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, uma bactéria, um vírus, um polinucleótido nu ou um polinucleótido conjugado. Os vectores são introduzidos em células e/ou microorganismos por métodos convencionais incluindo electroporação (Fromm et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 5824 (1985)), infecção por vectores virais, penetração balística de alta velocidade por partículas pequenas com o ácido nucleico dentro da matriz de contas pequenas ou 94 partículas, ou na superfície (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)), e/ou similares.
As células hospedeiras modificadas por engenharia genética podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme seja apropriado para actividades tais como, por exemplo, etapas de rastreios, promotores de activação ou transformantes de selecção. Estas células podem opcionalmente ser cultivadas em organismos transgénicos. Outras referências úteis, incluindo mas sem limitação para isolamento e cultivo celular (por exemplo, para o isolamento posterior de um ácido nucleico) incluem Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edição, Wiley-Liss, Nova Iorque e as referências citadas em dito texto; Payne et ai. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in liquid Systems John Wiley e Sons, Inc. Nova Iorque, NY; Gamborq e Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nova Iorque) e Atlas e Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. Vários métodos bem conhecidos para introduzir ácidos nucleicos alvo em células estão disponíveis, qualquer dos quaiss pode ser usado na memória descritiva. Estes incluem: fusão das células receptoras com protoplastos bacterianos que contêm o ADN, electroporação, bombardeamento com projécteis e infecção com vectores virais (analisados adicionalmente posteriormente) , etc. Podem ser usadas células bacterianas para amplificar o número de plasmídeos que contêm construções de ADN da presente memória descritiva. As bactérias são cultivadas até a fase logarítmica e os plasmídeos dentro das bactérias podem ser isolados por uma diversidade de métodos conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, Sambrook). Além disso, estão disponíveis no mercado kits para a purificação de plasmídeos a partir de bactérias, (veja-se, por exemplo, 95
EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™ de Stratagene; e, QIAprep™ de Qiagen) . Os plasmídeos isolados e purificados são manipulados adicionalmente depois para produzir outros plasmídeos, são usados para transfectar células ou são incorporados em vectores relacionados para infectar organismos. Os vectores típicos contêm terminadores da transcrição e a tradução, sequências de início da transcrição e tradução, e promotores úteis para a regulação da expressão do ácido nucleico alvo particular. Os vectores compreendem opcionalmente cassetes de expressão genéricos que contêm pelo menos uma sequência terminadora independente, sequência que permite a replicação da cassete em eucariotas, ou procariotas, ou ambos (incluindo, mas sem limitação, vectores transportadores) e marcadores de selecção para sistemas tanto procariotas como eucariotas. Os vectores são adequados para a replicação e integração em procariotas, eucariotas ou ambos. Veja-se, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature 328:731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos mencionados anteriormente). É proporcionado um catálogo de bactérias e bacteriófagos úteis para clonagem, por exemplo, por a ATCC, por exemplo, The ATCC Catalogue of Bactéria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (ed) publicado por a ATCC. Também são encontrados métodos básicos adicionais para sequenciação, clonagem e outros aspectos da biologia molecular e considerações teóricas subjacentes em Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Além disso, essencialmente qualquer ácido nucleico (e praticamente qualquer ácido nucleico marcado, tanto convencional como não convencional) pode ser pedido de forma personalizada ou convencional em qualquer de uma diversidade de fontes comerciais, tais como Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponível em 96
Internet em mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponível em Internet em genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponível em Internet em expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitas outras.
CODÕES SELECTORES
Os codões selectores da invenção expandem o marco de codões genéticos da maquinaria biossintética de proteínas. Por exemplo, um codão selector inclui, mas sem limitação, um codão de três bases único, um codão sem sentido, tal como um codão de parada, incluindo mas sem limitação, um codão âmbar (UAG), um codão ocre, ou um codão ópalo (UGA), um codão não natural, um codão de quatro ou mais bases, um codão pouco comum ou similares. Resulta facilmente evidente para os peritos na especialidade que existe um amplo intervalo no número de codões selectores que podem ser introduzidos num gene ou polinucleótido desejado incluindo, mas sem limitação, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais num polinucleótido simples que codifica pelo menos uma parte do polipéptido FGF-21.
Numa forma de realização, os métodos da memória descritiva envolvem o uso de um codão selector que é um codão de parada para a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais in vivo. Por exemplo, é produzido um ARNt-0 que reconhece o codão de parada incluindo, mas sem limitação, UAG, e é aminoacilado por uma RS-0 com um aminoácido não natural desejado. 0 ARNt-0 não é reconhecido pelas aminoacil-ARNt sintetases do hospedeirao de ocorrência natural. Pode ser usada mutagénese dirigida convencional para introduzir o codão de parada, incluindo, mas sem limitação, TAG, no local de interesse num polipéptido de interesse. Veja-se, por exemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16: 791-802. Quando a 0-RS, ARNt-0 e o ácido nucleico que 97 codifica o polipéptido de interesse são combinados in vivo, o aminoácido não natural é incorporado em resposta ao codão UAG para proporcionar um polipéptido que contém o aminoácido não natural na posição especificada. A incorporação de aminoácidos não naturais in vivo pode ser realizada sem perturbação significativa da célula hospedeira eucariota. Por exemplo, devido a que a eficácia de supressão do codão UAG depende da competição entre o ARNt-O, incluindo, mas sem limitação, o ARNt supressor âmbar, e um factor de libertação eucariota (incluindo, mas sem limitação, eRF) (que se liga a um codão de parada e inicia a libertação do péptido crescente do ribossoma), a eficácia de supressão pode ser modulada, incluindo mas sem limitação, aumentando o nivel de expressão de ARNt-0 e/ou o ARNt supressor.
Também podem ser codificados aminoácidos não naturais com codões raros. Por exemplo, quando a concentração de arginina numa reacção de síntese de proteína in vitro se reduce, o codão de arginina raro, AGG, mostrou que é eficaz para a inserção de Ala por meio de um ARNt sintético acilado com alanina. Veja-se, por exemplo, Ma et al., Biochemistry, 32: 7939 (1993). Neste caso, o ARNt sintético compete com o ARNtArg de ocorrência natural, que existe como uma espécie minoritária em Escherichia coli. Alguns organismos não usam todos os tripletos codónicos. Um codão não designado AGA em Micrococcus luteus foi utilizado para a inserção de aminoácidos num extracto de transcrição/tradução in vitro. Veja-se, por exemplo, Kowal e Oliver, Nucl. Acid. Res., 25: 4685 (1997). Podem ser gerados componentes da presente invenção para usar estes codões raros in vivo.
Os codões selectores também compreendem codões estendidos incluindo, mas sem limitação, codões de quatro ou mais bases, tais como codões de quatro, cinco, seis ou mais bases. Os exemplos de codões de quatro bases incluem, mas 98 sem limitação, AGGA, QUAG, UAGA, CCCU e similares. Os exemplos de codões de cinco bases incluem, mas sem limitação, AGGAC, CCCCU, CCCUC, QUAGA, QUACU, UAGGC e similares. Uma caracteristica da invenção inclui usar codões estendidos com base em supressão de deslocamento de fase. Podem ser inseridos codões de quatro ou mais bases incluindo, mas sem limitação, um ou múltiplos aminoácidos não naturais na mesma proteína. Por exemplo, em presencia de ARNt-0 mutados incluindo, mas sem limitação, um ARNt supressor de deslocamento de fase especial, com voltas anticodónicas, por exemplo, com voltas anticodónicas de pelo menos 8-10 nt, o codão de quatro ou mais bases é lido como um só aminoácido. Em outras formas de realização, as voltas anticodónicas podem descodificar, incluindo mas sem limitação, pelo menos um codão de quatro bases, pelo menos um codão de cinco bases, pelo menos um codão de seis bases ou mais. Já que existem 256 possíveis codões de quatro bases, podem ser codificados múltiplos aminoácidos não naturais na mesma célula usando um codão de quatro ou mais bases. Veja-se, Anderson et al., (2002) Exploring the
Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code:
Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769. Por exemplo, foram usados codões de quatro bases para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas usando métodos biossintéticos in vitro. Veja-se, por exemplo, Ma et al. , (1993) Biochemistry, 32: 7939; e Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 34. CGGG e AGGU foram usados para incorporar simultaneamente 2-naftilalanina e um derivado de NBD de lisina em estreptavidina in vitro com dois ARNt supressores de deslocamento de fase quimicamente acilados. Veja-se, por exemplo, Hohsaka et al., (1999) J.
Am. Chem. Soc., 121: 12194. Num estudo in vivo, Moore et 99 al. examinaram a capacidade de derivados de ARNtLeu com anticodões NQUA para suprimir codões UAGN (N pode ser OU, A, G ou C) e descobriram que o quadruplete UAGA pode ser descodificado por um ARNtLeu com um anticodão UQUA com uma eficácia de 13 a 26% com pouca descodificação na fase 0 ou -1. Veja-se Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298: 195. Numa forma de realização, podem ser usados codões estendidos com base em codões raros ou codões sem sentido na presente invenção, que podem reduzir a leitura em sentido errado e a supressão de deslocamento de fase em outros locais não desejados.
Para um sistema dado, um codão selector também pode incluir um dos codões de três bases naturais, em que o sistema endógeno não usa (ou usa poucas vezes) o codão de base natural. Por exemplo, este inclui um sistema sem um ARNt que reconheça o codão de três bases natural, e/ou um sistema no que o codão de três bases é um codão raro.
Os codões selectores incluem opcionalmente pares de bases não naturais. Estes pares de bases não naturais expandem adicionalmente o alfabeto genético existente. Um par de bases extra aumenta o número de tripletos de codões de 64 a 125. As propriedades de pares de terceira base incluem emparelhamento de bases estável e selectivo, a incorporação enzimática eficaz em ADN com alta fidelidade por uma polimerase e a extensão de iniciador continua eficaz depois da síntese do par de bases não naturais nascente. As descrições de pares de bases não naturais que podem ser adaptadas para métodos e composições incluem, por exemplo, Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20: 177-182. Veja-se também, Wu, E., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 14626-14630. Mais adiante outras publicações são listadas.
Para uso in vivo, o nucleósido não natural é permeável a membrana e é fosforilado para formar o trifosfato 100 correspondente. Além disso, a informação genética aumentada é estável e não é destruída por enzimas celulares. As tentativas anteriores de Benner e outros aproveitaram os padrões de formação de ligações de hidrogénio gue são diferentes de agueles pares de Watson-Crick canónicos, sendo o exemplo mais notável deless o par iso-C:iso-G. Veja-se, por exemplo, Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111: 8322; e Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602. Estas bases em geral são emparelhadas de forma errónea em certo grau com bases naturais e não podem ser replicadas de forma enzimática. Kool et al demonstraram que as interacções de empacotamento hidrófobo entre bases podem substituir os ligações de hidrogénio para dirigir a formação de pares de bases. Veja-se, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602; e Guckian e Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. Numa tentativa de desenvolver um par de bases não natural que satisfaça todos os requisitos anteriores, Schultz, Romesberg et al sintetizaram sistematicamente e estudaram uma série de bases hidrófobas não naturais. Foi descoberto que um autopar PICS:PICS é mais estável que os pares de bases naturais, e pode ser incorporado eficazmente no ADN por o fragmento de Klenow da ADN polimerase I de Escherichia coli (KF). Veja-se, por exemplo, McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 11585-6; e Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 3274. Um autopar 3MN:3MN pode ser sintetizada por KF com eficácia e selectividade suficientes para a função biológica. Veja-se, por exemplo, Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 8803. No entanto, ambas bases actuam como um terminador de cadeia para replicação adicional. Foi desenvolvida recentemente uma ADN polimerase mutante que pode ser usada para replicar o autopar de PICS. Além disso, pode ser replicada um autopar 7AI. Veja-se, por exemplo, Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123: 7439. Também foi desenvolvida um novo 101 par de metalobases, Dipic:Py, que forma um par estável após sua ligação com Cu(II). Veja-se, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 10714. Devido a que os codões estendidos e os codões não naturais são intrinsecamente ortogonais aos codões naturais, os métodos da invenção podem aproveitar esta propriedade para gerar ARNt ortogonais para eles.
Também pode ser usado um sistema de derivação traducional para incorporar um aminoácido não natural num polipéptido desejado. Num sistema de derivação traducional, é incorporado uma sequência grande num gene mas não se traduz em proteínas. A sequência contém uma estrutura que age como um sinal para induzir que o ribossoma salte a sequência e retome a tradução cadeia debaixo da inserção.
Em certas formas de realização, a proteína ou polipéptido de interesse (ou parte do mesmo) nos métodos e/ou composições da invenção se codifica por um ácido nucleico. Tipicamente, o ácido nucleico compreende pelo menos um codão selector, pelo menos dois codões selectores, pelo menos três codões selectores, pelo menos quatro codões selectores, pelo menos cinco codões selectores, pelo menos seis codões selectores, pelo menos sete codões selectores, pelo menos oito codões selectores, pelo menos nove codões selectores, ou dez ou mais codões selectores.
Os genes que codificam proteínas ou polipéptidos de interesse podem ser mutagenizados usando métodos conhecidos por um perito habitual na especialidade e que se descrevem no presente documento que incluem, por exemplo, um ou mais codões selectores para a incorporação de um aminoácido não natural. Por exemplo, um ácido nucleico para uma proteína de interesse é mutagenizado para incluir um ou mais codões selectores, o que possibilita a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais. A invenção inclui qualquer de tais variantes incluindo, mas sem limitação, versões mutantes de qualquer proteína, por exemplo, incluindo pelo 102 menos um aminoácido não natural. De forma similar, a memória descritiva também inclui ácidos nucleicos correspondentes, isto é, qualquer ácido nucleico com um ou mais codões selectores que codifiquem um ou mais aminoácidos não naturais.
As moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de interesse tal como um polipéptido FGF-21 podem ser mutagenizadas facilmente para introduzir uma cisteína em qualquer posição desejada do polipéptido. A cisteína se usa amplamente para introduzir moléculas reactivas, polímeros solúveis em água, proteínas ou uma ampla diversidade de outras moléculas, numa proteína de interesse. São conhecidos pelos peritos comuns na especialidade métodos adequados para a incorporação de cisteína numa posição desejada de um polipéptido, tais como os descritos na Patente US N° 6.608.183 e técnicas de mutagénese convencionais. IV. Aminoácidos Não Codificados de Forma Natural
Uma diversidade muito ampla de aminoácidos não codificados de forma natural são adequados para uso na presente invenção. Podem ser introduzidos qualquer número de aminoácidos não codificados de forma natural num polipéptido FGF- 21. Em geral, os aminoácidos não codificados de forma natural introduzidos são substancialmente quimicamente inertes para os 20 aminoácidos codificados geneticamente comuns (isto é, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina). Em algumas formas de realização, os aminoácidos não codificados de forma natural incluem grupos funcionais de cadeias laterais que reagem eficaz e selectivamente com grupos funcionais não encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas sem limitação, grupos azido, cetona, aldeído e aminooxi) para 103 formar conjugados estáveis. Por exemplo, um polipéptido FGF-21 que inclui um aminoácido não codificado de forma natural que contém um grupo funcional azido pode ser feito reagir com um polímero (incluindo, mas sem limitação, poli(etilenoglicol) ou, como alternativa, um segundo polipéptido que contém um resíduo alquino, para formar um conjugado estável resultante da reacção selectiva dos grupos funcionais de azida e alquino para formar um produto de cicloadição de Huisgen [3+2]. A estrutura genérica de um aminoácido alfa é ilustrada como segue (Fórmula I):
I
R
Um aminoácido não codificado de forma natural é tipicamente qualquer estrutura que tenha a fórmula anteriormente enumerada em que o grupo R é qualquer substituinte distinto do usado nos vinte aminoácidos naturais, e pode ser adequado para uso na presente invenção. Devido a que os aminoácidos não codificados de forma natural da invenção tipicamente diferem dos aminoácidos naturais somente na estrutura da cadeia lateral, os aminoácidos não codificados de forma natural formam ligações amida com outros aminoácidos incluindo, mas sem limitação, naturais ou não codificados de forma natural, da mesma maneira em que se formam em polipéptidos de ocorrência natural. No entanto, os aminoácidos não codificados de forma natural têm grupos de cadeias laterais que os distinguem dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R opcionalmente compreende um grupo alquil-, aril-, acil-, ceto-, azido-, hidroxil-, hidrazina, ciano-, halo-, hidrazida, alquenilo, alcinilo, éter, tiol, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfino, heterocíclico, enona, imina, aldeído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino ou similares ou qualquer 104 combinação dos mesmos. Outros aminoácidos de ocorrência não natural de interesse que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas sem limitação, aminoácidos que compreendem um agente de reticulação fotoactivável, aminoácidos com marcadores de spin, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de ligação a metais, aminoácidos que contêm metais, aminoácidos radioactivos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem de forma covalente ou não covalente com outras moléculas, aminoácidos fotolibertadores e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos que compreendem biotina ou um análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tais como uma serina substituída com açúcar, outros aminoácidos modificados com hidratos de carbono, aminoácidos que contêm ceto, aminoácidos que compreendem polietilenoglicol ou poliéter, aminoácidos substituídos com átomos pesados, aminoácidos quimicamente cliváveis e/ou fotocliváveis, aminoácidos com cadeias laterais alongadas em comparação com os aminoácidos naturais incluindo, mas sem limitação, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia larga, incluindo, mas sem limitação, maiores de aproximadamente cinco ou maiores de aproximadamente dez carbonos, aminoácidos que contêm açúcar ligado a carbono, aminoácidos activos para redox, aminoácidos que contêm tioaminoácidos, e aminoácidos que compreendem um ou mais resíduos tóxicos.
Os aminoácidos não codificados de forma natural de exemplo que podem ser adequados para uso na presente invenção e que são úteis para reacções com polímeros solúveis em água incluem, mas sem limitação, os que têm grupos reactivos de carbonilo, aminooxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida e alquino. Em algumas formas de realização, os aminoácidos não codificados de forma natural compreendem um resíduo de sacárido. Os exemplos de tais aminoácidos incluem IV-acetil-L-glucoseminil-L-serina, IV-acetil-L-galactoseminil-L-serina, iV-acetil-L-glucoseminil-L- 105 treonina, IV-acetil-L-glucoseminil-L-asparagina e O-manosaminil-L-serina. Os exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos em que a ligação N- ou O- de ocorrência natural entre o aminoácido e o sacárido é substituída por uma ligação covalente não encontrada habitualmente na natureza, incluindo, mas sem limitação, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e similares. Os exemplos de tais aminoácidos também incluem sacáridos que não estão habitualmente em proteínas de ocorrência natural tais como 2-desoxiglucose, 2-desoxigalactose e similares. Muitos dos aminoácidos não codificados de forma natural proporcionados no presente documento estão disponíveis comercialmente, por exemplo, de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Estados Unidos), Novabiochem (uma divisão de EMD Biosciences, Darmstadt, Amelanha) ou Peptech (Burlington, MA, Estados Unidos). Os que não estão disponíveis comercialmente são sintetizados opcionalmente como se proporciona no presente documento ou usando métodos convencionais conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. Em relação com as técnicas de síntese orgânica veja-se, por exemplo, Organic Chemistry por Fessendon e Fessendon, (1982, Segunda Edição, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Terceira Edição, 1985, Wiley e Sons, Nova Iorque); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg (Terceira Edição, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova Iorque). Vejam-se também as Patentes US N° 7.045.337 e 7.083.970. Além de aminoácidos não naturais que contêm cadeias laterais novas, os aminoácidos não naturais que podem ser adequados para uso na presente invenção também compreendem opcionalmente estruturas de cadeia principal modificada, incluindo mas sem limitação, como é ilustrado pelas estruturas de Fórmula II e Fórmula III:
II 106 R
em que Z tipicamente compreende OH, NH2, SH, NH-R', ou S-R'; Xe E, que podem ser iguais ou diferentes, tipicamente compreendem S ou O e R e R', que são opcionalmente iguais ou diferentes, são seleccionados tipicamente da mesma lista de constituintes para o grupo R descrito anteriormente para os aminoácidos não naturais que têm a Fórmula I assim como hidrogénio. Por exemplo, os aminoácidos não naturais da invenção opcionalmente compreendem substituições no grupo amino ou carboxilo como é ilustrado pelas Fórmulas II e III. Os aminoácidos não naturais deste tipo incluem, mas sem limitação, a-hidroxiácidos, α-tioácidos, (X-aminotiocarboxilatos, incluindo, mas sem limitação, com cadeias laterais correspondentes aos vinte aminoácidos naturais comuns ou cadeias laterais não naturais. Além disso, as substituições no carbono (X opcionalmente incluem, mas sem limitação, aminoácidos L, D ou a-a dissubstituidos tais como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutirico e similares. Outras alternativas estruturais incluem aminoácidos cíclicos tais como análogos de prolina, assim como análogos de prolina de anel de 3, 4, 6, 7, 8 e 9 membros, β e γ aminoácidos tais como β-alanina substituída e ácido γ-aminobutírico.
Muitos aminoácidos não naturais baseiam-se em aminoácidos não naturais tais como tirosina, glutamina, fenilalanina e 107 similares, e são adequados para uso na presente invenção. Os análogos de tirosina incluem, mas sem limitação, tirosinas substituídas em posição para, tirosinas substituídas em posição orto e tirosinas substituídas em posição meta, compreendendo a tirosina substituída, incluindo mas sem limitação, um grupo ceto (incluindo, mas sem limitação, um grupo acetilo) , um grupo benzoílo, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo carboxi, um grupo isoproprilo, um grupo metilo, um hidrocarboneto Ce - C2o de cadeia linear ou ramificado, um hidrocarboneto saturado ou insaturado, uma grupo O-metilo, um grupo poliéter, um grupo nitro, um grupo alcinilo ou similares. Além disso, também são contemplados anéis de arilo com múltiplas substituições. Os análogos de glutamina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas sem limitação, derivados de (X-hidroxi, derivados γ-substituídos, derivados cíclicos e derivados de glutamina substituídos com amida. Os análogos de fenilalanina de exemplo que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas sem limitação, fenilalaninas substituídas em posição para, fenilalaninas substituídas em posição orto e fenilalaninas substituídas em posição meta, em o substituem compreende, incluindo mas sem limitação, um grupo hidroxi, um grupo metoxi, um grupo metilo, um grupo alilo, um aldeído, um azido, um iodo, um bromo, um grupo ceto (incluindo, mas sem limitação, um grupo acetilo), um benzoílo, um grupo alcinilo ou similares. Os exemplos específicos de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas sem limitação, ap-acetil-L-fenilalanina, uma O-metil-L-tirosina, uma L-3-(2-naftil)alanina, uma 3-metil-fenilalanina, uma Ο-4-alil-L-tirosina, uma 4-propril-L-tirosina, uma tri-O-acetil-GlcNAcP-serina, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropril-L-fenilalanina, uma p-azido-L-fenilalanina, uma 108 p-acil-L-fenilalanina, uma p-benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfoserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p-iodo-fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, uma isopropril-L-fenilalanina e uma p-propargiloxi-fenilalanina e similares. São proporcionadas exemplos de estruturas de uma diversidade de aminoácidos não naturais que podem ser adequadas para uso na presente invenção em, por exemplo, o documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids". Veja-se também Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24 para análogos de metionina adicionais. O Pedido Internacional N° PCT/US06/47822 titulado "Compolocalns Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides", descreve a alquilação redutiva de resíduos de amina aromáticos, incluindo mas sem limitação, p-aminofenilalanina e aminação redutiva.
Numa forma de realização, são proporcionadas composições de um polipéptido FGF-21 que incluem um aminoácido não natural (tal como p-(propargiloxi)-fenilalanina). Também são proporcionadas diversas composições que compreendem p-(propargiloxi)-fenilalanina e, incluindo mas sem limitação, proteínas e/ou células. Num aspecto, uma composição que inclui o aminoácido não natural p-(propargiloxi)-fenilalanina também inclui um ARNt ortogonal. O aminoácido não natural pode ser ligado (incluindo, mas sem limitação, de forma covalente) com o ARNt ortogonal, incluindo mas sem limitação, a ligação covalente com o ARN ortogonal através de uma ligação de aminoacilo, a ligação covalente com um 3' OH ou um 2' OH de um açúcar ribose terminal do ARNt ortogonal, etc.
As fracções químicas através de aminoácidos não naturais que podem ser incorporadas em proteínas oferecem uma diversidade de vantagens e manipulações da proteína. Por 109 exemplo, a reactividade única de um grupo funcional ceto permite a modificação selectiva de proteínas com qualquer de vários reactivos que contêm hidrazina ou hidroxilamina in vitro e in vivo. Um aminoácido não natural com átomos pesados, por exemplo, pode ser útil para o cálculo das fases de dados de estrutura de raios X. A introdução específica de local de átomos pesados usando aminoácidos não naturais também proporciona selectividade e flexibilidade na selecção de posições para átomos pesados. Os aminoácidos não naturais fotorreactivos (incluindo, mas sem limitação, aminoácidos com cadeias laterais de benzofenona e arilazidas (incluindo, mas sem limitação, fenilazida)) , por exemplo, possibilitam a fotorreticulação in vivo e in vitro eficaz de proteínas. Os exemplos de aminoácidos não naturais fotorreactivos incluem, mas sem limitação, p-azido-fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina. A proteína com os aminoácidos não naturais fotorreactivos pode depois ser reticulada a vontade por excitação do controlo temporal que proporciona o grupo fotorreactivo. Num exemplo, o grupo metilo de um aminoácido não natural pode ser substituído com, incluindo mas sem limitação, um grupo metilo marcado com isótopos, como uma sonda de estrutura local e dinâmica, incluindo, mas sem limitação, com o uso de resonancia magnética nuclear e espectroscopia de vibração. Os grupos funcionais alcinilo ou azido, por exemplo, permiten a modificação selectiva de proteínas com moléculas através de uma reacção de cicloadição [3+2].
Um aminoácido não natural incorporado num polipéptido na extremidade amino terminal pode estar composto por um grupo R que é qualquer substituinte distinto do usado nos vinte aminoácidos naturais e um 2o grupo reactivo diferente do grupo NH2 normalmente presente nos α-aminoácidos (veja-se a Fórmula I). Pode ser incorporado um aminoácido não natural similar na extremidade carboxilo terminal com um 2o grupo 110 reactivo diferente do grupo COOH normalmente presente nos α-aminoácidos (veja-se a Fórmula I).
Os aminoácidos não naturais da invenção podem ser seleccionados ou desenhados para proporcionar caracteristicas adicionais não disponíveis nos vinte aminoácidos naturais. Por exemplo, o aminoácido não natural pode opcionalmente ser desenhado ou seleccionado para modificar as propriedades biológicas de uma proteína, por exemplo, na que são incorporados. Por exemplo, as seguintes propriedades podem ser modificadas opcionalmente por inclusão de um aminoácido não natural numa proteína: toxicidade, biodistribuição, solubilidade, estabilidade, por exemplo, resistência térmica, hidrolítica ou oxidativa à degradação enzimática e similares, facilidade de purificação e processamento, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, actividade catalítica, potencial redox, semivida, capacidade para reagir com outras moléculas, por exemplo, de forma covalente ou de forma não covalente, e similares.
ESTRUTURA E SÍNTESE DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS: CARBONILO SEMELHANTE A CARBONO, CARBONILO MASCARADO, GRUPOS CARBONILOS PROTEGIDOS, E GRUPOS HIDROXILAMINA
Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona FGF-21 ligado a um polímero solúvel em água, por exemplo um PEG, por uma ligação oxima.
Muitos tipos de aminoácidos não naturalmente codificados são adequados para a formação de ligações oxima. Estes incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos não naturalmente codificados contendo um grupo carbonilo, dicarbonilo ou hidroxilamina. Tais aminoácidos estão descritos na publicação de patente US Nos 2006/0194256, 2006/0217532, e 2006/0217289 e WO 2006/069246, intitulada "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and 111 polypetides". São também descritos aminoácidos não naturalmente codificados na patente US N° 7.083.970 e patente US N° 7.045.337, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
Algumas formas de realização da invenção utilizam polipéptidos FGF-21, que são substituídos numa posição com um aminoácido para-acetilfenilalanina. A síntese de p-acetilo-(+/-)-fenilalanina e m-acetilo-(+/-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Outros aminoácidos contendo carbonilo ou dicarbonilo podem ser preparados de modo semelhante, por um perito na tecnologia. Mais ainda, exemplos de sínteses não limitativas de aminoácido não natural que estão aqui incluídas, são apresentadas nas figuras 4, 24-34 e 36-39 da patente US N° 7.083.970.
Aminoácidos com um grupo reactivo electrofílico permitem uma variedade de reacções para ligar moléculas, através de reacções de adição nucleofílica, entre outras. Tais grupos reactivos electrofílicos incluem um grupo carbonilo (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonilo), um grupo semelhante a carbonilo (que tem reactividade semelhante a um grupo carbonilo (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonilo) , e é estruturalmente semelhante a um grupo carbonilo), um grupo carbonilo mascarado (que pode ser rapidamente convertido num grupo carbonilo (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonilo)), ou um grupo carbonilo protegido (que tem reactividade semelhante a um grupo carbonilo (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonilo) após desprotecção). Tais aminoácidos incluem aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (IV): 112
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0- , -0-(alquileno ou alquileno substituído) r -S-, -S- (alquileno ou alquileno substituído) ~ r — S (0) k— em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno OU alquileno substituído)-, -C(0) ~ r -C(0)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S) ~ r -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N (R' )-, -NR' - (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0) N (R' )~, - CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - 113 C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e —C(R')2—N(R')—N(R')—, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; J é
R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído; cada R" é independentemente H, alquilo, alquilo substituído, ou um grupo protector, ou quando está presente mais do que um grupo R", dois R" formam opcionalmente um heterocicloalquilo;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogénio, alquilo inferior, ou alquilo inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam opcionalmente um cicloalquilo ou um heterocicloalquilo; ou os grupos -A-B-J-R formam em conjunto um cicloalquilo bicíclico ou tricíclico, ou heterocicloalquilo compreendendo pelo menos um grupo carbonilo, incluindo um grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, incluindo um grupo dicarbonilo protegido, ou grupo carbonilo mascarado, incluindo um grupo dicarbonilo mascarado; ou o grupo -J-R forma em conjunto um cicloalquilo monocíclico ou bicíclico, ou heterocicloalquilo compreendendo pelo menos um grupo carbonilo, incluindo um grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, incluindo um 114 grupo dicarbonilo protegido, ou grupo carbonilo mascarado, incluindo um grupo dicarbonilo mascarado; com a condição de que quando A é fenileno e cada R3 é Η, B está presente; e que quando A é -(CH2)4- e cada R3 é Η, B não é -NHC(O)(CH2CH2)-; e que quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R não é metilo.
Além disso, são incluídos tendo a estrutura da fórmula (V) :
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)- 115 (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C (S (alquileno ou alquileno substituído)-, -N (R' ) - , -NR (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R' CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, S (0) fcN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0) kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; com a condição de que quando A é fenileno, B está presente; e que quando A é -(CH2)4-, B não é -NHC(O) (CH2CH2)-; e que quando A e B estão ausentes, R não é metilo.
Além disso, são incluídos aminoácidos tendo a estrutura da fórmula (VI):
em que: grupo consistindo de inferior substituído, inferior substituído, B é um linker seleccionado do alquileno inferior, alquileno alcenileno inferior, alcenileno 116 heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído) r -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno OU alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (0)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0) kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, —C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, -N(R')2, -C(0)kR' onde k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -0R', e -S(0)kR' , onde cada R' é independentemente H, alquilo, ou alquilo substituído.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:
117
em que tais compostos são opcionalmente um grupo protegido amino, carboxilo protegido ou um sal do mesmo. Além disso, qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais, podem ser incorporados num polipéptido de aminoácido não natural.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (VII): (Chefes.
em que B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído) t -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído) r -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -c(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R ' CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, S (0) kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R’)-, 118 N(R')S (0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')- C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, —N (R' ) 2, -C(0)kR' onde k é 1, 2 ou 3, -C (0) N (R' ) 2, -0R', e -S(0)kR', onde cada R' é independentemente H, alquilo, ou alquilo substituído; e n é 0 a 8; com a condição de que quando A é -(CH2)4-, B não é -NHC(O) (CH2CH2)-.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:
♦ e
119 em que tais compostos são opcionalmente, amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos e carboxilo protegidos, ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais, podem ser incorporados num polipéptido de aminoácido não natural.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (VIII):
(VIII), em que A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, —S (0) k— em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)- 120 (alquileno ou alquileno substituído)-, -c(S)-, -C (S (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R' )-, CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, S(0)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O) kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (IX):
B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0- -, -0-(alquileno ou alquileno substituído) , -s-, -S-(alquileno ou alquileno substituído) —, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0) -C(0)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S) -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N (R' )-, -NR'- 121 (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (0) kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, N(R' )S (0) kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C (R' ) =N—N=, -C(R')2-N=N- e -C(R') 2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e r2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptidos, ou polinucleotídeo; em que cada Ra é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, -N(R')2, -C(0)kR' onde k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -0R', e -S(0)kR\ onde cada R' é independentemente H, alquilo, ou alquilo substituído.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:
em que tais compostos são opcionalmente, amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino 122 122 dos mesmos, qualquer um podem ser natural. aminoácidos protegidos e carboxilo protegidos, ou um sal Além disso, estes aminoácidos não naturais e dos seguintes aminoácidos não naturais, incorporados num polipéptido de aminoácido não Além disso, são incluidos os seguintes possuindo a estrutura de fórmula (X):
em que B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído) r — S (0) k— em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno OU alquileno substituído)-, -C(0)-, -c(0)- (alquileno OU alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno OU alquileno substituído)-, -N (R' ) - , -NR' - (alquileno ou alquileno substituído)-, —C (0) N (R' ) -, - CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0) kN(R' )-, —N(R')—N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e 123 R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, -N(R')2, -C(0)kR' onde k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -0R', e -S(0)kR', onde cada R' é independentemente H, alquilo, ou alquilo substituído; e n é 0 a 8.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:
em que tais compostos são opcionalmente, amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos e carboxilo protegidos, ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais, podem ser incorporados num polipéptido de aminoácido não natural.
Além das estruturas monocarbonilo, os aminoácidos não naturais aqui descritos podem incluir grupos tais como dicarbonilo, semelhantes a dicarbonilo, dicarbonilo mascarado e grupos dicarbonilo protegidos.
Por exemplo, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XI): 124 124
<XD, em que A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído) r -S(0)k— em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno OU alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno ou alquileno substituído)-, -C (0) N (R ' CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, S (0) kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído; 125
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotideo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotideo.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XII):
B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -s-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k— em que k é 1, 2 ou 3, -s(0)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0) — f -C(0)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S) r -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N (R' )~r -NR' - (alquileno ou alquileno substituído)-, -C (0) N (R ' )-, - CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')—, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R’)=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C (R ' )2-M=N- e -C (R' )2“N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído; 126
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; em que cada Ra é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, —N(R')2λ -C(0)kR' onde k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2r -0R', e -S (0) kR', onde cada R' é independentemente H, alquilo, ou alquilo substituído.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:
O
e em que tais compostos são opcionalmente, amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos e carboxilo protegidos, ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais, podem ser incorporados num polipéptido de aminoácido não natural.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XIII):
O
127 em que B é opcional, e quando presente é um linker seleccionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, — S (0) k— em que k é 1, 2 ou 3, -S(0)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, 1 2 W 1 (alquileno ou alquileno substituído)-, —C(0)N(R' )-, ~ CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, N(R' ) S (0) kN(R')-, -N(R')—N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, -N(R')2, -C (0) kR' onde k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -0R', e -S(0)kR', onde cada R' é independentemente H, alquilo, ou alquilo substituído; e n é 0 a 8.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos: 128
em que tais compostos são opcionalmente, amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos e carboxilo protegidos, ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais, podem ser incorporados num polipéptido de aminoácido não natural.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XIV):
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, 129 alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; Xi é C, S ou S(0); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), onde R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XIV-A):
(XÍV-A) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, 130 heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), onde R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XIV-B):
R,HN
(XIV-B) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, 131 heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), onde R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XV):
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; 132 R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; Xj é C, S ou S(0); e n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, alcoxi, alquilamina, halogénio, alquilo, arilo, ou qualquer R8 e R9 podem em conjunto formar =0 ou um cicloalquilo, ou quaisquer dois grupos adjacentes R8 podem em conjunto formar um cicloalquilo.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XV-A):
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído; 133 r2 é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotideo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotideo; néO, 1, 2, 3, 4ou5;e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, alcoxi, alquilamina, halogénio, alquilo, arilo, ou qualquer R8 e R9 podem em conjunto formar =0 ou um cicloalquilo, ou quaisquer dois grupos adjacentes R8 podem em conjunto formar um cicloalquilo.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XV-B): Μ*
(XV-B) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotideo; 134 R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotideo; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, alcoxi, alquilamina, halogénio, alquilo, arilo, ou qualquer R8 e R9 podem em conjunto formar =0 ou um cicloalquilo, ou quaisquer dois grupos adjacentes R8 podem em conjunto formar um cicloalquilo.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XVI):
(XVI); em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e 135 r2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotideo; Xi é C, S ou S(0); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), onde R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XVI-A):
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; 136 L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), onde R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído.
Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XVI-B):
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), onde R' é H, alquilo, 137 alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído.
Além disso, são incluídos os aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XVII):
ΊΓΥ o (XVII), em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; M é -C(R3)-, <*>
m (W
X k~v\ R« R, <*»> <«> o» «ΛΛΓ ,c—| <b) R« 0») ww»L-o- ** 0>> <*> A. * 138
ou
em que (a) indica a ligação ao grupo A, e (b) indica a ligação aos respectivos grupos carbonilo, R3 e R4 são independentemente escolhidos de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 formam opcionalmente um cicloalquilo ou um heterocicloalquilo; R é H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído; T3 é uma ligação, C(R) (R) , 0 ou S, e R é H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo.
Além disso, são incluídos os aminoácidos possuindo a estrutura de fórmula (XVIII):
em que: M é -C (R3) - 139
em que (a) indica a ligação ao grupo A, e (b) indica a ligação aos respectivos grupos carbonilo, R3 e R4 são independentemente escolhidos de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 formam opcionalmente um cicloalquilo ou um heterocicloalquilo; R é H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído; T3 é uma ligação, C(R) (R) , 0 ou S, e R é H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído;
Ri é opcional, e quando presente é H, um grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido, ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, halogénio, alquilo, alquilo substituído, -N(R')2, -C(0)kR' onde k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -0R', e -S(0)kR', onde cada R' é independentemente H, alquilo, ou alquilo substituído. 140 Além estrutura disso, sao incluídos de fórmula (XIX): os aminoácido possuindo a
em que: R é H, halogénio, alquilo, alquilo cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído; e T3 é O ou S. Além disso, são incluídos os aminoácido estrutura de fórmula (XX): substituído, possuindo a
(XX), em que: R é H, halogénio, alquilo, alquilo cicloalquilo, ou cicloalquilo substituído. Além disso, são incluídos os seguinte possuindo estruturas de fórmula (XXI): substituído, aminoácidos 141 Ri* fl
Em algumas formas de realização, um polipéptido compreendendo um aminoácido não natural, é quimicamente modificado para gerar um carbonilo reactivo ou um grupo funcional dicarbonilo. Por exemplo, uma funcionalidade de aldeído útil para reacções de conjugação, pode ser gerada de uma funcionalidade tendo grupos amino e hidroxilo adjacentes. Quando a molécula biologicamente activa é um polipéptido, por exemplo, uma serina ou treonina no terminal-N (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposto através de digestão química ou enzimática), pode ser usado para gerar uma funcionalidade aldeído, sob condições de clivagem moderadamente oxidativa usando periodato. Veja-se, por exemplo, Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. e Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). No entanto, os métodos conhecidos na tecnologia estão restritos ao aminoácido no terminal-N do péptido ou proteína.
Na presente invenção, um aminoácido não natural tendo grupos hidroxilo e amino adjacentes, pode ser incorporado no polipéptido como uma funcionalidade aldeído "mascarada". Por exemplo, a 5-hidroxilisina tem um grupo hidroxilo adjacente à amina epsilon. As condições de reacção para gerar o aldeído, envolvem tipicamente a adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições suaves, para evitar a oxidação noutros locais no interior do polipéptido. O pH da reacção de oxidação é tipicamente cerca de 7,0. Uma reacção típica envolve a adição de cerca de 1,5 de excesso molar de metaperiodato de sódio a uma 142 solução tamponada do polipéptido, seguida de incubação durante cerca de 10 minutos no escuro. Veja-se, por exemplo a patente US N° 6.423.685. A funcionalidade carbonilo ou dicarbonilo pode reagir selectivamente com um reagente contendo hidroxilamina sob condições suaves, em solução aquosa, para formar a ligação oxima correspondente, que é estável em condições fisiológicas. Veja-se, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além disso, a reactividade única do grupo carbonilo ou dicarbonilo, permite a modificação selectiva na presença das outras cadeias laterais de aminoácidos. Veja-se, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. e Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al. , Science 276:1125-1128 (1997). Estrutura e síntese de aminoácidos não naturais: aminoácidos contendo hidroxilamina
Pedido de patente provisório US N° 60/638,418. Assim, as divulgações fornecidas na secção V (intitulada "aminoácidos não naturais"), parte B (intitulada "estrutura e síntese de aminoácidos não naturais: aminoácidos contendo hidroxilamina"), no pedido de patente provisório US N° 60/638,418, aplicam-se integralmente aos métodos, composições (incluindo as fórmulas I-XXXV) , técnicas e estratégias para fazer, purificar, caracterizar, e usar aminoácidos não naturais, polipéptidos de aminoácidos não naturais e polipéptidos de aminoácidos não naturais modificados aqui descritos com a mesma extensão como se tais divulgações fossem aqui totalmente apresentadas. Publicação de patente US Nos 2006/0194256, 2006/0217532, e 2006/0217289 e documento WO 2006/069246 intitulada "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides". 143 Síntese química de aminoácidos não naturais
Muitos dos aminoácidos não naturais adequados para utilização na presente invenção estão disponíveis comercialmente, por exemplo de Sigma (EUA) ou Aldrich (Milwaukee, WI, EUA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados tal como aqui proporcionado, ou tal como fornecido em várias publicações, ou utilizando métodos padrão conhecidos dos peritos na tecnologia. Veja-se, por exemplo, para técnicas de síntese orgânica, Química orgânica por Fessendon e Fessendon, (1982, Segunda edição, Willard Grant Press, Boston Mass.) ; Química orgânica avançada por March (Terceira edição, 1985, Wiley and Sons, Nova Iorque); e Química orgânica avançada por Carey e Sundberg (Terceira Edição, partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova York). Outras publicações que descrevem a síntese de aminoácidos não naturais incluem por exemplo, WO 2002/085923, intitulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids"; Matsoukas et al., (1995) J. Med.
Chem., 38, 4660-4669; King, F. E. e Kidd, D. A. A. (1949) A new synthesis of glutamine and of γ-dipeptides of glutamic acid from phthylated intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O. M. e Chatterrji, R. (1959) Synthesis of derivatives of glutamine as model substrates for anti-tumor agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J. C. et al. (1988) Absolute configuration of the enantiomers of 7- chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl] amino] quinoline (chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M.,
Vilmont, M. e Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as potencial antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5;
Koskinen, A. Μ. P. e Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-substituted prolines as conformationally constrained amino acid analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B. D. e Rapoport, H. (1985) Synthesis of optically pure pipecolates from L-asparagine. Application to the total synthesis of (+)-apovincamine through amino acid 144 decarbonylation and iminium ion cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of novel alpha-amino-acids and derivatives using radical chemistry: synthesis of L-and D-alpha-amino-adipic acids, L-alpha-aminopimelic acid and appropriate unsaturated derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; e, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Veja-se também, a publicação de patente US N° 2004/0198637 intitulada "Protein Arrays". A. Grupos reactivos carbonilo
Os aminoácidos com um grupo reactivo carbonilo permitem uma variedade de reacções para ligar moléculas (incluindo mas não limitado a, PEG ou outras moléculas solúveis em água), através da adição nucleofilica ou reacções de condensação de aldol entre outras.
Exemplos de aminoácidos contendo carbonilo podem ser representados como se segue: (ÇH^CGRj
em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, ou arilo substituído; R2 é H, alquilo, arilo, alquilo substituído, e arilo substituído; e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal amino, e R4 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal carboxi. Em algumas formas de realização, n é 1, Rj é fenilo e R2 é um alquilo simples (isto é, metilo, etilo, ou propilo), e a porção cetona é posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquilo. Em algumas formas de realização, n é 1, 145
Rx é fenilo e R2 é um alquilo simples (isto é, metilo, etilo, ou propilo), e a porção cetona é posicionada na posição meta em relação à cadeia lateral de alquilo. A síntese de p-acetilo-(+/-)-fenilalanina e m-acetilo-( + /-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Outros aminoácidos contendo carbonilo podem ser preparados de modo semelhante por um perito na tecnologia.
Em algumas formas de realização, um polipéptido compreendendo um aminoácido não naturalmente codificado, é quimicamente modificado para gerar um grupo funcional carbonilo reactivo. Por exemplo, uma funcionalidade de aldeído útil para reacções de conjugação, pode ser gerada de uma funcionalidade tendo grupos amino e hidroxilo adjacentes. Quando a molécula biologicamente activa é um polipéptido, por exemplo, uma serina ou treonina no terminal-N (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposto através de digestão química ou enzimática), pode ser usado para gerar uma funcionalidade aldeído, sob condições de clivagem moderadamente oxidativa usando periodato. Veja-se, por exemplo, Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. e Stroh, j., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). No entanto, os métodos conhecidos na tecnologia estão restritos ao aminoácido no terminal-N do péptido ou proteína.
Na presente invenção, um aminoácido não naturalmente codificado tendo grupos hidroxilo e amino adjacentes, pode ser incorporado no polipéptido como uma funcionalidade aldeído "mascarada". Por exemplo, a 5-hidroxilisina tem um grupo hidroxilo adjacente à amina epsilon. As condições de reacção para gerar o aldeído, envolvem tipicamente a adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições suaves, para evitar a oxidação noutros locais no interior do polipéptido. O pH da reacção de oxidação é tipicamente 146 cerca de 7,0. Uma reacção típica envolve a adição de cerca de 1,5 de excesso molar de metaperiodato de sódio a uma solução tamponada do polipéptido, seguida de incubação durante cerca de 10 minutos no escuro. Veja-se, por exemplo a patente US N° 6.423.685. A funcionalidade carbonilo pode reagir selectivamente com um reagente contendo hidrazina, hidrazida, hidroxilamina ou semicarbazida sob condições suaves, em solução aquosa, para formar as ligações hidrazona, oxima ou semicarbazona correspondentes, que são estáveis em condições fisiológicas. Veja-se, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além disso, a reactividade única do grupo carbonilo, permite a modificação selectiva na presença das outras cadeias laterais de aminoácidos. Veja-se, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996);
Geoghegan, K. F. e Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997). B. Grupos reactivos hidrazina, hidrazida ou semicarbazida
Os aminoácidos não naturalmente codificados contendo um grupo nucleofílico, tal como uma hidrazina, hidrazida ou semicarbazida, permitem a reacção com uma variedade de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluindo mas não limitado a, com PEG ou outros polímeros solúveis em água).
Exemplos de aminoácidos contendo hidrazina, hidrazida ou semicarbazida podem ser representados como se segue:
147 em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, ou arilo substituído ou ausente; X é 0, N ou S ou ausente; R2 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal carboxi.
Em algumas formas de realização, n é 4, Ri está ausente, e X é N. Em algumas formas de realização, n é 2, Ri está ausente, e X está ausente. Em algumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X é 0, e o átomo de oxigénio é posicionado para em relação ao grupo alifático no anel de arilo.
Os aminoácidos contendo hidrazida, hidrazina, e semicarbazida estão disponíveis de fontes comerciais. Por exemplo, L-glutamato-y-hidrazida está disponível de Sigma Chemical (St. Louis, MO). Outros aminoácidos não estão disponíveis comercialmente podem ser preparados por um perito na tecnologia. Veja-se, por exemplo, a patente US N° 6.281.211.
Polipéptidos contendo aminoácidos não naturalmente codificados que tenham funcionalidades hidrazida, hidrazina ou semicarbazida, podem reagir eficientemente e selectivamente com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos, ou outros grupos funcionais com reactividade química similar. Veja-se, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). A reactividade única dos grupos funcionais hidrazida, hidrazina e semicarbazida, torna-os significativamente mais reactivos para aldeídos, cetonas e outros grupos electrofílicos, em comparação com os grupos nucleofílicos presentes nos 20 aminoácidos comuns (incluindo mas não limitado a, o grupo hidroxilo da serina ou treonina, ou os grupos amino da lisina e do terminal-N). C. Aminoácidos contendo aminooxi 148
Os aminoácidos não naturalmente codificados contendo um grupo aminooxi (também chamado uma hidroxilamina) , permitem a reacção com uma variedade de grupos electrofilicos para formar conjugados (incluindo mas não limitado a, com PEG ou outros polímeros solúveis em água). Tal como as hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a nucleofilicidade melhorada do grupo aminooxi, permite-lhe reagir eficientemente e selectivamente com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos, ou outros grupos funcionais com reactividade química similar. Veja-se, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang e C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001).
Enquanto que o resultado de uma reacção com um grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, no entanto, uma oxima resulta geralmente da reacção de um grupo aminooxi com um grupo contendo carbonilo, tal como uma cetona.
Exemplos de aminoácidos contendo grupos aminooxi podem ser representados como se segue:
em que n é 0-1,0; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, ou arilo substituído ou ausente; X é O, N, S ou ausente; m é 0-10; Y = C (O) ou ausente; R2 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal carboxi. Em algumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X é O, m é 1, e Y está presente. Em algumas formas de realização, n é 2, Ri e X estão ausentes, m é 0, e Y está ausente.
Os aminoácidos contendo aminooxi podem ser preparados de precursores de aminoácidos facilmente disponíveis (homoserina, serina e treonina). Veja-se, por exemplo, M. 149
Carrasco e R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003) . Certos aminoácidos contendo aminooxi, tal como L-2-amino-4-(aminooxi) ácido butírico), têm sido isolados de fontes naturais (Rosenthal, G., Life Sei. 60: 1635-1641 (1997). Outros aminoácidos contendo aminooxi podem ser preparados por um perito na tecnologia. D. Grupos reactivos azida e alcino A reactividade única dos grupos funcionais azida e alcino, torna-os extremamente úteis para a modificação selectiva de polipéptidos e outras moléculas biológicas. As azidas orgânicas, em especial as azidas alfáticas, e alcinos, são geralmente estáveis para com condições guimicas reactivas comuns. Em particular, ambos os grupos funcionais azida e alcino, são inertes para com as cadeias laterais (isto é, grupos R) dos 20 aminoácidos comuns encontrados em polipéptidos que ocorrem naturalmente. No entanto, quando postos em estreita proximidade, a natureza de "mola" dos grupos azida e alcino é revelada, e reagem selectivamente e eficientemente através da reacção de cicloadição Huisgen [3+2] para gerar o triazole correspondente. Veja-se, por exemplo, Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al. , J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).
Porque a reacção de cicloadição Huisgen envolve uma reacção de cicloadição selectiva (veja-se, por exemplo, Padwa, A., em Síntese orgânica compreensiva, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), pág. 1069-1109; Huisgen, R. em Química de cicloadição dipolar-1,3, (ed. Padwa, A., 1984), pág. 1-176) em vez de uma substituição nucleof ilica, a incorporação de aminoácidos não naturalmente codificados tendo cadeias laterais contendo azida e alcino, permitem aos polipéptidos resultantes ser modificados selectivamente na posição do aminoácido não naturalmente codificado. A 150 reacção de cicloadição envolvendo o polipéptido FGF-21 contendo azida ou alcino, pode ser realizada à temperatura ambiente, sob condições aquosas, pela adição de Cu(II) (incluindo mas não limitado a, na forma de uma quantidade catalítica de CuS04) na presença de um agente redutor, para reduzir Cu(II) a Cu(I), in situ, em quantidade catalítica. Veja-se, por exemplo, Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Exemplos de agentes redutores incluem, incluindo mas não se limitam a, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2+, Co2+, e um potencial eléctrico aplicado.
Em alguns casos, onde é desejada uma reacção de cicloadição Huisgen [3+2] entre uma azida e um alcino, o polipéptido FGF-21 compreende um aminoácido não naturalmente codificado compreendendo uma porção alcino, e o polímero solúvel em água para ser ligado ao aminoácido compreendendo uma porção azida. Alternativamente, pode também ser realizada a reacção inversa (isto é, com a porção azida no aminoácido e a porção alcino presente no polímero solúvel em água). O grupo funcional azida também pode reagir selectivamente com um polímero solúvel em água contendo um éster de arilo, e adequadamente funcionalizado com uma porção de fosfina de arilo para gerar uma ligação amida. O grupo fosfina de arilo reduz a azida in situ, e a amina resultante reage em seguida eficientemente com uma ligação éster proximal, para gerar a amida correspondente. Veja-se, por exemplo, E. Saxon e C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). 0 aminoácido contendo azida pode ser tanto uma azida de alquilo (incluindo mas não limitado a, 2-amino-6-azido-l-ácido hexanóico) ou uma azida de arilo (p-azido-fenilalanina) . 151
Exemplos de polímeros solúveis em água contendo um éster de arilo e uma porção de fosfina, podem ser representados como se segue:
em gue X pode ser 0, N, S ou ausente, Ph é fenilo, W é um polímero solúvel em água, e R pode ser H, grupos alquilo, arilo, alquilo substituído e arilo substituído. Exemplos de grupos R incluem, mas não estão limitados a, -CH2, -C(CH3)3, -0R', -NR'R", -SR', -halogéneo, -C(0)R', -C0NR'R", S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN e -N02. R', R", R'" e R"", cada um independentemente referem-se a hidrogénio, heteroalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, incluindo mas não limitado a, arilo substituído com 1-3 halogéneos, grupos alquilo, alcoxi ou tioalcoxi, ou grupos arilalquilo substituídos ou não substituídos. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente seleccionado, tal como são cada um dos grupos R', R' ', R" ' e R "" quando mais do que um destes grupos está presente. Quando R' e R" estão ligados ao mesmo átomo de azoto, podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 5, 6, ou 7 membros. Por exemplo, - NR'R" pretende incluir, mas não se limita a, 1- pirrolidinilo e 4-morfolinilo. Da discussão de substituintes anterior, um perito na tecnologia compreenderá que o termo "alquilo" pretende incluir grupos incluindo átomos de carbono ligados a grupos que não grupos de hidrogénio, tais como haloalquilo (incluindo mas não limitado a, -CF3 e -CH2CF3) e acilo (incluindo mas não 152 limitado a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (0) CH2OCH3, e semelhantes). 0 grupo funcional azida também pode reagir selectivamente com um polímero solúvel em água contendo um tioéster, e adequadamente funcionalizado com uma porção de fosfina de arilo para gerar uma ligação amida. 0 grupo fosfina de arilo reduz a azida in situ, e a amina resultante reage em seguida eficientemente com a ligação tioéster, para gerar a amida correspondente. Exemplos de polímeros solúveis em água contendo um tioéster e uma porção de fosfina, podem ser representados como se segue:
Q em que n é 1-10; X pode ser 0, N, S ou ausente, Ph é fenilo, e W é um polímero solúvel em água.
Exemplos de aminoácidos contendo alcino, podem ser representados como se segue:
Ra
<ÇH^R*X(CH3UCCH em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, ou arilo substituído ou ausente; X é 0, N, S ou ausente; m é 0-10, R2 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal carboxi. Em algumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X está ausente, m é 0, e a porção acetileno é posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquilo. Em algumas formas de realização, 153 n é 1, Ri é fenilo, X é 0, m é 1, e o grupo propargiloxi é posicionado na posição para em relação à cadeia lateral de alquilo (isto é, O-propargilo-tirosina) . Em algumas formas de realização, n é 1, Ri e X estão ausentes e m é 0 (isto é, proparilglicina).
Os aminoácidos contendo alcino estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, propargilglicina está comercialmente disponível de Peptech (Burlington, MA). Alternativamente, os aminoácidos contendo alcino podem ser preparados de acordo com métodos padrão. Por exemplo, p-propargiloxifenilalanina pode ser sintetizada, por exemplo, como descrito em Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), e 4-alcinilo-L-fenilalanina pode ser sintetizada como descrito em Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Outros aminoácidos contendo alcino podem ser preparados por um perito na tecnologia.
Exemplos de aminoácidos contendo azida podem ser representados como se segue:
em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, arilo substituído ou ausente; X é O, N, S ou ausente; m é 0-10; R2 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação de terminal carboxi. Em algumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X está ausente, m é 0, e a porção azida é posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquilo. Em algumas formas de realização, n é 0-4, e Ri e X estão ausentes e m = 0. Em algumas formas de realização, n 154 é 1, Ri é fenilo, X é 0, m é 2, e a porção β-azidoetoxi é posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquilo.
Os aminoácidos contendo azida estão disponíveis de fontes comerciais. Por exemplo, a 4-azidofenilalanina pode ser obtida de Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL) . Para os aminoácidos contendo azida que não estão disponíveis comercialmente, o grupo azida pode ser preparado relativamente facilmente utilizando métodos padrão conhecidos dos peritos na tecnologia, incluindo mas não limitado a, através do deslocamento de um grupo de saída adequado (incluindo mas não se limitam a, halido, mesilato, tosilato) ou através da abertura de uma lactona protegida adequada. Veja-se, por exemplo, Química orgânica avançada por March (terceira edição, 1985, Wiley and Sons, Nova Iorque). E. Grupos reactivos aminotiol A reactividade única de grupos funcionais aminotiol substituídos em beta, torna-os extremamente úteis para a modificação selectiva de polipéptidos e outras moléculas biológicas que contêm grupos aldeído, através da formação de tiazolidina. Veja-se, por exemplo, J. Shao e J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. Em algumas formas de realização, os aminoácidos aminotiol substituídos em beta podem ser incorporados em polipéptidos FGF-21, e em seguida reagir com polímeros solúveis em água compreendendo uma funcionalidade aldeído. Em algumas formas de realização, um polímero solúvel em água, um fármaco conjugado ou outra carga útil, pode ser acoplado a um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido aminotiol substituído em beta, através da formação de tiazolidina. F. Grupos reactivos adicionais 155 São descritos nos seguintes pedidos de patente grupos reactivos adicionais, e aminoácidos não naturalmente codificados gue podem ser incorporados em polipéptidos FGF-21 da invenção: publicação de patente US N° 2006/0194256, publicação de patente US N° 2006/0217532, publicação de patente US N° 2006/0217289, patente provisional US N° 60/755.338, patente provisional US N° 60/755.711, patente provisional US N° 60/755.018, pedido de patente internacional N° PCT/US06/49397, WO 2006/069246, patente provisional US N° 60/743.041, patente provisional US N° 60/743.040, pedido de patente internacional N° PCT/US06/47822, patente provisional US N° 60/882.819, patente provisional US N° 60/882.500, e patente provisional US N° 60/870.594.
Captação celular de aminoácidos não naturais _A captação de aminoácido não natural por uma célula, é uma questão que é tipicamente considerada quando se concebe e selecciona aminoácidos não naturais, incluindo mas não limitado a, para incorporação numa proteína. Por exemplo, a elevada densidade de carga dos α-aminoácidos, sugere que estes compostos sejam pouco prováveis de ser permeáveis à célula. Os aminoácidos naturais são captados para dentro da célula eucariótica, através de uma colecção de sistemas de transporte baseados em proteínas. Pode ser feita uma selecção rápida que avalia que aminoácidos não naturais, se existirem, são captados pelas células. Veja-se, por exemplo, os ensaios de toxicidade em, por exemplo, publicação de patente US N° 2004/0198637, intitulada "Protein arrays"; e Liu, D. R. e Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Embora a captação seja facilmente analisada com vários testes, uma alternativa para a concepção de aminoácidos não naturais que são passíveis de vias de captação celular, é o 156 de proporcionar vias biosintéticas para criar aminoácidos in vivo.
Biosíntese de aminoácidos não naturais _Existem já muitas vias biosintéticas nas células para a produção de aminoácidos e outros compostos. Embora possa não existir na natureza um método biosintético para um aminoácido não natural específico, incluindo mas não limitado a, numa célula, a divulgação fornece tais métodos. Por exemplo, vias biosintéticas para aminoácidos não naturais são opcionalmente geradas numa célula hospedeira, por adição de novas enzimas ou modificando as vias existentes da célula hospedeira. Novas enzimas adicionais são opcionalmente enzimas que ocorrem naturalmente, ou enzimas evoluídas artificialmente. Por exemplo, a biosíntese de p-aminofenilalanina (tal como apresentada num exemplo em WO 2002/085923, intitulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids") baseia-se na adição de uma combinação de enzimas conhecidas de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos numa célula eucariótica, transformando a célula com um plasmídeo que compreende os genes. Os genes, quando expressos na célula, fornecem uma via enzimática para sintetizar o composto desejado. Exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmente adicionadas são fornecidos nos exemplos abaixo. Sequências de enzimas adicionais são encontradas, por exemplo, no Genbank. Enzimas evoluídas artificialmente são também opcionalmente adicionadas numa célula do mesmo modo. Desta maneira, a maquinaria celular e os recursos de uma célula são manipulados para produzir aminoácidos não naturais.
Estão disponíveis uma variedade de métodos para a produção de enzimas novas, para uso em vias biosintéticas ou para a evolução das vias existentes. Por exemplo, a recombinação recursiva, incluindo mas não limitado a, tal 157 como desenvolvido por Maxygen, Inc. (disponível na internet em maxygen.com), é usada opcionalmente para desenvolver novas enzimas e vias. Veja-se, por exemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 ( 4) :389-391; e, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 91:10747-10751. Da mesma forma, DesignPath™ desenvolvido pela Genencor (disponível na internet em genencor.com) é usado opcionalmente para engenharia de via metabólica, incluindo mas não limitado a, projectar uma via para a criação de O-metilo-L-tirosina numa célula. Esta tecnologia reconstrói vias existentes em organismos hospedeiros usando uma combinação de novos genes, incluindo mas não se limitam a, aqueles identificados através de genómica funcional, e evolução molecular e design. A Diversa Corporation (disponível na internet em diversa.com) também fornece tecnologia para uma selecção rápida de bibliotecas de genes e vias de genes, incluindo mas não limitado a, para criar novas vias.
Tipicamente, o aminoácido não natural produzido com uma via biosintética de engenharia da invenção, é produzido numa concentração suficiente para a biosíntese de proteína eficiente, incluindo mas não limitado a, uma quantidade celular natural, mas não a tal ponto de afectar a concentração dos outros aminoácidos ou esgotar os recursos celulares. As concentrações típicas produzidas in vivo deste modo, são cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mM. Uma vez que uma célula é transformada com um plasmídeo que compreende os genes utilizados para produzir as enzimas desejadas para uma via específica, e um aminoácido não natural é gerado, as selecções in vivo são utilizadas opcionalmente para optimizar ainda mais a produção do aminoácido não natural, tanto para a síntese de proteínas ribossomais e o crescimento celular. 158
Polipéptidos com aminoácidos não naturais _A incorporação de um aminoácido não natural pode ser feita por uma variedade de fins, incluindo mas não limitado a, adaptar alterações na estrutura e/ou função da proteína, alterar o tamanho, acidez, nucleofilicidade, ligação de hidrogénio, hidrofobicidade, acessibilidade de locais alvo da protease, direccionar a uma porção (incluindo mas não limitado a, para uma matriz de proteína), adicionar uma molécula biologicamente activa, ligar um polímero, ligar um radionuclídeo, modular a semi-vida do soro, modular a penetração do tecido (por exemplo, tumores), modular o transporte activo, modular a especificidade ou distribuição do tecido, célula ou órgão, modular a imunogenicidade, modular a resistência à protease, etc. As proteínas que incluem um aminoácido não natural podem ter propriedades catalíticas ou biofísicas reforçadas, ou até mesmo inteiramente novas. Por exemplo, as seguintes propriedades são opcionalmente modificadas pela inclusão de um aminoácido não natural numa proteína: toxicidade, biodistribuição, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, capacidade catalítica, meia-vida (incluindo mas não limitado a, semi-vida do soro), capacidade de reagir com outras moléculas, incluindo mas não limitado a, covalentemente ou não covalentemente, e semelhantes. As composições incluindo proteínas que incluem pelo menos um aminoácido não natural são úteis para, incluindo mas não limitado a, terapêuticas novas, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo mas não limitado a, anticorpos), e incluindo mas não limitado a, estudo da estrutura e função da proteína. Veja-se, por exemplo, Dougherty, (2000) Unnatural amino acids as probes of protein structure and function, Current Opinion in Chemical Biology, 4: 645-652. 159
Num aspecto da invenção, uma composição inclui pelo menos uma proteína com pelo menos um aminoácido não natural.
Proteínas ou polipéptidos de interesse com um aminoácido não natural, são uma característica da invenção. A invenção também inclui polipéptidos ou proteínas com um aminoácido não natural, produzidos utilizando as composições e métodos da invenção. Pode também estar presente com a proteína um excipiente (incluindo mas não limitado a, um excipiente farmaceuticamente aceitável).
Ao produzir as proteínas ou polipéptidos de interesse com um aminoácido não natural em células eucarióticas, as proteínas ou polipéptidos incluirão tipicamente modificações pós-translacionais eucarióticas. Em certas formas de realização, uma proteína inclui um aminoácido não natural e pelo menos uma modificação pós-translacional que é feita in vivo por uma célula eucariótica, em que a modificação pós-translacional não é produzida por uma célula procariótica. Por exemplo, a modificação pós-tradução inclui, incluindo mas não limitado a, acetilação, acilação, modificação de lípido, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação glicolípido, glicosilação, e semelhantes. Num aspecto, a modificação pós-translacional inclui ligação de um oligossacárido (incluindo mas não limitado a, (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc)) a uma asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina. Veja-se a tabela 1, que lista alguns exemplos de oligossacáridos ligados a N, de proteínas eucarióticas (resíduos adicionais podem também estar presentes, que não são mostrados). Noutro aspecto, a modificação pós-translacional inclui ligação de um oligossacárido (incluindo mas não limitado a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc) a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina ou GalNAc-treonina, ou uma ligação GlcNAc-serina ou GlcNAc-treonina. 160
Tabela 1: Exemplos de oligossacáridos através de ligação GlcNAc
Tipo Estrutura base Manose alta Manai-6·*. Manai-6^. Mana 1-3·^ Manp1-4GlcNAcpi-4GlcNA< Manai Híbrid 0 J> Manfíl -4GJcNAc£t^GlcNA GlcNAcp1-2-Mana 1-3^^ Comple xo GlcNAcpi-2-Manai Manp1-4GlcNAep1 ^4GmA GlcNAe$1-2-Mana 1-3^^ Xilose MlRa1*6v J> Manp 1 -4GicNAcp1-40teNAcj51 -Asn Xyipi-2-^
Em ainda outro aspecto, a modificação pós-tradução inclui o processamento proteolitico de precursores (incluindo mas não limitado a, precursor de calcitonina, precursor péptido relacionado com o gene de calcitonina, hormona preproparatiróide, preproinsulina, proinsulina, prepro-opiomelanocortina, pro-opiomelanocortina e semelhantes), montagem numa proteína multi-subunidade ou montagem macromolecular, tradução para um outro local na célula (incluindo mas não limitado a, organelos, tais como o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, o núcleo, lisossomas, peroxissomas, mitocôndria, cloroplastos, vacúolos, etc, ou através da via secretora) . Em certas formas de realização, a proteína compreende uma sequência de secreção ou de localização, um marcador de epítopo, um marcador FLAG, um marcador de poli-histidina, uma fusão GST, ou semelhante. 161
Uma vantagem de um aminoácido não natural é que apresenta porções químicas adicionais, que podem ser usadas para adicionar moléculas adicionais. Estas modificações podem ser feitas in vivo numa célula eucariótica ou não eucariótica, ou in vitro. Assim, em certas formas de realização, a modificação pós-translacional é através do aminoácido não natural. Por exemplo, a modificação pós-translacional pode ser através de uma reacção nucleofílica-electrofílica. A maioria das reacções actualmente utilizadas para a modificação selectiva de proteínas, envolve a formação de ligação covalente entre os parceiros de reacção nucleofílicos e electrofílicos, incluindo mas não limitado à reacção de α-halocetonas com cadeias laterais de histidina ou cisteína. A selectividade nestes casos, é determinada pelo número e a acessibilidade dos resíduos nucleofílicos na proteína. Em proteínas da invenção, podem ser utilizadas outras reacções mais selectivas, tal como a reacção de um ceto-aminoácido não natural com hidrazidas ou compostos aminooxi, in vitro e in vivo. Veja-se, por exemplo, Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc., 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sei., 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sei., 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; e Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7. Isto permite a marcação selectiva de virtualmente qualquer proteína com uma série de reagentes, incluindo fluoróforos, agentes de reticulação, derivados sacarídeos e moléculas citotóxicas. Veja-se também, a patente US N° 6.927.042, intitulada "Glycoprotein synthesis". As modificações pós-translacionais, incluindo mas não limitado a, por meio de um aminoácido azido, podem também ser feitas através da ligação Staudinger (incluindo mas não limitado a, com 162 reagentes triarilfosfina). Veja-se, por exemplo, Kiick et al. , (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24.
Esta divulgação providencia um outro método altamente eficaz para a modificação selectiva de proteínas, que envolve a incorporação genética de aminoácidos não naturais, incluindo mas não limitado a, contendo uma porção azida ou alcinilo em proteínas, em resposta a um codão selector. Estas cadeias laterais de aminoácidos podem então ser modificadas por, incluindo mas não limitado a, uma reacção de cicloadição de Huisgen [3+2] (veja-se, por exemplo, Padwa, A. em Síntese orgânica compreensiva, vol. 4. (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, pág. 1069-1109; e Huisgen, R., em Química de cicloadição bipolar-1,3, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Nova Iorque, pág. 1-176) com, incluindo mas não limitado a, derivados de alcinilo ou azida, respectivamente. Porque este método envolve uma cicloadição, em vez de uma substituição nucleofílica, as proteínas podem ser modificadas com selectividade extremamente elevada. Esta reacção pode ser realizada à temperatura ambiente, em condições aquosas, com regioselectividade excelente (1,4 > 1,5), pela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu(I) à mistura de reacção. Veja-se, por exemplo, Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3464; e Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Outro método que pode ser usado, é a troca de ligandos num composto bis-arsénico com um motivo tetracisteína, veja-se, por exemplo, Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272.
Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção por meio de uma cicloadição [3+2], inclui virtualmente qualquer molécula com um derivado de azida ou de alcinilo. As moléculas incluem, mas não estão limitadas a, corantes, fluoróforos, agentes de reticulação, derivados 163 de sacáridos, polímeros (incluindo mas não limitado a, derivados de polietileno glicol), agentes de fotoreticulação, compostos citotóxicos, marcadores de afinidade, derivados de biotina, resinas, grânulos, uma segunda proteína ou polipéptido (ou mais) , polinucleotídeo(s) (incluindo mas não limitado a, ADN, ARN, etc) , agentes quelantes de metal, cofactores, ácidos gordos, hidratos de carbono, e semelhantes. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo alcinilo, incluindo mas não limitado a, p-propargiloxifenilalanina, ou um grupo azido, incluindo mas não limitado a, p-azido-fenilalanina, respectivamente. V. Geração in vivo de polipéptidos FGF-21 compreendendo aminoácidos não naturalmente codificados
Os polipéptidos FGF-21 da invenção podem ser gerados in vivo, utilizando tARN modificadas e sintetases de tARN, para adicionar ou substituir aminoácidos que não são codificados em sistemas que ocorrem naturalmente. Métodos para gerar tARNs e sintetases de tARN que utilizam aminoácidos que não são codificados em sistemas que ocorrem naturalmente são descritos em, por exemplo, patentes US Nos 7.045.337 e 7.083.970. Estes métodos envolvem a geração de uma maquinaria de translação, que funciona independentemente das sintetases e das tARNs endógenas para o sistema de tradução (e são por vezes referidos como "ortogonal"). Tipicamente, o sistema de tradução compreende uma tARN ortogonal (0-tARN), e uma sintetase de tARN aminoacilo ortogonal (O-RS). Tipicamente, a O-RS aminoacila preferencialmente a O-tARN com pelo menos um aminoácido que não ocorre naturalmente no sistema de tradução, e a O-tARN reconhece pelo menos um codão selector que não é reconhecido por outras tARNs no sistema. O sistema de tradução insere assim o aminoácido não naturalmente codificado numa proteína produzida no sistema, 164 em resposta a um codão selector codificado, "substituindo" assim um aminoácido numa posição no polipéptido codificado. Têm sido descritas na tecnologia uma grande variedade de tARNs ortogonais e sintetases de tARN aminoacilo, para a inserção de determinados aminoácidos sintéticos em polipéptidos, e são geralmente adequadas para utilização na presente invenção. Por exemplo, são descritas Ο-tARN ceto especificas/sintetases de tARN aminoacilo em Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:56-61 (2003) e Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746 (2003). Exemplos de 0-RS, ou porções das mesmas, são codificadas por sequências polinucleotidicas, e incluem sequências de aminoácidos divulgadas nas patentes US Nos 7.045.337 e 7.083.970. São também descritas moléculas de Ο-tARN correspondentes para utilização com as O-RSs nas patentes US Nos 7.045.337 e 7.083.970. São descritos exemplos adicionais de pares 0-tARN/sintetase de tARN aminoacilo em WO 2005/007870, WO 2005/007624, e WO 2005/019415. É descrito um exemplo de um sistema de O-tARN específica de azida/sintetase de tARN aminoacilo em Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Exemplos de sequências O-RS para p-azido-L-Phe incluem, mas não estão limitadas a, sequências de nucleótidos SEQ ID Nos: 14-16 e 29-32, e sequências de aminoácidos SEQ ID Nos: 46-48 e 61-64, como divulgadas na patente US N° 7.083.970. Exemplos de sequências Ο-tARN adequadas para utilização na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, sequências de nucleótidos SEQ ID Nos: 1-3 como divulgadas na patente US N° 7.083.970. Estão descritos outros exemplos de pares O-tARN/sintetase de tARN aminoacilo específicos para aminoácidos não naturalmente codificados específicos, na patente US N° 7.045.337. São descritas O-RS e Ο-tARN que incorporam tanto aminoácidos contendo ceto como azida em S. cerevisiae, em Chin, J. W., et al., Science 301:964-967 (2003) . 165 Têm sido relatados vários outros pares ortogonais. Têm sido descritos sistemas de glutaminilo (veja-se, por exemplo, Liu, D. R., e Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:4780-4785), aspartilo (veja-se, por exemplo, Pastrnak, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83: 2277-2286), e tirosilo (veja-se, por exemplo, Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokyo, Jpn) 124:1065-1068; e Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:2268-2273) derivados de tARNs e sintetases de S. cerevisiae, para a incorporação potencial de aminoácidos não naturais em E. coli. Têm sido descritos sistemas derivados de sintetases de glutaminilo de E. coli (veja-se, por exemplo, Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:2268-2273) e tirosilo (veja-se, por exemplo, Edwards, H., e Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641) para utilização em S. cerevisiae. O sistema tirosilo de E. coli tem sido utilizado para a incorporação de 3-iodo-L-tirosina in vivo, em células de mamíferos. Veja-se, Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699 . A utilização de O-tARN/sintetase de tARN aminoacilo envolve a selecção de um codão específico, que codifica o aminoácido não naturalmente codificado. Apesar de poder ser usado qualquer codão, é geralmente desejável seleccionar um codão que raramente, ou nunca, é usado na célula na qual a O-tARN/sintetase de tARN aminoacilo é expressa. Por exemplo, exemplos de codões incluem codões sem sentido, como codões de paragem (âmbar, ocre e opala), codões de quatro ou mais bases, e outros codões de três bases naturais, que são raramente ou não utilizados.
Pode(m) ser introduzido(s) codão(ões) selector(es) específico(s) em posições adequadas na sequência codificante do polinucleótido FGF-21, utilizando métodos de mutagénese conhecidos na tecnologia (incluindo mas não limitado a, mutagénese especifica do local, mutagénese de cassete, mutagénese de selecção de restrição, etc).
Os métodos para gerar componentes da maquinaria de biossintese de proteínas, tais como O-RSs, O-tARNs, e os pares ortogonais O-tARN/O-RS, que podem ser utilizados para incorporar um aminoácido não naturalmente codificado estão descritos em Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al. , J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) ; Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003) . Estão descritos métodos e composições para a incorporação in vivo de aminoácidos não naturalmente codificados na patente US N° 7.045.337. Estão também descritos métodos para seleccionar um par ortogonal tARN-sintetase de tARN para uso num sistema de tradução in vivo de um organismo nas patentes US Nos 7.045.337 e 7.083.970. A publicação PCT N° WO 04/035743, intitulada "Site specific incorporation of keto amino acids into proteins", descreve pares ortogonais RS e tARN para a incorporação de ceto-aminoácidos. A publicação PCT N° WO 04/094593, intitulada "Expanding the eukaryotic genetic code", descreve pares ortogonais RS e tARN para a incorporação de aminoácidos não naturalmente codificados em células hospedeiras eucarióticas. Métodos para produzir pelo menos uma sintetase tARN aminoacilo ortogonal recombinante (O-RS) compreendem: (a) gerar uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivada de pelo menos uma sintetase de tARN aminoacilo (RS) de um primeiro organismo, incluindo mas não limitado a, um organismo procariótico, tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum,
Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, ou semelhante, ou um organismo eucariótico; (b) seleccionar (e/ou rastrear) a biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para os membros que aminoacilem uma tARN ortogonal (O-tARN) 167 na presença de um aminoácido não naturalmente codificado e um aminoácido natural, proporcionando assim um conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes); e/ou, (c) seleccionar (opcionalmente através de selecção negativa) o conjunto para RSs activas (incluindo mas não limitado a, RSs mutantes) que aminoacilem preferencialmente a O-tARN, na ausência do aminoácido não naturalmente codificado, fornecendo assim pelo menos uma O-RS recombinante, em que pelo menos uma O-RS recombinante aminoacila preferencialmente a O-tARN com o aminoácido não naturalmente codificado.
Numa forma de realização, a RS é uma RS inactiva. A RS inactiva pode ser gerada por mutação de uma RS activa. Por exemplo, a RS inactiva pode ser gerada mutando pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, ou pelo menos cerca de 10 ou mais aminoácidos para aminoácidos diferentes, incluindo mas não limitado a, alanina.
As bibliotecas de RSs mutantes podem ser geradas utilizando várias técnicas conhecidas na tecnologia, incluindo mas não limitadas a, concepção racional baseada na estrutura tridimensional de proteína RS, ou mutagénese de nucleótidos RS numa técnica de concepção aleatória ou racional. Por exemplo, as RSs mutantes podem ser geradas por mutações específicas do local, mutações aleatórias, mutações de recombinação de geração de diversidade, construções quiméricas, concepção racional e por outros métodos aqui descritos ou conhecidos na tecnologia.
Numa forma de realização da divulgação, a selecção (e/ou rastreio) da biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para os membros que estão activos, incluindo mas não limitado a, que aminoacilam uma tARN ortogonal (O-tARN) na presença de um aminoácido não naturalmente codificado e um aminoácido natural, inclui: a introdução de uma selecção 168 positiva ou marcador de rastreio, incluindo mas não limitado a, um gene de resistência a antibiótico, ou semelhante, e a biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) numa pluralidade de células, em que a selecção positiva e/ou marcador de rastreio compreende pelo menos um codão selector, incluindo mas não limitado a, um codão âmbar, ocre, ou opala; o crescimento da pluralidade de células na presença de um agente de selecção; a identificação de células que sobrevivam (ou mostrem uma resposta especifica) na presença do agente de selecção e/ou rastreio, por supressão de pelo menos um codão selector na selecção positiva ou marcador de rastreio, proporcionando assim um subconjunto de células positivamente seleccionadas que contém o conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, a concentração do agente de selecção e/ou rastreio pode ser alterada.
Num aspecto da divulgação, o marcador de selecção positiva é um gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT), e o codão selector é um codão de paragem âmbar no gene de CAT. Opcionalmente, o marcador de selecção positiva é um gene β-lactamase, e o codão selector é um codão de paragem âmbar no gene de β-lactamase. Num outro aspecto da divulgação, o marcador de rastreio positivo compreende um marcador de rastreio fluorescente ou luminescente, ou um marcador de rastreio baseado em afinidade (incluindo mas não limitado a, um marcador de superfície celular).
Numa forma de realização da divulgação, a selecção ou rastreio negativo do conjunto para RSs activas (opcionalmente mutantes), que aminoacilem preferencialmente a O-tARN na ausência do aminoácido não naturalmente codificado inclui: a introdução de uma selecção negativa ou marcador de rastreio com o conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) da selecção ou rastreio positivo, numa pluralidade de células de um segundo organismo, em que a selecção negativa ou marcador de rastreio compreende pelo 169 menos um codão selector (incluindo mas não limitado a, um gene de resistência a antibiótico, incluindo mas não limitado a, um gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT)); e a identificação de células que sobrevivam, ou apresentem uma resposta de rastreio especifica, num primeiro meio suplementado com o aminoácido não naturalmente codificado e um agente de rastreio ou de selecção, mas que não consigam sobreviver, ou mostrar a resposta especifica, num segundo meio não suplementado com o aminoácido não naturalmente codificado e o agente de selecção ou de rastreio, proporcionando assim células sobreviventes ou células rastreadas com pelo menos uma O-RS recombinante. Por exemplo, um protocolo de identificação CAT actua opcionalmente como uma selecção positiva e/ou um rastreio negativo na determinação de O-RS recombinantes adequadas. Por exemplo, um conjunto de clones é replicado opcionalmente em placas de cultura contendo CAT (que compreende pelo menos um codão selector), com ou sem um ou mais aminoácido não naturalmente codificado. As colónias que crescem exclusivamente nas placas contendo aminoácidos não naturalmente codificados, são assim consideradas como contendo O-RS recombinante. Num aspecto da divulgação, a concentração do agente de selecção (e/ou rastreio) é alterada. Em alguns aspectos da divulgação os primeiros e segundos organismos são diferentes. Assim, o primeiro e/ou segundo organismo compreende opcionalmente: um procariota, um eucariota, um mamífero, uma Escherichia coli, um fungo, uma levedura, uma arqueobactéria, uma eubactéria, uma planta, um insecto, um protista, etc. Noutras formas de realização da divulgação, o marcador de rastreio compreende um marcador de rastreio fluorescente ou luminescente, ou um marcador de rastreio baseado em afinidade.
Noutra forma de realização da divulgação, o rastreio ou selecção (incluindo mas não limitado a, selecção negativa) do conjunto para RSs activas (opcionalmente 170 mutantes) inclui: o isolamento do conjunto de RSs mutantes activas da etapa de selecção positiva (b); a introdução de uma selecção negativa ou marcador de rastreio, em que a selecção negativa ou marcador de rastreio compreende pelo menos um codão selector (incluindo mas não limitado a, um gene de marcador tóxico, incluindo mas não limitado a, um gene de barnase ribonuclease, compreendendo pelo menos um codão selector), e o conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) numa pluralidade de células de um segundo organismo; e identificação das células que sobrevivam, ou mostrem uma resposta de rastreio específica, num primeiro meio não suplementado com o aminoácido não naturalmente codificado, mas que não consigam sobreviver, ou mostrar uma resposta de rastreio específica, num segundo meio suplementado com o aminoácido não naturalmente codificado, proporcionando assim células sobreviventes ou rastreadas com pelo menos uma O-RS recombinante, em que pelo menos uma 0-RS recombinante é específica para o aminoácido não naturalmente codificado. Num aspecto da divulgação, pelo menos um codão selector compreende cerca de dois ou mais codões selectores. Ditas formas de realização podem incluir opcionalmente, em que pelo menos um codão selector compreende dois ou mais codões selectores, e em que o primeiro e segundo organismo são diferentes (incluindo mas não limitado a, cada organismo é opcionalmente, incluindo mas não limitado a, um procariota, um eucariota, um mamífero, uma Escherichia coli, um fungo, uma levedura, uma arqueobactéria, uma eubactéria, uma planta, um insecto, um protista, etc) . Além disso, alguns aspectos da divulgação incluem, em que o marcador de selecção negativa compreende um gene de barnase ribonuclease (que compreende pelo menos um codão selector). Outros aspectos da divulgação incluem, em que o marcador de rastreio compreende opcionalmente um marcador de rastreio fluorescente ou luminescente, ou um marcador de rastreio baseado em afinidade. Nas formas de 171 realização desta divulgação, os rastreios e/ou selecções incluem opcionalmente variação da estringência de rastreio e/ou selecção.
Numa forma de realização da divulgação, os métodos para a produção de pelo menos uma sintetase de tARN aminoacilo ortogonal recombinante (O-RS) podem ainda compreender: (d) isolamento de pelo menos uma O-RS recombinante; (e) gerar um segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutada) derivado de pelo menos uma O-RS recombinante; e (f) repetir as etapas (b) e (c) até ser obtida uma O-RS mutada, que compreende uma capacidade de aminoacilar preferencialmente a Ο-tARN. Opcionalmente, as etapas (d)-(f) são repetidos, incluindo mas não limitado a, pelo menos cerca de duas vezes. Num aspecto da divulgação, o segundo conjunto de O-RS mutada derivado de pelo menos uma O-RS recombinante, pode ser gerado por mutagénese, incluindo mas não limitado a, mutagénese aleatória, mutagénese especifica do local, recombinação ou uma combinação destas. A estringência das etapas de selecção/rastreio, incluindo mas não limitado a, a etapa de selecção/rastreio positivo (b), a etapa de selecção/rastreio negativo (c), ou ambas as etapas de selecção/rastreio positivos e negativos (b) e (c) , nos métodos descritos anteriormente, inclui opcionalmente a variação da estringência de selecção/rastreio. Noutra forma de realização da divulgação, a etapa de selecção/rastreio positivo (b) , a etapa de selecção/rastreio negativo (c), ou ambos as etapas de selecção/rastreio positivos e negativos (b) e (c) , compreendem o uso de um repórter, em que o repórter é detectado por separação de células activada por fluorescência (FACS), ou em que o repórter é detectado por luminescência. Opcionalmente, o repórter é exibido numa superfície celular, numa apresentação de fagos, ou semelhante, e seleccionado com base na afinidade ou 172 actividade catalítica que envolve o aminoácido não naturalmente codificado, ou um análogo. Numa forma de realização da divulgação, a sintetase mutada é exibida numa superfície celular, numa apresentação de fagos, ou semelhante. Métodos para produzir uma tARN ortogonal recombinante (O-tARN) incluem: (a) gerar uma biblioteca de tARNs mutantes derivadas de pelo menos uma tARN, incluindo mas não limitado a, um supressor de tARN, de um primeiro organismo; (b) seleccionar (incluindo, mas não limitado a, selecção negativa) ou rastrear a biblioteca para tARNs (opcionalmente mutantes), que são aminoaciladas por uma sintetase de tARN aminoacilo (RS) de um segundo organismo, na ausência de uma RS do primeiro organismo, proporcionando assim um conjunto de tARNs (opcionalmente mutantes); e (c) seleccionar ou rastrear o conjunto de tARNs (opcionalmente mutantes) para membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, proporcionando assim pelo menos uma Ο-tARN recombinante, em que pelo menos uma O-tARN recombinante reconhece um codão selector, e não é eficientemente reconhecida pela RS do segundo organismo, e é preferencialmente aminoacilada pela O-RS. Em algumas formas de realização da divulgação, pelo menos uma tARN é um supressor de tARN, e/ou compreende um codão único de três bases de bases naturais e/ou não naturais, ou é um codão sem sentido, um codão raro, um codão não natural, um codão que compreende pelo menos 4 bases, um codão de paragem âmbar, um codão de paragem ocre, ou um codão de paragem opala. Numa forma de realização da divulgação, a 0-tARN recombinante possui uma melhoria da ortogonalidade. Será apreciado que em algumas formas de realização da divulgação, a O-tARN é opcionalmente importada para um primeiro organismo a partir de um segundo organismo, sem a necessidade de modificação. Em várias formas de realização da divulgação, os primeiros e segundos organismos ou são os 173 mesmos ou diferentes, e são escolhidos opcionalmente de, incluindo mas não limitado a, procariotas (incluindo mas não limitado a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacterium, etc), eucariotas, mamíferos, fungos, leveduras, arqueobactérias, eubactérias, plantas, insectos, protistas, etc. Além disso, a tARN recombinante é opcionalmente aminoacilada por um aminoácido não naturalmente codificado, em que o aminoácido não naturalmente codificado é biosintetizado in vivo, quer naturalmente, quer através de manipulação genética. 0 aminoácido não naturalmente codificado é opcionalmente adicionado a um meio de crescimento, para pelo menos o primeiro ou segundo organismo.
Num aspecto da divulgação, seleccionar (incluindo mas não limitado a, selecção negativa) ou rastrear a biblioteca para tARNs (opcionalmente mutantes) que são aminoaciladas por uma sintetase tARN aminoacilo (passo (b) ) inclui: a introdução de um gene de marcador tóxico, em que o gene de marcador tóxico compreende pelo menos um dos codões selectores (ou um gene que leva à produção de um agente tóxico ou estático, ou um gene essencial para o organismo, no qual esse gene de marcador compreende pelo menos um codão selector), e da biblioteca de tARNs (opcionalmente mutantes) numa pluralidade de células do segundo organismo; e a selecção de células sobreviventes, em que as células sobreviventes contêm o conjunto de tARNs (opcionalmente mutantes), compreendendo pelo menos uma tARN ortogonal ou uma tARN não funcional. Por exemplo, as células sobreviventes podem ser seleccionadas usando um ensaio de comparação de razão de densidade celular.
Noutro aspecto da divulgação, o gene de marcador tóxico pode incluir dois ou mais codões selectores. Noutra forma de realização dos métodos, o gene de marcador tóxico é um gene de barnase ribonuclease, onde o gene de barnase ribonuclease compreende pelo menos um codão âmbar. 174
Opcionalmente, o gene de barnase ribonuclease pode incluir dois ou mais codões âmbar.
Numa forma de realização da divulgação, a selecção ou rastreio do conjunto de tARNs (opcionalmente mutantes) para membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, podem incluir: a introdução de um gene de marcador de selecção ou rastreio positivo, em que o gene de marcador positivo compreende um gene de resistência a fármacos (incluindo mas não limitado a, o gene da β-lactamase, compreendendo pelo menos um dos codões selectores, tal como pelo menos um codão de paragem âmbar), ou um gene essencial para o organismo, ou um gene que leva à desintoxicação de um agente tóxico, juntamente com a 0-RS, e o conjunto de tARNs (opcionalmente mutantes) numa pluralidade de células do segundo organismo; e a identificação de células sobreviventes ou rastreadas, cultivadas na presença de um agente de selecção ou de rastreio, incluindo mas não limitado a, um antibiótico, proporcionando assim um conjunto de células possuindo pelo menos uma tARN recombinante, em que pelo menos uma tARN recombinante é aminoacilada pela O-RS, e insere um aminoácido num produto de tradução codificado pelo gene do marcador positivo, em resposta a pelo menos um codão selector. Noutra forma de realização da divulgação, a concentração do agente de selecção e/ou rastreio é alterada. São fornecidos métodos para gerar pares O-tARN/O-RS específicos. Os métodos incluem: (a) gerar uma biblioteca de tARNs mutantes derivadas de pelo menos uma tARN de um primeiro organismo; (b) seleccionar ou rastrear negativamente a biblioteca para tARNs (opcionalmente mutantes) , que são aminoaciladas por uma sintetase de tARN aminoacilo (RS) de um segundo organismo, na ausência de uma RS do primeiro organismo, proporcionando assim um conjunto de tARNs (opcionalmente mutantes); (c) seleccionar ou 175 rastrear o conjunto de tARNs (opcionalmente mutantes), para membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, proporcionando assim pelo menos uma O-tARN recombinante. Pelo menos uma O-tARN recombinante reconhece um codão selector, e não é eficientemente reconhecida pela RS do segundo organismo, e é preferencialmente aminoacilada pela O-RS. 0 método também inclui (d) gerar uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes), derivadas de pelo menos uma sintetase tARN aminoacilo (RS) de um terceiro organismo; (e) seleccionar ou rastrear a biblioteca de RSs mutantes, para membros que aminoacilem preferencialmente pelo menos uma O-tARN recombinante, na presença de um aminoácido não naturalmente codificado e de um aminoácido natural, proporcionando assim um conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes); e (f) seleccionar ou rastrear negativamente o conjunto para RSs activas (opcionalmente mutantes), que aminoacilem preferencialmente pelo menos uma O-tARN recombinante, na ausência do aminoácido não naturalmente codificado, proporcionando assim pelo menos um par O-tARN/O-RS especifico, em que pelo menos um par 0-tARN/O-RS especifico compreende pelo menos uma O-RS recombinante, que é específica para o aminoácido não naturalmente codificado, e pelo menos uma O-tARN recombinante. São incluídos pares O-tARN/O-RS específicos produzidos pelos métodos. Por exemplo, o par O-tARN/O-RS específico pode incluir, incluindo mas não limitado a, um par mutARNTyr-mutTyrRS, tal como um par mutARNTyr-SS12TyrRS, um par mutARNLeu-mutLeuRS, um par mutARNThr-mutThrRS, um par mutARNGlu-mutGluRS, ou semelhantes. Além disso, tais métodos incluem, em que o primeiro e terceiro organismo são o mesmo (incluindo mas não limitado a, Methanococcus jannaschii).
Estão também incluídos na presente divulgação métodos para seleccionar um par tARN ortogonal-sintetase de tARN, para uso num sistema de tradução in vivo de um segundo 176 organismo. Os métodos incluem: a introdução de um gene marcador, uma tARN e uma sintetase de tARN aminoacilo (RS), isolada ou derivada de um primeiro organismo para um primeiro conjunto de células do segundo organismo; introdução do gene marcador e a tARN num conjunto de células duplicado de um segundo organismo; e a selecção para células sobreviventes no primeiro conjunto que não conseguem sobreviver no conjunto de células duplicado, ou rastreio para células que mostrem uma resposta de rastreio especifica que não consigam dar tal resposta no conjunto de células duplicado, em que o primeiro conjunto e o conjunto de células duplicado são cultivados na presença de um agente de selecção ou de rastreio, em que as células sobreviventes ou rastreadas compreendem o par tARN ortogonal-sintetase de tARN, para utilização no sistema de tradução in vivo do segundo organismo. Numa forma de realização da divulgação, comparar e seleccionar ou rastrear inclui um ensaio de complementação in vivo. A concentração do agente de selecção ou de rastreio pode ser alterada.
Os organismos da presente divulgação compreendem uma variedade de organismos e uma variedade de combinações. Por exemplo, o primeiro e segundo organismos dos métodos da presente divulgação, podem ser o mesmo ou diferentes. Numa forma de realização da divulgação, os organismos são opcionalmente, um organismo procariótico, incluindo mas não limitado a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, ou semelhantes. Alternativamente, os organismos compreendem opcionalmente um organismo eucariótico, incluindo mas não limitado a, plantas (incluindo mas não limitado a, plantas complexas, tais como monocotiledóneas ou dicotiledóneas), algas, protistas, fungos (incluindo mas não limitado a, levedura, etc), 177 animais (incluindo mas não limitado a, mamíferos, insectos, artrópodes, etc), ou semelhantes. Noutra forma de realização da divulgação, o segundo organismo é um organismo procariótico, incluindo mas não limitado a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, ou semelhantes. Alternativamente, o segundo organismo pode ser um organismo eucariótico, incluindo mas não limitado a, uma levedura, uma célula animal, uma célula de planta, um fungo, uma célula de mamífero, ou semelhantes. Em várias formas de realização da divulgação o primeiro e segundo organismos são diferentes. VI. Localização de aminoácidos de ocorrência não natural em polipéptidos FGF-21 A presente invenção contempla a incorporação de um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural em polipéptidos FGF-21. Pode ser incorporado um aminoácido de ocorrência não natural numa posição particular que não interrompe a actividade do polipéptido. Este pode ser conseguido 1 fazendo substituições "conservativas" incluindo, mas sem limitação, substituindo aminoácidos hidrófobos com aminoácidos hidrófobos, aminoácidos volumosos com aminoácidos volumosos, aminoácidos hidrófilos com aminoácidos hidrófilos e/ou inserindo o aminoácido de ocorrência não natural numa localização que não é requerida para a actividade.
Pode ser usada uma diversidade de abordagens bioquímicas e estruturais para seleccionar os locais desejados para substituição com um aminoácido não codificado de forma natural dentro do polipéptido FGF-21. Resultará facilmente evidente para os peritos comuns na especialidade que qualquer posição da cadeia polipeptídica é adequada para selecção para incorporar um aminoácido não codificado de 178 forma natural, e a selecção pode ser baseada no desenho racional ou por selecção aleatória com respeito a qualquer propósito desejado ou nenhum em particular. A selecção de locais desejados pode ser para produzir uma molécula de FGF-21 que tenha qualquer propriedade ou actividade desejada, incluindo, mas sem limitação, agonistas, superagonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de ligação ao receptor, moduladores da actividade do receptor, formação de dimeros ou multimeros, sem mudanças na actividade ou propriedade em comparação com a molécula nativa, ou manipular qualquer propriedade física ou química do polipéptido tal como solubilidade, agregação ou estabilidade. Por exemplo, as localizações no polipéptido requeridas para a actividade biológica de polipéptidos FGF-21 podem ser identificados usando análise de mutação pontual, exploração de alanina, mutagénese de saturação e exploração com respeito à actividade biológica, ou métodos de exploração homólogos conhecidos na especialidade. Podem ser mutagenizados resíduos que são críticos para a bioactividade de FGF-21, resíduos que estão envolvidos na estabilidade farmacêutica, epítopos de anticorpos, ou resíduos de ligação a heparina ou receptor. As Patentes US N° 5.580.723; 5.834.250; 6.013.478; 6.428,954; e 6.451.561 descrevem métodos para a análise sistemática da estrutura e função de polipéptidos tais como FGF-21 identificando domínios activos que influem na actividade do polipéptido com uma substância alvo. Os resíduos distintos dos identificados como críticos para a actividade biológica por mutagénese de exploração de alanina ou homóloga podem ser bons candidatos para a sua substituição com um aminoácido não codificado de forma natural dependendo da actividade desejada buscada para o polipéptido. Como alternativa, os locais identificados como críticos para a actividade biológica também podem ser bons candidatos para substituição com um aminoácido não 179 codificado de forma natural, dependendo de novo da actividade desejada buscada para o polipéptido. Outra alternativa seria simplesmente realizar substituições seriadas em cada posição na cadeia polipeptídica com um aminoácido não codificado de forma natural e observar o efeito nas actividades do polipéptido. Torna-se facilmente evidente para os peritos comuns na especialidade que qualquer meio, técnica ou método para seleccionar uma posição para substituição com um aminoácido não natural em qualquer polipéptido é adequado para uso na presente invenção.
Recolheram-se já muitos dados usando os métodos apresentados no presente pedido e descobriram-se locais potenciais e benéficos de mutação e ensaiaram-se de forma bem-sucedida, como se descreve nos exemplos proporcionados posteriormente na presente memória descritiva. A descoberta de informação adicional com respeito à estrutura e actividade de mutantes, inclusive a que inclui alguns detalhes com respeito à formulação e/ou ensaios que não se descreveram especificamente nos exemplos, de polipéptidos FGF-21 que contêm deleções também pode ser examinada para determinar reacções da proteína que são provavelmente tolerantes a substituição com um aminoácido não codificado de forma natural. De maneira similar, pode ser usada a digestão com protease e anticorpos monoclonais para identificar regiões de FGF-21 que são responsáveis da ligação com o receptor de FGF-21. Uma vez que tenham sido eliminados os resíduos que provavelmente são intolerantes a substituição com aminoácidos não codificados de forma natural, pode ser examinado o impacto das substituições propostas em cada uma das posições restantes. Podem ser gerados modelos a partir das estruturas cristalinas tridimensionais de outros membros da família de FGF e receptores de FGF. 0 Banco de Dados de Proteínas (PDB, disponível em Internet em rcsb.org) é uma base de dados 180 centralizada que contém dados estruturais tridimensionais de moléculas grandes de proteínas e ácidos nucleicos. Os modelos podem ser realizados investigando a estrutura secundária e terciária dos polipéptidos, se dados estruturais tridimensionais não estiverem disponíveis. Portanto, os peritos comuns na especialidade podem identificar facilmente posições de aminoácidos que podem ser substituídas com aminoácidos não codificados de forma natural.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos FGF-21 da invenção compreendem um aminoácido de ocorrência não natural situado numa região da proteína que não quebra a estrutura do polipéptido.
Podem ser resíduos de exemplo de incorporação de um aminoácido não codificado de forma natural aqueles que são incluídos a partir de regiões de ligação ao receptor potenciais, podem estar completa ou parcialmente expostos ao solvente, ter interacções de ligações de hidrogénio mínimas ou nulas com resíduos próximos, podem estar expostos minimamente a resíduos reactivos próximos, podem estar numa ou mais das faces expostas, podem ser um local ou locais que se justapõem a um segundo FGF-21, ou outra molécula ou fragmento do mesmo, podem estar em regiões que são altamente flexíveis, ou estruturalmente rígidas, de acordo com é predito pela estrutura tridimensional, secundária, terciária, ou quaternária de FGF-21, unidos ou não unidos ao seu receptor, ou acoplados ou não acoplados a outra molécula biologicamente activa, ou podem modular a conformação do FGF-21 em si mesmo ou dímero ou multímero que compreende um ou mais FGF-21, alterando a flexibilidade ou rigidez da estrutura completa como for desejado. A família de proteínas de FGF-21 tem uma estrutura de trevo β ou folha β como se identifica por cristalografia (Harmer et al., Biochemistry 43: 629-640 (2004)). Um perito habitual na especialidade reconhece que a dita análise de 181 FGF-21 permite a determinação dos resíduos de aminoácidos que estão expostos na superfície em comparação com resíduos de aminoácidos que estão enterrados dentro da estrutura terciária da proteína. Portanto, é uma forma de realização da presente invenção substituir com um aminoácido não codificado de forma natural um aminoácido que é um resíduo exposto na superfície. É incorporado um aminoácido não codificado de forma natural na seguinte posição em FGF-21: 108 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) . O aminoácido de ocorrência não natural está na posição 108 em FGF-21 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Numa forma de realização, o aminoácido de ocorrência não natural está na posição 36 em FGF-21 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N° : 2-7) .
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 e outro aminoácido de ocorrência não natural numa das seguintes posições: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal), 1, 2 !, 3 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29, 30, 31, 32 , 33, . 34 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47 , 48, . 49 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57 , 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 6 4 65, 66, 6 7 , 68, 69, 70, 71, 72 , 73, 74, 75, 76, 77 , 78, . 79 80, 81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92 , 93, . 94 95, 96, 97 , 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes 182 nas SEQ ID N° : 2-1). Em outra forma de realizaçao, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 e outro aminoácido de ocorrência não natural numa das seguintes posiçoes: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146 , 135, 96, e 36 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realizaçao, há um aminoácido de ocorrência nao natural na posição 91 e na posição 131 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 91 e posição 77 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 91 e posição 108 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realizaçao, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 131 e posição 108 (SEQ ID N°: 1 ou OS aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-1). Em outra forma de realizaçao, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 131 e posição 77 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 131 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2- 7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 108 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 77 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 72 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 87 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2- 7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de 183 ocorrência não natural na posição 86 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) unido. Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 126 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 110 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 83 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2- 7) .
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural 1 adi ciona is numa ou mais da segu .intes posi .ções: antes da posição 1 (i st < o é, n extremidade N t erminal), 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7 , 8, 9 , io, 11 CM \—1 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86 co 88, 8S ), 90 , 91, 92, 93, ( 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 101, 102, 103, 104, 105, 106 f 107, 108, 109, 110, 111, 112 113, 114, 115, 116, 117, 118 t 119, 120, 121, 122, 123, 124 125, 126, 127, 128, 129, 130 t 131, 132, 133, 134, 135, 136 137, 138, 139, 140, 141, 142 t 143, 144, 145, 146, 147, 148 149, 150, 151, 152, 153, 154 t 155, 156, 157, 158, 159, 160 161, 162, 163, 164, 165, 166 t 167, 168, 169, 170, 171, 172 173, 174, 175, 176, 177 , 178, 179, 180 , 18: L, 182 (ist o é na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural numa ou mais das seguintes posições: 131, 108, 77, 184 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96, e 36 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7).
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 131 e outro aminoácido de ocorrência não natural numa ou mais das seguintes posições: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal), 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, - 9, CM i—1 i—1 i—1 V o i—1 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 1( 09, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 1' 45, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 1! 57, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 131 e outro aminoácido de ocorrência não natural numa ou mais das seguintes ; posições: 131, 108, 77 , 72, 87 co Oh 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7).
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 108 e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos em dois ou mais das seguintes posições: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal) , r 1, 2, 3, 4, - 5, 6, 7, 8, - 9, 10, 11 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 185 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64 , 65 , 66, 67, 68, 69 , 70 , 71 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79 , 80 , 81, 82, 83, 84 , 85 , 86 87, 88, 89, 90 , 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 113 , 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 125 , 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 137 , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172 173 , 174, 175, 176, 177 , 178, 179 , 180 , is: L, 182 (is to é na extremidade carboxilo da prote ina) (SEQ ID N° : : 1 OU 0 aminoácidos correspondentes das SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 108 e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos em dois ou mais das seguintes posições: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7).
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 77 e outro aminoácido de ocorrência não natural numa ou mais das seguintes posições: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal), 1, 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8, - 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99, 100, : L01, 102, 103, 104, 1 05, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 1 17, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 1 29, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 1 41, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 1 53, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 1 65, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174. 186
Um exame da estrutura cristalina de FGF-21 ou um membro ou membros da família de FGF e a sua interacção com o receptor de FOP pode indicar quais de certos resíduos de aminoácidos têm cadeias laterais que são completa ou parcialmente acessíveis ao solvente. A cadeia lateral de um aminoácido não codificado de forma natural nestas posições pode apontar em sentido contrário à superfície proteica e para fora em direcção ao solvente. 0 aminoácido de ocorrência não natural destas posições une-se a um polímero solúvel em água, incluindo a posição 108 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID N: 2-7) . Em algumas formas de realização, o aminoácido de ocorrência não natural em dois ou mais destas posições une-se a um polímero solúvel em água, incluindo, mas sem limitação, as posições: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal ) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, oo 9, 10, 11, 12 , 13, k·. i—1 15, 16, 17 , 18 , 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29, 30, 31, 32 , 33 , 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 4 7 , 48 , 49, 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57 , 58, 59, 60, 61, 62 , 63 , 64, 65, 66, 6 7 , 68, 69, 70, 71, 72 , 73, 74, 75, 76, 77 , 78 , 79, 80, 81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92 , 93 , 94, 95, 96, 97 , 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 t 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 t 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 t 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 t 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153 r 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 r 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 178, 179, 180 , 181, 182 (ist< o é, na extremidade carboxil O terminal da prote: ína) (SEQ ID N° : 1 ou l os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em algumas formas de realização, o aminoácido de ocorrência não natural numa ou mais destas posições une-se a um polímero solúvel em água, incluindo, mas sem limitaçao, as posições: 10, 52, 117, 126 , 131, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79 , 91, 96, 187 108 e 110 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7) . Em algumas formas de realização, o aminoácido de ocorrência não natural numa ou mais destas posições une-se a um polímero solúvel em água: 10, 52, 77, 117, 126, 131, 162, (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em algumas formas de realização, o aminoácido de ocorrência não natural numa ou mais destas posições une-se a um polímero solúvel em água: 87, 77, 83, 72 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em algumas formas de realização, o aminoácido de ocorrência não natural numa ou mais destas posições une-se a um polímero solúvel em água: 69, 79, 91, 96, 108 e 110 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em algumas formas de realização, o aminoácido de ocorrência não natural numa ou mais destas posições une-se a um polímero solúvel em água: 91, 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96, e 36 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7) . Em outra forma de realização, quando aparece um aminoácido de ocorrência não natural no aminoácido 91 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7), o aminoácido de ocorrência não natural une-se a um polímero solúvel em água.
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 ligado a um polímero em água e outro aminoácido de ocorrência não natural numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 , 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 , 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 , 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 92, 93, 94 , 95, 96, 188 97, hO co 99, 10 1—1 o \—1 1-1 o .02, 103, 1 04, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxil o da protc sina) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96, e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 unido a um polímero solúvel em água e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água : antes da posição 1 (isto é, na extremidade terminal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 2 2 , 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29 30, 31, 32, 33 , 34, 35, 36, 3 7 , 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44 45, 46, 47, 48 , 49, 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57 , 58, 59 60, 61, 62, 63 , 64, 65, 6 6, 6 7 , 68, 69, 70, 71, 72 , 73, 74 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 8 2 , 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89 90, 92, 93, 9 4, 95 , 96 , 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 189 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 unido a um polímero solúvel em água e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural que se unem a um polímero solúvel em água: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 unido a um polímero solúvel em água e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos em dois ou mais das seguinte s posiçõe s e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água : ant es da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal) 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, : L2, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 6 7 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 94 , 95 , 96 , 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 , 113 , 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 , 125 , 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 , 137 , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148 , 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 , 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172 , 173 , 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 , 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 91 unido a um polímero solúvel em água e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos em dois ou mais das seguintes posições e estes aminoácidos de 190 ocorrência nao natural unem-se a um polímero solúvel em água: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7).
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 131 unido a um polímero solúvel em água e outro aminoácido de ocorrência não natural numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: antes da posi ção 1 (istc ' é, na extremidade N terminal), 1, 2, 3 , 4 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 , 34, 35 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 , 49, 50 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 , 64, 65 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80 81, 82, 83 , 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 , 94, 95 96, 97, 9 8, 99 , 100, 101, 102, H 03, 104, 105, : 106, 107 108, 109, 110, 111, 112 , 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 120, 121, 122, 123, 124 , 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132 133, 134, 135, 136, 137 , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144 145, 146, 147, 148, 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168 169, 170, 171, 172, 173 , 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 181, 182 (isto é, na extremidade carboxil o da prote ína (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 131 e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água 91, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 131 unido a um polímero solúvel em água e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural numa das 191 seguintes posiçoes e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal) 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 , 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 , 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 , 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, \—I 00 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 , 94, 95, 96, 97, 98, 99 , 100, 101, 102, 103, 104, 105, : 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 , 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 , 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137 , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 , 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 131 unido a um polímero solúvel em água e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos que se unem a um polímero solúvel em água. 91, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 131 unido a um polímero solúvel em água e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos em dois ou mais das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 192 72, 73, 74 , 75, 76, 77, CO co CO o , 81, 82, 83, 84 , 85, CO Oh co CO co co 3, 90 , 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97 OO Oh 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 16 6, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178 , 179 oo \—1 OO \—1 o 1, l: 82 (isto é , na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 131 unido a um polímero solúvel em água e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos em dois ou mais das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: 91, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7).
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 108 unido a um polímero solúvel em água e outro aminoácido de ocorrência não natural numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: antes da pos: Íção 1 (isto é, na extremidade N terminal) , 1, 2, 3 , 4 5, < 5, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, . 15, 16, 17, 18 , 19, 20 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33 , 34, 35 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48 , 49, 50 51, 52, 53, 54 , 55 , 56 , 57, 58, 59, 60 , 61 • , 62, , 63, 64 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73 , 74, 75, 76, 77 , 78, 79 O 00 81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88 , 89, 90, 91, 92 , 93, 94 95, 96, 97 , 98, 99, 100 , 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107 109, , 110 r 111, 112, 113 , 114 , 115, 116, 117, 118, 119, 120 121, , 122 r 123, 124, 125 , 126 , 127, 128, 129, 130, 131, 132 133, , 134 r 135, 136, 137 , 138 , 139, 140, 141, 142, 143, 144 193 145, 146, 147, 148, 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 , 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 108 e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: 91, 131, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 108 unido a um polímero solúvel em água e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: antes da posi ção 1 (isto é, na extremidade N), 1 , 2, 3, 4, 5, 6 v 7 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 1 4, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30 , 31 , 32, 33, 34, 35 , 36, 37 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45 , 46 , 47, 48, 49, 50 , 51, 52 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59, 60 , 61 , 62, 63, 64, 65 , 66, 67 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75 , 76 , 77, 78, 79, 80 , 81, 82 83, 84, 85 , 86, 87, 88, 89, 90 , 91 , 92, 93, 94, 95 , 96, 97 00 Oh 99, 100, 1' 01, 102, 103, 1 04, 105, 106, 107, 109, 110 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 16 6, 167, 168, 169, 170 171, 172, 173, 174, 175, , 176, 177, 178, 179 , 180, 181, 18 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há aminoácido de ocorrência não natural em 108 unido a um polímero solúvel em água e um ou 194 mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos que se unem a um polímero solúvel em água: 91, 131, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N° : 2-7) . Em outra
forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 108 unido a um polímero solúvel em água e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural em dois ou mais das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: antes da posição 1 (isto é na extremidade N terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21 , 22 , 23, 24, 25, 26, 27 , 28, . 29 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36 , 37 , 38, 39, 40, 41, 42 , 43, . 44 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 51 , 52 , 53, 54, 55, 56, 57 , 58, . 59 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66 , 67 , 68, 69, 70, 71, 72 , 73, . 74 75, 76, 77, 78, r 79, 80, 81 ,82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89 90, 91, 92 , 93, 94, 95, 96 , 97 , 98, 99, 100 , io 1, 102, 103 104, 105, 106, 107, 109, 1 10, 111, 112, 113 , 11 4, 115, 116 117, 118, 119, 120, 121, 1 22, 123, 124, 125 , 126, 127, 128 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 , 13 8, 139, 140 141, 142, 143, 144, 145, 1 46, 147, 148, 149 , 15 0, 151, 152 153, 154, 155, 156, 157, 1 58, 159, 160, 161 , 16 2, 163, 164 165, 16 6, 167, 168, 169, 1 70, 171, 172, 173 , 17 4, 175, 176 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID t—1 O ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N° : 2-7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 108 unido a um polímero solúvel em água e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural em dois ou mais das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: 91, 131, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7).
Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 77 unido a um polímero solúvel em 195 água e outro aminoácido de ocorrência não natural numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polimero solúvel em água: antes da posi ção 1 (isto é : na extremidade K í terminal), 1, 2, 3 , 4 5, 6 , 7, 8 , 9 r 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 , 34, 35 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 , 49, 50 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 , 64, 65 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78, 79 , 80, 81 82, 83, 84 , 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96 97, 98, 9! 3, 10 0, 1 01, 102, 103, 1 04, 105, 106, 107, 108 109, 110, 111, 112, 113 , 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 121, 122, 123, 124, 125 , 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 133, 134, 135, 136, 137 , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144 145, 146, 147, 148, 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 16 6, 167, 168 169, 170, 171, 172, 173 , 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 181, 182 (isto é, na extremidade carboxil o da prote ina (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 77 e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polimero solúvel em água: 91, 131, 108, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N° : 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 77 unido a um polimero solúvel em água e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural numa das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polimero solúvel em água: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal), 1, 2, 3, . 4 5, 6, 7, , 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23 , 24, 25, 26, r 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 36, 37, 38 , 39, 40, 41, r 42, 43, 44, 45, 46, 47, co 49, 50 196 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58 , 59, 60, 61, 62, 63 , 64, 65, 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73 , 74, 75, 76, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99, 10 0, H 01, 102, li 03, 1 04, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 , 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 , 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 , 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxil o da prote :ína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 77 unido a um polimero solúvel em água e um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural que se unem a um polimero solúvel em água: 91, 131, 108, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7). Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 77 unido a um polimero solúvel em água e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural distintos em dois ou mais das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência nao natural unem-se a um polimero solúvel em água: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal), 1, 2 !, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 6 4, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78 , 79, 80, 81, 82, 83 , 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95 , 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 , 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 , 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 , 150, 151, 197 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 , 182 (isto é, na extremidade carboxilo da proteína) (SEQ ID N 0 : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID C\l o -7) . Em outra forma de realização, há um aminoácido de ocorrência não natural em 77 unido a um polímero solúvel em água e dois ou mais aminoácidos de ocorrência não natural em dois ou mais das seguintes posições e estes aminoácidos de ocorrência não natural unem-se a um polímero solúvel em água: 91, 131, 108, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 e 36 (SEQ ID N° : 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N° : 2-7) . Há um aminoácido de ocorrência não natural na posição 108 (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID N°: 2-7) unido a um polímero solúvel em água.
Uma grande diversidade de aminoácidos não codificados de forma natural podem substituir a, ou ser incorporados em, uma dada posição num polipéptido FGF-21. Em geral, selecciona-se um aminoácido não codificado de forma natural particular para a incorporação com base num exame da estrutura cristalina tridimensional de um polipéptido FGF-21 ou outro membro da família de FGF com o seu receptor, uma preferência por substituições conservativas (isto é, aminoácidos não codificados de forma natural com base em arilo, tais como p-acetilfenilalanina ou 0-propargiltirosina que substituem a Phe, Tyr ou Trp) e a química de conjugação específica que se deseja introduzir no polipéptido FGF-21 (por exemplo, a introdução de 4-azidofenilalanina se for desejado efectuar uma cicloadição de Huisgen [3+2] com um polímero solúvel em água que possui um resíduo alcino ou a formação de uma ligação amida com um polímero solúvel em água que possui um aril éster que, por sua vez, incorpora um resíduo de fosfina).
Numa forma de realização da memória descritiva, o método inclui adicionalmente incorporar na proteína o aminoácido 198 não natural, onde o aminoácido não natural compreende um primeiro grupo reactivo; e pôr em contacto a proteina com uma molécula (incluindo, mas sem limitação, um marcador, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietilenoglicol, um fotorreticulador, um radionúclido, um composto citotóxico, um fármaco, um marcador de afinidade, um marcador de fotoafinidade, um composto reactivo, uma resina, uma segunda proteína ou polipéptido ou análogo de polipéptido, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um cofactor, um ácido gordo, um hidrato de carbono, um polinucleótido, um ADN, um ARN, um polinucleótido antissense, um sacárido, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucleico inibidor, um biomaterial, uma nanopartícuia, um marcador de spin, um fluoróforo, um resíduo que contém metal, um resíduo radiactivo, um grupo funcional novo, um grupo que interage de forma covalente ou não covalente com outras moléculas, um resíduo fotolibertador, um resíduo excitável por radiação actínica, um resíduo fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, um resíduo que incorpora um átomo pesado, um grupo excisável quimicamente, um grupo fotoexcisável, uma cadeia lateral alargada, um açúcar unido a carbono, um agente activo redox, um amino tioácido, um resíduo tóxico, um resíduo marcado de forma isotópica, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo electrodenso, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente activo, um marcador detectável, uma molécula pequena, um ponto quântico, um nanotransmissor, um radionucleótido, um radiotransmissor, um agente de captura de neutrões, ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável) que compreende um segundo grupo reactivo. 0 primeiro grupo 199 reactivo reage com o segundo grupo reactivo para unir a molécula ao aminoácido não natural através de uma cicloadição [3+2]. Numa forma de realização da memória descritiva, o primeiro grupo reactivo é um resíduo alcinilo ou azido e o segundo grupo reactivo é um resíduo azido ou alcinilo. Por exemplo, o primeiro grupo reactivo é o resíduo alcinilo (incluindo, mas sem limitação, no aminoácido nao natural p-propargiloxifenilalanina) e o segundo grupo reactivo é o resíduo azido. Em outro exemplo, o primeiro grupo reactivo é o resíduo azido (incluindo, mas sem limitação, no aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reactivo é o resíduo alcinilo.
Em algumas formas de realização da memória descritiva, a substituição ou as substituições de aminoácidos não codificados de forma natural serão combinadas com outras adições, substituições ou deleções dentro do polipéptido FGF-21 para afectar a outros traços biológicos do polipéptido FGF-21. Em algumas formas de realização da memória descritiva, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo, mas sem limitação, resistência a degradação proteolítica) do polipéptido FGF-21 ou aumentar a afinidade do polipéptido FGF-21 pelo seu receptor. Em algumas formas de realização da memória descritiva, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade farmacêutica do polipéptido FGF-21. Em algumas formas de realização da memória descritiva, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo, mas sem limitação, guando se expressam em E. coli ou outras células hospedeiras) do polipéptido FGF-21. Em algumas formas de realização da memória descritiva, as adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade do polipéptido depois da expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas formas de realização 200 da memória descritiva, os locais são seleccionados para substituição com um aminoácido não natural ou codificado de forma natural além disso de outro local para incorporação de um aminoácido não natural que da como resultado um aumento da solubilidade do polipéptido depois da expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas formas de realização da memória descritiva, os polipéptidos FGF-21 compreendem outra adição, substituição ou deleção que modula a afinidade pelo receptor do polipéptido FGF-21, proteínas de ligação ou ligando associado, modula a transdução de sinais depois da ligação com o receptor de FGF-21, modula a semivida em circulação, modula a libertação ou biodisponibilidade, facilita a purificação ou melhora ou altera uma via particular de administração. Em algumas formas de realização da memória descritiva, os polipéptidos FGF-21 compreendem uma adição, substituição ou deleção que aumenta a afinidade da variante de FGF-21 pelo seu receptor. De forma similar, os polipéptidos FGF-21 podem compreender sequências de clivagem química ou enzimática, sequências de clivagem de protease, grupos reactivos, domínios de ligação a anticorpo (incluindo, mas sem limitação, FLAG ou poli-His) ou outras sequências baseadas em afinidade (incluindo, mas sem limitação, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas unidas (incluindo, mas sem limitação, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, mas sem limitação, GFP), purificação, transporte através de tecidos ou membranas celulares, libertação ou activação de pró-fármacos, redução do tamanho de FGF-21, ou outros traços do polipéptido.
Em algumas formas de realização, a substituição de um aminoácido não codificado de forma natural gera um antagonista de FGF-21. Em algumas formas de realização, um aminoácido não codificado de forma natural é substituído ou adicionado numa região envolvida na ligação com o receptor. Em algumas formas de realização, um aminoácido não 201 codificado de forma natural é substituído ou adicionado numa região envolvida na ligação com heparina. Em algumas formas de realização, os antagonistas de FGF-21 compreendem pelo menos uma substituição que provoca que FGF-21 actúe como um antagonista. Em algumas formas de realização, o antagonista de FGF-21 compreende um aminoácido não codificado de forma natural unido a um polímero solúvel em água que está presente numa região de ligação ao receptor da molécula de FGF-21. 1 aminoácido é substituído com um aminoácido não codificado de forma natural. Em alguns casos, o resíduo não codificado de forma natural une-se a um ou mais PEG lineares ou ramificados de peso molecular mais baixo, potenciando deste modo a afinidade de ligação e a semivida em soro comparável com respeito às espécies unidas a um só PEG de maior peso molecular. VII. Expressão em não eucariotas e eucariotas
Para obter expressão de alto nível de um polinucleótido de FGF-21 clonado, tipicamente são subclonados polinucleótidos que codificam um polipéptido FGF-21 da invenção num vector da expressão que contém um promotor forte para dirigir a transcrição, um terminador da transcrição/tradução e, se é para um ácido nucleico que codifica uma proteína, um local de ligação a ribossomas para o início da tradução. São conhecidos promotores bacterianos adequados pelos peritos comuns na especialidade e se descrevem, por exemplo, em Sambrook et al. e Ausubel et al.
Estão disponíveis sistemas da expressão bacterianos para expressar polipéptidos FGF-21 da invenção em, incluindo, mas sem limitação, E. coli, Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida e Salmonella (Paiva et al. , Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983)). Estão disponíveis comercialmente kits para tais sistemas da expressão. São conhecidos pelos peritos comuns na especialidade sistemas 202 da expressão eucariotas para células de mamífero, levedura e células de insecto e também estão disponíveis comercialmente. Em casos em que são usados ARNt ortogonais e aminoacil ARNt sintetases (descritos anteriormente) para expressar os polipéptidos FGF-21 da invenção, as células hospedeiras para expressão são seleccionados com base em sua capacidade para usar os componentes ortogonais. As células hospedeiras de exemplo incluem bactérias Gram-positivas (incluindo, mas sem limitação, B. brevis, B. subtilis ou Streptomyces) e bactérias Gram-negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), assim como levedura e outras células eucariotas. As células que compreendem pares de ARNt-O/RS-O podem ser usadas como é descrito no presente documento.
Uma célula hospedeira eucariota ou célula hospedeira não eucariota da revelação descritiva proporciona a capacidade para sintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Num aspecto, a composição inclui opcionalmente, incluindo, mas sem limitação, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250 microgramas, pelo menos 500 microgramas , pelo menos ; 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas, pelo menos 100 miligramas, pelo menos um gramo ou mais da proteína que compreende um aminoácido não natural, ou uma quantidade que pode ser conseguido com métodos de produção de proteínas in vivo (no presente documento são proporcionados detalhes sobre a produção e purificação de proteínas recombinantes). Em outro aspecto, a proteína está opcionalmente presente na composição a uma concentração de, incluindo, mas sem limitação, pelo menos 10 microgramas de proteína por litro, pelo menos 50 microgramas de proteína por litro, pelo menos 75 microgramas de proteína por litro, pelo menos 100 microgramas de proteína por litro, pelo menos 200 203 microgramas de proteína por litro, pelo menos 250 microgramas de proteína por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína de litro ou pelo menos 10 miligramas de proteína de litro ou mais em, incluindo, mas sem limitação, um lisado celular, um tampão, um tampão farmacêutico ou outra suspensão líquida (incluindo, mas sem limitação, num volume de, incluindo, mas sem limitação, qualquer de aproximadamente 1 nl a aproximadamente 100 1 ou mais). A produção de grandes quantidades (incluindo, mas sem limitação, maiores que as tipicamente possíveis com outros métodos, incluindo, mas sem limitação, tradução in vitro) de uma proteína numa célula eucariota que inclui pelo menos um aminoácido não natural é uma característica da invenção. Uma célula hospedeira eucariota ou célula hospedeira não eucariota da presente revelação proporciona a capacidade para biosintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Por exemplo, podem ser produzidas proteínas que compreendem um aminoácido não natural a uma concentração de, incluindo, mas sem limitação, pelo menos 10 μg/litro, pelo menos 50 μg/litro, pelo menos 75 μg/litro, pelo menos 100 μg/litro, pelo menos 200 μg/litro, pelo menos 250 μρ/1ί^ο, ou pelo menos 500 μg/litro, pelo menos 1 mg/litro, pelo menos 2 mg/litro, pelo menos 3 mg/litro, pelo menos 4 mg/litro, pelo menos 5 mg/litro, pelo menos 6 mg/litro, pelo menos 7 mg/litro, pelo menos 8 mg/litro, pelo menos 9 mg/litro, pelo menos 10 mg/litro, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, lg/litro, 5 g/litro, 10 g/litro ou mais de proteína num extracto celular, lisado celular, meio de cultura, um tampão e/ou similares. I. Sistemas da expressão. Cultura e isolamento
Podem ser expressos polipéptidos FGF-21 em qualquer variedade de sistemas da expressão adequados incluindo, por 204 exemplo, levedura, células de insecto, células de mamífero e bactérias. É proporcionada a seguir uma descrição dos sistemas da expressão de exemplo.
Levedura. Como é usado no presente documento, o termo "levedura" inclui qualquer das diversas leveduras capazes de expressar um gene que codifique um polipéptido FGF-21. Tais leveduras incluem, mas sem limitação, leveduras ascosporogénias (Endomycetales) , leveduras basidiosporogénias e leveduras que pertencem ao grupo de Fungos imperfeitos (Blastomycetes) . As leveduras ascosporogénias se dividem em duas famílias, Spermophthoraceae e Saccharomycetaceae. A segunda compreende quatro subfamílias, Schizosaccharomycoideae (por exemplo, género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae e Saccharomycoideae (por exemplo, géneros Pichia, Kluyveromyces e Saccharomyces). As leveduras basidiosporogénias incluem os géneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium e Filobasidiella. As leveduras que pertencem ao grupo dos Fungos Imperfeitos (Blastomycetes) se dividem em duas famílias, Sporobolomycetaceae (por exemplo, géneros Sporobolomyces e Bullera) e Cryptococcaceae (por exemplo, género Candida). São de particular interesse para uso com a presente invenção as espécies dentro dos géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopse e Candida, incluindo, mas sem limitação, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltose e H. polymorpha. A selecção de uma levedura adequada para a expressão de polipéptidos FGF-21 está dentro da experiência de um perito habitual na especialidade. Ao seleccionar hospedeiros de levedura para expressão, os hospedeiros adequados podem 205 incluir os que mostraram que têm, por exemplo, boa capacidade de secreção, baixa actividade proteolítica, boa capacidade de secreção, boa produção de proteina solúvel e resistência global. As leveduras estão disponíveis em geral de uma diversidade de fontes, incluindo, mas sem limitação, o Centro de Estirpes Genéticas de Levedura, Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade de Califórnia (Berkeley, CA) e a Colecção Americana de Culturas Tipo ("ATCC") (Manassas, VA). A expressão "hospedeiro de levedura" ou "célula hospedeira de levedura" inclui levedura que pode ser usada, ou foi usada, como um receptor para vectores recombinantes ou outro ADN de transferência. A expressão inclui a descendência da célula hospedeira de levedura original que recebeu os vectores recombinantes ou outro ADN de transferência. Entende-se que a descendência de uma só célula parental pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de ADN genómico ou total ao parental original, devido a mutação acidental ou deliberada. A descendência da célula parental que seja suficientemente similar à parental para ser caracterizada pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido FGF-21, se inclui na descendência pretendida por esta definição.
Foram desenvolvidos vectores da expressão e transformação, incluindo replicões extracromossómicos ou vectores de integração, para transformação em muitos hospedeiros de levedura. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores da expressão para S. cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1989) 122: 19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163; Hinnen et ai., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75: 1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6: 142); C. maltose (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141); H. polymorpha (Gleeson et ai., J. GENE. MICROBIOL. 206 (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202: 302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165); K. lactis (De Louvencourt et al. , J. BACTERIOL. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8: 135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141); P. pastoris (Patentes US N° 5,32 4,639; 4,92 9,555; e 4,83 7,148; Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5: 3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., NATURE (1982) 300: 706); e E. lipolytica; A. nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112 : 284-89; Tilbum et al., GENE (1983) 26: 205-221; e Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81: 1470-74); A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475-479); T. reesia (documento EP 0 244 234); e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357) . São conhecidas sequências de controlo para vectores de levedura pelos peritos comuns na especialidade e incluem, mas sem limitação, regiões promotoras de genes tais como álcool desidrogenase (ADH) (documento EP 0 284 044); enolase; glucoquinase; glucose-6-fosfato isomerase; gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH); hexoquinase; fosfofructoquinase; 3-fosfoglicerato mutase; e piruvato quinase (PyK) (documento EP 0 329 203) . O gene PH05 de levedura, que codifica fosfatase ácida, também pode proporcionar sequências promotoras úteis (Miyanohara et al., PROC. NATAL. ACAD. SCI USA (1983) 80: 1). Outras sequências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura podem incluir os promotores para 3-fosfoglicerato quinase (Hitzeman et al., J. BIOL.CHEM. (1980) 255: 12073); e outras enzimas glicoliticas, tais como piruvato descarboxilase, triosafosfato isomerase e fosfoglucose isomerase (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17: 4900; Hess et al., J. ADV. ΕΝΖΥΜΕ REG. (1969) 7: 149). Os 207 promotores de levedura induzíveis que têm a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento podem incluir as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2; isocitocromo C; fosfatase ácida; metalotioneína; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; enzimas degradativas associadas com o metabolismo do azoto; e enzimas responsáveis de utilização de maltose e galactose. Se descrevem adicionalmente vectores e promotores adequados para uso em expressão de leveduras no documento EP 0 073 657.
Também podem ser usados potenciadores de levedura com promotores de levedura. Além disso, os promotores sintéticos também podem actuar como promotores de levedura. Por exemplo, as sequências de activação cadeia arriba (UAS) de um promotor de levedura podem ser ligadas com a região de activação da transcrição de outro promotor de levedura, criando um promotor de híbrido sintético. Os exemplos de ditos promotores híbridos incluem a sequência reguladora de ADH ligada à região de activação da transcrição de GAP. Vejam-se as Patentes US N° 4.880.734 e 4.876.197. Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem nas sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, GAL10 ou PH05, combinados com a região de activação da transcrição de um gene de enzima glicolítica tal como GAP ou PyK. Veja-se o documento EP 0 164 556. Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores de ocorrência natural não procedentes de levedura que têm a capacidade para ser ligadas a ARN polimerase de levedura e iniciar a transcrição.
Outros elementos de controlo que podem compreender parte dos vectores da expressão de levedura incluem terminadores, por exemplo, de GAPDH ou os genes de enolase (Holland et al.r J. BIOL. CHEM. (1981) 256: 1385). Além disso, o origem de replicação do origem de plasmídeo 2μ é adequado para levedura. Um gene de selecção adequado para uso em levedura 208 é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura. Veja-se Tschumper et al., GENE (1980) 10: 157; Kingsman et al. , GENE (1979) 7: 141. O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade para crescer em triptofano De forma similar, as estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 2 0,622 ou 3 8,626) são complementados por plasmídeos conhecidos que portam o gene Leu2. São conhecidos pelos peritos habituais na especialidade métodos para introduzir ADN exógeno em hospedeiros de levedura e tipicamente incluem, mas sem limitação, a transformação de esferoplastos ou de células hospedeiras de levedura intactas tratadas com catiões alcalinos. Por exemplo, a transformação de levedura pode ser levada a cabo de acordo com o método descrito em Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76: 3829 e Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130: 946. No entanto, também podem ser usados outros métodos para introduzir ADN em células tais como por injecção nuclear, electroporação ou fusão de protoplastos como se descreve em geral em SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001) . As células hospedeiras de levedura depois podem ser cultivadas usando técnicas convencionais conhecidas pelos peritos comuns na especialidade. São conhecidos outros métodos para expressar proteínas heterólogas em células hospedeiras de levedura pelos peritos comuns na especialidade. Veja-se, em geral, a Publicação de Patente US N° 20020055169, as Patentes US N° 6.361.969; 6.312.923; 6.183.985; 6.083.723; 6.017.731; 5.674.706; 5.629.203; 5.602.034; e 5.089.398; as Patentes Reexaminadas US N° RE3 7, 343 e RE3 5, 749; as Pedidos de Patente Publicadas de PCT WO 99/07862; WO 98/37208; e WO 98/26080; as Pedidos de Patente Europeia EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; e EP 0 164 556. Veja-se também, 209
Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2): 79-93; Romanos et al., YEAST (1992) 8(6): 423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185: 3-7.
As estirpes hospedeiras de levedura podem ser cultivadas em fermentadores durante a etapa de amplificação usando métodos de fermentação semi-continuos convencionais conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. Os métodos de fermentação podem ser adaptados para responder às diferenças na via de utilização de carbono de um hospedeiro de levedura particular ou modo de controlo da expressão. Por exemplo, a fermentação de um hospedeiro de levedura de Saccharomyces pode requerer um fornecimento de glucose simples, uma fonte de azoto complexa (por exemplo, hidrolisados de caseína) e complementação com múltiplas vitaminas. Pelo contrário, a levedura metilotrófica P. pastoris pode requerer fornecimento de glicerol, metanol e pequenas quantidades de minerais, mas somente sais de amónio simples (azoto) para um crescimento e expressão óptimos. Veja-se, por exemplo, Patente US N° 5,32 4,639; Elliott et al.r J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; e Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29: 1113.
Tais métodos de fermentação, no entanto, podem ter certas características comuns independentes da estirpe hospedeira de levedura utilizada. Por exemplo, pode ser adicionado um nutriente limitante do crescimento, tipicamente carbono, ao fermentador durante a fase de amplificação para permitir o crescimento máximo. Além disso, os métodos de fermentação geralmente utilizam um meio de fermentação desenhado para conter quantidades adequadas de carbono, azoto, sais basais, fósforo e outros nutrientes menores (vitaminas, minerais em quantidades muito pequenas e sais, etc.). São descritos exemplos de meios de fermentação adequados para uso com Pichia nas Patentes US N° 5.324.639 e 5.231.178. O documento WO 2005/091944 descreve a expressão de FGF-21 em levedura. 210 Células de insecto infectadas por baculovírus. A expressão "hospedeiro de insecto" ou "célula hospedeira de insecto" refere-se a um insecto que pode ser usado, ou foi usado, como um receptor para vectores recombinantes ou outro ADN de transferência. A expressão inclui a descendência da célula hospedeira de insecto original que foi transfectada. Entende-se que a descendência de uma célula parental simples pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de ADN genómico total ao parental original, devido a uma mutação acidental ou deliberada. A descendência da célula parental que é suficientemente similar ao parental para ser caracterizada pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido FGF-21, se inclui na descendência pretendida por esta definição. A selecção de células de insecto adequadas para a expressão de polipéptidos FGF-21 é conhecida pelos peritos comuns na especialidade. Estão bem descritas na técnica várias espécies de insecto e estão disponíveis comercialmente incluindo Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Ao seleccionar hospedeiros insectos para a expressão, os hospedeiros adequados podem incluir os que mostraram que têm, entre outros, boa capacidade de secreção, baixa actividade proteolítica e resistência global. Os insectos estão em geral disponíveis de uma diversidade de fontes, incluindo, mas sem limitação, o Centro de Estirpes Genéticas de Insectos, Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade de Califórnia (Berkeley, CA) e a Colecção Americana de Culturas Tipo ("ATCC") (Manassas, VA) .
Em geral, os componentes de um sistema da expressão de insectos infectados por baculovírus inclui um vector de transferência, habitualmente um plasmídeo bacteriano, que 211 contém tanto um fragmento do genoma de baculovírus como um local de restrição conveniente para a inserção do gene heterólogo a expressar; um baculovírus de tipo selvagem com sequências homólogas ao fragmento específico de baculovírus no vector de transferência (este possibilita a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma de baculovírus); e células hospedeiras de insecto e meios de crescimento apropriados. Os materiais, métodos e técnicas usadas na construção de vectores, transfecção de células, selecção de placas, crescimento de células em cultura e similares são conhecidos na especialidade e estão disponíveis manuais que descrevem estas técnicas.
Depois de inserir o gene heterólogo no vector de transferência, o vector e o genoma virai de tipo selvagem é transfectado a uma célula hospedeira de insecto em que o vector e o genoma virai se recombinam. 0 vírus recombinante empacotado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Estão disponíveis comercialmente materiais e métodos para sistemas da expressão de células de insecto/baculovírus em forma de kit de, por exemplo, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Estas técnicas são conhecidas em geral pelos peritos comuns na especialidade e se descrevem completamente em SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN N° 1555 (1987) . Veja-se também, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVÍRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL. , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1 6,9-1 6,11 (1994); KING E POSSEE, THE BACULOVÍRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); e 0'REILLY ET AL. , BACULOVÍRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).
De facto, é conhecida pelos peritos comuns na especialidade a produção de diversas proteínas heterólogas usando sistemas da expressão de células de insecto/baculovírus. Vejam-se, por exemplo, as Patentes US N° 6.368.825; 6.342.216; 6.338.846; 6.261.805; 6.245.528. 6.225.060; 212 6.183.987; 6.168.932; 6.126. 944; 6.096.304 ; 6.013.433; 5.965.393; 5.939.285; 5.891. 676; 5.871.986 ; 5.861.279; 5.858.368; 5.843.733; 5.762. 939; 5.753.220 ; 5.605.827; 5.583.023; 5.571.709; 5. 516.657; 5.290.686; e os documentos WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082. São conhecidos na técnica vectores que são úteis nos sistemas da expressão de células de insecto/baculovirus e incluem, por exemplo, vectores de transferência e expressão em insectos derivados do baculovirus vírus da polihedrose nuclear de Autographacalifornica (AcNPV), que é um vector da expressão virai independente de auxiliar. Os vectores da expressão virais derivados deste sistema habitualmente usam o promotor do gene de polihedrina virai forte para dirigir a expressão de genes heterólogos. Veja-se, em geral, 0'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992) .
Antes de inserir o gene estranho no genoma do baculovirus, os componentes anteriormente descritos, que compreendem um promotor, líder (se for desejado), sequência codificante de interesse e sequência de terminação da transcrição, tipicamente são montadas numa construção de substituição intermediária (vector de transferência). As construções de substituição intermediárias são mantidas com frequência num replicão, tal como um elemento cromossómico extra (por exemplo, plasmídeos) capaz de estabelecer a manutenção num hospedeiro, tal como bactérias. 0 replicão terá um sistema de replicação, permitindo deste modo que se mantenha num hospedeiro adequado para clonagem e amplificação. Mais especificamente, o plasmídeo pode conter a sinal de 213 poliadenilação de polihedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42 : 177) e um gene de resistência a ampicilina procariota (amp) e origem de replicação para selecção e propagação em E. coli.
Um vector de transferência habitualmente usado para introduzir genes estranhos em AcNPV é pAc373. Também foram desenhados muitos outros vectores, conhecidos pelos peritos na especialidade, incluindo por exemplo, pVL985, que altera o codão de inicio da polihedrina de ATG a ATT, e que introduz um local de clonagem BamHI 32 pares de bases a jusante desde o ATT. Veja-se Luckow e Summers, VIROLOGY 170: 31 (1989). Outros vectores disponíveis comercialmente incluem, por exemplo, PBlueBac 4,5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac 4,5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Depois da inserção do gene heterólogo, o vector de transferência e genoma de baculovirus de tipo selvagem são co-transfectados numa célula hospedeira de insecto. São conhecidos na técnica métodos para introduzir ADN heterólogo no local desejado no virus baculovirus. Veja-se SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN N° 1555 (1987); Smith et al. , MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156; Luckow e Summers, VIROLOGY (1989) 170: 31.
Por exemplo, a inserção pode ser num gene tal como o gene da polihedrina, por recombinação de cruzamento duplo homólogo; a inserção também pode ser num local de enzima de restrição introduzido por engenharia genética no gene de baculovirus desejado. Veja-se, Miller et al., BIOESSAYS (1898) 11(4): 91. O transfecção pode ser conseguido por electroporação. Veja-se TROTTER E WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann e King, J. GENE. VIROL. (1989) 70: 3501. Como alternativa, podem ser usados lipossomas para transfectar as células de insecto com o vector da expressão recombinante e o baculovirus. Veja-se, por exemplo, Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26 (1): 36; Graves et al., 214 BIOCHEMISTRY (1998) 37: 6050; Nomura et al. , J. BIOL. CHEM. (1998) 273 (22): 13570; Schmidt et al. , PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12: 323; Siffert et al. , NATURE GENETICS (1998) 18: 45; TILKINS ET AL. , CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10: 263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17: 491; Kost et al. , GENE (1997) 190: 139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271: 22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376; Reverey et al. , J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (39): 23607-10; Stanley et ai., J. BIOL. CHEM. (1995) 270 : 4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68 (2): 766; e Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2): 274. Os lipossomas disponíveis comercialmente incluem, por exemplo, Cellfectin® e Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA). Além disso, pode ser usado transfecção de fosfato cálcico. Veja-se TROTTER E WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18 (19) : 5667; e Mann e King, J. GENE. VIROL. (1989) 70: 3501.
Os vectores da expressão de baculovírus habitualmente contêm um promotor de baculovírus. Um promotor de baculovírus é gualquer sequência de ADN capaz de ser ligada a uma ARN polimerase de baculovírus e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (por exemplo, gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de início da transcrição que habitualmente se situa próxima à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de início da transcrição tipicamente inclui um local de ligação a ARN polimerase e um local de início da transcrição. Um promotor de baculovírus também pode ter um segundo domínio chamado potenciador que, se está presente, habitualmente está distante do gene estrutural. Além disso, a expressão pode ser regulada ou constitutiva. proporcionam
Os genes estruturais, transcritos abundantemente em momentos tardios no ciclo de infecção, 215 sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos incluem sequências derivadas do gene que codifica a proteina de polihedro virai (FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression em THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVÍRUSES (1986); documentos EP 0 127 839 e 0 155 476) e o gene que codifica a proteina plO (Vlak et al., J. GENE. VIROL. (1988) 69: 765). 0 vector da expressão de baculovirus recém formado é empacotado num baculovirus recombinante infeccioso e as placas que crescem posteriormente podem ser purificadas por técnicas conhecidas pelos peritos comuns na especialidade. Veja-se Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11 (4): 91; SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN N° 1555 (1987) .
Foram desenvolvidos vectores da expressão de baculovirus recombinantes para infecção em várias células de insecto. Por exemplo, foram desenvolvidos baculovirus recombinantes para, entre outros, Aedes aegypti (ATCC N° CCL-125), Bombyx mori (ATCC N° CRL-8910), Drosophila melanogaster (ATCC N° 1963), Spodoptera frugiperda, e Trichoplusia ni. Veja-se Wright, NATURE (1986) 321: 718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56: 153; Smith et al. r MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156. Veja-se, em geral, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25: 225. Mais especificamente, as linhas celulares usadas para sistemas de vector da expressão de baculovirus habitualmente incluem, mas sem limitação, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC N° CRL-1711), Sf21 (Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., Cat. N° 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri-368 (Trichopulsia ni), e High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni).
Estão disponíveis comercialmente células e meios de cultura para expressão directa e de fusão de polipéptidos heterólogos num baculovírus/expressão, e é conhecida em geral pelos peritos comuns na especialidade a tecnologia de cultura celular. 216 E. Colif espécies de Pseudomonas e outros procariotas. São conhecidos pelos peritos comuns na especialidade técnicas da expressão bacteriana. Está disponível uma ampla diversidade de vectores para uso em hospedeiros bacterianos. Os vectores podem ser vectores de cópia única ou de uma multiplicidade alta ou baixa de cópias. Os vectores podem servir para clonagem e/ou expressão. Em vista da ampla bibliografia com respeito a vectores, disponibilidade comercial de muitos vectores e inclusive manuais que descrevem vectores e suas características e mapas de restrição, não é requerida uma análise exaustiva no presente documento. Como é bem conhecido, os vectores normalmente envolvem marcadores que possibilitam a selecção, podendo proporcionar ditos marcadores resistência a agentes citotóxicos, prototrofia ou imunidade. Frequentemente, está presente uma pluralidade de marcadores, que proporcionam diferentes características.
Um promotor bacteriano é qualquer sequência de ADN capaz de ser ligada a ARN polimerase bacteriana e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (por exemplo, gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de início da transcrição que habitualmente se situa próxima à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de início da transcrição tipicamente inclui um local de ligação a ARN polimerase e um local de início da transcrição. Um promotor bacteriano também pode ter um segundo domínio chamado operador, que pode sobrepor com um local de ligação com ARN polimerase adjacente em que começa a síntese de ARN. 0 operador permite a transcrição regulada (induzível) negativa, já que uma proteína repressora génica pode ser ligada ao operador e inibir deste modo a transcrição de um gene específico. Pode ser produzida expressão constitutiva em ausência de elementos reguladores negativos, tais como o operador. Além disso, pode ser conseguido regulação positiva por uma sequência de ligação 217 com proteína activadora génica que, se está presente, está habitualmente próxima (5') à sequência de ligação com ARN polimerase. Um exemplo de uma proteína activadora génica é a proteína activadora de catabolitos (CAP), que ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173]. A expressão regulada pode portanto ser positiva ou negativa, potenciando ou reduzindo deste modo a transcrição.
As sequências que codificam enzimas de vias metabólicas proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas que metabolizam açúcares, tais como galactose, lactose (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] e maltose. Os exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas tais como triptofano (trp) [Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8: 4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9 : 731; Patente US N° 4, 73 8, 921; Publicações de EP N° 036 776 e 121 775]. O sistema promotor de β-galactosidase (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes". Em Interferon 3 (Ed. I. Gresser)], sistemas promotores de bacteriófago lambda PL [Shimatake et ai., NATURE (1981) 292: 128] e T5 [Patente US N° 4.689.406] também proporciona sequências promotoras úteis. Os métodos preferidos da presente memória descritiva utilizam promotores fortes, tais como o promotor de T7 para induzir polipéptidos FGF-21 a níveis altos. São conhecidos pelos peritos comuns na especialidade exemplos de tais vectores e incluem a série pET29 de Novagen e os vectores pPOP descritos no documento WO 99/05297. Tais sistemas da expressão produzem altos níveis de polipéptidos FGF-21 no hospedeira sem afectar à viabilidade da célula hospedeira ou sus parâmetros de crescimento. pET19 (Novagen) é outro vector conhecido na técnica. 218
Além disso, também actuam como promotores bacterianos promotores sintéticos que não aparecem na natureza. Por exemplo, podem ser ligadas sequências de activação da transcrição de um promotor bacteriano ou bacteriófago com as sequências dos operões de outros promotores bacterianos ou bacteriófagos, criando um promotor híbrido sintético [Patente US N° 4,55 1,433]. Por exemplo, o promotor tac é um promotor híbrido trp-lac compreendido por sequências tanto de promotor trp como de operão lac que se regula por repressor lac [Amann et al., GENE (1983) 25: 167; de Boer e cl., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80: 21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores de ocorrência natural de origem não bacteriana que têm a capacidade de ser ligada a ARN polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor de ocorrência natural de origem não bacteriana também pode ser acoplado com uma ARN polimerase compatível para produzir altos níveis da expressão de alguns genes em procariotas. O sistema de ARN polimerase/promotor de bacteriófago T7 é um exemplo de um sistema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sei. (1985) 82: 1074] . Além disso, um promotor híbrido também pode estar compreendido por um promotor de bacteriófago e uma região operadora de E. coli (Publicação de EP N° 267 851). Além disso de uma sequência promotora operativa, um local de ligação a ribossoma eficaz também é útil para a expressão de genes estranhos em procariotas. Em E. coli, o local de ligação a ribossoma denomina-se a sequência Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão de início (ATG) e uma sequência de 3-9 nucleótidos de comprimento localizada 3-11 nucleótidos cadeia arriba do codão de início [Shine et al., NATURE (1975) 254: 34]. Acredita-se que a sequência SD promove a ligação de ARNm com o ribossoma pelo emparelhamento de bases entre a sequência SD e a extremidade 3' de ARNr 16S de E. coli [Steitz et al. 219 "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", em Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. Para expressar genes eucariotas e genes procariotas com locais de ligação a ribossoma fraco [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 19 8 9] . A expressão "hospedeiro bacteriano" ou "célula hospedeira bacteriana" refere-se a uma bactéria que pode ser usado ou foi usado, como um receptor para vectores recombinantes ou outro ADN de transferência. 0 termo inclui a descendência da célula hospedeira bacteriana original que foi transfectada. Entende-se que a descendência de uma célula parental simples pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de ADN genómico ou total à célula parental original, devido a mutação acidental ou deliberada. A descendência da célula parental que é suficientemente similar à célula parental para ser caracterizada pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido FGF-21, se inclui na descendência pretendida por esta definição. A selecção de bactérias hospedeiras adequadas para expressão de polipéptidos FGF-21 é conhecida pelos peritos comuns na especialidade. Ao seleccionar hospedeiros bacterianos para expressão, os hospedeiros adequados podem incluir os que foi demostrado que têm, entre outros, boa capacidade de formação de corpos de inclusão, baixa actividade proteolítica e resistência global. Estão disponíveis em geral hospedeiros bacterianos de uma diversidade de fontes incluindo, mas sem limitação, o Centro de Estirpes Bacterianas, Departamento de Biofisica e Física Médica, Universidade de Califórnia (Berkeley, CA) ; e a Colecção Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") (Manassas, VA) . A fermentação industrial/farmacêutica geralmente usa 220 bactérias derivadas de estirpes K (por exemplo W3110) ou de bactérias derivadas de estirpes B (por exemplo BL21). Estas estirpes são particularmente úteis devido a que sus parâmetros de crescimento são conhecidos extremamente bem e são resistentes. Além disso, estas estirpes não são patogénicas, o que é importante comercialmente por razões de segurança e ambientais. Outros exemplos de hospedeiros E. coli adequados incluem, mas sem limitação, estirpes de BL21, DH10B ou derivados das mesmas. Em outra forma de realização dos métodos da presente invenção, a hospedeira de E. coli é uma estirpe protease menos que inclui, mas sem limitação, OMP- e LON-. A estirpe de célula hospedeira pode ser uma espécie de Pseudomonas, incluindo, mas sem limitação Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas putida. Se sabe que Pseudomonas fluorescens biovar 1, designada estirpe MB101, é útil para produção recombinante e está disponível para métodos de produção de proteínas terapêuticos. Os exemplos de um sistema da expressão de Pseudomonas incluem o sistema disponível de The Dow Chemical Company como uma estirpe hospedeira (Midland, MI disponível em Internet em dow.com). sao
Uma vez que foi estabelecida uma estirpe de célula hospedeira recombinante (isto é, a construção da expressão foi introduzida na célula hospedeira e células hospedeiras são isoladas com a construção da expressão apropriada), a estirpe de célula hospedeira recombinante é cultivada em condições apropriadas para a produção de polipéptidos FGF-21. Como resultará evidente para um perito na especialidade, o método de cultura da estirpe de célula hospedeira recombinante dependerá da natureza da construção da expressão utilizada e da identidade da célula hospedeira. As estirpes hospedeiras recombinantes normalmente são cultivadas usando métodos que são conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. As células hospedeiras recombinantes tipicamente 221 cultivadas em meio liquido que contém fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos e, opcionalmente, que contêm vitaminas, aminoácidos, factores de crescimento e outros suplementos de cultura proteinicos conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. 0 meio liquido para cultura de células hospedeiras pode conter opcionalmente antibióticos ou antifúngicos para evitar o crescimento de microorganismos não desejáveis e/ou compostos incluindo, mas sem limitação, antibióticos para seleccionar células hospedeiras que contêm o vector da expressão.
As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em formatos contínuos ou descontínuos, com recolhida de células (no caso em que o polipéptido FGF-21 se acumule de forma intracelular) ou recolhida de sobrenadante de cultura em formatos contínuos ou descontínuos. Para produção em células hospedeiras procariotas, são preferidas cultura descontínuo e recolhida de células.
Os polipéptidos FGF-21 da presente invenção normalmente são purificados depois da expressão em sistemas recombinantes. 0 polipéptido FGF-21 pode ser purificado a partir de células hospedeiras ou meio de cultura por uma diversidade de métodos conhecidos na técnica. Os polipéptidos FGF-21 produzidos em células hospedeiras bacterianas podem ser pouco solúveis ou insolúveis (em forma de corpos de inclusão). Numa forma de realização da presente invenção, podem ser realizada substituições de aminoácidos facilmente no polipéptido FGF-21 que são seleccionados para o propósito de aumentar a solubilidade da proteína produzida de forma recombinante utilizando os métodos revelados no presente documento assim como os conhecidos na técnica. No caso de proteína insolúvel, a proteína pode ser recolhida de lisados de células hospedeiras por centrifugação e podem seguir adicionalmente de homogeneização das células. No caso de proteína pouco solúvel, podem ser adicionados compostos que incluem, mas sem limitação, polietilenimina 222 (ΡΕΙ) para induzir a precipitação de proteína parcialmente solúvel. A proteína precipitada pode depois ser recolhida convenientemente por centrifugação. Podem ser rompidas ou homogeneizadas células hospedeiras recombinantes para libertar os corpos de inclusão desde o interior das células usando uma diversidade de métodos conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. 0 rompimento ou homogeneização das células hospedeiras pode ser realizado usando técnicas bem conhecidas incluindo, mas sem limitação, rompimento enzimático de células, sonicação, homogeneização suave ou rompimento de libertação a alta pressão. Numa forma de realização do método da presente invenção, se usa a técnica de libertação a alta pressão para romper as células hospedeiras de E. coli para libertar os corpos de inclusão dos polipéptidos FGF-21. Quando são manipulados corpos de inclusão de polipéptido FGF-21, pode ser ventajoso minimizar o tempo de homogeneização em repetições para maximizar a produção de corpos de inclusão sem perda devido a factores tais como solubilização, cizalhamento mecânico ou proteólise. 0 polipéptido FGF-21 insolúvel ou precipitado pode depois ser solubilizado usando qualquer de vários agentes de solubilização adequados conhecidos na técnica. 0 polipéptido FGF-21 pode ser solubilizado com ureia ou cloridrato de guanidina. 0 volume do polipéptido FGF-21 solubilizado deveria ser minimizado de modo que possam ser produzidos lotes grandes usando tamanhos de lotes convenientemente manejáveis. Este factor pode ser significativo numa situação comercial a grande escala em que o hospedeiro recombinante pode ser cultivado em lotes que são de milhares de litros de volume. Além disso, quando se prepara polipéptido FGF-21 numa situação comercial a grande escala, em particular para usos farmacêuticos humanos, deveria ser evitado o uso de compostos químicos fortes que possam danificar a maquinaria e o recipiente ou 223 o produto proteico em si mesmo, se for possível. Foi mostrado no método da presente memória descritiva que o agente desnaturalizante mais suave ureia pode ser usado para solubilizar os corpos de inclusão de polipéptido FGF-21 em lugar do agente desnaturalizante mais forte cloridrato de guanidina. 0 uso de ureia reduz significativamente o risco de dano ao equipamento de aço inoxidável utilizado no método de fabricação e purificação de polipéptido FGF-21 enquanto que solubiliza eficazmente os corpos de inclusão de polipéptido FGF-21.
No caso de proteína de FGF-21 solúvel, o FGF-21 pode ser segregado no espaço periplásmico ou no meio de cultura. Por exemplo, FGF-21 foi segregado no espaço periplásmico de células W3110-B2 usando plasmídeos que codificam construções que incluem oito sequências líder diferentes, incluindo as enumeradas em SEQ ID N° : 39-44 e transformando estas em células W3110-B2, as células foram cultivadas depois a 37 °C até que a DO alcançou aproximadamente 0,8, ponto em que foi induzida a expressão com arabinose a 0,01 %. Cinco horas depois foram preparadas as amostras de libertação periplásmica dos cultivos e corridas nos geles (Figura 33) mostrando a expressão global (lisados totais) e secreções periplásmicas (fracção solúvel).
Além disso, FGF-21 solúvel pode estar presente no citoplasma das células hospedeiras. Pode ser desejado concentrar FGF-21 solúvel antes de realizar etapas de purificação. Podem ser usadas técnicas convencionais conhecidas pelos peritos comuns na especialidade para concentrar FGF-21 solúvel a partir de, por exemplo, lisados celulares ou meio de cultura. Além disso, podem ser usadas técnicas convencionais conhecidas pelos peritos comuns na especialidade para romper células hospedeiras e libertar FGF-21 solúvel do citoplasma ou espaço periplásmico das células hospedeiras. 224
Quando é produzido polipéptido FGF-21 como uma proteína de fusão, pode ser retirada a sequência de fusão. Pode ser conseguidoa a retirada de uma sequência de fusão por clivagem enzimática ou química. A retirada enzimática de sequências de fusão pode ser conseguida usando métodos conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. A selecção de enzima para retirada da sequência de fusão se determinará pela identidade da fusão e as condições de reacção serão especificadas pela secreção de enzima como resultará evidente para um perito habitual na especialidade. Pode ser conseguida clivagem química usando regentes químicos conhecidos pelos peritos comuns na especialidade, incluindo, mas sem limitação, brometo de cianogénio TEV protease e outros reagentes. 0 polipéptido FGF-21 clivado pode ser purificado a partir da sequência de fusão clivada por métodos conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. Tais métodos serão determinados pela identidade e propriedades da sequência de fusão e o polipéptido FGF-21, como resultará evidente para um perito habitual na especialidade. Os métodos para purificação podem incluir, mas sem limitação, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de permuta iónica ou diálise ou qualquer combinação dos mesmos. 0 polipéptido FGF-21 também pode ser purificado para retirar ADN da solução de proteína. Pode ser retirado ADN por meio de qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como precipitação ou cromatografia de permuta iónica, mas pode ser retirado por precipitação com um agente precipitante de ácido nucleico, tal como, mas sem limitação, sulfato de protamina. 0 polipéptido FGF-21 pode ser separado do ADN precipitado usando métodos bem conhecidos convencionais incluindo, mas sem limitação, centrifugação ou filtração. A retirada de moléculas de ácido nucleico do hospedeiro é um factor importante numa 225 situação em que o polipéptido FGF-21 vai ser usado para tratar seres humanos e os métodos da presente invenção reduzem o ADN da célula hospedeira a níveis farmaceuticamente aceitáveis.
Também podem ser usados métodos para fermentação a pequena escala ou a grande escala em expressão proteica, incluindo, mas sem limitação, fermentadores, balões de agitação, biorreactores de leito fluidizado, biorreactores de fibra oca, sistemas de cultivos de frascos rotatórios e sistemas de biorreactores de tanque com agitação. Cada um destes métodos pode ser realizado num método de modo descontínuo, semicontínuo ou contínuo.
Em geral podem ser recuperados polipéptidos FGF-21 humanos da invenção usando métodos convencionais na técnica. Por exemplo, pode ser centrifugado ou filtrado meio de cultura ou lisado celular para retirar resíduos celulares. 0 sobrenadante pode ser concentrado ou diluído a um volume desejado ou diafiltrado num tampão adequado para acondicionar a preparação para purificação adicional. A purificação adicional de polipéptido FGF-21 da presente invenção inclui separar formas desamidadas e cortadas do gradiente do polipéptido FGF-21 da forma intacta. métodos electroforéticos
Qualquer dos seguintes métodos de exemplo pode ser usado para purificação de polipéptidos FGF-21 da invenção: cromatografia de afinidade; cromatografia de permuta aniónica ou catiónica (usando, incluindo, mas sem limitação, DEAE SEPHAROSE); cromatografia em sílica; cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) ; HPLC de fase reversa; filtração em gel (usando, incluindo, mas sem limitação, SEPHADEX G-75); cromatografia de interacção hidrófoba; cromatografia de exclusão por tamanho; cromatografia de quelado metálico; ultrafiltração/diafiltração; precipitação de etanol; precipitação de sulfato de amónio; cromatofocagem; cromatografia de deslocamento; 226 (incluindo, mas sem limitação focagem isoeléctrico preparativa), solubilidade diferencial (incluindo, mas sem limitação precipitação com sulfato de amónio), SDS-PAGE ou extracção.
As proteínas da presente invenção, incluindo, mas sem limitação, proteínas que compreendem aminoácidos não naturais, péptidos que compreendem aminoácidos não naturais, anticorpos para proteínas que compreendem aminoácidos não naturais, parceiros de ligação para proteínas que compreendem aminoácidos não naturais, etc., podem ser purificadas, parcial ou substancialmente até homogeneidade, de acordo com métodos convencionais conhecidos e usados pelos peritos na especialidade. Em consequência, podem ser recuperados polipéptidos da invenção e ser purificadas por qualquer de vários métodos conhecidos pelos peritos comuns na especialidade, incluindo, mas sem limitação, precipitação por sulfato de amónio ou etanol, extracção de ácido ou base, cromatografia em coluna, cromatografia em coluna de afinidade, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia do fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de lecitina, electroforese em gel e similares. Podem ser usadas etapas de redobramento de proteínas, como for desejado, ao preparar proteínas maduras correctamente dobradas. Pode ser usada cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC), cromatografia de afinidade ou outros métodos adequados em etapas de purificação final nas que se deseja alta pureza. Numa forma de realização, são usados anticorpos preparados contra aminoácidos não naturais (ou proteínas ou péptidos que compreendem aminoácidos não naturais) como reactivos de purificação, incluindo, mas sem limitação, purificação baseada em afinidade de proteínas ou péptidos que compreendem um ou mais aminoácidos não naturais. Uma vez purificados, parcialmente ou até a 227 homogeneidade, como for desejado, os polipéptidos são usados opcionalmente para uma ampla diversidade de utilidades, incluindo, mas sem limitação, como componentes de ensaio, agentes terapêuticos, profilaxia, diagnóstico, reagentes de investigação e/ou como imunogénios para produção de anticorpos. Podem ser obtidos anticorpos gerados contra polipéptidos da presente invenção administrando os polipéptidos ou fragmentos que portam epitopos ou células a um animal, preferentemente a uma animal não humano, usando protocolos de rotina. Um perito habitual na especialidade poderia gerar anticorpos numa diversidade de técnicas conhecidas. Além disso, podem ser usado ratinhos transgénicos, ou outros organismos, incluindo outros mamíferos, para expressar anticorpos humanizados. Os anticorpos anteriormente descritos podem ser usados para isolar ou para identificar clones que expressam o polipéptido ou para purificar os polipéptidos. Também podem ser usados anticorpos contra polipéptidos da presente invenção para tratar doenças.
Também podem ser usados polipéptidos da presente invenção e polinucleótidos revelados no presente documento como vacinas. Em consequência, num aspecto adicional, a presente memória descritiva refere-se a um método para induzir uma resposta imunológica num mamífero que compreende inocular ao mamífero um polipéptido da presente invenção, adequado para produzir resposta imune de células T e/ou anticorpos, incluindo, por exemplo, células T que produzem citocinas ou células T citotóxicas, para proteger a dito animal de doença, se a doença já está estabelecida dentro do indivíduo ou não. Também pode ser induzida uma resposta imune num mamífero por um método que compreende fornecerr um polipéptido da presente invenção por meio de um vector que dirige a expressão do polinucleótido e codificar o polipéptido in vivo para induzir uma resposta imunológica tal para produzir anticorpo para proteger dito animal de 228 doenças da memória descritiva. Uma forma de administrar ao vector é acelerando-o nas células desejadas como um revestimento em partículas ou de outro modo. Tal vector de ácido nucleico pode compreender ADN, ARN, um ácido nucleico modificado ou um híbrido de ADN/ARN. Para uso como uma vacina, se proporcionará normalmente um polipéptido ou um vector de ácido nucleico como uma formulação de vacina (composição). A formulação pode compreender adicionalmente um veículo adequado. Já que um polipéptido pode ser decomposto no estômago, este pode ser administrado por via parentérica (por exemplo, injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intradérmica). As formulações adequadas para a administração parentérica incluem soluções de injecção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam à formulação isotónica com o sangue do receptor; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão ou agentes espessantes. A formulação de vacina também pode incluir sistemas adjuvantes para potenciar a imunogenicidade da formulação que são conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. A dosagem dependerá da actividade específica da vacina e pode ser determinada facilmente por experimentação de rotina.
Além de outras referências indicadas no presente documento, é conhecida pelos peritos comuns na especialidade uma diversidade de métodos de dobramento de proteínas/purificação, incluindo, mas sem limitação, os expostos em R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.E. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.E. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et ai. (1996) Protein Methods, 2a Edição Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris e Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL 229
Press em Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris e Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press em Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes, (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3a Edição Springer Verlag, NY; Janson e Ryden, (1998) Protein Purification: Principies High Resolution Methods and Applications Segunda Edição Wiley-VCH, NY; e Walker (1998), Protein Protocols on CDROM Humana Press, NJ; e as referências citadas nas mesmas.
Uma vantagem de produzir uma proteína ou polipéptido de interesse com um aminoácido não natural numa célula hospedeira eucariota ou célula hospedeira não eucariota é gue tipicamente as proteínas ou polipéptidos serão dobradas em sus conformações nativas. No entanto, em certas formas de realização da invenção, os peritos na especialidade reconhecerão gue, depois da síntese, a expressão e/ou purificação, as proteínas ou péptidos podem ter uma conformação diferente das conformações desejadas dos polipéptidos relevantes. Num aspecto da memória descritiva, a proteína ou polipéptido expresso opcionalmente se desnatura e depois ser re-natura. Isto se consegue utilizando métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas sem limitação, adicionando uma chaperonina à proteína ou polipéptido de interesse, solubilizando as proteínas num agente caotrópico tal como guanidina HC1, utilizando proteínas dissulfureto isomerase, etc.
Em geral, é ocasionalmente desejável desnaturar e reduzir polipéptidos expressos e depois provocar que os polipéptidos voltem a dobrar na conformação preferida. Por exemplo, pode ser adicionada guanidina, ureia, DTT, DTE e/ou uma chaperonina a um produto de tradução de interesse. São conhecidos métodos para reduzir, desnaturar e re-naturar proteínas pelos peritos comuns na especialidade (veja-se, as referências anteriores e Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman e Pastan 230 (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; e Buchner et al. , (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski et al., por exemplo, descrevem a desnaturação e redução de proteínas de corpos de inclusão em guanidina-DTE. As proteínas podem dobrar de novo num tampão redox que contém, incluindo, mas sem limitação, glutationa oxidada e L-arginina. Podem ser feitos fluir os reagentes de redobramento ou movidos de outro modo até entrar em contacto com o ou os polipéptidos ou outro produto da expressão ou vice-versa.
No caso de produção procariota de polipéptido FGF-21, o polipéptido FGF-21 produzido deste modo pode se dobrar de forma errónea e portanto tem actividade biológica reduzida ou não possui. A bioactividade da proteína pode ser restaurada por meio de "redobramento". Em geral, o polipéptido FGF-21 dobrado de forma errónea volta a se dobrar solubilizando (quando o polipéptido FGF-21 também é insolúvel), desdobrando e reduzindo a cadeia polipeptídica usando, por exemplo, um ou mais agentes caotrópicos (por exemplo, ureia e/ou guanidina) e um agente redutor capaz de reduzir ligações dissulfureto (por exemplo, ditiotreitol, DTT ou 2-mercaptoetanol, 2-ME). A uma concentração moderada de caótropo, é adicionado depois um agente oxidante (por exemplo, oxigénio, cistina ou cistamina), que permite a reformação de ligações dissulfureto. O polipéptido FGF-21 pode ser redobrado usando métodos convencionais conhecidos no técnico tais como os descritos nas Patentes US N° 4.511.502, 4.511.503 e 4.512.922. O polipéptido FGF-21 também pode ser co-dobrado com outras proteínas para formar heterodímeros ou heteromultímeros.
Depois do redobramento, o FGF-21 pode ser purificado adicionalmente. A purificação de FGF-21 pode ser conseguida usando uma diversidade de técnicas conhecidas pelos peritos comuns na especialidade, incluindo cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de permuta iónica, cromatografia 231 líquida de alto rendimento de fase inversa, cromatografia de afinidade e similares ou qualquer combinação das mesmas. A purificação adicional também pode incluir uma etapa de secado ou precipitação da proteína purificada.
Depois da purificação, FGF-21 pode ser toracada a diferentes tampões e/ou concentrada por qualquer de uma diversidade de métodos conhecidos na tércnica, incluindo, mas sem limitação, diafiltração e diálise. 0 FGF-21 que se proporciona como uma proteína purificada simples pode ser submetido a agregação e precipitação. 0 FGF-21 purificado pode ser pelo menos 90 % puro (como é medido por cromatografia líquida de alto rendimento de fase inversa, RP-HPLC ou electroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio, SDS-PAGE) ou pelo menos 95 % puro ou pelo menos 98 % puro ou pelo menos 99 % ou mais puro. Independentemente do valor numérico exacto da pureza do FGF-21, o FGF-21 é suficientemente puro para uso como um produto farmacêutico para processamento adicional, tal como conjugação com um polímero solúvel em água tal como PEG. Certas moléculas de FGF-21 podem ser usadas como agentes terapêuticos em ausência de outros princípios activos ou proteínas (distintos de excipientes, veículos e estabilizadores, albumina sérica e similares) ou podem formar complexo com outra proteína ou um polímero. Métodos de purificação gerais. Pode ser realizada uma qualquer de uma diversidade de etapas de isolamento no lisado celular, extracto, meio de cultura, corpos de inclusão, espaço periplásmico das células hospedeiras, citoplasma das células hospedeiras ou outro material, que compreende polipéptido FGF-21 ou em qualquer das misturas de polipéptidos FGF-21 resultantes de qualquer etapa de isolamento incluindo, mas sem limitação, cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de filtração em gel, cromatografia líquida de alto rendimento ("HPLC"), HPLC de 232 fase inversa ("RP HPLC"), adsorção de leito expandido ou qualquer combinação e/ou repetição das mesmas e em qualquer ordem apropriada. 0 equipamento e outros materiais necessários usados na forma de realização das técnicas descritas no presente documento estão disponíveis comercialmente. Bombas, colectores de fracções, monitores, gravadores e sistemas completos estão disponíveis em, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA), BioRad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) e Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway NJ) . Também estão disponíveis de tais companhias materiais cromatográficos que incluem, mas sem limitação, materiais de matriz de permuta, meios e tampões.
Pode ser conseguido equiilíbrio e outras etapas nos processos de cromatografia em coluna descritos no presente documento tais como lavagem e eluição, mais rapidamente usando equipamento especializado tal como uma bomba. As bombas disponíveis comercialmente incluem, mas sem limitação, HILOAD®, Bomba P-50, Bomba Peristáltica P-l, Bomba P-901 e Bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
Os exemplos de colectores de fracções incluem Colector de Fracções RediFrac, Colector de Fracções FRAC-100 e FRAC-200 e Colector de Fracções SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Também estão disponíveis misturadores para formar gradientes de concentração lineares e de pH. Os misturadores disponíveis comercialmente incluem Misturador de Gradiente GM-1 e Misturadores Em-Linha (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). 0 processo cromatográfico pode ser controlado usando qualquer monitor disponível comercialmente. Tais monitores podem ser usados para reunir informação como UV, pH e condutividade. Os exemplos de detectores incluem Monitor UV-1,UVICORDO S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900 e Monitor de 233
Conductividade (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . De facto, estão disponíveis comercialmente sistemas completos que incluem os diversos sistemas AKTA® de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
Numa forma de realização da presente memória descritiva, por exemplo, o polipéptido FGF-21 pode ser reduzido e desnaturado desnaturalizando em primeiro lugar o polipéptido FGF-21 purificado resultante em ureia, seguido de diluição em tampão TRIS que contém um agente redutor (tal como DTT) a um pH adequado. Em outra forma de realização da memória descritiva, o polipéptido FGF-21 é desnaturado em ureia num intervalo de concentração de entre aproximadamente 2 M e aproximadamente 9 M, seguido de diluição em tampão TRIS a um pH no intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0. A mistura de redobramento desta forma de realização pode depois ser incubada. Numa forma de realização da memória descritiva, a mistura de redobramento é incubada a temperatura ambiente durante de quatro a vinte e quatro horas. A mistura de polipéptido FGF-21 reduzida e desnaturalizada pode depois ser isolados ou ser purificadas adicionalmente.
Como é indicado no presente documento, o pH da primeira mistura de polipéptido FGF-21 pode ser ajustado antes de realizar qualquer etapa de isolamento posterior. Além disso, a primeira mistura de polipéptido FGF-21 ou qualquer mistura posterior do mesmo pode ser concentrado usando técnicas conhecidas na especialidade. Além disso, o tampão de eluição que compreende a primeira mistura de polipéptido FGF-21 ou qualquer mistura posterior do mesmo pode intercambiarse por um tampão adequado para a seguinte etapa de isolamento usando técnicas conhecidas pelos peritos comuns na especialidade.
Cromatografia de permuta iónica. Numa forma de realização e como uma etapa adicional opcional, pode ser realizada cromatografia de permuta iónica na primeira mistura de 234 polipéptido FGF-21. Veja-se em geral ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (N° de Cat. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) ) . As colunas de permuta iónica disponíveis comercialmente incluem Colunas HITRAP®,HIPREP® e HILOAD® (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ). Tais colunas utilizan permutadores aniónicos fortes tais como Q SEPHAROSE® de Fluxo Rápido, Q SEPHAROSE® de Alto Rendimento e Q SEPHAROSE XL; permutadores catiónicos fortes tais como SP SEPHAROSE® de Alto Rendimento, SP SEPHAROSE® de Fluxo Rápido e SP SEPHAROSE® XL; permutadores aniónicos débiles tais como DEAE SEPHAROSE de Fluxo Rápido; e permutadores catiónicos débiles tais como CM SEPHAROSE de Fluxo Rápido (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Pode ser realizada cromatografia em coluna de permuta aniónica ou catiónica no polipéptido FGF-21 em qualquer etapa do método de purificação para isolar o polipéptido FGF-21 substancialmente purificado. A etapa de cromatografia de permuta catiónica pode ser realizada usando qualquer matriz de permuta catiónica adequada. As matrizes de permuta catiónica úteis incluem, mas sem limitação, materiais de matriz de permuta catiónica fibrosas, porosas, não porosas, microgranulares, em contas ou reticuladas. Tais materiais de matriz de permuta catiónica incluem, mas sem limitação, celulose, agarose, dextrano, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílica, poliéter ou compostos de qualquer dos anteriores. A matriz de permuta catiónica pode ser qualquer permutador catiónico adequado incluindo permutadores catiónicos fortes e fracos. Os permutadores catiónicos fortes podem permanecer ionizados durante um amplo intervalo de pH e portanto, podem ser capazes de ser ligadas a FGF-21 durante um intervalo de pH amplo. Os permutadores catiónicos fracos, no entanto, podem perder ionização em função do pH. Por exemplo, um permutador catiónico fraco pode perder carga quando o pH baixa abaixo de aproximadamente pH 4 ou 235 ρΗ 5. Os permutadores catiónicos fortes adequados incluem, mas sem limitação, grupos funcionais carregados tais como sulfoproprilo (SP), metil sulfonato (S) ou sulfoetilo (SE). A matriz de permuta catiónica pode ser um permutador catiónico forte, preferentemente que tem um intervalo de pH de ligação com FGF-21 de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 6,0. Como alternativa, o permutador catiónico forte pode ter um intervalo de pH de ligação com FGF-21 de aproximadamente pH 2,5 a aproximadamente pH 5,5. A matriz de permuta catiónica pode ser um permutador catiónico forte que tem um pH de ligação com FGF-21 de aproximadamente 3,0. Como alternativa, a matriz de permuta catiónica pode ser um permutador catiónico forte, preferentemente que tem um intervalo de pH de ligação com FGF-21 de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. A matriz de permuta catiónica pode ser um permutador catiónico forte preferentemente que tem um intervalo de pH de ligação com FGF-21 de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 12,5. Como alternativa, o permutador catiónico forte pode ter um intervalo de pH de ligação com FGF-21 de aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 12,0. Antes de carregar o FGF-21, a matriz de permuta catiónica pode ser equilibrado, por exemplo, usando vários volumes de coluna de um ácido fraco diluído, por exemplo, quatro volumes de coluna de ácido acético 20 mM, pH 3. Depois do equilibrado, pode ser adicionado o FGF-21 e a coluna pode ser lavado de uma a várias vezes, antes da eluição de FGF-21 substancialmente purificado, usando também uma solução de ácido fraco tal como uma solução de ácido acético ou ácido fosfórico fraco. Por exemplo, podem ser usados aproximadamente 2-4 volumes de coluna de ácido acético 20 mM, pH 3, para lavar a coluna. Também podem ser usados lavados adicionais, usando por exemplo, 2-4 volumes de coluna de acetato de sódio 0,05 M, pH 5,5 ou acetato de sódio 0,05 M misturado com cloreto de sódio 0,1 M, pH 5,5. 236
Como alternativa, usando métodos conhecidos na técnica, a matriz de permuta catiónica pode ser equilibrada usando vários volumes de coluna de uma base fraca diluida.
Como alternativa, FGF-21 substancialmente purificado pode ser eluido pondo em contacto a matriz de permuta catiónica com um tampão que tenha um pH ou força iónica suficientemente baixos para deslocar o FGF-21 da matriz. 0 pH do tampão de eluição pode variar de aproximadamente pH 2,5 a aproximadamente pH 6,0. Mais especificamente, o pH do tampão de eluição pode variar de aproximadamente pH 2,5 a aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 2,5 a aproximadamente pH 5,0. O tampão de eluição pode ter um pH de aproximadamente 3,0. Além disso, a quantidade de tampão de eluição pode variar amplamente e geralmente estará no intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 volumes de coluna.
Depois da adsorção do polipéptido FGF-21 na matriz de permuta catiónica, pode ser eluido polipéptido FGF-21 substancialmente purificado pondo em contacto a matriz com um tampão que tenha um pH ou força iónica suficientemente altos para deslocar o polipéptido FGF-21 da matriz. Os tampões adequados para uso em eluição a pH alto de polipéptido FGF-21 substancialmente purificado podem incluir, mas sem limitação, tampões de citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES e MES que variam em concentração de pelo menos aproximadamente 5 mM a pelo menos aproximadamente 100 mM.
Cromatografia de fase inversa. Pode ser realizada RP-HPLC para purificar proteínas seguindo protocolos adequados que são conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. Veja-se, por exemplo, Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124: 217-230 (1982); Rivier et al. , J. CHROM. (1983) 268: 112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359: 391-402. Pode ser realizada RP-HPLC no polipéptido FGF-21 para isolar polipéptido FGF-21 substancialmente purificado. A este 237 respeito, podem ser usadas resinas derivatizadas com sílica com funcionalidades de alquilo com uma ampla diversidade de longitudes, incluindo, mas sem limitação, pelo menos aproximadamente C3, a pelo menos aproximadamente C30, pelo menos aproximadamente C3 a pelo menos aproximadamente C2o ou pelo menos aproximadamente C3 a pelo menos aproximadamente Cig. Como alternativa pode ser usado uma resina polimérica. Por exemplo, pode ser usado resina TosoHaas Amberchrome CGlOOOsd, que é uma resina de polímero de estireno. Também podem ser usado resinas poliméricas ou de ciano com uma ampla diversidade de longitudes de cadeia de alquilo. Além disso, a coluna de RP-HPLC pode ser lavado com um solvente tal como etanol. A coluna Source RP é outro exemplo de uma coluna de RP-HPLC.
Pode ser usado um tampão de eluição adequado que contenha um agente de emparelhamento de iões e um modificador orgânico tal como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, acetonitrilo ou etanol, para eluir o polipéptido FGF-21 da coluna de RP-HPLC. Os agentes de emparelhamento de iões mais habitualmente usados incluem, mas sem limitação, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutírico,
trietilamina, tetrametilamónio, tetrabutilamónio e acetato de trietilamónio. A eluição pode ser realizada usando um ou mais gradientes ou condições isocráticas, com condições de gradiente preferidas para reduzir o tempo de separação e aumentar a largura dos picos. Outro método envolve o uso de dois gradientes com diferentes intervalos de concentração de solvente. Os exemplos de tampões de eluição adequados para uso no presente documento podem incluir, mas sem limitação, soluções de acetato de amónio e acetonitrilo. Técnicas de purificação de cromatografia de interacção hidrófoba. Pode ser realizada cromatografia de interacção hidrófoba (HIC) no polipéptido FGF-21. Veja-se, em geral HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES 238 AND METHODS (N° de Cat. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ)). As matrizes de HIC adequadas podem incluir, mas sem limitação, matrizes alquil ou aril substituídas, tais como matrizes butil, hexil, octil ou fenil substituídas incluindo matrizes de agarose, agarose reticulada, sefarose, celulose, sílica, dextrano, poliestireno, poli(metacrilato) e resinas de modo misto, incluindo, mas sem limitação, uma resina de polietilenamina ou uma matriz de poli(metacrilato) butil ou fenil substituída. As fontes disponíveis comercialmente para cromatoqrafia em coluna de interacção hidrófoba incluem, mas sem limitação, colunas HITRAP®, HIPREP® e HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
Em resumen, antes de carregar, a coluna de HIC pode ser equilibrado usando tampões convencionais conhecidos pelos peritos comuns na especialidade, tais como solução de ácido acético/cloreto de sódio ou HEPES que contém sulfato de amónio. Pode ser usado sulfato de amónio como o tampão para carregar a coluna de HIC. Depois de carregar o polipéptido FGF-21, a coluna pode ser lavado depois usando tampões e condições convencionais para retirar materiais não desejados mas conservando o polipéptido FGF-21 na coluna de HIC. O polipéptido FGF-21 pode ser eluído com de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 volumes de coluna de um tampão convencional, tal como um tampão HEPES que contém EDTA e concentração de sulfato de amónio mais baixa que o tampão de equilíbrio ou um tampão de ácido acético/cloreto de sódio, entre outros. Também pode ser usado um gradiente salino linear decrescente, usando, por exemplo, um gradiente de fosfato de potássio, para eluir as moléculas de FGF-21. 0 eluente pode depois ser concentrado, por exemplo, por filtração tal como diafiltração ou ultrafiltração. Pode pode ser utilizada diafiltração para retirar a sal usada para eluir o polipéptido FGF-21. 239
Otras técnicas de purificação. Pode ser realizada outra etapa de isolamento, usando por exemplo, filtração em gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (N° de Cat. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), cromatografia de hidroxiapatita (as matrizes adequadas incluem, mas sem limitação, HA-Ultrogel, Alta Resolução (Calbiochem), Hidroxiapatita Cerâmica CHT (BioRad), Hidroxiapatita Bio - Gel HTP (BioRad)), HPLC, adsorção de leito expandido, ultrafiltração, diafiltração, liofilização e similares, na primeira mistura de polipéptido FGF-21 ou qualquer mistura posterior do mesmo, para retirar qualquer excesso de sais e para substituir o tampão com um tampão adequado para a seguinte etapa de isolamento ou inclusive formulação do produto farmacológico final. O rendimento de polipéptido FGF-21, incluindo polipéptido FGF-21 substancialmente purificado, pode ser controlado em cada etapa descrita no presente documento usando técnicas conhecidas pelos peritos comuns na especialidade. Tais técnicas também podem ser usadas para avaliar o rendimento de polipéptido FGF-21 substancialmente purificado depois da última etapa de isolamento. Por exemplo, o rendimento de polipéptido FGF-21 pode ser controlado usando qualquer de várias colunas de cromatografia liquida de alta pressão de fase inversa, que têm uma diversidade de longitudes de cadeia de alquilo tais como ciano RP-HPLC, Ci6 RP-HPLC, assim como HPLC de permuta catiónica e HPLC de filtração em gel.
Em formas de realização especificas da presente memória descritiva, o rendimento de FGF-21 depois de cada etapa de purificação pode ser de pelo menos aproximadamente 30 %, pelo menos aproximadamente 35 %, pelo menos aproximadamente 40 %, pelo menos aproximadamente 45 %, pelo menos aproximadamente 50 %, pelo menos aproximadamente 55 %, pelo menos aproximadamente 60 %, pelo menos aproximadamente 65 %, pelo menos aproximadamente 70 %, pelo menos 240 aproximadamente 75 %, pelo menos aproximadamente 80 %, pelo menos aproximadamente 85 %, pelo menos aproximadamente 90 %, pelo menos aproximadamente 91 %, pelo menos aproximadamente 92 %, pelo menos aproximadamente 93 %, pelo menos aproximadamente 94 %, pelo menos aproximadamente 95 %, pelo menos aproximadamente 96 %, pelo menos aproximadamente 97 %, pelo menos aproximadamente 98 %, pelo menos aproximadamente 99 %, pelo menos aproximadamente 99,9 % ou pelo menos aproximadamente 99,99 %, do FGF-21 no material de partida para cada etapa de purificação. A pureza pode ser determinada usando técnicas convencionais, tais como SDS-PAGE ou medindo polipéptido FGF-21 usando ensaios de transferência de Western e ELISA. Por exemplo, podem ser gerados anticorpos policlonais frente a proteínas isoladas de fermentação de levedura de controlo negativo e a recuperação de permuta catiónica. Os anticorpos também podem ser usado para explorar com respeito à presença de proteínas de célula hospedeira contaminantes. 0 material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste em partículas de gel de sílica, cujas superfícies portam cadeias de C4-alquilo. A separação de polipéptido FGF-21 das impurezas proteínicas se basa em diferenças na força das interacções hidrófobas. Se realiza eluição com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético diluído. Se realiza HPLC preparativa usando uma coluna de aço inoxidável (carregada de 2,8 a 3,2 litros de gel de sílica Vydac C4) . O eluato de hidroxiapatita Ultrogel é acidificado adicionando ácido trifluoroacético e é carregado na coluna de Vydac C4. Para lavado e eluição são usados um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético diluído. As fracções são recolhidas e neutralizadas imediatamente com tampão fosfato. As fracções de polipéptido FGF-21 que estão dentro dos limites de IPC são agrupadas. 241 0 material de DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste em grupos de dietilaminoetilo (DEAE) que se unem covalentemente à superfície de contas de Sepharose. A ligação de polipéptido FGF-21 com os grupos DEAE se media por interacções iónicas. 0 acetonitrilo e ácido trifluoroacético passam através da coluna sem ser retido. Depois de que estas substâncias tenham sido retirado por lavagem, as impurezas traço são retiradas lavando a coluna com tampão de acetato a um pH baixo. Depois a coluna é lavada com tampão fosfato neutro e é eluido o polipéptido FGF-21 com um tampão com força iónica aumentada. A coluna é empacotada com DEAE Sepharose de fluxo rápido. 0 volume de coluna se ajusta para assegurar uma carga polipeptidica de FGF-21 no intervalo de 3-10 mg de polipéptido FGF-21/ml de gel. A coluna é lavada com água e tampão de equilíbrio (fosfato de sódio/de potássio). As fracções agrupadas do eluato de HPLC são carregadas e a coluna é lavada com tampão de equilíbrio. Depois a coluna é lavada com tampão de lavagem (tampão de acetato de sódio) seguido de lavagem com tampão de equilíbrio. Posteriormente, o polipéptido FGF-21 é eluido da coluna com tampão de eluição (cloreto de sódio, fosfato de sódio/de potássio) e é recolhida numa fracção simples de acordo com o perfil de eluição maestro. O eluato da Coluna de DEAE Sepharose é ajustada à condutividade especificada. A substância farmacológica resultante se esteriliza por filtração em frascos de Teflon e é armazenada a -70 °C.
Os métodos adicionais que podem ser usada incluem, mas sem limitação, etapas para retirar endotoxinas. As endotoxinas são lipopoli-sacáridos (LPS) que são localizadas na membrana exterior de células hospedeiras Gram negativas, tais como, por exemplo, Escherichia coli. São conhecidos pelo perito na especialidade métodos para reduzir os níveis de endotoxinas e incluem, mas sem limitação, técnicas de purificação, usando suportes de sílica, pó de vidro ou hidroxiapatita, cromatografia de fase inversa, de 242 afinidade, de exclusão por tamanho, de permuta aniónico, cromatografia de interacção hidrófoba, uma combinação destes métodos e similares. Podem ser requeridos modificações ou métodos adicionais para retirar contaminantes tais como proteínas que migram conjuntamente do polipéptido de interesse. São conhecidos pelo perito na especialidade métodos para medir os níveis de endotoxinas e incluem, mas sem limitação, ensaios de Lisado de Amebocito Limulus (LAI). 0 ensaio Endosafe™ -PTS é um sistema colorimétrico, de tubo único que utiliza cartuchos precarregados com reactivo LAL, substrato cromogénico e endotoxina convencional de controlo junto com um espectrofotómetro portátil. Os métodos alternativos incluem, mas sem limitação, um método Kinetic LAL que é turbidimétrico e usa um formato de 96 pocillos.
Pode ser usada uma ampla diversidade de métodos e métodos para avaliar o rendimento e pureza de uma proteína de FGF-21 que compreende um ou mais aminoácidos não codificados de forma natural, incluindo, mas sem limitação, o ensaio de Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE corado com prata, SDS-PAGE corado com Coomassie, espectrometria de massas (incluindo, mas sem limitação, MALDI-TOF) e outros métodos para caracterizar proteínas conhecidos pelo perito habitual na especialidade.
Os métodos adicionais incluem, mas sem limitação: SDS-PAGE acoplado com métodos de tinção de proteínas, imunotransferência, desorção/ionização por laser assistido por matriz-espectrometria de massas (MALDI-MS), cromatografia líquida/espectrometria de massas, focagem isoeléctrico, permuta aniónico analítico, cromatofocagem e dicroísmo circular. VIII. Expressão em sistemas de alternância Têm sido empregues várias estratégias para introduzir aminoácidos não naturais em proteínas em células hospedeiras não recombinantes, células hospedeiras mutadas, 243 ou em sistemas livres de células. Estes sistemas também são adequados para utilização no fabrico dos polipéptidos FGF-21 da presente invenção. A derivatização de aminoácidos com cadeias laterais reactivas tais como Lys, Cys e Tyr resultou na conversão de lisina em N2-acetil-lisina. A síntese química também providencia um método directo para incorporar aminoácidos não naturais. Com o desenvolvimento recente da ligação enzimática e ligação química nativa de fragmentos peptídicos, é possível produzir proteínas grandes. Ver, por exemplo, P. E. Dawson e S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000). A ligação química peptídica e a ligação química nativa são descritas na Patente U.S. N.° 6 184 344, Publicação de Patente U.S. N.° 2004/0138412, Publicação de Patente U.S. N.° 2003/0208046, documento WO 02/098902, e documento WO 03/042235. Um método geral in vitro biossintét ico no qual um supressor ARNt quimicamente acilado com o aminoácido não natural desejado é adicionado a um extracto in vitro capaz de suportar a biossíntese de proteínas, foi usado para incorporar especificamente num local mais de 100 aminoácidos não naturais numa variedade de proteínas de virtualmente qualquer tamanho. Ver, por exemplo, V. W. Cornish, D. Mendel e P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unamino acid naturais into proteins, Science 244:182-188 (1989); e, J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-amino acid natural into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989). Um amplo espectro de grupos funcionais foi introduzido em proteínas para estudos de estabilidade de proteínas, dobragem de proteínas, mecanismo enzimático, e transdução de sinal. 244
Um método in vivo, designado incorporação por pressão selectiva, foi desenvolvido para explorar a promiscuidade das sintetases de tipo selvagem. Ver, por exemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroderand R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999). Uma estirpe auxotrófica, na qual a via metabólica relevante que fornece a célula com um aminoácido natural particular é desligada, é crescida em meio minimo que contém concentrações limitadas do aminoácido natural, enquanto a transcrição do gene alvo é reprimida. No inicio de uma fase de crescimento estacionária, o aminoácido natural é reduzido e substituído com o análogo aminoácido não natural. A indução da expressão da proteína recombinante resulta na acumulação de uma proteína que contém o análogo não natural. Por exemplo, usando esta estratégia, o, m e p-fluorofenilalaninas foram incorporadas em proteínas, e exibem dois ombros característicos no espectro UV que podem ser facilmente identificados, ver, por exemplo, C. Minks, R Huber, L. Moroder e N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000); a trifluorometionina foi usada para substituir a metionina em lisozima do bacteriofago T4 para estudar a sua interação com ligandos quitoligossacarideos por F NMR, ver, por exemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson e J. F. Honek, Biochemistry, 36: 3404(1997); e a trifluoroleucina foi incorporada em lugar de leucina, resultando numa estabilibidade química e térmica aumentada de uma proteína zíper de leucina. Ver, por exemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado e D.A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Além disso, a selenometionina e a telurometionina são incorporadas em várias proteínas recombinantes para facilitar a solução de fases na cristalografia por raios X. Ver, por exemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton e D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda e M. Hatada, Nat. Struct. 245
Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskom, J. Kellermann e R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); e, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Huinm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder e R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997). Análogos da metionina com funcionalidades alceno ou alcino também foram incorporados de forma eficiente, permitindo a modificação adicional de proteínas por meios quimicos. Ver, por exemplo, J. C. van
Hest e D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428: 68 (1998); J. C.. van Hest, K. L. Kiick e D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122 :1282 (2000); e, K. L . Kiick e D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000) ; Patente U.S. N.° 6 586 207;
Publicação de Patente U.S. 2002/0042097. O sucesso deste método depende do reconhecimento dos análogos do aminoácido natural por sintetases aminoacil-ARNt, que, em geral, requerem alta selectividade para assegurar a fidelidade da tradução das proteínas. Uma maneira de expandir o âmbito deste método é relaxar a especificidade do substrato das sintetases aminoacil-ARNt, o que foi conseguido num número limitado de casos. Por exemplo, a substituição de Ala294 por Gly em sintetase fenilalanil-ARNt de Escherichia coli (PheRS) aumenta o tamanho do bolso de ligação do substrato, e resulta na acilação de ARNtPhe por p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe). Ver, M. Ibba, P. Kast e H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994) . Uma estirpe de Escherichia coli que alberga este PheRS mutante permite a incorporação de p-Cl-fenilalanina ou p-Br-fenilalanina em lugar de fenilalanina. Ver, por exemplo, M. Ibba e H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); e, N. Sharma, R. Furter, P. Kast e D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Da mesma maneira, demonstrou-se que uma mutação de ponto Phel30Ser perto do local de ligação do aminoácido da sintetase tirosil-ARNt de Escherichia coli permitia que a azatirosina fosse incorporada mais eficientemente do que a tirosina. Ver, F. Hamano-Takaku, T. 246
Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll e S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000).
Outra estratégia para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas in vivo é modificar sintetases que têm mecanismos à prova de leitura. Estas sintetases não podem discriminar e, por isso, activar aminoácidos que são estruturalmente semelhantes aos cognatos aminoácidos naturais. Este erro é corrigido num local separado, que desacila o aminoácido não carregado do ARNt para manter a fidelidade da tradução das proteínas. Se a actividade à prova de leitura da sintetase é desabilitada, os análogos estruturais que são mal ativados podem escapar a função de edição e ser incorporados. Esta abordagem foi demonstrada recentemente com a sintetase valil-ARNt (ValRS). Ver, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. deCrecy-Lagard, P. Schimmel e P. Marliere, Science, 292:501 (2001). ValRS podem desaminoacilar ARNtVal com Cys, Thr, ou aminobutirato (Abu); estes aminoácidos não cognatos são subsequentemente hidrolizados pelo domínio de edição. Após mutagénese aleatória do cromossoma de Escherichia coli, uma estirpe mutante de Escherichia coli foi selecionada que tem uma mutação no local de edição de ValRS. Este ValRS editado defeituoso carrega incorretamente ARNtVal com Cys. Porque o Abu se parece estericamente a Cys (grupo -SH de Cys é substituído com -CH3 em Abu), o ValRS mutante também incorpora Abu em proteínas quando esta estirpe mutante de Escherichia coli é crescida na presença de Abu. Uma análise espectrométrica de massa mostra que cerca de 24 % das valinas são substituídas por Abu em cada posição de valina na proteína nativa. A síntese de fase sólida e métodos semi-sintéticos também permitiram a síntese de um número de proteínas que contêm aminoácidos novos. Por exemplo, ver as seguintes publicações e referências citadas nelas, que são como se segue: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, 247 R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptids. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am chem, 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins incluindo enzymes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thio-subtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: estrutura-engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by Chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); e, Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994). A modificação química foi utilizada para introduzir uma variedade de cadeias laterais não naturais, incluindo co-factores, rótulos spin e oligonucleótidos em proteínas in vitro. Ver, por exemplo, Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238 (4832) :1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The Chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984); Neet, K.E., Nanei A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966); e, Pollack, S.J., Nakayama, 248 G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988).
Em alternativa, os métodos biossintéticos que empregam aminoacil-ARNt modificados quimicamente foram utilizados para incorporar várias sondas biofísicas em proteínas sintetizadas in vitro. Ver as seguintes publicações e referências citadas nelas: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993); e, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sei, 83(22):8604-8608 (1986).
Previamente, foi demonstrado que os aminoácidos não naturais podem ser incorporados especificamente no local em proteínas in vitro pela adição de supressores ARNt quimicamente aminoacilados para reacções de síntese de proteínas programadas com um gene que contém uma mutação âmbar sem sentido desejada. Utilizando estas abordagens, pode-se substituir um número dos vinte aminoácidos comuns com homólogos estruturais próximas, por exemplo, fluorofenilalanina por fenilalanina, utilizando estirpes auxotrópicas para um aminoácido particular. Ver, por exemplo, Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-amino acid natural into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids 249 site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); e, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995).
Por exemplo, um supressor ARNt foi preparado de tal maneira que reconheceu o codão de terminação UAG e foi aminoacilado quimicamente com um aminoácido não natural. A mutagénese dirigida a um local convencional foi utilizada para introduzir o codão de terminação TAG, no local de interesse no gene da proteína. Ver, por exemplo, Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988). Quando o supressor ARNt acilado e o gene mutante foram combinados num sistema de tradução/transcrição in vitro, o aminoácido não natural foi incorporado em resposta ao codão UAG que forneceu uma proteína que contém aquele aminoácido na posição especificada. As experiências utilizando [3H]-Phe e experiências com ácidos a-hidroxi demonstraram que apenas o aminoácido desejado é incorporado na posição especificada pelo codão UAG que este aminoácido não é incorporado em nenhum outro local na proteína. Ver, por exemplo, Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6) : 425-432; e, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structure into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992).
Um ARNt pode ser aminoacilado com um aminoácido desejado por qualquer método ou técnica, incluindo mas não limitado a, aminoacilação química ou enzimática. A aminoacilação pode ser conseguida por sintetases aminoacil ARNt ou por outras moléculas enzimáticas, incluindo mas não limitado a, ribozimas. O termo "ribozima" é intercambiável com "ARN catalítico." Cech e colaboradores (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demonstraram a presença de 250 ARN que ocorre naturalmente que podem atuar como catalisadores (ribozimas). Contudo, apesar de se ter demonstrado que estes catalisadores ARN naturais atuam apenas em substratos de ácido ribonucleico para clivagem e e união, o desenvolvimento recente da evolução artificial de ribozimas expandiu o repertório da catálise a várias reacções quimicas. Estudos identificaram moléculas de ARN que podem catalisar ligações aminoacil-ARN por si próprias (2')3'-terminal (Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647), e uma molécula de ARN que pode transferir um aminoácido de uma molécula de ARN a outra (Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444). A publicação do pedido de Patente U.S. 2003/0228593 descreve métodos para construir ribozimas e a sua utilização na aminoacilação de ARNt com aminoácidos codificados não naturalmente e codificados naturalmente. Formas imobilizadas de substrato de moléculas enzimáticas que podem aminoacilar ARNt, incluindo mas não limitadas a, ribozimas, podem permitir a purificação por afinidade eficiente dos produtos aminoacilados. Exemplos de substratos adequados incluem agarose, sefarose, e contas magnéticas. A produção e utilização de uma forma imobilizada de substrato de ribozima para aminoacilação são descritas em Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 e na publicação do pedido de Patente U.S. 2003/0228593. Métodos de aminoacilação química incluem, mas não se limitam, àqueles introduzidos por Hecht e colaboradores (Hecht, S. M . Acc. Chem . Res. 1992,25,545; Heckler, T. G Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. 1 Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L Kuroda, Y. ; Kitano , s. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) por Schultz, Chamberlin, Dougherty e outros (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; 251
Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, Η. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, etal. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, Μ. E. etal. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34) para evitar a utilização de sintetases na aminoacilação. Tais métodos ou outros métodos de aminoacilação química podem ser usados para aminoacilar moléculas de ARNt. Métodos para gerar ARN catalítico podem envolver gerar conjuntos separados de sequências de ribozima aleatorizadas, realizando evolução dirigida nos conjuntos, classificando os conjuntos por actividade de aminoacilação desejável, e seleccionando sequências dessas ribozimas que exibem a actividade de aminoacilação desejada.
As ribozimas podem compreender motivos e/ou regiões que facilitam a actividade de acilação, tais como um motivo GGU e uma região rica em U. Por exemplo, foi reportado que regiões ricas em U podem facilitar o reconhecimento de um substrato de aminoácido, e um motivo GGU pode formar pares de base com o terminal 3' de um ARNt. Em combinação, o GGU e motivo e região rica em U facilitam o reconhecimento simultâneo de ambos aminoácido e ARNt simultâneamente, e facilitam assim a aminoacilação do terminal 3' do ARNt.
As ribozimas podem ser geradas por seleção in vitro utilizando um r24mini parcialmente aleatorizado conjugado com ARNtAsnCCCG, seguida por engenharia sistemática de uma sequência de consenso encontrada nos clones ativos. Uma ribozima exemplar obtida por este método é designada "ribozima Fx3" e é descrita na publicação do pedido de Patente U.S. N.° 2003/0228593 atua como um catalisador 252 versátil para a síntese de vários aminoacil-ARNt carregados com aminoácidos não naturais cognatos. A imobilização num substrato pode ser utilizada para permitir uma purificação por afinidade eficiente dos ARNt aminoacilados. Exemplos de substratos adequados incluem, mas não se limitam a, agarose, sefarose, e contas magnéticas. As ribozimas podem ser imobilizadas em resinas tomando partido da estrutura química do ARN, tais como o 3'-cis-diol na ribose do ARN pode ser oxidada com periodato para produzir o dialdeído correspondente para facilitar a imobilização do ARN na resina. Podem ser utilizados vários tipos de resinas incluindo resinas hidrazidas baratas em que a aminação redutora torna a interação entre a resina e a ribozima numa ligação irreversível. A síntese de aminoacil-ARNt pode ser facilitada significativamente por esta técnica de aminoacilação em coluna. Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4 descrevem um sistema de aminoacilação baseado em coluna. O isolamento dos ARNt aminoacilados pode ser conseguido de uma variedade de formas. Um método adequado é eluir os ARNt aminoacilados de uma coluna com um tampão tal como uma solução de acetato de sódio com 10 mM de EDTA, um tampão contendo 50 mM de N-(2-hidroxietilo)piperazina-N'-(3-ácido propanossulfónico) , 12,5 mM de KCI, pH 7,0, 10 mM EDTA, ou simplesmente uma água tamponada com EDTA (pH 7,0).
Os ARNt aminoacilados podem ser adicionados a reações de tradução de maneira a incorporar o aminoácido com o qual o ARNt foi aminoacilado numa posição de escolha num polipéptido feito pela reacção de tradução. Exemplos de sistemas de tradução nos quais os ARNt aminoacilados da presente invenção podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, lisados celulares. Os lisados celulares providenciam componentes de reacção necessários para a tradução in vltro de um polipéptido de um ARNm de entrada. Exemplos de tais componentes de reacção incluem, mas não se 253 limitam a, proteínas ribossomais, ARNr, aminoácidos, ARNt, GTP, ATP, factores de iniciação e de prolongamento da tradução e factores adicionais associados com a tradução. Além disso, os sistemas de tradução podem ser traduções em série ou tradução compartimentada. Os sistemas de tradução em série combinam componentes de reacção num único compartimento enquanto os sistemas de tradução compartimentada separam os componentes de reacção da tradução dos produtos de reacção que podem inibir a eficiência da tradução. Tais sistemas de tradução estão disponíveis comercialmente.
Além disso, pode ser utilizado um sistema do par transcrição/tradução. Os sistemas do par transcrição/tradução permitem a transcrição de um ADN de entrada num ARNm correspondente, que é por sua vez traduzido pelos componentes de reacção. Um exemplo de um par transcrição/tradução comercialmente disponível é o Sistema de Tradução Rápida (RTS, Roche Inc.). 0 sistema inclui uma mistura que contém lisado de E. coli para providenciar os componentes da tradução tais como ribossomas e factores de tradução. Além disso, uma ARN polimerase é incluída para a transcrição do ADN de entrada num molde de ARNm para utilização na tradução. RTS pode utilizar a compartimentação dos componentes de reacção por meio de uma membrana interposta entre os compartimentos da reacção, incluindo um compartimento de fornecimento/desperdício e um compartimento de transcrição/ tradução. A aminoacilação do ARNt pode ser realizada por outros agentes, incluindo mas não limitados a, transferases, polimerases, anticorpos catalíticos, proteínas multifuncionais, e afins.
Stephan na Scientist de 10 de Outubro de 2005, páginas 30-33, descreve métodos adicionais para incorporar aminoácidos codificados não naturalmente em proteínas. Lu 254 et al. na Mol Cell. 2001 Owt; 8 (4): 759-69 descrevem um método no qual uma proteína é quimicamente ligada a um péptido sintético contendo aminoácidos não naturais (ligação proteica expressa).
Também têm sido usadas técnicas de microinjeção para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas. Ver, por exemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, Μ. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty e Η. A. Lester, Science, 268:439 (1995); e, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). O oócito de Xenopus foi co-injetado com duas espécies de ARN feitas in vitro: um ARNm codificando a proteína alvo com um codão de terminação UAG na posição de interesse do aminoácido e um supressor ARNt âmbar aminoacilado com o aminoácido não natural desejado. A maquinaria de tradução do oócito depois insere o aminoácido não natural na posição especificada por UAG. Este método tem permitido estudos de função da estrutura in vivo de proteínas de membrana integrais, que não são geralmente amenos para os sistemas de expressão in vitro. Exemplos incluem a incorporação de um aminoácido fluorescente num receptor de taquiquinina, o neuroquinina-2, para medir distâncias por transferência de energia de ressonância por fluorescência, ver, por exemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel e A. Chollet, L Biol. Chem., 271:19991 (1996); a incorporação de aminoácidos biotinilados para identificar resíduos expostos à superfície em canais iónicos, ver, por exemplo, J. P. Gallivan, Η. A. Lester e D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); a utilização de análogos de tirosina enjaulados para monitorizar alterações conformacionais num canal iónico em tempo real, ver, por exemplo, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty e Η. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); e, a utilização de 255 aminoácidos alfa hidroxi para alterar a estrutura principal do canal iónico para sondagem dos seus mecanismos de entrada. Ver, por exemplo, P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty e Η. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); e, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz e J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001). A capacidade para incorporar aminoácidos não naturais directamente em proteínas in vivo oferece uma ampla variedade de vantagens incluindo, mas não limitadas a, uma elevada produção de proteínas mutantes, facilidade técnica, o potencial para estudar as proteínas mutantes em células ou possivelmente em organismos vivos e a utilização destas proteínas mutantes em tratamentos terapêuticos e usos diagnósticos. A capacidade para incluir aminoácidos não naturais de vários tamanhos, níveis de acidez, nucleofilicidades, hidrofobicidades, e outras propriedades em proteínas pode expandir enormemente a nossa capacidade para manipular racionalmente e sistematicamente as estruturas das proteínas, tanto para sondar a função das proteínas como para criar novas proteínas ou organismos com novas propriedades.
Numa tentativa de incorporar especificamente num local para-F-Phe, um par de sintetase ARNtPheCUA/fenilalanil-supressor ARNt âmbar de levedura foi utilizado num p-F-Phe resistente, estirpe Phe auxotrófica de Escherichia coli. Ver, por exemplo, R. Furter, Protein Sei., 7:419 (1998).
Também pode ser possível obter expressão de um polinucleótido FGF-21 da presente invenção utilizando um sistema de tradução livre de células (in-vitro). Os sistemas de tradução podem ser celulares ou livres de células, e podem ser procaróticos ou eucarióticos. Os sistemas de tradução celulares incluem, mas não se limitam a, preparações celulares completas tais como células permeabilizadas ou culturas de células em que uma sequência desejada de ácido nucleico pode ser transcrita para ARNm e 256 o ARNm traduzido. Os sistemas de tradução livres de células estão comercialmente disponíveis e muitos tipos e sistemas diferentes são bem conhecidos. Exemplos de sistemas livres de células incluem, mas não se limitam a, lisados procarióticos tais como lisados de Escherichia coli, e lisados eurcarióticos tais como extractos de germes de trigo, lisados de células de insectos, lisados de reticulócitos de coelho, lisados de oócitos de coelho e lisados de células humanas. Os extractos ou lisados eucarióticos podem ser preferidos quando a proteína resultante é glicosilada, fosforilada ou de outra forma modificada porque muitas de tais modificações apenas são possíveis em sistemas eucarióticos. Alguns destes extractos e lisados estão comercialmente disponíveis (Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, III.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.). Os extractos membranosos, tais como os extractos pancreáticos caninos que contêm membranas microssomais, também estão disponíveis que são úteis para proteínas secretoras de tradução. Nestes sistemas, que podem incluir tanto ARNm como um molde (tradução in vitro) ou ADN como um molde (transcrição e tradução in vitro combinada), a síntese in vitro é dirigida pelos ribossomas. Tem sido aplicado um esforço considerável no desenvolvimento de sistemas de expressão de proteínas livres de células. Ver, por exemplo, Kim, D.M. e J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74: 309-316 (2001); Kim, D.M. e J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22,1537-1542, (2000); Kim, D.M., e J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M., e J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); e Patnaik, R. e J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); Patente U.S. N.° 6 337 191; publicação de Patente U.S. N.° 2002/0081660; documento WO 00/55353; documento WO 90/05785. Outra abordagem que pode ser aplicada à expressão de polipéptidos FGF-21 compreendendo 257 um aminoácido codificado não naturalmente inclui a técnica de fusão péptido-ARNm. Ver, por exemplo, R. Roberts e J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sei. (USA) 94:12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003). Nesta abordagem, um molde de ARNm ligado a puromicina é traduzido em péptido no ribossoma. Se uma ou mais das moléculas de ARNt foi modificada, os aminoácidos não naturais também podem ser incorporados no péptido. Após a leitura do último codão de ARNm, a puromicina captura o terminal C do péptido. Se se observar que o conjugado ARNm-péptido resultante tem propriedades interessantes num ensaio in vitro, a sua identidade pode ser facilmente revelada da sequência de ARNm. Desta forma, podem ser classificadas bibliotecas de polipéptidos FGF-21 compreendendo um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente para identificar polipéptidos que têm propriedades desejadas. Mais recentemente, foram reportadas traduções de ribossomas in vitro com componentes purificados que permitem a síntese de péptidos substituídos com aminoácidos codificados não naturalmente. Ver, por exemplo, A. Forster et al., Proc. Natl Acad Sei. (USA) 100:6353 (2003).
Os sistemas de tradução reconstituídos também podem ser utilizados. As misturas dos factores de tradução purificados também foram utilizadas com sucesso para traduzir o ARNm em proteína bem como as combinações de lisados ou lisados suplementados com factores de tradução purificados tais como factor-1 (IF-1) de iniciação, IF-2, IF-3 (a ou p), factor de prolongamento T (EF-Tu), ou factores de terminação. Os sistemas livres de células também podem ser sistemas do par transcrição/tradução em que o ADN é introduzido no sistema, transcrito no ARNm e o ARNm traduzido como descrito em Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editores, Wiley Interscience, 1993). 0 ARN transcrito no sistema de 258 transcrição eucariótico pode ser na forma de ARN heteronuclear (ARNhn) ou tampas na extremidade 5' (7-metilo guanosina) e ARNm maduro com cauda poli A na extremidade 3', o que pode ser uma vantagem em certos sistemas de tradução. Por exemplo, ARNm com tampas são traduzidos com alta eficiência no sistema de lisado de reticulócito. IX. Polímeros macromoleculares unidos a polipéptidos FGF-21 Várias modificações aos polipéptidos de aminoácido não natural descritas aqui podem ser efetuadas utilizando as composições, métodos, técnicas e estratégias descritas aqui. Estas modificações incluem a incorporação de funcionalidade adicional no componente aminoácido não natural do polipéptido, incluindo, mas não limitado a, um rótulo; um corante; um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado do polietileno glicol; um fotorreticulado; um radioisótopo; um composto citotóxico; um fármaco; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reactivo; uma resina; uma segunda proteína ou polipéptido ou análogo de polipéptido; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um metal quelante; um co-factor; um ácido gordo; um hidrato de carbono; um polinucleót ido; um ADN; um ARN; um polinucleótido anti-sense; um sacarídeo; um dendrímero solúvel em água; uma ciclodextrina; um ácido ribonucleico inibitório; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo spin; um fluoróforo, uma fracção contendo metal; uma fracção radioactiva; um grupo funcional novo; um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas; uma fracção foto-enjaulada; uma fracção excitável de radiação actínica; uma fracção fotoisomerizável; biotina; um derivado da biotina; um análogo da biotina; uma fracção que incorpora um átomo pesado; um grupo fraccionado quimicamente; um grupo foto-fraccionado; uma cadeia lateral prolongada; um açúcar ligado a carbono; um agente ativo redox; um tio-aminoácido; uma fracção tóxica; uma fracção 259 isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quemiluminescente; um grupo denso de eletrões; um grupo magnético; um grupo intercalador; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente activo; um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ponto quantum; um nanotransmissor; um radionucleótido; um radiotransmissor; um agente de captura de neutrões; ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável. Como exemplo ilustrativo, não limitante, das composições, métodos, técnicas e estratégias descritos aqui, a descrição seguinte focará na adição de polímeros macromoleculares ao polipéptido de aminoácido não natural com o entendimento de que as composições, métodos, técnicas e estratégias descritas também são aplicáveis a ele (com as modificações apropriadas, se necessário e para as quais alguém habilitado na arte poderia fazer com as revelações aqui) ao adicionar outras funcionalidades, incluindo mas não limitadas àquelas listadas anteriormente.
Uma grande variedade de polímeros macromoleculares e outras moléculas podem ser ligadas a polipéptidos FGF-21 da presente invenção para modular propriedades biológicas do polipéptido FGF-21, e/ou providenciar novas propriedades biológicas à molécula FGF-21. Estes polímeros macromoleculares podem ser ligados ao polipéptido FGF-21 através de um aminoácido codificado naturalmente, através de aminoácido codificado não naturalmente, ou de qualquer substituinte funcional de um aminoácido natural ou não natural, ou de qualquer substituinte ou grupo funcional adicionado a um aminoácido natural ou não natural. 0 peso molecular do polímero pode variar num amplo intervalo, incluindo mas não limitado a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode ser entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo mas não limitado a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 260 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8 .000 Da, 7.000 Da, 6,000 Da, 5 .000 Da, 4, 000 Da, 3.000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da , 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da , e 100 Da.
Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da. A presente invenção providencia preparações substancialmente homogéneas de conjugados polímero:proteína. "Substancialmente homogénea" como utilizado aqui significa que se observa que as moléculas do conjugado polímerorproteína são mais da metade da proteína total. O conjugado polímero:proteína tem actividade biológica e as presentes preparações "substancialmente homogéneas" PEGiladas do polipéptido FGF-21 providenciadas aqui são aquelas que são homogéneas o suficiente para exibir as vantagens de uma preparação homogénea, por exemplo, facilidade na aplicação clínica na previsibilidade farmacocinética de lote para lote.
Também se pode escolher preparar uma mistura de moléculas de conjugado polímero:proteína, e a vantagem providenciada aqui é que se pode seleccionar a proporção de conjugado monopolímerorproteína para incluir na mistura. Assim, se desejado, pode-se preparar uma mistura de várias proteínas com vários números de fracções de polímero anexas (isto é, di-, tri-, tetra-, etc.) e combinar ditos 261 conjugados com o conjugado monopolímero:proteína preparado utilizando os métodos da presente invenção, e obter uma mistura com uma proporção pré-determinada de conjugados monopolímero:proteína. 0 polímero seleccionado pode ser solúvel em água de tal maneira que a proteína à qual está anexado não precipita num ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. 0 polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para utilização terapêutica da preparação do produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável.
Exemplos de polímeros incluem mas não se limitam a éteres polialquilo e análogos com tampas de alcoxi dos mesmos (por exemplo, polioxietileno glicol, polioxietileno/propileno glicol, e análogos com tampas de metoxi ou etoxi dos mesmos, especialmente polioxietileno glicol, sendo este último também conhecido como polietilenoglicol ou PEG); polivinilpirrolidonas; éteres de polivinilalquilo; polioxazolinas, polialquilo oxazolinas e polihidroxialquilo oxazolinas; poliacrilamidas, polialquilo acrilamidas, e polihidroxialquilo acrilamidas (por exemplo, polihidroxipropilmetacrilamida e derivados do mesmo); polihidroxialquilo acrilatos; ácidos polissiálicos e análogos dos mesmos; sequências peptídicas hidrofílicas; polissacarídeos e seus derivados, incluindo dextrano e derivados do dextrano, por exemplo, carboximetilodextrano, sulfatos de dextrano, aminodextrano; celulose e seus derivados, por exemplo, carboximetilo celulose, hidroxialquilo celuloses; quitina e seus derivados, por exemplo, quitosano, succinil quitosano, carboxiraetiloquitina, carboximetiloquitosano; ácido hialurónico e seus derivados; amidos; alginatos; sulfato de condroitina; albumina; pululano e carboximetilo de pululano; poliaminoácidos e derivados dos mesmos, por exemplo, ácidos poliglutâmicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas; copolímeros de anidrido 262 maleico tais como: copolímero de estireno e anidrido maleico, copolímero de éter de diviniletilo e anidrido maleico; álcoois de polivinilo; copolímeros dos mesmos; terpolímeros dos mesmos; misturas dos mesmos; e derivados dos precedentes. A proporção das moléculas de polietileno glicol para as moléculas de proteína variará, como variarão também as suas concentrações na mistura da reacção. Em geral, a razão óptima (em termos de eficiência da reacção na qual existe um excesso mínimo de proteína ou polímero que não reagiu) pode ser determinada pelo peso molecular do polietileno glicol seleccionado e pelo número disponível de grupos reactivos disponíveis. No que concerne ao peso molecular, tipicamente quanto maior o peso molecular do polímero, menor o número de moléculas do polímero que podem ser anexadas à proteína. Da mesma maneira, a ramificação do polímero deveria ser considerada na otimização destes parâmetros. Geralmente, quanto maior o peso molecular (ou quantos mais ramos) maior a razão polímero:proteína.
Como utilizado aqui, e quando se contemplam os conjugados de PEG:polipéptido FGF-21, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade que fornece o benefício desejado a um paciente. A quantidade variará de um indivíduo para outro e dependerá de um número de factores, incluindo a condição física global do paciente e da causa subjacente da condição patológica a ser tratada. A quantidade do polipéptido FGF-21 utilizada para terapêutica fornece uma taxa de alteração aceitável e mantém uma resposta desejada num nível benéfico. Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser rapidamente verificada por alguém com habilitação comum na arte utilizando materiais e procedimentos disponíveis publicamente. 0 polímero solúvel em água pode ter qualquer forma estrutural incluindo mas não limitada a linear, bifurcada 263 ou ramificada. Tipicamente, o polímero solúvel em água é um poli(alquileno glicol), tais como poli(etileno glicol) (PEG), mas outros polímeros solúveis em água também podem ser empregues. A título de exemplo, PEG é utilizado para descrever certas formas de realização desta invenção. PEG é um polímero solúvel em água bem conhecido que está comercialmente disponível ou que pode ser preparado por polimerização por abertura de anel do etileno glicol de acordo com métodos conhecidos daqueles com habilitação comum na arte (Sandler e Karo, Polimer Synthesis, Academic Press, New York, Volume 3, páginas 138-161). 0 termo "PEG" é utilizado amplamente para abranger qualquer molécula de polietileno glicol, sem consideração pelo tamanho ou pela modificação numa extremidade do PEG, e pode ser representeada como ligada ao polipéptido FGF-21 pela fórmula:
XO- (CH2CH20) n-CH2CH2-Y onde n é 2 a 10.000 e X é H ou uma modificação terminal, incluindo mas não limitada a, um Ci_4 alquilo, um grupo protector, ou um grupo funcional terminal.
Em alguns casos, um PEG utilizado na invenção termina numa extremidade com hidroxi ou metoxi, isto é, X é H ou CH3 ("metoxi PEG"). Em alternativa, o PEG pode terminar com um grupo reactivo, formando assim um polímero bifuncional. Grupos reactivos típicos podem incluir aqueles grupos reactivos que são comumente utilizados para reagir com os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo mas não limitados a, grupos maleimida, carbonatos activados (incluindo mas não limitados a, éster de p-nitrofenil), ésteres ativados (incluindo mas não limitados a, N-hidroxisuccinimida, éster de p-nitrofenil) e aldeídos) bem como grupos funcionais que são inertes aos 20 aminoácidos comuns mas que reagem especificamente com grupos funcionais complementares presentes em aminoácidos codificados não naturalmente (incluindo mas não limitados 264 a, grupos azida, grupos alcino) . De notar que a outra extremidade do PEG, que é representada na fórmula anterior por Y, anexará quer directa ou indirectamente a um polipéptido FGF-21 através de um aminoácido codificado que ocorre naturalmente ou não naturalmente. Por exemplo, Y pode ser uma ligação amida, carbamato ou ureia a um grupo amina (incluindo mas não limitado a, a amina epsilon da lisina ou o N-terminal) do polipéptido. Em alternativa, Y pode ser uma ligação maleimida a um grupo tiol (incluindo mas não limitado a, o grupo tiol da cisteina). Em alternativa, Y pode ser uma ligação a um resíduo não comumente acessível através dos 20 aminoácidos comuns. Por exemplo, um grupo azida no PEG pode ser reagido com um grupo alcino no polipéptido FGF-21 para formar um produto de cicloadição Huisgen [3+2]. Em alternativa, um grupo alcino no PEG pode ser reagido com um grupo azida presente num aminoácido codificado não naturalmente para formar um produto semelhante. Em algumas formas de realização, um forte nucleófilo (incluindo mas não limitado a, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) pode ser reagido com um grupo aldeído ou grupo cetona presente no aminoácido codificado não naturalmente para formar uma hidrazona, oxima ou semicarbazona, como aplicável, que em alguns casos pode ainda ser reduzida por tratamento com um agente redutor apropriado. Em alternativa, o forte nucleófilo pode ser incorporado no polipéptido FGF-21 através de um aminoácido codificado não naturalmente e utilizado para reagir preferencialmente com uma cetona ou grupo aldeído presentes no polímero solúvel em água.
Qualquer massa molecular para um PEG pode ser utilizada como praticamente desejada, incluindo mas não limitada a, de cerca de 100 Daltons (Da) a 100.000 Da ou mais como desejado (incluindo mas não limitado a, por vezes 0,1-50 kDa ou 10-40 kDa) . O peso molecular do PEG pode estar num amplo intervalo, incluindo mas não limitado a, 265 entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. PEG pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo mas não limitado a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50. 000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25. 000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000
Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas formas de realização, PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas formas de realização, PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, PEG está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, PEG está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, PEG está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da. PEG de cadeia ramificada, incluindo mas não limitados a, moléculas de PEG com cada cadeia com um peso molecular oscilando entre 1-100 kDa (incluindo mas não limitados a, 1-50 kDa ou 5-20 kDa) também podem ser utilizados. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode ser, incluindo mas não limitado a, entre cerca de 1.000 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode ser entre cerca de 1.000 Da e cerca de 100 .000 Da, incluindo mas nao limitado a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 1C i.OOO Da , 9 .000 Da, 8.000 Da, 7. 000 Da, 6. 000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da f e 1.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do PEG de 266 cadeia ramificada está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 20.000 Da. Um amplo espectro de moléculas de PEG são descritas em, incluindo mas não limitadas a, Shearwater Polímeros, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog.
Em geral, pelo menos um terminal da molécula de PEG está disponível para reacção com o aminoácido codificado não naturalmente. Por exemplo, os derivados do PEG que albergam fracções alcino e azida para reacção com cadeias laterais de aminoácido podem ser utilizados para anexar o PEG aos aminoácidos codificados não naturalmente como descrito aqui. Se o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma azida, então o PEG conterá tipicamente ou uma fracção alcino para efectuar a formação do produto de cicloadição [3+2] ou uma espécie do PEG activada (isto é, éster, carbonato) contendo um grupo fosfina para efectuar a formação da ligação amida. Em alternativa, se o aminoácido codificado não naturalmente compreende um alcino, então o PEG conterá tipicamente uma fracção azida para efetuar a formação do produto de cicloadição Huisgen [3+2]. Se o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonilo, o PEG compreenderá tipicamente um nucleófilo potente (incluindo mas não limitado a, uma funcionalidade hidrazida, hidrazina, hidroxilamina, ou semicarbazida) de maneira a efetuar a formação das ligações hidrazona, oxima, e semicarbazona correspondentes, respectivamente. Noutras alternativas, pode ser utilizado um reverso da orientação dos grupos reactivos descritos anteriormente, isto é, uma fracção azida no aminoácido codificado não naturalmente pode ser reagida com um derivado do PEG contendo um alcino. 267
Em algumas formas de realização, a variante do polipéptido FGF-21 com um derivado do PEG contém uma funcionalidade quimica que é reactiva com a funcionalidade quimica presente na cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente. A invenção providencia em algumas formas de realização derivados do polímero contendo azida e acetileno compreendendo uma estrutura principal do polímero solúvel em água que tem um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da. A estrutura principal do polímero do polímero solúvel em água pode ser poli(etileno glicol). Contudo, deve ser entendido que uma grande variedade de polímeros solúveis em água incluindo mas não limitados a poli(etileno)glicol e e outros polímeros relacionados, incluindo poli(dextrano) e poli(propileno glicol), também são adequados para utilização na prática desta invenção e que a utilização do termo PEG ou poli(etileno glicol) pretende-se que abranja e inclua todas estas moléculas. O termo PEG inclui, mas não se limita a, poli(etileno glicol) em qualquer uma das suas formas, incluindo PEG bifuncional, PEG com múltiplos braços, PEG derivada, PEG bifurcada, PEG ramificada, PEG pendente (isto é, PEG ou polímeros relacionados que têm um ou mais grupos funcionais pendentes da estrutura principal do polímero), ou PEG contendo ligações degradáveis. O PEG é tipicamente claro, incolor, inodoro, solúvel em água, estável ao calor, inerte a muitos agentes químicos, não hidrolisa ou deteriora, e é geralmente não tóxico. O poli(etileno glicol) é considerado biocompatível, o que significa que o PEG é capaz de co-existir com tecidos ou organismos vivos sem causar dano. Mais especificamente, o PEG é substancialmente não imunogénico, o que significa que o PEG não tende a produzir uma resposta imune no corpo. Quando anexado a uma molécula que tem alguma função desejável no corpo, tal como um agente biologicamente 268 activo, o PEG tende a mascarar o agente e pode reduzir ou eliminar qualquer resposta imune de maneira que um organismo pode tolerar a presença do agente. Os conjugados do PEG tendem a não produzir uma resposta imune substancial ou causar coagulação ou outros efeitos indesejáveis. PEG com a fórmula — CH2CH20—(CH2CH20)n - CH2CH2—, onde n é de cerca de 3 a cerca de 4000, tipicamente de cerca de 20 a cerca de 2000, é adequada para a utilização na presente invenção. PEG com um peso molecular de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da são, em algumas formas de realização da presente invenção, particularmente úteis como a estrutura principal do polímero. O peso molecular do PEG pode estar num intervalo amplo, incluindo mas não limitado a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do PEG pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100. 000 Da, incluindo mas nao limitado a, 100 . 000 Da, 95. .000 Da, 90. 000 Da, 85 .000 Da, 80. 000 Da, 75. 000 Da, 70 . ,000 Da, 65. 000 Da, 60 .000 Da, 55. 000 Da, 50. 000 Da, 45 . ,000 Da, 40 . 000 Da, 35 .000 Da, 30. 000 Da, 25. 000 Da, 20 . ,000 Da, 15.0 00 Da, 1 0.000 Da , 9 .000 Da, 8.000 Da, 7 .000 Da, 6.0 00 Da, 5 .000 Da, 4 . 000 Da, 3 .000 Da, 2.000 Da, 1 .000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da , 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da. A estrutura principal do polímero pode ser linear ou ramificada. Estruturas ramificadas do polímero são 269 geralmente conhecidas na arte. Tipicamente, um polímero ramificado tem uma fracção do núcleo do ramo central e uma pluralidade de cadeias lineares do polímero ligadas ao núcleo do ramo central. PEG é comumente utilizado nas formas ramificadas gue podem ser preparadas por adição de óxido de etileno a vários polióis, tais como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol e sorbitol. A fracção do ramo central também pode ser derivada de vários aminoácidos, tais como lisina. 0 poli(etileno glicol) ramificado pode ser representeado de forma geral como R(-PEG-OH)m no gual R é derivado de uma fracção do núcleo, tal como glicerol, oligómeros de glicerol, ou pentaeritritol, e m representa o número de braços. Moléculas de PEG com múltiplos braços, tais como aguelas descritas nas Patentes U.S. N.°s 5 932 462; 5 643 575; 5 229 490; 4 289 872; Pedido de Patente U.S. 2003/0143596; documento WO 96/21469; e documento WO 93/21259, também podem ser utilizadas como a estrutura principal do polímero. PEG ramificados também podem estar na forma de um PEG bifurcado representado por PEG (-YCHZ2) nr onde Y é um grupo de ligação e Z é um grupo terminal ativado ligado a um CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido.
Ainda uma outra forma ramificada, o PEG pendente, tem grupos reactivos, tais como carboxilo, ao longo da estrutura do PEG em vez de na extremidade das cadeias do PEG.
Além destas formas do PEG, o polímero também pode ser preparado com ligações fracas ou degradáveis na estrutura. Por exemplo, PEG pode ser preparado com ligações de éster na estrutura principal do polímero que são sujeitas a hidrólise. Como mostrado a seguir, esta hidrólise resulta na clivagem do polímero em fragmentos de peso molecular mais baixo: -peg-co2-peg-+h2o λ peg-co2h+ho-peg- 270 É entendido por aqueles com habilitação comum na arte que o termo poli(etileno glicol) ou PEG representa ou inclui todas as formas conhecidas na arte incluindo, mas não limitadas àquelas reveladas aqui.
Muitos outros polímeros também são adequados para utilização na presente invenção. Em algumas formas de realização, as estruturas de polímero que são solúveis em água, com 2 a cerca de 300 terminais, são particularmente úteis na invenção. Exemplos de polímeros adequados incluem, mas não se limitam a, outros poli(alquileno glicóis), tais como poli(propileno glicol) ("PPG"), copolímeros dos mesmos (incluindo mas não limitado a copolímeros de etileno glicol e propileno glicol) , terpolímeros dos mesmos, misturas dos mesmos, e afins. Apesar do peso molecular de cada cadeia da estrutura principal do polímero poder variar, está tipicamente no intervalo de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, frequentemente de cerca de 6.000 Da a cerca de 80.000 Da. O peso molecular de cada cadeia da estrutura principal do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo mas não limitado a, 100.000
Da, 95. 000 Da, 90 . 000 Da, 85.000 Da , 80.000 Da, 75 .000 Da, 70 . ,000 Da, 65. 000 Da, 60 .000 Da, 55 . 000 Da, 50. 000 Da, 45 . ,000 Da, 40 . 000 Da, 35 .000 Da, 30 . 000 Da, 25. 000 Da, 20 . ,000 Da, 15.0 00 Da, 10.0 00 Da, 9. 000 Da, 8.000 Da, 7, .000 Da, 6.000 Da, 5 . 000 Da, , 4. 000 Da, 3. 000 Da, 2.000 D, a, 1, .000 Da, 900 Da, 800 Da , 701 0 Da, , 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia da estrutura principal do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia da estrutura principal do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia da estrutura principal do polímero está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada 271 cadeia da estrutura principal do polímero está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia da estrutura principal do polímero está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da.
Aqueles com habilitação comum na arte reconhecerão que a lista precedente para estruturas substancialmente solúveis em água não é de nenhuma maneira exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todos os materiais poliméricos com as qualidades descritas anteriormente são contemplados como sendo adequados para utilização na presente invenção.
Em algumas formas de realização da presente invenção os derivados do polímero são "multi-funcionais", o que significa que a estrutura principal do polímero tem pelo menos dois terminais, e possivelmente tanto quanto cerca de 300 terminais, funcionalizados ou ativados com um grupo funcional. Os derivados do polímero multifuncionais incluem, mas não se limitam a, polímeros lineares com dois terminais, cada terminal sendo ligado a um grupo funcional que pode ser o mesmo ou diferente.
Numa forma de realização, o derivado do polímero tem a estrutura:
X-A-POLI-B-N=N=N em que: N=N=N é uma fracção azida; B é uma fracção de ligação, que pode estar presente ou ausente; POLI é um polímero não antigénico solúvel em água; A é uma fracção de ligação, que pode estar presente ou ausente e que pode ser o mesmo que B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional.
Exemplos de uma fracção de ligação para A e B incluem, mas não se limitam a, um grupo alquilo funcionalizado multiplicado contendo até 18, e pode conter entre 1-10 átomos de carbono. Um heteroátomo tal como o nitrogénio, oxigénio ou enxofre pode ser incluído com uma cadeia 272 alquilo. A cadeia alquilo também pode ser ramificada num heteroátomo. Outros exemplos de uma fracção de ligação para A e B incluem, mas não se limitam a, um grupo arilo funcionalizado multiplicado, contendo até 10 e pode conter 5-6 átomos de carbono. O grupo arilo pode ser substituído com um ou mais átomos de carbono, nitrogénio, oxigénio ou átomos de enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem aqueles grupos de ligação descritos na Patente U.S. N.°s 5 932 462; 5 643 575; e na publicação do pedido de Patente U.S. 2003/0143596. Aqueles com habilitação comum na arte reconhecerão que a lista precedente para fracções de ligação não é de maneira nenhuma exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todas as fracções de ligação tendo as qualidades descritas anteriormente são contempladas como adequadas para utilização na presente invenção.
Exemplos de grupos funcionais adequados para utilização como X incluem, mas não se limitam a, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster ativo, tal como ésteres de N-hidroxisuccinimidilo e ésteres de 1-benzotriazolilo, carbonato ativo, tal como N-hidroxisuccinimidilo carbonatos e 1-benzotriazolilo carbonatos, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamide, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epoxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alceno, cetona, e azida. Como é entendido por aqueles com habilitação comum na arte, a fracção X selecionada deveria ser compatível com o grupo azida de maneira que a reacção com o grupo azida não ocorra. Os derivados do polímero contendo azida podem ser homobifuncionais, o que significa que o segundo grupo 273 funcional (isto é, X) também é uma fracção azida, ou heterobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente. 0 termo "protegido" refere-se à presença de um grupo protetor ou fracção que previne a reacção do grupo funcional quimicamente reactivo sob certas condições de reacção. 0 grupo protetor variará dependendo do tipo de grupo quimicamente reactivo a ser protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reactivo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo protetor pode ser selecionado do grupo de terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Se o grupo quimicamente reactivo é um tiol, o grupo protetor pode ser ortopiridildissulfida. Se o grupo quimicamente reactivo é um ácido carboxílico, tal como ácido butanóico ou propiónico, ou um grupo hidroxilo, o grupo protetor pode ser benzilo ou um grupo alquilo tal como metilo, etilo, ou terc-butilo. Outros grupos protetores conhecidos na arte também podem ser utilizados na presente invenção.
Exemplos específicos de grupos funcionais terminais na literatura incluem, mas não se limitam a, N-succinimidil carbonato (ver por exemplo, Patente U.S. N.°s 5 281 698, 5 468 478), amina (ver, por exemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zalipsky etal. Eur. Polim. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (ver, por exemplo, Andresz etal. Makromol. Chem. 179: 301 (1978)), succinimidilo propionato e succinimidilo butanato (ver, por exemplo, Olson et al. in Poli(etiloeneglicol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; ver também Patente U.S. N.° 5 672 662), succinimidilo succinato (ver, por exemplo, Abuchowski et al. Câncer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) e Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979), éster de succinimidilo (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 4 670 417), benzotriazol carbonato (ver, por exemplo, Patente 274 U.S. N.° 5 650 234), glicidil éter (ver, por exemplo, Pitha et al. Eur. J Biochem. 94: 11 (1979), Elling et al.,
Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (ver, por exemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (ver, por exemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); e Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldeído (ver, por exemplo, Harris et al. J. Polim. Sei. Chem. Ed. 22:341 (1984), Patente U.S. N.° 5 824 784, Patente U.S. N.° 5 252 714), maleimida (ver, por exemplo, Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), e
Kogan, Synthetic Comm. 22:2417(1992)), ortopiridildissulfida (ver, por exemplo, Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acrilol (ver, por exemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 900 461) .
Em certas formas de realização da presente invenção, os derivados do polímero da invenção compreendem uma estrutura principal do polímero com a estrutura:
X-CH2CH20—(CH2CH20) n —CH2CH2 -N=N=N em que: X é um grupo funcional como descrito anteriormente; e n é cerca de 20 a cerca de 4000.
Numa outra forma de realização, os derivados do polímero da invenção compreendem uma estrutura principal do polímero com a estrutura: X-CH2CH20—(CH2CH20) n —CH2CH2 - O- (CH2) m-W-N=N=N em que: W é uma fraeção linker alifática ou aromática compreendendo entre 1-10 átomos de carbono; n é cerca de 20 a cerca de 4000; e 275 X é um grupo funcional como descrito anteriormente; m é entre 1 e 10.
Os derivados do PEG que contêm azida da invenção podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na arte e/ou revelados aqui. Num método, mostrado a seguir, uma estrutura principal do polímero solúvel em água com um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, tendo a estrutura principal do polímero um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo de saída adequado, é reagida com um anião azida (que pode ser emparelhado com qualquer de um número de contra-iões adequados, incluindo sódio, potássio, terc-butilamónio e assim por diante). 0 grupo de saída submete-se a um deslocamento nucleofílico e é substituído pela fracção azida, arcando com o polímero PEG que contém a azida desejada. X-PEG-L + N3~ -> X-PEG- N3
Como mostrado, uma estrutura principal do polímero adequada para utilização na presente invenção tem a fórmula X-PEG-L, em que PEG é poli(etileno glicol) e X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de saída adequado. Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não se limitam a, hidroxilo, hidroxilo protegido, acetal, alquenilo, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimida, ditiopiridina, e vinilpiridina, e cetona. Exemplos de grupos de saída adequados incluem, mas não se limitam a, cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato, e tosilato.
Num outro método de preparação dos derivados do polímero que contêm azida da presente invenção, um agente de ligação que suporta uma funcionalidade de azida é contactado com uma estrutura principal do polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, em que o agente de ligação suporta uma 276 funcionalidade química que reagirá selectivamente com uma funcionalidade química no polímero PEG, para formar um produto do derivado do polímero que contém azida em que a azida é separada da estrutura principal do polímero por um grupo de ligação.
Um esquema de reacção exemplar é mostrado a seguir: X-PEG-M + N-lin*er-N=N=N - PG-X-PEG-linÃ:er-N=N=N em que: PEG é poli(etileno glicol) e X é um grupo de nivelamento tal como alcoxi ou um grupo funcional como descrito anteriormente; e M é um grupo funcional que não é reactivo com a funcionalidade azida mas que reagirá eficientemente e selectivamente com o grupo funcional N.
Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não se limitam a, M sendo um ácido carboxílico, carbonato ou éster ativo se N é uma amina; M sendo uma cetona se N é uma hidrazida ou fracção aminooxi; M sendo um grupo de saída se N é um nucleófilo. A purificação do produto bruto pode ser conseguida por métodos conhecidos incluindo, mas não limitados a, precipitação do produto seguido de cromatografia, se necessário.
Um exemplo mais específico é mostrado a seguir no caso do PEG diamina, no qual uma das aminas é protegida por uma fracção do grupo protetor tal como terc-butil-Boc e o PEG diamina mono-protegido resultante é reagido com uma fracção de ligação que suporta a funcionalidade azida:
BocHN-PEG-NH2 + H02C- (ch2) 3-n=n=n
Neste momento, o grupo amina pode ser unido ao grupo ácido carboxílico utilizando uma variedade de agentes de ativação tais como cloreto de tionil ou reagentes de carbodiimida e N-hidroxisuccinimida ou N- hidroxibenzotriazol para criar uma ligação amida entre o derivado do PEG monoamina e a fracção linker que suporta azida. Após a formação bem-sucedida da ligação amida, o 277 derivado que contém azida N-terc-butil-Boc-protegido resultante pode ser utilizado directamente para modificar moléculas bioativas ou pode ser mais elaborado para instalar outros grupos funcionais úteis. Por exemplo, o grupo N-t-Boc pode ser hidrolizado por tratamento com ácido forte para gerar um omega-amino-PEG-azida. A amina resultante pode ser utilizada como um cabo sintético para instalar outras funcionalidades úteis tais como grupos maleimida, dissulfidas ativadas, ésteres ativados e assim por diante para a criação de reagentes heterobifuncionais valiosos.
Os derivados heterobifuncionais são particularmente úteis quando se deseja anexar moléculas diferentes a cada terminal do polimero. Por exemplo, o omega-N-amino-N-azida PEG permitiria a anexação de uma molécula tendo um grupo electrofilico ativado, tal como um aldeído, cetona, éster ativado, carbonato ativado e assim por diante, a um terminal do PEG e uma molécula tendo um grupo acetileno aos outros terminais do PEG.
Numa outra forma de realização da invenção, o derivado do polímero tem a estrutura:
X-A-POLI-B-CAC-R em que: R pode ser tanto H ou um alquilo, alceno, alquioxi, ou arilo ou grupo arilo substituído; B é uma fracção de ligação, que pode estar presente ou ausente; POLI é um polímero não antigénico solúvel em água; A é uma fracção de ligação, que pode estar presente ou ausente e que pode ser a mesma que B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional.
Exemplos de uma fracção de ligação para A e B incluem, mas não se limitam a, um grupo alquilo funcionalizado multiplicado contendo até 18, e pode conter entre 1-10 átomos de carbono. Um heteroátomo tal como nitrogénio, oxigénio ou enxofre pode ser incluído com a cadeia alquilo. 278 A cadeia alquilo também pode ser ramificada num heteroátomo. Outros exemplos de uma fracção de ligação para A e B incluem, mas não se limitam a, um grupo arilo funcionalizado multiplicado, contendo até 10 e pode conter 5-6 átomos de carbono. O grupo arilo pode ser substituído com um ou mais átomos de carbono, nitrogénio, oxigénio ou átomos de enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem aqueles grupos de ligação descritos nas Patentes U.S. N.°s 5 932 462 e 5 643 575 e Publicação do pedido de Patente U.S. 2003/0143596. Aqueles com habilitação comum na arte reconhecerão que a lista precedente para as fracções de ligação não é de nenhuma maneira exaustiva e pretende-se que seja meramente ilustrativa, e que uma grande variedade de fracções de ligação tendo as qualidades descritas anteriormente são contempladas como úteis na presente invenção.
Exemplos de grupos funcionais adequados para utilização como X incluem hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster ativo, tal como ésteres de N-hidroxisuccinimidilo e ésteres de 1-benzotriazolilo, carbonato ativo, tais como N-hidroxisuccinimidil carbonatos e 1-benzotriazolil carbonatos, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, e tresilato, alceno, cetona, e acetileno. Como seria entendido, a fracção X selecionada deveria ser compatível com o grupo acetileno de maneira que a reacção com o grupo acetileno não ocorra. Os derivados do polímero contendo acetileno podem ser homobifuncionais, o que significa que o segundo grupo funcional (isto é, X) também é uma fracção acetileno, ou heterobifuncionais, o que 279 significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.
Numa outra forma de realização da presente invenção, os derivados do polimero compreendem uma estrutura principal do polímero com a estrutura:
X-CH2CH20- (CH2CH20) n —CH2CH2 - 0- (CH2)m-C=CH em que: X é um grupo funcional como descrito anteriormente; n é cerca de 20 a cerca de 4000; e m é entre 1 e 10.
Exemplos específicos de cada dos polímeros PEG heterobifuncionais são mostrados a seguir.
Os derivados de PEG que contêm acetileno da invenção podem ser preparados utilizando métodos conhecidos daqueles com habilitação comum na arte e/ou revelados aqui. Num método, uma estrutura principal do polímero solúvel em água com um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, a estrutura principal do polímero tendo um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo nucleofílico adequado, é reagida com um composto que suporta tanto uma funcionalidade acetileno como um grupo de saída que é adequado para reacção com o grupo nucleofílico no PEG. Quando o polímero PEG que suporta a fracção nucleofílica e a molécula que suporta o grupo de saída são combinados, o grupo de saída submete-se a um deslocamento nucleofílico e é substituído pela fracção nucleofílica, arcando com o polímero que contém acetileno desejado. X-PEG-Nu + L-A-C - X-PEG-Nu-A-C=CR'
Como mostrado, uma estrutura principal do polímero preferida para utilização na reacção tem a fórmula X-PEG-Nu, em que PEG é poli(etileno glicol), Nu é uma fracção nucleofílica e X é um grupo funcional que não reage com Nu, L ou a funcionalidade acetileno.
Exemplos de Nu incluem, mas não se limitam a, amina, alcoxi, ariloxi, sulfidrilo, imino, carboxilato, hidrazida, 280 grupos aminoxi que reagiriam primariamente através de um mecanismo tipo SN2. Exemplos adicionais de grupos Nu incluem aqueles grupos funcionais que reagiriam primariamente através de uma reacção de adição nucleofilica. Exemplos de grupos L incluem cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato, e tosilato e outros grupos que se espera que sejam submetidos a deslocamento nucleofilico bem como cetonas, aldeídos, tioésteres, olefinas, grupos carbonilo alfa-beta insaturados, carbonatos e outros grupos electrofilicos que se espera sejam submetidos a adição por nucleófilos.
Noutra forma de realização da presente invenção, A é um linker alifático de entre 1-10 átomos de carbono ou um anel arilo substituído de entre 6-14 átomos de carbono. X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de saída adequado.
Num outro método para preparação dos derivados do polímero que contém acetileno da invenção, um polímero PEG com um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, suportando tanto um grupo funcional protegido como um agente de nivelamento num terminal e um grupo de saída adequado no outro terminal é contactado por um anião acetileno.
Um esquema de reacção exemplar é mostrado a seguir: X-PEG-L + -C^CR' - X-PEG-C^CR' em que: PEG é poli(etileno glicol) e X é um grupo de nivelamento tal como alcoxi ou um grupo funcional como descrito anteriormente; e R' é tanto H, um alquilo, alcoxi, arilo ou grupo ariloxi ou um alquilo substituído, alcoxi, arilo ou grupo ariloxi.
No exemplo anterior, o grupo de saída L deveria ser suficientemente reactivo para submeter-se ao deslocamento de tipo SN2 quando contactado com uma concentração suficiente do anião acetileno. As condições de reacção 281 requeridas para conseguir o deslocamento SN2 dos grupos de saida por aniões acetileno são conhecidas daqueles com habilitação comum na arte. A purificação do produto bruto pode normalmente ser conseguida por métodos conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a, precipitação do produto seguido de cromatografia, se necessário.
Polímeros solúveis em água podem ser ligados aos polipéptidos FGF-21 da invenção. Os polímeros solúveis em água podem ser ligados através de um aminoácido codificado não naturalmente incorporado no polipéptido FGF-21 ou qualquer grupo funcional ou substituinte de um aminoácido codificado não naturalmente ou codificado naturalmente, ou qualquer grupo funcional ou substituinte adicionado a um aminoácido codificado não naturalmente ou codificado naturalmente. Em alternativa, os polímeros solúveis em água estão ligados a um polipéptido FGF-21 que incorpora um aminoácido codificado não naturalmente através de um aminoácido que ocorre naturalmente (incluindo mas não limitado a, cisteína, lisina ou o grupo amina do resíduo N-terminal). Os polipéptidos FGF-21 da invenção compreendem 1 aminoácido não natural, em que um aminoácido codificado não naturalmente está ligado ao polímero(s) solúvel em água (incluindo mas não limitado a, PEG e/ou oligossacarídeos). Em alguns casos, os polipéptidos FGF-21 da invenção compreendem ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais aminoácido(s) naturalmente codificados ligados a polímeros solúveis em água. Em alguns casos, os polipéptidos FGF-21 da invenção compreendem um ou mais aminoácido(s) codificados não naturalmente ligados a polímeros solúveis em água e um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente ligados a polímeros solúveis em água. Em algumas formas de realização, os polímeros solúveis em água utlizados na presente invenção aumentam a meia-vida do soro do polipéptido FGF-21 em relação à forma não conjugada. 282 0 número de polímeros solúveis em água ligados a um polipéptido FGF-21 (isto é, a extensão da PEGilação ou glicosilação) da presente invenção pode ser ajustado para providenciar uma característica alterada (incluindo mas não limitada a, aumentada ou diminuída) farmacológica, farmacocinética ou farmacodinâmica tal como meia-vida in vivo. Em algumas formas de realização, a meia-vida de FGF- 21 é aumentada pelo menos em cerca de 10, 20, 30 , 40, ΟΊ O > 60, 70 , 80, 90 por cento 2 vezes , 5 vezes, 6 vezes , 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes sobre um polipéptido não modificado. Os derivados do PEG contendo um grupo nucleofílico forte (isto é, hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ou semicarbazida).
Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo carbonilo é modificado com um derivado do PEG que contém um terminal hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou fracção semicarbazida que está ligada directamente à estrutura do PEG.
Em algumas formas de realização, o derivado do PEG com terminal de hidroxilamina terá a estrutura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2)m-0-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 (isto é, peso molecular médio é entre 5-40 kDa).
Em algumas formas de realização, o derivado do PEG que contém hidrazina ou hidrazida terá a estrutura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2)m-X-NH-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonilo (C=0) que pode estar presente ou ausente. 283
Em algumas formas de realização, o derivado do PEG que contém semicarbazida terá a estrutura: RO-(CH2CH20) n -0-(CH2)m-NH-C (0)-NH-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000.
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido que contém carbonilo é modificado com um derivado do PEG que contém um terminal hidroxilamina, hidrazida, hidrazina, ou fracção semicarbazida que está ligada à estrutura do PEG por meio de uma ligação amida.
Em algumas formas de realização, os derivados do PEG com terminal de hidroxilamina têm a estrutura: RO- (CH2CH2O) n-0- (CH2) -NH-C (0) (CH2)m-0-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 (isto é, peso molecular médio é entre 5-40 kDa).
Em algumas formas de realização, os derivados do PEG que contêm hidrazina ou hidrazida têm a estrutura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2)m-X-NH-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, n é 100-1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonilo (C=0) que pode estar presente ou ausente.
Em algumas formas de realização, os derivados do PEG que contêm semicarbazida têm a estrutura: RO-(CH2CH20) n—O—(CH2) 2-NH-C (O) (CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000.
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido que contém carbonilo é modificado com um derivado do PEG ramificado que contém um terminal hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou fracção semicarbazida, tendo cada cadeia do PEG ramificado um peso molecular que varia de 10-40 kDa e, e pode ser de 5-20 kDa. 284
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente é modificado com um derivado do PEG com uma estrutura ramificada. Por exemplo, em algumas formas de realização, o derivado do PEG com terminal de hidrazina ou hidrazida terá a seguinte estrutura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) -NH-C (0) ] 2CH (CH2) m-X-NH-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000, e X é opcionalmente um grupo carbonilo (C=0) que pode estar presente ou ausente.
Em algumas formas de realização, os derivados do PEG que contêm um grupo semicarbazida terão a estrutura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-C (O) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2)m-NH-C (O) -NH-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2-10 e n é 100-1.000.
Em algumas formas de realização, os derivados do PEG que contêm um grupo hidroxilamina terão a estrutura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-C (O) -NH-CH2-CH2]2CH-X- (CH2)m-0-NH2 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2-10 e n é 100-1.000. O grau e locais nos quais o polímero (s) solúveis em água estão ligados ao polipéptido FGF-21 pode modular a ligação do polipéptido FGF-21 ao receptor do polipéptido FGF-21. Em algumas formas de realização, as ligações são arranjadas de tal maneira que o polipéptido FGF-21 se liga ao receptor do polipéptido FGF-21 com um Kd de cerca de 400 nM ou inferior, com um Kd de 150 nM ou inferior, e em alguns casos com um Kd de 100 nM ou inferior, como medido por um ensaio de ligação de equilíbrio, tal como aquele descrito em Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988) para FGF-21. 285 Métodos e química para ativação de polímeros bem como para conjugação de péptidos são descritos na literatura são conhecidos na arte. Método utilizados normalmente para a ativação de polímeros incluem, mas não se limitam a, ativação dos grupos funcionais com brometo de cianogénio, periodato, glutaraldeído, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, halogenetos de sulfonilo,
triclorotriazina, etc. (ver, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILIZATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Mareei Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992) , CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLIMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Volume 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991) .
Estão disponíveis vários artigos de revisão e monografias sobre a funcionalização e conjugação do PEG. Ver, por exemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995). Métodos para ativação de polímeros também podem ser encontrados no documento WO 94/17039, Patente U.S. N.° 5 324 844, documento WO 94/18247, documento WO 94/04193, Patente U.S. N.° 5 219 564, Patente U.S. N.° 5 122 614, documento WO 90/13540, Patente U.S. N.° 5 281 698, e documento WO 93/15189, e para conjugação entre polímeros ativados e enzimas incluindo, mas não limitado a, factor de coagulação VIII (documento WO 94/15625), hemoglobina (documento WO 94/09027), molécula transportadora de oxigénio (Patente U.S. N.° 4 412 989), ribonuclease e 286 superóxido dismutase (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)). A PEGilação (isto é, adição de qualquer polímero solúvel em áqua) de polipéptidos FGF-21 que contêm um aminoácido codificado não naturalmente, tal como p-azida-L-fenilalanina, é realizada por qualquer método conveniente. Por exemplo, o polipéptido FGF-21 é PEGilado com um derivado mPEG com terminal alcino. Sucintamente, um excesso de mPEG(5000)-0-CH2-C^CH sólido é adicionado, com estimulante, a uma solução aquosa de polipéptido FGF-21 que contém p-azida-L-Phe à temperatura ambiente. Tipicamente, a solução aquosa é tamponada com um tampão que tem um pKa próximo do pH ao qual a reacção será realizada (geralmente pH cerca de 4-10). Exemplos de tampões adequados para PEGilação a pH 7,5, por exemplo, incluem, mas não se limitam a, HEPES, fosfato, borato, TRIS-HC1, EPPS, e TES. O pH é continuamente monitorizado e ajustado se necessário. Tipicamente, permite-se que a reacção continue durante entre cerca de 1 a 48 horas.
Os produtos da reacção são subsequentemente sujeitos a cromatografia de interação hidrofóbica para separar as variantes do polipéptido FGF-21 PEGilado das variantes do mPEG(5000)-0-CH2-C=CH livre e quaisquer complexos de alto peso molecular do polipéptido FGF-21 PEGilado que podem formar quando o PEG não bloqueado é ativado em ambas as extremidades da molécula, reticulando assim as moléculas variantes do polipéptido FGF-21. As condições durante a cromatografia de interação hidrofóbica são tais que o mPEG(5000)-0-CH2-C^CH livre flui através da coluna, enquanto quaisquer complexos variantes reticulados do polipéptido FGF-21 PEGilado eluem após as formas desejadas, que contêm uma molécula variante do polipéptido FGF-21 conjugada com um ou mais grupos PEG. Condições adequadas variam dependendo dos tamanhos relativos dos complexos reticulados versus os conjugados desejados e são 287 prontamente determinados por aqueles com habilitação comum na arte. 0 eluente que contém os conjugados desejados é concentrado por ultrafiltração e dessalinizado por diafiltração.
Se necessário, o polipéptido FGF-21 PEGilado obtido a partir da cromatografia hidrofóbica pode ainda ser purificado através de um ou mais procedimentos conhecidos daqueles com habilitação comum na arte incluindo, mas não limitado a, cromatografia por afinidade; cromatografia por intercâmbio de aniões ou catiões (utilizando, incluindo mas não limitado a, DEAE SEPHAROSE); cromatografia em sílica; HPLC de fase reversa; filtração por gel (utilizando, incluindo mas não limitado a, SEPHADEX G-75); cromatografia de interação hidrofóbica; cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia com quelato de metal; ultrafiltração/ diafiltração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amónio; focagem isoelétrica; cromatografia por deslocamento; procedimentos eletroforéticos (incluindo mas não limitados a focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (incluindo mas não limitada a precipitação com sulfato de amónio), ou extração. 0 peso molecular aparente pode ser estimado por GPC por comparação com padrões da proteína globular (Preneta, AZ em PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989,293-306). A pureza do conjugado FGF-21-PEG pode ser avaliada por degradação proteolítica (incluindo mas não limitada a, clivagem da tripsina) seguida de análise de espectrometria de massa. Pepinsky RB., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):1059-66 (2001).
Um polímero solúvel em água ligado a um aminoácido de um polipéptido FGF-21 da invenção pode ainda ser derivado ou substituído sem limitação.
Derivados do PEG que contêm azida 288
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 é modificado com um derivado do PEG que contém uma fracção azida que reagirá com uma fracção alcino presente na cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente. Em geral, os derivados do PEG terão um peso molecular médio que varia de 1-100 kDa e, em algumas formas de realização, de 10-40 kDa.
Em algumas formas de realização, o derivado do PEG com terminal azida terá a estrutura: RO-(CH2CH20) n-0-(CH2)m-N3 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 (isto é, peso molecular médio está entre 5-40 kDa).
Numa outra forma de realização, o derivado do PEG com terminal azida terá a estrutura: RO-(CH2CH20)n -0-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, p é 2-10 e n é 100-1.000 (isto é, peso molecular médio está entre 5-40 kDa).
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido que contém um alcino é modificado com um derivado do PEG ramificado que contém um terminal com fracção azida, tendo cada cadeia do PEG ramificado um peso molecular que varia de 10-40 kDa e pode ser de 5-20 kDa. Por exemplo, em algumas formas de realização, o derivado do PEG com terminal azida terá a seguinte estrutura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2) m-X- (CH2) pN3 onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, p é 2-10, e n é 100-1.000, e X é opcionalmente um O, N, S ou grupo carbonilo (C=0) , em cada caso qe pode estar presente ou ausente.
Derivados do PEG contendo alcino
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 é modificado com um derivado do PEG que contém uma fracção alcino que reagirá com uma fracção azida 289 presente na cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente.
Em algumas formas de realização, o derivado do PEG com terminal alcino terá a seguinte estrutura:
RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) m-C=CH onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 (isto é, peso molecular médio está entre 5-40 kDa).
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido não naturalmente codificado que contém alcino é modificado com um derivado do PEG que contém um terminal azida ou terminal com fracção alcino que está ligado à estrutura do PEG por meio de uma ligação amida.
Em algumas formas de realização, o derivado do PEG com terminal alcino terá a seguinte estrutura: R0-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0)-(CH2)p-C=CH onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, p é 2-10 e n é 100-1.000.
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido que contém azida é modificado com um derivado do PEG ramificado que contém um terminal com fracção alcino, tendo cada cadeia do PEG ramificado um peso molecular que varia de 10-40 kDa e pode ser de 5-2 0 kDa. Por exemplo, em algumas formas de realização, o derivado do PEG com terminal alcino terá a seguinte estrutura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) 2CH (CH2) m-X- (CH2) p C^CH onde R é um simples alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, p é 2-10, e n é 100-1.000, e X é opcionalmente um O, N, S ou grupo carbonilo (C=0), ou não está presente. Derivados do PEG contendo fosfina
Numa outra forma de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 é modificado com um derivado do PEG que contém um grupo funcional ativado (incluindo mas não 290 limitado a, éster, carbonato) compreendendo ainda um grupo arilo fosfina que reagirá com uma fracção azida presente na cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente. Em geral, os derivados do PEG terão um peso molecular médio que varia de 1-100 kDa e, em algumas formas de realização, de 10-40 kDa.
Em algumas formas de realização, o derivado do PEG terá a estrutura:
Ph2P(H2C)n^SYX'w o em que n é 1-10; X pode ser O, N, S ou não estar presente, Ph é fenilo, e W é um polímero solúvel em água.
Em algumas formas de realização, o derivado do PEG terá a estrutura:
em que X pode ser O, N, S ou não estar presente, Ph é fenilo, W é um polímero solúvel em água e R pode ser H, alquilo, arilo, grupos alquilo substituído e arilo substituído. Grupos R exemplares incluem, mas não se limitam a, -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -halogéneo, -C(O)R', -CONR'R", - S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN e -N02. R', R", R"' e R"" cada independentemente referem-se ao hidrogénio, heteroalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, incluindo mas não limitado a, arilo substituído com 1-3 halogéneos, alquilo substituído ou não substituído, grupos alcoxi ou tioalcoxi, ou grupos ariloalquilo. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada grupos R', R", R'" e R"" quando mais do que um destes grupos está presente. Quando R' e R" são anexados ao mesmo átomo de nitrogénio, podem ser combinados com o átomo de nitrogénio para formar um anel com 5, 6, ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R" é suposto que inclua, mas não se limite a, 291 1-pirrolidinilo e 4-morfolinilo. Da discussão anterior dos substituintes, alguém com habilitação na arte compreenderá que o termo "alquilo" é suposto incluir grupos incluindo átomos de carbono ligados a outros grupos que não os grupos de hidrogénio, tais como haloalquilo (incluindo mas não limitado a, -CF3 e -CH2CF3) e acilo (incluindo mas não limitado a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (0) CH2OCH3, e afins).
Outros derivados do PEG e técnicas gerais de PEGilação
Outras moléculas do PEG exemplares que podem estar ligadas a polipéptidos FGF-21, bem como métodos de PEGilação incluem, mas não se limitam a, aqueles descritos em, por exemplo, publicações de Patente U.S. N.° 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0114647; 2002/0156047; 2002/0072573; 2002/0002250; 2003/0220447; 2003/0105275; 2002/0099133; 2002/0052430; 2001/0056171; 2003/0158333; 2003/0105224; 2002/0086939; 2002/0040076; 2001/0044526; 2003/0143596; 2003/0023023; 2002/0082345; 2002/0037949; 2001/0021763;
Patentes U.S. N.° 6.646.110; 5.824.778; 5.476.653; 5.219.564; 5.629.384; 5.736.625 ; 4.902.502; 5.281.698; 5.122.614; 5.473.034; 5.516.673 ; 5.382.657; 6.552.167; 6.610.281; 6.515.100; 6.461.603 ; 6.436.386; 6.214.966; 5.990.237; 5.900.461; 5.739.208 ; 5.672.662; 5.446.090; 5.808.096; 5.612.460; 5.324.844 ; 5.252.714; 6.420.339; 6.201.072; 6.451.346; 6.306.821 ; 5.559.213; 5.747.646; 5.834.594; 5.849.860; 5.980.948 ; 6.004.573; 6.129.912; documento WO 97/32607, documento EP 229 108, documento EP 402 378, documento WO 92/16555, documento WO 94/04193, documento WO 94/14758, documento WO 94/17039, documento WO 94/18247, documento WO 94/28024, documento WO 95/00162, documento WO 95/11924, documento W095/13090, documento WO 95/33490, documento WO 96/00080, documento WO 97/18832, documento WO 98/41562, documento WO 98/48837, documento WO 99/32134, documento WO 99/32139, documento WO 99/32140, 292 documento WO 96/40791, documento WO 98/32466, documento WO 95/06058, documento EP 439 508, documento WO 97/03106, documento WO 96/21469, documento WO 95/13312, documento EP 921 131, documento WO 98/05363, documento EP 809 996, documento WO 96/41813, documento WO 96/07670, documento EP 605 963, documento EP 510 356, documento EP 400 472, documento EP 183 503 e documento EP 154 316. Quaisquer das moléculas do PEG descritas aqui podem ser utilizadas em qualquer forma, incluindo mas não limitada a, cadeia simples, cadeia ramificada, cadeia multibraço, funcional individual, bi-funcional, multi-funcional, ou qualquer combinação das mesmas.
Polímeros adicionais e derivados do PEG são descritos nos seguintes pedidos de patentes: publicação da Patente U.S. N.° 2006/0194256, publicação da Patente U.S. N.° 2006/0217532, publicação da Patente U.S. N.° 2006/0217289, Patente provisória U.S. N.° 60/755,338; Patente provisória U.S. N.° 60/755,711; Patente provisória U.S. N.° 60/755,018; Pedido de Patente Internacional N.° PCT/US06/49397; documento WO 2006/069246; Patente provisória U.S. N.° 60/743,041; Patente provisória U.S. N.° 60/743,040; Pedido de Patente Internacional N.° PCT/US06/47822; Patente provisória U.S. N.° 60/882,819; Patente provisória U.S. N.° 60/882,500; e Patente provisória U.S. N.° 60/870,594.
Aumentando a afinidade pela albumina do soro Várias moléculas podem também ser fundidas aos polipéptidos FGF-21 da invenção para modular a meia-vida dos polipéptidos FGF-21 no soro. Em algumas formas de realização, as moléculas estão ligadas ou fundidas com polipéptidos FGF-21 da invenção para aumentar a afinidade por albumina do soro endógena num animal.
Por exemplo, em alguns casos, é feita uma fusão recombinante de um polipéptido FGF-21 e uma sequência de ligação da albumina. Sequências de ligação da albumina 293 exemplares incluem, mas não se limitam a, o domínio de ligação da albumina da proteína G do estreptococos (ver. por exemplo, Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996) e Sjolander et al., J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)), ou péptidos de ligação da albumina tais como aqueles descritos em, por exemplo, Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).
Noutras formas de realização, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção são acilados com ácidos gordos. Em alguns casos, os ácidos gordos promovem a ligação à albumina do soro. Ver, por exemplo, Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995).
Noutras formas de realização, os polipéptidos FGF-21 da invenção são fundidos directamente com albumina do soro (incluindo mas não limitado a, albumina do soro humana). Aqueles peritos na especialidade reconhecerão que uma grande variedade de outras moléculas podem também ser ligadas aos FGF-21 na presente invenção para modular a ligação à albumina do soro ou outros componentes do soro. X. Glicosilação dos polipéptidos FGF-21 A invenção inclui polipéptidos FGF-21 que incorporam um ou mais aminoácidos não naturalmente codificados que suportam resíduos de sacarídeo. Os resíduos de sacarídeo podem ser tanto naturais (incluindo mas não limitado a, N-acetilglucosamina) ou não naturais (incluindo mas não limitado a, 3-fluorogalactose). Os sacarídeos podem estar ligados aos aminoácidos codificados não naturalmente ou por uma ligação glicosídica ligada a N ou O (incluindo mas não limitado a, N-acetilgalactose-L-serina) ou por uma ligação não natural (incluindo mas não limitado a, um oxima ou o correspondente glicosida ligada a C ou S).
As fracções do sacarídeo (incluindo mas não limitado a, glicosil) podem ser adicionadas aos polipéptidos FGF-21 tanto in vivo como in vitro. Em algumas formas de 294 realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente que contém carbonilo é modificado com um sacarideo derivado com um grupo aminooxi para gerar o polipéptido glicosilado correspondente ligado através de uma ligação oxima. Uma vez anexado ao aminoácido codificado não naturalmente, o sacarideo pode ainda ser elaborado por tratamento com glicosiltransferases e outras enzimas para gerar uma ligação de oligossacarideo ao polipéptido FGF-21. Ver, por exemplo, H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003) .
Em algumas formas de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente que contém carbonilo é modificado directamente com um glicano com uma estrutura definida preparado como um derivado aminooxi. Alguém com habilitação comum na arte reconhecerá que outras funcionalidades, incluindo azida, alcino, hidrazida, hidrazina, e semicarbazida, podem ser utilizadas para ligar o sacarideo ao aminoácido codificado não naturalmente.
Em algumas formas de realização da invenção, um polipéptido FGF-21 compreendendo uma azida ou um aminoácido codificado não naturalmente que contém alquinilo pode depois ser modificado por, incluindo mas não limitado a, um reacção de cicloadição Huisgen [3+2] com, incluindo mas não limitado a, derivados de alquinilo ou azida, respetivamente. Este método permite que as proteínas sejam modificadas com uma selectividade extremamente alta. XI. Dímeros e multímeros FGF-21 A presente invenção também providencia para FGF-21 e FGF-21 combinações análogas tais como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros, ou heteromultímeros (isto é, trímeros, tetrâmeros, etc.) onde FGF-21 que contém um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente é ligado a outro FGF-21 ou uma variante FGF-21 do mesmo ou qualquer 295 outro polipéptido que não seja FGF-21 ou uma variante FGF-21 do mesmo, seja directamente à estrutura do polipéptido ou através de um linker. Devido ao seu peso molecular aumentado em comparação com monómeros, o dimero FGF-21 ou conjugados multimero podem exibir propriedades novas ou desejadas, incluindo mas não limitado a, diferente meia-vida terapêutica modulada, farmacodinâmica, farmacocinética, farmacológica ou meia-vida plasma modulada relativa ao FGF-21 monomérico. Em algumas formas de realização, os dimeros FGF-21 da invenção modularão a transdução do sinal do receptor FGF-21. Noutras formas de realização, os dimeros ou multimeros FGF-21 da presente invenção atuarão como um antagonista, agonista, ou modulador do receptor FGF-21.
Em algumas formas de realização, uma ou mais das moléculas de FGF-21 presentes num FGF-21 que contém dimero ou multimero compreende um aminoácido codificado não naturalmente ligado a um polimero solúvel em água.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos FGF-21 são ligados directamente, incluindo mas não limitado a, através de uma ligação amida Asn- Lys ou ligação dissulfida Cys-Cys. Em algumas formas de realização, os polipéptidos FGF-21, e/ou a molécula do não FGF-21 ligada, compreenderá diferentes aminoácidos codificados não naturalmente para facilitar a dimerização, incluindo mas não limitado a, um alcino num aminoácido não naturalmente codificado de um primeiro polipéptido FGF-21 e uma azida num segundo aminoácido codificado não naturalmente de uma segunda molécula será conjugado através de uma cicloadição Huisgen [3+2]. Em alternativa, FGF-21, e/ou a molécula de não FGF-21 ligada compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente que contém cetona pode ser conjugado com um segundo polipéptido compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente que contém hidroxilamina e os polipéptidos são reagidos através da formação da oxima correspondente. 296
Em alternativa, os dois polipéptidos FGF-21, e/ou a molécula de não FGF-21 ligada, são ligados através de um linker. Qualquer linker hetero ou homobifuncional pode ser utilizado para ligar duas moléculas, e/ou as moléculas de não FGF-21 ligadas, que podem ter a mesma sequência primária ou uma diferente. Em alguns casos, o linker utilizado para acorrentar o FGF-21, e/ou as moléculas não FGF-21 ligadas pode ser um reagente PEG bifuncional. 0 linker pode ter um amplo intervalo de pesos moleculares ou comprimentos moleculares. Linkers com peso molecular superior ou inferior podem ser utilizados para providenciar uma relação ou conformação espacial desejada entre FGF-21 e a entidade ligada ou entre FGF-21 e o seu receptor, ou entre a entidade ligada e o seu parceiro de ligação, se houver algum. Os linkers que têm um comprimento molecular mais longo ou mais curto também podem ser utilizados para providenciar um espaço ou flexibilidade desejada entre FGF-21 e a entidade ligada, ou entre a entidade ligada e o seu parceiro de ligação, se houver algum.
Em algumas formas de realização, a invenção providencia linkers bifuncionais solúveis em água que têm uma estrutura em haltere que inclui: a) uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, uma hidroxilamina, ou uma fracção que contém carbonilo em pelo menos uma primeira extremidade de uma estrutura principal do polímero; e b) pelo menos um segundo grupo funcional numa segunda extremidade da estrutura principal do polímero. 0 segundo grupo funcional pode ser o mesmo ou diferente que o do primeiro grupo funcional. 0 segundo grupo funcional, em algumas formas de realização, não é reactivo com o primeiro grupo funcional. A invenção providencia, em algumas formas de realização, compostos solúveis em água que compreendem pelo menos um braço de uma estrutura molecular ramificada. Por exemplo, a estrutura molecular ramificada pode ser dendrítica. 297
Em algumas formas de realização, a invenção providencia multimeros compreendendo um ou mais polipéptido FGF-21, formado por reações com polímeros solúveis em água ativados gue têm a estrutura:
R-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X em que n é de cerca de 5 a 3.000, m é 2-10, X pode ser uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, um grupo aminooxi, uma hidroxilamina, um acetilo, ou fracção que contém carbonilo, e R é grupo de nivelamento, um grupo funcional, ou um grupo de saida que pode ser o mesmo ou diferente de X. R pode ser, por exemplo, um grupo funcional selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster de N-hidroxisuccinimidilo, éster de 1-benzotriazolilo, N-hidroxisuccinimidilo carbonato, 1-benzotriazolilo carbonato, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, e tresilato, alceno, e cetona. XII. Medição da actividade do polipéptido FGF-21 e afinidade do polipéptido FGF-21 para o receptor do polipéptido FGF-21
Foi demonstrado que FGF-21 estimula a absorção de glicose e aumenta a sensibilidade à insulina em adipócitos 3T3-L1, um modelo in vitro utilizado para o estudo do metabolismo do tecido adiposo como mostrado no Exemplo 3 da Publicação da Patente U.S. N.° 20040259780. Uma característica dos diabetes de tipo 2 é a deficiência da absorção de glicose em vários tipos de tecidos incluindo o tecido adiposo. Assim, FGF-21 é útil para tratar diabetes do tipo 2 diminuindo os níveis de glicose no sangue. Além 298 disso, FGF- 21 é útil para tratar a obesidade aumentando o dispêndio de energia através de uma utilização da glicose mais rápida e mais eficiente. Além disso, foi demonstrado que o FGF-21 estimula a absorção de glicose em adipócitos 3T3-L1 numa maneira independente da insulina, indicando que é útil para tratar também o diabetes de tipo 1. Ver Publicação da Patente U.S. N.° 20040259780. Foi demonstrado que o FGF-21 estimula a absorção de glicose em adipócitos 3T3-L1 numa maneira dependente da concentração a uma concentração subótima de insulina (5 nM) e na ausência de insulina na Publicação da Patente U.S. N.° 20040259780. Além disso, o FGF-21 induz a absorção da glicose num modelo de tecido ex vivo, descrito na Publicação da Patente U.S. N.0 20040259780. A absorção de glicose em adipócitos 3T3-1 pode ser avaliada utilizando o seguinte método. As células 3T3-L1 são obtidas a partir da Coleção de Culturas Tipo Americana (ATCC, Rockville, Md.). As células são cultivadas em meio de crescimento (GM) que contém 10 % de soro fetal bovino enriquecido com ferro em meio de Eagle modificado por Dulbecco. Para a diferenciação do adipócito padrão, 2 dias após as células terem atingido confluência (referida como dia 0), as células são expostas ao meio de diferenciação (DM) que contém 10 % de soro fetal bovino, 10 mg/ml de insulina, 1 mM de dexametasona, e 0,5 mM de isobutilmetiloxantina, durante 48 horas. As células são depois mantidas em meio de pós diferenciação que contém 10 % de soro fetal bovino, e 10 mg/ml de insulina. A potência in vitro pode ser medida com um ensaio de absorção de glicose que são conhecidos daqueles com habilitação ordinária na arte. A potência in vitro pode ser definida como a medida da absorção de glicose de um composto FGF-21 num ensaio baseado em células e é uma medida da potência biológica do composto FGF. Pode ser expresso como a EC50 299 que é a concentração eficaz do composto que resulta em 50 % da actividade numa experiência de resposta de dose única.
Ensaio de transporte da glicose dependente da insulina a absorção da hexose, como ensaiado pela acumulação de 0,1 mM de 2-deoxi-D- [14C] glicose, é medida como se segue: adipócitos 3T3-L1 em placas com 12 poços são lavados duas vezes com tampão KRP (136 mM de NaCl, 4, 7 mM de KC1, 10 mM de NaP04, 0,9 mM de CaCl2, 0,9 mM de MgSCq, pH 7,4) aquecido a 37° C e contendo 0,2 % de BSA, incubado em meio L-15 de Leibovitz contendo 0,2 % de BSA durante 2 horas a 37° C ao ar livre, lavado duas vezes de novo com KRP contendo, 0,2 % de tampão BSA, e incubado em KRP, 0,2 % de tampão BSA na ausência (Me2SO apenas) ou presença de wortmannin durante 30 minutos a 37° C ao ar livre. A insulina é depois adicionada a uma concentração final de 100 nM durante 15 minutos, e a absorção de 2-deoxi-D-[ 14C]glicose é medida durante os últimos 4 minutos. A absorção não especifica, medida na presença de 10 mM de citocalasina B, é subtraída de todos os valores. As concentrações da proteína são determinadas com o ensaio do ácido bicinconínico de Pierce. A absorção é medida rotineiramente em triplicado ou quadruplicado para cada experiência. 0 efeito do pré-tratamento agudo e crónico dos adipócitos 3T3-L1 com FGF-21 na presença de insulina pode ser investigado.
Ensaio de transporte da glicose independente da insulina os fibroblastos 3T3-L1 são colocados numa placa com 96 poços e diferenciados em células adiposas (adipócitos) durante 2 semanas. Após a diferenciação passam fome em meio livre de soro e são tratadas com FGF- 21 durante 24 horas. Em tratamento, as células são lavadas duas vezes com tampão KRBH, contendo 0,1 % de BSA. A absorção de glicose é realizada na presença de glicose rotulada (sem insulina) em tampão KPBH. Foi demonstrado que o FGF-21 estimula a absorção de glicose em adipócitos 3T3-L1 numa maneira dependente da concentração a uma 300 concentração subótima de insulina (5 nM) e na ausência de insulina (ver Publicação da Patente U.S. N.° 2004259780). Além disso, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção podem induzir a absorção de glicose num modelo de tecido ex vivo.
No modelo de transporte da glicose ex vivo, o ensaio de transporte da glicose é descrito como se segue: Soluções Tampão de Stock-Stock 1 de Krebs-Henseleit: NaCl (1,16 M); KC1 (0, 046 M) ; KH2P04 (0,0116 M) ; NaHC03 (0, 0253 M) . Stock 2: CaCl2 (0,025 M) ; MgS04 (2H20) (0,0116 M) . BSA: A utilização de ICN Cohn Fracção V, ácido gordo livre BSA directamente sem dialisar. Preparação do meio: adicionar 50 ml de Krebs stock 1 a 395 ml de dH20 e gás com 95 % 02/5 % C02 durante 1 hora. Adicionar 50 ml de stock 2 e trazer para 500 ml com dH20. Adicionar 500 mg de ICN ácido gordo livre BSA. Meios de pré-incubação e de incubação: 32 mM de manitol, 8 mM de meio de lavagem de glicose: 40 mM de manitol, 2 mM de piruvato. Meio de transporte: 39 mM de manitol, 1 mM de 2-DG; 32 mM de manitol, 8 mM de 3-O-MG. Solução de insulina: (Insulina Porcina [Lilly] 100.000,000 mU/ml) a uma concentração final de 2000 mU/ml ou 13,3 nM. Preparação dos meios de rotulagem radioativo: actividades especificas utilizadas: 2DG=1,5 mCi/ml; 3-0-G=437 mCi/ml; ou, manitol=8 mCi/m. Foram anestesiados ratos com 0,1 cc de Nembutal por 100 g de peso corporal. 0 tecido muscular é excisado e enxaguado em 0,9 % de solução salina, depois colocado em meio de pré-incubação (2 ml) a 29° C durante 1 hora. O tecido muscular é transferido para meio de incubação (2 ml; o mesmo que o da pré-incubação exceto que incluindo insulina ou composto teste) e incubado durante 30 minutos (depende das condições experimentais). O tecido muscular é depois transferido para meio de lavagem (2 ml) durante 10 minutos a 29°C, depois transferido para meio de rotulagem (1,5 ml) durante 10 minutos (3-O-MG) ou 20 minutos (2DG). O tecido muscular é aparado, pesado e 301 colocado em tubos de polipropileno em gelo seco. 1 ml de 1 N KOH é adicionado aos tubos que são de pois colocados num banho de água a 70° C durante 10-15 minutos, agitando os tubos num vórtice cada poucos minutos. Os tubos são arrefecidos em gelo e 1 ml de 1 NHC1 é adicionado, depois bem misturado. 200 ml de sobrenadante é depois colocado em tubos de cintilação duplicados e contados num contador de cintilação comparados com padrões radioativos conhecidos.
Para contração, os músculos são primeiro incubados durante 1 hora em meio de pré-incubação/incubação. Após 1 hora, um músculo de cada par (um par por rato) é preso com um alfinete ao aparelho de estimulação e o outro músculo é transferido para um novo frasco de meio de incubação. O músculo contraído é estimulado por treinos de 200 msegundos de 70 Hz sendo cada impulso num treino de 0,1 msegundos. Os treinos são entregues a 1/segundo a 10-15V durante 2x10 minutos com 1 minuto de descanso pelo meio. No final do período de estimulação, o músculo é removido do aparelho de estimulação e colocado em meio de lavagem durante 10 minutos, seguido de meio de rotulagem como definido anteriormente. O receptor do FGF pode ser preparado utilizando técnicas e métodos que são conhecidos por alguém com habilitação comum na arte. A actividade do polipéptido FGF-21 pode ser determinada usando ensaios in vitro ou in vivo padrão ou conhecidos. Para um polipéptido FGF-21 PEGilado ou não PEGilado compreendendo um aminoácido não natural, a afinidade do FGF-21 pelo seu receptor pode ser medida utilizando um biosensor BIAcore™ (Pharmacia).
Independentemente de que métodos são utilizados para criar os polipéptidos FGF-21, os polipéptidos FGF-21 são sujeitos a ensaios para actividade biológica. Em geral, o teste para actividade biológica deveria providenciar uma análise para o resultado desejado, tal como aumento ou diminuição na actividade biológica (como comparado com FGF- 302 21 modificado), actividade biológica diferente (como comparado com FGF-21 modificado), análise de afinidade do receptor ou do parceiro de ligação, alterações estruturais ou conformacionais do próprio FGF-21 ou do seu receptor (como comparado com o FGF-21 modificado), ou análise da meia-vida do soro. A compilação de referências anterior para metodologias de ensaios não é exaustiva, e aqueles com habilitação comum na arte reconhecerão outros ensaios úteis para testar o resultado final desejado. XIII. Medição de potência, semivida funcional in vivo, e parâmetros farmocinéticos
Um importante aspecto da invenção é a semivida biológica prolongada, que se obtém através de construção do polipéptido FGF-21 com a conjugação do polipéptido com um meio polimérico solúvel. A diminuição rápida pós-administração das concentrações séricas do FGF-21 tornou importante avaliar as respostas biológicas ao tratamento com o polipéptido FGF-21 conjugado e não conjugado e respectivas variantes. 0 polipéptido FGF-21 conjugado e não conjugado e as respectivas variantes da presente invenção poderão ter semividas séricas prolongadas também pós-administração, através, por exemplo, da via subcutânea ou i.v., tornando possível a sua medição através, por exemplo, do método ELISA ou através de um ensaio de varrimento primário. É possível usar kits ELISA ou RIA de fontes comerciais. A medição da semivida biológica in vivo pode ser realizada como descrito no presente documento. A potência e a semivida funcional in vivo de um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado de modo não natural podem ser determinadas de acordo com os protocolos conhecidos dos especialistas da técnica.
Os parâmetros farmocinéticos para um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado de modo não natural podem ser avaliados em ratos macho Sprague-Dawley 303 normais (N=5 animais por grupo de tratamento). Os animais receberão uma dose única de 25 pg/rato iv ou 50 pg/rato sc, e serão tiradas aproximadamente 5-7 amostras de sangue de acordo com uma evolução de tempo pré-definida, cobrindo em geral cerca de 6 horas para um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural, não conjugado com um polimero hidrossolúvel, e cerca de 4 dias para um polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural e conjugado com um polimero hidrossolúvel. Os dados farmocinéticos para o FGF-21 sem um aminoácido codificado de forma não natural podem ser comparados directamente com os dados obtidos para polipéptidos FGF-21 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural.
Os parâmetros farmocinéticos também podem ser avaliados num primata, por exemplo, macacos cynomolgus. Tipicamente, ministra-se uma única injecção seja subcutaneamente ou por via intravenosa, e os níveis dos FGF-21 séricos são monitorizados ao longo do tempo. A actividade específica dos polipéptidos FGF-21 de acordo com a presente invenção pode ser determinada através de diversos ensaios conhecidos do estado da técnica. A actividade biológica das muteínas do polipéptido FGF-21, ou dos respectivos fragmentos, obtidos e purificados de acordo com a presente invenção, pode ser testada através dos métodos descritos ou referenciados no presente documento ou conhecidos dos especialistas comuns da técnica.
Os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados para tratar animais que padeçam de diabetes mellitus não insulino-dependente (tipo II), diabetes insulino-dependente (tipo I), bem como obesidade, eliminação deficiente da glicose, hiperglicemia, hiperinsulinemia, e semelhantes. O FGF-21 é eficaz em modelos animais da diabetes e da obesidade, como mostrado na publicação de patente US N.° 20040259780 . Dado que os 304 perfis metabólicos diferem entre diversos modelos animais da obesidade e da diabetes, foram realizadas análises de múltiplos modelos de modo a separar os efeitos da hiperinsulinemia, da hiperglicemia e da obesidade. Os ratinhos diabéticos (db/db) e obesos (ob/ob) são caracterizados por obesidade massiva, hiperfagia, hiperglicemia variável, insulinorresistência, hiperinsulinemia e termogénese deficiente (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, in Diabetes Mellitus; H. Rifkin e D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nova Iorque, ed. 4, 1990), pág. 299-340). Porém, a diabetes é muito mais grave no modelo db/db (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, in Diabetes Mellitus; H. Rifkin e D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nova Iorque, ed. 4, 1990), pág. 299-340). As ratos Zucker (fa/fa) são gravemente obesas, hiperinsulinémicas e insulinorresistentes (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, in Diabetes Mellitus; H. Rifkin e D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nova Iorque, ed. 4, 1990), pág. 299-340), e a mutação fa/fa poderá ser o equivalente na rato da mutação db murina (Friedman et al. , Cell 69:217-220, 1992; Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7806, 1991). Os ratinhos Tubby (tub/tub) são caracterizados por obesidade, insulinorresistência moderada e hiperinsulinemia sem hiperglicemia significativa (Coleman et al., J. Heredity 81: 424, 1990) . O modelo do monossódio-glutamato (MSG) para a obesidade de indução química (Olney, Science 164:719, 1969; Cameron et al., Cli. Exp. Pharmacol. Physiol. 5:41, 1978), onde a obesidade é menos grave do que nos modelos genéticos e evolui sem hiperfagia, hiperinsulinemia e insulinorresistência, também poderá ser analisado. Por fim, o modelo da estreptozotocina (STZ) para a diabetes de indução química pode ser testado para analisar os efeitos 305 da hiperglicemia na ausência de obesidade. Os animais tratados com STZ têm défice de insulina e são gravemente hiperglicémicos (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, in Diabetes Mellitus; H. Rifkin e D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nova Iorgue, ed. 4, 1990), pág. 299-340).
Os polipéptidos FGF-21 da invenção podem ser avaliados num modelo de choque séptico in vivo em ratinhos ob/ob. Ver a publicação de patente U.S. N.° 20050176631. XIV. Administração e composições farmacêuticas
Os polipéptidos ou as proteínas da invenção (inclusive, mas sem limitação a estes, FGF-21, sintetases, proteínas compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais, etc.) são opcionalmente empregues para fins terapêuticos, inclusive, mas sem ficarem a isso limitados, em combinação com um suporte farmacêutico apropriado. Essas composições, por exemplo, compreendem uma quantidade com eficácia terapêutica do composto, e um suporte ou excipiente aceitável em farmácia. Esse suporte ou excipiente inclui, sem ficar a isso limitado, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose, água, glicerol, etanol, e/ou combinações dos mesmos. A formulação é concebida para ser apropriada para o modo de administração. Em geral, os métodos de administração de proteínas são conhecidos dos especialistas comuns da técnica e podem ser aplicados à administração dos polipéptidos da invenção.
As composições terapêuticas compreendendo um ou mais polipéptidos da invenção são opcionalmente testadas num ou em mais modelos animais in vitro e/ou in vivo apropriados de doença, de modo a ajusta-los em termos de eficácia, metabolismo tecidular e para fazer estimativas de doses, de acordo com os métodos conhecidos dos especialistas comuns da técnica. Em particular, as dosagens podem ser inicialmente determinadas através de actividade, 306 estabilidade ou de outras medições apropriadas de homólogos de aminoácidos não naturais aqui presentes com naturais (inclusive, mas sem ficarem a isso limitados, comparação de um polipéptido FGF-21 modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais com um polipéptidos FGF-21 de aminoácidos naturais), ou seja, num ensaio relevante. A administração pode ser realizada por qualquer uma das vias normalmente empregues para introduzir uma molécula em contacto final com células sanguíneas ou tecidulares. Os polipéptidos de aminoácidos não naturais da invenção são ministrados de qualquer maneira apropriada, opcionalmente com um ou mais suportes aceitáveis em farmácia. Os métodos apropriados de administração desses polipéptidos no contexto da presente invenção a um doente estão disponíveis e, embora mais do que uma via possa ser utilizada para administrar uma composição particular, uma via particular poderá com frequência proporcionar uma acção ou uma reacção mais imediata e mais eficaz do que outra via.
Os suportes aceitáveis em farmácia são em parte determinados pela composição particular que é ministrada, bem como pelo método particular utilizado para ministrar a composição. Em conformidade com isso, existe uma grande variedade de formulações apropriadas das composições farmacêuticas da presente invenção.
Os polipéptidos FGF-21 da invenção podem ser ministrados através de qualquer via convencional apropriada para proteínas ou péptidos, inclusive, sem ficarem a isso limitados, a via parenteral, por exemplo, injecções inclusive, sem ficarem a isso limitadas, por via subcutânea ou intravenosa ou qualquer outra forma de injecções ou infusões. As composições de polipéptidos podem ser ministradas por uma série de vias, inclusive, sem ficarem a isso limitadas, via oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, subcutânea, tópica, sublingual, ou rectal. As composições compreendendo 307 polipéptidos de aminoácidos não naturais, modificados ou não modificados, podem também ser ministradas através de lipossomas. Essas vias de administração e as formulações apropriadas são em geral conhecidas dos especialistas da técnica. O polipéptido FGF-21 pode ser empregue por si só ou em combinação com outros componentes apropriados, como é o caso de um suporte farmacêutico. O polipéptido FGF-21 pode ser utilizado em combinação com outros agentes, inclusive, mas sem ficar a isso limitado, um agente antidiabético oral. O termo "agente antidiabético" deverá significar qualquer fármaco que possa ser empregue no tratamento, na prevenção ou então na redução da gravidade de um qualquer distúrbio do metabolismo da glicose, ou de respectivas complicações, inclusive quaisquer umas das condições, doença ou complicações descritas no presente documento. Os agentes antidiabéticos incluem insulina, tiazolidinodionas, sulfonilureias, derivados do ácido benzóico, inibidores da alfa-glicosidase, ou semelhantes. Outras categorias gerais de agentes antidiabéticos que poderão ser parte de uma composição em questão incluem (estando os termos definidos entre aspas): "produtos farmacológicos" reconhecidos na United States Pharmacopoeia oficial ou no National Formulary oficial (ou qualquer respectivo suplemento); "novo fármaco" e "novo fármaco animal" aprovados pela FDA dos E.U.A, tal como esses termos são empregues no Titulo 21 do United States Code; qualquer fármaco que requeira aprovação de uma entidade governamental, nos Estados Unidos ou fora dos Estados Unidos ("fármaco aprovado"); qualquer fármaco que seja necessário para obter aprovação regulamentar de modo a estar em conformidade com o 21 U.S.C. .sctn.355(a) ("fármaco aprovado regulamentar"); qualquer agente que seja ou que tenha sido sujeito a uma aplicação farmacológica a humanos ao abrigo do 21 U.S.C..sctn.379(g) ("fármaco humano"). (todas as 308 referências a código estatutário para esta definição referem-se a esse código como a data de registo original do presente pedido.) Outros agentes antidiabéticos são revelados no presente documento e são conhecidos dos especialistas da técnica. Os fármacos ou agentes antidiabéticos actuais empregues na gestão da diabetes do tipo II que são bem conhecidos do estado da técnica incluem uma série de categorias: as biguanidas, tiazolidinodionas, as sulfonilureias, derivados do ácido benzóico e inibidores da glicosidase. Estes fármacos têm usualmente modos de acção distintos. Pensa-se que as biguanidas, por exemplo, a metformina, previnem a gliconeogénese hepática excessiva. Pensa-se que as tiazolidinodionas actuam fazendo aumentar a taxa de eliminação periférica da glicose. As sulfonilureias, por exemplo, a tolbutamida e a gliburida, e os derivados do ácido benzóico, por exemplo, a repaglinida, reduzem a glicose plasmática ao estimular a secreção de insulina. Os inibidores da alfa-glicosidase inibem de forma competitiva a alfa-glicosidase, que metaboliza os hidratos de carbono, retardando assim a absorção dos hidratos de carbono e atenuando a hiperglicemia pós-prandial. Além disso, existe uma série de terapias propostas para o tratamento da diabetes que ainda não foram aprovadas para utilização humana.
Os fármacos ou os agentes antidiabéticos actuais, empregues na gestão da diabetes e dos seus síndromas precursores, como a insulinorresistência, que são bem conhecidos do estado da técnica, incluem cinco classes de compostos: as biguanidas, por exemplo, metformina; tiazolidinodionas; as sulfonilureias, por exemplo, tolbutamida e gliburida; derivados do ácido benzóico, por exemplo repaglinida; e inibidores da glicosidase. Além destes agentes, é possível recorrer a uma série de outras terapias em combinação com os polipéptidos FGF-21 da presente invenção, para melhorar o controlo da glicose, 309 inclusive, sem se ficar a eles limitado, inibidores da DPP-4. Alguns destes agentes antidiabéticos foram aprovados para utilização humana. Os compostos de DPP-4 principais testados em ensaios clínicos incluem Vildagliptin (Galvus) (LAF237), Sitagliptin (Januvia), Saxagliptin e Alogliptin. A Januvia (Sitagliptin) foi aprovada para o tratamento da diabetes do tipo II nos Estados Unidos em 17 de Outubro de 2006, com vista à utilização como monoterapia ou como terapia combinada com a metformina ou com uma tiazolidinodiona. A administração do composto Novartis de primeira geração 1-[[[2-[(5-ciano-piridin-2-il)-amino]-etil]-amino]-acetil]-2-ciano-(S)-pirrolidina (NVP DPP728) durante um período de 4 semanas a 93 doentes com diabetes do tipo II (HbAlc média de 7,4 %) reduziu os níveis de glicose plasmática, insulina e HbAlc durante o período de estudo de 4 semanas. Ver Inhibition of Dipeptidyl Peptidase IV Improves Metabolic Control Over a 4-Week Study Period in Type 2 Diabetes. Diabetes Care. Maio de 2002; 25 (S) : 869-875. Também se observou que os doentes que recebiam metformina apresentavam benefícios de redução da glicose aditivos no seguimento da implementação da terapia com GLP-1. Ver Additive glucose-lowering effects of glucagon-like peptide-1 and metformin in type 2 diabetes. Diabetes Care. Abril de 2001; 24(4):720-5. Num estudo de 10 doentes masculinos não diabéticos obesos, a administração da metformina estava associada a níveis mais elevados de GLP-1 em circulação a seguir a incremento oral de glicose, e em experiências utilizando plasma humano colectivo, a metformina (0,1-0,5 microg/mL) inibiu de forma significativa a degradação de GLP-1(7-36)amida a seguir a incubação durante 30 min nos 37 graus C, na presença ou na ausência da DPP-4. Os autores deste estudo levantaram a possibilidade de a metformina poder inibir a decomposição enzimática do GLP-1 tanto in vitro como in vivo. Ver Effect of metformin on glucagon-like peptide I (GLP-1) and leptin 310 leveis in obese nondiabetlc subjects. Diabetes Care. Março de 2001; 24(3):489-94. Analysls of the relationshlp between DPP-4, and GLP-1 degradation uslng blochemical analyses in vitro. Demuth et al. não descobriram qualquer efeito da metformina na degradação mediada pela DPP-4 do GLP-1 utilizando uma série de fontes de DPP-4 humana. Ver Meformin Effects on Dipeptidylpeptidase IV Degradation of Glucagon-like Peptide-1. Biochem Biophys Res Commun. 15 de Março de 2002; 291(5):1302-8.
Dentre as biguanidas que podem ser utilizadas como agentes terapêuticos diabéticos, a metformina deu mostras de ser particularmente bem sucedida. A metformina (N,N-dimetilimidodicarbonimidicdiamida; 1,1-dimetilbiguanida; N,N-dimetilbiguanida; N,N-dimetilbiguanida; N'-dimetilguanilguanidina) é um agente antidiabético que actua através da redução da produção de glicose pelo fígado e através da redução da absorção intestinal de glicose. Também se pena que melhora a sensibilidade à insulina dos tecidos noutro local do corpo (aumenta a absorção e a utilização de glicose periférica). A metformina melhora a tolerância à glicose no caso de sujeitos intolerantes à glicose (IGT) e de sujeitos com diabetes do tipo II, reduzindo a glicose plasmática tanto pré-prandial como pós-prandial. A metformina não é geralmente eficaz na ausência de insulina. Bailey, Diabetes Care 15:755-72 (1992). A eficácia da metformina foi demonstrada em diversos ensaios. Num estudo de diabéticos do tipo II moderadamente obesos, os valores da HbAlc melhoraram de 8,6 % para 7,1 % passadas 29 semanas de terapia unicamente com metformina ou em combinação com sulfonilureia. DeFronzo et al., New Engl. J. Med. 333:541-49 (1995). A metformina também teve um efeito favorável nos lípidos séricos, reduzindo os níveis de triglicéridos séricos em jejum médios, colesterol total e colesterol LDL e não mostrando efeitos secundários noutros valores lipídicos. Noutro ensaio, a metformina 311 melhorou o controlo glicémico em sujeitos com diabetes do tipo II de modo relacionado com a dose. Passadas 14 semanas, a metformina de 500 e a de 2000 mg ao dia reduziram a HbAlc em 0,9 % e 2,0 %, respectivamente. Garber et al., Am J. Med. 102 : 491-97 (1997). A metformina também poderá ter um efeito terapêutico favorável em não diabéticos insulinorresistentes. Um estudo indicava que o tratamento de mulheres não diabéticas obesas e hipertensas com a metformina diminuía a pressão arterial, o fibrinogénio de insulina plasmático estimulado por glicose. Giugliano et al., Diabetes Care 16:1387-90 (1993). A metformina é geralmente ministrada na forma de HC1-metformina. Esta e todas as outros formas úteis da metformina encontram-se contempladas para serem empregues com os polipéptidos FGF-21 da presente invenção. Em geral, um regime de dosagem fixa encontra-se individualizado para gerir a hiperglicemia na diabetes com a HCl-metformina ou com qualquer outro agente farmacológico. A individualização da dosagem é realizada com base tanto na eficácia como na tolerância, não excedendo geralmente a dose diária máxima recomendada de 2550 mg.
As tiazolidinodionas contempladas para utilização na realização da presente invenção incluem troglitazona, e semelhantes. Estes compostos são bem conhecidos, por exemplo, como descritos nas patentes U.S. N.°s 5.223.522, 5.132.317, 5.120.754, 5.061.717, 4.897.405, 4.873.255, 4.687.777, 4.572.912, 4.287.200 e 5.002.953; e em Current Pharmaceutical Design 2:85-101 (1996). A troglitazona é um agente anti-hiperglicémico oral que aumenta o transporte de glicose, possivelmente através da activação do Receptor γ Activado por Proliferadores de Peroxissomo [peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARy)]. Com essa activação, a troglitazona poderá aumentar a expressão dos transportadores de glicose GLUT4, resultando num aumento da absorção de glicose insulino-estimulada. A troglitazona 312 também poderá atenuar a gliconeogénese e/ou a activaçao da glicólise. A HbAlc é um teste do sangue que mede a quantidade de glicosilado que é geralmente mais elevada quando o doente passou por períodos de elevados níveis de glicose no sangue. 0 teste fornece uma estimativa dos últimos 2-3 meses de gestão da diabetes de um doente. 0 controlo glicémico resultante da terapia com troglitazona reduz a HbAlc em aproximadamente 1 a 2 %. Mimura et al., Diabetes Med. 11:685-91 (1994); Kumar et al., Diabetologia 39:701-09 (1996). Os efeitos poderão não ocorrer durante algumas semanas após o início da terapia. A troglitazona também poderá reduzir as necessidades em termos de insulina. Num ensaio com doentes com diabetes do tipo II e utilizando insulina exógena, a HbAlc média decresceu em 0,8 % e 1,4 % para doses de 200 e 600 mg de troglitazona, respectivamente. As necessidades em termos de insulina decresceram até 29 %. Schwartz et al., New Engl. J. Med. 338:861-66 (1998). Noutro estudo com diabéticos tipo II utilizando troglitazona de 400 e 600 mg, ocorreu uma redução dos niveis de glicose em jejum e pós-prandial, e o clamp euglicémico hiperinsulinémico indicava que a eliminação de glicose era de aproximadamente 45 % acima de níveis de pré-tratamento. Maggs et al., Ann. Intern. Med. 128:176-85 (1998) .
Num estudo, 400 mg de troglitazona aumentaram as taxas de eliminação de glicose em doentes obesos com intolerância à glicose ou com tolerância normal à glicose. Nolan et al., New Eng. J. Med 331:1188-93 (1994). Noutro estudo de mulheres com IGT e um histórico de diabetes gestacional, 600 mg de troglitazona melhoraram a homeostasia da insulina, melhorando inclusivamente a sensibilidade à insulina e reduzindo as concentrações de insulina em circulação, mas a tolerância à glicose manteve-se inalterada. Berkowitz et al., Diabetes 45:172-79 (1996). As 313 tiazolidinodionas podem ser utilizadas com populações em risco de contrair diabetes do tipo II, como é o caso de mulheres com POCS ou GDM, para prevenir ou retardar o aparecimento da diabetes do tipo II. Patente U.S. N.° 5.874.454. As quantidades eficazes de troglitazona, quando utilizadas por si só, variam de cerca de 10 mg a cerca de 800 mg por dose diária, e um intervalo de quantidades correspondente encontra-se contemplado com vista à utilização na presente invenção. Além da sua utilização com metformina, a troglitazona poderá ser utilizada em combinação com a insulina e com um agente de sulfonilureia. Ver, por exemplo, a patente U.S. N.° 5.859.037.
As sulfonilureias geralmente funcionam reduzindo a glicose plasmática através do aumento da liberação de insulina do pâncreas. Especificamente, as sulfonilureias actuam através do bloqueio dos canais de potássio sensíveis a ATP. A sulfonilureia glimepirida também poderá aumentar a sensibilidade à insulina, ao estimular a translocação dos transportadores GLUT4. As sulfonilureias são tipicamente prescritas se a HbAlc for superior a 8 %. Ver também a patente U.S. N.°s 5.258.185, 4.873.080.
As sulfonilureias são uma classe de compostos bem conhecida do estado da técnica, como descrito, por exemplo, nas patentes U.S. N.°s 3.454.635, 3.669.966, 2.968.158, 3.501.495, 3.708.486, 3.668.215, 3.654.357 e 3.097.242. Os exemplos de sulfonilureias contempladas para utilização em determinadas execuções da presente invenção (com dosagens diárias típicas indicadas em parêntesis), incluindo aceto-hexamida (numa quantidade de cerca de 250 a cerca de 1500 mg) , cloropropamida (numa quantidade de cerca de 10 0 a cerca de 500 mg) , tolazimida (numa quantidade de cerca de 100 a cerca de 1000 mg), tolbutamida (numa quantidade de cerca de 500 a cerca de 3000 mg), gliclazida (numa quantidade de cerca de 80 a cerca de 320 mg) , glipizida (numa quantidade de cerca de 5 a cerca de 40 mg), glipizida 314 GITS (numa quantidade de cerca de 5 a cerca de 20 mg), gliburida (numa quantidade de cerca de 1 a cerca de 20 mg), gliburida micronizada (numa quantidade de cerca de 0,75 a cerca de 12 mg), glimeperida (numa quantidade de cerca de 1 a cerca de 8 mg), AG-EE 623 ZW, e semelhantes. A glimepirida é o primeiro agente antidiabético nesta classe a ser aprovado para utilização com insulina, podendo haver um menor risco de hipoglicemia associada à sua utilização.
Uma série de inibidores da alfa-glicosidase poderá ser utilizada com a presente invenção para tratar e/ou prevenir a diabetes. Estes inibidores inibem de forma competitiva a alfa-glicosidase, que metaboliza os hidratos de carbono, retardando assim a absorção dos hidratos de carbono e atenuando a hiperglicemia pós-prandial. Clissod et al., Drugs 35:214-23 (1988). A redução da glicose poderá ser demonstrada através de diminuição dos níveis de HbAlc. Os exemplos de inibidores da alfa-glicosidase contemplados para a utilização na realização da presente invenção incluem acarbose, miglitol, e semelhantes. Doses eficazes tanto de acarbose como de miglitol encontram-se entre cerca de 25 e cerca de 300 mg por dia. É possível empregar os inibidores da alfa-glicosidase com os polipéptidos da presente invenção, em combinação com sulfonilureias. Demonstrou-se que os inibidores da alfa-glicosidase em combinação unicamente com sulfonilureias diminuem em geral os níveis de HbAlc entre cerca de 0,5 e 1,0 %. Além disso, demonstrou-se que os inibidores da alfa-glicosidase são eficazes na redução do aumento pós-prandial da glicose do sangue. Lefevre et al., Drugs 44:29-38 (1992) . É possível utilizar uma série de derivados do ácido benzóico com os polipéptidos da presente invenção no tratamento e/ou na prevenção da diabetes. Estes agentes, também conhecidos por meglitinidas, são agentes hipoglicémicos não-sulfonilureia, tendo capacidade de 315 secreção de insulina. Por exemplo, a repaglinida parece ligar-se a canais de potássio sensíveis a ATP em células beta pancreáticas, aumentando assim a secreção de insulina. Os exemplos de derivados do ácido benzóico contemplados para utilização na realização da presente invenção incluem a repaglinida e semelhantes. No caso da repaglinida, a dosagem diária eficaz poderá encontrar-se entre cerca de 0,5 mg e cerca de 16 mg, e o agente poderá ser tomado antes de cada refeição.
Uma série de agentes encontra-se actualmente sob investigação como antidiabéticos potenciais nos humanos. Qualquer um desses agentes poderá ser empregue com os polipéptidos da presente invenção, com vista ao tratamento e/ou à prevenção de distúrbios metabólicos, e em particular da diabetes, caso fiquem disponíveis para utilização terapêutica.
Outra categoria de agentes antidiabéticos, consistindo em inibidores da carnitina palmitoil-transferase I (CPT-I), como o etomoxir, que é uma execução adicional da invenção, poderá ser utilizada com os polipéptidos FGF-21 modificados para modular a glicose do sangue. O etomoxir inibe de modo irreversível a carnitina palmitoil-transferase I, a qual é necessária na oxidação dos ácidos gordos. Essa inibição poderá reduzir a hiperglicemia em jejum, pois os produtos da oxidação de ácidos gordos estimulam a gliconeogénese hepática. O etomoxir poderá melhorar a sensibilidade à insulina nos diabéticos do tipo II. Hubinger et al., Hormone Metab. Res. 24:115-18 (1992).
Outros agentes antidiabéticos conhecidos incluem preparações de insulina (por exemplo, preparações de insulina animal extraídas do pâncreas de bovinos e suínos; preparações de insulina humana geneticamente sintetizada utilizando Escherichia coli, levedura; zinco-insulina; protamina-zinco-insulina; fragmento ou derivado de insulina (por exemplo, INS-1), preparação de insulina oral), 316
sensibilizadores à insulina (por exemplo, pioglitazona ou um respectivo sal (preferencialmente hidrocloreto), rosiglitazona ou um respectivo sal (preferencialmente maleato), Ne-toglitazone, Rivoglitazone (CS-011), FK-614, o composto descrito no WOOl/38325, Tesaglitazar (AZ-242), Ragaglitazar (N,N-622), Muraglitazar (BMS-298585), Edaglitazone (BM-13-1258), Metaglidasen (MBX-102); Naveglitazar (LY-519818), MX-6054, LY-510929, AMG-131 (T-131), THR-0921), inibidores da α-glicosidase (por exemplo, voglibose, acarbose, miglitol, emiglitato, etc.), biguanidas (por exemplo, fenformina, metformina, buformina ou um respectivo sal (por exemplo, hidrocloreto, fumarato, succinato)), secretagogos de insulina [sulfonilureia (por exemplo, tolbutamida, glibenclamida, gliclazida, cloropropamida, tolazamida, aceto-hexamida, gliclopiramida, glimepirida, glipizida, glibuzol), repaglinida, nateglinida, mitiglinida ou respectivo hidrato de sal de cálcio], inibidores da dipeptidil peptidase IV (por exemplo, Vidagliptin (LAF237), P32/98, Sitagliptin (MK-431), P93/01, PT-100, Saxagliptin (BMS-477118), T-6666, TS-021), .beta.3-agonistas (por exemplo, AJ-9677), agonistas de GPR40, polipéptidos do tipo glucagona (I) (glp 1), (glp2), ou outras hormonas peptídicas diabetogénicas, agonistas do receptor do GLP-1 [por exemplo, GLP-1, agente GLP-1MR, N,N-2211, AC-2993 (exendina-4) , BIM-51077, Aib(8,35)hGLP-1 (7,37)NH.sub.2, CJC-[131], agonistas da amilina (por exemplo, pramlintida), inibidores da fosfotirosina fosfatase (por exemplo, vanadato de sódio), inibidores da gliconeogénese (por exemplo, inibidores da glicogénio fosforilase, inibidores da glicose-6 fosfatase, antagonistas da glucagona), inibidores do SGLUT (cotransportador de sódio-glicose = sodium-glucose cotransporter) (por exemplo, T-1095), inibidores da 11.beta.-hidroxiesteróide desidrogenase (por exemplo, BVT-3498), adiponectina ou os seus agonistas, inibidores de IKK 317 (por exemplo, AS-2868), fármacos que melhoram a resistência à leptina, agonistas do receptor da somatostatina (os compostos descritos nos WO01/25228, WO03/42204, W098/44921, W098/45285, W099/2273.5, etc.), activadores da glicocinase (por exemplo, R.sup.o-28-1675) , GIP (péptido insulinotrópico dependente da glicose = Glucose-dependent insulinotropic peptide) e semelhantes podem ser mencionados. 0 polipéptido FGF-21 compreendendo um aminoácido não natural, seja por si só ou em combinação com outros componentes apropriados, também pode ser produzido na forma de formulações de aerossol (ou seja, pode ser "nebulizado") para ser ministrado através de inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores aceitáveis pressurizados, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogénio, e semelhantes.
As formulações apropriadas para a administração parenteral, tais como, por exemplo, vias intra-articular (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e subcutânea, inclusive soluções injectáveis estéreis isotónicas aquosas e não aquosas, que poderão conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do receptor em questão, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas, que poderão incluir agentes de suspensão, solubilizadores, espessantes, estabilizadores e conservantes. As formulações do FGF-21 podem ser apresentadas em recipientes vedados de dose unitária ou de doses múltiplas, tais como ampolas e frascos. A administração parenteral e a administração intravenosa são métodos preferidos de administração. Em particular, as vias de administração já em utilização para terapêuticas de homólogos de aminoácidos naturais (inclusive, mas sem ficarem a isso limitados, aqueles tipicamente empregues para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, 318 interleucinas, anticorpos, FGFs, e/ou qualquer outra proteína fornecida em farmácia), juntamente com formulações actualmente utilizadas, constituem vias preferidas de administração e de formulação para os polipéptidos da invenção. A dose ministrada a um doente, no contexto da presente invenção, é suficiente para ter uma resposta terapêutica favorável no doente ao longo do tempo, ou outra actividade apropriada, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia do vector, ou da formulação, particular e pela actividade, estabilidade ou semivida sérica do polipéptido de aminoácidos não naturais utilizado e do estado do doente, bem como do peso corporal ou da superfície total do doente a ser tratado. 0 tamanho da dose também é determinado pela existência, pela natureza e pelo grau de quaisquer efeitos secundários adversos que acompanham a administração de um vector, de uma formulação, particular, ou outro do género num doente particular.
Na determinação da quantidade eficaz do vector ou da formulação a ser ministrado/a no tratamento ou na profilaxia de uma doença (inclusive, sem ficar a estes limitada, cancros, doenças herdadas, diabetes, SIDA, ou semelhantes), o médico assistente avalia os níveis plasmáticos em circulação, os níveis de toxicidade da formulação, a progressão da doença e/ou, se relevante, a produção de anticorpos anti-polipéptidos de aminoácidos não naturais. A dose ministrada, por exemplo, a um doente de 70 quilogramas, encontra-se tipicamente numa gama equivalente a dosagens de proteínas terapêuticas actualmente empregues, ajustada para a actividade alterada ou para semivida sérica da composição relevante. Os vectores ou as formulações farmacêuticas da presente invenção podem complementar as condições de tratamento através de qualquer terapia convencional conhecida, incluindo a administração de 319 anticorpos, administração de vacinas, administração de agentes citotóxicos, polipéptidos de aminoácidos naturais, ácidos nucleicos, análogos nucleotidicos, modificadores de respostas biológicas, e semelhantes.
Com vista à administração, as formulações da presente invenção são ministradas a uma taxa determinada pelo LD-50 ou ED-50 da formulação relevante, e/ou pela observação de quaisquer efeitos secundários dos polipéptidos de aminoácidos não naturais em diversas concentrações, incluindo, sem ficaram a essas limitadas, como aplicado à massa e ao estado geral de saúde do doente. É possível conseguir a administração através de doses únicas ou divididas.
Se um doente sujeito a infusão de uma formulação desenvolver febres, arrepios ou dores musculares, ele/ela receberá a dose apropriada de aspirina, ibuprofeno, acetaminofeno ou de outro fármaco de controlo de dor/febre. Os doentes que sofrem de reacções à infusão, como febre, dores musculares e arrepios, são pré-medicados 30 minutos antes das futuras reacções a infusões, com aspirina, acetaminofeno ou, inclusive, sem se ficar a isso limitado, difenidramina. A meperidina é utilizada no caso de arrepios e de dores musculares mais graves, os quais não respondem rapidamente a antipiréticos e a anti-histamínicos. A infusão celular é desacelerada ou descontinuada dependendo da gravidade da reacção.
Os polipéptidos FGF-21 humanos da invenção podem ser ministrados directamente a um sujeito mamífero. A administração é realizada por qualquer uma das vias normalmente utilizadas na introdução do polipéptido FGF-21 num sujeito. As composições de polipéptidos FGF-21 de acordo com as execuções da presente invenção incluem as adequadas a administração oral, rectal, tópica, por inalação (inclusive, sem se ficar a isso limitado, através de um aerossol), bucal (inclusive, sem se ficar a isso 320 limitado, sublingual), vaginal, parenteral (inclusive, sem se ficar a isso limitado, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-articular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial ou intravenosa), tópica (ou seja, tanto superfície de pele como de mucosa, inclusive a superfície das vias respiratórias) e transdérmica, embora a via mais apropriada em qualquer caso vá depender da natureza e da gravidade do estado a ser tratado. A administração poderá ser local ou sistémica. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes vedados de dose unitária ou de doses múltiplas, tais como ampolas e frascos. Os polipéptidos FGF-21 da presente invenção podem ser preparados numa mistura numa forma injectável de dosagem unitária (inclusive, sem se ficar a isso limitado, solução, suspensão ou emulsão) com um suporte aceitável em farmácia. Os polipéptidos FGF-21 da invenção também podem ser ministrados através de infusão contínua (utilizando inclusive, mas sem se ficar a isso limitado, minibombas como as bombas osmóticas), formulações de bolus único ou de deposição de libertação lenta.
As formulações apropriadas para administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotónicas, que poderão conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas, que poderão incluir agentes de suspensão, solubilizadores, espessantes, estabilizadores e conservantes. As soluções e as suspensões podem ser preparadas a partir de pós estéreis, granulados e comprimidos do tipo previamente descrito. A liofilização é uma técnica comumente empregue de apresentação de proteínas, a qual serve para remover água da preparação proteica em questão. A liofilização é um processo onde o material a ser seco é primeiro congelado e depois o gelo ou o solvente congelado é removido por 321 sublimação num ambiente de vácuo. Um excipiente poderá ser incluído em formulações pré-liofilizadas para aumentar a estabilidade durante o processo de liofilização e/ou para melhorar a estabilidade do produto liofilizado aquando do armazenamento. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3): 285-291 (1991). A absorção de líquido pulverizado de fármacos também é conhecida dos especialistas comuns da técnica. Por exemplo, consultar Broadhead, J. et al., "The Spray Dryinq of Pharmaceuticals, " in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992). A par de fármacos de pequenas moléculas, uma variedade de materiais biológicos foi aplicada por absorção de líquido pulverizado e esses incluem: enzimas, soros, plasma, microorganismos e leveduras. A absorção de líquido pulverizado é uma técnica útil, pois consegue converter uma preparação farmacêutica líquida num pó fino, não pulverulento ou aglomerado num processo de etapa única. A técnica básica compreende as quatro etapas seguintes: a) atomização da solução de alimentação num spray; b) contacto spray-ar; c) secagem do spray; e d) separação do produto seco do ar de secagem. As patentes U.S. N.°s 6,235, 710 e 6,001,800 descrevem a preparação de eritropoietina recombinante por absorção de líquido pulverizado.
As composições e formulações farmacêuticas da invenção poderão incluir um suporte, excipiente ou estabilizador aceite em farmácia. Os suportes aceites em farmácia são determinados em parte pela composição particular a ser ministrada, bem como pelo método particular utilizado para ministrar a composição. Em conformidade com isso, existe uma grande variedade de formulações apropriadas de composições farmacêuticas (inclusive suportes, excipientes ou estabilizadores aceites em farmácia opcionais) da presente invenção (consultar, por exemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17.a ed. 1985)). 322
Os suportes apropriados incluem, sem ficarem a eles limitados, tampões contendo succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo, sem ficarem a ele limitados, o ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular, incluindo, mas sem ficarem a eles limitados, menos de cerca de 10 resíduos; proteínas, inclusive, sem ficarem a elas limitadas, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, polivinilpirrolidona; aminoácidos, inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina ou derivados de histidina, metionina, glutamato ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, trealose, sacarose, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, EDTA e edentato-dissódio; iões metálicos bivalentes, inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, zinco, cobalto ou cobre; álcoois de açúcar, inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, manitol ou sorbitol; contra-iões salificantes, inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, sódio e cloreto de sódio; e/ou agentes tensioactivos não iónicos, inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, Tween™ (inclusive, mas sem ficar a estes limitado, Tween 80 (polysorbate 80) e Tween 20 (polysorbate 20), Pluronics™ e outros ácidos plurónicos, inclusive, mas sem ficarem a eles limitados, ácido plurónico F68 (poloxamer 188), ou PEG. Os agentes tensioactivos apropriados incluem, por exemplo, mas sem ficarem a eles limitados, poliéteres com base em poli-(óxido de etileno)-poli-(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), ou seja, (PEO-PPO-PEO) , ou poli-(óxido de propileno)-poli-(óxido de etileno)-poli-(óxido de propileno), ou seja, (PPO-PEO-PPO), ou uma respectiva combinação. Os PEO-PPO-PEO e PPO-PEO-PPO 323 encontram-se disponíveis no mercado com os nomes de marca Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ e R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) e encontram-se ainda descritos na patente U.S. N.° 4,820,352. Outros polímeros em bloco de etileno/polipropileno poderão ser agentes tensioactivos apropriados. Um agente tensioactivo ou uma combinação de agentes tensioactivos poderá ser utilizado/a para estabilizar o FGF-21 PEGguilado contra um ou mais stresses, inclusive, mas sem limitação a este, o stress que resulta de agitação. Alguns dos anteriores poderão ser designados por "agentes de volume." Alguns também poderão ser designados por "modificadores de tonicidade." Também se poderá aplicar conservantes antimicrobianos com vista à estabilidade de produtos e à eficácia antimicrobiana; os conservantes apropriados incluem, sem ficarem a estes limitados, álcool benzílico, cloreto de benzalcónio, metacresol, metilparabeno/propilparabeno, cresol e fenol, ou uma combinação dos mesmos.
Os polipéptidos FGF-21 da invenção ligados a polímeros hidrossolúveis como PEG também podem ser ministrados por ou como parte de sistemas de libertação sustentada. As composições de libertação sustentada compreendem, inclusive mas sem limitação a estas, matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de produtos moldados, inclusive mas sem limitação a estas, películas, ou microcápsulas. As matrizes de libertação sustentada incluem materiais biocompatíveis, tais como poli-(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), acetato de etilenovinilo (Langer et al., supra) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988), polilactidas (ácido poliláctico) (patente U.S. N.° 3,773,919; EP 58,481), poliglicólido (polímero do ácido glicólico) , polilactida-co-glicólido (copolímeros do ácido láctico e do ácido glicólico) polianidridos, copolímeros do ácido L- 324 324 glutâmico e Biopolymers, polipéptidos, condroitina, fosfolípidos, gama-etil-L-glutarnato (Sidman et al., 22, 547-556 (1983), poli(orto)-ésteres, ácido hialurónico, colagénio, sulfato de ácidos carboxilicos, ácidos gordos, polissacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos, tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona e silicone. As composições de libertação sustentada também incluem um composto retido em lipossomas. Prepara-se os lipossomas contendo o composto por métodos de si conhecidos: DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985);
Hwang et al., Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A., 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; patente U.S. N.° 4,619,794; EP 143,949; patente U.S. N.° 5.021.234; pedido de patente nipónico 83-118008; patentes U.S. N.° 4.485.045 e N.° 4.544.545; e EP 102.324.
Os polipéptidos FGF-21 retidos em lipossomas podem ser preparados por métodos descritos, por exemplo, no DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP36,676; patente U.S. N.° 4.619.794; EP 143.949; patente U.S. N.° 5.021.234; pedido de patente nipónica 83-118008; patentes U.S. N.° 4.485.045 e N.° 4.544.545; e EP 102,324. A composição e o tamanho dos lipossomas são bem conhecidos ou podem ser facilmente determinados a nível empírico por um especialista comum da técnica. Alguns exemplos de lipossomas encontram-se descritos, por exemplo, em Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:1327-1331 (1995);
Lasic D e Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery Systems for câncer therapy, in Teicher B (ed): CÂNCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Câncer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et 325 al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002); Mamot C, et al., Câncer Res. 63: 3154-3161 (2003). A dose ministrada a um doente no contexto da presente invenção deverá ser suficiente para levar a uma resposta favorável no sujeito ao longo do tempo. Dum modo geral, a quantidade com eficácia farmacêutica total do polipéptido FGF-21 da presente invenção ministrada por via parenteral por dose encontra-se entre cerca de 0,01 pg/kg/dia e cerca de 100 pg/kg, ou entre cerca de 0,05 mg/kg e cerca de 1 mg/kg, de peso corporal do doente, embora esteja sujeita a discrição terapêutica. A frequência de dosagem também está sujeita a discrição terapêutica, e poderá ser mais frequente ou menos frequente do que os produtos do polipéptido FGF-21 disponíveis no mercado, aprovados para utilização nos humanos. Em geral, um polipéptido FGF-21 PEGuilado da invenção pode ser ministrado através de qualquer uma das vias de administração acima descritas.
Em algumas execuções, os polipéptidos FGF-21 modificados da presente invenção modulam o efeito de um agente antidiabético. Noutra execução da presente divulgação, é possível co-administrar os polipéptidos FGF-21 modificados com um agente antidiabético. Noutra execução da presente divulgação, é possível ministrar os polipéptidos FGF-21 modificados antes do tratamento com um agente antidiabético. Noutra execução da presente divulgação, é possível ministrar os polipéptidos FGF-21 modificados a seguir ao tratamento com um agente antidiabético. Noutra execução da presente divulgação, os polipéptidos FGF-21 modificados são co-ministrados com metformina. Noutra execução da presente divulgação, o tratamento terapêutico com os polipéptidos FGF-21 modificados da invenção e metformina aumenta a capacidade de a metformina modular a glicose plasmática, na presença ou na ausência de insulina. Na terapia combinada, a metformina foi utilizada com sulfonilureias, inibidores da 326 alfa-glicosidase, troglitazeona, e insulina. A metformina combinada com uma sulfonilureia aumenta a sensibilidade à insulina e poderá reduzir a glicose plasmática. Em alternativa, a metformina com repaglinida poderá ser mais eficaz do que a glipizida, e pelo menos tão eficaz como a gliburida, na manutenção do controlo glicémico durante muitos meses. A metformina com a troglitazona melhora o controlo da glicose no caso de excesso de qualquer um dos agentes por si só. Inzucchi et al., New. Eng. J. Med. 338:867-72 (1998). Em algumas execuções da divulgação, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção são co-administrados com a Klotho beta. Em algumas execuções da divulgação, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção são co-administrados com a Klotho beta, que inclui um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente. Em algumas execuções da divulgação, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção são co-administrados com a Klotho beta e com um agente antidiabético. Em algumas execuções da divulgação, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção são co-administrados com um agente antidiabético. Em algumas execuções da divulgação, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção são utilizados em combinação com um ou mais dos seguintes: taurina, ácido alfa-lipóico, um extracto de amora, crómio, glutamina, Enicostemma littorale Blame, Scoparia dulcis, um extracto de estragão e Andrographis paniculata. Em algumas execuções da divulgação, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção são utilizados em combinação com um ou mais dos seguintes: preparações de insulina (por exemplo, preparações de insulina animal extraída do pâncreas de bovinos e suínos; preparações de insulina humana de síntese genética utilizando Escherichia coli, levedura; zinco-insulina; protamina-zinco-insulina; fragmento ou derivado de insulina (por exemplo, INS-1), preparação de insulina oral), sensibilizadores à insulina (por exemplo, pioglitazona ou um respectivo sal 327 (preferencialmente hidrocloreto) , rosiglitazona ou um respectivo sal (preferencialmente maleato) , netoglitazona, Rivoglitazone (CS-011), FK-614, o composto descrito no WO01/38325, Tesaglitazar (AZ-242), Ragaglitazar (N,N-622), Muraglitazar (BMS-298585), Edaglitazone (BM-13-1258), Metaglidasen (MBX-102), Naveglitazar (LY-519818), MX-6054, LY-510929, AMG-131(T-131), THR-0921), inibidores da a-glicosidase (por exemplo, voglibose, acarbose, miglitol, emiglitato, etc.), biguanidas (por exemplo, fenformina, metformina, buformina ou um respectivo sal (por exemplo, hidrocloreto, fumarato, succinato)), secretagogos de insulina [sulfonilureia (por exemplo, tolbutamida, glibenclamida, gliclazida, cloropropamida, tolazamida, aceto-hexamida, gliclopiramida, glimepirida, glipizida, glibuzol), repaglinida, nateglinida, mitiglinida ou um respectivo hidrato de sal de cálcio], inibidores da dipeptidil peptidase IV (por exemplo, Vidagliptin (LAF237), P32/98, Sitagliptin (MK-431), P93/01, PT-100, Saxagliptin (BMS-477118), T-6666, TS-021), .beta.3-agonistas (por exemplo, AJ-9677), agonistas de GPR40, polipéptidos do tipo glucagona (I) (glp I), (glp2), ou outras hormonas peptidicas diabetogénicas, agonistas do receptor do GLP-1 [por exemplo, GLP-1, agente GLP-1MR, N,N-2211, AC-2993 (exendina-4), BIM-51077, Aib(8,35)hGLP-1 (7,37)NH.sub.2, CJC-[131], agonista da amilina (por exemplo, pramlintida), inibidores da fosfotirosina fosfatase (por exemplo, vanadato de sódio), inibidores da gliconeogénese (por exemplo, inibidores da glicogénio fosforilase, inibidores da glicose-6-fosfatase, antagonistas da glucagona), inibidores do SGLUT (sodium-glucose cotransporter) (por exemplo, T-1095), inibidores da 11.beta.-hidroxiesteróide desidrogenase (por exemplo, BVT-3498), adiponectina ou respectivos agonistas, inibidores de IKK (por exemplo, AS-2868), fármacos que melhoram a resistência à leptina, agonista do receptor da somatostatina (os compostos 328 descritos nos documentos WOOl/25228, W003/42204, W098/44921, W098/45285, W099/2273.5, etc.)/· activadores da glicocinase (por exemplo, R.sup.ο-28-Ιβ75), GIP (Glucose-dependent insulinotropic peptide).
Em algumas execuções da divulgação, os polipéptidos da presente invenção são utilizados em combinação com potenciadores da insulina, tais como, inclusive mas sem se ficar a eles limitados, taurina, ácido alfa-lipóico, um extracto de amora, crómio, glutamina, Enicostemma littorale Blume, Scoparia dulcis, um extracto de estragão e Andrographis paniculata. Noutra execução, a presente invenção poderá compreender um ou mais dentre isomalte, trealose ou D-manose para uma maior potenciação da secreção ou da actividade da insulina. Numa execução adicional da divulgação, utiliza-se o potenciador de insulina e os polipéptidos da presente invenção além de outro agente antidiabético.
Um modo de determinação da eficácia terapêutica dos polipéptidos e de terapias combinadas, inclusive dos polipéptidos da presente invenção, é através de uma redução dos niveis da HbAlc do doente. Numa execução, os polipéptidos da presente invenção reduzem os niveis da HbAlc em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 o 0 t 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 o 0 r 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, ou com uma alteração de pelo menos 50 % em relação aos niveis da HbAlc dois meses antes do inicio da terapia com os polipéptidos FGF-21 modificados, a partir de três meses antes do inicio da terapia com os polipéptidos FGF-21 modificados, ou por alterações percentuais a partir de uma linha de base. Noutra execução, os polipéptidos da presente invenção ministrados a um doente, que também está a ser tratado com um agente antidiabético, modulam a capacidade de o agente antidiabético baixar a glicose do sangue. Noutra execução, os polipéptidos da presente invenção ministrados a um 329 doente, que também está a ser tratado com um agente antidiabético, reduzem os níveis da HbAlc em pelo menos 1 o o r 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 O o. "O , / 0 , 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 o o r 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 o o r 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, ou com uma alteração de pelo menos 50 % em relaçao aos níveis da HbAlc dois meses antes do inicio da terapia com os polipéptidos FGF-21 modificados, a partir de três meses antes do inicio da terapia com os polipéptidos FGF-21 modificados, ou com alterações percentuais a partir de uma linha de base ou de uma linha de base de pré-tratamento.
Noutra execução, os polipéptidos FGF-21 modificados da presente invenção modulam a capacidade de a troglitazona reduzir as necessidades de insulina. Noutra execução, execução adicional, os polipéptidos FGF-21 modificados da presente invenção, quando ministrados a um doente que está a ser tratado com troglitazona, diminuem ainda mais as referidas necessidades do doente em termos de insulina. A troglitazona utilizada em combinação com a presente invenção poderá ser empregue para retardar ou prevenir a diabetes do tipo II em determinadas execuções da presente invenção.
Numa execução da presente divulgação, os polipéptidos FGF-21 modificados são co-administrados com uma sulfonilureia. Noutra execução da presente divulgação, os polipéptidos FGF-21 modificados são ministrados antes do tratamento com uma sulfonilureia. Noutra execução da presente divulgação, os polipéptidos FGF-21 modificados são ministrados após o tratamento com uma sulfonilureia. Em algumas execuções da presente divulgação, o tratamento com uma dose terapêutica dos polipéptidos FGF-21 modificados modula a glicose sérica. Noutra execução da divulgação, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção são ministrados com a Klotho beta, que modula os efeitos dos polipéptidos na glicose do sangue. Noutra execução da divulgação, os 330 polipéptidos FGF-21 da presente invenção são ministrados com a Klotho beta, que reduz mais a glicose do sangue do que a utilização unicamente dos polipéptidos FGF-21 modificados. Noutra execução da divulgação, estas alterações são medidas recorrendo a testes da HbAlc. Noutra execução da divulgação, os polipéptidos FGF-21 da presente invenção e a Klotho beta são ministrados a um doente que está a ser tratado com um agente antidiabético que reduz mais a glicose do sangue do que a utilização unicamente do agente antidiabético. XV. Utilizações terapêuticas dos polipéptidos FGF 21 da invenção
Os polipéptidos FGF-21 da invenção podem ser empregues no tratamento de uma grande variedade de distúrbios. É possível utilizar os polipéptidos FGF-21 da invenção no tratamento de mamíferos que padeçam de diabetes mellitus não insulino-dependente (diabetes do tipo II), diabetes insulino-dependente (diabetes do tipo I), bem como de obesidade, eliminação deficiente da glicose, hiperglicemia, hiperinsulinemia, e de qualquer outra doença ou condição que possa ser mediada pelos FGF-21. A intolerância à glicose pode ser definida com uma sensibilidade excepcional à glicose. A hiperglicemia é definida como um excesso de açúcar (glicose) no sangue. A hiperinsulinemia é definida como um valor superior ao normal de insulina no sangue. A insulinorresistência é definida como um estado em que uma quantidade normal de insulina produz uma resposta biológica subnormal. A obesidade, em termos do sujeito humano, pode ser definida com o peso corporal 20 porcento acima do peso corporal ideal para uma determinada população (R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, pág. 904-916). A diabetes mellitus é caracterizada em dois grupos amplos, com base nas manifestações clínicas, nomeadamente a forma não dependente da insulina ou aquela que aparece na idade madura, também conhecida por tipo II; e a forma insulino- 331 dependente ou juvenil, também conhecida por tipo I. A nível clínico, a maioria das pessoas com diabetes na idade madura do tipo II é obesa, usualmente com o aparecimento de manifestações de sintomas clínicos da doença numa idade acima dos 40. Em contrapartida, os doentes com diabetes juvenil tipo I não têm excesso de peso em relação à sua idade e à sua altura, com o rápido aparecimento da doença numa idade jovem, com frequência antes dos 30, embora a diabetes do tipo I possa aparecer em qualquer idade. A diabetes mellitus é um distúrbio metabólico nos humanos, com uma prevalência de aproximadamente um porcento na população geral, com um quarto destes sendo do tipo I (Foster, D. W., Harrison’s Principies of Internai Medicine, cap. 114, pag. 661-678, 10.â Ed., McGraw-Hill, Nova Iorque). A doença manifesta-se na forma de uma série de anomalias metabólicas de indução hormonal que levam eventualmente a complicações sérias, de longo prazo e debilitantes, implicando vários sistemas de órgãos, inclusive olhos, rins, nervos e vasos sanguíneos. Em termos patológicos, a doença é caracterizada por lesões nas membranas basais, o que se pode demonstrar sob microscopia electrónica. A diabetes mellitus não insulino-dependente (diabetes do tipo II) é uma doença debilitante, caracterizada por elevados níveis de glicose, insulina e corticosteróides em circulação no sangue. A incidência da diabetes do tipo II é elevada e tem vindo a tornar-se a causa principal de mortalidade, de morbilidade e de custos com a saúde em todo o mundo (Amos et al., Diabetic Med. 14:Sl-85, 1997).
As causas da diabetes do tipo II não são bem compreendidas. A diabetes do tipo II é caracterizada por um excesso de produção de glicose, apesar da disponibilidade de insulina, e os níveis de glicose em circulação permanecem excessivamente elevados em resultado de um défice de eliminação da glicose. Julga-se ocorrer tanto uma 332 resistência dos tecidos-alvo à acção da insulina, como uma secreção reduzida de insulina ("falha das células β"). Os principais tecidos responsivos à insulina para a homeostasia da glicose são o fígado, onde a insulina estimula a síntese de glicogénio e inibe a gliconeogénese; o músculo, onde a insulina estimula a absorção de glicose e o glicogénio estimula a absorção de glicose e inibe a lipólise. Por conseguinte, em consequência da condição diabética, está-se na presença de níveis elevados de glicose no sangue, e de um nível de açúcar no sangue elevado prolongado, o que é indicador de uma condição que levará a danos a nível dos vasos sanguíneos e dos nervos.
Actualmente, existem diversas abordagens farmacológicas para o tratamento da diabetes do tipo II (Scheen et al., Diabetes Care, 22(9):1568-1577, 1999). Estas actuam por diferentes modos de acção: 1) as sulfonilureias essencialmente estimulam a secreção de insulina; 2) as biguanidas (metformina) actuam ao promover a utilização da glicose, ao diminuir a produção de glicose hepática e ao diminuir a produção de glicose intestinal; 3) os inibidores da α-glicosidase (acarbose, miglitol) desaceleram a digestão dos hidratos de carbono e consequentemente a absorção intestinal e reduzem a hiperglicemia pós-prandial; 4) as tiazolidinodionas (tro-glitazona) aumentam a acção da insulina, promovendo assim a utilização da glicose nos tecidos periféricos; e 5) a insulina estimula a utilização da glicose tecidular e inibe a produção de glicose a nível hepático. As abordagens farmacológicas acima mencionadas podem ser utilizadas individualmente ou em terapia combinada. No entanto, cada abordagem tem as suas limitações e efeitos secundários. A obesidade é uma doença crónica de elevada prevalência na sociedade moderna e está associada não só a um estigma social, mas também a uma menor esperança de vida e a inúmeros problemas médicos, inclusive um 333 desenvolvimento psicológico adverso, distúrbios dermatológicos como infecções, veias varicosas, intolerância ao exercício, diabetes mellitus, insulinorresistência, hipertensão, hipercolesterolemia e doença cardíaca coronária. Rissanen et al., British Medicai Journal, 301: 835-837 (1990).
As terapias existentes para a obesidade incluem dietas padrão e exercício, dietas de valor calórico muito reduzido, terapia comportamental, farmacoterapia incluindo supressores do apetite, fármacos termogénicos, inibidores da absorção alimentar, dispositivos mecânicos como tala metálica, cordões para a cintura e balões, e cirurgia. Jung e Chong, Clinicai Endocrinology, 35: 11-20 (1991); Bray, Am. J. Clin. Nutr., 55: 538S-544S (1992).
Tendo em conta a grande prevalência da obesidade na nossa sociedade e as graves consequências a ela associadas, como acima debatido, qualquer fármaco terapêutico potencialmente útil na redução do peso em pessoas obesas poderá ter um efeito extremamente benéfico na sua saúde. Existe a necessidade no estado da técnica de um fármaco que reduza o peso corporal total dos sujeitos obesos relativamente ao seu peso corporal ideal, sem efeitos secundários significativos e que ajudem o sujeito obeso a manter esse nível reduzido de peso.
Pretende-se assim arranjar um regime de tratamento que possa ser utilizado para levar o peso corporal de sujeitos obesos a um peso corporal ideal normal. Pretende-se ainda arranjar uma terapia da obesidade que leve à manutenção do peso corporal reduzido durante um período prolongado de tempo. A obesidade está altamente correlacionada com a insulinorresistência e com a diabetes em animais de laboratório e em humanos. De facto, a obesidade e a insulinorresistência, sendo esta última geralmente acompanhada de hiperinsulinemia ou de hiperglicemia, ou de 334 ambas, são características da diabetes do tipo II. Além disso, a diabetes do tipo II está associada a um risco duplo a quádruplo de doença arterial coronária. Apesar de décadas de pesquisa relativamente a estes problemas graves de saúde, desconhece-se a etiologia da obesidade e da insulinorresistência.
Os diabéticos tipo I mostram caracteristicamente insulina plasmática muito baixa ou imensurável com elevação da glucagona. Independentemente de qual a etiologia precisa, a maioria dos doentes tipo I têm anticorpos em circulação dirigidos contra as suas próprias células pancreáticas, inclusive anticorpos contra a insulina, contra o citoplasma das células dos ilhéus de Langerhans e contra a enzima ácido glutâmico decarboxilase. Uma resposta imunitária dirigida especificamente contra as células beta (células produtoras de insulina) leva à diabetes do tipo I. Esta especificidade é sustentada pelo quadro clinico anterior, uma vez que as células beta segregam insulina enquanto as células alfa segregam glucagona.
Os regimes terapêuticos actuais para a diabetes do tipo I incluem modificações à dieta, de modo a minimizar a hiperglicemia resultante da falta de insulina natural, que, por sua vez, é o resultado de as células beta estarem danificadas. A dieta também é modificada em termos de administração de insulina, para compensar os efeitos hipoglicémicos da hormona. Seja qual for a forma de tratamento, é necessária a administração parenteral de insulina para todos os diabéticos tipo I, dai o termo diabetes "insulino-dependente".
Por conseguinte, existe a necessidade de uma terapia eficaz para a diabetes do tipo II, que tenha menos efeitos secundários do que as abordagens farmacêuticas disponíveis. Além disso, uma terapia alternativa eficaz à insulina poderá ser proveitosa no tratamento da diabetes do tipo I. A presente divulgação fornece uma terapia farmacológica, 335 que estimula a absorção de glicose e aumenta a sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos e tem menos efeitos secundários do que os regimes de tratamento actuais para a diabetes do tipo II. Além disso, a presente divulgação fornece um tratamento alternativo para a diabetes do tipo I. Além disso, a presente invenção pode ser utilizada no tratamento da obesidade ao aumentar o gasto energético através de uma utilização mais rápida e mais eficiente da glicose. A presente divulgação fornece um método para o tratamento de um mamífero, que apresenta um ou mais dentre diabetes do tipo I, diabetes do tipo II, obesidade, insulinorresistência, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, ou hiperglicemia, compreendendo a administração ao referido mamífero, carenciado desse tratamento, de uma quantidade com eficácia terapêutica do polipéptido FGF-21 da invenção. 0 método de tratamento poderá ser suficiente para alcançar no referido mamífero pelo menos uma das seguintes modificações: redução do armazenamento de gordura corporal, diminuição da insulinorresistência, redução da hiperinsulinemia, aumento da tolerância à glicose, e redução da hiperglicemia.
Noutro aspecto, a presente divulgação é relativa a um método para o tratamento de um animal doméstico, inclusive, mas sem ficar a estes limitado, bovinos, suínos, ovinos, equinos e outros do género, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do FGF-21 ou de uma respectiva variante, de modo a reduzir o armazenamento de gordura corporal. A redução do armazenamento de gordura corporal a longo prazo ou numa base permanente num animal doméstico constituiria obviamente uma vantagem económica considerável para os humanos, em particular visto os animais fornecerem uma grande proporção da dieta humana; e a gordura animal 336 poder acabar por voltar a constituir depósitos de gordura no ser humano. É possível utilizar o factor de crescimento fibroblástico 21 [fibroblast growth factor 21 (FGF-21)] na redução da morbilidade e da mortalidade associadas a doentes em estado crítico. Ver a publicação da patente U.S. N.° 20050176631. Os doentes em estado crítico que necessitam de cuidados intensivos durante um período de tempo prolongado correm um elevado risco de morte e apresentam uma mortalidade substancial. Uma causa comum da admissão de doentes às unidades de cuidados intensivos (UCI) é a síndrome da resposta inflamatória sistémica (SIRS) associada a insultos infecciosos (septicemia), bem como causas patológicas não infecciosas, tais como pancreatite, isquemia, traumatismos múltiplos e lesão tecidular, choque hemorrágico e lesão orgânica imuno-mediada. A presente divulgação também compreende um método para reduzir a mortalidade e a morbilidade em doentes em estado crítico, que padeçam de síndrome da resposta inflamatória sistémica (SIRS) associada a insultos infecciosos, bem como a causas patológicas não infecciosas, compreendendo a administração a doentes em estado crítico de uma quantidade com eficácia terapêutica do FGF-21. Os exemplos de condições que envolvem a SIRS incluem septicemia, pancreatite, isquemia, traumatismos múltiplos e lesão tecidular, choque hemorrágico, lesão orgânica imuno-mediada, síndrome da insuficiência respiratória aguda (SIRA), choque, insuficiência renal, e síndrome de falência de múltiplos órgãos (MODS). A presente divulgação também compreende um método para a redução da mortalidade e da morbilidade em doentes em estado crítico, que padecem de insuficiência respiratória.
Uma complicação frequente da SIRS é o desenvolvimento de disfunção sistémica orgânica, inclusive síndrome de insuficiência respiratória aguda (SIRA), choque, 337 insuficiência renal, e sindrome de falência de múltiplos órgãos (MODS), aumentando todos o risco de resultado adverso. Embora muitos especialistas pensem que algum tipo de apoio nutricional é benéfico no caso de doentes em estado crítico, no sentido de ajudar a restaurar a estabilidade metabólica, os benefícios e as características específicas desse apoio continuam controversos, devido à falta de ensaios clínicos aleatorizados bem controlados.
Dado que a hiperglicemia e a insulinorresistência são comuns em doentes em estado crítico, aos quais foi dado apoio nutricional, algumas UCI ministram insulina para tratar a hiperglicemia excessiva em doentes em estado crítico alimentados. De facto, estudos recentes documentam que a utilização de insulina exógena, para manter a glicose do sangue num nível que não seja superior a 110 mg por decilitro, reduziu a morbilidade e a mortalidade em doentes em estado crítico na unidade cirúrgica de cuidados intensivos, independentemente de eles terem ou não histórico de diabetes (Van den Berghe, et al. N Engl J Med., 345 (19) : 1359, 2001) . A presente divulgação compreende um método para a redução da mortalidade e da morbilidade nestes doentes em estado crítico, através da administração do FGF-21. Os doentes em estado crítico englobados pela presente invenção passam em geral por um estado hipermetabólico instável. Este estado metabólico instável deve-se a alterações no metabolismo de substrato, que poderão levar a deficiências relativas em alguns nutrientes. Em geral, verifica-se um aumento da oxidação tanto de gordura como de músculo.
Os doentes em estado crítico, nos quais a administração do FGF-21 é capaz de reduzir o risco de mortalidade e de morbilidade, são preferencialmente doentes que têm sindrome de resposta inflamatória sistémica ou insuficiência respiratória. Uma redução da morbilidade significa uma redução da probabilidade de um doente em 338 estado crítico desenvolver doenças, condições ou sintomas adicionais, ou uma redução da gravidade de doenças, condições ou sintomas adicionais. Por exemplo, a redução da morbilidade poderá corresponder a uma diminuição da incidência de bacteremia ou septicemia ou de complicações associadas a falência orgânica múltipla. A síndrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS) descreve um processo inflamatório associado a um grande número de condições clinicas e compreende, sem ficar a elas limitada, mais do que uma das seguintes manifestações clínicas: (1) uma temperatura corporal superior a 38 °C ou inferior a 36 °C; (2) um ritmo cardíaco superior a 90 batidas por minuto; (3) taquipneia, manifestada por um índice respiratório superior a 20 inspirações por minuto, ou hiperventilação, como indicado por um PaC02 inferior a 32 mm Hg; e (4) uma alteração na contagem de glóbulos brancos, como é o caso de uma contagem superior a 12.000/cu mm, uma contagem inferior a 4.000/cu mm, ou a presença de mais de 10 % de neutrófilos imaturos. Estas alterações fisiológicas deverão representar uma alteração aguda da linha de base, face à ausência de outras causas conhecidas dessas anomalias, tais como quimioterapia, neutropenia induzida, e leucopenia. A septicemia é definida como uma SIRS resultante de infecção. As causas patogénicas não infecciosas da SIRS poderão incluir pancreatite, isquemia, traumatismos múltiplos e lesão tecidular, inclusive, mas sem limitação a estes, lesões por esmagamento ou queimaduras graves, choque hemorrágico, lesão orgânica imuno-mediada, e administração exógena desses mediadores putativos do processo inflamatório como o factor de necrose tumoral e outras citocinas. O choque séptico e a disfunção multiorgânica são causas principais de morbilidade e de mortalidade no panorama das UCI. A septicemia está associada à activação e 339 é mediada por essa activação de uma série de mecanismos de defesa do hospedeiro, inclusive da rede de citocinas, leucócitos, e cascata do complemento, e sistemas de coagulação/fibrinólise, inclusive o endotélio. A coagulação intravascular disseminada (CID) e outros graus de coagulopatia de consumo associada a deposição de fibrina na microvasculatura de diversos órgãos são manifestações de septicemia/choque séptico. Os efeitos a jusante da resposta de defesa do hospedeiro nos órgãos-alvo é um mediador importante no desenvolvimento de síndrome da falência de múltiplos órgãos (MODS) e contribui para o mau prognóstico de doentes com septicemia, septicemia grave e septicemia complicada devido a choque. A insuficiência respiratória indica uma condição em que os doentes têm dificuldade em respirar devido a algum tipo de disfunção pulmonar. Muitas vezes estes doentes apresentam diferentes graus de hipoxemia, que poderá ou não ser refractária ao tratamento com oxigénio suplementar. A insuficiência respiratória poderá ocorrer em doentes com défice da função pulmonar devido a lesão pulmonar directa ou poderá ocorrer devido a lesão pulmonar indirecta, como no caso de um processo sistémico. Além disso, a presença de múltiplos distúrbios de predisposição aumenta substancialmente o risco, assim como a presença de factores secundários, tais como alcoolismo crónico, doença pulmonar crónica e baixo pH sérico.
Algumas causas de lesão pulmonar directa incluem pneumonia, aspiração de sucos gástricos, contusão pulmonar, embolias de gordura, quase afogamento, lesão por inalação, grandes altitudes e edema pulmonar por reperfusão após transplante do pulmão ou embolectomia pulmonar. Algumas causas de lesão pulmonar indirecta incluem septicemia, traumatismo grave com choque e múltiplas transfusões; bypass cardiopulmonar, overdose com drogas, pancreatite aguda, e transfusões de produtos sanguíneos. 340
Uma classe de distúrbios pulmonares que causa insuficiência respiratória está associada à sindrome conhecida por Cor Pulmonale. Estes distúrbios estão associados a hipoxemia crónica, tendo por resultado uma pressão elevada na circulação pulmonar, designada por hipertensão pulmonar. A consequente hipertensão pulmonar aumenta a carga de trabalho do ventrículo direito, levando assim à sua dilatação ou à sua hipertrofia. A Cor Pulmonale apresenta-se em geral na forma de uma insuficiência cardíaca direita definida por um aumento sustentado das pressões ventriculares do lado direito e evidência clínica de um menor retorno venoso ao lado direito do coração.
As doenças pulmonares obstrutivas crónicas (DPOC), que incluem enfisema e bronquite crónica, também causam insuficiência respiratória e são caracterizadas por uma obstrução do fluxo de ar. As DPOC são a quarta principal causa de morte e ceifam mais de 100.000 vidas por ano. A sindrome de insuficiência respiratória aguda (SIRA) é em geral progressiva e é caracterizada por diferentes estágios. A sindrome manifesta-se geralmente pelo rápido aparecimento de insuficiência respiratória num doente com um factor de risco relativamente à condição. A hipoxemia arterial que é refractária ao tratamento com oxigénio suplementar é uma característica típica. Poderá haver enchimento pulmonar, consolidação e a ocorrência de atelectasia em zonas pulmonares dependentes; contudo, áreas não dependentes poderão ter inflamação substancial. A sindrome poderá progredir para alveolite fibrosante com hipoxemia persistente, maior espaço morto alveolar, e para uma maior diminuição da complacência pulmonar. Também poderá ocorrer o desenvolvimento de hipertensão pulmonar, a qual resulta de danos no leito capilar pulmonar. A gravidade da lesão pulmonar clínica varia. Tanto os doentes com hipoxemia menos grave, como definido por uma relação da pressão parcial de oxigénio arterial para a 341 fracção de oxigénio inspirado de 300 ou menos, como os doentes com hipoxemia de maior gravidade, como definido por uma relação de 200 ou menos, são englobados pela presente invenção. Em geral, os doentes com uma relação de 300 ou menos são classificados como tendo uma lesão pulmonar aguda, e os doentes com uma relação de 200 ou menos são classificados como tendo sindrome de insuficiência respiratória aguda. A fase aguda da lesão pulmonar aguda é caracterizada por uma entrada de fluido de edema com abundância proteica nos espaços de ar em consequência de maior permeabilidade vascular da barreira alveolar-capilar. A perda de integridade epitelial onde ocorre alteração da permeabilidade pode levar a inundação alveolar, interromper o transporte normal de fluidos, o que afecta a remoção de fluido de edema do espaço alveolar, reduzir a produção e aparecimento de agente tensioactivo, levar a choque séptico nos doentes com pneumonia bacteriana, e provocar fibrose. A septicemia está associada a maior risco de progressão de lesão pulmonar aguda.
Sob condições como a septicemia, onde ocorre hipermetabolismo, existe uma decomposição proteica acelerada tanto para sustentar a gliconeogénese como para libertar os aminoácidos necessários a uma maior síntese proteica. A hiperglicemia poderá estar presente e também poderão estar presentes elevadas concentrações de triglicéridos e de outros lípidos séricos.
No caso de doentes com função respiratória comprometida, o hipermetabolismo poderá afectar a relação da produção de dióxido de carbono para consumo de oxigénio. Isto é conhecido por quociente respiratório (R/Q) e, em indivíduos normais, encontra-se entre cerca de 0,85 e cerca de 0,90. O metabolismo excessivo das gorduras tem uma tendência de redução do R/Q, enquanto o metabolismo excessivo da glicose aumenta o R/Q. Os doentes com 342 insuficiência respiratória têm muitas vezes dificuldade em eliminar o dióxido de carbono e, assim, apresentam quocientes respiratórios anormalmente elevados.
Os doentes em estado critico englobados pela presente invenção também sofrem em geral de uma resposta ao stress particular, caracterizada por uma regulação no sentido de redução transiente da maioria dos produtos celulares, e por uma regulação no sentido crescente de proteínas de choque térmico. Além disso, esta resposta ao stress implica a activação de hormonas como a glucagona, a hormona de crescimento, cortisol, e citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Embora esta resposta ao stress pareça ter uma função protectora, a mesma gera instabilidade metabólica adicional nestes doentes em estado crítico. Por exemplo, a activação destas hormonas específicas provoca elevações da glicose sérica, tendo por resultado a hiperglicemia. Além disso, os danos cardíacos e noutros órgãos poderão ser exacerbados por estímulos adrenérgicos. Além disso, poderão ocorrer alterações da tiróide, o que poderá produzir efeitos significativos na actividade metabólica.
As quantidades médias do FGF-21 poderão variar e, em particular, deverão ter por base as recomendações e a prescrição de um médico qualificado. A quantidade precisa do FGF-21 é uma questão de preferência, sujeita a factores como o tipo exacto de condição a ser tratada, bem como aos demais ingredientes na composição. A invenção também compreende a administração de uma quantidade com eficácia terapêutica de outro agente activo. A quantidade a ser ministrada poderá ser prontamente determinada por um especialista comum da técnica com base na terapia com o FGF-21.
As Composições farmacêuticas da invenção podem ser produzidas de modo convencional.
Exemplos 343
Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitam a invenção reivindicada.
Exemplo 1
Este exemplo descreve um dos muitos conjuntos de critérios potenciais para a selecção de locais de incorporação de aminoácidos não codificados de forma natural em FGF-21. A Figura 1 mostra a homologia de sequência entre FGF-21 (número de acesso de Proteína BC018404) e FGF-19 (número de acesso de Proteína BAA75500) como se determina usando Vector NTI (Invitrogen; Carlsbad, CA). Os aminoácidos marcados com um asterisco são similares entre as duas moléculas. Os aminoácidos que estão sublinhados são idênticos entre os dois polipéptidos. Geraram-se sete polipéptidos FGF-21 diferentes substituindo um aminoácido codificado de forma natural com um aminoácido não codificado de forma natural. Cada polipéptido teve um dos aminoácidos marcados com um rectângulo na Figura 1 substituído com para-acetilfenilalanina. Os polipéptidos gerados não possuíam as sequências líder mostradas nas Figuras 1 e 3 e foram marcadas com uma cauda de His na extremidade N terminal com 6 resíduos de histidina. SEQ ID N° 1 é uma sequência de 181 aminoácidos de FGF-21 humano (forma P) sem a sequência líder. SEQ ID N° 2 é a sequência de FGF-21 humano (forma P) sem a sequência líder e com uma cauda de His na extremidade N terminal. Cada um dos polipéptidos gerados teve uma substituição de aminoácidos não codificados de forma natural numa das seguintes posições 10, 52, 77, 117, 126, 131 e 162 de SEQ ID N° 1. A Figura 2 mostra a estrutura de FGF-19 humano que foi obtida do Banco de Dados de Proteínas (PDB) (Bernstein et al. J. Mol. Biol. 1997, 112, pp 535) (IPWA) e marcada usando o software PyMOL (DeLano Scientific; Paio Alto, CA). Os aminoácidos correspondentes a V34, L79, G104, S144, K155, L160 e S196 de FGF-19 foram substituídos com para-
acetilf enilalanina em polipéptidos FGF-21 da invenção. A 344 linha descontínua indica regiões que não foram resolvidas na estrutura original. A Figura 3 mostra a homologia de sequência entre FGF-21 (número de acesso de Proteína BC018404) e FGF-2 (número de acesso de Proteína BAA75500) como foi determinada usando Vector NTI (Invitrogen; Carlsbad, CA). Os aminoácidos marcados com um asterisco são similares entre as duas moléculas. Os aminoácidos que estão sublinhados são idênticos entre os dois polipéptidos. Os 7 aminoácidos mostrados na Figura 1 como locais para substituição também se situam num rectângulo na Figura 3. A Figura 4 mostra a estrutura de FGF-2 humano que foi obtida de PDB (ICVS) e marcada usando o software PyMOL (DeLano Scientific; Paio Alto, CA) . As estruturas cinzas são receptor de FGF humano 1 (FGFR1) e as pretas são FGF2 humano. Plotnikov, AN et al. Cell. 3 de Setembro de 1999; 98(5): 641-50 descreve a estrutura cristalina de FGF2 unido ao receptor de FGF. Os aminoácidos correspondentes a F21, K62, K86, V125, K134, T139 de FGF-2 foram substituídos com para-acetilfenilalanina em polipéptidos FGF-21 da invenção. A linha descontínua indica regiões que não foram resolvidas na estrutura original.
Outro conjunto de critérios para a selecção de locais preferidos de incorporação de aminoácidos não codificados de forma natural é o seguinte. Foram usadas dez estruturas cristalinas do Banco de Dados de Proteínas para modelar a estrutura de FGF-21: 1PWA (FGF-19 humano); 1IJT (FGF-4 humano); INUN (Complexo de FGF10 humano-Receptor de FGF 2b) ; 1G82 (dímero de FGF-9 humano com Receptor de FGF e heparina); 1IHK (FGF-9 humano); IBAR (FGF-1 bovino); 1QQK (FGF-7 de rato); 1K5U (FGF-1 humano); 1FQ9 (FGF-2 humano com Receptor de FGF 1 e heparina) ; e 2FDB (FGF-8b humano com Receptor de FGF 2c) . As coordenadas para estas estruturas estão disponíveis do Banco de Dados de Proteínas (PDB) (Bernstein et al. J. Mol. Biol. 1997, 112, pp 535). 345
Uma comparação das estruturas cristalinas indicou que eram muito similares na estrutura central. No entanto, descobriu-se que as extremidades N- e C- eram altamente divergentes entre estas moléculas de FGF e portanto as extremidades não puderam ser modeladas. A modelagem identificou dois resíduos, Y22 e Y104, que estavam altamente conservados e estavam envolvidos na ligação com o receptor. Também se identificaram dois locais de ligação a heparina potenciais que envolveram R36 e E37. As posições de aminoácidos identificadas para os resíduos de ligação ao receptor e ligação a heparina correspondem a SEQ ID N° 1. Como resultado, identificaram-se resíduos que 1) não interfeririam com a ligação com o receptor de FGF ou heparina, 2) não estariam presentes no interior da proteína, e 3) estariam em regiões que eram bastante uniformes entre as estruturas cristalinas. É incorporado um aminoácido não codificado de forma natural nas seguintes posições de FGF-21: 108 SEQ ID N° 1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID N° 2-7).
Os seguintes critérios foram usados para avaliar cada posição de FGF-21 com respeito à introdução de um aminoácido não codificado de forma natural: o resíduo (a) não deveria interferir com a ligação do receptor de FGF-21 com base na análise estrutural, (b) não deveria ser afectado por mutagénese de exploração homóloga ou de alanina, (c) deveria ser exposto na superfície e mostrar interacções de ligações de hidrogénio de van der Waals mínimas com os resíduos circundantes, (d) deveria ser suprimido ou ser variável em variantes de FGF-21, (e) daria como resultado mudanças conservativas após a substituição com um aminoácido não codificado de forma natural e (f) poderia ser encontrado em regiões altamente flexíveis ou regiões estruturalmente rígidas.
Também podem ser usadas estruturas cristalinas adicionais ou diferentes para membros da família de FGF tais como 346 estruturas para FGF-23 e/ou FGF-19 para seleccionar locais para incorporação de um ou mais aminoácidos não codificados de forma natural em FGF-21. Por exemplo, a estrutura cristalina de FGF-19 humano (PDB ID 2P23) e/ou a estrutura cristalina de FGF-19 humano (PDB ID 2P23) e/ou FGF-23 humano (PDB ID 2P39) podem proporcionar informação adicional para seleccionar locais para incorporação de aminoácidos não codificados de forma natural em FGF-21. Tais locais podem estar em diferentes regiões da proteina, incluindo, mas sem limitação, as extremidades N- e C-, regiões de ligação com o receptor e de ligação com heparina. Além disso, podem ser realizados cálculos adicionais sobre a molécula de FGF-21 1, utilizando o programa Cx (Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18, pp 980) para avaliar o âmbito da protrusão para cada átomo da proteina. É incorporado um aminoácido não codificado de forma natural nas seguintes posições em FGF-21: 108 (SEQ ID N° 1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID N° 2-7).
Exemplo 2
Este exemplo detalha a clonagem e expressão de um polipéptido FGF-21 que inclui um aminoácido não codificado de forma natural em E. coli. Este exemplo também descreve um método para avaliar a actividade biológica de polipéptidos FGF-21 modificados.
Conhecem-se métodos para clonar FGF-21 pelos peritos comuns na especialidade. Detalham-se sequências polipeptídicas e polinucleotídicas para FGF-21 e clonagem de FGF-21 em células hospedeiras na Patente US N° 6.716.626; Publicações
de Patente US N° 2005/0176631 , 2005/0037457, 2004/0185494, 2004/0259780, 2002/0164713 e 2001/0012628; documentos WO 01/36640; WO 03/011213; WO 03/059270; WO 04/110472; WO 05/061712; WO 05/072769; WO 05/091944; WO 05/113606; WO 06/028595; WO 06/028714; WO 06/050247; WO 06/065582; WO 06/078463. 347
Mostra-se ADNc que codifica a forma P de FGF-21 sem a sequência líder como SEQ ID N° 8. Este polipéptido mostra-se como SEQ ID N° 1.
Mostra-se ADNc que codifica uma forma P marcada com His de FGF-21 sem uma sequência líder como SEQ ID N° 9. Este polipéptido mostra-se como SEQ ID N° 2.
Mostra-se ADNc que codifica a forma P de FGF-21 com uma sequência líder que contém 3 leucinas juntas como SEQ ID N° 10. Este polipéptido mostra-se como SEQ ID N° 3.
Mostra-se ADNc que codifica a forma P de FGF-21 com uma sequência líder que contém 2 leucinas juntas como SEQ ID N° 11. Este polipéptido mostra-se como SEQ ID N° 4.
Mostra-se ADNc que codifica a forma L de FGF-21 sem a sequência líder como SEQ ID N° 12. Este polipéptido mostra-se como SEQ ID N° 5.
Mostra-se ADNc que codifica a forma L de FGF-21 com uma sequência líder que contém 3 leucinas juntas como SEQ ID N° 13. Este polipéptido mostra-se como SEQ ID N° 6.
Mostra-se ADNc que codifica a forma L de FGF-21 com uma sequência líder que contém 2 leucinas juntas como SEQ ID N° 14. Este polipéptido mostra-se como SEQ ID N° 7.
Usa-se um sistema de tradução introduzido que compreende um ARNt ortogonal (ARNt-O) e uma aminoacil ARNt sintetase ortogonal (RS-O) para expressar FGF-21 que contém um aminoácido codificado de forma natural. A RS-0 aminoacilo preferentemente o ARNt-0 com um aminoácido não codificado de forma natural. Por sua vez, o sistema de tradução insere o aminoácido não codificado de forma natural em FGF-21, em resposta a um codão selector codificado. Descrevem-se sequências de RS-0 e ARNt-0 adequadas no documento W02006/068802 intitulado "Compolocalns of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof" (E9; SEQ ID N° 15) e o documento WO 2007/021297 intitulado "Compolocalns of tRNA and Uses Thereof" (F13; SEQ ID N° 16)
Quadro 2: sequências de RS-0 e ARNt-0 348
SEQ ID N° 17 ARNmtTyr/QUA de M. jannaschii ARNt SEQ ID N° 18 HLAD03; um ARNt supressor âmbar optimizado ARNt SEQ ID N° 19 HL325A; um ARNt supressor de deslocamento de fase AGGA optimizado ARNt SEQ ID N° 20 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-L-fenilalanina p-Az-PheRS (6) RS SEQ ID N° 21 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-benzoil-L-fenilalanina p-BpaRS (1) RS SEQ ID N° 22 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de propargil-fenilalanina Propargil-PheRS RS SEQ ID N° 23 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de propargil-fenilalanina Propargil-PheRS RS SEQ ID N° 24 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de propargil-fenilalanina Propargil-PheRS RS SEQ ID N° 25 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina p-Az-PheRS (1) RS SEQ ID N° 26 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina p-Az-PheRS (3) RS SEQ ID N° 27 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina p-Az- PheRS (4) RS SEQ ID N° 28 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina p-Az- PheRS (2) RS SEQ ID N° 29 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-acetil-fenilalanina (LWl) RS SEQ ID Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação RS 349
2 o co o de p-acetil-fenilalanina (LW5) SEQ ID N° 31 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-acetil-f enilalanina (LW6) RS SEQ ID N° 32 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina (AzPheRS-5) RS SEQ ID N° 33 Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina (AzPheRS-6) RS A transformação de E. coli com plasmídeos que contêm o gene de FGF-21 modificado e o par de aminoacil ARNt sintetase/ARNt ortogonal (especifico para o aminoácido não codificado de forma natural desejado) permite a incorporação especifica de local de aminoácido não codificado de forma natural no polipéptido FGF-21. Amplificou-se FGF-21 maduro de tipo selvagem por PCR a partir de uma reacção de síntese de ADNc derivada de ARNm poliA+ de fígado humano sano (Biochain) usando protocolos convencionais e clonou-se em pET30 (NcoI-BamHI). Depois de confirmação de sequência, subclonou-se FGF-21 que incluía uma sequência N-terminal HHHHHHSGG num vector de supressão que continha um tirosil ARNtTyr/QUA supressor âmbar de Methanococcus jannaschii (ARNtTyr/QUA Mj) sob o controlo constitutivo de um promotor sintético derivado da sequência promotora de lipoproteína de E. coli (Miller, J.H., Gene, 1986), assim como a tirosil-ARNt-sintetase ortogonal (MjTyrRS) sob o controlo do promotor de GlnRS de E. coli. A expressão de FGF-21 estaba sob o controlo do promotor de T7. Introduziram-se mutações âmbar usando protocolos de mutação de mudança rápida convencionais (Stratagene; A Jolla, Califórnia). Verificou-se a sequência de todas as construções.
Supressão com para-acetil-fenilalanina (pAcF) Transformaram-se plasmídeos (pVK3-hisFGF21) na estirpe W3110 B2 de E. coli na qual a expressão da T7 polimerase estava sob o controlo de um promotor induzível por 350 arabinose. Diluíram-se culturas bacterianas durante a noite 1:100 em balões de agitação que continham meio de cultura 2X YT e cultivaram-se a 37 °C a uma D060o de ~0,8. Induziu-se a expressão proteica por meio da adição de arabinose (0,2 % final) e para-acetil-fenilalanina (pAcF) a uma concentração final de 4 mM. As culturas foram incubadas a 37 °C durante 4 horas. As células foram sedimentadas e foram ressuspensas em tampão de lise B-PER (Pierce) 100 μΙ/DO/ml + 10 yg/ml de DNase e foram incubadas a 37 °C durante 30 min. O material celular foi retirado por centrifugação e o sobrenadante foi retirado. O sedimento foi ressuspenso numa quantidade igual de tampão de carga de proteínas de SDS-PAGE. Todas as amostras foram carregadas num gel PAGE 4-12 % com MES e DTT. Conhecem-se pelos peritos comuns na especialidade métodos para purificação de FGF-21 e confirmam-se por SDS-PAGE, Análise de Transferência de Western ou espectrometria de massas de armadilha de iões de ionização por electronebulização e similares.
Mostra-se a expressão de FGF-21 marcado com His N-terminal e supressão em 7 locais âmbar na Figura 5. O polipéptido FGF-21 está marcado com uma flecha. A Figura 5 mostra as amostras de sedimentos de B-PER-Pista 1: Marcador; Pista 2: pré-indução com VK3-FGF21, sobrenadante; Pista 3: pré-indução com VK3-FGF21, sedimento; Pista 4: VK3-FGF21 arabinose 0,2 %, sobrenadante; Pista 5: VK3-FGF21 arabinose 0,2 %, sedimento; Pista 6: VK3-FGF21- pAcF- L10, arabinose 0,2 %; Pista 7: VK3-FGF21-pAcF- L52, arabinose 0,2 %; Pista 8: VK3-FGF21- pAcF- R77, arabinose 0,2 %; Pista 9: VK3-FGF21- pAcF- Hl17, arabinose 0,2 %; Pista 10: VK3-FGF21-pAcF-R126, arabinose 0,2 %; Pista 11: VK3-FGF21-pAcF-R131, arabinose 0,2 %; Pista 12: VK3-FGF21-pAcF-S, 162, arabinose 0,2 %. Os números de posição indicados para a substituição de aminoácidos baseiam-se em SEQ ID N°: 1. 351 A Figura 6 mostra as amostras de sobrenadante de B-PER -Pista 1: pré-indução com VK3-FGF21, sobrenadante; Pista 2: pré-indução com VK3-FGF21, sedimento; Pista 3: marcador, Pista 4: VK3-FGF21 arabinose 0,2 %, sobrenadante, Pista 5: VK3-FGF21 arabinose 0,2 %, sedimento; Pista 6: VK3-FGF21- pAcF-LlO, arabinose 0,2 %; Pista 7: VK3-FGF21-pAcF-L52; arabinose, 0,2 %; Pista 8: VK3-FGF21-pAcF-R77, arabinose 0. 2 %; Pista 9: VK3-FGF21-pAcF-H117, arabinose 0,2 %; Pista 10: VK3-FGF 21-pAcF-Rl26, arabinose 0,2 %; Pista 11: VK3- FGF2l-pAcF-R131, arabinose 0,2 %; Pista 12: VK3-FGF21-pAcF-S162, arabinose 0,2 %. Os números de posições indicados para a substituição de aminoácidos baseiam-se em SEQ ID N°: 1.
As proteínas de FGF-21 mutantes marcadas com His podem ser purificadas usando métodos conhecidos pelos peritos comuns na especialidade. A resina de quelação de níquel ProBond (Invitrogen, Carlsbad, CA) pode ser usada por meio dos métodos de purificação de proteínas marcadas com His convencionais proporcionados pelo fabricante. pVKlO (Figura 24) desenvolveu-se para utilização com a proteína de FGF-21 não marcada, que tem uma sequência proporcionada na Figura 25. Este foi o vector usado para realizar os mutantes R36am e Y83am e há dados adicionais sobre estas proteínas mutantes de FGF-21 não marcadas com His e a sua purificação posteriormente nos exemplos e mostram-se nas figuras.
Diferenciação de 3T3-L1 a adipócitos e ensaio de captação de glicose
Para avaliar a actividade biológica de polipéptidos FGF-21, pode ser realizado o seguinte ensaio. Cultivam-se fibroblastos 3T3-L1 de ratinho (ATCC N° CL-173) numa placa de 10 cm com DMEM que contém soro bovino fetal a 10 %. As células são mantidas a uma densidade não mais alta de 70 % para expansão. Antes de começar a diferenciação a adipócitos, permite-se que as células cheguem a 100 % de 352 confluência; o meio deve ser mudado a cada 2 dias. As células são contadas e cultivadas a 25.000 células/poço numa placa de 96 poços (as células também podem ser cultivadas numa placa de 96 poços Cytostar-T) e são incubadas durante outras 48 horas. Induz-se a diferenciação adicionando o seguinte meio depois de retirar o meio de cultura anterior: DMEM complementado com FBS 10 % (soro bovino fetal), dexametasona 1 μΜ (DBX), 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) 0,5 mM e insulina 5 yg/ml. Um modo alternativo para induzir a diferenciação é tratar as células com rosiglitazona 1 μΜ e incubar durante 6 dias antes de mudar o meio a DMEM/FBS 10 %, uma vez que esta é a maneira mais rápida de induzir que os fibroblastos 3T3-L1 diferenciem-se a adipócitos. Uma terceira possibilidade é combinar os dois métodos para encurtar o tempo para diferenciação.
Depois de adicionar meio que contém DBX/IBMX/insulina às células, as células são incubadas durante 48 horas. O meio é mudado a DMEM/FBS 10 %/insulina 5 pg/ml e as células são incubadas durante 48 horas. A seguir, o meio é mudado a DMEM/FBS 10 % e o meio é substituído com meio novo a cada 2 dias. As células serão diferenciadas entre 7 e 14 dias. As células diferenciadas acumulam gotas de lípidos. As células podem ser coradas com OIL RED O. Uma vez que 95 % dos adipócitos contêm gotas de lípidos, as células podem ser usadas para o ensaio de captura de glicose.
As 3T3-L1 diferenciadas são tratadas com FGF-21 (1 pg/ml) em DMEM complementado com BSA sem ácidos gordos 0,1 % durante 18 horas para privar de alimento às células. As células são lavadas depois 3 vezes com tampão HEPES Krebs-Ringer (KRH = NaCl 0,118M, KC1 5 mM, CaCl2 2,54 mM, KH2P04 1,19 mM, MgSCq 1,19 mM e HEPES 20 mM) complementado com FAF-BSA 0,1 %. A mistura de marcação é preparada adicionando 4 μ(3ί, 0,1 mM de 2-desoxiD-[ 1-3H]-glicose a tampão de KRH/FAF-BSA 0,1 %. As células são adicionadas e 353 são incubadas durante 1 hora a 37 °C. A reacção é interrompida lavando as células dois vezes com PBS frio que contém citocalasina B 20 μΜ. A placa é seca para eliminar qualquer tampão residual. Adiciona-se liquido de cintilação a cada poço e as amostras são contadas num TopCounter.
Um modo alternativo para medir a captação de glicose é carregar as células 3T3-L1 diferenciadas com um substrato não radiactivo como 2-NBDG e ler com um leitor de placas de fluorescência. Um método indirecto para medir a captação de glicose é medir a expressão de GLUT1 ou GLUT4 na superfície de membrana celular. GLUT1 e GLUT4 são transportadores de glicose que se translocam na superfície de membrana celular desde as vesículas internas após estimulação com insulina ou FGF-21.
Pode ser desenvolvido um ELISA em células vivas.
Exemplo 3
Este exemplo detalha a introdução de um aminoácido que contém carbonilo e posterior reacção com um PEG que contém aminooxi.
Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipéptido FGF-21 que incorpora um aminoácido não codificado de forma natural que contém cetona que é feita reagir posteriormente com um PEG que contém aminooxi de aproximadamente 5.000 de PM. Cada um dos resíduos antes da pos: Lção 1 (isto 1 é, na extremidade N terminal) , 1, 2, 3 , 4 5, < 5, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 *·. i—1 00 82, 83 , 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 96, 97, 98, 99 , 100, 101, 102 , li 03, 104, 105, 106, 107 108, , 109 t 110, 111, 112 , 113 , i: 14, 115, 116, 117 , H8, 119 120, , 121 r 122, 123, 124 , 125 , 126, 127, 128, 129 , 130, 131 132, , 133 t 134, 135, 136 , 137 , 138, 139, 140, 141 , 142, 143 354 144, 145, 146, 147, 148, 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 , 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo terminal da proteína) (SEQ ID N 0 : 1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID N°: 2-7) é substituído de forma separada com um aminoácido não codificado de forma natural que tem a seguinte estrutura:
As sequências utilizadas para incorporação específica de local de p-acetil-fenilalanina em FGF-21 são SEQ ID N°: 1 (FGF-21) e SEQ ID N° : 16 ó 17 (ARNmutt, ARNtm Tyr/QUA de M. jannaschii), e 15, 29, 30 ó 31 (TyrRS LW1, 5 ó 6) descritas no Exemplo 2 anterior.
Uma vez modificada, a variante do polipéptido FGF-21 que compreende o aminoácido que contém carbonilo é feito reagir com um derivado de PEG que contém aminooxi da forma: R-PEG (N)-0-(CH2)n-0-NH2
Em que R é metilo, n é 3 e N é aproximadamente 5.000 PM. O FGF-21 purificado que contém p-acetilfenilalanina dissolvido a 10 mg/ml em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7,0 ou em acetato de sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4,5, é feito reagir com um excesso de 10 a 100 vezes de PEG que contém aminooxi, e depois se agita durante 10 - 16 horas a temperatura ambiente (Jencks, W. J Am.Chem.. Soc. 1959, 81, pp 475). O PEG-FGF-21 é diluído depois num tampão apropriado para purificação e análise imediata.
Exemplo 4 355
Conjugação com um PEG que consiste num grupo de hidroxilamina unido ao PEG por meio de uma ligação amida. Acopla-se um reagente de PEG que tem a seguinte estrutura a um aminoácido não codificado de forma natural que contém cetona usando o método descrito no Exemplo 3: R-PEG (N) -0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2)n-0-NH2 em que R = metilo, n = 4 e N é aproximadamente 20.0 00 PM. As condições de reacção, purificação e análise são como se descreve no Exemplo 3.
Exemplo 5
Este exemplo detalha a introdução de dois aminoácidos não codificados de forma natural distintos em polipéptidos FGF-21.
Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipéptido FGF-21 que incorpora aminoácidos não codificados de forma natural que compreendem uma func úonalidade de cetona em duas posiçoes entre os segu .intes resí .duos: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N t erminal), 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, CM 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, Oh co QD O 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 00 88, 89, 90 , 91, 92, 93, < 94, 9 5, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 f 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 r 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 r 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142 r 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 r 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 t 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 , 17 8, 179, 180 , 18: L, 182 (ist o é, na extremidade carboxilo terminal da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID N°: 2-7). O polipéptido FGF-21 é preparado como se descreve nos 356
Exemplos 1 e 2, excepto que se introduz o codão selector em dois locais distintos dentro do ácido nucleico.
Exemplo 6
Este exemplo detalha a conjugação de polipéptido FGF-21 com um PEG que contém hidrazida e posterior redução in situ. É preparado um polipéptido FGF-21 que incorpora um aminoácido que contém carbonilo de acordo com o método descrito nos Exemplos 2 e 3. Uma vez modificado, um PEG que contém hidrazida que tem a seguinte estrutura se conjuga com o polipéptido FGF-21: R-PEG(N) -0-(CH2)2-NH-C(0) (CH2) n-X-NH-NH2 em que R = metilo, n = 2 e N = 10.000 PM e X é um grupo carbonilo (C = O). O FGF-21 purificado que contém p-acetil-fenilalanina é dissolvido a entre 0,1 e 10 mg/ml em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7,0 ou em acetato de sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4,5, é feito reagir com um excesso de 1 a 100 vezes de PEG que contém hidrazida, e a hidrazona correspondente é reduzida in situ por meio da adição de NaCNBH3 1 M de reserva (Sigma Chemical, St. Louis, MO), dissolvido em H20, a uma concentração final de 10-50 mM. São levadas a cabo reacções no escuro de 4 °C a TA durante 18-24 horas. As reacções são interrompidas por meio de adição de Tris 1 M (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a aproximadamente pH 7,6 a uma concentração de Tris final de 50 mM ou são diluidas em tampão apropriado para purificação imediata • Exemplo 7 Este exemplo detalha a introdução de um aminoácido que contém alcino num polipéptido FGF- -21 e derivatizaçao com mPEG-azida. Os seguintes residuos, antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal), 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 357 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86 87, 88, 8< 3, 90 , 91, • 92, 93, ! 94, 9 5, 96 , 97, 98, 99, 100 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172 173, 174, 175, 176, 177 , 178, 179, 180, 18! L, 182 (isto é na extremidade carboxilo terminal da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID N°: 2-7), são substituídos cada um com o seguinte aminoácido não codificado de forma natural:
As sequências utilizadas para incorporação específica de local de p-propargil-tirosina em FGF-21 são SEQ ID N°: 1 (FGF-21), SEQ ID N° : 16 ó 17 (ARNtmut, ARNtm Tyr/QUA de M. jannaschii) e 22, 23 ó 24 descritos no Exemplo 2 anterior. 0 polipéptido FGF-21 que contém a propargil tirosina é expresso em E. coli e é purificado usando as condições descritas no Exemplo 3. 0 FGF-21 purificado que contém propargil-tirosina dissolvido a entre 0,1 e 10 mg/ml em tampão PB (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 0,15 M, pH = 8) e um excesso de 10 a 1000 vezes de um PEG que contém azida é adicionado à mistura de reacção. Adiciona-se depois uma quantidade catalítica de CuS04 e fio de Cu à mistura de reacção. Depois a mistura é incubada (incluindo, mas sem limitação, 358 aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente ou 37 "C, ou durante a noite a 4 °C) , é adicionado H20 e a mistura é filtrada através de uma membrana de diálise. a amostra pode ser analisada com respeito à adição, incluindo, mas sem limitação, por métodos similares descritos no Exemplo 3. Neste Exemplo, o PEG terá a seguinte estrutura: R-PEG (N) -0- (CH2) 2-NH-C (0XCH2) n-N3
Em que R é metilo, n é 4 e N é 10.000 PM.
Exemplo 8
Este exemplo detalha a substituição de um aminoácido grande hidrófobo num polipéptido FGF-21 com propargil tirosina.
Um resíduo de Phe, Trp ou Tyr presente dentro de uma das seguintes regiões de FGF-21: antes da posição 1 (isto é, na extremidade N terminal) , r 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7 , 8, 9 , 10, 11 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86 co >» 88, 8! 9, 90 , 91 , 92 93,9 4, 95, 96 , 97 , 98, 99, 100 101, 102, 103, 104, 105, , 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 113, 114, 115, 116, 117, , 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 125, 126, 127, 128, 129, , 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 137, 138, 139, 140, 141, , 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148 149, 150, 151, 152, 153, , 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 161, 162, 163, 164, 165, , 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172 173, 174, 175, 176, 17 2 178, 179, 180, . 18: L, 182 (ist o é na extremidade carboxilo terminal da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID N° : 2-7) é substituído com o seguinte aminoácido não codificado de forma natural como se descreve no Exemplo 7: 359
Uma vez modificado, une-se um PEG à variante do polipéptido FGF-21 que compreende o aminoácido que contém alcino. 0 PEG terá a sequinte estrutura:
Me-PEG(N)-0-(CH2) 2-N3 e métodos de acoplamento seguirão aos do Exemplo 7. Este gerará uma variante de polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido não codificado de forma natural que é aproximadamente isostérico com um dos aminoácidos hidrófobos grandes de ocorrência natural e que se modifica com um derivado de PEG num local distinto dentro do polipéptido.
Exemplo 9
Este exemplo detalha a geração de um homodímero, heterodimero, homomultímero ou heteromultímero de polipéptidos FGF-21 separados por um ou mais linkers de PEG. A variante de polipéptido FGF-21 que contém alcino produzida no Exemplo 7 é feita reagir com um derivado de PEG da forma: N3- (CH2) n-C (0) -NH- (CH2) 2-0-PEG (N) -0- (CH2) 2-NH-C (0) - (CH2) n-N3 em que n é 4 e o PEG tem um PM meio de aproximadamente 5.000, para gerar o homodímero de polipéptido FGF-21 correspondente no qual as duas moléculas de FGF-21 se separam fisicamente por PEG. De uma maneira análoga pode ser acoplado um polipéptido FGF-21 com um ou mais polipéptidos distintos para formar heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros. Serão realizados o acoplamento, purificação e análise como nos Exemplos 7 e 3. Exemplo 10 360
Este exemplo detalha o acoplamento de um resíduo de sacárido com um polipéptido FGF-21.
Um resíduo dos seguintes é substituído com o aminoácido não codificado de forma natural posterior: antes da posição 1 (is to é na extremidade N termi nal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, , 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26 , 27 , 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41 , 42 , 43, 44, 45, 46, 47 , 48 , 49, 50,51 , 52, 53, 54, 55, 56 ., 57 58, 9, 60, 61 ,62, 63, 64, i 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71 , 72 , 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86 , 87 , 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99, 100, 1 01, 102, 103, 104, : L05, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123 , 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 , 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147 , 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 , 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171 , 172, 173, 174, 175, . 176, 177, 178 , 179 , 180, 181, 182 (isto é, na extremidade carboxilo terminal da proteína) (SEQ ID N°: 1 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID N° : 2-7) como se descreve no Exemplo 3.
Uma vez modificada, a variante do polipéptido FGF-21 que compreende o aminoácido que contém carbonilo é feito reagir com um análogo de aminooxi ligado a β de N-acetilglicosemina (GlcNAc). A variante do polipéptido FGF-21 (10 mg/ml) e o aminooxi sacárido (21 mM) são misturados em tampão de acetato de sódio 100 mM aquoso (pH 5,5) e são incubados a 37 °C durante 7 a 26 horas. Um segundo sacárido acopla-se com o primeiro enzimaticamente incubando o 361 polipéptido FGF-21 conjugado com sacárido (5 mg/ml) com UDP-galactose (16 mM) e β-l,4-galacitosiltransferasa (0,4 unidades/ml) em tampão HEPES 150 mM (pH 7,4) durante 48 horas a temperatura ambiente (Schanbacher et al. J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061).
Exemplo 11
Este exemplo detalha a geração de um antagonista do polipéptido FGF-21 pegilado.
Um residuo, incluindo, mas sem limitação os envolvidos em ligação com o receptor de FGF-21, é substituído com o seguinte aminoácido não codificado de forma natural como se descreve no Exemplo 3.
Uma vez modificada, a variante do polipéptido FGF-21 que compreende o aminoácido que contém carbonilo se fará reagir com um derivado de PEG que contém aminooxi da forma: R-PEG(N) -O- (CH2) n-0-NH2 em que R é metilo, n é 4 e N é 20.000 PM para gerar um antagonista do polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido não codificado de forma natural que se modifica com um derivado de PEG num local simples dentro do polipéptido. 0 acoplamento, purificação e análise são realizados como no Exemplo 3.
Exemplo 12
Geração de um homodímero, heterodimero, homomultimero ou heteromultímero de polipéptido FGF-21 no qual as moléculas de FGF-21 se unem directamente.
Uma variante do polipéptido FGF-21 que compreende o aminoácido que contém alcino pode ser acoplada directamente a outra variante do polipéptido FGF-21 que compreende o aminoácido que contém azido. De uma maneira análoga pode 362 ser acoplado um polipéptido FGF-21 com um ou mais polipéptidos distintos para formar heterodimeros, homomultimeros ou heteromultimeros. São realizados acoplamento, purificação e análise como nos Exemplos 3, 6 e 7.
Exemplo 13 PEG-OH + Br-(CH2)„-C=CR’ PEG-0-(CH2)„-OCR’
A B 0 polialquilenoglicol (P-OH) é feito reagir com o haleto de alquilo (A) para formar o éter (B) . Nestes compostos, n é um número inteiro de um a nove e R' pode ser um grupo alquilo ou heteroalquilo Cl a C20 de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado. R' Também pode ser um alquilo cíclico ou heteroalquilo cíclico saturado ou insaturado C3 a C7, um grupo arilo ou heteroarilo substituído ou sem substituir, ou um grupo alcarilo substituído ou sem substituir (o alquilo é um alquilo Cl a C20 saturado ou insaturado) ou heteroalcarilo. Tipicamente, o PEG-OH é polietilenoglicol (PEG) ou monometoxi polietilenoglicol (mPEG) que tem um peso molecular de 800 a 40.000 Daltons (Da).
Exemplo 14 mPEG-OH + Br-CH2 -C=CH mPEG-0-CH2-C=CH mPEG-OH com um peso molecular de 20.000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 ml). Uma solução de brometo de propargilo, dissolveu-se como uma solução a 80 % em peso em xileno (0,56 ml, 5 mmol, 50 equiv., Aldrich), e depois à solução foi adicionada uma quantidade catalítica de Kl e a mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 2 horas. Depois adicionou-se água (1 ml) e o solvente foi retirado a vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2C12 (25 ml) e a camada orgânica foi separada, seca em Na2S04 anidro, e o volume foi reduzido para dar aproximadamente 2 ml. Esta solução de 363 CH2C12 foi adicionada gota a gota a éter dietilico (150 ml). O precipitado resultante foi recolhido, lavado com várias porções de éter dietilico frio e seco, proporcionando propargil-O-PEG.
Exemplo 15 mPEG-OH + Br- (CH2) 3-C=CH -» mPEG-O-(CH2) 3-C=CH O mPEG-OH com um peso molecular de 20.000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 ml). Depois, à mistura foram adicionados cinquenta equivalentes de 5-bromo-l-pentina (0,53 ml, 5 mmol, Aldrich) e uma quantidade catalítica de ΚΙ. A mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 16 horas. Depois, adicionou-se água (1 ml) e o solvente foi retirado a vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2C12 (25 ml) e a camada orgânica foi separada, seca em Na2S04 anidro e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 ml. Esta solução de CH2C12 foi adicionada gota a gota a éter dietilico (150 ml). O precipitado resultante foi recolhido, lavado com várias porções de éter dietilico frio e seco, proporcionando o alcino correspondente. Pode ser usado 5-cloro-l-pentina numa reacção similar.
Exemplo 16
(1) m-HOCH2C6H4OH + NaOH + Br-CH2-C=CH m-H0CH2C6H40-CH2-C=CH (2) m-H0CH2C6H40-CH2-CsCH + MsCl + N (Et) 3 -» m-Ms0CH2C6H40-
CH2-Cs=CH
(3) m-Ms0CH2C6H40-CH2-C=CH + LiBr -> m-Br-CH2C6H40-CH2-C=CH
(4) mPEG-OH + m-Br-CH2C6H40-CH2-C=CH -» mPEG-0-CH2-C6H40-CH2-C=CH A uma solução de 3-hidroxibenzilalcohol (2,4 g, 20 mmol) em THF (50 ml) e água (2,5 ml) adicionou-se em primeiro lugar hidróxido de sódio em pó (1,5 g, 37,5 mmol) e depois uma solução de brometo de propargilo, dissolvida em forma de uma solução a 80 % em xileno (3,36 ml, 30 mmol). A mistura 364 de reacção foi aquecida a refluxo durante 6 horas. À mistura foi adicionado ácido cítrico a 10 % (2,5 ml) e o solvente foi retirado a vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etilo (3 x 15 ml) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução saturada de NaCl (10 ml), secas em MgS04 e concentradas, dando álcool 3-propargiloxibenzílico.
Adicionaram-se cloreto de metanosulfonilo (2,5 g, 15,7 mmol) e trietilamina (2,8 ml, 20 mmol) a uma solução do composto 3 (2,0 g, 11,0 mmol) em CH2C12 a 0 °C e a reacção foi colocada no frigorífico durante 16 horas. Um tratamento habitual proporcionou o mesilato em forma de um óleo de cor amarela pálida. Este óleo (2,4 g, 9,2 mmol) dissolveu-se em THF (20 ml) e adicionou-se LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). A mistura de reacção foi aquecida a refluxo durante 1 hora e depois foi arrefecida a temperatura ambiente. À mistura foi adicionada água (2,5 ml) e o solvente foi retirado a vácuo. 0 resíduo foi extraído com acetato de etilo (3 x 15 ml) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução saturada de NaCI (10 ml), foram secas em Na2S04 anidro e foram concentradas para dar o brometo desejado. Dissolveu-se mPEG-OH 20 kDa (1,0 g, 0,05 mmol, Sunbio) em THF (20 ml) e a solução foi arrefecida num banho de gelo. Adicionou-se NaH (6 mg, 0,25 mmol) com agitação vigorosa durante um período de vários minutos seguido da adição do brometo obtido anteriormente (2,55 g, 11,4 mmol) e uma quantidade catalítica de ΚΙ. O banho de refrigeração foi retirado e a mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 12 horas. À mistura foi adicionada água (1,0 ml) e o solvente foi retirado a vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2C12 (25 ml) e a camada orgânica foi separada, seca em Na2S04 anidro, e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 ml. A adição gota a gota a uma solução de éter (150 ml) deu como resultado um precipitado de cor branca, que foi recolhido para produzir o derivado de PEG. 365
Exemplo 17 mPEG-NH2 + X-C (O) - (CH2) n-C=CR -> mPEG-NH-C (O) - (CH2) n-C=CR'
Os polímeros de poli(etilenoglicol) que contêm alcino terminal também podem ser obtidos por meio do acoplamento de um polímero de poli(etilenoglicol) que contém um grupo funcional terminal a uma molécula reactiva que contém a funcionalidade alcino como foi mostrado anteriormente. n está entre 1 e 10. R' pode ser H ou um grupo alquilo pequeno de Cl a C4.
Exemplo 18
(1) H02C- (CH2) 2-C=CH + NHS +DCC NHSO-C (O) - (CH2) 2-C=CH
(2) mPEG-NH2 + NHSO-C (O) - (CH2) 2-C=CH mPEG-NH-C (O) - (CH2) 2-C=CH
Dissolveu-se ácido 4-pentinóico (2,943 g, 3,0 mmol) em CH2C12 (25 ml). Adicionaram-se N-hidroxisuccinimida (3,80 g, 3,3 mmol) e DCC (4,66 g, 3,0 mmol) e a solução foi agitada durante a noite a temperatura ambiente. O NHS éster bruto resultante 7 foi usado na seguinte reacção sem purificação adicional.
Dissolveu-se mPEG-NH2 com um peso molecular de 5.000 Da (mPEG-NH2, 1 g, Sunbio) em THF (50 ml) e a mistura foi arrefecida a 4 °C. Adicionou-se em porções o NHS éster 7 (400 mg, 0,4 mmol) com agitação vigorosa. A mistura foi deixada em agitação durante 3 horas enquanto se aquecia a temperatura ambiente. Depois, adicionou-se água (2 ml) e o solvente foi retirado a vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2C12 (50 ml) e a camada orgânica foi separada, seca em Na2S04 anidro, e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 ml. Esta solução de CH2C12 foi adicionada em porções a éter (150 ml). O precipitado resultante foi recolhido e seco a vácuo.
Exemplo 19
Este Exemplo representa a preparação do metano sulfonil éster de poli (etilenoglicol) , que também pode ser 366 denominado como o metanosulfonato ou mesilato de poli(etilenoglicol). 0 tosilato correspondente e os haletos podem ser preparados por meio de métodos similares. mPEG-OH + CH3SO2CI + N (Et) 3 -> mPEG-0-S02CH3 mPEG-N3 0 mPEG-OH (PM = 3,400, 25 g, 10 mmol) em 150 ml de tolueno foi destilado azeotropicamente durante 2 horas numa atmosfera de azoto e a solução foi arrefecida a temperatura ambiente. À solução foram adicionados 40 ml de CH2CI2 seco e 2,1 ml de trietilamina seca (15 mmol). A solução foi arrefecida num banho de gelo e foram adicionados gota a gota 1,2 ml de cloreto de metanosulfonilo destilado (15 mmol) . A solução foi agitada a temperatura ambiente numa atmosfera de azoto durante a noite, e a reacção foi interrompida adicionando 2 ml de etanol absoluto. A mistura foi evaporada a vácuo para retirar os solventes, principalmente aqueles distintos de tolueno, foi filtrada, concentrada de novo a vácuo e depois foi precipitada em 100 ml de éter dietilico. O filtrado foi lavado com várias porções de éter dietilico frio e seco a vácuo, proporcionando o mesilato. O mesilato (20 g, 8 mmol) dissolveu-se em 75 ml de THF e a solução foi arrefecida a 4 °C. À solução arrefecida foi adicionada azida de sódio (1,56 g, 24 mmol). A reacção foi aquecida a refluxo numa atmosfera de azoto durante 2 horas. Depois, os solventes foram evaporados e o resíduo foi diluído com CH2C12 (50 ml). A fracção orgânica foi lavada com uma solução de NaCl e seco sobre MgS04 anidro. O volume foi reduzido até 20 ml e o produto foi precipitado por meio da adição a 150 ml de éter seco frio.
Exemplo 20
(1) N3-C6H4-CO2H -» N3-C6H4CH2OH (2) N3-C6H4CH20H -» Br-CH2-C6H4-N3 (3) mPEG-OH + Br-CH2-C6H4-N3 -> mPEG-0-CH2-C6H4-N3 367 0 álcool 4-azidobenzílico pode ser produzido usando o método descrito na Patente US 5.998.595. Adicionaram-se cloreto de metanosulf onilo (2,5 g, 15,7 mmol) e trietilamina (2,8 ml, 20 mmol) a uma solução de álcool 4- azidobenzilico (1,75 g, 11,0 mmol) em CH2C12 a 0 °C e a reacção foi colocada no frigorifico durante 16 horas. Um tratamento habitual proporcionou o mesilato em forma de um óleo de cor amarela pálida. Este óleo (9,2 mmol) dissolveu-se em THF (20 ml) e adicionou-se LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). A mistura de reacção foi aquecida a refluxo durante 1 hora e depois foi arrefecida a temperatura ambiente. À mistura foi adicionada água (2,5 ml) e o solvente foi retirado a vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etilo (3 x 15 ml) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução saturada de NaCl (10 ml), foram secas em Na2S04 anidro e foram concentradas, dando o brometo desejado.
Foi tratado mPEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 ml) e à mistura foi adicionada o brometo (3,32 g, 15 mmol) junto com uma quantidade catalítica de ΚΙ. A mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 12 horas. À mistura foi adicionada água (1,0 ml) e o solvente foi retirado a vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2C12 (25 ml) e a camada orgânica foi separada, seca em Na2S04 anidro, e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 ml. A adição gota a gota a uma solução de éter (150 ml) deu como resultado um precipitado que foi recolhido, produzindo mPEG-0-CH2-C6H4-N3.
Exemplo 21 NH2-PEG-0-CH2CH2C02H + N3-CH2CH2C02-NHS N3-CH2CH2-C (O) NH- peg-o-ch2ch2co2h
Dissolveu-se NH2-PEG-0-CH2CH2C02H (PM 3,400 Da, 2,0 g) numa solução saturada aquosa de NaHC03 (10 ml) e a solução foi arrefecida a 0 °C. Adicionou-se propionato de 3-azido-l-N-hidroxisuccinimido (5 equiv.) com agitação vigorosa. Depois 368 de 3 horas, foram adicionados 20 ml de H20 e a mistura foi agitada durante 45 minutos mais a temperatura ambiente. O pH foi ajustado a 3 com H2S04 0,5 N e adicionou-se NaCl a uma concentração de aproximadamente 15 % em peso. A mistura de reacção foi extraído com CH2C12 (100 ml x 3), foi seca em Na2S04 e concentrada. Depois da precipitação com éter dietílico frio, o produto foi recolhido por filtração e seco a vácuo, produzindo o derivado de PEG omega-carboxiazida.
Exemplo 22 mPEG-OMs + HC=CLi -> mPEG-0-CH2-CH2-C=C-H A uma solução de acetileto de lítio (4 equiv.), preparado como é conhecido na técnica e arrefecido a -78 °C em THF, foi adicionada gota a gota uma solução de mPEG-OM dissolvida em THF com agitação vigorosa. Depois de 3 horas, foi deixada que a reacção se aquecesse a temperatura ambiente e foi interrompida com a adição de 1 ml de butanol. Depois, foram adicionados 20 ml de H20 e a mistura foi agitada durante 45 minutos mais a temperatura ambiente. 0 pH foi ajustado a 3 com H2S04 0,5 N e adicionou-se NaCl a uma concentração de aproximadamente 15 % em peso. A mistura de reacção foi extraída com CH2C12 (100 ml x 3), foi seca em Na2S04 e concentrada. Depois da precipitação com éter dietílico frio, o produto foi recolhido por filtração e seco a vácuo, produzindo 1-(but-3-iniloxi)- metoxipolietilenoglicol (mPEG).
Exemplo 23
Podem ser incorporados aminoácidos que contêm azido e acetileno seleccionando os locais em proteínas usando os métodos descritos em L. Wang, et al. , (2001), Science 292:498-500, J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical
Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3 (11):1135-1137; J. W. Chin, et ai., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024: e L. Wang, & 369 P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Uma vez que tenham sido incorporados os aminoácidos, é levada a cabo a reacção de cicloadição com proteína 0,01 mM em tampão fosfato (PB), pH 8, na presença de derivado de PEG 2 mM, CuS04 1 mM, e ~ 1 mg de fio de Cu durante 4 horas a 37 °C. Exemplo 24
Este exemplo descreve a síntese de derivados de p-Acetil-D,L-fenilalanina (pAF) e m-PEG-hidroxilamina. A pAF racémica é sintetizada usando o método que foi descrito previamente em Zhang, Z., Smith, B. A. C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746.
Para sintetizar o derivado de m-PEG-hidroxilamina, completam-se os seguintes métodos. A uma solução de ácido (N-t-Boc-aminooxi)acético (0,382 g, 2,0 mmol) e 1,3-diisoproprilcarbodiimida (0,16 ml, 1,0 mmol) em diclorometano (DCM, 70 ml), que é agitada a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora adicionam-se metoxi- polietilenoglicol amina (m-PEG-NH2, 7,5 g, 0,25 mmol, Mt. 30 K, de BioVectra) e diisopropriletilamina (0,1 ml, 0,5 mmol). A reacção é agitada a TA durante 48 horas e depois é concentrada a aproximadamente 100 ml. A mistura é adicionada gota a gota a éter frio (800 ml) . O produto t-Boc-protegido é retirado por precipitação e recolhido por filtração e lavado com éter 3 x 100 ml. É purificado adicionalmente por meio da dissolução de novo em DCM (100 ml) e a precipitação duas vezes em éter (800 ml). O produto é seco com um rendimento a vácuo de 7,2 g (96 %), confirmado por RMN e teste de Nihidrina. O deBoc do produto protegido (7,0 g) que foi obtido
anteriormente é realizado em TFA a 50 %/DCM (40 ml) a 0 °C durante 1 hora e depois a TA durante 1,5 hora. Depois de eliminar a maior parte do TFA a vácuo, o sal de TFA do derivado de hidroxilamina é convertido no sal de HC1 adicionando HC1 4 N em dioxano (1 ml) ao resíduo. O 370 precipitado é dissolvido em DCM (50 ml) eé precipitado de novo em éter (800 ml). O produto final (6,8 g, 97 %) é recolhido por filtração, é lavado com éter 3 x 100 ml, seco a vácuo e armazenado numa atmosfera de azoto. Outros derivados de PEG (5 K, 20 K) hidroxilamina são sintetizados usando o mesmo método.
Exemplo 25
Análise de fosforilação de ERK1/2 inducida por FGF-21 WT e análogos de PEG 30K:
Cultivar 293 transfectadas de forma estável com Klotho humano beta a 100.000 células/poço (DMEM + FBS 10 %) numa placa revestida com poli-Lys. Ao dia seguinte as células são 100 % confluentes, o meio é retirado por aspiração e é substituído com meio novo e incubado durante a noite. Depois de 24 horas as células são estimuladas com os análogos de FGF-21 de PEG 30K apropriados usando como padrão FGF21WT. Cada composto individual é preparado dissolvendo o mesmo em PBS/BSA 1 %. As células são tratadas por triplicado durante 10 minutos a 37 °C no incubador. Depois de 10 minutos o meio de incubação é retirado por aspiração cuidadosamente de cada poço e são adicionados 40 μΐ de tampão de lise de sinalização celular lx frio que contém inibidores de protease/ fosfatase (cocktail PI, Na3VN4 e PMSF) a cada poço para produzir lisados celulares. Situa-se uma placa de 96 poços em gelo durante 20 minutos e depois se sedimenta por centrifugação a 4000 rpm durante 10 minutos.
Os lisados celulares são congelados a -80 °C. Mais tarde cada amostra é descongelada e são adicionados 10 μΐ de lisados celulares à placa tratada com MSD revestida com anticorpo que captura as formas tanto não fosforiladas como fosforiladas de ERK1/2. É produzida a incubação com anticorpo primário durante 2 horas, depois a placa é lavada várias vezes com tampão específico seguido de adição de anticorpo secundário. Depois de uma hora de incubação a 371 placa é lavada de novo várias vezes. Adiciona-se tampão para leitura a cada poço. A placa é transferida a uma máquina de leitura de MSD. A curva que é produzida baseia-se nas unidades de leitura anti ERK1/2 fosforilado e calcula-se a CE50 usando Siqma Plot. A perda de actividade em vezes calcula-se dividindo CE50 do composto especifico pegilado 30 K com a CE50 do WT.
Exemplo 26: Protocolo de ensaio de fosforilação de ERK 1/2 celular (pERK) e análise de MSD
Mantiveram-se células 293 β Klotho-4 em DMEM + FBS 10 % + P/S + geneticina 0,5 mg/ml. Quando as células alcançaram 50-90 % de confluência, foram tripsinizadas, e foram cultivadas 100.000 células/poço em placas de 96 poços revestidas com poli-D-lys em DMEM + FBS 10 % + P/S.
Ao dia seguinte quando as células eram 100 % confluentes, comprovou-se para assegurar que o meio ainda era vermelho. Depois o meio foi retirado por aspiração. Pipetearam-se 200 μΐ/poço de diluições seriadas de variantes de FGF-21 (em PBS + BSA 1 %) na placa de 96 poços. A placa de 96 poços foi situada depois num incubador de C02 5 % a 37 °C durante exactamente 9 minutos. Os tratamentos com FGF-21 foram retirados depois completamente por aspiração e foram adicionados 40 μΐ/poço de tampão de lise de sinalização celular lx + cocktail de inibidor de protease Sigma 1 x + ortovanadato de sódio 2 mM + PMSF 1 mM + inibidor de MSD fosfatase I lx + inibidor de MSD fosfatase II lx + cocktail de inibidor de MSD protease lx + MSD PMSF 2 mM recém-preparado. A placa foi situada em gelo e foi separada durante 25 minutos, enquanto se pipeteava cada poço acima e abaixo com um pipeteador P20 para misturar os lisados. Depois de misturar os poços, situou-se o cubo de gelo completo e a placa num agitador a 4 °C durante o resíduo do tempo. Depois de 25 minutos, a placa foi sedimentada por centrifugação a 4000 rpm, 10 minutos a 4 °C. Transferiram- 372 se os sobrenadantes a uma placa de 96 poços de fundo redondo fria em gelo.
Análise de MSP
Este ensaio foi realizado usando o ensaio de fosfo (T/E 202/204; 185/187)/ERK1/2 total do kit de lisado de células completas do sistema de ensaio MULTI-SPOT Meso Scala Discovery.
Todos os reagentes de MSD foram descongelados a temperatura ambiente e todos os tampões necessários foram preparados de acordo com as instruções do kit. Para cada poço, foram adicionados 150 μΐ de bloqueador à uma placa dupla de fosfo ERK-ERK total e foi permitido que se bloqueasse durante 1 hora a temperatura ambiente num agitador. A placa foi lavada depois 4x com 160 μΐ/poço de tampão de lavado lx. Adicionaram-se 16 μΐ/poço de tampão de lise + inibidores de protease e fosfatase (preparados anteriormente para as estimulações celulares) e transferiram-se 10 μΐ/poço da placa de sobrenadante de lisado frio aos poços da placa de MSD (o volume total foi convertido depois em 26 μΐ/poço). A placa de MSD foi incubada durante 3 horas a temperatura ambiente num agitador. A placa foi lavada depois 4x com 160 μΐ/poço de tampão de lavado lx. Adicionaram-se 25 μΐ/poço de anticorpo de detecção (diluído 50x em tampão de diluição de anticorpos) e preparou-se para incubar durante 1 hora a temperatura ambiente num agitador. A placa foi lavada de novo 4x com 160 μΐ/poço de tampão de lavado lx e foram adicionados 150 μΐ/poço de tampão de leitura T lx depois do qual a placa foi lida imediatamente numa máquina geradora de imagens sector 2400 de MSD.
Quantificação de BCA
Usou-se o kit de ensaio de proteína BCA de Pierce. Foi diluído um padrão de BSA numa placa de 96 poços desde uma concentração superior de 2 mg/ml, com diluições 2x pelas colunas em tampão de lise de sinalização celular lx. (O último conjunto de poços foram de tampão, sem BSA) . 373
Pipetearam-se 25 μΐ/poço dos padrões de BSA por duplicado em dois placas de 96 poços MaxiSorp. Foram preparados diluições de lisados 3x em tampão de lise de sinalização celular lx e foram adicionados 25 μΐ/poço às placas MaxiSorp. Preparou-se o reagente de trabalho de acordo com a folha de instruções do kit de Pierce. Pipetearam-se 200 μΐ em cada poço das placas MaxiSorp. As placas foram incubadas a temperatura ambiente e foram lidas a λ = 562 nm no leitor de placas.
Análise de Dados
Calcularam-se as concentrações para todos os lisados com o kit de BCA. Quando os lisados são todos similares em concentração, então não se normaliza com respeito à análise MS D. Para a análise de MSD, média de pontos repetidos, calcula-se o desvio tipico e os valores de CV. Usa-se SigmaPlot para calcular os valores de CE50 para diluições seriadas de variantes de FGF-21 e usa-se Fold Above WT CE50 como o critério de classificação para as variantes. Os resultados podem ser na Figura 7a e 7b do presente pedido. Exemplo 27: Método a jusante não marcado de FGF-21 Solubilização de preparação de corpos de inclusão Foi ressuspensa a pasta celular misturando num sólido 10 % final em tampão de corpos de inclusão (IB) I a 4 °C (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM, Triton X-100 1 %; 4 °C). As células foram lisadas passando material ressuspenso através de um micro fluidificador um total de duas vezes, depois se centrifugou (10.000 g; 15 minutos; 4 °C) e o sobrenadante foi decantado. O sedimento de IB foi lavado por ressuspensão num volume adicional de tampão IB I (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM, Triton X-100 1 %; 4 °C) e foi passado o material ressuspenso através de um micro fluidificador um total de duas vezes, depois se centrifugou (10.000 g; 15 minutos; 4 °C) e o sobrenadante foi decantado. O sedimento de IB foi ressuspenso num volume de tampão II (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM, EDTA 1 mM; 4 374 °C), depois se centrifugou (10.000 g; 15 minutos; 4 °C) e o sobrenadante foi decantado. O sedimento de IB foi ressuspenso depois em meio volume de tampão II (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 4 °C). IB foi separada em aliquotas em recipientes apropriados, depois se centrifugou (10.000 g; 15 min; 4 °C) e o sobrenadante foi decantado. Os corpos de inclusão foram solubilizados (este é o ponto no qual poderiam ser armazenados de outro modo a -80 °C até a sua utilização posterior)
Solubilização de corpos de inclusão
Os corpos de inclusão foram solubilizados a uma concentração final entre 10 e 15 mg/ml em tampão de solubilização (Tris 20 mM, pH 8,0; ureia 8 Μ; β-ΜΕ 10 mM) e IB solubilizados incubados a temperatura ambiente com mistura constante durante 1 hora. O material insolúvel foi retirado por filtração (filtro de PES de 0,45 μπι) e a concentração proteica foi ajustado (não sempre necessário) por diluição com tampão de solubilização adicional (quando a concentração proteica é alta).
Redobragem
Redobragem por diluição a uma concentração proteica final de 0,5 mg/ml em Tris 20 mM, pH 8,0; 4 °C. Foi permitida que voltassem a se dobrar durante 18 a 24 horas a 4 °C. Purificação
Reacção de redobragem filtrada através de um filtro de PES de 0,45 pm. O material carregado sobre uma coluna de Q HP (GE Healthcare) foi equilibrado em tampão A. (Tris 20 mM, pH 7,5). Eluiu-se FGF-21 com um gradiente linear sobre 20 VC a tampão B 100 % (Tris 20 mM, pH 7,5; NaCl 250 mM) . Agruparam-se os FGF-21 monoméricos.
Pegilação e purificação
Tomou-se o grupo de Q HP e permutou-se o tampão a Tris 20 mM, pH 8,0; ureia 2 M; EDTA 1 mM. O pH foi reduzido a 4,0 com ácido acético glacial 50 %. Concentrou-se a amostra até 4,0 ± 1,0 mg/ml. Adicionou-se um excesso molar de PEG 12:1 375 e uma concentração final de hidrazida acética 1 %, pH 4,0 à amostra. Foi incubada a 28 °C durante 48-72 horas. Adicionou-se uma base de Tris a uma concentração final 50 mM a reacção de PEG e foi diluído 10 vezes com água RO. Se aseguró que a conductividad era < 1 ms/cm e o pH estava entre 8,0-9,0. Se carregado material sobre uma coluna 30Q Source (GE Healthcare) equilibrada em Tampão A. (Tris 20 mM, pH 8,0). Eluiu-se PEG-FGF-21 com um gradiente linear sobre 20 VC a 100 % B (Tris 20 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM) . Agrupou-se PEG-FGF-21 e permutou-se o tampão a Tris 20 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM. Concentrou-se material de PEG entre 1 e 2 mg/ml e esterilizou-se por filtragem usando filtro de PES de 0,22 pm. Armazenou-se a 4 °C. Para armazenamento prolongado, congelou-se rapidamente e armazenou-se a -80 °C.
Exemplo 28
Propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 em ratos
Este protocolo foi usado para proporcionar dados (encontrados nas Figuras 11-23) sobre as propriedades farmacocinéticas de compostos de FGF-21 nativos e modificados com PEG produzidos por tecnologia patenteada de Ambrx em ratos com cateteres. A farmacocinética dos artículos de ensaio foi ensaiada por ELISA específica para FGF-21 humano a partir de amostras de soro obtidas em pontos de tempo específicos depois de dosagem farmacológica.
Artículos de ensaio: 1. O composto de Ambrx PEG-R77 FGF-21 se usará a 0,25 mg/ml diluído em PBS IX. 2. 0 mg/ml composto diluído de Ambrx em PBS IX. PEG-Y104 FGF-21 se usará a 0,25 3. 0 composto de Ambrx PEG-R12 6 FGF-21 se usará a 0,25 mg/ml diluído em PBS IX.
Formulação/gualidade do artículo de ensaio: 376
Concentrações de reserva = PEG-R77 FGF-21 1,0 mg/ml PEG-Y104 FGF-21 1,16 mg/ml PEG-R126 FGF-21 1,08 mg/ml Animais:
Serão colocados cirurgicamente cateteres na veia jugular a doce (12) ratos macho Sprague-Dawley (SD) que pesam aproximadamente 250-275 gramas ao inicio do estudo antes de chegar a Ambrx. Os animais foram recebidos de CRL em boas condições e foram aclimatados à localização do estudo durante pelo menos 3 dias antes do inicio do estudo. Os ratos serão pesados no dia da administração do articulo de ensaio. Os animais serão alojados em condições sem patogénios convencionais com água e comida a vontade.
Grupos de animais: Todos os compostos serão administrados por via subcutânea
Grupo 1 (n = 4): injecção SC de PEG-R77 (0,25 mg/kg).
Grupo 2 (n = 4): injecção SC de PEG-Y104 (0,25 mg/kg).
Grupo 3 (n = 4): injecção SC de PEG-R126 (0,25 mg/kg).
Os animais são pesados antes da administração do artículo de ensaio. Os compostos são formulados para serem administrados a IX PC em μΐ. Injecta-se uma administração subcutânea do artículo de ensaio na região escapular dorsal. Os animais receberão uma injecção simples de artículo de ensaio (tempo = 0). Em pontos de tempo específicos (veja-se posteriormente), será extraído sangue completo dos animais, será recolhido em tubos de colecta microtainer SST. Será permitido que o soro coagule durante 30 minutos antes da centrifugação. O soro será transferido a tubos de titulação de poliproprileno, vedados com microtiras, e será armazenado a -800 °C até que se analise por ELISA para determinar as concentrações em soro de FGF-21 .
Colecta de dados/Critérios de valoração: 377
Cada animal se usará durante um ciclo temporal de PK completo. Serão extraídos aproximadamente 0,25 ml de sangue completo dos cateteres das veias jugulares. Imediatamente depois da colecta de sangue, os cateteres serão lavados abundantemente com 0,1 ml de solução salina.
Serão requeridos os seguintes pontos de tempo de colecta para animais que recebem material do artículo de ensaio com base no perfil farmacocinético antecipado dos artículos de ensaio:
Pré-sangramento, 1, 2, 4, 8, 24, 32 48, 56, 72 e 96 horas depois da dose.
Terminação:
Todos os animais serão sacrificados depois da conclusão do estudo
Resultados:
Os resultados mostram-se no quadro a seguir e nas figuras que acompanham o presente pedido. 378
Propriedades de PK de isómero de PEG de FGF21-IV
Isómero de PEG 30K Intravenoso 0,25 mg/kg R72 R7 7 H87 E9 1 Y1 04 EI 10 RI 26 PI 46 Lambda_z 1/h 0, 057 0,043 0, 044 0, 052 Lambda_z inferior h 8 8 8 8 Lambda_z superior h 48 48 48 48 HL_Lambd a_z h 12,27 16, 44 15,61 13,67 Tmax h 0,25 0,25 0,25 0,312 5 Cmax ng/ml 5998, 6 5802, 3 7821, 4 8655, 8 CO ng/ml 6 8 61, 4 6662, 5 9280, 1 9149, 9 AUCINF_o bs h* / ng /ml 53714 ,9 52962 , i 69435 ,8 86554 ,6 Vz_obs ml/kg 82,46 113,1 0 81,65 58,06 CI_obs ml/h/ kg 4, 65 4, 74 3,61 2,92 MRTINF_o bs h 14, 49 13,81 16, 18 14, 83 Vss_obs ml/kg 67, 46 65,53 58,53 43,48 379
Propriedades de PK de isómero de PEG de FGF21-SC
Isómero Subcutâneo de PEG 0,251 mg/kg 30K R72 R7 H87 E91 Y10 Eli RI 2 PI 46 7 4 0 6 Lambda_z 1 h 0,04 0, 035 0,031 3 7 Lambda_z h 24 24 24 24 inferior Lambda_z h 96 90 96 96 superior HL_Lambd h 14, 16,1 19,93 22, 01 a z 72 4 Tmax h 24 24 22 24 Cmax ng/ml 254 174, 229, 7 321,3 ,5 3 AUCINF_o h*/ng/ 8206 12177 15908 bs ml ,7 ,2 ,4 Vz_obs ml/kg 458 731, 606,2 503, 4 ,9 1 CI_obs ml/h/k 21, 31,6 20, 91 15, 86 g 92 7 MRTINF_0 h 36, 36,3 40,35 40,07 bs 52 1
Exemplo 29
Estudos in vivo de FGF-21 PEGilado
Administram-se PEG-FGF-21, FGF-21 não modulado e solução de tampão a ratinhos ou ratos. Os resultados mostrarão actividade superior e semivida prolongada do FGF-21
Tmax aumentada de compostos pegilados Tl/2 aumentado de compostos pegilados AUC aumentada de compostos pegilados
Atributos de PK dependentes de local de pegilação 380 PEGilado da presente invenção em comparação com FGF-21 não modificado. De forma similar, são administrados FGF-21 modificado, FGF-21 não modificado e solução de tampão a ratinhos ou ratos.
Análise farmacocinético O documento WO 2005/091944 descreve estudos farmacocinéticos que podem ser realizados com os compostos de FGF-21 da presente invenção. Administra-se um polipéptido FGF-21 da invenção por vias intravenosa ou subcutânea a ratinhos. Tomam-se amostras sanguíneas dos animais antes e em pontos de tempo depois da dosagem. É recolhido plasma de cada amostra e é analisado por radioimunoensaio. Pode ser calculada a semivida de eliminação e ser comparada entre polipéptidos FGF-21 que compreendem um aminoácido não codificado de forma natural e FGF-21 de tipo selvagem ou diversas formas de polipéptidos FGF-21 da invenção. De forma similar, podem ser administrados polipéptidos FGF-21 da invenção a macacos cynomolgus. Tomam-se amostras sanguíneas dos animais antes e em pontos de tempo da dosagem. É recolhido plasma de cada amostra e é analisado por radioimunoensaio.
Podem ser administrados polipéptidos da invenção a ratos macho ZDF (ratos gordos diabéticos; de 8 semanas de idade no começo do estudo, Charles River-GMI). Alimenta-se os ratos com ração Purina 5008 a vontade. Preparam-se os seguintes grupos de ensaio: solução salina; insulina 4U/dia; FGF-21, 500 μρ/dia Acute (o grupo de dosagem de
Acute é dosificado uma vez e tomam-se amostras sanguíneas a T=0, 2, 4, 8 e 24 horas depois da dose); FGF-21, 100 μρ/dia; FGF-21, 250 μq/dia; FGF-21, 500 μς/άίά; FGF-21 (uma vez/dia) 500 μρ/ml; Solução Salina Delgados; Insulina 4U/dia Delgados; FGF-21 500 μρ/dia Delgados. Os grupos de delgados representam ratos ZDF delgados não diabéticos.
Os compostos são injectados s.c. (duas vezes ao dia) excepto para o segundo grupo de 500 μρ/dia que recebe uma 381 injecção por dia durante o transcurso do estudo (7 dias). Injecta-se veiculo a ratos controlo (PBS; 0,1 ml). Depois de 7 dias de dosagem, submetem-se os animais a um ensaio de tolerância a glicose oral. É recolhido sangue para glicose e triglicéridos por sangramento com pinça da cauda sem anestesia. Os polipéptidos FGF-21 podem reduzir os níveis de glicose em plasma de uma maneira dependente de dose. Além disso, os ratos ZDF delgados podem não ficar hipoglicémicos depois de exposição a polipéptidos FGF-21 da invenção em comparação com ratos com dose de insulina. Modelo de obesidade oh!oh O modelo de ratinhos ob/ob é um modelo animal para hiperglucemia, resistência a insulina e obesidade. Podem ser medidos os níveis de glicose em plasma depois de tratamento com polipéptido FGF-21 em comparação com grupos de controlo de veículo e insulina em ratinhos ob/ob. Neste modelo de obesidade, aos grupos de ensaio de ratinhos ob/ob macho (7 semanas de idade) é injectado veículo somente (PBS), insulina (4 OU/dia) ou polipéptido FGF-21 (5 μg/dia e 25 μρ/άίη), por via subcutânea (0,1 ml, duas vezes ao dia) durante sete dias. É recolhido sangue por sangramento com pinça da cauda os dias 1, 3 e 7, uma hora depois da injecção do primeiro composto, e são medidos os níveis de glicose em plasma usando um protocolo convencional. Os polipéptidos FGF-21 da invenção estimulam a captação de glicose se forem reduzidos os níveis de glicose em plasma em comparação com o grupo de controlo de veículo. Os níveis de triglicéridos podem ser comparados depois de tratamento com polipéptidos FGF-21 da invenção em comparação com outras moléculas. O polipéptido pode ser administrado ao ratinho por meio de múltiplas doses, infusão contínua ou uma dose simples, etc.
Exemplo 30
Avaliação farmacocinética de análogos de FGF21: As propriedades farmacocinéticas dos análogos de FGF-21 382 30KPEG-pAF(Νβ-His) com diversos locais de conjugação de PEG foram avaliados em rato. Outros parâmetros estudados foram PM de PEG, assim como a dose de composto administrado. Foi determinada a percentagem de biodisponibilidade para várias variantes de 30KPEG-pAF(Νβ-His)FGF21.
Animais: Toda a experimentação animal foi analisada de acordo com os protocolos aprovados pelo Comité de Cuidado e Uso de Animais Institucional. Foram obtidos ratos macho Sprague-Dawley (175-300 g) de Charles River Laboratories. Os ratos foram alojados individualmente em jaulas em habitações com um ciclo de luz/escuridão de 12 horas e foram aclimatados ao viveiro Ambrx durante pelo menos 3 dias antes da experimentação. Proporcionou-se aos animais acesso a ração de roedores Purina 5001 e água a vontade. Dosagem e colecta de soro: Foram instalados cirurgicamente cateteres na veia jugular para colecta de sangue por CRL antes do envio. Depois de permeabilidade de cateter bem-sucedida, foi designado aos animais a grupos de tratamento antes de dosagem. Foi administrada uma dose simples de composto por via intravenosa ou via subcutânea num volume de dose de 1 ml/kg. As concentrações de dose do composto foram derivadas por diluição em PBS usando a concentração de reserva como foi designado no Certificado de Libertação. Foram colhidas amostras sanguíneas em diversos pontos de tempo por meio do cateter permanente e foram postos em tubos de microcentrífuga SST. Foi recolhido soro depois da centrifugação e armazenou-se a -80 °C até sua análise. Análise farmacocinética: O ensaio para a quantificação de PEG-FGF-21 em soro de ratos Sprague-Dawley desenvolveu-se em Ambrx Inc., A Jolla, CA. São revestidos poços de microplacas com anticorpo policlonal IgG anti- FGF-21 humano de cabra (PAb; RnD Systems, clon AF2539) que se usa como o reagente de captura. São carregadas amostras de padrão (STD) e controlo de qualidade (QC), ambas preparadas por meio de adições de análogo de PEG-FGF-21 em soro de 383 rato Sprague Dawley 100 %, e amostras de estudo nos poços depois de pré-tratamento 1:100 com tampão de bloqueio I. O FGF-21 nas amostras STD, QC e de estudo se captura pelo PAb imobilizado. Os materiais não ligados são retirados lavando os poços. Adiciona-se PAb IgG anti-FGF-21 humano de cabra com biotina (RnD Systems, clon BAF2539) aos poços seguido de uma etapa de lavagem e a adição de peroxidase de rábano silvestre com estreptavidina (SA-HRP; RnD Systems, N° de Catálogo DY998) para detecção do PEG-FGF-21 capturado. Depois de outra etapa de lavagem, é adicionado solução de substrato de tetrametilbencidina (TMB, Kirkegaard Perry Laboratories) aos poços. A TMB reage com o peróxido na presença de HRP e produz um sinal colorimétrico proporcional à quantidade de análogo de PEG-FGF-21 unida pelo reagente de captura na etapa inicial. O desenvolvimento da cor é interrompida por meio da adição de ácido sulfúrico 2 N e a intensidade da cor (densidade óptica DO) é medido a 450 nm. A conversão de unidades de DO para as amostras de estudo e as QC a concentração é conseguida através de uma comparação mediada por software informático com uma curva padrão na mesma placa, da qual é realizada regressão de acordo com um modelo de regressão logística de 5 parâmetros usando o pacote de redução de dados SOFTmax Pro v5. Os resultados são apresentados em unidades de concentração ng/ml.
As concentrações também podem ser medidas por um ensaio de tipo sandwich de duplo anticorpo ou outros métodos conhecidos pelos peritos na especialidade. As concentrações calcularam-se usando uma curva padrão gerada a partir do composto dosifiçado correspondente. Os parâmetros farmacocinéticos foram estimados usando o programa de modelado WinNonlin (Pharsight, versão 4,1). Foi usada análise não compartimentalizada para os dados de animais individuais com integração trapezoidal linear em direcção a 384 acima/logarítmica em direcção a abaixo, e os dados de concentração se ponderaron uniformemente.
Conclusões: As propriedades farmacocinéticas de FGF-21 N6-His WT estavam em consonância com as apresentadas por Kharito-nenkov e col, 2005 e foram comparáveis à proteína de FGF-21 WT não marcada.
Os perfis farmacocinéticos dos isómeros de 30KPEG-pAF(N6-His)FGF21 aumentaram significativamente por meio da adição de uma molécula de PEG de 3 0 kDa em comparação com os resultados obtidos de FGF-21 WT (não PEGilado).
Os compostos PEGilados mostraram perfis de PK notavelmente diferentes quando foram dosificados por via subcutânea ao nível de 0,25 mg/kg. H87 e L86 tendiam a ter um atributo de PK inferior em comparação com os outros isómeros. Além disso, os compostos R131 e Q108 PEG30 geraram propriedades de PK superiores de forma diferencial. Mais especificamente, estes compostos tinham AUC, Cmax e semivida terminal melhoradas. Uma análise da actividade estrutural em profundidade pode revelar explicações estruturais para as diversas propriedades de PK de cada isómero. A comparação do peso molecular de PEG mostrou que 30KPEG-pAF91(N6-His)FGF21 tinha uma persistência ligeiramente maior em circulação que 20KPEG-pAF91(Νβ-His)FGF21. No entanto, como o isómero de 20 kDa tinha um valor de Cmax mais alto, a AUCinf total para dois compostos era comparável. A biodisponibilidade para a isoforma de 20 kDa foi ligeiramente melhor que a variante de 30 kDa a 30 % versus 20 %, respectivamente.
Quadro 3. Valores de parâmetros farmacocinéticos para os compostos dosificados por via subcutânea a 0,25 mg/kg em rato. 385 0,25 mg/k g SC 11 /2 termina 1 Tma X Cmax AUCtodo AUCinf Vz / f Cl/f MRTiN F h h ng/m 1 h*ng/ml h*ng/m 1 ml/kg ml/h/k g h N6Hi s WT 1,26 0,9 92,1 261,6 297,3 1768, 9 971,2 2,52 PP WT 1,19 1,5 96,6 259,8 294, 7 1576, 2 910,4 2,53 R72 14, 72 24 254, 5 NE 11824, 7 458,9 21, 9 36,5 2 R77 32,30 22 237, 0 144571, 9 17687, 8 655, 8 14, 4 59, 1 8 L86 33,90 27 52,2 3215,7 3928,8 3153, 3 66,0 59,2 7 H87 16,14 24 174, 3 NE 8206,7 731,1 31, 7 36,3 1 E91 19,93 22 229, 7 NE 12177, 2 606,2 20,9 40,3 5 Y104 12,37 24 321, 9 19085,8 21188, 1 416,3 11, 9 47, 6 3 Q108 27,31 24 590, 3 31837,4 36387, 1 272, 4 7,0 51, 7 1 R126 16,48 20 248, 1 13238,3 15033, 4 643,0 16,8 49,5 7 R131 26,13 24 545, 4 27373,4 30786, 0 315, 0 8,3 50,4 1 PI 46 22,01 24 321, 3 NE 15908, 4 503,4 15, 9 40,0 7
Foram avaliadas as curvas de concentração em soro versus tempo por análise não compartimentai (Pharsight, versão 4,1) . N = 3-4 ratos por composto. ND: não realizado; NE: 386 não avaliado. Tmax: tempo para alcançar Cmax; Cmax: concentração máxima; ti/2 terminal: semivida terminal; AUCúltima: área sob a curva de concentração-tempo para a última mostra de plasma/ponto temporal; AUCinf: área sob a curva de concentração-tempo extrapolada ao infinito; MRT: tempo de residência média; Cl/f: eliminação de plasma total aparente; Vz/f: volume aparente de distribuição durante a fase terminal.
Quadro 4. Valores de parâmetros farmacocinéticos para 20KPEG-pAF91(16-hHis)FGF21 dosifiçado por via subcutânea a 0,25 mg/kg em rato._
Rato N° 1 Rato N° 2 Rato N° 3 Rato N° 4 11/2 terminal h 22,6 24, 4 17,3 16, 9 Tmax h 8 8 8 24 Cmax ng/ml 163, 0 182,1 155, 7 88, 8 AUCtodo h*ng/ml 7629, 1 7659,1 6461,4 4375,4 aucinf h*ng/ml 8232,0 8333,8 6661,2 4521,7 Vz/f ml/kg 989,8 1054,2 937,3 1347,7 Cl/f ml/h/kg 30,4 30,0 37,5 55,3 MRT inf h 39,9 41, 0 32,5 34,3
Foram avaliadas as curvas de concentração versus tempo por análise não compartimentai (Pharsight, versão 4,1). ND: não realizado; NE: não pôde ser avaliado. Tmax: tempo para alcançar Cmax; Cmax: concentração máxima; ti/2 terminal: semivida terminal; AUCúltima: área sob a curva de concentração-tempo até à última amostra de plasma/ponto temporal; AUCinf: área sob a curva de concentração-tempo extrapolada até o infinito; MRT: tempo de residência médio; Cl/f: depuração de plasma total aparente; Vz/f: volume aparente de distribuição durante a fase terminal.
Exemplo 31
Ensaio clinico humano da segurança e/ou eficácia de FGF-21 PEGilado que compreende um aminoácido não codificado de forma natural. 387
Objectivo Observar a segurança e farmacocinética de FGF-21 humano recombinante PEGilado administrado por via subcutânea que compreende um aminoácido não codificado de forma natural.
Pacientes. São admitidos no estudo dezoito voluntários saudáveis que variam entre 20 e 40 anos de idade e pesam entre 60 e 90 kg. Os indivíduos não terão valores de laboratório anómalos clinicamente significativos para hematologia ou química de soro, e terão uma exploração toxicológica de urina, exploração de VIH e antigénio de superfície de hepatite B negativa. Não deveriam ter nenhum indício do seguinte: hipertensão; um histórico de qualquer doença hematológica primária; historial de doença hepática, renal, cardiovascular, gastrointestinal, geniturinária, metabólica, neurológica significativa; um histórico de anemia ou distúrbio de ataques; uma sensibilidade conhecida a produtos derivados de bactérias ou mamíferos, PEG ou albumina de soro humano; consumidor habitual e em grande quantidade de bebidas que contenham cafeína, participação em qualquer outro ensaio clínico ou que tiveram transfusão de sangue ou a tenham doado num período de 30 dias da entrada no estudo; que tiveram exposição a FGF-21 num período de três meses da entrada no estudo; que tiveram uma doença num período de sete dias da entrada no estudo; e que tenham anomalias significativas no exame físico prévio ao estudo ou as avaliações de laboratório clínicas num período de 14 dias da entrada no estudo. Todos os sujeitos são avaliáveis com respeito a segurança e todas as colectas de sangue para a análise farmacocinético são colhidas como está programado. Todos os estudos são realizados com aprovação do comité de ética institucional e consentimento do paciente.
Desenho do estudo. Este será um estudo de cruzamento de dois períodos, aleatório, aberto, em centro único, de Fase I em voluntários homens saudáveis. São designados 388 aleatoriamente dezoito sujeitos a um de dois grupos de sequência de tratamento (nove sujeitos/grupo). Administra-se FGF-21 durante dois periodos de dosagem separados como uma injecção s.c. de bolus na parte superior da coxa usando doses equivalentes do FGF-21 PEGilado que compreende um aminoácido não codificado de forma natural e o produto disponível comercialmente seleccionado. A dose e frequência de administração do produto disponível comercialmente é como se indica no prospecto. Podem ser adicionadas dosagem adicional, frequência de dosagem ou outros parâmetros como for desejado, usando os produtos disponíveis comercialmente ao estudo incluindo grupos adicionais de sujeitos. Cada período de dosagem se separa por um período de 14 dias sem tratamento. Os sujeitos estão confinados no centro de estudo pelo menos 12 horas antes e 72 horas depois da dosagem durante cada um dos dois períodos de dosagem, mas não entre os períodos de dosagem. Podem ser adicionados grupos adicionais de sujeitos se também vão ser testadas frequência, dosagem adicional ou outro parâmetro para o FGF-21 PEGilado. A formulação experimental de FGF-21 é o FGF-21 PEGilado que compreende um aminoácido não codificado de forma natural.
Amostragem de sangue. Sangue em série é extraído por punção venosa directa antes e depois da administração de FGF-21. São obtidas amostras de sangue venoso (5 ml) para determinação das concentrações de FGF-21 em soro a aproximadamente 30, 20 e 10 minutos antes da dosagem (3 amostras de linha basal) e aproximadamente aos seguintes tempos depois de dosagem: 30 minutos e às 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 e 72 horas. Cada amostra de soro se divide em duas alíquotas. Todas as amostras de soro são armazenadas a -20 °C. As amostras de soro são enviadas em gelo seco. São realizados ensaios de laboratório clínico em jejum (hematologia, química de soro e análise de urina) imediatamente antes da dose inicial o dia 1, na manhã do 389 dia 4, imediatamente antes da dosagem do dia 16 e na manhã do dia 19. Métodos bioanalíticos. Usa-se um kit de ELISA para a determinação de concentrações de FGF-21 em soro. Determinações de segurança. Registam-se os signos vitais imediatamente antes de cada dosagem (Dias 1 e 16) e às 6, 24, 48 e 72 horas depois de cada dosagem. As determinações de segurança baseiam-se na incidência e tipo de acontecimentos adversos e as mudanças nos ensaios de laboratório clínicos desde a linha basal. Além disso, são avaliadas mudanças desde antes do estudo nas medições de sinais vitais, incluindo pressão sanguínea, e resultados do exame físico.
Análise de dados. Os valores de concentração em soro posteriores à dose são corrigidos com respeito às concentrações de FGF-21 de linha basal antes da dose restando de cada um dos valores posteriores à dose a concentração de FGF-21 de linha basal media determinada calculando a média dos níveis de FGF-21 das três amostras colectas aos 30, 20 e 10 minutos antes da dosagem. As concentrações de FGF-21 em soro pré-dose não se incluem no cálculo do valor médio se estão abaixo do nível de quantificação do ensaio. São determinados os parâmetros farmacocinéticos a partir dos dados de concentração em soro corregidos com respeito às concentrações de FGF-21 de linha basal. Os parâmetros farmacocinéticos são calculados por métodos independentes do modelo num sistema informático Digital Equipment Corporation VAX 8600 usando a última versão do software BIOAVL. São determinados os seguintes parâmetros farmacocinéticos: concentração máxima em soro (Cmax) ; tempo até concentração máxima em soro (tmax) ; área sob a curva de concentração-tempo (AUC) desde tempo cero até o momento da última toma de mostra sanguínea (AUC0-72) calculada com o uso da regra trapezoidal linear; e semivida de eliminação terminal (11/2) /· calculada a partir da 390 constante de velocidade de eliminação. A constante de velocidade de eliminação se estima por regressão linear de pontos de dados consecutivos na região linear terminal da representação de concentração-tempo logarítmica-linear. São calculados a média, desvio típica (DT) e coeficiente de variação (CV) dos parâmetros farmacocinéticos para cada tratamento. Calcula-se a relação das médias dos parâmetros (formulação conservada/formulação não conservada). Resultados de segurança. A incidência dos acontecimentos adversos é distribuída uniformemente entre os grupos de tratamento. No há mudanças clinicamente significativos desde a linha basal ou ensaios de laboratório clínicos pré-estudo ou pressões sanguíneas, e não há mudanças notáveis desde antes do estudo nos resultados de exame físico e medições de signos vitais. Os perfis de segurança para os dois grupos de tratamento deveriam parecer similares. Resultados farmacocinéticos. Perfis de concentração-tempo de FGF-21 em soro meios (não corregidos para os níveis de FGF-21 de linha basal) nos 18 sujeitos depois de recibir e FGF-21 PEGilado que compreende um aminoácido não codificado de forma natural em cada ponto temporal medido. Todos os sujeitos deveriam ter concentrações de FGF-21 de linha basal pré-dose dentro do intervalo fisiológico normal. São determinados os parâmetros farmacocinéticos a partir dos dados de soro corregidos com respeito a concentrações de FGF-21 de linha basal médias pré-dose e são determinados Cmax e tmax. O tmax meio para qualquer comparador ou comparadores clínicos seleccionados é significativamente mais corto que o tmax para o FGF-21 PEGilado que compreende o aminoácido não codificado de forma natural. Os valores de semivida terminal são significativamente mais curtos para o comparador ou os comparadores pré-clínicos testados em comparação com a semivida terminal para o FGF-21 PEGilado que compreende um aminoácido não codificado de forma natural. 391
Embora o presente estudo seja realizado em sujeitos masculinos saudáveis, seriam antecipadas caracteristicas de absorção e perfis de segurança similares em outras populações de pacientes; tais como pacientes masculinos ou femininos com cancro ou insuficiência renal crónica, pacientes com insuficiência renal pediátrica, pacientes em programas de pré-depósito autólogo, ou pacientes com cirurgia electiva programada.
Em conclusão, as doses simples administradas por via subcutânea de FGF-21 PEGilado que compreende aminoácido não codificado de forma natural serão seguras e toleradas bem por sujeitos masculinos saudáveis. Com base numa incidência comparativa de acontecimentos adversos, valores clínicos de laboratório, signos vitais e resultados de exame físico, os perfis de segurança das formas disponíveis comercialmente de FGF-21 e FGF-21 PEGilado que compreende aminoácido não codificado de forma natural serão equivalentes. 0 FGF-21 PEGilado que compreende aminoácido não codificado de forma natural potencialmente proporciona uma grande utilidade clínica a pacientes e fornecedores de cuidados sanitários. Entende-se que os exemplos e formas de realização descritas no presente documento são para propósitos ilustrativos somente e que serão sugeridas aos peritos comuns na especialidade diversas modificações ou mudanças à luz dos mesmos e estas devem ser incluídas dentro do espírito e âmbito do presente pedido e âmbito das reivindicações adjuntas. 392
Quadro 5: Sequências citadas.
SEQ ID N» Nome da Sequência 1 Sequência de aminoácidos de FGF-21 sem líder (forma P) HPIPDSSPLLQF OGQ VRQRVL YTDDAQQTE AHLEIREDGTV GGAADQSPE 2 Sequência de aminoácidos de FGF-21 sem líder (forma P) MHHHHHHSGGHP1PDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDO TVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFD PEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLP taggedGLPPAPPEPPGILAPOPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS 3 Sequência de aminoácidos de FGF-21 com líder (forma P)- líder com 3 leucinas (forma P de 29 aminoácidos) MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYL YTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV1QILGVKTS RFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGN KSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQ GRSPSYAS 4 Sequência de aminoácidos de FGF-21 com líder (forma P)- líder com 3 leucinas MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLY TDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSR FLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFMLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNK SPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQO leudnesRSPSYAS 393 (continuação) SEQ ID N2 Nome da Sequência 5 Sequência de aminoácidos de FGF-21 com líder (forma L) Is Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ue Leu Gly Vai Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu Is Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 6 Sequência de aminoácidos de FGF-21 com líder (forma L)- líder com 3 leucinas (forma I, de 209 aminoácidos) 394
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Fhe Glu His Ser Gly Leu Trp Vai Ser Vai Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Ghi Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin lie Leu Gly Vai Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pio Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 395 (continuação) SEQ ID N2 Nome da Sequência 7 Sequência de aminoácidos de FGF-21 com líder (forma L)- líder com 2 leucinas (forma L de 208 aminoácidos) Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly LeuTrpVal Ser Vai Leu Ala Gly Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala His Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Ur Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin lie Leu Gly Vai Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pio Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
3% 8 Sequência de nucleótidos de FGF-21 sem líder (forma P) CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTC CGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCA CCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGA GCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTC AAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATG GGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCC GGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATAC AATGT7TACCAGTCCGAAGCCC ACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGAC CCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCC CCCGCACCCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGAT GTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGA AGCCCCAGCTACGCTTCCTGA 397 (continuação)
SEQ ID N2 Nome da Sequência 9 Sequência de nucleótidos de FGF-21 sem líder (forma P)-His ATGCATCATCATCATCATCATAGCGGCGGCCACCCCATCCCTGACTCC AGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTAC ACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGA TGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGC AGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAG ACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCG CTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAG GACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCAC CTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACC AGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACCCCCGGAGCC ACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCC TCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTC tagged CTGA 398 ίο
Sequência de nucleótidos de FGF-21 coi líder (forma P) - líder com 3 leucinas
ATGGACTCGGACGAGACCGGGTTCGAGCACTCAGGACTGTGGGTTTCT leucinssGTGCTGGCTGGTCTTCTGCTGGGAGCCTGCCAGGCACACCCCATCCCT
GACTCCAGTCCICTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCOjOCAGCGGTAC CTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAG GGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTC TCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAG TCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATG GATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTC TTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGC TGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGA GGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACCCCCG GAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCG GACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTICCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTAC GCTTCCTGA 399 (continuação)
SEQ ID N2 Nome da Sequência 11 Sequência de nucleótidos de FGF-21 com líder (forma P) - líder com 2 leucinas 12 Sequência de nucleótidos de FGF-21 sem líder (forma L) CACCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTACCTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACGGTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCGGGAGTTAITC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGGGCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTTGAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGGAACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCAGGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTGGGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CATGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCCAGCTACGCTICCTGA 400 (continuação)
SEQ ID N2 Nome da Sequência 13 Sequência de nucleótidos de FGF-21 com líder (forma L) - líder com 3 leucinas ATG GAC TCG GAC GAG ACC GGG TTC GAG CAC TCA GGA CTG TGG GTT TCT GTG CTG Ga GGT CTT CTG CTG GGA GCC TGC CAG GCA CAC CCC ATC CCT GAC TCC AGT CCT QC CTG CAA TTC GGG GGC CAA GTC CGG CAG CGG TAC CTC TAC ACA GATGATGCC CAG CAG ACA GAA GCC CAC CTG GAG ATC AGG GAG GAT GGG ACG GTG GGG GGC GCT Ga GAC CAG AGC CCC GAA AGT aC CTG CAG aG AAA GCC HG AAG CCG GGA GTT ATT CAA ATC HG GGA GTC AAG ACA TCC AGG TTC CTG TGC CAG CGG CCA GAT GGG GCC aG TAT GGA TCG CTC CAC TTT GAC ca GAG GCC TGC AGC TTC CGG GAG aG CTT OT GAG GAC GGA TAC AAT GTT TAC CAG TCC GAA GCC CAC GGC aC CCG CTG CAC CTG CCA GGG AAC AAG TCC CCA CAC CGG GAC Ca GCA CCC CGA GGA CCA GCT CGC TTC aG CCA aA CCA GGC aG CCC CCC GCA CTC CCG GAG CCA CCC GGA ATC aG GCC CCC CAG CCC CCC GAT GTG GGC TCC TCG GAC Ca CTG AGC ATG GTG GGA Ca TCC CAG GGC CGA AGC CCC AGC TAC Ga TCC TGA 401 (continuação) SEQ ID N2 Nome da Sequência 14 Sequência de nucleótidos de FGF-21 com líder (forma L) - líder com 2 leucinas ATG GAC TCG GAC GAG ACC GGG TTC GAG CAC TCA GGA CTG TGG GTT TCT GTG CTG GCT GGT CTT CTG GGA GCC TGC CAG GCA CAC CCC ATC CCT GAC TCC AGT CCT CTC CTG CAA TTC GGG GGC CAA GTC CGG CAG CGG TAC CTC TAC ACA GAT GAT GCC CAG CAG ACA GAA GCC CAC CTG GAG ATC AGG GAG GAT GGG ACG GTG GGG GGC GCT GCT GAC CAG AGC CCC GAA AGT CTC CTG CAG CTG AAA GCC HG AAG CCG GGA GTT ATT CAA ATC HG GGA GTC AAG ACA TCC AGG TTC CTG TGC CAG CGG CCA GAT GGG GCC CTG TAT GGA TCG CTC CAC ΤΓΓ GAC CCT GAG GCC TGC AGC TTC CGG GAG CTG CTT CTT GAG GAC GGA TAC AAT GTT TAC CAG TCC GAA GCC CAC GGC CTC CCG CTG CAC CTG CCA GGG AAC AAG TCC CCA CAC CGG GAC CCT GCA CCC CGA GGA CCA GCT CGC TTC CTG CCA CTA CCA GGC CTG CCC CCC GCA CTC CCG GAG CCA CCC GGA ATC CTG GCC CCC CAG CCC CCC GAT GTG GGC TCC TCG GAC CCT CTG AGC ATG GTG leucinesGGA CCT TCC CAG GGC CGA AGC CCC AGC TAC GCT TCC TGA 34 A Sequência de aminoácidos de FGF-21 ( Rattus norvegícus - ref|1IP_570108.11 [18543365]) 402 Met AspTipMet Lys Ser Arg Vai Gly Ala Pro Gly Leu Trp Vai Cys Leu Leu Leu Pro Vai Phe Leu Leu Gly Vai Cys Glu Ala Tyr Pro He Ser Asp Ser Ser Pio Leu Leu Glu Phe Gly Gly Gin Vai Arg Glu Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Glu Asp Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Hir Vai Vai Gly Thr Ala His Arg Ser Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly Vai Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Glu Glu Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly Ser Pro His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Lys Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Glu Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu Arg Leu Pro Glu Lys Asp Ser Glu Asp Pro Ala Thr Arg Gly Pro Vai Arg Phe Leu Pro Met Pro Gly Leu Pro His Glu Pro Glu Glu Glu Pro Gly Vai Leu Pro Pro Glu Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Vai Glu Pro Leu Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 403 (continuação) SEQ ID N2 Nome da Sequência 35 a Sequência de aminoácidos de FGF-21 (nus muscuius - ref|HP_064397.ii[9910218]) Met Glu Trp Met Arg Ser Arg Vai Gly Thi Leu Gly Leu Trp Vai Arg Leu Leu Leu Ala Vai Phe Leu Leu Gly Vai Tyr Gin Ala Tyr Pio lie Pro Asp Ser Ser Pio Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Are Gin Arg Tyr Leu Tyr Ur Asp Asp Asp Gin Asp Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Vai Vai Gly Ala Ala His Arg Ser Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly Vai Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gin Gin Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Pro His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu Arg Leu Pro Gin Lys Asp Ser Pro Asn GÍn Asp Ala Thr Ser Trp Gly Pro Vai Arg Phe Leu Pro Met Pro Gly Leu Leu His Glu Pro Gin Asp Gin AÍa Gly Phe Leu Pro Pro Glu Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Vai Glu Pro Leu Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 404 36 A Sequência de aminoácidos de FGF-21 (Danio rerio-ref |ΝΡ_001038789.11 [11367Π92])
Met Leu Phe Ala Cys Phe Phe De Phe Phe Ala Leu Phe Pro His Leu Arg Tip Cys Met Tyi Vai Pro Ala Gin Asn Vai Leu Leu Gin Phe Gly TTir Gin Vai Arg Glu Arg Leu Leu Tyr Thr Asp Gly Leu Phe Leu Glu Met Asn Pro Asp Gly Ser Vai Lys Gly Ser Pro Glu Lys Asn Leu Asn Cys Vai Leu Glu Leu Arg Ser Vai Lys Ala Gly Glu Thr Vai Ile Gin Ser Ala Ala Thr Ser Leu Tyr Leu Cys Vai Asp Asp Gin Asp Lys Leu Lys Gly Gin His His Tyr Ser Ala Leu Asp Cys Thr Phe Gin Glu Leu Leu Leu Asp Gly Tyr Ser Phe Phe Leu Ser Pro His Thr Asn Leu Pro Vai Ser Leu Leu Ser Lys Arg Gin Lys His Gly Asn Pro Leu Ser Arg Phe Leu Pro Vai Ser Arg Ala Glu Asp Ser Arg Thr Gin Glu Vai Lys Gin Tyr Ile Gin Asp De Asn Leu Asp Ser Asp Asp Pro Leu Gly Met Gly His Arg Ser His Leu Gin lír Vai Phe Ser Pro Ser Leu His Thr Lys Lys 405 (continuação)
SEQ ID N2 Nome da Sequência 37 Sequência de aminoácidos de Klotho beta (h<mo sapíens - refinp_783864.ii [28376633]) MKPGCAAGSPGNEWiFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVT GFSGDGRAIWSKNPNFTPVHESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWK KDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSY1FLEKDLSALDFIGVSFYQFS1 SWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNÍEÍVTLYHWDLPLALQE KYGGWKNDT11DIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYIVAWHGYGTG MHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSniG SHWIEPNRSENTMD1FKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKXLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNB4AKMGQKVSLNLREAL NWDCLE YWNPR1LIAENG WFTDSRVKTEDTT AIYMMKNFLSQ VLQAÍRLD EiRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTERRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYY KQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWCVIBSVLKPESVASSPQFSDPHL YVTOTGNRIliiRVEGVRLKmQCTDFVNMQLEMLAMVTHYR FALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCWSEGLKLGISAMVTLYYPIHA EGLPEPLLHADGENPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRL SDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHAIAWEYDRQFRPSQRGAVSLSLHAD WABPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKH RRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDfCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSD RD1QFLQDITRLSSPTRLAV1PWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQ ALEDDRLRKYYtGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFF TSDFKAKSSIQFVNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLRVQKKPL IFLGCCFFSTLVLLLSIA1FORQKRRKFWKAXNLOHIPLKKGKRVVS 406 38
Sequência de aminoácidos de Klotho beta (mus muscuius - refNP_ii2457.i GN13626032) 407 (continuação) SEQ ID Nome da Sequência mktgcaagspgnewiffssderntrsrktmsnralqrsavlsafvllra VTGFSGDGKA1WDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEG SWKTDGRGPSIWDRyVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSF YQFS1SWPEFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDL PLTLQEEYGGWKNATMlDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWmHNPYLVAW HGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQK.G WLSITLGSHMEPNRTDNMBDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEF MKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTWKMGQNVSLN LRQVLNW1KLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTA1YMMKNFLNQVLQ A1KFDE3RVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSS AHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFT DPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRIKTRPSQCTOYVS1KKRVEMLAKMKV THYQFALD1VTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCWSEGLKLGVFPMVTLYH PTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNIAKAFQDYAELCFREGDLVKLW1TINE PNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLS LHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEY1 ASKKQRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHíTrHJFVIHKQLNTNR SVADRDVQFLQDimSSPSEAVTPWGVRKLUWIRRNYRDRDIYITAN GIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKP RFGFFTSDFRAKSSVQFYSEISSSGLPAENRSPACGQPAEDTDCTICSRV EKKPLIFFGCCFISTLAVLLSITVFHHQKJIRKPQKARNLQ NIPLKKGHSRVFS 39 Sequência líder de nucleótidos OmpA atgaaaaaaactgctatcgcgatcgctgtagctctggctggtttcgcgaccgtagctaacgct
40 Sequência líder de nucleótidos OmpA MKKTAIAIAVALAGFATVANA 41 Sequência líder de nucleótidos MalE atgaaaataaaaacaggtgcacgcatcctcgcattatccgcattaacgacgatgatgttttccgcctcggctctcgcc 42 Sequência líder de nucleótidos MalE MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA 409 (continuação)
SEQ ID Nome da Sequência N2 43 Sequência líder de nucleótídos Stll atgaaaaagaatatcgcatttcttcttgcatctatgttcgttttttctattgctacaaatgcctatgca 44 Sequência líder de nucleótidos Stll MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA 410
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His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin 50 55 60
Ile Leu Gly Vai Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai 145 ISO 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 412
Met His His His His His His Ser Gly Gly His Pro Ile Pro Asp Ser 15 10 15
Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr 20 25 30
Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp 35 40 45
Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gin 50 55 60
Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly Vai Lys Thr 65 70 75 80
Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu 85 90 95
His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp 100 105 110
Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu 115 120 125
Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala 130 135 140
Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro 145 150 155 160
Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro Leu 165 170 175
Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 185 190 <210> 3 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 413
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Vai Ser 15 10 15
Vai Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala His Pro Ile Pro 20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr 35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60
Glu Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly Vai 8S 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp 180 185 190
Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205
Ser
<210> 4 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 414
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Vai Ser 15 10 15
Vai Leu Ala Gly Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala His Pro Ile Pro Asp 20 25 30
Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr Leu 35 40 45
Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu 50 55 60
Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu Leu 65 70 75 80
Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly Vai Lys 85 90 95
Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser 100 105 110
Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu 115 120 125
Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His 130 135 140
Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro 145 150 155 160
Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro 165 170 175
Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro 180 185 190
Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 195 200 205
<210> 5 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 415
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro 1 5
Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp 20
Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr 35 40
Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys 50 55
Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin 60
Ile Leu Gly Vai Lys Thr Ser Arg 65 70
Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe 85
Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110 '
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 6 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 416
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Vai Ser 15 10 15
Vai Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala His Pro Ile Pro 20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr 35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60
Glu Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly Vai 85 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 165 170 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp 180 185 190
Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205
Ser
<210> 7 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 417
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Vai Ser 15 10 15
Vai Leu Ala Gly Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala His Pro Ile Pro Asp 20 25 30
Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr Leu 35 40 45
Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu 50 55 60
Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu Leu 65 70 75 80
Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly Vai Lys 85 90 95
Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser 100 105 110
Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu 115 120 125
Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His 130 135 140
Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro 145 150 155 160
Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro 165 170 175
Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro 180 185 190
Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 195 200 205 <210> 8 <211> 546 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 418 caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 60 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 120 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 180 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 240 gccctgtatg gaCcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 300 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 360 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 420 ggcctgcccc ccgcaccccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 480 qgctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 540 tcctga 546
<210> 9 <211> 576 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 atgcatcatc atcatcatca tagcggcggc caccccatcc ctgactccag tcctctcctg 60 caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac ctctacacag atgatgccca gcagacagaa 120 gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa 180 agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca 240 tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct 300 gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa 360 gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc 420 cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca ggcctgcccc ccgcaccccc ggagccaccc 480 ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg ggctcctcgg accctctgag catggtggga 540 ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct tcctga 576
<210> 10 <211> 630 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 419 atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt 60 cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc atccctgact ccagtcctct cctgcaattc 120 gggggccaag tccggcagcg gtacctctac acagatgatg cccagcagac agaagcccac 180 ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc 240 ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg 300 ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc 360 tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac 420 ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag Cccccacacc gggaccctgc accccgagga 480 ccagctcgct tcctgccact accaggcctg ccccccgcac ccccggagcc acccggaatc 540 ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc 600 cagggccgaa gccccagcta cgcttcotga 630
<210> 11 <211> 627 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt 60 cttctgggag cctgccaggc acaccccatc cctgactcca gtcctctcct gcaattcggg 120 ggccaagtcc ggcagcggta cctctacaca gatgatgccc agcagacaga agcccacctg 180 gagatcaggg aggatgggac ggtggggggc gctgctgacc agagccccga aagtctcctg 240 cagctgaaag ccttgaagcc gggagttatt caaatcttgg gagtcaagac atccaggttc 300 ctgtgccagc ggccagatgg ggccctgtat ggatcgctcc actttgaccc tgaggcctgc 360 agcttccggg agctgcttct tgaggacgga tacaatgttt accagtccga agcccacggc 420 ctcccgctgc acctgccagg gaacaagtcc ccacaccggg accctgcacc ccgaggacca 480 gctcgcttcc tgccactacc aggcctgccc cccgcacccc cggagccacc cggaatcctg 540 gccccccagc cccccgatgt gggctcctcg gaccctctga gcatggtggg accttcccag 600 ggccgaagcc ccagctacgc ttcctga 627 <210> 12 <211> 545
<212> ADN 420 <213> Homo sapiens <400> 12 caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 60 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 120 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 180 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 240 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 300 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 360 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 420 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 480 ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc agctacgctt 540 cctga 545 <210> 13 <211> 630 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt 60 cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc atccctgact ccagtcctct cctgcaattc 120 gggggccaag tccggcagcg gtacctctac acagatgatg cccagcagac agaagcccac 180 ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc 240 ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg 300 ttcctgtgcc agcggccaga tggaçccctg tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc 360 tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac 420 ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag tccccacacc gggaccctgc accccgagga 480 ccagctcgct tcctgccact accaggcctg ccccccgcac tcccggagcc acccggaatc 540 ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc 600 cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga 630 <210> 14 <211> 627 421
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 gggtttctgt gctggctggt 60 gtcctctcct gcaattcggg 120 agcagacaga agcccacctg 180 agagccccga aagtctcctg 240 gagtcaagac atccaggttc · 300 actttgaccc tgaggcctgc 360 accagtccga agcccacggc 420 accctgcacc ccgaggacca 480 cggagccacc cggaatcctg 540 gcatggtggg accttcccag 600 627 atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt cttctgggag cctgccaggc acaccccatc cctgactcca ggccaagtcc ggcagcggta cctctacaca gatgatgccc gagatcaggg aggatgggac ggtggggggc gctgctgacc cagctgaaag ccttgaagcc gggagttatt caaatcttgg ctgtgccagc ggccagatgg ggccctgtat ggatcgctcc agcttccggg agctgcttct tgaggacgga tacaatgttt ctcccgctgc acctgccagg gaacaagtcc ccacaccggg gctcgcttcc tgccactacc aggcctgccc cccgcactcc gccccccagc cccccgatgt gggctcctcg gaccctctga ggccgaagcc ccagctacgc ttcctga <210> 15 <211> 77 <212> ADN <213> Artificial <220> de ARNt de Methanococcus <223> ARNt mutante derivado jannaschii <400> 15 ccgcatggcg ctggttcaaa 60 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat tccagcccgc cggacca <210> 16 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial 77 422 <220> <223> Sintetase mutante Methanococcus jannaschii derivada de sintetase de <400> 16
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 S 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Vai 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Tyr Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Glu His Gly Leu Asp Lys 100 105 110 423 Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Gly Ile His 145 150 155 160 Tyr Glu Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 2S5 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 28S Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 17 <211> 77 <212> ADN <213> Methanococcus j annaschii <400> 17 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 424 <210> 18 <211> 88 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Um ARNt supressor âmbar optimizado <400> 18 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc gagggttcga atcccttccc tgggacca <210> 19 <211> 89 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Um ARNt supressor de alteração da grelha de leitura (frameshift) AGGA optimizado <400> 19 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 20 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-L-fenilalanina 425 <4Ο0> 20
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Thr Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160
Tyr Leu Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 426
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Sei Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 . 295 300
Arg Leu 305 <210> 21 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-benzoil-L-fenilalanina <400> 21 427
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Ser Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 428
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Thr Ser His 145 150 155 160
Tyr Leu Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 185 2GC 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 28S
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 <210> 22 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de propargil-fenilalanina <400> 22 429
Met Asp Glu Phe Glu Met Xle Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 430
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Pro Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Ala Ile Tyr 145 150 155 160
Leu Ala Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile His 165 170 175
Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His Asn 180 185 190
Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205
Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220
Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240
Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255
Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285
Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300
Leu 305 <210> 23 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial 431 <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de propargil-fenilalanina <400> 23
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 432 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Pro Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Ile Pro Tyr 145 150 155 160
Leu Pro Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile His 165 170 175
Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His Asn 180 185 190
Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205
Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220
Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240
Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255
Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285
Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300
Leu 305 433 <210> 24 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de propargil-fenilalanina <400> 24 434
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Tbr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly Hie Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Lys Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 * " 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Ala Ile Tyr 145 150 155 160
Leu Ala Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile His 165 170 175
Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His Asn 180 185 190
Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205
Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220
Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240
Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255
Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 435
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285
Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300
Leu 305 <210> 25 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <400> 25 436
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Atg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyt Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Asn Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Pro Leu His 145 150 155 160
Tyr Gin Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 437
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lye Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu Hls Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 <210> 26 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <400> 26 438
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu leu Asp 6S 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Ser Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 439
Lys Val Ala Glu Vai Ile Tyr Pro 145 150
Ile Met Gin Val Asn Pro Leu His 155 160
Tyr Gin Gly Val Asp Val Ala Val 165
Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 170 175
Hls Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu 180
Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 18S 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 <210> 27 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <400> 27 440
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys 1 5
Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu 20
Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys 35 40
Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin 50 55
Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr 65 70
Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 75 80
Glu He Arg Lys Ile Gly Asp Tyr
Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 441 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Thr Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 ' 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Pro Vai His 145 150 155 160
Tyr Gin Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 <210> 28 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> 442 <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de ροζ ido-fenilalanina <400> 28
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 443
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Ser Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Pro Ser His 145 150 155 160
Tyr Gin Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 lie Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu ryr Pro Leu Thr lie Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 444 <210> 29 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-acetil-fenilalanina <400> 29 445
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glo Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Glu Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Gly Cys His 145 150 155 160
Tyr Arg Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 446
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 <210> 30 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-acetil -fenilalanina <400> 30 447
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile He Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Glu Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Gly Thr His 145 150 155 160
Tyr Arg Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 448
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 <210> 31 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-acetil-fenilalanina <400> 31 449
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Glu Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Gly Gly His 450 145 150 155 160
Tyr Leu Gly Vai Asp Vai Ile Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 <210> 32 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <400> 32 451
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys 1 5
Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu 20
Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys 35 40
Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin 50 55
Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr 65 70
Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr 85
Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 90 95 452
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr VaX Tyr Gly Ser Arg Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 HO
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Vai Ile His 145 150 155 160
Tyr Asp Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu inc; <210> 33 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> 453 <223> Aminoacil ARNt sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <400> 33
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 15 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 454
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Vai Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Vai Tyr Gly Ser Thr Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140
Lys Vai Ala Glu Vai Ile Tyr Pro Ile Met Gin Vai Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160
Tyr Leu Gly Vai Asp Vai Ala Vai Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Vai Vai Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Vai Vai Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Vai Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305 455 <210> 34 <211> 208 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 34
Met Asp Trp Met Lys Ser Arg Vai Gly Ala Pro Gly Leu Trp Vai Cys 15 10 15
Leu Leu Leu Pro Vai Phe Leu Leu Gly Vai Cys Glu Ala Tyr Pro Ile 20 25 30
Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg 35 40 45
Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Asp Thr Glu Ala His Leu Glu Ile 50 55 60
Arg Glu Asp Gly Thr Vai Vai Gly Thr Ala His Arg Ser Pro Glu Ser 65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly 85 90 95
Vai Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gin Gin Pro Asp Gly Thr Leu Tyr 100 105 110
Gly Ser Pro His Phe Asp Pro Glu 115 120
Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu 125
Leu Lys Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr 130 135
Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro 140
Leu Arg Leu Pro Gin Lys Asp Ser 145 150
Gin Asp Pro Ala Thr Arg Gly Pro 155 160
Vai Arg Phe Leu Pro Met Pro Gly 165
Leu Pro His Glu Pro Gin Glu Gin 170 175
Pro Gly Vai Leu Pro Pro Glu Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp Pro 180 185 190
Leu Ser Met Vai Glu Pro Leu Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 195 200 205 <210> 35 456
<211> 210 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35
Met Glu Trp Met Arg Ser Arg Vai Gly Thr Leu Gly Leu Trp Vai Arg 15 10 15
Leu Leu Leu Ala Vai Phe Leu Leu Gly Vai Tyr Gin Ala Tyr Pro Ile 20 25 30
Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg 35 40 45
Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Asp Thr Glu Ala His Leu Glu Ile 50 55 60
Arg Glu Asp Gly Thr Vai Vai Gly Ala Ala His Arg Ser Pro Glu Ser 65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai Ile Gin Ile Leu Gly 85 90 95
Vai Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gin Gin Pro Asp Gly Ala Leu Tyr 100 105 110
Gly Ser Pro His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu 115 120 125
Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro 130 135 140
Leu Arg Leu Pro Gin Lys Asp Ser Pro Asn Gin Asp Ala Thr Ser Trp 145 150 1S5 160
Gly Pro Vai Arg Phe Leu Pro Met Pro Gly Leu Leu His Glu Pro Gin 165 170 175
Asp Gin Ala Gly Phe Leu Pro Pro Glu Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser 180 185 190
Asp Pro Leu Ser Met Vai Glu Pro Leu Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr 195 200 205
Ala Ser 210 457 <210> 36 <211> 194 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 36
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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 92129707 P [0001] • US 98806007 P [0001] • WO 0136640 A [0006] [0024] [0129] [0692] • WO 0118172 A [0006] • US 20040259780 A [0006] [0009] [0129] [0582] [0596] [0692] • US 20010012628 A [0007] [0129] [0692] • US 6716626 B [0008] [0033] [0129] [0692] • WO 03011213 A [0010] [0129] [0692] • WO 03059270 A [0011] [0129] [0692] • US 20050176631 A [0011] [0129] [0598] [0660] [0692] • WO 2005091944 A [0012] [0014] [0024] [0034] [0130] [0132] [0387] [0793] • WO05091944A [0012] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0129] [0692] • US 6610281 B [0021] [0022] [0202] [0566] • US 6602498 B [0022] • WO 011817 A [0024] • WO 2005074546 A [0024] • WO 2006050247 A [0024] • US 2006194256 A [0024] 470 • US 7259248 B [0024] • US 20050037457 A [0129] [0692] • US 20040185494 A [0129] [0692] • US 20020164713 A [0129] [0692] • WO 04110472 A [0129] [0692] • WO 05061712 A [0129] [0692] • WO 05072769 A [0129] [0692] • WO 05113606 A [0129] [0692] • WO 06028595 A [0129] [0692] • WO 06028714 A [0129] [0692] • WO 06050247 A [0129] [0692] • WO 06065582 A [0129] [0692] • WO 06078463 A [0129] [0692] • US 5750373 A [0130] • US 5766883 A [0130] • WO 9724445 A [0130] • US 5876969 A [0130] • US 4904584 A [0132] • WO 9967291 A [0132] • WO 9903887 A [0132] • WO 0026354 A [0132] • US 5218092 A [0132] • EP 188256 A [0143] • US 4671958 A [0143] • US 4659839 A [0143] • US 4414148 A [0143] • US 4699784 A [0143] • US 4680338 A [0143] • US 4569789 A [0143] [0332] 471 • US 5252714 A [0152] [0509] • WO 03101972 A [0197] • US 6521427 B [0216] • US 6608183 B [0237] • US 7045337 B [0242] [0249] [0326] [0327] [0328] [0328] • US 7083970 B [0242] [0249] [0250] [0326] [0327] [0332] • WO 2002085923 A [0243] [0286] [0314] • US 0647822 W [0243] [0312] [0567] • US 20060194256 A [0249] [0285] [0312] [0567] • US 20060217532 A [0249] [0285] [0312] [0567] • US 20060217289 A [0249] [0285] [0312] [0567] • WO 2006069246 A [0249] [0285] [0312] [0567] • US 6423685 B [0283] [0291] • US 638418 P [0285] • US 20040198637 A [0286] [0313] • US 6281211 B [0296] • US 60755338 B [0312] [0567] • US 60755711 B [0312] [0567] • US 60755018 B [0312] [0567] • US 0649397 W [0312] [0567] • US 60743041 B [0312] [0567] • US 60743040 B [0312] [0567] • US 60882819 B [0312] [0567] • US 60882500 B [0312] [0567] • US 60870594 B [0312] [0567] • US 6927042 B [0322] • WO 2005007870 A [0327] • WO 2005007624 A [0327] 472 wo 2005019415 A [0327] wo 04035742 ! 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Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido FGF-21 que compreende uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1-7, excepto que um aminoácido é substituído por um aminoácido codificado de forma não natural na posição 108 (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 2-7), em que um polímero solúvel em água é ligado ao aminoácido codificado de forma não natural presente no dito polipéptido FGF-21.
2. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido se liga a um linker, polímero, ou molécula biologicamente activa.
3. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido se liga a um polímero bifuncional, linker bifuncional, ou pelo menos um polipéptido FGF-2 adicional. 4. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 3, em que o linker ou polímero bifuncional se liga a um segundo polipéptido. 5. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 4, em que o segundo polipéptido é um polipéptido FGF-21.
6. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero solúvel em água compreende um grupo de poli(etileno glicol). 7. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonilo, um grupo aminooxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alcino. 2 8. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 7, em que o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonilo. 9. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular de entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa.
10. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 9, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular de entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 50 kDa.
11. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, que é feito por reacção de um polipéptido FGF-21 que compreende um aminoácido que contém carbonilo com um polímero solúvel em água que compreende um grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida. 12. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 11, em que o grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida é ligado ao polímero solúvel em água através de uma ligação amida. 13. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, que é feito por reacção de um polímero solúvel em água que compreende um grupo carbonilo com um polipéptido que compreende um aminoácido codificado de forma não natural que compreende um grupo aminooxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida ou um grupo semicarbazida. 14. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero solúvel em água é um polímero ramificado ou multibraços. 3 15. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 14, em que cada ramificação do polímero solúvel em água tem um peso molecular de entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa.
16. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o aminoácido codificado de forma não natural compreende uma fracção de sacárido. 17. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 2, em que o linker, polímero, ou molécula biologicamente activa é ligado ao polipéptido via uma fracção de sacárido.
18. Uma composição que compreende o polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
19. Um polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, codificado por um polinucleótido que tem uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14, em que o dito polinucleótido compreende um codão selector.
20. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 19, em que o polímero solúvel em água compreende um grupo de poli(etileno glicol).
21. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 19, em que o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonilo, um grupo aminooxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alcino.
22. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 20, em que o grupo de poli(etileno glicol) tem um peso molecular de entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. 4 23. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 20, em que o grupo de poli(etileno glicol) é um polímero ramificado ou multibraços.
24. A composição de acordo com a reivindicação 23, em que o grupo de poli(etileno glicol) tem um peso molecular de entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa.
25. Uma composição que compreende o polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 19 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
26. Um polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, que compreende um polímero solúvel em água ligado por uma ligação covalente ao polipéptido FGF-21 no aminoácido de ocorrência não natural.
27. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 26, em que o polímero solúvel em água compreende uma fracção de poli(etileno glicol).
28. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 7 em que dito aminoácido codificado de forma não natural se liga a uma molécula de poli(etileno glicol).
29. Um polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, que compreende pelo menos um linker, polímero, ou molécula biologicamente activa, em que o dito linker, polímero, ou molécula biologicamente activa é unido ao polipéptido através de um grupo funcional do aminoácido codificado de forma não natural, que é ribossomicamente incorporado no polipéptido.
30. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 29, em que dito polipéptido FGF-21 é monoPEGilado. 5
31. Um polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, que compreende um linker, polímero ou molécula biologicamente activa que é unido ao aminoácido codificado de forma não natural, em que o dito aminoácido codificado de forma não natural é ribossomicamente incorporado no polipéptido. 32. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 31, em que o polipéptido FGF-21 compreende um linker, polímero, ou molécula biologicamente activa. 33. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo cetona. 34. 0 polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polipéptido FGF-21 compreende uma sequência como mostrada em SEQ ID NO: 1 excepto que um aminoácido é substituído por um aminoácido codificado de forma não natural na posição 108.
35. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o dito aminoácido codificado de forma não natural é para-acetil-fenilalanina.
36. O polipéptido FGF-21 de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polímero solúvel em água é um grupo de poli(etileno glicol) que tem um peso molecular de 30 kDa.
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