JP2017528149A - 低アレルギー誘発性で苦味の低下した大豆オリゴペプチド、その調製方法、およびその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドならびにその調製方法および用途を提供する。本調製方法は以下の工程を含む：１）大豆タンパク質粉末を水と混合して大豆タンパク質溶液を取得し、それから大豆タンパク質溶液に対して熱変性を行って、変性タンパク質溶液を調製する工程；２）変性タンパク質溶液のｐＨ値を６〜９に調整し、それから中性プロテアーゼとパパインを添加して第１の酵素分解を行い、第１の酵素加水分解物を得る工程；３）第１の酵素加水分解物中にアルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼを添加して第２の酵素分解を行い、酵素の不活化を行った後、第２の酵素加水分解物を得る工程；そして４）第２の酵素加水分解物を遠心分離し、遠心分離した上清液に対して膜濾過を行って、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを得る工程。本発明の調製方法は、大豆タンパク質のアレルゲン性を完全に排除し、その製品の味を確保することができる。調製されたアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドは、粉ミルクまたは健康食品において広範に応用される。

Description

本発明は、大豆オリゴペプチド、特に、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドならびにその調製方法および用途に関する。

大豆タンパク質は、植物性のタンパク質であり、牛乳タンパク質のものと同様なアミノ酸組成を有し、種々の必須アミノ酸が豊富であり、そして大豆タンパク質は、栄養価において動物性タンパク質と同等であり、遺伝子構造上、ヒトのアミノ酸に最も近く、よって、最も栄養価の高い植物性タンパク質であるとみなされている。しかし、大豆タンパク質中には、例えば、グリシニン、β−コングリシニン、Ｐ３４、ＧｌｙｍＢｄ２８Ｋなど、複数のアレルゲンが存在しており、これらのうち、グリシンとβ−コングリシニンは大豆タンパク質中において合計で約７０％となる主成分である；例えば大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）のような一部の大豆タンパク質は、従来的な製造プロセス（例えば、高温条件下）の間、安定した構造を保持することから、大豆アレルゲンタンパク質を検出するための指標として一般に使用されている。現在、大豆アレルゲンによる影響を受け、それにより呼吸、皮膚、消化管やその他の症状などの大豆アレルギーを引き起こす幼児が約１〜６％存在しており、さらに、大豆製品が増加するにつれて、大人のアレルギーの発生率も上昇している。

大豆タンパク質の脱アレルギー化のための方法は、熱処理、化学処理、発酵法、酵素法などを含む。熱処理は、大豆アレルゲンの脱アレルギー化のための最も一般的なアプローチであり、大豆タンパク質の構造を変えることができ、抗原性タンパク質のアレルギー活性を低下させることができる；しかし、Ｐ３４タンパク質の表面エピトープの複雑な構造のため、加熱だけで大豆タンパク質のアレルゲン性を完全に排除することは不可能である。化学処理は主に、化学試薬によりトリプシンインヒビターの活性を低下させるために使用されるが、必然的に、化学的残留物などの食品安全性の問題が生じる。

発酵法は主に、カビ、枯草菌や他の微生物を用いて大豆製品中の抗原性タンパク質を分解するが、発酵によって大豆タンパク質をアレルゲン性の低い低分子ペプチドに加水分解することができるものの、加水分解されたタンパク質が抗体によって認識されるのに必要な立体構造を保持するか否かが依然として疑問である。例えば、中国特許公報ＣＮ１０１９９０９８４Ａ号は、飼料として使用される、耐酸化性が高くアレルゲン性が低い、発酵ひき割り大豆の製造方法を開示しているが、ここでは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）が、ひき割り大豆発酵基材の発酵のために使用され、発酵後には大分子のタンパク質が有意に分解されているものの、発酵産物のアレルゲン性は検定されておらず、それゆえ、発酵産物中にアレルギー性の大豆断片が依然として存在するか否かは判定することができない；そのうえ、この方法は、発酵産物の味を評価していない。Herianらは、放射性アレルゲン吸着試験（ＲＡＳＴ）によって、豆モヤシ、酸加水分解醤油、カビ加水分解醤油、発酵黒豆、および味噌を含む従来的な５種の豆発酵製品のアレルゲン性を検定した結果、５種の発酵大豆製品が、ほぼ同様なアレルギー患者の血清ＩｇＥとの結合能を有することを示し、それにより、大豆タンパク質が加水分解されて低分子ペプチドになるものの、アレルゲン性大豆タンパク質またはその断片が依然としてある程度存在することが示された。

酵素法は、大豆の抗原タンパク質を特定の酵素で加水分解することができ、その効果は、酵素の種類、加水分解前の前処理、加水分解の程度などの多くの要因によって影響を受ける；特に、大豆タンパク質は、様々なアレルゲンおよび複雑な表面エピトープ構造を有するため、それはまた、大豆タンパク質のアレルギー化を完全に排除するために様々なアレルゲンを同時に分解する方法についても課題を提起する。加えて、酵素分解は大豆抗原タンパク質の抗原性エピトープを効果的に損壊しうるものの、三次元タンパク質構造または疎水性領域内に隠されている一部の線状エピトープの曝露によって、酵素分解産物が新たなアレルギー源性を獲得するという懸念がある。同時に、酵素法の分解プロセスは、大豆タンパク質からの苦味および渋味成分の放出を誘発し、そうして、製品の味および実際の応用に影響を及ぼす可能性がある。

中国特許出願公開公報第ＣＮ１０１９９０９８４Ａ号

本発明は、大豆タンパク質のアレルゲン性を完全に排除することができず、製品の味が悪いという従来技術の技術的欠陥に対処するために、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドならびにその製造方法および用途を提供する。

本発明により提供されるアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドの製造方法は、以下の工程を含む：

１）大豆タンパク質粉末を水と混合して大豆タンパク質溶液を取得し、大豆タンパク質溶液に対して熱変性を行って、変性タンパク質溶液を得る工程；

２）変性タンパク質溶液のｐＨ値を６〜９に調整し、それから中性プロテアーゼとパパインを添加して第１の酵素分解を行い、第１の酵素加水分解物を得る工程；

３）第１の酵素加水分解物中にアルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼ（flavor protease）を添加して第２の酵素分解を行い、酵素の不活化を行った後、第２の酵素加水分解物を得る工程；そして

４）第２の酵素加水分解物を遠心分離し、遠心分離した上清液に対して膜濾過を行って、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを得る工程。

本発明で用いられる大豆タンパク質粉末においては、タンパク質の総含有量は６０重量％以上、さらには６０〜９５重量％である；大豆タンパク質溶液の調製の際、大豆タンパク質粉末と水との質量対体積比は１：（５〜１０）とすることができ、すなわち、大豆タンパク質溶液を調製するために１ｋｇの大豆タンパク質粉末と５〜１０Ｌの水とが混合される。大豆タンパク質溶液の濃度が高すぎる（質量対体積比が１：５より大きい）場合、溶液は粘性となり、流動性が悪く、したがって、酵素分解効率の低下が生じる；濃度が低すぎる（質量対体積比が１：１０より小さい）場合、反応体積が大きすぎて、以降の操作（例えば、膜濾過、濃縮など）に影響を与えると共に、それに応じてコストが上昇する。

さらに、熱変性の実施は、大豆タンパク質溶液を７０〜９０℃に加熱し、この温度を維持し、２０〜６０分間、連続的に撹拌する工程を含む。熱変性処理は、大豆タンパク質の空間的構造を破壊し、それによって大豆タンパク質のアレルゲン性を減少させることができる；そして、大豆タンパク質溶液の流動性と粘度の問題を解決し、その後の酵素分解を促進することもできる。

本発明者は、大豆タンパク質のアレルゲン性を完全に排除すると同時に酵素分解生成物中の苦味物質および渋味物質の生成を阻害する酵素法の使用に関して相当な量の研究を行った後、大部分のプロテアーゼが大豆タンパク質のアレルゲン性を完全に排除することができず、かつ／または酵素分解生成物中の苦味物質および渋味物質の生成を阻害できないことを見出した。例えば、ブロメラインは、大豆タンパク質のアレルゲン性の除去に対して明らかな効果を有さない；中性プロテアーゼは、大豆タンパク質のアレルゲン性をある程度除去することができるが、苦味物質が酵素分解産物中に存在し、除去することができない。本発明者らは、研究中に驚くべきことに、中性プロテアーゼとパパインを含む複合酵素を用いた第１の酵素分解を行い、それから、アルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼを含む複合酵素を用いた酵素分解（第２の酵素分解）を行うだけで、大豆タンパク質のアレルゲン性をより完全に排除すると同時に、酵素分解産物中の苦味物質および渋味物質の生成を抑制できることを見出した。

特に、本発明の第１の酵素分解においては、中性プロテアーゼの量が１０〜１００Ｕ／ｇ、パパインの量が１０〜１００Ｕ／ｇであり、第１の酵素分解が３０〜６０℃で行われ、第１の酵素分解の時間が１〜３時間に調節される。さらに、パパインに対する中性プロテアーゼの量比は１：（１〜３）であり、例えば、中性プロテアーゼの量が１０Ｕ／ｇである一方でパパインの量は１０〜３０Ｕ／ｇとされる。中性プロテアーゼとパパインとの併用は、大豆タンパク質の完全分解によってそのアレルゲン性を排除すると同時に、苦味成分および渋味成分の放出を抑制して、酵素分解産物の味を改善するのに役立つ。

本発明の第２の酵素分解の際、アルカリプロテアーゼの量は１０〜１００Ｕ／ｇ、風味プロテアーゼの量は１０〜１００Ｕ／ｇであり、第２の酵素分解は３０〜６０℃で行われ、第２の酵素分解の時間は１〜３時間に調節される。さらに、第２の酵素分解は５〜８のｐＨ値で行われ、すなわち、第１の酵素加水分解物のｐＨ値が５〜８の範囲内にない場合には、第１の酵素加水分解物のｐＨ値を５〜８に調整し、それから第２の酵素分解のためにアルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼを添加する必要がある；アルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼの量比は１：（１〜４）であり、例えば、アルカリプロテアーゼの量が１０Ｕ／ｇの場合、風味プロテアーゼの量は１０〜４０Ｕ／ｇである。第１の酵素分解または第２の酵素分解の時間が短すぎると（１時間未満）、タンパク質の分解に不利であり、時間が長すぎる（３時間より長い）場合、苦味物質と渋味物質の生成につながりうる。

第１の酵素分解の後、アルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼとの組み合わせによるさらなる酵素分解は、第１の酵素分解産物のさらなる分解につながり、大豆タンパク質のアレルゲン性を排除し、苦味および渋味成分の放出を制御して、酵素分解生成物の味を改善する；２つの酵素分解工程は、大豆タンパク質中の主要アレルゲン性タンパク質（グリシニンおよびβ−コングリシニンを含む）とトリプシンインヒビターの両方の含量を９９％またはそれ以上減少させることができる。加えて、これら２つの酵素分解工程は、分子量がより小さなオリゴペプチド（例えば、１０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチド）への大豆タンパク質の完全な分解に寄与し、よって、大豆タンパク質の利用率を向上させるのに役立つ。

本発明では、酵素の量は大豆タンパク質粉末の重量に基づき、すなわち、大豆タンパク質溶液を調製するために１ｇの大豆タンパク質粉末を使用する場合には、１０〜１００Ｕの中性プロテアーゼが使用される。さらに、酵素の不活化は１１０〜１２０℃で行われ、酵素不活化の時間は１０〜３０分に調節される。

さらに、工程４）における遠心分離の際の回転速度は２０００〜６０００回転／分に調節することができる。遠心分離は、従来的な装置、例えば、水平螺旋遠心分離機、円筒型遠心分離機などを用いて行うことができる。加えて、膜濾過は、孔径が１〜２００ｎｍ、さらには１〜５０ｎｍの濾過膜を用いて行うことができる；膜濾過の際、膜濾過の絶対圧は０．２〜０．４ＭＰａに調節することができ、温度は３０〜８０℃に調節する。遠心分離した第２の酵素加水分解物の上清液の膜濾過は、分子量の大きな成分をさらに捕捉して、酵素加水分解物中の高分子量アレルゲン性タンパク質成分の除去を最大限に高めることができる。

本発明においては、膜濾過後に得られる濾液を脱色し、濃縮してもよい。具体的には、脱色は従来的な脱色剤、例えば、活性炭粉末を用いて行うことができ、脱色剤と濾液の質量比は（５〜１０）：１００とし、脱色の温度は７０〜９０℃、例えば８０℃とし、脱色の時間は２０〜４０分とすることができ、脱色を攪拌下で行ってもよい。脱色後、脱色剤は、例えば板枠式圧濾機を用いて、常法により除去することができる。さらに、脱色剤の濾液除去は、蒸発によって濃縮されてもよく、例えば、二重効用流下膜式蒸発器を用いて濃縮を行ってもよい。蒸発による濃縮の際、蒸気圧は０．１±０．０２ＭＰａに、蒸発温度は４０〜８０℃に調節されうる。濃縮後、濃縮液の体積は元の体積の１／３〜１／２に減少しうる。さらに、濃縮後に滅菌および乾燥を行って、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド粉末を調製してもよい。乾燥は例えば、噴霧乾燥であってもよい。

本発明はまた、上記のいずれかの調製方法に従って調製される、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを提供する。アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドでは、グリシニンの含有量は２００ｍｇ／ｋｇ未満であり、β−コングリシニンの含有量は１５０ｍｇ／ｋｇ未満であり、大豆トリプシンインヒビターの含有量は１００ｍｇ／ｋｇ未満である；さらに、アレルゲン性が低く苦みのほとんどない大豆オリゴペプチドでは、グリシニンの含有量は１２５ｍｇ／ｋｇ未満であり、β−コングリシニンの含有量は９０ｍｇ／ｋｇ未満であり、大豆トリプシンインヒビターの含有量は５０ｍｇ／ｋｇ未満である。

さらに、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドでは、５０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの含有量が８５重量％を超え、分子量が１０００Ｄａ未満のペプチドの含有量が６０重量％を超える；そしてさらに、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドでは、５０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの含有量は９５重量％を超え、１０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの含有量は８５重量％を超える。

本発明はまた、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない上記の大豆オリゴペプチドの粉ミルクまたは健康食品における用途も提供する。粉ミルクは、乳児用粉ミルク、成人用粉ミルク、中高年成人用粉ミルクなどを含みうる。

本発明の方法では、大豆タンパク質の熱変性後、４種類の特異的なプロテアーゼを用いた酵素分解を２段階で行って、種々のアレルゲンおよび複雑な表面エピトープ構造による大豆タンパク質のアレルゲン性を完全に排除することができないという問題を解決するだけでなく、大豆タンパク質中の主要なアレルゲン性タンパク質、すなわちグリシニン、β−コングリシニンおよび大豆トリプシンインヒビターの総含量を９９％以上減少させる；加えて、この方法は、大豆タンパク質からの苦味および渋味成分の放出を防ぎ、よって、製品の味を確保する。本発明の方法は、処理がシンプルであり、よって大規模生産に適しており、そして、調製されるアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドは、広い範囲の用途を有する。

本発明の目的、技術的解決策および利点をより明確にするために、本発明の技術的解決策が本発明の実施例と共に明確かつ完全に説明されるが、当然、記載されている実施例は、本発明の実施例の全てではなく、一部に過ぎない。本発明の実施例に基づき、創造的努力なしに当業者によって得られる他の全ての実施例は、本発明の保護範囲に入るものとする。

本発明において用いられたプロテアーゼは全て、Novozymes Biotechnology Co. Ltd.から購入した。

実施例１
１．熱変性
約６０％のタンパク質含量を有する５００ｋｇの大豆タンパク質粉末、次いで４０００Ｌの水を反応器に加え、均一に攪拌して大豆タンパク質溶液を調製した。大豆タンパク質溶液を約８０℃に加熱し、この温度を保ちながら約４０分間連続的に撹拌し、変性タンパク質溶液を調製した。

２．第１の酵素分解
変性タンパク質溶液を約５０℃に冷却し、そのｐＨ値を約７に調整した。中性プロテアーゼおよびパパインの量をいずれも大豆タンパク質粉末１ｇあたり約５０Ｕとして、中性プロテアーゼとパパインを変性タンパク質溶液に加えた。約５０℃の温度のまま第１の酵素分解を約３時間行い、それによって第１の酵素加水分解物を調製した。

３．第２の酵素分解
アルカリプロテアーゼの量を大豆タンパク質粉末１ｇあたり約５０Ｕ、風味プロテアーゼの量を大豆タンパク質粉末１ｇあたり約１００Ｕとして、上で得られた第１の酵素加水分解物にアルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼを添加した。約５０℃の温度のまま第２の酵素分解を約２時間行った。得られた酵素加水分解物を１２０℃に加熱し、２０分間の酵素不活化に付して、第２の酵素加水分解物を調製した。

４．遠心分離および膜濾過
第２の酵素加水分解物を４０００回転／分の回転速度で遠心分離し、後の使用のために遠心分離上清液を回収した。

遠心分離した上清液を孔径約５０ｎｍのセラミック膜で濾過し、濾過時の絶対圧を約０．３ＭＰａ、温度を約５０℃に調節して、濾液を得た。

５．脱色、濃縮および滅菌
１０：１００の活性炭粉末対濾液の質量比で、濾液に活性炭粉末を添加した。それから、約８０℃で３０分間、撹拌下で脱色を行い、脱色後、活性炭粉末を板枠式圧濾機によって除去して、脱色溶液を得た。

蒸気圧を約０．１ＭＰａに調節し、蒸発温度を約６０℃に調節して、脱色した溶液を蒸発させて元の体積の半分に濃縮した。濃縮液に対して滅菌および噴霧乾燥を行い、それによりアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを調製した。

６．特性検出と味の評価の実施
アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド中のグリシニンおよびβ−コングリシニンの含有量を検出するために、グリシンシンＥＬＩＳＡキット（Unibiotest社製）およびβ−コングリシニンＥＬＩＳＡキット（Unibiotest社製）をそれぞれ使用し、大豆アレルゲン試薬キット（ELISASYSTEM社製）を用いて、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド中の大豆トリプシンインヒビターの含有量を検出し、一方、何も処理していない大豆タンパク質溶液をブランク対照として用いた。特性検出結果を表１に示した。

上で調製したアレルゲンが低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド中の種々の成分の分子量分布をＧＢ／Ｔ ２２７２９−２００８に従って検出した。結果を表２に示した。

上で調製したアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを水に溶解し、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを１０重量％含有する溶液を調製した；アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド溶液の苦味評価のために、２０名（半数は男性、半数は女性）の評価グループが設置されたが、評価方法は以下の通りである：アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド溶液１ｍＬを取り、苦味がちょうど感じとれるまで溶液の勾配希釈を行い、希釈倍数を苦味値として、２０人の平均苦味値を計算する。結果を表３に示した。

実施例２
１．熱変性
約６５％のタンパク質含量を有する５００ｋｇの大豆タンパク質粉末、次いで５０００Ｌの水を反応器に加え、均一に攪拌して大豆タンパク質溶液を調製した。大豆タンパク質溶液を約９０℃に加熱し、この温度を保ちながら約２０分間連続的に撹拌し、変性タンパク質溶液を調製した。

２．第１の酵素分解
変性タンパク質溶液を約４０℃に冷却し、そのｐＨ値を約８に調整した。中性プロテアーゼの量を大豆タンパク質粉末１ｇあたり約１０Ｕ、パパインの量を大豆タンパク質粉末１ｇあたり約３０Ｕとして、中性プロテアーゼとパパインを変性タンパク質溶液に添加した。約４０℃の温度のまま第１の酵素分解を約２時間行い、それによって第１の酵素加水分解物を調製した。

３．第２の酵素分解
アルカリプロテアーゼおよび風味プロテアーゼの量をいずれも大豆タンパク質粉末１ｇあたり約７５Ｕとして、上で得られた第１の酵素加水分解物にアルカリプロテアーゼおよび風味プロテアーゼを添加した。約４０℃の温度のまま第２の酵素分解を約３時間行った。得られた酵素加水分解物を１１０℃に加熱し、３０分間の酵素不活化に付して、第２の酵素加水分解物を調製した。

４．遠心分離および膜濾過
第２の酵素加水分解物を３５００回転／分の回転速度で遠心分離し、後の使用のために遠心分離上清液を回収した。

遠心分離した上清液を孔径約２００ｎｍの濾過膜で濾過し、濾過時の絶対圧を約０．４ＭＰａ、温度を約８０℃に調節して、濾液を得た。

５．脱色、濃縮および滅菌
５：１００の活性炭粉末対濾液の質量比で、濾液に活性炭粉末をに添加した。それから、約８０℃で約３０分間、撹拌下で脱色を行い、脱色後、活性炭粉末を板枠式圧濾機によって除去して、脱色溶液を得た；

蒸気圧を約０．１ＭＰａに調節し、蒸発温度を約８０℃に調節して、脱色した溶液を蒸発させて元の体積の３分の１に濃縮した。濃縮液に対して滅菌および噴霧乾燥を行い、それによりアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを調製した。アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドの特性検出結果、分子量分布および味評価結果をそれぞれ表１から表３に示した。

実施例３
１．熱変性
約７０％のタンパク質含量を有する５００ｋｇの大豆タンパク質粉末、次いで２５００Ｌの水を反応器に加え、均一に攪拌して大豆タンパク質溶液を調製した。大豆蛋白溶液を約８０℃に加熱し、この温度を維持して約６０分間連続的に攪拌して変性タンパク質溶液を調製した。

２．第１の酵素分解
変性タンパク質溶液を約６０℃に冷却し、そのｐＨ値を約６に調整した。中性プロテアーゼの量を大豆タンパク質粉末１ｇあたり約５０Ｕ、パパインの量を大豆タンパク質粉末１ｇあたり約１００Ｕとして、中性プロテアーゼとパパインを変性タンパク質溶液に添加した。約６０℃の温度のまま第１の酵素分解を約１時間行い、それによって第１の酵素加水分解物を調製した。

３．第２の酵素分解
アルカリプロテアーゼの量を大豆タンパク質粉末１ｇあたり約４０Ｕ、風味プロテアーゼの量を大豆タンパク質粉末１ｇあたり約１６０Ｕとして、上で得られた第１の酵素加水分解物にアルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼを添加した。約６０℃の温度のまま第２の酵素分解を約１時間行った。得られた酵素加水分解物を１２０℃に加熱し、２０分間の酵素不活化に付して、第２の酵素加水分解物を調製した。

４．遠心分離および膜濾過
第２の酵素加水分解物を４０００回転／分の回転速度で遠心分離し、後の使用のために遠心分離上清液を回収した。

遠心分離した上清液を孔径約５０ｎｍの濾過膜で濾過し、濾過時の絶対圧を約０．２ＭＰａ、温度を約３０℃に調節して、濾液を得た。

５．脱色、濃縮および滅菌
８：１００の活性炭粉末対濾液の質量比で、濾液に活性炭粉末をに添加した。それから、約８０℃で約３０分間、撹拌下で脱色を行い、脱色後、活性炭粉末を板枠式圧濾機によって除去して、脱色溶液を得た；

蒸気圧を約０．１ＭＰａに調節し、蒸発温度を約６０℃に調節して、脱色した溶液を蒸発させて元の体積の３分の１に濃縮した。濃縮液に対して滅菌および噴霧乾燥を行い、それによりアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを調製した。アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドの特性検出結果、分子量分布および味評価結果をそれぞれ表１から表３に示した。

比較例１
実施例１で調製した変性タンパク質溶液を約４０℃に冷却し、そのｐＨ値を約８に調整した。中性プロテアーゼを大豆タンパク質粉末１グラムあたり約１００Ｕの量で変性タンパク質溶液に添加した。約４０℃の温度を保持して約５時間酵素分解を行い、得られた酵素加水分解物を実施例１の方法に従って遠心分離、濃縮、滅菌、乾燥して、大豆ペプチドを調製した。その特性検出結果および味評価結果をそれぞれ表１および表３に示した。

比較例２
実施例１で調製した変性タンパク質溶液を約５０℃に冷却し、そのｐＨ値を約７に調整した。ブロメラインを大豆タンパク質粉末１グラムあたり約２５０Ｕの量で変性タンパク質溶液に添加した。約５０℃の温度を保持して約５時間酵素分解を行い、得られた酵素加水分解物を実施例１の方法に従って遠心分離、濃縮、滅菌、乾燥して、大豆ペプチドを調製した。その特性検出結果および味評価結果をそれぞれ表１および表３に示した。

比較例３
実施例１で調製した第２の酵素加水分解物を実施例１の方法に従って膜濾過と脱色を経由せずに直接、順番に遠心、濃縮、滅菌し、乾燥させ、大豆ペプチドを調製した。その特性検出結果および味評価結果をそれぞれ表１および表３に示した。

表１の結果から、以下のように結論されうる：

１．本発明により調製されるアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドでは、アレルゲン性タンパク質、すなわち、グリシニン、β−コングリシニンおよび大豆トリプシンインヒビターの含量が有意に減少しており、３つのタンパク質の総含量が９９重量％以上低減されうる。これは、本発明の方法が、大豆タンパク質のアレルゲン性を完全に排除することができ、優れた脱アレルギー化効果を有していることを示している。

２．大豆タンパク質の処理にブロメラインを使用した場合、大豆タンパク質の脱アレルギー化効果は明白でなかった；大豆タンパク質の処理に中性プロテアーゼを採用した場合には、大豆タンパク質のアレルゲン性をある程度排除することができたが、脱アレルギー化効果はそれほど良好ではなかった。

３．大豆のアレルゲン性タンパク質成分は、単なる酵素分解技術では完全に除去することができず、膜濾過および脱色などの特定のプロセスと組み合わせた本発明の複雑な酵素分解技術を用いることでのみ、大豆アレルゲンを最大限に排除することができる。

これは、大豆タンパク質の処理に使用する場合、任意のプロテアーゼまたはその組み合わせでは、大豆タンパク質のアレルゲン性を低減または排除することができず、特定の組成のプロテアーゼと特定のプロセス（例えば、予めの変性、段階的な酵素分解 、膜濾過、脱色など）を採用することによってのみ、大豆タンパク質のアレルゲン性を完全に排除することができることを示している。

表２の結果から、以下のように結論されうる：

本発明により調製されるアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド中の分子量５０００Ｄａ未満のペプチドの含有量は９５重量％より多く、分子量１０００Ｄａ未満のペプチドの含有量は８５重量％より多かった。

表３の結果から、以下のように結論されうる：

本発明により調製されるアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドは、苦味成分の量が少なく、よって風味が良好であり、これは、本発明の方法が酵素分解産物中の苦味物質の生成を効率的に抑制できることを示している；ブロメライン、中性プロテアーゼなどのプロテアーゼを大豆タンパク質の処理のために採用することでは、大豆タンパク質からの苦味成分および渋味成分の放出を効率的に回避することができない。

最後に、上記の例は単に説明することを意図したものであり、本発明の技術的解決策を限定するものではない；本発明を上記の実施例に従って詳細に説明したが、当業者であれば、上記の実施例に記載された技術的解決策をさらに変更することができ、その中の技術的特徴の一部または全部を等価なものに置換できることを理解するはずである；そして、これらの変更およびこれらの置換は、本発明のこれらの例の技術的解決策の範囲から、対応する技術的解決策の本質を逸脱させるものではない。

Claims (10)

1. アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドの調製方法であって、
   １）大豆タンパク質粉末を水と混合して大豆タンパク質溶液を取得し、大豆タンパク質溶液に対して熱変性を行って、変性タンパク質溶液を得る工程；
   ２）変性タンパク質溶液のｐＨ値を６〜９に調整し、それから中性プロテアーゼとパパインを添加して第１の酵素分解を行い、第１の酵素加水分解物を得る工程；
   ３）第１の酵素加水分解物中にアルカリプロテアーゼと風味プロテアーゼを添加して第２の酵素分解を行い、酵素の不活化を行った後、第２の酵素加水分解物を得る工程；そして
   ４）第２の酵素加水分解物を遠心分離し、遠心分離した上清液に対して膜濾過を行って、アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドを得る工程
   を含む方法。
2. 大豆タンパク質粉末と水との質量対体積比が１：（５〜１０）である、請求項１に記載の方法。
3. 熱変性の実施が、大豆タンパク質溶液を７０〜９０℃に加熱し、この温度を維持し、２０〜６０分間、連続的に撹拌する工程を含む、請求項１に記載の方法。
4. 中性プロテアーゼの量が１０〜１００Ｕ／ｇ、パパインの量が１０〜１００Ｕ／ｇであり、第１の酵素分解が３０〜６０℃で行われ、第１の酵素分解の時間が１〜３時間に調節される、請求項１に記載の方法。
5. アルカリプロテアーゼの量が１０〜１００Ｕ／ｇ、風味プロテアーゼの量が１０〜１００Ｕ／ｇであり、第２の酵素分解が３０〜６０℃で行われ、第２の酵素分解の時間が１〜３時間に調節される、請求項１に記載の方法。
6. 酵素の不活化が１１０〜１２０℃で行われ、酵素不活化の時間が１０〜３０分に調節される、請求項１に記載の方法。
7. 膜濾過が孔径１〜２００ｎｍの濾過膜を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
8. アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドにおけるグリシニンの含有量が２００ｍｇ／ｋｇ未満であり、β−コングリシニンの含有量が１５０ｍｇ／ｋｇ未満であり、大豆トリプシンインヒビターの含有量が１００ｍｇ／ｋｇ未満である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって調製されるアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド。
9. アレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドにおける５０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの含有量が８５重量％より高く、１０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの含有量が６０重量％より高い、請求項８に記載のアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチド。
10. 粉ミルクまたは健康食品における、請求項８または９に記載のアレルゲン性が低く苦味のほとんどない大豆オリゴペプチドの使用。