CN103652315A - 一种采用酶复合改性降低大豆分离蛋白致敏性的方法 - Google Patents

一种采用酶复合改性降低大豆分离蛋白致敏性的方法 Download PDF

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Abstract

一种采用酶复合改性降低大豆分离蛋白致敏性的方法，所述的方法包括：首先用Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，水解液经转谷氨酰胺酶交联，蛋白交联产物在60-70℃下进行真空浓缩，再利用喷雾干燥得到含水量小于5%的大豆分离蛋白粉。本发明方法所得大豆分离蛋白粉致敏性低，产品经ELISA检测，致敏性下降为60.4-91.3%，且加工性能好，无不良风味；具有良好的推广和应用前景，可广泛用于食品、药品等领域，特别适用作过敏患者的食品原料。

Description

一种采用酶复合改性降低大豆分离蛋白致敏性的方法
技术领域
本发明属于豆制品加工技术领域。
背景技术
大豆是我国主要的植物性蛋白食物资源，但同时也是8类主要过敏食物之一，目前约有0.3%-0.4%的婴幼儿患有大豆过敏症，随着大豆制品种类和数量的增多，成年人大豆过敏的发病率也在不断上升。显而易见，大豆过敏已经严重影响了部分人群的生活质量，甚至危及生命。因此，开发低致敏性大豆制品，保护大豆过敏患者的摄入安全，具有重要的现实意义。 
据有关文献报道，降低大豆过敏原的加工方法主要有热处理、辐照、酶法改性、糖基化反应和发酵等。在这些方法中，酶解法是一种较常用的蛋白改性法。蛋白酶可以破坏大豆蛋白的一些过敏原表位，特别是其构象表位，也可以通过断裂一些化学键来破坏致敏原表位的一级结构，从而降低或者消除大豆蛋白致敏性。因此，采用酶解法对大豆蛋白进行脱敏愈来愈受到人们关注。但是，水解过程中大量疏水基团的暴露，使得水解物带有苦腥味。酶交联是酶法改性蛋白质的另一种有效方法，其中，转谷氨酰胺酶交联己经成为蛋白质改性的研究热点。酶交联能使过敏原蛋白内部多肽链之间或蛋白质分子之间形成共价键，使原先暴露在表面的过敏原表位包埋入蛋白质分子内部而消除其致敏性，该方法已被应用于低致敏性花生和牛奶等食品的开发；同时，转谷氨酰胺酶还可以通过催化蛋白质分子发生聚合，改善蛋白质的功能特性（如乳化性和发泡性等）。由于酶水解和酶交联两种酶法改性在降低蛋白致敏性方面具有一定的互补性，这种酶复合改性法将为低致敏或无致敏大豆制品的开发提供一条很好的途径。目前，基于转谷氨酰胺酶交联大豆蛋白改善其加工特性的研究报道较多，而酶解结合酶交联对大豆分离蛋白致敏性影响的研究还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有酶解技术在降低过敏蛋白致敏性的不足之处，提供一种酶复合改性降低大豆分离蛋白致敏性的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明所述的一种采用酶复合改性降低大豆分离蛋白致敏性的方法，按以下步骤：
（1）用磷酸盐缓冲溶液将大豆分离蛋白配制成浓度为10mg/mL的均匀溶液，之后转移至水解罐，然后按酶活与蛋白底物的比例为5000-30000 U/g蛋白质加入Alcalase碱性蛋白酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，控制温度为40-60℃，pH值6.0-9.0，水解时间为1.0-2.5 h，当水解度为15%-20%时，终止水解反应，立即将水解样放入沸水中加热10 min灭酶，收集大豆分离蛋白酶解液。
（2）取步骤（1）收集的蛋白酶解液搅拌预热后，调整pH至7.0，按酶活与蛋白底物的比例为5.0-30.0U/g的量加入转谷氨酰胺酶进行交联反应，反应体系温度维持在40-60℃，时间为1.0-3.0 h，反应结束后80℃加热5min使酶失活，冷却至室温后调整pH至7.0。
（3）将步骤（2）所处理的酶解液交联产物在真空度为0.08 MPa、温度为50℃的条件下，进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
（4）将步骤（3）所得的浓缩物在进风口温度为170-180℃、排风口温度80-85℃、进料温度为60℃的条件下进行喷雾干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分离蛋白粉。
本发明的优点是：1、本发明能显著降低大豆分离蛋白的致敏性，产品经ELISA检测，致敏性下降为60.4-91.3%；2、本发明方法所得大豆分离蛋白粉加工特性良好，营养价值高，且无苦腥味和其它不良风味；3、本发明所得产品具有良好的推广和应用前景，可广泛的用作过敏患者的食品原料。
具体实施方式
本发明将通过以下具体实例作进一步说明。
实施例1。
1．低致敏大豆分离蛋白生产工艺。
（1）用缓冲溶液将大豆分离蛋白配制成浓度为10mg/mL的均匀溶液，之后转移至水解罐，然后按酶活与蛋白底物的比例为5000 U/g蛋白质加入Alcalase碱性蛋白酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，控制温度为40℃，pH值9.0，水解时间为2.0 h，当水解度为15%时，终止水解反应，立即将水解样放入沸水中加热10 min灭酶，调节pH至一定值，收集大豆分离蛋白酶解液。
（2）取步骤（1）收集的蛋白酶解液搅拌预热后，调整pH至7.0，按酶活与蛋白底物的比例为5.0U/g的量加入转谷氨酰胺酶进行交联反应，反应体系温度维持在60℃，时间为2.0 h，反应结束后80℃加热5min使酶失活，冷却至室温后调整pH至7.0。
（3）将步骤（2）所处理的酶解液交联产物在真空度为0.08 MPa、温度为50℃的条件下，进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
（4）将步骤（3）所得的浓缩物在进风口温度为170℃，排风口温度80℃，进料温度为60℃的条件下进行喷雾干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分离蛋白粉。
2．产品致敏性检测。
通过间接ELISA检测IgE结合能力反映产品的致敏性变化。
将酶复合改性处理后的大豆分离蛋白溶液稀释至2.5μg /mL，在酶标板上每孔加入100μL，以未处理大豆分离蛋白溶液为对照。4℃过夜后，PBST洗板三次，每次5min，拍干。每孔加入250μL 3%明胶，37℃封阻1h，洗板三次。另准备一块酶标板将倍比稀释的竞争抗原以同样的方式进行封阻，洗板之后，每孔加入1:20稀释度的人血清100μL，37℃反应1h。反应结束后，每孔吸取100μL转移至第一块板内，37℃孵育1h，PBST洗板三次。每孔加入100μL稀释5000倍的HRP标记羊抗人IgE，37℃反应1h，PBST洗涤拍干。每孔加入OPD显色液100μL，37℃避光反应15min后，每孔50μL加入2M H2SO4终止液，在490nm处用酶标仪测定OD值。
IgE结合能力（%）=（1-B/B0）×100%，B0：无竞争蛋白时的OD值；B：各加工条件下竞争蛋白对应的OD值。
致敏性降低（%）=（1-IgE样品/ IgE对照）×100%，采用本发明所述方法处理的大豆分离蛋白，样品的致敏性下降为60.4%。
实施例2。
1．低致敏大豆分离蛋白生产工艺。
（1）用磷酸盐缓冲溶液将大豆分离蛋白配制成浓度为10mg/mL的均匀溶液，之后转移至水解罐，然后按酶活与蛋白底物的比例为10000 U/g蛋白质加入Alcalase碱性蛋白酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，控制温度为45℃，pH值7.0，水解时间为1.5 h，当水解度为17%时，终止水解反应，立即将水解样放入沸水中加热10 min灭酶，调节pH至一定值，收集大豆分离蛋白酶解液。
（2）取步骤（1）收集的蛋白酶解液搅拌预热后，调整pH至7.0，按酶活与蛋白底物的比例为10.0U/g的量加入转谷氨酰胺酶进行交联反应，反应体系温度维持在50℃，时间为3.0 h，反应结束后80℃加热5min使酶失活，冷却至室温后调整pH至7.0。
（3）将步骤（2）所处理的酶解液交联产物在真空度为0.08 MPa、温度为50℃的条件下，进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
（4）将步骤（3）所得的浓缩物在进风口温度为175℃，排风口温度80℃，进料温度为60℃的条件下进行喷雾干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分离蛋白粉。
2．产品致敏性检测。
检测方法同实施例1，采用本发明所述方法处理的大豆分离蛋白，样品的致敏性下降为83.7%。
实施例3。
1．低致敏大豆分离蛋白生产工艺。
（1）用磷酸盐缓冲溶液将大豆分离蛋白配制成浓度为10mg/mL的均匀溶液，之后转移至水解罐，然后按酶活与蛋白底物的比例为20000 U/g蛋白质加入Alcalase碱性蛋白酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，控制温度为50℃，pH值8.0，水解时间为2.0 h，当水解度为20%时，终止水解反应，立即将水解样放入沸水中加热10 min灭酶，调节pH至一定值，收集大豆分离蛋白酶解液。
（2）取步骤（1）收集的蛋白酶解液搅拌预热后，调整pH至7.0，按酶活与蛋白底物的比例为20.0U/g的量加入转谷氨酰胺酶进行交联反应，反应体系温度维持在50℃，时间为2.0 h，反应结束后80℃加热5min使酶失活，冷却至室温后调整pH至7.0。
（3）将步骤（2）所处理的酶解液交联产物在真空度为0.08 MPa、温度为50℃的条件下，进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
（4）将步骤（3）所得的浓缩物在进风口温度为180℃，排风口温度85℃，进料温度为60℃的条件下进行喷雾干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分离蛋白粉。
2．产品致敏性检测。
检测方法同实施例1，采用本发明所述方法处理的大豆分离蛋白，样品的致敏性下降为91.3%。
实施例4。
1．低致敏大豆分离蛋白生产工艺。
（1）用磷酸盐缓冲溶液将大豆分离蛋白配制成浓度为10mg/mL的均匀溶液，之后转移至水解罐，然后按酶活与蛋白底物的比例为30000 U/g蛋白质加入Alcalase碱性蛋白酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，控制温度为60℃，pH值9.0，水解时间为1.0 h，当水解度为18%时，终止水解反应，立即将水解样放入沸水中加热10 min灭酶，调节pH至一定值，收集大豆分离蛋白酶解液。
（2）取步骤（1）收集的蛋白酶解液搅拌预热后，调整pH至7.0，按酶活与蛋白底物的比例为30.0U/g的量加入转谷氨酰胺酶进行交联反应，反应体系温度维持在40℃，时间为1.0 h，反应结束后80℃加热5min使酶失活，冷却至室温后调整pH至7.0。
（3）将步骤（2）所处理的酶解液交联产物在真空度为0.08 MPa、温度为50℃的条件下，进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
（4）将步骤（3）所得的浓缩物在进风口温度为175℃，排风口温度85℃，进料温度为60℃的条件下进行喷雾干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分离蛋白粉。
2．产品致敏性检测。
检测方法同实施例1，采用本发明所述方法处理的大豆分离蛋白，样品的致敏性下降为78.9%。

Claims (1)

1.一种采用酶复合改性降低大豆分离蛋白致敏性的方法，其特征是按以下步骤：
（1）用磷酸盐缓冲溶液将大豆分离蛋白配制成浓度为10mg/mL的均匀溶液，之后转移至水解罐，然后按酶活与蛋白底物的比例为5000-30000 U/g蛋白质加入Alcalase碱性蛋白酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，控制温度为40-60℃，pH值6.0-9.0，水解时间为1.0-2.5 h，当水解度为15%-20%时，终止水解反应，立即将水解样放入沸水中加热10 min灭酶，收集大豆分离蛋白酶解液；
（2）取步骤（1）收集的蛋白酶解液搅拌预热后，调整pH至7.0，按酶活与蛋白底物的比例为5.0-30.0U/g的量加入转谷氨酰胺酶进行交联反应，反应体系温度维持在40-60℃，时间为1.0-3.0 h，反应结束后80℃加热5min使酶失活，冷却至室温后调整pH至7.0；
（3）将步骤（2）所处理的酶解液交联产物在真空度为0.08 MPa、温度为50℃的条件下，进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上；
（4）将步骤（3）所得的浓缩物在进风口温度为170-180℃、排风口温度80-85℃、进料温度为60℃的条件下进行喷雾干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分离蛋白粉。
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