CN103910791B - 一种用于降低牛乳过敏蛋白潜在致敏性的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于改变牛乳过敏蛋白潜在致敏性的方法，按以下步骤：（1）制备蛋白溶液：用0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液将β‑乳球蛋白稀释成0.4mg/ml的均匀蛋白溶液；（2）将步骤（1）配制好的β‑乳球蛋白溶液分装于密封于锡箔袋中，于室温下进行高压处理，压力水平设置为200MPa，处理时间为30min。本发明见效快且操作简便，只需将分离纯化的蛋白溶液，经过固定压力的高压处理即可达到改变潜在致敏性的目的；所需试剂都是常规试剂，且使用常规的静高压灭菌装置就可以进行操作；较低压力的高压处理不仅能降低蛋白的致敏性，还能维持蛋白质的感官特性和营养价值。

Description

一种用于降低牛乳过敏蛋白潜在致敏性的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种通过非热加工技术降低牛乳过敏蛋白β-乳球蛋白潜在致敏性的方法。
背景技术
牛乳乳清蛋白中的β-乳球蛋白是牛乳中主要的过敏原之一。由于β-乳球蛋白具有耐酸和耐蛋白酶水解等特性，因此该蛋白经过消化后，还会有部分完整的β-乳球蛋白或其肽段残存于人体内，导致过敏反应。因此利用各种加工手段降低β-乳球蛋白的过敏原性具有深远的意义。
食物过敏原不是通过完整的蛋白质分子产生过敏反应，这些引起食物过敏反应的免疫学物质基础就是过敏原表位。而表位包括线性表位和构象性表位，是其过敏原性的结构基础。
目前已有用于降低牛乳过敏原蛋白β-乳球蛋白的加工方法包括生物加工、化学加工、物理加工等技术。其中，生物加工是利用基因工程技术改变过敏蛋白的基因序列；化学加工则通过酶改性和糖基化等方式改变过敏原蛋白的结构，从而达到降低其致敏性的目的。然而这些技术均存在一定的局限性：β-乳球蛋白主要是以构象性表位为主，难以通过序列变化大幅度改变构象性表位；而β-乳球蛋白具有耐酶解特性，导致酶改性的效果不佳，且糖基化过程中产生的中间产物，会引起人们对食物安全性的考量。
物理加工又可分为热加工和非热加工。热加工是牛乳及其乳制品生产过程中常用的灭菌技术，加热过程中会导致牛乳过敏蛋白产生去折叠或聚合等结构变化，从而诱导牛乳过敏蛋白的潜在致敏性的改变。但是，热加工也会致使牛乳中部分营养物质的损失。而非热加工技术不仅能实现热加工预期的加工效果，并能降低食品中有害微生物菌群的数量，同时可维持食品原有的感官和营养品质，保留其中的热敏性营养成分。在非热加工处理中，同时改变牛乳的潜在致敏性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于降低牛乳过敏蛋白潜在致敏性的方法。
本发明是通过以下步骤来实现。
（1）制备蛋白溶液：用0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液将β-乳球蛋白稀释成0.4mg/ml的均匀蛋白溶液。
（2）将步骤（1）配制好的β-乳球蛋白溶液分装于密封于锡箔袋中，于室温下进行高压处理。压力水平设置为200MPa，处理时间为30min。
对照未处理蛋白，采用竞争抑制性ELISA可以判断出过敏蛋白的致敏性变化，及其变化的程度。
静高压技术是一种作用强度较大的非热加工技术。该技术能杀菌和使蛋白质变性，高压对蛋白大分子的作用主要是通过压力的增加使物质体积发生变化，从而引起分子间结合方式的变化，导致其化学键的破坏或重聚，最终影响蛋白大分子的功能特性。大分子物质的结构会受到压力的影响，然而小分子物质，比如氨基酸，维他命，芳香成分和营养物质不会被压力所破坏。该过程引起过敏蛋白的线性和构象性表位发生破坏，从而改变其潜在致敏性。
本发明采用常规的静高压灭菌技术，并通过控制蛋白浓度以及高压压力，以改变过敏蛋白的潜在致敏性。该过程中需要注意高压处理时必须排尽锡箔袋内空气，不能将蛋白溶液直接进行处理，这是影响静高压处理结果的关键之处。
本发明建立的静高压处理方法，具有如下优点：见效快且操作简便，只需将分离纯化的蛋白溶液，经过固定压力的高压处理即可达到改变潜在致敏性的目的；所需试剂都是常规试剂，且使用常规的静高压灭菌装置就可以进行操作；较低压力的高压处理不仅能降低蛋白的致敏性，还能维持蛋白质的感官特性和营养价值。
附图说明
图1为本发明静高压处理对β-乳球蛋白IgE结合能力的影响。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步说明，但本发明并不受其限制。
实施例1。
1、静高压技术处理β-乳球蛋白。
具体实施过程包括如下步骤。
1）样品制备：对牛乳进行分离纯化得到β-乳球蛋白，测定的蛋白浓度为0.4mg/mL，纯度大于99%。
2）静高压处理：将分离纯化的β-乳球蛋白溶液密封于锡箔袋中，于室温下进行高压处理。压力水平分别设置为100，200，300，400，500MPa，处理时间均为30min。
2、β-乳球蛋白致敏性变化的定量分析。
静高压处理后的β-乳球蛋白溶液作为被分析的蛋白样品，通过竞争抑制性ELISA检测其潜在致敏性的变化。对照未处理蛋白，可以判断出该过敏蛋白潜在致敏性的改变程度。具体实施过程包括如下步骤。
1）构建牛乳过敏患者血清池：选定11位符合既定条件的牛乳过敏患者的血清混合制备而成。这些患者的血清符合以下条件：对牛乳过敏呈阳性；总的IgE水平均>100 IU/mL；特异性IgE水平均>1 IU/mL。
2）抗原包被：将100~500MPa处理后的各个β-乳球蛋白溶液稀释至2.5μg /mL,在一块酶标板上分别包被上100μL，以未处理β-乳球蛋白溶液为对照。4℃过夜后PBST洗板三次，每次5min。
3）明胶封阻：每孔加入250μL 3%明胶，37℃封阻1h。洗板三次。
4）一抗反应：另准备一块酶标板以同样的方式进行封阻，洗涤之后，每孔加入1:20稀释度的人血清100μL，37℃反应1h。反应时间结束后，每孔吸取100μL转移至第一块板内，37℃孵育1h，PBST洗板三次。
5）二抗反应：每孔加入1:5000稀释度的生物素标记羊抗人IgE二抗100μL，37℃反应1h。PBST洗板。
6）亲和素反应：每孔加入1:60稀释的HRP-链霉素标记的亲和素100μL，37℃反应，洗板。
7）OPD显色和检测：每孔加入100μL 现配制的OPD显色液，37℃避光反应15min，反应结束后每孔50μL加入2M H2SO4终止液，在490nm处用酶标仪测定OD值。
8）结果的计算：IgE结合能力（%）=（1-B/B0）×100%，B0：无竞争蛋白时的OD值；B：各加工条件下竞争蛋白对应的OD值。
经过静高压处理后β-乳球蛋白的潜在致敏性变化如附图1所示，静高压技术处理牛乳过敏原β-乳球蛋白后，通过竞争抑制性ELISA方法分析其IgE结合能力的变化。压力分别设置为100，200，300，400，500MPa，处理时间均为30min。随着压力的增加，其致敏性先大幅度降低后缓慢升高，其中压力为200 MPa时，致敏性降低程度最大。

Claims (1)

1.一种用于降低牛乳过敏蛋白潜在致敏性的方法，其特征是按以下步骤：
（1）制备蛋白溶液：用0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液将β-乳球蛋白稀释成0.4mg/ml的均匀蛋白溶液；
（2）将步骤（1）配制好的β-乳球蛋白溶液分装于密封于锡箔袋中，于室温下进行高压处理，压力水平设置为200MPa，处理时间为30min。
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