JP2007020586A - 修飾組換えワクシニアウイルスおよびその他の微生物、その使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 これらの微生物は、腫瘍および他の増殖組織などの免疫特権組織および細胞に、また、炎症組織に、他の組織、細胞および器官に比べて集積するように設計され、従って、それらは宿主生物に対して比較的低い毒性を示す。また、これらの微生物は、それらが集積する細胞の細胞膜を漏出性とし、その結果、タンパク質および他の細胞産物に対して反応性のある抗体を産生し、また、増殖組織、特に腫瘍を利用して選択されたタンパク質または他の産物を産生させるように設計または修飾される。
【選択図】 なし
Description
「癌遺伝子療法およびワクチン療法のための腫瘍特異的送達ビヒクルとして有用な組換えワクシニアウイルス」と題された2003年6月18日出願のEP03 013 826.7、「腫瘍組織におけるポリペプチド、RNAまたはその他の化合物の生産方法」と題された2003年8月14日出願のEP03 018 478.2および「腫瘍に対する生物の自己免疫誘導のための微生物または細胞の使用」と題された2003年10月22日出願のEP03 024 283.8の各々の優先権を主張する。支障がない限り、これらの出願の主題は出典明示によりそのまま本明細書に含まれる。
マイクローブおよび細胞を含む弱毒または修飾微生物を含むワクチン、ならびにそれらの微生物およびワクチンを作製する方法が提供される。特に、修飾細菌、真核細胞およびウイルスが提供され、さらに、増殖性疾患および炎症性疾患の処置のため、ならびに腫瘍における産物の生産のためのその使用方法も提供される。
図1Aは、用いた組換えワクシニアウイルスRVGL8の概略図である。組換えワクシニアウイルスRVGL8は、実施例1に記載のインビボ組換え法を用いることで構築した。NotIで消化した野生型ワクシニアウイルスDNAと非消化プラスミドDNA pNZ2の複合体を、インビボ組換えのためにPUV−VV感染細胞にトランスフェクトした。VGLは、野生型ワクシニアウイルス(Lister ATCC VR−1549株);RVGL8は、NotI部位にlacZ遺伝子をコードする組換えワクシニアウイルス;NotLおよびNotRは、ワクシニアウイルスゲノムのユニークなNotI制限部位の左および右セグメント;pE/Lは、合成初期/後期ワクシニアウイルスプロモーター;p7.5は、初期/後期ワクシニアウイルスプロモーター;lacZは、大腸菌のlacZ遺伝子である。
図1Bは、実施例に記載の種々のワクシニア株の概略図である。これらのウイルスで達成された結果は実施例に示す。
図2は、腫瘍における核酸分子、タンパク質および代謝化合物またはその他の細胞産物などの産物を生産するための方法のフローチャートを示す。
A.定義
B.腫瘍特異的治療のための微生物
B.腫瘍特異的治療のための微生物
1.特徴
a.弱毒化
i.毒性の軽減
ii.腫瘍に集積し、その他の器官には実質的に集積しない
iii.腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起または増強する能力
iv.病原性と腫瘍抗原の放出のバランス
b.免疫原性
c.複製成分
d.遺伝的変異体
i.修飾された特徴
ii.外因的遺伝子発現
iii.検出可能な遺伝子産物
iv.治療遺伝子産物
v.超抗原の発現
vi.採取する遺伝子産物の発現
2.ウイルス
a.細胞質内ウイルス
i.ポックスウイルス
a.ワクシニアウイルス
b.修飾ワクシニアウイルス
c.F3遺伝子
d.多重修飾
e.Lister株
ii.その他の細胞質内ウイルス
b.アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス
3.細菌
a.好気性細菌
b.嫌気性細菌
4.真核細胞
C.弱毒微生物の作出方法
1.遺伝的修飾
2.上記特徴に関するスクリーニング
3.ヒトにおけるこのような微生物の開発方法
D.治療方法
1.投与
a.微生物投与前のステップ
b.投与様式
c.用量
d.投与回数
e.同時投与
i.複数の微生物の投与
ii.治療化合物
f.被験体の状態
2.モニタリング
a.微生物の遺伝子発現のモニタリング
b.腫瘍サイズのモニタリング
c.抗体力価のニタリング
d.健康状態の診断のモニタリング
e.処置と統合したモニタリング
E.遺伝子産物および抗体の生産方法
1.組換えタンパク質およびRNA分子の生産
2.抗体の生産
F.医薬組成物、組合せおよびキット
1.医薬組成物
2.宿主細胞
3.組合せ
4.キット
G.実施例
特に断りのない限り、本明細書で用いられている技術用語および科学用語は全て、当業者によって共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本明細書における開示全体のいたるところで引用されている特許、特許出願および公報、ウェブサイトならびにその他の刊行物は、特に断りのない限り、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。本明細書の用語に複数の定義がある場合には、本節の定義が優先する。URLまたはその他このような識別名もしくはアドレスで引用がなされている場合には、このような識別名は変更されることがあり、インターネット上の特定の情報は移り変わることがあるが、同等の情報が既知であるか、インターネットおよび/または適当なデータベースを検索するなどすることで容易に入手できるものと理解される。それらの引用は、そのような情報の利用可能性および公的普及を証明するものである。
1)高ストリンジェンシー:0.1×SSPE、0.1%SDS、65℃
2)中ストリンジェンシー:0.2×SSPE、0.1%SDS、50℃
3)低ストリンジェンシー:1.0×SSPE、0.1%SDS、50℃
本明細書では、新生物性疾患およびその他の増殖性疾患ならびに炎症性疾患の治療のための微生物、およびそのような微生物の作製方法および使用方法が提供される。本明細書で提供されるマイクローブ(または微生物)を媒介とする処置方法は、宿主への微生物の投与、腫瘍などの標的細胞または組織における微生物の集積、その結果としてのそれらの細胞の漏出または溶解を含み、それにより漏出または放出された抗原に対する免疫応答が具備され、それによりその微生物が集積している組織または細胞の阻害が起こる。
本明細書で提供され、本明細書の方法で用いられる微生物は弱毒され、免疫原性であり、かつ、複製能を有する。
本明細書で提供される方法で用いられるマイクローブは一般に弱毒されている。弱毒マイクローブは、宿主で疾病を引き起こす能力が軽減されている。この能力の軽減は、マイクローブの病原能に対する様々な異なる修飾のいずれに起因するものであってもよい。例えば、マイクローブは、その非弱毒型に比べて毒性が軽減されていてもよいし、非腫瘍器官または組織における集積能が軽減されていてもよいし、細胞溶解または細胞死を起こす能力が軽減されていてもよいし、あるいは、複製能が軽減されていてもよい。しかしながら、本明細書で提供される弱毒マイクローブは少なくともいくらかの複製能、および腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織を漏出もしくは溶解させる、または細胞死を受けさせる、またはそうでなければ腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織に対する免疫応答を生じさせる、もしくは増強する能力を保持している。
マイクローブは、宿主の健康状態を悪化させる1以上の化合物を製造することによりそれらの宿主に対して有毒となり得る。宿主に対する毒性は、敗血性ショック、神経作用、または筋肉作用を含む様々な様式のいずれかで顕在化し得る。本明細書で提供されるマイクローブは、宿主に対して軽減された毒性を有し得る。本方法および組成物のマイクローブの軽減された毒性は、宿主が有毒作用を受けない毒性から、宿主がマイクローブの有毒作用から一般に死に至らない毒性までの範囲に及び得る。いくつかの態様では、マイクローブは、宿主が一般に、腫瘍性、転移性または壊死性の器官または組織に対する作用を超えて、宿主内のマイクローブの存在から顕著な長期作用を持たないように毒性が軽減されたものである。例えば、軽減された毒性として約1ヶ月未満持続する微熱または微弱感染があり得、この発熱または感染後には、宿主はその発熱または感染からくる毒性作用を受けない。別の例では、軽減された毒性は、マイクローブの投与後、宿主に約5%以下の意図しない体重低下として測定される場合もある。他の例では、マイクローブは宿主に対して全く毒性を持たない。
マイクローブは宿主の様々な組織および器官のいずれにも集積し得る。集積は宿主全体に一様に分布するときもあるし、あるいは1つまたはいくつかの器官または組織に濃縮されるときもある。本明細書で提供されるマイクローブは腫瘍および転移物のような免疫特権細胞および組織などの標的化された組織に集積し得る。いくつかの態様では、本明細書で提供されるマイクローブは、野生型マイクローブを用いた場合に起こる集積と同等またはそれ以上の、正常器官または組織に比した、腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織における集積を示す。他の態様では、本明細書で提供されるマイクローブは、他の特定の器官または組織における集積と同等またはそれ以上の、腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織における集積を示す。例えば、本明細書で提供されるマイクローブは、他の特定の器官または組織における集積よりも少なくとも約2倍高い、少なくとも約5倍高い、少なくとも約10倍高い、少なくとも約100倍高い、少なくとも約1,000倍高い、少なくとも約10,000倍高い、少なくとも約100,000倍高い、または少なくとも約1,000,000倍高い、腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織における集積を示し得る。
本明細書の微生物は、腫瘍細胞のような免疫特権細胞および組織などの標的化組織または細胞において抗原に対する免疫応答を生じるか、または増強する。この免疫応答は、免疫刺激サイトカインの存在および免疫応答を生じ得る抗原化合物の放出を含む様々な機構のいずれによっても惹起され得る。
腫瘍のような免疫特権細胞および組織などの標的細胞および組織の処置を含む典型的な
方法は、その迅速かつ完全な除去を引き起こすように設計されている。例えば、多くのウイルス、細菌または真核細胞は、腫瘍細胞をはじめ様々な細胞で溶解および/またはアポトーシスを誘導し得る。旺盛な溶解または細胞死の誘導が可能な微生物は病原性が高い可能性があり、宿主に死をもたらすことさえある。さらに、このような急速かつ完全な溶解に基づく治療方法は一般に治療上無効である。
本明細書で提供される微生物はまた免疫原性であってもよい。免疫原性微生物は、その微生物に対する宿主の免疫応答を作り出すことができる。一態様では、これらの微生物は大きな抗−(微生物)抗体力価をもたらすに十分免疫原性であり得る。本明細書で提供される微生物は免疫応答惹起能を有し得る。この免疫応答はウイルス抗原に応答して活性化され得るか、または、微生物感染によって誘導されるサイトカインもしくはケモカインの産生の結果として活性化され得る。微生物に対する免疫応答は、その宿主生物に対する病原性の可能性を引き下げ得るものである。
本明細書で提供される微生物は複製能を有し得る。様々なウイルスまたは細菌系において、投与する微生物は、宿主に対する病原性の危険性を制限するために複製不能とされる。複製不能であればその微生物から宿主を保護することができるが、その微生物の腫瘍細胞感染および死滅能も制限されてしまい、一般に一時的な効果しか得られない。これに対し、本明細書で提供される微生物は弱毒されてはいるが複製能を有し得るので、宿主に対する毒性が低く、かつ、主として腫瘍に、または腫瘍のみに集積することになる。よって、本明細書で提供される微生物は宿主に対する病原性を生み出さずに複製能を有し得る。
本明細書で提供される微生物はそれらの野生型から修飾され得る。修飾には様々な変化のいずれかを含んでよく、一般には微生物のゲノムまたは核酸分子に対する変化を含む。核酸分子の修飾の例としては、末端切断、挿入、欠失および突然変異が挙げられる。修飾の一例として、微生物遺伝子を末端切断、挿入、欠失または突然変異により修飾できる。挿入の一例としては、外因性遺伝子を微生物のゲノムに挿入することができる。
本明細書で提供される微生物の修飾は、病原性、毒性、腫瘍に優先的に集積する能力、細胞溶解または細胞死誘導能、腫瘍細胞に対して免疫応答を惹起する能力、免疫原性、複製能のような本明細書で提供されるものを含む微生物の特徴の修飾をもたらすことができる。変異体は、当技術分野で公知であり、Murphy et al., Virus Res. 1994, 32:13−26で呼吸器合胞体ウイルスに関して例示されているように、突然変異誘発、および細胞培養または組織培養での継代と目的特性の選抜などの一般法により得ることができる。
本明細書で提供される微生物はまた、1以上の外因性遺伝子を発現する能力を有し得る。遺伝子発現は遺伝子によりコードされるタンパク質の発現、および/または遺伝子によりコードされるRNA分子の発現を含み得る。いくつかの態様では、これらの微生物は外因性遺伝子の産物を腫瘍から採取できるよう十分高いレベルとする外因性遺伝子を発現することができる。内因性遺伝子の発現は構成的プロモーターにより、または誘導プロモーターにより制御することができる。発現はまた、その微生物により発現される1以上のタンパク質またはRNA分子によって左右され得る。誘導プロモーター系の例としては、酵母GAL4 DNA結合ドメインと、また単純ヘルペスウイルスタンパク質VP16の活性化ドメインと融合されているプロゲステロン受容体を含むキメラ転写因子、および1以上の外因性遺伝子と連結されているアデノウイルス主要後期E1B TATAボックスの上流の一連のGAL4認識配列を含む合成プロモーターが挙げられ、この例の系では、被験体にRU486を投与すれば、外因性遺伝子を誘導することができる。発現される外因性遺伝子としては、治療遺伝子産物をコードする遺伝子、画像化に使用できる遺伝子産物などの検出可能な遺伝子産物をコードする遺伝子、採取しようとする遺伝子産物をコードする遺伝子、採取しようとする抗体の抗原をコードする遺伝子が挙げられる。本明細書で提供される微生物はインビボおよびインビトロで遺伝子を発現させるのに使用できる。タンパク質の例としては、リポータータンパク質(大腸菌β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ)、検出を補助するタンパク質、すなわち検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導し得るタンパク質(例えば、ルシフェラーゼ、緑色および赤色蛍光タンパク質、トランスフェリン受容体)、腫瘍治療に有用なタンパク質(シュードモナスA内毒素、ジフテリア毒、p53、Arf、Bax、腫瘍壊死因子−α、HSV TK、大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アンギオスタチン、エンドスタチン、種々のサイトカイン類)および他の多くのタンパク質が挙げられる。
本明細書で提供される微生物は、その産物が検出可能であるか、またはその産物が検出可能なシグナルを提供できる1以上の遺伝子を発現し得る。様々な検出可能な遺伝子産物(検出可能なタンパク質など)が当技術分野で公知であり、本明細書で提供される微生物とともに使用することができる。検出可能なタンパク質としては、検出可能な化合物と特異的に結合することができる受容体または他のタンパク質、蛍光シグナルなどの検出可能なシグナルを発することができるタンパク質、検出可能な反応を触媒することができるか、または検出可能な産物の形成を触媒することができる酵素が挙げられる。
本明細書で提供される微生物は、その産物が細胞死を誘導するか、またはその産物が抗腫瘍免疫応答を誘導する1以上の遺伝子を発現することができ、このような遺伝子は治療遺伝子とみなすことができる。有毒タンパク質もしくはアポトーシスタンパク質、またはsiRNAなど、様々な治療遺伝子産物が当技術分野で公知であり、本明細書で提供される微生物とともに使用可能である。これらの治療遺伝子は、例えばチャネル形成タンパク質またはその他の溶解タンパク質として宿主細胞を直接死に至らせることにより、あるいはアポトーシスを誘導することにより、あるいは不可欠な細胞プロセスを阻害することにより、あるいは細胞に対する免疫応答を誘導することにより、あるいは同等の作用を有する化合物と相互作用させることにより、例えば、活性の低い化合物を細胞傷害性化合物に変換することにより働き得る。
本明細書で提供される微生物は1以上の超抗原を発現するように修飾され得る。超抗原は、多くの場合、T細胞の大きな応答によってもたらされる大きな免疫応答を活性化させることができる抗原である。様々な超抗原が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ジフテリア毒、ブドウ球菌内毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEEおよびSEH)、毒性ショック症候群毒素1、剥奪性(Exfoliating)毒素(EXft)、化膿連鎖球菌(Streptococcal Pyrogenic)外毒素A、BおよびC(SPE A、BおよびC)、マウス乳癌ウイルスタンパク質(MMTV)、連鎖球菌Mタンパク質、ウェルシュ菌(Clostridial Perfringens)内毒素(CPET)、マイコプラズマ関節炎超抗原が挙げられる。
採取を目的とした微生物により発現可能な遺伝子の例としては、ヒト遺伝子がある。遺伝子の例の一覧としては、Dr. Victor A. McKusickとジョンズ・ホプキンス大学その他の共同研究者らが著述および編集し、また、NCBI(the National Center for Biotechnology Information)、Online Mendelian Inheritance in Man, OMIMTM、ジョンズ・ホプキンス大学(Baltimore, Md.)のCenter for Medical Genetics、およびNational Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), 1999がWorld Wide Web向けに開発したヒト遺伝子と遺伝疾患の一覧、ならびにPubMedおよびGenbankなどの公開データベースで利用できるもの(例えば、(ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM)参照)が挙げられる。これらの遺伝子としては、限定されるものではないが、239f2h9、3pk、4ebp1、4ebp2、al1、al2m1、al2m2、al2m3、al2m4、al5、a1b、albg、alst、a2m、a2mr、a2mrap、aa、aaa、aaa、aabt、aac1、aac2、aact、aadac、aanat、aars、aas、aat、aavs1、abc1、abc2、abc3、abc7、abc8、abcr、abi1、abl1、abl2、abl1、abo、abp、abp1、abpa、abpx、abr、acaa、acac、acaca、acacb、acad1、acadm、acads、acadsb、acadv1、acat、acat1、acat2、acc、accb、accn1、accn2、accpn、ace1、ach、ache、achm1、achm2、achrb、achrd、achrg、acls、acly、aco1、aco2、acox、acox1、acox2、acox3、acp1、acp2、acp5、acpp、acr、acrv1、acs3、acs3、acs4、act2、act35、acta1、acta2、acta3、actb、actc、actg1、actg2、act11、actn1、actn2、actn3、actsa、acug、acvr1、acvr2b、acvrl1、acvrlk1、acvrlk2、acvrlk3、acy1、ad1、ad2、ad3、ad4、ad5、ada、adam10、adam11、adam12、adam3、adam3a、adam3b、adam8、adar、adarb1、adarb2、adcp1、adcp2、adcy1、adcy2、adcy3、adcy3、adcy4、adcy5、adcy6、adcy7、adcy8、adcy9、adcyap1、adcyaplr1、add1、add2、add3、add1、adfn、adh1、adh2、adh3、adh4、adh5、adh7、adhaps、adhc1@、adhr、adhr、adk、ad1、adm、admlx、adora1、adora2a、adora2b、adora21、adora21、adora3、adprt、adra1a、adra1b、adra1c、adra1d、adra2a、adra2b、adra2c、adra211、adra212、adra2r、adrb1、adrb1r、adrb2、adrb2rl1、adrb3、adrbk1、adrbk2、ads1、adss、adtb1、adx、adxr、ae1、ae2、ae3、aegl1、aemk、aes、af10、af17、af4、af6、af8t、af9、afd1、afdn、afg3、afg311、afm、afp、afx1、aga、agc1、ager、ag1、agmx1、agmx2、agp1、agp7、agps、agrn、agrp、agrt、ags、agt、agti1、agtr1、agtr1a、agtr2、agtrl1、agxt、ahc、ahcy、ahd、ahds、ahnak、aho2、ahr、ahsg、ahx、aib1、aic、aic1、aied、aih1、aih2、aih3、aim1、air、airc、aire、ak1、ak2、ak3、akap149、akt1、akt2、aku、alad、alas1、alas2、alb、alb2、alba、alcam、ald、aldh1、aldh10、aldh2、aldh3、aldh4、aldh5、aldh6、aldh9、ald11、aldoa、aldob、aldoc、aldr1、alds、alk、alk1、alk2、alk3、alk6、alms1、alox12、alox15、alox5、alp、alpi、alp1、alpp、alpp12、alr、alr、als1、als2、als4、als5、alss、ambn、ambp、amcd1、amcd2b、amcn、amcn1、amcx1、amd1、amdm、amelx、amely、amfr、amg、amg1、amgx、amh、amhr、amhr2、aml1、aml1t1、aml2、aml3、amog、ampd1、ampd2、ampd3、amph、amph1、ampk、amt、amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、an2、anc、ancr、ang、ang1、anh1、ank1、ank2、ank3、anop1、anova、anp、anpep、anpra、anprb、anprc、ans、ant1、ant2、ant3、ant3y、anx1、anx11、anx13、anx2、anx214、anx3、anx4、anx5、anx6、anx7、anx8、aoah、aoc2、aox1、ap2tf、apah1、apba1、apba2、apbb1、apbb2、apc、apcs、ape、apeced、apeh、apex、api1、api2、api3、apj、aplp、aplp1、aplp2、apnh、apo31、apoa1、apoa2、apoa4、apob、apobec1、apoc1、apoc2、apoc3、apoc4、apod、apoe、apoer2、apoh、apolmt、apolp1@、apolp2@、app、appbp1、appl1、aprf、aprt、aps、apt1、aptl1g1、apx1、apy、aqdq、aqp0、aqp1、aqp2、aqp21、aqp3、aqp4、aqp5、aqp6、aqp7、ar、ar1、ara、araf1、araf2、arcn1、ard1、ard1、areg、arf1、arf2、arf3、arf41、arf5、arg、arg1、args、arh12、arh6、arh9、arha、arhb、arhc、arhg、arhgap2、arhgap3、arhgap6、arhgdia、arhgdib、arhh、arix、arl2、armd1、arnt、arnt1、aro、arp、arp1、arpkd、arr3、arrb1、arrb2、arsa、arsacs、arsb、arsc1、arsc2、arsd、arse、arsf、art、art1、art3、art4、arts、arvd1、arvd2、arvd3、arvd4、as、asat、asb、ascl1、ascl2、asct1、asd1、asd2、asgr1、asgr2、ash1、asip、as1、asln、asm1、asma、asmd、asmt、asmtlx、asmty、asnrs、asns、aspa、ass、astm1、astn、asv、at、at1、at2r1、at3、ata、atbf1、atcay、atf1、ath1、aths、atm、atoh1、atox1、atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a11、atp1b1、atp1b2、atp1b3、atp1b11、atp1g1、atp2a1、atp2a2、atp2a3、atp2b、atp2b1、atp2b2、atp2b2、atp2b3、atp2b4、atp4a、atp4b、atp5、atp5a、atp5b、atp5g1、atp5g2、atp5g3、atp5o、atp6a、atp6b1、atp6c、atp6e、atp6n1、atp7a、atp7b、atpm、atpsb、atpsk1、atpsk2、atq1、atr、atr、atr1、atr1、atr2、atrc1、atrc2、atrx、ats、atsv、atx1、atx2、au、auf1、auf1a、aut、avcd、aved、avp、avpr1a、avpr1b、avpr2、avpr3、avrp、avsd、awa1、ax1、axl1g、axsf、azf1、azf2、azgp1、azu1、b120、b144、blg1、b29、b2m、b2mr、b3galt4、b4galt1、ba2r、bab1、bag1、bai1、bai2、bai3、bak1、bam22、bap1、bap135、bapx1、bard1、bark2、bas、bat1、bat2、bat3、bat4、bat5、bax、bb1、bbbg1、bbbg2、bbs1、bbs2、bbs3、bbs4、bbs5、bcas1、bcat1、bcat2、bcate2、bcd1、bcei、bche、bckdha、bckdhb、bcl1、bcl10、bcl2、bcl2a1、bcl212、bcl3、bcl5、bcl6、bcl7、bcl7a、bcl8、bcl9、bclw、bcm、bcm1、bcma、bcns、bcns、bcp、bcpm、bcpr、bcr、bcrl2、bcrl3、bcrl4、bcsg1、bct1、bct2、bdb、bdb1、bdc、bde、bdkrb1、bdkrb2、bdmf、bdmr、bdnf、bed、bedp、bek、bene、bevi、bf、bf1、bf2、bfhd、bfic、bfls、bfnc2、bfp、bfsp1、bft、bglap、bgmr、bgn、bgp、bhd、bhpcdh、bhr1、bicd1、bid、bigh3、bin1、bir、bjs、bkma1、blast1、blau、blk、blm、blmh、bltr、blvra、blvrb、blym、bmal1、bmd、bmh、bmi1、bmp1、bmp2、bmp2a、bmp2b1、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8、bmpr1a、bmpr1b、bmx、bmyb、bn51t、bnc、bnc1、bnp、bor、bpad、bpag1、bpag2、bpes、bpes1、bpes2、bpgm、bph1、bpi、br、br140、braf、brca1、brca2、brca3、brcacox、brcd1、brcd2、brdt、brf1、brhc、bric、brks、brn3a、brn3b、brn3c、brrn1、brw1c、bs、bsap、bsep、bsf2、bsg、bsnd、bss1、bst1、bst2、btak、btc、btd、bteb、bteb1、btg1、btg2、bths、btk、btk1、btn、bts、bub1b、bubr1、bwr1a、bwr1b、bws、bwscr1a、bwscr1b、bzrp、bzx、c11orf13、c1nh、c1qa、c1qb、c1qbp、c1qg、c1r、c1s、c2、c21orf1、c21orf2、c21orf3、c2ta、c3、c3br、c3dr、c3g、c4a、c4b、c4bpa、c4bpb、c4f、c4s、c5、c5ar、c5r1、c6、c7、c8a、c8b、c8g、c9、ca1、ca12、ca125、ca2、ca21h、ca3、ca4、ca5、ca6、ca7、ca8、ca9、caaf1、cabp9k、cac、cac@、caca、cacd、cacna1a、cacna1b、cacna1c、cacna1d、cacna1e、cacna1f、cacna1s、cacna2、cacnb1、cacnb2、cacnb3、cacnb4、cacng、cacnl1a1、cacnl1a2、cacnl1a3、cacnl1a4、cacnl1a5、cacnl1a6、cacnl2a、cacnlb1、cacnlg、cacp、cact、cacy、cad、cad11、c
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tp63、tp73、tpa、tpbg、tpc、tpc、tph、tph2、tpi1、tp12、tpm1、tpm2、tpm3、tpm4、tpmt、tpo、tpo、tpp2、tpr、tpr1、tprd、tps1、tps2、tpsn、tpst1、tpst2、tpt、tpt1、tptps、tpx、tpx1、tr、tr2、tr4、tra1、traf1、traf5、trailr2、tran、trance、trap170、trc3、trc8、tre、treb36、trek、trf1、trg1、trh、trhr、tric5、trio、trip1、trip14、trip6、trk、trk1、trka、trkb、trkc、trke、trl1、trl2、trm1、trm1、trm2、trma、trmi1、trmi2、trn、trn1、tro、trp1、trp1、trp2、trp3、trpc1、trpm2、trpo、trps1、trps2、trq1、trr、trr3、trrap、trsp、trt1、trt2、trv1、trv2、trv3、trv4、trv5、try1、try2、ts、ts13、ts546、tsbn51、tsc tsc1、tsc2、tsd、tse1、tsg101、tsg7、tshb、tshr、tsix、tsp3、tspy、tssc3、tst1、tst1、tsta3、tsy、ttc1、ttc3、ttf、ttf1、ttf2、ttg2、ttim1、ttn、ttp、ttp1、ttpa、ttr、tuba3、tubal1、tubb、tufm、tuft1、tulp1、tuple1、tw、tweak、twik1、twist、txgp11、txk、txn、txnr、txnrd1、tyh、tyk1、tyk2、tyk3、tyms、tyr、tyr1、tyro3、tyrp1、tyrp2、tys、u17hg、ulrnp、u22hg、u2af1、u2aflrs1、u2aflrs2、u2aflrs3、uba52、ubb、ubc、ubc4、ubc7、ubc8、ubch2、ubc1、ube1、ube2、ube2a、ube2b、ube2e2、ube2g、ube2g2、ube2h、ube2i、ube211、ube2v1、ube3a、ubh1、ubid4、ub11、uch11、ucn、ucp1、ucp2、ucp3、udpgdh、uev1、ufd11、ufs、ugalt、ugb、ugcg、ugdh、ugn、ugp1、ugp2、ugpp2、ugt1、ugt1a1、ugt2b11、ugt2b15、ugt2b17、ugt2b4、ugt2b7、ugt2b8、ugt2b9、ugt1、uhg、uhx1、ukhc、umod、umph2、umpk、umps、unc18、unc18b、und、ung、unr、unr、uox、up、upk1b、ups、uqbp、uqcrb、uqcrc1、uqcrc2、uqcrfs1、uqor1、uqor13、uqor22、urk、urkr、uroc、urod、uros、usf1、usf2、ush1、ush1a、ush1b、ush1c、ush1d、ush1e、ush1f、ush2a、ush3、usp11、usp5、usp7、usp9x、usp9y、ut1、ut2、ute、utr、utrn、utx、uty、uv20、uv24、uvo、vacht、vacm1、vamp1、vamp2、vars1、vasp、vat1、vat2、vav、vav1、vav2、vbch、vbp1、vcam1、vcf、vc1、vcp、vdac1、vdac2、vdd1、vdi、vdr、vegf、vegfb、vegfd、vegfr3、vgf、vg1、vgr1、vh1、vhr、vil1、vil2、vim、vip、vipr1、vipr2、vis1、vla1、vla5a、vlacs、vlcad、vldlr、vmat1、vmcm、vmd1、vmd2、vnra、vnt、vp、vpp1、vpp3、vpreb1、vpreb2、vrf、vrk1、vrk2、vrnf、vrni、vsn11、vtn、vwf、vws、waf1、wars、was、wbs、wd1、wdr2、wee1、wfrs、wfs、wfs1、wgn1、whcr、wi、wisp1、wisp2、wisp3、wnd、wnt1、wnt10b、wnt13、wnt14、wnt15、wnt2、wnt3、wnt5a、wnt7a、wnt7b、wnt8b、wrb、wrn、ws1、ws2a、ws2b、ws4、wsn、wss、wss、wt1、wt2、wt3、wt4、wt5、wts、wts1、wws、x11、xbp1、xbp2、xce、xdh、xe169、xe7、xe7y、xg、xgr、xh2、xiap、xic、xist、xk、xla、xla2、xlp、xlpd、xlrs1、xm、xpa、xpb、xpc、xpcc、xpct、xpf、xpf、xpg、xpmc2h、xpnpep2、xpo1、xrcc1、xrcc2、xrcc3、xrcc4、xrcc5、xrcc9、xrs、xs、xwnt2、yb1、yes1、yk140、y11、yrrm1、yt、ywha1、ywhab、ywhah、ywhaz、yy1、zac、zag、zan、zap70、zf87、zfm1、zfp3、zfp36、zfp37、zfx、zfy、zic1、zic2、zic3、zipk、znf1、znf10、znf117、znf11a、znf11b、znf12、znf121、znf123、znf124、znf125、znf126、znf13、znf14、znf141、znf144、znf146、znf147、znf157、znf16、znf160、znf162、znf163、znf165、znf169、znf173、znf179、znf189、znf19、znf192、znf193、znf195、znf198、znf2、znf20、znf200、znf204、znf217、znf22、znf23、znf24、znf25、znf26、znf27、znf29、znf3、znf32、znf34、znf35、znf36、znf38、znf4、znf40、znf41、znf42、znf44、znf45、znf46、znf5、znf6、znf69、znf7、znf70、znf71、znf72、znf73、znf74、znf75、znf75a、znf75c、znf76、znf77、znf79、znf8、zn80、znf81、znf83、znf9、znfc150、znfc25、znfxy、znt3、znt4、zp3a、zp3b、zpk、zws1、およびzyxが挙げられる。
、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、iadA、iap、ibpA、ibpB、icd、iclR、ihfA、ihfB、ileR、ileS、ileT、ileU、ileV、ileX、ileY、ilvA、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvF、ilvG、ilvH、ilvI、ilvJ、ilvM、ilvN、ilvR、ilvU、ilvY、imp、inaA、inaR?、infA、infB、infC、inm、insA(IS1)、intA、isb(IS1)、isfA、ispA、ispB、KanR、katE、katG、kba、kbl、kch、kdgK、kdgR、kdgT、kdpA、kdpB、kdpC、kdpD、kdpE、kdpF、kdsA、kdsB、kdtA、kdtB、kefB、kefC、kgtp、ksgA、ksgB、ksgC、ksgD、lacA、lacI、lacY、lacZ、lamB、lar、ldcC、ldhA、lepA、lepB、leuA、leuB、leuC、leuD、leuJ、leuO、leuP、leuQ、leuR、leuS、leuT、leuU、leuV、leuW、leuX、leuY、leuZ、lev、lexA、lgt、lhr、ligA、ligT、linB、lipA、lipB、lit、livF、livG、livH、livJ、livK、livM、lldD、IldP、lldR、lolA、lon、lpcA、lpcB、lpd、lplA、lpp、lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lrb、lrhA、lrp、Irs lspA、lysA、lysC、lysP、lysQ、lysR、lysS、lysT、lysU、lysV、lysW、lysX、lysY、lysZ、lytA、lytB、lyx、maa、mac、mae、mafA、mafB、malE、malF、malG、malI、malK、malM、malP、malQ、malS、malT、malX、malY、malZ、manA、manC、manX、manY、manZ、map、marA、marB、marR、mbrB、mcrA、mcrB、mcrC、mcrD、mdaB、mdh、mdoB、mdoG、mdoH、meb、melA、melB、melR、menA、menB、menC、menD、menE、menF、mepA、mesJ、metA、metB、metC、metD、metE、metF、metG、metH、metJ、metK、metL、metR、metT、metU、metV、metW、metY、metZ、mfd、mglA、mglB、mglC、mglR、mgsA、mgtA、mhpA、mhpB、mhpC、mhpD、mhpE、mhpF、mhpR、miaA、miaD、micF、minC、minD、minE、mioC、mltA、mltB、mltC、mltD、mmrA(rhlB?)、mng、mntA、moaA、moaB、moaC、moaD、moaE、mobA、mobB、moc、modA、modB、modC、modE、modF、moeA、moeB、mog、molR、motA、motB、mpl、mppA、mprA、mraA−−?、mraY、mrcA、mrcB、mrdA、mrdB、mreB、mreC、mreD、mrp、mrr、msbA、msbB、mscL、msrA、msyB、mtg、mtgA、mtlA、mtlD、mtlR、mtr、mttA、mttB、mttC、mukB、mukE、mukF、mul、murA、murB、murC、murD、murE、murF、murG、murH、murI、mutG(推定)、mutH、mutL、mutM、mutS、mutT、mutY、nac、nadA、nadB、nadC、nadE、nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、nalB、nalD、nanA、nanE、nanK、nanR、nanT、napA、napB、napC、napD、napF、napG、napH、narG、narH、narI、narJ、narK、narL、narP、narQ、narU、narV、narW、narX、narY、narZ、ndh、ndk、neaB、nei、nemA、nfi、nfnA、nfnB、nfo、nfrA、nfrB、nfrD、nfsA、nhaA、nhaB、nhaR、nikA、nikB、nikC、nikD、nikE、nirB、nirC、nirD、nlpA、nlpB、nlpC、nlpD、nmpC(qsr’)、non、npr、nrdA、nrdB、nrdD、nrdE、nrdF、nrdG、nrfA、nrfB、nrfC、nrfD、nrfE、nrfF、nrfG、nth、ntpA、nuoA、nuoB、nuoC、nuoE、nuoF、nuoG、nuoH、nuoI、nuoJ、nuoK、nuoL、nuoM、nuoN、nupC、nupG、nusA、nusB、nusG、nuvA、nuvC、ogrK、ogt、ompA、ompC、ompF、ompG、ompR、ompT、ompX、oppA、oppB、oppC、oppD、oppE、oppF、opr、ops、oraA、ordL、orf−23(purB、reg)orfl95(nikA−reg)、orn、osmB、osmC、osmE、osmY、otsA、otsB、oxyR、oxyS、pabA、pabB、pabC、pac、pal、panB、panC、panD、panF、parC、parE、pat、pbpG、pck、pcm、pcnB、pdhR、pdxA、pdxB、pdxH、pdxJ、pdxK、pdxL、pdxY、pepA、pepD、pepE、pepN、pepP、pepQ、pepT、pfkA、pfkB、pflA、pflB、pflC、pflD、pfs、pgi、pgk、pgl、pgm、pgpA、pgpB、pgsA、pheA、pheP、pheS、pheT、pheU、pheV、phnC、phnD、phnE、phnF、phnG、phnH、phnI、phnJ、phnK、phnL、phnM、phnN、phnO、phnP、phoA、phoB、phoE、phoH、phoP、phoQ、phoR、phoU、phrB、phxB、pin、pioO、pit、pldA、pldB、plsB、plsC、plsX、pmbA、pncA、pncB、pnp、pntA、pntB、pnuC、poaR、polA、polB、popD、potA、potB、potC、potD、potE、potF、potG、potH、potI、poxA、poxB、ppa、ppc、pphA、pphB、ppiA、ppiB、ppiC、ppk、pppA、pps、ppx、pqiA、pqiB、pqqL、pqqM、prc、prfA、prfB、prfC、priA、priB、priC、prlC、prlZ、prmA、prmB、proA、proB、proC、proK、proL、proM、proP、proQ、proS、proT、proV、proW、proX、prpA、prpC、prpR、prr、prs、psd、psiF、pspA、pspB、pspC、pspE、pspF、pssA、pssR、pstA、pstB、pstC、pstS、psu、pta、pth、ptrA、ptrB、ptsG、ptsH、ptsI、ptsN”−”、ptsP、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purN、purP、purR、purT、purU、pus、putA、putP、pykA、pykF、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrI、qmeC、qmeD、qmeE、qor、queA、racC、racR、radA、radC、ranA、rarD、ras、rbfA、rbn、rbsA、rbsB、rbsC、rbsD、rbsK、rbsR、rcsA、rcsB、rcsC、rcsF、rdgA、rdgB、recA、recB、recC、recD、recE、recF、recG、recJ、recN、recO、recQ、recR、recT、relA、relB、relE、relF、relX、rep、rer、rfaB、rfaC、rfaD、rfaF、rfaG、rfaH、rfaI、rfaJ、rfaK、rfaL、rfaP、rfaQ、rfaS、rfaY、rfaZ、rfbA、rfbB、rfbC、rfbD、rfbX、rfc、rfe、rffA、rffC、rffD、rffE、rffG、rffH、rffM、rffT、rhaA、rhaB、rhaD、rhaR、rhaS、rhaT、rhlB、rhlE、rho、ribA、ribB、ribC、ribD、ribE、ribF、ridA、ridB、rimB、rimC、rimD、rimE、rimG、rimH、rimI、rimJ、rimK、rimL、rimM、rit、rlpA、rlpB、rluA、rluC、rluD、rmf、rna、rnb、rnc、rnd、rne、rnhA、rnhB、rnk、rnpA、rnpB、rnr、rnt、rob、rorB、rpe、rph、rpiA、rpiB、rpiR、rplA、rplB、rplC、rplD、rplE、rplF、rplI、rplJ、rplK、rplL、rplM、rplN、rplO、rplP、rplQ、rplR、rplS、rplT、rplU、rplV、rplW、rplX、rplY、rpmA、rpmB、rpmC、rpmD、rpmE、rpmF、rpmG、rpmH、rpmI、rpmJ、rpoA、rpoB、rpoC、rpoD、rpoE、rpoH、rpoN、rpoS、rpoZ、rpsA、rpsB、rpsC、rpsD、rpsE、rpsF、rpsG、rpsH、rpsI、rpsJ、rpsK、rpsL、rpsM、rpsN、rpsO、rpsP、rpsQ、rpsR、rpsS、rpsT、rpsU、rrfA、rrfB、rrfC、rrfD、rrfE、rrfF、rrfG、rrfH、rrlA、rrlB、rrlC、rrlD、rrlE、rrlG、rrlH、rrmA、rrsA、rrsB、rrsC、rrsD、rrsE、rrsG、rrsH、rsd、rseA、rseB、rseC、rspA、rspB、rssA、rssB、rsuA、rtcA、rtcB、rtcR、rtn、rus(qsr’)、ruvA、ruvB、ruvC、sad、sanA、sapA、sapB、sapC、sapD、sapF、sbaA、sbcB、sbcC、sbcD、sbmA、sbmC(gyrI)、sbp、sdaA、sdaB、sdaC、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sdiA、sds、secA、secB、secD、secE、secF、secG、secY、selA、selB、selC、selD、semA、seqA、serA、serB、serC、serR 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本明細書で提供される微生物はウイルスを含む。このようなウイルスは一般に、本明細書で提供される微生物の1以上の特徴を有する。例えば、本明細書で提供されるウイルスは減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍などの免疫特権細胞および組織における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性タンパク質を発現する能力およびそれらの組合せを有し得る。いくつかの態様では、これらのウイルスは、腫瘍細胞を激しく死滅させることなく、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化させる能力を有する。
本明細書で提供されるウイルスは、ウイルスの生活環が宿主細胞の核へのウイルス核酸分子の侵入を必要としない細胞質内ウイルスであってもよい。様々な細胞質内ウイルスが知られており、限定されるものではないが、ポックスウイルス、アフリカブタコレラ科ウイルス、および種々のRNAウイルス(ピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルス、コロナウイルスおよびラブドウイルスなど)が挙げられる。いくつかの態様では、ウイルスの核酸分子はウイルスの生活環を通じて宿主細胞の核へ侵入しない。他の態様では、ウイルスの生活環は宿主細胞の核タンパク質を用いることなく遂行し得る。他の態様では、ウイルスの毒力または病原性は、ウイルス複製に関与する1以上のウイルスタンパク質の活性をモジュレートすることによりモジュレート可能である。
一態様では、本明細書で提供されるウイルスはポックスウイルス科から選択される。ポックスウイルスとしては、オルソポックスウイルス、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モラシポックスウイルスおよびヤタポックスウイルスなどのコルドポックスウイルス亜科、ならびに昆虫ポックスウイルスA、昆虫ポックスウイルスB、および昆虫ポックスウイルスAなどのエントモポックスウイルス亜科が含まれる。コルドポックスウイルス亜科は脊椎動物のポックスウイルスであり、同じ抗原性、形態および宿主域を有し、従って、本明細書ではこのような様々なポックスウイルスが使用できる。当業者ならば、その属または個々のウイルスの既知の特性に従って、また、ウイルスの選択された特性(例えば、病原性、免疫応答惹起能、優先的腫瘍局在)、ウイルスの意図する使用、腫瘍の種類および宿主生物に従って、特定のコルドポックスウイルス属または個々のコルドポックスウイルス亜科を選択することができる。コルドポックスウイルス属の例としては、オルソポックスウイルスおよびアビポックスウイルスが挙げられる。
オルソポックスウイルスの一例としてワクシニアウイルスがある。Western Reserve(WR)、Copenhagen、Tashkent、Tian Tan、Lister、Wyeth、IHD−J、およびIHD−W、Brighton、Ankara、MVA、Dairen I、L−IPV、LC16M8、LC16MO、LIVP、WR 65−16、Connaught、New York City Board of Healthを含む、様々なワクシニアウイルス株が利用できる。ワクシニアウイルスの例としては、ListerまたはLIVPワクシニアウイルスが挙げられる。既知のワクシニアウイルスのいずれも、または本明細書で提供される、または当業者にとってワクシニアウイルスの毒性が軽減されていることが既知のものに対応するその修飾物が挙げられる。しかしながら一般にこの突然変異は多重突然変異であり、このウイルスは毒性を軽減すべくさらに選択される。
本明細書では、本明細書の他所でより全般的に記載されているように、挿入、突然変異または欠失を有するワクシニアウイルスが提供される。これらのワクシニアウイルスは低毒性を持つよう、そして標的組織に集積するように修飾または選択される。このようなウイルスの例としては、LIVP株に由来するものがある。
当技術分野で公知の突然変異の他、本明細書で提供されるワクシニアウイルスはF3遺伝子(配列番号1;F3遺伝子の例はGenBank受託番号M57977に示されており、ここにはF3 LIVP株のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列が含まれている;Mikryukov et al., Biotekhnologiya 4:442−449 (1988)参照)。例えば、このF3遺伝子は、ワクシニアウイルスLIVP株DNA(Mikryukov et al., Biotekhnologiy 4 (1988), 442−449)の、F3遺伝子内に位置するユニークな単一のNotI制限部位の35番においてか、またはHindIII−F断片内の1475番において、外来DNA配をNotIで消化したウイルスDNAへ挿入することにより修飾されている。本明細書で示されるように、lacZまたはルシフェラーゼ/GFPを含む核酸分子をLIVP株のF3遺伝子のNotI部位(M57977ではヌクレオチド1473〜1480、または配列番号1のヌクレオチド33〜40)に挿入すると、野生型ワクシニアウイルスに対して、脳および心臓を含むヌードマウスの非腫瘍器官におけるワクシニアウイルスの集積を低下させることができる。従って、本明細書で提供される方法で使用するため、ワクシニアウイルスはF3遺伝子の挿入、突然変異もしくは欠失、または相当する遺伝子座の突然変異を含み得る。例えば、本明細書で示されるように、F3分断修飾型LIVPワクシニアウイルスは、インビボにおいて腫瘍細胞で選択的に複製することができる。よって、F3遺伝子が分断された修飾ワクシニアウイルス(例えば、修飾LIVP株)は、腫瘍に向けた遺伝子療法ならびに腫瘍および転移の検出のための方法など、本明細書で提供される方法において使用可能である。
本明細書で提供されるワクシニアウイルスはまた、2以上の挿入、突然変異または欠失を含み得る。よって、本明細書で示される遺伝子座または当技術分野で既知の他の遺伝子座の2以上の挿入、突然変異または欠失を含むワクシニアウイルスも含まれる。一態様では、ワクシニアウイルスはF3遺伝子に1つの挿入、突然変異または欠失と、1以上の付加的な挿入、突然変異または欠失を含む。修飾ワクシニアウイルスの一態様では、少なくともF3遺伝子は外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。F3遺伝子の修飾などの修飾は一般に、その遺伝子または遺伝子産物の少なくとも部分的な不活性化を招く。一例では、このF3遺伝子とTK遺伝子が、外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。別の例では、このF3遺伝子とHA遺伝子が、外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。別の例では、F3遺伝子とTK遺伝子およびHA遺伝子の双方が外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。別の例では、HA遺伝子とTK遺伝子が外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。よって、本組成物および方法は、(a)F3遺伝子、(b)TK遺伝子、および(c)HA遺伝子の2以上が修飾されている修飾ワクシニアウイルスを含む。一態様では、F3遺伝子、TK遺伝子およびHA遺伝子の少なくとも2つが、例えば、そのコード領域内のヌクレオチドの挿入、欠失および/または置換により不活性化されているか、またはこれら遺伝子のうち2以上の調節配列が挿入、欠失または突然変異により不活性化されている。
別の態様では、本明細書で提供されるウイルスおよび方法はワクシニアウイルスのLister株に対する修飾に基づくこともできる。Lister(Elstreeとも呼ばれる)ワクシニアウイルスは様々な供給源のいずれから入手してもよい。例えば、ElstreeワクシニアウイルスはATCCで受託番号VR−1549として入手できる。Listerワクシニア株は腫瘍細胞において高い形質導入効率を有し、遺伝子発現レベルも高い。
また、本明細書では、ポックスウイルスではない細胞質内ウイルスも提供される。細胞質内ウイルスは宿主細胞の核にウイルス核酸分子を導入しなくとも複製することができる。このような様々な細胞質内ウイルスが当技術分野で公知であり、アフリカブタコレラ科のウイルス、ならびにアレナウイルス、ピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、およびラボウイルスなどの種々のRNAウイルスが挙げられる。トガウイルスの例としては、シンドビスウイルスが挙げられる。アレナウイルスの例としては、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルスが挙げられる。ラボウイルスの例としては、水疱性口内炎ウイルスが挙げられる。パラミクソウイルスの例としては、ニューカッスル病ウイルスおよび麻疹ウイルスが挙げられる。ピコルナウイルスの例としては、ポリオウイルス、ウシエンテロウイルスおよびライノウイルスが挙げられる。フラビウイルスの例としては、黄熱病ウイルスが挙げられ、弱毒黄熱病ウイルスは、Barrett et al., Biologicals 25:17−25 (1997), and McAllister et al., J. Virol. 74:9197−9205 (2000)で例示されているように当技術分野で公知である。
さらに本明細書では、それらの生活環に、核酸分子の、宿主細胞の核への侵入を含むウイルスも提供される。このような様々なウイルスが当技術分野で公知であり、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルスおよびオルソミクソウイルスが挙げられる。ヘルペスウイルスの例としては、1型単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびエプスタイン−バーウイルスが挙げられる。パポーバウイルスの例としては、ヒト乳頭腫ウイルスおよびSV40ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、レンチウイルスが挙げられる。オルソミクソウイルスの例としては、インフルエンザウイルスが挙げられる。パルボウイルスの例としては、アデノ随伴ウイルスが挙げられる。
また、本明細書で提供される方法では細菌も使用できる。所望の特徴を有する様々な細菌のいずれもが使用できる。一態様では、好気性細菌が使用できる。別の態様では、嫌気性細菌が使用できる。別の態様では、細胞外細菌が使用できる。別の態様では、細胞内細菌が使用できる。
従来の研究では、腫瘍への投与のためには嫌気性細菌が好ましいとの仮説が立てられていた(Lemmon et al., 1997 Gene Therapy 4:791−796)。本明細書で示されるように、好気性細菌は腫瘍で生存および増殖可能であることが決定づけられた。よって、本明細書で提供される方法で用いられる細菌は、酸素が供給される環境で生存および増殖可能な細菌を含み得る。いくつかの態様では、これらの細菌は生存および増殖するために酸素が供給される環境に存在しなければならない。様々な好気性細菌が当技術分野で公知であり、乳酸菌、サルモネラ菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、ビブリオ菌、リステリア菌、および大腸菌が挙げられる。細菌の例としては、コレラ菌、リステリア菌、ネズミチフス菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・カセイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・パラカセイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・パランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・サリバリアス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・スポロゲネス(Lactobacillus sporogenes)、ラクトバチルス・ラクチス(Lactobacillus lactis)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)、スメグマ菌(Myobacterium smegmatis)、マイコバクテリア・バカエ(Mycobacterium vaccae)、マイコバクテリア・ミクロチ(Mycobacterium microti)、マイコバクテリア・ハバナ(Mycobacterium habana)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、およびシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)が挙げられる。
本明細書で提供される方法で用いられる細菌は、生存および増殖のために酸素を必要としない細菌を含み得る。いくつかの態様では、これらの細菌は生存および増殖するために酸素がない環境に存在しなければならない。様々な好気性細菌が当技術分野で公知であり、クロストリジウム菌、ビフィドバクテリウムが挙げられる。細菌の例としては、ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticus)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ノービ菌(Clostridium novyi)、クロストリジウム・ソルデリー(Clostridium sordellii)、クロストリジウム・アブソナム(Clostridium absonum)、クロストリジウム・ビフェルメンタンス(Clostridium bifermentans)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticus)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)、およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・インファチス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ラテロスポラム(Bifidobacterium laterosporus)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(Bifidobacterium animalis)、イスラエル放線菌(Actinomyces israelii)、ユーバクテリウム・レンタム(Eubacterium lentum)、ペプトストレプトコッカス・アンエアロビス(Peptostreptococcus anaerobis)、およびペプトコッカス・プレボッティー(Peptococcus prevotti)、およびアシドアミノコッカス・ファーメンタス(Acidaminococcus fermentans)が挙げられる。
本明細書で提供される微生物、ならびにそのような微生物を作製および使用する方法にはまた、霊長類などの哺乳類を含む多細胞真核生物に由来する細胞を含む真核細胞も包含され、細胞の例としては、ヒト細胞がある。一般に、これらの細胞は単離細胞である。例えば、真核細胞は、霊長類腫瘍細胞などの哺乳類腫瘍細胞を含む腫瘍細胞であってよく、霊長類腫瘍細胞の例としては、ヒト乳癌細胞などのヒト腫瘍細胞がある。別の例では、真核細胞はヒト繊維肉腫細胞などの繊維肉腫細胞を含み得る。ヒト繊維肉腫細胞の例としては、HT1080(ATCC受託番号CCL−121、CRL−12011またはCRL−12012)が挙げられる。別の例では、真核細胞は霊長類幹細胞などの哺乳類幹細胞を含む幹細胞を含み、霊長類幹細胞の例としてはヒト幹細胞が挙げられる。
本明細書で提供される微生物は、ウイルス、細菌および真核細胞などの微生物を修飾するための、当技術分野で周知の標準的方法により形成することができる。要するに、これらの方法は微生物に1以上の遺伝的修飾を導入した後、その修飾を反映した特性に関して、または目的とする他の特性に関してそれらの微生物をスクリーニングすることを含む。
分子生物学の標準的技術を用いて、本明細書で提供される修飾微生物を作製することができる。このような技術としては、種々の核酸操作技術、核酸導入プロトコール、核酸増幅プロトコール、および当技術分野で公知の他の分子生物学が挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的突然変異誘発を用いて、突然変異を目的の遺伝子に導入することができる。あるいは、相同組換えを用いて目的の標的配列に突然変異または外因性配列を導入することもできる。核酸導入プロトコールとしては、塩化カルシウム形質転換/トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介核酸導入、N−[1−(2,3−ジオロイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート媒介形質転換、およびその他が挙げられる。別の突然変異誘発プロトコールでは、特定の遺伝子における点突然変異は、正の選択圧を使用するために選択することもできる。例えば、Current Techniques in Molecular Biology(Ed. Ausubel, et al.)参照。核酸増幅プロトコールとしては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が挙げられる。当技術分野では、多様なウイルスおよび細胞性生物に関して、プラスミド、ベクター、プロモーターおよびその他の調節配列などの核酸ツールの使用が周知である。さらに多様な核酸ツールが、ATCCおよび種々の商業ソースを含む多くの異なる供給源から入手可能である。当業者ならば、技術および設計の選択に関する知識に従い、特定のウイルスまたは細胞性生物の遺伝的修飾に適当なツールおよび方法を容易に選択することができる。
修飾微生物は、減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる増強された能力、増強された免疫原性、増強または低下された複製能、および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにそれらの組合せなどの本明細書に記載の特徴を含む、いずれの所望の特徴に関してもスクリーニングすることができる。例えば、これらの修飾微生物は、腫瘍細胞を激しく死滅させることなく、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力に関してスクリーニングすることができる。別の例では、これらの微生物は、画像化に使用できる遺伝子を含む、検出可能な1以上の遺伝子の発現に関して、あるいは、遺伝子産物の製造もしくは採取のため、かつ/またはその遺伝子産物に対する抗体の採取のための1以上の遺伝子の発現に関してスクリーニングすることができる。
本明細書では、癌細胞、腫瘍および転移を含む免疫特権細胞または組織を処置または予防する方法を含む治療方法が提供される。本明細書で提供される方法は、微生物を腫瘍および/または転移を含む被験体に投与することを含む。本明細書で提供される方法は、その微生物が腫瘍細胞を死滅させる、または腫瘍の大きさを減じる必要はない。その代わりに、本明細書で提供される方法は、被験体において抗腫瘍免疫応答を誘導または増強し得る微生物を被験体に投与することを含む。いくつかの態様では、本明細書で提供される微生物は、被験体において微生物により誘導される疾病を引き起こすことなく被験体に投与することができる。いくつかの態様では、これらの微生物は腫瘍または転移に集積し得る。いくつかの態様では、これらの微生物は被験体において抗腫瘍免疫応答を惹起することができ、この場合、微生物が引き起こす抗腫瘍免疫応答は一般に、微生物が引き起こす腫瘍細胞死がほとんどない、または全くない結果として、この微生物を媒介とする抗腫瘍免疫応答は何日間か、例えば1週間以上、10日以上、2週間以上、または1ヶ月以上といった間にわたって発達し得る。いくつかの例示的方法では、この微生物は腫瘍に存在でき、微生物がそれ自体、腫瘍の増殖を抑えるに十分な腫瘍細胞死を誘導することなく、抗腫瘍免疫応答を誘導することができる。
本明細書で提供される方法を実施する場合、微生物を、腫瘍を有するかまたは新生細胞を有する被験体、または免疫化された被験体を含む被験体に投与すればよい。投与する微生物は本明細書で提供される微生物、または被験体への投与に関して既知のその他の微生物、例えば、ワクチン療法に用いられることが知られているいずれかの微生物のような抗原微生物を含む、被験体への治療的投与に関して知られているいずれの既知微生物であってもよい。いくつかの態様では、投与される微生物は、減弱された病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、高い免疫原性、複製能、および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにそれらの組合せといった特徴を含む微生物である。
いくつかの態様では、微生物を被験体に投与する前に1以上のステップを行うことができる。限定されるものではないが、微生物の投与に適当な症状を有するかどうか被験体を診断すること、被験体の免疫応答性の測定、被験体の免疫化、化学療法薬での被験体の処置、放射線での被験体の処置、または被験体の外科的処置を含む様々な先行ステップのいずれを行ってもよい。
被験体に微生物を投与するには、その投与様式が微生物の腫瘍または転移への侵入を可能とする限り、いずれの様式を用いてもよい。投与様式としては、限定されるものではないが、静脈投与、腹腔投与、皮下投与、筋肉投与、局所投与、腫瘍内投与、多重穿刺(例えば、天然痘ワクチンとともに用いられているもの)、吸入、鼻腔投与、経口投与、腔内投与(例えば、カテーテルを介した膀胱への投与、坐薬または浣腸による消化管への投与)、耳内投与または眼内投与が挙げられる。当業者ならば、被験体および微生物に適合し、かつ、腫瘍および/または転移に到達する微生物が得られる可能性もある投与様式を選択することができる。投与経路は、当業者ならば、疾病の性質、腫瘍の種類、および医薬組成物に含まれる特定の微生物を含む様々な因子のいずれかに従って選択することができる。標的部位への投与は、例えば、コロイド分散系としての弾道送達により行うことができ、あるいは、全身送達は、動脈注射により行うことができる。
用量は、様々な方法および量のいずれであってもよく、当業者ならば公知の臨床因子に従って決定することができる。医学分野で公知のように、ある任意の患者の用量は、その被験体の種、大きさ、体表面積、年齢、性別、免疫応答性、および健康状態、投与する特定の微生物、投与の期間および経路、疾病の種類およびステージ(例えば、腫瘍の大きさ)、ならびに同時に投与する薬物などの他の化合物を含む多くの因子に依存し得る。上記の因子の他、このようなレベルは、当業者が決定できるような微生物の感染力および微生物の性質に左右され得る。本明細書で提供される方法で用いられるウイルスの少なくともいくつかは、本明細書で用いられている細菌よりも感染力が高いものがある。よって、本方法のいくつかの態様では、ウイルスは細菌よりも低いレベルで投与することができる。本方法では、微生物の適性最低用量レベルは、腫瘍または転移においてその微生物が生存、増殖および複製するに十分なレベルであり得る。65kgのヒトにウイルスを投与する場合の最低レベルの例としては、少なくとも約5×105プラーク形成単位(pfu)、少なくとも約1×106pfu、少なくとも約5×106pfu、少なくとも約1×107pfu、または少なくとも約1×108pfuが挙げられる。65kgのヒトに細菌を投与する場合の最低レベルの例としては、少なくとも約5×106コロニー形成単位(cfu)、少なくとも約1×107cfu、少なくとも約5×107cfu、少なくとも約1×108cfu、または少なくとも約1×109cfuが挙げられる。本方法では、微生物の適性最高用量レベルは、宿主に毒性がないレベル、3倍以上の脾腫が生じないレベル、約1日後または約3日後または約7日後に正常な組織または器官にコロニーまたはプラークを生じないレベルであり得る。65kgのヒトにウイルスを投与する場合の最高レベルの例としては、せいぜい約5×1010pfu、せいぜい約1×1010pfu、せいぜい約5×109pfu、せいぜい約1×109pfu、またはせいぜい約1×108pfuが挙げられる。65kgのヒトに細菌を投与する場合の最高レベルの例としては、せいぜい約5×1011pfu、せいぜい約1×1011pfu、せいぜい約5×1010pfu、せいぜい約1×1010pfu、またはせいぜい約1×109pfuが挙げられる。
本明細書で提供される方法は、被験体への微生物の単回投与または被験体への微生物の多回投与を含み得る。いくつかの態様では、腫瘍内に微生物を確立するには、そこで微生物が増殖でき、被験体において抗腫瘍応答を誘導または増強することができる場所には単回投与で十分であり、このような方法は、被験体において抗腫瘍応答を誘導または増強するためにさらなる微生物の投与を必要とせず、例えば腫瘍増殖の阻害、転移の増殖または形成の阻害、腫瘍または転移の大きさの低減、腫瘍または転移の排除、新生物性疾患の再発または新たな腫瘍形成の阻害または予防、あるいはその他の癌治療効果をもたらすことができる。他の態様では、微生物は異なる時期に、一般には少なくとも1日おきに投与することができる。分割投与は、前の投与で腫瘍または転移への微生物の送達が不十分であった場合でも、腫瘍または転移への微生物の送達確率を高めることができる。分割投与は、微生物の増殖が起こり得る腫瘍または転移における局在を高めることができるか、そうでなければ、腫瘍に集積する微生物の力価を高めることができ、これにより、宿主の抗腫瘍免疫応答を惹起または増強する上で、腫瘍からの抗原またはその他の化合物の放出規模を高めることができ、さらにまた、所望により、微生物に基づく腫瘍溶解または腫瘍細胞死のレベルを高めることができる。微生物の分割投与は微生物抗原に対する被験体の免疫応答をさらに拡大することができ、これにより、微生物が集積した腫瘍または転移に対する宿主の免疫応答を拡大することができ、また、被験体が抗腫瘍免疫応答を具備する確率を高めることができる。
また、異なる治療微生物または治療化合物などのさらなる治療物質が投与される方法も提供される。これらは最初の微生物と同時、逐次または間欠的に投与することができる。このさらなる治療物質は微生物またはその遺伝子産物と相互作用できるか、またはこのさらなる治療物質は微生物とは独立に作用し得る。
2種以上の微生物を被験体に投与するための方法が提供される。投与は同時、逐次または間欠的に行うことができる。複数の微生物を単一の組成物として投与することもできるし、または2以上の組成物として投与することもできる。この2種以上の微生物は、少なくとも2種の細菌、少なくとも2種のウイルス、少なくとも2種の真核細胞、または細菌、ウイルスおよび真核細胞から選択される2種以上のものであり得る。この複数の微生物は、微生物を含有する組成物の組合せとして、および/または投与向けにパッケージングされた微生物および所望によりその使用説明書を含むキットとして提供することができる。これらの組成物は単位用量投与(すなわち、直接投与)として製剤された微生物であり、希釈剤またはその他の添加剤が必要な場合もある。
これらの方法は微生物またはその複数を被験体に投与するのに加えて、被験体に1以上の治療化合物を投与することを含み得る。治療化合物は、腫瘍治療効果に関して単独で、または微生物とともに作用し得る。単独で作用し得る治療化合物としては、腫瘍増殖を阻害することができるか、転移の増殖および/または形成を阻害することができるか、腫瘍または転移の大きさを小さくすることができるか、微生物の腫瘍において蓄積し、腫瘍において複製する能力を低下させることなく腫瘍または転移を排除することができるか、また、被験体において抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる様々な既知の化学療法薬化合物のいずれもが含まれる。
別の態様では、被験体に微生物を投与するための本明細書で提供される方法は、麻酔した被験体、警戒中の被験体、高体温の被験体、低体温の被験体、または腫瘍における微生物の集積に影響を及ぼすことが知られている被験体のその他の状態を含む、様々な状態のいずれにある被験体に対しても行うことができる。本明細書で示されるように、麻酔されている被験体は麻酔されていない被験体よりも腫瘍における微生物の集積速度が遅くなり得ることが判明している。さらに本明細書では、低体温の被験体は正常体温の被験体よりも腫瘍における微生物の集積速度が遅くなり得ることが判明していることも示される。よって、本明細書では、被験体に微生物を投与する方法が提供され、その方法は被験体に微生物を投与することを含んでよく、その被験体は全身麻酔などの麻酔下になく、例えば、被験体は局所麻酔下にあってもよく、あるいは麻酔されていなくてもよい。また、本明細書では、被験体に微生物を投与する方法が提供され、その方法は体温変化を有する被験体に微生物を投与することを含んでもよく、この体温変化は腫瘍に集積する微生物の能力に影響を及ぼすことができ、一般には、体温の低下は腫瘍に集積する微生物の能力を低下させ得る。よって、一例としての態様では、被験体に微生物を投与する方法が提供され、その方法は正常を上回る温度まで被験体の体温を高めること、および被験体に微生物を投与することを含み、この微生物は、正常体温の被験体の腫瘍に集積する微生物の能力に対して、高体温の被験体でより容易に集積することができる。
本明細書で提供される方法は、被験体のモニタリング、腫瘍のモニタリングおよび/または被験体に投与した微生物のモニタリングのうち1以上のステップをさらに含み得る。限定されるものではないが、腫瘍の大きさのモニタリング、抗(腫瘍抗原)抗体力価のモニタリング、転移の存在および/または大きさのモニタリング、被験体のリンパ節のモニタリング、被験体の体重、または血液もしくは尿マーカーを含む他の健康指標のモニタリング、抗(微生物抗原)抗体力価のモニタリング、微生物での検出可能な遺伝子産物の発現のモニタリング、および被験体の腫瘍、組織または器官における微生物力価の直接的モニタリングを含む様々なモニタリングステップのいずれを本明細書で提供される方法に含んでもよい。
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、微生物により発現される1以上の遺伝子をモニタリングすることを含み得る。本明細書で提供されるもの、またはそうでなければ、当技術分野で公知などの微生物は、限定されるものではないが、検出可能なタンパク質を含む1以上の検出可能な遺伝子産物を発現し得る。
また、本明細書では、腫瘍および/または転移の大きさおよび位置をモニタリングする方法も提供される。腫瘍および/または転移の大きさは、外部評価法または断層撮影法もしくは磁気映像法を含む当技術分野で公知の様々な方法のいずれによってモニタリングしてもよい。当技術分野で公知の方法の他、本明細書で提供される、例えば微生物遺伝子発をモニタリングする方法は、腫瘍および/または転移の大きさをモニタリングするために使用できる。
本明細書で提供される方法はまた、被験体への微生物の投与に応答して産生される抗体を含む、被験体において抗体力価をモニタリングすることを含み得る。本明細書で提供される方法において投与される微生物は内因性の微生物抗原に対して免疫応答を惹起することができる。本明細書で提供される方法において投与される微生物はまた、微生物により発現される外因性遺伝子に対しても免疫応答を惹起することができる。本明細書で提供される方法において投与される微生物はまた、腫瘍抗原に対しても免疫応答を惹起することができる。微生物抗原、微生物により発現される外因性の遺伝子産物、または腫瘍抗原に対する抗体力価のモニタリングは、微生物の毒性をモニタリングする方法、処置方法の有効性をモニタリングする方法、または生産または採取のための遺伝子産物または抗体のレベルをモニタリングする方法において使用できる。
本明細書で提供される方法はまた、被験体の健康状態をモニタリングする方法を含み得る。本明細書で提供される方法のいくつかは、新生物性疾患の治療方法を含む治療方法である。被験体の健康状態のモニタリングは、当技術分野で公知のように、その治療方法の有効性を決定するために使用できる。本明細書で提供される方法はまた、被験体に微生物を投与するステップも含み得る。被験体の健康状態のモニタリングは、被験体に投与した微生物の病原性を決定するために使用できる。当技術分野で公知のように、新生物性疾患、感染性疾患、または免疫関連疾患などの疾病をモニタリングするための様々な健康診断方法のいずれもがモニタリング可能である。例えば、被験体の体重、血圧、脈拍、呼吸、血色、体温またはその他の観察可能な状態が被験体の健康状態を示し得る。さらにまた、被験体由来のサンプルにおける1以上の成分の有無またはレベルも被験体の健康状態を示し得る。典型的なサンプルとしては血液および尿サンプルが挙げられ、この場合、1以上の成分の有無またはレベルは、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断試験を行うことにより決定することができる。被験体の健康状態の指標となる成分の例としては、限定されるものではないが、白血球数、ヘマトクリット、C反応性タンパク質濃度が挙げられる。
また、本明細書では、治療をモニタリングする方法が提供され、その治療的判定はこのモニタリングの結果に基づくものであり得る。本明細書で提供される治療方法は、被験体に微生物を投与することを含み、この微生物は腫瘍および/または転移に優先的に集積することができ、かつ、そこでこの微生物は抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる。このような治療方法は、特定の微生物の多数回投与、第二の微生物の投与、または治療化合物の投与を含む様々なステップを含み得る。被験体に投与する微生物または化合物の量、時期または種類の決定は、その被験体のモニタリングから得られた1以上の結果をもとにすることができる。例えば、被験体の抗体力価は、微生物または化合物を投与するのが望ましいかどうか、微生物または化合物の投与量、および投与する微生物または化合物の種類を決定するために使用でき、例えば、低抗体力価はさらなる微生物、異なる微生物、または微生物遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物を投与するのが望ましいことを示し得る。別の例では、被験体の全身的な健康状態は、微生物または化合物を投与するのが望ましいかどうか、微生物または化合物の投与量、および投与する微生物または化合物の種類を決定するために使用でき、例えば、その被験体が健康であると決定された場合は、さらなる微生物、異なる微生物、または微生物遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物を投与するのが望ましいことを示し得る。別の例では、微生物により発現される検出可能な遺伝子産物のモニタリングは、微生物または化合物を投与するのが望ましいかどうか、微生物または化合物の投与量、および投与する微生物または化合物の種類を決定するために使用できる。このようなモニタリング方法は、その治療方法が効果的かどうか、その治療方法が被験体に対して病原性があるかどうか、その微生物が腫瘍または転移に集積したかどうか、およびその微生物が正常組織または器官に集積したかどうかを決定するために使用できる。このような決定をもとに、さらなる治療方法が望まれるかどうか、またその形態を導き出すことができる。
本明細書では、外因性遺伝子の産物の生産のための、および/または外因性遺伝子産物に特異的な抗体の生産のための微生物、ならびにそのような微生物を製造および使用するための方法が提供される。本明細書で提供される方法は、生物活性タンパク質の効率的な組換え生産をもたらす。EP A1 1 281 772では、発光融合遺伝子構築物rVV−ruc−gfpを担持するワクシニアウイルス(LIVP株)をヌードマウスに静注した際、そのウイルス粒子は、発光の吸光によって測定したところ4日以内に全ての内部器官から除去されることが分かったことが開示されている。これに対し、注射したワクシニアウイルスの運命が、皮下移植したC6ラット神経膠腫細胞から増殖した腫瘍を有するヌードマウスと同様の経過をたどったとき、ウイルス粒子は腫瘍組織に一定時間留まり、持続的な発光をもたらすことが分かった。同じ腫瘍におけるウイルスによりコードされている融合タンパク質の存在および増幅を、実体顕微鏡下でGFP蛍光を観察することにより、また、低照度ビデオ撮影カメラ下でルシフェラーゼにより触媒される発光を検出することにより生きた動物でモニタリングした。腫瘍特異的な発光は、C6神経膠腫の皮下移植を有するヌードマウスにウイルスを注入した4日後に検出された。rVV−ruc−gfpウイルス粒子の腫瘍集積はまた、移植したPC−3ヒト前立腺細胞から発達した皮下腫瘍を有するヌードマウスでも、MCF−7ヒト乳癌の正所移植を有するマウスでも見られた。さらに、免疫応答性ラットにおける頭蓋内C6ラット神経膠腫細胞移植片、およびC57マウスにおけるMB−49ヒト膀胱腫瘍細胞移植片もこのワクシニアウイルスで標的化した。原発乳癌の他、反対側の乳房領域、ならびに露出している肺表面の結節にも小さな転移腫瘍が外部検出されたが、このことは、反対側乳房および肺への転移を示唆する。要するに、発光細胞または微生物、例えば、ワクシニアウイルスは転移腫瘍の検出および処置に使用できることが示された。
(a)新規のポリペプチドコードカセットを担持するトランスジェニック動物を作製する必要がないこと;
(b)この腫瘍系は組織培養よりも効率がよいこと;
(c)宿主動物にマイナスの作用がなく、腫瘍において、動物の発達タンパク質または他の有毒タンパク質を妨げるタンパク質を過剰生産することができること;
(d)この系は、cDNAクローニングからタンパク質および抗血清の生産まで4〜6週間以内と、迅速であること;
(e)この系は比較的安価であり、容易にスケールアップできること;
(f)適切なタンパク質の折りたたみおよび修飾が達成できること;
(g)高い抗原性が達成でき、より良い抗体生産に有益であること;そして
(h)発酵槽として、腫瘍を有するマウスなどの動物において種特異的細胞に基づくタンパク質生産が達成できる。
(1)目的のDNAまたはcDNAをワクシニアウイルスゲノムへ挿入すること;
(2)そのワクシニアウイルスゲノムを発現マーカーとしての発光タンパク質構築物で修飾すること;
(3)組換えおよび細胞培養におけるウイルスの集合;
(4)挿入を担持する個々のウイルス粒子のスクリーニング、およびその後の大規模ウイルス生産と濃縮;
(5)それらのウイルス粒子を、ヒト、非ヒト霊長類またはその他の哺乳類起源の腫瘍を担持するマウスまたはその他の動物に投与すること;
(6)発光に基づく、動物におけるウイルス複製とタンパク質の過剰生産の確認;
(7)腫瘍組織、および所望により血液(別途)の採取;および
(8)常法を用いた、腫瘍からの過剰生産されたタンパク質の精製、および所望により血液からの抗血清の精製。
腫瘍組織を動物から外科的に摘出することができる。腫瘍組織をホモジナイズした後、目的のポリペプチド、RNAまたはその他の生体化合物を確立された方法に従って精製することができる。例えば、組換えポリペプチドの場合、そのポリペプチドはhisタグなどの結合可能なタグを含んでもよく、例えば、カラムクロマトグラフィーにより精製することができる。動物の腫瘍におけるこのポリペプチドまたはRNAの十分な量の集積に必要な時間は、例えば動物の種類または腫瘍の種類などの多くの因子によって異なり、当業者ならば慣例の実験によって決定することができる。一般に、目的のポリペプチドの発現はウイルス注入から2日後に検出することができる。発現は注射後約2週間をピークとし、最大2ヶ月持続する。いくつかの態様では、腫瘍における目的のポリペプチドまたはRNAの量は、微生物により発現される検出可能な物質をモニタリングすることにより求めることができ、その検出可能な物質の濃度は、腫瘍における目的のポリペプチドまたはRNAの量を反映することができる。
また、目的の抗体を生産する方法であって、以下のステップ:(a)抗原をコードするヌクレオチド配列を含む微生物を担癌動物に投与すること;そして(b)その動物から得た血清からその抗原に対する抗体を単離することを含む方法も提供される。この抗原に対する抗体は周知の方法に従って単離および精製され得る。特定の混入抗原(例えば、細菌抗原)に対する抗体は吸着により除去することができ、標的抗原に対する抗体は、アフィニティー精製、例えば、カラムのリガンドとして組換え抗原を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーによるなど、当技術分野で公知の方法によって混入抗体から分離することができる。抗体は1回の採取で動物から集めることもできるし、または、当技術分野で公知のように回収放血により経時的に集めることもできる。
本明細書では、本明細書で提供される微生物と1以上の成分を含む医薬組成物、組合せおよびキットが提供される。医薬組成物は、微生物と医薬担体を含み得る。組合せは、2種以上の微生物、微生物と検出可能な化合物、微生物と微生物発現調節化合物、微生物と治療化合物を含み得る。キットは、本明細書で提供される医薬組成物および/または組合せ、および使用説明書、被験体において微生物を検出するための装置、被験体に化合物を投与するための装置および被験体に化合物を投与するための装置などの1以上の成分を含み得る。
また、本明細書では、修飾微生物と好適な医薬担体を含む医薬組成物が提供される。好適な医薬担体の例は当技術分野で公知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルションなどのエマルション、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このような担体は常法により調剤することができ、好適な用量で被験体に投与することができる。微生物の送達に使用できるコロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション(混合)、ミセル、リポソームおよびリポプレックスを含む脂質に基づく系が挙げられる。コロイド系の一例としてはリポソームがある。所望の組織だけに送達を達成するためには、器官特異的または細胞特異的リポソームが使用できる。リポソームの標的化は、当業者ならば一般に知られている方法を適用して行うことができる。この標的化は、受動的標的化(リポソームが洞様毛細血管を含む器官のRESの細胞に分布する自然の傾向を利用する)または能動的標的化(例えば、周知の方法によりリポソームと特定のリガンド、例えば、抗体、受容体、糖類、糖脂質、タンパク質などとを結合させることによる)を含む。これらの方法では、リポソームを、特異的細胞表面リガンドを介して特定の組織、例えば、腫瘍組織に標的化するためにモノクローナルを使用することができる。
また、本明細書では、修飾ワクシニアウイルスなどの本明細書で提供される微生物を含む宿主細胞も提供される。これらの宿主細胞は、ワクシニアウイルスなどの微生物感染に感受性のある組織様々な哺乳類、鳥類および昆虫細胞および組織のいずれもを含み、ニワトリ胚、ウサギ、ハムスターおよびサル腎細胞、例えば、CV−1、BSC40、Vero、BSC40およびBSC−1、およびヒトHeLa細胞が挙げられる。これらの宿主細胞を形質転換する方法、形質転換体を表現型により選択する方法などは当技術分野で公知である。
組合せとしては、微生物と1以上の成分を含み得る。本明細書ではまた、組合せはいずれも、微生物の代わりに、微生物と1以上の成分を含む医薬組成物および/または宿主細胞も含み得る。
キットは、所望により、他の試薬または装置、使用説明書を含み得る組合せでパッケージングされる。本明細書で提供されるキットはいずれも、微生物の代わりに、微生物および/または組合せと1以上の成分を含む医薬組成物、宿主細胞を含み得る。
以下の実施例は単に説明のために示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
組換えウイルスの作製
VGLと呼ばれる、野生型ワクシニアウイルス(VV)LIVP株(the Lister Institute of Viral Preparations, Moscow, Russia由来、もとはATCC受託番号VR−1549のLister株の弱毒により誘導された周知のウイルス株;Al’tshtein et al., (1983) Dokl. Akad. Nauk USSR 285:696−699参照)を、本明細書でRVGLXと称する組換えウイルスの構築のための親ウイルスとして用いた。全てのワクシニアウイルスを、スクロース勾配(Yoklik)を用いて精製した。VVを増殖させ、CV−1細胞(ATCC受託番号CCL−70)を用いたプラークアッセイにより力価を求めた。組換えワクシニアウイルスを構築するための方法は当業者に公知である(例えば、Chakrabarti et al., 1985 Mol. Cell Biol. 5:3403および米国特許第4,722,848号参照)。表1は本実施例に記載の組換えVV株をまとめたものである。
LIVP VV(3×108pfu/ml)を1μg/mlのプソラレン(Calbiochem, La Jolla, CA)とともにインキュベートし、ハンクのバッファー中、室温にて10分間懸濁させた後、365nmの長波長UV真空管5本を備えたStratalinker 1800 UV架橋装置(Stratagent, La Jolla CA)内で5分間照射してPUV−VVを作出した。
lacZ遺伝子が挿入されたNotI部位を含む組換えワクシニアウイルスRVGL8の構築は、Timiryasova et al. (2001), BioTechniques 31, 534−540に記載の通りに行った。要するに、これは次のようにして作製した。ワクシニアp7.5プロモーターと強力な合成ワクシニアpE/Lプロモーターの制御下にlacZ遺伝子を含む、pSC65(Chakrabarti et al. (1997), BioTechniques 23, 1094−1097参照;また、Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley−Interscience Supplement 15:16.17.2 (1992)も参照;また、本明細書の配列番号5およびPCT国際出願WO99/32646の配列番号57も参照)のBamHI/SmaI断片(3293bp)を、制限酵素消化により単離し、クレノウ酵素で平滑末端とし、pNT8プラスミド(Timiryasova et al. (2001), BioTechniques 31: 534−540)のSmaI部位にクローニングし、シャトルプラスミドpNZ2を作出した。
フォワード:5’−GGGAATTCTTATACATCCTGTTCTATC−3’(配列番号3);
リバース:5’−CCAAGCTTATGAGGAGTATTGCGGGGCTAC−3’(配列番号4)
を用いて、野生型VV LIVP株のNotI領域を増幅した。得られた972bp断片は、5’末端と3’末端にそれぞれフランキングEcoRIとHindIII部位を含んでいた。このPCR産物をEcoRIおよびHindIIIで切断し、pUC28(Benes et al., (1993) Gene 130: 151)に挿入した。プラスミドpUC28はpUC18(ATCCから受託番号37253として入手可能)から、プライマー:
pUC28 I:5’AATTCAGATCTCCATGGATCGATGAGCT3’(配列番号6);
pUC28 II:3’GTCTAGAGGTACCTAGCTAC5’(配列番号7)
を用い、合成オリゴアダプターをpUC18のEcoRIおよびSstI部位に導入することにより作製する。これはpUC18のポリリンカーにBglII、ClaI、およびNcoI部位を導入する。
60mmディッシュ(Corning, Corning, NY, USA)で増殖させたCV−1アフリカミドリザル腎繊維芽細胞(ATCC受託番号CCL−70)を多重感染度(MOI)1でPUV−VV(プソラレンおよびUVで処理したLIVP株;例えば、Tsung et al. (1996), J. Virol. 70, 165−171; Timiryasova et al. (2001), BioTechniques 31, 534−540; Timiryasova et al. (2001), J. Gene 3 Med. 3, 468−477参照)に感染させた。
ウイルスDNAをサザンブロットにより分析した。要するに、ウイルスDNAを単離するため、10cmプレートで増殖させたCV−1細胞の密集単層を野生型VV(LIVP株)または単一の組換えプラークから得られたウイルス保存株のVVに感染させた。細胞変性効果が完全となったとき、細胞を採取し、そのペレットを3mlの10mM Tris−HC1、pH9.0に再懸濁させた。ウイルス粒子を溶解させ、プロテイナーゼKで処理し、ウイルスDNAをフェノール/クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿により単離した。このDNAを100μ1の無菌水に再懸濁させた。このウイルスDNAサンプルを37℃で一晩、NotIで消化した後、フェノール−クロロホルム処理を行い、沈殿させ、そして10μgのDNAサンプルを0.8%アガロースゲルで分離した。このDNAを、正電荷を有するナイロン膜(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)に移し、GSジーンリンカー(Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を用いてこの膜に固定した。DNAのDIG標識は非放射性DNA標識および検出キット(Roche Diagnostics Corporation)を用い、60分間37℃でインキュベートすることで行った。このメンブランを、lacZ遺伝子をコードするプラスミドpNZ2の変性DIG標識3357bp NotI−NotI DNA断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション条件およびブロットの展開は製造業者が示しているように行った。
組換えウイルスRVGL2の構築には、ワクシニアウイルスLIVPを用いた。組換えウイルスRVGL23の構築には、ワクシニアウイルスWestern Reserve(WR)を用いた。ウミシイタケルシフェラーゼとオワンクラゲGFPの融合物のcDNA(ruc−gfp;1788bp;Wang et al., (1996) Bioluminescence Chemiluminescence 9:419−422; Wang et al., (2002) Mol. Genet. Genomics 268:160−168; Wang et al. (1997) pp 419−422 in Bioluminescence and Chemiluminescence: molecular reporting with photons, Hastings et al., eds., Wiley, Chicheser UK;また、米国特許第5,976,796号も参照;また、ruc−gfp構築物の配列を示す本明細書の配列番号8も参照)を、制限エンドヌクレアーゼPmeIにより、Wang et al., (1996) Bioluminescence Chemiluminescence 9:419−422およびWang et al., (2002) Mol. Genet. Genomics 268:160−168ならびに以下に簡単に記載されているプラスミドpcDNA−ruc−gfp(RG)から切り出し、そしてpSC65プラスミドのSmaI部位(配列番号5参照;また、PCT国際出願WO99/32646の配列番号57も参照)に挿入し、pSC65−RG−1プラスミドDNAを得た。
組換えワクシニアウイルスRVGL5は、ワクシニアゲノムのHA遺伝子に挿入されたワクシニア後期p11プロモーターの制御下のlacZ遺伝子を含む(Timiryasova et al. (1993) Mol Biol 27:392−402;また、Timiryasova et al., (1992) Oncol. Res 11:133−144も参照)。組換えワクシニアウイルスRVGL9は、VVゲノムのF3遺伝子に挿入された合成初期/後期ワクシニアプロモーター(PE/L)の制御下のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子(ruc)と緑色蛍光タンパク質のcDNA(gfp)の融合物を含む(Timiryasova et al., (2000) pp. 457−459 in Proceedings of the 11th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Case et al., eds)。RVGP5およびRVGLP9は、RVGLP2およびRVGLP23に関して記載した通りに構築した。
ポリA配列を有するヒトトランスフェリン受容体(hTR)(2800bp)のcDNAをBamHIによりpCDTR1プラスミド(ATCC受託番号59324および59325)を単離し、クレノウで処理し、pSC65プラスミド(本明細書の配列番号5およびPCT国際出願WO99/32646の配列番号57参照)のSalI部位に挿入し、pSC−TfRおよびpSC−rTfRを得た。プラスミドpSC−rTfRは、ワクシニアPE/Lプロモーターと反対の方向にcDNA hTR、およびワクシニアTK遺伝子への挿入のためのワクシニア配列よりフランキングされた初期/後期ワクシニアp7.5プロモーターの制御下に大腸菌β−ガラクトシダーゼを含む。RVGL20ウイルスの構築には、pSC−rTfRを用いた。F3遺伝子座にruc−gfp融合物を含み、単一の欠損を有する組換えウイルスRVGL9は、LIVP株においてユニークなNotI部位を含むものであり(上記参照、また、Timiryasova et al., (2000) pp. 457−459 in Proceedings of the 11th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Case et al., edsも参照)、上記のような相同組換によりRVGL20ウイルスの作出のための親ウイルスとして用いた。RVGL20ウイルスの概略は図1Bに示されている。
大腸菌のβ−グルクロニダーゼ(gus)のcDNA(1879bp)を、XbaI(クレノウ断片で平滑末端化)およびHindIIIを用いてpLacGusプラスミド(Invitrogen;本明細書の配列番号9参照)から遊離させ、XhoI(クレノウで処理)およびHindIIIで消化したpSC11プラスミドpSC65(Chakrabarti et al.(1985) Mol. Cell Biol. 5:3403−3409;本明細書の配列番号5およびPCT国際出願WO99/32646の配列番号57参照)の、ワクシニアp11後期プロモーターの制御下にクローニングし、プラスミドpSC−GUSを得た。pSC−GUSプラスミド由来のSmaI−HindIII断片を、ワクシニアの血球凝集素遺伝子へ抗原遺伝子を挿入するためのベクターであるpVY6プラスミド(例えば、Flexner et al., (1988) Nature 355:259−262; Flexner et al., (1988) Virology 166: 339−349参照;また、米国特許第5,718,902号も参照)をSmaIおよびBamHIで消化したものに挿入し、pVY−GUSプラスミドを得た。得られたプラスミドをpVY−GUSプラスミドと呼び、血球凝集素(HA)遺伝子への挿入のためのワクシニア配列によりフランキングされた、ワクシニア後期プロモーターp11の制御下にgusをコードするcDNAを含む。二重の欠損を有する組換えウイルスRVGL20を、RVGL21ウイルスの構築のための親ウイルスとして用いた。CV−1細胞に、MOI 0.1でRVGL20ウイルスを感染させた。感染2時間後、細胞を、FuGene6トランスフェクション試薬(Roche)を用いて、pVY−GUSプラスミドDNAでトランスフェクトした。組換えウイルスプラークを、CV−1細胞において、寒天培地にβ−グルクロニダーゼ基質である5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸(X−GlcA)(Research Products Int. Co., Mt. Prospect, IL, USA)を添加した際の色をスクリーニングすることで選択した。X−GlcAの存在下、寒天培地で8回の純化を行った後、純粋な組換えウイルスRVGL21が選択された。RVGL21ウイルスはTK、F3およびHA遺伝子に分断を有しており、図1Bに概略が示されている。
CV−1、C6(ATCC受託番号CCL−107)、B16−F10(ATCC受託番号CRL−6475)、およびGI−101A(Rumbaugh−Goodwin Institute for Cancer Research Inc. Plantation, FL;米国特許第5,693,533号)細胞を24ウェルプレートに、それぞれ1×105、2×105、4×105、および2×105細胞/ウェルで播種した。翌日、これらの細胞に同時に0.001または0.01PFU/細胞の野生型LIVPおよびその突然変異株を感染させた。このウイルス懸濁液を細胞単層(0.15ml/ウェル)に加え、37℃で1時間、10分ごとに軽く振盪しながらインキュベートした。次に、ウイルスを取り出し、適当な完全増殖培地を加え(1ml/ウェル)、その後、37℃にてウイルス感染後24、48、72および96時間インキュベートした。休止細胞培養物を確立するため、CV−1細胞の密集単層を、5%FBSを含むDMEM中、37℃で6日間インキュベートした。これらの休止細胞を感染させ、上記のような感染後同じ時点で採取した。感染細胞からウイルスを凍結および解凍1回で放出させた。ウイルス力価はCV−1細胞に対するプラークアッセイにより2回測定し、PFU/mlで表した。
ウイルスレベルのインビトロ分析
LacZ
組換えワクシニアウイルスにより誘導されたlacZ発現の分析は従前に記載されている通りに行った(Timiryasova et al. (2001), BioTechniques 31, 534−540)。要するに、6ウェルプレート(Corning, Corning, NY, USA)で増殖させたCV−1細胞にウイルス原液の10倍希釈液を感染させた。このウイルスを37℃で1時間、時々揺動しながら吸収させた。次に、このウイルス接種物を、1%の寒天を含む完全培地に置き換え、48時間インキュベーションを行った。ウイルスプラークを可視化するため、1ml当たり300μgのX−Gal(Molcular Probes, Eugene, Oregon, USA)と0.1%のニュートラルレッド(Sigma, St. Louis, MO, USA)を第2の寒天上層に加え、プラークを計数し、37℃で12時間インキュベートした後に単離した。インビトロ細胞におけるワクシニアウイルスのレベルはまた、細胞のプラーク形成単位(PFU)を測定することによっても求めることができる。
wt LIVPウイルスおよびその突然変異株の感染および複製能を、3種類の腫瘍細胞系統(C6、GI−101A、B16−F10)で分裂CV−1細胞および休止CV−1細胞について分析した。これらの結果は、ワクシニア突然変異株が、MOI 0.001で、分裂CV−1細胞に効率的に感染および複製することを示す。分裂CV−1細胞からは、有意な収量のワクシニアウイルスが得られた。分裂CV−1細胞におけるVVおよびその突然変異株の収量は、休止CV−1細胞の場合よりも約10倍高かった。インビトロ研究においてワクシニア突然変異株とwtウイルスの間のウイルス回収については有意な違いはなかった。分裂CV−1細胞においては、TK、F3およびHA遺伝子の分断はVV突然変異株の複製に差をもたらすことはなかった。3種類の腫瘍細胞を試験した。MOI 0.001での細胞変性効果に対する相対的感受性は次の通りであった:CV−1(分裂、最高)、CV−1(休止)、C6、GI−101A、B16−F10(最低)。マウスB16−F10黒色腫細胞はMOI 0.001でのウイルス感染に感受性がなかった。MOI 0.01で感染した黒色腫細胞からは極めて低いウイルス力価が回収された。また、WR株はインビトロで黒色腫細胞にLIVP株よりも効率的に感染することができ、ウイルス回収率もLIVP株よりも高かったことも認められた。
動物モデルおよびアッセイ
動物モデル
動物試験には6〜8週齢の無胸腺ヌードマウス(nu/nu)およびC57BL/6マウス(Harlan Animal Res., Inc., Wilmington, MA)を用いた。各5匹または4匹のマウス群に0.1ml量の静注にて107PFUのVVを静脈感染させた。マウスを、rucおよびgfpの発現に関してそれぞれ低照度画像装置および蛍光画像装置で画像化した。この研究は開始に先だって、the Animal Research Committee of LAB Research International Inc. (San Diego, CA, USA)の承認を得た。動物の取り扱いは、LAB Research International Inc. (San Diego, CA, USA)の免許獣医の指示のもとで行った。
皮下神経膠腫腫瘍を確立するため、ラット神経膠腫C6細胞(ATCC受託番号CCL−107)をトリプシン処理により採集し、6〜8週齢の雄無胸腺マウスの右後脚に5×105細胞/0.1ml/マウスを皮下注射(s.c.)した。C6細胞移植後7日目、腫瘍サイズ中央値が約150mm3になった際に、107PFU/0.1ml/マウスの用量のウイルスを静注(i.v.)した。ウイルス注射後14日目にマウスを殺した。RVGL9ウイルスを用いた動態研究では、ウイルス注射後20分、1時間、4時間、18時間、36時間、3日、5日、7日および14日目にマウスを殺した。
皮下(s.c)乳癌を発達させるため、ヒト乳癌GI−101A細胞(Rumbaugh−Goodwin Institute for Cancer Research Inc. Plantation, FL;米国特許第5,693,533号)を5×106細胞/0.1ml/マウスの用量で、6〜8週齢の雌無胸腺マウスの右後脚に皮下注射した。GI−101A細胞の移植後30日目、腫瘍サイズ中央値が約500mm3になった際に、107PFU/マウスの用量のウイルスを静注した。ウイルス注射後14日目にマウスを殺した。生存実験および乳癌治療研究用のマウスは長期間(ウイルス注射後100日以上)維持した。約4000mm3の大きさの腫瘍を発達させた、かつ/または体重が50%減のマウスを殺した。
黒色腫モデルに関しては、2×105細胞/0.04ml/マウスの用量のマウス黒色腫B16−F10細胞(ATCC受託番号CRL−6475)を、6〜8週齢の雄C57BL/6マウスの足蹠に注射した。細胞移植後18日目、腫瘍が確立された際(腫瘍サイズ中央値約100mm3)に、107/マウスの用量のウイルスを静注した。マウスはウイルス注射後10日目に殺した。
ヌードマウスの腫瘍および器官からのワクシニアウイルスの回収
殺した動物から血液を採集し、器官(肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、卵巣、膀胱、脳、心臓)および腫瘍を採取し、プロテアーゼインヒビターの混合物を含むPBS中でホモジナイズした。器官の解剖または切開ごとに鋏と鉗子を交換し、組織の交差混入がないようにした。サンプルを凍結および解凍し、1,000gで5分間遠心分離した。ウイルス力価を、CV−1細胞に対し、血清フリー培地で希釈した上清において、プラークアッセイおよび48時間インキュベーション後、1%(wt/vol)クリスタルバイオレット溶液でのそれらの染色により求めた。各サンプルを2回ずつアッセイし、ウイルス力価を平均PFU/g組織として表した。
皮下ヒト乳癌を担持する6週齢のヌードマウスで生存研究を行った。マウスに107のワクシニアウイルスを静注し、生存を追跡した。1週間に2回、個々の体重を測定した。ウイルス感染後の体重の増/減をパーセンテージとして算出した:(ウイルス注射日の体重(g)−腫瘍重(g)/モニタリング日の体重(g)−腫瘍重(g))×100%。安楽死させた動物から脾臓を摘出し、秤量した。RSWは次のように算出した:RSW=脾臓の重量(g)×104/動物体重(g)−腫瘍重(g)。平均腫瘍体積が3000mm3に達するか、または疾病の兆候が現れた際にマウスを安楽死させた。the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従い、人道的に急速CO2安楽死を行った。
LacZ
マウスの組織サンプルおよび血清中の大腸菌β−ガラクトシダーゼ活性を、製造業者の説明書に従い、化学発光ガラクト−ライトプラス(商標)アッセイ系(Applied Biosystems, Bedford, MA, USA)を用いて測定した。要するに、1〜20μlのサンプルを、1:100希釈した反応バッファー希釈液200μlを含む試験管に移し、室温で30分間インキュベートした。サンプルの入ったこの試験管に300μ1アリコートの促進剤(−II)を加え、手早く混合し、照度計を用いてシグナルを読みとった。β−ガラクトシダーゼ活性を組織1g当たりの相対発光量(relative light units)(RLU)として表した。精製大腸菌β−ガラクトシダーゼ(Sigma)を陽性対照として用い、標準曲線を作製した。
ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、従前に記載されているもの(Yu and Szalay, 2002)を若干改変し、Turner TD 20e照度計(Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA)を用いてホモジナイズした後の組織サンプルの上清において測定した。要するに、20μlのサンプルを、基質コエレントラジンを含む500μlのルシフェラーゼアッセイバッファー(0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1Mリン酸カリウム、pH7.4)に加えた。ルシフェラーゼ活性は10秒間隔で測定し、組織1g当たりのRLUとして表した。
ワクシニアウイルスRVGL8の腫瘍選択的複製
6匹のマウス由来の腫瘍サンプルおよび種々の器官、ならびに正常器官からのwt LIVP(VGL)およびRVGL8の回収。VGLは腫瘍、精巣、膀胱、および肝臓、ならびに脳から回収された。しかしながら、組換えウイルスRVGL8はほぼ腫瘍だけに見られ(マウス#24では、精巣、膀胱および肝臓に、マウス#22では、精巣にウイルスが見られた)、6匹の供試動物の脳組織からはウイルスは回収されなかった。この知見は、NotI部位の分断を有するRVGL8の安全性を証明するものである。
単一のF3遺伝子突然変異を有し、ruc−gfpを担持するワクシニアウイルスRVGL9を用い、皮下神経膠腫を有する免疫抑制無胸腺マウスに静脈投与した後のベクターの組織分布パターンを評価した。この組換えウイルスを用いた組織分布データは、このVV株によるウイルス分布と腫瘍ターゲッティングを示した。rucおよびgfpの発現に基づくマウスにおけるウイルス複製の非侵襲的画像化により、動態研究を行った。皮下ラット神経膠腫C6を担持する各群4〜5匹の動物に、尾の静脈から107のRVGL9ウイルスを注射した。ウイルス注射後20分、1時間、4時間、18時間および36時間、3日、5日および14日で動物を殺した。ウイルス静注後のいずれの時点でも、脳、膀胱または精巣から活性のあるウイルス粒子は回収されなかった。ウイルス注射後初期の時点では、脾臓、心臓および肺からいくらかのウイルス粒子が回収された。感染18時間後、これらの器官のRVGL9ウイルスの力価は低下した。18時間後、心臓組織においてウイルスは回収されず、脾臓および肺からは、ウイルス注射後それぞれ3221.0および3521.9PFU/g組織が回収されたのに対し、14日目では、それぞれ156.5および44PFU/g組織前後が回収された。肝臓および腎臓からのウイルス回収のパターンは、脾臓、心臓、または肺のパターンとは異なっていた。ウイルス注射後の初期の時点で、腎臓にウイルスはなく、肝臓からは174.9PFU/g組織のウイルスが回収された。ウイルス注射後5日目では、これらの器官のウイルス力価は上昇し、ウイルス注射後14日目で低下した。腫瘍組織では、ウイルスの検出はウイルス投与(1.6×103PFU/g組織)18時間後に始まり、観測中経時的に劇的に増加した(7日目では1.8×108PFU/g組織)。腫瘍組織のウイルスは、1回のウイルス静注の後、60日以上検出可能であった。これらの結果は、これらのワクシニア突然変異株の腫瘍特異的複製を証明するものである。ウイルス回収と腫瘍および器官における導入遺伝子の発現との間には相関が認められた。RVGL9ウイルス動態のデータをもとに、黒色腫および神経膠腫および乳癌モデルにおける種々のワクシニア突然変異株の組織分布研究にはそれぞれ10日または14日を用いた。
皮下神経膠腫を担持する免疫不全マウスにおいてワクシニアウイルスの組織分布を調べるため、C6ラット神経膠腫細胞移植後7日目に、ウイルスを1×107PFU/0.1ml/マウスの用量で静注した。ウイルス注射後14日目にマウスを殺し、種々の組織でウイルス力価を測定した。wt WRウイルスを注射したマウスはウイルスの病原性のために病状を示し、死に至った。従って、WRを注射したマウスはウイルス注射後7日目に殺した。野生型LIVPウイルスは脳からだけでなく、分析した全ての組織から回収された。wt LIVPを注射したマウスから回収されたウイルス粒子の量は、VVのwt WR株の場合よりもはるかに少なかった。これらの結果を表1Aに示す。
皮下GI−101Aヒト乳癌を有する免疫抑制マウスにおける組織分布のデータを表1Bに示す。
足蹠に黒色腫を担持する免疫応答性マウスにおけるVVの組織分布も研究した。B16F10黒色腫細胞移植後17日目のBL/6マウスに、尾の静脈から、107PFU/マウスの用量のウイルスを静注した。ウイルス注射後10日目に、PBSを注射した対照群で腫瘍の大きさが大きくなったため、全ての群のマウスを殺した。これらの結果を表1Cに示す。
b ウイルス注射後7日目にマウスを殺犠牲にした。
c PFU/20μl血清
d ウイルス注射後9日目にマウスを殺犠牲にした。
e 全ての供試組織でウイルスは回収されなかった。
組換えワクシニアウイルスRVGL7、RVGL9およびRVGL21による、ヌードマウスに移植したヒト乳癌の退縮
RVGL7およびRVGL9
図1Bはこれらの実験に用いた組換えワクシニアウイルス概略図を示す。RVGL7は、RVGL9の作製に関して記載したように作製した。RVGL7はEGFPおよびlacZをコードする核酸を含み、TK遺伝子に挿入されたpE/Lおよびp7.5レギュレーター領域を含む。
ヒトGI−101A乳癌細胞(5×106細胞/マウス)を、マウスの右大腿に皮下移植した。細胞移植後30日目に、ウミシイタケルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質の融合物を発現するNotI(F3)分断ウイルスRVGL9(RVGL9=rVV−RG=rVVruc−gfp)を、1×107PFU/マウスの用量で尾の静脈から静注した。ウイルス注射後9日目、すなわち、細胞移植後39日目に、GFPの蛍光画像およびルシフェラーゼ発現の低照度画像を採取したところ、ウイルスの蔓延が示された。
ヒトGI−101A乳癌細胞(5×106細胞/マウス)を、マウスの右大腿に皮下移植した。細胞移植後30日目に、マウスにRVGL7=rVV−GFT=TK−またはRVGL9−rVV−ruc−gfp=NotI(3)分断ウイルス(0.1ml中1×107PFU/マウス)およびPBS対照を静注した。GI−101A細胞移植後65日目、ウイルスまたはPBS注射後35日目に画像を撮った。これらの結果は、TK−またはNotI(F3)分断ワクシニアウイルスを注射したマウスにおける腫瘍体積が、PBSを注射したマウスの腫瘍に比べて著しく退縮していることを示す。
ヒトGI101A乳癌細胞(5×106細胞/マウス)を、マウスの右大腿に皮下移植した。細胞移植後30日目に、マウスにRVGL7=rVV−GFP=TK−またはRVGL9=rVV−RG−rVV−ruc−gfp−NotI(F3)分断ウイルス(0.1ml中1×107pfuPFU/マウス)を静注した。これらのデータは、TK−またはNotI(F3)分断ワクシニアウイルスを注射したマウスの腫瘍領域におけるGFPの発現を示す。マウス身体の他の部位ではGFPシグナルは見られなかった。これらの結果はまた、GFPの発現が、尾の静脈からウイルスを注射した後48時間といった早期に可視化できることを示した。ウイルス注射後16日目に極めて強いGFPシグナルが見られたが、これはそれぞれTK−またはNotI(F3)分断ウイルスに関して約1300〜1620mm3の腫瘍体積に相当するものであった。腫瘍体積の縮小によるGFPシグナルの低下は、25日目(TK−またはNotI(F3)分断ウイルスのそれぞれに関して1218〜1277mm3)および32日目(TK−またはNotI(F3)分断ウイルスのそれぞれに関して514〜887mm3)に見られた。
G1−101A乳癌細胞を5×106細胞/マウスの用量で、4〜5週齢の雌無胸腺(nu/nu)マウスの右大腿に皮下移植した。腫瘍移植後30日目、腫瘍体積が約500mm3に達した際に、単回量の(0.1ml中1×107PFU/マウス)のRVGL7=rVV−GFP=TK−またはRVGL9=rVV−RG=rVV−ruc−gfp=NotI(F3)分断ワクシニアウイルスまたはPBS対照を静注した(尾の静脈から)。1週間に2回、腫瘍の寸法をノギスで測定し、(L×H×W)/2[式中、L、HおよびWはそれぞれ、腫瘍の長さ、幅および高さを表す]で体積を算出し、mm3で表した。これらのデータは、TK−、NotI(F3)分断ワクシニアウイルスを注射したマウスにおける有意な(65日目で60〜80%)腫瘍の退縮を示す。これに対し、PBSを注射したマウスでは、腫瘍が極めて急速に増殖した。
wt LIVP、LIVP株の突然変異株である単一F3−、単一TK−、および二重F3−、TK−の1回静注で処置した免疫抑制マウスの100%で、皮下GI−101A乳癌の退縮が起こった。上記ウイルスで処置したマウスではある程度の毒性が見られた。三重欠損TK、F3およびHA遺伝子を有するRVGL21ウイルスはヌードマウスにおいて毒性を示さなかったことから、このウイルスを長期研究に用いた。三重突然変異RVGL21ウイルスを用いた場合の高用量処置と低用量処置の間の抗腫瘍活性および生存率の差は有意ではなかった。RVGL21を注射したマウスの腫瘍領域におけるGFPの発現をモニタリングした。マウス身体の他の部位ではGFPシグナルは見られなかった。GFPの発現は、尾の静脈からウイルスを注射した後48時間といった早期に可視化できる。ウイルス注射後16日目に、発明者らはGFPの極めて強いシグナルを観測したが、これは約1300〜1620mm3の腫瘍体積に相当するものであり、25日目(1218〜1277mm3)と32日目(514〜887mm3)に、腫瘍体積の縮小により、GFPシグナルが低下した。腫瘍体積の縮小はマウスの視診によっても明らかであった。
ワクシニアウイルスの毒性および毒力の軽減
マウス体重および生存率のモニタリングによるワクシニアウイルスの病原性の軽減
種々の皮下腫瘍を有する無胸腺および免疫応答性マウスにおいて、ウイルスの静脈投与後の体重変化率%を調べた。wt LIVPおよびwt WRおよびいくつかの突然変異株を107PFU/マウスの用量で尾の静脈から注射したところ、2週間の観察期間内で進行性のワクシニアウイルス感染が見られた。投与後1週間で、マウスは尾と足蹠に典型的な水疱形成を示した。その後、体重が減少し、口腔域の腫脹を伴う場合もあり、ひどい場合には、死に至った。VVのWR株の場合、マウスはウイルスの静注後7日目に脂肪が始まった。一方、組換えLIVPウイルスを受容しているマウスは、同じ期間中、体重が増加するか、同じ体重を維持した。
5×105/0.1ml/マウスの用量のラット神経膠腫C6細胞を、0日目にヌードマウス(5〜6週齢の雄マウス)に皮下移植した。7日目にワクシニアウイルスを1×107PFU/0.1ml/マウスの用量で静注した(尾の静脈から)。1週間に2回動物を秤量した。注射後14日目の体重の増/減をパーセンテージとして算出した:ウイルス注射日の体重−腫瘍重(g)/14日目の体重−腫瘍重(g)×100%。VGL(野生型ワクシニアウイルスLIVP株)およびRVGL5(HindIII−N−分断型)の注射はヌードマウスに毒性を生じ、マウスは体重減を続ける。組換えワクシニアウイルスRVGL5(HA分断型)、RVGL7(TK分断型)、RVGL8(NotI(F3)分断型)、RVGL19(二重、TK−およびNotI(F3)分断型)はヌードマウスにおける毒性が小さく、いくらかの体重減の後、感染後10日目にマウスは体重増加を始めた。
ワクシニアウイルス静注後の、皮下GI−101Aヒト乳癌を有する無胸腺マウスの体重変化をモニタリングした。wt WR株を注射したマウスは、ウイルスの毒性のため、体重の25.6%を失い、死に至った。wt LIVPウイルスを注射したマウスは長期間生存したが、マウスは体重の26.4%を失った。TK−WR株を注射したマウスは体重の17.8%を失ったが、TK−LIVPウイルスを注射したマウスは体重の1.9%増を示した。LIVP株の他の突然変異株を注射したマウスは全て安定しており、これらのマウスではウイルスに関連する毒性は見られなかった。
足蹠にマウスB16−F10黒色腫を担持する免疫応答性C57BL/6マウスにおけるワクシニアウイルスの毒性を研究した。試験中、全ての群のマウスが生存したが、wt WR株は、wt LIVPおよび組換え株よりも免疫応答性マウスにおいて毒性が高かった。wt WR株を注射したマウスは、ウイルスの静注後10日目に体重の約11.4%を失ったが、wt LIVP株ならびにその二重(RVGL20)および三重(RVGL21)突然変異株を注射したマウスはそれぞれ、体重の2.2%、1.3%、および0.6%を失ったに過ぎなかったのに対し、PBSを注射したマウスでは体重の7.1%減であった。RVGL2(TK−)、RVGL5(HA−)、RVGL9(F3−)、およびRVGL23(TK−WR株)を静脈投与したマウスは同じ期間に体重増を続けた。
長期生存に対する種々の突然変異の効果を調べるため、皮下GI−101Aヒト乳癌を担持するマウスに用量107のウイルスを静脈投与し、ウイルス感染後の生存率を観測した。これらの結果は、注射したウイルスによって生存率に違いがあることを示した。皮下乳癌を担持するヌードマウスにWR株を注射したところ(静注、1×107/マウス)、死亡率100%となり、5匹の打ち4匹のマウスがウイルス注射後9日目に死に至り、1匹が11日目に死に至った。LIVP株を注射したマウスは35日生存した。単一突然変異ウイルスRVGL9(F3−)を注射したマウスには毒性が表れ、ウイルス注射後34日目に25%のマウスが死に至ったが、LIVP株におけるF3遺伝子の欠損は、マウスの生存を57日まで引き延ばした。二重突然変異ウイルスRVGL20(F3−、TK−)を注射したマウスは、ウイルス注射後34日目に死に始めたが、F3を注射したマウスよりも長く生存した。RVGL20ウイルスを注射したマウスは65日目の時点で生存率50%を達成し、116日まで有意に長い生存期間を示した。LIVPウイルスの単一突然変異TK−ウイルスは、単一突然変異F3−ウイルスまたは二重突然変異F3−,TK−ウイルスよりも病原性が低く、TK−ウイルス注射後80日では全てのマウスが生存しており、14.3%のマウスが130日生存した。三重突然変異TK−、F3−、およびHA−ウイルス(RVGL21)を注射した全てのマウスが130日(試験期間)生存し、他群のマウスに比べてウイルス毒性の兆候なく生存を続けた。
免疫能力免疫応答性C57BL/6マウス
いくつかの群の動物が脾臓肥大を示したことから、相対的脾臓重(RSW)を算出した。これらの結果を次の通り表2に示す。
RSW=脾臓重(g)×104/(動物体重(g)−腫瘍重(g))
a p<02.02 腫瘍なしのLIVP、WR、RVGL23を除く全ての群に対して
b p<0.039 腫瘍なしのPBS、腫瘍なしのLIVP、RVGL5、WR、RVGL23に対して
c p<0.046 PBS、RVGL2、RVGL20、RVGL21を除く全ての群に対して
d p<0.006 腫瘍なしのLIVP、PBS、WR、RVGL23を除く全ての群に対して
e p<0.048 腫瘍なしのPBS、LIVP、RVGL2、WR、RVGL23を除く全ての群に対して
f p<0.045 PBS、RVGL2、RVGL21sを除く全ての群に対して
g p<0.035 PBS、LIVP、RVGL20、WR、RVGL23に対して
hp<0.049 腫瘍なしのLIVP、RVGL20、WR、RVGL23を除く全ての群に対して
i p<0.049 他の全ての群に対して
皮下神経膠腫を有するかまたは有さないヌードマウスでは、wt WRまたはWRのTK−ウイルスを注射したマウスはそれぞれ最低のRSW37.3または46.9を有し、これは腫瘍を持たず、PBSを注射したマウスのRSW(43.6)より小さかった。RVGL5(HA−)およびRVGL21(TK−、F3−、HA−)群ではそれぞれ最高のRSW143.8および114.が認められた。PBS注射群に比べ、wt LIVP、RVGL2、RVGL9、RVGL204を注射したマウス群の間で統計学的に有意な差は見られなかった。
皮下ヒト乳癌を担持する免疫抑制マウスにおけるRSWのこれらの結果は、wt LIVPおよびその突然変異株を注射した全てのマウスが、wt WRまたはTK−WRウイルスを注射したマウスに比べて肥大した脾臓を有することを示す(p<0.045)。最大の肥大は、LIVP株の単一HA−、単一F3−、二重F3−、TK−突然変異株を注射したマウスで見られた。
2匹のマウス#437および#458は、RVGL21注射後(それぞれ107および4×105を静注)190日を超えて生存し、疾病またはウイルスに関連する毒性の兆候もなかった。
腫瘍に対する生物の自己免疫を誘導するための微生物または細胞の使用
本実施例は、本明細書、および「腫瘍組織におけるポリペプチド、RNAまたは他の化合物の生産」に関する先行出願EP 03 018 478.2で提供される方法が、腫瘍組織に対する抗体の生産のためにも使用できることを示す。これらの抗体は担癌生物の自己免疫をもたらす。さらに、これらの抗体は単離して、他の生物体での腫瘍の処置にも使用できる。
サンプル:
1)マウス細胞溶解物(対照);
2)精製および変性させたワクシニアウイルス粒子;
3)GI−101A腫瘍細胞溶解物;
4)精製緑色蛍光タンパク質;
5)精製ルシフェラーゼタンパク質;
6)精製β−ガラクトシダーゼタンパク質
抗血清:
a)非腫瘍マウス由来の抗血清;
b)GI−101A腫瘍マウス由来の抗血清;
c)ワクシニア静注後14日目のGI−101A腫瘍マウス由来の抗血清;
d)ワクシニア静注後65日目のGI−101A腫瘍マウス由来の抗血清;
e)ワクシニア静注後80日目(GI−101A腫瘍排除後)の腫瘍フリーマウス由来の抗血清
担癌マウスにおける、ワクシニアウイルスにより送達されたlacZを介したβ−ガラクトシダーゼおよび抗β−ガラクトシダーゼの産生
35匹の無胸腺nu/nuマウス(5週齢、25g、雄)を用い、ゲノムに種々の欠損を有するワクシニアウイルス(LIVP株)の生体分布および腫瘍ターゲッティングを実証した。表1に示すように、マウスを各5匹の7群に分けた。
野生型ワクシニアウイルス(レポーター遺伝子もβ−ガラクトシダーゼ遺伝子も持たない)を注射した非腫瘍マウスならびに腫瘍マウスでは、器官、血液および腫瘍サンプルにおいてβ−ガラクトシダーゼの発現は検出されなかった。これに対し、β−ガラクトシダーゼ発現ウイルスに感染させたマウスの腫瘍では、抗レベルのβ−ガラクトシダーゼが発現した。また、表2に示されるように、β−ガラクトシダーゼは血液サンプルにおいても検出されたが、血液サンプルからウイルスは回収されなかった。
マウス血液中に存在するβ−ガラクトシダーゼの量が抗体産生を惹起するのに十分なものかどうかを決定するため、2匹のマウス(第5群のマウス#116と第6群の#119)から血清を採集し、ウエスタン分析でβ−ガラクトシダーゼに対する一次抗体に関して試験した。大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ(Roche, 567 779)を抗原標準として用い、マウスモノクローナル抗大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ(Sigma, G6282)を抗体陽性対照として用いた。β−ガラクトシダーゼのさらなる供給源として、MOI 1pfu/細胞でのRVGL7感染後24時間目のCV−1細胞から総タンパク質を得、#143と呼ばれるマウス(RVGL7で処置)から腫瘍タンパク質サンプルを得た。
腫瘍治療のための哺乳類細胞
本明細書で示されるように、ある種の細菌、ウイルス、および哺乳類細胞(BVMC)は、全身投与したとき、腫瘍に侵入し、選択的に複製する。従って、担癌生物において、全身注射した哺乳類細胞およびある種の細菌(サルモネラ菌、クロストリジウム腫、ビブリオ菌、大腸菌などの嫌気性菌)細胞はここでも固形腫瘍に侵入し、複製する。腫瘍の検出および治療には、遺伝的に標識した細胞を使用できる。BVMCターゲッティングを介した腫瘍での遺伝子発現の他、導入遺伝子と組織/腫瘍特異的プロモーターを連結することによっても腫瘍特異的な遺伝子発現が達成できる。腫瘍特異的遺伝子発現を得るためには、様々な体系的ターゲッティングスキームが使用できる。これらの戦略には、前立腺特異的プロモーターによって指示されるウイルス遺伝子発現など、特定の器官でのみ遺伝子発現を活性化させる組織/腫瘍特異的プロモーターの使用;細胞外マトリックス(すなわち、コラーゲン)標的化ウイルスベクターの使用;および抗体に向けられたウイルスベクターの使用が含まれる。腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター粒子、複製選択的HSV、ワクシニアウイルスおよびこのような他のウイルスなど、マーカー遺伝子または治療遺伝子のための腫瘍特異的送達ビヒクルとしての、条件により複製するウイルスも探索されている。
化膿連鎖球菌投与後に腫瘍の発達が阻害される
本実施例および以下の実施例は、腫瘍にコロニー形成させるための細菌細胞の使用;コロニー形成を定量するための細胞におけるリポーターの使用;腫瘍阻害のためのコロニー化弱毒細菌細胞の使用を実証するものである。細菌およびウイルスは同時投与するか、または逐次投与する。細菌の前にウイルスを投与すると、細菌による腫瘍内コロニー形成が高まる。プロドラッグを活性化する酵素を発現する細菌を投与し、それによりコロニー形成した細胞を標的化する。
化膿連鎖球菌M−タイプ1 T−タイプ1(ATCCカタログ番号700294)を細菌ルシフェラーゼ発現カセット(Lamberton GR, Pereau MJ, Illes K, Kelly IL, Chrisler J, Childers BJ, Oberg KC, Szalay AA. 2002. Construction and characterization of a bioluminescent Streptococcus pyogenes. Proceedings of the 12th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Case JF, Herring PJ, Robison BH, Haddock SHD, Kricka LJ, Stanley PE (eds). Chichester: Wiley, pp 85−88)を含むpDC123−luxFプラスミドで形質転換させた。ルシフェラーゼは外から加えたデカナールの存在下で検出することができる。
25週齢のマウスの右側大腿に皮下注射を行った。各マウスに、pLEIN由来レトロウイルス(Clontech;また、WO03/14380も参照)で形質転換した5×105 C6神経膠腫細胞を注射した。これらの皮下腫瘍を、細菌注射に先立ち、移植後7日間発達させた。
コレラ菌の腫瘍への局在
プラスミドおよび細菌株
弱毒コレラ菌Bengal2株血清型0139,M010 DattRS1を、luxCDABEカセット(Voisey et al. (1998) Biotechniques 24:56−58)を含むpLITE201で形質転換させた。形質転換株は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現のために発光株となる。
ヌードマウス群(n>20)に、本明細書の実施例に記載のように、C6神経膠腫(500mm3)を移植した。1×108の形質転換細菌(コレラ菌)を100μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁させた。この細菌懸濁液を各マウスの右後ろ脚に注射した。注射後、これらの動物を実施例Aに記載のように、低照度画像装置下でモニタリングした。
力価およびルシフェラーゼ活性
2種の各注射群からのマウスを注射後の各時点で殺した。腫瘍を摘出し、ホモジナイズした。細菌力価およびウイルス力価ならびにルシフェラーゼ活性を、本明細書の実施例に記載のように測定した。
コレラ菌の局在は本発明の実施例にウイルスに関して記載したようにして行った。要するに、CO2ガスで安楽死させた動物から器官および血液サンプルを単離した。器官を粉砕し、細菌力価の分析のため、クロラムフェニコール薬剤選択を伴う寒天プレートにプレーティングした。
細菌およびウイルスの同時投与および逐次投与
コレラ菌/pLITE(実施例B参照)およびワクシニアウイルスVV−TK−−gfp−lacZ(実施例4参照)を一緒に、または同時に投与した。C6神経膠腫を有するヌードマウス群に、下表に示されるように細菌および/またはウイルスを注射した。各群3匹の雄マウスに注射した。細菌および/またはウイルスは腫瘍移植後11日目と16日目に注射した。腫瘍増殖、ルシフェラーゼおよびGFP活性を、本明細書の実施例に記載されているようにモニタリングした。
21日目(腫瘍移植後21日)に動物を殺した。各動物から腫瘍を摘出し、粉砕した。第3群、4群および5群についてはウイルス力価をアッセイした。第1群、2群および5群については細菌力価をアッセイした。力価(コロニー形成単位およびプラーク形成単位)の測定は、これまでに実施例に記載したように行った。
PNP発現細菌およびプロドラッグの投与による腫瘍阻害
プラスミド pSOD−DeoDは、構成的SOD(スーパーオキシドジスムターゼ)プロモーターの制御下に、細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(PNP)(Sorcher et al. (1994) GeneTher. 1(4):223−238)を含む。プラスミドpSOD−DeoD−luxは、pSOD−DeoDに挿入されたluxCDABE発現カセット(Voisey et al. (1998) Biotechniques 24:56−58)を含む。
ヌードマウスに、pLEINレトロウイルス形質転換C6神経膠腫細胞を注射した。このpLEINレトロウイルスはウイルスプロモーターLTR(Clontech;また、WO03/14380も参照)の制御下でEGFPを発現する。細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌DH5αを、腫瘍移植後8日目に、プロドラッグ(6−メチルプリンデオキシリボース(6−MPDR))と一緒に、またはなしに注射した。その後の各時点で腫瘍体積をモニタリングした(これまでの実施例で行った通り)。
Claims (93)
- 修飾チミジンキナーゼ(TK)および/または修飾HA遺伝子、ならびに修飾F3遺伝子または中断されたF3遺伝子座を含む、組換えワクシニアウイルス。
- (a)F3遺伝子、ならびに(b)TK遺伝子および/またはHA遺伝子が不活性化されている、請求項1に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 少なくともF3遺伝子がその中への異種核酸の挿入により不活性化されている、請求項1または2に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 前記F3遺伝子および前記TK遺伝子が異種核酸の挿入により不活性化されている、請求項2に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 前記ワクシニアウイルスがLister株である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
- その株がLIVP株である、請求項5に記載の組換えウイルス。
- 前記F3遺伝子の修飾がF3遺伝子または相当する遺伝子座内のNotI部位にある、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 前記修飾が、ワクシニアウイルスLIVP株DNAのF3遺伝子の35番またはHindIII−F断片内の1475番にある、請求項7に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 前記TK、HAおよび/またはF3遺伝子が、タンパク質をコードする異種核酸の挿入を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 前記異種核酸が、タンパク質をコードする核酸と作動可能なように連結されている調節配列を含む、請求項8に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 前記調節配列がワクシニアウイルス初期/後期プロモーターp7.5を含む、請求項10に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 前記調節配列が初期/後期ワクシニアpE/Lプロモーターを含む、請求項10または11に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 前記異種核酸が、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導し得るタンパク質をコードする、請求項9〜12のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、腫瘍細胞。
- 医薬上許容されるビヒクル中に請求項1〜13のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、医薬組成物。
- 全身投与用に製剤されている、請求項16に記載の医薬組成物。
- 静脈内投与用に製剤されているか、または送達ビヒクル中に製剤されている、請求項11に記載の医薬組成物。
- 請求項16〜18のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む組成物;および
抗癌薬
を含む、組合せ。 - 前記抗癌薬が化学療法化合物である、請求項19に記載の組合せ。
- 前記抗癌薬が、アルキル化剤、代謝拮抗物質、プラチナ配位錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤および抗癌多糖類から選択される、請求項20に記載の組合せ。
- 前記抗癌薬が、ガンシクロビル、5−フルオロウラシル、6−メチルプリンデオキシリボシド、セファロスポリン−ドキソルビシン、4−[(2−クロロエチル)(2−メスロキシ(mesuloxy)エチル)アミノ]ベンゾイル−L−グルタミン酸、アセトミノフェン、インドール−3−酢酸、CB1954、7−エチル−10−[4−(1−ピペリジノ)−1−ピペリジノ]カルボニルオキシカンプトテシン、ビス−(2−クロロエチル)アミノ−4−ヒドロキシフェニルアミノメタノン28、1−クロロメチル−5−ヒドロキシ−1,2−ジヒドロ(dihyro)−3H−ベンズ[e]インドール、エピルビシン−グルクロニド、5’−デオキシ−5−フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、およびリナマリンから選択される、請求項19に記載の組合せ。
- 前記化合物およびウイルスが、2個の組成物中に別々にパッケージングされる、請求項19〜22のいずれか一項に記載の組合せ。
- 前記化合物およびウイルスが、単一の組成物としてパッケージングされる、請求項19〜22のいずれか一項に記載の組合せ。
- 動物において免疫特権細胞を排除するための方法であって、請求項16〜18のいずれか一項に記載の医薬組成物を動物に投与し、それにより、前記ウイルスが免疫特権細胞に集積することで、それらの細胞の排除またはそれらの数の減少をもたらす自己免疫を媒介することを含む、方法。
- 前記免疫特権細胞が腫瘍細胞である、請求項25に記載の方法。
- 免疫特権細胞または組織を排除するための、請求項16〜18のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
- ワクシニアの修飾TKおよびHA遺伝子、ならびに修飾F3遺伝子またはそのF3遺伝子に相当する遺伝子座を含む、組換えポックスウイルス。
- 遺伝子療法またはワクチン療法用の医薬組成物の製造のための、(a)請求項1〜13および28のいずれか一項に記載の組換えウイルス、または(b)修飾F3遺伝子、TK遺伝子またはHA遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの、使用。
- 前記遺伝子療法が癌遺伝子療法である、請求項29に記載の使用。
- 動物において免疫特権細胞または組織を排除するための薬剤の製剤を目的とした微生物の使用であって、
その微生物が免疫特権細胞に集積し;
その微生物が、免疫特権細胞または組織を含まない器官および組織には毒性レベルまで集積しない、使用。 - 癌の処置のための請求項19〜24のいずれか一項に記載の組合せの使用。
- 癌の処置のための薬剤の処方のための請求項19〜24の組合せの使用。
- ポリペプチドもしくはRNAまたは産物化合物の生産のための方法であって、
(a)そのポリペプチドもしくはRNAをコードする核酸を含むか、または産物として化合物を産生する微生物を担癌動物に投与すること;なお、
その微生物は免疫特権細胞に集積し;かつ
その微生物は、免疫特権細胞または組織を含まない器官および組織には毒性レベルまで集積しない;
(b)その動物から腫瘍組織を採取すること;そして
(c)その腫瘍からポリペプチドもしくはRNAまたは化合物を単離すること
を含む、方法。 - 前記微生物が真核細胞、原核細胞またはウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 前記微生物が細胞質内ウイルスまたは弱毒細菌である、請求項34または請求項35に記載の方法。
- 前記細菌が弱毒ビブリオ菌株、大腸菌株、リステリア菌株、サルモネラ菌株および連鎖球菌株の中から選択される、請求項36に記載の方法。
- 前記動物が非ヒト動物である、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
- ポリペプチド、RNA分子または細胞内化合物と、そのポリペプチド、RNA分子または化合物と特異的に反応する抗体とを同時に生産するための方法であって、
a)前記化合物、ポリペプチドまたはRNA分子を発現または産生する微生物を担癌動物に投与すること;そして
b)その動物の血清から抗体を単離すること
を含む、方法。 - ステップ(a)の後に
その動物から腫瘍組織を採取すること;そして
その腫瘍組織から前記ポリペプチド、RNA分子または細胞内化合物を単離すること
をさらに含む、請求項39に記載の方法。 - 前記動物が非ヒト動物である、請求項39または40に記載の方法。
- 前記微生物が細菌、哺乳類細胞またはウイルスである、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が免疫特権細胞に集積し;かつ
前記微生物が、免疫特権細胞または組織を含まない器官および組織には毒性レベルまで集積しない、
請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。 - 前記微生物がポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびシンドビスウイルスの中から選択されるウイルスである、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が細胞質内ウイルスまたは真核細胞である、請求項39〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が免疫細胞である、請求項45に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項46に記載の方法。
- 前記微生物が、レポーター遺伝子構築物をコードするDNA分子を含む、請求項34〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子構築物が、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導もしくは生成するタンパク質をコードする、請求項48に記載の方法。
- 前記タンパク質がルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質である、請求項49に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子構築物が生物発光生成系をコードし、さらに所望により蛍光タンパク質をコードする、請求項48に記載の方法。
- 前記微生物が哺乳類細胞である、請求項34〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が細菌細胞である、請求項34〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がウイルスである、請求項34〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項54に記載の方法。
- 前記ワクシニアウイルスがLIVP株である、請求項55に記載の方法。
- 前記細菌が弱毒コレラ菌である、請求項53に記載の方法。
- 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項34〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 動物において免疫特権細胞または組織を排除するための方法であって、
少なくとも2種の微生物を投与することを含み、それらの微生物は同時に、逐次にまたは間欠的に投与され、それらの微生物が免疫特権細胞に集積し、それによりその動物が免疫特権細胞または組織に対して自己免疫化される、方法。 - 前記免疫特権細胞または組織が腫瘍細胞を含む、請求項59に記載の方法。
- 免疫特権細胞または組織の排除のための薬剤の製剤を目的とした少なくとも2種の微生物の使用であって、
それらの微生物が免疫特権細胞に集積し、それによりその動物が免疫特権細胞または組織に対して自己免疫化される、使用;および
少なくとも1種の微生物が請求項1〜14および22のいずれかに記載の組換えウイルスである、使用。 - 前記免疫特権細胞または組織が腫瘍細胞を含む、請求項61に記載の使用。
- 免疫特権細胞または組織の排除のために動物に投与することを目的に製剤された少なくとも2種の微生物を含む組合せであって、微生物の1種が、請求項1〜13および22のいずれか一項に記載の組換えウイルスである、組合せ。
- 前記免疫特権細胞または組織が腫瘍細胞を含む、請求項63に記載の組合せ。
- 前記微生物が個別の組成物として製剤される、請求項63に記載の組合せ。
- 各微生物が単位投与形として製剤およびパッケージングされる組成物中に含まれる、請求項63〜65のいずれか一項に記載の組合せを含むキット。
- 免疫特権組織または細胞において異種核酸によりコードされる産物に対する抗体の生産のための方法であって、
(a)選択されたタンパク質またはRNAをコードする核酸を含む微生物を、免疫特権組織または細胞を含む動物に投与すること;そして
(b)動物の血液または血清から、そのタンパク質またはRNAに対する抗体を単離すること
を含む、方法。 - 前記動物が非ヒト動物である、請求項67に記載の方法。
- 前記動物がヒト動物である、請求項67に記載の方法。
- 前記免疫特権組織または細胞が腫瘍細胞を含む、請求項67〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫特権組織において産生される産物が腫瘍抗原を含む、請求項67〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が真核細胞、細菌またはウイルスである、請求項47〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が哺乳類細胞である、請求項67〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が弱毒細胞質内ウイルスである、請求項67〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が弱毒ポックスウイルスである、請求項67〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がワクシニアウイルスである、請求項67〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスがLister株である、請求項76に記載の方法。
- 前記ウイルスがLIVP株である、請求項77に記載の方法。
- 前記ウイルスがLIVP(配列番号34)のF3遺伝子またはF3遺伝子座に相当する遺伝子座において挿入を含む、請求項74〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 被験体において免疫特権細胞または組織の増殖を阻害する方法であって、
(a)被験体に、検出可能な遺伝子産物をコードする修飾微生物(その修飾微生物は、免疫特権組織または細胞に集積する)を投与すること;
(b)被験体に、その微生物の病原性を軽減する治療物質を投与すること;
(c)被験体における検出可能な遺伝子産物の存在を、その検出可能な遺伝子産物が実質的に被験体の免疫特権組織または細胞だけに存在するようになるまでモニタリングすること;そして
(d)治療化合物の投与を終了または中止し、それにより微生物が病原性を増し、免疫特権細胞または組織の増殖が阻害されること
を含む、方法。 - 免疫特権細胞または組織の増殖が、免疫特権細胞に対する免疫応答を誘導または増強することにより阻害される、請求項80に記載の方法。
- 前記治療化合物が、細胞溶解またはアポトーシスをもたらす微生物によりコードされている1以上の遺伝子の発現を低下させる、請求項80に記載の方法。
- 動物に請求項1〜13のいずれか一項に記載のワクシニアウイルスを投与することを含む、動物において、免疫特権細胞または組織を排除するための治療方法であって、
そのワクシニアウイルスが免疫特権細胞に集積し、非罹患器官および組織には集積せず、そして動物において毒性が低く、結果として免疫特権細胞において細胞膜の漏出をもたらし、それにより、その動物がそれらの細胞またはそれらの細胞の産物に対する自己抗体を産生する、方法。 - 前記非罹患器官が卵巣または精巣を含む、請求項83に記載の方法。
- 前記免疫特権細胞または組織が腫瘍細胞を含む、請求項83または請求項84に記載の方法。
- 前記ワクシニアウイルスがLIVP株である、請求項83〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ワクシニアウイルスが治療産物を含むかまたは発現する、請求項83に記載の方法。
- 前記ワクシニアウイルスが治療産物をコードする核酸を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記自己抗体が抗腫瘍抗体を含む、請求項83〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 癌を処置するための請求項19〜24のいずれか一項に記載の組合せの使用。
- 癌を処置するための薬剤の製剤のための請求項19〜24に記載の組合せの使用。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、ワクチン。
- 天然痘に対する予防接種のための請求項92に記載のワクチンの使用。
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