CN114540521B - 具有降糖降脂功效的植物乳杆菌84-3特异性分子靶标及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有降糖降脂功效的植物乳杆菌84‑3特异性分子靶标及其检测方法。用于检测植物乳杆菌或植物乳杆菌84‑3的特异性分子靶标，其特征在于，所述的用于检测植物乳杆菌的特异性分子靶标是如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述的用于植物乳杆菌84‑3的特异性分子靶标是如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本发明的检测方法所需时间短，只需将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳即可准确知道样品中是否有植物乳杆菌种及植物乳杆菌84‑3菌株，降低了检测成本。本发明是针对植物乳杆菌种及植物乳杆菌84‑3的菌株的特异性检测靶标，能将植物乳杆菌从乳酸菌属中区分出来，能够将菌株植物乳杆菌84‑3从植物乳杆菌属中区分出来，是一种新的检测方法。

Description

具有降糖降脂功效的植物乳杆菌84-3特异性分子靶标及其检 测方法

技术领域：

本发明属于微生物检验技术领域，具体涉及具有降糖降脂功效的植物乳杆菌84-3特异性分子靶标及其检测方法。

背景技术：

在发酵食品中最常用的菌株是乳酸菌，近年来，植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)等乳酸菌通常作为发酵食品中的发酵剂。尤其值得一提的是，植物乳杆菌作为一种最常见的益生菌已被广泛研究并安全地应用于各种发酵制品中。另外，益生菌的生长特性及其功能特性是具有菌株特异性的。因此，将目标菌株与同一物种的其他菌株中区分开是至关重要的。

虽然表型性状最初被用来识别乳酸菌，但目前存在很多方法已经被开发用于这些细菌的鉴定。目前常用的方法可能是基于DNA分析、蛋白质谱和代谢谱，但与代谢谱和蛋白质谱相比，细菌DNA更加稳定，易于提取，可通过PCR、测序和酶切处理。目前，DNA分析方法多种多样，这些方法主要包括染色体DNA限制性内切酶分析/脉冲场凝胶电泳技术(RFLP/PFGE)、扩增选定基因组区域限制性内切分析(ARDRA)、重复序列扩增(Rep-PCR)、随机序列扩增(RAPD-PCR)、扩增片段长度多态性分析(AFLP)等。然而，PFGE、AFLP和核糖体基因分型耗时较长，需要专业的和先进的软硬件设备，而RAPD重复性较低。同时，DNA指纹分型方法不适用于工业生产中频繁的检测。相反，PCR鉴定可以直接使用从混合细菌群体中分离的DNA，而不需要培养步骤，也不需要先进的软硬件，且在菌种和亚种水平上，大多数乳酸菌都可以通过PCR被鉴定出来。菌株特异性水平的PCR鉴定的关键在于菌株特异性序列的挖掘和菌株特异性引物对的设计。

随着微生物全基因组测序技术的发展，基于全基因组序列比对分析，获得特异性分子检测靶标，可以开发简单快速、廉价高效、高灵敏可靠的PCR鉴定技术。本发明基于比较基因组学分析，获得一段目标序列，并设计专用引物进行特异性验证，将其作为植物乳杆菌84-3种属和植物乳杆菌84-3菌株鉴定的特异性分子靶标，以开发一种快速、经济、易于执行的方法来鉴定植物乳杆菌种和植物乳杆菌84-3菌株。

发明内容：

本发明旨在针对现有技术中植物乳杆菌种和植物乳杆菌84-3菌株检测所需时间过长，专业技能要求高，重复性低，检测成本过高，操作复杂等缺点，提供用于鉴别植物乳杆菌种和植物乳杆菌84-3菌株的特异性检测靶标及其相应的PCR检测方法。另外本发明是针对植物乳杆菌种和植物乳杆菌84-3菌株的特异性分子检测靶标，能将植物乳杆菌从乳酸菌属中区分出来，能够将菌株植物乳杆菌84-3从植物乳杆菌属中区分出来。

本发明的目的通过下述技术方案实现：为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测植物乳杆菌或植物乳杆菌84-3的特异性分子靶标，所述的用于检测植物乳杆菌的特异性分子靶标是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述的用于检测植物乳杆菌84-3的特异性分子靶标是如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述特异性分子靶标在检测植物乳杆菌种和/或植物乳杆菌84-3中的应用，例如在含有植物乳杆菌种和/或植物乳杆菌84-3的功能食品及乳酸菌制品中的应用。

本发明还提供检测植物乳杆菌和/或植物乳杆菌84-3的引物组，检测植物乳杆菌的特异性分子靶标的引物为：正向引物145F：5'-ACGCCCAACTTTCCGTTGTA-3'和反向引物145R：5'-CGACCGCACTATGGATGTGT-3'；所述的检测植物乳杆菌84-3的特异性分子靶标的正向引物175F：5'-AGAGTTACGGCAGTTCAAAACA-3'，反向引物175R：5'-ATCATCGTCGCCATCTCCT-3'。

本发明还提供一种检测植物乳杆菌和/或植物乳杆菌84-3的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测微生物的DNA，以提取的DNA为模板，采用上述引物对其进行PCR扩增；

(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现大小145bp和175bp的条带则判定样品中分别含有植物乳杆菌和植物乳杆菌84-3，若电泳结果未出现目标大小的条带则判定样品中不含有植物乳杆菌和植物乳杆菌84-3。

优选地，所述PCR扩增，其反应体系为25μl，其中包括：2×Taq PCR MasterMixⅡ12.5μl、正向引物和反向引物各1μl、DNA模板1μl和无菌双蒸水9.5μl。

优选地，当检测植物乳杆菌时，其PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，68.5℃退火30s，72℃延伸30s，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。

优选地，当检测植物乳杆菌84-3时，其PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。

优选地，植物乳杆菌和植物乳杆菌84-3进行实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μl，其中包括：2×RealUniversal PreMix预混液10μl,50×ROX Reference Dye 0.4μl，正向引物和反向引物各0.6μl、DNA模板1μl和无菌双蒸水7.4μl。

优选地，植物乳杆菌和植物乳杆菌84-3进行实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性5s，60.0℃退火30s，72℃延伸10s，2-4步共40个循环；最后72℃延伸10min。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明的检测方法所需时间短，只需将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳即可准确知道样品中是否有植物乳杆菌种及植物乳杆菌84-3菌株，降低了检测成本；本发明是基于全基因组测序数据，通过泛基因分析得到的植物乳杆菌种及植物乳杆菌84-3的菌株特异性靶标，检测结果更为可靠；同时本发明是针对植物乳杆菌种及植物乳杆菌84-3的菌株的特异性检测靶标，能将植物乳杆菌从乳酸菌属中区分出来，能够将菌株植物乳杆菌84-3从植物乳杆菌属中区分出来，是一种新的检测方法。

Lactobacillusplantarum 84-3于2021年9月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：61965。

附图说明

图1为本发明所述的植物乳杆菌84-3益生特性的测定(耐酸性实验、耐胆盐实验、对模拟胃肠道耐受性实验)；

图2为本发明所述的各组大鼠初始体重及最终体重；

图3为本发明所述的各组大鼠造模后10天空腹血糖，造模成功后空腹血糖的变化及结束时空腹血糖；

图4为本发明所述的各组大鼠葡萄糖耐量OGTT、曲线下面积AUC、血清胰岛素、糖化血红蛋白和胰高血糖素水平；

图5为本发明所述的各组大鼠血糖相关指标(GLP-1含量、DPP-IV和α葡萄糖苷酶酶活)；

图6为本发明所述的各组大鼠血脂四项水平(TC、TG、HDL-C和LDL-C)；

图7为本发明所述的各组大鼠脂肪细胞因子水平(瘦素和脂联素)；

图8为本发明所述的各组大鼠炎症因子水平(IL-6，IL-10，TNF-α，CRP和内毒素)；

图9为本发明所述的各组大鼠肝脏和胰腺组织病理切片观察；

图10为本发明所述的各组大鼠血清氨基酸组成(芳香族氨基酸、支链氨基酸和Fisher比值)；图11为本发明所述的各组大鼠结肠粪便中短链脂肪酸的含量(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和总酸)；

图12为使用本发明植物乳杆菌种的分子靶标对47株植物乳杆菌进行检测其结果示意图(图中标号C为空白对照，1-47均为植物乳杆菌，目标条带大小为145bp)。

图13为使用本发明植物乳杆菌种的分子靶标对非植物乳杆菌种进行检测其结果示意图(图中标号+为植物乳杆菌，标号C为空白对照，其余均为非植物乳杆菌的其他乳酸菌，目标条带大小为145bp)。

图14为使用本发明植物乳杆菌84-3菌株的分子靶标对41株植物乳杆菌进行检测其结果示意图(图中标号+为植物乳杆菌84-3，标号C为空白对照，其余均为植物乳杆菌的其他菌株，目标条带大小为175bp)。

图15为使用本发明植物乳杆菌84-3的分子靶标对非植物乳杆菌84-3进行检测其结果示意图(图中标号+为植物乳杆菌84-3，标号C为空白对照，其余均为非植物乳杆菌的其他菌株，目标条带大小为175bp)

图16为使用本发明植物乳杆菌种实时荧光定量PCR标准曲线

图17为使用本发明植物乳杆菌84-3实时荧光定量PCR标准曲线

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1植物乳杆菌84-3益生特性的测定

参考王芬等的方法进行植物乳杆菌84-3耐酸性、耐胆盐和模拟胃肠液耐受性实验。将植物乳杆菌84-3以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体分别重悬于pH值为3.0的MRS肉汤培养基、含2％胆盐(pH8.0)的无菌去离子水、人工模拟的胃液(pH2.0)、人工模拟的肠液(pH8.0)中，调节菌液浓度至1×10⁹cfu/mL。然后于37℃分别孵育3h，24h，3h，24h，收集菌液，进行活菌计数。耐受性的计算公式如下：

存活率(％)＝logN₁/logN₀*100

注：N₁:经pH＝3.0处理以后的活菌数；N₀经pH＝6.4(正常)MRS肉汤培养基中的活菌数

如图1所示，植物乳杆菌84-3在pH3.0的酸性条件下，在含2％胆盐的无菌去离子水中、在人工模拟的胃液(pH2.0)中、在人工模拟的肠液(pH 8.0)中，培养3h，24h，3h，24h后，均表现出了很高的存活率，分别为91.4％、73.5％、61.6％和82.1％。

实施例2 2型糖尿病模型大鼠的建立及分组设计

(1)菌液的制备。将活化3次后的细菌悬液(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)在4℃6000r/min离心10min，用灭菌磷酸盐缓冲液(pH 6.8)清洗3次菌体，然后将细菌的浓度调整至1*10⁹CFU/mL用于后续实验。

(2)2型糖尿病模型大鼠的建立。实验动物：4-5周龄的雄性SPF级Wistar大鼠(108-116g)，饲养于广东省科学院微生物研究所动物房(伦理审查编号：GT-IACUC202006014)，采用12h/12h的明暗交替环境，且温度和湿度适宜，自由摄食和饮水。适应性饲养1周后进行正式实验，根据大鼠体重，利用随机数表法进行分组。其中，2型糖尿病造模方法：高糖高脂结合低剂量链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导。所用高糖高脂饲料：购自北京华阜康生物科技股份有限公司，编号：KK鼠料1042。

(3)动物实验分组。1)正常组(Normal Control，NC组)：普通基础维持饲料饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重生理盐水4周，第五周腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液(0.1mmol/L，pH 4.4)，第5-13周每天灌胃1mL/100g体重生理盐水直至实验结束。2)模型组(DiabeticControl，DC组)：高脂高糖饲料饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重生理盐水4周，第五周腹腔注射35mg/kg STZ，第5-13周每天灌胃1mL/100g体重生理盐水直至实验结束。3)阿卡波糖组(Acarbose，Acar组)：高脂高糖饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重50mg/kg的阿卡波糖4周，第五周腹腔注射35mg/kg STZ(链脲佐菌素)，第5-13周每天灌胃1mL/100g体重50mg/kg的阿卡波糖直至实验结束。4)鼠里糖乳杆菌(LGG组)：高脂高糖饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重1*10⁹CFU/mL 4周，第五周腹腔注射35mg/kg体重STZ，第5-13周每天灌胃1mL/100g体重1*10⁹CFU/mL鼠里糖乳杆菌菌液，直至实验结束。5)植物乳杆菌(84-3组)：高脂高糖饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重1*10⁹CFU/mL 4周，第五周腹腔注射35mg/kg体重STZ，第5-13周每天灌胃1mL/100g体重1*10⁹CFU/mL植物乳杆菌84-3菌液，直至实验结束。

实施例3大鼠结肠粪便、组织样本的收集

在实验的最后一天，大鼠禁食12h(正常饮水)，将舒泰50以100uL/100g体重的剂量肌肉注射麻醉下心脏取血，静置2小时后，离心取上清得到血清(3500r/min，15min)，带回实验室放置在-80℃冰箱用于后续生理生化、炎症因子指标和氨基酸组成的检测。实验大鼠取血后，收集肝脏、胰腺和小肠，将各组织分装，一部分组织切块放在提前准备好的甲醛试剂中固定，用于组织病理切片观察，其余的组织液氮速冻，干冰运输至实验室，-80℃冰箱保藏用于后续生理生化指标分析。收集结肠内容物，用于短链脂肪酸的测定。

实施例4大鼠体重、血糖、血脂及炎症因子检测分析

(1)大鼠体重变化的测定，记录初始体重，最终体重。从图2(A)可看出，各组的初始体重组间无差异(P>0.05)。实验结束时正常组(NC)大鼠的最终体重和体重变化显著高于模型组(DC)，且模型组(DC)与正常组(NC)相比，显著降低了14％。经植物乳杆菌84-3处理后，可以改善糖尿病大鼠体重下降的趋势，然而，见图2(B)，植物乳杆菌84-3干预后大鼠最终体重与模型组(DC)之间相比无显著性差异(P>0.05)，我们推测是由于植物乳杆菌84-3的干预时间还不够长。

(2)大鼠空腹血糖的测定。造模成功后每周测定一次空腹血糖，通过尾尖取血。从图3(A)可看出，大鼠腹腔注射STZ 10天后，除正常组(NC)外，其余各组的空腹血糖平均水平均高于7.0mmol/L，研究表明空腹血糖>7.0mmol/L，就代表2型糖尿病造模成功，因此，本研究2型糖尿病大鼠模型造模成功，可用于后续进一步的研究。同时，结果显示，模型组(DC)的空腹血糖水平显著高于其他各组(P<0.05)，且植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG组均可显著抑制大鼠的空腹血糖升高(P<0.05)，且植物乳杆菌84-3降低空腹血糖的能力更强，其降血糖潜力有待进一步研究。同时，我们可以发现，糖尿病组的空腹血糖水平在STZ注射后7-12周期间均显著高于正常组(NC)(P<0.05)图3(B)。第9周开始，植物乳杆菌84-3、鼠里糖乳杆菌LGG和阿卡波糖ACAR组的空腹血糖呈现下降的趋势，说明随着乳酸菌干预时间的延长，2型糖尿病大鼠的空腹血糖可以得到不同程度的改善。在第11周时，植物乳杆菌84-3的空腹血糖水平降到最低，其中，植物乳杆菌84-3显著低于鼠里糖乳杆菌LGG(P<0.05)，与阿卡波糖组无显著性差异(P>0.05)，如图3(C)，直到实验结束时都维持在比鼠里糖乳杆菌血糖低的水平。

(3)大鼠口服葡萄糖耐量实验的测定。第12周，2g/kg葡萄糖溶液给大鼠灌胃，在灌胃前(0min)和灌胃后(30min，60min，90min，120min)测定血糖，利用GraphPadPrism软件计算曲线下面积(Area under curve，AUC)，评估大鼠的口服葡萄糖耐量(oral glucosetolerance test，OGTT)。从图4(A)可看出，正常组(NC)的血糖值变化不大，糖耐受性依然保持平稳。与正常组(NC)相比，糖尿病组各时间点血糖浓度显著高于正常组，且模型组(DC)的血糖浓度在2个小时内基本不变，稳定在最高水平，说明模型组(DC)大鼠的糖耐受性严重受损。结果也显示，乳酸菌组和阿卡波糖组在30min时血糖浓度最高，之后持续降低。与模型组(DC)相比，乳酸菌组和阿卡波糖组降低了血糖值(P<0.05)，尤其是植物乳杆菌84-3的血糖值和耐受性与阿卡波糖ACAR无显著性差异(P>0.05)，接近于正常组(NC)。同样，我们从图4(B)，模型组(DC)AUC葡萄糖值明显高于其他各组，与模型组(DC)相比，乳酸菌组(植物乳杆菌84-3，鼠里糖乳杆菌LGG)大鼠对葡萄糖的反应和对高糖水平的调节能力均增强，显著降低了糖尿病的AUC葡萄糖值(P<0.05)，说明植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG对2型糖尿病大鼠的糖耐量具有显著改善作用，防止高血糖的发生。

(4)大鼠血清HbA1c、胰岛素和GC的测定。利用ELISA试剂盒(Dogesce)测定血清胰岛素、胰高血糖素(Glucagon，GC)和HbA1c含量，具体操作按照说明书进行。实验结束时各组大鼠血清中胰岛素和胰高血糖素的含量如图4(C)(D)所示，乳酸菌组(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)的胰岛素的含量比模型组(DC)含量均有显著升高(P<0.05)，且乳酸菌各组之间无显著性差异(P>0.05)，这可能是由于胰岛素敏感性的提高。另外，各乳酸菌组和药物组的胰高血糖素水平均呈不同程度的下降趋势，其中，植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG组的胰高血糖素的含量比模型组(DC)含量均显著降低(P<0.05)，特别是植物乳杆菌84-3，其胰高血糖素的含量与正常组(NC)相比无显著性差异(P>0.05)，说明植物乳杆菌84-3改善了胰高血糖素症。另外，实验结束时各组大鼠血清中HbA1c的含量如图4(E)所示，模型组(DC)的HbA1c与正常组(NC)相比，显著升高(P<0.05)。与模型组(DC)相比，乳酸菌组和药物组的HbA1c的含量显著降低(P<0.05)。值得注意的是，植物乳杆菌84-3的HbA1c含量显著低于鼠里糖乳杆菌LGG和阿卡波糖ACAR组(P<0.05)。

(5)大鼠血清GLP-1含量、肝脏DPP-IV和小肠中α葡萄糖苷酶酶活的测定。利用ELISA试剂盒(Dogesce)测定血清GLP-1含量和肝脏中二肽激肽酶(Dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)和小肠中α葡萄糖苷酶酶活，具体操作按照说明书进行。实验结束时各组大鼠肝脏中DPP-IV活性如图5(A)所示，模型组(DC)的DPP-IV活性比正常组(NC)显著升高(P<0.05)。阿卡波糖ACAR组与模型组(DC)相比无显著性差异(P>0.05)。植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG的DPP-IV活性与正常组(NC)相比无显著差异(P>0.05)，说明大鼠肝脏DPP-IV的活性已恢复至正常水平，且植物乳杆菌84-3的DPP-IV的活性最低。由以上结果可知，模型组(DC)的DPP-IV活性有所增加，喂食植物乳杆菌84-3后可以有效降低DPP-IV活性，说明植物乳杆菌84-3可能是通过降低糖尿病大鼠的DPP-IV活性来达到有效调节血糖的作用。同时，我们发现，实验结束时各组大鼠小肠中α葡萄糖苷酶活性如图5(B)所示，模型组(DC)的α-葡萄糖苷酶活性比正常组(NC)显著升高(P<0.05)。鼠里糖乳杆菌LGG与模型组(DC)相比无显著性差异(P>0.05)。植物乳杆菌84-3和阿卡波糖ACAR组的α-葡萄糖苷酶活性与正常组(NC)相比无显著差异(P>0.05)，说明大鼠小肠α-葡萄糖苷酶的活性已恢复至正常水平，植物乳杆菌84-3对糖尿病大鼠的α-葡萄糖苷酶有较好的调节作用。另外，我们从5(C)实验结束时各组大鼠血清中的GLP-1含量。模型组(DC)的GLP-1含量较正常组(NC)显著降低(P<0.05)，其余各组与模型组(DC)相比，其GLP-1含量都有所增加(P<0.05)，但鼠里糖乳杆菌84-3和阿卡波糖ACAR组之间无显著性差异(P>0.05)；植物乳杆菌84-3的GLP-1含量与其它组相比显著增加(P<0.05)。这些结果表明，植物乳杆菌84-3可能是通过改变GLP-1的合成速率来刺激糖尿病大鼠胰岛素分泌和降低血糖，其具体机制有待于我们进一步探索。

(6)大鼠血清脂质四项指标的测定。利用全自动生化分析仪测定血清中TC，TG，HDL-C和LDL-C的含量。实验结束时各组大鼠血清中的血脂含量见图6。糖尿病模型组(DC)大鼠显著升高了TC、TG和LDL-C的浓度(P<0.05)，乳酸菌组(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)和阳性对照药物组阿卡波糖ACAR组的TC，TG和LDL-C含量均下降至正常水平且略高于正常组，特别是，植物乳杆菌84-3显著降低了TC和LDL-C(P<0.05)。然而，除鼠里糖乳杆菌LGG组外，模型组(DC)组大鼠的HDL-C水平高于植物乳杆菌84-3，但无显著性差异(P>0.05)，鼠里糖乳杆菌LGG组的HDL-C水平高于植物乳杆菌84-3(P<0.05)。本研究结果表明，乳酸菌具有保护大鼠血脂发生异常的功能，特别是植物乳杆菌84-3可显著降低血脂水平并恢复至正常水平。

(7)大鼠血清中瘦素和脂联素的测定。利用ELISA试剂盒(Dogesce)测定血清中瘦素和脂联素含量，具体操作按照说明书进行。实验结束时各组大鼠血清中的瘦素水平如图7(A)所示，模型组(DC)的瘦素水平比正常组(NC)显著增加(P<0.05)。乳酸菌组与模型组(DC)相比显著降低(P<0.05)，乳酸菌组(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)之间无显著性差异(P>0.05)，说明喂食乳酸菌后可以降低瘦素水平。另外，实验结束时各组大鼠血清中的脂联素水平如图7(B)所示，模型组(DC)脂联素水平比正常组(NC)显著降低(P<0.05)，而乳酸菌组和药物组与模型组(DC)相比，显著升高，说明大鼠体内脂联素水平已恢复，接近正常水平。其中，植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG的脂联素水平显著高于药物组阿卡波糖ACAR组(P<0.05)，且植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG之间无显著性差异(P>0.05)，以上结果表明，植物乳杆菌84-3对糖尿病大鼠的脂肪因子有较好的调节作用。

(8)大鼠血清中炎症因子的测定。利用ELISA试剂盒(Dogesce)测定血清中炎症因子(C反应蛋白、内毒素、TNF-α、IL-6和IL-10)含量，具体操作按照说明书进行。实验结束时各组大鼠血清中的炎症因子水平如图8所示，模型组(DC)的CRP、内毒素、TNF-α和IL-6水平比正常组(NC)显著升高，IL-10显著降低(P<0.05)。乳酸菌组(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)与模型组(DC)相比CRP、内毒素、TNF-α和IL-6水平显著降低(P<0.05)，IL-10水平升高，说明大鼠体内促炎因子的含量已恢复至正常水平，且增加抗炎因子水平。特别是植物乳杆菌84-3降低C反应蛋白、内毒素、TNF-α和IL-6的水平最多，也显著增加IL-10的水平。由以上结果可知，模型组(DC)的促炎因子都有所增加，喂食乳酸菌后可以有效降低促炎因子水平，尤其是植物乳杆菌84-3对糖尿病大鼠的炎症因子有很好的改善作用。我们推测因乳酸菌的喂食导致肠道中有益菌群的增加，使得体内的内毒素水平有所降低，从而缓解了2型糖尿病大鼠的症状。

(9)大鼠肝脏和胰腺组织病理切片。肝脏、胰腺和小肠H&E染色送广东省科学院微生物研究所分析检测中心进行分析。显微镜下观察，如图9(A)，为大鼠肝脏组织形态结构比较结果。正常组(NC)大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈单行放射状排列；而2型糖尿病模型组(DC)大鼠的肝细胞排列无规则，脂肪变性，形成脂肪空泡；而药物阿卡波糖ACAR，乳酸菌(鼠里糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌84-3)预防组大鼠肝脏形态结构得到不同程度的改善，我们可以看出干预组各组肝细胞排列较整齐，以中央静脉为中心呈现放射状排列，通过减少脂肪泡的大小和数量显著抑制肝脏脂肪变性的形成。胰腺组织结构如图9(B)所示，正常组(NC)大鼠胰岛细胞组织结构完整，排列有序，且胰岛与外分泌腺之间边界清晰。而糖尿病模型组(DC)胰岛细胞受到明显的损伤，且胰岛边缘与外部组织不清晰，胰岛萎缩，形态结构极不完整，胰岛细胞数量减少。与模型组(DC)相比，阿卡波糖ACAR和乳酸菌干预组胰腺组织结构均有明显恢复，可明显逆转胰腺异常组织病理改变，且植物乳杆菌84-3的胰腺组织结构恢复更佳。总的来说，益生乳酸菌可明显改善肝脏、胰腺组织学的变化。

实施例5大鼠血清氨基酸组成分析

血清样本前处理：从-80℃冰箱取出血清样本并在4℃冰箱中解冻，然后取出在12000r/min，15min离心，取上清加入等体积的8％的5-磺基水杨酸静置30min，12000r/min，15min离心，取上清，放置于进样瓶中，待上机检测，上机条件和检测条件见表1和2。上机条件：

表1上机条件

检测条件：

表2检测条件

Fisher比值＝支链氨基酸(缬氨酸+亮氨酸+异亮氨酸)/芳香族氨基酸(苯丙氨酸+酪氨酸+色氨酸)*100％

其中，Fisher比值正常范围在2.69～3.85之间

实验结束时各组大鼠血清中氨基酸的含量如图10，从我们的结果可以看出，与正常组(NC)相比，糖尿病模型组(DC)大鼠支链氨基酸水平和Fischer比值显著增加(P＜0.05)，而芳香族氨基酸水平显著降低(P＜0.05)，而经植物乳杆菌84-3干预后可显著降低支链氨基酸水平，显著降低了Fischer比值。以上结果表明，经喂食乳酸菌后，部分氨基酸可恢复至正常水平，对于乳酸菌对氨基酸的改善机制还有待于我们进一步研究，特别是涉及氨基酸的代谢通路的研究，因此，后期有必要利用组学技术阐明乳酸菌是如何通过改善氨基酸的表达来达到降糖降脂功效的。

实施例6大鼠结肠粪便中短链脂肪酸谱的测定

样本预处理：结肠粪便样本(50mg)加入500μL 0.001％硫酸，均质，室温放置5min，13000r/min在4℃下离心25min，收集上清，上清液经0.22μm滤膜过滤；气相色谱条件：气相色谱仪：Agilent 7693A，色谱柱：TG-624SiIMS(30m×0.25mm×0.25μm)。压力：7.2452psi，总气体流量：20mL/min，吹扫气体流量：3mL/min，火焰电离检测器温度：250℃，氮气用作载气。用挥发性脂肪酸混合标准品(Supelco，Bellefonte，PA，USA)获得校正曲线。

实验结束时各组大鼠结肠粪便中短链脂肪酸的含量如图11，我们可以发现，与正常组(NC)相比，2型糖尿病模型组(DC)大鼠结肠粪便中短链脂肪酸的含量明显减少(P<0.05)。我们还发现，不同乳酸菌对短链脂肪酸表现出不同程度的增加。与模型组(DC)相比，乳酸菌组增加了乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的产生，对照菌株鼠里糖乳杆菌LGG显著增加了戊酸的水平(P<0.05)，而植物乳杆菌84-3干预后同时显著增加了糖尿病大鼠结肠粪便中丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸的含量(P<0.05)。因此，我们推测喂食植物乳杆菌84-3对于2型糖尿病葡萄糖代谢调节方面发挥的作用可能是通过产生短链脂肪酸来实现的。

实施例7植物乳杆菌种特异性分子靶标的挖掘

主要根据泛基因组分析结果获得植物乳杆菌特有的分子靶标。其中共选取135株植物乳杆菌的全基因组数据(来自NCBI数据库)、79株德氏乳杆菌全基因组数据(来自NCBI数据库)、80株发酵乳杆菌全基因组数据(来自NCBI数据库)、61株唾液乳杆菌全基因组数据(来自NCBI数据库)、53株肠球菌全基因组数据(来自NCBI数据库)，69株戊糖片球菌全基因组数据(来自NCBI数据库)，另外6个菌种各包含本实验室分离到的菌株，泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics Analysis Pipeline，PGAP)中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。之后选取植物乳杆菌种特有的基因，通过本地Blast比对剔除非特异性序列，经PCR扩增验证之后得到植物乳杆菌种特异性检测靶标(泛基因组分析所用菌株种类及数量见表3)。

表3：泛基因组分析所用菌株种类及数量

由此筛选得到1个植物乳杆菌的特异性检测靶标，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列(atggcacagtcaattgttgaagcgcctattcgggtggatacgagtcggaaaattattcatgtggacatggacgcgttttatgcgtcgatcgaagagcgggagcatccagcctacaagacgcagccgttagtgatcgcgcatgatcctcggcagacaggtgggcgaggcgttgtgacgacggctaactatgttgcccgccaatttggtgttcactcggcgatgccagctgctaaagcattagaactctgcccaacagcagtatttaagacgcccaactttccgttgtaccgcgaagtttcggcgcagattcatcgtattttccatgagtatacagagatgattgagccaattgcctttgatgaggcttacttggatgtgactacgaataagaaacacatccatagtgcggtcgaactggcgcaccgattacaacaagaaatttggcatcaaacacatttaacttgttcaacgggaatctcctacaacaaattcattgccaaactagcatcagattatcgaaaaccagcgggtgtgacgatcgtattaccacaggatgcagaaccatttttgttacgtgaacccatcgagaaatttcggggtgtcggtaaaaagacggtacctaaaatgcacgatttaggaatcaagactggacaggatttatacgcacagtctgaattagacctaatcaaacaatttggcaagttgggctatattttataccggcgagtgcgcggcagtgatgatcggccagtcgagtatttacgtgaacggaaatcaatcggcaaagagcggacgtttggaccgtttctccaatcgacgacggaagttaatacgcacttgaaggccatcgctaagttggtagcagctagcatgcaatcgcatcagcgccacggtaaaacactcgttctcaagttgcgttacggtgactttgtcacaattaccaagcggcgaacgttcggtgaattcatacctaatgacgcggccttgtttgagcagtacgccgaagagatttttgaagaggtggtcgatgatcattttaactctggcatccgcctgttagggatcacgctaactggcttggcaccactggcgtttgagaacttaacgttaccactttatccaaatgataattaa)。

实施例8植物乳杆菌种特异性靶标快速检测方法的建立

根据序列SEQ ID NO:1设计一对特异性扩增引物，引物序列如下：

正向引物145F：5'-ACGCCCAACTTTCCGTTGTA-3'，

反向引物145R：5'-CGACCGCACTATGGATGTGT-3'。

以本实验室从食品样品中分离得到的植物乳杆菌(包括47株植物乳杆菌)的基因组DNA为模板进行PCR验证。

PCR反应体系为25μl，其中包括：2×Taq PCR MasterMixⅡ12.5μl、上游引物和下游引物各1μl、DNA模板1μl和无菌双蒸水9.5μl。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，68.5℃退火30s，72℃延伸30s，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。

使用琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5％)进行PCR产物的检测，判断凝胶电泳检测扩增产物在145bp是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有植物乳杆菌；如果没有出现相应单一扩增条带，则说明样品中不含有植物乳杆菌。检测结果如表4和图12，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表4：植物乳杆菌种分子靶标检测方法建立的实验结果

实施例9植物乳杆菌PCR检测方法特异性评估结果

取7株短乳杆菌、5株发酵乳杆菌等非植物乳杆菌种进行植物乳杆菌种分子靶标特异性试验。按照DNA模板提取方法提取上述菌株基因组DNA，并按照实施例8所述方法进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如表5和图13所示(图中的+表示植物乳杆菌阳性对照)，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表5：使用68株非植物乳杆菌的乳酸菌进行特异性检验的结果

综上，本发明的分子靶标对植物乳杆菌种具有特异性，在常见其他乳酸菌中检测不出该分子靶标，因此，分子靶标可作为专门针对检测植物乳杆菌种的特异靶标。

实施例10为菌株植物乳杆菌84-3特异性分子靶标的挖掘

主要根据泛基因组分析结果获得植物乳杆菌特有的分子靶标。其中共选取534株植物乳杆菌的全基因组数据(来自NCBI数据库)，泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics Analysis Pipeline，PGAP)中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。之后选取植物乳杆菌种特有的基因，通过本地Blast比对剔除非特异性序列，经PCR扩增验证之后得到植物乳杆菌种特异性检测靶标(泛基因组分析所用菌株种类及数量见表6)。由此筛选得到1个植物乳杆菌84-3的特异性检测靶标，如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

植物乳杆菌84-3的特异性靶标序列：

atgagtgacgaagtgaaagtggaatgttattttgtaccaaacttggattttatagcagagttacggcagttcaaaacaggtgaaaaatatccgatttatagaaacgcggattattttatattaatggctgaaaatggtgaattcaatttaacccaaaaagcattaaatgaaactatccataattggagtagctttggacggtttgaatctgtaggagatggcgacgatgattaa(SEQ ID NO.2所示)。

表6：泛基因组分析所用菌株种类及数量

实施例11为菌株植物乳杆菌84-3特异性靶标快速检测方法的建立

根据序列SEQ ID NO:2设计一对特异性扩增引物，引物序列如下：

正向引物175F：5'-AGAGTTACGGCAGTTCAAAACA-3'，

反向引物175R：5'-ATCATCGTCGCCATCTCCT-3'。

以本实验室从发酵食品样品中分离得到的植物乳杆菌(包括41株植物乳杆菌)的基因组DNA为模板进行PCR验证。

PCR反应体系为25μl，其中包括：2×Taq PCR MasterMixⅡ12.5μl、上游引物和下游引物各1μl、DNA模板1μl和无菌双蒸水9.5μl。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。

取41株植物乳杆菌进行植物乳杆菌84-3特异性分子靶标试验。使用琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5％)进行PCR产物的检测，判断凝胶电泳检测扩增产物在175bp是否存在单一扩增条带，如果存在，说明该菌株是植物乳杆菌84-3；如果没有出现相应单一扩增条带，则说明该菌株不是植物乳杆菌84-3。检测结果如表7和图14(图中的+表示植物乳杆菌84-3)，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表7：菌株植物乳杆菌84-3分子靶标检测方法建立的实验结果

实施例12植物乳杆菌84-3PCR检测方法特异性评估结果

取83株发酵乳杆菌等非植物乳杆菌84-3特异性分子靶标试验。按照DNA模板提取方法提取上述菌株基因组DNA，并按照实施例11所述方法进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如表8和图15所示，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表8：使用83株非植物乳杆菌84-3的乳酸菌进行特异性检验的结果

PCR扩增产物凝胶结果如图14和图15所示，1～41为其他植物乳杆菌菌株，42～108为非目标乳杆菌属菌株，109～124为非乳杆菌属菌株，+为目标阳性植物乳杆菌84-3，C为阴性对照组，对照组的模板为不含基因组的水溶液。从图14和图15可得，所述引物组的检测结果只有植物乳杆菌84-3菌株显示出特异性扩增条带，非植物乳杆菌84-3菌株均无特异性条带，说明序列84_3_02108为植物乳杆菌84-3菌株的特异性分子靶标。

综上，本发明的分子靶标对菌株植物乳杆菌84-3具有特异性，在常见其他植物乳杆菌及乳酸菌中检测不出该分子靶标，因此，分子靶标可作为专门针对检测植物乳杆菌种的特异靶标。

实施例13为植物乳杆菌种和植物乳杆菌84-3的定量测定

对经10倍稀释的不同拷贝数的DNA进行实时荧光定量测定，植物乳杆菌和植物乳杆菌84-3进行实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μl，其中包括：2×RealUniversalPreMix预混液10μl,50×ROX Reference Dye 0.4μl，正向引物和反向引物(植物乳杆菌用正向引物145F和反向引物145R，植物乳杆菌84-3用正向引物175F和反向引物175R)各0.6μl、DNA模板1μl和无菌双蒸水7.4μl。植物乳杆菌和植物乳杆菌84-3进行实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性5s，60.0℃退火30s，72℃延伸10s，2-4步共40个循环；最后72℃延伸10min。分别得到植物乳杆菌种和植物乳杆菌84-3的扩增的荧光阈值(CT值)，以拷贝数为横坐标，CT值为纵坐标制作标准曲线。检测结果如图16和图17所示，标准曲线的相关系数R²>0.99，同时溶解曲线呈单峰，表明扩增条件及引物特异性适宜，该方法可用于植物乳杆菌种和植物乳杆菌84-3菌株的定量测定。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

广东环凯生物科技有限公司

广东科环生物科技有限公司

<120> 具有降糖降脂功效的植物乳杆菌84-3特异性分子靶标及其检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1134

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌84-3(Lactiplantibacillus plantarum)

<400> 1

atggcacagt caattgttga agcgcctatt cgggtggata cgagtcggaa aattattcat 60

gtggacatgg acgcgtttta tgcgtcgatc gaagagcggg agcatccagc ctacaagacg 120

cagccgttag tgatcgcgca tgatcctcgg cagacaggtg ggcgaggcgt tgtgacgacg 180

gctaactatg ttgcccgcca atttggtgtt cactcggcga tgccagctgc taaagcatta 240

gaactctgcc caacagcagt atttaagacg cccaactttc cgttgtaccg cgaagtttcg 300

gcgcagattc atcgtatttt ccatgagtat acagagatga ttgagccaat tgcctttgat 360

gaggcttact tggatgtgac tacgaataag aaacacatcc atagtgcggt cgaactggcg 420

caccgattac aacaagaaat ttggcatcaa acacatttaa cttgttcaac gggaatctcc 480

tacaacaaat tcattgccaa actagcatca gattatcgaa aaccagcggg tgtgacgatc 540

gtattaccac aggatgcaga accatttttg ttacgtgaac ccatcgagaa atttcggggt 600

gtcggtaaaa agacggtacc taaaatgcac gatttaggaa tcaagactgg acaggattta 660

tacgcacagt ctgaattaga cctaatcaaa caatttggca agttgggcta tattttatac 720

cggcgagtgc gcggcagtga tgatcggcca gtcgagtatt tacgtgaacg gaaatcaatc 780

ggcaaagagc ggacgtttgg accgtttctc caatcgacga cggaagttaa tacgcacttg 840

aaggccatcg ctaagttggt agcagctagc atgcaatcgc atcagcgcca cggtaaaaca 900

ctcgttctca agttgcgtta cggtgacttt gtcacaatta ccaagcggcg aacgttcggt 960

gaattcatac ctaatgacgc ggccttgttt gagcagtacg ccgaagagat ttttgaagag 1020

gtggtcgatg atcattttaa ctctggcatc cgcctgttag ggatcacgct aactggcttg 1080

gcaccactgg cgtttgagaa cttaacgtta ccactttatc caaatgataa ttaa 1134

<210> 2

<211> 234

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌84-3(Lactiplantibacillus plantarum)

<400> 2

atgagtgacg aagtgaaagt ggaatgttat tttgtaccaa acttggattt tatagcagag 60

ttacggcagt tcaaaacagg tgaaaaatat ccgatttata gaaacgcgga ttattttata 120

ttaatggctg aaaatggtga attcaattta acccaaaaag cattaaatga aactatccat 180

aattggagta gctttggacg gtttgaatct gtaggagatg gcgacgatga ttaa 234

Claims (10)

1.用于检测植物乳杆菌或植物乳杆菌84-3的特异性分子靶标，其特征在于，所述的用于检测植物乳杆菌的特异性分子靶标是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述的用于植物乳杆菌84-3的特异性分子靶标是如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的特异性分子靶标在检测植物乳杆菌种和/或植物乳杆菌84-3中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的特异性分子靶标在检测含有植物乳杆菌和/或植物乳杆菌84-3的功能食品及乳酸菌制品中的应用。

4.一种检测植物乳杆菌和/或植物乳杆菌84-3的引物组，其特征在于，所述的检测植物乳杆菌的引物为：正向引物145F：5'-ACGCCCAACTTTCCGTTGTA-3'和反向引物145R：5'-CGACCGCACTATGGATGTGT-3'；所述的检测植物乳杆菌84-3的引物为：正向引物175F：5'-AGAGTTACGGCAGTTCAAAACA-3'，反向引物175R：5'-ATCATCGTCGCCATCTCCT-3'。

5.一种检测植物乳杆菌和/或植物乳杆菌84-3的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测微生物的DNA，以提取的DNA为模板，分别采用权利要求4所述的检测植物乳杆菌种和/或植物乳杆菌84-3的引物组对其进行PCR扩增；

(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现大小145bp和175bp的条带则判定样品中分别含有植物乳杆菌和植物乳杆菌84-3，若电泳结果未出现目标大小的条带则判定样品中不含有植物乳杆菌和植物乳杆菌84-3。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增，其反应体系为25μl，其中包括：2×Taq PCR MasterMixⅡ12.5μl、正向引物和反向引物各1μl、DNA模板1μl和无菌双蒸水9.5μl。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当检测植物乳杆菌时，其PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，68.5℃退火30s，72℃延伸30s，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当检测植物乳杆菌84-3时，其PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增是实时荧光定量PCR扩增，反应体系为20μl，其中包括：2×RealUniversal PreMix预混液10μl,50×ROX ReferenceDye0.4μl，正向引物和反向引物各0.6μl、DNA模板1μl和无菌双蒸水7.4μl。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性5s，60.0℃退火30s，72℃延伸10s，2-4步共40个循环；最后72℃延伸10min。

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