JP2004029026A - ポリヌクレオチド分析用アレイ - Google Patents

Abstract

【課題】オリゴヌクレオチドアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイを含む装置を提供する。
【解決手段】オリゴヌクレオチドのアレイであって、但し、（ａ）多数の公知の区域を含み、（ｂ）各公知区域がその中に配置されたオリゴヌクレオチドを有し、（ｃ）一つの公知の区域内に配置されたオリゴヌクレオチドが別の区域に配置されたオリゴヌクレオチドとは異なり、そして、（ｄ）不透過性支持体に共有結合している、アレイが提供される。
【選択図】　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヌクレオチドの分析に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１．概論
核酸配列の分子分析に主として次の３方法がある：制限フラグメントのゲル電気泳動、分子ハイブリッド形成および迅速ＤＮＡ塩基配列決定方法。これらの３方法は生物学において基礎研究と、医学および農業のような生物学の応用分野との両方において広範囲に用いられている。これらの方法が現在用いられている規模についての若干の示唆は、現在１年間に１００万より充分に大きい塩基対が蓄積されるＤＮＡ塩基配列の蓄積速度によって与えられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法は強力ではあるけれども、限界を有している。制限フラグメントとハイブリッド形成方法は広範囲な領域を大ざっぱに分析するにすぎないが、迅速である。塩基配列分析法は究極的な分析を与えるが、緩慢であり、一度に短い範囲（ｓｔｒｅｔｃｈ）のみを分析するにすぎない。現在の方法よりも迅速な方法、および特に核分析において多量の塩基配列をカバーする方法が必要とされている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は単一分析でフィンガープリントと、部分的または完全な塩基配列との両方を生じ、複合ＤＮＡおよびＲＮＡの集団にクローニングの必要なく直接用いることのできるような新しいアプローチを提供する。
【０００５】
本発明は、特定の長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体もしくは特定部分のアレイ（ａｒｒａｙ）をその表面に結合してなる支持体を用いることにより、ポリヌクレオチドの決定されていない配列もしくは決定されていない配列の変異体を分析する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下、ポリヌクレオチド中の相補体を有するオリゴヌクレオチドをそれを有しないオリゴヌクレオチドから区別しうる条件下でアレイに供給し、そして
オリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に関連する表面上の標識の位置を観察する、ことを含み、ここで異なるオリゴヌクレオチドはアレイの別々のセルを占有していることを特徴とする。
【０００６】
本発明はまた、特定の長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体もしくは特定部分のアレイをその表面に結合してなる支持体を用いることにより、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下でアレイに供給し、そしてオリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に関連する表面上の標識の位置を観察する、ことを含み、ここで、各々のオリゴヌクレオチドは末端ヌクレオチドを介して支持体の表面に結合しており、異なるオリゴヌクレオチドはアレイの別々のセルを占有していることを特徴とする。
【０００７】
本発明はまた、特定の長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体もしくは特定部分のアレイをその表面に結合してなる支持体を用いることにより、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、
ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下でアレイに供給し、そしてオリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に関連する表面上の標識の位置を観察する、ことを含み、ここで各々のオリゴヌクレオチドはインサイチュで合成されており、共有結合を介して支持体の表面に結合しており、異なるオリゴヌクレオチドはアレイの別々のセルを占有していることを特徴とする。
【０００８】
本発明はまた、正確な適合（マッチ）と不適合（ミスマッチ）との間を区別するように選択された長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体もしくは特定部分のアレイをその表面に結合してなる支持体を用いることにより、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析する方法を提供する。この方法は、
ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、
ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下でアレイに供給し、そしてオリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に関連する表面上の標識の位置を観察する、ことを含み、ここで異なるオリゴヌクレオチドはアレイの別々のセルを占有していることを特徴とする。
【０００９】
本発明はまた、ポリヌクレオチドの決定されていない配列もしくは決定されていない配列の変異体を分析するための装置であって、異なる配列を有する異なるオリゴヌクレオチドのアレイをその表面に結合してなる支持体を含み、ここでオリゴヌクレオチドはアレイのセルを占有し表面に結合しており、アレイの１つのセルのオリゴヌクレオチドの定められた配列はアレイの他のセルのオリゴヌクレオチドの定められた配列とは異なっており、かつ、配置は、分析されるべきポリヌクレオチド配列のアレイへの供給がハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチド中の相捕体を有するオリゴヌクレオチドをそれを有しないオリゴヌクレオチドから区別しうるようなものであることを特徴とする装置を提供する。
【００１０】
本発明はまた、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析するための装置であって、少なくとも２つの定められたセルに分画された表面を有する支持体を含み、各々のセルには既知の配列のオリゴヌクレオチドが結合されており、各々のセルのオリゴヌクレオチドは末端ヌクレオチドを介して支持体の表面に結合されており、ここで第１のセルのオリゴヌクレオチドの配列は別のセルのオリゴヌクレオチドの配列と異なることを特徴とする装置を提供する。
【００１１】
本発明はまた、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析するための装置であって、少なくとも２つの定められたセルに分画された表面を有する支持体を含み、各々のセルには既知の配列のオリゴヌクレオチドが結合されており、各々のセルのオリゴヌクレオチドはインサイチュで合成されており、かつ共有結合を介して支持体の表面に結合されており、ここで第１のセルのオリゴヌクレオチドの配列は別のセルのオリゴヌクレオチドの配列と異なることを特徴とする装置を提供する。
【００１２】
本発明はまた、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析するための装置であって、少なくとも２つの定められたセルに分画された表面を有する支持体を含み、各々のセルには既知の配列のオリゴヌクレオチドが結合されており、各々のセルのオリゴヌクレオチドは正確な適合と不適切な適合との間を区別するように選択された長さを有しており、ここで第１のセルのオリゴヌクレオチドの配列は別のセルのオリゴヌクレオチドの配列と異なることを特徴とする装置を提供する。
【００１３】
本発明はまた、本発明の装置のために、支持体物質の別々のセル中に選択された長さのオリゴヌクレオチドのアレイを生成する方法を提供する。この方法は、
ａ）支持体物質を別々のセル区域に分画し；
ｂ）あるヌクレオチドをセル区域の第１のセットにカップリングさせ；
ｃ）あるヌクレオチドをセル区域の第２のセットにカップリングさせ；
ｄ）あるヌクレオチドをセル区域の第３のセットにカップリングさせ；そして
ｅ）所望のアレイが生成するまで一連のカップリング工程を続ける；
の各工程を含み、
カップリングは、各々の区域において、支持体の表面に対してまたは前工程においてその区域にカップリングされたヌクレオチドに対して実施されることを特徴とする。
【００１４】
本発明は１態様において、支持体とその表面に取付けた、アレイの別々のセルを占有し、ハイブリッド形成反応に参加しうる特定長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体または特定の部分のアレイから成るポリヌクレオチド塩基配列の分析装置を提供する。ポリヌクレオチド塩基配列の差異を調べるために、本発明は他の態様において支持体と、その表面に取付けた、アレイの別々のセルを占有するハイブリッド形成反応に参加しうるオリゴヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド塩基配列を含む特定長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体または特定部分のアレイとから成る装置を提供する。
【００１５】
他の態様において本発明はその表面に特定長さのオリゴヌクレオチドの完全セットの全体または特定部分のアレイを取付けた支持体を用いることによるポリヌクレオチド塩基配列の分析方法であって（異なるオリゴヌクレオチドがアレイの別々のセルを占有する）、ポリヌクレオチド塩基配列またはそのフラグメントを標識して標識物質を形成し、ハイブリッド形成条件下で標識物質をアレイに加え、オリゴヌクレオチドセットの特定要素と結合した、表面の標識の位置を観察することから成る方法を提供する。
【００１６】
このように、本発明の考えは１種類の特定長さまたは数種類の特定長さのオリゴヌクレオチドの完全セットの全体または特定部分の組織化アレイ（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄａｒｒａｙ）を提供することである。支持フィルムまたはガラスプレート上に展開されるアレイはハイブリッド形成反応の標的を形成する。ハイブリッド形成の特定条件とオリゴヌクレオチドの長さとはいずれにしても正確に適合したオリゴヌクレオチドと不適合（ミスマッチ）のオリゴヌクレオチドとを識別する有効な装置のために充分でなければならない。ハイブリッド形成反応では、特定長さ以上のポリヌクレオチド塩基配列またはフラグメントのオリゴマーを含み、その性質が特定の用途に依存する標識プローブによって、アレイが利用される。例えば、プローブはポリメラーゼ連鎖反応によってゲノムＤＮＡから増幅される標識塩基配列、またはｍＲＮＡ集団、または例えば全ゲノムのような、複合塩基配列からのオリゴヌクレオチドの完全セットを含む。最終結果は分析塩基配列中に存在するオリゴヌクレオチドに一致する充てんセル（ｆｉｌｌｅｄ　ｃｅｌｌ）のセットと、分析塩基配列中に存在しない配列に一致する「エンプティ」座位のセットである。このパターンは被分析塩基配列のすべてを表すフィンガープリントを生ずる。さらに、オリゴヌクレオチド長さをオリゴヌクレオチドの殆んどまたはすべてが１回のみ生ずるように選択するならば、被分析塩基配列の殆んどまたは全てを集合させることも可能である。
【００１７】
アレイ「ルックアップ表」中に存在するオリゴヌクレオチドの数、長さおよび塩基配列も用途に依存する。アレイは被分析塩基配列に関する塩基配列情報が存在しない場合に必要になるような、特定長さのあらゆる可能なオリゴヌクレオチドを含みうる。この場合に、使用オリゴヌクレオチドの好ましい長さは被分析塩基配列の長さに依存し、被分析塩基配列中の特定オリゴマーの１コピーにすぎないと思われるような長さである。このようなアレイは大きい。被分析塩基配列に関する情報が全く得られない場合には、アレイは選択された部合集合（ｓｅｌｅｃｔｅｄｓｕｂｓｅｔ）でありうる。公知の塩基配列の分析では、アレイのサイズは塩基配列の長さと同じオーダーであり、例えば突然変位遺伝子の分析のような多くの用途では、きわめて短い。これらの要素については下記で詳細に考察する。
【００１８】
２．塩基配列プローブとしてのオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと塩基対合した二本鎖（ｂａｓｅ　ｐａｉｒｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）を形成する。二本鎖の安定性はオリゴヌクレオチドの長さと塩基組成とに依存する。二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）安定性に対する塩基組成の効果は高濃度の４級アミンまたは３級アミンの存在によって非常に減ぜられる。しかし、ハイブリッドの熱安定性に対してオリゴヌクレオチド二本鎖中の不適合（ミスマッチ）の強力な効果が存在し、このことがオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成技術を突然変異分析のためおよびＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応による増幅の特異的塩基配列を選択するためのこのような強力な方法にしている。不適合の位置は不安定化度（ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｄｅｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）に影響を与える。二本鎖の中心に存在する不適合は末端不適合の１℃に比べてＴｍを１０℃低下させる。ここに述べる方法に密接に関係する、不適合の位置に依存するある範囲の識別力が存在する。例えば、ハイブリッド形成を二本鎖のＴｍ近くで実施して不適合二本鎖の形成率を減ずることによる。または非反復表現（ｕｎｉｑｕｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に必要である以上にオリゴヌクレオチドの長さを増大することによるような、識別改良方法が幾つか存在する。これの系統的実施方法を考察する。
【００１９】
３．既知塩基配列の分析
オリゴヌクレオチドプローブの最も有効な使用方法の１つはヒト遺伝子中の単独塩基変化の検出である。最初の例は鎌状赤血球病を生ずるベータグロビン遺伝子における単独塩基変化であった。このアプローチを例えばＤＭＤ遺伝子およびＨＰＲＴ遺伝子のような、同じ表現型を生ずる多くの異なる突然変異が生ずる遺伝子にまで拡大して、例えばハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）およびのう胞性線維症のような疾患遺伝子座（ｄｉｓｅａｓｅ　ｌｏｃｕｓ）を含むことが結合分析によって判明している領域における突然変異のヒトゲノムの効果的な走査方法を発見することが必要とされている。如何なる既知の塩基配列も重複オリゴヌクレオチドのセットとして完全に表すことができる。セットのサイズＮはｓ＋１〜Ｎであり、Ｎは塩基配列の長さ、ｓはオリゴマーの長さである。例えば１ｋｂの遺伝子は特定長さの約１０００オリゴヌクレオチドの重複セットに分けることができる。別々のセル内にこれらのオリゴヌクレオチドの各々によって構成されたアレイは例えばヒトゲノム中の単独コピー遺伝子（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｐｙ　ｇｅｎｅ）または混合ＲＮＡ集団中のメッセンジャーＲＮＡのような、何らかの意味で相同塩基配列を検出するための多重ハイブリッド形成プローブとして用いられる。長さｓは、塩基配列内のオリゴマーが被分析配列中のどこかで表される確率がごく小さいように選択することができる。これは下記の統計を考察する項に述べる式から算出することができる。あまり完全ではない分析では、例えば一部重複または非重複セットで塩基配列を表すことによって、５までのファクターを用いてアレイのサイズを減ずることが可能である。完全重複セットを用いることの利点は、ｓ連続オリゴヌクレオチド中の不適合が走査されるので、塩基配列差の正確な位置確認が可能になることである。
【００２０】
４．未知塩基配列の分析
あらゆる自由生活有機体（ｆｒｅｅ　ｌｉｖｉｎｇ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）のゲノムは１００万以上の塩基対であり、いずれのゲノムもまだ完全には解明されていない。制限座位マッピングは塩基配列のごく一部のみを明らかにするにすぎず、２ゲノムの比較に用いる場合に突然変異の小部分のみを検出できるにすぎない。関係する遺伝子に直接接近することのできない多くの生物学的問題に分子生物学の全エネルギーを集中するには、複合塩基配列のさらに効果的な分析方法が必要である。多くの場合に、核酸の完全な塩基配列を決定する必要はなく、重要な配列は２種類の核酸を区別するような配列である。３例を挙げると、野性型有機体と突然変異体含有有機体とでは異なるＤＮＡ塩基配列は問題遺伝子の単離方法を誘導しうる；同様に、癌細胞とその正常相対細胞との間の塩基配列差によって形質転換の原因を解明することができる；また、２細胞型の間で異なるＲＮＡ配列はこれらを区別する機能を与える。これらの問題は塩基配列差を確認する方法によって、分子分析で解説することができる。ここに述べるアプローチを用いると、このような差は２種類の核酸、例えば２遺伝子型のゲノムＤＮＡまたは２細胞型のｍＲＮＡ集団から全ての可能な塩基配列を表すオリゴヌクレオチドアレイにハイブリッド形成することによって示される。１塩基配列によって占められ他方の配列によって示されていないアレイ中の位置は２塩基配列の差を表す。これは関係する塩基配列のクローンの単離に用いられるプローブの合成に必要な塩基配列情報を与える。
【００２１】
４．１塩基配列情報の組立て
アレイへのハイブリッド形成の結果を調べることによって、塩基配列を再構成することができる。長い配列内からの長さｓのオリゴヌクレオチドは長さｓ−１にわたって他の２塩基配列と重複する。各陽性のオリゴヌクレオチドから出発して、左へ４オリゴヌクレオチドおよび１塩基置換体と重複しうる右方へ４オリゴヌクレオチドについてアレイを調べる。これらの４オリゴヌクレオチドの中の１個のみが右方へ陽性であることが判明した場合には、重複と右方への付加塩基とが未知塩基配列中のｓ塩基を決定する。このプロセスを両方向にくり返して、アレイ中の他のオリゴヌクレオチドとの独特の適合を求める。各独特適合が再構成配列に塩基を加える。
【００２２】
４．２統計学
長さＮの塩基配列は長さｓ塩基対の〜Ｎ重複塩基配列のセットに分解される。（二重鎖核酸では、Ｎ塩基対の配列の塩基配列複合度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）は、２本の鎖が異なる配列を有するので２Ｎであるが、本発明のためには、この２という係数は重要ではない）。長さｓのオリゴヌクレオチドでは、４^Ｓ種類の配列組合せが存在する。複合度Ｎの被分析配列中に大ていのオリゴヌクレオチドが１回のみ表われることを保証するには、ｓの大きさはどの位であるべきか？ランダム配列では、１つ以上のコピー中に存在するｓマー（ｓ−ｍｅｒ）の期待数は
【００２３】
【数１】

【００２４】
である。
【００２５】
実用的な理由から、単独塩基変化によってあらゆるｓマーに如何に多くの配列が関係するかを知ることも有用である。各位置は３塩基の１つによって置換されるので、単独塩基変化によって各ｓマーに関して３ｓ配列が存在し、Ｎ塩基の配列中のｓマーが１置換を可能にする配列中の他のｓマーと関係する確率は３ｓ×Ｎ／４^Ｓである。この場合に適合配列と不適合配列の相対シグナルは、完全適合を単独塩基だけ異る適合から区別することにハイブリッド形成条件が如何に良好であるかにも依存する。（４^ＳがＮより大きい、大きさのオーダーである場合には、１塩基変化によるいかなるオリゴヌクレオチドに比べてもごく小さい３ｓ／１０であるにちがいない）。不適合配列からのハイブリッド収量が完全な二重鎖によって形成される収量の一部にすぎないことが示唆される。
【００２６】
下記に示すように、プローブ中に相補性を有するオリゴヌクレオチドを相補性を有さないオリゴヌクレオチドから区別させる条件が存在すると考える。
【００２７】
４．３アレイフォーマット、構成とサイズ
異なる複合度の塩基配列を分析するために必要なアレイの規模について考えるために、アレイを方形マトリックスと見なすことが便利である。一定長さのすべての配列を４塩基を表す４列を引き、次に同様に４縦列を引くことによって構成されるマトリックス中に１回のみ表すことができる。これは４×４マトリックスを形成し、１６方形の各々１６ダブレットの１つを表す。次に、大きさが１／４である以外は同じ４マトリックスを各オリジナルマトリックス中に描いた。これによって全体で２５６テトラヌクレオチド配列を含む、１６×１６マトリックスが形成される。このプロセスをくり返すと、特定の深さｓ、セル数が４^ｓに等しいマトリックスが得られる。上述したように、ｓの選択は、これが塩基配列複合度を決定するので、非常に重要である。下記で検討するように、ｓは、複合ゲノムのために充分に大きくなければならない構成マトリックスのサイズをも決定する。最後に、オリゴヌクレオチドの長さはハイブリッド形成条件と、ハイブリッド形成プローブとしてのそれらの識別力とを決定する。
【００２８】

この表は数個のゲノムの第１分析を実施するために必要なアレイの予想規模を示す。例は通常の方法によって塩基配列を決定された（コスミドスケール）、または現在塩基配列決定中（大腸菌スケール）であるゲノムであるか、または問題の大きさがかなり検討されている（ヒトスケール）ゲノムであるために、選択した。表はマトリックスアプローチの予想スケールが通常のアプローチのごく一部であることも示す。これは用いられるＸ線フィルムの面積に容易に認められる。分析に要する時間がゲル方法に要する時間のごく一部であることも明らかである。「ゲノム」縦列はマトリックスのセルの約５％を満たすランダム配列の長さを示す。これは下記で考察する塩基配列決定法の第一段階の最適条件であるように選択した。このサイズでは、正シグナルの割合の大きいことが各オリゴマーの１回発生を示し、これは２ゲノムを比較して配列差を知るために必要な条件である。
【００２９】
５．不完全塩基配列の精製
複合配列の再構成は、配列中でくり返されるオリゴマーが発生する個所において再構成配列が中断されるという結果を生ずる。例えばヒトＤＮＡに分散され、タンデム反復する、ＤＮＡの構造組織の一部をなす長い反復構造の成分として反復が存在する。しかし、マトリックスに用いるオリゴヌクレオチドの長さが非反復表現の全体を与えるために必要であるよりも短い場合には、偶発的に反復が生ずる。このような反復は単離されやすい。すなわち、反復オリゴマーを囲む配列は互いに関係していない。これらの反復によって生ずるギャップは配列を長いオリゴマーに伸長することによって解消される。あらゆる可能なオリゴマーのアレイ表現を用いた、第１分析によって反復することが判明した塩基配列は、原則として、各端部での伸長によって再合成することができる。各反復オリゴマーに対して、新しいマトリックス中に４×４＝１６オリゴマーが存在する。ハイブリッド形成分析は、配列が完成するまで、くり返される。実際には、ハイブリッド形成における陽性シグナルの結果が不明瞭であるので、第１分析において明確な陰性結果を与えなかったすべての配列の伸長による第１結果の精製（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）を利用することが好ましい。このアプローチの利点は配列の伸長によって、短いオリゴマーの末端に近い不適合を伸長オリゴマーの中央近くに持ってきて、二重鎖形成の識別力を高めることである。
【００３０】
５．１バクテリオファージλＤＮＡの塩基配列の仮説的分析
ラムダファージＤＮＡは４８，５０２塩基対長さである。これの塩基配列は完全に決定されているので、これの一重鎖を分析のコンピューターシミュレーションにテストケースとして処理した。表は、この複合度の配列に用いるオリゴマーの適当なサイズが１０マーであることを示す。１０マーのマトリックスでは、サイズは１０２４ライン平方であった。コンピューターでのラムダ１０マーの「ハイブリッド形成」後に、４６，３７７セルが陽性であり、１９５７が二重発生を示し、７５が三重発生を示し、３セルが四重発生を示した。これらの４６，３７７陽性セルはマトリックスのそれらの位置から推定して、既知の配列を表した。各々を３′末端において４×１塩基、５′末端において４×１塩基伸長させて、１６×４６，３３７＝７４２，０３２セルを得た。この伸長セットは二重発生を１６１に減じ、さらに１６倍の伸長はこの数を１０に減じ、再度の実験は完全に重複した結果を示した。完全に重複した配列の同じ最終結果は４^１６マトリックスから出発して得られるが、このマトリックスはすべての１０マーを表すために必要なマトリックスよりも４０００倍大きく、この上に表された配列の大部分は冗長であった。
【００３１】
５．２マトリックスのレイダウン
ここに述べた方法は、例を上述したように、４塩基の先駆物質を所定パターンでレイダウンすることによって、アレイのセル中にオリゴヌクレオチドを合成することによってマトリックスが製造されることを可能にする。先駆物質を供給する自動装置はまだ開発されていないが、明白に可能性が存在する。この目的にペンプロッターその他のコンピューター制御プリンティング装置を用いることも困難でない筈である。複合ゲノムは非常に多数のセルを必要とするので、アレイのピクセルサイズが小さければ小さいほど良い。しかし、これらを如何に小さく製造するかについては限界がある。１００ミクロンはかなり満足できる上限であるが、組織および拡散のために、紙ではおそらく達せられない。例えばガラスのような滑らかな不透過性表面では、例えばレーザータイプセッター（ｌａｓｅｒ　ｔｙｐｅｓｅｔｔｅｒ）を用いて溶媒抵抗性グリッドを形成し、暴露部分にオリゴヌクレオチドを構成することによって約１０ミクロンまでの分析が達成される。本発明のオリゴヌクレオチド合成方法の適用を可能にする魅力的な可能性の１つは、ガラスプレートの表面上の顕微鏡パッチとしての微孔質ガラスを焼結することである。プリンティングメカニズムが緩慢である場合には、非常に多数のラインまたはドッドのレイダウンには長時間を要する。しかし、低コストジェットプリンターは約１０，０００スポット／秒の速度でプリントすることができる。このような速度では、約３時間に１０^８スポットをプリントすることができる。
【００３２】
５．３オリゴヌクレオチドの合成
幾つかのオリゴヌクレオチド合成方法が存在する。現在用いられている大ていの方法は制御孔度ガラス（ＣＰＧ）の固体支持体にヌクレオチドを結合させる方法であり、ガラス面での合成に用いるため適している。それらをその上で合成したマトリックスにまだ結合した状態のハイブリッド形成プローブとしてのオリゴヌクレオチドの直接使用については、我々の知るところでは、開示されていないが、合成後に結合させた固体支持体上のハイブリッド形成プローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用は報告されている。ＰＣＴ出願第ＷＯ　８５／０１０５１号はＣＰＧカラムに結合したオリゴヌクレオチドの合成方法を述べている。我々が実施した実験では、ファージラムダの左手ｃｏｓ座位に相補的な１３マーを合成するためにアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）オリゴヌクレオチド合成器の支持体としてＣＰＧを用いた。カップリング工程は理論的収量にすべて密接した。全合成と脱保護との工程を通して第１塩基は、支持体媒質に共有結合によって安定に結合した。
【００３３】
６．プローブ、ハイブリッド形成および検出
微孔質ガラス上に合成されるオリゴヌクレオチドの収量は約３０μｍｏｌ／ｇである。この物質の１ミクロン厚さ×１０ミクロン平方のパッチは、ヒトＤＮＡ約２ｇに等価である、〜３×１０^−１２μｍｏｌを維持した。それ故、ハイブリッド形成反応はプローブ中のオリゴヌクレオチドよりも非常に大きく過剰な結合オリゴヌクレオチドによって実施される。そのため、収量は反応のすべての段階において濃度に比例するので、プローブ塩基配列の単独発生と多量発生とを含むハイブリッド形成を区別できる系の設計が可能であるべきである。
【００３４】
被分析ポリヌクレオチド配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかである。プローブを製造するには、ポリヌクレオチドを分解してフラグメントを形成する。ポリヌクレオチドをできるだけランダムな方法で分解して、支持体上の特定の長さを中心とした平均の長さのオリゴヌクレオチドおよび塩基配列決定用ゲルでの電気泳動によって選択される正確な長さｓのオリゴマーを形成することが好ましい。プローブを次に標識する。例えば、長さｓのオリゴヌクレオチドを末端標識することができる。^３２Ｐで標識する場合には、全ヒトＤＮＡからの個々のｓマーの放射能収量（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｙｉｅｌｄ）は１０^４ｄｐｍ／総ＤＮＡｍｇ以上になりうる。検出のためには、このごく一部が１０〜１００ミクロン平方のパッチに必要である。これはハイブリッド形成条件を二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）のＴｍに近いように選択することを可能にする、これはハイブリッドの収量および形成速度を減ずるが、識別力を高める。結合オリゴヌクレオチドが過剰に存在するので、平衡近くで作用する場合にもシグナルが問題になる必要はない。
【００３５】
ハイブリッド形成条件は、フィルターへのハイブリッド形成に用いる標準方法に適することが知られている条件に合わせて選択することができるが、最適条件を確立することが重要である。特に、温度は±０．５℃より良好に、密接に制御することが必要である。特に、オリゴヌクレオチドの選択された長さが小さい場合に、ハイブリッド形成速度および／またはハイブリッド形成度の僅かな差を分析が識別しうることが必要である。装置は種々なオリゴヌクレオチドの間の塩基組成の差に対してプログラムされることが必要である。アレイの構成では、これを同じ塩基組成を有するサブマトリックス（ｓｕｂ−ｍａｔｒｉｃｅｓ）に分割することが好ましい。これは塩基組成によって僅かに異なるＴｍを明確にすることを容易にする。
【００３６】
特に^３２Ｐによるオートラジオグラフィーは画像分解（ｉｍａｇｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を生じ、分析を決定する限定要素になる；ハロゲン駆動銀フィルムの限界は約２５ミクロンである。直接検出系が明らかに好ましいと考えられる。蛍光プローブも考られ、標的オリゴヌクレオチドが高濃度であるならば、蛍光の低感度も問題にならない。
【００３７】
我々はデジタルスキャナーによる走査ラジオグラフィー画像もかなり経験している。我々の現在の設計は２５ミクロンまでの分析を可能にするが、ハイブリッド形成反応の質と、１つ以上の塩基配列の存在から１つの配列の不存在をどのように良好に識別するかとに依存して、分析範囲は現在の適用よりも低い範囲にまで容易に伸長される。ぼう大なプレートを測定する装置が約１μの精度を有する。走査速度は数分間内に数百万セルのマトリックスが走査されるような速度である。データ分析のソフトウェアは直接的であるが、大きなデータセットは迅速なコンピュータを必要とする。
【００３８】
下記の実験は請求項の実行可能性を実証する。市販の顕微鏡スライド〔ＢＤＨスーパープレミウム（ＢＤＨ　Ｓｕｐｅｒ　Ｐｒｅｍｉｕｍ）７６×２６×１ｍｍ〕を支持体として用いた。これらは芳香族ヘテロ環塩基の脱保護に用いられる条件、すなわち３０％ＮＨ_３、５５℃、１０時間に耐えることのできる長い脂肪族リンカーによって誘導体化した（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）。次のオリゴヌクレオチドの出発点として役立つヒドロキシル基を有するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を２段階で合成する。スライドを最初に、触媒としてヒューニッヒの塩基（Ｈｕｎｉｇ’ｓ　ｂａｓｅ）数滴を含むキシレン中の３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランの２５％溶液で最初に処理する。反応は乾燥管を備えたステイニングジャー（ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｊａｒ）中で、９０℃において２０時間実施する。スライドをＭｅＯＨ，Ｅｔ_２Ｏで洗浄し、風乾させる。ストレート（ｎｅａｔ）のヘキサエチレングリコールと痕跡量の濃硫酸を加え、混合物を８０℃に２０時間維持する。スライドをＭｅＯＨ，Ｅｔ_２Ｏで洗浄し、風乾させ、使用するまで−２０℃において乾燥維持する。この調製法は英国特許第８８２２２２８，６号（１９８８年９月２１日出願）に述べられている。
【００３９】
オリゴヌクレオチド合成サイクルは次のように実施する：
カップリング溶液を各工程に対して、無水アセトニトリル中０．５Ｍテトラゾール６量（ｖｏｌ．）と必要なベーターシアノエチルホスホーラミジトの０．２Ｍ溶液５量とを混合することによって新たに製造する。カップリング時間は３分間である。ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ_２Ｏ中Ｉ_２の０．１Ｍ溶液による酸化は安定なホスホトリエステル結合を生ずる。ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸による５′未満の脱トリチル化はオリゴヌクレオチド鎖のさらに伸長を可能にする。スライド上の反応性部位に対して用いたホスホーラミジドの過剰量はカップリングを完成させるために充分に大きいので、キャッピング段階は存在しなかった。合成が完成した後に、オリゴヌクレオチドを３０％ＮＨ_３中、５５℃において１０時間脱保護する。カップリング段階に用いた化学薬品は感湿性であるので、この重要な段階は次のように密閉容器内の無水条件下で実施しなければならない。合成すべきパッチの形を、上述のように誘導体化した顕微鏡スライドと、同じサイズおよび厚さのテフロン（登録商標）片との間にサンドイッチしたシリコーンゴムシート（７６×２６×０．５ｍｍ）から切断した。これに、カップリング溶液の注射器による注入、抽出およびアルゴンによる空隙のフラッシュを可能にするプラスチック・チューブの小片を取付けた。全組立て体をホールドバックペーパークリップ（ｆｏｌｄｂａｃｋ　ｐａｐｅｒ　ｃｌｉｐ）によって一緒に維持した。カップリング後に、セットアップを分解し、スライドをスティニングジャー中に浸せきすることによって、次の化学反応（ヨウ素による酸化：ＴＣＡ処理による脱トリチル化）に通した。
【００４０】
【実施例】
実施例１
第１例として、カップリング溶液レベルを工程１０〜１４に徐々に減ずることによって、スライド上にオリゴーｄＴ_１０−オリゴーｄＴ_１４の配列を合成した。このようにして、スライドの上部に１０マーを合成し、底部に１４マーを合成し、この間に１１，１２，１３マーを合成した。ハイブリッド形成プローブとしてポリヌクレオチドキナーゼ反応によって、１５０万ｃ．ｐ．ｍ．の総活性まで^３２Ｐによって５′末端において標識した１０ｐｍｏｌオリゴｄＡ_１２を用いた。ハイブリッド形成は顕微鏡スライドに適合するように製造し：ＴＥ中１Ｍ　ＮａＣｌ　１．２ｍｌ、０．１％ＳＤＳを充てんしたパースペックス（プレキシーガラス）容器内で２０℃において５分間実施した。オリゴヌクレオチドを含まない同じ溶液中で短時間すすいだ後に、放射線モニター（ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒ）によって２０００ｃｐｓ以上を検出することができた。オートラジオグラフは全てのカウントがオリゴヌクレオチド合成部分から生じたこと、すなわちガラスまたはリンカーのみによって誘導体化した領域への非特異的結合が存在しないことを示した。０．１Ｍ　ＮａＣｌ中に一部溶解した後に、標的への示差結合（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｂｉｎｄ）が検出可能である、すなわち長いオリゴーｄＴへよりも短いオリゴーｄＴへの結合が少ない。スライドを洗浄溶液中で徐々に加熱することによって、Ｔｍ（５０％溶離した場合の転移の中点値）が３３°であることが測定された。３９°でのインキュベーション後に検出可能なカウントは存在しなかった。ハイブリッド形成と溶解はシグナルを弱めることなく８回くり返した。結果は再現可能である。入力カウントの少なくとも５％が各サイクルにおいてスライドに取り込まれたことが考えられる。
【００４１】
実施例２
適合または不適合オリゴヌクレオチドを区別できるかどうかを知るために、２配列３’ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＧＧＡ（ＣｏｓＬ）と３’ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＴＣＴ　ＧＧＡを合成した、これらは７位置の１塩基によって異なる。第７塩基以外の全ての塩基を長方形パッチに加えた。第７塩基では、長方形の半分を代わりに露出し、２ストリップにおいて２種類の塩基を加えた。ｃｏｓＲプローブオリゴヌクレオチド（５′ＧＧＧ　ＣＧＧ　ＣＧＡ　ＣＣＴ）（^３２Ｐにより１１０万ｃ．ｐ．ｍ．まで標識したキナーゼ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ，ＴＥ，０．１％ＳＤＳ）のハイブリッド形成を３０℃において５時間実施した。スライドの前面はすすぎ洗い後に１００ｃ．ｐ．ｓ．を示した。オートラジオグラフィーは完全に相補的オリゴヌクレオチドを含むスライド部分にのみアニーリングが生ずることを示した。不適合配列を含むパッチではシグナルが検出されなかった。
【００４２】
実施例３
ハイブリッド形成挙動に対する不適合または短い塩基配列の影響をさらに調べるために、１つ（ａ）は２４オリゴヌクレオチドのアレイ、他方（ｂ）は７２オリゴヌクレオチドのアレイの２アレイを構成した。
【００４３】
これらのアレイを第１表（ａ）と（ｂ）に示すようにセットした。これらのアレイのレイダウンに用いたマスク（ｍａｓｋ）は以前の実験に用いたものとは異なるものであった。シリコーンゴムチューブ（外径１ｍｍ）の長さをプレーンな顕微鏡スライドの表面にＵ字形にシリコーンゴムセメントで付着させた。これらのマスクを誘導体化顕微鏡スライドに対してクランプし、生じた空隙中にカップリング溶液を注射器によって注入した。このようにして、空隙内のスライド部分のみがホスホーラミジド溶液と接触した。不適合塩基の位置を例外として、第１表に挙げたアレイはスライド幅の大部分をカバーするマスクを用いてレイダウンさせた。次のカップリング反応において誘導体化スライドを３ｍｍ上下させることによってこのマスクをオフセット（ｏｆｆ−ｓｅｔ）させると、３′末端と５′末端において切り取られたオリゴヌクレオチドが生成した。
【００４４】
不適合を導入するために、第１マスクの幅１／２（アレイ（ａ）のために）または１／３（アレイ（ｂ）のために）をカバーしたマスクを用いた。６位置と７位置の塩基は２本または３本の細長いストリップによってレイダウンした。これはスライドの各１／２（アレイ（ａ））または各１／３（アレイ（ｂ））に１塩基のみ異なるオリゴヌクレオチドの合成を生じた。他の位置では、配列は最も長い配列から末端配列のないことによって異なった。
【００４５】
アレイ（ｂ）では、第１表（ｂ）に示した配列の間に配列の２縦列が存在し、この場合にはスライドがシリコーンゴムシールによってストリップ状に遮へいされたので、全ての位置において第６塩基と第７塩基とが欠損した。従って、９０の異なる位置においてスライド上に表された７２種類の塩基配列が存在した。
【００４６】
１９マー　５′ＣＴＣ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　Ｃを用いてハイブリッド形成した（２００万ｃｐｍ、ＴＥ中０．１Ｍ　ＮａＣｌ　１．２ｍｌ、０．１％ＳＤＳ、２０°）。
【００４７】
洗浄と溶離後にオートラジオグラフィーを行った。スライドは各溶離工程において５分間洗浄液中に保持し、それから暴露させた（４５分間、強化）。溶離温度はそれぞれ２３、３６、４２、４７、５５および６０℃であった。
【００４８】
表に示したように、オリゴヌクレオチドは異なる融解挙動を示した。短いオリゴヌクレオチドは長いオリゴヌクレオチドよりも前に融解し、５５℃では、完全適合１９マーのみが安定であり、他のすべてのオリゴヌクレオチドは溶離した。従って、この方法は末端の１塩基欠損のみによって異なる１８マーと１９マーとを識別することができる。オリゴヌクレオチド末端と内部部位における不適合はすべて、完全な二重鎖が残留する条件下で融解した。
【００４９】
従って、不適合配列または長さにおいて１塩基程度異なるオリゴヌクレオチドを排除する非常に激しいハイブリッド形成条件を用いることができる。固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を用いた方法で不適合の効果にこれほど敏感である方法は他に存在しない。
【００５０】
実施例４
遺伝疾患の診断への本発明の適用をテストするために、野性型とβ−グロビン遺伝子の鎌状赤血球突然変異とに対して特異的なオリゴヌクレオチド配列を有するアレイ（ａ）と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてβ−グロビン遺伝子から増幅した１１０塩基対フラグメントとをハイブリッド形成した。正常固体の血液からの全ＤＮＡ（１μｇ）を適当なプライマー　オリゴヌクレオチドの存在下でＰＣＲによって増幅した。生成した１１０塩基対フラグメントをアガロースゲルを通しての電気泳動によって精製した。溶離後に、小サンプル（約１０ピコグラムｐｇ）を第２ＰＣＲ反応においてα−^３２Ｐ−ｄＣＴＰ（５０マイクロキュリー）を用いて標識した。このＰＣＲは上流で開始するオリゴヌクレオチドのみを含有した。延長時間９分間による６０サイクルの増幅後にゲル濾過によって先駆物質から生成物を除去した。放射性生成物のゲル電気泳動は１１０塩基フラグメントに長さが相当する主要バンドを示した。この生成物（１００，０００ｃ．ｐ．ｍ．０．９Ｍ　ＮａＣｌ中、ＴＥ，０．１％ＳＤＳ）の１／４をアレイ（ａ）にハイブリッド形成した。３０°での２時間後に、１５０００ｃ．ｐ．ｍ．が吸収された。ハイブリッドの融解挙動は実施例３の１９マーに述べた融解挙動に従い、この融解挙動はオリゴヌクレオチドの融解挙動と同じであることが判明した。すなわち、不適合がハイブリッドの融点をかなり低下させ、完全適合二重鎖が残留するが不適合二重鎖は完全に融解するような条件が容易に発見された。
【００５１】
従って、本発明を用いてＤＮＡの長いフラグメントおよびオリゴヌクレオチド分析することができる、この例は突然変異の核酸配列を調べるために本発明を如何に利用するかを示す。特に、遺伝疾患の診断にどのように利用するかを示す。
【００５２】
実施例５
先駆物質をレイダウンさせるための自動化系をテストするために、上記のやり方で加えた１２塩基の中の１１塩基を用いてｃｏｓＬオリゴヌクレオチドを合成した。しかし、第７塩基を加えるために、スライドをペンプロッター含有アルゴン充てん室に移した。プロッターのペンを、ペンと同じ形状およびサイズを有するが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）チューブをも有し、これを通して化学薬品がプロッターの床に配置されたガラススライドの表面に放出される「ナイロン製」の要素と取り替えた。マイクロコンピューターを用いてプロッターと、化学薬品を放出する注射器ポンプとを制御した。注射器からの放出チューブを有するペンはスライド上の位置に移動し、ペンが降下し、ポンプが始動してカップリング溶液をレイダウンさせる。ペンに連続的にＧ、ＴおよびＡホスホーラミジド溶液を充てんし、１２スポットのアレイを３種類のオリゴヌクレオチド配列を有する、４個ずつの３グループとしてレイダウンさせた。例２に述べたようにｃｏｓＬにハイブリッド形成し、オートラジオグラフィーした後に、シグナルはｄＧを加えた完全適合オリゴヌクレオチドの４スポット上でのみ見られた。
【００５３】
結論として、次のことを実証した。
１．平たいガラスプレート上で良好な収量においてオリゴヌクレオチドを合成することができる。
２．サンプル上の小スポットにおいて高密度で、多重配列を簡単な手動方法またはコンピューター制御装置を用いて自動的に合成することができる。
３．プレート上でのオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成を非常に簡単な方法で実施することができる。ハイブリッド形成は効果的であり、ハイブリッドは短時間のオートラジオグラフィー暴露によって検出することができる。
４．ハイブリッド形成は特異的である。オリゴヌクレオチドが存在しないプレート部分ではシグナルが検出されない。不適合塩基の効果を調べ、１２マー〜１９マーの長さの範囲内のオリゴヌクレオチドのいずれかの位置での単独不適合塩基がハイブリッドの安定性を充分に低下させ、シグナルは非常に低いレベルに低下するが、完全適合ハイブリッドへの有意なハイブリッド形成は保有される。
５．オリゴヌクレオチドはガラスに安定に結合し、プレートはハイブリッド形成に反復して用いることができる。
【００５４】
本発明はこのように、ヌクレオチド配列の新規な分析方法を提供し、広範囲な用途を見出すと思われる。可能な用途の幾つかを下記に挙げる：
フィンガープリントまたはマッピングツールとしてのオリゴヌクレオチドの小アレイ
遺伝疾患を含めた既知突然変異の分析
上記例４は本発明を如何に用いて突然変異を分析するかを示す。遺伝病の検出を含めてこのような方法には多くの用途がある。
【００５５】
ゲノムフィンガープリンティング
検出可能な疾患を生ずる突然変異と同様に、この方法を用いてＤＮＡのいずれかの区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）における点変異を検出することができる。制限フラグメント長さ多型性（ＲＦＬＰ）を生ずる塩基差を含む多くの領域に関する塩基配列が現在入手可能である。このような多型性を示すオリゴヌクレオチドのアレイは２つの対立制限部位を表すオリゴヌクレオチド対から製造することができる。ＲＦＬＰを含む配列の増幅および次のプレートへのハイブリッド形成は、試験ゲノム中にどのような対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）が存在するかを示すことができる。単独分析で分析することのできるオリゴヌクレオチド数は非常に大きい。選択した対立遺伝子から製造した５０対は個体に特有のフィンガープリントを与えるために充分である。
【００５６】
結合分析
最後のパラグラフに述べた方法を系図（ｐｅｄｉｇｒｅｅ）に適用すると、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が指摘される。アレイ中の各スポット対はゲル電気泳動とプロッティングを用いたＲＦＬＰ分析のトラックに認められるような情報を与え、これは現在ルーチンに結合研究に用いられている。オリゴヌクレオチドの対立遺伝子対のアレイへのハイブリッド形成によって、単独分析において多くの対立遺伝子対を分析することが可能になり、これはＤＮＡ多型性と例えば疾患遺伝子のような表現型マーカーとの間の結合の検出に用いられる方法を非常に簡単化する。
【００５７】
上記例は我々が開発し、実験によって実証した方法を用いて実施することができる。
【００５８】
配列読み取りツールとしてのオリゴヌクレオチドの大きなアレイ
オリゴヌクレオチドが小パッチ内の正確に定めた位置に２方法の１つによって、すなわちペンプロッターのペンから先駆物質を放出することによってまたはシリコーンゴムで部分を遮へいすることによって合成できることを示した。各位置に異なる配列を有する大きなアレイの合成にペンプロッターを用いる方法は明白である。幾つかの用途に対して、アレイは予め定められ、限定されたセットでありうるが、他の用途に対しては、アレイは予め定められた長さの各配列から構成される。後者に対して遮へい方法は交差ラインを形成するマスク中に先駆物質をレイダウンすることによって用いられる。これを実施する多くの方法があるが、１例のみを説明のために用いる：
１．最初の４塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔを方形プレート上の４本の幅広ストリップ中に配置する。
【００５９】
２．第２セットを第１ストリップと等しい幅であり、第１ストリップと直交する４本のストリップ中にレイダウンする。アレイをすべてで１６個のジヌクレオチドから構成する。
【００６０】
３．第３層と第４層を第１ストリップの幅の１／４である４ストリップの４セット中にレイダウンする。４本の狭いストリップの各セットは幅広ストリップの１本の内を通る。この場合にアレイはすべてで２５６個のテトラヌクレオチドから構成される。
【００６１】
４．各回に先行２層の幅の１／４であるストリップによって２層をレイダウンすることによって、プロセスをくり返す。加えた各層はオリゴヌクレオチドの長さを１塩基だけ伸長し、異なるオリゴヌクレオチド配列の数を４の倍数ずつ増やす。
【００６２】
このようなアレイのサイズはストリップの幅によって定まる。配置した最も狭いストリップは１ｍｍであるが、これが下限でないことは明らかである。
【００６３】
塩基配列の一部が予め定められたものであり、一部があらゆる可能な配列から構成されたものであるアレイには有用な用途が存在する。例えば、ｍＲＮＡ集団の特徴付けである。
【００６４】
ｍＲＮＡ集団の特徴付け
高級真核生物中の大ていのｍＲＮＡは３′末端近くに配列ＡＡＵＡＡＡを有している。ｍＲＮＡ分析に用いられるアレイはプレート全体でこの配列を有すると考えられる。ｍＲＮＡ集団を分析するには、これをＮｍＡＡＴＡＡＡＮｎ型のすべての配列から成るアレイとハイブリッド形成させる。例えば哺乳動物細胞のような入手源に存在すると考えられる数千のｍＲＮＡの大部分に対する非反復オリゴヌクレオチド表現を与えるために充分であるｍ＋ｎ＝８に対して、アレイは２５６要素平方である。上記遮へい方法を用いて２５６×２５６要素をＡＡＴＡＡＡ上に配置する。約１ｍｍのストリップでは、アレイは約２５６ｍｍ平方であると考えられる。
【００６５】
この分析はｍＲＮＡ集団の複合度を測定し、異なる細胞型からの集団の比較の根拠として用いられる。このアプローチの利点はハイブリッド形成パターンの差が集団において異なるすべてのｍＲＮＡを単離させるために用いられるオリゴヌクレオチドの配列を形成することである。
【００６６】
塩基配列決定
特定の長さのあらゆる可能なオリゴヌクレオチドから成るアレイを用いて、この概念を未知塩基配列の決定にまで拡大することは、我々が現在までに合成したよりも大きなアレイを必要とする。しかし、スポットのサイズをスケールダウンさせ、数を我々が開発した小アレイでテストしてきた方法の拡大によって必要とされる数にスケールアップすることが可能である。我々の経験によると、この方法はゲルに基づく方法よりも操作が非常に簡単である。
【００６７】
【表１】

【００６８】
【配列表】

Claims (32)

1. オリゴヌクレオチドのアレイであって、但し、（ａ）多数の公知の区域を含み、（ｂ）各公知区域がその中に配置されたオリゴヌクレオチドを有し、（ｃ）一つの公知の区域内に配置されたオリゴヌクレオチドが別の区域に配置されたオリゴヌクレオチドとは異なり、そして、（ｄ）不透過性支持体に共有結合している、アレイ。
2. 公知の区域が約１０μｍから約１００μｍの間のサイズを有する、請求項１記載のアレイ。
3. 不透過性支持体がガラス製である、請求項１記載のアレイ。
4. ７２から１．１×１０^１２の公知区域を含む、請求項１記載のアレイ。
5. 各オリゴヌクレオチドの長さが８から２０ヌクレオチドである、請求項１記載のアレイ。
6. ポリヌクレオチドを分析するための装置であって、但し、装置が異なるオリゴヌクレオチドのアレイをその不透過性表面上に結合して支持体を含み、オリゴヌクレオチドがアレイの公知の区域を占め、アレイの一つの公知の区域のオリゴヌクレオチドの配列がアレイの別の公知区域のオリゴヌクレオチドの配列とは異なる、装置。
7. オリゴヌクレオチドが支持体に対して共有結合を通して結合している、請求項６記載の装置。
8. 公知の区域が約１０μｍから約１００μｍのサイズを有する、請求項６記載の装置。
9. 支持体がガラス製である、請求項６記載の装置。
10. ７２から１．１×１０^１２の公知区域を含む、請求項６記載の装置。
11. 各オリゴヌクレオチドの長さが８から２０ヌクレオチドである、請求項６記載の装置。
12. ポリヌクレオチドを分析するための装置であって、但し、装置は、（ｉ）不透過性表面を有する支持体；及び（ｉｉ）規定された配列を有する異なるオリゴヌクレオチドのアレイを有し、但し、（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドはアレイの公知の区域を占め；（ｉｖ）アレイの一つの公知の区域のオリゴヌクレオチドの規定された配列がアレイの別の公知区域のオリゴヌクレオチドの規定された配列とは異なり、そして（ｖ）アレイが共有結合を通して支持体表面上に結合している、装置。
13. オリゴヌクレオチドが支持体に対して共有結合を通して結合している、請求項１２記載の装置。
14. 公知の区域が約１０μｍから約１００μｍのサイズを有する、請求項１２記載の装置。
15. 支持体がガラス製である、請求項１２記載の装置。
16. ７２から１．１×１０^１２の公知区域を含む、請求項１２記載の装置。
17. 各オリゴヌクレオチドの長さが８から２０ヌクレオチドである、請求項１２記載の装置。
18. ポリヌクレオチドを分析するための装置であって、但し、装置は、少なくとも２つの公知の区域に分離された不透過性ガラス支持体を含み、支持体は共有結合により結合したオリゴヌクレオチドを有し、第１の公知区域のオリゴヌクレオチドの配列が第２の公知区域のオリゴヌクレオチドの配列とは異なる、装置。
19. 公知の区域が約１０μｍから約１００μｍのサイズを有する、請求項１８記載の装置。
20. 支持体がガラス製である、請求項１８記載の装置。
21. ７２から１．１×１０^１２の公知区域を含む、請求項１８記載の装置。
22. 各オリゴヌクレオチドの長さが８から２０ヌクレオチドである、請求項１８記載の装置。
23. ポリヌクレオチドを分析するための装置であって、但し、装置は、少なくとも２つの公知の区域に分離された不透過性ガラス支持体を含み、当該区域にはオリゴヌクレオチドが共有結合により結合し、第１の公知区域のオリゴヌクレオチドの配列が第２の公知区域のオリゴヌクレオチドの配列とは異なる、装置。
24. 公知の区域が約１０μｍから約１００μｍのサイズを有する、請求項２３記載の装置。
25. ７２から１．１×１０^１２の公知区域を含む、請求項２３記載の装置。
26. 各オリゴヌクレオチドの長さが８から２０ヌクレオチドである、請求項２３記載の装置。
27. ポリヌクレオチドを分析するための方法であって、
    分析される標識ポリヌクレオチド又はその断片をハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのアレイに適用するが、但し、アレイは予め決定された異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドが支持体の公知の異なる区域にリンカーを通して共有結合した不透過性支持体を含み、そして
    ポリヌクレオチド又はその断片がハイブリダイズした領域及びポリヌクレオチド又はその断片がハイブリダイズしなかった領域を観察することにより、ポリヌクレオチドを分析すること
    を含む方法。
28. 不透過性支持体がシリコーン製である、請求項２７記載の方法。
29. 不透過性支持体がガラス製である、請求項２７記載の方法。
30. ポリヌクレオチドをランダムに分解して選択された長さのオリゴヌクレオチドの混合物を形成し、当該混合物はその後に標識されてアレイに適用される標識核酸を形成する、請求項２７記載の方法。
31. ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片が^３２Ｐ又は蛍光標識により標識される、請求項２７記載の方法。
32. ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片がｍＲＮＡ、ゲノミックＤＮＡ又はＰＣＲ産物である、請求項２７記載の方法。