ES2392348T3

ES2392348T3 - Cerveza estabilizada microbiológicamente

Info

Publication number: ES2392348T3
Application number: ES06753686T
Authority: ES
Inventors: Tillmann DÖRR; Lutz Guderjahn; Jörg Kowalczyk; Roland Pahl; Jan Schneider
Original assignee: Suedzucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 2005-10-26
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2012-12-07
Anticipated expiration: 2026-05-17
Also published as: EP1943327B1; RU2380400C1; CN101346458B; AU2006308258B2; WO2007048450A8; NO20082305L; EP1943328B1; WO2007048450A1; RU2008120678A; JP2009513114A; MY147478A; WO2007048449A1; KR101189651B1; EP1943328A1; BRPI0617878A2; KR20080060283A; AU2006308259B2; CN101346458A; JP4864977B2; US9359586B2

Abstract

Procedimiento para la fabricación de cerveza o una bebida mixta a base de cerveza, estabilizadamicrobiológicamente, que comprende las siguientes etapas:a) mezclar agua de fabricación de cerveza, lúpulo y una fuente de hidratos de carbono para obtener un mosto,b) cocción del mosto yc) fermentación microbiana del mosto,caracterizado porque se añade isomaltulosa de forma adicional o exclusivamente después de la filtración de lacerveza o bien, adicional o exclusivamente, justo antes del envasado o antes del almacenamiento de la cerveza o dela bebida mixta a base de cerveza.

Description

Cerveza estabilizada microbiologicamente

5 La presente invencion se refiere a medios y a un procedimiento para la fabricacion de cerveza estabilizada microbiologicamente. En los ultimos diez afos aproximadamente ha surgido otra vez un gran numero de pequefas cervecerias, las denominadas cervecerias caseras o artesanas ("pub breweries") que se distinguen de las grandes cervecerias sobre todo por su reducido volumen de produccion, que casi siempre cubre solo el despacho en el propio establecimiento y la venta directa de pequefos envases tales como botellas, asi como por un proceso cervecero y de envasado mas sencillo. Mientras que, sobre todo las grandes cervecerias, mantienen instalaciones industriales a gran escala con las que se

15 puede producir y envasar la cerveza en condiciones que inhiben los germenes o de baja contaminacion microbiologica, muchas pequefas cervecerias carecen de las correspondientes medidas de prevencion. Para las pequefas cervecerias las medidas constructivas o a nivel de procedimiento que aseguran estas condiciones favorables en las que se evita por completo una contaminacion con microorganismos que dafan la cerveza, casi nunca resultan economicamente atractivas. Por otro lado, precisamente la fabricacion y el envase con baja contaminacion microbiologica tiene un efecto positivo sobre el resultado del proceso cervecero; muchos de los microorganismos introducidos durante la fabricacion "dafan la cerveza". Una cerveza fabricada con pocos organismos que la dafan es apta para un almacenamiento prolongado y puede ser envasada facilmente en botellas o en barriles incluso en un entorno no totalmente libre de germenes, sin

25 que se espere un resultado negativo. Resulta preferible poner a disposicion procedimientos y medios sencillos y economicos que permitan tanto a las grandes cervecerias industriales como tambien a las pequefas cervecerias llevar a cabo la fabricacion y el envasado de cerveza que este estabilizada microbiologicamente. El riesgo de contaminacion, es decir de una desestabilizacion microbiologica de la cerveza, existe sobre todo en relacion con el envasado de la cerveza en botellas, barriles o envases similares. Con "baja contaminacion microbiologica" no se entiende una total asepsia. El numero de germenes que dafan la cerveza presentes en la misma, especialmente microorganismos tales como bacterias y hongos, deberia ser tan reducido que la cerveza no se deteriore durante los prolongados tiempos de almacenamiento de semanas y meses. Si se mantiene reducido el numero de los germenes que dafan la cerveza existira una menor probabilidad de que se desarrollen cultivos que

35 perjudiquen a la cerveza. Preferentemente, el envasado se realiza de forma esteril a efectos de bebida o a efectos de cerveza, respectivamente. Por el estado de la tecnica se conocen procedimientos para el envasado de cerveza y otras bebidas con baja contaminacion microbiologica. Un envasado de cerveza con baja contaminacion microbiologica puede realizarse con un coste de vigilancia biologica. En este caso, se toman medidas de limpieza y esterilizacion intensivas en las instalaciones de envasado y las correspondientes salas. Estas medidas van acompafadas de un elevado gasto en controles biologicos y tambien de mucho trabajo y elevados costes. Tanto para la permanente vigilancia de la baja contaminacion microbiologica como tambien para su mantenimiento se han de tomar en parte medidas costosas a nivel de aparatos o procedimientos. Sin embargo, la seguridad resulta insuficiente si se compara con el gasto

45 necesario. Por lo tanto, estas medidas se adoptan rara vez. Para el envasado de bebidas azucaradas con una base de cerveza, tales como bebidas mixtas a base de cerveza o cerveza de malta las cuales presentan un muy alto riesgo de contaminacion, el procedimiento no es suficientemente seguro. Otra medida para el envasado de cerveza con baja contaminacion microbiologica es la breve pasteurizacion a temperatura elevada (HTST). A tal efecto la cerveza es calentada mediante un pasteurizador, casi siempre al pasar por un intercambiador de calor de placas, y a continuacion es enfriada otra vez. El pasteurizador se instala, de forma idonea, directamente delante del envasador. No obstante existe el peligro de una contaminacion secundaria, por ejemplo durante el proceso de envasado o por envasar en envases ya contaminados. La pasteurizacion HTST es una medida que se adopta a menudo; sin embargo, no es suficientemente segura para el envasado de bebidas

55 azucaradas con una base de cerveza. Otra medida para el envasado de cerveza con baja contaminacion microbiologica es la filtracion por membrana o la esterilizacion en frio. El procedimiento corresponde basicamente al procedimiento HTST, pero en lugar de un pasteurizador se utiliza un sistema de filtracion por membrana para reducir los germenes que, debido al tamafo de los poros del filtro, hace posible la separacion de los microorganismos presentes en la cerveza. Tambien en este caso existe el peligro de una contaminacion secundaria. Este procedimiento tampoco resulta suficientemente seguro para el envasado de bebidas azucaradas con base de cerveza. Otra medida consiste en la pasteurizacion total de botellas o latas ya envasadas y cerradas, preferentemente en el

65 pasteurizador de tunel o de camara. En este procedimiento, los envases en los que se ha envasado la cerveza se han calentado, por ejemplo, mediante agua caliente o vapor y, a continuacion, se han enfriado otra vez. Este

procedimiento se utiliza a menudo en cervecerias con largos trayectos de distribucion, por ejemplo para la exportacion de cerveza a ultramar. En este caso, se puede controlar el peligro de una contaminacion secundaria durante el envasado. De esta manera, se pueden estabilizar biologicamente, de forma suficientemente segura, incluso bebidas azucaradas tales como la cerveza de malta o bebidas mixtas a base de cerveza. Debido al elevado gasto en aparatos, este procedimiento resulta costoso. Ademas de los elevados costes corrientes, tales como un elevado consumo de agua y de energia, tambien resultan desventajosos los elevados costes de inversion para las instalaciones asi como la necesidad de un mayor espacio. Ademas, los envases y sus cierres estan expuestos regularmente a altas exigencias (especialmente referente a la estabilidad termica y de presion). Por ejemplo, las botellas de plastico fabricadas del PET habitual en la industria de las bebidas no pueden ser pasteurizadas de acuerdo con el procedimiento conocido. Ademas resulta desventajosa la alteracion del sabor por el proceso de pasteurizacion.

Otras posibilidades para el envasado de cerveza con baja contaminacion microbiologica o para proporcionar cerveza envasada estabilizada microbiologicamente, son procedimientos que se conocen de la industria de zumos y refrescos. Entre ellas esta la esterilizacion quimica. En algunas limonadas la ley alimentaria permite utilizar el conservante dimetil dicarbonato (DMDC) justo antes del envasado. Generalmente esto requiere una pasteurizacion HTST precedente. Si se aplica correctamente, la sustancia afadida actua todavia en la botella envasada y cerrada y se desintegra despues de un cierto tiempo. Un inconveniente constituye la aplicacion de la sustancia que es tecnicamente muy dificil en la cerveceria, ya que resulta perjudicial para la salud y presenta un elevado punto de congelacion. Para cervezas azucaradas, tales como bebidas mixtas a base de cerveza o cerveza de malta, la aplicacion de esta sustancia no es adecuada ya que la concentracion permitida se puede utilizar solo en la parte de limonada o base de limonada concentrada. Pero en relacion con el envasado de la cerveza, la sustancia deberia ser afadida en un momento anterior, de manera que existe el riesgo de que la misma ya no actue en la botella ya llenada. Por lo tanto, la esterilizacion quimica mencionada anteriormente no entra en consideracion en terminos generales.

Otro metodo de envasado conocido del ambito de la industria de zumos y refrescos es el envasado aseptico, es decir libre de germenes. Esto conlleva un considerable gasto en equipos tecnicos tales como sala aseptica y tecnicas de aislamiento. Este procedimiento implica ademas una reorientacion del concepto de garantia de calidad incluyendo la validacion y la calificacion de los operarios. Su aplicacion en el envasado de cerveza a gran escala, como tambien en el envasado en cervecerias artesanales no es realista debido al elevado gasto tecnico y organizativo.

Por el documento DE 23 44 252 se describe un procedimiento para la fabricacion de una bebida clara, con bajo contenido de alcohol, similar a la cerveza, con isomaltulosa.

Por los documentos DE 103 61 313 y WO 2005/0616� 0 se describen asimismo procedimientos para la fabricacion de cervezas conbajo contenidode alcohol orefrescos parecidos ala cerveza con isomaltulosa. La GB1.060.6 �1 se refiere a un procedimiento para la fabricacion de bebidas alcoholicas y describe procedimientos de estabilizacion microbiologica.

El problema tecnico que sirvio de punto de partida para la presente invencion consiste, por consiguiente, substancialmente en el hecho de proporcionar procedimientos y medios para la fabricacion y el envasado de cerveza

: o bebidas mixtas a base de cerveza que puedan ser llevados a cabo de forma muy sencilla y economica, y de reducir de forma mas eficaz o estabilizar el numero de microorganismos que dafan la cerveza durante y/o despues de su fabricacion. Debido a ello se debe obtener una cerveza o una bebida mixta a base de cerveza estabilizada microbiologicamente en el estado envasado. Ademas, los procedimientos y medios deben ser aptos para su aplicacion en procedimientos de fabricacion de cerveza conocidos y en instalaciones cerveceras conocidas sin que ello requiera una adaptacion esencial de las etapas del proceso.

El problema tecnico se resuelve porque se proporciona un procedimiento para la fabricacion de cerveza o de una bebida mixta a base de cerveza estabilizada microbiologicamente a partir de agua cervecera, lupulo y, como minimo, una fuente de hidratos de carbono, en el que en una primera etapa (a) se mezclan el agua cervecera, el lupulo y una fuente de hidratos de carbono formando un mosto. En una etapa siguiente (b) se hierve el mosto. En otra etapa siguiente (c) se realiza una fermentacion microbiana del mosto. El procedimiento de la invencion se caracteriza porque la isomaltulosa es afadida adicional o exclusivamente despues de la filtracion de la cerveza, o bien adicional

: o exclusivamente justo antes del envasado o antes del almacenamiento de la cerveza o de la bebida mixta a base de cerveza.

Es decir, que la invencion ensefa a elaborar cerveza o bebidas mixtas a base de cerveza a partir de agua cervecera, lupulo y una fuente de hidratos de carbono a la que se afade isomaltulosa o una mezcla que contenga isomaltulosa como agente estabilizador. Sorprendentemente, los inventores encontraron que la isomaltulosa o una mezcla que contenga isomaltulosa reduce en la fuente de hidratos de carbono, el numero de microorganismos reconocidos como desventajoso, es decir que dafan la cerveza, o estabiliza la cerveza que se obtiene microbiologicamente. Debido a la isomaltulosa o la mezcla que contiene isolmaltulosa el numero de estos microorganismos no crece en el siguiente proceso de fabricacion ni durante el envasado, de manera que a

continuacion se obtiene una cerveza con bajo contenido en germenes o esencialmente libre de germenes que dafan la cerveza la cual presenta una estabilidad microbiana. La cerveza obtenida y envasada de esta manera es entonces apta para un almacenamiento prolongado.

Con "estabilizado microbiologicamente" o "estabilizacion microbiologica" se entiende a efectos de la presente invencion, que un alimento expuesto generalmente a la contaminacion y al deterioro presenta determinadas propiedades debido a las cuales se suprime o se impide completamente el crecimiento posterior o indeseado de microorganismos. Estos microorganismos, tambien denominados germenes, son en primer lugar bacterias y hongos tales como mohos o levaduras. A los mismos pertenecen no solamente aquellos organismos que, debido a su actividad metabolica influyen negativamente en la calidad y el sabor del alimento, sino tambien germenes potencialmente patogenos que pueden poner en peligro la salud del hombre. La estabilizacion microbiologica, segun la invencion, hace que el numero de estos microorganismos no sobrepase un umbral determinado en periodos oportunos de almacenamiento, de manera que el alimento no se deteriore o que implique un riesgo para la salud.

Tal como un experto en la materia puede reconocer facilmente, en el contexto de la presente invencion, como "cerveza" no se entiende solamente una cerveza que se obtiene una vez fermentado completamente o casi completamente el mosto, es decir, los componentes de hidratos de carbono contenidos en la misma. Segun la presente invencion, como cerveza se entiende tambien una bebida mixta a base de cerveza que se obtiene cuando se afade a la cerveza antes, durante o despues de su fabricacion, como minimo, otro componente de hidratos de carbono que no ha sido fermentado o solo parcialmente. Mediante la presente invencion, como cerveza se entiende, por ejemplo, una bebida mixta a base de cerveza, donde a una cerveza elaborada de forma convencional se le ha afadido isomaltulosa, durante o despues de su fabricacion.

El agente estabilizador puede ser afadido tambien a una fuente de hidratos de carbono que contiene cereales malteados (malta), el fruto crudo de cereales o una mezcla de cereales malteados y el fruto crudo de cereales. En la fuente de hidratos de carbono utilizada, se sustituye preferentemente de forma parcial la malta y/o el fruto crudo por isomaltulosa o por una mezcla que contiene isomaltulosa. La relacion entre los demas componentes de la fuente de hidratos de carbono, es decir, especialmente de la malta y/o del fruto crudo de cereales, y la isomaltulosa afadida puede ser desde 6:1 hasta 1:1, preferentemente de 4:1 a 2:1, muy preferentemente, en funcion del campo de aplicacion, precisamente 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 o 1:1.

A efectos de modificar lo menos posible los procedimientos conocidos y probados para la fabricacion de cerveza, la isomaltulosa, o la mezcla que contiene isomaltulosa, es afadida a la fuente de hidratos de carbono, preferentemente antes de mezclar esta con el agua cervecera y el lupulo, y preferentemente en forma de sirope, solucion y/o como solido cristalino. A tal efecto, se afade la isomaltulosa o la mezcla que contiene isomaltulosa junto con la restante fuente de hidratos de carbono, el agua cervecera y el lupulo al mosto.

La isomaltulosa tambien puede ser afadida a la cerveza en la sala de coccion y pasar a continuacion por todo el proceso de fermentacion principal y secundario.

La isomaltulosa tambien puede ser afadida exclusiva o adicionalmente despues de la fermentacion principal. Mediante la adicion de la isomaltulosa, despues de la fermentacion principal, se garantiza que la isomaltulosa no pueda ser metabolizada durante dicha fermentacion principal, sin embargo, la levadura todavia suele presentar una actividad residual durante la fermentacion secundaria.

De acuerdo con la invencion, la isomaltulosa es afadida a la cerveza, adicional o exclusivamente, solo despues de la filtracion. Al afadir la isomaltulosa a la cerveza despues de la filtracion, debido a la separacion de la levadura, la mezcla no es sometida a ningunas alteraciones por los procesos de fermentacion deseados.

De acuerdo con la invencion, la isomaltulosa es afadida alternativa, adicional o exclusivamente, justo antes del envasado o antes del almacenamiento de la cerveza o de la bebida mixta a base de cerveza.

Segun la invencion, en las modalidades de la adicion de isomaltulosa, esta actua de acuerdo con la invencion como un agente estabilizador que inhibe el crecimiento de germenes o inhibidor microbiano. En todo caso, la adicion de isomaltulosa, ya sea en forma de sirope, de solucion o como solido cristalino, puede ser incorporada sin problemas en procedimientos de fabricacion de cerveza conocidos, de manera que se evita un gasto adicional en la realizacion del procedimiento o en aparatos.

Sobre todo en bebidas mixtas a base de cerveza que, debido a su contenido en limonada, son generalmente mas perecederos, la utilizacion de isomaltulosa en la parte de cerveza contribuye a mejorar notablemente la estabilidad biologica de la bebida mixta a base de cerveza. Ademas, se obtienen otras ventajas conocidas tales como la aptitud para diabeticos de la bebida mixta a base de cerveza que se ha fabricado.

Sorprendentemente, la utilizacion preferente, segun la invencion, de la isomaltulosa en bebidas mixtas a base de cerveza no produce el efecto desventajoso del deterioro del sabor que se conoce de otros sustitutos del azucar o sustancias edulcorantes. En especial, la adicion de isomaltulosa a la cerveza o a bebidas mixtas a base de cerveza

no altera aspectos de sabor como la plenitud de sabor en boca, o solo de forma insignificante.

Por lo tanto, tambien es posible fabricar una cerveza o una bebida mixta a base de cerveza que contiene isomaltulosa como agente endulzante. Preferentemente, la isomaltulosa esta contenida como el unico agente endulzante. Ademas, la isomaltulosa esta contenida preferentemente como el unico agente endulzante que confiere cuerpo.

Por lo tanto, tambien constituye un objeto de la presente invencion la utilizacion de la isomaltulosa como un agente estabilizador o inhibidor microbiano para la fabricacion, sobre todo para el envasado, de cerveza o bebidas mixtas a base de cerveza con baja contaminacion microbiologica, especialmente de acuerdo con el procedimiento de la invencion descrito por la presente y sus variaciones preferentes, segun la invencion.

La isomaltulosa es un azucar reductor que sorprendentemente no puede ser asimilado y metabolizado, o solamente con mucha dificultad, por las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis. La isomaltulosa (6�O a D glucopiranosilfructosa), conocida con el nombre de PalatinoseTM, es una quetosa de disacarido presente en la naturaleza, por ejemplo en la miel. Segun el documento DE 44 14 1�5 C1, la isomaltulosa puede ser fabricada a gran escala a partir de sacarosa mediante transposicion enzimatica, por ejemplo, utilizando celulas bacterianas inmovilizadas, especialmente de la especie Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici y Serratia p/ymuthica o una sacarosa� isomerasa aislada de las mismas.

Una "mezcla que contiene isomaltulosa" es una combinacion de isomaltulosa con, como minimo, otro hidrato de carbono, especialmente fructosa, glucosa, sacarosa, trehalulosa, leucrosa, tagatosa, turanosa, isomaltulosa, isomelizitosa, oligosacaridos con un grado de polimerizacion de 3 6 4 o mas, o mezclas de las mismas. Segun una variante la mezcla contiene isomaltulosa y fructosa, segun otra variante la mezcla contiene isomaltulosa y sacarosa, segun otra variante la mezcla contiene isomaltulosa y trehalulosa, segun otra variante la mezcla contiene isomaltulosa y leucrosa, segun otra variante la mezcla contiene isomaltulosa y tagatosa, segun otra variante la mezcla contiene isomaltulosa y turanosa, segun otra variante la mezcla contiene isomaltulosa e isomaltosa, segun otra variante la mezcla contiene isomaltulosa e isomelizitosa, segun otra variante la mezcla contiene isomaltulosa y oligosacaridos con un grado de polimerizacion de 3 o 4 o mas. Segun una realizacion preferente, la mezcla que contiene isomaltulosa es el producto de la isomerizacion de la sacarosa que se obtiene mediante transglucosilacion de la sacarosa, preferentemente utilizando celulas muertas o vivas de Protaminobacter rubrum o de extractos enzimaticos producidos a partir de las mismas. Las mezclas que contienen isomaltulosa incluyen, segun una realizacion muy preferente de la invencion, aproximadamente ��5 % de isomaltulosa, 10 % de trehalulosa, 0,5 �2 % de sacarosa, 1�1,5 % de isomaltosa, oligosacaridos, 2,5� 3,5 % de fructosa y 2,0�2,5 % de glucosa o estan hechos con ello, siendo las indicaciones referidas al contenido porcentual en solidos.

Como "mosto" se entiende el extracto de una fuente de hidratos de carbono como, por ejemplo malta, que ha sido liberado de componentes insolubles y que se mezcla con agua y, preferentemente lupulo, y se cuece. Tras la coccion con lupulo se obtiene el denominado mosto de bombeo (Ausschlagwurze). Una vez enfriado el mosto cocido se presenta como mosto a "levadurizar" (Anstellwurze). El mosto se elabora preferentemente mediante maceracion, clarificacion, coccion del mosto y tratamiento del mosto. La elaboracion del mosto tiene especialmente el fin de transformar los componentes, en un principio no disueltos, de la fuente de hidratos de carbono, especialmente malta, en sustancias solubles y fermentables, separar los componentes solidos que quedan y, finalmente, afadir la especie, es decir el lupulo. En la maceracion se mezcla preferentemente primero la fuente de hidratos de carbono triturada, en especial malta, con el agua cervecera. A continuacion sigue, preferentemente en el denominado proceso de maceracion, segun un programa especifico de temperatura y tiempo, una transformacion enzimatica dirigida de las sustancias contenidas en la fuente de hidratos de carbono, en el que el proceso mas importante es la degradacion completa de almidon en azucares fermentables tales como glucosa, maltosa o maltotriosa y dextrinas no fermentables. La temperatura optima para la formacion de maltosa esta en 600 650 C, para la formacion de dextrina en �00 �50 C. La temperatura determina el grado de fermentacion final del mosto en funcion del tipo de cerveza. Tras la clarificacion y el endulzamiento del orujo con agua caliente (� �0 C), el mosto es cocido preferentemente durante 60 hasta 100 min, preferentemente con adicion de lupulo, afadiendo en funcion del tipo de cerveza a fabricar preferentemente aproximadamente 150 hasta 500 g/hl de lupulo. Mediante la evaporacion de preferentemente 6�10 %, aproximadamente, de la cantidad inicial se ajusta el contenido en mosto original. Durante la coccion tiene lugar ademas una esterilizacion, se produce la coagulacion de sustancias proteicas, la isomerizacion de las sustancias amargas del lupulo y la formacion y parcialmente tambien la evaporacion de sustancias aromaticas. A continuacion, el mosto cocido y lupulizado es liberado de turbios, preferentemente, en un tanque Whirlpool (= de clarificacion por remolino) y/o mediante filtracion. Tras el enfriamiento del mosto que se realiza habitualmente en intercambiadores de calor de placas, se eliminan parcialmente los turbios frios y se lleva a cabo un aireado intensivo para suministrar oxigeno a los microorganismos utilizados para la fermentacion. Inmediatamente despues se afade al mosto preferentemente, como minimo, un microorganismo adecuado, capaz de provocar la fermentacion, como por ejemplo levadura. Dado que el mosto utilizado para la fermentacion puede contener diferentes fuentes de hidratos de carbono, aplicando el procedimiento de la invencion se pueden elaborar tambien cervezas claras u oscuras, estabilizadas microbiologicamente.

Tambien se puede sustituir una parte del extracto de mosto por isomaltulosa. Asi se reduce la porcion de hidratos de

carbono metabolizables en el mosto, de manera que preferentemente se reduce ademas el contenido de alcohol de la bebida fabricada con respecto al de una cerveza normal. El contenido de alcohol de las cervezas fabricadas de forma estabilizada microbiologicamente, segun el procedimiento de la invencion, puede ser bajado en su caso utilizando un procedimiento de extraccion de alcohol. Con "cerveza sin alcohol" se entiende una cerveza con un contenido de alcohol de menos de 0,5 % que presenta preferentemente de un al % aproximadamente de mosto original. (Las indicaciones en % se refieren a % en volumen, si no se indica lo contrario). Con una "cerveza de bajo contenido de alcohol" se entiende, segun la invencion una cerveza que presenta un contenido de alcohol de menos del 5 %, especialmente de menos del 4 %.

Con una "fuente de hidratos de carbono" se entiende materiales que contienen hidratos de carbono tales como cereales en los que los hidratos de carbono pueden ser transformados durante la elaboracion del mosto al menos parcialmente en azucares solubles y fermentables tales como glucosa, maltosa o maltotriosa que son utilizados durante la fermentacion por microorganismos, en especial por levaduras, como fuente de hidratos de carbono. Segun una realizacion preferente de la invencion la fuente de hidratos de carbono utilizada esta formada por cereales malteados, fruto crudo o una mezcla de ambos.

Los cereales malteados son preferentemente granos y semillas de cebada, trigo, centeno, avena, mijo, triticale, arroz, sorgo y/o maiz que han sido sometidos a un procedimiento de fabricacion de malta. El fruto crudo esta formado preferentemente por granos y semillas de cebada, trigo, centeno, avena, mijo, sorgo, triticale, arroz y/o maiz que que han sido triturados pero no malteados.

Preferentemente, los materiales de partida son azucarados antes de la fermentacion. A tal efecto, se utilizan las enzimas propias de la malta que tienen un efecto hidrolitico tales como las amilasas, las maltasas, etc. que transforman el almidon en dextrinas no fermentables y glucosa, maltosa y maltotriosa fermentable. En el malteado, se deja germinar los cereales ablandados preferentemente de 120 C hasta 1�0 C, y se interrumpe este proceso de germinacion en el momento en el que la formacion de enzimas y los procesos de disolucion han alcanzado la medida deseada. Esto se realiza preferentemente mediante la aplicacion de temperaturas elevadas con un gran caudal de aire. Mediante presecado aproximadamente de 40 hasta 500 C ("Schwelken") se puede reducir el contenido en agua de mas del 50% a 10 hasta 12%. A continuacion, se puede elevar la temperatura preferentemente de �0 hasta �50 C aproximadamente para reducir el contenido de agua de la malta preferentemente de 4 hasta 5 %, aproximadamente. Este proceso recibe el nombre de "Darren" (= secado).

El proceso de fermentacion se realiza preferentemente en dos etapas. La fermentacion principal se inicia mediante adicion de microorganismos, en especial levaduras, levaduras de fermentacion baja o levaduras de fermentacion alta. Al final de la fermentacion principal la levadura se sedimenta en el fondo o en el cono del recipiente de fermentacion. Preferentemente, la cerveza joven que se obtiene en la fermentacion principal se vuelve a enfriar y a someter a una fermentacion secundaria en la que se fermenta el extracto restante y preferentemente se clarifica la cerveza. Durante la fermentacion desaparece tambien el sabor del mosto y, especialmente durante la fermentacion secundaria se forma el puro sabor de cerveza. El proceso tambien se denomina maduracion. Se puede influir en la fermentacion, por ejemplo, mediante diferentes temperaturas de fermentacion, una produccion por fermentacion alta y baja, fermentacion abierta o fermentacion cerrada, etc.

Preferentemente, para la fermentacion se utiliza un unico o varios de los microorganismos seleccionados de una cepa de Saccharomyces cerevisiae de fermentacion baja, una cepa de Saccharomyces cerevisiae de fermentacion alta, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus y Schizosaccharomyces pombe.

Preferentemente, se elabora una cerveza de fermentacion alta o de fermentacion baja estabilizada microbiologicamente utilizando el procedimiento de la invencion. La cerveza de fermentacion baja se obtiene mediante una fermentacion baja, en la que despues de la fermentacion la levadura se deposita en el fondo del recipiente donde puede ser separada. La cerveza de fermentacion alta es una cerveza que se obtiene mediante fermentacion alta en la que la levadura sube a la superficie al terminar la fermentacion y alli es separada en la medida de lo posible.

Segun otra realizacion preferente de la invencion se preve que el proceso de fermentacion se lleva a cabo utilizando, como minimo, una levadura y, como minimo, un acidificador seleccionado del grupo formado por representantes de Lactobacillus sp., Acetobacter sp. y Gluconobacter sp. Segun una variante preferente de esta realizacion se preve, por ejemplo, que la fermentacion se lleve a cabo utilizando S. cerevisiae y/o S. diastaticus y/o Schizosaccharomyces pombe y un representante de Lactobacillus. Los lactobacilos que tambien se conocen como bacterias del acido lactico son capaces de provocar la fermentacion acida de la leche. Las cervezas sin alcohol o de bajo contenido de alcohol o bebidas parecidas a la cerveza elaboradas por una fermentacion de este tipo se caracterizan por un suave sabor acido que se parece mas o menos al de una "Berliner Wei�e" (cerveza blanca de Berlin).

Segun otra variante preferente de esta realizacion se preve, por ejemplo, que la fermentacion se lleve a cabo utilizando S. cervisiae y/o S. diastaticus y/o Schizosaccharomyces pombe y un representante de Acetobacter. El genero Acetobacter comprende, en el sentido mas estricto, las bacterias del acido acetico que pueden formar acido acetico mediante oxidacion de etanol. Confiere un sabor un poco acido a las cervezas sin alcohol o de bajo

contenido de alcohol o a las bebidas parecidas a la cerveza que se han fabricado asi, sabor que se diferencia claramente del de las bebidas obtenidas utilizando Lactobacillus.

Segun otra variante preferente de esta realizacion se preve por ejemplo que la fermentacion se lleve a cabo utilizando S. cerevisiae y/o S. diastaticus y/o Schizosaccharomyces pombe y un representante de Gluconobacter. El Gluconobacter puede oxidar por un lado etanol para obtener acido acetico y, por otro lado, glucosa para obtener acido gluconico. Las cervezas sin alcohol o de bajo contenido de alcohol o bebidas parecidas a la cerveza elaboradas mediante esta fermentacion mixta presentan asimismo un agradable sabor acido.

Por lo tanto, tambien es objeto de la presente invencion una cerveza estabilizada microbiologicamente que puede ser fabricada segun el procedimiento descrito anteriormente y que, preferentemente, es fabricada de acuerdo con este procedimiento.

Tambien es un objeto una cerveza sin alcohol o de bajo contenido de alcohol, una cerveza dietetica, una bebida malteada, una cerveza de malta o un refresco parecido a la cerveza estabilizadas microbiologicamente que han sido fabricadas mediante el procedimiento de la invencion. Segun una realizacion preferente se trata de una cerveza sin alcohol o de bajo contenido de alcohol, clara, estabilizada microbiologicamente, o bien una cerveza sin alcohol o de bajo contenido de alcohol, oscura, estabilizada microbiologicamente.

Como "bebida malteada" se entiende por la presente, especialmente una bebida oscura, con aroma a malta, dulce de malta, poco lupulizada, que contiene acido carbonico, y que ademas es de bajo contenido de alcohol hasta sin alcohol. Preferentemente, la bebida malteada es cocida con aproximadamente % de mosto original a partir de la parte de malta. Tras la filtracion, se ajusta preferentemente con azucares para endulzar (glucosa, sacarosa) a 12% de mosto original (aproximadamente un tercio del mosto original).

Debido a las ventajas de la isomaltulosa con respecto a azucares tradicionales, es decir, sacarosa, tales con menor poder edulcorante, mayor estabilidad microbiologica, aptitud para diabeticos, propiedades anticariogenicas, se puede elegir una porcion mas elevada de isolmaltulosa en el mosto original.

Otro objeto es tambien una bebida mixta a base de cerveza estabilizada microbiologicamente que contiene la cerveza estabilizada microbiologicamente, segun la invencion, y como minimo otro componente elegido entre: extractos de hierbas, aromas, cafeina, colorantes, aminoacidos, acidos alimentarios, componentes frutales tales como zumo de fruta, concentrado de fruta, pulpa de fruta o extractos de fruta, azucar, sustitutos de azucar, tales como alcoholes de azucar, edulcorantes intensivos, agua y aguardiente de vino (etanol). Preferentemente, la bebida mixta a base de cerveza comprende la cerveza estabilizada microbiologicamente, segun la invencion, y como minimo otro componente.

Como "componentes de hierbas" se entienden especialmente: extractos, soluciones, extractos y esencias de partes vegetales, preferentemente de anis, raiz de valeriana, ortiga, hojas de mora, hojas de fresa, hinojo, manto de la virgen, anserina, ginseng, escaramujo, flores de hibisco, hojas de frambuesa, sauco, cebada, jengibre, hierba de San Juan, camomila, coriandro, menta verde, planta de lapacho, lavanda, hierba de limon, mejorana, malva, melisa, muerdago, menta, calendula, romero, genciana, milenrama, tomillo, hisopo, canela, etc.

Como "componentes de fruta" se entiende especialmente: extractos de fruta, preferentemente a partir de manzanas, platanos, peras, pifas, naranjas, pomelos, cerezas, guindas, limones, granadillas, melocotones, espino amarillo, frambuesas, fresas, moras, grosellas, grosellas espinosas, kiwis, etc.

Preferentemente, se preve que la bebida mixta a base de cerveza contenga sustancias olorosas y/o sustancias para dar sabores naturales o identicos al natural como componente aromatico tales como aceites etereos a partir de plantas o frutos tales como el aceite citrico, aceite de menta o aceite de clavo, esencias frutales, zumos de fruta aromatizantes, anis, mentol, eucalipto, etc.

Los componentes colorantes son preferentemente colorantes de origen vegetal tales como carotinoides, flavonoides

o antocianos, colorantes de origen animal, pigmentos inorganicos tales como pigmento de oxido de hierro, productos del bronceado enzimatico y no enzimatico, productos de calentamiento tales como caramelo, colorante caramelo o colorantes sinteticos tales como compuestos azo, trifenilmetano, indigoid, xanteno o quinolina. Colorantes sinteticos apropiados son por ejemplo eritrosina, carmin de indigo o tartrazina que se utilizan para corregir el color y/o para obtener un aspecto atractivo de la bebida mixta a base de cerveza de la invencion.

Los componentes de aminoacidos son preferentemente mezclas de aminoacidos esenciales. Los aminoacidos preferentes son His, Ile, Lys, Thr, Trp, Val y taurina.

Los componentes de acidos son preferentemente acidos alimentarios. Segun una realizacion preferente, las bebidas, segun la invencion, tambien existen como bebidas gaseosas, es decir que pueden contener acido carbonico/dioxido de carbono.

Segun una realizacion muy preferente, las bebidas mixtas a base de cerveza de la invencion contienen tambien componentes de cafeina tales como preparaciones o extractos de granos de cafe, plantas de te o partes de las mismas, plantas de mate o partes de las mismas, nuez de cola, grano de cacao o guarana.

Ejemplos de realizacion La invencion se explicara con mas detalle por medio de los siguientes ejemplos. Las figuras muestran:

Figura 1:: Concentraciones de isomaltulosa antes y despues de la incubacion con organismos que dafan la cerveza;

Figura 2:: Concentraciones de isomaltulosa en funcion de diferentes factores de estabilidad;

Figura 3:: Concentraciones de isomaltulosa en muestras incubadas con S. cerevisiae MJJ 2;

Figura 4:: Analisis del espectro de azucar despues de siete dias de incubacion;

Figura 5:: Concentraciones de acidos en funcion de los microorganismos elegidos.

Figura 6:: Cata de valoracion de las bebidas mixtas a base de cerveza que estan compuestas de una cerveza de base y una limonada (nota ideal: 3): cerveza de base = Pilsen (figura 6a), cerveza de base = cerveza dietetica (figura 6b), cerveza de base = Pilsen sin alcohol (figura 6c), cerveza de base = Doppelbock (figura 6d),

Figura: �: Porcion de los componentes aromaticos despues de la fermentacion de mostos reales;

Figura: �: Degustacion que valora las cervezas de mostos reales;

Figura: �: Contenidos de isomaltulosa despues de la fermentacion de medios de modelo. Esta remarcado el rango de valores del 5 % por encima y por debajo del valor inicial.

Figura 10:: Contenidos de isomaltulosa despues de la fermentacion de medios de modelo con bacterias. Esta remarcado el rango de valores del 5 % por encima y por debajo del valor inicial.

Figura 11:: Curvas de turbiedad en bebidas mixtas a base de cerveza contaminadas con las sustancias edulcorantes sacarosa (Sac), isomaltulosa (Pal) o una mezcla de edulcorantes (Sst) con angulos de medicion de �00 y 250.

Figura 12:: Aparicion de abombamiento en botellas PET con bebidas mixtas a base de cerveza contaminadas con las sustancias edulcorantes sacarosa (Sac), isomaltulosa (Pal) o una mezcla de edulcorantes (Sst).

Ejemplo 1: Metabolizacion de isomaltulosa en el medio de modelo

1.1 Medios de modelo

El medio de modelo se ha elaborado de la siguiente manera: 50 g isomaltulosa fueron disueltos en 500 ml de agua bidestilada; 6, g de Yeast�Nitrogen�Base (YNB) fueron disueltos en 500 ml de agua bidestilada; 5 ml de la solucion de isomaltulosa fueron esterilizados en autoclave en probetas con tubo Durham; la solucion YNB fue esterilizada en autoclave por separado y, a continuacion, fueron pipeteados 5 ml de forma esteril en cada probeta ya llenada de solucion de isomaltulosa y esterilizada en autoclave.

En una primera carga se ajustaron los parametros de valor pH, contenido de alcohol y ausencia de oxigeno, tal como se presentan en la cerveza envasada: 5 % de contenido de alcohol (etanol), valor pH 4,5 e incubacion sin oxigeno (jarra de anaerobios). En otras cargas se fue variando los factores inhibidores del crecimiento, respectivamente, vease la tabla 1.

Tabla 1: El medio de modelo no tratado tiene un pH de 5,1. Mediante 100 ml de soluciones de patron se determinaron las cantidades en acido sulfurico 0,1 normal 0,05 mol/l que se necesitaron para ajustar los valores de pH deseados. Se eligio acido sulfurico para no aportar ninguna fuente adicional de C al medio.

Factor: Valores de ajuste

Valor pH: 3,6; 3, ; 4,0; 4,2; 4,4

Contenido en sust. amargas (isohumulonas): 10; 20; 30; 40; 50 mg/l

Contenido en alcohol: 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 % vol

5 Una solucion de isohumulonas fue diluida 1:20, de manera que 10 mg de la solucion contenian aproximadamente 0,1 mg de isohumulonas:

Solucion al 20 % 1 mg de la solucion contiene 0,2 mg isohumulonas 10 10 mg de la solucion contienen 2 mg isohumulonas;

Dilucion 1:20 10 mg de la solucion diluida contienen 0,1 mg isohumulonas; 10 mg de la solucion (0,1 mg isohumulonas) afadidos a 10 ml de la solucion de patron corresponden a 10 mg de isohumulonas por litro.

15 El contenido de alcohol fue ajustado a las respectivas concentraciones con un alcohol desnaturalizado al �6 %.

Las probetas incubadas en atmosfera aerobica fueron cerradas con tapones de algodon, las muestras anaerobicas fueron cerradas asimismo con tapones de algodon, pero incubadas en una jarra de anaerobios.

1.2 Microorganismos

Se eligio un grupo de microorganismos que se conocen por dafar la cerveza o porque en ensayos previos mostraron su capacidad de aprovechar la isomaltulosa. Estos microorganismos se muestran en la tabla 2. 25 Tabla 2:

Microorganismo: Potencial dafino para la bebida

Pediococcus damnosus: Anaerobico, crece en presencia de alcohol y sustancias amargas del lupulo

Lactobacillus brevis: Anaerobico, crece en presencia de alcohol y sustancias amargas del lupulo, muy a menudo responsables del deterioro de la cerveza

Megasphera cerevisiae: Fuertemente anaerobico, crece en presencia de alcohol y sustancias amargas del lupulo

Pectinatus frisenqensis: Fuertemente anaerobico, crece en presencia de alcohol y sustancias amargas del lupulo

Schizosaccharomyces pombe: Fermenta la isomaltulosa, ademas de otros azucares, rapida y completamente

Saccharomyces diastaticus: Es capaz de fermentar dextrinas (los denominados sobrefermentadores)

Saccharomyces cerevisiae MJJ 2: Fermenta la isomaltulosa, ademas de otros azucares, rapida y completamente

Los microorganismos fueron atraidos en 100 ml de caldo de cultivo, despues lavados con una solucion de

30 isomaltulosa y resuspendidos en 5 ml de solucion de isomaltulosa. Las probetas fueron incubadas con 0,5 ml de la solucion resuspendida. La incubacion se realizo a 260 C.

1.3 Analisis

35 Como indicador del crecimiento se valoro la aparicion de turbiedad y la formacion de gas en las probetas. Para detectar que efectivamente se produce una degradacion de isomaltulosa, el extracto fue medido antes y despues de la incubacion y se determino mediante medicion de extincion durante la reaccion con acido dinitrosalicilico (DNS) el contenido en azucares reductores antes y despues de la incubacion.

40 La medicion de extracto de la solucion se realizo a traves de la determinacion de la densidad mediante un resonador de flexion (empresa Anton�Paar).

El contenido en isomaltulosa se determino mediante la reduccion de acido 3,5 dinitrosalicilico a acido 3�amino� 5� nitrosalicilico. Debido a ello, resulta en la solucion un cambio de color de amarillo a marron rojizo. La concentracion

45 de un azucar reductor puede determinarse cuantitativamente debido a este cambio de color. Dado que la isomaltulosa es el unico azucar en el medio de prueba (al contrario de los medios reales, tal como el mosto), se puede determinar la concentracion de isomaltulosa antes y despues de la incubacion con el metodo DNS.

En 50 ml de agua destilada fueron disueltos 30 g de tartrato Na�� y se afadio 20 ml NaOH (2 mol/l). A esta solucion 50 se afadio con agitacion 1 g de acido dinitrosalicilico (DNS). A continuacion, se relleno con agua destilada a 100 ml.

Se presentaron 0,25 ml de la solucion a examinar en una probeta y se mezclaron con 0,25 ml de la solucion DNS. Ambas soluciones fueron calentadas conjuntamente durante cinco minutos al bafo maria hirviente. Una vez enfriado, se afadio ml de agua (destilada) y tras la mezcla se midio la extincion a 546 nm. Una vez establecida una recta de calibrado se pudo detectar asi la concentracion de isomaltulosa en la solucion de patron antes y despues de la incubacion.

Se mostro que una recta de calibrado detectada presentaba la mayor precision en un rango de concentracion de

5 menos del 1,5 % de azucar en la solucion. Correspondientemente, las muestras a medir fueron diluidas 1:5 antes de la medicion, a efectos de alcanzar el rango de la maxima precision con un 5 % teorico de isomaltulosa (antes de la incubacion) en la solucion.

1.4 Resultados

10 En la tabla 3, se muestra los resultados de la valoracion visual del crecimiento por medio de los parametros aparicion de turbiedad y formacion de gas (n.b.: no observado, +: aparicion de turbiedad y/o formacion de gas; : sin turbiedad ni formacion de gas).

15 Tabla 3:

pH 4,5: Alcohol 5 % v/v Anaerobico

Schizosaccharomyces pombe: + + +

Saccharomyces cerevisiae MJJ 2: + + +

Saccharomyces diastaticus: + + +

Lactobacillus brevis

Pediococcus damnosus

Pectinatus frisingensis: n.b. n.b. +

Megasphera cerevisiae: n.b. n.b. +

Valorado segun los criterios de la aparicion de turbiedad y la formacion de gas, en todas las levaduras hubo crecimiento bajo todas las condiciones. En Saccharomyces diastaticus, sin embargo, solo se observo la aparicion de

20 turbiedad sin formacion de gas acompafante. Esto es inusual en una levadura en fermentacion. Pectinatus frisingensis y Megasphera cerevisiae fueron capaces en condiciones anaerobicas de desarrollar turbiedad y en Lactobacillus brevis y Pediococcus damnosus no se desarrollaron indicios de crecimiento.

A lo largo del tiempo de incubacion se documentaron visualmente los parametros de aparicion de turbiedad y 25 formacion de gas. Los resultados observados se describiran a continuacion:

1.4.1 Pediococcus brevis, Lactobaci//us brevis, Megasphera cerevisiae, Pectinatus frisingensis

En ninguna de las cargas inoculadas se pudo observar ni aparicion de turbiedad ni formacion de gas. 30

1.4.2 Schizosaccharomyces pombe

Ya tras pocos dias se observo la formacion de gas en algunas cargas. Sin embargo, no se pudo observar ninguna regularidad segun las concentraciones de los parametros variados. Tras una semana de incubacion, se habia

35 formado en general la cantidad de gas maxima que pueden detectar los tubos Durham y, en algunas cargas, la levadura empezo a sedimentar.

1.4.3 Saccharomyces diastaticus

40 Esta levadura producia, en el transcurso de la primera semana, una ligera turbiedad cuya intensidad aumento en la segunda semana. La aparicion de turbiedad fue retrasada visiblemente por concentraciones de alcohol de 6% y 6,5 %. Asimismo, con un pH 3,6 tambien se constato que al turbiedad empezo a aparecer solo tres dias despues de que se observara la aparicion de turbiedad con valores de pH mas altos. Parecio remarcable que grandes partes de la masa celular que se formaba se encontraban en la superficie del liquido, tanto en cargas sometidas a incubacion

45 aerobica, como en cargas sometidas a incubacion anaerobica. En ninguna carga la levadura dio lugar a la formacion de gas en las primeras tres semanas. En el transcurso de las segunda y tercera semanas la levadura sedimentaba por completo, menos la sustancia celular adherente al vidrio en la superficie del liquido.

La observacion microscopica de las celulas de levadura sedimentadas tanto en el borde como tambien en el fondo

50 muestran una gran porcion en celulas inusualmente pequefas. Tras realizar un frotis de las pequefas celulas cosechadas en un agar de mosto se observaron otra vez celulas de tamafo normal. Debido a ello, se concluye que Saccharomyces diastaticus tiende a crecer escasamente cuando isomaltulosa es la unica fuente de hidratos de carbono disponible.

55 1.4.4 Saccharomyces cerevisiae MJJ 2

La adicion de alcohol en una concentracion del 6,5 % retrasa la aparicion de turbiedad hasta el inicio de la segunda

semana, la formacion de gas se produjo solo a mediados de la segunda semana. En bajas concentraciones, el alcohol aparentemente no dificulto el crecimiento de la levadura. Bajar el pH tampoco tuvo el efecto de dificultar el crecimiento hasta que no se bajo a un valor de 3,�. Con un pH de 3,6 se formaron turbiedad y gas solo a mediados de la segunda semana. Mediante la adicion de lupulo tambien se retraso la aparicion de turbiedad y la formacion de gas hasta la segunda semana de incubacion. La formacion de gas parecio menor que en las demas series. En las cargas sometidas a incubacion anaerobica, la actividad de crecimiento se desarrollo mas lentamente que en las muestras sometidas a incubacion anaerobica. Tras haberse sedimentada la levadura durante la tercera semana, el volumen del gas formado se quedo atras con respecto al de las muestras aerobicas.

1.4.5 Consideraci6n genera/

En la figura 1, se muestra las concentraciones de isomaltulosa detectadas mediante ensayo DNS de todas las cargas sin incubacion, y despues de tres semanas de incubacion anaerobica sin factores conservantes (incubacion anaerobica, sin factores conservantes, tres semanas de incubacion a 260 C).

A excepcion de las cargas incubadas con Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae MJJ 2, todos los valores se encuentran en un rango de variacion de menos del 5 % con respecto a la concentracion medida de la solucion de patron sin incubar.

Esto se interpreta de manera que solo las levaduras Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 y Schizosaccharomyces pombe eran capaces de degradar la isomaltulosa en el periodo observado en una atmosfera anaerobica sin factores conservantes afadidos. Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 redujo el contenido de isomaltulosa en la solucion de patron en un 26 %, mientras que Schizosaccharomyces pombe pudo metabolizar la isomaltulosa por completo.

Las bacterias examinadas solo fueron incubadas anaerobicamente, en ninguna carga se detecto una degradacion de isomaltulosa. Las levaduras tambien fueron incubadas aerobicamente. Tambien en condiciones aerobicas, Schizosaccharomyces pombe metabolizo la isomaltulosa por completo, en todos los parametros de conservacion y en todas las concentraciones.

En la figura 2, se muestra las concentraciones de isomaltulosa medidas mediante el metodo DNS en las muestras incubadas con Saccharomyces diastaticus (valores medios de las series tras tres semanas de incubacion a 260 C). Los resultados se muestran como valores medios de los diferentes factores de conservacion.

Saccharomyces diastaticus mostro tambien en condiciones aerobicas la capacidad de metabolizar la isomaltulosa. En esta serie de medicion, se produjeron variaciones en las concentraciones medidas que sobrepasaron un margen de error del 5 %. En concentraciones medidas de mas del 5% de isomaltulosa, se presupone de que a lo largo del tiempo de incubacion se evaporan pequefas cantidades de agua de la solucion. Por esta razon, estos valores medidos solo han de considerarse como una tendencia.

En la figura 3, se muestran concentraciones de isomaltulosa medidas mediante el metodo DNS en las muestras incubadas con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 (valores medios de las series de factores selectivos incubadas aerobicamente, en comparacion con la incubacion anaerobica a 260 C).

Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 mostro un mejor aprovechamiento de la isomaltulosa en una atmosfera aerobica que en ausencia de oxigeno. En la figura se reconoce claramente que la variacion del pH y la adicion de alcohol no son capaces, dentro del marco examinado aqui, de inhibir la metabolizacion de isomaltulosa por parte de esta levadura. Sin embargo, se dificulta el aprovechamiento de isomaltulosa para Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 en presencia de sustancias amargas del lupulo y en ausencia de oxigeno.

Ejemplo 2: Cerveza dietetica comercial es cargada de isomaltulosa

Cerveza dietetica comercial (aqui: Pilsen dietetica de Henninger) ha sido cargada de isomaltulosa en una cantidad tal que el contenido del extracto residual real era del 4 % g/g. En esta cerveza todos los factores selectivos propios de la cerveza estan presentes de forma combinada. Seguidamente, la cerveza dietetica que contiene isomaltulosa fue incubada con los microorganismos de prueba (ejemplo 1, tabla 2) durante siete dias a 260 C. La serie de ensayos fue acompafada analiticamente, realizando analisis de los mostos y de las cervezas segun las prescripciones para metodos analiticos para la industria cervecera de la comision de analisis centroeuropea e.V. (asociacion registrada, MEBA�) y midiendo adicionalmente los espectros de sacaridos. El aprovechamiento de isomaltulosa ha sido detectado mediante el analisis del espectro de sacaridos y acidos, ya que en la solucion real, cerveza, se encuentran ademas de la isomaltulosa tambien otros azucares reductores. Antes de realizar el analisis, se separaron los microorganismos de prueba mediante filtracion por membrana (0,45 !m) para establecer un estado estable. La medicion del espectro de acidos y sacaridos se realizo mediante el metodo HPLC/GC del modo en si conocido.

En la tabla 4, se muestra en que cargas se ha observado crecimiento debido a la aparicion de turbiedad (� = sin turbiedad, + = turbiedad, ++ = fuerte turbiedad).

Tabla 4:

Cerveza dietetica mas isomaltulosa inoculada con:: Turbiedad (tras� dias)

Saccharomyces diastaticus: +

Saccharomyces cerevisiae MJJ 2: ++

Schizosaccharomyces pombe: +

Pectinatus frisingensis: ++

Pediococcus damnosus

Megasphera cerevisiae: ++

Lactobacillus brevis

5 Dentro del periodo observado, Pediococcus damnosus y Lactobacillus brevis no mostraron crecimiento (turbiedad de la muestra), Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces diastaticus provocaron solamente una ligera turbiedad. Saccharomyces cerevisiae MJJ 2, Pectinatus frisingensis y Megasphera cerevisiae eran capaces de desarrollar una fuerte turbiedad.

10 En la figura 4, se muestran los resultados del analisis del espectro de azucares de las cervezas dieteticas tras siete dias de incubacion a 260 C.

En cerveza cero (= cerveza dietetica comercial sin adicion de isomaltulosa), no se encontro ninguno de los azucares analizados. Es decir, que alli no hay azucares aprovechables de bajo peso molecular. En la cerveza dietetica sin

15 incubar, pero cargada de isomaltulosa, se han encontrado ademas de 22,5 g/l de isomaltulosa solo trazas de fructosa y glucosa. En las cervezas incubadas, a excepcion de la cerveza incubada con Schizosaccharomyces pombe, se han encontrado en el marco de las precisiones de medicion y pesada las mismas concentraciones de isomaltulosa que en la cerveza sin incubar (desviaciones � 5 %). Asimismo, solo se han formado concentraciones medibles de glucosa y fructosa en cerveza incubada con Schizosaccharomyces pombe.

20 En la tabla 5, se muestran las concentraciones de isomaltulosa de cada una de las cervezas y la correspondiente proporcion con respecto a la concentracion inicial.

Tabla 5: 25

Muestra: Concentraciones de isomaltulosa tras la incubacion (%)

Cerveza dietetica comercial, no modificada: 0

Cerveza dietetica comercial + isomaltulosa (= H+P): 100

H+P incubada con Saccharomyces diastaticus: 100

H+P incubada con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2: 100

H+P incubada con Schizosaccharomyces pombe: �3

H+P incubada con Pectinatus frisingensis: 100

H+P incubada con Pediococcus damnosus: 100

H+P incubada con Megasphera cerevisiae: 100

H+P incubada con Lactobacillus brevis: 100

Tras la separacion de los microorganismos mediante filtracion por membrana, en todas las cervezas inoculadas existia todavia la concentracion inicial de isomaltulosa. La unica excepcion fue la cerveza que habia sido incubada con Schizosaccharomyces pombe. En este caso hubo una reduccion en 1� % y tambien fue el unico caso en el que

30 se encontro una concentracion medible de glucosa y fructosa, los productos de disociacion de la isomaltulosa. El crecimiento celular detectado por medio de la aparicion de turbiedad solo tuvo lugar, por lo tanto, en el caso de la levadura Schizosaccharomyces pombe basado en la isomaltulosa.

Ademas, se midio los valores pH de las cervezas incubadas. Todos los valores estuvieron en 4,5 o 4,6. Este

35 resultado junto con el analisis del espectro de acidos de las muestras mostro que ninguno de los microorganismos incubados en las muestras habia formado un acido, y prueba adicional y especificamente para los lactobacilos que no se produjo ningun crecimiento. Un factor importante para el deterioro de las bebidas por lactobacilos es la formacion de acido lactico que puede perjudicar fuertemente el aroma de la bebida en cuestion.

40 En la figura 5, se pueden ver los resultados del analisis del espectro de acidos. Los contenidos en los acidos medidos no se mueven en concentraciones elevadas fuera de lo normal. Solo en la muestra incubada con Pectinatus frisingensis se encuentran contenidos ligeramente mas elevados de acido succinico y acido acetico con respecto a las muestras sin incubar. Con 0,3 g/l, los valores son reducidos. En lo que se refiere al contenido en acido lactico (lactato) cabe sefalar que el mismo es mas reducido en las muestras incubadas con Pectinatus frisingensis,

45 Pediococcus damnosus y Megasphera cerevisiae en comparacion con la muestra cero. Al faltar un sustrato aprovechable, aparentemente, se ha metabolizado el lactato, un proceso descrito en la literatura en el que se utiliza el lactato como sustrato para la gluconeogenesis. En la muestra incubada con Lactobacillus brevis se ha medido el

mismo contenido como en las pruebas sin incubar. Es decir que ni se metabolizo lactato, ni tampoco se formo lactato nuevo por la metabolizacion de la bacteria. Esto es valorado como otro indicio para la ausencia de actividad metabolica de esta bacteria.

Ejemplo 3 (no segun la invencion): Elaboracion de "cerveza dietetica"

Como "cerveza dietetica" se entiende una cerveza que de forma ideal presenta en el producto acabado solo isomaltulosa como hidrato de carbono.

Dado que para la fabricacion de cervezas dieteticas es de vital importancia macerar intensamente, se utilizo a titulo ejemplar un proceso de maceracion en el que se hace mucho hincapie en las temperaturas optimas de las enzimas de la malta que degradan el almidon:

Inicio de maceracion a 500 C, 15 min de reposo Calentamiento a 550 C (10 C/min), 30 min de reposo Calentamiento a 620 C (10 C/min), 45 min de reposo Calentamiento a 650 C (10 C/min), 45 min de reposo Calentamiento a 6 0 C (10 C/min), 30 min de reposo Calentamiento a �00 C (10 C/min), 30 min de reposo Calentamiento a �20 C (10 C/min), 20 min de reposo Calentamiento a �0 C (10 C/min), Final de maceracion

La carga de malta estaba formada de 100 % malta de Pilsen, se agrego lupulo en una dosis de �0 mg a �acido/l de mosto de bombeo, formado por extracto de CO2.

Una parte fue fabricada como ejemplo de comparacion sin adicion de isomaltulosa, catada y analizada. Esta cerveza representa a la "cerveza cero". A otra parte de la cerveza se afadio isomaltulosa durante la coccion, debido a lo cual se encontraba isomaltulosa en la cerveza durante la fermentacion principal.

Dicha fermentacion principal se realizo sin presion con la levadura de fermentacion baja Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 de 150 hasta 1�0 C. Hacia el final de la fermentacion se elevo la temperatura, a efectos de reducir en la medida de lo posible el contenido en extracto del mosto. Una vez alcanzado el grado de fermentacion final determinado previamente la cerveza es bombeada a traves de tuberias a los tanques de almacenamiento.

La serie de ensayos fue acompafada analiticamente, realizando analisis de los mostos y de las cervezas, segun las prescripciones para metodos analiticos para la industria cervecera de la comision de analisis centroeuropea e.V. (MEBA�) y midiendo adicionalmente los espectros de sacaridos. En cuanto al aroma de las cervezas, se midieron los contenidos en esteres seleccionados, aromaticamente activos y alcoholes superiores, asi como el acetaldehido. Asimismo se detectaron analiticamente los contenidos en acidos de las cervezas acabadas, y las mismas fueron catadas comparandolas entre si y evaluandolas.

En la cerveza dietetica fabricada segun la invencion, no se aprecia ningun menoscabo de las caracteristicas sensoriales tales como la calidad del olor, la calidad del sabor, la plenitud de sabor en boca, el burbujeo y la calidad del sabor amargo (amargor). En muchos casos, la cerveza dietetica segun la invencion fue preferida en lugar de la cerveza dietetica conocida (aqui: Pilsen dietetica de Henninger).

Ejemplo 4 (no segun la invencion): Elaboracion de "cerveza con reducido contenido de alcohol"

Se sustituyen partes del mosto original por isomaltulosa, de manera que con una fermentacion "normal" se genera menos alcohol que con una cerveza completa tradicional. En el proceso descrito anteriormente en relacion con el ejemplo 3, la maceracion se llevo a cabo de tal manera que se pudo alcanzar al maximo grado de fermentacion posible. Debido a la fermentacion completa de los hidratos de carbono alcanzables se genera naturalmente un alto contenido en alcohol. Por este motivo, en este ejemplo se hizo servir un programa de maceracion mas breve y menos intensivo y, por lo tanto los hidratos de carbono de la malta no fueron transformados completamente en azucar fermentable:

Inicio de maceracion a 620 C, sin reposo Calentamiento a 660 C (10 C/min), 30 min de reposo Calentamiento a �20 C (10 C/min), 20 min de reposo Calentamiento a �0 C Final de maceracion

Sustituyendo aproximadamente una cuarta parte del mosto original por isomaltulosa en el momento de la coccion, se pretende reducir el sustrato disponible para la levadura. De esta manera, se puede elaborar una cerveza que, comparada con cervezas completas tradicionales, contiene menos alcohol. La adicion de lupulo se realizo igual que

en las cervezas dieteticas a �0 mg de a acido por litro de mosto de bombeo.

La fermentacion principal se realizo sin presion con la levadura de fermentacion baja Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 a 120 C. El bombeo a los tanques de maduracion se realizo con un contenido de extracto que supero en aproximadamente 1,5 % el extracto esperado en la fermentacion final.

La analitica acompafante (segun MEBA� y especifica para el aroma) correspondia a la del ejemplo 3.

Igual que en el ejemplo 3, en la cerveza sin alcohol elaborada segun la invencion, no se aprecia ningun menoscabo de las caracteristicas sensoriales. En muchos casos, la cerveza sin alcohol segun la invencion, fue preferida a la cerveza sin alcohol conocida.

Ejemplo 5 (no segun la invencion): Elaboracion de una "bebida malteada"

Dado que una bebida malteada solo deberia ser elaborada con una fermentacion muy incompleta, no era necesario aplicar un programa de maceracion para un grado de fermentacion lo mas alto posible. Se hizo servir el mismo programa de maceracion que en el ejemplo 4.

Para conseguir que el color del producto fuera tan oscuro como suele ser habitual en cervezas de malta, se utilizo la siguiente mezcla de malta:

40 % de malta Pilsen 30 % de malta de Munich 20 % de malta Cara 10 % de malta de color

El mosto original se ajusto de tal manera que se obtuvo la mitad del extracto a partir de la malta, mientras que la otra mitad fue afadida en forma de isomaltulosa (azucar cristalizado) a la coccion. En total, se ajusto al mosto original a 12 %. La adicion de lupulo se realizo a 15 mg de a acido/l de mosto de bombeo.

Tras la separacion de los turbios calientes la bebida malteada fue vertida en un pequefo barril y tras ser enfriada fue cargada con poca levadura (Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11). Despues de medio dia de tiempo de contacto a 00 C, la levadura fue separada en gran parte mediante el trasvase a presion a otro tanque de almacenamiento. Este tipo de fermentacion atiende al denominado proceso de contacto en frio. Tras dos semanas de almacenamiento se realizo el filtrado y el envasado.

Las bebidas malteadas obtenidas fueron evaluadas tanto a nivel sensorial como tambien analitico (segun MEBA� y especifico para el aroma) igual que en los ejemplos 3 y 4, y fueron comparadas con cervezas malteadas comerciales.

Igual que en los ejemplos 3 y 4, en la bebida malteada elaborada segun la invencion, tampoco se aprecia ningun menoscabo de las caracteristicas sensoriales. En muchos casos, la bebida malteada segun la invencion, fue preferida a cervezas malteadas conocidas.

Ejemplo 6: Elaboracion de bebidas mixtas a base de cerveza

6.1 Cargas

Se elaboraron doce bebidas mixtas a base de cerveza diferentes a partir de componentes de cerveza y limonada a escala de 10 litros, variando cada vez la componente de cerveza y la sustancia endulzante en la parte de limonada.

Para los ensayos, se eligieron los siguientes cuatro tipos de cerveza diferentes (tambien con miras a ensayos posteriores con respecto a la estabilidad biologica de las bebidas):

•�: Una cerveza Pilsen, para simular las bebidas mixtas a base de cervezas habituales en el comercio.

•�: Una cerveza dietetica, con un contenido muy reducido en hidratos de carbono residuales. Debido a la practica ausencia de hidratos de carbono propios aprovechables, en este caso la sustancia endulzante utilizada en la parte de limonada resulta decisiva para la plenitud de sabor en boca. Ademas falta sustrato propio de cerveza en contaminaciones eventuales.

•�: Una cerveza Pilsen sin alcohol. La bebida mixta a base de cerveza elaborada con esta cerveza no contiene el factor selectivo alcohol, y asimismo falta la influencia del alcohol para que la bebida mixta a base de cerveza tenga plenitud de sabor en boca.

•�: Una cerveza Doppelbock. �sta tiene en comparacion con cervezas completas, un contenido de alcohol mas

elevado y, por otro lado, un contenido en extracto residual mas elevado que representa un sustrato adicional ademas del edulcorante de la limonada para eventuales contaminantes.

La parte de limonada ha sido elaborada a partir de una base con aroma de lima�limon de la empresa Wild, n0 de 5 prod. 3 �110050331 y acido citrico. Como sustancia endulzante su utilizo:

•� Sacarosa,

•� Isomaltulosa, 10

•� Una mezcla de edulcorantes de la empresa Wild (Sweet Up; compuesta de ciclamato, sacarina, aspartamo y acesulfame �).

La mezcla de edulcorantes fue elegida ya que este producto se utiliza a gran escala industrial en la fabricacion de

15 bebidas mixtas a base de cerveza y, por lo tanto, resulta practico. Ademas, se compensan los inconvenientes que algunos componentes suponen para el sabor mediante la mezcla de edulcorantes. Se utilizo acido citrico para la acidificacion.

Una vez pesados, los ingredientes fueron puestos en solucion en agua cervecera.

20 La variacion de las diferentes sustancias edulcorantes y las cervezas dio lugar a las siguientes cargas del ensayo para bebidas mixtas a base de cerveza:

Tabla 6: 25

12 cargas de ensayo para bebida mixta a base de cerveza y limonada

Pilsen: Isomaltulosa Pilsen dietetica Isomaltulosa

Sacarosa
Sacarosa

Edulcorante
Edulcorante

Pilsen sin alcohol: Isomaltulosa Doppelbock Isomaltulosa

Sacarosa
Sacarosa

Edulcorante
Edulcorante

La sacarosa y la mezcla de edulcorantes fueron dosificadas del modo en si conocido y segun las recomendaciones de la empresa Wild Flavours. La isomaltulosa fue dosificada ajustando, despues de catar, el mismo poder edulcorante que en otras limonadas. Se vertieron la cerveza y la limonada juntas en un barril tipo "�eg" de 30 litros,

30 se mezclo y a continuacion se carbonato. La carbonatacion se realizo mediante introduccion de CO2 por la trayectoria del liquido de la cabeza del grifo. Para la fijacion de CO2, los barriles cargados de una presion de gas de 1,� bar fueron almacenados a 00 C durante 24 horas. Tras almacenamiento en frio, la presion del barril era todavia de 0,� - 0,� bar.

35 6.2 Evaluacion

Se realizaron catas triangulares con preferencia (segun MEBA�) con 10 catadores. Con la misma cerveza de base se realizaron catas comparando las variantes con diferentes edulcorantes entre si. Se quiso averiguar que edulcorante era preferido sensorialmente. Se tenia que detectar la muestra divergente y anotar la preferencia

40 respectiva. Solo si la muestra divergente fue asignada correctamente, se valoraria tambien la preferencia.

Asimismo se realizaron catas de valoracion con las bebidas mixtas a base de la cerveza que se habian elaborado. A tal efecto, se aplico un esquema propio. Mediante la valoracion, se intentaria diferenciar las impresiones gustativas en funcion de las diferentes sustancias edulcorantes utilizadas en la bebida mixta a base de cerveza. Resulto ser de

45 crucial importancia la impresion gustativa del dulzor, que podia ser valorada tanto positiva como negativamente, igual que las otras caracteristicas tambien. Ademas del dulzor existian los siguientes criterios de valoracion:

Plenitud de sabor en boca, amargor, frutado, acidez, armonia (relacion dulzor/acidez) y frescura. Las valoraciones tenian grados de 1 al 5, representando el "3" el valor a alcanzar. Valores por encima representaban impresiones

50 gustativas demasiado intensas tales como, por ejemplo "demasiado dulce". Valores por debajo del "3" representaban impresiones gustativas demasiado flojas tales como, por ejemplo "no bastante dulce". De esta manera el catador pudo valorar tambien la calidad de cada uno de los criterios mas precisamente. La valoracion del frescor fue graduada solo del 1 al 3, donde 3 significa "refrescante" y 1 "no refrescante". Finalmente, se valoro la calidad total: numeros enteros del 1 (= peor resultado) al 5 (= mejor resultado).

6.3 Resultados

6.3.1 Ana/isis qufmico-tecnicos

A continuacion estan representados los analisis de los componentes individuales de las limonadas. Tabla �:

Analisis del agua utilizada para la fabricacion de la parte de limonada

Dureza total: dH 0,5

Dureza del calcio: dH 0

Alcalinidad residual: dH 0,�24

Valor pH: 6,�

Valor p: 0

Valor m: 0,33

Conductividad: !S/ cm 4�

El agua se caracteriza por su muy poca dureza despues del tratamiento, que es lo que se requiere de forma ideal para la elaboracion de bebidas mixtas a base de cerveza acidificadas.

10 Tabla �:

Analisis de las cervezas de base utilizadas

Pilsen: Pilsen dietetico Pilsen sin alcohol Doppelbock

Mosto original: % peso 11,23 �,32 5,2� 1�,65

Contenido de alcohol: % vol 5,02 4,�3 0,41 �,46

Extracto, aparente: % peso 1,�6 0,01 4,46 3,4�

Valor pH: 4,35 4,56 4,35 14,�2

Unidades de amargor: BU 31 1� 26 25

Se reconoce claramente que, a diferencia de la cerveza Pilsen, la cerveza dietetica contiene notablemente menos extracto residual aparente (hidratos de carbono), la cerveza sin alcohol contiene menos alcohol presentando un

15 extracto residual parecido y la cerveza Doppelbock contiene claramente mas alcohol como tambien mas extracto residual. La cerveza dietetica contiene menos unidades de amargor, lo cual podria tener un efecto negativo en el caso de una contaminacion con microorganismos que dafan la cerveza.

Entre los valores de pH medidos los mas bajos se han medido en la cerveza Pilsen y en la Pilsen sin alcohol, y la 20 cerveza Doppelbock presento el valor mas elevado.

En las siguientes tablas se reflejan los analisis de las bebidas mixtas a base de cerveza acabadas.

Tabla �: 25

Analisis de las bebidas mixtas a base de cerveza con Pilsen como cerveza de base

Isomaltulosa: Sacarosa Edulcorante

Extracto, aparente: % peso 11,20 4,�1 0,��

Alcohol: % vol 2,60 2,6� 2,53

Valor pH: 3,3� 3,3� 3,41

Unidades de amargor: BU 15 15 15

Tabla 10:

Analisis de las bebidas mixtas a base de cerveza con la cerveza dietetica como cerveza de base

Isomaltulosa: Sacarosa Edulcorante

Extracto, aparente: % peso 10,2� 4,01 0,14

Alcohol: % vol 2,52 2,54 2,4�

Valor pH: 3,46 3,4� 3,4�

Unidades de amargor: BU 12 11 12

30 Tabla 11: Tabla 12:

Analisis de las bebidas mixtas a base de cerveza con la cerveza sin alcohol como cerveza de base

Isomaltulosa: Sacarosa Edulcorante

Extracto, aparente: % peso 12,53 6,26 2,40

Alcohol: % vol 0,04 0,06 0,05

Isomaltulosa: Sacarosa Edulcorante

Valor pH: 3,4� 3,52 3,52

Unidades de amargor: BU 13 13 13

Analisis de las bebidas mixtas a base de cerveza con Doppelbock como cerveza de base

Isomaltulosa: Sacarosa Edulcorante

Extracto, aparente: % peso 12,55 6,26 2,41

Alcohol: % vol 3,�5 3,�� 3,�1

Valor pH: 3,�1 3,�2 3,�1

Unidades de amargor: BU 12 11 12

5 Se reconocen claramente las diferencias en los valores de los analisis debido a las diferentes cervezas de base. Todos los valores de pH de las bebidas mixtas a base de cerveza se situan por debajo de los de las cervezas de base, debido al acido citrico de la parte de limonada.

Debido a la dilucion con la limonada solo hay aproximadamente la mitad de las unidades de amargor comparado con

10 las cervezas de base. Debido a esta "reduccion por la mitad" se reduce la influencia del escaso amargor de salida de la cerveza dietetica y los valores de amargor de las bebidas mixtas se situan todos en un orden de magnitud parecido. Los contenidos de alcohol de las bebidas mixtas a base de cerveza han sido medidos de acuerdo con las cervezas de base; las bebidas elaboradas con la cerveza sin alcohol contienen menos de 0,1 % en vol. de alcohol y han de ser consideradas por lo tanto como sin alcohol igual que la cerveza de base. Las bebidas con la cerveza

15 Pilsen o la cerveza dietetica utilizadas presentan alcohol aproximadamente del 2,5 % o escasamente 2, % en vol. y el valor de las bebidas mixtas elaboradas con la cerveza Doppelbock es de escasamente 4 % en vol. Este valor es parecido a los de bebidas normales de cerveza pura. Los contenidos de extracto medidos corresponden asimismo a las cervezas de base, sin embargo el contenido de extracto mas alto lo presentan las bebidas endulzadas con isomaltulosa, respectivamente, debido a la adicion aumentada con respecto a la sacarosa. Las bebidas que

20 contienen sacarosa presentan los segundos extractos mas elevados, las mezclas endulzadas con los edulcorantes el mas bajo. En total, las bebidas a base de cerveza dietetica presentan el menor contenido de extracto, seguido de las bebidas mixtas con la cerveza Pilsen. Curiosamente, las cervezas de base Doppelbock y la cerveza sin alcohol dieron como resultado aproximadamente los mismos contenidos en extracto residual, dado que la cerveza sin alcohol aparentemente contenia todavia extracto residual no fermentado. Debido a la aptitud para diabeticos de la

25 cerveza dietetica, resulta que tambien las bebidas mixtas que contienen la mezcla de edulcorantes (casi sin calorias) y la isomaltulosa (indice glucemico mas bajo) son aptos para diabeticos.

6.3.2 Cata

30 En las tablas se muestran los resultados de las catas de tres vasos con asignacion de clasificacion, en las que se pretendia detectar cual de las sustancias edulcorantes era preferente utilizando la misma cerveza de base.

Las catas fueron realizadas por diez personas respectivamente; dado que tres sustancias edulcorantes son el objeto de examinacion, resultaron en total treinta catas a evaluar por cada cerveza de base. 35 Tabla 13:

Cata de tres vasos con asignacion, bebidas mixtas a base de cerveza con diferentes cervezas de base (se requieren 15 asignaciones correctas para adquirir un nivel significante del �5 % (a = 0,05)

Pilsen: Pilsen dietetica Pilsen sin alcohol Doppelbock

Se prefirio isomaltulosa: 5

Se prefirio sacarosa: 2 5

Se prefirieron edulcorantes: 4 2 1

Correctos: 15 1� 1� 1�

Alfa (0,05): 15 15 15 15

En bebidas mixtas a base de cerveza utilizando Pilsen como cerveza de base se asignaron correctamente 15 catas,

40 por lo tanto las diferentes bebidas mixtas a base de cerveza son significantemente diferentes en funcion de la sustancia endulzante utilizada. De las 15 asignaciones correctas se prefirio veces la bebida que contenia edulcorante, 5 veces aquella que contenia isomaltulosa. 2 catadores prefirieron la bebida mixta a base de cerveza endulzada con sacarosa y con Pilsen como cerveza de base.

45 De las bebidas mixtas a base de cerveza con cerveza dietetica como cerveza de base se prefirio mas a menudo la bebida con isomaltulosa, la bebida mixta a base de cerveza que contenia edulcorantes es la que menos veces ha sido elegida como la mejor.

1� catadores de la bebida mixta elaborada con cerveza sin alcohol asignaron correctamente las muestras

5 coincidentes en la cata de tres vasos y, por lo tanto, fueron evaluadas 1� valoraciones. Al utilizar Pilsen sin alcohol como cerveza de base, los endulzamientos mediante ambos azucares fueron preferidos un numero parecido de veces, ambos fueron valorados como claramente mejores que la mezcla de edulcorantes.

1� valoraciones de la bebida mixta con la cerveza Bock fueron sometidas a evaluacion. La sensacion mas agradable

10 la produjo el endulzamiento con isomaltulosa, seguida de sacarosa. Un solo catador percibio como mas agradable el endulzamiento con edulcorantes con esta cerveza de base.

En total, con las cuatro cervezas de base diferentes se percibio aproximadamente tanto el mismo numero de veces los azucares isomaltulosa y sacarosa como el endulzamiento mas agradable (la isomaltulosa fue preferida mas

15 veces), la utilizacion de la mezcla de edulcorantes fue la que menos se prefirio.

6.3.2.1 Perfi/es aromaticos

En la figura 6 se muestran los resultados de las catas de valoracion.

20 Los perfiles aromaticos de las diferentes bebidas mixtas a base de cerveza con Pilsen como cerveza de base (figura 6a) se parecen mucho. Se pueden ver diferencias notables en los parametros de amargor y acidez. En este aspecto, aquellas bebidas que han sido endulzadas con edulcorantes obtuvieron valores que estaban por encima del optimo. Por lo visto, el endulzamiento con los azucares sacarosa e isomaltulosa compensa estas impresiones gustativas de

25 forma mas eficaz que la mezcla de edulcorantes.

Tambien en las bebidas mixtas a base de cerveza con Pilsen dietetica como cerveza de base (figura 6b) los perfiles aromaticos se parecen. Tambien en este caso, las impresiones gustativas amargor y acidez han sido realzadas mas fuertemente cuando se endulzo con edulcorantes, y estos parametros fueron percibidos como los menos intensos en 30 las bebidas endulzadas con isomaltulosa. La cerveza endulzada con sacarosa obtuvo por poco la peor valoracion para el parametro de la plenitud de sabor en boca. En su conjunto la plenitud de sabor en boca fue valorado, tal como se esperaba, claramente peor que en las bebidas mixtas a base de cerveza con Pilsen como cerveza de base.

En las bebidas mixtas a base de cerveza con Pilsen sin alcohol como cerveza de base (figura 6c) a penas se han

35 detectado diferencias significativas en el perfil aromatico. La cerveza endulzada con isomaltulosa obtuvo notas ligeramente mejores en los parametros frutado, plenitud y armonia. La impresion de acidez mas fuerte se percibio donde se habian aplicado los edulcorantes, sin embargo tambien la impresion de dulzor era la mas fuerte en este caso y en algunos casos aislados, la impresion de dulzor fue percibido como demasiado fuerte.

40 Observando los resultados de la cata de valoracion de bebidas mixtas a base de cerveza con Doppelbock como cerveza de base, se reconoce que los perfiles aromaticos de las bebidas elaboradas con esta cerveza se diferencian bastante claramente de las bebidas con las demas cervezas de base. Tanto la plenitud y la armonia, como tambien la impresion de dulzor sobrepasan en este caso la nota ideal 3, es decir que se valoraron como demasiado sobresaliente o divergente del ideal. Los amargores, sin embargo, se percibieron claramente menos fuertes, a pesar

45 de que, en comparacion la cerveza de base poseia unidades de amargor mas elevadas que la cerveza dietetica. La impresion aromatica de la cerveza Bockbier utilizada predomina en este caso aparentemente por encima de la parte de limonada y, provoca peores valoraciones de las bebidas mixtas a base de cerveza que en las demas cervezas de base.

50 6.3.2.2 Efecto refrescante y ca/idad tota/

Ademas se valoro el efecto refrescante como una de las caracteristicas integrales de una bebida mixta a base de cerveza, asi como la calidad total. En la tabla 14 se muestran los resultados de estas valoraciones.

55 Tabla 14: Las bebidas mixtas a base de cerveza con la Pilsen como cerveza de base, fueron valoradas con el maximo valor en este parametro de valoracion. Las bebidas basadas en Doppelbock, sin embargo, fueron valoradas como las menos refrescantes. En lo referido a los diferentes edulcorantes, no se puede hacer ninguna declaracion clara. La

Efecto refrescante: Calidad total sensorial

Pilsen: Isomaltulosa Sacarosa Edulcorante 2,5 2,�5 2,�5 3,�5 3,5 3,�5

Dietetica: Isomaltulosa Sacarosa Edulcorante 2,�5 2,5 2,5 3,�5 3,5 2,�5

Pilsen sin alcohol: Isomaltulosa Sacarosa Edulcorante 2,4 2,3 2,2 3,� 3,5 3,5

5 isomaltulosa, por ejemplo, fue valorada como la menos refrescante entre las bebidas mixtas a base de cerveza con Pilsen, sin embargo fue la mejor en las bebidas mixtas a base de cerveza dietetica. Las valoraciones de las demas sustancias edulcorantes son parecidas.

De la evaluacion de la calidad total sensorial no resulto ninguna tendencia clara. Entre las cuatro bebidas mixtas

10 mejor valoradas a base de cerveza se encuentran tres que han sido endulzadas con isomaltulosa. La bebida que obtuvo la peor calificacion fue aquella que tenia una cerveza dietetica como cerveza de base y fue endulzada con la mezcla de edulcorantes. Esta bebida presenta solo cantidades muy pequefas de hidratos de carbono. Las bebidas mixtas peor valoradas fueron en su conjunto las que contenian Doppelbock como cerveza de base.

15 Los valores medios de frescor y calidad total (tabla 15) dejan entrever que la isomaltulosa y la sacarosa fueron claramente mejor valoradas en ambos casos que la mezcla de edulcorantes. La isomaltulosa obtuvo mejores valoraciones en la calidad total, mientras que las bebidas que han sido endulzadas con sacarosa fueron valoradas como algo mas refrescantes.

20 Tabla 15:

Efecto refrescante: Calidad total sensorial

Isomaltulosa: 2,34 3,65

Sacarosa: 2,40 3,4�

Edulcorante: 2,2� 3,20

El endulzamiento de las bebidas mixtas a base de cerveza con sacarosa e isomaltulosa ha de ser considerado como aproximadamente identico debido a las catas realizadas, la utilizacion de la mezcla de edulcorantes pierde 25 claramente en una comparacion.

6.4 Contaminacion de las bebidas mixtas a base de cerveza

6.4.1 Las cargas

30 Las bebidas mixtas finalizadas han sido envasadas en botellas de plastico tipo PET de 0,5 l mediante envasador manual. Antes de roscar se han pipeteado 50 !l de la suspension lavada de cultivo puro en el flujo de CO2 en las botellas.

35 Para la contaminacion se han utilizado las siguientes bacterias:

•�: Lactobacillus brevis (DSM 20054)

•�: Pediococcus damnosus (DSM: 20331)

•�: y Megasphera cerevisiae (cepa salvaje)

40 Adicionalmente, algunas botellas fueron incubadas con las siguientes levaduras:

•� Saccharomyces diastaticus (capa salvaje)

•� Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 45 •� y Schizosaccharomyces pombe (cepa salvaje)

La incubacion se realizo a 200 C en ausencia de luz en botellas cerradas.

6.4.2 Medici6n de/ deterioro microbio/6gico

50 Se midio la turbiedad en las botellas mediante un fotometro de proceso (Sigrist �TL 30�21) en los angulos de medicion de �00 y 250. Se realizo la medicion en dos angulos diferentes para tener en cuenta los diferentes tamafos celulares de las levaduras y las bacterias. La turbiedad maxima detectable se situo en unos 20 EBC.

55 En determinados puntos seleccionados se detecto la aparicion de abombamiento por medio de la deformacion de las botellas de PET utilizadas:

•� Altura absoluta de la botella

•�: Diametro a la altura de 11,5 cm

•�: y comienzo del escalon .

Para la medicion se utilizo un calibrador digital.

6.4.3 Curvas de turbiedad

Tras la incubacion de las diferentes cargas resultaron las curvas de turbiedad que estan representadas en los siguientes graficos.

6.4.3.1 S. diastaticus

En la figura 11a se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen como cerveza de base que ha sido contaminada con Saccharomyces diastaticus. La bebida endulzada con sacarosa ya alcanzo el maximo valor de turbiedad el segundo dia de incubacion. Al endulzar con edulcorantes la turbiedad se incrementa poco a poco, pero tambien alcanza el valor maximo en el periodo observado. Aparentemente, Saccharomyces diastaticus es capaz de crecer en base al extracto residual de la cerveza de base y enturbiar la bebida. En el extracto de cerveza que contiene isomaltulosa, el aumento del turbiedad es el mas lento; y cabe suponer que el crecimiento tiene lugar esencialmente en base al extracto de cerveza y que la isomaltulosa no acelera el deterioro de la bebida.

En la figura 11b se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen dietetica como cerveza de base que ha sido contaminada con Saccharomyces diastaticus. Al utilizar la cerveza dietetica como cerveza de base solo aparece una notable turbiedad cuando se endulza con la sacarosa convencional. La cerveza dietetica no aporta ningun extracto propio de manera que se puede llegar a la conclusion que Saccharomyces diastaticus no puede aprovechar ni la mezcla de edulcorantes ni la isomaltulosa como sustrato.

En la figura 11c se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen sin alcohol como cerveza de base que ha sido contaminada con Saccharomyces diastaticus. En las cargas con la cerveza sin alcohol todas alcanzan el maximo de turbiedad en el periodo observado. La sacarosa provoca el aumento de turbiedad mas rapido, en las otras dos cargas, al no ser impedida por el alcohol, la levadura es capaz de crecer debido al extracto residual de la parte de cerveza. El deterioro mas lento se produce en las cargas que contienen isomaltulosa.

En la figura 11d se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Doppelbock como cerveza de base que ha sido contaminada con Saccharomyces diastaticus. A pesar del contenido de alcohol mas elevado que presento la bebida mixta a base de cerveza debido a la utilizacion de la cerveza Doppelbock, casi todas las cargas alcanzaron con la misma rapidez el valor maximo de turbiedad aproximadamente el tercer dia de incubacion. Estas bebidas mixtas a base de cerveza presentan los valores de pH mas elevados y un contenido en sustancias amargas bastante bajo. La cerveza de base utilizada contenia ademas grandes cantidades de extracto residual fermentable sobre cuya base tenia lugar el crecimiento celular.

6.4.3.2. S. cerevisiae MJJ2

En la figura 11e se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen como cerveza de base que ha sido contaminada con Saccharomyces cerevisiae MJJ2. La levadura de fermentacion alta Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 desarrolla el crecimiento celular mas rapido en presencia de sacarosa. Claramente mas tarde, pero sin duda, sobre la base de la isomaltulosa tiene lugar el aumento de la turbiedad en la carga con isomaltulosa. �ue la turbiedad no aumente al utilizar la mezcla de edulcorantes muestra que ni los edulcorantes ni el extracto residual de la cerveza Pilsen pueden ser aprovechados como base para el crecimiento.

En la figura 11f se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen dietetica como cerveza de base que ha sido contaminada con Saccharomyces cerevisiae. En la bebida mixta elaborada sobre la base de cerveza dietetica aparece muy rapidamente una turbiedad cuando la bebida contiene sacarosa. La isomaltulosa es metabolizada mucho mas lentamente que la sacarosa, pero con mas rapidez que al utilizar cerveza Pilsen como cerveza de base, lo cual puede deberse esencialmente al hecho de que la cerveza dietetica contiene menos lupulo y algo menos alcohol. En esta carga de ensayo, la inhibicion del crecimiento de la levadura debido a estas dos sustancias es menos fuerte. En la carga con los edulcorantes no se produce ningun aumento de la turbiedad.

En la figura 11g se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen sin alcohol como cerveza de base que ha sido contaminada con Saccharomyces cerevisiae. En ausencia de alcohol la levadura es capaz de aprovechar, como minimo, partes del extracto residual presentes en esta cerveza lo cual queda demostrado por el aumento de la turbiedad utilizando los edulcorantes para endulzar. Al utilizar sacarosa para endulzar la turbiedad maxima ya se alcanza el tercer dia. En la carga que contiene isomaltulosa,, el aumento de turbiedad es mas lento. En todas las cargas se aprovechan partes del extracto residual presente en la cerveza.

En la figura 11h se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Doppelbock como cerveza de base que ha sido contaminada con Saccharomyces cerevisiae. Tambien la levadura observada en este caso es capaz de

crecer muy rapidamente en todas las cargas con la cerveza Doppelbock como cerveza de base. Ello es debido a la gran cantidad de extracto residual fermentable y los efectos relativamente menores de los factores selectivos como son el valor de pH y el contenido en sustancia amarga.

6.4.3.3. S. pombe

En la figura 11i se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen como cerveza de base que ha sido contaminada con Schizosaccharomyces pombe. Las cargas con Pilsen como cerveza de base y la levadura Schizosaccharomyces pombe muestran un desarrollo muy atipico. Dado que las cargas con los edulcorantes, por un lado, y la sacarosa, por otro lado, presentan casi desde el inicio una turbiedad notable, que se mantiene sin embargo casi constante durante el transcurso del tiempo, se concluye que en este caso existe una turbiedad coloidal de la parte de cerveza provocada eventualmente porque durante el envasado haya entrado demasiado aire. Esta teoria es apoyada por el hecho de que sobre todo los valores de la medicion de turbiedad a 250 C son elevados. Las mediciones a 250 muestran de forma tendencial mas bien pequefas particulas de turbiedad, sin embargo, las celulas de levadura tambien debian reconocerse a �00.

En la figura 11j se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen dietetica como cerveza de base que ha sido contaminada con Schizosaccharomyces pombe. Durante la incubacion con Schizosaccharomyces pombe de las bebidas mixtas con la cerveza dietetica como parte de cerveza no se aprecia un marcado aumento de la turbiedad en ninguna de las cargas. Esto se interpreta de manera que, debido a la conjuncion de ausencia de oxigeno, presencia de alcohol y de lupulo, se impidio el crecimiento de la levadura. Dado que esta levadura, sin embargo ya habia sido capaz en series de ensayos similares de aprovechar la isomaltulosa en cerveza dietetica pura, en este caso probablemente sea el valor de pH reducido por la limonada que tiene un papel decisivo para la falta de crecimiento celular en estas cargas. De la tabla 10 se desprende que los valores de pH de las bebidas mixtas a base de cerveza estan en 3,5 o incluso ligeramente por debajo, mientras que el valor pH de una cerveza esta ligeramente por encima de 4.

En la figura 11k se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen sin alcohol como cerveza de base que ha sido contaminada con Schizosaccharomyces pombe. En ausencia de alcohol, Schizosaccharomyces pombe no es capaz aparentemente de desarrollar una ligera actividad a pesar del reducido valor de pH. Esto se puede decir al menos para las conversiones con sacarosa. En los endulzamientos mas dificiles de aprovechar de las cargas con isomaltulosa y edulcorantes, solo se aprecian aumentos insignificantes y ambiguos de la turbiedad durante el periodo observado.

En la figura 11l se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Doppelbock como cerveza de base que ha sido contaminada con Schizosaccharomyces pombe. Las bebidas que han sido elaboradas con la cerveza Doppelbock muestran en todas las cargas aumentos de turbiedad bastante rapidos. Esto se atribuye al hecho de que no solamente se introducen las ya mencionadas porciones elevadas de azucares fermentables de la cerveza, sino que adicionalmente estas bebidas mixtas a base de cerveza presentan tambien los valores de pH mas altos de todas las cargas (vease la tabla 12). En este caso, los mismos se situan ligeramente por encima de 3, .

6.4.3.4 P. damnosus

En la figura 11m se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen como cerveza de base que ha sido contaminada con Pediococcus damnosus. Al utilizar la cerveza Pilsen, todas las cargas permanecian estables durante mucho tiempo despues de la contaminacion con Pediococcus damnosus. Las cargas endulzadas con sacarosa presentaron al final del periodo observado una marcada turbiedad y, por lo tanto, deterioro.

En la figura 11n se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen dietetica como cerveza de base que ha sido contaminada con Pediococcus damnosus. Las curvas de turbiedad que se han encontrado utilizando una cerveza dietetica como base estan en buena correlacion con las que se han encontrado con la cerveza de base Pilsen. El aumento mas rapido de la turbiedad en las cargas que contienen sacarosa tiene su fundamento en los contenidos algo mas reducidos de alcohol y sustancia amarga. El hecho de que incluso con una cerveza dietetica, que no aporta una porcion de hidratos de carbono propia, solo se pudo detectar un aumento de turbiedad cuando se endulzo con sacarosa, apoya la hipotesis que se habia tomado con Pilsen como cerveza de base, de que el crecimiento celular realmente tuvo lugar sobre la base de la sustancia endulzante sacarosa y que las demas sustancias edulcorantes no ofrecian ninguna base para que P. damnosus pudiera vivir. En la figura 11o se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen sin alcohol como cerveza de base que ha sido contaminada con Pediococcus damnosus.

Tambien en las cargas con la cerveza sin alcohol, solo las cargas que contenian sacarosa mostraron un aumento de la turbiedad. P. damnosus solo puede utilizar la sacarosa.

En la figura 11p se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Doppelbock como cerveza de base que ha sido contaminada con Pediococcus damnosus. El enturbiamiento que se habia observado en las otras cargas se retrasa en este caso debido al contenido en alcohol mas elevado. Sin embargo, al final del periodo observado, se

produjo en todas las cargas un ligero aumento del turbiedad. Por ello se concluye que en este caso tiene lugar un ligero crecimiento sobre la base del azucar residual de la parte de cerveza.

6.4.3.5 L. brevis

En la figura 11q se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen como cerveza de base que ha sido contaminada con Lactobacillus brevis. Durante la incubacion con Lactobacillus brevis de las cargas con Pilsen como cerveza de base no se observa ningun aumento de turbiedad. Valores constantes ligeramente aumentados se consideran turbiedad basica que puede ser producida entre otros tambien por la introduccion de la suspension celular durante la inoculacion.

En la figura 11r se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen dietetica como cerveza de base que ha sido contaminada con Lactobacillus brevis. Todas las cargas observadas permanecieron constantes durante mucho tiempo. Se aprecia un ligero aumento de turbiedad en las cargas con sacarosa. Este efecto puede ser debido a las concentraciones algo mas bajas de alcohol y sustancia amarga de la cerveza dietetica.

En la figura 11s se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen sin alcohol como cerveza de base que ha sido contaminada con Lactobacillus brevis. En las cargas con la cerveza sin alcohol como base, el aumento de turbiedad observado en la carga que contenia sacarosa demuestra que, en ausencia de alcohol, L. brevis es capaz de deteriorar las bebidas que contienen sacarosa. Las otras dos cargas permanecieron constantes; no hubo aprovechamiento de la isomaltulosa ni de los edulcorantes.

En la figura 11t se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Doppelbock como cerveza de base que ha sido contaminada con Lactobacillus brevis. En las cargas de las bebidas mixtas elaboradas con Doppelbock como cerveza de base no se observa ningun aumento de turbiedad. Probablemente debido al contenido de alcohol mas elevado, junto con el pH que es mas bajo de lo tipico para una cerveza, no se puede detectar ninguna actividad de crecimiento.

6.4.3.6 M. cerevisiae

En la figura 11u se muestran las curvas de turbiedad de la bebida mixta con Pilsen como cerveza de base que ha sido contaminada con Megasphera cerevisiae. Se describe la serie de ensayos con las mezclas elaboradas con la cerveza de base Pilsen a titulo de ejemplo que sirve para todas las cargas con Megasphera cerevisiae. En ninguna carga se ha observado un aumento de turbiedad. Parece muy probable que ello se debe a los valores de pH que estan muy por debajo de 4 incluso en el caso de la bebida mixta elaborada con Doppelbock.

6.4.4 Aparici6n de abombamiento

Igual que la turbiedad, la denominada aparicion de abombamiento es un claro indicio para el deterioro de una bebida refrescante. Cuando el contenido de la botella se deteriora por la actividad microbiana, se pueden observar deformaciones (abombamientos) en las botellas debido a la mayor presion interior, asi como la turbiedad que se ha formado.

Las desviaciones de las botellas sin incubar (botella cero) que se muestran en las figuras 12a hasta 12l han sido medidas despues del llenado de la botella, pero antes de la incubacion. Esto significa que ligeras variaciones con respecto a este valor de referencia se deben al aumento de presion normal que se produce por el almacenamiento de la bebida carbonatada a 200 C. En adelante, esta dilatacion se denomina dilatacion normal que se muestra en el ejemplo de la siguiente figura.

En la figura 12a se muestran las variaciones de altura de las botellas contaminadas tras la incubacion con Saccharomyces diastaticus en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Se puede ver que tras la incubacion con Megasphera cerevisiae de las botellas llenadas estas presentan ligeras variaciones con respecto a la botella cero. Sin embargo, no se habia detectado ningun crecimiento por medio de la turbiedad medida. Asimismo hay que sefalar que Megasphera solo da lugar a la formacion de cantidades minimas de CO2, si cabe, incluso cuando se produce crecimiento y, por lo tanto, dificilmente puede contribuir a un aumento de la presion interior de la botella.

La aparicion de abombamiento es generalmente mas apropiada para la deteccion del deterioro de bebidas provocado por levaduras que para el provocado por bacterias, dado que las levaduras producen notablemente mas CO2 durante su actividad metabolica. El riesgo de abombamiento tiene por lo tanto mas relevancia para el deterioro provocado por levaduras que no para el provocado por bacterias, las cuales deterioran mas las bebidas por provocar turbiedad y malos aromas.

En la figura 12b se muestran las variaciones de altura de las botellas contaminadas tras la incubacion con Saccharomyces diastaticus en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Las deformaciones de la botella que se han producido estan esencialmente en correlacion con las curvas de turbiedad detectadas. Se pueden

provocar ligeras variaciones en las dimensiones por el aumento de la presion interior que se produce durante el almacenamiento de una bebida carbonatada a 200 C. Solo en las cargas que contenian sacarosa se podian observar cambios evidentes en la altura absoluta de las botellas inoculadas con Saccharomyces diastaticus.

En la figura 12c se muestran las variaciones del diametro de las botellas contaminadas tras incubacion con Saccharomyces diastaticus en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Igual que en las mediciones de altura, solo se observan variaciones evidentes en las dimensiones de la botella donde Saccharomyces diastaticus podia aprovechar sacarosa.

En la figura 12d se muestran las variaciones en el comienzo del escalon de las botellas contaminadas tras incubacion con Saccharomyces diastaticus en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Una vez mas, tras la incubacion con Saccharomyces diastaticus, se denotan variaciones evidentes solo en las bebidas endulzadas con sacarosa. Curiosamente, las desviaciones mas fuertes se producen en la carga con la cerveza dietetica en la que la parte de hidratos de carbono proviene exclusivamente del endulzamiento de la parte de limonada. En todas las cargas inoculadas con Saccharomyces diastaticus solo se ha aprovechado la sacarosa como base metabolica.

En la figura 12e se muestran las variaciones de altura de las botellas contaminadas tras la incubacion con Saccharomyces cerevisiae MJJ2 en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Para las cargas incubadas con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 se puede decir que las desviaciones mas evidentes se han producido en las bebidas endulzadas con sacarosa. Las bebidas que contenian isomaltulosa, en las que tambien se han producido turbiedades mas o menos fuertes debido a la multiplicacion de celulas, muestran ligeros aumentos en altura pero claramente inferiores a las que se producen con sacarosa.

En la figura 12f se muestran las variaciones del diametro de las botellas contaminadas tras incubacion con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 en comparacion con la botella no deformada (botella cero). En cuanto a las variaciones del diametro de las botellas tras la incubacion con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 se puede decir, igual que para el aumento en altura, que las deformaciones mas evidentes se han producido en las bebidas endulzadas con sacarosa, las dilataciones en las cargas que contenian isomaltulosa y edulcorantes se situaban dentro del rango de la dilatacion normal.

En la figura 12g se muestran las variaciones del comienzo del escalon de las botellas contaminadas tras incubacion con Saccharomyces cerevisiae MJJ2 en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Se puede reconocer claramente que solo en las cargas de ensayo endulzadas con sacarosa se han producido deformaciones relevantes en la botella con respecto al parametro del comienzo del escalon de las botellas incubadas con Saccharomyces cerevisiae MJJ2.

En la figura 12h se muestran las variaciones de altura de las botellas contaminadas tras la incubacion con Schizosaccharomyces pombe en comparacion con la botella no deformada (botella cero). En ninguna de las cargas incubadas con Schizosaccharomyces se mostro un crecimiento significante, correspondientemente no se han detectado dilataciones en las botellas que sobrepasan la dilatacion normal lo mismo es valido para las figuras 12i y 12j.

En la figura 12i se muestran las variaciones del diametro de las botellas contaminadas tras incubacion con Schizosaccharomyces pombe en comparacion con la botella no deformada (botella cero). En la figura 12j se muestran las variaciones del comienzo del escalon de las botellas contaminadas tras incubacion con Schizosaccharomyces pombe en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Tal como era de esperar, no se han producido deformaciones evidentes en aquellas cargas de ensayo contaminadas con bacterias en las que tampoco se habia medido turbiedad. Pediococcus damnosus era capaz (excepcion: Doppelbock como cerveza de base) de provocar turbiedad en las bebidas mixtas endulzadas con sacarosa. En las mezclas con cerveza dietetica y con cerveza sin alcohol incluso mucho antes del final del periodo observado. Se reconocen pequefas desviaciones en la dilatacion de altura.

En la figura 12k se muestran las variaciones de altura de las botellas contaminadas tras incubacion con Pediococcus damnosus en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Sin embargo, esta dilatacion es menor y no ha sido verificada en los demas puntos de medicion. Una razon para ello puede ser que Pediococcus pertenece a las bacterias del acido lactico homofermentativas que incluso con una fuerte actividad metabolica solo son capaces de formar pequefas cantidades de CO2.

En la figura 12l se muestran las variaciones de altura de las botellas contaminadas tras incubacion con Lactobacillus brevis en comparacion con la botella no deformada (botella cero). Por medio de la turbiedad solo se detecto un crecimiento de L. brevis en la bebida mixta a base de cerveza elaborada con cerveza sin alcohol y la parte de limonada endulzada con sacarosa. Ciertamente Lactobacillus brevis es heterofermentativo, pero el crecimiento era muy lento, de manera que solo se detecto una desviacion en el parametro de la dilatacion de altura que estaba solo muy poco por encima de la dilatacion normal.

6.5 Resumen

Se han elaborado bebidas mixtas a base de cerveza que se diferenciaban debido a las diferentes cervezas de base elegidas en los parametros de contenido de alcohol, aporte de hidratos de carbono de la parte de cerveza y contenido en sustancias amargas. Variando la sustancia endulzante se afadieron a las bebidas mixtas ya sea sacarosa o isomaltulosa como posible sustrato, o bien no se aportaron hidratos de carbono aprovechables utilizando edulcorantes en la parte de limonada. Debido a la gran relevancia de las levaduras como organismos dafinos en refrescos pobres en alcohol, pero ricos en azucar, las bebidas han sido contaminadas intencionadamente con tres levaduras distintas e incubadas a 200 C. Se eligio la levadura Saccharomyces diastaticus porque tiene una importancia excepcional como organismo que dafa la cerveza, ya que ademas de la capacidad normal de fermentar hidratos de carbono de bajo peso molecular tambien es capaz de fermentar cadenas de hidratos de carbono mas largas, las denominadas dextrinas. Tambien se han utilizado las levaduras Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae MJJ2. En ensayos previos habian sido capaces de aprovechar la isomaltulosa; Schizosaccharomyces pombe tambien era capaz de ello en la cerveza envasada.

Ademas de estas levaduras, se han utilizado tambien bacterias que tienen una gran importancia como germenes de deterioro para la cerveza envasada. Se eligieron Pediococcus damnosus, Lactobacillus brevis y Megasphera cerevisiae.

Se ha mostrado que las levaduras Saccharomyces diastaticus y Saccharomyces cerevisiae MJJ2 han sido capaces muy rapidamente de deteriorar la mayoria de las bebidas contaminadas. Esto sucedio tanto por la aparicion de una fuerte turbiedad, como tambien por una fuerte deformacion de las botellas (abombamiento). Pero mientras Saccharomyces diastaticus solo era capaz de crecer en presencia de sacarosa en la carga de ensayo con cerveza dietetica (aporte de hidratos de carbono solo a traves de la parte de limonada), Saccharomyces cerevisiae MJJ2 crecio tambien en la carga endulzada con isomaltulosa, aunque de forma sorprendentemente mas lenta que cuando se endulzo con sacarosa. Por ello, se concluye que Saccharomyces cerevisiae MJJ2 era capaz de aprovechar tambien la isomaltulosa en estas condiciones, pero de forma sorprendentemente mas lenta que la sacarosa. Sorprendentemente, Saccharomyces diastaticus no pudo aprovechar la isomaltulosa en ninguna de las bebidas elaboradas.

Esta levadura no es capaz de forma general de aprovechar la isomaltulosa como sustrato. El crecimiento detectado de las levaduras Saccharomyces en las cargas que han sido elaboradas con otras cervezas de base que la cerveza dietetica tuvo lugar casi de forma identica en todas las variantes de endulzamiento y se atribuye a la utilizacion de grandes cantidades de extracto residual que ha sido aportado a la bebida mixta acabada por las partes componentes de la cerveza.

Schizosaccharomyces pombe, en general, no mostro una actividad perceptible en ninguna de las cargas examinadas. Se supone que ello se debe sobre todo a los valores de pH que, debido a la adicion de limonada, se situaban claramente por debajo de los de las cervezas normales.

En la evaluacion de las cargas de ensayo inoculadas con bacterias que dafan la cerveza sorprende que Pediococcus damnosus y Lactobacillus brevis solo eran capaces de enturbiar aquellas cargas que contenian sacarosa. En ninguna de las cargas endulzadas con isomaltulosa o con la mezcla de edulcorantes estas bacterias fueron capaces de provocar turbiedad. Megasphera cerevisiae que tambien fue examinada no fue capaz en general de crecer en bebidas mixtas a base de cerveza; la razon para ello ha de buscarse sobre todo en los bajos valores de pH de las bebidas.

Resumiendo, de los organismos examinados solo Saccharomyces cerevisiae MJJ2 es capaz de aprovechar la isomaltulosa utilizada para endulzar, pero de forma sorprendentemente mas lenta que la sacarosa existente alternativamente. Los demas organismos, sorprendentemente, no pueden aprovechar la isomaltulosa.

Es decir que, con respecto a la utilizacion de sacarosa para endulzar la parte de limonada de bebidas mixtas a base de cerveza, la isomaltulosa es capaz de mejorar notablemente la estabilidad biologica. Las cargas que contenian la mezcla de edulcorantes presentaban la misma estabilidad que las bebidas endulzadas con isomaltulosa. Sin embargo, estas obtuvieron peores resultados en la cata que son inaceptables en su conjunto.

Ejemplo (no segun la invencion): Influencia de la isomaltulosa sobre el perfil aromatico de mostos reales fermentados

�.1 Mostos reales

Se elaboro un mosto de Pilsen. Una parte de este mosto fue tratado de manera que aproximadamente una cuarta parte del extracto estaba formado por isomaltulosa. El mosto original no tratado y el mosto que contenia isomaltulosa fueron fermentados en las mismas condiciones (sin presion, 120 C) por las mismas levaduras que se han utilizado en los mostos de patron.

Dado que se queria simular la practica normal de la fabricacion de cerveza, estos mostos no fueron llevados en una

sola etapa hasta la fermentacion final, sino hasta aproximadamente 1 a 1,5 % por encima del extracto a esperar en la fermentacion final, y luego se afadio una fermentacion secundaria durante 14 dias a 10 C. En las cervezas elaboradas de esta manera, se analizaron de forma especifica segun MEBA�, asi como por cromatografia de gases los mismos, componentes aromaticos seleccionados que en los mostos de patron. Adicionalmente se realizaron 5 catas de valoracion. Se pretendia detectar la variacion del perfil aromatico detectado analiticamente y de la impresion gustativa en funcion del contenido en isomaltulosa.

En la cerveceria de investigacion del Instituto Cervecero de Investigacion y Ensefanza (VLB) se elaboro un mosto de cerveza (tipo Pilsen) que fue ajustado mediante redilucion con agua y adicion de isomaltulosa de tal manera que

10 aproximadamente el 25 % del contenido en extracto del mosto estaba formado por isomaltulosa. El mosto no modificado y el mosto con isomaltulosa fueron fermentados paralelamente en las mismas condiciones por diferentes levaduras.

En la tabla 16 se muestran los analisis de los mostos. 15 Tabla 16:

Analisis de mostos con y sin isomaltulosa

Parametro: Unidad Mosto original Mosto 25 % isomaltulosa

Contenido en extracto: % 11,26 11,33

Extracto, aparente, de fermentacion final: % 1,�3 4,2

Grado de fermentacion final, aparente: % �3,3 62,6

pH: 5,36 5,2

Profundidad de color: EBC ,6 6,4

Unidades de amargor: BE 4�,1 31,6

Nitrogeno total: ppm �6� 655

Nitrogeno de aminoacidos libres: ppm 1�5 124

�inc: ppm 0,1� 0,15

DMS: ppb 30 20

Los mostos fueron ajustados a un contenido en extracto muy parecido. La adicion de isomaltulosa hace que baje el 20 grado de fermentacion, dado que aumenta la parte de hidratos de carbono no fermentables (en la analitica del grado de fermentacion final) debido a la sustitucion del extracto propio del mosto por isomaltulosa. Los demas valores analiticos varian en funcion de la redilucion, es decir que baja el contenido, tal como sustancias amargas o fracciones proteicas.

25 Ambos mostos han sido fermentados con las cuatro levaduras siguientes, respectivamente:

•� Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11,

•� Saccharomyces cerevisiae MJJ 25, 30

•� Saccharomyces cerevisiae MJJ 2,

•� Schizosaccharomyces pombe

35 �.2 Analisis de los componentes aromaticos

En todas las cargas de fermentacion se ha determinado el siguiente componente aromatico una vez terminada la fermentacion (= 4 dias sin disminucion de extracto): acetaldehido, etilacetato, 1 �propanol, isobutanol, iso�anilacetato, 2�metilbutanol, 3�metilbutanol, 2 �feniletanol, fenilacetato. Ademas de los componentes aromaticos relevantes 40 tambien se detectaron las dicetonas vicinales formadas durante la fermentacion. Se trata de componentes aromaticos relativamente importantes que se utilizan en muchos casos en la practica cervecera como sustancias clave para controlar la fermentacion principal.

�.3 Resultados 45

�.3.1 E/ desarro//o de /a fermentaci6n

El desarrollo de la fermentacion de los dos mostos reales (con y sin isomaltulosa) con Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 muestra la siguiente imagen: Inicialmente, la disminucion de extracto es casi identica, 50 despues la curva de disminucion se vuelve mas plana en el mosto que contiene isomaltulosa. Una vez el mosto que no contenia isomaltulosa habia alcanzado el valor deseado, se interrumpio tambien la fermentacion del mosto que contenia isomaltulosa. Tal como se esperaba, el extracto residual era mas alto en este caso.

Tambien en la fermentacion con Saccharomyces cerevisiae MJJ 25, las curvas de disminucion de extracto solo son paralelas inicialmente. Las curvas difieren relativamente pronto (a partir del 50 dia de fermentacion) y la diferencia del extracto residual es bastante evidente.

5 El desarrollo de la fermentacion de mostos reales (con y sin isomaltulosa) con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 muestra la siguiente imagen: Las curvas de fermentacion se parecen a las anteriores, la disminucion de extracto comienza de forma similar, despues la curva del mosto que contiene isomaltulosa se vuelve mas plana.

El desarrollo de la fermentacion de mostos reales (con y sin isomaltulosa) con Schizosaccharomyces pombe

10 muestra la siguiente imagen: Las curvas de desarrollo del extracto son casi identicas cuando se utiliza Schizosaccharomyces pombe. Tambien los valores finales que se alcanzan son muy parecidos, dado que la isomaltulosa tambien puede ser aprovechada como sustrato por esta levadura.

�.3.2 Ana/isis de /as cervezas acabadas

15 En la tabla 1� se muestran los valores analiticos de los mostos (con y sin isomaltulosa) fermentados con Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 y Saccharomyces cerevisiae MJJ 25.

Tabla 1�: 20

MJJ 11 sin isomaltulosa: MJJ 11 con isomaltulosa MJJ 25 sin isomaltulosa MJJ 25 con isomaltulosa

Mosto original, calculado �%�: 11,25 11,24 11,32 11,2�

Extracto, aparente �%�: 2,35 3,6� 3,3 4,16

Extracto, real �%�: 4,04 5,1 4,�2 5,44

Alcohol �% en vol�: 4,�1 3,�� 4,2� 3,5�

pH: 4,4 4,25 4,6� 4,4

Unidades de amargor �BU�: 30 2� 33 2�

Estabilidad de la espuma �s�: 2�6 263 343 2�1

En la tabla 1� se muestran los valores analiticos de los mostos (con o sin isomaltulosa) fermentados con Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae MJJ 2.

25 Tabla 1�:

Schiz. pombe sin isomaltulosa: Schiz. pombe con isomaltulosa MJJ 2 sin isomaltulosa MJJ 2 con isomaltulosa

Mosto original, calculado �%�: 11,2� 11,32 11,2� 11,56

Extracto, aparente �%�: 2,41 4,21 2,13 4,5�

Extracto, real �%�: 4,0� 5,5 3,�� 5,�1

Alcohol �% en vol�: 4,6� 3,64 4,�6 3,�5

pH: 4,3� 4,36 4,45 4,36

Unidades de amargor �BU�: 33 26 2� 25

Estabilidad de la espuma �s�: 2�6 1�� 22� 256

Se puede ver claramente que el extracto residual de las cervezas cargadas con isomaltulosa es mas alto tras la

fermentacion, ya que la isomaltulosa no ha sido fermentada. De ello resulta en todos los casos tambien un menor 30 contenido de alcohol. Esto tambien es valido para Schizosaccharomyces pombe que pudo aprovechar en los mostos

de patron las soluciones que contenian isomaltulosa de forma similar a la solucion de referencia. En soluciones

complejas de mezclas de hidratos de carbono aparentemente esta levadura tambien aprovecha primero otros

azucares. En esta serie de ensayos la fermentacion se termino antes de poder degradar la isomaltulosa. El valor de

pH de las cervezas que contienen isomaltulosa es, en general, ligeramente mas bajo que el de las cervezas de 35 comparacion, pudiendose decir lo mismo tambien para las unidades de amargor, pero en este caso el valor mas bajo

se debe a la redilucion.

�.3.3 Componentes aromaticos

40 En la figura �a se muestra el contenido en componentes aromaticos tras fermentacion de los mostos reales mediante Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 y Saccharomyces cerevisiae MJJ 25.

No se evidencia una clara influencia de la adicion de isomaltulosa sobre la formacion de componentes aromaticos.

MJJ 11 genera ciertamente en casi todos los componentes en la carga sin isomaltulosa, elevadas cantidades de la 45 sustancia respectiva, pero las diferencias son insignificantes y, ademas, se deben probablemente a la cantidad

absoluta algo inferior del sustrato utilizado. Asimismo se comprueba que Saccharomyces cerevisiae MJJ 25 genera

en algunos casos en la solucion que contiene isomaltulosa concentraciones mas elevadas de la sustancia en

cuestion. Por medio de los datos mostrados en la presente, no se puede decir inequivocamente que la presencia de isomaltulosa influye sobre el perfil aromatico que se ha formado.

En la figura �b se muestra el contenido en componentes aromaticos tras fermentacion de los mostos reales mediante Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae MJJ 2.

Asimismo no se evidencia una clara influencia de la adicion de isomaltulosa sobre la formacion de componentes aromaticos. En la mayoria de los casos se forman, ciertamente, menos de las sustancias observadas en los mostos con adicion de isomaltulosa, pero esto se debe tambien a que se ha utilizado en conjunto menos cantidad de sustrato. Extraordinariamente, Schizosaccharomyces pombe genero otra vez mas acetaldehido en presencia de isomaltulosa.

En los mostos sin isomaltulosa se forman menos diacetilo y pentandiona. La diferencia en las concentraciones no se explica solamente con la menor conversion de sustrato: En los mostos que contienen isomaltulosa se ha sustituido aproximadamente una cuarta parte del extracto por isomaltulosa. Sin embargo, los contenidos medidos corresponden solamente al 50 % o incluso menos en los mostos con isomaltulosa comparado con mostos sin tratar. La presencia de isomaltulosa en los mostos dificulta aquellas vias metabolicas que estan relacionadas con la formacion de las sustancias diacetilo y pentandiona constituyen una excepcion en este caso los mostos que han sido fermentados con Schizosaccharomyces pombe.

La presencia de isomaltulosa no influye de forma significativa sobre el desarrollo de sustancias del grupo de los esteres y alcoholes alifaticos elevados (y acetaldehido). Una excepcion constituye en este caso la levadura Schizosaccharomyces pombe que aparentemente genera mas acetaldehido cuando en lugar de maltosa tambien esta presente isomaltulosa como sustrato. Esta levadura tambien constituye la excepcion en la formacion de dicetonas vicinales. En las tipicas levaduras cerveceras la formacion de estas sustancias es aparentemente ralentizada por la presencia de isomaltulosa.

�.3.4 Cata

Adicionalmente a la analitica quimica se realizo una cata con valoracion de las cervezas una vez terminada la fermentacion principal y la fermentacion secundaria. En una escala de 1 a 5 se evaluaron los siguientes parametros: impresion de dulzor, impresion de amargor, aroma de lupulo, malta, frutado, burbujeo, plenitud de sabor en boca e impresion general.

A continuacion, se muestran los resultados de las catas.

En la figura �a se muestran los resultados de la cata de valoracion de las cervezas elaboradas de los mostos reales; fermentadas con Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11(10 catadores): Los perfiles aromaticos resultantes del esquema de cata tras fermentacion por Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 se superponen entre si de forma casi identica, independientemente de si el mosto contenia isomaltulosa o no. Solo en la impresion general, la cerveza con isomaltulosa ha sido valorada algo mejor. Un motivo indicado a menudo ha sido una impresion general "redonda" a pesar de que los parametros individuales han sido valorados igual.

En la figura �b se muestran los resultados de la cata de valoracion de las cervezas elaboradas de los mostos reales; fermentadas con Saccharomyces cerevisiae MJJ 25 (10 catadores): Tambien tras fermentacion con Saccharomyces cerevisiae MJJ 25 los perfiles aromaticos se sobreponen entre si de forma casi identica. Una vez mas la cerveza que contenia isomaltulosa fue valorada ligeramente mejor en la impresion general, a pesar de que los parametros individuales habian sido valorados igual. Sin embargo, tras fermentacion con Saccharomyces cerevisiae MJJ 25 se percibieron como mas fuertes tanto la impresion de amargor, como el frutado de las cervezas.

En la figura c se muestran los resultados de la cata de valoracion de las cervezas elaboradas de los mostos reales; fermentadas con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 (10 catadores): Tras fermentacion con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 las cervezas han sido valoradas otra vez de forma muy parecida. La cerveza sin isomaltulosa ha sido percibida como menos dulce, en cambio predomino mas la impresion de amargor que aparentemente fue compensada, por otro lado, por la presencia de la isomaltulosa. En cuanto a calidad general, las dos cervezas han sido valoradas igual.

En la figura �d se muestran los resultados de la cata de valoracion de las cervezas elaboradas de los mostos reales; fermentadas con Schizosaccharomyces pombe (10 catadores): Tras fermentacion con Schizosaccharomyces pombe las cervezas se diferenciaban aparentemente de forma clara. La cerveza que contenia isomaltulosa fue percibida como mas dulce, pero aparentemente este dulzor fue percibido como maltoso. Aunque la intensidad del amargor fue percibida igual de fuerte, en la cerveza sin isomaltulosa este amargor fue percibido como algo mas aromatico de lupulo, una impresion que aparentemente fue compensada por la isomaltulosa contenida en la misma. Sin embargo, en la valoracion de la calidad general, la cerveza que contenia isomaltulosa obtuvo otra vez una valoracion ligeramente mejor.

Las cervezas que contenian isomaltulosa, mayoritariamente, no han sido percibidos como claramente diferentes con respecto a las cervezas de referencia. En cuanto a calidad general, la adicion de la misma puede hacer que la impresion de la cerveza aparezca algo mas "redonda" debido a la compensacion de influencias desagradables para el sabor tal como, por ejemplo, fuerte amargor.

Ejemplo �: El aprovechamiento de isomaltulosa por bacterias y la influencia de los factores selectivos propios de la cerveza sobre al aprovechamiento de la isomaltulosa por las levaduras

�.1 Fabricacion del medio

Se elaboraron de forma esteril una isomaltulosa al 5 % y una solucion de patron que contenia 6,� g/l YNB (Yeast Nitrogen Base). La incubacion se realizo a 260 C a escala de 10 litros en probetas con tubos Durham.

Los respectivos factores selectivos fueron ajustados de la siguiente manera:

•�: Manipulacion del valor del pH mediante adicion de acido fosforico,

•�: Contenido en sustancias amargas mediante adicion de isohumulonas,

•�: Contenido de alcohol mediante adicion de etanol desnaturalizado al �6 %, y

•�: Privacion de oxigeno mediante incubacion en jarra de anaerobios. El aprovechamiento de isomaltulosa fue medido mediante el control de la formacion de gas (visual), la medicion mediante metodo DNS (fotometricamente) y el analisis del espectro de azucar (HPLC).

�.2 Microorganismos examinados y analisis Se ha examinado el aprovechamiento de las siguientes levaduras:

•�: Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 (levadura cervecera);

•�: Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 (Levadura cervecera, aprovecha bien la isomaltulosa);

•�: Schizosaccharomyces pombe (aprovecha bien la isomaltulosa) y

•�: Saccharomyces diastaticus (dafa la cerveza, capaz de sobrefermentar)

Ademas, se examino el aprovechamiento de la isomaltulosa por bacterias conocidas, que dafan la cerveza. A tal efecto se eligieron "condiciones ideales", anaerobicas, 2 �0 C, incubacion de 21 dias:

•�: Pediococcus damnosus (DSM: 20331),

•�: Megasphera cerevisiae (cepa salvaje),

•�: Pectinatus frisingensis (DSM: 20465) y

•�: Lactobacillus brevis (DSM: 20054).

La denominacion "cepa salvaje" significa que se trata de una cepa que ha sido aislada de cerveza contaminada y no tiene numero DSM (DSM: Coleccion alemana de microorganismos).

Adicionalmente se han examinado otros lactobacilos debido a la importancia que tienen estos como organismos que dafan la cerveza y como cultivos probioticos en la industria alimentaria:

•�: L. fructivorans (DSM: 20203),

•�: L. fructivorans (cepa salvaje),

•�: L. corniformis (DSM: 20001),

•�: L. lindneri (DSM: 206�0),

•�: L. lindneri (DSM: 20�61),

•�: L. casei (DSM: 2001),

•�: L. curvatus (cepa salvaje), 5 •� L. brevis (DSM: 6235),

•� L. brevis (cepa salvaje),

•�: L. acidophilus (DSM: 20242), 10

•� L. amylovorus (DSM: 20552),

•�: L. delbruckli (DSM: 2004�), 15 •� L. fermentum (DSM: 2004�),

•� L. gasseri (DSM: 200��),

•�: L. johnsonii (DSM: 20553), 20

•� L. plantarum (DSM: 1202�),

•�: L. reuteri (DSM: 20015), 25 •� L. rhamnosus (DSM: 20023) y

•� L. salivarius (DSM: 204�2).

Dado que por la literatura se conoce de los lactobacilos que este tipo de bacterias no puede sintetizar todos los

30 aminoacidos, se han realizado experimentos paralelamente al medio no tratado, en los que el medio contenia adicionalmente 2% de peptona. Debido a la clasificacion de los lactobacilos, asimismo conocida por la literatura, en los tolerantes al lupulo y los intolerantes al mismo, se ha establecido una tercera serie de ensayos en los que el medio contenia 20 mg/l de isohumulonas.

35 Las concentraciones de isomaltulosa han sido detectadas mediante HPLC en 42, 3 g/l. Este valor esta contrapuesto a los contenidos residuales descritos abajo tras incubacion como valor de salida. El medio de modelo ha sido incubado con adicion de factores selectivos especificos de la cerveza.

�.3 Resultados 40

8.3.1 Levaduras

Tras un tiempo de incubacion de 14 dias se obtuvieron para Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 los resultados mostrados en la figura �.

45 En la figura a se muestran contenidos en isomaltulosa en la solucion de patron sin incubar y tras 14 dias de incubacion (anaerobico, 260 C) con Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 (medido mediante HPLC).

Se puede ver que los valores medidos corresponden al valor inicial con una precision de 5 %. Esto significa que no

50 ha tenido lugar una metabolizacion de la isomaltulosa. El valor mas bajo se ha medido en la solucion sin factores selectivos, pero tambien en este caso no se puede hablar de una disminucion de la metabolizacion. Por medio de esta serie de ensayos se puede decir que Saccharomyces carlsbergensis MJJ 11 no ha podido fermentar la isomaltulosa en el periodo observado independientemente de las influencias selectivas existentes.

55 En la siguiente figura se muestra la correspondiente serie de ensayos con la levadura Saccharomyces cerevisiae MJJ 2. Esta levadura es conocida de series de ensayos anteriores como capaz de aprovechar la isomaltulosa.

En la figura �b se muestran los contenidos en isomaltulosa en la solucion de patron sin incubar y tras 14 dias de incubacion (anaerobico, 260 C) con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 (medido mediante HPLC).

60 Tras catorce dias de incubacion se ha medido una disminucion en la carga sin factores selectivos. Sin embargo, tambien en este caso esta disminucion es solo insignificante y en ninguna carga de las que han sido modificadas se ha medido una disminucion parecida.

65 En la figura c se muestran los contenidos en isomaltulosa en la solucion de patron sin incubar y tras 14 dias de

incubacion (aerobico, 260 C) con Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 (medido mediante HPLC).

Tal como se ha esperado, Saccharomyces cerevisiae MJJ 2 mostro en condiciones aerobicas una capacidad claramente mayor de aprovechar isomaltulosa. En la carga no modificada se habian metabolizado tras 14 dias aproximadamente el 5 % de la isomaltulosa. En una atmosfera aerobica, ademas, se ha detectado una ligera degradacion de la isomaltulosa incluso con un pH de 4, pero ya no se produce ningun aprovechamiento de isomaltulosa cuando se baja mas el valor pH.

La mera ausencia de oxigeno dificulta a esta levadura el aprovechamiento de isomaltulosa como sustrato. La presencia de sustancias amargas del lupulo y alcohol, asi como una reduccion del valor de pH por debajo de 4 hace que la metabolizacion de isomaltulosa se pare por completo.

El mismo ensayo se ha realizado con Schizosaccharomyces pombe. En la figura �d se muestran los contenidos de azucar en la solucion de patron sin incubar y tras 14 dias de incubacion (anaerobica, 260 C) con Saccharomyces pombe (medido mediante HPLC).

Se puede ver claramente que esta levadura es capaz en todas las condiciones de ensayo de aprovechar la isomaltulosa ofrecida como sustrato. Solo en la carga con el pH mas bajo existe aun una concentracion residual de isomaltulosa que se puede medir, de manera que al bajar mas todavia el valor de pH, el aprovechamiento de isomaltulosa podria quedar eventualmente impedido, pero valores de pH por debajo de 3 se encuentran solo en muy pocas bebidas y tampoco muy por debajo de este valor. Los factores selectivos tipicos de la cerveza no son capaces, ni combinados como la carga con 5 % de alcohol y la presencia de sustancias amargas del lupulo, de impedir el aprovechamiento de isomaltulosa.

Se ha detectado que Schizosaccharomyces pombe puede aprovechar la isomaltulosa de forma eficaz. Los valores medidos para los azucares individuales glucosa y fructosa sugieren que esta levadura disgrega la isomaltulosa de forma extracelular antes de que los azucares simples sean asimilados despues.

Otra imagen/situacion se presenta tras la realizacion de la serie de ensayos con la levadura Saccharomyces diastaticus conocida como organismo que dafa las bebidas. En la figura �e se muestran contenidos en isomaltulosa en la solucion de patron sin incubar y tras 14 dias de incubacion (anaerobico, 260 C) con Saccharomyces diastaticus (medido mediante HPLC).

En ninguna de las cargas examinadas se ha detectado una disminucion de la concentracion de isomaltulosa. Los valores se mantienen otra vez constantes en un rango de oscilacion de 5 %, de manera que se puede concluir que Saccharomyces diastaticus no es capaz de fermentar isomaltulosa.

8.3.2 Bacterias

En la figura 10 estan representados los resultados de los ensayos de incubacion con cuatro bacterias conocidas como que dafan la cerveza.

En la figura 10a se muestran los contenidos de isomaltulosa en la solucion de patron sin incubar y tras 21 dias de incubacion (anaerobica, 2�0 C) con las bacterias seleccionadas que dafan la cerveza (medido mediante HPLC).

En ninguna de las cargas se ha detectado un aprovechamiento de isomaltulosa en el marco de la precision de medicion. Ninguna de las bacterias examinadas es capaz de crecer sobre la base de isomaltulosa.

Vista la importancia del grupo de los lactobacilos, no solamente como organismos que dafan la cerveza, sino tambien como organismos en la flora intestinal y dental de mamiferos y su aplicabilidad como cultivos probioticos en la industria alimentaria se ha examinado adicionalmente un grupo de diferentes lactobacilos en cuanto a su capacidad de aprovechar isomaltulosa.

En la figura 10b se muestran los contenidos de isomaltulosa tras 21 dias de incubacion (anaerobico, 2�0 C) con diferentes lactobacilos (medido mediante ensayo DNS).

Tras el largo periodo de incubacion de tres semanas, las variaciones en las concentraciones de isomaltulosa estan dentro del 5 %. Los valores mas bajos se han medido para las bacterias L. lindnerii 20�61, L. brevis 6235 y L. rhamnosus 20023. Los valores estan dentro del rango de variacion del 5 % y, ademas, visualmente no se ha observado ningun crecimiento celular masivo. Por lo tanto, no se puede decir por medio de esta medicion que los organismos examinados sean capaces de aprovechar isomaltulosa.

Dado que se conoce por la literatura que los lactobacilos no pueden sintetizar todos los aminoacidos, se ha realizado otra serie de ensayos en los que se ha afadido un 2 % de peptona a la solucion de patron. De esta manera se quiere descartar que un solo eventual crecimiento no haya sido detectado porque no habia fuentes de nitrogeno.

En la figura 10c se muestran los contenidos de isomaltulosa tras 21 dias de incubacion (anaerobico, 2 �0 C) con diferentes lactobacilos con adicion de peptona adicional (medido mediante ensayo DNS).

Una vez mas, en ningun valor medido se ha detectado una disminucion de mas del 5 % con respecto al valor inicial.

5 Sin embargo, sorprende que en este caso varios valores se acercan bastante a este valor limite. Asimismo, cabe sefalar que en los organismos que tenian los valores mas bajos en la serie de mediciones sin peptona, se han vuelto a medir valores bastante bajos.

Para organismos tal como Lactobacillus lindnerii 20� 61 no se puede descartar con total seguridad que pueda

10 aprovechar la isomaltulosa tras una adaptacion adecuada. Sin embargo, hay que tomar en consideracion que en este caso se llevo a cabo una incubacion durante tres semanas en condiciones casi ideales, y aun asi las concentraciones de isomaltulosa disminuyeron solo de forma insignificante. Por lo tanto, y teniendo en cuenta eventuales imprecisiones de medicion (algunos valores son superiores a la concentracion inicial), no se puede considerar que el aprovechamiento sea demostrado por medio de las mediciones descritas en la presente.

15 Correspondientemente resulto de la serie de ensayos en la que a la solucion se le afadieron sustancias amargas del lupulo como sustancia inhibidora, que tampoco en este caso los valores medidos tras la incubacion no eran inferiores al �5 % del valor inicial. Es decir que una vez mas no se ha podido detectar un aprovechamiento de la isomaltulosa en el periodo observado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la fabricacion de cerveza o una bebida mixta a base de cerveza, estabilizada microbiologicamente, que comprende las siguientes etapas:

5 a) mezclar agua de fabricacion de cerveza, lupulo y una fuente de hidratos de carbono para obtener un mosto, b) coccion del mosto y c) fermentacion microbiana del mosto,

10 caracterizado porque se afade isomaltulosa de forma adicional o exclusivamente despues de la filtracion de la cerveza o bien, adicional o exclusivamente, justo antes del envasado o antes del almacenamiento de la cerveza o de la bebida mixta a base de cerveza.
2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la fuente de hidratos de carbono contiene cereales malteados 15 y/o fruto crudo de cereales.
3. Procedimiento, segun una de las reivindicaciones anteriores, en el que se afade la mezcla que contiene isomaltulosa o la isomaltulosa en forma de sirope, en solucion o como solido cristalino.

20 4. Utilizacion de isomaltulosa como agente estabilizador para estabilizar microbiologicamente cerveza o bebidas mixtas a base de cerveza.