BE1005704A4

BE1005704A4 - Farmaceutisch preparaat op basis van rhamnolipide.

Info

Publication number: BE1005704A4
Application number: BE9200115A
Authority: BE
Original assignee: Piljac Goran & Piljac Visnja
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1992-02-04
Publication date: 1993-12-21
Also published as: WO1993014767A2; JP2004149547A; EP0630252A1; ATE284697T1; CA2129542C; EP0630252B1; DK0630252T3; WO1993014767A3; PT630252E; JPH09503196A; ES2235155T3; CA2129542A1; JP3860206B2; AU3453493A; DE69333723D1; DE69333723T2

Abstract

De uitvinding heeft betekking op een farmaceutisch preparaat bevattende als actief bestanddeel tenminste één rhamnolipide of een farmaceutisch acceptabel zout daarvan, en een drager en/of verdunmiddel, dat bij voorkeur bevat een rhamnolipide met de algemene formule: (zie fig) waarin R1=H, alfa-L-rhamnopyranosyl;R2=H, -CH-CH2-COOH;R3=(C5-C20)-verzadigd, -mono- of poly-onverzadigd alkyl;R4=(C5-C20)-verzadigd, -mono- of poly-onverzadigd alkyl, en op het gebruik van het preparaat voor de behandeling van dermatologische afwijkingen, en als kosmetisch preparaat.

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Farmaceutisch preparaat   oo   basis van rhamnolipide 
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een farmaceutisch preparaat dat als actief bestanddeel tenminste   een   rhamnolipide bevat. Meer in het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een dergelijk farmaceutisch preparaat voor de behandeling van dermatologische afwijkingen, virale infecties, en voor kosmetische doeleinden. 



   Tot de bio-oppervlakte-actieve stoffen behoren glycolipiden. Door de verschillende combinaties van koolhydraten en lipiden, tezamen met structureel verschillende bindingen en verschillende ionische toestanden, bestaan er een groot aantal glycolipiden met een onderling sterk verschillende hydrofiele-lipofiele balans. 



   Het is bekend dat verschillende stammen van Pseudomonas, zoals Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovorans, in staat zijn om rhamnolipiden extracellulair uit te scheiden, wanneer zij worden gekweekt op oplosbare, alsook op onoplosbare koolstofoppervlakken. 



   De onderhavige uitvinding heeft betrekking op farmaceutische preparaten die dergelijke rhamnolipiden bevatten. Uit een uitgebreid onderzoek is namelijk gebleken, dat dergelijke rhamnolipide bevattende farmaceutische preparaten een helende werking vertonen op dermatologische afwijkingen, zoals Acnae vulgaris, Pytiriasis versicolor, Erythrasma, Piedra alba, Dermatitis allergica contactu, Neurodermitis circumscripta multilocularis, Neurodermitis diffusa, Neurodermitis erythrodermica, Neurodermitis circumscripta chronica unilocularis, Neurodermitis verrucosa, Neurodermitis infantum, Prurigo chronica, Rosa cea, Dermatitis rosacei formis steroidica, Psoriasis vulgaris, Lychen ruber planus, Strophulus infantum, Urticaria 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 allergica, Dermatitis nummularis eczematoides, Erythema exsudativum multiforme, Epydermolysis bullosa hereditaria dystrophica recessiva,

   Dermatitis seborrhoica, Erythema nodosum, Pemfigus vulgaris, Dermatitis herpetiformis Duhring, Lupus erythematosus   systemicus,   Herpes simplex infecties, Ichtyosis vulgaris, Erythrodermia ichtyosiformis, Keratodermitis palmoplantaris, Epidermolysis bullosa hereditaria simplex, enzovoorts. 



   Bij voorkeur is het rhamnolipide een rhamnolipide met de algemene formule 
 EMI2.1 
 
Zeer werkzame rhamnolipiden worden verkregen indien het rhamnolipide een di-rhamnolipide is. 



   Indien de substituent R2 waterstof is, bevat het rhamnolipide slechts   een   lipidegroep. Indien de substituent R2 
 EMI2.2 
 wordt gevormd door CH R bevat het rhamnolipide-molecuul twee lipide-eenheden die onderling verbonden zijn door een esterbinding. 



   De subsituenten R3 en R4 kunnen worden gekozen uit rechte of vertakte   (Cg-C2o)-verzadigde,-mono-of   polyonverzadigde alkylgroepen. Voorkeur gaat uit naar onvertakte, verzadigde alkylgroepen met de algemene formule   (CH-CHs,   waarin x = 4-20. De meeste voorkeur gaat uit naar alkylgroepen waarin x = 4 of 6. 



   Een zeer werkzaam farmaceutisch preparaat wordt verkregen indien dit bevat het rhamnolipide (alfa-L-   rhamnopyranosyl- (1, 2) alfa-L-rhamnopyranosyl) -3-    hydroxydecoanoyl-3-hydroxydecaanzuur. 



   Aan de hand van een niet-limitatief voorbeeld zullen hierna van een rhamnolipide de isolatie en het gebruik in een farmaceutisch preparaat volgens de uitvinding worden beschreven. Hierbij is van de volgende methoden gebruik gemaakt. 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 



   1. Isolatie en karakterisering 
Uit boorvloeistof van een olieput werden bacteriestammen geïsoleerd die rhamnolipiden kunnen synthetiseren op zowel een vloeibare koolstofbron (glucose) als op een onoplosbare koolstofbron (glycerol, gasolie). Deze geïsoleerde bacteriestammen zijn gekarakteriseerd als Pseudomonasstammen (BBL Minitek Numerical Determination and Identification System, Becton, Dichinson and Company.) 
2. Concentratie en zuivering 
De door extracellulaire secretie in het medium aanwezige rhamnolipiden werden op verschillende wijzen geconcentreerd en gezuiverd. a) zuur precipitate
De pH van de supernatant werd met behulp van zoutzuur gebracht op een pH 1, 5-2, 0, waarna werd ingedampt tot 1/10 van het oorspronkelijke volume en het concentraat liet men over de nacht bij   40C   staan.

   De afgecentrifugeerde pellet (0, 5-2, 0 g/l) werd gecentrifugeerd bij 17. 300 x g gedurende 30 minuten bij   4 C   en vervolgens geëxtraheerd met   CH2C12,   gefiltreerd, drooggedampt, opnieuw geresuspendeerd in water en vervolgens opnieuw geprecipiteerd. 
 EMI3.1 
 schuimfractionering Samengeperste lucht werd gebracht tot in de supernatant en gevormd schuim werd opgenomen in een afzonderlijke houder, of gebracht in aangezuurd water (pH   1, 5-2, 0).   c) chromatografie
Supernatant werd gebracht op een preparatieve kolom (Amberlit XAD-8 of XAD-2 hars, Rohm & Haas). De kolom was geëquilibreerd met water en werd na absorptie doorspoeld met water. De actieve componenten werden geelueerd met een lagere alkylalcohol, zoals ethanol of methanol.

   Het gebruikte 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 oplosmiddel werd afgedampt onder vacuüm en het concentraat werd aangezuurd en geprecipiteerd zoals hiervoor is beschreven. 



   3. Chemische detectie en karakterisering. 



     Dunne-laag-chromatografie   werd analytisch uitgevoerd met silica gel 60F 254 platen (Merck) en preparatief uitgevoerd met Kemika-platen. Voor een optimale scheiding kunnen de navolgende oplosmiddelmengsels worden gebruikt :   CHCI3-MeOH-azijnzuur-water (25 : 15 : 4 : 2 ; 12 : 15 : 4 : 2 ; 25 : 25 : 4 : 2)      CHCIg-MeOH-azijnzuur   (80 : 15 : 5) 
 EMI4.1 
 Hexaan-isopropylether-azijnzuur (15 CHC13-MeOH-NH40H (25%)-water    : 10 : 1)propanol-NH40H   (25%)   (4 : 1).   



   VOORBEELD
Pseudomonas aeruginosa werd aeroob gekweekt bij een temperatuur van   32OC.   De volgende kweekmedia bleken zeer geschikt voor de rhamnolipide-produktie. a) 5 g glucose, 5 g pepton, 2 g gistextract, 5 g NaCl, 0, 5 g KH2PO4, 2 9   MgSO. H O,   3 g KN03, 1 ml Gottlib oplossing en 1 liter water. b) 20 g glucose, 10 g gistextract, 20 g CaC03 en 1 liter water. 



   Glucose kan worden vervangen door glycerol, waardoor een twee-fasensysteem ontstaat. Glycerol als koolstofbron levert een betere opbrengst in vergelijking tot glucose, maar een meer gecompliceerd proces is vereist. De verandering van de oppervlaktespanning van het kweekmedium naar 28-31 mN/m werd gemeten met behulp van een White's ring tensiometer. 



  Deze verlaging van de oppervlaktespanning is een goede maat voor de opbrengst aan het einde van de fermentatie. De rhamnolipideconcentratie werd spectrofotometrisch gemeten met antron-reagens. Nadat de biomassa was afgescheiden door centrifugeren, werd de supernatant gechromatografeerd op silica gel 60 F 254 platen en op Kemika platen. 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 



   Glycolipiden konden worden aangetoond door gebruik te maken van de navolgede reagentsia, voor lipiden alphanaphtol, voor glycolipiden diphenylamin, en voor koolhydraten en oligosacchariden beta-naphtol-timol en anthron. Gebruikmaking van deze reagentsia leverde op, dat de verbindingen van het glycolipide-type zijn. Met alphacyclodextrine, reagents en kleurstof voor vetzuren, kon worden aangetoond dat het lipofiele/hydrofobe deel van het molecuul bestaat uit vetzuurketens met een even aantal koolstofatomen. Negatieve resultaten werden verkregen met reagentsia voor   onverzadigd   lipiden. Met behulp van alkali KMnO4 en ammoniacaal AgN03 kon de aanwezigheid van glycosidische bindingen worden aangetoond.

   Door alkalische hydrolyse werden esterbindingen tussen aanwezige vetzuren gesplitst, en door zure hydrolyse werd de   O-glycosidische   binding tussen de suikergroep en delOH-groep van het lipidedeel van het molecuul gesplitst. 



   10 volumina van de supernatant die de rhamnolipiden bevat, werden geleid over een amberlit XAD-8 of XAD-2 kolom (Rohm & Haas). De kolom werd gewassen met water. De rhamnolipiden werden geëlueerd met 100% MeOH. De fracties die de rhamnolipiden bevatten werden drooggedampt en daarna opgenomen in dezelfde hoeveelheid zuiver water. 1 N HCl werd toegevoegd om de rhamnolipiden neer te slaan. De neergeslagen rhamnolipiden werden gecentrifugeerd bij 3. 000 toeren per minuut gedurende 10 minuten. De neergeslagen rhamnolipiden werden opnieuw gewassen met zuiver water en vervolgens gecentrifugeerd bij 3. 000 toeren per minuut gedurende 10 minuten. Met behulp van 1/10 N NaOH werd de pH van de neergeslagen lipiden ingesteld op 7, 2.

   Na vriesdrogen werd 10 g van het gevriesdroogde preparaat opgelost in 50 ml propanol en gebracht op een silica-kolom (Waters HPLC, volume 500 ml) die was geëquilibreerd met hexaan. Met behulp van 5 liter 
 EMI5.1 
 propanol werden verontreinigingen geëlueerd. De rhamnolipiden werden geëlueerd onder gebruikmaking van het oplosmiddelmengsel propanol-25%   NH40H   (4 : 1). De actieve fracties werden drooggedampt en opgelost in water, neergeslagen met 1 N HCL, gecentrifugeerd bij 3. 000 toeren 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 per minuut, en de neerslagen werden met behulp van 0, 1 N NaOH ingesteld op pH 7, 2 en gevriesdroogd. 



   De verkregen, zuivere rhamnolipiden werden gebruikt voor het bereiden van de farmaceutische preparaten volgens de uitvinding. Deze preparaten kunnen bestaan uit oplossingen, zalven, crèmes, gels,   vloeistoffen, Ipoeders,   pillen en   dergelijke.   



   Afhankelijk van de te behandelen afwijking, bijvoorbeeld de dermatologische afwijking, de ernst van de ziekte, de leeftijd van de   patiënt, fen dergelijke,   bevatten de farmaceutische preparaten vanaf   Q, 05   tot 10 gew. % actief rhamnolipide. Bij voorkeur echter is de rhamnolipideconcentratie vanaf 0, 1 tot 2, 0 gew. %, meer bij voorkeur vanaf 0, 1 tot   1,   0 gew. %. De ondergrens wordt bepaald door de activiteit van het aanwezige rhamnolipide en de bovengrens voornamelijk door kostenoverwegingen. 



   Formuleringsvoorbeeld Een zalfbasis werd aangerijkt met   1, 0 gel. %   rhamnolipide. Het rhamnolipide was (alfa-L-rhamnopyranosyl- (1, 2) alfa-Lrhamnopyranosyl)-3-hydroxydecoanoyl-3-hydroxydecaanzuur, en was geidentificeerd met i) 1H- en 13C-NMR gegevens; en ii) massaspectrofotometriegegevens. 
 EMI6.1 
 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 
 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> 



  13C-NMR <SEP> (75 <SEP> MHz <SEP> ; <SEP> DMSO-d6)
<tb> C <SEP> ppm <SEP> C <SEP> ppm <SEP> C <SEP> ppm
<tb> 1" <SEP> 97,7 <SEP> 1 <SEP> 173,3 <SEP> 1' <SEP> 170,6
<tb> 2" <SEP> 77,3 <SEP> 2 <SEP> 40, <SEP> 8 <SEP> 21 <SEP> 40, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> 3" <SEP> 70,4  <SEP> 3 <SEP> 72, <SEP> 20 <SEP> I <SEP> 3 <SEP> I <SEP> 71, <SEP> 40 <SEP> 
<tb> 4" <SEP> 73,2 <SEP> 4 <SEP> 33, <SEP> 7 <SEP> 4' <SEP> 32,5
<tb> 5" <SEP> 68,9 <SEP> 5 <SEP> 24,8 <SEP> 5' <SEP> 24,1
<tb> 6" <SEP> 17,9 <SEP> 6 <SEP> # <SEP> 28,8-29,2 <SEP> 6'# <SEP> 28,8-29,2
<tb> 1'" <SEP> 102,2 <SEP> 7 <SEP> 7'
<tb> 2'" <SEP> 70,4  <SEP> 8 <SEP> 31,4 <SEP> 8' <SEP> 31,4
<tb> 3'" <SEP> 70,8  <SEP> 9 <SEP> 22, <SEP> 2 <SEP> @ <SEP> 9' <SEP> 22,2
<tb> 4'" <SEP> 72,4 <SEP> 10 <SEP> 14, <SEP> 0 <SEP> 10'14, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 5'" <SEP> 68,8
<tb> 6'" <SEP> 17,8
<tb> 1H-NMR <SEP> (300 <SEP> MHz, <SEP> DMSO-d6)

  
<tb> !
<tb> suiker-deel
<tb> H <SEP> ppm
<tb> 1" <SEP> ; <SEP> 1'" <SEP> 4,8' <SEP> 4,9 <SEP> singlet <SEP> (24)
<tb> 2" <SEP> ; <SEP> 2111 <SEP> 
<tb> # <SEP> 3,20 <SEP> -- > 4,10 <SEP> multiplet <SEP> (8H)
<tb> 5" <SEP> ; <SEP> 5'"
<tb> 6" <SEP> ; <SEP> 6'"1, <SEP> 21 <SEP> doublet, <SEP> J=5, <SEP> 9 <SEP> Hz <SEP> (6H)
<tb> lipide-deel
<tb> H <SEP> ppm
<tb> 2,2' <SEP> 2,43, <SEP> 2,54 <SEP> 2x <SEP> doublet, <SEP> J=6,0 <SEP> Hz <SEP> (4H)
<tb> 3,3' <SEP> #3,20 <SEP> - <SEP> 4,1 <SEP> multiplet <SEP> (2H)
<tb> 5,24
<tb> 4, <SEP> 4' <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> multiplet <SEP> (4H)
<tb> 5,5'- > <SEP> 9,9' <SEP> 1,3 <SEP> multiplet <SEP> (16H)
<tb> 10,10' <SEP> 0,97 <SEP> triplet, <SEP> J=6,3 <SEP> Hz <SEP> (6H)
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 
 EMI8.1 
 m/z : 673 [M + Na] m/z : 695 [M + H + 2Na]+ m/z : 525 [M minus terminaal lipide m/z :

   379   [m - CloH - rhamnose   +   2Na] +   minus terminaal lipide en rhamnose
Bij humane patiënten werden de navolgende dermatologische afwijkingen behandeid met het preparaat uit het formuleringsvoorbeeld : Psoriasis pustulosa, Neurodermitis chronica multilocularis, Lichen ruber planus en Acne papulopustulosa. Behandeling van de'aangetaste huidoppervlakken gedurende een periode vanaf twee weken had tot gevolg dat de meeste verschijnselen van de 
 EMI8.2 
 dermatologische afwijkingen nagenoeg volledig verdwenen. 



  I

Claims

EMI9.1

CONCLUSIES I 1. Farmaceutisch preparaat bevattende als actief bestanddeel tenminste een rhamnolipide of een farmaceutisch acceptabel zout daarvan, en een drager en/of verdunmiddel. EMI9.2 I
2. Preparaat volgens conclusie l, bevattende een rhamnolipide met de algemene formule : EMI9.3 waarin Ri = H, alfa-L-rhamnopyranosyl ; R2 = H,-CH-CH2-COOH ; R4 R3 = (C5-C20)-verzadigd,-mono-of poly-onverzadigd alkyl ; R4 = (C5-C20)-verzadigd, -mono- of poly-onverzadigd alkyl
; 3. Preparaat volgens conclusie 2, waarin R3=- (CH2),-CH3, en x = 4-20.
4. Preparaat volgens conclusie 3, waarin x = 4 of 6.
5. Preparaat volgens conclusie 2-4, EMI9.4 R4 =- en x = 5-20. i
6. Preparaat volgens conclusie 5, waarin x = 4 of 6.
7. Preparaat volgens conclusie 2-6, waarin R1 = alfa-L-rhamnopyranosyl. EMI9.5
8. Preparaat volgens conclusie 2-7, waarin x = 6.

I <Desc/Clms Page number 10> EMI10.1
9. Preparaat volgens conclusie 2-8, waarin R2 (CH2) y CH3 en y
= 10. Preparaat volgens conclusie 9, waarin y = of 6.

I t
11. Preparaat volgens conclusie 1-10, waarin het rhamnolipide is (alfa-L-rhamnopyranosyl- alfa-L-
12. Preparaat volgens conclusie 1-11, voor de behandeling van dermatologische afwijkingen.
13. Preparaat volgens conclusie 1-11, voor gebruik als kosmetisch preparaat.

!