JP3860206B2 - ラムノ脂質を基礎とする薬理製剤 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は少なくとも一種のラムノ脂質（rhamnolipid）を活性成分として含んで成る薬理製剤に関する。詳しくは、本発明は皮膚障害、ウィルス感染症の処置のための、及び化粧品の目的のためのかかる薬理製剤に関する。
生体界面活性剤には糖脂質がある。様々な炭水化物と脂質との組合せと、構造的に異なる結合及び異なるイオン状態により、相互に非常に異なる親水性／親油性のバランスを有する様々な糖脂質がある。様々なシュードモナス（Pseudomonas）の株、例えばシュードモナス アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）が、ラムノ脂質の細胞外分泌を、可溶性及び不溶性炭素源での増殖のときに可能である。
【０００２】
本発明はこのようなラムノ脂質を含んで成る薬理製剤に関する。広範囲に及びリサーチに基づき、このようなラムノ脂質を基礎とする薬理製剤は皮膚病、例えば尋常性座瘡、雑色性ひこう疹、紅色陰癬、砂毛白質、接触アレルギー性皮膚炎、多房限局性神経皮膚炎、汎発性神経皮膚炎、紅皮性神経皮膚炎、単房限局慢性神経皮膚炎、疣贅性神経皮膚炎、幼児性神経皮膚炎、慢性痒疹、しゅさ、ステロイド性蟻痒しゅさ皮膚炎、乾癬、発赤扁平苔癬、幼児性ストロフルス、アレルギー性じんま疹、貨幣状類湿疹皮膚炎、漏出性多形紅斑、水庖遺伝ジストロフィー退縮性表皮剥離、脂漏性皮膚炎、結節性紅斑、尋常性天疱瘡、ヘルペス状ダーリング（Duhring）皮膚炎、全身性エリテマトーデス、単純ヘルペス感染症、パピロマウィルス感染症、尋常性魚鱗癬、魚鱗癬紅皮症、手足の角質皮膚炎、水疱遺伝性単純表皮剥離等に対して治療作用を示す。
【０００３】
好ましくは、このラムノ脂質は次の一般式のラムノ脂質である：
【化４】

非常に活性なラムノ脂質はこのラムノ脂質がジ−ラムノ脂質であるときに獲得される。置換基Ｒ₂が水素のとき、このラムノ脂質は一個の脂質基しか含んで成らない。置換基Ｒ₂が
【化５】

により形成されるとき、このラムノ脂質分子はエステル結合により相互に連結された２個の脂質単位を含んで成る。
置換基Ｒ₃及びＲ₄は、直鎖又は枝分れした（Ｃ₅−Ｃ₂₀）−飽和型のモノ又はポリ−不飽和型アルキル基より選ばれうる。枝分れしていない、一般式(CH₂)_x−CH₃（ここでｘ＝４−20）を有する飽和型アルキル基が好ましい。アルキル基にとってｘは４又は６であることがより好ましい。
【０００４】
非常に活性な薬理製剤は、それが含んで成るラムノ脂質が（アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１，２）−アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル）−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸であるときに得られる
【０００５】
限定でない例に基づいて、このラムノ脂質の単離及び本発明にかかわる薬理製剤への利用を説明する。ここでは下記の方法が利用されうる。
１．単離及び特性化
油井の堀削土壌から細菌株を単離し、それらの株は可溶性炭素源（グルコース）及び不溶性炭素源（グリセロール、ガス油）の両者に基づいてラムノ脂質を合成できる。これらの単離細菌株はシュードモナス株として特性化された（BBL Minitek, Numerical Determination and Identification System, Becton, Dichinsonand Company）。
２．濃縮及び精製
細胞外分泌により培地中に存在しているラムノ脂質を様々な手順を利用して濃縮及び精製した。
ａ）酸抽出
上清液のpHを塩酸でpH1.5〜2.0に調整し、次いで初期容量の１／10にまでエバポレートし、そして４℃に一夜放置した。ペレット（0.5〜2.0ｇ／ｌ）を４℃で30分17,300ｇで遠心し、次いでCH₂Cl₂を用いて抽出し、濾過し、エバポレートし、水に再懸濁し、そして再び沈殿させた。
ｂ）発泡分画
この上清液に圧縮エアーを導入し、次いで生成した泡を分離容器に通すか、又は酸性水(pH1.5〜2.0)へと導いた。
ｃ）クロマトグラフィー
上清液を調製カラムに載せた（アンバーライト（Amberlit）XAD−８又はXAD−２樹脂、Rohm & Haas）。このカラムを水で平衡化し、そして吸着後、水ですすいだ。活性化合物を低級アルキルアルコール、例えばエタノール及びメタノールを用いて溶離した。使用した溶媒を真空で蒸発させ、そしてその濃縮物を酸性にし、そして上記の通りに沈殿させた。
３．化学検定及び特性化
薄層クロマトグラフィーをシリカゲル60Ｆ 254プレート（Merck）を用いて分析的に行い、且つKemikaプレートを用いて調製的に行った。最適分離のために、下記の溶媒混合物を用いた。
CHCl₃−MeOH−酢酸−水（25：15：４：２；12：15：４：２；25：25：４：２）
CH₃Cl₃−MeOH−酢酸（80：15：５）
ヘキサン−イソプロピルエーテル−酢酸（15：10：１）
CHCl₃−MeOH−NH₄OH（25％）−水（65：25：４：２）
プロパノール−NH₄OH（25％）（４：１）。
【実施例】
【０００６】
シュードモナス アエルギノーザを32℃の温度で培養した。下記の培養培地がラムノ脂質の生産にとって非常に適切であった。
ａ）５ｇのグルコース、５ｇのペプトン、２ｇの酵母抽出物、５ｇのNaCl、0.5ｇのKH₂PO₄、２ｇのMgSO₄・H₂O、３ｇのKNO₃、１mlのGottlib溶液及び１リットルの水。
ｂ）20ｇのグルコース、10ｇの酵母抽出、20ｇのCaCO₃及び１リットルの水。
グルコースはグリセロールで代替してよく、この場合二相系が形成される。炭素源としてグリセロールはグルコースに比してより良い収率を供するが、しかしより複雑な工程が必要とされる。28〜31mN／ｍに至る培養培地の表面張力の変化がWhiteの環張力計を用いて測定された。表面張力の減少は発酵終了時においての収率の良さの指標である。そのラムノ脂質濃度はアントロン試薬を用いて分光学的に測定した。遠心によるバイオマスの分離の後、その上清液をシリカゲル60Ｆ 254プレート及びKemikaプレートでクロマトグラフィーにかけた。
【０００７】
糖脂質の存在は、下記の試薬を用いて証明した。脂質についてはアルファ−ナフトール、糖脂質についてはジフェニルアミン、そして炭水化物及びオリゴ糖についてはベータ−ナフトール及びアントロン。これらの試薬を用い、それらの化合物が糖脂質のタイプであることが証明された。脂質酸にとっての試薬、且つ染料であるアルファシクロデキストリンを用い、この分子の親油性／親水性部分は偶数個の炭素原子を有する脂肪酸より成ることが証明された。不飽和脂質にとっての試薬を用いてネガティブな結果が得られた。アルカリ性KMnO₄及びアンモニア性AgNO₃を用い、グリコシド結合の存在が証明された。アルカリ加水分解を利用して脂肪酸間のエステル結合を分断し、そして酸性加水分解を利用してこの分子の糖基と脂質部分のOH基間のＯ−グルコシド結合を分断した。
【０００８】
ラムノ脂質を含んで成る10容量の上清液をXAD−２カラムのアンバーライトXAD−８（Rohm & Haas）に通した。このカラムを水で洗った。このラムノ脂質を100％のMeOHを用いて溶離させた。ラムノ脂質を含んで成る画分をエバポレートし、次いで純水に加えた。このラムノ脂質を沈殿させるために１ＮのHClを加えた。沈殿したラムノ脂質を3000rpmで10分遠心した。このようして沈殿させたラムノ脂質を純水を用いて洗い、次いで3000rpmで10分遠心した。１／10ＮのNaOHを用い、沈殿脂質のpHを7.2に合わせた。凍結乾燥後、10ｇの凍結乾燥製剤を50mlのプロパノールに溶かし、次いでヘキサンで平衡にしたシリカカラム（Waters HPLC、容量500ml）に載せた。５ｌのプロパノールを用い、不純物を溶離させた。ラムノ脂質をプロパノール−25％のNH₄OH（４：１）を含んで成る溶媒混合物を用いて溶離させた。活性画分をエバポレートし、そして水に溶かし、再び１ＮのHClの中で沈殿させ、3000rpmで遠心し、そしてその沈殿物を0.1ＮのNaOHを用いてpH7.2に調整し、そして凍結乾燥した。
獲得した純粋なラムノ脂質を本発明にかかわる薬理製剤を調製するために用いた。これらの製剤は溶液、オイントメント、クリーム、ゲル、流体、粉末、ピル等を構成しうる。
処置すべき疾患、例えば皮膚病、障害のひどさ、患者の年齢等に応じ、この薬理製剤は0.05〜10重量％の活性ラムノ脂質を含んで成りうる。好ましくは、このラムノ脂質濃度は0.1〜2.0重量％、より好ましくは0.1〜1.0重量％にする。下限値は本ラムノ脂質の活性により決定され、そして上限値は主として経済的に決定される。
【０００９】
処方例
オイントメントベースを1.0重量％のラムノ脂質を用いて富化させた。ラムノ脂質は（アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１，２）アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル）−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸とし、そして
ｉ）¹Ｈ及び¹³C-NMRデーター；並びに
ｉｉ）マススペクトルデーター
を用いて同定した。
【化６】

【表１】

【００１０】
【表２】

【００１１】
ヒト患者に関して、下記の皮膚障害を本処方例にかかわる製剤を用いて処置した：乾癬、慢性多房神経皮膚炎、発赤扁平苔癬及び丘疹性座瘡。約２週間にわたる冒された皮膚表面の処置は、その皮膚障害の特徴の実質的に全体的な消失をもたらした。

Claims (10)

1. 乾癬の治療のための、次の−般式のラムノ脂質：
   

   

   （式中、
   Ｒ₁＝アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル；
   Ｒ₂＝Ｈ又は
   

   

   Ｒ₃＝（Ｃ₅−Ｃ₂₀）の飽和アルキル又はモノもしくはポリ不飽和アルキル
   Ｒ₄＝（Ｃ₅−Ｃ₂₀）の飽和アルキル又はモノもしくはポリ不飽和アルキル
   である）を含んで成る医薬製剤。
2. Ｒ₃＝−(CH₂)_x−CH₃、そしてｘ＝４〜20である、請求項１記載の製剤。
3. ｘ＝４又は６である、請求項２記載の製剤。
4. Ｒ₄＝−(CH₂)_x−CH₃、そしてｘ＝４〜20である、請求項１〜３のいずれか１項記載の製剤。
5. ｘ＝４又は６である、請求項４記載の製剤。
6. ｘ＝６である、請求項５記載の製剤。
7. Ｒ₂＝
   

   

   そしてｙ＝４〜19である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
8. ｙ＝４又は６である、請求項７記載の製剤。
9. 前記ラムノ脂質が（アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１，２）アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル）−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
10. 前記ラムノ脂質を0.05〜10重量％の活性ラムノ脂質濃度で含んで成る、請求項１〜９のいずれか１項記載の製剤。