DE3026172C2

DE3026172C2 -

Info

Publication number: DE3026172C2
Application number: DE3026172A
Authority: DE
Inventors: Tadashi Yokohama Kanagawa Jp Miyasaka; Masahiko Higashiyamato Tokio/Tokyo Jp Mutai; Seigo Tokio/Tokyo Jp Sawada; Kenichiro Mitaka Tokio/Tokyo Jp Nokata; Hisao Amagasaki Hyogo Jp Hagiwara
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1979-07-10
Filing date: 1980-07-10
Publication date: 1991-05-08
Also published as: AU6027380A; AR228575A1; GB2056973A; CH648316A5; FR2462437A1; IT1199976B; NL188219C; AU536181B2; US4399282A; NL188219B; USRE32518E; IT8023348A1; IT8023348A0; GB2056973B; NL8003988A; DE3026172A1; FR2462437B1

Description

Die Erfindung betrifft neue Derivate von Camptothecin, einem Alkaloid mit Antitumorwirkung einschließlich carcinostatischer Wirksamkeit, und insbesondere neue Camptothecinderivate mit einem organischen Kohlenstoffsubstituenten in 7-Stellung des Camptothecingerüsts, die starke Antitumorwirkung und/oder niedere Toxizität aufweisen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie sie enthaltende pharmazeutische Mittel:

Camptothecin ist ein cytotoxisches Alkaloid, das zuerst von Wall etal (J. Am. Chem. Soc. 88 (1966) 3888) aus Blättern und Rinde von Camptotheca accuminata (Nyssaceae), einer in China heimischen Pflanze, isoliert wurde; Camptothecin besitzt pentacyclische Struktur, die aus einem kondensierten Ringsystem von Chinolin (Ringe A und B), Pyrrolin (Ring C), α-Pyridon (Ring D) und einem sechsgliedrigen Lacton (Ring E) besteht und aufgrund der S-Konfiguration einer tertiären Hydroxygruppe in 20-Stellung Rechtsdrehung zeigt. Frühere Berichte über die carcinostatische Wirksamkeit von Camptothecin bezogen sich auf die Inhibitionswirkung gegenüber experimentell übertragenen Karzinomen wie Leucaemia L-1210 bei Mäusen oder Walker-256-Tumor bei Ratten (Chem. Rev. 23 (1973) 385; Cancer Treat. Rep. 60 (1967) 1007), die die Forschung auf dem Gebiet der Camptothecinsynthese stimulierten; aus später veröffentlichten biologischen Untersuchungen ergab sich jedoch, daß diese Verbindung hoch toxisch ist und sich demzufolge nicht als Chemotherapeutikum eignet. Aufgrund der hohen Toxizität wird Camptothecin selbst außer in China nicht für klinische Behandlungen eingesetzt; diese Verbindung stellt jedoch derzeit noch eine der wirksamsten Substanzen mit Antitumoraktivität dar und wird infolgedessen unter dem Gesichtspunkt eines biologischen Reagens, das zu einer selektiven Inhibierung der Biosynthese von Ribosomen- und Messenger-Ribonucleinsäuren ohne Störung der Mitochondrien-, 4S- oder 5S-Ribonucleinsäuren in der Lage ist, als wichtig angesehen (Nature (London), New Biol. 237 (1972) 144).

Diese frühen Berichte über die signifikante Antitumorwirksamkeit von Camptothecin stimulierten das intensive Interesse an der Totalsynthese und an chemischen Modifizierungen von Camptothecin. In zahlreichen Veröffentlichungen ist die Synthese von dl-Camptothecin, seinen intermediären Derivaten und von (+)-20(S)-Camptothecin beschrieben; die Synthese von (+)-20(S)-Camptothecin (rechtsdrehend) ist von E. J. Corey et al., J. Am. Chem. Soc. 40 (1975) 2140, publiziert. Die Synthese von dl-Camptothecin ist ferner auch beispielsweise von J. C. Bradley et al., J. Org. Chem. 41 (1976) 699, und H. G. M. Walraven et al., Tetrahedron 36 (1980) 321, veröffentlicht; die letztgenannte Publikation betrifft einen Bericht über die jüngste Synthese von Camptothecin.

Das natürliche Camptothecin, das aus Camptotheca accuminata isoliert wird, liegt bekanntermaßen in der d-Form vor. Keine der obigen Publikationen bezieht sich jedoch auf die chemische Modifizierung der Camptothecinstruktur im Hinblick auf seine chemotherapeutische Anwendung. Die bisher publizierten chemischen Modifizierungen beziehen sich hauptsächlich auf die Ringe D und/oder E des Camptothecingerüsts; die Ergebnisse dieser Modifizierungen waren jedoch bisher ausschließlich negativ im Hinblick auf die Beibehaltung der erwarteten carcinostatischen Wirksamkeit und führten nur zu einer außerordentlich geringen Verbesserung der Toxizität (J. Med. Chem. 19 (1976) 675).

Aus chemotherapeutischer Sicht ist es von Bedeutung, daß sich die chemischen Modifizierungen des Camptothecins auf die Ringe A, B und C beschränken sollten, ohne daß damit irgendwelche bedeutenderen Veränderungen in der gesamten Gerüststruktur verbunden sind, insbesondere in den Ringen D und E des natürlichen Camptothecins, da anzunehmen ist, daß die Ringe D und E für die oben erläuterte biologische Wirksamkeit wesentliche Strukturelemente darstellen. Über die Funktionalisierung von Resten mit den Ringen A, B und C ist nur wenig bekannt; Informationen liegen lediglich über die in China ausgeführte Nitrierung des Camptothecins in konzentrierter Schwefelsäure unter scharfen Reaktionsbedingungen zur Herstellung von 12-Nitrocamptothecin vor, das sich von anderen Reaktionsprodukten nur in aufwendigen Trennschritten abtrennen ließ.

Das 12-Nitro-Derivat wird anschließend zum entsprechenden 12-Amino-Derivat reduziert, das danach diazotiert und anschließend hydrolysiert oder zur Einführung einer Hydroxygruppe, eines Chloratoms, einer Cyanogruppe oder einer Carboxylgruppe in 12-Stellung des Camptothecins der Sandmeyer-Reaktion unterzogen wird (P. Pei-chuang et al., Hau Hsueh Hsueh Pao 33 (1975) 71; Chem. Abstr. 84 (1976) 115629p). Nach diesem Verfahren sind allerdings vier Stufen zur Herstellung des 12-Cyano-Derivats und fünf Stufen zur Herstellung des 12-Carboxy-Derivats aus natürlichem Camptothecin erforderlich. Außer diesem Verfahren, bei dem eine Anzahl aufwendiger Reaktionsstufen zur Einführung eines funktionellen Substituenten in 12-Stellung des Camptothecins erforderlich ist, war bisher nichts über chemische Modifizierungen zur Einführung eines funktionellen Substituenten im Ring A, B und/oder C bekannt.

Die extremen Schwierigkeiten, einen Substituenten in den Ring A, B und/oder C des Camptothecins einzuführen, beruhen wahrscheinlich auf der schlechten Löslichkeit des Camptothecins in gewöhnlichen organischen Lösungsmitteln und auf den Eigenschaften des stickstoffhaltigen heterocyclischen Rings, die Ionenreaktionen, insbesondere die sog. elektrophilen Reaktionen, die üblicherweise an aromatischen Ringen durchgeführt werden, beispielsweise Friedel-Crafts-Reaktionen, Vilsmeier-Haack-Reaktionen und andere Alkylierungs- und Acylierungsreaktionen, verhin dern.

Aus diesen Gründen bestand auf diesem Gebiet ein großes Interesse an der Entwicklung neuer Derivate von Camptothecin mit hoher Antitumorwirksamkeit und/oder sehr geringer Toxizität durch chemische Modifizierung von natürlichem Camptothecin im Ring A, B und/oder C in einer Stufe ohne gleichzeitige Einführung irgendwelcher Veränderungen in der Struktur der Ringe D und E, die als für die physiologische Wirksamkeit unerläßlich angesehen wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Camptothecinderivate anzugeben, die wirksame Antitumormittel darstellen und sich insbesondere zur Verabreichung durch Injektion sowie zur oralen Verabreichung eignen und zugleich bei sehr niederer Toxizität im lebenden Körper gut absorbierbar sind; ferner sollen Verfahren zur Herstellung dieser Camptothecinderivate angegeben werden, nach denen Substituenten in den Ring B des Camptothecins ohne irgendeine Modifizierung der Struktur der Ringe D und E des Camptothecins eingeführt werden können. Erfindungsgemäß sollen dementsprechend auch Antitumormittel unter Verwendung dieser Camptothecinderivate angegeben werden.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Mit der Zielsetzung der Synthese neuer Camptothecinderivate mit extrem verringerter Toxizität unter Erhaltung der inhärenten Antitumorwirkung wurden erfindungsgemäß experimentelle Untersuchungen zum Ersatz von Wasserstoffatomen in den Ringen A, B und C durch einen von Wasserstoff verschiedenen Substituenten durchgeführt, wobei sorgfältig darauf geachtet wurde, daß bei diesem Austausch von Wasserstoffatomen gegen Substituenten keinerlei Veränderungen in der Struktur der Ringe D und E eintraten, die als für die physiologische Wirksamkeit des Camptothecins unerläßlich angesehen wird.

Als Ergebnis der im Rahmen der Erfindung durchgeführten umfangreichen Untersuchungen wurde überraschenderweise festgestellt, daß verschiedene organische Gruppen in 7-Stellung des Camptothecins ohne Veränderung der Ringe D und E eingeführt werden können, wenn anstelle der üblicherweise angewandten Ionenreaktionen Camptothecin in einer verdünnten wäßrigen Säurelösung einer radikalischen Substitutionsreaktion unterworfen wird. Die Erfindung, die ein allgemeines Verfahren zur Einführung funktioneller Substituenten in bestimmte Positionen des Camptothecingerüsts lehrt, beruht auf dieser Feststellung. Es ist entsprechend im Rahmen der Erfindung erstmals möglich, eine Reihe neuer Camptothecinderivate einstufig durch Einführung eines funktionellen Substituenten in 7-Stellung im Ring B herzustellen, wobei die grundlegende Gerüststruktur der Ringe A, B, C, D und E und die darin enthaltenden funktionellen Gruppen bei der Substitutionsreaktion unverändert bleiben.

Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden neue Camptothecinderivate der allgemeinen Formel (I)

in der X CH₂OH, COOH oder CH₂OR₁ mit R₁=Acyl einer niederen aliphatischen Carbonsäure bedeutet,
sowie die wasserlöslichen Alkalimetallsalze dieser Verbindungen angegeben.

Beispiele für R₁ sind Acylreste aliphatische Carbonsäuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure und Valerinsäure.

Die erfindungsgemäßen Camptothecinderivate besitzen ausgezeichnete pharmakologische Eigenschaften, wobei sie gegenüber bekannten Verbindungen hinsichtlich der Antitumorwirkung und/oder Toxizität günstiger sind. Beispiele für typische erfindungsgemäße Camptothecinderivate sind 7-Hydroxymethylcamptothecin, 7-Acet oxymethylcamptothecin, 7-Propionyloxymethyl camptothecin, 7-Butyryloxymethylcamptothecin, 7-Isovaleryloxymethylcamptothecin und Camptothecin-7-carbonsäure.

Die erfindungsgemäßen neuen Camptothecinderivate sind nicht auf Derivate des natürlich vorkommenden (+)-Camptothecins beschränkt und umfassen auch entsprechende Derivate synthetisch erhaltener entsprechender (-)- und dl- Camptothecine.

Camptothecin selbst weist als Ring E einen Lactonring auf; dieser Lactonring kann durch Einwirkung alkalischer Reagentien geöffnet werden. Wenn die erfindungsgemäßen Camptothecinderivate in ähnlicher Weise z. B. mit einem Alkalihydroxid oder -carbonat in üblicher Weise bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur behandelt werden, können sie in die entsprechenden Alkalimetallsalze wie etwa das Natrium-, Kalium- oder Lithiumsalz übergeführt werden. Diese Salze sind sämtlich wasserlöslich und werden von der Erfindung mit umfaßt; sie werden durch Einwirkung einer Säure oder in vivo leicht wieder in die freie Säure umgewandelt.

Die pharmakologische Wirkung der Camptothecinderivate wird demgemäß durch entsprechende Umsetzungen nicht beeinflußt. Bevorzugte Salze der Camptothecinderivate sind die Natrium- und Kaliumsalze.

Die Erfindung gibt ferner ein Verfahren zur Herstellung der Camptothecinderivate an. Nach einer erfindungsgemäßen Ausführungsweise ist das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Camptothecinderivate gekennzeichnet durch Umsetzung von Camptothecin in einer radikalischen Reaktion mit einer Hydroxymethylverbindung der allgemeinen Formel (II)

A-CH₂OH (II)

mit A=H, COOH oder CH₂OH

in Gegenwart von Schwefelsäure und eines Peroxids oder eines Azobisacylonitrils als Radikalbildner in einem wäßrigen Medium zu 7-Hydroxymethylcamptothecin
und ggf
Umsetzung des 7-Hydroxymethylcamptothecins mit einem Acylierungsmittel zum entsprechenden 7-Acyloxy methylcamptothecin
oder ggf.
Oxidation des 7-Hydroxymethylcamptothecins zu 7-Carboxy camptothecin
sowie erforderlichenfalls Umwandlung der freien Verbindung in ein entsprechendes Alkalimetallsalz oder umgekehrt.

Als Ausgangsmaterial können natürliches Camptothecin oder synthetisch erhaltene Camptothecinformen, d. h. d-, l- und dl-Camptothecin, verwendet werden.

Die Hydroxymethylverbindungen der allgemeinen Formel (II) sind leicht erhältliche handelsübliche Verbindungen; hierunter ist Methanol bevorzugt, also der Fall, in dem A gleich H ist.

In der ersten Hauptreaktionsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Radikalreaktion üblicherweise in einem wäßrigen Medium in Gegenwart oder Abwesenheit eines Übergangsmetallions durchgeführt. Dieser erste Hauptreaktionsschritt wird dementsprechend allgemein durch Lösen von Camptothecin in einer wäßrigen Lösung von Schwefelsäure und Methanol, Zusatz eines Radikalbildners und Umsetzung des Gemischs unter geeigneten Reaktionsbedingungen bis zur Beendigung der radikalischen Reaktion durchgeführt. Als Radikalbildner können bei der erfindungsgemäßen Umsetzung beliebige, als Initiatoren für Radikalreaktionen bekannte Peroxide eingesetzt werden. Bevorzugte Beispiele für derartige Peroxide sind anorganische Peroxide wie Wasserstoffperoxid, Peroxoschwefelsäure bzw. Peroxidschwefelsäure und ihre Salze wie beispielsweise Kaliumperoxosulfat, Natriumperoxosulfat, Ammoniumperoxosulfat, Bariumperoxid, Natriumperoxid, Carosche Säure und ihre Salze und Calciumperoxid sowie organische Peroxide wie etwa t-Butylhydroperoxid, Benzoylperoxid, Lauroylperoxid, Caprylylperoxid und Di-t-butylperoxid (DTBP). Ferner sind Azobisacylonitrile wie 2.2′-Azobisisobutyronitril (AIBN) gut als Radikalbildner geeignet.

Von diesen anorganischen und organischen Peroxiden werden erfindungsgemäß Wasserstoffperoxid, Peroxosulfate und t-Butylhydroperoxid bevorzugt.

Beispiele für Übergangsmetallsalze, die zur Bildung von Übergangsmetallionen durch Dissoziation im Reaktionsmedium in der Lage sind, sind etwa Silbersalze wie Silbernitrat, Silbersulfat, Silbercarbonat und Silberacetat, Eisensalze und -oxide wie Eisen(II)sulfat, Eisen(II)chlorid und Eisen(II)oxid, Kupfersalze wie Kupfer(I)chlorid, Kupfer(II)sulfat und Kupfer(II)nitrat, Cobaltsalze wie Cobaltchlorid, Cobaltsulfat, Cobaltnitrat und Cobaltacetat, Nickelsalze wie Nickelnitrat, Nickelsulfat und Nickelchlorid, Bleisalze wie Bleiacetat, Quecksilbersalze wie Quecksilber(I)chlorid und Quecksilber(II)chlorid sowie Cadmiumverbindungen wie Cadmiumnitrat und Cadmiumchlorid. Neben diesen Verbindungen können in gleicher Weise auch Thallium- und Zinkverbindungen wie etwa Zinksulfat eingesetzt werden. Die Verwendung von Silber- und Eisenverbindungen ist hierbei am meisten bevorzugt.

Die Anwesenheit des Übergangsmetallions im Reaktionsmedium ist nicht zwingend erforderlich; zur Erzielung einer schnellen und möglichst vollständigen Radikalreaktion ist jedoch die Anwesenheit derartiger Ionen empfehlenswert. Das zur Bildung von Übergangsmetallionen befähigte Übergangsmetallsalz wird in einem Mengenverhältnis eingesetzt, das im Bereich zwischen einer fast äquimolaren Menge bis zu einem etwa 30-molaren Überschuß, bezogen auf das Ausgangs- Camptothecin, und vorzugsweise in der 10- bis 30fachen Molmenge, eingesetzt. Wenn die Menge des Übergangsmetallsalzes unter der dem Camptothecin äquivalenten Menge liegt, ist kaum eine Beschleunigung der radikalischen Reaktion festzustellen. Andererseits wird kein zusätzlicher Vorteil erzielt, wenn die Menge des Übergangsmetallsalzes mehr als 30 mol/mol Camptothecin beträgt. Die Verwendung zu hoher Überschußmengen an Übergangsmetallsalz führt ferner zu unerwünschten Effekten bei der Abtrennung der resultierenden Reaktionsprodukte aus dem Reaktionsge misch.

Wesentliche Reaktionsbedingungen sind die Reaktionstemperatur und die Reaktionsdauer. Die Reaktionstemperatur kann dabei innerhalb eines weiten Bereichs zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt des Reaktionsgemischs gewählt werden. Die Reaktionsdauer beträgt üblicherweise einige Stunden bis 1 Tag und hängt allgemein von der jeweiligen Reaktionstemperatur ab. Wenn in der angewandten wäßrigen Lösung von Schwefelsäure und Methanol, die Camptothecin enthält, ein Übergangsmetallion vorhanden ist und dieser Lösung ein Peroxid allmählich zugesetzt wird, wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur erhöht, so daß 7-Hydroxymethylcamptothecin in höherer Ausbeute erhalten wird.

Eine allgemeine Verfahrensweise zur Durchführung des ersten Hauptreaktionsschritts umfaßt folgende Schritte:

Auflösen des Camptothecins in einer wäßrigen Lösung von Schwefelsäure und der Hydroxymethylverbindung, Zugabe des radikalischen Reaktionsinitiators zur wäßrigen Lösung, Umsetzung des Gemischs unter Aufrechterhaltung einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt des Reaktionsgemischs während einer Reaktionsdauer zwischen einigen Stunden und 1 Tag und Eingießen des Reaktions gemischs in Eiswasser zur Abtrennung des resultierenden 7-Hydroxymethylcamptothecins als Niederschlag aus dem Reaktionsgemisch. Die ausgefällten rohen Kristalle werden durch Filtration oder Extraktion des Reaktionsgemischs mit einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Chloroform, Ethylacetat, Butanol, Amylalkohol, Tetrachlorkohlenstoff und Schwefelkohlenstoff gewonnen. Die Verwendung von Chloroform ist hierzu am meisten bevorzugt. Das resultierende rohe 7-Hydroxymethylcamptothecin kann in üblicher Weise gereinigt werden, beispielsweise durch Umkristallisieren aus Dimethylformamid-Dioxan, durch Dünnschichtchromatographie, durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie oder etwa durch Kombination dieser Reinigungsverfahren.

Das so erhaltene 7-Hydroxymethylcamptothecin besitzt ausgezeichnete pharmakologische Eigenschaften und kann direkt als Arzneimittel verwendet werden, eignet sich jedoch auch günstig als Zwischenprodukt zur Herstellung verschiedener Camptothecinderivate, die an der Hydroxymethylgruppe in 7-Stellung funktionell substituiert sind.

7-Hydroxymethylcamptothecin und davon abgeleitete 7-substituierte Camptothecine können erforderlichenfalls durch Behandlung des Camptothecinderivats in freier Form mit einem Alkalihydroxid oder -carbonat bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur in wasserlösliche Alkalisalze umgewandelt werden. Diese Alkalisalze werden durch Öffnung des Lactonrings (Ring E) erzeugt. Derartige Alkalisalze können jedoch durch Behandlung der Salze mit einer Säure leicht wieder in die freie Form umgewandelt werden, wobei der Lactonring bei gleichzeitiger Wasserabspaltung (Dehydrocyclisierung) gebildet wird. Camptothecin und seine Derivate bilden im Prinzip keine Säureadditionssalze, obgleich sie zwei tertiäre Stickstoffatome enthalten.

Die Hydroxymethylgruppe des 7-Hydroxymethylcamptothecins kann ggf. zur Herstellung der entsprechenden 7-Acyloxymethylcamptothecine mit einem Acylierungsmittel behandelt werden; durch Behandlung mit einem Oxidationsmittel läßt sich ferner die entsprechende Camptothecin-7-carbonsäure herstellen.

Die Acylierung des 7-Hydroxymethylcamptothecins wird in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von 7-Hydroxymethylcamptothecin mit einem Acylierungsmittel, üblicherweise in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels oder eines Säureakzeptors, durchgeführt. Beispiele für derartige Acylierungsmittel sind Carbonsäuren und reaktive funktionelle Carbonsäurederivate, beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, sowie Halogenide und niedere Alkylester dieser Säuren wie beispielsweise Acetylchlorid und Propionylbromid. Als reaktives funktionelles Carbonsäurederivat wird vorzugsweise das Säureanhydrid verwendet. Bevorzugte Beispiele für Säureakzeptoren sind etwa anorganische Basen wie Natriumcarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, Alkalihydroxide und Calciumcarbonat sowie organische Basen wie Triäthylamin, Pyridin und Tetramethylammoniumhydroxid. Allgemein ist die Verwendung reaktiver funktioneller Derivate der Carbonsäuren bevorzugt, wobei die Reaktion in Gegenwart des säurebindenden Säureakzeptors bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur beschleunigt wird.

Da 7-Hydroxymethylcamptothecin zwei Hydroxygruppen aufweist, können 7-Acyloxymethylcamptothecine als auch 7-Acyloxymethyl-20- acyloxycamptothecine gebildet werden. Wenn das Acylierungsmittel in einem hohen Überschuß eingesetzt oder eine höhere Reaktionstemperatur angewandt wird, besteht die Tendenz zur Acylierung beider Hydroxygruppen, von denen die der Hydroxymethylgruppe eine primäre Hydroxygruppe und die Hydroxygruppe in 20-Stellung eine tertiäre Hydroxygruppe ist, wobei dann diacylierte Produkte in höherem Mengenanteil entstehen. Deshalb muß eine fast stöchiometrische Menge oder ein leichter Überschuß an Acylierungsmittel gegenüber dem als Ausgangsmaterial eingesetzten 7-Hydroxymethylcamptothecin verwendet oder die Reaktion bei niederer Temperatur, beispielsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt werden, am überwiegend lediglich die Hydroxygruppe in der 7-Hydroxymethyl-Gruppe zu acylieren.

Die Acylierungsreaktion wird normalerweise wie üblich durch Lösen des 7-Hydroxymethylcamptothecins in einem inerten Lösungsmittel, das ein Dehydratisierungsmittel oder einen Säureakzeptor enthält, Zugabe eines Acylierungsmittels und Rühren des Gemischs bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur durchgeführt. Diese Reaktion kann durch Verwendung eines üblichen Veresterungskatalysators wie Schwefelsäure, Natriumacetat, Pyridin, Fluoroborsäure, p-Toluolsulfonsäure sowie stark saurer Ionenaustauscher beschleunigt werden.

Das in der ersten Hauptreaktionsstufe erhaltene 7-Hydroxymethylcamptothecin kann in der nachfolgenden Reaktionsstufe mit einem zur Umwandlung der Hydroxymethylgruppe in eine Carboxylgruppe geeigneten Oxidationsmittel in an sich bekannter Weise oxidiert werden. Derartige Oxidationsmittel sind dem Fachmann geläufig und werden beispielsweise unter den wasserfreien Chromaten, Dichromaten und Permanganaten ausgewählt. Diese Oxidationsreaktion wird üblicherweise bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur in Gegenwart von Aceton, Essigsäure, Schwefelsäure od. dgl. als Reaktionsmedium durchgeführt, wobei 7-Carboxycamptothecin bzw. Camptothecin-7-carbonsäure erhalten wird. Diese Carbonsäure kann erforderlichenfalls durch Umkristallisieren in Dioxan gereinigt werden.

Die erfindungsgemäßen neuen Camptothecinderivate besitzen hohe Antitumorwirksamkeit und/oder sehr geringe Toxizität. Aus den Ergebnissen von Tierversuchen geht hervor, daß die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Camptothecinderivate dem Camptothecin selbst hinischtlich der Antitumorwirksamkeit bei lymphatischer Leukämie L-1210 (Stamm des National Cancer Institute) überlegen ist. Die Toxizität der erfindungsgemäßen Camptothecinderivate ist allgemein niedrig. Die pharmakologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen neuen Camptothecinderivate beträgt im Vergleich zu Camptothecin selbst 100 bis 170%, ausgedrückt als Verhältnis der mittleren Lebensdauer behandelter Mäuse zur mittleren Lebensdauer unbehandelter Kontrollmäuse in Prozent (T/C- Wert, %). Die erfindungsgemäßen Camptothecinderivate eignen sich daher günstig als Antitumormittel sowie als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer geeigneter Derivate.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Teile und Prozentangaben sind massebezogen.

Die Schmelzpunkte wurden in Kapillarröhrchen gemessen und sind unkorrigiert. Die NMR-Spektren wurden mit den NMR- Spektrophotometern Hitachi R-22 90MC und JEOL FX-100 aufgenommen, wobei Tetramethylsilan (TMS) als interner Standard verwendet wurde. Die Massenspektren wurden mit Massenspektrometern Hitachi RMS-4 und JEOL JMS D300 aufgenommen. Die IR- und UV-Spektren wurden auf Spektralphotometern JASCO IRA-1 bzw. Hitachi EPS-3 aufgezeichnet. Die optische Drehung wurde mit einem automatischen Polarimeter Yanagimoto Yanaco OR-50 gemessen.

Beispiel 1 Herstellung von 7-Hydroxymethylcamptothecin

Camptothecin (100 mg, 0,287 mmol) wurde in Methanol (25 ml) suspendiert und anschließend durch Zugabe von 75%iger Schwefelsäure (10 ml) unter Eiskühlung darin gelöst. Die Lösung wurde am Rückfluß tropfenweise unter Rühren mit einer wäßrigen Lösung (100 ml) von Ammoniumpersulfat (15 g, 0,0657 mol) während 16 h versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend in Eiswasser (100 ml) gegossen, worauf das organische Material mit einem Dioxan-Chloroform-Gemisch (1 : 1, 500 ml) und danach dreimal mit Chloroform (100 ml, dreimal) extrahiert wurde. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Der verbleibende, orangefarbene Feststoff wurde mit Methanol (200 ml) erwärmt (50 bis 60°C) und 30 min gerührt. Ein unlöslicher Anteil wurde abfiltriert; nach Trocknen unter vermindertem Druck und Umkristallisieren aus Dimethylformamid-Dioxan wurden 40 mg (36,9%) 7-Hydroxymethylcamptothecin in Form leicht hellgelber, prismatischer Kristalle erhalten;

F. 274 bis 276°C (unter Zersetzung).

Rf-Wert 0,125 (5% Methanol-Chloro form).

IR-Spektrum (KBr):
δ_max (cm^-1): 3300, 2960, 1770, 1665, 1605, 1470, 1200, 1170, 1115, 770.

NMR-Spektrum (DMSO-d₆):
δ (ppm): 0,90 (3H, t, J=7 Hz), 1,88 (2H, q, J=7 Hz), 5,23 (2H, s), 5,34 (2H, s), 5,40 (2H, s), 7,30 (1H, s), 7,55-8,13 (4H, m).

Massenspektrum:
m/e: 378,1283 [M+] (C₁₂H₁₈N₂O₅=378,1209).

UV-Spektrum (ÄtOH):
λ_max (nm): 220, 245, 253,3, 292, 302, 335 (sh), 359, 372.

Beispiel 2 Herstellung von 7-Hydroxymethylcamptothecin

Camptothecin (3,00 g, 8,61 mmol) wurde in Methanol (90 ml) suspendiert und anschließend durch Zugabe von 75%iger Schwefelsäure (75 ml) und Wasser (75 ml) darin gelöst. Zu der Lösung wurde FeSO₄ · 7 H₂O (40 g, 0,143 mol) zugegeben; danach wurde während 2 h 30%iges Wasserstoffperoxid (15 ml) unter Eiskühlung und unter Rühren tropfenweise zugesetzt. Nach der Zugabe des Wasserstoffperoxids wurde das Reaktionsgemisch 14 h bei Raumtemperatur gerührt und danach in Eiswasser (1 l) eingegossen. Der ausgefällte gelblichbraune Feststoff wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 2,5 g 7-Hydroxymethylcamptothecin anfielen.

Das Filtrat wurde viermal mit Chloroform (250 ml×4) extrahiert, worauf 200 mg rohes kristallines Produkt erhalten wurde.

Insgesamt wurden 2,7 g (82,9%) 7-Hydroxymethylcamptothecin erhalten, das aufgrund der IR-Spektren sowie der Dünnschichtchromatographie mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Produkt identisch war.

Beispiel 3 Herstellung von 7-Hydroxymethylcamptothecin

Camptothecin (50 mg, 0,143 mmol) wurde in 75%iger Schwefelsäure (3 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden Glycolsäure (500 mg, 6,57 mmol) und Silbernitrat (250 mg, 1,31 mmol) zugegeben, worauf die Lösung während 2 h tropfenweise unter Erwärmen (100 bis 110°C) und Rühren mit einer wäßrigen Lösung (15 ml) von Ammoniumpersulfat (3,00 g, 0,0131 mmol) versetzt wurde. Nach Abkühlenlassen des Reaktionsgemischs wurde Eiswasser (100 ml) in das Reaktionsgemisch eingegossen, das darauf mit Chloroform (100 ml×3) extrahiert wurde. Die Chloroformschichten wurden vereinigt, mit einer 7%igen wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (300 ml) und danach mit einer gesättigten Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft.

Der erhaltene Rückstand wurde zur Abtrennung und Reinigung des 7-Hydroxymethylcamptothecins einer Dünnschichtchromatographie (5% Methanol-Chloroform) unterzogen, wobei 10,3 mg (19,0%) reines 7-Hydroxymethylcamptothecin erhalten wurden. Daneben wurden 10,7 mg Camptothecin zu rückgewonnen.

Beispiel 4 Herstellung von 7-Acetoxymethylcamptothecin

7-Hydroxymethylcamptothecin (150 mg, 0,431 mmol) wurde in einem Gemisch von Pyridin (20 ml) und Dimethylformamid (2 ml) gelöst. Diese Lösung wurde während 7 h unter Rühren bei Raumtemperatur mit Acetanhydrid (105 mg, 1,03 mmol) in kleinen Portionen versetzt.

Das Reaktionsgemisch wurde anschließend unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, worauf der Rückstand in Chloroform (250 ml) wiederaufgenommen wurde. Die erhaltene Lösung wurde zunächst mit einer 5%igen wäßrigen Lösung (100 ml) von Natriumhydrogencarbonat und anschließend mit 5%iger Salzsäure (100 ml) ausgeschüttelt. Die erhaltene Chloroformschicht wurde mit einer gesättigten Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Der erhaltene Rückstand wurde durch Umkristallisieren aus n-Hexan-Chloroform gereinigt, worauf 142 mg (78,4%) 7-Acetoxymethylcamptothecin in Form hell gelbweißer, nadelförmiger Kristalle erhalten wurden.

F. 277 bis 279°C (unter Zersetzung)

IR-Spektrum (KBr):
ν_max (cm^-1): 3320, 2970, 1770, 1660, 1610, 1235, 770.

NMR-Spektrum (CDCl₃):
δ (ppm): 1,03 (3H, t, J=7 Hz), 1,89 (2H, q, J=7 Hz), 2,18 (3H, s), 5,44 (2H, s), 5,26, 5,72 (beide 1H, s, dxd, J=16,5 Hz), 5,71 (2H, s), 7,70 (1H, s), 7,58-8,28 (4H, m).

Massenspektrum:
m/e: 420,1369 [M⁺] für C₂₃H₂₀N₂O₆ =420,1314.

UV-Spektrum (EtOH):
λ_max (nm): 220, 246 (sh), 255, 292, 336 (sh), 373.

Beispiel 5 Herstellung von 7-Propionyloxymethylcampto thecin

7-Hydroxymethylcamptothecin (378 mg, 1 mmol) wurde unter Erwärmen in wasserfreiem Dimethylformamid (80 ml) gelöst. Nach Abkühlen der Lösung wurden wasserfreies Pyridin (1 ml) und Propionsäureanhydrid (1 ml, 8 Äquivalent) zugesetzt, worauf das Gemisch 24 h bei Raumtemperatur gerührt wurde. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Gemisch zur Zersetzung des überschüssigen Anhydrids mit Äthanol (10 ml) versetzt, wobei eine Zeitlang gerührt wurde; anschließend wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert.

Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel (10 g) gereinigt, worauf 420 mg (96,8%) rohes 7-Propionylmethylcamptothecin in kristalliner Form erhalten wurden. Nach Umkristallisieren des Rohprodukts aus n-Hexan-Chloroform wurden 210 mg (48,4%) hell gelbweiße, nadelförmige Kristalle erhalten.

F. 279 bis 280°C.

IR-Spektrum (KBr):
ν_max (cm^-1): 3230, 1740, 1655, 1595, 1460, 1165, 765.

NMR-Spektrum (CDCl₃):
δ (ppm): 1,05 (3H, t, J=7 Hz), 1,18 (3H, t, J=7 Hz), 1,91 (2H, q, J=7 Hz), 2,47 (2H, q, J=7 Hz), 5,28 (2H, d, J=17 Hz), 5,44 (2H, s), 5,70 (2H, d, J=17 Hz), 5,71 (2H, s), 7,63 (1H, s), 7,70-8,30 (4H, m).

Massenspektrum:
m/e: 434 [M⁺] (C₂₄H₂₂N₂O₆=434,15).

Beispiel 6 Herstellung von 7-Butyryloxymethylcampto thecin

7-Hydroxymethylcamptothecin (378 mg, 1 mmol) wurde unter Erwärmen in wasserfreiem Dimethylformamid (80 ml) gelöst. Danach wurde diese Lösung mit wasserfreiem Pyridin (1 ml) und n-Buttersäureanhydrid (1 ml, etwa 8 Äquivalent) versetzt, wonach das Gemisch 4 h bei 60°C gerührt wurde.

Nach Vervollständigung der Reaktion wurden dem Reaktionsgemisch 10 ml Ethanol zur Zersetzung von überschüssigem Anhydrid zugesetzt, wobei eine Zeitlang gerührt wurde; die Lösungsmittel wurden dann unter vermindertem Druck abdestilliert.

Der erhaltene Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel (10 g) unter Verwendung von Chloroform als Elutionsmittel gereinigt; anschließend wurde aus n-Hexan- Chloroform umkristallisiert, wonach 160 mg (35,7%) 7-Butyryloxymethylcamptothecin in Form hell gelbweißer, nadelförmiger Kristalle erhalten wurden.

F. 252 bis 254°C.

IR-Spektrum (KBr):
ν_max (cm^-1): 3350, 1750, 1740, 1665, 1600, 1435, 1155, 770.

NMR-Spektrum (CDCl₃):
δ (ppm): 0,94 (3H, t, J=7 Hz), 1,05 (3H, t, J=7 Hz), 1,69 (2H, sex, J=7 Hz), 1,91 (2H, q, J=7 Hz), 2,42 (2H, t, J=7 Hz), 5,28 (2H, d, J=16 Hz), 5,44 (2H, s), 5,69 (2H, s), 5,72 (2H, d, J=16 Hz), 7,63 (1H, s), 7,58-8,25 (4H, m).

Massenspektrum:
m/e: 448 [M⁺] (C₂₅H₂₄N₂O₆=448,16).

Beispiel 7 Herstellung von 7-Isovaleroxymethylcampto thecin

7-Hydroxymethylcamptothecin (200 mg, 0,53 mmol) wurde unter Erwärmen in wasserfreiem Pyridin (50 ml) gelöst. Der Lösung wurde Isovaleriansäurechlorid (190 mg, 3 Äquivalent) zugegeben, worauf das Gemisch 2 h bei 80°C gerührt wurde.

Danach wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf der erhaltene Rückstand in Chloroform (100 ml) gelöst wurde. Die Lösung wurde bei 0°C mit einer 5%igen wäßrigen Lösung (50 ml) von Natriumcarbonat und einer gesättigten wäßrigen Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen; die Chloroformschicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels wurde der Rückstand durch Säulenchromatographie an Silicagel (7 g) unter Verwendung von Chloroform als Elutionsmittel sowie anschließendes Umkristallisieren aus n-Hexan-Chloroform gereinigt, wonach 110 mg (44,9%) 7-Isovaleroxymethylcamptothecin in Form hell gelbweißer Kristalle erhalten wurden.

F. 240 bis 242°C.

IR-Spektrum (KBr):
ν_max (cm^-1): 3450, 2950, 1740, 1650, 1595, 1160, 760.

NMR-Spektrum (CDCl₃):
δ (ppm): 0,94 (6H, d, J=7 Hz), 1,07 (3H, t, J=7 Hz), 1,91 (2H, q, J=7 Hz), 2,31 (2H, d, J=7 Hz), 3,71 (1H, m), 5,30 (2H, d, J=16 Hz), 5,45 (2H, s), 5,69 (2H, d, J=16 Hz), 5,72 (2H, s), 7,65 (1H, s), 7,57-8,27 (4H, m).

Massenspektrum:
m/e: 462 [M⁺] (C₂₆H₂₆N₂O₆=462,18).

Beispiel 8 Herstellung von Camptothecin-7-carbonsäure

7-Hydroxymethylcamptothecin (200 mg, 0,529 mmol) wurde in Dioxan (300 ml) gelöst. Dieser Lösung wurde Jones-Reagens (2,5 ml, etwa 5,35 mmol) zugesetzt, worauf das Gemisch 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt wurde. Nach Abfiltrieren des gebildeten Niederschlags wurde das Filtrat anschließend unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Danach wurde der Rückstand mit Wasser (15 ml) versetzt; unlösliches Material wurde abfiltriert und gründlich mit Wasser (50 ml) gewaschen. Dieses Fällungsprodukt wurde durch Umkristallisieren aus Dioxan gereinigt, worauf Camptothecin-7-carbonsäure in Form hellgelber Kristalle in einer Menge von 95 mg (45,8%) erhalten wurde.

F. <300°C.

IR-Spektrum (KBr):
ν_max (cm^-1): 3450-2670, 1760, 1650, 1595, 1240, 1170, 785.

NMR-Spektrum (CDCl₃):
δ (ppm): 0,91 (3H, t, J=7 Hz), 1,90 (2H, q, J=7 Hz), 5,31 (2H, s), 5,41 (2H, s), 6,50 (1H, br s, D₂O ex.), 7,30 (1H, s), 7,65-8,18 (3H, m), 8,76-8,84 (1H, m).

Massenspektrum:
m/e: 392,0995 [M⁺] (C₂₁H₁₆N₂O₆=392,1002).

UV-Spektrum (EtOH):
λ_max (nm): 220, 249 (sh), 290, 310, 336 (sh), 360, 374.

Pharmakologische Versuche

Folgende Verbindungen wurden miteinander verglichen:

Camptothecin (im folgenden mit CPT bezeichnet)

7-Hydroxymethylcamptothecin (7-CH₂OH)
Camptothecin-7-carbonsäure (7-COOH)
7-Acetoxymethylcamptothecin (7-CH₂OCOCH₃)
7-Propionyloxymethylcamptothecin (7-CH₂OCOCH₂CH₃)
7-Butyryloxymethylcamptothecin (7-CH₂OCOCH₃H₇).

Die Antitumoraktivität jeder Verbindung wurde wie folgt bestimmt:

Verschiedene Gruppen von weiblichen BDF₁-Mäusen mit einem Körpergewicht von je etwa 25 g wurden als Versuchstiere verwendet.

Jede Mäusegruppe bestand aus 10 Versuchstieren, denen 5,5×10⁴ Tumorzellen der lymphatischen Mäuseleukämie L-1210 intraperitoneal transplantiert wurden. 24 Std. nach der Transplantation wurde jeder Maus einmal am Tag intraperitoneal eine Gesamtmenge von 1, 5, 25 oder 40 mg/kg Körpergewicht jeder Testverbindung an 5 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Jede Testverbindung wurde in Form einer Suspension in physiologischer Salzlösung verabreicht. Jede Kontrollgruppe erhielt die entsprechende Menge physiologische Salzlösung allein.

Nach dem Transplantieren der Tumorzellen wurden die Mäuse 40 Tage beobachtet, um die lebensverlängernde Wirkung der Testverbindung zu bestimmen. Die Anzahl von Tagen, die eine behandelte Mäusegruppe überlebte, und die Anzahl von Tagen, die die Kontrollgruppe überlebte, wurden bestimmt. Jede Maus die länger als 40 Tage überlebte, wurde als "vollständig geheilt" angesehen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Aus der mittleren Anzahl von Überlebenstagen der Testgruppen (T) und der Kontrollgruppe (C) wurde ein prozentuales Überlebensverhältnis, d. h. eine Antitumorwirkung, T/C (%), gemäß der folgenden Gleichung berechnet:

In Tabelle 1 ist auch der berechnete T/C-Wert für jede Verbindung angegeben. Das Verhältnis von Dosis : T/C-Wert für jede Testverbindung wird halblogarithmisch aufgetragen, wobei auf der Abszisse die Dosis und auf der Ordinate der T/C-Wert angegeben sind. Durch die entsprechenden Punkte wird eine Linie gezogen; eine Testverbindung wird dann als wirksam angesehen, wenn der T/C-Wert bei einer bestimmten Dosis über 120% liegt.

Für jede Testverbindung wird der Schnittpunkt der Linie mit einer Linie, für die T/C=120%, bestimmt und als Mindesteffektivdosis (MED) angegeben.

Die Dosis, bei der der T/C-Wert ein Maximum erreicht, wird als Maximaltoleranzdosis (MTD) jeder Verbindung angegeben; er wurde wie folgt bestimmt:

Aus Tabelle 1 wurde die Dosis, die den maximalen T/C-Wert zeigt, zur Berechnung von MTD ausgewählt. Die oben angegebenen Versuche wurden mit einer größeren Dosis wiederholt, um die Dosis zu bestimmen, bei der T/C-Wert das Maximum erreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Die für jede Testverbindung auf diese Weise erhaltenen MED- und MTD-Werte sind in Tabelle 3 angegeben:

Tabelle 3

Die Antitumorwirkung jeder Testverbindung wurde durch Berechnen des therapeutischen Index (TI) gemäß folgender Gleichung bestimmt:

Der so berechnete TI-Wert jeder Testverbindung ist auch in Tabelle 3 angegeben. Im allgemeinen haben die erfindungsgemäßen 7-substituierten Camptothecinderivate einen um etwa 2-4mal höheren TI-Wert als Camptothecin selbst.

Claims

1. Camptothecinderivate der allgemeinen Formel (I) in der X CH₂OH, COOH oder CH₂OR₁ mit R₁=Acyl einer niederen aliphatischen Carbonsäure bedeutet, sowie ihre Alkalimetallsalze.

2. 7-Hydroxymethylcamptothecin.

3. 7-Acetoxymethylcamptothecin.

4. 7-Propionyloxymethylcamptothecin.

5. 7-Butyryloxymethylcamptothecin.

6. Camptothecin-7-carbonsäure.

7. Verfahren zur Herstellung der Camptothecinderivate der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Camptothecin in einer radikalischen Reaktion mit einer Hydroxymethylverbindung der allgemeinen Formel (II) A-CH₂OH (II)mit A=H, COOH oder CH₂OH
in Gegenwart von Schwefelsäure und einem Peroxid oder einem Azobisacylonitril als Radikalbildner in einem wäßrigen Medium umsetzt und das erhaltene 7-Hydroxy methylcamptothecin ggf. in üblicher Weise mit einem Acylierungsmittel zum entsprechenden 7-Acyloxymethylcamptothecin umsetzt oder ggf. in üblicher Weise zu 7-Carboxycamptothecin oxidiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Radikalreaktion in Gegenwart von Übergangsmetallionen durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Übergangsmetallsalz Silbernitrat verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Übergangsmetallsalz Eisen(II)sulfat verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Peroxid Ammoniumperoxysulfat verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Peroxid Wasserstoffperoxid verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Übergangsmetallsalz in einer Menge eingesetzt wird, die zwischen einer dem eingesetzten Camptothecin fast äquimolaren Menge und einem etwa 30molaren Überschuß gegenüber dem eingesetzten Camptothecin liegt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation des 7-Hydroxymethylcamptothecins zu 7-Carboxycamptothecin mit einem unter den wasserfreien Chromaten, Dichromaten und Permanganaten ausgewählten Oxidationsmittel durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Hydroxymethylverbindung Methanol verwendet wird.

16. Pharmazeutische Mittel, gekennzeichnet durch ein Camptothecinderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6.