CZ303715B6

CZ303715B6 - Farmaceutická kombinace 5-chlor-N-({(5S)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4-morfolinyl)fenyl]-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu, léciva tuto kombinaci obsahující a její pouzití

Info

Publication number: CZ303715B6
Application number: CZ20033451A
Authority: CZ
Inventors: Straub@Alexander; Lampe@Thomas; Pernerstorfer@Josef; Perzborn@Elisabeth; Pohlmann@Jens; Röhring@Susanne; Schlemmer@Karl-Heinz
Original assignee: Bayer Intellectual Property Gmbh
Priority date: 2001-06-20
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2013-04-03
Also published as: EP1411932B1; DE50214206D1; HU230120B1; HUP0400240A3; ATE457171T1; CA2451258A1; AU2002312982B2; NO20035743D0; IL159257A0; BR0210941A; NZ530223A; MXPA03011519A; US7767702B2; SK287904B6; UA82986C2; RU2004101404A; KR100904138B1; SK15302003A3; BRPI0210941B8; CY1110019T1

Abstract

Resení se týká kombinací A) 5-chlor-N-({(5S)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4-morfolinyl)fenyl]-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu s B) Klopidogrelem nebo Aspirinem, léciv tyto kombinace obsahujících a jejich pouzití, obzvláste pro profylaxi a/nebo osetrení tromboembolických onemocnení.

Description

Farmaceutická kombinace 5-chlor-A-({(55)-2-oxo-3-[4-{3-oxo-4-morfolinyl)fenyl]-l,3oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu, léčiva tuto kombinaci obsahující a její použití

Oblast techniky

Vynález se týká kombinací A) 5-chlor-;V-({(5,S')-2-oxo-3-[4-(3-oxo4-morfolinyl)fcnyl]-l ,3oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu sB) jinými účinnými látkami, léčiv tyto kombinace obsahujících a jejich použití, obzvláště pro profylaxi a/nebo ošetření tromboembolických onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Oxazolidinony působí obzvláště jako selektivní inhibitory krevního srážecího faktoru Xa a jako antikoagulanty.

Antitrombotický účinek inhibitorů faktoru Xa mohl být prokázán na mnoha zvířecích modelech (viz WO-A 99/37 304; WO-A 99/06 371; J. Hauptmann, J. Sttirzebecher, Thrombózis Research 1999, 93, 203; F. Al-Obeidi, J. A. Ostrém, Factor Xa inhibitors, Exp. Opin. Ther. Patents 1999, 9, 931; B.-Y. Zhu, R. M. Scarborough, Curr. Opin. Card. Pulm. Ren. Inv. Drugs 1999, 1 (1), 63; M. Samama, J. M. Walenga, B. Kaiser, J. Fareed, Specific Factor Xa Inhibitors, Cardiovascular Thrombózis: Thrombocardiology and Thromboneurology, Second Edition, editováno M. Verstaete, V. Fuster, E. J. Topol, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia 1998), jakož i v klinických studiích na pacientech (The Ephesus Study, Blood, Vol. 96, 490a, 2 000; the Penthifra Study, Blood, Vol. 96, 490a, 2 000; The Pentamaks Study, Blood, Vol. 96, 490a až 491a, 2 000; The Penthathlon 2 000 Study, Blood, Vol. 96, 491a, 2 000). Inhibitory faktoru Xa se mohou proto výhodně použít v léčivech pro profylaxi a/nebo ošetření tromboembolických onemocnění.

Tromboembolická onemocnění cév jsou nejčastější příčinou morbidity a mortality v industrializovaných zemích (Thiemes Innere Medizin, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York; American Heart Assocíation, 2 000 heart and stroke statistical update, Dallas, TX: American Heart Assocíation, 2 000). Antikoagulatorická terapie se osvědčila při ošetření cévních onemocnění, aby se zamezilo trombotickým uzavřením cév, popřípadě aby se tromboticky uzavřené cévy znovu otevřely a mají vysoký význam při profylaxi a ošetření koronárních, periferních a cerebrálních cévních onemocnění, jakož i při profylaxi a/nebo ošetření žilních trombóz a plicních embolií.

Příčinou tromboembolických komplikací mohou být aterosklerotické změny stěn cév, obzvláště poruchy funkce endothelu, které mohou vést k akutním trombotickým uzavřením. Ateroskleróza je multifaktoriální onemocnění, které je závislé na mnoha kardiovaskulárních rizikových faktorech. Klinické studie ukázaly, že profylaxe s antikoagulanty neovlivňují průběh arterielního onemocnění rozhodujícím způsobem. Cílené ošetření rizikových faktorů s antitrombotickou terapií je tedy výhodné.

Rizikové faktory pro koronární, periferní a cerebrální cévní onemocnění jsou například : zvýšená hladina sérového cholesterolu, arterielní hypertonie, kouření cigaret, diabetes mellitus (Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, W. Forth, D. Henschler, W. Rummel, K. Starke; Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin, Oxford; Thiemes Innere Medizin, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York). Základem preventivních medicínských principů je vyřazení těchto rizikových faktor. Vedle změny životosprávy k tomu patří také farmakologická opatření, jako je například antihypertenzivní terapie, léčiva snižující lipidy nebo profylaxe trombózy. Kromě toho je pro ošetření již vzniklého koronárního onemocnění srdce vhodná kombinace s koronárními terapeutiky.

Ve spise WO 00/53 264 se popisuje kombinace inhibitorů faktoru Xa se sloučeninami, jako je Aspirin nebo Heparin, pro ošetření tromboembolických onemocnění. V tomto spise není uvažován Rivaroxaban.

Na kombinaci Rivaroxabanu s Aspirinem je možno pohlížet jako na výběr, který se dá zdůvodnit biologickými daty, která ukazují překvapivý synergický efekt sloučenin. Pro odborníky nemohlo být předpokládatelné, že by kombinace Rivaroxabanu s Aspirinem vykazovala synergický efekt. Jako inhibitory faktoru Xa v tomto spise uváděné sloučeniny mají kompletně jiné struktury než Rivaroxaban. Dále není v uvedeném WO spise vedle Rivaroxabanu uvažován ani Klopidogrel. S technickým úkolem seznámený odborník by tedy i při znalosti obsahu tohoto spisu nemohl odvodit možnost kombinace těchto účinných látek, které nejsou vůbec uvažované.

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že kombinace 5-chlor-N^r-({(55)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4-morfoIinyl)fenyl]-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu s určitými jinými účinnými látkami mají zajímavé vlastnosti a jsou lépe vhodné pro profylaxi a/nebo ošetření různých onemocnění než jednotlivé účinné látky.

Předmětem předloženého vynálezu je tedy farmaceutická kombinace obsahující

A) 5-chlor-ÍV-({(5X)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4-morfolinyl)fenyl]-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)2-thiofenkarboxamid vzorce

jeho farmaceuticky přijatelné soli, hydráty nebo jejich směsi a

B) Klopidogrel nebo Aspirin.

Pod pojmem „kombinace“ se ve smyslu předloženého vynálezu rozumí nejen aplikační formy, které obsahují všechny komponenty (takzvané fixkombinace) a kombinační balení, která obsahují komponenty navzájem odděleně, ale také současně nebo časově oddělené aplikované komponenty, pokud se používají pro profylaxi a/nebo ošetření toho samého onemocnění. Rovněž je možné navzájem kombinovat dvě nebo více účinných látek, jedná se při tom tedy o dvojnásobné nebo vícenásobné kombinace.

Fyziologicky neškodné, to znamená farmaceuticky přijatelné soli, mohou být soli sloučeniny podle předloženého vynálezu s anorganickými nebo organickými kyselinami. Výhodné jsou soli s anorganickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina fosforečná nebo kyselina sírová, nebo soli s organickými karboxylovými nebo sulfonovými kyselinami, jako je například kyselina octová, kyselina trifluoroctová, kyselina propionová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina jablečná, kyselina citrónová, kyselina vinCZ 303715 B6 ná, kyselina mléčná, kyselina benzoová, kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová, kyselina benzensulfonová, kyselina toluensulfonová nebo kyselina naftalendisulfonová.

Jako farmaceuticky přijatelné soli je možno uvést také soli s obvyklými bázemi, jako jsou například soli alkalických kovů (například sodné nebo draselné soli), soli kovů alkalických zemin (například vápenaté nebo hořečnaté soli) nebo soli amoniové, odvozené od amoniaku nebo organických aminů, jako je například diethylamin, triethylamin, ethyldiisopropylamin, prokain, dibenzylamin, A-methylmorfolin, dihydroabietylamin nebo methylpiperidin.

Jako „hydráty“ se podle předloženého vynálezu označují takové formy sloučeniny, které v pevném nebo kapalném stavu tvoří hydrataci s vodou molekulovou sloučeninu (solvát). V hydrátech jsou molekuly vody připojeny mezimolekulárními silami, obzvláště vazbami vodíkovými můstky. Pevné hydráty obsahují vodu jako takzvanou krystalovou vodu ve stechiometrických poměrech, přičemž molekuly vody nemusí být se zřetelem na svůj vazebný stav rovnocenné. Jako příklady hydrátů je možno uvést seskvihydráty, monohydráty, dihydráty nebo trihydráty. Odpovídajícím způsobem přicházejí v úvahu také hydráty solí sloučenin podle předloženého vynálezu.

Kombinace podle předloženého vynálezu jsou obzvláště vhodné pro profylaxi a/nebo ošetření arterielních trombóz a embolií při koronárních onemocněních srdce, cerebrovaskulámích poruch prokrvení a poruch periferního arterielního prokrvení, žilních trombóz a plicních embolií.

Jednotlivé účinné látky kombinací jsou z literatury známé a z větší části komerčně dostupné. Mohou se popřípadě používat v subterapeuticky účinných dávkách.

Pro profylaxi a/nebo ošetření arterielních onemocnění cév je vhodná kombinační terapie kombinací podle vynálezu s látkami snižujícími obsah lipidů, obzvláště s inhibitory HMG-CoA-(3hydroxy-3-methylglutaryl-Koenzym A)-reduktázy, jako je například Cerivastatin (Rivastatin, Baycol, US 5 177 080), Lovastatin (Mevacor, US 4 231 938), Simvastatin (Zocor, US 4 444 784), Pravastatin (Pravachol, US 4 346 227), Fluvastatin (Lescol, US 5 354 772), Atorvastatin (Lipitor, US 5 273 995), nebo s koronárními terapeutiky/vasodilatátory, obzvláště inhibitory ACE-(enzym přeměňující angiotensin), jako je například Kaptopril, Lisinopril, Enalapril, Ramipril, Cilazapril, Benazepril, Fosinopril, Quinapril, Perindopril, antagonisty AII-(angiotensin II)—receptorů, jako je například Embusartan (US 5 863 930), Losartan, Valsartan, Irbesartan, Candesartan, Eprosartan, Temisartan, antagonisty β-adrenoceptorů, jako je například Karvedilol, Alprenolol, Bisoprolol, Acetobutol, Atenolol, Betaxolol, Karteolol, Metoprolol, Nadolol, Pantabutol, Pindolol, Propanolol, Tomolol, antagonisty α-1-adrenoceptorů, jako je například Prazosin, Bunazosin, Doxazosin, Terazosin, diuretiky, jako je například Hydrochlorothiazid, Furosemid, Bumetanid, Piretanid, Torasemid, Amilorid, Dihydralazin, blokátory kalciových kanálů, jako je například Verapamil, Diltiazem nebo deriváty dihydropyridinu, jako je například Nifedipin (Adalat) nebo Nitredipin (Bayotensin), látkami, které způsobují zvýšení cyklického guanosinmonofosfátu (cGMP), jako jsou například stimulátory rozpustné guanylátcyklázy (WO 98/16 223, WO 98/16 507, WO 98/23 619, WO 00/06 567, WO 00/06 568, WO 00/06 569, WO 00/21 954, WO 00/66 582, WO 01/17 998, WO 01/19 776, WO 01/19 355, WO 01/19 778).

Farmakoterapeutickým cílem ošetření již existujícího koronárního onemocnění srdce je odstranění nepoměru mezi nabídkou kyslíku a potřebou kyslíku v oběhu myokardu, napadeném ischemií. Pro ošetření při již existujícím koronárním onemocnění srdce je tedy obzvláště vhodná kombinační terapie s koronárními terapeutiky, obzvláště s antagonisty β-adrenoreceptorů; inhibitory ACE-(enzym přeměňujícího angiotensin); antagonisty A-II-(angiotensin 11)—receptorů; nitropreparáty, jako je například isosorbid-5-mononitrát, isosorbid—dinitrát a glyceroltrinitrát; látkami, způsobujícími zvýšení cyklického guanosinmonofosfátu (cGMP); blokátoty kalciových kanálů. Velký počet těchto sloučenin se používá také pro terapii vysokého krevního tlaku.

Aby se opět uvolnily tromboticky uzavřené cévy, osvědčila se trombolytická terapie s plasminogen-aktivátory (trombolytika/fibrinolytika), jako je například aktivátor tkáňového plasminogenu (t-PA), streptokináza, retepláza nebo urokináza. Samotná aplikace plasminogen-aktivátorů nepotlačuje ale další růst trombu. Vysoké dávky plasminogen-aktivátorů k tomu mohou znamenat zvýšené riziko krvácení. Kombinované dávky trombolytika a kombinace podle vynálezu pro otevření tromboticky uzavřený cév při koronárních onemocněních srdce, transitovaných ischemických atacích, mozkové mrtvici, periferním arterielním onemocnění uzavřením a plicní embolii, potlačují další růst trombu inhibici tvorby trombu a snižují tedy riziko nového uzavření. Kromě toho se může při kombinační terapii s trombolytikem snížit terapeuticky potřebná dávka trombolytika, což vede ke snížení komplikací krvácením a představuje to tedy podstatnou výhodu ve srovnání s monoterapií.

Kombinace podle vynálezu se mohou podávat také v kombinaci s jinými antikoagulatoricky účinnými substancemi (antikoagulanty) pro profylaxi a/nebo ošetření arterielních, intrakardiálních a žilních tromboembolických onemocnění. Kombinační terapie, obzvláště s heparinem (UFH), nízkomolekulárním heparinem (MMH), jako je například Tinzaparin, Cetroparin, Pamaparin, Nadroparin, Ardeparin, Enoxaparin, Reviparin, Dalteparin nebo s přímými inhibitory trombinu, jako je například indurin, vede k zesílenému antitrombotickému účinku.

Kombinace podle vynálezu se mohou kromě toho podávat také v kombinaci s látkami potlačujícími agregaci krevních destiček (inhibitory agregace krevních destiček, inhibitory agregace trombocytů) pro profylaxi a/nebo ošetření arterielních, intrakardiálních a žilních tromboembolických onemocnění. Při lesi endothelu dochází k přilnutí ke stěně a aktivaci krevních destiček a k současné stimulaci srážení krve. Toto vede ke vzniku destičky a fibrin obsahujících trombů, přičemž destičky přispívají ke stabilizaci fibrinové mřížky (J. Hirsh, E. W. Salzman, V. J. Marder, R. W. Colman, OverView of the Thrombotic Process and its Therapy, str. 1151 až 1163 v Hemostatis and Thrombózis: Basic Principles and Clinical Practice, Third Edition, editováno R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Maděr, E. W. Salzman, J., Lippincott Company, Philadelphia, 1994). Současná inhibice srážení krve a agregace krevních destiček vede tedy k zesílenému antitrombotickému účinku. Pro kombinační terapii jsou obzvláště vhodné kombinace oxazolidinonu s inhibitory agregace krevních destiček, jako je například Aspirin, Ticlopidin (Ticlid), Klopidogrel (Plavix); antagonisty fibrinogenových receptorů; antagonisty glykoproteinu Ilb/IIIa, jako je například Abciximab, Eptifibatid, Tirofiban, Lambifiban, Lefradafiban.

Pro aplikaci kombinací podle předloženého vynálezu přicházejí v úvahu všechny obvyklé aplikační formy. Výhodně se provádí aplikace orálně, linguálně, sublinguálně, bukálně, rektálně nebo parenterálně (to znamená za obejití intestinálního traktu, tedy intravenózně, intraarterielně, intrakardiálně, intrakutánně, subkutánně, transdermálně, intraperitoneálně nebo intramuskulámě).

Předmětem předloženého vynálezu jsou také farmaceutické přípravky, které vedle netoxických, inertních farmaceuticky vhodných pomocných látek a/nebo nosičů obsahují jednu nebo více kombinací podle předloženého vynálezu nebo z kombinace podle předloženého vynálezu sestávajíPři tom mají být kombinace podle předloženého vynálezu ve výše uvedených farmaceutických přípravcích přítomné v koncentraci asi 0,1 až 99,5 % hmotnostních, výhodně 0,5 až 95 %, vztaženo na celkovou směs.

Výše uvedené farmaceutické přípravky mohou kromě kombinací podle předloženého vynálezu obsahovat také další farmaceutické účinné látky.

Výroba výše uvedených farmaceutických přípravků může probíhat obvyklými způsoby pomocí o sobě známých metod, například smísením účinné látky nebo účinných látek s nosičem nebo nosiči.

Všeobecně se ukázalo jako výhodné pro dosažení požadovaných výsledků aplikovat kombinace podle předloženého vynálezu v celkovém množství asi 0,001 až 100 mg/kg, výhodně asi 0,01 až

100 mg/kg, obzvláště asi 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti za 24 hodin, popřípadě ve formě více jednotlivých dávek.

Přesto může být popřípadě potřebné se od výše uvedených množství odchýlit a sice v závislosti na tělesné hmotnosti, popřípadě typu aplikace, na druhu a tíži onemocnění, na individuálním chování vůči medikamentu, na druhu přípravku a okamžiku, popřípadě intervalu, při nebo ve kterém se podávání provádí. Tak může být v některých případech dostatečné vystačit s menším množstvím, než je výše uvedené minimální množství, zatímco v jiných případech musí být překročena horní hranice. V případě aplikace větších množství je možno doporučit tyto dávky rozdělit na více dávek během dne a sice buď ve více jednotlivých dávkách, nebo jako trvalá infuze.

Dalším předmětem předloženého vynálezu jsou výše definované kombinace pro profylaxi nebo ošetření onemocnění.

Dalším předmětem předloženého vynálezu jsou léčiva, obsahující alespoň jednu z výše definovaných kombinací a popřípadě další farmaceuticky účinné látky.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je použití výše definovaných kombinací pro výrobu léčiv pro profylaxi a/nebo ošetření výše popsaných onemocnění, výhodně tromboembolických onemocnění, obzvláště srdečního infarktu, angíny pectoris (uzavřená instabilní angína), náhlé zástavy srdce, reokluze a restenózy po angioplastii nebo aortokoronámím bypassu, mozkové mrtvice, transitorických ischemických ataků, nemoci periferního arterielního uzavření, plicní embolie nebo hlubokých žilních trombóz.

Předložený vynález je ozřejměn pomocí následujících příkladů provedení, které by však tento vynález v žádném případě neměly omezovat. Procentické údaje v následujících příkladech se vztahují vždy na hmotnost, díly jsou hmotnostní díly.

Příklady provedení vynálezu

A. Hodnocení fyziologické účinnosti

1. Fyziologická účinnost 5-chlor-/V-({(55)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4-morfolínyl)fenyl]-l,3oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu

5-chlor-TV-({(55)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4-morfolinyl)fenyl]-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)-2thiofenkarboxamid působí obzvláště jako selektivní inhibitor krevního srážecího faktoru Xa a neinhibuje, nebo inhibuje teprve při značně vyšších koncentracích také ostatní serinproteázy, jako je trombin, plasmin nebo trypsin.

Jako „selektivní“ se označují takové inhibitory krevního srážecího faktoru Xa, u kterých je hodnota IC₅o pro inhibici faktoru Xa ve srovnání s hodnotami IC50 pro inhibici ostatních serinproteáz, obzvláště trombinu, plasminu a trypsinu, o stonásobek, výhodně o pětinásobek a obzvláště o tisícinásobek nižší, přičemž co se týká testovacích metod pro selektivitu, poukazuje se na dále popsané testovací metody z příkladů A—1) a.l) a a.2).

Obzvláště výhodné biologické vlastnosti 5-chlor-/V-({(55)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4-morfolinyl)fenyl]-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu se mohou zjistit pomocí následujících metod.

a) Popis testů (/'« vitro)

a.l) Měření inhibice faktoru Xa

Enzymatická aktivita humánního faktoru Xa (FXa) se měří přes reakci pro FXa-specifický chromogenní substrát. Při tom odštěpuje faktor Xa z chromogenního substrátu p-nitroanilin. Stanovení se provádí následujícím způsobem na mikrotitračních destičkách.

Zkoušené látky se v různých koncentracích rozpustí v dimethylsulfoxidu a po dobu 10 minut se při teplotě 25 °C inkubují s humánním FXa (0,5 nmol/1 rozpuštěno v 50mmol/l Tris-pufru [C,C,C-Tris(hydroxymethyl)aminomethan], 150mmol/l NaCl, 0,1% BSA (hovězí sérový albumin), pH = 8,3). Jako kontrola slouží čistý dimethylsulfoxid. Potom se přidá chromogenní substrát (150pmol/l Pefachrome® FXa firmy Pentapharm). Po 20 minutách inkubační doby při teplotě 25 °C se zjišťuje extinkce při 405 nm. Extinkce testovaných vsázek se zkoušenou substancí se srovnávají s kontrolními vsázkami bez zkoušené substance a z toho se vypočtou hodnoty IC₅₀. a.2) Stanovení selektivity

Pro důkaz selektivní FXa-inhibice se zkoušené substance zkouší na svoji inhibici jiných humánních serinproteáz, jako je trombin, trypsin a plasmin. Pro stanovení enzymatické aktivity trombinu (75 mU/ml), trypsinu (500 mU/ml) a plasminu (3,2 nmol/1) se tyto enzymy rozpustí v Trispufru (lOOmmol/l, 20mmol/l CaCL, pH = 8,0) a po dobu 10 minut se inkubují se zkoušenou substancí nebo rozpouštědlem. Potom se přídavkem odpovídajícího specifického chromogenního substrátu (Cromozym Thrombin® firmy Boehringer Mannheim, Chromozym Trypsin® firmy Boehringer Mannheim, Chromozym Plasmin® firmy Boehringer Mannheim) nastartuje enzymatická reakce a stanovuje se extinkce po 20 minutách při 405 nm. Všechna stanovení se provádějí při teplotě 37 °C. Extinkce testovaných vsázek se zkoušenou substancí se srovnávají s kontrolními vzorky bez zkoušené substance a z toho se vypočtou hodnoty IC₅oa. 3) Stanovení antikoagulačního účinku

Antikoagulační účinek zkoušených substancí se stanovuje in vitro v humánní plazmě. K tomu se odebere humánní krev za použití 0,11 molámího roztoku citrátu sodného jako předlohy v poměru ve směsi citrát sodný/krev 1/9. Krev se bezprostředně po odběru dobře promísí a 10 minut se odstřeďuje při asi 2 000 g. Supematant se odpipetuje. Protrombinová doba (PT, synonymum: tromboplastinová doba, Quick-test) se stanovuje za přítomnosti proměnlivé koncentrace zkoušené substance nebo odpovídajícího rozpouštědla s komerčně obvyklým testovacím kitem (Neoplastin® firmy Boehringer Mannheim). Testované sloučeniny se inkubují po dobu 10 minut při teplotě 37 °C s plazmou. Potom se přídavkem Thromboplasinu vyvolá srážení a stanovuje se okamžik nástupu srážení. Zjišťuje se koncentrace zkoušené látky, která způsobuje zdvojnásobení protrombinové doby.

b) Stanovení antitrombotického účinku (in vivo).

b. l) Arteriovenózní Shunt-model (krysy)

Lačné samčí krysy (kmen: HSD CPB: WU) o hmotnosti 200 až 250 g se narkotizují ompun/Ketavet roztokem (12 mg/kg, 50 mg/kg). Tvorba trombů se vyvolává v arteriovenózním shuntu podle metody, popsané Cristopherem N. Berrym a kol., v Br. J. Pharmacol. (1994), 113, 1209 až 1214. Ktomu se volně vypreparuje levá Véna jugularis a pravá Arteria carotis. Extraporální shunt se uloží pomocí lOcm dlouhé polyethylenové hadičky (PE 60) mezi obě cévy. Tato polyethylenová hadička má ve středu zavázánu další 3 cm dlouhou polyethylenovou hadičku (PE 160), která obsahuje pro dosažení trombogenního povrchu zdrsněné a do smyčky uložené nylonové vlákno. Extrakorporální oběh se ponechá po dobu 15 minut. Potom se shunt odstraní a nylonové vlákno s trombem se okamžitě zváží. Hmotnost prázdného nylonového vlákna se zjistí před počátkem pokusu. Zkoušené substance se aplikují před zavedením extrakorporálního oběhu buď intravenózně přes ocasní cévu, nebo orálně pomocí jícní sondy u bdících zvířat.

Výsledky jsou uvedené v tabulce 1:

Tabulka 1: Antitrombotický účinek v modelu arteriovenózního shuntu (krysy) po orální nebo intravenózní dávce

Příklad	ED₅₀ [mg/kg] p.o.	ED₅₀ [mg/kg] i.v.
1	3

b.2) Arterielní model trombózy (krysy)

Samčí lačné krysy (kmen: HSD CPB: WU) se narkotizují, jak je uvedeno výše. Krysy jsou těžké v průměru 200 g. Vypreparuje se levá Arteria carotis (asi 2 cm). Tvorba arterielního trombu se indikuje mechanickým poškozením cévy podle metody, popsané K. Mengem a kol., NaunynSchmiedeberg's Arch. Pharmacol. (1977), 301, 115 až 119. Ktomu se vypreparovaná Arteria carotis odsvorkuje z krevního oběhu, po dobu 2 minut se v kovovém žlábku ochladí na teplotu 12 °C a pro standardizaci velikosti trombu se současně komprimuje hmotností 200 g. Potom se průtok krve dodatečně redukuje sponkou, vloženou okolo Arteria carotis distálně od poškozeného úseku cévy. Proximální svorka se odstraní, rána se uzavře a po 4 hodinách se opět otevře, aby se poraněný úsek cévy odebral. Úsek cévy se longitudinálně otevře a trombus se ze zraněného úseku cévy odstraní. Ihned se zjistí vlhká hmotnost trombu. Zkoušené substance se na počátku pokusu aplikují buď intravenózně přes ocasní tepnu, nebo orálně bdělým zvířatům pomocí jícnové sondy. b.3) Venózní model trombózy (krysy)

Samčí lačné krysy (kmen: HSD CPB: WU) se narkotizují, jak je uvedeno výše. Krysy jsou těžké v průměru 200 g. Vypreparuje se levá Véna jungularis (asi 2 cm). Tvorba venózního trombu se indukuje mechanickým poškozením cévy podle metody, popsané K. Mengem a kol., NeunynSchmiedeberg's Arch. Pharmacol. (1977), 301, 115 až 119. K tomu se vypreparovaná Véna jugularis odsvorkuje z krevního oběhu, po dobu 2 minut se v kovovém žlábku ochladí na teplotu -12 °C a pro standardizaci velikosti trombu se současně komprimuje hmotností 200 g. Potom se průtok krve opět otevře, rána se uzavře a po 4 hodinách se opět otevře, aby se poraněný úsek cévy odebral. Ihned se zjistí vlhká hmotnost trombu. Zkoušené substance se na počátku pokusu aplikují buď intravenózně přes ocasní tepnu, nebo orálně bdělým zvířatům pomocí jícnové sondy.

2. Fyziologická účinnost kombinací sloučeniny podle vynálezu

a) In vivo zkoušky na modelu trombózy u krys

Pod narkózou se u krys (HSD CPB: WU, Harlan Winkelmann) vypreparuje Arteria carotis. Kousek filtračního papíru, nasycený vodným 10% roztokem chloridu železitého (rozpuštěný v IN vodné kyselině chlorovodíkové), se opatrně dá pod vypreparovanou cévu v souladu s metodou popsanou Kurzem a kol. (Rat Model of Arterial Thrombosis Induced by Ferric Chloride, Thrombosis Research 60, 269 až 280, 1990). Po 3 minutách se tento kousek filtračního papíru odstraní. Arteria carotis se po 15 minutách vyjme, trombus se odebere a ihned se zváží. Zvířata (10 krys ve skupině) se předem ošetří 1 mg/kg vždy jednotlivou účinnou látkou (oxazolidin, popřípadě kombinační účinná látka) nebo kombinací 1 mg/kg oxazolidinonu a 1 mg/kg kombinační účinné látky. Zvířata kontrolní skupiny se ošetří odpovídajícím rozpouštědlem. Statistická signifikance se vypočte pomocí Studentova t-testu. Jako statisticky signifikantní účinek se považují hodnoty s p < 0,05 (Medical Statistics, MJ Campbell, D. Machin, Second Edition, John Wiley & Sons). Výsledky jsou uvedené v následující tabulce 2:

Tabulka: 2

Synergický antitrombotický účinek kombinace podle vynálezu s Klopidogrelem

Snížení hmotnosti trombu po orálním ošetření
sloučeninou z př. 1 [1 mg/kg]	Klopidogrelem [ 1 mg/kg]	kombinací sloučeniny z př. 1 [1 mg/kg] s Klopidogrelem [1 mg/kg]
22%	28%	39%
žádný efekt	žádný efekt	žádný efekt
(p>0,05)	(p> 0,05)	(p < 0,05)

Jak je uvedeno v tabulce 2, dosahuje se s kombinací 5-chlor-/V-({(5S)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-45 morfolinyl)fenyl]-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu jako sloučeninou z příkladu 1 s inhibitorem agregace krevních destiček, jako je Klopidogrel, synergického účinku, to znamená, že obě komponenty se navzájem zesilují ve svém účinku. Při jednotlivém dávkování byly obě sloučeniny při zkoušené dávce neúčinné. Kombinace obou sloučenin vedla k signifikantnímu snížení hmotnosti trombu. Kombinací s látkou potlačující agregaci krevních destiček se io tedy může podstatně zlepšit antitrombotická terapie.

B. Výrobní příklady Příklady syntézy

Příklad 1

Výroba 5-chlor-V-({(5»Sj-2-Oxo-3-f4-{3-oxo-4-morfolinyl)fenylJ-L3-oxazolidin-5-yl}methyl)-2-thiofenkarboxamidu

O

a) 2-((2Á)-2-hydroxy-3-{[4-(3-oxo-4-morfolinyl)fenyl]amÍno}propyl)-l//-isoindol-l,3(27/)—dion:

Suspenze 2-[(25)-2-oxiranylmethyl]-l//-isoindol-l,3-(277)-dionu (A. Gutcait a kol., Tetrahedron Asym. 1996, 7, 1641) (5,68 g, 27,9 mmol) a 4-(4-aminofenyl)-3-morfolinonu (5,37 g, 27,9 mmol) ve směsi ethylalkoholu a vody (9 : 1, 140 ml) se refluxuje po dobu 14 hodin (sraženina přechází do roztoku, po určité době znovu tvorba sraženiny). Sraženina (požadovaný produkt) se odfiltruj, třikrát se promyje diethyletherem a usuší. Spojené matečné louhy se ve vakuu zahustí a po přídavku druhé porce 2—[(2<S)—2—oxiranylmethy!]—177—isoindol—1,3—(277)—dionu (2,84 g, 14,0 mmol) se suspendují ve směsi ethylalkoholu a vody (9:1) (70 ml) a refluxují se po dobu 13 hodin (sraženina přechází do roztoku, po nějaké době znovu tvorba sraženiny). Sraženina (požadovaný produkt) se odfiltruje, třikrát se promyje diethyletherem a usuší. Celkový výtěžek činí 10,14 g (92 % teorie).

MS (ESI): m/z (%) = 418 ([M+Na]⁺, 84), 396 ([M+H]⁺, 93); HPLC (metoda 3): rt (%) = 3,34 (100).

b) 2-({(5S)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4-morfolinyl)fenyl]-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)-17/-isoindol—1,3(277)—dion:

K suspenzi aminoalkoholu (3,58 g, 9,05 mmol) v tetrahydrofuranu (90 ml) se pod argonovou atmosférou přidá pří teplotě místnosti /V,A''-karbonyIdiimidazoI (2,94 g, 18,1 mmol) a dimethylaminopyridin (katalytické množství). Reakční suspense se míchá při teplotě 60 °C po dobu 12 hodin (sraženina přechází do roztoku a po určité době dochází znovu ke tvorbě sraženiny), smísí se na druhou porcí, Λζ/V-karbonyldiimidazolu (2,94 g, 18,1 mmol) a míchá se po dobu dalších 12 hodin při teplotě 60 °C. Sraženina (požadovaný produkt) se odfiltruje, promyje se tetrahydrofuranem a usuší. Filtrát se ve vakuu odpaří a další produkt se čistí pomocí mžikové chromatografie. Celkový výtěžek činí 3,32 g, což odpovídá 87 % teorie.

MS (ESI): m/z (%) = 422 ([M+H]⁺, 100);

HPLC (metoda 4): rt (%) = 3,37 (100).

c) 5-chlor-7V-({55)-2-oxo-3-[4-(3-oxo-4~morfolinyl)fenyl]-l,3-oxazolidin-5--yl}methyl)2-thiofenkarboxamid:

K. suspenzi oxazolidinonu (4,45 g, 10,6 mmol) v ethylalkoholu (102 ml) se při teplotě místnosti přidá po kapkách methylamin (40% ve vodě, 10,2 ml, 0,142 mol). Reakční směs se zahřívá po dobu jedné hodiny k varu pod zpětným chladičem a ve vakuu se odpaří. Surový produkt se bez dalšího čištění použije v další reakci.

K roztoku aminu v pyridinu (90 ml) se pod argonovou atmosférou při teplotě 0 °C přikape chlorid kyseliny 5-chlorthiofen-2-karboxylové (2,29 g, 12,7 mmol). Chlazení ledem se odstraní a reakční směs se míchá po dobu jedné hodiny, načež se smísí s vodou. Po přídavku dichlormethanu a oddělení fází se vodná fáze extrahuje dichlormethanem. Organické fáze se spojí, vysuší se pomocí bezvodého síranu sodného, přefiltrují a ve vakuu se zahustí. Požadovaný produkt se čistí pomocí mžikové chromatografie (směsi dichlormethanu a methylalkoholu). Celkový výtěžek činí 3,92 g, což odpovídá 86 % teorie.

T. t.: 232 až 233 °C;

’H NMR (DMSO-d⁶, 200 MHz): 9,05 - 8,90 (t, J = 5,8 Hz, IH), 7,70 (d, J = 4,1 Hz, IH), 7,56 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,41 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,20 (d, J = 4,1 Hz, IH), 4,93 - 4,75 (m, IH), 4,27 4,12 (m,3H), 4,02-3,91 (m, 2H), 3,91 - 3,79 (dd, J = 6,1 Hz, 9,2 Hz, IH), 3,76 - 3,66 (m, 2H), 3,66-3,54 (m, 2H);

MS (ESI): m/z (%) = 436 ([M+H]\ 100, Cl-Muster);

HPLC (metoda 2): rt (%) = 3,60 (100);

[α]^2|ο = -38° (c 0,2985, DMSO); ee: 99 %. IC₅₀: 0,7nM

Claims

1. Farmaceutická kombinace, v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje

A) sloučeninu 5-chlor-A-({(55)-2-oxo-3-[4-(3-oxo^l-morfolinyl)fenyl]--l,3-oxazolidin-5yl}methyl)-2-thiofenkarboxamid vzorce

Ql jeho farmaceuticky přijatelné soli, hydráty nebo jejich směsi, a

B) Klopidogrel nebo Aspirin.

2. Kombinace podle nároku 1 pro profylaxi a/nebo ošetření onemocnění.

3. Léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu kombinaci podle nároku 1 a popřípadě další farmaceutické účinné látky.

4. Léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu kombinaci podle nároku 1, jakož i jednu nebo více farmakologicky neškodných pomocných látek a/nebo nosičů.

5. Použití kombinací podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro profylaxi a/nebo ošetření tromboembolických onemocnění.

6. Použití kombinací podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro profylaxi a/nebo ošetření srdečního infarktu, angíny pectoris, zahrnující instabilní angínu, náhlé zástavy srdce, reokluze a restenózy po angioplastii nebo aortokoronárním bypassu, mozkové mrtvice, transitorických ischemických ataků, nemoci periferního arterielního uzavření, plicní embolie nebo hlubokých žilních trombóz.