CN1989254A - 生产纤维寡糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产纤维寡糖的方法，所述方法包括在纤维素酶的存在下酶分解水不溶性天然纤维素类物质，所述水不溶性天然纤维素类物质具有小于或等于700的平均聚合度、小于或等于100μm的平均粒径并且可溶于二乙醚的物质的含量小于1质量％。本发明还提供了一种生产纤维寡糖的方法，所述方法包括在纤维素酶的存在下酶分解水不溶性天然纤维素类物质，所述水不溶性天然纤维素类物质具有小于或等于700的平均聚合度，含有大于或等于10质量％的胶态纤维素成分，并且可溶于二乙醚的物质的含量小于1质量％。

Description

生产纤维寡糖的方法
技术领域
本发明涉及一种通过酶分解纤维素类物质获得纤维寡糖的方法。本发明特别涉及将平均聚合度、平均粒径、胶态纤维素成分含量和可溶于二乙醚的物质的含量均被控制在一定范围内的水不溶性天然纤维素类物质用作基质，并使用β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性的活性比(β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)被控制在一定范围的纤维素酶进行酶分解，由此在短时间内提高纤维素的分解率，从而高收率地选择性地生产纤维寡糖的方法。
背景技术
纤维寡糖是纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖的通称，是1至6个吡喃型葡萄糖单元通过β-1，4键连接在一起的一种寡糖。
近年来，对纤维寡糖的生理学功能与其它寡糖一样正在进行阐明。因此，纤维寡糖有望成为保健食品的新型原料(非专利文献1)。
纤维寡糖通过使用酶水解其聚合物、纤维素而获得。但是，天然存在的纤维素极难溶于水并且高度结晶，因此难以通过纤维素酶进行酶分解。所以这存在问题。
在纤维素的酶分解反应中，作为分解产物获得的纤维寡糖会被纤维素酶中的β-葡糖苷酶成分进一步分解成葡萄糖单体，从而导致纤维寡糖收率降低。因此，这存在另一个问题(非专利文献2)。
鉴于上述问题，为提高酶分解纤维素时纤维寡糖的收率，到目前为止已经进行了很多尝试。
使用特定纤维素生产纤维寡糖的方法包括：
专利文献1描述了一种生产纤维寡糖的方法，其中使用含有大量非结晶性纤维素的纤维素原料，在木质素的存在下使用纤维素酶进行水解反应，同时，随时从反应溶液中至少收集由水解反应生成的纤维寡糖中的纤维二糖。
专利文献2描述了一种生产纤维寡糖的方法，在该方法中使用纤维素酶部分水解湿纸浆，以至少收集生成的纤维寡糖中的纤维二糖，其中所述湿纸浆是通过将含有天然木质纤维素的原料煮过之后不进行干燥而获得的。在这些生产方法中，纤维素酶中所包含的纤维寡糖分解酶β-葡糖苷酶被吸附在木质素中，并抑制了β-葡糖苷酶的作用，从而抑制了纤维寡糖分解成葡萄糖，从而提高了纤维寡糖的反应选择性。然而，在这些生产方法中，所得糖化液体中包含大量木质素，结果降低了纤维寡糖的收率。此外，由于为获得高纯度的纤维寡糖需要将木质素从糖化液体中除去的处理，因此复杂的提纯步骤一直都是个问题。
专利文献3描述了一种通过将含有1质量％～20质量％的木质素的木质纤维素与纤维素酶和诸如白腐菌等木质素分解菌反应的生产纤维二糖(一种纤维寡糖)的方法。该方法可以提高纤维素酶对基质的作用，而无需用于除去纤维素中的木质素的处理。然而，其分解产物不仅包含纤维二糖，还包含木质素分解产物，因此会像上述方法一样，导致纤维寡糖收率降低。此外，由于为获得高纯度的纤维二糖需要除去木质素分解产物的步骤，因此复杂的提纯步骤一直都是个问题。
专利文献4描述了一种生产纤维寡糖的方法，在该方法中，在将纤维素酶加入通过将纤维素溶解在诸如氧化胺、氯化锂/N，N-二甲基乙酰胺、铜铵和粘胶纤维等溶剂中而获得的纤维素溶液中后，从所得溶液中获得含有纤维素酶的再生纤维素，然后在缓冲剂的存在下通过再生纤维素中所包含的纤维素酶进行酶反应，以生产纤维寡糖。该方法不需要诸如对纤维素酶进行提纯等专门的预处理，并且能够提高纤维寡糖的收率。然而，由于该方法需要溶解和再生纤维素的步骤，因此复杂的步骤一直都是个问题。在纤维素溶解中所用的化学物质，如氧化胺、氯化锂/N，N-二甲基乙酰胺、铜铵和粘胶纤维，对于纤维素酶均具有较大的作用。结果，在纤维素的分解反应受到这些化学物质的影响方面存在问题。
专利文献5描述了一种生产纤维二糖的方法，该方法使用保水性为230％～280％、滤水度为550ml～640ml的漂白粥浆作为原料。此处所用粥浆是煮/漂白处理后未干燥的纸浆。虽然使用粥浆作为原料确实可以提高纤维二糖的生产量，但是由于未干燥的粥浆具有很高的保水性，所以在酶分解时其基质浓度受到限制。因此，较低的纤维寡糖生产率一直都是个问题。
专利文献6描述了一种方法，在该方法中使用超临界水或亚临界水由含有纤维素的物质将纤维素成分溶液化后，向所得处理液中补充纤维素酶制剂，用纤维素酶制剂将纤维素和具有高聚合度的纤维寡糖(纤维素部分分解产物)水解，从而获得葡萄糖和/或纤维寡糖。该方法能够同时改善纤维寡糖，如纤维二糖和纤维三糖的生产量和收率。然而，该方法在关于纤维素预处理的安全性方面存在问题，例如在超临界或亚临界水处理所需的耐压、耐酸设备的设备安全性和加压和加热的安全性方面存在问题。
专利文献7描述了一种生产纤维寡糖的方法，该方法使用下述纸浆作为纤维素酶的反应基质，所述纸浆具有通过X射线衍射测定的10％～80％的纤维素I结晶度、200％～1000％的保水性，其中将所述纸浆进行了选自原纤维化处理、机械化学处理和化学处理中的任意一种或多种处理。该方法能够提高纤维二糖的生产量和纤维素分解率。然而，由于使用具有高保水性的纤维浆作为纤维素，该方法存在在诸如预处理(例如原纤维化处理、机械化学处理和化学处理)和随后的酶分解以及寡糖提纯等每一生产步骤中，发生阻塞或基质浓度受到限制等纤维寡糖生产率较低的问题。该方法与本发明的方法具有本质上的区别：在本发明的方法中，平均聚合度、平均粒径、胶态成分含量等被控制在较高水平，并且在包括酶分解在内的每一步骤中的处理性质均得到了提高。
通过使用特定纤维素酶来酶分解纤维素，从而提高纤维寡糖收率的方法包括以下专利文献8至11：
专利文献8描述了一种在纤维素酶的作用下，在水性反应溶液中由纤维素类物质生产纤维寡糖的方法，所述纤维素酶由属于纤维弧菌属的微生物生产，在该方法中组合使用了超滤反应器，以便消除生成物阻害，从而生产并积累纤维寡糖。根据该方法，仅由纤维二糖和纤维三糖构成的纤维寡糖可以作为酶分解纤维素类物质的分解产物而获得。然而，由于通过纤维弧菌属微生物生产的酶不容易对结晶性纤维素起作用，因此需要非结晶性纤维素作为基质来缩短反应时间和提高收率。这样，复杂的步骤一直成为问题。
专利文献9描述了一种通过使用纤维素酶分解纤维素来生产纤维寡糖的方法，其中纤维素酶预先与pH被平衡为3.5～5.0的弱酸性阳离子交换树脂接触，从而选择性地除去纤维素酶中的β-葡糖苷酶，然后使已除去β-葡糖苷酶的纤维素酶与纤维素接触。按照该方法，通过酶分解纤维素减少葡萄糖，因此能够获得具有大于或等于60％的纤维寡糖的分解产物。然而，上述方法需要除去纤维素酶中的β-葡糖苷酶的步骤。这样就存在生产纤维寡糖的步骤很复杂的问题。此外，因为该提纯纤维素酶的步骤需要的阳离子交换树脂的量要比未反应的纤维素酶的量大75倍～1000倍，所以被处理的纤维素酶的量受到限制，并且纤维寡糖的生产率不足。因此，存在纤维素酶提纯成本和阳离子交换树脂的分离/提纯剂成本很高的问题。
专利文献10描述了一种纤维素酶提纯方法，其中在将纤维素酶与纤维素酯和/或纤维素醚酯一起溶解并温育固定的一段时间后，改变pH并将不溶的固体部分从溶液中分离出去，从而选择性地除去纤维素酶中的β-葡糖苷酶；专利文献10还描述了一种纤维二糖的生产方法，其中将纤维素与已除去β-葡糖苷酶的纤维素酶一起加入水性介质中，以制造一种悬浮液，进而将该悬浮液温育固定的一段时间，以在该悬浮液中生产纤维二糖，然后收集所述纤维二糖。
专利文献11描述了一种纤维素酶提纯方法，其中在将壳聚糖和纤维素酶溶解到pH被调节为能使壳聚糖溶解的pH的水性介质中并温育固定的一段时间后，改变pH并将不溶的固体部分从溶液中分离出去，从而选择性地除去纤维素酶中的β-葡糖苷酶；专利文献11还描述了一种纤维二糖的生产方法，其中将纤维素与已除去β-葡糖苷酶的纤维素酶一起加入水性介质中，以制造一种悬浮液，进而将该悬浮液温育固定的一段时间，以在该悬浮液中生产纤维二糖，然后收集所述纤维二糖。这些方法通过使用纤维素衍生物或壳聚糖对纤维素酶进行吸附/分离处理，并使纤维素与仍吸附在纤维素衍生物或壳聚糖中的纤维素酶接触，提高了纤维二糖的收率。然而，这些方法需要提纯纤维素酶的处理，因此生产步骤复杂。由于纤维素酶提纯中使用的纤维素衍生物和壳聚糖很昂贵，因此存在需要很高成本的问题。此外，由于在酶分解纤维素中纤维素酶与纤维素衍生物和壳聚糖一起使用，因此还存在这样的问题，即需要将它们从分解反应溶液中除去的步骤。
迄今为止，尚未有下述方法问世：将平均聚合度、平均粒径、胶态纤维素成分含量和可溶于二乙醚的物质的含量通过预处理被控制在一定范围内的水不溶性天然纤维素类物质用作基质，并使用β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性的活性比(β-纤维素酶活性/结晶性纤维素分解活性)被控制在一定范围的纤维素酶进行酶分解，因此在短时间内提高纤维素的分解率，从而高收率地选择性地生产纤维寡糖。
[非专利文献1]Cellulose Communications，5，No 2，91-97(1998)
[非专利文献2]《Cellulase》Kodansha Scientific出版，97-104(1987)
[专利文献1]特开平5-317073号公报
[专利文献2]特开平7-184678号公报
[专利文献3]特开平8-89274号公报
[专利文献4]特开平8-308589号公报
[专利文献5]特开平9-107087号公报
[专利文献6]特开2001-95594号公报
[专利文献7]特开2005-68140号公报
[专利文献8]特开平01-256394号公报
[专利文献9]特开平05-115293号公报
[专利文献10]特开平05-227957号公报
[专利文献11]特开平05-227958号公报
发明内容
本发明的一个目标是通过在特定纤维素酶的存在下，酶分解用作原料的水不溶性天然纤维类物质来高收率地选择性地生产纤维寡糖，从而在短时间内提高纤维素的分解率。
本发明人通过以下发现完成了本发明：为解决上述问题，将平均聚合度、平均粒径、胶态纤维素成分含量和可溶于二乙醚的物质的含量均被控制在一定范围内的水不溶性天然纤维素类物质用作原料，并使用具有特定活性的纤维素酶对其进行酶分解，从而在短时间内提高纤维素的分解率，从而以高收率选择性地得到纤维寡糖。
因此，本发明为如下：
(1)一种生产纤维寡糖的方法，所述方法包括在纤维素酶的存在下酶分解水不溶性天然纤维素类物质，所述水不溶性天然纤维素类物质具有小于或等于700的平均聚合度、小于或等于100μm的平均粒径并且可溶于二乙醚的物质的含量小于1质量％；
(2)一种生产纤维寡糖的方法，所述方法包括在纤维素酶的存在下酶分解水不溶性天然纤维素类物质，所述水不溶性天然纤维素类物质具有小于或等于700的平均聚合度，含有大于或等于10质量％的胶态纤维素成分，并且可溶于二乙醚的物质的含量小于1质量％；
(3)如(1)或(2)所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质的平均粒径小于或等于100μm，并包含大于或等于10质量％的胶态纤维素成分；
(4)如(1)至(3)任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质的平均聚合度小于或等于500，并且平均粒径小于或等于50μm；
(5)如(1)至(4)任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质的平均聚合度小于或等于400，并且平均粒径小于或等于30μm；
(6)如(1)至(5)任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质包含大于或等于15重量％的胶态纤维素成分；
(7)如(1)至(6)任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述纤维素酶的活性比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.7；
(8)如(7)所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述纤维素酶的活性比小于或等于0.5；
(9)如(8)所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述纤维素酶的活性比小于或等于0.35；
(10)如(1)至(9)任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述可溶于二乙醚的物质为木质素；
(11)如(1)至(10)任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质包含纤维素I型晶体；
(12)如(1)至11任一项所述的纤维素酶的生产方法，其中，在通过培养生产纤维素酶的微生物而获得的培养液中，β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性的活性比(温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.5；
(13)如(12)所述的纤维素酶的生产方法，其中β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性的活性比小于或等于0.35；
(14)如(12)或(13)任一项所述的纤维素酶的生产方法，其中所述生产纤维素酶的微生物是作为生产β-葡糖苷酶少的菌株而选择得到的菌株；
(15)如(12)至(14)任一项所述的纤维素酶的生产方法，其中在培养所述生产纤维素酶的微生物时，将培养期间的pH控制为小于3.5；
(16)如(12)至(15)任一项所述的纤维素酶的生产方法，其中所述生产纤维素酶的微生物是属于木霉菌属的菌株；
(17)一种纤维寡糖，其特征在于，所述纤维寡糖可溶于二乙醚的物质的含量小于或等于2000ppm；
(18)通过如(1)至(11)任一项所述的方法获得的纤维寡糖，其特征在于可溶于二乙醚的物质的含量小于或等于2000ppm；
(19)如(18)所述的纤维寡糖，其中所述可溶于二乙醚的物质的含量小于或等于1000ppm；
(20)一种食品、化妆品或药用制剂，其特征在于包含通过如(1)至(11)任一项所述的方法获得的纤维寡糖；和
(21)一种食品、化妆品或药用制剂，其特征在于包含如(17)或(18)所述的纤维寡糖。
根据本发明的通过酶分解水不溶性天然纤维素类物质来生产纤维寡糖的方法，可以在短时间内提高纤维的分解率，并且以高收率选择性地生产纤维寡糖。
附图说明
图1是显示在实施例13和14以及比较例6中的培养期间内pH随时间变化的图；
图2是显示在实施例15中的培养期间内pH随时间变化的图；和
图3是显示在实施例16和比较例7中结晶性纤维素分解产物的浓度变化的图。在该图中，反应溶液中分解产物累积量(％)由反应溶液中葡萄糖和纤维寡糖的总浓度表示，而纤维二糖纯度由纤维寡糖与反应溶液中累积的分解产物的量之比(百分比)表示。通过使用突变株和减小培养溶液中的pH，可以提高相对于分解产物累积量的纤维二糖的纯度。
具体实施方式
下面将详细描述本发明，特别是其优选方面。
本发明中使用的天然纤维素类物质是含有纤维素的天然存在的水不溶性纤维物质。天然纤维素类物质可以来自于植物或动物。可以生产天然纤维素类物质的动物和植物的实例包括树木、竹子、麦秆、稻草、棉花、苎麻、甘蔗渣、洋麻、甜菜、海鞘和细菌纤维素。可以单独使用这些天然纤维素类物质中的一种作为原料，也可以混合使用它们中的两种或两种以上作为原料。
本发明中使用的纤维素类物质需要是天然纤维素类物质。天然纤维素和再生纤维素可以通过其晶形而区分。本发明的天然纤维素类物质需要包含纤维素I晶体，并且其含量需大于或等于1％。纤维素I晶体含量更优选大于或等于50％。此处所用的纤维素I晶形可以通过使用广角粉末X射线衍射仪(理学电机(株)制造，商品名：Rotaflex RU300)获得的X射线衍射图案来辨别。其含量由纤维素I晶体的峰面积占通过X射线衍射获得的衍射图像的总峰面积的百分比来表示。可以使用本领域中已知的方法，将要进行广角粉末X射线衍射测量的干燥状态的纤维素类物质粉末化，然后用于测量，而湿润状态的纤维素类物质，可以使用本领域中已知的方法将其干燥，然后粉末化，并用于测量。优选较高的纤维素I晶体含量，因为这样接近于天然纤维素的纤维素类物质会用在酶分解中，从而使人工化学处理步骤，如纤维素再生处理得到简化。纤维素I晶体的最高含量不受特别限制，然而，考虑到目前已知的天然纤维素组成，其最高含量小于99％。
本发明中使用的天然纤维素类物质是水不溶性的。此处所用的“水不溶性”是指天然纤维素类物质中含有大于或等于90质量％的水不溶性成分。该水不溶性成分通过下述方法获得：在25℃下将纤维素类物质分散在纯水中，并通过超滤(截流分子量：10000)除去水溶性成分，然后定量分析水不溶性残余物。
本发明中的水不溶性天然纤维素类物质具有小于或等于700的平均聚合度。此处所用的平均聚合度可以通过使用如“the JapanesePharmacopoeia(日本药典)，第14版”(广川书店出版)中的结晶性纤维素确认试验(3)所规定的铜乙二胺溶液的还原比粘度法测量。由于平均聚合度小于或等于700的纤维素类物质更容易进行诸如搅拌、粉碎和研磨等物理处理，因此可以容易地控制其胶态成分的量。当水不溶性天然纤维素类物质的平均聚合度被控制在上述范围内时，可以为纤维素类物质中的纤维赋予多孔性。因此，酶-基质接触的可能性增大，当酶分解纤维素类物质时纤维素的分解速率会提高。平均聚合度优选小于或等于500，更优选小于或等于400。较小的平均聚合度可以更容易地控制胶态成分的量和分解速率。因此，最小平均聚合度不受特别限制，然而，考虑到通过简便步骤所获得的平均聚合度的范围，优选最小平均聚合度大于10。
本发明中使用的水不溶性天然纤维素类物质具有小于或等于100μm的平均粒径。此处所用的平均粒径是指通过下述方法获得的体积频度粒径分布中的50％累积粒径：将纤维素类物质制成浓度为0.2质量％的水性乳液，使用高剪切均化器(日本精机(株)制造，商品名：Excel AutoHomogenizer ED-7，处理条件：以5000rpm的速度处理3分钟)将其分散，将分散液的pH调整为7.5～8.5以后，进行离心分离(久保田商事(株)制造，商品名：6930 Centrifuge，处理条件：以2000G的离心力处理5分钟)，然后分离出分散液的上清液成分和沉淀成分，并测量各成分的重量比。各成分的体积频度粒径分布是使用水作为介质，通过激光衍射仪(堀场制作所(株)制造，商品名LA-910，超声波处理1分钟)获得的，并且乘以上清液成分和沉淀成分的重量比以获得体积频度粒径分布中的50％累积粒径。优选平均粒径小于或等于100μm，因为这样在酶分解纤维素时，纤维素与纤维素酶的接触面积(可及度，accessibility)会增大，使得可以改善纤维寡糖的生产速率和收率。平均粒径更优选小于或等于50μm，特别优选小于或等于30μm，进一步更优选小于或等于10μm。较小的平均粒径可以更好地改善纤维寡糖的生产速率、生产选择性和收率。因此，最小平均粒径不受特别限制，然而，考虑到通过简便步骤所获得的平均粒径的范围，优选最小平均粒径大于或等于0.01μm。
本发明中使用的水不溶性天然纤维素类物质需要包含大于或等于10质量％的胶态纤维素成分。此处所用的胶态纤维素成分由离心分离后留在上清液中的纤维素固体含量的百分比表示，所述上清液如下获得：通过使用高剪切均化器(日本精机(株)制造，商品名：Excel AutoHomogenizer ED-7，处理条件：以5000rpm的速度处理3分钟)分散天然纤维素类物质浓度为0.2质量％的水悬浮液，并将pH调整为7.5～8.5，然后离心分离(久保田商事(株)制造，商品名：Centrifuge Model 6930，处理条件：以2000G的离心力处理5分钟)。胶态纤维素成分含量大于或等于10质量％使得可以改善纤维寡糖的生产速率、生产选择性和收率。胶态纤维素成分含量更优选大于或等于15质量％，特别优选大于或等于40质量％。该胶态纤维素成分的量是影响与纤维素类物质的平均粒径无关的酶分解性的一个因素。尽管胶态纤维素成分的量对于改善纤维寡糖的生产速率、选择性和收率的机理尚不清楚，但可能的机理在于，胶态纤维素成分量的增加允许稳定的纤维素悬浮液作为基质，并且允许酶与基质均匀接触，从而改善上述酶分解性。较高的胶态纤维素成分含量可以更好地改善酶分解性。因此，胶态纤维素成分的最高含量不受特别限制，然而，考虑到通过简便预处理所达到的范围，最高含量小于或等于99.9质量％。
本发明中使用的水不溶性天然纤维素类物质具有小于1质量％的可溶于二乙醚的物质。此处所用的可溶于二乙醚的物质是指纤维素类物质中可溶于二乙醚的杂质，例如木质素和木质素分解产物，并且所述可溶于二乙醚的物质的含量可以通过如“the Japanese Pharmacopoeia(日本药典)，第14版”(广川书店出版)中的结晶性纤维素纯度试验(2)中所规定的可溶于二乙醚的物质的定量分析方法测量。使用木质素含量小于1质量％的高纯度纤维素可以更好地改善通过酶分解获得的纤维寡糖的纯度。纤维寡糖纯度的提高导致生产收率的提高，从而有助于酶分解后纤维寡糖的提纯和纤维素酶的收集。可溶于二乙醚的物质的含量更优选小于或等于0.5质量％，进一步更优选小于或等于0.3质量％。较低的可溶于二乙醚的物质的含量可以更好地改善上述纤维寡糖的纯度。因此，可溶于二乙醚的物质的最低含量不受特别限制，然而，考虑到通过简便预处理所实现的木质素的含量范围，最低含量大于或等于0.0005质量％。
能够使天然纤维素类物质的平均聚合度、平均粒径、胶态纤维素成分含量和可溶于二乙醚的物质的含量满足本发明范围的优选处理方法包括以下方法：
对于控制平均聚合度和可溶于二乙醚的物质的含量的方法不加特别限制，只要是本领域中已知的方法即可。其一个实例包括水解处理。优选该水解处理是因为这样可以除去纤维素纤维内的非结晶性纤维素和半纤维素以及杂质(例如木质素)，从而为纤维内部赋予多孔性，因此酶分解时纤维素酶更易于渗透到纤维内部，从而改善纤维素的分解速率和纤维寡糖的收率。
此外，优选水解还因为当使用本领域内已知的方法进一步处理水解的纤维素类物质时，纤维素类物质因具有多孔的纤维内部而更易于进行机械处理，并且可以更容易地控制纤维素类物质的平均粒径和胶态成分含量。
水解的方法不受特别限制，然而可以例举出加酸水解、碱氧化分解、热水分解、蒸汽喷发和微波分解。可以单独使用这些方法中的任意一种方法，也可以组合使用它们中的两种或两种以上的方法。当进行上述方法中的加酸水解时，通过向保持分散在水性介质中的纤维素类物质中加入适量质子酸、羧酸、路易斯酸、杂多酸等，并在搅拌下加热所得混合物，可以容易地控制平均聚合度。在此情况下，诸如温度、压力和时间等反应条件根据纤维素的种类和浓度，以及酸的种类和浓度而有所不同，但是，应该适当调整这些反应条件，以达到理想的平均聚合度。例如，对于上述加酸水解，优选的反应条件是在大于或等于100℃并加压的条件下使用小于或等于1质量％的矿物酸溶液处理纤维素10分钟以上。这是因为诸如酸等催化成分会渗透到纤维素纤维的内部，从而促进水解，因此可以减少催化成分的用量。
控制平均粒径和胶态纤维素成分含量的方法不受特别限制，只要该方法为本领域中已知的方法即可。其实例包括研磨、粉碎、筛分、气旋分离和使用离心分离机的离心分离。这些方法可以单独使用，也可以组合使用它们中的两种或两种以上的方法。这些方法都可以作为湿法和干法来进行。通过湿法单独获得的纤维素类物质可以在酶分解前混合在一起，而通过干法单独获得的纤维素类物质也可以在酶分解前混合在一起。另外，也可以将通过湿法获得的纤维素类物质与通过干法获得纤维素类物质混合在一起。
例如，当通过湿法处理纤维素时，通过对含有1％～99％的纤维素类物质和介质的纤维素分散液进行研磨、粉碎等本领域内已知的处理，可以容易地调整纤维素类物质的平均粒径或胶态纤维素成分含量。在该情况下，所使用的介质不受特别限制，可以包括水、诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、2-甲基丁醇和苯甲醇等醇类、诸如戊烷、己烷、庚烷和环己烷等烃类，以及诸如丙酮和乙基甲基酮等酮类。特别是，优选的有机溶剂为在药品、食品和其添加剂的生产步骤中所用的任意溶剂，并且包括在《医药品添加物事典》(Dictionary of Pharmaceutical Additives)(药事日报社出版)、《日本药典》和《食品添加物公定书》(Official Methodfor Food Additives)(广川书店出版)中分类为溶剂的那些溶剂。可以单独使用水和有机溶剂，也可以组合使用它们中的两种或两种以上溶剂。可选地是，在将一种介质用在分散液中然后将其除去后，可以将纤维素类物质再次分散到不同介质中。
研磨方法包括：使用诸如单向旋转式搅拌桨叶、多轴旋转式搅拌桨叶、往复反转式搅拌桨叶、上下运动式搅拌桨叶、旋转并上下运动式搅拌桨叶和管路式搅拌桨叶等搅拌桨叶的研磨方法，例如便携式混合器、固体混合器和侧面混合器；喷射式搅拌研磨方法，如管线混合器；使用高剪切均化器、高压均化器、超声波均化器等的方法；使用捏合机的旋转挤出式研磨方法；以及压密与剪切相结合的研磨方法，例如辊磨机、球磨机、振动球磨机和珠磨机，上述任何方法都可以单独使用或组合使用。
粉碎方法包括筛网式粉碎方法，例如筛磨机和锤磨机；桨叶旋转剪切筛网式粉碎法，例如速磨机(flash mill)；喷气式粉碎法，例如喷射磨；压密与剪切相结合的粉碎法，例如辊磨机、球磨机、振动球磨机和珠磨机；以及搅拌桨叶式粉碎法，上述任何方法都可以单独使用或组合使用。
本发明的纤维素酶是纤维素分解酶的通称。具有分解纤维素活性的任何纤维素酶均包含在根据本发明的纤维素酶中。纤维素酶的酶源的实例包括生产纤维素酶的活微生物本身或其培养上清液、从生产纤维素酶的活微生物生产的酶中提纯的酶，或者由提纯的酶与诸如赋形剂、稳定剂等添加剂一起制备的制剂。当将纤维素酶制剂用在酶分解中时，向该制剂中加入的添加剂不受特别限制。其剂型可以是粉末、颗粒、液体等任意形式。
纤维素酶的来源不受特别限制，可以包括由本领域中已知的生产纤维素酶的微生物生产的纤维素酶，所述生产纤维素酶的微生物包括如《Cellulase(纤维素酶)》(Kodansha Scientific出版(1987))和《Dictionaryof Cellulose(纤维素辞典)》(朝仓书店出版(2000))中所述的木霉素属、枝顶孢属、曲霉属、杆菌属、假单胞菌属、青霉菌属、气单孢菌属、耙齿菌属(Irpex)、侧孢霉属和腐殖菌属微生物。然而，本发明的纤维素酶不仅限于本领域中已知的来源于上述微生物的酶，它还包括能够分解纤维素的任意酶，其中包括来源于新发现的微生物的酶。
优选地是，本发明中使用的纤维素酶的β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性之比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.7。此处所用的活性比通过纤维寡糖的分解能力(β-葡糖苷酶活性)与纤维素酶分解纤维素的能力(结晶性纤维素分解活性)之比来获得。优选较小的活性比，因为这样可以获得较高的分解纤维素的能力和较低的分解寡糖的能力，从而提高寡糖的生产率。活性比更优选小于或等于0.5，进一步优选小于或等于0.4，特别优选小于或等于0.35，最优选小于或等于0.30。由于较小的活性比可以更好地改善纤维寡糖的收率，因此最小活性比不受特别限制，但是，考虑到容易实现的活性比的范围，最小活性比大于或等于0.01。
此处所用的β-葡糖苷酶活性是指在将纤维二糖(一种纤维寡糖)用作基质从而使纤维素酶可以在水性介质中对其发挥作用时，由纤维二糖生产葡萄糖的酶活性。该活性通过在1mL反应溶液中1分钟内产生的葡萄糖的摩尔数(μmol/mL*min)来测量，并由单位：U(单位)/mL表示。该β-葡糖苷酶活性可以通过以下方法测量：将2质量％的纤维二糖(Aldrich制造，特级)和纤维素酶溶解在pH为4.5的50mM的乙酸/乙酸钠缓冲液中，在密封条件下将其在55℃的水浴中反应1小时后，定量测量反应溶液中葡萄糖的浓度。
此处所用的结晶性纤维素分解活性是指在将结晶性纤维素用作基质，从而使纤维素酶可以在水性介质中对其发挥作用时，生产诸如纤维二糖和纤维三糖等纤维寡糖以及葡萄糖的酶活性。该活性通过在1mL反应溶液中1分钟内产生的纤维寡糖和葡萄糖的总摩尔数(μmol/mL*min)来测量，并由单位：U(单位)/mL表示。该结晶性纤维素分解活性可以通过上述β-葡糖苷酶活性测量方法来测量，即，使用5质量％的结晶性纤维素(通过使用转速为126rpm的万能搅拌混合机(商品名，三英制作所制造)的钩状桨叶(hook blade)捏合并搅拌含水量被调整为60％的Ceolus PH-101(商品名，旭化成化学株式会社制造)90分钟而获得)代替纤维二糖，并使用与上述相同的方法进行酶分解，以定量测量反应溶液中分解和生成的诸如纤维寡糖和葡萄糖等糖的总量。
在上述各种活性测量方法中，反应溶液中的纤维寡糖和葡萄糖可以通过高效液相色谱(柱：Asahipak NH2P-50(商品名，岛津制作所制造)，高效液相色谱：SCL-10A型(商品名，岛津制作所制造)，移动床：乙腈/水＝75/25(体积比)，循环量：1mL/min，样品溶液：10μL)进行定量测定。
获得具有满足本发明范围的β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性的活性比(β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)的纤维素酶的方法包括以下方法：
优选将能够生产活性比(温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.5的纤维素酶的菌株用作生产纤维素酶的细菌。可以使用任何菌株，只要其活性比满足上述范围即可。任何通过菌株的人工诱变方法(例如紫外线照射、X射线照射、使用突变诱导剂处理)获得的突变株、天然存在的突变株或者通过基因操作或细胞融合获得的突变株均可以用在本发明中，只要这些突变株能够生产具有小于或等于0.5的活性比(温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)的纤维素酶即可。该比例(温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)优选小于或等于0.35，更优选小于或等于0.2。由于较小的活性比可以更好地改善纤维寡糖的收率，因此最小活性比不受特别限制，但是，考虑到容易实现的活性比的范围，最小活性比大于或等于0.01。
温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性比通过以下方法测量。
(1)结晶性纤维素分解活性
向悬浮在50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5)中的0.4ml的5质量％结晶性纤维素(通过使用转速为126rpm的万能搅拌混合机(商品名，三英制作所制造)的钩状桨叶捏合并搅拌含水量被调整为60％的CeolusPH-101(商品名，旭化成化学株式会社制造)90分钟而获得)的基质溶液中加入0.1ml适当稀释的酶溶液后，使该混合物在40℃的水浴中反应4小时，接下来，将其在95℃加热10分钟，结束反应，然后通过HPLC法(高效液相色谱法)定量测量反应溶液中的葡萄糖浓度。将在1分钟内释放葡萄糖和纤维寡糖的总量为1μmol的酶的量定义为1酶单位(1U)。
(2)β-葡糖苷酶活性
向溶解在50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5)中的0.4ml的2.5质量％纤维二糖(Aldrich制造，特级)的基质溶液中加入0.1ml酶溶液后，使该混合物在40℃的水浴中反应4小时，接下来，将其在100℃加热10分钟，结束反应，然后通过HPLC法定量测量反应溶液中的葡萄糖浓度。将在1分钟内释放1μmol葡萄糖的酶的量定义为1酶单位(1U)。
在上述各种活性测量方法中，反应溶液中的纤维寡糖和葡萄糖可以通过上述高效液相色谱来定量测量。
此处，所用的典型菌株的实例包括里氏木霉(Trichoderma reesei)NBRC31329菌株。
另外，活性比(温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)较小的菌株可以通过例如下述方法获得。如果需要，可以对能够生产纤维素酶的微生物进行本领域中已知的诱变处理，例如紫外线照射或者使用突变诱导剂(例如亚硝基胍)，然后从其菌株中选择活性比(β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)较小的菌株。例如，可以将里氏木霉NBRC31329用作诱变处理中使用的微生物(母株)，在28℃下将其在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上培养3至10天。生成的孢子以105个孢子/mL～108个孢子/mL悬浮在盐水中，使用EMS(甲磺酸乙酯)(100μg/ml～500μg/ml，pH7.0，28℃，5～24小时)进行诱变处理。活性比(温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)较小的菌株的选择可以通过下述方法实现：通过离心分离从经诱变处理的孢子的悬浮液中收集孢子，洗涤孢子，再使用葡萄糖作为碳源培养这些孢子，然后使用本领域中已知的方法测量所得培养物的酶活性。通过使用得自各经诱变处理的菌株的培养物并酶分解用作基质的纤维二糖或结晶性纤维素以定量测量生成的还原糖可以定量地选择感兴趣的菌株，或者另外也可以通过使用本领域中已知的与培养物发生酶反应的比色基质来定性地选择感兴趣的菌株。
纤维素酶可以由通过培养生产纤维素酶的细菌菌株获得的培养上清液获得。培养基中使用的碳源的实例有纤维素粉末、纤维二糖、滤纸、普通纸、锯末、麸皮、谷壳、甘蔗渣、豆饼、咖啡渣、淀粉和乳糖。诸如硝酸铵和硫酸铵等无机铵盐以及诸如尿素、氨基酸、肉汁、酵母膏、多聚蛋白胨和蛋白质分解产物等含氮有机物可以用作氮源。KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、Fe2Cl3·6H2O、MnCl3·4H2O、ZnSO4·7H2O、等可以用作无机盐。可以选择性地使用含有有机微量养料的培养基。对于培养物，可以使用常用通气搅拌培养装置，且可以使用上述培养基，并将温度和pH控制到能使生产菌株生长的温度和pH附近。然后，使用本领域中已知的方法，例如离心分离和过滤，从所得培养溶液中除去菌株体，以获得上清液。该上清液可以直接用作粗酶溶液。
可以进一步降低活性比(温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)的培养方法的实例包括将培养期间的培养溶液的pH控制在小于3.5并大于或等于能使生产纤维素酶的细菌生长的pH值的方法。具体是，在25℃～35℃下，将上述里氏木霉NBRC31329菌株或其突变株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面上培养3至10天。将所得培养物在下述培养基中在28℃接种并预培养2至4天，其中将100mL包含纤维素作为悬浮并溶解的碳源的培养基分散到500mL的锥形瓶中并高压消毒。将预培养溶液接种到将3L具有与上述培养基相同组成的培养基放到5L的广口发酵罐(jar fermentor)中并高压消毒的培养基中，在温度为28℃、搅拌速率为200rpm～400rpm、通气速率为0.3vvm～1vvm的条件下培养。使用NaOH或氨水将培养期间的pH控制为2～3.5，优选为2.5～3.0。经过4至7天的培养后，使用本领域中已知的方法，例如离心分离和过滤，从培养溶液中除去菌株体，以获得上清液。该上清液可以直接用作粗酶溶液。
这样获得的粗酶溶液可以通过常用蛋白质提纯方法，例如硫酸铵分离、利用溶剂的沉淀分离或柱色谱进行进一步提纯。
可选地是，当纤维素酶是来自可商业获得的酶时，该酶可以通过常用蛋白质提纯方法，例如硫酸铵分离、利用溶剂的沉淀分离或柱色谱来提纯，以获得活性比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.7的部分。
下面将描述本发明的生产纤维寡糖的方法。
本发明的生产纤维寡糖的方法是在纤维素酶的存在下酶分解本发明的天然纤维素类物质的方法。优选该方法中使用的纤维素酶的β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性之比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.7。本发明中获得的主要由纤维寡糖构成的水溶液通过本领域中已知的方法提纯和/或干燥。
本领域中任何已知的方法都可以被用作酶分解的方法，而不受特别限制。该方法的实例包括下述方法：将作为基质的本发明的纤维素类物质悬浮在水性介质中，然后加入本发明的纤维素酶，并在搅拌或振动下加热以进行糖化反应。
在上述方法中，需要适当调整诸如悬浮和搅拌方法、加入纤维素酶/基质的方法和顺序以其浓度等反应条件，以便高收率地生产纤维寡糖。在该情况下，反应溶液的pH和温度可以落在不会使酶失活的范围内，当反应在常压下进行时，它们通常会落在5℃～95℃的温度范围内和1～11的pH范围内。此时，如上所述，压力、温度和pH都得到了适当的调整，从而能够以较高收率生产纤维寡糖。然而，当使用通过将上述里氏木霉NBRC31329菌株或其突变株作为生产纤维素酶的细菌获得的纤维素酶时，优选将纤维素在常压、温度为50℃～60℃、pH为3.0～5.5的条件在乙酸盐或磷酸盐缓冲液中酶分解。
该酶反应可以在分批系统和连续系统中进行。为避免在酶分解反应中纤维二糖成为生产障碍，反应系统中的纤维二糖浓度应保持在一定范围内，这对于改善纤维寡糖的生产率是很重要的。将反应系统中纤维二糖的浓度保持在一定范围内的方法可以是下述方法：通过诸如超滤或反向渗透过滤等薄膜过滤从反应系统中提出生成的纤维二糖的方法；将诸如干燥的植物粉末(例如活性炭、竹子和木头)等多孔的有机基材、诸如二氧化硅等多孔的无机基材引入反应系统中并使纤维二糖吸附于其上的方法；将纤维素基质固定在柱等之中的方法，在所述柱中使含有纤维素酶的反应溶液循环；或者将纤维素酶固定在聚合物等之中的方法，在所述聚合物中使含有纤维素的反应溶液循环。
可以选择性地对通过上述酶分解获得的主要由纤维寡糖构成的水溶液进行诸如脱色、脱盐和除酶等提纯处理。提纯方法不受特别限制，只要是本领域中已知的方法即可。但是，例如可以使用活性炭处理、离子交换树脂处理、色谱处理、诸如微滤、超滤和反向渗透过滤等过滤处理、以及结晶处理。这些方法可以单独使用，也可以两种或两种以上组合使用。
经上述方法提纯的主要由纤维寡糖构成的水溶液可以不进行其它处理而使用，但是，如果需要，也可以通过干燥而固化。干燥方法不受特别限制，只要是本领域中已知的方法即可。但是，例如，可以使用喷雾干燥、冷冻干燥、滚筒干燥、薄膜干燥、板式干燥(plate drying)、闪速干燥和真空干燥。这些方法可以单独使用，也可以两种或两种以上组合使用。
在上述提纯和干燥处理中，例如，除水以外还可以选择性地使用有机溶剂作为纤维寡糖的介质。对于该处理中所使用的有机溶剂不作特别限制。优选的有机溶剂为在例如药品、食品和其添加剂的生产步骤中所用的任意溶剂，并且包括在《医药品添加物事典》(Dictionary ofPharmaceutical Additives)(药事日报社出版)、《日本药典》和《食品添加物公定书》(Official Method for Food Additives)(广川书店出版)中分类为溶剂的那些溶剂。可以单独使用水和有机溶剂，也可以组合使用它们中的两种或两种以上溶剂。可选地是，在将一种介质用在分散液中然后将其除去后，可以将纤维寡糖再次分散到不同介质中。
进行了上述步骤后的纤维寡糖在常温下的使用形态包括但不特别限于固体、悬浮液、乳液、糖浆或溶液。固体纤维寡糖的实例包括粉末、颗粒、丸状、成型物、层压体和固态分散体。
下面将介绍通过本发明的方法获得的纤维寡糖。
本发明的纤维寡糖中的可溶于二乙醚的物质的含量优选小于或等于2000ppm，更优选小于或等于1000ppm。此处所用的可溶于二乙醚的物质的含量是指诸如纤维素类物质中的木质素或木质素分解产物等可溶于二乙醚的杂质的含量，并且可以通过如“Japanese Pharmacopoeia(日本药典)，第14版”(广川书店出版)中的结晶性纤维素纯度试验(2)中所规定的可溶于二乙醚的物质的定量分析方法测量。优选纤维寡糖中具有小于或等于2000ppm的可溶于二乙醚的物质的含量，原因在于其包含较少的杂质，从而呈现较高的白色，在将其应用于食品、化妆品和药用制剂时可以容易地进行提纯。特别是，当将纤维寡糖与诸如药剂等活性成分结合使用时是优选的，因为它可以抑制活性成分的分解。当将纤维寡糖用作用于化学转化的原料时是优选的，因为由于它包含的杂质较少，因此不容易引发副反应，并能提高化学转化收率。可溶于二乙醚的物质的含量更优选小于或等于1000ppm，进而优选小于或等于500ppm，更进而优选小于或等于300ppm，最优选小于或等于100ppm。可溶于二乙醚的物质的含量越低，上述效果就会变得越好。因此，虽然其下限不受特别限制，但是通过简便方法能够实现的木质素含量的范围大于或等于0.1ppm。
通过本发明获得的纤维寡糖的应用不受特别限制，例如可以用作食品、化妆品、药物和一般工业制品等领域中的食品成分、化妆品成分、颜料成分、香料成分、药物活性成分、农药成分、饲料成分、化肥成分、培养基成分和分析试剂成分、以及添加剂、中间原料和发酵原料。
通过本发明获得的纤维寡糖在食品中的应用包括：凝胶，如果冻、布丁和酸乳酪；调料，如蛋黄酱、调味品、沙司、肉汁、汤和经加工的蔬菜；杀菌罐头和冷藏食品，如咖喱、碎肉、肉羹、炖品和汤；经加工的畜牧制品，如汉堡包、熏肉、香肠、意大利香肠和火腿；鱼酱制品，如清煮鱼酱、管状鱼酱饼、鱼火腿/香肠和炸鱼酱；经加工的麦类制品，如面包、湿面条、干面条、通心粉、意大利面条、中国馒头皮、蛋糕粉、预混合料、白汁沙司、饺子皮和春卷皮；罐装或瓶装食品，例如咖喱、沙司、汤、用酱油煮的食品和果酱；糖果点心，如糖果、糖锭、糖片、巧克力、饼干、甜饼、米饼、日本/西方糖果点心、未烤制的蛋糕、小吃、蜜饯和布丁；熟食和经处理的食品，如油炸食品、油炸丸子、饺子和中国馒头；以及糊状食品，如蔬菜酱、肉馅、果酱、鱼酱和其它海产品酱。还包括奶制品，如冰淇淋、牛奶冻、乳冰(lact ice)、生奶油、炼乳、黄油、酸乳酪、乳酪和白汁沙司，以及经加工的油类和脂肪类制品，如人造黄油、涂抹人造奶油(fat spread)和起酥油。另外，纤维寡糖还可以用于诸如可乐等碳酸饮料；诸如碳酸水果饮料、酒精水果饮料、混有奶制品的水果饮料、混有果汁或果肉的饮料和牛奶饮料等饮料；诸如咖啡、牛奶、豆奶、可可奶、果奶和酸乳酪等乳酸/牛奶饮料；和诸如煎茶、乌龙茶、绿茶和红茶等茶饮品。
在本发明中获得的纤维寡糖预计可以获得多种生理活性，如激活有益的肠道菌落(例如激活乳酸菌和乳杆菌)、降低血糖浓度和血胰岛素浓度、降低血液中的胆固醇、降低体内脂肪比例、促进脂类/糖类代谢机能、通便/改善便臭和防龋齿性。因此，除了上述在常见食品中的应用之外，纤维寡糖还可以在保健食品、健康食品和膳食等应用中用作具有生理活性的物质。
此外，因为在本发明中获得的纤维寡糖具有高纯度，所以该纤维寡糖还可以用作化学转化为各种纤维寡糖衍生物的原料。
[实施例]
虽然将参考实施例来描述本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。
(实施例1)
向低速搅拌器(30-L反应器)中加入2kg可商业获得的源于针叶树的溶解浆(平均聚合度：781，可溶于二乙醚的物质的含量：1.1％，平均粒径：174μm)和30L 3N的盐酸溶液，在105℃下搅拌水解30分钟。使用吸滤器(Nutsche)过滤所得酸不溶性残余物，并在70L纯水中洗涤四次，获得固体含量为40.1％的湿滤饼(平均聚合度：220，可溶于二乙醚的物质的含量：0.03质量％，平均粒径：69.1μm，胶态纤维素含量：13.4质量％，纤维素I晶体含量：85％)。
将溶解在0.2N乙酸-乙酸钠缓冲液(PH4.5)中的可商业获得的源于木霉素的纤维素酶制剂(商品名：T“Amano”4)加入湿滤饼中，以便将湿滤饼中的固体含量和蛋白质浓度分别调整为5％和0.25％。将这样获得的混合物(共计25mL)放置在50mL的玻璃瓶中。将该玻璃瓶放置在48℃的恒温振荡水槽中，并在90rpm的振荡速度下反应如表1中所示的固定的一段时间。在开始反应后如表1所示的固定的时间段中，分配300μL仍处于悬浮状态的反应溶液。使用超滤组件(截流分子量：5000)除去酶后，通过高效液相色谱(岛津制作所制造，柱：TSK-GEL AMIDO-80(商品名，Tosoh制造)，移动床：乙腈/水＝6/4)分析所得溶液。所得到的结果如表1中所示。表中的寡糖的选择性是通过(纤维二糖浓度+纤维三糖浓度)/总糖浓度×100(％)计算的值。
(实施例2)
使用与实施例1中相同的方法，对可商业获得的源于针叶树的溶解浆(平均聚合度：781，可溶于二乙醚的物质的含量：1.1％，平均粒径：174μm)进行加酸水解。将所得湿滤饼制成絮团形态，然后放到60℃的快速干燥机中，干燥12小时。
使用家用混合器粉碎所得干燥物，将获得的粉碎的纤维素物质用喷气粉碎机(Seishin Enterprise制造，商品名：Jet Mill STJ-2000型)粉化，以获得纤维素粉末(平均聚合度：220，可溶于二乙醚的物质的含量：0.03质量％，平均粒径16.4μm，胶态纤维素含量：17.5质量％，纤维素I晶体含量：86％)。将该纤维素粉末用作基质，并使用与实施例1中相同的方法进行酶分解。得到的结果如表1中所示。
实施例2使用的平均聚合度和可溶于二乙醚的物质的含量与实施例1中的相同，平均粒径比实施例1中的小，胶态纤维素含量比实施例1中的大。由表1可以看出，在实施例2中，与实施例1相比，通过减小基质的平均粒径，使糖浓度达到10％和20％所需的反应时间缩短，且对于每种糖浓度改善了寡糖的选择性。
(实施例3)
使用与实施例1中相同的方法，对可商业获得的源于阔叶树的溶解浆(平均聚合度：1682，可溶于二乙醚的物质的含量：0.9％，平均粒径：91μm)进行加酸水解。向所得湿滤饼中加入纯水，以制成纤维素浓度为10％的分散液。使用高剪切均化器(特殊机化(株)制造，商品名：TKHomogenizer)搅拌该分散液30分钟，以获得纤维素分散液(平均聚合度：151，可溶于二乙醚的物质的含量：0.1质量％，平均粒径：8.7μm，胶态纤维素含量：55.5质量％，纤维素I晶体含量：85％)。将该纤维素分散液用作基质，并使用与实施例1中相同的方法进行酶分解。得到的结果如表1中所示。
实施例3使用的平均聚合度比实施例1和实施2中的小，使用的可溶于二乙醚的物质的含量比实施例1和实施例2中的大，使用的平均粒径比实施例1和实施例2中的小，使用的胶态纤维素含量比实施例1和实施例2中的高。由表1中可以看出，在实施例3中，与实施例1和实施例2相比，反应时间得到了进一步的缩短，对应每种糖浓度寡糖的选择性也得到了改善。虽然在实施例1和实施例2中寡糖的选择性随糖浓度的升高而降低，但是在实施例3中寡糖的选择性即使是糖浓度升高也没有降低。
(实施例4)
除了将水解条件改变为使用盐酸浓度为5N的盐酸溶液在18℃下进行12小时之外，使用与实施例1中相同的方法对可商业获得的源于针叶树的溶解浆(平均聚合度：781，可溶于二乙醚的物质的含量：1.1质量％，平均粒径：174μm)进行水解。与实施例1相似，洗涤并过滤所得酸不溶性残余物，以获得湿滤饼(平均聚合度：690，可溶于二乙醚的物质的含量：0.7％，平均粒径：49.8μm)。将该湿滤饼制成纤维素浓度为10％的水分散液。使用超高性能分散机/湿式粉磨机(Ashizawa制造，商品名：Pearl Mill RL，氧化铝珠直径2mm，填充率：80％)对该水分散液进行压密/研磨处理，以获得纤维素微粒分散体(平均聚合度：690，可溶于二乙醚的物质的含量：0.7质量％，平均粒径：7.1μm，胶态纤维素含量：87.5质量％，纤维素I晶体含量：77％)。将该纤维素微粒分散体用作基质，并使用与实施例1中相同的方法进行酶分解。得到的结果如表1中所示。
实施例4使用的平均聚合度和可溶于二乙醚的物质的含量比实施例1、实施例2和实施例3中的大，使用的平均粒径比实施例1、实施例2和实施例3中的小，使用的胶态纤维素含量比实施例1、实施例2和实施例3中的高。由表1中可以看出，在实施例4中，寡糖的选择性与实施例3中的相同，但是反应时间与实施例3相比得到了改善。此外，在实施例4中，寡糖的选择性即使是升高糖浓度也很难降低。
(实施例5)
除了使用可商业获得的源于棉籽绒的纸浆(平均聚合度：1853)，并在130℃的5N的盐酸水溶液中水解12小时之外，使用与实施例1中相同的方法进行水解，以获得湿滤饼(平均聚合度：49)。将该湿滤饼制成纤维素浓度为10％的水分散液。使用超高性能分散机/湿式粉磨机(Ashizawa制造，商品名：Pearl Mill RL，氧化铝珠直径2mm，填充率：80％)对该水分散液进行压密/研磨处理，以获得纤维素微粒分散体(平均聚合度：49，可溶于二乙醚的物质的含量：0.9质量％，平均粒径：10.3μm，胶态纤维素含量：94.1质量％，纤维素I晶体含量：75％)。将该纤维素微粒分散体用作基质，除了将酶改变为源于黑曲霉的CELLULASENAGASE(Nagase & Co.，Ltd.制造，商品名)之外，使用与实施例1相同的方法进行酶分解。得到的结果如表1中所示。
实施例5使用的平均聚合度比实施例4中的低，使用的可溶于二乙醚的物质的含量比实施例4中的高，使用的平均粒径比实施例4中的大，但是使用的胶态纤维素含量比实施例4中的高。由表1中可以看出，在实施例5中，与实施例4相比，反应时间缩短了一半，寡糖的选择性也得到了提高。
(比较例1)
将实施例1中使用的可商业获得的源于针叶树的溶解浆加入3N盐酸溶液中，以制造纤维素浓度为10％的分散液。使用高剪切均化器(特殊机化(株)制造，商品名：TK Homogenizer)在常温下将该分散液搅拌60分钟，获得纤维素分散液(平均聚合度：723，可溶于二乙醚的物质的含量：0.9质量％，平均粒径：49.3μm，胶态纤维素含量：10.2质量％，纤维素I晶体含量：85％)。将未进行加酸水解的该纤维素分散液用作基质，并使用与实施例1中相同的方法进行酶分解。得到的结果如表1中所示。
比较例1使用的平均粒径和可溶于二乙醚的物质的含量在本发明的范围内，而平均聚合度超出了本发明的范围。由表1中可以看出，在比较例1中，与各实施例相比，糖浓度达到10％和20％所需的反应时间被延长，且酶分解变慢。另外，对于每种糖浓度寡糖的选择性达不到各实施例所达到的水平。
(比较例2)
将通过实施例4中的步骤所获得的湿滤饼制成纤维素浓度为10％的水分散液。使用目径为45μm的网筛对该水分散液进行湿法分离。将残存在网筛上的固体物质(平均聚合度：690，可溶于二乙醚的物质的含量：0.7质量％，平均粒径：107.3μm，胶态纤维素含量：5.2质量％，纤维素I晶体含量：85％)用作基质，并使用与实施例1相同的方法进行酶分解。得到的结果如表1中所示。
比较例2使用的平均聚合度和可溶于二乙醚的物质的含量在本发明的范围内，而平均粒径超出了本发明的范围。由表1中可以看出，在比较例2中，与各实施例相比，反应时间变慢，且寡糖的选择性达不到各实施例所达到的水平。
(比较例3)
除了将水解条件改变为使用盐酸浓度为4N的盐酸溶液在35℃下进行18小时之外，使用与实施例1中相同的方法对可商业获得的源于针叶树的未漂白的牛皮纸纸浆(平均聚合度：1670，可溶于二乙醚的物质的含量：12质量％，平均粒径：154μm)进行水解。与实施例1相似，洗涤并过滤所得酸不溶性残余物，以获得湿滤饼(平均聚合度：490，可溶于二乙醚的物质的含量：4.4质量％，平均粒径：48.7μm，胶态纤维素含量：12.8质量％，纤维素I晶体含量：86％)。
使用该湿滤饼并以与实施例1相同的方法进行酶分解。得到的结果如表1中所示。
比较例3使用的平均聚合度和平均粒径在本发明的范围内，而可溶于二乙醚的物质的含量超出了本发明的范围。由表1中可以看出，在比较例3中，与比较例1和比较例2相比，纤维寡糖的收率略有提高，但是反应时间和寡糖的选择性均达不到实施例所达到的水平。
[表1]
  纤维素基质的基本物理性质     酶分解数据
  平均聚合度(-)     平均粒径(μm)   胶态成分含量(质量％)   可溶于二乙醚的物质的含量(质量％)     总糖浓度(mg/mL)     反应时间(小时)   寡糖的选择性(％)
实施例1 220 69.1 13.4 0.03     1020     519   54.013.0
实施例2 220 16.4 17.5 0.03     1020     417   61.015.0
实施例3 151 8.7 55.5 0.1     1020     1.55   54.055.5
实施例4 690 7.1 87.5 0.7     1020     14   57.052.0
实施例5 49 10.3 94.1 0.9     1020     0.62   61.060.5
比较例1 723 49.3 10.2 0.9     1020     1036   33.07.5
比较例2 690 107.3 5.2 0.7     1020     824   15.08.5
比较例3 490 48.7 12.8 4.4     1020     1244   37.210.5
(制备例1)
将里氏木霉NBRC31329接种到马铃薯葡萄糖培养基(Difco制造)中，并在37℃下培养7天，然后，将取自该培养基表面的一铂环量孢子在下述培养基中接种并在28℃下预培养3天，所述培养基为将1g多聚蛋白胨、0.5g酵母膏、2g磷酸一钾、1.5g硫酸铵、0.3g硫酸镁、0.3g氯化钙、1mL痕量元素(通过将6mg硼酸、26mg四水合钼酸铵、100mg六水合氯化铁(III)、40mg五水合硫酸铜、8mg四水合硫酸锰和200mg七水合硫酸锌溶解在总量为100mL的纯水中获得)、1mL AdecanolLG-109和10g结晶性纤维素(旭化成化学株式会社制造，商品名：PH-101)悬浮、溶解在总量为1L的纯水中，再将其中的100mL分配到500mL的锥形瓶中并进行高压消毒。此外，将10mL预培养溶液接种到5L广口发酵罐中，该发酵罐中盛有与上述培养基组成相同的培养基，在温度为28℃、搅拌速率为400rpm、通气速率为0.5vvm的条件下进行培养。培养期间使用NaOH将pH控制为3。培养7天后，离心分离所得溶液。使用目径为0.46μm的微孔滤膜，从获得的上清液中除去菌株体。使用截流分子量为13000的超滤膜(旭化成化学株式会社制造，商品名：Microza Pencil Module ACP-0013)，将滤液体积浓缩为原来的十分之一，以获得粗酶。
表2列出了该粗酶活性比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)的测量结果。
(制备例2)
将里氏木霉NBRC31329接种到马铃薯葡萄糖培养基(Difco制造)中，并在37℃下培养7天，然后，将取自该培养基表面的一铂环量孢子在下述培养基中接种并在28℃下培养3天，所述培养基为将1g多聚蛋白胨、0.5g酵母膏、2g磷酸一钾、1.5g硫酸铵、0.3g硫酸镁、0.3g氯化钙、1mL痕量元素(通过将6mg硼酸、26mg四水合钼酸铵、100mg六水合氯化铁(III)、40mg五水合硫酸铜、8mg四水合硫酸锰和200mg七水合硫酸锌溶解在总量为100mL的纯水中获得)、1mL AdecanolLG-109和10g结晶性纤维素(旭化成化学株式会社制造，商品名：PH-101)悬浮、溶解在总量为1L的纯水中，再将其中的100mL分配到500mL的锥形瓶中并进行高压消毒。此外，将10mL预培养溶液接种到5L广口发酵罐中，该发酵罐中盛有1L与上述培养基组成相同的培养基，并在温度为28℃、搅拌速率为400rpm、通气速率为0.5vvm的条件下进行培养。培养期间使用NaOH将pH控制为4。培养7天后，离心分离所得溶液。使用目径为0.46μm的微孔滤膜，从获得的上清液中除去菌株体。使用截流分子量为13000的超滤膜(旭化成化学株式会社制造，商品名：Microza Pencil Module ACP-0013)，将滤液体积浓缩为原来的十分之一，以获得粗酶。
表2列出了该粗酶的活性比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)的测量结果。
(制备例3)
将可商业获得的纤维素酶(合同酒精制造，商品名：GODO-TCD)溶解在50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH4.8)中，使纤维素酶的浓度为500mg/mL。将该混合物引入阴离子交换柱(Amersham制造，商品名：DEAE-Sepharose FF)中。通过线性梯度法，使50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.8)和溶解在50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.8)中的1摩尔％的氯化钠在柱中循环，从而从可商业获得的酶中获得分离样品。测量获得的所有馏分的β-葡糖苷酶活性和结晶性纤维素分解活性，合并活性比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.5的馏分。使用截流分子量为10000的超滤组件(Millipore制造，商品名：Amicon Ultra-15离心过滤机)，将获得的纤维二糖馏分的体积浓缩为原来的五分之一，以获得纯化酶(提纯的酶中的蛋白质浓度：15.4mg/mL)。
表2列出了该纯化酶活性比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)的测量结果。
(实施例6)
在低速搅拌器(30-L反应器)中加入2kg可商业获得的源于针叶树的溶解浆(平均聚合度：781，可溶于二乙醚的物质的含量：1.1％，平均粒径：174μm)，并在110℃下使用的3N盐酸溶液的水解条件下水解30分钟。洗涤并过滤所得酸不溶性残余物，以获得湿滤饼。将获得的湿滤饼制成絮团形态，并在60℃的烘箱内通气/干燥12小时。向所得干燥物中加入纯水，以将其含水量调整为60％，并使用混合器(三英制作所制造，商品名：万能搅拌混合机，钩状桨叶转速为126rpm，90分钟)研磨，获得磨碎的纤维素(平均聚合度：220，平均粒径：9.1μm，胶态纤维素成分含量：66.1质量％，可溶于二乙醚的物质的含量：0.03质量％，纤维素I结晶含量：78％)。
然后，将5质量％的该磨碎的纤维素悬浮并溶解在制备例1中获得的粗酶的50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.8)中。将这样获得的混合物(共计25mL)放置在玻璃瓶中。将该玻璃瓶放置在55℃的恒温振荡水槽中，在90rpm的振荡速度下反应。在开始反应后的固定的一段时间中，分配300μL仍处于悬浮状态的反应溶液。使用超滤组件(截流分子量：10000)除去酶和未分解的纤维素后，通过高效液相色谱分析所得溶液的糖浓度。得到的结果如表2中所示。
反应溶液中的纤维寡糖和葡萄糖通过高效液相色谱(柱：AsahipakNH2P-50(商品名，岛津制作所制造)，高效液相色谱：SCL-10A型(商品名，岛津制作所制造)，移动床：乙腈/水＝75/25(体积比)，循环量：1mL/min，样品溶液：10μL)进行定量分析。
表中的反应时间是生成的糖(纤维寡糖和葡萄糖)的总量与所用纤维素的量之间的比达到20质量％时所需要的反应时间。寡糖的选择性通过用(纤维二糖浓度+纤维三糖浓度)/总糖浓度×100(％)计算的值表达。
(实施例7)
除了将水解条件变为使用盐酸浓度为5N的盐酸溶液在18℃下进行12小时之外，使用与实施例1中相同的方法对可商业获得的源于针叶树的溶解浆(平均聚合度：781，可溶于二乙醚的物质的含量：1.1％，平均粒径：174μm)进行水解。与实施例1相似，洗涤并过滤所得酸不溶性残余物，以获得湿滤饼(平均聚合度：690，可溶于二乙醚的物质的含量：0.7质量％，平均粒径：49.8μm)。将该湿滤饼制成纤维素浓度为10％的水分散液。使用超高性能分散机/湿式粉磨机(Ashizawa制造，商品名：Pearl Mill RL，氧化铝珠直径2mm，填充率：80％)对该水分散液进行压密/研磨处理，以获得纤维素微粒分散体(平均聚合度：690，可溶于二乙醚的物质的含量：0.7质量％，平均粒径：7.1μm，胶态成分含量：87.5质量％，纤维素I晶体含量：77％)。此外，使用与实施例6相似的方式酶分解获得的湿滤饼。得到的结果如表2中所示。
在实施例7中，对与实施例6中的纤维素相比具有较小平均粒径和较高的胶态成分含量的纤维素进行酶分解。与实施例6相比，缩短了反应时间，改善了寡糖的选择性。
(实施例8)
以与实施例1中相同的方法使用实施例6中获得的纤维素湿滤饼并使用制备例3中获得的纯化酶进行酶分解。得到的结果如表2中所示。
实施例8使用的酶具有比实施例6中使用的酶小的活性比(β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)。虽然通过改变酶延长了反应时间，但是选择性得到了改善。
(实施例9)
将可商业获得的源于针叶树的溶解浆(平均聚合度：781，可溶于二乙醚的物质的含量：1.1质量％，平均粒径：174μm)在105℃下搅拌水解30分钟。使用吸滤器过滤所得酸不溶性残余物，并在70L纯水中洗涤四次，以获得固体含量为40.1％的湿滤饼(平均聚合度：220，平均粒径：69.1μm，胶态成分含量：13.4质量％，可溶于二乙醚的物质的含量：0.03质量％，纤维素I晶体含量：85％)。使用该纤维素湿滤饼并以与实施例6中相同的方法使用制备例3中获得的纯化酶进行酶分解。得到的结果如表2中所示。
实施例9使用的酶具有比实施例6使用的酶小的活性比(β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)，并且与实施例6相比，实施例9使用的纤维素具有更大的平均粒径和更小的胶态成分含量。虽然通过改变酶和基质延长了反应时间，但是选择性得到了改善。
(实施例10)
使用实施例6中获得的纤维素湿滤饼并以与实施例6中相同的方法使用制备例2中获得的酶进行酶分解。得到的结果如表2中所示。
实施例10使用的酶具有比实施例6中使用的酶大的活性比(β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)。虽然改变酶后反应时间与实施例6中的相等，但是降低了选择性。
(比较例4)
使用实施例6至实施例9中使用的可商业获得的纸浆(平均聚合度：781)，而进行水解。向该纸浆中加入纯水(固体含量：40质量％)，并使用与实施例6相同的方法进行研磨处理，以获得湿滤饼(平均聚合度：781，平均粒径：49.3μm，胶态纤维素成分含量：10.2质量％，可溶于二乙醚的物质的含量：0.9质量％，纤维素I晶体含量：85％)。使用该湿滤饼并以与实施例6相同的方法进行酶分解。得到的结果如表2中所示。
比较例4使用的纤维素的平均聚合度超出了本发明的范围，而平均粒径和胶态纤维素成分含量在本发明的范围内。与各实施例相比，延长了反应时间并降低了纤维寡糖的选择性。
(比较例5)
将通过实施例6中的步骤获得的湿滤饼制成纤维素浓度为10％的水分散液。使用目径为45μm的网筛对该水分散液进行湿法分离。将残存在网筛上的固体物质(平均聚合度：220，平均粒径：103.4μm，胶态成分含量：9.7质量％，可溶于二乙醚的物质的含量：0.03质量％，纤维素I晶体含量：85％)用作基质，并使用与实施例6相同的方法进行酶分解。得到的结果如表2中所示。
比较例5使用的平均聚合度和可溶于二乙醚的物质的含量在本发明的范围内，而平均粒径超出了本发明的范围，胶态成分含量小于本发明的范围。与各实施例相比，在比较例5中，反应时间变慢，纤维寡糖的选择性达不到各实施例所达到的水平。
[表2]
   纤维素类物质的物理性质值  纤维素酶的物理性质值     酶分解结果
平均聚合度(-) 平均粒径(μm)  胶态纤维素成分含量(质量％)   可溶于二乙醚的物质的含量(质量％)  β-葡糖苷酶活性：A(U/ml)   结晶性纤维素分解活性：B(U/ml)     55℃时的活性比：A/B     反应时间(小时) 寡糖的选择性(％)
  实施例6    220     9.1  66.1   0.03  0.17   0.54     0.31     5   67.6
  实施例7    690     7.1  87.5   0.7  0.17   0.54     0.31     4   75.7
  实施例8    220     9.1  66.1   0.03  0.10   0.58     0.17     8   83.4
  实施例9    220     69.1  13.4   0.03  0.10   0.58     0.17     24   72.6
  实施例10    220     9.1  66.1   0.03  0.22   0.51     0.43     5   59.4
  比较例4    781     49.3  10.2   0.9  0.17   0.54     0.31     39   50.4
  比较例5    220     103.4  9.7   0.03  0.17   0.54     0.31     30   66.3
(实施例11)
在28℃下将里氏木霉NBRC31329在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上培养7天。生成的孢子以106个孢子/mL悬浮在2ml 100mM的磷酸钙缓冲液(pH7)中，并加入24μl的EMS(甲磺酸乙酯)。在28℃下振荡该混合物16小时，从而对该混合物施加诱变处理。通过离心分离从该孢子悬浮液中收集孢子，然后在100mM的磷酸钙缓冲液(pH7)中充分洗涤，并稀释为100～300个孢子/板。在28℃下将该稀释液在下述培养基中培养5天，所述培养基为将1g葡萄糖、1g酵母膏、2g(NH4)2SO4、4g KH2PO4、2g Na2HPO4、200mg MgSO4·7H2O、1mg CaCl2·2H2O、TritonX-100、1mL痕量元素(通过将6mg硼酸、26mg四水合钼酸铵、100mg六水合氯化铁(III)、40mg五水合硫酸铜、8mg四水合硫酸锰和200mg七水合硫酸锌溶解在总量为100mL的纯水中获得)和20g琼脂溶解并悬浮在1L纯水中，再进行高压消毒，并通过使用薄膜过滤器过滤进行消毒。测量所得培养溶液的B-葡糖苷酶活性和结晶性纤维素分解活性，以选择突变株里氏木霉GL-1。该突变株根据布达佩斯条约从2005年4月15日起保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏所(International Patent Organism Depositary National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，保藏登记号为FERMBP-10323。
(实施例12)
在25℃下将里氏木霉NBRC31329和在实施例11中获得的突变株GL-1各自在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上培养7天，以充分形成孢子。将1铂环量孢子接种在下述培养基中，并在28℃、搅拌下培养5天，所述培养基为将1.0g多聚蛋白胨、0.5酵母膏、2.0g KH2PO4、1.5g(NH4)2SO4、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2·2H2O、1.0ml Tween 80(半井化学药品(株)制造)、1.0ml痕量元素溶液(通过将6mg H3BO4、26mg(NH4)6Mo7O24·4H2O、100mg FeCl3·6H2O、40mg CuSO4·5H2O、8mg MnSO4·4H2O和200mg ZnSO4·7H2O溶解并悬浮在100ml水中获得)和7.5g酒石酸溶解并悬浮在1L水中，然后将pH调整为4.0，将其中100mL分配到500mL的锥形瓶中，再加入1g结晶性纤维素(旭化成化学株式会社制造，商品名：PH-101)，并进行高压消毒。在第五天，离心分离该培养溶液。测量所得上清液在40℃下的纤维素酶活性和β-葡糖苷酶活性。得到的结果如表3中所示。
(实施例13)
将里氏木霉NBRC31329接种到马铃薯葡萄糖培养基(Difco制造)中，并在37℃下培养7天。将取自该培养基表面的一铂环量孢子接种在下述培养基中，并在28℃下预培养3天，所述培养基为将1g多聚蛋白胨、0.5g酵母膏、2g磷酸一钾、1.5g硫酸铵、0.3g硫酸镁、0.3g氯化钙、1mL痕量元素(通过将6mg硼酸、26mg四水合钼酸铵、100mg六水合氯化铁(III)、40mg五水合硫酸铜、8mg四水合硫酸锰和200mg七水合硫酸锌溶解在总量为100mL的纯水中获得)和1mL AdecanolLG-109悬浮并溶解在总量为1L的纯水中，再将其中的100mL分配到500mL的锥形瓶中，二者中均加入1g结晶性纤维素(旭化成化学株式会社制造，商品名：PH-101)，并进行高压消毒。此外，将30mL预培养溶液接种到5L广口发酵罐中，该发酵罐中盛有与上述培养基组成相同的培养基，在温度为28℃、搅拌速率为400rpm、通气速率为0.5vvm的条件下进行培养。培养期间使用NaOH溶液将最小pH控制为3.0。培养5天后，离心分离所得溶液，获得作为粗酶的上清液。通过上述方法，测量获得的酶溶液的结晶性纤维素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培养期间pH随时间的变化如图1所示，活性测量的结果如表4中所示。
(实施例14)
当使用与实施例13相同的方法对里氏木霉NBRC31329进行培养时，使用NaOH将培养期间的最低pH控制为2.5，获得粗酶溶液。通过上述方法测量获得的酶溶液的结晶性纤维素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培养期间pH随时间的变化如图1所示，活性测量的结果如表4中所示。
(比较例6)
当使用与实施例13相同的方法对里氏木霉NBRC31329进行培养时，使用NaOH将培养期间的最低pH控制为3.5或4或5，获得粗酶溶液。通过上述方法测量获得的酶溶液的结晶性纤维素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培养期间pH随时间的变化如图1所示，活性测量的结果如表4中所示。
(实施例15)
使用与实施例13相同的方法培养实施例11中获得的GL-1菌株。当培养该菌株时，使用NaOH将培养期间的最低pH控制为3或4，获得粗酶溶液。培养期间pH随时间的变化如图2所示。
(实施例16)
向8ml 5质量％的结晶性纤维素(通过使用126rpm的万能搅拌混合机(商品名，三英制作所制造)的钩状桨叶捏合并搅拌含水量被调整为60％的Ceolus PH-101(商品名，旭化成化学株式会社制造)90分钟而获得)中分别加入2mL在实施例13和实施例15中获得的纤维素酶粗酶溶液，并在55℃、搅拌的条件下进行水解。反应2小时、4小时、6小时、8小时后，将该混合物在95℃加热15分钟，以结束酶反应。通过离心分离得到清液，使用上述HPLC法测量该上清液的纤维寡糖浓度和葡萄糖浓度。得到的结果如图3中所示。
(比较例7)
当使用与实施例16相同的方法酶分解结晶性纤维素时，将比较例6中获得的纤维素酶用作粗酶溶液。结果如图3中所示。
[表3]
菌株   结晶性纤维素分解活性(A)(U/ml)   β-葡糖苷酶活性(B)(U/ml) (B)/(A)
  NBRC31329   0.50   0.23     0.46
  GL-1   0.58   0.20     0.34
[表4]
培养pH   培养时间(小时)   结晶性纤维素分解活性(A)(U/ml)   β-葡糖苷酶活性(B)(U/ml) (B)/(A)
    2.5   90   0.402   0.052    0.13
    3   65   0.501   0.069    0.14
    3.5   65   0.571   0.214    0.37
    4   65   0.358   0.145    0.40
    5   65   0.272   0.102    0.38
(实施例17)
将可商业获得的结晶性纤维素(旭化成化学株式会社制造，商品名：PH-101)制成固体含量为10质量％的水分散液，并使用珠磨机(AshizawaFinetech制造，商品名：Pearl Mill RL5，容积：5L，研磨介质：直径为1mm的氧化锆珠，转速：1800rpm，在容器内的停留时间：70分钟)进行湿磨。然后，向100ml所获磨碎的纤维素水分散液(平均聚合度：220，平均粒径：0.7μm，胶态纤维素含量：54质量％，可溶于二乙醚的物质的含量：0.03质量％，纤维素I晶体含量：75％)中加入200mL粗酶溶液，所述粗酶溶液是通过利用超滤(截流分子量：13000)浓缩实施例15中pH为3时培养的上清液(体积浓缩为原来的五分之一)而获得的。通过加入50mM的乙酸/乙酸钠缓冲液(pH 4.5)将其总体积调整为500mL。将该混合物放到1L玻璃可分烧瓶中，在使用3-1 Motor(商品名)进行内部搅拌下，使其在55℃的温浴中反应。在反应开始两小时后，分配300μm仍处于悬浮状态的反应溶液。使用超滤组件(截流分子量：10000)除去酶和未分解的纤维素后，通过高效液相色谱分析所得溶液的糖浓度，从而定量分析反应溶液中存在的纤维素残余物。结果，在反应两小时后，纤维素分解速率为82％，寡糖的选择性为81％。
(实施例18)
将实施例17中获得的磨碎的纤维素水分散液放在与实施例17相同的烧瓶中，并在与实施例17相同的条件下，使用反应槽来进行反应，在所述反应槽中安装了截流分子量为13000的聚丙烯腈制中空超滤组件(旭化成化学株式会社制造，商品名：Microza ACP-0013)。在使反应溶液在压力为0.1MPa、循环流速为4L/小时下在超滤组件中循环的同时，使反应进行2小时。测量通过超滤获得的透过液的糖浓度，从而定量分析反应溶液中存在的纤维素残余物。
结果，纤维素的分解率为95质量％，寡糖的选择性为85％。
(实施例19)
除了将反应溶液中纤维素浓度设定为2.5质量％之外，使用与实施例18相同的设备进行酶分解。在酶分解期间，纤维素的分解率通过对透过液的分析来测量。将该反应进行24小时，同时加入磨碎的纤维素水分散液，以便将反应溶液中的纤维素浓度恒定保持为2.5质量％。使用与实施例18相同的方法测量透过液中的糖浓度，从而定量分析反应溶液中存在的纤维素残余物。
结果，纤维素的分解率为98质量％，寡糖的选择性为92％。
(实施例20)
通过离子交换树脂(三菱化学制造，商品名：DIAION WA30和SK1B)除去实施例19中获得的纤维寡糖水溶液中的乙酸，然后在60℃下干燥8小时，并在研钵中粉碎，以获得纤维寡糖粉末。按照《日本药典》(第14版，广川书店出版)的结晶性纤维素纯度试验(2)中所规定的可溶于二乙醚的物质的定量分析方法，测量该粉末中可溶于二乙醚的物质的含量。获得的可溶于二乙醚的物质的含量为200ppm。
(比较例8)
使用家用混合器粉碎可商业获得的未漂白的溶解浆(源于Spuruce，平均聚合度：1680，平均粒径：128μm，胶态纤维素含量：4质量％，可溶于二乙醚的物质的含量：1.5质量％，纤维素I晶体含量：85％)。向作为基质的所获得的经粉碎的纤维素中加入pH为5.5的乙酸缓冲液，以制备纤维素含量为2质量％的水分散液。在上述纤维素水分散液中，以基于所述水分散液为0.1质量％的浓度溶解可商业获得的纤维素酶(合同酒精制造，商品名：GODO-TCD)，并使用与实施例17中相同的方法，在pH为5.0下进行酶分解24小时。结果，纤维素的分解率为29质量％，寡糖的选择性为55％。使用与实施例20相同的方法粉碎该纤维寡糖水溶液，并测量其可溶于二乙醚的物质的含量。可溶于二乙醚的物质的含量为3200ppm。
工业实用性
通过本发明的方法获得的纤维寡糖不仅优选用作普通食品的原料，还优选用作保健食品的原料、化学转化的原料如用于合成医药中间体和其它化学品的材料，以及食品、药物和一般工业制品领域中用于发酵的原料。

Claims (21)

1.一种生产纤维寡糖的方法，所述方法包括在纤维素酶的存在下酶分解水不溶性天然纤维素类物质，所述水不溶性天然纤维素类物质具有小于或等于700的平均聚合度、小于或等于100μm的平均粒径并且可溶于二乙醚的物质的含量小于1质量％。
2.一种生产纤维寡糖的方法，所述方法包括在纤维素酶的存在下酶分解水不溶性天然纤维素类物质，所述水不溶性天然纤维素类物质具有小于或等于700的平均聚合度，含有大于或等于10质量％的胶态纤维素成分，并且可溶于二乙醚的物质的含量小于1质量％。
3.如权利要求1或2所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质的平均粒径小于或等于100μm，并包含大于或等于10质量％的胶态纤维素成分。
4.如权利要求1至3任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质的平均聚合度小于或等于500，并且平均粒径小于或等于50μm。
5.如权利要求1至4任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质的平均聚合度小于或等于400，并且平均粒径小于或等于30μm。
6.如权利要求1至5任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质包含大于或等于15重量％的胶态纤维素成分。
7.如权利要求1至6任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述纤维素酶的活性比(温度为55℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.7。
8.如权利要求7所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述纤维素酶的活性比小于或等于0.5。
9.如权利要求8所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述纤维素酶的活性比小于或等于0.35。
10.如权利要求1至9任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述可溶于二乙醚的物质为木质素。
11.如权利要求1至10任一项所述的生产纤维寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纤维素类物质包含纤维素I型晶体。
12.一种如权利要求1至11任一项所述的纤维素酶的生产方法，其中，在通过培养生产纤维素酶的细菌而获得的培养液中，β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性的活性比(温度为40℃时的β-葡糖苷酶活性/结晶性纤维素分解活性)小于或等于0.5。
13.如权利要求12所述的纤维素酶的生产方法，其中β-葡糖苷酶活性与结晶性纤维素分解活性的活性比小于或等于0.35。
14.如权利要求12或13所述的纤维素酶的生产方法，其中所述生产纤维素酶的细菌是作为生产β-葡糖苷酶少的菌株而选择得到的菌株。
15.如权利要求12至14任一项所述的纤维素酶的生产方法，其中在培养所述生产纤维素酶的细菌时，将培养期间的pH控制为小于3.5。
16.如权利要求12至15任一项所述的纤维素酶的生产方法，其中所述生产纤维素酶的细菌是属于木霉菌属的菌株。
17.一种纤维寡糖，其特征在于，所述纤维寡糖可溶于二乙醚的物质的含量小于或等于2000ppm。
18.通过如权利要求1至11任一项所述的方法获得的纤维寡糖，其特征在于可溶于二乙醚的物质的含量小于或等于2000ppm。
19.如权利要求18所述的纤维寡糖，其中所述可溶于二乙醚的物质的含量小于或等于1000ppm。
20.一种食品、化妆品或药用制剂，其特征在于包含通过如权利要求1至11任一项所述的方法获得的纤维寡糖。
21.一种食品、化妆品或药用制剂，其特征在于包含如权利要求17或18所述的纤维寡糖。
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