KR20070041539A

KR20070041539A - 셀로올리고당의 제조 방법

Info

Publication number: KR20070041539A
Application number: KR1020077002134A
Authority: KR
Inventors: 나오아끼 야마사끼; 이찌로 이부끼; 고지 이사까
Original assignee: 아사히 가세이 케미칼즈 가부시키가이샤
Priority date: 2004-07-27
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2007-04-18
Also published as: EP1811038A4; TWI301155B; US20070207108A1; EP1811038B1; CA2575237C; JPWO2006011479A1; CN1989254A; KR100894374B1; JP4372787B2; US7947656B2; EP1811038A1; CA2575237A1; ATE545707T1; TW200613559A; CN1989254B; WO2006011479A1

Abstract

본 발명은 평균 중합도가 700 이하이고, 평균 입경이 100 ㎛ 이하이고, 디에틸에테르 가용물 함유율이 1 질량％ 미만인 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질을 셀룰라아제의 존재하에서 효소 분해하는 것을 포함하는 셀로올리고당의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 평균 중합도가 700 이하이고, 콜로이드상 셀룰로오스 성분을 10 질량％ 이상 함유하며, 디에틸에테르 가용물 함유율이 1 질량％ 미만인 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질을 셀룰라아제의 존재하에서 효소 분해하는 것을 포함하는 셀로올리고당의 제조 방법에 관한 것이다.

셀로올리고당, 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질, 셀룰라아제, 디에틸에테르 가용물

Description

셀로올리고당의 제조 방법 {Processes for Producing Cellooligosaccharide}

본 발명은 셀룰로오스계 재료를 효소 분해하여 셀로올리고당을 얻는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 평균 중합도, 평균 입경, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율, 디에틸에테르 가용물 함유율을 특정한 범위로 제어한 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질을 기질로 하고, β-글루코시다아제 활성과 결정 셀룰로오스 분해 활성의 활성비(β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)를 특정한 범위로 제어한 셀룰라아제를 이용하여 효소 분해함으로써, 단시간만에 셀룰로오스 분해율을 높이고, 셀로올리고당을 선택적으로 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

셀로올리고당은 셀로비오스, 셀로트리오스, 셀로테트라오스, 셀로펜타오스 및 셀로헥사오스의 총칭이며, 글루코피라노스 단위가 1 내지 6개, β-1,4 결합한 소당류이다.

최근, 셀로올리고당은 다른 올리고당과 마찬가지로 그 생리 기능이 명확해지고 있으며, 기능성 식품의 신소재로서 기대되고 있다(비특허 문헌 1).

셀로올리고당은 그 중합체인 셀룰로오스를 효소로 가수분해함으로써 얻어지는데, 천연에 존재하는 셀룰로오스는 물에 난용성이고, 결정성이 높기 때문에 셀룰 라아제에 의해 효소 분해되기 어려운 것이 문제였다.

또한, 셀룰로오스의 효소 분해 반응에서는 분해 생성물로서 얻어진 셀로올리고당이 셀룰라아제 중의 한 성분인 β-글루코시다아제에 의해 더욱 글루코오스 단위로 분해되어, 셀로올리고당의 수율이 저하하는 것도 문제였다(비특허 문헌 2).

상기한 과제와 관련하여 종래 셀룰로오스 효소 분해시의 셀로올리고당의 수율 향상을 목적으로서 많은 시도가 이루어져 왔다.

특정한 셀룰로오스를 사용한 셀로올리고당의 제조 방법으로서는 이하의 것을 들 수 있다.

특허 문헌 1에는 비결정성 셀룰로오스를 많이 포함하는 셀룰로오스 원료를 사용하여, 셀룰라아제에 의한 가수분해 반응을 리그닌의 존재하에서 행함과 동시에 , 가수분해 반응에 의해 생성되는 셀로올리고당 중 적어도 셀로비오스를 수시로 반응액으로부터 채취하는 셀로올리고당의 제조 방법이 기재되어 있다.

특허 문헌 2에는 천연 리그노셀룰로오스를 포함하는 원료를 증해(cooking)하여 증해 후에 건조를 거치지 않고 얻어지는 습식 펄프를 셀룰라아제에 의해 부분 가수분해하여 생성된 셀로올리고당 중 적어도 셀로비오스를 채취하는 셀로올리고당의 제조 방법이 기재되어 있다. 이들 제조 방법은 셀룰라아제에 포함되는 셀로올리고당 분해 효소인 β-글루코시다아제를 리그닌에 흡착시켜 β-글루코시다아제의 작용을 억제시킴으로써 셀로올리고당의 글루코오스에의 분해를 억제하고, 셀로올리고당의 반응 선택률을 높이는 것이다. 그러나, 이들 제조 방법에서는, 얻어지는 당화액에 다량의 리그닌이 포함되기 때문에, 결과적으로 셀로올리고당의 수량이 낮 아진다. 또한, 고순도의 셀로올리고당을 얻기 위해서는, 당화액으로부터의 탈리그닌 처리가 필요해지기 때문에 정제 공정이 복잡해지는 문제가 있었다.

특허 문헌 3에는 1 내지 20 질량％의 리그닌을 함유하는 리그노셀룰로오스를 셀룰라아제 및 백색 부패 균류 등의 리그닌 분해균과 동시에 반응시킴으로써 셀로올리고당의 1종인 셀로비오스를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법에서는 셀룰로오스의 탈리그닌 처리를 거치지 않고, 기질에 대한 셀룰라아제의 작용을 높일 수 있는데, 그 분해 생성물에는 셀로비오스 이외에 리그닌 분해물이 혼입되기 때문에, 상기와 마찬가지로 셀로올리고당의 수량이 낮아진다. 또한, 고순도의 셀로비오스를 얻기 위해서는 리그닌 분해물의 제거 공정이 필요해져 정제 공정이 복잡해진다는 문제가 있었다.

특허 문헌 4에는 셀룰로오스를 아민옥시드, 염화리튬/N,N-디메틸아세트아미드, 구리 암모니아, 비스코스 등의 용제에 용해한 셀룰로오스 용액 중에 셀룰라아제를 첨가한 후, 얻어진 용액으로부터 셀룰라아제 함유 재생 셀룰로오스를 얻고, 이어서 상기 재생 셀룰로오스를 완충액의 존재하에서 셀룰로오스 중에 포함된 셀룰라아제에 효소 반응을 행하게 하여 셀로올리고당을 생산시키는 셀로올리고당의 제조 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법에서는 셀룰라아제에 정제 등의 특별한 전처리를 실시할 필요가 없어 셀로올리고당의 수율이 향상되지만, 셀룰로오스를 용해 재생시키는 공정이 필요하여, 공정이 번잡해지는 문제가 있었다. 또한, 셀룰로오스 용해에 사용하는 아민옥시드, 염화리튬/N,N-디메틸아세트아미드, 구리 암모니아, 비스코스 등의 화학 물질이 적지 않게 셀룰라아제에 작용하여, 셀룰로오스 분 해 반응에 영향을 미치는 문제가 있었다.

특허 문헌 5에는 보수도(water retentivity)가 230 내지 280 ％이고, 여수도(drainability)가 550 내지 640 ㎖인 표백 슬러쉬 펄프를 원료로 하는 셀로비오스의 제조 방법이 기재되어 있다. 여기서 말하는 슬러쉬 펄프란, 증해ㆍ표백 처리 후의 미건조 펄프를 말하며, 이것을 원료로 함으로써 명확하게 셀로비오스의 생성량이 향상되지만, 미건조 슬러쉬 펄프는 보수도가 높기 때문에, 효소 분해시의 기질 농도가 제한되므로 셀로올리고당의 생산성이 불량해지는 문제가 있었다.

특허 문헌 6에는 셀룰로오스를 함유하는 재료로부터 셀룰로오스 성분을 초임계 또는 아임계수로 가용화한 후, 처리액에 셀룰라아제 제제를 첨가하고, 셀룰로오스 및 셀룰로오스의 부분 분해물인 고중합도 셀로올리고당을 셀룰라아제 제제에 의해 가수분해함으로써 글루코오스 및/또는 셀로올리고당을 얻는 방법이 기재되어 있다. 이 방법에 따르면, 셀로비오스, 셀로트리오스 등의 셀로올리고당의 생성량, 수율 모두 향상되지만, 초임계, 아임계수 처리에 필요한, 내압ㆍ내산 설비 등의 설비상의 안전성, 가압ㆍ가열을 행하는 데 있어서의 안전성 등의 셀룰로오스 전처리의 안전성이 문제가 된다는 과제가 있었다.

특허 문헌 7에는, X선 회절법에 의한 셀룰로오스 I형 결정화도의 값이 10 ％ 내지 80 ％이고, 보수도가 200 ％ 내지 1000 ％인 펄프를 셀룰라아제 반응 기질로서 사용하는 셀로올리고당의 제조 방법, 및 그 펄프에 피브릴화 처리, 기계 화학 처리, 화학적 처리 중 어느 하나 또는 복수의 처리를 실시하는 셀로올리고당의 제조 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법에 따르면, 셀로비오스의 생성량, 셀룰로오 스의 분해율이 향상되지만, 셀룰로오스로서 보수도가 높은 섬유상의 펄프를 사용하기 때문에 피브릴화 처리, 기계 화학 처리, 화학 처리 등의 전처리, 및 그에 이어지는 효소 분해, 올리고당의 정제 등의 각 제조 공정에서 블록킹을 일으키고, 기질 농도가 제한되는 등의 셀로올리고당의 생산성이 불량해지는 문제가 있어, 본 발명과 같이 평균 중합도, 평균 입경, 콜로이드상 성분 함유율 등을 고도로 제어하여, 효소 분해를 포함하는 각 공정에서의 처리성을 높인 것과는 본질적으로 다른 것이었다.

또한, 특정한 셀룰라아제를 사용하여 셀룰로오스를 효소 분해함으로써 셀로올리고당의 수율을 향상시키는 방법으로서는, 이하의 특허 문헌 8 내지 11을 들 수 있다.

특허 문헌 8에는 셀로비브리오(cellovibrio)속에 속하는 미생물이 생산하는 셀룰라아제의 작용에 의해, 수성 반응액 중에서 셀룰로오스계 물질로부터 셀로올리고당을 제조하는 방법에 있어서, 한외 여과 반응기를 조합함으로써 생성물 저해를 해제하여, 셀로올리고당을 생성 축적시키는 셀로올리고당의 제조 방법이 기재되어 있다. 이 방법에 따르면, 셀룰로오스계 물질의 효소 분해에 의한 분해 생성물로서 셀로비오스, 셀로트리오스만으로 이루어지는 셀로올리고당이 얻어진다. 그러나, 셀로비브리오속 미생물이 생산하는 효소는 결정성 셀룰로오스에는 작용하기 어렵고, 반응 시간을 단축하여 수율을 향상시키기 위해서는 기질로서 비정질 셀룰로오스가 필요하여 공정이 복잡해지는 문제가 있었다.

특허 문헌 9에는 셀룰로오스를 셀룰라아제로 분해하여 셀로올리고당을 생성 시키는 방법에 있어서, 미리 셀룰라아제를 pH 3.5 내지 5.0으로 평형화한 약산성 양이온 교환 수지에 접촉시킴으로써, 셀룰라아제 중의 β-글루코시다아제를 선택적으로 제거하고, 이러한 β-글루코시다아제를 제거한 셀룰라아제를 셀룰로오스에 접촉시키는, 셀로올리고당의 제조 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법에 따르면, 셀룰로오스의 효소 분해에 의해 글루코오스를 감소시키고, 셀로올리고당이 60 ％ 이상인 분해 생성물을 얻을 수 있다. 그러나, 상기 방법에서는 셀룰라아제 중의 β-글루코시다아제를 제거하는 공정이 필요해져, 셀로올리고당 제조 공정이 복잡해지는 문제가 있었다. 또한, 이 셀룰라아제 정제 공정에서는 미처리 셀룰라아제에 대하여, 75 내지 1000배의 양이온 교환 수지가 필요해지기 때문에 셀룰라아제 처리량이 제한되고, 셀로올리고당의 생산성이 불충분하며, 셀룰라아제 정제 비용, 양이온 교환 수지의 분리 정제제 비용이 상승한다는 문제가 있었다.

특허 문헌 10에는 셀룰로오스에스테르 또는 셀룰로오스에테르에스테르 중 어느 하나 또는 양쪽과 셀룰라아제를 용해하여 일정 시간 보온한 후, pH를 변화시켜 불용화된 고형 분획과 용액을 분리함으로써 셀룰라아제 중에 함유되는 β-글루코시다아제를 선택적으로 제거하는 셀룰라아제 정제 방법, 또한 이 β-글루코시다아제가 제거된 셀룰라아제와 셀룰로오스를 수성 매체 중에 첨가하여 현탁액으로 하고, 상기 현탁액을 일정 시간 보온하여 상기 현탁액 중에 셀로비오스를 생성시켜, 상기 셀로비오스를 채취하는 셀로비오스의 제조 방법이 기재되어 있다.

특허 문헌 11에는 키토산이 가용이 되도록 pH를 조정하여 이루어지는 수성 매체 중에 상기 키토산과 셀룰라아제를 용해하여 일정 시간 보온한 후, pH를 변화 시켜 불용화한 고형 분획과 용액을 분리함으로써 셀룰라아제 중에 함유되는 β-글루코시다아제를 선택적으로 제거하는 셀룰라아제의 정제 방법, 또한 이 β-글루코시다아제가 제거된 셀룰라아제와 셀룰로오스를 수성 매체 중에 첨가하여 현탁액으로 하고, 상기 현탁액을 일정 시간 보온하여 상기 현탁액 중에 셀로비오스를 생성시켜, 상기 셀로비오스를 채취하는 셀로비오스의 제조 방법이 기재되어 있다. 이들 방법에 따르면, 셀룰라아제를 셀룰로오스 유도체 또는 키토산으로 흡착 분리 처리하고, 셀룰로오스 유도체 또는 키토산에 흡착시킨 상태로 셀룰로오스와 접촉시킴으로써 셀로비오스 수율이 향상된다. 그러나, 이 방법에서는 셀룰라아제의 정제 처리가 필요해지기 때문에 제조 공정이 복잡해지고, 셀룰라아제 정제에 사용하는 셀룰로오스 유도체, 키토산이 고가이기 때문에 비용고가 되는 과제가 있었다. 또한, 셀룰라아제는 셀룰로오스 유도체 또는 키토산과 동시에 셀룰로오스 효소 분해에 사용되기 때문에, 분해 반응액으로부터 이들을 제거하는 공정이 필요해지는 문제가 있었다.

종래, 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질에 전처리를 실시하여, 그 평균 중합도, 평균 입경, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율, 및 디에틸에테르 가용물 함유율을 특정한 범위로 제어한 셀룰로오스계 물질을 기질로 하고, β-글루코시다아제 활성과 결정 셀룰로오스 분해 활성의 활성비(β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)를 특정한 범위로 제어한 셀룰라아제로 효소 분해함으로써 단시간만에 셀룰로오스 분해율을 높이고, 셀로올리고당을 선택적으로 고수율로 생산하는 방법은 알려져 있지 않았다.

비특허 문헌 1: Cellulose Communications, 5, No 2, 91-97(1998)

비특허 문헌 2: 「셀룰라아제」 고단사 사이엔틱픽 발행, 97-104(1987)

특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)5-317073호 공보

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (평)7-184678호 공보

특허 문헌 3: 일본 특허 공개 (평)8-89274호 공보

특허 문헌 4: 일본 특허 공개 (평)8-308589호 공보

특허 문헌 5: 일본 특허 공개 (평)9-107087호 공보

특허 문헌 6: 일본 특허 공개 제2001-95594호 공보

특허 문헌 7: 일본 특허 공개 제2005-68140호 공보

특허 문헌 8: 일본 특허 공개 (평)01-256394호 공보

특허 문헌 9: 일본 특허 공개 (평)05-115293호 공보

특허 문헌 10: 일본 특허 공개 (평)05-227957호 공보

특허 문헌 11: 일본 특허 공개 (평)05-227958호 공보

본 발명은 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질을 원료로 하고, 특정한 셀룰라아제의 존재하에서 효소 분해함으로써 단시간만에 셀룰로오스 분해율을 높이고, 셀로올리고당을 선택적으로 고수율로 생산하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 수불용성의 천연 셀룰로오스계 물질을 원료로 하여, 평균 중합도, 평균 입경, 콜로이드상 셀룰로오스 성분, 및 디에틸에테르 가용물 함유율을 특정한 범위로 제어하고, 특정한 활성을 갖는 셀룰라아제를 사용하여 효소 분해함으로써 단시간만에 셀룰로오스 분해율을 높여, 셀로올리고당을 선택적으로 고수율로 얻을 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 하기와 같다.

(1) 평균 중합도가 700 이하이고, 평균 입경이 100 ㎛ 이하이고, 디에틸에테르 가용물 함유율이 1 질량％ 미만인 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질을 셀룰라아제의 존재하에서 효소 분해하는 것을 포함하는 셀로올리고당의 제조 방법.

(2) 평균 중합도가 700 이하이고, 콜로이드상 셀룰로오스 성분을 10 질량％ 이상 함유하고, 디에틸에테르 가용물 함유율이 1 질량％ 미만인 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질을 셀룰라아제의 존재하에서 효소 분해하는 것을 포함하는 셀로올리고당의 제조 방법.

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질이 평균 입경이 100 ㎛ 이하이고, 콜로이드상 셀룰로오스 성분을 10 질량％ 이상 함유하는 것인 셀로올리고당의 제조 방법.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질의 평균 중합도가 500 이하, 평균 입경이 50 ㎛ 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질의 평균 중합도가 400 이하, 평균 입경이 30 ㎛ 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.

(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질이 콜로이드상 셀룰로오스 성분을 15 질량％ 이상 함유하는 것인 셀로올리고당의 제조 방법.

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 셀룰라아제의 활성비(온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 0.7 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.

(8) 상기 (7)에 있어서, 상기 셀룰라아제의 활성비가 0.5 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.

(9) 상기 (8)에 있어서, 상기 셀룰라아제의 활성비가 0.35 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.

(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 디에틸에테르 가용물이 리그닌인 셀로올리고당의 제조 방법.

(11) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질이 셀룰로오스 I형 결정을 함유하는 것인 셀로올리고당의 제조 방법.

(12) 셀룰라아제 생산균을 배양하여 얻어지는 배양액 중의 β-글루코시다아제 활성과 결정성 셀룰로오스 분해 활성의 활성비(온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정성 셀룰로오스 분해 활성)가 0.5 이하인, 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 따른 셀룰라아제의 제조 방법.

(13) 상기 (12)에 있어서, 상기 β-글루코시다아제 활성과 결정성 셀룰로오스 분해 활성의 활성비가 0.35 이하인 셀룰라아제의 제조 방법.

(14) 상기 (12) 또는 (13)에 있어서, 상기 셀룰라아제 생산균이 β-글루코시다아제의 생산이 억제된 균주로서 선택함으로써 얻어지는 균주인 셀룰라아제의 제조 방법.

(15) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 상기 셀룰라아제 생산균의 배양에 있어서 배양 중의 pH를 3.5 미만으로 제어하는 셀룰라아제의 제조 방법.

(16) 상기 (12) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 상기 셀룰라아제 생산균이 트리코데르마(Trichoderma)속에 속하는 균주인 셀룰라아제의 제조 방법.

(17) 디에틸에테르 가용물 함유율이 2000 ppm 이하인 것을 특징으로 하는 셀로올리고당.

(18) 디에틸에테르 가용물 함유율이 2000 ppm 이하인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 셀로올리고당.

(19) 상기 (18)에 있어서, 디에틸에테르 가용물 함유율이 1000 ppm 이하인 셀로올리고당.

(20) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 셀로올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품, 화장품, 또는 의약품 조성물.

(21) 상기 (17) 또는 (18)에 기재된 셀로올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품, 화장품, 또는 의약품 조성물.

<발명의 효과>

본 발명의 수불용성의 천연 셀룰로오스계 물질의 효소 분해에 의해 셀로올리고당을 제조하는 방법에 의해, 짧은 반응 시간으로 셀룰로오스 분해율을 높여 셀로올리고당을 선택적으로, 고수율로 제조할 수 있다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

본 발명에 대하여, 특히 그 바람직한 양태를 중심으로, 이하에 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 사용하는 천연 셀룰로오스계 물질은 셀룰로오스를 함유하는 천연 유래의 수불용성 섬유질 물질이다. 그 유래는 식물성일 수도 있고, 동물성일 수도 있으며, 그것을 생산하는 동식물로서는, 예를 들면 목재, 대나무, 밀짚, 벼짚, 면, 모시, 바가스, 케나프, 사탕무우, 호야, 박테리아 셀룰로오스 등을 들 수 있으며, 원료로서 이들 중에서 1종의 천연 셀룰로오스계 물질을 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 혼합한 것을 사용할 수도 있다.

본 발명에 사용하는 셀룰로오스계 물질은 천연 셀룰로오스계 물질일 필요가 있다. 천연 셀룰로오스와 재생 셀룰로오스는 그 결정 형태로 구별할 수 있다. 본 발명의 천연 셀룰로오스계 물질은 셀룰로오스 I형 결정을 함유하고, 그 함유율은 1 ％ 이상일 필요가 있다. 보다 바람직한 셀룰로오스 I형 결정의 함유율은 50 ％ 이상이다. 여기서 말하는 셀룰로오스 I형의 결정형이란, 분말 광각 X선 회절법(리가꾸 덴끼(주) 제조, 상품명 로타플렉스 RU-300)에 의해 얻어지는 X선 회절 패턴으로 판별할 수 있는 것이며, 그 함유율은 X선 회절에 의해 얻어진 회절상의 총 피크 면적에서 차지하는, 셀룰로오스 I형 결정의 피크 면적의 백분율로 나타내는 것이다. 분말 광각 X선 회절 측정에 사용하는 셀룰로오스계 물질이 건조 상태라면 공지된 방법으로 분말화하여 측정에 사용할 수 있으며, 습윤 상태라면 공지된 방법으로 건조한 후, 분말화하여 측정에 사용할 수 있다. 셀룰로오스 I형 결정의 함유율이 높을수록 천연에 가까운 셀룰로오스계 물질을 효소 분해에 사용하게 되며, 셀룰로오스의 재생 처리 등의 인공적인 화학 처리 공정이 간략화되므로 바람직하다. 그 상한은 특별히 제한되지 않지만, 현재 알려져 있는 천연 셀룰로오스의 조성에서부터 99 ％ 미만이다.

본 발명에서 사용하는 천연 셀룰로오스계 물질은 수불용성이며, 여기서 말하는 수불용성이란, 천연 셀룰로오스계 물질 중에 90 질량％ 이상의 수불용성 성분을 함유하는 것이다. 이 수불용성 성분이란, 25 ℃의 순수한 물에 셀룰로오스계 물질을 분산시켜, 한외 여과(분획 분자량 10000)에 의해 수가용성 성분을 제거한 후, 수불용성 잔사를 정량함으로써 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용하는 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질의 평균 중합도는 700 이하이다. 여기서 말하는 평균 중합도는 「제14 개정 일본 약전」(히로까와 서점 발행)의 결정 셀룰로오스 확인 시험 (3)에 규정된 구리 에틸렌디아민 용액에 의한 환원비 점도법에 의해 측정할 수 있다. 평균 중합도가 700 이하이면, 셀룰로오스계 물질이 교반, 분쇄, 마쇄 등의 물리 처리를 받기 쉬워지므로, 그 콜로이드상 성분량을 용이하게 제어할 수 있다. 또한, 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질의 평균 중합도를 상기 범위로 제어함으로써, 셀룰로오스계 물질 중의 섬유질이 다공질화하기 때문에 효소 분해시의 효소-기질 접촉 확률이 증대하여 셀룰로오스 분해 속도가 향상된다. 바람직하게는 평균 중합도가 500 이하, 더욱 바람직하게는 400 이하이다. 평균 중합도가 작을수록 콜로이드상 성분량의 제어, 분해 속도 제어가 용이해지기 때문에 중합도의 하한은 특별히 제한되지 않지만, 간편한 조작으로 얻어지는 평균 중합도의 범위는 10을 초과하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질의 평균 입경은 100 ㎛ 이하이다. 여기서 말하는 평균 입경이란, 셀룰로오스계 물질을 0.2 질량％ 농도로 수현탁액으로 하고, 고전단 균질기(닛본 세이끼(주) 제조, 상품명 엑셀 오토 호모지나이저 ED-7, 처리 조건 회전수 5000 rpm, 3 분간)로 분산시켜 그 pH를 7.5 내지 8.5로 조정한 후, 원심 분리(구보따 쇼지(주) 제조, 상품명 6930형 원심 분리기, 처리 조건 원심력 2000 G, 5 분간)하여 원심 후의 상청 성분과 침강 성분으로 분획하여 각 성분의 중량비를 측정한다. 이어서, 이들 성분에 대하여 물을 매체로서 레이저 회절법(호리바 세이사꾸쇼(주) 제조, 상품명 LA-910, 초음파 처리 1 분)에 의해 얻어진 각 성분의 부피 빈도 입도 분포에 상청 성분과 침강 성분의 중량비를 곱하고, 합성한 부피 빈도 입도 분포에서의 누적 50 ％ 입경이다. 평균 입경이 100 ㎛ 이하이면, 셀룰로오스를 효소 분해할 때, 셀룰로오스와 셀룰라아제의 접촉 면적(접근율)이 증대되기 때문에, 셀로올리고당의 생성 속도, 수율이 향상되므로 바람직하다. 보다 바람직하게는 평균 입경이 50 ㎛ 이하이고, 특히 바람직하게는 30 ㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 10 ㎛ 이하이다. 평균 입경이 작을수록 셀로올리고당의 생성 속도, 생성 선택률, 수율이 향상되기 때문에 평균 입경의 하한은 특별히 제한되지 않지만, 간편한 조작으로 얻어지는 평균 입경의 범위는 0.01 ㎛ 이상이다.

본 발명에서 사용하는 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질은, 콜로이드상 셀룰로오스 성분을 10 질량％ 이상 함유할 필요가 있다. 여기서 말하는 콜로이드상 셀룰로오스 성분이란, 천연 셀룰로오스계 물질을 0.2 질량％ 농도로 수현탁액으로 하고, 고전단 균질기(닛본 세이끼(주) 제조, 상품명 엑셀 오토 호모지나이저 ED-7, 처리 조건 회전수 5000 rpm, 3 분간)로 분산시켜 그 pH를 7.5 내지 8.5로 조정한 후, 원심 분리(구보따 쇼지(주) 제조, 상품명 6930형 원심 분리기, 처리 조건 원심력 2000 G, 5 분간)하여 원심 후의 상청에 잔존하는 셀룰로오스 고형분의 질량 백분율이다. 콜로이드상 셀룰로오스 성분의 함유량이 10 질량％ 이상이면, 셀로올리고당의 생성 속도, 생성 선택률, 수율이 향상된다. 콜로이드상 셀룰로오스 성분의 함유량은 보다 바람직하게는 15 질량％ 이상이고, 특히 바람직하게는 40 질량％ 이상이다. 이 콜로이드상 셀룰로오스 성분량은, 셀룰로오스계 물질의 평균 입경과 독립적으로 효소 분해성에 작용하는 인자이다. 콜로이드상 셀룰로오스 성분량과 셀로올리고당의 생성 속도, 선택률, 및 수율 향상에의 메카니즘은 명확하지 않지만, 콜로이드상 셀룰로오스 성분이 증가함으로써, 기질이 되는 셀룰로오스가 현탁 안정화하고, 효소와 기질이 균일하게 접촉함으로써 상기한 효소 분해성을 향상시키는 것이라고 생각된다. 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유량은, 많으면 많을수록 효소 분해성을 향상시킬 수 있기 때문에, 그 상한은 특별히 제한되지 않지만, 간편한 전처리에 의해 달성되는 범위는 99.9 질량％ 이하이다.

본 발명에서 사용하는 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질의 디에틸에테르 가용물 함유율은 1 질량％ 미만이다. 여기서 말하는 디에틸에테르 가용물 함유율은, 셀룰로오스계 물질 중의 리그닌, 리그닌 분해물 등의 디에틸에테르에 가용인 불순물을 말하며, 「제14 개정 일본 약전」(히로까와 서점 발행)의 결정 셀룰로오스 순도 시험 (2)에 규정된 디에틸에테르 가용물의 정량법에 의해 측정할 수 있다. 리그닌 함유율이 1 질량％ 미만인 고순도 셀룰로오스를 사용함으로써, 효소 분해에 의해 얻어지는 셀로올리고당의 순도가 보다 향상된다. 또한, 셀로올리고당의 순도가 향상되면, 결과적으로 생성 수율도 향상되며, 효소 분해 후의 셀로올리고당의 정제, 셀룰라아제의 회수가 용이해진다. 보다 바람직하게는 디에틸에테르 가용물 함유율이 0.5 질량％ 이하이고, 더욱 바람직하게는 0.3 질량％ 이하이다. 이 디에틸에테르 가용물 함유율이 적을수록 상술한 셀로올리고당의 순도가 향상되기 때문에, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 간편한 전처리로 달성되는 리그닌 함유율의 범위는 0.0005 질량％ 이상이다.

천연 셀룰로오스계 물질의 평균 중합도, 평균 입경, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율, 및 디에틸에테르 가용물 함유율이 본 발명의 범위를 충족하기 위한 바람직한 처리 방법으로서는 이하의 것을 들 수 있다.

평균 중합도, 및 디에틸에테르 가용물 함유율을 제어하는 방법은, 공지된 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 일례로서 가수분해 처리를 들 수 있다. 또한, 이 가수분해 처리에 의해 셀룰로오스 섬유질 내부의 비정질 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스, 리그닌 등의 불순물이 제거되고, 섬유질 내부가 다공질화하여 효소 분해시에 섬유 내부까지 셀룰라아제가 침투하기 쉬워져, 셀룰로오스의 분해 속도, 셀로올리고당 수율이 모두 향상되기 때문에 바람직하다.

또한, 가수분해된 셀룰로오스계 물질은, 섬유질 내부가 다공질화되어 있기 때문에, 그것을 공지된 방법으로 더 처리하는 경우, 기계 처리를 받기 쉬워지고, 셀룰로오스계 물질의 평균 입경, 콜로이드상 성분 함유율의 제어가 용이해지기 때문에 바람직하다.

가수분해의 방법은 특별히 제한되지 않지만, 일례로서는 산 가수분해, 알칼리 산화 분해, 열수 분해, 스팀 익스플로우젼, 마이크로파 분해 등을 들 수 있다. 이들 방법은 어느 하나를 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다. 상기 중 산 가수분해를 행하는 경우에는, 셀룰로오스계 물질을 수계 매체에 분산시킨 상태로 양성자산, 카르복실산, 루이스산, 헤테로폴리산 등을 적량 첨가하여 교반시키면서, 가온함으로써 용이하게 평균 중합도를 제어할 수 있다. 이 때의 온도, 압력, 시간 등의 반응 조건은 셀룰로오스 종류, 셀룰로오스 농도, 산 종류, 산 농도에 따라 상이하지만, 목적으로 하는 평균 중합도가 달성되도록 적절하게 조정되는 것이다. 예를 들면, 상술한 산 가수분해 반응 조건으로서는 1 질량％ 이하의 무기산 수용액을 사용하여 100 ℃ 이상, 가압하에서 10 분 이상 셀룰로오스를 처리함으로써 산 등의 촉매 성분이 셀룰로오스 섬유 내부까지 침투하여 가수분해가 촉진되고, 사용하는 촉매 성분량이 적어지기 때문에 바람직하다.

평균 입경, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유량을 제어하는 방법도, 공지된 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 일례로서는 마쇄, 분쇄, 체를 사용한 분급, 사이클론, 원심 분리기를 이용한 원심 분리 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합한 방법일 수도 있다. 또한, 상술한 처리는 습식일 수도 있고, 건식일 수도 있으며, 각각 습식으로 얻어진 것끼리를 효소 분해 전에 혼합할 수도 있고, 각각 건식으로 얻어진 것끼리를 효소 분해 전에 혼합할 수도 있으며, 습식 또는 건식으로 얻어진 것을 조합할 수도 있다.

예를 들면, 습식으로 셀룰로오스를 처리하는 경우에는, 1 내지 99 ％의 셀룰로오스계 물질과 매체를 포함하는 셀룰로오스 분산체에, 공지된 마쇄, 분쇄 등을 실시함으로써, 셀룰로오스계 물질의 평균 입경 또는 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유량을 용이하게 조정할 수 있다. 여기서 사용되는 매체도 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 물, 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필알코올, 부틸알코올, 2-메틸부틸알코올, 벤질알코올 등의 알코올류, 펜탄, 헥산, 헵탄, 시클로헥산 등의 탄화수소류, 아세톤, 에틸메틸케톤 등의 케톤류를 들 수 있다. 특히, 유기 용제는 의약품, 식품 및 이들의 첨가제를 제조하는 공정에서 사용되는 것이 바람직하며, 「의약품 첨가물 사전」(야꾸지 닛뽀사(주) 발행), 「일본 약전」,「식품 첨가물 공정서」(모두 히로까와 서점 발행)에 용제로서 분류되어 있는 것을 들 수 있다. 물, 유기 용제는 이들을 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용하는 것도 자유로우며, 1종의 매체로 일단 분산시킨 후, 그 매체를 제거하고, 다른 매체에 분산시킬 수도 있다.

마쇄 방법으로서는 포터블 믹서(portable mixer), 입체 믹서, 측면 믹서 등의 한방향 회전식, 다축 회전식, 왕복 반전식, 상하 이동식, 회전 및 상하 이동식, 관로식 등의 교반 날개를 사용하는 마쇄 방법, 라인 믹서 등의 분류식 교반 마쇄 방법, 고전단 균질기, 고압 균질기, 초음파 균질기 등을 사용하는 마쇄 방법, 니이더를 사용한 회전 압출식의 마쇄 방법, 롤밀, 볼밀, 진동 볼밀, 비드밀 등의 압밀과 전단을 조합한 마쇄 방법 등의 어느 방법이든 사용할 수 있으며, 이들을 조합한 방법일 수도 있다.

분쇄 방법으로서는 스크린 밀, 햄머 밀 등의 스크린식 분쇄 방법, 플래시 밀 등의 날개 회전 전단 스크린식 분쇄 방법, 제트밀 등의 기류식 분쇄 방법, 롤밀, 볼밀, 진동 볼밀, 비드밀 등의 압밀과 전단을 조합한 분쇄 방법, 날개 교반식 분쇄 방법 등의 어느 방법이든 사용할 수 있으며, 이들을 조합한 방법일 수도 있다.

본 발명의 셀룰라아제란, 셀룰로오스를 분해하는 효소의 총칭이며, 셀룰로오스의 분해 활성을 갖고 있으면, 본 발명에서 말하는 셀룰라아제에 포함된다. 셀룰라아제 효소원으로서는, 예를 들면 셀룰라아제 생산성 생균체 그 자체 또는 그의 배양 상청액, 셀룰라아제 생산성 생균이 생산하는 효소를 정제한 것, 정제 효소를 부형제, 안정화제 등의 첨가제와 함께 제제화한 것 등을 들 수 있다. 셀룰라아제 제제품을 사용하여 효소 분해를 행하는 경우, 제제에 첨가되는 첨가제에도 특별히 제한은 없으며, 그 제형은 분말, 과립, 액체 등 중 어느 하나일 수 있다.

셀룰라아제의 기원에 대해서도 특별히 제한은 없으며, 예를 들면 공지된 셀룰라아제를 생산하는 미생물로서는 트리코데르마(Trichoderma)속, 아크레모늄(Acremonium)속, 아스퍼길루스(Aspergillus)속, 바실루스(Bacillus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 페니실륨(Penicillium)속, 아에로모나스(Aeromonus)속, 이르펙스(Irpex)속, 스포로트리쿰(Sporotrichum)속, 후미콜라(Humicola)속 등의 「셀룰라아제」(고단사 사이엔틱픽 발행(1987)), 「셀룰로오스의 사전」(아사꾸라 서점 발행 (2000))에 기재된 미생물이 생산하는 셀룰라아제를 들 수 있지만, 셀룰로오스를 분해하는 효소라면 상기 공지된 미생물 유래의 효소로 한정되지 않고, 신규로 발견된 미생물 유래의 효소도 본 발명의 셀룰라아제에 포함된다.

본 발명에서 사용하는 셀룰라아제는 β-글루코시다아제 활성과 결정 셀룰로오스 분해 활성의 활성비(온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 0.7 이하인 것이 바람직하다. 여기서 말하는 활성비는 셀룰라아제의 셀룰로오스 분해능(결정 셀룰로오스 분해 활성)에 대한 셀로올리고당의 분해능(β-글루코시다아제 활성)의 비로 표시된다. 상기 활성비가 작으면 작을수록 셀룰로오스 분해능이 높고, 올리고당 분해능이 낮으며, 올리고당의 생산성이 향상되기 때문에 바람직하다. 활성비는 0.5 이하가 보다 바람직하고, 0.4 이하가 더욱 바람직하고, 0.35 이하가 특히 바람직하고, 0.30 이하가 가장 바람직하다. 활성비는 작으면 작을수록 셀로올리고당의 수율이 향상되기 때문에 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 용이하게 달성시키는 활성비의 범위는 0.01 이상이다.

여기서 말하는 β-글루코시다아제란, 셀로올리고당의 일종인 셀로비오스를 기질로 하여 셀룰라아제를 수성 매체 중에서 작용시킨 경우, 셀로비오스로부터 글루코오스를 생성하는 효소 활성을 말하며, 반응액 1 mL 중에 1 분간 생성되는 글루코오스의 몰수(㎛ol/mL*분)로 측정되고, U(유닛)/mL이라는 단위로 표시된다. 이 β-글루코시다아제 활성은, 셀로비오스 2 질량％(알드리치 제조, 특등급)와 셀룰라아제를 pH 4.5의 50 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충액에 용해시켜, 마개를 한 상태에서 55 ℃ 수욕 중에서 1 시간 반응시킨 후의 반응액 중의 글루코오스 농도를 정량함으로써 측정할 수 있다.

또한, 여기서 말하는 결정 셀룰로오스 분해 활성이란, 결정 셀룰로오스를 기질로 하여 셀룰라아제를 수성 매체 중에서 작용시킨 경우, 셀로비오스, 셀로트리오스 등의 셀로올리고당과, 글루코오스를 생성하는 효소 활성을 말하며, 반응액 1 mL 중에 1 분간 생성되는 셀로올리고당 및 글루코오스의 총 몰수(㎛ol/mL* 분)로 측정되고, U(유닛)/mL이라는 단위로 표시된다. 이 결정 셀룰로오스 분해 활성은, 상술한 β-글루코시다아제 활성 측정법으로, 셀로비오스 대신에 결정 셀룰로오스 5 질량％(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 세오러스 PH-101을 수분 60 ％로서 산에이 세이사꾸쇼 제조의 상품명 만능 교반 혼합기로 훅 날개에 의해 90 분간, 126 rpm으로 혼련 교반한 것)를 사용하여 마찬가지로 효소 분해하고, 반응액 중의 셀로올리고당, 글루코오스 등의 분해 생성당 총량을 정량함으로써 측정할 수 있다.

상술한 각종 활성 측정법에 있어서, 반응액 중의 셀로올리고당 및 글루코오스는 고속 액체 크로마토그래피(칼럼: 시마즈 세이사꾸쇼 제조, 상품명 아사히팩(Asahipak) NH₂P-50, 고속 액체 크로마토그래피: 시마즈 세이사꾸쇼 제조, 상품명 SCL-10A형, 이동층: 아세토니트릴/물=75/25(용적비) 순환량: 1 mL/분, 시료액: 10 ㎕)에 의해 정량할 수 있다.

β-글루코시다아제 활성과 결정 셀룰로오스 분해 활성의 활성비(β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 본 발명의 범위를 충족하는 셀룰라아제를 얻는 방법으로서는 이하의 것을 들 수 있다.

셀룰라아제를 생산하는 균으로서는 (온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)비가 0.5 이하인 셀룰라아제를 생산하는 균주를 사용하는 것이 바람직하며, 활성비가 상술한 범위를 충족하면 어느 균주든 사용할 수 있다. 또한, 균주의 인공 변이 방법, 예를 들면 자외선 조사, X선 조사, 변이 유발제 처리 등, 또는 자연 발생에 의한 변이주, 또는 유전자 조작 또는 세포 융합에 의한 변이주에서도 (온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)비가 0.5 이하인 셀룰라아제를 생산하는 균주라면 모두 본 발명에 사용할 수 있다. 이 (온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)비는 0.35 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.2 이하이다. 활성비는 작으면 작을수록 셀로올리고당의 수율이 향상되기 때문에 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 용이하게 달성시키는 활성비의 범위는 0.01 이상이다.

이러한 온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성, 및 결정 셀룰로오스 분해 활성은 하기의 방법으로 측정된다.

(1) 결정 셀룰로오스 분해 활성

50 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 5)에 현탁한 5 질량％의 결정성 셀룰로오스(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 세오러스(Ceolus) PH-101을 수분 60 ％로서 산에이 세이사꾸쇼 제조의 상품명 만능 교반 혼합기로 훅 날개에 의해 90 분간, 126 rpm으로 혼련 교반한 것)의 기질액 0.4 ㎖에 적당하게 희석한 효소액을 0.1 ㎖ 첨가하여 40 ℃ 수욕 중에서 4 시간 반응시킨 후, 95 ℃에서 10 분간 가열하여 반응을 정지시켜 반응액 중의 글루코오스 농도를 HPLC법으로 정량한다. 1 분간 유리되는 글루코오스 및 셀로올리고당의 총량이 1 ㎛ole인 효소량을 1 효소 단위(1 U)라고 정의한다.

(2) β-글루코시다아제 활성

50 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 5)에 용해한 2.5 질량％ 셀로비오스(알드리치 제조, 특등급)의 기질액 0.4 ㎖에 효소액을 0.1 ㎖ 첨가하여 40 ℃의 수욕 중에서 4 시간 반응시킨 후, 100 ℃에서 10 분간 가열하여 반응을 정지하고, 반응액 중의 글루코오스 농도를 HPLC법으로 정량한다. 1 분간 1 ㎛ole의 글루코오스를 유리하는 효소량을 1 효소 단위(1 U)라고 정의한다.

상술한 각종 활성 측정법에 있어서, 반응액 중의 셀로올리고당 및 글루코오스는 상술한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정량할 수 있다.

여기서 사용하는 대표적인 균주로서는, 예를 들면 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei) NBRC31329주를 들 수 있다.

또한, (온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정성 셀룰로오스 분해 활성)비가 낮은 균주는, 예를 들면 다음 방법으로 얻어진다. 셀룰라아제 생산능을 갖는 미생물을, 필요하면 자외선 조사나 니트로소구아니딘과 같은 변이 유발제의 사용 등 공지된 변이 유도 처리를 행하고, 이들 균주로부터 (β-글루코시다아제 활성/결정성 셀룰로오스 분해 활성)비가 낮은 균주를 선택한다. 변이 유도 처리에 사용하는 미생물로서는, 예를 들면 친주(parent strain)로서 트리코데르마 리세이 NBRC31329를 사용하고, 포테이토 덱스트로오스 한천 사면 배지 상에서 28 ℃로 3 내지 10 일간 배양한다. 생성된 포자를 생리적 식염수에 10⁵ 내지 10⁸개/mL가 되도록 현탁하고, EMS(에틸 메탄술포네이트)로 변이 처리를 실시한다(100 내지 500 ㎍/㎖, pH 7.0, 28 ℃, 5 내지 24 시간). (온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정성 셀룰로오스 분해 활성)비가 낮은 균주의 선택은, 이 변이 유발 처리 포자의 현탁액으로부터 원심 분리에 의해 포자를 모아 잘 세정하고, 글루코오스를 탄소원으로서 배양하여 배양물의 효소 활성을 공지된 방법으로 측정함으로써 달성된다. 예를 들면, 각 변이 처리 균주의 배양물을 사용하여, 셀로비오스 또는 결정 셀룰로오스를 기질로서 효소 분해하여 생성된 환원당을 정량할 수도 있으며, 공지된 발색 기질을 사용하여 배양물과 효소 반응시킴으로써 정성적으로 목적하는 균주를 선택할 수도 있다.

셀룰라아제 생산 균주를 배양하고, 배양 상청액으로부터 셀룰라아제를 취득할 수 있다. 배지에 사용되는 탄소원으로서는 셀룰로오스 파우더, 셀로비오스, 여과지, 일반 종이류, 톱밥, 맹장지, 왕겨, 바가스, 대두 지게미, 커피 지게미, 전분, 락토오스 등이 사용된다. 질소원으로서는 황산암모늄, 질산암모늄 등의 무기 암모늄염, 요소, 아미노산, 육류 엑기스, 효모 엑기스, 폴리펩톤, 단백질 분해물 등의 유기 질소 함유물이 사용된다. 무기 염류로서는 KH₂PO₄, MgSO₄ㆍ7H₂O, CaCl₂ㆍ2H₂O, Fe₂Cl₃ㆍ6H₂O, MnCl₃ㆍ4H₂O, ZnSO₄ㆍ7H₂O 등이 사용된다. 필요하면 유기 미량 영양물을 함유하는 배지가 사용된다. 배양에는 통상적인 통기 교반 배양 장치가 사용되며, 상기 배지를 사용하여 생산 균주의 생육 가능한 온도, 생육 가능한 pH 부근에서 제어된다. 이어서, 배양액으로부터 원심 분리, 여과 등의 공지된 방법에 의해 균체를 제거하여 상청액을 얻는다. 이 상청액은 그대로 조 효소액으로서 사용할 수 있다.

또한, (온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)비를 낮게 억제하는 배양 방법으로서, 예를 들면 배양 중, 배양액의 pH를 pH 3.5 미만 또한 셀룰라아제 생산균의 생육 가능한 pH 이상으로 제어하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 상기 트리코데르마 리세이 NBRC31329주 또는 그 변이주를 포테이토 덱스트로오스 한천 사면에서 25 내지 35 ℃로 3 내지 10 일간 배양하여 배양 현탁 및 용해를 행하고, 셀룰로오스를 탄소원으로 하는 배지를 500 mL 용적의 삼각 플라스크에 100 mL 분주하고, 오토클레이브 멸균한 배지에 식균하여 28 ℃에서 2 내지 4 일간 전배양을 행한다. 또한, 동일한 조성의 배지 3 L를 5 L의 단지 발효기에 넣어 오토클레이브 살균한 배지에 전배양액을 이식하고, 온도 28 ℃, 교반 200 내지 400 rpm, 통기 0.3 내지 1 vvm으로 배양을 행하고, 배양 중 NaOH 또는 암모니아수로 pH 2 내지 3.5, 바람직하게는 2.5 내지 3.0으로 제어한다. 4 내지 7일간 배양을 행한 후, 배양액을 원심 분리, 여과 등의 공지된 방법에 의해 균체를 제거하여 상청액을 얻는다. 이 상청액은 그대로 조 효소액으로서 사용할 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어진 효소 조 정제액은, 또한 통상적인 단백 정제법, 황산암모늄 분획, 용매에 의한 침전 분획, 칼럼 크로마토그래피 등에 의한 정제를 행할 수도 있다.

또한, 셀룰라아제를 시판 중인 효소로부터 얻는 경우에는, 통상적인 단백 정제 방법인 황산암모늄 분획, 용매에 의한 침전 분획, 칼럼 크로마토그래피 등에 의한 정제를 행하여 (온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)비가 0.7 이하인 분획을 얻는다.

이하에 본 발명의 셀로올리고당의 제조 방법을 설명한다.

본 발명의 셀로올리고당의 제조 방법은, 본 발명의 천연 셀룰로오스계 물질을 셀룰라아제의 존재하에서 효소 분해하는 방법이며, 여기서 사용하는 셀룰라아제는 β-글루코시다아제 활성과 결정 셀룰로오스 분해 활성의 활성비(온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 0.7 이하인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 얻어진 셀로올리고당을 주성분으로 하는 수용액은 공지된 방법으로 정제 및/또는 건조된다.

효소 분해 방법은 공지된 방법을 사용하는 것이 바람직하며, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 일례로서는 기질로서 본 발명의 셀룰로오스계 물질을 수성 매체 중에 현탁시키고, 본 발명의 셀룰라아제를 첨가하여 교반 또는 진탕하면서 가온하여 당화 반응을 행하는 방법을 들 수 있다.

상기 방법에 있어서, 현탁 방법, 교반 방법, 셀룰라아제ㆍ기질의 첨가 방법ㆍ첨가 순서, 이들의 농도 등의 반응 조건은, 셀로올리고당이 보다 고수율로 얻어지도록 적절하게 조정되는 것이다. 이 때의 반응액의 pH 및 온도는 효소가 실활하지 않는 범위 내이면 되며, 일반적으로는 상압에서 반응을 행하는 경우, 온도는 5 내지 95 ℃, pH는 1 내지 11의 범위일 수 있다. 또한, 상기 압력, 온도 및 pH에 대해서도, 상기와 마찬가지로 셀로올리고당이 보다 고수율로 얻어지도록 적절하게조정되는 것이지만, 상술한 트리코데르마 리세이 NBRC31329주 또는 그의 변이주를 셀룰라아제 생산균으로 하고, 얻어진 셀룰라아제를 사용하는 경우에는 셀룰로오스의 효소 분해는 상압에서, 아세트산 또는 인산 완충액 중에서 온도 50 내지 60 ℃, pH 3.0 내지 5.5의 범위에서 행하는 것이 바람직하다.

상기 효소 반응은 배치식으로 행할 수도 있고, 연속식으로 행할 수도 있다. 효소 분해 반응에 있어서, 셀로비오스에 의한 생성물 저해를 피하기 위해서는, 반응계 내의 셀로비오스 농도를 특정 범위로 유지하는 것이 셀로올리고당의 생산성을 향상시키는 데 있어서 중요하다. 반응계 내의 셀로비오스 농도를 특정 범위로 유지하는 방법으로서는 한외 여과, 역침투 여과 등의 막 여과에 의해, 반응계로부터 생성된 셀로비오스를 추출하는 방법일 수도 있고, 활성탄, 대나무, 목재 등의 건조 식물분 등의 유기 다공질 기재, 이산화규소 등의 무기 다공질 기재 등을 반응계에 도입하고, 이들에 셀로비오스를 흡착시키는 방법일 수도 있고, 셀룰로오스 기질을 칼럼 등에 고정화하여 셀룰라아제를 포함하는 반응액을 유통시키는 방법일 수도 있고, 셀룰라아제를 고분자 등에 고정화하여 셀룰로오스를 포함하는 반응액을 유통시키는 방법일 수도 있다.

상술한 효소 분해에 의해 얻어진 셀로올리고당을 주성분으로 하는 수용액은, 필요에 따라 탈색, 탈염, 효소 제거 등의 정제 처리를 실시할 수 있다. 정제 방법은 공지된 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 활성탄 처리, 이온 교환 수지 처리, 크로마토그래피 처리, 정밀 여과, 한외 여과, 역침투 여과 등의 여과 처리, 정석 처리 등을 이용할 수 있고, 이들을 단독으로 이용할 수도 있으며, 2종 이상을 조합할 수도 있다.

상기한 방법으로 정제된 셀로올리고당을 주성분으로 하는 수용액은 그대로 사용할 수도 있지만, 필요에 따라 건조에 의해 고화시킬 수도 있다. 건조 방법은 공지된 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 분무 건조, 동결 건조, 드럼 건조, 박막 건조, 선반 건조, 기류 건조, 진공 건조 등을 이용할 수도 있고, 이들을 단독으로 이용할 수도 있으며, 2종 이상을 조합할 수도 있다.

상기한 정제, 건조 처리시의 셀로올리고당의 매체로서는 물 이외에, 필요에 따라 유기 용제 등을 사용할 수도 있다. 여기서 사용되는 유기 용제에도 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 의약품, 식품 및 이들의 첨가제를 제조하는 공정에서 사용되는 것이 바람직하며, 「의약품 첨가물 사전」(야꾸지 닛뽀사(주) 발행), 「일본 약전」, 「식품 첨가물 공정서」(모두 히로까와 서점 발행)에 용제로서 분류되어 있는 것을 들 수 있다. 물, 유기 용제는 이들을 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용하는 것도 자유로우며, 1종의 매체로 일단 분산시킨 후, 그 매체를 제거하고, 다른 매체에 분산시킬 수도 있다.

상기한 공정을 거친 셀로올리고당의 형태에는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 상온에서 고체, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 용액상으로 사용할 수 있다. 고체상 셀로올리고당의 일례로서는 분말, 과립, 펠릿, 성형체, 적층체, 고체 분산체 등을 들 수 있다.

이어서, 본 발명의 방법으로 얻어지는 셀로올리고당에 대하여 설명한다.

본 발명의 셀로올리고당은 디에틸에테르 가용물 함유율이 2000 ppm 이하인 것이 바람직하며, 1000 ppm 이하인 것이 보다 바람직하다. 여기서 말하는 디에틸에테르 가용물 함유율은, 셀룰로오스계 물질 중의 리그닌, 리그닌 분해물 등의 디에틸에테르에 가용인 불순물 함유율을 말하며, 「제14 개정 일본 약전」(히로까와 서점 발행)의 결정 셀룰로오스 순도 시험 (2)에 규정된 디에틸에테르 가용물의 정량법에 의해 측정할 수 있다. 디에틸에테르 가용물 함유율이 2000 ppm 이하인 셀로올리고당은 불순물이 적기 때문에 백색도가 높고, 상기 셀로올리고당을 식품, 화장품, 의약품에 사용할 때의 정제가 용이해지기 때문에 바람직하다. 특히 셀로올리고당을 의약품 등의 활성 성분과의 조성물로 할 때에는, 활성 성분의 분해를 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 상기 셀로올리고당을 화학 변환 원료로서 사용할 때에는, 불순물이 적어서 부반응이 생기기 어렵고, 화학 변환 수율이 향상되기 때문에 바람직하다. 보다 바람직하게는 디에틸에테르 가용물 함유율이 1000 ppm 이하이고, 더욱 바람직하게는 500 ppm 이하, 특히 바람직하게는 300 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하이다. 이 디에틸에테르 가용물 함유율이 적을수록 상술한 효과가 얻어지기 때문에 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 간편한 처리로 달성되는 리그닌 함유율의 범위는 0.1 ppm 이상이다.

본 발명에 의해 얻어지는 셀로올리고당의 용도는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 식품, 화장품, 의약품, 일반 공업 제품 등의 분야에서 식품 성분, 화장품 성분, 색소 성분, 향료 성분, 의약품 약효 성분, 농약 성분, 사료 성분, 비료 성분, 배지 성분, 분석용 시약 성분 및 첨가제, 중간 원료, 발효 원료 등으로서 사용할 수도 있다.

본 발명에 의해 얻어지는 셀로올리고당은, 식품에서는 예를 들면 젤리, 푸딩, 요구르트 등의 겔, 마요네즈, 드레싱, 소스류, 육즙, 스프, 야채 가공품 등의 조미료, 카레, 저민 고기, 미트 소스, 스튜, 스프 등의 레토르트 식품, 냉동 식품, 햄버거, 베이컨, 소시지, 살라미 소시지, 햄류 등의 축산 가공품, 생선묵, 생선 꼬치, 어육 햄ㆍ소시지, 튀김 생선묵 등의 어류 페이스트 제품, 빵, 생면, 건면, 마카로니, 스파게티, 중국식 찐빵 피류, 케이크 믹스, 프리믹스, 화이트 소스, 교자ㆍ춘권 등의 피류 등의 밀 가공 식품, 카레, 소스, 스프, 해산물 조림, 잼 등의 통조림, 병조림류, 캔디, 트로키, 정제형 과자, 초콜렛, 비스킷, 쿠키, 쌀과자, 일본과 서양 과자, 양생 과자, 스낵 과자, 설탕 과자, 푸딩 등의 과자류, 튀김 식품류, 고로케, 교자, 중국식 찐빵 등의 조리 가공품, 야채 페이스트, 저민 고기, 과실 페이스트, 어패류의 페이스트 등의 페이스트류이다. 또한, 아이스크림, 아이스밀크, 락트 아이스, 휘핑 크림, 연유, 버터, 요구르트, 치즈, 화이트 소스 등의 유제품, 마가린, 페트 스프레드, 쇼트닝 등의 유지 가공품 등이 있다. 또한, 콜라 등의 탄산 음료, 탄산 함유품, 알코올 함유품, 유제품과 혼합한 과실 음료, 과즙 또는 과실 함유 음료, 우유 음료 등의 음료, 커피, 우유, 두유, 코코아 우유, 후르츠 우유, 요구르트 등의 락트산/우유 음료 등, 엽차, 우롱차, 가루 녹차, 홍차 등의 차 음료 등에 사용할 수도 있다.

본 발명에서 얻어지는 셀로올리고당은 유산균, 락트산 간균 등의 활성화 등의 장내 유용 세균총 부활, 혈중당 농도, 혈중 인슐린 농도의 감소, 혈중 콜레스테롤의 감소, 체지방률의 감소, 지질ㆍ당질 대사 촉진 기능, 변통ㆍ변 냄새 개선, 저항 촉성 등의 각종 생리 활성을 기대할 수 있기 때문에, 상기한 통상적인 식품 용도에 추가하여 생리 활성 물질로서, 기능성 식품, 건강 식품, 다이어트 식품 등의 용도로 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 의해 얻어지는 셀로올리고당은 고순도이기 때문에, 각종 셀리올리고당 유도체로의 화학 변환 원료로서 사용할 수도 있다.

본 발명을 실시예에 기초하여 설명하지만, 본 발명은 이것들로 한정되는 것이 아니다.

<실시예 1>

시판 중인 침엽수 유래의 용해 펄프(평균 중합도 781, 디에틸에테르 가용물 함유율 1.1 ％, 평균 입경 174 ㎛) 2 kg, 3 N 염산 수용액 30 L를 저속형 교반기(30 L 반응기)에 넣고, 105 ℃에서 30 분간 교반하면서 가수분해하였다. 얻어진 산불용성 잔사는 누체(Nutsche)를 사용하여 여과하고 70 L의 순수한 물로 4회 세정한 후, 고형분 40.1 ％의 습식 케이크를 얻었다(평균 중합도 220, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.03 질량％, 평균 입경 69.1 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율 13.4 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 85 ％).

이 습식 케이크가 고형분 5 ％, 단백질 농도로 0.25 ％가 되도록 트리코데르마 유래의 시판 중인 셀룰라아제 제제 상품명 T「아마노」4를 0.2 N 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)으로 용해시킨 것을 첨가하여 전량 25 mL로 하고, 50 mL의 유리제 바이알병에 넣었다. 이 유리제 바이알병을 48 ℃의 항온 진탕 수조에 넣고, 진탕 속도 90 rpm으로 하기 표 1에 나타낸 소정 시간 동안 반응시켰다. 반 응 개시 후, 표 1에 나타낸 소정 시간 동안 반응액을 현탁 상태로 300 ㎕ 분주하고, 한외 여과 모듈(분획 분자량 5000)을 사용하여 효소를 제거한 후, 고속 액체 크로마토그래피(시마즈 세이사꾸쇼(주) 제조, 칼럼: 도소(주) 제조, 상품명 TSK-GEL AMIDO-80, 이동상: 아세토니트릴/물=6/4)로 분석하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다. 표 중의 올리고당 선택률은 (셀로비오스 농도 + 셀로트리오스 농도)/전체 당 농도 × 100(％)로 산출한 값이다.

<실시예 2>

실시예 1과 동일하게 시판 중인 침엽수 유래의 용해 펄프(평균 중합도 781, 디에틸에테르 가용물 함유율 1.1 ％, 평균 입경 174 ㎛)를 산 가수분해하고, 얻어진 습식 케이크를 플록상으로 60 ℃의 기류식 건조기에 넣고 12 시간 건조하였다.

얻어진 건조물을 가정용 믹서로 해쇄하고, 얻어진 셀룰로오스 조쇄물을 기류식 분쇄기((주)세이신 기교 제조, 상품명 제트밀 STJ-200형)로 분쇄하여 셀룰로오스 미분쇄물을 얻었다(평균 중합도 220, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.03 질량％, 평균 입경 16.4 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율 17.5 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 86 ％). 이 셀룰로오스 미분쇄물을 기질로서, 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 분해를 행하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.

실시예 2는 실시예 1에 대하여 평균 중합도, 디에틸에테르 가용물 함유율이 동일하고, 평균 입경을 작게, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율을 많이 한 것이다. 표 1로부터, 실시예 2는 실시예 1에 대하여 기질의 평균 입경을 작게 함으로써, 당 농도 10 ％, 20 ％에 도달하기까지의 반응 시간이 짧아지고, 또한 어느 당 농도에 있어서나 올리고당 선택률이 향상되었다.

<실시예 3>

시판 중인 활엽수 유래의 용해 펄프(평균 중합도 1682, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.9 ％, 평균 입경 91 ㎛)를 실시예 1과 동일하게 산 가수분해하고, 얻어진 습식 케이크에 순수한 물을 첨가하여 셀룰로오스 농도 10 ％의 분산액으로 하고, 고전단 균질기(도꾸슈 기까(주) 제조, 상품명 TK 호모지나이저)로 30 분간 교반하여 셀룰로오스 분산체를 얻었다(평균 중합도 151, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.1 질량％, 평균 입경 8.7 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율 55.5 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 85 ％). 이 셀룰로오스 분산체를 기질로 하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 분해를 행하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.

실시예 3은 실시예 1, 2에 비하여 평균 중합도가 작고, 디에틸에테르 가용물 함유율이 높으며, 평균 입경을 작게, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율을 많이 한 것이다. 표 1로부터, 실시예 3은 실시예 1, 2에 대하여 더욱 반응 시간이 단축되고, 각각의 당 농도에서의 올리고당 선택률도 향상되었다. 또한, 실시예 1 및 2는 당 농도의 상승에 따라 올리고당 선택률이 저하했지만, 실시예 3은 당 농도가 상승해도 올리고당 선택률은 저하하지 않았다.

<실시예 4>

실시예 1과 동일하게 시판 중인 침엽수 유래의 용해 펄프(평균 중합도 781, 디에틸에테르 가용물 함유율 1.1 질량％, 평균 입경 174 ㎛)를 사용하고, 가수분해 조건을 염산 농도 5 N 염산 수용액, 18 ℃, 12 시간으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 가수분해, 산 불용성 잔사를 세정, 여과하여 습식 케이크를 얻었다(평균 중합도 690, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.7 ％, 평균 입경 49.8 ㎛). 이 습식 케이크를 셀룰로오스 10 ％ 농도의 수분산체로 하여, 초고성능 분산기ㆍ습식 미분쇄기(아시자와(주) 제조, 상품명 펄밀 RL, Φ2 mm 알루미나 비드 사용, 충전율 80 ％)를 사용하여 압밀ㆍ마쇄 처리를 실시하여 셀룰로오스 미립자 분산체를 얻었다(평균 중합도 690, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.7 질량％, 평균 입경 7.1 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율 87.5 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 77 ％). 이 셀룰로오스 미립자 분산체를 기질로 하여, 실시예 1과 동일하게 효소 분해를 행하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.

실시예 4는 실시예 1, 2 및 3에 비하여 평균 중합도 및 디에틸에테르 가용물 함유율이 높지만, 평균 입경이 작고, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율이 큰 것이다. 표 1로부터, 실시예 4도 실시예 3과 올리고당 선택률은 동등했지만, 반응 속도는 향상되었다. 또한, 실시예 4는 당 농도가 상승하더라도 셀로올리고당의 수율은 거의 저하하지 않았다.

<실시예 5>

시판 중인 코튼 린터 유래의 펄프(평균 중합도 1853)를 사용하고, 가수분해 조건을 염산 농도 5 N 염산 수용액, 130 ℃, 12 시간으로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 가수분해하여 습식 케이크를 얻었다(평균 중합도 49). 이 습식 케이크를 셀룰로오스 10 ％ 농도의 수분해체로 하고, 초고성능 분산기ㆍ습식 미분쇄기(아시자와(주) 제조, 상품명 펄밀 RL, Φ2 mm 알루미나제 비드 사용, 충전율 80 ％) 를 사용하여 압밀ㆍ마쇄 처리를 실시하여 셀룰로오스 미립자 분산체를 얻었다(평균 중합도 49, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.9 질량％, 평균 입경 10.3 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 함유량 94.1 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 75 ％). 이 셀룰로오스 미립자 분산체를 실시예 1과 동일한 방법으로 효소를 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 유래의 나가세 산교(주) 제조의 상품명 「셀룰레이스나가세(CELLULASENAGASE)」로 바꾸어 효소 분해를 행하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.

실시예 5는 실시예 4에 비하여 평균 중합도가 작고, 디에틸에테르 가용물 함유율이 많으며, 평균 입경은 크지만, 콜로이드상 셀룰로오스 성분량은 많은 것이다. 표 1로부터, 실시예 5는 실시예 4에 대하여 반응 시간은 반감하고, 올리고당 선택률은 향상되었다.

<비교예 1>

실시예 1에서 사용한 시판 침엽수 유래의 용해 펄프를 사용하고, 3 N 염산 수용액 중에서 셀룰로오스 농도 10 ％의 분산액으로 하여 상온에서 고전단 균질기도꾸슈 기까(주) 제조, 상품명 TK 호모지나이저)로 60 분간 교반하여 셀룰로오스 분산체를 얻었다(평균 중합도 723, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.9 질량％, 평균 입경 49.3 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율 10.2 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 85 ％). 이 산 가수분해를 거치지 않은 셀룰로오스 분산체를 기질로 하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 분해를 행하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.

비교예 1은 평균 입경, 디에틸에테르 가용물 함유율이 본 발명의 범위에 있고, 평균 중합도가 본 발명의 범위를 초과하는 것이다. 표 1로부터, 비교예 1은 각 실시예에 대하여 당 농도 10 및 20 ％에 도달하기까지의 반응 시간이 길고, 효소 분해가 느렸다. 또한, 올리고당 선택률은 어느 당 농도에 있어서나 각 실시예의 수준에 도달하지 못하였다.

<비교예 2>

실시예 4의 조작에 의해 얻어진 습식 케이크를 셀룰로오스 10 ％ 농도의 수분산체로 하고, 메쉬 45 ㎛의 체를 사용하여 습식 분획한 후, 체 상에 남은 고형분(평균 중합도 690, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.7 질량％, 평균 입경 107.3 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율 5.2 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 85 ％)을 기질로서 사용하여, 실시예 1과 동일하게 효소 분해를 행하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.

비교예 2는 평균 중합도, 디에틸에테르 가용물 함유율이 본 발명의 범위에 있고, 평균 입경이 본 발명의 범위를 초과하는 것이다. 표 1로부터, 비교예 2는 각 실시예에 대하여 반응 속도가 느리고, 올리고당 선택률도 실시예의 수준에 도달하지 못하였다.

<비교예 3>

시판 중인 미표백 침엽수 유래의 크래프트 펄프(평균 중합도 1670, 디에틸에테르 가용물 함유율 12 질량％, 평균 입경 154 ㎛)를, 가수분해 조건을 염산 농도 4 N 염산 수용액, 35 ℃, 18 시간으로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 가수 분해, 산 불용성 잔사를 세정, 여과하여 습식 케이크를 얻었다(평균 중합도 490, 디에틸에테르 가용물 함유율 4.4 질량％, 평균 입경 48.7 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율 12.8 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 86 ％).

이 습식 케이크를 사용하여, 실시예 1과 동일하게 효소 분해를 행하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.

비교예 3은 평균 중합도, 평균 입경이 본 발명의 범위에 있고, 디에틸에테르 가용물 함유율이 본 발명의 범위를 초과하는 것이다. 표 1로부터, 비교예 3은 비교예 1 및 2에 대하여 셀로올리고당 수율은 약간 향상되었지만, 각 실시예에 대해서는 반응 속도, 올리고당 선택률 모두 실시예의 수준에는 도달하지 못하였다.

<제조예 1>

포테이토 덱스트로오스 배지(Difco사 제조)에 트리코데르마 리세이 NBRC31329를 접종하여 37 ℃에서 7 일간 배양한 후, 그 배지 표면으로부터 포자 1 백금이(loopful)를 취하여, 폴리펩톤 1 g, 효모 엑기스 0.5 g, 인산1칼륨 2 g, 황산암모늄 1.5 g, 황산마그네슘 0.3 g, 염화칼슘 0.3 g, 미량 원소 1 mL(붕산 6 mg, 몰리브덴산암모늄 4수화물 26 mg, 염화철(III) 6수화물 100 mg, 황산구리 5수화물 40 mg, 황산망간 4수화물 8 mg, 황산아연 7수화물 200 mg을 전량 100 mL의 정제수에 용해시킨 것), 아데카놀 LG-109 1 mL, 결정 셀룰로오스(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 PH-101) 10 g을 전량 1 L의 정제수에 현탁 및 용해시켜 500 mL 용적 삼각 플라스크에 100 mL 분주하고, 오토클레이브 멸균한 배지에 식균하여 28 ℃에서 3 일간 전배양을 행하였다. 또한, 동일한 배지 1 L를 넣은 5 L의 단지 발효기에 전배양액을 10 mL 이식하고, 28 ℃, 교반 400 rpm, 통기 0.5 vvm으로 배양을 행하고, 배양 중 NaOH로 pH 3으로 제어하였다. 7 일간 배양을 행한 배양 후의 액체를 원심 분리하고, 상청을 메쉬 0.46 ㎛의 정밀 여과막으로 제균하고, 여과액을 분획 분자량 13000의 한외 여과막(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 마이크로자 펜실형 모듈 ACP-0013)으로 부피비 10배 농축하여 조 효소를 얻었다.

이 조 효소에 대하여 활성비(온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)를 측정한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

<제조예 2>

포테이토 덱스트로오스 배지(Difco사 제조)에 트리코데르마 리세이 NBRC31329를 접종하여 37 ℃에서 7 일간 배양한 후, 그 배지 표면으로부터 포자 1 백금이를 취하여, 폴리펩톤 1 g, 효모 엑기스 0.5 g, 인산1칼륨 2 g, 황산암모늄 1.5 g, 황산마그네슘 0.3 g, 염화칼슘 0.3 g, 미량 원소 1 mL(붕산 6 mg, 몰리브덴산암모늄 4수화물 26 mg, 염화철(III) 6수화물 100 mg, 황산구리 5수화물 40 mg, 황산망간 4수화물 8 mg, 황산아연 7수화물 200 mg을 전량 100 mL의 정제수에 용해시킨 것), 아데카놀 LG-109 1 mL, 결정 셀룰로오스(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 PH-101) 10 g을 전량 1 L의 정제수에 현탁 및 용해시켜 500 mL 용적 삼각 플라스크에 100 mL 분주하고, 오토클레이브 멸균한 배지에 식균하여 28 ℃에서 3 일간 전배양을 행하였다. 또한, 동일한 배지 1 L를 넣은 5 L의 단지 발효기에 전배양액을 10 mL 이식하고, 28 ℃, 교반 400 rpm, 통기 0.5 vvm으로 배양을 행하고, 배양 중 NaOH로 pH 4로 제어하였다. 7 일간 배양을 행한 배양 후의 액체를 원심 분리하고, 상청을 메쉬 0.46 ㎛의 정밀 여과막으로 제균하고, 여과액을 분획 분자량 13000의 한외 여과막(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 마이크로자 펜실형 모듈 ACP-0013)으로 부피비 10배 농축하여 조 효소를 얻었다.

이 조 효소에 대하여 활성비(온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)를 측정한 결과를 표 2에 나타내었다.

<제조예 3>

시판 중인 셀룰라아제(고도 슈세이 제조, 상품명 GODO-TCD)를 500 mg/mL가 되도록 50 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 4.8)에 용해하고, 음이온 교환 칼럼(아마샴 제조, 상품명 DEAE-Sepharose FF)에 도입하여, 칼럼 내를 50 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 4.8)과, 1 몰％의 염화나트륨을 용해시킨 50 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 4.8)을 선형 구배법에 의해 유통시킴으로써, 시판 효소로부터 분획 샘플을 얻었다. 얻어진 모든 분획에 대하여 β-글루코시다아제 활성 및 결정 셀룰로오스 분해 활성을 측정하고, 활성비(온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 0.5 이하인 분획을 조합하였다. 얻어진 셀로비오스 분획을 분획 분자량 10000의 한외 여과 모듈(밀리포어 제조, 상품명 아미콘 울트라 15 센트리푸갈 필터)로 부피비 5배까지 농축하여 정제 효소를 얻었다(정제 효소 중의 단백질 농도는 15.4 mg/mL).

이 정제 효소에 대하여, 활성비(온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)를 측정한 결과를 표 2에 나타내었다.

<실시예 6>

시판 중인 침엽수 유래의 용해 펄프(평균 중합도 781, 디에틸에테르 가용물 함유율 1.1 ％, 평균 입경 174 ㎛) 2 kg을 사용하여 저속형 교반기(30 L 반응기)에 넣고, 가수분해 조건을 3 N 염산 수용액, 110 ℃, 30 분으로 하여 가수분해하고, 산 불용성 잔사를 세정, 여과하여 습식 케이크를 얻었다. 얻어진 습식 케이크를 플록상(flock form)으로 하여 60 ℃의 오븐 중에서 12 시간 통기 건조시켰다. 건조물에 정제수를 첨가하고, 수분 60 ％로 하여 믹서(산에이 세이사꾸쇼 제조, 상품명 만능 교반 혼합기, 훅 날개, 90 분간, 126 rpm)로 마쇄하여 마쇄 셀룰로오스를 얻었다(평균 중합도 220, 평균 입경 9.1 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분량 66.1 질량％, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.03 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 78 ％).

이 마쇄 셀룰로오스 5 질량％를 제조예 1에서 얻어진 조 효소의 50 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 4.8)에 현탁 용해시켜 전량 25 mL로 하고, 유리제 바이알병에 넣었다. 이 유리제 바이알병을 55 ℃의 항온 진탕 수조에 넣고, 진탕 속도 90 rpm으로 반응시켰다. 반응 개시 후 소정 시간, 반응액을 현탁 상태로 300 ㎕ 분주하고, 한외 여과 모듈(분획 분자량 10000)을 사용하여 효소, 미분해 셀룰로오스를 제거한 후, 고속 액체 크로마토그래피로 당 농도를 분석하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

반응액 중의 셀로올리고당, 글루코오스의 정량은 고속 액체 크로마토그래피(칼럼: 시마즈 세이사꾸쇼 제조 상품명 Asahipak NH₂P-50, 고속 액체 크로마토그래피: 시마즈 세이사꾸쇼 제조 상품명 SCL-10A형, 이동층: 아세토니트릴/물=75/25(용적비) 순환량: 1 mL/분. 시료액: 10 ㎕)로 행하였다.

표 중의 반응 시간은, 투입 셀룰로오스량에 대하여 셀로올리고당, 글루코오스의 총 생성 당량의 비가 20 질량％에 도달하는 데 필요한 반응 시간이다. 또한, 올리고당 선택률은 (셀로비오스 농도 + 셀로트리오스 농도)/전체 당 농도 × 100(％)로 산출한 값으로 표시된다.

<실시예 7>

시판 중인 침엽수 유래의 용해 펄프(평균 중합도 781, 디에틸에테르 가용물 함유율 1.1 ％, 평균 입경 174 ㎛)를 사용하고, 가수분해 조건을 염산 농도 5 N 염산 수용액, 18 ℃, 12 시간으로 하고, 실시예 1과 동일하게 가수분해하여 산불용성 잔사를 세정, 여과하여 습식 케이크를 얻었다(평균 중합도 690, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.7 질량％, 평균 입경 49.8 ㎛). 이 습식 케이크를 셀룰로오스 10 ％ 농도의 수분산체로 하고, 초고성능 분산기ㆍ습식 미분쇄기(아시자와(주) 제조, 상품명 펄밀 RL, Φ2 mm 알루미나 비드 사용, 충전율 80 ％)를 사용하여, 압밀ㆍ마쇄 처리를 실시하여 셀룰로오스 미립자 분산체를 얻었다(평균 중합도 690, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.7 질량％, 평균 입경 7.1 ㎛, 콜로이드상 성분 함유율 87.5 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 77 ％). 또한, 얻어진 습식 케이크를 실시예 6과 동일하게 효소 분해하고, 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

실시예 7은 실시예 6에 대하여 평균 입경이 작고, 콜로이드 성분량이 많은 셀룰로오스를 효소 분해한 것이며, 반응 시간이 단축되고, 올리고당 선택률도 향상되었다.

<실시예 8>

실시예 6에서 얻어진 습식 케이크상 셀룰로오스를 사용하고, 제조예 3에서 얻어진 정제 효소를 사용하여 실시예 1과 동일하게 효소 분해하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

실시예 8은 실시예 6에 대하여 활성비(β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 작은 것으로 효소를 바꾼 것이다. 효소를 바꿈으로써 반응 시간은 연장되었지만, 선택률은 향상되었다.

<실시예 9>

시판 중인 침엽수 유래의 용해 펄프(평균 중합도 781, 디에틸에테르 가용물 함유율 1.1 질량％, 평균 입경 174 ㎛)를 105 ℃에서 30 분간 교반하면서 가수분해하고, 얻어진 산불용성 잔사는 누체를 사용하여 여과하고, 70 L의 순수한 물로 4회 세정한 후, 고형분 40.1 ％의 습식 케이크를 얻었다(평균 중합도 220, 평균 입경 69.1 ㎛, 콜로이드상 성분 함유율 13.4 질량％, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.03 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 85 ％). 이 습식 케이크상 셀룰로오스를 사용하고, 제조예 3에서 얻어진 정제 효소를 사용하여 실시예 6과 동일하게 효소 분해하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

실시예 9는 실시예 6에 대하여 활성비(β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 작은 것으로 효소를 바꾸고, 또한 평균 입경이 크고, 콜로이드 성분량이 적은 셀룰로오스를 사용한 것이다. 효소, 기질을 바꿈으로써 반응 시간은 연장되었지만, 선택률은 향상되었다.

<실시예 10>

실시예 6에서 얻어진 습식 케이크상 셀룰로오스를 사용하고, 제조예 2에서 얻어진 효소를 사용하여, 실시예 6과 동일하게 효소 분해하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

실시예 10은 실시예 6에 대하여 활성비(β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 큰 것으로 효소를 바꾼 것이다. 효소를 바꿈으로써 반응 시간은 동등했지만, 선택률은 저하하였다.

<비교예 4>

실시예 6 내지 9에서 사용한 시판 중인 펄프(평균 중합도 781)를 사용하고, 가수분해를 거치지 않고 순수한 물을 첨가하여(고형분 40 질량％), 실시예 6과 동일하게 마쇄 처리를 실시하여 습식 케이크를 얻었다(평균 중합도 781, 평균 입경 49.3 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분량 10.2 질량％, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.9 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 85 ％). 이것을 사용하여 실시예 6과 동일하게 효소 분해하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

비교예 4는 셀룰로오스의 평균 중합도가 본 발명의 범위에 없고, 평균 입경, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유량이 본 발명의 범위를 충족하는 것이며, 각 실시예에 대하여 반응 시간이 길고, 셀로올리고당 선택률도 낮았다.

<비교예 5>

실시예 6의 조작에 의해 얻어진 습식 케이크를 셀룰로오스 10 ％ 농도의 수분산체로 하고, 메쉬 45 ㎛의 체를 사용하여 습식 분획한 후, 체 상에 남은 고형분(평균 중합도 220, 평균 입경 103.4 ㎛, 콜로이드상 성분 함유율 9.7 질량％, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.03 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 85 ％)을 기질로서 사용하여, 실시예 6과 동일하게 효소 분해를 행하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

비교예 5는 평균 중합도, 디에틸에테르 가용물 함유율은 본 발명의 범위에 있고, 평균 입경이 크며, 콜로이드상 성분 함유율이 작은 것이었다. 비교예 5는 각 실시예에 대하여 반응 속도가 느리고, 셀로올리고당 선택률도 실시예의 수준에 도달하지 못하였다.

<실시예 11>

트리코데르마 리세이 NBRC31329를 포테이토 덱스트로오스 한천 사면 배지 상에서 28 ℃로 7 일간 배양하였다. 생성한 포자를 100 mM 인산칼슘 완충액(pH 7) 2 ㎖에 10⁶개/mL가 되도록 현탁하고, EMS(에틸 메탄술포네이트) 24 ㎕를 첨가하여 28 ℃에서 16 시간 진탕하여 변이 처리를 실시하였다. 이 포자 현탁액으로부터 원심 분리에 의해 포자를 모아 100 mM 인산칼슘 완충액(pH 7)으로 잘 세정하고, 평판당 100 내지 300 포자가 되도록 희석하고, 글루코오스 1 g, 효모 엑기스 1 g, (NH₄)₂ SO₄2 g, KH₂PO₄ 4 g, Na₂HPO₄ 2 g, MgSO₄ㆍ7H₂0 200 mg, CaCl₂ㆍ2H₂O 1 mg, 트리톤 X-100, 미량 원소 1 mL(붕산 6 mg, 몰리브덴산 암모늄 4수화물 26 mg, 염화철(III) 6수화물 100 mg, 황산구리 5수화물 40 mg, 황산망간 4수화물 8 mg, 황산아연 7수화물 200 mg을 전량 100 mL의 정제수에 용해시킨 것), 한천 20 g을 1 L의 물에 용해 또는 현탁시킨 후, 오토클레이브 멸균하고, 또한 멤브레인 필터로 여과 멸균하여 28 ℃에서 5 일간 배양한 배양액의 β-글루코시다아제 활성 및 결정 셀룰로오스 분해 활성을 측정하고, 변이주 트리코데르마 리세이 GL-1을 선택하였다. 이 변이주는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 쥬오 다이 6(우편 번호 305-8566))에 부다페스트 조약하에 2005년 4월 15일에 기탁되어 있고, 수탁번호 FERM BP-10323을 받고 있다.

<실시예 12>

트리코데르마 리세이 NBRC31329 및 실시예 11에서 취득한 변이주 GL-1주의 각 균주를 포테이토 덱스트로오스 한천 사면 배지 상에서 25 ℃로 7 일간 배양하여 포자를 충분히 형성시켰다. 그 1 백금이를 폴리펩톤 1.0 g, 효모 엑기스 0.5 g, KH₂PO₄ 2.0 g, (NH₄)₂SO₄ 1.5 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.3 g, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.3 g, 트윈 80(나까라이 가가꾸 야꾸힝(주) 제조) 1.0 ㎖, 미량 원소액(H₃BO₄ 6 mg, (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 26 mg, FeCl₃ㆍ6H₂O 100 mg, CuSO₄.5H₂O 40 mg, MnSO₄ㆍ4H₂O 8 mg, ZnSO₄ㆍ7H₂O 200 mg을 물 100 ㎖에 용해 및 현탁한 액) 1.0 ㎖, 타르타르산 7.5 g을 물 1 L에 용해 및 현탁시켜 pH 4.0으로 조정하고, 500 mL 용적 삼각 플라스크에 100 mL 분주하여 결정 셀룰로오스(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 PH-101) 1 g을 첨가한 후, 오토클레이브 멸균한 배지에 접종하여 28 ℃에서 5 일간 진탕 배양하였다. 5 일째에 배양액을 원심 분리하고, 그 상청에 대하여 온도 40 ℃에서 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<실시예 13>

포테이토 덱스트로오스 배지(Difco사 제조)에 트리코데르마 리세이 NBRC31329를 접종하여 37 ℃에서 7 일간 배양하였다. 그 배지 표면에서 포자 1 백금이를 취하여, 폴리펩톤 1 g, 효모 엑기스 0.5 g, 인산1칼륨 2 g, 황산암모늄 1.5 g, 황산마그네슘 0.3 g, 염화칼슘 0.3 g, 미량 원소 1 mL(붕산 6 mg, 몰리브덴산 암모늄 4수화물 26 mg, 염화철(III) 6수화물 100 mg, 황산구리 5수화물 40 mg, 황산망간 4수화물 8 mg, 황산아연 7수화물 200 mg을 전량 100 mL의 정제수에 용해시킨 것), 아데카놀 LG-109 1 mL를 전량 1 L의 정제수에 현탁 및 용해시켜 500 mL 용적의 삼각 플라스크에 100 mL 분주하고, 각 플라스크에 결정 셀룰로오스(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 PH-101) 1 g을 첨가한 후, 오토클레이브 멸균한 배지에 식균하고, 28 ℃에서 3 일간 전배양을 행하였다. 또한, 동일한 배지 3 L를 넣은 5 L의 단지 발효기에 전배양액 30 mL를 이식하고, 28 ℃, 교반 400 rpm, 통기 0.5 vvm으로 배양을 행하고, 배양 중 NaOH 수용액으로 pH의 하한을 pH 3.0으로 제어하였다. 5 일간 배양을 행한 배양 후의 액체를 원심 분리하고, 상청을 조 효소로서 얻었다. 얻어진 효소액의 결정성 셀룰라아제 분해 활성 및 β-글루코시다아제 활성을 상술한 방법으로 측정하였다. 배양 중의 pH 경시 변화를 도 1에, 활성 측정 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

<실시예 14>

실시예 13과 동일한 방법으로 트리코데르마 리세이 NBRC31329를 배양할 때, 배양 중 NaOH로 pH의 하한을 pH 2.5로 제어하여 조 효소액을 얻었다. 얻어진 효소액의 결정성 셀룰라아제 분해 활성 및 β-글루코시다아제 활성을 상술한 방법으로 측정하였다. 배양 중의 pH 경시 변화를 도 1에, 활성 측정 결과를 표 4에 나타내었다.

<비교예 6>

실시예 13과 동일한 방법으로 트리코데르마 리세이 NBRC31329를 배양할 때, 배양 중 NaOH로 pH의 하한을 pH 3.5 또는 4 또는 5로 제어하여 조 효소액을 얻었다. 얻어진 효소액의 결정성 셀룰라아제 분해 활성 및 β-글루코시다아제 활성을 상술한 방법으로 측정하였다. 배양 중의 pH 경시 변화를 도 1에, 활성 측정 결과를 표 4에 나타내었다.

<실시예 15>

실시예 13과 동일한 방법으로 실시예 11에서 얻은 GL-1주를 배양하였다. 배양을 행할 때, 배양 중 NaOH로 pH의 하한을 pH 3 또는 pH 4로 제어하여 조 효소액을 얻었다. 배양 중의 pH 경시 변화를 도 2에 나타내었다.

<실시예 16>

결정 셀룰로오스 5 질량％(아사히 가세이 케미컬즈 제조의 상품명 세오러스 PH-101을 수분 60 ％로서, 산에이 세이사꾸쇼 제조의 상품명 분능 교반 혼합기로 훅 날개에 의해 90 분간, 126 rpm으로 혼련 교반한 것) 8 ㎖에 실시예 13 및 실시예 15에서 얻은 셀룰라아제 조 효소액을 2 ㎖ 첨가하고, 55 ℃ 교반 조건하에서 가수분해를 행하였다. 2 시간, 4 시간, 6 시간 및 8 시간 반응 후, 95 ℃에서 15 분간 가열하여 효소 반응을 정지하고, 원심 분리에 의해 상청액을 얻고, 상술한 HPLC법에 의해 셀로올리고당 및 글루코오스의 농도를 측정하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.

<비교예 7>

실시예 16과 동일한 방법으로 결정성 셀룰로오스를 효소 분해할 때, 비교예 6에서 얻은 셀룰라아제를 조 효소액으로서 사용하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.

<실시예 17>

시판 중인 결정 셀룰로오스(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 PH-101)를 고형분 10 질량％의 수분산체로서 비드밀로 습식 마쇄(아시자와 파인테크 제조, 상품명 펄밀 RL5, 장치 크기 5 L, 분쇄 미디어: Φ 1 mm의 지르코니아 비드, 회전수: 1800 rpm, 장치 내 체류 시간 70 분)하여 얻은 마쇄 셀룰로오스 수분산체(평균 중합도 220, 평균 입경 0.7 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 함유율 54 질량％, 디에틸에테르 가용물 함유율 0.03 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 75 ％) 100 mL에 실시예 15에서 pH 3으로 배양한 상청을 한외 여과(분획 분자량 13000)에 의해 부피비로 5배 농축하여 얻어진 조 효소액 200 mL를 첨가하고, pH 4.5의 50 mM 아세트산/아세트산나트륨 완충액으로 전량 500 mL로서, 1 L 용적의 유리제 세퍼러블 플라스크에서 상품명 3-1 모터로 내부 교반하면서, 55 ℃ 온욕 중에서 반응을 행하였다. 반응 개시 후 2 시간만에 반응액을 현탁 상태에서 300 ㎕ 분주하고, 한외 여과 모듈(분획 분자량 10000)을 사용하여 효소 및 미분해 셀룰로오스를 제거한 후, 고속 액체 크로마토그래피로 당 농도를 분석하여, 반응액 중에 잔존하는 셀룰로오스 잔사를 정량하였다. 결과로부터, 반응 시간 2 시간에 있어서 셀룰로오스 분해율은 82 ％, 올리고당 선택률은 81 ％였다.

<실시예 18>

실시예 17에서 얻어진 마쇄 셀룰로오스 수분산체를 사용하고, 실시예 17과 동일한 플라스크에 분획 분자량 13000의 폴리아크릴로니트릴제의 중공 한외 여과 모듈(아사히 가세이 케미컬즈 제조, 상품명 마이크로자 ACP-0013)을 세팅한 반응조를 사용하여, 실시예 17과 동일한 조건으로 반응하면서 0.1 MPa, 매시간 4 L의 순환 유량으로 한외 여과 모듈에 반응액을 유통시키면서 2 시간 반응을 행하였다. 한외 여과에 의해 얻어진 투과액 중의 당 농도를 측정하고, 반응액 중에 잔존하는 셀룰로오스 잔사를 정량하였다.

결과로부터, 셀룰로오스 분해율은 95 질량％, 올리고당 선택률은 85 ％였다. <실시예 19>

반응액 중의 셀룰로오스 농도를 2.5 질량％로 한 것 이외에는, 실시예 18과 동일한 장치를 이용하여 효소 분해를 행하였다. 효소 분해 중, 투과액 중의 분석에 의해 셀룰로오스 분해율을 측정하고, 항상 반응액 중의 셀룰로오스 농도를 2.5 질량％로 유지하도록 마쇄 셀룰로오스 수분산체를 추가하면서 24 시간 반응을 행하였다. 실시예 18과 동일하게 투과액 중의 당 농도를 측정하고, 반응액 중에 잔존하는 셀룰로오스 잔사를 정량하였다.

결과로부터, 셀룰로오스 분해율은 98 질량％, 올리고당 선택률은 92 ％였다.

<실시예 20>

실시예 19에서 얻어진 셀로올리고당 수용액 이온 교환 수지(미쯔비시 가가꾸 제조, 상품명 다이아이온 WA30 및 SK1B)로 탈아세트산한 후, 60 ℃에서 8 시간 건조하고, 유발로 분쇄하여 셀로올리고당 분말을 얻었다. 이 셀로올리고당 분말을 사용하여 「제14 개정 일본 약전」(히로까와 서점 발행)의 결정 셀룰로오스 순도 시험 (2)에 규정된 디에틸에테르 가용물의 정량법으로 측정한 디에틸에테르 가용물 함유율은 200 ppm이었다.

<비교예 8>

시판 중인 미표백 용해 펄프(Spuruce 유래, 평균 중합도 1680, 평균 입경 128 ㎛, 콜로이드상 셀룰로오스 성분 함유율 4 질량％, 디에틸에테르 가용물 함유율 1.5 질량％, 셀룰로오스 I형 결정 함유율 85 ％)를 가정용 믹서로 분쇄하고, 이것을 기질로서 pH 5.5의 아세트산 완충액을 첨가하여 셀룰로오스가 2 질량％인 수분산체로 하였다. 또한, 상기한 셀룰로오스 수분산체에 시판 중인 셀룰라아제(고도 슈세이 제조, 상품명 GODO-TCD)를 수용액에 대하여 0.1 질량％ 용해하고, pH 5.0으로 24 시간 실시예 17의 방법으로 효소 분해를 행하였다. 결과로부터, 셀룰로오스 분해율은 29 질량％, 올리고당 선택률은 55 ％였다. 이 셀로올리고당 수용액을 실시예 20의 방법으로 분말화하고, 실시예 20의 방법으로 디에틸에테르 가용물 함유율을 정량하며, 디에틸에테르 가용물 함유율은 3200 ppm이었다.

본 발명의 방법에 의해 얻어지는 셀로올리고당은 통상의 식품 소재에 추가하여 기능성 식품 소재, 의약품 및 기타 화학품의 중간체 합성 재료 등의 화학 변환 원료, 발효 원료로서 식품, 의약품, 일반 공업 제품 분야에서 바람직하게 사용할 수 있다.

도 1은 실시예 13 및 14 및 비교예 6에서의 배양 중의 pH 경시 변화를 나타내는 그래프이다.

도 2는 실시예 15에서의 배양 중의 pH 경시 변화를 나타내는 그래프이다.

도 3은 실시예 16 및 비교예 7에서의 결정 셀룰로오스 분해의 생성물의 농도 변화를 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 「반응액 중의 분해물 축적량(％)」은 반응액 중의 글루코오스, 셀로올리고당의 총계 농도이고, 셀로비오스 순도는 반응액 중의 분해물 축적량에 대한 셀로올리고당의 비율(백분율)이다. 변이주를 사용하고, 배양액 중의 pH를 낮춤으로써 분해물 축적량당 셀로비오스 순도가 향상되었 다.

Claims

평균 중합도가 700 이하이고, 평균 입경이 100 ㎛ 이하이고, 디에틸에테르 가용물 함유율이 1 질량％ 미만인 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질을 셀룰라아제의 존재하에서 효소 분해하는 것을 포함하는 셀로올리고당의 제조 방법.
평균 중합도가 700 이하이고, 콜로이드상 셀룰로오스 성분을 10 질량％ 이상 함유하고, 디에틸에테르 가용물 함유율이 1 질량％ 미만인 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질을 셀룰라아제의 존재하에서 효소 분해하는 것을 포함하는 셀로올리고당의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질이 평균 입경이 100 ㎛ 이하이고, 콜로이드상 셀룰로오스 성분을 10 질량％ 이상 함유하는 것인 셀로올리고당의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질의 평균 중합도가 500 이하, 평균 입경이 50 ㎛ 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스 계 물질의 평균 중합도가 400 이하, 평균 입경이 30 ㎛ 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질이 콜로이드상 셀룰로오스 성분을 15 질량％ 이상 함유하는 것인 셀로올리고당의 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰라아제의 활성비(온도 55 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정 셀룰로오스 분해 활성)가 0.7 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 셀룰라아제의 활성비가 0.5 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 셀룰라아제의 활성비가 0.35 이하인 셀로올리고당의 제조 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디에틸에테르 가용물이 리그닌인 셀로올리고당의 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 천연 셀룰로오스계 물질이 셀룰로오스 I형 결정을 함유하는 것인 셀로올리고당의 제조 방법.
셀룰라아제 생산균을 배양하여 얻어지는 배양액 중의 β-글루코시다아제 활성과 결정성 셀룰로오스 분해 활성의 활성비(온도 40 ℃에서의 β-글루코시다아제 활성/결정성 셀룰로오스 분해 활성)가 0.5 이하인, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 셀룰라아제의 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 β-글루코시다아제 활성과 결정성 셀룰로오스 분해 활성의 활성비가 0.35 이하인 셀룰라아제의 제조 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 셀룰라아제 생산균이 β-글루코시다아제의 생산이 억제된 균주로서 선택함으로써 얻어지는 균주인 셀룰라아제의 제조 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰라아제 생산균의 배양에 있어서 배양 중의 pH를 3.5 미만으로 제어하는 셀룰라아제의 제조 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰라아제 생산균이 트리코데르마(Trichoderma)속에 속하는 균주인 셀룰라아제의 제조 방법.
디에틸에테르 가용물 함유율이 2000 ppm 이하인 것을 특징으로 하는 셀로올리고당.
디에틸에테르 가용물 함유율이 2000 ppm 이하인 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 셀로올리고당.
제18항에 있어서, 디에틸에테르 가용물 함유율이 1000 ppm 이하인 셀로올리고당.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 셀로올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품, 화장품 또는 의약품 조성물.
제17항 또는 제18항에 기재된 셀로올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품, 화장품 또는 의약품 조성물.