TWI301155B - Process of producing cellooligosaccharide - Google Patents

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1301155 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 •本發明係關於將纖維素系材料進行酵素分解，而得到纖 、維寡醣之方法。特定而言，本發明係關於藉由以平均聚合 度、平均粒徑、膠體狀纖維素成分含有率及二乙醚可溶物 合有率控制於特定範圍之水不溶性纖維素系物質做為基 質，使用將β-葡萄糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性之 • 活性比（β_葡萄糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性）控制於 特定範圍之纖維素酶進行酵素分解，於短時間提高纖維素 分解率，並以高回收率選擇性地生產纖維募醣之方法。 【先前技術】 纖維寡醣為纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖 =纖維六糖之總稱，為丨至6個葡萄吡喃糖（gluc〇pyran〇叫 單元經β-1，4-鍵結而成之寡聚醣類。 近年，纖維寡糖與其他寡醣同樣地，生理機能漸趨於明 馨 m ’可以期待將其做為機能性食品之新原料（非專利文獻 1)。 纖維寡醣雖可藉由酵素水解為其聚合體之纖維素而得 到，然而由於存在於天然界之纖維素在水中為難溶性，且 結晶性高，有「不易接受由纖維素酶引起之酵素分解」之 難題。 〜， 判（马分解生成 物之纖維寡醣，亦有「會被纖維素酶中成分之一之卜葡萄 糖普酶再分解為葡萄糖單元，使纖維寡醣之收率降低」之 103774-970513.doc 1301155 難題（非專利文獻2)。 針對上述課題，先前已有許多以提高纖維素酵素分解時 纖維寡醣之收率為目的之嘗試。 使用特定纖維素之纖維募醣之製造方法說明於下。 專利文獻1中記載使用含有大量非結晶纖維素之纖維素 原料，在木質素存在下藉由纖維素酶進行水解反應，同時 酼時從反應液中提取由纖維素酶水解反應生成之纖維寡醣 之一之纖維二糖之纖維募醣製造方法。 專利文獻2中記載將含有天然木質纖維素原料蒗解，將 蒸解後經乾燥得到之座紙裝藉由纖維素酶進行部分水解、， 至^提取纖維寡醣中之纖維二糠之纖維募_製造方法。此 等製以方法中，由於纖維素酶所包含之為纖維募醣分解酵 素之β_葡萄糖苷酶被木質素吸附M"葡萄糠㈣之作 二受到抑制，致使纖維募醣分解為葡萄糖之反應受到抑 | :因而可提高纖維寡醣之反應選擇率。然而，此等製造 方法中由於合有大量之木質素，結果使纖維募醣之收量變 ^又’為得到高純度之纖維寡醣，必須從糖化液進行脫 木質素處理，因而古你拉在 有使精製步驟變得複雜之問題。 專利文獻3中記載將含有 盥纖唯夸醢；《 & , 1至20貝里/〇木質素之木質纖維 …纖維素酶及白色腐朽菌等木 造為纖維寡醣之二 起反應，以製 素之脫木質f處理 。此方法巾雖經纖維 負素處理，可提高纖維素 由於其分解咮忐仏丄 J 土貝艾作用，然而 與上述同樣地，纖％宣締 卜之木質素分解物’ 纖維养聽之收量變低。又，為得到高純度 103774-970513.doc 1301155 之纖維寡聽，必須進行除去木質素分解物之步驟，因而有 使精製步驟變得複雜之問題。 4因而有 專利文獻4中全p # + w /NN-m °载纖維素溶於胺氧化物、氯化鐘 之纖唯一辛Λφ醯胺、銅-氨及人造絲黏液(visc°se)等溶劑 =:Γ添加纖維素酶後，從所得到之溶液中得到 =在ΓΓ生纖維素，繼而將該再生纖維素於緩衝 液存在下，猎由纖維素中 產生鏞雔宣^ 甲L3之纖維素酶進行酵素反應， 產生、義維养醣之纖維寡酶製造方法。該方 維素酶騎㈣以―對纖 地主句τ使纖維养醣之收率提高，鈇 而必須進行纖維素溶解再 …、 #生之步驟，因而有步驟變得複雜 /Ν，=Γ 溶解中所使用之胺氧化物、氯化- /乙醯胺、銅-氨及人造絲黏液等化學物質多會 1維素酶作用，因而有影響纖維素分解反應之問題。 利文獻5中冗載使用保水度為23〇至2嶋，遽水度為 ;糖：製造方法。其中所謂「液體紙浆」意指蒸解·漂白 处里2未乾燥紙漿’以其做為原料的碟能提高纖维二糖 之生成量’然而未乾燥之液體紙漿由於保水度高，酵素分 解時之基質濃度受到限制，有纖維寡醣之生產性變差之問 題0 專利文獻6中記载從含有纖維素之材料令將纖維素用超 臨界或亞臨界水進行可溶化後，料理液中添加纖维辛 酶’將纖維素及為纖維素部分分解物之高聚合度纖維寡醣 猎由纖維素酶製劑水解，得到葡萄糖及/或纖維寡醣之方 J03774-970513.doc 1301155 糖等纖維募醣 若依妝该方法，雖纖維二糖及纖維 收率可同時提高，然而有「成為超臨界或亞臨界 而要之耐壓.耐酸等設備之設備上安全性，以及加 難題。“、、方面之*全性等纖維素前處理之安全性問題」之

姓專利文獻7巾記載使用藉由义光繞射法得狀纖維素^型 ，晶化度之值為10%至8〇%，且保水度為2〇〇%至1〇〇〇%之 表裝做為纖維素酶反應基質之纖維寡St製造方法，以及對 該紙漿施行纖維化處理、機械化學處理或化學處理等任一 種或複數種處理之纖維寡醣製造方法。若依照該方法，雖 纖維二糖之生成量及纖維素之分解率可提高，然而由於使 /、乂度兩之纖維狀紙漿做為纖維素，在纖維化處理、機 j化學處理或化學處理等前處理，以及隨後之酵素分解或 养醣精製等各種製造步驟中，有發生堵塞及基質濃度受限 制等纖維寡醣生產性變差之問題，此與本發明藉由高度控 制平均聚合度、平均粒徑及膠體狀成分含有率等，提高包 含酵素分解之各步驟之處理性，在本質上不同。 又’使用特定之纖維素酶對纖維素進行酵素處理，以提 同纖維养醣之收率之方法，如以下專利文獻8至11所列 舉0 專利文獻8中記載藉由纖維弧菌（Cell〇vibrio)屬所屬微生 物生產之纖維素酶之作用，於水性反應液中從纖維素系物 質製造纖維寡醣之方法中，藉由將超過濾反應器組合以解 除生成物抑制，因而生成並積蓄纖維募醣之纖維募醣製造 103774-970513.doc 1301155 方法。若依照該方法，則從纖維素系物質酵素分解之分解 2成物’可得到只包含纖維：糖及纖維三糖之纖維寡酷。 2而’纖維弧㈣微生物所生產之酵素難以對結晶性纖維 $作用’為縮短反應時間及提高㈣，有必要以非晶質纖 、、隹素做為基質，因而有步驟變得複雜之問題。 f利文獻9中記載藉由纖維素酶將纖維素分解而生成 維寡畴之方法巾’預先將纖維素酶與_.5至5•時衡化之 弱酸性陽離子交換樹脂接觸，選擇性地除去纖維素酶中之 萄糖㈣，並使該除去β_㈣糖㈣之纖維素酶與纖 2素接觸之纖維寡醣製造方法。若依照該方法，藉由纖維 酵素分解’可得到葡萄糖降低，而纖維寡餹佔60%以 上^之分解生成物1而，該方法中必須有將纖維素酶中之 «萄糖㈣除去之步驟，而有使纖維寡酿製造步驟變得 複雜之問題。X，該纖維素酶精製步驟中，由於對未處理

之纖維㈣Μ必須㈣75至副倍之陽離子交換樹脂， 因而有纖維素酶處理量受限制，纖維寡醣之生產性不充 分’:及纖維素酶精製成本及陽離子交換樹脂分離精製劑 成本南之問題。 專利文獻1G中記載纖維素s旨或纖維㈣任—或兩者與纖 維素酶一起溶解，經一段時間保溫後，使pH改變，藉由將 不溶化之固體部分與溶液分離，選擇性地除去纖維㈣中 含有之β-葡萄糖㈣之纖維素酶精製方法，·又，將該卜葡 萄糖㈣之纖維㈣與纖維素懸浮於水性_中，形成懸 夺液，將該懸浮液經—段時間保溫後，從該懸浮液中生成 103774-970513.doc 1301155 纖維二糖，再提取該纖維二糖之纖維二糖製造方法。 專利文獻11中記載在調整pH至殼聚糖（chit〇san)可溶化 之水性溶媒中，將上述殼聚糖與纖維素酶一起溶解，經一 又夺間保皿後，使pfj改變，藉由將不溶化之固體部分與溶 液/刀離’選擇性地除去纖維素酶中所含之β_葡萄糖脊酶之 纖維素酶精製方法；又’將該β_葡萄糖㈣之纖維素酶與 纖維素懸浮於水性載财，形成懸浮液，將該懸浮液經一 段時間保溫後，從該懸浮液中生成纖維二糖，再提取該纖 維二糖之纖維二糖製造方法1依照此等方法，將纖維素 轉用纖維素衍生物或殼聚糖進行吸附分離處理，以吸附於 纖維素衍生物或殼聚糖之狀態與纖維素酶接觸，可提高纖 =收率。然而，此方法中由於必須進行纖維素酶之精 ==由於纖維素酶精製處理中使用之纖維素衍生物 I糖為高價物’有成本變高之問題。X，由於纖维辛 ==衍生物或殼聚糖一起用於纖維素酵素分解= 先i進行將其特分解反應液巾除去之步驟之問題。 理，醉由"I 之天素系物質施行前處 含㈣及二合：、平均粒經、膠體狀纖維素成分 物質做為美質物含有率控制於特定範圍之纖維素系 刀解活性之活性比((3_葡 μ常 活性)控制於特定範圍之纖維素酶進==維素分解 之方法。 门收早選擇性地生產纖維募醣 103774-970513.doc • 11 - 1301155 [非專利文獻 1] Cellulose Communications，5，Νο·2，91-97 (1998) [非專利文獻2] 「纖維素酶」講談社Scientific發行， 97-104 (1987)

[專利文獻1]曰本特開平5-3 17073號公報 [專利文獻2]曰本特開平n84678號公報 [專利文獻3]日本特開平8-89274號公報 [專利文獻4]日本特開平8-3〇8589號公報 [專利文獻5]日本特開平9-107087號公報 [專利文獻6]日本特開2〇〇 1_95594號公報 [專利文獻7]曰本特開2005-68 140號公報 [專利文獻8]曰本特開平0U56394號公報 [專利文獻9]曰本特開平〇5_115293號公報 [專利文獻10]曰本特開平05-227957號公報 [專利文獻11]曰本特開平〇5-227958號公報 【發明内容】 發明欲解決之課題 本發明之目的’係以水不溶性之天然纖維素系物質做為 原料，在特㈣維㈣存在下進彳情素分解，於短時間提 高纖維素分解率，並以高收率選擇性地生產纖維寡醣。 欲解決該課題之手段 本發明人等為解決上十〔 4 4通’ U水不溶性天然纖維素系 物質做為原料，將其平均聚合度、平均粒徑、膠體狀纖維 素成分含有率及二乙料溶物含有率控制於敎範圍，並 103774-970513.doc -12- !3〇1155 使用具有特定活性之纖維素酶對其進行酵素分冑，發現可 於短時間提高纖維素分解率，並以高收率選擇性地生產纖 維寡醣，於是達成本發明。 亦即，本發明如以下說明。 (1) 一種纖維寡醣之製造方法，其包含將平均聚合度7〇〇 以下、平均粒徑1〇〇 μιη以下、二乙醚可溶物含有率不到i 質量％之水不溶性天然纖維素系物質，在纖維素酶存在下 進行酵素分解之步驟。 (2) —種纖維寡醣之製造方法，其包含將平均聚合度7〇〇 以下、含有10質量％以上之膠體狀纖維素成分、二乙醚可 溶物含有率不到i質量％之水不溶性天然纖維素系物質， 在纖維素酶存在下進行酵素分解之步驟。 (3) 如（1)或（2)之纖維寡醣之製造方法，其中該水不溶性 天然纖維素糸物質之平均粒徑為1 Q〇 以下，且含有1 〇質 量％以上之膠體狀纖維素成分。 (4) 如（1)至（3)中任一項之纖維寡醣之製造方法，其中該 水不溶性天然纖維素系物質之平均聚合度為5〇〇以下，平 均粒徑為50 μιη以下。 (5) 如（1)至（4)中任一項之纖維寡醣之製造方法，其中該 水不溶性天然纖維素系物質之平均聚合度為4〇〇以下，平 均粒徑為3 0 μιη以下。 (6) 如（1)至（5)中任一項之纖維寡醣之製造方法，其中該 水不溶性天然纖維素系物質含有丨5質量％以上之膠體狀纖 維素成分。 103774-970513.doc -13 · 1301155 (7)如（1)至（6)中任一項之纖維寡醣之製 7 ’左，其中該 纖維素酶之活性比（於溫度5rc之卜葡萄糖苦酶活性/結晶 性纖維素分解活性）為0.7以下。 ⑻如⑺之纖維募醣之製造方法，纟中該纖維素酶之活 性比為0.5以下。 ’ 其中該纖維素酶之活 (9)如（8)之纖維募醣之製造方法， 性比為0.35以下。

⑽如⑴至⑼中任一項之纖維寡醣之製造方法，其中該 二乙醚可溶物為木質素。 “ (11) 如⑴至（10)中任—項之纖維寡醣之製造方法，其中 該水不溶性天然纖維素系物質含有纖維素〗型結晶。八 (12) -種(1)至(11)中任一項記載之纖維素酶之製造方 法，其中在培養纖維素酶生產菌所得到之培養液中，β葡 萄糖苦酶活性與結晶性纖維素分解活性之活性比（於溫度 40。(：之β_葡萄糖㈣活性/結晶性纖維素分解活性）為_ 下。 (13)如（12)記载之纖維素酶輿 哪< Ik方法，其中該β_葡萄 糖苷酶活性與結晶性纖維素分 * I刀解活性之活性比為0·35以 (14) 如（12)或（13)記载之纖维去給 纖維素酶之製造方法，其中該纖 維素酶生產菌係藉由選擇可抑 # 评j抑制/5 -匍萄糖苷酶生產之菌 株所付到之菌株。 (15) 如（12)至（14)中任一項之输 、 、之、截維素駟之製造方法，其中 於培養5亥纖維素每生產菌時， τ將pH控制於35以下。 103774-970513.doc 1301155 (16)如（12)至（15)中任— 項之纖維素酶之製造方法，Α中 該纖維素酶生產菌為屬％八τ 座国為屬於木黴菌屬（TriehGde (Π) 一種纖維寡醣，苴特η Α ^ 国株 々特被為二乙醚可溶物含有 2000 ppm以下。 午荷 (18) 種藉由⑴至⑴）中任—項之方法得到之纖維寡 膽’其特徵為二乙喊可溶物含有率為鹰ppm以下。、’

(19) 如(18)之纖維寡醣，其二乙醚可溶物含有率為麵 ppm以下。 一 (20) -種食品、化妝品或醫藥品組合物，其特徵為含有 藉由（1)至（11)中任-項之方法得到之纖維寡聽。 (21)種& σ口、化妝品或醫藥品組合物，其特徵為含有 (17)或（18)之纖維寡醣。 發明之效果 依照本發明之藉由水不溶性纖維素系物質進行酵素分 解’製造纖維募醣之方法，可於短反應時間内提高纖維素 y刀解率，並以高收率選擇性地製造纖維寡醣。 【實施方式】 實施本發明之最佳態樣 有關本發明’以其特佳實施形態為中心，具體地說明如 下。 本發明所使用之天然纖維素系物質為含有纖維素之天然 水不/谷性纖維質物質。其之來源可為植物性或動物性，可 產生該物質之動、植物，例如木材、竹、麥蒿、稻蒿、 棉、竽麻、蔗渣、洋麻、甜菜、海鞘或細菌性纖維素等， 103774-970513.doc -15- 1301155 可使用其中一種天然纖維素系物質做為原料，亦可使用2 種以上混合者做為原料。 本發明所使用之纖維素系物質必須為天然纖維素系物 質。天然纖維素與再生纖維素可藉由其結晶形態加以區 別。本發明之天然纖維素系物質含有纖維素j型結晶，其 含有率必須為1 %以上 -- 〜 丁干又狂两

50%以上。其中纖維素j型之結晶型意指可藉由粉末廣角X 光繞射法（理學電機股份有限公司製，商品名： 化並用於測定即可，若為溼潤狀態，可藉由公知之方法乾 燥後，予以粉末化，再使用於測定。纖維素j型結晶之含 有率越高，則使用越接近天然之纖維素系物質進行酵素分 解，而可將人工之化學處理步驟簡略化，故為較佳。其: 限並無特別限定，從現今所知之天然纖維素組成而士 。 為 99%以下。 RU-300)所得到之X光繞射圖案判定，其含有率係以藉由X 光繞射得到之繞射圖像之纖維素丨型結晶吸收波峰面積佔 總吸收波峰面積之百分率表示。供粉末廣角X光繞射測定 之纖維素系物質若為乾燥狀態，只要藉由公知之方法粉末 本發明所使用之天然纖維素系物質為水不溶性。其中， 「水不溶性」意指該天然纖維素系物質中含有9〇質量^以 上之水不溶性成分。該「水不溶性成分」意指將纖維素系 物質分散於25°C之純水中，藉由超過濾（劃分界限：分^ 量10000)，除去水可溶性部分後，經定量水不溶性殘餘物 所得到。 ' 103774-970513.doc -16 - 1301155 本發明所使用之天然纖維素系物質之平均聚合度為700 以下。該平均聚合度可藉由「日本藥局方第14次修訂版」 (廣川書店發行）之結晶纖維素確認試驗（3)所規定之「使用 銅伸乙二胺溶液之還原比黏度法」測定。若平均聚合度為 700以下’由於纖維素物質易於接受攪拌、粉碎或磨碎等 物理性處理，將可容易地控制其膠體狀成分量。又，藉由 將水不,谷性天然纖維素系物質之平均聚合度控制於上述範 鲁圍，由於纖維素系物質中之纖維質多孔質化，酵素分解時 酵素-基質接觸精確率增大，可使纖維素分解速度提高。 其中以平均聚合度500以下為較佳，而以4〇〇以下為更佳。 由於平均聚合度愈小，膠體狀成分量之控制及分解速度變 得越容易，因此對於下限並無特別限定，不過，藉由簡便 操作可以得到之平均聚合度範圍超過丨〇。

本發明所使用之水不溶性天然纖維素系物質之平均粒徑 為100 ,以下。該「平均粒徑」意指『將該纖維素系物i * 以G.2f4%濃度形成水懸浮液，並藉由高剪切均質機（日 本精機股份有限公司製，商品名：Excei AutQ H〇mogenizer ED-7，處理條件··回轉數5〇〇〇卬瓜，3分鐘） 分散，調整其pH為7·5至8·5後，進行離心（久保田商事股份 有限公司製，商品名：6930型離心器，處理條件：離心力 2〇00 G，5分鐘），將離心後之上清成分及沉降成分分離， 再分別測定其重量比’·繼而以水為載劑，將此等成分付諸 於雷射繞射法（堀場製作所股份有限公司製，商品名： ㈣，超音波處理i分鐘），_將得到之各成分口之體積頻 103774-970513.doc -17- 1301155 率粒度分布乘以上清成分與沉降成分之重量比，所得之體 積頻率粒度分布中之累積50%粒徑』。若平均粒徑為100 μιη以

下’則將纖維素進行酵素分解時，由於纖維素與纖維素酶 之接觸面積（aCCeSsibility)增大，纖維募醣之生成速度與收 率提高，故較佳。其中以平均粒徑50 μιη以下為更佳，而 以30 μιη以下為特佳，以10 μηι以下為最佳。由於平均粒徑 愈小’纖維募醣之生成速度、生成選擇率及收率提高，因 此對於下限並無特別限定，不過，藉由簡便操作可得到之 平均粒徑範圍為0.0丨μπι以上。 本發明中使用之水不溶性天然纖維素系物質必須含有10 質量％以上之膠體狀纖維素成分。該「膠體狀纖維素成 分」意指將該纖維素系物質以0·2質量％濃度形成水懸浮 液，並藉由高剪切均質機（日本精機股份有限公司製，商 品名：Excel Auto Homogenizer ED_7 ,處理條件：回轉數 5000 rpm，3分鐘）分散，調整其pH為7.5至8.5後，進行離 久保田商事股份有限公司製，商品名：6930型離心 器’處理條件：離心力2_ G，5分鐘），離心後殘存於上 /月液之纖維素固形份之質量百分率。若膠體狀纖維素成分 為0¾里/〇以上，則纖維寡聽之生成速度、生成選擇率及 收率可提冋。#中膠體狀纖維素成分以。質量％以上為更 佳，而以4〇質量。/〇以μ或^士 μ 、 上為特佳。該膠體狀纖維素成分量盘 纖維素系物質之平均粒徑Α ^ 仏為各獨立地作用於酵素分解性之 因子。雖然提高纖維寡醣 王风迷！ 生成選擇率及收桌 之機構尚不明確，铁而$纟丨Μ 而研判猎由膠體狀纖維素成分增加， 103774-970513.doc -18- 1301155 使為基質之纖維素懸浮安定化，使酵素與基質均勻地接 觸’因此提高上述酵素分解性。由於膠體狀纖維素成分含 篁愈多，愈可提高酵素分解性，因此對於其上限並無特別 限定，不過，藉由簡便前處理可得到之範圍為99·9質量％ 以下。

本發明所使用之天然纖維素系物質之二乙醚可溶物含有 率不到1質量％。該二乙醚可溶物含有率為纖維素系物質 中木質素或木質素分解物等可溶於乙醚之雜質，可藉由 日本藥局方第14次修訂版」（廣川書店發行）之結晶纖維 素純度試驗（2)所規定之二乙縫可溶物定量法測定。藉由使 用木質素含有率不到i質量％之高純度纖維素，酵素分解 ^得^之纖維寡_之純度可更為提高。又，若纖維募聽之 屯度提呵，生成收率亦將提高，酵素分解後之纖維寡醣之 精製及纖維素酶之回收將變得容易。其中二乙鱗可溶物含 有率以〇.5質量％以下為更佳，而以〇3質量％以下為特佳。 :::二乙鍵可溶物含有率愈少，上述纖維寡醣之純度愈 ’因此對於其下限並無特別限定，不過，藉由簡便 則處理可得到之木質素含有率範圍為G._5f量％以上。 天然纖維素系物質之单始人 維素成分含有率及粒徑、膠體狀纖 範圍之Μ 乙㈣溶物含有率均能滿足本發明之 乂處理方法，如以下所列舉者。 控制平均聚合度及二乙 知之方、、I j，合物3有率之方法只要為公 矣之方去即可，並無特別限定，其 又，益T+I 4 例為水解處理。 糟由该水解處理，去 了去除纖維素纖維質内部之非晶質 103774-970513.doc •19- 1301155 纖維素及钱料或木質素# 化，當酵素分解時，纖唯+酿” /吏纖維質内部多孔質 纖維素酶各易滲透至纖維内部， 時提高纖維素之分解速声 "可同 肝疋度及纖維养醣之收率，故 ::水解之纖維素系物質，由於纖維質内部變；多孔 1化，當將其再藉由公知之方法處理時，容易接受機2 控制變得容易，因膠體狀成分之含有率之 =方法並無特別限定，舉例而言，可為 explosion),„: 、4方法可單獨使用任何—種，亦可2種以上併 進订 >、中之酉夂水解時，將纖維素系物質分散於水性载 ^之狀匕下’適里添加質子酸、缓酸、路易士酸或雜多酸 (het⑽P〇ly acid)等，藉由擾拌同時加溫，可容易地控制平 均聚合度。此時之溫度、壓力及時間等反應條件，雖隨纖 維素種類、纖維素濃度、酸種類及酸濃度而異，然而可隨 '、達到之平均t合度目標而適宜地調整。例如，關於上述 酉文水解之反應條件，係使用1質量％以下之礦酸水溶液， 於100C以上’加壓下，處理纖維素1〇分鐘以上，使酸等 觸媒成刀/參透至纖維素纖維内部，以促進水解，由於使用 之觸媒成分量變少，故為較佳。 控制平均粒徑及膠體狀纖維素成分含量之方法，只要為 么知之方法即可，並無特別限定，舉例而言，可為磨碎、 杨碎、使用4分級、旋風分離、使用離心機之離心等，該 法可單獨使用’亦可將2種以上組合使用。又’上述 103774-970513.doc 1301155 =:為澄式，亦可為乾式，亦可將分別以渥式所得到 =素分解前彼此混合，並將分別以乾式所得到 素分解前彼此混合，再將、屬々 砰 冉將溼式及乾式所得到者加以組合。 歹】如用屋式處理纖維素時，H # a + j , 猎由將合有1至99%纖維 莖> e 聲再京刀放體^丁公知之磨碎或粉碎 專’可各易地調整纖維辛季物皙 素成分含量。"所：=之+均粒徑及膠體狀纖維 〆、中所使用之載劑亦無特別

水、甲醇、乙醇、正丙醇、旦W ▲疋T為例如 苄醇等醇類，戍燒 P 一 _ τ _ ' 2_甲基丁醇或 酮或乙基甲基酮等_類。尤豆 次者丙 含口及1Μ 八，有機溶劑以製造醫藥品、 h及其等之添加劑之步驟中所使 「醫藥品i ^ Ύ為例如 Γ ^ /、」（樂事日報社股份有限公司發杆、 「曰本藥局方或厂 Α以，仃）、 艮口口添加物公定書」（均為廣川查店 種以上自由併用，亦可一二::劑可單獨使用，亦可2 劑，再分散於不同载^ 政於1種载劑後，除去該载 磨碎方法可為使用輕便式 合機等之單方向回轉式二:：：立體混合機或側面混 移動式、回轉及上下夕、、回4、在復反轉式、上下 法，使用管線混合機^ “ 式寺攪拌翼之磨碎方 切均質機，高壓均Μ万法使用高剪 用捏合機之回轉押出^超曰波均質機等之磨碎方法，使 :料磨機或珠粒磨機等將壓密 = 中之任何方法，亦可為將此之磨卒方法等 103774-970513.doc • 21 - l3〇ll55 柘碎方法可為磨選機幼creen mU1)、錘磨機等之篩式粉 碎方法，快轉磨（flash mill)等翼回轉剪斷篩式粉碎方法， 嘴射磨等將麼密與剪切組合之粉碎方法及翼攪拌式粉碎方 法等之任一種方法，亦可為將此等組合之方法。 本發明之纖維素酶意指分解纖維素之酵素之總稱，只要 具有纖維素之分解活性，即包含於本發明「纖維素酶」 中。纖維素酶之來源，可為例如從纖維素酶生產性活菌體 > 本身或其培養上清液，將纖維素酶生產性活菌生產之酵素 精製者，或者將精製酵素與賦形劑或安定劑等添加劑一併 進行製劑化者4。使用纖維素酶製劑品進行酵素分解時， 添加於製劑之添加劑亦無特別限定，其之劑型可為粉末、 顆粒或液體等之任一種。 關於纖維素酶之起源，亦無特別限定，舉例而言，可為 公知之生產纖維素酶之微生物，如木黴菌（Trich〇derma)屬、 頂頭孢黴（Acremonium)屬、麴菌（Aspergillus)屬、芽孢桿菌 > (Bacillus)屬、假單孢桿菌（Pse_udomonas)屬、青黴菌（penki版叫 屬、產氣單孢菌（Aeromonus)屬、耙齒菌（irpex)屬、孢子絲菌 (Sporotrichum)屬或腐殖菌（Humicola)屬等「纖維素酶」（講 談社Scientific發行（1987))或「纖維素酶事典」（朝倉書店 發行（2000))記載之微生物生產之纖維素酶，然而只要為分 解纖維素之酵素’不限於來自上述公知之微生物之酵素， 即使來自新發現之微生物之酵素’亦包含於本發明之纖維 素酶中。 本發明所使用之纖維素酶以β-葡萄糖苷酶活性與結晶性 103774-970513.doc -22- 1301155 纖維素分解活性之活性比（溫度55°C時之β-葡萄糖苷酶活 性/結晶性纖維素分解活性）〇·7以下為較佳。其中之「活性 比」表示纖維素酶之纖維寡醣分解能力（β_葡萄糖苷酶活 •性）對纖維素分解能力（結晶性纖維素分解活性）之比。該活 性比愈小，纖維素分解能力愈高，而纖維寡醣分解能力愈 低’由於可提高寡醣生產性故較佳。其中以活性比〇. 5以 下為更佳，以0.4以下又更佳，以〇.35以下為特佳，而以 鲁 0.30以下為最佳。由於活性比愈小，纖維寡醣之收率可提 高，因此對於其下限並無特別限定，然而容易達成之活性 比之範圍為0.01以上。 其中之「β-葡萄糖苷酶」意指以纖維寡醣之一之纖維二 糖做為基質，使纖維素酶在水性載劑中作用時，從纖維二 糖生成葡萄糖之酵素活性，係以反應液丨瓜乙於丨分鐘生成 之葡萄糖莫耳數bmol/mL*min·)所測得之「u(單元）/mL」 單位表不。該β-葡萄糖苷酶可藉由將纖維二糖2質量 • %(Aldrich公司製，特級品）與纖維素酶在ΡΗ4.5之50 mM醋 酸-醋酸鈉缓衝液中溶解， 於密閉狀態下在55°C水浴中進 行1小時反應後，定量反應液中葡萄糖之濃度而測定。 又，「結晶性纖維素分解活性」意指以結晶纖維素做為 基質，使纖維素酶在水性载劑中作用日夺，生成纖維二糖或

結晶性 性纖維素分解活性可依照上述之β-葡萄糖苦酶活性測 活性測 〜纖雒秦釅興葡甸糖之總莫耳 则丨/mPmin.)換算成「叫叫就」單位來表示。、該 103774-970513.doc •23· 1301155 定法’惟以結晶纖維素5質量％(將旭化成化學品公司梦之 〇一 PH-HH(商品名)調成含水分6〇%，藉由三英製： 製之萬能（商品名）攪拌混合機之釣型葉片，以126啊针 90分鐘混煉㈣而得者）代替纖維三糖，同樣地進行酵: 分解’並定量反應液中纖維募畴與葡萄糖等分解生成糖她 上述各種活性測定法中，反應液中之纖維募醣及葡萄糖 可藉由高速液體層析（管桎：島津製作所製，商品名 Asahipak NH2P_5〇;高速液體層析儀：島津製作所製:商 =名SCL.10A型，移動層：乙腈/水=75/25(體積比），循環 量：1 mL/min.，試料液：10 而定量。 义 得到β-葡萄糖㈣活性與結晶性纖維素分解活性之活性 比㈣萄糖㈣活性/結晶性纖維素分解活性）収本發明 之範圍之纖維素酶之方法，如以下說明。

生產纖維素酶之菌以使用生產活性比值（温度4〇t時之 葡萄糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性）〇·5以下之纖維 素酶之菌株為較佳，只要活性比滿足上述範圍，任何菌株 均可使用。又，即使為藉m變方法（例如紫外線照 射法、X光照射或突變誘發處理劑處理等）或自然發生之突 變株，或者藉由基因操作或細胞融合得到之突變株，口、要 為生產活性比值（溫度40t時之β-葡萄糖苷酶活性/結晶性 纖維素分解活性）〇·5以下之纖維素酶之菌株，任何菌株均 可使用於本發明。該活性比值（溫度4〇t時之^葡萄糖苷 酶活性/結晶性纖維素分解活性）以〇·35以下為較佳，而以 103774-970513.doc -24- 1301155 0·2以下為更佳。由於活性比愈小，纖維寡醣之收率可提 高’因此對於其下限並無特別限定，然而容易達成之活性 比之範圍為0.01以上。 該溫度40°c時之β-葡萄糠苷酶活性及結晶性纖維素分解 活性係依照下列方法測定。 (1) 結晶性纖維素分解活性 在50 mM醋酸《•醋酸納缓衝液（pfj5)中懸浮之5質量。/。結晶 纖維素（將旭化成化學品公司製之Ce〇lus ρη-1〇ι(商品名） 調成含水分60%，藉由三英製作所製之萬能（商品名）攪拌 混合機之鉤型葉片，以126 rpm進行9〇分鐘混煉攪拌所得 者）之基質液0.4 ml中添加經適當稀釋之酵素液〇1瓜丨，於 4〇°C水浴中進行4小時反應後，於95t加熱1〇分鐘使反應 停止，並以HPLC定量反應液中之葡萄糖濃度。將i分鐘： 到之游離葡萄糖及纖維募醣之總量為丨之酵素量定 義為1酵素單位（1U)。 (2) β-葡萄糖苷酶活性 在50 mM醋酸-醋酸鈉缓衝液（ρΗ5)中溶解之25質量％纖 維二糖（Aldrich公司製，特級品）之基質液〇4 ml中添加酵 素液〇] mi ’於40〇C水浴中進行4小時反應後，於1〇代加 分鐘使反應停止，並以帆以量反應液中之葡萄糖 濃度。將1分鐘游離出1 pmole葡萄糖之酵素量定義為磺 素單位（1U)。 j述各種活性測定法中，反應液中之纖維寡醣及葡萄糖 可藉由上述之高速液體層析來定量。 103774-970513.doc -25- 1301155 其中所使用之代表性菌株為例如瑞氏木黴菌（Trich〇derma reesei)NBRC31329株。 又，活性比值（溫度40°C時之β-葡萄糖苷酶活性/結晶性 纖維素分解活性）低之菌株可藉由例如以下之方法得到。 將具有纖維素酶生產能力之微生物，視需要使用紫外線照 射或如亞硝基脈（nitrosoguanidine)之突變誘發劑等，進行 公知之突變誘發處理，從此等菌株篩選活性比值（溫度仆它時 之β-葡萄糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性）低之菌株。 犬變誘V處理所使用之微生物，例如為以瑞氏木黴菌 NBRC3 1329株做為親株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基 上於28 C培養3至10日者。將生成之孢子在生理食鹽水中 懸浮成10至108個/mL，並用EMS(甲磺酸乙酯）施行突變處 理（100至 500 pg/mi，pH7 〇，28t：，5至24小時）。活性比 值（溫度4(TC時之β_葡萄糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活 性）低之菌株之選擇，可藉由將經突變誘發處理之孢子懸 浮液離心而將孢子集中，充分洗淨，卩葡萄糖做為碳源進 行培養’並將培養物之酵素活性依照公知之方法測定而達 成。例如，可使用各經變異處理菌株之培養物，以纖維二 糖或結晶纖維素做為基質進行酵素分解，然後定量生成之 還原糖，或者亦可使用公知之顯色基質與培養物進行酵素 反應，以定性方式選擇目標菌株。 培養纖維素酶生產菌株，可從上清液取得纖維素酶。培 養基中使用之碳源，可使用纖維素粉、纖維二糖、遽紙、 -般紙類、鋸木屑、麥糠、稻穀殼、蔗渣、豆粕、咖啡 103774-970513.doc •26- 1301155 ^ 氣泰或乳糖等。做為氮源者，可使用硫酸銨或硝酸錢 等無機銨鹽，尿素、胺基酸、肉萃取物、酵母萃取物、聚 蛋白腺或蛋白分解物等有機含氮物。關於無機鹽類，可使 用尺1^〇4、]^8〇4.7氏0、€&(：12.21120、？62(：13· 紐20、MnCl3 · 4H20或ZnS04 · 7H20等。視需要可使用含 有有機微量營養物之培養基。培養時可使用一般之通氣攪 摔培養裝置’並使用上述培養基，控制於生產菌株可繁殖 之溫度及可繁殖之pH附近。繼而，從培養液藉由離心或過 遽等公知之方法除去菌體，得到上清液。該上清液可依原 樣當做粗酵素液使用。 再者，將活性比值（溫度40。(：時之β-葡萄糖苷酶活性/結 晶性纖維素分解活性）抑制於低值之培養方法，可為例如 在培養中將培養液之pH控制於ρΗ3.5以下且纖維素酶生產 菌可繁瘦之pH以上之方法。具體而言，將上述瑞氏木黴菌 (Tfichodenna reesei) NBRC31329株或其變異株在馬鈴薯葡 萄糖瓊脂斜面培養基上於25至35°C培養3至10日，將培養 物懸浮及溶解並以纖維素做為碳源之培養基，以每1〇〇 mL 分注於500 mL容積之三角燒瓶中，並植菌於經熱壓釜 (autoclave)滅菌之培養基，於28°C進行2至4日前培養。再 者，將相同組成之培養基3L加入5L搖瓶發酵器（jar fermenter)，將前培養液移植於經熱壓釜殺菌之培養基 中，於溫度28°C，攪拌200至400 rpm，通氣0.3至1 vvm之 條件下進行培養，培養中以NaOH或氨水將pH值控制在 2〜3,5，以2.5〜3.0更佳。進行4至7日培養後，將培養液藉 103774-970513.doc -27- 1301155 由離心或過濾等公知之方法除去菌體，得到上清液上 清液可依原樣當做粗酵素液使用。 、4上 以上方式得到之酵素粗製液亦可再藉由通 法、硫酸銨分劃法、使料媒之沉澱分劃或層 、 精盤。 1戍寻進行 又，從市售酵素得到纖維素酶之情況，可藉由為雨A 白精製方法之硫酸銨分劃、使用溶媒之沉 ；：兩蛋

製，得到活性比值(溫度-時之二 活性/結晶性纖維素分解活性）為0.7以下之部分。 ％ 以下說明本發明之纖維寡醣之製造方法。 +贫听之纖維寡 衣這乃法，為將本發明 素系物質’於纖維素酶存在下進行酵素分解之方/、= 使用之纖維素酶以β•葡萄糖㈣活性與結晶性纖維p 活性之活性比(溫度训時之β_葡萄糖普酶活性…：： 維素分解活雖7以下為較佳。再者，本㈣^:纖 纖維寡醣為主成分之水溶液 付，之 或乾燥。 了猎由公知之方法精製及/ 酵素分解方法只要使用公知之方 定，舉一例如下··將做為其 ，並無特別限 、為土質之本發明纖維素系物質鵡津 於水性载劑中，添加本發明 、芯/ 々％ 5之纖維素酶，授掉 加溫，進行糖化反應之方法。 ㈣次振盪同時 上述方法中，懸浮方式、攪 添加方式及添加順序以及其等之濃二等反：㈣及基質之 此時，反應液之pH及 103774-970513.doc -28- 1301155 溫度只要在酵素不失活之範圍内即可，一般而言，在常 壓進行反應時，T為溫度5至95t，师⑼之範圍: 又，關於壓力、溫度及pH’亦與上述同樣地，可適宜地 調整以得到較高收率之纖維寡醣，不過使用以上述瑞 木黴菌NBRC31329株或其突變株做為纖維素酶生產 得到之纖維素酶時，纖維素之酵素分解以在，醋妒 或磷酸緩衝液中，溫度5〇w，pH3〇至55曰： 行為較佳。 該酵素反應可採取批以特，亦可採取連續式進行。 酵素分解反應中’為避免纖維二糖造成之生成物抑制，將 反應系内之纖維二糖濃度保持於特定範圍，在提高纖維寡 酶之生產性上甚為重要。將反應系内之纖維二糖濃度保持 =特定範圍之方法’可為藉由超過濾或逆渗透過濾等膜過 ’從反應系統將生成之纖維二糖取出之方法，或者將活 石夕Ϊ益ΓΓ材等乾燥植物粉等有機多孔質基材或二氧化 (，，、機夕孔質基材導入反應系統’藉其等將纖維二糖吸 或者將纖維素基質固定於管柱等，再使含有纖 等t反應液流過之方法’或者將纖維素酶固定於高分 于等，再使含有纖維素之反應液流過之方法。 藉2料素分解得収纖維寡醣做為主成份 要時可施行脫色、脫氯或去除酵素 精製方法只要為公知之方法即 例如活柹π忐田 並…、特別限疋，可使用 濟、赶、^=離子父換樹脂處理，層析處理，精密過 α起過遽或逆滲透過渡等過瀘、處理，或者晶析處理等， 103774.970513.d〇c -29- 1301155 /、等可單獨使用，亦可將2種以上組合使用。 藉由上述方法精製之纖維寡醣做為主成份之水溶液，可 原樣使用，然而視需要亦可藉由乾燥使其固化。乾燥方法 只要為公知之方法即可，並無特別限定，可使用例如嘴霧 乾燥、冷來乾燥、滾筒乾燥、薄膜乾燥、塔板乾燥、氣流 乾燥或真空乾燥#，其等可單獨使用，亦可將2種以上組 合使用。 '

上述之精製或乾燥處理時之纖維寡醣之載劑，除水以 外，可視需要使用有機溶劑等。#中所使用之有機溶劑亦 無特別限^，而以例如製造醫藥品、食品及其等之添加劑 之步驟中所用者為較佳’可為例如「醫藥品添加物事典」 (藥事日報社股份有限公司發行）、「日本藥局方」或「ς品 添加物A S書」（均為廣川書店發行）中歸類為溶劑者。水 及有機溶劑可單獨使用，亦可2種以上自由併帛，亦可一 度分散於1種載劑後’除去該載劑，再分散於不同載劑。 經由上述步驟得到之纖維寡醣之㈣，並無特別限定， 可使用常溫下之固體、懸浮液、乳化液、糖漿或溶液狀。 固體狀纖維寡醣之-例，可為例如粉末、顆粒、片粒、成 形體、積層體或固體分散體等。 繼而，針對本發明之方法得到之纖維寡膽加以說明。 本發明之纖維募醣以二乙趟可溶物含有率繼啊以下 為較佳’而以i_ ppm以下為更佳。其中之「二乙越可溶 物含有率」為纖維素系物質中木質素或木質素分解物等乙 醚可溶之雜質含有率，可依照「日本藥局方心次修訂 103774-970513.doc -30- 1301155 」（廣；丨Θ店發仃）之結晶纖維素純度試驗（2)規定之二乙 鱗可溶物定量法測定。二乙趟可溶物含有率為· _以 下之纖維寡耱由於雜質少’白色度高，因將該纖維募醣使 用於食品、化妝品或醫藥品時之精製容易，故較佳。尤笪 將纖維寡聽做為醫藥品等之活性成分之組合物，由於能降 低活性成分之分解，姓# 刀解故較佳。又，將該纖維募醣做為化學 =料使用時’由於雜質少，不易產生副反應，可提高 予轉化率，故較佳。其中以二乙料溶物含有率1000 ppm以下為更佳’而以5〇〇 ppm以下又更佳以_啊以 下為特佳，以100 ppm以下為最佳。由於該二乙料溶物 含有率愈少，愈可得到上述效果，因此對於其下限並盈特 別限制，而簡便處理可達成之木質素含有率範圍為〇ι ppm以上。 藉由本發明所得狀纖維寡醣之用途並無㈣限定，可 使用於例如食品、化粧品、醫藥品或一般工業製品等之領 域y故為食品成分、化粧品成分、色素成分、香料成分、 醫藥品藥效成分、農藥成分、飼料成分、肥料成分、培 基成分、分析用試藥成分以及添加劑、中間原料或發酵 料等。 藉由本發明所得到之纖維寡醣，於食品方面，可使用於 例如果醬、布丁或優酷乳等凝膠’蛋黃醬、沙拉醬、調味 醬類、佐料汁、湯汁或蔬菜加工品等調味料，咖哩、菜肉 醬（hash)、肉醬汁、燉品（stew)或湯等蒸煮食品，冷藏食 品’夹肉麵包、培根肉、香腸、蒜味香腸㈣如s謂㈣ 103774-970513.doc 31- 1301155 或火腿類等畜產加工品，魚糕、竹輪（日式魚肉加工品）、 魚肉火腿·香腸或油炸魚糕等水產煉製品，麵包、生麵、 乾麵、通心麵（macaroni)、義大利麵（spaghetti)、中華饅頭 皮、蛋糕粉（cake mix)、預拌醬、白汁醬、餃子、春捲等 皮類等之小麥加工品，咖哩、調味醬、湯汁、佃煮（曰式 小菜）或果醬等之罐裝或瓶裝類，甜糖、糖錠、糖果片、 巧克力、小圓餅、脆餅乾、米製餅果、日式洋糖果、西式 糖果、點心糖果、砂糖糖果或布丁等餅乾糖果類，油炸 類、炸芋肉丸、餃子或中華饅頭等調理加工品，蔬菜糊、 肉銘、水果糊或魚貝類糊等之糊類。χ，亦可使用於冰溪 淋、冰牛乳、牛奶冰、乳清糕、煉乳、奶油、優路乳、： 赂或白汁醬等之乳製品，乳瑪琳、油脂塗抹醬或际油等之 油脂加工品等。再者，可使用於可樂等之碳酸飲料，或添 加碳酸、添加酒精或與乳製品混合之水果飲料，果汁或添 加果實之飲料，或乳性飲料等之飲料，咖啡、牛乳、豆 礼、可可牛乳、水果牛乳Μ憂絡乳等乳酸/乳性飲料等， 或烈佘、烏龍茶、抹茶或紅茶等茶飲料等。 本發明得到之纖維寡醣可期待具有活化腸时用細菌族 群諸如將乳酸菌或乳酸桿菌等活性化，降低血中糖濃度及 血中胰島素濃度，降低血中膽_，降低體脂肪率，促進 脂質·糖質代謝，改善通便·便臭，抗虫主牙等各種生理活 f生因此除用於上述通常食品之外，亦可用於機能性食 品、健康食品或減肥食品等。 又’依照本發明所得到之纖維寡聽由於為高純度，亦可 103774-970513.doc -32- 1301155 使用為形成各種纖維寡糖衍生物之化學轉化原料。 【實施例】 茲根據實施例對本發明加以說明，然而本發明並不受其 等之限定。 (實施例1) 將市售之來自針葉樹之溶解紙漿（平均聚合度781，二乙 醚可溶物含有率1.1%，平均粒徑174 μιη) 2 kg及3 N鹽酸水 溶液30 L加入低速型攪拌機（30 L反應器），於105 °C攪拌30 分鐘同時水解。將得到之酸不溶性殘餘物使用努彩漏斗 (1^\^(：1^)過濾，用70 1^之純水洗淨4次後，得到40.1%之溼 塊體（平均聚合度220，二乙醚可溶物含有率〇·〇3質量〇/0， 平均粒徑69·1 μιη，膠體狀纖維素成分含有率13·4質量％， 纖維素I型結晶含有率85%)。 對該溼塊體添加含固形份5%，蛋白質濃度〇·25%之來自 木黴菌之市售纖維素酶製劑（商品名：T「Amano」4)溶於 〇·2 N醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH4.5)之溶液，使全量成為25 mL， 並充填於5〇 mL玻璃製小瓶中。將該玻璃製小瓶放入481 之恆溫震盪水槽，以震盪速度90 rpm，依表丨所示之設定 時間進行反應。反應開始後，依表1所示之設定時間，將 反應液以懸浮狀態分注為每份300 pL。使用超過濾模組 (分劃分子量5000) ’除去酵素後，藉由高速液體層析（島津 製作所股份有限公司製，管柱：東麗股份有限公司製，商 品名：TSK-GEL AMIDO-80，移動相：乙腈/水—⑷分 析。得到之結果如表1所示。表中之募酿選擇率為依照（纖 103774-970513.doc -33· 1301155 維一糖/辰度+纖維三糖濃度）/全糖濃度“㈧（❶/心算出之值。 (實施例2) ^實施例1同樣地將市售之來自針葉樹之溶解紙漿（平均 Λ ^ 81 一乙醚可溶物含有率，平均粒徑174 μιη) 進打酸水解，將得到之渥塊體以f狀加人6Gt之器流式乾 燥機，進行12小時乾燥。 將侍到之乾燥物使用家庭用混合機碎裂，將得到之纖維 素粗卒物用氣流式粉碎機（清新企業股份有限公司製，商 口口名· null STJ_2⑽型）粉碎，得到纖維素微粉碎物（平 句聚口度220,二乙驗可溶物含有率G()3質量。，平均粒徑 ΊΙ陣，膠體狀纖維素成分含有率17.5質量％，纖維素1 5L。曰曰各有率86%)。IX該纖維素微粉碎物做為基質，用與 實施例1同樣之方法進行酵素分解。得到之結果如表以斤 示。 實^例2，相對於實施例1，為平均聚合度及二乙醚可溶 物含有率相同，而平均粒徑較小，膠體狀纖維素成分含有 率車乂夕者攸表1可知實施例2，與實施例丨相較，由於平 均粒徑變小，㈣度達到㈣或2()%之反應時間縮短，再 者，於任一種反應濃度下，募醣選擇率均提高。 (實施例3) 將市f之來自闊葉樹之溶解紙毁（平均聚合度1682,二 乙醚可命物合有率〇.9%，平均粒徑9ι _)與實施例^同樣 ^進行酸水解，在得到之澄塊體中添加純水，形成纖維素 派度10/。之分散液，再用高剪切均質機（特殊機化股份有限 103774-970513.doc •34· 1301155 公司製，商品名·· τκ均質機）糌姓“八μ 、）見#30刀鐘，得到纖維素分 政體（平均聚合度151，二乙醚可溶物人 J，合物含有率0.1質量％，平 均粒徑8·7 μηι，膠體狀纖維素成 又刀s有率55.5質量％，纖 維素1型結晶含有率85%)。以該纖維素分散體做為基質， 用與實施例!同樣之方法進行酵素分解。得到之結! 所示。 實施例3,與實施例1Λ2相較，為平均聚合度較小，二

乙醚可溶物含有率較高，且平均粉 十3粒仅較小，膠體狀纖維素 成分含有率較多者。從表1可知， 貫施例3與實施例1及2相 較’反應時間更為縮短，#分別使糖濃度中之募醋選擇率 提高。又，實施例心，隨著糖濃度上升寡醣選擇率將降 低；然巾’實施例3，R使糖濃度上升，寡醣選擇率並未 降低。 (實施例4) 與實施例1同樣地’使用市售之來自針葉樹之溶解紙漿 (平均聚合度781，二乙醚可溶物含有率hl質量％，平均粒 徑174 μηι)，除水解條件為：鹽酸濃度為5 N之鹽酸水溶 液，18°C，12小時以外，與實施例i同樣方式進行水解， 將酸不溶性殘餘物洗淨，過濾，得到溼塊體（平均聚合度 690，二乙醚可溶物含有率〇·7質量❶/。，平均粒徑49 8 μηι)。將該溼塊體調製成纖維素10%濃度之水分散體，並 使用超高性能分散機·溼式微粉碎機（蘆澤股份有限公司 製，商品名·· Perl RL ’使用φ2❿瓜矽石珠粒，充填率 80%)，施行壓密·磨碎處理，得到纖維素微粒子分散體 103774-970513.doc -35- 1301155 (平均聚合度690，二乙醚可溶物含有率〇·7質量。/❶，平均粒 徑7.1 μπι，膠體狀纖維素成分含有率87.5質量％，纖維素I 型結晶含有率77%)。以該微粒子分散體做為基質，用與實 施例1同樣之方法進行酵素分解。得到之結果如表1所示。 實施例4與實施例1、2及3相較，為平均聚合度及二乙醚 可溶物含有率較高’而平均粒徑較小，膠體狀纖維素成分 含有率較大者。從表1可知實施例4與實施例3之募醣選擇 率為同4 ’而反應速度提高。又，實施例4，即使糖濃度 上升，纖維寡醣之收率幾乎未降低。 (實施例5) 使用市售之來自棉絨之紙漿（平均聚合度1853)，除水解 條件為：鹽酸濃度為5 Ν之鹽酸水溶液，i3〇〇c，12小時以 外，與實施例1同樣方式進行水解，得到溼塊體（平均聚合 度49)。將該溼塊體調製成纖維素1〇%濃度之水分解體，i 使用超高性能分散機.渔式微粉碎機（蘆澤股份有限公司 製，商品名：Perl RL，使用φ2 mm矽石製珠粒，充填率 8〇%)，施行壓密.磨碎處理，得到纖維素微粒子分散體 (平均聚合度49，二乙醚可溶物含有率〇 9質量％，平均粒 徑1〇·3 ’’膠體狀纖維素含量941質量％ ’纖維訇型結 晶含有率75%)。以該微粒子分散體做為基質，將酵素以來 自黑麴菌（Aspergillus niger)之長瀨產業股份有限公司製

Cellu丨ase Nagase(商品名）代替，進行酵素分解。得到之結 果如表1所示。 實施例5與實施例4相較，為平均聚合度小而二乙喊可溶 103774-970513.doc -36 - 1301155 物含有率較多，平均粒徑較大，膠體狀纖維素成分含有率 較多者。從表1可知實施例5，相對於實施例4，反應時間 減半而寡醣選擇率提高。 (比較例1)

使用在實施例1中使用之溶解紙漿，在3 N鹽酸水溶液中 調製成纖維素濃度1〇%之分散液，於常溫下用高剪切均質 機（特殊機化股份有限公司製，商品名：TK均質機）攪拌6〇 分鐘’得到纖維素分散體（平均聚合度723，二乙醚可溶物 含有率0.9質量。/❶，平均粒徑49·3 μπι，膠體狀纖維素成分 含有率10_2質量％，纖維素〗型結晶含有率85%)。以該未經 酸水解之纖維素分散體做為基質，用與實施例丨同樣之方 法進行酵素分解。得到之結果如表1所示。 比較例1為平均粒徑及二乙醚可溶物含有率在本發明之 範圍，而平均聚合度較大者。從表丨可知比較例丨相對於各 實施例而言，糖濃度達到10或20%之反應時間長，酵素分 解遲緩。又，寡醣選擇率在任何一種糖濃度下均未達到各 實施例之水準。 (比較例2) 將依照實施例4之操作所得到之座塊體調製成纖維素 10%濃度之水分散液，使用開孔45 _之篩網，進行澄式 分離後’使帛篩上殘留t固形冑分(平均聚合度690，二 卞岣粒徑107.3 μιη，膠體狀纖 醚可溶物含有率0.7質量 維素成分含有率5·2質量％，纖維素J】 京1型結晶含有率85%)做 為基質，以與實施例1同樣方式進 運仃酵素分解。得到之結 103774-970513.doc -37- 1301155 果如表1所示。 比較例2為平均聚合度及二乙醚可溶物含有率在本發明 之範圍，而平均粒徑較大者。從表丨可知比較例2相對於各 實施例而δ，反應速度遲緩，寡醣選擇率亦未能達到實施 例之水準。 (比較例3) 將市售之未漂白之來自針葉樹之牛皮紙漿（平均聚合度 1670，二乙醚可溶物含有率12質量％，平均粒徑154， 除水解條件為：鹽酸濃度為4 鹽酸水溶液，35它， 小時以外，與實施例1同樣方式進行水解，將酸不溶性殘 餘物洗淨，過濾，得到溼塊體（平均聚合度49〇，二乙醚可 溶物含有率4.4質量％，平均粒徑48·7 μιη，膠體狀纖維素 成分含有率12·8質量％，纖維素〖型結晶含有率86%)。 使用該溼塊體，以與實施例丨同樣方式進行酵素分解。 得到之結果如表1所示。 比較例3為平均聚合度及平均粒徑在本發明之範圍，而 乙醚可溶性含有率較大者。從表丨可知比較例3，與比較例 1及2相較，纖維募醣收率有些提高，而與各實施例相關 較，反應速度及寡醣選擇率均未達到各實施例之水準。 表1 平均聚合度 (一） 纖維素基1 平均粒徑 (μηι) ί基礎物性 膠體成分 含有率 (質量％) 一乙喊可溶 物含有率 (質量％) 1 全糖濃度 (mg/mL) 哮素分解數 反應時間 (hr) 寡醣選擇军" (%) 實施例1 220 69.1 13.4 0.03 10 20 5 1Q 54.0 1 Q A 實施例2 220 16.4 17.5 0.03 10 20 ί y 4 17 U.U 61.0 ^ 15.0 實施例3 151 8.7 55.5 0.1 -------- 10 20 1.5 5 54.0 55.5 103774-970513.doc -38- 1301155 實施例4 690 7.1 87.5 0.7 10 20 1 4 57.0 52.0 實施例5 49 10.3 94.1 0.9 10 20 0.6 2 61.0 60.5 比較例1 723 49.3 10.2 0.9 10 20 10 36 33.0 7.5 比較例2 690 107.3 5.2 0.7 10 8 15.0 20 24 8.5 比較例3 490 48.7 12.8 4.4 10 12 37.2 20 44 10.5 (製造例1) 將瑞氏木黴菌（Trichoderma reesei) NBRC31329株接種於 馬鈴薯葡萄糖培養基（Difco公司製），並在37°C培養7曰 後，從該培養基表面取出1白金耳孢子，並添加聚蛋白腺1 g、 酵母萃取物〇·5 g、碌酸一卸2 g、硫酸銨1.5 g、硫酸鎂0.3 g、氣化鈣0.3 g、微量元素1 mL(將硼酸6 mg、鉬酸銨四水 合物26 mg、氣化鐵（III)六水合物1 〇〇 mg、硫酸銅五水合 物40 mg、硫酸錳四水合物8 mg及硫酸鋅七水合物2〇〇 mg

溶於全S 100 mL精製水而形成者）、Adekanol LG-109 1 mL 及結晶纖維素（旭化成化學公司製，商品名g懸 浮及溶解於全篁1 L之精製水，以每1〇〇 mL分注於500 mL 容積三角燒瓶中，並植菌於經熱壓釜滅菌之培養基，於28 °c進行3日前培養。再者，將前培養液1〇 mL移植於添加相 同培養基1 L之5 L搖瓶發酵器（jar fermenter)中，於28°C，授摔 40〇rpm，通氣0.5 vvm下進行培養，培養中以Na〇H控制於 pH3。進行7日培養後，將培養後之液體離心，將上清液以 開孔0.46 μηι之精密過濾膜除菌，將濾液藉由分劃分子量 13000之超過濾膜（旭化成化學公司製，商品*Micr〇za鉛筆 型模組ACP-0013)以體積比1〇倍濃縮，得到粗酵素。 103774-970513.doc -39- 1301155 針對該粗酵素，測定活性比（溫度55〇c之卜葡萄糖苷酶 活性/結晶性纖維素分解活性）之結果如表2所示。 (製造例2) 將瑞氏木黴菌（Trichoderma reesei) NBRC31329株接種於 馬鋒薯葡萄糖培養基（Difco公司製），並在37°C培養7曰 後，從該培養基表面取出1白金耳孢子，並添加聚蛋白丨g、 酵母萃取物0.5 g、鱗酸一鉀2 g、硫酸錄ι·5 g、硫酸鎂〇·3 g、 氣化約〇·3 g、微ϊ元素1 mL(將侧酸6 mg、鉑酸錢四水合 物26 mg、氣化鐵（ΠΙ)六水合物1 〇〇 mg、硫酸銅五水合物 40 mg、硫酸錳四水合物8 mg及硫酸鋅七水合物2〇〇 溶 於王里100 mL精製水而形成者）、Adekanol LG-109 1 mL及 結晶纖維素（旭化成化學公司製，商品名ρίΙ_1〇1)1() g懸浮 及溶解於全量1 L之精製水，以每1〇〇 mL分注於500 mL容 積二角燒瓶中，並植菌於經熱壓爸滅菌之培養基，於28 進行3日前培養。再者，將前培養液1〇 mL移植於添加相同 培養基1 L之5 L搖瓶發酵器（jar fermenter)中，於28°C，攪拌 400 rpm，通氣〇·5 vvm下進行培養，培養期間以Na〇H控制 於pH 4。進行7日培養後，將培養後之液體離心，將上清 液以開孔0.46 μιη之精密過濾膜除菌，將濾液藉由分劃分 子量13000之超過濾膜（旭化成化學公司製，商品名Microza 船筆型模組ACP-0013)以體積比1〇倍濃縮，得到粗酵素。 針對該粗酵素，測定活性比（溫度55。〇時之β-葡萄糖苷 酶活性/結晶性纖維素分解活性）之結果如表2所示。 (製造例3) 103774-970513.doc -40- 1301155 將市售之纖維素酶（合同酒精公司製，商品名：GODO-TCD)以成為500 mg/mL之方式溶於50 mM醋酸-醋酸鈉緩衝 液（ρΗ4·8) ’並導入陰離子交換管柱（Amersham公司製，商 - 品名：DEAE-Sepharose FF)，並將管柱内部以50 mM醋酸_ 醋酸鈉緩衝液（ρΗ4·8)與溶解1莫耳。/。氯化鈉之50 醋酸- 酉曰納緩衝液（ρΗ4·8)依照線性梯度（Hnear gra(jient)法流 過，從市售酵素得到分劃之樣本。對所有得到之部分測定 • β-葡萄糖苷酶活性及結晶性纖維素分解活性，並將活性比 (度55 c時之β-葡萄糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活 性）0.5以下之部分合併。將得到之纖維二糖部分藉由分劃 为子篁10000之超過濾模組（MilHp〇re公司製，商品名··

Amicon Ultra_15離心過濾器）濃縮至體積比為5倍為止， 得到精製酵素（精製酵素中之蛋白質濃度為154叫就）。 針對該精製酵素，測定活性比（溫度55t時之卜葡萄糖 芽酶活性/結晶性纖維素分解活性)之結果如表2所示。 鲁 （實施例6) 使用市售之來自針葉樹之溶解紙漿（平均聚合度781，二 乙峻可溶物含有率，平均粒㈣4_)2kg，加入低 速型攪拌機（30 L反應器）’以「3 N鹽酸水溶液，⑽， ”」之X解條件進仃水解，將酸不溶性殘餘物洗淨並 過濾，得到溼塊體。使得到之溼 60°r to ^ ^ 鬼體成為I狀，並使其在 0 c烘相中通氣乾燥12小時。 於乾煉物中添加精製水，成 為各60〇/〇水分，並用混合 攪拉、、胃人^ 央裟作所製，商品名··萬能 搜拌此合機，鉤型葉片，9〇分 刀题’ 126 rpm)磨碎，得到磨 103774-970513.doc •41- 1301155 碎纖維素（平均聚合度220，平均粒徑9· 1 μηι，膠體狀纖維 素成份量66.1質量％，二乙醚可溶物含有率〇〇3質量％，纖 維素I型結晶含有率78%)。 將該磨碎纖維素5質量％懸浮溶解於製造例1得到之粗酵 素之50 mMSf酸·醋酸鈉緩衝液（ρΗ4·8)，使全量成為25 mL ’添加於玻璃製小瓶中。將該玻璃製小瓶放入55 °C之 I*亙1震盪水槽中，以震盪速度9〇 進行反應。依照反應 開始後之設定時間，將反應液以懸浮狀態分注成每份300 μί， 並使用超過濾模組（分劃分子量1〇〇〇〇)，除去酵素及未分解 纖維素後’藉由高速液體層析分析糖濃度。得到之結果如 表2所示。 反應液中之纖維寡醣及葡萄糖之定量，係藉由高速液體 層析（管柱：島津製作所製，商品名：AsahipakNH2P_5〇, 高速液體層析儀：島津製作所製，商品名：SCL-10A型，

移動層：乙腈/水=75/25(體積比），循環量：】虹/—.，試 料液：10 pL)而進行。 表中之反應時間為纖維寡醣及㈣糖之總生成糖量對添 加之纖維素量之比到達2〇質量％所需要之反應時間。又， 寡醣選擇率係表示藉由（纖維二糖濃度+纖維三糖濃度）/全 糖濃度xl〇0(%)算出之值。 (實施例7) 使用市售之來自針㈣之溶解紙襞（平均聚合度781，_ 乙醚可溶物含有率1.1%，平始抑灰 十勺粒仏174 μηι)，除水解條件為 5 Ν鹽酸水溶液，18°C，12Α拄丨ν从 12小時以外，以與實施例1同樣方 103774-970513.doc -42- 1301155

式進行水解’將酸不溶性殘餘物洗淨，過濾，得到溼丨鬼胃 (平均聚合度690，二乙醚可溶物含有率0.7質量％，平均粒 徑49·8 μιη)。將該溼塊體製成10%濃度之水分散體，並使 用超高性能分散機·溼式微粉碎機（蘆澤股份有限公司 製’商品名· Perl研磨機RL，使用φ2 mm石夕石珠粒，充填 率80%)，施行壓碎·磨碎處理，得到纖維素微粒子分散體 (平均聚合度690，二乙醚可溶物含有率〇.7質量％，平均粒 徑7·1 μπι ’膠體狀成份含有率87·5質量。/❶，纖維素I型結晶 含有率77%)。又，將得到之溼塊體以與實施例6同樣方^ 進行酵素分解，得到之結果如表2所示。 實施例7與實施例6相較，為將平均粒徑較小，膠體成份 里杈多之纖維素進行酵素分解者，其反應時間縮短， 選擇率亦提高。 聽 (實施例8) 使用實施例6得到之溼塊體狀纖維素，並使用製造例3得 到之精製酵素，依照與實施例丨同樣方式進行酵素分解p 侍到之結果如表2所示。 、、實施例8’與實施例6相較，為以活性比(卜葡萄糖苦酶 活I·生/結晶性纖維素分解活性）較小之酵素代替者。由於酵 素改變，雖然反應時間延長，但選擇率提高。 、 (實施例9) 將市售之來自針葉樹之溶解紙漿（平均聚合度781，二乙 趟可溶物含有率L1質量％，平均粒徑174㈣，於如;， 擾拌30分鐘，料水解，將得到之酸不溶性殘餘物使用努 103774-970513.doc -43- 1301155 彩漏斗（NUtsche)過濾、，並以7〇 L純水洗淨4次後，得到固 形伤40.1〇/〇之渥塊體（平均聚合度22〇，平均粒徑的」㈣， 膠體狀成份含有率13.4質量％，r乙醚可溶物含有率003 =%，纖維素!型結晶含有率85%)。使用該渔塊體狀纖 維素，並使用製造例3得到之精製酵素，依照與實施例6同 樣方式進行酵素分解。得到之結果如表2所示。 實施例9’與實施例6相較，以活性比(β_葡萄糖苦酶活 性/結晶性纖維素分解活性）較小之酵素代替，且使用平均 粒徑較大’膠體成份量較少之纖維素。由於酵素及基質改 變，雖然反應時間延長，但選擇率提高。 土、 (實施例10) 使用實施例6得到之澄塊體狀纖維素，並使用製造例2得 到之酵素，依照與實施例6同樣方式進行酵素分解。得到 之結果如表2所示。 實施例1〇,與實施例6相較，為以活性萄糖㈣ 活性/結晶性纖維素分解活性）較大之酵素代替者。由於酵 素改變，雖然反應時間同等，但選擇率降低。 (比較例4) 使用實施例6至9中使用之市售紙衆（平均聚合度Μ， 在不經水解下，添加純水，與__ 樣方式施行磨碎處理，得到溼塊體（平均聚合度Μ〗，平均 粒徑49.3叫，膠體狀纖維素成份量1〇2質量％，二乙㈣ 溶物含有率G.9質量％ ’纖維素！型結晶含有率抓）。使用 其並以與實施例6同樣方式進行酵素分解。得到之社果如 103774-970513.doc -44- 1301155 表2所示。 比較例4為纖維素之平均聚合度未在本發明範圍内，币 平均粒徑及膠體狀纖維素成分含量滿足本發明之範圍者， 與各實施例相較，反應時間變長，寡醣選擇率亦降低。 (比較例5) · 將藉由實關6㈣得収渥塊體製成纖㈣濃度為 之水分散體，使用開孔45 μιη之筛網，進行澄式分則 後，使用篩上殘餘之固形份（平均聚合度22〇,平均粒徑 103.4 μηι，膠體狀成份含有率9 7質量％，二乙醚可溶物含 有率0.03質量％ ’纖維素！型結晶含有率85%)做為基質，以 與實施例6同樣方式進行酵素分解。得到之結果如表2所 示。 比較例5為平均聚合度及二乙醚可溶物含有率在本發明 範圍内，而平均粒徑較大，膠體狀成分含有率較小者。比 較例5 ’與各實施例相較，反應速度遲緩，寡醣選擇率亦 未達到實施例之水準。 表2 i 平均聚合i (一） 5^參物質物性值 纖維素酶物性值 酵素分解結果 肀均粒徑 (μηι) 膠體狀纖 維素成分 含有率 (質量％) 二乙醚可 溶物含有 率 (質量％) β-葡萄糖 苷酶活性 :Α U/mL 結晶纖維 素分解活 性 :B U/mL 活性比 :A/B 55〇C 反應時間 (hr) 募醣選系軍' (%) 實施例6 220 9.1 66.1 0.03 0.17 0.54 0.31 5 67.6 實施例7 690 7.1 87.5 0.7 0.17 0.54 0.31 4 75.7 實施例8 220 9.1 66.1 0.03 0.10 0.58 0.17 8 83.4 貫施例9 220 69j[ 13.4 H 0.03 0.10 0.58 0.17 24 72.6 實施例10 比較例4 220 781 ~ 9.1 -------- 66.1 0.03 0.22 0.51 0.43 5 ~ 59.4 49.3 10.2 0.9 0.17 0.54 0.31 39 50.4 比較例5 220 103.4 9.7 0.03 0.17 0.54 0.31 30 66.3 (實施例11) 103774-970513.doc • 45- 1301155 將瑞氏木黴菌（Trichoderma reesei) NBRC31329株在馬鈴 薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上於28°C培養7日，將生成之孢 子懸浮於100 mM磷酸鈣缓衝液（pH7)2 ml，形成1〇6個 /mL，添加EMS(甲磺酸乙酯）24 μΐ，並於28°C震盪16小 時，施行突變處理。從該孢子懸浮液藉由離心收集孢子， 以lOOmM磷酸鈣缓衝液（pH7)充分洗淨，稀釋成每平板1〇〇 至3 00個孢子，並將葡萄糖1 g、酵母萃取物1 g、 (NH4)2S〇4 2 g、KH2P〇4 4 g、Na2HP04 2 g、MgS04 · 7H20 200 mg、CaCl2 · 2H20 1 mg、Triton X-100、微量元 素1 mL(將硼酸6 mg、顧酸錄四水合物26 mg、氯化鐵（hi) 六水合物100 mg、硫酸銅五水合物40 mg、硫酸I孟四水合 物8 mg及硫酸鋅七水合物200 mg溶於全量1〇〇 mL之精製水 者）及瓊脂20g溶解或懸浮於1 L水中後，用熱壓釜滅菌， 再以膜過濾器過濾滅菌，於28 °C培養5日，測定培養液之 β-葡萄糖苷酶活性及結晶性纖維素分解活性，選擇突變株 瑞氏木黴菌（Trichoderma reesei) GL_1。將該突變株於2〇〇5 年4月15日，依據布達佩斯條約，寄存於獨立行政法人產 業技術總合研究所專利生物寄託中心（日本國茨城縣筑波 市東1 丁目1番地1中央第6(郵政編號305-8566))，寄存編號 FERM BP-10323。此外，該突變株亦於2〇〇5年1〇月7曰寄 存於中華民國（台灣）食品工業發展研究所，寄存編號 BCRC 930082 〇 (實施例12) 將瑞氏木黴菌（Trichoderma reesei) NBRC3 1329株及實施 ㈣46- 103774-970513.doc 1301155 例11中取得之變異株（}1^1株之各菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂 斜面培養基上於25°C培養7日，充分地形成孢子。將其1白 金耳聚蛋白棘1.0 g、酵母萃取物0.5 g、KH2P〇4 2.0 g、 (NH4)2S04 1_5 g、MgS〇4 · 7Η20 0·3 g、CaCl2 · 2Η20 〇·3 g、Tween 80(半井化學藥品股份有限公司製）1〇 ml、微量 元素液（將 H3B04 6 mg、（ΝΗ4)6Μο7024 · 4HO 26 mg、 FeCl3 · 6H20 100 mg、CuS〇4 · 5H20 40 mg、MnS04 · 4H2〇 8 mg 及 Z11SO4 · 7H20 200 mg 溶解及懸浮於水100 ml 之液體）1.0 ml及酒石酸7.5 g溶解或懸浮於1 L水中後，調 整至ρΗ4·0，以每1〇〇 mL分注於500 mL容積三角燒瓶中， 添加結晶纖維素（旭化成化學公司製，商品名：PH_101)1 g 後，接種於經熱壓釜滅菌之培養基，於28 °C震盪培養5 曰。於第5日將培養液離心，於溫度40 °C測定其上清液之 結晶性纖維素分解活性及β-葡萄糖苷酶活性。結果如表3 所示。 (實施例13)

將瑞氏木黴菌（Trichodermareesei)NBRC31329株接種於 馬鈴薯葡萄糖培養基（Difco公司製），並在37°C培養7曰 後’從該培養基表面取出1白金耳孢子，並添加聚蛋白腺1 g、 酵母萃取物0.5 g、磷酸一鉀2 g、硫酸銨1.5 g、硫酸鎂0.3 g、氯化約〇·3 g、微量元素1 mL(將删酸6 mg、鉬酸銨四水 合物26 mg、氣化鐵（III)六水合物1〇〇 mg、硫酸銅五水合 物40 mg、硫酸猛四水合物8 mg及硫酸鋅七水合物200 mg 溶於全量100 mL精製水而形成者）、Adekanol LG-109 1 mL 103774-970513.doc -47- 1301155

懸浮及溶解於全量丨精製水，以每1〇〇 mL分注於5〇〇 mL容積三角燒瓶中，於各燒瓶添加丨g結晶纖維素（旭化成 chemicals公司製，商品名pH_1〇1)後並植菌於經熱壓釜滅 菌之培養基，於28°C進行3日前培養。再者，將前培養液 30 mL移植於添加相同培養基3 [之5 L搖瓶發酵器q訂 fermenter)中，於28〇C，攪拌 4〇〇 rpm，通氣 〇5 vvm 下進行 培養，培養中以NaOH水溶液wpH下限控制於pH3〇。進行 5曰培養後，將培養後之液體離心，得到為粗酵素之上清 液。依照上述方法，測定得到之粗酵素之結晶性纖維素分 解活性及β-葡萄糖苷酶活性。培養中之pH經時變化如圖j 所示，活性測定結果如表4所示。 (實施例I4) 依照與實施例13同樣之方法，在培養瑞氏木黴菌 (Trichoderma reesei) NBRC31329株時，於培養中用 將pH之下限控制於PH2.5，得到粗酵素液。依照上述之方 法測定得到之酵素液之結晶性纖維素分解活性及卜葡萄糖 苷酶活性。培養中之pH經時變化如圖丨所示，活性測定於 果如表4所示。 (比較例6) 在培養瑞氏木黴菌 依照與實施例13同樣之方法 (Trichoderma reesei) NBRC31329株時，於拉矣丄

蚕中用NaOH 將pH之下限控制於ρΗ3.5或4或5，得到粗酵素液。贫^上 述之方法測定得到之酵素液之結晶性纖維素分解、、舌〖生及^ 葡萄糠苷酶活性。培養中之pH經時變化如圖】& 一 M 1所示，活性 103774-970513.doc -48- 1301155 測定結果如表4所示。 (實施例15) 依照與實施例13同樣之方法，培養實施例11所得之GL-1 株。於進行培養時，培養中用Na〇H將pH之下限控制於 pH3或pH4，得到粗酵素液。培養中之pH經時變化如圖2所 示。 (實施例16) | 於結晶纖維素5質量％(將旭化成化學公司製，商品名：

Ceolus PH-101製成含水分6〇%，並藉由三英製作所製，商 品名··萬能攪拌混合機之鉤形葉片，以126 rpm混煉擾拌 90分鐘者）8 ml中，添加實施例13及實施例15中得到之纖維 素S#粗酵素液2 ml ’並於5 5 °C擾拌條件下進行水解。於2 hr、4 hr、6 hr及8 hr反應後，在95°C加熱15分鐘，停止酵 素反應，並藉由離心得到上清液，再藉由上述HPLC法測 定纖維募醣及葡萄糖之濃度。結果如圖3所示。 | (比較例7) 以與實施例16同樣之方法，將結晶性纖維素進行酵素分 解時，使用比較例6中得到之纖維素酶做為粗酵素液。結 果如圖3所示。 [表3] 滅株 結晶性纖維素分解 活性(A) (U/ml) β-葡萄糖苷酶 活性(B) (U/ml) (B)/(A) NBRC 31329 0.50 0.23 0.46 GL-1 0.58 0.20 0.34 [表4] 103774-970513.doc •49- 1301155 PH ~2^5^ 夺） 結晶性纖維素分解 活性(A)(U/ml) P-匍萄糖苷酶活性 (B)(U/ml) (Β)/(Α)" A 0.402 0.501 0.571 0.052^ 0^069~ 0.214 0.13 0·14— 〇 Η 5 ^__65^ 0.358 0.272 0.145^ 〇T〇2~ \J.D / 0.40 0.38 (實施例17) 將市售之結晶纖維素（旭化成化學公司製，商品名：pH· 101)調製成固形份Η)質量％之水分散體，用珠粒研磨機進 霉 行漫式磨碎（蘆澤精密技術公司製，商品名Perl rL5，槽容 積5 L，粉碎介質：φ1 mm之锆土珠粒，回轉數：18⑻ 槽内滯留時間70分鐘），在得到之磨碎水分散體（平 =聚合度220，平均粒徑〇_7 μηι，膠體狀纖維素含有率54 質量％，二乙料溶物含有率〇.〇3%，纖維^型結晶含有 率75%)之1〇〇 m]L中，添加實施例15中將ρΗ3培養之上清液 藉由超過濾'(分劃分子量13_)以體積比5倍濃縮所得到之 粗酵素液200 mL ’添加阳4.5之5()福醋酸/醋酸納緩衝液 齡將全量調為500 mL，於】L容積之玻璃製可分離燒瓶中， 乂商口α名3-1之馬達進行内部授拌，同時於Μ。。溫浴中進 仃反應。在反應開始後2小時，將反應液以懸浮狀態分注 為每份300 ^，使用超過濾模組（分劃分子量1〇_，除去 酵素及未刀解纖維素’藉由高速液體層析分析糖濃度，定 量反應液中殘存之纖維素殘餘量。從其結果，可知反應時 間2小時之時’纖維素分解率為咖，寡醣選擇率和％。 (實施例18) 使用實加例1 7传到之磨碎纖維素水分散體，並使用於實 103774-970513.doc -50- 1301155 施例17同樣之燒瓶中裝置分劃分子量13000之聚丙稀猜製 之中空超過濾模組（旭化成化學公司製，商品名： ACP-0013)之反應槽，以實施例17同樣之條件進行反應， 同時以0.1 MPa，每小時4 L之循環流量將反應液流過超過 濾模組，同時進行2小時反應。測定藉由超過濾得到之透 過液中之糖濃度，定量反應液中殘存之纖維素殘餘量。

從結果可知纖維素分解率為95質量％，寡醣選擇率為 85% 〇 (實施例19) 除將反應液中之纖維素濃度調為2·5質量％以外，使用與 實施例18同樣之裝置進行酵素分解。酵素分解中，藉由透 過液中之分析，測定纖維素分解率，為保持反應液中纖維 素濃度為2·5質量％ ’經f追加磨碎纖維素水分散液，同時 進行24小時反應。與實施例18同樣地，測定透過液中之糖 濃度，定量反應液中殘存之纖維素殘餘量。 從結果可知纖維素分解率為98質量％，寡醣選擇率為 92% 〇 (實施例20) #將實&例19得到之纖維寡醣水溶液用離子交換樹脂（三 菱化。予A司製’商品名·· Diai〇n WA30及SK1B)脫酷酸後， C乾燥8小時，用乳钵粉碎，得到纖維寡醣粉末。使 用該纖維寡醣粉末，依照「曰本藥局方第14次修訂版」 /丨窃店1行）之結晶纖維素純度試驗（2)中規定之二乙醚 可’合物之疋I法所測定之二乙醚可溶物含有率為200 103774-970513.doc -51· I3〇ii55 ppm 〇 (比較例8) 將市售之未漂白溶解紙漿（購自spuruee公司，平均聚合 度1680，平均粒徑128 μιη，膠體狀纖維素含有率4質量 % ’二乙醚可溶物含有率1>5質量％ ’纖維素1型結晶含有率 85%)以家庭用混合機粉碎’以其為基質，添加ρΗ5·5之醋 酸緩衝液，將纖維素調為2質量％之水分散體。再將市售 1 之纖維素酶(合同酒精公司製，商品名：GODO-TCD)以對 水溶液(Μ質量·於上述纖維素水分散體中，依照實施例 17之方* ’於ρΗ5·()下進行24小時酵素分解。絲，纖維素 分解率為29質#%’寡醣選擇率為55%。將該纖維寡聽水溶 液依照實施例20之方法粉末化，並藉由實施例⑼之方法定 量二乙醚可溶物含有率，二乙醚可溶物含有率為32〇〇 ppm 〇 產業上之可利用性 警依&本發明之方法得到之纖維寡聽，除做為通常之食品 材料外，亦可做為機能性食品材料、醫藥品及其他化學品 之中間合成材料等之化學轉化原料或發酵原料，適合利用 於食品、醫藥品及一般工業製品領域。 【圖式簡單說明】 圖1為表示實施例13及14以及比較例6於培養期間之^^^直 經時變化之圖。 圖2為表示實施例i 5於培養期間之値經時變化之圖。 圖3為表示實施例16及比較例7中結晶纖維素分解生成物 103774-970513.doc -52- 1301155 之濃度變化之圖。圖中「反應液中之分解物蓄積量（％)」 意指反應液中葡萄糖及纖維寡醣之總計濃度，「纖維二糖 純度」為反應液中纖維寡醣對分解物蓄積量之比例（百分 率）。使用突變株，使培養液中之pH降低，每一分解物蓄 積量之纖維二糖純度提高。

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Claims (1)

1301155 十、申請專利範圍：

種纖維券酶之製造方法，其包含將平均聚合度700以 下、含有_量％以上之膠體狀纖維素成分、二乙醚可 ’合物3有率不到1質量％之水不溶性天然纖維素系物質， 在纖維素酶存在下進行酵素分解。 、 如凊求項1之纖維寡醣之製造方法，其中前述水不溶性 天然纖維素系物質之平均粒徑為100 μηι以下。 如請求項2之纖維寡聽之製造方法，其中前述水不溶性 天然纖維素系物質之平均聚合度為500以下，平均粒徑 為50 μηι以下。 4. 如請求項3之纖維寡膽之製造方法，其中前述水不溶性 天然纖維素系物質之平均聚合度為4〇〇以下，平均粒徑 為30 μηι以下。 5. 如請求項！之纖維寡醣之製造方法，丨巾前述水不溶性 天然纖維素系物質含有i 5質量％以上之膠體狀纖維素成 分。 6. 如請求項！之纖維寡醣之製造方法，纟中前述纖維素酶 之活性比（於溫度55°C之β_葡萄糖皆酶活性/結晶性纖維 素分解活性）為0.7以下。 7. 如請求項6之纖維寡醣之製造方法，其中前述纖維素酶 之活性比為0.5以下。 8. 如請求項7之纖維寡醣之製造方法，其中前述纖維素酶 之活性比為0.35以下。 9. 如請求項1之纖維寡醣之製造方法，其中前述二乙醚可 103774-970513.doc 1301155 溶物為木質素。 •如明求項1之纖維寡醣之製造方 天然纖維素系物質含有纖維㈣結日日别述水不溶性 U·—種藉由請求項U1G中任 醣，其特徵在;^ 、之方法得到之纖維寡 亏铖在於二乙醚可溶 Ϊ2·如請求瑁】〗—， s令手為2〇〇〇 ppm以下。 欠項11之纖維寡_，其中 WOO ppm以下。 乙醚可洛物含有率為

種艮叩組合物，其特徵在於含有藉由上 任一項之方法得収纖維寡酿。a 4項1至10中 “· -種化粧品組合物’其特徵在 中任一項之t、+ / 猎由哨求項1至1 0 <万法得到之纖維寡醣。 1 5 ·種醫藥品組合物，：^ n i ^ 中任一項之太/ 有藉由請求項 、之方法得到之纖維寡醣。 16. —種纖維幸酿—a f 中任一項^ ’其係製造用於請求項1至10 方法包含块表祕Ό A H维素酶者’該 。養纖維素_生產菌，其中 係藉由潠in ^ 1 μ F牙、崎生產® 、擇可抑制β-葡萄糖苷酶生產 M 株。 王座之_株所得到之菌 如明求員16之纖維素酶之製造方 在吝结或η "、甲月丨】迷纖維素酶 、、 於木黴菌屬（Trichoderma)之菌株。 1 8 ·如咕求項17之纖維素酶之製造方 維素酶生產詰吐 八中於培養前述纖 產囷時，將培養中之pH控制於未達3·5。 103774-970513.doc 1301155 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） • 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）

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