CN101842114A - 治疗和诊断纤维化、肿瘤侵入、血管生成和转移的方法和组合物 - Google Patents

治疗和诊断纤维化、肿瘤侵入、血管生成和转移的方法和组合物 Download PDF

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S·奥格
P·范瓦拉西拉
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D·马歇尔
A·K·霍尔泽
H·罗德里格斯
M·奥亚苏
S·A·麦克考雷
C·A·加西亚
D·H·柏曼
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Abstract

本发明提供利用加工形式赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂，LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂，或LOX或LOXL的抑制剂与其它治疗剂的协同组合来预防和治疗异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关各种疾病的新方法和相关组合物及试剂盒。还提供通过将上皮-间充质过渡(EMT)状态的细胞与候选药剂接触并检测细胞的EMT状态改变来选择防止或抑制肿瘤侵入、血管生成和转移的药剂的新方法。还提供利用特异性识别加工形式LOX或LOXL的分子或药剂来诊断或监测异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关各种疾病的方法和相关组合物及试剂盒。本文还提供利用包含LOX或LOXL抑制剂的组合物来预防、治疗纤维化相关的各种疾病和病症的方法和相关组合物、医学装置、系统和试剂盒。这种疾病或病症包括病理性心血管病症和疾病，例如高血压、高血压性心脏病、心肌梗塞、动脉粥样硬化和再狭窄、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、皮肤瘢痕、瘢痕瘤形成及阿尔茨海默病。

Description

治疗和诊断纤维化、肿瘤侵入、血管生成和转移的方法和组合物
                            交叉引用
本申请要求以下申请的优先权：2007年8月2日提交的美国临时申请号60/963,282，名为“Methods for Selecting Inhibitors of Tumor Invasion，Angiogenesis，and Metastasis(选择肿瘤侵入、血管生成和转移的抑制剂的方法)”(代理人案件号35120-704 101)；2007年8月2日提交的美国临时申请号60/963,249，名为“Treatment of Diseases With Inhibitors of Active LysylOxidase(用活性赖氨酰氧化酶抑制剂治疗疾病)”(代理人案件号35120-706.101)；2007年8月2日提交的美国临时申请号60/963,214，名为“Treatment of Diseases Through Inhibition of Both Lysyl Oxidase and LysylOxidase-Like Proteins(通过同时抑制赖氨酰氧化酶和赖氨酰氧化酶样蛋白来治疗疾病)”(代理人案件号35120-706.102)；2007年8月2日提交的美国临时申请号60/963,248，名为“Diagnosis or Monitoring of Diseases byAssessing Active Lysyl Oxidase Levels or Activity(通过评估活性赖氨酰氧化酶水平或活性来诊断或监测疾病)(代理人案件号35120-706.103)；和2007年8月2日提交的美国临时申请号60/963,246，名为“Combination TherapyIncluding Lysyl Oxidase Modulators(包含赖氨酰氧化酶调节剂的组合治疗)”(代理人案件号35120-707.101)，本申请还与以下申请有关：2008年8月1日提交，名为“LOX and LOXL2 Inhibitors and Uses(LOX和LOXL2抑制剂及其应用)”的共同待批美国专利申请(代理人案件号35120-715.201)，序列号__，和2008年8月1日提交，名为“LOX and LOXL2 Inhibitors andUses(LOX和LOXL2抑制剂及其应用)”的PCT专利申请(代理人案件号35120-715.601)，序列号__，各份申请通过引用全文纳入本文。
                            背景
1.癌症
癌症是美国和其它发达国家的严重公众健康问题。目前，在美国每4例死亡中即有一例死于癌症。癌症治疗包括用化疗药物治疗患者来杀伤肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞的亚组常对药物治疗耐受并能存活，从而在原部位或远端转移部位再次繁衍，进而导致可检测的疾病复发和发病。据信，具有侵入性和转移能力增加以及药物耐受性改变等特性的许多癌肿瘤细胞经历包括或类似于EMT(上皮-间充质过渡)的形态转化。经历EMT的细胞丧失上皮细胞正常的黏着性并经历各种改变，包括E-钙粘蛋白表达和间充质标记物表达丧失，运动性增加、侵入性增加和对细胞死亡的耐受性增加。
目前癌症的主导疗法是外科手术、放疗和化疗。化疗方法，例如抗-肿瘤抗生素，烷化剂、亚硝基脲化合物、长春花-生物碱、类固醇激素和抗-代谢药物构成了肿瘤学家可用疗剂的主体。虽然在癌症治疗领域已取得了进展，但癌症依然是主要的健康问题。
2.血管生成
血管生成是在已有毛细血管外形成新血管，其是各种生理学和病理学过程中一系列至关重要的事件。正常的组织生长，例如胚胎发育、伤口愈合和月经周期的特征在于依赖新血管形成来供应氧和营养物以及除去废物。大量不同且无关的疾病也与新血管系统有关。某些病状中，血管生成较低，应提高以改善疾病情况。然而，更常见的是，血管生成过度是各种病状的重要特征，包括以细胞增殖不正常或不受控为特征或与之有关的病状。涉及过度血管生成的病状包括，例如癌症(实体瘤和血液学肿瘤)、心血管疾病(例如动脉粥样硬化和再狭窄)、慢性炎症(类风湿性关节炎、克罗恩病)、糖尿病(糖尿病性视网膜病)、银屑病、子宫内膜异位、新生血管性青光眼和肥胖症。这些病症可从血管生成的化疗抑制中获益。
血管生成过程通常使正常情况下休眠的内皮增殖和迁移，细胞外周基质发生受控蛋白酶解并且通过产生毛细血管而合成新胞外基质组分。新的胞内和胞间接触的建立，内皮细胞形态分化成毛细血管样管状网络支持它们随后的成熟、支化、重塑和选择性退化，从而形成高度组织的功能性微血管网络。在正常情况下，血管内皮与其周围基质组分以及与促血管生成和血管抑制细胞因子和协调生理学血管生成的生长因子的自分泌、旁分泌和两侧分泌(amphicrine)相互作用在空间和时间上受到严格调控。
血管生成对肿瘤组织生长至关重要。观察到肿瘤比正常组织具有更多血管已有100多年。几项实验性研究提示原发性肿瘤生长和转移需要新生血管形成。与上述良好协调的正常组织生长过程相反，活性肿瘤生长所需的病理性血管生成通常是持续性和持久的，血管生成表型的初始获得是各种实体瘤和血液学肿瘤类型产生的共同机制。不能募集和维持血管网络的肿瘤通常在原位保持休眠，就像无症状的病损。转移也依赖于血管生成：肿瘤细胞要成功转移，其通常必须能使用原发性肿瘤的血管系统、在循环中活下来、停在靶器官的微血管系统中、离开该血管系统、在靶器官中生长并在靶部位诱导血管生成。因此，血管生成看来是转移级联反应开始以及完成所必需的。
因此，血管生成对于肿瘤生长和转移的重要性为化疗提供了最佳的潜在靶位。合适的抗-血管生成剂可通过延迟血管生成的开始(即，阻断“血管生成开关”)或通过阻断许多肿瘤类型特征性的持续和病灶新血管形成而直接或间接影响肿瘤-相关的血管生成。现正在多个临床试验中积极评估针对肿瘤-相关内皮以及涉及持续的病理性血管生成的多种分子和细胞过程及靶标的抗-血管生成治疗的安全性和效率。然而，迄今为止发现和/或鉴定到的安全和/或有效的抗血管生成剂有限。
3.纤维化
纤维化是作为伤口愈合过程的一部分会在受伤组织中发生是纤维组织异常累积。这种组织损伤可以是物理伤害、炎症、感染、接触毒素和其它原因所致。纤维化的例子包括皮肤瘢痕形成、瘢痕瘤、肝纤维化、肺纤维化(例如，矽肺、石棉沉着病)、肾纤维化(包括糖尿病性肾病)、硬皮病和肾小球硬化症。
例如，肝脏(肝)纤维化可作为对慢性肝损伤的伤口愈合反应的一部分而发生。纤维化可作为血色病、威尔逊病、酒精中毒、血吸虫病、病毒性肝炎、胆管阻塞、接触毒素和代谢紊乱的并发症而发生。据信，这种疤痕组织的形成表示身体试图包裹受伤的组织。肝纤维化的特征在于数量上与正常肝脏中不同的胞外基质累积。不作检查，肝纤维化会发展成肝硬化(定义为存在包裹的结节)、肝衰竭和死亡。
Li和Frieman(Gastroenterol.Hepatol.14：618-633，1999)总结道，肝纤维化的实际和提出的治疗方案包括去除潜在的诱因(例如，毒素或感染因子)；抑制炎症(使用，例如皮质激素、IL-1受体拮抗剂或其它药剂)；使用，例如γ干扰素或抗氧化剂下调星形细胞活化；促进基质降解；或促进星形细胞凋亡。虽然近年来有所进展，但许多这些方案仍处于实验阶段，现有的治疗目的在于抑制炎症而不是致力于潜在的生物化学过程。因此，本领域仍需要治疗纤维化，包括肝脏和肺纤维化的材料和方法。
本领域需要治疗异常或不良血管生成和纤维化相关的癌症、疾病的改进方法。本发明解决了这一需要并提供相关优点。
                            概述
I.通过抑制加工的LOX或LOXL来治疗
本发明提供利用赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)抑制剂来预防和治疗异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关各种疾病的新方法和相关组合物及试剂盒。LOX或LOXL可以是全长或加工形式。全长LOX或LOXL是原酶或前肽形式(即，没有信号序列)，而加工形式或切割形式是成熟的形式。LOX或LOXL的全长和加工形式均可以有活性。LOX或LOXL可以是分泌的形式，其也可有活性。抑制LOX或LOXL可有效预防和治疗肿瘤侵入和转移，和治疗异常血管生成相关疾病以及纤维化疾病。
一个实施方式提供体内治疗或预防对象中肿瘤侵入或转移的方法，所述方法包括给予该对象有效量的活性LOX或LOXL的抑制剂。
另一实施方式提供体内降低对象中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予该对象有效量的加工LOX或LOXL的抑制剂，从而将肿瘤生长降低至少25％、50％、75％、90％或95％。在一些实施方式中，所述肿瘤是转移性肿瘤。
还有另一实施方式提供增加或提高具有转移性肿瘤的对象存活机会的方法，所述方法包括：给予有此需要的对象有效量的加工LOX或LOXL蛋白的抑制剂，从而将所治疗对象的存活机会增加或提高一段时期。例如，该对象的存活可以增加至少10天、1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或者甚至10年。
蛋白酶解加工或切割后LOX或LOXL可以是LOX或LOXL的成熟形式。LOXL的例子包括但不限于：LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4。在一些实施方式中，LOX或LOXL的抑制剂可以是活性LOX、LOXL2或LOXL4的抑制剂。在一些这样的实施方式中，LOX或LOXL的抑制剂可以抑制活性LOX和LOXL2。
LOX或LOXL抑制剂可以是，例如针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。这些抑制剂可以是非竞争性抑制剂。
II.通过抑制LOX和LOXL来治疗
本发明还提供通过抑制赖氨酰氧化酶(LOX)和一种或多种赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)来预防和治疗异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关各种疾病的新方法和相关组合物及试剂盒。同时抑制LOX和LOXL可有效预防或治疗各种肿瘤的侵入和转移，并治疗异常血管生成相关疾病和纤维化疾病。
一个实施方式提供体内治疗或预防对象中肿瘤侵入或转移的方法，所述方法包括给予该对象有效量的LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂。
另一实施方式提供体内降低对象中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予该对象有效量的LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂，从而将肿瘤生长降低至少25％、50％、75％、90％或甚至95％。根据一些实施方式，所述肿瘤是转移性肿瘤。
还有另一实施方式提供增加或提高具有转移性肿瘤的对象存活机会的方法，所述方法包括：给予有此需要的对象有效量的LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂，从而将所治疗对象的存活机会增加或提高一段时期。例如，该对象的存活可以增加至少10天、1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或者甚至10年。
LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂可以不同，分别特异性抑制LOX和LOXL。或者，LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂可以是同时抑制LOX和LOXL的相同分子。LOXL可以是，例如LOXL1、2、3或4。在一些实施方式中，LOXL是LOXL2或4。在某些实施方式中，LOXL是LOXL2。
LOX或LOXL可以是全长或加工形式。LOX或LOXL可以是原酶形式或成熟形式，两种形式可以均有活性。LOX或LOXL可以是分泌形式，其也可有活性。LOX或LOXL的加工形式是蛋白酶解加工或切割后的形式。
LOXL的例子包括但不限于：LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4。在一些实施方式中，LOX或LOXL的抑制剂可以是活性LOX、LOXL2或LOXL4的抑制剂。在一些这样的实施方式中，LOX或LOXL的抑制剂抑制活性LOX和LOXL2。
LOX或LOXL抑制剂可以是，例如针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。这些抑制剂可以是非竞争性抑制剂。
III.组合治疗
本发明还提供利用赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的调节剂(例如，活化剂/激动剂或抑制剂/拮抗剂)来预防和治疗异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关疾病，例如癌症、肿瘤、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、硬皮病、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病的组合物、试剂盒和方法。
LOX或LOXL的抑制剂可与其它治疗剂，例如化疗剂、抗肿瘤生物药剂、抗血管生成剂和抗纤维化药剂组合来预防或治疗这些疾病或病症。据信抑制LOX或LOXL可使肿瘤细胞中上皮-间充质过渡(EMT)减缓或停止，或将间充质-上皮过渡(MET)诱导至低致瘤性状态，从而使得肿瘤或患病细胞对化疗药物、抗肿瘤生物药剂、抗血管生成剂和抗纤维化药剂更敏感。通过肿瘤细胞对治疗剂的细胞毒性作用致敏，LOX或LOXL的抑制剂与另一种治疗剂的协同性组合可用于防止或抑制肿瘤侵入和转移、抑制原发性肿瘤生长，还可用于有效地预防或治疗癌症。
IV.选择药剂
在另一方面，本发明提供选择防止或抑制肿瘤侵入、血管生成和转移的药剂的新方法。根据本发明，抑制赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)可使肿瘤细胞中上皮-间充质过渡(EMT)减缓或停止，或将间充质-上皮过渡(MET)诱导至低致瘤性状态，从而防止或抑制肿瘤侵入、血管生成和转移并使得原发性肿瘤细胞对其它治疗干预，例如放疗、化疗药物、抗肿瘤生物药剂、抗血管生成剂和抗纤维化药剂更敏感。
一个实施方式提供选择肿瘤侵入、血管生成或转移的抑制剂的方法，所述方法包括：将处于EMT状态的细胞与LOX或LOXL抑制剂接触；检测细胞EMT状态的改变，其中EMT状态降低或从EMT向MET状态改变表明LOX或LOXL抑制剂是肿瘤侵入、血管生成或转移的抑制剂。
V.诊断
在还有另一方面，本发明提供利用特异性识别活性或成熟形式赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的分子或物质来诊断或监测异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关各种疾病的新方法和相关组合物及试剂盒。发明人相信加工的LOX或LOXL是肿瘤侵入和转移，以及异常血管生成相关疾病和纤维化疾病的至关重要生物标记。加工形式的LOX或LOXL可以是有活性的。LOX或LOXL可以是原酶形式或成熟形式。LOX或LOXL还可以是分泌形式，其也可以是有活性的。
一个实施方式提供诊断或监测对象中癌症转移的方法，所述方法包括：评估血液或肿瘤中加工LOX或LOXL的水平或活性，从而与参比样品相比，血液或肿瘤中加工LOX或LOXL水平或活性的改变表明有转移性肿瘤生长存在。所述改变可以是加工LOX或LOXL水平或活性的增加或降低。与参比样品相比，血液或肿瘤样品中加工LOX或LOXL水平或活性增加表明有转移性肿瘤生长存在。
另一实施方式提供监测对象对治疗，包括LOX/LOXL调节剂，例如癌症、肿瘤、血管生成和纤维化疾病治疗的反应的方法。在另一实施方式中，该方法包括：将LOX或LOXL的调节剂给予该对象后检测该对象中胶原端肽或羟脯氨酸含量的改变，其中所述改变表明该LOX或LOXL调节剂对该对象有治疗作用。所述改变可以是增加或降低。例如，胶原端肽或羟脯氨酸含量降低可表示有治疗作用。
该方法包括将LOX或LOXL的调节剂给予对象后检测该对象中C-反应活性蛋白质或其它急性期反应物水平的改变，其中所述改变表明该LOX或LOXL调节剂对该对象有治疗作用。所述改变可以是C-反应活性蛋白质水平的增加或降低。C-反应活性蛋白质水平降低通常表示LOX活性降低。
VI.纤维化的治疗
另一方面提供了体内预防、治疗或缓解对象中纤维化的方法，所述方法包括给予该对象有效量的赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)抑制剂。LOX或LOXL的抑制剂可以是活性形式LOX或LOXL的抑制剂。
纤维化的示范性形式包括但不限于：心脏纤维化、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、皮肤瘢痕形成和瘢痕瘤及阿尔茨海默病。在还有其它实施方式中，心脏纤维化与高血压、高血压性心脏病(HHD)、心肌梗塞(MI)、动脉粥样硬化和再狭窄相关。
肾纤维化可包括但不限于：糖尿病性肾病、膀胱输尿管反流、小管间质性肾纤维化、肾小球肾炎或(GN)、局灶性节段性肾小球硬化、膜性肾小球肾炎或肾小球毛细血管性GN。肝纤维化可包括但不限于：肝硬化和相关病症，例如慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、酒精性脂肪肝(ASH)、非酒精性脂肪肝(NASH)、原发性胆汁性肝硬变(PBC)、胆汁性肝硬变和自身免疫性肝炎。肺纤维化包括特发性肺纤维化(EPF)或隐原性纤维化肺泡炎、慢性纤维形成性间质肺炎、间质性肺病(ILD)和弥散性实质性肺病(DPLD)。也可用本文所述组合物预防、治疗或缓解心脏纤维化、充血性心力衰竭、心肌病、心脏功能的心肌梗塞后缺陷；动脉粥样硬化；类风湿性关节炎；青光眼；年龄相关的黄斑变性(湿性AMD和干性AMD)；肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)；多发性硬化症；和久喘。
本文还提供将LOX/LOXL抑制剂局部递送至纤维化部位的组合物、装置、系统和试剂盒。可利用医学装置，例如导管和支架来局部递送，因而实质性降低了全身性递送这种LOX/LOXL抑制剂的相关毒性或其它副作用的风险。
可在病理性心脏病症或疾病，例如高血压、高血压性心脏病(HHD)、心肌梗塞(MI)、动脉粥样硬化和再狭窄之前、同时或之后递送LOX/LOXL抑制剂以防止这种病理学心脏病症或疾病相关的病理性纤维化的发作、降低其风险或对其再次治疗。例如，可在这种病理性心脏病症或疾病发作后至少1小时、2小时、3小时、5小时或10小时，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天给予LOX/LOXL抑制剂。
LOX或LOXL可以是全长或加工形式。LOX或LOXL可以是原酶形式或成熟形式，两种形式均有活性。LOX或LOXL可以是分泌形式，其也可有活性。LOX或LOXL的加工形式是蛋白酶解加工或切割后的形式。
LOXL的例子包括但不限于：LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4。在一些实施方式中，LOX或LOXL的抑制剂可以是活性LOX、LOXL2或LOXL4的抑制剂。在一些这样的实施方式中，LOX或LOXL的抑制剂抑制活性LOX和LOXL2。
LOX或LOXL抑制剂可以是，例如针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。这些抑制剂可以是非竞争性抑制剂。
                        附图简述
图1是LOX/LOXL基因组和蛋白质组成的示意图。
图2是含有预测的和测定的N-和O-糖基化位点、二联核定位信号(bipartitenuclear localization signal)和前胶原C-蛋白酶位点的LOX/LOXL序列比对。
图3描述了上皮-间充质过渡及其在侵入和转移中的作用。
图4是EMT和MET及用于评估细胞的EMT或MET表型的标记的示意图。
图5是LOX/LOXL在EMT-MET提升或降低中的作用以及EMT-MET细胞的药物耐受性或敏感性的示意图。
图6显示了用LOXL2转染MCF-7(低LOXL2)细胞诱导EMT。(A)MCF-7野生型(WT)细胞和(B)MCF-7-Loxl2.克隆1作E-钙粘蛋白染色。第一抗体：抗-E-钙粘蛋白(10μg/ml)；第二抗体：抗-小鼠-cy3(红)；DAPI：核(蓝)。(C)MCF-7野生型细胞和(D)MCF-7-Loxl2.克隆1作罗丹明鬼笔毒环肽：肌动蛋白细胞骨架(红)和DAPI：核(蓝)染色。野生型MCF7显示上皮表型，强烈E-钙粘蛋白阳性(膜染色)(A)，肌动蛋白细胞骨架的罗丹明鬼笔毒环肽染色显示环形模式(C)。用LOXL2转染的MCF7改变成间充质表型，丧失E-钙粘蛋白表达(B)，以及肌动蛋白细胞骨架重塑(延长、纺锤体形状、长肌动蛋白纤维)(D)。
图7显示在MDA-MB-231中通过消除LOXL2来诱导MET-样改变。(A-B)MDA-MB-231WT细胞和(C-F)MDA-MB-231shLoxl2(C，D)：库1；(E，F)：库2)稳定敲减细胞作罗丹明鬼笔毒环肽染色(肌动蛋白细胞骨架染色)。WT细胞延长且是纺锤形(A-B)，而MDA-MB-231shLoxl2稳定敲减细胞的形状圆且小(C-F)。通过shRNA敲减消除LOXL2后，F-肌动蛋白染色(罗丹明鬼笔毒环肽)从纤丝向环形/细胞边缘移动。
图8显示源自稳定CHO-Loxl2细胞的条件化培养基(CM)对MCF-7WT细胞的作用。(A-B)30％SFII培养基中培养的MCF-7细胞：350μl常规MCF-7完全培养基中的150μl SFII培养基(用于CHO-Loxl2细胞的培养基)。(C-D)30％条件化培养基(CM)中的MCF-7细胞：350μl常规MCF-7完全培养基中的CHO-Loxl2的150μl CM(从3天无血清CM浓缩22倍)。用CHO-Loxl2细胞的浓缩无血清CM处理MCF-7细胞4天。如肌动蛋白细胞骨架的罗丹明-鬼笔毒环肽染色所示，与用对照条件化培养基处理的细胞(不表达LOXL2的CHO细胞)(A-B)相比，用LOXL2-表达细胞的条件化培养基处理的MCF-7(C-D)经历表型改变。细胞延长，具有长的F-肌动蛋白纤维，这类似于经历EMT的细胞，而不像显示更为环状“肌动蛋白边缘”染色的对照处理细胞。这些数据支持LOXL2诱导的EMT-样改变是由分泌的(胞外)LOXL2诱导。(E)显示源自稳定CHO-Loxl2细胞的不同浓度CM对MCF-7WT细胞的作用和它们的形态学变化。用浓度增加的含LOXL2的CM处理细胞导致EMT-样表型改变一致增加。
图9显示抗-Loxl2mAb可阻断将MBA-MD-MB-231(表达高水平的LOXL2)CM和MCF-7WT细胞培育中观察到EMT表型。(A，C，E)用MCF-7细胞的CM(培养)的MCF-7WT细胞，(B，D，F)用MBA-MD-231细胞的CM(培养)的MCF-7WT细胞，其中(C-F)显示用CM(培养)的细胞，所述CM在加入MCF-7细胞之前与抗-Loxl2mAb预培育分别是(C，D)：mAb 18号和(E，F)：mAb 423号，各种浓度的抗体(C，E)：2μg；(D，F)：4μg。
图10显示培育MDA-MB-231CM与MCF-7细胞得到的EMT-样改变的特异性阻断作用。(A)“预-培育”：收集并澄清的CM与抗Loxl2 418号或422号mAb预培育(室温下(RT)1.5小时)，然后施加在MCF-7细胞上4天。(B)“未预-培育”：CM与MDA-MB-231细胞在有抗-Loxl2 418号或422号mAb存在下(培育)(3天)，然后在收集和澄清之前，施加于MCF-7上4天。(A)和(B)中EMT-样形态均被阻断。作为非-EMT-样对照，(C)用MCF-7细胞的3天条件化培养基(CM)处理MCF-7细胞4天，其具有WT MCF-7细胞典型的圆形和扁平形态。作为EMT-样对象，(D)用未与任何Loxl2mAb培育(培育4天)的MDA231细胞的3天CM处理MCF-7细胞和(E)用与抗-肌动蛋白抗体预培育(培育4天)的MDA231细胞的3天CM处理MCF-7细胞。(D)和(E)中均见到纺锤形细胞的EMT-样形态。
图11显示用Hs578t肿瘤细胞(表达高水平LOXL2)和抗-Loxl2mAb的条件化培养基处理MCF-7(低LOXL2)诱导出的EMT-样表型改变可阻断观察到的EMT表型。(A)将MCF-7细胞的3天条件化培养基(CM)的条件化培养基施加于MCF-7细胞4天，其具有WT MCF-7细胞典型的圆形和扁平形态。(B，C，D)将Hs-578t细胞(LOXL2高)的条件化培养基施加于MCF-7细胞(LOXL2低/阴性)。(A-D)细胞作罗丹明-鬼笔毒环肽(F-肌动蛋白，红)和DAPI(核，蓝)。确认这些作用是LOXL2，而不是其它蛋白质特异性的，将条件化培养基与4μg(C)作为负对照的抗β-肌动蛋白抗体或(D)抗LOXL2抗体混合。当Hs578t细胞的条件化培养基先与抗-LOXL2抗体预培育再加入MCF7细胞时，EMT-样表型被阻断(D)。用抗β-肌动蛋白抗体以相同方式处理CM未能阻断MCF7细胞中的表型改变(C)，支持了由于将抗体加入CM，LOXL2的阻断作用是特异性而不是非特异性作用。
图12显示用MDA MB 231细胞的条件化培养基(CM)培育的SW620细胞经历EMT表型改变。(A-B)SW620细胞与MDA MB 231细胞的条件化培养基(CM)培育，20倍和40倍。箭头标出了经历EMT-样表型的SW620细胞形态。72小时后，细胞经历EMT表型(由罗丹明鬼笔毒环肽染色所示)改变。(C-D)72小时后，与293野生型细胞的条件化培养基(CM)培育的SW620细胞维持典型的“正常”圆形，20倍和40倍。MDA MB 231或293细胞的条件化培养基(CM)是3天CM。
图13显示与293的CM：Loxl2.MCD转染物培育的SW620细胞。(A，C，E)显示72小时后经历EMT表型(由罗丹明鬼笔毒环肽染色所示)改变的细胞(50％CM：50％竞争培养基)。(B，C，E)分别是(A，C，E)的放大图，其中箭头标出经历EMT-样表型的SW620细胞的形态。293：Loxl2.MCD是经转染并表达LOXL2片段(称为LOXL2-MCD，其包括赖氨心氧化酶结构域)的293细胞。看来单用LOXL2的该部分足以诱导至少部分EMT-样表型改变。不是所有细胞均经历表型改变，但明显可区分各组细胞。
图14是一幅示意图：(A)未切割和胞内LOX/LOXL及切割的活性LOX/LOXL，(B)活性LOX/LOXL的细胞摄取和活性促进了EMT，而当结合于抑制剂，例如抗体时，LOX/LOXL的摄取被阻断，从而降低了EMT和/或增加MET。
图15显示3T3细胞中的表面相关LOX活性受到BAPN、LOX mAb和LOX siRNA抑制。依据Amplex Ultra Red与5-二氨基戊烷底物的氧化，通过辣根过氧化物酶-偶连的荧光测定方法定量测定到3T3细胞表面明显有特异性LOX活性。不可逆小分子抑制剂BAPN、用LOX肽产生的单克隆抗体和特异性靶向LOX mRNA的siRNA寡核苷酸抑制了LOX活性。
图16显示了细胞系中占优势的LOXL2的两种形式。(A)细胞系中LOXL2蛋白表达和分泌。乳腺肿瘤细胞系：Hs578t、MDA-MB-231、MCF7；肺肿瘤细胞系：A549。(B)通常检测到的LOXL2形式的示意图。
图17显示从CHO细胞纯化的LOXL2蛋白表达。CHO细胞中表达Myc-His标记的(C-末端)LOXL2。主要有两种显示(如图16所示)：前肽LOXL2和在SRCR2和SRCR3之间切割的LOXL2。CHO细胞中还分泌LOXL2。
图18显示通过层析分离LOXL2诸种类。(A)分离的LOXL2诸种类的层析。(B)证实LOXL2诸种类的分离的蛋白质印迹分析。
图19显示表明LOXL2的两种形式均有活性的体外酶反应。
图20是LOXL2的IC50图。利用活性LOXL2和LOXL2抗体，AB0023在体外酶试验中进行LOXL2抑制。M1和M20均是AB0023。Asc＝腹水产生的，未标记的＝生物反应器产生的，相同的结果。剂量反应显示随着抗体浓度升高活性降低。LOXL2制品包括两种加工形式(前肽和成熟的)。
图21显示了LOXL2的抑制模式。(A)AB0023是LOXL2的非竞争性抑制剂，而(B)βAPN是LOXL2的竞争性抑制剂。E＝酶，P＝产物，S＝底物，I/A＝抑制剂/抗体。
图22显示具有酶活性的LOXL2的最小催化区(MCD)。(A)是LOXL2MCD构建物的示意图。(B)LOXL2MCD有效分泌。(C)LOXL2MCD具有酶活性。
图23描述了抗-LOX抗体的内在化和摄取。利用抗体在肝肿瘤细胞中进行LOX的免疫荧光分析。(A-B)用siNT转染Hs578t细胞(非靶向敲减对照)，与mAb培育3小时。Lox定位于胞质溶胶中。(C-D)用siLOX转染的Hs578t细胞与mAb培育3小时。LOX蛋白水平降低，从而支持siLOX的消除作用。LOX蛋白也在细胞的周质中。用M37(A，C)或M64抗体(B，D)检测LOX。获得LOXl2mAb的类似内在化和摄取结果。因此，这些结果支持染色是LOX或LOXL2特异性的这一结论。
图24显示(A)透化或(B)未透化细胞的汇合Hs578t细胞和抗-LOX抗体内在化和摄取。细胞是汇合后2天，以50,000个细胞/孔接种在8室载玻片后4天。细胞与抗-Lox M64培育3小时，用Alexa 488-绿检测。获得Loxl2mAb的类似内在化和摄取结果。
图25显示用siRNA转染的Hs578t中抗-LOX抗体的内在化和摄取，Hs578t细胞用(A，B)siN或(C，D)siLOX转染并与LOX抗体培育5小时。转染后7天用抗-Lox M64(A，C)或抗-胶原I(B，D)检测以取得细胞的图像。获得Loxl2mAb的类似内在化和摄取结果。
图26显示LOX Pep2M64的特异性。筛选mAb抑制细胞侵入和经(A)胶原I和/或(B)胶原IV基质迁移的能力。(C)在小室载玻片上检测M64Mab对Hs578T细胞的特异性(汇合后：第6天)。(D)与胶原相比，LOX定位于小室载玻片上的Hs578T细胞(汇合后：第6天)。细胞未透化处理，图像放大63倍。
图27显示从第0天到汇合后第15天的Hs578T细胞时程研究。
图28描述了利用LOXL2和LOX抗体对转移性乳腺肿瘤组织(淋巴结)样品的免疫组化(IHC)分析。利用乳腺TMA：CC08-21-002(赛伯第公司(Cybrdi))，一种转移性非特异性浸润导管癌样品进行IHC，其中(A，B)LOXL2；(C，D)Ki67，一种细胞增殖标记和(E，F)及LOX。肿瘤细胞均表达LOXL2和LOX，有证据表明基质细胞均表达LOXL2和LOX，(棕色染色)。(A，C，E)20倍放大；(B，E，F)40倍放大。
图29描述了利用LOXL2和LOX抗体对原发性乳腺肿瘤样品的免疫组化(IHC)分析。利用乳腺TMA：CC08-21-002(赛伯第公司)，一种非特异性浸润导管癌-II级样品进行IHC，其中(A，B)LOXL2；(C，D)Ki67，一种细胞增殖标记和(E，F)及LOX。原发性乳腺肿瘤中LOXL2和LOX共表达，在肿瘤细胞中强烈检测到LOXL2蛋白，LOX蛋白主要在直接围绕肿瘤细胞的基质细胞(基质成纤维细胞和/或基质成纤维母细胞)中检测到。(A，C，E)放大20倍；(B，E，F)放大40倍。
图30显示了利用埃飞矩阵公司(Affymetrix，Inc)提供的DNA芯片检测出与正常组织相比，肿瘤和纤维化疾病组织过表达LOX和LOXL2的mRNA水平。
图31描述了与同一患者的相邻正常组织中的表达相比，肺腺癌样品中LOX/LOXL的表达。A)LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL4，B)的数据与A)相同，其中只有LOX和LOXL2作图。T：肿瘤；N：正常。
图32描述了肺腺癌样品中根据持家基因RPL19标准化的LOX/LOXL表达。肿瘤和毗邻的正常组织分别作图，(A)LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL4，(B)依据与(A)相同的数据只对LOX和LOXL2作图。T：肿瘤；N：正常。
图33显示了低氧MCF-7细胞中LOX和LOXL2的共表达。正常情况下表达极低水平LOX和LOXL2的MCF7细胞中，LOX和LOXL2均由低氧诱导(上调倍数与含氧正常条件下培养的细胞绘制于左轴)。细胞在调节至2％O2、5％CO2(与含氧正常：约20％O2、5％CO2)的组织培养箱中培养3天。MCF5：乳腺肿瘤细胞系。
图34显示人细胞系中赖氨酰氧化酶家族成员的mRNA水平。对100ng/rxn RNA进行一步qRT-PCR。MCF7、MB231、BT549、Hs578t：乳腺肿瘤细胞系；A549：肺肿瘤细胞系；HT1080：纤维肉瘤细胞系；HFF：成纤维细胞细胞系。
图35是图36-39中LOX/LOXL2的(A)shRNA和(B)siRNA敲减的RTPCR验证。(C)还利用转染了Lox、Loxl2、Lox/Loxl2siRNA的MDA-MB 231细胞进行了迁移试验。与非-靶向siRNA对照相比，Lox siRNA敲减抑制了52％的MDA MB 231细胞侵入特性。(D)(C)中所示MDA MB 231细胞中siRNA敲减的支持性Taqman数据。
图36显示shLOXL2细胞的埃洛替尼(erlotinib)敏感性。shLOXL2敲减细胞系(shLOXL2.195)显示细胞活力降低约7倍。将计算的IC50与对照细胞系(sh对照)作比较。亲代细胞系是MDA-MB-231。生长百分比(活力)绘制于左轴。埃洛替尼代表了药物级EGFR抑制剂，包括吉非替尼(gefitinib)。
图37显示MDA-MB-231shLOX细胞系的氨甲蝶呤(MTX)敏感性。生长百分比(活力)绘制于左轴。与对照细胞系(GFP对照)相比，shLOX敲减细胞系显示活力降低约2倍。
图38显示siLOX/LOXL2或LOX抗体(处理)的顺铂(DDP)敏感性。抗-LOX(处理)的(A)MDA-MB-231siLOX和siLOXL2细胞系或(B)MiaCaPa 2细胞系以及它们对DDP的敏感性。活力绘制于左轴。与对照细胞系(非-靶向对照)相比，siLOX和siLOXL2敲减细胞系的活力降低约25％。(C)DDP对用或不用抗-LOX处理的MiaCaPa 2和其它细胞系的IC50。(D)与未处理(Unt)相比，单用LOX(M64)或LOXL2(M20)抗体的生长抑制作用。
图39显示MDA-MB-231siRNA或shRNA细胞系的阿霉素敏感性。(A)siLOX、siLOXL2和siLOX/LOXL2细胞系。活力绘制于左轴。siLOX、siLOXL2和siLOX/siLOXL2双重敲减细胞系显示对阿霉素的敏感性增加，其中与亲代细胞系(对照)相比，计算的IC50显示降低27％-55％。(B)显示与(C)MD A-MB-231shLOX和shLOXL2细胞系的阿霉素敏感性相比，MDA-MB-231siLOX、siLOXL2和siLOX/LOXL2敲减的阿霉素敏感性。活力绘制于左轴。
图40显示植入裸鼠肾下被膜的MCF7肿瘤细胞和LOXL2转染MCF7细胞的移植体大小平均增益。使移植体形成肿瘤，16天。LOXL2稳定转染入MCF7(MCF7-LOXL2)产生比野生型MCF7细胞观察到的大得多/更具侵袭性的原发性肿瘤。
图41显示植入裸鼠肾下被膜的HT1080肿瘤细胞的移植体大小平均增益。使移植体形成肿瘤，10天。用各种抗体(30mg/kg，腹膜内注射)处理小鼠，每周两次。用以下物质处理各组(每组5只小鼠)：AC1：负对照抗体；M64、M5或M11：“非-LOXL2”抗体(抗-LOX抗体)；或AB23：LOXL2抗体。利用AB23的趋势：在该侵袭性原发性肿瘤模型中平均肿瘤大小约低25％。
图42描述了赖氨酰氧化酶的酶学特征。LOX/LOXL酶通过乒乓机制起作用，米-门二氏动力学描述了这种机制。
图43描述了酶促抑制作用的普通模式。
图44描述了酶促抑制作用，例如LOXL2的抑制作用的模式。
                            详述
I.通过抑制LOX或LOXL来治疗
本发明提供利用赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)加工形式的抑制剂来预防和治疗异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关各种疾病的新方法和相关组合物及试剂盒。
虽然不想受理论的束缚，但抑制加工形式的LOX或LOXL能有效预防或治疗肿瘤侵入和转移，并且治疗异常血管生成相关疾病和纤维化疾病。
一个实施方式提供体内治疗或预防对象中肿瘤侵入或转移的方法，所述方法包括给予该对象有效量的LOX或LOXL的抑制剂。
另一实施方式提供体内降低对象中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予该对象有效量的加工LOX或LOXL的抑制剂，从而将肿瘤生长降低至少25％、50％、75％、90％或95％。根据一些实施方式，所述肿瘤可以是转移性肿瘤。
还有另一实施方式提供增加或提高具有转移性肿瘤的对象存活机会的方法，所述方法包括：给予有此需要的对象有效量的加工LOX或LOXL的抑制剂，从而将所治疗对象的存活机会增加或提高一段时期。在一些实施方式中，该对象的存活可以增加至少10天、1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或者甚至10年。
LOX或LOXL的加工形式可以是有活性的。LOX或LOXL还可以是分泌形式，其也可有活性。活性LOX或LOXL可以是蛋白酶解加工或切割后的成熟形式。LOXL的例子包括但不限于：LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4。在一些实施方式中，LOX或LOXL的抑制剂是活性LOX、LOXL2或LOXL4的抑制剂。例如，LOX或LOXL的抑制剂抑制活性LOX和活性LOXL2。
LOX或LOXL抑制剂可以是针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
在一些实施方式中，LOX或LOXL抑制剂是特异性结合LOX或LOXL中某区域的抗体，所述区域具有选自下表1和2所示SEQ ID NO：1-18的氨基酸序列。
如下文和实施例部分所述，活性LOX或LOXL的抑制剂(例如，小分子或抗体)可用于抑制肿瘤侵入、血管生成或转移，还可用于治疗癌症、肿瘤和异常血管生成相关疾病以及纤维化疾病。
II.通过抑制LOX和LOXL来治疗
本发明还提供利用加工形式的赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的抑制剂来预防和治疗异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关各种疾病的新方法和相关组合物及试剂盒。
同时抑制LOX和LOXL可有效预防或治疗各种肿瘤的侵入和转移，并治疗异常血管生成相关疾病和纤维化疾病。
一个实施方式提供体内治疗或预防对象中肿瘤侵入或转移的方法，所述方法包括给予该对象有效量的LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂。
另一实施方式提供体内降低对象中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予该对象有效量的LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂，从而将肿瘤生长降低至少25％、50％、75％、90％或甚至95％。根据一些实施方式，所述肿瘤可以是转移性肿瘤。
还有另一实施方式提供增加或提高具有转移性肿瘤的对象存活机会的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂，从而将所治疗对象的存活机会增加或提高一段时期。在一些实施方式中，该对象的存活可以增加至少10天、1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或者10年。
LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂可以不同，分别特异性抑制LOX和LOXL。或者，LOX的抑制剂和LOXL的抑制剂可以是同时抑制LOX和LOXL的相同分子。在一些实施方式中，LOXL是LOXL1、2、3或4。在一些这样的实施方式中，LOXL是LOXL2或4，例如LOXL是LOXL2。
LOX或LOXL的抑制剂任选抑制蛋白酶解加工或切割后的LOX或LOXL的形式。LOX或LOXL可以是原酶形式或成熟形式。LOX或LOXL可以是活性形式。全长或加工形式的LOX或LOXL可以有活性。
LOX或LOXL的抑制剂任选抑制LOX或LOXL的分泌形式。
LOX或LOXL抑制剂可以是针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
在一些实施方式中，LOX或LOXL抑制剂是特异性结合LOX或LOXL中某区域的抗体，所述区域具有选自下表1和2所示SEQ ID NO：1-18的氨基酸序列。
如下文和实施例部分所述，LOX或LOXL的各种抑制剂(例如，小分子或抗体)可用于抑制肿瘤侵入、血管生成或转移，还可用于治疗癌症、肿瘤和异常血管生成相关疾病以及纤维化疾病。
III.组合治疗
本发明还提供利用赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的调节剂来预防和治疗异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关各种疾病的新方法和相关组合物及试剂盒。
如下文所详述的，抑制LOX或LOXL可使肿瘤细胞中上皮-间充质过渡(EMT)的进程减缓或停止，或将间充质-上皮过渡(MET)诱导至低致瘤性状态，从而使得肿瘤或患病细胞对放疗、化疗药物、抗肿瘤生物药剂、抗血管生成剂和抗纤维化药剂更敏感。
IV.选择药剂
本发明提供选择防止或抑制肿瘤侵入、血管生成和转移的药剂的新方法。这些药剂可单用或与其它治疗剂联用以预防或治疗异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关疾病，例如癌症、肿瘤、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、硬皮病、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、硬皮病、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病
本发明提供选择肿瘤侵入、血管生成或转移的抑制剂的方法，所述方法包括将处于间充质-上皮过渡(EMT)状态的细胞与赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的抑制剂接触；检测细胞EMT状态的改变，其中EMT状态降低或从EMT向MET状态改变表明LOX或LOXL抑制剂是纤维化、肿瘤侵入、血管生成或转移的抑制剂。因此，本文还提供采用EMT-MET试验筛选有助于肿瘤细胞中EMT向MET过渡的LOX/LOXL抑制剂的方法。
不想受理论的束缚，但LOX和LOXL在EMT中的作用与肿瘤细胞摄取活性LOX或LOXL，从而LOX或LOXL能与相关胞内辅因子相互作用有关；抑制LOX或LOXL能使肿瘤细胞中EMT的进程减缓或停止，或将MET诱导至低致瘤性状态，从而防止或抑制肿瘤的侵入、血管生成和转移，并使得原发性肿瘤细胞对其它治疗干预，例如放疗、化疗药物、抗肿瘤生物药剂、抗血管生成剂和抗纤维化药剂更敏感。
细胞的EMT状态的特征在于波形蛋白或纤连蛋白的阳性染色，E-钙粘蛋白染色水平低和F-肌动蛋白的鬼笔毒环肽染色显示的肌动蛋白细胞骨架延长及重塑。因此，可通过测量或检测波形蛋白或纤连蛋白染色降低、E-钙粘蛋白染色增加和/或F-肌动蛋白的鬼笔毒环肽染色显示的肌动蛋白细胞骨架重塑来监测EMT状态的降低或从EMT向MET的过渡。
任选可采用体外或体内肿瘤侵入或迁移来评估细胞的EMT或MET表型，因为侵袭性和迁移能力增加与EMT相关。例如，可采用体外伤口愈合或刮擦试验来监测从EMT向MET状态的过渡，因为处于EMT状态的细胞更具侵袭性和迁移性，从而比侵袭性或迁移较弱的细胞更快地填充擦痕。
如下文和实施例部分所述，可采用EMT-MET过渡试验检验各种LOX或LOXL抑制剂(例如，小分子或抗体)抑制肿瘤侵入、血管生成或转移的能力。抑制全长或加工形式的LOX或LOXL可有效预防或治疗治疗侵入和转移。因此，本文还提供筛选、选择和设计用于抑制活性形式LOX或LOXL的候选化合物的方法，和产生抵御活性形式LOX或LOXL的抗体的方法。
V.诊断
本发明提供利用特异性识别加工形式赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的分子或药剂来诊断或监测各种异常细胞增殖、血管生成和纤维化相关疾病的新方法和相关组合物及试剂盒。不想受理论的束缚，加工形式的LOX或LOXL是肿瘤侵入和转移以及异常血管生成相关疾病和纤维化疾病的重要生物标记。
一个实施方式提供诊断或监测对象中癌症转移的方法，所述方法包括评估血液或肿瘤中加工LOX或LOXL的水平或活性，从而与参比样品相比，血液或肿瘤中加工LOX或LOXL的水平或活性改变表明存在转移性肿瘤生长。所述改变可以是加工LOX或LOXL水平或活性的增加或降低。与参比样品相比，加工LOX或LOXL水平或活性增加表明存在转移性肿瘤生长。
如下文详述的，可通过各种方法评估加工LOX或LOXL的水平，所述方法包括但不限于：利用特异性结合加工形式LOX或LOXL的抗体的免疫组化方法。可采用各种方法，包括但不限于产色和荧光计试验来检测活性LOX或LOXL的酶活性。
VI.治疗纤维化
本文还提供利用活性形式赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的抑制剂来预防和治疗各种纤维化相关疾病的组合物、方法和试剂盒。
一方面提供治疗对象中病理性心脏病症或疾病的方法，所述方法包括：给予该对象有效量的LOX或LOXL抑制剂。例如，病理性心脏病症或疾病可以是高血压、高血压性心脏病(HHD)、心肌梗塞(MI)、动脉粥样硬化或再狭窄相关。
另一方面提供治疗对象中病理性心脏病症或疾病的方法，所述方法包括：在不良心脏事件之前、同时或之后给予该对象有效量的LOX或LOXL的抑制剂。所述不良心脏事件可以是心肌梗塞，例如急性心肌梗塞。
可在不良心脏事件之前、同时或之后给予LOX或LOXL的抑制剂。例如，可在心肌梗塞后至少1小时、2小时、3小时、5小时或10小时，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天给予所述抑制剂。
可将LOX或LOXL的抑制剂局部递送至不良心脏事件所致的纤维化部位。
还有另一方面提供预防或治疗对象中病理性心脏病症或疾病的方法，包括：包含LOX或LOXL抑制剂的组件。该组件可以是掺入LOX或LOXL抑制剂的支架，可以是分子量低于500道尔顿的小分子，例如β-氨基丙腈(BAPN)。可将抑制剂包被在支架上。
或者，该装置可包含将LOX或LOXL抑制剂局部递送至不良心脏事件所致心脏纤维化部位的导管。
还有另一方面提供试剂盒，其装有：包含药学上可接受的赋形剂配制的LOX或LOXL抑制剂的药物组合物；和如何利用该药物组合物治疗或预防病理性心脏病症或疾病的使用说明书。
还提供了用于治疗或预防对象中纤维化相关疾病的方法、组合物和试剂盒，包括：给予该对象有效量的LOX或LOXL抑制剂。纤维化相关疾病可选自肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、皮肤瘢痕和瘢痕瘤形成以及阿尔茨海默病。
LOX或LOXL的抑制剂可以是活性LOX或LOXL的抑制剂。活性LOX或LOXL可以是蛋白酶解加工或切割后的成熟形式LOX或LOXL。LOXL的例子包括但不限于：LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4。LOX或LOXL的抑制剂可以是活性LOX、LOXL2或LOXL4的抑制剂。在一些实施方式中，LOX或LOXL的抑制剂同时抑制活性LOX和活性LOXL2。
LOX或LOXL抑制剂可以是针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
在某些实施方式中，LOX或LOXL抑制剂是特异性结合LOX或LOXL中某区域的抗体，所述区域具有选自下表1和2所示SEQ ID NO：1-18的氨基酸序列。
如下文和实施例所详述的，可利用LOX或LOXL的各种抑制剂(例如，小分子或抗体)。
1.赖氨酰氧化酶和赖氨酰氧化酶-样蛋白
本文所用的术语“赖氨酰氧化酶”指催化以下反应的酶：肽基-L-赖氨酰-肽+O2+H2O→肽基-醛基赖氨酰(allysyl)-肽+NH3+H2O2。赖氨酰氧化酶(EC 1.4.3.13)的其它同义词包括蛋白质-赖氨酸6-氧化酶和蛋白质-L-赖氨酸：氧6-氧化还原酶(脱氨基作用)。参见，例如Harris等，Biochim.Biophys.Acta 341：332-44(1974)；Rayton等，J.Biol.Chem.254：621-26(1979)；Stassen，Biophys.Acta 438：49-60(1976)。LOX是在其活性中心具有酪氨酰醌的赖氨酰加成物的含铜醌蛋白，其催化肽基赖氨酸氧化以形成肽基α-氨基己二-δ-半醛。一旦形成，该半醛可与邻近的醛或其它赖氨酰基团自发缩合以形成链内和链间交联。参见，例如Rucker等，Am.J.Clin.Nutr.67：996S-1002S(1998)。赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的例子包括具有与以下序列之一表达或翻译的多肽基本上相同的氨基酸序列的酶：EMBL/GenBank登录号：M94054；AAA59525.1-mRNA；S45875；AAB23549.1-mRNA；S78694；AAB21243.1-mRNA；AF039291；AAD02130.1-mRNA；BC074820；AAH74820.1-mRNA；BC074872；AAH74872.1-mRNA；M84150；AAA59541.1-基因组DNA。LOX的一种实施方式是人赖氨酰氧化酶(hLOX)前蛋白原。
LOXL酶样酶或蛋白的例子见Molnar等，Biochim Biophys Acta.1647：220-24(2003)；Csiszar，Prog.Nucl.Acid Res.70：1-32(2001)；和2001年11月8日公布的WO 01/83702，所有这些文献通过引用纳入本文。(在这三份出版物中应注意：“LOXL1”称为“LOXL”，而在本发明中，利用“LOXL”总体上指代赖氨酰氧化酶-样蛋白，不只是LOXL1)。这些酶包括LOXL1，由GenBank/EMBL BC015090保藏的mRNA编码；AAH15090.1；LOXL2，由GenBank/EMBL U89942保藏的mRNA编码；LOXL3，由GenBank/EMBLAF282619保藏的mRNA编码；AAK51671.1；和LOXL4，由GenBank/EMBLAF338441保藏的mRNA编码；AAK71934.1。
“赖氨酰氧化酶”或LOX还包括基本上保留了其催化赖氨酰残基脱氨基作用的酶活性的功能片段或衍生物。功能片段或衍生物通常保留其赖氨酰基氧化活性的至少50％。在一些实施方式中，功能片段或衍生物通常保留其赖氨酰基氧化活性的至少、或60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。赖氨酰氧化酶还可包括不实质性改变其活性的保守性氨基酸取代。本领域技术人员已知合适的保守性氨基酸取代，通常可作出这种取代而不改变所得分子的生物学活性。本领域技术人员知道在多肽的非必需区域进行单氨基酸取代通常不会实质性改变生物学活性。参见，例如Watson等，Molecular Biology of the Gene(基因的分子生物学)，第4版，1987，BC出版公司(The Benjamin/Cummings Pub.Co.)，第224页。
下文提供了一些赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白例子的细节。
赖氨酰氧化酶是含铜的胺氧化酶，其将伯胺底物氧化成反应活性醛。赖氨酰氧化酶催化胶原中肽基赖氨酸和羟基赖氨酸残基以及弹性蛋白中肽基赖氨酸残基的氧化脱氨基作用，其对于胞外基质的形成至关重要。得到的肽基醛自发缩合并经历氧化反应以形成胞外基质的正常结构完整性所需的赖氨酸-衍生共价交联。过氧化氢(H2O2)和铵的释放量与肽基醛产物成化学计量关系。参见，例如Kagan等，J.Cell.Biochem.88：660-72(2003)。
LOX的主要活性是在细胞外氧化胶原和弹性蛋白中的特定赖氨酸残基，但它还可在胞内起作用，从而可能调节基因表达(Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12817-12822(1997)，Giampuzzi等，J.Biol.Chem.275：36341-36349(2000))。此外，LOX诱导单核细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的趋化性(Lazarus等，Matrix Biol.14：727-731(1995)；Nelson等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.188：346-352(1988))。LOX本身可由许多生长因子和类固醇，例如TGF-β、TNF-α和干扰素诱导(Csiszar，Prog.Nucl.Acid Res.70：1-32(2001))。最近的研究将不同生物学功能，例如发育调控、肿瘤抑制、细胞运动性和细胞衰老中的其它作用归于LOX。LOX及其最近发现的氨基氧化酶家族，LOX-样(LOXL)可在它们的胞内和胞外定位中起重要作用。
已知人和小鼠中存在5种不同的赖氨酰氧化酶，LOX和四种LOX相关或LOX-样蛋白(LOXL、LOXL2、LOXL3、LOXL4)，出于本发明的目的，统称为“LOX/LOXL”。赖氨酰氧化酶的5种形式位于5种不同染色体上。这些家族成员显示在结构和功能上有一定重叠，但显示的功能还是不同。例如，诱变所致小鼠中靶向LOX缺失看来在分娩时是致命的(Hornstra等，J.Biol.Chem.278：14387-14393(2003))，而LOXL缺陷不导致严重的发育表型(Bronson等，Neurosci.Lett.390：118-122(2005))。
LOX具有高度保守的蛋白质结构域，在包括人、小鼠、大鼠、鸡、鱼和果蝇在内的几个物种中是保守性的。人LOX家族具有含205氨基酸LOX催化结构域的高度保守C-末端区域。保守区域含有铜结合的(Cu)、保守性细胞因子受体样结构域(CRL)和赖氨酰-酪氨酰醌辅因子位点(LTQ)。预测的胞外信号序列以阴影框出。类似地，12个半胱氨酸残基也是保守性的，其中2个位于前多肽原区域内，而10个在LOX的催化活性加工形式中(Csiszar，Prog.Nucl.Acid Res.70：1-32(2001))。保守区域还包括纤连蛋白结合结构域。
LOX的前多肽原区域含有信号肽，经切割(切割位点估计在Cys21-Ala22之间)产生信号序列肽和48kDa的氨基酸前肽形式LOX，本文也称为全长形式。该前肽在通过高尔基体时是N-糖基化的，其分泌入胞外环境，金属内切蛋白酶(一种前胶原C-蛋白酶)在Glyl68-Aspl69之间切割该酶原或前肽，该蛋白酶是Bmp1、Tll1和Tll2基因的产物。BMP I(骨形态发生蛋白I)是将该前肽加工成功能性30kDa酶和18kDa前肽的前胶原C-蛋白酶。编码该前肽的序列是中等(60-70％)保守的，而编码该酶原中包含活性位点的C-末端30kDa区域的序列是高度(约95％)保守的(Kagan和Li，J.Cell.Biochem.88：660-672(2003)；Kagan等，J.Cell Biochem.59：329-38(1995))。随后还除去了N-糖基单位。
相似的潜在信号肽预计在LOXL、LOXL2、LOXL3和LOXL4的氨基末端。对于LOXL，预计的信号切割位点介于Gly25-Gln26之间；对于LOXL2，介于Ala25-Gln26之间；对于LOXL3，介于Gly25-Ser26之间。前-胶原和前-LOX中BMP-1切割的共有(位点)介于Ala/Gly-Asp之间，其后常有酸性或荷电残基。产生加工LOXL的潜在切割位点是Gly303-Asp304，然而，其后是非典型的Pro。LOXL3还在Gly447-Asp448具有潜在的切割位点，其后是Asp，在此位点进行加工可产生大小与成熟LOX相似的成熟肽。还在LOXL4内鉴定到BMP-1的潜在切割位点，位于残基Ala569-Asp570处(Kim等，J.Biol.Chem.278：52071-52074(2003))。与LOXL家族的其它成员类似，LOXL2也可经蛋白酶解加工并分泌入培养基(Akiri等，CancerRes.63：1657-1666(2003))。
LOX和LOXL中已知不共有的特征是富含清除受体半胱氨酸(SRCR)结构域。LOX和LOXL缺乏SRCR结构域，而LOXL2、LOXL3和LOXL4各在N-末端具有4个SRCR结构域。SRCR结构域在分泌型、跨膜或胞外基质蛋白质中发现。还知道SRCR结构域在许多分泌型和受体蛋白中介导配体结合(Hoheneste等，Nat.Struct.Biol.6：228-232(1999)；Sasaki等，EMBOJ.17：1606-1613(1998))。LOXL的另一独特结构域是存在富含脯氨酸的结构域(Molnar等，Biochimica Biophsyica Acta 1647：220-224(2003))。
LOX和各种LOXL的组织分布也可能不同。LOX在心脏、胎盘、睾丸、肺、肾脏和子宫中高度表达，但在脑和肝脏中很少表达。LOXL1在胎盘、肾脏、肌肉、心脏、肺和胰腺中表达，与LOX一样在脑和肝脏中很少表达(Kim等，J.Biol.Chem.270：7176-7182(1995))。LOXL2在子宫、胎盘和其它器官中高度表达，但与LOX和LOXL类似，在脑和肝脏中表达很少(Jourdan Le-Saux等，J.Biol.Chem.274：12939：12944(1999))。LOXL3在睾丸、脾脏和前列腺中高度表达，在胎盘中中等表达，在肝脏中不表达，而LOXL4在肝脏中高度表达(Huang等，Matrix Biol.20：153-157(2001)；Maki和Kivirikko，Biochem.J.355：381-387(2001)；Jourdan Le-Saux等，Genomics74：211-218(2001)；Asuncion等，Matrix Biol.20：487-491(2001))。
LOX和不同LOXL蛋白在疾病中的表达或参与也不同。这可能是因为许多原因，例如组织分布、加工、结构域、活性调节中的差异，以及这些蛋白质之间的其它差异。例如，LOX和LOXL涉及纤维化疾病，因为LOX和LOXL在围绕纤维化区域的肌型成纤维细胞中均高度表达(Kagen，Pathol.Res.Pract.190：910-919(1994)；Murawaki等，Hepatology 14：1167-1173(1991)；Siegel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：2945-2949(1978)；JourdanLe-Saux等，Biochem.Biophys.Res.Comm.199：587-592(1994)；Kim等，J.Cell Biochem.72：181-188(1999))。LOX和各种LOXL还涉及许多癌症。例如，已有研究显示在人膀胱癌中LOXL和LOXL4能后生沉默(epigenetically silenced)并抑制ras/胞外信号-调节的激酶信号传导途径(Wu等，Cancer Res.67：4123-4129(2007))。其它研究显示在头颈鳞状细胞癌中LOXL4基因选择性上调和扩增(Gorough等，J.Pathol.212：74-82(2007))。LOX和LOXL2也显示涉及许多肿瘤，例如结肠和食道癌(Csiszar，Prog.Nucl.Acid Res.70：1-32(2001))。在乳腺癌中，LOX和LOXL家族成员与癌症有关(Kirschmann等，Cancer Res.62：448-4483(2002))。
2.筛选活性LOX/LOXL的调节剂
还可采用各种筛选试验来选择活性LOX/LOXL的调节剂。前蛋白原分泌和蛋白酶解加工后，可采用各种筛选试验选择活性LOX/LOXL。一个实施方式提供选择结合活性LOX/LOXL的化合物的方法，所述方法包括将候选结合化合物与活性LOX或LOXL的多肽培育；和测定是否发生结合。
另一实施方式提供鉴定调节剂，例如活性LOX/LOXL的活化剂/激动剂或抑制剂/拮抗剂的方法，所述方法包括将候选化合物与活性LOX/LOXL培育；检验活性LOX/LOXL的生物学活性；和测定该活性LOX/LOXL的生物学活性是否改变。
另一实施方式提供鉴定活性LOX/LOXL的活化剂或抑制剂的方法，所述方法包括将候选化合物在含有活性LOX/LOXL的细胞培养液中培育；和检测该培养液中细胞的生物学活性改变，其中培养液中细胞的生物学活性改变表明是活性LOX/LOXL的活化剂或抑制剂。所述生物学活性的改变可以是LOX/LOXL特定功能、LOX/LOXL酶活性或LOX/LOXL的水平。在一些实施方式中，生物学活性是细胞功能，例如迁移、EMT/MET或其它活性，所述改变是与对照或参比样品相比较。例如，对照可以是负对照样品，可包括加入候选化合物后活性LOX/LOXL水平降低的培养液，或活性LOX/LOXL含量相同但未加入候选化合物的培养液。在一些实施方式中，将活性LOX/LOXL含量不同的各培养液与候选化合物接触。例如，如果观察到生物学活性有改变，并且如果这种改变在活性LOX/LOXL含量较高的培养液中较大，该化合物鉴定为活性LOX/LOXL的活化剂。
在另一实施方式中，表达的显著量LOX和/或LOXL可用作本文所述筛选试验的活性LOX/LOXL来源，而完整的细胞裂解物可不只含有活性LOX和/或LOXL，还含有无活性LOX和/或LOXL。
所述化合物或多种化合物可以是化学合成的或微生物产生的和/或包含在，例如样品，如植物、动物或微生物的细胞提取物中。此外，这些化合物可以是本领域已知，但迄今为止不知能抑制或活化活性LOX/LOXL。反应混合物可以是无细胞的提取物，或者可包含细胞或组织培养物。本领域技术人员已知本发明方法的合适装置，例如通常在Alberts等，Molecular Biology of theCell(细胞的分子生物学)，第三版(1994)和随附实施例中描述的。可以将多种化合物，例如加入反应混合物、培养液、注射入细胞或者施加于转基因动物。本发明方法中可用的细胞或组织是本发明的宿主细胞、哺乳动物细胞或非人转基因动物。
如果本发明方法鉴定了含有化合物或多种化合物的样品，则可能从鉴定为含有能抑制或活化活性LOX/LOXL的化合物的原始样品中分离该化合物，或者可进一步细分该原始样品(例如，如果其由多种不同化合物构成)，从而减少每份样品中不同物质的数量并用原始样品的小部分重复该方法。根据样品的复杂程度，上述步骤可进行数次，例如，直至按照本发明方法鉴定的样品只含有数量有限的或只有一种物质。在一些实施方式中，样品包含化学和/或物理特性类似的物质，在一些实施方式中，所述物质是相同的。
本领域技术人员已知产生和筛选大文库的几种方法来鉴定对靶标，例如活性LOX/LOXL具有特异性亲和力的化合物。这些方法包括噬菌体展示方法，该方法展示噬菌体的随机化肽并通过固定化受体的亲和层析作筛选；参见，例如WO 91/17271、WO 92/01047、美国专利号5,223,409。
在另一方法中，采用光刻法合成固定在芯片上的聚合物组合文库；参见，例如美国专利号5,143,854、WO 90/15070和WO 92/10092。固定的聚合物与标记的受体接触，扫描标记以鉴定结合受体的聚合物。例如Kramer，Methods Mol.Biol.87(1998)，25-39中描述了在连续纤维素膜支持物上合成和筛选肽文库，从而可用于鉴定本发明多肽的结合配体，和由此可能的抑制剂和活化剂。该方法还可用于，例如测定活性LOX/LOXL中的结合位点和识别基序。可以相似方式测定DnaK陪伴分子的底物特异性，接触位于人白介素-6及其受体之间；分别参见Rudiger，EMBO J.16(1997)，1501-1507和Weiergraber，FEBS Lett.379(1996)，122-126。
此外，可采用上述方法构建衍生自活性LOX/LOXL的结合表位。成功描述了用于抗-p24(HIV-1)单克隆抗体的肽表位的类似方法；参见Kramer，Cell 91(1997)，799-809。采用群集氨基酸肽文库对肽-抗体相互作用进行指纹分析的常规途径描述于Kramer，Mol.Immunol.32(1995)，459-465。此外，可按照Doring，Mol.Immunol.31(1994)，1059-1067所述的方法获得活性LOX/LOXL的拮抗剂，并从与本发明多肽特异性结合的单克隆抗体中鉴定。
最近，WO 98/25146进一步描述了从复合物文库中筛选具有所需特性的化合物的方法，所述特性例如是激动、结合或拮抗多肽或其细胞受体。这种文库中的复合物包括所测试的化合物、记录化合物合成中至少一个步骤的标签和对报道分子修饰敏感的系链(tether)。采用修饰系链来表示复合物含有具有所需特性的化合物。可解码所述标签以显示这种化合物合成中的至少一步。鉴定与本发明多肽或编码这种分子的核酸分子相互作用的化合物的其它方法是，例如体外筛选噬菌体展示系统以及滤膜结合试验或利用，例如法玛西亚公司(Pharmacia)的BIAcore设备“实时”检测相互作用。
本发明可采用所有这些方法来鉴定活性LOX/LOXL或相关多肽的活化剂/激动剂和抑制剂/拮抗剂。
可利用这种活化剂或抑制剂的基础结构的各种来源，包括，例如本发明多肽的模拟类似物。可以通过用立体异构体，即D-氨基酸取代预计生物学活性必需的氨基酸来产生本发明多肽的模拟类似物或其生物学活性片段；参见，例如Tsukida，J.Med.Chem.40(1997)，3534-3541。此外，如果利用片段设计生物学活性类似物，可将前模拟(pro-mimetic)组分掺入肽以重建除去原始多肽部分后丧失的至少一些构象特性；参见，例如Nachman，Regul.Pept.57(1995)，359-370。此外，活性LOX/LOXL可用于鉴定能与天然多肽一样有效结合或起到本发明多肽的配体、底物、结合伴侣或受体作用的合成化学肽模拟物；参见，例如Engleman，J.Clin.Invest.99(1997)，2284-2292。例如，可利用合适的计算机程序进行活性LOX/LOXL的结构基序的折叠模拟和计算机再设计(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.11(1995)，675-679)。蛋白质折叠的计算机重建可用于详细肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。可通过互补肽序列的计算机辅助检索，利用合适程序鉴定赖氨酰氧化酶多肽及其相互作用蛋白质的相互作用位点(Fassina，Immunomethods 5(1994)，114-120)。现有技术，例如Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann.KY.Acad.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中描述了用于设计蛋白质和肽的其它合适的计算机系统。上述计算机分析获得的结果可用于，例如制备本发明蛋白质或其片段的肽模拟物。蛋白质的天然氨基酸序列的这种拟肽(pseudopeptide)类似物可极其有效地模拟亲代蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，将不难获得的无手性o-氨基酸残基掺入本发明蛋白质或其片段导致酰胺键被脂族链的聚亚乙基单位取代，从而提供构建肽模拟物的便利方案(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。现有技术(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)描述了其它系统中的小肽激素的超反应活性肽模拟类似物。还可通过连续酰胺烷化合成肽模拟物组合文库并检验所得化合物，例如它们的结合和免疫学特性以鉴定活性LOX/LOXL调节剂的合适肽模拟物。现有技术，例如Ostresh，Methods in Enzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述了肽模拟物组合文库的产生和使用方法。此外，可利用本发明多肽的三维和/或晶体学结构设计本发明多肽的生物学活性的肽模拟物抑制剂(Rose，Biochemistry35(1996)，12933-12944；Rutenber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
模拟天然生物学多肽的活性的低分子量合成分子的结构设计和分析还描述于，例如Dowd，Nature Biotechnol.16(1998)，190-195；Kieber-Emmons，Current Opinion Biotechnol.8(1997)，435-441；Moore，Proc.West Pharmacol.Soc.40(1997)，115-119；Mathews，Proc.West Pharmacol.Soc.40(1997)，121-125；Mukhija，European J.Biochem.254(1998)，433-438。
本领域技术人员还熟知可能设计、合成和评估，例如可用作活性LOX/LOXL或相关多肽的底物或配体的小有机化合物的模拟物。例如，已有描述说对于拮抗多药耐药辅助相关蛋白的细胞毒性，哈帕罗星(hapalosin)的D-葡萄糖模拟物显示与哈帕罗星相似的效率；参见Dinh，J.Med.Chem.41(1998)，981-987。
本文所述的抑制剂，例如抗体可结合LOX/LOXL，其可以是竞争性抑制剂、无竞争性抑制剂(uncompetitive inhibitor)或非竞争性抑制剂(non-competitive inhibitor)。对于竞争性抑制，抑制剂通常与底物具有相似的结构。底物浓度低时抑制作用明显，但可在底物浓度高时克服。对于无竞争性抑制，抑制剂结合底物在活性位点结合后变得可用的位点。抑制作用在底物浓度高时最明显。对于非-竞争性抑制，抑制剂结合远离底物结合位点的位点，相对抑制作用在所有底物浓度下通常相同。在一个实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段特异性结合全长和加工的LOX或LOXL2。在一方面，全长和加工的LOX或LOXL2是该酶的活性形式。
3.针对LOX/LOXL的抗体
本文所用的术语“抗体”表示包含特异性结合抗原性表位的必需可变区序列的分离或重组结合物质。因此，抗体是显示所需生物学活性，例如结合特异性靶抗原的任何形式的抗体或其片段。因此，其以最广泛的含义使用并专门包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、纳米抗体、双抗体(diabody)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，包括但不限于scFV、Fab和Fab2，只要它们显示所需生物学活性。因此，术语“人抗体”指除可能的非人CDR区域外，含有人来源序列的抗体，该术语不暗示存在Ig分子的完整结构，只是暗示该抗体在人中的免疫原性作用最低。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线形抗体(Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生各含一个抗原结合位点的两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，和残留的“Fc”片段，该名称反映出易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点而仍能交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原-识别和-结合位点的抗体片段。该区域由一个重链可变域和一个轻链可变域的紧密、非共价缔合的二聚体构成。就是这种构型使得各可变域的3个CDR相互作用从而在VH-VL二聚体表面上限定了抗原结合位点。6个CDR共同赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即使是一个可变域(或只含3个抗原特异性CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和力低于完整的结合位点。
“Fab”片段还含有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab片段与Fab’片段的区别在于在重链CH1区的羧基末端加入少许残基，包括抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸。在本文中，Fab’-SH指代Fab’，其中恒定区的半胱氨酸残基具有游离的巯基。最初产生的F(ab′)2抗体片段是之间具有绞链半胱氨酸的一对Fab’片段。其它化学偶连的抗体片段也是已知的。
根据它们恒定区的氨基酸序列，可将任何有脊椎物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分成两种明显不同类型中的一种，称为κ和λ。依据它们重链的恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成不同种类。免疫球蛋白有5种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类别中的几种可再分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一根多肽链中。在一些实施方式中，Fv多肽还可在VH和VL结构域之间包含多肽接头，从而使得sFv形成抗原结合的所需结构。sFv的综述可参见Pluckthun刊于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，第113卷，Rosenburg和Moore编，S-V公司(Springer-Verlag)，纽约，第269-315页(1994)。
术语“双抗体”指含两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段在同一多肽链(VH-VL)中含有与轻链可变域(VL)相连的重链可变域(VH)。利用很短从而不能在同一链的两个结构域之间进行配对的接头，可迫使这些结构域与另一链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。对双抗体的更全面描述见，例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。
“分离的抗体”是从其天然环境的组分中鉴定和分离的和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰该抗体的诊断或治疗应用的物质，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在一些实施方式中，抗体可以纯化至(1)以抗体的重量计，通过Lowry方法测定到大于95％，例如大于99重量％，(2)利用旋振杯顺序分析仪(spinning cup sequenator)测定到足以获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)利用考马斯蓝或银染色剂，通过SDS-PAGE在还原性或非还原性条件下测定到均质。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为不存在抗体天然环境的至少一种组分。然而，分离的抗体通常由至少一个纯化步骤制得。
在一些实施方式中，抗-LOX/LOXL抗体是人源化抗体或人抗体。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合型免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括其中受者互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和性能的非-人物种(供者抗体)，例如小鼠、大鼠或家兔CDR的残基替代的人免疫球蛋白(受者抗体)。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非-人残基替代。人源化抗体还可包含既未在受者抗体中也未在输入的CDR或框架序列中发现的残基。人源化抗体通常包含基本上所有或至少一个和通常两个可变区，其中所有或基本上所有CDR区域对应于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些。
人源化抗体还任选含有免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))。
本领域熟知人源化非人抗体的方法。人源化抗体通常具有引入其中的一个或多个非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”或“供者”残基，一般取自“输入”或“供者”可变域。基本上可按照Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522 525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323327(1988))；Verhoeyen等.，Science，239：1534 1536(1988))的方法，用啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列进行人源化。因此，这种“人源化”抗体包括嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变域被非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿类抗体类似位点的残基取代的人抗体。
还可采用本领域已知的各种技术制备人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581(1991))。还可采用Cole等和Boerner等的技术制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991))。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠来制备人抗体。刺激后，观察到人抗体产生，这在各方面与人中观察到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体库。例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科技出版物中描述了该方法：Marks等，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812 13(1994)；Fishwald等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
还可如上所述采用已知的选择和/或诱变方法对抗体进行亲和力成熟化。在一些实施方式中，亲和力成熟的抗体的亲和力是制备该成熟化抗体的起始抗体(通常是鼠、家兔、鸡、人源化或人抗体)的5倍、超过10倍、超过20倍、或者甚至超过30倍。
抗-LOX/LOXL抗体还可以是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆、还可以是人或人源化抗体。在本例中，一种结合特异性是对LOX的，而另一种是对任何其它抗原的，例如细胞表面蛋白质或受体或受体亚基。在其它实施方式中，结合特异性之一是对LOX的，另一种是对LOXL蛋白的，例如LOXL2或LOXL4。
抗-LOX/LOXL抗体还可以是免疫偶联物(immunoconjugate)。这种免疫偶联物包含偶连于细胞毒性剂，例如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或底物来源的酶活性毒素，或它们的片段)或放射性同位素(即，放射性偶联物)的抗-LOX抗体。
“特异性结合”特定多肽或特定多肽上表位或“对其有特异性”的抗体是与该特定多肽或特定多肽上表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。在一些实施方式中，本发明抗体(单克隆抗体、scFv、Fab或其它形式的抗体)特异性结合人LOX/LOXL(例如，hLOX和hLOXL1-4)，在约4℃、25℃、37℃或42℃检测时，其解离常数Kd等于或小于100nM、小于10nM、任选小于1nM、任选小于0.5nM、任选小于0.1nM、任选小于0.01nM、或任选小于0.005nM。
本发明抗体任选结合LOX或LOXL的一个或多个蛋白水解切割位点，例如加工成熟形式的LOX或LOXL的切割位点，藉此有效阻断LOX或LOXL的加工从而降低活性LOX或LOXL的水平。
本发明抗体任选特异性且选择性地结合全长形式的LOX，与人LOX的前蛋白原、成熟或加工的人LOX、或其它赖氨酰氧化酶-样或赖氨酰氧化酶-相关蛋白(例如，LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4；参见Molnar等，(2003)Biochim Biophys.Acta.1647：220-224；Csiszar，Prog.Nucl.Acid Res.70：1-32(2001)；和2001年11约8日公布的WO 01/83702)的结合亲和力相比，其结合亲和力高，例如至少10倍、至少100倍或者甚至至少1000倍。
本发明抗体任选特异性且选择性地结合成熟或加工形式的LOX，与人LOX的前蛋白原、全长形式的人LOX、或其它赖氨酰氧化酶-样或赖氨酰氧化酶-相关蛋白(例如，LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4；参见Molnar等，(2003)Biochim Biophys.Acta.1647：220-224)的结合亲和力相比，其结合亲和力高，例如至少10倍、至少100倍或者甚至至少1000倍。
在一些实施方式中，抗体特异性结合选自SEQ ID NO：1-18的hLOX区域中的表位。
本发明抗体任选同时结合人LOX和人LOXL2，与其它赖氨酰氧化酶-样或赖氨酰氧化酶-相关蛋白(例如，LOXL1、LOXL3和LOXL4；参见Molnar等，(2003)Biochim Biophys.Acta.1647：220-224)的结合亲和力相比，其结合亲和力高，例如10倍、至少100倍或者甚至至少1000倍。
本发明抗体任选不仅结合LOX或LOXL，还降低或抑制LOX或LOXL的摄取或内在化(例如，通过整联蛋白β1或其它细胞受体或蛋白质)。据信，这种抗体能减弱EMT，因此可用于本文披露的应用。
本发明抗体任选不仅结合LOX或LOXL，还降低或抑制LOX或LOXL的赖氨酰氧化酶活性。据信，这种抗体能减弱EMT，因此可用于本文披露的应用。
还采用上述试验进行LOX/LOXL与其它蛋白质，例如细胞受体(例如，摄取受体整联蛋白β1)、BTK(burton agammagloublinemia tyrosine kinase，伯顿无丙种球蛋白血症酪氨酸激酶)或其它整联蛋白的结合，其中使用的是细胞受体(例如，摄取受体整联蛋白β1)、BTK(伯顿无丙种球蛋白血症酪氨酸激酶)或其它整联蛋白而非ECM蛋白。
选择抑制LOX/LOXL与ECM蛋白、细胞受体和整联蛋白结合的那些LOX/LOXL抗体作为进一步开发的候选对象。
LOX/LOXL酶通过乒乓机制起作用，米-门二氏动力学描述了这种机制(图41)。本发明的LOX/LOXL抗体可以是LOX/LOXL的竞争性抑制剂、无竞争性抑制剂或非竞争性抑制剂。用作竞争性抑制剂、无竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂的抗体的作用机制描述于图42。对于竞争性抑制，抑制剂通常与底物具有相似的结构。底物浓度低时抑制作用明显，但可在底物浓度高时克服。对于无竞争性抑制，抑制剂结合底物在活性位点结合后变得可用的位点。抑制作用在底物浓度高时最明显。对于非-竞争性抑制，抑制剂结合远离底物结合位点的位点。相对抑制作用在所有底物浓度下通常相同。因此，抑制剂可以是LOX/LOXL抗体，例如LOXL2(的抗体)，其可以是竞争性抑制剂、无竞争性抑制剂或非竞争性抑制剂(图43)。
4.靶向LOX/LOXL的多核苷酸
可利用能特异性杂交编码LOX或LOXL的mRNA转录物的反义多核苷酸得到LOX或LOXL水平或活性的抑制剂。
本发明的多核苷酸抑制剂任选能降低或抑制LOX或LOXL的摄取或内在化。据信，这种多核苷酸抑制剂能减弱EMT，因此可用于本文披露的应用。
本发明的多核苷酸抑制剂任选降低或抑制LOX或LOXL的赖氨酰氧化酶活性。据信，这种多核苷酸抑制剂能减弱EMT，因此可用于本文披露的应用。
设计可用于有效下调LOX或LOXL2的反义分子时通常考虑反义方法中采用的两方面因素。第一方面是将寡核苷酸递送入合适细胞的胞质，而第二方面是设计以抑制其翻译的方式特异性结合细胞内所指定mRNA的寡核苷酸。
设计反义寡核苷酸时，通常考虑几方面。为利用反义寡核苷酸或类似物有效体内抑制基因表达，寡核苷酸或类似物通常要满足以下要求：(i)与靶序列结合的特异性足够；(ii)水中的溶解性；(iii)对胞内和胞外核酸酶的稳定性；(iv)穿透细胞膜的能力；和(v)用于治疗机体时的低毒性。根据解释靶mRNA和寡核苷酸中结构改变的能量的热力学循环，鉴定与其靶mRNA具有最高预计结合亲和力的那些序列的算法有，例如Walton等，Biotechnol Bioeng 65：1-9(1999)所述的。
这些算法已成功用于在细胞中实施反义方法。Walton等开发的算法使得科学家能成功设计家兔β-球蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转录物的反义寡核苷酸。同一研究组还报道通过动力学PCR技术评估证明理性选择的寡核苷酸针对细胞培养物中的3种模型靶mRNA(人乳酸脱氢酶A和B和大鼠gp130)的反义活性在几乎所有病例中有效，包括利用磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸化学方法对两种细胞类型的三种不同靶标进行测试。
此外，利用体外系统设计和预计特异性寡核苷酸效率的几种方法也得到公开(Matveeva等，Nature Biotechnology 16：1374-1375(1998))。
本发明可用的反义分予包括至少10个碱基，例如10-15个、15-20个碱基、至少17、至少18、至少19、至少20、至少22、至少25、至少30、或甚至至少40个碱基的多核苷酸或多核苷酸类似物，其在生理条件下可在体内与某多核苷酸链的一部分杂交，所述多核苷酸链编码与SEQ ID NO：1、4、5或7有至少50％同源性，或与其N-末端部分有至少75％同源性的多肽，而所述同源性采用威斯康星序列分析包的BestFit软件，利用Smith和Waterman算法测定，其中空位成熟罚分等于8，空位延伸罚分等于2。
可从给予组织的核酸构建物表达本发明可用的反义寡核苷酸，在该情况中，可利用诱导型启动子来打开和关闭反义表达，或者可化学合成这种寡核苷酸并作为，例如药物组合物的一部分而直接给予组织。
化学合成的寡核苷酸及其类似物能具有选择的预定序列提供了下调基因表达的手段。可考虑四类基因表达调节方案。
在转录水平，通过链置换或形成三链螺旋结合基因组DNA的反义或有义寡核苷酸或类似物可阻止转录。在转录物水平，结合靶mRNA分子的反义寡核苷酸或类似物导致胞内RNA酶H酶促切割杂交体。在该情况中，寡核苷酸或寡核苷酸类似物通过杂交靶向mRNA而提供由RNA酶H识别和破坏的双链杂交体。或者，这种杂交体形成可干扰正确的剪接。两种情况均造成可翻译的靶mRNA完整转录物的数量降低或消除。
在翻译水平，结合靶mRNA分子的反义寡核苷酸或类似物通过空间位阻阻止必需翻译因子(核糖体)结合靶mRNA，本领域将该现像称为杂交扣留，从而使得这些mRNA无法翻译。
未修饰的寡核苷酸通常不可用作反义序列，因为它们的体内半衰期短，在此期间核酸酶将其快速降解。此外，它们常难以制备毫克以上的数量。此外，这种寡核苷酸通常是不佳的细胞膜穿透剂。因此，通常以合适方式设计寡核苷酸类似物。
例如，通过精巧的“转回(switch back)”化学连接减少通过三链螺旋形成的双链DNA(dsDNA)识别的相关产生问题，从而能识别一条链上的多嘌呤序列，并且通过“转回”，可识别另一链上的同型嘌呤序列。就离子强度和pH而言，利用人工碱基还能形成良好的双链体，从而改善结合条件。
RNA寡核苷酸还可用于反义抑制，因为它们与靶标形成稳定的RNA-RNA双链体，提示抑制作用有效。然而，由于它们的溶解性低，通常利用为此目的而设计的RNA寡核苷酸在细胞内表达。当试图靶向编码丰富和长命蛋白的mRNA时，可采用该方法。
可采用反义疗法来治疗许多威胁生命的疾病，许多优点胜过传统药物。传统药物通常在致病蛋白质形成后进行干预。然而，反义疗法可阻断mRNA转录/翻译并在蛋白质形成前进行干预，由于反义疗法只靶向一种特定的mRNA，与目前的蛋白质抑制治疗相比，它们更有效而副作用较低。
几个临床试验证明反义寡核苷酸的安全性、可行性和活性。例如，已成功使用了适合治疗癌症的反义寡核苷酸(Holmund等，Curr.Opin.Mol.Ther.1：372-385(1999))，而通过靶向c-myb基因、p53和Bcl-2的反义寡核苷酸治疗血液恶性肿瘤已进入临床试验并显示可为患者耐受(Gerwitz，Curr.Opin.Mol.Ther.1：297-306(1999))。
最近，已有报道说人类肝素酶基因表达的反义介导抑制能在小鼠模型中抑制人癌症细胞的胸膜扩散(Uno等，Cancer Res 61：7855-60(2001))。
最近，FDA批准了第一种反义药物。该药物-福米韦生由埃斯埃斯公司(Isis)开发，表明能局部治疗对CMV视网膜炎的其它治疗不耐受或具有禁忌症或对CMV视网膜炎的以前治疗反应不足的AIDS患者的巨细胞病毒(药物疗法新闻网(Pharmacotherapy News Network))。
因此，目前一致的意见是上述反义技术领域的最近发展产生了高度精确的反义设计算法和各种寡核苷酸递送系统，从而普通技术人员能设计和实施适于下调已知序列表达而无需诉诸过多试验和错误实验的反义方法。
抑制LOX或LOXL的另一机制是RNA干扰(RNAi)，该方法利用与靶mRNA同源并导致其降解的小干扰dsRNA(siRNA或小发夹RNA，shRNA)分子(Carthew，Curr.Opin.Cell.Biol.13：244-248(2001))。例如，LOXL2特异性shRNA的表达感染各种类型的癌细胞能有效改变它们的形态和侵袭性。
RNA干扰通常是两步方法。在称为起始步骤的第一步中，可通过切酶作用将输入dsRNA消化成21-23核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)，该酶是dsRNA特异性核糖核酸酶的RNA酶III家族的一元，其以ATP依赖性方式加工(切割)dsRNA(直接或通过转基因或病毒引入)。连续切割事件将RNA降解成19-21bp双链体(siRNA)，各含2-核苷酸3’突出端(Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genet.Dev.12：225-232(2002)；Bernstein，Nature 409：363-366(2001))。
在效应步骤中，siRNA双链体与核酸酶复合物结合以形成RNA-诱导的沉默复合物(RISC)。RISC活化需要siRNA双链体的ATP-依赖性解旋。然后，活性RISC通过碱基配对相互作用靶向同源转录物，通常从siRNA的3’端将mRNA切割成约12个核苷酸片段(Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genet.Dev.12：225-232(2002)；Hammond等，Nat.Rev.Gen.2：110-119(2001)；Sharp，Genes.Dev.15：485-490(2001))。虽然切割机制尚未阐明，但研究表明各RISC含有一个siRNA和RNA酶(Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genet.Dev.12：225-232(2002))。
由于RNAi的显著效力，提示RNAi途径内有扩增步骤。可通过拷贝输入dsRNA产生更多siRNA，或通过复制形成的siRNA进行扩增。或者，通过RISC的多重翻转事件实现扩增(Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genet.Dev.12：225-232(2002)；Hammond等，Nat.Rev.Gen.2：110-119(2001)；Sharp，Genes.Dev.15：485-490(2001))。RNAi还描述于Tuschl，Chem.Biochem.2：239-245(2001)；Cullen，Nat.Immunol.3：597-599(2002)；和Brantl，Biochem.Biophys.Act.1575：15-25(2002)。
可如下所述合成适用于本发明的RNAi分子。首先，扫描AA二核苷酸序列的AUG密码子下游的LOX或LOXL mRNA序列。将各AA和3’毗连19个核苷酸的发生率记录为潜在的siRNA靶位点。从开放读框选择siRNA靶位点，药物非翻译区(UTR)富含调节蛋白质结合位点。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合(Tuschl，Chem.Biochem.2：239-245(2001))。然而，应该知道针对非翻译区的siRNA也可能是有效的，如GAPDH所示，其中针对5’UTR的siRNA介导细胞GADPH mRNA降低约90％并完全消除蛋白质水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。第二，利用任何序列比对软件，例如从NCBI服务器(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)获得的BLAST软件，将潜在的靶位点与合适的基因组数据库(例如，人、小鼠、大鼠等)比较。滤出与其它编码序列显示明显同源性的推定靶位点。
选择合格靶序列作为siRNA合成的模板。选择的序列可包括G/C含量低的那些序列，因为这些序列显示介导基因沉默比G/C含量高于55％的那些序列更有效。可沿着用于评估的靶基因的长度选择几个靶位点。为更好地评估选择的siRNA，联用负对照。负对照siRNA包括的核苷酸组成可与siRNA相同，但与基因组缺乏明显的同源性。因此，可利用siRNA的乱序核苷酸序列，只要其与任何其它基因不显示任何明显的同源性。
可从有助于siRNA转录物在引入宿主细胞后即可稳定表达的表达载体转录本发明的siRNA分子。工程改造这些载体以表达shRNA，体内加工成能执行基因特异性沉默的siRNA分子(Brummelkamp等，Science 296：550-553(2002)；Paddison等，Genes Dev.16：948-958(2002)；Paul等，Nature Biotech.20：505-508(2002)；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-6052(2002))。
ShRNA是具有发夹环结构的单链多核苷酸。单链多核苷酸具有连接双链区域中一条链的3’端和双链区域中另一链的5’端的环区段。由可与靶序列，例如编码LOX或LOXL的多核苷酸，或LOX或LOXL mRNA杂交的第一序列和与该第一序列互补的第二序列形成双链区域，因此该第一和第二序列形成连接序列连接其诸末端从而形成发夹环结构的双链区域。第一序列可与编码LOX/LOXL的多核苷酸的任何部分杂交。shRNA的双链茎结构域包含限制性内切核酸酶位点。
shRNA的茎环结构可具有任选的核苷酸突出端，例如2-bp突出端，例如3’UU-突出端。虽然可能有偏差，茎的范围通常为约15-49、约15-35、约19-35、约21-31bp、或约21-29bp，环的范围是约4-30bp，例如约4-23bp。
为在细胞内表达shRNA，可利用含有聚合酶III H1-RNA或U6启动子、茎环RNA插入物的克隆位点和4 5-胸苷转录终止信号的质粒载体。聚合酶III启动子通常具有良好限定的起始和终止位点，它们的转录物缺乏多聚(A)尾。多聚胸苷道(polythymidine tract)确定这些启动子的终止信号，转录物通常在第二尿苷后切割。在此位置切割表达的shRNA中产生3’UU突出端，其类似于合成siRNA的3’突出端。在哺乳动物细胞中表达shRNA的其它方法描述于以下引用的参考文献。
合适表达载体的例子是pSUPERTM，其包含具有良好限定的转录起点和由一行5个胸苷(T5)构成的终止信号的聚合酶-III H1-RNA基因启动子(Brummelkamp等，Science 296：550-553(2002))。在终止位点切割转录物是在第二尿苷后，因而产生类似于合成siRNA的末端的转录物，其还含有核苷酸突出端。克隆siRNA，从而使其包含感兴趣的序列，即，通过短间隔区而与同一序列的逆互补序列隔开的LOX或LOXL。得到的转录物本身回折叠(fold back)，形成介导LOX或LOXL RNAi的茎环结构。
另一合适的siRNA表达载体编码受不同polIII启动子调控的有义和反义siRNA(Miyagishi和Taira，Nature Biotech.20：497-500(2002))。该载体产生的siRNA还包含5胸苷(T5)终止信号。
由于通过脂质转染将合成siRNA引入细胞的方法可能导致一些细胞类型中的转染效率低和/或沉默效应的持续性短，现已开发了载体介导的方法。
因此，可利用逆转录病毒将本发明所用的siRNA分子递送入细胞。与诸如脂质转染等方法相比，利用逆转录病毒递送siRNA有几个优点，因为逆转录病毒递送通常更有效而均匀并能立即选择稳定的“敲减”细胞(Devroe和Silver，BMC Biotechnol.2：15(2002))。
最近的科技出版物验证了这种短双链RNA分子在抑制靶mRNA表达中的效力，因此明确证明了这种分子的治疗潜力。例如，现已利用RNAi抑制丙型肝炎(病毒)(McCaffrey等，Nature 418：38-39(2002))、HIV-1(Jacque等，Nature 418：435-438(2002))、宫颈癌细胞(Jiang和Milner，Oncogene21：6041-6048(2002))和白血病细胞(Wilda等，Oncogene 21，5716-5724(2002))表达。
5.抗瘤或抗纤维化药剂
按照本发明，LOX或LOXL的抑制剂可以与化疗剂联用以使肿瘤细胞(例如，从EMT状态过渡到MET状态)对化疗剂敏感，因此，不仅阻止或抑制肿瘤侵入和转移，还抑制原发性肿瘤生长。
本文所用的术语“化疗剂”或“化疗的”(或用化疗剂进行治疗的情况中的“化疗”)表示包括用于治疗癌症的任何非蛋白(即，非肽)化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；磺酸烷酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苄替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类和甲基三聚氰胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙烯胺三嗪、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；己酸配质类(例如，泡番荔枝辛(bullatacin)和泡番荔枝辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡力他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；缩酚酸肽类抗肿瘤药(cryptophycin)(特别是缩酚酸肽类1和缩酚酸肽类8)；多拉司他汀；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；潘克他汀(pancratistatin)；萨珂敌汀(sarcodictyin)；海绵他汀(spongistatin)；氮芥，例如瘤可宁、萘氮芥、环磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀(foremustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，刺孢霉素(calicheamicin)，特别是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素
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I1，参见，例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994)；蒽环类，包括蒽环A；二膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二氮杂-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubincin)(亚得里亚霉素TM)(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉代-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素，例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如德莫蝶呤(demopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗-肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酸内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；德福法明(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；醋酸羟哔咔唑；大环内酯类抗肿瘤药(epothilone)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇类物质(maytansinoids)，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSKTM；丙亚胺；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌毒素(anguidine))；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞苷(gacytosine)；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(新泽西州普林斯顿布里斯托美时施贵宝肿瘤公司(Bristol MeyersSquibb Oncology，Princeton，N.J.)TAXOLTM)和多西他赛(法国安东尼RPR公司(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)TAXOTERETM)；瘤可宁；吉西他滨(GemzarTM)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vancristine)；长春瑞滨(NavelbineTM)；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；昔洛达(xeoloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸类，例如维甲酸；卡培他滨；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。“化疗剂”的定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗-激素剂，例如抗-雌激素和选择性雌激素调节剂(SERM)，包括，例如他莫昔芬(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、凯奥昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FarestonTM)；调节肾上腺中雌激素产生的芳香酶的抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MegaceTM)、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑(RivisorTM)、来曲唑(FemaraTM)和阿那曲唑(ArimidexTM)；和抗-雄激素，例如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一个实施方式中，与LOX/LOXL调节剂联用的抗瘤剂是酪氨酸激酶抑制剂。例如，ZD1839(AZKK公司(AstraZeneca K.K.)的IressaTM)显示对EGFR(表皮生长因子受体)酪氨酸激酶的ATP结合位点的ATP有竞争性作用，并通过抑制酪氨酸激酶的自磷酸化而抑制酪氨酸激酶活性。
因此，通过阻断EGFR-提供的信号转导(配体，例如表皮生长因子(EGF)结合EGFR的胞外结构域，然后活化EGFR酪氨酸激酶的胞内结构域，从而不仅导致EGFR的自磷酸化，还导致各种胞内靶蛋白的自磷酸化，然后将增殖信号从癌细胞表面转导至核，并导致癌细胞的增殖、渗透、转移、血管生成)而表现出抗癌症作用。
IMC-C225或西妥昔单抗(ErbituxTM)是EGFR-靶向单克隆抗体，其识别细胞膜表面上EGFR的受体部分并抑制EGFR的自磷酸化，从而抑制酪氨酸激酶活性。赫赛汀是针对EGFR同源的Her2/Neu的单克隆抗体，甲磺酸伊马替尼(GLEEVECTM，以前称为STI-571)能抑制BCR-Abl和c-kit的酪氨酸激酶活性(2号非专利文件)。索拉法尼(Sorafenib)(NexavarTM)是Raf激酶、PDGF(血小板衍生的生长因子)、VEGF受体2和3激酶和c-Kit的小分子抑制剂。
本文所用针对肿瘤抗原的单克隆抗体是用肿瘤和白血病细胞所表达的抗原，例如肿瘤特异性抗原引发的抗体。单克隆抗体还包括全人和人源化抗体。
癌症治疗的治疗性抗体的另一例子包括曲妥单抗(HERCEPTINTM；HER2蛋白的过表达与临床上更具侵袭性的疾病和不佳的预后有关)；利妥昔单抗(RITUXANTM)是用淋巴瘤细胞上的CD20产生并选择性消除正常和恶性的CD20+前-B和成熟B细胞；阿仑单抗(CAMPATHTM)，特异性靶向B和T淋巴细胞上发现的CD52抗原的单克隆抗体，用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和淋巴瘤；和吉姆单抗佐格米星(Gemtuzumabzogamicin)(MYLOTARGTM)，包含针对CD33的特异性抗体和化疗剂(佐格米星)的抗体偶联物，其指示可以治疗复发的成人急性髓细胞性白血病。
在另一实施方式中，抗-血管生成剂与LOX/LOXL抑制剂组合来治疗癌症和异常或不良血管生成相关的其它疾病。抗血管生成剂的例子包括但不限于：视黄酸及其衍生物、2-甲氧基雌二醇、ANGIOSTATINTM、ENDOSTATINTM、苏拉明、角鲨胺、金属蛋白酶-I的组织抑制剂、金属蛋白酶-2的组织抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、软骨-衍生的抑制剂、紫杉醇、血小板因子4、硫酸鱼精蛋白(鲱精蛋白)、硫酸几丁质衍生物(从雪花蟹壳制备)、硫酸化多糖肽聚糖复合物(sp-pg)、星形胞菌素、基质代谢的调节物，包括，例如脯氨酸类似物((I-氮杂环丁烷-2-羧酸(LACA)、顺羟脯氨酸、d，I-3，4-脱氢脯氨酸、硫代脯氨酸、延胡索酸α-二吡啶基，β-氨基丙腈、4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3h)-噁唑酮；氨甲蝶呤、米托蒽醌、肝素、干扰素、2巨球蛋白-血清、黑猩猩(chimp)-3、糜蛋白酶抑制素、β-环糊精十四烷硫酸酯、埃坡恩霉素(eponemycin)；烟曲霉素、硫代苹果酸金钠、d-青霉胺(CDPT)、β-1-抗胶原酶-血清、α.2-抗血纤维蛋白酶、比生群、氯苯扎利二钠、n-2-羧基苯基-4-氯氨茴酸二钠或″CCA″、沙立度胺；血管抑制性类固醇、羧基氨基咪唑(cargboxynaminolmidazole)；金属蛋白酶抑制剂，例如BB94。其它抗-血管生成剂包括抗体，例如针对这些血管生成性生长因子的单克隆抗体：bFGF、aFGF、FGF-5、VEGF同种型、VEGF-C、HGF/SF和Ang-1/Ang-2。Ferrara N.和Alitalo，K.″Clinical application ofangiogenic growth factors and their inhibitors(血管生成性生长因子和它们的抑制剂的临床应用)″(1999)Nature Medicine 5：1359-1364。其它抗血管生成剂可包括VEGF转录的抑制剂。
示范性的抗-纤维化剂包括但不限于：化合物，例如β-氨基丙腈(BAPN)以及以下文献公开的化合物：1990年10月23日授予Palfreyman等的美国专利号4,965,288，名称为“Inhibitors of lysyl oxidase，relating to inhibitors oflysyl oxidase and their use in the treatment of diseases and conditionsassociated with the abnormal deposition of collagen(赖氨酰氧化酶抑制剂，涉及赖氨酰氧化酶抑制剂以及它们在治疗胶原异常沉积相关疾病和病症中的应用)”；1991年3月5日授予Kagan等的U.S.4,997,854，名称为“Anti-fibroticagents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase in situ usingadj acently positioned diamine analogue substrate(抗纤维变性剂和利用毗邻定位的二胺类似底物原位抑制赖氨酰氧化酶活性的方法)”，其涉及抑制LOX来治疗各种病理性纤维化状态，这些文献通过引用纳入本文。其它示范性抑制剂描述于1990年7月24日授予Palfreyman等的U.S.4,943,593，名称为“Inhibitors of lysyl oxidase(赖氨酰氧化酶的抑制剂)”，其涉及诸如2-异丁基-3-氟-、氯-、或溴-烯丙胺等化合物；以及，例如U.S.5,021,456；U.S.5,5059,714；U.S.5,120,764；U.S.5,182,297；U.S.5,252,608(涉及2-(1-萘氧基甲基)-3-氟烯丙胺)；和美国专利申请号2004/0248871，这些文献通过引用纳入本文。示范性抗-纤维化剂还包括与赖氨酰氧化酶的活性位点上的羰基反应的伯胺，包括与羰基结合后产生通过共振稳定的产物的那些，例如以下伯胺：乙二胺，肼，苯基肼和它们的衍生物、氨基脲和脲衍生物，氨基腈，例如β-氨基丙腈(BAPN)，或2-硝基乙胺，不饱和或饱和卤代胺，例如2-溴-乙胺、2-氯乙胺、2-三氟乙胺、3-溴丙胺、对-卤代苄胺，硒代高半胱氨酸内酯。在另一实施方式中，抗-纤维化剂是穿透或不穿透细胞的铜螯合剂。其它示范性化合物包括间接抑制剂，这些化合物阻断赖氨酰氧化酶对赖氨酰基或羟基赖氨酰基残基进行氧化脱氨而衍生醛衍生物，例如硫醇胺(thiolamine)，特别是D-青霉胺或其类似物，例如2-氨基-5-巯基-5-甲基己酸、D-2-氨基-3-甲基-3-((2-乙酰胺基乙基)二硫代)丁酸、对-2-氨基-3-甲基-3-((2-氨基乙基)二硫代)丁酸、4-((对-1-二甲基-2-氨基-2-羧乙基)二硫代)丁烷亚磺酸钠、2-乙酰胺基乙基-2-乙酰胺基乙硫醇亚磺酸酯(sulphanate)、4-巯基丁烷亚磺酸钠三水合物。
6.给药制剂、试剂盒和途径
还考虑了包含采用所公开方法鉴定为LOX/LOXL调节剂的化合物的治疗性组合物。在一个实施方式中，本文提供预防和治疗转移性肿瘤生长的治疗性组合物，该组合物在药学上可接受的运载体物质中包含治疗有效量的LOX/LOXL抑制剂；其中所述抑制剂抑制赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白，例如LOXL-2，其中所述抑制剂的用量足以预防和治疗转移性肿瘤生长。在另一实施方式中，本文提供预防和治疗转移性肿瘤生长的治疗性组合物，该组合物在药学上可接受的运载体物质中组合包含治疗有效量的LOX/LOXL抑制剂，并与放疗、外科手术、化疗或非LOX/LOXL抑制剂的抗癌症生物物质组合。
本文所用的术语“治疗有效量”或“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。治疗有效剂量还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将各活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。例如，当采用体内给予LOX/LOXL抗体时，常规剂量可以是约10纳克到最多100毫克/千克哺乳动物体重/天或更多，例如，约1微克/千克/天到50毫克/千克/天，任选约100微克/千克/天到20毫克/千克/天、500微克/千克/天到10毫克/千克/天、或1毫克/千克/天到10毫克/千克/天不等，取决于给药途径。
本领域技术人员鉴于本文可知道各种药物组合物及其制备技术和应用。合适的药物组合物和相关给药技术的细节可参见本文的详细指导，进一步的补充可见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药学科学和实践)，第20版，(Lippincott，Williams & Wilkins 2003)等教材。
所述组合物还包含药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，即，运载体。这些运载体参与将所述化合物从一个器官、或身体部分携带或运输至另一器官或身体部分。就与制剂的其它成分相容和不伤害患者而言，各运载体应是“可接受的”。可用作药学上可接受的运载体的材料的一些例子包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；乙二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；糖；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸缓冲溶液；和药物制剂中利用的其它无毒相容物质。组合物中还可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
本发明另一方面涉及执行组合给予LOX/LOXL调节剂与其它治疗剂的试剂盒。在一个实施方式中，所述试剂盒装有在药物运载体中配制的LOX/LOXL抑制剂和一种或多种不同药物制品中适当配制的至少一种非LOX/LOXL抑制剂的治疗剂。
制剂和递送方法通常根据待治疗的部位和疾病而改进。示范性制剂包括但不限于：适于胃肠外给药，例如静脉内、动脉内、肌肉内或皮下给药的那些，包括包裹在胶束、脂质体或药物释放胶囊(掺入为缓释而设计的生物相容包衣中的活性剂)中的制剂；可摄取制剂；局部应用的制剂，例如乳膏、软膏和凝胶；和其它制剂，例如吸入剂、气溶胶和喷雾剂。本发明化合物的剂型根据治疗所需的程度和严重性、所给予组合物的活性、对象的总体健康和技术人员熟知的其它考虑而有所不同。
可将本文所述的药剂掺入适于给药的药物组合物。这种组合物通常包含药剂和药学上可接受的运载体。还可将补充性活性化合物掺入组合物中。
在还有另一实施方式中，局部递送本文所述药剂。与全身性递送相比，局部递送能将药剂非全身性递送至，例如纤维化的部位以降低对象的全身(接触)。可利用各种医学移植装置实现这种局部递送，所述装置包括但不限于支架和导管。本领域建立了将所需药剂包衣、植入、编码或者粘附于医学装置，例如支架和导管的方法，本文考虑了这些方法。
植入支架已用于携带医学药剂，例如血栓溶解剂。美国专利号5,163,952公开了热记忆扩张塑料支架装置，其配制成在该支架本身的材料中携带医学药剂。美国专利号5,092,877公开了聚合材料支架，其可具有化合物递送相关的包衣。涉及利用生物可降解和生物可吸收聚合物的装置类别的其它专利包括美国专利号4,916,193、美国专利号4,994,071。例如，美国专利号5,304,121公开了施加于支架的包衣，其由水凝胶聚合物和预选择的化合物，例如细胞生长抑制剂或肝素构成。美国专利号5,464,650描述了制备携带治疗性物质的包衣血管内支架的方法，其中聚合物包衣材料溶解于溶剂并且治疗性物质分散在溶剂中。然后在涂布后蒸发溶剂。
美国专利号6,120,536描述了用于各种假体装置，包括支架的其它类型包衣。可利用本文所述药剂的其它医学或假体装置的例子包括但不限于：血液交换装置、血管通路端口、中心静脉导管、心血管导管、体外回路(extracorpeal circuit)、血管移植物、泵、心瓣膜和心血管缝线。本发明的适用性不应视作局限于植入体设计、植入体位置或构建材料，而无论本文公开的详细实施方式。用本文所述药剂包衣的装置，包括支架和导管能将药剂递送至特定或局部部位。这种部位特异性递送可提供手段以便利用由于溶解性、全身性毒性顾虑或其它问题而不适于全身性递送的剂量和药物，例如β-氨基丙腈(BAPN)和相关化合物或其它胺氧化酶抑制剂(例如，上述LOX/LOXL的小分子抑制剂)。例如，已知可用BAPN抑制LOX，但该化合物毒性高，从而在全身性给予时其有效应用存在问题。利用支架、导管或其它医学装置递送活性剂或化合物，例如BAPN能以靶向或局部方式使用有效剂量的化合物，因而降低了这种化合物和目前给药途径相关的全身性毒性作用。
7.组合物适应症
本发明药物制剂可用于治疗各种疾病。
本文所用的“防止”包括预防、防止症状的发作，防止纤维化相关或LOX/LOXL活性相关疾病或病症的进展。本文所用的“抑制”、“治疗”和“缓解”可互换使用，指，例如症状停滞、存活延长、症状部分或完全缓解、纤维化相关或LOX/LOXL活性相关病状、疾病或病症的部分或完全消除。
可将治疗有效量的组合物给予患者(例如，哺乳动物，如人或非人动物，如灵长类、啮齿类、牛、马、猪、绵羊等)，所述有效量足够以适用于任何医学治疗的合理效益/风险比通过抑制疾病或病症，例如纤维化或LOX/LOXL活性相关的本文所述那些而产生所需疗效。对于本发明组合物的人给药，可采用本领域普通技术人员已知的方法配制组合物。治疗有效量是在器官或组织中至少部分达到所需治疗或预防作用的用量。在一个实例中，预防和/或治疗性治疗疾病或病症所需的LOX/LOXL抑制剂用量本身不固定。LOX/LOXL抑制剂的给予量随疾病或病症的类型、疾病或病症的广泛性和患有该疾病或病症的哺乳动物的大小而有所不同。
当患者经历疾病迹象或症状的部分或完全缓和或减轻，特别是包括但不限于存活延长时，视作有反应。根据预后因素，包括复发次数、疾病阶段和其它因素检测的预计无进展存活时间是数月到数年。延长的存活包括但不限于至少1个月、约至少2个月、约至少3个月、约至少4个月、约至少6个月、约至少1年、约至少2年、约至少3年、或更长的时间。检测的总体存活也是数月到数年。患者的症状可保持停滞，或可减退。
可利用本发明药物制剂治疗的非限制性适应症包括涉及不良或不受控细胞增殖的那些适应症。这种适应症包括良性肿瘤、各种类型的癌症，例如原发性肿瘤和肿瘤转移、再狭窄(例如，冠状动脉、颈动脉和大脑病损)、血液学疾病、内皮细胞的异常刺激(动脉粥样硬化)、外科手术对身体组织的伤害、伤口愈合异常、血管生成异常、产生组织纤维化的疾病、黄斑变性、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、硬皮病、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病、重复性运动障碍(repetitive motion disorder)、未高度血管化的组织的疾病和器官移植物相关的增殖反应。
良性肿瘤中的细胞通常保留它们的分化特征，不以完全不受控的方式分裂。良性肿瘤通常是固定且非转移性的。可采用本发明治疗的良性肿瘤的具体类型包括但不限于：血管瘤、肝细胞腺瘤、多孔性血管瘤、灶性结节性增生、听觉神经瘤(acoustic neuromas)、神经纤维瘤、胆管腺瘤、胆管囊腺瘤(bileduct cystanoma)、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、间皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、结节再生性增生、沙眼和化脓性肉芽肿。
在恶性肿瘤中，细胞变得不分化、对身体的生长控制信号没有反应并以不受控方式扩增。恶性肿瘤是侵袭性的，能传播到远端部位(转移性)。恶性肿瘤通常分成两类：原发性和继发性。原发性肿瘤从发现它们的组织中直接产生。继发性肿瘤或转移瘤是源自身体的其它位置但现在传播到远端器官的肿瘤。转移的常见途径是在毗邻结构中直接生长，通过血管或淋巴系统传播和沿着组织面和身体间隙(腹水、脑脊液等)运动。
可通过本文公开的方法治疗的原发性和转移性肿瘤可包括但不限于：肺癌(包括但不限于肺腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、细支气管肺泡癌、非小细胞癌、小细胞癌、间皮瘤)；乳腺癌(包括但不限于导管癌、小叶癌、炎性乳腺癌、透明细胞癌、粘液癌)；结肠直肠癌(包括但不限于结肠癌、直肠癌)；肛门癌；胰腺癌(包括但不限于胰腺腺癌、胰岛细胞癌、神经内分泌肿瘤)；前列腺癌；卵巢癌(包括但不限于卵巢上皮癌或表面上皮-间质肿瘤，包括浆液性肿瘤、内膜样瘤和粘液性囊腺癌、性索间质细胞瘤)；肝脏和胆管癌(包括但不限于肝细胞癌、胆管癌、血管瘤)；食道癌(包括但不限于食道腺癌和鳞状细胞癌)；非-霍奇金淋巴瘤；膀胱癌；子宫癌(包括但不限于子宫内膜腺癌、子宫乳头状浆液性腺癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤和平滑肌肉瘤、混合型苗勒肿瘤)；神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、髓质母细胞瘤、和其它脑肿瘤；肾脏癌症(包括但不限于肾细胞癌、透明细胞癌、肾母细胞瘤)；头颈癌(包括但不限于鳞状细胞癌)；胃癌(包括但不限于胃腺癌、胃肠道间质瘤)；多发性骨髓瘤；睾丸癌；生殖细胞瘤；神经内分泌肿瘤；子宫颈癌；胃肠道、乳腺和其它器官的类癌；和印戒细胞癌。
间充质肿瘤可包括但不限于肉瘤、纤维肉瘤、血管瘤、血管瘤病、血管外皮细胞瘤、假血管瘤性间质性增生、成肌纤维胞瘤、纤维瘤病、炎性成肌纤维胞瘤、脂肪瘤、血管脂肪瘤、颗粒细胞瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤、血管肉瘤、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤。
可采用本发明治疗的癌症或恶性肿瘤(原发性或继发性)的具体类型还包括但不限于：皮肤癌、骨癌、脑癌、喉、胆囊、胰腺、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、神经组织、头和颈、支气管的癌症、基底细胞癌、溃疡性和乳头型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤(veticulum cell sarcoma)、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胆结石、胰岛细胞肿瘤、原发性脑肿瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞肿瘤、毛细胞肿瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤(mucosal neuronms)、肠神经节瘤、增生性角膜神经肿瘤、马方体质肿瘤(marfanoid habitus tumor)、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌肿瘤、宫颈非典型增生和原位癌、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤病损、真菌病(mycosis fungoide)、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其它肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞肿瘤、红细胞增多症、腺癌、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforma)、白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、表皮状癌、和其它癌及肉瘤。
血液学病症包括可导致血细胞发育异常改变的血细胞异常生长和血液学恶性肿瘤，例如各种白血病。血液学病症的例子包括但不限于：急性髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和镰状细胞性贫血。
急性髓细胞性白血病(AML)是在成年人中最常发生的急性白血病类型。几种遗传病和免疫缺陷状态与AML风险增加有关。这些病症包括DNA稳定性有缺陷的、导致随机染色体断裂的病症，例如布卢姆综合征、范康尼贫血、L-F宗族(Li-Fraumeni kindreds)、运动失调性毛细血管扩张症和x连锁无丙种球蛋白血症。
急性前髓细胞性白血病(APML)代表了AML的不同亚组。该亚型的特征在于含有15；17染色体易位的前髓细胞性胚细胞。该易位导致产生由视黄酸受体和序列PML组成的融合转录物。
急性成淋巴细胞性白血病(ALL)是由各种亚型体现出不同临床特征的异源疾病。ALL显示重现性细胞遗传异常(reoccurring cytogeneticabnormality)。最常见的细胞遗传异常是9；22易位。得到的费城染色体(Philadelphia chromosome)表示患者的预后不佳。
慢性髓细胞性白血病(CML)是多能干细胞的无性骨髓增生病。CML的特征在于特定染色体异常，其涉及染色体9和22易位，从而产生费城染色体。电离辐射与CML的产生有关。
骨髓增生异常综合征(MDS)是因为在包括骨髓、红细胞和巨核细胞谱系在内的一个或多个造血谱系中存在发育异常改变而分成一组的异源无性造血干细胞病。这些改变在这三种谱系的一种或多种中导致细胞减少。患有MDS的患者通常产生贫血、嗜中性白细胞减少症(感染)或血小板减少症(出血)相关的并发症。通常约10％-约70％的MDS患者产生急性白血病。
对于各种外科手术过程，包括关节外科手术、肠外科手术和瘢痕瘤瘢痕形成，治疗外科手术期间的身体组织伤害导致异常细胞增殖是可能的。产生纤维化组织的疾病包括肺气肿。可采用本发明治疗的重复性运动障碍包括腕管综合征。可采用本发明治疗的细胞增殖性病症的例子是骨肿瘤。
可采用本发明治疗的器官移植相关增殖性反应包括导致潜在的器官排斥或相关并发症的增殖性反应。具体地说，这些增殖性反应可在心脏、肺、肝脏、肾脏和其它身体器官或器官系统的移植期间发生。
本文所述药物制剂可用于预防或治疗将胶原交联或纤维化增加作为它们病因一部分的各种疾病。例如，所述组合物的适应症还可包括纤维化。纤维化是可作为受伤组织中伤口愈合过程一部分而发生的纤维组织异常累积。物理损伤、炎症、感染、接触毒素和其它原因可导致这种组织伤害。纤维化的例子包括皮肤瘢痕形成、瘢痕瘤、肝纤维化、肺纤维化(例如，矽肺、石棉沉着病)、肾纤维化(包括糖尿病性肾病)和肾小球硬化症。其它例子包括但不限于肺气肿和慢性阻塞性肺病(COPD)；多发性硬化症；慢性哮喘；动脉粥样硬化；类风湿性关节炎；青光眼；和年龄相关的黄斑变性(湿性AMD和干性AMD)。
心血管纤维化
本发明还提供用于治疗或预防与心血管疾病，例如充血性心力衰竭、心肌病、心肌梗塞后心脏功能缺陷、高血压性心脏病(HHD)、心肌梗塞(MI)、动脉粥样硬化、再狭窄(例如，冠状动脉、颈动脉和脑损伤)和心脏缺血事件相关心脏病有关的心血管或心脏纤维化的组合物、方法、系统、医学装置和试剂盒。
特定赖氨酰氧化酶的表达可与心肌梗塞后的炎性反应和伤口愈合的不同阶段有关。通过特异性抑制下游纤维化反应相关的特定赖氨酰氧化酶，可避免心脏重塑和伤口愈合的有害后果，同时发生即时MI后的修复/愈合过程。
MI后的治愈反应可诱导LOX/LOXL表达，但如果该过程继续下去，未经检查的过度交联导致胞外基质重塑或纤维化，从而造成心脏机能失调。破坏基质和交联的胶原或弹性蛋白的酶看来起作用较慢或效率不高，因此交联事件占上风。除了基质重塑外，由于LOX/LOXL在上皮-间充质过渡(EMT)中也起作用，其进一步造成心肌细胞重塑和心肌细胞肥大。
MI诱导的初始修复性纤维化是有益的(例如，防止动脉瘤和相关的损伤)，可不受阻碍地进行。然而，虽然不想受特定理论或作用机制的束缚，但本发明人相信在这种修复性纤维化阶段后开始抗-LOX/LOXL治疗能减弱导致心脏机能失调的反应性(不当的)纤维化。例如，可在MI后2、4、6、8、10、12、14、16、16、20、22、24、36、48或更多小时(包括其间的所有整数)开始抗-LOX/LOXL治疗。此外，可在MI后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天开始抗-LOX/LOXL治疗。类似地，血压升高(高血压)导致心脏组织中胶原沉积增加和蛋白质降解减少(Berk等，J.Clin.Invest.，117(3)：568-575(2007))。高血压性心脏病或高血压诊断和/或确定后开始抗-LOX/LOXL治疗能预防、降低或缓解高血压相关的纤维化。可在诊断或检测到血压或全身血压升高后的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天开始这种抗-LOX/LOXL治疗。
在一些实施方式中，可利用生物标记测定不适当水平的交联何时可能发生：LOX水平已显示与C反应性蛋白(CRP)-一种常用的生物标记-有关，当CRP水平高于合适的正常水平时可开始治疗。现有方法和测试试剂盒能更直接地检测尿液或血液中交联胶原端肽的释放。这些胶原片段的水平升高可表明从修复性纤维化向反应性(不当的)纤维化过渡。此外，可检测心脏功能和输出量，包括与心室有效收缩相关的那些。
在一些实施方式中，预见治疗持续时间有限。治疗只要持续足够长，从而能防止或减弱反应性纤维化以防止或减轻心脏机能失调即可。例如，当需要较短的治疗持续时间时，可利用短效Fab抗体片段。或者，可在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周(包括其间的所有天数)中，利用有限剂量的血清半衰期较长的全长抗体。可采用心脏功能的标准测试连同评估上述相关生物标记来监测进展并视需要调节剂量。治疗持续时间有限提高了该方法的安全性。
用于本文所述组合物给药的适应症还包括心血管适应症以外发现的纤维化。纤维化是可作为受伤组织中伤口愈合过程一部分而发生的纤维组织异常累积。物理损伤、炎症、感染、接触毒素和其它原因可导致这种组织伤害。纤维化的例子包括皮肤瘢痕形成、瘢痕瘤、肝纤维化、肺纤维化(例如，矽肺、石棉沉着病)、和肾纤维化(包括糖尿病性肾病和肾小球硬化症)。此外，纤维化和胶原沉积参与β-淀粉样蛋白斑块的形成，因而造成阿尔茨海默病的产生和进展。本文所述组合物还考虑可用于治疗、预防和/或缓解以下纤维化病症。
皮肤瘢痕和瘢痕瘤形成
已知皮肤瘢痕和瘢痕瘤形成涉及过量胶原沉积和/或胶原沉积失调。相对于受伤皮肤组织的正常成纤维细胞重塑的这种偏差可导致厚而难看的瘢痕。瘢痕瘤已知部分是伤口愈合失调和随后胶原沉积升高所致。与正常伤口愈合中所见的瘢痕不同，瘢痕瘤不会随时间而褪色或复原。虽然瘢痕瘤通常是良性的皮肤肿瘤，但它们不好看且可累积成更成问题的皮肤变形和/或病损(Appleton，I等，Apoptosis，Necrosis，and Proliferation：PossibleImplications in the Etiology of Keloids(凋亡、坏死和增殖：可能涉及瘢痕瘤病因学)，Am.J.Pathol.，149(5)：1441-1447(1996))。胶原在皮肤中的累积也涉及硬皮病-皮肤组织增厚或变硬的许多病症的通用术语，它们的共同特征是成纤维细胞导致皮肤组织中胶原的过度产生或失调(Akagi，A等.，Expression of Type XVI Collagen in Human Skin Fibroblasts：EnhancedExpression in Fibrotic Skin Disease(人皮肤成纤维细胞中XVI型胶原的表达：纤维化皮肤疾病中表达增强)，J.Invest.Dermatol.，113：246-250(1999))。由于胶原沉积在纤维化皮肤病，例如硬皮病和瘢痕瘤形成中的核心作用，本文所述组合物可用于预防、治疗和/或缓解纤维化皮肤病，包括但不限于硬皮病和瘢痕瘤形成。
肝纤维化
肝脏纤维化涉及许多肝脏疾病的病理学过程。如前所述，纤维化可作为血色病、威尔逊病、酒精中毒、血吸虫病、病毒性肝炎、胆管阻塞、接触毒素和代谢紊乱的并发症而发生。不作检查，肝纤维化会发展成肝硬化(定义为存在包裹的结节)、肝衰竭和死亡。
本文公开的组合物和方法可治疗肝纤维化，包括但不限于：肝硬化和相关病症，例如慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、酒精性脂肪肝(ASH)、非酒精性脂肪肝(NASH)、原发性胆汁性肝硬变(PBC)、胆汁性肝硬变和自身免疫性肝炎。
例如寄生虫和病毒感染(例如，HBV、HCV、HIV、血吸虫)等来源或酒精消费的长期应激对肝脏的长期伤害通常导致肝脏重塑，可能包裹受损区域并保护其余肝脏组织免遭伤害(Li和Friedman，Gastroenterol.Hepatol.14：618-633，1999)。肝脏纤维化导致胞外基质改变，包括总胶原含量增加3-10倍和低密度基膜被高密度基质替换，从而损害了肝细胞、肝脏星形细胞和内皮细胞的代谢和合成功能(Girogescu，M.，Non-invasive Biochemical Markers of LiverFibrosis(肝脏纤维化的非侵袭性生物化学标记)，J.Gastrointestin.Liver Dis.，15(2)：149-159(2006))。因此，本文所述的组合物可用于预防、治疗和/或缓解纤维变性肝脏疾病，本文考虑了这种应用。
肾脏纤维化
与肝脏纤维化相似，各种疾病和对肾脏的伤害可导致肾脏纤维化。这种疾病和伤害的例子包括慢性肾脏疾病、代谢综合征、膀胱输尿管反流、小管间质性肾脏纤维化、糖尿病(包括糖尿病性肾病)和造成的肾小球肾炎(GN)，包括但不限于局灶性节段性肾小球硬化和膜性肾小球肾炎、肾小球毛细血管性GN。
现已了解到代谢综合征是包括糖尿病标志，例如胰岛素耐受性以及中枢或内脏肥胖和高血压在内的一组异常情况。在几乎所有的情况中，葡萄糖失调刺激细胞因子释放和上调胞外基质沉积。导致慢性肾脏疾病、糖尿病、代谢综合征和肾小球肾炎的其它因素包括高脂血症、高血压和蛋白尿，所有这些进一步伤害肾脏并进一步刺激胞外基质沉积。因此，不管原发性诱因是什么，对肾脏的伤害可导致肾脏纤维化和相伴的肾脏功能丧失(Schena，F.和Gesualdo，L.，Pathogenic Mechanisms of Diabetic Nephropathy(糖尿病性肾病的病理学机制)，J.Am.Soc.Nephrol.，16：S30-33(2005)；Whaley-Connell，A.，和Sower，J.R.，Chronic Kidney Disease and the Cardiometabolic Syndrome(慢性肾病和心脏代谢综合征)，J.Clin.Hypert.，8(8)：546-48(2006))。因此，本文所述的组合物可用于预防、治疗和/或缓解纤维变性肾病(慢性肾病、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、代谢综合征)，本发明考虑了这种应用。
肺纤维化
肺纤维化包括许多综合征和疾病。示范性疾病包括特发性肺纤维化(EPF)、特发性间质性肺炎和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。肺纤维化还可包括但不限于：隐原性纤维化肺泡炎、慢性纤维形成性间质肺炎、间质性肺病(ILD)和弥散性实质性肺病(DPLD)。
包括上述疾病在内的大多数肺纤维化的病理学机制尚不十分清楚，然而，所有疾病均表征为炎性细胞的内流和随后富含胶原的胞外基质的合成及沉积增加(Chua等，Am J.Respir.Cell.Mol.Biol.，33：9-13(2005)；Tzortzaki等，J.Histochem.& Cytochem.，54(6)：693-700(2006)；Armstrong等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，160：1910-1915(1999))。由于胶原和胞外基质沉积增加在肺纤维化中确有作用，本文所述组合物可通过抑制LOX/LOXL而用于肺纤维化的预防、治疗和/或缓解。
阿尔茨海默病
阿尔茨海默病是特征在于淀粉样蛋白-β斑块累积导致神经元丧失的渐进性神经变性疾病，还知道阿尔茨海默病中赖氨酰氧化酶活性增加(Gilad等，Neurosci.Lett.，376(3)：210-13(2005))。淀粉样蛋白-β含有代表LOX/LOXL活性靶标的多个赖氨酸残基，因此，抑制LOX/LOXL能治疗、预防或缓解阿尔茨海默病中淀粉样蛋白斑块的累积。还知道淀粉样蛋白-β斑块构成其它蛋白质。导致淀粉样蛋白-β斑块形成和含量的一种这样的蛋白质是称为CLAC-P的胶原蛋白。CLAC-P的结构类似于XIII型胶原，但其分布在神经元中。CLAC-P结合淀粉样蛋白-β并导致淀粉样蛋白-β斑块形成(Soederberg等，J.Biol.Chem.，280(2)：1007-1015(2005))。因此，本文所述的组合物可用于预防、治疗和/或缓解阿尔茨海默病，包括但不限于防止淀粉样蛋白-β斑块形成以及降低淀粉样蛋白-β斑块的持续性。
可采用本文所述方法和组合物治疗或预防的异常血管生成包括伴有以下疾病的异常血管生成：类风湿性关节炎、缺血-再灌注相关的脑水肿和损伤、皮质缺血、卵巢超常增生和过度血管形成(hypervascularity)、(多囊性卵巢综合征)、子宫内膜异位、银屑病、糖尿病性视网膜病、和其它眼部血管生成疾病，例如早熟性视网膜病变(retinopathy of prematurity)(晶状体后纤维形成)、肌变性、角膜移植排异、新生血管性青光眼(neuroscular glaucoma)和OW综合征(Oster Webber syndrome)。
异常血管生成相关疾病需要或诱导血管生长。例如，角膜血管生成包括3个阶段：前-血管潜伏期，活性新血管生成和血管成熟及消退。各种血管生成因子，包括炎性反应的元素，例如白细胞、血小板、细胞因子和类花生酸类物质，或未鉴定的血浆成分的本体和机制尚待揭示。
在另一实施方式中，本发明的药物制剂可用于治疗不良或异常血管生成相关疾病。该方法包括组合给予患不良或异常血管生成的患者LOX/LOX抑制剂和并非所述LOX/LOXL抑制剂的抗瘤剂或抗血管生成剂。抑制血管生成和/或血管生成疾病所需的这些药剂的具体剂量可取决于病症的严重性、给药途径和可由主治医师决定的相关因素。所接受和有效的每日剂量通常是足以有效抑制血管生成和/或血管生成疾病的用量。
按照该实施方式，本发明的药物制剂可用于治疗不良血管生成相关的各种疾病，例如视网膜/脉络膜新血管生成和角膜新血管生成。视网膜/脉络膜新血管生成的例子包括但不限于：贝斯特病(Bests diseases)、近视、视窝(胚胎)、斯塔格特病(Stargarts diseases)、佩吉特病、静脉阻塞、动脉阻塞、镰状细胞性贫血、结节病、梅毒、弹性纤维假黄瘤、慢性非特异性呼吸阻塞性疾病(carotid abostructive diseases)、慢性眼葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆病、全身性红斑狼疮、早熟性视网膜病变、伊尔斯病、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、贝切特病(Bechets diseases)、导致视网膜炎或脉络膜炎(chroiditis)的感染、假定的眼组织胞浆菌病、扁平部睫状体炎、慢性视网膜剥离、高浓度综合征、弓形体病、外伤和激光后并发症(post-lasercomplication)、发红(rubesis)相关疾病(眼角(angle)的新血管生成)和纤维血管或纤维组织异常增殖导致的疾病，包括所有形式的增殖性玻璃体视网膜病变。角膜新血管生成的例子包括但不限于：流行性角(膜)结膜炎、维生素A缺乏、接触镜过度佩带、特发性角膜炎、高级边缘角膜炎(superior limbickeratitis)、干燥型翼状胬肉角膜炎(pterygium keratitis sicca)、斯耶格伦综合征(sjogrens)、红斑痤疮、小水疱病(phylectenulosis)、糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病变、角膜移植排异、蚕食性角膜溃疡、特里昂边缘变性(Terrien′s marginal degeneration)、边缘角质层分离(marginal keratolysis)、多动脉炎、瓦格纳肉样瘤病(Wegener sarcoidosis)、巩膜炎、类天疱疮样放射性角膜切开术(periphigoid radial keratotomy)、新生血管性青光眼和晶状体后纤维组织增生症、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学品烧灼(chemicalbums)、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹病毒感染、带状疱疹感染、原生动物感染和卡波西肉瘤。
在还有另一实施方式中，本发明药物制剂可用于治疗异常血管生成相关的慢性炎性疾病。该方法包括组合给予患有异常血管生成相关慢性炎性疾病的患者LOX/LOXL抑制剂与并非所述LOX/LOXL抑制剂的抗瘤剂或抗血管生成剂。慢性炎症取决于连续形成毛细管抽芽以维持炎性细胞的内流。内流和炎性细胞的存在产生肉芽肿，因此，维持了慢性炎性状态。利用本发明药物制剂抑制血管生成可防止肉芽肿形成，从而缓解疾病。慢性炎性疾病的例子包括但不限于：炎性肠病，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎、银屑病和类风湿性关节炎。
炎性肠病，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎的特征在于胃肠道中各个部位的慢性炎症和血管生成。例如，克罗恩病是主要影响远端回肠和结肠的慢性透壁炎性疾病，但也可能发生在自口至肛门和肛周区域的胃肠道任何部分。克罗恩病的患者通常具有异常疼痛、发热、厌食症、体重丧失和异常肿胀相关的慢性腹泻。溃疡性结肠炎也是在结肠粘膜中发生的慢性、非特异性、炎性和溃疡性疾病，其特征在于有血性腹泻存在。这些炎性肠病通常由遍布胃肠道的慢性肉芽肿炎症导致，包括炎性细胞圆柱体所围绕的新毛细管抽芽。利用本发明药物制剂抑制血管生成应能抑制抽芽形成并防止肉芽肿形成。炎性肠病还有肠外表现，例如皮肤病损。这种病损的特征在于炎症和血管生成，可发生在胃肠道以外的许多部位。利用本发明药物制剂抑制血管生成应能降低炎性细胞的内流并防止病损形成。
结节病是另一种慢性炎性疾病，其特征在于是多系统肉芽肿疾病。该疾病的肉芽肿可以在身体的任何部位形成，因此，症状依赖于肉芽肿的部位和该疾病是否活跃。血管生成性毛细管抽芽产生肉芽肿，从而持续供应炎性细胞。利用本发明药物制剂抑制血管生成，可抑制这种肉芽肿形成。银屑病也是慢性和复发性炎性疾病，其特征在于各种大小的丘疹和斑块。利用本发明药物制剂治疗应能防止维持特征性病损所需的新血管形成并减轻患者的症状。
类风湿性关节炎(RA)也是慢性炎性疾病，其特征在于外周关节的非特异性炎症。据信，关节的滑液衬里中的血管经历血管生成。除了形成新的血管网络，内皮细胞还释放导致血管翳生长和软骨破坏的因子和活性氧中间体。参与血管生成的因子可积极促进并帮助维持类风湿性关节炎的慢性发炎状态。单用本发明药物制剂或与其它抗-RA药剂联用来治疗可防止维持慢性炎症所需的新血管形成并减轻RA患者的症状。
8.疾病诊断
本发明还提供利用识别不同形式的LOX或LOXL的试剂来诊断、监测、分期或检测上述疾病的方法。例如，为此目的可利用针对不同形式的LOX或LOXL(分泌、成熟形式的前蛋白原)的上述抗体。
如上所述，成熟LOX或LOXL被切割，可根据其分子量的改变(免疫印迹)或利用检测未切割与切割形式的LOX/LOXL的抗体以及采用各种检测方法，例如免疫组化方法(IHC)进行细胞定位来检测。
据信，胞外基质和条件化培养基(例如，参见实施例4)应含有经蛋白酶解加工的LOX或LOXL，而未切割的LOX/LOXL应定位于胞内。由于从胞外空间摄取，在胞内也可检测到一些切割的LOX/LOXL。
可以收集个体的样品，并通过测定无活性或活性LOX水平或不同形式LOX/LOXL水平进行分析。可先进行该项分析，再开始利用赖氨酰氧化酶-特异性疗剂的治疗以鉴定活性LOX/LOXL表达或活性升高的肿瘤。可利用任何样品进行这种诊断分析，所述样品包括但不限于：细胞、细胞的蛋白质或膜提取物，诸如痰、血液、血清、血浆或尿液等生物学液体，或诸如组织样品、福尔马林-固定或冷冻的组织切片等生物学样品。
可采用任何合适的方法来检测和分析无活性和/或活性LOX/LOXL。本文所用的术语“样品”指人、动物的样品，或指研究样品，例如，细胞、组织、器官、液体、气体、气溶胶、浆液、胶体或凝结物质。可在体内测试样品，例如无需从人或动物中取出，或者可在体外测试。可在加工后，例如通过组织学方法测试样品。术语“样品”还指新鲜取自人或动物的细胞、组织、器官或液体，或指经加工或保存的细胞、组织、器官或液体。
一个实施方式提供诊断对象的癌症转移的方法，包括：评估血液中活性LOX或LOXL水平或活性，与参比样品相比，血液中活性LOX或LOXL水平或活性改变表明有转移性肿瘤生长存在。在一些情况中，血液中活性LOX或LOXL水平或活性可以低于较早检测的，表明该对象的癌症转移风险较高；癌症已转移；或者癌症转移增加。
另一实施方式提供诊断具有肿瘤的对象中癌症转移的方法，包括评估肿瘤中活性LOX或LOXL水平或活性，与参比样品相比，该肿瘤中活性LOX或LOXL水平或活性改变表明有转移性肿瘤生长存在。在一些情况中，肿瘤中活性LOX或LOXL水平或活性可以高于较早检测的，表明该对象的癌症转移风险较高；癌症已转移；或者癌症转移增加。
参比样品可源自同一对象，在不同时间取自同一肿瘤或者取自身体的其它部位，或取自另一个体。
检测活性LOX/LOXL水平可采取免疫测定的形式，其用针对该蛋白的抗体检测活性LOX或LOXL蛋白是否存在，例如，特异性结合活性或分泌LOX或LOXL的抗体。
免疫测定还可与激光诱导的荧光联用(参见，例如各自通过引用纳入本文的Schmalzing和Nashabeh，Electrophoresis 18：2184-93(1997)；和Bao，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.699：463-80(1997))。还可按照本发明的方法，利用脂质体免疫测定，例如流动-注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器来测定活性LOX或LOXL2水平(Rongen等，J.Immunol.Methods 204：105-133(1997))。免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)特别适用于本发明方法。还可采用放射性免疫测定来检测样品对活性LOX或LOXL是否呈阳性或检测活性LOX或LOXL的水平。可采用的放射性免疫测定利用，例如碘-125标记的第二抗体。
此外，可检测活性LOX或LOXL的活性，因而可忽略无活性酶的含量。可利用含标记赖氨酸的可溶性弹性蛋白或可溶性胶原作为底物，采用多种方法检测活性LOX或LOXL的酶活性。活性试验的细节见Royce等，“Coppermetabolism in mottled mouse mutants.The effect of copper therapy on lysyloxidase activity in brindled(Mobr)mice(杂色小鼠突变体的铜代谢.铜治疗对有斑纹(Mobr)小鼠中赖氨酰氧化酶活性的作用)”Biochem J.1982年2月15日；202(2)：369-371。可采用生色试验。其中一种描述于Palamakumbura等，“A fluorometric assay for detection of lysyl oxidase enzyme activity inbiological samples(检测生物学样品中赖氨酰氧化酶活性的荧光试验)”AnalBiochem.2002年1月15日；300(2)：245-51。
本文还提供监测对象对治疗的反应的方法，包括LOX/LOXL的调节剂，例如癌症、肿瘤和纤维变性疾病的治疗。该方法包括：给予对象LOX或LOXL调节剂后检测该对象中C-反应活性蛋白或其它急性期反应物水平的改变，其中有改变表明该LOX或LOXL调节剂对该患者有疗效。C-反应活性蛋白是全身性炎症的重要药效学标记。此外，认为C-反应活性蛋白提高了LOX表达(Li等，Circulation Research；(2004)95：877)。因此，不想受理论的束缚，与给予LOX或LOXL抑制剂之前相比，C-反应活性蛋白(例如，在对象的血液样品中)的水平降低表明该对象对利用LOX或LOXL抑制剂进行治疗有反应。方法包括监测C-反应活性蛋白的水平是升高还是降低，从而表明对象对该治疗的反应。
另一实施方式还提供监测对象对治疗的反应的方法，包括LOX/LOXL的调节剂，例如癌症、肿瘤和纤维变性疾病的治疗。该方法包括：给予对象LOX或LOXL调节剂后检测该对象中胶原端肽水平或羟脯氨酸含量的改变，其中有改变表明该LOX或LOXL调节剂对该患者有疗效。所述改变可以是升高或降低。例如，胶原端肽或羟脯氨酸含量降低可以表明有疗效。
虽然描述和示出了本发明的示范性实施方式，但普通技术人员可以作出本文所述发明的许多改进、改变和替代方式，它们无一脱离本发明的构思。因此，所有这些改变、改进和替代方式应视作属于本发明的范围。提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。
实施例
实施例1：EMT/MET试验
为检测细胞是否处于EMT或MET状态，用上皮或间充质状态的细胞蛋白标记，例如E-钙粘蛋白、波形蛋白、纤连蛋白和鬼笔毒环肽的特异性抗体染色细胞来检测F-肌动蛋白(图4)。
罗丹明鬼笔毒环肽染色方案
染色之日前24小时接种细胞；24小时后细胞在8-室载玻片中生长至约80％汇合。随后一天，吸出培养基，用1X PBS清洗小室。然后在室温下，用4％低聚甲醛(PFA)固定细胞20分钟，再用1X PBS清洗一次。室温下，用PBS配制的0.5％皂苷(新泽西州菲利浦斯勃格市JTB公司(JTBaker，Phillipsburg，NJ))处理细胞5分钟进行透化处理。用1X PBS小心清洗小室一次，向细胞中加入PBS配制的罗丹明鬼笔毒环肽的1∶100稀释液(加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，Ca))，室温下培育15分钟。用1X PBS清洗小室两次，给载玻片装上Vectashield(加利福尼亚州伯林格姆市的载体实验室(Vector Laboratories，Burlingame，CA))。
E-钙粘蛋白染色方案
染色之日前24小时接种细胞；随后一天细胞在8-室载玻片中生长至约80％汇合。随后一天，吸出培养基，用1X PBS清洗小室。然后用冰冷却的甲醇固定细胞，然后在-20℃培育2分钟。细胞用1X PBS清洗一次，向载玻片小室中加入1微克/毫升新泽西州吉布斯城盖尔生物化学公司(Calbiochem，Gibbstown，NJ)的E-钙粘蛋白抗体。载玻片在37℃再培育1小时。用1X PBS小心清洗小室后，加入第二抗体(抗-小鼠IgG cy3偶连的，宾夕法尼州西格罗夫市杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno Research，West Grove，Pa))，室温下培育30-45分钟。用1X PBS清洗小室两次，装上Vectashield(加利福尼亚州伯林格姆市的载体实验室)。
实施例2：在内源性表达显著水平LOX/LOXL的细胞中降低EMT/促进 MET的LOX/LOXL抑制剂的试验
BT-549、Hs5788t、MDA-MB-231或NCI-H226细胞表达显著水平的LOX/LOXL并处于EMT或EMT样状态。将细胞以约25-50％汇合接种于纽约州罗彻斯特市N&N国际公司(Nalgene Nunc International.Rochester，NewYork)的8-孔室玻璃载玻片上。细胞在含氧量低(2％氧)、缺氧(0.02％氧)或含氧量正常(21％氧)的条件下培育18小时。
将LOX/LOXL抑制剂(例如，抗-LOX/LOXL抗体、LOX/LOXL siRNA、LOX/LOXL shRNA、小分子抑制剂，例如βAPN或D-青霉胺(D-penacillamine))和对照(例如，LOX/LOXL有义寡核苷酸、无关对照抗体、小分子载体，例如DMSO)加入细胞培养液。通过RT-PCR和免疫印迹分析测定LOX/LOXL水平。
48-72小时后，按照实施例1染色细胞。用LOX/LOXL有义寡核苷酸转染的细胞应维持EMT特征性的阳性波形蛋白或纤连蛋白染色以及E-钙粘蛋白染色水平低，而F-肌动蛋白的鬼笔毒环肽染色显示延长和重塑的肌动蛋白细胞骨架。用未有效靶向LOX/LOXL从而不能实现EMT细胞的MET诱导的候选LOX/LOXL抑制剂处理的细胞也应维持这些EMT特征。
用LOX/LOXL抑制剂处理的细胞应减少EMT特征并表现出E-钙粘蛋白染色增强和波形蛋白或纤连蛋白染色降低或可忽略的MET特征。这些细胞的罗丹明-鬼笔毒环肽染色应显示更紧实和规则的肌动蛋白细胞骨架。
还采用侵入/迁移试验来评估细胞的EMT和MET表型，因为侵入和迁移能力增加与EMT有关(参见，例如Bedogni等，Cancer Res.64：2552-2560(2004))。使细胞血清消除24小时，然后将104-106个细胞一式三份接种在包被和未包被的插片上(例如，BD生物科学公司(BD Biosciences)的MatrigelTM包被插片)，在含氧正常或氧气消除的条件下培育24小时(例如，在含氧正常/低氧条件下LOX/LOXL表达不同，如图33所示)。在整个实验期间继续用LOX/LOXL抑制剂和对照处理。
维持EMT状态的细胞应是侵袭性和迁移性的，与MET细胞相比，更能侵入通过MatrigelTM包被的插片或通过其它表面修饰的插片迁移。采用伤口愈合或刮擦试验进行类似分析，其中利用移液管尖在细胞的汇合菌苔中作出擦痕。利用显微镜在24-96小时期间监测该擦痕。侵袭性和迁移性更强的EMT状态细胞应比侵袭性或迁移性更弱的细胞更快填充该擦痕。
选择减弱EMT或促进MET的那些LOX/LOXL抑制剂作为进一步开发的候选对象。
如图26A和B所述，筛选抑制细胞侵袭和迁移的mAb。纯化和浓缩筛选的最终Pep2上清液(MO63-MO82，各为50ng和200ng)。使MDA MB 231细胞血清消除24小时，并以20,000个细胞/孔接种入无血清培养基中。用50ng和200ng抗体血清一式三份处理细胞，并培育48小时。用钙黄绿素AM染色侵袭性细胞，用96孔荧光读数计检测荧光(485nm激发，520发射)。
实施例3：用LOX/LOXL转染的细胞检验降低EMT/促进MET的 LOX/LOXL抑制剂的试验
MDCK、MCF-7或SW620细胞不表达显著水平的LOX/LOXL并处于EMT状态。用表达LOX/LOXL的质粒转染细胞以在细胞中诱导EMT(参见，例如图6)。将转染的细胞在含氧量正常(21％氧)、含氧量低(2％氧)或缺氧(0.02％氧)的条件下培育18小时。通过RT-PCR和免疫印迹分析测定LOX/LOXL表达水平。
用LOX/LOXL抑制剂和对照处理转染的细胞，如实施例2所述测定MET/EMT状态。通过RT-PCR和免疫印迹分析测定LOX/LOXL的表达水平。
有效的LOX/LOXL抑制剂应阻止转染细胞的EMT状态，或诱导其MET(图7)。用LOX/LOXL有义寡核苷酸处理的转染细胞应处于EMT状态，与未经处理，或用对照，例如无关对照抗体处理的转染细胞一样。如实施例1所述分析处理的转染细胞的EMT/MET状态。还如实施例2所述采用侵入和/或迁移试验分析细胞。
选择减弱EMT和促进MET的那些LOX/LOXL抑制剂作为进一步开发的候选对象。
实施例4：用条件化培养基(CM)处理的细胞检验降低EMT/促进MET的 LOX/LOXL抑制剂的试验
从CHO细胞制备CM：
将CHO-Loxl2细胞接种入含25ml培养基(MEM+10％FBS，完全的)的T175烧瓶。48小时后，将培养基替换为20ml SFMII培养基(此时细胞90-95％汇合)。72小时后收集培养液并经22uM聚乙烯滤膜过滤。利用阿米康(amicon)(15kD截断值)浓缩器将过滤的培养液浓缩20-25倍。制备9-10烧瓶的20ml培养液以制得8ml浓缩的条件化培养基以供实验。
用CM处理细胞：
先将MCF-7细胞以每孔50,000个细胞接种于8-室载玻片，1天后用CM处理。用完全培养基(MEM+10％FBS，1X L-谷氨酰胺)接种细胞。将500μlCho-Loxl2细胞的新鲜条件化培养基加入含有MCF7细胞的小室。细胞与CM培育48小时。MCF7野生型细胞的条件化培养基用作负对照。与CM培育48小时后，用罗丹明鬼笔毒环肽染色细胞(图8)。
实施例5：利用条件化培养基(CM)处理细胞的抗-LOXL2mAb阻断试验
将MDA-MB-231(图9、10、12)或Hs578t细胞(图11)以80％汇合接种在T75烧瓶中，在DMEM、10％FBS和1X L-谷氨酰胺中培养。这些细胞生长72小时以获取实验所用的CM。72小时后，简单离心CM以除去死细胞和碎片，将CM置于已经以每孔50,000个细胞接种在8-室载玻片中的MCF-7细胞(图10、11)或SW620细胞(图12)上。通常在与条件化培养基培育48小时后观察到EMT-样表型改变。MCF-7或SW620CM用作负对照。进行了两个不同的实验以证明抗-loxl mAb抑制与上皮-间充质过渡(EMT)相伴发生的表型改变的阻断能力。
实验1：“预-培育”：
先将MDA-MB-231或Hs578t细胞的1ml CM(离心以除去细胞碎片)与2μg或4μg(终浓度)抗-loxl2预培育1.5小时，再加入MCF7或SW620细胞。抗-肌动蛋白用作负mAb对照(图10E)。然后将条件化培养基加入MCF7或SW620细胞，在37℃，5％CO2下培育48小时。用罗丹明鬼笔毒环肽染色MCF7或SW620细胞的肌动蛋白细胞骨架以分析EMT表型改变的阻断情况(图9)。
实验2：“未-预培育”：
将MDA-MB-231或Hs578t细胞以80％汇合接种在T25烧瓶中，在DMEM、10％FBS和1X L-谷氨酰胺中培养。将抗-Loxl2mAb(4μg终浓度)分别加入各烧瓶，用培养基培育烧瓶72小时。抗-肌动蛋白用作负mAb对照(图10E)。离心条件化培养基以除去任何细胞碎片，然后加入MCF7或SW620细胞，在37℃，5％CO2下培育48小时。用罗丹明鬼笔毒环肽染色MCF7或SW620细胞的肌动蛋白细胞骨架以分析EMT表型改变的阻断情况(图11、12)。
实施例6：用转染细胞的CM处理的细胞的抗-LOXL2mAb阻断试验
产生Hloxl-2MCD稳定细胞系
将pSecTag2hygro-hLOXL2MCD(最小催化结构域，氨基酸TAPDLVLNAE...至读框末+Myc+His标签)转染入Hek293细胞，在潮霉素B选择压力下选择各克隆。利用抗-His抗体，通过蛋白质印迹测定表达(参见图22)。
产生条件化培养基以供在SW620细胞中进行EMT研究
利用均在30ml cDMEM(DMEM+L-谷氨酰胺+10％FBS，无青霉素/链霉素)中的12E6细胞或6E6细胞将hLOXL2MCD Hek293稳定细胞系7号接种入T175烧瓶。细胞生长72小时，然后收集条件化培养基以便用于下述SW620/EMT实验中。作为对照，以相同的密度接种Hek293细胞并作相同处理。
稳定Loxl2-MCD的条件化培养基和MET的诱导：
将SW620细胞以每孔50,000个细胞接种在含有DMEM、10％FBS和1x L-谷氨酰胺的8-室孔载玻片中。从表达人Loxl2-MCD的细胞收集条件化培养基以便用于上述SW620/EMT试验。在各室中，将500μl条件化培养基加入各孔。293细胞的条件化培养基用作负对照。通常在72-79小时后观察到EMT-样表型改变(图13)。
72-96小时后，表达人Loxl2-SRCR结构域1-2和3-4的稳定克隆的CM不诱导EMT-样表型改变。
实施例7：LOX/LOXL抑制剂与化疗剂的试验
利用实施例2、3或4鉴定的降低EMT/促进MET的LOX/LOXL抑制剂处理BT-549、Hs5788t、MBA-MD231或NCI-H226肿瘤细胞系，或者诸如MCF-7或SW620等经转染以表达LOX/LOXL或用表达LOX/LOXL的细胞的CM处理的细胞系。
在用LOX/LOXL抑制剂处理的同时或之后将化疗剂，例如烷化剂(例如，顺铂、卡铂)、抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、吉西他滨)、蒽环类抗生素(例如，多柔比星)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊苷)、有丝分裂抑制剂(例如，紫杉醇)、EGFR抑制剂(例如，埃洛替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib))、或其它药剂，例如多奇他赛(doclitaxel)、蒽环类抗生素、5-氟尿嘧啶加入细胞。
采用细胞活力和凋亡试验比较用LOX/LOXL抑制剂和化疗剂处理的细胞与单用化疗剂处理的细胞。利用普罗麦格公司(Promega)的CellTiter-GloTM检测细胞活力，利用普罗麦格公司的Apo-ONETM检测凋亡，方案如生产商手册所述。
一式三份绘制各组实验条件的剂量反应曲线(化疗剂量、LOX/LOXL抑制剂剂量、剂量数的范围、治疗时间)。还利用侵袭和迁移实验进行分析以测定是否在LOX/LOXL抑制剂和化疗药物之间观察到降低细胞侵袭和迁移的协同作用。
与单用化疗剂处理的细胞相比，与化疗剂协同作用的LOX/LOXL抑制剂应降低细胞活力、增加凋亡细胞数量和/或降低侵袭或迁移能力。选择与化疗剂协同作用的那些LOX/LOXL抑制剂作为进一步开发的候选对象。
实施例8：LOX/LOXL抑制的药物敏感性试验
以每孔7,500个细胞接种96孔板，24小时后，将培养基替换为含有各种浓度的顺铂(新泽西州吉布斯城盖尔生物化学公司)、埃洛替尼(马萨诸塞州沃本市LC实验室(LC Laboratories，Woburn，MA))、紫杉醇(俄亥俄州梭仑市MP生物医药公司(MP Biomedicals，Solon，OH))、氨甲蝶呤(新泽西州吉布斯城盖尔生物化学公司)、β-氨基丙腈(密苏里州圣路易斯市西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))或250纳克/孔抗体的培养基。连续接触5天后，清洗培养液，按照生产商的使用说明书利用加利福尼亚州圣路易斯-奥比斯波市普罗麦格公司(Promega，San Luis Obispo，CA)的CellTiter-GloTM测定活细胞数。每种细胞系具有各药物浓度的三份样品(图36、37、38)。
对于siRNA药物敏感性研究，按照生产商(科罗拉多州拉斐特市热力科学公司(Thermo Scientific，Lafayette，CO))的使用说明书，利用Dharmafect转染试剂，用20uM LOX、LOXL2，或非靶向Stealth SelectTMRNAi验证的寡聚物瞬时转染细胞，24小时后接触药物。采用定量PCR验证药物接触后的降低水平。利用MISSION
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shRNA慢病毒系统(圣路易斯市西格玛-阿尔德里奇公司)产生稳定的shRNA细胞系。采用定量PCR验证LOX或LOXL2的降低(图35)。
实施例9：LOX和LOXL2的抗体
用表1所列肽免疫小鼠产生识别LOX和LOXL2蛋白的抗体。SEQ ID 1和8用于产生抗体。筛选产生的抗体以测定抗体是否特异性识别未切割的非活性形式LOX，成熟的活性形式，或同时识别未切割和切割形式。
SEQ ID 2-6所示肽基于成熟的LOX或LOXL2酶。选自表1的肽用于免疫小鼠。给BALB/c小鼠注射160mg纯化的肽。对于初次注射，将肽与完全弗氏佐剂混合(1∶1)，皮下注射。随后在没有佐剂存在下进行腹膜内注射。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定LOX或LOXL2的血清抗体，其中全长或活性LOX或LOXL2蛋白结合于聚苯乙烯平板。在至少2个月期间进行至少2次免疫后，取出针对LOX或LOXL2的抗体滴度高的一只小鼠的脾脏，与P3U1小鼠浆细胞瘤细胞系的细胞融合。在ELISA试验中利用全长以及活性形式筛选得到的克隆结合LOX或LOXL2或二者的能力。
通过ELISA测定抗体对LOX或LOXL2的单独或交叉反应的特异性。分离和亚克隆与LOX或LOXL2有反应活性的杂交瘤产生的抗体。该杂交瘤生长在组织培养基以及腹水中以用作LOX或LOXL2抗体的来源。
为产生LOX或LOXL2的人单克隆抗体，如EP 0239400(Winter等)所述，通过将其互补决定区(CDR)取代成人单克隆抗体或单克隆抗体片段来改变上述小鼠单克隆抗体。用鼠可变区的其它CDR取代人重链和轻链Ig可变区的CDR。随后可将这些改变的Ig可变区与人Ig恒定区组合以产生除取代的鼠CDR外，其组成在总体上是人的抗体。与嵌合抗体相比，预计这种CDR-取代的抗体不大可能在人中引发免疫应答，因为CDR-取代的抗体含有大量更少非人的组分。通过CDR“嫁接”人源化单克隆抗体的过程称为“整形”(Riechmann等，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))。
通过遗传工程改造移植鼠LOX或LOXL2抗体CDR(例如，鼠单克隆抗体的CDR，如Burbelo等，Coll.Relat.Res.6：153-162(1986)所述)，藉此通过克隆鼠重链和轻链可变区(V)基因区段测定CDR DNA序列，然后通过定点诱变将其转染至相应的人V区。在该过程的最后阶段，加入所需同种型(通常对于CH是γI，对于CL是κ)的人恒定区基因区段，人源化重链和轻链基因在哺乳动物细胞中共表达以产生可溶性人源化抗体。
将这些CDR转移至人抗体赋予该抗体原始鼠抗体的抗原结合特性。在结构上，V区“框架”区上装了6个鼠抗体的CDR。CDR-嫁接成功的原因在于小鼠和人抗体之间的框架区具有极其相似的3-D结构，CDR的连接点类似，因此可交换CDR。可如Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Queen等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：10029(1989)；和Orlandi等，Proc.Natl.Acad.ScL USA 86：3833(1989)所示范的制备这种人源化抗体同源物。
然而，据信框架区内的某些氨基酸与CDR相互作用并影响总的抗原结合亲和力。直接转移鼠抗体的CDR来产生人源化抗体而对人V区框架不作任何修饰常导致结合亲和力部分或完全丧失。因此，优选改变接受抗体框架区中的残基以获得结合活性。
Queen等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)和WO90/07861(蛋白质设计实验室公司(Protein Design Labs Inc.))描述了通过组合鼠mAb(抗-Tac)与人免疫球蛋白框架区和恒定区来制备在接受抗体的框架区中含有修饰残基的人源化抗体。他们描述了直接CDR转移而对人V区框架残基不作任何修饰常导致的结合亲和力丧失问题的一种解决方法；他们的解决方法涉及两个关键步骤。第一，通过计算机分析原始鼠抗体的V框架区的最佳蛋白质序列同源性来选择人V框架区，在该情况中，是抗-TacmAb。在第二步骤中，通过计算机对鼠V区域的三级结构建模来目测观察可能与鼠CDR相互作用的框架氨基酸残基，然后将这些鼠氨基酸残基加在同源性人框架上。对于白介素2受体的特异性抗体(Queen等，1989[同上])和单纯疱疹病毒(HSV)的特异性抗体(Co.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：2869-2873，(1991))，他们的方法利用含有假定的鼠接触残基的同源性人框架，从而导致人源化抗体具有与原始鼠抗体相似的结合亲和力。
该人源化方法的其它细节见授予Winter等的U.S.5,225,539；授予Boss等的U.S.4,816,397和授予Cabilly等的U.S.4,816,567及U.S.6,331,415，这些专利均是本领域技术人员已知的并出于描述示范性制备方法的目的通过引用专门纳入本文。
如上所述，用具有LOX和LOXL2之间，例如SEQ ID 4和5之间，和SEQID 6和7之间的非保守性氨基酸的随机化氨基酸的肽免疫小鼠制备识别LOX和LOXL2的抗体。产生的抗体应对LOX和LOXL2具有交叉选择性。
选择对LOX或LOXL2有特异性，或对LOX和LOXL2有交叉反应性的那些LOX/LOXL2抗体作为进一步开发的候选对象。
表1.LOX/LOXL2免疫原肽
  SEQID.   基因   序列 选择性
  1   LOX   SRVDGMVGDDPYNPYK 胶原酶IV位点
  2   LOX   DTYERPRPGGRYRPG 成熟的肽
  3   LOXL2   RRLLRFSSQII{NNGQSDFRPKNGR 酶结构域
  4   LOX   EDTSCDYGYHRRFA 酶结构域，与SEQ ID 5交叉反应
  5   LOXL2   EDTECEGDIQKNYE 酶结构域，与SEQ ID 4交叉反应
  6   LOX   DPYYIQASTYVQKMSMYNLRC 酶结构域，与SEQ ID 7交叉反应
  SEQID.   基因   序列 选择性
  7   LOXL2   nAEMVQQTTYLEDRPMFMLQC 酶结构域，与SEQ ID 6交叉反应
  8   LOX   GSQYGPGRRRDPGA 前肽
实施例10：产生与LOX和LOXL成员交叉反应的抗体
用衍生自LOX/LOXL蛋白的高度保守性C-末端区域的肽免疫小鼠产生与LOX和LOXL成员交叉反应的抗体，该区域还包括催化结构域。针对该区域产生的抗体识别活性形式的LOX/LOXL。
获得用于产生抗体的肽的结构域是催化结构域、铜结合结构域、赖氨酰-酪氨酰醌辅因子结构域和细胞因子受体样结构域。铜结合结构域和催化结构域的序列见表2，如实施例9所述，这些序列用于免疫的小鼠。类似地，通过ELISA测定所产生抗体针对全长和加工形式的LOX、LOXL、LOXL2、LOXL3和LOXL4的特异性。
含有LOX、LOXL、LOXL2、LOXL3和LOXL4之间非保守氨基酸的随机氨基酸的肽也用于免疫小鼠，从而产生对各种形式的LOX/LOXL蛋白，例如LOX和LOXL，或对所有5种LOX家族成员具有交叉反应性的抗体。免疫小鼠和产生小鼠及人抗体见实施例9。
选择对LOX和各种LOXL成员具有交叉反应性的LOX/LOXL抗体作为进一步开发的候选对象。
表2：LOX/LOXL免疫原肽
  SEQ ID.   基因   序列   结构域
  9   LOX   WEWHSCHQHYH   Cu结合
  10   LOXL   WEWHSCHQHYH   Cu结合
  11   LOXL2   WIWHDCHRHYH   Cu结合
  12   LOXL3   WVWHECHGHYH   Cu结合
  13   LOXL4   WVWHQCHRHYH   Cu客户
  14   LOX   DIDCQWIDITDVKPGNY   催化结构域
  15   LOXL   DIDCQWIDITDVQPGNY   催化结构域
  16   LOXL2   DIDCQWVDITDVPPGDY   催化结构域
  17   LOXL3   DIDCQWIDITDVKPGNY   催化结构域
  18   LOXL4   DIDCQWVDITDVGPGNY   催化结构域
实施例11：产生识别活性LOX/LOXL并降低EMT/促进MET的抗体
EMT细胞分泌活性LOX/LOXL。利用实施例9和10产生的抗体处理实施例2、3或4的EMT细胞。然后如实施例1所述测定细胞的EMT或MET特征。识别活性LOX/LOXL2的抗体应降低细胞的EMT和促进细胞的MET。
选择降低细胞的EMT并促进细胞的MET的那些LOX/LOXL抗体作为进一步开发的候选对象。
实施例12：通过抗体抑制LOX/LOXL活性
将实施例9或10产生的抗体用于Fogelgren等，J.Biol.Chem.280：24690-24697(2005)所述的LOX/LOXL活性试验。简言之，LOX/LOXL活性试验反应混合物由50mM硼酸钠(pH 8.2)、1.2M脲、40uM Amplex红、0.1单位/ml辣根过氧化物酶和10mM 1，5-二氨基戊烷(diamineopentane)(尸胺)底物构成。或者，在生理缓冲液，例如pH 7.5的磷酸缓冲液中进行Amplex红试验。在有或没有500uM BAPN或实施例9或10的抗体存在下将蛋白质，LOX/LOXL加入反应混合物并培育。在560nm下激发荧光产物，在590nm对发射波长读数(例如，BMG实验室技术公司(BMG Labtechnologies Inc.)PO公司(Polarstar Optima))。LOX/LOXL在有BAPN存在下用作负对照，而在没有BAPN存在下用作正对照。根据荧光量检测活性。
选择抑制LOX/LOXL活性的那些LOX/LOXL抗体作为进一步开发的候选对象。
实施例13：通过LOX/LOXL抗体抑制LOX/LOXL结合其它细胞或胞外 基质组分
将实施例9或10产生的抗体用于ECM结合试验。如Fogelgren等，J.Biol.Chem.280：24690-24697(2005)所述进行固相结合试验。4℃，用弹性蛋白原、I型胶原、可溶性血浆纤连蛋白(pFN)、不可溶细胞纤连蛋白(cFN)、层粘连蛋白或BSA包被康宁公司(Corning)的高蛋白结合EIA/RIA微量滴定板的各孔过夜。各孔经封闭、洗涤，然后在有或没有LOX/LOXL抗体存在下与标记的LOX/LOXL(例如，GST-LOX/LOXL)培育过夜。再次洗涤各孔，依次用针对LOX/LOXL的标签的一抗(例如，抗-GST)和过氧化物酶标记的二抗检测LOX/LOXL结合量。然后用皮尔斯公司(Pierce)的荧光过氧化物酶底物试剂盒定量测定过氧化物酶活性。一式三份测定样品，用统计学软件计算解离常数(例如，图垫公司(Graphpad，Inc.)的Prism3)。
还进行结合试验，其中利用LOX/LOXL包被微量滴定板各孔。在弹性蛋白原、I型胶原、pFN、cFN或BSA之前或同时，将实施例9或10的抗体加入各孔。如上所述检测结合，其中ECM蛋白用其各自的抗体，或者针对标签的抗体(如果利用作标签形式的ECM蛋白)检测，从而检测ECM的结合量。
还采用上述试验进行LOX/LOXL与其它蛋白质，例如细胞受体(例如，摄取受体整联蛋白β1)、BTK(伯顿无丙种球蛋白血症酪氨酸激酶)或其它整联蛋白的结合，其中利用细胞受体(例如，摄取受体整联蛋白β1)、BTK(伯顿无丙种球蛋白血症酪氨酸激酶)或其它整联蛋白替代ECM蛋白。
选择抑制LOX/LOXL结合ECM蛋白、细胞受体和整联蛋白的那些LOX/LOXL抗体作为进一步开发的候选对象。
实施例14：抑制LOX活性
LOX比活性在NIH3T3细胞的细胞表面上很明显。基于Amplex超级红与1，5-二氨基戊烷底物，采用辣根过氧化物酶-偶连的荧光试验方法定量测定活性。不可逆的小分子抑制剂，BAPN，用LOX肽产生的单克隆抗体和特异性靶向LOX mRNA的siRNA寡核苷酸抑制LOX活性(图15)。
用100nM LOX siRNA(英杰斯蒂尔斯公司(Invitrogen Stealth)，HSS106117，AUAACAGCCAGGACUCAAUCCCUGU)或非靶向对照转染NIH3T3细胞。将25ul Dharmafect
Figure GPA00001084310300731
3号(达玛康公司(Dharmacon))与1mlOPTIMEM I
Figure GPA00001084310300732
(英杰公司(Invitrogen))，室温下静置5分钟。然后加入50ul 20uM siRNA，混合，室温下培育该转染混合物15分钟。然后将1ml转染混合物加入含1x106个细胞，生长培养基配制的胰蛋白酶处理细胞悬液中，将得到的混合物涂布在10cm2培养皿中。转染6天后，胰蛋白酶处理细胞，以50,000个细胞/孔再次涂布在96孔板中。转染7天后，用2x PBS洗涤细胞并与100ul以下反应混合物培育：PBS配制的100uM Amplex超级红
Figure GPA00001084310300733
(英杰公司)、20mM二氨基戊烷(弗鲁卡公司(Fluka))和4u/ml辣根过氧化物酶(西格玛公司(Sigma))。恰在加入二氨基戊烷和HRP之前，将BAPN和LOX mAb分别加入至1mM和15ug/ml终浓度。37℃，用分子装置公司的M5平板读数计(Molecular Devices M5plate reader)读数平板。以动力学方式设置平板读数计来读取荧光(激发＝544nm，发射＝590nm)约2.5小时。
实施例15：抑制LOXL2活性
所有平板购自康宁公司。二抗和微微底物购自皮尔斯公司。Amplex红试剂购自英杰公司。辣根过氧化物酶(HRP)、1，5-二氨基戊烷、消泡剂购自西格玛公司。所有ProteOn试剂购自生物辐射公司(Bio-Rad)。LOXL2购自研发系统公司(R&D systems)。本项研究所用的抗体由抗体方案公司(AntibodySolution)制备或通过阿拉贡生物科学公司(Aragen Biosciences)的腹水制备。所有其它试剂均是尽可能高的质量。
通过ELISA结合
采用基于ELISA的发光来测定抗体与LOXL2的结合。4℃，用50mM硼酸盐缓冲液(pH 8.0)配制的0.1μg/mL LOXL2或感兴趣抗原包被白色康宁平板过夜。用BioTek平板洗涤器洗涤平板，室温下，用PBST(0.05％吐温-20)配制的5％脱脂奶封闭1小时。用PBST(0.05％吐温-20)洗涤平板，然后立即使用或保存于4℃干燥器内待用。用PBST(0.01％吐温-20)连续稀释待测试的抗体，每孔加入100μL各稀释液。室温下，平板与测试品培育1小时，然后用PBST(0.05％吐温-20)洗涤。用PBST(0.05％吐温-20)配制的5％脱脂奶将检测抗体(抗-小鼠HRP偶联物)稀释16,000倍，每孔施加100μL。平板与检测抗体培育1小时，然后用PBST(0.05％PBST)洗涤。按照生产商的使用说明书，利用皮尔斯公司的超级信号ELISA微微化学发光底物(SuperSignal ELISA pico chemiluminescent substrate)检测信号。利用分子装置公司M5平板读数计检测发光，积分时间为500ms，捕捉所有波长。对数据作背景校正，利用GraFit程序，以朗缪尔等温方程(Langmuir isothermequation)拟合发光信号对抗体浓度的依赖性。如果抗原浓度与解离常数相似，则采用紧密结合的二次方程。报道的解离值从依据这些方程的拟合值获得。
朗缪尔等温方程：
[ PL ] = B max * [ L ] K D * [ L ]
紧密结合方程：
[ PL ] = B max * ( [ P ] T + [ L ] T + K D ) - ( [ P ] T + [ L ] T + K D ) 2 - 4 [ P ] T [ L ] T 2 [ P ] T
通过SPR(表面等离振子共振)的结合
利用25℃恒温的生物辐射公司的ProteOn仪器检测结合亲和力。采用两种方法，利用胺偶连来测定结合亲和力；一种方法中抗体固定，加入抗原(LOX)，而另一种方法中抗原(LOXL2)固定，加入抗体。利用ProteOn固定试剂盒提供的1∶1的NHS与EDC将抗体或抗原固定在GLC芯片上。首先用NHS/EDC混合物活化芯片，然后使乙酸盐缓冲液，pH4.5配制成1μg/mL抗原或抗体流过活化的表面来偶连。这通常产生约500RU的偶连。然后加入1M乙醇胺给活化的芯片表面封端。将偶连的芯片保存在4℃，用50mM氢氧化钠再生。
用抗体或抗原的一系列PBST(0.05％吐温-20)稀释液检测偶连的芯片来测定解离常数。利用未偶连通道作为参比，获得ProteOn上可用的所有6个通道的数据。利用生物辐射公司的ProteOn管理软件分析收集的数据。
筛选试验
首先根据ELISA点测试(ELISA point tests)选择候选抗体。由抗体方案公司对多抗原进行ELISA，选择在感兴趣抗原中显示强烈ELISA信号的抗体在酶试验中作进一步表征。当底物1，5-二氨基戊烷脱氨，而酶再生时，LOXL2产生过氧化氢。
采用将过氧化物的产生(LOXL2释放的)与HRP相偶连的生物化学试验，并检测amplex红向荧光产物的转化来评估抗体抑制酶活性的能力。将抗体杂交瘤上清液(10μL)加到40μL酶混合物(50mM硼酸钠pH 8.0，5单位/毫升HRP，125nM LOXL2，10ppm消泡剂)中，室温下在96孔全区域黑平板(full area black plate)中培育1小时。加入50μL底物溶液(62.5mM硼酸钠，100μM Amplex红试剂，20mM 1，5-二氨基戊烷，10ppm消泡剂)启动酶反应，37℃，用分子装置公司的M5平板读数计读数。以动力学模式设置该平板读数计来读取荧光(激发＝544nm，发射＝590nm)，1小时。数据记录为荧光与时间反应曲线的斜率。将这些斜率与向酶混合物中加入杂交瘤培养基的对照比较。低于对照的斜率认为是抑制剂。
IC50测定
采用上述偶连的酶试验，检测所选抗体对LOXL2的剂量反应。用PBST(0.01％吐温-20)制备抗体的一系列稀释液，将10μL该稀释液加入40μL酶混合物(50mM硼酸钠pH 8.0，5单位/毫升HRP，125nM LOXL2，10ppm消泡剂)，室温下在96孔全区域黑平板中培育1小时。加入50μL底物溶液(62.5mM硼酸钠，100μM Amplex红试剂，20mM 1，5-二氨基戊烷，10ppm消泡剂)启动酶反应，采用上述条件，用M5平板读数计读数。将荧光反应-时间函数的斜率对抗体浓度作图，利用GraFit将数据拟合成4参数拟合。该图的中点是表观IC50，还是50％的总反应得到抑制的浓度(例如，图20)。
抑制方式
采用下述模型检测抗体对LOXL2的抑制方式。在这些实验中，监测抗体浓度升高下，稳态率(steady state rate)对1，5-二氨基戊烷浓度的依赖性。其目的是评估有抗体存在下底物的Km、kcat或二者是否改变。采用下图所示模型，利用Grafit总体分析收集的数据。参数α描述了化合物对底物亲和力的作用。α值等于1描述了其中化合物同等结合游离酶和酶-底物复合物的情况(可能是非竞争性抑制)。该值小于1描述了其中化合物结合酶-底物复合物的相互作用(可能是无竞争性抑制)。该值大于1对应于结合游离酶胜过酶-底物复合物的化合物(可能是竞争性抑制)。β值描述了调节剂对酶速率的作用。抑制剂的该值小于1(对于完全抑制剂，β＝0)，激活剂的该值大于1。KA是化合物的解离常数，Ks是底物的米氏常数，k是酶的催化速率。从上述荧光反应-时间函数的斜率测定稳态率。将数据制作成在几种固定的抗体浓度下，稳态率对底物(1，5-二氨基戊烷)浓度依赖性的图，并用GraFit分析(例如，图21A，利用直接竞争剂，如图21B所示)。
实施例16：通过免疫印迹和免疫组化(IHC)分析检测LOX/LOXL
通过在裂解缓冲液(例如，100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCL、8M脲、0.05％吐温-20，pH 8.0；或EDTA、NP40、Tris、NaCl、PMSF和“完全迷你蛋白酶抑制剂混合物”(罗氏(Roche)，第11836153001号)；或“莱米力(Laemmli)SDS样品缓冲液，4X”(波士顿生物产品公司(Boston BioProducts)，BP-110R号)中裂解细胞进行免疫印迹(蛋白质印迹)分析。将裂解液(通常是15-25微克总蛋白)加载于4-12％Tris-甘氨酸凝胶(加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司)或NuPAGE Novex 4-12％Bis Tris凝胶(英杰公司)上。将大小分级的蛋白质转移到PVDF膜(加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司)或硝酸纤维素膜(英杰公司)上。
4℃，在含2％BSA、5％奶粉的PBS中封闭免疫印迹过夜。与抗-LOX/LOXL一抗(单克隆或多克隆)培育后，根据生产商推荐的条件用二抗培育印迹以便检测，例如抗-兔IgG-HRP(GE保健公司(GE Healthcare)或杰克逊免疫研究实验室(Jackson Immunoresearch Lab))、抗-小鼠IgG-HRP(GE保健公司)、抗-山羊IgG-HRP(杰克逊免疫研究实验室)、或IRDye680-偶连的山羊抗-小鼠IgG、IRDye680-偶连的驴抗-兔IgG(洛克蓝德公司(Rockland Inc.))。显色并检测化学发光信号，采用皮尔斯公司的底物(SuperSignal West Femto Max orPico Max Sensitivity Substrate)或者利用阿姆山姆公司(Amersham)的ECL抗-小鼠IgG HRP，用AI公司(Alpha Innotech)的Chemiglow West检测。直接检测荧光标记的二抗。
除了从组织制备的免疫印迹，商品化购得的含有从正常组织和肿瘤组织分离的大小分级蛋白质的预加载免疫印迹(例如，购自加利福尼亚州PS股份有限公司(ProSci Incorporated，CA))可用于分析LOX/LOXL在正常组织和肿瘤组织中的分子量分布。
利用组织切片和安排在组织微阵列中的组织切片检测正常组织和肿瘤组织中的LOX/LOXL蛋白质表达和细胞定位(例如，购自赛伯第公司，PS公司(Pro Sci)和其它来源)。根据生产商的使用说明书，利用BD公司(BiocareMedical)的背景狙击剂(BACKGROUND sniper)封闭组织样品以免非特异性结合。在各种缓冲液、pH条件和温度下进行抗原回收以确保组织切片中的检测可靠。利用肿瘤细胞系评估LOX/LOXL的抗体(利用小鼠或家兔产生，单克隆或多克隆)的IHC特性。根据生产商的使用说明书，将合适的抗体与组织切片培育(通常在1-10微克/毫升，用稀释缓冲液稀释(加利福尼亚州康科德城的BD公司(Concord，CA)或加利福尼亚州卡平特里亚(Carpinteria，CA)的DAKO公司)。
根据生产商的使用说明书，利用家兔-探针HRP聚合物试剂盒(BD公司的MACH2或MACH3或DAKO公司的EnVision)或小鼠-探针HRP聚合物试剂盒(BD公司的MACH2或MACH3或DAKO公司的EnVision)进行检测。或者，根据生产商的使用说明书，利用辣根过氧化物酶偶连的抗-小鼠、家兔或山羊IgG(GE保健公司或杰克逊免疫研究实验室)或瓦克它汀精英ABC试剂盒(Vectastain Elite ABC kit)(抗-小鼠、家兔或山羊，载体实验室(Vector laboratories))或EnVision试剂盒(抗小鼠和家兔，DAKO公司)进行检测。
实施例17：检测两种形式的LOXL2
切割LOXL2，通过蛋白质印迹根据其分子量的改变检测(图16、17)。通过层析分离两种形式(图18)并检测两种形式的活性(图19)。
实施例18：LOX/LOXL2的内在化和摄取
在含有10％FBS和1X谷氨酰胺的DMEM中培养Hs578t细胞。将细胞接种在新泽西州富兰克林湖BD猛禽公司(BD Falcon，Franklin Lakes，NJ)的8室载玻片中，使之粘着过夜。对于低汇合，以30-40,000个细胞/载玻片接种细胞。24小时后，采用低汇合检测胞质溶胶中的LOX。对于高汇合，以100,000个细胞/载玻片接种细胞。约48-72小时后，采用高汇合检测基质和胶原酶相关的LOX。
随后一天，将1μg/ml(常规生长培养基中的终浓度)抗-LOX M64或抗-Loxl2M20单克隆Ab(mAb)加入各小室。对于连续摄取，在不同时间点将mAb与细胞培育：例如，3小时、8小时、24小时(过夜)。连续摄取适当量后，除去培养基，用1X PBS清洗各小室。室温下，将细胞在4％PFA(低聚甲醛)中固定20分钟。固定后，室温下用1X PBS洗涤细胞5分钟，然后室温下在50mM氯化铵中猝灭10分钟。室温下，用1X PBS再次洗涤细胞5分钟。
室温下，通过加入皂苷缓冲液(含0.5％皂苷/1％BSA的PBS)透化处理细胞20分钟。室温下，将第二检测Ab(Alexa氟488驴-小鼠IgG，加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司)加入缓冲液，培育细胞30-45分钟。然后用3X皂苷缓冲液洗涤细胞。给载玻片装上Vectashield(加利福尼亚州伯林格姆市的载体实验室)。
为检测胶原，先将抗-胶原抗体(1∶50，盖尔生物化学公司的抗-1型胶原家兔多克隆，新泽西州吉布斯城)培育1小时，再用4％PFA固定细胞。胶原的二抗是驴抗-家兔Cy3(宾夕法尼州西格罗夫市杰克逊免疫研究公司)。
Hs578t细胞中Lox和Loxl2的siRNA敲减
将Hs578t细胞培养在10cm组织培养平板的含10％FBS和1X谷氨酰胺的DMEM中。将细胞培养至约75％汇合。细胞达到75％汇合时配制转染反应/混合物。制备两种混合物：在15ml锥形试管中，将60μl 20uM siRNA与1ml最佳物质(最终siRNA浓度为100nM)。在另一15ml锥形试管中，将伊利诺斯州芝加哥热力科技公司(Thermo Scientific，Chicago，Illinois)的30μlDharmafectTM 3转染试剂与1ml OptiMEMTM混合。室温下培育两试管5分钟。5分钟后，将两试管的内含物混合成一份。室温下，小心地上下抽吸混合物并培育20分钟。
用胰蛋白酶处理Hs578t细胞，将之重悬在10ml完全培养基中并加入10cm组织培养平板。对于各siRNA条件，将2ml合并的转染混合物加入10cm平板。轻轻旋振平板，置于37℃和5％CO2的培养箱中过夜。无需改变培养基，培养细胞上数日。对于免疫荧光研究(图23、24、35)，转染进行至少5天以确保足够的敲减和降低的蛋白质水平。
总结
结果证明低细胞汇合时，LOX和LOXL2并未保持分泌在胞外基质中，而能被肿瘤细胞再次摄取(随着抗体内在化)。匹配的siRNA敲减对照支持这种染色模式的特异性(图23、24、25)。该细胞汇合时，在细胞外的胞外基质中更易检测到LOX和LOXL2，重摄取明显很少。匹配的siRNA敲减对照再次支持染色模式。Loxl2mAb处理细胞以替代siRNA敲减得到抗-Lox和抗-Loxl2mAb的内在化和重摄取及其胶原共区域化的相似结果。
实施例19：LOX/LOXL2内在化和摄取的时程
对早已汇合的细胞启动时程(第0天)。所用的细胞系是同时表达LOX和LOXL2的乳腺肿瘤细胞系Hs578t。
IHC方案(小室载玻片上的细胞；依据DAKO公司的En Vision+系统-HRP)：
所有步骤在RT(室温下)进行，一抗浓度是5μg/ml的抗-LOX和15ug/ml抗-LOXL2。用PBS(X 3)洗涤细胞。然后先进行过氧化物酶封闭(5分钟)，再用PBS(x 3)洗涤。随后将细胞与用0.05M Tris-HCl，pH 7.6w/1％BSA稀释的一抗培育(30培育)。分别利用M64和M20，LOX和LOXL2单克隆抗体(参见，例如图26)。然后先用PBS(x 3)洗涤细胞，再用4％PFA固定(10分钟)。随后先用PBS(x 3)洗涤细胞，再加入过氧化物酶标记的聚合物(30分钟)。然后用PBS(x 3)洗涤细胞。随后加入底物-色原(20μL DAB/1mL底物缓冲液)，5-10分钟。然后先用蒸馏水洗涤细胞，再用苏木精复染(有时是任选的)、脱水并用Entellan永久固定。
Picro-Sirius红(Sirius红F3B)染色方案；
胶原组织化学分析采用Siruis Red染色。用4％PFA固定细胞(10分钟)，然而，固定不是关键性的。然后在室温下，用Picro-Sirius红(饱和苦味酸配制的Sirius红0.1％(电子显微镜公司(Electron Microscopy sciences)，目录号26357-02))染色细胞。然后用2份酸化水(5ml乙酸加1L蒸馏水)，再用乙醇分级脱水并固定。
结果
如图27所示，在第0天，LOX和胶原I早已分泌并与基质结合，但LOXL2定位在胞质溶胶中既未分泌也未与基质结合。在第5天，分泌更多的LOX和胶原I，LOXL2分泌/与基质结合。在第9天，LOX、LOXL2、I胶原共同定位在相同区域中。在第1天，检测到LOX染色模式改变，表明分泌和/或与基质结合的LOX较少。然而，LOXL2、胶原I和Sirius红染色仍彼此类似，未检测到染色模式有真实改变。第13天和第15天时，所有蛋白质的染色模式类似于第11天的那些。依据这些结果，LOX和LOXL2分泌的定时分别有一些差异。LOX和LOXL2的分泌看来受调控并与细胞汇合有关。分泌的定时可调节可用的活性、胞外LOX和LOXL2，进而可启动胶原交联。
该实施例连同本文披露的其它实施例证明LOX和LOXL2的分泌受高度调控。细胞密度低时，本文公开的数据表明分泌的LOX和LOXL2被细胞快速重摄取(具体地说，在细胞内检测到LOX和LOXL2抗体，提示它们有效内在化)。细胞密度高时，LOX和LOXL2不再重摄取，但发现与胶原基质结合(胞外)，如特异性LOX和LOXL2抗体定位所测定的。肿瘤细胞和肝纤维化细胞的IHC分析表明LOX和LOXL2的调控相似，其中患病区域中胞内和胞外LOX/LOXL差异分布。
实施例20：LOX和LOXL2组织表达
除非另有表述，所用的去封闭小室(decloaking chamber)和溶液购自加利福尼亚州康科德城的生物保健医学公司(BioCareMedical)。除非另有表述，所有过程在室温下进行。
给去封闭小室注入500ml蒸馏水(diH2O)。给一个载玻片容器注入200ml通用Decloaker抗原回收溶液，给另一个载玻片容器注入200ml Hot清洗液；将马里兰州弗雷德里克市塞伯第公司(Cybrdi，Frederick，Maryland)的组织显微镜(TMA)载玻片置于含去封闭溶液的容器中，然后置于去封闭小室中。对于乳腺TMA，将温度设置在80℃，30分钟。一旦温度达到90℃，从去封闭抗原回收溶液中取出载玻片，置于含热清洗液的容器中。通过每两分钟用1/3diH2O替换1/3的热清洗液来缓慢降低热清洗容器中的温度，直至容器内的温度为室温。然后用diH2O清洗载玻片一次，再用含0.1％吐温-20的PBS清洗一次。
用Peroxidazed-1处理载玻片5分钟，然后用PBS清洗一次，2分钟。然后用SNIPER对载玻片作背景封闭5-10分钟，再用PBS清洗一次，2分钟。用DV绿色通用稀释剂(Da Vinci Green Universal Diluent)稀释一抗(Ab)。利用5μg/ml家兔多克隆抗-Loxl2抗体和3μg/ml单克隆抗-Lox M64。将载玻片与一抗培育2小时，然后用PBS-吐温-20清洗3次，每次清洗2分钟。利用Mach3聚合物试剂盒，通过加入小鼠或家兔探针来检测抗原，20分钟。然后用PBS-吐温-20清洗载玻片一次，然后加入小鼠或家兔聚合物，20分钟。然后用PBS-吐温-20清洗载玻片5次，每次2分钟。将DAB色原加入载玻片，7分钟，用diH2O清洗一次。将DAB闪光物(DAB sparkle)加入载玻片，1分钟，用diH2O清洗一次。然后用苏木精对载玻片作计数器染色30秒-1分钟，用水清洗5分钟，随后用分级乙醇脱水。用宾夕法尼州哈特菲尔德市电子显微镜科学公司的(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，Pa)安泰兰(entellan)固定介质固定载玻片。组织表达见图28和29。
实施例21：肺腺瘤中的LOX和LOXL2表达
对肺腺瘤作LOX和LOXL2的RT-PCR分析。对原发性肿瘤进行分析，但一些与转移或复发有关。数据是肿瘤与匹配的毗邻“正常”组织片的比例，所述组织无需完全正常，肿瘤和正常的各转录物数据描述于图31和32。LOXL2在10个肿瘤的约4-5个中过表达，并倾向于与淋巴结转移或其它复发/转移相关的已知肿瘤有关(表3)。所用的引物和探针列于表4。
表3.肺腺癌病理学特征
Figure GPA00001084310300821
表4：qRT-PCR序列
Figure GPA00001084310300831
实施例22：糖尿病性肾病/肾纤维化的动物模型
过表达诱导型cAMP早期阻遏物的转基因小鼠显示严重的糖尿病并表现出肾小球肥大、肾小球基底膜增厚和硬化病损。这些小鼠可用作糖尿病性肾病的模型。可将本文所述化合物给予该模型系统并分析它们预防、治疗和/或缓解肾脏纤维化的能力。
根据动物实验的已有方案和指导产生转基因小鼠。根据以前鉴定的LOX/LOXL抑制剂的剂量和给药时间点确定治疗组大小、方案和对照。在整个组织学和生物化学分析的实验时间范围的预定时间点监测和/或处死小鼠。
组织学分析包括肾脏切片的显微和免疫组化分析。通过已有的生物化学染色和显微分析鉴定肾小球表面区域和肾小球数量。通过用于肾脏切片的电子显微镜的已有方法测定肾小球基底膜增厚。
还监测血清和尿液变量以便测定肾脏活性/衰竭。通过包括ELISA和HPLC在内的已有方法测定血液葡萄糖和胰岛素水平。还通过已有试验监测血清蛋白质，例如肌酸酐和白蛋白。检验尿液样品的蛋白质水平，包括白蛋白和肌酸酐。采用包括ELISA和HPLC在内的已有试验检测尿液中的蛋白质。
采用上述动物模型系统，例如糖尿病性肾病小鼠模型，可检验本文公开的化合物是否能预防、治疗和/或缓解肾脏纤维化。
实施例23：心肌缺血/梗死纤维化和ECM重塑的动物模型
根据现有动物处理指南和方案饲养和处理雄性Wistar大鼠。根据动物实验的已有方案和指导产生转基因小鼠。根据以前鉴定的LOX/LOXL抑制剂的剂量和给药时间点确定治疗组大小、方案和对照。在预定时间点监测和/或处死经历缺血/再灌注损伤的大鼠，然后通过x-射线、显微CT成像、显微组织检查和免疫组化分析。
缺血/再灌注损伤方案
麻醉大鼠并置于通风处。外科手术暴露心脏，将迷你-肺冠状动脉闭合器(基于导管的闭合系统)置于围绕所需冠状动脉。然后闭合胸腔，将闭合器-导管和静脉导管在肩胛骨之间取出。手术后，动物先恢复5天再开始缺血/再灌注方案。
缺血
采用以下时间表通过闭合器-导管实施缺血，所述时间表包括：至少一次预处理闭合，20秒，然后恢复5分钟，至少一次闭合，2分钟，然后恢复5分钟。随后，可改变闭合时间，最多30分钟。可改变缺血方案长度，其中典型的方案长度是4周。每周实施缺血一次，在整个试验期间通过超声心动描记监测心脏功能。试验结束时对大鼠施以安乐死，切下心脏并检测微脉管系统、心室大小和功能以及纤维化程度。在缺血试验期间，以预定的时间点和剂量给予LOX/LOXL抑制剂。分组增加给药剂量和给药频率从而足以获得剂量限制性毒性和效率。在所有方案期间维持对照动物和方案。
分析
试验期间通过超声心动描记记录心室短轴图像来测定心室大小。分析舒张和收缩区域，其定义为心脏周期中最小和最大心室腔面积。通过包括显微CT和x-射线在内的各种成像和染色技术测定切下的心脏的冠状动脉流动和微脉管系统。通过心脏组织切片和三色染色法或其它已知的心脏组织染色法来测定心室纤维化。还进行横断面显微术和组织学分析以评估心室容量、大小和心室壁变薄。
采用动物模型系统，例如上述的心脏ECM重塑系统，可检验本文所述化合物是否能预防、治疗和/或缓解心脏纤维化和心脏ECM重塑。
实施例24：肺纤维化和ECM重塑的动物模型
博莱霉素诱导肺纤维化是评估肺纤维形成，包括IPF、间质性肺炎和ARDS的标准模型。根据动物处理指南和方案饲养和处理雄性Wistar大鼠。根据以前鉴定的LOX/LOXL抑制剂的剂量和给药时间点确定治疗组大小、方案和对照。给大鼠气管内注射确定剂量(通常是5mg/kg)的博莱霉素。整个治疗期间维持对照动物。
给予博莱霉素后，给予测试组预定的LOX/LOXL抑制剂并在预定时间点监测和/或处死以评估肺纤维化。可以改变测试期，其中示范性的测试期是4周。处死后，检测大鼠肺的纤维化和胶原含量。通过已有染色方法和显微术染色并检查大鼠肺切片中纤维化的存在和程度。此外，通过已有试验，例如羟脯氨酸试验测定大鼠肺的胶原含量。
利用动物模型系统，例如上述博莱霉素诱导肺纤维化模型，可检验本文所述化合物是否能预防、治疗和/或缓解肺纤维化。

Claims (94)

1.一种体内治疗或预防对象中肿瘤侵入或转移的方法，所述方法包括：
给予该对象有效量的活性赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂。
2.一种体内治疗或预防对象中血管生成的方法，所述方法包括：
给予该对象有效量的活性赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂。
3.一种体内治疗或预防对象中纤维化的方法，所述方法包括：
给予该对象有效量的活性赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂。
4.一种体内降低对象的肿瘤生长的方法，所述方法包括：
给予该对象有效量的活性赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂，从而将所述肿瘤生长降低至少25％、50％、75％、90％或95％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是转移性肿瘤。
6.一种增加或提高具有转移性肿瘤的对象存活机会的方法，所述方法包括：
给予有此需要的对象有效量的活性赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂，
从而将所治疗对象的存活机会增加或提高一段时期。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述对象的存活增加至少10天、1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或10年。
8.如权利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
9.如权利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是特异性结合LOX或LOXL中某区域的抗体，所述区域具有选自SEQ ID NO：1-18的氨基酸序列。
10.如权利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是活性LOX、LOXL2或LOXL4的抑制剂。
11.如权利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂抑制活性LOX和活性LOXL2。
12.如权利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特征在于，所述活性LOX或LOXL是前蛋白原经蛋白酶解加工后的LOX或LOXL的成熟形式。
13.一种体内治疗或预防对象中肿瘤侵入或转移的方法，所述方法包括：
给予该对象有效量的赖氨酰氧化酶的抑制剂和赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂。
14.一种体内降低对象的肿瘤生长的方法，所述方法包括：
给予该对象有效量的赖氨酰氧化酶的抑制剂和赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂，从而将所述肿瘤生长降低至少25％、50％、75％、90％或95％。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是转移性肿瘤。
16.一种增加或提高具有转移性肿瘤的对象存活机会的方法，所述方法包括：
给予有此需要的对象有效量的赖氨酰氧化酶的抑制剂和赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂，
从而将所治疗对象的存活机会增加或提高一段时期。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述对象的存活增加至少10天、1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或10年。
18.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
19.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOX抑制剂和所述LOXL抑制剂不同。
20.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOX抑制剂和所述LOXL抑制剂不同，二者分别特异性结合LOX和LOXL。
21.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOX抑制剂或所述LOXL抑制剂是特异性结合LOX或LOXL某区域的抗体，所述区域具有选自SEQ ID NO：1-18的氨基酸序列。
22.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOX抑制剂和所述LOXL抑制剂是单一抗体，其中所述抗体对所述LOX和所述LOXL具有结合亲和力。
23.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOXL抑制剂是LOXL1、LOXL2或LOXL4的抑制剂。
24.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOXL抑制剂是LOXL2或LOXL4的抑制剂。
25.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是活性LOX、LOXL2或LOXL4的抑制剂。
26.如权利要求13、14或16所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂抑制活性LOX和活性LOXL2。
27.一种组合物，其包含：
赖氨酰氧化酶的抑制剂，
赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂，和
药学上可接受的运载体。
28.一种治疗患有异常细胞增殖、异常血管生成、异常细胞侵入或迁移入局部组织和/或远端部位相关疾病或纤维变性疾病的宿主的方法，所述方法包括：
组合给予所述宿主治疗有效量的赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白中至少之一的抑制剂和并非LOX或LOXL抑制剂的第二治疗剂。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是特异性结合LOX或LOXL某区域的抗体，所述区域具有选自SEQ ID NO：1-18的氨基酸序列。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是活性LOX、LOXL2或LOXL4的抑制剂。
32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂抑制活性LOX和LOXL2。
33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述活性LOX或LOXL是前蛋白原经蛋白酶解加工后的LOX或LOXL的成熟形式。
34.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述第二治疗剂是化疗剂。
35.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述第二治疗剂是治疗性生物剂。
36.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述第二治疗剂是射线。
37.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂和所述第二治疗剂通过抑制LOX或LOXL协同治疗疾病，所述抑制作用使得宿主中的患病细胞对所述治疗剂的抗增殖或促凋亡作用更敏感，并且降低患病细胞的活力。
38.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述异常细胞增殖相关疾病是癌症、肿瘤或再狭窄。
39.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述纤维变性疾病选自：皮肤瘢痕形成、瘢痕瘤、肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、糖尿病性肾病、硬皮病和肾小球硬化症。
40.一种组合物，其包含：
赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白中至少之一的抑制剂，
并非所述赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白中至少之一的第二治疗剂，和
药学上可接受的运载体。
41.一种选择肿瘤侵入、血管生成或转移的抑制剂的方法，所述方法包括：
将处于上皮-间充质过渡(EMT)状态的细胞与赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶-样蛋白的抑制剂接触；和
检测所述细胞的EMT状态的改变，
其中，EMT状态降低或从EMT向间充质-上皮过渡(MET)状态改变表明该LOX或LOXL的抑制剂是肿瘤侵入、血管生成或转移的抑制剂。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述细胞的EMT状态具有选自以下的特征：阳性波形蛋白、阳性纤连蛋白染色，E-钙粘蛋白染色水平低或不可检测、F-肌动蛋白的鬼笔毒环肽染色显示延长及重塑的肌动蛋白细胞骨架。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述细胞的MET状态具有选自以下的特征：波形蛋白的水平低或检测不到、纤连蛋白染色的水平低或不可检测，E-钙粘蛋白染色阳性或高水平、F-肌动蛋白的鬼笔毒环肽染色显示生理上正常的肌动蛋白细胞骨架。
44.如权利要求41所述的方法，其特征在于，通过测量或检测与接触LOX或LOXL抑制剂之前的细胞相比，波形蛋白或纤连蛋白染色降低和/或E-钙粘蛋白染色增加检测EMT状态的降低或从EMT向MET状态的过渡。
45.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述检测步骤包括采用体外刮擦试验来检测所述细胞的侵袭或迁移能力。
46.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是针对LOX或LOXL的抗体、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
47.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述细胞是选自以下的肿瘤细胞系：BT-549、Hs5788t、MBA-MD231、NCI-H226、MCF-7和SW620细胞系。
48.如权利要求41所述的方法，其特征在于，还包括：
在LOX或LOXL抑制剂存在时将所述细胞与并非LOX或LOXL抑制剂的治疗剂接触；和
检测所述细胞活力的改变。
49.一种诊断对象中癌症转移的方法，所述方法包括：
评估血液中活性LOX或LOXL的水平或活性，
其中与参比样品相比，血液中活性LOX或LOXL的水平或活性改变表明存在转移性肿瘤生长。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，血液中活性LOX或LOXL的水平或活性低于参比样品表明癌症转移存在或增加。
51.一种诊断具有肿瘤的对象中癌症转移的方法，所述方法包括：
评估肿瘤中活性LOX或LOXL水平或活性，
其中与参比样品相比，肿瘤中活性LOX或LOXL水平或活性改变表明存在转移性肿瘤生长。
52.如权利要求49或51所述的方法，其特征在于，肿瘤中活性LOX或LOXL水平或活性高于参比样品的表明癌症转移存在或增加。
53.如权利要求49或51所述的方法，其特征在于，所述评估步骤包括利用结合所述活性LOX或LOXL的抗体评估所述活性LOX或LOXL的水平。
54.如权利要求49或51所述的方法，其特征在于，所述评估步骤包括利用结合活性LOX、LOXL2或LOXL4的抗体评估所述活性LOX或LOXL的水平。
55.如权利要求49或51所述的方法，其特征在于，所述评估步骤包括利用结合所述活性LOX和活性LOXL的抗体评估所述活性LOX或LOXL的水平。
56.如权利要求49或51所述的方法，其特征在于，所述活性LOX或LOXL是前蛋白原经蛋白酶解加工后的成熟形式LOX或LOXL。
57.一种监测对象对包括LOX/LOXL调节剂在内的治疗剂在疾病治疗中的反应的方法，所述方法包括：
将LOX或LOXL的调节剂给予该对象后检测该对象中C-反应活性蛋白水平的改变，
其中所述改变表明该LOX或LOXL调节剂对该对象有治疗作用。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL的调节剂是LOX或LOXL的抑制剂。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，与给予所述LOX或LOXL抑制剂之前的那些水平相比，对象血液样品中C-反应活性蛋白的水平降低表明该对象对用所述LOX或LOXL抑制剂治疗有反应。
60.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述疾病是异常细胞增殖相关疾病。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述异常细胞增殖相关疾病是癌症、肿瘤或再狭窄。
62.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述疾病是纤维变性疾病。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述纤维变性疾病选自：皮肤瘢痕形成、瘢痕瘤、肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、糖尿病性肾病、硬皮病和肾小球硬化症。
64.一种治疗对象中的病理性心脏病症或疾病的方法，所述方法包括给予该对象有效量的赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的抑制剂。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL的抑制剂抑制LOX或LOXL的活性形式。
66.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述病理性心血管病症或疾病是高血压、高血压性心脏病、心肌梗塞、动脉粥样硬化或再狭窄。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述病理性心血管病症或疾病与心血管纤维化有关，并且所述LOX或LOXL的抑制剂局部给予至心血管纤维化的部位。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL的抑制剂通过支架给予。
69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL的抑制剂包被在所述支架上。
70.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂通过导管局部给予至心血管纤维化的部位。
71.如权利要求64所述的方法，其特征在于，在所述病理性心血管病症发作前给予所述LOX或LOXL抑制剂。
72.如权利要求64所述的方法，其特征在于，在所述病理性心血管病症发作后给予所述LOX或LOXL抑制剂。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述病理性心血管病症是心肌梗塞，在所述心肌梗塞后至少1、2、3、5或10小时，或在所述心肌梗塞后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天给予所述LOX或LOXL的抑制剂。
74.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL的抑制剂是针对LOX或LOXL的抗体或其抗原结合片段、小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
75.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是特异性结合LOX或LOXL中某区域的抗体或其抗原结合片段，所述区域具有选自SEQ ID NO：1-18的氨基酸序列。
76.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是活性LOX、LOXL2或LOXL4中至少一种的抑制剂。
77.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂抑制活性LOX和活性LOXL2。
78.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述活性LOX或LOXL是前蛋白原经蛋白酶解加工后的LOX或LOXL的成熟形式。
79.一种预防对象中的病理性心血管病症或疾病的方法，所述方法包括在不良心血管事件之前、同时或之后给予该对象有效量的赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的抑制剂。
80.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述不良心血管事件是心肌梗塞。
81.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述不良心血管事件是急性心肌梗塞。
82.如权利要求79所述的方法，其特征在于，在心肌梗塞后至少1、2、3、5或10小时，或在心肌梗塞后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天给予所述抑制剂。
83.一种预防或治疗对象中病理性心脏病症或疾病的装置，所述装置包括含有赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的抑制剂的组件。
84.如权利要求83所述的装置，其特征在于，所述组件是支架。
85.如权利要求83所述的装置，其特征在于，所述LOX或LOXL的抑制剂的分子量低于500道尔顿。
86.如权利要求85所述的装置，其特征在于，所述LOX或LOXL的抑制剂是包被在支架上的β-氨基丙腈(BAPN)。
87.如权利要求83所述的装置，其特征在于，所述装置还包括将LOX或LOXL抑制剂局部递送至不良心脏事件所致心脏纤维化部位的导管。
88.一种试剂盒，其装有：包含LOX或LOXL的抑制剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物；和如何利用该药物组合物治疗或预防病理性心脏病症或疾病的使用说明书。
89.一种治疗对象中纤维化相关疾病的方法，所述方法包括：给予该对象有效量的赖氨酰氧化酶(LOX)或赖氨酰氧化酶-样蛋白(LOXL)的抑制剂，其中所述纤维化选自：肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、皮肤瘢痕、瘢痕瘤形成和阿尔茨海默病。
90.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂抑制活性形式的LOX或LOXL。
91.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是针对LOX或LOXL的抗体或其抗原结合片段、LOX或LOXL的小分子抑制剂、针对LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反义多核苷酸。
92.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是特异性结合LOX或LOXL中某区域的抗体或其抗原结合片段，所述区域具有选自SEQ ID NO：1-18的氨基酸序列。
93.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂抑制活性LOX和活性LOXL2。
94.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述LOX或LOXL抑制剂是前蛋白原经蛋白酶解加工后的LOX或LOXL的成熟形式。
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