CN106492218A - 氨基丙腈在制备药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了氨基丙腈在制备药物中的用途，该药物用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化。本发明所提出的含有氨基丙腈的药物，与未载有氨基丙腈的对照组相比，能够有效地使肝纤维化F3阶段(METAVIR分期标准)小鼠的纤维化标志基因col 1a1、Acta2和Desmin的表达下降，并且小鼠的肝脏组织结构变得完整、胶原纤维沉积减少同时胶原纤维变得更细、胶原结构变得疏松弥散、以及被激活的星型细胞减少，说明氨基丙腈对于肝纤维化、肝硬化具有明显的改善效果。

Description

氨基丙腈在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及氨基丙腈在制备药物中的用途。更具体的，本发明涉及氨基丙腈在制备药物中的用途和用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化的药物组合物。

背景技术

肝硬化是世界第十四位致死疾病，在发达国家发病率更高，是欧洲第四致死疾病。肝纤维化、肝硬化的治疗也面临许多挑战，比如缺少对纤维化进程表征的标志物，对纤维化病人的发病程度进行分期，难以预测病人疾病的进程，并且缺少对肝纤维化、肝硬化病人有效的治疗方案。

随着现代生物学、医学的发展，肝脏纤维化发病机制和分子信号变化越来越清晰，并且越来越多的证据表明肝纤维化可能是可逆的，这也促进对肝纤维化药物研发的信心，但是目前，针对肝纤维化的治疗除了去除根本的致病因素(如乙型肝炎、丙型肝炎病毒等)，尚无有效的治疗措施。目前为止，FDA尚未批准针对肝纤维化、肝硬化的药物及疗法，

所以，研发针对肝纤维化、肝硬化的药物是目前基础研究领域和制药领域的热点之一。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

本发明人在研究过程中发现，在肝脏受到急性损伤时的修复过程会伴随着纤维化发生，肝脏内增加Ⅰ型胶原可以保护肝脏细胞受到进一步刺激从而促进肝脏再生，但是持续的慢性损伤就会引发持续性、不可控的纤维化发生，这种情况下就会影响肝脏的再生功能。如果没有有效的控制措施，肝纤维化会导致肝脏内组织重构形成纤维疤痕(Fibrousscar)，进一步使得再生的肝脏细胞形成结节(Nodules)发展成为肝硬化(Cirrhosis)、肝门静脉高压，最终可能发展成为肝衰竭、肝癌。从解剖病理学角度，肝纤维化可以分为四个阶段，F0阶段中没有肝纤维化，F2阶段出现门静脉周纤维化，F3阶段为桥接肝纤维化，F4阶段为肝硬化。

本发明的发明人主要针对肝脏纤维化的后期进行研究，此期的肝脏内部的Ⅰ型胶原大量沉积并会导致肝细胞损伤。其中，赖氨酰氧化酶(LOX)是胶原和弹性蛋白交联的关键性酶，该酶参与细胞外基质重构，能够促进胶原纤维的聚集，而氨基丙腈(BAPN)作用的靶点就是赖氨酰氧化酶。本发明的发明人意外地发现，在肝纤维化后期甚至肝硬化阶段，使用针对细胞外基质的药物氨基丙腈，能有效的缓解晚期肝纤维化、肝硬化。

有鉴于此，本发明的一个目的在于提出一种针对细胞外基质的、有效缓解晚期肝纤维化或肝硬化的药物。

在本发明的第一方面，本发明提出了氨基丙腈在制备药物中的用途。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化。目前，氨基丙腈主要还只用于预防和治疗肿瘤的研究中，以及用于类风湿性疾病的治疗。本发明的发明人意外地发现，氨基丙腈通过抑制末期纤维化、硬化肝脏中一型胶原的交联，使得激活的星型细胞减少，促进细胞外基质重构，肝脏修复和末期肝脏纤维化、肝硬化逆转。

需要说明的是，本文中“氨基丙腈”应作广义的理解，包括氨基丙腈及其药学上可以接受的盐，例如3-氨基丙腈或者3-氨基丙腈富马酸盐，等等，在此不再赘述。

发明人意外地发现，采用本发明实施例的含有氨基丙腈的药物，与未载有氨基丙腈的对照组相比，能够有效地使肝纤维化F3阶段小鼠的纤维化标志基因col 1a1、Acta2和Desmin的表达下降，并且小鼠的肝脏组织结构变得完整、胶原纤维沉积减少同时胶原纤维变得更细、胶原结构变得疏松弥散、以及被激活的星型细胞减少，说明氨基丙腈对于肝纤维化具有明显的改善效果。

另外，根据本发明上述实施例的氨基丙腈在制备药物中的用途，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述氨基丙腈为3-氨基丙腈富马酸盐。本发明的发明人意外地发现，氨基丙腈是一个包含胺基和丁腈基团的两个功能基团的有机物，而氨基丙腈的药学上可以接受的盐是以固体形式存在，能够解决3-氨基丙腈在常温易下聚合的问题，同时3-氨基丙腈富马酸盐还有良好的水溶性。

由此，采用本发明实施例的含有3-氨基丙腈富马酸盐的药物，该氨基丙腈的富马酸盐的形式具有更好的水溶性，更易被实验小鼠的肝脏所吸收，更易针对赖氨酰氧化酶的靶点位置作用，且3-氨基丙腈富马酸盐对于晚期肝纤维化、肝硬化具有明显的改善效果。

根据本发明的实施例，所述药物通过腹腔注射给药。本发明的发明人经过研究发现，采用含有氨基丙腈的治疗肝纤维化的药物通过腹腔注射的给药方式，能够更快速地被给药对象的肝脏所吸收，更效率地针对赖氨酰氧化酶的靶点位置作用，进一步促进3-氨基丙腈富马酸盐对于晚期肝纤维化、肝硬化的改善效果。

根据本发明的实施例，所述3-氨基丙腈富马酸盐的剂量为100mg/kg。本发明的发明人经过长期地研究发现，根据给药对象的重量，根据本发明的一些实施例，例如实验小鼠的重量，腹腔注射的3-氨基丙腈富马酸盐的剂量为100mg/kg。其中，给药剂量低于100mg/kg则小鼠的肝纤维化治疗效果不明显；给药剂量若高于100mg/kg，则小鼠的肝纤维化治疗效果的提升不再增强，而且可能伴随有副反应的出现。

由此，采用本发明实施例的给药量，与未载有氨基丙腈的对照组相比，能够更有效地使肝纤维化F3阶段小鼠的纤维化标志基因col 1a1、Acta2和Desmin的表达明显地下降，并且小鼠的肝脏组织结构更完整、胶原纤维沉积减少以及被激活的星型细胞减少，说明特定给药量的氨基丙腈对于晚期肝纤维化、肝硬化具有更明显的改善效果。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化的药物组合物。

根据本发明的实施例，所述药物组合物含有氨基丙腈。发明人意外地发现，采用本发明实施例的药物组合物，能够有效地使肝纤维化F3阶段(晚期肝纤维化、肝硬化)小鼠的纤维化标志基因col 1a1、Acta2和Desmin的表达下降，并且使小鼠的肝脏组织结构恢复完整、其胶原纤维沉积减少同时胶原纤维更细、并且其胶原结构变得疏松弥散、以及被激活的星型细胞减少，说明含有氨基丙腈的药物组合物在治疗肝纤维化有明显的作用。本领域技术人员能够理解的是，前面针对氨基丙腈在制备药物中的用途所描述的特征和优点，仍适用于该用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化的药物组合物，在此不再赘述。

另外，根据本发明上述实施例的药物组合物，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述氨基丙腈为3-氨基丙腈富马酸盐。由此，采用本发明实施例的含有3-氨基丙腈富马酸盐的药物组合物，具有更好的生物相容性，更易被实验小鼠的肝脏所吸收，更易针对赖氨酰氧化酶的靶点位置作用，且对于晚期肝纤维化、肝硬化具有明显的改善效果。

在本发明的第三方面，本方面提出了一种药物联合。

根据本发明的实施例，所述药物联合用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化，且所述药物联合包含：氨基丙腈作为第一活性剂；不同于氨基丙腈的药物作为第二活性剂，所述不同于氨基丙腈的药物具有治疗晚期肝纤维化或肝硬化的功能。本发明的发明人经过长期研究发现，氨基丙腈可作为唯一的活性剂或与其不同的第二活性剂进行联合作用，能够更好地治疗晚期肝纤维化、肝硬化。

需要说明的是，对于“不同于氨基丙腈的药物”的具体类型不受具体的限定，包括但不限于抗纤维化药物、抗肿瘤药物、抗高血压药物、抗血管生成药物，例如肾素抑制剂、结缔组织生长因子拮抗剂、成纤维细胞生长因子拮抗剂、干扰素γ、松弛素、内皮素受体拮抗剂、转化生长因子β拮抗剂、血小板衍生生长因子拮抗剂、内皮生长因子受体拮抗剂、CCR5抑制剂，等等，只要是不同于氨基丙腈的具有治疗晚期肝纤维化或肝硬化的功能的药物均可。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明一个实施例的健康小鼠在诱导慢性肝损伤10周前后的组织学鉴定对比图和免疫荧光染色对比图；

图2是根据本发明另一个实施例的BAPN组和对照组的肝纤维化标志基因表达的柱状图；

图3是根据本发明另一个实施例的BAPN组和对照组的组织学鉴定图；

图4是根据本发明另一个实施例的BAPN组和对照组的胶原纤维的统计柱状图；

图5是根据本发明另一个实施例的BAPN组和对照组的免疫荧光染色图；以及

图6是根据本发明另一个实施例的BAPN组和对照组的激活星型细胞(αSMA为其标志物)统计图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，本技术领域人员会理解，下面实施例旨在用于解释本发明，而不应视为对本发明的限制。除非特别说明，在下面实施例中没有明确描述具体技术或条件的，本领域技术人员可以按照本领域内的常用的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市购到的常规产品。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实验小鼠：8周龄，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

组织学鉴定方法：将小鼠的部分肝脏组织固于10％的福尔马林溶液内，进行石蜡包埋，切8ul切片之后进行常规苏木素和伊红(H&E)染色，观察肝脏组织病理学变化；或者利用天狼猩红染色观察胶原纤维沉积，并利用Image J软件对天狼猩红染色的阳性区域进行定量统计。

免疫荧光实验：取小鼠的部分肝脏组织包埋于OCT内，冰冻切片至8微米，进行αSMA和collagen的免疫荧光染色。

实施例1

在该实施例中，将10只健康的实验小鼠通过10周的慢性肝损伤诱导，得到肝脏内部出现严重程度纤维化的实验小鼠。具体的，在该实施例中，根据小鼠的重量每次腹腔注射2.5mL/kg的CCl₄和橄榄油的体积比为1:4的混合溶液，每周注射2次，诱导周期为10周。并且，另外选择健康小鼠作为模型构建的对照。

该实施例的诱导慢性肝损伤10周的小鼠，其肝脏组织进行组织学鉴定结果，如图1.b和图1d所示。健康小鼠肝脏的结构和胶原纤维如图1a和图1c所示。图1.b中，H&E染色的肝脏组织结构出现明显的门静脉-门静脉桥接，同时也出现门静脉-中央静脉桥接，说明肝脏纤维化程度严重，到了末期纤维化、肝硬化阶段。图1d中，天狼猩红染色胶原纤维显示出CCL4诱导十周的小鼠呈现大量的纤维聚集，同时显示出与图1c相同的纤维化分期特征。

该实施例的诱导慢性肝损伤10周的小鼠，其肝脏组织进行免疫荧光实验的结果，如图1.f和图1.h所示。图1.e和图1.g为正常小鼠肝脏内一型胶原和αSMA染色。图1.f中，相对于正常小鼠，末期纤维化、硬化小鼠肝脏中出现大量激活的星型细胞，如不进行抑制，会造成更进一步的损伤；图1.h中，使用特异性和灵敏性更强的单克隆抗体COL-1染色发现，相对于正常小鼠，一型胶原蛋白纤维沉积严重，覆盖整个肝脏区域。

根据组织学天狼猩红染色结合METAVIR肝纤维化分级方法，小鼠肝纤维化诱导至F3阶段，即非常严重的肝脏纤维化，早期肝硬化阶段。

实施例2

在该实施例中，对实施例1中的5只慢性肝损伤的小鼠，进行BAPN的给药实验。具体的，在该实施例中，根据小鼠的重量每次腹腔注射100mg/kg的BAPN，每天一次，实验周期为2周。2周后，三氯乙醇麻醉小鼠，取其肝脏组织进行分析。

对比例1

在该对比例中，按照与实施例2基本相同的实验方法，对实施例1中的另外5只慢性肝损伤的小鼠，进行药物载体-PBS的对照实验。区别在于，在该对比例中，每天腹腔注射100mg/kg的PBS。

实施例3

在该实施例中，对实施例2的BAPN组的所有小鼠肝脏组织和对比例1的对照组的所有小鼠肝脏组织，分别提取RNA反转录为cDNA，进行qPCR检测纤维化标志基因的表达情况。具体的，在该实施例中，纤维化标志基因分别选择col 1a1、Acta2和Desmin。

该实施例的2组小鼠肝脏的纤维化标志基因的表达情况，如图2所示。由图2可看出，与对比例的药物载体(Vehicle)-PBS组相比，实施例2的BAPN组的纤维化标志基因col1a1、Acta2和Desmin的表达均有所下降，实施例2与对比例1之间的差异基因进行t检验(Student's t test)，发现纤维化标志基因均出现显著性差异(*p<0.05，显著差别)这说明接收BAPN的给药后，小鼠的肝脏晚期纤维化有所恢复。

实施例4

在该实施例中，对实施例2的BAPN组的小鼠肝脏组织和对比例1的对照组的小鼠肝脏组织，进行组织学鉴定。具体的，在该实施例中，分别采用苏木红/伊红染色和天狼猩红染色，以及对天狼星红染色的结果中的阳性区通过Image J软件进行定量统计分析。

该实施例的苏木红和伊红(H&E)染色的对比结果，如图3.a和图3.c所示。可看出，与对比例的药物载体-PBS组(图3.a)相比，实施例2的BAPN组(图3.c)的肝脏组织结构变得更加正常，桥接减少显示BAPN的给药后小鼠的肝脏晚期纤维化有所恢复。

该实施例的天狼猩红染色的对比结果，如图3.b和图3.d所示。可看出，与对比例的药物载体-PBS组(图3.b)相比，实施例2的BAPN组(图3.d)的胶原纤维的数目和面积显著的降低，桥接减少，且胶原纤维变得更细，显示BAPN的给药后小鼠的肝脏晚期纤维化有所恢复。

该实施例的天狼星红染色结果的统计分析，如图4所示。由图4可看出，与对比例的药物载体(Vehicle)-PBS组相比，实施例2的BAPN组的胶原纤维沉积下降，BAPN组的胶原纤维显著地从3.2％减少至2.4％，针对统计结果进行t检验，显示两组之间呈现极显著的差异(***P<0.001)。说明BAPN的给药后小鼠的肝脏晚期纤维化有所恢复。

实施例5

在该实施例中，对实施例2的BAPN组的小鼠肝脏组织和对比例1的对照组的小鼠肝脏组织，进行免疫荧光实验。具体的，在该实施例中，分别提取小鼠肝脏组织的RNA，反转录为cDNA，进行qPCR检测纤维化标志基因的表达情况。

该实施例的免疫荧光染色结果，如图5和图6所示。

图5中分别显示了纤维化标志基因col 1a1、Acta2和Merged的染色情况。可看出，与对比例1的药物载体(Vehicle)-PBS组相比，实施例2的BAPN组的肝脏组织具有更少的αSMA阳性区域，表明被激活的星型细胞更少，而collagen阳性区域的胶原结构变得更疏松弥散，说明BAPN影响LOX沉积细胞外基质的能力。

图6，是针对图5中αSMA阳性区域的星型细胞定量统计分析的结果。可看出，BAPN组的星型细胞显著地从6.4％减少至2.2％，针对统计结果进行t检验，显示两组之间呈现极显著差异(***P<0.001)，说明BAPN的给药后小鼠的肝脏晚期纤维化有所恢复。

总结

综合实施例1～5和对比例1可得出，本发明所提出的含有氨基丙腈的药物，与未载有氨基丙腈的对照组相比，能够有效地使末期肝纤维化阶段肝硬化小鼠的纤维化标志基因col1a1、Acta2和Desmin的表达下降，并且小鼠的肝脏组织结构更完整、胶原纤维沉积减少同时胶原纤维更细、胶原结构变得疏松弥散、以及被激活的星型细胞减少，说明氨基丙腈对于肝纤维化具有明显的治疗效果。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.氨基丙腈在制备药物中的用途，所述药物用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述氨基丙腈为3-氨基丙腈富马酸盐。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物通过腹腔注射给药。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述3-氨基丙腈富马酸盐的剂量为100mg/kg。

5.一种用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有氨基丙腈。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述氨基丙腈为3-氨基丙腈富马酸盐。

7.一种药物联合，其特征在于，所述药物联合用于治疗晚期肝纤维化、肝硬化，且所述药物联合包含：

氨基丙腈作为第一活性剂；

不同于氨基丙腈的药物作为第二活性剂，所述不同于氨基丙腈的药物具有治疗晚期肝纤维化或肝硬化的功能。

8.根据权利要求7所述的药物联合，其特征在于，所述第二活性剂包括抗纤维化药物、抗肿瘤药物、抗高血压药物和抗血管生成药物的至少一种。