ES2609689T3 - Anticuerpo que enlaza con la integrina alfa4beta7 y su uso para tratar la enfermedad intestinal inflamatoria - Google Patents
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Abstract
Una inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antígeno de la misma que tiene especificidad de enlace para la integrina α4β7, para su uso en el tratamiento de un humano que tiene una enfermedad seleccionada del grupo consistente de una enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de la insulina, colangitis, pericolangitis y enfermedad de injerto contra huésped, en donde dicho uso comprende administrar la inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antígeno de la misma en una dosis inicial seguida por una o más dosis posteriores y el intervalo mínimo entre dos dosis cualquiera es un periodo de al menos 1 día, y en donde no se administran más de 8 mg de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antígeno por kg de peso corporal durante un periodo de un mes, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antígeno enlaza específicamente con α4β7 pro no enlace con α4β1 y en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antígeno de la misma inhibe el enlace de la integrina α4β7 con MAdCAM-1.
Description
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Anticuerpo que enlaza con la integrina alfa4beta7 y su uso para tratar la enfermedad intestinal inflamatoria Descripcion
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los receptores de la integrina son importantes para regular tanto la regulacion de linfocitos como el reclutamiento a los sitios de inflamacion (Carlos, T.M. y Harlan, J.M., Blood, 84:2068-2101 (1994)). La integrina a4p7 humana tiene varios ligandos, uno de los cuales es la adresina vascular de la mucosa MAdCAM-1 (Berlin, C., y otros, Cell 74:185-195 (1993); Erle, D.J., y otros, J. Immunol. 153:517-528 (1994)) expresada en venulas endoteliales altas en nodulos linfaticos mesentericos y placas de Peyer (Streeter, P.R. y otros, Nature 331:41-46 (1988)). Como tal, la integrina a4p7 actua como un receptor de guiado que media la migracion de linfocitos al tejido linfoide de la mucosa intestinal (Schweighoffer, T., y otros, J. Immunol. 151-717 -729 (1993)). Ademas, la integrina a4p7 interactua con la fibronectina y la molecula de adhesion celular vascular- (VCAM-1).
La enfermedad intestinal inflamatoria (EII), como la colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn, por ejemplo, puede ser una enfermedad debilitadora y progresiva que implica la inflamacion del tracto gastrointestinal. Afectando a una estimacion de dos millones de personas solo en los Estados Unidos, los slntomas incluyen dolor abdominal, calambres, diarrea y sangrado rectal. Los tratamientos de la EII han incluido farmacos antiinflamatorios (como, corticoesteroides y sulfasalazina), farmacos inmunosupresivos (como, 6-mercaptopurina, ciclosporina y azatioprina) y cirugla (como, colectomla). Podolsky, New Engl. J. Med., 315:928-937 (1991) y Podolsky, New Engl. J. Med., 325:1008-1016 (1991). Sin embargo, dichos agentes terapeuticos no han sido efectivos en mantener la remision de la EII.
Los anticuerpos contra la integrina a4p7 humana, como la el anticuerpo monoclonal murino Act-1 (mAb Act- 1), interfieren con la integrina a4p7 enlazando con la molecula-1 de adhesion celular de la adresina de la mucosa (MAdCAM-1) presente en venulas endoteliales altas en los nodulos linfaticos de la mucosa. El Act-1 fue originalmente aislado por Lazarovits, A.I., y otros, j. Immunol. 133:1857-1862 (1984), de ratones inmunizados con linfocitos T-especlficos del toxoide del tetano humanos y se informo que era un anticuerpo IgG1/K de raton. Analisis mas recientes del anticuerpo por Schweighoffer, T y otros, J. Immunol. 151:717-729 (1993) demostraron que puede enlazar con un subconjunto de linfocitos T CD4+ de la memoria humana que expresan selectivamente la integrina a4p7. Sin embargo, un problema serio usando anticuerpos murinos para las aplicaciones terapeuticas en humanos es que son altamente inmunogenicos en humanos e inducen rapidamente una respuesta de anticuerpos anti- murinos (HAMA), lo que reduce la eficacia del anticuerpo del raton en pacientes y puede evitar la administration continuada. La respuesta HAMA resulta en un despeje rapido del anticuerpo de raton, limitando severamente cualquier beneficio terapeutico.
Gastroenterology, 116, N° 4, parte 2, pagina A726, (1999) divulga el tratamiento de colitis ulcerosa con un anticuerpo humanizado recombinante con integrina alfa 4 (Antegren (R)). El documento describe los resultados de un estudio en el que un dosis individual de 3 mg/kg de Antegren que enlaza con las integrinas a4p1 y a4p7, se administro a pacientes con colitis ulcerosa. El documento informa que el tratamiento dio como resultado una reduction de la puntuacion Powell-Tuck (PT) mediana de un nivel de pre-tratamiento de 10 a 7,5 y 6. Esta es uan reduction mediana de la puntuacion PT de 2,5 y 4 despues del tratamiento.
Por lo tanto, existe una necesidad de enfoques terapeuticos mejorados a enfermedades intestinales cronicas y otros desordenes inflamatorios de los tejidos de la mucosa.
RESUMEN DE LA INVENCION
La invention proporciona inmunoglobulina humanizada o un fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para su uso en el tratamiento de un humano que tiene una enfermedad como se define en las reivindicaciones anadidas.
Se describe en la presente un metodo para administrar un anticuerpo (por ejemplo anticuerpo humanizado). Se divulga en la presente un metodo para tratar a un humano que tiene una enfermedad asociada con infiltration de leucocitos de tejidos de la mucosa que comprende administrar al humano una cantidad efectiva de una inmunoglobulina que tiene especificidad de enlace con la integrina a4p7. En aspectos preferidos de la divulgation no se administran mas de alrededor de 8 mg de inmunoglobulina por kg de peso corporal en un periodo de alrededor de un mes. En aspectos particulares de la divulgacion, la inmunoglobulina puede incluir una o mas regiones determinantes complementarias (CDRs) que tienen la secuencia de aminoacidos de una CDR de Act-1 mAb murina. El LDP-02 es un anticuerpo preferido para la administracion. La inmunoglobulina puede administrarse en dosis multiples y el intervalo entre dosis puede ser al menos 1 dla o mayor. En realizaciones particulares, el intervalo entre dosis puede ser al menos 7, 14 o 21 dlas o alrededor de un mes. En una realization, la cantidad de inmunoglobulina administrada por dosis puede ser una cantidad que es suficiente para lograr alrededor del 50% o mas de saturation de sitios de enlace de a4p7 en linfocitos circulantes y/o alrededor del 50% o mas de inhibition de expresion de integrina a4p7 en la superficie de linfocitos circulantes durante un periodo de al menos alrededor de 10 dlas tras la
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administracion de la dosis. En otra realizacion, la cantidad de inmunoglobulina administrada por dosis puede ser una cantidad que es suficiente para lograr y mantener una concentracion serica de dicha inmunoglobulina de al menos alrededor de 1 pg/ml durante un periodo de alrededor de 10 dlas tras la administracion de la dosis.
La inmunoglobulina puede administrarse sola o junto con uno o mas agentes para tratar una enfermedad asociada con la infiltracion de leucocitos de los tejidos de la mucosa. Por ejemplo, al inmunoglobulina puede administrarse con esteroides, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios no esteroideos o inmunomoduladores. En una realizacion preferida, la inmunoglobulina se administra para tratar a un humano que tiene un enfermedad inflamatoria intestinal, como enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La FIGURA 1 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoacidos deducida (SEQ ID NO:2) de la region de cadena ligera del Act-1 del raton (Mus musculus) unida con la secuencia del peptido senal de cadena ligera del Act-1.
La FIGURA 2 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:3) y la secuencia de
aminoacidos (SEQ ID NO:4) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo Act-1 de raton. La
secuencia de nucleotidos de la region variable esta unida con una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de peptido senal de cadena pesada del Act-1 de raton deducida, para producir una secuencia compuesta. (La identidad del cebador que amplifica la region de cadena pesada se dedujo de la secuencia degenerada, y la secuencia de aminoacidos para el peptido senal se derivo del cebador, secuencia abajo y secuencias de otros peptidos senal. El peptido senal mostrado puede no ser identico al del hibridoma del Act- 1).
La FIGURA 3 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:5) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:6) de una parte de la cadena pesada de un anticuerpo Act-1 humanizado (LDP02) con un peptido senal de cadena pesada.
La FIGURa 4 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:7) y la secuencia de
aminoacidos (SEQ ID NO:8) de una parte de la cadena ligera de un anticuerpo Act-1 humanizado con un
peptido senal de cadena ligera,
La FIGURA 5 es una ilustracion de la secuencia de aminoacidos de las regiones determinantes complementarias de cadena ligera (CDR1, SEQ ID NO: 9; CDR2, SEQ ID NO:10; CDR3, SEQ ID NO:11) y las regiones determinantes de cadena pesada (CDR1, SEQ ID NO: 12; CDR2, SEQ ID NO:13; CDR3, sEQ ID NO:14)del anticuerpo murino Act-1 y LDP-02.
La FIGURA 6 es un grafico que muestra los niveles de LDP-02 sericos medios (pg/mL) en hombres sanos durante el tiempo que sigue a una unica administracion de LDP-02. Los niveles de LDP-02 serico medios se vuelven insignificantes en el dlas 36 despues de la administracion de 0,15 mg/kg por inyeccion intravenosa (IV)(-v) o subcutanea (SC)(-^-) y despues de la administracion de 0,5 mg/kg por inyeccion intravenosa (-▲-). Sin embargo el LDP-02 serico era todavla medible mas alla del dla 36 despues de la administracion de 1,5 mg/kg (-x) o 2,5 mg/kg (-*-) por inyeccion intravenosa.
La FIGURA 7 es un grafico que muestra la perdida persistente de la senal de a4p7 (detectada con Act-1 mAb) despues de la administracion del lDP-02. alrededor del 90% de la senal de a4p7 se perdio rapidamente (MESF = 10%) despues de la administracion del LDP-02 y persistio despues de la administracion de todas las dosis de LDP-02. Entre alrededor del dla 7 y el dla 22, la senal de a4p7 empezo a volver a la llnea base para el grupo de dosis IV de 0,15 mg/kg (-■-) y para el grupo de dosis SC de0,15 mg/kg (-♦-). Entre el dla 22 y el dla 36 la senal de a4p7 empezo a volver a la llnea base para el grupo de dosis (-▲-) IV de 0,5 mg/kg. En las dosis de LDP02 mas altas estudiadas (1,5 mg/kg (-x) y 2,5 mg/kg (-*-), la perdida de la senal a4p7 perduro durante mas de 36 dlas despues de las dosis IV unicas. Para el grupo de dosis de 2,5 mg/kg (-*-), la perdida de la senal de a4p7 perduro hasta alrededor del Dla 70 (datos proporcionados en la presente en el Apendice al Estudio L297-007). MESF: fluorescencia soluble equivalente media.
La FIGURA 8 es un grafico que muestra los niveles de LDP-02 sericos medidos (pg/mL) en pacientes con colitis ulcerosa a lo largo del tiempo despues de una unica administracion de LDP-02. Los niveles de LDP-02 sericos medios subieron rapidamente despues de la administracion del LDP-02. La concentracion de LDP-02 serico cayo por debajo de 1,0 pg/mL en pacientes administrados con LDP-02 a 0,15 mg/kg por inyeccion intravenosa (-▲-= o subcutanea (-•-) en los diez dlas despues de la dosis. Sin embargo, las concentraciones de LDP-02 sericas permanecieron por encima de 1,0 pg/mL durante alrededor de 20 dlas despues de la administracion de 0,5 mg/kg por inyeccion intravenosa (-■-). La concentracion serica de LDP-02 permanecio por encima de 1 pg/mL durante alrededor de 60 dlas despues de la administracion de 2,0 mg/kg por inyeccion intravenosa (-▼-).
La FIGURA 9 es un grafico que muestra la perdida persistente de la senal de a4p7 (detectada con Act-1 mAB) despues de la administracion de LDP-02. Alrededor del 90% de la senal de a4p7 se perdio rapidamente (MESF = = 10%) despues de la administracion de LDP-02 y la duracion de la perdida de senal fue dependiente de la dosis. Comenzando alrededor del Dla 10, la senal de a4p7 comenzo a retornar a la llnea de base para el grupo administrado con 0,15 mg/kg de LDP-02 por inyeccion IV (-■-) o SC (-♦-). Sin embargo, la senal de a4p7 comenzo a retornar a la llnea de base entre el dla 30 y el dla 60 para el grupo administrado con 0,5 mg/kg (-A-) de forma intravenosa, y despues del dla 60 para el grupo administrado con
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2,0 mg/kg (-x-) intravenosamente (datos proporcionados en la presente por el Apendice al Estudio L297- 006). MESF: fluorescencia soluble equivalente media.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La invention proporciona una inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para su uso en el tratamiento de un humano que tiene una enfermedad como se define en las reivindicaciones anadidas.
Se describe en la presente un metodo para administrar un anticuerpo (inmunoglobulina) a un sujeto . En un aspecto de la divulgation, el anticuerpo a administrar es un anticuerpo humanizado que tiene una especificidad de enlace par la integrina a4p7 (por ejemplo, a4p7 mamlfera (por ejemplo a4p7 humana (Homo sapiens). Preferiblemente, las inmunoglobulinas humanizadas descritas en la presente pueden enlazar con la integrina a4p7 con una afinidad de al menos alrededor de 107M-1, preferiblemente al menos alrededor de 108M-1, y mas preferiblemente al menos alrededor de 109M-1. En una realization, la inmunoglobulina humanizada descrita en la presente incluye una region que enlaza con el antlgeno de origen no humano que enlaza con la integrina a4p7 y una region constante derivada de una region constante humana. En otro aspecto de la divulgacion, la inmunoglobulina humanizada que enlaza con la integrina a4p7 comprende una region determinante complementaria de origen no humano y una region marco variable de origen humano, y si se desea, una region constante de origen humano. Por ejemplo, la inmunoglobulina humanizada puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una region determinante complementaria derivada de una anticuerpo de origen no humano que enlaza con la integrina a4p7 y una region marco derivada de una cadena ligera de origen humano, y la cadena pesada comprende una region determinante complementaria derivada de un anticuerpo de origen no humano que enlaza con la integrina a4p7 y una region marco derivada de una cadena pesada de origen humano.
Las inmunoglobulinas de origen natural tienen una estructura de nucleo comun en la que dos cadenas ligeras identicas (alrededor de 24 kD) y dos cadenas pesadas identicas (alrededor de 55 o 70 kD) forman un tetramero. La parte amino-terminal de cada cadena se conoce como la region variable (V) y se puede distinguir de las regiones constantes conservadas (C) del resto de cada cadena. Dentro de la region variable de la cadena ligera hay una parte C-terminal conocida como la region J. Dentro de la region variable de la cadena pesada, hay una region D ademas de la region J. La mayorla de la variation de la secuencia de aminoacidos en las inmunoglobulinas se confina a tres localizaciones separadas en las regiones V conocidas como regiones hipervariables o regiones determinantes complementarias (CDRs) que estan implicadas directamente en el enlace con el antlgeno. Partiendo del termino amino, estas regiones estan designadas CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente. Las CDRs se mantienen en su lugar por regiones marco mas conservadas (FRs). Partiendo del termino amino, estas regiones estan designadas FR1, FR2, FR3, y FR4, respectivamente. Las localizaciones de las regiones CDR y FR y un sistema de numeration han sido definidos por Karat y otros. (Kabat, E.A. y otros., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)).
Las inmunoglobulinas humanas se pueden dividir en clases y subclases, dependiendo del isotopo de la cadena pesada. Las clases incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IGE, en las que las cadenas pesadas son del tipo gamma (Y), mu (p), alfa (a)m, delta (5) o epsilon (e), respectivamente. Las subclases incluyen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e iGA2, en las que las cadenas pesadas son del tipo y1, y2, y3, y4, a1 y a2, respectivamente. Las moleculas de inmunoglobulina humanas de una clase o subclase seleccionada pueden contener una cadena ligera kappa (k) o lambda (A). Ver, por ejemplo, Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M.J., Ed., Capltulo 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co, Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2a Ed., Capltulo 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984).
El termino "inmunoglobulina" como se usa en la presente incluye anticuerpos completos y fragmentos biologicamente funcionales de los mismos. Dichos fragmentos biologicamente funcionales de los mismos mantienen al menos una funcion de enlace con el antlgeno de un anticuerpo de longitud completa correspondiente (por ejemplo especificidad para la a4p7 del anticuerpo Act-1), y preferiblemente, mantienen la capacidad de inhibir la interaction de la a4p7 con uno o mas de sus ligandos (por ejemplo, MAdCAM-1, fibronectina). En una realizacion particularmente preferida, los fragmentos biologicamente funcionales pueden inhibir el enlace de la a4p7 con la adresina de la mucosa (MAdCAM-1). Ejemplos de fragmentos de anticuerpos biologicamente funcionales que pueden ser administrados como se describe en la presente incluyen fragmentos capaces de enlazar con una integrina a4p7, como anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2. Dichos fragmentos pueden ser producidos por escision enzimatica o por tecnicas recombinantes. Por ejemplo, la escision de la papalna o la pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab')2, respectivamente. Tambien se pueden usar otras proteasas con la especificidad de sustrato requerida para generar Fab, F(ab')2 u otros fragmentos que enlazan con el antlgeno. Los anticuerpos pueden ser tambien producidos de una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpos en los que uno o mas codones de parada han sido introducidos corriente arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, un gen quimerico que codifica una parte de la cadena pesada de F(ab')2 puede ser designado para incluir secuencias de ADN que codifican el domino CH1 y la region bisagra de la cadena pesada.
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El termino "inmunoglobulina humanizada" como se usa en la presente se refiere a una inmunoglobulina (anticuerpo) que comprende partes de inmunoglobulinas de origen diferente, en donde al menos una parte es de origen humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender partes derivadas de una inmunoglobulina de origen no humano con la especificidad requisito, como un raton, y de secuencias de inmunoglobulina de origen humano (por ejemplo, inmunoglobulina quimerica), unidas juntas qulmicamente por tecnicas convencionales (por ejemplo, sintetica o preparadas como un polipeptido contiguo usando tecnologla de ADN recombinante (por ejemplo, ADN que codifica las partes de protelnas del anticuerpo quimerico puede ser expresado para producir una cadena de polipeptidos contiguos). Otro ejemplo de una inmunoglobulina humanizada es una inmunoglobulina que contiene una o mas cadenas de inmunoglobulina que comprenden una CDR derivada de un anticuerpo de origen no humano y una region marco derivada de una cadena ligera y/o pesada de origen humano (por ejemplo, anticuerpos CDR- injertados con o sin cambios de marco). Los anticuerpos de cadena sencilla quimericos o CDR-injertados tambien estan abarcados por el termino inmunoglobulina humanizada. Ver, por ejemplo, Cabilly y otros., Patente U.S. N° 4.816.567; Cabilly y otros., Patente Europea N° 0.125.023 B1; Boss y otros., Patente U.S. N° 4.816.397; Boss y otros, Patente Europea N° 0.120.694 B1, Neuberger, M.S. y otros, WO 86/01533; Neuberger, M.S. y otros, Patente Europea N° 0.194.276 B1; Winter, Patente U.S. N° 5.225.539; Winter, Patente Europea N° 0.239.400 B1; Queen y otros, Patente Europea N° 0 451 216 B1; Padlan, E.A. y otros, Patente Europea. N° 0.519.596 B1. Ver tambien, Ladner y otros, Patente U.S. N° 4.946.778; Huston, Patente U.S. N° 5.476.786; y Bird, R.E. y otros, Science, 242: 423-426 (1988)), referentes a anticuerpos de cadena sencilla. En realizaciones particulares, la inmunoglobulina humanizada puede incluir una cadena de inmunoglobulina (por ejemplo, cadena pesada) que tiene una region variable de origen no humano (por ejemplo, origen murino) y al menos una parte de una region constante humana (por ejemplo, Cy1), y una cadena de inmunoglobulina (por ejemplo, cadena ligera) en donde al menos una CDR es de origen no humano (por ejemplo origen murino) y las regiones marco (FR1, FR2, FR3, FR4) y, opcionalmente, la region constante (por ejemplo, Ck, CA) son de origen humano.
La region que enlaza con el antlgeno de la inmunoglobulina humanizada (la parte no humana) puede estar derivada de una inmunoglobulina de origen no humano (referida como una inmunoglobulina donante) que tiene una especificidad de enlace para la integrina a4p7. Por ejemplo, una region que enlaza con el antlgeno adecuada puede estar derivada de un anticuerpo monoclonal Act-1 murino (Lazarovits, A.I. y otros, J. Immunol., 133(4): 1857-1864 (1984)). Otras fuentes incluyen anticuerpos especlficos de la integrina a4p7 obtenidos de fuentes no humanas, como roedores (por ejemplo, raton, rata), conejos, cerdos, cabras o primates no humanos (por ejemplo, monos). Se pueden hacer otros anticuerpos policlonales o monoclonales, como anticuerpos que enlazan con el mismo epltopo o con un epltopo similar como el anticuerpo Act-1 (por ejemplo Kohler y otros, Nature, 256:495-497 (1975); Harlow y otros, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, Ny); y Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verano '94), Ausubel y otros, Eds. (John Wiley & Sons: New York, NY), Capltulo 11 (1991)).
Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos contra un inmunogeno apropiado en una mamlfero adecuado (por ejemplo, un raton, rata, conejo, oveja). La preparacion de una antlgeno inmunizante, y la produccion de un anticuerpo monoclonal se puede realizar usando cualquier tecnica adecuada. Se han descrito una variedad de metodos (ver por ejemplo, Kohler y otros, Nature, 256: 495-497 (1975) y Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein y otros, Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski y otros, Patente U.S. N° 4.172.124; Harlow, E. y D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verano '94), Ausubel, F.M. y otros, Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY), Capltulo 11, (1991)). Por ejemplo, los agentes inmunizantes adecuados incluyen celulas que tiene a4p7, fracciones de membrana que contienen a4p7, fragmentos inmunogenicos de inmunogenos adecuados incluyen a4p7, un peptido p4 conjugado con un portador adecuado y similares. Las celulas productoras de anticuerpos (por ejemplo, un linfocito9 pueden ser aisladas de, por ejemplo, los nodulos linfaticos o el bazo de un animal inmunizado. Las celulas pueden ser entonces fusionadas con una celula inmortalizada adecuada (por ejemplo, una llnea celular de mieloma (por ejemplo, SP2/0, P3x63Ag8.653)), formando de este modo un hibridoma. Las celulas fusionadas pueden ser aisladas empleando tecnicas de cultivo selectivas. Las celulas que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden ser seleccionadas usando un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA). Se pueden usar otros metodos adecuados de producir o aislar anticuerpos (anticuerpos humanos, anticuerpos no humanos de la especificidad requisito, incluyendo, por ejemplo, metodos que seleccionan anticuerpos recombinantes de una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentacion de fagos). Los animales transgenicos capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos (por ejemplo, XenoMouse™ (Abgenix, Fremont, CA) pueden ser producidos usando metodos adecuados (ver por ejemplo, WO 98/24893 (Abgenix), publicada el 11 de Junio de 1998; Kucherlapate, R. y Jakobovits, A., Patente U.S. N° 5.939.598; Jakobovits y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits y otros, Nature, 362: 255-258 (1993)). Se han descrito metodos adicionales para la produccion de animales transgenicos capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos (por ejemplo, Lonberg y otros, Patente U.S. N° 5.545.806; Surani y otros, Patente U.S. N° 5.545.807; Lonberg y otros, WO97/13852).
En una realizacion, la region que enlaza con el antlgeno de la inmunoglobulina humanizada comprende una CDR de origen no humano. En esta realizacion la inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de enlace para la integrina a4p7 comprende al menos una DCR de origen no humano. Por ejemplo, las CDRs pueden derivarse de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas de origen no humanos, como la inmunoglobulina humanizada que incluye sustancialmente la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3, y/o la cadena
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ligera CDR1, CDR2 y CDR3, de una o mas inmunoglobulinas de origen no humano, y la inmunoglobulina humanizada resultante tiene especificidad de enlace para la integrina a4p7. Preferiblemente, las tres CDRs de una cadena seleccionada son sustancialmente las mismas que las CDRs de la cadena correspondiente de un donante, y mas preferiblemente, las seis CDRs de las cadenas ligeras y pesadas son sustancialmente las mismas que las CDRs de las cadenas del donante correspondiente. En una realizacion preferida, a una o mas CDRs de origen no humano tienen las secuencias de aminoacidos de las CDRs del Act-1 Ab murino (SEQ ID NOS: 9-14).
La parte de la inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humanizada que es de origen humano (la parte humana) puede estar derivada de cualquier inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humana adecuada. Por ejemplo, una region constante o parte de la misma, si esta presente, puede estar derivada de las cadenas ligeras k o A, y/o las cadenas pesadas y (por ejemplo y1, y2, y3, y4), P, a (por ejemplo, a1, a2), 5 o e de anticuerpos humanos, incluyendo las variantes alelicas. Se puede seleccionar una region constante particular (por ejemplo, IgG1), variante o porciones de la misma para tejer la funcion efectora. Por ejemplo, se puede incorporar una region constante mutada (variante) en una protelna de fusion para minimizar el enlace con los receptores Fc y/o la capacidad de fijar el complemento (ver por ejemplo, Winter y otros, GB 2.209.757 B; Morrison y otros, WO 89/07142; Morgan y otros, WO 94/29351, 22 de Diciembre de 1994). El LDP-02 contiene una region constante de cadena pesada (region constante de cadena pesada y1 humana) que fue modificada para reducir el enlace con los receptores Fcy humanos. Las modificaciones del Fc del LDP-02 estan en las posiciones 235 y 237 (es decir, Leu235- Ala235 y Gly237-Ala237).
Si estan presentes, las regiones marco de origen humano (por ejemplo, de la region variable de cadena ligera) estan preferiblemente derivadas de una region variable de anticuerpo humano que tiene una similitud de secuencia con la region analoga (por ejemplo, region variable de cadena ligera) del donante de la region que enlaza con el antlgeno. Otras fuentes de regiones marco para partes de origen humano de una inmunoglobulina humanizada incluyen secuencias de consenso variables humanas (ver por ejemplo, Kettleborough, C.A. y otros, Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter y otros, WO 94/04679, publicada el 3 de Marzo de 1994)). Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo o region variable usada para obtener la parte no humana se puede comparar con las secuencias humanas como se describen en Kabat, E.A., y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health y Human Services, U.S. Government Printing Office (1991). En una realizacion particularmente preferida, las regiones marco de una cadena de inmunoglobulina humana estan derivadas de una region variable humana que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia general, y preferiblemente al menos un 70% de identidad de secuencia general, con la region variable del anticuerpo del donante no humano (por ejemplo, anticuerpo Act-1 de raton). Una parte humana puede estar tambien derivada de una anticuerpo humano que tiene al menos alrededor de un 65% de identidad de secuencia, y preferiblemente al menos alrededor de un 70% de identidad de secuencia, dentro de la parte particular (por ejemplo FR) que se esta usando, cuando se compara con la parte equivalente (por ejemplo, fR) del donante no humano. La identidad de la secuencia de aminoacidos puede ser determinada usando un algoritmo de alineacion de secuencias adecuado, como el sistema Lasergene (DNASTAR, Inc., madison, WI), usando los parametros por defecto.
En una realizacion, la inmunoglobulina humanizada comprende al menos una de las regiones marco (FR) derivadas de una o mas cadenas de un anticuerpo de origen humano. Asl, la FR puede incluir una Fr1 y/o FR2 y/o FR3 y/o FR4 derivadas de uno o mas anticuerpos de origen humano. Preferiblemente, la parte humana de una cadena humanizada seleccionado incluye las FR1, FR3, FR3 y FR4 derivadas de una region variable de origen humano (por ejemplo, de una cadena de inmunoglobulina humana, de una secuencia de consenso humana).
Las partes de inmunoglobulina de origen humano y no humano para el uso de preparar anticuerpos humanizados pueden tener secuencias identicas a inmunoglobulinas o partes de inmunoglobulinas de las que estan derivadas o a variantes de las mismas. Dichas variantes incluyen mutantes que difieren por la adicion, delecion, o sustitucion de uno o mas residuos. Como se ha indicado anteriormente, las CDRs que son de origen no humano son sustancialmente las mismas que en el donante no humano, y preferiblemente son identicas a las CDRS del donante no humano. Se pueden hacer cambios en la region marco, como los que sustituyen un residuo de la region marco de origen humano con un residuo de la posicion correspondiente del donante. Se pueden hacer una o mas mutaciones en la region marco, incluyendo deleciones, inserciones, y sustituciones de uno o mas aminoacidos. Para un anticuerpo o cadena humanizado seleccionado, se pueden disenar mutaciones de marco adecuadas. Preferiblemente, las inmunoglobulinas humanizadas pueden enlazar con la integrina a4p7 con una afinidad similar o mejor que la del donante no humano. Las variantes pueden ser producidas por una variedad de metodos adecuados, incluyendo mutagenesis de cadenas humanas de aceptador o donante no humano.
Las inmunoglobulina (por ejemplo, inmunoglobulinas humanas y/o humanizadas) que tienen especificidad de enlace para la integrina a4p7 humana incluyen inmunoglobulinas (incluyendo fragmentos que enlazan con el antlgeno) que pueden enlazar determinantes (epltopos) de la cadena a4 (por ejemplo, mAb HP1/2 (Pulido, y otros, J Biol Chem 266:10241-10245 (1991), MAb 21.6 murino and MAb humanizado 21.6 (Bendig y otros, Patente U.S. N° 5.840.299)) y/o la cadena p7 del heterodlmero a4p7. Por ejemplo, en realizaciones particulares, la inmunoglobulina humanizada puede enlazar especlfica o selectivamente con un determinante del complejo a4p7, pero no enlazar determinantes (epltopos) en la cadena a4 o la cadena p7. En una realizacion, la inmunoglobulina humanizada puede tener especificidad de enlace para un epltopo combinacional en el heterodlmeros a4p7. Dicha inmunoglobulina
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puede enlazar con la a4p7 y no enlazar con la a4p1, por ejemplo. Los anticuerpos que tienen especificidad de enlace para el complejo a4p7 incluyen, el anticuerpo Act-1 murino, y un Act-1 humanizado referido como LDP-02 (ver, WO 98/06248 por LeukoSite, Inc., publicada el 19 de febrero de 1998 y la Patente U.S. Numero 7.147.852.
En una realizacion preferida, la inmunoglobulina humanizada tiene al menos una funcion caracterlstica del anticuerpo Act-1 murino, como la funcion de enlace (por ejemplo, teniendo especificidad para la integrina a4p7, teniendo la misma especificidad epitopica o similar), y/o funcion inhibidora (por ejemplo, la capacidad de inhibir la adhesion dependiente de la a4p7 in vitro y//o in vivo, como la capacidad de inhibir la integrina a4p7 que enlaza con la MAdCAM-1 in vitro y/o in vivo, o la capacidad de inhibir el enlace de una celula que tiene la integrina a4p7 a un ligando de la misma (por ejemplo, una celula que tiene MAdCAM-1)). Asl, las inmunoglobulinas humanizadas preferidas pueden tener la especificidad de enlace del anticuerpo Act-1 murino, la especificidad epitopica del anticuerpo Act-1 murino (por ejemplo, pueden competir con el Act-1 murino, un anticuerpo Act-1 quimerico, o Act-1 humanizado (por ejemplo, LDP-02) para enlazar con la a4p7 (por ejemplo, en una celula que tiene la integrina a4p7)), y o funcion inhibidora. Una Ab humanizada particularmente preferida es la LDP-02.
La funcion de enlace de una inmunoglobulina humana o humanizada que tiene especificidad de enlace con la integrina a4p7 se puede detectar por metodos inmunologicos estandares, por ejemplo usando ensayos que monitorizan la formacion de un complejo entre la inmunoglobulina humanizada y la integrina a4p7 (por ejemplo, una fraccion de membrana que comprende la integrina a4p7, o^ una celula que tiene la integrina a4p7, como un linfocito humano (por ejemplo, un linfocito del subconjunto CD4+a4hipV°), la llnea celular de los linfocitos humanos o la celula huesped recombinante que comprende el acido nuclelco que codifica a4 y/o p7 que expresa la integrina a4p7. Tambien se pueden usar ensayos de enlace y/o adhesion u otros metodos adecuados en procesos para la identificacion y/o asilamiento de inmunoglobulinas (por ejemplo, inmunoglobulinas humanas y/o humanizadas) (por ejemplo de una biblioteca) con la especificidad requisito (por ejemplo, un ensayo que monitoriza la adhesion entre una celula que tiene una integrina a4p7 y un ligando de la misma (por ejemplo, una segunda celula que expresa MAdCAM, una protelna de fusion MAdCAM inmovilizada (por ejemplo, quimera MAd-CAM-1g), u otros metodos adecuados.
Las partes de inmunoglobulina de origen humano y no humano para el uso de preparar inmunoglobulinas humanizadas incluyen cadenas ligeras, cadenas pesadas y partes de cadenas ligeras y pesadas. Estas partes de inmunoglobulina se pueden obtener o derivar de inmunoglobulinas (por ejemplo, por la slntesis novo de una parte), o se pueden expresar y producir acidos nuclelcos que codifican una inmunoglobulina o cadena de la misma que tienen la propiedad deseada (por ejemplo, enlaza con la integrina a4p7, similitud de secuencia). Las inmunoglobulinas humanizadas que comprenden las partes deseada (por ejemplo, region que enlaza con el antlgeno, CDR, FR, region constante) de origen humano y no humano se pueden producir usando acidos nuclelcos sinteticos y/o recombinantes para preparar genes (por ejemplo, ADNc) que codifican la cadena humanizada deseada. Para preparar una parte de una cadena, se pueden introducir uno o mas codones de parada en la posicion deseada. Por ejemplo, las secuencias de acidos nuclelcos (por ejemplo, ADN) que codifican regiones variables humanizadas recien disenadas pueden ser construidos usando metodos de mutagenesis PCR para alterar las secuencias de ADN existentes (ver por ejemplo, Kamman, M., y otros Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989)). Los cebadores PCR que codifican las nuevas CDRs se pueden hibridizar a una plantilla de ADN de una region variable previamente humanizada que se basa en la misma, o una muy similar, region variable (Sato, K. y otros, Cancer Research 53:851856 (1993)). Si una secuencia de ADN similar no esta disponible para el uso como plantilla, un acido nuclelco que comprende una secuencia que codifica una secuencia de la region variable se puede construir de oligonucleotidos sinteticos (ver por ejemplo, Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). Tambien se puede incorporar una secuencia que codifica un peptido senal en el acido nuclelco (por ejemplo, en la slntesis, en el momento de la insercion en un vector). Si la secuencia del peptido senal natural no esta disponible, se puede usar una secuencia del peptido senal de otro anticuerpo (ver por ejemplo, Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Usando estos metodos, los metodos descritos en la presente u otros metodos adecuados, las variantes pueden ser producidas facilmente. En una realizacion, las regiones variables clonadas (por ejemplo, de la LDP-02) pueden ser mutagenizadas, y se pueden seleccionar las secuencias que codifican variantes con la especificidad deseada (por ejemplo, de una biblioteca de fagos; ver por ejemplo, Krebber y otros., U.S. 5.514.548; Hoogenboom y otros, Wo 93/06213, publicada el 1 de abril de 1993)).
Las inmunoglobulinas humanas y/o humanizadas pueden administrarse (por ejemplo a un humano) con propositos terapeuticos y/o de diagnostico.
Por ejemplo, puede administrarse una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humana que tiene especificidad de enlace par ala integrina a4p7 a un humano para tratar una enfermedad asociada con la infiltracion de leucocitos de los tejidos de la mucosa (por ejemplo enfermedad de colon inflamatoria, como enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa). El tratamiento incluye tratamiento terapeutico o profilactico (por ejemplo, terapia de mantenimiento). De acuerdo con el metodo, la enfermedad se puede prevenir o retrasar (por ejemplo, aparicion retrasada, remision prolongada o quiescencia) o la severidad de la enfermedad se puede reducir en su totalidad o en parte.
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En una realizacion, no se administran mas de alrededor de 8 mg de inmunoglobulina por kg de peso corporal durante un periodo de alrededor de 1 mes. En realizaciones adicionales, no se administran mas de alrededor de 7 o alrededor de 6 o alrededor de 5 o alrededor de 4 o alrededor de 3 o alrededor de 2 o alrededor de 1 mg de inmunoglobulina por kg de peso corporal durante un periodo de alrededor de 1 mes. Como se usa en la presente, el termino "mes" se refiere a un mes de calendario y abarca periodos de 28, 29, 30 y 31 dlas. Cuando se va a administrar un fragmento que enlaza con el antlgeno de una inmunoglobulina humanizada, la cantidad que se administra durante el periodo de alrededor de un mes se puede ajustar de acuerdo con el tamano del fragmento. Por ejemplo, si el fragmento que enlaza con el antlgeno es de alrededor de la mitad del tamano del anticuerpo intacto por peso (por ejemplo, medido en kDa), la cantidad administrada durante un periodo de alrededor de 1 mes puede ser de alrededor de 4 mg por kg de peso corporal o menos. La cantidad de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno administrada se puede expresar como mg/kg de peso corporal o usando cualquier otra unidad adecuada. Por ejemplo, la cantidad de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno administrado se puede expresar como moles de sitios que enlazan con el antlgeno por kg de peso corporal. El numero de moles de sitios que enlazan con el antlgeno es dependiente del tamano, cantidad y Valencia de la inmunoglobulina o fragmento y se puede determinar facilmente. por ejemplo, los fragmentos de IgG y F(ab')2 de la misma son divalentes y una dosis que comprende 1 nanomol de fragmento IgG o F(ab')2 comprende 2 nanomoles de sitios que enlazan con el antlgeno. El tamano de un anticuerpo o fragmento que enlaza con el antlgeno se puede determinar usando cualquier metodo adecuado (por ejemplo, filtracion en gel).
El anticuerpo humanizado o el fragmento que enlaza con el antlgeno se puede administrar en una unica dosis o en una dosis inicial seguida por una o mas dosis posteriores. Cuando se desean multiples dosis, el intervalo entre dosis y la cantidad de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno pueden ser ajustados para conseguir el efecto terapeutico deseado pero no es mas de hasta alrededor de 8 mg de inmunoglobulina o fragmento por kg de peso corporal durante un periodo de alrededor de 1 mes. Preferiblemente, cada dosis comprende independientemente de alrededor de 0,1 a alrededor de 8 mg o de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mg de inmunoglobulina o fragmento por kg de peso corporal. Mas preferiblemente, cada dosis comprende independientemente de alrededor de 0,1 a alrededor de 2,5 mg de inmunoglobulina o fragmento por kg de peso corporal. Mas preferiblemente, cada dosis comprende independientemente alrededor de 0,15, alrededor de 0,5, alrededor de 1,0, alrededor de 1,5 o alrededor de 2,0 mg de inmunoglobulina o fragmento por kg de peso corporal.
El intervalo entre dos dosis cualquiera (por ejemplo, dosis inicial y primera dosis posterior, primera dosis posterior y segunda dosis posterior) puede variar independientemente.
Por ejemplo, se puede administrar la dosis inicial y una primera dosis posterior puede ser administrada alrededor de 1 dla despues. Despues de eso, la segunda y tercera dosis posteriores se pueden administrar en intervalos de alrededor de 1 mes. Generalmente el intervalo mlnimo entre dosis es un periodo de al menos alrededor de 1 dla o al menos alrededor de 7 dlas. En realizaciones particulares, el intervalo mlnimo entre dosis es un periodo de al menos alrededor de 14 dlas, o al menos 21 dlas o al menos alrededor de 1 mes (por ejemplo, 28, 29, 30, 31 dlas. En realizaciones adicionales, el intervalo entre dosis puede ser de al menos alrededor de 40, alrededor de 50, alrededor de 60, alrededor de 70, alrededor de 80, alrededor de 90, alrededor de 100, alrededor de 110 o alrededor de 120 dlas.
La cantidad de inmunoglobulina humanizada o fragmentos que enlazan con el antlgeno de la misma administrada en cada dosis puede ser una cantidad que es suficiente para producir un efecto farmacocinetico o farmacodinamico deseado. Una variedad de parametros farmacocineticos y farmacologicos de inmunoglobulinas humanas y/o humanizadas o fragmentos que enlazan con el antlgeno de las mismas se puede medir usando metodos adecuados. Por ejemplo, los parametros farmacodinamicos de los anticuerpos y fragmentos que enlazan con el antlgeno (por ejemplo, saturacion de antlgeno, inhibicion inducida por anticuerpos de expresion del antlgeno) se pueden medir usando inmunoensayos adecuados. Por ejemplo, como se describe en la presente, la senal de a4p7 (es decir, enlace de anticuerpo etiquetado a a4p7) despues de la administracion de LDP-02 se midio por citometrla de flujo. Los resultados del ensayo revelaron que la administracion de LDP-02 puede resultar en la saturacion de la a4p7 y/o la inhibicion de la expresion de la a4p7 en la superficie de los linfocitos circulantes.
Por lo tanto, cada dosis a ser administrada puede comprender una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para conseguir a) alrededor del 50% o mayor saturacion de los sitios de enlace de la integrina a4p7 en linfocitos circulantes (por ejemplo, celulas CD8+) y/o b) alrededor del 50% o mas inhibicion de la expresion de la integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes durante un periodo de al menos alrededor de 10 dlas despues de la administracion de la dosis. en otras realizaciones, cada dosis puede comprender una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para conseguir y mantener a) alrededor del 60% o mas, alrededor del 70% o mas, alrededor del 80% o mas o alrededor del 85% o mas saturacion de los sitios de enlace de la integrina a4p7 en linfocitos circulantes y/o b) alrededor del 60% o mas, alrededor del 70% o mas, alrededor del 80% o mas o alrededor del 85% o mas inhibicion de la expresion de la integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes durante un periodo de al menos alrededor de 10 dlas despues de la administracion de la dosis.
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En otras realizaciones particulares, cada dosis puede comprender una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para conseguir un grado deseado de saturacion de los sitios de enlace de la integrina a4p7 en linfocitos circulantes (por ejemplo celulas CD8+) y/o inhibir la expresion de la integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes al grado deseado durante un periodo de al menos alrededor de 14 dlas, al menos alrededor de 20 dlas, al menos alrededor de 25 dlas o al menos alrededor de un mes despues de la administracion de la dosis. En realizaciones adicionales, cada dosis puede comprender una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para conseguir un grado deseado de saturacion de los sitios de enlace de la integrina a4p7 en linfocitos circulantes (por ejemplo celulas CD8+) y/o inhibir la expresion de la integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes al grado deseado durante un periodo de al menos alrededor de 40, alrededor de 50, alrededor de 60, alrededor de 70, alrededor de 80, alrededor de 90, alrededor de 100, alrededor de 110 o alrededor de 120 dlas.
Los ensayos adecuados para determinar la dosis de anticuerpo requerida para conseguir una concentracion serica deseada o para saturar y/o inhibir la expresion de un antlgeno objetivo se puede disenar facilmente. Por ejemplo, se puede usar un ensayo basado en la citometrla de flujo para medir la expresion de la a4p7 en la superficie de las celulas aisladas de un sujeto despues de la administracion de una inmunoglobulina (por ejemplo, humanizada) que enlaza con la a4p7. En una realizacion, se puede usar un anticuerpo murino que enlaza con la a4p7humana. Preferiblemente, el anticuerpo murino puede enlazar con un epltopo en la a4p7 que es distinto del epltopo enlazado por la inmunoglobulina humanizada y el enlace del anticuerpo murino con la a4p7 no se inhibe (por ejemplo, bloquea) por el enlace anterior de la inmunoglobulina humanizada. Los anticuerpos murinos u otros anticuerpos con estas propiedades se pueden preparar y seleccionar usando los metodos descritos en la presente u otros metodos adecuados. El nivel de la expresion de a4p7 en linfocitos circulantes (por ejemplo celulas CD8+) aisladas de un humano se puede medir o determinar usando cada uno de los anticuerpos (es decir, inmunoglobulina a ser administrada, anticuerpo murino)9 por citometrla de flujo u otros metodos adecuados. Entonces, el anticuerpo humano o humanizado a ser administrado se puede administrar al humano, se puede sacar sangre periferica en momentos predeterminados despues de al administracion, y los linfocitos pueden ser aislados (por ejemplo, por centrifugacion en gradiente de densidad) para el analisis. Los linfocitos de la sangre periferica (por ejemplo, celulas CD8) pueden ser tenidos con cada uno de los anticuerpos y la cantidad de a4p7 detectada por cada anticuerpo puede ser medida o detectada por citometrla de flujo u otros metodos adecuados. una disminucion en la cantidad de integrina a4p7 medida o determinada usando la inmunoglobulina humana o humanizada es indicativa de a) ocupacion de integrina persistente por la inmunoglobulina administrada (por ejemplo, saturacion de antlgeno) y/o b) inhibicion de la expresion de la a4p7 en la superficie de los linfocitos (por ejemplo, modulacion detenida de la a4p7, derramamiento de la a4p7). Una disminucion en la cantidad de integrina a4p7 medida o detectada usando la inmunoglobulina humana o humanizada junto con ningun cambio en la cantidad de integrina a4p7 medida o determinada usando el anticuerpo murino es indicativa de ocupacion persistente de la a4p7 8por ejemplo, saturacion) por la inmunoglobulina humana o humanizada administrada. Una disminucion en la cantidad de integrina a4p7 medida o detectada usando la inmunoglobulina humana o humanizada junto con una disminucion en la cantidad de integrina a4p7 medida o detectada usando el anticuerpo murino es indicativa de la inhibicion de la expresion de la a4p7 en la superficie de los linfocitos circulantes.
Los parametros farmacocineticos, como la concentracion serica del anticuerpo a lo largo del tiempo despues de la administracion de dicho anticuerpo pueden ser medidos usando un inmunoensayo como un ELISA o un ensayo basado en celulas. Por ejemplo, como se describe en la presente, la concentracion serica de una inmunoglobulina a4p7 humanizada (LDP-02) en puntos temporales predeterminados despues de una unica administracion del anticuerpo (LDP-02) se midio usando un ensayo basado en celulas. Los resultados del ensayo revelaron que la concentracion serica de la LDP-02 puede permanecer elevada (por ejemplo, en o por encima de 1 pg/mL) durante un periodo de alrededor de 10 dlas o mas despues de la administracion del anticuerpo humanizado. La presencia prolongada de la LDP-02 en el suero puede ser indicativa de eficacia superior como resultado de la inhibicion persistente de la funcion de la a4p7, por ejemplo inhibicion persistente de la adhesion mediada por la a4p7de leucocitos con MAdCAM.
En consecuencia, cada dosis a ser administrada puede comprender una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para conseguir y mantener una concentracion serica de al menos 1 pg/mL durante un periodo de al menos alrededor de 10 dlas despues de la administracion de la dosis. En realizaciones particulares, cada dosis puede comprender una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para conseguir y mantener una concentracion serica de al menos 1 pg/mL durante un periodo de al menos alrededor de 14 dlas, al menos alrededor de 20 dlas, al menos alrededor de 25 dlas o al menos alrededor de un mes despues de al administracion de la dosis. En realizaciones adicionales, cada dosis puede comprender una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para conseguir y mantener una concentracion serica de al menos 1 pg/mL durante un periodo de al menos alrededor de 40, alrededor de 50, alrededor de 60, alrededor de 70, alrededor de 80, alrededor de 90,a alrededor de 100, alrededor de 110 o alrededor de 120 dlas.
Como se discute en la presente, los fragmentos que enlazan con el antlgeno de una inmunoglobulina humana o humanizada pueden ser sustancialmente mas pequenos y, por lo tanto, enlazar mas antlgenos (a4p7) por unidad de protelna (pg) que la inmunoglobulina intacta o nativa. En consecuencia, la concentracion serica de un fragmento que enlaza con el antlgeno de una inmunoglobulina humana o humanizada que puede ser indicativa de
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eficacia superior puede ser inferior a 1 pg/mL. Asl, cuando se desea la administracion de un fragmento que enlaza con el antlgeno de una inmunoglobulina humanizada, la dosis puede comprender una cantidad de fragmento que enlaza con el antlgeno que es suficiente para conseguir una concentracion serica que es proporcional a 1 pg/mL, para una inmunoglobulina intacta. Por ejemplo, si el fragmento que enlaza con el antlgeno es de alrededor de la mitad de tamano del anticuerpo intacto por peso (por ejemplo, medido en kDa), la dosis puede comprender una cantidad suficiente para conseguir y mantener una concentracion serica de alrededor de 0,5 pg/mL durante un periodo de al menos alrededor de 10 dlas. La concentracion de suero deseada de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con los antlgenos puede ser expresada como pg/mL o usando cualquier unidad adecuada. Por ejemplo, la cantidad de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno administrada puede ser expresada como moles de sitios de enlace del antlgeno por volumen de suero (por ejemplo, M).
Las inmunoglobulinas humanizadas pueden ser administradas para aplicaciones de diagnostico in vivo o para modular la funcion de al integrina a4p7en aplicaciones terapeuticas (incluyendo profilacticas). Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas se pueden usar para detectar y/o medir el nivel de integrina a4p7 en un sujeto. Por ejemplo, una inmunoglobulina humanizada que tiene una especificidad de enlace para la integrina a4p7 se puede administrar a un humano y complejos anticuerpo-integrina a4p7 que estan formados se pueden detectar usando metodos adecuados. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser etiquetado con, por ejemplo, radionucleidos (125l, mln, tecnecio-99m), una etiqueta de epltopo (tag), una etiqueta de afinidad (por ejemplo, biotina, avidina), un marcador espln, un enzima, un grupo fluorescente o un grupo quimioluminiscente y se pueden usar metodos de deteccion adecuados. En una aplicacion del metodo. las inmunoglobulinas humanizadas pueden ser usadas para analizar tejidos normales frente a inflamados (por ejemplo, de un humano) para la reactividad y/o expresion de la integrina a4p7 (por ejemplo, radiologicamente) o para detectar asociaciones entre EII u otras condiciones y la expresion aumentada de la a4p7 (por ejemplo, en tejidos afectados). Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden ser administradas para la valoracion de la presencia de la integrina a4p7 en tejidos normales frente a inflamados, a traves de la cual se puede valorar la presencia de enfermedad, progreso de la enfermedad y/o eficacia de al terapia anti-integrina a4p7 en la enfermedad inflamatoria.
Las inmunoglobulinas humanizadas (incluyendo los fragmentos que enlazan con el antlgeno) se pueden administrar a un individuo para modular (por ejemplo, inhibir (reducir o evitar) la funcion de enlace y/o la funcion de infiltracion del leucocito (por ejemplo, linfocito, monocito) de la integrina a4p7. Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas que inhiben el enlace de la integrina a4p7 a un ligando (es decir, uno o mas ligandos) se pueden administrar para el tratamiento de enfermedades asociadas con la infiltracion de leucocitos (por ejemplo, linfocitos, monocitos) de tejidos (incluyendo el reclutamiento y/o acumulacion de leucocitos en tejidos), particularmente de tejidos que expresan la molecula MAdCAM. Se administra una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma (es decir, una o mas inmunoglobulinas o fragmentos) a un individuo (por ejemplo, un mamlfero, como un humano u otro primate) para tratar la mencionada enfermedad. Por ejemplo, se pueden tratar las enfermedades inflamatorias, incluyendo las enfermedades que estan asociadas con la infiltracion de leucocitos del tracto gastrointestinal (incluyendo el endotelio asociado a los intestinos), otros tejidos de la mucosa, o tejidos que expresan la molecula MAdCAM-1 (por ejemplo tejidos asociados a los intestinos, como las venulas de la lamina propia del intestino delgado y grueso, y la glandula mamaria (por ejemplo, la glandula mamaria lactante)). De manera similar, se puede tratar a un individuo que tiene una enfermedad asociada con la infiltracion de leucocitos de tejidos como resultado del enlace de leucocitos con celulas (por ejemplo, celulas endoteliales) que expresan MAdCAM-1.
En una realizacion particularmente preferida, las enfermedades que pueden ser tratadas en consecuencia incluyen la enfermedad intestinal inflamatoria (EII), como la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn, ielitis, enfermedad Celiaca, Esprue no tropical, enteropatla asociada con artropatlas seronegativas, colitis microscopica o colagenosa, gastroenteritis eosinofllica, o pouchitis resultante despues de proctocolectomia, y anastomosis ileoanal.
La pancreatitis y la diabetes mellitus dependiente de la insulina son otras enfermedades que se pueden tratar usando el metodo descrito en la presente. Se ha informado que la MAdCAM-1 es expresada por algunos vasos en el pancreas exocrino de ratones NOD (diabeticos no obesos), asl como de ratones BALB/c y SJL. La expresion de MAdCAM-1 fue inducida segun se informa en el endotelio en islotes inflamados del pancreas del raton NOD, y la MAdCAM-1 fue la adresina predominante expresada en el endotelio de islotes NOD en etapas tempranas de al insulitis (Hanninen, A. y otros, C.Clin. Invest., 92:2509-2515 (1993)). Ademas, se observo la acumulacion de linfocitos que expresan la a4p7 dentro de los islotes, y la MAdCAM-1 estaba implicada en el enlace de celulas de linfoma por la a4p7 a vasos de islotes inflamados (Hanninen, A., y otros., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)).
Ejemplos de enfermedades inflamatorias asociadas con los tejidos de la mucosa que pueden ser tratadas de acuerdo con la invencion incluyen colangitis o pericolangitis (conducto biliar y tejido colindante del hlgado) y enfermedad injerto contra huesped (por ejemplo, en el tracto gastrointestinal). Como se ve en la enfermedad de Crohn, la inflamacion a menudo se extiende mas alla de la superficei de la mucosa, por lo tanto las enfermedades inflamatorias cronicas del pulmon que resultan en fibrosis intersticial, como la neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades de colageno, sarcoidosis, y otras condiciones idiopaticas son susceptibles de tratamiento.
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El tratamiento puede ser curativo, inducir la remision o la quiescencia o evitar la recalda o reaparicion de la enfermedad activa. De acuerdo con el metodo, el tratamiento puede ser episodico o cronico (por ejemplo, tratamiento cronico de la enfermedad activa, para mantener la enfermedad quiescente, para inducir a la quiescencia y mantener a la quiescencia), por ejemplo.
En un aspecto particularmente preferido de la divulgacion, una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de enlace para la integrina a4p7 se administra a un humano que tiene enfermedad intestinal cronica, como colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. La inmunoglobulina puede ser administrada para tratar la enfermedad activa y/o para mantener la quiescencia (es decir, inhibir la recalda o la reaparicion). En un aspecto particular de la divulgacion la inmunoglobulina humanizada puede ser administrada para mantener la quiescencia de la enfermedad intestinal inflamatoria que ha sido inducida por el tratamiento con uno o mas de otros agentes (por ejemplo esteroides (prednisona, prednisolona, hormona adrenocorticotropica (ACTH)), ciclosporina A, FK506, anticuerpo que tiene especificidad de enlace con la TNFa (infliximab, CDP571), azatiopreno, 6-mercatopurina, acido 5- aminosalicllico (5-ASA) o compuestos que con tiene 5-ASA (por ejemplo, sulfsalazina, olsalazina, balsalazida), antibioticos (por ejemplo, metronidazol), interleucinas (IL-10, IL-11), nicotina, heparina, talidomida, lidocane) o cirugla (por ejemplo, reseccion intestinal).
La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma es administrado en una cantidad efectiva. Para la terapia, una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para conseguir el efecto terapeutico deseado (incluyendo profilactico) (como, una cantidad suficiente para reducir o evitar el enlace mediado por integrina a4p7 con un ligando de la misma y/o la senalizacion, inhibiendo de este modo la adhesion e infiltracion de leucocitos y/o las respuestas celulares asociadas; una cantidad suficiente para inducir la remision o evitar la recalda o la reaparicion de la enfermedad. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma puede ser administrado en una dosis inicial seguida por una o mas dosis posteriores como se describe en la presente. La cantidad de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno administrada en una dosis particular as! como el intervalo entre dosis puede depender de las caracterlsticas del individuo, como la salud general, edad, sexo, peso corporal, y tolerancia a los farmacos as! como el tipo y severidad de la enfermedad. La persona experta sera capaz de determinar las dosis adecuadas dependiendo de estos y otros factores.
De acuerdo con el metodo descrito en la presente, la inmunoglobulina humanizada puede ser administrada a un individuo (por ejemplo un humano) sola o en conjuncion con otro agente (es decir, uno o mas agentes adicionales). Una inmunoglobulina humanizada puede ser administrada antes, junto con o posteriormente a la administracion del agente adicional. En un aspecto de la divulgacion, se administra mas de una inmunoglobulina humanizada que inhibe el enlace de la integrina a4p7 con sus ligandos. En otra realizacion, se administra un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo humano, anticuerpo humanizado), como un anticuerpo anti-MAdCAM-1, anti- VCAM-1, o anti-ICAM-1, que inhibe el enlace de leucocitos con un ligando endotelial ademas de una inmunoglobulina humanizada que enlaza con la integrina a4p7. En otro aspecto de la divulgacion, se puede administrar un ingrediente farmacologicamente activo adicional (por ejemplo, un compuesto antiinflamatorio, como el acido 5-aminosalicllico (5-ASA) o compuestos que contienen 5-ASA (por ejemplo, sulfsalazina, olsalazina, balsalazida), otro compuesto antiinflamatorio no esteroideo, o un compuesto antiinflamatorio esteroideo (por ejemplo, prednisona, prednisolona, hormona adrenocorticotopica (ACTH)), agentes inmunosupresores (azatiopreno, 6- mercatopurina, ciclosporina A, FK506), inmunomoduladores (por ejemplo, anticuerpos que tiene especificidad de enlace para la TNFa (infliximab, CDP571), talidomida, interleucinas (por ejemplo, IL-10 humana recombinante, IL-11 humana recombinante)) antibioticos (por ejemplo, motronidazol), nicotina, heparina, lidocaina) en conjuncion con una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion.
Son posibles una variedad de vlas de administracion, incluyendo, pro no limitadas necesariamente a, parenteral (por ejemplo, inyeccion intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal, subcutanea), oral (por ejemplo, dietetica), topica, inhalacion, (por ejemplo, intrabronquial, intranasal o inhalacion oral, gotas intranasales), o rectal, dependiendo de la enfermedad o condicion a ser tratada. Se prefiere la administracion parenteral, particularmente la inyeccion intravenosas y la inyeccion subcutanea).
La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma se puede administrar al individuo como parte de una composicion farmaceutica o fisiologica para el tratamiento de una enfermedad asociada con la infiltracion de leucocitos de los tejidos de la mucosa (por ejemplo enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Chron). Dicha composicion puede comprender una inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno que tiene una especificidad de enlace para la integrina a4p7 como se describe en la presente, y un portador farmaceuticamente o fisiologicamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas o fisiologicas para la co-terapia pueden comprende una inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno que tiene especificidad de enlace para la integrina a4p7 y uno o mas agentes terapeuticos adicionales. Una inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno que tiene especificidad de enlace para la funcion de la integrina a4p7 y un agente terapeutico adicional pueden ser componentes de composiciones separadas que se pueden mezclar juntas antes de la administracion o ser administrados de forma separada. La formulacion variara de acuerdo con la via de administracion seleccionada (por ejemplo, solucion, emulsion, capsula). Los portadores adecuados pueden contener ingredientes inertes que no interaction con la inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno y/o agentes terapeuticos adicionales. Se pueden emplear tecnicas de formulacion farmaceuticas
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estandares, como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Los portadores adecuados para la administracion parenteral incluyen, por ejemplo, agua esteril, solucion salina fisiologica, solucion salina bacteriostatica (solucion salina que contiene alrededor de un 0,9% de alcohol bencllico), solucion salina regulada con fosfato, solucion de Hank, lactato de Ringer y similares. Los metodos para encapsular composiciones (como en un recubrimiento de gelatina dura o ciclodextrano) son conocidos en la tecnica (Baker, y otros "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986). Para la inhalacion, el agente se puede solubilizar y cargar en un dispensador adecuado para la administracion (por ejemplo, un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosol presurizado).
La presente invention se ilustrara ahora por los siguientes Ejemplos, que no se pretende que sean limitativos de ninguna manera.
EJEMPLOS
Introduction
La LDP-02 es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado que enlaza con al integrina a4p7, una glicoprotelna de la superficie celular presente en la superficie de la mayorla de los linfocitos T y B, la a4p7media el trafico de linfocitos a la mucosa gastrointestinal y el tejido linfoide asociado a los intestinos a traves de la interaction de adhesion con el receptor de guiado MAdcAM-1. Bloqueando las interacciones a4p7-MAd-CAM-1, la LDP-02 puede inhibir el reclutamiento de leucocitos de la vasculatura a la mucosa gastrointestinal, teniendo as! un efecto beneficioso en la actividad inflamatoria en pacientes afligidos con enfermedad intestinal inflamatoria (EII) como colitis ulcerosa y Enfermedad de Crohn.
Esta section presenta information de las dos pruebas cllnicas de LDP-02 que se han completado. Estas pruebas incluyen un estudio de Fase I completado realizado en sujetos sanos (Estudio L297-007) y una prueba de Fase Ib/IIa completada en pacientes con colitis ulcerosa (UC) (Estudio L-297-006). La tabla 1 describe cada uno de estos estudios.
Tabla 1
- N° de Estudio. #
- Estado del Diseno del Estudio/ Regimen de dosificacion, Dosis, Via Numero d Sujetos
- Sitios Pals
- Estudio Poblacion que participan
- L297-007
- Completado Estudio de unica Dla 1 (dosis unica) Total= 19
- 1
- dosis ascendente, 0.15 mg/kg IV LDP-02= 14
- UK
- placebo-controlado , doble ciego, aleatorizado, de Fase I, 0.15 mg/kg SC Placebo= 5
- Sujetos Masculinos 0.5 mg/kg IV
- Sanos de 18-50anos 1.5 mg/kg IV
- de edad 2.5 mg/kg IV
- L297-006
- Completado Estudio multicentro, Dla 1 (unica dosis) Total= 29
- 5
- dosis unica creciente, 0.15 mg/kg SC LDP-02= 21
- Canada
- placebo-controlada, 0.15 mg/kg IV Placebo= 8
- doble ciego, aleatorizada, Fase 0.5 mg/kg IV
- Ib/IIa 2.0 mg/kg IV
- Pacientes con colitis ulcerosa moderadamente severa. Antes el uso de esteroides fue Placebo IV
- limitado (<20mg/dla). Se permitio el uso de 5-ASAs
Ejemplo 1: Estudio L297-007
El estudio L-297-007 titulado, "Un estudio de Dosis Creciente, Doble Ciego, Placebo-Controlado Investigando la Tolerabilidad, Farmacodinamicas y Farmacocineticas de la LDP02 Dada por las Vlas Subcutanea e
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Intravenosa en Voluntaries Masculinos Sanos" se ha completado con los resultados finales presentados en esta seccion.
Diseno del Estudio
El Estudio L297-007 fue un estudio de dosis unica ascendente, placebo-controlado, doble ciego, aleatorizado en voluntarios masculinos sanos. Los voluntarios masculinos sanos de 18 a 50 anos de edad que cumplieron todos los criterios de inclusion/exclusion fueron inscritos en el estudio secuencialmente por el grupo de estudio y, dentro de cada grupo de estudio, fueron asignados aleatoriamente para recibir LDP-02 o placebo (es decir, regulador de citrato sodico isotonico). Para minimizar el riesgo a los sujetos, la seguridad y la tolerabilidad fueron revisadas a cada nivel de dosis antes de aumentar al siguiente nivel de dosis. Los grupos de tratamiento y numeros de sujetos planeados para el estudio se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 Estudio L-297-007: Grupos de Estudio
- Grupo
- Via de Administracion * LDP-02 # Placebo # sujetos
- Dosis de los sujetos
- 1
- IV 3 0.15 mg/kg
- 1
- SC
- 3 0.15 mg/kg 1
- 2
- IV 3 0.5mg/kg) 1
- 3
- IV 3 1.5mg/kg
- 4
- IV 3 2.5 mg/kg 1
- *SC= administracion subcutanea; IV
- = administracion intravenosa
En el Dla 1 del estudio. se administro la LDP-02 o el placebo o por SC en el muslo (grupo 1 de dosificacion SC solo) o por infusion IV a tasa constante de 30 minutos (Grupos 1-4). Las valoraciones de seguridad incluyeron el registro de eventos adversos, examenes flsicos, signos vitales, laboratorios cllnicos (es decir, hematologla, qulmicas de sangre, y analisis de orina), niveles de citoquina en sangre, y electrocardiogramas de 12 derivaciones (ECGs). Ademas, como esta fue a la primera prueba cllnica de la LDP-02, se llevo a cabo una monitorizacion cardiaca constante antes de la dosis hasta 4 horas despues de la dosis. las muestras de sangre se obtuvieron para evaluar la respuesta anti-anticuerpos a la LDP-02, los niveles de citoquinas, la concentracion de LDP-02 serica (farmacocineticas), y la saturacion y ocupacion del sitio de enlace de los receptores de a4p7 y subconjuntos de linfocitos (farmacodinamicas). Las valoraciones del estudio fueron realizadas en momentos especificados a traves de 36 dlas despues del tratamiento. Siguiendo a los resultados de los analisis farmacocineticos y farmacodinamicos (inmunologicos) del Dla 36, se corrigio el protocolo para permitir extracciones adicionales de sangre para sujetos que recibieron la LDP-02. Estas extracciones de sangre se usaron para seguir los niveles sericos de lDP-02 hasta que se volvieron no cuantificables (es decir, por debajo del llmite de cuantificacion [BLQ] y para asegurar que la saturacion de a4p7 y poblaciones de la memoria celular hablan retornado las niveles de la llnea de base (pre-dosis). Esta correccion fue particularmente importante en los grupos de dosis mas altas donde las caracterlsticas de las cineticas de fase terminal no estaban bien establecidas en el Dla 36.
Resultados del Estudio
Farmacocineticas
El ensayo de la LDP-02 en suero se realizo usando un ensayo basado en celulas validado. Los estandares y muestras fueron incubados con una llnea celular objetivo (HUT-78) que expresa el antlgeno a4p7. despues del lavado, se anadio un IgG1 antihumano policlonal fluorescentemente etiquetado. La intensidad de la fluorescencia se midio por citometrla de flujo y se comparo con la intensidad de la fluorescencia de los estandares de LDP-02. La concentracion de suero efectiva de la LDP-02 fue entonces definida por comparacion de la muestra con una curva estandar generada con concentraciones conocidas de LDP-02.
Las muestras de sangre para la determinacion de la concentracion serica de LDP-02 fueron recogidas antes de la dosis, 1, 1,5, 3, 8, 12 y 24 horas despues de la dosificacion, y en los Dias 3, 5, 7, 8, 15, 22 y 36. Cuando se conocio que la LDP-02 era todavla detectable en el Dla 36, las extracciones de sangre para los sujetos que recibieron la LDP-02 continuo hasta que los niveles hubieron caldo por debajo de los llmites de cuantificacion del ensayo. Trece de los 14 sujetos que recibieron la LDP02 volvieron para extracciones de sangre de seguimiento hasta un maximo de 226 dlas despues de la dosis.
Las concentraciones de LDP-02 a lo largo del tiempo por paciente individual y parametros farmacocineticos medios por grupo de dosis de LDP-02 se presentan en el Apendice al Estudio L297-007. Las concentraciones
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sericas de LDP-02 medias a lo largo del tiempo estan representadas hasta la ultima extraccion de sangre para todos los grupos de tratamiento en la FIGURA 6.
Tabla 3 Estudio L297-007: Parametros Farmacocineticos Medios de la LDP-02 en sujetos Sanos1
- Parametro Farmacocinetico
- I Dosis y Via de Administracion de la LDP-02 (numero de sujetos)
- 0.15 mg/kg SC (n=3)
- 0.15 mg/kg IV (n=3) 0.5 mg/kg IV (n=3) 1.5 mg/kg IV (n=3) 2.5 mg/kg IV (n=2)
- Cmax (pg/mL)
- 1.112 7.648 15.760 118.813 101.749
- (0.519) (3.201) (7.476) (14.544) (5.117)
- tmax (dlas)
- (mediana &
- 6.01 0.13 0.5 0.13 0.05
- intervalo)
- (4.01 - 6.01) (0.04 - 0.33) (0.06-0.5) (0.06- 0.33) (0.04-0.06)
- T1/2z (dlas)
- 4.33 4.39 4.02 14.9 17.1
- (2.23) (151) (0.71) (10.3) (8.91)
- AUC1
- 10.4 19.5 83.6 660 1651
- (pgdla/mL)
- (4.40) (5.00) (18.3) (229) (229)
- Az (1/dla)
- 0.1852 0.1731 0.1763 0.0994 0.0469
- (0.0735) (0.0673) (0.0344) (0.1145) (0.0244)
- AUC
- 11.4 20.3 85.1 755 1747
- (pgdla/mL)
- (5.80) (5.88) (18.2) (308) (95.8)
- AUC
- % Extrapolado
- 5.9 3.4 1.8 9.5 5.7
- (7.3) (3.2) (14) (16.1) (8.0)
- CL*
- 15.3 7.75 6.06 2.31 1.43
- (mLdla/kg)
- (6.26) (193) (132) (1.19) (0.08)
- Vz *
- 82.5 46.6 34.3 54.0 35.9
- (mL/g)
- (6.88) (10.1) (2.84) (51.4) (20.3)
''Todos los valores son medios +/- SD a menos que se indique lo contrario. El SD aparece entre parentesis. *Los plazos de depuracion y volumen para los grupos de dosis SC son la depuracion aparente (CL/F) y el volumen aparente(V2/F).__________________________________________________________________
Los valores se obtuvieron para los parametros farmacocineticos de unica dosis IV medios para los 4 grupos de dosis (Cmax', ti/2z y AUC). Las muestras de seguimientos (es decir, las tomadas mas alla del Dla 36), donde la atencion se centro en la seguridad, permitieron alguna caracterizacion adicional de los perfiles de concentracion- tiempo. La diferencia en los valores de ti/2z entre los 2 grupos de dosis mas baja (0,15 y 0,5 mg/kg) y los grupos de dosis mas alta (1,5 y 2,5 mg/kg) de alrededor de 10 dlas se pueden explicar en que la fase terminal "verdadera" para los grupos de dosis mas alta no se ha caracterizado. Las farmacocineticas no compartimentales de las dosis mas bajas de la LDP-02 (0,15 y 0,5 mg/kg) fueron bien caracterizadas y las farmacocineticas no lineales fueron evidentes a medida que la dosis se aumento hasta 2,5 mg/kg.
Valoracion del Efecto Farmacodinamico de la LDP-02
Se uso un analisis de clasificacion celular activado por fluorescencia (FACS) para medir la presencia de sitios a4p7 en los linfocitos de la sangre periferica antes y despues de la administracion de LDP-02. Para detectar las a4p7 que eran reconocidas por el anticuerpo, se anadio a las muestras de la sangre del paciente ACT-1 etiquetada con biotina, el homologo murino de la LDP-02 y se detectaron usando PR-estreptavidina. La fluorescencia soluble equivalente media estandarizada (MESF) es proporcional al numero de sitios a4p7 detectables.
El enlace de la a4p7 serica a lo largo del tiempo (valores MESF y porcentaje de la llnea de base en cada punto temporal post-dosis) son presentados por sujetos individuales y por grupos de tratamiento en el Apendice al Estudio L297-007.
Como se midio por el analisis FACS, la saturacion media de la integrina a4p7 en los linfocitos a lo largo del tiempo (es decir, al Dla 36) para cada tratamiento se presenta en la FIGURA 7. Como se ve en la Figura 7, no hubo
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deteccion de sitios de enlace a4p7 libres en los linfocitos durante al menos dos semanas despues de la administracion de todas las dosis de LDP-02. entre alrededor del dia 7 y el dia 2, la senal de a4p7 empezo a retornar a la linea de base para el grupo de dosis 0,15 mg/kg IV y para el grupo de dosis 0,15 mg/kg SC. Entre el dia 22 y el dia 36, la senal de a4p7 empezo a retornar a la linea de base para el grupo de dosis 0,5 mg/kg IV. En las dosis mas altas de LDP-02 estudiadas (1,5, y 2,5 mg/kg) la perdida de la senal de a4p7 persistio durante mas de 36 dias despues de las dosis IV sencillas. Para el grupo de dosis 2,5 mg/kg, la saturacion del enlace de la a4p7 continuo hasta el Dia 70 (ver, datos en Apendice al Estudio L297-007).
El muestro de sangre de seguimiento hasta alrededor del Dia de Estudio 200 se hizo para confirmar que los sitios de enlace de a4p7 libres en los linfocitos habian retornado a los niveles de la linea de base (pre-dosis). La reaparicion inicial de los sitios de a4p7 libres parecio tener lugar cuando las concentraciones de sangre de LDP-02 se volvieron no detectables.
Conclusiones
La administracion de la LDP-02 en las dosis IV de 0,15, 0,50, 1,50 y 2,5 mg/kg y una dosis SC de 0,15 mg/kg a sujetos masculinos sanos fue bien tolerada.
Despues de la administracion de todas las dosis de LDP-02 no hubo deteccion de sitios de enlace de a4p7 libres en linfocitos durante aproximadamente dos semanas despues de la dosis. La saturacion de los sitios de enlace de a4p7 continuo hasta aproximadamente 2 semanas despues de la dosificacion para el grupo 0,15 mg/kg IV y hasta aproximadamente 3 semanas despues de la dosis para los grupos 0,15 mg/kg Sc y 0,5 mg/kg IV. La duracion del efecto persistio durante un mes o mas con la dosis 1,5 mg/kg IV y continuo hasta aproximadamente el Dia 70 con el 2,5 mg/kg LDP-02 IV. Las muestras de seguimiento obtenidas despues del Dia 36 demostraron que la expresion de los sitios de enlace de a4p7 libres habian retornado a la linea de base (niveles pre-dosis). No surgieron anticuerpos anti-idiotipo contra la LDP-02 indicando que no inicio una respuesta inmunogenica humoral. Las farmacocineticas no-compartimentales de las dosis mas bajas de LDP-02 (0,15 y 0,5 mg/kg) se volvieron evidentes a medida que la dosis se aumento hasta 2,5 mg/kg.
APENDICE AL ESTUDIO L297-007
Concentration Serica de LDP-02 a lo Largo del Tiempo por sujeto y por Grupo de Tratamiento. Los Datos de los pacientes individuales se presentan en las Tablas 4-9.
Tabla 4 0,15 mg/kg LDP-02 IV
- Sujeto #2 Sujeto # 3 Sujeto # 4 Media pg/mL (n=3)
- Tiempo ( hr)
- Tiempo (dia) pg/mL Tiempo (hr) Tiempo (dia) pg/mL Tiempo (hr) Tiempo (dia) pg/mL
- Pre-
- Pre-
- 0.01 Pre- Pre- 0.01 Pre- Pre- 0.01 0.01
- Dosis
- Dosis
- Dosis
- Dosis
- Dosis
- Dosis
- 1.0
- 0.042 5.24 1.0 0.042 7.98 1.0 0.042 2.48 5.24
- 1.5
- 0.063 5.33 1.5 0.063 6.21 1.5 0.063 3.42 4.99
- 3.0
- 0.125 5.47 3.0 0.125 4.66 3.0 0.125 4.29 4.81
- 8.0
- 0.333 10.67 8.0 0.333 5.10 8.0 0.333 3.26 6.34
- 12.0
- 0.500 4.49 12.0 0.500 4.50 12.0 0.500 2.42 3.80
- 24.0
- 1.000 3.23 24.0 1.000 3.63 24.0 1.000 2.24 3.03
- 72.0
- 3.000 1.84 72.0 3.000 2.94 72.0 3.000 3.05 2.61
- 120.0
- 5.000 1.21 120.0 5.000 1.84 120.0 5.000 1.16 1.40
- 168.0
- 7.000 0.94 168.0 7.000 1.29 168.0 7.000 0.74 0.99
- 192.0
- 8.000 0.63 192.0 8.000 1.13 192.0 8.000 0.70 0.82
- 360.0
- 15.000 0.04 360.0 15.000 0.53 360.0 15.000 0.26 0.28
- 528.0
- 22.000 0.02 528.0 22.000 0.21 528.0 22.000 0.09 0.10
- 864.0
- 36.000 0.02 864.0 36.000 0.01 864.0 36.000 0.01 0.01
- 3912.0 163.000 0.01 3912.0 163.000 0.01 0.01
- 4920.0 205.000 0.01 4752.0 198.000 0.01 0.01
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Tabla 5 0,15 mg/kg LDP-02 SC
Tabla 6 0,5 mg/kg LDP-02 IV
- Sujeto # 9
- Sujeto # 10 Sujeto # 12 Media
- Tiempo (hr)
- Tiempo (day) jjig/mL Tiempo (hr) Tiempo (day) |xg/mL Tiempo (hr) Tiempo (day) (jig/mL ng/mL (n=3)
- Pre- Dosis
- Pre- Dosis
- 0.01 Pre-Dosis Pre-Dosis 0.01 Pre-Dosis Pre-Dosis 0.01 0.01
- 1.0
- 0.042 9.06 1.0 0.042 10.74 1.0 0.042 10.93 10.24
- 1.5
- 0.063 24.39 1.5 0.063 6.62 15 0.063 8.17 13.06
- 3.0
- 0.125 16.37 3.0 0.125 10.14 3.0 0.125 9.94 12.15
- 8.0
- 0.333 15.04 8.0 0.333 9.30 8.0 0.333 9.35 11.23
- 12.0
- 0.500 10.64 12.0 0.500 11.70 12.0 0.500 11.19 11.18
- 24.0
- 1.000 9.17 24.0 1.000 9.00 24.0 1.000 8.52 8.90
- 72.0
- 3.000 5.34 72.0 3.000 7.55 72.0 3.000 7.60 6.83
- 120.0
- 5.000 10.25 120.0 5.000 2.43 120.0 5.000 8.58 7.09
- 168.0
- 7.000 5.74 168.0 7.000 6.59 168.0 7.000 4.93 5.75
- 192.0
- 8.000 3.79 192.0 8.000 2.48 192.0 8.000 4.32 3.53
- 360.0
- 15.000 1.70 360.0 15.000 2.21 360.0 15.000 2.49 2.13
- 528.0
- 22.000 0.41 528.0 22.000 0.12 528.0 22.000 1.65 0.73
- 864.0
- 36.000 0.01 864.0 36.000 0.01 864.0 36.000 0.11 0.04
- 3576.0
- 149.00 0.01 3912.0 163.000 0.01 3576.0 149.000 0.01 0.01
- 5424.0 226.000 0.01 0.01
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Tabla 7 1,5 mg/kg LDP-020 IV
- Sujeto # 13
- Sujeto #15 Sujeto # 16 Media |xg/mL (n=3)
- Tiempo (hr)
- Tempo (dia) (xg/mL Tempo (hr) Tempo (dia) |j,g/mL Tempo (hr) Tempo (dia) p,g/mL
- Pre-
- Pre-
- 0.01 Pre- Pre- 0.01 Pre- Pre- 0.01 0.01
- Dosis
- Dosis
- Dosis Dosis Dosis Dosis
- 1.0
- 0.042 87.62 10 0.042 58.06 1.0 0.042 103.10 82.93
- 1.5
- 0.063 63.67 1.5 0.063 134.97 1.5 0.063 86.05 94.90
- 3.0
- 0.125 92.78 30 0.125 63.78 3.0 0.125 106.78 87.78
- S.O
- 0.333 114.69 8.0 0.333 64.12 8.0 0.333 84.42 87.74
- 12.0
- 0.500 73.02 12.0 0.500 43.76 12.0 0.500 44.09 53.62
- 24.0
- 1.000 99.61 24,0 1.000 77.77 24.0 1.000 71.80 83.06
- 72.0
- 3.000 102.88 72 0 3.000 38.82 72.0 3.000 67.61 69.77
- 120.0
- 5.000 42.46 120.0 5.000 25.26 120.0 5.000 23.95 30.56
- 168.0
- 7.000 26.10 168.0 7.000 18.42 168.0 7.000 23.85 22.79
- 192.0
- 8.000 46.47 192.0 8.000 11.90 192.0 8.000 19.85 26.07
- 360.0
- 15 000 19.83 3600 15.000 580 3600 15.000 19.54 15.06
- 528.0
- 22.000 10.93 528.0 22.000 0.11 528.0 22.000 13.89 8.31
- 864.0
- 36 000 0.19 864.0 36.000 0.69 864.0 36.000 9.49 3.46
- 1968.0
- 82.000 0.48 1968.0 163.000 0.30 0.39
- 3264.0
- 136.000 0.01 3264.0 212.000 0.03 0.02
- 4272.0
- 178.000 0.01 4824.0 201.000 0.01 3960.0 165.000 0.01 0.01
Tabla 8 2,5 mg/kg LDP-02 IV
Sujeto # 18
Tiempo (hr) Tiempo (dia) p.g/mL
Sujeto #19
Tiempo (hr) Tiempo (dia) M-g/mL
Media ixg/mL (n=2)
Pre-Dosis
1.0
1.5
3.0
8.0 12.0
24.0
72.0
120.0 168.0
192.0
360.0
Pre-Dosis
0.042
0.063
0.125
0.333
0.500
1.000
3.000
5.000
7.000
8.000 15.000
0.01
105.37
71.27
73.49
84.00
103.81
68.79
63.30
53.33
50.72
43.47
22.82
Pre-Dosis
1.0
1.5
3.0
8.0 12.0
24.0
72.0
120.0 168.0
192.0
360.0
Pre-Dosis
0.042
0.063
0.125
0.333
0.500
1.000
3.000
5.000
7.000
8.000 15.000
0.01
84.06
98.13
81.59
80.17
85.53
85.52
69.49
59.11
54.63
67.32
23.85
0.01
94.72
84.70
77.54
82.09
94.67 77.15
66.40 56.22
52.67
55.40 23.34
528.0
864.0
1680.0
3312.0
3984.0
22.000
36.000
70.000
138.000
166.000
22.45
17.42
5.48
0.01
0.01
528.0
864.0
1656.0
2976.0
3648.0
4536.0
22.000
36.000
69.000
124.000
152.000
189.000
21.92
20.63
4.63
0.08
0.01
0.01
22.19
19.03
5.06
0.04
0.01
0.01
5
10
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25
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40
45
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Estudio L-297-007: Los Parametros Farmacocineticos Medios por Datos de Grupo de Tratamiento de pacientes individuales se presentan en las Tablas 10-14.
Claims (38)
- 5101520253035404550556065Reivindicaciones1. Una inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma que tiene especificidad de enlace para la integrina a4p7, para su uso en el tratamiento de un humano que tiene una enfermedad seleccionada del grupo consistente de una enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de la insulina, colangitis, pericolangitis y enfermedad de injerto contra huesped, en donde dicho uso comprende administrar la inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma en una dosis inicial seguida por una o mas dosis posteriores y el intervalo mlnimo entre dos dosis cualquiera es un periodo de al menos 1 dla, y en donde no se administran mas de 8 mg de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno por kg de peso corporal durante un periodo de un mes, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno enlaza especlficamente con a4p7 pro no enlace con a4p1 y en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma inhibe el enlace de la integrina a4p7 con MAdCAM-1.
- 2. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de la reivindicacion 1, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma comprende una region de enlace con el antlgeno que comprende tres regiones determinantes complementarias (CDR1, CDR2 y CDR3) de una region variable de cadena ligera y tres regiones determinantes complementarias (CDR1, CDR2 y CDR3) de una region variable de cadena pesada de la secuencia de aminoacidos enunciada a continuacion:cadena ligera: CDR1 SEQ ID NO:9CDR2 SEQ ID NO:10 CDR3 SEQ ID NO:11 cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO:12 CDR2 SEQ ID NO:13 CDR3 SEQ ID NO:14.
- 3. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de la reivindicacion 1, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma comprende una cadena pesada y una cadena ligera, la cadena ligera comprendiendo regiones determinantes complementarias derivadas de un anticuerpo de origen no humano que enlaza con a4p7 y una region marco derivada de una cadena ligera de origen humano, en donde cada una de dichas regiones determinantes complementarias (CDR1, CDR2 y CDR3) comprende la secuencia de aminoacidos enunciada a continuacion:cadena ligera: CDR1 SEQ ID NO:9CDR2 SEQ ID NO:10 CDR3 SEQ ID NO:11la cadena pesada comprendiendo regiones determinantes complementarias derivadas de un anticuerpo de origen no humano que enlaza con a4p7 y una region marco derivada de una cadena pesada de origen humano, en donde cada una de dichas regiones determinantes complementarias (CDR1, CDR2 y CDR3) comprende la secuencia de aminoacidos enunciada a continuacion:cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO:12 CDR2 SEQ ID NO:13 CDR3 SEQ ID NO:14.
- 4. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de la reivindicacion 3, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma comprende la region variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:6.
- 5. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de la reivindicacion 3 o 4, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma comprende a region variable de cadena ligera SEQ ID NO:8.
- 6. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para lograr:a) 50% o mas de saturation de sitios de enlace de integrina a4p7 en linfocitos circulantes,b) 50% o mas de inhibition de expresion de integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes, oc) 50% o mas de sitios de enlace de integrina a4p7 en linfocitos circulantes y 50% o mas de inhibicion de expresion de integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantesen donde (i) dicha saturacion se puede mantener durante un periodo de al menos 10 dlas tras la administration de dichas dosis; (ii) dicha inhibicion se puede mantener durante un periodo de al menos 10 dlas tras la administracion5101520253035404550556065de dichas dosis; o (iii) dicha saturacion e inhibicion se pueden mantener cada una durante un periodo de al menos 10 dlas tras la administracion de dichas dosis.
- 7. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de la reivindicacion 6, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente una cantidad de inmunoglobulina o fragmento que es suficiente para lograr y mantener dicha saturacion y/o inhibicion durante un periodo de al menos 14 dlas, o al menos 20 dlas, o al menos 25 dlas, o al menos 30 dlas, o al menos 60 dlas tras la administracion de dicha dosis.
- 8. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de la reivindicacion 6, en donde cada una de dichas dosis comprende una cantidad de inmunoglobulina que es suficiente para lograr y mantener una concentracion serica de inmunoglobulina de al menos 1 pg/ml durante un periodo de al menos 10 dlas, o al menos 14 dlas, o al menos 20 dlas, o al menos 25 dlas, o al menos 30 dlas, o al menos 60 dlas tras la administracion de dicha dosis.
- 9. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente de 0,1 a 8 mg de inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma por kg de peso corporal.
- 10. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente 0,15, 0,5, 1,0, 1,5 o 2,0 mg de inmunoglobulina o fragmento por kg de peso corporal.
- 11. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el intervalo entre dosis es de al menos 14 dlas, o al menos 21 dlas, o al menos 28 dlas, o al menos 30 dlas.
- 12. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas el uso de una cantidad efectiva de uno o mas agentes terapeuticos adicionales.
- 13. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho uso es para tratar a un humano que tiene enfermedad inflamatoria intestinal.
- 14. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho intervalo entre dos dosis cualquiera es un periodo de 7 dlas.
- 15. Una inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma que tiene especificidad de enlace para la integrina a4p7, para su uso en el tratamiento de recalda y/o recurrencia de enfermedad inflamatoria intestinal quiescente (stet) en donde dicho uso comprende administrar una cantidad efectiva de una inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma que enlaza especlficamente con a4p7, pero no enlaza con a4p1, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma inhibe el enlace de la integrina a4p7 con MAdCAM-1, y en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma se administra en dosis y el intervalo mlnimo entre dos dosis cualquiera es un periodo de al menos 7 dlas, y en donde no se administran mas de 8 mg de inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma por kg de peso corporal durante un periodo de un mes.
-
16. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de la
reivindicacion 15, en donde el intervalo entre dosis es de al menos 14 dlas, o al menos 21 dlas, o al menos un mes. -
17. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de lareivindicacion 15, en donde el intervalo entre dosis es de al menos 40 dlas. -
18. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de lareivindicacion 15, en donde el intervalo entre dosis es de al menos 50 dlas. - 19. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16, 17 o 18, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente de alrededor de 0,1 a alrededor de 8 mg o de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mg o de alrededor de 0,1 a alrededor de 2,5 mg de inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno por kg de peso corporal.
- 20. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16, 17, 18 o 19, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma comprende una region de enlace con el antlgeno que comprende tres regiones determinantes complementarias (CDR1, CDR2 y CDR3) de una region variable de cadena ligera y tres regiones determinantes5101520253035404550556065complementarias (CDR1, CDR2 y CDR3) de una region variable de cadena pesada de la secuencia de aminoacidos enunciada a continuacion:cadena ligera: CDR1 SEQ ID NO:9CDR2 SEQ ID NO:10 CDR3 SEQ ID NO:11 cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO:12 CDR2 SEQ ID NO:13 CDR3 SEQ ID NO:14.
- 21. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de lareivindicacion 6, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente una cantidad deinmunoglobulina que es suficiente para lograr a) 60% o mas de saturacion de sitios de enlace de integrina a4p7 en linfocitos circulantes, b) 60% o mas de inhibicion de expresion de integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes, o c) 60% o mas de saturacion de sitios de enlace de integrina a4p7 en linfocitos circulantes y 60% o mas de inhibicion de expresion de integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes.
- 22. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de lareivindicacion 6, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente una cantidad deinmunoglobulina que es suficiente para lograr a) 70% o mas de saturacion de sitios de enlace de integrina a4p7 en linfocitos circulantes, b) 70% o mas de inhibicion de expresion de integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes, o c) 70% o mas de saturacion de sitios de enlace de integrina a4p7 en linfocitos circulantes y 70% o mas de inhibicion de expresion de integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes.
- 23. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de lareivindicacion 6, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente una cantidad deinmunoglobulina que es suficiente para lograr a) 80% o mas de saturacion de sitios de enlace de integrina a4p7 en linfocitos circulantes, b) 80% o mas de inhibicion de expresion de integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes, o c) 80% o mas de saturacion de sitios de enlace de integrina a4p7 en linfocitos circulantes y 80% o mas de inhibicion de expresion de integrina a4p7 en la superficie celular de linfocitos circulantes.
- 24. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de lareivindicacion 6, en donde cada una de dichas dosis comprende independientemente una cantidad deinmunoglobulina que es suficiente para a) lograr y mantener dicha saturacion durante un periodo de al menos 14, 30 o 60 dlas tras la administracion de dicha dosis, b) lograr y mantener dicha inhibicion durante un periodo de al menos 14, 30 o 60 dlas tras la administracion de dicha dosis, o c) lograr y mantener dicha saturacion e inhibicion durante un periodo de al menos 14, 30 o 60 dlas tras la administracion de dicha dosis.
- 25. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha enfermedad inflamatoria intestinal se selecciona del grupo consistente de Enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
- 26. La inmunoglobulina humanizada o fragmento que enlaza con el antlgeno de la misma para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento que enlaza con el antlgeno se administra a dicho humano subcutaneamente o intravenosamente.ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTTCTGTTGTTCTGGATTCCTGTTTCCGGAGGT1 ---------------—-------------------—---------------------------------------■'------------------------------60TACTTCAACGGACAATCCGACAACCACGAAGACAACAAGACCTAAGGACAAAGGCCTCCA [MKLPVRLLVLLLF WIPVSGG]Peptido SerialGATGTTGTGGTGACTCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGCTTTGGAGATCAAGTTTCT61 — ----------------------------------------------------—■----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 120CTACAACACCACTGAGTTTGAGGTGAGAGGGACGGACAGTCGAAACCTCTAGTTCAAAGA[DVVVTQTPLSLPVSFGDQV SMarco 1ATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGCAAAGAGTTATGGGAACACCTATTTGTCTTGG
121 -----------------------------—----------------------------------------—---------------------------------------------------------------------*----------------------------------------------------------------------------------------------------------------_______------------------------ 180
TAGAGAACGTCCAGATCAGTCTGAGAACGTTTCTCAATACCCTTGTGGATAAACAGAACC IS C] [R S S Q S L A K S Y G N T Y L S][WCDR 1TACCTGCACAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTCCTCATCXATGGGATTTCCAACAGATTT
181 -----------------------------------------------------------------*-------------------------------------------------------------- 240ATGGACGTGTTCGGACCGGTCAGAGGTGTCGAGGAGTAGATACCCTAAAGGTTGTCTAAA YLHKPGQSPQLLI Y][G I s n r f
Marco 2 - CDR 2TCTGGGGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGGACAGATTTCACACTCAAGAXC
■241 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------— 300
AGACCCCACGGTCTGTCCAAGTCACCGTCACCAAGTCCCTGTCTAAAGTGTGAGTTCTAG S](6 . V P DR F S G SG S G TD FT L K IMarco 3
AGCACAATAAAGCCTGAGGACTTGGGAATGTATTACTGCTTACAAGGTACACATCAGCCG 301 -----------r— --------,-------------------------------------------------------------------:------------------------------ 360tcgtgttatttcggactcctgaacccttacataatgacgaatgttccatgtgtagtcggcS T I KPE DLGM YY C] {L Q G T H Q PCDR 3TACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA361 —-----------------<1----------------------------------------------------- ■ 'ATGTGCAAGCCTCCCCCCTGGTTCGACCTTTATTTT Y T][F G G G T K b E I K]Marco 4FIG. 1ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTATCAACAGCTACAAGTGTCCACTCCCAG1 -------------------------------------------------------•------------------------------------------------------------------------' 60TACCCTACCTCGACATAGTAGGAGAAGAACCATAGTTGTCGATGTTCACAGGTGAGGGTC MGWSCI ILFLVSTATS VHS][QPeptido SerialGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGCTGTCC61 -----------------------------------------------------------*-------------------------------------;------------------------------ 120CAGGTTGACGTCGTCGGACCCCGACTCGAACACTTCGGACCCTGAAGTCACTTCGACAGG .V Q L Q Q P GA ELVKPGT S V K LSMarco 1TGCAAGGGTTATGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCeT121 -------------------------------------------------•«*—----------------•----------------------------------------------------- 180ACGTTCCCAATACCGATGTGGAAGTGGTCGATGACCTACGTGACCCACTTCGTCTCCGGA C K G Y G Y T F Tj (S Y W M H] [W V K Q R PCDR 1GGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGAGAGTAATACTAACTACAAT
lal ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 240CCTGTTCCGGAACTCACCTAGCCTCTCTAACTAGGAAGACTCTCATTATGATTGATGTTA G Q G L E W I G] [E IDPSESNTNYN
Marco 2 . CDR 2CAAAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACATrrCCTCCAGCACAGCCTACATG
241 ----------------------------------.r-------—---------------—----------------------------------—--------------— 300GTTTTTAAGTTCCCGTTCCGGTGTAACTGACATCTGTAAAGGAGGTCGTGTCGGATGTACqkfkghkatltvdissstaym Marco 3CAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTACTATTGTGCAAGAGGGGGTTAC301 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 360GTCGAGTCGTCGGACTGTAGACTCCTGAGACGCCAGATGATAACACGTTCTCCCCCAATG Q , L S SLTS EDSAVVyCA R] [G G YGACGGATGGGACTATGCTATTGACTACTGGGGTCAAGGCACCTCAGTCACCGTCTCCTCA •36i -------------------------------------------------------______-----5----------------------—-------------------------- 420CTGCCTACCCTGATACGATAACTGATGACCCCAGTTCCGTGGAGTCAGTGGCAGAGGAGT D G W D Y A I D Y] (W G Q G T S V T V S S]CDR 3 Marco 4FIG. 2- 10 20 30 40
- * * * * * * k k *
- ATG
- AAA TGC ACC TGG GTC ATT CTC TTC TTG GTA TCA ACA GCT ACA AGT
- M
- K C T W V I L F h V S T A T S>
- Sitio de escision dc pcptido individual
- 50
- 60 70 80 90
- *
- * * * Spe I* * ★ * *
- *
- GTC
- CAC TCC1CAG GTC •CAA CTA GTG CAG TCT GGG GCT • GAG GTT AAG AAG
- V
- H S Q V Q b V Q S G A E V X K
- 100
- 110 120 130 140
- * * * * ★ * k * *
- CCT
- GGG GCT TCA GTG -AAG GTG TCC TGC AAG GGT TCT GGC TAC AC® 4BTC
- P
- G A s V K V S C K G S G Y T F>
- Xba I
- 150 160 170 180 190
- *
- *
- * * * * k * k 1 *
- ACC
- AGC TAC TGG ATG CAT TGG GTG AGG CAG GCG CCT GGC CAA CGT CTA
- T
- S Y W M H w V R Q A P G Q S1 t>>
- 200 210 220 230 240
- *
- * * * * k k * * *
- GAG
- TGG ATC GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAG AGT AAT ACT AAC TAC AAT
- E
- w I G E I D P S E S N T N Y N>.
- 250 260 270 280 Nhe I
- * * * k ★ ★ k * ★
- CM
- AAA TTC AAG GGA CGC GTC ACA TTG ACT GTA GAC ATT TCC GCT AGC
- Q
- K F K G R V T i T V D I S A S>
- 290
- 300 310 320 330
- *
- * ★ * k ■ * * * * k
- ACA
- GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACT GCG GTC
- T
- A Y M E L S S L R S E D T A V>
- 340
- 350 360 370 380
- * ★ * * * * * * *
- TAC
- TAT TGT GCA AGA GGG GGT TAC GAC GGA TGG GAC TAT GCT ATT GAC
- Y
- Y
- C A R G G Y D G W D Y A I D>
- 390 400 BstE II 410 420 Region ,430
- k
- * * ■* * * ★ *1 constante >*
- TAC
- TGG GGT CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC tca| GCC TCC ACC AAG
- V
- W G Q G T L| _V____3L_ V S s A S T K>
- 440 450 460 470 480
- *
- * ★ * * * * * k k
- GGC
- CCA TCG GTC TTC ccc CTG GCA CCC TCC rcc AAG AGC ACC TCT GGG
- G
- P S V F p L A P S s K S T S G>
- 490 500 510 520
- ★ k * * * k * * * Edad I
- GGC
- ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG
- G
- T A A L G C L V K D Y F P El P>
530 540* | * *GTG ACG GTG TCG _Vj T V S>FIG. 310*20*30*40*ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TtG GTG CTT CTG TTG TTC TGG ATT CCT- M
- K L p
- 50
- Bst>E I 60
- *
- *
- *
- GTT
- TCC GGA GGT
- V
- S G G
VRLLVL LL F Sitio de escision de peptido individual vo so* * * * *GAT GTT GTG ATG ACT CAA AGT CCA CTCW I90★TCC CTGV VHP>*CCTP>
100 110 120 130 140
* * * * * * * * *GTC ACC CCT GGA GAA CCA GCT TCT ATC TCT TGC AGG TCT AGT CAG AGT
V T P G E P A S I S C R S S Q S>180 Asp 718lfc *190*
150 160 170* * * * * * i __________CTT GCA AAG AGT TAT GGG AAC ACC TAT TTG TCT TGG TAC CTG CAG AAGLAKS YGNTYLS |W Y jL Q K> -
200 . 210 220 230 240
*Msc X ■* ** * * * * * *CcJFgGC Chk TCT CCA CAG CTC CTC ATC TAT GGG ATT TCC AAC AGA TTT
P G Q S P Q L L I Y G I S N R F>250*260*270*280*TCT GGG GTG CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGT TCA GGG ACA GAT TTCACAT- G V P
- D R
- 290
- 300 Nrul
- * *
- *
- CTC AAG ATC
- TCG CGA
- L K I
- S R
34 0 *DF>VQ390*350*400*310*320*GTA GAG GCT GAG GAC GTG GGA V- E
- A E D V G V Y
- 360 *
- * 370 ★ * 3 80 *
- CCG P.
- TAC Y ACG T TTC GGA F G CAG Q GGG ACC G T
- 410 ★
- Kas I
- GCG A!
- GCG A CC P>
33 0* *GTG TAT TACY>K>FIG. 4Cadena Ligera- CDRJ
- R S S Q S L A K SYGNTYLS
- CDR2
- G I S N R F S
- CDR3
- L Q G T H Q P Y T
Cadena Pesada CDR1CDR2CDR3S Y W M HE l D P S E SNTNYNQ K FKG GGYDGWDYAIDYFIG. 5imagen1 Datos Farmacocineticos medios: L297-007 - 100.00
- 10.00
- 0.15 mg/kg IV
- 0.15 mg/kg SC
- 0.5 mg/kg IV1.001.5 mg/kg IV
- 2.5 mg/kg IV
- 0.10
- 0.01100150Dia de estudio (aproximado en d£as >36FIG. 6
imagen2 —*6— 2.5 mg/kg IV120%£ 100% **§ - 0.15 mg/kg SC80%
- 0.15 mg/kg IV
- 0.5 mg/kg IV60%1.5 mg/kg IV<30%20%DiaFIG. 7
imagen3 Perfiles LDP-02 sencos mediosEstudio L297-006 fase lb/lla100Medio +/- SD 0.15 mgrtig s.cMedio +/- SD 0.1 5 mg/kg i.vMedio +/- SD 0.S mg/kg i.v.Medio +/- SD 2.0 mg/kg i.vTiempo (dias)FIG. 8imagen4
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