CN113302288A

CN113302288A - 控制癌症中细胞状态转变的方法

Info

Publication number: CN113302288A
Application number: CN201980088659.8A
Authority: CN
Inventors: 谭伟梁; 卢思羽; 卓丽萍
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2018-11-12
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2021-08-24
Also published as: JP2022513024A; SG11202104963WA; WO2020101571A1; EP3880803A1; US20220008358A1; EP3880803A4

Abstract

本发明涉及一种通过将癌细胞与间充质‑上皮转化诱导剂足以导致在细胞中诱导MET的时间和条件下接触而在基底样(或间充质样)癌细胞中诱导间充质‑上皮转化(MET)的方法。此外，还提供了一种抑制受试者中癌症的上皮间充质转化(EMT)的方法，该方法包括：在足以抑制受试者中癌症的上皮间充质转化(EMT)的时间和条件下，施用脂质代谢抑制剂或调节剂。

Description

控制癌症中细胞状态转变的方法

技术领域

本发明涉及癌症生物学领域。特别地，提供了一种在癌细胞中诱导间充质-上皮转化(MET)的方法。

背景技术

乳腺癌是一种异质性疾病，其按受体表达状态进行典型地分层；这需要不同的治疗策略来实现最佳的疾病控制。虽然雌激素受体阳性(ER+)和ERRB2/HER2阳性肿瘤通常对靶向治疗反应良好，但三阴性乳腺癌(TNBC)亚型定义为不存在ER、孕激素受体(PR)和HER2表达，缺乏有针对性的方法，并且仍然难以接受标准护理化疗。在TNBC的临床管理中制定新的辅助治疗方案方面取得的进展有限，针对TNBC的治疗药物的II期和III期试验缺乏前景。这强调需要探索更有效的TNBC治疗策略。癌细胞中上皮间质转化(EMT)程序的激活通常归因于耐药表型的获得，部分原因是获得了癌症干细胞样特性。几项研究从概念上表明，EMT程序的逆转，即间充质-上皮转化(MET)，可能会导致癌细胞重新获得对化疗的敏感性。

虽然受体状态一直是临床分类、预后和管理决策的主要依据之一，但基因表达谱已被应用于将乳腺癌分为几种“内在”分子亚型：Luminal A、Luminal B、HER2富集(HER2-enriched)亚型、基底样(Basal-like)亚型以及紧密连接蛋白低表达(Claudin-low)亚型。尽管仍有一些争论，但已经观察到ER+肿瘤倾向于管腔样(管腔样)型并表达“上皮”标记基因，例如E-钙粘蛋白，而TNBC带有基底样基因特征并表达“间充质”标记，包括密蛋白和波形蛋白。在细胞状态转变期间，“上皮”或“间充质”特征的获得是否确实分别与管腔样或基底样癌有关，尚不清楚。除了细胞状态的变化之外，MET可能能够将基底样乳腺癌转化为更偏向于管腔样乳腺癌，其中表达ER或管腔细胞角蛋白。

EMT程序是公认的，可以通过细胞外和细胞内信号通路的改变来调节。例如，TGFβ和PDGF等外在信号导致细胞内信号转导级联的激活，最终导致EMT相关转录因子(如TWIST、SNAIL、SLUG和ZEB1)的激活。相比之下，促进MET的途径似乎更加多样化且定义不清。例如，毛喉素诱导的MET通过激活导致表观遗传重编程的cAMP途径起作用，而据报道，TGFβ抑制剂可介导生殖干细胞中的MET。在这两种情况下，精确的机制仍然难以捉摸。此外，尽管原则上可能对cAMP激活或TGFβ受体抑制等潜在途径的生化或遗传调节可能有助于促进MET，但它们在临床相关应用中的潜力可能不会出现。

虽然控制细胞状态的信号通路和转录调节因子已被充分了解，但其他新出现的方面，尤其是对癌细胞功能有贡献的代谢，仍然知之甚少。代谢改变已重新成为肿瘤的标志，强调了代谢途径在调节肿瘤细胞行为中的作用及其治疗意义。绝大多数研究都集中在评估癌细胞和正常细胞之间的代谢差异，特别是对糖酵解的需求。鉴于癌细胞之间的表型多样性和可塑性，关于其代谢特征对功能适应的关联和贡献知之甚少。表面上，癌细胞在细胞状态之间的转变需要不同的能量需求来支持这些功能。

发明内容

本文提供了一种在癌细胞中诱导间充质-上皮转化(MET)的方法。一方面，提供了一种在癌细胞中诱导间充质-上皮转化(MET)的方法，所述方法包括：使细胞与间充质-上皮转化诱导剂在足以在细胞中诱导MET的时间和条件下接触，其中，所述癌细胞是基底样(间充质样)癌细胞。这种癌细胞属于癌症的间充质亚型。

一方面，提供了用于在患者的细胞中诱导间充质-上皮转化(MET)的间充质-上皮转化(MET)诱导剂。

一方面，提供了间充质-上皮转化(MET)诱导剂在制备用于在患者的细胞中诱导间充质-上皮转化的药物中的用途。

一方面，提供了一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：在治疗患者的癌症的时间和条件下，将间充质-上皮转化(MET)诱导剂与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或者脂质代谢抑制剂或调节剂组合施用于患者。

一方面，提供了一种用于在有需要的患者中治疗癌症的间充质-上皮转化(MET)诱导剂，其中，将所述间充质-上皮转化(MET)诱导剂与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂组合施用于患者。

一方面，提供了间充质-上皮转化(MET)诱导剂在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途，其中，将所述药物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂组合施用于患者。

一方面，提供了一种使癌症患者对抗癌疗法敏感的方法，所述方法包括：在使患者对抗癌疗法敏感的时间和条件下，对患者施用视黄素。

一方面，提供了一种用于使癌症患者对抗癌疗法敏感的间充质-上皮转化(MET)诱导剂。

一方面，提供了间充质-上皮转化(MET)诱导剂在制备用于使患者对抗癌疗法敏感的药物中的用途。

一方面，提供了一种鉴定诱导细胞间充质-上皮转化的药剂的方法，所述方法包括：

a)将细胞与待筛选的测试药剂接触；和

b)检测选自由CD24、CD44、CD166、CDH1、ZEB1和SEPINE1组成的群组的基因的启动子的表达；其中，一种或多种基因的表达与对照相比的变化表明测试药剂能够诱导细胞中的间充质-上皮转化。

在一个方面，提供了一种鉴定对组合疗法有反应的癌症患者的方法，所述组合疗法包含诱导间充质-上皮转化(MET)的化合物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂的组合，所述方法包括：对从所述患者获得的样品进行癌症的间充质亚型的检测，其中，基底样癌的存在表明患者对组合疗法有反应。

一方面，提供了一种鉴定和治疗对组合疗法有反应的癌症患者的方法，所述组合疗法包含诱导间充质-上皮转化(MET)的化合物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂的组合，所述方法包括：对从所述患者获得的样品进行癌症的间充质亚型的检测，其中癌症的间充质亚型的存在表明患者对组合疗法有反应；以及用组合疗法治疗患者。

一方面，提供了一种抑制受试者中癌症的上皮间充质转化(EMT)的方法，所述方法包括：在足以抑制所述受试者中癌症的上皮间充质转化(EMT)的时间和条件下，施用脂质代谢抑制剂或调节剂。

一方面，提供了用于抑制受试者中癌症的上皮-间质转化(EMT)的脂质代谢抑制剂或调节剂。

一方面，提供了脂质代谢抑制剂或调节剂在制备用于抑制受试者中癌症的上皮-间质转化(EMT)的药物中的用途。

一方面，提供了一种阻断或预防受试者中癌症转移的方法，所述方法包括：在足以阻断或预防受试者中癌转移的时间和条件下，施用脂质代谢抑制剂或调节剂。

一方面，提供了一种用于阻断或预防受试者中癌症转移的脂质代谢抑制剂或调节剂。

一方面，提供了脂质代谢抑制剂或调节剂在制备用于阻断或预防受试者中癌症转移的药物中的用途。

简要附图说明

某些实施例由以下附图说明。应当理解，以下描述仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在对描述进行限制。

图1：高通量化学库筛选将视黄素确定为间充质-上皮转化的促进剂(A)使用小分子化合物库生成用于MET筛选的报告细胞系。(B)用A83-01处理的NAMEC8-SERPINElprom-Luc细胞的Dual-glo荧光酶检测。数据表示为平均FF/Ren+/-SEM，n＝3，**P＜0.01通过学生t检验。(C)使用LOPAC、抗癌药物、激酶抑制剂和生物活性脂质库筛选的NAMEC8-SERPINE1prom-Luc细胞的Dual-glo荧光酶检测。数据表示为平均FF/Ren，n＝3。命中以红色圈出。(D)具有61种化合物的初级和次级筛选的散点图。绘制了来自两个筛选的FF/Ren值并计算了线性趋势线。(E)41种化合物的Dual-glo荧光素酶测定以5点剂量反应进行。化合物根据生理功能分为9类。数据表示为平均FF/Ren，n＝3。灰色框代表由DMSO导致＜50％细胞活力的剂量。

图2：视黄素诱导基底样乳腺癌细胞转化为管腔并增强其对化疗的敏感性(A)用DMSO、贝沙罗汀(1μM)或TTNPB(1μM)处理的NAMEC8的细胞形态图像。图像以50倍放大率拍摄。刻度代表100μm。(B)贝沙罗汀处理的NAMEC8细胞相对于DMSO的EMT和谱系标记基因的表达。通过学生t检验，数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(C)DMSO相比贝沙罗汀处理的NAMEC细胞中EMT和谱系标记的蛋白质表达。贝沙罗汀以0.1μM、0.5μM和1μM的递增浓度处理。β-肌动蛋白用作上样对照。(D)DMSO相比贝沙罗汀处理的NAMEC8细胞中EMT和谱系标记的免疫荧光染色。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。(E)DMSO相比贝沙罗汀处理的NAMEC8细胞中CD44染色的流式细胞术直方图。(F)DMSO与贝沙罗汀或TTNPB处理的NAMEC8细胞的乳腺球形成测定。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。右下角：条形图显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01。(G)在BC2.2、BC22.1、BC29.1、MetBr-007 DR、BC24.1、BC33.1中EMT和谱系标记的蛋白质表达：DMSO相比贝沙罗汀处理的细胞。β-肌动蛋白用作上样对照。(H)BC2.2中EMT和谱系标记的免疫荧光染色：DMSO相比贝沙罗汀处理的细胞。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。(I)DMSO相比贝沙罗汀处理的BC2.2细胞的乳腺球形成试验。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。右图：条形图显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01。(J)在存在或不存在10μM5-FU的情况下，用贝沙罗汀处理的NAMEC8的细胞形态图像。图像以50倍放大率拍摄。(K)DMSO与贝沙罗汀处理的NAMEC8细胞对不同浓度的5-FU的剂量反应图。IC50值显示在下方的表中。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3。(L)SUM159PAC-R细胞生成过程示意图(顶部)。SUM159PT与PACR细胞对不同PAC浓度的剂量反应图(底部)。IC50值显示在表中。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3。(M)DMSO相比贝沙罗汀处理的SUM159PACR细胞对不同浓度的5-FU的剂量反应图。IC50值显示在表中。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3。

图3：视黄素治疗促进MET并降低TNBC细胞在动物中的致瘤性(A)在皮下注射到NSG小鼠中之前，用DMSO、贝沙罗汀或TTNPB预处理的SUM159的肿瘤测量(顶部)。数据表示为平均直径+/-SEM，对于DMSO，n＝6，对于贝沙罗汀和TTNPB，n＝8个肿瘤，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。在植入后第7周和第8周处死的小鼠肿瘤的代表性图像(底部)。(B)在皮下注射到NSG小鼠中之前用DMSO、贝沙罗汀或ATRA预处理的MCF7-Ras的肿瘤大小(顶部)。数据表示为平均直径+/-SEM，对于DMSO，n＝4，对于贝沙罗汀和ATRA，n＝6个肿瘤。在植入后第9周处死的小鼠肿瘤的代表性图像(底部)。(C)小鼠异种移植实验工作流程示意图(顶部)。来自NAMEC8-Ras(左)、BC2.2(中)和BC22.1(右)中对照小鼠相比贝沙罗汀喂养的小鼠的肿瘤大小(底部)。数据表示为平均直径+/-SEM，对照组n＝6，贝沙罗汀(NAMEC8-Ras)n＝4，对照和贝沙罗汀(BC2.2和BC22.1)n＝7，*P＜0.05，**P＜0.01。(D)对照小鼠相比贝沙罗汀喂养小鼠中形成的NAMEC8-Ras肿瘤切片的苏木精和伊红染色。图像以200倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。(E)对照小鼠相比贝沙罗汀喂养小鼠的NAMEC8-Ras肿瘤切片中EMT和谱系标记的免疫荧光染色。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。(F)相对于对照小鼠的肿瘤，在贝沙罗汀喂养的小鼠中形成的NAMEC8-Ras(顶部)和BC2.2(底部)肿瘤中视黄酸反应基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。

图4：表观遗传扰动增强并增加了视黄素诱导的细胞状态变化的持久性(A)用表观遗传化合物处理的NAMEC8-SERPINE1prom-Luc细胞的Dual-glo荧光酶活性图。数据表示为平均FF/Ren，n＝3。命中以红色圈出。(B)用贝沙罗汀处理的NAMEC8-SERPINE1prom-Luc细胞的Dual-glo荧光酶活性图，加上单个表观遗传化合物。数据表示为平均FF/Ren，n＝3。命中以红色圈出。(C)用DMSO、贝沙罗汀、CI-994、SBHA、贝沙罗汀+C1-994或贝沙罗汀+SBHA处理的NAMEC8细胞形态图像。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(D)用DMSO、贝沙罗汀、CI-994、SBHA、贝沙罗汀+C1-994或贝沙罗汀+SBHA处理的NAMEC8的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。(E)用DMSO、贝沙罗汀+CI-994、贝沙罗汀+SBHA(药物“开启”)处理并停用7-10天(药物“关闭”)的NAMEC8细胞形态图像。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(F)用DMSO、贝沙罗汀、CI-994、贝沙罗汀+CI-994、-贝沙罗汀和-(贝沙罗汀+CI-994)处理的NAMEC8的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。(G)BC2.2中KRT5(顶部)和KRT8(底部)在用DMSO、贝沙罗汀、CI-994、贝沙罗汀+CI994、-贝沙罗汀、-(贝沙罗汀+CI994)进行免疫荧光染色。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。(H)用DMSO、贝沙罗汀、CI-994、贝沙罗汀+CI-994、-贝沙罗汀、-(贝沙罗汀+CI-994)处理的NAMEC8的乳腺球形成测定。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。图表显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。(I)视黄素受体和表观遗传调控因子对基因表达的转录调控。在间充质细胞状态下，RAR和RXR往往与HDACs等辅抑制因子结合，从而抑制上皮基因的转录。暴露于贝沙罗汀会导致RAR和RXR的激活，从而导致蛋白质相互作用从辅抑制因子变为共激活因子。HDAC抑制通过维持基因启动子处的组蛋白乙酰化来帮助增强基因转录活性。

图5：脂质代谢基因受视黄素受体调节(A)经DMSO、ST(短期；7天)贝沙罗汀或LT(长期；14天)贝沙罗汀处理的NAMEC8中，使用RXRα、RARα、H3K27ac和p300抗体的ChIP-seq峰的全局热图。(B)显示NAMEC8中ST-和LT-贝沙罗汀处理后RXRα、RARα、H3K27ac和p300在基因体中的占有率的图。(C)基因轨迹描述了ST-和LT-贝沙罗汀处理过的NAMEC8中STRA6、DHRS3、PLIN1、PLIN2和ACSL5位点的RXRα和H3K27ac结合增加，以及MGLL位点的RXRα和H3K27ac结合减少。x轴显示染色体位置，基因结构如下方所示，每个刻度单位代表5kb。y轴以每bp的rpm为单位显示基因组占有率。(D)在NAMEC8中使用贝沙罗汀处理后与RXRα结合有所增强的基因的基因本体通路富集分析。(E)在贝沙罗汀处理后的NAMEC8中通过增强H3K27ac信号进行排列的超级增强子图。(F)在贝沙罗汀处理后的NAMEC8、SUM159细胞、MetBr-007DR、BC29.1和BC22.1细胞中脂质相关基因的热图。数据代表log2倍数变化。(G)与NAMEC8(顶部)和BC2.2(底部)中的DMSO相关的贝沙罗汀处理后参与TAG合成的脂质相关基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图6：间充质-上皮转化通过将脂肪酸引导至脂滴存储来限制β-氧化。(a)在DMSO相比贝沙罗汀处理的NAMEC8细胞中通过LC-MSMS测量到的相对脂质含量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。贝沙罗汀处理后上调的基因通过RT-PCR验证(红色)。(b)DMSO相比贝沙罗汀处理的NAMEC8、SUM159和BC2.2中的脂滴染色。图像以200倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。(c)在以下条件下在NAMEC8细胞中的乳腺球形成测定。用贝沙罗汀、FSG67或FSG67+贝沙罗汀处理(左)。在存在或不存在贝沙罗汀的情况下暴露Ctrl sh或shAGPAT细胞(中间)。在贝沙罗汀和AmidepsineA的各种组合存在的情况下进行治疗(右)。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(d)在存在或不存在棕榈酸酯的情况下，DMSO相比贝沙罗汀处理的NAMEC8细胞的耗氧率(OCR)。黑色箭头表示脂肪酸β-氧化(FAO)的速率。(e)HMLE相比NAMEC8细胞中通过LC-MSMS测量到的相对脂质含量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3。经RT-PCR验证的NAMEC8中相对于HMLE的下调基因为蓝色。(f)HMLE与NAMEC8中的脂滴染色。图像以10倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。Seahorse在一组乳腺癌细胞系中测量的脂肪酸β-氧化(FAO)速率。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3。(g)BT549和MCF7在基础培养基(含1％FBS、2.5mM葡萄糖的DMEM)、补充有25mM葡萄糖、20μM棕榈酸酯或20μM硫辛酸的基础培养基中生长6天的细胞活力测定。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3。

图7：间充质-上皮转化的诱导依赖于脂肪酸修饰剂肉碱棕榈酰转移酶。a)用贝沙罗汀、依托莫司、贝沙罗汀+依托莫司、-贝沙罗汀、-(贝沙罗汀+依托莫司)处理的NAMEC8的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。b)用贝沙罗汀、依托莫司、贝沙罗汀+依托莫司、-贝沙罗汀、-(贝沙罗汀+依托莫司)处理的NAMEC8的乳腺球形成测定。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。图表显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，***P＜0.001，****P＜0.0001。c)用DMSO或贝沙罗汀处理的NAMEC8Ctrlsh、CPT1A-sh1和sh2细胞中的脂滴染色。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。d)用DMSO或贝沙罗汀处理的NAMEC8Ctrlsh和CPT1A-sh1细胞的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。e)用DMSO和贝沙罗汀处理的NAMEC8Ctrlsh、CPT1A-sh1和sh2细胞的乳腺球形成测定(左)。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。显示CPT1A敲低的蛋白质表达(右上)。图表显示了＞100μm的球体数量(右下角)。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01，***P＜0.001。f)NAMEC8空白对照中的脂滴染色，CPT1A-1-和CPT1A-2-过表达NAMEC8细胞用DMSO或贝沙罗汀处理。图像以200倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。g)NAMEC8空白对照和用DMSO或贝沙罗汀处理的CPTlA-1过表达细胞的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。h)NAMEC8空白对照、用DMSO和贝沙罗汀处理的CPT1A-1-和CPT1A-2-过表达细胞的乳腺球形成测定(左)。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。显示CPT1A过表达的蛋白质表达(右上)。图表显示了＞100μm的球体数量(右下角)。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，****P＜0.0001。

图8：脂肪酸氧化受损使脂质重新引导至支持上皮细胞状态并阻止EMT。a)HMLE-TwistER对照与4OHT诱导细胞(顶部)、HMLE-Zeb1对照与DOX诱导的细胞(中间)，MCF7-Slug+Sox9对照与DOX诱导的细胞中的脂滴染色。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。b)在存在或不存在棕榈酸酯的情况下，HMLE-TwistER对照与4-OHT诱导的细胞的耗氧率(OCR)(左)。黑色箭头表示FAO的比率。HMLE-TwistER对照与4OHT诱导细胞中的FAO比率(右)。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05。c)在存在或不存在4-OHT的情况下，用依托莫司处理的HMLE-Twist ER的形态学。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。d)在存在或不存在4-OHT的情况下，用依托莫司处理的HMLE-Twist ER中EMT标志物的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。e)MCF7-Slug+Sox9Ctrlsh和shCPT1A细胞+/-DOX诱导中的脂滴染色。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。f)MCF7-Slug+Sox9Ctrlsh和shCPTlA细胞+/-DOX诱导的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。g)小鼠异种移植实验的工作流程示意图(上)。左下：E-钙粘蛋白和波形蛋白在对照组(无DOX)与DOX组以及依托莫司+DOX组(放大200倍)中形成的原发性肿瘤中的免疫荧光染色。比例尺代表50μm。还显示了整体荧光肺图像(放大100倍)和肺转移灶肺切片的组织学(放大10倍)。白色比例尺代表100μm，黑色比例尺代表50μm。右下：图表显示每个肺的转移灶数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝5技术重复，**P＜0.01。h)说明驱动上皮细胞和间充质细胞状态的不同脂肪酸代谢的模型。在间充质细胞状态下，β-氧化很高，脂质储存最少。在诱导MET后，上皮细胞状态的特征在于抑制β-氧化和脂质储存的积累。

图9.(A)用LOPAC(左上)、抗癌药物(右上)、激酶抑制剂(左下)和生物活性脂质(下)处理的NAMEC8-SERPINElprom-Luc细胞Dual-glo荧光酶检测的Z-分数。数据表示为平均值，n＝3。

图10.(A)用DMSO、贝沙罗汀(1μM)或TTNPB(1μM)处理的SUM159的细胞形态图像。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(B)贝沙罗汀处理的SUM159细胞相对于DMSO处理而言EMT和谱系标记基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(C)DMSO相比贝沙罗汀处理的SUM159细胞中EMT和谱系标记的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。(D)DMSO相比贝沙罗汀处理的SUM159细胞中CD24和CD44表达的流式细胞术分析。(E)DMSO、贝沙罗汀或TTNPB处理的SUM159细胞的乳腺球形成测定。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。条形图显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。(F)贝沙罗汀相对于DMSO处理的BC2.2、BC22.1和BC29.1细胞的EMT和谱系标记基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(G)用DMSO或贝沙罗汀处理的BC22.1(左)和BC29.1(右)中EMT和谱系标记的免疫荧光染色。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(H)DMSO相比贝沙罗汀处理的BC22.1(顶部)和BC29.1(底部)的乳腺球形成分析。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。条形图显示＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05。(I)用增加剂量的贝沙罗汀或1μMTTNPB处理的NAMEC8细胞中雌激素受体元件(ERE)报告基因活性的荧光素酶测定。数据表示为平均FF/Ren+/-SEM，n＝3，*P＜0.05。(J)用贝沙罗汀处理的NAMEC8和BC2.2中雌激素受体(ER)靶基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05。(K)DMSO与贝沙罗汀处理的NAMEC8对不同浓度的盐酸雷洛昔芬的剂量响应图。IC50值显示在表中。(L)相对于DMSO，贝沙罗汀处理中BC24.1(左)和BC33.1(右)的EMT和谱系标记基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3。(M)使用Ctrl shRNA或RXRαshRNA在NAMEC8中敲低RXRα。β-肌动蛋白用作上样对照。(N)相对于DMSO，贝沙罗汀处理的NAMEC8 Ctrl shRNA和RXRαsh1细胞的EMT和谱系基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05。(O)用DMSO或贝沙罗汀处理的NAMEC8 Ctrl shRNA和RXRαsh1中EMT和谱系标记的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。(P)DMSO相比贝沙罗汀处理的SUM159(中)、BC2.2(右)细胞对不同浓度的5-FU的剂量反应图。IC50值显示在下方表格中。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3。(Q)在存在或不存在2nM紫杉醇的情况下，用贝沙罗汀处理的NAMEC8的细胞形态图像。图像以50倍放大率拍摄。(R)DMSO与贝沙罗汀处理的NAMEC8对不同浓度PAC的剂量响应图。IC50值显示在表中。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3(S)DMSO与贝沙罗汀处理的SUM159 PACR细胞的形态。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(T)相对于DMSO，贝沙罗汀处理的SUM159PACR细胞的EMT和谱系标记基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(U)DMSO与贝沙罗汀处理的SUM159PACR的EMT和谱系标记的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。(V)DMSO或贝沙罗汀处理的SUM159 PACR细胞的乳腺球形成测定。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。条形图显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01。

图11.(A)在第7周和第8周(顶部)用DMSO、贝沙罗汀或TTNPB预处理的SUM159的肿瘤重量。在第7周和第8周(底部)用DMSO、贝沙罗汀或TTNPB预处理的SUM159的肿瘤体积。数据表示为平均值+/-SEM，n＝6。(B)用DMSO、贝沙罗汀或ATRA预处理的MCF7-Ras的肿瘤重量(顶部)和肿瘤体积(底部)。数据表示为平均值+/-SEM，n＝6。(C)在6天内用DMSO、贝沙罗汀或ATRA处理的NAMEC8(左)、MCF7(中)和MCF10A(右)细胞活力(通过MTS分析测量)。数据代表平均值+/-SEM，n＝3。(D)对照小鼠与贝沙罗汀喂养小鼠中形成的NAMEC8-Ras、BC2.2和BC22.1肿瘤的图像。(E)NAMEC8-Ras、BC2.2和BC22.1肿瘤在对照小鼠与贝沙罗汀喂养小鼠中形成的肿瘤重量(顶部)。NAMEC8-Ras、BC2.2、BC22.1肿瘤在对照小鼠与贝沙罗汀喂养小鼠中形成的肿瘤体积(底部)。数据表示为平均值+/-SEM，n＝6。(F)对照小鼠与贝沙罗汀喂养小鼠的BC2.2肿瘤切片中EMT和谱系标记的免疫荧光染色。图像以200倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。

图12.(A)相对于DMSO，用贝沙罗汀、CI-994或贝沙罗汀+CI-994处理的NAMEC8(左)和SUM159(右)中EMT和谱系标记基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(B)NAMEC8-SERPINE1prom-Luc细胞的Dual-glo荧光酶检测，首先用DMSO、贝沙罗汀处理，然后停用化合物24小时、48小时或72小时(药物“关闭”)。数据表示为平均值+/-SEM，n＝6，**P＜0.01，***P＜0.001。(C)NAMEC8-SERPINE1prom-Luc细胞的Dual-glo荧光酶检测，首先用DMSO、贝沙罗汀+CI-994处理的，然后停用化合物24小时、48小时或72小时(药物“关闭”)。数据表示为平均值+/-SEM，n＝6，****P＜0.0001。(D)用DMSO、贝沙罗汀、SBHA、贝沙罗汀+SBHA、-贝沙罗汀、-(贝沙罗汀+SBHA)处理的NAMEC8的乳腺球形成测定。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。图表显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(E)用贝沙罗汀、CI-994、贝沙罗汀+CI-994、-贝沙罗汀或-(贝沙罗汀+CI-994)处理的SUM159(顶部)和BC2.2(底部)的乳腺球形成测定。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。图表显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图13.(A)用DMSO、ST(短期；7天)贝沙罗汀或LT(长期；14天)贝沙罗汀体处理的SUM159中，使用RXRα、RARα、H3K27ac和p300抗体的ChIP-Seq峰的全局热图。(B)图显示了ST-和LT-贝沙罗汀处理后的SUM159细胞中RXRα、RARα、H3K27ac和p300在基因体中的占有率。(C)基因轨迹描述了ST-和LT-贝沙罗汀处理后的SUM159细胞中，STRA6、DHRS3、PLIN1、PLIN2和ACSL5基因座处RXRα和H3K27ac结合的增加，以及MGLL基因座处RXRα和H3K27ac结合的减少。x轴显示染色体位置，基因结构如下图所示，每个刻度单位代表5kb。y轴以每bp的rpm为单位显示基因组占有率。(D)对来自RNA-Seq的基因进行基因本体通路富集分析，这些基因在经LT贝沙罗汀处理后的SUM159中log2倍数变化＞1。(E)来自RNA-Seq的基因的基因本体通路富集分析，在贝沙罗汀处理后的MetBr-007-DR中log2倍数变化＞1。(F)贝沙罗汀处理的SUM159中，通过增加H3K27ac信号而排列的超级增强子图。(G)与相比DMSO，TTNPB处理后的NAMEC8中参与TAG合成的脂质相关基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。

图14：间充质-上皮转化通过将脂肪酸引导至脂滴储存来限制β-氧化。a)BC29.1和BC22.1的脂滴染色：DMSO相比贝沙罗汀处理。图像以200倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。b)在以下条件下处理的NAMEC8中的脂滴染色：用贝沙罗汀、FSG67或FSG67+贝沙罗汀治疗(左)；Ctrl sh或shAGPAT细胞暴露于在存在或不存在贝沙罗汀的情况(中间)；在贝沙罗汀和AmidepsineA的各种组合存在的情况下进行处理(右)。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。c)在以下条件下NAMEC8细胞中上皮和管腔标志物的蛋白质表达：用贝沙罗汀、FSG67或FSG67+贝沙罗汀处理(左)；Ctrl sh或shAGPAT细胞暴露于存在或不存在贝沙罗汀的情况(中间)；在贝沙罗汀和AmidepsineA的各种组合存在的情况下进行处理(右)。β-肌动蛋白用作上样对照。d)图表显示在以下条件下NAMEC8细胞中乳腺球形成试验的球数＞100μm：用贝沙罗汀、FSG67或FSG67+贝沙罗汀处理(左)；Ctrl sh或shAGPAT细胞于暴露于存在或不存在贝沙罗汀的情况下(中间)；在贝沙罗汀和AmidepsineA的各种组合存在的情况下进行治疗(右)。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。e)SUM159(左)和BC2.2(右)的耗氧率(OCR)：DMSO相比贝沙罗汀，存在或不存在棕榈酸酯。黑色箭头表示脂肪酸β-氧化(FAO)的速率。f)显示NAMEC8(左)、SUM159(中)和BC2.2(右)中的FAO比率的图表：DMSO相比贝沙罗汀处理。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01，***P＜0.001。g)相对于HMLE，NAMEC8中参与TAG合成的脂质相关基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。

图15：间充质-上皮转化的诱导依赖于脂肪酸修饰剂肉碱棕榈酰转移酶。a)图表显示了在用贝沙罗汀、依托莫司、贝沙罗汀+依托莫司处理的SUM159中FAO的比率。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01，***P＜0.001。b)用贝沙罗汀、依托莫克、贝沙罗汀+依托莫克、-贝沙罗汀或-(贝沙罗汀+依托莫司)处理的NAMEC8的形态。图像以100倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。c)用贝沙罗汀、依托莫司或贝沙罗汀+依托莫司处理的NAMEC8的EMT和视黄素反应基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。d)用贝沙罗汀、依托莫司、贝沙罗汀+依托莫司、-贝沙罗汀或-(贝沙罗汀+依托莫司)处理的SUM159的乳腺球形成测定。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。图表显示了＞100μm的球体数量。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。e)图显示了用DMSO或贝沙罗汀处理的载体或CPT1A过表达SUM159细胞中的FAO比率。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，**P＜0.01。f)用DMSO或贝沙罗汀处理的SUM159载体、CPT1A-1-和CPT1A-2过表达细胞的脂滴染色。图像以200倍放大率拍摄。刻度代表50μm。g)用DMSO或贝沙罗汀处理的NAMEC8载体和CPT1A过表达细胞的形态学。图像以40倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。h)用DMSO和贝沙罗汀处理的SUM159载体、CPT1A-1和CPT1A-2过表达细胞的乳腺球形成测定(左)。图像以50倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。显示CPT1A过表达的蛋白质表达(右上)。图表显示了＞100μm的球体数量(右下角)。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，****P＜0.0001。

图16：脂肪酸氧化的损伤使脂质重新引导至支持上皮细胞状态并阻断EMT。(a)相比对照，在存在或不存在4-OHT的情况下用依托莫司处理的HMLE-Twist ER中EMT基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。(b)相对于对照，在存在或不存在多西环素诱导的情况下，用依托莫司处理的MCF7-Slug+Sox9中EMT基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。(c)在存在或不存在多西环素诱导的情况下，用依托莫司处理的MCF7-Slug+Sox9中EMT标记的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。(d)相对于对照，在存在或不存在多西环素诱导的情况下，用依托莫司处理的HMLE-Zeb1的细胞形态图像。图像以40倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。(e)相对于Ctrlsh细胞，MCF7-Slug+Sox9Ctrlsh和shCPT1A细胞+/-DOX诱导中EMT基因的基因表达。数据表示为平均值+/-SEM，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。(f)相对于对照，在存在或不存在TGFβ的情况下，用依托莫司处理的A549的细胞形态图像。图像以40倍放大率拍摄。比例尺代表50μm。(g)在存在或不存在TGFβ的情况下，用依托莫司处理的A549中EMT标志物的蛋白质表达。β-肌动蛋白用作上样对照。

图17：表观遗传文库筛选以确定有效的MET诱导剂。(A)用表观遗传文库筛选的NAMEC8-SERPINE1细胞的Dual-glo荧光酶检测，以确定MET诱导剂。数据表示为SERPINE1启动子活性(平均FF/Ren值)针对海肾的细胞活力，n＝3。A83-01(黑色圆圈)作为阳性对照，SERPINE1启动子活性低于A83-01的化合物被确定为命中(红色圆圈)。(B)以6点剂量反应进行的MET筛选结果的Dual-glo荧光酶检测。数据表示为SERPINE1启动子活性(平均FF/Ren值)相对于浓度，n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001，ns，不显著。(C)用DMSO和表观遗传化合物处理的NAMEC8的细胞形态图像。LLY-283和GSK591在20nM下使用，UNC0642和SGC-CBP30在1μM下使用。只有SGC-CBP30处理导致上皮样形态。图像以4倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(D)用表观遗传命中处理的NAMEC8的EMT和基底/管腔基因的qRT-PCR分析。显示了相对于DMSO的mRNA水平。数据表示为平均值，±SEM，n＝3。(E)NAMEC8中EMT和基底/管腔标记物在表观遗传命中处理后的免疫印迹分析。与其他化合物相比，SGC-CBP30表现出最剧烈的变化。β-肌动蛋白用作上样对照。(F)左：NAMEC8的乳腺球形成分析在用表观遗传命中处理后。在三种测试化合物中观察到乳腺球形成和球体尺寸的显著减少。图像以4倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。右：条形图代表肿瘤球数＞50μm。数据表示为平均值，±SEM，n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，ns，不显著。(G)NAMEC8、DMSO与SGC-CBP30处理细胞中CD44和CD24染色的流式细胞术分析。在SGC-CBP30处理后观察到CD44表达降低的细胞群，表明对非干细胞样状态的诱导。

图18：CREBBP/EP300溴结构域抑制在SUM159 TNBC细胞系中诱导MET。(A)用DMSO和表观遗传化合物处理的SUM159的细胞形态图像。LLY-283和GSK591在30nM下使用，UNC0642和SGC-CBP30在2μM下使用。图像以4倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(B)SUM159中EMT和基底/管腔标记物在表观遗传命中处理后的免疫印迹分析。β-肌动蛋白用作上样对照。(C)顶部：SUM159在表观遗传命中处理后的乳腺球形成分析。在SGC-CBP30处理的细胞中观察到乳腺球形成和球体大小的显著减少。图像以4倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。底部：条形图表示＞50μm的肿瘤球体数量。数据表示为平均值，±SEM，n＝3，*p＜0.05。(D)SUM159、DMSO与SGC-CBP30处理细胞中CD44和CD24染色的流式细胞术分析。细胞表达降低的CD44表达和更高的CD24表达，表明对非干细胞样状态的诱导。

图19：CREBBP/EP300溴结构域抑制在体内降低了基底样TNBC的肿瘤负荷。(A)用1μM的A-485处理的NAMEC8的细胞形态图像。在A-485处理后观察到上皮样形态。图像以4倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。(B)用A-485处理后NAMEC8中EMT和基底/管腔标记的免疫印迹分析。β-肌动蛋白用作上样对照。(C)顶部：用A-485处理后NAMEC8的乳腺球形成分析。观察到球形成和球尺寸的减少。图像以4倍放大率拍摄。比例尺代表100μm。底部：条形图表示＞50μm的肿瘤球体数量。数据表示为平均值，±SEM，n＝3，ns，不显著。(D)NAMEC8、DMSO与A-485处理细胞中CD44和CD24染色的流式细胞仪分析。细胞表达更高的CD44表达处理，表明A-485未能诱导干细胞样特征的丧失。(E)用SGC-CBP30和A-485处理后NAMEC8中组蛋白乙酰化标记的免疫印迹分析。H3和β-肌动蛋白用作上样对照。(F)顶部：在皮下注射到NSG小鼠之前，用DMSO、SGC-CBP30和A-485预处理的NAMEC8-Ras的肿瘤大小。数据表示为平均值，±SEM，n＝3，*p＜0.05，ns，不显著。底部：来自第11周处死的小鼠的肿瘤图像。SGC-CBP30治疗显著减少了小鼠的肿瘤形成。(G)工作模型显示在溴结构域抑制后CREBBP/EP300诱导的TNBC细胞状态转变。在没有溴结构域抑制剂的情况下，CREBBP和EP300可以识别组蛋白上的乙酰化赖氨酸以介导间充质基因激活，从而维持细胞处于间充质状态。然而，溴结构域抑制剂的存在会阻断CREBBP和EP300蛋白的阅读功能，从而减少维持间充质细胞状态所需的基因转录调控。

图20：用于确定有效MET诱导剂的代谢库筛选。(A)NAMEC8-SERPINE1细胞的Dual-glo荧光素酶测定用代谢文库筛选以确定MET诱导剂。数据表示为SERPINE1启动子活性(平均FF/Ren值)针对海肾的细胞活力，n＝3。确定为命中的化合物以红色圈出。(B)确定为命中的化合物汇总在表中，其各自的分子靶标列在右栏中。(C)在5点剂量反应下进行的MET筛选结果的Dual-glo荧光酶检测。数据表示为SERPINE1启动子活性(平均FF/Ren值)与浓度的关系，C-IN-1谷氨酰胺酶抑制剂显示出降低SERPINE1启动子活性的剂量反应效应。(D)蛋白质印迹显示上皮和间充质乳腺癌细胞系中的GLS1表达。(E)用500nMC-IN-1处理的NAMEC8的细胞形态图像。(F)用MET命中处理后，NAMEC8中EMT和基底/管腔标记的免疫印迹分析。(G)使用3shRNA敲低NAMEC8中GLS1的蛋白质印迹显示。(H)NAMEC8 ctrlsh与GLS1sh2和GLS1sh3用紫杉醇处理的细胞滴度发光测定。GLSsh2细胞的IC50低于Ctrlsh细胞。(I)具有sh2和sh3的NAMEC8Hras细胞中GLS1敲低的蛋白质印迹。(J)NAMEC8HrasCtrlshvsGLS1sh2vsGLS1sh3细胞的乳腺球测定。7天后计数＞100um的球。(K)NAMEC8HrasCtrlsh和GLS1sh2细胞被皮下注射到NSG小鼠中，并在8周内跟踪肿瘤生长。

详细描述

间充质-上皮转化诱导剂

本文提供了在癌细胞中诱导间充质-上皮转化(MET)的方法。一方面，提供了一种在癌细胞中诱导MET的方法，所述方法包括将细胞与间充质-上皮转化诱导剂在足以诱导细胞中的MET的时间和条件下接触，其中，所述癌细胞是一种基底样(或间充质样)癌细胞。

细胞状态转变可以控制癌细胞的功能行为，控制它们的致瘤性和对治疗的反应。上皮间质转化(EMT)可以赋予癌症干细胞样特性，并增强肿瘤细胞的致瘤潜力和耐药性。EMT在TNBC中可能高度激活，导致复发和化疗耐药。发明人已经发现间充质-上皮转化(MET)，EMT的逆过程，可以抑制这些表型，并使肿瘤对包括化学疗法和免疫疗法在内的各种标准护理疗法敏感。具体而言，发明人开发了：(I)可用于鉴定可改善癌症反应的药物、化学探针和药物靶标的技术平台；(ii)增强抗肿瘤反应的新型组合疗法；(iii)新的药物靶点，其激活或抑制可以逆转耐药性，使肿瘤对包括化学疗法和免疫疗法在内的各种标准护理疗法敏感，并抑制肿瘤生长。

在一实施方案中，提供了一种抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括将细胞与间充质-上皮转化诱导剂在足以抑制癌细胞生长的时间和条件下接触，其中，癌细胞是一种基底样(或间充质样)癌细胞。

术语“上皮”或“上皮样”是本领域所理解的，并且可以通过形态、分子和/或功能特征来识别。例如，与间充质细胞相比，上皮细胞或上皮样细胞通常具有圆形或鹅卵石外观，表达上皮标志物E-钙粘蛋白，快速分裂和/或具有相对低水平的运动性、侵袭性和/或贴壁依赖性生长。

术语“间充质的”或“间充质样的”是本领域所理解的，并且可以通过形态、分子和/或功能特征来识别。例如，与上皮细胞相比，间充质或间充质样细胞通常具有细长或纺锤形的外观，表达间充质标志物波形蛋白、纤连蛋白和N-钙粘蛋白，分裂缓慢或不分裂和/或具有相对高水平的运动性、侵袭性和/或不依赖贴壁生长。

术语“上皮-间充质转化”(“EMT”)是本领域已知的，是指上皮癌细胞呈现间充质表型的过程，这被认为是与癌转移有关。此外，虽然不希望受到任何理论的限制，但这些间充质细胞通常表现出降低的粘附性、增加的运动性和侵袭性，并且对化学治疗剂和/或辐射(例如针对快速分裂细胞的治疗)具有相对抗性。

术语“间充质-上皮转化”(“MET”)在本领域中也是已知的，并且指经历EMT的细胞重编程以重新获得一种或多种上皮特征(例如如上所述)。例如，此类细胞通常表现出降低的运动性和/或侵袭性和/或快速分裂，从而可能重新获得对细胞毒剂的敏感性。

在一实施方案中，该方法可以是体外、体内或离体方法。

MET诱导剂可以是选自由TGFβ抑制剂、腺苷/肾上腺素能、GABA或NMDA受体调节剂、神经递质、表观遗传修饰化合物所组成的群组的化合物。

在一实施方案中，MET诱导剂选自由以下组成的群组：阿莫替尼(MP-470)、Evista(盐酸雷洛昔芬)、异维甲酸、SB216763、维甲酸(Aberela)、1，3-二丙基-8-对磺基苯基黄嘌呤、5-溴-2’-脱氧尿苷、盐酸阿普洛尔、盐酸胺碘酮、盐酸阿扑吗啡半水合物、硝酸甲基阿托品、斑蝥酸、L-798106、L-天冬氨酸、Rhodblock 6、TNP、贝沙罗汀、PD-161570、SB-525334、13-顺式-视黄酸、AC-55649、盐酸雷洛昔芬、视黄酸、他扎罗汀、TTNPB、U0126、阿莫替尼(MP-470)、AG-490、Abitrexate(甲氨蝶呤)、Roscovitin(Seliciclib，CYC202)、PIK-294、U0126-EtOH、PH-797804、Arry-380、二磷酸莫替沙尼(AMG-706)、CH5132799、PIK-93、KN-62、16，16-二甲基前列腺素D2、SB431542、前列腺素D2乙醇酰胺、6-酮前列腺素E1、普罗斯左汀(Prostratin)、CAY10587、15-脱氧-_12，14-前列腺素D2、UCM707、D4476、16-苯氧基丁诺前列腺素A2、KN-93、前列腺素D2-1-glycerylester、C-8神经酰胺、S-乙基N-[4-(三氟甲基)苯基]异硫脲(盐酸盐)、LLY-283，GSK591，UNC0642、SGC-CBP30、丹参酮I、血红素、奥托非尼(Autophinib)、β-拉帕醌、Vps34-PIK-III、谷氨酰胺酶C-IN-1、GSK256066、AN-2728、GSK2837808A、阿维A酯、芬维A胺、T0901317、AGI-6780、SW033291以及NCT-503。

在一实施方案中，MET诱导剂是视黄素。视黄素可以例如是脱氢视黄醇、双脱氢视黄醇、维甲酸(视黄酸)、异维甲酸、阿利维甲酸、阿维A酯、阿维A酸、阿达帕林、贝沙罗汀、13-顺式-视黄酸、他扎罗汀、TTNPB、阿维A酯或芬维A胺。

在一实施方案中，视黄素是视黄酸受体α(RAR-α)激动剂或视黄酸X受体α(RXR-α)激动剂。RAR-α激动剂可以是TTNPB、IRX5183、SY-1425、阿维A酯或芬维A胺。RXR-α激动剂可以是贝沙罗汀。

所述MET诱导剂可以是代谢酶或途径的调节剂(例如抑制剂或诱导剂)。例如，代谢酶或途径的调节剂可以是谷氨酰胺酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、自噬调节剂、磷脂酶抑制剂、拓扑异构酶、PI3K、乳酸脱氢酶、15-PGDH或磷酸甘油酸脱氢酶。

在一实施方案中，MET诱导剂是谷氨酰胺酶抑制剂。谷氨酰胺酶抑制剂可以是谷氨酰胺酶C-IN-1、CB839(Telaglenastat)、UPGL00004或BPTES。谷氨酰胺酶抑制剂可以是谷氨酰胺酶1(GLS1)抑制剂。谷氨酰胺酶抑制剂可以是谷氨酰胺酶C抑制剂或肾型谷氨酰胺酶(KGA)抑制剂。

在一实施方案中，MET诱导剂是磷酸二酯酶(PDE)抑制剂。在一实施方案中，PDE抑制剂是PDE4抑制剂。在一实施方案中，PDE抑制剂是GSK256066或AN-2728。

在一实施方案中，MET诱导剂是自噬的调节剂(例如抑制剂或诱导剂)。自噬调节剂可以是血红素、奥托非尼、β-拉帕酮、Vps34-PIK-III或芬维A胺。

MET诱导剂可以是磷脂酶抑制剂(例如丹参酮I)，拓扑异构酶(例如β-拉帕醌)，PI3K(Vps34-PIK-III、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Alpelisib)，乳酸脱氢酶(例如GSK28378158A)，15-PGDH(例如SW033291)或磷酸甘油酸脱氢酶(例如NCT-503)。

MET诱导剂可以是表观遗传修饰化合物。表观遗传修饰化合物可以是p300/CREBBP溴结构域、蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)或组蛋白甲基转移酶的抑制剂。

在一实施方案中，MET诱导剂是p300/CREBBP溴结构域抑制剂。p300/CREBBP溴结构域抑制剂可以是SGC-CBP30、GNE-272或GNE-781。

在一实施方案中，MET诱导剂是PRMT5抑制剂。PRMT5的抑制剂可以是LLY-283或GSK591。

在一实施方案中，MET诱导剂可以是组蛋白甲基转移酶(例如G9a和/或GLP)的抑制剂。在一实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是UNC0642。

上皮间质转化抑制剂

MET诱导剂也可以是EMT的抑制剂。在一实施方案中，MET抑制剂是选自TGFβ抑制剂、腺苷/肾上腺素能、GABA或NMDA受体调节剂、神经递质、表观遗传修饰化合物的化合物。在一实施方案中，EMT抑制剂是视黄素。

在一实施方案中，EMT抑制剂选自以下组成的群组：阿莫替尼(MP-470)、Evista(盐酸雷洛昔芬)、异维甲酸、SB 216763、维甲酸(Aberela)、1，3-二丙基-8-对磺基苯基黄嘌呤、5-溴-2’-脱氧尿苷、盐酸阿普洛尔、盐酸胺碘酮、盐酸阿扑吗啡半水合物、硝酸甲基阿托品、斑蝥酸、L-798106、L-天冬氨酸、Rhodblock 6、TNP、贝沙罗汀、PD-161570、SB-525334、13-顺式-视黄酸、AC-55649、盐酸雷洛昔芬、视黄酸、他扎罗汀、TTNPB、U0126、阿莫替尼(MP-470)、AG-490、Abitrexate(甲氨蝶呤)、Roscovitine(Seliciclib，CYC202)、PIK-294、U0126-EtOH、PH-797804、Arry-380、二磷酸莫替沙尼(AMG-706)、CH5132799、PIK-93、KN-62、16，16-二甲基前列腺素D2、SB 431542、前列腺素D2乙醇酰胺、6-酮前列腺素E1、普罗斯左汀、CAY10587、15-脱氧-_12，14-前列腺素D2、UCM707、D 4476、16-苯氧基丁诺前列腺素A2、KN-93、前列腺素D2-1-甘油酯、C-8神经酰胺以及S-乙基N-[4-(三氟甲基)苯基]异硫脲(盐酸盐)。

在一实施方案中，EMT抑制剂是脂质代谢的抑制剂或调节剂(或脂肪酸氧化的抑制剂)。

所述脂质代谢抑制剂可以是肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)的抑制剂。在一实施方案中，CPT1的抑制剂是依托莫司、哌克昔林、替格列卡(teglicar)或羟苯甘氨酸。在一实施方案中，CPT1的抑制剂是依托莫司。

所述脂质代谢抑制剂可以是线粒体硫解酶的抑制剂。在一实施方案中，线粒体硫解酶的抑制剂是4-溴巴豆酸。

所述脂质代谢抑制剂可以是长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)的抑制剂。在一实施方案中，ACSL的抑制剂是Triacsin C或噻唑烷二酮(TZD)。

所述脂质代谢抑制剂可以是3-酮酰基辅酶A硫解酶(3-KAT)的抑制剂。在一实施方案中，3-KAT的抑制剂是曲美他嗪或雷诺嗪。

所述脂质代谢抑制剂可以是单酰基甘油脂肪酶(MGLL)的抑制剂。在一实施方案中，MGLL的抑制剂是JZL184。

所述癌细胞可以是基底样乳腺癌或TNBC，但不是管腔/ER+乳腺癌。在一实施方案中，癌细胞选自三阴性乳腺癌和间充质样癌，例如头颈癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌和结直肠癌。

所述癌细胞可以是化疗抗性癌细胞。换言之，所述癌细胞可能是对抗癌疗法反应差或基本上无反应的细胞。在一实施方案中，所述癌细胞是一种对标准护理疗法有抗性的细胞。

癌细胞也可以是转移性癌细胞。

药物组合

通过涉及视黄素和表观遗传调节剂的组合疗法方法，可以实现更有效和更持久的癌症控制。发明人已经表明，几种表观遗传调节剂本身也可以诱导MET。它们与视黄素的组合可以进一步增强和维持MET转化表型。

通过视黄素诱导的MET将间充质细胞转化为上皮表型也可以使细胞对免疫肿瘤药物(如免疫检查点抑制剂)敏感。视黄素可能通过增强T辅助细胞和T调节细胞群、增加I型和II型干扰素信号、干扰素γ信号、增加细胞因子介导的信号和激活补体级联反应而具有免疫调节作用(表4A和4B)。

在一实施方案中，该方法进一步包括：在癌细胞中诱导MET后，将细胞与化学治疗剂(例如紫杉醇或5-氟尿嘧啶)、表观遗传修饰化合物(例如I类HDAC抑制剂(例如C1-994和SBHA))或免疫调节剂接触。该方法可以包括同时或顺序地使细胞与间充质上皮转化的诱导剂接触。

在一实施方案中，该方法进一步包括使细胞与化学治疗剂接触。所述化学治疗剂可选自由：苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、多柔比星、美沙拉嗪、沙利度胺、来那度胺、替西罗莫司、依维莫司、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、福斯塔马替尼、紫杉醇、多西他赛、奥法木单抗、利妥昔单抗、地塞米松、泼尼松、CAL-101、伊布单抗、托西妥单抗、硼替佐米、喷司他丁、内皮抑素或其组合所组成的群组。

在一实施方案中，该方法进一步包括使细胞与表观遗传修饰化合物接触。表观遗传修饰化合物可以是HDAC抑制剂。HDAC抑制剂可以是I类HDAC抑制剂。HDAC抑制剂可选自异羟肟酸伏立诺他(SAHA)、贝利司他(PXD101)、LAQ824和帕比司他(LBH589)；和苯甲酰胺：恩替司他(MS-275)、泰克地那林(CI994)和mocetinostat(MGCD0103)。

在一实施方案中，该方法进一步包括：使细胞与免疫调节剂接触。在一实施方案中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。

如本文所用，术语“免疫检查点”是指CD4和CD8 T细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子有效地充当“刹车”以下调或抑制抗肿瘤免疫反应。免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡配体1(PD-L1，也称为B7-H1、CD274)，程序性死亡1(PD-1)，CTLA-4，B7H1，B7H4，OX-40，CD137，CD40，2B4，IDO1，IDO2，VISTA，CD27，CD28，PD-L2(B7-DC，CD273)，LAG3，CD80，CD86，PDL2，B7H3，HVEM，BTLA，KIR，GAL9，TIM3，A2aR，MARCO(具有胶原结构的巨噬细胞受体)，PS(磷脂酰丝氨酸)，ICOS(诱导性T细胞共刺激剂)，HAVCR2，CD276，VT70CN1和CD160。

如本文所用，“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点分子活性的任何调节剂。免疫检查点抑制剂包括：小分子抑制剂、抗体、抗体衍生物(包括Fab片段和scFv)、抗体-药物偶联物、反义寡核苷酸、siRNA、适体、肽和肽模拟物。降低免疫检查点分子的表达和/或活性的抑制性核酸也可用于本文公开的方法中。一实施方案是用于干扰或抑制靶基因表达的小抑制性RNA(siRNA)。

在一实施方案中，MET诱导剂与免疫检查点抑制剂共同给药，其中，免疫检查点抑制剂是程序性死亡-配体1(PD-L1，也称为B7-H1、CD274)、程序性死亡1(PD-1)、CTLA-4、PD-L2(B7-DC、CD273)、LAG3、TIM3、2B4、A2aR、B7H1、B7H3、B7H4、BTLA、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137、CD160、CD226、CD276、DR3、GAL9、GITR、HAVCR2、HVEM、IDO1、IDO2、ICOS(诱导性T细胞共刺激剂)、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO(具有胶原结构的巨噬细胞受体)、PS(磷脂酰丝氨酸)、OX-40、SLAM、TIGHT、VISTA、VTCN1或其任何组合的抑制剂。

在一实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂。在一实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂。在一实施方案中，免疫检查点抑制剂是LAG3的抑制剂。在一实施方案中，免疫检查点抑制剂是TIM3的抑制剂。

免疫调节剂也可以是细胞治疗剂，例如T细胞(例如CarT细胞)、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。

在一实施方案中，提供了一种在癌细胞中诱导MET的方法，所述方法包括：使细胞与间充质-上皮转化诱导剂和化学治疗剂在足以在细胞中诱导MET的时间和条件下接触，其中，所述癌细胞是基底样(或间充质样)癌细胞。间充质-上皮转化诱导剂可以是视黄素，例如贝沙罗汀。化学治疗剂可以是紫杉醇或5-氟尿嘧啶。

在一实施方案中，提供了一种在癌细胞中诱导MET的方法，所述方法包括：将细胞与间充质-上皮转化诱导剂和表观遗传修饰化合物在足以在细胞中诱导MET的时间和条件下接触，其中，所述癌细胞是基底样(或间充质样)癌细胞。所述间充质-上皮转化诱导剂可以是视黄素，例如贝沙罗汀。所述表观遗传修饰剂可以是I类HDAC抑制剂，例如C1-994和SBHA。

在一实施方案中，提供了一种在癌细胞中诱导MET的方法，所述方法包括：使细胞与间充质-上皮转化诱导剂和免疫调节剂在足以在细胞中诱导MET的时间和条件下接触，其中，所述癌细胞是基底或基底样(或间充质样)癌细胞。所述间充质-上皮转化诱导剂可以是视黄素，例如贝沙罗汀。所述免疫调节剂可以是免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体、抗PDL1抗体或抗CTLA-4抗体。

脂质代谢途径

发明人已经表明，上皮细胞和间充质细胞状态由不同的代谢途径定义。一个关键发现与支持上皮细胞和间充质细胞状态的脂质代谢途径的差异有关。这些发现揭示了重要且新颖的治疗靶点，特别是可以被激活或抑制的代谢基因：(I)靶向或杀死更具侵袭性的间充质亚型肿瘤；(ii)导致MET转换；(iii)阻断EMT和疾病进展(即肿瘤生长、侵袭、转移和抵抗)。

不受理论束缚，本发明人发现间充质肿瘤细胞通过利用脂肪酸作为能量底物来源更多地依赖于脂肪酸氧化(FAO)代谢途径，而上皮肿瘤细胞倾向于将脂肪酸储存为脂滴。为了靶向间充质肿瘤细胞，可以靶向FAO中涉及的关键基因(如ACSL、CPT1、3-KAT、线粒体硫解酶和MGLL)。抑制这些基因可以选择性地杀死间充质肿瘤细胞。ACSL的抑制剂包括TriacsinC(临床前)和噻唑烷二酮(TZD)(已用于糖尿病临床)。CPT1的抑制剂包括依托莫司(由于肝毒性而失败的临床试验)、哌克昔林(临床用于心绞痛)、羟苯甘氨酸(临床前)。3-KAT的抑制剂包括曲美他嗪、雷诺嗪(临床用于心绞痛)。线粒体硫解酶的抑制剂包括4-溴巴豆酸(临床前)。MGLL的抑制剂包括JZL184(临床前)。

此外，这些FAO途径抑制剂与标准护理疗法的组合可能会更有效地靶向间充质肿瘤细胞，从而抑制肿瘤生长、降低耐药性、阻断转移并改善抗癌反应。

发明人进一步发现，破坏脂肪酸氧化可以进一步阻断癌症转移。使用靶向基因CPT1的FAO的抑制剂依托莫司可以阻止乳腺癌转移。使用CPT1抑制剂或靶向FAO的抑制剂来抑制FAO可以作为具有强烈癌转移倾向的癌症以及诸如卵巢癌、乳腺癌、口腔癌等依赖于FAO的癌症的有效抗癌转移剂。

如本文所定义的方法还可包括：在癌细胞中诱导MET之后，使细胞与脂质代谢的抑制剂或调节剂接触。所述脂质代谢抑制剂可以是脂肪酸氧化(FAO)途径的抑制剂。在一实施方案中，脂质代谢抑制剂是选自由长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)、3-酮酰基辅酶A硫解酶(3-KAT)、线粒体硫解酶和单酰基甘油脂肪酶(MGLL)所组成的群组的酶的抑制剂，或者是选自由甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(AGPAT)、前列腺酸性磷酸酶(PPAP)、二脂酰甘油脂酰基转移酶(DGAT)所组成的群组的酶的激活剂。

所述脂质代谢抑制剂可以是肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)的抑制剂。在一实施方案中，CPT1的抑制剂是依托莫司、哌克昔林或羟苯甘氨酸。

在一实施方案中，提供了一种在癌细胞中诱导MET的方法，所述方法包括：将细胞与间充质-上皮转化诱导剂和脂质代谢抑制剂在足以诱导细胞中的MET的时间和条件下接触，其中，所述癌细胞是基底样(或间充质样)癌细胞。所述MET诱导剂可以是视黄素，例如贝沙罗汀。苏式脂质代谢抑制剂可以是CPT1的抑制剂，例如依托莫司。

在一实施方案中，提供了一种在癌细胞中诱导MET的方法，所述方法包括：使细胞与间充质-上皮转化诱导剂和CPTl的抑制剂在足以在细胞中诱导MET的时间和条件下接触，其中，所述癌细胞是基底样(或间充质样)癌细胞。

在一实施方案中，提供了一种在癌细胞中诱导MET的方法，所述方法包括：使细胞与贝沙罗汀和依托莫司的组合在足以在癌细胞中诱导MET的时间和条件下接触。

本文定义的方法可包括治疗患者的癌症或使患者对抗癌疗法敏感。

除非另有说明，否则本文所用的术语“治疗”是指部分或完全逆转、减轻、抑制或预防癌症患者体内肿瘤、肿瘤转移或其他致癌细胞或肿瘤细胞的生长。除非另有说明，本文所用的术语“治疗”是指治疗行为。

术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换使用。如本文所用，它们是指动物。仅作为示例，受试者可以是但不限于哺乳动物，包括但不限于人。这些术语不需要医疗专业人员的监督(无论是连续的还是间歇的)。

通过使癌症或癌细胞(例如，癌症干细胞和/或具有间充质表型的癌细胞)对抗癌疗法“敏感”或“增加癌症或癌细胞对抗癌治疗的敏感性”，这意味着，较低剂量的抗癌治疗药物可有效治疗癌症和/或与不存在本发明方法时的反应相比较，癌症或癌细胞对相同剂量的抗癌药物的反应更强。

在一实施方案中，提供了一种抑制癌细胞中上皮-间充质转化(EMT)的方法，所述方法包括：使细胞与上皮-间充质转化(EMT)抑制剂在足以抑制上皮-间充质转化的时间和条件下接触癌细胞，其中，癌细胞是基底样(或间充质样)癌细胞。这可能包括阻断癌细胞的疾病进展(即肿瘤生长、侵袭、转移和抵抗)。

在一实施方案中，提供了一种用于抑制癌细胞中的上皮-间充质转化(EMT)的上皮-间充质转化(EMT)抑制剂。

在一实施方案中，提供了上皮-间充质转化(EMT)抑制剂在制备用于抑制癌细胞中的上皮-间充质转化的药物中的用途。

在抑制EMT中，抑制剂可以是CPT1的抑制剂，例如依托莫司、哌克昔林或羟苯甘氨酸。

在抑制EMT中，抑制剂可以是线粒体硫解酶的抑制剂。在一实施方案中，线粒体硫解酶的抑制剂是4-溴巴豆酸。

在抑制EMT中，抑制剂可以是长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)的抑制剂。在一实施方案中，ACSL的抑制剂是TriacsinC或噻唑烷二酮(TZD)。

在抑制EMT中，抑制剂可以是3-酮酰基辅酶A硫解酶(3-KAT)的抑制剂。在一实施方案中，3-KAT的抑制剂是曲美他嗪或雷诺嗪。

在抑制EMT中，抑制剂可以是单酰基甘油脂肪酶(MGLL)的抑制剂。在一实施方案中，MGLL的抑制制是JZL184。

间充质-上皮转化诱导剂可以与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂或调节剂同时或依次给药。

一方面，提供了在制备用于使患者对抗癌疗法敏感的药物中使用的间充质-上皮转化(MET)诱导剂。

在一实施方案中，提供了一种在受试者中诱导间充质-上皮转化(MET)的方法，所述方法包括在诱导间充质-上皮转化的时间和条件下施用脂质代谢的抑制剂或调节剂。脂质代谢的抑制剂或调节剂还可用于(I)靶向或杀死更具侵袭性的间充质亚型肿瘤或(ii)阻断EMT和疾病进展(即肿瘤生长、侵袭、转移和抵抗)。

脂质代谢的抑制剂或调节剂可以是脂肪酸氧化途径的抑制剂。在一实施方案中，脂质代谢的抑制剂或调节剂是选自由长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)、3-酮酰基-辅酶A硫解酶(3-KAT)、线粒体硫解酶和单酰基甘油脂肪酶(MGLL)所组成的群组的酶的抑制剂，或者是选自由甘油-3-磷酸乙酰转移酶(GPAT)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(AGPAT)、前列腺酸性磷酸酶(PPAP)、二脂酰甘油脂酰基转移酶(DGAT)所组成的群组的酶的激活剂。

脂质代谢抑制剂可以是肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)的抑制剂。在一实施方案中，CPT1的抑制剂是依托莫司、哌克昔林或羟苯甘氨酸。在一实施方案中，CPT1的抑制剂是依托莫司。

脂质代谢抑制剂可以是线粒体硫解酶的抑制剂。在一实施方案中，线粒体硫解酶的抑制剂是4-溴巴豆酸。

脂质代谢抑制剂可以是长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)的抑制剂。在一实施方案中，ACSL的抑制剂是Triacsin C或噻唑烷二酮(TZD)。

脂质代谢抑制剂可以是3-酮酰基辅酶A硫解酶(3-KAT)的抑制剂。在一实施方案中，3-KAT的抑制剂是曲美他嗪或雷诺嗪。

脂质代谢抑制剂可以是单酰基甘油脂肪酶(MGLL)的抑制剂。在一实施方案中，MGLL的抑制剂是JZL184。

脂质代谢抑制剂可以作为单一药剂或与另一种抗癌剂例如标准护理化学治疗剂或放射疗法组合以治疗癌症。

在一实施方案中，提供了一种用于在受试者中诱导癌症的间充质上皮转化(MET)脂质代谢抑制剂或调节剂。

在一实施方案中，提供了脂质代谢抑制剂或调节剂在制备用于诱导受试者癌症间充质上皮转化(MET)的药物中的用途。

在一实施方案中，提供了一种阻断或预防受试者中癌症转移的方法，所述方法包括在足以阻断或预防受试者转移的时间和条件下施用脂质代谢抑制剂或调节剂。

在一实施方案中，提供了一种用于阻断或预防受试者中癌症的转移的脂质代谢抑制剂或调节剂。

在一实施方案中，提供了脂质代谢抑制剂或调节剂在制备用于阻断或预防受试者中癌症转移的药物中的用途。

在一实施方案中，提供了一种抑制受试者中癌症的上皮-间充质转化(EMT)的方法，所述方法包括：在足以抑制受试者中癌症的上皮间充质转化(EMT)的时间和条件下，施用脂质代谢的抑制剂或调节剂。

在一实施方案中，提供了一种用于抑制受试者中癌症的上皮-间质转化(EMT)的脂质代谢抑制剂或调节剂。

在一实施方案中，提供了脂质代谢抑制剂或调节剂在制备用于抑制受试者中癌症的上皮-间质转化(EMT)的药物中的用途。

在一实施方案中，提供了一种表征癌症侵袭性的方法，所述方法包括：对从患者获得的样品中进行间充质样脂质特征的检测。还提供了一种诊断癌症的方法，包括对从患者获得的样品进行间充质样脂质特征的检测。

一方面，提供了一种鉴定诱导细胞中的间充质-上皮转化的药剂的方法，所述方法包括：a)将细胞与待筛选的测试药剂接触；和b)检测选自由CD24、CD44、CD166、CDH1、ZEB1和SEPINE1组成的群组的基因的启动子的表达；其中，一种或多种基因的表达与对照相比的变化表明测试药剂能够诱导细胞中的间充质-上皮转化。

与对照相比，一种或多种基因的表达变化可以是一种或多种基因表达的增加或减少。对照可以是未与待筛选的测试药剂接触的细胞。

所述细胞是被报告细胞系，其被改造成从待检测表达的基因的启动子表达可测量的标记。

本文还提供了报告基因表达构建体，其能够从选自由CD24、CD44、CD166、CDH1、ZEB1和SERPINE1组成的群组的基因的启动子表达可测量的标记。

本文提供了一个平台，该平台包括在高通量小分子/药物库筛选中使用基因修饰的癌细胞系来检测有效的MET诱导剂。细胞系可以检测细胞状态的变化，同时排除一般的细胞毒性药物。这与检测细胞活力表型丧失的其他常见筛选不同，因为大多数抗癌药物筛选旨在测量药物治疗导致的细胞杀伤。

本文提供工程改造的报告细胞系，其包含如本文定义的报告表达构建体。本文还提供了用于鉴定诱导细胞中的间充质-上皮转化的试剂的试剂盒(或平台)。

癌细胞状态，即上皮或间充质状态，的控制可用于提高癌细胞对治疗的反应性。用视黄素和其他调节化合物诱导MET的通路治疗基底样乳腺癌或TNBC，但不治疗luminal/ER+乳腺癌。这为选择更可能对视黄素治疗产生反应的患者群体提供了重要的分层策略。这些患者患有基底样乳腺癌或TNBC，具有激活的EMT程序。这种MET方法可以扩展到其他实体癌的间充质样肿瘤，包括胃癌、结直肠癌、头颈癌、肺癌、胰腺癌、肝癌，所有这些肿瘤都可能包含具有间充质特征的肿瘤。

对于乳腺癌，可以通过以下方式对患者进行分层：(I)肿瘤活检/切除的IHC或蛋白质表达，在此期间将评估ER、PR、HER2的表达，从而区分乳腺癌的luminal、HER2和基底亚型；(ii)使用分子诊断学，例如包括显示间充质表型的基因表达特征的PAM50；(iii)使用肿瘤活检/切除的IHC或蛋白质表达，在此期间，间充质标志物，如波形蛋白、纤连蛋白、slug、zeb1、细胞角蛋白5、细胞角蛋白14，以及上皮标志物，如E-钙粘蛋白、EpCam、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18、粘蛋白1，的表达将被评估。

一方面，提供了一种鉴定对组合疗法有反应的癌症患者的方法，所述组合疗法包含诱导间充质-上皮转化(MET)的化合物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂的组合，所述方法包括：对从所述患者获得的样品进行癌症的间充质亚型的检测，其中，癌症的间充质亚型的存在表明患者对组合疗法有反应。

癌症的间充质亚型可以指基底样(或间充质样)癌症。

在一实施方案中，所述方法包括用组合疗法治疗患者。

一方面，提供了一种鉴定和治疗对组合疗法有反应的癌症患者的方法，所述组合疗法包含诱导间充质-上皮转化(MET)的化合物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂的组合，所述方法包括：a)对从所述患者获得的样品进行癌症的间充质亚型的检测，其中，癌症的间充质亚型的存在表明患者对组合疗法有反应；以及b)用组合疗法治疗患者。

本文提供了对患者群体进行分层并鉴定可能对组合疗法有反应的患者亚组的方法。该方法可以包括在从每个患者获得的样品中检测具有间充质癌症亚型的患者亚组。

本文提供了监测癌症患者对组合疗法的反应的方法，所述组合疗法包含诱导间充质-上皮转化(MET)的化合物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂的组合。

部分患者可以接受视黄素作为新辅助治疗或与各种标准治疗相结合。各种癌症的标准护理疗法可能有所不同。MET的特点是EMT标志物的变化、基底细胞角蛋白向管腔细胞角蛋白的转变、抑制癌症干细胞特性和增强对SOC疗法的敏感性，从而改善临床反应。可以通过以下方式监测患者对视黄素组合疗法的肿瘤反应：(I)肿瘤活检/切除的IHC或蛋白质表达，在此期间将评估ER、PR、HER2的表达，从而区分乳腺癌的1uminal、HER2和基底亚型；(ii)使用分子诊断学，例如包括显示间充质表型的基因表达特征的PAM50；(iii)使用肿瘤活检/切除的IHC或蛋白质表达，在此期间，间充质标志物，如波形蛋白、纤连蛋白、slug、zeb1、细胞角蛋白5、细胞角蛋白14，以及上皮标志物，如E-钙粘蛋白、EpCam、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18、粘蛋白1，的表达将被评估。作为终点临床结果，将使用反应的临床测量，例如肿瘤大小。类似的方法将用于其他癌症，但使用癌症特异性分子标记。

在本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变体将被理解为暗示包括所陈述的元素或整数或方法步骤或者元素或整数或方法步骤的组，但不排除任何其他元素或整数或方法步骤或者其他元素或整数或方法步骤的组。

本说明书中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数方面，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“一种方法”的引用包括一种方法，以及两种或多种方法；提及“一种药剂”包括一种药剂，以及两种或多种药剂；提及“本公开”包括本公开教导的单个和多个方面；等等。在此教导和实现的方面包含在术语“发明”中。本文中考虑的任何变体和衍生物都包含在本发明的“形式”中。

示例

材料和方法

细胞系和细胞培养

人类乳腺上皮细胞系(HMLE)如所公开的那样产生并使用逆转录病毒载体永生化以表达人类端粒酶的催化亚基hTERT和SV-40大T抗原。NAMEC8如所公开的那样产生。简而言之，HMLE细胞生长至50％汇合，然后用0.05％胰蛋白酶进行差别胰酶消化1分钟。小心地收集分离的细胞并以每孔约200个细胞重新接种至24孔板中。在扩增时，筛选出细胞群在形态上具有间充质性并且可以稳定增殖的选孔。产生克隆和非克隆NAMEC细胞系。NAMEC8是源自至少200个间充质细胞的非克隆系。HMLE细胞和NAMEC保存在MEGM(Lonza)中。

HMLE-Twist-ER细胞如所公开的那样被生成。对于EMT诱导，每48小时向培养基中加入100nM4-羟基三苯氧胺乙醇溶液以诱导Twist表达。对照细胞用乙醇处理。如前所述那样生成MCF7-Slug+Sox9细胞。HMLE-Zeb1细胞是通过感染FUW-Zeb1和rTTA产生的。每48小时向培养基中加入多西环素以诱导Zeb1表达。为了从NAMEC8产生致瘤细胞，用pWZL-Blast-Ras感染细胞。MCF7、MCF7-Ras、SUM159如前所述保持不变。所有细胞培养物均保持在37℃和5％CO₂下。

原代人体细胞

经患者同意并根据IRB批准的方案(2015/2976)从新加坡国家癌症中心(NCCS)获得癌症患者的乳房组织活检。组织在F12培养基中用1mg/ml胶原酶IV(Gibco)和1mg/ml分散酶II(Thermo Fisher Scientific)消化2小时，同时在37℃培养箱中摇动。然后将细胞悬液通过细胞滤网并以1500rpm离心10分钟。然后将细胞洗涤两次并重悬于培养基中，然后如前所述接种到经辐照的3T3饲养细胞上。当汇合时，通过首先使用0.15％胰蛋白酶提起饲养层2分钟来进行传代培养。去除饲养细胞后，加入0.25％胰蛋白酶以分离肿瘤祖细胞。

患者源性乳腺癌异种移植的建立和治疗

经患者同意并根据IRB批准的方案(2015/2976)从新加坡国家癌症中心(NCCS)获得原代人类乳腺癌样本。所有动物实验均获得新加坡科学技术与研究机构-生物资源中心IACUC(协议编号171286)的批准。将患者来源的乳腺肿瘤碎片(约3×1×1mm)双侧插入6-8周龄NSG雌性小鼠的腹股沟乳腺脂肪垫，以初步建立肿瘤，一旦建立，随后在NSG小鼠中扩增。在这项研究中，已建立的BC2.2肿瘤片段被植入一群6-8周龄雌性NSG小鼠中。对于BC22.1，将1×10⁶细胞皮下注射到NSG小鼠的两侧。

生成用于筛选化合物的报告细胞系

使用ClaI和SpeI对pGreenFire1-mCMV进行酶切并进行凝胶纯化。基因Zeb1、Serpine1、CDH1、CD24、CD44、CD166的启动子序列是使用AccuPrime Taq DNA聚合酶(ThermoFisher Scientific)并采用预先设计的含有ClaI和SpeI限制性酶切位点的引物从人类基因组DNA中扩增出来的。然后用限制酶消化PCR产物并进行凝胶纯化。使用Quick Ligase(Fermentas)将载体与PCR插入片段连接并转化到Stbl2感受态细胞中。挑取菌落并接种到含有氨苄青霉素的结核病培养基中。然后使用质粒小量制备试剂盒(Qiagen)分离质粒并送去测序(1stBASE Laboratories)。验证质粒序列后，转染HEK293细胞，生成慢病毒。使用FuGENE6(Promega)进行转染。在24小时和48小时收获病毒上清液。然后使用聚凝胺(8μg/μl)用病毒感染NAMEC8细胞两次，并使用Dual-Glo荧光素酶系统(Promega)检查良好的转导效率。

化合物库筛选

化合物库的储备板由GIS CHiP设施以1mM浓度在DMSO中制备。使用自动分配系统(BioTek)将NAMEC8-SERPINE1prom-Luc细胞以在总体积为50μl中700个细胞/孔的密度接种到384孔板中。然后在第二天使用带有Bravo工作站(Agilent Technologies)的机器人针转移将0.5μl化合物添加到孔中。然后使细胞生长3天，并使用Dual-Glo荧光素酶系统(Promega)测量启动子-荧光素酶活性。

Dual-Glo萤光素酶检测

根据制造商的说明进行测定。为了测量384孔板中的荧光素酶活性，首先从板中取出培养基。萤火虫萤光素酶活性通过向孔中加入30μlDual-Glo萤光素酶底物(Promega)并在使用TECAN M1000 Pro读板器测量发光之前孵育10分钟来确定。然后将15μl Dual-GloStop&Glo底物加入孔中，孵育10分钟并在读板器上测量发光以确定海肾荧光素酶活性。然后通过采用萤火虫荧光素酶而不是海肾荧光素酶来计算启动子荧光素酶活性。

ERE-荧光素酶活性检测

ERE荧光素酶构建体由新加坡CSI的Alan Prem Kumar友情提供。为了测量ERE-荧光素酶活性，在转染前24小时接种细胞。ERE-荧光素酶(1μg)和NSV-Renilla(0.1μg)使用Lipofectamine 2000进行包装并转染到NAMEC8中。转染后24小时，将细胞重新接种到96孔板中进行药物处理。萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的活性在处理后24小时用Dual-Glo萤光素酶系统(Promega)进行测量。

慢病毒shRNA和过表达构建体

慢病毒shRNA来自Broad Institute的RNAiConsortium(TRC)集合。所用shRNA的克隆ID是：TRCN0000072181(GFP对照)、TRCN0000330783(RXRαshRNA1)、TRCN0000021616(RXRαshRNA2)、TRCN0000021618(RXRαshRNA3)、TRCN0502010203020302030202020021616。将每个shRNA克隆到慢病毒质粒pLKO.1(Addgene)中。

对于CPT1A的过表达，从pCMV6-CPT1A(Origene Cat#RC200485)中酶切CPT1A的ORF并克隆到pMN-GFP载体(来自于强实验室，GIS)。通过测序确认阳性克隆，并将该阳性克隆用于逆转录病毒生产。为了过表达Zeb1，将Zeb1的ORF克隆到FUW-LPT2载体中。通过测序确认阳性克隆并将其用于慢病毒生产。

为了生产慢病毒，使用FuGENE6(Promega)将质粒包装到带有包装质粒的HEK293T细胞中。为了生产逆转录病毒，使用FuGENE6(Promega)将质粒包装到带有包装质粒的PlatA细胞中。在48小时收获病毒并转导到靶细胞中。用2μg/ml嘌呤霉素筛选感染细胞7天。

RNA分离、逆转录和实时PCR分析

细胞在冰冷的PBS中漂洗两次。使用Trizol(Invitrogen)提取总RNA，并使用RNeasy试剂盒(Qiagen)进行柱纯化。使用SuperScriptIII第一链合成系统(Thermo FisherScientific)在37℃下用500ng总RNA合成cDNA2小时，然后稀释5倍。使用ABI Prism 7900HT序列检测系统2.2(Applied Biosystems)，用下面列出的基因特异性引物测量mRNA水平。结果被归一化为GAPDH并使用SDS2.2软件进行分析。

增殖检测

为了测量细胞生长速率，将1000个细胞一式三份接种到96孔板上。根据制造商的说明，使用Cell Titre Glo试剂(Promega)或

单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS)(Promega)测量细胞活力。

蛋白质提取和免疫印迹

在冰冷的PBS中从培养皿中收获和刮下细胞。然后将它们在4℃下以12000rpm的速度离心5分钟。然后将颗粒在液氮中速冻或在冰冷的RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific)中裂解，并在冰上放置30分钟。随后，裂解物在4℃下以12000rpm离心10分钟。然后吸出上清液并置于新管中。使用Coomaisse Blue确定蛋白质浓度。将50-80μg总蛋白与NuPAGETM LDS样品缓冲液混合，并在70℃下加热10分钟。将样品装入NuPAGETM 4-12％Bis-Tris凝胶(预制聚丙烯酰胺凝胶；InvitrogenTM)。凝胶电泳在200V下进行1.5小时，然后印迹到硝酸纤维素膜(Trans-Blot TurboTM转移包；Bio-Rad)上。膜用含有0.1％Tween-20(Santa Cruz)的5％脱脂牛奶Tris缓冲盐水(TBS；1st BASE)封闭，然后与一抗在4℃下孵育过夜。此后，将膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在室温下孵育1小时。最后，使用增强型化学发光(ECL)试剂(Thermo Scientific，34075)和ChemidocTM Imager(Bio-Rad，17001401)观察免疫反应性蛋白质。

荧光激活细胞分选(FACS)

细胞被胰蛋白酶消化直到它们从细胞培养板分离。然后加入中和培养基(含有20％FBS的DMEM)以灭活胰蛋白酶。然后将细胞以1200rpm离心3分钟，并将细胞沉淀重悬于PBS/2％FBS中。细胞用DAPI(1∶2000)染色并在分选前通过40μm过滤器过滤。FACS在BD AriaFusion流式细胞分析仪上完成。

CD24和CD44的染色

按照FACS收集细胞并重悬于100μl含有CD24-PE和CD44-APC(BD-Biosciences)抗体的溶液中，该抗体在含2％FBS的PBS中稀释(1：40稀释)。将细胞染色45分钟，每10分钟涡旋一次以确保染色均匀。抗体孵育后，将细胞洗涤一次并重悬于300μl含2％FBS的PBS中。然后将细胞通过40μm过滤器过滤并在BDLSR Fortessa X-20细胞分析仪上进行分析。

乳腺球群细胞

检测

对于乳腺球培养，将细胞以700个细胞/孔接种到96孔的添加有4μg/ml肝素、0.5μg/ml氢化可的松和1％甲基纤维素的Mammocult培养基(干细胞技术)的超低粘附平板上。在7-10天后对球体(＞100μm)进行计数。

细胞免疫荧光(IF)染色

细胞培养物在4％多聚甲醛中固定，并用0.25％Triton X-100进行透化，然后用PBST中的1％牛血清白蛋白封闭。细胞在特定的一抗中孵育，然后是与Alexa Fluor-488或-594(分子探针)偶联的适当二抗。然后用DAPI染色细胞核，然后使用带有内置AxioCamMR3相机(蔡司)的Axio Observer D1落射荧光显微镜观察和成像，使用最佳过滤器和100-200x的放大倍数。

SUM159PACR细胞的产生

SUM159细胞暴露于从10nM开始逐步增加的PAC。每两天更换含有新鲜药物的培养基，当细胞达到80-90％汇合时分裂细胞。PAC的浓度在每次分裂时增加10nM，直到细胞能够在100nM下存活。然后对细胞进行细胞活力测定以测量IC50。IC50值使用GraphPad Prism软件确定。当与亲本细胞系相比IC50值增加至少10倍时，细胞被认为对PAC具有抗性。

IC₅₀的体外测量

将细胞以2000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。第二天以10点剂量反应方式添加药物(5-FU/PAC)。在使用Cell Titer Glo试剂(Promega)测量细胞活力之前，让细胞生长3天。将数据标准化为空白对照。生成等值线图并使用GraphPad Prism软件确定IC₅₀值。

使用NSG小鼠的体内实验

所有动物实验均获得新加坡科学技术与研究局生物资源中心IACUC的批准(协议编号140940)。对于预处理的SUM159和MCF7-Ras细胞，将1×10⁶细胞悬浮在含有50％基质胶的100μl培养基中，并皮下注射到雌性NSG小鼠的两侧。每周一次通过触诊检查NSG小鼠的肿瘤，当肿瘤直径达到约15毫米时收获肿瘤。对于NSG小鼠的治疗，将1×10⁵NAMEC8-Ras细胞悬浮在100μl含有50％基质胶的培养基中，并皮下注射到NSG小鼠的两侧。通过触诊检查NSG小鼠的肿瘤形成，当肿瘤长约3mm时，将小鼠随机分为两组：空白组(玉米油中的5％DMSO)和治疗组(贝沙罗汀，100mg/kg/天口服给药)。每周使用游标卡尺测量肿瘤大小，当肿瘤达到约15mm或治疗约4周后处死小鼠。对于源自患者的细胞，在NSG小鼠的每个部位皮下注射2×10⁶个细胞。

如前所述进行用tdTomato荧光蛋白标记的MCF7-Slug+Sox9细胞的原位肿瘤移植。简而言之，将1×10⁶细胞重新悬浮在30μl含有50％基质胶的培养基中，并注射到NSG小鼠的乳腺脂肪垫中。将小鼠随机分为3组(对照组，DOX组，以及依托莫司+DOX组)。小鼠通过腹腔注射给药空白对照(0.9％w/vNaCl)或依托莫司(20mg/kg)。每天注射，持续3周。然后通过饮用水给予多西环素2周。在多西环素治疗停止后10周处死小鼠并在荧光显微镜下分析肺转移癌。

肿瘤切片的苏木精和曙红染色

肿瘤切片在4％多聚甲醛中固定过夜，浸入70％乙醇中，送至IMCB高级分子病理学实验室进行石蜡化和苏木精伊红染色。

肿瘤切片的免疫荧光(IF)染色

将肿瘤切片在4％多聚甲醛中固定过夜，浸入70％乙醇中，然后送到IMCB高级分子病理学实验室进行石蜡化。对于IF染色，将载玻片脱蜡并在PBS中再水化。使用屏障笔用疏水屏障包围组织，并用封闭缓冲液(1％牛血清白蛋白；BSA；1％马血清以及0.2％TritonX-100的PBS)封闭1小时。然后用PBS洗涤，并在特定的一抗中于4℃下孵育过夜。用PBS洗涤载玻片，并在室温下用适当的二抗与Alexa Fluor-488或-594(Molecular Probes)结合孵育1小时。然后使用带有DAPI(VectorLaboratories)和盖玻片的

封固培养基将组织封固在载玻片上。盖玻片周围用指甲油永久密封以延长储存时间。使用带有内置AxioCamMR3相机(Zeiss)的Axio Observer D1落射荧光显微镜，使用最佳滤光片和100-200倍放大率对载玻片进行观察和成像。使用AxioVision Rel4.8图像软件获得荧光图像分析和荧光叠加图像。。

染色质免疫沉淀-测序(ChIP-Seq)

如前所述进行ChIP测定。简而言之，在室温下将细胞与1％甲醛交联10分钟，然后通过添加125mM甘氨酸灭活甲醛。使用抗RARα、抗RXRα、抗H3K27ace或抗p300抗体免疫沉淀含有平均大小为200-500bp的DNA片段的染色质提取物。然后将富含ChIP的DNA去交联并使用Illumina TruSeq ChIP试剂盒进行文库制备，然后使用Illumina测序进行分析。

转录组测序(RNA-Seq)

细胞用贝沙罗汀或DMSO处理并用Trizol裂解。使用Qiagen RNeasy试剂盒(#74106)提取总RNA。在生物分析仪上测量RNA完整性和浓度，并使用Illumina True-Seq RNA试剂盒制备文库，然后使用Illumina测序进行分析。

基因组数据分析

对于ChIP-Seq数据处理，使用BWA对齐器将读数与人类基因组(hg19)对齐。使用Picard Markduplicates.jar对对齐的读数进行重复数据删除。使用带默认参数的MACS2peak-caller执行峰值调用。使用DiffBind进行差异绑定。H3K27ac超增强子使用所述的ROSE算法进行鉴定。ChIP-Seq的数据保存在GEO(登录号：GSE119824)中。

对于RNA-Seq数据处理，使用TopHat2将读数与人类参考基因组GRCh37.p13对齐，并使用featureCounts进行读数计数。低表达基因(即少于60％的样本中计数少于10的基因)被排除在进一步分析之外。然后通过修剪的M值平均值(TMM)方法对文库大小进行缩放。差异表达基因使用R包limma进行鉴定，并通过GREAT软件进行基因本体通路分析。RNA-Seq的数据保存在SRA数据库中(登录号：SRP152713)。

脂质提取

使用丁醇：甲醇(1：1)作为提取溶剂从细胞沉淀中提取脂质。萃取溶剂包括由以下成分组成的内标混合物：17：0LPC(溶血磷酸胆碱)、C14LPE(溶血磷酸乙醇胺)、C17神经酰胺、C17磷酸胆碱、C17磷酸丝氨酸、C17：0PG、C8-神经酰胺、DMPE(1，2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPG(1，2-二肉豆蔻酰-甘油-3-磷酸-(1′rac-甘油)、DMPS(二肉豆蔻酰-甘油-磷酸丝氨酸)、12：0DG(1，2-二月桂酰-sn-甘油)、C8 GluCer(D-葡萄糖基-β1-1′-N-辛酰基-D-赤型鞘氨醇)、24∶0SM(N-木质素酰-D-赤型鞘氨醇磷酰胆碱)、24∶1SM(N-神经酰-D-赤型-鞘氨酰磷酰胆碱)、d5-TAG 48∶0。除d5-TAG 48∶0来自CDN同位素外，所有标准品均来自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL，USA)。所有标准品均被添加至终浓度为100ng/ml。将100μl提取溶剂(包括标准品)添加到装有细胞沉淀的小瓶中的1×10⁷个细胞中。将混合物涡旋15秒。然后将样品进行声波处理在室温下在超声波浴中放置60分钟。然后将混合物以14000g离心5分钟。将上清液转移到新管中并保持在-80℃直至分析。

脂质分析

使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)系统(连接至Agilent 6490 QQQ的Agilent1290 UHPLC)分析样品。使用反相色谱柱(Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18，2.1×50mm，1.8μm)进行分离。使用流动相A(40％乙腈/60％水，含10mM甲酸铵)和流动相B(90％异丙醇/10％乙腈，含10mM甲酸铵)进行梯度洗脱。通过汇集来自每个样品的脂质提取物的等分试样产生质量控制(QC)样品。在分析过程中，每10个样品注入一个QC样品，以监测实验程序的性能。在阳性多反应监测(MRM)模式下定量脂质。MS参数：气体温度300℃，气体流速5L/min，鞘气流速11L/min，鞘气温度250℃。使用MassHunter定量分析软件(安捷伦)提取数据。使用内标和细胞数对脂质进行标准化。使用GraphPad Prism和Mann-Whitney U检验完成图表和统计分析。

脂滴染色

用荧光Bodipy染料可视化细胞内脂滴。培养中的细胞在室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟，用PBS冲洗两次，并用0.2％TritonX-100的PBS透化10分钟，并与在PBS中稀释的Bodipy(最终浓度1μg/ml)一起在4℃下孵育过夜。细胞用PBS洗涤并用DAPI染色。荧光图像是使用带有内置AxioCamMR3相机(蔡司)的Axio Observer D1落射荧光显微镜获得的，使用最佳过滤器和100-200×放大倍数。

脂肪酸β-氧化测定

根据制造商的说明，在XF96分析仪(Seahorse Bioscience)上使用线粒体压力测试测量FAO率。将细胞以9000个细胞/孔的密度接种在96孔XF96细胞培养板的完全培养基中。然后将细胞与XF改良的DMEM测定培养基(Seahorse Bioscience)一起孵育，次日添加1mM谷氨酰胺、0.5mM葡萄糖、1％FBS和0.5mM肉碱，持续18小时。在测定当天，在非CO₂培养箱中进行分析前45分钟，将细胞在FAO测定培养基(KHB：111mM NaCl、4.7mM KCl、1.25mMCaCl₂、2mM MgSO₄、1.2mM NaH₂PO₄，添加有2.5mM葡萄糖、0.5mM肉碱、5mM HEPES，调整pH至7.4)中孵育。Seahorse细胞线粒体压力测试化合物(2μM寡霉素、2μM FCCP、2μM鱼藤酮)。为了抑制FAO，在测定前15分钟加入依托莫司(40μM)。就在开始测定之前，将XF棕榈酸酯-BSAFAO底物或BSA添加到细胞中。然后将板放入XF96分析仪中，并使用推荐的方案运行XF CellMito压力测试。当相对于BSA对照补充棕榈酸酯-BSA FAO底物时，FAO的比率通过最大呼吸的差异计算。

统计分析

GraphPad Prism(GraphPad Software)v7.0用于统计分析。除非另有说明，否则所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差。学生t检验(双尾)用于比较两组并计算p值。P＜0.05被认为具有统计学意义。相关图例中标明了显著性水平。

示例1

为了广泛了解MET过程的分子基础和治疗效用，我们进行了高通量小分子库筛选，以无偏倚的方式识别具有MET促进特性的药剂类别。这使我们发现视黄素是最有效的MET促进剂，通过HDAC抑制剂的表观遗传增强可以进一步增强其效力和持久性。令人惊讶的是，除了经典的MET标记基因和表型变化之外，用视黄素治疗导致基底样到官腔样的转变，伴随细胞角蛋白表达发生转变，以及在一些患者来源的肿瘤细胞模型中重新表达ER。向荷瘤动物施用视黄素会引起类似于MET的肿瘤结构变化并阻止肿瘤生长。此外，我们首次揭示了乳腺癌中的细胞状态转变是由脂质代谢的重编程定义的，特别是视黄素的参与及其对β-氧化和脂质储存之间转换的调节。正如全基因组分析所揭示的那样，视黄素通过视黄酸受体(RAR)和视黄素X受体(RXR)结合并靶向关键的脂质代谢基因。这导致间充质细胞状态中脂肪酸用于β-氧化的利用重新定向到上皮细胞状态中的脂滴储存。介导这种变迁的关键代谢酶的中断导致MET过程的抑制。相反，使用CPT1抑制剂，依托莫司，对β-氧化的扰乱，重新引导脂肪酸变迁并促进更多的上皮细胞表型，此外还能够在动物模型中阻止EMT驱动的乳腺癌转移。

高通量小分子库筛选将视黄素鉴定为间充质-上皮转化的促进剂

在乳腺癌中获得间充质细胞状态通常与更具侵袭性的表型相关，这些表型也具有化疗抗性和癌症干细胞样。我们推断，通过间充质-上皮转化(MET)过程将间充质转化为更为上皮细胞状态可能会降低作为乳腺癌组合疗法的形式之一的癌细胞的致瘤性和化疗抗性。为了鉴定具有促进MET能力的小分子化合物，我们利用了间充质乳腺细胞系NAMEC8，它对细胞状态的扰动有反应，与启动子萤火虫荧光素酶报告基因偶联作为细胞状态变化的读数(图1A)。我们测试了几种基因启动子，包括CD24、CD44、CD166、CDH1、ZEB1和SERPINE1，它们之前已被证明与上皮细胞或间充质细胞表型相关。从其他研究来看，TGFβ可以在几种癌细胞系中促进EMT，而抑制TGFβ通路可以阻断EMT或适度诱导MET样表型。因此，我们利用TGFβR抑制剂A83-01作为阳性对照来评估这些基因启动子对细胞状态变化的反应(图1B)。其中SERPINElprom-Luc在用A83-01处理时表现出最为动态的反应，因为它被下调了至少50％。

我们筛选了包含＞2700种化合物的四个化合物库(LOPAC、抗癌、激酶抑制剂、生物活性脂质)，以鉴定具有MET促进特性的分子类别(图1C)。值得注意的是，在间充质NAMEC8SERPINE1prom-Luc报告细胞中，我们进一步加入了一个海肾荧光素酶报告基因(Renilla-luciferase reporter)，它受组成型CMV启动子的控制，作为细胞数量的读数。目的是确定改变细胞状态而不对细胞活力产生不利影响的化合物(图1A)。从这个初步筛选中，“命中率”为2.19％(61种化合物)。还计算并绘制了Z-分数(图8A)。这些在二次筛选和剂量反应测量中得到验证，表明符合率为83.6％(51种化合物)，从而强调了基于报告基因筛选的稳健性(图1D、E和表1)。至少代表了8类化合物，包括TGFβ抑制剂，我们之前将其用作阳性对照。有趣的是，腺苷/肾上腺素能、GABA和NMDA受体激动剂和拮抗剂等化合物，以及一些先前未涉及细胞状态转变的神经递质，被确定为潜在的调节剂。在这些类别中，视黄素似乎以剂量依赖性方式诱导了SERPINElprom-Luc报告基因的最显著性的减少(图1E)。

表1初步筛选中确定的MET诱导剂列表

视黄素诱导基底样乳腺癌细胞转化为管腔样并增强其对化疗的敏感性

出于多种原因，我们选择将视黄素作为MET诱导剂。首先，它们代表了我们筛选中最有效的一类MET诱导化合物。其次，它们是临床上可行的药物，被用作急性早幼粒细胞白血病的鉴别药物，尽管它们对其他癌症的效用和功效仍不清楚。最后，视黄素诱导细胞状态变化或促进分化的方式和机制尚未得到很好的阐明。从我们的筛选中，我们选择了最强的RARα(TTNPB)和RXRα(贝沙罗汀)激动剂进行验证研究以及生化和通路表征。与标记间充质细胞状态的SERPINE1prom-Luc报告基因活性的下调一致，用贝沙罗汀或TTNPB处理NAMEC8和另一种间充质TNBC细胞系SUM159导致形态从散在、纺锤形和成纤维细胞样显著性地变化为上皮样形态，以紧密的上皮岛簇为特征(图2A和9A)。这种形态变化与间充质特征标记(ZEB1、SERPINE1、FN1、SLUG)的下调和上皮标记CDH1的伴随增加有关(图2B、C、D和9B、C)。我们第一次注意到细胞角蛋白表达从KRT5(通常与基底样、三阴性乳腺癌相关)转变为KRT8，后者在乳腺癌的管腔亚型、ER+亚型中表达。粘蛋白1(MUC1)，作为TNBC中不常见的管腔乳腺癌的特征标志物，也被上调。这些数据提供了第一个指示，即在MET之外，这些被认为代表基底样、三阴性乳腺癌的癌细胞可能已经获得了管腔样特征。因为间充质表型已被证明与癌症干细胞样状态相关，我们检查了CD44的表达和视黄素处理细胞的乳腺球形成能力。NAMEC8和SUM159细胞均通过流式细胞仪显示表面CD44表达显著降低，并且乳腺球形成能力显著降低(图2E、F和9D、E)。

为了进一步评估视黄素在经典癌细胞系之外的影响，这些细胞系往往是同质的、与其亲本肿瘤不同或具有改变的可塑性，我们从活检或切除的三阴性和ER+乳腺肿瘤(表2)。与我们之前的发现一致，患者来源的三阴性乳腺癌细胞系(BC2.2、BC22.1、BC29.1、MetBR007-DR)进行贝沙罗汀的治疗增加了E-钙粘蛋白的表达，同时在不同程度上降低了SLUG表达。然而，更值得注意的是，我们继续观察到细胞角蛋白表达从KRT5到KRT8的转变，以及MUC1表达的增加(图2G、H和9F、G)。患者来源的癌细胞的乳腺球形成能力在视黄素治疗后也降低(图2I和9H)。令人惊讶的是，在其中三个肿瘤细胞系中，我们注意到雌激素受体(ER)表达的上调，这是ER+管腔乳腺癌的标志。用贝沙罗汀或TTNPB处理后，雌激素反应元件(ERE)-荧光素酶报告基因也增加(图9I)。为了支持这一点，在两种癌细胞系(NAMEC8和BC2.2)中，通过贝沙罗汀治疗，ER靶基因如ABCA3、NRIP1、TFF1和CREB1都被明显地升高(图9J)。由于其他基底样癌细胞现在已经获得了ER表达，我们想知道它们是否也获得了对抗ER疗法的敏感性，这种疗法是针对携带ER+肿瘤的乳腺癌患者进行的。有趣的是，贝沙罗汀处理的癌细胞似乎对低剂量的选择性ER调节剂盐酸雷洛昔芬变得敏感(图9K)。尽管如此，我们注意到药物敏感性的差异是适度的两倍，因此表明从基底样到真正管腔表型的转换可能是不完整的。非常有趣的是，当将贝沙罗汀应用于由ER+、管腔样乳腺肿瘤产生的患者来源的肿瘤细胞系(BC24.1和BC33.1)时，上皮/间充质或管腔/基底标志物(图2G和9L)，表明视黄素在间充质样乳腺癌细胞中发挥作用，但在上皮样乳腺癌细胞中不发挥作用。

接下来，我们想确定视黄素确实通过视黄酸受体(RXRα或RARα)起作用和发出信号。使用靶向RXRα的shRNA，在NAMEC8中实现了稳定的敲低(图9M)。现在在RXRα敲低细胞中消除了由贝沙罗汀诱导的上皮-管腔标志物的增加和间充质基底标志物的丢失(图9N，O)。这些证实了视黄素诱导的细胞状态变化依赖于RXRα受体及其下游活性。

通过EMT获得间充质细胞表型已被证明赋予对广泛化疗的抗性。我们推断相反的现象，即MET，可能会使其他间充质癌细胞对化疗药物敏感，从而克服耐药性。毫不奇怪，在经典的间充质样癌细胞系(NAMEC8和SUM159)和两种源自患者的TNBC细胞系(BC2.2和BC22.1)中，暴露于导致MET的贝沙罗汀能够赋予TNBC的护理标准至少增加4-6倍的5-FU或紫杉醇敏感性(图2J、K和9P、Q、R)。

在乳腺癌管理的背景下，在初治患者中使用视黄素联合化疗可能是不可行的。要使视黄素在TNBC中用作治疗剂，需要在耐化疗的癌细胞中对其进行评估。为了测试这一点，我们生成了紫杉醇抗性(PACR)SUM159细胞，与亲本(PT)细胞相比，它的紫杉醇抗性增加了20倍以上(图2L)。SUM159 PACR细胞从间充质样转变为上皮样表型，呈现成簇形态，并在用贝沙罗汀处理后上皮和管腔标志物的表达升高(图9S、T、U)。贝沙罗汀处理的PACR细胞也具有降低的乳腺球形成能力(图9V)，表明癌症干细胞样特性的降低。更重要的是，他们获得了对替代化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性，从而表明耐药癌细胞可能对这种治疗策略有反应(图2M)。

表2.患者来源的乳腺癌细胞系的分子信息

视黄素在体内促进MET并降低动物TNBC细胞的致瘤性

我们推断，从间充质细胞状态到上皮细胞状态的转变可能会导致基底样、间充质样乳腺癌细胞失去致瘤性。用贝沙罗汀或TTNPB对SUM159细胞进行离体治疗确实严重削弱了它们在移植到免疫功能低下的NSG小鼠后长达7周的致瘤潜力，尽管在此之后，肿瘤生长加快(图3A和10A)，表明短期(14天)离体治疗不足以介导细胞状态的永久或持久变化。它还表明，贝沙罗汀的持续强制治疗可能是阻止肿瘤生长所必需的。有趣的是，当管腔上皮样乳腺癌细胞系MCF7-Ras类似地暴露于贝沙罗汀或全反式视黄酸(ATRA)时，未观察到对肿瘤细胞生长的影响(图3B和10B)。值得注意的是，致瘤性的降低并非归因于视黄素在阻止细胞增殖方面的作用，因为它们保持与对照细胞相似的生长能力(图10C)。这清楚地强调了视黄素诱导的细胞状态变化在基底乳腺癌而非管腔乳腺癌中的效用。

为了评估视黄素在荷瘤动物中的功效，我们首先将NAMEC8-Ras细胞和其他两种源自患者的TNBC细胞系(BC2.2和BC22.1)移植到NSG小鼠中，并到第4周时使肿瘤直径达到～3mm。在研究期间每天通过口服强饲法对其中一组服用贝沙罗汀，对另一组服用空白对照。与空白治疗的小鼠相比，贝沙罗汀喂养的荷瘤小鼠的肿瘤生长速度和负担显著降低(图3C和10D、E)。为了理解这种生长减少的原因，我们收集了残留的肿瘤进行分析。肿瘤的免疫组织化学显示对照肿瘤是具有导管特征的3级癌，而来自贝沙罗汀治疗的小鼠的肿瘤是不粘连的并分开的。后者还显示存在具有局灶性坏死的梭形细胞，纤维血管核心表明可能存在乳头状或假乳头状成分(图3D)，因此表明细胞状态发生了变化。为了证实这一点，我们对肿瘤切片中的EMT标志物进行了免疫荧光染色。来自贝沙罗汀治疗的小鼠的肿瘤此时显示出E-钙粘蛋白的表达和纤连蛋白的丢失，因此表明作为第一次治疗干预的结果在体内出现了MET表型。此外，在这些肿瘤中，细胞角蛋白表达发生了转变，从基底相关的KRT5到管腔相关的KRT8(图3E和10F)。由于视黄素通过结合DNA的RXR和RAR受体激活靶基因，如STRA6、CRAPBP2、DHRS3、ANGPTL4、IP6K3和ACSL5，我们分析了它们在治疗动物肿瘤中的表达。所有靶基因表达至少上调两倍(图3F)，从而证实细胞状态的转换是通过视黄素靶基因活性介导的。

示例2

表观遗传扰动增强和增加视黄素诱导的细胞状态变化的持久性

虽然视黄素可以促进间充质乳腺癌细胞的MET，但在没有持续暴露于视黄素的情况下，该表型似乎是可逆的，至少是部分可逆的。这表明癌细胞的固有可塑性，可能是动态表观遗传重塑的结果。我们假设人们也许能够通过结合视黄素诱导的细胞状态转变来修饰表观遗传学来增强上皮细胞状态。首先，我们测试了表观遗传修饰化合物本身是否可以诱导MET。以类似于我们之前描述的筛选MET化合物的方式，我们筛选了35种表观遗传修饰化合物，其中6种能够下调间充质NAMEC8报告细胞中的SERPINE1prom-Luc活性。虽然这些将活性降低了15-53％，但绝大多数没有达到由贝沙罗汀处理引起的相同幅度(图4A)。我们接下来评估了表观遗传化合物与贝沙罗汀的组合是否可能对MET产生更大的影响。有趣的是，几种表观遗传化合物能够与贝沙罗汀一起产生附加益处，从而诱导SERPINE1prom-Luc活性的更剧烈下调(图4B)。我们专注于C1-994和SBHA，它们都是I类HDAC抑制剂(HDACi)

HDACi与贝沙罗汀的组合导致上皮细胞形态和相关EMT标志物发生更强烈的变化(图4C、D和11A)。例如，ZEB1和SLUG的减少更为强烈，而KRT8和MUC1的增益更为明显。因为单独使用视黄素不会导致稳定的MET表型，我们评估了该组合是否可能在两种药物停用后延长上皮细胞状态的维持。事实上，仅用视黄素处理的NAMEC8细胞的SERPINE1prom-Luc活性降低在停药三天后恢复，而在用视黄素和HDACi的组合处理的细胞中持续降低(图11B、C)。更重要的是，当化合物在7天治疗后停用，经历过MET的癌细胞能够将上皮表型维持至少另外7天(图4E、F、G)。此外，乳腺球形成能力也不断受到抑制(图4H和11D，E)。相比之下，单独使用贝沙罗汀处理的细胞逐渐恢复为更具间充质性的细胞表型，并部分重建了乳腺球形成能力。在没有视黄素配体的情况下，RAR和RXR结合DNA，同时与包括NCoR和HDAC在内的转录共抑制因子相关联，导致基因沉默。当暴露于视黄素时，它们与受体结合并导致共激活剂，如组蛋白乙酰转移酶p300，的募集。同时，HDAC的抑制可能允许维持促进基因转录的表观遗传学，从而产生更有效和持久的MET(图4I)。

脂质代谢基因受视黄素受体调节

RAR和RXR是DNA结合转录因子，它们通过在存在或不存在视黄素的情况下调节靶基因表达来发挥作用。报道的与视黄素信号相关的通路包括TGFβ、NFkB和Nrf2^27-29。为了了解RAR和RXR程序细胞状态转换的方式，我们进行了ChIP-seq从而以无偏倚的方式确定它们的靶基因的集合。我们将间充质NAMEC8和SUM159癌细胞暴露于短期(ST：7天)和长期(LT：14天)视黄素治疗，然后对RXR、RAR、RAR和p300的靶基因结合位点进行全基因组分析。暴露于RXR配体贝沙罗汀导致一部分基因被RXR和RAR结合，因为两者都可以形成异二聚体。这些基因还显示p300结合和H3K27ac(组蛋白3，赖氨酸27乙酰化)修饰的增加，这标志着基因增强子(图5A、B和12A、B)。例如，众所周知的视黄素靶基因，如STRA6和DHRS3等，它们最初在间充质细胞状态下不受RXR的约束，但后来与MET结合(图5C和12C)。

我们接下来试图通过使用基因本体分析绘制顶部RXR结合基因图来确定由RXR调节的功能途径。这表明脂质代谢是MET期间受到干扰的主要途径——这种现象以前没有被研究过(图5D)。为了进一步测试RXR结合基因是否与RXR激活引起的转录变化相关，我们对癌细胞系和用贝沙罗汀处理的患者来源的癌细胞进行了RNA-seq，以检测基因表达变化。与上述分析一致，上调至少两倍以上的基因在与脂质代谢相关的途径中显示出明显的富集(图12D、E)。超级增强子是关键基因的特征，有助于定义细胞状态和细胞谱系。对H3K27ac标记的分析揭示了在MET时包含超级增强子的关键基因。其中包括视黄素靶基因，例如DHRS3、RXR和GDF15，以及脂质代谢基因，例如B4GALT5和ACSL1(图5E和12F)。例如，脂质代谢基因如PLIN1、PLIN2、ACSL5和MGLL在贝沙罗汀处理后表现出明显的RXR募集和增加的H3K27ac修饰(图5C和12C)；这进一步强调了他们在MET中所推断的作用。

为了阐明在细胞状态变化期间脂质代谢的哪些特定方面可能会改变，我们更详细地检查了RXR靶基因列表，这些基因在多个癌细胞系和用贝沙罗汀治疗的患者来源的癌细胞中显示出一致的上调或下调(图5F)。有趣的是，许多脂质相关基因形成了从脂肪酸产生甘油三酯(TAGs)的途径。参与TAG合成的基因(ACSL4、ACSL5、AGPAT4、AGPAT9、GPAM、DGAT2、PLIN1)被上调，而参与TAG降解的脂肪酶MGLL被强烈下调(图5G和12G)。因此，这些结果强烈表明MET期间脂质代谢的重编程。

间充质-上皮转化通过将脂肪酸引导至脂质储存来限制β-氧化

脂肪酸的一个主要命运是它们作为TAG的转化和储存。关键的脂质代谢酶，长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)、甘油-3-磷酸乙酰转移酶(GPAT)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(AGPAT)、前列腺酸性磷酸酶(PPAP)和二脂酰甘油脂酰基转移酶(DGAT)在视黄素处理后均上调，可能有助于推动脂肪酸转化为中间体，如二酰基甘油(DAG)和TAG(图4a)。为了证明这一点，我们使用基于脂质质谱的脂质组学在细胞状态变化时确定了脂肪酸及其下游中间体的命运。事实上，在贝沙罗汀治疗后，磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)等脂质种类显著增加，它们是脂肪酸的下游代谢物。还观察到DAG和TAG物质的积累(图6a)。TAGs在积累时可以储存在脂滴中。有趣的是，在经历过MET的间充质癌细胞中观察到明显丰富的脂滴，而对照处理的细胞不含那么多脂滴(图6b和图14a)，这表明脂肪酸的命运可能在间充质和上皮细胞状态中有所不同。

我们试图从功能上测试参与TAG合成途径的中间脂质酶是否确实是调节MET所必需的。与空白治疗或shRNA敲低对照相比，GPAT(使用FSG67)和DGAT(使用AmidepsineA)的药理学抑制以及AGPAT9的shRNA敲低都导致视黄素治疗期间脂滴的积累明显减少(图14b)。这是由于MET被阻断，因为当GPAT、DGAT或AGPAT9被功能性破坏时，即使在存在视黄素治疗的情况下，上皮管腔基因标记物(如E-钙粘蛋白、KRT8和MUC1)的增加也受到抑制(图14c)。与MET阻断相关的是这些间充质NAMEC8细胞的乳腺球形成能力的相应挽救，清楚地强调了TAG合成途径对上皮细胞状态的重要性(图6c和图14d)。

由于更多的上皮细胞状态似乎与更多的脂质储存有关，我们推断在间充质细胞状态下，脂肪酸可能被用作替代生化途径的能量来源，如脂肪酸β-氧化(FAO)。β-氧化是一种分解代谢过程，通过该过程，脂肪酸在线粒体中被分解以产生乙酰辅酶A，从而为TCA循环提供燃料。在这里，我们使用耗氧率(OCR)作为TCA循环活动的读数。使用棕榈酸酯作为脂肪酸的来源，位于间充质状态的对照处理细胞显然有利于棕榈酸酯的能量产生。相比之下，已转变为上皮状态的被贝沙罗汀处理的细胞在补充棕榈酸酯时显示出较低的OCR(图6d和图14e、f)，因此表明脂肪酸的利用和命运在处于不同细胞状态的癌细胞之间有所不同。间充质癌细胞倾向于依赖β-氧化，而处于上皮状态的癌细胞似乎将脂肪酸分流至脂滴储存。

在视黄素诱导的MET中观察到脂肪酸利用从β-氧化到脂质储存的这种转变后，我们想知道处于天然细胞状态的癌细胞是否也表现出这种代谢偏好。比较稳定存在于上皮(HMLE)或间充质(NAMEC8)细胞状态的两种同基因细胞系，前者确实显示出更多的脂质种类有利于TAG的产生，并最终形成脂滴(图6e、f和图14g)。与上皮HMLE和间充质癌细胞系(BT549、MDA-MB-468和SUM159)相比，与上皮癌细胞系相比，间充质癌细胞系(BT549、MDA-MB-468和SUM159)的FAO率更高，这反映了对β-氧化的更高依赖性。MCF7和T47D)(图6g)。重要的是，在缺乏营养的条件下补充棕榈酸或硫辛酸时，间充质癌细胞系BT549具有生长优势，而上皮癌细胞系MCF7没有表现出这种代谢偏好(图6h)。

间充质-上皮转化的诱导依赖于脂肪酸修饰剂肉碱棕榈酰转移酶

如果癌细胞确实依赖β-氧化来维持间充质表型，我们假设抑制β-氧化可能有助于通过限制癌细胞依赖的代谢途径来促进或稳定上皮细胞表型。肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)是一种关键的线粒体酶，负责催化酰基基团从长链脂肪酰基辅酶A转移形成酰基肉碱。从本质上讲，这允许将脂肪酸运输到线粒体中，为TCA循环提供燃料并利用脂肪酸作为能量来源。我们首先表明，将间充质癌细胞暴露于CPT1抑制剂依托莫司，以单独的方式或者与贝沙罗汀组合的方式，完全抑制了FAO活性(图15a)。尽管我们证明单独使用贝沙罗汀可以引起MET，但依托莫司本身却无法做到。然而，贝沙罗汀和依托莫司的组合发挥了更有效的MET表型，即使在移除药物至少7天后，该表型也更加持久和持续(图7a和图15b、c)。用组合疗法处理的细胞在停用药物后也维持对乳腺球形成的抑制作用(图7b和图15d)。

为了表明添加依托莫司对MET的增强是准确的，我们在NAMEC8中对CPT1A(CPT1的主要同种型)进行了基因敲除。CPT1A的敲低导致贝沙罗汀处理后脂滴的积累增加(图7c)，这与更强的MET表型相对应，如间充质/基础蛋白的明显减少和管腔蛋白的增加所示(图7d)。与对照细胞相比，在CPT1A敲低细胞经贝沙罗汀处理后的对乳腺球形成的更大抑制也表现出增强的MET表型(图7e)。

如果间充质癌细胞确实通过β-氧化来代谢脂肪酸，我们推断CPT1通过其过度表达增加的活性将克服贝沙罗汀的作用和上皮细胞表型的诱导。我们在NAMEC8细胞中过表达CPT1A，令人惊讶的是，这足以克服FAO的贝沙罗汀依赖性抑制(图15e)。在过表达CPT1A的两种细胞系中，即使在贝沙罗汀处理后，细胞也清楚地显示出不存在脂滴(图7f和图15f)，进一步表明CPT1A过表达细胞中存在活性的FAO。这与贝沙罗汀处理后CPT1A过表达细胞中间充质表型的维持相对应，如贝沙罗汀处理后的细胞以分散方式生长(图15g)、间充质标志物的维持和上皮/管腔标志物的诱导抑制(图7g)所证明的那样。在CPT1A过表达细胞系中进行的乳腺球形成试验中，即使在贝沙罗汀处理的情况下，乳腺球形成也得以挽救(图7h和图15h)；这表明脂肪酸进入线粒体以进行β-氧化的增强足以克服由贝沙罗汀诱导的细胞状态变化的影响。因此，虽然细胞状态转变的上游触发是必要的，但代谢需求的重编程对于加强细胞状态是必不可少的，并且似乎足以克服MET诱导剂的影响。

脂肪酸氧化受损将脂质重新引导至支持上皮细胞状态并阻断EMT

由于MET将脂肪酸的命运编程为脂质储存，我们推断逆过程，即EMT，将导致相反的结果。使用分别含有EMT转录因子Twist、Zeb1和Slug可诱导表达的三种不同细胞系(HMLE-Twist-ER、HMLE-Zeb1、MCF7-Slug)，当细胞处于上皮状态时，我们观察到大量脂滴，它们随着细胞转变为间充质状态而丢失(图8a)。使用HMLE-Twist-ER细胞，我们还证明了EMT程序的激活可以重新编程癌细胞的代谢需求，从脂质储存到β-氧化，如通过OCR测量的(图8b和图16a)。

由于EMT期间代谢重编程的变化转化为FAO的变化，我们假设CPT1的抑制可能对EMT进展产生影响。将HMLE-Twist ER细胞暴露于4-OHT诱导了EMT，而用依托莫司处理能够显著阻止这种转变(图8c、d)。这在另一个诱导型EMT细胞系模型MCF7-Slug+Sox9中得到了复制，其中依托莫司在MCF7乳腺癌细胞中也阻断了Slug+Sox9诱导的EMT(图16b、c、d)32。CPT1对EMT程序的重要性也通过CPT1A的基因敲低得到证实，这导致无法诱导EMT进展并因此维持上皮表型(图8e、f和图16e)。这强调了脂肪酸利用在控制和编程细胞状态中的重要性。依托莫司在阻断TGFβ诱导的EMT中的作用也显示在肺癌细胞系A549中(图16f和g)。

最后，我们试图在功能上测试代谢途径的直接扰动，在这种情况下，脂肪酸氧化，是否可以改变体内动物模型中EMT诱导的癌转移过程。我们利用细胞系模型MCF7-Slug+Sox9，其中EMT转录因子Slug和Sox9的多西环素诱导伴随表达在预先建立的MCF7肿瘤异种移植物中可以强烈诱导体内EMT并促进其他非转移性肿瘤细胞的从NSG小鼠的脂肪垫到肺的转移(图8g)32.此处，将MCF7-Slug+Sox9细胞移植到NSG小鼠的脂肪垫中，并在植入后一周开始药物治疗。一组小鼠在给予多西环素之前施用了依托莫司(每天20毫克/千克)。另一组小鼠被施用多西环素，同时用空白对照进行假治疗。10周后，免疫荧光分析显示，对照处理的小鼠的原发肿瘤本质上仍然是上皮，并表达了E-钙粘蛋白(图8g)。相比之下，多西环素治疗小鼠的肿瘤显示出EMT的标志，包括间充质标志物波形蛋白的表达和伴随的E-钙粘蛋白的损失。然而，同时接受了依托莫司的多西环素治疗小鼠的肿瘤显示出上皮特征的保留，从而证明了体内EMT的阻断。更重要的是，在多西环素治疗的小鼠的肺中检测到广泛的转移性结节，而接受依托莫司的实验组具有与对照治疗的小鼠相似数量的转移性病变(图8g)。这提供了第一个概念证明，即脂肪酸氧化是激活EMT程序产生转移所必需的，并且这种关键代谢途径的药理学抑制可能有助于控制乳腺癌的转移。

表观遗传调控控制细胞状态转变

由于EMT是一个可逆过程，已发现组蛋白修饰和DNA甲基化等表观遗传机制在调节EMT响应基因的表达中很重要。例如，在EMT程序激活期间E-钙粘蛋白的表观遗传沉默已经得到很好的阐明。此外，研究还报道了各种表观遗传调节剂，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)，能够对癌细胞发挥分化作用。因此，为了阐明EMT与表观遗传调控之间的分子联系，我们使用由多种表观遗传化合物组成的综合表观遗传文库——结构基因组学联盟(SGC)表观遗传化学探针文库(Cayman)进行了MET和抑制EMT筛选。

对于MET筛选，与A83-01相比，良好的命中对应于可以诱导较低SERPINE1启动子活性的命中。初级筛选揭示了能够诱导MET而不会对细胞活力产生不利影响的几个命中(图17A)。这些命中包括蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)、G9a/GLP组蛋白甲基转移酶和CREBBP/EP300溴结构域的抑制剂。然后在六种不同浓度下检查它们以评估它们随药物浓度增加对SERPINE1启动子活性的剂量依赖性变化，并比较每种化合物的MET诱导潜力(图17B)。随着浓度的增加，所有四种化合物都显示出SERPINE1启动子活性的明显剂量依赖性降低。之后，他们随后接受了体外验证试验，以测试它们在促进间充质TNBC细胞中的MET方面的功效

表观遗传命中的系统验证确定CREBBP/EP300溴结构域抑制剂是有效的MET诱导剂

从MET筛选中，选择了在降低SERPINE1启动子活性方面最有效的四个命中(图17C，以红色圈出)用于体外验证研究。即，这些化合物包括：PRMT5抑制剂-LLY-283和GSK591，组蛋白甲基转移酶G9a和GLP的抑制剂-UNC0642，以及CREBBP和EP300溴结构域抑制剂-SGC-CBP30。这些化合物首先在间充质NAMEC8细胞中进行处理，以从形态学上验证它们是否可以诱导细胞状态的变化。如图3C所示，仅用SGC-CBP30处理会导致细胞形态发生明显变化，从分散的纺锤体和成纤维细胞样细胞转变为紧密的上皮岛簇，这是上皮样形态的特征。这表明与其他命中相比，SGC-CBP30在诱导间充质细胞中的MET方面可能是更强的药剂。另一方面，未观察到其他三种化合物在NAMEC8中诱导上皮样形态(图17C)。

然后评估用命中处理的细胞的EMT和基底/管腔标记的转录和蛋白质表达的变化(图17D和E)。与形态学观察相似，SGC-CBP30被证明在诱导上皮表型方面最有效。SGC-CBP30显著增加了上皮标志物E-钙粘蛋白的表达，并下调了几种间充质标志物、纤连蛋白、ZEB1和SLUG。相反，在用LLY-283、GSK591和UNC0642处理的细胞中没有观察到明显的变化。此外，由于间充质表型通常与基底样细胞相关，并且当前研究的兴趣在于TNBC，因此还在药物治疗时评估基底和管腔标志物。观察到SGC-CBP30治疗增加了粘蛋白1(MUC1)——一种通常在管腔乳腺癌中表达的糖蛋白(图17D和E)。因此，这表明SGC-CBP30不仅可以诱导MET，还可以介导基底样间充质细胞中管腔样特征的获得。

当细胞重悬在乳腺球培养基中时，观察到LLY-283(p＜0.01)、GSK591(p＜0.01)和SGC-CBP30(p＜0.05)预处理显著减少了形成的球体的大小和数量。相比之下，DMSO预处理的细胞能够有效地形成球体(图17F)。因此，这表明在用这些化合物处理后，间充质NAMEC8细胞的体外干细胞减少。此外，乳腺干细胞样细胞的典型特征是存在CD44high/CD24-/low细胞表面标志物。因此，在用SGC-CBP30处理后，通过流式细胞术分析这些细胞表面标志物的表达，因为该化合物在各种验证试验中表现出更强的MET诱导潜力。图3G显示，通过SGC-CBP30处理，观察到CD44表达较低的细胞群，表明该经典干细胞标记的表达受到抑制。这表明当NAMEC8细胞用SGC-CBP30处理时干细胞特性的丧失。治疗后干细胞样特性的降低强烈表明间充质细胞状态的转变，因为干细胞样特征与间充质表型相关。

为了确保这些命中促进细胞状态转变的作用可以在癌细胞中重现，在TNBC细胞系SUM159中进一步评估了这些化合物。与NAMEC8中所证明的类似，与其他命中相比，SGC-CBP30被观察到是更强的MET诱导剂，增加了SUM159中的上皮特征并降低了干细胞特性(图18A-D)。当SUM159细胞在SGC-CBP30处理后通过流式细胞术分析CD44和CD24细胞表面标志物的表达时，细胞表现出CD44表达略有下降，细胞群获得CD24表达(图3I)。这表明在抑制SUM159中的CREBBP/EP300溴结构域后，从干细胞样状态(CD44high/CD24-/low)转变为非干细胞样状态(CD44low/CD24high)。因此，这些数据表明SGC-CBP30不仅可以减少间充质和基底样特征，还可以诱导TNBC干细胞的丧失，从而可能降低其致瘤性和侵袭性。

抑制CREBBP/EP300蛋白的组蛋白乙酰转移酶结构域未能诱导有效的MET转化

由于CREBBP和EP300包含溴结构域和HAT结构域，我们接下来探讨了抑制这些蛋白质的HAT结构域是否会诱导与抑制溴结构域相似的表型。当NAMEC8用A-485(CREBBP/EP300的有效和选择性HAT抑制剂)处理时，观察到紧密的上皮岛簇，表明上皮样细胞形态(图19A)。A-485处理还证明E-钙粘蛋白表达上调，间充质标记物略有减少(图19B)。这些数据表明，与SGC-CBP30类似，抑制这些蛋白质的HAT结构域似乎促进了间充质细胞中的MET。然而，当通过乳腺球测定评估A-485处理的细胞的体外干细胞特性时，球计数与DMSO处理的细胞没有显著差异(图19C)，表明A-485在减少间充质细胞的干细胞特性方面的潜力有限。有趣的是，当在A-485处理后分析NAMEC8细胞的CD44和CD24细胞表面标志物的表达时，观察到CD44表达的明显增加(图19D)。因此，数据表明抑制CREBBP/EP300蛋白的HAT结构域只能在NAMEC8细胞中诱导上皮样表型，但不能降低体外干细胞特性。

由于CREBBP和EP300是乙酰转移酶，我们接下来评估了SGC-CBP30和A-485处理后三种最常见的乙酰化组蛋白标记——组蛋白H3的赖氨酸14、18和27(H3K14ac、H3K18ac和H3K27ac)。数据显示，在SGC-CBP30处理后，所有乙酰化标记都减少了，但与A-485处理相比，减少的程度较小(图19E)。由于SGC-CBP30被证明在MET转化中相比A-485更有效，这表明细胞状态转变可能不仅仅归因于乙酰化状态的变化，而且溴结构域的参与也是必不可少的。然而，需要做更多的工作来阐明溴结构域和HAT是否确实调节了不同的靶基因和蛋白质，并探索溴结构域抑制对MET转化的影响。通过阐明抑制CREBBP/EP300的溴结构域如何特异性诱导间充质细胞中的细胞状态转变的机制，可以作为TNBC的新治疗方法。

CREBBP/EP300溴结构域抑制降低体内基底样TNBC的肿瘤负荷

在确定CREBBP/EP300介导的表观遗传改变可以诱导MET并降低基底样、间充质TNBC细胞的干细胞样特性后，我们接下来研究了TNBC对CREBBP/EP300溴结构域和HAT抑制的致瘤潜力，以确定它是否可以减少小鼠的肿瘤负荷。当NAMEC8-Ras细胞在皮下注射到免疫缺陷NODscidγ(NSG)小鼠之前用SGC-CBP30和A-485预处理时，与DMSO治疗相比，仅SGC-CBP30治疗在11周后导致显著较小的肿瘤细胞。在A-485预处理后仍观察到肿瘤形成(图19F)。这补充了体外研究结果，即与A-485相比，SGC-CBP30在间充质细胞的MET转化中更有效。因此，这表明通过CREBBP/EP300溴结构域抑制改变TNBC细胞的基因调控，细胞的致瘤性降低。然而，需要重复体内研究，以确保这一观察结果是一致和可重复的。此外，需要对肿瘤组织进行组织学分析，以确定由DMSO形成的肿瘤与药物处理的细胞之间是否存在任何形态学差异。尽管如此，我们最初的体内数据表明，抑制CREBBP/EP300蛋白的溴结构域可以降低高度侵袭性TNBC的致瘤潜力。

总之，这些数据表明CREBBP和EP300蛋白可能在维持间充质细胞状态方面发挥作用。抑制这两种共激活蛋白的溴结构域可能会导致转录调控减少，以及维持细胞处于间充质状态所必需的基因表观遗传学的修饰。因此，我们假设CREBBP和EP300的溴结构域可能调节与超级增强子相关的间充质基因。这些基因会被过度乙酰化，从而导致更大的转录激活，如由CREBBP/EP300溴结构域介导的(图19G)。抑制溴结构域会阻碍共激活因子和转录因子与这些间充质基因的启动子的结合，导致乙酰化减少和随后的基因转录。因此，我们假设MET的诱导可能是由于对维持间充质细胞状态很重要的基因转录减少(图19G)。

针对代谢靶标的MET诱导剂的表型筛选

针对代谢靶标的MET诱导剂的表型筛选NAMEC8-SERPINE1细胞用于筛选代谢靶标的303种化合物库(MedChem Express)，以识别MET诱导剂。15种化合物被鉴定为MET强诱导剂，我们选择了6种化合物进行体外正交验证：谷氨酰胺酶C-IN-1、GSK256066、GSK2837808A、AGI-6780、SW033291和NCT-503(图20A和B)。Dual-glo荧光酶检测在NAMEC8-SERPINE1细胞中进行，该细胞用6种选定的化合物以浓度从10nM增加到2uM的方式进行处理。用化合物谷氨酰胺酶C-iN-1、GSK256066和AGI-6780观察到SERPINE1启动子活性的剂量依赖性降低(图20C)。

为了研究谷氨酰胺酶与间充质表型之间的任何可能关联，在一组上皮与间充质乳腺癌细胞系中进行了谷氨酰胺酶的蛋白质印迹分析。发现间充质乳腺癌细胞系与上皮乳腺癌细胞系相比表达更高水平的GLS1，表明GLS1可能是间充质细胞状态的决定因素并且是三阴性乳腺癌的潜在生物标志物(图20D)。

为了进行MET的体外验证，用C-IN-1处理NAMEC8细胞。在C-IN-1处理后诱导了从间充质细胞中通常观察到的分散分布到紧密的上皮岛簇的形态变化(图20E)。在C-IN-1治疗后，通过蛋白质印迹观察到分子标志物的相应变化，其中间充质蛋白Zeb1、纤连蛋白、Slug和Snail减少，上皮E-钙粘蛋白增加，基底细胞角蛋白5减少，管腔标志物细胞角蛋白8、粘蛋白1和ER增加(图20F)。这为谷氨酰胺酶抑制后MET的诱导提供了分子证据。

在NAMEC8中使用3种shRNA(图20G)对GLS1进行基因敲低，然后用紫杉醇处理以研究MET诱导后化学敏感性的变化。与Ctrlsh细胞相比，在GLS1sh2细胞中观察到对紫杉醇的IC50降低(图20H)，表明转化为上皮表型后化学敏感性增加。乳腺球测定也作为干细胞特性的体外测定进行。与Ctrlsh细胞相比，在GLS1sh2和sh3细胞中观察到形成的球体数量减少，表明干细胞特性降低(图20I)。GLS1的基因敲除也在NAMEC8-HRas细胞中进行，并皮下注射到NSG小鼠的侧腹。与Ctrlsh细胞相比，GLS1sh2细胞观察到肿瘤生长减少(图20J和K)。这表明诱导MET后致瘤潜力降低。

示例3

讨论

细胞状态的改变代表了一种控制癌细胞对治疗反应的新兴方法。在急性早幼粒细胞白血病和皮肤T细胞淋巴瘤中，视黄素已被用作具有治愈目的的一线佐剂。然而，在实体瘤中，我们证明了视黄素作为细胞状态转变的诱导剂，这使得原本耐药的乳腺癌细胞对标准治疗产生更好的反应，因此可能在临床上用于组合疗法。此外，视黄素诱导的MET还会将细胞从更具侵袭性的间充质状态转变为转移性较低的上皮状态。在转移性乳腺癌患者的小群体研究中，视黄素治疗没有产生反应，可能是由于缺乏肿瘤分子亚型分层和患者选择。根据我们的研究产生的新信息，我们表明本质上更倾向于间充质的基底样TNBC更有可能做出反应。这凸显了对可以将潜在响应者与非响应者进行分层的生物标志物的需求。

免疫检查点阻断疗法已显示出对某些癌症的显著益处。利用免疫系统的吸引力在于其共同点——无论癌症的分子变化多么多样化，免疫系统在其识别和攻击癌细胞的内在能力方面具有天然优势。虽然免疫检查点(PD1、PD-L1)抑制剂在治疗某些人类癌症方面有效，例如黑色素瘤和肺癌，但它们在ER+/PR+乳腺癌中没有取得类似的成功；他们目前正在进行转移性TNBC的积极临床研究。Keynote012报告了在1期研究中使用Pembrolizumab单药治疗的反应率为18％。Keynote086，一项2期Pembrolizumab单药治疗研究显示反应率为5％。一些研究表明，癌细胞状态与免疫标志物(如基于细胞的模型中PD-L1)的表达之间存在潜在关联。间充质到上皮细胞状态的转化可能会引发内在的分子变化，现在导致肿瘤细胞变得更容易受到免疫细胞的攻击，从而提高乳腺癌免疫治疗的成功率。

从机制上讲，可能有几种途径可以实现MET表型的转化。在我们的研究中，视黄素是最有效的一类以非偏倚的方式鉴定的此类诱导剂。我们首次证明，它们通过在细胞状态转换过程中重新连接脂质代谢而起作用(图7I)。脂质代谢是否确实是细胞状态变化的驱动因素或结果仍有待确定。用依托莫司抑制β-氧化不足以诱导MET，这表明其他途径也是必要的，或者需要同时抑制FAO途径的几种酶。然而，单独的CPT1A过表达足以阻断贝沙罗汀诱导的MET，并且通过依托莫司治疗延长了贝沙罗汀的作用，表明代谢重编程是使细胞能够在细胞状态之间转换以及维持过渡的必要特征.除了TNBC，MET转化还可以广泛适用于具有间充质特征并引发其对其他疗法的反应的癌症。

为什么癌细胞状态的差异会带来独特的代谢需求？在胚胎干细胞中，谷氨酰胺和α-酮戊二酸(αKG)通过提高αKG与琥珀酸的比率来支持多能性，促进DNA和组蛋白的去甲基化。在癌症中，细胞状态控制增殖、侵袭性和对压力的耐受性，这需要对特定代谢物的严格要求。例如，天冬酰胺的可用性通常会促进EMT驱动的转移或肿瘤生长，而顺铂耐药的癌细胞似乎依赖谷氨酰胺进行核苷酸生物合成。在我们的研究中，将脂肪酸引导至β-氧化以产生能量可能会使处于间充质状态的癌细胞在侵袭和转移过程中耐受营养水平的波动，而更增殖的上皮状态可能会优先采用有氧糖酵解，即使在富含葡萄糖的条件下，这是典型的大块肿瘤细胞。因此，在癌症进展的不同步骤中对特定代谢途径的成瘾可用于靶向细胞状态，并为抗代谢物治疗策略开辟新途径。

表3：关键资源表

表4：NAMEC8中贝沙罗汀处理后上调基因的基因本体通路富集分析。下面重点介绍免疫反应途径和基因。

A GO生物过程

细胞增殖的调节(CO：0042127)

细胞因子介导的信号通路(CO：0019221)

血管生成的调节(CO：0045765)

细胞死亡的正调控(GO：0010942)

糖胺聚糖生物合成过程(GO：006024)

血管生成的正调控(GO：0045766)

细胞对氧含量降低的反应(GO：0036294)

细胞增殖的正调控(GO：0008284)

细胞对I型干扰素的反应(CO：0071357)

B)在NAMEC8中贝沙罗汀处理后上调基因的WikiPathway分析。下面重点介绍免疫反应途径和基因。

BWikiPathwavs

核受体元通路WP2882

II干扰素信号(IFNG)WP619

透明细胞肾细胞癌的通路WP4018

苯并芘代谢WP696

VEGFA-VEGFR2信号通路WP3888

血清素转运蛋白活性WP1455

补体激活WP545

光动力疗法诱导的HIF-1存活信号WP3614

造血干细胞分化WP2849

前列腺素合成与调控WP98

序列表

<110> 新加坡科技研究局

<120> 控制癌症中细胞状态转变的方法

<130> S61013719

<160> 68

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDH1的正向引物

<400> 1

atggctcaag aaacatttgt cat 23

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDH1的反向引物

<400> 2

gagcttgcgg cccgaat 17

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD24的正向引物

<400> 3

gagaacagga tgccccttag aat 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD24的反向引物

<400> 4

aaatctgcgt gggtaggagc a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD44的正向引物

<400> 5

atcttgccac agccactgat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD44的反向引物

<400> 6

tcggaagttg gctgcagttt 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SERPINE 1的正向引物

<400> 7

cgggcagctc gaagaagtg 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SERPINE 1的反向引物

<400> 8

tagaggaata gcgggggatc at 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD166的正向引物

<400> 9

agggggagga gagagagatt cg 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD166的反向引物

<400> 10

gcggagatca agaggcagaa 20

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZEB1的正向引物

<400> 11

cggcggatcg attcagctta tttattcca 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZEB1的反向引物

<400> 12

cggtaaacta gtgatcctct cgcttgtgt 29

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDH1的正向引物

<400> 13

ttgcaccggt cgacaaagga c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDH1的反向引物

<400> 14

tggattccag aaacggaggc c 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VIM的正向引物

<400> 15

acccgcacca acgagaaggt 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VIM的反向引物

<400> 16

attctgctgc tccaggaagc g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SLUG的正向引物

<400> 17

taccgctgct ccattccacg 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SLUG的反向引物

<400> 18

catgggggtc tgaaagcttg g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH的正向引物

<400> 19

tggcaaattc catggcaccg 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH的反向引物

<400> 20

cgccccactt gattttggag g 21

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SERPINE1的正向引物

<400> 21

gcaccacaga cgcgatctt 19

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SERPINE1的反向引物

<400> 22

acctctgaaa agtccacttg c 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZEB1的正向引物

<400> 23

tgcactgagt gtggaaaagc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZEB1的反向引物

<400> 24

tggtgatgct gaaagagacg 20

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MUC1的正向引物

<400> 25

tgccgccgaa agaactacg 19

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MUC1的反向引物

<400> 26

tggggtactc gctcatagga t 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRT5的正向引物

<400> 27

caaggttgat gcactgatgg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRT5的反向引物

<400> 28

tgtcagagac atgcgtctgc 20

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRT8的反向引物

<400> 29

cagaagtcct acaaggtgtc ca 22

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRT8的反向引物

<400> 30

ctctggttga ccgtaactgc g 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FN1的正向引物

<400> 31

gagaatggac ctgcaagccc a 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FN2的反向引物

<400> 32

agtgcaagtg atgcgtccgc 20

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GREB1的正向引物

<400> 33

atgggaaatt cttacgctgg ac 22

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GREB1的反向引物

<400> 34

cactcggcta ccaccttct 19

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ABCA3的正向引物

<400> 35

ctcctctgga agaactacac cc 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ABCA3的反向引物

<400> 36

gggcacattt tccgactgaa tc 22

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NRIP1的正向引物

<400> 37

ggatcaggta ctgccgttga c 21

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NRIP1的反向引物

<400> 38

ctggaccatt actttgacag gtg 23

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TFF1的正向引物

<400> 39

ccctcccagt gtgcaaataa g 21

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TFF1的反向引物

<400> 40

gaacggtgtc gtcgaaacag 20

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LIPE的正向引物

<400> 41

tcagtgtcta ggtcagactg g 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LIPE的反向引物

<400> 42

aggcttctgt tgggtattgg a 21

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNPLA2的正向引物

<400> 43

ggcttcctcg gcgtctacta 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNPLA2的反向引物

<400> 44

tttaccaggt tgaaggaggg g 21

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACSL4的正向引物

<400> 45

catccctgga gcagatactc t 21

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACSL4的反向引物

<400> 46

tcacttagga tttccctggt cc 22

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACSL5的正向引物

<400> 47

ctcaacccgt cttacctctt ct 22

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACSL5的反向引物

<400> 48

gcagcaactt gttaggtcat tg 22

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AGPAT4的正向引物

<400> 49

ctcagggcta atcatcaaca cc 22

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AGPAT4的反向引物

<400> 50

gcttgagatg caataggaca gt 22

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AGPAT9的正向引物

<400> 51

cgctggttct cggcttcat 19

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AGPAT9的反向引物

<400> 52

tggcccactc taaagttttc ac 22

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPAM的正向引物

<400> 53

gatgtaagca cacaagtgag ga 22

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPAM的反向引物

<400> 54

tccgactcat taggctttct ttc 23

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPAP2A的正向引物

<400> 55

ggcaggttgt ccttctattc ag 22

<210> 56

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPAP2A的反向引物

<400> 56

cagtgtgggg cgtaagagt 19

<210> 57

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DGAT2的正向引物

<400> 57

attgctggct catcgctgt 19

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DGAT2的反向引物

<400> 58

gggaaagtag tctcgaaagt agc 23

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PLIN1的正向引物

<400> 59

tgtgcaatgc ctatgagaag g 21

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PLIN1的反向引物

<400> 60

agggcgggga tcttttcct 19

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MGLL的正向引物

<400> 61

atgccagagg aaagttcccc 20

<210> 62

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MGLL的反向引物

<400> 62

cgtctgcatt gaccaggtg 19

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ESR1的正向引物

<400> 63

cccactcaac agcgtgtctc 20

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ESR1的反向引物

<400> 64

cgtcgattat ctgaatttgg cct 23

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PTGS1的正向引物

<400> 65

cgccagtgaa tccctgttgt t 21

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PTGS1的反向引物

<400> 66

aaggtggcat tgacaaactc c 21

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HADHB的正向引物

<400> 67

ctgtccagac caaaacgaag aa 22

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HADHB的反向引物

<400> 68

cgatgcaaca aacccgtaag c 21

Claims

1.一种在癌细胞中诱导间充质-上皮转化(MET)的方法，所述方法包括：使细胞与间充质-上皮转化诱导剂在足以在细胞中诱导MET的时间和条件下接触，其中，所述癌细胞是基底样(间充质样)癌细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法是体外、体内或离体方法。

3.如权利要求1所述的方法，其中，MET诱导剂是视黄素。

4.如权利要求3所述的方法，其中视黄素是视黄素X受体α(RXR-α)激动剂或视黄酸受体α(RAR-α)激动剂。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述RXR-α激动剂是贝沙罗汀或视黄酸。

6.如权利要求4所述的方法，其中，RAR-α激动剂是TTNPB、IRX5183或SY-1425。

7.如权利要求1所述的方法，其中，MET诱导剂是表观遗传修饰化合物、TGFβ抑制剂、腺苷/肾上腺素能、GABA或NMDA受体调节剂或神经递质。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述表观遗传修饰化合物是p300/CREBBP溴结构域的抑制剂。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述p300/CREBBP溴结构域的抑制剂是SGC-CBP30。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述MET诱导剂是谷氨酰胺酶抑制剂。

11.如权利要求10所述的方法，其中，谷氨酰胺酶抑制剂是谷氨酰胺酶C-IN-1、CB839(Telaglenastat)、UPGL00004或BPTES。

12.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌细胞选自三阴性乳腺癌或其他间充质样癌，例如头颈癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、和结直肠癌。

13.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌细胞是对标准护理疗法具有抗性的癌细胞。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括：在癌细胞中诱导MET之后，使细胞与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物或免疫调节剂接触。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述化学治疗剂是紫杉醇或5-氟尿嘧啶。

16.如权利要求14所述的方法，其中，所述表观遗传修饰化合物是选自CI-994或SBHA的I类HDAC抑制剂。

17.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括使基底样(或间充质样)癌与脂质代谢的抑制剂或调节剂接触。

18.如权利要求17所述的方法，其中，脂质代谢抑制剂是长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)、肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)或线粒体硫解酶、3-酮酰基辅酶A硫解酶(3-KAT)和单酰基甘油脂肪酶(MGLL)。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述CPT1的抑制剂为依托莫司、哌克昔林或奥昔芬尼。

20.权利要求17所述的方法，其中，所述脂质代谢抑制剂是参与脂肪酸氧化途径的酶的抑制剂。

21.如权利要求17所述的方法，其中，所述脂质代谢调节剂是选自由甘油-3-磷酸乙酰转移酶(GPAT)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(AGPAT)、前列腺酸性磷酸酶(PPAP)、二脂酰甘油脂酰基转移酶(DGAT)。

22.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括治疗患者的癌症或使患者对抗癌疗法敏感。

23.一种间充质-上皮转化(MET)诱导剂，用于在患者细胞中诱导间充质-上皮转化。

24.间充质-上皮转化(MET)诱导剂在制备用于诱导患者细胞中间充质-上皮转化的药物中的用途。

25.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：在治疗患者癌症的时间和条件下，将间充质-上皮转化(MET)诱导剂与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质抑制剂组合施用于患者。

26.一种用于在有需要的患者中治疗癌症的间充质-上皮转化(MET)诱导剂，其中，将所述间充质-上皮转化(MET)诱导剂与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂组合施用于患者。

27.间充质-上皮转化(MET)诱导剂在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途，其中，将所述药物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂组合施用于患者。

28.一种使癌症患者对抗癌疗法敏感的方法，所述方法包括：在使患者对抗癌疗法敏感的时间和条件下，对患者施用视黄素。

29.一种用于使癌症患者对抗癌疗法敏感的间充质-上皮转化(MET)诱导剂。

30.间充质-上皮转化(MET)诱导剂在制备用于使患者对抗癌疗法敏感的药物中的用途。

31.一种鉴定诱导细胞中的间充质-上皮转化的药剂的方法，所述方法包括：

c)将细胞与待筛选的测试药剂接触；以及

d)检测选自由CD24、CD44、CD166、CDH1、ZEB1和SEPINE1组成的群组的基因的启动子的表达；其中，一种或多种基因的表达与对照相比的变化表明测试药剂能够诱导细胞中的间充质-上皮转化。

32.如权利要求31所述的方法，其中，所述细胞是被报告细胞系，其被改造成从待检测表达的基因的启动子表达可测量的标记。

33.一种鉴定对组合疗法有反应的癌症患者的方法，所述组合疗法包含诱导间充质-上皮转化(MET)的化合物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂的组合，所述方法包括：对从所述患者获得的样品进行癌症的间充质亚型的检测，其中，基底样癌的存在表明患者对组合疗法有反应。

34.如权利要求33所述的方法，其中，癌症的间充质亚型是基底样(或间充质样)。

35.如权利要求33所述的方法，其中，所述方法包括用组合疗法治疗患者。

36.一种鉴定和治疗对组合疗法有反应的癌症患者的方法，所述组合疗法包含诱导间充质-上皮转化(MET)的化合物与化学治疗剂、表观遗传修饰化合物、免疫调节剂或脂质代谢抑制剂的组合，所述方法包括：

a)对从所述患者获得的样品进行癌症的间充质亚型的检测，其中，癌症的间充质亚型的存在表明患者对组合疗法有反应；以及

b)用组合疗法治疗患者。

37.如权利要求36所述的方法，其中，所述方法进一步包括将所述间充质亚型癌症与脂质代谢的抑制剂或调节剂接触。

38.一种抑制受试者中癌症的上皮间充质转化(EMT)的方法，所述方法包括：在足以抑制所述受试者中癌症的上皮间充质转化(EMT)的时间和条件下，施用脂质代谢抑制剂或调节剂。

39.如权利要求38所述的方法，其中，所述脂质代谢抑制剂是长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)、肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)或线粒体硫解酶、3-酮酰基辅酶A硫解酶(3-KAT)和单酰基甘油脂肪酶(MGLL)。

40.如权利要求39所述的方法，其中，所述CPT1的抑制剂是依托莫司、哌克昔林或羟苯甘氨酸。

41.如权利要求38所述的方法，其中，所述脂质代谢抑制剂是参与脂肪酸氧化途径的酶的抑制剂。

42.如权利要求38所述的方法，其中，所述脂质代谢调节剂是选自由甘油-3-磷酸乙酰转移酶(GPAT)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(AGPAT)、前列腺酸性磷酸酶(PPAP)、二脂酰甘油脂酰基转移酶(DGAT)所组成的群组的酶的激活剂。

43.一种用于抑制受试者中癌症的上皮-间充质转化(EMT)的脂质代谢抑制剂或调节剂。

44.脂质代谢抑制剂或调节剂在制备用于抑制受试者中癌症的上皮-间质转化(EMT)的药物中的用途。

45.一种阻断或预防受试者中癌症转移的方法，所述方法包括：在足以阻断或预防受试者中癌转移的时间和条件下，施用脂质代谢抑制剂或调节剂。

46.一种用于阻断或预防受试者中癌症转移的脂质代谢抑制剂或调节剂。

47.脂质代谢抑制剂或调节剂在制备用于阻断或预防受试者中癌症转移的药物中的用途。