CN102711753A - 治疗眼纤维化的方法和组合物 - Google Patents

治疗眼纤维化的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102711753A
CN102711753A CN2010800538989A CN201080053898A CN102711753A CN 102711753 A CN102711753 A CN 102711753A CN 2010800538989 A CN2010800538989 A CN 2010800538989A CN 201080053898 A CN201080053898 A CN 201080053898A CN 102711753 A CN102711753 A CN 102711753A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lysyloxidase
antibody
lox
loxl2
eye
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800538989A
Other languages
English (en)
Inventor
I·斯托尔曼斯
T·范贝尔根
V·史密斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gilead Biologics Inc
Original Assignee
Gilead Biologics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gilead Biologics Inc filed Critical Gilead Biologics Inc
Publication of CN102711753A publication Critical patent/CN102711753A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本文公开了治疗例如在通过小梁切除术治疗青光眼过程中发生的眼纤维化的方法和组合物。组合物包含一种或赖氨酰氧化酶型酶(例如LOX、LOXL2)的活性调节剂，所述方法包括制备调节剂的方法和对需要的对象给予调节剂的方法。

Description

治疗眼纤维化的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年9月29日提交的美国临时专利申请系列号61/277,918和2010年6月11日提交的美国临时专利申请系列号61/397,456的优先权，其公开内容通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
有关联邦资助的说明
无。
技术领域
本申请属于例如在青光眼中发生的眼部神经病变领域，及其治疗。
背景技术
青光眼是一类特征为眼内压(IOP)增高和视神经损伤的神经性眼病。青光眼可导致视力下降或丧失，是导致失明的第二大原因。目前对青光眼的治疗涉及通过化学或机械手段降低眼内压。
例如，治疗青光眼最常见和有效的方法是小梁切除术，此手术过程中眼的部分小梁网被除去以使房水排出眼并进入结膜，从而降低眼内压。然而，小梁切除术一般后随有炎症和纤维化。1/3到1/2的小梁切除术最终由于结膜内纤维化而失败。
发明内容
发明人发现了平行于小梁切除术后可能发生的纤维化损伤的一些赖氨酰氧化酶型酶表达的改变。因此，对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的调节有助于降低和/或逆转这种纤维化损伤。例如，在治疗青光眼的小梁切除术后，对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的调节可减少伴随纤维化损伤，从而改善结果。
调节一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的组合物可包含蛋白质(例如抗体或小肽)，核酸(例如形成三链体的寡核苷酸、siRNA、shRNA、微小RNA、核酶)或有机小分子(例如分子量小于1kD)，例如可通过组合化学方法合成。
因此，本发明包括但不限于以下实施方式：
1.一种在生物体内治疗眼纤维化的方法，其中，该方法包括：抑制生物体的一个或多个细胞中的一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性。
2.如实施方式1所述的方法，其中，一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性被抑制。
3.如实施方式2所述的方法，其中，所述赖氨酰氧化酶型酶是赖氨酰氧化酶(LOX)。
4.如实施方式2所述的方法，其中，所述赖氨酰氧化酶型酶是赖氨酰氧化酶相关蛋白2(LOX2)。
5.如实施方式3所述的方法，其中，所述LOX活性通过给予生物体抗LOX抗体来抑制。
6.如实施方式4所述的方法，其中，所述LOXL2活性通过给予生物体抗LOXL2抗体来抑制。
7.如实施方式1所述的方法，其中，所述眼纤维化发生在青光眼治疗中。
8.如实施方式7所述的方法，其中，所述青光眼治疗涉及眼部手术，例如小梁切除术。
9.如实施方式5所述的方法，其中，所述抗LOX抗体被引入生物体眼内。
10.如实施方式6所述的方法，其中，所述抗LOX2抗体被引入生物体眼内。
11.如实施方式5所述的方法，其中，所述编码抗LOX抗体的多核苷酸给予生物体。
12.如实施方式6所述的方法，其中，所述编码抗LOXL2抗体的多核苷酸给予生物体。
13.如实施方式11或12所述的方法，其中，所述多核苷酸被引入生物体眼内。
14.如实施方式11-13中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种多核苷酸被包封在病毒载体中，所述病毒载体选自腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。
15.如实施方式14所述的方法，其中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)。
16.如实施方式15所述的方法，其中，所述病毒载体是AAV 2型或AAV 4型。
17.如实施方式1所述的方法，其中，所述生物体是哺乳动物。
18.如实施方式17所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
附图简要说明
图1(A图和B图)显示了双眼都经历小梁切除术的家兔左眼(A图，上图)和右眼(B图，下图)的眼内压(IOP)的测量值。用Tono-Pen
Figure BPA00001563284600031
眼压计测量IOP。数据表示成各时间点相对于手术前IOP值的IOP变化(平均值±SEM)。对于星号标出的点，p＜0.05。
图2(A图和B图)显示了双眼都经历小梁切除术的家兔左眼(A图，上图)和右眼(B图，下图)的滤过泡面积的测量值。数据表示成各个时间点的滤过泡面积(mm2)。对于星号标出的点，p＜0.05。
图3(A-H图)显示了纤维化滤过泡(A、B、C和D图)和未纤维化结膜(E、F、G和H图)在小梁切除术后3天(A和E图)、8天(B和F图)、14天(C和G图)、以及30天(D和H图)的CD45免疫染色切片。
图4显示了手术后不同时间采得的滤过泡(标记成“纤维化”)和结膜(标记为“未纤维化”)样品中的白细胞密度，如所标示。通过测量切片中CD45阳性细胞数量并除以切片面积来计算白细胞密度(平均值±SEM)。在未纤维化结膜样品中没有观察到CD45染色。所有纤维化样品的p＜0.05。
图5(A-H图)显示了滤过泡(A、B、C和D图)和结膜(E、F、G和H图)在小梁切除术后3天(A和E图)、8天(B和F图)、14天(C和G图)、以及30天(D和H图)的三色染色的薄切片。
图6(A-H图)显示了滤过泡(A、B、C和D图)和结膜(E、F、G和H部分)在小梁切除术后3天(A和E图)、8天(B和F图)、14天(C和G图)、以及30天(D和H图)的天狼星红染色的薄切片。
图7(A-H图)显示了滤过泡(A、B、C和D图)和结膜(E、F、G和H图)在小梁切除术后3天(A和E图)、8天(B和F图)、14天(C和G图)、以及30天(D和H图)的苏木精和伊红(H&E)染色的薄切片。
图8(A-C图)显示了小梁切除术后3、8、14和30天时滤过泡(标记为“纤维化”)和未纤维化结膜(标记为“未纤维化”)的切片中胶原沉积的定量分析(平均值±SEM)。通过测定作为切片总面积百分数的胶原纤维(用三色染成蓝色，用天狼星红染成红色，用H&E染成紫色)占据的面积来定量胶原沉积。A图显示了三色染色切片的分析。B图显示了天狼星红染色切片的分析。C图显示了H&E染色切片的分析。对于星号标出的点，p＜0.05。
图9显示了来自眼纤维化(标记为“优质”)和未纤维化(标记为“劣质”)部分组织的代表性薄切片，其对赖氨酰氧化酶(LOX)免疫染色。如所示在小梁切除术后3、8、14、和30天获得眼。
图10显示了来自眼纤维化(标记为“优质”)和未纤维化(标记为“劣质”)部分组织的代表性薄切片，其对赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)免疫染色。如所示在小梁切除术后3、8、14、和30天获得眼。
图11(A和B图)显示了小梁切除术后第3、8、14和30天时纤维化和非纤维化眼组织中赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样-2(LOXL2)蛋白水平的定量。通过测定LOX或LOXL2免疫染色阳性的切片总面积百分数来定量蛋白水平。图11的A图显示了LOX的结果；图11的B图显示了LOXL2的结果。
图12(A和B图)显示了小梁切除术后对照(PBS)和抗体处理的眼中眼内压(IOP)。A图显示抗LOX抗体的效力；B图显示抗LOXL2抗体的效力。
图13(A和B图)显示了小梁切除术后对照(PBS)和抗体处理的眼中的滤过泡面积。图13的A图显示抗LOX抗体的效力；图13的B图显示抗LOXL2抗体的效力。
图14(A和B图)显示了小梁切除术后对照(PBS)和抗体处理的眼中的滤过泡高度。图14的A图显示抗LOX抗体的效力；图14的B图显示抗LOXL2抗体的效力。
图15(A和B图)显示了卡普兰-迈耶存活曲线代表的滤过泡存活测量值。图15的A图显示抗LOX抗体的效力；图15的B图显示抗LOXL2抗体的效力。
图16显示了第30日的眼中滤过泡薄切片内CD31、CD45和胶原试验的代表性结果的显微照片。最左侧的栏显示了CD31的免疫组织化学实验；中间栏显示了CD45的免疫组织化学实验；而最右侧的栏显示胶原的天狼星红染色实验。最顶行显示了用抗LOX抗体治疗的动物眼的滤过泡切片；第二行显示了来自同一动物对照(用PBS治疗)眼的切片。第三行显示了用抗LOXL2抗体治疗的动物眼的滤过泡切片；最后一行显示了来自同一动物对照(用PBS治疗)眼的切片。
图17(A和B图)显示了小梁切除术后第30日的滤过泡和非滤过泡组织中CD31表达的定量分析。图17的A图显示了用抗LOX抗体的疗效。图17的B图显示了用抗LOXL2抗体的疗效。在两个图中，最左侧的一对柱显示了非滤过泡组织的结果，最右侧的一对柱显示了滤过泡的结果。对于每一对柱，最左侧的柱显示对照(PBS处理的)眼的结果，而最右侧的柱显示抗体治疗的眼的结果。
图18(A和B图)显示了小梁切除术后第30日的滤过泡和非滤过泡组织中CD45表达的定量分析。图18的A图显示了用抗LOX抗体的疗效。图18的B图显示了用抗LOXL2抗体的疗效。在两个图中，最左侧的一对柱显示了非滤过泡组织的结果，最右侧的一对柱显示了滤过泡的结果。对于每一对柱，最左侧的柱显示对照(PBS处理的)眼的结果，而最右侧的柱显示抗体治疗的眼的结果。
图19(A和B图)显示了小梁切除术后第30日的滤过泡和非滤过泡组织中胶原沉积的定量分析。图19的A图显示了用抗LOX抗体的疗效。图19的B图显示了用抗LOXL2抗体的疗效。在两个图中，最左侧的一对柱显示了非滤过泡组织的结果，最右侧的一对柱显示了滤过泡的结果。对于每一对柱，最左侧的柱显示对照(PBS处理的)眼的结果，而最右侧的柱显示抗体治疗的眼的结果。
发明详述
除非另有说明，本文的实施采用细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域和相关领域中的标准方法和常规技术，所述方法和技术在本领域技术范围内。这些技术描述于文献中并因而本领域技术人员可用。见例如Alberts，B.等，“Molecular Biology of the Cell(《细胞分子生物学》)，”第5版，加兰出版公司(Garland Science)，纽约州纽约，2008；Voet，D.等“Fundamentals of Biochemistry：Life at the Molecular Level(《生物化学基础：分子水平的生活》)”，第三版，约翰威利公司(John Wiley & Sons)，新泽西州霍博肯，2008；Sambrook，J等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验手册》)，”第三版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2001；Ausubel，F.等，“Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)”约翰威利公司，纽约，1987，定期更新；Freshney，R.I.，“Culture of AnimalCells：A Manual of Basic Technique(《动物细胞培养：基础技术手册》)”第四版；约翰威利公司，新泽西州萨摩赛特，2000；以及“Methods in Enzymology(《酶学方法》)，”丛书，学术出版社(Academic Press)，加利福尼亚州圣地亚哥。
眼纤维化中赖氨酰氧化酶型酶的作用
赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样(LOXL)蛋白质涉及胞外空间内胶原和弹性蛋白的交联。这些蛋白在纤维化过程中起到重要作用。
因此在一个方面，如本文所述的调节赖氨酰氧化酶型酶活性的组合物用于治疗表征为眼纤维化的病症。在一些实施方式中，调节赖氨酰氧化酶(LOX)的活性(例如抑制)。在一些实施方式中，调节了赖氨酰氧化酶样2蛋白(LOXL2)的活性(例如抑制)。一种表征为眼纤维化的病症的非限制性例子是小梁切除术，其用于治疗青光眼。
在某些实施方式中，赖氨酰氧化酶型酶的活性被抑制。赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂可以是抗体、小RNA分子、核酶、形成三链体的核酸、有机小分子(例如分子量小于1kd)或抑制赖氨酰氧化酶型酶编码基因表达的转录因子。见例如US2003/0114410；US 2006/0127402；US 2007/0021365；US2007/0225242和共有的US2009/0053224和US 2009/0104201；其通过引用纳入本文以公开各种类型的赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂。还参见美国专利号6,534,261，通过引用纳入本文以公开制备抑制赖氨酰氧化酶型酶编码基因表达的转录因子的方法。
在一些实施方式中，赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂是结合赖氨酰氧化酶型酶并抑制其活性的抗体。在另一个实施方式中，抑制是非竞争性的。结合一种或多种赖氨酰氧化酶型酶并抑制其活性的示例性抗体公开于共有的美国专利申请公开号US2009/0053224和US2009/0104201中，其公开内容通过引用纳入本文以用于公开结合赖氨酰氧化酶型酶的抗体的制备、组成和用途。
在一些实施方式中，用编码抗赖氨酰氧化酶抗体的核酸或功能性抗体片段作为赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂。可通过任何本领域已知方法给予这些核酸。例如，可将任选在缓冲液或药物载体溶液中的裸露核酸注入眼中，其配制成用作滴眼剂或系统性给药的溶液。
赖氨酰氧化酶型酶
本文所用的术语“赖氨酰氧化酶型酶”指催化赖氨酸和羟赖氨酸残基的ε-氨基氧化脱氨的蛋白家族成员，该氧化脱氨导致肽基赖氨酸转变成肽基-α-氨基己二酸-δ-半醛(醛赖氨酸)并释放化学计量量的氨和过氧化氢：
Figure BPA00001563284600071
此反应最常胞外发生于胶原和弹性蛋白中的赖氨酸残基上。醛赖氨酸的醛基具有反应性且能与其它醛赖氨酸和赖氨酸残基自发缩合，导致胶原分子交联以形成胶原纤维。
已从鸡、大鼠、小鼠、牛和人中纯化赖氨酰氧化酶型酶。所有赖氨酰氧化酶型酶包含长约205个氨基酸的共有催化结构域，其位于所述蛋白羧基末端部分且含有该酶的活性位点。所述活性位点包括含保守氨基酸序列的铜结合位点，所述序列含配位Cu(II)原子的4个组氨酸残基。所述活性位点还包含赖氨酰酪氨酰醌(LTQ)辅因子，由赖氨酸和酪氨酸残基(对应于大鼠赖氨酰氧化酶的lys314和tyr349，以及人赖氨酰氧化酶的lys320和tyr355)之间的分子内共价连接形成。形成LTQ辅因子的酪氨酸残基周边序列也在赖氨酰氧化酶型酶中保守。所述催化结构域还包含10个保守性半胱氨酸残基，其参与5个二硫键的形成。所述催化结构域还包括纤连蛋白结合域。最后，所述催化结构域中存在含有4个半胱氨酸残基的类似生长因子和细胞因子受体结构域的氨基酸序列。尽管存在这些保守区，不同赖氨酰氧化酶型酶可在催化结构域内和之外通过核苷酸和氨基酸序列不同的区域来彼此区分。
此酶家族中分离和表征的第一个成员是赖氨酰氧化酶(EC 1.4.3.13)；也称为蛋白-赖氨酸6-氧化酶、蛋白-L-赖氨酸：氧6-氧化还原酶(脱氨基)或LOX。参见例如Harris等，Biochim.Biophys.Acta 341：332-344(1974)；Rayton等，J.Biol.Chem.254：621-626(1979)；Stassen，Biophys.Acta 438：49-60(1976)。
随后发现了其它赖氨酰氧化酶型酶。这些蛋白称为“LOX样”或“LOXL”。它们都包含上述共有催化结构域并具有类似酶活性。目前，已知人和小鼠中都存在5种不同赖氨酰氧化酶型酶：LOX和4种LOX相关或LOX样蛋白LOXL1(也标注为“赖氨酰氧化酶样”、“LOXL”或“LOL”)、LOXL2(也标注为“LOR-1”)、LOXL3(也标注为“LOR-2”)和LOXL4。编码所述5种不同赖氨酰氧化酶型酶的基因各位于不同染色体。见例如，Molnar等，Biochim Biophys Acta.1647：220-24(2003)；Csiszar，Prog.Nucl.Acid Res.70：1-32(2001)；2001年11月8日出版的WO01/83702和美国专利号6,300,092，其都通过引用纳入本文。已从鼠EC细胞系中分离出名为LOXC的LOX样蛋白，其与LOXL4具有一些相似性但表达模式不同。Ito等(2001)J.Biol.Chem.276：24023-2561。从果蝇(Drosophila)中分离了2种赖氨酰氧化酶型酶DmLOXL-1和DmLOXL-2。
尽管所有赖氨酰氧化酶型酶共有一个共同催化结构域，但它们也彼此不同，具体是在其氨基末端区。所述4种LOXL蛋白与LOX相比具有氨基末端延伸。因此，人前体LOX(preproLOX)(即信号序列切割前的初级翻译产物，见下)包含417个氨基酸残基；LOXL1包含574个，LOXL2包含638个，LOXL3包含753个而LOXL4包含756个。
LOXL2、LOXL3和LOXL4在其氨基末端区含有4个重复的清道夫受体半胱氨酸富集(SRCR)结构域。这些结构域在LOX或LOXL1中不存在。在分泌、跨膜或胞外基质蛋白中发现SRCR结构域，已知该结构域在许多分泌和受体蛋白中介导配体结合。Hoheneste等(1999)Nat.Struct.Biol.6：228-232；Sasaki等.(1998)EMBO J.17：1606-1613。LOXL3在SRCR结构域外还包含氨基末端区的核定位信号。富含脯氨酸的结构域看来是LOXL 1特有的。Molnar等(2003)Biochim.Biophys.Acta 1647：220-224。各种赖氨酰氧化酶型酶的糖基化模式也不同。
所述赖氨酰氧化酶型酶的组织分布也不同。人LOX mRNA在心脏、胎盘、睾丸、肺、肾和子宫中高表达，但在脑和肝中微弱表达。人LOX1 mRNA在胎盘、肾、肌肉、心脏、肺和胰腺中表达，且与LOX类似，在脑和肝中表达水平低许多。Kim等(1995)J.Biol.Chem.270：7176-2561。高水平的LOXL2 mRNA在子宫、胎盘和其它器官中表达，但如LOX和LOXL1，其在脑和肝中低水平表达。JourdanLe-Saux等(1999)J.Biol.Chem.274：12939：12944。LOXL3mRNA在睾丸、脾和前列腺中高表达，在胎盘中适度表达，在肝中不表达，而在肝中观察到高水平的LOXL4mRNA。Huang等(2001)Matrix Biol.20：153-157；Maki和Kivirikko(2001)Biochem.J.355：381-387；Jourdan Le-Saux等(2001)Genomics 74：211-218；Asuncion等(2001)Matrix Biol.20：487-491.
不同赖氨酰氧化酶型酶在疾病中的表达和/或参与也可改变。见例如Kagen(1994)Pathol.Res.Pract.190：910-919；Murawaki等(1991)Hepatology14：1167-1173；Siegel等(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：2945-2949；JourdanLe-Saux等(1994)Biochem.Biophys.Res.Comm.199：587-592；和Kim等(1999)J.CellBiochem.72：181-188.赖氨酰氧化酶型酶还与许多癌症有关，包括头颈癌、膀胱癌、结肠癌、食管癌和乳腺癌。见例如Wu等(2007)Cancer Res.67：4123-4129；Gorough等(2007)J.Pathol.212：74-82；Csiszar(2001)Prog.Nucl.Acid Res.70：1-32和Kirschmann等(2002)Cancer Res.62：4478-4483.
因此，尽管所述赖氨酰氧化酶型酶在结构和功能上呈现某些重叠，它们各具有独特的结构以及功能。例如，就结构而言，针对LOX蛋白催化结构域产生的某些抗体不结合LOXL2。就功能而言，据报道小鼠中靶向缺失LOX看来在分娩时致命，而LOXL1缺陷不引起严重的发育表型。Hornstra等(2003)J.Biol.Chem.278：14387-14393；Bronson等(2005)Neurosci.Lett.390：118-122.
尽管最广泛记载的赖氨酰氧化酶型酶活性是氧化细胞外胶原和弹性蛋白中的特定赖氨酸残基，但有证据显示赖氨酰氧化酶型酶还参与许多胞内过程。例如，据报道某些赖氨酰氧化酶型酶调节基因表达。Li等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：12817-12822；Giampuzzi等(2000)J.Biol.Chem.275：36341-2561。此外，据报道LOX氧化组蛋白H1中的赖氨酸残基。LOX的其它胞外活性包括诱导单核细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的趋化性。Lazarus等(1995)Matrix Biol.14：727-731；Nelson等(1988)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.188：346-352。LOX自身表达受许多生长因子和类固醇如TGF-β、TNF-α和干扰素诱导。Csiszar(2001)Prog.Nucl.AcidRes.70：1-32。近期研究显示LOX在多种生物学功能如发育调节、肿瘤抑制、细胞迁移和细胞衰老中具有其它作用。
来自各种来源的赖氨酰氧化酶(LOX)蛋白的示例包括具有的氨基酸序列与以下序列之一所表达或翻译的多肽基本相同的酶：EMBL/GenBank登录号：M94054；AAA59525.1-mRNA；S45875；AAB23549.1-mRNA；S78694；AAB21243.1-mRNA；AF039291；AAD02130.1-mRNA；BC074820；AAH74820.1-mRNA；BC074872；AAH74872.1-mRNA；M84150；AAA59541.1-基因组DNA。LOX的一个实施方式是人赖氨酰氧化酶(hLOX)前原蛋白。
赖氨酰氧化酶样酶编码序列的示例性公开如下：LOXL1由以GenBank/EMBLBC015090保藏的mRNA编码；AAH15090.1；LOXL2由以GenBank/EMBL U89942保藏的mRNA编码；LOXL3由以GenBank/EMBL AF282619保藏的mRNA编码；AAK51671.1；LOXL4由以GenBank/EMBL AF338441保藏的mRNA编码；AAK71934.1。
称为前原肽的LOX蛋白初级翻译产物包含从氨基酸1-21延伸的信号序列。此信号序列在小鼠和人LOX中都通过Cys21与Ala22间的切割来胞内释放，从而产生LOX的46-48kDa前肽形式，在本文中也称为全长形式。所述前肽在通过高尔基体时进行N-糖基化以产生50kDa蛋白，然后分泌到胞外环境中。在此阶段，所述蛋白没有催化活性。在小鼠LOX的Gly168和Asp169之间、人LOX的Gly174和Asp175之间的进一步切割产生成熟、具催化活性的30-32kDA酶，释放18kDa前肽。此最终切割事件由金属内切蛋白酶前胶原C蛋白酶催化，该酶也称为骨形态发生蛋白-1(BMP-1)。有趣的是，该酶还在LOX底物—胶原的加工中发挥作用。然后去除N-糖基单元。
预测可能的信号肽切割位点在LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4的氨基末端。所预测信号切割位点为：LOXL1为Gly25和Gln26之间，LOXL2为Ala25和Gln26之间，LOXL3为Gly25和Ser26之间，LOXL4为Arg23和Pro24之间。
已鉴定LOXL1蛋白的BMP-1切割位点在Ser354和Asp355之间。Borel等(2001)J.Biol.Chem.276：48944-48949。已预测其它赖氨酰氧化酶型酶的潜在BMP-1切割位点，预测是根据前胶原和前LOX中BMP-1切割的共有序列位于Ala/Gly-Asp序列，之后通常是酸性或带电残基。LOXL3中预测的BMP-1切割位点位于Gly447和Asp448之间；加工此位点可产生与成熟LOX大小类似的成熟肽。也在LOXL4内鉴定了潜在的BMP-1切割位点，位于残基Ala569和Asp570之间。Kim等(2003)J.Biol.Chem.278：52071-2561。LOXL2也可与其它LOXL家族成员类似地进行蛋白水解切割并分泌。Akiri等(2003)Cancer Res.63：1657-1666.
如赖氨酰氧化酶中存在共有催化结构域所预期，存在活性位点的所述酶原C末端30kDa区的序列高度保守(约95％)。在所述前肽结构域中观察到较为适度的保守性(约60-70％)。
就本公开的目的而言，术语“赖氨酰氧化酶型酶”包括所有上述5种赖氨酸氧化酶，也包括基本保留酶活性如能催化赖氨酰残基脱氨的LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4的功能片段和/或衍生物。通常，功能片段或衍生物保留其至少50％的赖氨酸氧化活性。在一些实施方式中，功能片段或衍生物保留其至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的赖氨酸氧化活性。
赖氨酰氧化酶型酶的功能片段还旨在包括不显著改变催化活性的保守性氨基酸取代(就天然多肽序列而言)。术语“保守性氨基酸取代”指基于某些共有结构和/或性质的氨基酸分组。就共有结构而言，氨基酸可分成含非极性侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)，含极性不带电侧链(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸)和含极性带电侧链(赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸)。含芳族侧链的氨基酸组包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。脯氨酸、色氨酸和组氨酸中存在杂环侧链。在含非极性侧链的氨基酸组中，具有短烃侧链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)可与具有较长、非烃侧链的氨基酸(甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)相区分。在具有极性带电侧链的氨基酸组中，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)可与带碱性侧链的氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)相区分。
一种确定个体氨基酸共有性质的功能性方法是分析同源生物体对应蛋白之间氨基酸改变的归一化频率(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of ProteinStructure(《蛋白结构原理》)，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，1979)。根据此类分析，可限定氨基酸组，同源蛋白中优选用某组内的氨基酸互相取代，从而对总体的蛋白结构具有相似的影响(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，《蛋白结构原理》，施普林格出版公司，1979)。根据此类分析，可鉴定彼此保守性取代的以下氨基酸组：
(i)含带电基团的氨基酸，由Glu、Asp、Lys、Arg和His组成，
(ii)含带正电基团的氨基酸，由Lys、Arg和His组成，
(iii)含带负电基团的氨基酸，由Glu和Asp组成，
(iv)含芳族基团的氨基酸，由Phe、Tyr和Trp组成，
(v)含氮环基团的氨基酸，由His和Trp组成，
(vi)含大的脂肪族非极性基团的氨基酸，由Val、Leu和Ile组成，
(vii)含微极性基团的氨基酸，由Met和Cys组成，
(viii)含小残基的氨基酸，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成，
(ix)含脂肪族基团的氨基酸，由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成，以及
(x)含羟基的氨基酸，由Ser和Thr组成。
因此，如上所示范，氨基酸的保守性取代为本领域技术人员已知且可常规进行而不改变所得分子的生物学活性。本领域技术人员还认识到，多肽非必需区域的单一氨基酸取代通常不显著改变生物学活性。参见例如Watson等“MolecularBiology of the Gene(《基因分子生物学》)”第4版，1987，加利福尼亚州门洛帕克的本杰明/卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Pub.Co.)，第224页。
有关赖氨酰氧化酶型酶的额外信息见例如Rucker等(1998)Am.J.Clin.Nutr.67：996S-1002S和Kagan等(2003)J.Cell.Biochem 88：660-672.另见共有的美国专利申请公开号2009/0053224(2009年2月26日)和2009/0104201(2009年4月23日)；其公开内容通过引用纳入本文。
赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂
赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂包括激活剂(激动剂)和抑制剂(拮抗剂)，并可用多种筛选试验选出。在一种实施方式中，调节剂可通过确定测试化合物是否结合赖氨酰氧化酶型酶来鉴定，其中，若发生结合，则所述化合物为候选调节剂。可选地，可对此类候选调节剂进行其它测试。或者，候选化合物可接触赖氨酰氧化酶型酶，并分析所述赖氨酰氧化酶型酶的生物学活性；改变所述赖氨酰氧化酶型酶生物学活性的化合物为赖氨酰氧化酶型酶的调节剂。通常，降低赖氨酰氧化酶型酶生物学活性的化合物为所述酶的抑制剂。
鉴定赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂的其它方法包括将候选化合物在含有一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的细胞培养物中孵育，并分析所述细胞的一种或多种生物学活性或特征。改变培养物中所述细胞的生物活性或特征的化合物是赖氨酰氧化酶型酶活性的潜在调节剂。可分析的生物学活性包括例如，赖氨酸氧化、过氧化物生成、氨生成、赖氨酰氧化酶型酶水平、编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA水平，和/或赖氨酰氧化酶型酶的一种或多种特异性功能。前述试验的其它实施方式中，在不与候选化合物接触的情况下，将所述一种或多种生物活性或细胞特征与一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的水平或活性相关联。例如，所述生物活性可以是细胞功能如迁移，趋化，上皮-间充质转化或间充质-上皮转化，且所述变化通过与一种或多种对照或参比样品的比较测得。例如，阴性对照样品可包括赖氨酰氧化酶型酶水平降低的其中添加候选化合物的培养物；或是与测试培养物的赖氨酰氧化酶型酶含量相同但不添加候选化合物的培养物。在一些实施方式中，含有不同水平赖氨酰氧化酶型酶的单独培养物接触候选化合物。若观察到生物学活性的变化，并且若所述变化在具有较高水平赖氨酰氧化酶型酶的培养物中更大，则所述化合物鉴定为赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂。确定所述化合物是赖氨酰氧化酶型酶的激活剂还是抑制剂可以由所述化合物诱导的表型凸显，或可能需要进一步试验，例如测试所述化合物对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的酶活性的影响。
本领域已知获得赖氨酰氧化酶型酶的生化或重组方法，以及细胞培养和酶促试验方法以鉴定上述赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂。
赖氨酰氧化酶型酶的酶活性可以用多种不同方法测试。例如，评价赖氨酰氧化酶的酶活性可通过检测和/或定量分析过氧化氢、铵离子和/或醛的生成，通过分析赖氨酸氧化和/或胶原交联，或通过测量细胞侵袭能力、细胞粘附、细胞生长或转移性生长。参见例如Trackman等(1981)Anal.Biochem.113：336-342；Kagan等(1982)Meth.Enzymol.82A：637-649；Palamakumbura等(2002)Anal.Biochem.300：245-251；Albini等(1987)Cancer Res.47：3239-3245；Kamath等(2001)CancerRes.61：5933-5940；美国专利号4,997,854和美国专利申请公开号2004/0248871.
例如，测试化合物包括但不限于：有机小化合物(例如分子量为约50-约2,500Da的有机分子)，核酸或蛋白质。所述化合物或多种化合物可以由化学合成或微生物制备和/或包含在例如样品中，如来自诸如植物、动物或微生物的细胞提取物。此外，所述化合物可以是本领域已知但此前未知能调节赖氨酰氧化酶型酶活性。用于分析赖氨酰氧化酶型酶调节剂的反应混合物可以是无细胞的提取物，或者可以含有细胞培养物或组织培养物。例如，多种化合物可以加至反应化合物、加至培养基、注入细胞内或给予转基因动物。例如，试验中所用细胞或组织可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞，或可含有或取自非人的转基因动物。
本领域技术人员已知多种方法能用于产生和筛选大型文库以鉴定对某靶标如赖氨酰氧化酶型酶具有特异亲和性的化合物。这些方法包括噬菌体展示方法，其中随机肽由噬菌体展示并采用固定化受体通过亲和层析进行筛选。参见例如，WO91/17271、WO 92/01047和美国专利号5,223,409。在另一方法中，用光刻法合成固定在固相载体(例如，“芯片(chip)”)上的聚合物组合文库。参见例如，美国专利号5,143,854，WO 90/15070和WO 92/10092。固定化聚合物接触带标记的受体(例如，赖氨酰氧化酶型酶)，并扫描支撑物以确定标记的位置，从而鉴定结合所述受体的聚合物。
已描述在连续纤维素膜支撑物上合成并筛选肽文库，其能用于鉴定感兴趣多肽(例如，赖氨酰氧化酶型酶)的结合配体，例如，参见Kramer(1998)Methods Mol.Biol.87：25-39。由此试验鉴定的配体是感兴趣蛋白的候选调节剂，并可选定用于进一步测试。例如，该方法还可用于测得感兴趣蛋白的结合位点和识别基序。参见例如，Rudiger(1997)EMBO J.16：1501-1507和Weiergraber(1996)FEBS Lett379：122-126。
WO 98/25146描述了用于筛选具有所需性质的化合物复合物文库的其它方法，所需性质如激活、结合或拮抗多肽或其细胞受体的能力。这种文库中的复合物包括受测试的化合物，记录所述化合物合成中至少一个步骤的标签，和易被报道分子修饰的系留部分(tether)。用系留部分的修饰来指示某复合物含有具备某所需性质的化合物。可解码所述标签以显示该化合物合成中的至少一个步骤。用于鉴定与赖氨酰氧化酶型酶相互作用的化合物的其它方法有，例如，用噬菌体展示系统的体外筛选，过滤结合实验，和相互作用的″实时″测定，采用如BIAcore仪器(法玛西亚公司(Pharmacia))。
所有这些方法可按本发明所述用于鉴定赖氨酰氧化酶型酶或相关多肽的活化剂/激动剂和抑制剂/拮抗剂。
合成赖氨酰氧化酶型酶调节剂的另一途径是使用肽的模拟类似物。模拟肽类似物可以通过如用立体异构体即D-氨基酸取代天然产生的氨基酸来生成，参见例如Tsukida(1997)J.Med.Chem.40：3534-3541。此外，前模拟物(pro-mimetic)组分可掺入肽中以重建可能在去除初始多肽部分时丧失的构象性质。参见例如Nachman(1995)Regul.Pept.57：359-370。
构建肽模拟物的另一方法是将非手性o-氨基酸残基掺入肽使得脂链的聚亚甲基单元取代酰胺键。Banerjee(1996)Biopolymers 39：769-777。其它系统中小肽激素的强效肽模拟类似物也已有描述。Zhang(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.224：327-331。
也可通过由连续酰胺烷化合成肽模拟物组合文库，然后测试所得化合物，例如测试其结合和免疫学性质，来鉴定赖氨酰氧化酶型酶调节剂的肽模拟物。拟肽组合文库的产生和使用方法已有描述。参见例如，Ostresh，(1996)Methods inEnzymology 267：220-234和Dorner(1996)Bioorg.Med.Chem.4：709-715。此外，一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的三维和/或晶体结构可用于设计一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的肽模拟物抑制剂。Rose(1996)Biochemistry 35：12933-12944；Rutenber(1996)Bioorg.Med.Chem.4：1545-1558。
模拟天然生物学多肽的低分子量合成分子的基于结构的设计和合成还可见例如Dowd(1998)Nature Biotechnol.16：190-195；Kieber-Emmons(1997)CurrentOpinion Biotechnol.8：435-441；Moore(1997)Proc.West Pharmacol.Soc.40：115-119；Mathews(1997)Proc.West Pharmacol.Soc.40：121-125；和Mukhija(1998)EuropeanJ.Biochem.254：433-438.
本领域技术人员还熟知可以设计、合成并评估有机小化合物的模拟物，例如，能用作赖氨酰氧化酶型酶的底物或配体的模拟物。例如，已描述海帕洛素(hapalosin)的D-葡萄糖模拟物显示在细胞毒性中拮抗多药耐药相关蛋白的功效与海帕洛素类似。Dinh(1998)J.Med.Chem.41：981-987。
可以研究赖氨酰氧化酶型酶的结构，用来指导选择调节剂，例如，小分子、肽、肽模拟物和抗体。赖氨酰氧化酶型酶的结构性质有助于鉴定能结合赖氨酰氧化酶型酶或作为其配体、底物、结合伴侣或受体的天然或合成分子。参见例如，Engleman(1997)J.Clin.Invest.99：2284-2292。例如，可采用适当的计算机程序进行赖氨酰氧化酶型酶结构基序的折叠模拟和计算机重新设计。Olszewski(1996)Proteins 25：286-299；Hoffman(1995)Comput.Appl.Biosci.11：675-679。蛋白质折叠的计算机模拟可用于详细肽和蛋白质结构的构象与能量分析。Monge(1995)J.Mol.Biol.247：995-1012；Renouf(1995)Adv.Exp.Med.Biol.376：37-45。适当的程序可用于利用计算机协助搜索互补肽序列来鉴定赖氨酰氧化酶型酶上与配体和结合伴侣相互作用的位点。Fassina(1994)Immunomethods 5：114-120。已描述用于设计蛋白质和肽的其它系统，例如Berry(1994)Biochem.Soc.Trans.22：1033-1036；Wodak(1987)，Ann.N.Y.Acad.Sci.501：1-13；和Pabo(1986)Biochemistry 25：5987-5991。上述结构分析所得结果可用于，例如，制备能对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性起调节剂作用的有机分子、肽和肽模拟物。
赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂可以是竞争性抑制剂、无竞争性抑制剂、混合型抑制剂或非竞争性抑制剂。竞争性抑制剂通常和底物具有结构相似性，往往结合活性位点，并在较低底物浓度下更有效。存在竞争性抑制剂时，表观KM有提高。无竞争性抑制剂通常结合酶-底物复合物或底物在活性位点结合后可用的位点，并可能使活性位点变形。存在无竞争性抑制剂时，表观KM和Vmax都降低，且底物浓度对抑制的影响很小或没有。混合型抑制剂既能结合游离酶，也能结合酶-底物复合物，并因此对底物结合与催化活性都有影响。非竞争性抑制是混合型抑制的特例，其中此类抑制剂以相等亲合力结合酶与酶-底物复合物，抑制不受底物浓度影响。非竞争性抑制剂通常与酶在活性位点外的区域结合。对于酶抑制的更多细节可参见例如，Voet等，(2008)同上。对于酶如赖氨酰氧化酶型酶而言，其天然底物(例如，胶原蛋白、弹性蛋白)通常在体内以极大过量存在(与任何抑制剂在体内能实现的浓度相比)，非竞争性抑制剂因为抑制不受底物浓度影响而具有优势。
抗体
在某些实施方式中，赖氨酰氧化酶型酶的调节剂是抗体。在另一些实施方式中，抗体是赖氨酰氧化酶型酶活性的抑制剂。
本文所用的术语″抗体″指所含肽序列(例如，可变区序列)能特异性结合抗原表位的分离或重组多肽结合试剂。该术语以最广义应用，且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，纳米抗体，双抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，所述片段包括但不限于Fv、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fab2，只要它们呈现所需的生物学活性。术语“人抗体”指除了可能的非人CDR区，含有源自人序列的抗体，且不意味着必须存在免疫球蛋白分子的完全结构，只要所述抗体在人体中具有最小的免疫原性效应(即，不诱导生成其自身的抗体)。
″抗体片段″包括全长抗体的部分，例如全长抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等(1995)Protein Eng.8(10)：1057-1062)；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生各含单个抗原结合位点的两个相同抗原结合片段，称为″Fab″片段，和残留的″Fc″片段，该命名反映易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍能交联抗原的F(ab′)2片段。
″Fv″是含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。该区由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成。在该构象中各可变区的三个CDR相互作用限定VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。六个CDR共同将抗原结合特异性赋予抗体。但是，即使单个可变区(或仅含抗原特异的6个CDR中3个的分离VH或VL区)仍具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和性通常低于完整的Fv片段。
在重链和轻链可变区以外，“Fab”片段还含有轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab片段最初在木瓜蛋白酶消化抗体后观察到。Fab′片段与Fab片段的区别在于F(ab′)片段在重链CH1区羧基末端含有数个额外残基，包括抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab′)2片段含有在绞链区附近通过二硫键连接的两个Fab片段，最初在胃蛋白酶消化抗体后观察到。Fab′-SH是本文对其中恒定区的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab′片段的命名。还已知抗体片段的其它化学偶联。
来自任意脊椎动物种的抗体(免疫球蛋白)的″轻链″可根据其恒定区的氨基酸序列分为称作κ和λ的两种截然不同类型中的一种。根据其重链上恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种还可分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
″单链Fv″或″sFv″或″scFv″抗体片段含有抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方式中，Fv多肽的VH和VL结构域之间还包含多肽接头，这可使sFv形成抗原结合所需结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(《单克隆抗体药物学》)，第113卷(Rosenburg和Moore编)纽约的施普林格出版公司，第269-315页(1994).
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链中相互连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)(VH-VL)。使用长度过短以至于无法在同一条链的两个结构域之间形成配对的接头时，该结构域只能与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。二抗体的描述还可见例如EP404,097；WO 93/11161和Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448。
″分离″抗体是已从其天然环境的组成中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境的组成可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方式中，分离的抗体纯化至(1)按罗氏(Lowry)法确定抗体重量超过95％，例如，超过99％重量；(2)纯化程度足以获取N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，例如通过使用转杯式测序仪获取；或者(3)通过还原或非还原条件下的凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)用考马斯蓝或银染检测达到均一性。术语″分离的抗体″包括重组细胞内的原位抗体，因为该抗体天然环境中的至少一种组分将不存在。在某些实施方式中，分离的抗体由至少一个纯化步骤制得。
在一些实施方式中，抗体为人源化抗体或人抗体。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和性和性能的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR残基取代。因此，非人(如鼠)抗体的人源化形式是包含衍生自非人免疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白。非人序列主要位于可变区，具体是互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基所替换。人源化抗体也可包含受体抗体和输入CDR或构架序列中均未见的残基。在某些实施方式中，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个可变区的全部，其中所有或几乎所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，所有或几乎所有的构架区是人免疫球蛋白共有序列的构架区。就本发明的目的而言，人源化抗体还可包括免疫球蛋白片段，如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列。
人源化抗体也可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的Fc。参见例如Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature332：323-329；and Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596.
本领域已知人源化非人抗体的方法。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称作″输入″或″供体″残基，它们一般取自″输入″或″供体″可变区。例如，可基本按照Winter和同事所述方法通过用啮齿动物CDR或CDR序列代替人抗体的相应序列进行人源化。参见例如Jones等，同上；Riechmann等，同上和Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536.因此，这些“人源化”抗体包括嵌合抗体(美国专利号4816567)，其中明显小于完整的人可变区由来自非人物种的相应序列取代。在某些实施方式中，人源化抗体是其中一些CDR残基和可选的一些构架区残基由啮齿动物抗体(例如鼠单克隆抗体)中相似位点的残基取代的人抗体。
例如，人抗体也可通过使用噬菌体展示文库来制备。Hoogenboom等(1991)J.Mol.Biol.227：381；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581。其它制备人单克隆抗体的方法公开于Cole等(1985)“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)”Alan R.Liss，第77页和Boefrner等(1991)J.Immunol.147：86-95。
人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因被部分或完全灭活的转基因动物(如小鼠)中来制备。在免疫攻击后，观察到人抗体生成，其在所有方面都与人中所见非常相似，包括基因重排、装配和抗体库。该方法公开于例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和以下科学出版物：Marks等(1992)Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等(1994)Nature 368：856-859；Morrison(1994)Nature 368：812-813；Fishwald等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；Neuberger(1996)Nature Biotechnology 14：826；和Lonberg等(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93。
可以用上述已知的选择和/或突变方法使抗体亲和成熟。在一些实施方式中，亲和成熟抗体的亲和性是用以制备成熟化抗体的起始抗体(通常为鼠、兔、鸡、人源化或人)亲和性的5倍或更高，10倍或更高，20倍或更高，或30倍或更高。
抗体也可以是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，并可以是人或人源化的抗体。在本情况中，所述两种不同的结合特异性可以针对两种不同的赖氨酰氧化酶型酶或单个赖氨酰氧化酶型酶上的两个不同表位。
本文公开的抗体还可以是免疫偶联物。这种免疫偶联物包括偶联有第二分子如报道子的抗体(例如对赖氨酰氧化酶型酶)。免疫偶联物还可包括偶联有细胞毒性试剂如化疗试剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的具酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性偶联物)的抗体。
″特异性结合″或″特异于″具体多肽或具体多肽上某表位的抗体是能结合该具体多肽或表位而基本不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体特异性结合其靶标的解离常数(Kd)等于或低于100nM，可选低于10nM，可选低于1nM，可选低于0.5nM，可选低于0.1nM，可选低于0.01nM，或可选低于0.005nM；以单克隆抗体、scFv、Fab或其它抗体形式在约4℃、25℃、37℃或42℃的温度测得。
在某些实施方式中，本发明的抗体结合赖氨酰氧化酶型酶中的一个或多个加工位点(例如，蛋白水解切割位点)，从而有效阻断原酶或前原酶加工成具催化活性的酶，从而降低赖氨酰氧化酶型酶的活性。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体结合人LOX和/或人LOXL2的结合亲和性高于其对其它赖氨酰氧化酶型酶如LOX1、LOXL2、LOXL3和LOXL4的结合亲和性，例如高10倍、高至少100倍、或甚至高至少1000倍。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体是赖氨酰氧化酶型酶催化活性的非竞争性抑制剂。在某些实施方式中，本发明所述的抗体在赖氨酰氧化酶型酶的催化域外结合。在某些实施方式中，本发明所述的抗体结合LOXL2的SRCR4结构域。在某些实施方式中，结合LOXL2的SRCR4结构域并作为非竞争性抑制剂的抗LOXL2抗体是AB0023抗体，其描述于共有的美国专利申请公开号US2009/0053224和US 2009/0104201。在某些实施方式中，结合LOXL2的SRCR4结构域并作为非竞争性抑制剂的抗LOXL2抗体是AB0024抗体(AB0023抗体的人形式)，其描述于共有的美国专利申请公开号US 2009/0053224和US 2009/0104201。
可选地，本发明所述的抗体不但结合赖氨酰氧化酶型酶，还降低或抑制所述赖氨酰氧化酶型酶的摄取或内化，例如经由整联蛋白β1或其它细胞受体或蛋白。此类抗体能例如结合胞外基质蛋白、细胞受体和/或整联蛋白。
能够识别赖氨酰氧化酶型酶的示范性抗体，以及涉及赖氨酰氧化酶型酶的其它公开内容可见共有的美国专利申请公开号US 2009/0053224和US 2009/0104201，其公开内容通过引用纳入本文以描述针对赖氨酰氧化酶型酶的抗体、其制备方法及其用途。
用于调节赖氨酰氧化酶型酶表达的多核苷酸
反义
赖氨酰氧化酶型酶的调节(如抑制)可通过下调赖氨酰氧化酶型酶的转录或翻译水平表达实现。一种此类调节方法涉及使用能序列特异性结合编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA转录物的反义寡核苷酸或多核苷酸。
反义寡核苷酸(或反义寡核苷酸类似物)与目标mRNA分子的结合可导致胞内核糖核酸酶H酶切割杂交物。在一些情况下，反义RNA-mRNA杂交物的形成可干扰正确剪接。这两种情况中，适于翻译的完整的功能性靶mRNA数量都减少或消除。在其它情况中，反义寡核苷酸或寡核苷酸类似物与靶mRNA的结合可避免(例如，通过位阻)核糖体结合，从而防止mRNA翻译。
反义寡核苷酸可包括任意类型的核苷酸亚基，例如，其可以是DNA、RNA、类似物如肽核酸(PNA)，或上述各种的混合物。RNA寡核苷酸与靶mRNA分子形成更稳定的双链体，但该未杂交的寡核苷酸在胞内稳定性低于其它类型寡核苷酸和寡核苷酸类似物。这可以通过在细胞内用为此目的设计的载体来表达RNA寡核苷酸而克服。例如，可以在尝试靶向编码高丰度且长寿命蛋白的mRNA时使用这一方法。
设计反义寡核苷酸时可以考虑的其它注意事项包括：(i)结合靶序列时的充分特异性；(ii)溶解度；(iii)抵御胞内和胞外核酸酶的稳定性；(iv)穿透细胞膜的能力；以及(v)用于治疗生物体时的低毒性。
已有算法根据说明所述靶mRNA和所述寡核苷酸的结构性变化能量的热力学循环来鉴定对其靶mRNA具有最高预期结合亲和性的寡核苷酸序列。例如，Walton等(1999)Biotechnol.Bioeng.65：1-9利用此类方法设计了针对兔β-球蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转录物的反义寡核苷酸。同一研究组还报道了细胞培养中针对三种模型靶mRNA(人乳酸脱氢酶A和B及大鼠gp130)合理选定的寡核苷酸的反义活性在几乎所有情况中都证实有效。这包括利用由磷酸二酯和硫代磷酸酯化学制备的寡核苷酸在两种细胞类型中对三种不同靶标的测试。
此外，还有多种方法利用体外系统设计特异性寡核苷酸并预测其效率。参见例如Matveeva等(1998)Nature Biotechnology 16：1374-1375。
本文所述的反义寡核苷酸包括多核苷酸或多核苷酸类似物，其至少有10个核苷酸，例如10-15个，15-20个，至少17个，至少18个，至少19个，至少20个，至少22个，至少25个，至少30个或甚至至少40个核苷酸。这种多核苷酸或多核苷酸类似物能在生理条件下体内与编码赖氨酰氧化酶型酶如LOX或LOXL2的mRNA退火或杂交(即，基于碱基互补形成双链结构)。
如本发明所述的反义寡核苷酸可由给予细胞或组织的核酸构建物表达。可选地，反义序列的表达由诱导型启动子控制，使得细胞或组织内反义序列的表达可开启或关闭。或者，反义寡核苷酸可以化学合成并作为如药物组合物的部分而直接给予细胞或组织。
反义技术已产生高度精确的反义设计算法和多种寡核苷酸递送系统，因此本领域普通技术人员能设计并实施适于下调已知序列表达的反义方法。对于有关反义技术的其它信息，见例如Lichtenstein等.，“Antisense Technology：A PracticalApproach(反义技术：实践方法)，”牛津大学出版社(Oxford University Press)，1998。
小RNA和RNAi
抑制赖氨酰氧化酶型酶活性的另一方法是RNA干扰(RNAi)，该方法利用双链小干扰RNA(siRNA)分子，该分子与靶mRNA同源并导致其降解。Carthew(2001)Curr.Opin.Cell.Biol.13：244-248。
RNA干扰通常是两步法。在称为启动步骤的第一步中，输入的dsRNA被消化成21-23个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)，消化可能是通过切酶(Dicer)的作用，该酶是双链特异性核糖核酸酶RNA酶III家族的成员，以ATP依赖性方式切割RNA。例如，可以直接或经转基因或病毒递送输入RNA。连续的切割事件将RNA降解成19-21bp的双链体(siRNA)，各含2个核苷酸的3’突出。Hutvagner等(2002)Curr.Opin.Genet.Dev.12：225-232；Bernstein(2001)Nature 409：363-366。
在第二步—效应步骤中，siRNA双链体结合核酸酶复合物形成RNA诱导沉默复合物(RISC)。活化RISC需要siRNA双链体的ATP依赖性解链。然后活性RISC(含有单个siRNA和RNA酶)通过碱基配对相互作用靶向同源性转录物并通常从所述siRNA的3′末端开始将所述mRNA切割成约12个核苷酸的片段。Hutvagner等，见上；Hammond等(2001)Nat.Rev.Gen.2：110-119；Sharp(2001)Genes.Dev.15：485-490。
RNAi和相关方法也描述于Tuschl(2001)Chem.Biochem.2：239-245；Cullen(2002)Nat.Immunol.3：597-599；和Brantl(2002)Biochem.Biophys.Acta.1575：15-25。
适用于本发明作为赖氨酰氧化酶型酶活性抑制剂的RNAi分子的示例性合成策略是扫描起始密码子下游适当的mRNA序列寻找AA双核苷酸序列。将每个AA及其下游(即，3’相邻)19个核苷酸记录为潜在的siRNA靶位点。优选编码区的靶位点，因为结合mRNA非翻译区(UTR)和/或翻译起始复合物的蛋白质可能干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合。Tuschl(2001)同上。但应当理解，针对非翻译区的siRNA也可以是有效的，因为已证明在siRNA针对GAPDH基因5’UTR的情况中，其介导细胞GAPDH mRNA降低约90％并完全消除蛋白水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。一旦如上所述获取一组潜在靶位点，将所述潜在靶标的序列与适当的基因组数据库(例如，人、小鼠、大鼠等)用序列比对软件(例如，可从NCBI在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST软件)进行比较。排除与其它编码序列呈现显著同源性的潜在靶位点。
符合条件的靶序列选作siRNA合成模板。选定序列可以包括低G/C含量的序列，因为已经显示在介导基因沉默中它们比G/C含量超过55％的那些更为有效。可沿所评估靶基因长度上选择多个靶位点。为了更好地评估所选siRNA，联用阴性对照。阴性对照siRNA可包括与测试siRNA的核苷酸组成相同但与所述基因组缺乏显著同源性的序列。因此，例如，可利用所述siRNA的错义核苷酸序列，只要其不显示与其它任意基因的任何显著同源性。
本发明所述的siRNA分子可以由表达载体转录，该载体一旦引入宿主细胞就能促进所述siRNA转录物的稳定表达。这些载体经工程改造以表达小发夹RNA(shRNA)，其在体内加工成能实现基因特异性沉默的siRNA分子。参见例如，Brummelkamp等(2002)Science 296：550-553；Paddison等(2002)GenesDev.16：948-958；Paul等，(2002)Nature Biotech.20：505-508；Yu等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-6052。
小发夹RNA(shRNA)是形成双链发夹环结构的单链多核苷酸。双链区由可与靶序列杂交的第一序列和与所述第一序列互补的第二序列形成，靶序列是例如编码赖氨酰氧化酶型酶的多核苷酸(例如，LOX或LOXL2mRNA)。所述第一和第二序列形成双链区；而位于所述第一和第二序列间的未碱基配对接头核苷酸形成发夹环结构。shRNA的双链区(茎)可包括限制性内切核酸酶识别位点。
shRNA分子可以具有任选的核苷酸突出，例如2-bp的突出如3′UU突出。尽管可能有变化，茎长度的范围通常为约15-49，约15-35，约19-35，约21-31bp，或约21-29bp，且所述环的大小可在约4-30bp范围内，例如，约4-23bp。
为了在细胞内表达shRNA，可以利用含启动子(例如，RNA聚合酶III H1-RNA启动子或U6RNA启动子)，用于插入shRNA编码序列的克隆位点以及转录终止信号(例如某段4-5个腺苷-胸苷碱基对)的质粒载体。聚合酶III启动子通常具有确定的转录起始和终止位点，且其转录物没有聚腺苷酸尾。这些启动子的终止信号由聚胸苷束限定，且转录物通常在第二个编码尿苷后切割。所表达shRNA中该位置的切割产生3′UU突出，类似于合成siRNA的3′突出。前文引用的参考文献中描述了在哺乳动物细胞中表达shRNA的其它方法。
合适shRNA表达载体的一个示例是pSUPERTM(低聚引擎有限公司(Oligoengine，Inc.)，华盛顿州西雅图)，其包括聚合酶-III H1-RNA基因启动子和明确的转录起始位点与由5个连续腺苷-胸苷对组成的终止信号。Brummelkamp等，同上。转录产物在第二尿苷(终止序列所编码的5个之中)后的位点处切割产生类似于合成siRNA末端的转录物，其也含有核苷酸突出。将待转录成shRNA的序列克隆入这类载体使其产生转录物，其包含与部分mRNA靶标(例如，编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA)互补的第一序列和含所述第一序列的反向互补体的第二序列，所述第一序列和第二序列由较短间隔子分开。所得转录物自身折返形成茎环结构，其介导RNA干扰(RNAi)。
另一合适的siRNA表达载体在单独的pol III启动子调节下编码有义和反义siRNA。Miyagishi等(2002)Nature Biotech.20：497-500.该载体产生的siRNA还包括五胸苷(T5)终止信号。
siRNA、shRNA和/或其编码载体可用多种方法如脂质转染引入细胞。也已开发载体介导的方法。例如，可用逆转录病毒将siRNA分子递送入细胞。在某些情况中，用逆转录病毒递送siRNA可提供优势，因为逆转录病毒递送可以有效、均一并直接选择稳定的“敲减(knock-down)细胞。Devroe等(2002)BMC Biotechnol.2：15。
最近的科技出版物证实了这种短双链RNA分子在抑制靶mRNA表达中的功效并从而明确表明此类分子的治疗性潜力。例如，RNAi被用于抑制丙肝病毒感染的细胞(McCaffrey等(2002)Nature 418：38-39)，HIV-1感染的细胞(Jacque等(2002)Nature 418：435-438)，宫颈癌细胞(Jiang等(2002)Oncogene 21：6041-6048)和白血病细胞(Wilda等(2002)Oncogene 21：5716-5724)。
调节赖氨酰氧化酶型酶表达的方法
调节赖氨酰氧化酶型酶活性的另一方法是调节其编码基因的表达，若基因表达被抑制则导致活性水平较低，而若基因表达被激活则活性水平较高。可用多种方法实现细胞内基因表达的调节。
例如，通过链置换或三链体形成而结合基因组DNA(例如，赖氨酰氧化酶型基因的调控区)的寡核苷酸可阻断转录，从而避免赖氨酰氧化酶型酶的表达。对此已描述了称为″转回(switch back)″化学连接的用途，其中寡核苷酸识别其靶标中一条链上的聚嘌呤延伸和另一链上的同型嘌呤序列。三链体形成还可利用含有人工碱基的寡核苷酸获得，从而就离子强度和pH而言扩展了结合条件。
还可通过例如将含有功能域和DNA-结合域的融合蛋白或编码此类融合蛋白的核酸引入细胞内，来实现赖氨酰氧化酶型酶编码基因的转录调节。例如，功能域可以是转录活化结构域或转录抑制结构域。示例性转录活化结构域包括VP16、VP64和NF-κB的p65亚基，示例性转录抑制结构域包括KRAB、KOX和v-erbA。
在某些实施方式中，此类融合蛋白的DNA结合域部分是在赖氨酰氧化酶型酶编码基因中或其附近结合、或在该基因调节区结合的序列特异性DNA结合域。DNA结合域可天然结合于所述基因或调节区的序列或其附近，或者可以工程改造为如此结合。例如，所述DNA结合域可以获自天然产生的调节赖氨酰氧化酶型酶编码基因表达的蛋白质。或者，所述DNA结合域可以经工程改造以结合赖氨酰氧化酶型酶编码基因中或其邻近或此类基因调节区中所选序列。
在这方面，可用锌指DNA结合域，因为能工程改造锌指蛋白以结合选定的任意DNA序列。锌指结合域包括一个或多个锌指结构。Miller等(1985)EMBO J4：1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American，二月：56-65；美国专利号6,453,242。通常，单个锌指长约30个氨基酸，并含有4个锌-配位氨基酸残基。结构研究表明典型锌指基序(C2H2)含有抵靠α螺旋(通常含两个锌配位组氨酸残基)堆积的两个β片层(保持在β转角中，其通常含有两个锌配位半胱氨酸残基)。
锌指包括经典的C2H2锌指(即，其中锌离子由2个半胱氨酸和2个组氨酸残基配位)和非经典锌指，例如，C3H锌指(其中锌离子由3个半胱氨酸和1个组氨酸残基配位)和C4锌指(其中锌离子由4个半胱氨酸残基配位)。非经典锌指还可包括用半胱氨酸或组氨酸以外的氨基酸取代这些锌配位残基其中之一的锌指。参见例如，WO 02/057293(2002年7月25日)和US 2003/0108880(2003年6月12日)。
锌指结合域可工程改造为相比天然产生的锌指蛋白具有新结合特异性，从而能够构建经工程改造结合选定序列的锌指结合域。参见例如Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416。工程改造方法包括但不限于合理设计与多种经验选择方法。
例如，合理设计包括利用包含三联(或四联)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中各三联或四联核苷酸序列与一种或多种结合该特定三联或四联序列的锌指氨基酸序列相关联。例如，参见美国专利6,140,081；6,453,242；6,534,261；6,610,512；6,746,838；6,866,997；7,030,215；7,067,617；美国专利申请公开号2002/0165356；2004/0197892；2007/0154989；2007/0213269；和国际专利申请公开号WO 98/53059和WO 2003/016496。
示范性选择方法包括噬菌体展示、相互作用陷阱、杂交体选择和双杂交系统，其公开于美国专利号5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,140,466；6,200,759；6,242,568；6,410,248；6,733,970；6,790,941；7,029,847和7,297,491；以及美国专利申请公开号2007/0009948和2007/0009962；WO98/37186；WO 01/60970和GB 2,338,237。
增强锌指结合域结合特异性的描述参见如美国专利号6,794,136(2004年9月21日)。与指间接头序列有关的锌指蛋白工程改造的其它方面公开于美国专利号6,479,626和美国专利申请公开号2003/0119023.另见Moore等，(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1432-1436；Moore等(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：1437-1441和WO 01/53480。
关于含工程改造锌指DNA结合域的融合蛋白用途的进一步详述可参见例如美国专利6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,070,934、7,163,824和7,220,719。
调控赖氨酰氧化酶型酶的表达的其它方法包括定向诱变基因或控制所述基因表达的调节区。用含核酸酶结构域和经工程改造DNA结合域的融合蛋白的定向诱变示例性方法已有提供，例如，参见美国专利申请公开2005/0064474、2007/0134796和2007/0218528。
制剂、试剂盒和给予途径
还提供了含鉴定为赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂(例如赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂或激活剂)的化合物的治疗组合物。这些组合物通常包括调节剂和药学上可接受的载体。补充的活性化合物也可纳入所述组合物。赖氨酰氧化酶型酶的活性调节剂，特别是抑制剂还可用于例如与神经细胞营养剂(术语“神经细胞营养剂”和“抗神经病变剂”在本说明书中互换使用)联合，减少或消除由于提高的眼内压造成的神经病变。因此，本文所述治疗组合物可包含赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂和一种神经细胞营养剂。在其它实施方式中，治疗性组合物包括治疗有效量的赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂，但不含有神经细胞营养剂，所述组合物与神经细胞营养剂分开给予。
本文所用的术语“治疗有效量”或“有效量”指单独或与另一治疗剂联合给予细胞、组织或对象(例如哺乳动物如人或非人动物，如灵长类动物、啮齿动物、牛、马、猪、羊等)时，有效防止或缓解病情或疾病发展的治疗剂含量。治疗有效剂量还指足以引起症状完全或部分缓解如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症或者治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度提高的化合物量。例如，赖氨酰氧化酶型酶活性抑制剂的治疗有效量随着疾病或紊乱类型、疾病或紊乱的广泛性、患有疾病或紊乱的生物体大小而改变。
本文公开的治疗组合物用于减少小梁切除术导致的损伤等。因此，赖氨酰氧化酶型酶的活性调节剂(例如抑制剂)的“治疗有效量”是能预防或减少小梁切除术(例如在青光眼治疗过程中发生的)导致的纤维化损伤的量。赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂(例如抑制剂)的治疗有效量还可描述为维持小梁切除术临床益处的量，例如与手术干预前的IOP相比，在手术治疗的眼中维持眼内压(IOP)降低，这是通过例如在手术治疗的眼中预防IOP显著升高，例如在小梁切除术中维持引入滤过泡实现的。手术治疗后降低的IOP的维持可描述成在手术治疗后提供降低的IOP持续至少5日、至少10日、至少15日、至少30日或以上。小梁切除术后滤过泡引入的维持可描述成在手术后维持滤过泡至少5日、至少10日、至少15日、至少30日或以上。
例如，当赖氨酰氧化酶抑制剂是抗体且所述抗体在体内给予时，取决于例如体重、给予途径、疾病严重性等，剂量可从每天约10ng/kg变化到多至100mg/kg哺乳动物体重或更高，例如约1微克/千克/天-50毫克/千克/天，可任选约100微克/千克/天-20毫克/千克/天，500微克/千克/天-10毫克/千克/天，或1毫克/千克/天-10毫克/千克/天。
赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂与抗神经病变剂联用时，也可以指所述组合的治疗有效剂量，无论是组合、依序或同时给予，该剂量是引起纤维化损伤和神经病变减少的所述调节剂与抗神经病变剂的组合量。可有超过一种浓度组合是治疗有效的。
根据本公开，本领域技术人员已知各种药物组合物和其制备及应用技术。对于合适的药物组合物及其给药技术的详细列表，可见本文的详细描述，其进一步由以下教材补充如Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第17版1985；Brunton等，“Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics(《古德曼吉尔曼治疗学的药理学基础》)，”麦格劳希尔公司(McGraw-Hill)，2005；费城科学大学(编)，“(Remington：The Science and Practiceof Pharmacy(《雷明顿：：药物科学和实践》)，”Lippincott Williams & Wilkins，2005；和费城科学大学(编)，“Remington：The Principles of Pharmacy Practice(《雷明顿：药物实践原理》)，”Lippincott Williams & Wilkins，2008。
公开的治疗组合物还包括药学上可接受的材料、组合物或载剂，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，即运载体。这些运载体参与将对象调节剂从一个器官或机体区域转运到另一器官或机体区域。各运载体从与制剂的其它成分的相容性和对患者无害的意义上而言应“可接受”。能用作药学上可接受运载体的材料的一些示例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可油和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中采用的其它无毒相容性物质。所述组合物中还可存在湿润剂，乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，涂覆剂，甜味剂，增味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂。
本文的另一方面涉及给予赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂的试剂盒。本文的另一方面涉及组合给予赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂和抗神经病变剂的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包括配制于药物运载体中的赖氨酰氧化酶型酶活性抑制剂(例如LOX或LOXL2抑制剂)，可选含有至少一种抗神经病变剂，适当配制成一种或多种单独药物制剂。
制剂和递送方法可根据纤维化损伤的位置和程度调整。示例性制剂包括但不限于适于胃肠外给药例如静脉内、动脉内、眼内或皮下给药的制剂，包括包封于胶束、脂质体或药物释放胶囊(活性药剂纳入设计用于缓释的生物相容性包衣内)的制剂；可摄取的制剂；外用制剂，如滴眼剂、乳膏、油膏和凝胶；和其它制剂如吸入剂、气溶胶和喷雾剂。本文的化合物剂量根据治疗需求的程度和严重性、所给予组合物的活性、对象的整体健康状况和技术人员熟知的其它考量而变化。
在另一些实施方式中，本文所述组合物局部递送。可实现这种局部传递，例如通过眼内注射或通过应用滴眼剂。对象内的眼内给药可通过例如结膜内给药实现。小梁切除术治疗的对象中眼内给药可通过在手术位点处或周围应用赖氨酰氧化酶型酶的活性调节剂(例如抑制剂)来实现。
给药
为了用赖氨酰氧化酶型酶的调节剂治疗眼纤维化，可使用任何本领域已知的方法对眼递送物质。例如，可用直接对眼注射递送赖氨酰氧化酶型酶的调节剂，例如抗LOX抗体或抗LOXL2抗体(或编码这些抗体的多核苷酸)。在其它实施方式中，采用赖氨酰氧化酶型酶调节剂外用给药。例如，眼可浸在含有调节剂的溶液中，或调节剂可配制于用作滴眼剂的溶液。还可系统性给予赖氨酰氧化酶型酶的调节剂，提供到达眼的有效浓度，而没有(或可接受)眼外副作用。
编码赖氨酰氧化酶型酶的抗体的核酸(或赖氨酰氧化酶型酶活性的任意其它类型调节剂，例如抑制剂，如核酶、siRNA、shRNA或微小RNA)可任选地包封在病毒载体中。本领域已知多种病毒载体，包括细小病毒、乳多泡病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒和慢病毒。
一类重组病毒载体基于缺陷型和非病原性细小病毒腺相关病毒血清型2(AAV-2)。载体衍生自含有AAV145bp末端反向重复序列并侧接转基因表达盒的质粒。用该载体系统通过整合入感染细胞的基因组获得有效基因转移和稳定的转基因递送。Wagner等(1998)Lancet 351：1702-1703；Kearns等(1996)Gene Ther.9：748-755
其它腺关联病毒载体包括AAV血清型1、5、6、7、8和9；以及嵌合AAV血清型，例如AAV 2/1和AAV 2/5。单链和双链(例如自身互补)的AAV载体都可使用。
实施例
实施例1：兔小梁切除术模型
在该研究中使用四只雌性新西兰兔，12-14周龄，每只重2-3公斤。肌肉内注射55.5mgKetalar
Figure BPA00001563284600301
(50mg/ml)和39.5mg Rompun
Figure BPA00001563284600302
(2％)引发全身麻醉。在每只动物的双眼内如下进行小梁切除术。在显微镜下，抬起基于边缘的结膜瓣，然后钝器剥离结膜下空间。形成大约2.5mmx4mm的巩膜瓣后，去除一片小梁网，进行虹膜切除术。虹膜切除术后，闭合巩膜和结膜瓣。手术结束后，形成滤过泡。
在手术后的既定时间点检测动物并测定IOP。手术后的第1日检测双眼，然后每两日一次，直至杀死小鼠。用Tono-Pen眼压计测量IOP。观察和记录滤过泡的大小和特征，用滤过泡失败(由滤过泡的结疤、变平、和血管化指示)作为终点。
小梁切除术后第3、8、14和30日，各通过给予致死剂量的Rompun
Figure BPA00001563284600304
杀死一只动物，剜出双眼。从每只眼内收集滤过泡上部(含有纤维化结膜)和非纤维化结膜的下部。将来自各动物一只眼的样品冷冻在液氮内，用于RNA和蛋白质分析。收集来自各动物另一只眼的样品，固定在4％多聚甲醛中并石蜡包埋。切出七微米切片。对一些切片通过免疫组织化学分析炎症量度CD45的表达(实施例4)。通过用苏木精和伊红(H&E)染色，用马氏三色染色和天狼星红染色分析其它切片的纤维化(实施例5)。用免疫组织化学分析其它切片的LOX和LOXL2表达(实施例6)。
用蔡司成像仪Z1以放大倍数10x和分辨率1292x968像素来获得图像，用蔡司Axiocam MRC5拍照。用蔡司KS300软件对图像进行形态学分析。用该软件确定整个切片的面积，测定切片内对于不同标记阳性染色的面积(见下)，并计算对于研究中特定标记阳性的整个切片面积的比例。对单独样品用Statistica 6.1统计软件，通过斯氏T-检验分析数据。小于0.05的p值视为统计上显著。
实施例2：IOP测定
小梁切除术前，小梁切除术后第1日，其后每两日测定眼内压(IOP)(图1)。在左眼和右眼中，IOP在小梁切除术后1日内降低了30-40％，直到第13-15日都保持稳定；然后IOP升高，回到与手术前存在的相当或更高的水平。
实施例3：滤过泡面积的测定
用卡尺测量滤过泡长度和宽度，确定滤过泡面积(图2)。对于双眼，手术后第1日的平均滤过泡面积是14-19mm2。此后，滤过泡面积稳定下降，直至小梁切除术后第13日滤过泡面积为1-2mm2。13日后，在研究中的两只剩余动物内滤过泡失败(即变平，结疤和血管化)。
实施例4：炎症
免疫组织化学分析水泡的纤维化上部和非纤维化结膜的薄切片中的白细胞标记CD45，CD45的存在指示炎症。对该分析，95℃进行20分钟抗原修复，用兔血清作为封闭剂。将切片与小鼠抗兔CD45抗体(1/100；ADS公司(AbDSerotec))一起室温孵育过夜。翌日，将载玻片与生物素化兔抗小鼠抗体(Dakocytomation)一起以1/300稀释度室温孵育45分钟。然后用TSA间接试剂盒(perkin Elmer TSATM；NEL7004)在室温下显影切片，用TNT洗涤缓冲液洗涤。以1/100稀释度使用链霉亲和素过氧化物酶，将生物素以1/50稀释在工作缓冲液中。用二氨基联苯胺四盐酸(DAB，密苏里州圣路易斯的西格玛(Sigma))作为发色团。
对CD45阳性细胞进行计数，并用蔡司KS300软件测定切片面积。然后以每平方米的CD45阳性细胞数计算切片的白细胞密度，用作炎症程度的量度。
该分析的结果表明，在结膜的非纤维化样品中不存在白细胞(即未观察到CD45免疫反应性)。在纤维化滤过泡样品中，白细胞数从第3日到第8日增加，第8日达到峰值，然后下降。参见图3中染色样品的例子。图4显示了小梁切除术后第3、8、14和30天的CD45水平的定量。
实施例5：纤维化
用三色、天狼星红或苏木精/伊红(H&E)对如上所述获得的薄切片染色，然后用显微镜分析。图5、6和7中分别显示了三色、天狼星红和H&E染色切片的例子。
通过测定显示胶原染色的切片面积并将其表示成切片总面积的百分数，定量评分纤维化程度。用蔡司KS300软件测定面积。
全部三种染色方法的结果揭示，非纤维化结膜组织中的胶原沉积在所有时间点相当；而纤维化组织中的胶原水平在每个时间点都比非纤维化组织中高，在纤维化组织中从第3天到第14天有轻微向上的趋势。见图8。有趣的是，注意到第14日胶原沉积似乎达到了平台，就在第13日滤过泡失败之后。因此，可能在第13日左右同时发生的IOP提高和滤过泡失败是由于纤维化损伤。
实施例6：赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)蛋白质的表达
用免疫组织化学评估如上所述从滤过泡的上部纤维化部分和下部非纤维化结膜获得的7微米切片中LOX和LOX2蛋白的存在。用M64抗体检测LOX；用M20抗体检测LOXL2。两者都是小鼠抗人单克隆抗体，两者都描述于共有的美国专利申请公开号2009/0053224。以1/1000的稀释度使用M64(3ug/ml)；以1/200的稀释度使用M20(55ug/ml)。
用类似于实施例4公开的方法进行免疫组织化学。用蔡司成像仪Z1以放大倍数10x和分辨率1292x968像素获得图像，采用和蔡司Axiocam MRC5。用蔡司KS300软件进行形态分析。对各样品用Statistica 6.1统计软件，通过斯氏T-检验分析数据。小于0.05的p值视为统计上显著。
图9和10显示了对LOX和LOXL2染色的代表性切片。图11显示了小梁切除术后眼纤维化和非纤维化区域内LOX和LOXL2的表达水平定量。结果通常表明，LOX和LOXL2在滤过泡的纤维化组织中的表达都相较下方的非纤维化结膜组织表达高许多。
实施例7：LOX和LOXL2mRNA的表达
从冷冻组织中纯化RNA(见实施例1)，用于赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶相关蛋白(例如LOXL2)转录水平的分析。
将组织样品悬浮于700μl含β-巯基乙醇的Qiagen RLT缓冲液中，用Polytron手持电匀浆器匀浆。根据生产商说明书(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州瓦伦西亚)用RNeasy小试剂盒进行RNA分离。洗脱的RNA用Ambion rDNAseI根据试剂说明书进行脱氧核糖核酸酶处理。
通过定量反转录/聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定赖氨酰氧化酶和赖氨酰氧化酶样蛋白的水平。用司查塔基(Strategene)Brilliant II一步核心试剂盒根据生产商说明书，在每个反应中使用100ng RNA模板进行反转录和扩增反应。用BeaconDesignerTM软件(Premier Biosoft，加利福尼亚州帕洛阿尔托)设计目标mRNA的引物和FAM/BHQ-1探针，就引物而言所用终浓度为400nm且探针为250nM。
通过体外siRNA敲减实验验证了引物/探针组对靶mRNA的特异性，并用表达中到高水平靶mRNA的细胞系RNA稀释物测试了其扩增效力。100％的效力对应于扩增反应对数期每个循环中扩增子量倍增，使得每3.32个循环扩增子量增加10倍。通过将Ct对输入RNA浓度在半对数级上作图，并测定如此产生的曲线斜率来确定效力。然后如下计算效力百分数(E)：
E＝(10-1/斜率-1)x 100
确定全部引物/探针组的扩增效力＞90％。
将测试mRNA水平对核糖体蛋白L19(RPL19)的mRNA水平归一化，结果表达成纤维化滤过泡组织中相较非纤维化结膜组织的相对表达。
实施例8：小梁切除术后LOX和LOXL2的抑制剂治疗
纤维化滤过泡组织中LOX和LOXL2的表达增加(实施例6)提示这些蛋白活性的减少可能阻止纤维化和最终的滤过泡失败。为了测试这个想法，在小梁切除术后用抗LOX和抗LOXL2抗体治疗动物；并测定眼内压(IOP)和各种滤过泡性质(实施例9)。还测定了抗体治疗对炎症(实施例10)、新血管生成(实施例10)和纤维化(实施例11)程度的效果。
抗LOX抗体M64和抗LOXL2抗体M20配制在含3mg/ml工作溶液的PBST中(1X磷酸缓冲盐，pH 7.4+0.01％吐温20)。抗体的工作溶液储存在4℃。
在该研究中使用12只雌性新西兰兔，12-14周龄。对于每只动物，如实施例1所述对双眼进行小梁切除术，除了巩膜瓣的大小为5mmx5mm。手术后，用抗体处理一只眼，用载体(PBS，pH 7.4)处理各动物的另一只眼。六只动物接受抗LOX抗体，另六只接受抗LOXL2抗体。在第0日给予抗体(即在手术后立即)，然后一周两次持续30日。在第0日，在结膜下注射100μl抗体(0.3mg)，在一只眼的前房中注射200μl(0.6mg)，对另一只眼给予载体(结膜下100μl，前房中200μl)。此后，通过结膜下注射一周两次给予100μl抗体(0.3mg)，同时在对照眼中结膜下注射100μl载体。
实施例9：LOX和LOXL2对滤过泡性质的抑制效果
手术后第1日和此后直至杀死每隔一日检测2只眼的眼内压(IOP)和滤过泡性质。用Tono-Pen
Figure BPA00001563284600341
眼压计测量IOP。滤过泡性质包括滤过泡面积、滤过泡高度和结膜血管化。出现结疤的扁平滤过泡视作滤过泡失败。
眼内压
在测试的每个时间点对照和治疗眼中眼内压类似(图12)。
滤过泡面积
用卡尺测量滤过泡面积。在小梁切除术后用抗LOX或抗LOXL2抗体治疗眼，导致滤过泡面积相较对照眼有统计学显著的增加(图13)。
滤过泡高度
用卡尺测量滤过泡高度。在小梁切除术后用抗LOX或抗LOXL2抗体治疗眼，导致滤过泡高度相较对照眼有统计学显著的增加(图14)。
滤过泡存活
将滤过泡存活(即不存在滤过泡失败)作为研究终点，而将滤过泡失败定义为出现结疤扁平的滤过泡。在抗体处理和未处理眼中滤过泡的分析显示，相较用对照的PBS处理的眼，用抗LOX抗体或用抗LOXL2抗体处理显著延长了术后滤过泡存活。图15显示了用卡普兰-迈耶存活图形式表示的这些数据。用对数秩检验对滤过泡失败进行卡普兰-迈耶存活分析。
实施例10：LOX和LOXL2对血管生成和炎症的抑制效果
手术后第30天杀死全部动物。死亡后，立即剜出双眼(对照和用抗体处理的)。从每只眼中收集滤过泡上部(含纤维化结膜)和非纤维化结膜的下部。这些样品固定在4％多聚甲醛中，石蜡包埋。切出七微米切片。分析一些切片的CD31表达，评估新血管生成；其它分析作为炎症量度的CD45表达。用天狼星红染色分析其它切片的纤维化。
在配有Axiocam Mrc5数码相机(卡尔蔡司(Karl Zeiss))，放大倍数为20倍，分辨率为2584x 1936像素的莱卡显微镜上获得图像。用Axiovision软件进行形态测量学分析(即薄切片中面积的测量)。
用斯氏t检验对各样品分析组织学数据。用混合模型分析分析各时间点的数据以用于重复的测量(使用SAS9.2)。小于0.05的p值被认为是统计学显著的。数据表示为平均值±SEM。
血管生成
通过免疫组织化学分析第30天的眼的薄切片中内皮标记CD31的表达，其存在表明有新血管生成。对于该分析，37℃对切片进行胰蛋白酶消化7分钟，用山羊血清作为封闭剂。将切片与小鼠抗人CD31抗体(1/500；Pharmingen)一起室温孵育过夜。翌日，将载玻片与生物素化山羊抗小鼠抗体(Dakocytomation)一起以1/300稀释度在室温下孵育45分钟。然后用TSA间接试剂盒(perkin Elmer TSATM；NEL7004)室温下显影切片，用TNT洗涤缓冲液洗涤。以1/100稀释度使用链霉亲和素过氧化物酶，将生物素以1/50稀释在工作缓冲液中。用二氨基联苯胺(DAB，密苏里州圣路易斯的西格玛)作为生色团。通过测定显示CD31免疫反应性的切片面积，并将其表示成总损伤面积的百分数，定量新血管生成程度。
在图16的最左栏显示了代表性结果，图17显示了定量分析。通过测定显示CD31免疫反应性的切片面积，并将其表示成总切片面积的百分数，进行定量。用蔡司Axiovision 40V 4.7.1.0软件测定面积。
CD31水平的定量显示了在滤过泡中，术后用抗LOXL2抗体治疗使得新血管生成相较PBS处理的眼在统计学上显著减少了47％(图17，B图)。当矫正非滤过泡组织中的背景CD31水平时，观察到CD31表达减少65％。
对照和抗体处理的眼的非滤过泡组织中(图17，A图；图17，B图)CD31表达相似，用抗LOX抗体处理与对照眼相比在此实验中未减少滤过泡中CD31的表达(图17，A图)。
炎症
通过确定显示CD45免疫反应性的细胞数，并将该数据表示成切片中CD45阳性细胞的密度，定量炎症程度。如上文实施例4所述进行CD45的免疫组织化学分析。
图16的中间栏显示了代表性结果，图18显示了定量分析。用蔡司Axiovision40V 4.7.1.0软件测定面积。
CD45水平的定量显示了在滤过泡中，术后用抗LOXL2抗体治疗使得炎症相较PBS处理的眼在统计学上显著减少了34％(图18，B图)。当矫正非滤过泡组织中的背景CD45水平时，观察到CD45表达减少53％。
对照和抗体处理的眼的非滤过泡组织中(图18，A图；图18，B图)CD45表达相似，用抗LOX抗体处理与对照眼相比在此实验中未减少滤过泡中CD45的表达(图18，A图)。
实施例11：LOX和LOXL2对纤维化的抑制效果
通过用天狼星红染色测试治疗和未治疗眼中的胶原沉积，确定抗体治疗对纤维化的作用。在偏振光下分析天狼星红染色的切片。
通过测定显示胶原染色的切片面积，并将其表示成切片总面积的百分数，定量评分纤维化程度。用蔡司Axiovision 40V 4.7.1.0软件测定面积。
在图16的最右栏显示了代表性结果，图19显示了定量分析。胶原水平的定量显示了在滤过泡中，术后用抗LOXL2抗体治疗使得胶原沉积相较PBS处理的眼在统计学上显著减少了16％(图19，B图)。当矫正非滤过泡组织中的背景CD45胶原水平时，观察到胶原沉积减少26％。
当矫正非滤过泡组织中的背景胶原水平时，用抗LOX抗体治疗也使得胶原沉积在统计学上显著下降22％，得到63％的减少。
来自对照的非滤过泡组织和抗体处理的眼内胶原沉积类似(图19A，19B)。
实施例12：LOX和LOXL2对房水中各种细胞因子和生长因子表达的抑制效果
在第-1，1，4，6，8，15和30日，从各眼收集房水样品(200μl)。用ELISA分析第30日样品中多种不同生长因子和细胞因子的存在(RBM，德克萨斯州奥斯汀)。
该分析结果表明，在用抗LOX抗体治疗的眼中，β2-微球蛋白、ICAM-1(胞内粘着分子-1)和RANTES(活化后调节，正常T细胞表达和分泌的)相较对照(PBS处理的)眼而上调。在用抗LOXL2抗体处理的眼中，下列分子的表达增加：α1-抗胰蛋白酶、β2-微球蛋白、因子VII、ICAM-1、IL-15(白细胞介素-15)、IL-17(白细胞介素17)、IL-1β(白细胞介素-1β)、IL-1ra(白细胞介素-1受体拮抗剂)、MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)，MMP-3(基质金属蛋白酶-3)和VCAM-1(血管细胞粘着分子-1)。
总之，抗LOX和抗LOXL2抗体都能通过与对照相比增加滤过泡面积和滤过泡存活来显著改善手术结果。相较对照，抗LOXL2处理组中不同免疫组织化学染色(CD31、CD45和天狼星红)的分析显示血管生成、炎症和纤维化显著减少。用抗LOX抗体处理使得胶原沉积相较对照显著减少。
这些结果显示，LOX和LOXL2对于眼伤口愈合的过程很重要，并提供了小梁切除术后重复抗LOX和抗LOXL2注射有效性的证据。它们还显示了在小梁切除术模型内，用抗LOX和抗LOXL2抗体处理后许多细胞因子和其它蛋白水平的改变。

Claims (18)

1.一种在生物体内治疗眼纤维化的方法，其中，所述方法包括：
抑制生物体的一个或多个细胞中赖氨酰氧化酶(LOX)蛋白质或赖氨酰氧化酶样-2(LOXL2)蛋白质的活性。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述赖氨酰氧化酶(LOX)蛋白质的活性被抑制。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述赖氨酰氧化酶相关-2(LOXL2)蛋白质的活性被抑制。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述LOX活性通过给予生物体抗LOX抗体来抑制。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LOXL2活性通过给予生物体抗LOXL2抗体来抑制。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述眼纤维化发生在接受青光眼治疗的生物体内。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述青光眼治疗是眼部手术。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述手术是小梁切除术。
9.如权利要求4、6、7或8中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗LOX抗体被引入生物体眼内。
10.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗LOXL2抗体被引入生物体眼内。
11.如权利要求4、6、7或8中任一项所述的方法，其特征在于，所述编码抗LOX抗体的多核苷酸给予生物体。
12.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述编码抗LOXL2抗体的多核苷酸给予生物体。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸被引入生物体眼内。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包封在病毒载体中，所述病毒载体选自腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是AAV2型或AAV4型。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物体是哺乳动物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
CN2010800538989A 2009-09-29 2010-09-28 治疗眼纤维化的方法和组合物 Pending CN102711753A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27791809P 2009-09-29 2009-09-29
US61/277,918 2009-09-29
US39745610P 2010-06-11 2010-06-11
US61/397,456 2010-06-11
PCT/US2010/050542 WO2011041309A1 (en) 2009-09-29 2010-09-28 Methods and compositions for treatment of ocular fibrosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102711753A true CN102711753A (zh) 2012-10-03

Family

ID=43780639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800538989A Pending CN102711753A (zh) 2009-09-29 2010-09-28 治疗眼纤维化的方法和组合物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20110076285A1 (zh)
EP (1) EP2482814A4 (zh)
JP (1) JP2013506005A (zh)
KR (1) KR20120091146A (zh)
CN (1) CN102711753A (zh)
AU (1) AU2010300813A1 (zh)
BR (1) BR112012007114A2 (zh)
CA (1) CA2775877A1 (zh)
MX (1) MX2012003759A (zh)
RU (1) RU2012117896A (zh)
WO (1) WO2011041309A1 (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030114410A1 (en) 2000-08-08 2003-06-19 Technion Research And Development Foundation Ltd. Pharmaceutical compositions and methods useful for modulating angiogenesis and inhibiting metastasis and tumor fibrosis
HUE025283T2 (en) * 2007-08-02 2016-03-29 Gilead Biologics Inc LOX and LOX2 inhibitors and their use
WO2010080769A2 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Arresto Biosciences, Inc. Chemotherapeutic methods and compositions
CN102439141A (zh) * 2009-02-06 2012-05-02 吉联亚生物科技有限公司 治疗新生血管形成的方法和组合物
AU2010284039A1 (en) * 2009-08-21 2012-03-22 Gilead Biologics, Inc. In vivo screening assays
RU2012110587A (ru) * 2009-08-21 2013-09-27 Джилид Байолоджикс, Инк. Терапевтические способы и композиции
WO2011022667A2 (en) 2009-08-21 2011-02-24 Arresto Biosciences, Inc Catalytic domains from lysyl oxidase and loxl2
WO2011022670A1 (en) * 2009-08-21 2011-02-24 Arresto Biosciences, Inc In vivo screening assays
AU2011212830B2 (en) * 2010-02-04 2014-05-22 Gilead Biologics, Inc. Antibodies that bind to lysyl oxidase-like 2 (LOXL2) and methods of use therefor
EP4324454A3 (en) 2016-03-08 2024-05-01 University of Utah Research Foundation Cross-linking agents and associated methods
WO2018035451A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Calimmune, Inc. Methods and compositions for treating conditions using recombinant self-complementary adeno-associated virus
US20200318080A1 (en) * 2016-08-19 2020-10-08 Colorado State University Research Foundation Methods and compositions for treating equine conditions using recombinant self-complementary adeno-associated virus
WO2018106956A2 (en) 2016-12-07 2018-06-14 University Of Florida Research Foundation, Incorporated IL-1RA CDNAs
WO2019178329A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating graves disease
GB201809295D0 (en) 2018-06-06 2018-07-25 Institute Of Cancer Res Royal Cancer Hospital Lox inhibitors
KR20200030875A (ko) 2018-09-13 2020-03-23 전남대학교산학협력단 트리코스타틴 a를 유효성분으로 포함하는 결막 섬유화 억제용 약학적 조성물
GB201818750D0 (en) 2018-11-16 2019-01-02 Institute Of Cancer Res Royal Cancer Hospital Lox inhibitors
GB202209624D0 (en) 2022-06-30 2022-08-17 Institute Of Cancer Res Royal Cancer Hospital Prodrugs
GB202209622D0 (en) 2022-06-30 2022-08-17 Institute Of Cancer Res Royal Cancer Hospital Compounds

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030152926A1 (en) * 1999-08-11 2003-08-14 Eos Biotechnology, Inc. Novel methods of diagnosis of angiogenesis, compositions and methods of screening for angiogenesis modulators
US20090053224A1 (en) * 2007-08-02 2009-02-26 Arresto Biosciences Lox and loxl2 inhibitors and uses thereof
US20090239947A1 (en) * 2008-01-25 2009-09-24 Weixang Dai Inhibition of proliferation and fibrotic response of activated corneal stromal cells

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6300092B1 (en) * 1999-01-27 2001-10-09 Millennium Pharmaceuticals Inc. Methods of use of a novel lysyl oxidase-related protein
US20030114410A1 (en) * 2000-08-08 2003-06-19 Technion Research And Development Foundation Ltd. Pharmaceutical compositions and methods useful for modulating angiogenesis and inhibiting metastasis and tumor fibrosis
US20060134172A1 (en) * 2004-12-21 2006-06-22 Alcon, Inc. Agents which regulate, inhibit, or modulate the activity and/or expression of lysyl oxidase (LOX) and LOX-like proteases as a unique means to both lower intraocular pressure and treat glaucomatous retinopathies/optic neuropathies
US20070021365A1 (en) * 2005-06-21 2007-01-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Inhibition of Lysyl oxidase for treating tumor growth and diagnostics relating thereto
US20070225242A1 (en) * 2005-06-21 2007-09-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and composition for treating and preventing tumor metastasis in vivo
IL184627A0 (en) * 2007-07-15 2008-12-29 Technion Res & Dev Foundation Agents for diagnosing and modulating metastasis and fibrosis as well as inflammation in a mammalian tissue
WO2010080769A2 (en) * 2009-01-06 2010-07-15 Arresto Biosciences, Inc. Chemotherapeutic methods and compositions
CN102439141A (zh) * 2009-02-06 2012-05-02 吉联亚生物科技有限公司 治疗新生血管形成的方法和组合物
WO2011022667A2 (en) * 2009-08-21 2011-02-24 Arresto Biosciences, Inc Catalytic domains from lysyl oxidase and loxl2
AU2010284039A1 (en) * 2009-08-21 2012-03-22 Gilead Biologics, Inc. In vivo screening assays
RU2012110587A (ru) * 2009-08-21 2013-09-27 Джилид Байолоджикс, Инк. Терапевтические способы и композиции
WO2011022670A1 (en) * 2009-08-21 2011-02-24 Arresto Biosciences, Inc In vivo screening assays

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030152926A1 (en) * 1999-08-11 2003-08-14 Eos Biotechnology, Inc. Novel methods of diagnosis of angiogenesis, compositions and methods of screening for angiogenesis modulators
US20090053224A1 (en) * 2007-08-02 2009-02-26 Arresto Biosciences Lox and loxl2 inhibitors and uses thereof
US20090239947A1 (en) * 2008-01-25 2009-09-24 Weixang Dai Inhibition of proliferation and fibrotic response of activated corneal stromal cells

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013506005A (ja) 2013-02-21
WO2011041309A1 (en) 2011-04-07
EP2482814A1 (en) 2012-08-08
KR20120091146A (ko) 2012-08-17
BR112012007114A2 (pt) 2016-07-05
EP2482814A4 (en) 2013-04-03
AU2010300813A1 (en) 2012-04-26
CA2775877A1 (en) 2011-04-07
RU2012117896A (ru) 2013-11-10
MX2012003759A (es) 2012-07-23
US20110076285A1 (en) 2011-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102711753A (zh) 治疗眼纤维化的方法和组合物
RU2561672C2 (ru) Способы и композиции для лечения фиброзных заболеваний легких
US20110044907A1 (en) In vivo screening assays
CN102439141A (zh) 治疗新生血管形成的方法和组合物
US20110076272A1 (en) Therapeutic methods and compositions
US20140186340A1 (en) Methods and Compositions for Normalization of Tumor Vasculature by Inhibition of LOXL2
CN102713601A (zh) 体外筛选试验
AU2015203752A1 (en) Methods and compositions for treatment of pulmonary fibrotic disorders

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121003